Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednos ť za jeho obsah  
►B NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 440/2008  
z 30. mája 2008,  
ktorým sa ustanovujú testovacie metódy pod ľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) 
č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)  
(Text s významom pre EHP)  
(Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1)  
Zmenené a doplnené:  
Úradný vestník  
Č. Strana  Dátum  
►M1 Nariadenie Komisie (ES) č. 761/2009 z 23. júla 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Nariadenie Komisie (EÚ) č. 1152/2010 z 8. decembra 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Nariadenie Komisie (EÚ) č. 640/2012 zo 6. júla 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Nariadenie Komisie (EÚ) č. 260/2014 z 24. januára 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Nariadenie Komisie (EÚ) č. 900/2014 z 15. júla 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1
NARIADENIE KOMISIE (ES) č. 440/2008  
z 30. mája 2008,  
ktorým sa ustanovujú testovacie metódy pod ľa nariadenia 
Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, 
hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)  
(Text s významom pre EHP)  
KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLO ČENSTIEV,  
so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spolo čenstva, 
so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 
z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 
76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (
 1 ), a najmä na jeho článok 13 ods. 3, 
keďže: 
(1) Podľa nariadenia (ES) č. 1907/2006 sa testovacie metódy majú 
prijať na úrovni Spolo čenstva na ú čely testovania látok 
v prípadoch, ke ď sa testovanie vyžaduje na získanie informácií 
o vlastnostiach látok.  
(2) V prílohe V k smernici Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 
o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opat ­
rení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a ozna čovania nebezpe čných 
látok (  2 ) sa ustanovili metódy ur čovania fyzikálno-chemických vlast ­
ností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov. Príloha V k smernici 67/548/EHS sa vypustila smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2006/121/ES s ú činnosťou od 1. júna 2008.
 
(3) Testovacie metódy uvedené v prílohe V k smernici 67/548/EHS 
by sa mali do tohto nariadenia zahrnú ť. 
(4) Týmto nariadením sa nevylu čuje použitie iných testovacích 
metód za predpokladu, že sú v súlade s článkom 13 ods. 3 
nariadenia (ES) č. 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1, opravená verzia v Ú. v. EÚ L 136, 
29.5.2007, s. 3. 
( 2 ) Ú. v. ES 196, 16.8.1967, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená 
smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2006/121/ES (Ú. v. ES L 396, 30.12.2006, s. 850, opravená verzia v Ú. v. EÚ L 136, 29.5.2007, s. 281)  – 
príslušné odkazy sa budú aktualizova ť, keď sa zverejní 30. ATP.
 (5) Pri vypracovávaní testovacích metód by sa mali v plnej miere 
zohľadňovať zásady nahradenia, obmedzenia a zdokonalenia 
využívania zvierat v postupoch, predovšetkým vtedy, ke ď sú 
k dispozícii schválené metódy, ktorými sa testovanie na zviera ­
tách môže nahradi ť, obmedzi ť alebo zdokonali ť. 
(6) Ustanovenia tohto nariadenia sú v súlade so stanoviskom výboru 
zriadeného pod ľa článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,  
PRIJALA TOTO NARIADENIE:  
Článok 1  
Testovacie metódy, ktoré sa majú uplat ňovať na účely nariadenia (ES) 
č. 1907/2006, sa uvádzajú v prílohe k tomuto nariadeniu.  
Článok 2  
Komisia v prípade potreby preskúma testovacie metódy uvedené 
v tomto nariadení s cie ľom nahradi ť, obmedzi ť a zdokonali ť testovanie 
na stavovcoch.  
Článok 3  
Všetky odkazy na prílohu V k smernici 67/548/EHS sa vykladajú ako 
odkaz na toto nariadenie.  
Článok 4  
Toto nariadenie nadobúda ú činnosť dňom nasledujúcim po jeho uverej ­
není v  Úradnom vestníku Európskej únie . 
Uplatňuje sa od 1. júna 2008.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
PRÍLOHA  
ČASŤ A: METÓDY NA STANOVENIE FYZIKÁLNO-CHEMICKÝCH 
VLASTNOSTÍ  
OBSAH 
A.1. TEPLOTA TOPENIA A TUHNUTIA 
A.2. TEPLOTA VARU 
A.3. RELATÍVNA HUSTOTA A.4. TLAK PARY A.5. POVRCHOVÉ NAPÄTIE 
A.6. ROZPUSTNOS Ť VO VODE 
A.8. ROZDE ĽOVACÍ KOEFICIENT 
A.9. TEPLOTA VZPLANUTIA 
A.10. HOR ĽAVOSŤ (TUHÉ LÁTKY) 
A.11. HOR ĽAVOSŤ (PLYNY) 
A.12. HOR ĽAVOSŤ (KONTAKT S VODOU) 
A.13. SAMOZÁPALNÉ VLASTNOSTI TUHÝCH LÁTOK 
A KVAPALÍN 
A.14. VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI 
A.15. TEPLOTA SAMOVZNIETENIA (KVAPALINY A PLYNY) A.16. RELATÍVNA TEPLOTA SAMOVZNIETENIA PRE TUHÉ 
LÁTKY 
A.17. OXIDA ČNÉ VLASTNOSTI (TUHÉ LÁTKY) 
A.18. ČÍSELNÁ PRIEMERNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOS Ť 
A DISTRIBÚCIA MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ POLY ­
MÉROV 
A.19. OBSAH ZLOŽIEK S NÍZKOU MOLEKULOVOU HMOTNO ­
SŤOU V POLYMÉROCH 
A.20. ROZPÚŠ ŤACIE/EXTRAKTÍVNE VLASTNOSTI POLYMÉROV 
VO VODE 
A.21. OXIDA ČNÉ VLASTNOSTI (KVAPALINY) 
A.22. D ĹŽKOVÁ HODNOTA GEOMETRICKÉHO VYJADRENIA 
PRIEMERU VLÁKEN
 
▼M4 
A.23. ROZDE ĽOVACÍ KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): 
METÓDA POMALÉHO MIEŠANIA  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. TEPLOTA TOPENIA A TUHNUTIA  
1. METÓDA  
Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD 
testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) a (3).  
1.1. ÚVOD 
Na stanovenie teploty topenia látok je potrebné použi ť opísané 
metódy, prístroje a zariadenia, a to bez akýchko ľvek obmedzení 
týkajúcich sa stup ňa ich čistoty. 
Výber metódy závisí od charakteru látky ur čenej na testovanie. 
Z toho dôvodu limitujúce faktory budú závisie ť od toho, či príslušná 
látka môže by ť rozomletá na prášok ľahko, ťažko alebo vôbec nie. 
Pre niektoré látky je vhodnejšie stanovenie teploty tuhnutia, a preto 
boli do tejto metódy zahrnuté aj normy pre toto stanovenie. 
V prípadoch, kde kvôli zvláštnym vlastnostiam látky nie je možné bez 
problémov mera ť žiadny z uvedených parametrov, môže by ť vhodné 
stanovenie teploty kvapalného skupenstva, resp. teploty tuhnutia olejov.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Teplota topenia je definovaná ako teplota, pri ktorej sa zmena 
z tuhého do kvapalného skupenstva prejavuje pri atmosférickom tlaku, a táto teplota ideálne zodpovedá teplote tuhnutia. 
Keďže fázová zmena mnohých látok sa uskuto čňuje v ur čitom 
tepelnom rozmedzí, často sa opisuje ako rozmedzie topenia. 
Prepočítavanie jednotiek (K na
 o C) 
t = T – 273,15 
t: teplota v stup ňoch Celzia, stupne Celzia (  o C) 
T: termodynamická teplota, kelvin (K)  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky nemusia by ť použité vo všetkých prípadoch, ak sa 
skúma nová látka alebo nová látka obsiahnutá v prípravku. V prvom rade by mali slúži ť na občasnú kontrolu ú činnosti metódy, jej 
správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiah ­
nutými pri použití iných metód. 
Niektoré kalibra čné látky sú uvedené v odkazoch (4).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Stanoví sa teplota (teplotné rozmedzie) fázovej zmeny z tuhého do 
kvapalného skupenstva alebo z kvapalného do tuhého skupenstva. Prakticky sa po čas zohrievania, resp. ochladzovania vzorky testo ­
vanej látky pri atmosférickom tlaku stanovujú teploty po čiatočného 
štádia topenia, resp. tuhnutia, a kone čného štádia topenia, resp. 
tuhnutia. Opísaných je pä ť metód, menovite kapilárna metóda, 
metódy tepelných blokov, stanovenia teploty tuhnutia, metódy 
termickej analýzy a stanovenie teploty kvapalného skupenstva, 
resp. teploty tuhnutia (metóda vyvinutá pre ropné oleje). 
V určitých prípadoch môže by ť vhodné mera ť namiesto teploty 
topenia teplotu tuhnutia.
 
1.4.1.  Kapilárna metóda  
1.4.1.1.  Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalinovým kúpe ľom 
Malé množstvo jemne rozomletej látky sa vloží do kapilárnej rúrky 
a tesne sa natla čí. Rúrka sa zohrieva spolu s teplomerom 
a v priebehu vlastného topenia sa nárast teploty adjustuje na menej ako 1 K/min. Stanovuje sa po čiatočná a kone čná teplota topenia.
 
1.4.1.2.  Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kovovým blokom  
Postupuje sa tak, ako je to opísané v odseku 1.4.1.1, avšak 
s výnimkou, že kapilárna rúrka a teplomer sú umiestnené do zahrie ­
vaného kovového bloku, pri čom celý proces a hodnoty na teplomere 
možno sledova ť otvormi v bloku.  
1.4.1.3.  Foto článková detekcia  
Vzorka v kapilárnej rúrke sa zahrieva automaticky v kovovom valci. 
Dierou vo valci sa cez sledovanú látku namieri svetelný lú č na 
presne kalibrovaný fotoelektrický článok. Optické vlastnosti vä čšiny 
látok sa po čas topenia menia tak, že látka sa z neprieh ľadnej mení na 
priehľadnú. Intenzita svetla dopadajúceho na fotoelektrický článok sa 
tak zvýši a vyšle stop signál k digitálnemu indikátoru, ktorý od číta 
teplotu z platinového odporového teplomeru, ktorý je umiestnený vo 
vyhrievacej komore. Táto metóda nie je vhodná pre niektoré inten ­
zívne sfarbené látky.  
1.4.2.  Tepelné bloky  
1.4.2.1.  Koflerov tepelný blok  
Koflerov tepelný blok pozostáva z dvoch kusov kovu s rozdielnou 
tepelnou vodivos ťou a s elektrickým ohrievaním, pri čom samotný 
blok je zhotovený tak, aby teplotný gradient bol takmer lineárny 
po celej jeho d ĺžke. Teplota Koflerovho tepelného bloku sa môže 
meniť v rozmedzí od 283 do 573 K. Tepelný blok je vybavený 
zvláštnym zariadením na čítanie teploty, ktoré je opatrené posuvným 
bežcom s ru čičkou a tabu ľkou zostavenou pre konkrétny typ žera ­
viacej tyče. Na stanovenie teploty topenia sa testovaná látka v tenkej 
vrstve nanesie na tepelný blok. V priebehu nieko ľkých sekúnd sa 
vytvorí zrete ľná deliaca čiara medzi kvapalnou a tuhou fázou. 
Teplota na deliacej čiare sa od číta nastavením ru čičky do takej 
polohy, aby spo čívala priamo na čiare. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Mikroskop na sledovanie taveniny  
Na stanovenie teploty topenia pri ve ľmi malých množstvách mate ­
riálu sa používajú viaceré mikroskopicky sledované horúce štádiá. V prípade vä čšiny horúcich štádií sa teplota meria citlivým termo č­
lánkom, ale niekedy sa používajú aj klasické ortu ťové teplomery. 
Typický prístroj na mikroskopické sledovanie teploty topenia v horúcich štádiách pozostáva z vyhrievacej komory, v ktorej sa nachádza kovová plat ňa, na ktorú sa umiestni vzorka na podložné 
sklíčko. Uprostred kovovej platne je otvor, ktorý umož ňuje preni ­
kanie svetelných lú čov z osvet ľovacieho zrkadielka mikroskopu. 
Počas používania je komora uzavretá sklenou plat ňou, aby sa zabrá ­
nilo prístupu vzduchu do priestoru so skúmanou vzorkou. 
Zahrievanie vzorky je regulované reostatom. Na ve ľmi presné 
merania na opticky anizotropných látkach možno použi ť polarizo ­
vané svetlo.
 
1.4.2.3.  Menisková metóda  
Táto metóda sa používa špeciálne pre polyamidy. 
Vizuálne sa stanovuje teplota, pri ktorej dochádza k posunu menisku 
silikónového oleja, vloženého medzi zdroj horúceho štádia a krycie sklíčko, spočívajúce na polyamidovej testovanej vzorke.
 
1.4.3.  Metóda na stanovenie teploty tuhnutia  
Vzorka sa umiestni do zvláštnej skúšobnej trubice, ktorá sa potom 
vloží do prístroja na stanovovanie teploty tuhnutia. Po čas ochladzo ­
vania sa vzorka jemne a neustále mieša a vo vhodných intervaloch sa 
meria teplota. Ak pri nieko ľkých za sebou nasledujúcich čítaniach 
zostáva teplota konštantná, jej hodnota (s korektúrou odchýlky teplo ­
mera) sa zaznamená ako teplota tuhnutia. 
Má sa zabráni ť podchladeniu udržiavaním rovnováhy medzi tuhou 
a kvapalnou fázou.  
1.4.4.  Tepelná (termická) analýza  
1.4.4.1.  Diferenciálna tepelná (termická) analýza (DTA)  
V rámci tohto postupu sa zaznamenáva rozdiel v teplotách medzi 
príslušnou testovanou látkou a referen čným materiálom ako funkcia 
teploty, pri čom testovaná látka aj referen čný materiál sú vystavené 
tomu istému regulovanému a kontrolovanému tepelnému programu. Keď testovaná vzorka podstúpi fázovú zmenu majúcu za následok 
zmenu entalpic, táto zmena sa prejaví ako endotermická (topenie) 
alebo exotermická (tuhnutie) odchýlka od základnej čiary zazname ­
návajúcej teplotu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Diferenciálna snímacia kalorimetria (DSK)  
V rámci tohto postupu sa zaznamenáva rozdiel v energetických vstu ­
poch do príslušnej testovanej látky a do referen čného materiálu, pri čom 
testovaná látka aj referen čný materiál sú vystavené tomu istému regu ­
lovanému a kontrolovanému tepelnému programu. Toto je energia, 
ktorá je potrebná na vytvorenie nulového teplotného rozdielu medzi testovanou látkou a referen čným materiálom. Ke ď testovaná vzorka 
podstúpi fázovú zmenu majúcu za následok zmenu entalpie, táto 
zmena sa prejaví ako endotermická (topenie) alebo exotermická (tuh ­
nutie) odchýlka od základnej čiary zaznamenávajúcej tepelný tok.
 
1.4.5.  Teplota tuhnutia olejov  
Táto metóda bola vyvinutá na použitie s ropnými olejmi a je vhodná 
na použitie s olejovitými látkami vyzna čujúcimi sa nízkymi teplo ­
tami topenia. 
Po predchádzajúcom zohriatí sa vzorka ochladzuje špecifickou 
rýchlosťou a v intervaloch poklesu teploty o 3 K sa skúma jej 
tekutosť. Najnižšia teplota, pri ktorej sa ešte dá pozorova ť pohyb 
testovanej látky, sa zaznamená ako teplota tuhnutia oleja.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Použiteľnosť a presnos ť rozličných metód používaných na stano ­
venie teploty topenia, resp. rozmedzia topenia je uvedená 
v nasledujúcej tabu ľke: 
TABUĽKA: POUŽITE ĽNOSŤ METÓD  
A. Kapilárne metódy  
Metóda merania Látky, ktoré 
možno rozomlie ť 
na prášok Látky, ktoré 
nemožno ľahko 
rozomlieť na 
prášok Rozsah teplôt Odhadnutá 
presnosť ( 1 ) Platná norma  
Zariadenie na 
stanovenie teploty 
topenia kvapali ­
novým kúpe ľom áno len pre 
niekoľko látok 273 až 573 K + 0,3 K JIS K 0064 
Zariadenie na 
stanovenie teploty topenia s kovovým 
blokom áno len pre 
niekoľko látok 293 až > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Detekcia foto č­
lánkom áno pre niektoré 
látky 
s použitím 
prídavných 
zariadení 253 až 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Závisí od typu zariadenia a stup ňa čistoty látky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Vyhrievacie bloky a metódy tuhnutia  
Metóda merania Látky, ktoré 
možno rozomlie ť 
na prášok Látky, ktoré 
nemožno ľahko 
rozomlieť na 
prášok Rozsah teplôt Odhadnutá 
presnosť ( 1 ) Platná norma  
Koflerov vyhrie ­
vací stolík áno nie 283 až 
> 573 K ± 1 K ANSI/ASTM 
D 3451-76 
Taviaci mikroskop áno len pre 
niekoľko látok 273 až 
> 5 73 K ± 0,5 K DIN 53736 
Menisková 
metóda nie predovšetkým 
pre polyamidy 293 až 
> 573 K ± 0,5 K ISO I2I8 (E) 
Metóda stanovenia 
teploty tuhnutia áno áno 223 až 573 K ± 0,5 K napr. BS 4695  
( 1 ) Závisí od typu zariadenia a stup ňa čistoty látky.  
C. Tepelná (termická) analýza  
Metóda merania Látky, ktoré 
možno rozomlie ť 
na prášok Látky, ktoré 
nemožno ľahko 
rozomlieť na 
prášok Rozsah teplôt Odhadnutá 
presnosť ( 1 ) Platná norma  
Diferenčná tepelná 
analýza áno áno 173 až 
1 273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 537-76 
Diferenčná skeno­
vacia kalorimetria áno áno 173 až 
1 273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Závisí od typu zariadenia a stup ňa čistoty látky.  
D. Teplota tuhnutia olejov  
Metóda merania Látky, ktoré 
možno rozomlie ť 
na prášok Látky, ktoré 
nemožno ľahko 
rozomlieť na 
prášok Rozsah teplôt Odhadnutá 
presnosť ( 1 ) Platná norma  
Teplota tuhnutia 
olejov pre minerálne 
oleje 
a olejovité 
látky pre minerálne 
oleje a olejovité 
látky 223 až 323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Závisí od typu zariadenia a stup ňa čistoty látky.  
1.6. OPIS METÓD 
Postupy skoro všetkých skúšobných metód sú opísané 
v medzinárodných a štátnych normách (pozri dodatok 1).  
1.6.1.  Metódy s kapilárnou rúrkou  
Keď sú testované látky, ktoré sú rozdrvené na jemný prach, vysta ­
vené pomalému nárastu teploty, zvy čajne prejavujú štádiá topenia, 
ktoré sú znázornené na obrázku 1.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Obrázok 1
  
Počas stanovovania teploty topenia sa teploty zaznamenávajú na 
začiatku procesu topenia a v kone čnom štádiu.  
1.6.1.1.  Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalinovým kúpe ľom 
Na obrázku 2 je znázornený typ štandardizovaného prístroja na 
meranie teploty topenia vyrobeného zo skla (JIS K 0064); všetky 
špecifikácie (rozmery) sú uvedené v milimetroch (mm).  
Obrázok 2
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Temperačná kvapalina:  
Je potrebné zvoli ť vhodnú kvapalinu. Vo ľba správnej kvapaliny 
závisí od teploty topenia, ktorá má by ť stanovená, napr. parafínový 
olej pre teploty topenia, ktoré nepresahujú 473 K, silikónový olej pre teploty topenia, ktoré nepresahujú 573 K. 
Pre teploty topenia nad 523 K sa môže použi ť zmes pozostávajúca 
z troch dielov kyseliny sírovej a dvoch dielov síranu draselného (v pomere hmôt). Pri použití takejto zmesi je potrebné dodržiava ť 
vhodné bezpe čnostné opatrenia.
 
Teplomer:  
Treba používa ť len také teplomery, ktoré sp ĺňajú požiadavky týchto 
alebo ekvivalentných noriem: 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Postup:  
Suchá testovaná látka sa v trecej miske rozomelie na jemný prášok 
a vloží sa do kapilárnej rúrky, ktorá je na jednom konci zatavená. Testovaný prášok sa tesne natla čí tak, aby nápl ň tvorila približne 
3 mm stĺpec. Na ú čely dosiahnutia rovnomerne natesnanej vzorky 
je potrebné kapilárnu rúrku pusti ť z výšky približne 700 mm cez 
sklenú rúrku vertikálne na hodinkové sklí čko. 
Naplnená kapilárna rúrka sa umiestni do kúpe ľa tak, aby sa stredná 
časť ortuťovej guľôčky teplomeru dotýkala tej časti rúrky, v ktorej je 
umiestnená testovaná vzorka. Kapilárna rúrka sa do prístroja vkladá zvyčajne pri teplote, ktorá je o 10 K nižšia ako samotná teplota 
topenia. 
Temperačná kvapalina sa zahrieva tak, aby nárast teploty predsta ­
voval približne 3 K za minútu. Kvapalinu je potrebné neustále 
miešať. Pri teplote približne o 10 K nižšej ako predpokladaná teplota 
topenia testovanej látky sa nárast teploty nastaví na maximálne 1 K za minútu.
 
Výpočet: 
Výpočet teploty topenia je takýto: 
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E )n 
kde: 
T = korigovaná teplota topenia v K 
T D = teplota od čítaná na teplomere D v K 
T E = teplota od čítaná na teplomere E v K 
n = po čet dielikov ortu ťového stĺpca teplomeru D na výstupnej 
trubičke. 
1.6.1.2.  Zariadenia na meranie teploty topenia s kovovým blokom  
Prístroje: 
Pozostávajú z týchto častí: 
— valcovitý blok, ktorého horná časť je dutá a vytvára komoru 
(pozri obrázok 3), 
— kovový vrchnák s dvoma alebo viacerými otvormi umož ňujúcimi 
zasunutie rúrok do kovového bloku,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— ohrevný systém kovového bloku, pozostávajúci napríklad 
z elektrického odporu zabudovaného do kovového bloku, 
— reostat na reguláciu príkonu energie v prípade použitia elektric ­
kého ohrievania, 
— štyri okienka zo žiaruvzdorného skla na bo čných stenách 
komory, ktoré sú umiestnené proti ľahlo a vzájomne v pravých 
uhloch. Pred jedným z týchto okienok je namontovaný okulár na sledovanie kapilárnej rúrky. Zvyšné tri okienka sa používajú na 
osvetlenie vnútornej komory kovového bloku pomocou lámp, 
— kapilárna rúrka zo žiaruvzdorného skla, na jednom konci 
uzavretá (pozri odsek 1.6.1.1).
 
Teplomer:  
Pozri normy spomínané v odseku 1.6.1.1. Možno tiež použi ť termoe­
lektrické meracie zariadenia s porovnate ľným stup ňom presnosti.  
Obrázok 3
  
1.6.1.3.  Foto článková (fotónková) detekcia 
Prístroje a postup:  
Prístroj pozostáva z kovovej komory s automatickým ohrevným 
systémom. Tri kapilárne rúrky sa naplnia testovanou látkou pod ľa 
pokynov uvedených v odseku 1.6.1.1 a umiestnia sa do piecky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Na účely kalibrovania prístroja existuje viacero lineárnych prírastkov 
teploty a vhodný nárast teploty je elektricky nastavovaný pred ­
volenou konštantnou a lineárnou rýchlos ťou ohrevu. Registra čné 
prístroje ukazujú skuto čnú teplotu v piecke, ako aj teplotu testovanej 
látky umiestnenej v kapilárnych rúrkach.  
1.6.2.  Tepelné bloky  
1.6.2.1.  Koflerov tepelný blok  
Pozri dodatok.  
1.6.2.2.  Mikroskop na sledovanie taveniny  
Pozri dodatok.  
1.6.2.3.  Menisková metóda (polyamidy)  
Pozri dodatok. 
Rýchlosť ohrevu pri teplote topenia by mala by ť nižšia ako 1 K za 
minútu.  
1.6.3.  Metódy na stanovenie teploty tuhnutia  
Pozri dodatok.  
1.6.4.  Tepelná analýza  
1.6.4.1.  Diferenciálna tepelná analýza  
Pozri dodatok.  
1.6.4.2.  Diferenciálna snímacia kalorimetria  
Pozri dodatok.  
1.6.5.  Stanovenie teploty tuhnutia olejov  
Pozri dodatok.  
2. ÚDAJE  
V niektorých prípadoch je potrebná korekcia teplomeru.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— použitú metódu, — presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi) 
a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak 
boli takéto uskuto čnené, 
— stanovenie presnosti. Ako teplota topenia sa v správe uvádza priemer najmenej dvoch 
meraní, ktoré sa nachádzajú v rozmedzí stanovenej presnosti (pozri 
tabuľky).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Ak sa rozdiel medzi teplotou na za čiatku a v kone čnom štádiu 
procesu topenia nachádza v rámci hrani čných limitov presnosti 
metódy, za teplotu topenia sa bude považova ť teplota nameraná 
v konečnom štádiu procesu topenia. Inak sa v správe uvádzajú 
obidve teploty. 
Ak sa testovaná látka rozloží alebo sublimuje ešte pred dosiahnutím 
teploty topenia, v správe je potrebné uvies ť teplotu, pri ktorej bol 
tento jav pozorovaný. 
V správe musia by ť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú 
dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho stavu testovanej látky.
 
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline No 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. (vyd.). Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803 – 834. 
(3) R. Weissberger ed. (vyd.): Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience 
Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505 – 515.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Dodatok  
V prípade potreby dodato čných technických podrobností možno použi ť napríklad 
tieto technické normy:  
1. Kapilárne metódy  
1.1. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalným kúpe ľom 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products
 
1.2. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kovovým blokom 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen 
ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of 
„melting point“  
2. Tepelné bloky  
2.1. Koflerov tepelný blok 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Mikroskop na sledovanie tavenín 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen. 
2.3. Menisková metóda (polyamidy) 
ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of 
„melting point“  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion“ méthode du ménisque
 
3. Metódy na stanovenie teploty tuhnutia  
BS 463 3 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Tepelná analýza  
4.1. Diferenciálna tepelná analýza 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Diferenciálna snímacia kalorimetria 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Stanovenie teploty tuhnutia olejov  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van 
aardolieproducten: Troebelingspunt en 
vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. TEPLOTA VARU  
1. METÓDA  
Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD 
testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) a (3).  
1.1. ÚVOD 
Metódy, prístroje a zariadenia opísané v tejto časti môžu by ť použité 
pre kvapalné látky a látky s nízkou teplotou topenia za predpokladu, 
že tieto látky nepodliehajú reakciám pod teplotou varu (napr. samo ­
voľnej oxidácii alebo prešmykovaniu či degradácii a pod.). Metódy 
môžu byť aplikované na čisté, ako aj na ne čisté kvapalné látky. 
Dôraz sa kladie na metódy využívajúce foto článkovú detekciu 
a tepelnú (termickú) analýzu, pretože tieto metódy umož ňujú stano ­
venie teploty topenia a zárove ň aj teploty varu. Navyše, merania sa 
môžu uskuto čniť automaticky. 
Tzv. „dynamická metóda“ má tú výhodu, že sa môže použi ť aj na 
stanovenie tlaku pary a nie je teda potrebné upravova ť teplotu varu 
k normálnemu tlaku (101,325 kPa), pretože normálny tlak sa môže 
počas meraní upravova ť manostatom.  
Poznámky:  
Vplyv prímesí na stanovenie teploty varu závisí vo ve ľkej miere od 
charakteru prímesi. Ke ď sa vo vzorke nachádzajú prchavé prímesi, 
ktoré by mohli nepriaznivo ovplyvni ť výsledky, testovaná látka sa 
očistí. 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Normálna teplota varu je definovaná ako teplota, pri ktorej má tlak 
pary danej kvapaliny hodnotu 101,325 kPa. 
Ak sa teplota varu nemeria pri normálnom atmosférickom tlaku, 
závislosť teploty od tlaku pary môže by ť opísaná Clausiusovou- 
Clapeyronovou rovnicou:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ konst  
kde: 
P = tlak pary testovanej látky v pascaloch ΔH
 v = jej výparné teplo (skupenské teplo vyparovania) v J mol  -1 
R = univerzálna mólová plynová konštanta = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = termodynamická teplota v K 
Teplota varuje stanovená pri zoh ľadnení okolitého tlaku pôsobiaceho 
počas merania.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Prepočty 
Tlak (jednotky: kPa) 100kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(„bar“ je na ďalej prípustná jednotka, avšak neodporú ča 
sa jej používanie) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(jednotky „mm Hg“ a „Torr“ nie sú prípustné) 
1 atm = štandardná atmosféra = 101 325 Pa 
(jednotka „atm“ nie je prípustná). 
Teplota (jednotky K – kelvin) t = T – 273,15 
t: teplota v stup ňoch Celzia, stupne Celzia (
 o C), 
T: termodynamická teplota, kelvin (K).  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky nemusia by ť použité vo všetkých prípadoch, ke ď sa 
skúma nová látka alebo nová látka obsiahnutá v prípravku. V prvom rade by mali slúži ť na občasnú kontrolu ú činnosti metódy, jej 
správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami dosiah ­
nutými pri použití iných metód. 
Niektoré kalibra čné látky možno vyh ľadať v metódach uvedených 
v dodatku.
 
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Päť metód na stanovenie teploty varu (rozmedzia varu) sa zakladá na 
meraní teploty varu, dve ďalšie sa zakladajú na tepelnej analýze.  
1.4.1.  Stanovenie použitím ebuliometra  
Ebuliometre boli pôvodne vyvinuté na stanovenie hmotnosti molekúl 
zvýšením teploty varu, ale sú vhodné aj na presné merania teploty varu. Ve ľmi jednoduchý prístroj je opísaný v technickej norme 
ASTM D 1120-72 (pozri dodatok). Kvapalina sa v tomto prístroji 
zohrieva v rovnovážnych podmienkach pri atmosférickom tlaku až 
po dosiahnutie varu.
 
1.4.2.  Dynamická metóda  
Táto metóda spo číva v meraní rekondenza čnej teploty pary 
v spätnom toku po čas varu pomocou vhodného teplomeru. Pri 
tejto metóde môže by ť regulovaný tlak.  
1.4.3.  Destila čná metóda pre teplotu varu  
Táto metóda spo číva v destilácii kvapaliny a v meraní rekonden ­
začnej teploty pary a v stanovení množstva destilátu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Metóda pod ľa Siwoloboffa  
Testovaná vzorka sa zahrieva vo vzorkovej rúrke, ktorá je ponorená 
do kvapaliny v tepelnom kúpeli. Do vzorkovej rúrky sa zasunie zatavená kapilára, ktorá obsahuje vo svojej spodnej časti vzduchovú 
bublinu.
 
1.4.5.  Foto článková detekcia  
Postupuje sa pod ľa princípov Siwoloboffovej metódy, avšak 
s uskutočnením automatického fotoelektrického merania pri použití 
stúpajúcich bublín.  
1.4.6.  Diferenciálna tepelná analýza  
Touto technikou merania sa zaznamenáva teplotný rozdiel medzi 
testovanou látkou a referen čným materiálom ako funkcia teploty, 
pričom testovaná látka aj referen čný materiál sú vystavené tomu 
istému regulovanému a kontrolovanému teplotnému programu. Ke ď 
testovaná vzorka prejde fázovou zmenou zahrnujúcou zmenu ental ­
pie, táto zmena sa prejaví endotermickou odchýlkou (varom) od základnej línie teplotného záznamu.
 
1.4.7.  Diferenciálna snímacia kalorimetria  
Touto meracou technikou sa zaznamenáva rozdiel vo vstupoch 
energie do testovanej látky a do referen čného materiálu ako funkcia 
teploty, pri čom testovaná látka aj referen čný materiál sú vystavené 
tomu istému regulovanému a kontrolovanému teplotnému programu. 
Toto je energia, ktorá je potrebná na vytvorenie nulového teplotného rozdielu medzi testovanou látkou a referen čným materiálom. Ke ď 
testovaná vzorka prejde fázovou zmenou zahrnujúcou zmenu ental ­
pie, táto zmena sa prejaví endotermickou odchýlkou (varom) od 
základnej línie záznamu tepelného toku.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Aplikovate ľnosť a presnos ť rozdielnych metód použitých na stano ­
venie teploty varu, resp. teplotného rozmedzia, je uvedená v tabuľke 1.
 
Tabuľka 1 
Porovnanie metód  
Metóda merania Odhadnutá presnos ť Platná norma  
Stanovenie ebuliometrom ± 1,4 K (do 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (do 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamická metóda ± 0,5 K (do 600 K) (  2 ) 
Destilačná metóda (stanovenie 
rozmedzia teploty varu) ± 0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Postup pod ľa Siwoloboffa ± 2 K (do 600 K) (  2 ) 
Detekcia foto článkom ± 0,3 K (do 373 K) (  2 ) 
Diferenčná tepelná analýza ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76 
Diferenčná snímacia kalorimetria ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K(do 1 273K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Táto presnos ť platí len pre jednoduchý prístroj opísaný napr. v norme ASTM D 1120-72; môže by ť zlepšená 
použitím dokonalejšieho ebuliometra. 
( 2 ) Platí len pre čisté látky. Použitie za iných okolností by malo by ť zdôvodnené.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. OPIS SKÚŠOBNÝCH METÓD 
Postupy niektorých skúšobných metód sú opísané v medzinárodných 
a štátnych technických normách (pozri dodatok).  
1.6.1.  Ebuliometer  
Pozri dodatok.  
1.6.2.  Dynamická metóda  
Pozri testovaciu metódu A.4 na stanovenie tlaku pary. 
Zaznamenáva sa teplota varu pozorovaná pri aplikovanom tlaku 
101,325 kPa.  
1.6.3.  Destila čný proces (rozmedzie varu)  
Pozri dodatok.  
1.6.4.  Metóda pod ľa Siwoloboffa  
Testovaná vzorka sa zahrieva v prístroji na meranie teploty topenia 
vo vzorkovej rúrke s priemerom približne 5 mm (obrázok 1). 
Obrázok 1 znázor ňuje typ štandardizovaného prístroja na meranie 
teploty topenia a teploty varu (pod ľa technickej normy JIS 
K 0064) (vyrobený zo skla, všetky rozmery sú uvedené v milimetroch).
 
