1991R2568 — SK — 01.11.2003 — 020.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

Zmenené a doplnené:







(*) Tento akt nebol zatiaľ uverejnený v slovenčine.









▼B

NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91

z 11. júla 1991,

o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických metódach







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na nariadenie Rady č. 136/66/EHS z 22. septembra 1966 o založení spoločnej organizácie trhu s olejmi a tukmi ( 1 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením (EHS) č. 3577/90 ( 2 ), a najmä na jeho článok 35 a, keďže príloha k nariadeniu č. 136/66/EHS zahŕňa opisy a definície olivového oleja a oleja z olivových zvyškov predávané v každom členskom štáte, v obchodovaní v rámci spoločenstva a obchodovaní s tretími krajinami; keďže by sa na účely rozlíšenia medzi rôznymi druhmi oleja mali stanoviť fyzikálne a chemické vlastnosti každého z nich a organoleptické vlastnosti panenského oleja s cieľom zaručiť čistotu a kvalitu príslušných produktov bez toho, aby boli dotknuté ostatné existujúce ustanovenia; keďže by sa prítomnosť vlastností rôznych druhov oleja mala stanoviť jednotne v rámci spoločenstva; keďže by sa na tento účel mali v rámci spoločenstva zaviesť metódy chemickej analýzy a organoleptického hodnotenia; keďže by sa na prechodné obdobie malo povoliť používanie iných metód analýzy platných v členských štátoch za predpokladu, že v prípade rozdielu vo výsledkoch budú rozhodujúce tie, ktoré sa získali použitím obvyklej metódy; keďže definovanie fyzikálnych a chemických vlastností olivového oleja a metód analýzy si vyžiadalo prílohu s doplňujúcimi poznámkami ku kapitole 15 colného sadzobníka; keďže pre metódu hodnotenia organoleptických vlastností panenského oleja je potrebné zostavenie skupín vybraných a vyškolených hodnotiteľov; keďže by lehota potrebná na zostavenie takýchto skupín mala byť presne stanovená; keďže s prihliadnutím na problémy, na ktoré môžu niektoré členské štáty pri zostavovaní skupín hodnotiteľov naraziť, využívanie skupín v ostatných členských by malo byť autorizované; keďže, s cieľom zaistiť, aby systém poplatkov uplatňujúcich sa na dovoz olivových zvyškov fungoval správne, bolo by potrebné ustanoviť jednotnú metódu na stanovenie obsahu oleja v týchto produktoch; keďže s cieľom neuškodiť obchodu by bolo potrebné zaviesť ustanovenie pre olej plnený do obalov pred nadobudnutím účinnosti tohto nariadenia, ktoré by obmedzovalo predávanie tohto oleja počas stanovenej lehoty; keďže je potrebné zrušiť nariadenie Komisie (EHS) č. 1058/77 ( 3 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením EHS č. 1858/88 ( 4 ); keďže Riadiaci výbor pre oleje a tuky nezaslal svoje stanovisko v lehote, ktorú určil jeho predseda, PRIJALA TOTO NARIADENIE:







▼M20

Článok 1

1. Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považujú za panenské olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

2. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za lampantový olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

3. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

4. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za olivový olej zmiešaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

5. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za surový zvyškový olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

6. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

7. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za zvyškový olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

▼B

Článok 2

1. Vlastnosti olejov, ustanovené v prílohe I, sa budú stanovovať v súlade s nižšie uvedenými metódami analýzy:

— na stanovenie voľných mastných kyselín, vyjadrených ako percento kyseliny olejovej, metóda uvedená v prílohe II,

— na stanovenie peroxidového čísla metóda uvedená v prílohe III,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— na stanovenie obsahu sterolov metóda uvedená v prílohe V,

— na stanovenie erytrodiolu a uvaolu metóda uvedená v prílohe VI,

— na stanovenie nasýtených mastných kyselín v polohe 2. triglyceridu metóda uvedená v prílohe VII,

▼M20 —————

▼B

— na spektrofotometrickú analýzu metóda uvedená v prílohe IX,

— na stanovenie zloženia mastných kyselín metóda uvedená v prílohe X A a X B,

— na stanovenie prchavých halogenovaných rozpúšťadiel metóda uvedená v prílohe XI,

— na hodnotenie organoleptických vlastností panenského olivového oleja metóda uvedená v prílohe XII,

▼M20 —————

▼M11

— na stanovenie stigmastadiénov, metóda uvedená v prílohe XVII,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Na účely overenia stanoveného v odseku 3 sa analýzy uvedené v prílohách II, III, IX, X a XII a akékoľvek krížové analýzy požadované podľa vnútroštátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokiaľ sa odber vzoriek vykoná viac ako štyri mesiace pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti, analýza by sa mala vykonať najneskôr po uplynutí štyroch mesiacov nasledujúcich po mesiaci odberu vzorky. Na iné analýzy stanovené v tomto nariadení sa neuplatňujú žiadne časové obmedzenia. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Článok 2a

Vnútroštátne orgány alebo ich zástupcovia môžu overiť či je vzorka v súlade s deklarovanou kategóriou:

a) buď vykonaním analýz stanovených v prílohe I v ľubovoľnom poradí;

b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib v rozhodovacom strome, až kým nedosiahnu jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.

▼M19 —————

▼M5

Článok ►M19 3 ◄

Ak sa zistí, že organoleptické charakteristiky určitého oleja nezodpovedajú jeho opisu, tak dotknutý členský štát uplatňuje bez toho, aby boli dotknuté akékoľvek iné pokuty, administratívne peňažné pokuty, ktoré treba stanoviť vzhľadom na závažnosť zistených nezrovnalostí.

Pri hodnotení nezrovnalosti sa musí venovať pozornosť najmä prirodzeným zmenám charakteristík oleja uchovávaného za normálnych podmienok.

Členské štáty informujú Komisiu na začiatku každého polroku o počte a druhu zistených nezrovnalostí a o pokutách uplatnených v priebehu predchádzajúceho polroku.

▼M5

Článok 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degustačných porôt na svojom území na ťažkosti, môžu sa obrátiť na degustačnú porotu schválenú v inom členskom štáte.

3. Každý členský štát vypracuje zoznam degustačných porôt ustanovených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpečí dosiahnutie súladu s týmito podmienkami.

▼M19 —————

▼B

Článok 6

1. Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvyškov, ktoré vznikajú pri extrakcii olivového oleja (číselné znaky KN 2306 90 11 a 2306 90 19), sa stanoví použitím metódy uvedenej v prílohe XV.

2. Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmotnosti oleja ku hmotnosti sušiny.

▼M20

Článok 7

Uplatňujú sa ustanovenia spoločenstva týkajúce sa prítomnosti nečistôt.

Pokiaľ ide o halogénované rozpúšťadlá, pre všetky kategórie olivových olejov platia nasledovné limity:

— maximálny objem každého detekovaného halogénovaného rozpúšťadla: 0,1 mg/kg,

— maximálny celkový objem detekovaných halogénovaných rozpúšťadiel: 0,2 mg/kg.

▼B

Článok 8

1. Členské štáty budú Komisiu informovať o prijatých opatreniach pri zavádzaní tohto nariadenia.

2. Členský štát na začiatku každého polroka zašle Komisii prehľad analytických údajov o uskutočnených testoch za predchádzajúci polrok.

Výsledky bude posudzovať Riadiaci výbor pre oleje a tuky v súlade s postupmi uvedenými v článku 39 nariadenia č. 136/66/EHS.

Článok 9

Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zrušuje.

Článok 10

1. Táto smernica nadobúda účinnosť tretí deň od jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.

Postup uvedený v prílohe XII sa však bude uplatňovať od ►M1 1. novembra 1992 ◄ , okrem postupov týkajúcich sa systému intervencie.

▼M5

Daná metóda sa neuplatňuje na panenský olivový olej pripravený na trh pred 1. novembrom 1992.

▼B

2. Toto nariadenie sa nebude uplatňovať na olivový olej a olej z olivových zvyškov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie nadobudlo účinnosť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.

Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.









PRÍLOHY

Obsah







Príloha I: Vlastnosti olivového oleja ▼M17 Príloha Ia: Odbor vzoriek olivového oleja a zvyškového olivového oleja v priamom obale do 100 litrov ▼M20 Príloha Ib: Rozhodovací strom ▼B Príloha II: Stanovenie voľných mastných kyselín Príloha III: Stanovenie peroxidového čísla Príloha IV: ►M6 Stanovenie obsahu vosku plynovo - kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny ◄ Príloha V: Stanovenie zloženia a obsahu sterolov metódou kapilárnej plynovej Príloha VI: Stanovenie erytrodiolu a uvaolu Príloha VII: Stanovenie nasýtených mastných kyselín v polohe 2 triglyceridu ▼M20 ————— ▼B Príloha IX: Spektrofotometrické skúšanie v ultrafialovom svetle Príloha X A: Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil Príloha XI: Stanovenie prchavých halogenovaných rozpúšťadiel v olivovom oleji Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Príloha XV: Obsah oleja v olivových zvyškoch Príloha XVI: Stanovenie jódového čísla ▼M11 Príloha XVII: Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M20









PRÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY TYPOV OLIVOVÉHO OLEJA







Kategória Kyslosť (%) * Peroxidové číslo mEq O2/kg * Vosky mg/kg ** Nasýtené kyseliny v 2-pozícii triglyceridu (%) Stigmastadieny mg/kg (1) Rozdiel medzi HPLC ECN42 a teoretickou ECN42 K232 * K270 * ΔK * Organoleptické hodnotenieMedián defektov (Md)* Organoleptické hodnotenieMedián voňavosti (Mf)* 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Panenský olivový olej ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 2,5 Mf > 0 3. Lampantový olivový olej > 2,0 — 300 (3) ≤ 1,5 ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (2) – 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 – – 5. Zmiešaný olivový olej z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 – – 6. Surový zvyškový olivový olej — — > 350 (4) ≤ 2,2 — ≤ 0,6 — — — – – 7. Rafinovaný zvyškový olivový olej ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 – – 8. Zvyškový olivový olej ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 – – (1) Súčet izomérov, ktoré mohli (alebo nemohli) byť oddelené kapilárnou kolónou. (2) Alebo ak je medián defektov menší alebo rovný 2,5 a medián voňavosti je rovný 0. (3) Oleje s obsahom vosku medzi 300 mg/kg a 250 mg/kg sa považujú za lampantové olivové oleje, ak je celkový objem alifatického alkoholu menší ako 250 mg/kg alebo ak je obsah erytrodiolu menší alebo rovný 3,5 %. (4) Oleje s obsahom vosku medzi 300 mg/kg a 250 mg/kg sa považujú za surové zvyškové olivové oleje, ak je celkový objem alifatického alkoholu väčší ako 350 mg/kg alebo ak je obsah erytrodiolu a uvaolu menší alebo rovný 3,5 %.







Kategória (1)Obsah mastných kyselín Suma transolejových izomérov (%) Suma translinolových a translinolenových izomérov (%) Skladba sterolov Steroly spolu (mg/kg) Erytrodiol a uvaol (%) (**) Myristová (%) Linolová (%) Arachidová (%) Eikosenová (%) Behenová (%) Lignocerová (%) Cholesterol (%) Brassicasterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) β-sitosterol (%) (2) δ-7-stigmasterol (%) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 1 000 4,5 2. Panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampantový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 – ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Zmiešaný olivový olej z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surový zvyškový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 – ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinovaný zvyškový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Zvyškový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Iné prítomné mastné kyseliny v (%): palmitová: 7,5 až 20,0; palmitoolejová: 0,3 až 0,5; heptadekánová: 0,3; heptadekénová: 0,3; stearová: 0,5 až 5,0; olejová: 55,0 až 83,0; linolová: 3,5 až 21. (2) Suma δ-5-23-stigmastadionol + cholesterol + β-sitosterol + sitostanol + δ-5-avenasterol + δ-5-24-stigmastadionol. (3) Oleje s obsahom vosku medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa považujú za lampantové olivové oleje, ak je celkový alifatický objem alkoholu rovný alebo menší ako 350 mg/kg alebo ak je obsah erytrodiolu menší alebo rovný 3,5 %. (4) Oleje s obsahom vosku medzi 300 mg/kg a 350 mg/kg sa považujú za surové zvyškové olivové oleje, ak je celkový alifatický objem alkoholu väčší ako 350 mg/kg a ak je obsah erytrodiolu a uvaolu menší alebo rovný 3,5 %. Poznámky: a) Výsledky analýz sa musia vyjadriť s rovnakým počtom desatinných miest ako sa používajú pre každú charakteristiku. Číslo na štvrtom desatinnom mieste sa musí zaokrúhliť o jednu smerom hore, ak je číslo na bezprostredne nasledujúcom desatinnom mieste väčšie ako 4. b) Pokiaľ stanoveným hodnotám nezodpovedá práve jedna charakteristika, kategória oleja sa môže zmeniť alebo sa olej môže na účely tohto nariadenia vyhlásiť za nečistý. c) Ak je charakteristika označená hviezdičkou (*) odvolávajúcou sa na kvalitu oleja, znamená to nasledovné: — pre lampantový olej je možné, aby obidva príslušné limity boli súčasne odlišné od stanovených hodnôt, — pre panenské olivové oleje, sa kategória oleja zmení, ak je aspoň jeden z limitov odlišný od stanovených hodnôt, hoci budú stále zaradené v niektorej kategórií panenských olivových olejov. d) Ak je charakteristika označená dvoma hviezdičkami (**) znamená to, že u všetkých typov zvyškového oleja sa obidva príslušné limity môžu súčasne líšiť od stanovených hodnôt.









