Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednos ť za jeho obsah  
►B NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91  
z 11. júla 1991,  
o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických 
metódach  
(Ú. v. ES L 248, 5.9.1991, s. 1)  
Zmenené a doplnené:  
Úradný vestník  
Č. Strana  Dátum  
►M1 Nariadenie Komisie (EHS) č. 3682/91 zo 17. decembra 1991  L 349  36  18.12.1991  
►M2 Nariadenie Komisie (EHS) č. 1429/92 z 26. mája 1992  L 150  17  2.6.1992  
►M3 Commission Regulation (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)  L 176  27  30.6.1992  
►M4 Commission Regulation (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)  L 199  18  18.7.1992  
►M5 Nariadenie Rady (EHS) č. 3288/92 z 12. novembra 1992  L 327  28  13.11.1992  
►M6 Nariadenie Komisie (EHS) č. 183/93 z 29. januára 1993  L 22  58  30.1.1993  
►M7 zmenené a doplnené Nariadenie Komisie (EHS) č. 826/93 zo 6. apríla 
1993  L 87  6  7.4.1993  
►M8 Commission Regulation (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)  L 66  29  18.3.1993  
►M9 Nariadenie Komisie (ES) č. 177/94 z 28. januára 1994  L 24  33  29.1.1994  
►M10  Commission Regulation (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)  L 280  43  29.10.1994  
►M11  Nariadenie Komisie (ES) č. 656/95 z 28. marca 1995  L 69  1  29.3.1995  
►M12  Commission Regulation (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)  L 258  49  28.10.1995  
►M13  Commission Regulation (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)  L 341  25  12.12.1997  
►M14  Nariadenie Komisie (ES) č. 282/98 z 3. februára 1998  L 28  5  4.2.1998  
►M15  Commission Regulation (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)  L 282  55  20.10.1998  
►M16  Nariadenie Komisie (EHS) č. 379/1999 z 19 februára 1999  L 46  15  20.2.1999  
►M17  Commission Regulation (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)  L 65  9  7.3.2001  
►M18  Commission Regulation (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)  L 276  8  19.10.2001  
►M19  Commission Regulation (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)  L 128  8  15.5.2002  
►M20  Nariadenie Komisie (ES) č. 1989/2003 zo 6. novembra 2003  L 295  57  13.11.2003  
►M21  Nariadenie Komisie (ES) č. 702/2007 z 21. júna 2007  L 161  11  22.6.2007  
►M22  Nariadenie Komisie (ES) č. 640/2008 zo 4. júla 2008  L 178  11  5.7.2008  
►M23  Nariadenie Komisie (EÚ) č. 61/2011 z 24. januára 2011  L 23  1  27.1.2011  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 1  
(*) Tento akt nebol zatia ľ uverejnený v sloven čine.
NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91  
z 11. júla 1991,  
o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o 
príslušných analytických metódach  
KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLO ČENSTIEV,  
so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spolo čen­
stva, 
so zreteľom na nariadenie Rady č. 136/66/EHS z 22. septembra 1966 
o založení spolo čnej organizácie trhu s olejmi a tukmi (  1 ), naposledy 
zmenené a doplnené nariadením (EHS) č. 3577/90 (  2 ), a najmä na jeho 
článok 35 a,  
keďže príloha k nariadeniu č. 136/66/EHS zah ŕňa opisy a definície 
olivového oleja a oleja z olivových zvyškov predávané v každom člen­
skom štáte, v obchodovaní v rámci spolo čenstva a obchodovaní s tretími 
krajinami;  
keďže by sa na ú čely rozlíšenia medzi rôznymi druhmi oleja mali 
stanoviť fyzikálne a chemické vlastnosti každého z nich 
a organoleptické vlastnosti panenského oleja s cie ľom zaručiť čistotu 
a kvalitu príslušných produktov bez toho, aby boli dotknuté ostatné existujúce ustanovenia;
 
keďže by sa prítomnos ť vlastností rôznych druhov oleja mala stanovi ť 
jednotne v rámci spolo čenstva; ke ďže by sa na tento ú čel mali v rámci 
spoločenstva zavies ť metódy chemickej analýzy a organoleptického 
hodnotenia; ke ďže by sa na prechodné obdobie malo povoli ť používanie 
iných metód analýzy platných v členských štátoch za predpokladu, že 
v prípade rozdielu vo výsledkoch budú rozhodujúce tie, ktoré sa získali použitím obvyklej metódy;
 
keďže definovanie fyzikálnych a chemických vlastností olivového oleja 
a metód analýzy si vyžiadalo prílohu s dopl ňujúcimi poznámkami ku 
kapitole 15 colného sadzobníka;  
keďže pre metódu hodnotenia organoleptických vlastností panenského 
oleja je potrebné zostavenie skupín vybraných a vyškolených hodnoti ­
teľov; keďže by lehota potrebná na zostavenie takýchto skupín mala by ť 
presne stanovená; ke ďže s prihliadnutím na problémy, na ktoré môžu 
niektoré členské štáty pri zostavovaní skupín hodnotite ľov narazi ť, 
využívanie skupín v ostatných členských by malo by ť autorizované;  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 2  
( 1 ) Ú. v. ES 172, 30.9.1966, s. 3025/66. 
( 2 ) Ú. v. ES L 353, 17.12.1990, s. 23.
 keďže, s cie ľom zaisti ť, aby systém poplatkov uplat ňujúcich sa na 
dovoz olivových zvyškov fungoval správne, bolo by potrebné ustanovi ť 
jednotnú metódu na stanovenie obsahu oleja v týchto produktoch;  
keďže s cieľom neuškodi ť obchodu by bolo potrebné zavies ť ustano­
venie pre olej plnený do obalov pred nadobudnutím ú činnosti tohto 
nariadenia, ktoré by obmedzovalo predávanie tohto oleja po čas stano­
venej lehoty;  
keďže je potrebné zruši ť nariadenie Komisie (EHS) č. 1058/77 (  1 ), 
naposledy zmenené a doplnené nariadením EHS č. 1858/88 (  2 ); 
keďže Riadiaci výbor pre oleje a tuky nezaslal svoje stanovisko 
v lehote, ktorú ur čil jeho predseda,  
PRIJALA TOTO NARIADENIE:  
▼M20  
Článok 1  
1. Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považujú za panenské olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č. 136/­
66/EHS.
 
2. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za lampantový 
olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/­
EHS.  
3. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
 
4. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za olivový olej zmiešaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
 
5. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za surový zvyškový olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
 
6. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č. 136/66/­
EHS.
 
7. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými 
v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za zvyškový olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.  ▼
B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 3  
( 1 ) Ú. v. ES L 128, 24.5.1977, s. 6. 
( 2 ) Ú. v. ES L 166, 1.7.1988, s. 10.
 Článok 2  
1. Vlastnosti olejov, ustanovené v prílohe I, sa budú stanovova ť 
v súlade s nižšie uvedenými metódami analýzy:  
— na stanovenie vo ľných mastných kyselín, vyjadrených ako percento 
kyseliny olejovej, metóda uvedená v prílohe II,  
— na stanovenie peroxidového čísla metóda uvedená v prílohe III,  
▼M19  
— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,  
▼B 
— na stanovenie obsahu sterolov metóda uvedená v prílohe V,  
— na stanovenie erytrodiolu a uvaolu metóda uvedená v prílohe VI,  
▼M21  
— na stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu 
metóda uvedená v prílohe VII,  
▼M20  __________  
▼B 
— na spektrofotometrickú analýzu metóda uvedená v prílohe IX,  
— na stanovenie zloženia mastných kyselín metóda uvedená v prílohe 
X A a X B,  
— na stanovenie prchavých halogenovaných rozpúš ťadiel metóda 
uvedená v prílohe XI,  
— na hodnotenie organoleptických vlastností panenského olivového 
oleja metóda uvedená v prílohe XII,  
▼M20  __________  
▼M11  
— na stanovenie stigmastadiénov, metóda uvedená v prílohe XVII,  
▼M13  
— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method 
set out in Annex XVIII,  
▼M19  
— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given 
in Annex XIX.  
▼M23  
— na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín 
a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatogra ­
fiou metóda uvedená v prílohe XX.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 4
 
2. Verification by national authorities or their representatives of the 
organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.
 
The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first 
subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.
 
Should the panel not confirm the category declared as regards the 
organoleptic characteristics, at the interested party's request the national 
authorities or their representatives shall have two counter-assessments 
carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.
 
▼M17  
3. When the national authorities or their representatives verify the 
characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, 
the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regula ­
tion. 
▼
M19  
Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard 
EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:
 
— the tenth working day after they are taken, during the period from 
October to May, and  
— the fifth working day after they are taken, during the period from 
June to September.  
▼M17  
4. ►M20  Na účely overenia stanoveného v odseku 3 sa analýzy 
uvedené v prílohách II, III, IX, X a XII a akéko ľvek krížové analýzy 
požadované pod ľa vnútroštátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú pred 
uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokia ľ sa odber vzoriek 
vykoná viac ako štyri mesiace pred uplynutím minimálnej doby trvan ­
livosti, analýza by sa mala vykona ť najneskôr po uplynutí štyroch 
mesiacov nasledujúcich po mesiaci odberu vzorky. Na iné analýzy stanovené v tomto nariadení sa neuplat ňujú žiadne časové obme ­
dzenia. ◄ ▼
M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 5
 
Unless the sample was taken less than one month before the minimum 
durability date, if the results of the analyses do not match the charac ­
teristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.
 
▼M19  
5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by 
the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.
 
▼M20  
Článok 2a  
Vnútroštátne orgány alebo ich zástupcovia môžu overi ť či je vzorka 
v súlade s deklarovanou kategóriou:  
a) buď vykonaním analýz stanovených v prílohe I v ľubovoľnom 
poradí;  
b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib v rozhodovacom 
strome, až kým nedosiahnu jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.
 
▼M19  __________  
▼M5 
Článok  ►M19  3 ◄ 
Ak sa zistí, že organoleptické charakteristiky ur čitého oleja nezodpove ­
dajú jeho opisu, tak dotknutý členský štát uplat ňuje bez toho, aby boli 
dotknuté akéko ľvek iné pokuty, administratívne pe ňažné pokuty, ktoré 
treba stanovi ť vzhľadom na závažnos ť zistených nezrovnalostí.  
Pri hodnotení nezrovnalosti sa musí venova ť pozornos ť najmä priro ­
dzeným zmenám charakteristík oleja uchovávaného za normálnych podmienok.
 
Členské štáty informujú Komisiu na za čiatku každého polroku o po čte 
a druhu zistených nezrovnalostí a o pokutách uplatnených v priebehu predchádzajúceho polroku.
 
Článok 4  
▼M19  
1. The Member States may approve assessment panels so that 
national authorities or their representatives can assess and verify orga ­
noleptic characteristics.  
The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:  
— the requirements of Annex XII.4 are met,  
— the panel head is given training recognised for this purpose by the 
Member State,  ▼M17  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 6
 
— continued approval depends on performance in annual checks 
arranged by the Member State.  
Member States shall notify to the Commission a list of approved panels 
and the action taken under this paragraph.  
▼M5 
2. Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degusta čných porôt na 
svojom území na ťažkosti, môžu sa obráti ť na degusta čnú porotu schvá ­
lenú v inom členskom štáte.  
3. Každý členský štát vypracuje zoznam degusta čných porôt ustano ­
vených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpe čí dosiahnutie súladu 
s týmito podmienkami.
 
▼M19  __________  
▼B 
Článok 6  
1. Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvyškov, ktoré 
vznikajú pri extrakcii olivového oleja ( číselné znaky KN 2306 90 11 
a 2306 90 19), sa stanoví použitím metódy uvedenej v prílohe XV.  
2. Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmot ­
nosti oleja ku hmotnosti sušiny.  
▼M20  
Článok 7  
Uplatňujú sa ustanovenia spolo čenstva týkajúce sa prítomnosti ne čistôt.  
Pokiaľ ide o halogénované rozpúš ťadlá, pre všetky kategórie olivových 
olejov platia nasledovné limity:  
— maximálny objem každého detekovaného halogénovaného rozpúš ­ 
ťadla: 0,1 mg/kg,  
— maximálny celkový objem detekovaných halogénovaných rozpúš ťa­
diel: 0,2 mg/kg.  
▼B 
Článok 8  
1. Členské štáty budú Komisiu informova ť o prijatých opatreniach 
pri zavádzaní tohto nariadenia.  
2. Členský štát na za čiatku každého polroka zašle Komisii preh ľad 
analytických údajov o uskuto čnených testoch za predchádzajúci polrok.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 7
 
Výsledky bude posudzova ť Riadiaci výbor pre oleje a tuky v súlade 
s postupmi uvedenými v článku 39 nariadenia č. 136/66/EHS.  
Článok 9  
Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zrušuje.  
Článok 10  
1. Táto smernica nadobúda ú činnosť tretí deň od jej uverejnenia 
v Úradnom vestníku Európskych spolo čenstiev.  
Postup uvedený v prílohe XII sa však bude uplat ňovať od  
►M1 1. novembra 1992 ◄, okrem postupov týkajúcich sa systému 
intervencie.  
▼M5 
Daná metóda sa neuplat ňuje na panenský olivový olej pripravený na trh 
pred 1. novembrom 1992.  
▼B 
2. Toto nariadenie sa nebude uplat ňovať na olivový olej a olej 
z olivových zvyškov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie nadobudlo ú činnosť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.
 
Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatnite ľné vo 
všetkých členských štátoch.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 8
 
PRÍLOHY  
Obsah  
Príloha I: Vlastnosti olivových olejov 
Príloha Ia: Odbor vzoriek olivového oleja a zvyškového olivového 
oleja v priamom obale do 100 litrov 
Príloha Ib: Rozhodovací strom Príloha II:  ►
M21  Stanovenie vo ľných mastných kyselín, studená 
metóda ◄ 
Príloha III: Stanovenie peroxidového čísla 
Príloha IV:  ►M6 Stanovenie obsahu vosku plynovo - kvapalinovou 
chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny ◄ 
Príloha V: Stanovenie zloženia a obsahu sterolov metódou 
kapilárnej plynovej 
Príloha VI: Stanovenie erytrodiolu a uvaolu Príloha VII:  ►
M21  Stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril 
monopalmitátu ◄ 
▼M20  __________  
▼B 
Príloha IX: Spektrofotometrické skúšanie v ultrafialovom svetle 
Príloha X A: Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou 
chromatografiou 
Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil 
and olive-pomace oil 
Príloha XI: Stanovenie prchavých halogenovaných rozpúš ťadiel 
v olivovom oleji 
Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils  
▼M20  __________  
▼M19  __________  
▼B 
Príloha XV: Obsah oleja v olivových zvyškoch 
Príloha XVII: Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with 
ECN42 
Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content
 
▼M23  
Príloha XX: Metóda na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mast ­
ných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou 
plynovou chromatografiou  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 9
 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 10
 ▼M23  
PRÍLOHA I  
VLASTNOSTI OLIVOVÝCH OLEJOV  
Kategória Metylestery mastných 
kyselín (FAME) 
a etylestery mastných 
kyselín (FAEE) Acidita 
(%) 
(*) Peroxi­
dové číslo 
mEq 
O 2 /kg 
(*) Vosky 
mg/kg 
(**) 2-glyceril monopalmitát 
(%) Stigmasta ­
dién 
mg/kg (  1 ) Rozdiel: 
ECN42(H ­
PLC) 
a ECN42 
(teoretický 
výpočet) K 232 (*) K  270 (*) Delta-K 
(*) Organoleptické 
hodnotenie 
Medián defek ­
toru (Md) (*) Organolep ­
tické 
hodnotenie 
Medián 
ovocnosti 
(Mf) (*)  
1. Extra panenský olivový olej Σ FAME + FAEE 
≤ 75 mg/kg alebo 
75 mg/kg < Σ 
FAME + FAEE 
≤ 150 mg/kg 
a (FAEE/FAME) 
≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 
≤ 1,0 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom > 14 % 
2. Panenský olivový olej — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 
≤ 1,0 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom > 14 % 
3. Lampantový olivový olej — > 2,0 — ≤ 300 (  3 ) ≤ 0,9 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md 
> 3,5 (  2 ) — 
≤ 1,1 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom > 14 % 
4. Rafinovaný olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 
≤ 1,1 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom > 14 %
 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 11
 ▼M23  
Kategória Metylestery mastných 
kyselín (FAME) 
a etylestery mastných 
kyselín (FAEE) Acidita 
(%) 
(*) Peroxi­
dové číslo 
mEq 
O 2 /kg 
(*) Vosky 
mg/kg 
(**) 2-glyceril monopalmitát 
(%) Stigmasta ­
dién 
mg/kg (  1 ) Rozdiel: 
ECN42(H ­
PLC) 
a ECN42 
(teoretický 
výpočet) K 232 (*) K  270 (*) Delta-K 
(*) Organoleptické 
hodnotenie 
Medián defek ­
toru (Md) (*) Organolep ­
tické 
hodnotenie 
Medián 
ovocnosti 
(Mf) (*)  
5. Olivový olej - zložený 
z rafinovaných olivových olejov a panenských olivo ­
vých olejov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 
≤ 1,0 ak je % kyse ­
liny palmitovej 
celkom > 14 % 
6. Surový olej z olivových 
výliskov — — — > 350 (
 4 ) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 
7. Rafinovaný olej z olivových 
výliskov — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 
8. Olej z olivových výliskov — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —  
( 1 ) Súhrn izomérov, ktoré sa (ne-)dajú separova ť pomocou kapilárnej kolóny. 
( 2 ) Alebo ak medián defektoru je najviac 3,5 a medián ovocnosti je rovný 0. 
( 3 ) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoho lov najviac 350 mg/kg alebo ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu najviac 3,5 %. 
( 4 ) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatický ch alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 
3,5 %.
 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 12
 ▼M23  
Kategória Obsah kyselín (  1 ) Súhrn 
trans- 
izoméro­
v kyse­
liny 
olejovej 
(%) Súhrn 
trans- 
izomérov 
kyselín 
linolove­
j + linole­
novej 
(%) Zloženie sterolov 
Steroly 
celkom 
(mg/kg) Erytrodiol 
a uvaol 
(%) (**) Myristová 
(%) Linole­
nová 
(%) Araši­
dová 
(%) Eikozá­
nová 
(%) Behé­
nová 
(%) Lignoce­
rová 
(%) Choles­
terol 
(%) Brassi­
kasterol 
(%) Kampes­
terol 
(%) Stigmasterol 
(%) Betasitos­
terol 
(%) (  2 ) Delta-7- 
stigmas­
tenol 
(%) 
1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 
2. Panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 
3. Lampantový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (  3 ) 
4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 
5. Zmiešaný olivový olej - zložený 
z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 
6. Surový olej z olivových výliskov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (
 4 ) 
7. Rafinovaný olej z olivových výli ­
skov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 
8. Olej z olivových výliskov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5  
( 1 ) Obsah ostatných mastných kyselín (%): palmitovej: 7,5 - 20,0; palmitoolejovej: 0,3 - 3,5; heptadekánovej: ≤ 0,3; heptadecénovej: ≤ 0,3; stearovej: 0,5 - 5,0; olejovej: 55,0 - 83,0; linolovej: 3,5 - 21,0 
( 2 ) Súhrn : Delta-5,23-stigmastadienol+chlerosterol+beta-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-stigmastadienol. 
( 3 ) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoho lov najviac 350 mg/kg alebo ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu najviac 3,5 %. 
( 4 ) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg až 350 mg/kg sa považujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatický ch alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 
3,5 %.  
Poznámky:  
(a) Výsledky analýz sa uvádzajú s rovnakým po čtom desatinných miest, aký je ur čený pre jednotlivé vlastnosti. 
Číslica na poslednom desatinnom mieste sa zaokrúhli smerom hore, ak je nasledujúca číslica väčšia ako 4. 
(b) Ak aspo ň jedna charakteristika nezodpovedá ur čeným hodnotám, na ú čely tohto nariadenia je to dosta čujúci dôvod na zaradenie olivového oleja do inej kategórie alebo na jeho ozna čenie za nevyhovujúci z h ľadiska čistoty. 
(c) Kvalitatívne vlastnosti olejov ozna čené hviezdi čkou (*) znamenajú, že: 
— v prípade lampantového olivového oleja sa príslušné medzné hodnoty nemusia dodrža ť súčasne, 
— v prípade panenských olivových olejov je nedodržanie aspo ň jednej z týchto medzných hodnôt dôvodom na zmenu kategórie pri zachovaní zaradenia v kategórii panenských olivových olejov. 
(d) Kvalitatívne vlastnosti olivových olejov ozna čené dvoma hviezdi čkami (**) znamenajú, že pre všetky olivové oleje z olivových výliskov sa príslušné medzné hodnoty nemusia dodrža ť súčasne.
PRÍLOHA Ia  
ODBOR VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA A ZVYŠKOVÉHO 
OLIVOVÉHO OLEJA V PRIAMOM OBALE DO 100 LITROV  
Táto metóda odberu vzoriek sa uplat ňuje na dodávky olivového oleja alebo 
zvyškového olivového oleja nepresahujúce 125 000 litrov, umiestneného 
v priamom obale do 100 litrov.  
Ak dodávka prekra čuje 125 000 litrov, musí sa rozdeli ť na dávky v objeme 
najviac 125 000 litrov. Ak je dodávka menšia ako 125 000 litrov, tvorí jednu 
dávku. Táto metóda sa potom uplat ňuje na každú dávku.  
Minimálny po čet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobra ť, je určený na 
základe ve ľkosti dávky v súlade s tabu ľkou uvedenou v bode 1.  
Veľkosť primárnej vzorky je ur čená na základe objemu priameho obalu, pod ľa 
tabuľky uvedenej v bode 2.1.  
Termíny dodávka, primárna vzorka a laboratórna vzorka majú význam pod ľa 
definícií uvedených v norme EN ISO 5555.  
„Dávka“ znamená sadu predajných jednotiek, ktoré sa vytvárajú, vyrábajú 
a označujú v príslušných podmienkach tak, aby sa olej, nachádzajúci sa 
v konkrétnej predajnej jednotke mohol posudzova ť ako homogénny, pokia ľ ide 
o všetky analytické charakteristiky.  
1. POČET PRIMÁRNYCH VZORIEK NA ODBER  
Minimálny po čet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobra ť, je určený na 
základe ve ľkosti dávky v súlade s touto tabu ľkou:  
Veľkosť dávky (v litroch) menšia ako Minimálny po čet primárnych vzoriek  
7 500 2 
25 000 3 75 000 4 
125 000 5
 
Priame obaly vybrané na vytvorenie primárnej vzorky musia by ť v rámci 
dávky susediace.  
V prípade pochybnosti, členské štáty zvyšujú po čet primárnych vzoriek, 
ktoré sa majú odobra ť. 
2. OBSAH PRIMÁRNYCH VZORIEK  
2.1 Primárne vzorky musia obsahova ť: 
Pokiaľ má priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z:  
a) aspoň 5 litrov a) 3 priamych obalov 
b) aspoň 3 litre, ale menej ako 5 
litrov b) 3 priamych obalov 
c) aspoň 2 litre, ale menej ako 3 
litre c) 3 priamych obalov 
d) aspoň 1 liter, ale menej ako 2 
litre d) 6 priamych obalov 
e) aspoň 0,75 litra, ale menej ako 1 
liter e) 6 priamych obalov 
f) menej ako 0,75 litra f) trojnásobku množstva oleja 
z minimálneho po čtu obalov 
s celkovým objemom viac ako 
1,5 litra  ▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 13
 
2.2 Primárne vzorky sa do doby analýzy uchovávajú v priamych obaloch. 
Olej v primárnej vzorke sa potom ďalej rozde ľuje, pokia ľ je to možné, 
do troch laboratórnych vzoriek s cie ľom: 
a) analýz spomínaných v prílohách II, III, IX a X;  
b) analýz spomínaných v prílohách XII;  
c) iných analýz.  
2.3 Balenia, ktoré tvoria primárnu vzorku sa rozde ľujú na menšie časti 
v súlade s kontrolnými postupmi ustanovenými vo vnútroštátnych práv ­
nych predpisoch.  
3. ANALÝZA A VÝSLEDKY  
a) Každá primárna vzorka uvedená v bode 1 sa rozde ľuje do laboratórnych 
vzoriek v súlade s bodom 2.5 normy EN ISO 5555 a analyzuje takto:  
— určenie voľných mastných kyselín pod ľa prvej zarážky článku 2 
ods. 1,  
— určenie peroxidového čísla podľa druhej zarážky článku 2 ods. 1,  
— spektrofotometrická analýza pod ľa ôsmej zarážky článku 2 ods.1,  
— určenie skladby mastných kyselín pod ľa deviatej zarážky článku 2 
ods. 1.  
b) Pokiaľ jeden z výsledkov analýz, uvedených pod písmenom a, aspo ň na 
jednej primárnej vzorke odobratej z rovnakej dávky nie je v súlade 
s charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá príslušná dávka 
sa vyhlási za nevyhovujúcu.  
Pokiaľ výsledky analýz, uvedených pod písmenom a, na primárnych 
vzorkách z rovnakej dávky nie sú jednotné za predpokladu opakovate ľ­
nosti príslušných metód, celá dávka sa vyhlási za nejednotnú a všetky 
primárne vzorky sa podrobia ďalším požadovaným analýzam. 
V opačnom prípade sa ďalším analýzam podrobuje iba jedna primárna 
vzorka z dávky.  
c) Pokiaľ niektorý z výsledkov analýz, uvedených v druhom odseku 
písmena b, nie je v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, 
celá dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu.  
Pokiaľ všetky výsledky analýz, uvedených v druhom odseku písmena b, 
sú v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za vyhovujúcu.
 ▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 14
 
PRÍLOHA Ib  
ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY 
S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU  
Analýzu na overenie súladu olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja 
s deklarovanou kategóriou je možné vykona ť: 
a) buď vykonaním analýz ur čených na overenie súladu s charakteristikami stano ­
venými v prílohe I, a to v náhodnom poradí;  
b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib na rozhodovacom strome, 
až kým sa nedosiahne jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom 
strome.  
Analýzy týkajúce sa ne čistôt, požadované na overenie súladu s normami Európ ­
skeho spolo čenstva, sa vykonávajú samostatne.  
Rozhodovací strom sa uplat ňuje na všetky kategórie olivového oleja 
a zvyškového olivového oleja. Skladá sa z tabuliek o číslovaných od 1 do 11, 
ku ktorým sa musí pristupova ť na základe deklarovanej kategórie príslušného 
oleja v poradí stanovenom vo všeobecnej tabu ľke. 
Kľúč k všeobecným tabu ľkám 1 až 11:  
— dvojitá čiara (=) ukazuje cestu, po ktorej treba ís ť v prípade súladu (kladnej 
odpovede) s kritériami stanovenými v predchádzajúcom okienku. Bodkovaná 
čiara (…) nazna čuje alternatívnu cestu, ktorá sa má použi ť v prípade nesú ­
ladu,  
— položky v okienkach v tabu ľkách 1 až 11 sa vz ťahujú na analýzy stanovené 
v tomto nariadení na základe tabu ľky rovnocennosti stanovenej v doplnku 1 
k tejto prílohe,  
— písmená v zátvorkách nachádzajúce sa v kruhoch negatívneho rozhodnutia 
v tabuľkách 1 až 11 poskytujú krížovú referenciu na indikatívnu informáciu 
poskytnutú v doplnku 2 k tejto prílohe. Sami o sebe písmená neznamenajú 
nutnosť vykonáva ť analýzy alebo nazna čovať pravdivos ť uvedených pred ­
pokladov.  ▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 15
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 16
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 17
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 18
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 19
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 20
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 21
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 22
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 23
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 24
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 25
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 26
 
▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 27
 
Doplnok 1  
Tabuľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými 
v rozhodovacom strome  
▼M21  
– Acidita/kyslos ť Príloha II Stanovenie vo ľných mastných kyselín, 
studená metóda  
▼M20  
– Peroxidové číslo Príloha III Ur čenie peroxidového čísla 
– UF spektrometria Príloha IX Spektrofotometrická analýza – Organoleptické hodnotenie Príloha XII Organoleptické hodnotenie panenského 
olivového oleja 
– 3,5- stigmastadiény Príloha XVII Metóda ur čovania stigmastadiénov 
v rastlinných olejoch 
– Trans-izoméry mastných 
kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín 
plynovou chromatografiou 
Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín 
– Obsah mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín 
plynovou chromatografiou 
Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín 
– ΔECN42 Príloha XVIII Ur čenie skladby triglyceridov s ECN42 
(rozdiel medzi údajmi z HPLC a teoretickým obsahom) 
– Skladba sterolov a celkové 
steroly Príloha V Ur čenie skladby a obsahu sterolov 
plynovou chromatografiou s kapilárnou 
kolónou 
– Erytrodiol a uvaol Príloha VI Ur čenie erytrodiolu a uvaolu 
– Vosky Príloha IV Ur čenie obsahu voskov sterolov 
plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou 
– Alifatické alkoholy Príloha XIX Ur čenie obsahu alifatických alkoholov 
plynovou chromatografiou s kapilárnou 
kolónou
 
▼M21  
– Mastné kyseliny nasýtené 
v pozícii 2 Príloha VII Stanovenie percentuálneho obsahu 
2-glyceril monopalmitátu  ▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 28
 
Doplnok 2  
Tabuľka 1  
a) Pozri panenský alebo lampantový olivový olej (Kritériá kvality  Tabuľka 2  
alebo Kritériá kvality a čistoty  Tabuľka 4) 
b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty  Tabuľka 4) 
Tabuľka 2  
a) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty  Tabuľka 4) 
b) Pozri extra panenský olivový olej (Kritériá kvality  Tabuľka 1) 
Tabuľka 3  
a) Prítomnos ť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)  
b) Prítomnos ť zvyškového olivového oleja  
Tabuľka 4  
a) Pozri extra panenský alebo panenský olivový olej (Kritériá kvality  Tabuľka 1 
a Tabuľka 2) 
b) Prítomnos ť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)  
c) Prítomnos ť zvyškového olivového oleja  
d) Prítomnos ť esterifikovaných olejov  
Tabuľka 7  
a) Prítomnos ť zvyškového olivového oleja  
b) Prítomnos ť esterifikovaných olejov  
Tabuľka 8  
a) Prítomnos ť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)  
b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty  Tabuľka 4) 
c) Prítomnos ť esterifikovaných olejov  
Tabuľka 11  
a) Prítomnos ť esterifikovaných olejov  ▼M20  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 29
 
PRÍLOHA II  
▼M21  
STANOVENIE VO ĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN, STUDENÁ METÓDA  
▼B 
1. STANOVENIE KYSLOSTI  
Stanovenie vo ľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah 
voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslos ť vypočítaná obvyklým 
spôsobom.  
1.1. Princíp  
Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpúš ťadiel a prítomné vo ľné mastné kyse ­
liny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.  
1.2. Činidlá  
Všetky činidlá (reagenty) by mali by ť schválenej analytickej kvality 
a mala by sa použi ť buď destilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.  
1.2.1. Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov.  
Poznámka:  Dietyléter je vysoko hor ľavý a môže tvori ť výbušné peroxidy. 
Je potrebné s ním narába ť opatrne.  
Počas použitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2), na 
100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3).  
Poznámka:  Ak sa nedá použi ť dietyléter, je ho možné nahradi ť zmesou 
rozpúšťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné, 
etanol môžete nahradi ť 2-propanolom(izo-propanolom).  
1.2.2. Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) približne 0,01 
mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) približne 0,5 mol/l.  
Musí byť známa presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju 
skontrolova ť bezprostredne pred použitím. Používajte roztok pripravený 
najmenej pä ť dní pred termínom použitia, uschovaný v tmavej sklenenej 
fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal by ť bezfarebný alebo vo farbe 
slamy.  
Poznámka:  Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného 
je možné pripravi ť nasledovne. Prive ďte do varu 1 000 ml 
etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblín a nechajte vrie ť pod spätným chladi čom po dobu 
jednej hodiny. Ihne ď oddestilujte. V destiláte rozpustite poža ­
dované množstvo hydroxidu draselného. Nechajte nieko ľko 
dní odstá ť a zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhli či­
tanu draselného.
 
