1978L0633 — SK — 20.12.1983 — 002.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

►B ÔSMA SMERNICA KOMISIE z 15. júna 1978, ktorou sa stanovujú analytické metódy spoločenstva pre potreby úradnej kontroly krmív (78/633/EHS) (Ú. v. ES L 206, 29.7.1978, p.43)

Zmenené a doplnené:









▼B

ÔSMA SMERNICA KOMISIE

z 15. júna 1978,

ktorou sa stanovujú analytické metódy spoločenstva pre potreby úradnej kontroly krmív

(78/633/EHS)







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady 70/373/EHS z 20. júla 1970 o zavedení metód vzorkovania a analytických metód spoločenstva pre potreby úradnej kontroly krmív ( 1 ) naposledy zmenenú a doplnenú Aktom o pristúpení, najmä na jej článok 2, Keďže smernica požaduje, aby sa vykonávala úradná kontrola krmív pomocou metód vzorkovania a analytických metód spoločenstva kvôli overovaniu súladu s požiadavkami vyplývajúcimi z opatrení ustanovených zákonmi, inými právnymi predpismi alebo administratívnymi opatreniami týkajúcimi sa kvality a zloženia krmív; Keďže smernice Komisie 71/250/EHS z 15. júna 1971 ( 2 ), 71/393/EHS z 18. novembra 1971 ( 3 ), 72/199/EHS z 27. apríla 1972 ( 4 ), 73/46/EHS z 5. decembra 1972 ( 5 ), 74/203/EHS z 25. marca 1974 ( 6 ), 75/84/EHS z 20. decembra 1974 ( 7 ) a 76/372/EHS z 1. marca 1976 ( 8 ) už ustanovili niekoľko analytických metód spoločenstva; keďže pokrok v prácach, ku ktorému odvtedy prišlo, ukazuje, že je vhodné prijať ôsmy súbor metód; Keďže opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá, PRIJALA TÚTO SMERNICU:







Článok 1

1. Členské štáty sú povinné vykonávať analýzy pre potreby úradných kontrol krmív, pokiaľ ide o ich obsah bacitracínu zinočnatého, flavofosfolipolu, železa, medi, mangánu a zinku, v súlade s metódami popísanými v prílohe k tejto smernici.

▼M1 —————

▼B

Článok 2

Členské štáty do 1. januára 1979 príjmu zákony, iné právne predpisy alebo administratívne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Bezodkladne o tom budú informovať Komisiu.

Článok 3

Táto smernica je adresovaná členským štátom.









PRÍLOHA

▼M2

1. URČENIE OBSAHU BACITRACÍNU ZINOČNATÉHO

— difúziou v agarovom médiu —

1. ÚČEL A OBLASŤ

Táto metóda slúži na stanovenie obsahu bacitracínu zinočnatého v krmivách a premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 5 mg/kg (5 ppm) ( 9 ).

2. PODSTATA

Vzorka sa extrahuje pri pH 2 pomocou zmesi metylalkoholu/vody/kyseliny chlorovodíkovej a roztoku síranu sodného. Pridaním síranu sodného sa vyzrážajú všetky rozpustné soli medi, ktoré môžu rušivo pôsobiť pri rozbore. Hodnota pH extraktu sa upraví na 6,5, extrakt sa koncentruje (ak je to potrebné) a zriedi. Jeho antibiotická aktivita sa stanoví zmeraním difúzie bacitracínu zinočnatého v agarovom médiu naočkovanom mikroorganizmom Micrococcus luteus (flavus). Difúzia sa prejaví tvorbou inhibičných zón mikroorganizmu. Vzťah medzi priemerom týchto zón a logaritmom koncentrácie antibiotika v rozsahu použitých antibiotických koncentrácií sa považuje za priamo úmerný.

3. MIKROORGANIZMUS: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC 10240

3.1. Udržiavanie zásobnej kultúry

Naočkujte šikmé plochy kultivačného média (4.1) mikroorganizmom Micrococcus luteus (flavus) a inkubujte 24 hodín pri teplote 30 °C. Skladujte kultúru v chladničke pri teplote asi 4 °C. Preočkujte každé dva týždne.

3.2. Príprava bakteriálnej suspenzie ( 10 )

Zozbierajte produkt z čerstvo pripravenej šikmej plochy agaru (3.1) pomocou 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Túto suspenziu použite na naočkovanie 250 ml kultivačného média (4.1), v Rouxovej banke a inkubujte 18 až 20 hodín pri teplote 30 °C. Zozbierajte produkt do 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a zamiešajte. Zrieďte suspenziu na 1/10 pomocou roztoku chloridu sodného (4.3). Priechod svetla suspenziou musí byť asi 75 %, meraný pri 650 nm v kyvete o priemere 1 cm oproti roztoku chloridu sodného (4.3). Túto suspenziu možno skladovať 1 týždeň pri teplote asi 4 °C.

4. KULTIVAČNÉ MÉDIÁ A ČINIDLÁ

4.1. Kultivačné médium ( 11 )







Mäsový bujón 6,0 g Tryptón 4,0 g Kvasinkový extrakt 3,0 g Mäsový extrakt 1,5 g Glukóza 1,0 g Agar 10,0 až 20,0 g Voda 1 000 ml ph 6,5 až 6,6 (po sterilizácii).

