10.

Príloha IV sa nahrádza nasledovným textom a diagramom:



„PRÍLOHA IV Stanovenie obsahu vosku plynovo-kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny 1. OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu vosku v určitých tukoch a olejoch za skúšobných podmienok. Môže sa používať najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným lisovaním a získaným extrakciou (olej z olivových výliskov). 2. PRINCÍP Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej ako prvej za skúšobných podmienok (ktorej polarita je nižšia ako polarita triglyceridov), potom priama analýza plynovo-kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny. 3. PRÍSTROJ 3.1. 25-ml Erlenmeyerova banka. 3.2. Sklená kolóna na chromatografiu s vnútorným priemerom 15 mm a s dĺžkou 30-40 cm. 3.3. Vhodný plynovo-kvapalinový chromatograf s kapilárnou kolónou, vybavený systémom na priame zavedenie do kolóny nasledovného: 3.3.1 Termostatom regulovaná sušiareň (pec) pre kolóny, schopná udržiavať požadovanú teplotu s presnosťou na 1 °C. 3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny. 3.3.3. Plameňový ionizačný detektor a prevodník-zosilňovač. 3.3.4. Zapisovač – integrátor schopný pracovať s prevodníkom-zosilňovačom (3.3.3), rýchlosť ozvy pod 1 sekundu, s variabilnou rýchlosťou posunu papiera. 3.3.5. Kapilárna kolóna, sklo alebo tavený kremeň, dĺžka 10 až 15 m, o vnútornom priemere 0,25-0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalinou SE-52 alebo SE-54 alebo ekvivalentnými kvapalinami s homogénnou hrúbkou 0,10 až 0,30 μm. 3.4. Mikrostriekačka so zariadením na vstrekovaciu kapacitu do kolóny 10 ml, vybavená cementovanou ihlou. 4. ČINIDLÁ 4.1. Silikagél, 70/230 mešov, artikel 7754 Merck. Vložte silikagél do pece na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Nechajte vychladnúť a pridajte 2 % vody. Kvôli homogenizácii suspenzie dobre pretrepte. Pred použitím uchovávajte v tme po dobu najmenej 12 hodín. 4.2. n-hexán, pre chromatografiu. 4.3. etyléter, pre chromatografiu. 4.4. n-heptán, pre chromatografiu. 4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný štandard). 4.6. Nosný plyn: vodík, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu. 4.7. Pomocné plyny — vodík, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu. — vzduch, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu. 5. POSTUP 5.1. Oddelenie voskovej frakcie. 5.1.1 Príprava chromatografickej kolóny. Suspenzujte 15 g hydratovaného silikagélu - v 2 % bezvodom n-hexáne a vlejte do kolóny. Nechajte usadiť sa samovoľne. Usadzovanie ukončite pomocou elektrickej trepačky s cieľom dosiahnuť homogénnejší chromatografický pás. Perkolujte v 30 ml n-hexánu s cieľom odstrániť všetky nečistoty. 5.1.2. Stĺpcová chromatografia Navážte presne 500 mg vzorky do 25 ml banky a pridajte vhodné množstvo vnútorného štandardu v závislosti od predpokladaného obsahu vosku, napríklad pridajte 0,1 mg laurylarašidátu v prípade olivového oleja a 0,25 až 0,5 mg v prípade oleja z olivových výliskov. Pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1, pomocou dvoch 2-ml dávok n-hexánu. Napustite rozpúšťadlo do výšky 1 mm nad hornou úrovňou absorbentu. Potom začnite chromatografické eluovanie; zozbierajte 140 ml zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd (2,1 ml/minúta). Sušte výslednú frakciu v rotačnej odparke až do odstránenia takmer celého rozpúšťadla. Posledné 2 alebo 3 ml rozpúšťadla odstráňte pomocou slabého prúdu dusíka, potom pridajte 10 ml n-heptánu. 5.2. Plynovo-kvapalinová chromatografická analýza 5.2.1. Predbežný postup, kondicionovanie kolóny. 5.2.1.1. Namontujte kolónu k plynovo-kvapalinovému chromatografu, pričom vstupný port sa musí pripojiť k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte prístroj na plynovo-kvapalinovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača, atď.). 