Obrázok 1
  
Kapilárna rúrka (varná kapilára), ktorá je zatavená približne vo výške 
1 cm nad spodným koncom, sa umiestni do vzorkovej rúrky. Výška úrovne, do ktorej sa pridá testovaná látka, musí by ť taká, aby zata ­
vená časť kapiláry bola pod hladinou kvapaliny. Vzorková rúrka 
obsahujúca varnú kapiláru sa bu ď pripevní k teplomeru pomocou 
gumičky, alebo sa zboku fixuje podpierkou (pozri obrázok 2).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Obrázok 2  
Princíp pod ľa Siwoloboffa  Obrázok 3  
Modifikovaný princíp
  
Temperačná kvapalina sa zvolí v závislosti od teploty varu. Pri 
teplotách do 573 K možno použi ť silikónový olej. Parafínový olej 
možno použi ť len do teploty 473 K. Zahrievanie tempera čnej kvapa ­
liny musí by ť spočiatku adjustované na nárast teploty 3 K za minútu. 
Temperačná kvapalina sa musí neustále mieša ť. Pri teplote približne 
10 K pod predpokladanou teplotou varu sa intenzita zahrievania zníži na menej ako 1 K za minútu. V bezprostrednej blízkosti teploty varu sa vo varnej kapiláre za čnú rýchlo tvori ť bublinky. 
Teplota varu je tá teplota, ke ď pri momentálnom ochladení 
v kapiláre ustane tvorba re ťazca bubliniek a zrazu za čne stúpať 
stĺpec kvapaliny. Zodpovedajúci údaj na stupnici teplomeru bude 
predstavova ť teplotu varu príslušnej testovanej látky. 
V prípade modifikovaného princípu (obrázok 3) sa teplota varu 
stanovuje v kapiláre na meranie teploty topenia. Koniec kapiláry 
sa nataví a natiahne do hrotu v d ĺžke asi 2 cm (a) a nasaje sa 
malé množstvo testovanej látky. Otvorený koniec jemnej kapiláry sa uzavrie zatavením tak, že na konci zostane malá vzduchová 
bublinka. Po čas zohrievania v prístroji na stanovenie teploty topenia 
(b) sa vzduchová bublinka rozpína. Teplota varu zodpovedá teplote, pri ktorej testovaná látka dosiahne povrch tempera čnej kvapaliny (c).
 
1.6.5.  Foto článková detekcia  
Testovaná vzorka sa zahrieva v kapiláre umiestnenej vo vyhrie ­
vanom kovovom bloku. 
Cez vhodne umiestnené otvory v kovovom bloku sa nasmeruje 
svetelný lú č cez testovanú látku na dôkladne kalibrovaný foto článok. 
Počas nárastu teploty testovanej vzorky sa vo varnej kapiláre za čnú 
objavovať samostatné vzduchové bublinky. Ke ď sa dosiahne teplota 
varu, počet vzduchových bubliniek sa nápadne zvýši. Tento jav 
spôsobí zmenu v intenzite svetla zaznamenanú foto článkom, ktorý 
vyšle stop signál indikátoru od čítavajúcemu teplotu z platinového 
odporového teplomeru umiestneného v kovovom bloku. 
Táto metóda je obzvláš ť výhodná, pretože umož ňuje stanovenie 
skúmaných hodnôt aj pri teplotách nižších ako bežná izbová teplota 
až do 253,15 K (–20  o C) bez akýchko ľvek zmien na prístroji. Inštru ­
ment stačí iba umiestni ť do chladiaceho kúpe ľa. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Tepelná analýza  
1.6.6.1.  Diferenciálna tepelná analýza  
Pozri dodatok.  
1.6.6.2.  Diferenciálna snímacia kalorimetria  
Pozri dodatok.  
2. ÚDAJE  
Pri malých odchýlkach od normálneho tlaku (max. ± 5 kPa) sa 
teploty varu normalizujú na T  n pomocou tejto rovnice pod ľa 
Sidneyho Younga: 
T n = T + (f  T × Δp) 
kde: 
Δp = (101,325 – p) [pozor na znamienko!] 
P = meranie tlaku v kPa f
 T = pomer zmeny teploty varu k tlaku v K/kPa 
T = nameraná teplota varu v K 
T n = teplota varu korigovaná k normálnemu tlaku v K 
Opravné koeficienty na teplotu, f  T , a rovnice na ich aproximáciu sú 
pre mnohé látky zahrnuté v uvedených medzinárodných a národných technických normách. 
Napríklad v metóde pod ľa technickej normy DIN 53171 sa spomí ­
najú tieto hrubé opravy pre rozpúš ťadlá obsiahnuté v náterových 
farbách:
 
Tabuľka 2 
Opravné koeficienty f  T na teplotu  
Teplota T (K) Opravný koeficient f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— použitú metódu, — presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a ne čistoty) 
a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak 
boli takéto uskuto čnené, 
— odhad presnosti. Ako teplota varu sa uvádza stredná hodnota najmenej dvoch meraní, 
ktoré sú v rozmedzí stanovenej presnosti (pozri tabu ľku 1). 
V správe musia by ť zaznamenané namerané teploty varu a ich prie ­
merné hodnoty a tlak, resp. tlaky, pri ktorých boli merania uskuto č­
nené a sú uvedené v kPa. Odporú ča sa, aby použitý tlak dosahoval 
hodnoty blížiace sa normálnemu atmosférickému tlaku. 
V správe musia by ť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú 
dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí 
a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.
 
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the 
Council C (81) 30 final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental 
thermodynamics, Butterworths, London, 1975, volume II. 
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience 
Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Dodatok  
V prípade potreby dodato čných technických podrobností možno použi ť napríklad 
tieto technické normy:  
1. Ebuliometer  
1.1. Zariadenia na stanovenie teploty topenia s kvapalným kúpe ľom 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destila čný proces (rozmedzie varu)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/7 1 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Diferenciálna tepelná analýza a diferenciálna snímacia kalori ­
metria  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. RELATÍVNA HUSTOTA  
1. METÓDA  
Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD 
testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkaze (2).  
1.1. ÚVOD 
Opísané metódy na stanovenie relatívnej hustoty sa môžu použi ť pre 
tuhé a kvapalné látky bez akýchko ľvek obmedzení v spojitosti so 
stupňom ich čistoty. Rozli čné použite ľné metódy sú uvedené 
v tabuľke 1.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Relatívna hustota, D  20 4 , tuhých látok alebo kvapalín je pomer medzi 
hmotnosťou objemu príslušnej látky ur čenej na testovanie, stano ­
venou pri teplote 20  o C, a hmotnos ťou toho istého objemu vody, 
stanovenou pri teplote 4  o C. Relatívna hustota nemá žiadny rozmer. 
Hustota, P, danej látky je pomer hmotnosti, m, a jej objemu, v. Hustota, P, sa udáva v jednotkách SI, v kg/m
 3 . 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY (1) (3) 
Referenčné látky sa nemusia použi ť vo všetkých prípadoch, ke ď sa 
skúma nová chemická látka alebo nová chemická látka obsiahnutá v chemickom prípravku. V prvom rade by mali slúži ť na občasnú 
kontrolu ú činnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie 
porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.
 
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNÝCH METÓD 
Používajú sa štyri triedy (skupiny) skúšobných metód.  
1.4.1.  Výtla čné metódy  
1.4.1.1.  Hustomer  (pre kvapalné látky) 
Dostatočne presné a rýchle stanovenia hustoty možno dosiahnu ť 
ponorným hustomerom, ktorý umož ňuje stanovenie hustoty testo ­
vanej kvapaliny na základe h ĺbky ponorenia od čítaním príslušnej 
hodnoty z delenej stupnice.  
1.4.1.2.  Hydrostatické váhy  (pre tuhé a kvapalné látky) 
Na stanovenie hustoty možno použi ť rozdiel medzi hmotnos ťou 
príslušnej testovanej vzorky, meranou vo vzduchu a vo vhodnej 
kvapaline (napr. vo vode). 
V prípade tuhých látok sa nameraná hustota vz ťahuje iba na 
konkrétnu použitú vzorku. Na stanovenie hustoty kvapalín sa teleso so známym objemom, v, odváži najprv vo vzduchu a potom 
v kvapaline.
 
1.4.1.3.  Metóda ponoreného telesa  (pre kvapalné látky) (4) 
V rámci tejto metódy sa hustota kvapaliny stanoví z rozdielu hodnôt 
váženia kvapaliny pred ponorením a po ponorení telesa so známym 
objemom do testovanej kvapaliny.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Pyknometrické metódy  
Pre tuhé alebo kvapalné látky možno použi ť pyknometre rozli čných 
tvarov a so známymi objemami. Hustota sa vypo číta z rozdielu 
hmotnosti medzi plným a prázdnym pyknometrom a jeho známeho 
objemu.  
1.4.3.  Vzduchový porovnávací pyknometer  (pre tuhé látky) 
Hustota tuhej látky v akejko ľvek forme sa môže mera ť pri teplote 
miestnosti pomocou plynového porovnávacieho pyknometra. Objem látky sa meria vo vzduchu alebo v inertnom plyne vo valci 
s menite ľným kalibrovaným objemom. Na výpo čet hustoty sa 
jedno meranie hmotnosti vykoná po ukon čení merania objemu.
 
1.4.4.  Oscilujúci hustomer  (5) (6) (7) 
Hustota kvapaliny sa môže mera ť aj oscilujúcim hustomerom. 
Mechanický oscilátor zostrojený v tvare trubice do U sa rozkmitá na rezonan čný kmito čet oscilátora, ktorý závisí od jeho hmotnosti. 
Vloženie testovanej látky zmení rezonan čný kmito čet oscilátora. 
Prístroj musí by ť kalibrovaný dvoma kvapalnými látkami známej 
hustoty. Tieto látky by sa mali zvoli ť podľa možnosti tak, aby ich 
hustoty pokryli celý meraný rozsah.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Použiteľnosť rozdielnych metód používaných na stanovenie rela ­
tívnej hustoty je uvedená v tabu ľke. 
1.6. OPIS METÓD 
Technické normy uvedené ako príklady, ktoré treba použi ť pre doda ­
točné technické podrobnosti, sú uvedené v dodatku. 
Testy sa musia vykona ť pri teplote 20  o C, a zárove ň je potrebné 
uskutočniť vždy aspo ň dve merania.  
2. ÚDAJE  
Pozrite príslušné technické normy uvedené v dodatku.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— použitú metódu, — presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi) 
a opatrenia v rámci predbežnej purifikácie testovanej látky, ak 
sa takéto uskuto čnili. 
Relatívna hustota,
 D 20 
4 , musí by ť v správe uvedená pod ľa definície 
v bode 1.2, spolu s fyzikálnym stavom meranej látky. 
Musia by ť uvedené všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité 
pre interpretáciu výsledkov, obzvláš ť v súvislosti s prímesami 
a s fyzikálnym skupenstvom testovanej látky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabuľka 
Použiteľnosť metód  
Metóda merania Hustota Najvyššia možná 
hodnota dyna ­
mickej viskozity Platná norma 
tuhé látky kvapaliny  
1.4.1.1. Hustomer áno 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Hydrostatické váhy a) tuhé látky áno ISO 1183 (A), b) kvapaliny áno 5 Pa s ISO 901 a 758 
1.4.1.3. Metóda ponoreného 
telesa áno 22 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Pyknometer ISO 3507 
a) tuhé látky áno ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) kvapaliny áno 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Vzduchový porovnávací 
pyknometer áno DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Oscilujúci hustomer áno 5 Pa s
 
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inters ­
cience Publ., New York, 1959, vol I, Part 1. 
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 508. 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427 – 
430. 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297 – 302. 
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeuti ­
sche Industrie, 1975, vol. 37, 717 – 726. 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253 – 255.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Dodatok  
V prípade potreby dodato čných technických podrobností možno použi ť napríklad 
tieto technické normy:  
1. Výtla čné metódy  
1.1. Hydrometer 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Aerometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Hydrostatické váhy  
Pre tuhé látky  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Pre kvapalné látky  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3. Metóda ponoreného telesa 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of 
density; immersed body method  
2. Pyknometrické metódy  
2.1. Pre kvapalné látky 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100. 10
 -6 m 2 s -1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100. 10  - 
6 m 2 s -1 at 20  o C, applicable in particular 
also to hydrocarbons and aqueous solutions 
as well as to liquids with higher vapour 
pressure, approximately 1 bar at 90  o C) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer 
method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary – stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric method
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Pre tuhé látky 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Vzduchový porovnávací pyknometer  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. Tlak pary  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 104 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Táto revidovaná verzia metódy A.4(1) obsahuje dodato čnú metódu, 
výtokovú metódu: izotermálnu termogravimetriu ur čenú pre látky 
s veľmi nízkym tlakom (až do 10  –10 Pa). Vzh ľadom na potreby 
postupov, najmä pokia ľ ide o získanie tlaku pary v prípade látok 
s nízkym tlakom pary, sa prehodnotili iné postupy tejto metódy pri zohľadnení rozmedzí použite ľnosti. 
Pri termodynamickej rovnováhe je tlak pary čistej látky výlu čne 
funkciou teploty. Základné princípy sú uvedené v odkazoch (2) (3). 
Neexistuje jediný postup merania, ktorý by sa dal aplikova ť na celé 
rozmedzie tlakov pary od menej ako 10
 –10 Pa do 10  5 Pa. V tejto metóde 
sa uvádza osem metód na meranie tlaku pary, ktoré sa môžu použi ť 
v rôznych rozmedziach tlakov pary. Porovnávajú sa rôzne metódy, pokiaľ ide o uplatnenie a rozsah merania v tabu ľke 1. Metódy sa 
môžu použi ť výlučne na zlú čeniny, ktoré sa v podmienkach testu 
nerozkladajú. V prípadoch, ke ď sa z technických dôvodov nemôžu 
uplatniť experimentálne metódy, možno tiež tlak pary odhadnú ť 
a odporúčaná metóda odhadu je uvedená v dodatku.
 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Tlak pary látky je definovaný ako tlak nasýtenej pary nad tuhou 
alebo kvapalnou látkou. 
Pre tlak sa používa jednotka SI pascal (Pa). Ďalej sa uvádzajú iné 
jednotky, ktoré sa používali v minulosti, spolu s ich prepo čítavacími 
koeficientmi: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosféra = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Jednotkou teploty v rámci sústavy SI je kelvin (K). Stupne Celzia sa 
prepočítavajú na kelviny pod ľa vzorca: 
T = t + 273,15 kde T je kelvin alebo termodynamická teplota a t je teplota 
v stupňoch Celzia.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabuľka 1  
Metóda merania Látky Odhadovaná 
opakovate ľnosť Odhadovaná 
reprodukovate ľ­
nosť Odporúčaný rozsah 
Tuhá Kvapalná  
Dynamická metóda s nízkou 
teplotou 
tavenia áno do 25 % 
1 až 5 % do 25 % 
1 až 5 % 10 3 Pa až 2 × 10  3 
Pa 
2 × 10  3 Pa až 
10 5 Pa 
Statická metóda áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 10 Pa až 10  5 Pa 
10 –2 Pa až 10  5 
Pa (  1 ) 
Metóda 
s s použitím izote ­
niskopu áno áno 5 až 10 % 5 až 10 % 10  2 Pa až 10  5 Pa 
Výtoková metóda: 
váhy na meranie tlaku pary áno áno 5 až 20 % do 50 % 10
 –3 až 1 Pa 
Výtoková metóda: 
Knudsenova komôrka áno áno 10 až 30 % — 10
 –10 až 1 Pa 
Výtoková metóda: 
izotermálna termo ­
gravimetria áno áno 5 až 30 % do 50 % 10  –10 až 1 Pa 
Metóda plynovej 
saturácie áno áno 10 až 30 % do 50 % 10  –10 až 10  3 Pa 
Metóda rotujúcej 
guľôčky áno áno 10 až 20 % — 10  –4 až 0,5 Pa  
( 1 ) Pri použití kapacitného manometra.  
1.3. PRINCÍP TESTU 
Vo všeobecnosti sa tlak pary stanovuje pri rozli čných teplotách. 
V limitovanom teplotnom rozmedzí je logaritmus tlaku pary čistej 
látky lineárnou funkciou inverzie termodynamickej teploty pod ľa 
zjednodušenej Clapeyronovej-Clausiusovej rovnice:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ konštanta  
kde: 
p = tlak pary látky vyjadrený v pascaloch 
ΔHv = teplota vyparovania v J mol  –1 
R = všeobecná plynová konštanta, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = teplota v K (v kelvinoch).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky sa nemusia použi ť. V prvom rade slúžia na ob časnú 
kontrolu ú činnosti metódy a na umožnenie porovnania výsledkov 
dosiahnutých pri použití rozli čných metód.  
1.5. OPIS METÓDY  
1.5.1.  Dynamická metóda (Cottrellova metóda)  
1.5.1.1.  Princíp  
Tlak pary sa meria stanovením teploty varu látky pri rôznych špeci ­
fikovaných tlakoch v rozmedzí približne 10  3 a 10  5 Pa. Táto metóda 
sa odporú ča aj na stanovenie teploty varu. Na tento ú čel sa dá použi ť 
až do teploty 600 K. Teploty varu kvapalných látok sú približne o 0,1 °C vyššie v h ĺbke 3 až 4 cm ako na povrchu kvôli hydro ­
statickému tlaku st ĺpca kvapaliny. V Cottrellovej metóde (4) sa 
teplomer umiestni do pary nad povrch kvapaliny a vriaca kvapalina sa kontinuálne vyzdvihne nad gu ľôčku teplomeru. Tenká vrstva 
kvapaliny, ktorá je v rovnováhe s parou pri atmosférickom tlaku, 
pokryje gu ľôčku. Teplomer takto odmeria skuto čný bod varu bez 
chýb kvôli prehriatiu alebo hydrostatickému tlaku. Pumpa, ktorú skonštruoval Cottrell, je znázornená na obrázku 1. Trubica A obsahuje vriacu kvapalinu. Platinový drôt B zatavený do dna 
umožňuje rovnomerný var. Bo čná trubica C vedie k chladi ču 
a plášť D zabra ňuje, aby sa studený kondenzát dostal k teplomeru 
E. Keď kvapalina v A vrie, bubliny a kvapalina zachytená v lieviku 
sa vlejú cez dve ramená pumpy F nad gu ľôčku teplomeru.  
Obrázok 1
 Obrázok 2
  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrellova pumpa (4) 
A: Termo článok 
B: Objem na vyrovnávanie vákua C: Manometer D: Vákuum E: Miesto merania 
F: Ohrievací článok približne 150 W
 
1.5.1.2.  Prístroje  
Veľmi presný prístroj využívajúci Cottrellovu metódu je znázornený na 
obrázku 2. Pozostáva z trubice s varnou časťou v spodnej časti, chla­
diča v strednej časti a výstupom a prírubou v hornej časti. Cottrellova 
pumpa je umiestnená vo varnej časti, ktorú zohrieva elektrický patró ­
nový ohrieva č. Teplota sa meria pomocou pláš ťového termo článku 
alebo odporového teplomera zasunutím cez prírubu na vrchu. Výstup 
je pripojený k zariadeniu na reguláciu tlaku. Zariadenie na reguláciu 
tlaku pozostáva z vákuovej pumpy, objemu na vyrovnávanie, mano ­
statu na dávkovanie dusíka na reguláciu tlaku a manometra.  
1.5.1.3.  Postup  
Látka sa umiestni do varnej časti. S problémami sa možno stretnú ť 
v prípade tuhých látok, ktoré nie sú vo forme prášku, ale tieto problémy sa môžu v niektorých prípadoch vyrieši ť zahriatím chla ­
diaceho pláš ťa. Po naplnení nádoby sa prístroj tesne uzavrie 
v prírube a testovaná látka sa odplyní. Použitie tejto metódy nie je vhodné pre peniace látky. 
Ďalej sa nastaví najnižší požadovaný tlak a zapne sa ohrievanie. 
Zároveň sa sníma č teploty pripojí na registra čný prístroj. 
Rovnováha sa dosiahne vtedy, ke ď sa zaregistruje konštantná teplota 
varu pri konštantnom tlaku. Treba dáva ť pozor najmä na to, aby sa 
zabránilo prudkému varu. Okrem toho sa musí v chladi či dosiahnu ť 
úplná kondenzácia. Ke ď sa stanovuje tlak pary tuhých látok s nízkou 
teplotou topenia, je potrebné dba ť na to, aby sa zabránilo zabloko ­
vaniu chladi ča. 
Po zaregistrovaní tohto rovnovážneho bodu sa nastaví vyšší tlak. 
Postup pokra čuje rovnakým spôsobom až po dosiahnutie tlaku 
10
 5 Pa (spolu je to približne 5 až 10 meraní). V rámci kontroly sa 
musia rovnovážne body opakova ť a merať pri klesajúcich tlakoch.  
1.5.2.  Statická metóda  
1.5.2.1.  Princíp  
V statickej metóde (5) sa pri termodynamickej rovnováhe stanovuje tlak 
pary pri špecifikovanej teplote. Táto metóda je vhodná pre látky 
a viaczložkové kvapaliny a tuhé látky v rozmedzí od 10  –1 do 10  5 Pa 
a za predpokladu, že sa bude postupova ť opatrne, aj v rozmedzí 1 až 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Prístroje  
Prístroj pozostáva z kúpe ľa s konštantnou teplotou (presnos ť ± 0,2 K), 
nádoby na testovanú vzorku pripojenej k podtlakovej rúrke, manometra a systému na reguláciu tlaku. Komora na vzorky (obrázok 3a) je pripo ­
jená k podtlakovej rúrke cez ventil a diferenciálny manometer (trubica 
v tvare U obsahuje vhodnú manometrovú kvapalinu), ktorá slúži ako nulový indikátor. Pre diferen čný manometer možno použi ť ortuť, sili­
kóny a ftaláty v závislosti od tlakového rozmedzia a chemických vlast ­
ností testovanej látky. Pokia ľ možno, malo by sa z ekologických 
dôvodov vyhnú ť používaniu ortuti. Testovaná látka sa nesmie vo 
výraznejšej miere rozpúš ťať v kvapaline nachádzajúcej sa v trubici 
v tvare U alebo s ňou reagova ť. Namiesto trubice v tvare U možno 
použiť manometer (obrázok 3b). Pre manometer možno v rozsahu 
normálneho atmosférického tlaku do 10
 2 Pa použiť ortuť, zatiaľ čo 
silikóny a ftaláty sú vhodné na použitie pri tlakoch nižších ako 
10 2 Pa až po 10 Pa. Existujú aj iné manometre, ktoré možno použi ť 
pri tlakoch nižších ako 10  2 Pa a pri tlakoch nižších ako 10  –1 Pa sa môžu 
dokonca použi ť kapacitné manometre so zahrievate ľnou membránou. 
Teplota sa meria na vonkajšej stene nádoby obsahujúcej vzorku 
alebo v samotnej nádobe.  
1.5.2.3.  Postup  
Ak sa použije prístroj opísaný na obrázku 3a, napl ňte trubicu v tvare 
U zvolenou kvapalinou, ktorá musí by ť pred odčítaním nameraných 
hodnôt odplynená pri zvýšenej teplote. Testovaná látka sa umiestni do prístroja a odplyní pri zníženej teplote. V prípade viaczložkovej vzorky 
by mala by ť teplota dostato čne nízka, aby sa zabezpe čilo, že sa 
nezmení zloženie materiálu. Rovnováhu možno rýchlejšie dosiahnu ť 
miešaním. Vzorka sa môže chladi ť kvapalným dusíkom alebo suchým 
ľadom, pri čom treba dba ť na to, aby sa zabránilo kondenzácii vzduchu 
alebo nasatiu kvapaliny. Pri otvorenej polohe ventilu nad nádobou sa 
po nieko ľkých minútach odsávaním odstráni vzduch. Ak je to 
potrebné, musí sa postup odplynenia opakova ť niekoľkokrát.  
Obrázok 3a
 Obrázok 3b
  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Keď sa vzorka pri uzatvorenom ventile zahreje, tlak pary narastá. 
Toto zmení rovnováhu kvapaliny v trubici v tvare U. Na kompen ­
zovanie tohto javu sa do prístroja cez ventil vpúš ťa dusík alebo 
vzduch dovtedy, kým sa diferenciálny indikátor tlaku opä ť neustáli 
na nulovej hodnote. Tlak, ktorý je na to potrebný, sa môže od čítať 
z manometra alebo z presného prístroja. Tento tlak zodpovedá tlaku 
pary testovanej látky pri teplote merania. Ak sa použije prístroj opísaný na obrázku 3b, tlak pary sa od čítava priamo. 
Teplotná závislos ť tlaku pary sa stanovuje v primerane krátkych 
intervaloch (spolu približne 5 až 10 meracích bodov) až po požado ­
vané maximum teploty. 
Odčítania nízkych teplôt sa musia opakova ť ako kontrola. Ak sa 
hodnoty získané z opakovaných od čítaní nezhodujú s krivkou 
získanou pre stúpajúcu teplotu, môže to by ť následkom jednej 
z uvedených skuto čností: 
i) testovaná vzorka ešte obsahuje vzduch (napríklad materiály 
s vysokou viskozitou) alebo nízkovriace látky, ktorý sa uvo ľňuje 
alebo ktoré sa uvo ľňujú počas zahrievania; 
ii) testovaná látka podlieha chemickej reakcii v skúmanom 
teplotnom rozmedzí (napr. rozklad alebo polymerizácia).
 
1.5.3.  Metóda s s použitím izoteniskopu  
1.5.3.1.  Princíp  
Izoteniskop (6) je založený na princípe statickej metódy. Pri tejto 
metóde sa vzorka umiestni do banky, ktorá sa udržiava pri konštantnom tlaku a je pripojená k manometru a vákuovej pumpe. 
Nečistoty prchavejšie ako testovaná látka sa odstránia odplynením 
pri zníženom tlaku. Tlak pary vzorky pri zvolených teplotách sa vyrovnáva známym tlakom inertného plynu. Izoteniskop bol vyvi ­
nutý na meranie tlaku pary ur čitých kvapalných uh ľovodíkov, ale je 
vhodný aj na skúmanie tuhých látok. Metóda obvykle nie je vhodná 
pre viaczložkové systémy. Výsledky sú ovplyvnené len malými chybami v prípade vzoriek, ktoré obsahujú neprchavé ne čistoty. 
Odporúčané rozmedzie je 10
 2 až 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Prístroje  
Príklad meracieho prístroja je znázornený na obrázku 4. Úplný opis 
možno nájs ť v ASTM D 2879 – 86 (6).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Postup  
V prípade kvapalín samotná testovaná látka slúži ako kvapalina 
v diferenciálnom manometri. Množstvo kvapaliny, ktoré je dostato čné 
na zaplnenie banky a krátkeho ramena manometra, sa umiestni do 
izoteniskopu. Izoteniskop sa napojí na vákuový systém a vákuuje, potom sa naplní dusíkom. Vákuovanie a pre čistenie systému sa 
opakuje dvakrát, aby sa odstránil reziduálny kyslík. Naplnený izoteni ­
skop sa umiestni v horizontálnej polohe tak, aby sa testovaná vzorka 
rozšírila v tenkej vrstve vo vzorkovej banke a manometri. Tlak systému sa redukuje na 133 Pa a vzorka sa mierne zahrieva, až kým neza čne 
vrieť (odstránenie rozpustených plynov). Izoteniskop sa potom 
umiestni tak, aby sa vzorka opä ť vrátila do banky a naplnila krátke 
rameno manometra. Tlak sa udržiava na 133 Pa. Vytiahnutý hrot banky so vzorkou sa zohrieva malým plame ňom dovtedy, kým sa uvo ľnená 
para zo vzorky nerozšíri v dostato čnej miere na to, aby vytla čila časť 
vzorky z hornej časti banky a ramena manometra do manometra, 
vytvoriac tak plynom naplnený priestor bez prítomnosti dusíka. Izote ­
niskop sa potom umiestni do kúpe ľa s konštantnou teplotou a tlak 
dusíka sa nastaví tak, aby sa rovnal tlaku vzorky. V rovnovážnom 
stave sa tlak dusíka rovná tlaku pary testovanej látky.
 
Obrázok 4
  
V prípade tuhých látok a v závislosti od tlakového a teplotného 
rozmedzia sa použijú manometrové kvapaliny, napr. silikónové 
kvapaliny alebo ftaláty. Odplynená manometrová kvapalina sa naleje do vydutiny na dlhom ramene izoteniskopu. Potom sa tuhá látka určená na skúmanie umiestni do banky a odplyní sa pri zvýšenej 
teplote. Po tomto úkone sa izoteniskop nakloní tak, aby tlakomerová 
kvapalina mohla natiec ť do trubice v tvare U.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Výtoková metóda: váhy na meranie tlaku pary  (7) 
1.5.4.1.  Princíp  
Vzorka testovanej látky sa zahrieva v malej piecke a umiestni do 
vákuového zvonu. Piecka je prikrytá vekom s malými otvormi 
známych priemerov. Para testovanej látky, ktorá uniká z jedného 
z otvorov, sa nasmeruje na misku citlivých váh, ktoré sa tiež nachá ­
dzajú vo vákuovom zvone. V niektorých modeloch môže by ť miska 
váh obklopená chladiacou nádobou zabezpe čujúcou odvádzanie tepla 
smerom von prenosom tepla a chladená sálaním tak, aby sa unika ­
júca para na nej kondenzovala. Impulz prúdu pary pôsobí na váhy ako sila. Tlak pary možno odvodi ť dvomi spôsobmi: priamo zo sily 
pôsobiacej na misku váh a tiež z rýchlosti odparovania s použitím 
Hertzovej-Knudsenovej rovnice (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
kde: 
G = rýchlos ť odparovania (kg s  –1 m –2 ) 
M = mólová hmotnos ť (g mol  –1 ) 
T = teplota (K) R = všeobecná plynová konštanta (J mol
 –1 K –1 ) 
P = tlak pary (Pa) 
Odporúčané rozmedzie je 10  –3 až 1 Pa.  
1.5.4.2.  Prístroje  
Všeobecný princíp prístroja je znázornený na obrázku 5.  
Obrázok 5
  
A: Podložka F: Chladiaci box a chladiaca ty č 
B: Pohyblivá cievka G: Odparovacia piecka C: Vákuový zvon H: Dewarova nádoba s tekutým dusíkom D: Váhy s miskou I: Meranie teploty vzorky E: Vákuový merací prístroj J: Testovaná látka
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Výtoková metóda: Knudsenova komôrka  
1.5.5.1.  Princíp  
Táto metóda je založená na odhade hmotnosti testovanej látky, ktorá za 
jednotku času unikla z Knudsenovej komôrky (8) vo forme pary cez 
mikrootvor v ultravákuových podmienkach. Hmotnos ť výtokovej 
uniknutej pary sa dá zisti ť buď stanovením úbytku hmotnosti komôrky, 
alebo kondenzáciou pary pri nízkej teplote a stanovením množstva 
vyprchanej látky využitím chromatografie. Tlak pary sa vypo číta 
s použitím Hertzovej-Knudsenovej rovnice (pozri oddiel 1.5.4.1) s korekčnými koeficientmi, ktoré závisia od parametrov prístroja (9). 
Odporúčané rozmedzie je 10
 –10 až 1 Pa (10) (11) (12) (13) (14).  
1.5.5.2.  Prístroje  
Všeobecný princíp prístroja je znázornený na obrázku 6.  
Obrázok 6
  
1: Pripojenie na vákuum 7: Veko so závitom 
2: Dutina na zasunutie platinového odporového 
teplomera alebo na meranie a reguláciu teploty 8: Krídlové matice 
3: Veko vákuovej nádoby 9: Svorníky 
4: Tesniaci O-krúžok 10: Efúzne komôrky z nehrdzavejúcej ocele 
5: Hliníková vákuová nádoba 11: Ohrievacie teleso 6: Zariadenie na inštalovanie a vyberanie 
efúznych komôr
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Výtoková metóda: izotermálna termogravimetria  
1.5.6.1.  Princíp  
Metóda je založená na stanovení zvýšených rýchlostí odparovania 
v prípade testovanej látky pri zvýšených teplotách a tlaku okolitého 
prostredia s použitím termogravimetrie (10) (15) (16) (17) (18) 
(19) (20). Rýchlosti odparovania v  T vznikajú na základe vystavenia 
zvolenej zlú čeniny pomalému prúdu inertného plynu a sledovania 
úbytku hmotnosti pri ur čených izotermických teplotách 
T v kelvinoch po čas príslušných časových období. Tlaky pary p  T 
sa vypočítajú z hodnôt v  T s použitím lineárneho vz ťahu medzi loga ­
ritmom tlaku pary a logaritmom rýchlosti odparovania. V prípade 
potreby sa môže urobi ť extrapolácia na teploty 20 °C a 25 °C 
regresnou analýzou log p  T proti 1/T. Táto metóda je vhodná 
pre látky, ktoré majú tlak pár rovnako nízky ako 10  –10 Pa (10  –­
12 mbar) a stupe ň čistoty čo možno najbližšie k 100 %, aby sa 
zabránilo chybnej interpretácii nameraných úbytkov hmotnosti.  
1.5.6.2.  Prístroje  
Všeobecný princíp experimentálnej zostavy je znázornený na 
obrázku 7.  
Obrázok 7
  
Nosná došti čka so vzorkou, ktorá visí na mikrováhach v komore 
s regulovanou teplotou, sa umiestni do prúdu suchého dusíka, ktorý unáša odparené molekuly testovanej látky. Po opustení komory sa prúd plynu pre čistí na sorp čnej jednotke.
 