4.2. Skúšobné médium (c)







Tryptón 10,0 g Kvasinkový extrakt 3,0 g Mäsový extrakt 1,5 g Glukóza 1,0 g Agar 10,0 až 20,0 g Tween 80 1 ml Voda 1 000 ml ph 6,5 (po sterilizácii)

4.3. Chlorid sodný, roztok 0,8 % (w/v): rozpustite 8 g chloridu sodného vo vode a zrieďte na 1 000 ml; sterilizujte.

4.4. Zmes metylalkoholu, vody a kyseliny chlorovodíkovej (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5. Fosfátový pufer, pH 6,5:



Hydrofosforečnan draselný, K2HPO4 22,15 g Dihydrofosforečnan draselný, KH2PO4 27,85 g Voda do 1 000 ml

4.6. Kyselina chlorovodíková (d: 1,18 až 1,19).

4.7. Kyselina chlorovodíková (0,1 M).

4.8. Hydroxid sodný — roztok 1 M

4.9. Síran sodný — roztok cca 0,5 M.

4.10. Brómkrezolová červeň, roztok 0,04 % (w/v): rozpustite 0,1 g brómkrezolovej červene v 18,5 ml roztoku hydroxidu sodného 0,01 M. Doplňte do 250 ml vodou a zamiešajte.

4.11. Štandardná látka: bacitracín zinočnatý o známej aktivite (v m.j.).

5. ŠTANDARDNÉ ROZTOKY

Navážte také množstvo štandardu bacitracínu zinočnatého (4.11), ktoré obsahuje 1 050 m.j. (podľa uvedenej aktivity). Pridajte 5 ml kyseliny chlorovodíkovej 0,1 M (4.7) a nechajte stáť 15 minút. Pridajte 30 ml vody, upravte pH na hodnotu 4,5 pomocou fosfátového pufra (4.5) (cca 4 ml), doplňte do 50 ml vodou a dobre zamiešajte (1 ml = 21 m.j.).

Z tohto roztoku pripravte postupným riedením pomocou fosfátového pufra (4.5) nasledujúce roztoky:







s8 0,42 m.j./ml s4 0,21 m.j./ml s2 0,105 m.j./ml s1 0,0525 m.j./ml

6. PRÍPRAVA EXTRAKTU A SKÚŠOBNÝCH ROZTOKOV

6.1. Extrakcia

6.1.1. Premixy a minerálne krmivá

Navážte vzorku o množstve 2,0 až 5,0 g, pridajte 29,0 ml zmesi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a krátko pretrepte. Skontrolujte, či pH je približne 2. Trepte 10 minút, pridajte 30 ml fosfátového pufra (4.5), trepte 15 minút a odstreďte. Odoberte vhodnú alikvótnu časť supernatantu a upravte pH na 6,5 roztokom hydroxidu 1 M (4.8) pomocou pH-metra alebo roztokom brómkrezolovej červene (4.10) ako indikátorom. Zrieďte fosfátovým pufrom (4.5), aby ste získali očakávaný obsah bacitracínu zinočnatého 0,42 m.j./ml (= u8).

6.1.2. Bielkovinové koncentráty

Navážte vzorku o množstve 10,0, pridajte 49,0 ml zmesi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a krátko pretrepte. Skontrolujte, či pH je približne 2. Trepte 10 minút. Pridajte 50 ml fosfátového pufra (4.5), trepte 15 minút a odstreďte. Odoberte vhodnú alikvótnu časť supernatantu a upravte pH na 6,5 roztokom hydroxidu 1 M (4.8) pomocou pH-metra alebo roztokom brómkrezolovej červene (4.10) ako indikátorom. Odparte na približne polovičné množstvo v rotačnej odparke pri teplote nepresahujúcej 35 °C.

Zrieďte fosfátovým pufrom (4.5), aby ste získali očakávaný obsah bacitracínu zinočnatého 0,42 m.j./ml (= u8).

6.1.3. Ostatné krmivá

Navážte vzorku o množstve 10,0 g (20,0 g pri očakávanom obsahu bacitracínu zinočnatého 5 mg/kg). Pridajte zmes 24,0 ml zmesi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a homogenizujte 10 minút. Pridajte 25 ml fosfátového pufra (4.5), trepte 15 minút a odstreďte. Odoberte 20 ml supernatantu a upravte pH na 6,5 roztokom hydroxidu 1 M (4.8) pomocou pH-metra alebo roztokom brómkrezolovej červene (4.10) ako indikátorom. Odparte na približne 4 ml v rotačnej odparke pri teplote nepresahujúcej 35 °C. Zvyšok zrieďte fosfátovým pufrom (4.5), aby ste získali očakávaný obsah bacitracínu zinočnatého 0,42 m.j./ml (= u8).

6.2. Skúšobné roztoky

Z roztoku u8 pripravte roztoky u4 (očakávaný obsah: 0,21 m.j./ml), u2 (očakávaný obsah. 0,105 m.j./ml) a u1 (očakávaný obsah: 0,0525 m.j./ml) postupným riedením (1 + 1) pomocou fosfátového pufra (4.5).

7. SKÚŠOBNÝ POSTUP

7.1. Očkovanie skúšobného média

Naočkujte skúšobné médium (4.2) bakteriálnou suspenziou (3.2) pri teplote cca 50 °C. Predbežnými skúškami na platniach so skúšobným médiom (4.2) stanovte množstvo bakteriálnej suspenzie potrebné na vznik najväčších a najzreteľnejších inhibičných zón s rôznymi koncentráciami bacitracínu zinočnatého.