PRÍLOHA Ia

ODBOR VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA A ZVYŠKOVÉHO OLIVOVÉHO OLEJA V PRIAMOM OBALE DO 100 LITROV

Táto metóda odberu vzoriek sa uplatňuje na dodávky olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja nepresahujúce 125 000 litrov, umiestneného v priamom obale do 100 litrov.

Ak dodávka prekračuje 125 000 litrov, musí sa rozdeliť na dávky v objeme najviac 125 000 litrov. Ak je dodávka menšia ako 125 000 litrov, tvorí jednu dávku. Táto metóda sa potom uplatňuje na každú dávku.

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s tabuľkou uvedenou v bode 1.

Veľkosť primárnej vzorky je určená na základe objemu priameho obalu, podľa tabuľky uvedenej v bode 2.1.

Termíny dodávka, primárna vzorka a laboratórna vzorka majú význam podľa definícií uvedených v norme EN ISO 5555.

„Dávka“ znamená sadu predajných jednotiek, ktoré sa vytvárajú, vyrábajú a označujú v príslušných podmienkach tak, aby sa olej, nachádzajúci sa v konkrétnej predajnej jednotke mohol posudzovať ako homogénny, pokiaľ ide o všetky analytické charakteristiky.

1. POČET PRIMÁRNYCH VZORIEK NA ODBER

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s touto tabuľkou:







Veľkosť dávky (v litroch) menšia ako Minimálny počet primárnych vzoriek 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Priame obaly vybrané na vytvorenie primárnej vzorky musia byť v rámci dávky susediace.

V prípade pochybnosti, členské štáty zvyšujú počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať.

2. OBSAH PRIMÁRNYCH VZORIEK

2.1 Primárne vzorky musia obsahovať:



Pokiaľ má priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z: a) aspoň 5 litrov a) 3 priamych obalov b) aspoň 3 litre, ale menej ako 5 litrov b) 3 priamych obalov c) aspoň 2 litre, ale menej ako 3 litre c) 3 priamych obalov d) aspoň 1 liter, ale menej ako 2 litre d) 6 priamych obalov e) aspoň 0,75 litra, ale menej ako 1 liter e) 6 priamych obalov f) menej ako 0,75 litra f) trojnásobku množstva oleja z minimálneho počtu obalov s celkovým objemom viac ako 1,5 litra

2.2 Primárne vzorky sa do doby analýzy uchovávajú v priamych obaloch. Olej v primárnej vzorke sa potom ďalej rozdeľuje, pokiaľ je to možné, do troch laboratórnych vzoriek s cieľom: a) analýz spomínaných v prílohách II, III, IX a X; b) analýz spomínaných v prílohách XII; c) iných analýz.

2.3 Balenia, ktoré tvoria primárnu vzorku sa rozdeľujú na menšie časti v súlade s kontrolnými postupmi ustanovenými vo vnútroštátnych právnych predpisoch.

3. ANALÝZA A VÝSLEDKY

a) Každá primárna vzorka uvedená v bode 1 sa rozdeľuje do laboratórnych vzoriek v súlade s bodom 2.5 normy EN ISO 5555 a analyzuje takto: — určenie voľných mastných kyselín podľa prvej zarážky článku 2 ods. 1, — určenie peroxidového čísla podľa druhej zarážky článku 2 ods. 1, — spektrofotometrická analýza podľa ôsmej zarážky článku 2 ods.1, — určenie skladby mastných kyselín podľa deviatej zarážky článku 2 ods. 1.

b) Pokiaľ jeden z výsledkov analýz, uvedených pod písmenom a, aspoň na jednej primárnej vzorke odobratej z rovnakej dávky nie je v súlade s charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá príslušná dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu. Pokiaľ výsledky analýz, uvedených pod písmenom a, na primárnych vzorkách z rovnakej dávky nie sú jednotné za predpokladu opakovateľnosti príslušných metód, celá dávka sa vyhlási za nejednotnú a všetky primárne vzorky sa podrobia ďalším požadovaným analýzam. V opačnom prípade sa ďalším analýzam podrobuje iba jedna primárna vzorka z dávky.

c) Pokiaľ niektorý z výsledkov analýz, uvedených v druhom odseku písmena b, nie je v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu. Pokiaľ všetky výsledky analýz, uvedených v druhom odseku písmena b, sú v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za vyhovujúcu.

▼M20









PRÍLOHA Ib

ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU

Analýzu na overenie súladu olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja s deklarovanou kategóriou je možné vykonať:

a) buď vykonaním analýz určených na overenie súladu s charakteristikami stanovenými v prílohe I, a to v náhodnom poradí;

b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib na rozhodovacom strome, až kým sa nedosiahne jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.

Analýzy týkajúce sa nečistôt, požadované na overenie súladu s normami Európskeho spoločenstva, sa vykonávajú samostatne.

Rozhodovací strom sa uplatňuje na všetky kategórie olivového oleja a zvyškového olivového oleja. Skladá sa z tabuliek očíslovaných od 1 do 11, ku ktorým sa musí pristupovať na základe deklarovanej kategórie príslušného oleja v poradí stanovenom vo všeobecnej tabuľke.

Kľúč k všeobecným tabuľkám 1 až 11:

— dvojitá čiara (=) ukazuje cestu, po ktorej treba ísť v prípade súladu (kladnej odpovede) s kritériami stanovenými v predchádzajúcom okienku. Bodkovaná čiara (…) naznačuje alternatívnu cestu, ktorá sa má použiť v prípade nesúladu,

— položky v okienkach v tabuľkách 1 až 11 sa vzťahujú na analýzy stanovené v tomto nariadení na základe tabuľky rovnocennosti stanovenej v doplnku 1 k tejto prílohe,

— písmená v zátvorkách nachádzajúce sa v kruhoch negatívneho rozhodnutia v tabuľkách 1 až 11 poskytujú krížovú referenciu na indikatívnu informáciu poskytnutú v doplnku 2 k tejto prílohe. Sami o sebe písmená neznamenajú nutnosť vykonávať analýzy alebo naznačovať pravdivosť uvedených predpokladov.









Doplnok 1

Tabuľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými v rozhodovacom strome







– Kyslosť Príloha II Určenie voľných mastných kyselín – Peroxidové číslo Príloha III Určenie peroxidového čísla – UF spektrometria Príloha IX Spektrofotometrická analýza – Organoleptické hodnotenie Príloha XII Organoleptické hodnotenie panenského olivového oleja – 3,5- stigmastadiény Príloha XVII Metóda určovania stigmastadiénov v rastlinných olejoch – Trans-izoméry mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín – Obsah mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín – ΔECN42 Príloha XVIII Určenie skladby triglyceridov s ECN42 (rozdiel medzi údajmi z HPLC a teoretickým obsahom) – Skladba sterolov a celkové steroly Príloha V Určenie skladby a obsahu sterolov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou – Erytrodiol a uvaol Príloha VI Určenie erytrodiolu a uvaolu – Vosky Príloha IV Určenie obsahu voskov sterolov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou – Alifatické alkoholy Príloha XIX Určenie obsahu alifatických alkoholov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou – Nasýtené mastné kyseliny v 2-pozícii Príloha VII Určenie nasýtených mastných kyselín na pozícií 2 triglyceridu









Doplnok 2

Tabuľka 1

a) Pozri panenský alebo lampantový olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 2 alebo Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

Tabuľka 2

a) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

b) Pozri extra panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 1)

Tabuľka 3

a) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

b) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

Tabuľka 4

a) Pozri extra panenský alebo panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 1 a Tabuľka 2)

b) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

c) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

d) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 7

a) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

b) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 8

a) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

c) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 11

a) Prítomnosť esterifikovaných olejov

▼B









PRÍLOHA II

STANOVENIE VOĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN

1. STANOVENIE KYSLOSTI

Stanovenie voľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslosť vypočítaná obvyklým spôsobom.

1.1. Princíp

Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpúšťadiel a prítomné voľné mastné kyseliny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.

1.2. Činidlá

Všetky činidlá (reagenty) by mali byť schválenej analytickej kvality a mala by sa použiť buď destilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.

1.2.1. Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov. Poznámka: Dietyléter je vysoko horľavý a môže tvoriť výbušné peroxidy. Je potrebné s ním narábať opatrne. Počas použitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2), na 100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3). Poznámka: Ak sa nedá použiť dietyléter, je ho možné nahradiť zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné, etanol môžete nahradiť 2-propanolom(izo-propanolom).

1.2.2. Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) približne 0,01 mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) približne 0,5 mol/l. Musí byť známa presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju skontrolovať bezprostredne pred použitím. Používajte roztok pripravený najmenej päť dní pred termínom použitia, uschovaný v tmavej sklenenej fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal byť bezfarebný alebo vo farbe slamy. Poznámka: Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného je možné pripraviť nasledovne. Priveďte do varu 1 000 ml etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblín a nechajte vrieť pod spätným chladičom po dobu jednej hodiny. Ihneď oddestilujte. V destiláte rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Nechajte niekoľko dní odstáť a zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhličitanu draselného. Roztok môže byť rovnako pripravený aj bez destilácie a to nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium butylate“ a nechajte zmes odležať na niekoľko dní. Odlejte tekutý supernatant a rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Roztok je pripravený na použitie.

1.2.3. Fenolftaleín, 10 g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v) alebo alkalická modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v).

1.3. Prístrojové vybavenie

Bežné laboratórne vybavenie zahŕňajúce:

1.3.1. analytické váhy;

1.3.2. 250 ml kónickú banku;

1.3.3. 10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.

1.4. Postup

1.4.1. Príprava vzorky na testovanie (Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a nečistôt spolu menší ako 1 %, vzorku použite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje 1 %, je potrebné vzorku prefiltrovať.)

1.4.2. Odoberanie vzorky (vzorkovanie) Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade s nasledujúcou tabuľkou:



Predpokladané číslo kyslosti Hmotnosť vzorky (g) Presnosť váženia (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorku odvážte v kónickej banke (1.3.2).

1.4.3. Stanovenie Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 až 150 ml predtým zneutralizovanej zmesi dietyléteru a etanolu (1.2.1). Titrujte počas zmiešania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného (1.2.2) (pozri pozn. 2) až do zmeny zafarbenia indikátora (ružová farba fenolftaleínu vydrží aspoň 10 sekúnd). Poznámka 1. Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je možné nahradiť vodným roztokom hydroxidu draselného alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody nevyvolá rozdelenie fáz. Poznámka 2. Ak spotrebované množstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu draselného presiahne 10 ml, použite 0,5 ml/l roztok. Poznámka 3. Ak sa roztok počas titrácie zakalí, pridajte dostatočné množstvo rozpúšťadiel (1.2.1), aby sa roztok vyčíril.

1.5. Kyslosť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej

Kyslosť vyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:

kde:

V = objem použitého titračného roztoku hydroxidu draselného, v ml;

c = presná koncentrácia použitého titračného roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M = mólová hmotnosť v g/mol kyseliny použitej na vyjadrenie výsledku (M =282 g/mol);

m = hmotnosť vzorky v g.

Za výsledok sa považuje aritmetický ►M6 dvoch výpočtov ◄ stanovení.









PRÍLOHA III

STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1. OBLASŤ

Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla v olejoch a tukoch.

