Tento dokument slú žičisto na potrebu dokumentácie a in štitúcie nenesú nijakú zodpovednos ťza jeho obsah
►B NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91
z 11. júla 1991,
o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvy škov a o príslu šných analytických
metódach
(Ú. v. ES L 248, 5.9.1991, s. 1)
Zmenené a doplnené:
Úradný vestník
Č. Strana Dátum
►M1 Nariadenie Komisie (EHS) č. 3682/91 zo 17. decembra 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Nariadenie Komisie (EHS) č. 1429/92 z 26. mája 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Commission Regulation (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*) L 176 27 30.6.1992
►M4 Commission Regulation (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*) L 199 18 18.7.1992
►M5 Nariadenie Rady (EHS) č. 3288/92 z 12. novembra 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6 Nariadenie Komisie (EHS) č. 183/93 z 29. januára 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 zmenené a doplnené Nariadenie Komisie (EHS) č. 826/93 zo 6. apríla
1993L 87 6 7.4.1993
►M8 Commission Regulation (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*) L 66 29 18.3.1993
►M9 Nariadenie Komisie (ES) č. 177/94 z 28. januára 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Commission Regulation (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*) L 280 43 29.10.1994
►M11 Nariadenie Komisie (ES) č. 656/95 z 28. marca 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Commission Regulation (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*) L 258 49 28.10.1995
►M13 Commission Regulation (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*) L 341 25 12.12.1997
►M14 Nariadenie Komisie (ES) č. 282/98 z 3. februára 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15 Commission Regulation (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*) L 282 55 20.10.1998
►M16 Nariadenie Komisie (EHS) č. 379/1999 z 19 februára 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17 Commission Regulation (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*) L 65 9 7.3.2001
►M18 Commission Regulation (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*) L 276 8 19.10.2001
►M19 Commission Regulation (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*) L 128 8 15.5.2002
►M20 Nariadenie Komisie (ES) č. 1989/2003 zo 6. novembra 2003 L 295 57 13.11.2003
►M21 Nariadenie Komisie (ES) č. 702/2007 z 21. júna 2007 L 161 11 22.6.20071991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —1
(*) Tento akt nebol zatia ľuverejnený v sloven čine.
NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91
z 11. júla 1991,
o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvy škov
a o príslu šných analytických metódach
KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLO ČENSTIEV,
so zrete ľom na Zmluvu o zalo žení Európskeho hospodárskeho spolo-
čenstva,
so zrete ľom na nariadenie Rady č. 136/66/EHS z 22. septembra 1966
o zalo žení spolo čnej organizácie trhu s olejmi a tukmi (1), naposledy
zmenené a doplnené nariadením (EHS) č. 3577/90 (2), a najmä na jeho
článok 35 a,
keďže príloha k nariadeniu č. 136/66/EHS zah ŕňa opisy a definície
olivového oleja a oleja z olivových zvy škov predávané v ka ždom člen-
skom štáte, v obchodovaní v rámci spolo čenstva a obchodovaní s tretími
krajinami;
keďžeb ys an aú čely rozlí šenia medzi rôznymi druhmi oleja mali
stanovi ťfyzikálne a chemické vlastnosti ka ždého z nich
a organoleptické vlastnosti panenského oleja s cie ľom zaru čiťčistotu
a kvalitu príslu šných produktov bez toho, aby boli dotknuté ostatné
existujúce ustanovenia;
keďže by sa prítomnos ťvlastností rôznych druhov oleja mala stanovi ť
jednotne v rámci spolo čenstva; ke ďže by sa na tento ú čel mali v rámci
spolo čenstva zavies ťmetódy chemickej analýzy a organoleptického
hodnotenia; ke ďže by sa na prechodné obdobie malo povoli ťpoužívanie
iných metód analýzy platných v členských štátoch za predpokladu, že
v prípade rozdielu vo výsledkoch budú rozhodujúce tie, ktoré sa získalipoužitím obvyklej metódy;
keďže definovanie fyzikálnych a chemických vlastností olivového oleja
a metód analýzy si vy žiadalo prílohu s dopl ňujúcimi poznámkami ku
kapitole 15 colného sadzobníka;
keďže pre metódu hodnotenia organoleptických vlastností panenského
oleja je potrebné zostavenie skupín vybraných a vy školených hodnoti-
teľov; ke ďže by lehota potrebná na zostavenie takýchto skupín mala by
ť
presne stanovená; ke ďže s prihliadnutím na problémy, na ktoré mô žu
niektoré členské štáty pri zostavovaní skupín hodnotite ľov narazi ť,
využívanie skupín v ostatných členských by malo by ťautorizované;
keďže, s cie ľom zaisti ť, aby systém poplatkov uplat ňujúcich sa
na dovoz olivových zvy škov fungoval správne, bolo by potrebné usta-
noviťjednotnú metódu na stanovenie obsahu oleja v týchto produktoch;
keďže s cie ľom neu škodiťobchodu by bolo potrebné zavies ťustano-
venie pre olej plnený do obalov pred nadobudnutím ú činnosti tohto
nariadenia, ktoré by obmedzovalo predávanie tohto oleja po čas stano-
venej lehoty;
keďže je potrebné zru šiťnariadenie Komisie (EHS) č. 1058/77 (3),
naposledy zmenené a doplnené nariadením EHS č. 1858/88 (4);
keďže Riadiaci výbor pre oleje a tuky nezaslal svoje stanovisko
v lehote, ktorú ur čil jeho predseda,▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —2
(1) Ú. v. ES 172, 30.9.1966, s. 3025/66.
(2) Ú. v. ES L 353, 17.12.1990, s. 23.
(3) Ú. v. ES L 128, 24.5.1977, s. 6.
(4) Ú. v. ES L 166, 1.7.1988, s. 10.
PRIJALA TOTO NARIADENIE:
▼M20
Článok 1
1. Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žujú za panenské
olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č.
136/66/EHS.
2. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za lampantový
olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/
EHS.
3. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za rafinovaný
olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
4. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za olivový olej
zmie šaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových
olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
5. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za surový zvy škový
olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
6. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za rafinovaný
zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č.
136/66/EHS.
7. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými
v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa pova žuje za zvy škový
olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.
▼B
Článok 2
1. Vlastnosti olejov, ustanovené v prílohe I, sa budú stanovova ť
v súlade s ni žšie uvedenými metódami analýzy:
—na stanovenie vo ľných mastných kyselín, vyjadrených ako percento
kyseliny olejovej, metóda uvedená v prílohe II,
—na stanovenie peroxidového čísla metóda uvedená v prílohe III,
▼M19
—for determination of the wax content, the method given in Annex
IV,
▼B
—na stanovenie obsahu sterolov metóda uvedená v prílohe V,
—na stanovenie erytrodiolu a uvaolu metóda uvedená v prílohe VI,
▼M21
—na stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu
metóda uvedená v prílohe VII,
▼M20__________
▼B
—na spektrofotometrickú analýzu metóda uvedená v prílohe IX,
—na stanovenie zlo ženia mastných kyselín metóda uvedená v prílohe
XAaXB ,
—na stanovenie prchavých halogenovaných rozpú šťadiel metóda
uvedená v prílohe XI,▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —3
—na hodnotenie organoleptických vlastností panenského olivového
oleja metóda uvedená v prílohe XII,
▼M20__________
▼M11
—na stanovenie stigmastadiénov, metóda uvedená v prílohe XVII,
▼M13
—for determining the content of triglycerides with ECN42, the method
set out in Annex XVIII,
▼M19
—for determination of the aliphatic alcohol content, the method given
in Annex XIX.
2. Verification by national authorities or their representatives of the
organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tastingpanels approved by the Member States.
The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first
subparagraph shall be deemed consonant with the category declared ifa panel approved by the Member State confirms the grading.
Should the panel not confirm the category declared as regards the
organoleptic characteristics, at the interested party's request the nationalauthorities or their representatives shall have two counter-assessmentscarried out by other approved panels, at least one by a panel approvedby the producer Member State concerned. The characteristics concernedshall be deemed consonant with the characteristics declared if at least
two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not
the case, the interested party shall be responsible for the cost of thecounter-assessments.
▼
M17
3. When the national authorities or their representatives verify the
characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall
be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the
preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However,notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case ofbatches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres,the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regula-tion.
▼
M19
Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standardEN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away fromstrong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysisno later than:
—the tenth working day after they are taken, during the period from
October to May, and
—the fifth working day after they are taken, during the period from
June to September.
▼
M17
4.►M20 Na ú čely overenia stanoveného v odseku 3 sa analýzy
uvedené v prílohách II, III, IX, X a XII a akéko ľvek krí žové analýzy
požadované pod ľa vnútro štátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú pred
uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokia ľsa odber vzoriek
vykoná viac ako štyri mesiace pred uplynutím minimálnej doby trvan-
livosti, analýza by sa mala vykona ťnajneskôr po uplynutí štyroch
mesiacov nasledujúcich po mesiaci odberu vzorky. Na iné analýzystanovené v tomto nariadení sa neuplat ňujú žiadne časové obme-
dzenia.◄
Unless the sample was taken less than one month before the minimum
durability date, if the results of the analyses do not match the characte-ristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party▼
B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —4
concerned shall be notified no later than one month before the end of
the period laid down in the first subparagraph.
▼M19
5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils bythe methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall bedirectly compared with the limits laid down in this Regulation.
▼
M20
Článok 2a
Vnútro štátne orgány alebo ich zástupcovia mô žu overi ťči je vzorka
v súlade s deklarovanou kategóriou:
a) bu ďvykonaním analýz stanovených v prílohe I v ľubovo ľnom
poradí;
b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib v rozhodovacom
strome, a žkým nedosiahnu jedno z rie šení nachádzajúcich sa
v rozhodovacom strome.
▼M19__________
▼M5
Článok►M19 3◄
Ak sa zistí, že organoleptické charakteristiky ur čitého oleja nezodpove-
dajú jeho opisu, tak dotknutý členský štát uplat ňuje bez toho, aby boli
dotknuté akéko ľvek iné pokuty, administratívne pe ňažné pokuty, ktoré
treba stanovi ťvzhľadom na záva žnosťzistených nezrovnalostí.
Pri hodnotení nezrovnalosti sa musí venova ťpozornos ťnajmä priro-
dzeným zmenám charakteristík oleja uchovávaného za normálnychpodmienok.
Členské štáty informujú Komisiu na za čiatku ka ždého polroku o po čte
a druhu zistených nezrovnalostí a o pokutách uplatnených v priebehupredchádzajúceho polroku.
Článok 4
▼
M19
1. The Member States may approve assessment panels so that
national authorities or their representatives can assess and verify orga-
noleptic characteristics.
The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:—the requirements of Annex XII.4 are met,
—the panel head is given training recognised for this purpose by the
Member State,
—continued approval depends on performance in annual checks
arranged by the Member State.
Member States shall notify to the Commission a list of approved panels
and the action taken under this paragraph.
▼
M5
2. Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degusta čných porôt na
svojom území na ťažkosti, mô žu sa obráti ťna degusta čnú porotu schvá-
lenú v inom členskom štáte.
3. Ka ždýčlenský štát vypracuje zoznam degusta čných porôt ustano-
vených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade
s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpe čí dosiahnutie súladu
s týmito podmienkami.▼M171991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —5
__________
▼B
Článok 6
1. Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvy škov, ktoré
vznikajú pri extrakcii olivového oleja ( číselné znaky KN 2306 90 11
a 2306 90 19), sa stanoví pou žitím metódy uvedenej v prílohe XV.
2. Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmot-
nosti oleja ku hmotnosti su šiny.
▼M20
Článok 7
Uplat ňujú sa ustanovenia spolo čenstva týkajúce sa prítomnosti ne čistôt.
Pokia ľide o halogénované rozpú šťadlá, pre v šetky kategórie olivových
olejov platia nasledovné limity:
—maximálny objem ka ždého detekovaného halogénovaného rozpú-
šťadla: 0,1 mg/kg,
—maximálny celkový objem detekovaných halogénovaných rozpú šťa-
diel: 0,2 mg/kg.
▼B
Článok 8
1. Členské štáty budú Komisiu informova ťo prijatých opatreniach
pri zavádzaní tohto nariadenia.
2. Členský štát na za čiatku ka ždého polroka za šle Komisii preh ľad
analytických údajov o uskuto čnených testoch za predchádzajúci polrok.
Výsledky bude posudzova ťRiadiaci výbor pre oleje a tuky v súlade
s postupmi uvedenými v článku 39 nariadenia č. 136/66/EHS.
Článok 9
Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zru šuje.
Článok 10
1. Táto smernica nadobúda ú činnos ťtretí de ňod jej uverejnenia
vÚradnom vestníku Európskych spolo čenstiev.
Postup uvedený v prílohe XII sa v šak bude uplat ňovaťod
►M1 1. novembra 1992 ◄,okrem postupov týkajúcich sa systému
intervencie.
▼M5
Daná metóda sa neuplat ňuje na panenský olivový olej pripravený na trh
pred 1. novembrom 1992.
▼B
2. Toto nariadenie sa nebude uplat ňovaťna olivový olej a olej
z olivových zvy škov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie
nadobudlo ú činnos ť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.
Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatnite ľné vo
všetkých členských štátoch.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —6
PRÍLOHY
Obsah
Príloha I: Vlastnosti olivového oleja
▼M17
Príloha Ia: Odbor vzoriek olivového oleja a zvy škového olivového
oleja v priamom obale do 100 litrov
▼M20
Príloha Ib: Rozhodovací strom
▼B
Príloha II: ►M21 Stanovenie vo ľných mastných kyselín, studená
metóda◄
Príloha III: Stanovenie peroxidového čísla
Príloha IV: ►M6Stanovenie obsahu vosku plynovo - kvapalinovou
chromatografiou s pou žitím kapilárnej kolóny ◄
Príloha V: Stanovenie zlo ženia a obsahu sterolov metódou kapi-
lárnej plynovej
Príloha VI: Stanovenie erytrodiolu a uvaolu
Príloha VII: ►M21 Stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril
monopalmitátu ◄
▼M20__________
▼B
Príloha IX: Spektrofotometrické skú šanie v ultrafialovom svetle
Príloha X A: Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chro-
matografiou
Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil
and olive-pomace oil
Príloha XI: Stanovenie prchavých halogenovaných rozpú šťadiel
v olivovom oleji
Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils
▼M20__________
▼M19__________
▼B
Príloha XV: Obsah oleja v olivových zvy škoch
Príloha XVI: Stanovenie jódového čísla
▼M11
Príloha XVII: Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch
▼M13
Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with
ECN42▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —7
Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —8
1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —9PRÍLOHA I
VLASTNOSTI OLIVOVÝCH OLEJOV
KategóriaAcidita/
Kyslos ť
(%) (*)Peroxi-
dové číslo
mEq O 2/
kg (*)Vosky
mg/kg (**)2-glyceril monopalmitát
(%)Stigmasta-
dién
mg/kg (1)Rozdiel
ECN42
HPLC –
ECN42
Teoretický
výpo četK232(*) K270(*)Delta-
K (*)Organoleptické
hodnotenie
Medián defek-
toru (Md) (*)Organolep-
tické
hodnotenie
Medián
ovocnosti
(Mf) (*)
1. Extra panenský olivový olej ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤0,9 ak je % kyseliny palmitovej
celkom ≤14 %
≤1,0 ak je % kyseliny palmitovej
celkom > 14 %≤0,10 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Panenský olivový olej ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤0,9 ak je % kyseliny palmitovej
celkom ≤14 %
≤1,0 ak je % kyseliny palmitovej
celkom > 14 %≤0,10 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Lampantový olivový olej > 2,0 — ≤300 (3)≤0,9 ak je % kyseliny palmitovej
celkom ≤14 %
≤1,1 ak je % kyseliny palmitovej
celkom > 14 %≤0,50 ≤0,3 ——— Md > 2,5 (2) —
4. Rafinovaný olivový olej ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤0,9 ak je % kyseliny palmitovej
celkom ≤14 %
≤1,1 ak je % kyseliny palmitovej
celkom > 14 %— ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 ——
5. Olivový olej – zložený
z rafinovaných olivovýcholejov a panenských olivovýcholejov≤1,0 ≤15 ≤350 ≤0,9 ak je % kyseliny palmitovej
celkom ≤14 %
≤1,0 ak je % kyseliny palmitovej
celkom > 14 %— ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 ——
6. Surový olej z olivových výli-
skov—— > 350 (
4) ≤1,4 — ≤0,6 ——— — —
7. Rafinovaný olej z olivových
výliskov≤0,3 ≤5 > 350 ≤1,4 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 ——
8. Olej z olivových výliskov ≤1,0 ≤15 > 350 ≤1,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 ——
(1) Súhrn izomérov, ktoré sa (ne-)dajú separova ťpomocou kapilárnej kolóny.
(2) Alebo ak medián defektoru je najviac 2,5 a medián ovocnosti je rovný 0.
(3) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa pova žujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov najviac 350 mg/kg alebo ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu
najviac 3,5.
(4) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa pova žujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vy šší ako 350 mg/kg a ak je percentuálny podiel erytrodiolu
a uvaolu vy šší ako 3,5.▼M21
1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —10KategóriaObsah kyselín (1)
Súhrn
transizo-
mérov
kyseliny
olejovej
(%)Súhrn
transizo-
mérov
kyselín
linolovej
+ linole-
novej
(%)Zloženie sterolov
Steroly
celkom
(mg/kg)Erytrodiol
a uvaol
(%) (**)Myri-
stová
(%)Linole-
nová
(%)Arachi-
dová
(%)Eikozá-
nová
(%)Behé-
nová
(%)Lignoce-
rová
(%)Chole-
sterol
(%)Brassi-
kasterol
(%)Kampe-
sterol
(%)Stigmasterol
(%)Betasito-
sterol
(%) (2)Delta-7-
stigma-
stenol
(%)
1. Extra panenský olivový
olej≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,2 ≤0,2 ≤0,05 ≤0,05 ≤0,5 ≤0,1 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 000 ≤4,5
2. Panenský olivový olej ≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,2 ≤0,2 ≤0,05 ≤0,05 ≤0,5 ≤0,1 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 000 ≤4,5
3. Lampantový olivový olej ≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,2 ≤0,2 ≤0,10 ≤0,10 ≤0,5 ≤0,1 ≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5 ≥1 000 ≤4,5 (3)
4. Rafinovaný olivový olej ≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,2 ≤0,2 ≤0,20 ≤0,30 ≤0,5 ≤0,1 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 000 ≤4,5
5. Zmie šaný olivový olej –
zložený z rafinovaných
olivových olejov
a panenských olivových
olejov≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,2 ≤0,2 ≤0,20 ≤0,30 ≤0,5 ≤0,1 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 000 ≤4,5
6. Surový olej z olivových
výliskov≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,3 ≤0,2 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,5 ≤0,2 ≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5 ≥2 500 > 4,5 (4)
7. Rafinovaný olej
z olivových výliskov≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,3 ≤0,2 ≤0,40 ≤0,35 ≤0,5 ≤0,2 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 800 > 4,5
8. Olej z olivových výli-
skov≤0,05 ≤1,0 ≤0,6 ≤0,4 ≤0,3 ≤0,2 ≤0,40 ≤0,35 ≤0,5 ≤0,2 ≤4,0 < kamp. ≥93,0 ≤0,5 ≥1 600 > 4,5
(1) Obsah ostatných mastných kyselín (%): palmitovej: 7,5 –20,0; palmitoolejovej: 0,3 –3,5; heptadekánovej: ≤0,3; heptadecénovej: ≤0,3; stearovej: 0,5 –5,0; olejovej: 55,0 –83,0; linolovej: 3,5 –21,0.
(2) Súhrn: Delta-5,23-stigmastadienol+clerosterol+beta-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-stigmastadienol.
(3) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa pova žujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov najviac 350 mg/kg alebo ak je percentuálny podiel erytrodiolu a uvaolu
nižší ako alebo rovný 3,5.
(4) Oleje s obsahom voskov medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa pova žujú za surový olej z olivových výliskov, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vy šší ako 350 mg/kg a ak je percentuálny podiel erytrodiolu
a uvaolu vy šší ako 3,5.
Poznámky:
a) Výsledky analýz sa uvádzajú s rovnakým po čtom desatinných miest, aký je ur čený pre jednotlivé vlastnosti.
Číslica na poslednom desatinnom mieste sa zaokrúhli smerom nahor, ak je nasledujúca číslica vä čšia ako 4.
b) Ak aspo ňjedna charakteristika nezodpovedá ur čeným hodnotám, je to dosta čujúci dôvod na zaradenie olivového oleja do inej kategórie alebo na jeho ozna čenie za nevyhovujúci z h ľadiska čistoty.
c) Kvalitatívne vlastnosti olejov ozna čené hviezdi čkou (*) znamenajú, že:
—v prípade lampantového olivového oleja sa príslu šné medzné hodnoty nemusia dodr žaťsúčasne,
—v prípade panenských olivových olejov je nedodr žanie aspo ňjednej z týchto medzných hodnôt dôvodom na zmenu kategórie pri zachovaní zaradenia v kategórii panenských olivových olejov.
d) Kvalitatívne vlastnosti olivových olejov ozna čené dvoma hviezdi čkami (**) znamenajú, že pre v šetky olivové oleje z olivových výliskov sa príslu šné medzné hodnoty nemusia dodr žaťsúčasne.▼M21
PRÍLOHA Ia
ODBOR VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA A ZVY ŠKOVÉHO
OLIVOVÉHO OLEJA V PRIAMOM OBALE DO 100 LITROV
Táto metóda odberu vzoriek sa uplat ňuje na dodávky olivového oleja alebo
zvyškového olivového oleja nepresahujúce 125 000 litrov, umiestneného
v priamom obale do 100 litrov.
Ak dodávka prekra čuje 125 000 litrov, musí sa rozdeli ťna dávky v objeme
najviac 125 000 litrov. Ak je dodávka men šia ako 125 000 litrov, tvorí jednu
dávku. Táto metóda sa potom uplat ňuje na ka ždú dávku.
Minimálny po čet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobra ť,j eu r čený na
základe ve ľkosti dávky v súlade s tabu ľkou uvedenou v bode 1.
Veľkosťprimárnej vzorky je ur čená na základe objemu priameho obalu, pod ľa
tabuľky uvedenej v bode 2.1.
Termíny dodávka, primárna vzorka a laboratórna vzorka majú význam pod ľa
definícií uvedených v norme EN ISO 5555.
„Dávka “znamená sadu predajných jednotiek, ktoré sa vytvárajú, vyrábajú
a ozna čujú v príslu šných podmienkach tak, aby sa olej, nachádzajúci sa
v konkrétnej predajnej jednotke mohol posudzova ťako homogénny, pokia ľide
ovšetky analytické charakteristiky.
1. PO ČET PRIMÁRNYCH VZORIEK NA ODBER
Minimálny po čet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobra ť,j eu r čený na
základe ve ľkosti dávky v súlade s touto tabu ľkou:
Veľkosťdávky (v litroch) men šia ako Minimálny po čet primárnych vzoriek
7 500 2
25 000 375 000 4
125 000 5
Priame obaly vybrané na vytvorenie primárnej vzorky musia by ťv rámci
dávky susediace.
V prípade pochybnosti, členské štáty zvy šujú po čet primárnych vzoriek,
ktoré sa majú odobra ť.
