1991R2568 — SK — 01.01.2015 — 027.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

Zmenené a doplnené:







(*) Tento akt nebol zatiaľ uverejnený v slovenčine.









▼B

NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91

z 11. júla 1991,

o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických metódach







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na nariadenie Rady č. 136/66/EHS z 22. septembra 1966 o založení spoločnej organizácie trhu s olejmi a tukmi ( 1 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením (EHS) č. 3577/90 ( 2 ), a najmä na jeho článok 35 a, keďže príloha k nariadeniu č. 136/66/EHS zahŕňa opisy a definície olivového oleja a oleja z olivových zvyškov predávané v každom členskom štáte, v obchodovaní v rámci spoločenstva a obchodovaní s tretími krajinami; keďže by sa na účely rozlíšenia medzi rôznymi druhmi oleja mali stanoviť fyzikálne a chemické vlastnosti každého z nich a organoleptické vlastnosti panenského oleja s cieľom zaručiť čistotu a kvalitu príslušných produktov bez toho, aby boli dotknuté ostatné existujúce ustanovenia; keďže by sa prítomnosť vlastností rôznych druhov oleja mala stanoviť jednotne v rámci spoločenstva; keďže by sa na tento účel mali v rámci spoločenstva zaviesť metódy chemickej analýzy a organoleptického hodnotenia; keďže by sa na prechodné obdobie malo povoliť používanie iných metód analýzy platných v členských štátoch za predpokladu, že v prípade rozdielu vo výsledkoch budú rozhodujúce tie, ktoré sa získali použitím obvyklej metódy; keďže definovanie fyzikálnych a chemických vlastností olivového oleja a metód analýzy si vyžiadalo prílohu s doplňujúcimi poznámkami ku kapitole 15 colného sadzobníka; keďže pre metódu hodnotenia organoleptických vlastností panenského oleja je potrebné zostavenie skupín vybraných a vyškolených hodnotiteľov; keďže by lehota potrebná na zostavenie takýchto skupín mala byť presne stanovená; keďže s prihliadnutím na problémy, na ktoré môžu niektoré členské štáty pri zostavovaní skupín hodnotiteľov naraziť, využívanie skupín v ostatných členských by malo byť autorizované; keďže, s cieľom zaistiť, aby systém poplatkov uplatňujúcich sa na dovoz olivových zvyškov fungoval správne, bolo by potrebné ustanoviť jednotnú metódu na stanovenie obsahu oleja v týchto produktoch; keďže s cieľom neuškodiť obchodu by bolo potrebné zaviesť ustanovenie pre olej plnený do obalov pred nadobudnutím účinnosti tohto nariadenia, ktoré by obmedzovalo predávanie tohto oleja počas stanovenej lehoty; keďže je potrebné zrušiť nariadenie Komisie (EHS) č. 1058/77 ( 3 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením EHS č. 1858/88 ( 4 ); keďže Riadiaci výbor pre oleje a tuky nezaslal svoje stanovisko v lehote, ktorú určil jeho predseda, PRIJALA TOTO NARIADENIE:







▼M20

Článok 1

1. Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považujú za panenské olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

2. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za lampantový olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

3. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

4. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za olivový olej zmiešaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

5. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za surový zvyškový olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

6. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

7. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za zvyškový olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

▼M26

Článok 2

1. Vlastnosti olejov uvedené v prílohe I sa stanovujú v súlade s týmito analytickými metódami:

a) na stanovenie voľných mastných kyselín vyjadrených ako percentuálny obsah kyseliny olejovej – metóda uvedená v prílohe II;

b) na stanovenie peroxidového čísla – metóda uvedená v prílohe III;

c) na stanovenie obsahu voskov – metóda uvedená v prílohe IV;

d) na stanovenie zloženia a obsahu sterolov a triterpénových diolov kapilárnou plynovou chromatografiou – metóda uvedená v prílohe V;

e) na stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu – metóda uvedená v prílohe VII;

f) na spektrofotometrickú analýzu – metóda uvedená v prílohe IX;

g) na stanovenie zloženia mastných kyselín – metóda uvedená v prílohách X A a X B;

h) na stanovenie prchavých halogénovaných rozpúšťadiel – metóda uvedená v prílohe XI;

i) na hodnotenie organoleptických vlastností panenského olivového oleja – metóda uvedená v prílohe XII;

j) na stanovenie stigmastadiénov – metóda uvedená v prílohe XVII;

k) na stanovenie obsahu triacylglycerolov prostredníctvom ECN42 – metóda uvedená v prílohe XVIII;

l) na stanovenie obsahu alifatických alkoholov – metóda uvedená v prílohe XIX;

m) na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín – metóda uvedená v prílohe XX.

Na zisťovanie prítomnosti cudzích prímesí rastlinných olejov v olivovom oleji sa uplatňuje analytická metóda uvedená v prílohe XXa.

2. Overovanie organoleptických vlastností panenských olejov uskutočňujú vnútroštátne orgány alebo ich zástupcovia prostredníctvom degustačných porôt schválených členskými štátmi.

Organoleptické vlastnosti olejov, ako sa uvádza v prvom pododseku, sa považujú za zhodné s deklarovanou kategóriou, ak degustačná porota schválená príslušným členským štátom toto zatriedenie potvrdila.

V prípade, že by degustačná porota nepotvrdila deklarovanú kategóriu, pokiaľ ide o organoleptické vlastnosti, vnútroštátne orgány alebo ich zástupcovia na žiadosť zainteresovanej strany bezodkladne vykonajú dve kontrolné posúdenia prostredníctvom iných schválených porôt, z ktorých aspoň jedna je porotou schválenou dotknutým členským štátom produkujúcim olivový olej. Príslušné vlastnosti sa považujú za zhodné s deklarovanými vlastnosťami, ak sa deklarované zatriedenie potvrdí aspoň dvomi kontrolnými posúdeniami. Ak sa tak nestane, uvedená zainteresovaná strana znáša náklady na kontrolné posúdenia.

3. Na overovanie vlastností oleja podľa odseku 1 vnútroštátnymi orgánmi alebo ich zástupcami sa vzorky odoberajú v súlade s medzinárodnými normami EN ISO 661 o príprave vzoriek na analýzu a EN ISO 5555 o odbere vzoriek. Bez ohľadu na bod 6.8 normy EN ISO 5555 sa však odber vzorky v prípade dávok takýchto olejov vo vnútornom obale uskutoční v súlade s prílohou Ia k tomuto nariadeniu. Odber vzoriek olejov v prepravných obaloch, v prípade ktorých odber nemožno uskutočniť podľa normy EN ISO 5555, sa uskutočňuje v súlade s pokynmi príslušných orgánov členského štátu.

Bez toho, aby bola dotknutá norma EN ISO 5555 a kapitola 6 normy EN ISO 661, sa odobraté vzorky čo najskôr umiestnia na tmavé miesto, mimo silného zdroja tepla, a zašlú do laboratória na analýzu, a to najneskôr piaty pracovný deň po odobratí, inak sa vzorky udržiavajú spôsobom, aby sa ich kvalita neznížila alebo aby sa neznehodnotili počas prepravy alebo skladovania pred odoslaním do laboratória.

4. Na účely overovania stanoveného v odseku 3 sa analýzy uvedené v prílohách II, III, IX, XII a XX a všetky kontrolné analýzy vyžadované podľa vnútroštátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú v prípade balených výrobkov pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokiaľ ide o odber vzoriek olejov v prepravných obaloch, uvedené analýzy sa vykonajú najneskôr šesť mesiacov po mesiaci odberu vzorky.

Na ostatné analýzy stanovené v tomto nariadení sa neuplatňuje žiadne časové obmedzenie.

Ak výsledky analýz nezodpovedajú deklarovaným vlastnostiam kategórie olivového oleja alebo oleja z olivových výliskov, táto skutočnosť sa oznámi dotknutej strane najneskôr mesiac pred koncom lehoty stanovenej v prvom pododseku, a to okrem prípadov, keď sa vzorka odobrala menej ako dva mesiace pred dátumom minimálnej trvanlivosti.

5. Na účely určenia vlastností olivových olejov metódami stanovenými v odseku 1 prvom pododseku sa výsledky analýzy priamo porovnajú s medznými hodnotami stanovenými v tomto nariadení.

▼M25

Článok 2a

1. Na účely tohto článku označuje „predávaný olivový olej“ celkové množstvo olivového oleja a zvyškového olivového oleja príslušného členského štátu, ktorý sa v tomto štáte spotrebuje alebo sa z neho vyvezie.

2. Členské štáty zabezpečia selektívne a primerane časté vykonávanie kontrol zhody na základe analýzy rizík, aby sa zaistilo, že predávaný olivový olej je v súlade s deklarovanou kategóriou.

3. Kritéria na posúdenie rizík môžu zahŕňať aj:

a) kategóriu oleja, obdobie výroby, cenu oleja vzhľadom na cenu iných rastlinných olejov, postupy miešania a balenia, skladovacie zariadenia a podmienky, krajinu pôvodu, krajinu určenia, spôsob prepravy alebo objem zásielky;

b) pozíciu subjektov v obchodnom reťazci, objem a/alebo hodnotu oleja, ktorý predávajú, kategórie oleja, ktoré predávajú, druh vykonávanej podnikateľskej činnosti, ako je mletie, skladovanie, rafinovanie, miešanie, balenie alebo maloobchodný predaj;

c) zistenia z predchádzajúcich kontrol vrátane počtu a druhu zistených nedostatkov, obvyklej kvality predávaného oleja, úrovne používaného technického vybavenia;

d) spoľahlivosť systémov zaistenia kvality alebo systémov samokontroly subjektu týkajúcich sa dodržiavania obchodných noriem;

e) miesto vykonávania kontrol, najmä či ide o prvé miesto vstupu do Únie, posledné miesto výstupu z Únie alebo miesto výroby, balenia, nakladania alebo predaja oleja koncovému spotrebiteľovi;

f) akékoľvek ďalšie informácie, ktoré môžu poukazovať na riziko nedodržiavania noriem.

4. Členské štáty vopred ustanovia:

a) kritériá posúdenia rizika nedodržiavania obchodných noriem pri zásielkach;

b) na základe analýzy rizík pre každú rizikovú kategóriu minimálny počet subjektov alebo zásielok a/alebo množstiev, pri ktorých sa vykonajú kontroly zhody.

Ročne sa vykoná minimálne jedna kontrola zhody na tisíc ton predávaného olivového oleja v členskom štáte.

5. Členské štáty overujú súlad:

a) vykonaním analýz stanovených v prílohe I v ľubovoľnom poradí alebo

b) postupne v poradí stanovenom v prílohe Ib v rozhodovacom strome, až kým nedosiahnu jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.

▼M19 —————

▼M25

Článok 3

Ak sa zistí, že určitý olej nezodpovedá jeho opisu kategórie, dotknutý členský štát uplatňuje bez toho, aby boli dotknuté akékoľvek iné pokuty, účinné, primerané a odrádzajúce sankcie, ktoré treba stanoviť vzhľadom na závažnosť zistených nezrovnalostí.

Pokiaľ sa pri kontrolách zistia výrazné nezrovnalosti, zvýšia členské štáty periodicitu kontrol, ktoré sa týkajú stupňa uvedenia na trh, kategórie oleja, pôvodu alebo iných kritérií.

▼M5

Článok 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degustačných porôt na svojom území na ťažkosti, môžu sa obrátiť na degustačnú porotu schválenú v inom členskom štáte.

3. Každý členský štát vypracuje zoznam degustačných porôt ustanovených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpečí dosiahnutie súladu s týmito podmienkami.

▼M19 —————

▼B

Článok 6

1. Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvyškov, ktoré vznikajú pri extrakcii olivového oleja (číselné znaky KN 2306 90 11 a 2306 90 19 ), sa stanoví použitím metódy uvedenej v prílohe XV.

2. Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmotnosti oleja ku hmotnosti sušiny.