2. POUŽITIE

Táto technická norma sa vzťahuje na živočíšne a rastlinné oleje a tuky.

3. DEFINÍCIA

Peroxidové číslo je množstvo tých zložiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodid draselný za uvedených prevádzkových podmienok.

4. PRINCÍP

Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časť vzorky, kyselina octová a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvoľneného jódu štandardizovaným roztokom tiosíranu sodného.

5. PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE

Všetky použité prístroje nesmú obsahovať redukujúce alebo oxidujúce látky.

Poznámka: Nemastite zábrusové povrchy.

5.1. 3 ml sklenená navažovacia lodička

5.2. Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, približne 250 ml objemu, predsušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokiaľ možno, oxidom uhličitým).

5.3. 25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml

6. ČINIDLÁ

6.1. Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.2. Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.3. Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód a jodičnany

6.4. Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný vodný roztok, štandardizovaný tesne pred použitím

6.5. Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l, čerstvo pripravená z prírodného rozpustného škrobu

7. VZORKA

Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla, udržiavajte ju v chlade a v úplne (až povrch) naplnených sklenených zásobníkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými zátkami.

8. POSTUP

Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle. V sklenenej navažovačke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvážte s presnosťou na 0,001 g množstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabuľkou a podľa predpokladaného peroxidového čísla:







Predpokladané peroxidové číslo (meq) Hmotnosť navážky (g) 0 až 12 5,0 až 2,0 12 až 20 2,0 až 1,2 20 až 30 1,2 až 0,8 30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3

Odzátkujte banku (5.2) a vložte sklenenú navažovačku s odváženou časťou testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Miešaním rýchlo rozpustite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútu a nechajte 5 minúť stáť v tme pri teplote 15 až 25 oC.

Pridajte približne 75 ml destilovanej vody. Uvoľnený jód stitrujte roztokom tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vyššie ako 12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor použite roztok škrobu.

Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.

Zároveň vykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekročí 0,05 ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vymeňte znečistené činidlá.

9. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka na kilogram, sa udáva podľa vzorca:

kde:

V = objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného (6.4), použitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;

T = presná molarita použitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);

m = hmotnosť navážky vzorky, v (g).

Za výsledok sa bude považovať aritmetický priemer z dvoch výpočtov.

▼M6









PRÍLOHA IV

STANOVENIE OBSAHU VOSKU PLYNOVO-KVAPALINOVOU CHROMATOGRAFIOU S POUŽITÍM KAPILÁRNEJ KOLÓNY

1. OBLASŤ POUŽITIA

Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu vosku v určitých tukoch a olejoch za skúšobných podmienok.

Môže sa používať najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným lisovaním a získaným extrakciou (olej z olivových výliskov).

2. PRINCÍP

Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej ako prvej za skúšobných podmienok (ktorej polarita je nižšia ako polarita triglyceridov), potom priama analýza plynovo-kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny.

3. PRÍSTROJ

3.1. 25-ml Erlenmeyerova banka.

3.2. Sklená kolóna na chromatografiu s vnútorným priemerom 15 mm a s dĺžkou 30-40 cm.

3.3. Vhodný plynovo-kvapalinový chromatograf s kapilárnou kolónou, vybavený systémom na priame zavedenie do kolóny nasledovného: 3.3.1 Termostatom regulovaná sušiareň (pec) pre kolóny, schopná udržiavať požadovanú teplotu s presnosťou na 1 °C. 3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny. 3.3.3. Plameňový ionizačný detektor a prevodník-zosilňovač. 3.3.4. Zapisovač – integrátor schopný pracovať s prevodníkom-zosilňovačom (3.3.3), rýchlosť ozvy pod 1 sekundu, s variabilnou rýchlosťou posunu papiera. 3.3.5. Kapilárna kolóna, sklo alebo tavený kremeň, dĺžka 10 až 15 m, o vnútornom priemere 0,25-0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalinou SE-52 alebo SE-54 alebo ekvivalentnými kvapalinami s homogénnou hrúbkou 0,10 až 0,30 μm.

3.4. Mikrostriekačka so zariadením na vstrekovaciu kapacitu do kolóny 10 ml, vybavená cementovanou ihlou.

4. ČINIDLÁ

4.1. Silikagél, 70/230 mešov, artikel 7754 Merck. Vložte silikagél do pece na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Nechajte vychladnúť a pridajte 2 % vody. Kvôli homogenizácii suspenzie dobre pretrepte. Pred použitím uchovávajte v tme po dobu najmenej 12 hodín.

4.2. n-hexán, pre chromatografiu.

4.3. etyléter, pre chromatografiu.

4.4. n-heptán, pre chromatografiu.

4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný štandard).

4.6. Nosný plyn: vodík, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu.

4.7. Pomocné plyny — vodík, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu. — vzduch, čistý, pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu.

5. POSTUP

5.1. Oddelenie voskovej frakcie.

5.1.1 Príprava chromatografickej kolóny. Suspenzujte 15 g hydratovaného silikagélu - v 2 % bezvodom n-hexáne a vlejte do kolóny. Nechajte usadiť sa samovoľne. Usadzovanie ukončite pomocou elektrickej trepačky s cieľom dosiahnuť homogénnejší chromatografický pás. Perkolujte v 30 ml n-hexánu s cieľom odstrániť všetky nečistoty.

5.1.2. Stĺpcová chromatografia Navážte presne 500 mg vzorky do 25 ml banky a pridajte vhodné množstvo vnútorného štandardu v závislosti od predpokladaného obsahu vosku, napríklad pridajte 0,1 mg laurylarašidátu v prípade olivového oleja a 0,25 až 0,5 mg v prípade oleja z olivových výliskov. Pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1, pomocou dvoch 2-ml dávok n-hexánu. Napustite rozpúšťadlo do výšky 1 mm nad hornou úrovňou absorbentu. Potom začnite chromatografické eluovanie; zozbierajte 140 ml zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd (2,1 ml/minúta). Sušte výslednú frakciu v rotačnej odparke až do odstránenia takmer celého rozpúšťadla. Posledné 2 alebo 3 ml rozpúšťadla odstráňte pomocou slabého prúdu dusíka, potom pridajte 10 ml n-heptánu.

5.2. Plynovo-kvapalinová chromatografická analýza

5.2.1. Predbežný postup, kondicionovanie kolóny. 5.2.1.1. Namontujte kolónu k plynovo-kvapalinovému chromatografu, pričom vstupný port sa musí pripojiť k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte prístroj na plynovo-kvapalinovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača, atď.). 5.2.1.2. Pokiaľ sa kolóny používajú po prvýkrát, je potrebné ich kondicionovať. Zaveďte mierny prietok plynu cez kolónu a potom zapnite prístroj na plynovo-kvapalinovú chromatografiu. Postupne zahrejte na teplotu najmenej o 20 °C vyššiu ako je prevádzková teplota (poznámka). Túto teplotu udržiavajte najmenej po dobu dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky (nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču, nastavte teplotu pece pre kolónu, nastavte detektor, atď.). Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí byť lineárna, nesmie obsahovať píky akéhokoľvek druhu a nesmie vykazovať žiadnu odchýlku. Negatívna priamočiara odchýlka svedči o tom, že kolóna je nesprávne pripojená; pozitívna odchýlka svedčí o tom, že kolóna nebola správne kondicionovaná. Poznámka: Teplotu kondicionovania udržiavajte vždy na úrovni najmenej 20 °C pod maximálnou teplotou špecifikovanou pre používaný eluent.

5.2.2. Voľba prevádzkových podmienok. 5.2.2.1. Prevádzkové podmienky sú spravidla nasledovné: — teplota kolóny: 80 °C spočiatku, zvyšovaná rýchlosťou 30 °C/minúta na hodnotu 120 °C, potom ju naprogramujte tak, aby stúpala rýchlosťou 5 °C/minúta až na hodnotu 340 °C, — teplota detektora: 350 °C, — lineárna rýchlosť nosného plynu: vodík, 20 až 35 cm/sek., — citlivosť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho tlmenia, — citlivosť zapisovača: 1 až 2 mV, od spodnej časti stupnice, — rýchlosť posuvu papiera: 30 cm/hodina, — vstreknuté množstvo 0,5-1 μl v roztoku. Tieto podmienky sa môžu upraviť tak, aby vyhovovali charakteristikám kolóny a prístroju na plynovo- kvapalinovú chromatografiu (tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledovné podmienky: retenčný čas C32 vnútorného štandardu musí byť 25 ± 2 minúty a najreprezentatívnejší pík voskov sa musí nachádzať v rozmedzí 60 až 100 % od spodnej časti stupnice). 5.2.2.2. Určite parametre integrácie píku takým spôsobom, aby ste dosiahli správne vyhodnotenie príslušných plôch píku.

5.2.3. Vykonanie analýzy 5.2.3.1. Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostriekačky; piestik natiahnite dozadu až dovtedy, kým nebude ihla prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd vstreknite. Po cca piatich sekundách ihlu jemne vytiahnite. 5.2.3.2. Záznam nechajte prebiehať dovtedy, až kým vosky nebudú úplne eluované. Základná čiara musí vždy vyhovovať požadovaným podmienkam (5.2.1.2).

5.2.4. Identifikácia píku Píky identifikujte z retenčných časov porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi, analyzovanými za rovnakých podmienok. Na obr. 1 je uvedený chromatogram voskov panenského olivového oleja.

5.2.5. Kvantitatívna analýza 5.2.5.1. Určite plochy píkov zodpovedajúce vnútornému štandardu a alifatickým esterom od C40 do C46 pomocou integrátora. 5.2.5.2. Stanovte obsah vosku každého esteru v mg/kg tuku podľa príslušného vzorca: pričom: AX = plocha píku každého esteru; AS = plocha píku laurylarašidátu; mS = hmotnosť pridaného laurylarašidátu v miligramoch; m = hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Uveďte obsahy rôznych voskov a súčet týchto obsahov v mg/kg tuku.









DODATOK

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Vstreknite 1 až 3 μl metánu (propánu) do prístroja na plynovo - kvapalinovú chromatografiu po jeho nastavení na bežné prevádzkové podmienky. Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho vstreknutia až do času, keď sa neobjaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/sek. je daná vzorcom L/tM, pričom L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.

▼B









PRÍLOHA V

STANOVENIE ZLOŽENIA A OBSAHU STEROLOV PLYNOVOU CHROMATOHRAFIOU NA KAPILÁRNYCH KOLÓNACH

1. OBLASŤ

Metóda opisuje postup stanovenia obsahu jednotlivých sterolov a celkového obsahu sterolov v tukoch.

2. PRINCÍP METÓDY

Tuk s pridaným α — cholesterolom ako vnútorným štandardom, je zmydelnený etanolickým roztokom hydroxidu draselného a látky nepodliehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.

Sterolová frakcia sa chromatografiou na silikagélových platniach oddelí od extraktu nezmydeliteľných látok. Steroly získané zo silikagélu sa prevedú na trimetylsilylétery a analyzujú sa metódou plynovej chromatografie na kapilárnych kolónach.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1. 250 ml banka s guľatým dnom so spätným chladičom a zábrusovými spojkami

3.2. 500 ml oddeľovacie lieviky.

3.3. 250 ml banky

3.4. Kompletné zariadenie na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou, používajúca sklenené platne rozmerov 20 × 20 cm

3.5. UV lampa s vlnovou dĺžkou 366 alebo 254 nm, na skúmanie TLC platní

3.6. 100 μl a 500 μl mikrostriekačky

3.7. Valcovitý filtračný lievik s G3 poréznou fritou (pórozita 15-40 μm) s priemerom približne 2 cm a výškou 5 cm, s pripojením vhodným na vákuovú filtráciu a s vonkajším zábrusom 12/21

3.8. 50 ml vákuová banka s 12/21 skleneným vnútorným zábrusom na použitie s filtračným lievikom (3.7)

3.9. 10 ml skúmavka s kónickým dnom a tesniacou zátkou

3.10. Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vybavený deliacim systémom pozostávajúci z: 3.10.1. termostatickej komory pre kolóny (kolónová pec), ktorá udrží požadovanú teplotu presnosťou na ± 1 oC; 3.10.2. teplotne nastaviteľnej splyňovacej jednotky (nástrek) so silanizovaným skleneným splyňovacím elementom (linerom); 3.10.3. plameňovoionizačného detektora a konvertora — zosilňovača; 3.10.4. zapisovača — integrátora pre operácie s prevodníkom — zosilňovačom (3.10.3), s časovou odozvou nepresahujúcou jednu sekundu a s rôznymi rýchlosťami posunu papiera.

