1991R2568 — SK — 01.01.2014 — 025.001

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

Zmenené a doplnené:







(*) Tento akt nebol zatiaľ uverejnený v slovenčine.









▼B

NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91

z 11. júla 1991,

o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických metódach







KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, so zreteľom na nariadenie Rady č. 136/66/EHS z 22. septembra 1966 o založení spoločnej organizácie trhu s olejmi a tukmi ( 1 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením (EHS) č. 3577/90 ( 2 ), a najmä na jeho článok 35 a, keďže príloha k nariadeniu č. 136/66/EHS zahŕňa opisy a definície olivového oleja a oleja z olivových zvyškov predávané v každom členskom štáte, v obchodovaní v rámci spoločenstva a obchodovaní s tretími krajinami; keďže by sa na účely rozlíšenia medzi rôznymi druhmi oleja mali stanoviť fyzikálne a chemické vlastnosti každého z nich a organoleptické vlastnosti panenského oleja s cieľom zaručiť čistotu a kvalitu príslušných produktov bez toho, aby boli dotknuté ostatné existujúce ustanovenia; keďže by sa prítomnosť vlastností rôznych druhov oleja mala stanoviť jednotne v rámci spoločenstva; keďže by sa na tento účel mali v rámci spoločenstva zaviesť metódy chemickej analýzy a organoleptického hodnotenia; keďže by sa na prechodné obdobie malo povoliť používanie iných metód analýzy platných v členských štátoch za predpokladu, že v prípade rozdielu vo výsledkoch budú rozhodujúce tie, ktoré sa získali použitím obvyklej metódy; keďže definovanie fyzikálnych a chemických vlastností olivového oleja a metód analýzy si vyžiadalo prílohu s doplňujúcimi poznámkami ku kapitole 15 colného sadzobníka; keďže pre metódu hodnotenia organoleptických vlastností panenského oleja je potrebné zostavenie skupín vybraných a vyškolených hodnotiteľov; keďže by lehota potrebná na zostavenie takýchto skupín mala byť presne stanovená; keďže s prihliadnutím na problémy, na ktoré môžu niektoré členské štáty pri zostavovaní skupín hodnotiteľov naraziť, využívanie skupín v ostatných členských by malo byť autorizované; keďže, s cieľom zaistiť, aby systém poplatkov uplatňujúcich sa na dovoz olivových zvyškov fungoval správne, bolo by potrebné ustanoviť jednotnú metódu na stanovenie obsahu oleja v týchto produktoch; keďže s cieľom neuškodiť obchodu by bolo potrebné zaviesť ustanovenie pre olej plnený do obalov pred nadobudnutím účinnosti tohto nariadenia, ktoré by obmedzovalo predávanie tohto oleja počas stanovenej lehoty; keďže je potrebné zrušiť nariadenie Komisie (EHS) č. 1058/77 ( 3 ), naposledy zmenené a doplnené nariadením EHS č. 1858/88 ( 4 ); keďže Riadiaci výbor pre oleje a tuky nezaslal svoje stanovisko v lehote, ktorú určil jeho predseda, PRIJALA TOTO NARIADENIE:







▼M20

Článok 1

1. Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považujú za panenské olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

2. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za lampantový olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

3. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

4. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za olivový olej zmiešaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

5. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za surový zvyškový olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

6. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

7. Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za zvyškový olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

▼B

Článok 2

1. Vlastnosti olejov, ustanovené v prílohe I, sa budú stanovovať v súlade s nižšie uvedenými metódami analýzy:

— na stanovenie voľných mastných kyselín, vyjadrených ako percento kyseliny olejovej, metóda uvedená v prílohe II,

— na stanovenie peroxidového čísla metóda uvedená v prílohe III,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— na stanovenie obsahu sterolov metóda uvedená v prílohe V,

— na stanovenie erytrodiolu a uvaolu metóda uvedená v prílohe VI,

▼M21

— na stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu metóda uvedená v prílohe VII,

▼M20 —————

▼B

— na spektrofotometrickú analýzu metóda uvedená v prílohe IX,

— na stanovenie zloženia mastných kyselín metóda uvedená v prílohe X A a X B,

— na stanovenie prchavých halogenovaných rozpúšťadiel metóda uvedená v prílohe XI,

— na hodnotenie organoleptických vlastností panenského olivového oleja metóda uvedená v prílohe XII,

▼M20 —————

▼M11

— na stanovenie stigmastadiénov, metóda uvedená v prílohe XVII,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX,

▼M23

— na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou metóda uvedená v prílohe XX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Na účely overenia stanoveného v odseku 3 sa analýzy uvedené v prílohách II, III, IX, X a XII a akékoľvek krížové analýzy požadované podľa vnútroštátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokiaľ sa odber vzoriek vykoná viac ako štyri mesiace pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti, analýza by sa mala vykonať najneskôr po uplynutí štyroch mesiacov nasledujúcich po mesiaci odberu vzorky. Na iné analýzy stanovené v tomto nariadení sa neuplatňujú žiadne časové obmedzenia. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M25

Článok 2a

1. Na účely tohto článku označuje „predávaný olivový olej“ celkové množstvo olivového oleja a zvyškového olivového oleja príslušného členského štátu, ktorý sa v tomto štáte spotrebuje alebo sa z neho vyvezie.

2. Členské štáty zabezpečia selektívne a primerane časté vykonávanie kontrol zhody na základe analýzy rizík, aby sa zaistilo, že predávaný olivový olej je v súlade s deklarovanou kategóriou.

3. Kritéria na posúdenie rizík môžu zahŕňať aj:

a) kategóriu oleja, obdobie výroby, cenu oleja vzhľadom na cenu iných rastlinných olejov, postupy miešania a balenia, skladovacie zariadenia a podmienky, krajinu pôvodu, krajinu určenia, spôsob prepravy alebo objem zásielky;

b) pozíciu subjektov v obchodnom reťazci, objem a/alebo hodnotu oleja, ktorý predávajú, kategórie oleja, ktoré predávajú, druh vykonávanej podnikateľskej činnosti, ako je mletie, skladovanie, rafinovanie, miešanie, balenie alebo maloobchodný predaj;

c) zistenia z predchádzajúcich kontrol vrátane počtu a druhu zistených nedostatkov, obvyklej kvality predávaného oleja, úrovne používaného technického vybavenia;

d) spoľahlivosť systémov zaistenia kvality alebo systémov samokontroly subjektu týkajúcich sa dodržiavania obchodných noriem;

e) miesto vykonávania kontrol, najmä či ide o prvé miesto vstupu do Únie, posledné miesto výstupu z Únie alebo miesto výroby, balenia, nakladania alebo predaja oleja koncovému spotrebiteľovi;

f) akékoľvek ďalšie informácie, ktoré môžu poukazovať na riziko nedodržiavania noriem.

4. Členské štáty vopred ustanovia:

a) kritériá posúdenia rizika nedodržiavania obchodných noriem pri zásielkach;

b) na základe analýzy rizík pre každú rizikovú kategóriu minimálny počet subjektov alebo zásielok a/alebo množstiev, pri ktorých sa vykonajú kontroly zhody.

Ročne sa vykoná minimálne jedna kontrola zhody na tisíc ton predávaného olivového oleja v členskom štáte.

5. Členské štáty overujú súlad:

a) vykonaním analýz stanovených v prílohe I v ľubovoľnom poradí alebo

b) postupne v poradí stanovenom v prílohe Ib v rozhodovacom strome, až kým nedosiahnu jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.

▼M19 —————

▼M25

Článok 3

Ak sa zistí, že určitý olej nezodpovedá jeho opisu kategórie, dotknutý členský štát uplatňuje bez toho, aby boli dotknuté akékoľvek iné pokuty, účinné, primerané a odrádzajúce sankcie, ktoré treba stanoviť vzhľadom na závažnosť zistených nezrovnalostí.

Pokiaľ sa pri kontrolách zistia výrazné nezrovnalosti, zvýšia členské štáty periodicitu kontrol, ktoré sa týkajú stupňa uvedenia na trh, kategórie oleja, pôvodu alebo iných kritérií.

▼M5

Článok 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degustačných porôt na svojom území na ťažkosti, môžu sa obrátiť na degustačnú porotu schválenú v inom členskom štáte.

3. Každý členský štát vypracuje zoznam degustačných porôt ustanovených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpečí dosiahnutie súladu s týmito podmienkami.

▼M19 —————

▼B

Článok 6

1. Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvyškov, ktoré vznikajú pri extrakcii olivového oleja (číselné znaky KN 2306 90 11 a 2306 90 19 ), sa stanoví použitím metódy uvedenej v prílohe XV.

2. Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmotnosti oleja ku hmotnosti sušiny.

▼M20

Článok 7

Uplatňujú sa ustanovenia spoločenstva týkajúce sa prítomnosti nečistôt.

Pokiaľ ide o halogénované rozpúšťadlá, pre všetky kategórie olivových olejov platia nasledovné limity:

— maximálny objem každého detekovaného halogénovaného rozpúšťadla: 0,1 mg/kg,

— maximálny celkový objem detekovaných halogénovaných rozpúšťadiel: 0,2 mg/kg.

▼M25

Článok 7a

Fyzické alebo právnické osoby a skupiny osôb, ktoré skladujú olivový olej a zvyškový olivový olej od štádia extrakcie v mlyne až po štádium plnenia do fliaš na akékoľvek odborné alebo komerčné účely, sú povinné viesť evidenciu o vstupe a výstupe každej kategórie tohto oleja.

Členský štát zaistí riadne dodržiavanie povinnosti ustanovenej v prvom odseku.

▼M25

Článok 8

1. Členské štáty Komisii oznámia opatrenia na vykonávanie tohto nariadenia. Komisiu informujú o ich akýchkoľvek následných zmenách.

▼B

2. Členský štát na začiatku každého polroka zašle Komisii prehľad analytických údajov o uskutočnených testoch za predchádzajúci polrok.

Výsledky bude posudzovať Riadiaci výbor pre oleje a tuky v súlade s postupmi uvedenými v článku 39 nariadenia č. 136/66/EHS.

▼M25

3. Oznámenia uvedené v tomto nariadení sa podávajú podľa nariadenia Komisie (ES) č. 792/2009 ( 5 ).

▼B

Článok 9

Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zrušuje.

Článok 10

1. Táto smernica nadobúda účinnosť tretí deň od jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.

Postup uvedený v prílohe XII sa však bude uplatňovať od ►M1 1. novembra 1992 ◄ , okrem postupov týkajúcich sa systému intervencie.

▼M5

Daná metóda sa neuplatňuje na panenský olivový olej pripravený na trh pred 1. novembrom 1992.

▼B

2. Toto nariadenie sa nebude uplatňovať na olivový olej a olej z olivových zvyškov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie nadobudlo účinnosť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.

Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.