5.2.1.2. Pokiaľ sa kolóny používajú po prvýkrát, je potrebné ich kondicionovať. Zaveďte mierny prietok plynu cez kolónu a potom zapnite prístroj na plynovo-kvapalinovú chromatografiu. Postupne zahrejte na teplotu najmenej o 20 °C vyššiu ako je prevádzková teplota (poznámka). Túto teplotu udržiavajte najmenej po dobu dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky (nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču, nastavte teplotu pece pre kolónu, nastavte detektor, atď.). Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí byť lineárna, nesmie obsahovať píky akéhokoľvek druhu a nesmie vykazovať žiadnu odchýlku. Negatívna priamočiara odchýlka svedči o tom, že kolóna je nesprávne pripojená; pozitívna odchýlka svedčí o tom, že kolóna nebola správne kondicionovaná. Teplotu kondicionovania udržiavajte vždy na úrovni najmenej 20 °C pod maximálnou teplotou špecifikovanou pre používaný eluent. 5.2.2. Voľba prevádzkových podmienok. 5.2.2.1. Prevádzkové podmienky sú spravidla nasledovné: — teplota kolóny: 80 °C spočiatku, zvyšovaná rýchlosťou 30 °C/minúta na hodnotu 120 °C, potom ju naprogramujte tak, aby stúpala rýchlosťou 5 °C/minúta až na hodnotu 340 °C, — teplota detektora: 350 °C, — lineárna rýchlosť nosného plynu: vodík, 20 až 35 cm/sek., — citlivosť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho tlmenia, — citlivosť zapisovača: 1 až 2 mV, od spodnej časti stupnice, — rýchlosť posuvu papiera: 30 cm/hodina, — vstreknuté množstvo 0,5-1 μl v roztoku. Tieto podmienky sa môžu upraviť tak, aby vyhovovali charakteristikám kolóny a prístroju na plynovo- kvapalinovú chromatografiu (tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledovné podmienky: retenčný čas C32 vnútorného štandardu musí byť 25 ± 2 minúty a najreprezentatívnejší pík voskov sa musí nachádzať v rozmedzí 60 až 100 % od spodnej časti stupnice). 5.2.2.2. Určite parametre integrácie píku takým spôsobom, aby ste dosiahli správne vyhodnotenie príslušných plôch píku. 5.2.3. Vykonanie analýzy 5.2.3.1. Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostriekačky; piestik natiahnite dozadu až dovtedy, kým nebude ihla prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd vstreknite. Po cca piatich sekundách ihlu jemne vytiahnite. 5.2.3.2. Záznam nechajte prebiehať dovtedy, až kým vosky nebudú úplne eluované. Základná čiara musí vždy vyhovovať požadovaným podmienkam (5.2.1.2). 5.2.4. Identifikácia píku Píky identifikujte z retenčných časov porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi, analyzovanými za rovnakých podmienok. Na obr. 1 je uvedený chromatogram voskov panenského olivového oleja. 5.2.5. Kvantitatívna analýza 5.2.5.1. Určite plochy píkov zodpovedajúce vnútornému štandardu a alifatickým esterom od C40 do C46 pomocou integrátora. 5.2.5.2. Stanovte obsah vosku každého esteru v mg/kg tuku podľa príslušného vzorca: pričom: AX = plocha píku každého esteru; AS = plocha píku laurylarašidátu; mS = hmotnosť pridaného laurylarašidátu v miligramoch; m = hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie v gramoch. 6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV Uveďte obsahy rôznych voskov a súčet týchto obsahov v mg/kg tuku.



DODATOK Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu Vstreknite 1 až 3 μl metánu (propánu) do prístroja na plynovo - kvapalinovú chromatografiu po jeho nastavení na bežné prevádzkové podmienky. Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho vstreknutia až do času, keď sa neobjaví pík (tM). Lineárna rýchlosť v cm/sek. je daná vzorcom L/tM, pričom L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.