3.11. Kapilárna kolóna sklenená alebo z taveného kremeňa, dĺžky 20-30 m, o vnútornom priemere 0,25 až 0.32 mm, s kvapalnou fázou SE-52 alebo SE-54 alebo inou ekvivalentnou fázou, s hrúbkou filmu medzi 0,10 a 0,30 μm

3.12. Mikrostriekačka na plynovú chromatografiu, s objemom 10 μl a s vytvrdenou ihlou

4. ČINIDLÁ

4.1. Hydroxid draselný; približne 2 mol/l etanolický roztok: 130 g hydroxidu draselného (minimálna koncentrácia 85 %) sa rozpustí za chladenia v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom do objemu 1 litra. Roztok by sa mal skladovať v dobre uzatvorenej fľaši z tmavého skla.

4.2. Dietyléter, čistý na analýzu

4.3. Bezvodý tiosíran sodný, čistý na analýzu

4.4. Silikagélové TLC sklenené platne, bez fluorescenčného detektora, hrúbky 0,25 mm (na komerčné použitie, vhodné na okamžité použitie)

4.5. Hydroxid draselný, približne 0,2 2 mol/l etanolický roztok; 13 g hydroxidu draselného sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a doplní sa do etanolom do objemu 1 litra.

4.6. Benzén, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.7. Acetón, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.8. Hexán, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.9. Dietyléter, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.10. Chloroform, na chromatografiu

4.11. Referenčný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: zmes cholesterol alebo fytosteroly, ►M6 2 % ◄ roztok v chloroforme

4.12. 2,7 — dichlórfluoresceín, 0,2 % etanolický roztok. Slabo alkalický roztok získame pridaním niekoľkých kvapiek 2 N roztoku hydroxidu draselného.

4.13. Bezvodý pyridín; na chromatografiu

4.14. Hexametyldisilazán

4.15. Trimetylchlórsilán

4.16. Referenčný roztok trimetylsilylových éterov sterolu. Pripraví sa priamo pred použitím z čistých sterolov získaných z olejov, ktoré ho obsahujú.

4.17. α — cholestanol, 0,2 % roztok (m/V) v chloroforme (vnútorný štandard)

4.18. Nosný plyn: vodík a hélium, čistoty na plynovú chromatografiu

4.19. Pomocné plyny: — vodík, čistoty na plynovú chromatografiu, — vzduch, čistoty na plynovú chromatografiu.

5. POSTUP

5.1. Príprava látky nepodliehajúcej zmydelneniu. 5.1.1. Do 250 ml destilačnej banky dajte pomocou 500 μl mikrostriekačky taký objem 0,2 % roztoku α — cholestanolu v chloroforme (4.17), obsahujúceho množstvo α — cholestanolu zodpovedajúcemu približne 10 % obsahu sterolu v alikvotnej čiastke vzorky, ktorá sa odobrala na analýzu. Napr. k 5 g vzorky pridajte 500μl 0,2 % roztoku α– cholestanolu, ak sa analyzuje olivový olej alebo olej zo semien, a 1 500 μl, ak sa jedná o rastlinný ►M6 ————— ◄ olej z olivových výliskov. Odparte dosucha pod prúdom dusíka a potom do tej istej banky privážte 5 g suchej prefiltrovanej vzorky. ►M6 Oleje ◄ s obsahom zistiteľných množstiev cholesterolu môžu vykazovať píky s retenčným časom identickým s cholestanolom. Pokiaľ sa tak stane, sterolová frakcia by sa mala opakovane analyzovať s alebo bez vnútorného štandardu ►M6 alebo sa namiesto cholestanolu bude musieť použiť betulinol ◄ . 5.1.2. Pridajte 50 ml 2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného, nasaďte spätný chladič a zariadenie zahrievajte vo vodnom kúpeli do mierneho varu a za stáleho silného miešania, až kým sa zmydelňovanie neukončí (roztok sa vyčíri). Zahrievajte ešte ďalších 20 minút a potom cez spätný chladič prilejte 50 ml destilovanej vody, spätný chladič odpojte a banku ochlaďte na teplotu približne 30 oC. 5.1.3. Obsah banky kvantitatívne preneste do 500 ml oddeľovacieho lievika pomocou viacnásobného opláchnutia destilovanou vodou (celkovo sa jej použije asi 50 ml). Pridajte približne 80 ml dietyléteru, všetko riadne pretrepávajte 30 sekúnd a potom nechajte usadiť (pozn.1). Oddeľte spodnú vodnú vrstvu do druhého oddeľovacieho lievika. Rovnakým spôsobom vykonáme dve ďalšie extrakcie z vodnej fázy, pri každej sa použije 60-70 ml dietyléteru. Poznámka 1. Akákoľvek emulzia sa dá odstrániť pridaním malých množstiev etyl- alebo metylalkoholu vo forme spreja. 5.1.4. Vložte dietyléterové extrakty do jedného oddeľovacieho lievika a prepierajte destilovanou vodou (50 ml každý raz), až kým voda nevykazuje neutrálnu reakciu. Odstráňte vypieraciu vodu, zostávajúcu vrstvu vysušte bezvodým tiosíranom sodným a prefiltrujte cez bezvodý tiosíran sodný do predtým odváženej 250 ml banky, lievik a filter opláchnite malým množstvom dietyléteru. 5.1.5. Oddestilujte éter na niekoľko ml a potom pod slabým vákuom alebo pod prúdom dusíka vysušte, sušenie dokončite v sušičke pri 100 oC asi štvrťhodinu a zvyšok odvážte po ochladení v exsikátore.

5.2. Oddelenie sterolovej frakcie 5.2.1. Príprava základných platní. Silikagélové platne (4.4.) úplne ponorte na 10 sekúnd do 0,2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného (4.5) a potom ich nechajte dve hodiny sušiť v digestóriu a nakoniec ich dosušte v sušičke jednu hodinu pri teplote 100 oC. Vyberte platne zo sušičky a uložte ich až do ďalšieho použitia do exsikátora s chloridom vápenatým (takto ošetrené platne sa musia použiť do dvoch týždňov). Poznámka 2. Ak sa na separáciu sterolovej frakcie použijú základné silikagélové platne, látky, ktoré nepodliehajú zmydelneniu, nie je potrebné upravovať oxidom hlinitým. Takýmto spôsobom sa všetky zlúčeniny kyslého charakteru zložky (mastné kyseliny a iné) zachytia na začiatku a skupina sterolov sa zreteľne oddelí od skupiny alifatických a triterpénových alkoholov. 5.2.2. Zmes benzénu a acetónu v pomere objemov 95:5 (v/v) vložte do vyvíjacej komory v hrúbke vrstvy cca 1 cm. Alternatívne je možné použiť zmes hexán/dietyléter v pomere objemov 65:35 hexánu. Komoru uzatvorte vhodným krytom a nechajte ju stáť asi pol hodiny, aby sa ustálila rovnováha medzi parami a kvapalinou. Na vnútorné steny komory sa môžu pripevniť pásy filtračného papiera namočené vo vyvíjacej zmesi, čím sa skráti čas vyvíjania asi o jednu tretinu a získa sa rovnomernejšia a pravidelnejšia elúcia zložiek. Poznámka 3. Po každej analýze sa musí vymeniť vyvíjací roztok, aby sa úplne zabezpečili reprodukovateľné podmienky vyvíjania. 5.2.3. V chloroforme pripravte približne 5 % roztok látok nepodliehajúcich zmydelneniu (5.1.5.) a pomocou 100 μl mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu 0,3 ml roztoku v rovnomernom pásiku minimálnej hrúbky, približne 2 cm od spodku platne. V línii s pásikom naneste 2 až 3 μl referenčného roztoku sterolov (4.11) na jeden koniec tak, že sterolová skupina môže byť po vyvolaní identifikovaná. 5.2.4. Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.2. Udržujte izbovú teplotu v rozmedzí 15 až 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od hornej hrany platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu alebo dosku nechajte krátko prikrytú krytom. 5.2.5. Platňu mierne a pravidelne postriekajte roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď sa platňa pozoruje pod ultrafialovým svetlom, sterolová skupina sa dá identifikovať podľa škvŕn získaných z referenčného roztoku, zoskupených v rade. Označte hranice skupiny čiernou ceruzkou pozdĺž okrajov fluorescencie. 5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) zoškrabte silikagél z označenej plochy. Umiestnite jemne rozotretý materiál do filtračného lievika (3.7). Pridajte 10 ml horúceho chloroformu, opatrne premiešajte kovovou kopistkou a prefiltrujte za vákua, filtrát pozbierajte do banky (3.8), pripojenej k filtračnému lieviku. Spláchnite zvyšok v lieviku dietyléterom (asi 10 ml každý raz), zbierajte filtrát do tej jednej banky pripojenej k filtračnému lieviku. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml a zvyšný roztok prelejte do vopred odváženej 10 ml skúmavky (3.9), odparte dosucha stredným zahrievaním pod slabým prúdom dusíka, znovu rozpustite v niekoľkých kvapkách acetónu, opäť odparte, na 10 minút vložte do sušičky pri teplote 105 oC a nechajte ochladiť v exsikátore a odvážte. Zvyšok vo vnútri skúmavky pozostáva zo sterolovej frakcie.

5.3. Príprava trimetylsilylových esterov 5.3.1. Pridajte silanizačné činidlo, pozostávajúce zo zmesi objemov 9.3.1 (v/v/v) pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylsilánu (pozn.4) v pomere 50 μl na každý miligram sterolov, do skúmavky obsahujúcej sterolovú frakciu tak, aby sa zabránilo akejkoľvek absorpcii vlhkosti (pozn.5). Poznámka 4. Roztoky na priame použitie sú dostupné v obchodnej sieti. Prípustné sú tiež silanizačné činidlá, ako napr. bis-trimetylsilyl, triflúoroacetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktoré sa riedia rovnakým objemom bezvodého pyridínu. 5.3.2. Skúmavku zazátkujte a opatrne pretrepávajte bez pretáčania, až kým nie sú steroly úplne rozpustené. Potom nechajte skúmavku stáť aspoň 15 minút pri izbovej teplote a následne niekoľko minút odstreďujte. Číry roztok je pripravený na plynovú chromatografickú analýzu. Poznámka 5. Možný vznik slabej opalescencie je bežný a nespôsobuje žiadne interferencie. Vznik bielych vločiek alebo objavenie sa ružového zafarbenia sú znaky prítomnosti alebo znečistenia činidla. V takomto prípade je potrebné test zopakovať.