7.2. Príprava platní

Difúzia v agare sa vykoná na platniach so štyrmi koncentráciami štandardného roztoku (s8, s4, s2 a s1) a štyrmi koncentráciami skúšobného roztoku (u8, u4, u2 a u1). Tieto štyri koncentrácie extraktu a štandardu sa musia umiestniť na každú platňu. Preto vyberte dostatočne veľké platne, ktoré umožnia vytvoriť v agarovom médiu aspoň osem jamiek o priemere 10 až 13 mm a najmenej s 30 mm odstupom medzi ich stredmi. Skúšku môžete vykonať na sklenených platniach s hliníkovým alebo umelohmotným prstencom o priemere 200 mm a výške 20 mm, pripevnených na nich.

Nalejte na platne médium (4.2) naočkované podľa bodu 7.1 v takom množstve, aby ste získali vrstvu s približnou hrúbkou 2 mm (60 ml na platňu s priemerom 200 mm). Nechajte stuhnúť vo vodorovnej polohe, vyvŕtajte jamky a nalejte do nich presne odmerané množstvá skúšobných a štandardných roztokov (od 0,10 do 0,15 ml do jednej jamky, v závislosti od priemeru). Každú koncentráciu aplikujte aspoň štyri razy, aby bolo každé stanovenie predmetom hodnotenia 32 inhibičných zón.

7.3. Inkubácia

Inkubujte platne 16 až 18 hodín pri teplote 30 ± 2 °C.

8. HODNOTENIE

Odmerajte priemer inhibičných zón s presnosťou na 0,1 mm. Zaznamenajte priemerné hodnoty meraní každej koncentrácie na semilogaritmický papier, znázorňujúci logaritmus koncentrácií vo vzťahu k priemerom inhibičných zón. Zakreslite „optimálnu“ rastovú krivku štandardu aj extraktu podľa nižšie uvedeného príkladu:

Stanovte „optimálny“ rastový bod na najnižšiu koncentráciu štandardu (SL) pomocou vzorca:

a)

Stanovte „optimálny“ rastový bod na najvyššiu koncentráciu štandardu (SH) pomocou vzorca:

b)

Obdobne vypočítajte „optimálne“ rastové body na najnižšiu koncentráciu extraktu (UL) a najvyššiu koncentráciu extraktu (UH), pričom s1, s2, s4 a s8 vo vzorci uvedenom vyššie nahradíte hodnotami u1, u2, u4 a u8.

Vypočítané hodnoty SL a SH zaznamenajte na ten istý grafický papier a spojte ich, aby ste získali „optimálnu“ rastovú krivku na štandardný roztok. Obdobne zaznamenajte UL a UH a spojte ich, čím získate „optimálnu“ rastovú krivku na extrakt.

Ak neexistujú interferencie, krivky majú byť rovnobežné. Z praktických dôvodov krivky možno považovať za rovnobežné, ak hodnoty (SH — SL) a (UH — UL) sa neodlišujú od svojej priemernej hodnoty o viac ako 10 %.

Ak krivky nie sú rovnobežné, môžete vynechať buď u1 a s1 alebo u8 a s8 a SL, SH, UL a UH vypočítať pomocou alternatívnych vzorcov, aby ste získali alternatívne krivky „optimálneho“ rastu:







a′) SL = alebo b′) SH = alebo

a obdobne pre UL a UH. Musia byť splnené rovnaké kritériá rovnobežnosti. V záverečnej správe treba uviesť, že výsledok bol vypočítaný z troch koncentrácií.

Keď sa krivky považujú za rovnobežné, vypočítajte logaritmus relatívnej aktivity (log A) pomocou jedného z nasledujúcich vzorcov podľa toho, či pri hodnotení rovnobežnosti boli použité tri alebo štyri koncentrácie.

Pre štyri koncentrácie

c)

Pre tri koncentrácie

d)

alebo

d′)

Aktivita skúšobného extraktu = aktivita príslušného štandardu × A

(u8 = s8 × A)

Ak sa relatívna aktivita nachádza mimo rozsahu 0,5 až 2,0, zopakujte skúšku, pričom vhodne upravte koncentrácie extraktu alebo ak to nie je možné, koncentrácie štandardných roztokov. Ak nie je možné dosiahnuť, aby relatívna aktivita bola v požadovanom rozpätí, každý získaný výsledok musí byť považovaný za približný a túto skutočnosť treba uviesť v záverečnej správe.

Keď sa krivky nepovažujú za rovnobežné, zopakujte stanovenie. Ak ani potom nedosiahnete rovnobežnosť, stanovenie musíte považovať za neuspokojivé.

Výsledok vyjadrite v miligramoch bacitracínu zinočnatého na kilogram krmiva.

9. OPAKOVATEĽNOSŤ

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení, vykonaných na tej istej vzorke tým istým analytikom, nesmie presiahnuť:

— 2 mg/kg v absolútnej hodnote pri obsahoch bacitracínu zinočnatého do 10 mg/kg,

— 20 % z najvyššej hodnoty pri obsahoch od 10 do 25 mg/kg,

— 5 mg/kg v absolútnej hodnote pri obsahoch od 25 do 50 mg/kg,

— 10 % z najvyššej hodnoty pri obsahoch nad 50 mg/kg.

▼B

2. STANOVENIE OBSAHU FLAVOFOSFOLIPOLU DIFÚZNOU PLATŇOVOU METÓDOU V AGAROVOM MÉDIU

1. ÚČEL A ROZSAH POUŽITIA

Táto metóda je určená na stanovenie obsahu flavofosfolipolu v krmivách, koncentrátoch a premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti obsahu je 1 mg/kg (1 ppm).