1.5.6.3.  Postup  
Testovaná látka sa aplikuje na povrch zdrsnenej sklenej došti čky 
v homogénnej vrstve. V prípade tuhých látok sa došti čka rovno ­
merne navlh čí roztokom testovanej látky vo vhodnom rozpúš ťadle 
a vysuší v inertnej atmosfére. Na meranie sa pokrytá došti čka 
umiestni do termogravimetrického analyzátora a následne sa konti ­
nuálne meria úbytok hmotnosti ako funkcia času. ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Rýchlosť odparovania v  T sa pri stanovenej teplote vypo číta z úbytku 
hmotnosti Δm doštičky so vzorkou na základe  
v T ¼ Δm 
F Ö t g cm  –2 h –1 Ê Ì  
kde F je povrchová plocha nanesených testovaných látok, obvykle 
povrchová plocha došti čky so vzorkou, a t je čas úbytku hmotnosti 
Δm. 
Tlak pary p  T sa vypočíta na základe toho, že je funkciou rýchlosti 
odparovania v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
kde C a D sú konštanty špecifické pre používané experimentálne 
usporiadanie závislé od priemeru komory, kde sa uskuto čňuje mera­
nie, a od prietokovej rýchlosti plynu. Tieto konštanty sa musia stanoviť vopred tak, že sa odmeria súbor zlú čenín so známym 
tlakom pary a regresiou log p
 T proti log v  T (11) (21) (22). 
Vzťah medzi tlakom pary p  T a teplotou T v kelvinoch je daný 
vzorcom 
Log p  T = A + B 1/T 
kde A a B sú konštanty získané regresiou log p  T proti 1/T. Na 
základe tejto rovnice sa extrapoláciou môže tlak pary vypo čítať 
pre akúko ľvek inú teplotu.  
1.5.7.  Metóda plynovej saturácie  (23)  
1.5.7.1.  Princíp  
Prúd inertného nosného plynu sa prepúš ťa cez vzorku testovanej 
látky alebo nad ňou dostato čne pomaly, aby sa plyn nasýtil parou 
testovanej látky. Dosiahnutie nasýtenia v plynnej fáze je mimoriadne 
dôležité. Transportovaná látka sa zachytí obvykle s použitím 
sorbentu a zmeria sa jej množstvo. Ako alternatíva k zachyteniu pary a následnej analýze sa môžu použi ť analytické techniky typu 
„in-train“ ako plynová chromatografia na stanovenie množstva trans ­
portovanej látky. Tlak pary sa vypo číta na základe predpokladu, že 
je dodržaný zákon ideálneho plynu a že celkový tlak zmesi plynov sa rovná sume tlakov plynov tvoriacich zmes. Parciálny tlak testo ­
vanej látky, t. j. tlak pary, sa vypo číta na základe známeho objemu 
celkového plynu a hmotnosti transportovaného materiálu. 
Postup plynovej saturácie možno použi ť na tuhé alebo kvapalné látky. 
Môže sa použi ť pre tlaky pár až do 10
 –10 Pa (10) (11) (12) (13) (14). 
Metóda je najspo ľahlivejšia pre tlaky pár nižšie ako 10  3 Pa. Pre vyššie 
tlaky pár ako 10  3 Pa sú obvykle nadhodnotené pravdepodobne kvôli 
vytváraniu aerosólu. Ke ďže merania tlaku pary sa uskuto čňujú pri 
teplote miestnosti, nie je potrebná extrapolácia údajov z vysokých 
teplôt a vyhne sa tak extrapolácii vysokej teploty, ktorá môže často 
spôsobova ť vážne chyby.  
1.5.7.2.  Prístroje  
Postup vyžaduje, aby sa použila nádoba s konštantnou teplotou. Na 
obrázku 8 je znázornená nádoba, v ktorej sa nachádzajú držiaky na tri tuhé a tri kvapalné vzorky, ktoré umož ňujú trojnásobnú analýzu 
buď tuhej, alebo kvapalnej vzorky. Teplota je regulovaná v rozmedzí 
± 0,5 °C alebo viac.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Obrázok 8
  
Vo všeobecnosti sa ako inertný nosný plyn používa dusík, ale príleži ­
tostne sa môže vyžadova ť aj použitie iného plynu (24). Nosný plyn musí 
byť suchý. Prúd plynu sa rozdelí do 6 prúdov regulovaných ihlovými 
ventilmi (otvor približne 0,79 mm) a prúdi do nádoby cez medenú 
trubicu s vnútorným priemerom 3,8 mm. Po vyrovnaní teploty plyn 
prúdi cez vzorku a zachytáva č so sorbentom a opúš ťa nádobu. 
Tuhé vzorky sa vložia do sklenej rúrky s vnútorným priemerom 5 mm 
medzi zátky zo sklenej vaty (pozri obrázok 9). Na obrázku 10 je 
znázornený držiak kvapalnej vzorky a sorp čný systém. Najlepšie 
reprodukovate ľnou metódou na meranie tlaku pary kvapalín je nanies ť 
kvapalinu na sklené gu ľôčky alebo na inertný sorbent, ako napr. 
kremeň, a naplni ť držiak týmito gu ľôčkami. Alternatívne sa môže 
prúdenie nosného plynu nastavi ť tak, aby prechádzal cez hrubú fritu 
a prebublal cez kolónu testovanej kvapalnej látky.  
Obrázok 9
  Obrázok 10
  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorpčný systém sa skladá z vrchnej a spodnej sorp čnej časti. Pri 
veľmi nízkych tlakoch pary sa na sorbente zachytia len ve ľmi 
malé množstvá a adsorpcia na sklenej vate a sklenej trubici medzi vzorkou a sorbentom môže spôsobi ť vážny problém. 
Ďalším účinným spôsobom na získanie odpareného materiálu sú 
zachytáva če chladené tuhým CO
 2 . Nespôsobujú žiadny protitlak na 
saturátorovú kolónu a zachytený materiál sa tiež ve ľmi jednoducho 
kvantitatívne uvo ľňuje. 
1.5.7.3.  Postup  
Prietoková rýchlos ť unikajúceho nosného plynu sa meria pri izbovej 
teplote. Prietoková rýchlos ť sa počas experimentu často kontroluje, 
aby sa zabezpe čila správna hodnota pre celkový objem nosného 
plynu. Uprednost ňuje sa priebežné sledovanie hmotnostným prieto ­
komerom. Nasýtenie plynnej fázy môže vyžadova ť značný čas 
kontaktu, a preto aj pomerne nízke prietokové rýchlosti plynu (25). 
Na konci experimentu sa obidve časti sorbentu, vrchná a spodná, 
analyzujú samostatne. Zlú čenina v každej časti sa pridaním rozpúš ť­
adla desorbuje. Výsledné roztoky sa kvantitatívne analyzujú na stanovenie hmotnosti desorbovanej z každej časti. Výber analytickej 
metódy (aj výber sorbentu a rozpúš ťadla na desorpciu) je ur čený 
vlastnosťami testovaného materiálu. Ú činnosť desorpcie sa stanoví 
vstreknutím známeho množstva vzorky na sorbent, jej desorpciou a analýzou získaného množstva. Je dôležité skontrolova ť účinnosť 
desorpcie a koncentráciu, ktorá je rovnaká alebo približná ako 
koncentrácia vzorky, pri podmienkach testu. 
Na zabezpe čenie toho, aby sa nosný plyn nasýtil testovanou látkou, 
sa používajú tri rozdielne prietokové rýchlosti. Ak vypo čítaný tlak 
pary nevykazuje žiadnu závislos ť od prietokovej rýchlosti, pred ­
pokladá sa, že plyn je nasýtený. 
Tlak pary sa vypo číta na základe rovnice:  
p ¼
 W 
V Ü RT 
M 
kde: 
p = tlak pary (Pa) W = hmotnos ť odparenej testovanej látky (g) 
V = objem nasýteného plynu (m
 3 ) 
R = všeobecná plynová konštanta 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = teplota (K) 
M = mólová hmotnos ť testovanej látky (g mol  –1 ). 
Namerané objemy musia by ť opravené z h ľadiska tlakových 
a teplotných rozdielov medzi prietokomerom a saturátorom.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Rotujúca gu ľôčka 
1.5.8.1.  Princíp  
Táto metóda využíva meradlo viskozity rotujúceho rotora, v ktorom 
je meracím prvkom malá oce ľová guľôčka, ktorá je zavesená do 
magnetického po ľa, v ktorom rotuje (26) (27) (28). Snímacie cievky 
umožňujú meranie jej rýchlosti otá čania. Ak gu ľôčka dosiahla danú 
rotačnú rýchlos ť, približne 400 otá čok za sekundu, ďalšie budenie sa 
zastaví a následkom trenia plynu dochádza k spoma ľovaniu. Pokles 
rýchlosti otá čania sa meria ako funkcia času. Tlak pary sa odvodí zo 
spomalenia oce ľovej guľôčky, ktoré je závislé od tlaku. Odporú čané 
rozmedzie je 10  –4 až 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Prístroje  
Schematický nákres pokusného systému je zobrazený na obrázku 
11. Meracia hlava je umiestnená v termostaticky upravovanom 
uzavretom priestore s presnos ťou regulácie na 0,1 °C. Nádoba so 
vzorkou je umiestnená v termostaticky upravovanom uzavretom prie ­
store tiež s presnos ťou regulácie na 0,1 °C. Všetky ostatné časti 
zostavy sa udržiavajú pri vyššej teplote, aby sa zabránilo kondenzá ­
cii. Celý prístroj je napojený na vysokovákuový systém.  
Obrázok 11
  
2. ÚDAJE A SPRÁVY  
2.1. ÚDAJE 
Tlak pary zo všetkých predchádzajúcich metód sa musí stanovi ť 
aspoň pre dve teploty. V rozmedzí od 0 °C do 50 °C sa odporú čajú 
tri alebo viacej teplôt, aby sa dala skontrolova ť lineárnos ť krivky 
tlaku plynu. V prípade výtokovej metódy (Knudsenova komôrka a izotermická termogravimetria) a metód plynovej saturácie sa pre stanovenie teplotného rozmedzia odporú ča 120 °C až 150 °C 
namiesto 0 °C až 50 °C.
 
2.2. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
— použitú metódu,  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— presnú špecifikáciu látky (identitu a prímesi) a opatrenia v rámci 
predbežnej purifikácie testovanej látky, ak sa uskuto čnili, 
— minimálne dve tlakové a teplotné hodnoty a prednostne tri alebo viac 
sa vyžadujú v rozmedzí od 0 °C do 50 °C (alebo 120 °C až 150 °C), 
— aspoň jedna teplota musí by ť pod 25 °C, ak je to technicky 
možné na základe zvolenej metódy, 
— všetky pôvodné údaje, 
— log p verzus 1/T krivka, 
— odhad tlaku pary pri 20 °C alebo 25 °C. Ak sa pozoruje premena (zmena skupenstva, rozklad), treba uvies ť 
nasledujúce informácie: 
— charakter zmeny, — teplotu, pri ktorej sa zmena prejavuje pri atmosférickom tlaku, 
— tlak pary pri 10 °C a 20 °C pod teplotou premeny a 10 °C 
a 20 °C nad touto teplotou (s výnimkou premeny z tuhej látky na plyn). 
V správe z testu musia by ť uvedené všetky informácie a poznámky, 
ktoré sú dôležité pre interpretáciu výsledkov testu, najmä týkajúce sa nečistôt a fyzikálneho stavu (skupenstva) testovanej látky.
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
1. Úradný vestník Európskych spolo čenstiev L 383A, s. 26 – 
47 (1992). 
2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 
3. Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 
4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York. 
5. NF T 20 – 048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa – Static 
method. 
6. ASTM D 2879 – 86, Standard test method for vapour pressure 
– temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope. 
7. NF T 20 – 047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173. 
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521 – 532. 
11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000). 
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22 – 28. 
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269 – 278. 
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117 – 122. 
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973), 137 – 147. 
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant 
Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974), 393 – 400. 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., 
A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relati ­
onship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982), 161 – 168. 
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric 
Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995), 27 – 31. 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998), 300 – 310. 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998), 1512 – 20. 
21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range –25 °C to 150 °C. 
22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). 23. 40 CFR, 796 (1993), pp 148 – 153, Office of the Federal 
Register, Washington DC.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 
25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 
27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642. 
28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Dodatok  
Metóda odhadu  
ÚVOD 
Predbežne vypo čítané hodnoty tlaku pary sa môžu použi ť na: 
— rozhodnutie, ktorá z existujúcich pokusných metód je najvhodnejšia, — poskytnutie odhadu alebo medznej hodnoty v prípadoch, ke ď sa pokusná 
metóda z technických prí čin nemôže uplatni ť.
 
METÓDA ODHADU 
Tlak pary kvapalín a tuhých látok sa môže odhadnú ť s s použitím modifikovanej 
Watsonovej korelácie (a). Jediným potrebným pokusným údajom je normálna 
teplota varu. Táto metóda sa dá použi ť v celom rozmedzí tlaku od 10  5 Pa do 
10 –5 Pa. 
Podrobné informácie o tejto metóde sú uvedené v príru čke Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods (Príru čka metód na odhadovanie vlast ­
ností) (b). Pozri aj OECD Environmental Monograph (Monografia OECD 
o životnom prostredí), č. 67 písm. c).  
POSTUP VÝPO ČTU 
Tlak pary sa vypo číta takto:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
kde: 
T = daná teplota T
 b = normálny bod varu 
P VP = tlak pary pri teplote T 
ΔH Vb = výparné teplo 
ΔZ b = koeficient stla čiteľnosti (odhadovaný pri 0,97) 
m = empirický koeficient závislý od fyzikálneho skupenstva pri danej 
teplote T. 
Ďalej 
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
kde K  F je empirický koeficient zoh ľadňujúci polaritu testovanej látky. Pre viaceré 
typy zlúčenín sú koeficienty K  F uvedené v odkazoch pod písmenom b).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Často sú k dispozícii údaje, ktoré uvádzajú teplotu varu pri zníženom tlaku. 
V takom prípade sa tlak pary vypo číta takto: 
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
kde T  1 je bod varu pri zníženom tlaku P  1 . 
SPRÁVA 
Ak sa použije metóda odhadu, správa o teste musí obsahova ť úplnú dokumen ­
táciu výpo čtov. 
POUŽITÁ LITERATÚRA 
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. 
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill. 
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asse ­
ssment (1993).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. POVRCHOVÉ NAPÄTIE  
1. METÓDA  
Opísané metódy sú upravené smernicou na vykonávanie OECD 
testov (1). Základné princípy sú uvedené v odkaze (2).  
1.1. ÚVOD 
Opísané metódy sú ur čené na meranie povrchového napätia vodných 
roztokov. 
Pred vykonaním týchto testov sa odporú ča získať predbežné infor ­
mácie o rozpustnosti vo vode, hydrolýznych vlastnostiach a kritickej koncentrácii pre tvorbu micel testovanej látky. 
Nasledujúce uvedené metódy sa dajú použi ť pre väčšinu chemikálií 
bez akýchko ľvek obmedzení v spojitosti s ich stup ňom čistoty. 
Meranie povrchového napätia metódou krúžkového tenzometra sa 
obmedzuje na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižšou ako približne 200 mPa s.
 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Entalpia vo ľnej hladiny na jednotku povrchovej plochy sa vz ťahuje 
na povrchové napätie. 
Povrchové napätie sa udáva ako: N/m (jednotka SI) alebo mN/m (podjednotka SI) 1 N/m = 10
 3 dyn/cm 
1 N/m = 1 dyn/cm v zastaranej jednotkovej sústave cgs  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky nemusia by ť použité vo všetkých prípadoch, ke ď sa 
skúma nová látka. V prvom rade by mali slúži ť na občasnú kontrolu 
účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania 
s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód. 
Referenčné látky, ktoré pokrývajú široký rozsah povrchových napätí, 
sú uvedené v odkazoch (1) a (3).  
1.4. PRINCÍP METÓD 
Metódy sú založené na meraní maximálnej sily, ktorá musí by ť 
vynaložená vertikálne na strmienok alebo krúžok v kontakte 
s hladinou testovanej kvapaliny umiestnenej v meracej miske na 
účely jeho oddelenia od tejto hladiny alebo na došti čku s jednou 
hranou v kontakte s povrchom na ú čely zdvihnutia filmu, ktorý sa 
vytvoril. 
Látky, ktoré sú rozpustné vo vode pri koncentrácii aspo ň 1 mg/l, sú 
testované vo vodnom roztoku pri jednej koncentrácii.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Tieto metódy sa dajú realizova ť s väčšou presnos ťou, než aká sa 
pravdepodobne bude požadova ť na environmentálne zhodnocovanie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. OPIS METÓD 
Roztok testovanej látky sa pripraví v destilovanej vode. Koncentrácia 
tohto roztoku by mala predstavova ť 90 % nasýtenej rozpustnosti 
testovanej látky vo vode; ke ď táto koncentrácia prevyšuje 1 g/l, na 
účely testovania sa použije koncentrácia 1 g/l. Látky s rozpustnos ťou 
vo vode nižšou ako 1 mg/l sa nemusia testova ť. 
1.6.1.  Došti čková metóda  
Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) 
(Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia 
pomocou kvapalinových filmov).  
1.6.2.  Strmienková metóda  
Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) (Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia 
pomocou kvapalinových filmov).
 
1.6.3.  Krúžková metóda  
Pozri technické normy ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid films) (Povrchovo aktívne činidlá – stanovenie povrchového napätia 
pomocou kvapalinových filmov).
 
1.6.4.  Harmonizovaná krúžková metóda pod ľa OECD  
1.6.4.1.  Prístroje  
Na účely tohto merania posta čujú komer čne dostupné tenzometre. 
Pozostávajú z nasledujúcich častí: 
— pohyblivá doska na vzorky, — systém na meranie sily, — meracie teleso (krúžok), — meracia nádoba.
 
1.6.4.1.1. P o h y b l i v á d o s k a n a v z o r k y 
Pohyblivá doska na vzorky sa používa ako podložka pod termore ­
gulovanú meraciu nádobu obsahujúcu kvapalinu ur čenú na testova ­
nie. Spolu s meracím systémom je prichytená na stojan.  
1.6.4.1.2. S y s t é m n a m e r a n i e s i l y 
Systém na meranie sily (pozrite obrázok) je umiestnený nad dosku 
na vzorky. Odchýlka merania sily nemá presahova ť hodnotu ± 10  -6 
N, zodpovedajúc tak dovolenej chybe ± 0,1 mg pri meraní hmot ­
nosti. Vo vä čšine prípadov je meracia stupnica komer čne dostupných 
tenzometrov kalibrovaná v mN/m, takže povrchové napätie môže by ť 
odčítané priamo v mN/m s presnos ťou na 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M e r a c i e t e l e s o ( k r ú ž o k ) 
Krúžok je zvy čajne vyrobený z platinovo-irídiového drôtu s hrúbkou 
približne 0,4 mm a so stredným obvodom 60 mm. Drôtený krúžok je zavesený horizontálne na kovový kolík a drôtenú upínaciu konzolu, aby sa tak vytvorilo prepojenie so systémom na meranie sily (pozri 
obrázok).
 
Obrázok  
Meracie teleso (krúžok)  
(Všetky rozmery sú vyjadrené v milimetroch)
  
1.6.4.1.4. M e r a c i a n á d o b a 
Meracia nádoba ur čená pre testovanú látku musí by ť termoregulo ­
vaná sklená nádoba. Musí ma ť také vlastnosti, aby po čas merania 
teplota testovaného kvapalinového roztoku a plynová fáza nad jeho povrchom zostali konštantné a aby sa testovaná vzorka nemohla 
odparovať. Vyhovujúce sú valcovité sklené nádoby s vnútorným 
priemerom najmenej 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Príprava prístroja  
1.6.4.2.1. Č i s t e n i e 
Sklené nádoby musia by ť dôkladne vy čistené. Ak je to potrebné, 
musia sa umy ť horúcou kyselinou chrómsírovou a následne sirupo ­
vitou kyselinou fosfore čnou (83 až 98 hmotnostných % H  3 PO 4 ), 
dôkladne opláchnu ť pod vodou z vodovodu a nakoniec umy ť 
v dvakrát destilovanej vode, až kým sa nedosiahne neutrálna reakcia, 
a potom sa musia osuši ť alebo vymy ť časťou kvapalnej vzorky 
určenej na testovanie, resp. meranie. 
Krúžok sa musí najprv dôkladne opláchnu ť vo vode, aby sa odstrá ­
nili všetky látky, ktoré sú rozpustné vo vode, potom sa krátko ponorí 
do kyseliny chrómsírovej, umyje v dvakrát destilovanej vode, až kým sa nedosiahne neutrálna reakcia, a nakoniec sa krátko ohreje nad metanolovým plame ňom. 
Upozornenie:  
Kontaminácia látkami, ktoré sa nerozpustili alebo nerozrušili kyse ­
linou chrómsírovou alebo kyselinou fosfore čnou, ako napríklad sili ­
kónmi, sa musí odstráni ť pomocou vhodného organického rozpúš ť­
adla.
 
1.6.4.2.2. K a l i b r á c i a p r í s t r o j a 
Kalibrácia prístroja spo číva v kontrole nulového bodu a jeho nasta ­
vení takým spôsobom, aby ozna čenie prístroja umož ňovalo spo ľah­
livé stanovenie hodnôt v mN/m.  
Inštalácia:  
Prístroj musí by ť vyvážený napríklad pomocou liehovej vodováhy na 
tenzometrovej základni nastavovacími skrutkami umiestnenými 
naspodku základovej platne.  
Nastavenie nulového bodu:  
Po inštalácii krúžku na prístroj a pred jeho ponorením do kyseliny 
musí byť ukazovate ľ tenzometra nastavený na nulu a musí sa skon ­
trolovať, či je krúžok rovnobežný s hladinou kvapaliny. Na tento 
účel možno použi ť hladinu kvapaliny ako zrkadlo.  
Kalibrácie:  
Vlastná testová kalibrácia sa môže uskuto čniť jedným z týchto dvoch 
postupov: 
a) použitím závažia: postup používajúci závažia známej hmotnosti 
medzi 0,1 g a 1,0 g umiestnené na krúžku. Kalibra čná konštanta 
(konštanta pri ciachovaní), Φ a , ktorou musia by ť vynásobené všetky 
hodnoty od čítané na inštrumente, sa stanoví pod ľa rovnice (1): 
Φ a ¼ σ r 
σ a 
kde: 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m) 
m = hmotnos ť závažia (g) 
g = gravita čné zrýchlenie (981 cm s  -2 pri hladine mora) 
b = stredný obvod krúžku (cm) 
σ a = údaj na stupnici tenzometra po umiestnení závažia na 
krúžok (mN/m);  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) použitím vody: postup používajúci čistú vodu, ktorej povrchové 
napätie sa napríklad pri teplote 23  o C rovná 72,3 mN/m. Tento 
postup sa dá uskuto čniť rýchlejšie ako hmotnostná kalibrácia, len 
je tu stále riziko, že povrchové napätie vody bude skreslené stopami kontaminácie povrchovo aktívnymi činidlami. 
Kalibračná konštanta, Φ
 b , ktorou musia by ť vynásobené všetky 
údaje odčítané na prístroji, sa stanoví pod ľa rovnice (2): 
Φ b ¼ σ o 
σ g 
kde: 
σ o = hodnota citovaná v literatúre pre povrchové napätie vody 
(mN/m) 
σ g = nameraná hodnota povrchového napätia vody (mN/m) obidve 
hodnoty pri tej istej teplote.  
1.6.4.3.  Príprava vzoriek  
Pri príprave vodných roztokov látok ur čených na testovanie treba 
použiť požadované koncentrácie vo vode, pri čom roztoky nesmú 
obsahova ť žiadne nerozpustené látky. 
Roztok sa musí udržiava ť pri konštantnej teplote (± 0,5  o C). Keďže 
povrchové napätie roztoku sa v meracej nádobe mení v priebehu 
času, treba uskuto čniť viacero meraní v rozli čných časoch, ako aj 
vynášať hodnoty vo forme krivky diagramu ako funkcie času. Keď 
sa ďalšie zmeny už neobjavia, dosiahol sa rovnovážny stav. 
Prach a plynová kontaminácia inými látkami rušivo pôsobia na výsledky 
meraní. Celý postup sa preto uskuto ční pod ochranným krytom.  
1.6.5.  Podmienky skúšania  
Meranie sa musí uskuto čniť pri teplote približne 20  o C a táto teplota 
sa udržiava v rozmedzí ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Realizácia testu  
Roztoky ur čené na meranie treba premiestni ť do dôkladne o čistenej 
meracej nádoby, pri čom treba dba ť na to, aby sa zabránilo peneniu. 
Meracia nádoba sa potom položí na dosku prístroja. Dosku potom treba dvíhať až dovtedy, kým sa krúžok neponorí pod hladinu roztoku ur če­
ného na meranie. Doska sa potom pozvo ľna a rovnomerne spúš ťa 
nadol (rýchlos ťou približne 0,5 cm/min), akoby sme krúžok chceli 
oddeliť od hladiny kvapaliny, a to až dovtedy, kým sa nedosiahne 
maximálna sila. Vrstva kvapaliny prilipnutá ku krúžku sa však od neho nesmie oddeli ť. Po ukon čení merania treba krúžok opä ť ponoriť 
pod hladinu a merania sa takto opakujú až dovtedy, kým sa nedosiahne 
konštantná hodnota povrchového napätia. Čas, ktorý uplynul od 
premiestnenia testovaného roztoku do meracej nádoby, sa musí zazna ­
menať pre každé jedno stanovenie. Hodnoty sa od čítajú vždy pri maxi ­
málnej sile vyvinutej pri snahe o oddelenie krúžku od povrchu hladiny 
kvapaliny.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. ÚDAJE  
Na výpočet povrchového napätia sa hodnota od čítaná v mN/m zo 
stupnice prístroja najprv vynásobí kalibra čným koeficientom Φ a 
alebo Φ b (v závislosti od použitého kalibra čného postupu). Takto 
získame hodnotu, ktorá je iba približná, a vyžaduje si preto korekciu. 
Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korek čné koeficienty pre 
hodnoty povrchového napätia meraného krúžkovou metódou, ktoré 
sú závislé od rozmerov krúžku, hustoty testovanej kvapaliny a od jej povrchového napätia. 
Keďže je veľmi ťažké stanovi ť korekčný koeficient pre každé jedno 
samostatné meranie z Harkinsových a Jordanových tabuliek, na ú čely 
výpočtu povrchového napätia vodných roztokov možno použi ť zjed­
nodušený postup od čítania korek čných hodnôt povrchového napätia 
priamo z tabu ľky. (Na od čítanie v rozmedzí tabu ľkových hodnôt 
treba použi ť interpoláciu.)
 
Tabuľka 
Korekcia nameraného povrchového napätia  
Platí iba pre vodné roztoky, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (stredný polomer krúžku) 
r = 0,185 mm (polomer drôtu, z ktorého je krúžok 
zhotovený)  
Experimentálna hodnota (mN/m) Korigovaná hodnota (mN/m} 
Kalibrácia závažiami [pozri bod 
1.6.4.2.2 písm. a)] Kalibrácia vodou [pozri bod 1.6.4.2.2 
písm. b)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Experimentálna hodnota (mN/m) Korigovaná hodnota (mN/m} 
Kalibrácia závažiami [pozri bod 
1.6.4.2.2 písm. a)] Kalibrácia vodou [pozri bod 1.6.4.2.2 
písm. b)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 
78 73,2 — 
Táto tabu ľka bola zostavená na základe Harkinsovej-Jordanovej korek ­
cie. Je podobná tabu ľke uvedenej v technickej norme DIN Standard 
(DIN 53914) pre vodu a vodné roztoky (hustota ρ = 1g/cm
 3 ) a je 
vhodná pre komer čne dostupný krúžok s rozmermi R = 9,55 mm 
(stredný polomer krúžku) a r = 0,185 mm (polomer drôtu, z ktorého 
je krúžok zhotovený). Tabu ľka udáva korigované hodnoty pre merania 
povrchového napätia vykonané po kalibrácii závažiami alebo vodou. 
Alternatívne, bez predchádzajúcej kalibrácie, sa povrchové napätie 
môže vypo čítať podľa tohto vzorca:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
kde: 
F = sila nameraná na dynamometri v bode prerušenia filmu 
R = polomer krúžku 
f = korek čný (opravný) koeficient (1)  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— použitú metódu, 
— typ použitej vody alebo roztoku, — presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), 
— výsledky merania: povrchové napätie (hodnoty od čítané zo stup ­
nice) uvádzajúce jednotlivé samostatné od čítania hodnôt a ich 
aritmetický priemer, ako aj korigované stredné hodnoty (zoh ľad­ 
ňujúce koeficient zariadenia a korek čnú tabuľku),
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— koncentráciu roztoku, 
— testovaciu teplotu, — vek použitého roztoku, obzvláš ť čas medzi prípravou a meraním 
roztoku, 
— opis časovej závislosti povrchového napätia po premiestnení 
roztoku do meracej nádoby, 
— všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu 
výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupen ­
stva testovanej látky.
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Za predpokladu, že destilovaná voda má povrchové napätie 72,75 
mN/m pri teplote 20  o C, látky prejavujúce povrchové napätie nižšie 
ako 60 mN/m za podmienok tejto metódy treba považova ť za 
povrchovo aktívne materiály.  
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV. 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. (4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, 1751.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. ROZPUSTNOS Ť VO VODE  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 105 (1995). Táto testovacia metóda je revidovanou verziou pôvodných usmernení TG 105, ktoré boli prijaté v roku 1981. 
Medzi sú časnou verziou a verziou z roku 1981 nie je žiadny podstatný 
rozdiel. Zmenil sa najmä formát. Revízia je založená na testovacej metóde EÚ „Rozpustnos ť vo vode“ (
 1 ). 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
2. Rozpustnos ť látok vo vode môže by ť do značnej miery ovplyvnená prítom ­
nosťou prímesí. Táto testovacia metóda je zameraná na ur čenie rozpustnosti 
absolútne čistých látok vo vode, ktoré sú vo vode stabilné a nie sú prchavé. 
Pred stanovením rozpustnosti vo vode je užito čné získať predbežné infor ­
mácie o testovanej látke, ako je štruktúrny vzorec, tlak pary, disocia čná 
konštanta a hydrolýza ako funkcia pH. 
3. V rámci tejto testovacej metódy sú opísané dve metódy, metóda vypierania 
z kolóny, ktorá sa týka rozpustnosti nižšej ako 10  –2 g/l, a banková metóda, 
ktorá sa týka rozpustnosti vyššej ako 10  –2 g/l. Takisto je tu opísaný jedno ­
duchý predbežný test. Umož ňuje stanovenie približného vhodného množstva 
vzorky, ktorá sa má použi ť v konečnom teste, ako aj čas potrebný na 
dosiahnutie nasýtenia.  
POJMY A JEDNOTKY 
4. Rozpustnos ť látky vo vode je satura čná hmotnostná koncentrácia látky vo 
vode pri danej teplote. 
5. Rozpustnos ť vo vode je vyjadrená ako hmotnos ť rozpustenej látky na objem 
roztoku. Jednotka SI je kg/m  3 , ale môže sa použi ť aj g/l.  
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
6. Referen čné chemikálie sa pri skúmaní testovanej látky nemusia použi ť. 
OPIS METÓD  
Podmienky testovania  
7. Test pod ľa možnosti prebieha pri teplote 20 ± 0,5 °C. Zvolená teplota by sa 
mala udržiava ť na konštantnej úrovni vo všetkých relevantných sú častiach 
skúšobného zariadenia.  
Predbežný test  
8. V rámci postupu, ktorý pozostáva z nieko ľkých krokov, sa pri izbovej 
teplote pridáva čoraz väčší objem vody približne do 0,1 g vzorky (tuhé 
testované látky musia by ť rozomleté na prach) v 10 ml odmernom valci 
so sklenou zátkou. Po každom pridaní množstva vody sa zmes trepe po čas 
desiatich minút a vizuálne sa skontroluje, či v nej neostali nerozpustené časti 
vzorky. Ak sa po pridaní 10 ml vody vzorka alebo jej časti nerozpustia,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
pokus pokra čuje v odmernom valci s objemom 100 ml. Približná rozpust ­
nosť je uvedená v tabu ľke 1 pod tým objemom vody, v ktorom dôjde 
k úplnému rozpusteniu testovanej vzorky. Ak je rozpustnos ť nízka, na 
rozpustenie testovanej látky môže by ť potrebný dlhší čas a pokus by mal 
prebiehať aspoň 24 hodín. Ak ani po 24 hodinách látka nie je rozpustená, 
malo by sa poskytnú ť viac času (až 96 hodín) alebo by sa malo vyskúša ť 
ďalšie riedenie, aby sa získala istota, či by sa nemala použi ť metóda vypie ­
rania z kolóny alebo banková metóda.  
Tabuľka 1 
ml vody na 0,1 g rozpustnej 
látky 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
približná rozpustnos ť v g/l > 1 000 1 000 – 
200 200 – 
100 100 – 50 50 – 10 10 – 1 < 1  
Metóda vypierania z kolóny  
Princíp  
9. Táto metóda je založená na vypieraní testovanej látky vodou z mikrokolóny, 
ktorá je naplnená inertným nosným materiálom, ktorý sa predtým pokryl nadbytkom testovanej látky (2). Rozpustnos ť vo vode je daná hmotnostnou 
koncentráciou eluátu, ke ď dosiahne rovnovážny stav, v závislosti od času.
 