5.4. Plynovochromatografická analýza 5.4.1. Prípravné postupy a kondiciovanie kolón 5.4.1.1. Kapilárna kolóna sa zachytí vo vnútri plynového chromatografu, pripojte vstup kolóny na odparovač, ktorý je spojený s deliacim systémom a výstup kolóny na detektor. Vykonajte celkovú kontrolu plynového chromatografu (netesnosť v plynových okruhu, výkonnosť detektora, výkonnosť deliaceho systému a zapisovača, atď.). 5.4.1.2. Kapilárnu kolónu, ktorá ešte nebola použitá, je potrebné kondiciovať. Nastavte malý prietok nosného plynu cez kapilárnu kolónu a potom zapnite plynový chromatograf, postupne vyhrievajte, až kým nedosiahnete teplotu minimálne 20 oC nad pracovnú teplotu (pozn. 6). Udržujte túto teplotu aspoň dve hodiny a potom sa zariadenie nastaví na pracovný chod [nastavenie prietokov plynov a deliaceho pomeru (odfuku), zapálenie plameňa, pripojenie na elektronický zapisovač, nastavenie teploty termostatu, detektora a nástreku, atď.] a potom zosnímajte signál pri citlivosti aspoň dvojnásobne vyššej ako pri analýze. Základná línia má byť lineárna, bez špičiek akéhokoľvek pôvodu, a nemala by vykazovať žiadne znaky výkyvov (driftov). Negatívny priamočiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnosť kolónových spojov, kým pozitívny driftv indikuje nedostatočné kondiciovanie kolóny. Poznámka 6. Teplota kondiciovania má byť aspoň o 20 oC nižšia, ako je maximálna pracovná teplota predpokladaná na používanú kvapalnú fázu. 5.4.2. Výber pracovných podmienok 5.4.2.1. Hlavné pracovné podmienky sú nasledujúce: — teplota kolóny: 260 oC ± 5 oC — teplota odparovača: 280 oC, — teplota detektora: 290 oC, — lineárna rýchlosť nosného plynu: hélium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — deliaci pomer: 1: 50 a 1: 100, — citlivosť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho zoslabenia, — rozsah zapisovača: 1 až 2 mV na celý rozsah (celá škála — fs), — rýchlosť posunu papiera: 30 až 60 cm/h, — množstvo dávkovanej látky: 0,5 až 1 μl TMSE roztoku. Tieto podmienky sa môžu líšiť podľa vlastností kolóny a plynového chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledujúce podmienky: — retenčný čas ß — sitosterolu má byť 20 ± 5 minút, — vrchol (pík) kampasterolu má byť: pre olivový olej (priemerný obsah 3 %) 15 ± 5 % hodnoty celkového rozsahu; pre sójový olej (priemerný obsah 20 %) 80 ± 10 % hodnoty celkového rozsahu, — všetky prítomné steroly musia byť rozdelené. Okrem toho, aby sa píky mohli rozdeliť, musia byť úplne rozlíšené, t. j. stopový pík by sa mal vrátiť na základnú líniu pred vylúhovaním ďalšieho píku. Neúplné rozlíšenie je avšak tolerované, ale s podmienkou, že pík v TRR 1,02 je možné kvantifikovať použitím kolmice 5.4.3. Vykonanie analýzy 5.4.3.1. Do 10 μl mikrostriekačky natiahnite 1 μl hexánu, potom natiahnite 0,5 μl vzduchu a následne 0,5 až 1 μl roztoku vzorky. Vytiahnite piest mikrostriekačky tak, aby bola ihla prázdna. Ihlu zaveďte cez septum (tesnenie) do dávkovacieho zariadenia (nástreku) a po jednej až dvoch sekundách roztok rýchlo nadávkujte a ihlu približne po piatich sekundách pomaly vytiahnite. 5.4.3.2. Pokračujte v zaznamenávaní chromatogramu, až kým sa všetky prítomné steroly úplne nevylúhujú. Základná línia bude vždy v súlade s požiadavkami v bode 5.4.1.2. 5.4.4. Identifikácia píkov (vrcholov) Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná podľa retenčných časov a porovnaním so zmesou TMSE sterolov, analyzovanou za rovnakých podmienok. Steroly eluujú v nasledujúcom poradí: Cholesterol, brassikasterol, 24-metylén cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7 — kampesterol, Δ 5,23- stigmastadienol, klerosterol, β — sistosterol, sitostanol, Δ 5 — avenasterol, Δ 5,24 — stigmastadienol, Δ 7 — stigmastenol, Δ 7 — avenastenol. Retenčné časy sitosterolu pre kolóny SE — 52 a SE– 54 sú v tabuľke 1. Obr.1 a 2 ukazujú typické chromatografy niektorých olejov. 5.4.5. Kvantitatívny odhad 5.4.5.1. Plochy píkov α — cholestanolu a sterolov vypočítajte použitím elektronického integrátora. Neuvádzajte píky zložiek, ktoré nie sú zahrnuté v zozname v tab.1. Odozvový faktor pre α — cholestanol sa rovná 1. 5.4.5.2. Obsahy všetkých alkoholov, vyjadrených v mg/100 g tukových látok, sa vypočítajú nasledovne: kde: Ax = plocha píku sterolu x ►M6 ————— ◄ (mm2), As = plocha píku α — cholestanolu ►M6 ————— ◄ (mm2), ms = hmotnosť pridaného α — cholestanolu, v miligramoch (mg), m = hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch (g)

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov ako v mg/100 g tukových látok a ich sumu ako „celkové steroly“.

6.2. Vypočítajte percento každého jednotlivého sterolu z pomeru plochy daného píku k celkovej ploche sterolov: kde: Ax = plocha píku sterolu x; ∑A = celková plocha sterolov.









DODATOK

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Nadávkujte 1 až 3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu za obvyklých pracovných podmienok a stopkami zmerajte čas, za ktorý prejde plyn kolónou od momentu nástreku až po čas, kedy sa objaví (vylúhuje) pík (tM).

Lineárna rýchlosť v (cm/s) je daná L/tM, kde L je dĺžka kolóny v centimetroch (cm) a tM je čas nameraný v sekundách (s).







Tabuľka 1 Relatívne retenčné časy sterolov Pík Označenie Relatívne retenčný čas SE 54 kolóna SE52 kolóna 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]- 24-metyl-Δ-5,22-cholestadién-3β-ol 0,73 0,71 4 24-metylén-cholesterol 24-metylén-Δ-5,24-cholesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-5-cholesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]- 24-etyl-Δ-5,22-cholestadién-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-7-cholesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ-5,23-cholestadién-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]- 24-etyl-Δ-5,25-cholestadién-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl-Δ-5-cholestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-5-cholesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyI-Δ-5,24-cholestadién-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl-Δ-7,24-cholestadién-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-Δ-7-cholesten-3β-ol 1,16 1,16

Obrázok 1

Chromatografický záznam sterolovej frakcie nerafinovaného olivového oleja

Obrázok 2

Chromatografický záznam sterolovej frakcie rafinovaného olivového oleja









PRÍLOHA VI

STANOVENIE ERYTRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erytrodiol (bežne chápaný ako erytrodiolové glykoly a uvaol spolu) tvorí podstatnú časť nezmydlovateľnej frakcie charakteristickej pre niektoré druhy tukov. Nachádza sa v oveľa vyšších koncentráciách rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja ako sú koncentrácie iných olejov, napr. lisovaný olivový olej a olej z hroznových zrniečok, v ktorých je taktiež obsiahnutý, a tak jeho prítomnosť môže dokázať prítomnosť rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja.

1. OBLASŤ

Metóda opisuje postup detekcie erytrodiolu v tukoch

2. PODSTATA

Tuk sa zmydelní metanolicko-etanolickým roztokom hydroxidu draselného. Nezmydelniteľná frakcia sa potom extrahuje dietyléterom a prečistí sa prechodom cez kolónu z oxidu hlinitého.

Nezmydelniteľné látky sa pri tenkovrstvovej chromatografii na silikagélovej platni rozdelia na skupiny zodpovedajúce sterolovej a erytrodiolovej frakcii. Steroly a erytrodiol, získaný z platní, sa prevedú na trimetylsilylové estery a zmes sa analyzuje plynovou chromatografiou.

Výsledok sa vyjadrí ako percento erytrodiolu v zmesi erytrodiolu a sterolov.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1. Vybavenie uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4. ČINIDLÁ

4.1. Činidlá uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4.2. Referenčný roztok erytrodiolu, 0,5 % roztok v chloroforme.

5. POSTUP

5.1. Príprava nezmydelniteľných látok

Ako je popísané v odseku 5.1.2. prílohy V.

5.2. Oddelenie erytrodiolu a sterolov

5.2.1. Pozri odstavec 5.2.1 prílohy V.

5.2.2. Pozri odstavec 5.2.2 prílohy V.

5.2.3. Pripravte 5 % roztok nezmydelniteľných látok v chloroforme. Pomocou 0,1 ml mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu čo najtenší a najrovnomernejší pásik 0,3 ml roztoku približne 1,5 cm od spodného okraja platne. Na jeden koniec platne umiestnite niekoľko mikrolitrov roztokov cholesterolu a erytrodiolu, ktoré budú slúžiť ako etalóny (na porovnanie).

5.2.4. Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.1. Okolitá teplota by mala byť asi 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od horného okraja platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu.

5.2.5. Platňu mierne a pravidelne postriekajte alkoholovým roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď platňu pozorujete pod ultrafialovým svetlom, sterolová a erytrodiolová skupina sa dá identifikovať podľa toho, že sa zoskupujú v rade so štandardami. Bodmi označte iba vonkajšie okraje fluorescencie.

5.2.6. Pomocou kovovej škrabky /kopistky/ zoškrabte silikagél z označenej plochy. Preneste materiál z platne do 50 ml banky. Pridajte 15 ml horúceho chloroformu, dobre pretrepte a prefiltrujte cez filtračný lievik so sintrovaným skleneným diskom tak, aby sa silikagél preniesol na filter. Trikrát premyte horúcim chloroformom (asi 10 ml každý raz), filtrát zbierajte do 100 ml banky. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml, preneste ho do kalibrovanej 10 ml centrifugačnej skúmavky s kužeľovým dnom, vysušte slabým zahrievaním pod prúdom dusíka a odvážte.

5.3. Príprava trimetylsilylových esterov

Ako je popísané v odseku 5.3 prílohy V.

5.4. Plynovochromatografická analýza

Ako je popísané v odseku 5.4 prílohy V. Pracovné podmienky pre plynový chromatograf musia byť také, aby bolo možné vykonať analýzu sterolov a oddeliť TMSE od erytrodiolu a uvaolu.

Ak ste už vykonali nástrek vzorky, pokračujte v zaznamenávaní, kým nie sú prítomné steroly a kým sa erytrodiol a uvaol nevyelujú. Potom identifikujte píky (retenčné časy erytrodiolu a uvaolu pre β- sitosterol sú 1,45 a 1,55, v tomto poradí) a vypoČítajte plochy tak, ako pri steroloch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

kde:

A1 = plocha píku erytrodiolu ►M6 ————— ◄ (mm2);

A2 = plocha píku uvaolu ►M6 ————— ◄ (mm2),

∑ Asterolov = celková plocha píkov pre steroly ►M6 ————— ◄ (mm2).

Výsledok sa udáva na jedno desatinné miesto









PRÍLOHA VII

STANOVENIE MASTNÝCH KYSELÍN V POLOHE 2 V TRIGLYCERIDOCH OLEJOV A TUKOV

1. OBLASŤ

Táto norma opisuje metódu stanovenia zloženia frakcie mastných kyselín z oleja alebo tuku, ktoré sa esterifikujú v polohe 2 (alebo vnútornej pozícii) glycerolu.

2. POUŽITIE

Túto technickú normu je možné aplikovať na oleje a tuky majúce bod topenia pod 45oC, a to kvôli charakteristickým vlastnostiam pankreatickej lipázy.

Nemožno ju použiť bezvýhradne na oleje a tuky obsahujúce veľké množstvá mastných kyselín s 12 a menej uhlíkovými atómami (kokosový olej a olej z palmových jadier, maslový tuk) alebo vysoko nenasýtené mastné kyseliny (s viac ako štyrmi dvojitými väzbami) obsahujúce 20 a viac uhlíkových atómov (rybí olej alebo olej z morských živočíchov) alebo mastné kyseliny obsahujúce kyslíkaté skupiny, iné ako karboxylovú skupinu.

3. PODSTATA

Možná neutralizácia kyslých olejov a tukov v rozpúšťadle. Čistenie prechodom cez kolónu s oxidom hlinitým. Čiastočná hydrolýza triglyceridov pankreatickou lipázou počas stanoveného času. Separácia vzniknutých monoglyceridov tenkovrstvovou chromatografiou a metanolýza týchto monoglyceridov. Analýza týchto metylesterov plynovo-kvapalinovou chromatografiou.

4. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

4.1. 100 ml banka s guľatým dnom

4.2. 25 ml banka s guľatým dnom so zábrusovým hrdlom

4.3. 1 m dlhý vzduchový chladič, ktorý je možné pripevniť na banku 4.2

4.4. 250 ml kužeľová banka

4.5. 50 ml kadička

4.6. 500 ml oddeľovací lievik

4.7. Sklenená chromatografická kolóna s 13 mm vnútorným priemerom, 400 mm dlhá, vybavená sklenenou fritou a kohútikom

4.8. 10 ml centrifugačná skúmavka so zábrusovou sklenenou zátkou

4.9. 5 ml byreta delená po 0,05 ml

4.10. 1 ml podkožná striekačka s tenkou ihlou

4.11. Mikropipeta, na vytvorenie 3 až 4 ìl kvapiek

4.12. Rozprašovač na použitie pri tenkovrstvovej chromatografii

4.13. Sklenené platne na použitie pri tenkovrstvovej chromatografii, 20 × 20 cm

4.14. Sklenená vyvíjacia komora na použitie pri tenkovrstvovej chromatografii, so zábrusovým vekom, použiteľná na 20 × 20 cm platne

4.15. Sprej na použitie pri tenkovrstvovej chromatografii

4.16. Pec nastaviteľná na 103 oC ± 2 oC

4.17. Termostat regulovateľný v rozmedzí 30 až 45 oC ± 0,5 oC

4.18. Rotačná odparka

4.19. Vibračná elektronická trepačka s možnosťou silného pretrepávania centrifugačnej skúmavky

4.20. Ultrafialová lampa na testovanie tenkovrstvových platní

4.21. pH meter 4.22. Špirálové miešadlo 4.23. 5 ml byreta 4.24. Stopky

4.25. Laboratórne miešadlo, vhodné na disperzie a zmesi heterogénnych materiálov

5. ČINIDLÁ

5.1. n - hexán, prípadne ľahký benzín (bod varu od 30 do 50 oC), chromatografickej kvality

5.2. 2- propanol alebo 95 % etanol (v/v), p.a.

