A.

Blokujúci alebo konkurenčný test ELISA sa vykonáva podľa tohto predpísaného postupu: Konkurenčným testom ELISA za použitia monoklonnej protilátky 3-17-A3 možno identifikovať protilátky na všetky známe sérotypy vírusu katarálnej horúčky oviec a kôz (BTV). Test spočíva v prerušení reakcie medzi antigénom BTV a druhovo špecifickou protilátkou (3-17-A3) tým, že sa pridá testované sérum. Protilátky na BTV, ktoré sú v testovanom sére prítomné, blokujú reaktívnosť monoklonnej protilátky (Mab), v dôsledku čoho sa obmedzí predpokladaná zmena farby po pridaní enzýmom označenej protilátky proti myšiam a chromogénu/substrátu. Séra možno testovať pri jedinom zriedení 1:5 (škvrnový test – dodatok 1) alebo ich možno titrovať (sérová titrácia – dodatok 2), až kým sa nedosiahne konečný bod zriedenia. Hodnoty tlmenia väčšie ako 50 % možno považovať za pozitívne. 1. Príslušné mikrotitračné platničky na test ELISA. 2. Antigén: dodaný vo forme bunečného koncentrátu, pripraveného, ako sa popisuje nižšie a skladovaného pri teplote buď – 20 °C alebo – 70 °C. 3. Blokujúci tlmivý roztok: fosfátom tlmený soľný roztok (PBS) obsahujúci 0,3 % BTV negatívneho séra z dospelých jedincov hovädzieho dobytka, 0,1 % (v/v) Tween-20 (dodaného vo forme polyoxyetylénsorbitonmonolauranového sirupu) v PBS. 4. Monoklonná protilátka: 3-17-A3 (dodaná vo forme hybridomovej, na povrchu plávajúcej tkanivovej kultúry) nasmerovaná proti druhovo špecifickému polypeptidu VP7, skladovaná pri teplote – 20 °C alebo zmrazením vysušená a pred použitím zrieďovaná 1/100 blokujúcim tlmivým roztokom. 5. Konjugovaný radikál: králičí globulín proti myšiam (adsorbovaný a eluovaný) konjugovaný s peroxidázou chrenu a uchovávaný na tmavom mieste pri teplote 4 °C. 6. Chromogén a substrát: ortofenyléndiamín (OPD-chromogén) s konečnou koncentráciou 0,4 mg/ml v sterilnej destilovanej vode. Peroxid vodíka (30 % w/v-substrát) 0,05 obj. % pridaných bezprostredne pred použitím (5μl H2O2 na 10 ml OPD)). (S OPD manipulujte opatrne – s gumovými rukavicami na rukách – môže ísť o mutagén). 7. 1 molárna kyselina sírová: 26,6 ml kyseliny sa pridá do 473,4 ml destilovanej vody. (nezabudnite – vždy pridávajte kyselinu do vody, nikdy nie vodu do kyseliny.) 8. Kruhová trepačka. 9. Vyhodnocovač platničky ELISA (test možno vyhodnotiť vizuálne). Cc: kontrolná vzorka konjugovaného radikálu (bez séra/bez monoklonnej protilátky); C++: kontrolná vzorka silne pozitívneho séra; C+: kontrolná vzorka slabo pozitívneho séra; C–: kontrolná vzorka negatívneho séra; Cm: kontrolná vzorka monoklonnej protilátky (bez séra).



Dodatok 1: Zriedenie na škvrnový test (1:5) konfigurácia (40 sér/platnička) Kontrolné vzorky Testové séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Dodatok 2: Konfigurácia sérovej titrácie (10 sér/platnička) Kontrolné vzorky Testové séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Kontrolná vzorka konjugovaného radikálu (Cc) : Priehradky 1A a 1B obsahujú slepé kontrolné vzorky pozostávajúce z antigénu BTV a konjugovaného radikálu. Mono pouit na predbené vyhodnotenie testu ELISA. Kontrolná vzorka Mab (Cm) : Stlpce 1 a 2, rady G a H obsahujú kontrolnú vzorku monoklonnej protilátky, ktorá pozostáva z BTV antigénu, monoklonnej protilátky a konjugovaného radikálu. Tieto priehradky predstavujú maximálne zafarbenie. Stredná hodnota optickej hustoty hodnôt zistených u tejto kontrolnej vzorky predstavuje 0 % hodnoty tlmenia. Pozitívna kontrolná vzorka (C++,C–) : Stlpce 1 a 2, rady C-D-E-F. Tieto priehradky obsahujú antigén BTV, silné, resp. slabé pozitívne antisérum BTV, Mab a konjugovaný radikál. Negatívna kontrolná vzorka (C–) : Priehradky 2A a 2B obsahujú negatívne kontrolné vzorky, ktoré obsahujú antigén BTV, negatívne sérum BTV, Mab a konjugovaný radikál. Testovacie séra : V prípade rozsiahlych sérologických pokusov a rýchleho skríningu, séra by sa mohli testovat pri jedinom zriedení 1:5 (Dodatok 1). Alebo mono testovat 10 sér v rozsahu od 1:5 ku 1:640 (Dodatok 2). Takto sa získajú urcité údaje o titre protilátky obsiahnutej v testovom sére. 1. V PBS zrieďte antigén BTV na predtitrovanú koncentráciu, krátko previbrujte ultrazvukom, aby sa rozptýlil zhluk víru (pokiaľ nie je k dispozícii ultrazvukový prístroj, silne pipetujte) a pridajte 50 μl do všetkých priehradiek platničky na test ELISA. Poklopte boky platničky, aby sa rozptýlil antigén. 2. Inkubujte pri teplote 37 °C po dobu 60 minút na kruhovej trepačke. Platničky umyte a priehradky vyprázdnite nesterilným PBS a usušte na absorpčnom papieri. 3. Priehradky s kontrolnou vzorkou: do priehradiek Cc pridajte 100 μl blokujúceho tlmivého roztoku. Do príslušných priehradiek C–, C+ a C++ pridajte 50 μl pozitívneho a negatívneho kontrolného séra pri zriedení 1:5 (10 μl séra + 40 μl blokujúceho tlmivého roztoku). Do priehradiek s kontrolnou vzorkou Mab pridajte 50 μl blokujúceho tlmivého roztoku. Metóda titrácie pri škvrnovom teste: Do blokujúceho tlmivého roztoku pridajte každé zo sér zriedené v pomere 1:5, aby sa zdvojili priehradky v stĺpcoch 3 až 12 (10 μl séra + 40 μl blokujúceho tlmivého roztoku), alebo Metóda sérovej titrácie: V blokujúcom tlmivom roztoku pripravte dve série zriedení každej z testových vzoriek (1:5 až 1:640) cez osem priehradiek stĺpcov 3 až 12. 4. Bezprostredne po pridaní testového séra zrieďte Mab 1:100 v blokujúcom tlmivom roztoku a pridajte 50 μl do všetkých priehradiek platničky okrem tých, ktoré obsahujú slepú vzorku. 5. Po dobu 60 minút inkubujte pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. Trikrát umyte za použitia PBS a vysušte. 6. Králičí koncentrát proti myšiam zrieďte na 1/5 000 v blokujúcom tlmivom roztoku a pridajte 50 μl do všetkých priehradiek platničky. 7. Po dobu 60 minút inkubujte pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. Trikrát umyte za použitia PBS a vysušte. 8. Nechajte roztopiť OPD a bezprostredne pred použitím pridajte 5 μl 30 % peroxidu vodíka do každých 10 ml OPD. Pridajte 50 μl do všetkých priehradiek platničky. Nechajte meniť farbu po dobu približne 10 minút a reakciu zastavte 1-mólovou kyselinou sírovou (50 μl na jednu priehradku). Farba by sa mala meniť v priehradkách obsahujúcich kontrolné vzorky Mab, ako aj v tých, ktoré obsahujú séra bez protilátky na BTV. 9. Platničky preskúmajte a výsledok zaznamenajte buď vizuálne, alebo pomocou spektrofotometra. Za použitia softvéru vytlačte hodnoty OD a percento tlmenia (PI) u testových a kontrolných vzoriek, vychádzajúc pri tom zo strednej hodnoty, ktorá sa zaznamenala v priehradkách obsahujúcich kontrolnú vzorku antigénu. Údaje vyjadrené vo forme hodnôt OD a PI sa používajú na to, aby sa určilo, či sa výsledky testu pohybujú v prijateľných medziach. Horná limita kontrolných vzoriek (UCL) a dolná limita kontrolných vzoriek (LCL) u kontrolných vzoriek Mab (antigén plus Mab, ak sa nepoužijú testové séra) sa pohybuje v rozmedzí hodnôt OD 0,4 až 1,4. Každá platnička, ktorá nevyhovuje vyššie uvedeným kritériám, sa musí zamietnuť. Pokiaľ počítačový softvér nie je k dispozícii, vytlačte hodnoty OD na tlačiarni ELISA. Vypočítajte strednú hodnotu OD pre priehradky obsahujúce kontrolnú vzorku antigénu, ktorá sa rovná 100 % hodnote. Vypočítajte 50 % hodnotu OD a ručne vypočítajte pozitívnosť a negatívnosť každej vzorky. Percentuálna hodnota tlmenia = 100 – (OD každej testovej kontrolnej vzorky/stredná hodnota OD CM) x 100. Zdvojené priehradky s negatívnym kontrolným sérom a zdvojené priehradky so slepou vzorkou by mali dosiahnuť hodnoty PI v rozmedzí +25 % až –25 %, resp. +95 % až + 105 %. Pokiaľ sa hodnoty nepohybujú