PRÍLOHY

Obsah







Príloha I: Vlastnosti olivových olejov Príloha Ia: Odbor vzoriek olivového oleja a zvyškového olivového oleja v priamom obale do 100 litrov Príloha Ib: Rozhodovací strom Príloha II: ►M21 Stanovenie voľných mastných kyselín, studená metóda ◄ Príloha III: Stanovenie peroxidového čísla Príloha IV: ►M6 Stanovenie obsahu vosku plynovo - kvapalinovou chromatografiou s použitím kapilárnej kolóny ◄ Príloha V: Stanovenie zloženia a obsahu sterolov metódou kapilárnej plynovej Príloha VI: Stanovenie erytrodiolu a uvaolu Príloha VII: ►M21 Stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu ◄ ▼M20 ————— ▼B Príloha IX: Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti Príloha X A: Analýza metylesterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil Príloha XI: Stanovenie prchavých halogenovaných rozpúšťadiel v olivovom oleji Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Príloha XV: Obsah oleja v olivových zvyškoch Príloha XVI: Stanovenie jódového čísla Príloha XVII: Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch Príloha XVIII: Stanovenie rozdielu medzi skutočným a teoretickým obsahom triglyceridov s ECN 42 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content ▼M23 Príloha XX: Metóda na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou ▼M25 Príloha XXI: Výsledky kontrol zhody vykonaných na olivovom oleji podľa článku 8 ods. 2

▼M23









PRÍLOHA I

VLASTNOSTI OLIVOVÝCH OLEJOV







Kategória Metylestery mastných kyselín (FAME) a etylestery mastných kyselín (FAEE) Acidita (%) (*) Peroxidové číslo mEq O2/kg (*) Vosky mg/kg (**) 2-glyceril monopalmitát (%) Stigmastadién mg/kg (1) Rozdiel: ECN42 (HPLC) a ECN42 (teoretický výpočet) K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptické hodnotenie Medián defektoru (Md) (*) Organoleptické hodnotenie Medián ovocnosti (Mf) (*) 1. Extra panenský olivový olej Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg alebo 75 mg/kg < Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg a (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkom ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkom > 14 % 2. Panenský olivový olej — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkom ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkom > 14 % 3. Lampantový olivový olej — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkom ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkom > 14 % 4. Rafinovaný olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkom ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkom > 14 % 5. Olivový olej - zložený z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkom ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkom > 14 % 6. Surový olej z olivových výliskov — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinovaný olej z olivových výliskov — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olej z olivových výliskov — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategória Obsah kyselín (1) Súhrn trans- izomérov kyseliny olejovej (%) Súhrn trans- izomérov kyselín linolovej + linolenovej (%) Zloženie sterolov Steroly celkom (mg/kg) Erytrodiol a uvaol (%) (**) Myristová (%) Linolenová (%) Arašidová (%) Eikozánová (%) Behénová (%) Lignocerová (%) Cholesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7- stigmastenol (%) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Panenský olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampantový olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Zmiešaný olivový olej - zložený z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surový olej z olivových výliskov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinovaný olej z olivových výliskov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olej z olivových výliskov ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









PRÍLOHA Ia

ODBOR VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA A ZVYŠKOVÉHO OLIVOVÉHO OLEJA V PRIAMOM OBALE DO 100 LITROV

Táto metóda odberu vzoriek sa uplatňuje na dodávky olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja nepresahujúce 125 000 litrov, umiestneného v priamom obale do 100 litrov.

Ak dodávka prekračuje 125 000 litrov, musí sa rozdeliť na dávky v objeme najviac 125 000 litrov. Ak je dodávka menšia ako 125 000 litrov, tvorí jednu dávku. Táto metóda sa potom uplatňuje na každú dávku.

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s tabuľkou uvedenou v bode 1.

Veľkosť primárnej vzorky je určená na základe objemu priameho obalu, podľa tabuľky uvedenej v bode 2.1.

Termíny dodávka, primárna vzorka a laboratórna vzorka majú význam podľa definícií uvedených v norme EN ISO 5555.

„Dávka“ znamená sadu predajných jednotiek, ktoré sa vytvárajú, vyrábajú a označujú v príslušných podmienkach tak, aby sa olej, nachádzajúci sa v konkrétnej predajnej jednotke mohol posudzovať ako homogénny, pokiaľ ide o všetky analytické charakteristiky.

1. POČET PRIMÁRNYCH VZORIEK NA ODBER

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s touto tabuľkou:







Veľkosť dávky (v litroch) menšia ako Minimálny počet primárnych vzoriek 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Priame obaly vybrané na vytvorenie primárnej vzorky musia byť v rámci dávky susediace.

V prípade pochybnosti, členské štáty zvyšujú počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať.

2. OBSAH PRIMÁRNYCH VZORIEK

2.1 Primárne vzorky musia obsahovať:



Pokiaľ má priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z: a) aspoň 5 litrov a) 3 priamych obalov b) aspoň 3 litre, ale menej ako 5 litrov b) 3 priamych obalov c) aspoň 2 litre, ale menej ako 3 litre c) 3 priamych obalov d) aspoň 1 liter, ale menej ako 2 litre d) 6 priamych obalov e) aspoň 0,75 litra, ale menej ako 1 liter e) 6 priamych obalov f) menej ako 0,75 litra f) trojnásobku množstva oleja z minimálneho počtu obalov s celkovým objemom viac ako 1,5 litra

2.2 Primárne vzorky sa do doby analýzy uchovávajú v priamych obaloch. Olej v primárnej vzorke sa potom ďalej rozdeľuje, pokiaľ je to možné, do troch laboratórnych vzoriek s cieľom: a) analýz spomínaných v prílohách II, III, IX a X; b) analýz spomínaných v prílohách XII; c) iných analýz.

2.3 Balenia, ktoré tvoria primárnu vzorku sa rozdeľujú na menšie časti v súlade s kontrolnými postupmi ustanovenými vo vnútroštátnych právnych predpisoch.

3. ANALÝZA A VÝSLEDKY

a) Každá primárna vzorka uvedená v bode 1 sa rozdeľuje do laboratórnych vzoriek v súlade s bodom 2.5 normy EN ISO 5555 a analyzuje takto: — určenie voľných mastných kyselín podľa prvej zarážky článku 2 ods. 1, — určenie peroxidového čísla podľa druhej zarážky článku 2 ods. 1, — spektrofotometrická analýza podľa ôsmej zarážky článku 2 ods.1, — určenie skladby mastných kyselín podľa deviatej zarážky článku 2 ods. 1.

b) Pokiaľ jeden z výsledkov analýz, uvedených pod písmenom a, aspoň na jednej primárnej vzorke odobratej z rovnakej dávky nie je v súlade s charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá príslušná dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu. Pokiaľ výsledky analýz, uvedených pod písmenom a, na primárnych vzorkách z rovnakej dávky nie sú jednotné za predpokladu opakovateľnosti príslušných metód, celá dávka sa vyhlási za nejednotnú a všetky primárne vzorky sa podrobia ďalším požadovaným analýzam. V opačnom prípade sa ďalším analýzam podrobuje iba jedna primárna vzorka z dávky.

c) Pokiaľ niektorý z výsledkov analýz, uvedených v druhom odseku písmena b, nie je v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za nevyhovujúcu. Pokiaľ všetky výsledky analýz, uvedených v druhom odseku písmena b, sú v súlade charakteristikami deklarovanej kategórie oleja, celá dávka sa vyhlási za vyhovujúcu.

▼M20









PRÍLOHA Ib

ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU

Analýzu na overenie súladu olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja s deklarovanou kategóriou je možné vykonať:

a) buď vykonaním analýz určených na overenie súladu s charakteristikami stanovenými v prílohe I, a to v náhodnom poradí;

b) alebo postupne, v poradí stanovenom v prílohe Ib na rozhodovacom strome, až kým sa nedosiahne jedno z riešení nachádzajúcich sa v rozhodovacom strome.

Analýzy týkajúce sa nečistôt, požadované na overenie súladu s normami Európskeho spoločenstva, sa vykonávajú samostatne.

Rozhodovací strom sa uplatňuje na všetky kategórie olivového oleja a zvyškového olivového oleja. Skladá sa z tabuliek očíslovaných od 1 do 11, ku ktorým sa musí pristupovať na základe deklarovanej kategórie príslušného oleja v poradí stanovenom vo všeobecnej tabuľke.

Kľúč k všeobecným tabuľkám 1 až 11:

— dvojitá čiara (=) ukazuje cestu, po ktorej treba ísť v prípade súladu (kladnej odpovede) s kritériami stanovenými v predchádzajúcom okienku. Bodkovaná čiara (…) naznačuje alternatívnu cestu, ktorá sa má použiť v prípade nesúladu,

— položky v okienkach v tabuľkách 1 až 11 sa vzťahujú na analýzy stanovené v tomto nariadení na základe tabuľky rovnocennosti stanovenej v doplnku 1 k tejto prílohe,

— písmená v zátvorkách nachádzajúce sa v kruhoch negatívneho rozhodnutia v tabuľkách 1 až 11 poskytujú krížovú referenciu na indikatívnu informáciu poskytnutú v doplnku 2 k tejto prílohe. Sami o sebe písmená neznamenajú nutnosť vykonávať analýzy alebo naznačovať pravdivosť uvedených predpokladov.









Doplnok 1

Tabuľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými v rozhodovacom strome







▼M21 — Acidita/kyslosť Príloha II Stanovenie voľných mastných kyselín, studená metóda ▼M20 – Peroxidové číslo Príloha III Určenie peroxidového čísla – UF spektrometria Príloha IX Spektrofotometrická analýza – Organoleptické hodnotenie Príloha XII Organoleptické hodnotenie panenského olivového oleja – 3,5- stigmastadiény Príloha XVII Metóda určovania stigmastadiénov v rastlinných olejoch – Trans-izoméry mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín – Obsah mastných kyselín Príloha Xa a Analýza metyl esterov mastných kyselín plynovou chromatografiou Príloha Xb Príprava metyl esterov mastných kyselín – ΔECN42 Príloha XVIII Určenie skladby triglyceridov s ECN42 (rozdiel medzi údajmi z HPLC a teoretickým obsahom) – Skladba sterolov a celkové steroly Príloha V Určenie skladby a obsahu sterolov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou – Erytrodiol a uvaol Príloha VI Určenie erytrodiolu a uvaolu — Vosky Príloha IV Určenie obsahu voskov sterolov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou – Alifatické alkoholy Príloha XIX Určenie obsahu alifatických alkoholov plynovou chromatografiou s kapilárnou kolónou ▼M21 – Mastné kyseliny nasýtené v pozícii 2 Príloha VII Stanovenie percentuálneho obsahu 2-glyceril monopalmitátu ▼M20









Doplnok 2

Tabuľka 1

a) Pozri panenský alebo lampantový olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 2 alebo Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

Tabuľka 2

a) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

b) Pozri extra panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 1)

Tabuľka 3

a) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

b) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

Tabuľka 4

a) Pozri extra panenský alebo panenský olivový olej (Kritériá kvality Tabuľka 1 a Tabuľka 2)

b) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

c) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

d) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 7

a) Prítomnosť zvyškového olivového oleja

b) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 8

a) Prítomnosť rafinovaného oleja (olivového alebo iného)

b) Pozri lampantový olivový olej (Kritériá kvality a čistoty Tabuľka 4)

c) Prítomnosť esterifikovaných olejov

Tabuľka 11

a) Prítomnosť esterifikovaných olejov

▼B









PRÍLOHA II

▼M21

STANOVENIE VOĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN, STUDENÁ METÓDA

▼B

1. STANOVENIE KYSLOSTI

Stanovenie voľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslosť vypočítaná obvyklým spôsobom.

1.1. Princíp

Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpúšťadiel a prítomné voľné mastné kyseliny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.

1.2. Činidlá

Všetky činidlá (reagenty) by mali byť schválenej analytickej kvality a mala by sa použiť buď destilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.