▼M20

Článok 7

Uplatňujú sa ustanovenia spoločenstva týkajúce sa prítomnosti nečistôt.

Pokiaľ ide o halogénované rozpúšťadlá, pre všetky kategórie olivových olejov platia nasledovné limity:

— maximálny objem každého detekovaného halogénovaného rozpúšťadla: 0,1 mg/kg,

— maximálny celkový objem detekovaných halogénovaných rozpúšťadiel: 0,2 mg/kg.

▼M25

Článok 7a

Fyzické alebo právnické osoby a skupiny osôb, ktoré skladujú olivový olej a zvyškový olivový olej od štádia extrakcie v mlyne až po štádium plnenia do fliaš na akékoľvek odborné alebo komerčné účely, sú povinné viesť evidenciu o vstupe a výstupe každej kategórie tohto oleja.

Členský štát zaistí riadne dodržiavanie povinnosti ustanovenej v prvom odseku.

▼M25

Článok 8

1. Členské štáty Komisii oznámia opatrenia na vykonávanie tohto nariadenia. Komisiu informujú o ich akýchkoľvek následných zmenách.

2. Najneskôr do 31. mája každého roku členské štáty predložia Komisii správu o zavádzaní tohto nariadenia za predchádzajúci kalendárny rok. Správa obsahuje minimálne výsledky kontrol zhody vykonaných na olivovom oleji podľa šablón stanovených v prílohe XXI.

3. Oznámenia uvedené v tomto nariadení sa podávajú podľa nariadenia Komisie (ES) č. 792/2009 ( 5 ).

▼B

Článok 9

Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zrušuje.

Článok 10

1. Táto smernica nadobúda účinnosť tretí deň od jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.

Postup uvedený v prílohe XII sa však bude uplatňovať od ►M1 1. novembra 1992 ◄ , okrem postupov týkajúcich sa systému intervencie.

▼M5

Daná metóda sa neuplatňuje na panenský olivový olej pripravený na trh pred 1. novembrom 1992.

▼B

2. Toto nariadenie sa nebude uplatňovať na olivový olej a olej z olivových zvyškov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie nadobudlo účinnosť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.

Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.









PRÍLOHY

Obsah







Príloha I: Vlastnosti olivových olejov Príloha Ia: Odber vzoriek olivového oleja alebo oleja z olivových výliskov dodávaných v bezprostrednom obale Príloha Ib: Rozhodovací strom na overenie súladu vzorky olivového oleja s deklarovanou kategóriou Príloha II: ►M21 Stanovenie voľných mastných kyselín, studená metóda ◄ Príloha III: Stanovenie peroxidového čísla Príloha IV: ►M6 Stanovenie obsahu vosku plynovo - kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny ◄ Príloha V: Stanovovanie skladby a obsahu sterolov a triterpénových diolov kapilárnou plynovou chromatografiou Príloha VII: ►M21 Stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu ◄ ▼M20 ————— ▼B Príloha IX: Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti Príloha X A: Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil Príloha XI: Stanovenie prchavých halogenovaných rozpúšťadiel v olivovom oleji Príloha XII: Metóda medzinárodnej rady pre olivy na organoleptické hodnotenie panenských olivových olejov ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Príloha XV: Obsah oleja v olivových zvyškoch Príloha XVI: Stanovenie jódového čísla Príloha XVII: Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch Príloha XVIII: Stanovenie rozdielu medzi skutočným a teoretickým obsahom triglyceridov s ECN 42 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content ▼M23 Príloha XX: Metóda na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou ▼M26 Príloha XXa: Metóda zisťovania cudzích olejov v olivových olejoch ▼M25 Príloha XXI: Výsledky kontrol zhody vykonaných na olivovom oleji podľa článku 8 ods. 2

▼M26









PRÍLOHA I

VLASTNOSTI OLIVOVÝCH OLEJOV







Kategória Etylestery mastných kyselín (EEMK) mg/kg (*) Kyslosť (%) (*) Peroxidové číslo mEq O2/kg (*) Vosky mg/kg (**) 2-glyceril monopalmitát (%) Stigmastadiény mg/kg (1) Rozdiel: ECN42 (HPLC) a ECN42 (2) (teoretický výpočet) K232 (*) K268 alebo K270 (*) Delta-K (*) Organoleptické hodnotenie Medián defektoru (Md) (*) Organoleptické hodnotenie Medián ovocnosti (Mf) (*) 1. Extra panenský olivový olej EEMK ≤ 40 (rok zberu 2013 – 2014) (3) EEMK ≤ 35 (rok zberu 2014 – 2015) EEMK ≤ 30 (roky zberu po roku 2015) ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 0,9 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % > 14 % 2. Panenský olivový olej — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 0,9 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % > 14 % 3. Lampový olivový olej — > 2,0 — (4) ≤ 0,9 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (5) — ≤ 1,1 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % > 14 % 4. Rafinovaný olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 0,9 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % > 14 % 5. Olivový olej zložený z rafinovaných a panenských olivových olejov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 0,9 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ak je celkový obsah kyseliny palmitovej v % > 14 % 6. Surový olej z olivových výliskov — — — (6) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafinovaný olej z olivových výliskov — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olej z olivových výliskov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Celkový obsah izomérov, ktoré sa (ne-)dajú separovať pomocou kapilárnej kolóny. (2) Olivový olej musí spĺňať požiadavky podľa metódy stanovenej v prílohe XXa. (3) Táto mezdná hodnota sa uplatňuje na olivové oleje vyrobené počnúc 1. marcom 2014. (4) Oleje s obsahom voskov od 300 mg/kg do 350 mg/kg sa považujú za lampový olivový olej, ak celkovo obsahujú najviac 350 mg/kg alifatických alkoholov alebo ak obsahujú najviac 3,5 % erytrodiolu a uvaolu. (5) Alebo ak je medián defektoru nad 3,5 alebo ak je medián defektoru najviac 3,5 a medián ovocnosti je rovný 0. (6) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je obsah erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 3,5 %.







Kategória Skladba mastných kyselín (1) Celkový obsah trans- izomérov kyseliny olejovej (%) Celkový obsah trans- izomérov kyseliny linolovej + kyseliny linolénovej (%) Skladba sterolov Celkový obsah sterolov (mg/kg) Erytrodiol a uvaol (%) (**) Myristová (%) Linolénová (%) Ikozánová (%) Eikosenová (%) Behénová (%) Lignocerová (%) Cholesterol (%) Brasikasterol (%) Kampesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App β-sitosterol (%) (3) Delta-7-stigmastenol (2) (%) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Panenský olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampový olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivový olej zložený z rafinovaných a panenských olivových olejov ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surový olej z olivových výliskov ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafinovaný olej z olivových výliskov ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olej z olivových výliskov ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Obsah ostatných mastných kyselín (%): palmitovej: 7,50 – 20,00; palmitoolejovej: 0,30 – 3,50; heptadekánovej: ≤ 0,30; heptadecénovej: ≤ 0,30; stearovej: 0,50 – 5,00; olejovej: 55,00 – 83,00; linolovej: 3,50 – 21,00. (2) Pozri dodatok k tejto prílohe. (3) App β-sitosterol: Delta-5,23-stigmastadienol+chlerosterol+beta-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-stigmastadienol. (4) Oleje s obsahom voskov od 300 mg/kg do 350 mg/kg sa považujú za lampový olivový olej, ak celkovo obsahujú najviac 350 mg/kg alifatických alkoholov alebo ak obsahujú najviac 3,5 % erytrodiolu a uvaolu. (5) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je obsah erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 3,5 %.

Poznámky:

a) Výsledky analýz sa musia uvádzať s rovnakým počtom desatinných miest, aký je určený pre jednotlivé vlastnosti. Číslica na poslednom desatinnom mieste sa musí zaokrúhliť smerom nahor, ak je nasledujúca číslica väčšia ako 4.

b) Ak hoci len jediná vlastnosť nezodpovedá určeným hodnotám, je to dostačujúci dôvod na to, aby sa na účely tohto nariadenia tento olivový olej zaradil do inej kategórie alebo aby bol označený za nevyhovujúci z hľadiska čistoty.

c) Kvalitatívna vlastnosť oleja označená hviezdičkou (*) znamená, že: – v prípade lampového olivového oleja sa obe príslušné medzné hodnoty môžu líšiť od stanovených hodnôt súčasne; – v prípade panenských olivových olejov, ak sa aspoň jedna z týchto medzných hodnôt líši od stanovených hodnôt, je to dôvod na zmenu kategórie olejov, hoci ich zaradenie v jednej z kategórii panenských olivových olejov sa naďalej zachová.

d) Kvalitatívne vlastnosti olivových olejov označené dvoma hviezdičkami (**) znamenajú, že pre všetky druhy olivových olejov z olivových výliskov sa obe príslušné medzné hodnoty môžu líši od stanovených hodnôt súčasne.









Dodatok

Rozhodovací strom

Rozhodovací strom pre kampesterol v panenských a extra panenských olivových olejoch:

Ostatné parametre musia spĺňať medzné hodnoty stanovené v tomto nariadení.

Rozhodovací strom pre delta-7-stigmastenol:

— v extra panenských a panenských olivových olejoch —

Ostatné parametre musia spĺňať medzné hodnoty stanovené v tomto nariadení.

— v oleji z olivových výliskov (surovom a rafinovanom) —









PRÍLOHA Ia

ODBER VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA ALEBO OLEJA Z OLIVOVÝCH VÝLISKOV DODÁVANÝCH V BEZPROSTREDNOM OBALE

Táto metóda odberu vzoriek sa uplatňuje na dávky olivového oleja alebo oleja z olivových výliskov umiestnené v bezprostrednom obale. V závislosti od toho, či bezprostredný obal presahuje 5 litrov alebo nie, sa uplatňujú rôzne metódy odberu.

„Dávka“ je sada predajných jednotiek, ktoré sa produkujú, vyrábajú a balia v takých podmienkach, že olej nachádzajúci sa v každej predajnej jednotke sa považuje za homogénny, pokiaľ ide o všetky analytické vlastnosti. Individualizácia dávky sa musí uskutočniť v súlade so smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2011/91/EÚ ( 6 ).

„Čiastková vzorka“ je množstvo oleja v bezprostrednom obale odobraného z náhodného bodu dávky.

1. OBSAH PRIMÁRNEJ VZORKY

1.1. Bezprostredný obal nepresahujúci 5 litrov

„Primárna vzorka“ v prípade bezprostredného obalu nepresahujúceho 5 litrov je počet čiastkových vzoriek odobraných z dávky, a to v súlade s tabuľkou 1.







Tabuľka 1 Minimálna veľkosť primárnej vzorky musí pozostávať z nasledovného Pokiaľ má bezprostredný obal objem Primárna vzorka sa skladá z oleja a) aspoň 1 liter a) z 1 bezprostredného obalu b) menej ako 1 liter b) z minimálneho počtu balení s celkovým objemom aspoň 1,0 litra

Každý členský štát môže zvýšiť počet balení, ktorý sa uvádza v tabuľke 1 a ktorý predstavuje primárnu vzorku, podľa vlastných potrieb (napr. na účely organoleptického hodnotenia iným laboratóriom, ako tým, ktoré vykonalo chemickú analýzu, kontrolné analýzy atď.).

1.2. Bezprostredný obal presahujúci 5 litrov

„Primárna vzorka“ v prípade bezprostredného obalu presahujúceho 5 litrov je reprezentatívna časť všetkých čiastkových vzoriek získaná ich delením, a to v súlade s tabuľkou 2. Primárna vzorka sa musí skladať z rôznych ukážok.

„Ukážka“ primárnej vzorky je každé balenie, z ktorého prvotná vzorka pozostáva.