2. PRINCÍP

Vzorka sa vyextrahuje zriedeným metanolom za ohrievania a pri spätnom toku. Po odstredení sa extrakt vyčistí (podľa potreby) úpravou pomocou iónomeničových živíc a zriedi. Jeho antibiotická aktivita sa stanoví meraním difúzie flavofosfolipolu v agarovom médiu naočkovanom baktériami Staphylococcus aureus. Difúzia sa prejaví tvorbou inhibičných zón tohto mikroorganizmu. Priemer týchto zón sa považuje za priamo úmerný logaritmu antibiotickej koncentrácie v rozsahu použitých antibiotických koncentrácií.

3. MIKROORGANIZMUS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Uchovávanie základnej testovacej kultúry

Naočkujte Staphylococcus aureus do šikmého agarového kultivačného média (4.1). Inkubujte 24 hodín pri teplote 37 °C, uložte do chladničky pri teplote asi 4 °C a každé dva mesiace znovu naočkujte do šikmého agaru.

3.2. Príprava bakteriálnej suspenzie ( 12 )

Odložte si nabok dve skúmavky so základnou testovacou kultúrou (3.1) a každý týždeň ich znovu naočkujte. Inkubujte ich 24 hodín pri teplote 37 °C a uložte ich do chladničky pri teplote asi 4 °C.

24 hodín pred skúškou naočkujte týmto nárastom kultúry dve až štyri skúmavky obsahujúce šikmé agarové kultivačné médium (4.1). Inkubujte 16 až 18 hodín pri teplote 37 °C. Vytvorte suspenziu nárastu kultúry v roztoku chloridu sodného (4.3). Hodnota prenosu svetla suspenziou meraná pri 578 nm v 1 cm komore musí byť asi 40 % v porovnaní s roztokom chloridu sodného (4.3).

4. KULTIVAČNÉ MÉDIÁ A CHEMIKÁLIE

4.1. Kultivačné médium ( 13 )







Mäsový peptón 6.0 g Tryptón 4,0 g Kvasničný autolyzát 3,0 g Mäsový extrakt 1,5 g Glukóza 1,0 g Agar 15,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizácii)

4.2. Skúšobné médium

4.2.1. Základná vrstva ( 14 )







Mäsový peptón 6.0 g Kvasničný autolyzát 3,0 g Mäsový extrakt 1,5 g Agar 10,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizácii)

4.2.2. Očkovacia vrstva

Ako v bode 4.1, ale s pridaním 2,0 g silikónovej protipeniacej emulzie ( 15 ).

4.3. Vodný roztok chloridu sodného 0,4 % (w/v): rozpustite 4 g chloridu sodného a.p. vo vode a zrieďte doliatím do 1 000 ml; sterilizujte.

4.4. Metanol, čistý.

4.5. 50 % roztok metanolu (v/v): zrieďte 500 ml metanolu (4.4) doliatím 500 ml vody.

4.6. 80 % roztok metanolu (v/v): zrieďte 800 ml metanolu (4.4) doliatím 200 ml vody.

4.7. Tris (hydroxy-metyl)-amino-metán a.p.

4.8. 1,5 % roztok chloridu draselného v metanole (w/v): rozpustite 1,5 g chloridu draselného a.p. v 20 ml vody, doplňte metanol (4.4) do objemu 100 ml.

4.9. Menič katiónov: Dowex 50 W x 8, 20 až 50 ôk sita na palec, Na forma (kat. Serva č. 41600) alebo ekvivalentný.

4.10. Menič aniónov Dowex 1 x 2, 50 až 100 ôk sita na palec, Cl forma (kat. Serva č. 41010) alebo ekvivalentný. Pred použitím ho uložte na 12 až 14 hodín do 80 % metanolu (4.6).

4.11. Sklená vata

4.12. Lakmusový papier (pH 6,6 až 8,1).

4.13. Kyselina askorbová.

4.14. Štandardná látka: flavofosfolipol so známou aktivitou.

5. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

5.1. Sklená trubica pre chromatografiu: vnútorný priemer 9 mm, dĺžka: 150 až 200 mm, osadená uzatváracím kohútikom na zúženej časti dolného konca a zabrúseným skleným spojom (na pripojenie ku kvapkaciemu lieviku (5.2) na hornom konci.

5.2. Kvapkací lievik 250 ml, osadený uzatváracím kohútikom a zabrúseným skleným spojom.

5.3. Kužeľová banka objemu 250 ml so zabrúseným skleným spojom.

5.4. Spätný chladič so zabrúseným skleným spojom.

6. ŠTANDARDNÉ ROZTOKY

Rozpustite presne odvážené množstvo štandardnej látky (4.14) v 50 % roztoku metanolu (4.5) a zrieďte ho tak, aby ste dosiahli zásobný roztok obsahujúci 100 μg flavofosfolipolu na mililiter. Pri skladovaní v nádobe so zabrúsenou zátkou pri teplote 4 °C zostane tento roztok stabilný až dva mesiace.

