A)

Blokujúci alebo kompetitívny test ELISA sa vykonáva podľa tohto protokolu: Kompetitívnym testom ELISA s použitím monoklonnej protilátky 3-17-A3 možno identifikovať protilátky na všetky známe sérotypy vírusu katarálnej horúčky oviec (BTV). Test spočíva v prerušení reakcie medzi antigénom BTV a skupinovo špecifickou monoklonnou protilátkou (3-17-A3) tým, že sa pridá testové sérum. Protilátky na BTV, ktoré sú v testovom sére prítomné, blokujú reaktívnosť monoklonnej protilátky (Mab), v dôsledku čoho sa obmedzí predpokladaná zmena farby po pridaní enzýmom označenej protilátky proti myšiam a chromogénu/substrátu. Séra možno testovať pri jednoduchom zriedení 1:5 (škvrnový test – dodatok 1) alebo ich možno titrovať (sérová titrácia – dodatok 2), až kým sa nedosiahne koncový bod zriedenia. Inhibičné hodnoty vyššie než 50 % je možné považovať za pozitívne. Materiál a činidlá: 1. Príslušné mikrotitračné platničky na test ELISA. 2. Antigén: dodaný vo forme koncentrátu získaného z buniek pripraveného podľa opisu uvedeného ďalej a skladovaného pri teplote buď – 20 °C alebo – 70 °C. 3. Blokujúci pufrovaný roztok: fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) obsahujúci 0,3 % BTV negatívneho séra z dospelých jedincov hovädzieho dobytka, 0,1 % (v/v) Tween-20 (dodaného vo forme polyoxyetylénsorbitonmonolauranového sirupu) v PBS. 4. Monoklonná protilátka: 3-17-A3 (dodaná vo forme hybridomového supernatantu tkanivovej kultúry) nasmerovaná proti skupinovo špecifickému polypeptidu VP7, skladovaná pri teplote – 20 °C alebo zmrazením vysušená a pred použitím zrieďovaná v pomere 1:100 blokujúcim pufrovaným roztokom. 5. Konjugát: králičí globulín proti myšiam (adsorbovaný a vyluhovaný) konjugovaný s peroxidázou chrenu a uchovávaný na tmavom mieste pri teplote 4 °C. 6. Chromogén a substrát: ortofenyléndiamín (OPD-chromogén) s konečnou koncentráciou 0,44 mg/ml v sterilnej destilovanej vode. Peroxid vodíka (30 % w/v-substrát) 0,05 % v/v pridaný bezprostredne pred použitím (5μl H2O2 na 10 ml OPD). (S OPD manipulujte opatrne – s gumovými rukavicami na rukách – môže ísť o mutagén). 7. 1 molárna kyselina sírová: 26,6 ml kyseliny sa pridá do 473,4 ml destilovanej vody. (nezabudnite – vždy pridávajte kyselinu do vody, nikdy nie vodu do kyseliny.) 8. Kruhová trepačka. 9. Vyhodnocovač platničky ELISA (test možno vyhodnotiť vizuálne). Formát testu Cc: kontrola konjugátu (bez séra/bez monoklonnej protilátky); C++: silne pozitívna kontrola séra; C++: slabo pozitívna kontrola séra; C-: negatívna kontrola séra; Cm: kontrolna monoklonnej protilátky (bez séra).



DODATOK 1 Zriedenie na škvrnový test (1:5) formát (40 sér/platnička) Kontroly Testové séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



DODATOK 2 Formát sérovej titrácie (10 sér/platnička) Kontroly Testové séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protokol o teste: Kontrola konjugátu (Cc) : Jamky 1A a 1B sú slepá kontrola pozostávajúca z antigénu BTV a konjugátu. To možno použiť na kalibráciu vyhodnocovača testu ELISA. Kontrola Mab (Cm) : Stĺpce 1 a 2, rady G a H sú kontrola monoklonnej protilátky a obsahujú antigén BTV, monoklonnú protilátku a konjugát. Tieto jamky predstavujú maximálne zafarbenie. Stredná hodnota optickej hustoty hodnôt zistených z tejto kontroly predstavuje 0 %-nú hodnotu inhibície. Pozitívna kontrola (C++, C+) : Stĺpce 1 a 2, riadky C-D-E-F. Tieto jamky obsahujú antigén BTV, silné a slabé pozitívne sérum BTV v uvedenom poradí, Mab a konjugát. Negatívna kontrola (C–) : Jamky 2A a 2B sú negatívne kontroly, ktoré obsahujú antigén BTV, negatívne antisérum BTV, Mab a konjugát. Testové séra : V prípade rozsiahlych sérologických prieskumov a rýchleho skríningu sa séra môžu testovať pri jednoduchom zriedení 1:5 (Dodatok 1). Alebo možno testovať 10 sér pri zriedení v rozsahu od 1:5 ku 1:640 (Dodatok 2). Takto sa získajú určité údaje o titre protilátky v testovom sére. Postup: 1. V PBS zrieďte antigén BTV na predtitrovanú koncentráciu, krátko previbrujte ultrazvukom, aby sa rozptýlil zhluk vírusu (pokiaľ nie je k dispozícii ultrazvukový prístroj, silne pipetujte) a pridajte 50 μl do všetkých jamiek platničky na test ELISA. Poklopte boky platničky, aby sa rozptýlil antigén. 2. Inkubujte 60 minút pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. Platničky umyte trikrát vypláchnutím jamiek nesterilným PBS a usušte na absorpčnom papieri. 3. Jamky s kontrolou: do jamiek Cc pridajte 100 μl blokujúceho pufrovaného roztoku. Do príslušných jamiek C–, C+ a C++ pridajte 50 μl pozitívneho a negatívneho kontrolného séra pri zriedení 1:5 (10 μl séra + 40 μl blokujúceho pufrovaného roztoku). Do jamiek s kontrolou Mab pridajte 50 μl blokujúceho pufrovaného roztoku. Metóda titrácie pri škvrnovom teste: Do blokujúceho pufrovaného roztoku pridajte každé z testových sér zriedené v pomere 1:5, aby sa zdvojili jamky v stĺpcoch 3 až 12 (10 μl séra + 40 μl blokujúceho pufrovaného roztoku) alebo metóda sérovej titrácie: V blokujúcom pufrovanom roztoku pripravte dve série zriedení každej z testových vzoriek (1:5 až 1:640) cez osem jamiek jednotlivých stĺpcov 3 až 12. 4. Bezprostredne po pridaní testového séra zrieďte Mab 1:100 v blokujúcom pufrovanom roztoku a pridajte 50 μl do všetkých jamiek platničky okrem tých, ktoré obsahujú slepú kontrolu. 5. Inkubujte 60 minút pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. Trikrát umyte s použitím PBS a vysušte. 6. Králičí koncentrát proti myšiam zrieďte na 1/5000 v blokujúcom pufrovanom roztoku a pridajte 50 μl do všetkých jamiek platničky. 7. Inkubujte 60 minút pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. Trikrát umyte s použitím PBS a vysušte. 8. Nechajte roztopiť O-fenyléndiamín dihydrochorid (OPD) a bezprostredne pred použitím pridajte 5 μl 30 %-ného peroxidu vodíka do každých 10 ml OPD. Pridajte 50 μl do všetkých jamiek platničky. Nechajte meniť farbu približne 10 minút a reakciu zastavte 1 molárnou kyselinou sírovou (50 μl na jednu jamku). Farba by sa mala meniť v jamkách obsahujúcich kontroly Mab, ako aj v tých, ktoré obsahujú séra bez protilátky na BTV. 9. Platničky preskúmajte a výsledok zaznamenajte buď vizuálne alebo pomocou spektrofotometra. Analýza výsledkov: S použitím softvéru vytlačte hodnoty optickej hustoty (OD) a percentuálnu inhibíciu (PI) v prípade testových a kontrolných sér založené na strednej hodnote, ktorá sa zaznamenala v jamkách obsahujúcich kontrolu antigénu. Údaje vyjadrené ako hodnoty OD a PI sa používajú na to, aby sa určilo, či sa výsledky testu pohybujú v prijateľných medziach. Horná hranica kontroly (UCL) a dolná hranica kontroly (LCL) v prípade kontroly Mab (antigén plus Mab, ak sa nepoužijú testové séra) sa pohybujú v rozmedzí hodnôt OD 0,4 až 1,4. Každá platnička, pri ktorej sa ukáže, že nevyhovuje uvedeným kritériám, sa musí odmietnuť. Pokiaľ počítačový softvér nie je k dispozícii, vytlačte hodnoty OD na tlačiarni ELISA. Stanovte strednú hodnotu OD pre jamky obsahujúce kontrolu antigénu, ktorá sa rovná 100 %-nej hodnote. Stanovte 50 %-nú hodnotu OD a manuálne vypočítajte pozitívnosť a negatívnosť každej vzorky. Percentuálna hodnota inhibície = 100 – (OD každej testovej kontroly/stredná hodnota OD Cm) × 100. Zdvojené jamky s negatívnym kontrolným sérom a zdvojené jamky so slepou vzorkou musia dosiahnuť hodnoty PI v rozmedzí + 25 % až – 25 % v prípade negatívneho kontrolného séra a + 95 % až + 105 % v prípade slepej vzorky. Ak sa hodnoty pohybujú mimo týchto hraníc, neznamená to, že je výsledok nesprávny, ale vyjadruje, že sa podkladová farba vyvíja. V prípade silných a slabých pozitívnych sér sa zaznamenané hodnoty PI musia pohybovať v rozmedzí + 81 % až + 100 % v prípade silných pozitívnych sér, resp. v rozmedzí + 51 % až + 80 % v prípade slabých pozitívnych sér. Diagnostická prahová hodnota pre testové séra je 50 % (PI 50 % alebo OD 50 %). Vzorky so zaznamenanými hodnotami PI >50 % sa zaznamenajú ako negatívne. Vzorky, v prípade ktorých sa zaznamenali hodnoty PI vyššie alebo nižšie ako je prahová hodnota pre zdvojené jamky, sa považujú za vzorky vyvolávajúce pochybnosti; takého vzorky je možné opätovne podrobiť škvrnovému testu a/alebo titrácii. Pozitívne vzorky je možné tiež titrovať na stanovenie stupňa pozitivity. Vizuálne vyhodnotenie: Pozitívne a negatívne vzorky ľahko rozoznať voľným okom; slabo pozitívne alebo silne negatívne vzorky možno voľným okom posúdiť ťažšie. Titrácia antigénu BTV ELISA: 1. Trikrát umyte 40 – 60 radov súbežných buniek BKH-21 Eaglovým médiom bez obsahu séra a infikujte vírusom katarálnej horúčky oviec sérotypu 1 Eaglovo médium bez obsahu séra. 2. Inkubujte pri teplote 37 °C a každý deň skúmajte cytopatický účinok (CPE). 3. Keď je CPE zavŕšený na 90 % až 100 % bunkovej vrstvy každého radu, zozbierajte vírus strasením buniek, ktoré ešte môžu byť prilepené, zo skla. 4. Odstreďte pri 2 000 až 3 000 ot/min. s cieľom peletovať bunky. 5. Supernatant odstráňte a bunky znovu rozptýľte v približne 30 ml PBS obsahujúcom 1 % sarkosylu a 2 ml fenylmetylsulfonylfluoridu (pufrovaný roztok na rozpúšťanie). Toto môže spôsobiť, že bunky začnú vytvárať gél a kvôli potlačeniu tohto účinku možno pridať viac pufrovaného roztoku na rozpúšťanie. (NB: fenylmetylsulfonylfluorid je škodlivý – manipulujte s ním mimoriadne opatrne.) 6. Bunky na 60 sekúnd narušte ultrazvukovou sondou pri amplitúde 30 mikrónov. 7. Odstreďujte pri 10 000 ot./min. 10 minút. 8. Supernatant uskladnite pri teplote + 4 °C a zvyšnú peletu buniek znovu rozptýľte v 10 až 20 ml pufrovaného roztoku na rozpúšťanie. 9. Previbrujte ultrazvukom a vyčírte, pričom supernatant skladujte v každej fáze, spolu trikrát. 10. Zhromaždite supernatanty a odstreďujte pri 24 000 ot./min. (100,000 g) 120 minút pri teplote + 4 °C nad 5 ml vrstvou 40 %-nej sacharózy (w/v v PBS) s použitím 30 ml Beckmannovych odstreďovacích rúrok a rotora SW 28. 11. Supernatant odstráňte, dôkladne vypustite rúrky a peletu znova rozptýľte v PBS ultrazvukom. Antigén skladujte v alikvotných čiastkach pri teplote – 20 °C. Titrácia antigénu BTV ELISA: Antigén katarálnej horúčky oviec ELISA sa titruje nepriamym testom ELISA. Dvojnásobné zriedenia antigénu sa titrujú podľa konštantne zriedenej (1/100) monoklonnej protilátky 3-17-A3. Protokol je takýto: 1. Natitrujte 1:20 zriedenie antigénu BTV v PBS cez mikrotitračnú platničku v zdvojenej sérii zriedení (50 μl/jamka) s použitím viackanálikovej pipety. 2. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 3. Platničky trikrát umyte s použitím PBS. 4. Do každej jamky mikrotitračnej platničky pridajte 50 μl monoklonnej protilátky 3-17-A3 (zriedenej 1/100). 5. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 6. Platničky trikrát umyte s použitím PBS. 7. Do každej jamky mikrotitračnej platničky pridajte 50 μl králičieho globulínu proti myšiam, konjugovaného s peroxidázou chrenu, zriedeného na predtitrovanú optimálnu koncentráciu. 8. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 37 °C na kruhovej trepačke. 9. Pridajte skôr opísaný substrát a chromogén. Po 10 minútach zastavte reakciu pridaním 1 molárnej kyseliny sírovej (50 μl/jamka). V kompetitívnom pokuse musí prevyšovať monoklonná protilátka, preto sa zvolí zriedenie antigénu, ktoré leží na titračnej krivke (a nie v oblasti základne), pričom sa po 10 minútach dosiahne hodnota približne 0,8 OD.