Vybavenie  
10. Vybavenie pozostáva z mikrokolóny (obrázok 1), ktorá sa udržiava pri 
konštantnej teplote. Je spojené bu ď s recirkula čným čerpadlom (obrázok 
2), alebo s egaliza čnou nádobou (obrázok 3). Mikrokolóna obsahuje inertný 
nosný materiál, ktorý na mieste drží malá zátka zo sklenej vaty, ktorá slúži 
aj na filtrovanie častíc. Medzi materiál, ktorý je možné použi ť ako nosný, 
patria sklené gu ľôčky, diatomit alebo iný inertný materiál. 
11. Mikrokolóna znázornená na obrázku 1 je vhodná na zostrojenie vybavenia 
s recirkula čných čerpadlom. Má uzavretý priestor nad kvapalinou („head 
space“) poskytujúci pä ť úložných objemov (vypustených na za čiatku 
pokusu) a objem piatich vzoriek (odobratých na analýzu v priebehu poku ­
su). Veľkosť je možné prípadne zníži ť, ak možno do systému v priebehu 
pokusu prida ť vodu ako náhradu za pôvodných pä ť úložných objemov 
vypustených zo systému spolu s prímesami. Kolóna je napojená na rúrku 
vyrobenú z inertného materiálu, ktorá predstavuje recirkula čné čerpadlo 
schopné napumpova ť približne 25 ml/h. Recirkula čné čerpadlo môže by ť 
napríklad peristaltické alebo membránové čerpadlo. Musí sa dba ť na to, aby 
nedošlo ku kontaminácii a/alebo adsorpcii materiálom, z ktorého sú zhoto ­
vené rúrky. 
12. Schematická zostava s využitím egaliza čnej nádoby je znázornená na 
obrázku 3. V tejto zostave je mikrokolóna vybavená jednocestným uzatvá ­
racím ventilom. Spojenie s egaliza čnou nádobou tvorí zabrúsená sklenená 
spojka a rúrka vyrobená z inertného materiálu. Prietok z egaliza čnej nádoby 
by mal by ť približne 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Obrázok 1
  
Rozmery v mm 
A. Prípojka pre zabrúsenú sklenenú spojku 
B. Uzavretý priestor nad kvapalinou C. Vnútorná časť 5 
D. Vonkajšia časť 19 
E. Zátka zo sklenej vaty 
F. Uzatvárací ventil
 
Obrázok 2
  
A. Vyrovnávanie tlaku vzduchom 
B. Prietokomer 
C. Mikrokolóna D. Termostaticky kontrolované cirkula čné čerpadlo 
E. Recirkula čné čerpadlo 
F. Dvojcestný ventil pre vzorkovanie
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Obrázok 3
  
A. Egaliza čná nádoba (napr. 2,5-litrová chemická banka) 
B. Kolóna 
C. Frak čný akumulátor 
D. Termostat 
E. Teflónová rúrka 
F. Zabrúsená sklenená spojka 
G. Vodné potrubie (medzi termostatom a kolónou, s vnútorným prie ­
merom približne 8 mm) 
13. Približne 600 mg nosného materiálu sa premiestni do 50 ml banky 
s guľatým dnom. Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí 
v prchavom rozpúš ťadle s analytickou kvalitou reagentov a primerané 
množstvo tohto roztoku sa pridá do nosného materiálu. Rozpúš ťadlo sa 
úplne odparí, napr. pomocou rota čnej odparky, lebo inak sa v priebehu 
vypierania nedosiahne nasýtenie nosi ča vodou z dôvodu rozkladu na 
povrchu. Nosný materiál s aplikovanou látkou sa nechá má čať približne 
v 5 ml vody dve hodiny a suspenzia sa vleje do mikrokolóny. Suchý nosný materiál sa prípadne môže vlia ť do mikrokolóny naplnenej vodou 
a nechať vyvažova ť dve hodiny. 
14. Aplikácia testovanej látky na nosný materiál môže spôsobova ť problémy, 
ktoré budú vies ť k chybným výsledkom, napr. ak sa testovaná látka nanáša 
ako olej. Tieto problémy treba preskúma ť a v správe o teste uvies ť podrob­
nosti.
 
Postup s využitím recirkula čného čerpadla  
15. Spustí sa prúdenie cez kolónu. Odporú ča sa použi ť prietok približne 
25 ml/h, ktorý v prípade opísanej kolóny zodpovedá desiatim úložným objemom/h. Najmenej prvých pä ť úložných objemov sa vypustí s cie ľom 
odstrániť prímesi rozpustné vo vode. Potom sa čerpadlo nechá beža ť až 
dovtedy, kým sa nedosiahne rovnováha vymedzená piatimi za sebou nasle ­
dujúcimi vzorkami, ktorých koncentrácie sa nelíšia viac ako ± 30 % v náhodnom slede. Vzorky by mali by ť od seba oddelené časovými inter ­
valmi zodpovedajúcimi prietoku najmenej desa ť úložných objemov. 
V závislosti od použitej analytickej metódy môže by ť vhodnejšie zostroji ť 
krivku koncentrácia/ čas, aby sa ukázalo, že bola dosiahnutá rovnováha.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Postup s využitím egaliza čnej nádoby  
16. Za sebou nasledujúce eluátové frakcie by sa potom mali zachytáva ť 
a analyzova ť podľa zvolenej metódy. Frakcie zo stredného eluátového 
rozsahu, v ktorých sú koncentrácie konštantné v rozsahu ± 30 % minimálne 
v piatich následných frakciách, sa použijú na stanovenie rozpustnosti. 
17. Ako eluent sa uprednost ňuje dvakrát destilovaná voda. Takisto možno 
použiť aj deionizovanú vodu s odporom vyšším ako 10 megaohmov/cm 
a celkovým obsahom organického uhlíka nižším ako 0,01 %. 
18. V prípade oboch postupov sa druhé kolo merania vykonáva pri polovi čnej 
miere prvého prietoku. Ak sú výsledky oboch kôl meraní súhlasné, test bol 
uskutočnený na uspokojivej úrovni. Ak je nameraná rozpustnos ť pri nižšom 
prietoku vyššia, znižovanie miery prietoku na polovicu musí pokra čovať 
dovtedy, kým dve za sebou nasledujúce kolá meraní nevykážu rovnakú rozpustnos ť. 
19. V obidvoch prípadoch by sa frakcie mali kontrolova ť z hľadiska prítomnosti 
koloidného materiálu skúmaním Tyndallovho efektu. Prítomnos ť čiastočiek 
znehodnocuje výsledky a test sa musí zopakova ť po zdokonalení postupu 
filtrácie v kolóne. 
20. Hodnota pH každej vzorky sa musí zmera ť podľa možnosti pomocou 
špeciálnych indika čných pásikov.
 
Banková metóda  
Princíp  
21. Testovaná látka (tuhé látky musia by ť rozomleté na prach) sa rozpustí vo 
vode pri teplote o nie čo vyššej, ako je testovacia teplota. Ke ď sa dosiahne 
nasýtenie, zmes sa ochladí a udržiava sa pri testovacej teplote. Meranie sa môže alternatívne uskuto čniť priamo pri testovacej teplote, ak sa vhodným 
vzorkovaním zabezpe čí, že sa dosiahne nasýtený rovnovážny stav. Následne 
sa hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnom roztoku, ktorý 
nesmie obsahova ť žiadne nerozpustené častice, stanoví vhodnou analytickou 
metódou (3).
 
Vybavenie  
22. Je potrebný tento materiál: 
— normálne laboratórne sklené nádoby a vybavenie laboratórnymi 
prístrojmi, 
— zariadenie na premiešavanie, resp. pretrepávanie, roztokov pri kontrolo ­
vanej a regulovanej konštantnej teplote, 
— odstredivka (pod ľa možnosti termostatovaná), ak sa požaduje pri emul ­
ziách, a 
— analytické vybavenie.  
Postup  
23. Množstvo testovanej látky potrebnej na nasýtenie želaného objemu vody sa 
odhaduje z predbežného testu. Približne pä ťnásobok stanoveného množstva 
sa odváži do každej z troch sklených nádob vybavených sklenými zátkami (napr. do odstredivkových skúmaviek, sklených baniek). Do každej nádoby 
sa pridá objem vody zvolený pod ľa analytickej metódy a rozsahu rozpust ­
nosti. Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešava ť pri teplote 
30 °C. Odporú ča sa použi ť trepačku alebo mieša čku schopnú fungova ť pri 
konštantnej teplote, napr. magnetické miešadlo v termostatickom vodnom 
kúpeli. Po uplynutí jedného d ňa sa jedna z nádob ďalších 24 hodín opätovne 
vyváži pri skúšobnej teplote s ob časným pretrepaním. Obsah nádoby sa
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
odstredí pri skúšobnej teplote a pomocou vhodnej analytickej metódy sa 
stanoví koncentrácia testovanej látky v čírej vodnej fáze. So zvyšnými 
dvoma bankami sa naloží podobne po po čiatočnom vyvážení pri teplote 
30 °C po čas dvoch dní v prípade jednej a po čas troch dní v prípade druhej. 
Ak sa namerané koncentrácie aspo ň v dvoch posledných nádobách nelíšia 
o viac ako 15 %, test bol uskuto čnený na uspokojivej úrovni. Ak výsledky 
z nádob 1, 2 a 3 prejavia tendenciu narastajúcich hodnôt, celý test sa musí zopakova ť pri použití dlhších vyvažovacích časov. 
24. Test sa môže uskuto čniť aj bez predchádzajúcej inkubácie pri teplote 30 °C. 
Na účely odhadu rýchlosti vzniku satura čnej rovnováhy sa vzorky odoberú, 
až keď už čas miešania neovplyv ňuje merané koncentrácie. 
25. Hodnota pH každej vzorky sa musí zmera ť podľa možnosti pomocou 
špeciálnych indika čných pásikov.
 
Analytické stanovenie  
26. Odporú ča sa použi ť špecifickú metódu pre príslušnú testovanú látku, lebo 
malé množstvá rozpustných prímesí môžu spôsobi ť veľké chyby 
v nameranej rozpustnosti. Príkladmi takýchto metód sú plynová alebo kvapalinová chromatografia, titrácia, fotometria alebo voltametria.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
Metóda vypierania z kolóny  
27. Pre každé kolo sa musí vypo čítať stredná hodnota a smerodajná odchýlka 
namerané najmenej pri piatich po sebe nasledujúcich vzorkách zo satura čnej 
úrovne. Stredné hodnoty získané z dvoch testov s rôznym prietokom by sa 
nemali líši ť o viac ako 30 %.  
Banková metóda  
28. Jednotlivé výsledky z každej z troch baniek, ktoré sa nesmú líši ť o viac ako 
15 %, sa spriemerujú.  
Správa o teste  
Metóda vypierania z kolóny  
29. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
— výsledky predbežného testu, — chemická identita a prímesi (opatrenia v rámci predbežnej purifikácie, ak 
boli uskuto čnené), 
— koncentrácie, prietoky a pH pre každú vzorku, 
— stredné hodnoty a smerodajné odchýlky namerané najmenej pri piatich 
vzorkách zo satura čnej úrovne každého kola meraní, 
— priemer dvoch za sebou nasledujúcich kôl meraní, 
— teplota vody po čas saturačného procesu, 
— metóda analýzy, 
— charakteristické vlastnosti nosného materiálu, — spôsob aplikácie testovanej látky na nosný materiál, 
— druh použitého riedidla, 
— dôkazy akejko ľvek chemickej nestálosti látky po čas testu, 
— všetky informácie dôležité pre interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce 
sa prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Banková metóda  
30. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
— výsledky predbežného testu, — chemická identita a prímesi (opatrenia v rámci predbežnej purifikácie, ak 
boli uskuto čnené), 
— samostatné analytické stanovenia hodnôt a ich priemer v prípadoch, kde 
boli pre každú banku stanovené viaceré hodnoty, 
— pH každej vzorky, — priemer hodnôt pre rozdielne banky, pri ktorých sa dosiahla súhlasnos ť 
výsledkov, 
— testovacia teplota, — analytická metóda, — dôkazy akejko ľvek chemickej nestálosti látky po čas testu, 
— všetky informácie dôležité na interpretáciu výsledkov, najmä týkajúce sa 
prímesí a fyzikálneho skupenstva (stavu) testovanej látky.
 
LITERATÚRA  
1. Smernica Komisie 92/69/EHS z 31. júla 1992, ktorou sa po sedemnástykrát 
prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasi ­
fikácie, balenia a ozna čovania nebezpe čných látok (Ú. v. ES L 383, 
29.12.1992, s. 113). 
2. NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method. 
3. NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility – Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. ROZDE ĽOVACÍ KOEFICIENT  
1. METÓDA  
Opísaná metóda „trepa čkovej banky“ je upravená smernicou na 
vykonávanie testov OECD (1).  
1.1. ÚVOD 
Na účely realizácie tejto metódy sa odporú ča získať predbežné infor ­
mácie o štruktúrnom vzorci, disocia čnej konštante, rozpustnosti vo 
vode, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanole a povrchovom napätí látky určenej na testovanie. 
Merania na ionizovate ľných testovaných látkach by sa mali reali ­
zovať iba v ich neionizovanej forme (vo ľná kyselina alebo vo ľná 
zásada) dosiahnutej použitím vhodného tlmivého roztoku s hodnotou pH minimálne o jednu jednotku pH pod (vo ľná kyselina) alebo nad 
(voľná zásada) hodnotou pH. 
Táto testovacia metóda pozostáva z dvoch samostatných postupov: 
z metódy trepa čkovej banky a vysokoú činnej kvapalinovej chroma ­
tografie (HPLC). Prvý z uvedených postupov sa dá aplikova ť, keď 
hodnota log P
 ow patrí do rozsahu od – 2 do 4, a druhý, ke ď táto 
hodnota patrí do rozsahu od 0 do 6. Pred uskuto čnením ktorého ­
koľvek z uvedených postupov je potrebné najprv získa ť predbežný 
odhad rozde ľovacieho koeficientu. 
Metóda trepa čkovej banky sa dá použi ť iba v prípade absolútne 
čistých testovaných látok rozpustných vo vode a n-oktanole. 
Nemožno ju uplatni ť v prípade povrchovo aktívnych látok (pre 
ktoré treba zabezpe čiť vypočítanú hodnotu alebo odhad založený 
na rozpustnosti vo vode a n-oktanole). 
Metóda vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) sa nedá 
použiť v prípade silných kyselín a zásad, polymetalických látok, 
povrchovo aktívnych látok alebo látok, ktoré reagujú s eluentom. 
Pre tieto materiály treba zabezpe čiť vypočítanú hodnotu alebo 
odhad založený na rozpustnosti vo vode a n-oktanole. 
Metóda vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) je 
menej citlivá na prítomnos ť prímesí v testovanej látke alebo 
prípravku než metóda trepa čkovej banky. Napriek tomu však prímesi 
v niektorých prípadoch môžu zna čne skomplikova ť interpretáciu 
výsledkov, pretože vrcholová špecifikácia sa stáva neistou. Pre zmesi, ktoré vykazujú nerozpustené pásmo, treba ur čiť vrchné 
a spodné medzné hodnoty log P.
 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Rozdeľovací koeficient (P) je definovaný ako pomer rovnovážnych 
koncentrácií (c  i ) rozpustenej látky v dvojfázovom systéme pozostá ­
vajúcom z dvoch do zna čnej miery nezmiešate ľných rozpúš ťadiel. 
V prípade n-oktanolu a vody platí:  
P ow ¼ c nÄoktanÄlÄol 
c voda 
Rozdeľovací koeficient (P) je preto kvocientom dvoch koncentrácií 
a udáva sa vo forme dekadického logaritmu (log P).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY  
Metóda trepa čkovej banky  
Referenčné látky sa nemusia použi ť vo všetkých prípadoch, ke ď sa 
skúma nová látka. V prvom rade by mali slúži ť na občasnú kontrolu 
účinnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania 
s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.  
Metóda HPLC  
Na účely korelácie nameraných údajov HPLC (vysokoú činnej kvapa ­
linovej chromatografie) príslušnej zlú čeniny s jej hodnotou P treba 
zostrojiť kalibračný graf údajov log P verzus chromatografické údaje 
s použitím najmenej 6 referen čných bodov. Zostáva na užívate ľovi, 
aby si zvolil príslušné vhodné referen čné látky. Vždy ke ď je to 
možné, najmenej jedna referen čná látka má ma ť hodnotu P  ow vyššiu 
než testovaná látka a iná zasa hodnotu P  ow nižšiu než testovaná 
látka. Pre hodnoty log P nižšie ako 4 môže by ť kalibrácia založená 
na údajoch nadobudnutých v rámci metódy trepa čkovej banky. Pre 
hodnoty log P vyššie ako 4 môže by ť kalibrácia založená na literár ­
nych údajoch s potvrdenou platnos ťou, ak tieto súhlasia 
s vypočítanými hodnotami. Pre vä čšiu presnos ť sa odporú ča radšej 
vybrať také referen čné látky, ktoré majú podobnú štruktúru ako 
príslušná testovaná látka. 
Existujú obsiahle zoznamy hodnôt log P  ow pre mnohé skupiny 
chemických látok a prípravkov (2) (3). Ak údaje týkajúce sa rozdeľovacích koeficientov štrukturálne príbuzných látok nie sú 
dostupné, možno použi ť všeobecnejšiu kalibráciu uskuto čnenú 
s inými referen čnými látkami. 
Zoznam odporú čaných referen čných látok a ich hodnoty P
 ow sú 
uvedené v dodatku 2.  
1.4. PRINCÍP METÓDY  
1.4.1.  Metóda trepa čkovej banky  
Na účely stanovenia rozde ľovacieho koeficientu musí by ť dosiahnutá 
rovnováha medzi všetkými vzájomne pôsobiacimi zložkami systému a musia by ť stanovené koncentrácie látok rozpustených v dvoch 
fázach. Štúdium odbornej literatúry týkajúcej sa tejto otázky ukazuje, 
že na vyriešenie problému dôkladného premiešania dvoch fáz s ich následnou separáciou na ú čely stanovenia rovnovážnej koncentrácie 
pre testovanú látku možno použi ť viacero odlišných technických 
postupov.
 
1.4.2.  Metóda HPLC (vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie)  
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia sa uskuto čňuje na analy ­
tických kolónach naplnených komer čne dostupnou tuhou fázou obsa ­
hujúcou dlhé uh ľovodíkové re ťazce (napr. C  8 , C  18 ), ktoré sú 
chemicky viazané na kremík. Látky injektované na takúto kolónu sa pohybujú pozd ĺž nej rozdielnymi rýchlos ťami, pretože dochádza 
k rozdielnym stup ňom rozde ľovania medzi pohyblivú fázu 
a uhľovodíkovú nepohyblivú fázu. Zmesi látok sa vypierajú 
v poradí za sebou v závislosti od ich hydrofóbnosti, pri čom látky 
rozpustné vo vode sa vypierajú ako prvé a látky rozpustné v oleji 
ako posledné, proporcionálne k ich rozde ľovaciemu koeficientu 
medzi uh ľovodíkom a vodou. Toto umož ňuje vytvorenie vzájom ­
ného vzťahu medzi dobou zdržania na takejto kolóne s reverznou 
fázou a rozde ľovacím koeficientom n-oktanol/voda. Rozde ľovací 
koeficient je odvodený z činiteľa využitia (kapacitného faktora) 
k, daného výrazom:
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
v ktorom t  r = doba zdržania (retencie) testovanej látky a t  o = prie­
merný čas, ktorý potrebuje molekula rozpúš ťadla na to, aby prešla 
kolónou (ne činná doba). 
Kvantitatívne analytické metódy sa nepožadujú a potrebné je iba 
stanovenie časov vypierania.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.5.1.  Opakovate ľnosť 
Metóda trepa čkovej banky  
Na účely zaistenia presnosti rozde ľovacieho koeficientu je potrebné 
vykonať duplikátne stanovenia za troch odlišných skúšobných 
podmienok, pri čom možno meni ť množstvo špecifikovanej látky, 
ako aj pomer objemov rozpúš ťadiel. Stanovené hodnoty rozde ľova­
cieho koeficientu vyjadrené ako ich dekadické (Briggsove) logaritmy musia patri ť do rozsahu ± 0,3 log jednotiek.
 
Metóda HPLC (vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie)  
Na účely zvýšenia dôveryhodnosti merania sa musia uskuto čniť 
duplikátne stanovenia. Hodnoty log P odvodené z jednotlivých 
meraní musia patri ť do rozsahu ± 0,1 log jednotiek.  
1.5.2.  Citlivos ť 
Metóda trepa čkovej banky  
Rozsah merania v rámci tejto metódy je ur čovaný možnos ťou sledo­
vania analytického postupu. Toto by malo umožni ť stanovenie 
hodnôt log P  ow v rozmedzí od – 2 do 4 (príležitostne, ke ď sú na 
to podmienky, toto rozmedzie môže by ť rozšírené na log P  ow 
s hodnotou až 5), ke ď koncentrácia rozpustenej látky ani v jednej 
fáze nepresiahne hodnotu 0,01 mol na jeden liter.  
Metóda HPLC (vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie)  
Metóda vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie umož ňuje odha­
dovanie rozde ľovacích koeficientov v rozmedzí log P  ow od 0 do 6. 
Za normálnych okolností možno rozde ľovací koeficient látky alebo 
prípravku odhadnú ť s presnos ťou na ± 1 log jednotku hodnoty 
v rámci metódy trepa čkovej banky. Typické korelácie možno nájs ť 
v odkazoch (4) (5) (6) (7) (8). Vyššia presnos ť sa môže zvy čajne 
dosiahnuť vtedy, ke ď sú korela čné diagramy založené na štruktúrne 
príbuzných referen čných látkach (9).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Špecifickos ť 
Metóda trepa čkovej banky  
Nernstov rozde ľovací zákon sa dá použi ť iba pri konštantnej teplote, 
tlaku a hodnote pH pre zriedené roztoky. Uplat ňuje sa výlu čne pre 
čisté látky dispergované medzi dve čisté riedidlá. Ak sa v tom istom 
čase objavia v jednej alebo obidvoch fázach viaceré odlišné rozpus ­
tené látky, môže to nepriaznivo ovplyvni ť výsledky. 
Disociácia alebo spájanie rozpustených molekúl má za následok 
odchýlky od Nernstovho rozde ľovacieho zákona. Takéto odchýlky 
sú nazna čované skuto čnosťou, že rozde ľovací koeficient sa stane 
závislý od koncentrácie roztoku. 
Kvôli viacnásobným rovnovážnym stavom by sa táto testovacia 
metóda nemala aplikova ť na ionizovate ľné prípravky bez uplatnenia 
korekcie. V prípade takýchto prípravkov by sa malo uvažova ť 
o použití tlmivých roztokov namiesto vody, pri čom hodnota pH 
tlmivého roztoku by mala predstavova ť minimálne jednu jednotku 
pH z pKa testovanej látky, a zárove ň treba ma ť na pamäti závažnos ť 
tejto hodnoty pH pre životné prostredie.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Predbežný odhad rozde ľovacieho koeficientu  
Uprednost ňuje sa odhad rozde ľovacieho koeficientu použitím výpo č­
tovej metódy (dodatok 1) alebo, kde je to vhodné, z pomeru rozpust ­
ností testovanej látky v čistých rozpúš ťadlách (10).  
1.6.2.  Metóda trepa čkovej banky  
1.6.2.1.  Príprava  
n-oktanol: stanovenie rozde ľovacieho koeficientu by sa malo usku ­
točniť s reagentom analytickej triedy vysokej čistoty. 
Voda: použije sa voda destilovaná alebo dvakrát destilovaná v sklenom 
alebo kremennom destila čnom prístroji. V zdôvodnených prípadoch 
treba na ionizovate ľné prípravky namiesto vody použi ť tlmivé roztoky.  
Upozornenie:  
Nesmie sa používa ť voda odoberaná priamo z ionexu (vymie ňača 
iónov).  
1.6.2.1.1. P r e d s a t u r á c i a r o z p ú š ť a d i e l 
Predtým než sa stanoví rozde ľovací koeficient, fázy rozpúš ťadlového 
systému sa vzájomne nasýtia trepaním pri teplote pokusu. Na tento 
účel je praktické pretrepáva ť dve veľké a vysoké f ľaše s n-okta ­
nolom analytickej triedy vysokej čistoty alebo s vodou, pri čom 
každá musí obsahova ť dostatočné množstvo druhého rozpúš ťadla, 
počas 24 hodín na mechanickej trepa čke a potom sa nechajú odstá ť 
dostatočne dlhý čas na to, aby sa fázy od seba oddelili a aby sa 
dosiahol stav saturácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r í p r a v a n a t e s t 
Celý objem sústavy dvoch fáz by mal skoro úplne naplni ť testovaciu 
nádobu. Toto pomôže zabráni ť stratám materiálu následkom 
vyprchávania. Objemový pomer a množstvá látky, ktoré sa majú použiť, sú stanovené týmto: 
— predbežným odhadom rozde ľovacieho koeficientu (pozri vyššie), 
— minimálnym množstvom testovanej látky potrebným pre analy ­
tický postup a 
— obmedzením maximálnej koncentrácie v každej fáze na 0,01 mol 
na liter. 
Uskutočňujú sa tri testy. V prvom teste sa použije vypo čítaný obje ­
mový pomer n-oktanolu k vode; v druhom teste sa tento pomer vydelí dvoma; a v tre ťom teste sa tento pomer vynásobí dvoma 
(napr. 1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3. T e s t o v a n á l á t k a 
V n-oktanole predsaturovanom vodou sa pripraví základný zásobný 
roztok. Koncentrácia tohto základného zásobného roztoku musí by ť 
presne stanovená ešte predtým, než sa použije na stanovenie 
rozdeľovacieho koeficientu. Tento roztok by mal by ť uskladnený 
v takých podmienkach, ktoré zaru čia jeho stabilitu.  
1.6.2.2.  Podmienky skúšania  
Testovacia teplota sa musí udržiava ť na konštantnej úrovni (± 1  o C) 
a musí by ť v rozmedzí od 20  o C do 25  o C. 
1.6.2.3.  Postup merania  
1.6.2.3.1. V y t v o r e n i e r o z d e ľ o v a c e j r o v n o v á h y 
Pre každú zo skúšobných podmienok treba pripravi ť duplikátne 
skúšobné nádoby obsahujúce požadované, presne odmerané množ ­
stvá dvoch rozpúš ťadiel spolu s potrebným množstvom základného 
zásobného roztoku. 
Fázy n-oktanolu (n-oktanolové fázy) sa musia mera ť podľa objemu. 
Skúšobné nádoby treba bu ď umiestni ť na vhodnú trepa čku, alebo ich 
pretrepáva ť ručne. V prípade použitia odstredivkovej skúmavky 
spočíva odporú čaná metóda v rýchlom obracaní skúmavky o 180 
stupňov okolo jej prie čnej osi tak, aby všetok zachytený vzduch 
vystúpil cez obidve fázy. Skúsenosti ukázali, že na vytvorenie 
rozdeľovacej rovnováhy zvy čajne posta čí 50 takýchto obratov. Na 
zabezpečenie želaného výsledku sa odporú ča 100 obratov v priebehu 
piatich minút.  
1.6.2.3.2. O d d e ľ o v a n i e f á z o d s t r e ď o v a n í m 
Keď je to potrebné, na ú čely oddelenia fáz by malo by ť výkonané 
odstredenie zmesi. Tento úkon by sa mal uskuto čniť v laboratórnej 
odstredivke s udržiavanou stálou teplotou miestnosti alebo v prípade, ak sa použije odstredivka bez tepelnej regulácie, odstredivkové 
skúmavky by mali by ť ponechané pri skúšobnej teplote po čas 
najmenej jednej hodiny pred za čatím analýzy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analýza  
Na stanovenie rozde ľovacieho koeficientu je potrebné stanovi ť 
koncentrácie testovanej látky v obidvoch fázach. Toto možno usku ­
točniť odobratím alikvotnej časti oboch fáz z každej skúmavky pre 
každú zo skúšobných podmienok a ich analyzovaním zvoleným 
postupom. Celkové množstvo látky prítomné v oboch fázach treba vypočítať a porovna ť s množstvom látky, ktoré sa pôvodne použilo. 
Vodná fáza by sa mala vzorkova ť takým postupom, ktorý by mini ­
malizoval riziko prítomnosti stopových množstiev n-oktanolu: na 
odber vzorky z vodnej fázy sa môže použi ť sklená injek čná strie­
kačka s oddelite ľnou ihlou. Injek čná strieka čka by mala by ť 
spočiatku čiastočne naplnená vzduchom. Po čas prenikania ihly cez 
vrstvu n-oktanolu treba mierne vypudzova ť vzduch z injek čnej strie­
kačky. Potom sa do strieka čky naberie primeraný objem vodnej fázy. 
Striekačka sa rýchlym pohybom vytiahne z roztoku a ihla sa 
odstráni. Obsah strieka čky potom možno použi ť ako vodnú vzorku. 
Koncentrácia v oboch odstredením oddelených fázach by sa pod ľa 
možnosti mala stanovi ť metódou špecifickou pre príslušnú testovanú 
látku. Príklady analytických metód, ktoré tu možno použi ť, sú: 
— fotometrické metódy, 
— plynová chromatografia, 
— vysokoú činná kvapalinová chromatografia (HPLC).
 
1.6.3.  Metóda HPLC (vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie)  
1.6.3.1.  Príprava  
Prístroje  
Požaduje sa kvapalinový chromatograf vybavený impulzovým 
čerpadlom a vhodným zariadením na detekciu. Odporú ča sa použitie 
vstrekovacieho ventilu so vstrekovacími slu čkami. Prítomnos ť polár­
nych skupín v nepohyblivej fáze môže vážne naruši ť fungovanie 
kolóny vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie. Z toho dôvodu 
by mali stacionárne fázy obsahova ť minimálne percento polárnych 
skupín (11). Možno použi ť aj komer čné mikro časticové náplne so 
spätnou fázou alebo kolóny s hotovou nápl ňou. Medzi vstrekovací 
systém a analytickú kolónu sa môže umiestni ť ochranná kolóna.  
Pohyblivá fáza  
Na prípravu elua čného rozpúš ťadla, ktoré treba pred použitím odply ­
niť, sa použije metanol kvalitatívnej triedy HPLC a voda kvalita ­
tívnej triedy HPLC. Treba použi ť izokratické vypieranie. Ďalej treba 
použiť pomery metanolu a vody s minimálnym obsahom vody 25 %. 
Na vypieranie prípravkov s hodnotou log P 6 v priebehu jednej 
hodiny pri prietoku 1 ml za minútu posta čí typický pomer zmesi 
metanolu a vody 3:1 (v/v). Pre prípravky s vysokým log P môže byť potrebné skráti ť čas vypierania (ako aj časy referen čných látok) 
znížením polarity pohyblivej fázy alebo skrátením d ĺžky kolóny. 
Látky s ve ľmi nízkou rozpustnos ťou v n-oktanole majú pri použití 
metódy vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie tendenciu vyka ­
zovať abnormálne nízke hodnoty log P
 ow , pričom zóny takýchto 
prípravkov sa niekedy spájajú s čelom rozpúš ťadla. Toto pravdepo ­
dobne vyplýva zo skuto čnosti, že rozde ľovací proces je príliš pomalý 
na to, aby dosiahol rovnovážny stav v čase potrebnom za normál ­
nych okolností v rámci separácie metódou vysokoú činnej kvapali ­
novej chromatografie. Na dosiahnutie spo ľahlivej hodnoty môže by ť 
potom účinné zníženie prietoku, resp. zmenšenie pomeru metanolu 
a vody.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Testované a referen čné látky by mali by ť rozpustné v pohyblivej 
fáze v dostato čných koncentráciách, aby sa umožnila ich detekcia. 
Iba vo výnimo čných prípadoch sa môžu so zmesou metanolu a vody 
použiť aj aditíva, pretože tieto menia vlastnosti kolóny. V prípade 
chromatografov s aditívami je povinné použi ť samostatnú kolónu 
toho istého typu. Ak zmes metanolu a vody nie je vhodná, môžu 
sa použiť iné zmesi organického rozpúš ťadla a vody, napr. zmes 
etanolu a vody alebo acetonitrilu (nitrilu kyseliny etánovej) a vody. 
Hodnota pH eluentu je kritická pre ionizovate ľné látky. Tieto 
hodnoty musia patri ť do opera čného rozmedzia pH kolóny, ktoré 
leží zvyčajne medzi hodnotami 2 až 8. Odporú ča sa pufrovanie. 
Treba dba ť na to, aby sa zabránilo zrážaniu solí a poškodeniu 
kolóny, ku ktorým dochádza v prípade použitia niektorých organic ­
kých zmesí fázy a pufra. Merania metódou vysokoú činnej kvapali ­
novej chromatografie (HPLC) s nepohyblivými fázami na báze kremíka s hodnotami pH nad 8 sa neodporú čajú, pretože použitie 
alkalickej pohyblivej fázy môže zaprí činiť rýchle poškodenie funk č­
nosti kolóny.
 
Rozpustené látky  
Referenčné látky sa musia vyzna čovať maximálnou možnou čistotou. 
Ak je to možné, látky alebo prípravky ur čené na použitie v rámci 
testu alebo kalibrácie sú rozpustené v pohyblivej fáze.  
Podmienky skúšania  
Teplota po čas merania by sa nemala meni ť v rozsahu vä čšom ako 
± 2 K (kelvin).  
1.6.3.2.  Meranie  
Výpočet nečinnej doby t  0 
Nečinná doba t  0 môže byť stanovená použitím bu ď homologického 
radu (napr. n-alkylmetylových ketónov), alebo nezadržaných, resp. neeluovaných, organických látok alebo prípravkov (napr. tiomo čo­
viny alebo formamidu, amidu kyseliny metánovej). Na výpo čet 
nečinnej doby t
 0 s použitím homologického radu sa injektuje 
najmenej sedem členov homologického radu a stanovia sa príslušné 
doby zdržania. Prvotné (nespracované) doby zdržania t  r(nc + 1 sú 
graficky znázornené v diagrame ako funkcia t  r(nc) a stanovený je 
úsek a a sklon b regresnej rovnice: 
t r(n c + 1) = a + b t  r(n c ) 
(kde n  c = počet atómov uhlíka). Ne činná doba t  0 je potom daná vz ťahom: 
t o = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibračný graf  
Ďalším krokom postupu je zostrojenie korela čného diagramu hodnôt 
log k verzus log P pre príslušné referen čné látky. V praktickom 
postupe sa sú časne vstrekne súbor piatich až desiatich štandardných 
referenčných látok, ktorých hodnota log P sa nachádza v blízkosti 
predpokladaného rozmedzia, a stanovia sa doby zdržania, pod ľa 
možnosti na záznamovej integra čnej jednotke napojenej na detek čný 
systém. Zodpovedajúce logaritmy kapacitných faktorov log k sa vypočítajú a nanesú do diagramu ako funkcia log P stanovenou 
metódou trepa čkovej banky. Kalibrácia sa uskuto čňuje 
v pravidelných časových intervaloch, a to najmenej raz denne, aby 
sa tak dali vzia ť do úvahy možné zmeny v činnosti kolóny.
 