Z tohto zásobného roztoku pripravte postupným zrieďovaním 50 % metanolom (4.5) tieto roztoky:







S8 0,2 μg/ml S4 0,1 μg/ml S2 0,05 μg/ml S1 0,525 μg/ml

7. PRÍPRAVA EXTRAKTU

7.1. Extrakcia

7.1.1. Koncentráty, premixy a minerálne krmivá

Odvážte 2,0 až 5,0 g vzorky, pridajte asi 150 mg kyseliny askorbovej (4.13). Homogenizujte pomocou 150 ml 50 % roztoku metanolu (4.5) v kužeľovej banke (5.3) a upravte pH na hodnotu 8,1 až 8,2 pomocou asi 400 mg tris(hydroxy-metyl)-amino-metánu (4.7). Skontrolujte hodnotu pH lakmusovým papierom (4.12). Nechajte 15 minút stáť, potom znovu upravte pH na hodnotu 8,1 až 8,2 pomocou tris(hydroxy-metyl)-amino-metánu (4.7) a varte 10 minút pri spätnom toku (5.4) a stálom miešaní. Nechajte ochladiť, odstreďte zmes a zlejte extrakt.

7.1.2. Ostatné krmivá

Odvážte 5,0 až 30,0 g vzorky obsahujúcej najmenej 30 μg flavofosfolipolu. Homogenizujte pomocou 150 ml 50 % roztoku metanolu (4.5) v kužeľovej banke (5.3) a upravte pH na hodnotu 8,1 až 8,2 pomocou asi 400 mg tris(hydroxy-metyl)-amino-metánu (4.7). Skontrolujte hodnotu pH lakmusovým papierom (4.12). Nechajte 15 minút stáť, potom znovu upravte pH na hodnotu 8,1 až 8,2 pomocou tris(hydroxy-metyl)-amino-metánu (4.7) a varte 10 minút pri spätnom toku (5.4) a stálom miešaní. Nechajte ochladiť, odstreďte zmes a zlejte extrakt.

7.2. Čistenie (v prípade koncentrátov, premixov a minerálnych krmív je možné tento krok vynechať)

Zmiešajte 110 ml extraktu s 11 g meniča katiónov (4.9), varte jednu minútu pri spätnom toku (5.4) a stálom miešaní. Oddeľte menič katiónov odstredením alebo filtráciou. Zmiešajte 100 ml extraktu so 150 ml metanolu (4.4) a uložte roztok na 12 až 15 hodín pri teplote 4 °C. V studenom stave roztok prefiltrujte.

Zasuňte zátku zo sklenej vaty (4.11) do dolného konca sklenej trubice (5.1), nalejte do trubice 5 ml meniča aniónov (4.10) a umyte stĺpec pomocou 100 ml 80 % roztoku metanolu (4.6). Pomocou lievika (5.2) preneste do stĺpca najmenej 100 ml filtrátu s predpokladaným obsahom 16 μg flavofosfolipolu (200 ml na 30 g vzorky krmiva pri 1 ppm). V prípade potreby filtrát pred prenesením do stĺpca zrieďte pomocou 80 % roztoku metanolu (4.6) tak, aby ste dosiahli predpokladaný obsah flavofosfolipolu 16 μg/100 ml. Upravte prietok asi na 2 ml/minútu. Vytekajúci roztok vylejte. Potom umyte stĺpec pomocou 50 ml 80 % roztoku metanolu (4.6) a vytekajúci roztok vylejte.

Vymývajte flavofosfolipol roztokom chloridu draselného v metanole (4.8), pričom prietok udržiavajte na hodnote asi 2 ml/minútu. Odoberte 50 ml eluátu do odmernej banky, pridajte 30 ml vody a zmiešajte. Tento roztok musí obsahovať flavofosfolipol v množstve 0,2 g/ml (= U8).

7.3. Skúšobné roztoky

Podľa potreby (t. j. ak bol krok čistenia vynechaný) zrieďte extrakt získaný v bode 7.1.1 pomocou 50 % roztoku metanolu (4.5) tak, aby ste dosiahli predpokladaný obsah flavofosfolipolu 0,2 μg/ml (= U8).

Z roztoku U8 pripravte roztoky U4 (predpokladaný obsah: 0,1 μg/ml), U2 (predpokladaný obsah: 0,05 μg/ml) a U1 (predpokladaný obsah: 0,025 μg/ml) postupným zrieďovaním pomocou 50 % roztoku metanolu (4.5) (v pomere 1 diel roztoku k 1 dielu roztoku metanolu).

8. PRACOVNÝ POSTUP

8.1. Naočkovanie skúšobného média

Naočkujte skúšobné médium (4.2) bakteriálnou suspenziou (3.2) pri teplote asi 50 °C. Predbežnými skúškami na platniach so skúšobným médiom (4.2.2) stanovte množstvo bakteriálnej suspenzie potrebné na vytvorenie najväčších a najjasnejších inhibičných zón s rôznymi koncentráciami flavofosfolipolu (asi 30 ml/liter).

8.2. Príprava platní

K difúzii do agaru dochádza na platniach so štyrmi koncentráciami štandardného roztoku (S8, S4, S2, S1) a štyrmi koncentráciami skúšobného roztoku (U8, U4, U2, U1). Na každej platni musia byť nevyhnutne umiestnené tieto štyri koncentrácie extraktu a štandardného roztoku. Na tento účel vyberte platne dostatočne veľké na to, aby sa na nich mohlo vytvoriť najmenej osem otvorov s priemerom 10 až 13 mm a so vzdialenosťami medzi ich stredmi najmenej 30 mm v agarovom médiu. Skúšku možno vykonať na platniach pozostávajúcich z vrstvy skla, na hornej ploche ktorých je umiestnený obrubový hliníkový alebo plastový prstenec s priemerom 200 mm a výškou 20 mm.