5.3. 2- propanol alebo etanol 1/1 vodný roztok

5.4. Dietyléter, bez peroxidov

5.5. Acetón

5.6. Kyselina mravčia, najmenej 98 % (m/m)

5.7. Vyvíjacie rozpúšťadlo: zmes n - hexánu (5.1), dietyléteru (5.4) a kyseliny mravčej (5.6) v pomere 70/30/1 (v/v/v)

5.8. Oxid hlinitý aktivovaný, na chromatografiu, neutrálny, skupina Brockmann I

5.9. Kremičitý prášok, so spojivom, vhodnej kvality na tenkovrstvovú chromatografiu

5.10. Pankreatická lipáza vhodnej kvality (pozn.1 a 2)

5.11. Hydroxid sodný, vodný roztok 120g/l

5.12. Kyselina chlorovodíková, 6 mol/l vodný roztok

5.13. Chlorid vápenatý CaCl2), vodný roztok 220 g/l

5.14. Cholát sodný (enzymatickej kvality), vodný roztok 1 g/l

5.15. Tlmiaci roztok (pufer): 1M vodný roztok tris-hydroxymetylaminometánu, upravený na pH = 8 pridaním kyseliny chlorovodíkovej (5.12) (kontrolované potenciometrom)

5.16. Fenolftaleín, 10g/l roztok v 95 % (v/v) etanole

5.17. 2′, 7′- dichlórfluoresceín, roztok 2g/l v 95 % (v/v) etanole, mierne zalkalizovaný pridaním jednej kvapky 1 N roztoku hydroxidu sodného na 100 ml

5.18 Neutralizovaný olej 5.19 Hydroxid sodný, 0,01 N vodný roztok 5.20 Cholát sodný (enzymatickej kvality), vodný roztok 200 g/l 5.21 Arabská guma, 100 g/l vodný roztok

6. PRÍPRAVA VZORKY

Ak je kyslosť vzorky pod 3 %, stanovená podľa prílohy II, prečistite priamo cez oxid hlinitý podľa 6.2.

Ak je kyslosť vzorky nad 3 %, stanovená podľa prílohy II, zneutralizujeme zásadou za prítomnosti rozpúšťadla podľa 6.1., potom necháme prejsť cez oxid hlinitý podľa 6.2.

6.1. Neutralizácia zásadou za prítomnosti rozpúšťadla Do oddeľovacieho lievika (4.6) vlejeme približne 10 g surového oleja a pridáme 100 ml hexánu (5.1), 50 ml 2-propanolu (5.2) a niekoľko kvapiek fenolftaleínového roztoku (5.16) a množstvo hydroxidu sodného zodpovedajúce voľnej kyslosti oleja plus 0,3 % navyše. 1 minútu silno pretrepávajte, pridajte 50 ml destilovanej vody, znova pretrepte a nechajte usadiť. Po rozdelení odstráňte spodnú mydlovú vrstvu. Taktiež odstráňte všetky stredné vrstvy (nerozpustené látky, sliz). Hexánový roztok zneutralizovaného oleja prepierajte viackrát za sebou v 25 – 30 ml roztoku 2 – propanolu (5.3), až kým nezmizne ružové fenolftaleínové zafarbenie. Odstráňte väčšinu hexánu vákuovou destiláciou v rotačnej odparke (4.18), olej vysušte pri teplote 30 až 40oC vákuom pomocou prúdu čistého dusíka, až kým sa hexán úplne neodstráni.

6.2. Čistenie cez oxid hlinitý Pripravte suspenziu 15 g aktivovaného oxidu hlinitého (5.8) v 50 ml hexánu (5.1) a nalejte ho, za stáleho miešania, do chromatografickej kolóny (4.7). Nechajte oxid hlinitý rovnomerne usadiť a umožnite, aby hladina rozpúšťadla klesla na 1 až 2 mm nad absorbent. Opatrne vlejte do kolóny roztok 5 g oleja v 25 ml hexánu (5.1); pozbierajte všetok eluent do banky s guľatým dnom (4.1).

7. Príprava chromatografických platní Sklenené platne (4.13) dokonale vyčistite etanolom, ľahkým benzínom a acetónom, aby sa odstránili všetky stopy mastných látok. 30 g prášku oxidu kremičitého (5.9) dajte do kužeľovej banky (4.4). Pridajte 60 ml destilovanej vody. Zazátkujte a 1 minútu silne pretrepávajte. Riedku kašu ihneď preneste do rozprašovača (4.12) a na čistú platňu naneste 0,25 mm hrubú vrstvu. Platne 15 minút sušte na vzduchu a potom v peci (4.16) hodinu pri teplote 103 oC ± 2 oC. Pred použitím platne vychlaďte v exsikátore na izbovú teplotu. V obchodenej sieti sú dostupné pripravené platne.

8. POSTUP 8.1. Hydrolýza pankreatickou lipázou. Odvážte približne 0,1 g pripravenej vzorky do centrifugačnej skúmavky (4.8), ak je vzorka kvapalný olej, postupujte presne ako je uvedené nižšie. Pridajte 20 mg lipázy (5.10) a 2 ml tlmiaceho roztoku (5.15). Poriadne, ale opatrne pretrepte a potom pridajte 0,5 ml roztoku cholátu sodného (5.14) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého (5.13). Skúmavku uzatvorte zábrusovou zátkou, opatrne pretrepte (zabráňte namočeniu zátky) a skúmavku ihneď vložte do termostatu (4.17) nastaveného na 40 ± 0,5 oC a ručne pretrepávajte presne jednu minútu. Skúmavku vyberte z termostatu a elektrickou trepačkou (4.19) silno pretrepávajte presne dve minúty. Ihneď ochlaďte pod tečúcou vodou, pridajte 1 ml kyseliny chlorovodíkovej (5.12) a 1 ml dietyléteru (5.4). Zazátkujte a silno premiešajte elektrickou trepačkou. Nechajte postáť a pomocou striekačky (4.10) odstráňte organickú vrstvu, ak je to po odstreďovaní nutné. 8.2. Separácia monoglyceridov tenkovrstvovou chromatografiou Mikropipetou (4.11) naneste extrakt na chromatografickú platňu, približne 1,5 mm od spodného okraja, v tenkom rovnomernom pásiku, a to čo najrovnejšie. Vložte platňu do dobre nasýtenej vyvíjacej komory (4.14) a vyvíjajte s vyvíjacím rozpúšťadlom (5.7) pri teplote približne 20 oC, až do 1 cm od vrchného okraja platne. Platňu vysušte vzduchom pri rovnakej teplote, aká bola v komore, a postriekajte ju roztokom 2′, 7′- dichlórfluoresceínu (5.17). Identifikujte skupinu monoglyceridov (Rf približne 0,035) pod ultrafialovým svetlom (4.20). 8.3. Analýza monoglyceridov chromatografiou plyn-kvapalina Pomocou špachtle zoškrabte skupinu získanú v 8.2 (neodstraňujte zložky zadržané na základnej línii) a preneste ju do metylačnej banky (4.2). Upravte pozbieraný oxid kremičitý priamo podľa metód opísaných v prílohe X B tak, aby sa monoglyceridy previedli na metylestery, a potom otestujte estery plynovou chromatografiou, ako je opísané v prílohe X A.

9. VYJADRENIE VÝSLEDOV Vypočítajte zloženie mastných kyselín v polohe 2 na jedno desatinné miesto (pozn. 3).

10. POZNÁMKY Poznámka 1: Kontrola aktivity lipázy Pripravte olejovú emulziu pretrepávaním zmesi 165 ml roztoku arabskej gumy (5.21), 15 g roztlčeného ľadu a 20 ml zneutralizovaného oleja (5.18) vo vhodnej miešacej komore. 10 ml tejto emulzie dajte do kadičky (4.5), následne postupne pridajte 0,3 ml roztoku cholátu sodného (5.20) a 20 ml destilovanej vody. Kadičku vložte do termostatu nastaveného na 37 ± 0,5 oC (pozn.4), ponorte elektródy pH metra (4.21) a špirálové miešadlo (4.22). Pomocou byrety (4.23) pridajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného (5.19), kým pH nedosiahne hodnotu 8,5. Pridajte dostatočné množstvo vodnej suspenzie lipázy (pozri nižšie). Hneď ako sa na pH metri ukáže hodnota pH 8,3, stlačte stopky (4.24) a prikvapkávajte roztok hydroxidu sodného (5.19) v takom pomere, aby sa pH udržiavalo na hodnote 8,3. Každú minútu odčítavajte spotrebovaný objem alkalického roztoku. Zaznamenajte pozorovania vo forme grafu, časové údaje na osi úsečiek (os x) a ml alkalického roztoku potrebného na dosiahnutie konštantného pH na osi poradníc (osi y). Získaný graf by mal byť lineárny. Vyššie uvedená suspenzia lipázy je koncentrácia 1 na tisíc (m/m) suspenzie vo vode. Pre každý vyhovujúci test pre túto suspenziu by sa tak malo spotrebovať približne 1 ml alkalického roztoku počas 4 až 5 minút. Obvykle je potrebných približne 1 až 5 g prášku. Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré bude uvoľnené 10 ìl- ekvivalentami kyseliny za minútu. Potom aktivita použitého prášku A, meraná v lipázových jednotkách na mg, je vyjadrená nasledujúcim vzorcom: kde V je množstvo roztoku hydroxidu sodného (5.19) spotrebovaného za minútu, vypočítaného z grafu, m je hmotnosť v mg testovaného dielu prášku. Poznámka 2: Príprava lipázy Lipázy, ktoré majú dostatočnú lipázovú aktivitu, sú dostupné v obchodnej sieti. Je ich však možno aj pripraviť v laboratóriu podľa nasledujúceho postupu: Vychlaďte 5 kg čerstvých pankreasov z prasiat na 0 oC, odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozomeľte v miešači tak, aby ste získali pastovitú tekutinu. Miešajte pastu miešadlom (4.25) štyri až šesť hodín s 2,5 l bezvodého acetónu a odstreďte. Extrahujte zvyšok ešte trikrát rovnakým objemom acetónu, potom dvakrát zmesou acetónu a dietyléteru 1/1 (v/v) a dvakrát dietyléterom. Sušte zvyšok pod vákuom 48 hodín, aby ste získali stabilný prášok, ktorý uskladnite v chladničke. Poznámka 3: V každom prípade sa odporúča stanoviť zloženie všetkých mastných kyselín v tej istej vzorke, keďže porovnanie s týmito kyselinami v polohe 2 napomôže pri vyhodnotení získaných údajov. Poznámka 4: Ak sa použije tekutý olej, teplota pri hydrolýze sa nastaví na 37 oC. Na testovanú vzorku sa však teplota nastaví na 40 oC, aby sa mohli testovať tuky s bodom topenia do 45 oC.

▼M20 —————

▼B









PRÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ OBLASTI

ÚVOD

Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti môže poskytnúť informácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali počas technologických procesov.

Absorpcia pri vlnových dĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená prítomnosťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E1 % 1 cm (extinkcia 1 % roztoku tuku v špecifikovanom rozpúšťadle, v kyvete hrúbej 1 cm) obvykle určená ako K (tiež vyjadrovaná ako „extinkčný koeficient“).

1. OBLASŤ

Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivového oleja v ultrafialovej oblasti.

2. PODSTATA

Testovaný tuk sa rozpustí v požadovanom rozpúšťadle a extinkcia roztoku sa potom stanoví pri určenej vlnovej dĺžke so zreteľom na čisté rozpúšťadlo. Určité extinkcie sa vypočítavajú zo spektrofotometrických údajov.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1. Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220 a 360 mm, s možnosťou odčítavania jednotlivých nanometrických jednotiek.

3.2. Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou dĺžkou 1 cm. Keď sa kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpúšťadlom, nemali by medzi sebou vykazovať rozdiel väčšií ako 0,01 jednotky extinkcie.