Roztok môže by ť rovnako pripravený aj bez destilácie a to 
nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium 
butylate“ a nechajte zmes odleža ť na nieko ľko dní. Odlejte 
tekutý supernatant a rozpustite požadované množstvo hydro ­
xidu draselného. Roztok je pripravený na použitie.  
1.2.3. Fenolftaleín, 10 g/l rozpusti ť v 95 až 96 % etanole (v/v) alebo alkalická 
modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpusti ť v 95 až 96 % 
etanole (v/v).  
1.3. Prístrojové vybavenie  
Bežné laboratórne vybavenie zah ŕňajúce:  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 30
 
1.3.1. analytické váhy;  
1.3.2. 250 ml kónickú banku;  
1.3.3. 10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.  
1.4. Postup  
1.4.1. Príprava vzorky na testovanie  
(Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a ne čistôt 
spolu menší ako 1 %, vzorku použite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje 
1 %, je potrebné vzorku prefiltrova ť.) 
1.4.2. Odoberanie vzorky (vzorkovanie)  
Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade 
s nasledujúcou tabu ľkou:  
Predpokladané číslo 
kyslosti Hmotnosť vzorky 
(g) Presnosť váženia 
(g) 
< 1 20 0,05 
1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 
15 až 75 0,5 0,001 
> 75 0,1 0,0002
 
Vzorku odvážte v kónickej banke (1.3.2).  
1.4.3. Stanovenie  
Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 až 150 ml predtým zneutralizovanej zmesi 
dietyléteru a etanolu (1.2.1).  
Titrujte po čas zmiešania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného 
(1.2.2) (pozri pozn. 2) až do zmeny zafarbenia indikátora (ružová farba fenolftaleínu vydrží aspo ň 10 sekúnd).
 
Poznámka 1.  Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je 
možné nahradi ť vodným roztokom hydroxidu draselného 
alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody nevyvolá rozdelenie fáz.
 
Poznámka 2.  Ak spotrebované množstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu 
draselného presiahne 10 ml, použite 0,5 ml/l roztok.  
Poznámka 3.  Ak sa roztok po čas titrácie zakalí, pridajte dostato čné množ­
stvo rozpúš ťadiel (1.2.1), aby sa roztok vy číril. 
1.5. Kyslos ť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej  
Kyslosť vyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:  
V Ü c Ü M 
1000 Ü 100 
m ¼ V Ü c Ü M 
10 Ü m ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 31
 
kde: 
V = objem použitého titra čného roztoku hydroxidu draselného, v ml;  
c = presná koncentrácia použitého titra čného roztoku hydroxidu drasel ­
ného v mol/l;  
M = mólová hmotnos ť v g/mol kyseliny použitej na vyjadrenie výsledku 
(M =282 g/mol);  
m = hmotnos ť vzorky v g.  
Za výsledok sa považuje aritmetický  ►M6 dvoch výpo čtov ◄ stanovení.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 32
 
PRÍLOHA III  
STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA  
1. OBLAS Ť 
Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla 
v olejoch a tukoch.  
2. POUŽITIE  
Táto technická norma sa vz ťahuje na živo číšne a rastlinné oleje a tuky.  
3. DEFINÍCIA  
Peroxidové číslo je množstvo tých zložiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené 
ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodid 
draselný za uvedených prevádzkových podmienok.  
4. PRINCÍP  
Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časť vzorky, kyselina octová 
a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvo ľneného jódu štan ­
dardizovaným roztokom tiosíranu sodného.  
5. PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE  
Všetky použité prístroje nesmú obsahova ť redukujúce alebo oxidujúce látky.  
Poznámka:  Nemastite zábrusové povrchy.  
5.1. 3 ml sklenená navažovacia lodi čka 
5.2. Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, približne 250 ml objemu, pred ­
sušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokia ľ 
možno, oxidom uhli čitým).  
5.3. 25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml  
6. ČINIDLÁ  
6.1. Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého 
inertného plynu  
6.2. Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom 
čistého, suchého inertného plynu  
6.3. Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód 
a jodičnany  
6.4. Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný 
vodný roztok, štandardizovaný tesne pred použitím  
6.5. Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l, čerstvo pripravená 
z prírodného rozpustného škrobu  
7. VZORKA  
Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla, 
udržiavajte ju v chlade a v úplne (až povrch) naplnených sklenených zásob ­
níkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými 
zátkami.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 33
 
8. POSTUP  
Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle. 
V sklenenej navažova čke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvážte 
s presnos ťou na 0,001 g množstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabu ľkou 
a podľa predpokladaného peroxidového čísla:  
Predpokladané peroxidové číslo 
(meq) Hmotnosť navážky 
(g) 
0 až 12 5,0 až 2,0 
12 až 20 2,0 až 1,2 
20 až 30 1,2 až 0,8 
30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3
 
Odzátkujte banku (5.2) a vložte sklenenú navažova čku s odváženou časťou 
testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Miešaním rýchlo 
rozpustite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútu a nechajte 5 minú ť stáť v tme pri teplote 15 až 25
 o C. 
Pridajte približne 75 ml destilovanej vody. Uvo ľnený jód stitrujte roztokom 
tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty 
nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vyššie ako 
12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor použite roztok škrobu.  
Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.  
Zároveň vykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekro čí 
0,05 ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vyme ňte znečistené 
činidlá.  
9. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka na 
kilogram, sa udáva pod ľa vzorca:  
PV ¼ V Ü T Ü 1000 
m 
kde: 
V = objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného 
(6.4), použitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;  
T = presná molarita použitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);  
m = hmotnos ť navážky vzorky, v (g).  
Za výsledok sa bude považova ť aritmetický priemer z dvoch výpo čtov. ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 34
 
PRÍLOHA IV  
STANOVENIE OBSAHU VOSKOV POMOCOU KAPILÁRNEJ 
PLYNOVEJ CHROMATOGRAFIE  
1. PREDMET  
Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu voskov v olivových 
olejoch. Vosky sa separujú v závislosti od po čtu atómov uhlíka. Môže 
sa používa ť najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným liso ­
vaním a olejom získaným extrakciou (olej z výliskov).  
2. PRINCÍP  
Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frak ­
cionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie 
frakcie eluovanej pri testovacích podmienkach ako prvej (ktorej polarita je nižšia ako polarita frakcie triglyceridov), potom priama analýza kapilárnou plynovou chromatografiou.
 
3. MATERIÁL  
3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka.  
3.2. Sklená kolóna na plynovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 
15,0 mm, výškou 30 až 40 cm a vybavená kohútikom.  
3.3. Plynový chromatograf vhodný na fungovanie s kapilárnou kolónou, vyba ­
vený systémom na priame zavádzanie do kolóny s týmito zložkami:  
3.3.1. Termostatická komora pre kolóny, vybavená teplotným programátorom.  
3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny.  
3.3.3. Plame ňovoioniza čný detektor a prevodník-zosil ňovač. 
3.3.4. Zapisova č-integrátor schopný pracova ť s prevodníkom-zosil ňovačom 
(3.3.3), rýchlos ť odozvy nižšia ako 1 sekunda, s menite ľnou rýchlos ťou 
posunu papiera. (Takisto je možné používa ť informatizované systémy, 
ktoré sú založené na získaní údajov z plynovej chromatografie prostred ­
níctvom osobného po čítača). 
3.3.5. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s d ĺžkou 8 až 12 metrov, 
vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá 
kvapalnou fázou, s rovnomernou hrúbkou 0,10 – 0,30 μm. (Kvapalné 
fázy vhodné na použitie, v obchodnej sieti ako typ SE52 alebo SE54).  
3.4. Mikrostrieka čka s kapacitou 10 μl na priamy nástrek do kolóny, vybavená 
cementovanou ihlou.  
3.5. Elektrický vibrátor.  
3.6. Rota čná odparka.  
3.7. Muf ľová pec.  
3.8. Analytické váhy s garantovanou presnos ťou merania na ± 0,1 mg.  
3.9. Bežné laboratórne sklené pomôcky.  
4. CHEMICKÉ ČINIDLÁ  
4.1. Silikagél s granulometriou medzi 60 a 200 μm. 
Silikagél vložte do pece aspo ň na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Po 
vychladnutí pridajte 2 % vody vzh ľadom na množstvo odobraného silika ­
gélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala. Najmenej 12 hodín 
pred použitím uchovávajte v tme.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 35
 
4.2. n-hexán na chromatografiu.  
4.3. Etyléter na chromatografiu.  
4.4. n-heptán na chromatografiu.  
4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný 
štandard). [ Je tiež možné použi ť palmityl-palmitát (hexadecyl-palmitát) 
alebo myristyl-stearát (teradecyl-oktadekanoát) ]. 
4.5.1.  Sudán 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).  
4.6. Nosný plyn: vodík alebo čisté hélium na plynovú chromatografiu.  
4.7. Pomocné plyny:  
— čistý vodík na plynovoú chromatografiu,  
— čistý vzduch na plynovú chromatografiu.  
5. POSTUP  
5.1. Príprava chromatografickej kolóny  
Suspenzujte 15 g silikagélu (4.1) v n-hexáne (4.2) a zave ďte do kolóny 
(3.2). Spontánne usadzovanie dokon čite pomocou elektrickej trepa čky 
(3.5) s cie ľom dosiahnu ť homogénnejšiu chromatografickú vrstvu. Perko ­
lujte 30 ml n-hexánu s cie ľom eliminova ť všetky prípadné ne čistoty. 
Presne odvážte pomocou váh (3.8). Vložte 500 mg vzorky do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1), pridajte primerané množstvo vnútorného 
štandardu (4.5) vzh ľadom na predpokladaný obsah voskov. Napríklad: 
v prípade olivového oleja pridajte 0,1 mg laurylarašidátu a v prípade oleja z olivových výliskov 0,25 až 0,5 mg. Takto pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny s pomocou dvoch 2 ml dielov 
n-hexánu (4.2).
 
Napustite rozpúš ťadlo až do výšky 1 mm nad hornú úrove ň absorbentu, 
potom perkolujte ďalších 70 ml n-hexánu, aby sa eliminovali prirodzene 
prítomné n-alkány. Za čnite chromatografickú elúciu zozbieraním 180 ml 
zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri zachovaní prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. Elúcia vzorky sa má uskuto čniť pri 
okolitej teplote 22 °C ± 4 °C.
 
Poznámky: —  Zmes n-hexánu/etyléteru (99:1) sa musí pripravova ť 
denne.  
— Na umožnenie vizuálnej kontroly správnej elúcie voskov 
je možné prida ť do vzorky roztoku 100 μl 1 %-ného 
sudánu v elu čnej zmesi. Farbivo má retenciu na rozhraní 
voskov a triglyceridov, preto ke ď zafarbenie dosiahne dno 
chromatografickej kolóny, je potrebné elúciu zastavi ť, lebo 
všetky vosky boli eluované.  
Takto získanú frakciu sušte v rota čnej odparke (3.6) až do takmer úplnej 
eliminácie rozpúš ťadla. Posledné 2 ml rozpúš ťadla eliminujte pomocou 
slabého prúdu azotu; potom pridajte 2 – 4 ml n-heptánu.  
5.2. Analýza plynovou chromatografiou  
5.2.1.  Predbežné úkony  
Namontujte kolónu do plynového chromatografu (3.3), pri čom vstupný 
port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skon ­
trolujte bežným spôsobom prístrojové vybavenie na plynovú chromato ­
grafiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, ú činnosť detektora 
a zapisova ča atď.). ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 36
 
Pokiaľ sa kolóna používa po prvý raz, je potrebné ju kondicionova ť. 
Zaveďte do kolóny mierny prietok plynu, potom zapnite prístroj na 
plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 hodinách dosiahne teplota 350 °C. Túto teplotu udržiavajte najmenej počas dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky 
[nastavte prietok plynu, zapá ľte plamienok, pripojte k elektrickému zapi ­
sovaču (3.3.4), nastavte teplotu komory pre kolónu, nastavte detektor 
atď.]. Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej, ako sa 
vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí by ť lineárna, nesmie 
obsahova ť píky akéhoko ľvek druhu a nesmie vykazova ť žiadnu odchýlku.
 
Negatívna priamo čiara odchýlka ukazuje, že kolóna je nesprávne pripo ­
jená; pozitívna odchýlka znamená, že kolóna nebola dostato čne kondicio ­
novaná.  
5.2.2.  Voľba prevádzkových podmienok  
Prevádzkové podmienky, ktoré treba pozorova ť, sú spravidla tieto:  
— teplota kolóny: 
20 °C/ 
minúta 5 °C/ 
minúta 20 °C/ 
minúta 
na 
začiatku 
80 °C 
(1′) → 240 °C → 325 °C 
(6′) → 340 °C 
(10′) 
— teplota detektora: 350 °C,  
— množstvo vstreknutej látky: 1 μl roztoku (2 – 4 ml) n-heptánu,  
— nosný plyn: hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlos ťou pre 
zvolený plyn (pozri dodatok),  
— citlivos ť prístroja: taká, aby zodpovedala nižšie uvedeným 
podmienkam:  
Uvedené podmienky môžu by ť upravené v závislosti od vlastností kolóny 
a prístroja na plynovú chromatografiu tak, aby sa dosiahla separácia všet ­
kých voskov, posta čujúce rozlíšenie píkov (pozri obrázok) a reten čný čas 
vnútorného štandardu C  32 bol 18 ± 3 minúty. Najreprezentatívnejší pík 
vosku by mal dosahova ť aspoň 60 % rozsahu stupnice.  
Parametre integrácie píkov sa stanovia takým spôsobom, aby sa dosiahlo 
správne vyhodnotenie príslušných plôch píkov.  
Poznámka:  Vzhľadom na vysokú kone čnú teplotu sa pripúš ťa kladná 
odchýlka, ktorá nesmie prekro čiť 10 % rozsahu stupnice.  
5.3. Vykonanie analýzy  
Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostrieka čky; natiahnite piestik 
dozadu, až kým ihla nebude prázdna. Ihlu zave ďte do injek čného systému 
a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd rýchlo vstreknite; po uplynutí asi piatich sekúnd ihlu pomaly vytiahnite.
 
Záznam nechajte prebieha ť dovtedy, až kým neprebehne úplná elúcia 
voskov.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 37
 
Základná čiara musí vždy zodpoveda ť požadovaným podmienkam.  
5.4. Identifikácia píkov  
Jednotlivé píky identifikujte z reten čných časov a porovnaním so zmesami 
voskov so známymi reten čnými časmi, analyzovanými pri rovnakých 
podmienkach.  
Na obrázku je znázornený chromatogram voskov panenského olivového 
oleja.  
5.5. Kvantitatívne hodnotenie  
Integrátorom vypo čítajte plochy píkov interného štandardu a alifatických 
esterov od C  40 do C  46 . 
Vypočítajte obsah voskov každého esteru v mg/kg tuku pod ľa príslušného 
vzorca: 
ester ; mg =kg ¼ A x Ü m s Ü 1000 
A s Ü m 
kde: 
A x = plocha píku každého esteru v milimetroch štvorcových;  
A s = plocha píku vnútorného štandardu v milimetroch štvorcových,  
m s = množstvo pridaného vnútorného štandardu v miligramoch;  
m = množstvo vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
Uveďte celkové obsahy jednotlivých voskov od C  40 do C  46 v mg/kg tuku 
(ppm).  
Poznámka:  Zložky, ktoré treba kvantifikova ť, sa stanovujú vzh ľadom na 
susediace píky esterov s po čtom uhlíkov medzi C  40 a C  46 
podľa príkladu chromatogramu voskov olivového oleja 
znázorneného na nasledujúcom obrázku. Ak sa ester C  46 
ukáže dvojmo, odporú ča sa analyzova ť na jeho identifikáciu 
frakciu voskov oleja z olivových výliskov, v ktorom je pík 
esteru C  46 ľahko identifikovate ľný, pretože výrazne prevažuje.  
Výsledky sa uvádzajú na jedno desatinné miesto.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 38
 
Obrázok  
Chromatogram voskov istého olivového oleja  ( 1 )
 
Vysvetlivky : 
I.S. = laurylarašidát  
1. = diterpénové estery  
2 + 2′ = estery C  40 
3 + 3′ = estery C  42 
4 + 4′ = estery C  44 
5. = estery C  46 
6. = sterol-estery a triterpénový alkohol.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 39  
( 1 ) Po elúcii sterol-esterov sa na chromatografickom zázname nemajú ukáza ť výrazné píky (triglyceridy).
 Dodatok  
Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu  
Vstreknite do prístroja na plynovú chromatografiu nastaveného na bežné prevá ­
dzkové podmienky 1 až 3 μl metánu (alebo propánu). Odmerajte čas, ktorý 
potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho zavedenia až dovtedy, kým sa neobjaví pík (t
 M ). 
Lineárna rýchlos ť v cm/sek je daná vzorcom L/t  M , pričom L je d ĺžka kolóny 
v cm a t  M je čas nameraný v sekundách.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 40
 
PRÍLOHA V  
STANOVENIE ZLOŽENIA A OBSAHU STEROLOV PLYNOVOU 
CHROMATOHRAFIOU NA KAPILÁRNYCH KOLÓNACH  
1. OBLAS Ť 
Metóda opisuje postup stanovenia obsahu jednotlivých sterolov 
a celkového obsahu sterolov v tukoch.  
2. PRINCÍP METÓDY  
Tuk s pridaným α — cholesterolom ako vnútorným štandardom, je 
zmydelnený etanolickým roztokom hydroxidu draselného a látky nepod ­
liehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.  
Sterolová frakcia sa chromatografiou na silikagélových platniach oddelí 
od extraktu nezmydelite ľných látok. Steroly získané zo silikagélu sa 
prevedú na trimetylsilylétery a analyzujú sa metódou plynovej chroma ­
tografie na kapilárnych kolónach.  
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE  
3.1. 250 ml banka s gu ľatým dnom so spätným chladi čom a zábrusovými 
spojkami  
3.2. 500 ml odde ľovacie lieviky.  
3.3. 250 ml banky  
3.4. Kompletné zariadenie na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou, 
používajúca sklenené platne rozmerov 20 × 20 cm  
3.5. UV lampa s vlnovou d ĺžkou 366 alebo 254 nm, na skúmanie TLC platní  
3.6. 100 μl a 500 μl mikrostrieka čky 
3.7. Valcovitý filtra čný lievik s G3 poréznou fritou (pórozita 15-40 μm) 
s priemerom približne 2 cm a výškou 5 cm, s pripojením vhodným na vákuovú filtráciu a s vonkajším zábrusom 12/21
 
3.8. 50 ml vákuová banka s 12/21 skleneným vnútorným zábrusom na 
použitie s filtra čným lievikom (3.7)  
3.9. 10 ml skúmavka s kónickým dnom a tesniacou zátkou  
3.10. Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vyba ­
vený deliacim systémom pozostávajúci z:  
3.10.1. termostatickej komory pre kolóny (kolónová pec), ktorá udrží požado ­
vanú teplotu presnos ťou na ± 1  o C; 
3.10.2. teplotne nastavite ľnej splyňovacej jednotky (nástrek) so silanizovaným 
skleneným sply ňovacím elementom (linerom);  
3.10.3. plame ňovoioniza čného detektora a konvertora — zosil ňovača; 
3.10.4. zapisova ča — integrátora pre operácie s prevodníkom — zosil ňovačom 
(3.10.3), s časovou odozvou nepresahujúcou jednu sekundu a s rôznymi 
rýchlosťami posunu papiera.  
3.11. Kapilárna kolóna sklenená alebo z taveného kreme ňa, dĺžky 20-30 m, 
o vnútornom priemere 0,25 až 0.32 mm, s kvapalnou fázou SE-52 alebo 
SE-54 alebo inou ekvivalentnou fázou, s hrúbkou filmu medzi 0,10 
a 0,30 μm 
3.12. Mikrostrieka čka na plynovú chromatografiu, s objemom 10 μl a s 
vytvrdenou ihlou  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 41
 
4. ČINIDLÁ  
4.1. Hydroxid draselný; približne 2 mol/l etanolický roztok: 130 g hydroxidu 
draselného (minimálna koncentrácia 85 %) sa rozpustí za chladenia 
v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom do objemu 1 litra. Roztok by sa mal skladova ť v dobre uzatvorenej f ľaši z tmavého skla.
 
4.2. Dietyléter, čistý na analýzu  
4.3. Bezvodý tiosíran sodný, čistý na analýzu  
4.4. Silikagélové TLC sklenené platne, bez fluorescen čného detektora, hrúbky 
0,25 mm (na komer čné použitie, vhodné na okamžité použitie)  
4.5. Hydroxid draselný, približne 0,2 2 mol/l etanolický roztok; 
13 g hydroxidu draselného sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a 
doplní sa do etanolom do objemu 1 litra.  
4.6. Benzén, na chromatografiu (pozri 5.2.2)  
4.7. Acetón, na chromatografiu (pozri 5.2.2)  
4.8. Hexán, na chromatografiu (pozri 5.2.2)  
4.9. Dietyléter, na chromatografiu (pozri 5.2.2)  
4.10. Chloroform, na chromatografiu  
4.11. Referen čný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: zmes cholesterol 
alebo fytosteroly,  ►M6 2 % ◄ roztok v chloroforme  
4.12. 2,7 — dichlórfluoresceín, 0,2 % etanolický roztok. Slabo alkalický 
roztok získame pridaním nieko ľkých kvapiek 2 N roztoku hydroxidu 
draselného.  
4.13. Bezvodý pyridín; na chromatografiu  
4.14. Hexametyldisilazán  
4.15. Trimetylchlórsilán  
4.16. Referen čný roztok trimetylsilylových éterov sterolu. Pripraví sa priamo 
pred použitím z čistých sterolov získaných z olejov, ktoré ho obsahujú.  
4.17. α — cholestanol, 0,2 % roztok (m/V) v chloroforme (vnútorný štandard)  
4.18. Nosný plyn: vodík a hélium, čistoty na plynovú chromatografiu  
4.19. Pomocné plyny:  
— vodík, čistoty na plynovú chromatografiu,  
— vzduch, čistoty na plynovú chromatografiu.  
5. POSTUP  
5.1. Príprava látky nepodliehajúcej zmydelneniu.  
5.1.1. Do 250 ml destila čnej banky dajte pomocou 500 μl mikrostrieka čky taký 
objem 0,2 % roztoku α — cholestanolu v chloroforme (4.17), obsahujú ­
ceho množstvo α — cholestanolu zodpovedajúcemu približne 10 % 
obsahu sterolu v alikvotnej čiastke vzorky, ktorá sa odobrala na analýzu. 
Napr. k 5 g vzorky pridajte 500 μl 0,2 % roztoku α– cholestanolu, ak sa 
analyzuje olivový olej alebo olej zo semien, a 1 500 μl, ak sa jedná 
o rastlinný  ►M6 __________  ◄olej z olivových výliskov.  
Odparte dosucha pod prúdom dusíka a potom do tej istej banky privážte 
5 g suchej prefiltrovanej vzorky.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 42
 
►M6 Oleje ◄ s obsahom zistite ľných množstiev cholesterolu môžu 
vykazova ť píky s reten čným časom identickým s cholestanolom. Pokia ľ 
sa tak stane, sterolová frakcia by sa mala opakovane analyzova ť s alebo 
bez vnútorného štandardu  ►M6 alebo sa namiesto cholestanolu bude 
musieť použiť betulinol ◄. 
5.1.2. Pridajte 50 ml 2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného, 
nasaďte spätný chladi č a zariadenie zahrievajte vo vodnom kúpeli do 
mierneho varu a za stáleho silného miešania, až kým sa zmydel ňovanie 
neukončí (roztok sa vy číri). Zahrievajte ešte ďalších 20 minút a potom 
cez spätný chladi č prilejte 50 ml destilovanej vody, spätný chladi č 
odpojte a banku ochla ďte na teplotu približne 30  o C. 
5.1.3. Obsah banky kvantitatívne preneste do 500 ml odde ľovacieho lievika 
pomocou viacnásobného opláchnutia destilovanou vodou (celkovo sa jej použije asi 50 ml). Pridajte približne 80 ml dietyléteru, všetko riadne 
pretrepávajte 30 sekúnd a potom nechajte usadi ť (pozn.1).
 