1.2.1. Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov. Poznámka:Dietyléter je vysoko horľavý a môže tvoriť výbušné peroxidy. Je potrebné s ním narábať opatrne. Počas použitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2), na 100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3). Poznámka: Ak sa nedá použiť dietyléter, je ho možné nahradiť zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné, etanol môžete nahradiť 2-propanolom(izo-propanolom).

1.2.2. Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) približne 0,01 mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) približne 0,5 mol/l. Musí byť známa presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju skontrolovať bezprostredne pred použitím. Používajte roztok pripravený najmenej päť dní pred termínom použitia, uschovaný v tmavej sklenenej fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal byť bezfarebný alebo vo farbe slamy. Poznámka: Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného je možné pripraviť nasledovne. Priveďte do varu 1 000 ml etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblín a nechajte vrieť pod spätným chladičom po dobu jednej hodiny. Ihneď oddestilujte. V destiláte rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Nechajte niekoľko dní odstáť a zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhličitanu draselného. Roztok môže byť rovnako pripravený aj bez destilácie a to nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium butylate“ a nechajte zmes odležať na niekoľko dní. Odlejte tekutý supernatant a rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Roztok je pripravený na použitie.

1.2.3. Fenolftaleín, 10 g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v) alebo alkalická modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v).

1.3. Prístrojové vybavenie

Bežné laboratórne vybavenie zahŕňajúce:

1.3.1. analytické váhy;

1.3.2. 250 ml kónickú banku;

1.3.3. 10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.

1.4. Postup

1.4.1. Príprava vzorky na testovanie (Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a nečistôt spolu menší ako 1 %, vzorku použite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje 1 %, je potrebné vzorku prefiltrovať.)

1.4.2. Odoberanie vzorky (vzorkovanie) Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade s nasledujúcou tabuľkou:



Predpokladané číslo kyslosti Hmotnosť vzorky (g) Presnosť váženia (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorku odvážte v kónickej banke (1.3.2).

1.4.3. Stanovenie Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 až 150 ml predtým zneutralizovanej zmesi dietyléteru a etanolu (1.2.1). Titrujte počas zmiešania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného (1.2.2) (pozri pozn. 2) až do zmeny zafarbenia indikátora (ružová farba fenolftaleínu vydrží aspoň 10 sekúnd). Poznámka 1. Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je možné nahradiť vodným roztokom hydroxidu draselného alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody nevyvolá rozdelenie fáz. Poznámka 2. Ak spotrebované množstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu draselného presiahne 10 ml, použite 0,5 ml/l roztok. Poznámka 3.Ak sa roztok počas titrácie zakalí, pridajte dostatočné množstvo rozpúšťadiel (1.2.1), aby sa roztok vyčíril.

1.5. Kyslosť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej

Kyslosť vyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:

kde:

V = objem použitého titračného roztoku hydroxidu draselného, v ml;

c = presná koncentrácia použitého titračného roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M = mólová hmotnosť v g/mol kyseliny použitej na vyjadrenie výsledku (M =282 g/mol);

m = hmotnosť vzorky v g.

Za výsledok sa považuje aritmetický ►M6 dvoch výpočtov ◄ stanovení.









PRÍLOHA III

STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1. OBLASŤ

Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla v olejoch a tukoch.

2. POUŽITIE

Táto technická norma sa vzťahuje na živočíšne a rastlinné oleje a tuky.

3. DEFINÍCIA

Peroxidové číslo je množstvo tých zložiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodid draselný za uvedených prevádzkových podmienok.

4. PRINCÍP

Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časť vzorky, kyselina octová a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvoľneného jódu štandardizovaným roztokom tiosíranu sodného.

5. PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE

Všetky použité prístroje nesmú obsahovať redukujúce alebo oxidujúce látky.

Poznámka: Nemastite zábrusové povrchy.

5.1. 3 ml sklenená navažovacia lodička

5.2. Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, približne 250 ml objemu, predsušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokiaľ možno, oxidom uhličitým).

5.3. 25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml

6. ČINIDLÁ

6.1. Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.2. Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.3. Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód a jodičnany

6.4. Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný vodný roztok, štandardizovaný tesne pred použitím

6.5. Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l, čerstvo pripravená z prírodného rozpustného škrobu

7. VZORKA

Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla, udržiavajte ju v chlade a v úplne (až povrch) naplnených sklenených zásobníkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými zátkami.

8. POSTUP

Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle. V sklenenej navažovačke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvážte s presnosťou na 0,001 g množstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabuľkou a podľa predpokladaného peroxidového čísla:







Predpokladané peroxidové číslo (meq) Hmotnosť navážky (g) 0 až 12 5,0 až 2,0 12 až 20 2,0 až 1,2 20 až 30 1,2 až 0,8 30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3

Odzátkujte banku (5.2) a vložte sklenenú navažovačku s odváženou časťou testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Miešaním rýchlo rozpustite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútu a nechajte 5 minúť stáť v tme pri teplote 15 až 25 oC.

Pridajte približne 75 ml destilovanej vody. Uvoľnený jód stitrujte roztokom tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vyššie ako 12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor použite roztok škrobu.

Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.

Zároveň vykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekročí 0,05 ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vymeňte znečistené činidlá.

9. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka na kilogram, sa udáva podľa vzorca:

kde:

V = objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného (6.4), použitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;

T = presná molarita použitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);

m = hmotnosť navážky vzorky, v (g).

Za výsledok sa bude považovať aritmetický priemer z dvoch výpočtov.

▼M21









PRÍLOHA IV

STANOVENIE OBSAHU VOSKOV POMOCOU KAPILÁRNEJ PLYNOVEJ CHROMATOGRAFIE

1. PREDMET

Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu voskov v olivových olejoch. Vosky sa separujú v závislosti od počtu atómov uhlíka. Môže sa používať najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným lisovaním a olejom získaným extrakciou (olej z výliskov).

2. PRINCÍP

Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej pri testovacích podmienkach ako prvej (ktorej polarita je nižšia ako polarita frakcie triglyceridov), potom priama analýza kapilárnou plynovou chromatografiou.

3. MATERIÁL

3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka.

3.2. Sklená kolóna na plynovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 15,0 mm, výškou 30 až 40 cm a vybavená kohútikom.

3.3. Plynový chromatograf vhodný na fungovanie s kapilárnou kolónou, vybavený systémom na priame zavádzanie do kolóny s týmito zložkami: 3.3.1. Termostatická komora pre kolóny, vybavená teplotným programátorom. 3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny. 3.3.3. Plameňovoionizačný detektor a prevodník-zosilňovač. 3.3.4. Zapisovač-integrátor schopný pracovať s prevodníkom-zosilňovačom (3.3.3), rýchlosť odozvy nižšia ako 1 sekunda, s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera. (Takisto je možné používať informatizované systémy, ktoré sú založené na získaní údajov z plynovej chromatografie prostredníctvom osobného počítača). 3.3.5. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalnou fázou, s rovnomernou hrúbkou 0,10 – 0,30 μm. (Kvapalné fázy vhodné na použitie, v obchodnej sieti ako typ SE52 alebo SE54).

3.4. Mikrostriekačka s kapacitou 10 μl na priamy nástrek do kolóny, vybavená cementovanou ihlou.

3.5. Elektrický vibrátor.

3.6. Rotačná odparka.

3.7. Mufľová pec.

3.8. Analytické váhy s garantovanou presnosťou merania na ± 0,1 mg.

3.9. Bežné laboratórne sklené pomôcky.

4. CHEMICKÉ ČINIDLÁ

4.1. Silikagél s granulometriou medzi 60 a 200 μm. Silikagél vložte do pece aspoň na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Po vychladnutí pridajte 2 % vody vzhľadom na množstvo odobraného silikagélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala. Najmenej 12 hodín pred použitím uchovávajte v tme.

4.2. n-hexán na chromatografiu.

4.3. Etyléter na chromatografiu.

4.4. n-heptán na chromatografiu.

4.5. Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný štandard). [Je tiež možné použiť palmityl-palmitát (hexadecyl-palmitát) alebo myristyl-stearát (teradecyl-oktadekanoát)]. 4.5.1. Sudán 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6. Nosný plyn: vodík alebo čisté hélium na plynovú chromatografiu.

4.7. Pomocné plyny: — čistý vodík na plynovoú chromatografiu, — čistý vzduch na plynovú chromatografiu.

5. POSTUP

5.1. Príprava chromatografickej kolóny

Suspenzujte 15 g silikagélu (4.1) v n-hexáne (4.2) a zaveďte do kolóny (3.2). Spontánne usadzovanie dokončite pomocou elektrickej trepačky (3.5) s cieľom dosiahnuť homogénnejšiu chromatografickú vrstvu. Perkolujte 30 ml n-hexánu s cieľom eliminovať všetky prípadné nečistoty. Presne odvážte pomocou váh (3.8). Vložte 500 mg vzorky do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1), pridajte primerané množstvo vnútorného štandardu (4.5) vzhľadom na predpokladaný obsah voskov. Napríklad: v prípade olivového oleja pridajte 0,1 mg laurylarašidátu a v prípade oleja z olivových výliskov 0,25 až 0,5 mg. Takto pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny s pomocou dvoch 2 ml dielov n-hexánu (4.2).

Napustite rozpúšťadlo až do výšky 1 mm nad hornú úroveň absorbentu, potom perkolujte ďalších 70 ml n-hexánu, aby sa eliminovali prirodzene prítomné n-alkány. Začnite chromatografickú elúciu zozbieraním 180 ml zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri zachovaní prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. Elúcia vzorky sa má uskutočniť pri okolitej teplote 22 °C ± 4 °C.

Poznámky:

— Zmes n-hexánu/etyléteru (99:1) sa musí pripravovať denne.

— Na umožnenie vizuálnej kontroly správnej elúcie voskov je možné pridať do vzorky roztoku 100 μl 1 %-ného sudánu v elučnej zmesi. Farbivo má retenciu na rozhraní voskov a triglyceridov, preto keď zafarbenie dosiahne dno chromatografickej kolóny, je potrebné elúciu zastaviť, lebo všetky vosky boli eluované.

Takto získanú frakciu sušte v rotačnej odparke (3.6) až do takmer úplnej eliminácie rozpúšťadla. Posledné 2 ml rozpúšťadla eliminujte pomocou slabého prúdu azotu; potom pridajte 2 – 4 ml n-heptánu.

5.2. Analýza plynovou chromatografiou

5.2.1. Predbežné úkony

Namontujte kolónu do plynového chromatografu (3.3), pričom vstupný port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte bežným spôsobom prístrojové vybavenie na plynovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača atď.).

Pokiaľ sa kolóna používa po prvý raz, je potrebné ju kondicionovať. Zaveďte do kolóny mierny prietok plynu, potom zapnite prístroj na plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 hodinách dosiahne teplota 350 °C. Túto teplotu udržiavajte najmenej počas dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky [nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču (3.3.4), nastavte teplotu komory pre kolónu, nastavte detektor atď.]. Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej, ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí byť lineárna, nesmie obsahovať píky akéhokoľvek druhu a nesmie vykazovať žiadnu odchýlku.

Negatívna priamočiara odchýlka ukazuje, že kolóna je nesprávne pripojená; pozitívna odchýlka znamená, že kolóna nebola dostatočne kondicionovaná.

