2009R0152 — SK — 17.07.2014 — 004.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

►B NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 152/2009 z 27. januára 2009, ktorým sa stanovujú metódy odberu vzoriek a analýzy na účely úradných kontrol krmív (Text s významom pre EHP) (Ú. v. ES L 054, 26.2.2009, p.1)

Zmenené a doplnené:









▼B

NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 152/2009

z 27. januára 2009,

ktorým sa stanovujú metódy odberu vzoriek a analýzy na účely úradných kontrol krmív

(Text s významom pre EHP)







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 z 29. apríla 2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s cieľom zabezpečiť overenie dodržiavania potravinového a krmivového práva a predpisov o zdraví zvierat a o starostlivosti o zvieratá ( 1 ), a najmä na jeho článok 11 ods. 4 písm. a), b) a c), keďže: (1) Na implementáciu smernice 70/373/EHS boli prijaté tieto akty, ktoré zostávajú v platnosti v súlade s článkom 61 ods. 2 nariadenia (ES) č. 882/2004: — prvá smernica Komisie 71/250/EHS z 15. júna 1971, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 2 ), — druhá smernica Komisie 71/393/EHS z 18. novembra 1971, ustanovujúca metódy analýzy na úradnú kontrolu krmív v Spoločenstve ( 3 ), — tretia smernica Komisie 72/199/EHS z 27. apríla 1972 stanovujúca analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 4 ), — štvrtá smernica Komisie 73/46/EHS z 5. decembra 1972, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 5 ), — prvá smernica Komisie 76/371/EHS z 1. marca 1976, ktorou sa určujú metódy Spoločenstva pre odber vzoriek na úradnú kontrolu krmív ( 6 ), — siedma smernica Komisie 76/372/EHS z 1. marca 1976, ktorá ustanovuje analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 7 ), — ôsma smernica Komisie 78/633/EHS z 15. júna 1978, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva pre potreby úradnej kontroly krmív ( 8 ), — deviata smernica Komisie 81/715/EHS z 31. júla 1981, ktorá ustanovuje metódy analýzy na úradnú kontrolu krmív v Spoločenstve ( 9 ), — desiata smernica Komisie 84/425/EHS z 25. júla 1984, ktorá stanovuje metódy analýzy pri úradnej kontrole krmív v Spoločenstve ( 10 ), — smernica Komisie 86/174/EHS z 9. apríla 1986, ktorá stanovuje metódu výpočtu energetickej hodnoty kŕmnej zmesi pre hydinu ( 11 ), — jedenásta Smernica Komisie 93/70/EHS z 28. júla 1993, ktorou sa určujú metódy analýzy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 12 ), — dvanásta smernica Komisie 93/117/ES zo 17. decembra 1993, ktorou sa stanovujú analytické metódy Spoločenstva na úradnú kontrolu krmív ( 13 ), — smernica Komisie 98/64/ES z 3. septembra 1998, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie aminokyselín, olejov a tukov a olaquindoxu v krmivách a ktorou sa mení a dopĺňa smernica 71/393/EHS ( 14 ), — smernica Komisie č. 1999/27/ES z 20. apríla 1999, ktorou sa zavádzajú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie amprólia, diklazurilu a karbadoxu v krmivách a ktorá mení a dopĺňa smernice 71/250/EHS, 73/46/EHS a zrušuje smernica 74/203/EHS ( 15 ), — smernica Komisie 1999/76/ES z 23. júla 1999 stanovujúca analytickú metódu Spoločenstva pre stanovenie lasalocidu sodného v krmivách ( 16 ), — smernica Komisie 2000/45/ES zo 6. júla 2000, ktorou sa ustanovujú analytické metódy Spoločenstva na stanovenie vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách ( 17 ), — smernica Komisie 2002/70/ES z 26. júla 2002, ktorou sa zavádzajú požiadavky na určovanie koncentrácie dioxínov a PCB podobných dioxínom v krmivách ( 18 ), — smernica Komisie 2003/126/ES z 23. decembra 2003 o analytickej metóde na stanovenie zložiek živočíšneho pôvodu na úradnú kontrolu krmiva ( 19 ). (2) Keďže smernica 70/373/EHS bola nahradená nariadením (ES) č. 882/2004, je vhodné nahradiť vykonávacie predpisy k tejto smernici jediným nariadením. Zároveň by sa metódy mali prispôsobiť vývoju vedeckých a technický poznatkov. Metódy, ktoré už nie sú platné pre svoj plánovaný účel, by sa mali vypustiť. Očakáva sa aktualizácia ustanovení o odbere vzoriek v plánovanom čase, pri ktorej sa zohľadní súčasný vývoj v spôsobe výroby, skladovania, prepravy a uvádzania krmiva na trh, napriek tomu je však vhodné dovtedy zachovať súčasné predpisy týkajúce sa odberu vzoriek. (3) Smernice 71/250/EHS, 71/393/EHS, 72/199/EHS, 73/46/EHS, 76/371/EHS, 76/372/EHS, 78/633/EHS, 81/715/EHS, 84/425/EHS, 86/174/EHS, 93/70/EHS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES a 2003/126/ES by sa preto mali zrušiť. (4) Opatrenia ustanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, keďže: PRIJALA TOTO NARIADENIE:







▼M3

Článok 1

Odber vzoriek na účely úradných kontrol krmív, najmä pokiaľ ide o stanovenie zložiek vrátane materiálov, ktoré obsahujú geneticky modifikované organizmy alebo sa skladajú z geneticky modifikovaných organizmov (GMO), alebo sú z nich vyrobené, doplnkových látok definovaných v nariadení Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1831/2003 ( 20 ), nežiaducich látok definovaných v smernici Európskeho parlamentu a Rady 2002/32/ES ( 21 ) sa vykonáva v súlade s metódami stanovenými v prílohe I.

Metóda odberu vzoriek stanovená v prílohe I je uplatniteľná na kontrolu krmív, pokiaľ ide o stanovenie rezíduí pesticídov definované v nariadení Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 396/2005 ( 22 ), a kontrolu súladu s nariadením (EÚ) č. 619/2011.

▼B

Článok 2

Vzorky na analýzu sa pripravujú a výsledky sa vyjadrujú v súlade s metódami stanovenými v prílohe II.

Článok 3

Analýza na účely úradnej kontroly krmív sa vykonáva použitím metód stanovených v prílohe III (metódy analýzy na kontrolu zloženia kŕmnych surovín a kŕmnych zmesí), prílohe IV (metódy analýzy na účely kontroly obsahu povolených doplnkových látok), prílohe V (metódy analýzy na kontrolu nežiaducich látok v krmivách) a prílohe VI (metódy analýzy na určenie zložiek živočíšneho pôvodu na účely úradnej kontroly krmív).

Článok 4

Energetická hodnota kŕmnej zmesi pre hydinu sa vypočíta podľa prílohy VII.

Článok 5

Metódy analýzy na účely kontroly nelegálnej prítomnosti doplnkových látok, ktoré už nie sú povolené, stanovené v prílohe VIII, sa používajú na účely potvrdenia.

Článok 6

Smernice 71/250/EHS, 71/393/EHS, 72/199/EHS, 73/46/EHS, 76/371/EHS, 76/372/EHS, 78/633/EHS, 81/715/EHS, 84/425/EHS, 86/174/EHS, 93/70/EHS, 93/117/ES, 98/64/ES, 1999/27/ES, 1999/76/ES, 2000/45/ES, 2002/70/ES a 2003/126/ES sa zrušujú.

Odkazy na tieto zrušené smernice sa považujú za odkazy na toto nariadenie a vykladajú sa v súlade s tabuľkami zhody v prílohe IX.

Článok 7

Toto nariadenie nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Uplatňuje sa od 26. augusta 2009.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.

▼M3









PRÍLOHA I

METÓDY ODBERU VZORIEK

1. ÚČEL A OBLASŤ

Vzorky určené na úradnú kontrolu krmív sa odoberajú v súlade s metódami opísanými nižšie. Takto získané vzorky sa považujú za reprezentatívne pre vzorkované partie.

Účelom odberu reprezentatívnych vzoriek je získať malý podiel šarže tak, aby stanovenie každej konkrétnej vlastnosti tohto podielu predstavovalo priemernú hodnotu vlastnosti tejto šarže. Šarža sa vzorkuje opakovaným odberom čiastkových vzoriek z jednotlivých miest šarže. Tieto čiastkové vzorky sa spolu zmiešajú tak, aby tvorili súhrnnú vzorku, z ktorej sa reprezentatívnym delením pripravia konečné reprezentatívne vzorky.

Ak partie krmív určené na odber vzoriek preukážu pri vizuálnej kontrole kvalitatívny rozdiel oproti ostatným krmivám z rovnakej šarže, takéto partie sa oddelia od ostatného krmiva a budú sa považovať za samostatnú čiastkovú šaržu. Ak krmivo nemožno rozdeliť na samostatné čiastkové šarže, odoberie sa z neho vzorka ako z jednej šarže. V takýchto prípadoch sa táto skutočnosť uvedie v správe o odbere vzoriek.

Ak sa stanovilo, že krmivo ovzorkované v súlade s ustanoveniami tohto nariadenia nezodpovedá požiadavkám EÚ a je súčasťou šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu, predpokladá sa, že toto zistenie sa týka celého množstva krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú žiadne dôkazy o tom, že zvyšok tejto šarže nezodpovedá požiadavkám EÚ.

2. VYMEDZENIA POJMOV

— Šarža (alebo partia) : je identifikovateľné množstvo krmiva, ktoré má vykazovať jednotné vlastnosti, ako sú napríklad pôvod, druh, typ balenia, baliareň, odosielateľ alebo označenie a v prípade výrobného procesu jednotka vyrobená v jednom zariadení s použitím jednotných výrobných parametrov, alebo viacero takýchto jednotiek, keď sú vyrobené v kontinuálnom poradí a skladované spolu.

— Vzorkovaná partia : šarža alebo identifikovaná časť šarže alebo čiastkovej šarže.

— Zapečatená vzorka : vzorka zapečatená tak, aby nebol možný prístup ku vzorke bez porušenia alebo bez odstránenia pečate.

— Čiastková vzorka : množstvo odobraté z jedného miesta vzorkovanej partie.

— Súhrnná vzorka : súhrn všetkých čiastkových vzoriek odobratých z tej istej vzorkovanej partie.

— Zredukovaná vzorka : časť súhrnnej vzorky získaná reprezentatívnym delením.

— Konečná vzorka : časť zredukovanej vzorky alebo zhomogenizovanej súhrnnej vzorky.

— Laboratórna vzorka : vzorka určená pre laboratórium (v podobe prijatej laboratóriom), pričom môže ísť o konečnú, zredukovanú alebo súhrnnú vzorku.

3. VŠEOBECNÉ USTANOVENIA

— Pracovníci odoberajúci vzorky: vzorky odoberajú pracovníci poverení príslušným orgánom na tento účel.

— Vzorka musí byť zapečatená tak, aby nebol možný prístup ku vzorke bez porušenia alebo bez odstránenia pečate. Značka pečate by mala byť zreteľne rozpoznateľná a jasne viditeľná. Vzorku možno prípadne umiestniť do nádoby, ktorá sa dá uzavrieť tak, aby ju nebolo možné otvoriť bez nezvratného poškodenia nádrže alebo nádoby, čím sa zabráni opätovnému použitiu tejto nádrže alebo nádoby.

— Identifikácia vzorky: vzorka musí byť nezmazateľne označená a musí sa dať identifikovať tak, aby ju bolo možné jednoznačne prepojiť so správou o odbere vzoriek.

— Z každej súhrnnej vzorky sa odoberú najmenej dve konečné vzorky: minimálne jedna vzorka je určená na kontrolu (vymáhanie práva) a jedna je pre prevádzkovateľa krmivárskeho podniku (obhajoba). Jedna konečná vzorka sa prípadne môže odobrať na referenčné účely. V prípade homogenizácie celej súhrnnej vzorky sa konečné vzorky odoberú z homogenizovanej súhrnnej vzorky, pokiaľ takýto postup nie je v rozpore s pravidlami členského štátu, pokiaľ ide o práva prevádzkovateľa krmivárskeho podniku.

4. PRÍSTROJE A POMÔCKY

4.1. Prístroje a pomôcky na odber vzoriek musia byť vyrobené z materiálov, ktoré nemôžu kontaminovať výrobky určené na odber vzoriek. Prístroje a pomôcky, ktoré sú určené na viacnásobné použitie, sa musia dať ľahko vyčistiť, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii.

4.2. Odporúčané vybavenie na odber vzoriek zo suchých krmív 4.2.1. Ručný odber vzoriek 4.2.1.1. Lopatka s plochým dnom a vertikálnymi stranami. 4.2.1.2. Vzorkovacia tyč s dlhou dutinou alebo priehradkami. Rozmery vzorkovacej tyče musia byť primerané vlastnostiam vzorkovanej partie (hĺbka nádoby, rozmery vreca atď.) a veľkosti častíc krmív. V prípade, že má vzorkovacia tyč niekoľko otvorov, by tieto otvory mali byť oddelené pomocou priehradiek alebo by mali byť usporiadané postupne, aby sa zabezpečilo odobratie vzorky na rôznych miestach pozdĺž tyče. 4.2.2. Mechanický odber vzoriek Na odber vzoriek z krmiva v pohybe sa môže používať vhodné mechanické vybavenie. Výraz „vhodné“ znamená, že sa ovzorkuje minimálne celá časť produktu v pohybe. Odber vzoriek z krmiva v pohybe (pri vysokej prietokovej rýchlosti) možno vykonať pomocou automatických vzorkovačov. 4.2.3. Delič vzorky Ak je to možné a vhodné, zariadenie určené na delenie vzorky na približne rovnaké časti by sa malo používať na prípravu zredukovaných vzoriek reprezentatívnym spôsobom.

5. KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA POČTU ČIASTKOVÝCH VZORIEK

— Kvantitatívne požiadavky uvedené v bodoch 5.1 a 5.2 týkajúce sa počtu čiastkových vzoriek sa vzťahujú na veľkosť vzorkovaných partií maximálne do 500 ton, z ktorých možno odoberať vzorky reprezentatívnym spôsobom. Opísaný postup odberu vzoriek platí rovnako aj pre množstvá väčšie, ako je predpísaná maximálna veľkosť vzorkovanej partie, za predpokladu, že sa nezohľadní maximálny počet čiastkových vzoriek stanovený v nižšie uvedenej tabuľke, pričom počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa druhej odmocniny vzorca uvedeného v príslušnej časti postupu (pozri bod 5.3) a minimálna veľkosť súhrnnej vzorky sa úmerne zvýši. To však nebráni tomu, aby sa veľká šarža rozdelila do menších čiastkových šarží a aby sa z každej čiastkovej šarže odobrala vzorka v súlade s postupom opísaným v bodoch 5.1 a 5.2.

— Veľkosť vzorkovanej partie musí byť taká, aby v odobratej vzorke bola prítomná každá zložka krmiva.

— Pri veľmi veľkých šaržách alebo čiastkových šaržách (> 500 ton) a pri šaržách, ktoré sa prepravujú alebo skladujú spôsobom, že nie je možné odobrať vzorku v súlade s postupom odberu vzoriek uvedeným v bodoch 5.1 a 5.2 tejto kapitoly, použije sa postup odoberania vzoriek uvedený v bode 5.3.

— V prípade, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku je podľa právnych predpisov povinný dodržiavať toto nariadenie v rámci systému povinného monitorovania, prevádzkovateľ krmivárskeho podniku sa môže odchýliť od kvantitatívnych požiadaviek stanovených v tejto kapitole na účely zohľadnenia prevádzkových charakteristík pod podmienkou, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku príslušnému orgánu uspokojivo preukázal rovnocennosť postupu odberu vzoriek, pokiaľ ide o reprezentatívnosť, a po schválení zo strany príslušného orgánu.

— Ak vo výnimočných prípadoch nie je možné použiť metódu odberu vzoriek v súvislosti s kvantitatívnymi požiadavkami z dôvodu neprijateľných obchodných následkov vyplývajúcich z poškodenia šarže (v dôsledku foriem balenia, dopravných prostriedkov atď.), môže sa použiť alternatívna metóda odberu vzoriek za predpokladu, že je čo najreprezentatívnejšia a je úplne opísaná a zdokumentovaná.

5.1. Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive

5.1.1. Voľné ložené suché krmivá







Veľkosť vzorkovanej partie Minimálny počet čiastkových vzoriek ≤ 2,5 tony 7 > 2,5 tony √ 20-násobok počtu ton, ktoré tvoria vzorkovanú partiu (1), až do 40 čiastkových vzoriek (1) Ak je získaný počet vyjadrený zlomkom, zaokrúhli sa na najbližšie vyššie celé číslo.

5.1.2. Voľné ložené tekuté krmivá







Veľkosť vzorkovanej partie Minimálny počet čiastkových vzoriek ≤ 2,5 tony alebo ≤ 2 500 litrov 4 (1) > 2,5 tony alebo > 2 500 litrov 7 (1) (1) V prípade, že nie je možné kvapalinu homogenizovať, počet čiastkových vzoriek sa musí zvýšiť.

5.1.3. Balené krmivo

Krmivo (pevné a tekuté) môže byť balené vo vreckách, vrecúškach, plechovkách, nádobách atď., ktoré sú v tabuľke uvedené ako jednotky. Z veľkých jednotiek (≥ 500 kg alebo litrov) sa odber vzoriek musí vykonávať v súlade s ustanoveniami určenými pre voľné ložené krmivá (pozri oddiel 5.1.1 a 5.1.2).







Veľkosť vzorkovanej partie Minimálny počet jednotiek, z ktorých sa musí odobrať (aspoň) jedna čiastková vzorka (1) 1 až 20 jednotiek 1 jednotka (2) 21 až 150 jednotiek 3 jednotky (2) 151 až 400 jednotiek 5 jednotiek (2) > 400 jednotiek ¼ √ počet jednotiek, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (3), až do 40 jednotiek (1) V prípade, keď otvorenie jednotky môže ovplyvniť analýzu (napr. kaziace sa vlhké krmivo), čiastkovou vzorkou musí byť neotvorená jednotka. (2) V prípade jednotiek, ktorých obsah nepresahuje 1 kg alebo jeden liter, čiastkovou vzorkou je obsah jednej pôvodnej jednotky. (3) Ak je získaný počet vyjadrený zlomkom, zaokrúhli sa na najbližšie vyššie celé číslo.

5.1.4. Bloky krmiva a minerálne lizy

Odoberie sa minimálne jeden blok alebo jeden liz na vzorkovanú partiu s počtom 25 jednotiek, najviac však štyri bloky alebo štyri lizy.

V prípade blokov alebo lizov s hmotnosťou najviac 1 kg sa za čiastkovú vzorku považuje obsah jedného bloku alebo jedného lizu.

5.1.5. Objemové krmivá/krmoviny







Veľkosť vzorkovanej partie Minimálny počet čiastkových vzoriek (1) ≤ 5 ton 5 > 5 ton √ 5-násobok počtu ton, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (2), až do 40 čiastkových vzoriek (1) Je známe, že v niektorých situáciách (napr. pri siláži) nie je možné odobrať požadované čiastkové vzorky bez toho, aby došlo k neprijateľnému poškodeniu šarže. V takýchto situáciách možno použiť alternatívnu metódu odberu vzorky a pokyny na odber vzorky z takýchto šarží sa vypracujú do nadobudnutia účinnosti tohto nariadenia. (2) Ak je získaný počet vyjadrený zlomkom, zaokrúhli sa na najbližšie vyššie celé číslo.

5.2. Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v súvislosti s kontrolou zložiek alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive

Tieto kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek sa uplatňujú v týchto situáciách:

— kontrola aflatoxínov, ražného námelu, mykotoxínov a škodlivých botanických nečistôt v kŕmnych surovinách,

— kontrola krížovej kontaminácie niektorou zo zložiek vrátane geneticky modifikovaného materiálu alebo látkou, v prípade ktorej sa v kŕmnych surovinách predpokladá nerovnomerné rozloženie.

V prípade, že má kontrolný orgán silné podozrenie na takéto nerovnomerné rozloženie aj v prípade krížovej kontaminácie niektorou zo zložíek alebo látkou v kŕmnej zmesi, môžu sa uplatniť kvantitatívne požiadavky stanovené v nižšie uvedenej tabuľke.







Veľkosť vzorkovanej partie Minimálny počet čiastkových vzoriek < 80 ton Pozri kvantitatívne požiadavky v bode 5.1. Počet čiastkových vzoriek, ktoré sa musia odobrať, sa musí vynásobiť koeficientom 2,5. ≥ 80 ton 100

5.3. Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v prípade veľmi veľkých šarží

V prípade veľkých vzorkovaných partií (vzorkované partie > 500 ton) sa musí odobrať počet čiastkových vzoriek = 40 čiastkových vzoriek + √ ton v súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive alebo 100 čiastkových vzoriek + √ ton v súvislosti s kontrolou zložiek alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v kŕmnych surovinách.

6. KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA SÚHRNNEJ VZORKY







Vyžaduje sa jedna súhrnná vzorka na vzorkovanú partiu. Charakter krmiva Minimálna veľkosť súhrnnej vzorky (1) (2) 6.1. Voľne ložené krmivá 4 kg 6.2. Balené krmivá: 4 kg (3) 6.3. Tekuté alebo polotekuté krmivá: 4 litre 6.4. Bloky krmiva a minerálne lizy: 6.4.1. Každý s hmotnosťou viac ako 1 kg 4 kg 6.4.2. Každý s hmotnosťou do 1 kg Hmotnosť štyroch pôvodných blokov alebo lizov 6.5. Objemové krmivo/krmoviny 4 kg (4) (1) V prípade, že má vzorkované krmivo vysokú cenu, možno odobrať menšie množstvo súhrnnej vzorky pod podmienkou, že bude opísané a zdokumentované v správe o odbere vzoriek. (2) V súlade s ustanoveniami nariadenia Komisie (EÚ) č. 619/2011 z 24. júna 2011, ktorým sa stanovujú metódy odberu vzoriek a analýzy na účely úradnej kontroly krmív, pokiaľ ide o prítomnosť geneticky modifikovaného materiálu, v prípade ktorého prebieha povoľovacie konanie alebo povolenie ktorého vypršalo (Ú. v. EÚ L 166, 25.6.2011, s. 9), musí súhrnná vzorka na kontrolu prítomnosti geneticky modifikovaného materiálu obsahovať aspoň 35 000 semien/zŕn. To znamená, že v prípade kukurice musí byť veľkosť súhrnnej vzorky aspoň 10,5 kg a v prípade sóje 7 kg. U ostatných semien a zŕn, ako sú jačmeň, proso, ovos, ryža, raž, pšenica a semeno repky olejnej zodpovedá veľkosť súhrnnej vzorky vážiacej 4 kg viac ako 35 000 semenám. (3) V prípade baleného krmiva nemusí byť možné dosiahnuť pri súhrnnej vzorke veľkosť 4 kg v závislosti od veľkosti jednotlivých jednotiek. (4) V prípade, že ide o objemové krmivo alebo krmoviny s nízkou špecifickou hmotnosťou (napr. seno, slama), súhrnná vzorka by mala mať veľkosť minimálne 1 kg.

7. KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA KONEČNÝCH VZORIEK

Konečné vzorky

Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky. Množstvo konečnej vzorky na analýzu nie je menšie ako:







Suché krmivá 500 g (1) (2) (3) Tekuté alebo polotekuté krmivá 500 ml (1) (1) V súlade s ustanoveniami nariadenia Komisie (EÚ) č. 619/2011 musí konečná vzorka na kontrolu prítomnosti geneticky modifikovaného materiálu obsahovať minimálne 10 000 semien/zŕn. To znamená, že v prípade kukurice musí byť veľkosť konečnej vzorky aspoň 3 000 g a v prípade sójových bôbov 2 000 g. U ostatných semien a zŕn, ako sú jačmeň, proso, ovos, ryža, raž, pšenica a semeno repky olejnej zodpovedá veľkosť konečnej vzorky 500 g viac ako 10 000 semenám. (2) V prípade, že veľkosť súhrnnej vzorky je výrazne menšia ako 4 kg alebo litre (pozri poznámku pod čiarou k bodu 6), možno odobrať aj menšie množstvo konečnej vzorky pod podmienkou, že sa opíše a zdokumentuje v správe o odbere vzoriek. (3) V prípade odberu vzoriek zo strukovín, obilných zŕn a orechov na stanovenie rezíduí pesticídov musí byť minimálna veľkosť konečnej vzorky 1 kg v súlade s ustanoveniami smernice Komisie 2002/63/ES (Ú. v. ES L 187, 16.7.2002, s. 30).

8. METÓDA ODBERU VZORIEK PRE VEĽMI VEĽKÉ ŠARŽE ALEBO ŠARŽE USKLADNENÉ ALEBO PREPRAVOVANÉ SPÔSOBOM, PRI KTOROM NIE JE MOŽNÝ ODBER VZORKY Z CELEJ ŠARŽE

8.1. Všeobecné zásady

V prípade, že spôsob prepravy alebo skladovania šarže neumožňuje odobrať čiastkové vzorky z celej šarže, odber vzoriek z takýchto šarží by sa mal prednostne uskutočniť, keď je šarža v pohybe.

V prípade veľkých skladov určených na skladovanie krmiva by prevádzkovatelia mali byť nabádaní k tomu, aby v sklade nainštalovali zariadenie, ktoré umožní (automatický) odber vzoriek z celej uloženej šarže.

V prípade používania postupov odberu vzoriek stanovených v kapitole 8 bude prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca informovaný o postupe odberu vzoriek. V prípade, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca tento postup odberu vzoriek spochybní, prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca umožní príslušnému orgánu odobrať vzorku z celej šarže na svoje náklady.

8.2. Veľké šarže prepravované loďou

8.2.1. Dynamický odber vzoriek z veľkých šarží prepravovaných loďou

Odber vzoriek z veľkých šarží na lodiach sa prednostne vykonáva, keď je produkt v pohybe (dynamický odber vzoriek).

Odber vzoriek sa má uskutočňovať podľa jednotlivých buniek (jednotky nákladného priestoru, ktoré možno fyzicky oddeliť). Bunky sa však vyprázdňujú po častiach jedna po druhej, takže pôvodné fyzické oddelenie už po preprave do skladovacích zariadení neexistuje. Odber vzoriek preto možno uskutočniť na základe pôvodného fyzického oddelenia alebo na základe oddelenia po preprave do skladovacích zariadení.

Vykládka lode môže trvať niekoľko dní. Odber vzoriek sa spravidla musí vykonávať v pravidelných intervaloch počas celého trvania vykládky. Nie je však vždy možné ani vhodné, aby bol pri odbere vzoriek počas celej vykládky prítomný úradný inšpektor. Z toho dôvodu je možné ovzorkovať len časť celej šarže (vzorkovaná partia). Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie.

V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ sa z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

Prítomnosť inšpektora je nevyhnutná aj vtedy, keď sa úradná vzorka odoberá automaticky. V prípade, že sa automatický odber vzoriek vykonáva podľa vopred stanovených parametrov, ktoré počas odberu vzoriek nie je možné zmeniť, a čiastkové vzorky sa zhromažďujú v zapečatenej nádobe, aby sa predišlo prípadnému podvodu, prítomnosť inšpektora je potrebná len na začiatku odberu vzoriek, pri každej výmene nádoby so vzorkami a na konci odberu vzoriek.

8.2.2. Odber vzoriek zo šarží prepravovaných loďou prostredníctvom statického odberu vzoriek

V prípade, že sa odber vzoriek vykonáva staticky, musí sa použiť rovnaký postup ako pre skladovacie zariadenia (silá) prístupné zhora (pozri bod 8.4.1).

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti (zhora) šarže/bunky. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ sa z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.3. Odber vzoriek z veľkých šarží uložených v skladoch

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti šarže. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ sa z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.4. Odber vzoriek zo skladovacích zariadení (síl)

8.4.1. Odber vzoriek zo síl (ľahko) prístupných zhora

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti šarže. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ sa z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.4.2. Odber vzoriek zo síl, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá)

8.4.2.1. Silá, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá) s veľkosťou > 100 ton

Z krmiva skladovaného v takýchto silách sa nemôžu odoberať vzorky statickým spôsobom. Preto v prípade, keď sa musí odobrať vzorka krmiva v sile a keď neexistuje žiadna možnosť presunutia zásielky, musí sa s prevádzkovateľom uzatvoriť dohoda o tom, že bude inšpektora informovať o vyprázdnení sila s cieľom umožniť odber vzorky z krmiva v pohybe.

8.4.2.2. Silá, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá) s veľkosťou < 100 ton

Pri odbere vzoriek sa do nádoby vypustí 50 až 100 kg, z ktorých sa odoberie vzorka. Veľkosť súhrnnej vzorky zodpovedá celej šarži a počet čiastkových vzoriek súvisí s počtom síl vypustených do nádoby na odber vzorky. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ sa z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.5. Odber vzoriek z voľne ložených krmív vo veľkých uzavretých kontajneroch

Z takýchto šarží možno často odobrať vzorky len pri vykládke. V niektorých prípadoch nie je vykládka v čase dovozu alebo kontroly možná, a preto by sa mala vzorka odobrať pri vykladaní takýchto kontajnerov.

9. POKYNY PRE ODBER, PRÍPRAVU A BALENIE VZORIEK

9.1. Všeobecné pokyny

Vzorky sa musia odoberať a pripraviť bez zbytočného odkladu s ohľadom na preventívne opatrenia, ktoré sú potrebné na zabezpečenie toho, aby nedošlo k zámene ani ku kontaminácii produktu. Nástroje, ako aj plochy a nádoby určené na príjem vzoriek musia byť čisté a suché.

9.2. Čiastkové vzorky

Čiastkové vzorky sa musia odobrať náhodne z celej vzorkovanej partie a musia mať približne rovnakú veľkosť.

Veľkosť čiastkovej vzorky je najmenej 100 gramov alebo 25 gramov v prípade objemového krmiva alebo krmovín s nízkou špecifickou hmotnosťou.

V prípade, že podľa pravidiel týkajúcich sa postupu odberu vzoriek stanovených v bode 8 sa musí odobrať menej ako 40 čiastkových vzoriek, veľkosť čiastkových vzoriek sa stanoví na základe požadovanej veľkosti súhrnnej vzorky, ktorá sa má dosiahnuť (pozri bod 6).

V prípade odberu vzoriek z malých šarží baleného krmiva, z ktorých sa podľa kvantitatívnych požiadaviek musí odobrať obmedzený počet čiastkových vzoriek, čiastkovou vzorkou je obsah jednej pôvodnej jednotky, ktorej obsah nepresahuje 1 kg alebo jeden liter.

V prípade odberu vzoriek z balených krmív, ktoré tvoria malé jednotky (napr. < 250 g), závisí veľkosť čiastkovej vzorky od veľkosti jednotky.

9.2.1. Voľne ložené krmivá

Odber vzorky sa môže v prípade potreby vykonať počas pohybu vzorkovanej partie (nakladanie alebo vykladanie).

9.2.2. Balené krmivo

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa kapitoly 5 sa časť obsahu každej jednotky odoberá pomocou tyče alebo lopaty. V prípade potreby sa vzorky odoberú oddelene po vyprázdnení jednotiek.

9.2.3. Homogénne alebo homogenizovateľné tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa kapitoly 5 sa obsah v prípade potreby homogenizuje a z každej jednotky sa odoberie určité množstvo.

Čiastkové vzorky môžu byť odobraté počas vyprázdňovania obsahu jednotky.

9.2.4. Nehomogenizovateľné, tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa kapitoly 5 sa odoberú vzorky z rôznych vrstiev.

Vzorky môžu byť odobraté aj počas vyprázdňovania obsahu, ale prvé frakcie treba odstrániť.

V každom prípade celkový odobratý objem nesmie byť menší ako 10 litrov.

9.2.5. Bloky krmiva a minerálne lizy

Po výbere požadovaného počtu blokov alebo lizov na odber vzoriek podľa kapitoly 5 sa odoberie časť z každého bloku alebo lizu. V prípade podozrenia na nehomogenizovaný blok alebo liz sa ako vzorka môže odobrať celý blok alebo liz.

V prípade blokov alebo lizov s hmotnosťou najviac 1 kg sa za čiastkovú vzorku považuje obsah jedného bloku alebo jedného lizu.

9.3. Príprava súhrnných vzoriek

Čiastkové vzorky sa zmiešajú tak, aby vytvorili jednu súhrnnú vzorku.

9.4. Príprava konečných vzoriek

Súhrnná vzorka sa má dôkladne premiešať ( 23 ).

— Každá vzorka sa vloží do vhodnej nádoby/obalu. Urobia sa všetky potrebné preventívne opatrenia, aby počas prepravy alebo skladovania nedošlo k zmene zloženia vzorky, jej kontaminácii alebo znehodnoteniu.

— V prípade kontroly zložiek alebo látok rovnomerne rozložených v krmive možno súhrnnú vzorku reprezentatívne zredukovať na vzorku s hmotnosťou najmenej 2 kg alebo objemom najmenej 2 litre (zredukovaná vzorka) ( 24 ), a to podľa možnosti pomocou mechanického alebo automatického deliča. Pri kontrole prítomnosti rezíduí pesticídov v strukovinách, obilných zrnách a orechoch je minimálna veľkosť zredukovanej vzorky 3 kg. V prípade, že charakter krmiva neumožňuje použiť delič alebo v prípade, že delič nie je k dispozícii, možno vzorku zredukovať metódou štvrtenia. Zo zredukovaných vzoriek sa pripravia konečné vzorky (na účel kontroly, obhajoby a referencie), a to približne v rovnakom množstve a v súlade s kvantitatívnymi požiadavkami stanovenými v kapitole 7. V prípade kontroly zložiek vrátane geneticky modifikovaného materiálu alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, súhrnná vzorka musí byť: — — úplne homogenizovaná a následne rozdelená do konečných vzoriek, alebo — zredukovaná najmenej na 2 kg alebo 2 litre ( 25 ) pomocou mechanického alebo automatického deliča. Iba v prípade, keď charakter krmiva neumožňuje použiť delič, možno túto vzorku v prípade potreby zredukovať metódou štvrtenia. Na kontrolu prítomnosti geneticky modifikovaného materiálu v rámci nariadenia (EÚ) č. 619/2011 musí zredukovaná vzorka obsahovať najmenej 35 000 semien/zŕn, aby bolo možné získať konečné vzorky na účely kontroly, obrany a referencie pri najmenej 10 000 semenách/zrnách (pozri poznámku pod čiarou (**) v kapitole 6 a poznámku pod čiarou (*) v kapitole 7).

9.5. Balenie vzoriek

Nádoby alebo balenia sa zapečatia a označia tak, aby ich nebolo možné otvoriť bez porušenia pečate. Celé označenie musí byť neoddeliteľnou súčasťou pečate.

9.6. Zasielanie vzoriek do laboratória

Vzorka sa bez zbytočného odkladu zašle do určeného analytického laboratória spolu s informáciami, ktoré analytik potrebuje.

10. ZÁZNAM O ODBERE VZORKY

Z každého odberu vzorky sa musí vypracovať záznam umožňujúci jednoznačnú identifikáciu každej vzorkovanej partie a jej veľkosti.

Tento záznam musí taktiež zahŕňať všetky odchýlky od postupu odberu vzoriek stanoveného v tomto nariadení.

Okrem sprístupnenia záznamu úradnému kontrolnému laboratóriu sa záznam sprístupní prevádzkovateľovi krmivárskeho podniku a/alebo laboratóriu určenému prevádzkovateľom krmivárskeho podniku.









PRÍLOHA II

VŠEOBECNÉ USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA ANALYTICKÝCH METÓD PRE KRMIVÁ

A. PRÍPRAVA VZORIEK NA ANALÝZU

1. Účel

Postupy opísané nižšie sa týkajú prípravy na analýzu vzoriek zasielaných kontrolným laboratóriám po odobratí vzoriek v súlade s ustanoveniami stanovenými v prílohe I.

Laboratórne vzorky musia byť pripravené tak, aby navážené množstvá, ktoré sú uvedené v analytických metódach, boli homogénne a reprezentatívne pre konečné vzorky.

2. Preventívne opatrenia, ktoré sa majú prijať

Postup prípravy vzorky, ktorý sa má dodržiavať, závisí od metód analýzy, ktoré majú byť použité, a od zložiek alebo látok, ktoré sa majú kontrolovať. Preto je mimoriadne dôležité zabezpečiť, aby bol tento postup prípravy vzorky primeraný použitej analytickej metóde a zložkám alebo látkam, ktoré sa majú kontrolovať.

Všetky potrebné kroky pracovného postupu sa musia vykonať takým spôsobom, aby sa v čo najvyššej možnej miere zamedzilo kontaminácii vzorky a zmenám jej zloženia.

Mletie, premiešanie a preosievanie by sa malo vykonať bez zbytočného odkladu s minimálnym vystavením vzorky účinkom vzduchu a svetla. Nemali by sa používať mlynčeky a drviče, ktoré by mohli vzorky značne zahrievať.

Ručné mletie sa odporúča v prípade krmív obzvlášť citlivých na zohriatie. Malo by sa dbať aj na to, aby samotné prístrojové vybavenie nebolo zdrojom kontaminácie.

Ak prípravu nemožno vykonať bez výrazných zmien v obsahu vlhkosti vzorky, je potrebné obsah vlhkosti určiť pred prípravou a po nej podľa metódy stanovenej v časti A prílohy III.

3. Postup

3.1. Všeobecný postup

Testovaný podiel sa odoberie z konečnej vzorky. Delenie metódou kužeľov a štvrtenia sa neodporúča, keďže v jeho dôsledku môžu vzniknúť testované podiely s vysokou pravdepodobnosťou chyby z delenia.

3.1.1. Krmivá, ktoré sa môžu priamo drviť

— Preosiata konečná vzorka sa premieša a vloží sa do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Na zabezpečenie úplnej homogenizácie sa opätovne premieša bezprostredne pred navážením množstva na analýzu (testovaný podiel).

3.1.2. Krmivá, ktoré sa môžu drviť po vysušení

— Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, konečná vzorka sa vysuší tak, aby sa jej vlhkosť znížila na 8 až 12 %, v súlade s postupom na predsušenie opísaným v bode 4.3 metódy na stanovenie vlhkosti uvedenej v časti A prílohy III. Ďalej sa postupuje podľa oddielu 3.1.1.

3.1.3. Tekuté alebo polotekuté krmivá

— Konečná vzorka sa vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Na zabezpečenie úplnej homogenizácie sa opätovne premieša bezprostredne pred navážením množstva na analýzu (testovaný podiel).

3.1.4. Iné krmivá

— Konečné vzorky, ktoré sa nedajú pripraviť v súlade s jedným z uvedených postupov, by sa mali upraviť akýmkoľvek iným postupom, ktorým sa zabezpečí, že množstvá navážené na analýzu (testovaný podiel) budú homogénne a reprezentatívne pre konečné vzorky.

3.2. Osobitný postup v prípade preskúmania prostredníctvom vizuálnej kontroly alebo mikroskopu, alebo v prípade, keď je celá súhrnná vzorka homogenizovaná

— V prípade preskúmania prostredníctvom vizuálnej kontroly (bez použitia mikroskopu) sa na preskúmanie použije celá laboratórna vzorka.

— V prípade preskúmania pod mikroskopom môže laboratórium zredukovať súhrnnú vzorku alebo zredukovanú vzorku ešte viac zmenšiť. Konečné vzorky na účely obhajoby, prípadne na referenčné účely, sa odoberajú na základe postupu, ktorý je rovnaký ako postup pri konečnej vzorke na účely kontroly.

— V prípade homogenizácie celej súhrnnej vzorky sa konečné vzorky odoberú z homogenizovanej súhrnnej vzorky.

4. Uskladnenie vzoriek

Vzorky sa musia skladovať pri teplote, ktorá nespôsobí zmeny v ich zložení. Vzorky určené na analýzu vitamínov alebo látok, ktoré sú mimoriadne citlivé na svetlo, sa uskladňujú pri takých podmienkach, aby vzorka nebola vystavená negatívnym účinkom svetla.

B. USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA CHEMIKÁLIÍ A PRÍSTROJOVÉHO VYBAVENIA POUŽÍVANÝCH PRI ANALYTICKÝCH METÓDACH

1. Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, všetky chemikálie musia byť analyticky čisté (p.a.). Pri analýze mikroprvkov sa čistota chemikálií musí kontrolovať slepým pokusom. Na základe dosiahnutých výsledkov sa môže vyžadovať ďalšie prečistenie chemikálií.

2. Akýkoľvek krok pracovného postupu zahŕňajúci prípravu roztokov, riedenie, preplachovanie alebo premývanie, uvedený v analytických metódach bez uvedenia použitého rozpúšťadla alebo riediacej kvapaliny znamená, že sa musí použiť voda. Všeobecne platí, že voda musí byť demineralizovaná alebo destilovaná. V konkrétnych prípadoch, ktoré sú uvedené v analytických metódach, sa musí osobitne prečistiť.

3. Vzhľadom na zariadenie bežných kontrolných laboratórií sa pri analytických metódach uvádzajú len špeciálne nástroje a prístrojové vybavenie, alebo také, ktoré vyžadujú osobitné používanie. Musia byť čisté, najmä vtedy, keď ide o stanovenie veľmi malých množstiev látok.

C. POUŽITIE ANALYTICKÝCH METÓD A VYJADRENIE VÝSLEDKOV

1. Extrakčný postup

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické extrakčné postupy. Vo všeobecnosti platí, že iné extrakčné postupy ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý extrakčný postup má rovnakú extrakčnú účinnosť na analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

2. Postup čistenia

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické postupy čistenia. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy čistenia ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý postup čistenia má rovnaké analytické výsledky pre analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

3. Počet stanovení

Ak je pri analýze nežiaducich látok výsledok prvého stanovenia výrazne (> 50 %) nižší ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia, ak sa použijú vhodné postupy na určenie kvality. V ostatných prípadoch je na vylúčenie možnosti vnútornej krížovej kontaminácie alebo náhodného pomiešania vzoriek potrebná dvojnásobná analýza (druhé stanovenie). Na overenie súladu sa použije stredná hodnota týchto dvoch stanovení s prihliadnutím na neistotu merania.

Ak pri kontrole deklarovaného obsahu látky alebo zložky výsledok prvého stanovenia potvrdí deklarovaný obsah, t. j. ak analytický výsledok spadá do rozsahu prijateľnej odchýlky od deklarovaného obsahu, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia za podmienky, že sa použijú vhodné postupy na kontrolu kvality. V ostatných prípadoch je na vylúčenie možnosti vnútornej krížovej kontaminácie alebo náhodného pomiešania vzoriek potrebná dvojnásobná analýza (druhé stanovenie). Na overenie súladu sa použije stredná hodnota týchto dvoch stanovení s prihliadnutím na neistotu merania.

V niektorých prípadoch sa tento prijateľný rozsah odchýlky definuje v právnych predpisoch, ako napr. v nariadení Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009 z 13. júla 2009 o uvádzaní krmív na trh a ich používaní, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1831/2003 a ktorým sa zrušujú smernica Rady 79/373/EHS, smernica Komisie 80/511/EHS, smernice Rady 82/471/EHS, 83/228/EHS, 93/74/EHS, 93/113/ES a 96/25/ES a rozhodnutie Komisie 2004/217/ES ( 26 ).

4. Správa o použitej metóde analýzy

Správa o analýze musí obsahovať informácie o použitej metóde analýzy.

5. Správa o analytickom výsledku

Analytický výsledok sa vyjadruje spôsobom, ktorý je uvedený v analytickej metóde, príslušným počtom platných číslic a podľa potreby sa koriguje vzhľadom na obsah vlhkosti v konečnej vzorke pred prípravou.

6. Neistota merania a miera návratnosti v prípade analýzy nežiaducich látok

Pokiaľ ide o nežiaduce látky v zmysle smernice 2002/32/ES, produkt určený ako krmivo pre zvieratá sa považuje za nevyhovujúci z hľadiska najvyššieho prípustného obsahu, ak sa na základe analytického výsledku, ktorý sa týka krmiva s obsahom vlhkosti 12 %, najvyšší prípustný obsah pokladá za prekročený, pričom sa zohľadňuje rozšírená neistota merania a korekcia vzhľadom na návratnosť. Na posúdenie zhody sa používa analyzovaná koncentrácia korigovaná vzhľadom na návratnosť a po odpočítaní rozšírenej neistoty merania. Tento postup sa používa len v prípadoch, keď analytická metóda umožňuje odhad neistoty merania a korekcie vzhľadom na návratnosť (nie je možné ho použiť napr. v prípade mikroskopickej analýzy).

Správa o analytickom výsledku sa podáva takto (pokiaľ používaná analytická metóda umožňuje odhadnúť neistotu merania a mieru návratnosti):

a) korigovaný vzhľadom na návratnosť s uvedením miery návratnosti. Korekcia vzhľadom na návratnosť nie je potrebná v prípade, že miera návratnosti je v rozmedzí 90 – 110 %;

b) ako „x +/– U“, kde x je analytický výsledok a U je rozšírená neistota merania, pričom sa použije koeficient pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti.

Ak je však výsledok analýzy výrazne nižší (> 50 %) ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, a za podmienky, že sa uplatňujú vhodné postupy na kontrolu kvality, a ak analýzy slúžia len na účely kontroly dodržania právnych ustanovení, môže sa podať správa o analytickom výsledku bez korekcie vzhľadom na návratnosť, a miera návratnosti, ako aj neistota merania sa v týchto prípadoch môžu zo správy vynechať.

▼B









PRÍLOHA III

ANALYTICKÉ METÓDY NA KONTROLU ZLOŽENIA KŔMNYCH SUROVÍN A KŔMNYCH ZMESÍ

A. STANOVENIE VLHKOSTI

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie vlhkosti v krmivách. V prípade, že krmivo obsahuje prchavé látky, ako napr. organické kyseliny, treba si uvedomiť, že spolu s vlhkosťou sa stanoví aj značné množstvo prchavých látok.

Táto metóda sa nevzťahuje na analýzu mliečnych výrobkov ako kŕmnych surovín, analýzu minerálnych látok a zmesí zložených predovšetkým z minerálnych látok, analýzu živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, ani na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov.

2. Podstata metódy

Vzorka sa vysuší za špecifikovaných podmienok, ktoré sa líšia podľa druhu krmiva. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. V prípade krmív tuhého skupenstva, ktoré majú vysoký obsah vlhkosti, je potrebné ich predsušenie.

3. Prístrojové vybavenie

3.1. Mlynček z materiálu, ktorý neabsorbuje vlhkosť, ľahko sa čistí, umožňuje rýchle mletie bez vytvárania znateľného tepla, v najvyššej možnej miere zamedzuje kontaktu s okolitým vzduchom a spĺňa požiadavky uvedené nižšie v bodoch 4.1.1 a 4.1.2 (napr. kladivkové alebo vodou chladené mikromlynčeky, rozoberateľné kužeľové mlynčeky, nízkootáčkové mlynčeky alebo mlynčeky s ozubenými kolesami).

3.2. Analytické váhy s presnosťou na 1 mg.

3.3. Suché vysúšačky z nehrdzavejúceho kovu alebo skla s vrchnákmi zaručujúcimi vzduchotesné uzatvorenie; s pracovným povrchom, na ktorom je možné rozprestrieť skúšobnú vzorku vo vrstve približne 0,3 g/m2.

3.4. Elektricky vyhrievaná izotermická sušiareň (± 2 oC), primerane vetraná, s možnosťou rýchlej regulácie teploty ( 27 ).

3.5. Nastaviteľná elektricky vyhrievaná vákuová sušiareň vybavená olejovým čerpadlom a buď mechanizmom na vpúšťanie horúceho suchého vzduchu, alebo sušiacou látkou (napr. oxid vápenatý).

3.6. Exsikátor s hrubou perforovanou kovovou alebo porcelánovou platňou obsahujúci účinnú sušiacu látku.

4. Postup

Poznámka: Postupy opísané v tomto oddiele sa musia vykonať ihneď po otvorení balení so vzorkami. Analýza sa musí vykonať aspoň dvakrát.

4.1. Príprava

4.1.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.1.2 a 4.1.3

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Ak je potrebné, rozmeľte alebo rozdeľte ju takým spôsobom, aby sa zamedzilo akejkoľvek odchýlke v obsahu vlhkosti (pozri bod 6).

4.1.2. Obilniny a obilné krúpy

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Pomeľte na častice, z ktorých najmenej 50 % prejde sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm, a zvyšok, ktorý zostane na site s okrúhlymi okami s veľkosťou 1 mm, bude najviac 10 %.

4.1.3. Krmivá v tekutej alebo pastovitej forme, krmivá prevažne zložené z olejov a tukov

Odoberte približne 25 g vzorky, odvážte s presnosťou na 10 mg, pridajte primerané množstvo bezvodého piesku odváženého s presnosťou na 10 mg a miešajte, až kým sa nezíska homogénny produkt.

4.2. Sušenie

4.2.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.2.2 a 4.2.3

Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 1 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 103 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorka sa suší štyri hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 103 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) počas 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

Krmivá zložené prevažne z olejov a tukov sušte v sušiarni ešte ďalších 30 minút pri teplote 130 oC. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.2.2. Obilniny, múka, krúpy a šrot

Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g rozdrvenej vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 130 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorku nechajte sušiť dve hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 130 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

4.2.3. Kŕmna zmes obsahujúca viac ako 4 % sacharózy alebo laktózy: kŕmne suroviny ako napr. svätojánsky chlieb, hydrolyzované obilninové produkty, slad, sušené repné rezky, šťavy z rýb a cukru; kŕmne zmesi obsahujúce viac ako 25 % minerálnych solí vrátane vody z kryštalizácie. Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vysúšačku bez vrchnáka vložte do vákuovej sušiarne (3.5) predhriatej na teplotu medzi 80 oC a 85 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, nádobu do nej vložte čo najrýchlejšie. Nastavte tlak na 100 torrov a nechajte pri tomto tlaku sušiť štyri hodiny, buď pod prúdom horúceho suchého vzduchu alebo použite sušiaci prostriedok (približne 300 g na 20 vzoriek). V prípade použitia sušiacej látky odpojte vákuové čerpadlo po dosiahnutí predpísaného tlaku. Čas sušenia počítajte od momentu, keď sa teplota v sušiarni vráti na hodnotu od 80 oC do 85 oC. Opatrne upravte atmosférický tlak v sušiarni na pôvodnú hodnotu. Potom ju otvorte, ihneď na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. Sušte ďalších 30 minút vo vákuovej sušiarni pri teplote od 80 oC to 85 oC a opäť odvážte. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.3. Predsušenie

4.3.1. Krmivá iné ako krmivá patriace pod bod 4.3.2

Krmivá tuhého skupenstva s vysokým obsahom vlhkosti, ktoré spôsobujú problémy pri mletí, sa musia predsušiť podľa nasledujúceho postupu:

Navážte 50 g nerozdrvenej vzorky s presnosťou na 10 mg (lisované alebo zhrudkované krmivá sa môžu v prípade potreby rozdrviť nahrubo) vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte sušiť v sušiarni pri teplote od 60 oC to 70 oC, až kým sa vlhkosť nezníži na 8 % až 12 %. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 1 hodiny vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.1 a vysušte podľa bodu 4.2.1 alebo 4.2.3 podľa druhu krmiva.

4.3.2. Obilniny

Obilné zrná s obsahom vlhkosti vyšším ako 17 % sa musia predsušiť, a to nasledujúcim postupom:

Navážte 50 g nerozdrvených zŕn s presnosťou na 10 mg vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte v sušiarni 5 až 7 minút sušiť pri teplote 130 oC. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 2 hodín vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.2 a vysušte podľa bodu 4.2.2.

5. Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento zo vzorky sa vypočíta podľa tejto rovnice:

5.1. Sušenie bez predsušenia

kde:

m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,

m0 = hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.2. Sušenie s predsušením

kde:

m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,

m1 = hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch po predsušení,

m2 = hmotnosť skúšobnej vzorky po rozdrvení alebo pomletí v gramoch,

m0 = hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.3. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % absolútnej hodnoty vlhkosti.

6. Poznámky

Ak vzorku treba upraviť drvením a ak sa zdá, že táto úprava zmení obsah vlhkosti produktu, výsledky analýzy zložiek krmív sa musia upraviť na základe obsahu vlhkosti vzorky v jej pôvodnom stave.

B. STANOVENIE VLHKOSTI V ŽIVOČÍŠNYCH A RASTLINNÝCH TUKOCH A OLEJOCH

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch.

2. Podstata metódy

Vzorka je vysušená na konštantnú hmotnosť (úbytok hmotnosti medzi dvoma za sebou nasledujúcimi váženiami musí byť ≤ 1 mg) pri teplote 103 oC. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením.

3. Prístrojové vybavenie

3.1. Miska s plochým dnom z nehrdzavejúceho materiálu s priemerom 8 až 9 cm a výškou približne 3 cm.

3.2. Teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 oC do najmenej 110 oC a s dĺžkou približne 10 cm.

3.3. Pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa.

3.4. Exsikátor obsahujúci účinnú sušiacu látku.

3.5. Analytické váhy.

4. Postup

Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g zhomogenizovanej vzorky do suchej odváženej misky (3.1), v ktorej sa nachádza teplomer (3.2). Zohrejte na pieskovom kúpeli alebo vyhrievacej platni (3.3), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 oC za približne 7 minút.

Znížte intenzitu ohrevu pozorujúc frekvenciu akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 oC. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny.

S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 oC ± 2 oC, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 oC. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (3.4) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi za sebou nasledujúcimi váženiami nebude menší ako 2 mg.

Poznámka: Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne pred tým, ako začala hmotnosť stúpať.

5. Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento vzorky, je daný nasledujúcim vzorcom:

kde:

m = počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,

m1 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom pred zohrievaním,

m2 = hmotnosť misky v gramoch s obsahom po zohriatí.

Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako „menej ako 0,05 %“.

Opakovateľnosť

Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,05 % v absolútnej hodnote.

C. STANOVENIE OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTOK

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok na základe obsahu dusíka stanoveného podľa Kjeldahlovej metódy.

2. Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa zalkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného.

Uvoľnený amoniak sa eventuálne oddestiluje do prebytku roztoku kyseliny boritej, po čom nasleduje titrácia roztokom kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej.

3. Chemikálie

3.1. Síran draselný.

3.2. Katalyzátor: oxid meďnatý (II) CuO alebo pentahydrát síranu meďnatého (II), CuSO4 5H2 O.

3.3. Granulovaný zinok.

3.4. Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Indikátor metylčerveň; rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = 95 – 96 % (v/v).

3.9. Roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná.

3.13. Acetanilid (b.t. = 114 oC, N-obsah = 10,36 %).

3.14. Sacharóza (bez dusíka).

3.15. Kyselina boritá (H3BO3).

3.16. Indikátorový roztok metylčervene: rozpustite 100 mg metylčervene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.17. Roztok bromkrezolovej zelene: rozpustite 100 mg bromkrezolovej zelene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.18. Roztok kyseliny boritej (10 g/l až 40 g/l v závislosti od použitého prístrojového vybavenia) Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, do roztokov kyseliny boritej sa musia pridať indikátory metylčerveň a bromkrezol. Ak sa pripravuje 1 liter kyseliny boritej, pred úpravou objemu sa pridá 7 ml indikátorového roztoku metylčervene (3.16) a 10 ml roztoku bromkrezolovej zelene (3.17). V závislosti od použitej vody sa môže pH jednotlivých roztokov kyseliny boritej líšiť. Často je potrebná úprava pomocou malého objemu zásaditej látky tak, aby sme získali vhodné pH. Poznámka: Pridanie cca 3 až 4 ml NaOH (3.11) do 1 litra 10 g/l kyseliny boritej je zvyčajne dobrou metódou úpravy. Roztok skladujte pri izbovej teplote a počas skladovania ho chráňte pred svetlom a zdrojom amoniakových výparov.

3.19 Štandardný odmerný roztok kyseliny chlorovodíkovej c(HCL) = 0,10 mol/l. Poznámka: Možno použiť aj iné koncentrácie odmerných roztokov (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), ak sa to zohľadní pri výpočtoch. Koncentrácie by sa vždy mali vyjadriť s presnosťou na štyri desatinné miesta.

4. Prístrojové vybavenie

Prístrojové vybavenie je vhodné na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy.

5. Postup

5.1. Mineralizácia

Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (3.1), vhodné množstvo katalyzátora (3.2) [0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého (II) alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého (II)], 25 ml kyseliny sírovej (3.4) a v prípade potreby niekoľko granúl pemzy (3.12) a premiešajte.

Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich.

Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť.

5.2. Destilácia

Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom v prípade potreby pridajte niekoľko granúl zinku (3.3). Postupujte podľa bodov 5.2.1 alebo 5.2.2.

5.2.1. Destilácia do kyseliny sírovej

Do zachytávacej banky destilačného prístroja dajte presne odmerané množstvo 25 ml kyseliny sírovej (3.5) alebo (3.7) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (3.8).

Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku 8.1). Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku.

5.2.2. Destilácia do kyseliny boritej

V prípade manuálnej titrácie amoniakového obsahu destilátu sa uplatňuje nižšie opísaný postup. V prípade, že destilačná jednotka je plne automatizovaná a zahŕňa titráciu amoniakového obsahu destilátu, dodržiavajte pokyny pre prevádzku destilačnej jednotky.

Umiestnite zachytávaciu banku s obsahom 25 až 30 ml roztoku kyseliny boritej (3.18) pod otvor chladiča tak, že vývod chladiča je ponorená pod hladinu roztoku kyseliny boritej, ktorá je v prebytku. Prispôsobte destilačnú jednotku na dávkovanie 50 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9). S destilačnou jednotkou pracujte podľa pokynov výrobcu a destilujte amoniak uvoľnený pridaním roztoku hydroxidu sodného. Zachytávajte destilát do zachytávacieho roztoku kyseliny boritej. Množstvo destilátu (doba parnej destilácie) závisí od množstva dusíka vo vzorke. Dodržujte pokyny výrobcu.

Poznámka: V poloautomatickej destilačnej jednotke sa dopĺňanie zvyšného hydroxidu sodného a parná destilácia vykonávajú automaticky.

5.3. Titrácia

Postupujte podľa bodu 5.3.1 alebo 5.3.2.

5.3.1. Kyselina sírová

Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke s roztokom hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej až do dosiahnutia bodu ekvivalencie.

5.3.2. Kyselina boritá

Titrujte obsah zachytávacej banky so štandardným odmerným roztokom kyseliny chlorovodíkovej (3.19) alebo štandardným odmerným roztokom kyseliny sírovej (3.6) použitím byrety a prečítajte množstvo použitého titračného roztoku.

Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, bod ekvivalencie sa dosiahne pri prvom sfarbení obsahu na ružovo. Odčítajte objem byrety s presnosťou na 0,05 ml. Bod ekvivalencie možno lepšie vidieť, ak sa použije osvietená magnetická platňa na miešanie alebo fotometrický detektor.

Tento postup možno vykonať automaticky použitím parného destilátora s automatickou titráciou.

Pri prevádzke špecifického destilátora alebo destilátora/titrátora dodržiavajte pokyny výrobcu.

Poznámka: Pri použití automatického titračného systému sa titrácia začína hneď po začatí destilácie a použije sa 1 % roztok kyseliny boritej (3.18). Pri použití plne automatickej destilačnej jednotky sa automatická titrácia amoniaku môže vykonať aj pomocou detekcie bodu ekvivalencie použitím potenciometrického pH systému. V tomto prípade sa použije automatický titrátor s pH-metrom. Tento pH-meter má byť správne nakalibrovaný v rozsahu pH od 4 do 7 podľa bežných laboratórnych postupov týkajúcich sa kalibrácie pH. Bod ekvivalencie titrácie pH sa dosiahne pri hodnote pH 4,6, pričom ide o bod obratu na titračnej krivke (inflexný bod).

5.4. Slepý pokus

Vykonajte slepý pokus, ktorým sa potvrdí, že chemikálie neobsahujú dusík (mineralizáciou, destiláciou a titráciou), s použitím 1 g sacharózy (3.14) namiesto vzorky.

6. Výpočet výsledkov

Výpočty sa robia podľa bodu 6.1 alebo 6.2.

6.1. Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.1

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

V0 = objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri slepom pokuse,

V1 = objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri titrácii vzorky,

c = koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11),

m = hmotnosť (g) vzorky.

6.2. Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.2

6.2.1. Titrácia s kyselinou chlorovodíkovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m = hmotnosť (g) skúšobnej vzorky,

c = koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.19),

V0 = objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej pri slepom pokuse,

V1 = objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej na skúšobnú vzorku.

6.2.2. Titrácia s kyselinou sírovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m = hmotnosť (g) skúšobnej vzorky,

c = koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny sírovej (3.6),

V0 = objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej pri slepom pokuse,

V1 = objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej na skúšobnú vzorku.

7. Overenie metódy

7.1. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

— 0,2 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok nižší ako 20 %,

— 1,0 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah dusíkatých látok od 20 % do 40 %,

— 0,4 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok vyšší ako 40 %.

7.2. Správnosť

Vykonajte analýzu (mineralizáciu, destiláciu a titráciu) na 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.13) v prítomnosti 1 g sacharózy (3.14); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (3.5). Návratnosť musí byť aspoň 99 %.

8. Poznámky

8.1. Prístrojové vybavenie môže byť manuálne, poloautomatické a automatické. Ak si vybavenie vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez toho, aby došlo k stratám. Ak zachytávacia banka destilačného prístroja nie je vybavená prikvapkávacím lievikom, pridajte bezprostredne pred jej pripojením na chladič hydroxid sodný pomalým prilievaním kvapaliny po stene banky.

8.2. Ak zmineralizovaná látka stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (3.4) ako je množstvo uvedené vyššie.

8.3. Pri produktoch s nižším obsahom dusíka možno v prípade potreby objem kyseliny sírovej (3.7) pridávanej do zachytávacej banky znížiť na 10 alebo 15 ml a doplniť vodou na 25 ml.

8.4. Pri rutinnej analýze sa na stanovenie dusíkatých látok môžu použiť alternatívne metódy, no referenčnou metódou je Kjeldahlova metóda opísaná v časti C. Ekvivalencia výsledkov získaných alternatívnou metódou (napr. DUMAS) v porovnaní s referenčnou metódou sa musí dokázať samostatne pri každej matrici. Keďže výsledky získané alternatívnou metódou sa môžu aj v prípade overenia ekvivalencie nepatrne odchyľovať od výsledkov získaných referenčnou metódou, je potrebné v správe o analýze uviesť metódu analýzy použitú pri stanovení dusíkatých látok.

D. STANOVENIE MOČOVINY

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu močoviny v krmivách.

2. Podstata metódy

Vzorka sa rozmieša vo vode s číriacim činidlom. Suspenzia sa prefiltruje. Obsah močoviny vo filtráte sa stanovuje po pridaní 4-dimetylaminobenzaldehydu (4-DMAB) zmeraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 420 nm.

3. Chemikálie

3.1. Roztok 4-dimetylaminobenzaldehydu: rozpustite 1,6 g 4-DMAB v 100 ml 96 % etanolu a pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (ρ201,19 g/ml). Túto chemikáliu možno uchovávať maximálne dva týždne.

3.2. Carrezovo činidlo I: Rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého, Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.3. Carrezovo činidlo II: Rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4. Aktívne uhlie, ktoré neabsorbuje močovinu (je potrebné skontrolovať).

3.5. Močovina, 0,1 % roztok (w/v).

4. Prístrojové vybavenie

4.1. Mixér (trepačka): Približne 35 až 40 ot/min.

4.2. Skúmavky: 160 × 16 mm so zábrusovými zátkami.

4.3. Spektrofotometer.

5. Postup

5.1. Analýza vzorky

Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia (3.4) do 500 ml odmernej banky. Pridajte 400 ml vody a 5 ml Carrezovho činidla I (3.2), miešajte približne 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.3). Miešajte 30 minút v trepačke. Doplňte objem vodou, potrepte a prefiltrujte.

Odoberte 5 ml z číreho bezfarebného filtrátu do skúmaviek so zábrusovými zátkami, pridajte 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a premiešajte. Skúmavky umiestnite do vodného kúpeľa s teplotou 20 oC (+/– 4 oC). Po pätnástich minútach zmerajte absorbanciu roztoku vzorky pomocou spektrofotometra pri 420 nm. Porovnajte so slepým pokusom z použitých chemikálií.

5.2. Kalibračná krivka

Odoberte objemy 1, 2, 4, 5 a 10 ml z roztoku močoviny (3.5), vložte každý do jednej 100 ml odmernej banky a doplňte objem vodou. Odoberte z každého roztoku 5 ml, pridajte do každého 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1), zhomogenizujte a zmerajte absorbanciu podľa vyššie uvedeného postupu porovnaním s kontrolným roztokom obsahujúcim 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Zakreslite kalibračnú krivku.

6. Výpočet výsledkov

Množstvo močoviny vo vzorke sa stanoví pomocou kalibračnej krivky.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

7. Poznámky

7.1. V prípade, že obsah močoviny presahuje 3 %, zredukujte vzorku na 1 g alebo rozrieďte pôvodný roztok tak, aby v 500 ml nebolo viac ako 50 mg močoviny.

7.2. V prípade nízkeho obsahu močoviny vzorku zväčšite až dovtedy, kým filtrát zostane číry a bezfarebný.

7.3. Ak vzorka obsahuje dusíkaté zlúčeniny, ako sú aminokyseliny, absorbanciu treba merať pri 435 nm.

E. STANOVENIE PRCHAVÝCH DUSÍKATÝCH LÁTOK

I. MIKRODIFÚZIOU

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok v krmivách vyjadrených ako amoniak.

2. Podstata metódy

Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sú vytesnené mikrodifúziou s použitím roztoku uhličitanu draselného, zachytené v roztoku kyseliny boritej a titrované kyselinou sírovou.

3. Chemikálie

3.1. Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2. Indikátor: Rozpustite 33 mg bromkrezolovej zelene a 65 mg metylčervene v 100 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu.

3.3. Roztok kyseliny boritej: v odmernej banke s objemom 1 liter rozpustite 10 g kyseliny boritej v 200 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu a 700 ml vody. Pridajte 10 ml indikátora (3.2). Premiešajte a v prípade potreby upravte farbu roztoku na bledočervenú pridaním roztoku hydroxidu sodného. V 1 ml tohto roztoku sa zachytí najviac 300 μg NH3.

3.4. Nasýtený roztok uhličitanu draselného: Rozpustite 100 g uhličitanu draselného v 100 ml vriacej vody. Nechajte vychladnúť a prefiltrujte.

3.5. Kyselina sírová, 0,01 mol/liter.

4. Prístrojové vybavenie

4.1. Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

4.2. Sklenené alebo plastové Conwayove misky (pozri diagram).

4.3. Mikrobyrety delené na 1/100 ml.

5. Postup

Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte 30 minút v trepačke. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte vodou na celkový objem, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter.

Použitím pipety dajte 1 ml roztoku kyseliny boritej (3.3) do stredu Conwayovej misky a 1 ml filtrátu vzorky do medzikružia misky. Čiastočne prikryte vazelínou natretým vrchnákom. Rýchlo prikvapnite 1 ml nasýteného roztoku uhličitanu draselného (3.4) do medzikružia misky a vzduchotesne uzatvorte vrchnákom. Opatrne otáčajte misku v horizontálnej polohe tak, aby sa zmiešali obe chemikálie. Nechajte inkubovať aspoň štyri hodiny pri laboratórnej teplote alebo hodinu pri teplote 40 oC.

Použitím mikrobyrety (4.3) titrujte prchavé látky v roztoku kyseliny boritej s kyselinou sírovou (3.5).

Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať.

6. Výpočet výsledkov

1 ml H2SO40,01 mol/liter zodpovedá 0,34 mg amoniaku.

Vyjadrite výsledok ako percento zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

— 10 % v relatívnej hodnote pre obsah amoniaku nižší ako 1,0 %,

— 0,1 % v absolútnej hodnote pre obsah amoniaku 1,0 % alebo viac.

7. Poznámky

Ak obsah amoniaku vo vzorke presiahne 0,6 %, pôvodný filtrát rozrieďte.

CONWAYOVE MISKY

Mierka 1/1

II. DESTILÁCIOU

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok, vyjadrených ako amoniak, v rybej múčke, ktorá prakticky neobsahuje močovinu. Používa sa len pri obsahu amoniaku nižšom ako 0,25 %.

2. Podstata metódy

Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sa vytesnia pri bode varu pridaním oxidu horečnatého a zachytia v špecifikovanom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa spätne titruje s roztokom hydroxidu sodného.

3. Chemikálie

3.1. Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2. Oxid horečnatý.

3.3. Emulzia proti peneniu (napr. silikón).

3.4. Kyselina sírová, 0,05 mol/liter.

3.5. Roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/liter.

3.6. Roztok metylčervene 0,3 % v 95 % – 96 % (v/v) etanole.

4. Prístrojové vybavenie

4.1. Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

4.2. Kjeldahlov destilačný prístroj.

5. Postup

Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju spolu so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte v trepačke 30 minút. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte objem vodou, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter.

Odoberte čistý filtrát v množstve primeranom predpokladanému obsahu prchavých dusíkatých látok (100 ml je zvyčajne vhodné množstvo). Rozrieďte na 200 ml a pridajte 2 g oxidu horečnatého (3.2) a niekoľko kvapiek emulzie proti peneniu (3.3). Roztok musí reagovať na lakmusový papier zásadito; v opačnom prípade pridajte trochu oxidu horečnatého (3.2). Postupujte podľa bodov 5.2 a 5.3 analytickej metódy na stanovenie obsahu dusíkatých látok (časť C tejto prílohy).

Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať.

6. Výpočet výsledkov

1 ml H2SO40,05 mol/liter zodpovedá 1,7 mg amoniaku.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % amoniaku v relatívnej hodnote.

F. STANOVENIE AMINOKYSELÍN (OKREM TRYPTOFÁNU)

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie voľných (syntetických a prírodných) a celkových (viazaných peptidickou väzbou a voľných) aminokyselín v krmivách s použitím analyzátora aminokyselín. Je použiteľná pre tieto aminokyseliny: cysteín (cystín), metionín, lyzín, treonín, alanín, arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutámovú, glycín, histidín, izoleucín, leucín, fenylalanín, prolín, serín, tyrozín a valín.

Táto metóda nedokáže rozlíšiť soli aminokyselín a nedokáže diferencovať medzi D a L formami aminokyselín. Neplatí pre stanovenie tryptofánu alebo hydroxyanalógov aminokyselín.

2. Podstata metódy

2.1. Voľné aminokyseliny

Voľné aminokyseliny sa extrahujú zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu vyextrahované dusíkové makromolekuly sa vyzrážajú kyselinou sulfosalicylovou a odstránia sa filtráciou. Hodnota pH prefiltrovaného roztoku sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm.

2.2. Celkové aminokyseliny

Zvolený postup závisí od aminokyselín, ktoré sa majú skúmať. Cysteín (cystín) a metionín sa musia pred hydrolýzou zoxidovať na kyselinu cysteovú a metionín sulfón. Tyrozín sa musí stanoviť v hydrolyzátoch neoxidovaných vzoriek. Všetky ostatné aminokyseliny uvedené v bode 1 sa dajú stanoviť v oxidovanej alebo neoxidovanej vzorke.

Oxidácia sa vykoná pri 0 oC zmesou kyseliny permravčej a fenolu. Prebytočné oxidačné činidlo sa rozloží pomocou disiričitanu disodného. Oxidovaná alebo neoxidovaná vzorka sa hydrolizuje 23 hodín kyselinou chlorovodíkovou (3.20). Hodnota pH hydrolyzátu sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm (v prípade prolínu pri 440 nm).

3. Chemikálie

Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10μS).

3.1. Peroxid vodíka, w (w/w) = 30 %.

3.2. Kyselina mravčia, w (w/w) = 98 – 100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Disiričitan sodný

3.5. Hydroxid sodný

3.6. Dihydrát kyseliny 5-sulfosalicylovej

3.7. Kyselina chlorovodíková, hustota približne 1,18 g/ml.

3.8. Dihydrát citranu trojsodného.

3.9. 2,2'-tiodietanol (tiodiglykol).

3.10. Chlorid sodný.

3.11. Ninhydrín.

3.12. Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC.

3.13. Norleucín alebo iná zlúčenina vhodná na použitie ako vnútorný štandard.

3.14. Plynný dusík (< 10 ppm kyslíka).

3.15. 1-oktanol.

3.16. Aminokyseliny.

3.16.1. Štandardné látky uvedené v odseku 1. Čisté zlúčeniny bez obsahu vody z kryštalizácie. Pred použitím ich sušte vo vákuu jeden týždeň nad P2O5 alebo H2SO4.

3.16.2. Kyselina cysteová

3.16.3. Metionín sulfón.

3.17. Roztok hydroxidu sodného c = 7,5 mol/l: Rozpustite 300 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.18. Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.19. Roztok kyseliny mravčej a fenolu: Zmiešajte 889 g kyseliny mravčej (3.2) so 111 g vody a pridajte 4,73 g fenolu (3.3).

3.20. Hydrolyzačná zmes, c = 6 mol HCl/l s obsahom 1 g fenolu/l: Pridajte 1 g fenolu (3.3) k 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.21. Extrakčná zmes, c = 0,1 mol HCl/l s obsahom 2 % tiodiglykolu: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7), rozrieďte s približne 900 ml vody, pridajte 20 ml tiodiglykolu (3.9) a objem doplňte vodou na 1 liter (nezmiešajte 3.7 a 3.9 priamo).

3.22. Kyselina 5-sulfosalicylova, ß = 6 %: Rozpustite 60 g kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.6) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.23. Oxidačná zmes (kyselina permravčia – fenol): Zmiešajte 0,5 ml peroxidu vodíka (3.1) so 4,5 ml roztoku kyseliny mravčej s fenolom (3.19) v malej kadičke. Inkubujte pri teplote 20 – 30 oC 1 hodinu, aby sa vytvorila kyselina permravčia, potom nechajte vychladnúť v ľadovom kúpeli (15 minút) pred pridaním k vzorke. Upozornenie: Vyhnite sa kontaktu s kožou a použite ochranný odev.

3.24. Citranový tlmivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Rozpustite 19,61 g citranu sodného (3.8), 5 ml tioglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7) v približne 800 ml vody. Upravte pH na 2,20. Doplňte objem vodou na 1 liter.

3.25. Elučné tlmivé roztoky pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9).

3.26. Nihydrinové činidlo pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9).

3.27. Štandardné roztoky aminokyselín. Tieto roztoky treba skladovať pri teplote pod 5 oC.

3.27.1. Zásobný štandardný roztok aminokyselín (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml každá v kyseline chlorovodíkovej. Možno ich získať aj komerčne.

3.27.2. Zásobný štandardný roztok kyseliny cysteovej a metionín sulfónu, c = 1,25 μmol/ml. Rozpustite 0,2115 g kyseliny cysteovej (3.16.2) a 0,2265 g metionín sulfónu (3.16.3) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v 1 l odmernej banke a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac podobu 12 mesiacov. Tento roztok sa nepoužíva, ak zásobný štandardný roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovú a metionín sulfón.

3.27.3. Zásobný štandardný roztok vnútorného štandardu napr. norleucín, c = 20 μmol/ml. Rozpustite 0,6560 g norleucínu (3.13) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v odmernej banke a doplňte objem citranovým tlmivým roztokom na 250 ml. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 6 mesiacov.

3.27.4. Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi, c = 5 nmol/50 μl kyseliny cysteovej a metionín sulfónu a c = 10 nmol/50 μl ostatných aminokyselín. Rozpustite 2,2 g chloridu sodného (3.10) v 100 ml kadičke s 30 ml citranového tlmivého roztoku (3.24). Pridajte 4,00 ml zásobného štandardného roztoku aminokyselín (3.27.1), 4,00 ml zásobného štandardného roztoku kyseliny cysteovej a metionín sulfónu (3.27.2) a 0,50 ml zásobného štandardného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3), ak sa používa. Hydroxidom sodným (3.18) upravte pH na 2,20. Preneste kvantitatívne do 50 ml odmernej banky a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24) a premiešajte. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 3 mesiacov. Pozri poznámku 9.1.

3.27.5. Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi pripravenými podľa odseku 5.3.3.1 a na použitie s extraktmi (5.2). Kalibračný roztok sa pripravuje podľa 3.27.4, no bez použitia chloridu sodného. Skladujte pri teplote pod 5 oC po dobu najviac 3 mesiace.

4. Prístrojové vybavenie

4.1. Banka s guľatým dnom s objemom 100 alebo 250 ml vybavená spätným chladičom.

4.2. Fľaša z borokremičitého skla s objemom 100 ml so skrutkovým uzáverom s gumovou/teflonovou podložkou (napr. Duran, Schott) na použitie v sušiarni.

4.3. Sušiareň s nútenou ventiláciou a regulátorom teploty s presnosťou vyššou ako ± 2 oC.

4.4. pH meter (s presnosťou na tri desatinné miesta).

4.5. Membránový filter (0,22 μm).

4.6. Odstredivka.

4.7. Rotačná vákuová odparka.

4.8. Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo.

4.9. Analyzátor aminokyselín alebo zariadenie HPLC s iónovo-výmennou kolónou, zariadenie pre ninhydrín, postkolónová derivatizačná jednotka a fotometrický detektor. Kolóna je naplnená sulfónovanými polystyrénovými živicami, ktoré sú schopné oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. Prietok pre tlmivý roztok a ninhydrín zabezpečujú pumpy, ktoré majú stabilitu prietoku ±0,5 % v dobe, počas ktorej sa vykoná aj kalibrácia pomocou štandardu aj analyzovanie vzorky. U niektorých analyzátorov aminokyselín sa môžu použiť také postupy hydrolýzy, v ktorých hydrolyzát má koncentráciu sodíka c = 0,8 mol/l a obsahuje všetku zvyškovú kyselinu mravčiu z oxidácie. Iné analyzátory nedokážu uspokojivo oddeliť aminokyseliny, ak hydrolyzát obsahuje prebytok kyseliny mravčej a/alebo vysoké koncentrácie sodíkového iónu. V tomto prípade sa objem kyseliny zredukuje odparením na približne 5 ml po hydrolýze a pred úpravou pH. Odparenie musí prebehnúť vo vákuu pri teplote najviac 40 oC.

5. Postup

5.1. Príprava vzorky

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku treba pred mletím extrahovať s petroléterom (3.12).

5.2. Stanovenie voľných aminokyselín v krmivách a v premixoch

Navážte s presnosťou na 0,2 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmeyerovej banky a pridajte 100,0 ml extrakčnej zmesi (3.21). Zmes trepte 60 min. použitím mechanickej trepačky alebo magnetického miešadla (4.8). Nechajte sediment usadiť a pipetou odoberte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky s objemom 100 ml.

Primiešajte 5,0 ml roztoku kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.22) a pokračujte v miešaní pomocou magnetického miešadla po dobu 5 minút. Roztok nad sedimentom odstreďte alebo prefiltrujte, aby sa odstránili všetky zrazeniny. Preneste 10,0 ml výsledného roztoku do 100 ml kadičky a upravte pH na 2,20 použitím roztoku hydroxidu sodného (3.18), preneste do odmernej banky primeraného objemu s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24) a doplňte týmto roztokom (3.24) po značku.

Ak sa používa vnútorný štandard, pridajte 1,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a doplňte citranovým tlmivým roztokom (3.24) po značku.

Pristúpte k ďalšiemu kroku, ktorým je chromatografia, podľa odseku 5.4.

Ak sa extrakty neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC.

5.3. Stanovenie celkových aminokyselín

5.3.1. Oxidácia

Navážte s presnosťou na 0,2 mg 0,1 – 1 g pripravenej vzorky (5.1) do:

— 100 ml banky s guľatým dnom (4.1) na otvorenú hydrolýzu (5.3.2.3) alebo

— 250 banky s guľatým dnom (4.1), ak sa vyžaduje nízka koncentrácia sodíka (5.3.3.1), alebo

— 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) (na uzavretú hydrolýzu 5.3.2.4).

Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg a obsah vlhkosti nesmie presahovať 100 mg.

Vložte banku/fľašu do ľadového vodného kúpeľa a ochlaďte na 0 oC, pridajte 5 ml oxidačnej zmesi (3.23) a premiešajte sklenenou špachtľou s ohnutým hrotom. Utesnite banku/fľašu, v ktorej je špachtľa, vzduchotesnou fóliou, vložte ľadový vodný kúpeľ s utesnenou nádobou do chladničky pri teplote 0 oC a nechajte pôsobiť 16 hodín. Po 16 hodinách vyberte z chladničky a rozložte prebytok oxidačného činidla pridaním 0,84 g disiričitanu sodného (3.4).

Prejdite k bodu 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolýza

5.3.2.1. Hydrolýza oxidovaných vzoriek

K oxidovanej vzorke pripravenej podľa 5.3.1 pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20), pričom pozorne zmyte všetky zvyšky vzorky, ktoré sa držia na stranách nádoby a špachtle.

V závislosti od použitého postupu hydrolýzy postupujte podľa 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydrolýza neoxidovaných vzoriek

Navážte do 100 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom (4.1) alebo do 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) 0,1 až 1 g pripravenej vzorky (5.1) s presnosťou na 0,2 mg. Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg. Opatrne pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20) a zmiešajte so vzorkou. Postupujte podľa bodu 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.3. Otvorená hydrolýza

Pridajte 3 sklenené guľôčky k zmesi v banke (pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2) a varte pri stálom prebublávaní s refluxom 23 hodín. Po dokončení hydrolýzy chladič umyte 5 ml v citranového tlmivého roztoku (3.24). Odpojte banku a ochlaďte v ľadovom kúpeli.

Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.2.4. Uzavretá hydrolýza

Vložte fľašu s obsahom zmesi pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2 do sušiarne (4.3) pri teplote 110 oC. Počas prvej hodiny len položte na vrch nádoby skrutkový uzáver, aby ste predišli vytvoreniu tlaku (v dôsledku vytvárania plynných látok) a zabránili výbuchu. Nezatvárajte nádobu uzáverom. Po hodine uzatvorte nádobu uzáverom a nechajte na 23 hodín v sušiarni (4.3). Po ukončení hydrolýzy vyberte fľašu zo sušiarne, opatrne otvorte uzáver fľaše a vložte ju do ľadového vodného kúpeľa. Nechajte vychladnúť.

V závislosti od postupu na úpravu pH (5.3.3) preneste kvantitatívne obsah fľaše do 250 ml kadičky alebo 250 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24).

Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.3. Úprava pH

V závislosti od tolerancie analyzátora aminokyselín (4.9) voči sodíku postupujte pri úprave pH podľa bodov 5.3.3.1 alebo 5.3.3.2.

5.3.3.1. Chromatografické systémy (4.9) vyžadujúce nízku koncentráciu sodíka.

Pri použití analyzátora, ktorý vyžaduje nízku koncentráciu sodíka (keď sa musí znížiť objem kyseliny), sa odporúča použiť zásobný roztok vnútorného štandardu (3.27.3).

V takomto prípade pridajte k hydrolyzátu pred odparovaním 2,00 ml zásobného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3).

Pridajte 2 kvapky 1-oktanolu (3.15) k hydrolyzátu získanému podľa ods. 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

Použitím rotačnej odparky (4.7) znížte objem na 5 – 10 ml vo vákuu pri teplote 40 oC. Ak sa objem náhodou zníži na menej ako 5 ml, hydrolyzát sa musí znehodnotiť a analýza opakovať.

Upravte pH na 2,20 s roztokom hydroxidu sodného (3.18) a postupujte ďalej podľa odseku 5.3.4.

5.3.3.2. Pre všetky ostatné analyzátory aminokyselín (4.9)

Vezmite hydrolyzáty získané podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4 a čiastočne ich zneutralizujte opatrným pridávaním za miešania 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3.17), pričom je potrebné zabezpečiť, aby sa teplota udržala pod 40 oC.

Upravte pH na 2,20 pri izbovej teplote použitím roztoku hydroxidu sodného (3.17) a nakoniec roztoku hydroxidu sodného (3.18). Postupujte ďalej podľa bodu 5.3.4.

5.3.4. Roztok vzorky na chromatografiu

Kvantitatívne preneste hydrolyzát s upraveným pH (5.3.3.1 alebo 5.3.3.2) s citranovým tlmivým roztokom (3.24) do 200 ml odmernej banky a doplňte po značku tlmivým roztokom (3.24).

Ak ešte nebol použitý vnútorný štandard, pridajte 2,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24). Dôkladne premiešajte.

Pristúpte ďalej ku chromatografii (5.4).

Ak sa roztoky vzorky neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC.

5.4. Chromatografia

Pred chromatografiou upravte teplotu extraktu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3.4) na laboratórnu teplotu. Zmes potrepte a prefiltrujte vhodné množstvo cez 0,22 μm membránový filter (4.5). Výsledný číry roztok sa podrobí iónovo-výmennej chromatografii s použitím analyzátora aminokyselín (4.9).

Nastreknutie sa môže vykonať manuálne alebo automaticky. Dôležité je, aby sa na kolónu nadávkovalo rovnaké analyzované množstvo roztoku štandardov a vzoriek s odchýlkou ± 0,5 % s výnimkou prípadov používania vnútorného štandardu a aby boli pomery sodíka a aminokyselín v roztokoch štandardu a vzorky v najvyššej možnej miere podobné.

Vo všeobecnosti závisí frekvencia kalibrácií od stability ninhydrínového činidla a analytického systému. Štandard alebo vzorka sa rozriedi s citranovým tlmivým roztokom (3.24) tak, aby plocha píku štandardu predstavovala 30 – 200 % plochy píku aminokyseliny vzorky.

Chromatografia aminokyselín sa mierne odlišuje podľa typu použitého analyzátora a použitej živice. Zvolený systém musí byť schopný oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. V pracovnom rozsahu musí chromatografický systém poskytnúť lineárnu odozvu na zmeny v množstvách aminokyselín pridaných do kolóny.

Počas chromatografie, keď sa analyzuje ekvimolárny roztok (aminokyselín, ktoré sa stanovujú), sa uplatňujú pomery výšky údolia k výške píku, ako sa uvádza nižšie. Tento ekvimolárny roztok musí obsahovať najmenej 30 % maximálneho množstva každej aminokyseliny, ktorá sa dá presne odmerať pomocou systému analyzátora aminokyselín (4.9).

Pri oddeľovaní treonínu od serínu výška údolia k výške píku u nižšej z dvoch prekrývajúcich sa aminokyselín na chromatograme nesmie prekročiť pomer 2 : 10 (ak sa stanovuje len cystín, cysteín, metionín, treonin a lysín, nedostatočné oddelenie od susedných píkov nepriaznivo ovplyvní proces stanovenia). Pri všetkých ostatných aminokyselinách musí byť oddelenie v pomere lepšom ako 1 : 10.

Systém musí zabezpečiť, aby sa lyzín oddelil od „lyzínových artefaktov“ a od ornitínu.

6. Výpočet výsledkov

Plochy píkov vzorky a štandardu sa merajú pre každú jednotlivú aminokyselinu a vypočíta sa množstvo (X) v g aminokyselín na kg vzorky.

Ak sa použije vnútorný štandard, vynásobte:

A = plocha píku, hydrolyzátu alebo extraktu,

B = plocha píku, kalibračný štandardný roztok,

C = plocha píku, vnútorny štandard v hydrolyzáte alebo extrakte,

D = plocha píku, vnútorny štandard, kalibračný štandardný roztok,

M = molekulová hmotnosť aminokyseliny, ktorá sa stanovuje,

c = koncentrácia štandardu v μmol/ml,

m = hmotnosť vzorky (g) (upravená na pôvodnú hmotnosť ak je sušená alebo odtučnená),

V = celkový hydrolyzát v ml (5.3.4) alebo vypočítaný objem celkového zriedenia extraktu (6.1).

Cystín a cysteín sa obidva stanovujú ako kyselina cysteová v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočítajú sa ako cystín (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) pomocou M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionín sa stanovuje ako metionín sulfón v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočíta sa ako metionín pomocou M metionínu: 149,21 g/mol.

Pridaný voľný metionín sa stanovuje po extrakcii ako metionín a výpočet sa vykoná pomocou toho istého MW.

6.1. Celkový objem zriedených extraktov (F) na stanovenie voľných aminokyselín (5.2) sa vypočíta takto: V = objem konečného extraktu

7. Hodnotenie metódy

Metóda bola testovaná v rámci vzájomného porovnávania na medzinárodnej úrovni v roku 1990 pomocou štyroch rôznych krmív (kŕmna zmes pre ošípané, kŕmna zmes pre brojlery, bielkovinový koncentrát, premix). Výsledky priemeru a smerodajnej odchýlky po eliminácii odľahlých hodnôt sú uvedené v atbuľkách v tomto bode:







Priemery v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Bielkovinový koncentrát 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premix 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií

7.1. Opakovateľnosť

Opakovateľnosť vyjadrená ako „vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka“ uvedeného vzájomného porovnávania je uvedená v nasledujúcich tabuľkách:







Vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka (Sr) v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Bielkovinový koncentrát 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premix 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií







Variačný koeficient (%) vnútrolaboratórnej smerodajnej odchýlky (Sr) Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Bielkovinový koncentrát 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premix 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií

7.2. Reprodukovateľnosť

Výsledky medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky na základe uvedeného vzájomného porovnávania sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách:







Medzilaboratórna smerodajná odchýlka (SR) v g/kg Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Bielkovinový koncentrát 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premix 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií







Variačný koeficient (%) medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky (SR) Referenčný materiál Aminokyselina Treonín Cyst(e)ín Metionín Lysín Kŕmna zmes pre ošípané 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Kŕmna zmes pre brojlery 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Bielkovinový koncentrát 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premix 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = počet zúčastnených laboratórií

8. Využitie referenčných materiálov

Správne uplatňovanie tejto metódy sa overí vykonaním opakovaných meraní certifikovaných referenčných materiálov, ak sú takéto materiály k dispozícii. Odporúča sa kalibrácia certifikovaným kalibračným roztokom aminokyselín.

9. Poznámky

9.1. V dôsledku rozdielov medzi analyzátormi aminokyselín sa berú za základ konečné koncentrácie kalibračných roztokov štandardných aminokyselín (pozri body 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (pozri 5.3.4). Rozsah lineárnej odozvy prístroja sa musí preveriť pre všetky aminokyseliny. Štandardný roztok sa zriedi s citranovým tlmivým roztokom tak, aby plochy píkov boli v strede rozsahu.

9.2. V prípade použitia zariadenia na vysoko účinnú kvapalinovú chromatografiu na analýzu hydrolyzátov sa musia optimalizovať experimentálne podmienky v súlade s odporúčaniami výrobcu.

9.3. Uplatňovaním tejto metódy na krmivá s obsahom viac ako 1 % chloridu (koncentrát, minerálne krmivá, doplnkové krmivá) môže dôjsť k podhodnoteniu metionínu a musí sa vykonať osobitná úprava.

G. STANOVENIE TRYPTOFÁNU

1. Účel a oblasť

Metóda umožňuje stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje medzi D a L formami.

2. Podstata metódy

Na stanovenie celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí s nasýteným roztokom hydroxidu bárnatého a zahreje sa na 110 oC na 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá vnútorný štandard.

Na stanovenie voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí v prítomnosti vnútorného štandardu.

Tryptofán a vnútorný štandard v hydrolyzáte alebo v extrakte sa stanovujú pomocou HPLC s fluorescenčnou detekciou.

3. Chemikálie

3.1. Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10 μS/cm).

3.2. Štandardná látka: tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.3. Vnútorný štandard: α-metyl-tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.4. Oktahydrát hydroxidu bárnatého Ba(OH)2 8H2O (ktorý sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže narušiť proces stanovenia) (pozri poznámku 9.3).

3.5. Hydroxid sodný.

3.6. Kyselina orto-fosforečná, w (w/w) = 85 %.

3.7. Kyselina chlorovodíková, ρ201,19 g/ml.

3.8. Metanol, čistoty HPLC.

3.9. Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC.

3.10. Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40,0 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1).

3.11. Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l: Vezmite 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.12. Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l: Vezmite 82 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.13. Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.14. Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l. Vezmite 34 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1).

3.15. Koncentrovaný roztok tryptofánu (3.2), c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2553 g tryptofánu (3.2) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne.

3.16. Koncentrovaný roztok vnútorného štandardu, c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2728 g α-metyl-tryptofánu (3.3) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne.

3.17. Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a vnútorného štandardu: Vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Rozrieďte s vodou (3.1) a metanolom (3.8) na približne rovnaký objem a na približne rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %) ako hotový hydrolyzát. Tento roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím. Počas prípravy chráňte ho pred priamym slnečným svetlom.

3.18. Kyselina octová

3.19. 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol

3.20. Etanolamín w (w/w) > 98 %.

3.21. Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v 100 ml metanolu (3.8).

3.22. Mobilná fáza pre HPLC: 3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1g/100ml). Upravte pH na 5,00 pomocou etanolamínu (3.20). Objem doplňte vodou (3.1) na 1 000 ml.

4. Prístrojové vybavenie

4.1. Zariadenie HPLC s fluorescenčným detektorom.

4.2. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná

4.3. pH meter.

4.4. Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom.

4.5. Membránový filter, 0,45 μm.

4.6. Autokláv, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7. Mechanická trepačka alebo magnetická miešačka.

4.8. Vírivý mixér.

5. Postup

5.1. Príprava vzoriek

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla cez sito o veľkosti ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku sa pred mletím extrahujú petroléterom (3.9).

5.2. Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt)

Navážte s presnosťou na 1 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmayerovej banky. Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej, (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16). Zmes trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo na magnetickej miešačke (4.7). Nechajte sediment usadiť a napipetujte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Upravte pH na 3 pomocou hydroxidu sodného (3.10). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (3.8) na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a rozrieďte s vodou na objem potrebný na chromatografiu [približne rovnaký objem ako je objem kalibračného štandardného roztoku (3.17)].

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Pokračujte ďalším krokom chromatografie podľa odseku 5.4.

Roztok štandardu a extrakty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní.

5.3. Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát).

Navážte s presnosťou na 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (5.1) do polypropylénovej banky (4.4). Navážka vzorky má obsahovať približne 10 mg dusíka. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu bárnatého (3.4) a 10 ml vody. Premiešajte vo vírivom mixéri (4.8) alebo na magnetickej miešačke (4.7). Magnet potiahnutý teflónom ponechajte v zmesi. Steny nádoby opláchnite 4 ml vody. Položte na ňu skrutkový uzáver a voľne banku uzatvorte. Preneste do autoklávu (4.6) s vriacou vodou a nechajte v pare 30 – 60 minút. Uzatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) oC.

Pred otvorením autoklávu znížte teplotu na hodnotu tesne pod 100 oC. K teplej zmesi pridajte 30 ml vody laboratórnej teploty, aby ste sa vyhli kryštalizácii Ba(OH)2.8 H2O. Jemne potrepte alebo premiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Nechajte nádobu 15 minút ochladzovať vo vodnom/ľadovom kúpeli.

Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Nádobu nechajte v chladiacom kúpeli a neutralizujte pomocou HCl (3.11) za stáleho miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl (3.12). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a zrieďte s vodou, aby sa dosiahol stanovený objem potrebný na chromatografiu (napr. 100 ml). Pridanie metanolu nesmie spôsobiť vyzrážanie.

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Ďalším krokom je chromatografia podľa odseku 5.4.

Roztok štandardu a hydrolyzáty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať hydrolyzáty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní.

5.4. Stanovenie HPLC

Na usmernenie sú k dispozícii tieto podmienky pre izokratické eluovanie; môžu sa uplatniť iné podmienky, ak poskytujú rovnaké výsledky (pozri poznámky 9.1 a 9.2):







Kolóna na kvapalinovú chromatografiu kolóna (4.2): 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná Teplota kolóny: laboratórna teplota Mobilná fáza (3.22): 3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 pomocou tanolamínu (3.20). Doplňte objem vodou (3.1) na 1 000 ml Prietoková rýchlosť: 1 ml/min. Celkový čas analýzy: približne 34 min. Detekčná vlnová dĺžka: excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm Vstrekový objem 20 μl

6. Výpočet výsledkov

Množstvo tryptofánu (X) v g na 100 vzorky sa vypočíta podľa vzorca:

A = plocha píku vnútorného štandardu, kalibračného štandardného roztoku (3.17),

B = plocha píku extraktu tryptofánu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3),

V1 = objem v ml (2 ml) koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) pridaného do kalibračného roztoku (3.17),

c = koncentrácia v