Tabuľka 2 Minimálny počet čiastkových vzoriek, ktoré sa majú vybrať Počet balení v dávke Minimálny počet čiastkových vzoriek, ktoré sa majú vybrať Do 10 1 Od … 11 do 150 2 Od … 151 do 500 3 Od … 501 do 1 500 4 Od … 1 501 do 2 500 5 > 2 500 na 1 000 balení 1 čiastková vzorka naviac

S cieľom zmenšiť objem vzoriek z bezprostredných obalov sa obsah čiastkových vzoriek homogenizuje na účely prípravy primárnej vzorky. Obsah jednotlivých čiastkových vzoriek sa naleje do spoločnej nádoby, kde sa miešaním zhomogenizuje, pričom sa čo najviac chráni pred prevzdušnením.

Celý obsah primárnej vzorky sa rozleje do série obalov s minimálnym objemom 1,0 litra, z ktorých každý predstavuje ukážku primárnej vzorky.

Každý členský štát môže zvýšiť počet primárnych vzoriek podľa vlastných potrieb (napr. na účely organoleptického hodnotenia iným laboratóriom, ako tým, ktoré vykonalo chemickú analýzu, kontrolné analýzy atď.).

Každý obal sa musí naplniť spôsobom, pri ktorom je vrstva vzduchu nad povrchom vzorky minimálna, a následne vhodne uzavrieť a utesniť, aby sa zabezpečil proti nevhodnej manipulácii.

Uvedené ukážky sa musia označiť, aby sa zabezpečila ich správna identifikácia.

2. ANALÝZA A VÝSLEDKY

2.1. Každá primárna vzorka sa musí v súlade s bodom 2.5 normy EN ISO 5555 rozdeliť na laboratórne vzorky, ktoré sa musia analyzovať v poradí podľa rozhodovacieho stromu uvedeného v prílohe Ib alebo v akomkoľvek inom náhodnom poradí.

2.2. Pokiaľ sú všetky výsledky analýzy v súlade s vlastnosťami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za vyhovujúcu. Pokiaľ jediný výsledok analýzy nie je v súlade s vlastnosťami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu.

3. OVEROVANIE KATEGÓRIE DÁVKY

3.1. S cieľom overiť kategóriu dávky môže príslušný orgán zvýšiť počet primárnych vzoriek odobraných v rôznych bodoch dávky podľa tejto tabuľky:



Tabuľka 3 Počet primárnych vzoriek určený podľa veľkosti dávky Veľkosť dávky (v litroch) Počet primárnych vzoriek menej ako 7 500 2 od 7 500 do menej ako 25 000 3 od 25 000 do menej ako 75 000 4 od 75 000 do menej ako 125 000 5 najmenej 125 000 6 + 1 na každých ďalších 50 000 litrov Každá čiastková vzorka tvoriaca primárnu vzorku sa musí odobrať z kontinuálneho miesta dávky, pričom je nevyhnutné uviesť do poznámky miesto odberu každej primárnej vzorky a jednoznačne ju identifikovať. Zostavenie každej primárnej vzorky sa musí uskutočniť v súlade s postupmi uvedenými v bodoch 1.1 a 1.2. Každá primárna vzorka sa následne podrobí analýze uvedenej v článku 2 ods. 1.

3.2. Pokiaľ jeden z výsledkov analýzy uvedenej v článku 2 ods. 1 týkajúcej sa aspoň jednej primárnej vzorky nie je v súlade s vlastnosťami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka, z ktorej sa vzorka odobrala, sa vyhlási za nevyhovujúcu.









PRÍLOHA Ib

ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY OLIVOVÉHO OLEJA S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU

Tabuľka 1

Tabuľka 2

Tabuľka 3









Dodatok 1







Tabuľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými v rozhodovacom strome — Kyslosť Príloha II Stanovovanie voľných mastných kyselín, studená metóda — Peroxidové číslo Príloha III Stanovovanie peroxidového čísla — UV spektrometria Príloha IX Spektrofotometrická analýza — Organoleptické hodnotenie Príloha XII Organoleptické hodnotenie panenského olivového oleja — Etylestery Príloha XX Metóda stanovovania obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou — 3,5–stigmastadiény Príloha XVII Metóda stanovovania stigmastadiénov v rastlinných olejoch — Trans–izoméry mastných kyselín Príloha X A a Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha X B Príprava metylesterov mastných kyselín — Obsah mastných kyselín Príloha X A a Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha X B Príprava metylesterov mastných kyselín — ΔECN42 Príloha XVIII Stanovovanie skladby triacylglycerolov s ECN42 (rozdiel medzi údajmi z HPLC a teoretickým obsahom) — Skladba sterolov a celkové steroly — Erytrodiol a uvaol Príloha V Stanovovanie skladby a obsahu sterolov a triterpénových diolov kapilárnou plynovou chromatografiou — Vosky Príloha IV Stanovovanie obsahu voskov kapilárnou plynovou chromatografiou — Alifatické alkoholy Príloha XIX Stanovovanie obsahu alifatických alkoholov kapilárnou plynovou chromatografiou — Mastné kyseliny nasýtené v pozícii 2 Príloha VII Stanovovanie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu

▼B









PRÍLOHA II

▼M21

STANOVENIE VOĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN, STUDENÁ METÓDA

▼B

1. STANOVENIE KYSLOSTI

Stanovenie voľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslosť vypočítaná obvyklým spôsobom.

1.1. Princíp

Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpúšťadiel a prítomné voľné mastné kyseliny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.

1.2. Činidlá

Všetky činidlá (reagenty) by mali byť schválenej analytickej kvality a mala by sa použiť buď destilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.

1.2.1. Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov. Poznámka:Dietyléter je vysoko horľavý a môže tvoriť výbušné peroxidy. Je potrebné s ním narábať opatrne. Počas použitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2), na 100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3). Poznámka: Ak sa nedá použiť dietyléter, je ho možné nahradiť zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné, etanol môžete nahradiť 2-propanolom(izo-propanolom).

1.2.2. Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) približne 0,01 mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) približne 0,5 mol/l. Musí byť známa presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju skontrolovať bezprostredne pred použitím. Používajte roztok pripravený najmenej päť dní pred termínom použitia, uschovaný v tmavej sklenenej fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal byť bezfarebný alebo vo farbe slamy. Poznámka: Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného je možné pripraviť nasledovne. Priveďte do varu 1 000 ml etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblín a nechajte vrieť pod spätným chladičom po dobu jednej hodiny. Ihneď oddestilujte. V destiláte rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Nechajte niekoľko dní odstáť a zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhličitanu draselného. Roztok môže byť rovnako pripravený aj bez destilácie a to nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium butylate“ a nechajte zmes odležať na niekoľko dní. Odlejte tekutý supernatant a rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Roztok je pripravený na použitie.

1.2.3. Fenolftaleín, 10 g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v) alebo alkalická modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v).

1.3. Prístrojové vybavenie

Bežné laboratórne vybavenie zahŕňajúce:

1.3.1. analytické váhy;

1.3.2. 250 ml kónickú banku;

1.3.3. 10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.

1.4. Postup

1.4.1. Príprava vzorky na testovanie (Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a nečistôt spolu menší ako 1 %, vzorku použite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje 1 %, je potrebné vzorku prefiltrovať.)

1.4.2. Odoberanie vzorky (vzorkovanie) Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade s nasledujúcou tabuľkou:



Predpokladané číslo kyslosti Hmotnosť vzorky (g) Presnosť váženia (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorku odvážte v kónickej banke (1.3.2).

1.4.3. Stanovenie Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 až 150 ml predtým zneutralizovanej zmesi dietyléteru a etanolu (1.2.1). Titrujte počas zmiešania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného (1.2.2) (pozri pozn. 2) až do zmeny zafarbenia indikátora (ružová farba fenolftaleínu vydrží aspoň 10 sekúnd). Poznámka 1. Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je možné nahradiť vodným roztokom hydroxidu draselného alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody nevyvolá rozdelenie fáz. Poznámka 2. Ak spotrebované množstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu draselného presiahne 10 ml, použite 0,5 ml/l roztok. Poznámka 3.Ak sa roztok počas titrácie zakalí, pridajte dostatočné množstvo rozpúšťadiel (1.2.1), aby sa roztok vyčíril.

1.5. Kyslosť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej

Kyslosť vyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:

kde:

V = objem použitého titračného roztoku hydroxidu draselného, v ml;

c = presná koncentrácia použitého titračného roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M = mólová hmotnosť v g/mol kyseliny použitej na vyjadrenie výsledku (M =282 g/mol);

m = hmotnosť vzorky v g.

Za výsledok sa považuje aritmetický ►M6 dvoch výpočtov ◄ stanovení.









PRÍLOHA III

STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1. OBLASŤ

Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla v olejoch a tukoch.

2. POUŽITIE

Táto technická norma sa vzťahuje na živočíšne a rastlinné oleje a tuky.

3. DEFINÍCIA

Peroxidové číslo je množstvo tých zložiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodid draselný za uvedených prevádzkových podmienok.

4. PRINCÍP

Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časť vzorky, kyselina octová a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvoľneného jódu štandardizovaným roztokom tiosíranu sodného.

5. PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE

Všetky použité prístroje nesmú obsahovať redukujúce alebo oxidujúce látky.

Poznámka: Nemastite zábrusové povrchy.

5.1. 3 ml sklenená navažovacia lodička

5.2. Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, približne 250 ml objemu, predsušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokiaľ možno, oxidom uhličitým).

5.3. 25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml

6. ČINIDLÁ

6.1. Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.2. Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.3. Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód a jodičnany

6.4. Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný vodný roztok, štandardizovaný tesne pred použitím

6.5. Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l, čerstvo pripravená z prírodného rozpustného škrobu

7. VZORKA

Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla, udržiavajte ju v chlade a v úplne (až povrch) naplnených sklenených zásobníkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými zátkami.

8. POSTUP

Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle. V sklenenej navažovačke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvážte s presnosťou na 0,001 g množstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabuľkou a podľa predpokladaného peroxidového čísla:







Predpokladané peroxidové číslo (meq) Hmotnosť navážky (g) 0 až 12 5,0 až 2,0 12 až 20 2,0 až 1,2 20 až 30 1,2 až 0,8 30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3

Odzátkujte banku (5.2) a vložte sklenenú navažovačku s odváženou časťou testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Miešaním rýchlo rozpustite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútu a nechajte 5 minúť stáť v tme pri teplote 15 až 25 oC.

Pridajte približne 75 ml destilovanej vody. Uvoľnený jód stitrujte roztokom tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vyššie ako 12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor použite roztok škrobu.

Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.

Zároveň vykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekročí 0,05 ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vymeňte znečistené činidlá.

9. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka na kilogram, sa udáva podľa vzorca:

kde:

V = objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného (6.4), použitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;

T = presná molarita použitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);

m = hmotnosť navážky vzorky, v (g).

Za výsledok sa bude považovať aritmetický priemer z dvoch výpočtov.

▼M21









PRÍLOHA IV

STANOVENIE OBSAHU VOSKOV POMOCOU KAPILÁRNEJ PLYNOVEJ CHROMATOGRAFIE

1. PREDMET

Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu voskov v olivových olejoch. Vosky sa separujú v závislosti od počtu atómov uhlíka. Môže sa používať najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným lisovaním a olejom získaným extrakciou (olej z výliskov).

2. PRINCÍP

Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej pri testovacích podmienkach ako prvej (ktorej polarita je nižšia ako polarita frakcie triglyceridov), potom priama analýza kapilárnou plynovou chromatografiou.

3. MATERIÁL

3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka.

3.2. Sklená kolóna na plynovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 15,0 mm, výškou 30 až 40 cm a vybavená kohútikom.

3.3. Plynový chromatograf vhodný na fungovanie s kapilárnou kolónou, vybavený systémom na priame zavádzanie do kolóny s týmito zložkami: 3.3.1. Termostatická komora pre kolóny, vybavená teplotným programátorom. 3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny. 3.3.3. Plameňovoionizačný detektor a prevodník-zosilňovač. 3.3.4. Zapisovač-integrátor schopný pracovať s prevodníkom-zosilňovačom (3.3.3), rýchlosť odozvy nižšia ako 1 sekunda, s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera. (Takisto je možné používať informatizované systémy, ktoré sú založené na získaní údajov z plynovej chromatografie prostredníctvom osobného počítača). 3.3.5. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalnou fázou, s rovnomernou hrúbkou 0,10 – 0,30 μm. (Kvapalné fázy vhodné na použitie, v obchodnej sieti ako typ SE52 alebo SE54).