5.2.2. Voľba prevádzkových podmienok

Prevádzkové podmienky, ktoré treba pozorovať, sú spravidla tieto:

— teplota kolóny: —



20 °C/minúta 5 °C/minúta 20 °C/minúta na začiatku 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— teplota detektora: 350 °C,

— množstvo vstreknutej látky: 1 μl roztoku (2 – 4 ml) n-heptánu,

— nosný plyn: hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlosťou pre zvolený plyn (pozri dodatok),

— citlivosť prístroja: taká, aby zodpovedala nižšie uvedeným podmienkam:

Uvedené podmienky môžu byť upravené v závislosti od vlastností kolóny a prístroja na plynovú chromatografiu tak, aby sa dosiahla separácia všetkých voskov, postačujúce rozlíšenie píkov (pozri obrázok) a retenčný čas vnútorného štandardu C32 bol 18 ± 3 minúty. Najreprezentatívnejší pík vosku by mal dosahovať aspoň 60 % rozsahu stupnice.

Parametre integrácie píkov sa stanovia takým spôsobom, aby sa dosiahlo správne vyhodnotenie príslušných plôch píkov.

Poznámka:Vzhľadom na vysokú konečnú teplotu sa pripúšťa kladná odchýlka, ktorá nesmie prekročiť 10 % rozsahu stupnice.

5.3. Vykonanie analýzy

Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostriekačky; natiahnite piestik dozadu, až kým ihla nebude prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd rýchlo vstreknite; po uplynutí asi piatich sekúnd ihlu pomaly vytiahnite.

Záznam nechajte prebiehať dovtedy, až kým neprebehne úplná elúcia voskov.

Základná čiara musí vždy zodpovedať požadovaným podmienkam.

5.4. Identifikácia píkov

Jednotlivé píky identifikujte z retenčných časov a porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi, analyzovanými pri rovnakých podmienkach.

Na obrázku je znázornený chromatogram voskov panenského olivového oleja.

5.5. Kvantitatívne hodnotenie

Integrátorom vypočítajte plochy píkov interného štandardu a alifatických esterov od C40 do C46.

Vypočítajte obsah voskov každého esteru v mg/kg tuku podľa príslušného vzorca:

kde:

Ax = plocha píku každého esteru v milimetroch štvorcových;

As = plocha píku vnútorného štandardu v milimetroch štvorcových,

ms = množstvo pridaného vnútorného štandardu v miligramoch;

m = množstvo vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Uveďte celkové obsahy jednotlivých voskov od C40 do C46 v mg/kg tuku (ppm).

Poznámka:Zložky, ktoré treba kvantifikovať, sa stanovujú vzhľadom na susediace píky esterov s počtom uhlíkov medzi C40 a C46 podľa príkladu chromatogramu voskov olivového oleja znázorneného na nasledujúcom obrázku. Ak sa ester C46 ukáže dvojmo, odporúča sa analyzovať na jeho identifikáciu frakciu voskov oleja z olivových výliskov, v ktorom je pík esteru C46 ľahko identifikovateľný, pretože výrazne prevažuje.

Výsledky sa uvádzajú na jedno desatinné miesto.

Obrázok

Chromatogram voskov istého olivového oleja ( 6 )

Vysvetlivky:

I.S. = laurylarašidát

1. = diterpénové estery

2 + 2′ = estery C40

3 + 3′ = estery C42

4 + 4′ = estery C44

5. = estery C46

6. = sterol-estery a triterpénový alkohol.









Dodatok

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Vstreknite do prístroja na plynovú chromatografiu nastaveného na bežné prevádzkové podmienky 1 až 3 μl metánu (alebo propánu). Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho zavedenia až dovtedy, kým sa neobjaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/sek je daná vzorcom L/tM, pričom L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.

▼B









PRÍLOHA V

STANOVENIE ZLOŽENIA A OBSAHU STEROLOV PLYNOVOU CHROMATOHRAFIOU NA KAPILÁRNYCH KOLÓNACH

1. OBLASŤ

Metóda opisuje postup stanovenia obsahu jednotlivých sterolov a celkového obsahu sterolov v tukoch.

2. PRINCÍP METÓDY

Tuk s pridaným α — cholesterolom ako vnútorným štandardom, je zmydelnený etanolickým roztokom hydroxidu draselného a látky nepodliehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.

Sterolová frakcia sa chromatografiou na silikagélových platniach oddelí od extraktu nezmydeliteľných látok. Steroly získané zo silikagélu sa prevedú na trimetylsilylétery a analyzujú sa metódou plynovej chromatografie na kapilárnych kolónach.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1. 250 ml banka s guľatým dnom so spätným chladičom a zábrusovými spojkami

3.2. 500 ml oddeľovacie lieviky.

3.3. 250 ml banky

3.4. Kompletné zariadenie na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou, používajúca sklenené platne rozmerov 20 × 20 cm

3.5. UV lampa s vlnovou dĺžkou 366 alebo 254 nm, na skúmanie TLC platní

3.6. 100 μl a 500 μl mikrostriekačky

3.7. Valcovitý filtračný lievik s G3 poréznou fritou (pórozita 15-40 μm) s priemerom približne 2 cm a výškou 5 cm, s pripojením vhodným na vákuovú filtráciu a s vonkajším zábrusom 12/21

3.8. 50 ml vákuová banka s 12/21 skleneným vnútorným zábrusom na použitie s filtračným lievikom (3.7)

3.9. 10 ml skúmavka s kónickým dnom a tesniacou zátkou

3.10. Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vybavený deliacim systémom pozostávajúci z: 3.10.1. termostatickej komory pre kolóny (kolónová pec), ktorá udrží požadovanú teplotu presnosťou na ± 1 oC; 3.10.2. teplotne nastaviteľnej splyňovacej jednotky (nástrek) so silanizovaným skleneným splyňovacím elementom (linerom); 3.10.3. plameňovoionizačného detektora a konvertora — zosilňovača; 3.10.4. zapisovača — integrátora pre operácie s prevodníkom — zosilňovačom (3.10.3), s časovou odozvou nepresahujúcou jednu sekundu a s rôznymi rýchlosťami posunu papiera.

3.11. Kapilárna kolóna sklenená alebo z taveného kremeňa, dĺžky 20-30 m, o vnútornom priemere 0,25 až 0.32 mm, s kvapalnou fázou SE-52 alebo SE-54 alebo inou ekvivalentnou fázou, s hrúbkou filmu medzi 0,10 a 0,30 μm

3.12. Mikrostriekačka na plynovú chromatografiu, s objemom 10 μl a s vytvrdenou ihlou

4. ČINIDLÁ

4.1. Hydroxid draselný; približne 2 mol/l etanolický roztok: 130 g hydroxidu draselného (minimálna koncentrácia 85 %) sa rozpustí za chladenia v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom do objemu 1 litra. Roztok by sa mal skladovať v dobre uzatvorenej fľaši z tmavého skla.

4.2. Dietyléter, čistý na analýzu

4.3. Bezvodý tiosíran sodný, čistý na analýzu

4.4. Silikagélové TLC sklenené platne, bez fluorescenčného detektora, hrúbky 0,25 mm (na komerčné použitie, vhodné na okamžité použitie)

4.5. Hydroxid draselný, približne 0,2 2 mol/l etanolický roztok; 13 g hydroxidu draselného sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a doplní sa do etanolom do objemu 1 litra.

4.6. Benzén, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.7. Acetón, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.8. Hexán, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.9. Dietyléter, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.10. Chloroform, na chromatografiu

4.11. Referenčný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: zmes cholesterol alebo fytosteroly, ►M6 2 % ◄ roztok v chloroforme

4.12. 2,7 — dichlórfluoresceín, 0,2 % etanolický roztok. Slabo alkalický roztok získame pridaním niekoľkých kvapiek 2 N roztoku hydroxidu draselného.

4.13. Bezvodý pyridín; na chromatografiu

4.14. Hexametyldisilazán

4.15. Trimetylchlórsilán

4.16. Referenčný roztok trimetylsilylových éterov sterolu. Pripraví sa priamo pred použitím z čistých sterolov získaných z olejov, ktoré ho obsahujú.

4.17. α — cholestanol, 0,2 % roztok (m/V) v chloroforme (vnútorný štandard)

4.18. Nosný plyn: vodík a hélium, čistoty na plynovú chromatografiu

4.19. Pomocné plyny: — vodík, čistoty na plynovú chromatografiu, — vzduch, čistoty na plynovú chromatografiu.

5. POSTUP

5.1. Príprava látky nepodliehajúcej zmydelneniu. 5.1.1. Do 250 ml destilačnej banky dajte pomocou 500 μl mikrostriekačky taký objem 0,2 % roztoku α — cholestanolu v chloroforme (4.17), obsahujúceho množstvo α — cholestanolu zodpovedajúcemu približne 10 % obsahu sterolu v alikvotnej čiastke vzorky, ktorá sa odobrala na analýzu. Napr. k 5 g vzorky pridajte 500μl 0,2 % roztoku α– cholestanolu, ak sa analyzuje olivový olej alebo olej zo semien, a 1 500 μl, ak sa jedná o rastlinný ►M6 ————— ◄ olej z olivových výliskov. Odparte dosucha pod prúdom dusíka a potom do tej istej banky privážte 5 g suchej prefiltrovanej vzorky. ►M6 Oleje ◄ s obsahom zistiteľných množstiev cholesterolu môžu vykazovať píky s retenčným časom identickým s cholestanolom. Pokiaľ sa tak stane, sterolová frakcia by sa mala opakovane analyzovať s alebo bez vnútorného štandardu ►M6 alebo sa namiesto cholestanolu bude musieť použiť betulinol ◄ . 5.1.2. Pridajte 50 ml 2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného, nasaďte spätný chladič a zariadenie zahrievajte vo vodnom kúpeli do mierneho varu a za stáleho silného miešania, až kým sa zmydelňovanie neukončí (roztok sa vyčíri). Zahrievajte ešte ďalších 20 minút a potom cez spätný chladič prilejte 50 ml destilovanej vody, spätný chladič odpojte a banku ochlaďte na teplotu približne 30 oC. 5.1.3. Obsah banky kvantitatívne preneste do 500 ml oddeľovacieho lievika pomocou viacnásobného opláchnutia destilovanou vodou (celkovo sa jej použije asi 50 ml). Pridajte približne 80 ml dietyléteru, všetko riadne pretrepávajte 30 sekúnd a potom nechajte usadiť (pozn.1). Oddeľte spodnú vodnú vrstvu do druhého oddeľovacieho lievika. Rovnakým spôsobom vykonáme dve ďalšie extrakcie z vodnej fázy, pri každej sa použije 60-70 ml dietyléteru. Poznámka 1.Akákoľvek emulzia sa dá odstrániť pridaním malých množstiev etyl- alebo metylalkoholu vo forme spreja. 5.1.4. Vložte dietyléterové extrakty do jedného oddeľovacieho lievika a prepierajte destilovanou vodou (50 ml každý raz), až kým voda nevykazuje neutrálnu reakciu. Odstráňte vypieraciu vodu, zostávajúcu vrstvu vysušte bezvodým tiosíranom sodným a prefiltrujte cez bezvodý tiosíran sodný do predtým odváženej 250 ml banky, lievik a filter opláchnite malým množstvom dietyléteru. 5.1.5. Oddestilujte éter na niekoľko ml a potom pod slabým vákuom alebo pod prúdom dusíka vysušte, sušenie dokončite v sušičke pri 100 oC asi štvrťhodinu a zvyšok odvážte po ochladení v exsikátore.

5.2. Oddelenie sterolovej frakcie 5.2.1. Príprava základných platní. Silikagélové platne (4.4.) úplne ponorte na 10 sekúnd do 0,2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného (4.5) a potom ich nechajte dve hodiny sušiť v digestóriu a nakoniec ich dosušte v sušičke jednu hodinu pri teplote 100 oC. Vyberte platne zo sušičky a uložte ich až do ďalšieho použitia do exsikátora s chloridom vápenatým (takto ošetrené platne sa musia použiť do dvoch týždňov). Poznámka 2. Ak sa na separáciu sterolovej frakcie použijú základné silikagélové platne, látky, ktoré nepodliehajú zmydelneniu, nie je potrebné upravovať oxidom hlinitým. Takýmto spôsobom sa všetky zlúčeniny kyslého charakteru zložky (mastné kyseliny a iné) zachytia na začiatku a skupina sterolov sa zreteľne oddelí od skupiny alifatických a triterpénových alkoholov. 5.2.2. Zmes benzénu a acetónu v pomere objemov 95:5 (v/v) vložte do vyvíjacej komory v hrúbke vrstvy cca 1 cm. Alternatívne je možné použiť zmes hexán/dietyléter v pomere objemov 65:35 hexánu. Komoru uzatvorte vhodným krytom a nechajte ju stáť asi pol hodiny, aby sa ustálila rovnováha medzi parami a kvapalinou. Na vnútorné steny komory sa môžu pripevniť pásy filtračného papiera namočené vo vyvíjacej zmesi, čím sa skráti čas vyvíjania asi o jednu tretinu a získa sa rovnomernejšia a pravidelnejšia elúcia zložiek. Poznámka 3. Po každej analýze sa musí vymeniť vyvíjací roztok, aby sa úplne zabezpečili reprodukovateľné podmienky vyvíjania. 5.2.3. V chloroforme pripravte približne 5 % roztok látok nepodliehajúcich zmydelneniu (5.1.5.) a pomocou 100 μl mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu 0,3 ml roztoku v rovnomernom pásiku minimálnej hrúbky, približne 2 cm od spodku platne. V línii s pásikom naneste 2 až 3 μl referenčného roztoku sterolov (4.11) na jeden koniec tak, že sterolová skupina môže byť po vyvolaní identifikovaná. 5.2.4. Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.2. Udržujte izbovú teplotu v rozmedzí 15 až 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od hornej hrany platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu alebo dosku nechajte krátko prikrytú krytom. 5.2.5. Platňu mierne a pravidelne postriekajte roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď sa platňa pozoruje pod ultrafialovým svetlom, sterolová skupina sa dá identifikovať podľa škvŕn získaných z referenčného roztoku, zoskupených v rade. Označte hranice skupiny čiernou ceruzkou pozdĺž okrajov fluorescencie. 5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) zoškrabte silikagél z označenej plochy. Umiestnite jemne rozotretý materiál do filtračného lievika (3.7). Pridajte 10 ml horúceho chloroformu, opatrne premiešajte kovovou kopistkou a prefiltrujte za vákua, filtrát pozbierajte do banky (3.8), pripojenej k filtračnému lieviku. Spláchnite zvyšok v lieviku dietyléterom (asi 10 ml každý raz), zbierajte filtrát do tej jednej banky pripojenej k filtračnému lieviku. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml a zvyšný roztok prelejte do vopred odváženej 10 ml skúmavky (3.9), odparte dosucha stredným zahrievaním pod slabým prúdom dusíka, znovu rozpustite v niekoľkých kvapkách acetónu, opäť odparte, na 10 minút vložte do sušičky pri teplote 105 oC a nechajte ochladiť v exsikátore a odvážte. Zvyšok vo vnútri skúmavky pozostáva zo sterolovej frakcie.

5.3. Príprava trimetylsilylových esterov 5.3.1. Pridajte silanizačné činidlo, pozostávajúce zo zmesi objemov 9.3.1 (v/v/v) pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylsilánu (pozn.4) v pomere 50 μl na každý miligram sterolov, do skúmavky obsahujúcej sterolovú frakciu tak, aby sa zabránilo akejkoľvek absorpcii vlhkosti (pozn.5). Poznámka 4. Roztoky na priame použitie sú dostupné v obchodnej sieti. Prípustné sú tiež silanizačné činidlá, ako napr. bis-trimetylsilyl, triflúoroacetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktoré sa riedia rovnakým objemom bezvodého pyridínu. 5.3.2. Skúmavku zazátkujte a opatrne pretrepávajte bez pretáčania, až kým nie sú steroly úplne rozpustené. Potom nechajte skúmavku stáť aspoň 15 minút pri izbovej teplote a následne niekoľko minút odstreďujte. Číry roztok je pripravený na plynovú chromatografickú analýzu. Poznámka 5. Možný vznik slabej opalescencie je bežný a nespôsobuje žiadne interferencie. Vznik bielych vločiek alebo objavenie sa ružového zafarbenia sú znaky prítomnosti alebo znečistenia činidla. V takomto prípade je potrebné test zopakovať.

5.4. Plynovochromatografická analýza 5.4.1. Prípravné postupy a kondiciovanie kolón 5.4.1.1. Kapilárna kolóna sa zachytí vo vnútri plynového chromatografu, pripojte vstup kolóny na odparovač, ktorý je spojený s deliacim systémom a výstup kolóny na detektor. Vykonajte celkovú kontrolu plynového chromatografu (netesnosť v plynových okruhu, výkonnosť detektora, výkonnosť deliaceho systému a zapisovača, atď.). 5.4.1.2. Kapilárnu kolónu, ktorá ešte nebola použitá, je potrebné kondiciovať. Nastavte malý prietok nosného plynu cez kapilárnu kolónu a potom zapnite plynový chromatograf, postupne vyhrievajte, až kým nedosiahnete teplotu minimálne 20 oC nad pracovnú teplotu (pozn. 6). Udržujte túto teplotu aspoň dve hodiny a potom sa zariadenie nastaví na pracovný chod [nastavenie prietokov plynov a deliaceho pomeru (odfuku), zapálenie plameňa, pripojenie na elektronický zapisovač, nastavenie teploty termostatu, detektora a nástreku, atď.] a potom zosnímajte signál pri citlivosti aspoň dvojnásobne vyššej ako pri analýze. Základná línia má byť lineárna, bez špičiek akéhokoľvek pôvodu, a nemala by vykazovať žiadne znaky výkyvov (driftov). Negatívny priamočiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnosť kolónových spojov, kým pozitívny driftv indikuje nedostatočné kondiciovanie kolóny. Poznámka 6. Teplota kondiciovania má byť aspoň o 20 oC nižšia, ako je maximálna pracovná teplota predpokladaná na používanú kvapalnú fázu. 5.4.2. Výber pracovných podmienok 5.4.2.1. Hlavné pracovné podmienky sú nasledujúce: — teplota kolóny: 260 oC ± 5 oC — teplota odparovača: 280 oC, — teplota detektora: 290 oC, — lineárna rýchlosť nosného plynu: hélium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — deliaci pomer: 1: 50 a 1: 100, — citlivosť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho zoslabenia, — rozsah zapisovača: 1 až 2 mV na celý rozsah (celá škála — fs), — rýchlosť posunu papiera: 30 až 60 cm/h, — množstvo dávkovanej látky: 0,5 až 1 μl TMSE roztoku. Tieto podmienky sa môžu líšiť podľa vlastností kolóny a plynového chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledujúce podmienky: — retenčný čas ß — sitosterolu má byť 20 ± 5 minút, — vrchol (pík) kampasterolu má byť: pre olivový olej (priemerný obsah 3 %) 15 ± 5 % hodnoty celkového rozsahu; pre sójový olej (priemerný obsah 20 %) 80 ± 10 % hodnoty celkového rozsahu, — všetky prítomné steroly musia byť rozdelené. Okrem toho, aby sa píky mohli rozdeliť, musia byť úplne rozlíšené, t. j. stopový pík by sa mal vrátiť na základnú líniu pred vylúhovaním ďalšieho píku. Neúplné rozlíšenie je avšak tolerované, ale s podmienkou, že pík v TRR 1,02 je možné kvantifikovať použitím kolmice 5.4.3. Vykonanie analýzy 5.4.3.1. Do 10 μl mikrostriekačky natiahnite 1 μl hexánu, potom natiahnite 0,5 μl vzduchu a následne 0,5 až 1 μl roztoku vzorky. Vytiahnite piest mikrostriekačky tak, aby bola ihla prázdna. Ihlu zaveďte cez septum (tesnenie) do dávkovacieho zariadenia (nástreku) a po jednej až dvoch sekundách roztok rýchlo nadávkujte a ihlu približne po piatich sekundách pomaly vytiahnite. 5.4.3.2. Pokračujte v zaznamenávaní chromatogramu, až kým sa všetky prítomné steroly úplne nevylúhujú. Základná línia bude vždy v súlade s požiadavkami v bode 5.4.1.2. 5.4.4. Identifikácia píkov (vrcholov) Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná podľa retenčných časov a porovnaním so zmesou TMSE sterolov, analyzovanou za rovnakých podmienok. Steroly eluujú v nasledujúcom poradí: Cholesterol, brassikasterol, 24-metylén cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7 — kampesterol, Δ 5,23- stigmastadienol, klerosterol, β — sistosterol, sitostanol, Δ 5 — avenasterol, Δ 5,24 — stigmastadienol, Δ 7 — stigmastenol, Δ 7 — avenastenol. Retenčné časy sitosterolu pre kolóny SE — 52 a SE– 54 sú v tabuľke 1. Obr.1 a 2 ukazujú typické chromatografy niektorých olejov. 5.4.5. Kvantitatívny odhad 5.4.5.1. Plochy píkov α — cholestanolu a sterolov vypočítajte použitím elektronického integrátora. Neuvádzajte píky zložiek, ktoré nie sú zahrnuté v zozname v tab.1. Odozvový faktor pre α — cholestanol sa rovná 1. 5.4.5.2. Obsahy všetkých alkoholov, vyjadrených v mg/100 g tukových látok, sa vypočítajú nasledovne: kde: Ax = plocha píku sterolu x ►M6 ————— ◄ (mm2), As = plocha píku α — cholestanolu ►M6 ————— ◄ (mm2), ms = hmotnosť pridaného α — cholestanolu, v miligramoch (mg), m = hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch (g)

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov ako v mg/100 g tukových látok a ich sumu ako „celkové steroly“.

6.2. Vypočítajte percento každého jednotlivého sterolu z pomeru plochy daného píku k celkovej ploche sterolov: kde: Ax = plocha píku sterolu x; A = celková plocha sterolov.









DODATOK

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Nadávkujte 1 až 3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu za obvyklých pracovných podmienok a stopkami zmerajte čas, za ktorý prejde plyn kolónou od momentu nástreku až po čas, kedy sa objaví (vylúhuje) pík (tM).

Lineárna rýchlosť v (cm/s) je daná L/tM, kde L je dĺžka kolóny v centimetroch (cm) a tM je čas nameraný v sekundách (s).







Tabuľka 1 Relatívne retenčné časy sterolov Pík Označenie Relatívne retenčný čas SE 54 kolóna SE52 kolóna 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]- 24-metyl-Δ-5,22-cholestadién-3β-ol 0,73 0,71 4 24-metylén-cholesterol 24-metylén-Δ-5,24-cholesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-5-cholesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]- 24-etyl-Δ-5,22-cholestadién-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-7-cholesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ-5,23-cholestadién-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]- 24-etyl-Δ-5,25-cholestadién-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl-Δ-5-cholestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-5-cholesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyI-Δ-5,24-cholestadién-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl-Δ-7,24-cholestadién-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]- 24-etylidén-Δ-7-cholesten-3β-ol 1,16 1,16

Obrázok 1 Chromatografický záznam sterolovej frakcie nerafinovaného olivového oleja

Obrázok 2 Chromatografický záznam sterolovej frakcie rafinovaného olivového oleja









PRÍLOHA VI

STANOVENIE ERYTRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erytrodiol (bežne chápaný ako erytrodiolové glykoly a uvaol spolu) tvorí podstatnú časť nezmydlovateľnej frakcie charakteristickej pre niektoré druhy tukov. Nachádza sa v oveľa vyšších koncentráciách rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja ako sú koncentrácie iných olejov, napr. lisovaný olivový olej a olej z hroznových zrniečok, v ktorých je taktiež obsiahnutý, a tak jeho prítomnosť môže dokázať prítomnosť rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja.

1. OBLASŤ

Metóda opisuje postup detekcie erytrodiolu v tukoch

2. PODSTATA

Tuk sa zmydelní metanolicko-etanolickým roztokom hydroxidu draselného. Nezmydelniteľná frakcia sa potom extrahuje dietyléterom a prečistí sa prechodom cez kolónu z oxidu hlinitého.

Nezmydelniteľné látky sa pri tenkovrstvovej chromatografii na silikagélovej platni rozdelia na skupiny zodpovedajúce sterolovej a erytrodiolovej frakcii. Steroly a erytrodiol, získaný z platní, sa prevedú na trimetylsilylové estery a zmes sa analyzuje plynovou chromatografiou.

Výsledok sa vyjadrí ako percento erytrodiolu v zmesi erytrodiolu a sterolov.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1. Vybavenie uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4. ČINIDLÁ

4.1. Činidlá uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4.2. Referenčný roztok erytrodiolu, 0,5 % roztok v chloroforme.

5. POSTUP

5.1. Príprava nezmydelniteľných látok

Ako je popísané v odseku 5.1.2. prílohy V.

5.2. Oddelenie erytrodiolu a sterolov

5.2.1. Pozri odstavec 5.2.1 prílohy V.

5.2.2. Pozri odstavec 5.2.2 prílohy V.

5.2.3. Pripravte 5 % roztok nezmydelniteľných látok v chloroforme. Pomocou 0,1 ml mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu čo najtenší a najrovnomernejší pásik 0,3 ml roztoku približne 1,5 cm od spodného okraja platne. Na jeden koniec platne umiestnite niekoľko mikrolitrov roztokov cholesterolu a erytrodiolu, ktoré budú slúžiť ako etalóny (na porovnanie).

5.2.4. Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.1. Okolitá teplota by mala byť asi 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od horného okraja platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu.

5.2.5. Platňu mierne a pravidelne postriekajte alkoholovým roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď platňu pozorujete pod ultrafialovým svetlom, sterolová a erytrodiolová skupina sa dá identifikovať podľa toho, že sa zoskupujú v rade so štandardami. Bodmi označte iba vonkajšie okraje fluorescencie.

5.2.6. Pomocou kovovej škrabky /kopistky/ zoškrabte silikagél z označenej plochy. Preneste materiál z platne do 50 ml banky. Pridajte 15 ml horúceho chloroformu, dobre pretrepte a prefiltrujte cez filtračný lievik so sintrovaným skleneným diskom tak, aby sa silikagél preniesol na filter. Trikrát premyte horúcim chloroformom (asi 10 ml každý raz), filtrát zbierajte do 100 ml banky. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml, preneste ho do kalibrovanej 10 ml centrifugačnej skúmavky s kužeľovým dnom, vysušte slabým zahrievaním pod prúdom dusíka a odvážte.

5.3. Príprava trimetylsilylových esterov

Ako je popísané v odseku 5.3 prílohy V.

5.4. Plynovochromatografická analýza

Ako je popísané v odseku 5.4 prílohy V. Pracovné podmienky pre plynový chromatograf musia byť také, aby bolo možné vykonať analýzu sterolov a oddeliť TMSE od erytrodiolu a uvaolu.

Ak ste už vykonali nástrek vzorky, pokračujte v zaznamenávaní, kým nie sú prítomné steroly a kým sa erytrodiol a uvaol nevyelujú. Potom identifikujte píky (retenčné časy erytrodiolu a uvaolu pre β- sitosterol sú 1,45 a 1,55, v tomto poradí) a vypoČítajte plochy tak, ako pri steroloch.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

kde:

A1 = plocha píku erytrodiolu ►M6 ————— ◄ (mm2);

A2 = plocha píku uvaolu ►M6 ————— ◄ (mm2),

Asterolov = celková plocha píkov pre steroly ►M6 ————— ◄ (mm2).

Výsledok sa udáva na jedno desatinné miesto

▼M21









PRÍLOHA VII

STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA

Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuálneho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníctvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu.

Táto metóda je použiteľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej okolitej teplote (20 °C).

2. PRINCÍP

Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy: čiastočná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po silanizácii kapilárnou plynovou chromatografiou.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BEŽNÝ LABORATÓRNY MATERIÁL

3.1. 25 ml Erlenmeyerova banka

3.2. 100, 250 a 300 ml kadičky

3.3. Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 – 23 mm, dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotúčom a kohútikom

3.4. Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml

3.5. 100 a 250 ml banky

3.6. Rotačná odparka

3.7. 10 ml centrifugačná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou

3.8. Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky

3.9. Termostat s možnosťou udržiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C

3.10. Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml

3.11. 1 ml podkožná striekačka

3.12. 100 μl mikrostriekačka

3.13. 1 000 ml lievik

3.14. Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injekčným systémom „on column“ za studena na priame zavedenie vzorky do kolóny a pecou umožňujúcou udržiavať nastavenú teplotu s presnosťou na 1 °C

3.15. Studený injektor „on column“ na priame zavedenie vzorky do kolóny

3.16. Plameňovoionizačný detektor a elektrometer

3.17. Zapisovač-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlosťou odozvy najviac 1 sekundu a s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera

3.18. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 – 0,30 μm, použiteľná pri teplote 370 °C

3.19. 10 μl mikrostriekačka vybavená cementovou ihlou dlhou aspoň 7,5 cm na priame vstreknutie na kolónu.

4. ČINIDLÁ

4.1. Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh) pripravený takto: Silikagél vložte do porcelánovej kapsule, sušte aspoň štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 % hmotnosti silikagélu, takto: odvážte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby sa voda rovnomerne rozdelila. Pred použitím nechajte aspoň 12 hodín stáť.

4.2. n-hexán (na chromatografiu)

4.3. Izopropanol

4.4. Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1

4.5. Pankreatická lipáza. Použitá lipáza má mať aktivitu medzi 2,0 a 10 jednotkami lipázy na mg (V obchodnej sieti dostať pankreatické lipázy s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu.)

4.6. Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1 M upravený až na pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1)

4.7. Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa musí použiť do 15 dní od jeho prípravy)

4.8. Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok

4.9. Dietyléter na chromatografiu

4.10. Vyvíjacie rozpúšťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere 87/13)

4.11. 12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného

4.12. Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole

4.13. Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu

4.14. Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických látok – a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu

4.15. Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlórsilánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dostať v obchodnej sieti. Na silanizáciu sa môžu použiť aj ďalšie činidlá, konkrétne bis-trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedené rovnakým objemom bezvodého pyridínu.)

4.16. Referenčné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so známym percentuálnym zložením podobným vzorke.

5. POSTUP

5.1. Príprava vzorky

5.1.1. Oleje s obsahom voľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred chromatografiou na silikagélovej kolóne neutralizovať. Oleje s obsahom voľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizovať v súlade s bodom 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte 100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného (4.11), aký zodpovedá obsahu voľných kyselín v oleji s 5 % navýšením. Dôkladne pretrepávajte počas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej vody, znova pretrepte a nechajte stáť. Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánový roztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 – 60 ml roztoku izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) až do vymiznutia ružového sfarbenia fenolftaleínu. Eliminujte najväčšiu časť hexánu vákuovou destiláciou (napríklad s použitím rotačnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5). Vysúšajte olej vo vákuu až do úplnej eliminácie rozpúšťadla. Po skončení tejto procedúry má byť acidita oleja nižšia ako 0,5 %.

5.1.2. Vložte 1,0 g oleja pripraveného podľa vyššie uvedených indikácií do 25 ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej zmesi (4.10). Nechajte roztok postáť aspoň 15 minút pred chromatografiou na silikagélovej kolóne. Ak je roztok zakalený, odstreďte ho, aby boli zabezpečené optimálne podmienky na chromatografiu. (Môžu sa použiť aj už hotové 500 g silikagélové patróny SPE – na extrakciu na tuhých fázach).

5.1.3. Príprava chromatografickej kolóny Nalejte do kolóny (3.3) približne 30 ml vyvíjacieho rozpúšťadla (4.10), pomocou sklenenej tyčinky vložte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny; stlačte, aby sa odstránil vzduch. V kadičke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v približne 80 ml vyvíjacieho rozpúšťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny. Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený všetok silikagél; premyte vyvíjacím rozpúšťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina tekutiny dosiahla približne 2 mm nad vrchnou úrovňou silikagélu.

5.1.4. Chromatografia na kolóne Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvážte presne 1,0 g vzorky pripravenej podľa bodu 5.1. Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1.3. Nepohnite povrchom kolóny. Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiecť, až kým nedosiahne úroveň silikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpúšťadla. Upravte prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny približne za 60 – 70 minút). Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvážili. Odparte rozpúšťadlo vo vákuu a odstráňte jeho posledné stopy pod prúdom dusíka. Odvážte banku a vypočítajte množstvo získaného extrátu. [V prípade použitia už hotových silikagélových patrónov SPE postupujte takto: zaveďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov s 3 ml n-hexánu.] Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru v objemovom pomere 9/1. Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka až do vysušenia. Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overiť zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE.

5.2. Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1. Do centrifugačnej skúmavky odvážte 0,1 g oleja pripraveného podľa bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pričom po každom pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkou a umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmáčali zátku) a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte, počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnúť.

5.2.3. Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom odstreďte a pomocou mikrostriekačky preneste éterový roztok do čistej a suchej skúmavky.

5.3. Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia

5.3.1. Pomocou mikrostriekačky zaveďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml skúmavky s kónickým dnom.

5.3.2. Eliminujte rozpúšťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút odstáť.

5.3.3. Po 20 minútach pridajte 1 až 5 ml n-hexánu (v závislosti od chromatografických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chromatografiu.