Oddeľte spodnú vodnú vrstvu do druhého odde ľovacieho lievika. 
Rovnakým spôsobom vykonáme dve ďalšie extrakcie z vodnej fázy, 
pri každej sa použije 60-70 ml dietyléteru.  
Poznámka 1.  Akákoľvek emulzia sa dá odstráni ť pridaním malých množ ­
stiev etyl- alebo metylalkoholu vo forme spreja.  
5.1.4. Vložte dietyléterové extrakty do jedného odde ľovacieho lievika 
a prepierajte destilovanou vodou (50 ml každý raz), až kým voda nevy ­
kazuje neutrálnu reakciu.  
Odstráňte vypieraciu vodu, zostávajúcu vrstvu vysušte bezvodým tiosí ­
ranom sodným a prefiltrujte cez bezvodý tiosíran sodný do predtým odváženej 250 ml banky, lievik a filter opláchnite malým množstvom 
dietyléteru.
 
5.1.5. Oddestilujte éter na nieko ľko ml a potom pod slabým vákuom alebo pod 
prúdom dusíka vysušte, sušenie dokon čite v suši čke pri 100  o C asi 
štvrťhodinu a zvyšok odvážte po ochladení v exsikátore.  
5.2. Oddelenie sterolovej frakcie  
5.2.1. Príprava základných platní. Silikagélové platne (4.4.) úplne ponorte na 
10 sekúnd do 0,2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného (4.5) a potom ich nechajte dve hodiny suši ť v digestóriu a nakoniec ich 
dosušte v suši čke jednu hodinu pri teplote 100
 o C. 
Vyberte platne zo suši čky a uložte ich až do ďalšieho použitia do exsi ­
kátora s chloridom vápenatým (takto ošetrené platne sa musia použi ť do 
dvoch týžd ňov). 
Poznámka 2.  Ak sa na separáciu sterolovej frakcie použijú základné 
silikagélové platne, látky, ktoré nepodliehajú zmydelneniu, 
nie je potrebné upravova ť oxidom hlinitým. Takýmto 
spôsobom sa všetky zlú čeniny kyslého charakteru zložky 
(mastné kyseliny a iné) zachytia na za čiatku a skupina 
sterolov sa zrete ľne oddelí od skupiny alifatických 
a triterpénových alkoholov.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 43
 
5.2.2. Zmes benzénu a acetónu v pomere objemov 95:5 (v/v) vložte do vyví ­
jacej komory v hrúbke vrstvy cca 1 cm. Alternatívne je možné použi ť 
zmes hexán/dietyléter v pomere objemov 65:35 hexánu. Komoru uzat ­
vorte vhodným krytom a nechajte ju stá ť asi pol hodiny, aby sa ustálila 
rovnováha medzi parami a kvapalinou. Na vnútorné steny komory sa 
môžu pripevni ť pásy filtra čného papiera namo čené vo vyvíjacej zmesi, 
čím sa skráti čas vyvíjania asi o jednu tretinu a získa sa rovnomernejšia 
a pravidelnejšia elúcia zložiek.  
Poznámka 3.  Po každej analýze sa musí vymeni ť vyvíjací roztok, aby sa 
úplne zabezpe čili reprodukovate ľné podmienky vyvíjania.  
5.2.3. V chloroforme pripravte približne 5 % roztok látok nepodliehajúcich 
zmydelneniu (5.1.5.) a pomocou 100 μl mikrostrieka čky naneste na chro ­
matografickú plat ňu 0,3 ml roztoku v rovnomernom pásiku minimálnej 
hrúbky, približne 2 cm od spodku platne. V línii s pásikom naneste 2 až 
3 μl referenčného roztoku sterolov (4.11) na jeden koniec tak, že stero ­
lová skupina môže by ť po vyvolaní identifikovaná.  
5.2.4. Umiestnite plat ňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa 
uvádza v bode 5.2.2. Udržujte izbovú teplotu v rozmedzí 15 až 20  o C. 
Komoru ihne ď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluova ť, kým čelo 
rozpúšťadla nedosiahne vzdialenos ť približne 1 cm od hornej hrany 
platne. Potom plat ňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúš ťadlo odparte 
prúdom horúceho vzduchu alebo dosku nechajte krátko prikrytú krytom.  
5.2.5. Plat ňu mierne a pravidelne postriekajte roztokom 2,7- dichlórfluores ­
ceínu. Ke ď sa platňa pozoruje pod ultrafialovým svetlom, sterolová 
skupina sa dá identifikova ť podľa škvŕn získaných z referen čného 
roztoku, zoskupených v rade. Ozna čte hranice skupiny čiernou ceruzkou 
pozdĺž okrajov fluorescencie.  
5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) zoškrabte silikagél z ozna čenej 
plochy. Umiestnite jemne rozotretý materiál do filtra čného lievika (3.7). 
Pridajte 10 ml horúceho chloroformu, opatrne premiešajte kovovou kopistkou a prefiltrujte za vákua, filtrát pozbierajte do banky (3.8), pripo ­
jenej k filtra čnému lieviku.
 
Spláchnite zvyšok v lieviku dietyléterom (asi 10 ml každý raz), zbierajte 
filtrát do tej jednej banky pripojenej k filtra čnému lieviku. Odparte filtrát 
na objem 4 až 5 ml a zvyšný roztok prelejte do vopred odváženej 10 ml skúmavky (3.9), odparte dosucha stredným zahrievaním pod slabým 
prúdom dusíka, znovu rozpustite v nieko ľkých kvapkách acetónu, opä ť 
odparte, na 10 minút vložte do suši čky pri teplote 105
 o C a nechajte 
ochladiť v exsikátore a odvážte.  
Zvyšok vo vnútri skúmavky pozostáva zo sterolovej frakcie.  
5.3. Príprava trimetylsilylových esterov  
5.3.1. Pridajte silaniza čné činidlo, pozostávajúce zo zmesi objemov 9.3.1 (v/ ­
v/v) pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylsilánu (pozn.4) v pomere 50 μl 
na každý miligram sterolov, do skúmavky obsahujúcej sterolovú frakciu tak, aby sa zabránilo akejko ľvek absorpcii vlhkosti (pozn.5).
 
Poznámka 4.  Roztoky na priame použitie sú dostupné v obchodnej sieti. 
Prípustné sú tiež silaniza čné činidlá, ako napr. bis-trime ­
tylsilyl, triflúoroacetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktoré sa 
riedia rovnakým objemom bezvodého pyridínu.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 44
 
5.3.2. Skúmavku zazátkujte a opatrne pretrepávajte bez pretá čania, až kým nie 
sú steroly úplne rozpustené. Potom nechajte skúmavku stá ť aspoň 15 
minút pri izbovej teplote a následne nieko ľko minút odstre ďujte. Číry 
roztok je pripravený na plynovú chromatografickú analýzu.  
Poznámka 5.  Možný vznik slabej opalescencie je bežný a nespôsobuje 
žiadne interferencie. Vznik bielych vlo čiek alebo obja ­
venie sa ružového zafarbenia sú znaky prítomnosti alebo znečistenia činidla. V takomto prípade je potrebné test 
zopakova ť.
 
5.4. Plynovochromatografická analýza  
5.4.1. Prípravné postupy a kondiciovanie kolón  
5.4.1.1. Kapilárna kolóna sa zachytí vo vnútri plynového chromatografu, pripojte 
vstup kolóny na odparova č, ktorý je spojený s deliacim systémom 
a výstup kolóny na detektor.  
Vykonajte celkovú kontrolu plynového chromatografu (netesnos ť 
v plynových okruhu, výkonnos ť detektora, výkonnos ť deliaceho systému 
a zapisova ča, atď.). 
5.4.1.2. Kapilárnu kolónu, ktorá ešte nebola použitá, je potrebné kondiciova ť. 
Nastavte malý prietok nosného plynu cez kapilárnu kolónu a potom 
zapnite plynový chromatograf, postupne vyhrievajte, až kým nedosiah ­
nete teplotu minimálne 20  o C nad pracovnú teplotu (pozn. 6). Udržujte 
túto teplotu aspo ň dve hodiny a potom sa zariadenie nastaví na pracovný 
chod [nastavenie prietokov plynov a deliaceho pomeru (odfuku), zapá ­
lenie plame ňa, pripojenie na elektronický zapisova č, nastavenie teploty 
termostatu, detektora a nástreku, at ď.] a potom zosnímajte signál pri 
citlivosti aspo ň dvojnásobne vyššej ako pri analýze. Základná línia má 
byť lineárna, bez špi čiek akéhoko ľvek pôvodu, a nemala by vykazova ť 
žiadne znaky výkyvov (driftov).  
Negatívny priamo čiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnos ť 
kolónových spojov, kým pozitívny driftv indikuje nedostato čné kondi­
ciovanie kolóny.  
Poznámka 6.  Teplota kondiciovania má by ť aspoň o 20  o C nižšia, ako je 
maximálna pracovná teplota predpokladaná na používanú kvapalnú fázu.
 
5.4.2. Výber pracovných podmienok  
5.4.2.1. Hlavné pracovné podmienky sú nasledujúce:  
— teplota kolóny: 260  o C ± 5  o C 
— teplota odparova ča: 280  o C, 
— teplota detektora: 290  o C, 
— lineárna rýchlos ť nosného plynu: hélium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 
50 cm/s,  
— deliaci pomer: 1: 50 a 1: 100,  
— citlivos ť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho zoslabenia,  
— rozsah zapisova ča: 1 až 2 mV na celý rozsah (celá škála — fs),  
— rýchlos ť posunu papiera: 30 až 60 cm/h,  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 45
 
— množstvo dávkovanej látky: 0,5 až 1 μl TMSE roztoku.  
Tieto podmienky sa môžu líši ť podľa vlastností kolóny a plynového 
chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy sp ĺňajúce nasledujúce 
podmienky:  
— retenčný čas ß — sitosterolu má by ť 20 ± 5 minút,  
— vrchol (pík) kampasterolu má by ť: pre olivový olej (priemerný obsah 
3 %) 15 ± 5 % hodnoty celkového rozsahu; pre sójový olej (prie ­
merný obsah 20 %) 80 ± 10 % hodnoty celkového rozsahu,  
— všetky prítomné steroly musia by ť rozdelené. Okrem toho, aby sa 
píky mohli rozdeli ť, musia by ť úplne rozlíšené, t. j. stopový pík by 
sa mal vráti ť na základnú líniu pred vylúhovaním ďalšieho píku. 
Neúplné rozlíšenie je avšak tolerované, ale s podmienkou, že pík 
v TRR 1,02 je možné kvantifikova ť použitím kolmice  
5.4.3. Vykonanie analýzy  
5.4.3.1. Do 10 μl mikrostrieka čky natiahnite 1 μl hexánu, potom natiahnite 0,5 μl 
vzduchu a následne 0,5 až 1 μl roztoku vzorky. Vytiahnite piest mikro ­
striekačky tak, aby bola ihla prázdna. Ihlu zave ďte cez septum (tesnenie) 
do dávkovacieho zariadenia (nástreku) a po jednej až dvoch sekundách 
roztok rýchlo nadávkujte a ihlu približne po piatich sekundách pomaly vytiahnite.
 
5.4.3.2. Pokra čujte v zaznamenávaní chromatogramu, až kým sa všetky prítomné 
steroly úplne nevylúhujú.  
Základná línia bude vždy v súlade s požiadavkami v bode 5.4.1.2.  
5.4.4. Identifikácia píkov (vrcholov)  
Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná pod ľa retenčných časov 
a porovnaním so zmesou TMSE sterolov, analyzovanou za rovnakých podmienok.
 
Steroly eluujú v nasledujúcom poradí: Cholesterol, brassikasterol, 
24-metylén cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7 — 
kampesterol, Δ 5,23- stigmastadienol, klerosterol, β — sistosterol, sitos ­
tanol, Δ 5 — avenasterol, Δ 5,24 — stigmastadienol, Δ 7 — stigmas ­
tenol, Δ 7 — avenastenol.  
Retenčné časy sitosterolu pre kolóny SE — 52 a SE– 54 sú v tabu ľke 1.  
Obr.1 a 2 ukazujú typické chromatografy niektorých olejov.  
5.4.5. Kvantitatívny odhad  
5.4.5.1. Plochy píkov α — cholestanolu a sterolov vypo čítajte použitím elektro ­
nického integrátora. Neuvádzajte píky zložiek, ktoré nie sú zahrnuté 
v zozname v tab.1. Odozvový faktor pre α — cholestanol sa rovná 1.  
5.4.5.2. Obsahy všetkých alkoholov, vyjadrených v mg/100 g tukových látok, sa 
vypočítajú nasledovne:  
sterol x ¼ A x · m s · 100 
A s · m ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 46
 
kde: 
A x = plocha píku sterolu x  ►M6 __________  ◄, 
A s = plocha píku α — cholestanolu  ►M6 __________  ◄, 
m s = hmotnos ť pridaného α — cholestanolu, v miligramoch (mg),  
m = hmotnos ť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch (g)  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
6.1. Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov ako v mg/100 g tukových 
látok a ich sumu ako „celkové steroly“.  
6.2. Vypo čítajte percento každého jednotlivého sterolu z pomeru plochy 
daného píku k celkovej ploche sterolov:  
% sterolu x ¼ A x P A · 100 
kde: 
A x = plocha píku sterolu x;  
A = celková plocha sterolov.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 47
 
DODATOK  
Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu  
Nadávkujte 1 až 3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu za 
obvyklých pracovných podmienok a stopkami zmerajte čas, za ktorý prejde plyn 
kolónou od momentu nástreku až po čas, kedy sa objaví (vylúhuje) pík (t  M ). 
Lineárna rýchlos ť v (cm/s) je daná L/t  M , kde L je d ĺžka kolóny v centimetroch 
(cm) a t  M je čas nameraný v sekundách (s).  
Tabuľka 1  
Relatívne reten čné časy sterolov  
Pík Ozna čenie Relatívne reten čný čas 
SE 54 
kolóna SE52 
kolóna  
1 cholesterol Δ-5-cholesten-3 β-ol 0,67 0,63 
2 cholestanol 5 α-cholestan-3 β-ol 0,68 0,64 
3 brassikasterol [24S]- 24-metyl- Δ-5,22-cholestadién- 
3β-ol 0,73 0,71 
4 24-metylén-cholesterol 24-metylén- Δ-5,24-cholesten-3 β-ol 0,82 0,80 
5 kampesterol [24R]- 24-metyl- Δ-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81 
6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82 
7 stigmasterol [24R]- 24-etyl- Δ-5,22-cholestadién- 
3β-ol 0,88 0,87 
8 Δ-7-kampesterol [24R]- 24-metyl- Δ-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92 
9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl- Δ-5,23-cholesta ­
dién-3β-ol 0,95 0,95 
10 chlerosterol [24S]- 24-etyl- Δ-5,25-cholestadién- 
3β-ol 0,96 0,96 
11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl- Δ-5-cholestan-3 β-ol 1,00 1,00 
12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3 β-ol 1,02 1,02 
13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03 
14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyI- Δ-5,24-cholesta ­
dién-3β-ol 1,08 1,08 
15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl- Δ-7,24-cholesta ­
dién-3β-ol 1,12 1,12 
16 Δ-7-avenasterol [24Z]- 24-etylidén- Δ-7-cholesten-3 β-ol 1,16 1,16  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 48
 
Obrázok 1  
Chromatografický záznam sterolovej frakcie nerafinovaného olivového oleja
  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 49
 
Obrázok 2  
Chromatografický záznam sterolovej frakcie rafinovaného olivového oleja
  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 50
 
PRÍLOHA VI  
STANOVENIE ERYTRODIOLU A UVAOLU  
ÚVOD  
Erytrodiol (bežne chápaný ako erytrodiolové glykoly a uvaol spolu) tvorí 
podstatnú časť nezmydlovate ľnej frakcie charakteristickej pre niektoré 
druhy tukov. Nachádza sa v ove ľa vyšších koncentráciách rozpúš ťadlovo 
extrahovaného olivového oleja ako sú koncentrácie iných olejov, napr. 
lisovaný olivový olej a olej z hroznových zrnie čok, v ktorých je taktiež 
obsiahnutý, a tak jeho prítomnos ť môže dokáza ť prítomnos ť rozpúšťad­
lovo extrahovaného olivového oleja.  
1. OBLAS Ť 
Metóda opisuje postup detekcie erytrodiolu v tukoch  
2. PODSTATA  
Tuk sa zmydelní metanolicko-etanolickým roztokom hydroxidu drasel ­
ného. Nezmydelnite ľná frakcia sa potom extrahuje dietyléterom 
a prečistí sa prechodom cez kolónu z oxidu hlinitého.  
Nezmydelnite ľné látky sa pri tenkovrstvovej chromatografii na silikagé ­
lovej platni rozdelia na skupiny zodpovedajúce sterolovej a erytrodiolovej 
frakcii. Steroly a erytrodiol, získaný z platní, sa prevedú na trimetylsily ­
lové estery a zmes sa analyzuje plynovou chromatografiou.  
Výsledok sa vyjadrí ako percento erytrodiolu v zmesi erytrodiolu 
a sterolov.  
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE  
3.1. Vybavenie uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).  
4. ČINIDLÁ  
4.1. Činidlá uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).  
4.2. Referen čný roztok erytrodiolu, 0,5 % roztok v chloroforme.  
5. POSTUP  
5.1. Príprava nezmydelnite ľných látok  
Ako je popísané v odseku 5.1.2. prílohy V.  
5.2. Oddelenie erytrodiolu a sterolov  
5.2.1. Pozri odstavec 5.2.1 prílohy V.  
5.2.2. Pozri odstavec 5.2.2 prílohy V.  
5.2.3. Pripravte 5 % roztok nezmydelnite ľných látok v chloroforme.  
Pomocou 0,1 ml mikrostrieka čky naneste na chromatografickú plat ňu čo 
najtenší a najrovnomernejší pásik 0,3 ml roztoku približne 1,5 cm od spodného okraja platne.
 
Na jeden koniec platne umiestnite nieko ľko mikrolitrov roztokov choles ­
terolu a erytrodiolu, ktoré budú slúži ť ako etalóny (na porovnanie).  
5.2.4. Umiestnite plat ňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa 
uvádza v bode 5.2.1. Okolitá teplota by mala by ť asi 20  o C. Komoru 
ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluova ť, kým čelo rozpúš ťadla 
nedosiahne vzdialenos ť približne 1 cm od horného okraja platne. Potom 
platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúš ťadlo odparte prúdom horú ­
ceho vzduchu.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 51
 
5.2.5. Plat ňu mierne a pravidelne postriekajte alkoholovým roztokom 
2,7- dichlórfluoresceínu. Ke ď platňu pozorujete pod ultrafialovým 
svetlom, sterolová a erytrodiolová skupina sa dá identifikova ť podľa 
toho, že sa zoskupujú v rade so štandardami. Bodmi ozna čte iba vonkajšie 
okraje fluorescencie.  
5.2.6. Pomocou kovovej škrabky /kopistky/ zoškrabte silikagél z ozna čenej 
plochy. Preneste materiál z platne do 50 ml banky. Pridajte 15 ml horú ­
ceho chloroformu, dobre pretrepte a prefiltrujte cez filtra čný lievik so 
sintrovaným skleneným diskom tak, aby sa silikagél preniesol na filter. Trikrát premyte horúcim chloroformom (asi 10 ml každý raz), filtrát zbie ­
rajte do 100 ml banky. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml, preneste ho do 
kalibrovanej 10 ml centrifuga čnej skúmavky s kuže ľovým dnom, vysušte 
slabým zahrievaním pod prúdom dusíka a odvážte.
 
5.3. Príprava trimetylsilylových esterov  
Ako je popísané v odseku 5.3 prílohy V.  
5.4. Plynovochromatografická analýza  
Ako je popísané v odseku 5.4 prílohy V. Pracovné podmienky pre 
plynový chromatograf musia by ť také, aby bolo možné vykona ť analýzu 
sterolov a oddeli ť TMSE od erytrodiolu a uvaolu.  
Ak ste už vykonali nástrek vzorky, pokra čujte v zaznamenávaní, kým nie 
sú prítomné steroly a kým sa erytrodiol a uvaol nevyelujú. Potom iden ­
tifikujte píky (reten čné časy erytrodiolu a uvaolu pre β- sitosterol sú 1,45 
a 1,55, v tomto poradí) a vypo Čítajte plochy tak, ako pri steroloch.  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
Erythrodiol % ¼ A 1 þ A 2 
A 1 þ A 2 þ P A sterov Ü 100  
kde: 
A 1 = plocha píku erytrodiolu  ►M6 __________  ◄; 
A 2 = plocha píku uvaolu  ►M6 __________  ◄, 
A sterolov  = celková plocha píkov pre steroly  ►M6 __________  ◄. 
Výsledok sa udáva na jedno desatinné miesto  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 52
 
PRÍLOHA VII  
STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL MONO ­
PALMITÁTU  
1. Ú ČEL A OBLAS Ť POUŽITIA  
Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuál ­
neho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníc ­
tvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu.  
Táto metóda je použite ľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej 
okolitej teplote (20 °C).  
2. PRINCÍP  
Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy: čias­
točná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu 
vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 
2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po 
silanizácii kapilárnou plynovou chromatografiou.  
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BEŽNÝ LABORATÓRNY MATE ­
RIÁL  
3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka  
3.2. 100, 250 a 300 ml kadi čky 
3.3. Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 – 23 mm, 
dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotú čom a kohútikom  
3.4. Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml  
3.5. 100 a 250 ml banky  
3.6. Rota čná odparka  
3.7. 10 ml centrifuga čná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou  
3.8. Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky  
3.9. Termostat s možnos ťou udržiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C  
3.10. Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml  
3.11. 1 ml podkožná strieka čka 
3.12. 100 μl mikrostrieka čka 
3.13. 1 000 ml lievik  
3.14. Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injek čným 
systémom „on column“ za studena na priame zavedenie vzorky do kolóny a pecou umož ňujúcou udržiava ť nastavenú teplotu s presnos ťou 
na 1 °C
 
3.15. Studený injektor „on column“ na priame zavedenie vzorky do kolóny  
3.16. Plame ňovoioniza čný detektor a elektrometer  
3.17. Zapisova č-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlos ťou odozvy 
najviac 1 sekundu a s menite ľnou rýchlos ťou posunu papiera  
3.18. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s d ĺžkou 8 až 12 metrov, 
vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom 
alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 – 0,30 μm, použi­
teľná pri teplote 370 °C  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 53
 
3.19. 10 μl mikrostrieka čka vybavená cementovou ihlou dlhou aspo ň 7,5 cm 
na priame vstreknutie na kolónu.  
4. ČINIDLÁ  
4.1. Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh) 
pripravený takto: Silikagél vložte do porcelánovej kapsule, sušte aspo ň 
štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnú ť v exsikátore 
pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 % hmotnosti silikagélu, takto: odvážte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby 
sa voda rovnomerne rozdelila. Pred použitím nechajte aspo ň 12 hodín 
stáť.
 
4.2. n-hexán (na chromatografiu)  
4.3. Izopropanol  
4.4. Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1  
4.5. Pankreatická lipáza. Použitá lipáza má ma ť aktivitu medzi 2,0 a 10 
jednotkami lipázy na mg ( V obchodnej sieti dosta ť pankreatické lipázy 
s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu .) 
4.6. Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1 
M upravený až na pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním 
koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1)  
4.7. Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa 
musí použi ť do 15 dní od jeho prípravy)  
4.8. Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok  
4.9. Dietyléter na chromatografiu  
4.10. Vyvíjacie rozpúš ťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere 
87/13)  
4.11. 12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného  
4.12. Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole  
4.13. Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu  
4.14. Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických 
látok – a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu  
4.15. Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlór ­
silánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dosta ť v obchodnej 
sieti. Na silanizáciu sa môžu použi ť aj ďalšie činidlá, konkrétne bis- 
trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedené 
rovnakým objemom bezvodého pyridínu.)  
4.16. Referen čné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so 
známym percentuálnym zložením podobným vzorke.  
5. POSTUP  
5.1. Príprava vzorky  
5.1.1. Oleje s obsahom vo ľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred chro ­
matografiou na silikagélovej kolóne neutralizova ť. Oleje s obsahom 
voľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizova ť v súlade 
s bodom 5.1.1.1.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 54
 
5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte 
100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného 
(4.11), aký zodpovedá obsahu vo ľných kyselín v oleji s 5 % navýšením. 
Dôkladne pretrepávajte po čas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej 
vody, znova pretrepte a nechajte stá ť. 
Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte 
prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánový roztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 – 60 ml roztoku 
izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) až do vymiznutia 
ružového sfarbenia fenolftaleínu.
 
Eliminujte najvä čšiu časť hexánu vákuovou destiláciou (napríklad 
s použitím rota čnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5). 
Vysúšajte olej vo vákuu až do úplnej eliminácie rozpúš ťadla.  
Po skončení tejto procedúry má by ť acidita oleja nižšia ako 0,5 %.  
5.1.2. Vložte 1,0 g oleja pripraveného pod ľa vyššie uvedených indikácií do 
25 ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej 
zmesi (4.10). Nechajte roztok postá ť aspoň 15 minút pred chromatogra ­
fiou na silikagélovej kolóne.  
Ak je roztok zakalený, odstre ďte ho, aby boli zabezpe čené optimálne 
podmienky na chromatografiu. (Môžu sa použi ť aj už hotové 500 
g silikagélové patróny SPE – na extrakciu na tuhých fázach).  
5.1.3.  Príprava chromatografickej kolóny  
Nalejte do kolóny (3.3) približne 30 ml vyvíjacieho rozpúš ťadla (4.10), 
pomocou sklenenej ty činky vložte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny; 
stlačte, aby sa odstránil vzduch.  
V kadičke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v približne 80 ml 
vyvíjacieho rozpúš ťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny.  
Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený všetok silikagél; premyte vyví ­
jacím rozpúš ťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina teku ­
tiny dosiahla približne 2 mm nad vrchnou úrov ňou silikagélu.  
5.1.4.  Chromatografia na kolóne  
Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvážte presne 1,0 g vzorky 
pripravenej pod ľa bodu 5.1.  
Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do 
chromatografickej kolóny pripravenej pod ľa bodu 5.1.3. Nepohnite 
povrchom kolóny.  
Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiec ť, až kým nedosiahne 
úroveň silikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpúš ťadla. Upravte 
prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny približne za 60 – 70 minút).
 
Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvážili. Odparte 
rozpúšťadlo vo vákuu a odstrá ňte jeho posledné stopy pod prúdom 
dusíka.  
Odvážte banku a vypo čítajte množstvo získaného extrátu.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 55
 
[V prípade použitia už hotových silikagélových patrónov SPE postupujte 
takto: zave ďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov 
s 3 ml n-hexánu.]  
Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru 
v objemovom pomere 9/1.  
Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka až do 
vysušenia.  
Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overi ť 
zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE.  
5.2. Hydrolýza pankreatickou lipázou  
5.2.1. Do centrifuga čnej skúmavky odvážte 0,1 g oleja pripraveného pod ľa 
bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu 
sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pri čom po každom 
pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkou a umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C.
 