v tomto rozmedzí, neznamená to, že platnička sa neuzná, naznačuje to však, že farba pozadia sa mení. V prípade silných a slabých pozitívnych sér by sa zaznamenané hodnoty PI mali pohybovať v rozmedzí +81 až 100 %, resp. +51 % až +80 %. Diagnostická medza pre testové séra je 50 % (PI 50 % alebo OD 50 %). Vzorky, u ktorých sa zaznamenali hodnoty PI > 50 %, sa zaznamenajú ako negatívne. Vzorky, u ktorých sa zaznamenali hodnoty PI vyššie alebo nižšie ako je medza pre zdvojené priehradky, sa považujú za pochybné; takéto vzorky sa môžu opätovne preskúšať v škvrnovom teste alebo titráciou. Pozitívne vzorky možno takisto titrovať, aby sa zistil stupeň pozitívnosti. Vizuálne vyhodnocovanie: Pozitívne a negatívne vzorky ľahko rozoznať voľným okom; slabo pozitívne alebo negatívne vzorky možno voľným okom posúdiť ťažšie. 1. Trikrát umyte 40 – 60 radov súbežných buniek BKH-21 Eaglovým živným roztokom neobsahujúcim sérum a infikujte vírom katarálnej horúčky oviec a kôz sérotypu 1 v Eaglovom živnom roztoku neobsahujúcom sérum. 2. Inkubujte pri 37 °C a každý deň skúmajte cytopatický účinok (CPE). 3. Keď sa CTE zavŕši na 90 až 100 % bunkovej vrstvy každého radu, zozbierajte vírus strasením buniek zo skla. 4. Odstreďte pri 2 000 až 3 000 ot/min., aby sa z buniek vytvorili guličky. 5. Látku plávajúcu na povrchu odstráňte a bunky znovu suspendujte v približne 30 ml PBS obsahujúcom 1 % sarkosylu a 2 ml fenylmetylsulfonylfluoridu (rozložený tlmivý roztok). V dôsledku toho sa môže stať, že bunky vytvoria gel a na zníženie tohto účinku možno pridať ešte viac rozloženého tlmivého roztoku.(Upozornenie: fenylmetylsulfonyl fluorid je škodlivý – manipulujte s ním mimoriadne opatrne.) 6. Bunky na 30 sekúnd narušte ultrazvukovou sondou pri amplitúde 30 mikrónov. 7. Odstreďujte pri 10 000 ot/min. po dobu 10 minút. 8. Látku plávajúcu na povrchu uskladnite pri teplote +4 °C a zvyšujúci zhluk buniek znovu rozptýľte v 10 až 20 ml rozloženého tlmivého roztoku. 9. Previbrujte ultrazvukom a vyčírte, pričom na povrchu plávajúcu látku skladujte v každej fáze celkom trikrát. 10. Zhromaždite všetku plávajúcu látku a odstreďujte pri 24 000 ot./min. (100 000 g po dobu 120 minút pri teplote +4 °C nad 5 ml vrstvou 40 % sacharózy (w/v v PBS) za použitia 30 ml Beckmannovych odstreďovacích rúrok a rotora SW 28. 11. Látku plávajúcu na povrchu odstráňte, dôkladne vypustite rúrky a zhluk opätovne suspendujte ultrazvukom. Antigén uskladňujte vo vzorkách pri teplote –20 °C. Antigén katarálnej horúčky oviec a kôz pre test ELISA sa titruje nepriamym testom ELISA. Dvojnásobné zriedenia antigénu sa titruje podľa konštantne zriedenej (1/100) monoklonnej protilátky 3-17-A3. Postupuje sa takto: 1. Natitrujte 1:20 zriedenie antigénu BTV v PBS cez mikrotitračnú platničku v zdvojenej sérii zriedení (50 μl/priehradka) za použitia viackanálikovej pipety. 2. Po dobu jednej hodiny inkubujte pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 3. Platničky trikrát umyte PBS. 4. Do každej priehradky mikrotitračnej platničky pridajte 50 μl monoklonnej protilátky 3-17-A3 (zriedenej 1/100). 5. Po dobu jednej hodiny inkubujte pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 6. Platničky trikrát umyte PBS. 7. Do každej priehradky mikrotitračnej platničky pridajte 50 μl králičieho globulínu proti myšiam, konjugovaného s peroxidázou chrenu, zriedeného na predtitrovanú optimálnu koncentráciu. 8. Inkubujte po dobu jednej hodiny pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 9. Po 10 minútach reakciu zastavte pridaním 1 molárnej kyseliny sírovej (50 μl/priehradka). V konkurenčnom pokuse musí monoklonnámonoklonálna látka prevyšovať, preto sa zvolí antigén, ktorý pripadá na titračnú krivku (a nie na stabilnú oblasť), pri čom sa za 10 minút dosiahne hodnota 0,8 OD.