5.4. Plynová chromatografia

Hlavné operačné podmienky sú tieto:

— teplota injektora (injektor „on column“) nižšia ako teplota varu rozpúšťadla (68 °C),

— teplota detektora: 350 °C,

— teplota kolóny: nastavenie teploty pece: 60 °C počas 1 minúty, každú minútu zvýšte o 15 °C až do dosiahnutia 180 °C, potom o 5 °C za minútu až do 340 °C, ďalej udržiavajte 340 °C počas 13 minút,

— nosný plyn: vodík alebo hélium nastavené na lineárnu rýchlosť adekvátnu na dosiahnutie rozlíšenia znázorneného na obrázku 1. Retenčný čas triglyceridu C54 má byť 40 ± 5 minút (pozri obrázok 2). (Vyššie uvedené podmienky postupu sa uvádzajú len orientačne. Každý subjekt ich musí optimalizovať s cieľom dosiahnuť požadované rozlíšenie. Výška píku zodpovedajúca 2-glyceril monopalmitátu musí dosiahnuť aspoň 10 % rozsahu stupnice zapisovača.),

— Množstvo vstreknutej látky: 0,5 – 1 μl roztoku (5 ml) n-hexánu (5.3.3).

5.4.1. Identifikácia píkov

Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných retenčných časov a vzhľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach.

5.4.2. Kvantitatívne hodnotenie

Plocha každého píku sa vypočíta pomocou elektronického integrátora.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypočíta na základe vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a súčtom plôch píkov všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) podľa vzorca:

glycéryl monopalmitate (%):

kde:

Ax = plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu,

ΣA = súčet plôch všetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom.

Výsledok sa uvádza s presnosťou na jedno desatinné miesto.

7. SPRÁVA O ANALÝZE

V správe z analýzy sa má konkrétne uviesť:

— odkaz na túto metódu,

— všetky údaje potrebné na úplnú identifikáciu vzorky,

— výsledok analýzy,

— každé odklonenie sa od tejto metódy, či už vplyvom rozhodnutia dotknutých strán alebo z iného dôvodu,

— podrobné identifikačné údaje o laboratóriu, dátum uskutočnenia analýzy a podpis zodpovedných za analýzu.

Obrázok 1

Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafinovanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %)

Vysvetlivky:„acides gras libres“ = voľné mastné kyseliny; „huile d’olive rafinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej s pridaním 20 % esterifikovaného oleja; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitín; „1-2 mono C18 insat.“ = nesaturovaný 1-2 mono C18

Obrázok 2

Chromatogram:

A) neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B) esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

8. POZNÁMKY

PRÍPRAVA LIPÁZY

V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostatočnou aktivitou. V laboratóriu sa tiež dajú pripraviť takto:

5 kg čerstvých pankreasov z ošípaných ochlaďte na 0 °C. Odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozomeľte v mlynčeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu. Pretrepávajte túto hmotu 4 až 6 hodín spolu s 2,5 litra bezvodého acetónu a potom odstreďte. Ešte trikrát extrahujte zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom.

Sušte zvyšok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný prášok, ktorý bude dlhodobo uskladniteľný v chladničke chránený pred vlhkosťou.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Pripravte emulziu olivového oleja takto:

Počas 10 minút pretrepávajte v miešači zmes zloženú zo 165 ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15 g roztlčeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja.

Postupne zaveďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej 0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml a 20 ml destilovanej vody.

Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C; zaveďte elektródy pH-metra a špirálové miešadlo.

Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného 0,1 N, až kým nedosiahnete pH 8,3.

Pridajte objem suspenzie prášku lipázy vo vode (0,1 g/ml lipázy). Keď pH-meter ukáže pH 8,3, uveďte chronometer do činnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udržiavala na 8,3. Zaznamenajte každú minútu objem spotrebovaného roztoku.

Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, že os nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na osi závisle premenných (y-ová os) uvediete počet mililitrov alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udržanie konštantného pH. Mali by ste získať lineárny graf.

Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypočíta na základe vzorca:

kde:

A je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mg

V je počet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minútu (vypočítané na základe grafu)

N je molarita roztoku hydroxidu sodného

m je množstvo testovacej lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.

▼M20 —————

▼M25









PRÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ OBLASTI

PREDSLOV

Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti môže poskytnúť informácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali počas technologických procesov.

Absorpcia pri vlnových dĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená prítomnosťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E 1 % 1 cm (extinkcia 1 % roztoku tuku v špecifikovanom rozpúšťadle, v kyvete hrubej 1 cm) obvykle určené ako K (uvádzané tiež ako „extinkčný koeficient“).

1. ROZSAH PÔSOBNOSTI

Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivového oleja v ultrafialovej oblasti (ako je opísané v dodatku).

2. PRINCÍP METÓDY

Testovaný tuk sa rozpustí v požadovanom rozpúšťadle a extinkcia roztoku sa potom stanoví pri určenej vlnovej dĺžke so zreteľom na čisté rozpúšťadlo. Určité extinkcie sa vypočítavajú zo spektrofotometrických údajov. Vypočítava sa konkrétna absorbancia pri 232 nm a 268 nm v izo-oktáne alebo 232 nm a 270 nm v cyklohexáne pri koncentrácii 1 g na 100 ml v kyvete hrúbky 10 mm.

3. VYBAVENIE

3.1. Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220 a 360 nm, s možnosťou odčítavania jednotlivých nanometrických jednotiek. Pred použitím spektrometra sa odporúča kontrola mierok vlnovej dĺžky a absorbancie podľa nasledujúceho postupu. 3.1.1. Mierka vlnovej dĺžky: možno ju skontrolovať pomocou referenčného materiálu pozostávajúceho z optického skleneného filtra obsahujúceho oxid holmitý, ktorý odlíšené absorpčné pásma. Referenčný materiál je určený na overovanie a kalibráciu mierok vlnovej dĺžky spektrofotometrov vo viditeľnej a ultrafialovej oblasti, ktoré majú nominálne spektrálne šírky pásma 5 nm alebo menej. Holmiový sklenený filter sa meria v režime absorbancie oproti vzdušnej slepej vzorke, v rozsahu vlnových dĺžok 640 – 240 nm. V každej spektrálnej šírke pásma (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 a 3,00) sa vykonáva základná korekcia s prázdnym držiakom kyvety. Vlnové dĺžky spektrálnej šírky pásma sú uvedené v certifikáte referenčného materiálu v norme ISO 3656. 3.1.2. Mierka absorbancie: možno ju skontrolovať prostredníctvom referenčného materiálu pozostávajúceho zo 4 roztokov dvojchromanu draselného v kyseline chloristej uzavretých v štyroch UV kremenných kyvetách na meranie linearity a fotometrickej presnosti v ultrafialovej oblasti. Kyvety naplnené dvojchromanom draselným (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml a 100 mg/ml) sa merajú oproti slepej vzorke kyseliny chloristej. Čisté hodnoty absorbancie sú uvedené v certifikáte referenčného materiálu v norme ISO 3656.

3.2. Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou dĺžkou 1 cm. Keď sa kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpúšťadlom, nemali by medzi sebou vykazovať rozdiel väčší ako 0,01 jednotky extinkcie.

3.3. 25 ml odmerná banka.

3.4. Analytické váhy s presnosťou 0,0001 g.

4. ČINIDLÁ

Ak nie je stanovené inak, používajte len činidlá uznanej analytickej kvality.

Rozpúšťadlo: izo-oktán (2,2,4-trimetylpentán) na meranie pri 232 nm a 268 nm alebo cyklohexán na meranie pri 232 nm a 270 nm, s absorbanciou menej ako 0,12 pri 232 nm a menej ako 0,05 pri 250 nm oproti destilovanej vode, merané v kyvete hrúbky 10 mm.

5. POSTUP

5.1. Skúmaná vzorka musí byť dokonale homogénna a bez podozrivých nečistôt. Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote približne 30 °C, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote najviac 10 °C nad bodom topenia.

5.2. Presne odvážte približne 0,25 g (s presnosťou na 1 mg) takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej banky, doplňte určeným rozpúšťadlom po značku a zhomogenizujte. Výsledný roztok musí byť úplne priezračný. Ak je prítomná opalescencia alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.

5.3. Získaným roztokom naplňte kremennú kyvetu a za použitia rozpúšťadla na porovnanie zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej dĺžke medzi 232 – 276 nm. Namerané hodnoty sa musia nachádzať v rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie, merania sa musia zopakovať za použitia koncentrovanejších alebo zriedenejších roztokov, ak je to vhodné. POZNÁMKA: Nie je potrebné merať absorbanciu v celom rozsahu vlnových dĺžok.

6. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1. Zaznamenajte špecifické extinkcie (extinkčné koeficienty) pri rôznych vlnových dĺžkach, ktoré sa vypočítajú takto: kde: Κλ = špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke λ, Ελ = nameraná extinkcia pri vlnovej dĺžke λ, c = koncentrácia roztoku v g/100 ml, s = hrúbka kremennej kyvety v cm. Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.

6.2. Rozdiel špecifickej extinkcie (ΔΚ) Spektrofotometrická analýza olivového oleja v súlade s oficiálnou metódou v právnych predpisoch Únie zahŕňa stanovenie rozdielu absolútnej hodnoty špecifickej extinkcie (ΔΚ), ktorý je vyjadrený vzorcom: kde Km je špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke m, vlnová dĺžka pre maximálnu absorpciu závisí od použitého rozpúšťadla: 270 pre cyklohexán a 268 pre izo-oktán.









Dodatok







CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJA Kategória Metylestery mastných kyselín (FAME) a etylestery mastných kyselín (FAEE) Kyslosť (%) (*) Peroxidové číslo mEq 02/kg (*) Vosky mg/kg (**) 2-glyceril monopalmitát (%) Stigmastadién mg/kg (1) Rozdiel medzi HPLC ECN42 a teoretickým výpočtom ECN42 K232 (*) K270 (*) „K 270 alebo K 268 (5)“ ΔK (*) (5) Organoleptické hodnotenie Medián defektov (Md) (*) Organoleptické hodnotenie Medián ovocnosti (Mf) (*) 1. Extra panenský olivový olej Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg alebo 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg a (FAEE/FAME) ≤1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 2. Panenský olivový olej — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 3. Lampantový olivový olej — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 4. Rafinovaný olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 5. Zmiešaný olivový olej z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ak je % kyseliny palmitovej celkovo ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ak je % kyseliny palmitovej celkovo > 14% 6. Surový zvyškový olivový olej — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinovaný zvyškový olivový olej — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Zvyškový olivový olej ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Súčet izomérov, ktoré mohli (alebo nemohli) byť oddelené kapilárnou kolónou. (2) Alebo ak je medián defektov najviac 3,5 a medián ovocnosti je rovný 0. (3) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg – 350 mg/kg sa považujú za lampantový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov najviac 350 mg/kg alebo ak je obsah erytrodiolu a uvaolu najviac 3,5 %. (4) Oleje s obsahom voskov 300 mg/kg – 350 mg/kg sa považujú za surový zvyškový olivový olej, ak je celkový obsah alifatických alkoholov vyšší ako 350 mg/kg a ak je obsah erytrodiolu a uvaolu vyšší ako 3,5 %. (5) K 270 s rozpúšťadlom cyklohexán, K 268 s rozpúšťadlom izo-oktán.

▼B









PRÍLOHA X A

PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN

1. OBLASŤ

Táto metóda podáva všeobecný návod na použitie plynovej chromatografie využívajúcej náplňové kolóny alebo kapilárne kolóny na stanovenie kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia zmesi metyl esterov mastných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenou v prílohe X B.

Metóda sa nedá použiť na polymerizované mastné kyseliny.