5.2.2. Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmá čali zátku) 
a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte, 
počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnú ť. 
5.2.3. Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom 
odstreďte a pomocou mikrostrieka čky preneste éterový roztok do čistej 
a suchej skúmavky.  
5.3. Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia  
5.3.1. Pomocou mikrostrieka čky zaveďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml 
skúmavky s kónickým dnom.  
5.3.2. Eliminujte rozpúš ťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl 
činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút 
odstáť. 
5.3.3. Po 20 minútach pridajte 1 až 5 ml n-hexánu (v závislosti od chromato ­
grafických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chro ­
matografiu.  
5.4. Plynová chromatografia  
Hlavné opera čné podmienky sú tieto:  
— teplota injektora (injektor „on column“) nižšia ako teplota varu 
rozpúšťadla (68 °C),  
— teplota detektora: 350 °C,  
— teplota kolóny: nastavenie teploty pece: 60 °C po čas 1 minúty, každú 
minútu zvýšte o 15 °C až do dosiahnutia 180 °C, potom o 5 °C za 
minútu až do 340 °C, ďalej udržiavajte 340 °C po čas 13 minút,  
— nosný plyn: vodík alebo hélium nastavené na lineárnu rýchlos ť adek­
vátnu na dosiahnutie rozlíšenia znázorneného na obrázku 1. Reten čný 
čas triglyceridu C  54 má byť 40 ± 5 minút (pozri obrázok 2). ( Vyššie 
uvedené podmienky postupu sa uvádzajú len orienta čne. Každý 
subjekt ich musí optimalizova ť s cieľom dosiahnu ť požadované rozlí ­ 
šenie. Výška píku zodpovedajúca 2-glyceril monopalmitátu musí 
dosiahnuť aspoň 10 % rozsahu stupnice zapisova ča.), ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 56
 
— Množstvo vstreknutej látky: 0,5 – 1 μl roztoku (5 ml) n-hexánu 
(5.3.3).  
5.4.1.  Identifikácia píkov  
Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných 
retenčných časov a vzh ľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami 
zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach.  
5.4.2.  Kvantitatívne hodnotenie  
Plocha každého píku sa vypo číta pomocou elektronického integrátora.  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypo číta na základe 
vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a sú čtom plôch píkov 
všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) pod ľa vzorca:  
glycéryl monopalmitate (%):  A x 
ΣA Ü 100  
kde: 
A x = plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu,  
ΣA = súčet plôch všetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom.  
Výsledok sa uvádza s presnos ťou na jedno desatinné miesto.  
7. SPRÁVA O ANALÝZE  
V správe z analýzy sa má konkrétne uvies ť: 
— odkaz na túto metódu,  
— všetky údaje potrebné na úplnú identifikáciu vzorky,  
— výsledok analýzy,  
— každé odklonenie sa od tejto metódy, či už vplyvom rozhodnutia 
dotknutých strán alebo z iného dôvodu,  
— podrobné identifika čné údaje o laboratóriu, dátum uskuto čnenia 
analýzy a podpis zodpovedných za analýzu.  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 57
 
Obrázok 1  
Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafino ­
vanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %)
  
Vysvetlivky:  „acides gras libres“ = vo ľné mastné kyseliny; „huile d’olive rafinée + 20 % huile 
estérifiée“ = rafinovaný olivový olej s pridaním 20 % esterifikovaného oleja; „1-2 monopalmito ­
léine“ = 1-2 monopalmitín; „1-2 mono C  18 insat.“ = nesaturovaný 1-2 mono C  18 ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 58
 
Obrázok 2  
Chromatogram:  
A) neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapi ­
lárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia digly ­
ceridu alebo krátko potom.  
Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekro čiť 15 %.
  
Vysvetlivky:  
1 = Vo ľné mastné kyseliny  
2 = Monoglyceridy  
3 = Diglyceridy  
4 = Triglyceridy  
* = 2-monopalmitín  
** = Triglycerid C  54 ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 59
 
Chromatogram:  
B) esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 
12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko 
potom.  
Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekro čiť 15 %.
  
Vysvetlivky : 
1 = Vo ľné mastné kyseliny  
2 = Monoglyceridy  
3 = Diglyceridy  
4 = Triglyceridy  
* = 2-monopalmitín  
** = Triglycerid C  54 ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 60
 
8. POZNÁMKY  
Poznámka 1  PRÍPRAVA LIPÁZY  
V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostato čnou akti­
vitou. V laboratóriu sa tiež dajú pripravi ť takto:  
5 kg čerstvých pankreasov z ošípaných ochla ďte na 0 °C. 
Odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozome ľte 
v mlynčeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu. 
Pretrepávajte túto hmotu 4 až 6 hodín spolu s 2,5 litra bezvo ­
dého acetónu a potom odstre ďte. Ešte trikrát extrahujte 
zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom 
pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom.
 
Sušte zvyšok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný 
prášok, ktorý bude dlhodobo uskladnite ľný v chladni čke chrá­
nený pred vlhkos ťou. 
Poznámka 2  KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY  
Pripravte emulziu olivového oleja takto:  
Počas 10 minút pretrepávajte v mieša či zmes zloženú zo 
165 ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15 g roztl čeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja.
 
Postupne zave ďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej 
0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml 
a 20 ml destilovanej vody.  
Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C; 
zaveďte elektródy pH-metra a špirálové miešadlo.  
Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu 
sodného 0,1 N, až kým nedosiahnete pH 8,3.  
Pridajte objem suspenzie prášku lipázy vo vode (0,1 g/ml 
lipázy). Ke ď pH-meter ukáže pH 8,3, uve ďte chronometer 
do činnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu 
sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udržiavala na 
8,3. Zaznamenajte každú minútu objem spotrebovaného roztoku.
 
Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, že os 
nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na 
osi závisle premenných (y-ová os) uvediete po čet mililitrov 
alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udržanie konštantného pH. Mali by ste získa ť lineárny graf.
 
Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypo číta 
na základe vzorca:  
A ¼ V Ü N Ü 100 
m 
kde: 
A je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mg  
V je po čet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za 
minútu (vypo čítané na základe grafu)  
N je molarita roztoku hydroxidu sodného  
m je množstvo testovacej lipázy v mg.  
Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré 
uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.  
▼M20  __________  ▼M21  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 61
 
PRÍLOHA IX  
SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ 
OBLASTI  
ÚVOD  
Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti môže poskytnú ť infor­
mácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali 
počas technologických procesov.  
Absorpcia pri vlnových d ĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená 
prítomnos ťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto 
absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E  1 % 1 cm (extinkcia 1 % 
roztoku tuku v špecifikovanom rozpúš ťadle, v kyvete hrúbej 1 cm) obvykle 
určená ako K (tiež vyjadrovaná ako „extink čný koeficient“).  
1. OBLAS Ť 
Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivo ­
vého oleja v ultrafialovej oblasti.  
2. PODSTATA  
Testovaný tuk sa rozpustí v požadovanom rozpúš ťadle a extinkcia roztoku 
sa potom stanoví pri ur čenej vlnovej d ĺžke so zrete ľom na čisté rozpúš ťadlo. 
Určité extinkcie sa vypo čítavajú zo spektrofotometrických údajov.  
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE  
3.1. Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220 
a 360 mm, s možnos ťou odčítavania jednotlivých nanometrických jednotiek.  
3.2. Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou d ĺžkou 1 cm. Ke ď sa 
kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpúš ťadlom, nemali by medzi 
sebou vykazova ť rozdiel vä čšií ako 0,01 jednotky extinkcie.  
3.3. 25 ml odmerná banka  
▼M6 
3.4. Chromatografická kolóna s hornou časťou o dĺžke 270 mm a o priemere 
35 mm a so spodnou časťou o dĺžke 270 mm a priemere približne 10 mm.  
▼B 
4. ČINIDLÁ  
4.1. Spektrofotometricky čistý izo-oktán (2,2,4-trimetypentán)  
— Pokia ľ ide o destilovanú vodu, mal by ma ť transmitanciu nie menej ako 
60 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm alebo spektrofoto ­
metricky čistý cyklohexán, pokia ľ ide o destilovanú vodu, mal by ma ť 
transmitanciu nie menej ako 40 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 
250 nm.  
▼M6 __________  
4.2. Základný oxid hlinitý pre chromatografické kolóny pripravený 
a skontrolovaný tak, ako je opísané v prílohe 1.  
4.3. n-hexán, na chromatografiu  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 62
 
5. POSTUP  
5.1. Skúmaná vzorka musí by ť dokonale homogénna a bez podozrivých ne čistôt. 
Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote 
približne 30  o C, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote 
najviac 10  o C nad bodom topenia.  
5.2. Presne odvážte približne 0,25 g takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej 
banky, dopl ňte určeným rozpúš ťadlom po zna čku a zhomogenizujte. 
Výsledný roztok musí by ť úplne priezra čný. Ak je prítomná opalescencia 
alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.  
5.3. Získaným roztokom napl ňte kyvetu a za použitia rozpúš ťadla na porovnanie 
zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej d ĺžke medzi 232 až 276 nm.  
Namerané hodnoty sa musia nachádza ť v rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie, 
merania sa musia zopakova ť za použitia koncentrovanejších alebo zriede ­
nejších roztokov, ak je to vhodné.  
5.4. Ak je stanovenie ur čitej extinkcie požadované po prechode vzorky cez oxid 
hlinitý, postup je nasledujúci: Do chromatografickej kolóny dajte 
30 g základného oxidu hlinitého v suspenzii v hexáne. Po usadení adsor ­
bentu stiahnite nadbyto čný hexán dole na približne 1 cm nad horným 
okrajom oxidu hlinitého.  
V 100 ml hexánu rozpustite 10 g tuku, zhomogenizujte ho a prefiltrujte 
podľa opisu v 5.1. a nalejte roztok do kolóny. Zozbierajte eluát a za vákua 
odparte všetko rozpúš ťadlo pri teplote pod 25  o C. 
S takto získaným tukom hne ď pokračujte podľa postupu uvedeného v 5.2.  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
6.1. Zaznamenajte špecifické extinkcie (extink čné koeficienty) pri rôznych vlno ­
vých dĺžkach, ktoré sa vypo čítajú takto:  
K λ ¼ E λ 
c · s 
kde: 
K λ = špecifická extinkcia pri vlnovej d ĺžke λ ; 
E λ = nameraná extinkcia pri vlnovej d ĺžke λ; 
c = koncentrácia roztoku v g/100ml;  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 63
 
s = hrúbka kyvety v cm.  
Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.  
6.2. Spektrografická analýza olivového oleja súlade s oficiálnou metódou 
v nariadeniach EHS ustanovuje stanovenie extinkcie v izo-oktánovom 
roztoku pri vlnových d ĺžkach 232 a 270 nm a stanovenie K, ktoré je vyja ­
drené vzorcom:  
ΔK ¼ K m Ä K m Ä 4 þ K m þ 4 
2 
kde K  m je špecifická extinkcia pri vlnovej d ĺžke m, vlnová d ĺžka pre maxi ­
málnu absorpciu je okolo 270 nm.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 64
 
DOPLNOK I  
Príprava oxidu hlinitého a testovanie jeho aktivity  
A.1.1. P r í p r a v a o x i d u h l i n i t é h o  
Do hermeticky uzatvárate ľnej nádoby vložte oxid hlinitý, ktorý ste 
predtým sušili v peci po dobu troch hodín pri teplote 380 až 400  o C, 
pridajte destilovanú vodu v pomere 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, 
nádobu ihne ď uzatvorte, opakovane pretrepávajte a potom nechajte 
odstáť aspoň 12 hodín pred použitím.  
A.1.2. K o n t r o l a a k t i v i t y o x i d u h l i n i t é h o  
Pripravte chromatografickú kolónu s 30 g oxidu hlinitého. Postupujte 
podľa odseku 5.4., nasledujúcu zmes:  
— 95 % panenského olivového oleja, ktorého špecifická extinkcia je 
menej ako 0,18 pri 268 nm,  
— 5 % oleja z podzemnice olejnej, upraveného hlinkou v procese rafi ­
nácie, so špecifickou extinkciou nie menšou ako 4 pri 268 nm  
nechajte prejs ť cez kolónu.  
Ak má zmes pri prechode kolónou špecifickú extinkciu vä čšiu ako 0,11 
pri 268 nm, je oxid uhli čitý vyhovujúci, ak nie, úrove ň dehydrácie sa 
musí zvýši ť. ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 65
 
DODATOK II  
Kalibrácia spektrofotometra  
A.2. Prístroj sa musí kontrolova ť v intervaloch (najmenej každých šes ť 
mesiacov) pri obidvoch vlnových d ĺžkach a na presnos ť odozvy.  
A.2.1. Vlnovú d ĺžku je možné kontrolova ť pomocou použitia pár ortu ťovej 
lampy alebo pomocou vhodných filtrov.  
A.2.2. Pri kontrole odozvy fotocely a fotonásobi ča postupujte takto: Odvážte 
0,2000 g čistého chrómanu draselného pre spektrofotometriu a rozpustite 
v 0, 05N roztoku hydroxidu sodného v 1 000 ml odmernej banke a doplňte po zna čku. Odoberte presne 25 ml získaného roztoku, preneste 
do 500 ml odmernej banky a zrie ďte doplnením po zna čku tým istým 
roztokom hydroxidu draselného.
 
Zmerajte extinkciu takto získaného roztoku pri 275 nm použitím roztoku 
hydroxidu draselného ako porovnávacieho roztoku. Extinkcia meraná v 1 cm kyvete by mala by ť 0,200 ± 0, 005.
 ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 66
 
PRÍLOHA X A  
PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV 
MASTNÝCH KYSELÍN  
1. OBLAS Ť 
Táto metóda podáva všeobecný návod na použitie plynovej chromato ­
grafie využívajúcej nápl ňové kolóny alebo kapilárne kolóny na stano ­
venie kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia zmesi metyl esterov mast ­
ných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenou v prílohe X B.  
Metóda sa nedá použi ť na polymerizované mastné kyseliny.  
2. ČINIDLÁ  
2.1. Nosný plyn  
Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, at ď.), dokonale vysušený a s 
obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.  
Poznámka 1:  Vodík, ktorý sa používa ako nosný plyn iba pre kapilárne 
kolóny, môže dvojnásobne urýchli ť analýzu, ale je nebez ­
pečný. Sú k dispozícii bezpe čnostné zariadenia.  
2.2. Pomocné plyny.  
2.2.1. Vodík ( čistoty ≥ 99,9 %), bez organických ne čistôt 
2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických ne čistôt 
2.3. Porovnávací (referen čný) štandard  
Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku 
známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu
 
Je potrebné dba ť na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených 
mastných kyselín.  
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE  
Uvedené pokyny týkajúce sa bežného vybavenia používaného 
v plynovej chromatografii, využívajúce nápl ňové a/alebo kapilárne 
kolóny a plame ňovoioniza čný detektor. Je vhodné každé zariadenie 
s účinnosťou a rozlíšením uvedené v 4.1.2.  
3.1. Plynový chromatograf  
3.1.1. D á v k o v a c í ( i n j e k č n ý ) s y s t é m  
Použite niektorý z uvedených injek čných systémov:  
a) s nápl ňovými kolónami, s najmenším možným m ŕtvym objemom (v 
tomto prípade by mal da ť injektor zahria ť na teplotu o 20 až 50  o C 
vyššiu ako má kolóna) alebo  
b) s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal by ť injektor 
špeciálne navrhnutý na použitie pre takéto kolóny. Môže to by ť 
split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 67
 
Poznámka 2:  Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlíko ­
vými atómami sa môže použi ť injektor s pohyblivou ihlou.  
3.1.2 P e c  
Pec by mala by ť schopná vyhrieva ť kolónu na teplotu aspo ň 260  o C 
a udržiava ť požadovanú teplotu v rozmedzí 1  o C v prípade nápl ňovej 
kolóny a 0,1  o C pri kapilárnej kolóne. Táto druhá požiadavka je 
obzvlášť dôležitá pri kolónach z taveného kreme ňa. 
Vo všetkých prípadoch sa odporú ča teplotne-programovate ľné vyhrie ­
vanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.
 
3.1.3 N á p l ň o v á k o l ó n a  
3.1.3.1. Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných vo či analyzovaným látkam 
(napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi:  
a) dĺžka: 1 až 3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým 
reťazcom (nad C  20 ), dajú sa použi ť relatívne krátke kolóny. Ak 
analyzujeme kyseliny so 4 až uhlíkovými atómami, odporú ča sa 
použiť kolónu dlhú 2 m.  
b) vnútorný priemer: 2 až 4 mm.  
Poznámka 3.  Aksú prítomné polynenasýtené zložky s viac ako tromi 
dvojitými väzbami, tieto sa môžu rozloži ť v kolóne 
z nerezovej ocele.  
Poznámka 4.  Je možné použi ť aj systém s dvojicou nápl ňových kolón.  
3.1.3.2. Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí: 
a) nosič: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný 
inertný nosi č s úzkym rozmedzím ve ľkosti zŕn (25 μm rozmedzie 
medzi hranicami 125 až 200 μm); priemerná ve ľkosť častíc závisí od 
vnútorného priemeru a d ĺžky kolóny;  
b) stacionárna fáza : polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietyléng ­
lykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát, atď.), kyanosilikóny alebo každé iné kvapaliny umož ňujúce chroma ­
tografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť 
5 až 20 % (m/m) náplne nosi ča. Pri určitých separáciách je možné 
použiť nepolárne stacionárne fázy.
 
3.1.3.3. Kondiciovanie kolóny  
Pec postupne vyhrievajte až do 185  o C, ak je v hodné, pripravenú 
kolónu odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspoň 
16 hodín prúdi ť inertný plyn tempom 20 až 60 ml/min a potom ďalšie 2 
hodiny pri teplote 195  o C. 
3.1.4. K a p i l á r n a k o l ó n a  
3.1.4.1. Trubica vyrobená z materiálu odolného vo či analyzovaným (obvykle zo 
skla alebo z taveného kreme ňa). Vnútorný priemer 0,2 až 0,8 mm. 
Vnútorný povrch prešiel pred nanesením stacionárnej fázy patri čnou 
úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). D ĺžka 25 mm 
vyhovuje vo vä čšine prípadov.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 68
 
3.1.4.2. Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000), 
polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu 
(kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krížom viazanými väzbami (cross-linked bonded).
 
Poznámka 5.  Pri použití polárnych polyxilánov sa s ťažuje identifikácia 
a separácia kyseliny linoleovej a C  20 kyselín.  
Nanesená vrstva by mala by ť tenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm. 
3.1.4.3. Montáž a kondiciovanie kolóny  
Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiest ­
nenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnos ť), umiest­
nenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia m ŕtvych 
objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar 
(30 kPa), v prípade kolóny d ĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 
0,3 mm].  
Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3  o C/min od 
teploty prostredia až na teplotu 10  o C pod limitom dekompozície stacio ­
nárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie 
základu. Vrá ťte teplotu na 180  o C, aby ste pracovali v izotermálnych 
podmienkach.  
Poznámka 6.  Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej 
sieti 
3.1.5. Detektor, lepšie ak je s vyhrievaním na teplotu vyššiu ako teplota danej 
kolóny.  
3.2. Pipeta  
Pipeta by mala by ť s maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm 
dieliky.  
3.3. Zapisova č 
Ak sa na výpo čet zloženia analyzovanej zmesi použije krivka zo zapi ­
sovača, je potrebný presný elektronický zapisova č, kompatibilný 
s použitým prístrojom. Zapisova č by mal ma ť: 
a) odozvový pomer pod 1,5 s; lepšie 1 s (odozvový pomer je čas, za 
ktorý zapisovacie pero prejde od 0 do 90 % pod ľa náhleho vstupu 
100 % signálu);  
b) šírka papiera, minimálne 20 cm;  
c) rýchlos ť papiera, nastavite ľné hodnoty medzi 0,4 a 2,5 cm/min.  
3.4. Integrátor  
Pomocou elektronického integrátora je možné vykona ť rýchly a presný 
výpočet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivos ťou 
a dostatočnú korekciu odchýlky základnej línie.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 69
 
4. POSTUP  
Postupy uvedené v 4.1 až 4.3. sa vz ťahujú aj na plame ňovoioniza čný 
detektor.  
Alternatívne sa môže použi ť plynový chromatograf využívajúci kataro ­
metrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti). 
Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.  
4.1. Podmienky testovania  
4.1.1. Výber optimálnych pracovných podmienok  
4.1.1.1. Nápl ňové kolóny  
Pri výbere podmienok testovania je potrebné vzia ť do úvahy nasledu ­
júce premenné:  
a) dĺžku a priemer kolóny;  
b) druh a množstvo stacionárnej fázy;  
c) teplotu kolóny;  
d) prietok nosného plynu;  
e) požadované rozlíšenie;  
f) veľkosť testovanej navážky vybranej takým spôsobom, aby detektor 
a elektrometer dávali lineárnu odozvu;  
g) dĺžka analýzy.  
Vo všeobecnosti, hodnoty uvedené v tabu ľke 1 a 2 povedú 
k požadovaným výsledkom, t. j. aspo ň 2 000 teoretických priehradiek 
na meter d ĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15 
minút.  
Ak to zariadenie dovo ľuje, injektor by mal by ť nastavený na teplotu 
okolo 200  o C a detektor na teplotu rovnú alebo vyššiu ako je teplota 
kolóny.  
Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plame ňovoioni­
začného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1 
v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 až 10 krát vä čší 
ako prietok vodíka.  
Tabuľka 1  
Vnútorný priemer kolóny 
(v mm) Prietok nosného plynu 
(v ml/min)  
2 15 až 25 
3 20 až 40 
4 40 až 60  
Tabuľka 2  
Koncentrácia stacionárnej fázy 
% (m/m) Teplota kolóny  
o C 
5 175 
10 180 15 185 20 185
 ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 70
 
4.1.1.2. Kapilárna kolóna  
Vlastnosti ako ú činnosť a priepustnos ť kapilárnych kolón znamenajú, že 
separácia medzi zložkami a d ĺžkou trvania analýzy sú vo ve ľkej miere 
závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné opti ­
malizovať pracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo 
jednoduchšie na straty na hlave kolóny) pod ľa toho, či si želáte zlepši ť 
separáciu alebo urýchli ť analýzu.  
4.1.2. Stanovenie po čtu teoretických priehradiek (ú činnosť) a rozlíšenia (pozri 
obrázok 1)  
Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných 
množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla).  
Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna 
hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píku rozpúšťadla. Použite dostato čné množstvo zmesi metyl esterov, aby pík 
metyl stearátu zabral približne tri štvrtiny celkového rozsahu.
 
Vypočítajte počet teoretických priehradiek, n (ú činnosť) podľa vzorca:  
n ¼ 16 " 
dr 1 
ω 1 # 
2 
a rozlíšenie R pod ľa vzorca:  
R ¼ 2Δ 
ω 1 þ ω 2 
kde: 
dr 1 je retenčná vzdialenos ť v milimetroch od štartu chromato ­
gramu po maximum píku metyl stearátu;  
ω 1 a ω 2 sú šírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané 
medzi bodmi priese čníkov tangentov a interflexnými 
bodmi krivky so základnou líniou;  
Δ je vzdialenos ť v milimetroch medzi maximami píkov 
metyl stearátu a metyl oleátu,  
▼M2 
a index rozpustnosti 1r pri použití vzorca  
a 
b 
kde: 
a = výška najmenšieho píku meraná od základnej čiary; 
b = výška najnižšieho bodu priehlbiny medzi dvoma pri ľahlými 
píkmi meraná od základnej čiary. ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 71
 
Obrázok 1  
Chromatogram na stanovenie po čtu teoretických priehradiek (ú činnosť) 
a rozlíšenie
  
Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umožnia aspo ň 2 000 teore ­
tických priehradiek na meter d ĺžky kolóny a rozlíšenie aspo ň 1,25.  
4.2. Veľkosť navážky  
Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 až 2 μl roztoku metyl esterov 
pripraveného pod ľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.  
Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich približne 100 mg/ml 
roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 ml 
tohto roztoku.  
Ak sú zložky prítomné iba v stopových množstvách, ve ľkosť navážky 
môžete zvýši ť (až 10 násobne).  
4.3. Analýza  
Pracovné podmienky boli všeobecne definované v 4.1.1.  
Napriek tomu je možné pracova ť pri nižšej teplote kolóny, ak sa 
požaduje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo pri vyššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami uhlíka. V prípade potreby je možné využi ť programovanú 
teplotu v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl 
estery mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100
 o C (alebo od 50 do 60  o C, ak je prítomná kyselina 
butyrová) a ihne ď zvýšte teplotu s gratientom 4 až 8  o C/min do opti ­
málnej teploty. V niektorých prípadoch sa môžu kombinova ť obidva 
postupy.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 72
 
Po programovom vyhrievaní pokra čujte v elúcii pri konštantnej teplote, až 
kým sa všetky zložky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové vyhrie ­
vanie, použite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195  o C. 
Ak je vhodné, odporú ča sa vykona ť analýzu na dvoch ukotvených 
fázach rôznej polarity a tým sa overí neprítomnos ť prekrytých píkov, 
napríklad v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C  18:3 
a C  20:0 alebo C  18:3 a C  18:2 . 
4.4. Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov  
Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracov ­
ných podmienok, aké boli použité pri vzorkách a zmerajte reten čné časy 
alebo reten čné vzdialenosti zložiek mastných kyselín. Na semi-logarit ­
mický papier zhotovte, na každý stupe ň nenasýtenia, grafy ukazujúce 
logaritmus reten čného času alebo vzdialenosti ako funkciu po čtu uhlí­
kových atómov. Pri izotermických podmienkach by mali by ť grafy pre 
nerozvetvené kyseliny s rovnakým stup ňom nenasýtenia rovnobežné.  
Je nevyhnutné predís ť takému kondiciovaniu, po ktorom sa objavujú 
„maskované píky“, t. j. kde je nedostato čné rozlíšenie na rozdelenie 
dvoch zložiek.  
5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
5.1. Kvalitatívna analýza  
Identifikujte píky metylesterov pre vzorku z grafov uvedených v 4.4, 
interpoláciou, ak je vhodné.  
5.2. Kvantitatívna analýza  
5.2.1. S t a n o v e n i e z l o ž e n i a  
Okrem výnimo čných prípadov použite metódu vnútornej normalizácie, 
t. j. predpokladajme, že všetky zložky vzorky sú zastúpené na chroma ­
tografe, takže celková plocha pod píkmi prestavuje 100 % zložiek 
(úplná elúcia).  
Ak je v zariadení aj integrátor, použite jeho zaznamenané hodnoty. Ak 
sa v prístroji nenachádza, ur čite plochu pod každým píkom vynáso ­
bením výšky píku šírkou píku v polovi čnej výške, a ke ď je to vhodné, 
zoberte do úvahy rôzne zoslabenia po čas zápisu.  
5.2.2 M e t ó d a v ý p o č t u 
5.2.2.1. Ilustra čný (všeobecný) prípad  
Vypočítajte obsah danej zložky  i, vyjadrený ako percento hmotnosti 
metylesterov, stanovením percenta predstavujúceho plochu príslušného 
píku vzťahujúceho sa k sume plôch všetkých píkov, pomocou nasledu ­
júceho vzorca:  
A i P A Ü 100  
kde: 
A i je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i,  
A je suma plôch pod všetkými píkmi.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 73
 
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo. 
Poznámka 7.  V tomto ilustra čnom prípade je výsledok výpo čtu zalo­ 
žený na v pomerných plochách sa považuje za hmot ­
nostné percento. Pre prípady, v ktorých tento predpoklad nie je možný, pozri 5.2.2.2.
 