Nalejte na dosky také množstvo média (4.2.1), aby sa vytvorila vrstva hrubá asi 1,5 mm (45 ml v prípade platne s priemerom 200 mm). Nechajte ustáliť vo vodorovnej polohe a potom prelejte takým množstvom média (4.2.2) naočkovaného spôsobom popísaným v bode 8.1, aby sa vytvorila vrstva hrubá 1 mm (30 ml v prípade platne s priemerom 200 mm). Znovu nechajte ustáť vo vodorovnej polohe, vyvŕtajte otvory a nalejte do nich presne odmerané objemy skúšobných a štandardných roztokov (podľa priemeru od 0,10 do 0,15 ml na otvor).

Každú koncentráciu použite najmenej štyrikrát, takže pri každom postupe stanovenia obsahu flavofosfolipolu sa vyhodnotí 32 inhibičných zón.

8.3. Inkubácia

Inkubujte platne 16 až 18 hodín pri teplote 28 až 30 °C.

9. VYHODNOTENIE

Odmerajte priemer inhibičných zón s presnosťou na najbližšiu 0,1 mm. Zaznamenajte stredné hodnoty meraní každej koncentrácie na semilogaritmický grafický papier a vytvorte graf závislosti logaritmu koncentrácií od priemeru inhibičných zón. Nakreslite krivky najlepšej zhody štandardného roztoku a extraktu, napríklad ďalej uvedeným postupom.

Určite bod „najlepšej zhody“ pre najnižšiu koncentráciu štandardného roztoku (SL) pomocou vzorca:

(a)

(b)

Podobne vypočítajte body „najlepšej zhody“ pre najnižšiu koncentráciu extraktu (UL) a najvyššiu koncentráciu extraktu (UH) dosadením U1, U2, U4 a U8 za S1, S2, S4 a S8 do vyššie uvedených vzorcov.

Zaznamenajte vypočítané hodnoty SL a SH do toho istého grafického papiera, pospájajte ich a vytvorte priamku „najlepšej zhody“ štandardného roztoku. Podobne zaznamenajte UL a UH, pospájajte ich a vytvorte priamku „najlepšej zhody“ extraktu.

Ak neexistuje žiadne rušenie, tieto priamky musia byť rovnobežné. Na praktické účely sa tieto priamky považujú za rovnobežné, ak sa hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) nelíšia od ich strednej hodnoty o viac než 10 %.

Ak sa zistí, že tieto priamky nie sú rovnobežné, je možné vylúčiť buď U1 a S1 alebo U8 a S8, vypočítať SL, SH, UL a UH pomocou alternatívnych vzorcov a vytvoriť alternatívne priamky „najlepšej zhody“:

(a’) alebo alebo

(b’) alebo alebo

a podobne pre UL a UH. Tak, ako predtým, sa musí skontrolovať rovnobežnosť alternatívnych priamok najlepšej zhody. Skutočnosť, že výsledok bol vypočítaný z troch hodnôt koncentrácie, sa musí uviesť v záverečnej správe.

Ak tieto priamky považujete za rovnobežné, vypočítajte logaritmus pomernej aktivity (log.A) pomocou jedného z týchto vzorcov.

Pre štyri hodnoty koncentrácie

(c)

Pre tri hodnoty koncentrácie

(d)

alebo

(d’)

Skutočná aktivita = predpokladaná aktivita x pomerná aktivita.

Ak tieto priamky nepovažujete za lineárne, zopakujte postup stanovenia obsahu flavofosfolipolu. Ak sa ešte stále nedosiahla rovnobežnosť, vypočítajte logaritmus pomernej aktivity (log. A) pomocou vzorca c). Získaný výsledok sa však musí považovať za približný a musí sa to uviesť v záverečnej správe.

10. OPAKOVATEĽNOSŤ

Rozdiel medzi výsledkami dvoch postupov stanovenia obsahu flavofosfolipolu, ktoré na tej istej vzorke vykoná ten istý analytik, nesmie prekročiť:

0,5 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah flavofosfolipolu vyšší než 1 až do 2 mg/kg;

25 % najvyššej hodnoty pre obsah flavofosfolipolu vyšší než 2 až do 10 mg/kg;

20 % najvyššej hodnoty pre obsah flavofosfolipolu vyšší než 10 až do 25 mg/kg;

5 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah flavofosfolipolu vyšší než 25 až do 50 mg/kg;

10 % najvyššej hodnoty pre obsah flavofosfolipolu nad 50 mg/kg.

3. STANOVENIE OBSAHU MIKROPRVKOV ŽELEZA, MEDI, MANGÁNU A ZINKU

1. ÚČEL A ROZSAH POUŽITIA

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah mikroprvkov železa, medi, mangánu a zinku v krmivách. Dolné medze stanoviteľnosti obsahu sú:

železo (Fe): 20 mg/kg

meď (Cu): 10 mg/kg

mangán (Mn): 20 mg/kg

zinok (Zn): 20 mg/kg

2. PRINCÍP

Vzorka sa po spálení organických látok, ak nejaké obsahuje, ponorí do roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Obsah prvkov železa, medi, mangánu a zinku sa stanoví po vhodnom zriedení metódou atómovej absorpčnej spektrometrie.

3. CHEMIKÁLIE

Úvodné poznámky

Na prípravu chemikálií a analytických roztokov používajte vodu, ktorá bola získaná dvojitou destiláciou vody v destilačnom prístroji z borokremičitého skla alebo kremeňa alebo dvojitou úpravou na iónomeničovej živici a ktorá neobsahuje katióny prvkov, ktorých obsah sa má stanoviť.

Chemikálie musia mať aspoň analytickú triedu čistoty (a.p.). Neprítomnosť prvku, ktorého obsah sa má stanoviť, sa musí overiť slepým pokusom. V prípade potreby sa chemikálie musia ďalej vyčistiť.