3.4. Mikrostriekačka s kapacitou 10 μl na priamy nástrek do kolóny, vybavená cementovanou ihlou.

3.5. Elektrický vibrátor.

3.6. Rotačná odparka.

3.7. Mufľová pec.

3.8. Analytické váhy s garantovanou presnosťou merania na ± 0,1 mg.

3.9. Bežné laboratórne sklené pomôcky.

4. CHEMICKÉ ČINIDLÁ

4.1. Silikagél s granulometriou medzi 60 a 200 μm. Silikagél vložte do pece aspoň na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Po vychladnutí pridajte 2 % vody vzhľadom na množstvo odobraného silikagélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala. Najmenej 12 hodín pred použitím uchovávajte v tme.

4.2. n-hexán na chromatografiu.

4.3. Etyléter na chromatografiu.

4.4. n-heptán na chromatografiu.

4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný štandard). [Je tiež možné použiť palmityl-palmitát (hexadecyl-palmitát) alebo myristyl-stearát (teradecyl-oktadekanoát)]. 4.5.1. Sudán 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6. Nosný plyn: vodík alebo čisté hélium na plynovú chromatografiu.

4.7. Pomocné plyny: — čistý vodík na plynovoú chromatografiu, — čistý vzduch na plynovú chromatografiu.

5. POSTUP

5.1. Príprava chromatografickej kolóny

Suspenzujte 15 g silikagélu (4.1) v n-hexáne (4.2) a zaveďte do kolóny (3.2). Spontánne usadzovanie dokončite pomocou elektrickej trepačky (3.5) s cieľom dosiahnuť homogénnejšiu chromatografickú vrstvu. Perkolujte 30 ml n-hexánu s cieľom eliminovať všetky prípadné nečistoty. Presne odvážte pomocou váh (3.8). Vložte 500 mg vzorky do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1), pridajte primerané množstvo vnútorného štandardu (4.5) vzhľadom na predpokladaný obsah voskov. Napríklad: v prípade olivového oleja pridajte 0,1 mg laurylarašidátu a v prípade oleja z olivových výliskov 0,25 až 0,5 mg. Takto pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny s pomocou dvoch 2 ml dielov n-hexánu (4.2).

Napustite rozpúšťadlo až do výšky 1 mm nad hornú úroveň absorbentu, potom perkolujte ďalších 70 ml n-hexánu, aby sa eliminovali prirodzene prítomné n-alkány. Začnite chromatografickú elúciu zozbieraním 180 ml zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri zachovaní prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. Elúcia vzorky sa má uskutočniť pri okolitej teplote 22 °C ± 4 °C.

Poznámky:

— Zmes n-hexánu/etyléteru (99:1) sa musí pripravovať denne.

— Na umožnenie vizuálnej kontroly správnej elúcie voskov je možné pridať do vzorky roztoku 100 μl 1 %-ného sudánu v elučnej zmesi. Farbivo má retenciu na rozhraní voskov a triglyceridov, preto keď zafarbenie dosiahne dno chromatografickej kolóny, je potrebné elúciu zastaviť, lebo všetky vosky boli eluované.

Takto získanú frakciu sušte v rotačnej odparke (3.6) až do takmer úplnej eliminácie rozpúšťadla. Posledné 2 ml rozpúšťadla eliminujte pomocou slabého prúdu azotu; potom pridajte 2 – 4 ml n-heptánu.

5.2. Analýza plynovou chromatografiou

5.2.1. Predbežné úkony

Namontujte kolónu do plynového chromatografu (3.3), pričom vstupný port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte bežným spôsobom prístrojové vybavenie na plynovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača atď.).

Pokiaľ sa kolóna používa po prvý raz, je potrebné ju kondicionovať. Zaveďte do kolóny mierny prietok plynu, potom zapnite prístroj na plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 hodinách dosiahne teplota 350 °C. Túto teplotu udržiavajte najmenej počas dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky [nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču (3.3.4), nastavte teplotu komory pre kolónu, nastavte detektor atď.]. Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej, ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí byť lineárna, nesmie obsahovať píky akéhokoľvek druhu a nesmie vykazovať žiadnu odchýlku.

Negatívna priamočiara odchýlka ukazuje, že kolóna je nesprávne pripojená; pozitívna odchýlka znamená, že kolóna nebola dostatočne kondicionovaná.

5.2.2. Voľba prevádzkových podmienok

Prevádzkové podmienky, ktoré treba pozorovať, sú spravidla tieto:

— teplota kolóny: —



20 °C/minúta 5 °C/minúta 20 °C/minúta na začiatku 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— teplota detektora: 350 °C,

— množstvo vstreknutej látky: 1 μl roztoku (2 – 4 ml) n-heptánu,

— nosný plyn: hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlosťou pre zvolený plyn (pozri dodatok),

— citlivosť prístroja: taká, aby zodpovedala nižšie uvedeným podmienkam:

Uvedené podmienky môžu byť upravené v závislosti od vlastností kolóny a prístroja na plynovú chromatografiu tak, aby sa dosiahla separácia všetkých voskov, postačujúce rozlíšenie píkov (pozri obrázok) a retenčný čas vnútorného štandardu C32 bol 18 ± 3 minúty. Najreprezentatívnejší pík vosku by mal dosahovať aspoň 60 % rozsahu stupnice.

Parametre integrácie píkov sa stanovia takým spôsobom, aby sa dosiahlo správne vyhodnotenie príslušných plôch píkov.

Poznámka:Vzhľadom na vysokú konečnú teplotu sa pripúšťa kladná odchýlka, ktorá nesmie prekročiť 10 % rozsahu stupnice.

5.3. Vykonanie analýzy

Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostriekačky; natiahnite piestik dozadu, až kým ihla nebude prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd rýchlo vstreknite; po uplynutí asi piatich sekúnd ihlu pomaly vytiahnite.

Záznam nechajte prebiehať dovtedy, až kým neprebehne úplná elúcia voskov.

Základná čiara musí vždy zodpovedať požadovaným podmienkam.

5.4. Identifikácia píkov

Jednotlivé píky identifikujte z retenčných časov a porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi, analyzovanými pri rovnakých podmienkach.

Na obrázku je znázornený chromatogram voskov panenského olivového oleja.

5.5. Kvantitatívne hodnotenie

Integrátorom vypočítajte plochy píkov interného štandardu a alifatických esterov od C40 do C46.

Vypočítajte obsah voskov každého esteru v mg/kg tuku podľa príslušného vzorca:

kde:

Ax = plocha píku každého esteru v milimetroch štvorcových;

As = plocha píku vnútorného štandardu v milimetroch štvorcových,

ms = množstvo pridaného vnútorného štandardu v miligramoch;

m = množstvo vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Uveďte celkové obsahy jednotlivých voskov od C40 do C46 v mg/kg tuku (ppm).

Poznámka:Zložky, ktoré treba kvantifikovať, sa stanovujú vzhľadom na susediace píky esterov s počtom uhlíkov medzi C40 a C46 podľa príkladu chromatogramu voskov olivového oleja znázorneného na nasledujúcom obrázku. Ak sa ester C46 ukáže dvojmo, odporúča sa analyzovať na jeho identifikáciu frakciu voskov oleja z olivových výliskov, v ktorom je pík esteru C46 ľahko identifikovateľný, pretože výrazne prevažuje.

Výsledky sa uvádzajú na jedno desatinné miesto.

Obrázok

Chromatogram voskov istého olivového oleja ( 7 )

Vysvetlivky:

I.S. = laurylarašidát

1. = diterpénové estery

2 + 2′ = estery C40

3 + 3′ = estery C42

4 + 4′ = estery C44

5. = estery C46

6. = sterol-estery a triterpénový alkohol.









Dodatok

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Vstreknite do prístroja na plynovú chromatografiu nastaveného na bežné prevádzkové podmienky 1 až 3 μl metánu (alebo propánu). Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho zavedenia až dovtedy, kým sa neobjaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/sek je daná vzorcom L/tM, pričom L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.

▼M26









PRÍLOHA V

STANOVOVANIE SKLADBY A OBSAHU STEROLOV A TRITERPÉNOVÝCH DIOLOV KAPILÁRNOU PLYNOVOU CHROMATOGRAFIOU

1. ROZSAH PÔSOBNOSTI

Táto metóda opisuje postup stanovovania obsahu jednotlivých sterolov a celkového obsahu sterolov a triterpénových diolov v olivových olejoch a olejoch z olivových výliskov.

2. PODSTATA METÓDY

Olej s pridaným α-cholestanolom ako vnútorným štandardom sa zmydelní etanolovým roztokom hydroxidu draselného a látky nepodliehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.

Frakcia sterolov a triterpénových diolov sa oddelí od nezmydelniteľnej časti pomocou tenkovrstvovej chromatografie na základnej silikagélovej platni. Frakcie získané zo silikagélu sa transformujú na trimetylsilylétery (TMSE) a následne sa analyzujú kapilárnou plynovou chromatografiou.

3. LABORATÓRNA TECHNIKA

Bežné laboratórne vybavenie, a najmä:

3.1. 250 ml banka so spätným chladičom a zábrusovými sklenenými spojmi.

3.2. 500 ml oddeľovací lievik.

3.3. 250 ml banky.

3.4. Kompletná zostava na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou so sklenenými platňami s rozmermi 20 × 20 cm.

3.5. UV lampa s vlnovou dĺžkou 254 alebo 366 nm.

3.6. Mikrostriekačky s objemom 100 μl a 500 μl.

3.7. Valcovitý filtračný lievik s fritou G3 (pórovitosť 15 – 40 μm) s priemerom približne 2 cm a hĺbkou 5 cm, vhodný na filtrovanie vo vákuu, s vonkajším zábrusom.

3.8. 50 ml vákuová kónická banka s vnútorným zábrusom, vhodná na použitie s uvedeným filtračným lievikom (podľa bodu 3.7).

3.9. 10 ml skúmavka s kónickým dnom a so zabrúsenou sklenenou zátkou.

3.10. Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou vybavený injekčným systémom s deličom a pozostávajúci z/zo: 3.10.1. termostatickej komory pre kolóny schopné udržiavať požadovanú teplotu s presnosťou ± 1 °C, 3.10.2. dávkovacej jednotky s nastaviteľnou teplotou so silylovaným skleneným odparovacím prvkom a deličom, 3.10.3. plameňovoionizačného detektora (FID), 3.10.4. systému získavania údajov vhodného na použitie s detektorom FID (podľa bodu 3.10.3) s možnosťou manuálnej integrácie.

3.11. Kapilárna kolóna z taveného kremeňa s dĺžkou 20 až 30 m, s vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, potiahnutá vrstvou skladajúcou sa z 5 % difenylu a 95 % dimetylpolysiloxanu (SE-52 alebo SE-54 stacionárnou fázou alebo ekvivalentnou fázou) s jednotnou hrúbkou filmu od 0,10 do 0,30 μm.

3.12. Mikrostriekačka s kapacitou 10 μl na plynovú chromatografiu s cementovanou ihlou vhodnou pre injekčný systém s deličom.

3.13. Exsikátor s chloridom vápenatým

4. ČINIDLÁ

4.1. Hydroxid draselný s minimálnou koncentráciou stanovenou titrovaním 85 %.

4.2. Hydroxid draselný, približne 2 normálny etanolový roztok. 130 g hydroxidu draselného (podľa bodu 4.1) sa rozpustí za chladenia v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom na objem 1 litra (bod 4.10). Roztok sa môže skladovať v dobre uzatvorenej fľaši z tmavého skla najviac dva dni.