5.2.2.2. Použitie korek čných faktorov  
V niektorých prípadoch, napríklad za prítomnosti mastných kyselín 
s menej ako 8 atómami uhlíka alebo kyselín so sekundárnou skupinou, 
ak sa použije tepelnovodivostný detektor alebo sa požaduje predo ­
všetkým vyšší stupe ň presnosti, by sa mali použi ť korekčné faktory 
na prevedenie plošných percent na hmotnostné percentá zložiek.  
Stanovte korek čné faktory pomocou chromatografu odvodeného 
z analýzy porovnávacej zmesi metylesterov známeho zloženia, vyko ­
nanej za rovnakých pracovných podmienok ako pri vzorke.  
Pri tejto porovnávacej zmesi je hmotnostné percento zložky  i vyjadrené 
vzorcom:  
m i P m Ü 100  
kde: 
m i je hmotnos ť zložky  i v porovnávacej zmesi;  
Am je celková hmotnos ť rôznych zložiek v referen čnej zmesi 
(porovnávacom roztoku).  
Z chromatogram porovnávacieho roztoku (4.4) vypo čítajte percento 
(plocha/plocha) pre zložku  i takto:  
A i P A Ü 100  
kde: 
A i je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i,  
A je suma plôch pod všetkými píkmi.  
Korekčný faktor sa potom vypo číta: 
K i ¼ m i Ü P A 
A i Ü P m 
Bežnejšie sa korek čné faktory vyjadrujú pod ľa ich vzťahu k K  C16 , takže 
relatívnymi faktormi sa stávajú:  
K′ i ¼ K i 
K C16 
Pre vzorku, obsah každej vzorky  i, vyjadrený ako hmotnostné percento 
metyl esterov je:  
K′ i Ü A i P ðK′ i Ü A i Þ Ü 100  
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo. ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 74
 
5.2.2.3. Použitie vnútorného štandardu  
Pri niektorých analýzach (napr. ak nie sú kvantifikované všetky mastné 
kyseliny, ako ke ď sú vedľa kyselín so 16 alebo 18 uhlíkmi prítomné 
kyseliny so štyrmi alebo šiestimi uhlíkmi alebo ke ď je potrebné vo vzorke 
určiť absolútne množstvo mastnej kyseliny) je nevyhnutné použi ť 
vnútorný štandard. Mal by sa ur čiť korekčný faktor (ak je nejaký) pre 
vnútorný štandard.  
Hmotnostné percento zložky  i, vyjadrené ako metylester, je potom vyja ­
drené vzorcom:  
m s Ü K′ i Ü A i 
m Ü K′ s Ü A s Ü 100  
kde: 
A i je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke  i; 
A s je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá vnútornému štandardu;  
K′ i je korekčný faktor zložky  i (vzťahujúci sa na K  C1 ); 
K′ s je korekčný faktor vnútorného štandardu (vz ťahujúci sa na K  C16 ); 
m je hmotnos ť navážky vzorky, v miligramoch;  
m s je hmotnos ť vnútorného štandardu, v miligramoch.  
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo. 
▼M2 
6. OSOBITNÝ PRÍPAD — STANOVENIE TRANS-IZOMÉROV  
Je možné stanovi ť obsah trans-izomérov v mastných kyselinách s po čtom 
atómov uhlíka od 10 do 24 oddelením metylesterov s použitím plynových 
chromatografických kapilárnych kolón so špecifickou polaritou.  
6.1 Kapilárna kolóna vyrobená z oxidu kremi čitého s vnútorným priemerom 
0,25 mm až 0,32 mm a s d ĺžkou 50 m s nanesenou vrstvou kyanopro ­
pysilikónu, pri čom hrúbka vrstvy bude od 0,1 do 0,3 μm (typ SP 2380, 
C. P. sil 88, silor 10 a podobné druhy).  
▼M21  
6.2. Metyl-estery sa pripravia pod ľa postupu B uvedenom v ďalšej prílohe 
X „B“. Tuky alebo oleje s obsahom vo ľných kyselín viac ako 3 % 
musia by ť vopred neutralizované v súlade s bodom 5.1.1 prílohy VII.  
▼M2 
6.3 Pracovné podmienky pre plynovú chromatografiu sú takéto:  
— teplota kolóny nastavená na hodnotu od 150 °C do 230 °C 
(napríklad 165 °C po čas 15 minút a následné zvyšovanie rýchlos ťou 
5 °C za minútu na 200 °C);  
— teplota injektora: 250 °C, pokia ľ sa používa systém s deli čom, alebo 
začiatočná teplota kolóny, ak sa používa systém na kolóne;  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 75
 
— teplota detektora: 260 °C;  
— prietok nosného plynu (hélium a vodík): 1,2 ml za minútu.  
Vstreknuté množstvo musí by ť také, aby za použitých podmienok citli ­
vosti výška píku zodpovedajúceho metylesteru kyseliny arašidovej bola 
rovnaká alebo vä čšia ako 20 % spodnej časti stupnice.  
6.4 Identifikácia rôznych metylesterov sa vykoná na základe reten čných 
časov, ktoré sa porovnajú s reten čnými časmi referen čných zmesí (ako 
je uvedené v bode 2.3).  
Estery trans-mastných kyselín sa eluujú pred zodpovedajúcimi cis- 
izomérmi. Príklad chromatogramu je uvedený na obrázku 2.  
Obrázok 2:  
Plynový chromatogram trans-izomérov mastnej kyseliny s použitím kapilárnej 
kolóny
  
6.5 Ú činnosť kolóny stanovená v súlade s bodom 4.1.2 musí by ť taká, aby 
umožnila oddelenie ur čitých kritických dvojíc, napríklad dvojice 
tvorenej masívom píku trans-izoolejových kyselín a kyseliny olejovej, 
trans C18:1/cis C18:1 s indexom rozlíšenia vyšším ako 2.  
6.6 Percento rôznych trans-mastných kyselín sa vypo číta na základe pomeru 
medzi plochou príslušného píku a sú čtom plôch všetkých prítomných 
píkov.  
Percentá:  
— trans-oktadekénových kyselín (T 18:1) uvedených v prílohe I k 
nariadeniu ako suma trans-olejových izomérov;  
— cis-trans a trans-cis kyselín oktadekandiénových [(CT/TC) 18: 2] 
uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolo ­
vých izomérov;  
— trans–cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, kyselín okta ­
dekantriénových [(TCT + CCC + CTC;TCC) 18: 3] uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolénových izomérov
 
sa berú do úvahy.  ▼M2 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 76
 
Poznámka 8:  Berúc do úvahy osobitné charakteristiky tejto metódy, 
uvádzajte prosím výsledky na dve desatinné miesta.  
▼B 
7. ŠPECIÁLNY PRÍPAD — POUŽITIE KATAROMETRA AKO 
DETEKTORA (PRACUJÚCEHO NA PRINCÍPE ZMIEN TEPELNEJ 
VODIVOSTI)  
Na stanovenie kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia zmesi metyles ­
terov mastných kyselín sa dá taktiež použi ť plynový chromatograf 
využívajúci detektor pracujúci na princípe sledovania zmien tepelnej vodivosti (katarometer). V prípade jeho použitia, podmienky uvedené 
v odseku 3 a 4 sa upravia pod ľa tabuľky 3.
 
Pri kvantitatívnej analýze použite korek čné faktory uvedené v 5.2.2.2.  
Tabuľka 3  
Premenná Hodnota/podmienka  
Kolóna d ĺžka: 2 až 4 m 
vnútorný priemer: 4 mm 
Nosič zrná ve ľkosti medzi 160 a 200 μm 
Koncentrácia stacionárnej fázy 15 až 25 % (m/m) Nosný plyn hélium alebo ak sa toto nedá 
použiť, vodík s čo najnižším 
obsahom kyslíka 
Pomocné plyny žiadne Teplota injektora od 40 do 60
 o C nad teplotou 
kolóny 
Teplota kolóny 180 až 200  o C 
Prietok nosného plynu obvykle medzi 60 a 80 ml/min 
Veľkosť dávkovaného pomeru obvykle medzi 0,5 až 2 μl 
8. SPRÁVA O VÝSLEDKU TESTU  
Správa o výsledku testu vymedzuje metódy používané na prípravu 
metyl esterov a na plynovo chromatografickú analýzu a dosiahnuté výsledky. Uvedú sa v nej všetky podrobnosti o pracovnom postupe, 
ktoré neboli spomenuté v tejto medzinárodnej technickej norme alebo 
sa nepovažovali sa povinné, spolu s podrobnos ťami o akomko ľvek 
sprievodnom jave, ktorý by mohol ovplyvni ť výsledky.
 
Správa o výsledku testu bude zah ŕňať všetky informácie potrebné pre 
úplnú identifikáciu vzorky.  ▼M2 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 77
 
ANNEX X B  
PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM 
OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL  
The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl 
esters from olive oils and olive-pomace oils:  
Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium 
hydroxide  
Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol 
followed by esterification in acid medium.  
Each method will be applied according to the analytical parameter to be deter ­
mined and the oil category as indicated below:  
(a) determination of difference between actual and theoretical content of trigly ­
cerides with ECN42 ( ΔECN42):  
— method A will be applied to samples of all the oil categories after 
purification of the oil by passing it through a silica gel column;  
(b) determination of the fatty acid composition:  
— method A will be applied directly to samples of the following oil cate ­
gories:  
— virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,  
— refined olive oil,  
— olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),  
— refined olive-pomace oil,  
— olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace 
oil); 
— method B will be applied directly to samples of the following oil cate ­
gories:  
— virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,  
— crude olive-pomace oil;  
(c) determination of trans-isomers of fatty acids:  
— method A will be applied directly to samples of the following oil cate ­
gories:  
— virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,  
— refined olive oil,  
— olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),  
— refined olive-pomace oil,  
— olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace 
oil); 
— method A will be applied to the following categories of oils after puri ­
fication of the oil by passing it through a silica gel column:  
— virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,  
— crude olive-pomace oil.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 78
 
PURIFICATION OF OIL SAMPLES  
When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica 
gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC 
method 2.507.  
Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. 
A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from 
becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of 
hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar 
volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under 
reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for trigly ­
ceride analysis by HPLC, if necessary.
 
METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS  
1. Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potas ­
sium hydroxide  
1.1. Purpose  
This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with 
a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not 
esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-este ­
rified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.
 
1.2. Principle  
Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potas ­
sium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place 
(title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).  
1.3. Reagents  
Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.  
Heptane, chromatographic quality.  
Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 
11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.  
1.4. Apparatus  
Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.  
Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml  
1.5. Procedure  
In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil 
sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with 
a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. 
Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the 
solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage 
of the solution for more than 12 hours is not recommended.
 ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 79
 
2. Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol 
followed by esterification in acid medium  
2.1. Purpose  
This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free 
fatty acid content of more than 3,3 %.  
2.2. Principle  
Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the 
glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).
 
2.3. Reagents  
— heptane, chromatographic quality,  
— methanol containing not more than 0,05 % (m/m) water,  
— sodium methylate, 0,2 N methanolic solution: dissolve 5 g of sodium 
in 1 000 ml of methanol (this may be prepared from commercial solutions),
 
— phenolphthalein, 0,2 % methanolic solution,  
— sulphuric acid, 1 N in methanolic solution: add 3 ml of 96 % sulp ­
huric acid to 100 ml of methanol,  
— saturated solution of sodium chloride in water.  
2.4. Apparatus  
— 50 ml flat-bottomed volumetric flask with long, narrow, ground neck,  
— reflux condenser: air condenser (1 m long) with ground joint appro ­
priate to the neck of the flask,  
— boiling chips,  
— glass funnel.  
2.5. Procedure  
Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked 
volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which 
usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 
minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution 
until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit 
the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of 
heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.
 
Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated 
sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the 
lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.
 
Caution: Methylation by method B must be done under a hood.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 80
 
2.6. Alternatives to methylation Method B  
2.6.1.  Method C  
2.6.1.1. Principle  
The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydro ­
chloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.  
2.6.1.2. Apparatus  
— Strong glass vial of a capacity of about 5 ml (height 40 to 45 mm, 
diameter 14 to 16 mm).  
— 1 and 2 ml graduated pipettes.  
2.6.1.3. Reagents  
Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from 
gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).  
Hexane, chromatographic quality.  
Note 1:  Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be 
used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the 
commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulp ­
huric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted 
funnel with the rim just touching the surface of the liquid. 
Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be 
prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.
 
2.6.1.4. Procedure  
— Place in the glass vial 0,2 g of the fatty matter, which has previously 
been dried out on sodium sulphate and filtered, and 2 ml of hydro ­
chloric acid-methanol solution. Heat seal the vial.  
— Immerse the vial at 100 °C for 40 minutes.  
— Cool the vial under running water, open, add 2 ml of distilled water 
and 1 ml of hexane.  
— Centrifuge and remove the hexane phase, which is ready for use.  
2.6.2.  Method D  
2.6.2.1. Principle  
The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with 
methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.
 
2.6.2.2. Apparatus  
— Test tube of a capacity of about 20 ml, fitted with an air reflux 
condenser approximately 1 m in length, with ground glass joints.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 81
 
— 5 ml graduated pipette.  
— 50 ml separating funnel.  
— 10 ml and 25 ml measuring beakers.  
— 15 ml test tube with conical base.  
2.6.2.3. Reagents  
— Methylation reagent: anhydrous methanol-hexane-concentrated sulp ­
huric acid (p = 1,84) in the ratio 75:25:1 (V/V/V).  
— 40 to 60 °C petroleum ether.  
— Anhydrous sodium sulphate.  
2.6.2.4. Procedure  
Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.  
Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath 
(Note 2).  
Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with 
the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous 
phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add 
to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.
 
Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.  
Note 2:  To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit 
the temperature of the water bath to 90 °C.  
3. Precision parameters  
The statistical evaluation of the precision of methods A and 
B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.
 
RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF 
THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL  
1. Procedure  
The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane 
is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary 
column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyano ­
propylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).
 
Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive- 
pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.
 
2. Calculations  
2.1. For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the 
following fatty acids will be taken into account:  
Myristic (C14:0).  
Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the 
methyl and ethyl esters.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 82
 
Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the 
ω9 and ω7 isomers of the methyl ester.  
Margaric (C17:0).  
Margaroleic (C17:1).  
Stearic (C18:0).  
Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 
and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the 
methyl ester.  
Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the 
methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester.  
Arachidic (C20:0).  
Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans- 
isomers of the methyl ester.  
Eicosenoic (C20:1).  
Behenic (C22:0).  
Lignoceric (C24:0).  
Squalene will not be taken into account for the calculation of the total 
area.  
2.2. For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak correspon ­
ding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans- 
isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calcu ­
lation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17).
 
The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out 
according to the formula:  
% X ¼ ðArea X Ü 100Þ= ðtotal areaÞ ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 83
 
Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromato ­
graphic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 84
 
PRÍLOHA XI  
STANOVENIE OBSAHU PRCHAVÝCH HALOGENOVANÝCH 
ROZPÚŠ ŤADIEL V OLIVOVOM OLEJI  
1. METÓDA  
Analýza plynovou chromatografiou s použitím head space techniky.  
2. ZARIADENIE  
2.1. Plynový chromatograf vybavený detektorom elektrónového záchytu (ECD)  
2.2. Head space zariadenie  
2.3. Plynovochromatografická kolóna, sklenená, 2 m dlhá a s priemerom 2 mm, 
so stacionárnou fázou. OV 101 10 % alebo ekvivalent, impregnovaná kalci ­
novaná rozsievková zemina, kyslo praná a silanizovaná s časticami ve ľkosti 
od 80 do 100 mesh  
2.4. Nosný a pomocný plyn: dusík na plynovú chromatografiu, vhodný na 
detekciu elektrónovým záchytom  
2.5. Sklenené banky, od 10 do 15 ml, potiahnuté teflónom a s hliníkovou zátkou 
s otvormi pre strieka čku 
2.6. Hermeticky uzatvárate ľné svorky  
2.7. Plynotesné strieka čky 0,5 až 2ml  
3. ČINIDLÁ  
Štandard: halogenované rozpúš ťadlá, stup ňa čistoty vyhovujúceho plynovej 
chromatografii  
4. POSTUP  
4.1. Presne odvážte 3 g oleja, dajte do sklenenej banky (nepoužitej) a hermeticky 
ju uzatvorte. Vložte ju do termostatu nastaveného na 70  o C na jednu hodinu. 
Opatrne pomocou strieka čky odoberte 0,2 až 0,5 ml horného priestoru (head 
space). Nadávkujte do kolóny plynového chromatografu nastaveného nasle ­
dujúco:  
— teplota injektora: 150  o C, 
— teplota kolóny: 70 až 80  o C, 
— detektor teploty: 200 až 250  o C. 
Môžu sa použi ť aj iné teploty za predpokladu, že sa s tým nezmenia 
výsledky.  
4.2. Porovnávacie roztoky: pripravte roztoky štandardov pomocou rafinovaného 
olivového oleja so stopami rozpúš ťadla v koncentráciách v rozsahu 0.05 až 
do 1 ppm (mg/kg), zodpovedajúce odhadovanému obsahu vo vzorke. Halo ­
genované rozpúš ťadlá sa dajú zriedi ť a pentánom.  
4.3. Kvantitatívne vyhodnotenie: uve ďte do vzájomného vz ťahu plochy alebo 
výšky píkov vzorky a štandartného roztoku s najbližšou predpokladanou. 
Ak je odchýlka vä čšia ako 10 %, analýza sa musí zopakova ť štandartným 
spôsobom, až kým odchýlka nie je do 10 %. Obsah je stanovený na základe priemeru jednotlivých analýz.
 
4.4. Vyjadrenie výsledkov: v ppm (mg/kg). Detek čný limit pre túto metódu je 
0,01 mg/kg.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 85
 
PRÍLOHA XII  
METÓDA MEDZINÁRODNEJ RADY PRE OLIVOVÝ OLEJ NA 
ORGANOLEPTICKÉ HODNOTENIE PANENSKÝCH OLIVOVÝCH 
OLEJOV  
1. PREDMET A OBLAS Ť POUŽITIA  
Táto metóda sa zakladá na rozhodnutí Medzinárodnej rady pre olivový olej 
č. DEC-21/95-V/2007 zo 16. novembra 2007, ktoré sa týka upravenej 
metódy na organoleptické hodnotenie panenských olivových olejov. Jej 
cieľom je stanovi ť postup hodnotenia organoleptických vlastností panen ­
ských olivových olejov v zmysle bodu 1 prílohy XVI k nariadeniu (ES) č. 1234/2007 a stanovi ť metódu ich zatriedenia na základe týchto vlastností. 
Metóda obsahuje aj pokyny týkajúce sa nepovinného ozna čovania na etike ­
tách.
 
Opísaná metóda sa vz ťahuje iba na panenské olivové oleje a na ich zatrie ­
denie alebo ich ozna čovanie etiketami pod ľa intenzity vnímaných nedo ­
statkov, ovocnosti a ostatných pozitívnych atribútov, ktorú stanoví skupina 
vybraných vyškolených a odskúšaných ochutnáva čov tvoriacich porotu.  
2. VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE  
Pokiaľ ide o všeobecný základný slovník, testovaciu miestnos ť, pohár na 
ochutnávanie olejov a všetky ďalšie otázky spojené s touto metódou, odpo ­
rúča sa dodržiavanie predpisov stanovených Medzinárodnou radou pre 
olivový olej, najmä rozhodnutia č. DEC-21/95-V/2007 zo 16. novembra 
2007, ktoré sa týka upravenej metódy na organoleptické hodnotenie panen ­
ských olivových olejov.  
3. ŠPECIFICKÝ SLOVNÍK  
3.1. Pozitívne atribúty  
Ovocný: všetky čuchové vnemy charakteristické pre olej (v závislosti od 
druhu olív), získaný zo zdravých a čerstvých plodov, zelených alebo 
zrelých, ktoré vnímame priamo a/alebo retronazálne.  
Ovocnosť sa ozna čuje za  zelenú , ak čuchové vnemy pripomínajú zelené 
plody, čo je charakteristické pre olej získaný zo zelených plodov.  
Ovocnosť sa označuje za  zrelú , ak čuchové vnemy pripomínajú zrelé plody, 
čo je charakteristické pre olej získaný zo zelených a zrelých plodov.  
Horký: základná charakteristická chu ť oleja získaného zo zelených alebo 
dozrievajúcich olív, ktorú vnímame ohradenými jazykovými papilami zoskupenými v tvare písmena V.
 
Pikantný: hmatový vnem štípania charakteristický pre oleje vyrobené na 
začiatku sezóny, najmä z olív, ktoré ešte nedozreli; možno ho vníma ť 
v celej ústnej dutine a hlavne v hrdle.  
3.2. Negatívne atribúty  
Zatuchnutý/kalový: charakteristická aróma oleja získaného z olív, ktoré sa 
hromadili alebo skladovali v takých podmienkach, že sa dostali do pokro ­ 
čilého stavu anaeróbnej fermentácie, alebo oleja, ktorý sa ponechal 
v kontakte s kalmi z dekantácie v kadiach a nádržiach, ktoré takisto prešli anaeróbnou fermentáciou.
 
Plesnivý-vlhký: charakteristická aróma oleja získaného z olív napadnutých 
plesňou a kvasinkami následkom skladovania plodov po čas viacerých dní vo 
vlhkom prostredí.  ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 86
 
Vínový-octový/kyslý-ostrokyslý: charakteristická aróma niektorých olejov, 
ktorá pripomína víno alebo ocot. Je spôsobená hlavne aeróbnou fermentá ­
ciou olív alebo zvyškov olivovej hmoty na lisovacích diskoch, ktoré neboli dobre umyté, v dôsledku čoho dochádza k tvorbe kyseliny octovej, etyla ­
cetátu a etanolu.
 
Kovový: aróma pripomínajúca kovy. Je charakteristická pre olej, ktorý bol 
dlho v kontakte s kovovým povrchom po čas procesu drvenia, miešania, 
lisovania alebo skladovania.  
Zatuchnutý: aróma olejov, ktoré prešli procesom silnej oxidácie.  
Prehriaty alebo spálený: charakteristická aróma olejov, ktorá je dôsledkom 
príliš veľkého a/alebo dlhého zahriatia oleja po čas jeho získavania, a najmä 
počas miešania olivovej hmoty za tepla, ak sa toto miešanie vykonáva za 
nevhodných teplotných podmienok.  
Seno-drevo: charakteristická aróma niektorých olejov vyrobených zo 
suchých olív.  
Ťažký: hustý a glejovitý pocit v ústach, ktorý vyvolávajú niektoré staré 
oleje.  
Mastný: aróma oleja, ktorá pripomína arómu nafty, masti alebo minerálneho 
oleja.  
Rastlinná š ťava: aróma, ktorú olej získa po dlhšom kontakte s rastlinnou 
šťavou, ktorá prešla procesom fermentácie.  
Slaný: aróma oleja získaného z olív konzervovaných v slanom náleve.  
Esparto: charakteristická aróma oleja získaného z olív, ktoré sa vylisovali 
v nových diskoch z esparta. Môže by ť rôzna v závislosti od toho, či ide 
o disky vyrobené zo zeleného esparta, alebo zo suchého esparta.  
Zemitý: aróma oleja z olív, ktoré boli pozbierané spolu s hlinou alebo boli 
zablatené a neumyté.  
Červivý: aróma oleja z olív, ktoré boli silne napadnuté larvami olivovej 
mušky ( Bactrocera Oleae ). 
Uhorkový: charakteristická aróma oleja, ktorý bol príliš dlho hermeticky 
skladovaný najmä v nádobách z bieleho plechu; táto aróma sa pripisuje 
procesu tvorby nona-2,6-dienalu.  
Vlhké drevo: charakteristická aróma olejov získaných z olív, ktoré boli na 
strome poškodené mrazom.  
3.3. Nepovinná terminológia na ú čely označovania etiketami  
Predseda poroty môže na požiadanie potvrdi ť, že hodnotené oleje sp ĺňajú 
definície a intervaly zodpovedajúce ďalej uvedeným pojmom a prívlastkom 
v závislosti od intenzity a vnímania atribútov:  
a) pokiaľ ide o pozitívne atribúty uvedené v bode 3.1 ( ovocný , prípadne  
zelený  alebo  zrelý, pikantný  a horký ): 
i) pojem „intenzívny“ sa môže použi ť, ak je medián príslušného atri ­
bútu vyšší ako 6;  
ii) pojem „stredný“ sa môže použi ť, ak je medián príslušného atribútu 
medzi 3 a 6;  
iii) pojem „slabý“ sa môže použi ť, ak je medián príslušného atribútu 
nižší ako 3;  ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 87
 
iv) príslušné atribúty sa môžu použi ť bez odkazu na prívlastky uvedené 
v bodoch i), ii) a iii), ak je medián príslušného atribútu vyšší alebo sa 
rovná 3;  
b) pojem „vyvážený“ sa môže použi ť v prípade oleja, ktorý nevykazuje 
známky nevyváženosti. Nevyváženos ťou sa rozumie čuchový, chu ťový 
a hmatový vnem oleja, v ktorom medián atribútu  horký  a/alebo atribútu  
pikantný  je o dva body vyšší ako medián atribútu  ovocný ; 
c) pojem „jemný olej“ sa môže použi ť v prípade oleja, v ktorom sú 
mediány atribútu  horký  a atribútu  pikantný  nižšie alebo sa rovnajú 2.  
4. POROTA  
Porota sa skladá z predsedu poroty a z ôsmich až dvanástich ochutnáva čov. 
Predseda poroty musí ma ť kvalitnú odbornú prípravu a musí by ť znalcom 
a dobre informovaným expertom na rôzne druhy olejov. Zodpovedá za porotu, za jej organizáciu a fungovanie, prípravu, kodifikáciu 
a prezentáciu vzoriek ochutnáva čom, ako aj za zhromaž ďovanie údajov 
a ich štatistické spracovanie.
 