2. OBSAH PRIMÁRNYCH VZORIEK
2.1Primárne vzorky musia obsahova ť:
Pokia ľmá priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z:
a) aspo ň5 litrov a) 3 priamych obalov
b) aspo ň3 litre, ale menej ako 5
litrovb) 3 priamych obalov
c) aspo ň2 litre, ale menej ako 3
litrec) 3 priamych obalov
d) aspo ň1 liter, ale menej ako 2
litred) 6 priamych obalov
e) aspo ň0,75 litra, ale menej ako 1
litere) 6 priamych obalov▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —11
Pokia ľmá priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z:
f) menej ako 0,75 litra f) trojnásobku mno žstva oleja
z minimálneho po čtu obalov
s celkovým objemom viac ako1,5 litra
2.2Primárne vzorky sa do doby analýzy uchovávajú v priamych obaloch.
Olej v primárnej vzorke sa potom ďalej rozde ľuje, pokia ľje to mo žné,
do troch laboratórnych vzoriek s cie ľom:
a) analýz spomínaných v prílohách II, III, IX a X;b) analýz spomínaných v prílohách XII;c) iných analýz.
2.3Balenia, ktoré tvoria primárnu vzorku sa rozde ľujú na men šiečasti
v súlade s kontrolnými postupmi ustanovenými vo vnútro štátnych práv-
nych predpisoch.
3. ANALÝZA A VÝSLEDKY
a) Ka ždá primárna vzorka uvedená v bode 1 sa rozde ľuje do laboratórnych
vzoriek v súlade s bodom 2.5 normy EN ISO 5555 a analyzuje takto:
—určenie vo ľných mastných kyselín pod ľa prvej zará žkyčlánku 2
ods. 1,
—určenie peroxidového čísla pod ľa druhej zará žkyčlánku 2 ods. 1,
—spektrofotometrická analýza pod ľa ôsmej zará žkyčlánku 2 ods.1,
—určenie skladby mastných kyselín pod ľa deviatej zará žkyčlánku 2
ods. 1.
b) Pokia ľjeden z výsledkov analýz, uvedených pod písmenom a, aspo ňna
jednej primárnej vzorke odobratej z rovnakej dávky nie je v súlades charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá príslu šná dávka
sa vyhlási za nevyhovujúcu.
Pokia ľvýsledky analýz, uvedených pod písmenom a, na primárnych
vzorkách z rovnakej dávky nie sú jednotné za predpokladu opakovate ľ-
nosti príslu
šných metód, celá dávka sa vyhlási za nejednotnú a v šetky
primárne vzorky sa podrobia ďalším po žadovaným analýzam.
V opa čnom prípade sa ďalším analýzam podrobuje iba jedna primárna
vzorka z dávky.
c) Pokia ľniektorý z výsledkov analýz, uvedených v druhom odseku
písmena b, nie je v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie
oleja, celá dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu.
Pokia ľvšetky výsledky analýz, uvedených v druhom odseku písmena b,
sú v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka savyhlási za vyhovujúcu.▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —12
PRÍLOHA Ib
ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY
S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU
Analýzu na overenie súladu olivového oleja alebo zvy škového olivového oleja
s deklarovanou kategóriou je mo žné vykona ť:
a) bu ďvykonaním analýz ur čených na overenie súladu s charakteristikami stano-
venými v prílohe I, a to v náhodnom poradí;
b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib na rozhodovacom strome,
ažkým sa nedosiahne jedno z rie šení nachádzajúcich sa v rozhodovacom
strome.
Analýzy týkajúce sa ne čistôt, po žadované na overenie súladu s normami Európ-
skeho spolo čenstva, sa vykonávajú samostatne.
Rozhodovací strom sa uplat ňuje na v šetky kategórie olivového oleja
a zvy škového olivového oleja. Skladá sa z tabuliek o číslovaných od 1 do 11,
ku ktorým sa musí pristupova ťna základe deklarovanej kategórie príslu šného
oleja v poradí stanovenom vo v šeobecnej tabu ľke.
Kľúčkvšeobecným tabu ľkám 1 a ž11:
—dvojitá čiara (=) ukazuje cestu, po ktorej treba ís ťv prípade súladu (kladnej
odpovede) s kritériami stanovenými v predchádzajúcom okienku. Bodkovanáčiara ( …) nazna čuje alternatívnu cestu, ktorá sa má pou žiťv prípade nesú-
ladu,
—položky v okienkach v tabu ľkách 1 a ž11 sa vz ťahujú na analýzy stanovené
v tomto nariadení na základe tabu ľky rovnocennosti stanovenej v doplnku 1
k tejto prílohe,
—písmená v zátvorkách nachádzajúce sa v kruhoch negatívneho rozhodnutia
v tabu ľkách 1 a ž11 poskytujú krí
žovú referenciu na indikatívnu informáciu
poskytnutú v doplnku 2 k tejto prílohe. Sami o sebe písmená neznamenajú
nutnos ťvykonáva ťanalýzy alebo nazna čovaťpravdivos ťuvedených pred-
pokladov.▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —13
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —14
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —15
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —16
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —17
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —18
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —19
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —20
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —21
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —22
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —23
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —24
▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —25
Doplnok 1
Tabu ľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými
v rozhodovacom strome
▼M21
—Acidita/kyslos ť príloha II Stanovenie vo ľných mastných kyselín,
studená metóda
▼M20
–Peroxidové číslo Príloha III Ur čenie peroxidového čísla
–UF spektrometria Príloha IX Spektrofotometrická analýza
–Organoleptické hodnotenie Príloha XII Organoleptické hodnotenie panenského
olivového oleja
–3,5- stigmastadiény Príloha XVII Metóda ur čovania stigmastadiénov
v rastlinných olejoch
–Trans-izoméry mastných
kyselínPríloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín
plynovou chromatografiou
Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín
–Obsah mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín
plynovou chromatografiou
Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín
–ΔECN42 Príloha XVIII Ur čenie skladby triglyceridov s ECN42
(rozdiel medzi údajmi z HPLCa teoretickým obsahom)
–Skladba sterolov a celkové
sterolyPríloha V Ur čenie skladby a obsahu sterolov
plynovou chromatografiou s kapilárnou
kolónou
–Erytrodiol a uvaol Príloha VI Ur čenie erytrodiolu a uvaolu
▼M21
—Mastné kyseliny nasýtené
v pozícii 2príloha VII Stanovenie percentuálneho obsahu 2-
glyceril monopalmitátu
▼M20
–Alifatické alkoholy Príloha XIX Ur čenie obsahu alifatických alkoholov
plynovou chromatografiou s kapilárnou
kolónou
–Nasýtené mastné kyseliny
v 2-pozíciiPríloha VII Ur čenie nasýtených mastných kyselín na
pozícií 2 triglyceridu▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —26
Doplnok 2
Tabu ľka 1
a) Pozri panenský alebo lampantový olivový olej (Kritériá kvality Tabu ľka 2
alebo Kritériá kvality a čistoty Tabu ľka 4)
b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabu ľka 4)
Tabu ľka 2
a) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabu ľka 4)
b) Pozri extra panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabu ľka 1)
Tabu ľka 3
a) Prítomnos ťrafinovaného oleja (olivového alebo iného)
b) Prítomnos ťzvyškového olivového oleja
Tabu ľka 4
a) Pozri extra panenský alebo panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabu ľka 1
aTabu ľka 2)
b) Prítomnos ťrafinovaného oleja (olivového alebo iného)
c) Prítomnos ťzvyškového olivového oleja
d) Prítomnos ťesterifikovaných olejov
Tabu ľka 7
a) Prítomnos ťzvyškového olivového oleja
b) Prítomnos ťesterifikovaných olejov
Tabu ľka 8
a) Prítomnos ťrafinovaného oleja (olivového alebo iného)
b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabu ľka 4)
c) Prítomnos ťesterifikovaných olejov
Tabu ľka 11
a) Prítomnos ťesterifikovaných olejov▼M201991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —27
PRÍLOHA II
▼M21
STANOVENIE VO ĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN, STUDENÁ METÓDA
▼B
1. STANOVENIE KYSLOSTI
Stanovenie vo ľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah
voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslos ťvypo čítaná obvyklým
spôsobom.
1.1. Princíp
Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpú šťadiel a prítomné vo ľné mastné kyse-
liny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.
1.2. Činidlá
Všetky činidlá (reagenty) by mali by ťschválenej analytickej kvality
a mala by sa pou žiťbuďdestilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.
1.2.1. Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov.
Poznámka: Dietyléter je vysoko hor ľavý a mô že tvori ťvýbu šné peroxidy.
Je potrebné s ním narába ťopatrne.
Počas pou žitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2),
na 100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3).
Poznámka: Ak sa nedá pou žiťdietyléter, je ho mo žné nahradi ťzmesou
rozpú šťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné,
etanol mô žete nahradi ť2-propanolom(izo-propanolom).
1.2.2. Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) pribli žne 0,01
mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) pribli žne 0,5 mol/l.
Musí by ťznáma presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju
skontrolova ťbezprostredne pred pou žitím. Pou žívajte roztok pripravený
najmenej pä ťdní pred termínom pou žitia, uschovaný v tmavej sklenenej
fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal by ťbezfarebný alebo vo farbe
slamy.
Poznámka: Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného
je mo žné pripravi ťnasledovne. Prive ďte do varu 1 000 ml
etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkovýchhoblín a nechajte vrie ťpod spätným chladi čom po dobu
jednej hodiny. Ihne ďoddestilujte. V destiláte rozpustite po ža-
dované mno žstvo hydroxidu draselného. Nechajte nieko ľko
dní odstá ťa zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhli či-
tanu draselného.
Roztok mô žeb y ťrovnako pripravený aj bez destilácie a to
nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium
butylate “a nechajte zmes odle žaťna nieko ľko dní. Odlejte
tekutý supernatant a rozpustite po žadované mno žstvo hydro-
xidu draselného. Roztok je pripravený na pou žitie.
1.2.3. Fenolftaleín, 10 g/l rozpusti ťv9 5a ž96 % etanole (v/v) alebo alkalická
modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpusti ťv9 5a ž96 %
etanole (v/v).
1.3. Prístrojové vybavenie
Bežné laboratórne vybavenie zah ŕňajúce:
1.3.1. analytické váhy;
1.3.2. 250 ml kónickú banku;1.3.3. 10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.
1.4. Postup
1.4.1. Príprava vzorky na testovanie
(Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a ne čistôt
spolu men ší ako 1 %, vzorku pou žite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje
1 %, je potrebné vzorku prefiltrova ť.)▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —28
1.4.2. Odoberanie vzorky (vzorkovanie)
Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade
s nasledujúcou tabu ľkou:
Predpokladané číslo
kyslostiHmotnos ťvzorky
(g)Presnos ťváženia
(g)
< 1 20 0,05
1až4 10 0,02
4až15 2,5 0,01
15 až75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Vzorku odvá žte v kónickej banke (1.3.2).
1.4.3. Stanovenie
Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 a ž150 ml predtým zneutralizovanej zmesi
dietyléteru a etanolu (1.2.1).
Titrujte po čas zmie šania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného
(1.2.2) (pozri pozn. 2) a ždo zmeny zafarbenia indikátora (ru žová farba
fenolftaleínu vydr ží aspo ň10 sekúnd).
Poznámka 1. Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je
možné nahradi ťvodným roztokom hydroxidu draselného
alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody
nevyvolá rozdelenie fáz.
Poznámka 2. Ak spotrebované mno žstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu
draselného presiahne 10 ml, pou žite 0,5 ml/l roztok.
Poznámka 3. Ak sa roztok po čas titrácie zakalí, pridajte dostato čné mno ž-
stvo rozpú šťadiel (1.2.1), aby sa roztok vy číril.
1.5. Kyslos ť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej
Kyslos ťvyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
kde:
V = objem pou žitého titra čného roztoku hydroxidu draselného, v ml;
c = presná koncentrácia pou žitého titra čného roztoku hydroxidu drasel-
ného v mol/l;
M = mólová hmotnos ťv g/mol kyseliny pou žitej na vyjadrenie výsledku
(M =282 g/mol);
m = hmotnos ťvzorky v g.
Za výsledok sa pova žuje aritmetický ►M6 dvoch výpo čtov◄stano-
vení.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —29
PRÍLOHA III
STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA
1. OBLAS Ť
Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla
v olejoch a tukoch.
2. POU ŽITIE
Táto technická norma sa vz ťahuje na živočíšne a rastlinné oleje a tuky.
3. DEFINÍCIA
Peroxidové číslo je mno žstvo tých zlo žiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené
ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodiddraselný za uvedených prevádzkových podmienok.
4. PRINCÍP
Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časťvzorky, kyselina octová
a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvo ľneného jódu štan-
dardizovaným roztokom tiosíranu sodného.
5. PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE
Všetky pou žité prístroje nesmú obsahova ťredukujúce alebo oxidujúce látky.
Poznámka: Nemastite zábrusové povrchy.
5.1. 3 ml sklenená nava žovacia lodi čka
5.2. Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, pribli žne 250 ml objemu, pred-
sušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokia ľ
možno, oxidom uhli čitým).
5.3. 25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml6. ČINIDLÁ
6.1. Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého
inertného plynu
6.2. Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom
čistého, suchého inertného plynu
6.3. Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód
a jodi čnany
6.4. Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný
vodný roztok, štandardizovaný tesne pred pou žitím
6.5. Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l,
čerstvo pripravená
z prírodného rozpustného škrobu
7. VZORKA
Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla,
udržiavajte ju v chlade a v úplne (a žpovrch) naplnených sklenených zásob-
níkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými
zátkami.
8. POSTUP
Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle.
V sklenenej nava žovačke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvá žte
s presnos ťou na 0,001 g mno žstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabu ľkou
a pod ľa predpokladaného peroxidového čísla:
Predpokladané peroxidové číslo
(meq)Hmotnos ťnavážky
(g)
0až12 5,0 a ž2,0
12 až20 2,0 a ž1,2
20 až30 1,2 a ž0,8▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —30
Predpokladané peroxidové číslo
(meq)Hmotnos ťnavážky
(g)
30 až50 0,8 a ž0,5
50 až90 0,5 a ž0,3
Odzátkujte banku (5.2) a vlo žte sklenenú nava žovačku s odvá ženou časťou
testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Mie šaním rýchlo rozpu-
stite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml
roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútua nechajte 5 minú ťstáťv tme pri teplote 15 a ž25
oC.
Pridajte pribli žne 75 ml destilovanej vody. Uvo ľnený jód stitrujte roztokom
tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty
nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vy ššie ako
12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor pou žite roztok škrobu.
Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.Zárove ňvykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekro čí 0,05
ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vyme ňte zne čistené činidlá.
9. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka
na kilogram, sa udáva pod ľa vzorca:
PV¼
V/C2T/C21000
m
kde:
V = objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného
(6.4), pou žitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;
T = presná molarita pou žitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);
m = hmotnos ťnavážky vzorky, v (g).
Za výsledok sa bude pova žovaťaritmetický priemer z dvoch výpo čtov.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —31
PRÍLOHA IV
STANOVENIE OBSAHU VOSKOV POMOCOU KAPILÁRNEJ
PLYNOVEJ CHROMATOGRAFIE
1. PREDMET
Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu voskov v olivových
olejoch. Vosky sa separujú v závislosti od po čtu atómov uhlíka. Mô že
sa pou žívaťnajmä na rozlí šenie medzi olivovým olejom získaným liso-
vaním a olejom získaným extrakciou (olej z výliskov).
2. PRINCÍP
Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frak-
cionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie
frakcie eluovanej pri testovacích podmienkach ako prvej (ktorej polarita jenižšia ako polarita frakcie triglyceridov), potom priama analýza kapilárnou
plynovou chromatografiou.
3. MATERIÁL
3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka.
3.2. Sklená kolóna na plynovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 15,0
mm, vý škou 30 a ž40 cm a vybavená kohútikom.
3.3. Plynový chromatograf vhodný na fungovanie s kapilárnou kolónou, vyba-
vený systémom na priame zavádzanie do kolóny s týmito zlo žkami:
3.3.1. Termostatická komora pre kolóny, vybavená teplotným programátorom.3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny.3.3.3. Plame ňovoioniza čný detektor a prevodník-zosil ňovač.
3.3.4. Zapisova č-integrátor schopný pracova ťs prevodníkom-zosil ňovačom
(3.3.3), rýchlos ťodozvy ni žšia ako 1 sekunda, s menite ľnou rýchlos ťou
posunu papiera. (Takisto je mo žné pou žívaťinformatizované systémy,
ktoré sú zalo žené na získaní údajov z plynovej chromatografie prostred-
níctvom osobného po čítača).
3.3.5. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s d ĺžkou 8 a ž12 metrov,
vnútorným priemerom 0,25 a ž0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá
kvapalnou fázou, s rovnomernou hrúbkou 0,10 –0,30 μm. (Kvapalné
fázy vhodné na pou žitie, v obchodnej sieti ako typ SE52 alebo SE54).
3.4. Mikrostrieka čka s kapacitou 10 μ
l na priamy nástrek do kolóny, vybavená
cementovanou ihlou.
3.5. Elektrický vibrátor.
3.6. Rota čná odparka.
3.7. Muf ľová pec.
3.8. Analytické váhy s garantovanou presnos ťou merania na ± 0,1 mg.
3.9. Be žné laboratórne sklené pomôcky.
4. CHEMICKÉ ČINIDLÁ
4.1. Silikagél s granulometriou medzi 60 a 200 μm.
Silikagél vlo žte do pece aspo ňnaštyri hodiny pri teplote 500 °C. Po
vychladnutí pridajte 2 % vody vzh ľadom na mno žstvo odobraného silika-
gélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala. Najmenej 12 hodín
pred pou žitím uchovávajte v tme.
4.2. n-hexán na chromatografiu.4.3. Etyléter na chromatografiu.
4.4. n-heptán na chromatografiu.
4.5. Štandardný roztok laurylara šidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný
štandard). [ Je tie žmožné pou žiťpalmityl-palmitát (hexadecyl-palmitát)
alebo myristyl-stearát (teradecyl-oktadekanoát) ].
4.5.1. Sudán 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).
4.6. Nosný plyn: vodík alebo čisté hélium na plynovú chromatografiu.▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —32
4.7. Pomocné plyny:
—čistý vodík na plynovoú chromatografiu,
—čistý vzduch na plynovú chromatografiu.
5. POSTUP
5.1. Príprava chromatografickej kolóny
Suspenzujte 15 g silikagélu (4.1) v n-hexáne (4.2) a zave ďte do kolóny
(3.2). Spontánne usadzovanie dokon čite pomocou elektrickej trepa čky
(3.5) s cie ľom dosiahnu ťhomogénnej šiu chromatografickú vrstvu. Perko-
lujte 30 ml n-hexánu s cie ľom eliminova ťvšetky prípadné ne čistoty.
Presne odvá žte pomocou váh (3.8). Vlo žte 500 mg vzorky do 25 ml
Erlenmeyerovej banky (3.1), pridajte primerané mno žstvo vnútorného
štandardu (4.5) vzh ľadom na predpokladaný obsah voskov. Napríklad:
v prípade olivového oleja pridajte 0,1 mg laurylara šidátu a v prípade
oleja z olivových výliskov 0,25 a ž0,5 mg. Takto pripravenú vzorku
preneste do chromatografickej kolóny s pomocou dvoch 2 ml dielov n-
hexánu (4.2).
Napustite rozpú šťadlo a ždo vý šky 1 mm nad hornú úrove ňabsorbentu,
potom perkolujte ďalších 70 ml n-hexánu, aby sa eliminovali prirodzene
prítomné n-alkány. Za čnite chromatografickú elúciu zozbieraním 180 ml
zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99 : 1 pri zachovaní prietoku pribli žne
15 kvapiek ka ždých 10 sekúnd. Elúcia vzorky sa má uskuto čniťpri
okolitej teplote 22 °C ± 4 °C.
Poznámky: —Zmes n-hexánu/etyléteru (99 : 1) sa musí pripravova ť
denne.
—Na umo žnenie vizuálnej kontroly správnej elúcie voskov
je mo žné prida ťdo vzorky roztoku 100 μl 1 %-ného
sudánu v elu čnej zmesi. Farbivo má retenciu na rozhraní
voskov a triglyceridov, preto ke ďzafarbenie dosiahne dno
chromatografickej kolóny, je potrebné elúciu zastavi ť, lebo
všetky vosky boli eluované.
Takto získanú frakciu su šte v rota čnej odparke (3.6) a ždo takmer úplnej
eliminácie rozpú šťadla. Posledné 2 ml rozpú šťadla eliminujte pomocou
slabého prúdu azotu; potom pridajte 2 –4 ml n-heptánu.
5.2. Analýza plynovou chromatografiou
5.2.1. Predbe žné úkony
Namontujte kolónu do plynového chromatografu (3.3), pri čom vstupný
port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skon-
trolujte be žným spôsobom prístrojové vybavenie na plynovú chromato-
grafiu ( činnos ťuzavretých plynových obvodov, ú činnos ťdetektora
a zapisova čaa tď.).
Pokia ľsa kolóna pou žíva po prvý raz, je potrebné ju kondicionova ť.
Zave ďte do kolóny mierny prietok plynu, potom zapnite prístroj na
plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, a žkým sa pribli žne po 4
hodinách dosiahne teplota 350 °C. Túto teplotu udr žiavajte najmenej
počas dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky
[nastavte prietok plynu, zapá ľte plamienok, pripojte k elektrickému zapi-
sovaču (3.3.4), nastavte teplotu komory pre kolónu, nastavte detektor
atď.]. Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vy ššej, ako sa
vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí by ťlineárna, nesmie
obsahova ťpíky akéhoko ľvek druhu a nesmie vykazova ťžiadnu odchýlku.
Negatívna priamo čiara odchýlka ukazuje, že kolóna je nesprávne pripo-
jená; pozitívna odchýlka znamená, že kolóna nebola dostato čne kondicio-
novaná.
5.2.2. Voľba prevádzkových podmienok
Prevádzkové podmienky, ktoré treba pozorova ť, sú spravidla tieto:▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —33
—teplota kolóny:
20 °C/
minúta5 °C/
minúta20 °C/
minúta
na
začiatku
80 °C
(1′)→ 240 °C → 325 °C
(6′)→ 340 °C
(10′)
—teplota detektora: 350 °C,
—množstvo vstreknutej látky: 1 μl roztoku (2 –4 ml) n-heptánu,
—nosný plyn: hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlos ťou pre
zvolený plyn (pozri dodatok),
—citlivos ťprístroja: taká, aby zodpovedala ni žšie uvedeným
podmienkam:
Uvedené podmienky mô žub yťupravené v závislosti od vlastností kolóny
a prístroja na plynovú chromatografiu tak, aby sa dosiahla separácia v šet-
kých voskov, posta čujúce rozlí šenie píkov (pozri obrázok) a reten čnýčas
vnútorného štandardu C 32bol 18 ± 3 minúty. Najreprezentatívnej ší pík
vosku by mal dosahova ťaspoň60 % rozsahu stupnice.
Parametre integrácie píkov sa stanovia takým spôsobom, aby sa dosiahlo
správne vyhodnotenie príslu šných plôch píkov.
Poznámka: Vzhľadom na vysokú kone čnú teplotu sa pripú šťa kladná
odchýlka, ktorá nesmie prekro čiť10 % rozsahu stupnice.
5.3. Vykonanie analýzy
Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostrieka čky; natiahnite piestik
dozadu, a žkým ihla nebude prázdna. Ihlu zave ďte do injek čného systému
a po uplynutí jednej a ždvoch sekúnd rýchlo vstreknite; po uplynutí asi
piatich sekúnd ihlu pomaly vytiahnite.