4.3. Dietyléter, analytickej kvality.

4.4. Hydroxid draselný, približne 0,2 normálny etanolový roztok. 13 g hydroxidu draselného (podľa bodu 4.1) sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom na objem 1 litra (bod 4.10).

4.5. Bezvodý síran sodný, analytickej kvality.

4.6. Silikagélové tenkovrstvé sklenené platne (20 × 20 cm), bez fluorescenčného detektora, hrúbky 0,25 mm (komerčne dostupné a vhodné na okamžité použitie).

4.7. Toluén, chromatografickej kvality.

4.8. Acetón, chromatografickej kvality.

4.9. n-hexán, chromatografickej kvality.

4.10. Dietyléter, chromatografickej kvality.

4.11. Etanol, analytickej kvality.

4.12. Etylacetát, analytickej kvality.

4.13. Referenčný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: cholesterol alebo fytosteroly a 5 % roztok erytrodiolu v etylacetáte (podľa bodu 4.11).

4.14. 0,2 % roztok 2,7-dichlórfluoresceínu v etanole. Slabo alkalický roztok získame pridaním niekoľkých kvapiek 2 normálneho alkoholového roztoku hydroxidu draselného (podľa bodu 4.2).

4.15. Bezvodý pyridín, chromatografickej kvality (pozri poznámku 5).

4.16. Hexametyldisilazán, analytickej kvality.

4.17. Trimetylchlórsilán, analytickej kvality.

4.18. Skúšobné roztoky sterol trimetylsilyléterov. Pripraví sa priamo pred použitím zo sterolov a erytrodiolu získaných z olejov, ktoré ich obsahujú.

4.19. α-cholestanol, s čistotou viac ako 99 % (čistota sa musí skontrolovať prostredníctvom plynovochromatografickej analýzy).

4.20. α-cholestanol, vnútorný štandardný roztok, 0,2 % roztok (m/V) v etylacetáte (podľa bodu 4.11).

4.21. Fenolftaleínový roztok, 10 g/l v etanole (podľa bodu 4.10)

4.22. Nosný plyn: vodík alebo hélium, čistoty vhodnej na plynovú chromatografiu.

4.23. Pomocné plyny: vodík, hélium, dusík a vzduch, čistoty vhodnej na plynovú chromatografiu.

4.24. n-hexán (podľa bodu 4.9)/dietyléter (podľa bodu 4.10) – zmes v pomere 65:35 (V/V).

4.25. Silylačné činidlo, pozostávajúce zo zmesi pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylchlórsilánu v pomere 9:3:1 (V/V/V).

5. POSTUP

5.1. Príprava nezmydelniteľnej látky. 5.1.1. Pomocou 500 μl mikrostriekačky (podľa bodu 3.6) sa do 250 ml banky (podľa bodu 3.1) zavedie taký objem vnútorného štandardného roztoku α-cholestanolu (podľa bodu 4.20), ktorý obsahuje množstvo cholestanolu zodpovedajúce približne 10 % obsahu sterolov vo vzorke. Napr. v prípade 5 g vzorky olivového oleja sa pridá 500 μl roztoku α-cholestanolu (podľa bodu 4.20) a v prípade oleja z olivových výliskov 1 500 μl. V teplom vodnom kúpeli sa roztok pomocou jemného prúdu dusíka odparí dosucha, po vychladení banky sa do tej istej banky naváži 5 ± 0,01 g suchej prefiltrovanej vzorky. Poznámka 1: Živočíšne alebo rastlinné oleje a tuky s obsahom zistiteľných množstiev cholesterolu môžu vykazovať píky s retenčným časom blízkym cholestanolu. V takom prípade sa sterolová frakcia musí analyzovať zdvojene, a to s vnútorným štandardom a bez vnútorného štandardu. 5.1.2. Pridá sa 50 ml 2 normálneho etanolového roztoku hydroxidu draselného (podľa bodu 4.2) a trochu pemzy, nasadí sa spätný chladič a zariadenie sa zahrieva do mierneho varu, až kým neprebehne zmydelňovanie (roztok sa vyčíri). Zahrieva sa ešte ďalších 20 minút a potom sa cez chladič prileje 50 ml destilovanej vody, chladič sa odpojí a banka sa ochladí na teplotu približne 30 °C. 5.1.3. Obsah banky sa pomocou niekoľkých dávok destilovanej vody (50 ml) kvantitatívne prenesie do 500 ml oddeľovacieho lievika (podľa bodu 3.2). Pridá sa približne 80 ml dietyléteru (podľa bodu 4.10) a obsah sa silno pretrepáva približne 60 sekúnd, pričom sa tlak pravidelne uvoľňuje prevracaním oddeľovacieho lievika a otváraním kohútika. Nechá sa stáť do úplného oddelenia oboch fáz (poznámka 2). Následne sa mydlový roztok čo najdokonalejšie oddelí do druhého oddeľovacieho lievika. Rovnakým spôsobom sa vykonajú dve ďalšie extrakcie z vodno-alkoholovej fázy, pričom sa použije 60 až 70 ml dietyléteru (podľa bodu 4.10). Poznámka 2: Akákoľvek emulzia sa dá odstrániť pridaním malých množstiev etanolu (podľa bodu 4.11). 5.1.4. Získané tri éterové extrakty sa skombinujú v jednom oddeľovacom lieviku, ktorý obsahuje 50 ml vody. Extrakt sa opakovane premýva vodou (50 ml) dovtedy, kým sa premývacia voda neprestane sfarbovať do ružova po pridaní kvapky roztoku fenolftaleínu (podľa bodu 4.21). Po odstránení premývacej vody sa zostávajúca vrstva prefiltruje cez bezvodý síran sodný (podľa bodu 4.5) do predtým odváženej 250 ml banky, pričom sa lievik a filter prepláchne malými množstvami dietyléteru (podľa bodu 4.10). 5.1.5. Rozpúšťadlo sa odparí destilovaním v rotačnej vákuovej odparke pri 30 °C. Pridá sa 5 ml acetónu a prchavé rozpúšťadlo sa úplne odstráni miernym prúdom vzduchu. Zvyšok sa vysuší v peci pri 103 ± 2 °C počas 15 min. Nechá sa vychladiť v exsikátore a odváži sa s presnosťou na 0,1 mg.

5.2. Oddelenie frakcie sterolov a triterpénových diolov (erytrodiol + uvaol) 5.2.1. Príprava základných platní pre tenkovrstvovú chromatografiu. Silikagélové platne (podľa bodu 4.6) sa ponoria asi 4 cm na 10 sekúnd do 0,2 normálneho etanolového roztoku hydroxidu draselného (podľa bodu 4.5), potom sa nechajú dve hodiny sušiť v digestore a nakoniec sa umiestnia na jednu hodinu do pece vyhriatej na 100 °C. Platne sa po vybratí z pece uložia až do ďalšieho použitia do eksikátora s chloridom vápenatým (podľa bodu 3.13) (takto ošetrené platne sa musia použiť do 15 dní). Poznámka 3: Ak sa na separáciu sterolovej frakcie použijú základné silikagélové platne, nezmydelniteľnú frakciu nie je potrebné upravovať oxidom hlinitým. Takýmto spôsobom sa všetky zlúčeniny kyslého charakteru (mastné kyseliny a iné) zachytia pri štarte a pásmo sterolov sa zreteľne oddelí od pásma alifatických a triterpénových alkoholov. 5.2.2. Do vyvíjacej komory sa naleje zmes hexánu/dietyléteru (podľa bodu 4.24) (Poznámka 4) do výšky asi 1 cm. Komora sa uzatvorí vhodným krytom a nechá sa aspoň pol hodinu na chladnom mieste tak, aby sa dosiahla rovnováha nasýtených pár nad hladinou. Na vnútorné povrchy komory možno umiestniť prúžky filtračného papiera siahajuceho do eluentu (vyvíjacej zmesi). Tým sa zníži elučný čas približne o tretinu a elúcia zložiek bude jednotnejšia a pravidelnejšia. Poznámka 4: Elučnú zmes je potrebné vymeniť pri každej skúške, aby sa dosiahli dokonale reprodukovateľné elučné podmienky. Možno pri tom použiť aj alternatívne rozpúšťadlo, a to zmes n-hexánu/dietyléteru v pomere 50:50 (V/V). 5.2.3. Pripraví sa približne 5 % roztok nezmydelniteľnej látky (podľa bodu 5.1.5) v etylacetáte a pomocou 100 μl mikrostriekačky sa na spodný okraj (2 cm) chromatografickej platne (podľa bodu 5.2.1) nanesie 0,3 ml roztoku v úzkom a rovnomernom prúžku. V línii s týmto prúžkom sa nanesú 2 až 3 μl referenčného roztoku látky (podľa bodu 4.13) tak, aby sa pásmo sterolov a triterpénových diolov dalo po vyvolaní identifikovať. 5.2.4. Platňa sa umiestni do vyvíjacej komory pripravenej podľa opisu v bode 5.2.2. Teplota okolia by sa mala udržiavať v rozmedzí 15 až 20 °C (poznámka 5). Komora sa ihneď uzatvorí krytom a vzorka sa nechá eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od horného okraja platne. Potom sa platňa vyberie z vyvíjacej komory a rozpúšťadlo sa nechá odpariť prúdom horúceho vzduchu alebo krátkym ponechaním platne v digestore. Poznámka 5: Pri vyššej teplote sa separácia zhoršuje. 5.2.5. Platňa sa zľahka rovnomerne postrieka roztokom 2,7-dichlórfluoresceínu (podľa bodu 4.14) a nechá sa vyschnúť. Keď sa platňa sleduje pod ultrafialovým svetlom, pásma sterolov a triterpénových diolov sa dajú identifikovať podľa škvŕn získaných z referenčného roztoku, s ktorými sú zarovno. Hranice pásiem sa označia čiernou ceruzkou pozdĺž okrajov fluorescencie (pozri TLC platňu na obr. 3). 5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) sa silikagél zoškriabe z označenej plochy. Následne sa získaný jemne rozotretý materiál umiestni do filtračného lievika (podľa bodu 3.7). Pridá sa 10 ml horúceho etylacetátu (podľa bodu 4.12), opatrne sa premieša kovovou kopistkou a prefiltruje sa vo vákuu, pričom sa filtrát zbiera do kónickej banky (podľa bodu 3.8) pripojenej k filtračnému lieviku. Zvyšok v banke sa trikrát premyje dietyléterom (podľa bodu 4.3) (použije sa približne 10 ml pri každom oplachovaní), pričom sa filtrát zbiera do tej istej banky pripojenej k lieviku. Filtrát sa odparí na objem 4 až 5 ml, zvyšný roztok sa prenesie do predtým odváženej 10 ml skúmavky (podľa bodu 3.9), odparí sa dosucha miernym teplom pomocou jemného prúdu dusíka, následne sa opäť skvapalní pridaním niekoľkých kvapiek acetónu (podľa bodu 4.8) a opať sa nechá dosucha odpariť. Zvyšok vo vnútri skúmavky musí pozostávať z frakcie sterolov a frakcie triterpénových diolov.

5.3. Príprava trimetylsilyléterov. 5.3.1. Do skúmavky, v ktorej sa nachádza frakcia sterolov a triterpénov, sa pridá silylačné činidlo (podľa bodu 4.25) (poznámka 6) v pomere 50 μl na každý miligram sterolov a triterpénových diolov, pričom sa bráni navlhnutiu (poznámka 7). Poznámka 6: Hotové roztoky sú komerčne dostupné. Dostupné sú takisto iné silylačné činidlá, ako napr. bis-trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktorý sa musí riediť rovnakým objemom bezvodého pyridínu. Pyridín možno nahradiť rovnakým množstvom acetonitrilu. 5.3.2. Skúmavka sa zazátkujte a opatrne pretrepáva (bez obracania), až kým sa zložky úplne nerozpustia. Potom sa skúmavka nechá aspoň 15 minút stáť pri izbovej teplote a následne sa niekoľko minút odstreďuje. Číry roztok je pripravený na plynovochromatografickú analýzu. Poznámka 7: Slabá opalescencia, ktorá sa prípadne vytvorí, je bežný jav a nespôsobuje žiadnu anomáliu. Vznik bielych vločiek alebo ružového zafarbenia sú znaky prítomnosti vlhkosti alebo znehodnotenia činidla. V takom prípade sa skúška musí zopakovať (jedine, ak sa použili hexametyldisilazán/trimetylchlórsilán).