Namiesto štandardných roztokov sa môžu používať komerčné štandardné roztoky za predpokladu, že sú certifikované a pred použitím boli overené.

3.1. Kyselina chlorovodíková a.p. (d: 1,19).

3.2. Kyselina chlorovodíková (6 N).

3.3. Kyselina chlorovodíková (0,5 N).

3.4. 38 až 40 % kyselina fluorovodíková a.p. (v/v) s obsahom železa menej než 1 mg Fe/liter a s obsahom zvyšku po odparení menej než 10 mg (vo forme síranu)/liter.

3.5. Kyselina sírová a.p. (d: 1,84).

3.6. Peroxid vodíka a.p. (približne 100 objemových jednotiek kyslíka (30 % hmotnosti)).

3.7. Štandardný roztok železa (1 000 μg Fe/ml) pripravený takto: rozpustite 1 g železného drôtu a.p. v 200 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2), pridajte 16 ml peroxidu vodíka (3.6) a dolejte vodu do jedného litra. 3.7.1. Pracovný štandardný roztok železa (100 μg Fe/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.7) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody.

3.8. Štandardný roztok medi (1 000 μg Cu/ml) pripravený takto: rozpustite 1 g medi vo forme prášku (a.p) v 25 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2), pridajte 5 ml peroxidu vodíka (3.6) a dolejte vodu do jedného litra. 3.8.1. Pracovný štandardný roztok medi (10 μg Cu/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.8) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a potom zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.9. Štandardný roztok mangánu (1 000 μg Mn/ml) pripravený takto: rozpustite 1 g mangánu vo forme prášku (a.p.) v 25 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a dolejte vodu do jedného litra. 3.9.1. Pracovný štandardný roztok mangánu (10 μg Mn/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.9) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a potom zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.10. Štandardný roztok zinku (1 000 μg Zn/ml) pripravený takto: rozpustite 1 g zinku vo forme pásu alebo fólie (a.p). v 25 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a dolejte vodu do jedného litra. 3.10.1. Pracovný štandardný roztok zinku (10 μg Zn/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.10) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a potom zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.11. Roztok chloridu lantanitého pripravený takto: rozpustite 12 g oxidu lantanitého v 150 ml vody, pridajte 100 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a dolejte vodu do jedného litra.

4. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

4.1. Muflová pec s reguláciou teploty a zapisovačom.

4.2. Sklené predmety musia byť tvrdého borokremičitého typu a odporúča sa používať prístrojové vybavenie vyhradené výlučne pre postupy stanovenia obsahu mikroprvkov.

4.3. Platinová miska a (voliteľná) kremenná miska.

4.4. Atómový absorpčný spektrometer spĺňajúci požiadavky metódy, pokiaľ ide o citlivosť a presnosť v požadovanom rozsahu.

5. POSTUP

5.1. Vzorky obsahujúce organické látky

5.1.1. Spopolnenie a príprava roztoku na analýzu ( 16 )

i) Vložte 5 až 10 g vzorky odvážených s presnosťou na najbližšie 0,2 g do kremennej alebo platinovej misky (4.3) (pozri poznámku b)), vysušte ju v sušiarni pri teplote 105 °C a vložte misku do studenej muflovej pece (4.1). Zatvorte muflovú pec (pozri poznámku c)) a v priebehu asi 90 minút zvýšte jej teplotu na 450 až 475 °C. Udržujte teplotu 4 až 16 hodín (napr. v noci), čím sa odstránia uhlíkaté častice, potom pec otvorte a nechajte ju vychladnúť (pozri poznámku d)). Vymyte misku celkovým množstvom asi 5 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1) a pomaly a opatrne pridávajte kyselinu do kadičky (môže prísť k prudkej reakcii v dôsledku tvorby CO2). Pridávajte po kvapkách kyselinu chlorovodíkovú (3.1) a miešajte dovtedy, kým roztok celkom neprestane šumieť. Nechajte roztok odparovať až do vysušenia a príležitostne ho premiešajte sklenou tyčinkou. Ďalej pridajte do zvyšku 15 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a potom asi 120 ml vody. Zamiešajte sklenou tyčinkou, ktorá musí ostať v kadičke a prikryte kadičku hodinkovým sklíčkom. Pomaly uveďte do varu a udržiavajte na bode varu dovtedy, kým neuvidíte, že sa už žiadny ďalší popol nerozpúšťa. Prefiltrujte na bezpopolovom filtračnom papieri a filtrát zachyťte v 250 ml odmernej banke. Umyte kadičku a filter pomocou 5 ml horúceho 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a dvakrát vriacou vodou. Naplňte odmernú banku vodou až po značku (koncentrácia HCl asi 0,5 N).

ii) Ak je zvyšok na filtračnom papieri čierny (uhlík), vráťte ho späť do pece a znovu ho spopolnite pri teplote 450 až 475 °C. Toto spopolnenie, ktoré trvá iba niekoľko hodín (asi tri až päť hodín), sa skončí, keď je popol biely alebo takmer biely. Rozpustite zvyšok asi v 2 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), nechajte odparovať až do vysušenia a pridajte 5 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Ohrejte tento roztok, prefiltrujte ho do odmernej banky a dolejte vodu až po značku (koncentrácia HCl asi 0,5 N).