Predseda poroty vyberie ochutnáva čov a dohliada na ich prípravu a kontrolu 
ich výkonov s cie ľom zabezpe čiť, aby si udržali primeranú úrove ň spôso­
bilosti.  
Ochutnáva či pre organoleptické kontroly olivového oleja sa vyberú 
a vyškolia v závislosti od ich schopnosti rozlíši ť podobné vzorky v súlade 
s príručkou Medzinárodnej rady pre olivový olej pre výber, prípravu 
a kontrolu kvalifikovaných ochutnáva čov panenského olivového oleja.  
Poroty sa zaväzujú na ú časť na organoleptických hodnoteniach plánovaných 
na vnútroštátnej a medzinárodnej úrovni alebo na úrovni Spolo čenstva 
s cieľom umožni ť pravidelnú kontrolu a zosúladenie percep čných kritérií. 
Okrem toho, ak ide o poroty schválené v súlade s ustanoveniami článku 4 
ods. 1 tohto nariadenia, musia každoro čne poskytova ť príslušnému člen­
skému štátu všetky informácie o svojom zložení a o po čte hodnotení, 
ktoré vykonali ako akreditovaná porota.  
5. POSTUP PRE ORGANOLEPTICKÉ HODNOTENIE A ZATRIEDENIE  
5.1. Použitie profilového hárka ochutnáva čom 
Profilový hárok, ktorý má použi ť každý ochutnáva č, sa nachádza v dodatku 
A k tejto metóde.  
Každý ochutnáva č, ktorý je sú časťou poroty, musí ovo ňať a následne 
ochutnať testovaný olej. Potom musí na 10 cm stupnici v profilovom hárku, 
ktorý má k dispozícii, uvies ť intenzitu, s akou vníma každý z negatívnych 
a pozitívnych atribútov (  1 ). V prípade, že ochutnáva č vníma zelenos ť alebo 
zrelosť ovocného atribútu, zaškrtne v profilovom hárku príslušný rám ček. 
V prípade, že ochutnáva č vníma také negatívne atribúty, ktoré sa na profi ­
lovom hárku neuvádzajú, musí ich zaznamena ť do riadku „iné“, použijúc 
niektorý alebo niektoré z vymedzených pojmov, ktorými sa opíšu s čím 
najväčšou presnos ťou. ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 88  
( 1 ) Ochutnáva č môže odmietnu ť ochutnávanie oleja, pokia ľ pri priamom ovoniavaní zazna ­
mená, že niektorý z negatívnych atribútov je extrémne intenzívny. Na profilovom hárku 
sa zmieni o tejto výnimo čnej okolnosti.
 5.2. Využitie údajov predsedom poroty  
Predseda poroty musí zozbiera ť profilové hárky vyplnené každým jedným 
ochutnáva čom; musí skontrolova ť jednotlivé intenzity pridelené rôznym atri ­
bútom; ak zistí nejakú anomáliu, požiada ochutnáva ča, aby skontroloval svoj 
profilový hárok a v prípade potreby zopakoval test.  
Predseda poroty môže informácie od všetkých ochutnáva čov vložiť do počí­
tačového programu, ktorý zodpovedá metóde štatistického výpo čtu mediánu 
uvedenej v dodatku B. Vkladanie informácií za danú vzorku treba usku ­
točniť prostredníctvom matrice zloženej z 9 st ĺpcov, ktoré zodpovedajú 9 
zmyslovým atribútom, a z po čtu riadkov, ktorý zodpovedá po čtu ochutná ­
vačov poroty.  
Ak aspoň 50 % poroty vnímalo istý negatívny atribút a uviedlo to v riadku 
„iné“, vypo číta sa medián tohto nedostatku a olej sa pod ľa toho zatriedi.  
Pokiaľ ide o pojmy „zelený“ a „zrelý“, predseda poroty môže potvrdi ť, že 
testovaný olej sp ĺňa podmienky uvedené v bode 3.3.a iba v tom prípade, ak 
minimálne 50 % poroty upozornilo na vnímanie zrelosti alebo zelenosti 
ovocného atribútu.  
V prípade analýz, ktoré sa vykonávajú v rámci kontrol zhody, sa musí 
vykonať skúška. V prípade protichodných analýz musí predseda poroty 
zabezpečiť, aby sa analýza zopakovala. V prípade neplatných analýz sa 
hodnotenie musí vykona ť tretíkrát. V týchto prípadoch sa medián atribútov 
vypočíta na základe priemeru mediánov. Všetky opakovania týchto analýz 
sa musia vykona ť počas odlišných zasadnutí.  
5.3. Zatriedenie olejov  
Olej sa zaradí do niektorej z ďalej uvedených kategórií pod ľa mediánu 
nedostatkov a mediánu atribútu ovocnosti. Medián nedostatkov sa vyme ­
dzuje ako medián nedostatku vnímaného s najvä čšou intenzitou. Medián 
nedostatkov a medián ovocnosti sú vyjadrené s presnos ťou na jedno desa ­
tinné miesto a hodnota hrubého varia čného koeficientu, ktorý ich vyjadruje, 
musí byť nižšia alebo sa rovna ť 20 %.  
Triedenie olejov sa vykonáva porovnávaním hodnoty mediánu nedostatkov 
a mediánu ovocnosti s ďalej opísanými referen čnými intervalmi. Pri stano ­
vovaní hraníc týchto rozpätí sa zoh ľadnila chybnos ť metódy, a preto sa tieto 
hranice považujú sa absolútne. Po čítačové programy umož ňujú vizualizo ­
vané zatriedenie v tabu ľke štatistických údajov alebo v grafe.  
a) Extra panenský olivový olej: medián nedostatkov sa rovná 0 a medián 
ovocnosti je vyšší ako 0.  
b) Panenský olivový olej: medián nedostatkov je vyšší ako 0 a rovná sa 3,5 
alebo je nižší a medián ovocnosti je vyšší ako 0.  
c) Lampový olivový olej: medián nedostatkov je vyšší ako 3,5; alebo 
medián nedostatkov sa rovná 3,5 alebo je nižší a medián ovocnosti sa 
rovná 0.  
5.4. Osobitné prípady  
Ak je medián iného pozitívneho atribútu ako ovocnos ť vyšší ako 5,0, pred ­
seda poroty to zaznamená na osved čení o analýze oleja.  ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 89
 
Dodatok A  
Profilový hárok panenského olivového oleja
  ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 90
 
Dodatok B  
METÓDA VÝPO ČTU MEDIÁNU A INTERVALOV SPO ĽAHLIVOSTI  
Medián  
Me ¼ ½PðX< XmÞ ≤ 1=2 Λ PðX ≤ XmÞ ≥ 1=2â 
Medián je reálne číslo Xm, ktoré charakterizuje skuto čnosť, že pravdepodobnos ť 
(P), že hodnoty distribúcie (X) budú nižšie ako toto číslo (Xm), je nižšia alebo 
sa rovná 0,5, a že zárove ň pravdepodobnos ť (P), že hodnoty distribúcie (X) 
budú nižšie alebo sa rovna ť Xm, je vyššia alebo sa rovná 0,5. V inej definícii 
medián predstavuje 50. percentil distribúcie čísel v rastúcom poradí. Inými 
slovami, medián predstavuje strednú hodnotu série usporiadanej z nepárnych 
čísel alebo priemer obidvoch centrálnych hodnôt série usporiadanej z párnych 
čísel. 
Hrubá smerodajná odchýlka  
Na získanie spo ľahlivého odhadu variability, ktorá vzniká okolo mediánu, sa 
treba odvola ť na odhad hrubej smerodajnej odchýlky pod ľa Stuarta a Kendalla. 
Nasledujúci vzorec udáva asymptotickú smerodajnú odchýlku, t. j. hrubý odhad 
variability zvažovaných údajov, kde N je po čet pozorovaní a IQR medzikvarti ­
lový interval, ktorý zah ŕňa presne 50 % prípadov distribúcie akejko ľvek pravde ­
podobnosti. 
Sä ¼ 1; 25 IQR 
1; 35 N  
Pri výpo čte medzikvartilového intervalu sa vypo číta rozsah odchýlky medzi 
75. a 25. percentilom.  
IQR = 75. percentil – 25. percentil  
Percentil je hodnota Xpc, ktorú charakterizuje skuto čnosť, že pravdepodobnos ť 
(P), že hodnoty distribúcie budú nižšie ako Xpc, je nižšia alebo sa rovná ur čenej 
stotine, a že zárove ň pravdepodobnos ť (P), že hodnoty distribúcie budú nižšie 
alebo sa rovna ť Xpc, je vyššia alebo sa rovná uvedenej stotine. Stotina udáva 
zlomok vybranej distribúcie. V prípade mediánu sa rovná 50/100.  
Percentil ¼ " 
PðX< XpcÞ ≤ n 
100 Λ PðX ≤ XpcÞ ≥ n 
100 # 
V praxi to znamená, že percentil je hodnota distribúcie zodpovedajúca stanovenej 
ploche na črtnutej pod ľa krivky distribúcie alebo hustoty. Napríklad 25. percentil 
predstavuje hodnotu distribúcie, ktorá zodpovedá ploche rovnajúcej sa 0,25 alebo 25/100.
 
Hrubý varia čný koeficient v % (CVr)  
CVr % predstavuje bezrozmerné číslo, ktoré udáva percentuálny podiel variabi ­
lity analyzovanej série čísel. Z tohto dôvodu je tento koeficient ve ľmi užitočný 
na overenie spo ľahlivosti členov poroty.  
CVr % ¼ Sä 
Me 100 ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 91
 
95 % intervaly spo ľahlivosti pre medián  
95 % intervaly spo ľahlivosti (hodnota chyby prvého druhu sa rovná 0,05 alebo 
5 %) predstavujú interval, v ktorom by hodnota mediánu mohla kolísa ť za pred­
pokladu, že by bolo možné opakova ť skúšanie nekone čne veľa ráz. V praxi tento 
interval udáva interval variability skúšky za daných opera čných podmienok za 
predpokladu, že skúšku možno viackrát opakova ť. Interval slúži na hodnotenie 
spoľahlivosti skúšky ako v prípade CVR %.  
IC sup = Me + (c.S*)  
ICinf = Me – (c.S*)  
Pričom „c“ sa v prípade intervalu spo ľahlivosti 0,95 rovná 1,96.  
▼M20  __________  
▼M19  __________  ▼M22  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 92
 
PRÍLOHA XV  
1. OBSAH OLEJA V OLIVOVÝCH ZVYŠKOCH  
1.1. Prístrojové vybavenie  
— vhodný extrak čný prístroj vybavený s 200 až 250 ml bankou s gu ľatým 
dnom,  
— elektricky vyhrievaný kúpe ľ (napr. pieskový kúpe ľ, vodný kúpe ľ), 
— analytické váhy,  
— sušička nastavite ľná na maximálne 80  o C, 
— elektricky vyhrievaná pec s termostatom nastavite ľným na 103 ± 2  o C 
a ktorú možno vyfukova ť prúdom vzduchu alebo pracujúca za zníženého 
tlaku,  
— mechanický mlyn, ľahko udržiavate ľný, ktorý umož ňuje pomletie olivo ­
vých zvyškov bez zvýšenia ich teploty alebo nejakej znate ľnej zmeny 
v obsahu vlhkosti, prchavej podstaty alebo látok extrahovate ľných 
hexánom,  
— extrak čná patróna a vata alebo filtra čný papier, z ktorých už boli odstrá ­
nené látky extrahovate ľné hexánom,  
— exsikátor,  
— sito s okami s priemerom 1 mm,  
— malé kúsky vysušenej pemzy.  
1.2. Činidlo  
Normálny technický hexán, po ktorom musí po kompletnom odparení zosta ť 
zvyšok menej ako 0,002 g na 100 ml.  
2. POSTUP  
2.1. Príprava testovanej vzorky  
Ak je to nutné, použite mechanický mlyn, ktorý ste predtým dokonale 
vyčistili, na rozomletie laboratórnej vzorky, aby sa zmenšila ve ľkosť častíc 
tak, že úplne prejdú sitom.  
Použite jednu dvadsatinu vzorky na úplné vy čistenie mlynu, odho ďte 
zomletý materiál, zvyšok vzorky zome ľte a zozbierajte, opatrne zmiešajte 
a analyzujte bez odkladu.  
2.2. Veľkosť navážky  
Hneď po skončení mletia odvážte asi 10 g vzorky s presnos ťou na 0,01 g na 
vykonanie testu.  
2.3. Príprava extrak čnej patróny  
Naváženú vzorku vložte do patróny, zazátkujte vatou. Ak použijete filtra čný 
papier, navážku vzorky zaba ľte do neho.  
2.4. Predsušenie  
Ak sú olivové zvyšky ve ľmi vlhké (t. j. obsah vlhkosti a prchavých látok je 
viac ako 10 %), vykonajte predsušenie tak, že vložíte naplnenú patrónu (alebo filtra čný papier) do pece zahriatej na potrebný čas pri teplote nie 
viac ako 80
 o C, aby sa znížil obsah vlhkosti a prchavých látok na menej 
ako 10 %.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 93
 
2.5. Príprava banky s okrúhlym dnom  
Banku obsahujúcu jeden alebo dva kúsky pemzy odvážte s presnos ťou na 1 
mg, ktorú ste predtým vysušili v peci pri teplote 103 ± 2  o C a chladili 
v exsikátore aspo ň jednu hodinu.  
2.6. Prvotná extrakcia  
Do extrak čného prístroja zasu ňte extrakčnú patrónu (alebo filtra čný papier) 
s naváženou vzorkou. Do banky vlejte požadované množstvo hexánu. Upev ­
nite banku na extrak čný prístroj a celú ju ponorte do elektricky vyhrieva ­
ného kúpe ľa. Nastavte vyhrievanie tak, aby nebol refluxný pomer viac ako 
tri kvapky za sekundu (mierny, nie búrlivý var). Po štyroch hodinách extra ­
hovania nechajte vychladnú ť. Vyberte patrónu z extrak čného prístroja 
a dajte ju do prúdu vzduchu, aby sa odstránila vä čšina nasiaknutého rozpúš ­ 
ťadla.  
2.7. Druhá extrakcia  
Vyprázdnite obsah patróny do mikromlyna a zome ľte čo najjemnejšie. 
Vráťte zomletú zmes do patróny a umiestnite ju spä ť do extrak čného 
prístroja.  
Pokračujte v extrakcii ďalšie dve hodiny, použite takú istú banku s gu ľatým 
dnom, obsahujúcu prvý extrakt.  
Výsledný roztok v extrak čnej banke musí by ť číry. Ak nie je, prefiltrujte ho 
cez filtračný papier a nieko ľkokrát vymyte pôvodnú banku a filtra čný papier 
hexánom. Zbierajte filtrát a rozpúš ťadlo použité na oplachovanie v druhej 
banke s okrúhlym dnom, ktorú ste predtým vysušili a odvážili s presnos ťou 
na 1 mg.  
2.8. Odstránenie rozpúš ťadla a váženie extraktu  
Odstráňte väčšiu časť rozpúšťadla oddestilovaním v elektricky vyhrievanom 
kúpeli. Posledné stopy rozpúš ťadla odstrá ňte zahrievaním banky v peci pri 
teplote 103 ± 2  o C po dobu 20 minút. Procesu eliminácie rozpúš ťadla 
napomôžte bu ď privádzaním vzduchu, alebo lepšie inertného plynu, alebo 
použitím zníženého tlaku.  
Nechajte banku chladi ť v exsikátore aspo ň jednu hodinu a potom ju odvážte 
s presnos ťou na 1 mg.  
Znova ju za rovnakých podmienok zahrejte na 10 minút, vychla ďte 
v exsikátore a prevážte.  
Rozdiel medzi dvomi váženiami by nemal presiahnu ť 10 mg. Ak je rozdiel 
vyšší, znova zahrejte po dobu 10 minút, potom ďalej ochladzujte a odvážte, 
kým nie je rozdiel 10 g alebo nižší.  
Vykonajte paralelné stanovenia testovanej vzorky.  
3. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
3.1. Metóda výpo čtu a vzorec:  
a) získaný extrakt sa vyjadrí ako percento hmotnosti produktu a rovná sa:  
S ¼ m  1 Ü 100 
m 0 ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 94
 
kde: S je percento hmotnosti získaného extraktu z produktu, 
m 0 je hmotnos ť naváženej vzorky, v gramoch, 
m 1 je hmotnos ť extraktu po vysušení, v gramoch.  
Výsledkom bude aritmetický priemer dvoch paralelných stanovení za 
predpokladu, že sa splnili podmienky pre opakovate ľnosť. 
Výsledok udajte na jedno desatinné miesto.  
b) Extrakt sa vyjadrí na základe sušiny použitím vzorca:  
S Ü 100 
100 Ä U ¼ percento oleja v extrakte zo sušiny ; 
kde: S = je percento hmotnosti získaného extraktu z produktu (pozri 
a)) 
U = je obsah vlhkosti a prchavých látok  
3.2. Opakovate ľnosť 
Rozdiel medzi dvomi paralelnými stanoveniami vykonanými naraz alebo 
v rýchlom slede za sebou jedným pracovníkom nesmie prekro čiť 0,2 g 
hexánového extraktu na 100 g vzorky.  
Ak táto podmienka nie je splnená, zopakujte analýzu na dvoch ďalších 
navážkach vzorky. Ak aj v tomto prípade rozdiel presiahne 0,2 g, ako 
výsledok sa zoberie aritmetický priemer všetkých štyroch stanovení.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 95
 
PRÍLOHA XVI  
STANOVENIE JÓDOVÉHO ČÍSLA  
1. OBLAS Ť 
Táto medzinárodná technická norma špecifikuje metódu stanovenia jódo ­
vého čísla živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, neskôr uvádzaných 
ako tuky.  
2. DEFINÍCIA  
Na účely tejto medzinárodnej technickej normy platia nasledujúce definície:  
2.1. jódové číslo: hmotnos ť jódu absorbovaná vzorkou za pracovných 
podmienok špecifikovaných v tejto medzinárodnej technickej norme.  
Jódové číslo sa vyjadruje v gramoch jódu na 100 g vzorky.  
3. PODSTATA  
Rozpustite navážku vzorky v rozpúš ťadle a pridajte činidlo pod ľa Wijsa. Po 
určitej dobe pridajte roztok jodidu draselného a vodu a uvo ľnený jód 
stitrujte roztokom tiosíranu sodného.  
4. ČINIDLÁ  
Všetky činidlá by mali ma ť známu čistotu:  
4.1. voda , spĺňajúca požiadavky normy ISO 3696, stupe ň 3; 
4.2. jodid draselný,  roztok 100 g/l, neobsahujúci jodi čnany alebo vo ľný jód;  
4.3. škrob,  roztok.  
Rozmiešajte 5 g rozpustného škrobu v 30 ml vody a pridajte túto zmes do 
1 000 ml vriacej vody, povarte 3 minúty a nechajte vychladnú ť; 
4.4. tiosíran sodný,  štandardný odmerný roztok c(Na  2 S 2 O 3 .5H  2 O) = 0,1 mol/l, 
štandardizovaný (ofaktorovaný) nie skôr ako sedem dní pred použitím;  
4.5. rozpúšťadlo:  pripravené zmiešaním rovnakých objemov cyklohexánu 
a kyseliny octovej;  
4.6. Wijsove činidlo:  obsahujúce chlorid jodný v kyseline octovej. Je možné 
použiť aj obchodne dostupné Wijsove činidlo.  
5. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE  
Obvyklé laboratórne zariadenia, najmä tieto:  
5.1. sklenené navažovacie lodi čky, vhodné na navážku a vsunutie do banky (6.2);  
5.2. kužeľové banky,  500 ml objemu, vybavené zábrusnými zátkami a úplne 
suché.  
6. PRÍPRAVA TESTOVANEJ VZORKY  
Zhomogenizovaná vzorka sa vysuší tiosíranom sodným a prefiltruje.  
7. POSTUP  
7.1 Veľkosť navážky  
Hmotnosť navážky vzorky sa mení pod ľa predpokladaného jódového čísla 
uvedeného v tabu ľke 1. ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 96
 
Tabuľke 1  
Predpokladané jódové číslo Hmotnosť testovanej 
navážky  
menej ako 5 3,00 
5 až 20 1,00 
21 až 50 0,40 
51 až 100 0,20 
101 až 150 0,15 150 až 200 0,10
 
V sklenenej navažovacej lodi čke (5.1) odvážte navážku vzorky s presnos ťou 
na 0,1 mg.  
7.2. Stanovenie  
Navážku vložte do 500 ml banky (6.2). Pridajte 20 ml rozpúš ťadla, aby sa 
rozpustil tuk. Pridajte presne 25 ml Wijsovho činidla, banku zazátkujte, 
premiešajte jej obsah a uložte ju do tmy.  
Nepipetujte Wijsovo činidlo ústami. Podobne pripravte slepý pokus 
s rozpúšťadlom a činidlom, ale vynechajte navážku vzorky.  
Banky obsahujúce vzorky s jódovým číslom pod 150 ponechajte v tme 
jednu hodinu a banky so vzorkami s jódovým číslom nad 150 a s polyme ­
rizovanými produktmi alebo produktmi oxidovanými do vysokého stup ňa, 
ponechajte v tme dve hodiny.  
Po uplynutí tohto času do každej banky pridajte 20 ml roztoku jodidu 
draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1).  
Titrujte štandardným odmerným roztokom tiosíranu sodného (4.4), až kým 
sa takmer úplne nestratí žlté zafarbenie spôsobené jódom.  
Poznámka:  Potenciometrické stanovenie konca titrácie je prípustné.  
7.3. Počet stanovení  
Vykonajte dve stanovania na tej istej vzorke.  
8. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
Jódové číslo je vyjadrené výrazom:  
12; 69 c ðV 1 – V  2 Þ 
m 
kde: 
c = je číselná hodnota presnej koncentrácie v móloch na liter použitého 
štandardizovaného odmerného roztoku tiosíranu sodného (4.4)  
V 1 = je číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku 
tiosíranu sodného (4.4), použitého na slepý pokus, v mililitroch  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 97
 
V 2 = je číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku 
tiosíranu sodného (4.4), použitého pri stanovení, v mililitroch  
m = je číselná hodnota hmotnosti navážky vzorky (7.1), v gramoch.  
Za výsledok sa bude považova ť aritmetický priemer dvoch stanovení, za 
predpokladu, že opakovate ľnosť (9.2) je uspokojivá.  ▼B 1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 98
 
PRÍLOHA XVII  
METÓDY STANOVENIA STIGMASTADIÉNOV V RASTLINNÝCH 
OLEJOCH  
1. ÚČEL 
Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch obsahujúcich nízke 
koncentrácie týchto uh ľovodíkov, a to najmä v panenskom olivovom 
oleji a v surovom oleji z olivových zvyškov.  
2. ROZSAH  
Norma sa môže uplat ňovať na všetky rastlinné oleje, hoci merania sú 
spoľahlivé iba v prípade, ke ď obsah týchto uh ľovodíkov sa pohybuje 
v rozmedzí 0,01 až 4,0 mg/kg. Táto metóda je obzvláš ť vhodná na 
zistenie prítomnosti rafinovaných rastlinných olejov (olivový olej, olej 
z olivových zvyšky, slne čnicový olej, palmový olej at ď.) v panenskom 
olivovom oleji, nako ľko rafinované oleje obsahovali stigmastadiény 
a panenské oleje ich neobsahujú.  
3. POSTUP  
Izolácia nezmydelnite ľnej látky. Oddelenie frakcie steroidných uh ľovo­
díkov pomocou st ĺpcovej chromatografie na silikagély a analyzovanie 
pomocou kapilárnej plynovej chromatografie.  
4. APARATÚRA  
4.1. 250 ml banky vhodné na použitie so spätným chladi čom. 
4.2. Odde ľovacie lieviky o objeme 500 ml.  
4.3. 100 ml banky s gu ľatým dnom.  
4.4. Rota čná odparka.  
4.5. Sklená chromatografická kolóna (vnútorný priemer 1,5 až 2,0 cm, d ĺžka 
50 cm) s teflónovým kohútikom a so zátkou z vlákien sklenej vlny alebo s fritovým kotú čom na dne. S cie ľom pripravi ť silikagélovú kolónu nalejte 
do chromatografickej kolóny hexán do výšky približne 5 cm a potom ju 
naplňte suspenziou silikagélu v hexáne (15 g v 40 ml) pomocou dávok 
hexánu. Nechajte usadi ť a usadzovanie ukon čite aplikovaním slabých 
vibrácií. Pridajte bezvodý síran sodný do výšky približne 0,5 cm 
a nakoniec prebyto čný hexán eluujte.
 
4.6. Plynový chromatograf s plame ňovým ioniza čným detektorom, deleným 
alebo studeným injektorom na kolóne a pecou programovate ľnou 
s presnos ťou ± 1 °C.  
4.7. Kapilárna kolóna z taveného kreme ňa určená na plynovú chromatografiu 
(vnútorný priemer 0,25 alebo 0,32 mm a d ĺžka 25 m) potiahnutá fázou 
5 % fenylmetylsilikónu, s hrúbkou filmu 0,25 mm.  
Poznámka 1:  
Môžu sa používa ť aj iné kolóny s podobnou alebo nižšou polaritou.  
4.8. Integrátor-zapisova č s možnos ťou pracova ť v integra čnom režime údolie- 
údolie.  
4.9. 5 až 10 ml mikrostrieka čka na plynovú chromatografiu s cementovanou 
ihlou.  
4.10. Pláš ť s elektrickým ohrevom alebo zahrievacia platni čka. ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 99
 
5. ČINIDLÁ  
Všetky činidlá musia ma ť analytickú kvalitu, pokia ľ nie je stanovené inak. 
Musí sa používa ť destilovaná voda alebo voda minimálne ekvivalentnej 
čistoty.  
5.1. Hexán alebo zmes alkánov s rozmedzím bodov varu 65 až 70 °C, desti ­
lované v rektifika čnej kolóne.  
Poznámka 2:  
Rozpúšťadlo sa musí kvôli odstráneniu ne čistôt destilova ť. 
5.2. etanol 96 obj /obj.  
5.3. Bezvodý síran sodný.  
5.4. Alkoholický roztok hydroxidu draselného s koncentráciou 10 %. Pridajte 
10 ml vody k 50 g hydroxidu draselného, zamiešajte a zmes potom rozpustite v etanole na celkový objem 500 ml.
 
Poznámka 3:  
Alkoholický hydroxid draselný pri státí hnedne. Musí sa pripravova ť 
čerstvý každý de ň a uchováva ť v tesne zazátkovaných f ľašiach 
z tmavého skla.  
5.5. Silikagél 60 pre st ĺpcovú chromatografiu, 70 až 230 meš (Merck, refe ­
rencia 7734 alebo podobne).  
Poznámka 4:  
Silikagél sa môže obvykle použi ť priamo z kontejnera bez akejko ľvek 
ďalšej úpravy. Niektoré šarže silikagélu môžu vykazova ť nízku aktivitu, 
čo bude ma ť za následok zlé chromatografické oddelenie. Za takýchto 
okolností sa musí silikagél upravi ť nasledujúcim spôsobom: Aktivujte 
silikagél zahrievaním po dobu najmenej štyroch hodín pri teplote 550 °C. 
Po zahriatí vložte silikagél do exsikátora, pri čom sa silikagél ochladí 
a potom ho preneste do zazátkovanej f ľaše. Pridajte 2 % vody a trepte 
dovtedy, až kým nebudú vidite ľné žiadne hrudky a prášok bude vo ľne 
prúdiť. 
Ak niektoré šarže silikagélu budú ma ť za následok chromatogramy 
s interferujúcimi píkmi, tak silikagél sa musí upravi ť spôsobom opísaným 
vyššie. Alternatívou môže by ť použitie extra čistého silikagélu 60 (Merck, 
referencia 7754).  
5.6. Zásobný roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-diénu (Sigma, čistota 99 %) 
v hexáne (10 mg v 50 ml).  
5.7. Štandardný roztok cholesta-3, 5-diénu v hexáne pri koncentrácii 20 ppm, 
získaný zriedením roztoku uvedeného vyššie.  
Poznámka 5:  
Roztoky 5.6 a 5.7 sú stále po dobu najmenej štyroch mesiacov, ak sa 
uchovávajú pri teplote nižšej ako 4 °C.  
5.8. Roztok n-nonakozánu v hexáne pri koncentrácii približne100 ppm.  
5.9. Nosný plyn pre chromatografiu: hélium alebo vodík o čistote 99,9990 %.  
5.10. Pomocné plyny pre plame ňový ioniza čný detektor: vodík o čistote 
99,9990 % a čistený vzduch.  ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 100
 
6. POSTUP  
6.1. Prípravanezmydelnite ľnej látky  
6.1.1. Navážte 20 ± 0, 1 g oleja do 250 ml banky (4.1), pridajte 1 ml štandard ­
ného roztoku cholesta-3, 5-diénu (20 mg) a 75 ml 10 % alkoholického 
hydroxidu draselného, namontujte spätný chladi č a zahrievajte do mier ­
neho varu po dobu 30 minút. Vyberte banku obsahujúcu vzorku zo zdroja tepla a nechajte roztok trochu ochladnú ť (nenechajte roztok úplne 
vychladnú ť, nakoľko vzorka by stuhla). Pridajte 100 ml vody a preneste 
roztok do odde ľovacieho lievika (4.2) pomocou 100 ml hexánu. Zmesou 
30 sekúnd intenzívne trepte a potom ju nechajte oddeli ť sa.
 
Poznámka 6:  
Pokiaľ by sa vytvorila emulzia, ktorá by sa rýchle nerozplynula, tak 
pridajte etanol v malom množstve.  
6.1.2. Preneste spodnú vodnú fázu do druhého odde ľovacieho lievika a znovu 
extrahujte s použitím 100 ml hexánu. Spodnú fázu znovu vypustite 
a hexánové extrakty premyte (spojené v ďalšom odde ľovacom lieviku) 
trikrát, pri čom zakaždým použijete 100 ml zmesi etanol-voda (1:1), až 
kým sa nedosiahne neutrálne pH.  
6.1.3. Nechajte prejs ť roztok hexánu cez bezvodý síran sodný (50 g), premyte 
s 20 ml hexánu a nechajte odparova ť v rotačnej odparke pri 30 °C pri 
zníženom tlaku až do vysušenia.  
6.2. Oddeleniefrakcie steroidných uh ľovodíkov  
6.2.1. Preneste zvyšok do frakciona čnej kolóny pomocou dvoch 1-ml dávok 
hexánu, nechajte vzorku preteka ť kolónou a umožnite, aby hladina 
roztoku poklesla k hornej časti síranu sodného, a za čnite chromatografické 
eluovanie pomocou hexánu s rýchlos ťou prietoku približne 1 ml/min. 
Prvých 25 až 30 ml eluátu vyra ďte a nasledujúcich 40 ml frakcie 
zachyťte. Po zachytení preneste túto frakciu do 100-ml banky s gu ľatým 
dnom. (4.3)  
Poznámka 7:  
Prvá frakcia obsahuje nasýtené uh ľovodíky (obr. 1 a) a druhá frakcia 
steroidné uh ľovodíky. Ďalšie eluovanie poskytne skvalen a príbuzné 
zlúčeniny. Ak sa má dosiahnu ť dobré oddelenie nasýtených 
a steroidných uh ľovodíkov, tak sa vyžaduje optimalizácie objemov 
frakcie. Za týmto ú čelom sa musí objem prvej frakcie upravi ť tak, aby 
pri analýze druhej frakcie, píky predstavujúce nasýtené uh ľovodíky boli 
nízke (pozri obr. 1 c); ak sa neobjavia, ale intenzita štandardného píku je pritom nízka, objem sa musí zníži ť. V každom prípade, úplné oddelenie 
zložiek prvej a druhej frakcie nie je nevyhnutné, nako ľko počas GC 
(plynovo-chromatografickej) analýzy nedochádza k prekrývaniu píkov, pokiaľ sú podmienky plynovej chromatografie upravené tak, ako je 
uvedené v 6.3.1. Optimalizácia objemu druhej frakcie nie je spravidla 
potrebná, nako ľko dochádza k dobrému oddeleniu od ostatných kompo ­
nentov. Tak či onak, prítomnos ť veľkého píku pri približne o 1,5 minútu 
kratšom reten čnom čase v porovnaní so štandardom je zaprí činená skva ­
lénom a sved čí o zlom oddelení.
 