Záznam nechajte prebieha ťdovtedy, a žkým neprebehne úplná elúcia
voskov.
Základná čiara musí v ždy zodpoveda ťpožadovaným podmienkam.
5.4. Identifikácia píkov
Jednotlivé píky identifikujte z reten čných časov a porovnaním so zmesami
voskov so známymi reten čnými časmi, analyzovanými pri rovnakých
podmienkach.
Na obrázku je znázornený chromatogram voskov panenského olivového
oleja.
5.5. Kvantitatívne hodnotenie
Integrátorom vypo čítajte plochy píkov interného štandardu a alifatických
esterov od C40do C46.
Vypo čítajte obsah voskov ka ždého esteru v mg/kg tuku pod ľa príslu šného
vzorca:
ester;mg=kg¼Ax/C2ms/C21000
As/C2m
kde:
Ax= plocha píku ka ždého esteru v milimetroch štvorcových;
As= plocha píku vnútorného štandardu v milimetroch štvorcových,
ms= mno žstvo pridaného vnútorného štandardu v miligramoch;
m = mno žstvo vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
Uveďte celkové obsahy jednotlivých voskov od C40do C46v mg/kg tuku
(ppm).▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —34
Poznámka: Zložky, ktoré treba kvantifikova ť, sa stanovujú vzh ľadom na
susediace píky esterov s po čtom uhlíkov medzi C 40aC 46
podľa príkladu chromatogramu voskov olivového oleja
znázorneného na nasledujúcom obrázku. Ak sa ester C46
ukáže dvojmo, odporú ča sa analyzova ťna jeho identifikáciu
frakciu voskov oleja z olivových výliskov, v ktorom je pík
esteru C46ľahko identifikovate ľný, preto že výrazne preva žuje.
Výsledky sa uvádzajú na jedno desatinné miesto.▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —35
Obrázok
Chromatogram voskov istého olivového oleja (1)
Vysvetlivky :
I.S. = laurylara šidát
1. = diterpénové estery2+2 ′= estery C
40
3+3 ′= estery C42
4+4 ′= estery C44
5. = estery C46
6. = sterol-estery a triterpénový alkohol.▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —36
(1) Po elúcii sterol-esterov sa na chromatografickom zázname nemajú ukáza ťvýrazné píky (triglyceridy).
Dodatok
Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu
Vstreknite do prístroja na plynovú chromatografiu nastaveného na be žné prevádz-
kové podmienky 1 a ž3μl metánu (alebo propánu). Odmerajte čas, ktorý potre-
buje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho zavedenia a ždovtedy, kým sa
neobjaví pík (tM).
Lineárna rýchlos ťv cm/sek je daná vzorcom L/tM, pričom L je d ĺžka kolóny
vc matMječas nameraný v sekundách.▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —37
PRÍLOHA V
STANOVENIE ZLO ŽENIA A OBSAHU STEROLOV PLYNOVOU
CHROMATOHRAFIOU NA KAPILÁRNYCH KOLÓNACH
1. OBLAS Ť
Metóda opisuje postup stanovenia obsahu jednotlivých sterolov
a celkového obsahu sterolov v tukoch.
2. PRINCÍP METÓDY
Tuk s pridaným α—cholesterolom ako vnútorným štandardom, je
zmydelnený etanolickým roztokom hydroxidu draselného a látky nepo-
dliehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.
Sterolová frakcia sa chromatografiou na silikagélových platniach oddelí
od extraktu nezmydelite ľných látok. Steroly získané zo silikagélu sa
prevedú na trimetylsilylétery a analyzujú sa metódou plynovej chroma-
tografie na kapilárnych kolónach.
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
3.1. 250 ml banka s gu ľatým dnom so spätným chladi čom a zábrusovými
spojkami
3.2. 500 ml odde ľovacie lieviky.
3.3. 250 ml banky3.4. Kompletné zariadenie na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou,
používajúca sklenené platne rozmerov 20 × 20 cm
3.5. UV lampa s vlnovou d ĺžkou 366 alebo 254 nm, na skúmanie TLC platní
3.6. 100 μl a 500 μl mikrostrieka čky
3.7. Valcovitý filtra čný lievik s G3 poréznou fritou (pórozita 15-40 μm)
s priemerom pribli žne 2 cm a vý škou 5 cm, s pripojením vhodným
na vákuovú filtráciu a s vonkaj ším zábrusom 12/21
3.8. 50 ml vákuová banka s 12/21 skleneným vnútorným zábrusom
na pou žitie s filtra čným lievikom (3.7)
3.9. 10 ml skúmavka s kónickým dnom a tesniacou zátkou
3.10. Plynový chromatograf vhodný na pou žitie s kapilárnou kolónou, vyba-
vený deliacim systémom pozostávajúci z:
3.10.1. termostatickej komory pre kolóny (kolónová pec), ktorá udr žíp ožado-
vanú teplotu presnos ťou na ± 1
oC;
3.10.2. teplotne nastavite ľnej sply ňovacej jednotky (nástrek) so silanizovaným
skleneným sply ňovacím elementom (linerom);
3.10.3. plame ňovoioniza čného detektora a konvertora —zosilňovača;
3.10.4. zapisova ča—integrátora pre operácie s prevodníkom —zosilňovačom
(3.10.3), s časovou odozvou nepresahujúcou jednu sekundu a s rôznymi
rýchlos ťami posunu papiera.
3.11. Kapilárna kolóna sklenená alebo z taveného kreme ňa, dĺžky 20-30 m,
o vnútornom priemere 0,25 a ž0.32 mm, s kvapalnou fázou SE-52 alebo
SE-54 alebo inou ekvivalentnou fázou, s hrúbkou filmu medzi 0,10a 0,30 μm
3.12. Mikrostrieka čka na plynovú chromatografiu, s objemom 10 μl
a s vytvrdenou ihlou
4. ČINIDLÁ
4.1. Hydroxid draselný; pribli žne 2 mol/l etanolický roztok: 130 g hydroxidu
draselného (minimálna koncentrácia 85 %) sa rozpustí za chladenia
v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom do objemu 1litra. Roztok by sa mal skladova ťv dobre uzatvorenej f ľaši z tmavého
skla.
4.2. Dietyléter, čistý na analýzu
4.3. Bezvodý tiosíran sodný, čistý na analýzu▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —38
4.4. Silikagélové TLC sklenené platne, bez fluorescen čného detektora, hrúbky
0,25 mm (na komer čné pou žitie, vhodné na okam žité pou žitie)
4.5. Hydroxid draselný, pribli žne 0,2 2 mol/l etanolický roztok; 13 g hydro-
xidu draselného sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a doplní sa do
etanolom do objemu 1 litra.
4.6. Benzén, na chromatografiu (pozri 5.2.2)
4.7. Acetón, na chromatografiu (pozri 5.2.2)
4.8. Hexán, na chromatografiu (pozri 5.2.2)
4.9. Dietyléter, na chromatografiu (pozri 5.2.2)4.10. Chloroform, na chromatografiu
4.11. Referen čný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: zmes cholesterol
alebo fytosteroly, ►
M6 2%◄roztok v chloroforme
4.12. 2,7 —dichlórfluoresceín, 0,2 % etanolický roztok. Slabo alkalický
roztok získame pridaním nieko ľkých kvapiek 2 N roztoku hydroxidu
draselného.
4.13. Bezvodý pyridín; na chromatografiu
4.14. Hexametyldisilazán
4.15. Trimetylchlórsilán
4.16. Referen čný roztok trimetylsilylových éterov sterolu. Pripraví sa priamo
pred pou žitím z čistých sterolov získaných z olejov, ktoré ho obsahujú.
4.17. α—cholestanol, 0,2 % roztok (m/V) v chloroforme (vnútorný štandard)
4.18. Nosný plyn: vodík a hélium, čistoty na plynovú chromatografiu
4.19. Pomocné plyny:
—vodík, čistoty na plynovú chromatografiu,
—vzduch, čistoty na plynovú chromatografiu.
5. POSTUP
5.1. Príprava látky nepodliehajúcej zmydelneniu.
5.1.1. Do 250 ml destila čnej banky dajte pomocou 500 μl mikrostrieka čky taký
objem 0,2 % roztoku α—cholestanolu v chloroforme (4.17), obsahu-
júceho mno žstvo α—cholestanolu zodpovedajúcemu pribli žne 10 %
obsahu sterolu v alikvotnej čiastke vzorky, ktorá sa odobrala
na analýzu. Napr. k 5 g vzorky pridajte 500 μl 0,2 % roztoku α–chole-
stanolu, ak sa analyzuje olivový olej alebo olej zo semien, a 1 500 μl, ak
sa jedná o rastlinný ►M6__________◄olej z olivových výliskov.
Odparte dosucha pod prúdom dusíka a potom do tej istej banky privá žte
5 g suchej prefiltrovanej vzorky.
►M6 Oleje◄s obsahom zistite ľných mno žstiev cholesterolu mô žu
vykazova ťpíky s reten čným časom identickým s cholestanolom. Pokia ľ
sa tak stane, sterolová frakcia by sa mala opakovane analyzova ťs alebo
bez vnútorného štandardu ►M6 alebo sa namiesto cholestanolu bude
musie ťpoužiťbetulinol ◄.
5.1.2. Pridajte 50 ml 2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného,
nasaďte spätný chladi ča zariadenie zahrievajte vo vodnom kúpeli do
mierneho varu a za stáleho silného mie šania, a žkým sa zmydel ňovanie
neukon čí (roztok sa vy číri). Zahrievajte e šteďalších 20 minút a potom
cez spätný chladi čprilejte 50 ml destilovanej vody, spätný chladi č
odpojte a banku ochla ďte na teplotu pribli žne 30oC.
5.1.3. Obsah banky kvantitatívne preneste do 500 ml odde ľovacieho lievika
pomocou viacnásobného opláchnutia destilovanou vodou (celkovo sa
jej pou žije asi 50 ml). Pridajte pribli žne 80 ml dietyléteru, v šetko riadne
pretrepávajte 30 sekúnd a potom nechajte usadi ť(pozn.1).
Odde ľte spodnú vodnú vrstvu do druhého odde ľovacieho lievika.
Rovnakým spôsobom vykonáme dve ďalšie extrakcie z vodnej fázy,
pri ka ždej sa pou žije 60-70 ml dietyléteru.
Poznámka 1. Akáko ľvek emulzia sa dá odstráni ťpridaním malých mno ž-
stiev etyl- alebo metylalkoholu vo forme spreja.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —39
5.1.4. Vlo žte dietyléterové extrakty do jedného odde ľovacieho lievika
a prepierajte destilovanou vodou (50 ml ka ždý raz), a žkým voda nevy-
kazuje neutrálnu reakciu.
Odstrá ňte vypieraciu vodu, zostávajúcu vrstvu vysu šte bezvodým tiosí-
ranom sodným a prefiltrujte cez bezvodý tiosíran sodný do predtým
odvá ženej 250 ml banky, lievik a filter opláchnite malým mno žstvom
dietyléteru.
5.1.5. Oddestilujte éter na nieko ľko ml a potom pod slabým vákuom alebo pod
prúdom dusíka vysu šte, su šenie dokon čite v su šičke pri 100oC asi štvrť-
hodinu a zvy šok odvá žte po ochladení v exsikátore.
5.2. Oddelenie sterolovej frakcie5.2.1. Príprava základných platní. Silikagélové platne (4.4.) úplne ponorte
na 10 sekúnd do 0,2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného
(4.5) a potom ich nechajte dve hodiny su šiťv digestóriu a nakoniec ich
dosušte v su šičke jednu hodinu pri teplote 100
oC.
Vyberte platne zo su šičky a ulo žte ich a ždoďalšieho pou žitia do exsi-
kátora s chloridom vápenatým (takto o šetrené platne sa musia pou žiťdo
dvoch tý ždňov).
Poznámka 2. Ak sa na separáciu sterolovej frakcie pou žijú základné
silikagélové platne, látky, ktoré nepodliehajú zmydelneniu,
nie je potrebné upravova ťoxidom hlinitým. Takýmto
spôsobom sa v šetky zlú čeniny kyslého charakteru zlo žky
(mastné kyseliny a iné) zachytia na za čiatku a skupina
sterolov sa zrete ľne oddelí od skupiny alifatických
a triterpénových alkoholov.
5.2.2. Zmes benzénu a acetónu v pomere objemov 95:5 (v/v) vlo žte do vyví-
jacej komory v hrúbke vrstvy cca 1 cm. Alternatívne je mo žné pou žiť
zmes hexán/dietyléter v pomere objemov 65:35 hexánu. Komoru
uzatvorte vhodným krytom a nechajte ju stá ťasi pol hodiny, aby sa
ustálila rovnováha medzi parami a kvapalinou. Na vnútorné stenykomory sa mô žu pripevni ťpásy filtra čného papiera namo čené vo vyví-
jacej zmesi, čím sa skráti čas vyvíjania asi o jednu tretinu a získa sa
rovnomernej šia a pravidelnej šia elúcia zlo žiek.
Poznámka 3. Po ka ždej analýze sa musí vymeni ťvyvíjací roztok, aby sa
úplne zabezpe čili reprodukovate ľné podmienky vyvíjania.
5.2.3. V chloroforme pripravte pribli žne 5 % roztok látok nepodliehajúcich
zmydelneniu (5.1.5.) a pomocou 100 μl mikrostrieka
čky naneste
na chromatografickú plat ňu 0,3 ml roztoku v rovnomernom pásiku mini-
málnej hrúbky, pribli žne 2 cm od spodku platne. V línii s pásikom
naneste 2 a ž3μl referen čného roztoku sterolov (4.11) na jeden koniec
tak,že sterolová skupina mô žeb yťpo vyvolaní identifikovaná.
5.2.4. Umiestnite plat ňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa
uvádza v bode 5.2.2. Udr žujte izbovú teplotu v rozmedzí 15 a ž20oC.
Komoru ihne ďuzatvorte krytom a vzorku nechajte eluova ť, kým čelo
rozpú šťadla nedosiahne vzdialenos ťpribli žne 1 cm od hornej hrany
platne. Potom plat ňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpú šťadlo odparte
prúdom horúceho vzduchu alebo dosku nechajte krátko prikrytú krytom.
5.2.5. Plat ňu mierne a pravidelne postriekajte roztokom 2,7- dichlórfluore-
sceínu. Ke ďsa plat ňa pozoruje pod ultrafialovým svetlom, sterolová
skupina sa dá identifikova ťpodľaškvŕn získaných z referen čného
roztoku, zoskupených v rade. Ozna čte hranice skupiny čiernou ceruzkou
pozd ĺžokrajov fluorescencie.
5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) zo škrabte silikagél z ozna čenej
plochy. Umiestnite jemne rozotretý materiál do filtra čného lievika
(3.7). Pridajte 10 ml horúceho chloroformu, opatrne premie šajte kovovou
kopistkou a prefiltrujte za vákua, filtrát pozbierajte do banky (3.8), pripo-jenej k filtra čnému lieviku.
Spláchnite zvy šok v lieviku dietyléterom (asi 10 ml ka ždý raz), zbierajte
filtrát do tej jednej banky pripojenej k filtra čnému lieviku. Odparte filtrát
na objem 4 a ž5 ml a zvy šný roztok prelejte do vopred odvá ženej 10 ml
skúmavky (3.9), odparte dosucha stredným zahrievaním pod slabýmprúdom dusíka, znovu rozpustite v nieko ľkých kvapkách acetónu, opä ť
odparte, na 10 minút vlo žte do su šičky pri teplote 105
oC a nechajte
ochladi ťv exsikátore a odvá žte.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —40
Zvyšok vo vnútri skúmavky pozostáva zo sterolovej frakcie.
5.3. Príprava trimetylsilylových esterov
5.3.1. Pridajte silaniza čnéčinidlo, pozostávajúce zo zmesi objemov 9.3.1 (v/v/
v) pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylsilánu (pozn.4) v pomere 50 μl
na ka ždý miligram sterolov, do skúmavky obsahujúcej sterolovú frakciu
tak, aby sa zabránilo akejko ľvek absorpcii vlhkosti (pozn.5).
Poznámka 4. Roztoky na priame pou žitie sú dostupné v obchodnej sieti.
Prípustné sú tie žsilaniza čnéčinidlá, ako napr. bis-trime-
tylsilyl, triflúoroacetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktoré sariedia rovnakým objemom bezvodého pyridínu.
5.3.2. Skúmavku zazátkujte a opatrne pretrepávajte bez pretá čania, a žkým nie
sú steroly úplne rozpustené. Potom nechajte skúmavku stá ťaspoň15
minút pri izbovej teplote a následne nieko ľko minút odstre ďujte. Číry
roztok je pripravený na plynovú chromatografickú analýzu.
Poznámka 5. Možný vznik slabej opalescencie je be žný a nespôsobuje
žiadne interferencie. Vznik bielych vlo čiek alebo obja-
venie sa ru žového zafarbenia sú znaky prítomnosti alebo
znečistenia činidla. V takomto prípade je potrebné test
zopakova ť.
5.4. Plynovochromatografická analýza
5.4.1. Prípravné postupy a kondiciovanie kolón
5.4.1.1. Kapilárna kolóna sa zachytí vo vnútri plynového chromatografu, pripojte
vstup kolóny na odparova č, ktorý je spojený s deliacim systémom
a výstup kolóny na detektor.
Vykonajte celkovú kontrolu plynového chromatografu (netesnos ť
v plynových okruhu, výkonnos ťdetektora, výkonnos ťdeliaceho systému
a zapisova ča, atď.).
5.4.1.2. Kapilárnu kolónu, ktorá e šte nebola pou žitá, je potrebné kondiciova ť.
Nastavte malý prietok nosného plynu cez kapilárnu kolónu a potom
zapnite plynový chromatograf, postupne vyhrievajte, a žkým nedosiah-
nete teplotu minimálne 20
oC nad pracovnú teplotu (pozn. 6). Udr žujte
túto teplotu aspo ňdve hodiny a potom sa zariadenie nastaví na pracovný
chod [nastavenie prietokov plynov a deliaceho pomeru (odfuku), zapá-
lenie plame ňa, pripojenie na elektronický zapisova č, nastavenie teploty
termostatu, detektora a nástreku, at ď.] a potom zosnímajte signál pri
citlivosti aspo ňdvojnásobne vy ššej ako pri analýze. Základná línia má
byťlineárna, bez špičiek akéhoko ľvek pôvodu, a nemala by vykazova ť
žiadne znaky výkyvov (driftov).
Negatívny priamo čiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnos ť
kolónových spojov, kým pozitívny driftv indikuje nedostato čné kondi-
ciovanie kolóny.
Poznámka 6. Teplota kondiciovania má by ťaspoňo2 0oCn ižšia, ako je
maximálna pracovná teplota predpokladaná na pou žívanú
kvapalnú fázu.
5.4.2. Výber pracovných podmienok
5.4.2.1. Hlavné pracovné podmienky sú nasledujúce:
—teplota kolóny: 260oC±5oC
—teplota odparova ča: 280oC,
—teplota detektora: 290oC,
—lineárna rýchlos ťnosného plynu: hélium 20 a ž35 cm/s, vodík 30 a ž
50 cm/s,
—deliaci pomer: 1: 50 a 1: 100,
—citlivos ťprístroja: 4 a ž16 násobok minimálneho zoslabenia,
—rozsah zapisova ča: 1 a ž2 mV na celý rozsah (celá škála —fs),
—rýchlos ťposunu papiera: 30 a ž60 cm/h,
—množstvo dávkovanej látky: 0,5 a ž1μl TMSE roztoku.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —41
Tieto podmienky sa mô žul íšiťpodľa vlastností kolóny a plynového
chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy sp ĺňajúce nasledujúce
podmienky:
—reten čnýčas ß —sitosterolu má by ť20 ± 5 minút,
—vrchol (pík) kampasterolu má by ť: pre olivový olej (priemerný obsah
3 %) 15 ± 5 % hodnoty celkového rozsahu; pre sójový olej (prie-
merný obsah 20 %) 80 ± 10 % hodnoty celkového rozsahu,
—všetky prítomné steroly musia by ťrozdelené. Okrem toho, aby sa
píky mohli rozdeli ť, musia by ťúplne rozlí šené, t. j. stopový pík by
sa mal vráti ťna základnú líniu pred vylúhovaním ďalšieho píku.
Neúplné rozlí šenie je av šak tolerované, ale s podmienkou, že pík
v TRR 1,02 je mo žné kvantifikova ťpoužitím kolmice
5.4.3. Vykonanie analýzy5.4.3.1. Do 10 μl mikrostrieka čky natiahnite 1 μl hexánu, potom natiahnite 0,5 μl
vzduchu a následne 0,5 a ž1μl roztoku vzorky. Vytiahnite piest mikro-
strieka čky tak, aby bola ihla prázdna. Ihlu zave ďte cez septum (tesnenie)
do dávkovacieho zariadenia (nástreku) a po jednej a ždvoch sekundách
roztok rýchlo nadávkujte a ihlu pribli žne po piatich sekundách pomaly
vytiahnite.
5.4.3.2. Pokra čujte v zaznamenávaní chromatogramu, a žkým sa v šetky prítomné
steroly úplne nevylúhujú.
Základná línia bude v ždy v súlade s po ž
iadavkami v bode 5.4.1.2.
5.4.4. Identifikácia píkov (vrcholov)
Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná pod ľa reten čných časov
a porovnaním so zmesou TMSE sterolov, analyzovanou za rovnakýchpodmienok.
Steroly eluujú v nasledujúcom poradí: Cholesterol, brassikasterol, 24-
metylén cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7—
kampesterol, Δ5,23- stigmastadienol, klerosterol, β—sistosterol, sito-
stanol, Δ5—avenasterol, Δ5,24 —stigmastadienol, Δ7—stigma-
stenol, Δ7—avenastenol.
Reten čnéčasy sitosterolu pre kolóny SE —52 a SE –54 sú v tabu ľke 1.
Obr.1 a 2 ukazujú typické chromatografy niektorých olejov.
5.4.5. Kvantitatívny odhad
5.4.5.1. Plochy píkov α—cholestanolu a sterolov vypo čítajte pou žitím elektro-
nického integrátora. Neuvádzajte píky zlo žiek, ktoré nie sú zahrnuté
v zozname v tab.1. Odozvový faktor pre α—cholestanol sa rovná 1.
5.4.5.2. Obsahy v šetkých alkoholov, vyjadrených v mg/100 g tukových látok, sa
vypo čítajú nasledovne:
sterol x ¼Ax·ms·100
As·m
kde:
Ax= plocha píku sterolu x ►M6__________◄(mm2),
As= plocha píku α—cholestanolu ►M6__________◄(mm2),
ms= hmotnos ťpridaného α—cholestanolu, v miligramoch (mg),
m = hmotnos ťvzorky odobratej na stanovenie, v gramoch (g)
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
6.1. Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov ako v mg/100 g tukových
látok a ich sumu ako „celkové steroly “.
6.2. Vypo čítajte percento ka ždého jednotlivého sterolu z pomeru plochy
daného píku k celkovej ploche sterolov:▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —42
% sterolu x ¼AxPA·100
kde:
Ax= plocha píku sterolu x;
∑A = celková plocha sterolov.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —43
DODATOK
Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu
Nadávkujte 1 a ž3μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu za
obvyklých pracovných podmienok a stopkami zmerajte čas, za ktorý prejde plyn
kolónou od momentu nástreku a žpočas, kedy sa objaví (vylúhuje) pík (tM).