3.3. 25 ml odmerná banka

▼M6

3.4. Chromatografická kolóna s hornou časťou o dĺžke 270 mm a o priemere 35 mm a so spodnou časťou o dĺžke 270 mm a priemere približne 10 mm.

▼B

4. ČINIDLÁ

4.1. Spektrofotometricky čistý izo-oktán (2,2,4-trimetypentán) — Pokiaľ ide o destilovanú vodu, mal by mať transmitanciu nie menej ako 60 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm alebo spektrofotometricky čistý cyklohexán, pokiaľ ide o destilovanú vodu, mal by mať transmitanciu nie menej ako 40 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Základný oxid hlinitý pre chromatografické kolóny pripravený a skontrolovaný tak, ako je opísané v prílohe 1.

4.3. n-hexán, na chromatografiu

5. POSTUP

5.1. Skúmaná vzorka musí byť dokonale homogénna a bez podozrivých nečistôt. Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote približne 30 oC, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote najviac 10 oC nad bodom topenia.

5.2. Presne odvážte približne 0,25 g takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej banky, doplňte určeným rozpúšťadlom po značku a zhomogenizujte. Výsledný roztok musí byť úplne priezračný. Ak je prítomná opalescencia alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.

5.3. Získaným roztokom naplňte kyvetu a za použitia rozpúšťadla na porovnanie zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej dĺžke medzi 232 až 276 nm. Namerané hodnoty sa musia nachádzať v rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie, merania sa musia zopakovať za použitia koncentrovanejších alebo zriedenejších roztokov, ak je to vhodné.

5.4. Ak je stanovenie určitej extinkcie požadované po prechode vzorky cez oxid hlinitý, postup je nasledujúci: Do chromatografickej kolóny dajte 30 g základného oxidu hlinitého v suspenzii v hexáne. Po usadení adsorbentu stiahnite nadbytočný hexán dole na približne 1 cm nad horným okrajom oxidu hlinitého. V 100 ml hexánu rozpustite 10 g tuku, zhomogenizujte ho a prefiltrujte podľa opisu v 5.1. a nalejte roztok do kolóny. Zozbierajte eluát a za vákua odparte všetko rozpúšťadlo pri teplote pod 25 oC. S takto získaným tukom hneď pokračujte podľa postupu uvedeného v 5.2.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Zaznamenajte špecifické extinkcie (extinkčné koeficienty) pri rôznych vlnových dĺžkach, ktoré sa vypočítajú takto: kde: Kλ = špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke λ; Eλ = nameraná extinkcia pri vlnovej dĺžke λ; c = koncentrácia roztoku v g/100ml; s = hrúbka kyvety v cm. Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.

6.2. Spektrografická analýza olivového oleja súlade s oficiálnou metódou v nariadeniach EHS ustanovuje stanovenie extinkcie v izo-oktánovom roztoku pri vlnových dĺžkach 232 a 270 nm a stanovenie K, ktoré je vyjadrené vzorcom: kde Km je špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke m, vlnová dĺžka pre maximálnu absorpciu je okolo 270 nm.









DOPLNOK I

Príprava oxidu hlinitého a testovanie jeho aktivity

A.1.1. Príprava oxidu hlinitého

Do hermeticky uzatvárateľnej nádoby vložte oxid hlinitý, ktorý ste predtým sušili v peci po dobu troch hodín pri teplote 380 až 400 oC, pridajte destilovanú vodu v pomere 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, nádobu ihneď uzatvorte, opakovane pretrepávajte a potom nechajte odstáť aspoň 12 hodín pred použitím.

A.1.2. Kontrola aktivity oxidu hlinitého

Pripravte chromatografickú kolónu s 30 g oxidu hlinitého. Postupujte podľa odseku 5.4., nasledujúcu zmes:

— 95 % panenského olivového oleja, ktorého špecifická extinkcia je menej ako 0,18 pri 268 nm,

— 5 % oleja z podzemnice olejnej, upraveného hlinkou v procese rafinácie, so špecifickou extinkciou nie menšou ako 4 pri 268 nm

nechajte prejsť cez kolónu.

Ak má zmes pri prechode kolónou špecifickú extinkciu väčšiu ako 0,11 pri 268 nm, je oxid uhličitý vyhovujúci, ak nie, úroveň dehydrácie sa musí zvýšiť.









DODATOK II

Kalibrácia spektrofotometra

A.2. Prístroj sa musí kontrolovať v intervaloch (najmenej každých šesť mesiacov) pri obidvoch vlnových dĺžkach a na presnosť odozvy.

A.2.1. Vlnovú dĺžku je možné kontrolovať pomocou použitia pár ortuťovej lampy alebo pomocou vhodných filtrov.

A.2.2. Pri kontrole odozvy fotocely a fotonásobiča postupujte takto: Odvážte 0,2000 g čistého chrómanu draselného pre spektrofotometriu a rozpustite v 0, 05N roztoku hydroxidu sodného v 1 000 ml odmernej banke a doplňte po značku. Odoberte presne 25 ml získaného roztoku, preneste do 500 ml odmernej banky a zrieďte doplnením po značku tým istým roztokom hydroxidu draselného. Zmerajte extinkciu takto získaného roztoku pri 275 nm použitím roztoku hydroxidu draselného ako porovnávacieho roztoku. Extinkcia meraná v 1 cm kyvete by mala byť 0,200 ± 0, 005.









PRÍLOHA X A

PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN

1. OBLASŤ

Táto metóda podáva všeobecný návod na použitie plynovej chromatografie využívajúcej náplňové kolóny alebo kapilárne kolóny na stanovenie kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia zmesi metyl esterov mastných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenou v prílohe X B.

Metóda sa nedá použiť na polymerizované mastné kyseliny.

2. ČINIDLÁ

2.1. Nosný plyn

Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, atď.), dokonale vysušený a s obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.

Poznámka 1:

Vodík, ktorý sa používa ako nosný plyn iba pre kapilárne kolóny, môže dvojnásobne urýchliť analýzu, ale je nebezpečný. Sú k dispozícii bezpečnostné zariadenia.

2.2. Pomocné plyny.

2.2.1. Vodík (čistoty ≥ 99,9 %), bez organických nečistôt

2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických nečistôt

2.3. Porovnávací (referenčný) štandard

Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu

Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených mastných kyselín.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Uvedené pokyny týkajúce sa bežného vybavenia používaného v plynovej chromatografii, využívajúce náplňové a/alebo kapilárne kolóny a plameňovoionizačný detektor. Je vhodné každé zariadenie s účinnosťou a rozlíšením uvedené v 4.1.2.

3.1. Plynový chromatograf

3.1.1. Dávkovací (injekčný) systém

Použite niektorý z uvedených injekčných systémov:

a) s náplňovými kolónami, s najmenším možným mŕtvym objemom (v tomto prípade by mal dať injektor zahriať na teplotu o 20 až 50 oC vyššiu ako má kolóna) alebo

b) s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal byť injektor špeciálne navrhnutý na použitie pre takéto kolóny. Môže to byť split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.

Poznámka 2:

Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlíkovými atómami sa môže použiť injektor s pohyblivou ihlou.

3.1.2 Pec

Pec by mala byť schopná vyhrievať kolónu na teplotu aspoň 260 oC a udržiavať požadovanú teplotu v rozmedzí 1 oC v prípade náplňovej kolóny a 0,1 oC pri kapilárnej kolóne. Táto druhá požiadavka je obzvlášť dôležitá pri kolónach z taveného kremeňa.

Vo všetkých prípadoch sa odporúča teplotne-programovateľné vyhrievanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.

3.1.3 Náplňová kolóna

3.1.3.1. Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných voči analyzovaným látkam (napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi: a) dĺžka: 1 až 3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým reťazcom (nad C20), dajú sa použiť relatívne krátke kolóny. Ak analyzujeme kyseliny so 4 až uhlíkovými atómami, odporúča sa použiť kolónu dlhú 2 m. b) vnútorný priemer: 2 až 4 mm. Poznámka 3. Aksú prítomné polynenasýtené zložky s viac ako tromi dvojitými väzbami, tieto sa môžu rozložiť v kolóne z nerezovej ocele. Poznámka 4. Je možné použiť aj systém s dvojicou náplňových kolón.

3.1.3.2. Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí: a) nosič: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný inertný nosič s úzkym rozmedzím veľkosti zŕn (25 μm rozmedzie medzi hranicami 125 až 200 μm); priemerná veľkosť častíc závisí od vnútorného priemeru a dĺžky kolóny; b) stacionárna fáza: polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietylénglykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát, atď.), kyanosilikóny alebo každé iné kvapaliny umožňujúce chromatografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť 5 až 20 % (m/m) náplne nosiča. Pri určitých separáciách je možné použiť nepolárne stacionárne fázy.

3.1.3.3. Kondiciovanie kolóny Pec postupne vyhrievajte až do 185 oC, ak je v hodné, pripravenú kolónu odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspoň 16 hodín prúdiť inertný plyn tempom 20 až 60 ml/min a potom ďalšie 2 hodiny pri teplote 195 oC.

3.1.4. Kapilárna kolóna

3.1.4.1. Trubica vyrobená z materiálu odolného voči analyzovaným (obvykle zo skla alebo z taveného kremeňa). Vnútorný priemer 0,2 až 0,8 mm. Vnútorný povrch prešiel pred nanesením stacionárnej fázy patričnou úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). Dĺžka 25 mm vyhovuje vo väčšine prípadov.

3.1.4.2. Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000), polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu (kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krížom viazanými väzbami (cross-linked bonded). Poznámka 5. Pri použití polárnych polyxilánov sa sťažuje identifikácia a separácia kyseliny linoleovej a C20 kyselín. Nanesená vrstva by mala byť tenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3. Montáž a kondiciovanie kolóny Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiestnenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnosť), umiestnenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia mŕtvych objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar (30 kPa), v prípade kolóny dĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 0,3 mm]. Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3 oC/min od teploty prostredia až na teplotu 10o C pod limitom dekompozície stacionárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie základu. Vráťte teplotu na 180 oC, aby ste pracovali v izotermálnych podmienkach. Poznámka 6. Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej sieti

3.1.5. Detektor, lepšie ak je s vyhrievaním na teplotu vyššiu ako teplota danej kolóny.

3.2. Pipeta

Pipeta by mala byť s maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm dieliky.

3.3. Zapisovač

Ak sa na výpočet zloženia analyzovanej zmesi použije krivka zo zapisovača, je potrebný presný elektronický zapisovač, kompatibilný s použitým prístrojom. Zapisovač by mal mať:

a) odozvový pomer pod 1,5 s; lepšie 1 s (odozvový pomer je čas, za ktorý zapisovacie pero prejde od 0 do 90 % podľa náhleho vstupu 100 % signálu);

b) šírka papiera, minimálne 20 cm;

c) rýchlosť papiera, nastaviteľné hodnoty medzi 0,4 a 2,5 cm/min.

3.4. Integrátor

Pomocou elektronického integrátora je možné vykonať rýchly a presný výpočet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivosťou a dostatočnú korekciu odchýlky základnej línie.

4. POSTUP

Postupy uvedené v 4.1 až 4.3. sa vzťahujú aj na plameňovoionizačný detektor.

Alternatívne sa môže použiť plynový chromatograf využívajúci katarometrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti). Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.

4.1. Podmienky testovania

4.1.1. Výber optimálnych pracovných podmienok 4.1.1.1. Náplňové kolóny Pri výbere podmienok testovania je potrebné vziať do úvahy nasledujúce premenné: a) dĺžku a priemer kolóny; b) druh a množstvo stacionárnej fázy; c) teplotu kolóny; d) prietok nosného plynu; e) požadované rozlíšenie; f) veľkosť testovanej navážky vybranej takým spôsobom, aby detektor a elektrometer dávali lineárnu odozvu; g) dĺžka analýzy. Vo všeobecnosti, hodnoty uvedené v tabuľke 1 a 2 povedú k požadovaným výsledkom, t. j. aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15 minút. Ak to zariadenie dovoľuje, injektor by mal byť nastavený na teplotu okolo 200 oC a detektor na teplotu rovnú alebo vyššiu ako je teplota kolóny. Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plameňovoionizačného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1 v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 až 10 krát väčší ako prietok vodíka.