6.2.2. Odparujte druhú frakciu v rota čnej odparke pri 30 °C pri zníženom tlaku 
až do vysušenia a zvyšok ihne ď rozpustite v 0,2 ml hexánu. Roztok 
uchovávajte až do analýzy v chladni čke. 
Poznámka 8:  
Zvyšky 6.1.3 a 6.2.2 sa nesmú drža ť na suchom mieste a pri izbovej 
teplote. Ihne ď po ich získaní sa musí prida ť rozpúšťadlo a roztoky sa 
musia uchováva ť v chladni čke. ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 101
 
6.3. Plynová chromatografia  
6.3.1. Pracovné podmienky deleného vstrekovania  
— teplota injektora: 300 °C,  
— teplota detektora: 320 °C,  
— integrátor-zapisova č: parametre integrácie sa musia stanovi ť tak, aby 
sa dosiahlo správne vyhodnotenie plôch. Odporú ča sa integra čný 
režim údolie-údolie.  
— citlivos ť: približne 16 násobok minimálneho tlmenia,  
— množstvo vstreknutého roztoku: 1 ml,  
— teploty programovania pece: spo čiatku 235 °C po dobu šes ť minút 
a následné zvyšovanie rýchlos ťou 2 °C/minúta na teplotu 285 °C,  
— injektor s deli čom prietoku 1: 15,  
— nosný plyn: hélium alebo vodík pri tlaku približne 120 kPa.  
Tieto podmienky sa môžu upravova ť v súlade s charakteristikami chro ­
matografu a kolóny tak, aby sa získali chromatogramy sp ĺňajúce nasledu ­
júce požiadavky: pík vnútorného štandardu do približne 5 minút času 
uvedeného v 6.3.2; pík vnútorného štandardu musí predstavova ť aspoň 
80 % rozsahu stupnice.  
Systém na plynovú chromatografiu sa musí skontrolova ť vstreknutím 
zmesi zásobného roztoku cholestadiénu (5.6) a roztoku n- nonakozánu (5.8). Pík cholesta-3, 5-diénu sa musí objavi ť pred píkom n-nonakozánu 
(obr. 1c); pokia ľ sa neobjaví, tak možno vykona ť dva kroky: zníži ť 
teplotu pece a/alebo menej polárnu kolónu.
 
6.3.2. Identifikácia píku  
Pík vnútorného štandardu sa objaví približne za 19 minút a pík 3,5-stig ­
mastadiénu s relatívnym reten čným časom približne 1,29 (pozri obr. 1b). 
3,5-stigmastadién sa vyskytuje s malými množstvami izoméru a obvykle sa obidva eluujú spolu ako jeden chromatografický pík. Ak však bude kolóna príliš polárna alebo sa bude vyzna čovať vysokou rozlišovacou 
schopnosťou, izomér sa môže objavi ť ako malý pík skôr tesne pred 
píkom stigmasta-3, 5-diénu (obr. 2). S cie ľom zabezpe čiť, aby sa stigmas ­
tadiény eluovali ako jeden pík, je rozumné nahradi ť kolónu kolónou, ktorá 
je buď menej polárna, alebo má vä čší vnútorný priemer.
 
Poznámka 9:  
Stigmastadiény ur čené ako referencia sa môžu získa ť analýzou rafinova ­
ného rastlinného oleja s použitím menšieho množstva vzorky (1až 2 g). Stigmastadiény vytvárajú prominentný a ľahko identifikovate ľný pík.
 
6.3.3. Kvantitatívna analýza  
Obsah stigmastadiénov sa stanoví pod ľa vzorca:  
mg/kg stigmastadiénov =  A s Ü M  c 
A c Ü M  o ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 102
 
pričom: A  s = plocha píku stigmastadiénov (ak je pík rozložený na dva 
izoméry, tak sú čet plôch týchto dvoch píkov), 
A c = plocha vnútorného štandardu (cholestadién), 
M c = hmotnos ť pridaného štandardu v mikrogramoch, 
M o = hmotnos ť použitého oleja v gramoch.  
Hranica postrehu: približne 0,01 mg/kg.  ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 103
 
Obrázok 1  
Plynové chromatogramy získané zo vzoriek olivového oleja analyzovaných na 
kremennej kapilárnej kolóne (vnútorný priemer 0,25 mm a d ĺžka 25 m), potiah ­
nutej 5 % fenylmetylsilikónom s hrúbkou filmu 0,25 mm.  ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 104
 
a) Prvá frakcia (30 ml) z panenského oleja, s prídavkom štandardu.  
b) Druhá frakcia (40 ml) z olivového oleja obsahujúceho 0,10 mg/kg stigmas ­
tadiénov.  
c) Druhá frakcia (40 ml) obsahujúca malý podiel prvej frakcie.
  
Obrázok 2  
Plynový chromatogram získaný zo vzorky rafinovaného olivového oleja analy ­
zovaného na DB-5-kolóne vykazujúci izomér 3,5-stigmastadiénu.  ▼M11  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 105
 
ANNEX XVIII  
DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 
(DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL 
CONTENT)  
1. Scope  
Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive 
oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between 
the analytical results obtained by high performance liquid chromato ­
graphy (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.
 
2. Field application  
The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the 
detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic 
acid) in every class of olive oils.  
3. Principle  
The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC 
analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 
(calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the 
oil contains seed oils.
 
4. Method  
The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with 
ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: deter ­
mination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, 
calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols
 
4.1. Apparatus  
4.1.1. Round bottom flasks, 250 and 500 ml.  
4.1.2. Beakers 100 ml.  
4.1.3. Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm 
length, with cock and normalized cone (female) at the top.  
4.1.4. Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom, 
suitable to be connected with the top of the column.  
4.1.5. Glass rod, 600 mm length.  
4.1.6. Glass funnel, 80 mm diameter.  
4.1.7. Volumetric flasks, 50 ml.  
4.1.8. Volumetic flasks, 20 ml.  
4.1.9. Rotative evaporator.  
4.1.10. High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control 
of column temperature.  
4.1.11. Injection units for 10 μl delivery.  
4.1.12. Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at 
least 10  -4 units of refractive index.  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 106
 
4.1.13. Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal 
diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to 23 % 
carbon in the form of octadecylsilane (note 2).  
4.1.14. Recorder and/or integrator.  
4.2. Reagents  
The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be 
de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.
 
4.2.1. Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.  
4.2.2. Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.  
4.2.3. Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil 
ether 87/13 (v/v).  
4.2.4. Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standar ­
dized at 5 % (w/w).  
4.2.5. Glass wool.  
4.2.6. Acetone.  
4.2.7. Acetonitrile.  
4.2.8. HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted 
to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).  
4.2.9. Solubilization solvent: acetone.  
4.2.10. Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.) 
may be used and the retention times thence plotted in accordance with 
the equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).
 
4.3. Sample preparation  
As a number of interfering substances can rise false positive results, the 
sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.
 
4.3.1. C h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n p r e p a r a t i o n  
Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then 
introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).
 
In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution 
mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).
 
To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the 
beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.
 
Open the cock and let solvent elute from the column until its level is 
about 1 cm over the silicagel.  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 107
 
4.3.2. C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y  
Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously 
filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volume ­
tric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.
 
By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the 
column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute 
to the silicagel layer level.  
Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent 
rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass 
through the column).  
The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previ ­
ously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.
 
The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra 
virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum 
of 80 % for lampante and residue olive oils.  
4.4. HPLC analysis  
4.4.1. P r e p a r a t i o n o f t h e s a m p l e s f o r c h r o m a t o g r a p h i c 
a n a l y s i s  
A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 
0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).
 
4.4.2. P r o c e d u r e  
Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate 
of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is 
obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.  
4.4.3. C a l c u l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f r e s u l t s  
Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas 
of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:
 
% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.  
The results are to be given to within at least two decimal places.  
Note 1:  The elution order can be determined by calculating the equiva ­
lent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can 
be calculated more precisely by taking into account the origin of the 
double bond. If n
 o , n l and n  ln are the numbers of double bonds attributed 
to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:
 
ECN = CN - d  o n o - d l n l - d ln n ln , ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 108
 
where the coefficient do, d  l and d  ln can be calculated by means of the 
reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the 
relation obtained will be close in:  
ECN = CN - (2,60 n  o ) - (2,35 n  l ) - (2,17 n  ln ) 
Note 2:  Examples: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333 
Lichrosphere or equivalent (Merck) 100 CH18 
Art 50377.  
Note 3:  With several reference triglycerides, it is also possible to calcu ­
late the resolution with respect to triolein:  
α = RT' / RT triolein  
by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.  
The graph of log α against f (number of double bonds) enables the 
retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids 
contained in the reference triglycerides — see figure 2.  
Note 4:  The efficiency of the column should permit clear separation of 
the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.
 
Note 5:  A correct measure of the areas of all peaks of interest for the 
present determination is ensured if the second peak corresponding to 
ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.  
4.5. Calculation of triacylglycerols composition  
4.5.1. D e t e r m i n a t i o n o f f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n  
Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chroma ­
tographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/ ­
91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).
 
4.5.2. F a t t y a c i d s f o r c a l c u l a t i o n  
Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking 
into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. 
Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in considera ­
tion, because only these are important for olive oil.  
Fatty acid (FA) Abbreviation Molecular 
weight 
(MW) ECN 
Palmatic acid P 256,4 16 
Palmatoleic acid Po 254,4 14 Stearic acid S 284,5 18 Oleic acid O 282,5 16 Linoleic acid L 280,4 14 Linolenic acid Ln 278,4 12
 ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 109
 
4.5.3. C o n v e r s i o n o f a r e a % i n t o m o l e s f o r a l l f a t t y a c i d s  
moles P ¼ area % P 
MW P moles S ¼ area % S 
MW S moles Po ¼ area % Po 
MW Po  
(1) 
moles O ¼ area % O 
MW O moles L ¼ area % L 
MW L moles Ln ¼ area % Ln 
MW Ln 9 
>> > = 
>> > ; 
4.5.4. N o r m a l i z a t i o n o f f a t t y a c i d s t o 1 0 0 %  
moles % P ð1; 2; 3Þ ¼ moles P ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 
(2) moles % S ð1; 2; 3Þ ¼ moles S ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 
moles % Po ð1; 2; 3Þ ¼ moles Po ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 
moles % O ð1; 2; 3Þ ¼ moles O ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 
moles % L ð1; 2; 3Þ ¼ moles L ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 
moles % Ln ð1; 2; 3Þ ¼ moles Ln ä 100 
moles ðP þ S þ Po þ O þ L þ LnÞ 9 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > = 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > ;
 
The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the 
overall (1,2,3-) position of the TAGs.  
Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsa ­
turated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated: 
moles % SFA = moles % P + moles % S 
(3) 
moles UFA = 100 - moles % SFA  ) 
4.5.5. C a l c u l a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n i n 2 - a n d 
1 , 3 - p o s i t i o n s o f T A G s  
The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 
1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).
 
4.5.5.1. Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] 
moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 
(4) 
moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06  ) ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 110
 
4.5.5.2. Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]:  
moles % Poð2Þ ¼ moles % Poð1; 2; 3Þ 
moles % UFA ä ½100 Ä moles % Pð2Þ Ä moles % Sð2Þâ 
(5) moles % Oð2Þ ¼ moles % Oð1; 2; 3Þ 
moles % UFA ä ½100 Ä moles % Pð2Þ Ä mol % Sð2Þâ 
moles % Lð2Þ ¼ moles % Lð1; 2; 3Þ 
moles % UFA ä ½100 Ä moles % Pð2Þ Ä moles % Sð2Þâ 
moles % Lnð2Þ ¼ moles % Lnð1; 2; 3Þ 
moles % UFA ä ½100 Ä moles % Pð2Þ Ä moles % Sð2Þâ 9 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > = 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > ;
 
4.5.5.3. Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln 
(1,3)]:  
moles % P1 ; 3 ¼ moles % P1 ; 2; 3 Ä moles % Pð2Þ 
2 þ moles % Pð1; 2; 3Þ 
(6) moles % Sð1; 3Þ ¼ moles % Sð1; 2; 3Þ Ä moles % Sð2Þ 
2 þ moles % Sð1; 2; 3Þ 
moles % Poð1; 3Þ ¼ moles % Poð1; 2; 3Þ Ä moles % Poð2Þ 
2 þ moles % Poð1; 2; 3Þ 
moles % Oð1; 3Þ ¼ moles % Oð1; 2; 3Þ Ä moles % Oð2Þ 
2 þ moles % Oð1; 2; 3Þ 
moles % Lð1; 3Þ ¼ moles % Lð1; 2; 3Þ Ä moles % Lð2Þ 
2 þ moles % Lð1; 2; 3Þ 
moles % Lnð1; 3Þ ¼ moles % Lnð1; 2; 3Þ Ä moles % Lnð2Þ 
2 þ moles % Lnð1; 2; 3Þ 9 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > = 
> > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > ;
 
4.5.6. C a l c u l a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s  
4.5.6.1. TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo)  
moles % AAA ¼ moles % Að1; 3Þ ä moles % Að2Þ ä moles % Að1; 3Þ 
10000  (7) 
4.5.6.2. TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL)  
moles % AAB ¼ moles % Að1; 3Þ ä moles % Að2Þ ä moles % Bð1; 3Þ ä 2 
10000  
(8) 
moles % ABA ¼ moles % Að1; 3Þ ä moles % Bð2Þ ä moles % Að1; 3Þ 
10000 9 
>> > = 
>> > ; ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 111
 
4.5.6.3. TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn, 
PPoLn)  
moles % ABC ¼ moles % Að1; 3Þ ä moles % Bð2Þ ä moles % Cð1; 3Þ ä 2 
10000  
(9) moles % BCA ¼ moles % Bð1; 3Þ ä moles % Cð2Þ ä moles % Að1; 3Þ ä 2 
10000 
moles % CAB ¼ moles % Cð1; 3Þ ä moles % Að2Þ ä moles % Bð1; 3Þ ä 2 
10000 9 
> > > > > > > > > = 
> > > > > > > > > ;
 
4.5.6.4. Triacylglycerides with ECN42  
The following triglycerides with ECN42 are calculated according equa ­
tion 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only three peaks).
 
LLL 
PoLL and the positional isomer LPoL  
OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL  
PoPoL and the positional isomer PoLPo  
PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo  
PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL  
PoPoPo  
SLnLn and the positional isomer LnSLn  
PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn  
The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine 
triacylglycerols including their positional isomers. The results to be given with at least two decimal places.
 
5. Evaluation of the results  
The calculated theoretical content and the content determined by the 
HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data minus theoretical data is greater than the values states for the appropriate oil category in the Regulation, the sample contains seed oil.
 
Note:  Results are given to within one decimal figure.  
6. Example  (The numbers refer to the sections in the text of the method)  
4.5.1.  C a l c u l a t i o n o f m o l e s % f a t t y a c i d s f r o m G L C d a t a 
( a r e a % )  
The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:  
FA 
MW P 
256,4 S 
284,5 Po 
254,4 O 
282,5 L 
280,4 Ln 
278,4  
area % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 112
 
4.5.3.  C o n v e r s i o n o f a r e a % i n t o m o l e s f o r a l l f a t t y 
a c i d s  
moles P ¼ 10 
256; 4 ¼ 0; 03900 moles P  See formula (1)  
moles S ¼ 3 
284; 5 ¼ 0; 01054 moles S  See formula (1)  
moles Po ¼ 1 
254; 4 ¼ 0; 00393 moles Po  See formula (1)  
moles O ¼ 75 
282; 5 ¼ 0; 26549 moles O  See formula (1)  
moles L ¼ 10 
280; 4 ¼ 0; 03566 moles L  See formula (1)  
moles Ln ¼ 1 
278; 4 ¼ 0; 003594 moles Ln  See formula (1) 
Total = 0,35822 moles TAGs  
4.5.4. N o r m a l i z a t i o n o f f a t t y a c i d s t o 1 0 0 %  
moles % Pð1; 2; 3Þ ¼ 0; 03900 moles P ä 100 
0; 35822 moles ¼ 10; 888 %  See formula (2)  
moles % Sð1; 2; 3Þ ¼ 0; 01054 moles S ä 100 
0; 35822 moles ¼ 2; 944 %  See formula (2)  
moles % Poð1; 2; 3Þ ¼ 0; 00393 moles Po ä 100 
0; 35822 moles ¼ 1; 097 %  See formula (2)  
moles % Oð1; 2; 3Þ ¼ 0; 26549 moles O ä 100 
0; 35822 moles ¼ 74; 113 %  See formula (2)  
moles % Lð1; 2; 3Þ ¼ 0; 03566 moles L ä 100 
0; 35822 moles ¼ 9; 956 %  See formula (2)  
moles % Lnð1; 2; 3Þ ¼ 0; 00359 moles Ln ä 100 
0; 35822 moles ¼ 1; 003 %  See formula (2) 
Total moles % = 100,0 %  
Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of 
TAGs 
moles % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % See formula (3) 
moles % UFA = 100,000 % — 13,831 % = 86,169 % See formula (3)  
4.5.5. C a l c u l a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n i n 2 - a n d 
1 , 3 - p o s i t i o n s o f t h e T A G s  
4.5.5.1. Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] 
moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4) 
moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 113
 
4.5.5.2. Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln 
(1,3)]  
moles % Poð2Þ ¼ 1; 097 % 
86; 169 % ä ð100 Ä Ä 0; 659 Ä 0; 177Þ ¼ 1; 263 moles %  See formula (5)  
moles % Oð2Þ ¼ 74; 113 % 
86; 169 % ä ð100 Ä Ä 0; 659 Ä 0; 177Þ ¼ 85; 295 moles %  See formula (5)  
moles % Lð2Þ ¼ 9; 956 % 
86; 169 % ä ð100 Ä Ä 0; 659 Ä 0; 177Þ ¼ 11; 458 moles %  See formula (5)  
moles % Lnð2Þ ¼ 1; 003 % 
86; 169 % ä ð100 Ä Ä 0; 659 Ä 0; 177Þ ¼ 1; 154 moles %  See formula (5)  
4.5.5.3. Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and 
Ln(1,3)]  
moles % Pð1; 3Þ ¼ 10; 888 Ä 0; 659 
2 10; 888 ¼ 16; 005 moles %  See formula (6)  
moles % Sð1; 3Þ ¼ 2; 944 Ä 0; 177 
2 2; 944 ¼ 4; 327 moles %  See formula (6)  
moles % Poð1; 3Þ ¼ 1; 097 Ä 1; 263 
2 1; 097 ¼ 1; 015 moles %  See formula (6)  
moles % Oð1; 3Þ ¼ 74; 113 Ä 85; 295 
2 74; 113 ¼ 68; 522 moles %  See formula (6)  
moles % Lð1; 3Þ ¼ 9; 956 Ä 11; 458 
2 9; 956 ¼ 9; 205 moles %  See formula (6)  
moles % Lnð1; 3Þ ¼ 1; 003 Ä 1; 154 
2 1; 003 ¼ 0; 927 moles %  See formula (6)  
4.5.6. C a l c u l a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s  
From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions 
(see above):  
FA in 1,3-pos. 2-pos.  
P 16,005 % 0,653 % 
S 4,327 % 0,177 % 
Po 1,015 % 1,263 % O 68,522 % 85,295 % 
L 9,205 % 11,458 % 
Ln 0,927 % 1,154 % 
Sum 100,0 % 100,0 %
 
the following triacylglycerols are calculated:  
LLL 
PoPoPo  
PoLL with 1 positional isomer  
SLnLn with 1 positional isomer  
PoPoL with 1 positional isomer  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 114
 
PPoLn with 2 positional isomers  
OLLn with 2 positional isomers  
PLLn with 2 positional isomers  
PoOLn with 2 positional isomers.  
4.5.6.1. TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7)  
mol % LLL ¼ 9; 205 % ä 11; 458 % ä 9; 205 % 
10000  = 0,09708 mol LLL  
mol % PoPoPo ¼ 1; 015 % ä 1; 263 % ä 1; 015 % 
10000  = 0,00013 mol PoPoPo  
4.5.6.2. TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8)  
mol % PoLL þ LLPo ¼ 1; 015 % ä 11; 458 % ä 9; 205 % ä 2 
10000  = 0,02141  
mol % LPoL ¼ 9; 205 % ä 1; 263 % ä 9; 205 % 
10000  = 0,01070 
0,03211 mol PoLL  
mol % SLnLn þ LnLnS ¼ 4; 327 % ä 1; 154 % ä 0; 927 % ä 2 
10000  = 0,00093  
mol % LnSLn ¼ 0; 927 % ä 0; 177 % ä 0; 927 % 
10000  = 0,00002 
0,00095 mol SLnLn  
mol % PoPoL þ LPoPo ¼ 1; 015 % ä 1; 263 % ä 9; 205 % ä 2 
10000  = 0,00236  
mol % PoLPo ¼ 1; 015 % ä 11; 458 % ä 1; 015 % 
10000  = 0,00118 
0,00354 mol PoPoL  
4.5.6.3. TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) See formula (9)  
mol % PPoLn ¼ 16; 005 % ä 1; 263 % ä 0; 927 % ä 2 
10000  = 0,00375  
mol % LnPPo ¼ 0; 927 % ä 0; 653 % ä 1; 015 % ä 2 
10000  = 0,00012  
mol % PoLnP ¼ 1; 015 % ä 1; 154 % ä 16; 005 % ä 2 
10000  = 0,00375 
0,00762 mol PPoLn  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 115
 
mol % OLLn ¼ 68; 522 % ä 11; 458 % ä 0; 927 % ä 2 
10000  = 0,14577  
mol % LnOL ¼ 0; 927 % ä 85; 295 % ä 9; 205 % ä 2 
10000  = 0,14577  
mol % LLnO ¼ 9; 205 % ä 1; 154 % ä 68; 522 % ä 2 
10000  = 0,14577 
0,43671 mol OLLn  
mol % PLLn ¼ 16; 005 % ä 11; 458 % ä 0; 927 % ä 2 
10000  = 0,03400  
mol % LnPL ¼ 0; 927 % ä 0; 653 % ä 9; 205 % ä 2 
10000  = 0,00111  
mol % LLnP ¼ 9; 205 % ä 1; 154 % ä 16; 005 % ä 2 
10000  = 0,03400 
0,06911 mol PLLn  
mol % PoOLn ¼ 1; 015 % ä 85; 295 % ä 0; 927 % ä 2 
10000  = 0,01605  
mol % LnPoO ¼ 0; 927 % ä 1; 263 % ä 68; 522 % ä 2 
10000  = 0,01605  
mol % OLnPo ¼ 68; 522 % ä 1; 154 % ä 1; 015 % ä 2 
10000  = 0,01605 
0,04815 mol PoOLn 
ECN42 = 0,69540 mol TAGs  ▼M13  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 116
 
Obr. 1 : Graf log  α voči f (počet dvojitých väzieb)
  
Poznámka:  La = kyselina laurová; L = kyselina linolová; My = kyselina myristová; Ln = kyselina linolenová; P = 
kyselina palmitová; St = kyselina stearová; O = kyselina olejová.  ▼M14  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 117
 
Obr. 2 : sójový olej
  
Obr. 3 : Sójový olej/olivový olej 30/70
  ▼M14  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 118
 
Obr. 4 : Olivový olej
  ▼M14  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 119
 
ANNEX XIX  
DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY 
CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY  
1. OBJECT  
The procedure describes a method for the determination of aliphatic 
alcohols content in oils and fats.  
2. PRINCIPLE OF THE METHOD  
The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is sapo ­
nified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable 
matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethyl ­
silyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.
 
3. EQUIPMENT  
3.1. 250 ml round-bottomed flask fitted with a reflux condenser having 
ground-glass joints.  
3.2. 500 ml separating funnel.  
3.3. 250 ml round-bottomed flasks.  
3.4. Chromatographic tank for thin-layer chromatographic analysis, for glass 
plates of dimensions 20 x 20 cm.  
3.5. Ultraviolet lamp having a wavelength of 366 or 254 nm.  
3.6. 100 μl and 500 μl microsyringes.  
3.7. A cylindrical filter funnel with a G3 porous septum (porosity 15 to 
40 μm) of diameter approximately 2 cm and a depth of some 5 cm, 
with an attachment suitable for filtration under vacuum and a 12/21 male ground glass joint.
 
3.8. 50 ml vacuum conical flask with a 12/21 ground-glass female joint 
which can be fitted to the filter funnel (3.7).  
3.9. A 10 ml test tube with a tapering bottom and a sealing stopper.  
3.10. Gas chromatograph for use with a capillary column, and provided with 
a splitting system composed of:  
3.10.1. Thermostatic chamber for columns (column oven) to hold the tempera ­
ture desired with a precision of ± 1 °C.  
3.10.2. A temperature-adjustable injection unit with a persilanised glass vapori ­
sing element.  
3.10.3. A flame ionisation detector and converter-amplifier.  
3.10.4. Recorder-integrator for operation with the converter-amplifier (3.10.3), 
with response time not exceeding one second and with variable paper- 
speed.  
3.11. Glass or fused silica capillary column, of length 20 to 30 m, internal 
diameter 0,25 to 0,32 mm, with SE-52 or SE-54 liquid phase or equi ­
valent, with a film thickness between 0,10 and 0,30 μm. 
3.12. Microsyringe for gas chromatography, of 10 μl capacity with hardened 
needle.  
3.13. Analytical balance sensitive to 1 mg (with 0,1 mg display).  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 120
 
4. REAGENTS  
4.1. Potassium hydroxide, approximately 2 N ethanolic solution: 130 g 
potassium hydroxide (minimum concentration 85 %) is dissolved, with 
cooling, in 200 ml distilled water and then made up to one litre with ethanol. The solution should be stored in a well-stoppered opaque glass bottle.
 
4.2. Ethyl ether, pure for analysis.  
4.3. Anhydrous sodium sulphate, analytical purity.  
4.4. Glass plates coated with silica gel, without fluorescence indicator, thick ­
ness 0,25 mm (commercially available ready for use).  
4.5. Potassium hydroxide, approximately 0,2 N ethanolic solution; 13 g of 
potassium hydroxide are dissolved in 20 ml of distilled water and made 
up to one litre with ethanol.  
4.6. Benzene, for chromatography (see 5.2.2).  
4.7. Acetone, for chromatography (See 5.2.2).  
4.8. Hexane, for chromatography (see 5.2.2).  
4.9. Ethyl ether, for chromatography (see 5.2.2).  
4.10. Chloroform, for chromatography.  
4.11. Reference solution for thin-layer chromatography: cholesterol or phytos ­
terols, 5 % solution in chloroform.  
4.12. 0,2 % solution of 2', 7'-dichlorofluorescein in ethanol. Make slightly 
basic by adding a few drops of 2 N alcoholic potassium hydroxide 
solution.  
4.13. Anhydrous pyridine, for chromatography.  
4.14. Hexamethyl disilazane.  
4.15. Trimethylchlorosilane.  
4.16. Standard solutions of trimethylsilyl ethers of aliphatic alcohols from C  20 
to C  28 . They may be prepared from mixtures of pure alcohols at the time 
they are required for use.  
4.17. A 0,1 % (m/v) solution of 1-eicosanol in chloroform (internal standard).  
4.18. Carrier gas: hydrogen or helium, gas-chromatographic purity.  
4.19. Auxiliary gas: nitrogen, gas-chromatographic purity.  
5. PROCEDURE  
5.1. Preparation of the unsaponifiables  
5.1.1. Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, 
a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing 
a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For 
example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if 
olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil.
 
Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 
5 g of the dry filtered sample into the same flask.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 121
 
5.1.2. Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux 
condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, 
stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the 
condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to 
approximately 30 °C.
 
5.1.3. The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating 
funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl 
ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle 
(Note 1).
 
Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating 
funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the 
same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether.  
Note 1:  Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small 
quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.  
5.1.4. The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed 
with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives 
a neutral reaction.  
Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and 
filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed before ­
hand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl 
ether which are added to the total.  
5.1.5. Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight 
vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling 
in a desiccator.
 
5.2. Separation of alcoholic fractions  
5.2.1. Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed 
completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally 
placed in an oven at 100 °C for one hour.
 
Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until 
required for use (plates treated in this way must be used within 15 days).  
Note 2:  When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic 
fraction there is no need to treat the unsaponifiables with 
alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated 
distinctly from the sterol band.
 
5.2.2. Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-deve ­
loping chamber to a depth of approximately 1 cm (  1 ). 
Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour 
to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper 
dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank 
to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components.
 ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 122  
( 1 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be 
used to obtain distinct band separation.
 Note 3:  The developing solution must be replaced for each analysis in 
order to obtain reproducible developing conditions.  
5.2.3. An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chlo ­
roform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC 
plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned 
with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution 
(4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.
 
5.2.4. Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The 
ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Imme ­
diately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate.
 
The plate is then removed from the development chamber and the 
solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.
 
5.2.5. The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlo ­
rofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The 
aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the 
band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, 
together.
 
Note 4:  The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are 
to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.
 
5.2.6. Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place 
the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to 
the filter funnel.
 
Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 
10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the 
residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evapo ­
rate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool 
in a desiccator and weigh.
 
The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.  
5.3. Preparation of the trimethylsilyl ethers  
5.3.1. The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume 
(Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added 
to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption 
of moisture (Note 6).
 ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 123
 
Note 5:  Solutions which are ready for use are available commercially. 
Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethyl ­
silyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available.
 
Note 6:  The slight opalescence which may form is normal and does not 
cause any interference. The formation of a white floc or the 
appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.
 
5.3.2. Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the 
aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes 
at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.
 
5.4. Gas chromatography analysis  
5.4.1. Preliminary operations, column packing  
5.4.1.1. Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the 
injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly 
(tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the 
splitting system and of the recording system, etc.).
 
5.4.1.2. If the column is being used for the first time it is recommended that it 
should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through 
the capillary column and then the gas chromatography assembly is swit ­
ched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That tempera ­
ture is held for not less than two hours and then the assembly is brought 
to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the 
signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level 
contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connec ­
tions; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column.
 
Note 7:  The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than 
the maximum temperature contemplated for the liquid phase 
employed.  
5.4.2. Choice of operating conditions  
5.4.2.1. The guideline operating conditions are as follows:  
— column temperature: the initial isotherm is set at 180 °C for eight 
minutes and then programmed at 5 °C/minute to 260 °C and a further 
15 minutes at 260 °C,  
— temperature of evaporator: 280 °C,  
— temperature of detector: 290 °C,  
— linear velocity of carrier gas: helium 20 to 35 cm/s, hydrogen 30 to 
50 cm/s,  
— splitting ratio: 1:50 to 1:100,  
— sensitivity of instrument: 4 to 16 times the minimum attenuation,  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 124
 
— sensitivity of recording: 1 to 2 mV fs,  
— paper speed: 30 to 60 cm/h,  
— quantity of substance injected: 0,5 to 1 μl of TMSE solution.  
The above conditions may be modified according to the characteristics of 
the column and of the gas chromatograph to obtain chromatograms satisfying the following conditions:
 
— alcohol C  26 retention time shall be 18 ± 5 minutes,  
— the alcohol C  22 peak shall be 80 ± 20 % of the full scale value for 
olive oil and 40 ± 20 % of the full scale value for seed oil.  
5.4.2.2. The above requirements are checked by repeated injection of the stan ­
dard TMSE mixture of alcohols and the operating conditions are adjusted to yield the best possible results.
 
5.4.2.3. The parameters for the integration of peaks shall be set so that a correct 
appraisal of the areas of the peaks considered is obtained.  
5.4.3. Analytical procedure  
5.4.3.1. Using the microsyringe of 10 μl capacity draw in 1 μl of hexane 
followed by 0,5 μl of air and subsequently 0,5 to 1 μl of the sample 
solution; raise the plunger of the syringe further so the needle is emptied. Push the needle through the membrane of the injection unit and after one 
to two seconds inject rapidly, then slowly remove the needle after some 
five seconds.
 
5.4.3.2. Recording is effected until the TMSE of the aliphatic alcohols present 
have been eluted completely. The base line shall always correspond to the requirements of 5.4.1.2.
 
5.4.4. Peak identification  
The identification of individual peaks is effected according to the reten ­
tion times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.
 
A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown 
in Figure 1.  
5.4.5. Quantitative evaluation  
5.4.5.1. The peak areas of 1-eicosanol and of the aliphatic alcohols C  22 , C 24 , C 26 
and C  28 are calculated by electronic integration.  
5.4.5.2. The contents of each aliphatic alcohol, expressed in mg/1 000 g fatty 
substance, are calculated as follows:
  
where:  
A x = area of the alcohol peak x  
A s = area of 1-eicosanol  
m s = mass of 1-eicosanol in milligrams  
m = mass of sample drawn for determination, in grams.  
6. EXPRESSION OF THE RESULTS  
The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty 
substance and the sum of the ‘total aliphatic alcohols’ are reported.  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 125
 
APPENDIX  
Determination of the linear velocity of the gas  
1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at 
normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.
 
The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column 
in centimetres and tM is the measured time in seconds.
  
Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil  
1 = Eicosanol  
2 = Decosanol  
3 = Tricosanol  
4 = Tetracosanol  
5 = Pentacosanol  
6 = Hexacosanol  
7 = Heptacosanol  
8 = Octacosanol  ▼M19  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 126
 
PRÍLOHA XX  
Metóda na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín 
a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou  
1. ÚČEL 
Účelom tejto metódy je stanovenie obsahu voskov, metylesterov mast ­
ných kyselín a etylesterov mastných kyselín v olivových olejoch. Jednot ­
livé vosky a alkylestery sa oddelia pod ľa počtu atómov uhlíka. Metóda sa 
odporúča ako nástroj na rozlíšenie olivového oleja a oleja z olivových 
výliskov, ako aj kvalitatívny parameter extra panenských olivových olejov, ktorým sa umož ňuje detekcia falšovanej zmesi extra panenských 
olivových olejov s olejmi nižšej kvality, či už sú to panenské, lampantové 
oleje alebo niektoré oleje zbavené zápachu.
 
2. PRINCÍP METÓDY  
Pridanie vhodného vnútorného štandardu k oleju a následná frakcionácia 
chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie 
eluovanej za skúšobných podmienok (ktorej polarita je nižšia ako polarita 
triglyceridov) a následná priama analýza kapilárnou plynovou chromato ­
grafiou.  
3. PRÍSTROJE  
3.1. Erlenmeyerova banka, 25 ml.  
3.2. Sklená kolóna  na kvapalinovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 
15 mm, d ĺžkou 30 až 40 cm vybavená vhodným kohútikom.  
3.3. Plynový chromatograf  vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vyba ­
vený systémom priamej injektáže na kolónu (tzv. technika on-column), ktorého sú časťou sú:
 
3.3.1.  Pec regulovaná termostatom s programovate ľnou teplotou.  
3.3.2.  Studený injektor  na priamu injektáž na kolónu.  
3.3.3.  Plameňový ioniza čný detektor a zariadenie na prevod a zosilnenie 
signálu.  
3.3.4.  Zapisova č-integrátor  (poznámka 1) na použitie so zariadením na prevod 
a zosilnenie signálu (bod 3.3.3), s časovou odozvou nepresahujúcou 1 
sekundu a s rôznymi rýchlos ťami posunu papiera.  
Poznámka 1:  Môžu sa používa ť aj automatizované systémy, ktoré umož ­ 
ňujú zadávanie údajov z plynovej chromatografie prostred ­
níctvom osobného po čítača. 
3.3.5.  Kapilárna kolóna, tavený kreme ň (na analýzu voskov a metyl- 
a etylesterov) , dĺžka 8 až 12 m, vnútorný priemer 0,25 až 0,32 mm, 
z vnútornej strany pokrytá kvapalnou fázou (poznámka 2) s homogénnou hrúbkou 0,10 až 0,30 μm.
 
Poznámka 2:  Na tieto ú čely sú dostupné vhodné komer čné kvapalné fázy 
ako SE52, SE54 at ď. 
3.4. Mikrostrieka čka s kapacitou 10 μl na priamu injektáž na kolónu, vyba ­
vená cementovanou ihlou.  
3.5. Elektrická mieša čka. 
3.6. Rotačná odparka.  
3.7. Mufľová pec.  
3.8. Analytické  váhy s presnos ťou merania na ± 0,1 mg.  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 127
 
3.9. Bežné laboratórne sklo.  
4. ČINIDLÁ  
4.1. Silikagél , veľkosť zrna 60 až 200 μm. Vložte silikagél do muf ľovej pece 
na 500 °C aspo ň na 4 hodiny. Po vychladnutí pridajte 2 % vody 
vzhľadom na množstvo použitého silikagélu. Dobre pretrepte, aby sa 
hmota homogenizovala, a pred použitím uchovávajte v suši čke najmenej 
počas 12 hodín.  
4.2. n-hexán , na chromatografiu alebo analýzu zvyškov ( čistota musí by ť 
overená).  
VAROVANIE – Výpary sa môžu vznieti ť. Chráňte pred zdrojom tepla, 
iskrami alebo otvoreným oh ňom. Uistite sa, že f ľaše sú vždy dobre uzat ­
vorené. Po čas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Zabrá ňte hromadeniu 
výparov a odstrá ňte všetky prí činy možného vzniku požiaru, ako sú 
ohrievacie telesá alebo elektrické zariadenia, ktoré nie sú vyrobené 
z nehorľavého materiálu. Vdýchnutie je škodlivé, lebo môže spôsobi ť 
poškodenie nervových buniek. Zabrá ňte vdýchnutiu výparov. V prípade 
potreby použite vhodný dýchací prístroj. Zabrá ňte kontaktu s o čami 
a pokožkou.  
4.3. Dietyléter, na chromatografiu.  
VAROVANIE – Vysokohor ľavý a mierne toxický. Dráždi pokožku. 
Vdýchnutie je škodlivé. Môže spôsobi ť poškodenie o čí. Môže ma ť 
oneskorené ú činky. Môže vytvára ť výbušné peroxidy. Výpary sa môžu 
vznietiť. Chráňte pred zdrojom tepla, iskrami alebo otvoreným oh ňom. 
Uistite sa, že f ľaše sú vždy dobre uzatvorené. Po čas použitia zaistite 
riadnu ventiláciu. Zabrá ňte hromadeniu výparov a odstrá ňte všetky 
príčiny možného vzniku požiaru, ako sú ohrievacie telesá alebo elektrické 
zariadenia, ktoré nie sú vyrobené z nehor ľavého materiálu. Neodparujete 
dosucha ani takmer dosucha. Pridaním vody alebo vhodného reduk čného 
činidla možno zníži ť tvorbu peroxidov. Nepite. Zabrá ňte vdýchnutiu 
výparov. Zabrá ňte dlhotrvajúcemu alebo opakovanému kontaktu 
s pokožkou.  
4.4. n-heptán , na chromatografiu alebo  izo-oktán . 
VAROVANIE – Vznetlivý. Vdýchnutie je škodlivé. Chrá ňte pred 
zdrojom tepla, iskrami alebo otvoreným oh ňom. Uistite sa, že f ľaše sú 
vždy dobre uzatvorené. Po čas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Zabrá ňte 
vdýchnutiu výparov. Zabrá ňte dlhotrvajúcemu alebo opakovanému 
kontaktu s pokožkou.  
4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu  (poznámka 3 ) s koncentráciou 
0,05 % (m/V) v heptáne (vnútorný štandard pre vosky).  
Poznámka 3:  Možno použi ť aj palmityl-palmitát, myristyl-stearát alebo 
aršidyl-laureát.  
4.6. Štandardný roztok metyl-heptadekanoátu s koncentráciou 0,02 % 
(m/V) v heptáne (vnútorný štandard pre metyl- a etylestery).  
4.7. Sudán 1 [1-(fenyldiazenyl)naftalén-2-ol].  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 128
 
4.8. Nosný plyn: vodík alebo hélium, čistý, na plynovú chromatografiu.  
VAROVANIE  
Vodík.  Vysokohor ľavý, pod tlakom. Chrá ňte pred zdrojom tepla, iskrami, 
otvoreným oh ňom alebo elektrickými zariadeniami, ktoré nie sú vyrobené 
z nehorľavého materiálu. Uistite sa, že ventil f ľaše je uzavretý, ke ď sa 
nepoužíva. Vždy používajte s reduk čným ventilom. Uvo ľnite napätie 
redukčnej pružiny pred otvorením ventilu f ľaše. Pri otváraní ventilu 
nestojte pred výpustným otvorom f ľaše. Počas použitia zaistite riadnu 
ventiláciu. Neprepúš ťajte vodík z jednej f ľaše do druhej. Nemiešajte 
plyn vo f ľaši. Uistite sa, že f ľaše sa nemôžu prevrhnú ť. Chráňte ich 
pred slne čným žiarením a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom 
prostredí. Nepoužívajte poškodené alebo neozna čené fľaše. 
Hélium.  Vysokostla čený plyn. Znižuje množstvo kyslíka, ktoré je 
k dispozícii na dýchanie. F ľaše udržiavajte uzatvorené. Po čas použitia 
zaistite riadnu ventiláciu. Nevstupujte do skladovacích priestorov, ak 
nie sú riadne vetrané. Vždy používajte s reduk čným ventilom. Uvo ľnite 
napätie reduk čnej pružiny pred otvorením ventilu f ľaše. Neprepúš ťajte 
plyn z jednej f ľaše do druhej. Uistite sa, že f ľaše sa nemôžu prevrhnú ť. 
Pri otváraní ventilu nestojte pred výpustným otvorom f ľaše. Chrá ňte ich 
pred slne čným žiarením a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom 
prostredí. Nepoužívajte poškodené alebo neozna čené fľaše. Nevdychujte. 
Používajte výhradne na technické ú čely. 
4.9. Pomocné plyny : 
— Vodík, čistý, na plynovú chromatografiu.  
— Vzduch, čistý, na plynovú chromatografiu.  
VAROVANIE  
Vzduch.  Vysokostla čený plyn. V prítomnosti hor ľavých látok používajte 
opatrne, ke ďže teplota samovznietenia vä čšiny organických zložiek 
vzduchu je výrazne nižšia pod vysokým tlakom. Uistite sa, že ventil fľaše je uzavretý, ke ď sa nepoužíva. Vždy používajte s reduk čným 
ventilom. Uvo ľnite napätie reduk čnej pružiny pred otvorením ventilu 
fľaše. Pri otváraní ventilu nestojte pred výpustným otvorom f ľaše. Nepre ­
púšťajte plyn z jednej f ľaše do druhej. Nemiešajte plyn vo f ľaši. Uistite 
sa, že fľaše sa nemôžu prevrhnú ť. Chráňte ich pred slne čným žiarením 
a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom prostredí. Nepoužívajte poško ­
dené alebo neozna čené fľaše. Vzduch na technické ú čely sa nesmie 
používať na vdychovanie ani v dýchacích prístrojoch.
 
5. POSTUP  
5.1. Príprava chromatografickej kolóny  
Preveďte do suspenzie 15 g silikagélu (bod 4.1) v n-hexáne (bod 4.2) 
a zaveďte do kolóny (bod 3.2). Nechajte samovo ľne usadiť. Usadzovanie 
dokončite pomocou elektrickej trepa čky s cieľom dosiahnu ť homogén ­
nejšiu chromatografickú vrstvu. Premyte 30 ml n-hexánu s cie ľom 
odstrániť všetky prípadné ne čistoty. Analytickými váhami (bod 3.8) 
navážte presne 500 mg vzorky do 25 ml banky (bod 3.1) a pridajte 
vhodné množstvo vnútorného štandardu (bod 4.5) v závislosti od pred ­
pokladaného obsahu vosku, napríklad pridajte 0,1 mg laurylarašidátu v prípade olivového oleja, 0,25 až 0,50 mg v prípade oleja z olivových 
výliskov a 0,05 mg metyl-heptadekanoátu v prípade olivových olejov 
(bod 4.6).
 ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 129
 
Pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny pomocou dvoch 
2-ml dávok n-hexánu (bod 4.2).  
Napustite rozpúš ťadlo do výšky 1 mm nad hornou úrov ňou absorbentu. 
Premyte ďalším roztokom n-hexánu/dietyléteru v pomere 99:1 a zachy ťte 
220 ml roztoku pri prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. 
(Táto frakcia obsahuje metyl- a etylestery a vosky ). (Poznámka 4 ) 
(Poznámka 5 ). 
Poznámka 4:  Zmes n-hexánu/dietyléteru (99:1) by sa mala každý de ň 
čerstvo pripravi ť. 
Poznámka 5:  Na umožnenie vizuálnej kontroly správnej elúcie voskov 
možno do vzorky roztoku prida ť 100 μl 1 % farbiva 
Sudan I v elu čnej zmesi.  
Retenčný čas uvedeného farbiva sa nachádza medzi 
retenčným časom voskov a triglyceridov. Preto ke ď farbivo 
dosiahne dno chromatografickej kolóny, je potrebné elúciu zastaviť, lebo všetky vosky už boli eluované.
 
Sušte výslednú frakciu v rota čnej odparke až do odstránenia takmer 
celého rozpúš ťadla. Odstrá ňte posledné 2 ml pomocou slabého prúdu 
dusíka. Frakcia obsahujúca metyl- a etylestery sa zachytáva v 2 až 4 ml n-heptánu alebo izo-oktánu ako rozpúš ťadla.
 
5.2. Plynová chromatografická analýza  
5.2.1.  Postup prípravy  
Namontujte kolónu do plynového chromatografu (bod 3.3), pri čom 
vstupný port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte prístroj na plynovú chromatografiu ( činnosť 
uzavretých plynových obvodov, ú činnosť detektora a zapisova ča atď.).
 
Pokiaľ sa kolóna používa po prvýkrát, je potrebné ju kondicionova ť. 
Zaveďte mierny prietok plynu cez kolónu a potom zapnite prístroj na 
plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 
hodinách dosiahne teplota 350 °C.  
Túto teplotu udržiavajte najmenej po čas 2 hodín, potom prístroj nastavte 
na prevádzkové podmienky [nastavte prietok plynu, zapá ľte plamienok, 
pripojte k elektrickému zapisova ču (bod 3.3.4), nastavte teplotu pece pre 
kolónu, nastavte detektor at ď.]. Zapíšte signál pri citlivosti najmenej 
dvakrát vyššej, ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná línia by mala by ť lineárna, nesmie obsahova ť píky žiadneho druhu a nesmie 
vykazova ť žiadnu nestabilitu (drift).
 
Záporný priamo čiary drift indikuje nedokonalú tesnos ť spojov kolóny, 
kým kladný drift indikuje nedostato čné kondiciovanie kolóny.  
5.2.2.  Výber prevádzkových podmienok v prípade voskov a metyl- a etylesterov 
(poznámka 6)  
Prevádzkové podmienky sú spravidla tieto:  
— Teplota kolóny: 
20 °C/min 5 °C/min  
80 °C po čiatočná teplota (1 ′)
 140 °C
  335 °C (20)  
— Teplota detektora: 350 °C.  
— Injektované množstvo: 1 μl roztoku n-heptánu (2 až 4 ml).  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 130
 
— Nosný plyn: hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlos ťou 
pre zvolený plyn (pozri dodatok A).  
— Citlivos ť prístroja: vhodná na splnenie uvedených podmienok.  
Poznámka 6:  Vzhľadom na vysokú kone čnú teplotu sa pripúš ťa kladný 
drift, ktorý nesmie prekro čiť 10 % rozsahu stupnice.  
Uvedené podmienky možno upravi ť tak, aby vyhovovali charakteristikám 
kolóny a prístroju na plynovú chromatografiu, a to s cie ľom oddeli ť 
všetky vosky a metylestery mastných kyselín a etylestery mastných kyselín, ako aj získa ť uspokojivú separáciu píkov (pozri obrázky 2, 3 
a 4) a reten čný čas 18 ± 3 min. pre vnútorný štandard laurylarašidátu. 
Najreprezentatívnejší pík voskov sa musí nachádza ť nad 60 % rozsahu 
stupnice, zatia ľ čo pík metyl-heptadekanoátu – vnútorný štandard pre 
metyl- a etylestery musí dosiahnu ť plný rozsah stupnice.
 
Parametre integrácie píku by sa mali ur čiť tak, aby sa dosiahlo správne 
vyhodnotenie príslušných plôch píkov.  
5.3. Vykonanie analýzy  
Pomocou 10 μl mikrostrieka čky naberte 10 μl roztoku, pri čom piestik 
ťahajte dozadu až dovtedy, kým ihla nebude prázdna. Ihlu zave ďte do 
injekčného systému a po uplynutí 1 až 2 sekúnd rýchlo vstreknite. Po asi 
5 sekundách ihlu jemne vytiahnite.  
Zápis nechajte prebieha ť dovtedy, kým vosky alebo stigmastadiény 
nebudú úplne eluované v závislosti od analyzovanej frakcie.  
Základná línia musí vždy zodpoveda ť požadovaným podmienkam.  
5.4. Identifikácia píku  
Píky identifikujte z reten čných časov ich porovnaním so zmesami voskov 
so známymi reten čnými časmi analyzovanými za rovnakých podmienok. 
Alkylestery sa stanovujú zo zmesí metylesterov a etylesterov hlavných mastných kyselín v olivových olejoch (palmitovej a olejovej).
 
Na obrázku 1 je znázornený chromatogram voskov panenského olivového 
oleja. Na obrázkoch 2 a 3 sú znázornené chromatogramy dvoch maloob ­
chodne predávaných extra panenských olivových olejov, jedného 
s metylestermi a etylestermi a druhého bez nich. Na obrázku 4 sú znázor ­
nené chromatogramy v prípade extra panenského olivového oleja najvyššej kvality a toho istého oleja, ku ktorému sa primiešalo 20 % oleja zbaveného zápachu.
 
5.5. Kvantitatívna analýza voskov  
Pomocou integrátora ur číte plochy píkov zodpovedajúce vnútornému 
štandardu laurylarašidátu a alifatickým esterom od C  40 do C  46 . 
Určíte obsah všetkých voskov pripo čítaním každého jednotlivého vosku 
v mg/kg tuku pod ľa tohto vzorca: 
Vosky ; ðmg=kgÞ ¼ ðΣA x Þ·m s ·1000 
A s ·m ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 131
 
kde: 
A x = plocha zodpovedajúca píku pre jednotlivé estery, vypo čítaná 
pomocou po čítača 
A s = plocha zodpovedajúca píku pre vnútorný štandard laurylarašidátu, 
vypočítaná pomocou po čítača 
m s = hmotnos ť pridaného vnútornému štandardu laurylarašidátu, 
v miligramoch  
m = hmotnos ť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch.  
5.5.1.  Kvantitatívna analýza metylesterov a etylesterov  
Pomocou integrátora ur číte plochy píkov zodpovedajúce vnútornému štan ­
dardu metyl-heptadekanoátu, metylesterov mastných kyselín C  16 a C  18 
a etylesterov mastných kyselín C  16 a C  18 . 
Obsah alkylesterov v mg/kg tuku ur číte takto: 
Ester ; ðmg=kgÞ ¼ A x ·m s: ·1000 
A s ·m 
kde: 
A x = plocha zodpovedajúca píku pre jednotlivé estery C  16 a C  18 , vypo­ 
čítaná pomocou po čítača 
A s = plocha zodpovedajúca píku pre vnútorný štandard 
metyl-heptadekanoátu, vypo čítaná pomocou po čítača 
m s = hmotnos ť pridaného vnútornému štandardu metyl-heptadekanoátu, 
v miligramoch  
m = hmotnos ť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch.  
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV  
V správe uve ďte súčet obsahov rôznych voskov od C  40 do C  46 (poznámka 
7) v miligramoch na kilogram tuku.  
V správe uve ďte súčet obsahov metylesterov a etylesterov od C  16 do C  18 
a celkový sú čet oboch.  
Výsledky by sa mali vyjadri ť v najbližších mg/kg.  
Poznámka 7:  Prvky kvantitatívneho hodnotenia sa vz ťahujú na píky 
esterov s párnym po čtom atómov uhlíka medzi C  40 a C  46 
v súlade so vzorom chromatogramu voskov olivového oleja 
znázorneným na pripojenom obrázku. Pokia ľ sa ester C  46 
rozštiepi, na ú čely identifikácie sa odporú ča analyzova ť 
frakciu vosku oleja z olivových výliskov, kde možno pík C
 46 rozlíšiť, lebo zrete ľne prevláda.  
V správe uve ďte pomer obsahov etylesterov a metylesterov  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 132
 
Obrázok 1  
Príklad plynového chromatogramu frakcie voskov v olivovom oleji  ( 1 )
 
Píky s reten čným časom 5 až 8 min. metyl- a etylesterov mastných kyselín  
Legenda:  
I.S. = (vnútorný štandard – V.S.) laurylarašidát  
1 = diterpénové estery  
2+2′ = estery C  40 
3+3′ = estery C  42 
4+4′ = estery C  44 
5 = estery C  46 
6 = sterol-estery a triterpénové alkoholy  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 133  
( 1 ) Po elúcii sterol-esterov by chromatografický záznam nemal vykazova ť žiadne významné píky (triglyceridy).
 Obrázok 2  
Metylestery, etylestery a vosky v panenskom olivovom oleji
  
Legenda:  
1 – Metyl C  16 
2 – Etyl C  16 
3 – Metyl-heptadekanoát V.S.  
4 – Metyl C  18 
5 – Etyl C  18 
6 – Skvalén  
7 – Laurylarašidát V.S.  
A – Diterpénové estery  
B – Vosky  
C – Sterol-estery a triterpénové estery  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 134
 
Obrázok 3  
Metylestery, etylestery a vosky v extra panenskom olivovom oleji
  
Legenda:  
1 – Metyl-heptadekanoát V.S.  
2 – Metyl C  18 
3 – Etyl C  18 
4 – Skvalén  
5 – Laurylarašidát V.S.  
A – Diterpénové estery  
B – Vosky  
C – Sterol-estery a triterpénové estery  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 135
 
Obrázok 4  
Časť chromatogramu extra panenského olivového oleja a toho istého oleja, ku ktorému sa 
primiešal olej zbavený zápachu
  
Legenda:  
1 – Metyl-myristát V.S.  
2 – Metyl-palmitát  
3 – Etyl-palmitát  
4 – Metyl-heptadekanoát V.S.  
5 – Metyl-linoleát  
6 – Metyl-oleát  
7 – Metyl-stearát  
8 – Etyl-linoleát  
9 – Etyl oleát  
10 – Etyl-stearát  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 136
 
Dodatok A  
Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu  
Vstreknite 1:3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu po jeho 
nastavení na bežné prevádzkové podmienky. Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn 
na prechod cez kolónu od momentu jeho vstreknutia až do času, keď sa objaví 
pík (tM).  
Lineárna rýchlos ť v cm/s je daná vzorcom L/tM, kde L je d ĺžka kolóny v cm 
a tM je čas nameraný v sekundách.  ▼M23  1991R2568 — SK — 01.04.2011 — 023.001 — 137