Lineárna rýchlos ťv (cm/s) je daná L/tM, kde L je d ĺžka kolóny v centimetroch
(cm) a tMječas nameraný v sekundách (s).
Tabu ľka 1
Relatívne reten čnéčasy sterolov
Pík Ozna čenieRelatívne reten čnýčas
SE 54
kolónaSE52
kolóna
1 cholesterol Δ-5-cholesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5 α-cholestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brassikasterol [24S]- 24-metyl- Δ-5,22-cholestadién-
3β-ol0,73 0,71
4 24-metylén-cholesterol 24-metylén- Δ-5,24-cholesten-3 β-ol 0,82 0,80
5 kampesterol [24R]- 24-metyl- Δ-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24R]- 24-etyl- Δ-5,22-cholestadién-
3β-ol0,88 0,87
8 Δ-7-kampesterol [24R]- 24-metyl- Δ-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl- Δ-5,23-cholesta-
dién-3 β-ol0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]- 24-etyl- Δ-5,25-cholestadién-
3β-ol0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl- Δ-5-cholestan-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyI- Δ-5,24-cholesta-
dién-3 β-ol1,08 1,08
15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl- Δ-7,24-cholesta-
dién-3 β-ol1,12 1,12
16 Δ-7-avenasterol [24Z]- 24-etylidén- Δ-7-cholesten-3 β-
ol1,16 1,16▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —44
Obrázok 1
Chromatografický záznam sterolovej frakcie nerafinovaného olivového oleja
▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —45
Obrázok 2
Chromatografický záznam sterolovej frakcie rafinovaného olivového oleja
▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —46
PRÍLOHA VI
STANOVENIE ERYTRODIOLU A UVAOLU
ÚVOD
Erytrodiol (be žne chápaný ako erytrodiolové glykoly a uvaol spolu) tvorí
podstatnú časťnezmydlovate ľnej frakcie charakteristickej pre niektoré
druhy tukov. Nachádza sa v ove ľav yšších koncentráciách rozpú šťadlovo
extrahovaného olivového oleja ako sú koncentrácie iných olejov, napr.lisovaný olivový olej a olej z hroznových zrnie čok, v ktorých je taktie ž
obsiahnutý, a tak jeho prítomnos ťmôže dokáza ťprítomnos ťrozpú šťa-
dlovo extrahovaného olivového oleja.
1. OBLAS Ť
Metóda opisuje postup detekcie erytrodiolu v tukoch
2. PODSTATA
Tuk sa zmydelní metanolicko-etanolickým roztokom hydroxidu drasel-
ného. Nezmydelnite ľná frakcia sa potom extrahuje dietyléterom
a pre čistí sa prechodom cez kolónu z oxidu hlinitého.
Nezmydelnite ľné látky sa pri tenkovrstvovej chromatografii
na silikagélovej platni rozdelia na skupiny zodpovedajúce steroloveja erytrodiolovej frakcii. Steroly a erytrodiol, získaný z platní, sa prevedúna trimetylsilylové estery a zmes sa analyzuje plynovou chromatografiou.
Výsledok sa vyjadrí ako percento erytrodiolu v zmesi erytrodiolu
a sterolov.
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
3.1. Vybavenie uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).
4. ČINIDLÁ
4.1. Činidlá uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).
4.2. Referen čný roztok erytrodiolu, 0,5 % roztok v chloroforme.
5. POSTUP
5.1. Príprava nezmydelnite ľných látok
Ako je popísané v odseku 5.1.2. prílohy V.
5.2. Oddelenie erytrodiolu a sterolov
5.2.1. Pozri odstavec 5.2.1 prílohy V.
5.2.2. Pozri odstavec 5.2.2 prílohy V.
5.2.3. Pripravte 5 % roztok nezmydelnite ľných látok v chloroforme.
Pomocou 0,1 ml mikrostrieka čky naneste na chromatografickú plat ňučo
najten ší a najrovnomernej ší pásik 0,3 ml roztoku pribli žne 1,5 cm od
spodného okraja platne.
Na jeden koniec platne umiestnite nieko ľko mikrolitrov roztokov chole-
sterolu a erytrodiolu, ktoré budú slú žiťako etalóny (na porovnanie).
5.2.4. Umiestnite plat ňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa
uvádza v bode 5.2.1. Okolitá teplota by mala by ťasi 20oC. Komoru
ihneďuzatvorte krytom a vzorku nechajte eluova ť, kým čelo rozpú šťadla
nedosiahne vzdialenos ťpribli žne 1 cm od horného okraja platne. Potom
platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpú šťadlo odparte prúdom horú-
ceho vzduchu.
5.2.5. Plat ňu mierne a pravidelne postriekajte alkoholovým roztokom 2,7-
dichlórfluoresceínu. Ke ďplatňu pozorujete pod ultrafialovým svetlom,
sterolová a erytrodiolová skupina sa dá identifikova ťpodľa toho, žes a
zoskupujú v rade so štandardami. Bodmi ozna čte iba vonkaj šie okraje
fluorescencie.
5.2.6. Pomocou kovovej škrabky /kopistky/ zo škrabte silikagél z ozna čenej
plochy. Preneste materiál z platne do 50 ml banky. Pridajte 15 ml horú-ceho chloroformu, dobre pretrepte a prefiltrujte cez filtra čný lievik so
sintrovaným skleneným diskom tak, aby sa silikagél preniesol na filter.
Trikrát premyte horúcim chloroformom (asi 10 ml ka ždý raz), filtrát zbie-▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —47
rajte do 100 ml banky. Odparte filtrát na objem 4 a ž5 ml, preneste ho do
kalibrovanej 10 ml centrifuga čnej skúmavky s ku žeľovým dnom, vysu šte
slabým zahrievaním pod prúdom dusíka a odvá žte.
5.3. Príprava trimetylsilylových esterov
Ako je popísané v odseku 5.3 prílohy V.
5.4. Plynovochromatografická analýza
Ako je popísané v odseku 5.4 prílohy V. Pracovné podmienky pre
plynový chromatograf musia by ťtaké, aby bolo mo žné vykona ťanalýzu
sterolov a oddeli ťTMSE od erytrodiolu a uvaolu.
Ak ste u žvykonali nástrek vzorky, pokra čujte v zaznamenávaní, kým nie
sú prítomné steroly a kým sa erytrodiol a uvaol nevyelujú. Potom identi-fikujte píky (reten čnéčasy erytrodiolu a uvaolu pre β- sitosterol sú 1,45
a 1,55, v tomto poradí) a vypo Čítajte plochy tak, ako pri steroloch.
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
Erythrodiol % ¼A1þA2
A1þA2þPAsterov/C2100
kde:
A1 = plocha píku erytrodiolu ►M6__________◄(mm2);
A2 = plocha píku uvaolu ►M6__________◄(mm2),
∑Asterolov = celková plocha píkov pre steroly
►M6__________◄(mm2).
Výsledok sa udáva na jedno desatinné miesto▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —48
PRÍLOHA VII
STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL
MONOPALMITÁTU
1. Ú ČEL A OBLAS ŤPOU ŽITIA
Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuál-
neho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníc-
tvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu.
Táto metóda je pou žiteľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej
okolitej teplote (20 °C).
2. PRINCÍP
Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy:
čiastočná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu
vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po sila-nizácii kapilárnou plynovou chromatografiou.
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BE ŽNÝ LABORATÓRNY MATE-
RIÁL
3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka
3.2. 100, 250 a 300 ml kadi čky
3.3. Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 –23 mm,
dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotú čom a kohútikom
3.4. Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml
3.5. 100 a 250 ml banky
3.6. Rota čná odparka
3.7. 10 ml centrifuga čná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou
3.8. Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky3.9. Termostat s mo žnosťou udr žiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C
3.10. Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml3.11. 1 ml podko žná strieka čka
3.12. 100 μl mikrostrieka čka
3.13. 1 000 ml lievik
3.14. Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injek čným
systémom „on column “za studena na priame zavedenie vzorky do
kolóny a pecou umo žňujúcou udr žiavaťnastavenú teplotu s presnos ťou
na 1 °C
3.15. Studený injektor „on column “na priame zavedenie vzorky do kolóny
3.16. Plame ňovoioniza čný detektor a elektrometer
3.17. Zapisova č-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlos
ťou odozvy
najviac 1 sekundu a s menite ľnou rýchlos ťou posunu papiera
3.18. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s d ĺžkou 8 a ž12 metrov,
vnútorným priemerom 0,25 a ž0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom
alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 –0,30 μm, pou ži-
teľná pri teplote 370 °C
3.19. 10 μl mikrostrieka čka vybavená cementovou ihlou dlhou aspo ň7,5 cm
na priame vstreknutie na kolónu.
4. ČINIDLÁ
4.1. Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh)
pripravený takto: Silikagél vlo žte do porcelánovej kapsule, su šte aspo ň
štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnú ťv exsikátore
pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 %
hmotnosti silikagélu, takto: odvá žte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej
banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —49
sa voda rovnomerne rozdelila. Pred pou žitím nechajte aspo ň12 hodín
stáť.
4.2. n-hexán (na chromatografiu)4.3. Izopropanol
4.4. Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1
4.5. Pankreatická lipáza. Pou žitá lipáza má ma ťaktivitu medzi 2,0 a 10
jednotkami lipázy na mg ( V obchodnej sieti dosta ťpankreatické lipázy
s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu .)
4.6. Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1
M upravený a žna pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním
koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1)
4.7. Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa
musí pou žiťdo 15 dní od jeho prípravy)
4.8. Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok
4.9. Dietyléter na chromatografiu
4.10. Vyvíjacie rozpú šťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere
87/13)
4.11. 12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného
4.12. Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole
4.13. Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu
4.14. Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických
látok –a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu
4.15. Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlór-
silánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dosta ťv obchodnej
sieti. Na silanizáciu sa mô žu pou žiťajďalšiečinidlá, konkrétne bis-
trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedenérovnakým objemom bezvodého pyridínu.)
4.16. Referen čné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so
známym percentuálnym zlo žením podobným vzorke.
5. POSTUP
5.1. Príprava vzorky
5.1.1. Oleje s obsahom vo ľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred
chromatografiou na silikagélovej kolóne neutralizova ť. Oleje
s obsahom vo ľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizova ť
v súlade s bodom 5.1.1.1.
5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte
100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného
(4.11), aký zodpovedá obsahu vo ľných kyselín v oleji s 5 % navý šením.
Dôkladne pretrepávajte po čas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej
vody, znova pretrepte a nechajte stá ť
.
Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte
prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánovýroztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 –60 ml roztoku
izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) a ždo vymiznutia
ružového sfarbenia fenolftaleínu.
Eliminujte najvä čšiučasťhexánu vákuovou destiláciou (napríklad
s pou žitím rota čnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5).
Vysú šajte olej vo vákuu a ždo úplnej eliminácie rozpú šťadla.
Po skon čení tejto procedúry má by ťacidita oleja ni žšia ako 0,5 %.
5.1.2. Vlo žte 1,0 g oleja pripraveného pod ľav yššie uvedených indikácií do 25
ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej zmesi
(4.10). Nechajte roztok postá ťaspoň15 minút pred chromatografiou
na silikagélovej kolóne.
Ak je roztok zakalený, odstre ďte ho, aby boli zabezpe čené optimálne
podmienky na chromatografiu. (Mô žu sa pou žiťaj užhotové 500
g silikagélové patróny SPE –na extrakciu na tuhých fázach).▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —50
5.1.3. Príprava chromatografickej kolóny
Nalejte do kolóny (3.3) pribli žne 30 ml vyvíjacieho rozpú šťadla (4.10),
pomocou sklenenej ty činky vlo žte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny;
stlačte, aby sa odstránil vzduch.
V kadi čke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v pribli žne 80 ml
vyvíjacieho rozpú šťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny.
Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený v šetok silikagél; premyte vyví-
jacím rozpú šťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina teku-
tiny dosiahla pribli žne 2 mm nad vrchnou úrov ňou silikagélu.
5.1.4. Chromatografia na kolóne
Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvá žte presne 1,0 g vzorky
pripravenej pod ľa bodu 5.1.
Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do
chromatografickej kolóny pripravenej pod ľa bodu 5.1.3. Nepohnite
povrchom kolóny.
Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiec ť,ažkým nedosiahne
úrove ňsilikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpú šťadla. Upravte
prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny pribli žne za 60
–70 minút).
Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvá žili. Odparte
rozpú šťadlo vo vákuu a odstrá ňte jeho posledné stopy pod prúdom
dusíka.
Odvá žte banku a vypo čítajte mno žstvo získaného extrátu.
[V prípade pou žitia u žhotových silikagélových patrónov SPE postupujte
takto: zave ďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov s 3
ml n-hexánu.]
Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru
v objemovom pomere 9/1.
Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka a ždo
vysušenia.
Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overi ť
zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE.
5.2. Hydrolýza pankreatickou lipázou
5.2.1. Do centrifuga čnej skúmavky odvá žte 0,1 g oleja pripraveného pod ľa
bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu
sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pri čom po ka ždom
pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkoua umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C.
5.2.2. Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmá čali zátku)
a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte,
počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnú ť.
5.2.3. Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom
odstre ďte a pomocou mikrostrieka čky preneste éterový roztok do čistej
a suchej skúmavky.
5.3. Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia
5.3.1. Pomocou mikrostrieka čky zave ďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml
skúmavky s kónickým dnom.
5.3.2. Eliminujte rozpú šťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl
činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút
odstá ť.
5.3.3. Po 20 minútach pridajte 1 a ž5 ml n-hexánu (v závislosti od chromato-
grafických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chro-matografiu.
5.4. Plynová chromatografia
Hlavné opera čné podmienky sú tieto:
—teplota injektora (injektor „on column “)n ižšia ako teplota varu
rozpú šťadla (68 °C),▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —51
—teplota detektora: 350 °C,
—teplota kolóny: nastavenie teploty pece: 60 °C po čas 1 minúty, ka ždú
minútu zvý šte o 15 °C a ždo dosiahnutia 180 °C, potom o 5 °C za
minútu a ždo 340 °C, ďalej udr žiavajte 340 °C po čas 13 minút,
—nosný plyn: vodík alebo hélium nastavené na lineárnu rýchlos ť
adekvátnu na dosiahnutie rozlí šenia znázorneného na obrázku 1.
Reten čnýčas triglyceridu C54má by ť40 ± 5 minút (pozri obrázok
2). (Vyššie uvedené podmienky postupu sa uvádzajú len orienta čne.
Každý subjekt ich musí optimalizova ťs cie ľom dosiahnu ťpožadované
rozlí šenie. Vý ška píku zodpovedajúca 2-glyceril monopalmitátu musí
dosiahnu ťaspo ň10 % rozsahu stupnice zapisova ča.),
—Množstvo vstreknutej látky: 0,5 –1μl roztoku (5 ml) n-hexánu
(5.3.3).
5.4.1. Identifikácia píkov
Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných
reten čných časov a vzh ľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami
zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach.
5.4.2. Kvantitatívne hodnotenie
Plocha ka ždého píku sa vypo číta pomocou elektronického integrátora.
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypo číta na základe
vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a sú čtom plôch píkov
všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) pod ľa vzorca:
glycéryl monopalmitate (%):Ax
ΣA/C2100
kde:
Ax= plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu,
ΣA= s ú čet plôch v šetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom.
Výsledok sa uvádza s presnos ťou na jedno desatinné miesto.
7. SPRÁVA O ANALÝZE
V správe z analýzy sa má konkrétne uvies ť:
—odkaz na túto metódu,
—všetky údaje potrebné na úplnú identifikáciu vzorky,
—výsledok analýzy,
—každé odklonenie sa od tejto metódy, čiužvplyvom rozhodnutia
dotknutých strán alebo z iného dôvodu,
—podrobné identifika čné údaje o laboratóriu, dátum uskuto čnenia
analýzy a podpis zodpovedných za analýzu.▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —52
Obrázok 1
Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafino-
vanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %)
Vysvetlivky: „acides gras libres “=v o ľné mastné kyseliny; „huile d ’olive rafinée + 20 % huile
estérifiée “= rafinovaný olivový olej s pridaním 20 % esterifikovaného oleja; „1-2 monopalmito-
léine“= 1-2 monopalmitín; „1-2 mono C18insat. “= nesaturovaný 1-2 mono C18▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —53
Obrázok 2
Chromatogram:
A) neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapi-
lárna kolóna 8 –12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia digly-
ceridu alebo krátko potom.
Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekro čiť15 %.
Vysvetlivky:
1= V o ľné mastné kyseliny
2 = Monoglyceridy3 = Diglyceridy4 = Triglyceridy* = 2-monopalmitín** = Triglycerid C
54▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —54
Chromatogram:
B) esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 –
12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko
potom.
Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekro čiť15 %.
Vysvetlivky :
1= V o ľné mastné kyseliny
2 = Monoglyceridy
3 = Diglyceridy
4 = Triglyceridy* = 2-monopalmitín** = Triglycerid C
54▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —55
8. POZNÁMKY
Poznámka 1 PRÍPRAVA LIPÁZY
V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostato čnou akti-
vitou. V laboratóriu sa tie ždajú pripravi ťtakto:
5k g čerstvých pankreasov z o šípaných ochla ďte na 0 °C.
Odstrá ňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozome ľte
v mlyn čeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu.
Pretrepávajte túto hmotu 4 a ž6 hodín spolu s 2,5 litra bezvo-
dého acetónu a potom odstre ďte. E šte trikrát extrahujte
zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom
ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom
pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom.
Sušte zvy šok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný
prášok, ktorý bude dlhodobo uskladnite ľný v chladni čke chrá-
nený pred vlhkos ťou.
Poznámka 2 KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY
Pripravte emulziu olivového oleja takto:
Počas 10 minút pretrepávajte v mie šači zmes zlo ženú zo 165
ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15g roztl čeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja.
Postupne zave ďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej
0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml a 20
ml destilovanej vody.
Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C;
zaveďte elektródy pH-metra a špirálové mie šadlo.
Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu
sodného 0,1 N, a žkým nedosiahnete pH 8,3.
Pridajte objem suspenzie prá šku lipázy vo vode (0,1 g/ml
lipázy). Ke ďpH-meter uká že pH 8,3, uve
ďte chronometer
dočinnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu
sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udr žiavala na
8,3. Zaznamenajte ka ždú minútu objem spotrebovaného
roztoku.
Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, žeo s
nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na
osi závisle premenných (y-ová os) uvediete po čet mililitrov
alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udr žanie
konštantného pH. Mali by ste získa ťlineárny graf.
Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypo číta
na základe vzorca:
A¼V/C2N/C2100
m
kde:
A je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mgVj e p o čet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za
minútu (vypo čítané na základe grafu)
N je molarita roztoku hydroxidu sodnéhom je mno žstvo testovacej lipázy v mg.
Jednotka lipázy je definovaná ako mno žstvo enzýmu, ktoré
uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.
▼M20__________▼M211991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —56
PRÍLOHA IX
SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ
OBLASTI
ÚVOD
Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti mô že poskytnú ťinfor-
mácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali
počas technologických procesov.
Absorpcia pri vlnových d ĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená
prítomnos ťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto
absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E1%1c m (extinkcia 1 %
roztoku tuku v špecifikovanom rozpú šťadle, v kyvete hrúbej 1 cm) obvykle
určená ako K (tie žvyjadrovaná ako „extink čný koeficient “).
1. OBLAS Ť
Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivo-
vého oleja v ultrafialovej oblasti.
2. PODSTATA
Testovaný tuk sa rozpustí v po žadovanom rozpú šťadle a extinkcia roztoku
sa potom stanoví pri ur čenej vlnovej d ĺžke so zrete ľom na čisté rozpú šťadlo.
Určité extinkcie sa vypo čítavajú zo spektrofotometrických údajov.
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
3.1. Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220
a 360 mm, s mo žnosťou od čítavania jednotlivých nanometrických jednotiek.
3.2. Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou d ĺžkou 1 cm. Ke ďsa
kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpú šťadlom, nemali by medzi
sebou vykazova ťrozdiel vä čšií ako 0,01 jednotky extinkcie.
3.3. 25 ml odmerná banka
▼M6
3.4. Chromatografická kolóna s hornou časťou o d ĺžke 270 mm a o priemere
35 mm a so spodnou časťou o d ĺžke 270 mm a priemere pribli žne 10 mm.
▼B
4. ČINIDLÁ
4.1. Spektrofotometricky čistý izo-oktán (2,2,4-trimetypentán)
—Pokia ľide o destilovanú vodu, mal by ma ťtransmitanciu nie menej ako
60 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm alebo spektrofo-
tometricky čistý cyklohexán, pokia ľide o destilovanú vodu, mal by ma ť
transmitanciu nie menej ako 40 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri250 nm.
▼M6__________
▼B
4.2. Základný oxid hlinitý pre chromatografické kolóny pripravený
a skontrolovaný tak, ako je opísané v prílohe 1.
4.3. n-hexán, na chromatografiu
5. POSTUP
5.1. Skúmaná vzorka musí by ťdokonale homogénna a bez podozrivých ne čistôt.
Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote
pribli žne 30oC, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote
najviac 10oC nad bodom topenia.
5.2. Presne odvá žte pribli žne 0,25 g takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej
banky, dopl ňte ur čeným rozpú šťadlom po zna čku a zhomogenizujte.
Výsledný roztok musí by ťúplne priezra čný. Ak je prítomná opalescencia
alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.
5.3. Získaným roztokom napl ňte kyvetu a za pou žitia rozpú šťadla na porovnanie
zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej d ĺžke medzi 232 a ž276 nm.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —57
Namerané hodnoty sa musia nachádza ťv rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie,
merania sa musia zopakova ťza pou žitia koncentrovanej ších alebo zriede-
nejších roztokov, ak je to vhodné.
5.4. Ak je stanovenie ur čitej extinkcie po žadované po prechode vzorky cez oxid
hlinitý, postup je nasledujúci: Do chromatografickej kolóny dajte 30 gzákladného oxidu hlinitého v suspenzii v hexáne. Po usadení adsorbentu
stiahnite nadbyto čný hexán dole na pribli žne 1 cm nad horným okrajom
oxidu hlinitého.
V 100 ml hexánu rozpustite 10 g tuku, zhomogenizujte ho a prefiltrujte
podľa opisu v 5.1. a nalejte roztok do kolóny. Zozbierajte eluát a za vákua
odparte v šetko rozpú šťadlo pri teplote pod 25
oC.
S takto získaným tukom hne ďpokra čujte pod ľa postupu uvedeného v 5.2.
6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV6.1. Zaznamenajte špecifické extinkcie (extink čné koeficienty) pri rôznych vlno-
vých d ĺžkach, ktoré sa vypo čítajú takto:
K
λ¼Eλ
c·s
kde:
Kλ=špecifická extinkcia pri vlnovej d ĺžkeλ;
Eλ= nameraná extinkcia pri vlnovej d ĺžkeλ;
c = koncentrácia roztoku v g/100ml;s = hrúbka kyvety v cm.Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.