Tabuľka 1 Vnútorný priemer kolóny (v mm) Prietok nosného plynu (v ml/min) 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60



Tabuľka 2 Koncentrácia stacionárnej fázy % (m/m) Teplota kolóny oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilárna kolóna Vlastnosti ako účinnosť a priepustnosť kapilárnych kolón znamenajú, že separácia medzi zložkami a dĺžkou trvania analýzy sú vo veľkej miere závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné optimalizovať pracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo jednoduchšie na straty na hlave kolóny) podľa toho, či si želáte zlepšiť separáciu alebo urýchliť analýzu.

4.1.2. Stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenia (pozri obrázok 1) Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla). Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píku rozpúšťadla. Použite dostatočné množstvo zmesi metyl esterov, aby pík metyl stearátu zabral približne tri štvrtiny celkového rozsahu. Vypočítajte počet teoretických priehradiek, n (účinnosť) podľa vzorca: a rozlíšenie R podľa vzorca: kde: dr1 je retenčná vzdialenosť v milimetroch od štartu chromatogramu po maximum píku metyl stearátu; ω1 a ω2 sú šírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané medzi bodmi priesečníkov tangentov a interflexnými bodmi krivky so základnou líniou; Δ je vzdialenosť v milimetroch medzi maximami píkov metyl stearátu a metyl oleátu, ▼M2 a index rozpustnosti 1r pri použití vzorca kde: a = výška najmenšieho píku meraná od základnej čiary; b = výška najnižšieho bodu priehlbiny medzi dvoma priľahlými píkmi meraná od základnej čiary. ▼B Obrázok 1 Chromatogram na stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenie Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umožnia aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny a rozlíšenie aspoň 1,25.

4.2. Veľkosť navážky

Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 až 2 μl roztoku metyl esterov pripraveného podľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.

Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich približne 100 mg/ml roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 ml tohto roztoku.

Ak sú zložky prítomné iba v stopových množstvách, veľkosť navážky môžete zvýšiť (až 10 násobne).

4.3. Analýza

Pracovné podmienky boli všeobecne definované v 4.1.1.

Napriek tomu je možné pracovať pri nižšej teplote kolóny, ak sa požaduje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo pri vyššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami uhlíka. V prípade potreby je možné využiť programovanú teplotu v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl estery mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100 oC (alebo od 50 do 60 oC, ak je prítomná kyselina butyrová) a ihneď zvýšte teplotu s gratientom 4 až 8 oC/min do optimálnej teploty. V niektorých prípadoch sa môžu kombinovať obidva postupy.

Po programovom vyhrievaní pokračujte v elúcii pri konštantnej teplote, až kým sa všetky zložky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové vyhrievanie, použite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195 oC.

Ak je vhodné, odporúča sa vykonať analýzu na dvoch ukotvených fázach rôznej polarity a tým sa overí neprítomnosť prekrytých píkov, napríklad v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C18:3 a C20:0 alebo C 18:3 a C18:2.

4.4. Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov

Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracovných podmienok, aké boli použité pri vzorkách a zmerajte retenčné časy alebo retenčné vzdialenosti zložiek mastných kyselín. Na semi-logaritmický papier zhotovte, na každý stupeň nenasýtenia, grafy ukazujúce logaritmus retenčného času alebo vzdialenosti ako funkciu počtu uhlíkových atómov. Pri izotermických podmienkach by mali byť grafy pre nerozvetvené kyseliny s rovnakým stupňom nenasýtenia rovnobežné.

Je nevyhnutné predísť takému kondiciovaniu, po ktorom sa objavujú „maskované píky“, t. j. kde je nedostatočné rozlíšenie na rozdelenie dvoch zložiek.

5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

5.1. Kvalitatívna analýza

Identifikujte píky metylesterov pre vzorku z grafov uvedených v 4.4, interpoláciou, ak je vhodné.

5.2. Kvantitatívna analýza

5.2.1. Stanovenie zloženia

Okrem výnimočných prípadov použite metódu vnútornej normalizácie, t. j. predpokladajme, že všetky zložky vzorky sú zastúpené na chromatografe, takže celková plocha pod píkmi prestavuje 100 % zložiek (úplná elúcia).

Ak je v zariadení aj integrátor, použite jeho zaznamenané hodnoty. Ak sa v prístroji nenachádza, určite plochu pod každým píkom vynásobením výšky píku šírkou píku v polovičnej výške, a keď je to vhodné, zoberte do úvahy rôzne zoslabenia počas zápisu.

5.2.2 Metóda výpočtu

5.2.2.1. Ilustračný (všeobecný) prípad Vypočítajte obsah danej zložky i, vyjadrený ako percento hmotnosti metylesterov, stanovením percenta predstavujúceho plochu príslušného píku vzťahujúceho sa k sume plôch všetkých píkov, pomocou nasledujúceho vzorca: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i, ΣA je suma plôch pod všetkými píkmi. Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo. Poznámka 7. V tomto ilustračnom prípade je výsledok výpočtu založený na v pomerných plochách sa považuje za hmotnostné percento. Pre prípady, v ktorých tento predpoklad nie je možný, pozri 5.2.2..2.

5.2.2.2. Použitie korekčných faktorov V niektorých prípadoch, napríklad za prítomnosti mastných kyselín s menej ako 8 atómami uhlíka alebo kyselín so sekundárnou skupinou, ak sa použije tepelnovodivostný detektor alebo sa požaduje predovšetkým vyšší stupeň presnosti, by sa mali použiť korekčné faktory na prevedenie plošných percent na hmotnostné percentá zložiek. Stanovte korekčné faktory pomocou chromatografu odvodeného z analýzy porovnávacej zmesi metylesterov známeho zloženia, vykonanej za rovnakých pracovných podmienok ako pri vzorke. Pri tejto porovnávacej zmesi je hmotnostné percento zložky i vyjadrené vzorcom: kde: mi je hmotnosť zložky i v porovnávacej zmesi; ∑Am je celková hmotnosť rôznych zložiek v referenčnej zmesi (porovnávacom roztoku). Z chromatogram porovnávacieho roztoku (4.4) vypočítajte percento (plocha/plocha) pre zložku i takto: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i, ∑A je suma plôch pod všetkými píkmi. Korekčný faktor sa potom vypočíta: Bežnejšie sa korekčné faktory vyjadrujú podľa ich vzťahu k KC16, takže relatívnymi faktormi sa stávajú: Pre vzorku, obsah každej vzorky i, vyjadrený ako hmotnostné percento metyl esterov je: Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.

5.2.2.3. Použitie vnútorného štandardu Pri niektorých analýzach (napr. ak nie sú kvantifikované všetky mastné kyseliny, ako keď sú vedľa kyselín so 16 alebo 18 uhlíkmi prítomné kyseliny so štyrmi alebo šiestimi uhlíkmi alebo keď je potrebné vo vzorke určiť absolútne množstvo mastnej kyseliny) je nevyhnutné použiť vnútorný štandard. Mal by sa určiť korekčný faktor (ak je nejaký ) pre vnútorný štandard. Hmotnostné percento zložky i, vyjadrené ako metylester, je potom vyjadrené vzorcom: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i; As je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá vnútornému štandardu; K′i je korekčný faktor zložky i (vzťahujúci sa na KC1); K′s je korekčný faktor vnútorného štandardu (vzťahujúci sa na KC16); m je hmotnosť navážky vzorky, v miligramoch; ms je hmotnosť vnútorného štandardu, v miligramoch. Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.

▼M2

6. OSOBITNÝ PRÍPAD — STANOVENIE TRANS-IZOMÉROV

Je možné stanoviť obsah trans-izomérov v mastných kyselinách s počtom atómov uhlíka od 10 do 24 oddelením metylesterov s použitím plynových chromatografických kapilárnych kolón so špecifickou polaritou.

6.1 Kapilárna kolóna vyrobená z oxidu kremičitého s vnútorným priemerom 0,25 mm až 0,32 mm a s dĺžkou 50 m s nanesenou vrstvou kyanopropysilikónu, pričom hrúbka vrstvy bude od 0,1 do 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 a podobné druhy).

6.2 Metylestery sa pripravujú postupom uvedeným v prílohe X B. Mastné látky s voľnou aciditou vyššou ako 3 % sa musia kvôli bezpečnosti neutralizovať v súlade s bodom 6.1 prílohy VII.

6.3 Pracovné podmienky pre plynovú chromatografiu sú takéto: — teplota kolóny nastavená na hodnotu od 150 °C do 230 °C (napríklad 165 °C počas 15 minút a následné zvyšovanie rýchlosťou 5 °C za minútu na 200 °C); — teplota injektora: 250 °C, pokiaľ sa používa systém s deličom, alebo začiatočná teplota kolóny, ak sa používa systém na kolóne; — teplota detektora: 260 °C; — prietok nosného plynu (hélium a vodík): 1,2 ml za minútu. Vstreknuté množstvo musí byť také, aby za použitých podmienok citlivosti výška píku zodpovedajúceho metylesteru kyseliny arašidovej bola rovnaká alebo väčšia ako 20 % spodnej časti stupnice.

6.4 Identifikácia rôznych metylesterov sa vykoná na základe retenčných časov, ktoré sa porovnajú s retenčnými časmi referenčných zmesí (ako je uvedené v bode 2.3). Estery trans-mastných kyselín sa eluujú pred zodpovedajúcimi cis-izomérmi. Príklad chromatogramu je uvedený na obrázku 2. Obrázok 2: Plynový chromatogram trans-izomérov mastnej kyseliny s použitím kapilárnej kolóny

6.5 Účinnosť kolóny stanovená v súlade s bodom 4.1.2 musí byť taká, aby umožnila oddelenie určitých kritických dvojíc, napríklad dvojice tvorenej masívom píku trans-izoolejových kyselín a kyseliny olejovej, trans C18:1/cis C18:1 s indexom rozlíšenia vyšším ako 2.

6.6 Percento rôznych trans-mastných kyselín sa vypočíta na základe pomeru medzi plochou príslušného píku a súčtom plôch všetkých prítomných píkov. Percentá: — trans-oktadekénových kyselín (T 18:1) uvedených v prílohe I k nariadeniu ako suma trans-olejových izomérov; — cis-trans a trans-cis kyselín oktadekandiénových [(CT/TC) 18: 2] uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolových izomérov; — trans–cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, kyselín oktadekantriénových [(TCT + CCC + CTC;TCC) 18: 3] uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolénových izomérov sa berú do úvahy. Poznámka 8: Berúc do úvahy osobitné charakteristiky tejto metódy, uvádzajte prosím výsledky na dve desatinné miesta.

▼B

►M2 7. ◄ ŠPECIÁLNY PRÍPAD — POUŽITIE KATAROMETRA AKO DETEKTORA (PRACUJÚCEHO NA PRINCÍPE ZMIEN TEPELNEJ VODIVOSTI)

Na stanovenie kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia zmesi metylesterov mastných kyselín sa dá taktiež použiť plynový chromatograf využívajúci detektor pracujúci na princípe sledovania zmien tepelnej vodivosti (katarometer). V prípade jeho použitia, podmienky uvedené v odseku 3 a 4 sa upravia podľa tabuľky 3.

Pri kvantitatívnej analýze použite korekčné faktory uvedené v 5.2.2.2.







Tabuľka 3 Premenná Hodnota/podmienka Kolóna dĺžka: 2 až 4 m vnútorný priemer: 4 mm Nosič zrná veľkosti medzi 160 a 200 μm Koncentrácia stacionárnej fázy 15 až 25 % (m/m) Nosný plyn hélium alebo ak sa toto nedá použiť, vodík s čo najnižším obsahom kyslíka Pomocné plyny žiadne Teplota injektora od 40 do 60 oC nad teplotou kolóny Teplota kolóny 180 až 200 oC Prietok nosného plynu obvykle medzi 60 a 80 ml/min Veľkosť dávkovaného pomeru obvykle medzi 0,5 až 2 μl

►M2 8. ◄ SPRÁVA O VÝSLEDKU TESTU

Správa o výsledku testu vymedzuje metódy používané na prípravu metyl esterov a na plynovo chromatografickú analýzu a dosiahnuté výsledky. Uvedú sa v nej všetky podrobnosti o pracovnom postupe, ktoré neboli spomenuté v tejto medzinárodnej technickej norme alebo sa nepovažovali sa povinné, spolu s podrobnosťami o akomkoľvek sprievodnom jave, ktorý by mohol ovplyvniť výsledky.

Správa o výsledku testu bude zahŕňať všetky informácie potrebné pre úplnú identifikáciu vzorky.

▼M19









ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterificati