1972L0199 — SK — 27.08.1999 — 005.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

►B TRETIA SMERNICA KOMISIE z 27. apríla 1972 stanovujúca analytické metódy spoločenstva na úradnú kontrolu krmív (72/199/EHS) (Ú. v. ES L 123, 29.5.1972, p.6)

Zmenené a doplnené:









▼B

TRETIA SMERNICA KOMISIE

z 27. apríla 1972

stanovujúca analytické metódy spoločenstva na úradnú kontrolu krmív

(72/199/EHS)







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na smernicu Rady z 20. júla 1970 ( 1 ) o zavedení metód vzorkovania a analýz na úradnú kontrolu krmív v spoločenstve, a najmä na jej článok 2, keďže táto smernica vyžaduje, aby sa úradné kontroly krmív vykonávali metódami vzorkovania a analytickými metódami spoločenstva na kontrolu súladu s požiadavkami vyplývajúcimi podľa ustanovení stanovených zákonom, iným právnym predpisom alebo správnym úkonom týkajúcim sa kvality a zloženia krmív; keďže smernice Komisie č. 71/250/EHS ( 2 ) z 15. júna 1971 a č. 71/393/EHS ( 3 ) z 18. novembra 1971 už stanovili určitý počet analytických metód spoločenstva; keďže vzhľadom na pokrok dosiahnutý v následných činnostiach by sa mal prijať tretí súbor metód; keďže opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá, PRIJALA TÚTO SMERNICU:







Článok 1

Členské štáty vyžadujú, aby analýzy na úradné kontroly krmív, pokiaľ ide o obsahy škrobu, dusíkatých látok, stráviteľných dusíkatých látok, ktoré sa dajú rozložiť pepsínom a kyselinou chlorovodíkovou, voľného a celkového gosypolu a pokiaľ ide o aktivitu pepsínu, boli vykonávané metódami opísanými v prílohe I k tejto smernici.

▼M1 —————

▼B

Článok 2

Členské štáty vyžadujú, aby analýzy na úradné kontroly krmív, na účely ►M4 ————— ◄ stanovenia obsahov ►M4 ————— ◄ tylozínu a virginiamycínu v krmivách, boli vykonávané metódami opísanými v prílohe II k tejto smernici.

▼M1 —————

▼B

Článok 3

Členské štáty uvedú najneskôr do 1. júla 1973 do účinnosti zákony, iné právne predpisy alebo správne opatrenia nevyhnutné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Bezodkladne o tom budú informovať Komisiu.

Článok 4

Táto smernica je adresovaná členským štátom.









PRÍLOHA I

▼M5

1. STANOVENIE ŠKROBU

POLARIMETRICKÁ METÓDA

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsahy škrobu a produktov degradácie škrobu s vysokou molekulovou hmotnosťou v krmivách na účely kontroly súladu so smernicou Komisie 86/174/EHS a smernicou Rady 96/25/ES.

2. Podstata metódy

Táto metóda pozostáva z dvoch stanovení. Pri prvom stanovení sa vzorka za horúca upraví zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčírení a filtrácii sa polarimetrickým meraním stanoví optická otáčavosť roztoku.

Pri druhom stanovení sa vzorka extrahuje 40 % etanolom. Po okyslení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčírení a prefiltrovaní sa zmeria optická otáčavosť rovnakým spôsobom ako pri prvom stanovení.

Rozdiel medzi týmito dvomi meraniami, vynásobený známym faktorom udáva obsah škrobu vo vzorke.

3. Chemikálie

3.1. 25 % (w/w) kyselina chlorovodíková, d: 1,126 g/ml.

3.2. 1,128 % (w/v) kyselina chlorovodíková. Koncentrácia sa musí skontrolovať titráciou s použitím roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/liter v prítomnosti 0,1 % (w/v) metylčervene v 94 % (v/v) etanole. 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/liter.

3.3. Carrezovo činidlo I: rozpustite 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej vo vode. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4. Carrezovo činidlo II: rozpustite 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného [K4(Fe(KN)6].3 H2O vo vode. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.5. 40 % (v/v) etanol, d: 0,948g/ml pri 20°C.

4. Prístroje

4.1. 250 ml Erlenmeyerova banka so zábrusom a so spätným chladičom

4.2. Polarimeter alebo sacharimeter

5. Postup

5.1. Príprava vzorky

Vzorku meľte dovtedy, kým nebude dostatočne jemná, aby celá prešla cez sito s okrúhlymi otvormi 0,5 mm.

5.2. Stanovenie celkovej optickej otáčavosti (P alebo S) (pozri poznámku 7.1)

Navážte 2,5 g pomletej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte vzorku do 100 ml odmernej banky. Pridajte 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2), premiešajte tak, aby ste docielili rovnomerné rozptýlenie skúšobnej vzorky a pridajte ďalších 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa, pričom ňou prvé tri minúty intenzívne a stále pretrepávajte, aby sa zabránilo tvorbe hrudiek. Množstvo vody vo vodnom kúpeli musí byť dostatočné na to, aby kúpeľ zostal na bode varu aj po ponorení banky do kúpeľa. Banka sa nesmie vybrať z kúpeľa počas pretrepávania. Presne po 15 minútach ju vyberte z kúpeľa, pridajte 30 ml studenej vody a ihneď ochlaďte na teplotu 20°C.

Pridajte 5 ml Carrezovho činidla I (3.3) a pretrepávajte jednu minútu. Potom pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.4) a znovu pretrepávajte jednu minútu. Doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Ak filtrát nebude dokonale číry, (čo je zriedkavé), stanovenie zopakujte s použitím väčšieho množstva Carrezových činidiel I a II, napr. 10 ml.

Zmerajte optickú otáčavosť roztoku v 200 mm trubici pomocou polarimetra alebo sacharimetra.

5.3. Stanovenie optickej otáčavosti (Pa S) látok rozpustných v 40 % etanole.

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, vložte do 100 ml odmernej banky a pridajte približne 80 ml etanolu (3.5) (pozri poznámku 7.2). Banku nechajte stáť 1 hodinu pri laboratórnej teplote; počas tejto doby šesťkrát intenzívne pretrepte tak, aby sa skúšobná vzorka dôkladne premiešala s etanolom. Doplňte na požadovaný objem etanolom (3.5), premiešajte a prefiltrujte. Napipetujte 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorky) do 250 ml Erlenmeyerovej banky, pridajte 2,1 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1) a intenzívne pretrepte. Na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič a banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa. Presne po 15 minútach Erlenmeyerovu banku z kúpeľa vyberte, obsah preneste do 100 ml odmernej banky, prepláchnite malým množstvom studenej vody a ochlaďte na teplotu 20°C. Vyčírte použitím Carrezových činidiel I (3.3) a II (3.4), doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte, prefiltrujte a zmerajte optickú otáčavosť spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.2.

6. Výpočet výsledkov

Obsah škrobu ( %) sa vypočíta takto:

6.1. Meranie polarimetrom

P = celková optická otáčavosť v uhlových stupňoch

P' = optická otáčavosť v uhlových stupňoch látok rozpustných v 40 % (v/v) etanole

= špecifická optická otáčavosť istého škrobu. Ako faktor sa bežne akceptujú nasledovné číselné hodnoty: + 185,9° : ryžový škrob + 185,4° : zemiakový škrob + 184,6° : kukuričný škrob + 182,7° : pšeničný škrob + 181,5° : jačmenný škrob + 181,3° : ovsený škrob + 184,0° : ostatné druhy škrobu a zmesi škrobov v kŕmnych zmesiach

6.2. Meranie sacharimetrom

S = celková optická otáčavosť v sacharometrických stupňoch

S' = optická otáčavosť v sacharometrických stupňoch látok rozpustných v 40 % (v/v) etanole

N = hmotnosť g) sacharózy v 100 ml vody poskytujúca optickú otáčavosť 100 sacharometrických stupňov pri použití 200 mm trubice 16,29 g pre francúzske sacharimetre 26,00 g pre nemecké sacharimetre 20,00 g pre zmiešané sacharimetre.

= špecifická optická otáčavosť čistého škrobu (pozri 6.1)

6.3 Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v rovnakej vzorke nesmie presiahnuť 0,4 v absolútnej hodnote pre obsah škrobu menší ako 40 % a 1,1 % relatívnych pre obsah škrobu rovný alebo väčší ako 40 %.

7. Poznámky

7.1. Ak vzorka obsahuje viac ako 6 % uhličitanov, vypočítaných ako uhličitan vápenatý, tieto sa musia rozložiť pred stanovením celkovej optickej otáčavosti presne známym množstvom zriedenej kyseliny sírovej.

7.2. Ak ide o produkty s vysokým obsahom laktózy, ako je sušené mliečne sérum alebo sušené odstredené mlieko, postupujte po pridaní 80 ml etanolu (3.5) nasledovne. Na banku nasaďte spätný chladič a ponorte ju na 30 minút do vodného kúpeľa o teplote 50°C. Nechajte vychladnúť a pokračujte v analýze podľa bodu 5.3.

7.3. Ak sú nasledovné kŕmne suroviny prítomné vo významnom množstve v krmivách, je známe, že spôsobujú interferencie pri stanovovaní obsahu škrobu polarimetrickou metódou, čím sa dajú získať nesprávne výsledky: — výrobky z (cukrovej) repy, ako sú vylúhované rezky z (cukrovej) repy, melasa z (cukrovej) repy, melasovaná dužina z (cukrovej) repy, vinas z (cukrovej) repy, (repný) cukor, — citrusová dužina, — ľanové semeno, ľanové výlisky, ľanový extrahovaný šrot, — repkové semeno, repkové výlisky, repkový extrahovaný šrot, šupky repkového semena, — slnečnicové semeno, slnečnicový extrahovaný šrot, slnečnicový extrahovaný šrot z čiastočne lúpaných semien, — výlisky z kopry, extrahovaný šrot z kopry, — zemiaková dužina, — dehydrované kvasnice, — produkty bohaté na inulín (napr. rezky a múčka z topinambury), — oškvarky.

▼M3

2. STANOVENIE DUSÍKATÝCH LÁTOK

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok na základe obsahu dusíka, stanoveného podľa Kjeldahlovej metódy.

2. Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa zalkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného.

3. Chemikálie

3.1. Síran draselný

3.2. Katalyzátor: oxid meďnatý CuO alebo pentahydrát síranu meďnatého, CuSO4. 5H2O

3.3. Granulovaný zinok

3.4. Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5. Kyselina sírová c(½ H2SO4) = 0,5 mol/l

3.6. Kyselina sírová c(½ H2SO4) = 0,1 mol/l

3.7. Indikátor metylčerveň; rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = 95-96 % (v/v)

3.8. Roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý) δ = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.9. Roztok hydroxidu sodného c = 0,25 ml/l

3.10. Roztok hydroxidu sodného c = 0,1 mol/l

3.11 Granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná

3.12. Acetanilid ( bod topenia = 114 oC, N = 10,36 %)

3.13. Sacharóza (bez dusíka).

4. Prístroj

Prístroj vhodný na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy.

5. Postup

5.1. Mineralizácia

Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (3.1), vhodné množstvo katalyzátora (3.2) (0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého), 25 ml kyseliny sírovej (3.4) a niekoľko granúl pemzy (3.11) a premiešajte. Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich. Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť.

5.2. Destilácia

Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom pridajte niekoľko granúl zinku (3.3).

Do zachytávacej banky destilačného prístroja pridajte presne odmerané množstvo 25 ml kyseliny sírovej (3.5) alebo (3.6) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (3.7).

Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.8) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku 8.1).

Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku.

5.3. Titrácia

Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke roztokom hydroxidu sodného (3.9) alebo (3.10) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej, až do dosiahnutia bodu ekvivalencie.

5.4. Slepý pokus

Na potvrdenie toho, že chemikálie neobsahujú dusík, vykonajte slepý pokus (mineralizácia, destilácia a titrácia) použitím 1 g sacharózy (3.13) namiesto vzorky.

6. Výpočet výsledkov

Obsah dusíkatých látok sa vypočíta podľa nasledovného vzorca:

v ktorom,

v0 = objem (ml) NaOH (3.9 alebo 3.10) použitého pri slepom pokuse

v1 = objem (ml) NaOH (3.9 alebo 3.10) použitého pri titrácii vzorky

c = koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (3.9 alebo 3.10)

m = hmotnosť (g) vzorky.

7. Overovanie metódy

7.1. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

0,2 % v absolútnej hodnote, pre obsahy dusíkatých látok menšie ako 20 %;

1,0 % z vyššej hodnoty, pre obsahy dusíkatých látok od 20 % do 40 %;

0,4 % v absolútnej hodnote, pre obsahy dusíkatých látok väčšie ako 40 %;

7.2. Správnosť

Vykonajte analýzu (mineralizácia, destilácia a titrácia) 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.12) v prítomnosti 1 g sacharózy (3.13); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (3.5). Návratnosť musí byť najmenej 99 %.

8. Poznámky

8.1. Prístroj môže byť jednoduchý, poloautomatický alebo automatický. Ak prístroj vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez strát. Ak banka destilačného prístroja nie je opatrená prikvapkávacím lievikom, hydroxid sodný pridajte bezprostredne pred pripojením banky na chladič, pričom kvapalinu lejte tak, aby pomaly stekala po stene banky.

8.2. Ak mineralizát stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (3.4), než je určené vyššie.

8.3. U produktov s nízkym obsahom dusíka môže byť podľa potreby objem kyseliny sírovej (3.6) pridávanej do zachytávacej banky zmenšený na 10 alebo 15 ml a doplnený na 25 ml vodou.

▼B

3. STANOVENIE STRÁVITEĽNÝCH DUSÍKATÝCH LÁTOK ROZPUSTNÝCH PEPSÍNOM A KYSELINOU CHLOROVODÍKOVOU

1. Účel a rozsah

Táto metóda umožňuje stanoviť frakciu stráviteľných dusíkatých látok rozpustných pepsínom a kyselinou chlorovodíkovou za definovaných podmienok. Je použiteľná na všetky krmivá.

2. Podstata metódy

Vzorka sa zahrieva 48 hodín pri teplote 40 °C v roztoku pepsínu v kyseline chlorovodíkovej. Suspenzia sa prefiltruje a obsah dusíka vo filtráte sa stanoví metódou na stanovenie dusíkatých látok.

3. Chemikálie

3.1. Kyselina chlorovodíková, d: 1,125.

3.2. 0,075 N kyselina chlorovodíková.

3.3. pepsín, 2,0 j./mg; aktivita pepsínu je definovaná v metóde opísanej v časti 4 tejto prílohy a musí sa stanoviť touto metódou.

3.4. Približne 0,2 % (m/v) čerstvo pripravený roztok pepsínu v kyseline chlorovodíkovej (3.2); aktivita: 400 j./l.

3.5. Protipeniaca emulzia (napr. silikónový olej).

3.6. Všetky chemikálie uvedené v bode 3 v metóde na stanovenie dusíkatých látok.

4. Prístroje

4.1. Vodný kúpeľ alebo termostat nastavený na teplotu 40 °C ± 1 °C.

4.2. Kjeldahlov prístroj na mineralizáciu a titráciu.

5. Postup

5.1. Príprava roztoku (pozri poznámku 7.2)

Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 500 ml odmernej banky. Pridajte 450 ml roztoku pepsínu v kyseline chlorovodíkovej, (3.4) vopred zohriatého na 40 °C a premiešajte, aby sa zabránilo vzniku hrudiek. Skontroluje, či je pH suspenzie menšie ako 1,7. Banku vložte do vodného kúpeľa alebo do termostatu (4.1) a nechajte ju tam 48 hodín. Po 8, 24 a 32 hodinách obsah banky premiešajte. Po 48 hodinách pridajte 15 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), ochlaďte na 20 °C, doplňte na objem vodou a prefiltrujte.

5.2. Mineralizácia

250 ml filtrátu premiestnite do banky destilačného prístroja (4.2). Pridajte chemikálie potrebné na mineralizáciu, uvedené v druhej vete bodu 5.1 metódy na stanovenie dusíkatých látok. Premiešajte a priveďte do varu. Ak sa tvorí pena, pridajte niekoľko kvapiek protipeniacej emulzie (3.5). Pokračujte v intenzívnom vare až do takmer úplného odparenia vody. Znížte intenzitu zahrievania a opatrne odstráňte posledné zvyšky vody.

Keď sa roztok vyčíri a odfarbí (alebo je svetlozelený, ak sa použil katalyzátor na báze medi), varte ďalšiu hodinu a nechajte vychladnúť.

5.3. Destilácia a titrácia

Pokračujte postupom uvedeným v bode 5.2 a 5.3 metódy na stanovenie dusíkatých látok.

5.4. Slepý pokus

Vykonajte slepý pokus rovnakým postupom, ale bez vzorky, ktorá sa má analyzovať.

6. Výpočet výsledkov

Odpočítajte objem kyseliny sírovej spotrebovaný pri slepom pokuse od objemu spotrebovaného na skúšobnú vzorku. 1 ml 0,1 N kyseliny sírovej odpovedá 1,4 mg dusíka.

Množstvo dusíka vynásobte faktorom 6,25. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

— 0,4 v absolútnej hodnote, pre obsahy menšie ako 20 %;

— 2,0 % relatívnych, pre obsahy nie menšie ako 20 % a nie väčšie ako 40 %;

— 0,8 v absolútnej hodnote, pre obsahy väčšie ako 40 %.

7. Poznámky

7.1. Hodnoty získané touto metódou nemajú žiadne priame spojenie so stráviteľnosťou in vivo.

7.2. Produkty s obsahom oleja alebo tuku vyšším ako 10 % sa musia najskôr odtučniť extrakciou petroléterom (bod varu: 40 °C až 60 °C).

4. STANOVENIE AKTIVITY PEPSÍNU

1. Účel a rozsah

Táto metóda umožňuje stanoviť aktivitu pepsínu používaného na stanovenie stráviteľných dusíkatých látok rozpustných pepsínom a kyselinou chlorovodíkovou.

2. Podstata metódy

Hemoglobín sa vystaví účinku pepsínu v prostredí kyseliny chlorovodíkovej za definovaných podmienok. Nezhydrolyzovaná frakcia bielkovín sa vyzráža kyselinou trichlóroctovou. Do filtrátu sa pridá hydroxid sodný a Folin-Ciocalteuvo činidlo. Zmeria sa absorbancia tohto roztoku pri 750 nm a z kalibračnej krivky sa odčíta zodpovedajúce množstvo tyrozínu.

Definícia: Jednotka pepsínu je definovaná ako množstvo enzýmu ktoré, za podmienok danej metódy, uvoľní za minútu také množstvo hydroxyarylových skupín, ktoré má, po vyfarbení Folin-Ciocalteuvým činidlom, absorbanciu zodpovedajúcu absorbancii jedného μmólu tyrozínu vyfarbenému rovnakým spôsobom.

3. Chemikálie

3.1. 0,2 N kyselina chlorovodíková.

3.2. 0,06 N kyselina chlorovodíková.

3.3. 0,025 N kyselina chlorovodíková.

3.4. 5 % roztok (m./v.) kyseliny trichlóroctovej.

3.5. 0,5 N roztok hydroxidu sodného.

3.6. Folin-Ciocalteuvo činidlo. Do 2 litrovej banky s guľatým dnom a so zábrusom preneste 100 g dihydrátu wolfrámanu sodného (Na2WO4. 2H2O), 25 g dihydrátu molybdénanu sodného (Na2MoO4. 2H2O) a 700 ml vody. Pridajte 50 ml kyseliny fosforečnej (d: 1,71) a 100 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (d: 1,19), nasaďte na banku spätný chladič, obsah banky priveďte do varu a roztok nechajte mierne vrieť 10 hodín. Nechajte vychladnúť, odpojte spätný chladič, pridajte 175 g dihydrátu síranu lítneho (Li2SO4. 2H2O), 50 ml vody a 1 ml brómu. Kvôli odstráneniu prebytku brómu varte 15 minút. Nechajte vychladnúť, roztok preneste do 1 litrovej odmernej banky, doplňte na objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Nesmie zostať žiadne zelenkasté sfarbenie. Pred použitím zrieďte jeden objemový diel činidla 2 objemovými dielmi vody.

3.7. Roztok hemoglobínu. Navážte množstvo hemoglobínu (približne 2 g bielkovinového substrátu stanoveného podľa Ansonovej metódy) zodpovedajúce 354 mg dusíka ( 4 ) a vložte do 200 ml banky so zábrusom. Pridajte niekoľko ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2), banku pripojte na vývevu a pretrepávajte do úplného rozpustenia hemoglobínu. Vákuum odpojte a za stáleho miešania pridávajte kyselinu chlorovodíkovú (3.2) až na objem 100 ml. Pripravujte bezprostredne pred použitím.

3.8. Štandardný roztok tyrozínu. Rozpustite 181,2 mg tyrozínu v kyseline chlorovodíkovej (3.1) a doplňte na 1 liter tou istou kyselinou (zásobný roztok). 20,0 ml zrieďte na 100 ml kyselinou chlorovodíkovou (3.1). 1 ml tohto roztoku obsahuje 0,2 μmólu tyrozínu.

4. Prístroje

4.1. Vodný kúpeľ nastavený ultratermostatom na teplotu 25 °C ± 0,1 °C.

4.2. Spektrofotometer.

4.3. Stopky, s presnosťou: 1 sekunda.

4.4. pH meter.

5. Postup

5.1. Príprava roztoku (pozri poznámku 7.1)

Rozpustite 150 mg pepsínu v 100 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Do 50 ml odmernej banky napipetujte 2 ml roztoku a banku doplňte na požadovaný objem kyselinou chlorovodíkovou (3.3). hodnota pH, skontrolovaná pH metrom, musí byť 1,6 ± 0,1. Banku ponorte do vodného kúpeľa. (4.1).

5.2. Hydrolýza

5,0 ml roztoku hemoglobínu (3.7) napipetujte do skúmavky, zohrejte na teplotu 25 °C vo vodnom kúpeli (4.1), pridajte 1,0 ml roztoku pepsínu získaného podľa bodu 5.1 a premiešajte sklenenou tyčinkou na jednom konci hrubšou približne desiatimi pohybmi sem a tam. Skúmavku nechajte vo vodnom kúpeli pri teplote 25 °C presne 10 minút, pričom čas merajte od pridania roztoku pepsínu (čas a teplota sa musia presne dodržať). Potom pridajte 10,0 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.4) vopred zohriateho na 25 °C, premiešajte a prefiltrujte cez suchý filter.

5.3. Vznik sfarbenia a meranie absorbancie

Do 50 ml Erlenmeyerovej banky napipetujte 5,0 ml filtrátu, pridajte 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a, za stáleho miešania, 3,0 ml zriedeného Folin-Ciocalteuvho činidla (3.6). Po uplynutí 5 až 10 minút stanovte absorbanciu roztoku pomocou spektrofotometra pri 750 nm v kyvete o hrúbke 1 cm proti vode.

5.4. Slepý pokus

Pred každým stanovením vykonajte slepý pokus nasledujúcim spôsobom:

5,0 ml roztoku hemoglobínu (3.7) napipetujte do skúmavky,zohrejte na teplotu 25 °C vo vodnom kúpeli (4.1), pridajte 10,0 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.4) vopred zohriatej na 25 °C, premiešajte, potom pridajte 1,0 ml roztoku pepsínu získaného postupom uvedeným v bode 5.1. Premiešajte sklenenou tyčinkou a skúmavku nechajte vo vodnom kúpeli (4.1) pri teplote 25 °C presne 10 minút. Premiešajte a prefiltrujte cez suchý filter. Ďalej postupujte postupom uvedeným v bode 5.3.

5.5. Kalibračná krivka

Do 50 ml Erlenmeyerových baniek napipetujte 1,0; 2,0; 3,0 a 5,0 ml štandardného roztoku tyrozínu (3.8), čo zodpovedá 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 a 1,0 μmólu tyrozínu. Sériu baniek doplňte porovnávacím roztokom, ktorý neobsahuje tyrozín. Objemy doplňte na 5,0 ml kyselinou chlorovodíkovou (3.1). Pridajte 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a za stáleho miešania 3,0 ml zriedeného Folin-Ciocalteuvho činidla (3.6). Zmerajte absorbanciu spôsobom uvedeným v poslednej vete bodu 5.3. Zostrojte kalibračnú krivku vynesením absorbancií proti množstvám tyrozínu.

6. Výpočet výsledkov

Z kalibračnej krivky odčítajte množstvo tyrozínu, v μmóloch, zodpovedajúce absorbancii farebného roztoku, a korigujte podľa hodnoty slepého pokusu.

Aktivita pepsínu v μmóloch tyrozínu pri 25 °C, na mg a na minútu, sa vypočíta podľa vzorca:

kde:

a = množstvo tyrozínu v μmóloch odčítané z kalibračnej krivky;

p = hmotnosť pepsínu v mg pridaného podľa bodu 5.2.

7. Poznámky

7.1. Množstvo pepsínu, ktoré sa má rozpustiť, musí byť také, aby sa pri konečnom fotometrickom meraní dosiahla absorbancia 0,35 ± 0,035.

7.2. Dve jednotky na mg získané touto metódou zodpovedajú: 3,64 Ansonovým milijednotkám/mg (μmóly tyrozínu/mg/min pri 35,5 °C alebo 36 400 komerčným jednotkám/g (μmóly tyrozínu/g za 10 minút pri teplote 35,5 °C).

5. STANOVENIE VOĽNÉHO GOSYPOLU A GOSYPOLU

1. Účel a rozsah

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah voľného gosypolu, celkového gosypolu a chemicky príbuzných látok v bavlníkovom semene, v bavlníkovom extrahovanom šrote a v bavlníkových výliskoch a v kŕmnych zmesiach obsahujúcich tieto látky, v množstvách väčších ako 20 ppm.

2. Podstata metódy

Gosypol sa extrahuje v prítomnosti 3-aminopropanolu buď zmesou 2-propanolu a hexánu, ak ide o stanovovanie voľného gosypolu, alebo dimetylformamidom ak ide o stanovovanie celkového gosypolu. Gosypol sa prevedie anilínom na gosypol-dianilín, ktorého absorbancia sa zmeria pri 440 nm.

3. Chemikálie

3.1. Zmes 2-propanolu a hexánu: zmiešajte 60 objemových dielov 2-propanolu p.a. so 40 objemovými dielmi n-hexánu.

3.2. Činidlo A: vložte do 1 litrovej odmernej banky približne 500 ml zmesi 2-propanolu a hexánu (3.1), 2 ml 3 aminopropanolu, 8 ml ľadovej kyseliny octovej a 50 ml vody. Na objem 1 l doplňte zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1). Toto činidlo je stále jeden týždeň.

3.3. Činidlo B: napipetujte 2 ml 3-aminopropanolu a 10 ml ľadovej kyseliny octovej do 100 ml odmernej banky. Ochlaďte na laboratórnu teplotu a doplňte na objem 100 ml N, N-dimetylformamidom. Toto činidlo je stále jeden týždeň.

3.4. Anilín p.a.: ak absorbancia pri slepom pokuse presiahne hodnotu 0,022, anilín predestilujte nad práškovým zinkom, pričom prvých a posledných 10 % frakcie destilátu odstráňte. V chladničke a v banke z hnedého skla so zábrusovou zátkou sa bude toto činidlo uchovávať niekoľko mesiacov.

3.5. Štandardný roztok gosypolu A: vložte 27,9 mg octanu gosypolu do 250 ml odmernej banky. Rozpustite a na objem doplňte činidlom A (3.2). Napipetujte 50 ml tohto roztoku do 250 ml odmernej banky a doplňte na objem činidlom A.. koncentrácia gosypolu v tomto roztoku je 0,02 mg na ml. Pred použitím nechajte stáť jednu hodinu pri laboratórnej teplote.

3.6. Štandardný roztok gosypolu B: vložte 27,9 mg octanu gosypolu do 50 ml odmernej banky. Rozpustite a na objem doplňte činidlom B (3.3). Koncentrácia gosypolu v tomto roztoku je 0,5 mg na ml.

Štandardné roztoky gosypolu A a B sú stále 24 hodín, ak sú chránené pred svetlom.

4. Prístroje

4.1. Miešač (bubnový) približne 35 ot/min.

4.2. Spektrofotometer.

5. Postup

5.1. Skúšobná vzorka

Množstvo použitej skúšobnej vzorky závisí od predpokladaného obsahu gosypolu vo vzorke. Je výhodnejšie pracovať s malou skúšobnou vzorkou a s relatívne veľkým alikvotným podielom filtrátu, tak aby sa získalo dostatočné množstvo gosypolu na presné fotometrické meranie. Na stanovenie voľného gosypolu v bavlníkovom semene, v bavlníkovom extrahovanom šrote a v bavlníkových výliskoch by množstvo skúšobnej vzorky nemalo presiahnuť 1 g; ak ide o kŕmne zmesi to môže byť až 5 g. Väčšinou je vhodná alikvotná časť filtrátu 10 ml; mala by obsahovať 50 až 100 μg gosypolu. Na stanovenie celkového gosypolu by množstvo skúšobnej vzorky malo byť 0,5 – 5 g tak, aby alikvotná časť filtrátu 2 ml obsahovala 40 až 200 μg gosypolu.

Analýza by sa mala vykonať pri laboratórnej teplote okolo 20 °C.

5.2. Stanovenie voľného gosypolu

Vložte skúšobnú vzorku do 250 ml banky so zábrusovým hrdlom, na dno banky vložte drvené sklo. Pipetou pridajte 50 ml činidla A (3.2), banku zazátkujte a miešajte jednu hodinu v miešači. Prefiltrujte cez suchý filter a filtrát zachyťte v malej banke so zábrusovým hrdlom. Počas filtrácie lievik prikryte hodinovým sklíčkom. Napipetujte rovnaké alikvotné časti filtrátu obsahujúce 50 až 100 μg gosypolu do dvoch 25 ml odmerných baniek (A a B). Podľa potreby doplňte na objem 10 ml činidlom A (3.2). Obsah banky (A) doplňte na objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1). Tento roztok sa použije ako porovnávací roztok proti roztoku vzorky pri meraní.

Napipetujte 10 ml činidla A (3.2) do dvoch ďalších 25 ml odmerných baniek (C a D). Obsah banky (C) doplňte na objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1). Tento roztok sa použije ako porovnávací roztok proti slepému pokusu.

Do každej z baniek (D) a (B) pridajte 2 ml anilínu (3.4). Zahrievajte 30 minút nad vriacim vodným kúpeľom tak, aby sa vytvorila farba. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, doplňte na objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1), premiešajte a nechajte stáť jednu hodinu.

Zmerajte absorbanciu slepého roztoku (D) v porovnaní s porovnávacím roztokom (C), a absorbanciu roztoku vzorky (B) porovnaním s porovnávacím roztokom (A) na spektrofotometri pri 440 nm v sklenených kyvetách o hrúbke 1 cm.

Odpočítajte absorbanciu slepého roztoku od absorbancie roztoku vzorky (= korigovaná absorbancia). Z tejto hodnoty vypočítajte obsah voľného gosypolu ako je uvedené v bode 6.

5.3. Stanovenie celkového gosypolu

Vložte skúšobnú vzorku obsahujúcu 1 až 5 mg gosypolu do 50 ml odmernej banky a pridajte 10 ml činidla B (3.3). Zároveň pripravte slepý pokus tak, že vložíte 10 ml činidla B (3.3) do ďalšej 50 ml odmernej banky. Obidve banky zahrievajte 30 minút nad vriacim vodným kúpeľom. Ochlaďte na laboratórnu teplotu a obsah každej banky doplňte na objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1). Premiešajte a nechajte usadiť po dobu 10 až 15 minút, potom prefiltrujte a filtrát zachyťte do 25 ml odmerných baniek so zábrusovým hrdlom.

Napipetujte 2 ml filtrátu vzorky do dvoch 25 ml odmerných baniek a 2 ml filtrátu slepého pokusu do dvoch ďalších 25 ml baniek. Obsah jednej banky z každej série doplňte na objem 25 ml zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1). Tieto roztoky sa použijú ako porovnávacie roztoky.

Do každej z ďalších dvoch baniek pridajte 2 ml anilínu (3.4). Zahrievajte 30 minút nad vriacom vodným kúpeľom tak, aby sa vytvorila farba. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, doplňte na objem 25 ml zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1), premiešajte a nechajte stáť jednu hodinu.

Zmerajte absorbanciu tak, ako je uvedené v bode 5.2. Z tejto hodnoty vypočítajte obsah celkového gosypolu ako je uvedené v bode 6.

6. Výpočet výsledkov

Výsledky možno vypočítať buď zo špecifickej absorbancie (6.1) alebo s použitím kalibračnej krivky (6.2).

6.1. Výpočet zo špecifickej absorbancie

Špecifické absorbancie, za opísaných podmienok, sú nasledujúce:







voľný gosypol: celkový gosypol:

Obsah voľného alebo celkového gosyplu vo vzorke sa vypočíta s použitím nasledujúceho vzorca:

kde:

E = korigovaná absorbancia, stanovená podľa bodu 5.2;

P = množstvo skúšobnej vzorky v g;

a = alikvótny podiel filtrátu v ml.

6.2. Výpočet z kalibračnej krivky

6.2.1. Voľný gosypol

Pripravte 2 sady po piatich 25 ml odmerných bankách. Napipetujte 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml štandardného roztoku gosypolu A (3.5) do každej sady baniek. Doplňte na objem 10 ml činidlom A (3.2). Každú sadu doplňte o 25 ml odmernú banku obsahujúcu len 10 ml činidla A (3.2) (slepý pokus).

Doplňte objem baniek v prvej sade (vrátane banky na slepý pokus) na 25 ml zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1) (porovnávacia sada).

Pridajte 2 ml anilínu (3.4) do každej banky v druhej sade (vrátane banky na slepý pokus). Zohrievajte 30 minút nad vriacim vodným kúpeľom tak, aby sa vytvorila farba. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, doplňte objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1), premiešajte a nechajte stáť jednu hodinu (štandardná sada).

Stanovte absorbanciu roztokov v štandardnej sade podľa bodu 5.2. porovnaním so zodpovedajúcimi roztokmi porovnávacej sady. Zostrojte kalibračnú krivku vynesením absorbancií proti množstvám gosypolu (v μg).

6.2.2. Celkový gosypol

Pripravte šesť 50 ml odmerných baniek. Do prvej banky vložte 10 ml činidla B (3.3) a do ostatných baniek 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml štandardného roztoku gosypolu B (3.6) Obsah každej banky doplňte na objem 10 ml činidlom B (3.3). Zohrievajte 30 minút nad vriacim vodným kúpeľom. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, doplňte objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1), a premiešajte.

Napipetujte po 2,0 ml týchto roztokov do dvoch sád baniek pripravených po šiestich 25 ml odmerných bankách. Obsah baniek prvej sady doplňte na objem 25 ml zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1) (porovnávacia sada).

Pridajte 2 ml anilínu (3.4) do každej banky v druhej sade. Zohrievajte 30 minút nad vriacim vodným kúpeľom. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, doplňte objem zmesou 2-propanolu a hexánu (3.1), zamiešajte a nechajte stáť jednu hodinu (štandardná sada).

Stanovte absorbanciu roztokov v štandardnej sade podľa bodu 5.2. porovnaním so zodpovedajúcimi roztokmi porovnávacej sady. Zostrojte kalibračnú krivku vynesením absorbancií proti množstvám gosypolu (v μg).

6.3. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

— 15 % relatívnych, pre obsahy gosypolu menšie ako 500 ppm;

— 75 ppm, v absolútnej hodnote pre obsahy nie menšie ako 500 ppm a nie väčšie ako 750 ppm;

— 10 % relatívnych, pre obsahy väčšie ako 750 ppm;









PRÍLOHA II

▼M4 —————

▼B

4. STANOVENIE TYLOZÍNU

– difúziou na agare –

1. Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu tylozínu v krmivách, koncentrátoch a premixoch, ak je prítomný v množstvách väčších ako 2 ppm.

2. Podstata metódy

Vzorka sa vystaví pôsobeniu fosforečnanového tlmivého roztoku o hodnote pH 8, vopred zahriateho na teplotu 80 °C a potom sa extrahuje metanolom. Po odstredení sa extrakt zriedi a jeho antibiotická aktivita sa stanoví odmeraním difúzie tylozínu na agarovej pôde naočkovanom mikroorganizmom Sarcina lutea. Difúzia sa prejaví tvorbou inhibičných zón v prítomnosti mikroorganizmov. Priemer týchto zón je priamo úmerný logaritmu koncentrácie antibiotika.

3. Mikroorganizmus: Sarcina lutea ATCC č. 9341

3.1. Uchovávanie základného kmeňa

Inokulujte mikroorganizmom Sarcina lutea skúmavku so šikmým agarom pripraveným zo živnej pôdy (4.1), pH upravte na hodnotu 7,0. Inkubujte cez noc pri teplote 35 °C. Kultúru uchovávajte v chladničke a šikmý agar preočkujte každý mesiac.

3.2. Príprava bakteriálnej suspenzie

Z posledne pripravenej skúmavky so šikmým agarom (3.1) zmyte baktérie 2 – 3 ml fyziologického soľného roztoku (4.4). Touto suspenziou naočkujte Rouxovu fľašu obsahujúcu 250 ml živnej pôdy (4.1), s pH upraveným na hodnotu 7,0. Inkubujte 24 hodín pri teplote 35 °C, potom baktérie zmyte do 25 ml fyziologického soľného roztoku (4.4). Premiešajte a zrieďte túto suspenziu tak, aby ste dosiahli približne 75 % priepustnosť svetla pri 650 nm.

Ak sa suspenzia uchováva v chladničke, možno ju používať jeden týždeň.

Predbežnými skúškami na platniach so základnou pôdou na stanovenie (4.1) určite množstvo inokula, ktoré poskytne pre rôzne koncentrácie tylozínu najväčšie možné inhibičné zóny, ktoré budú ešte stále číre. Živná pôda sa očkuje pri teplote 48 °C až 50 °C.

4. Živná pôda a chemikálie

4.1. Základná živná pôda na stanovenie ( 5 )







Glukóza 1 g Tripsínový peptón 10 g Mäsový extrakt 1,5 g Kvasničný extrakt 3 g Agar, v závislosti od kvality 10 až 20 g Destilovaná voda do objemu 1 000 ml

V prípade uchovávania základného kmeňa a prípravy baktériovej suspenzie upravte pH bezprostredne pred použitím na hodnotu 7,0 a v prípade stanovenia na hodnotu 8,0.

4.2. Fosforečnanový tlmivý roztok, pH 8







Dihydrogénfosforečnan draselný KH2PO4 p.a. 0,523 g Hydrogénfosforečnan didraselný K2HPO4 p.a. 16,730 g Destilovaná voda do objemu 1 000 ml

4.3. Fosforečnanový tlmivý roztok, pH 7







Dihydrogénfosforečnan draselný KH2PO4 p.a. 5,5 g Hydrogénfosforečnan didraselný K2HPO4 p.a. 13,6 g Destilovaná voda do objemu 1 000 ml

4.4. Sterilný fyziologický soľný roztok.

4.5. Čistý metanol.

4.6. 40 % (/v/v)metanol.

4.7. Zmes fosforečnanový tlmivý roztok (4.2)/čistý metanol: v objemových dieloch 60/40.

4.8. Štandardná látka: Tylozín o známej aktivite.

5. Štandardné roztoky

Štandardnú látku (4.8) vysušte 3 hodiny pri teplote 60 °C vo vákuovej sušiarni (5 mm ortuťového stĺpca). Navážte 10 až 50 mg do odmernej banky, rozpustite v 5 ml metanolu (4.5) a roztok zrieďte fosforečnanovým tlmivým roztokom s pH 7 (4.3) tak, aby ste dosiahli koncentráciu typlozínu 1000 μg na ml.

Pripravte štandardný pracovný roztok S8 obsahujúci 2 μg na ml tylozínu zriedením zmesou (4.7).

Potom pripravte následnými riedeniami (1 + 1)zmesou (4.7), nasledovné koncentrácie:







S4 1 μg/ml S2 0,5 μg/ml S1 0,25 μg/ml

6. Extrakcia

Ak ide o koncentráty použite 10 g skúšobnej vzorky; ak ide o premixy a krmivá 20 g skúšobnej vzorky. Pridajte 60 ml fosforečnanového tlmivého roztoku s hodnotou pH 8 (4.2), vopred zahriateho na teplotu 80 °C a homogenizujte 2 minúty v mixéri (domáci mixér, Ultra-Turax, atď.).

Nechajte stáť 10 minút, pridajte 40 ml metanolu (4.5) a homogenizujte 5 minút. Extrakt odstreďte a alikvotnú primeranú časť zrieďte zmesou (4.7) tak, aby ste dosiahli predpokladanú koncentráciu tylozínu 2 μg/ml (= U8). Potom pripravte koncentrácie U4, U2 a U1 následnými riedeniami (1 + 1) zmesou (4.7).

Pre obsahy menšie ako 10 ppm odparte extrakt do sucha v rotačnej odparke pri teplote 35 °C a zvyšok rozpustite v 40 % metanole (4.6).

7. Metóda stanovenia

7.1. Inokulácia živnej pôdy

Inokulujte pri teplote 48 až 50 °C základnú živnú pôdu na stanovenie (4.1), hodnotu pH upravte na 8,0 bakteriálnou suspenziou (3.2).

7.2. Príprava platní

Difúzia na agare sa vykoná na platniach so 4 koncentráciami štandardného roztoku (S8, S4, S2, S1) a 4 koncentráciami extraktu (U8 U4, U2 a U1). Štyri koncentrácie extraktu a štandardného roztoku sa musia naniesť na každú platňu.

Z tohto dôvodu zvoľte dostatočne veľké platne, aby bolo možné urobiť do agarovej pôdy najmenej 8 jamiek o priemere 10 až 13 mm. Vypočítajte množstvo inokulovanej živnej pôdy (7.1) potrebné na získanie rovnomernej vrstvy približne 2 mm hrubej. Skúška by sa mala prednostne vykonať na sklenených platniach s dobre priliehajúcim hliníkovým alebo plastovým rámom o priemere 200 mm a výške 20 mm.

Do jamiek napipetujte presne odmerané množstvá od 0,10 do 0,15 ml roztoku antibiotika, v závislosti od priemeru jamiek.

Pri každej vzorke zopakujte difúziu aspoň 4-krát s každou koncentráciou tak, aby sa pri každom stanovení vyhodnotilo 32 inhibičných zón.

7.3. Inkubácia

Platne inkubujte cez noc pri teplote 35 až 37 °C.

8. Vyhodnotenie

Odmerajte priemer inhibičných zón, najlepšie projekciou. Zaznamenajte merania na semilogaritmický papier, vynesením logaritmu koncentrácií proti priemeru inhibičných zón. Zakreslite priamky štandardného roztoku a extraktu. Tieto dve priamky budú rovnobežné, za predpokladu, že nedošlo k interferencii.

Logaritmus relatívnej aktivity sa vypočíta podľa nasledovného vzorca:

Skutočná aktivita = predpokladaná aktivita x relatívna aktivita

9. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % relatívnych.

▼M2

5. STANOVENIE OBSAHU VIRGINIAMYCÍNU

— difúziou v agarovom médiu —

1. Účel a oblasť

Táto metóda slúži na stanovenie obsahu virginiamycínu v krmivách a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 2 mg/kg (2 ppm) ( 6 ).

2. Podstata

Vzorka sa extrahuje pomocou metylalkoholového roztoku Tween 80. Extrakt sa dekantuje alebo odstredí a zriedi. Jeho antibiotická aktivita sa určí zmeraním difúzie virginiamycínu v agarovom médiu, naočkovanom mikroorganizmom Micrococcus luteus. Difúzia sa prejaví vznikom inhibičných zón mikroorganizmu. Priemer týchto zón sa považuje za priamo úmerný logaritmu koncentrácie antibiotík v celom rozsahu použitých koncentrácií antibiotík.

3. Mikroorganizmus: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Udržiavanie zásobnej kultúry

Naočkujte šikmé plochy kultivačného média (4.1) v skúmavkách mikroorganizmom Micrococcus luteus a inkubujte 24 hodín pri teplote 30 °C. Skladujte kultúru v chladničke pri teplote asi 4 °C. Preočkujte každé dva týždne.

3.2. Príprava bakteriálnej suspenzie ( 7 )

Zozbierajte produkt z čerstvo pripravenej šikmej plochy agaru (3.1) pomocou 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Túto suspenziu použite na naočkovanie 250 ml kultivačného média (4.1), v Rouxovej banke a inkubujte 18 až 20 hodín pri teplote 30 °C. Zozbierajte produkt do 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a zamiešajte. Zrieďte suspenziu na 1/10 pomocou roztoku chloridu sodného (4.3). Priechod svetla suspenziou musí byť asi 75 %, meraný pri 650 nm v kyvete o priemere 1 cm oproti roztoku chloridu sodného (4.3). Túto suspenziu možno skladovať 1 týždeň pri teplote cca 4 °C.

4. Kultivačné médiá a činidlá

4.1. Kultivačné a skúšobné médium ( 8 )







Mäsový bujón 6,0 g Tryptón 4,0 g Kvasinkový extrakt 3,0 g Mäsový extrakt 1,5 g Glukóza 1,0 g Agar 10,0 až 20,0 g Voda 1 000 ml ph 6,5 (po sterilizácii).

4.2. Fosfátový pufer, pH 6







Hydrofosforečnan draselný, K2HPO4 2,0 g Dihydrofosforečnan draselný, KH2PO4 8,0 g Voda do 1 000 ml

4.3. Chlorid sodný, roztok 0,8 % (w/v): rozpustite 8 g chloridu sodného vo vode a zrieďte na 1 000 ml; sterilizujte.

4.4. Metylalkohol.

4.5. Zmes fosfátového pufra (4.2)/metylalkoholu (4.4): 80/20 (v/v).

4.6. Tween 80 metylalkoholový roztok 0,5 %: rozpustite 5 g Tween 80 v metylalkohole (4.4) a zrieďte metylalkoholom na 1 000 ml.

4.7. Štandardná látka: virginiamycín o známej aktivite.

5. Štandardné roztoky

Rozpustite presne navážené množstvo štandardnej látky (4.7) v metylalkohole (4.4) a zrieďte metylalkoholom (4.4), aby ste dostali zásobný roztok obsahujúci 1 000 μg virginiamycínu na ml.

Tento roztok, skladovaný v uzatvorenej banke pri teplote 4 °C, zostane stabilný až päť dní.

Z tohto zásobného roztoku pripravte postupným riedením pomocou zmesi (4.5) nasledujúce roztoky:







s8 1 μg/ml s4 0,5 μg/ml s2 0,25 μg/ml s1 0,125 μg/ml

6. Príprava extraktu a skúšobných roztokov

6.1. Extrakcia

6.1.1. Produkty s obsahom virginiamycínu do 100 mg/kg

Navážte 50 g vzorky, pridajte 200 ml roztoku (4.6) a trepte 30 minút. Nechajte usadiť alebo odstreďte, odoberte 20 ml supernatantu (vyčíreného roztoku) a odparte na cca 5 ml v rotačnej odparke pri teplote nepresahujúcej 40 °C. Zvyšok zrieďte zmesou (4.5), aby ste získali očakávaný obsah virginiamycínu 1 μg/ml (= u8).

6.1.2. Produkty s obsahom virginiamycínu nad 100 mg/kg

Navážte vzorku o množstve najviac 10,0 g a obsahujúce 1 až 50 mg virginiamycínu, pridajte 100 ml roztoku (4.6) a trepte 30 minút. Nechajte usadiť alebo odstreďte a potom zrieďte supernantant so zmesou (4.5), aby ste získali očakávaný obsah virginiamycínu 1 μg/ml (= u8).

6.2. Skúšobné roztoky

Z roztoku u8 pripravte roztoky u4 (očakávaný obsah: 0,5 μg/ml), u2 (očakávaný obsah. 0,25 μg/ml) a u1 (očakávaný obsah. 0,125 μg/ml) postupným riedením (1 + 1) zmesou (4.5).

7. Skúšobný postup

7.1. Očkovanie skúšobného média

Naočkujte skúšobné médium (4.1) bakteriálnou suspenziou (3.2) pri teplote cca 50 °C. Predbežnými skúškami na platniach s médiom (4.1) stanovte množstvo bakteriálnej suspenzie, potrebné na vznik najväčších a najzreteľnejších inhibičných zón s rôznymi koncentráciami virginiamycínu.

7.2. Príprava platní

Difúzia v agare sa vykoná na platniach so štyrmi koncentráciami štandardného roztoku (s8, s4, s2 a s1) a štyrmi koncentráciami skúšobného roztoku (u8, u4, u2 a u1). Tieto štyri koncentrácie extraktu a štandardného roztoku sa musia umiestniť na každú platňu. Preto vyberte dostatočne veľké platne, ktoré umožnia vytvoriť v agare aspoň osem jamiek o priemere 10 až 13 mm a aspoň s 30 mm odstupom medzi ich stredmi. Skúšku môžete vykonať na sklenených platniach s hliníkovým alebo umelohmotným prstencom o priemere 200 mm a výške 20 mm, pripevneným na nich.

Nalejte na platne médium (4.1) naočkované podľa bodu 7.1 v takom množstve, aby ste získali vrstvu s približnou hrúbkou 2 mm (60 ml na platňu s priemerom 200 mm). Nechajte stuhnúť vo vodorovnej polohe, vyvŕtajte jamky a nalejte do nich presne odmerané množstvá skúšobných a štandardných roztokov (od 0,10 do 0,15 ml do jednej jamky, v závislosti od priemeru). Každú koncentráciu aplikujte aspoň štyri razy, aby bolo každé stanovenie predmetom hodnotenia 32 inhibičných zón.

7.3. Inkubácia

Inkubujte platne 16 až 18 hodín pri teplote 30 ± 2 °C.

8. Hodnotenie

Odmerajte priemer inhibičných zón s presnosťou na 0,1 mm. Zaznamenajte priemerné hodnoty meraní každej koncentrácie na semilogaritmický papier, znázorniac logaritmus koncentrácií vo vzťahu k priemerom inhibičných zón. Zakreslite optimálnu rastovú krivku štandardného roztoku aj extraktu podľa nižšie uvedeného príkladu:

Stanovte „optimálny“ rastový bod na najnižšiu koncentráciu štandardu (SL) pomocou vzorca:

a)

Stanovte „optimálny“ rastový bod na najvyššiu koncentráciu štandardu (SH) pomocou vzorca:

b)

Obdobne vypočítajte „optimálne“ rastové body na najnižšiu koncentráciu extraktu (UL) a najvyššiu koncentráciu extraktu (UH), pričom s1, s2, s4 a s8 vo vzorci uvedenom vyššie nahradíte hodnotami u1, u2, u4 a u8.

Vypočítané hodnoty SL a SH zaznamenajte na ten istý grafický papier a spojte ich, aby ste získali „optimálnu“ rastovú krivku na štandardný roztok. Obdobne zaznamenajte UL a UH a spojte ich, čím získate „optimálnu“ rastovú krivku na extrakt.

Ak neexistujú žiadne interferencie, krivky majú byť rovnobežné. Z praktických dôvodov krivky možno považovať za rovnobežné, ak hodnoty (SH – SL) a (UH – UL) sa neodlišujú od svojej priemernej hodnoty o viac ako 10 %.

Ak krivky nie sú rovnobežné, môžete vynechať buď u1 a s1 alebo u8 a s8 a vypočítať SL, SH, UL a UH pomocou alternatívnych vzorcov, aby ste získali alternatívne krivky „optimálneho“ rastu:







a′) SL = alebo b′) SH = alebo

a obdobne pre UL a UH. Musia byť splnené rovnaké kritériá rovnobežnosti. V záverečnej správe treba uviesť, že výsledok bol vypočítaný z troch koncentrácií.

Keď sa krivky považujú za rovnobežné, vypočítajte logaritmus relatívnej aktivity (log A) pomocou jedného z nasledujúcich vzorcov podľa toho, či pri hodnotení rovnobežnosti boli použité tri alebo štyri koncentrácie.

Pre štyri koncentrácie

c)

Pre tri koncentrácie

d)

alebo

d′)

Aktivita skúšobného extraktu = aktivita príslušného štandardu x A

(u8 = s8 × A)

Ak sa relatívna aktivita nachádza mimo rozsahu 0,5 až 2,0, zopakujte skúšku, pričom vhodne upravte koncentrácie extraktu alebo ak to nie je možné, koncentrácie štandardných roztokov. Ak nie je možné dosiahnuť, aby relatívna aktivita bola v požadovanom rozpätí, každý získaný výsledok musí byť považovaný za približný a túto skutočnosť treba uviesť v záverečnej správe.

Keď sa krivky nepovažujú za rovnobežné, zopakujte stanovenie. Ak ani potom nedosiahnete rovnobežnosť, stanovenie musíte považovať za neuspokojivé.

Výsledok vyjadrite v miligramoch virginiamycínu na kilogram krmiva.

9. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch súbežných stanovení, vykonaných na tej istej vzorke tým istým analytikom, nesmie presiahnuť:

— 2 mg/kg v absolútnej hodnote pri obsahoch virginiamycínu do 10mg/kg,

— 20 % z najvyššej hodnoty pri obsahoch od 10 do 25 mg/kg,

— 5 mg/kg v absolútnej hodnote pri obsahoch od 25 do 50 mg/kg,

— 10 % z najvyššej hodnoty pri obsahoch nad 50 mg/kg.