6.2. Spektrografická analýza olivového oleja súlade s oficiálnou metódou
v nariadeniach EHS ustanovuje stanovenie extinkcie v izo-oktánovom
roztoku pri vlnových d ĺžkach 232 a 270 nm a stanovenie K, ktoré je vyja-
drené vzorcom:
ΔK¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
kde Kmješpecifická extinkcia pri vlnovej d ĺžke m, vlnová d ĺžka pre maxi-
málnu absorpciu je okolo 270 nm.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —58
DOPLNOK I
Príprava oxidu hlinitého a testovanie jeho aktivity
A.1.1. P r í p r a v a o x i d u h l i n i t é h o
Do hermeticky uzatvárate ľnej nádoby vlo žte oxid hlinitý, ktorý ste
predtým su šili v peci po dobu troch hodín pri teplote 380 a ž400oC,
pridajte destilovanú vodu v pomere 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, nádobu
ihneďuzatvorte, opakovane pretrepávajte a potom nechajte odstá ťaspoň
12 hodín pred pou žitím.
A.1.2. K o n t r o l a a k t i v i t y o x i d u h l i n i t é h o
Pripravte chromatografickú kolónu s 30 g oxidu hlinitého. Postupujte
podľa odseku 5.4., nasledujúcu zmes:
—95 % panenského olivového oleja, ktorého špecifická extinkcia je
menej ako 0,18 pri 268 nm,
—5 % oleja z podzemnice olejnej, upraveného hlinkou v procese rafi-
nácie, so špecifickou extinkciou nie men šou ako 4 pri 268 nm
nechajte prejs ťcez kolónu.
Ak má zmes pri prechode kolónou špecifickú extinkciu vä čšiu ako 0,11
pri 268 nm, je oxid uhli čitý vyhovujúci, ak nie, úrove ňdehydrácie sa
musí zvý šiť.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —59
DODATOK II
Kalibrácia spektrofotometra
A.2. Prístroj sa musí kontrolova ťv intervaloch (najmenej ka ždých šesť
mesiacov) pri obidvoch vlnových d ĺžkach a na presnos ťodozvy.
A.2.1. Vlnovú d ĺžku je mo žné kontrolova ťpomocou pou žitia pár ortu ťovej
lampy alebo pomocou vhodných filtrov.
A.2.2. Pri kontrole odozvy fotocely a fotonásobi ča postupujte takto: Odvá žte
0,2000 g čistého chrómanu draselného pre spektrofotometriu a rozpustite
v 0, 05N roztoku hydroxidu sodného v 1 000 ml odmernej banke
a dopl ňte po zna čku. Odoberte presne 25 ml získaného roztoku, preneste
do 500 ml odmernej banky a zrie ďte doplnením po zna čku tým istým
roztokom hydroxidu draselného.
Zmerajte extinkciu takto získaného roztoku pri 275 nm pou žitím roztoku
hydroxidu draselného ako porovnávacieho roztoku. Extinkcia meraná
v 1 cm kyvete by mala by ť0,200 ± 0, 005.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —60
PRÍLOHA X A
PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV
MASTNÝCH KYSELÍN
1. OBLAS Ť
Táto metóda podáva v šeobecný návod na pou žitie plynovej chromato-
grafie vyu žívajúcej nápl ňové kolóny alebo kapilárne kolóny
na stanovenie kvantitatívneho a kvalitatívneho zlo ženia zmesi metyl
esterov mastných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenouv prílohe X B.
Metóda sa nedá pou žiťna polymerizované mastné kyseliny.
2. ČINIDLÁ
2.1. Nosný plyn
Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, at ď.), dokonale vysu šený a s
obsahom kyslíka men ším ako 10 mg/kg.
Poznámka 1: Vodík, ktorý sa pou žíva ako nosný plyn iba pre kapilárne
kolóny, mô že dvojnásobne urýchli ťanalýzu, ale je nebez-
pečný. Sú k dispozícii bezpe čnostné zariadenia.
2.2. Pomocné plyny.2.2.1. Vodík ( čistoty ≥99,9 %), bez organických ne čistôt
2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických ne čistôt
2.3. Porovnávací (referen čný)štandard
Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku
známeho zlo ženia, najlep šie podobného zlo ženia ako tuková látka
na analýzu
Je potrebné dba ťna to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených
mastných kyselín.
3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
Uvedené pokyny týkajúce sa be žného vybavenia pou žívaného v plynovej
chromatografii, vyu žívajúce nápl ňové a/alebo kapilárne kolóny
a plame ňovoioniza čný detektor. Je vhodné ka ždé zariadenie
súčinnos
ťou a rozlí šením uvedené v 4.1.2.
3.1. Plynový chromatograf
3.1.1. Dávkovací (injek čný) systém
Použite niektorý z uvedených injek čných systémov:
a) s nápl ňovými kolónami, s najmen ším mo žným m ŕtvym objemom
(v tomto prípade by mal da ťinjektor zahria ťna teplotu o 20 a ž50
oCv y ššiu ako má kolóna) alebo
b) s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal by ťinjektor
špeciálne navrhnutý na pou žitie pre takéto kolóny. Mô žet ob y ť
split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.
Poznámka 2: Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlí-
kovými atómami sa mô že pou žiťinjektor s pohyblivou
ihlou.
3.1.2 P e c
Pec by mala by ťschopná vyhrieva ťkolónu na teplotu aspo ň260oC
a udr žiavaťpožadovanú teplotu v rozmedzí 1oC v prípade nápl ňovej
kolóny a 0,1oC pri kapilárnej kolóne. Táto druhá po žiadavka je obzvlá šť
dôležitá pri kolónach z taveného kreme ňa.
Vo v šetkých prípadoch sa odporú ča teplotne-programovate ľné vyhrie-
vanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovýmiatómami.
3.1.3 N á p l ňová kolóna
3.1.3.1. Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných vo či analyzovaným látkam
(napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi:▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —61
a) dĺžka: 1 a ž3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým
reťazcom (nad C 20), dajú sa pou žiťrelatívne krátke kolóny. Ak analy-
zujeme kyseliny so 4 a žuhlíkovými atómami, odporú ča sa pou žiť
kolónu dlhú 2 m.
b) vnútorný priemer: 2 a ž4 mm.
Poznámka 3. Aksú prítomné polynenasýtené zlo žky s viac ako tromi
dvojitými väzbami, tieto sa mô žu rozlo žiťv kolóne
z nerezovej ocele.
Poznámka 4. Je mo žné pou žiťaj systém s dvojicou nápl ňových kolón.
3.1.3.2. Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí:
a)nosi č: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný
inertný nosi čs úzkym rozmedzím ve ľkosti z ŕn (25 μm rozmedzie
medzi hranicami 125 a ž200 μm); priemerná ve ľkosťčastíc závisí
od vnútorného priemeru a d ĺžky kolóny;
b)stacionárna fáza : polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietylén-
glykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát,
atď.), kyanosilikóny alebo ka ždé iné kvapaliny umo žňujúce chroma-
tografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť5
až20 % (m/m) náplne nosi ča. Pri ur čitých separáciách je mo žné
použiťnepolárne stacionárne fázy.
3.1.3.3. Kondiciovanie kolóny
Pec postupne vyhrievajte a ždo 185oC, ak je v hodné, pripravenú kolónu
odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspo ň16 hodín
prúdi ťinertný plyn tempom 20 a ž60 ml/min a potom ďalšie 2 hodiny
pri teplote 195oC.
3.1.4. K a p i l á r n a k o l ó n a
3.1.4.1. Trubica vyrobená z materiálu odolného vo či analyzovaným (obvykle
zo skla alebo z taveného kreme ňa). Vnútorný priemer 0,2 a ž0,8 mm.
Vnútorný povrch pre šiel pred nanesením stacionárnej fázy patri čnou
úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). D ĺžka 25 mm vyho-
vuje vo vä čšine prípadov.
3.1.4.2. Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000),
polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu(kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krí žom viazanými väzbami
(cross-linked bonded).
Poznámka 5. Pri pou žití polárnych polyxilánov sa s ťažuje identifikácia
a separácia kyseliny linoleovej a C
20kyselín.
Nanesená vrstva by mala by ťtenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm.
3.1.4.3. Montá ža kondiciovanie kolóny
Pri montá ži kapilárnych kolón dodr žte obvyklé opatrenia, t. j. umiest-
nenie kolóny v peci (dr žiak), výber a montá žspojov (tesnos ť), umiest-
nenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia m ŕtvych
objemov). Ulo žte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar
(30 kPa), v prípade kolóny d ĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom
0,3 mm].
Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3oC/min od
teploty prostredia a žna teplotu 10oC pod limitom dekompozície stacio-
nárnej fázy. Udr žujte pec na tejto teplote jednu hodinu a ždo stabilizácie
základu. Vrá ťte teplotu na 180oC, aby ste pracovali v izotermálnych
podmienkach.
Poznámka 6. Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej
sieti
3.1.5. Detektor, lep šie ak je s vyhrievaním na teplotu vy ššiu ako teplota danej
kolóny.
3.2. Pipeta
Pipeta by mala by ťs maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm
dieliky.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —62
3.3. Zapisova č
Ak sa na výpo čet zlo ženia analyzovanej zmesi pou žije krivka
zo zapisova ča, je potrebný presný elektronický zapisova č, kompatibilný
s pou žitým prístrojom. Zapisova čby mal ma ť:
a) odozvový pomer pod 1,5 s; lep šie 1 s (odozvový pomer je čas, za
ktorý zapisovacie pero prejde od 0 do 90 % pod ľa náhleho vstupu
100 % signálu);
b)šírka papiera, minimálne 20 cm;
c) rýchlos ťpapiera, nastavite ľné hodnoty medzi 0,4 a 2,5 cm/min.
3.4. Integrátor
Pomocou elektronického integrátora je mo žné vykona ťrýchly a presný
výpo čet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivos ťou
a dostato čnú korekciu odchýlky základnej línie.
4. POSTUP
Postupy uvedené v 4.1 a ž4.3. sa vz ťahujú aj na plame ňovoioniza čný
detektor.
Alternatívne sa mô že pou žiťplynový chromatograf vyu žívajúci kataro-
metrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti).Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.
4.1. Podmienky testovania
4.1.1. Výber optimálnych pracovných podmienok
4.1.1.1. Nápl ňové kolóny
Pri výbere podmienok testovania je potrebné vzia ťdo úvahy nasledujúce
premenné:
a) dĺžku a priemer kolóny;
b) druh a mno žstvo stacionárnej fázy;
c) teplotu kolóny;d) prietok nosného plynu;
e) po žadované rozlí šenie;
f) ve ľkosťtestovanej navá žky vybranej takým spôsobom, aby detektor
a elektrometer dávali lineárnu odozvu;
g) dĺžka analýzy.
Vo v šeobecnosti, hodnoty uvedené v tabu ľke 1 a 2 povedú
kp o žadovaným výsledkom, t. j. aspo ň2 000 teoretických priehradiek
na meter d ĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15
minút.
Ak to zariadenie dovo ľuje, injektor by mal by ťnastavený na teplotu
okolo 200oC a detektor na teplotu rovnú alebo vy ššiu ako je teplota
kolóny.
Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plame ňovoioni-
začného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1
v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 a ž10 krát vä čší
ako prietok vodíka.
Tabu ľka 1
Vnútorný priemer kolóny
(v mm)Prietok nosného plynu
(v ml/min)
21 5 a ž25
32 0 a ž40
44 0 a ž60▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —63
Tabu ľka 2
Koncentrácia stacionárnej fázy
% (m/m)Teplota kolóny
oC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapilárna kolóna
Vlastnosti ako ú činnos ťa priepustnos ťkapilárnych kolón znamenajú, že
separácia medzi zlo žkami a d ĺžkou trvania analýzy sú vo ve ľkej miere
závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné opti-malizova ťpracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo
jednoduch šie na straty na hlave kolóny) pod ľa toho, čis iželáte zlep šiť
separáciu alebo urýchli ťanalýzu.
4.1.2. Stanovenie po čtu teoretických priehradiek (ú činnos ť) a rozlí šenia (pozri
obrázok 1)
Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných
množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla).
Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna
hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píkurozpú šťadla. Pou žite dostato čné mno žstvo zmesi metyl esterov, aby pík
metyl stearátu zabral pribli žne tri štvrtiny celkového rozsahu.
Vypo čítajte po čet teoretických priehradiek, n (ú činnos ť) pod ľa vzorca:
n¼16/C20
dr1
ω1/C212
a rozlí šenie R pod ľa vzorca:
R¼2Δ
ω1þω2
kde:
dr1 je reten čná vzdialenos ťv milimetroch od štartu chromato-
gramu po maximum píku metyl stearátu;
ω1aω2 súšírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané medzi
bodmi priese čníkov tangentov a interflexnými bodmi
krivky so základnou líniou;
Δ je vzdialenos ťv milimetroch medzi maximami píkov metyl
stearátu a metyl oleátu,
▼M2
a index rozpustnosti 1r pri pou žití vzorca
a
b
kde:
a= v ý ška najmen šieho píku meraná od základnej čiary;
b= v ý ška najni žšieho bodu priehlbiny medzi dvoma pri ľahlými píkmi
meraná od základnej čiary.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —64
Obrázok 1
Chromatogram na stanovenie po čtu teoretických priehradiek (ú činnos ť)
a rozlí šenie
Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umo žnia aspo ň2 000 teore-
tických priehradiek na meter d ĺžky kolóny a rozlí šenie aspo ň1,25.
4.2. Ve ľkosťnavážky
Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 a ž2μl roztoku metyl esterov
pripraveného pod ľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.
Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich pribli žne 100 mg/ml
roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 mltohto roztoku.
Ak sú zlo žky prítomné iba v stopových mno žstvách, ve ľkosťnavážky
môžete zvý šiť(až10 násobne).
4.3. Analýza
Pracovné podmienky boli v šeobecne definované v 4.1.1.
Napriek tomu je mo žné pracova ťpri ni žšej teplote kolóny, ak sa po ža-
duje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo
pri vy ššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami
uhlíka. V prípade potreby je mo žné vyu žiťprogramovanú teplotu
v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl estery mastných
kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100
oC
(alebo od 50 do 60oC, ak je prítomná kyselina butyrová) a ihne ďzvýšte
teplotu s gratientom 4 a ž8oC/min do optimálnej teploty. V niektorých
prípadoch sa mô žu kombinova ťobidva postupy.
Po programovom vyhrievaní pokra čujte v elúcii pri kon štantnej teplote,
ažkým sa v šetky zlo žky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové
vyhrievanie, pou žite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195oC.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —65
Ak je vhodné, odporú ča sa vykona ťanalýzu na dvoch ukotvených fázach
rôznej polarity a tým sa overí neprítomnos ťprekrytých píkov, napríklad
v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C18:3aC20:0alebo
C18:3aC18:2.
4.4. Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov
Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracov-
ných podmienok, aké boli pou žité pri vzorkách a zmerajte reten čnéčasy
alebo reten čné vzdialenosti zlo žiek mastných kyselín. Na semi-logarit-
mický papier zhotovte, na ka ždý stupe ňnenasýtenia, grafy ukazujúce
logaritmus reten čného času alebo vzdialenosti ako funkciu po čtu uhlíko-
vých atómov. Pri izotermických podmienkach by mali by ťgrafy pre
nerozvetvené kyseliny s rovnakým stup ňom nenasýtenia rovnobe žné.
Je nevyhnutné predís ťtakému kondiciovaniu, po ktorom sa objavujú
„maskované píky “, t. j. kde je nedostato čné rozlí šenie na rozdelenie
dvoch zlo žiek.
5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
5.1. Kvalitatívna analýza
Identifikujte píky metylesterov pre vzorku z grafov uvedených v 4.4,
interpoláciou, ak je vhodné.
5.2. Kvantitatívna analýza
5.2.1. S t a novenie zlo ženia
Okrem výnimo čných prípadov pou žite metódu vnútornej normalizácie, t.
j. predpokladajme, žev šetky zlo žky vzorky sú zastúpené
na chromatografe, tak že celková plocha pod píkmi prestavuje 100 %
zložiek (úplná elúcia).
Ak je v zariadení aj integrátor, pou žite jeho zaznamenané hodnoty. Ak sa
v prístroji nenachádza, ur čite plochu pod ka ždým píkom vynásobením
výšky píku šírkou píku v polovi čnej vý ške, a ke ďje to vhodné, zoberte
do úvahy rôzne zoslabenia po čas zápisu.
5.2.2 M e t ó d a v ý p o čtu
5.2.2.1. Ilustra čný (v šeobecný) prípad
Vypo čítajte obsah danej zlo žkyi, vyjadrený ako percento hmotnosti
metylesterov, stanovením percenta predstavujúceho plochu príslu šného
píku vz ťahujúceho sa k sume plôch v šetkých píkov, pomocou nasledu-
júceho vzorca:
AiPA/C2100
kde:
Aije plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zlo žke i,
ΣA je suma plôch pod v šetkými píkmi.
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.
Poznámka 7. V tomto ilustra čnom prípade je výsledok výpo čtu zalo žený
na v pomerných plochách sa pova žuje za hmotnostné
percento. Pre prípady, v ktorých tento predpoklad nie jemožný, pozri 5.2.2..2.
5.2.2.2. Pou žitie korek čných faktorov
V niektorých prípadoch, napríklad za prítomnosti mastných kyselín
s menej ako 8 atómami uhlíka alebo kyselín so sekundárnou skupinou,ak sa pou žije tepelnovodivostný detektor alebo sa po žaduje predov šet-
kým vy šší stupe ňpresnosti, by sa mali pou žiťkorek čné faktory
na prevedenie plo šných percent na hmotnostné percentá zlo žiek.
Stanovte korek čné faktory pomocou chromatografu odvodeného
z analýzy porovnávacej zmesi metylesterov známeho zlo ženia, vykonanej
za rovnakých pracovných podmienok ako pri vzorke.
Pri tejto porovnávacej zmesi je hmotnostné percento zlo žkyivyjadrené
vzorcom:▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —66
miPm/C2100
kde:
mije hmotnos ťzložkyiv porovnávacej zmesi;
∑Am je celková hmotnos ťrôznych zlo žiek v referen čnej zmesi (porov-
návacom roztoku).
Z chromatogram porovnávacieho roztoku (4.4) vypo čítajte percento
(plocha/plocha) pre zlo žkuitakto:
AiPA/C2100
kde:
Aije plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zlo žke i,
∑A je suma plôch pod v šetkými píkmi.
Korek čný faktor sa potom vypo číta:
Ki¼mi/C2PA
Ai/C2Pm
Bežnejšie sa korek čné faktory vyjadrujú pod ľa ich vz ťahu k KC16, takže
relatívnymi faktormi sa stávajú:
K′i¼Ki
KC16
Pre vzorku, obsah ka ždej vzorky i, vyjadrený ako hmotnostné percento
metyl esterov je:
K′i/C2AiPðK′i/C2AiÞ/C2100
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.
5.2.2.3. Pou žitie vnútorného štandardu
Pri niektorých analýzach (napr. ak nie sú kvantifikované v šetky mastné
kyseliny, ako ke ďsú ved ľa kyselín so 16 alebo 18 uhlíkmi prítomné
kyseliny so štyrmi alebo šiestimi uhlíkmi alebo ke ďje potrebné vo
vzorke ur čiťabsolútne mno žstvo mastnej kyseliny) je nevyhnutné pou žiť
vnútorný štandard. Mal by sa ur čiťkorek čný faktor (ak je nejaký ) pre
vnútorný štandard.
Hmotnostné percento zlo žkyi, vyjadrené ako metylester, je potom vyja-
drené vzorcom:▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —67
ms/C2K′i/C2Ai
m/C2K′s/C2As/C2100
kde:
Aije plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zlo žkei;
Asje plocha pod píkom, ktorý zodpovedá vnútornému štandardu;
K′ije korek čný faktor zlo žkyi(vzťahujúci sa na KC1);
K′sje korek čný faktor vnútorného štandardu (vz ťahujúci sa na KC16);
m je hmotnos ťnavážky vzorky, v miligramoch;
msje hmotnos ťvnútorného štandardu, v miligramoch.
Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.
▼M2
6. OSOBITNÝ PRÍPAD —STANOVENIE TRANS-IZOMÉROV
Je mo žné stanovi ťobsah trans-izomérov v mastných kyselinách s po čtom
atómov uhlíka od 10 do 24 oddelením metylesterov s pou žitím plyno-
vých chromatografických kapilárnych kolón so špecifickou polaritou.
6.1 Kapilárna kolóna vyrobená z oxidu kremi čitého s vnútorným priemerom
0,25 mm a ž0,32 mm a s d ĺžkou 50 m s nanesenou vrstvou kyanopro-
pysilikónu, pri čom hrúbka vrstvy bude od 0,1 do 0,3 μm (typ SP 2380,
C. P. sil 88, silor 10 a podobné druhy).
▼M21
6.2. Metyl-estery sa pripravia pod ľa postupu B uvedenom v ďalšej prílohe
X„B“. Tuky alebo oleje s obsahom vo ľných kyselín viac ako 3 % musia
byťvopred neutralizované v súlade s bodom 5.1.1 prílohy VII.
▼M2
6.3 Pracovné podmienky pre plynovú chromatografiu sú takéto:
—teplota kolóny nastavená na hodnotu od 150 °C do 230 °C (napríklad
165 °C po čas 15 minút a následné zvy šovanie rýchlos ťou 5 °C za
minútu na 200 °C);
—teplota injektora: 250 °C, pokia ľsa pou žíva systém s deli čom, alebo
začiatočná teplota kolóny, ak sa pou žíva systém na kolóne;
—teplota detektora: 260 °C;
—prietok nosného plynu (hélium a vodík): 1,2 ml za minútu.
Vstreknuté mno žstvo musí by ťtaké, aby za pou žitých podmienok citli-
vosti vý ška píku zodpovedajúceho metylesteru kyseliny ara šidovej bola
rovnaká alebo vä čšia ako 20 % spodnej časti stupnice.
6.4 Identifikácia rôznych metylesterov sa vykoná na základe reten čných
časov, ktoré sa porovnajú s reten čnými časmi referen čných zmesí (ako
je uvedené v bode 2.3).
Estery trans-mastných kyselín sa eluujú pred zodpovedajúcimi cis-
izomérmi. Príklad chromatogramu je uvedený na obrázku 2.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —68
Obrázok 2:
Plynový chromatogram trans-izomérov mastnej kyseliny s pou žitím kapilárnej
kolóny
6.5 Ú činnos ťkolóny stanovená v súlade s bodom 4.1.2 musí by ťtaká, aby
umožnila oddelenie ur čitých kritických dvojíc, napríklad dvojice tvorenej
masívom píku trans-izoolejových kyselín a kyseliny olejovej, transC18:1/cis C18:1 s indexom rozlí šenia vy šším ako 2.
6.6 Percento rôznych trans-mastných kyselín sa vypo číta na základe pomeru
medzi plochou príslu šného píku a sú čtom plôch v šetkých prítomných
píkov.
Percentá:—trans-oktadekénových kyselín (T 18:1) uvedených v prílohe
I k nariadeniu ako suma trans-olejových izomérov;
—cis-trans a trans-cis kyselín oktadekandiénových [(CT/TC) 18: 2]
uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolovýchizomérov;
—trans–cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, kyselín okta-
dekantriénových [(TCT + CCC + CTC;TCC) 18: 3] uvedených
v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolénových
izomérov
sa berú do úvahy.Poznámka 8: Berúc do úvahy osobitné charakteristiky tejto metódy,
uvádzajte prosím výsledky na dve desatinné miesta.
▼B
7. ŠPECIÁLNY PRÍPAD —POU ŽITIE KATAROMETRA AKO DETEK-
TORA (PRACUJÚCEHO NA PRINCÍPE ZMIEN TEPELNEJ VODI-
VOSTI)
Na stanovenie kvalitatívneho a kvantitatívneho zlo ženia zmesi metyle-
sterov mastných kyselín sa dá taktie žpoužiťplynový chromatograf
využívajúci detektor pracujúci na princípe sledovania zmien tepelnej
vodivosti (katarometer). V prípade jeho pou žitia, podmienky uvedené
v odseku 3 a 4 sa upravia pod ľa tabu ľky 3.
Pri kvantitatívnej analýze pou žite korek čné faktory uvedené v 5.2.2.2.▼M21991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —69
Tabu ľka 3
Premenná Hodnota/podmienka
Kolóna d ĺžka: 2 a ž4m
vnútorný priemer: 4 mm
Nosič zrná ve ľkosti medzi 160 a 200 μm
Koncentrácia stacionárnej fázy 15 a ž25 % (m/m)
Nosný plyn hélium alebo ak sa toto nedá
použiť, vodík s čo najni žším
obsahom kyslíka
Pomocné plyny žiadne
Teplota injektora od 40 do 60oC nad teplotou
kolóny
Teplota kolóny 180 a ž200oC
Prietok nosného plynu obvykle medzi 60 a 80 ml/min
Veľkosťdávkovaného pomeru obvykle medzi 0,5 a ž2μl
8. SPRÁVA O VÝSLEDKU TESTU
Správa o výsledku testu vymedzuje metódy pou žívané na prípravu metyl
esterov a na plynovo chromatografickú analýzu a dosiahnuté výsledky.
Uvedú sa v nej v šetky podrobnosti o pracovnom postupe, ktoré neboli
spomenuté v tejto medzinárodnej technickej norme alebo sa nepova žo-
vali sa povinné, spolu s podrobnos ťami o akomko ľvek sprievodnom
jave, ktorý by mohol ovplyvni ťvýsledky.
Správa o výsledku testu bude zah ŕňaťvšetky informácie potrebné pre
úplnú identifikáciu vzorky.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —70
ANNEX X B
PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM
OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL
The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl
esters from olive oils and olive-pomace oils:
Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium
hydroxide
Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol
followed by esterification in acid medium.
Each method will be applied according to the analytical parameter to be deter-
mined and the oil category as indicated below:
(a) determination of difference between actual and theoretical content of trigly-
cerides with ECN42 ( ΔECN42):
—method A will be applied to samples of all the oil categories after
purification of the oil by passing it through a silica gel column;
(b) determination of the fatty acid composition:
—method A will be applied directly to samples of the following oil cate-
gories:
—virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,
—refined olive oil,
—olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),
—refined olive-pomace oil,
—olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace
oil);
—method B will be applied directly to samples of the following oil cate-
gories:
—virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,
—crude olive-pomace oil;
(c) determination of trans-isomers of fatty acids:
—method A will be applied directly to samples of the following oil cate-
gories:
—virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %,
—refined olive oil,
—olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil),
—refined olive-pomace oil,
—olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace
oil);
—method A will be applied to the following categories of oils after puri-
fication of the oil by passing it through a silica gel column:
—virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %,
—crude olive-pomace oil.
PURIFICATION OF OIL SAMPLES
When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica
gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPACmethod 2.507.
Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used.
A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and
washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column frombecoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml ofhexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled
down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under
vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —71
volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under
reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of
heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The secondaliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for trigly-ceride analysis by HPLC, if necessary.
METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS
1. Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potas-
sium hydroxide
1.1. Purpose
This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with
a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are notesterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-este-
rified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially
methylated.
1.2. Principle
Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potas-
sium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place
(title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).
1.3. Reagents
Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.
Heptane, chromatographic quality.Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve
11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.
1.4. Apparatus
Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.
Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml
1.5. Procedure
In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil
sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolicpotassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint,
tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify
until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containingthe methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into thegas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator
until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than
12 hours is not recommended.
2. Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol
followed by esterification in acid medium
2.1. Purpose
This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free
fatty acid content of more than 3,3 %.
2.2. Principle
Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the
glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium(title 4.2. in IUPAC method 2.301).
2.3. Reagents
—heptane, chromatographic quality,
—methanol containing not more than 0,05 % (m/m) water,
—sodium methylate, 0,2 N methanolic solution: dissolve 5 g of sodium
in 1 000 ml of methanol (this may be prepared from commercialsolutions),
—phenolphthalein, 0,2 % methanolic solution,
—sulphuric acid, 1 N in methanolic solution: add 3 ml of 96 % sulp-
huric acid to 100 ml of methanol,
—saturated solution of sodium chloride in water.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —72
2.4. Apparatus
—50 ml flat-bottomed volumetric flask with long, narrow, ground neck,
—reflux condenser: air condenser (1 m long) with ground joint appro-
priate to the neck of the flask,
—boiling chips,
—glass funnel.
2.5. Procedure
Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked
volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium
methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser,
shake, and bring to the boil. The solution should become clear, whichusually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux
stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein
solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solutionuntil the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fitthe condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source
of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser,
add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml ofheptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.
Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated
sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches thelower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl estersfills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.
Caution: Methylation by method B must be done under a hood.
2.6. Alternatives to methylation Method B
2.6.1. Method C
2.6.1.1. Principle
The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydro-
chloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.
2.6.1.2. Apparatus
—Strong glass vial of a capacity of about 5 ml (height 40 to 45 mm,
diameter 14 to 16 mm).
—1 and 2 ml graduated pipettes.
2.6.1.3. Reagents
Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from
gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).
Hexane, chromatographic quality.
Note 1: Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be
used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be
prepared in the laboratory by simple displacement from the
commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulp-huric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by
methanol, it is advisable to take the usual precautions when
dissolving it, e.g. introduce the gas through a small invertedfunnel with the rim just touching the surface of the liquid.Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can
be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered
bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can beprepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrousmethanol.
2.6.1.4. Procedure
—Place in the glass vial 0,2 g of the fatty matter, which has previously
been dried out on sodium sulphate and filtered, and 2 ml of hydro-
chloric acid-methanol solution. Heat seal the vial.
—Immerse the vial at 100 °C for 40 minutes.
—Cool the vial under running water, open, add 2 ml of distilled water
and 1 ml of hexane.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —73
—Centrifuge and remove the hexane phase, which is ready for use.
2.6.2. Method D
2.6.2.1. Principle
The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with
methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extractedwith petroleum ether.
2.6.2.2. Apparatus
—Test tube of a capacity of about 20 ml, fitted with an air reflux
condenser approximately 1 m in length, with ground glass joints.
—5 ml graduated pipette.
—50 ml separating funnel.
—10 ml and 25 ml measuring beakers.
—15 ml test tube with conical base.
2.6.2.3. Reagents
—Methylation reagent: anhydrous methanol-hexane-concentrated sulp-
huric acid (p = 1,84) in the ratio 75:25:1 (V/V/V).
—40 to 60 °C petroleum ether.
—Anhydrous sodium sulphate.
2.6.2.4. Procedure
Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation
reagent.
Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath
(Note 2).
Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with
the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake
vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous
phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Addto the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate,shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate
in a 15 ml test tube with a conical base.
Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.
Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit
the temperature of the water bath to 90 °C.
3. Precision parameters
The statistical evaluation of the precision of methods A and B was
published by the International Olive Oil Council in its method COI/
T.20/CO. No 24.
RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF
THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL
1. Procedure
The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane
is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillarycolumn (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyano-
propylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid
trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).
Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-
pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and
trans-isomers of methyl esters.
2. Calculations
2.1. For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the
following fatty acids will be taken into account:
Myristic (C14:0).
Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the
methyl and ethyl esters.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —74
Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the
ω9 and ω7 isomers of the methyl ester.
Margaric (C17:0).Margaroleic (C17:1).Stearic (C18:0).Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9
andω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the
methyl ester.
Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the
methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester.
Arachidic (C20:0).Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-
isomers of the methyl ester.
Eicosenoic (C20:1).Behenic (C22:0).Lignoceric (C24:0).
Squalene will not be taken into account for the calculation of the total
area.
2.2. For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak correspon-
ding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum[trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-
isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calcu-
lation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be takeninto account (see COI/T.20/Doc. No. 17).
The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out
according to the formula:
%X ¼ðArea X x 100 Þ=ðtotal area Þ▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —75
Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromato-
graphic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —76
PRÍLOHA XI
STANOVENIE OBSAHU PRCHAVÝCH HALOGENOVANÝCH
ROZPÚ ŠŤADIEL V OLIVOVOM OLEJI
1. METÓDA
Analýza plynovou chromatografiou s pou žitím head space techniky.
2. ZARIADENIE
2.1. Plynový chromatograf vybavený detektorom elektrónového záchytu (ECD)2.2. Head space zariadenie2.3. Plynovochromatografická kolóna, sklenená, 2 m dlhá a s priemerom 2 mm,
so stacionárnou fázou. OV 101 10 % alebo ekvivalent, impregnovaná kalci-novaná rozsievková zemina, kyslo praná a silanizovaná s časticami ve ľkosti
od 80 do 100 mesh
2.4. Nosný a pomocný plyn: dusík na plynovú chromatografiu, vhodný
na detekciu elektrónovým záchytom
2.5. Sklenené banky, od 10 do 15 ml, potiahnuté teflónom a s hliníkovou zátkou
s otvormi pre strieka čku
2.6. Hermeticky uzatvárate ľné svorky
2.7. Plynotesné strieka čky 0,5 a ž2ml
3. ČINIDLÁ
Štandard: halogenované rozpú šťadlá, stup ňačistoty vyhovujúceho plynovej
chromatografii
4. POSTUP4.1. Presne odvá žte 3 g oleja, dajte do sklenenej banky (nepou žitej) a hermeticky
ju uzatvorte. Vlo žte ju do termostatu nastaveného na 70
oC na jednu hodinu.
Opatrne pomocou strieka čky odoberte 0,2 a ž0,5 ml horného priestoru (head
space). Nadávkujte do kolóny plynového chromatografu nastaveného nasle-dujúco:
—teplota injektora: 150
oC,
—teplota kolóny: 70 a ž80oC,
—detektor teploty: 200 a ž250oC.
Môžu sa pou žiťaj iné teploty za predpokladu, že sa s tým nezmenia
výsledky.
4.2. Porovnávacie roztoky: pripravte roztoky štandardov pomocou rafinovaného
olivového oleja so stopami rozpú šťadla v koncentráciách v rozsahu 0.05 a ž
do 1 ppm (mg/kg), zodpovedajúce odhadovanému obsahu vo vzorke. Halo-
genované rozpú šťadlá sa dajú zriedi ťa pentánom.
4.3. Kvantitatívne vyhodnotenie: uve ďte do vzájomného vz ťahu plochy alebo
výšky píkov vzorky a štandartného roztoku s najbli žšou predpokladanou.
Ak je odchýlka vä čšia ako 10 %, analýza sa musí zopakova ťštandartným
spôsobom, a žkým odchýlka nie je do 10 %. Obsah je stanovený na základe
priemeru jednotlivých analýz.
4.4. Vyjadrenie výsledkov: v ppm (mg/kg). Detek čný limit pre túto metódu je
0,01 mg/kg.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —77
ANNEX XII
ORGANOLEPTIC ASSESSMENT OF VIRGIN OLIVE OILS
1. PURPOSE AND SCOPE
This Annex sets the criteria required for organoleptic assessment of the
virgin oils defined at 1 in the Annex to Regulation No 136/66/EEC anddescribes the method of grading them with reference to characteristics.
This method can be used only for grading virgin oils on the basis of
fruitiness and intensity of defects by a group of selected trained tasters
operating as a panel in line with section 4.
2. GENERAL
For the general basic vocabulary, the tasting room, the general methodology
and the tasting glass compliance with the stipulations of the International
Olive Oil Council is recommended.
3. SPECIFIC VOCABULARY
3.1.Positive attributes
Fruity : range of smells (dependent on variety) characteristic of oil from
healthy fresh fruit, green or white, perceived directly or retronasally.
Bitter : characteristic taste of oil from green olives or olives turning colour.
Pungent : tingling sensation characteristic of oil made at the beginning of the
season mainly from olives that are still green.
3.2.Negative attributes
Atrojado (fusty) : characteristic flavour of oil from piled olives in advanced
anaerobic fermentation.
Mustiness/humidity : characteristic flavour of oil from olives in which large
numbers of fungi and yeasts had developed as a result of storage for severaldays in humid conditions.
Muddy sediment : characteristic flavour of oil that has remained in contact
with sediment in vats and tanks.
Winey/vinegary : characteristic flavour of certain oils reminiscent of wine or
vinegar, due basically to formation of acetic acid, ethyl acetate and ethanolby fermentation of the olives.
Metallic : flavour reminiscent of metal, characteristic of oil that has been in
prolonged contact with metal surfaces during crushing, mixing, pressing or
storage.
Rancid : flavour of oil that has become oxidised.
Heated or burnt : characteristic flavour caused by excessive and/or
prolonged heating during production, particularly by thermo-mixing of the
paste in unsuitable conditions.
Hay/wood : characteristic flavour of certain oils from dry olives.
Rough : thick and pasty mouthfeel produced by some oils.
Greasy : flavour reminiscent of diesel, grease or mineral oil.
Vegetable water : flavour acquired by oil through prolonged contact with the
vegetable water.
Brine : flavour of oil from olives preserved in salt solution.
Esparto : characteristic flavour of oil from olives pressed in new esparto
mats. It can vary according to whether the mats are of green or dried
esparto.
Earthy : flavour of oil from olives collected with earth or mud on them and
not washed.
Grubby : flavour of oil from olives heavily attacked by grubs of the olive fly
(Bactrocera oleae).
Cucumber : characteristic flavour of oil kept too long in hermetically sealed
containers, notably in tins, attributed to formation of 2,6-nonadienal.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —78
4. PANEL
The panel is appointed by the Member State and consists of a panel head
and from eight to twelve tasters. However, for the 2001/02 marketing year,
the panel may consist of fewer than eight tasters.
The panel head must be a soundly trained expert in the various types of oil.
He or she is responsible for the panel and its organisation and operation,
including preparation, coding and presentation of the samples to the tastersand collection and processing of the data.
He or she selects the testers, sees to their training and checks that their
performance remains of adequate standard.
The testers must be selected and trained on account of their skill in distin-
guishing between similar samples. The International Olive Oil Council's
manual on the selection, training and monitoring of qualified virgin oiltasters must be followed.
Panels must undertake to participate in national, Community and interna-
tional organoleptic assessments organised for the purposes of periodic moni-toring and harmonisation of perception criteria. They must also provide the
Member State concerned with full information each year on the composition
of the panel and the number of assessments made in their capacity as anapproved panel.
5. PROCEDURE FOR ORGANOLEPTIC ASSESSMENT AND GRADING
5.1.Use of profile sheet by taster
The profile sheet to be used by the taster is reproduced as Appendix A.
Tasters must each smell and then taste (
1) the oil submitted for examination
contained in the tasting glass, analysing their olfactory, gustatory, tactile and
kinaesthetic perceptions and mark on the sheet the intensity of their percep-tion of each negative and positive attribute.
If negative attributes not listed on the profile sheet are perceived these must
be noted under “Other ”using those of the terms defined in 3.2 above that
best describe them.
5.2.Processing of data by panel head
The panel head collects the profile sheets completed by the tasters and
scrutinises the intensities assigned. In the event of an anomaly he or shewill ask tasters to re-examine their sheet and if necessary repeat the test.
The panel head may feed each tester's data into a computer programme for
calculating the median (Appendix B). Input of each sample shall be madewith the help of a grid of 10 vertical columns for the 10 sensory attributes
and one line for each panel member.
If a negative attribute is mentioned under “Other ”by 50 % of the panel the
head must calculate the median for this attribute and grade accordingly.
In cases of assessment in connection with monitoring of conformity to
standards and of counter-assessment the panel head shall arrange for theassessment to be repeated twice at intervals of at least one day. The attribute
medians shall be calculated using the data from the profile sheets of the
three assessments.
5.3.Grading of oils
The oil is graded as follows in line with the median of the defects and the
median for “fruity ”. By this is understood the median of the negative attri-
bute perceived with greatest intensity. The value of the robust variationcoefficient for this negative attribute must be no greater than 20 %.
(a)extra virgin olive oil : the median of the defects is 0 and the median for
“fruity ”is above 0;
(b)virgin olive oil : the median of the defects is above 0 but not above 2,5
and the median for ”fruity “is above 0;▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —79
(1) But may refrain from tasting if they note some extremely intense negative attributes; they
will note this exceptional circumstance on the profile sheet.
(c)ordinary virgin olive oil : the median of the defects is above 2,5 but not
above 6,0; or the median of the defects is not above 2,5 and the median
for“fruity ”is 0;
(d)lampante virgin olive oil : the median of the defects is above 6,0.
From 1 November 2003 categories c) and d) are replaced by:(c)lampante olive oil : the median of the defects is above 2,5; or the median
of the defects is not above 2,5 and the median for “fruity ”is 0.
5.4.Special case
If the median of a positive attribute other than “fruity ”is above 5,0 the
panel head must note this on the analysis certificate.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —80
APPENDIX A
▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —81
APPENDIX B
METHOD OF CALCULATING MEDIAN AND CONFIDENCE INTERVALS
Median
The median is the real number Xm characterised by the fact that the probability
(P) that the values of the distribution (X) are below that number (Xm) is notmore than 0,5 and that simultaneously the probability (P) that the values of the
distribution (X) are not above Xm is not less than 0,5. Another definition consi-
ders the median to be the 50th percentile of a distribution of numbers ranked inorder of increase. In other terms the median represents the central value of anordered series of uneven numbers or the average of the two central values of an
ordered series of even numbers.
Robust standard deviation
To obtain a reliable estimate of the variability that arises around the median
recourse is required to the Stuart and Kendall method of estimating the robust
standard deviation. The formula for the asymptotic standard deviation S involves
N and IQR. N is the number of observations and IQR the interquartile range, i.e.the robust estimate of the variability of the data under consideration (the interqu-artile range covers exactly 50 % of the cases of any probability distribution). The
interquartile range is given by calculating the size of the deviation between the
75th and the 25th percentiles.
IQR ¼75th percentile —25th percentile
The percentile is the value Xpc characterised by the fact that the probability (P)
that the valves of the distribution are below Xpc is not more than a determined
hundredth and that simultaneously the probability (P) that the valves of the
distribution are not above Xpc is not less than the said hundredth. The hundredthindicates the distribution fraction used. In the case of the median this is 50/100.
In other words the percentile is the distribution value corresponding toa determined area plotted from the distribution or density curve. For example,the 25th percentile represents the distribution value corresponding to an areaequal to 0,25 or 25/100.
Robust variation coefficient %
The RVC represents a pure number, i.e. without dimension, that indicates the
percentage of variability of the series of numbers analysed against the Av value
of the median. For that reason it is very useful for verifying the reliability of the
panel members.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —82
Confidence intervals at 95 % on the median
The confidence intervals (C.I.) at 95 % (value of the error of first kind equal to
0,05 or 5 %) represent the range in which the value of the median would be able
to vary should it be possible to repeat the experiment an infinite number of times.In practice this interval indicates the range of variability of the test under theoperating conditions selected should it be possible to repeat the test several times.
The interval helps evaluate, as in the case of the RVC, the reliability of the test.
Upper C :I:¼Avþðc:SÞ
Lower C :I¼Av/C0ðc:SÞ
where c in the case of a confidence interval of 0,95 is equal to 1,96.
Grading is effected by comparing the median values with the reference ranges set
in section 5.3. The software package permits a visualised grading on a table ofthe statistics or on a graph.
▼M20__________
▼M19__________▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —83
PRÍLOHA XV
1. OBSAH OLEJA V OLIVOVÝCH ZVY ŠKOCH
1.1.Prístrojové vybavenie
—vhodný extrak čný prístroj vybavený s 200 a ž250 ml bankou s gu ľatým
dnom,
—elektricky vyhrievaný kúpe ľ(napr. pieskový kúpe ľ, vodný kúpe ľ),
—analytické váhy,
—sušička nastavite ľná na maximálne 80oC,
—elektricky vyhrievaná pec s termostatom nastavite ľným na 103 ± 2oC
a ktorú mo žno vyfukova ťprúdom vzduchu alebo pracujúca za zní ženého
tlaku,
—mechanický mlyn, ľahko udr žiavate ľný, ktorý umo žňuje pomletie olivo-
vých zvy škov bez zvý šenia ich teploty alebo nejakej znate ľnej zmeny
v obsahu vlhkosti, prchavej podstaty alebo látok extrahovate ľných
hexánom,
—extrak čná patróna a vata alebo filtra čný papier, z ktorých u žboli odstrá-
nené látky extrahovate ľné hexánom,
—exsikátor,
—sito s okami s priemerom 1 mm,
—malé kúsky vysu šenej pemzy.
1.2.Činidlo
Normálny technický hexán, po ktorom musí po kompletnom odparení zosta ť
zvyšok menej ako 0,002 g na 100 ml.
2. POSTUP
2.1.Príprava testovanej vzorky
Ak je to nutné, pou žite mechanický mlyn, ktorý ste predtým dokonale
vyčistili, na rozomletie laboratórnej vzorky, aby sa zmen šila ve ľkosťčastíc
tak,že úplne prejdú sitom.
Použite jednu dvadsatinu vzorky na úplné vy čistenie mlynu, odho ďte
zomletý materiál, zvy šok vzorky zome ľte a zozbierajte, opatrne zmie šajte
a analyzujte bez odkladu.
2.2.Veľkosťnavážky
Hneďpo skon čení mletia odvá žte asi 10 g vzorky s presnos ťou na 0,01 g
na vykonanie testu.
2.3.Príprava extrak čnej patróny
Navá ženú vzorku vlo žte do patróny, zazátkujte vatou. Ak pou žijete filtra čný
papier, navá žku vzorky zaba ľte do neho.
2.4.Predsu šenie
Ak sú olivové zvy šky ve ľmi vlhké (t. j. obsah vlhkosti a prchavých látok je
viac ako 10 %), vykonajte predsu šenie tak, že vlo žíte naplnenú patrónu
(alebo filtra čný papier) do pece zahriatej na potrebný čas pri teplote nie
viac ako 80oC, aby sa zní žil obsah vlhkosti a prchavých látok na menej
ako 10 %.
2.5.Príprava banky s okrúhlym dnom
Banku obsahujúcu jeden alebo dva kúsky pemzy odvá žte s presnos ťou
na 1 mg, ktorú ste predtým vysu šili v peci pri teplote 103 ± 2oC
a chladili v exsikátore aspo ňjednu hodinu.
2.6.Prvotná extrakcia
Do extrak čného prístroja zasu ňte extrak čnú patrónu (alebo filtra čný papier)
s navá ženou vzorkou. Do banky vlejte po žadované mno žstvo hexánu. Upev-
nite banku na extrak čný prístroj a celú ju ponorte do elektricky vyhrieva-
ného kúpe ľa. Nastavte vyhrievanie tak, aby nebol refluxný pomer viac ako
tri kvapky za sekundu (mierny, nie búrlivý var). Po štyroch hodinách extra-
hovania nechajte vychladnú ť. Vyberte patrónu z extrak čného prístroja▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —84
a dajte ju do prúdu vzduchu, aby sa odstránila vä čšina nasiaknutého rozpú-
šťadla.
2.7.Druhá extrakcia
Vyprázdnite obsah patróny do mikromlyna a zome ľtečo najjemnej šie.
Vráťte zomletú zmes do patróny a umiestnite ju spä ťdo extrak čného prís-
troja.
Pokra čujte v extrakcii ďalšie dve hodiny, pou žite takú istú banku s gu ľatým
dnom, obsahujúcu prvý extrakt.
Výsledný roztok v extrak čnej banke musí by ťčíry. Ak nie je, prefiltrujte ho
cez filtra čný papier a nieko ľkokrát vymyte pôvodnú banku a filtra čný papier
hexánom. Zbierajte filtrát a rozpú šťadlo pou žité na oplachovanie v druhej
banke s okrúhlym dnom, ktorú ste predtým vysu šili a odvá žili s presnos ťou
na 1 mg.
2.8.Odstránenie rozpú šťadla a vá ženie extraktu
Odstrá ňte vä čšiučasťrozpú šťadla oddestilovaním v elektricky vyhrievanom
kúpeli. Posledné stopy rozpú šťadla odstrá ňte zahrievaním banky v peci pri
teplote 103 ± 2oC po dobu 20 minút. Procesu eliminácie rozpú šťadla
napomô žte bu ďprivádzaním vzduchu, alebo lep šie inertného plynu, alebo
použitím zní ženého tlaku.
Nechajte banku chladi ťv exsikátore aspo ňjednu hodinu a potom ju odvá žte
s presnos ťou na 1 mg.
Znova ju za rovnakých podmienok zahrejte na 10 minút, vychla ďte
v exsikátore a prevá žte.
Rozdiel medzi dvomi vá ženiami by nemal presiahnu ť10 mg. Ak je rozdiel
vyšší, znova zahrejte po dobu 10 minút, potom ďalej ochladzujte a odvá žte,
kým nie je rozdiel 10 g alebo ni žší.
Vykonajte paralelné stanovenia testovanej vzorky.
3. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
3.1.Metóda výpo čtu a vzorec:
a) získaný extrakt sa vyjadrí ako percento hmotnosti produktu a rovná sa:
S¼m1/C2100
m0
kde: S je percento hmotnosti získaného extraktu z produktu,
m0je hmotnos ťnaváženej vzorky, v gramoch,
m1je hmotnos ťextraktu po vysu šení, v gramoch.
Výsledkom bude aritmetický priemer dvoch paralelných stanovení za
predpokladu, že sa splnili podmienky pre opakovate ľnosť.
Výsledok udajte na jedno desatinné miesto.
b) Extrakt sa vyjadrí na základe su šiny pou žitím vzorca:
S/C2100
100/C0U¼percento oleja v extrakte zo su šiny;
kde: S = je percento hmotnosti získaného extraktu z produktu (pozri
a))
U = je obsah vlhkosti a prchavých látok
3.2.Opakovate ľnosť
Rozdiel medzi dvomi paralelnými stanoveniami vykonanými naraz alebo
v rýchlom slede za sebou jedným pracovníkom nesmie prekro čiť0,2 g
hexánového extraktu na 100 g vzorky.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —85
Ak táto podmienka nie je splnená, zopakujte analýzu na dvoch ďalších
navážkach vzorky. Ak aj v tomto prípade rozdiel presiahne 0,2 g, ako
výsledok sa zoberie aritmetický priemer v šetkých štyroch stanovení.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —86
PRÍLOHA XVI
STANOVENIE JÓDOVÉHO ČÍSLA
1. OBLAS Ť
Táto medzinárodná technická norma špecifikuje metódu stanovenia jódo-
vého čísla živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, neskôr uvádzaných
ako tuky.
2. DEFINÍCIA
Na ú čely tejto medzinárodnej technickej normy platia nasledujúce definície:
2.1. jódové číslo: hmotnos ťjódu absorbovaná vzorkou za pracovných
podmienok špecifikovaných v tejto medzinárodnej technickej norme.
Jódové číslo sa vyjadruje v gramoch jódu na 100 g vzorky.
3. PODSTATA
Rozpustite navá žku vzorky v rozpú šťadle a pridajte činidlo pod ľa Wijsa. Po
určitej dobe pridajte roztok jodidu draselného a vodu a uvo ľnený jód
stitrujte roztokom tiosíranu sodného.
4. ČINIDLÁ
Všetky činidlá by mali ma ťznámu čistotu:
4.1. voda ,s pĺňajúca po žiadavky normy ISO 3696, stupe ň3;
4.2. jodid draselný, roztok 100 g/l, neobsahujúci jodi čnany alebo vo ľný jód;
4.3. škrob, roztok.
Rozmie šajte 5 g rozpustného škrobu v 30 ml vody a pridajte túto zmes do
1 000 ml vriacej vody, povarte 3 minúty a nechajte vychladnú ť;
4.4. tiosíran sodný, štandardný odmerný roztok c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l,
štandardizovaný (ofaktorovaný) nie skôr ako sedem dní pred pou žitím;
4.5. rozpú šťadlo: pripravené zmie šaním rovnakých objemov cyklohexánu
a kyseliny octovej;
4.6. Wijsove činidlo: obsahujúce chlorid jodný v kyseline octovej. Je mo žné
použiťaj obchodne dostupné Wijsove činidlo.
5. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE
Obvyklé laboratórne zariadenia, najmä tieto:
5.1. sklenené nava žovacie lodi čky,vhodné na navá žku a vsunutie do banky (6.2);
5.2. kužeľové banky, 500 ml objemu, vybavené zábrusnými zátkami a úplne
suché.
6. PRÍPRAVA TESTOVANEJ VZORKY
Zhomogenizovaná vzorka sa vysu ší tiosíranom sodným a prefiltruje.
7. POSTUP
7.1 Ve ľkosťnavážky
Hmotnos ťnavážky vzorky sa mení pod ľa predpokladaného jódového čísla
uvedeného v tabu ľke 1.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —87
Tabu ľke 1
Predpokladané jódové čísloHmotnos ťtestovanej
navážky
menej ako 5 3,00
5až20 1,00
21 až50 0,40
51 až100 0,20
101 a ž150 0,15
150 a ž200 0,10
V sklenenej nava žovacej lodi čke (5.1) odvá žte navá žku vzorky s presnos ťou
na 0,1 mg.
7.2. Stanovenie
Navá žku vlo žte do 500 ml banky (6.2). Pridajte 20ml rozpú šťadla, aby sa
rozpustil tuk. Pridajte presne 25 ml Wijsovho činidla, banku zazátkujte,
premie šajte jej obsah a ulo žte ju do tmy.
Nepipetujte Wijsovo činidlo ústami. Podobne pripravte slepý pokus
s rozpú šťadlom a činidlom, ale vynechajte navá žku vzorky.
Banky obsahujúce vzorky s jódovým číslom pod 150 ponechajte v tme
jednu hodinu a banky so vzorkami s jódovým číslom nad 150
a s polymerizovanými produktmi alebo produktmi oxidovanými do vyso-kého stup ňa, ponechajte v tme dve hodiny.
Po uplynutí tohto času do ka ždej banky pridajte 20 ml roztoku jodidu
draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1).
Titrujte štandardným odmerným roztokom tiosíranu sodného (4.4), a žkým
sa takmer úplne nestratí žlté zafarbenie spôsobené jódom.
Poznámka: Potenciometrické stanovenie konca titrácie je prípustné.
7.3. Po čet stanovení
Vykonajte dve stanovania na tej istej vzorke.
8. VYJADRENIE VÝSLEDKOV
Jódové číslo je vyjadrené výrazom:
12;69 cðV1–V2Þ
m
kde:
c= j e číselná hodnota presnej koncentrácie v móloch na liter pou žitého
štandardizovaného odmerného roztoku tiosíranu sodného (4.4)
V1=j e číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku
tiosíranu sodného (4.4), pou žitého na slepý pokus, v mililitroch
V2=j e číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku
tiosíranu sodného (4.4), pou žitého pri stanovení, v mililitroch
m= j e číselná hodnota hmotnosti navá žky vzorky (7.1), v gramoch.
Za výsledok sa bude pova žovaťaritmetický priemer dvoch stanovení, za
predpokladu, že opakovate ľnosť(9.2) je uspokojivá.▼B1991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —88
PRÍLOHA XVII
METÓDY STANOVENIA STIGMASTADIÉNOV V RASTLINNÝCH
OLEJOCH
1. Ú ČEL
Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch obsahujúcich nízke
koncentrácie týchto uh ľovodíkov, a to najmä v panenskom olivovom
oleji a v surovom oleji z olivových zvy škov.
2. ROZSAH
Norma sa mô že uplat ňovaťna v šetky rastlinné oleje, hoci merania sú
spoľahlivé iba v prípade, ke ďobsah týchto uh ľovodíkov sa pohybuje
v rozmedzí 0,01 a ž4,0 mg/kg. Táto metóda je obzvlá šťvhodná
na zistenie prítomnosti rafinovaných rastlinných olejov (olivový olej,olej z olivových zvy šky, slne čnicový olej, palmový olej at ď.)
v panenskom olivovom oleji, nako ľko rafinované oleje obsahovali stigma-
stadiény a panenské oleje ich neobsahujú.
3. POSTUP
Izolácia nezmydelnite ľnej látky. Oddelenie frakcie steroidných uh ľovo-
díkov pomocou st ĺpcovej chromatografie na silikagély a analyzovanie
pomocou kapilárnej plynovej chromatografie.
4. APARATÚRA
4.1. 250 ml banky vhodné na pou žitie so spätným chladi čom.
4.2. Odde ľovacie lieviky o objeme 500 ml.
4.3. 100 ml banky s gu ľatým dnom.
4.4. Rota čná odparka.
4.5. Sklená chromatografická kolóna (vnútorný priemer 1,5 a ž2,0 cm, d ĺžka
50 cm) s teflónovým kohútikom a so zátkou z vlákien sklenej vlny alebo
s fritovým kotú čom na dne. S cie ľom pripravi ťsilikagélovú kolónu nalejte
do chromatografickej kolóny hexán do vý šky pribli žne 5 cm a potom ju
naplňte suspenziou silikagélu v hexáne (15 g v 40 ml) pomocou dávok
hexánu. Nechajte usadi ťa usadzovanie ukon čite aplikovaním slabých
vibrácií. Pridajte bezvodý síran sodný do vý šky pribli ž
ne 0,5 cm
a nakoniec prebyto čný hexán eluujte.
4.6. Plynový chromatograf s plame ňovým ioniza čným detektorom, deleným
alebo studeným injektorom na kolóne a pecou programovate ľnou
s presnos ťou ± 1 °C.
4.7. Kapilárna kolóna z taveného kreme ňau rčená na plynovú chromatografiu
(vnútorný priemer 0,25 alebo 0,32 mm a d ĺžka 25 m) potiahnutá fázou
5 % fenylmetylsilikónu, s hrúbkou filmu 0,25 mm.
Poznámka 1:
Môžu sa pou žívaťaj iné kolóny s podobnou alebo ni žšou polaritou.
4.8. Integrátor-zapisova čsm o žnosťou pracova ťv integra čnom re žime údolie-
údolie.
4.9. 5 a ž10 ml mikrostrieka čka na plynovú chromatografiu s cementovanou
ihlou.
4.10. Plá šťs elektrickým ohrevom alebo zahrievacia platni čka.
5. ČINIDLÁ
Všetky činidlá musia ma ťanalytickú kvalitu, pokia ľnie je stanovené inak.
Musí sa pou žívaťdestilovaná voda alebo voda minimálne ekvivalentnej
čistoty.
5.1. Hexán alebo zmes alkánov s rozmedzím bodov varu 65 a ž70 °C, desti-
lované v rektifika čnej kolóne.
Poznámka 2:
Rozpú šťadlo sa musí kvôli odstráneniu ne čistôt destilova ť.
5.2. etanol 96 obj /obj.▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —89
5.3. Bezvodý síran sodný.
5.4. Alkoholický roztok hydroxidu draselného s koncentráciou 10 %. Pridajte
10 ml vody k 50 g hydroxidu draselného, zamie šajte a zmes potom
rozpustite v etanole na celkový objem 500 ml.
Poznámka 3:
Alkoholický hydroxid draselný pri státí hnedne. Musí sa pripravova ť
čerstvý ka ždý de ňa uchováva ťv tesne zazátkovaných f ľašiach
z tmavého skla.
5.5. Silikagél 60 pre st ĺpcovú chromatografiu, 70 a ž230 me š(Merck, refe-
rencia 7734 alebo podobne).
Poznámka 4:
Silikagél sa mô že obvykle pou žiťpriamo z kontejnera bez akejko ľvek
ďalšej úpravy. Niektoré šarže silikagélu mô žu vykazova ťnízku aktivitu,
čo bude ma ťza následok zlé chromatografické oddelenie. Za takýchto
okolností sa musí silikagél upravi ťnasledujúcim spôsobom: Aktivujte
silikagél zahrievaním po dobu najmenej štyroch hodín pri teplote 550 °
C. Po zahriatí vlo žte silikagél do exsikátora, pri čom sa silikagél ochladí
a potom ho preneste do zazátkovanej f ľaše. Pridajte 2 % vody a trepte
dovtedy, a žkým nebudú vidite ľnéžiadne hrudky a prá šok bude vo ľne
prúdi ť.
Ak niektoré šarže silikagélu budú ma ťza následok chromatogramy
s interferujúcimi píkmi, tak silikagél sa musí upravi ťspôsobom opísaným
vyššie. Alternatívou mô žeb yťpoužitie extra čistého silikagélu 60 (Merck,
referencia 7754).
5.6. Zásobný roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-diénu (Sigma, čistota 99 %)
v hexáne (10 mg v 50 ml).
5.7. Štandardný roztok cholesta-3, 5-diénu v hexáne pri koncentrácii 20 ppm,
získaný zriedením roztoku uvedeného vy ššie.
Poznámka 5:
Roztoky 5.6 a 5.7 sú stále po dobu najmenej štyroch mesiacov, ak sa
uchovávajú pri teplote ni žšej ako 4 °C.
5.8. Roztok n-nonakozánu v hexáne pri koncentrácii pribli žne100 ppm.
5.9. Nosný plyn pre chromatografiu: hélium alebo vodík o čistote 99,9990 %.
5.10. Pomocné plyny pre plame ňový ioniza čný detektor: vodík o čistote
99,9990 % a čistený vzduch.
6. POSTUP
6.1. Prípravanezmydelnite ľnej látky
6.1.1. Navá žte 20 ± 0, 1 g oleja do 250 ml banky (4.1), pridajte 1 ml štandard-
ného roztoku cholesta-3, 5-diénu (20 mg) a 75 ml 10 % alkoholickéhohydroxidu draselného, namontujte spätný chladi ča zahrievajte do mier-
neho varu po dobu 30 minút. Vyberte banku obsahujúcu vzorku zo zdroja
tepla a nechajte roztok trochu ochladnú ť(nenechajte roztok úplne
vychladnú ť, nako ľko vzorka by stuhla). Pridajte 100 ml vody a preneste
roztok do odde ľovacieho lievika (4.2) pomocou 100 ml hexánu. Zmesou
30 sekúnd intenzívne trepte a potom ju nechajte oddeli ťsa.
Poznámka 6:
Pokia ľby sa vytvorila emulzia, ktorá by sa rýchle nerozplynula, tak
pridajte etanol v malom mno žstve.
6.1.2. Preneste spodnú vodnú fázu do druhého odde ľovacieho lievika a znovu
extrahujte s pou žitím 100 ml hexánu. Spodnú fázu znovu vypustite
a hexánové extrakty premyte (spojené v ďalšom odde ľovacom lieviku)
trikrát, pri čom zaka ždým pou žijete 100 ml zmesi etanol-voda (1:1), a ž
kým sa nedosiahne neutrálne pH.
6.1.3. Nechajte prejs ťroztok hexánu cez bezvodý síran sodný (50 g), premyte
s 20 ml hexánu a nechajte odparova
ťv rota čnej odparke pri 30 °C pri
zníženom tlaku a ždo vysu šenia.▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —90
6.2. Oddeleniefrakcie steroidných uh ľovodíkov
6.2.1. Preneste zvy šok do frakciona čnej kolóny pomocou dvoch 1-ml dávok
hexánu, nechajte vzorku preteka ťkolónou a umo žnite, aby hladina
roztoku poklesla k hornej časti síranu sodného, a za čnite chromatografické
eluovanie pomocou hexánu s rýchlos ťou prietoku pribli žne 1ml/min.
Prvých 25 a ž30 ml eluátu vyra ďte a nasledujúcich 40 ml frakcie
zachy ťte. Po zachytení preneste túto frakciu do 100-ml banky
sg uľatým dnom. (4.3)
Poznámka 7:
Prvá frakcia obsahuje nasýtené uh ľovodíky (obr. 1 a) a druhá frakcia
steroidné uh ľovodíky. Ďalšie eluovanie poskytne skvalen a príbuzné
zlúčeniny. Ak sa má dosiahnu ťdobré oddelenie nasýtených
a steroidných uh ľovodíkov, tak sa vy žaduje optimalizácie objemov
frakcie. Za týmto ú čelom sa musí objem prvej frakcie upravi ťtak, aby
pri analýze druhej frakcie, píky predstavujúce nasýtené uh ľovodíky boli
nízke (pozri obr. 1 c); ak sa neobjavia, ale intenzita štandardného píku je
pritom nízka, objem sa musí zní žiť.Vk a ždom prípade, úplné oddelenie
zložiek prvej a druhej frakcie nie je nevyhnutné, nako ľko po čas GC
(plynovo-chromatografickej) analýzy nedochádza k prekrývaniu píkov,pokia ľsú podmienky plynovej chromatografie upravené tak, ako je
uvedené v 6.3.1. Optimalizácia objemu druhej frakcie nie je spravidla
potrebná, nako ľko dochádza k dobrému oddeleniu od ostatných kompo-
nentov. Tak či onak, prítomnos ťveľkého píku pri pribli žne o 1,5 minútu
kratšom reten č
nom čase v porovnaní so štandardom je zaprí činená skva-
lénom a sved čí o zlom oddelení.
6.2.2. Odparujte druhú frakciu v rota čnej odparke pri 30 °C pri zní ženom tlaku
aždo vysu šenia a zvy šok ihne ďrozpustite v 0,2 ml hexánu. Roztok
uchovávajte a ždo analýzy v chladni čke.
Poznámka 8:
Zvyšky 6.1.3 a 6.2.2 sa nesmú dr žaťna suchom mieste a pri izbovej
teplote. Ihne ďpo ich získaní sa musí prida ťrozpú šťadlo a roztoky sa
musia uchováva ťv chladni čke.
6.3. Plynová chromatografia
6.3.1. Pracovné podmienky deleného vstrekovania
—teplota injektora: 300 °C,
—teplota detektora: 320 °C,
—integrátor-zapisova č: parametre integrácie sa musia stanovi ťtak, aby
sa dosiahlo správne vyhodnotenie plôch. Odporú ča sa integra čný
režim údolie-údolie.
—citlivos ť: pribli žne 16 násobok minimálneho tlmenia,
—množstvo vstreknutého roztoku: 1 ml,
—teploty programovania pece: spo čiatku 235 °C po dobu šesťminút
a následné zvy šovanie rýchlos ťou 2 °C/minúta na teplotu 285 °C,
—injektor s deli čom prietoku 1: 15,
—nosný plyn: hélium alebo vodík pri tlaku pribli žne 120 kPa.
Tieto podmienky sa mô žu upravova ťv súlade s charakteristikami chro-
matografu a kolóny tak, aby sa získali chromatogramy sp ĺňajúce nasledu-
júce po žiadavky: pík vnútorného štandardu do pribli žne 5 minút času
uvedeného v 6.3.2; pík vnútorného štandardu musí predstavova ťaspoň
80 % rozsahu stupnice.
Systém na plynovú chromatografiu sa musí skontrolova ťvstreknutím
zmesi zásobného roztoku cholestadiénu (5.6) a roztoku n- nonakozánu
(5.8). Pík cholesta-3, 5-diénu sa musí objavi ťpred píkom n-nonakozánu
(obr. 1c); pokia ľsa neobjaví, tak mo žno vykona ťdva kroky: zní žiť
teplotu pece a/alebo menej polárnu kolónu.
6.3.2. Identifikácia píku
Pík vnútorného štandardu sa objaví pribli žne za 19 minút a pík 3,5-stig-
mastadiénu s relatívnym reten čným časom pribli žne 1,29 (pozri obr. 1b).
3,5-stigmastadién sa vyskytuje s malými mno žstvami izoméru a obvykle
sa obidva eluujú spolu ako jeden chromatografický pík. Ak v šak bude▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —91
kolóna príli špolárna alebo sa bude vyzna čovaťvysokou rozli šovacou
schopnos ťou, izomér sa mô že objavi ťako malý pík skôr tesne pred
píkom stigmasta-3, 5-diénu (obr. 2). S cie ľom zabezpe čiť, aby sa stigma-
stadiény eluovali ako jeden pík, je rozumné nahradi ťkolónu kolónou,
ktorá je bu ďmenej polárna, alebo má vä čší vnútorný priemer.
Poznámka 9:Stigmastadiény ur čené ako referencia sa mô žu získa ťanalýzou rafinova-
ného rastlinného oleja s pou žitím men šieho mno žstva vzorky (1a ž2 g).
Stigmastadiény vytvárajú prominentný a ľahko identifikovate ľný pík.
6.3.3. Kvantitatívna analýza
Obsah stigmastadiénov sa stanoví pod ľa vzorca:
mg/kg stigmastadiénov =
As/C2Mc
Ac/C2Mo
pričom: As= plocha píku stigmastadiénov (ak je pík rozlo žený na dva
izoméry, tak sú čet plôch týchto dvoch píkov),
Ac= plocha vnútorného štandardu (cholestadién),
Mc= hmotnos ťpridaného štandardu v mikrogramoch,
Mo= hmotnos ťpoužitého oleja v gramoch.
Hranica postrehu: pribli žne 0,01 mg/kg.▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —92
Obrázok 1▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —93
Plynové chromatogramy získané zo vzoriek olivového oleja analyzovaných
na kremennej kapilárnej kolóne (vnútorný priemer 0,25 mm a d ĺžka 25 m),
potiahnutej 5 % fenylmetylsilikónom s hrúbkou filmu 0,25 mm.
a) Prvá frakcia (30 ml) z panenského oleja, s prídavkom štandardu.
b) Druhá frakcia (40 ml) z olivového oleja obsahujúceho 0,10 mg/kg stigmasta-
diénov.
c) Druhá frakcia (40 ml) obsahujúca malý podiel prvej frakcie.
Obrázok 2
Plynový chromatogram získaný zo vzorky rafinovaného olivového oleja analy-
zovaného na DB-5-kolóne vykazujúci izomér 3,5-stigmastadiénu.▼M111991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —94
ANNEX XVIII
DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42
(DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL
CONTENT)
1. Scope
Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive
oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between
the analytical results obtained by high performance liquid chromato-graphy (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from thefatty acid composition.
2. Field application
The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the
detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleicacid) in every class of olive oils.
3. Principle
The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC
analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42
(calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition)
correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger thanthe values stated in the Regulation for each type of oil points out that theoil contains seed oils.
4. Method
The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with
ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one
essentially is made by the coordination of analytical data obtained bymeans of other methods: it is possible to distinguish three phases: deter-mination of fatty acid composition by capillary gas chromatography,
calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42,
HPLC determination of ECN42 triacylglycerols
4.1. Apparatus
4.1.1. Round bottom flasks, 250 and 500 ml.
4.1.2. Beakers 100 ml.4.1.3. Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm
length, with cock and normalized cone (female) at the top.
4.1.4. Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom,
suitable to be connected with the top of the column.