5.4. Plynovochromatografická analýza 5.4.1. Prípravné práce, kondiciovanie kapilárnej kolóny. 5.4.1.1. Kolóna sa (podľa bodu 3.11) upevní do plynového chromatografu tak, že vstupný koniec kolóny sa pripevní k injektoru s deličom a výstupný koniec k detektoru. Vykoná sa celková kontrola jednotky plynového chromatografu (netesnosti v plynových okruhoch, výkonnosť detektora, výkonnosť deliaceho systému a zapisovača atď.). 5.4.1.2. Ak sa kolóna používa prvýkrát, odporúča sa jej kondiciovanie: cez samotnú kolónu sa púšťa jemný prúd plynu a následne sa prepne na plynovochromatografickú jednotku a postupne sa zahrieva na teplotu aspoň o 20 °C vyššiu, ako je prevádzková teplota (poznámka 8). Táto teplota sa udržiava aspoň dve hodiny, potom sa jednotka nastaví na prevádzkový režim (upravia sa prietoky plynov a delič, zapáli sa plamienok, pripojí sa počítačový systém, upraví sa teplota kolóny, detektora a injektora atď.) a nakoniec sa zaznamená signál s citlovosťou, ktorá je aspoň dvakrát vyššia ako citlivosť určená pre analýzu. Základná línia má byť lineárna, bez akýchkoľvek píkov, a nesmie vykazovať žiadne výkyvy (drifty). Negatívny priamočiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnosť kolónových spojov, kým pozitívny drift indikuje nedostatočné kondiciovanie kolóny. Poznámka 8: Teplota kondiciovania musí byť vždy aspoň o 20 °C nižšia, ako je maximálna teplota špecifikovaná pre používanú stacionárnu fázu. 5.4.2. Výber pracovných podmienok. 5.4.2.1. Prevádzkové podmienky sú tieto: — teplota kolóny: 260 ± 5 °C, — teplota injektora: 280 – 300 °C, — teplota detektora: 280 – 300 °C, — lineárna rýchlosť nosného plynu: hélium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — deliaci pomer: 1:50 až 1:100, — citlivosť prístroja: 4 až 16–násobok minimálneho útlmu, — citlivosť záznamu: 1 až 2 mV v celom rozsahu, — množstvo dávkovanej látky: 0,5 až 1 μl TMSE roztoku. Tieto podmienky možno upraviť podľa vlastností kolóny a plynového chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce tieto požiadavky: — retenčný čas píku ß-sitosterolu by mal byť 20 ± 5 min, — pík kampasterolu by mal byť: v prípade olivového oleja (priemerný obsah 3 %) 20 ± 5 % celého rozsahu, v prípade sójového oleja (priemerný obsah 20 %) 80 ± 10 % celého rozsahu, — všetky prítomné steroly sa musia separovať. Okrem toho, že píky musia byť oddelené, musia byť aj úplne rozlíšené, t. j. záznam píku by sa mal vrátiť na základnú líniu pred vykreslením ďalšieho píku. Neúplné rozlíšenie je avšak tolerované, pod podmienkou, že pík možno pri relatívnom retenčnom čase 1,02 (sitostanol) kvantifikovať použitím kolmice. 5.4.3. Postup analýzy 5.4.3.1. Do 10 μl mikrostriekačky sa natiahne 1 μl hexánu, potom sa natiahne 0,5 μl vzduchu a následne 0,5 až 1 μl roztoku vzorky. Piest mikrostriekačky sa vytiahne natoľko, aby sa ihla vyprázdnila. Ihla sa zavedie cez membránu injektora a po jednej až dvoch sekundách sa roztok rýchlo vstrekne a ihla sa približne po piatich sekundách pomaly vytiahne. Miesto striekačky možno použiť aj automatický dávkovač. 5.4.3.2. Zaznamenávanie sa uskutočňuje do úplnej eluácie TMSE prítomných triterpénových diolov. Základná línia musí naďalej spĺňať požiadavky (podľa bodu 5.4.1.2). 5.4.4. Identifikácia píkov Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná podľa retenčných časov a porovnaním so zmesou TMSE sterolov a triterpénových diolov analyzovanou za rovnakých podmienok (pozri dodatok). Steroly a triterpénové dioly sa eluujú v tomto poradí: cholesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metylén-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol a uvaol. Retenčné časy ß-sitosterolu v kolónach SE-52 a SE-54 sa uvádzajú v tabuľke 1. Na obr.1 a 2 sú zobrazené typické chromatogramy niektorých olejov. 5.4.5. Kvantitatívne vyhodnotenie. 5.4.5.1. Pomocou počítačového systému sa vypočítajú plochy píkov α-cholestanolu, sterolov a triterpénových diolov. Vynechajú sa píky pre všetky zlúčeniny, ktoré nie sú zahrnuté (ergosterol sa nemusí počítať) medzi zlúčeninami uvedenými v tabuľke 1. Odozvový faktor α-cholestanolu by sa mal považovať za rovný 1. 5.4.5.2. Koncentrácia jednotlivých sterolov vyjadrená v mg/kg tukových látok sa vypočíta takto: kde: Ax = plocha píku sterolu x vypočítaná počítačovým systémom; As = plocha píku α-cholestanolu vypočítaná počítačovým systémom; ms = hmotnosť α-cholestanolu v miligramoch; m = hmotnosť vzorky použitej pri stanovení, v gramoch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov vyjadrené v mg/kg tukových látok a ich súčet ako „steroly spolu“. Zloženie jednotlivých sterolov a erytrodiolu a uvaolu by sa malo vyjadriť na jedno desatinné miesto. Steroly spolu sa musia vyjadriť v celých číslach.

6.2. Percentuálny obsah jednotlivých sterolov sa vypočíta z pomeru plochy príslušného píku k celkovej ploche píkov sterolov a erytrodiolu a uvaolu: kde: Ax = plocha píku sterolu x; ΣA = celková plocha píkov sterolov.

6.3. Zdanlivý β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Percentuálny obsah erytrodiolu a uvaolu sa vypočíta: kde ΣA = súčet plôch píkov sterolov vypočítaných počítačovým systémom; Er = plocha píku erytrodiolu vypočítaná počítačovým systémom; Uv = plocha píku uvaolu vypočítaná počítačovým systémom.









Dodatok

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na bežné pracovné podmienky sa nadávkuje metán (alebo propán) v objeme 1 až 3 μl a odmeria sa čas, za ktorý plyn prejde kolónou od momentu nástreku až po moment, kedy sa objaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/s je daná L/tM, kde L je dĺžka kolóny v centimetroch a tM nameraný čas v sekundách.







Tabuľka 1 Relatívne retenčné časy sterolov Pík Identifikácia Relatívny retenčný čas SE 54 kolóna SE 52 kolóna 1 cholesterol Δ-5-cholestén-3ß-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 brasikasterol [24S]-24-metyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol 0,73 0,71 * ergosterol [24S] 24 metyl Δ5-7-22 cholestatrién 3β-ol 0,78 0,76 4 24-metylén-cholesterol 24-metylén-Δ-5,24-cholestadién-3ß-o1 0,82 0,80 5 kampesterol (24R)-24-metyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol 0,83 0,81 6 kampestanol (24R)-24-metyl-cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol (24S)-24-etyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etyl-Δ-5,23-cholestadién-3ß-ol 0,95 0,95 10 klerosterol (24S)-24-etyl-Δ-5,25-cholestadién-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etylidén-Δ-cholestén-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etyl-Δ-5,24-cholestadién-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etylidén-Δ-7-cholestén-3ß-ol 1,16 1,16 17 erytrodiol 5α oleán-12-én-3β28 diol 1,41 1,41 18 uvaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52

Obrázok 1

Plynový chromatogram frakcie sterolov a triterpénových diolov lampového olivového oleja (s vnútorným štandardom)

Obrázok 2

Plynový chromatogram frakcie sterolov a triterpénových diolov rafinovaného olivového oleja (s vnútorným štandardom)

Obrázok 3

TLC platňa oleja z olivových výliskov so zónou, ktorá sa musí zoškriabať na účely stanovenia sterolov a triterpénových diolov

1 – Skvalén

2 – Triterpénové a alifatické alkoholy

3 – Steroly a triterpénové dioly

4 – Štart a voľné mastné kyseliny

▼M26 —————

▼M21









PRÍLOHA VII

STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA

Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuálneho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníctvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu.

Táto metóda je použiteľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej okolitej teplote (20 °C).

2. PRINCÍP

Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy: čiastočná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po silanizácii kapilárnou plynovou chromatografiou.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BEŽNÝ LABORATÓRNY MATERIÁL

3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka

3.2. 100, 250 a 300 ml kadičky

3.3. Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 – 23 mm, dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotúčom a kohútikom

3.4. Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml

3.5. 100 a 250 ml banky

3.6. Rotačná odparka

3.7. 10 ml centrifugačná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou

3.8. Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky

3.9. Termostat s možnosťou udržiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C

3.10. Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml

3.11. 1 ml podkožná striekačka

3.12. 100 μl mikrostriekačka

3.13. 1 000 ml lievik

3.14. Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injekčným systémom „on column“ za studena na priame zavedenie vzorky do kolóny a pecou umožňujúcou udržiavať nastavenú teplotu s presnosťou na 1 °C

3.15. Studený injektor „on column“ na priame zavedenie vzorky do kolóny

3.16. Plameňovoionizačný detektor a elektrometer

3.17. Zapisovač-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlosťou odozvy najviac 1 sekundu a s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera

3.18. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 – 0,30 μm, použiteľná pri teplote 370 °C

3.19. 10 μl mikrostriekačka vybavená cementovou ihlou dlhou aspoň 7,5 cm na priame vstreknutie na kolónu.

4. ČINIDLÁ

4.1. Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh) pripravený takto: Silikagél vložte do porcelánovej kapsule, sušte aspoň štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 % hmotnosti silikagélu, takto: odvážte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby sa voda rovnomerne rozdelila. Pred použitím nechajte aspoň 12 hodín stáť.

4.2. n-hexán (na chromatografiu)

4.3. Izopropanol

4.4. Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1

4.5. Pankreatická lipáza. Použitá lipáza má mať aktivitu medzi 2,0 a 10 jednotkami lipázy na mg (V obchodnej sieti dostať pankreatické lipázy s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu.)

4.6. Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1 M upravený až na pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1)

4.7. Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa musí použiť do 15 dní od jeho prípravy)

4.8. Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok

4.9. Dietyléter na chromatografiu

4.10. Vyvíjacie rozpúšťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere 87/13)

4.11. 12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného

4.12. Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole

4.13. Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu

4.14. Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických látok – a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu

4.15. Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlórsilánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dostať v obchodnej sieti. Na silanizáciu sa môžu použiť aj ďalšie činidlá, konkrétne bis-trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedené rovnakým objemom bezvodého pyridínu.)

4.16. Referenčné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so známym percentuálnym zložením podobným vzorke.

5. POSTUP

5.1. Príprava vzorky

5.1.1. Oleje s obsahom voľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred chromatografiou na silikagélovej kolóne neutralizovať. Oleje s obsahom voľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizovať v súlade s bodom 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte 100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného (4.11), aký zodpovedá obsahu voľných kyselín v oleji s 5 % navýšením. Dôkladne pretrepávajte počas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej vody, znova pretrepte a nechajte stáť. Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánový roztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 – 60 ml roztoku izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) až do vymiznutia ružového sfarbenia fenolftaleínu. Eliminujte najväčšiu časť hexánu vákuovou destiláciou (napríklad s použitím rotačnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5). Vysúšajte olej vo vákuu až do úplnej eliminácie rozpúšťadla. Po skončení tejto procedúry má byť acidita oleja nižšia ako 0,5 %.

5.1.2. Vložte 1,0 g oleja pripraveného podľa vyššie uvedených indikácií do 25 ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej zmesi (4.10). Nechajte roztok postáť aspoň 15 minút pred chromatografiou na silikagélovej kolóne. Ak je roztok zakalený, odstreďte ho, aby boli zabezpečené optimálne podmienky na chromatografiu. (Môžu sa použiť aj už hotové 500 g silikagélové patróny SPE – na extrakciu na tuhých fázach).

5.1.3. Príprava chromatografickej kolóny Nalejte do kolóny (3.3) približne 30 ml vyvíjacieho rozpúšťadla (4.10), pomocou sklenenej tyčinky vložte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny; stlačte, aby sa odstránil vzduch. V kadičke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v približne 80 ml vyvíjacieho rozpúšťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny. Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený všetok silikagél; premyte vyvíjacím rozpúšťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina tekutiny dosiahla približne 2 mm nad vrchnou úrovňou silikagélu.

5.1.4. Chromatografia na kolóne Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvážte presne 1,0 g vzorky pripravenej podľa bodu 5.1. Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1.3. Nepohnite povrchom kolóny. Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiecť, až kým nedosiahne úroveň silikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpúšťadla. Upravte prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny približne za 60 – 70 minút). Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvážili. Odparte rozpúšťadlo vo vákuu a odstráňte jeho posledné stopy pod prúdom dusíka. Odvážte banku a vypočítajte množstvo získaného extrátu. [V prípade použitia už hotových silikagélových patrónov SPE postupujte takto: zaveďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov s 3 ml n-hexánu.] Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru v objemovom pomere 9/1. Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka až do vysušenia. Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overiť zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE.

5.2. Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1. Do centrifugačnej skúmavky odvážte 0,1 g oleja pripraveného podľa bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pričom po každom pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkou a umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmáčali zátku) a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte, počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnúť.

5.2.3. Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom odstreďte a pomocou mikrostriekačky preneste éterový roztok do čistej a suchej skúmavky.

5.3. Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia

5.3.1. Pomocou mikrostriekačky zaveďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml skúmavky s kónickým dnom.

5.3.2. Eliminujte rozpúšťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút odstáť.

5.3.3. Po 20 minútach pridajte 1 až 5 ml n-hexánu (v závislosti od chromatografických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chromatografiu.

5.4. Plynová chromatografia

Hlavné operačné podmienky sú tieto:

— teplota injektora (injektor „on column“) nižšia ako teplota varu rozpúšťadla (68 °C),

— teplota detektora: 350 °C,

— teplota kolóny: nastavenie teploty pece: 60 °C počas 1 minúty, každú minútu zvýšte o 15 °C až do dosiahnutia 180 °C, potom o 5 °C za minútu až do 340 °C, ďalej udržiavajte 340 °C počas 13 minút,

— nosný plyn: vodík alebo hélium nastavené na lineárnu rýchlosť adekvátnu na dosiahnutie rozlíšenia znázorneného na obrázku 1. Retenčný čas triglyceridu C54 má byť 40 ± 5 minút (pozri obrázok 2). (Vyššie uvedené podmienky postupu sa uvádzajú len orientačne. Každý subjekt ich musí optimalizovať s cieľom dosiahnuť požadované rozlíšenie. Výška píku zodpovedajúca 2-glyceril monopalmitátu musí dosiahnuť aspoň 10 % rozsahu stupnice zapisovača.),

— Množstvo vstreknutej látky: 0,5 – 1 μl roztoku (5 ml) n-hexánu (5.3.3).

5.4.1. Identifikácia píkov

Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných retenčných časov a vzhľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach.

5.4.2. Kvantitatívne hodnotenie

Plocha každého píku sa vypočíta pomocou elektronického integrátora.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypočíta na základe vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a súčtom plôch píkov všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) podľa vzorca:

glycéryl monopalmitate (%):

kde:

Ax = plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu,

ΣA = súčet plôch všetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom.

Výsledok sa uvádza s presnosťou na jedno desatinné miesto.

7. SPRÁVA O ANALÝZE

V správe z analýzy sa má konkrétne uviesť:

— odkaz na túto metódu,

— všetky údaje potrebné na úplnú identifikáciu vzorky,

— výsledok analýzy,

— každé odklonenie sa od tejto metódy, či už vplyvom rozhodnutia dotknutých strán alebo z iného dôvodu,

— podrobné identifikačné údaje o laboratóriu, dátum uskutočnenia analýzy a podpis zodpovedných za analýzu.

Obrázok 1

Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafinovanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %)

Vysvetlivky:„acides gras libres“ = voľné mastné kyseliny; „huile d’olive rafinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej s pridaním 20 % esterifikovaného oleja; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitín; „1-2 mono C18 insat.“ = nesaturovaný 1-2 mono C18

Obrázok 2

Chromatogram:

A) neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B) esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

8. POZNÁMKY

PRÍPRAVA LIPÁZY

V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostatočnou aktivitou. V laboratóriu sa tiež dajú pripraviť takto:

5 kg čerstvých pankreasov z ošípaných ochlaďte na 0 °C. Odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozomeľte v mlynčeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu. Pretrepávajte túto hmotu 4 až 6 hodín spolu s 2,5 litra bezvodého acetónu a potom odstreďte. Ešte trikrát extrahujte zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom.

Sušte zvyšok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný prášok, ktorý bude dlhodobo uskladniteľný v chladničke chránený pred vlhkosťou.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Pripravte emulziu olivového oleja takto:

Počas 10 minút pretrepávajte v miešači zmes zloženú zo 165 ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15 g roztlčeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja.

Postupne zaveďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej 0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml a 20 ml destilovanej vody.

Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C; zaveďte elektródy pH-metra a špirálové miešadlo.

Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného 0,1 N, až kým nedosiahnete pH 8,3.

Pridajte objem suspenzie prášku lipázy vo vode (0,1 g/ml lipázy). Keď pH-meter ukáže pH 8,3, uveďte chronometer do činnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udržiavala na 8,3. Zaznamenajte každú minútu objem spotrebovaného roztoku.

Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, že os nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na osi závisle premenných (y-ová os) uvediete počet mililitrov alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udržanie konštantného pH. Mali by ste získať lineárny graf.

Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypočíta na základe vzorca:

kde:

A je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mg

V je počet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minútu (vypočítané na základe grafu)

N je molarita roztoku hydroxidu sodného

m je množstvo testovacej lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.

▼M20 —————

▼M25









PRÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ OBLASTI

PREDSLOV

Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti môže poskytnúť informácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali počas technologických procesov.

Absorpcia pri vlnových dĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená prítomnosťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E 1 % 1 cm (extinkcia 1 % roztoku tuku v špecifikovanom rozpúšťadle, v kyvete hrubej 1 cm) obvykle určené ako K (uvádzané tiež ako „extinkčný koeficient“).

1. ROZSAH PÔSOBNOSTI

Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivového oleja v ultrafialovej oblasti (ako je opísané v dodatku).

2. PRINCÍP METÓDY

Testovaný tuk sa rozpustí v požadovanom rozpúšťadle a extinkcia roztoku sa potom stanoví pri určenej vlnovej dĺžke so zreteľom na čisté rozpúšťadlo. Určité extinkcie sa vypočítavajú zo spektrofotometrických údajov. Vypočítava sa konkrétna absorbancia pri 232 nm a 268 nm v izo-oktáne alebo 232 nm a 270 nm v cyklohexáne pri koncentrácii 1 g na 100 ml v kyvete hrúbky 10 mm.

3. VYBAVENIE

3.1. Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220 a 360 nm, s možnosťou odčítavania jednotlivých nanometrických jednotiek. Pred použitím spektrometra sa odporúča kontrola mierok vlnovej dĺžky a absorbancie podľa nasledujúceho postupu. 3.1.1. Mierka vlnovej dĺžky: možno ju skontrolovať pomocou referenčného materiálu pozostávajúceho z optického skleneného filtra obsahujúceho oxid holmitý, ktorý odlíšené absorpčné pásma. Referenčný materiál je určený na overovanie a kalibráciu mierok vlnovej dĺžky spektrofotometrov vo viditeľnej a ultrafialovej oblasti, ktoré majú nominálne spektrálne šírky pásma 5 nm alebo menej. Holmiový sklenený filter sa meria v režime absorbancie oproti vzdušnej slepej vzorke, v rozsahu vlnových dĺžok 640 – 240 nm. V každej spektrálnej šírke pásma (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 a 3,00) sa vykonáva základná korekcia s prázdnym držiakom kyvety. Vlnové dĺžky spektrálnej šírky pásma sú uvedené v certifikáte referenčného materiálu v norme ISO 3656. 3.1.2. Mierka absorbancie: možno ju skontrolovať prostredníctvom referenčného materiálu pozostávajúceho zo 4 roztokov dvojchromanu draselného v kyseline chloristej uzavretých v štyroch UV kremenných kyvetách na meranie linearity a fotometrickej presnosti v ultrafialovej oblasti. Kyvety naplnené dvojchromanom draselným (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml a 100 mg/ml) sa merajú oproti slepej vzorke kyseliny chloristej. Čisté hodnoty absorbancie sú uvedené v certifikáte referenčného materiálu v norme ISO 3656.

3.2. Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou dĺžkou 1 cm. Keď sa kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpúšťadlom, nemali by medzi sebou vykazovať rozdiel väčší ako 0,01 jednotky extinkcie.

3.3. 25 ml odmerná banka.

3.4. Analytické váhy s presnosťou 0,0001 g.

4. ČINIDLÁ

Ak nie je stanovené inak, používajte len činidlá uznanej analytickej kvality.

Rozpúšťadlo: izo-oktán (2,2,4-trimetylpentán) na meranie pri 232 nm a 268 nm alebo cyklohexán na meranie pri 232 nm a 270 nm, s absorbanciou menej ako 0,12 pri 232 nm a menej ako 0,05 pri 250 nm oproti destilovanej vode, merané v kyvete hrúbky 10 mm.

5. POSTUP

5.1. Skúmaná vzorka musí byť dokonale homogénna a bez podozrivých nečistôt. Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote približne 30 °C, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote najviac 10 °C nad bodom topenia.

5.2. Presne odvážte približne 0,25 g (s presnosťou na 1 mg) takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej banky, doplňte určeným rozpúšťadlom po značku a zhomogenizujte. Výsledný roztok musí byť úplne priezračný. Ak je prítomná opalescencia alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.

5.3. Získaným roztokom naplňte kremennú kyvetu a za použitia rozpúšťadla na porovnanie zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej dĺžke medzi 232 – 276 nm. Namerané hodnoty sa musia nachádzať v rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie, merania sa musia zopakovať za použitia koncentrovanejších alebo zriedenejších roztokov, ak je to vhodné. POZNÁMKA: Nie je potrebné merať absorbanciu v celom rozsahu vlnových dĺžok.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Zaznamenajte špecifické extinkcie (extinkčné koeficienty) pri rôznych vlnových dĺžkach, ktoré sa vypočítajú takto: kde: Κλ = špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke λ, Ελ = nameraná extinkcia pri vlnovej dĺžke λ, c = koncentrácia roztoku v g/100 ml, s = hrúbka kremennej kyvety v cm. Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.

6.2. Rozdiel špecifickej extinkcie (ΔΚ) Spektrofotometrická analýza olivového oleja v súlade s oficiálnou metódou v právnych predpisoch Únie zahŕňa stanovenie rozdielu absolútnej hodnoty špecifickej extinkcie (ΔΚ), ktorý je vyjadrený vzorcom: kde Km je špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke m, vlnová dĺžka pre maximálnu absorpciu závisí od použitého rozpúšťadla: 270 pre cyklohexán a 268 pre izo-oktán.









Dodatok







CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJA Kategória Metylestery mastných kyselín (FAME) a etylestery mastných kyselín (FAEE) Kyslosť (%) (*) Peroxidové číslo mEq 02/kg (*) Vosky mg/kg (**) 2-glyceril monopalmitát (%) Stigmastadién mg/kg (1) Rozdiel medzi HPLC ECN42 a teoretickým výpočtom ECN42 K232 (*) K270 (*) „K 270 alebo K 268 (5)“ ΔK (*) (5) Organoleptické hodnotenie Medián defektov (Md) (*) Organoleptické hodnotenie Medián ovocnosti (Mf) (*) 1. Extra panenský olivový olej Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg alebo 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg a (FAEE/FAME) ≤1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 2. Panenský olivový olej — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 3. Lampantový olivový olej — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 4. Rafinovaný olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 5. Zmiešaný olivový olej z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 6. Surový zvyškový olivový olej — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinovaný zvyškový olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Zvyškový olivový olej ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Súčet izomérov, ktoré mohli (alebo nemohli) byť oddelené kapilárnou kolónou. (2) Alebo ak je medián defektov najviac 3,5 a medián ovocnosti je rovný 0. (3) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg – 350 mg/kg sa považujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov najviac 350 mg/kg alebo ak je obsah erytrodiolu a uvaolu najviac 3,5 %. (4) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg – 350 mg/kg sa považujú za surový zvyškový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je obsah erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 3,5 %. (5) K 270 s rozpúšťadlom cyklohexán, K 268 s rozpúšťadlom izo-oktán.

▼B









PRÍLOHA X A

PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN

1. OBLASŤ

Táto metóda podáva všeobecný návod na použitie plynovej chromatografie využívajúcej náplňové kolóny alebo kapilárne kolóny na stanovenie kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia zmesi metyl esterov mastných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenou v prílohe X B.

Metóda sa nedá použiť na polymerizované mastné kyseliny.

2. ČINIDLÁ

2.1. Nosný plyn

Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, atď.), dokonale vysušený a s obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.

Poznámka 1:

Vodík, ktorý sa používa ako nosný plyn iba pre kapilárne kolóny, môže dvojnásobne urýchliť analýzu, ale je nebezpečný. Sú k dispozícii bezpečnostné zariadenia.

2.2. Pomocné plyny.

2.2.1. Vodík (čistoty ≥ 99,9 %), bez organických nečistôt

2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických nečistôt

2.3. Porovnávací (referenčný) štandard

Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu

Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených mastných kyselín.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Uvedené pokyny týkajúce sa bežného vybavenia používaného v plynovej chromatografii, využívajúce náplňové a/alebo kapilárne kolóny a plameňovoionizačný detektor. Je vhodné každé zariadenie s účinnosťou a rozlíšením uvedené v 4.1.2.

3.1. Plynový chromatograf

3.1.1. Dávkovací (injekčný) systém

Použite niektorý z uvedených injekčných systémov:

a) s náplňovými kolónami, s najmenším možným mŕtvym objemom (v tomto prípade by mal dať injektor zahriať na teplotu o 20 až 50 oC vyššiu ako má kolóna) alebo

b) s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal byť injektor špeciálne navrhnutý na použitie pre takéto kolóny. Môže to byť split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.

Poznámka 2:

Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlíkovými atómami sa môže použiť injektor s pohyblivou ihlou.

3.1.2 Pec

Pec by mala byť schopná vyhrievať kolónu na teplotu aspoň 260 oC a udržiavať požadovanú teplotu v rozmedzí 1 oC v prípade náplňovej kolóny a 0,1 oC pri kapilárnej kolóne. Táto druhá požiadavka je obzvlášť dôležitá pri kolónach z taveného kremeňa.

Vo všetkých prípadoch sa odporúča teplotne-programovateľné vyhrievanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.

3.1.3 Náplňová kolóna

3.1.3.1. Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných voči analyzovaným látkam (napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi: a) dĺžka: 1 až 3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým reťazcom (nad C20), dajú sa použiť relatívne krátke kolóny. Ak analyzujeme kyseliny so 4 až uhlíkovými atómami, odporúča sa použiť kolónu dlhú 2 m. b) vnútorný priemer: 2 až 4 mm. Poznámka 3. Aksú prítomné polynenasýtené zložky s viac ako tromi dvojitými väzbami, tieto sa môžu rozložiť v kolóne z nerezovej ocele. Poznámka 4. Je možné použiť aj systém s dvojicou náplňových kolón.

3.1.3.2. Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí: a) nosič: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný inertný nosič s úzkym rozmedzím veľkosti zŕn (25 μm rozmedzie medzi hranicami 125 až 200 μm); priemerná veľkosť častíc závisí od vnútorného priemeru a dĺžky kolóny; b) stacionárna fáza: polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietylénglykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát, atď.), kyanosilikóny alebo každé iné kvapaliny umožňujúce chromatografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť 5 až 20 % (m/m) náplne nosiča. Pri určitých separáciách je možné použiť nepolárne stacionárne fázy.

3.1.3.3. Kondiciovanie kolóny Pec postupne vyhrievajte až do 185 oC, ak je v hodné, pripravenú kolónu odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspoň 16 hodín prúdiť inertný plyn tempom 20 až 60 ml/min a potom ďalšie 2 hodiny pri teplote 195 oC.

3.1.4. Kapilárna kolóna

3.1.4.1. Trubica vyrobená z materiálu odolného voči analyzovaným (obvykle zo skla alebo z taveného kremeňa). Vnútorný priemer 0,2 až 0,8 mm. Vnútorný povrch prešiel pred nanesením stacionárnej fázy patričnou úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). Dĺžka 25 mm vyhovuje vo väčšine prípadov.

3.1.4.2. Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000 ), polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu (kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krížom viazanými väzbami (cross-linked bonded). Poznámka 5.Pri použití polárnych polyxilánov sa sťažuje identifikácia a separácia kyseliny linoleovej a C20 kyselín. Nanesená vrstva by mala byť tenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3. Montáž a kondiciovanie kolóny Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiestnenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnosť), umiestnenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia mŕtvych objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar (30 kPa), v prípade kolóny dĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 0,3 mm]. Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3 oC/min od teploty prostredia až na teplotu 10o C pod limitom dekompozície stacionárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie základu. Vráťte teplotu na 180 oC, aby ste pracovali v izotermálnych podmienkach. Poznámka 6.Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej sieti

3.1.5. Detektor, lepšie ak je s vyhrievaním na teplotu vyššiu ako teplota danej kolóny.

3.2. Pipeta

Pipeta by mala byť s maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm dieliky.

3.3. Zapisovač

Ak sa na výpočet zloženia analyzovanej zmesi použije krivka zo zapisovača, je potrebný presný elektronický zapisovač, kompatibilný s použitým prístrojom. Zapisovač by mal mať:

a) odozvový pomer pod 1,5 s; lepšie 1 s (odozvový pomer je čas, za ktorý zapisovacie pero prejde od 0 do 90 % podľa náhleho vstupu 100 % signálu);

b) šírka papiera, minimálne 20 cm;

c) rýchlosť papiera, nastaviteľné hodnoty medzi 0,4 a 2,5 cm/min.

3.4. Integrátor

Pomocou elektronického integrátora je možné vykonať rýchly a presný výpočet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivosťou a dostatočnú korekciu odchýlky základnej línie.

4. POSTUP

Postupy uvedené v 4.1 až 4.3. sa vzťahujú aj na plameňovoionizačný detektor.

Alternatívne sa môže použiť plynový chromatograf využívajúci katarometrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti). Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.

4.1. Podmienky testovania

4.1.1. Výber optimálnych pracovných podmienok 4.1.1.1. Náplňové kolóny Pri výbere podmienok testovania je potrebné vziať do úvahy nasledujúce premenné: a) dĺžku a priemer kolóny; b) druh a množstvo stacionárnej fázy; c) teplotu kolóny; d) prietok nosného plynu; e) požadované rozlíšenie; f) veľkosť testovanej navážky vybranej takým spôsobom, aby detektor a elektrometer dávali lineárnu odozvu; g) dĺžka analýzy. Vo všeobecnosti, hodnoty uvedené v tabuľke 1 a 2 povedú k požadovaným výsledkom, t. j. aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15 minút. Ak to zariadenie dovoľuje, injektor by mal byť nastavený na teplotu okolo 200 oC a detektor na teplotu rovnú alebo vyššiu ako je teplota kolóny. Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plameňovoionizačného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1 v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 až 10 krát väčší ako prietok vodíka.



Tabuľka 1 Vnútorný priemer kolóny (v mm) Prietok nosného plynu (v ml/min) 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60



Tabuľka 2 Koncentrácia stacionárnej fázy % (m/m) Teplota kolóny oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilárna kolóna Vlastnosti ako účinnosť a priepustnosť kapilárnych kolón znamenajú, že separácia medzi zložkami a dĺžkou trvania analýzy sú vo veľkej miere závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné optimalizovať pracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo jednoduchšie na straty na hlave kolóny) podľa toho, či si želáte zlepšiť separáciu alebo urýchliť analýzu.

4.1.2. Stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenia (pozri obrázok 1) Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla). Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píku rozpúšťadla. Použite dostatočné množstvo zmesi metyl esterov, aby pík metyl stearátu zabral približne tri štvrtiny celkového rozsahu. Vypočítajte počet teoretických priehradiek, n (účinnosť) podľa vzorca: a rozlíšenie R podľa vzorca: kde: dr1 je retenčná vzdialenosť v milimetroch od štartu chromatogramu po maximum píku metyl stearátu; ω1 a ω2 sú šírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané medzi bodmi priesečníkov tangentov a interflexnými bodmi krivky so základnou líniou; Δ je vzdialenosť v milimetroch medzi maximami píkov metyl stearátu a metyl oleátu, ▼M2 a index rozpustnosti 1r pri použití vzorca kde: a = výška najmenšieho píku meraná od základnej čiary; b = výška najnižšieho bodu priehlbiny medzi dvoma priľahlými píkmi meraná od základnej čiary. ▼B Obrázok 1 Chromatogram na stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenie Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umožnia aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny a rozlíšenie aspoň 1,25.

4.2. Veľkosť navážky

Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 až 2 μl roztoku metyl esterov pripraveného podľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.

Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich približne 100 mg/ml roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 ml tohto roztoku.

Ak sú zložky prítomné iba v stopových množstvách, veľkosť navážky môžete zvýšiť (až 10 násobne).

4.3. Analýza

Pracovné podmienky boli všeobecne definované v 4.1.1.

Napriek tomu je možné pracovať pri nižšej teplote kolóny, ak sa požaduje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo pri vyššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami uhlíka. V prípade potreby je možné využiť programovanú teplotu v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl estery mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100 oC (alebo od 50 do 60 oC, ak je prítomná kyselina butyrová) a ihneď zvýšte teplotu s gratientom 4 až 8 oC/min do optimálnej teploty. V niektorých prípadoch sa môžu kombinovať obidva postupy.

Po programovom vyhrievaní pokračujte v elúcii pri konštantnej teplote, až kým sa všetky zložky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové vyhrievanie, použite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195 oC.

Ak je vhodné, odporúča sa vykonať analýzu na dvoch ukotvených fázach rôznej polarity a tým sa overí neprítomnosť prekrytých píkov, napríklad v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C18:3 a C20:0 alebo C 18:3 a C18:2.

4.4. Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov

Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracovných podmienok, aké boli použité pri vzorkách a zmerajte retenčné časy alebo retenčné vzdialenosti zložiek mastných kyselín. Na semi-logaritmický papier zhotovte, na každý stupeň nenasýtenia, grafy ukazujúce logaritmus retenčného času alebo vzdialenosti ako funkciu počtu uhlíkových atómov. Pri izotermických podmienkach by mali byť grafy pre nerozvetvené kyseliny s rovnakým stupňom nenasýtenia rovnobežné.

Je nevyhnutné predísť takému