Stanovenie kapacitného faktora testovanej látky  
Testovaná látka sa vstrekne do čo najmenšieho možného množstva 
mobilnej fázy. Stanoví sa (duplikátne) doba zdržania, čo umožní 
výpočet kapacitného faktora k. Z korela čného grafu referen čných 
látok sa dá interpolova ť rozdeľovací koeficient testovanej látky. 
Pre veľmi nízke a ve ľmi vysoké rozde ľovacie koeficienty je potrebná 
extrapolácia. V takýchto prípadoch treba dáva ť mimoriadny pozor na 
hranice významnosti regresnej čiary. 
2. ÚDAJE  
Metóda trepa čkovej banky  
Spoľahlivosť stanovených hodnôt P sa môže overi ť porovnaním stred ­
ných hodnôt duplikátnych stanovení s celkovou strednou hodnotou.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), 
— keď sa dané metódy nedajú uplatni ť (napr. povrchovo aktívny 
materiál), treba zabezpe čiť vypočítanú hodnotu alebo odhad zalo ­ 
žený na jednotlivých rozpustnostiach v n-oktanole a vo vode, 
— všetky informácie a poznámky dôležité pre interpretáciu 
výsledkov testu, najmä týkajúce sa prímesí a fyzikálneho skupen ­
stva (stavu) testovanej látky.  
V prípade metódy trepa čkovej banky:  
— výsledok predbežného odhadu, ak sa takýto uskuto čnil, 
— teplotu, pri ktorej sa hodnoty stanovovali, — údaje o analytických postupoch uplatnených pri stanovovaní 
koncentrácií, 
— čas a rýchlos ť odstreďovania, ak sa použilo,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— namerané koncentrácie v obidvoch fázach pre každé stanovenie 
(to znamená, že dohromady sa uvedú hodnoty 12 koncentrácií), 
— hmotnos ť testovanej látky, objem každej fázy použitý v každej 
skúšobnej nádobe a celkové vypo čítané množstvo testovanej 
látky prítomné v každej fáze po vyvážení (po dosiahnutí rovno ­
vážneho stavu), 
— vypočítané hodnoty rozde ľovacieho koeficientu (P) a stredná 
hodnota musia by ť uvedené pre každú sériu skúšobných podmie ­
nok, ako aj stredné hodnoty pre všetky stanovenia. Ak existujú 
náznaky závislosti rozde ľovacieho koeficientu od koncentrácie, 
táto skuto čnosť sa musí taktiež uvies ť v správe, 
— v správe sa musí uvies ť smerodajná odchýlka jednotlivých 
hodnôt P od ich strednej hodnoty, 
— stredná hodnota P zo všetkých stanovení sa musí tiež vyjadri ť 
ako jej logaritmus (základ 10), 
— vypočítanú teoretickú hodnotu P  ow , keď bola táto hodnota stano ­
vená alebo ke ď je nameraná hodnota > ako 10  4 , 
— hodnotu pH použitej vody a vodnej fázy po čas pokusu, 
— ak boli použité tlmivé roztoky, tak zdôvodnenie použitia tlmi ­
vých roztokov namiesto vody, ďalej zloženie, koncentráciu 
a hodnoty pH tlmivých roztokov, hodnotu pH vodnej fázy pred 
uskutočnením pokusu a po jeho ukon čení. 
V prípade metódy HPLC (vysokoú činnej kvapalinovej chromatografie):  
— výsledok predbežného odhadu, ak sa takýto uskuto čnil, 
— testované a referen čné látky a ich čistotu, 
— teplotné rozmedzie jednotlivých stanovení, 
— hodnoty pH, pri ktorých sa stanovenia vykonali, 
— podrobnosti o analytickej a ochrannej kolóne, pohyblivej (mobil ­
nej) fáze a detek čných prostriedkoch, 
— retenčné údaje a hodnoty log P z odbornej literatúry pre refe ­
renčné látky použité v rámci kalibrácie, 
— podrobnosti o zodpovedajúcej regresnej čiare (log k verzus log P), 
— priemerné reten čné údaje a interpolovanú hodnotu P pre testo ­
vanú látku alebo prípravok, 
— opis zariadenia a prevádzkových, resp. pracovných, podmienok, — eluačné profily, 
— množstvá testovaných a referen čných látok zavedených do 
kolóny, 
— nečinnú dobu a spôsob, akým sa merala.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979. 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College Claremont, California 91711. 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemo ­
sphere, 1980, vol. 80, 683. 
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219 (1981). 
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. (7) W. E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. (8) J. E. Haky and A. M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. (9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787. 
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223 – 339. 
(11) R. F. Rekker and H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479. 
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. 
(13) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977. 
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method. 
(15) C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. (16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. (17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and 
E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. 
(18) W. B. Neely, D. R. Branson and G. E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, 1113. 
(19) D. S. Brown and E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984. 
(22) Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel 1978. 
(23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J., Taylor, 
J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Dodatok 1  
Výpočtové/odhadové metódy  
ÚVOD  
Všeobecný úvod k výpo čtovým metódam, údaje a príklady sú uvedené 
v publikácii Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a). 
Vypočítané hodnoty P  ow sa môžu použi ť týmito spôsobmi: 
— na rozhodnutie o tom, ktorá z experimentálnych metód je vhodná (rozmedzie 
pri metóde trepa čkovej banky: log P  Ow : – 2 až 4, rozmedzie pri metóde 
HPLC: log P  Ow : 0 až 6), 
— na vo ľbu vhodných testových podmienok (napr. referen čných látok pre 
postupy HPLC, objemového pomeru n-oktanolu a vody pre metódu trepa č­
kovej banky), 
— ako laboratórna vnútorná (interná) kontrola z h ľadiska výskytu možných chýb 
v pokusoch, 
— na umožnenie odhadu hodnôt P  ow v prípadoch, kde sa nemôžu použi ť expe­
rimentálne metódy z technických dôvodov.  
ODHADOVÁ METÓDA  
Predbežný odhad rozde ľovacieho koeficientu  
Hodnota rozde ľovacieho koeficientu sa môže odhadnú ť použitím rozpustností 
testovanej látky v čistých rozpúš ťadlách:  
P odhad ¼ nasýtenie c  nÄoctanol  
nasýtenie c  voda 
VÝPOČTOVÉ METÓDY  
Princíp výpo čtových metód  
Všetky výpo čtové metódy sú založené na formálnom trieštení molekuly na 
vhodné subštruktúry, pre ktoré sú známe spo ľahlivé prírastky hodnoty log P  ow . 
Hodnota log P  ow celej molekuly sa potom vypo číta ako sú čet jej zodpovedajú ­
cich čiastkových hodnôt plus sú čet korekčných členov pre vnútromolekulové 
interakcie. 
Zoznamy fragmentových konštánt a korek čných členov sú uvedené v odkazoch 
(b) (c) (d) (e). Niektoré z nich sa pravidelne aktualizujú (b).  
Kritériá kvality  
Spoľahlivosť výpočtovej metódy vo všeobecnosti klesá s narastajúcou komplex ­
nosťou skúmanej látky alebo prípravku. V prípade jednoduchých molekúl 
s nízkou molekulovou hmotnos ťou a jednej alebo dvoch funk čných skupín 
možno predpoklada ť odchýlku 0,1 až 0,3 jednotiek log P  Ow medzi výsledkami 
rozličných fragmenta čných metód a nameranou hodnotou. V prípade komplex ­
nejších molekúl môžu by ť hranice chyby vä čšie. Bude to závisie ť od spoľahli­
vosti a dostupnosti fragmentových konštánt, ako aj od schopnosti rozozna ť 
vnútromolekulové interakcie (napr. vodíkové väzby) a správneho použitia korekčných členov (problém je jednoduchší pri použití po čítačového softvéru 
CLOGP-3) (b). V prípade ionizujúcich prípravkov je dôležité správne zoh ľad­
nenie náboja alebo stup ňa ionizácie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Postupy výpo čtov 
Hanschova π-metóda  
Pôvodná hydrofóbna substituen čná konštanta, π, ktorú zaviedol Fujita a kol. (f), 
je definovaná ako: 
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH) 
kde P  ow (PhX) je rozde ľovací koeficient aromatického derivátu a P  ow (PhH) je 
rozdeľovací koeficient pôvodnej látky alebo prípravku 
(napr. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71). 
Podľa tejto definície je metóda π (π-metóda) použite ľná predovšetkým na aroma ­
tickú substitúciu. Hodnoty π pre väčší počet substituentov boli zostavené do 
tabuľky (b) (c) (d). Používajú sa na výpo čet hodnoty log P  ow pre aromatické 
molekuly alebo subštruktúry.  
Rekkerova metóda  
Podľa Rekkera (g) sa hodnota log P  ow vypočíta týmto spôsobom:  
log P  ow ¼ X  
i a i f i þ X  
j ðinterakčné členyÞ 
kde f  i predstavuje konštanty rozdielnych molekulových fragmentov a a  i frek­
venciu ich výskytu v skúmanej molekule. Korek čné členy môžu by ť vyjadrené 
ako integrálny (celý) násobok jednej jedinej konštanty C  m (tzv. „magickej 
konštanty“). Fragmentové konštanty f  i a C  m boli stanovené zo zoznamu 1 054 
experimentálnych hodnôt P  ow (825 prípravkov) použitím zloženej regresnej 
analýzy (c) (h). Stanovenie interak čných členov sa vykonáva pod ľa stanovených 
pravidiel opísaných v odkazoch (e) (h) (i).  
Hanschova-Leova metóda  
Podľa Hanscha a Lea (c) sa hodnota log P  ow vypočíta z tohto vz ťahu: 
log P  ow ¼ X  
i a i f i þ X  
j b j F j 
kde f  i predstavuje konštanty rozdielnych molekulových fragmentov, F  j korekčné 
členy a a  i ,b j príslušné frekvencie výskytu. Deriváciou z pokusných hodnôt P  ow 
bol metódou pokusov a chýb stanovený zoznam atómových a skupinových frag ­
mentových hodnôt a zoznam korek čných členov F (tzv. „faktorov“). Korek čné 
členy boli usporiadané do nieko ľkých rozdielnych tried (a) (c). Je relatívne 
komplikované a náro čné načas zohľadniť všetky pravidlá a korek čné členy. 
Vyvinuté boli rôzne súbory programov (b).  
Kombinovaná metóda  
Výpočet hodnoty log P  ow komplexných molekúl sa dá do zna čnej miery zdoko ­
naliť, ak sa molekula rozdelí na vä čšie subštruktúry, pre ktoré existujú spo ľahlivé 
hodnoty log P  ow , a to buď z tabuliek (b) (c), alebo z vlastných meraní prísluš ­
ného laboratória. Takéto fragmenty (napr. heterocykly, antrachinón, azobenzén) 
sa potom môžu kombinova ť s Hanschovými hodnotami  π alebo s Rekkerovými, 
alebo Leovými fragmentovými konštantami.  
Poznámky  
i) Výpočtové metódy sa dajú použi ť iba pre čiastočne alebo úplne ionizované 
prípravky, ke ď možno vzia ť do úvahy potrebné korek čné faktory.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Ak možno predpoklada ť vnútromolekulové väzby, je potrebné priráta ť 
zodpovedajúci korek čný člen (približne + 0,6 až + 1,0 log P  ow jednotiek). 
Indikácie týkajúce sa prítomnosti takýchto väzieb možno získa ť zo stereo ­
modelov príslušnej molekuly alebo zo spektroskopických údajov o nej. 
iii) Ak sú možné viaceré tautomérne formy, za základ výpo čtu by sa mala použi ť 
najpravdepodobnejšia forma. 
iv) Je potrebné pozorne sledova ť všetky úpravy, resp. revidované vydania, 
zoznamov fragmentových konštánt.  
Správa  
Ak sa použijú výpo čtové alebo odhadové metódy, potom správa z testu obsahuje 
nasledujúce informácie: 
— opis testovanej látky (zmes, prímesi at ď.), 
— indikácie (údaje) týkajúce sa všetkých možných vnútromolekulových vodíko ­
vých väzieb, disociácií, nábojov a všetkých ostatných nezvy čajných efektov 
(napr. tautomérie), 
— opis použitej výpo čtovej metódy, 
— identifikáciu alebo spôsob zásobovania databázy, — zvláštnosti vo výbere (vo ľbe) fragmentov, 
— kompletnú dokumentáciu výpo čtov.
 
ODKAZY  
(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983. 
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). 
(c) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. 
(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.-Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479. 
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175. 
(g) R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1. 
(h) C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. 
(i) R. A. Scherrer, ACS, Americal Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Dodatok 2  
Odporúčané referen čné látky pre metódu HPLC  
Číslo Referen čná látka log P  ow pKa 
1 2-butanón 0,3 
2 4acetylpyridín 0,5 3 anilín 0,9 4 acetanilid 1,0 
5 benzylalkohol 1,1 
6 4-metoxyfenol 1,3 pK
 a = 10,26 
7 kyselina fenoxyoctová 1,4 pK  a = 3,12 
8 fenol 1,5 pK  a = 9,92 
9 2,4dinitrofenol 1,5 pK  a = 3,96 
10 benzonitril 1,6 11 fenylacetonitril 1,6 12 4metylbenzylalkohol 1,6 13 acetofenón 1,7 14 2nitrofenol 1,8 pK
 a = 7,17 
15 kyselina 3nitrobenzoová 1,8 pK  a = 3,47 
16 4chlóranilín 1,8 pK  a = 4,15 
17 nitrobenzén 1,9 18 3fenylpropán2ol 1,9 19 kyselina benzoová 1,9 pK
 a = 4,19 
20 p krezol 1,9 pK  a = 10,17 
21 kyselina škoricová 2,1 pK  a = 3,89 cis 4,44 trans 
22 anizol 2,1 23 metylbenzoát 2,1 24 benzén 2,1 
25 kyselina 3 metylbenzoová 2,4 pK
 a = 4,27 
26 4 chlórfenol 2,4 pK  a = 9,1 
27 trichlóretylén 2,4 28 atrazín 2,6 29 etylbenzoát 2,6 30 2,6dichlórbenzonitril 2,6 31 kyselina 3 chlórbenzoová 2,7 pK
 a = 3,82 
32 toluén 2,7 33 naftalénlol 2,7 pK
 a = 9,34 
34 2,3dichlóranilín 2,8 
35 chlórbenzén 2,8 
36 alylfenyléter 2,9 37 brómbenzén 3,0
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Číslo Referen čná látka log P  ow pKa 
38 etylbenzén 3,2 
39 benzofenón 3,2 40 4fenylfenol 3,2 pK
 a = 9,54 
41 tymol 3,3 
42 l,4dichlórbenzén 3,4 
43 difenylamín 3,4 pK  a = 0,79 
44 naftalén 3,6 45 fenylbenzoát 3,6 46 izopropylbenzén 3,7 47 2,4,6trichlórfenol 3,7 pK
 a = 6 
48 bifenyl 4,0 49 benzylbenzoát 4,0 50 2,4dinitro6sekbutylienol 4,1 51 1,2,4 trichlórbenzén 4,2 52 kyselina dodekánová 4,2 53 difenyléter 4,2 
54 nbutylbenzén 4,5 
55 fenantrén 4,5 56 fluorantén 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6difenylpyridín 4,9 59 trifenylamín 5,7 60 DDT 6,2 
Iné referen čné látky s nízkou log P
 ow látky s nízkou hodnotou log P  ow 
1 kyselina nikotínová - 0,07  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. TEPLOTA VZPLANUTIA  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Odporúča sa získa ť predbežné informácie o zápalnosti, resp. hor ľa­
vosti, látky ešte pred uskuto čnením tohto testu. Postup testu sa dá 
aplikovať na kvapalné látky, ktorých pary môžu by ť zapálené zapa ­ 
ľovacími zdrojmi. Skúšobné metódy uvedené v tomto texte sú 
spoľahlivé iba pre rozmedzia teploty vzplanutia, ktoré sú špecifiko ­
vané v jednotlivých metódach. 
Pri voľbe metódy, ktorá sa má použi ť, by sa malo uváži ť, či nemôže 
dôjsť k chemických reakciám medzi látkou a nosi čom vzorky.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Teplota vzplanutia je najnižšia teplota korigovaná na tlak 101,325 
kPa, pri ktorej kvapalina uvo ľňuje pary, za podmienok definovaných 
v skúšobnej metóde v takom množstve, že v skúšobnej nádobe sa 
vytvorí zápalná (hor ľavá) zmes pár a vzduchu. 
Jednotky:  o C 
t = T – 273,15 
(t v  o C a T v K)  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky sa nemusia použi ť vo všetkých prípadoch, ke ď sa 
skúma nová chemická látka. V prvom rade slúžia na ob časnú 
kontrolu ú činnosti metódy, jej správnej realizácie a na umožnenie 
porovnania s výsledkami dosiahnutými pri použití iných metód.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Látka sa umiestni do skúšobnej nádoby a zohrieva sa na testovaciu 
teplotu pod ľa postupu opísaného v príslušnej skúšobnej metóde. 
Zápalné (hor ľavé) pokusy sa uskuto čňujú na účely zistenia, či testo­
vaná vzorka pri po čiatočnej teplote vzplanie, alebo nie.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.5.1.  Opakovate ľnosť 
Opakovate ľnosť sa mení v závislosti od rozmedzia teploty vzplanutia 
a od použitej skúšobnej metódy; maximum 2  o C. 
1.5.2.  Citlivos ť 
Citlivosť závisí od použitej skúšobnej metódy.  
1.5.3.  Špecifickos ť 
Špecifickos ť niektorých skúšobných metód je obmedzená na ur čité 
rozmedzia teploty vzplanutia a je závislá od údajov týkajúcich sa 
vlastností testovanej látky (napr. vysoká viskozita).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
Vzorka príslušnej testovanej látky sa umiestni do skúšobného 
prístroja pod ľa 1.6.3.1 a/alebo 1.6.3.2. 
Kvôli bezpe čnosti sa odporú ča, aby sa pre látky s vysokou energiou 
alebo pre jedovaté látky použila metóda, v rámci ktorej sa testujú iba 
vzorky s malým objemom, približne 2 cm  3 . 
1.6.2.  Podmienky skúšania  
Ak to zodpovedá bezpe čnostným predpisom, prístroj sa postaví na 
miesto, kde nie je vystavený prievanu.  
1.6.3.  Realizácia testu  
1.6.3.1.  Rovnovážna metóda  
Pozri technické normy ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Nerovnovážna metóda  
Abelov prístroj:  
Pozri technické normy BS 2000, časť 170, NF M 07-011, NF 
T 66-009.  
Abelov-Penskyho prístroj:  
Pozri technické normy EN 57, DIN 51755 časť 1 (pre teploty od 5  o C 
do 65  o C), DIN 51755 časť 2 (pre teploty pod 5  o C), NF M07-036.  
Tagov prístroj:  
Pozri technickú normu ASTM D 56.  
Penskyho-Martensov prístroj:  
Pozri technické normy ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, 
BS 2000-34 NF M07-019.  
Poznámky:  
Ak sa zistí, že teplota vzplanutia stanovená nerovnovážnou metódou 
uvedenou v 1.6.3.2 je 0  o C ± 2  o C, 21  o C ± 2  o C alebo 55  o C ± 2  o C, 
mala by by ť potvrdená rovnovážnou metódou pri použití toho istého 
prístroja. 
Na oznamovanie sa smú použi ť iba tie metódy, ktoré sú schopné 
vyvinúť teplotu vzplanutia predmetnej testovanej látky. 
Na stanovenie teploty vzplanutia viskóznych kvapalín (farbív, živíc 
a podobných látok) obsahujúcich rozpúš ťadlá sa smú použi ť iba 
prístroje a skúšobné metódy vhodné na stanovovanie teploty vzpla ­
nutia viskóznych kvapalín. 
Pozri technické normy ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 
časť 1. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. ÚDAJE  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), 
— treba uvies ť použitú metódu, ako aj všetky prípadné odchýlky, 
— výsledky a všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu 
výsledkov.  
4. ODKAZY  
Žiadne.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  HOR ĽAVOSŤ (TUHÉ LÁTKY)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pred realizáciou tohto testu sa odporú ča získať predbežné informácie 
o potenciálne explozívnych vlastnostiach látky. 
Tento test by sa mal použi ť iba v prípade práškových, granulova ­
ných alebo pastovitých látok. 
Aby neboli zahrnuté všetky látky, ktoré môžu by ť zapálené, ale iba 
tie, ktoré horia rýchlo, alebo tie, ktorých spôsob horenia je v každom 
prípade mimoriadne nebezpe čný, za ve ľmi horľavé sa považujú iba 
tie látky, ktorých rýchlos ť horenia presahuje ur čitú medznú hodnotu. 
Môže by ť mimoriadne nebezpe čné, ak sa žeravenie šíri kovovým 
práškom, pretože je potom ve ľmi ťažké zahasi ť oheň. Kovové 
prášky treba považova ť za vysokohor ľavé, ak podporujú šírenie žera ­
venia cez hmotu v priebehu stanoveného času. 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Čas horenia je vyjadrený v sekundách.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Nie sú špecifikované.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Látka sa sformuje do neprerušeného prúžku alebo práškovej čiary 
v dĺžke asi 250 mm a uskuto ční sa predbežný skríningový test na 
stanovenie toho, či po zapálení plame ňom plynového horáka dôjde 
k šíreniu horenia plame ňom alebo tlením. Ak dôjde k šíreniu po 
dĺžke čiary aspo ň 200 mm v priebehu stanoveného času, uskuto ční 
sa následne kompletný testový program na stanovenie rýchlosti hore ­
nia. 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Nie sú stanovené.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Predbežný skríningový test  
Látka sa sformuje do neprerušeného prúžku alebo práškovej čiary 
v dĺžke asi 250 mm, so šírkou 20 mm a hrúbkou 10 mm na nehor ­ 
ľavej (oh ňovzdornej), nepórovitej podkladovej doske s nízkou 
tepelnou vodivos ťou. K jednému koncu práškovej čiary sa priloží 
horúci plame ň plynového horáka (s minimálnym priemerom 5 mm) 
a podrží sa, kým sa prášok nezapáli (nevznieti), alebo po čas maxi­
málne 2 minút (5 minút v prípade kovových práškov alebo práškov 
kovových zliatin). Treba sledova ť, či sa horenie rozšíri po d ĺžke 
200 mm práškovej čiary v priebehu 4-minútovej testovej periódy 
(alebo 40-minútovej periódy v prípade kovových práškov). Ak sa 
látka nezapáli a spa ľovanie sa nerozšíri bu ď horením plame ňom, 
alebo tlením po d ĺžke 200 mm práškovej čiary v priebehu 4-minú ­
tovej (alebo 40-minútovej) testovej periódy, príslušná testovaná látka 
sa nepovažuje za vysokohor ľavú, v takom prípade sa nepožaduje jej 
ďalšie testovanie. Ak sa horenie látky rozšíri po 200 mm d ĺžke 
práškovej čiary za čas kratší ako 4 minúty alebo za čas kratší ako 
40 minút v prípade kovových práškov, treba uskuto čniť postup 
uvedený v nasledujúcom texte (bod 1.6.2 a nasledujúce body).  
1.6.2.  Test rýchlosti horenia  
1.6.2.1.  Príprava  
Práškové alebo granulované testované látky sa zvo ľna nasypú do 
formy s d ĺžkou 250 mm, s trojuholníkovitým prierezom, 
s vnútornou výškou 10 mm a šírkou 20 mm. Na obidvoch stranách 
formy sú v pozd ĺžnom smere namontované dve kovové lišty, ktoré 
slúžia ako bo čné ohrani čenie a ktoré pre čnievajú 2 mm ponad 
vrchný okraj trojuholníkovitého prierezu (pozri obrázok). Forma sa 
potom zdvihne do výšky 2 cm a trikrát za sebou sa pustí, aby 
dopadla na tvrdý podklad, čím sa prášok utrasie. Ak je to potrebné, 
forma sa znova doplní práškom. Bo čné kovové lišty sa potom 
odstránia a prebyto čná testovaná látka (vo forme prášku) sa zhrnie. 
Na vrchnú stranu formy sa potom položí nehor ľavá (ohňovzdorná), 
nepórovitá podkladová doska s nízkou tepelnou vodivos ťou, prístroj 
sa obráti spodnou časťou navrch a forma sa odstráni. 
Pastovité látky sa nanesú vo forme črievka s d ĺžkou 250 mm 
a s prierezom s plochou približne 1 cm  2 na nehorľavú (ohňovzdor­
nú), nepórovitú podkladovú dosku s nízkou tepelnou vodivos ťou. 
1.6.2.2.  Podmienky skúšania  
V prípade látky, ktorá je citlivá na vlhkos ť, sa musí test uskuto čniť 
v čo najkratšom čase po vy ňatí látky z obalu.  
1.6.2.3.  Realizácia testu  
Umiestnite hranicu z práškovej testovanej látky do digestora prie čne 
na smer prúdenia vzduchu. 
Rýchlosť prúdenia vzduchu musí by ť dostatočná na to, aby sa zabrá ­
nilo úniku spalín do ovzdušia laboratória, a po čas testu by sa nemala 
meniť. Okolo prístroja by mala by ť postavená protiprievanová 
zástena. 
Hranica z práškovej testovanej látky sa na jednom konci zapáli 
pomocou horúceho plame ňa plynového horáka (minimálny priemer 
5 mm). Ke ď hranica prehorela vzdialenos ť 80 mm, na úseku ďalších 
100 mm sa zmeria rýchlos ť horenia.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Test sa opakuje šes ťkrát, pokia ľ sa pozitívny výsledok nezaregis ­
troval už skôr, pri čom zakaždým sa použije čistá a chladná podkla ­
dová doska.  
2. ÚDAJE  
Na vyhodnotenie je smerodajný čas horenia z predbežného skrínin ­
gového testu (1.6.1) a najkratší čas horenia z maximálne šiestich 
opakovaní hlavného testu (1.6.2.3).  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), — opis látky ur čenej na testovanie, jej fyzikálny stav vrátane obsahu 
vlhkosti, 
— výsledky z predbežného skríningového testu a z testu rýchlosti 
horenia, ak sa tento test tiež uskuto čnil, 
— všetky dopl ňujúce poznámky a pripomienky dôležité pre inter ­
pretáciu výsledkov.
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Práškovité, granulované alebo pastovité látky treba považova ť za 
veľmi horľavé, ak čas horenia v každom teste uskuto čnenom 
podľa skúšobného postupu opísaného v 1.6.2 je kratší ako 45 
sekúnd. Kovové prášky alebo prášky kovových zliatin sa považujú 
za vysokohor ľavé, keď sa dajú zapáli ť a ak sa plame ň alebo zóna 
reakcie rozšíri po celej d ĺžke vzorky za 10 minút alebo za kratší čas. 
4. ODKAZY  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Dodatok  
Obrázok  
Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej testovanej látky  
(všetky rozmery sa uvádzajú v milimetroch)
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  HOR ĽAVOSŤ (PLYNY)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda umož ňuje stanovenie toho, či sú plyny zmiešané so 
vzduchom pri teplote miestnosti (približne 20  o C) a pri atmosfé ­
rickom tlaku hor ľavé, a ak áno, v akom rozsahu koncentrácií. 
Zmesi s narastajúcimi koncentráciami plynu vo vzduchu sú vysta ­
vené elektrickej iskre a sleduje sa, či dôjde k zapáleniu (vzplanutiu).  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Rozsah zápalnosti je rozmedzie koncentrácie medzi dolnou a hornou 
medzou výbušnosti. Dolná a horná medza výbušnosti predstavuje tie medzné hodnoty koncentrácie hor ľavého plynu v prímesi so vzdu ­
chom, pri ktorých sa neobjavuje šírenie plame ňa.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Nie sú špecifikované.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Koncentrácia plynu vo vzduchu sa postupne zvyšuje a zmes je vysta ­
vená pri každej koncentrácii elektrickej iskre.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Nie sú stanovené.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Prístroje  
Testovacou nádobou je st ĺpcovitý sklený valec s minimálnym 
vnútorným priemerom 50 mm a s minimálnou výškou 300 mm. Zapaľovacie elektródy sú oddelené vzdialenos ťou 3 mm až 5 mm 
a sú umiestnené vo výške 60 mm nad dnom valca. Valec je vyba ­
vený otvorom na znižovanie tlaku. Prístroj musí by ť chránený 
krytom, aby sa obmedzili akéko ľvek škody spôsobené výbuchom. 
Ako zapa ľovací zdroj sa používa stojatá indukovaná iskra s 0,5- 
sekundovým trvaním, ktorá sa generuje z vysokonapä ťového trans ­
formátora s výstupným koncovým napätím 10 až 15 kV (maximálny príkon 300 W). Príklad vhodného použite ľného prístroja je opísaný 
v odkazoch (2).
 
1.6.2.  Podmienky skúšania  
Test sa musí uskuto čniť pri teplote miestnosti (približne 20  o C). ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Realizácia testu  
S použitím dávkovacích čerpadiel sa do skleného valca napustí 
známa koncentrácia plynu vo vzduchu. Cez zmes sa nechá preletie ť 
iskra a sleduje sa, či sa zo zapa ľovacieho zdroja oddelí plame ň 
a začne sa nezávisle šíri ť alebo nie. Koncentrácia plynu sa mení, 
resp. zvyšuje, postupne po jednom objemovom percente, až kým nedôjde k zapáleniu zmesi pod ľa vyššie uvedeného opisu. 
Ak štruktúra plynu nazna čuje, že daný plyn je pravdepodobne nehor ­ 
ľavý a že sa dá vypo čítať stechiometrická zmes so vzduchom, treba 
v jednopercentných krokoch testova ť iba zmesi v rozmedzí od 10 % 
pod stechiometrickou koncentráciou do 10 % nad touto koncentrá ­
ciou.
 
2. ÚDAJE  
Šírenie plame ňa je jediným relevantným informa čným údajom na 
stanovenie tejto vlastnosti.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), — opis použitého prístroja s uvedenými rozmermi, — teplotu, pri ktorej sa test uskuto čnil, 
— testované koncentrácie a získané výsledky, — výsledok testu: nehor ľavý alebo mimoriadne hor ľavý plyn, 
— ak sa dospelo k záveru, že testovaný plyn je nehor ľavý, treba 
uviesť rozsah koncentrácií, v rámci ktorého bol testovaný v 1 % 
krokoch, 
— musia by ť uvedené všetky informácie a poznámky dôležité pre 
interpretáciu výsledkov.
 
4. ODKAZY  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases. 
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, 
T. Redeker und H. Schacke. „Entwicklung einer Standard-Appa ­
ratur zur Messung von Explosionsgrenzen“. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126 – 127.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  HOR ĽAVOSŤ (KONTAKT S VODOU)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Táto testovacia metóda sa môže použi ť na stanovenie toho, či 
reakcia testovanej látky s vodou alebo vlhkým vzduchom vedie 
k vyvíjaniu nebezpe čných množstiev plynu alebo plynov, ktoré 
môžu byť mimoriadne hor ľavé. 
Testovacia metóda sa môže použi ť pre tuhé, ako aj kvapalné látky. 
Táto metóda sa nedá použi ť pre látky, ktoré sa spontánne zapa ľujú 
(vznecujú) pri kontakte so vzduchom.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Mimoriadne hor ľavé: látky, ktoré v kontakte s vodou alebo vzdušnou 
vlhkosťou uvoľňujú mimoriadne hor ľavé plyny v nebezpe čných 
množstvách pri minimálnej rýchlosti 1 l/kg za hodinu.  
1.3. PRINCÍP METÓDY 
Látka sa testuje pod ľa poradia krokov opísaných v nasledujúcich 
odsekoch. Ak v rámci ktoréhoko ľvek kroku dôjde k zapáleniu 
(vznieteniu), ďalšie testovanie už nie je potrebné. Ak je známe, že 
testovaná látka nereaguje búrlivo s vodou, možno postúpi ť rovno ku 
kroku 4 (1.3.4).  
1.3.1.  Krok 1  
Testovaná látka sa umiestni do vani čky obsahujúcej destilovanú 
vodu pri teplote 20  o C a sleduje sa, či sa uvoľnený plyn zapáli 
(vznieti) alebo nie.  
1.3.2.  Krok 2  
Testovaná látka sa umiestni pri teplote 20  o C na filtra čný papier 
plávajúci na hladine destilovanej vody v nádobe a sleduje sa, či sa 
uvoľnený plyn zapáli (vznieti) alebo nie. Filtra čný papier slúži 
výlučne na to, aby sa testovaná látka udržiavala na jednom mieste 
na účely zvýšenia pravdepodobnosti zapálenia (vznietenia) látky.  
1.3.3.  Krok 3  
Z testovanej látky sa urobí kôpka približne 2 cm vysoká s priemerom 
3 cm. Do kôpky sa pridá nieko ľko kvapiek vody a sleduje sa, či sa 
uvoľnený plyn zapáli (vznieti) alebo nie.  
1.3.4.  Krok 4  
Testovaná látka sa zmieša s destilovanou vodou pri teplote 20  o C 
a rýchlos ť uvoľňovania plynu sa meria sedem hodín, vždy 
v jednohodinových intervaloch. Ak je rýchlos ť uvoľňovania plynu 
po uplynutí siedmich hodín nestála alebo narastá, čas merania možno 
predĺžiť na maximálny čas piatich dní. Test možno kedyko ľvek 
zastaviť, ak rýchlos ť uvoľňovania plynu prekro čí hodnotu 1 l/kg 
za hodinu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Nie sú špecifikované.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Nie sú stanovené.  
1.6. OPIS METÓD  
1.6.1.  Krok 1  
1.6.1.1.  Podmienky skúšania  
Test sa uskuto čňuje pri teplote miestnosti (približne 20  o C). 
1.6.1.2.  Realizácia testu  
Malé množstvo testovanej látky (s priemerom približne 2 mm) sa 
umiestni do vani čky obsahujúcej destilovanú vodu. Treba sledova ť 
a zaznamena ť, či i) sa vôbec nejaký plyn uvo ľnil a či ii) došlo 
k zapáleniu (vznieteniu) plynu. Ak došlo k zapáleniu (vznieteniu) 
plynu, tak už nie je potrebné ďalšie testovanie látky, pretože látka 
sa týmto považuje za nebezpe čnú. 
1.6.2.  Krok 2  
1.6.2.1.  Prístroje  
Filtračný papier sa naplocho položí na hladinu destilovanej vody 
naliatej do vhodnej nádoby, napr. do odparovacej misky 
s priemerom 100 mm.  
1.6.2.2.  Podmienky skúšania  
Test sa uskuto čňuje pri teplote miestnosti (približne 20  o C). 
1.6.2.3.  Realizácia testu  
Malé množstvo testovanej látky (s priemerom približne 2 mm) sa 
umiestni do stredu filtra čného papiera. Treba sledova ť a zaznamena ť, 
či i) sa vôbec nejaký plyn uvo ľnil a či ii) došlo k zapáleniu (vznie ­
teniu) plynu. Ak došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu, tak už nie je potrebné ďalšie testovanie látky, pretože látka sa týmto považuje za 
nebezpečnú.
 
1.6.3.  Krok 3  
1.6.3.1.  Podmienky skúšania  
Test sa uskuto čňuje pri teplote miestnosti (približne 20  o C). 
1.6.3.2.  Realizácia testu  
Z testovanej látky sa urobí kôpka približne 2 cm vysoká, 
s priemerom 3 cm, s vrúbkovaním na vrcholku kôpky. Pridá sa niekoľko kvapiek vody a sleduje sa a zaznamenáva, či i) sa vôbec 
nejaký plyn uvo ľnil a či ii) došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu. Ak 
došlo k zapáleniu (vznieteniu) plynu, tak už nie je potrebné ďalšie 
testovanie látky, pretože látka sa týmto považuje za nebezpe čnú.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Krok 4  
1.6.4.1.  Prístroje  
Prístroj je zostavený pod ľa nákresu na obrázku.  
1.6.4.2.  Podmienky skúšania  
Skontrolujte testovanú látku v prepravnom obale z h ľadiska prítom ­
nosti prášku s ve ľkosťou častíc < 500 μm. Ak prášok tvorí viac ako 1 % 
hmotnosti alebo ak je vzorka drobivá, tak sa pred uskuto čnením testu 
musí celé množstvo látky rozomlie ť na prach vzh ľadom na redukciu 
veľkosti častíc počas skladovania a manipulácie. V ostatných prípa ­
doch sa látka testuje v takom stave, v akom bola doru čená. Test sa musí 
uskutočniť pri teplote miestnosti (približne 20  o C) a pri normálnom 
atmosférickom tlaku.  
1.6.4.3.  Realizácia testu  
Do odkvapkávajúceho lievika prístroja sa pridá 10 až 20 ml vody 
a do Erlenmeyerovej banky sa pridá 10 g testovanej látky. Objem 
uvoľneného plynu sa dá mera ť akýmkoľvek vhodným prostriedkom. 
Kohútik odde ľovacieho lievika sa otvorí, aby sa voda dostala do 
Erlenmeyerovej banky, a zárove ň sa zapnú stopky. Uvo ľňovanie 
plynu sa meria každú hodinu po čas siedmich hodín. Ak je po čas 
tohto času uvoľňovanie plynu nestále (kolísavé) alebo ak po uplynutí 
tohto času uvoľňovanie plynu ešte narastá, meranie môže pokra čovať 
ešte maximálne pä ť dní. Ak v ktoromko ľvek čase rýchlos ť uvoľňo­
vania plynu prekro čí hodnotu 1 l/kg/hod, test možno zastavi ť. Tento 
test sa musí trojnásobne zopakova ť. 
Ak je identita plynu neznáma, plyn sa musí analyzova ť. Keď plyn 
obsahuje mimoriadne hor ľavé zložky a nie je známe, či je celá zmes 
mimoriadne hor ľavá, treba pripravi ť zmes toho istého zloženia 
a potom ju testova ť podľa metódy A.11.  
2. ÚDAJE  
Testovaná látka sa považuje za nebezpe čnú, ak: 
— dôjde k spontánnemu zapáleniu (vznieteniu) po čas ktoréhoko ľvek 
kroku skúšobného postupu 
alebo 
— dochádza k uvo ľňovaniu hor ľavého (vznetlivého) plynu pri 
rýchlosti (miere) vä čšej ako 1 l/kg látky za hodinu.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), — podrobnosti o akejko ľvek počiatočnej príprave testovanej látky,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— výsledky testu (kroky 1, 2, 3 a 4), 
— identifikáciu uvo ľneného plynu, 
— rýchlos ť (mieru) uvo ľňovania plynu, ak sa uskuto čňuje krok 4 
(1.6.4), 
— všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.  
4. ODKAZY  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York. 
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Dodatok  
Obrázok  
Prístroj
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  SAMOZÁPALNÉ VLASTNOSTI TUHÝCH LÁTOK 
A KVAPALÍN  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Postup testu sa dá použi ť pre tuhé alebo kvapalné látky, ktoré sa 
v malých množstvách samovo ľne vznietia krátky čas po tom, čo sa 
dostali do kontaktu so vzduchom pri teplote miestnosti (približne 20  o C). 
Látky, ktoré musia by ť vystavené pôsobeniu vzduchu po čas niekoľ­
kých hodín alebo dní pri teplote miestnosti alebo pri zvýšenej teplote, kým dôjde k ich vznieteniu, nie sú pokryté touto testovacou metódou.
 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Látky so sklonom k samovznieteniu sa považujú za také vtedy, ak sa 
vznietia alebo spôsobia zuho ľnatenie za podmienok opísaných v 1.6. 
Môže by ť potrebné testova ť aj samozápalnos ť kvapalín použitím 
metódy A.15 – Teplota samovznietenia (kvapaliny a plyny).  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Nie sú špecifikované.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Testovaná látka, či už tuhá, alebo kvapalná, sa pridá do inertnej 
nosnej látky a vystaví sa kontaktu so vzduchom pri teplote okolitého 
prostredia na pä ť minút. Ak sa kvapalné látky nevznietia, tak sa 
absorbujú do filtra čného papiera a vystavia sa pôsobeniu vzduchu 
pri teplote okolitého prostredia (približne 20  o C) na päť minút. Ak sa 
testovaná tuhá látka alebo kvapalina vznieti alebo ak kvapalina 
zapáli alebo zuho ľnatí filtra čný papier, testovaná látka sa považuje 
za látku so sklonom k samovznieteniu.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Opakovate ľnosť: z bezpe čnostných dôvodov na potvrdenie sklonu 
samovznietenia testovanej látky posta čí jediný pozitívny výsledok.  
1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY  
1.6.1.  Prístroje  
Porcelánová miska s priemerom približne 10 cm sa naplní kreme ­
linou do výšky asi 5 mm pri teplote miestnosti (približne 20  o C). 
Poznámka: 
Kremelinu alebo akúko ľvek inú porovnate ľnú inertnú látku, ktorá je 
bežne k dispozícii, treba považova ť za látku zastupujúcu zeminu, na 
ktorú sa v prípade nehody testovaná látka môže roztriešti ť. 
Suchý filtra čný papier sa požaduje na testovanie kvapalín, ktoré sa 
nevznietia pri kontakte so vzduchom, ke ď sú v kontakte s inertnou 
nosnou látkou.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Realizácia testu  
a) Práškové tuhé látky  
Množstvo 1 cm  3 až 2 cm  3 práškovej látky ur čenej na testovanie sa 
nasype z výšky približne 1 m na nehor ľavý (ohňovzdorný) povrch 
a sleduje sa, či sa testovaná látka vznieti po čas pádu alebo 
v priebehu piatich minút po spo činutí na nehor ľavom povrchu. 
Test sa opakuje šes ťkrát za sebou, pokia ľ nedôjde k vznieteniu testo ­
vanej látky.  
b) Kvapaliny  
Približne 5 cm  3 kvapaliny ur čenej na testovanie sa naleje do pripra ­
venej porcelánovej misky a sleduje sa, či sa testovaná látka vznieti 
v priebehu piatich minút. 
Ak v rámci šiestich opakovaných testov nedôjde k vznieteniu testo ­
vanej látky, treba vykona ť nasledujúci test: 
Testovaná vzorka s objemom 0,5 ml sa nanesie injek čnou strie ­
kačkou na zvlnený filtra čný papier a sleduje sa, či dôjde 
k zapáleniu alebo zuho ľnateniu filtra čného papiera v priebehu piatich 
minút od pridania testovanej kvapaliny. Test sa opakuje trikrát za sebou, pokia ľ nedôjde k zapáleniu alebo zuho ľnateniu.
 
2. ÚDAJE  
2.1. PRÁCA S VÝSLEDKAMI 
Testovanie môže by ť zastavené, len čo sa v ktoromko ľvek čiast­
kovom teste objaví pozitívny výsledok.  
2.2. VYHODNOTENIE 
Ak sa testovaná látka vznieti v priebehu piatich minút po pridaní do 
inertnej nosnej látky a vystavení pôsobeniu vzduchu alebo ak kvapalná testovaná látka zuho ľnatie alebo zapáli filtra čný papier po 
jej pridaní na toto médium a po vystavení pôsobeniu vzduchu, tak sa 
považuje za samozápalnú.
 
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), — výsledky testov, — všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.
 
4. ODKAZY  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids. 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Metóda schematicky opisuje spôsob testovania na ú čely stanovenia, 
či tuhá alebo pastovitá látka predstavuje nebezpe čenstvo výbuchu, 
keď je vystavená ú činku plame ňa (citlivos ť na teplo) alebo nárazu, 
alebo treniu (citlivos ť na mechanické podnety), a či kvapalná látka 
predstavuje nebezpe čenstvo výbuchu, ke ď je vystavená ú činku 
plameňa alebo nárazu. 
Metóda pozostáva z troch častí: 
a) testu citlivosti na teplo (1); 
b) testu citlivosti na mechanické podnety vo forme nárazu (1); 
c) testu citlivosti na mechanické podnety vo forme trenia (1). 
Metóda poskytuje údaje na zhodnotenie a stanovenie pravdepodob ­
nosti vyvolania výbuchu ur čitými bežnými podnetmi. Metóda nie je 
určená na zis ťovanie skuto čnosti, či určitá látka je schopná výbuchu 
za akýchko ľvek podmienok. 
Metóda je vhodná na stanovenie toho, či príslušná látka bude pred ­
stavovať nebezpečenstvo výbuchu (citlivos ť na teplo a mechanické 
podnety) za konkrétnych podmienok špecifikovaných v smernici. Je 
založená na celom rade typov prístroja, ktoré sa vo ve ľkej miere 
používajú medzinárodne (1) a ktoré dávajú ú čelné a jednozna čné 
výsledky. Platí však všeobecný názor, že metóda nie je definitívna. Ako alternatívu k špecifikovanému prístroju možno použi ť aj iné 
prístroje, avšak za predpokladu, že tieto sú medzinárodne uznané 
a že ich výsledky sa dajú adekvátne zosúladi ť s príslušnými výsled ­
kami získanými pomocou špecifikovaného prístroja. 
Testy sa nemusia uskuto čniť, ak existujúce termodynamické infor ­
mácie (napr. zlu čovacie teplo, rozkladné teplo), resp. absencia ur či­
tých reaktívnych skupín (2) v štrukturálnom vzorci, dôvodne potvrdzujú domnienku, že príslušná látka nie je schopná rýchleho rozkladu s tvorbou plynov alebo uvo ľň
ovaním tepla (t. j. že materiál 
nepredstavuje žiadne riziko výbuchu). Pre kvapaliny sa nepožaduje 
test citlivosti na mechanické podnety vo forme trenia.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Výbušné látky: 
Látky, ktoré v špecifikovanom prístroji môžu vybuchnú ť účinkom 
plameňa alebo ktoré sú citlivé na nárazy alebo trenie (alebo sú 
citlivejšie na mechanické podnety než 1,3-dinitrobenzén v alternatívnom prístroji).
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
1,3-dinitrobenzén, technický kryštalický produkt preosiaty na 
jemnosť častíc 0,5 mm pre metódu testovania citlivosti na trenie 
a nárazy. 
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazín ( čiže RDX, hexogén, cyklonit – 
CAS 121-82-4), rekryštalizovaný z vodného cyklohexanónu, navlhko preosievaný cez 250 μm a zachytávaný na 150 μm site a sušený pri 
teplote 103
 o C ± 2  o C (počas 4 hodín) pre druhú sériu testov citli ­
vosti na trenie a nárazy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Predbežné testy sú potrebné na vytvorenie bezpe čných podmienok na 
uskutočnenie hlavných troch testov citlivosti.  
1.4.1.  Testy bezpe čnosti manipulácie (3)  
Z bezpečnostných dôvodov sa pred uskuto čnením hlavných testov 
veľmi malé vzorky (približne 10 mg) látky ur čenej na testovanie 
vystavia zahrievaniu bez obmedzenia v plynovom plameni 
v akejkoľvek vhodnej forme prístroja, nárazu udieraním kyjani čky 
o nákovu a treniu v akejko ľvek forme trecieho mechanizmu. Cie ľom 
je zistiť, či predmetná látka je taká citlivá a výbušná, že predpísané 
testy citlivosti, obzvláš ť test citlivosti na teplo, sa musia uskuto čniť 
so zvláštnou opatrnos ťou, aby sa zabránilo prípadnému zraneniu 
laboratórneho pracovníka.  
1.4.2.  Citlivos ť na teplo  
Metóda spo číva v zohrievaní testovanej látky v oce ľovej rúre 
uzavretej došti čkami s rozdielnymi priemermi otvoru na ú čely stano­
venia, či má testovaná látka tendenciu vybuchova ť v podmienkach 
intenzívneho tepla a definovaného obmedzenia.  
1.4.3.  Citlivos ť na mechanické podnety (náraz)  
Metóda spo číva vo vystavení testovanej látky nárazu spôsobenému 
telesom so špecifikovanou hmotnos ťou pusteným zo špecifikovanej 
výšky.  
1.4.4.  Citlivos ť na mechanické podnety (trenie)  
Metóda spo číva vo vystavení tuhých alebo pastovitých látok treniu 
medzi štandardnými povrchmi za špecifikovaných podmienok za ťa­ 
ženia a relatívneho pohybu.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Nie sú stanovené.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Citlivos ť na teplo (ú činok plame ňa) 
1.6.1.1.  Prístroje  
Prístroj pozostáva z jednorazovo použite ľnej oceľovej rúry 
s opakovate ľne použite ľným uzavieracím zariadením (obrázok 1), 
inštalovanej do zohrievacieho a ochranného zariadenia. Každá rúra je zhotovená z hlboko ťažného oce ľového plechu (pozri dodatok) 
a má vnútorný priemer 24 mm, d ĺžku 75 mm a hrúbku steny 
0,5 mm. Rúry sú na otvorenom konci upravené prírubou tak, aby sa umožnilo ich uzavretie zostavou uzáveru. Zostava uzáveru pozo ­
stáva z tlakuvzdornej došti čky s otvorom uprostred, tesne primknutej 
k rúre použitím dvojdielneho závitového spoja (matice a závitového 
goliera, okružia). Matica aj závitový golier sú vyrobené z chrómmangánovej ocele (pozri dodatok), ktorá je neiskrivá až do teploty 800
 o C. Doštičky majú hrúbku 6 mm, sú vyrobené zo 
žiaruvzdornej ocele (pozri dodatok) a sú k dispozícii s rozli čnými 
priemermi otvorov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Podmienky skúšania  
Za normálnych okolností sa látka testuje v takom stave, v akom ju 
dostali, hoci v niektorých prípadoch, napr. ak bola zlisovaná, liata alebo iným spôsobom kondenzovaná, je potrebné ju pred testovaním 
rozdrviť. 
V prípade tuhých látok množstvo materiálu, ktoré sa má použi ť 
v každom teste, sa stanoví použitím predbežného prípravného 
postupu „nasucho“. Dechtovaná rúra sa naplní množstvom 9 cm
 3 
testovanej látky, látka sa potom ubije silou 80 N vyvinutou na 
celý prie čny profil rúry. Z bezpe čnostných dôvodov alebo 
v prípade, kde fyzikálna forma látky môže by ť zmenená tlakom, 
sa môžu použi ť iné postupy jej plnenia do rúry, napr. ak je testovaná 
látka nadmerne citlivá na trenie, ubíjanie nepredstavuje vhodný postup. Ak je materiál stla čiteľný, pridá sa ho viac a potom sa 
ubíja dovtedy, kým v rúre nedosiahne úrove ň 55 mm od vrchnej 
časti. Stanoví sa celkové množstvo použité na naplnenie rúry do 
výšky 55 mm od jej vrchnej časti a pridajú sa dve ďalšie doplnkové 
množstvá, každé ubité silou 80 N. Pod ľa potreby sa potom materiál 
ešte pridá ubíjaním alebo sa z neho odoberie tak, aby bola rúra 
naplnená do výšky 15 mm od jej vrchnej časti. Uskuto ční sa 
druhé prípravné kolo „nasucho“, po čnúc ubitým množstvom pred ­
stavujúcim jednu tretinu celkovej hmotnosti zistenej v prvom kole. 
Pri ubíjaní silou 80 N sa pridajú dve ďalšie doplnkové množstvá 
a podľa potreby pridaním alebo odobratím materiálu sa upraví jeho 
úroveň na výšku 15 mm od vrchnej časti rúry. Množstvo tuhej látky 
stanovené v druhom prípravnom kole „nasucho“ sa potom použije 
pre každý pokus. Plnenie sa uskuto ční s tromi rovnakými množ ­
stvami, pri čom každé sa stla čí na objem 9 cm
 3 vyvinutím takej 
sily, aká je na to potrebná. (Postup sa dá u ľahčiť použitím rozper ­
ných krúžkov.) 
Kvapaliny a gély sa umiestnia do rúry do výšky 60 mm, pri čom pri 
géloch treba dáva ť veľký pozor na to, aby sa zabránilo tvorbe dutín 
v materiáli. Zospodu sa na rúru nasunie závitový golier (okružie), 
priloží sa došti čka s potrebnou ve ľkosťou otvoru uprostred a po 
pridaní malého množstva lubrikantu na báze sírnika molybdeni čitého 
sa naplno utiahne matica. Je dôležité skontrolova ť, či nezostali 
zvyškové množstvá testovanej látky zachytené medzi prírubou 
a doštičkou alebo v závitoch. 
Zohrievanie sa zabezpe čuje propánom odoberaným z priemyselnej 
tlakovej f ľaše, ktorá je vybavená regulátorom tlaku (60 až 
70 milibarov), cez merací prístroj (plynomer) a rovnomerne distri ­
buovaným (ako to potvrdzuje vizuálne pozorovanie plame ňov vychá­
dzajúcich z horákov) rozde ľovacím potrubím k štyrom horákom. 
Horáky sú rozmiestnené okolo skúšobnej komory tak, ako je to 
znázornené na obrázku 1 v dodatku. Štyri horáky majú celkovú spotrebu asi 3,2 l propánu za minútu. Môžu sa použi ť aj alternatívne 
vykurovacie plyny a horáky, ale rýchlos ť ohrevu musí zodpoveda ť 
špecifikácii na obrázku 3. Pre všetky prístroje sa musí rýchlos ť 
ohrevu periodicky kontrolova ť použitím skúmaviek naplnených 
dibutylftalátom, ako je to znázornené na obrázku 3.
 
1.6.1.3.  Realizácia testov  
Každý test sa vykonáva dovtedy, pokia ľ sa každá rúra neroztriešti, 
alebo sa zahrieva až pä ť minút. Test s výsledným roztrieštením rúry 
na tri alebo viacero kusov, ktoré môžu by ť v niektorých prípadoch 
spojené úzkymi pásikmi kovu, ako je to znázornené na obrázku 2, sa vyhodnocuje ako výbuch. Test, ktorého výsledkom je menej trieštivých 
úlomkov, alebo test, v rámci ktorého nedošlo vôbec k roztriešteniu 
rúry, sa považuje za test bez výsledného výbuchu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Najprv sa uskuto ční séria troch testov s uzáverovými došti čkami 
s priemerom otvorov 6,0 mm, a ak nedôjde k výbuchu, uskuto ční 
sa druhá séria troch testov s uzáverovými došti čkami s priemerom 
otvorov 2,0 mm. Ak dôjde k výbuchu v obidvoch sériách testov, realizácia ďalších testov sa už nepožaduje.
 
1.6.1.4.  Vyhodnotenie  
Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu 
v obidvoch horeuvedených sériách testov.  
1.6.2.  Citlivos ť na mechanické podnety (náraz)  
1.6.2.1.  Prístroje (obrázok 4)  
Hlavné časti typického prístroja s padacím bucharom pozostávajú 
z oceľovoliatinového bloku s podkladom, nákovy, stojanu, vodiacich 
líšt, padacích závaží, spúš ťacieho mechanizmu a držiaka na vzorky. 
Oceľová nákova 100 mm (priemer) × 70 mm (výška) je priskrutko ­
vaná k vrchnej strane oce ľového bloku 230 mm (d ĺžka) × 250 mm 
(šírka) × 200 mm (výška) s liatym podkladom 450 mm (d ĺžka) × 
450 mm (šírka) × 60 mm (výška). Stojan vyrobený z bezšvovej rúry 
z ťahanej ocele je upevnený v držiaku priskrutkovanom na zadnú 
časť oceľového bloku. Štyri skrutky zakotvujú prístroj k masívnemu 
betónovému kotevnému bloku s rozmermi 60 cm × 60 cm × 60 cm 
tak, aby vodiace lišty boli v absolútne vertikálnej polohe a aby padacie závažie po uvo ľnení padalo vo ľne. Na použitie sú vhodné 
5 kg a 10 kg závažia vyrobené z plnej ocele. Nárazová hlava 
každého závažia je zhotovená z kalenej ocele, HRC 60 až 63, 
a má minimálny priemer 25 mm. 
Vzorka ur čená na testovanie je uzavretá v nárazovom mechanizme, 
ktorý pozostáva z dvoch koaxiálnych plných oce ľových valcov 
umiestnených nad sebou v dutom valcovitom oce ľovom vodiacom 
prstenci. Plné oce ľové valce musia ma ť priemer 10 (- 0,003, - 0,005) 
mm a výšku 10 mm, musia ma ť leštený povrch, zaoblené hrany 
(polomer oblúka 0,5 mm) a tvrdos ť HRC 58 až 65. Dutý valec 
musí mať vonkajší priemer 16 mm, leštené v ŕtanie s vnútorným 
priemerom 10 (+ 0,005, + 0,010) mm a výšku 13 mm. Nárazový 
mechanizmus je namontovaný na vloženú nákovu (priemer 26 mm 
a výška 26 mm) zhotovenú z ocele a centrovanú prstencom s perforáciami, aby sa umožnil únik spalín.
 
1.6.2.2.  Podmienky skúšania  
Vzorka by mala ma ť objem 40 mm  3 alebo objem, ktorý je vhodný 
pre alternatívny prístroj. Tuhé látky by sa mali testova ť v suchom 
stave a mali by by ť pripravené týmito spôsobmi: 
a) práškové látky sa preosievajú ( číslo sita 0,5 mm). Všetok mate ­
riál, ktorý prepadol cez sito, sa použije na skúšobné ú čely; 
b) lisované, liate alebo iným spôsobom kondenzované látky sa 
rozdrvia na malé kúsky a preosejú sa. Na ú čely testovania sa 
použije frakcia z ŕn s priemerom od 0,5 mm do 1 mm a mala 
by reprezentova ť pôvodnú látku. 
Látky, ktoré sa normálne dodávajú ako pasty, by sa mali 
v prípadoch, ke ď je to možné, testova ť v suchom stave alebo 
v každom prípade po odstránení maximálne možného množstva 
riedidla, resp. rozpúš ťadla. Kvapalné látky sa testujú s 1 mm 
medzerou medzi vrchným a spodným oce ľovým valcom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Realizácia testov  
Vykoná sa séria šiestich testov s 10 kg padacím závažím púš ťaným 
z výšky 0,40 m (40 J). Ak po čas šiestich testov pri sile nárazu 40 
J dôjde k výbuchu, treba pokra čovať sériou ďalších šiestich testov 
s 5 kg padacím závažím púš ťaným z výšky 0,15 m (7,5 J). V inom 
prístroji sa testovaná vzorka porovnáva so zvolenou referen čnou 
látkou použitím zavedeného postupu (napr. striedavou technikou „up and down“ at ď.).
 
1.6.2.4.  Vyhodnotenie  
Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu 
(vyšľahnutie plame ňa alebo úder sú ekvivalentné výbuchu) aspo ň 
raz v niektorom z testov pri použití špecifikovaného nárazového 
prístroja alebo ak je testovaná vzorka citlivejšia ako 1,3-dinitro ­
benzén alebo RDX v alternatívnom teste citlivosti na náraz.  
1.6.3.  Citlivos ť na mechanické podnety (trenie)  
1.6.3.1.  Prístroje (obrázok 5)  
Trecí prístroj pozostáva z oce ľovoliatinovej podkladovej dosky, na 
ktorú je namontovaný trecí mechanizmus. Tento sa skladá 
z fixovaného porcelánového kolíka a pohyblivej porcelánovej doštičky. Porcelánová došti čka je nesená rámom, ktorý behá 
v dvoch vodiacich lištách. Rám je napojený na elektromotor ojnicou 
(spojovacou ty čou), excentrom a vhodným ozubeným prevodom tak, 
aby porcelánová došti čka vykonala jednorazový pohyb spä ť 
a dopredu pod porcelánovým kolíkom na vzdialenos ť 10 mm. Porce ­
lánový kolík môže by ť zaťažený silou napríklad 120 N alebo 360 N. 
Ploché porcelánové došti čky sú vyrobené z bieleho technického 
porcelánu (hrubos ť 9 μm až 32 μm) a majú rozmery 25 mm (d ĺžka) 
× 25 mm (šírka) × 5 mm (výška). Valcovitý porcelánový kolík je 
takisto vyrobený z bieleho technického porcelánu a je 15 mm dlhý, 
má priemer 10 mm a zdrsnené sférické koncové plochy s polomerom ohybu 10 mm.
 
1.6.3.2.  Podmienky skúšania  
Testovaná vzorka by mala ma ť objem 10 mm  3 alebo objem, ktorý sa 
hodí pre alternatívny prístroj. 
Tuhé látky sa testujú v suchom stave a sú pripravované týmito 
spôsobmi: 
a) práškové látky sa preosievajú ( číslo sita 0,5 mm); všetok materiál, 
ktorý prepadol cez sito, sa použije na skúšobné ú čely; 
b) lisované, liate alebo iným spôsobom kondenzované látky sa 
rozdrvia na malé kúsky a preosejú sa; na ú čely testovania sa 
použije frakcia z ŕn s priemerom < 0,5 mm. 
Látky, ktoré sa normálne dodávajú ako pasty, by sa mali 
v prípadoch, ke ď je to možné, testova ť v suchom stave. Ak látka 
určená na testovanie nemôže by ť pripravená v suchom stave, pasta 
(po odstránení maximálneho možného množstva rozpúš ťadla) sa 
testuje ako 0,5 mm hrubý, 2 mm široký a 10 mm dlhý film pripra ­
vený pomocou formy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Realizácia testov  
Porcelánový kolík sa nasmeruje na testovanú vzorku a za ťaží sa. 
Počas uskuto čňovania testu musia hubové rysky porcelánovej 
doštičky ležať priečne na smer pohybu. Treba dba ť na to, aby porce ­
lánový kolík spo číval priamo na testovanej vzorke, aby sa pod 
kolíkom nachádzalo dostato čné množstvo testovaného materiálu, 
a tiež na to, aby sa porcelánová došti čka pod kolíkom pohybovala 
správnym spôsobom. V prípade pastovitých látok sa na aplikáciu 
testovanej látky na došti čku používa 0,5 mm hrubá šablóna s 2 × 
10 mm drážkou. Porcelánová došti čka musí vykona ť pohyb v d ĺžke 
10 mm dopredu a spä ť pod porcelánovým kolíkom za 0,44 sekundy. 
Každá časť povrchu došti čky a kolíka sa smie použi ť iba raz; dva 
konce každého kolíka teda poslúžia na dva pokusy a každý z dvoch povrchov došti čky poslúži na tri pokusy. 
Séria šiestich testov sa uskuto ční so zaťažením 360 N. Ak sa po čas 
týchto šiestich testov dosiahne pozitívny výsledok, musí sa usku ­
točniť ďalšia séria šiestich testov so za ťažením 120 N. V inom 
prístroji sa vzorka porovnáva so zvolenou referen čnou látkou 
použitím zavedeného postupu (napr. striedavou technikou „up and 
down“ at ď.).
 
1.6.3.4.  Vyhodnotenie  
Výsledok testu sa považuje za pozitívny, ak dôjde k výbuchu (pra ­
skanie a/alebo úder alebo vyš ľahnutie plame ňa sú ekvivalentné výbu ­
chu) aspo ň raz v niektorom z testov so špecifikovaným trecím 
prístrojom alebo ak tento výsledok zodpovedá ekvivalentným krité ­
riám v alternatívnom teste citlivosti na trenie.  
2. ÚDAJE  
V zásade sa príslušná látka pod ľa smernice považuje za nebezpe čnú 
z hľadiska výbušnosti vtedy, ak sa dosiahol pozitívny výsledok 
v rámci testu citlivosti na teplo, náraz alebo trenie.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— identifikáciu, zloženie, čistotu, obsah vlhkosti at ď. testovanej 
látky, 
— fyzikálnu formu vzorky a údaje o tom, či bola rozdrvená, nalá ­
maná, resp. preosiata, alebo nie, 
— pozorovania po čas testov citlivosti na teplo (napr. hmotnos ť 
vzorky, po čet úlomkov at ď.), 
— pozorovania po čas testov citlivosti na mechanické podnety (napr. 
tvorba zna čného množstva dymu alebo úplné rozloženie bez 
zvukového efektu, plamene, iskry, zvuková rana, praskanie at ď.), 
— výsledky z každého typu testu, 
— ak sa použil alternatívny prístroj, musí sa poda ť vedecké zdôvod ­
nenie, ako aj dôkaz korelácie medzi výsledkami dosiahnutými so 
špecifikovaným prístrojom a výsledkami dosiahnutými 
s ekvivalentným prístrojom,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— všetky nepostrádate ľné poznámky ako odkazy na testy 
s podobnými produktmi, ktoré by mohli by ť dôležité pre správnu 
interpretáciu výsledkov, 
— všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre inter ­
pretáciu výsledkov.  
3.2. INTERPRETÁCIA A VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Správa z testu by sa mala zmieni ť o všetkých výsledkoch, ktoré sa 
považujú za chybné, zavádzajúce, anomálne alebo nereprezentatívne. 
Ak sa ktorýko ľvek z výsledkov anuluje, treba uvies ť vysvetlenie 
a nahradi ť ho výsledkom alternatívneho doplnkového testu. Pokia ľ 
sa anomálny výsledok nedá vysvetli ť, musí sa akceptova ť ako 
normálna hodnota a musí sa pod ľa toho aj použi ť na klasifikovanie 
príslušnej testovanej látky.  
4. ODKAZY  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods Tests 
and Criteria, 1990, United Nations, New York. 
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. 
(3) Koenen, H., Ide, K. H. and Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6 – 13 and 30 – 42. 
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Dodatok  
Príklad materiálovej špecifikácie pre test citlivosti na teplo (pozri technickú 
normu DIN 1623)  
(1) Rúra: materiálová špecifikácia č. 1.0336.505 g. 
(2) Uzáverová došti čka s otvorom: materiálová špecifikácia č. 1.4873. 
(3) Závitový golier a matica: materiálová špecifikácia č. 1.3817.  
Obrázok 1  
Testovací prístroj na stanovenie citlivosti na teplo  
(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch)
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Obrázok 2  
Test citlivosti na teplo  
(príklady trieštenia)
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Obrázok 3  
Kalibrácia rýchlosti ohrevu pre test citlivosti na teplo
  
Krivka teploty a času dosiahnutá zohrievaním dibutylftalátu (27 cm  5 ) v uzavretej rúre (uzáve ­
rová došti čka s otvorom 1,5 mm) pri nastavení prietoku propánu na 3,2 l/min. Teplota sa meria 
Cr-Al termo článkom s priemerom 1 mm uloženým v ochrannom plášti z nehrdzavejúcej ocele, 
umiestneným centrálne 43 mm pod okrajom rúry. Rýchlos ť ohrevu medzi 135  o C a 285  o C by 
mala byť medzi 185 a 215 K/min.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Obrázok 4  
Prístroj na testovanie citlivosti látok na náraz 
(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch)
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Obrázok 4  
Pokračovanie
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Obrázok 5  
Prístroj na testovanie citlivosti látok na trenie
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  TEPLOTA SAMOVZNIETENIA (KVAPALINY A PLYNY)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Výbušné látky a látky, ktoré sa samovo ľne vznecujú v kontakte so 
vzduchom pri teplote okolitého prostredia, by sa nemali predklada ť 
na testovanie touto metódou. Tento testovací postup sa dá použi ť 
v prípade plynov, kvapalín a pár, ktoré sa môžu zapáli ť za prítom ­
nosti vzduchu horúcim povrchom. 
Teplota samovznietenia sa môže do zna čnej miery redukova ť prítom­
nosťou katalytických prímesí, povrchovým materiálom alebo vä čším 
objemom skúšobnej nádoby.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Miera schopnosti látky samovo ľne sa vznieti ť sa vyjadruje teplotou 
samozápalu. Teplota samovznietenia predstavuje najnižšiu teplotu, 
pri ktorej sa testovaná látka vznieti, ke ď je zmiešaná so vzduchom 
za podmienok definovaných v skúšobnej metóde.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky sú citované v technických normách (pozri 1.6.3). 
V prvom rade by mali slúži ť na občasnú kontrolu ú činnosti metódy, 
jej správnej realizácie a na umožnenie porovnania s výsledkami 
dosiahnutými pri použití iných metód.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Metóda stanovuje minimálnu teplotu vnútorného povrchu uzavretého 
priestoru, ktorá bude ma ť za následok vznietenie plynu, pary alebo 
kvapaliny vstreknutej do tohto uzavretého priestoru.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Opakovate ľnosť sa mení v závislosti od rozmedzia teplôt samovz ­
nietenia a použitej skúšobnej metódy. 
Citlivosť a špecifickos ť závisia od použitej skúšobnej metódy.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Prístroje  
Prístroj je opísaný v metóde uvedenej v 1.6.3.  
1.6.2.  Podmienky skúšania  
Vzorka testovanej látky sa testuje pod ľa metódy uvedenej v 1.6.3.  
1.6.3.  Realizácia testu  
Pozri technické normy IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, 
BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. ÚDAJE  
V rámci testu sa zaznamenáva testovacia teplota, atmosférický tlak, 
množstvo testovanej vzorky a časové oneskorenie po moment, ke ď 
dôjde k vznieteniu.  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— presnú špecifikáciu testovanej látky (identifikáciu a prímesi), — množstvo použitej vzorky, atmosférický tlak, — použitý prístroj, — výsledky meraní (skúšobné teploty, výsledky týkajúce sa vznie ­
tenia, zodpovedajúce časy oneskorenia), 
— všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre inter ­
pretáciu výsledkov.
 
4. ODKAZY  
Žiadne.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  RELATÍVNA TEPLOTA SAMOVZNIETENIA PRE TUHÉ 
LÁTKY  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Výbušné látky a látky, ktoré sa vznecujú spontánne v kontakte so 
vzduchom pri teplote okolitého prostredia, by sa nemali testova ť 
touto metódou. 
Účelom tohto testu je poskytnú ť predbežné informácie 
o samozápalnosti tuhých látok pri zvýšených teplotách. 
Ak sa teplo vyvinuté bu ď reakciou látky s kyslíkom, alebo exoter ­
mickým rozkladom nerozptýli dostato čne rýchlo do okolitého prie ­
storu, dochádza k samozahriatiu, ktoré má za následok samovznie ­
tenie. K samovznieteniu preto dochádza vtedy, ke ď rýchlosť tvorby 
tepla presiahne rýchlos ť straty tepla. 
Testovací postup má význam ako predbežný skríningový test pre 
tuhé látky. Z h ľadiska komplexného charakteru vznietenia 
a horenia tuhých látok by sa teplota samovznietenia stanovená 
podľa tejto metódy mala použi ť iba na ú čely porovnania.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Teplota samovznietenia získaná touto metódou predstavuje mini ­
málnu teplotu okolitého prostredia vyjadrenú v  o C, pri ktorej sa za 
definovaných podmienok vznieti ur čitý objem látky.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
Určitý objem látky ur čenej na testovanie sa umiestni do piecky pri 
teplote miestnosti; zaznamená sa krivka teploty a času, vzťahujúca sa 
na podmienky v strede testovanej vzorky, pri čom teplota piecky sa 
pri rýchlosti ohrevu 0,5  o C za minútu zvýši na 400  o C, alebo na 
teplotu topenia, ak je táto nižšia. Na ú čely tohto testu sa teplota 
piecky, pri ktorej teplota testovanej vzorky dosiahne 400  o C samo­
zahriatím, nazýva teplotou samovznietenia.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Prístroje  
1.6.1.1.  Piecka  
Laboratórna piecka s programovate ľnou teplotou (s objemom 
približne 2 litre), vybavená prirodzenou cirkuláciou vzduchu a dekompresným mechanizmom na tlmenie ú činkov výbuchu. Aby 
sa zabránilo potenciálnemu nebezpe čiu výbuchu, musí sa dáva ť 
pozor, aby sa rozkladové plyny nedostali do kontaktu s prvkami 
elektrického vyhrievania.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Kocka z drôtenej siete  
Podľa šablóny zobrazenej na obrázku 1 treba vystrihnú ť kúsok 
drôtenej siete s otvormi 0,045 mm, vyrobenej z nehrdzavejúcej ocele. Potom treba sie ť posklada ť do tvaru kocky s otvorenou 
vrchnou stranou a zaisti ť drôtom.
 
1.6.1.3.  Tepelné články (termo články)  
Vhodné tepelné články (termo články).  
1.6.1.4.  Registra čný prístroj  
Ľubovoľný dvojkanálový registra čný prístroj kalibrovaný od 0  o C do 
600  o C alebo na zodpovedajúce napätie.  
1.6.2.  Podmienky skúšania  
Látky sa testujú v takom stave, v akom boli získané.  
1.6.3.  Realizácia testu  
Kocka sa naplní testovanou látkou a táto sa jemne utla čí, potom sa 
pridá viac testovanej látky, táto sa znova jemne utla čí a postup sa 
opakuje až dovtedy, kým kocka nie je úplne naplnená. Kocka sa potom zavesí do stredu piecky pri teplote miestnosti. Jeden termo č­
lánok sa umiestni do stredu kocky a druhý medzi kocku a stenu 
piecky, aby zaznamenával teplotu piecky. 
Počas zvyšovania teploty piecky rýchlos ťou 0,5
 o C za minútu na 
400  o C alebo na teplotu topenia, ak je táto nižšia, sa plynulo zazna ­
menáva teplota piecky a teplota testovanej vzorky. 
Keď sa testovaná látka vznieti (zapáli), termo článok vzorky ukáže 
veľmi silný nárast teploty nad teplotu piecky.  
2. ÚDAJE  
Teplota piecky, pri ktorej teplota testovanej vzorky dosiahne hodnotu 
400  o C samozahriatím, je dôležitá pre vyhodnotenie (obrázok 2).  
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— opis testovanej látky, 
— výsledky merania vrátane krivky teploty/ času, 
— všetky doplnkové poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov.  
4. ODKAZY  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Obrázok 1  
Schéma 20 mm testovanej kocky
  
Obrázok 2  
Typická krivka teploty/ času
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  OXIDA ČNÉ VLASTNOSTI (TUHÉ LÁTKY)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Odporúča sa získa ť predbežné informácie o všetkých potenciálne 
výbušných vlastnostiach látky ešte pred uskuto čnením testu. 
Tento test sa nedá použi ť pre kvapaliny, plyny, výbušné ani mimo ­
riadne hor ľavé látky, ani pre organické peroxidy. 
Tento test sa nemusí uskuto čniť, ak preskúmanie štrukturálneho 
vzorca potvrdí domnienku, že príslušná látka nie je schopná exoter ­
mickej reakcie s hor ľavým materiálom. 
Aby sa zistilo, či sa test musí uskuto čniť so zvláštnymi bezpe čnost­
nými opatreniami, treba vykona ť predbežný test.  
1.2. POJEM A JEDNOTKY 
Čas horenia: čas reakcie vyjadrený v sekundách, potrebný na to, aby 
reakčná zóna prešla celou hranicou vytvorenou z testovanej látky pri 
dodržaní postupu opísaného v 1.6. 
Rýchlosť horenia: vyjadrená v milimetroch za sekundu. 
Maximálna rýchlos ť horenia: najvyššia hodnota rýchlostí horenia 
získaná so zmesami obsahujúcimi 10 až 90 hmotnostných percent 
oxidantu.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Pre potreby hlavného aj predbežného testu sa ako referen čná látka 
používa dusi čnan bárnatý. 
Referenčnou zmesou je tá zmes dusi čnanu bárnatého s práškovou 
celulózou, pripravená pod ľa 1.6, ktorá dosiahla najvyššiu rýchlos ť 
horenia (zvy čajne je to zmes obsahujúca 60 hmotnostných percent 
dusičnanu bárnatého).  
1.4. PRINCÍP METÓDY 
V záujme bezpe čnosti sa uskuto čňuje predbežný test. Ak tento test 
jasne ukáže, že testovaná látka má oxida čné vlastnosti, nie je 
potrebné uskuto čniť žiadne ďalšie testy. Ak to však nie je tak, 
látku treba podrobi ť kompletnému testu. 
V rámci kompletného testu sa látka ur čená na testovanie zmieša 
s definovanou hor ľavinou v rozli čných pomeroch. Každá zmes sa 
potom sformuje do hranice, ktorá sa na jednom konci zapáli. Najvyššia stanovená, resp. zistená, rýchlos ť horenia sa porovná 
s maximálnou rýchlos ťou horenia referen čnej zmesi.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Ak je to nutné, možno použi ť akúkoľvek metódu drvenia, mletia 
alebo miešania za predpokladu, že rozdiel v maximálnej rýchlosti 
horenia v šiestich samostatných testoch sa nebude odchy ľovať od 
aritmetickej strednej hodnoty o viac ako 10 %.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
1.6.1.1.  Testovaná látka  
Veľkosť čiastočiek testovanej látky treba redukova ť na < 0,125 mm 
použitím tohto postupu: testovaná látka sa preoseje, zvyšná časť 
(frakcia) sa pomelie a tento postup sa opakuje dovtedy, kým celé množstvo ur čené na testovanie neprepadlo cez sito. 
Použiť možno akúko ľvek metódu mletia a preosievania, ktorá zodpo ­
vedá kritériám kvality. 
Pred prípravou zmesi sa látka ur čená na testovanie suší pri teplote 
105
 o C dovtedy, kým sa nedosiahne konštantná hmotnos ť. Ak je 
teplota rozkladu látky ur čenej na testovanie nižšia ako 105  o C, 
látka sa musí suši ť pri vhodnej nižšej teplote.  
1.6.1.2.  Horľavina  
Ako horľavina sa používa prášková celulóza. Celulóza musí by ť 
takého typu, aký sa používa v prípade chromatografie tenkej vrstvy alebo stĺpcovej chromatografie. Ako najvhodnejší sa osved čil typ 
s vyše 85 % podielom d ĺžky vlákien medzi 0,020 mm 
a 0,075 mm. Celulózový prášok sa preoseje cez sito ve ľkosti 
0,125 mm. Po čas celého testu treba používa ť tú istú várku celulózy. 
Pred prípravou zmesi sa prášková celulóza suší pri teplote 105
 o C 
dovtedy, kým sa nedosiahne konštantná teplota. 
Ak sa v predbežnom teste použije drevitá mú čka, treba pripravi ť 
drevitú mú čku z mäkkého dreva použitím tej časti materiálu, ktorá 
sa preosiala cez otvory sita ve ľkosti 1,6 mm, potom treba mú čku 
dôkladne premieša ť, sušiť pri teplote 105  o C štyri hodiny 
v navrstvení maximálne do výšky 25 mm. Materiál treba ochladi ť 
a uskladni ť vo vzduchotesnom obale naplnenom do maximálnej 
možnej miery až do času použitia, pod ľa možnosti do 24 hodín od 
ukončenia procesu sušenia.  
1.6.1.3.  Zápalný zdroj  
Ako zápalný zdroj sa odporú ča použiť plynový horák s horúcim 
plameňom (minimálny priemer 5 mm). V prípade, ak sa použije 
iný zápalný zdroj (napríklad pri testovaní v inertnej atmosfére), 
v správe sa musí uvies ť jeho opis a zdôvodnenie jeho použitia.  
1.6.2.  Realizácia testu  
Poznámka:  
Zmesi oxidantov s celulózou alebo drevitou mú čkou sa musia upra ­
vovať ako potenciálne výbušné látky a musí sa s nimi narába ť 
s patričnou opatrnos ťou. 
1.6.2.1.  Predbežný test  
Vysušená látka sa dôkladne premieša s vysušenou celulózou alebo 
drevitou mú čkou v hmotnostnom pomere 2 dielov testovanej látky a 1 
dielu celulózy alebo drevitej mú čky, zmes sa potom sformuje do malej 
hranice kónického tvaru s rozmermi 3,5 cm (priemer základne) × 2,5 cm 
(výška) naplnením (nie utlá čaním) formy kónického tvaru (napr. 
skleného laboratórneho lievika s upchatou stopkou).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Hranica sa umiestni na chladnú, nehor ľavú (ohňovzdornú), nepóro ­
vitú základovú plat ňu s nízkou tepelnou vodivos ťou. Test sa musí 
uskutočniť v digestore, ako je to uvedené v 1.6.2.2. 
Zápalný zdroj sa kontaktne priloží ku kuže ľu. Pozoruje sa 
a zaznamená prudkos ť a trvanie výslednej reakcie. 
Testovanú látku treba považova ť za oxida čnú, ak je reakcia prudká. 
V každom takom prípade, kde sú pochybnosti o dosiahnutom 
výsledku, je potrebné uskuto čniť kompletný hlavný test pod ľa 
opisu uvedeného nižšie.  
1.6.2.2.  Hlavný test  
Pripravia sa zmesi oxidantu a celulózy obsahujúce 10 až 90 hmot ­
nostných percent oxidantu v 10 % prírastkoch. Pre hrani čné prípady 
treba použi ť zmesi s rovnakým hmotnostným podielom oxidantu 
a celulózy, aby sa dosiahla presnejšia hodnota maximálnej rýchlosti horenia. 
Hranica sa vytvorí pomocou formy. Forma je vyrobená z kovu, má 
dĺžku 250 mm a trojuholníkovitý prierez s vnútornou výškou 10 mm 
a vnútornou šírkou 20 mm. Po obidvoch stranách formy sú 
v pozdĺžnom smere namontované kovové lišty, ktoré slúžia ako 
bočné ohrani čenie a ktoré pre čnievajú 2 mm ponad vrchný okraj 
trojuholníkovitého prierezu (pozrite obrázok). Žliabok 
s trojuholníkovitým prierezom sa zvo ľna naplní mierne nad okraj 
testovanou zmesou. Forma sa potom zdvihne do výšky 2 cm a pustí sa, aby dopadla na tvrdý podklad, čím sa zmes utrasie. 
Prebytočná zmes sa zhrnie šikmo nakloneným plátkom. Odstránia 
sa bočné kovové lišty a zostávajúci prášok sa uhladí použitím 
valčeka. Na vrchnú stranu formy sa potom položí nehor ľavá 
(ohňovzdorná), nepórovitá podkladová doska s nízkou tepelnou vodi ­
vosťou, prístroj sa obráti spodnou časťou navrch a forma sa odstráni. 
Hranica z práškovej zmesi sa umiestni do digestora prie čne na smer 
prúdenia vzduchu. 
Rýchlosť prúdenia vzduchu musí by ť dostatočná na to, aby sa zabrá ­
nilo úniku spalín do ovzdušia laboratória, a po čas testu by sa nemala 
meniť. Okolo prístroja by mala by ť postavená protiprievanová 
zástena. 
Kvôli hygroskopickým vlastnostiam celulózy a niektorých látok 
určených na testovanie by sa testy mali uskuto čniť čo možno najskôr 
po príprave. 
Dotykom plame ňa sa zapáli jeden koniec hranice z práškovej zmesi. 
Po tom, čo sa zóna reakcie rozšírila na po čiatočnú vzdialenos ť 
v dĺžke 30 mm, treba odmera ť čas reakcie na úseku ďalších 200 mm. 
Test sa uskuto ční s referen čnou látkou a najmenej raz s každým 
stanoveným hmotnostným pomerom zmesi testovanej látky a celulózy. 
Ak sa zistí, že maximálna rýchlos ť horenia je podstatne vyššia než 
v prípade referen čnej zmesi, test možno zastavi ť. V ostatných prípa ­
doch sa musí test opakova ť päťkrát v prípade každej z troch zmesí, 
ktoré dosiahli najvyššiu rýchlos ť horenia.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Ak vzniklo podozrenie, že výsledok je klamlivo pozitívny, test sa 
musí zopakova ť s použitím inertnej látky namiesto celulózy, ale 
s podobnou ve ľkosťou častíc, napríklad diatomitu. Alternatívne sa 
musí zmes testovanej látky s celulózou, ktorá dosiahla najvyššiu rýchlosť horenia, opakovane testova ť v inertnej atmosfére (< 2 % 
v/v obsahu kyslíka).
 
2. ÚDAJE  
Z bezpečnostných dôvodov sa musí práve maximálna rýchlos ť 
horenia – teda nie stredná hodnota – považova ť za charakteristickú 
oxidačnú vlastnos ť testovanej látky. 
Pre vyhodnotenie je dôležitá najvyššia hodnota rýchlosti horenia 
danej zmesi v rámci šiestich testov. 
Najvyššia hodnota rýchlosti horenia pre každú zmes oproti koncen ­
trácii oxidantu sa nanesie na graf. Z grafu sa potom vyberie maxi ­
málna rýchlos ť horenia. 
Šesť nameraných hodnôt rýchlosti horenia v rámci jedného skúšob ­
ného kola, získaných zo zmesi s maximálnou rýchlos ťou horenia, sa 
nesmie odchy ľovať od hodnoty aritmetického stredu o viac ako 
10 %, lebo inak bude potrebné zdokonali ť metódy drvenia, mletia 
a miešania testovanej látky. 
Treba porovna ť dosiahnutú maximálnu rýchlos ť horenia 
s maximálnou rýchlos ťou horenia referen čnej zmesi (pozri 1.3). 
Ak sa testy uskuto čňujú v inertnej atmosfére, maximálna rýchlos ť 
reakcie sa porovná s maximálnou rýchlos ťou reakcie referen čnej 
zmesi v inertnej atmosfére.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť nasledujúce 
informácie: 
— identitu, zloženie, čistotu, obsah vlhkosti at ď. testovanej látky, 
— všetky úpravy testovanej vzorky (napr. drvenie, mletie, sušenie), — druh zápalného zdroja použitého v teste, — výsledky meraní, — typ (formu) reakcie [napr. horenie plame ňom na povrchu, horenie 
cez celú hmotu, všetky informácie týkajúce sa produktov (splo ­
dín) horenia (spalín) at ď.], 
— všetky doplnkové poznámky a pripomienky dôležité pre inter ­
pretáciu výsledkov vrátane opisu prudkosti reakcie (horenie plameňom, iskrenie, pomalé tlenie at ď.) a približnej doby trvania 
v predbežnom bezpe čnostnom/skríningovom teste pre testovanú, 
ako aj pre referen čnú látku, 
— výsledky z testov s inertnou látkou, ak také existujú, — výsledky z testov uskuto čnených v inertnej atmosfére, ak také 
existujú.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Látku treba považova ť za oxida čnú vtedy, ke ď: 
a) v predbežnom skríningovom teste došlo k prudkej reakcii; 
b) v hlavnom teste je maximálna rýchlos ť horenia testovanej zmesi 
vyššia alebo sa rovná maximálnej rýchlosti horenia referen čnej 
zmesi celulózy a dusi čnanu bárnatého. 
Aby sa predišlo nesprávnym pozitívnym výsledkom, pri interpretácii 
výsledkov sa musia zoh ľadniť aj výsledky získané pri testovaní látky 
zmiešanej s inertným materiálom a/alebo pri testovaní v inertnej 
atmosfére.  
4. ODKAZY  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Dodatok  
Obrázok  
Forma a príslušenstvo na prípravu hranice z práškovitej skúšobnej látky  
(všetky rozmery sú uvedené v milimetroch)
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  ČÍSELNÁ PRIEMERNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOS Ť 
A DISTRIBÚCIA MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ 
POLYMÉROV  
1. METÓDA  
Táto metóda, založená na gélovej permea čnej chromatografii, je 
prevzatá z OECD TG 118 (1996). Základné princípy a ďalšie tech ­
nické informácie sú uvedené v odkaze (1).  
1.1. ÚVOD 
Vlastnosti polymérov sú ve ľmi rôznorodé, a nie je preto možné 
opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich 
vzájomného odde ľovania a vyhodnocovania a ktorá by brala do 
úvahy všetky možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri sepa ­
rácii polymérov. Predovšetkým nie vždy sa dá pri komplexných 
polymérových systémoch použi ť gélová permea čná chromatografia 
(GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického h ľadiska možné, 
dajú sa molekulové hmotnosti stanovi ť inými spôsobmi (pozri doda ­
tok). V takýchto prípadoch je potrebné uvies ť všetky podrobnosti 
a použitie konkrétnej metódy sa musí odôvodni ť. 
Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné 
informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov 
možno nájs ť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré treba 
v metóde urobi ť, musia by ť odôvodnené. Možno použi ť aj iné 
normy, no treba pri tom uvies ť plný odkaz. Pri opisovanej metóde 
sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydos ­
perzitou a možno ju modifikova ť tak, aby bola vhodná pre ur čité 
polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a pre vetvené polyméry s dlhými re ťazcami.
 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Číselná priemerná molekulová hmotnos ť M n a hmotnostná priemerná 
molekulová hmotnos ť M w sa stanovili pomocou týchto rovníc: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kde: 
H i je hladina signálu detektora od základnej čiary pre reten čný objem V  i 
M i je molekulová hmotnos ť polymérovej frakcie pri reten čnom 
objeme V  i a 
n je počet dátových bodov. 
Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá je mierou disperzity 
systému, je daná pomerom M  w /M n . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
GPC je relatívna metóda, a preto je pri nej potrebné uskuto čniť 
kalibráciu. Bežne sa na tento ú čel používajú lineárne skonštruované 
polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnos ťami 
M n a M  w a s úzkou oblas ťou distribúcie molekulových hmotností. 
Kalibračnú krivku možno použi ť na stanovenie molekulovej hmot ­
nosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. 
Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnos ťou a elu čným 
objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patria predovšetkým teplota, typ 
rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúš ťadiel), chromatografické podmienky 
a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. 
Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné 
hodnoty a ozna čujú sa ako „molekulové hmotnosti polystyrénového 
ekvivalentu“. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu mole ­
kulové hmotnosti do vä čšej alebo menšej miery od svojich absolút ­
nych hodnôt odlišova ť. Prípadné použitie iných štandardov, 
napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodni ť.
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné moleku ­
lové hmotnosti (M  n , M  w ) možno stanovi ť pomocou metódy GPC. 
Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamic ­
kých objemov jej jednotlivých zložiek (2). 
K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je 
naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvy čajne organický gél. 
Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatia ľ čo veľké molekuly sa 
z objemu gélu vylu čujú. Dráha, ktorú prekonajú ve ľké molekuly, je 
preto kratšia a vylu čujú sa ako prvé. Molekuly strednej ve ľkosti do 
niektorých pórov vnikajú a vylu čujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie 
molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je ve ľkosť 
pórov gélu, môžu vnika ť do všetkých z nich a vylu čujú sa ako 
posledné. 
V ideálnych podmienkach závisí odde ľovanie výlu čne od ve ľkosti 
jednotlivých molekúl, hoci v praxi je ťažké vyhnú ť sa aspoň urči­
tému stup ňu interferencie absorp čných vplyvov. Situácia sa môže 
zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a m ŕtvych 
objemov (2). 
Detekciu možno uskuto čňovať napríklad pomocou merania indexu 
lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je 
možné zostroji ť jednoduchú distribu čnú krivku. Aby však bolo 
možné prisúdi ť bodom na distribu čnej krivke molekulové hmotnosti, 
je potrebné kolónu najprv okalibrova ť. Robí sa to tak, že na kolónu 
sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnos ťou, 
v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad 
rozličné polystyrénové štandardy. Zvy čajne sa získava gaussovská 
krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmot
­
ností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo 
jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os 
je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Reprodukovate ľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elu čného 
objemu by mala by ť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhod ­
nocuje nezávisle od času a ak nesp ĺňa horeuvedené kritérium, potom 
je potrebné zabezpe čiť reprodukovate ľnosť analýzy pomocou vnútor ­
ného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické hodnoty takéto: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p je molekulová hmotnos ť štandardu v maxime píku)  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava štandardných roztokov polystyrénu  
Polystyrénové štandardy sa opatrným miešaním rozpustia vo 
zvolenom elu čnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadi ť 
odporúčaniami výrobcov. 
Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozli čných faktorov, 
napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí by ť prispô­
sobený d ĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej pre ťaženiu. Zvy čajné 
nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmermi 30 cm × 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použi ť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnu ť 
250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné ur čiť opti­
málny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky.
 
1.6.2.  Príprava roztoku vzorky  
V zásade rovnaké požiadavky sa vz ťahujú aj na prípravu roztokov 
vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade 
ju nemožno rozpúš ťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa 
vzorka pre čistí filtráciou cez membránový filter s ve ľkosťou pórov 
medzi 0,2 μm a 2 μm. 
V záverečnej správe sa treba zmieni ť o prítomnosti nerozpustených 
tuhých častíc, ktoré môžu by ť dôsledkom prítomnosti vysokých 
molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpus ­
tených čiastočiek je potrebné ur čiť pomocou primeranej metódy. 
Roztoky sa musia použi ť do 24 hodín.
 
1.6.3.  Prístrojové vybavenie  
— nádrž na rozpúš ťadlo, 
— zariadenie na odplynenie kvapalín (ak je potrebné), — čerpadlo,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), 
— nanášací systém, 
— chromatografické kolóny, 
— detektor, — prietokomer (ak je potrebný), — zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, — nádoba na odpad. Treba zabezpe čiť inertnosť systému GPC vo či používaným rozpúš ť­
adlám (napríklad použitím oce ľových kapilár, ak je rozpúš ťadlo THF).
 
1.6.4.  Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúš ťadla 
Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ru čne sa 
na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne presne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie strieka čky alebo 
stlačenie jej piestu pri ru čnom nanášaní vzorky môže spôsobi ť 
zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém 
na privádzanie rozpúš ťadla by nemal spôsobova ť pulzové vlny, čo 
možno v ideálnom prípad zabezpe čiť zaradením tlmi ča pulzov. 
Prietok sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min.
 
1.6.5.  Kolóna  
V závislosti od vzorky možno polymér charakterizova ť buď 
pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spoje ­
ných kolón. Ako nápl ň kolóny je komer čne dostupných viacero 
poréznych materiálov s definovanými vlastnos ťami (napríklad 
veľkosť pórov, limit vylu čovania). Vo ľba separa čného gélu a d ĺžky 
kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distri ­
búcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúš ťadla, teploty a rýchlosti prietoku 
(1) (2) (3).
 
1.6.6.  Teoretické poschodia kolóny  
Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii 
musí byť charakterizovaná po čtom teoretických poschodí. V prípade 
THF ako rozpúš ťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou d ĺžkou 
sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
alebo N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kde: 
N = po čet teoretických poschodí 
V e = elučný objem v maxime píku  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = šírka píku pri základnej čiare 
W 1/2 = šírka píku v polovici jeho výšky  
1.6.7.  Účinnosť separácie  
Okrem po čtu teoretických poschodí, ktorý ur čuje šírku pásu, hrá pri 
separácii úlohu aj jej ú činnosť, ktorá sa ur čuje na základe strmosti 
kalibračnej krivky. Ú činnosť separácie kolóny možno získa ť z tohto 
vzťahu: 
V e; M x Ä V e;ð10M  x Þ 
veľkosť plochy prierezu kolúny ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kde: 
V e, Mx = elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnos ťou M  x 
V e,(10.Mx)  = elučný objem polystyrénu s desa ťnásobne vä čšou 
molekulovou hmotnos ťou. 
Rozlíšiteľnosť systému sa zvy čajne definuje takto:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kde: 
V e1 , V e2 = elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov 
v maxime píku 
W 1 , W  2 = šírky píkov pri základnej čiare 
M 1 , M  2 = molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líši ť 
o faktor 10) 
R-hodnota kolóny musí by ť vyššia ako 1.7 (4).  
1.6.8.  Rozpúš ťadlá 
Všetky rozpúš ťadlá musia ma ť vysoký stupe ň čistoty (pri THF je 
stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúš ťadlo (v prípade potreby 
s atmosférou inertného plynu) musí by ť dostatočne veľký, aby 
umožnil kalibráciu kolóny a analýzu nieko ľkých vzoriek. Pred 
vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba rozpúš ťadlo zbavi ť 
plynov.  
1.6.9.  Kontrola teploty  
Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slu čka, 
detektor a hadi čky) musí by ť stála a musí zodpoveda ť zvolenému 
rozpúšťadlu. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie 
vzorky, ktorá sa eluuje z kolóny. V záujme eliminácie zbyto čného 
rozširovania píku by mala ma ť kyveta meracej komôrky detektora čo 
možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na 
rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal tento objem presahova ť 10 μl. Ako detek čná metóda sa zvy čajne používa dife ­
renciálna refraktometria. V závislosti od osobitných požiadaviek 
vzorky alebo elu čného činidla však možno použi ť aj iné typy detek ­
torov, napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor at ď.
 
2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY  
2.1. ÚDAJE 
Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vz ťahujúce sa na 
zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). 
Pri každej vzorke je potrebné uskuto čniť dva nezávislé pokusy. 
Každý z nich treba analyzova ť osobitne. 
Pri každom meraní treba uda ť M  n , M  w , M  w /M n a M  p . Treba 
výslovne uvies ť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty ekviva ­
lentné použitým štandardom. 
Po stanovení reten čných objemov alebo reten čných časov (pod ľa 
možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa vo či 
jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log M  p (M p je 
maximum píku kalibra čného štandardu). Na každú dekádu moleku ­
lových hmotností treba použi ť aspoň dva kalibra čné body, na zostro ­
jenie celej kalibra čnej krivky, ktorá by mala pokrýva ť odhadnutú 
molekulovú hmotnos ť vzorky, je potrebných aspo ň päť bodov. 
Koncový bod kalibra čnej krivky v oblasti nízkych molekulových 
hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhod ­
ného nepolárneho rozpúš ťadla. Číselné priemerné a hmotnostné prie ­
merné molekulové hmotnosti sa vo všeobecnosti stanovujú pomocou 
elektronického spracúvania údajov, založeného na vzorcoch uvede ­
ných v časti 1.2. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadi ť 
dokumentom ASTM D 3536-91 (3). 
V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je 
vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnos ť je vyššia ako 
molekulová hmotnos ť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto 
skutočnosti do úvahy môže by ť nadhodnotenie zastúpenia zložiek 
s nízkou molekulovou hmotnos ťou. Návod na uskuto čnenie korekcie 
obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnos ťou na nerozpustný 
polymér je uvedený v dodatku.  
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie:  
2.2.1.  Testovaná látka:  
— dostupné informácie o testovanej látke (totožnos ť, prísady, 
nečistoty/prímesi),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— postup spracovania vzorky, zistené skuto čnosti, problémy.  
2.2.2.  Prístroje a zariadenia:  
— zásobník na elu čné činidlo, inertný plyn, zariadenie na odply ­
nenie elu čného činidla, 
— zloženie elu čného činidla, ne čistoty/prímesi, 
— čerpadlo, tlmi č pulzov kvapaliny, nanášací systém, rozde ľovacie 
kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako sú ve ľkosť pórov, druh separa čného materiálu at ď., počet, 
dĺžka a usporiadanie použitých kolón), 
— počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), 
účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnos ť systému), 
— informácie o symetrii píkov, — teploty kolóny, spôsob kontroly teploty, — detektor (princíp merania, typ, objem meracej kyvety), 
— prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), 
— systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér 
a softvér).
 
2.2.3.  Kalibrácia systému:  
— podrobný opis metódy použitej na zostrojenie kalibra čnej krivky, 
— informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korela čný 
koeficient, odchýlka sú čtu štvorcov at ď.), 
— informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch 
a aproximáciách, ktoré sa uskuto čnili počas priebehu pokusu, 
a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, 
— všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibra čnej 
krivky musia by ť zdokumentované v tabu ľke, ktorá obsahuje 
pre každý bod merania tieto informácie: 
— názov vzorky, — výrobcu vzorky, — charakteristické hodnoty štandardov, t. j. M
 p , M  n , M  w a M  w /­
M n , tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené 
z následných meraní, a tiež podrobnosti o metóde stanovenia, 
— nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— hodnotu M  p , ktorá bola použitá na kalibráciu, 
— elučný objem alebo opravený reten čný čas, nameraný pri 
maxime píku, 
— M  p vypočítaná v maxime píku, 
— percentuálna odchýlka vypo čítanej hodnoty M  p od kali­
bračnej krivky.  
2.2.4.  Vyhodnotenie:  
— vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpe čenie 
požadovanej reprodukovate ľnosti (korek čná metóda, vnútorné 
štandardy at ď.), 
— informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe 
elučného objemu alebo reten čného času, 
— informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná 
úplná analýza píku, 
— opis vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa pri grafickom 
vyhodnocovaní použila, 
— príprava a predbežné spracovanie vzorky, — prítomnos ť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované, 
— objem ( μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, 
— opis vplyvov, ktoré mohli spôsobi ť odchýlku od ideálneho GPC 
profilu, 
— podrobný opis modifikácií uskuto čnených v testovacej metóde, 
— podrobnosti o rozsahu chýb merania, — všetky iné informácie a pozorované skuto čnosti, ktoré by mohli 
byť významné z h ľadiska interpretácie výsledkov.
 