4.1.5. Glass rod, 600 mm length.
4.1.6. Glass funnel, 80 mm diameter.
4.1.7. Volumetric flasks, 50 ml.4.1.8. Volumetic flasks, 20 ml.4.1.9. Rotative evaporator.4.1.10. High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control
of column temperature.
4.1.11. Injection units for 10 μl delivery.
4.1.12. Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at
least 10
-4units of refractive index.
4.1.13. Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal
diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to
23 % carbon in the form of octadecylsilane (note 2).
4.1.14. Recorder and/or integrator.4.2. Reagents
The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be
de-gassed, and may be recycled several times without effect on the
separations.▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —95
4.2.1. Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.
4.2.2. Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.4.2.3. Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil
ether 87/13 (v/v).
4.2.4. Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standar-
dized at 5 % (w/w).
4.2.5. Glass wool.4.2.6. Acetone.4.2.7. Acetonitrile.
4.2.8. HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted
to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).
4.2.9. Solubilization solvent: acetone.4.2.10. Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.)
may be used and the retention times thence plotted in accordance withthe equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms
obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive
oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).
4.3. Sample preparation
As a number of interfering substances can rise false positive results, the
sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used
for determination of polar substances in oxidised oils.
4.3.1. C h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n p r e p a r a t i o n
Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then
introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to thebottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).
In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution
mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glassfunnel (4.1.6).
To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the
beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside
the column, too.
Open the cock and let solvent elute from the column until its level is
about 1 cm over the silicagel.
4.3.2. C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y
Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously
filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volume-
tric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if
necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at roomtemperature and adjust the volume with elution solvent.
By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the
column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute
to the silicagel layer level.
Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent
rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to passthrough the column).
The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1)
previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent atreduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used toprepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.
The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra
virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum
of 80 % for lampante and residue olive oils.▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —96
4.4. HPLC analysis
4.4.1. P r e p a r a t i o n o f t h e s a m p l e s f o r c h r o m a t o g r a p h i c
analysis
A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5
± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).
4.4.2. P r o c e d u r e
Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate
of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is
obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.
4.4.3. C a l c u l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f r e s u l t s
Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas
of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equalto 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using theformula:
% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.The results are to be given to within at least two decimal places.Note 1: The elution order can be determined by calculating the equiva-
lent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, whereCN is the carbon number and n is the number of double bounds, it canbe calculated more precisely by taking into account the origin of the
double bond. If n
o,nland nlnare the numbers of double bonds attributed
to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbonnumber can be calculated by means of the relation of the formula:
ECN = CN - d
ono-dlnl-dlnnln,
where the coefficient do, dland dlncan be calculated by means of the
reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, therelation obtained will be close in:
ECN = CN - (2,60 n
o) - (2,35 nl) - (2,17 nln)
Note 2: Examples: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333
Lichrosphere or equivalent (Merck) 100 CH18
Art 50377.
Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calcu-
late the resolution with respect to triolein:
α= RT' / RT triolein
by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.The graph of log αagainst f (number of double bonds) enables the
retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acidscontained in the reference triglycerides —see figure 2.
Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of
the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent
RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.
Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the
present determination is ensured if the second peak corresponding to
ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.
4.5. Calculation of triacylglycerols composition
4.5.1. D e t e r m i n a t i o n o f f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n
Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chroma-
tographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation
is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solu-
tion).▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —97
4.5.2. F a t t y a c i d s f o r c a l c u l a t i o n
Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking
into account the following equivalencies between ECN and fatty acids.
Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in considera-tion, because only these are important for olive oil.
Fatty acid (FA) AbbreviationMolecular
weight
(MW)ECN
Palmatic acid P 256,4 16
Palmatoleic acid Po 254,4 14Stearic acid S 284,5 18Oleic acid O 282,5 16Linoleic acid L 280,4 14Linolenic acid Ln 278,4 12
4.5.3. C o n v e r s i o n o f a r e a % i n t o m o l e s f o r a l l f a t t y a c i d s
moles P ¼area % P
MW Pmoles S ¼area % S
MW Smoles Po ¼area % Po
MW Po
(1)
moles O ¼area % O
MW Omoles L ¼area % L
MW Lmoles Ln ¼area % Ln
MW Ln9
>>>=
>>>;
4.5.4. N o r m a l i z a t i o n o f f a t t y a c i d s t o 1 0 0 %
moles % P ð1;2;3Þ¼moles P /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ
(2)moles % S ð1;2;3Þ¼moles S /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ
moles % Po ð1;2;3Þ¼moles Po /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ
moles % O ð1;2;3Þ¼moles O /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ
moles % L ð1;2;3Þ¼moles L /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ
moles % Ln ð1;2;3Þ¼moles Ln /C3100
moles ðPþSþPoþOþLþLnÞ9
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>;
The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the
overall (1,2,3-) position of the TAGs.
Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsa-
turated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:
moles % SFA = moles % P + moles % S
(3)
moles UFA = 100 - moles % SFA)
4.5.5. C a l c u l a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n i n 2 - a n d
1,3- positions of TAGs
The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for
1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients forthe saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).
4.5.5.1. Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)]▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —98
moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06
(4)
moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06)
4.5.5.2. Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]:
moles % Po ð2Þ¼moles % Po ð1;2;3Þ
moles % UFA/C3½100 /C0moles % P ð2Þ/C0 moles % S ð2Þ/C138
(5)moles % O ð2Þ¼moles % O ð1;2;3Þ
moles % UFA/C3½100 /C0moles % P ð2Þ/C0 mol % S ð2Þ/C138
moles % L ð2Þ¼moles % L ð1;2;3Þ
moles % UFA/C3½100 /C0moles % P ð2Þ/C0 moles % S ð2Þ/C138
moles % Ln ð2Þ¼moles % Ln ð1;2;3Þ
moles % UFA/C3½100 /C0moles % P ð2Þ/C0 moles % S ð2Þ/C1389
>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>;
4.5.5.3. Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln
(1,3)]:
moles % P1 ;3¼moles % P1 ;2;3/C0moles % P ð2Þ
2þmoles % P ð1;2;3Þ
(6)moles % S ð1;3Þ¼moles % S ð1;2;3Þ/C0 moles % S ð2Þ
2þmoles % S ð1;2;3Þ
moles % Po ð1;3Þ¼moles % Po ð1;2;3Þ/C0 moles % Po ð2Þ
2þmoles % Po ð1;2;3Þ
moles % O ð1;3Þ¼moles % O ð1;2;3Þ/C0 moles % O ð2Þ
2þmoles % O ð1;2;3Þ
moles % L ð1;3Þ¼moles % L ð1;2;3Þ/C0 moles % L ð2Þ
2þmoles % L ð1;2;3Þ
moles % Ln ð1;3Þ¼moles % Ln ð1;2;3Þ/C0 moles % Ln ð2Þ
2þmoles % Ln ð1;2;3Þ9
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>;
4.5.6. C a l c u l a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s
4.5.6.1. TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo)
moles % AAA ¼moles % A ð1;3Þ/C3moles % A ð2Þ/C3moles % A ð1;3Þ
10000(7)
4.5.6.2. TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL)
moles % AAB ¼moles % A ð1;3Þ/C3 moles % A ð2Þ/C3 moles % B ð1;3Þ/C3 2
10000
(8)
moles % ABA ¼moles % A ð1;3Þ/C3 moles % B ð2Þ/C3 moles % A ð1;3Þ
100009
>>>=
>>>;
4.5.6.3. TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn,
PPoLn)▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —99
moles % ABC ¼moles % A ð1;3Þ/C3 moles % B ð2Þ/C3 moles % C ð1;3Þ/C3 2
10000
(9) moles % BCA ¼moles % B ð1;3Þ/C3 moles % C ð2Þ/C3 moles % A ð1;3Þ/C3 2
10000
moles % CAB ¼moles % C ð1;3Þ/C3 moles % A ð2Þ/C3 moles % B ð1;3Þ/C3 2
100009
>>>>>>>>>=
>>>>>>>>>;
4.5.6.4. Triacylglycerides with ECN42
The following triglycerides with ECN42 are calculated according equa-
tion 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only
three peaks).
LLLPoLL and the positional isomer LPoL
OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL
PoPoL and the positional isomer PoLPo
PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo
PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL
PoPoPo
SLnLn and the positional isomer LnSLn
PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn
The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine
triacylglycerols including their positional isomers. The results to be
given with at least two decimal places.
5. Evaluation of the results
The calculated theoretical content and the content determined by the
HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data
minus theoretical data is greater than the values states for the appropriateoil category in the Regulation, the sample contains seed oil.
Note: Results are given to within one decimal figure.
6. Example (The numbers refer to the sections in the text of the method)
4.5.1. Calculation of moles % fatty acids from GLC data
(area %)
The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:
FA
MWP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
area % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Conversion of area % into moles for all fatty
acids
moles P ¼10
256;4¼0;03900 moles P See formula (1)
moles S ¼3
284;5¼0;01054 moles S See formula (1)
moles Po ¼1
254;4¼0;00393 moles Po See formula (1)
moles O ¼75
282;5¼0;26549 moles O See formula (1)▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —100
moles L ¼10
280;4¼0;03566 moles L See formula (1)
moles Ln ¼1
278;4¼0;003594 moles Ln See formula (1)
Total = 0,35822 moles TAGs
4.5.4. N o r m a l i z a t i o n o f f a t t y a c i d s t o 1 0 0 %
moles % P ð1;2;3Þ¼0;03900 moles P /C3100
0;35822 moles¼10;888 % See formula (2)
moles % S ð1;2;3Þ¼0;01054 moles S /C3100
0;35822 moles¼2;944 % See formula (2)
moles % Po ð1;2;3Þ¼0;00393 moles Po /C3100
0;35822 moles¼1;097 % See formula (2)
moles % O ð1;2;3Þ¼0;26549 moles O /C3100
0;35822 moles¼74;113 % See formula (2)
moles % L ð1;2;3Þ¼0;03566 moles L /C3100
0;35822 moles¼9;956 % See formula (2)
moles % Ln ð1;2;3Þ¼0;00359 moles Ln /C3100
0;35822 moles¼1;003 % See formula (2)
Total moles % = 100,0 %
Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of
TAGs
moles % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % See formula (3)
moles % UFA = 100,000 % —13,831 % = 86,169 % See formula (3)
4.5.5. C a l c u l a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n i n 2 - a n d
1,3- positions of the TAGs
4.5.5.1. Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)]
moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4)
moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)
4.5.5.2. Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln
(1,3)]
moles % Po ð2Þ¼1;097 %
86;169 %/C3ð100 /C0/C0 0;659 /C00;177Þ¼ 1;263 moles % See formula (5)
moles % O ð2Þ¼74;113 %
86;169 %/C3ð100 /C0/C0 0;659 /C00;177Þ¼ 85;295 moles % See formula (5)
moles % L ð2Þ¼9;956 %
86;169 %/C3ð100 /C0/C0 0;659 /C00;177Þ¼ 11;458 moles % See formula (5)
moles % Ln ð2Þ¼1;003 %
86;169 %/C3ð100 /C0/C0 0;659 /C00;177Þ¼ 1;154 moles % See formula (5)▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —101
4.5.5.3. Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and
Ln(1,3)]
moles % P ð1;3Þ¼10;888 /C00;659
210;888 ¼16;005 moles % See formula (6)
moles % S ð1;3Þ¼2;944 /C00;177
22;944 ¼4;327 moles % See formula (6)
moles % Po ð1;3Þ¼1;097 /C01;263
21;097 ¼1;015 moles % See formula (6)
moles % O ð1;3Þ¼74;113 /C085;295
274;113 ¼68;522 moles % See formula (6)
moles % L ð1;3Þ¼9;956 /C011;458
29;956 ¼9;205 moles % See formula (6)
moles % Ln ð1;3Þ¼1;003 /C01;154
21;003 ¼0;927 moles % See formula (6)
4.5.6. C a l c u l a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s
From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions
(see above):
FA in 1,3-pos. 2-pos.
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Sum 100,0 % 100,0 %
the following triacylglycerols are calculated:
LLL
PoPoPoPoLL with 1 positional isomerSLnLn with 1 positional isomer
PoPoL with 1 positional isomer
PPoLn with 2 positional isomersOLLn with 2 positional isomersPLLn with 2 positional isomers
PoOLn with 2 positional isomers.
4.5.6.1. TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7)▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —102
mol % LLL ¼9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 mol LLL
mol % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8)
mol % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
mol % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
0,03211 mol PoLL
mol % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
mol % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,00002
0,00095 mol SLnLn
mol % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
mol % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL
4.5.6.3. TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
See formula (9)
mol % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
mol % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
mol % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
mol % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
mol % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
mol % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
mol % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
mol % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
mol % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
mol % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —103
mol % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
mol % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TAGs▼M131991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —104
Obr. 1 :Graf log αvoči f (po čet dvojitých väzieb)
Poznámka: La = kyselina laurová; L = kyselina linolová; My = kyselina myri-
stová; Ln = kyselina linolenová; P = kyselina palmitová; St = kyse-
lina stearová; O = kyselina olejová.▼M141991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —105
Obr. 2 :sójový olej
Obr. 3 :Sójový olej/olivový olej 30/70
▼M141991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —106
Obr. 4 :Olivový olej
▼M141991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —107
ANNEX XIX
DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY
CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY
1. OBJECT
The procedure describes a method for the determination of aliphatic
alcohols content in oils and fats.
2. PRINCIPLE OF THE METHOD
The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is sapo-
nified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiablematter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated fromthe unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate;
the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethyl-
silyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.
3. EQUIPMENT
3.1. 250 ml round-bottomed flask fitted with a reflux condenser having
ground-glass joints.
3.2. 500 ml separating funnel.
3.3. 250 ml round-bottomed flasks.
3.4. Chromatographic tank for thin-layer chromatographic analysis, for glass
plates of dimensions 20 x 20 cm.
3.5. Ultraviolet lamp having a wavelength of 366 or 254 nm.3.6. 100 μl and 500 μl microsyringes.
3.7. A cylindrical filter funnel with a G3 porous septum (porosity 15 to
40μm) of diameter approximately 2 cm and a depth of some 5 cm,
with an attachment suitable for filtration under vacuum and a 12/21 maleground glass joint.
3.8. 50 ml vacuum conical flask with a 12/21 ground-glass female joint
which can be fitted to the filter funnel (3.7).
3.9. A 10 ml test tube with a tapering bottom and a sealing stopper.
3.10. Gas chromatograph for use with a capillary column, and provided with
a splitting system composed of:
3.10.1. Thermostatic chamber for columns (column oven) to hold the tempera-
ture desired with a precision of ± 1 °C.
3.10.2. A temperature-adjustable injection unit with a persilanised glass vapori-
sing element.
3.10.3. A flame ionisation detector and converter-amplifier.3.10.4. Recorder-integrator for operation with the converter-amplifier (3.10.3),
with response time not exceeding one second and with variable paper-speed.
3.11. Glass or fused silica capillary column, of length 20 to 30 m, internal
diameter 0,25 to 0,32 mm, with SE-52 or SE-54 liquid phase or equi-valent, with a film thickness between 0,10 and 0,30 μm.
3.12. Microsyringe for gas chromatography, of 10 μl capacity with hardened
needle.
3.13. Analytical balance sensitive to 1 mg (with 0,1 mg display).
4. REAGENTS
4.1. Potassium hydroxide, approximately 2 N ethanolic solution: 130 g potas-
sium hydroxide (minimum concentration 85 %) is dissolved, withcooling, in 200 ml distilled water and then made up to one litre withethanol. The solution should be stored in a well-stoppered opaque glass
bottle.
4.2. Ethyl ether, pure for analysis.4.3. Anhydrous sodium sulphate, analytical purity.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —108
4.4. Glass plates coated with silica gel, without fluorescence indicator, thick-
ness 0,25 mm (commercially available ready for use).
4.5. Potassium hydroxide, approximately 0,2 N ethanolic solution; 13 g of
potassium hydroxide are dissolved in 20 ml of distilled water and made
up to one litre with ethanol.
4.6. Benzene, for chromatography (see 5.2.2).
4.7. Acetone, for chromatography (See 5.2.2).
4.8. Hexane, for chromatography (see 5.2.2).4.9. Ethyl ether, for chromatography (see 5.2.2).4.10. Chloroform, for chromatography.4.11. Reference solution for thin-layer chromatography: cholesterol or phyto-
sterols, 5 % solution in chloroform.
4.12. 0,2 % solution of 2', 7'-dichlorofluorescein in ethanol. Make slightly
basic by adding a few drops of 2 N alcoholic potassium hydroxidesolution.
4.13. Anhydrous pyridine, for chromatography.4.14. Hexamethyl disilazane.4.15. Trimethylchlorosilane.4.16. Standard solutions of trimethylsilyl ethers of aliphatic alcohols from C
20
to C28. They may be prepared from mixtures of pure alcohols at the time
they are required for use.
4.17. A 0,1 % (m/v) solution of 1-eicosanol in chloroform (internal standard).4.18. Carrier gas: hydrogen or helium, gas-chromatographic purity.4.19. Auxiliary gas: nitrogen, gas-chromatographic purity.
5. PROCEDURE
5.1. Preparation of the unsaponifiables
5.1.1. Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask,
a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containinga quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphaticalcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For
example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution
if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil.
Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately
5 g of the dry filtered sample into the same flask.
5.1.2. Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux
condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath,stirring continuously throughout the heating process until saponification
has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for
a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through thecondenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled toapproximately 30 °C.
5.1.3. The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating
funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using
a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl
ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle(Note 1).
Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating
funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in thesame manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether.
Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small
quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.
5.1.4. The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed
with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives
a neutral reaction.
Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and
filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed before-▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —109
hand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl
ether which are added to the total.
5.1.5. Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight
vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at
100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after
cooling in a desiccator.
5.2. Separation of alcoholic fractions
5.2.1. Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed
completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds,
and then left to dry for two hours under an extractor hood and finallyplaced in an oven at 100 °C for one hour.
Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until
required for use (plates treated in this way must be used within 15 days).
Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic
fraction there is no need to treat the unsaponifiables with
alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids andothers) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic
alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated
distinctly from the sterol band.
5.2.2. Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-deve-
loping chamber to a depth of approximately 1 cm (
1).
Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour
to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paperdipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tankto reduce the development time by approximately one third and obtain
more uniform, regular elution of the components.
Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in
order to obtain reproducible developing conditions.
5.2.3. An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chlo-
roform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniformstrip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC
plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned
with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution
(4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols bandafter development has been completed.
5.2.4. Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The
ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Imme-
diately close the chamber with the cover and allow to elute until the
solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of theplate.
The plate is then removed from the development chamber and the
solvent evaporated under a hot air current or the plate is left fora while under the extractor hood.
5.2.5. The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlo-
rofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. Thealiphatic alcohols band can be identified through being aligned withthe stain obtained from the reference solution: mark the limits of the
band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the
band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, toge-ther.
Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are
to be grouped together in view of the possible migration ofsome aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.
5.2.6. Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place
the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add
10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filterunder vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached tothe filter funnel.
Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately
10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —110
(1) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be
used to obtain distinct band separation.
funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the
residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evapo-
rate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make upagain using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place inan oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool
in a desiccator and weigh.
The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.
5.3. Preparation of the trimethylsilyl ethers
5.3.1. The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume
(Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the
proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added
to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorptionof moisture (Note 6).
Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially.
Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethyl-
silyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, whichhas to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine,are also available.
Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not
cause any interference. The formation of a white floc or the
appearance of a pink colour are indicative of the presence ofmoisture or deterioration of the reagent. If these occur the testmust be repeated.
5.3.2. Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the
aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutesat ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clearsolution is ready for gas chromatographic analysis.
5.4. Gas chromatography analysis
5.4.1. Preliminary operations, column packing
5.4.1.1. Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the
injector connected to the splitting system and the outlet end to thedetector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly(tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the
splitting system and of the recording system, etc.).
5.4.1.2. If the column is being used for the first time it is recommended that it
should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed throughthe capillary column and then the gas chromatography assembly is swit-
ched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C
above the operating temperature (see Note 7) is attained. That tempera-ture is held for not less than two hours and then the assembly is broughtto the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition,
connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of
the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and thesignal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest levelcontemplated for the execution of the analysis. The course of the base
line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift.
A negative straight-line drift indicates leakage from the column connec-tions; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column.
Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than
the maximum temperature contemplated for the liquid phase
employed.
5.4.2. Choice of operating conditions5.4.2.1. The guideline operating conditions are as follows:
—column temperature: the initial isotherm is set at 180 °C for eight
minutes and then programmed at 5 °C/minute to 260 °C and a further
15 minutes at 260 °C,
—temperature of evaporator: 280 °C,
—temperature of detector: 290 °C,
—linear velocity of carrier gas: helium 20 to 35 cm/s, hydrogen 30 to
50 cm/s,
—splitting ratio: 1:50 to 1:100,▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —111
—sensitivity of instrument: 4 to 16 times the minimum attenuation,
—sensitivity of recording: 1 to 2 mV fs,
—paper speed: 30 to 60 cm/h,
—quantity of substance injected: 0,5 to 1 μl of TMSE solution.
The above conditions may be modified according to the characteristics of
the column and of the gas chromatograph to obtain chromatogramssatisfying the following conditions:
—alcohol C
26retention time shall be 18 ± 5 minutes,
—the alcohol C22peak shall be 80 ± 20 % of the full scale value for
olive oil and 40 ± 20 % of the full scale value for seed oil.
5.4.2.2. The above requirements are checked by repeated injection of the stan-
dard TMSE mixture of alcohols and the operating conditions are adjustedto yield the best possible results.
5.4.2.3. The parameters for the integration of peaks shall be set so that a correct
appraisal of the areas of the peaks considered is obtained.
5.4.3. Analytical procedure5.4.3.1. Using the microsyringe of 10 μl capacity draw in 1 μl of hexane
followed by 0,5 μl of air and subsequently 0,5 to 1 μl of the sample
solution; raise the plunger of the syringe further so the needle is emptied.Push the needle through the membrane of the injection unit and after one
to two seconds inject rapidly, then slowly remove the needle after some
five seconds.
5.4.3.2. Recording is effected until the TMSE of the aliphatic alcohols present
have been eluted completely. The base line shall always correspond to
the requirements of 5.4.1.2.
5.4.4. Peak identification
The identification of individual peaks is effected according to the reten-
tion times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysedunder the same conditions.
A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown
in Figure 1.
5.4.5. Quantitative evaluation5.4.5.1. The peak areas of 1-eicosanol and of the aliphatic alcohols C
22,C24,C26
and C28are calculated by electronic integration.
5.4.5.2. The contents of each aliphatic alcohol, expressed in mg/1 000 g fatty
substance, are calculated as follows:
where:
Ax = area of the alcohol peak x
As= area of 1-eicosanol
ms= mass of 1-eicosanol in milligrams
m = mass of sample drawn for determination, in grams.
6. EXPRESSION OF THE RESULTS
The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty
substance and the sum of the “total aliphatic alcohols ”are reported.▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —112
APPENDIX
Determination of the linear velocity of the gas
1t o3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at
normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to
flow through the column from the instant of injection to the instant the peak
elutes (tM) is measured using a stop clock.
The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column
in centimetres and tM is the measured time in seconds.
Figure 1 —Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil
1 = Eicosanol
2 = Decosanol3 = Tricosanol4 = Tetracosanol5 = Pentacosanol6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol▼M191991R2568 —SK—01.01.2008 —021.001 —113