2. ČINIDLÁ

2.1. Nosný plyn

Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, atď.), dokonale vysušený a s obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.

Poznámka 1:

Vodík, ktorý sa používa ako nosný plyn iba pre kapilárne kolóny, môže dvojnásobne urýchliť analýzu, ale je nebezpečný. Sú k dispozícii bezpečnostné zariadenia.

2.2. Pomocné plyny.

2.2.1. Vodík (čistoty ≥ 99,9 %), bez organických nečistôt

2.2.2. Vzduch alebo kyslík, bez organických nečistôt

2.3. Porovnávací (referenčný) štandard

Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu

Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených mastných kyselín.

3. PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Uvedené pokyny týkajúce sa bežného vybavenia používaného v plynovej chromatografii, využívajúce náplňové a/alebo kapilárne kolóny a plameňovoionizačný detektor. Je vhodné každé zariadenie s účinnosťou a rozlíšením uvedené v 4.1.2.

3.1. Plynový chromatograf

3.1.1. Dávkovací (injekčný) systém

Použite niektorý z uvedených injekčných systémov:

a) s náplňovými kolónami, s najmenším možným mŕtvym objemom (v tomto prípade by mal dať injektor zahriať na teplotu o 20 až 50 oC vyššiu ako má kolóna) alebo

b) s kapilárnymi kolónami, v tomto prípade by mal byť injektor špeciálne navrhnutý na použitie pre takéto kolóny. Môže to byť split (s delením) typ alebo splitless (bez odfuku) on-column injektor.

Poznámka 2:

Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlíkovými atómami sa môže použiť injektor s pohyblivou ihlou.

3.1.2 Pec

Pec by mala byť schopná vyhrievať kolónu na teplotu aspoň 260 oC a udržiavať požadovanú teplotu v rozmedzí 1 oC v prípade náplňovej kolóny a 0,1 oC pri kapilárnej kolóne. Táto druhá požiadavka je obzvlášť dôležitá pri kolónach z taveného kremeňa.

Vo všetkých prípadoch sa odporúča teplotne-programovateľné vyhrievanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.

3.1.3 Náplňová kolóna

3.1.3.1. Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných voči analyzovaným látkam (napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi: a) dĺžka: 1 až 3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým reťazcom (nad C20), dajú sa použiť relatívne krátke kolóny. Ak analyzujeme kyseliny so 4 až uhlíkovými atómami, odporúča sa použiť kolónu dlhú 2 m. b) vnútorný priemer: 2 až 4 mm. Poznámka 3. Aksú prítomné polynenasýtené zložky s viac ako tromi dvojitými väzbami, tieto sa môžu rozložiť v kolóne z nerezovej ocele. Poznámka 4. Je možné použiť aj systém s dvojicou náplňových kolón.

3.1.3.2. Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí: a) nosič: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný inertný nosič s úzkym rozmedzím veľkosti zŕn (25 μm rozmedzie medzi hranicami 125 až 200 μm); priemerná veľkosť častíc závisí od vnútorného priemeru a dĺžky kolóny; b) stacionárna fáza: polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietylénglykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát, atď.), kyanosilikóny alebo každé iné kvapaliny umožňujúce chromatografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť 5 až 20 % (m/m) náplne nosiča. Pri určitých separáciách je možné použiť nepolárne stacionárne fázy.

3.1.3.3. Kondiciovanie kolóny Pec postupne vyhrievajte až do 185 oC, ak je v hodné, pripravenú kolónu odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspoň 16 hodín prúdiť inertný plyn tempom 20 až 60 ml/min a potom ďalšie 2 hodiny pri teplote 195 oC.

3.1.4. Kapilárna kolóna

3.1.4.1. Trubica vyrobená z materiálu odolného voči analyzovaným (obvykle zo skla alebo z taveného kremeňa). Vnútorný priemer 0,2 až 0,8 mm. Vnútorný povrch prešiel pred nanesením stacionárnej fázy patričnou úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). Dĺžka 25 mm vyhovuje vo väčšine prípadov.

3.1.4.2. Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000 ), polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu (kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krížom viazanými väzbami (cross-linked bonded). Poznámka 5.Pri použití polárnych polyxilánov sa sťažuje identifikácia a separácia kyseliny linoleovej a C20 kyselín. Nanesená vrstva by mala byť tenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3. Montáž a kondiciovanie kolóny Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiestnenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnosť), umiestnenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia mŕtvych objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar (30 kPa), v prípade kolóny dĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 0,3 mm]. Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3 oC/min od teploty prostredia až na teplotu 10o C pod limitom dekompozície stacionárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie základu. Vráťte teplotu na 180 oC, aby ste pracovali v izotermálnych podmienkach. Poznámka 6.Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej sieti

3.1.5. Detektor, lepšie ak je s vyhrievaním na teplotu vyššiu ako teplota danej kolóny.

3.2. Pipeta

Pipeta by mala byť s maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm dieliky.

3.3. Zapisovač

Ak sa na výpočet zloženia analyzovanej zmesi použije krivka zo zapisovača, je potrebný presný elektronický zapisovač, kompatibilný s použitým prístrojom. Zapisovač by mal mať:

a) odozvový pomer pod 1,5 s; lepšie 1 s (odozvový pomer je čas, za ktorý zapisovacie pero prejde od 0 do 90 % podľa náhleho vstupu 100 % signálu);

b) šírka papiera, minimálne 20 cm;

c) rýchlosť papiera, nastaviteľné hodnoty medzi 0,4 a 2,5 cm/min.

3.4. Integrátor

Pomocou elektronického integrátora je možné vykonať rýchly a presný výpočet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivosťou a dostatočnú korekciu odchýlky základnej línie.

4. POSTUP

Postupy uvedené v 4.1 až 4.3. sa vzťahujú aj na plameňovoionizačný detektor.

Alternatívne sa môže použiť plynový chromatograf využívajúci katarometrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti). Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.

4.1. Podmienky testovania

4.1.1. Výber optimálnych pracovných podmienok 4.1.1.1. Náplňové kolóny Pri výbere podmienok testovania je potrebné vziať do úvahy nasledujúce premenné: a) dĺžku a priemer kolóny; b) druh a množstvo stacionárnej fázy; c) teplotu kolóny; d) prietok nosného plynu; e) požadované rozlíšenie; f) veľkosť testovanej navážky vybranej takým spôsobom, aby detektor a elektrometer dávali lineárnu odozvu; g) dĺžka analýzy. Vo všeobecnosti, hodnoty uvedené v tabuľke 1 a 2 povedú k požadovaným výsledkom, t. j. aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15 minút. Ak to zariadenie dovoľuje, injektor by mal byť nastavený na teplotu okolo 200 oC a detektor na teplotu rovnú alebo vyššiu ako je teplota kolóny. Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plameňovoionizačného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1 v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 až 10 krát väčší ako prietok vodíka.



Tabuľka 1 Vnútorný priemer kolóny (v mm) Prietok nosného plynu (v ml/min) 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60



Tabuľka 2 Koncentrácia stacionárnej fázy % (m/m) Teplota kolóny oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilárna kolóna Vlastnosti ako účinnosť a priepustnosť kapilárnych kolón znamenajú, že separácia medzi zložkami a dĺžkou trvania analýzy sú vo veľkej miere závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné optimalizovať pracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo jednoduchšie na straty na hlave kolóny) podľa toho, či si želáte zlepšiť separáciu alebo urýchliť analýzu.

4.1.2. Stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenia (pozri obrázok 1) Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla). Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píku rozpúšťadla. Použite dostatočné množstvo zmesi metyl esterov, aby pík metyl stearátu zabral približne tri štvrtiny celkového rozsahu. Vypočítajte počet teoretických priehradiek, n (účinnosť) podľa vzorca: a rozlíšenie R podľa vzorca: kde: dr1 je retenčná vzdialenosť v milimetroch od štartu chromatogramu po maximum píku metyl stearátu; ω1 a ω2 sú šírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané medzi bodmi priesečníkov tangentov a interflexnými bodmi krivky so základnou líniou; Δ je vzdialenosť v milimetroch medzi maximami píkov metyl stearátu a metyl oleátu, ▼M2 a index rozpustnosti 1r pri použití vzorca kde: a = výška najmenšieho píku meraná od základnej čiary; b = výška najnižšieho bodu priehlbiny medzi dvoma priľahlými píkmi meraná od základnej čiary. ▼B Obrázok 1 Chromatogram na stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenie Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umožnia aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny a rozlíšenie aspoň 1,25.

4.2. Veľkosť navážky

Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 až 2 μl roztoku metyl esterov pripraveného podľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.

Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich približne 100 mg/ml roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 ml tohto roztoku.

Ak sú zložky prítomné iba v stopových množstvách, veľkosť navážky môžete zvýšiť (až 10 násobne).

4.3. Analýza

Pracovné podmienky boli všeobecne definované v 4.1.1.

Napriek tomu je možné pracovať pri nižšej teplote kolóny, ak sa požaduje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo pri vyššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami uhlíka. V prípade potreby je možné využiť programovanú teplotu v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl estery mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100 oC (alebo od 50 do 60 oC, ak je prítomná kyselina butyrová) a ihneď zvýšte teplotu s gratientom 4 až 8 oC/min do optimálnej teploty. V niektorých prípadoch sa môžu kombinovať obidva postupy.

Po programovom vyhrievaní pokračujte v elúcii pri konštantnej teplote, až kým sa všetky zložky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové vyhrievanie, použite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195 oC.

Ak je vhodné, odporúča sa vykonať analýzu na dvoch ukotvených fázach rôznej polarity a tým sa overí neprítomnosť prekrytých píkov, napríklad v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C18:3 a C20:0 alebo C 18:3 a C18:2.

4.4. Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov

Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracovných podmienok, aké boli použité pri vzorkách a zmerajte retenčné časy alebo retenčné vzdialenosti zložiek mastných kyselín. Na semi-logaritmický papier zhotovte, na každý stupeň nenasýtenia, grafy ukazujúce logaritmus retenčného času alebo vzdialenosti ako funkciu počtu uhlíkových atómov. Pri izotermických podmienkach by mali byť grafy pre nerozvetvené kyseliny s rovnakým stupňom nenasýtenia rovnobežné.

Je nevyhnutné predísť takému kondiciovaniu, po ktorom sa objavujú „maskované píky“, t. j. kde je nedostatočné rozlíšenie na rozdelenie dvoch zložiek.

5. VYJADRENIE VÝSLEDKOV

5.1. Kvalitatívna analýza

Identifikujte píky metylesterov pre vzorku z grafov uvedených v 4.4, interpoláciou, ak je vhodné.

5.2. Kvantitatívna analýza

5.2.1. Stanovenie zloženia

Okrem výnimočných prípadov použite metódu vnútornej normalizácie, t. j. predpokladajme, že všetky zložky vzorky sú zastúpené na chromatografe, takže celková plocha pod píkmi prestavuje 100 % zložiek (úplná elúcia).

Ak je v zariadení aj integrátor, použite jeho zaznamenané hodnoty. Ak sa v prístroji nenachádza, určite plochu pod každým píkom vynásobením výšky píku šírkou píku v polovičnej výške, a keď je to vhodné, zoberte do úvahy rôzne zoslabenia počas zápisu.

5.2.2 Metóda výpočtu

5.2.2.1. Ilustračný (všeobecný) prípad Vypočítajte obsa