Poznámky:

a) Pri stanovovaní obsahu mikroprvkov je dôležité pripraviť sa na riziká kontaminácie, najmä zinkom, meďou a železom. Z tohto dôvodu sa tieto kovy nesmú nachádzať na vybavení používanom pri príprave vzoriek. Kvôli zníženiu všeobecného rizika kontaminácie pracujte v bezprašnej atmosfére s úzkostlivo čistým vybavením a starostlivo poumývanými sklenými pomôckami. Stanovenie obsahu zinku je obzvlášť citlivé na mnoho typov kontaminácie, napr. zo sklených predmetov, chemikáliami, prachom atď.

b) Hmotnosť vzorky, ktorá sa má spopolniť, sa vypočíta z približného obsahu mikroprvkov v krmive vzhľadom na citlivosť použitého spektrofotometra. V prípade niektorých krmív s nízkym obsahom mikroprvkov môže byť potrebné začať sa 10 až 20 g vzorkou a doliať konečný roztok iba do 100 ml.

c) Spopolnenie sa musí vykonať v uzavretej peci bez prívodu vzduchu alebo kyslíka.

d) Teplota, ktorú udáva pyrometer, nesmie prekročiť 475 °C.

5.1.2. Spektrofotometrické stanovenie

5.1.2.1. Príprava kalibračných roztokov Pre každý z prvkov, ktorého obsah sa má stanoviť, pripravte z pracovných štandardných roztokov uvedených v bodoch 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1 niekoľko kalibračných roztokov, pričom koncentrácia HCl v každom z kalibračných roztokov je asi 0,5 N a (v prípade železa, mangánu a zinku) koncentrácia chloridu lantanitého je ekvivalentná 0,1 % La (w/v). Vybrané koncentrácie mikroprvkov sa musia nachádzať v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometra. V ďalej uvedených tabuľkách je formou príkladov popísané zloženie typických rozsahov kalibračných roztokov; v závislosti od typu a citlivosti použitého spektrofotometra však môže byť potrebné vybrať iné koncentrácie.



Železo μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml pracovného štandardného roztoku (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 + ml 6 N roztoku HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a doliať vodu do 100 ml.



Meď μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml pracovného štandardného roztoku (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N roztoku HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8 Doliať vodu do 100 ml.



Mangán μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml pracovného štandardného roztoku (3.9.1)(1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N roztoku HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a doliať vodu do 100 ml.



Zinok μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml pracovného štandardného roztoku (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 + ml 6 N roztoku HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a doliať vodu do 100 ml.

5.1.2.2. Príprava roztoku na analýzu Na stanovenie obsahu medi je za normálnych okolností možné priamo použiť roztok pripravený postupom podľa bodu 5.1.1. Ak je potrebné upraviť jeho koncentráciu tak, aby sa nachádzala v rozsahu kalibračných roztokov, je možné pipetou preniesť alikvótnu časť do 100 ml odmernej banky a doliať 0,5 N roztok kyseliny chlorovodíkovej (3.3) až po značku. Kvôli stanoveniu obsahu železa, mangánu a zinku preneste pipetou alikvótnu časť roztoku pripraveného podľa bodu 5.1.1 do 100 ml odmernej banky, pridajte 10 ml chloridu lantanitého (3.11) a dolejte 0,5 N roztok kyseliny chlorovodíkovej (3.3) až po značku (pozri tiež bod 8 „POZOROVANIE“).

5.1.2.3. Slepý pokus Súčasťou slepého pokusu musia byť všetky predpísané kroky postupu s tým, že sa vynecháva materiál vzorky. Ako slepý roztok sa nesmie použiť kalibračný roztok „0“.

5.1.2.4. Meranie atómovej absorpcie Odmerajte atómovú absorpciu kalibračných roztokov a analyzovaného roztoku pomocou plameňa acetylén-vzduch pri týchto vlnových dĺžkach: Fe : 248,3 nm Cu : 324,8 nm Mn : 279,5 nm Zn : 213,8 nm Každé meranie vykonajte štyrikrát.

5.2. Minerálne krmivá

Ak vzorka neobsahuje žiadne organické látky, je zbytočné ju vopred spopolniť. Postupujte tak, ako je popísané v bode 5.1.1 i); začnite od druhého odseku. Odparovanie roztoku s kyselinou fluorovodíkovou je možné vynechať.

6. VÝPOČET VÝSLEDKOV

Vypočítajte koncentráciu mikroprvku v analyzovanom roztoku pomocou kalibračnej krivky a výsledok vyjadrite v miligramoch mikroprvku na kilogram vzorky (ppm).

7. OPAKOVATEĽNOSŤ

Rozdiel medzi výsledkami dvoch súbežných stanovení obsahu príslušného mikroprvku, ktoré na tej istej vzorke vykoná ten istý analytik, nesmie prekročiť:

— 5 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah príslušného mikroprvku až do 50 mg/kg;

— 10 % vyššej hodnoty výsledku pre obsah príslušného mikroprvku od 50 až do 100 mg/kg;

— 10 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah príslušného mikroprvku od 100 až do 200 mg/kg;

— 5 % vyššej hodnoty výsledku pre obsah príslušného mikroprvku nad 200 mg/kg.

8. POZOROVANIE

Prítomnost velkých mnostiev fosforecnanov môe pôsobit rušivo pri stanovovaní obsahu eleza, mangánu a zinku. Tento rušivý vplyv sa musí korigovat pridaním roztoku chloridu lantanitého (3.11). Ak je však vo vzorke pomer hmotností

> 2, je moné vynechat pridanie roztoku chloridu lantanitého (3.11) do roztoku pre analýzu a do kalibracných roztokov.