3. ODKAZY  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil I. 
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). 
Modern Size Exclusion Liquid Chromatography; J. Wiley and Sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Mole ­
cular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromato ­
graphy-GPC). American Society for Testing and Materials, 
Philadelphia, Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Mole ­
cular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size- Exclusion Chromato ­
graphy. American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Dodatok  
Príklad ďalších metód na stanovenie číselnej priemernej molekulovej 
hmotnosti (M  n ) polymérov  
Prednostnou metódou na stanovenie M  n je gélová permea čná chromatografia 
(GPC), najmä ak je k dispozícii séria štandardov so štruktúrou podobnou štruk ­
túre stanovovaného polyméru. V prípadoch, v ktorých je použitie GPC sprevá ­
dzané praktickými problémami, alebo ak je vopred známe, že polymér nesp ĺňa 
regulačné kritérium pre M  n , sú k dispozícii náhradné metódy ako napríklad:  
1. Využitie koligatívnych vlastností  
1.1. Ebulioskopia/kryoskopia: 
meria sa zvyšovanie bodu varu (ebulioskopia) alebo znižovanie bodu 
tuhnutia (kryoskopia) rozpúš ťadla, do ktorého sa pridáva polymér. 
Metóda je založená na skuto čnosti, že vplyv rozpusteného polyméru 
na bod varu/tuhnutia kvapaliny závisí od jeho molekulovej hmotnosti (1) (2). 
Použiteľnosť: M
 n < 20 000. 
1.2. Znižovanie tlaku pár: 
pri tejto metóde sa meria tlak pár zvolenej referen čnej kvapaliny pred 
a po pridaní známych množstiev polyméru (1) (2). 
Použiteľnosť: M  n < 20 000 (teoreticky; v praxi je užito čnosť metódy 
obmedzená). 
1.3. Membránová osmometria: 
metóda využíva princíp osmózy, t. j. prirodzený sklon molekúl 
rozpúšťadla prechádza ť cez polopriepustnú membránu zo zriedeného 
do koncentrovaného prostredia až po dosiahnutie rovnováhy. Pri pokuse má zriedený roztok nulovú koncentráciu a koncentrovaný roztok obsahuje polymér. Prechádzaním rozpúš ťadla vzniká rozdiel 
tlaku, ktorého ve ľkosť závisí od koncentrácie a molekulovej hmot ­
nosti polyméru (1) (3) (4). 
Použiteľnosť: M
 n medzi 20 000 – 200 000. 
1.4. Osmometria v plynnej fáze: 
pri tejto metóde sa porovnáva rýchlos ť odparovania čistého aerosólu 
rozpúšťadla s rýchlos ťou odparovania najmenej troch aerosólov 
obsahujúcich rozli čné koncentrácie polyméru (1) (5) (6). 
Použiteľnosť: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Analýza koncovej skupiny  
Na použitie tejto metódy je potrebné pozna ť celkovú štruktúru polyméru 
a aj povahu skupín nachádzajúcich sa na konci re ťazcov (tieto skupiny 
musia byť od hlavného re ťazca polyméru odlíšite ľné napríklad pomocou 
NMR alebo titrácie/derivatizácie). Zo stanovenia molekulárnej koncen ­
trácie koncových skupín, ktoré sa nachádzajú v polyméri, možno 
vypočítať hodnotu molekulovej hmotnosti (7) (8) (9). 
Použiteľnosť: M  n do 50 000 (s klesajúcou spo ľahlivosťou). 
3. Odkazy  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York. 
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania. 
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 25 – 52. 
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania. 
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
mination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons. 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. 
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. 
Marcel Dekker, New York. 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139 – 2146.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  OBSAH ZLOŽIEK S NÍZKOU MOLEKULOVOU 
HMOTNOS ŤOU V POLYMÉROCH  
1. METÓDA  
Táto metóda, založená na gélovej permea čnej chromatografii, je 
prevzatá z OECD TG 119 (1996). Základné princípy a ďalšie tech ­
nické informácie sú uvedené v literárnych odkazoch.  
1.1. ÚVOD 
Vlastnosti polymérov sú ve ľmi rôznorodé, a nie je preto možné 
opísať jedinú metódu, ktorá by presne vymedzovala podmienky ich 
separácie a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky 
možnosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymé ­
rov. Predovšetkým nie vždy možno pri komplexných polymérových systémoch použi ť gélovú permea čnú chromatografiu (GPC). Tam, 
kde nie je použitie GPC z praktického h ľadiska možné, dajú sa 
molekulové hmotnosti stanovi ť inými spôsobmi (pozri dodatok). 
V takýchto prípadoch je potrebné uvies ť všetky podrobnosti 
a použitie konkrétnej metódy treba odôvodni ť. 
Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné 
informácie o vykonaní pokusu a spôsobe vyhodnotenia údajov možno nájs ť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré treba 
v metóde urobi ť, musia by ť odôvodnené. Možno použi ť aj iné 
normy, no treba pri tom uvies ť plný literárny odkaz. Pri opisovanej 
metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydisperzitou a možno ju modifikova ť tak, aby bola vhodná pre 
určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode 
a vetvené polyméry s dlhými re ťazcami.
 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Nízka molekulová hmotnos ť je arbitrárne definovaná ako moleku ­
lová hmotnos ť nižšia ako 1 000 daltonov. 
Číselná priemerná molekulová hmotnos ť M n a hmotnostná priemerná 
molekulová hmotnos ť M w sa stanovili pomocou týchto rovníc: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kde: 
H i = hladina signálu detektora od základnej čiary reten čného 
objemu V  i , 
M i = molekulová hmotnos ť polymérovej frakcie pri reten čnom 
objeme V  i a n je po čet dátových bodov 
Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá predstavuje mieru 
disperzity systému, je daná pomerom M  w /M n . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
GPC je relatívna metóda, a preto je potrebné uskuto čniť kalibráciu. 
Bežne sa na tento ú čel používajú lineárne konštruované polystyré ­
nové štandardy so známymi molekulovými hmotnos ťami M  n a M  w 
a s úzkou oblas ťou distribúcie. Kalibra čnú krivku možno použi ť na 
stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. 
Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnos ťou a elu čným 
objemom sú platné iba pri špecifických podmienkach daného 
pokusu. Medzi tieto podmienky patrí predovšetkým teplota, typ 
rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúš ťadiel), chromatografické podmienky 
a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. 
Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné 
hodnoty a ozna čujú sa ako „molekulové hmotnosti polystyrénového 
ekvivalentu“. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych 
a chemických rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu mole ­
kulové hmotnosti do vä čšej alebo menšej miery od svojich absolút ­
nych hodnôt odlišova ť. Prípadné použitie iných štandardov, 
napríklad polyetylénglykolu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu 
alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodni ť.
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné moleku ­
lové hmotnosti (M  n , M  w ) možno stanovi ť pomocou metódy GPC. 
Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamic ­
kých objemov jej jednotlivých zložiek (2). 
K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je 
naplnená poréznym materiálom, ktorým je zvy čajne organický gél. 
Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatia ľ čo veľké molekuly sa 
z objemu gélu vylu čujú. Dráha, ktorú prekonajú ve ľké molekuly, je 
preto kratšia a tieto sa vylu čujú ako prvé. Molekuly strednej ve ľkosti 
do niektorých pórov vnikajú a vylu čujú sa z kolóny neskôr. 
Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako 
je veľkosť pórov gélu, môžu vnika ť do všetkých z nich a vylu čujú sa 
ako posledné. 
V ideálnych podmienkach závisí odde ľovanie výlu čne od ve ľkosti 
jednotlivých molekúl, no v praxi býva ťažké vyhnú ť sa aspoň určitej 
interferencii absorp čných vplyvov. Situácia sa môže zhorši ť aj 
v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a m ŕtvych objemov (2). 
Detekciu možno uskuto čňovať napríklad pomocou merania indexu 
lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je 
možné zostroji ť jednoduchú distribu čnú krivku. Molekulové hmot ­
nosti možno bodom na distribu čnej krivke prisúdi ť iba po predchá ­
dzajúcom okalibrovaní kolóny. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnos ťou, v ideálnom 
prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozli čné poly­
styrénové štandardy. Zvy čajne sa získava gaussovská krivka, ktorá 
býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých 
typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená 
ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Obsah zložiek s nízkou molekulovou hmotnos ťou sa odvádza z tejto 
krivky. Výpo čet môže by ť presný iba vtedy, ak zložky s nízkou 
molekulovou hmotnos ťou ekvivalentne na hmotnostnom základe 
zodpovedajú polyméru ako celku.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Reprodukovate ľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elu čného 
objemu by mala by ť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhod ­
nocuje nezávisle od času a ak nesp ĺňa vyššie uvedené kritérium, 
potom je potrebné zabezpe čiť reprodukovate ľnosť analýzy pomocou 
vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú 
typické tieto hodnoty: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p je molekulová hmotnos ť štandardu v maxime píku)  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava štandardných roztokov polystyrénu  
Polystyrénové štandardy sa rozpustia opatrným miešaním vo 
zvolenom elu čnom činidle. Pri príprave roztokov sa treba riadi ť 
odporúčaniami výrobcov. 
Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozli čných faktorov, 
napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti 
analytického detektora. Maximálny nanášací objem sa musí prispô ­
sobiť dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej pre ťaženiu. Zvy čajné 
nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm × 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 
μl až 100 μl. Je možné použi ť aj vyššie objemy, nemali by však 
presiahnu ť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné 
určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou 
nanášanej vzorky.
 
1.6.2.  Príprava roztoku vzorky  
V zásade rovnaké požiadavky sa vz ťahujú aj na prípravu roztokov 
vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasaním rozpustí vo vhodnom 
rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade 
ju nemožno rozpúš ťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa 
vzorka pre čistí filtráciou cez membránový filter s ve ľkosťou pórov 
medzi 0,2 μm a 2 μm. 
V záverečnej správe je potrebné zmieni ť sa o prítomnosti nerozpus ­
tených tuhých častíc, ktoré môžu by ť dôsledkom prítomnosti vyso ­
kých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti 
rozpustených čiastočiek je potrebné ur čiť pomocou primeranej 
metódy. Roztoky sa musia použi ť do 24 hodín.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Korekcia na obsah ne čistôt a prímesí  
Zvyčajne je potrebné vykona ť korekciu na obsah molekúl 
s molekulovou hmotnos ťou M < 1 000, ktorými prispievajú zložky 
nepolymérovej povahy (napríklad ne čistoty, resp. prímesi). Korekciu 
netreba vykona ť v prípade, ak je ich nameraný obsah nižší ako 1 %. 
Na tento ú čel možno analyzova ť priamo roztok polyméru alebo GPC 
eluát. 
V prípadoch, v ktorých je eluát po prechode cez kolónu na vyko ­
nanie ďalšej analýzy príliš zriedený, treba ho koncentrova ť. Môže 
byť potrebné eluát odpari ť dosucha a opätovne rozpusti ť. Koncen ­
trovanie eluátu treba vykona ť za takých podmienok, ktoré zaru čia, že 
v ňom neprebehnú žiadne zmeny. Spracovanie eluátu po GPC závisí 
od analytickej metódy, ktorá sa použije na kvantitatívne stanovenie.  
1.6.4.  Prístrojové vybavenie  
Prístrojové vybavenie GPC zah ŕňa tieto zložky: 
— nádrž na rozpúš ťadlo, 
— zariadenie na odply ňovanie kvapalín (ak je potrebné), 
— čerpadlo, 
— tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), 
— nanášací systém, 
— chromatografické kolóny, 
— detektor, — prietokomer (ak je potrebný), — zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, 
— nádoba na odpad. 
Treba zabezpe čiť inertnosť systému GPC vo či používaným rozpúš ť­
adlám (napríklad použitím oce ľových kapilár, ak je rozpúš ťadlo THF).
 
1.6.5.  Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúš ťadla 
Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ru čne sa 
na kolónu nanesie v ostro vymedzenej zóne definované množstvo 
roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie strieka čky alebo stla čenie 
jej piestu pri ru čnom nanášaní vzorky môže spôsobi ť zmeny 
v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Systém na privá ­
dzanie rozpúš ťadla by nemal spôsobova ť pulzové vlny, čo možno 
v ideálnom prípade zabezpe čiť zaradením tlmi ča pulzov. Rýchlos ť 
prietoku sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min.  
1.6.6.  Kolóna  
V závislosti od vzorky možno polymér charakterizova ť buď pomocou 
jedinej kolóny, alebo pomocou viacerých za sebou spojených kolón. 
Ako nápl ň kolóny je komer čne dostupných viacero poréznych mate ­
riálov s definovanými vlastnos ťami (napríklad ve ľkosť pórov, limit 
vylučovania). Vo ľba separa čného gélu a d ĺžky kolóny závisí od vlast ­
ností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových 
hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od 
typu rozpúš ťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Teoretické poschodia kolóny  
Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii 
musí byť charakterizovaná po čtom teoretických poschodí. V prípade 
THF ako rozpúš ťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou d ĺžkou 
sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho 
rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
alebo N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kde: 
N = po čet teoretických poschodí 
V e = elučný objem v maxime píku 
W = šírka píku pri základnej čiare 
W 1/2 = šírka píku v polovici jeho výšky  
1.6.8.  Účinnosť separácie  
Okrem po čtu teoretických poschodí, ktorý ur čuje šírku pásu, hrá pri 
separácii úlohu aj jej ú činnosť, ktorá sa ur čuje na základe strmosti 
kalibračnej krivky. Ú činnosť separácie kolóny možno získa ť z tohto 
vzťahu: 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
veľkosť plochy prierezu kolóny ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kde: 
V e, Mx = elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnos ťou M x 
V e,(10.M x) = elučný objem polystyrénu s desa ťnásobne vä čšou 
molekulovou hmotnos ťou 
Rozlíšiteľnosť systému sa zvy čajne definuje takto:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kde: 
V e1 , V e2 = elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov 
v maxime píku 
W 1 , W  2 = šírky píkov pri základnej čiare 
M 1 , M  2 = molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líši ť 
o faktor 10). 
R-hodnota kolóny musí by ť vyššia ako 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Rozpúš ťadlá 
Všetky rozpúš ťadlá musia ma ť vysoký stupe ň čistoty (pri THF je 
stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na rozpúš ťadlo (v prípade potreby 
s atmosférou inertného plynu) musí by ť dostatočne veľký na to, aby 
umožnil kalibráciu kolóny a analýzu nieko ľkých vzoriek. Pred 
vháňaním do kolóny treba elu čné činidlo zbavi ť plynov pomocou 
čerpadla.  
1.6.10.  Kontrola teploty  
Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slu čka, 
detektor a hadi čky) musí by ť stála a musí zodpoveda ť zvolenému 
rozpúšťadlu.  
1.6.11.  Detektor  
Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie 
vzorky eluovanej z kolóny. V záujme eliminácie zbyto čného rozširo ­
vania píku by mala ma ť kyveta meracej komôrky detektora čo 
možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na 
rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal presahova ť 10 
μl. Ako detek čná metóda sa zvy čajne používa diferenciálna refrak ­
tometria. Možno použi ť aj iné typy detektorov (napríklad UV/VIS, 
IR, viskozitný detektor at ď.), ak si to vyžaduje osobitný charakter 
vzorky alebo elu čného činidla.  
2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY  
2.1. ÚDAJE 
Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vz ťahujúce sa na 
zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). 
Pri každej vzorke je potrebné uskuto čniť dva nezávislé pokusy. 
Každý z nich treba analyzova ť osobitne. 
Pri každom meraní treba uda ť M  n , M  w , M  w /M n a M  p . Treba 
výslovne uvies ť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty, ekviva ­
lentné použitým štandardom. 
Po stanovení reten čných objemov alebo reten čných časov (pod ľa 
možnosti korigovaných použitím vnútorného štandardu) sa vo či 
jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log M  p (M p je 
maximum píku kalibra čného štandardu). Na každú dekádu moleku ­
lových hmotností treba použi ť aspoň dva kalibra čné body, na zostro ­
jenie celej kalibra čnej krivky, ktorá by mala pokrýva ť odhadnutú 
molekulovú hmotnos ť vzorky, je potrebných aspo ň päť bodov. 
Koncový bod kalibra čnej krivky v oblasti nízkych molekulových 
hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhod ­
ného nepolárneho rozpúš ťadla. Pri stanovení sa časť krivky zodpo ­
vedajúcej molekulovým hmotnostiam nižším ako 1 000 pod ľa 
potreby koriguje na ne čistoty a prísady. Nanášacie krivky sa 
zvyčajne hodnotia pomocou elektronického spracovania údajov. 
V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadi ť dokumentom 
ASTM D 3536-91 (3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je 
vysoko pravdepodobné, že jeho molekulová hmotnos ť je vyššia ako 
molekulová hmotnos ť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto 
skutočnosti do úvahy môže by ť nadhodnotenie zastúpenia zložiek 
s nízkou molekulovou hmotnos ťou. Návod na uskuto čnenie korekcie 
obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnos ťou na nerozpustný 
polymér je uvedený v dodatku. 
Distribučná krivka sa musí znázorni ť vo forme tabu ľky alebo 
graficky (diferenciálna frekvencia alebo kumulatívna frekvencia 
v percentách proti log M). V grafickom znázornení by mal ma ť 
jeden poriadok molekulovej hmotnosti d ĺžku 4 cm a výška maxima 
píku by mala by ť asi 8 cm. Pri integrálnych distribu čných krivkách 
by mala by ť vzdialenos ť medzi 0 % a 100 % na osi y približne 
10 cm.  
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie:  
2.2.1.  Testovaná látka:  
— dostupné informácie o testovanej látke (totožnos ť, prísady, 
nečistoty/prímesi), 
— opis spracovania vzorky, zistené skuto čnosti, problémy.  
2.2.2.  Prístroje a zariadenia:  
— zásobník na elu čné činidlo, inertný plyn, odplynenie elu čného 
činidla, zloženie elu čného činidla, ne čistoty/prímesi, 
— čerpadlo, tlmi č pulzov kvapaliny, nanášací systém, 
— rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie 
o charakteristikách kolón, ako napríklad ve ľkosť pórov, druh 
separačného materiálu at ď., počet, dĺžka a usporiadanie použi ­
tých kolón), 
— počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), 
účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnos ť systému), 
— informácie o symetrii píkov, 
— teplota kolóny, spôsob kontroly teploty, 
— detektor (princíp merania, typ, objem kyvety), 
— prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), 
— systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér 
a softvér).  
2.2.3.  Kalibrácia systému:  
— podrobný opis metódy použitej na zostrojenie kalibra čnej krivky,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korela čný 
koeficient, odchýlka sú čtu štvorcov at ď.), 
— informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch 
a aproximáciách, ktoré sa uskuto čnili počas priebehu pokusu 
a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, 
— všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibra čnej 
krivky, musia by ť 
— zdokumentované v tabu ľke, ktorá obsahuje tieto informácie 
pre každý bod merania: 
— názov vzorky, 
— výrobcu vzorky, charakteristické hodnoty štandardov, 
t. j. M  p , M  n , M  w a M  w /M n , tak ako ich uvádza výrobca 
alebo ako boli odvodené z následných meraní, ako aj podrob ­
nosti o metóde stanovenia, 
— nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky, 
— hodnotu M  p , ktorá bola použitá na kalibráciu, 
— elučný objem alebo opravený reten čný čas nameraný pri 
maxime píku, 
— M  p vypočítanú v maxime píku, 
— percentuálnu odchýlku vypo čítanej hodnoty M  p od kali­
bračnej krivky.  
2.2.4.  Informácie o obsahu polyméru s nízkou molekulovou hmotnos ťou: 
— opis metódy, ktorá sa použila na vykonanie analýzy, a spôsobu 
vykonania pokusu, 
— informácie o percentuálnom obsahu molekúl s nízkou moleku ­
lovou hmotnos ťou (w/w) vzh ľadom na celkové množstvo vzorky, 
— informácie o percentuálnom obsahu (w/w) ne čistôt, prísad 
a iných molekúl nepolymérovej povahy vzh ľadom na celkové 
množstvo vzorky.  
2.2.5.  Vyhodnotenie:  
— vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpe čenie 
požadovanej reprodukovate ľnosti (korek čná metóda, vnútorné 
štandardy at ď.), 
— informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe 
elučného objemu alebo reten čného času, 
— informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná 
úplná analýza píku, 
— opis vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa použila, 
— príprava a predbežné spracovanie vzorky, 
— prítomnos ť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— objem ( μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, 
— opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobi ť odchýlku od ideálneho 
GPC profilu, 
— podrobné opísanie modifikácií uskuto čnených v testovacej 
metóde, 
— podrobnosti o rozsahu chýb merania, — všetky iné informácie a pozorované skuto čnosti, ktoré by mohli 
byť významné z h ľadiska interpretácie výsledkov.
 
3. ODKAZY  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. 
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size- Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Dodatok  
Návod na uskuto čnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou 
hmotnosťou na nerozpustný polymér  
Prítomnos ť nerozpustného polyméru vo vzorke spôsobuje úbytok hmotnosti 
počas analýzy GPC. Nerozpustný polymér sa nevratne zachytáva v kolóne 
alebo na filtri, zatia ľ čo rozpustná časť vzorky prechádza cez kolónu. Ak je 
možné ur čiť alebo mera ť prírastok indexu lomu (dn/dc) polyméru, potom je 
možné ur čiť aj veľkosť straty hmotnosti vzorky v kolóne. V takomto prípade 
sa uskuto čňuje korekcia pomocou externej kalibrácie, pri ktorej sa na kalibro ­
vanie odpovede refraktometra používajú štandardné materiály so známou koncen ­
tráciou a známym pomerom dn/dc. V príklade, ktorý je uvedený v ďalšom texte, 
sa ako štandard použil poly(metyl)metakrylát (pMMA). 
Pri externej kalibrácii pre analýzu akrylových polymérov sa ako štandard používa 
roztok pMMA so známou koncentráciou v tetrahydrofuráne, ktorý sa podrobuje 
analýze pomocou GPC. Zo získaných údajov sa pomocou tohto vz ťahu zistí 
konštanta refraktometra: 
K = R/(C × V × dn/dc) 
kde: K = konštanta refraktometra (v mikrovoltsekundách/ml), R = nameraná hodnota pre pMMA (v mikrovoltsekundách), C = koncentrácia štandardu pMMA (mg/ml), V = objem vzorky nanesenej do refraktometra (ml) a 
dn/dc = prírastok indexu lomu pre roztok pMMA v tetrahydrofuráne (v ml/ ­
mg). 
Pri štandardoch pMMA sa zvy čajne získavajú tieto údaje: 
R = 2 937 891 C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 × 10
 -5 ml/mg 
Výsledná hodnota K = 3,05 × 10  11 sa potom použije na vypo čítanie teoretickej 
odpovede detektora, ak ním prejde 100 % naneseného polyméru.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  ROZPÚŠ ŤACIE/EXTRAKTÍVNE VLASTNOSTI POLYMÉROV 
VO VODE  
1. METÓDA  
Metóda je prevzatá z revidovanej verzie OECD TG 120 (1997). 
Ďalšie technické informácie sa nachádzajú v odkaze (1).  
1.1. ÚVOD 
Skôr ako sa pri ur čitých polyméroch, napríklad emulzných, bude da ť 
použiť metóda, ktorá je opísaná v ďalšom texte, môže by ť potrebné 
vykonať prípravné postupy. Metódu nemožno použi ť pri kvapalných 
polyméroch a pri polyméroch, ktoré pri pokusných podmienkach 
reagujú s vodou. 
V prípadoch, v ktorých nie je metóda praktická alebo uskuto čniteľná, 
možno extrak čné vlastnosti polymérov stanovova ť inými metódami, 
ktoré je potrebné podrobne opísa ť a ich použitie odôvodni ť. 
1.2. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Extraktívne vlastnosti polymérov vo vodnom prostredí sa stanovujú 
pomocou bankovej metódy (pozri A.6 Rozpustnos ť vo vode, 
Banková metóda) s modifikáciami, ktoré sú opísané v ďalšom texte.  
1.4. KVALITATÍVNE KRITÉRIÁ 
Žiadne.  
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Vybavenie  
Pre metódu je potrebné toto vybavenie: 
— drviace zariadenie, napríklad drvi č, na získanie čiastočiek so 
známou ve ľkosťou, 
— trepacie zariadenie s možnos ťou kontrolovania teploty, 
— systém membránových filtrov, 
— primerané analytické zariadenie, 
— štandardizované sitá.  
1.5.2.  Príprava vzorky  
Reprezentatívna vzorka sa najprv rozdrví a pomocou primeraných sít 
upraví tak, aby sa získali čiastočky s veľkosťou medzi 0,125 mm 
a 0,25 mm. Po čas drvenia môže by ť v záujme zachovania stability 
vzorky potrebné zabezpe čiť chladenie. Materiály gumovitej konzis ­
tencie možno drvi ť pri teplote kvapalného dusíka (1). 
Ak dosiahnutie uvedeného rozmeru čiastočiek nie je možné, potom 
je potrebné pokúsi ť sa o dosiahnutie ich najmenšieho možného 
rozmeru a výsledok treba zaznamena ť. V testovacom protokole je 
potrebné uvies ť spôsob uskladnenia vzorky pred vykonaním testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Postup  
Do každej z troch nádob so sklenou zátkou sa naváži 10 g testovanej 
látky a pridá sa k nim 1 000 ml vody. Ak spracúvanie 10 g testovanej látky nie je z praktického h ľadiska možné, potom 
treba použi ť jej najvyššie možné množstvo blízke tejto hodnote 
a objem vody mu treba príslušným spôsobom prispôsobi ť. 
Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešava ť pri teplote 
20
 o C. Treba pri tom použi ť trepacie alebo miešacie zariadenie 
pracujúce pri stálej teplote. Po 24 hodinách sa obsah každej nádoby 
scentrifuguje alebo prefiltruje a pomocou vhodnej analytickej metódy 
sa v čírej vodnej fáze stanoví koncentrácia polyméru. Ak pre vodnú 
fázu neexistujú vhodné analytické metódy, potom možno celkovú rozpustnos ť/extraktivitu stanovi ť na základe suchej hmotnosti zvyšku 
na filtri alebo suchej hmotnosti scentrifugovanej usadeniny. 
Zvyčajne býva potrebné uskuto čniť kvantitatívne rozlíšenie medzi 
nečistotami a prímesami na jednej strane a medzi polymérnymi zlož ­
kami s nízkou molekulovou hmotnos ťou na druhej strane. V prípade 
gravimetrických stanovení je tiež dôležité vykona ť slepé meranie bez 
testovacej látky, aby sa vzali do úvahy prímesi/ne čistoty, ktoré sa do 
pokusu zanášajú po čas jeho postupu. 
Rozpúšťacie/extraktívne správanie polymérov vo vode pri 37
 o C pH 
2 a pH 9 možno stanovi ť rovnakým spôsobom ako pri vykonávaní 
pokusu pri 20  o C. Požadované hodnoty pH možno dosiahnu ť 
pridaním bu ď vhodných tlmivých roztokov, alebo vhodných kyselín, 
alebo zásad, ako sú kyselina chlorovodíková, kyselina octová, hydroxid sodný alebo draselný analytickej čistoty, alebo NH
 3 . 
V závislosti od použitej analytickej metódy treba uskuto čniť jeden 
alebo dva testy. Ak sú na priame analyzovanie obsahu polymérovej zložky vodnej fázy k dispozícii dostato čne špecifické metódy, potom 
by mal posta čovať jediný z horeuvedených testov. Ak však takéto 
metódy k dispozícii nie sú a stanovenie rozpúš ťacích/extraktívnych 
vlastností polyméru je obmedzené na nepriamu analýzu pomocou stanovenia iba celkového množstva organicky viazaného uhlíka 
(TOC) vo vodnom extrakte, potom je potrebné uskuto čniť prídavný 
test. Takýto prídavný test je potrebné vykona ť v triplikátoch 
s použitím desa ťnásobne menšieho množstva polyméru 
a rovnakého množstva vody ako pri prvom teste.
 
1.5.4.  Analýza  
1.5.4.1.  Testy vykonávané s jedným množstvom vzorky  
Môžu existova ť metódy na priamu analýzu polymerických zložiek 
vodnej fázy. Možno uvažova ť taktiež o nepriamej analýze 
rozpustených/extrahovaných zložiek, pri ktorej sa stanovuje celkové množstvo rozpustných čiastočiek, ktoré sa upravuje na obsah zložiek 
nepolymérovej povahy. 
Analýzu celkového obsahu polymérových látok vo vodne fáze 
možno uskuto čniť: 
buď pomocou dostato čne citlivej metódy, napríklad: 
— pomocou stanovenia TOC, pri ktorom sa vzorka najprv rozloží kyse ­
linou persírovou alebo kyselinou dvojchrómovu za vzniku CO
 2 , po 
čom nasleduje stanovenie pomocou IR alebo chemickej analýzy,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— pomocou atómovej absorp čnej spektrometrie (AAS) alebo na 
ekvivalentnej metóde založenej na emisii induktívne naviazanej 
plazmy (Inductively Coupled Plasma, ICP) pri polyméroch s obsahom kremíka alebo kovov, 
— pomocou UV absorpcie alebo spektrofluorometrie pri arylových 
polyméroch, 
— LC-MS pri nízkomolekulárnych vzorkách, alebo pomocou vákuového odparenia vodného extraktu dosucha 
a následnou spektroskopickou (IR, UV at ď.) alebo AAS/ICP 
analýzou zvyšku. 
Ak analýza vodnej fázy ako takej nie je z praktického h ľadiska 
uskutočniteľná, potom treba podrobi ť vodný extrakt extrakcii orga ­
nickým rozpúš ťadlom nemiešate ľným s vodou, čo môže by ť 
napríklad chlórovaný uh ľovodík. Rozpúš ťadlo sa potom nechá 
odpariť a zvyšok sa analyzuje na obsah daného polyméru vyššie 
uvedeným spôsobom. Všetky zložky takéhoto zvyšku, ktoré sa vyhodnotia ako ne čistoty alebo prímesi, je potrebné od výsledku 
odrátať, aby sa stanovil stupe ň rozpustnosti/extrakcie iba samotného 
polyméru. 
Ak je množstvo takýchto materiálov vo vzorke relatívne ve ľké, 
potom môže by ť potrebné podrobi ť zvyšok napríklad analýze 
pomocou HPLC alebo GC. Umožní to odlíši ť nečistoty od prítom ­
ných monomérov alebo ich derivátov, čím sa umožní stanovenie ich 
skutočného obsahu. 
V niektorých prípadoch môže posta čovať jednoduché odparenie 
organického rozpúš ťadla dosucha a odváženie zvyšku.
 
1.5.4.2.  Testy vykonávané s dvoma množstvami vzorky  
Všetky vodné extrakty sa analyzujú na prítomnos ť TOC. 
Nerozpustená/neextrahovaná časť vzorky sa podrobí gravimetric ­
kému stanoveniu. Ak zostanú po centrifugácii alebo filtrácii obsahu 
každej banky prichytené na stenách nádoby zvyšky polyméru, potom 
treba nádobu oplachova ť filtrátom dovtedy, kým sa na jej stenách 
nebude nachádza ť žiaden vidite ľný zvyšok. Filtrát sa potom podrobí 
opätovnej centrifugácii alebo filtrácii. Zvyšky, ktoré zostanú na filtri 
alebo v centrifuga čnej kyvete, sa nechajú vysuši ť pri 40  o C a odvážia 
sa. V sušení sa pokra čuje až po dosiahnutie konštantnej hmotnosti.  
2. ÚDAJE  
2.1. TESTY VYKONÁVANÉ S JEDNÝM MNOŽSTVOM VZORKY 
Je potrebné uvies ť jednotlivé výsledky získané pri každej z troch 
baniek a priemerné hodnoty vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem roztoku (zvy čajne mg/l) alebo v jednotkách hmotnosti na 
hmotnosť vzorky polyméru (zvy čajne mg/g). Treba uvies ť i straty 
hmotnosti vzorky (vypo čítané ako hmotnos ť rozpustenej látky vyde ­
lená hmotnos ťou pôvodnej vzorky). Treba vypo čítať relatívne štan ­
dardné odchýlky (RSD). Údaje pre celkové množstvo látky (polymér + hlavné prímesi at ď.) a iba pre samotný polymér 
(t. j. po od čítaní príspevku vyššie uvedených prímesí) treba uvies ť 
osobitne.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. TESTY VYKONÁVANÉ S DVOMA MNOŽSTVAMI VZORKY 
Treba uvies ť jednotlivé hodnoty TOC vodných extraktov oboch 
pokusov vykonaných v triplikátoch, vyjadrené v jednotkách hmot ­
nosti na objem rozpúš ťadla (zvy čajne mgC/l), ako aj v jednotkách 
hmotnosti na hmotnos ť pôvodnej vzorky (zvy čajne mgC/g). 
Z neexistencie rozdielu medzi výsledkami získanými pri vysokom 
a nízkom pomere vzorka/voda môže vyplýva ť, že všetky extrahova ­
teľné látky boli skuto čne aj extrahované. V takomto prípade nebude 
priama analýzy zvy čajne potrebná. 
Treba uvies ť jednotlivé hmotnosti zvyškov vyjadrené ako percentu ­
álny podiel z pôvodnej hmotnosti vzorky. Pri každom z pokusov treba vypo čítať priemerné hodnoty. Rozdiely medzi hodnotou 100 
a zisteným percentuálnym zastúpením predstavujú percentuálne 
zastúpenie rozpustenej a extrahovate ľnej hmoty v pôvodnej vzorke.
 
3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie:  
3.1.1.  Testovaná látka:  
— dostupné informácie o testovanej látke (totožnos ť, prímesy, 
nečistoty, obsah nízkomolekulárnych zložiek).  
3.1.2.  Pokusné podmienky:  
— opis použitých postupov a pokusných podmienok, 
— opis analytických a detek čných metód.  
3.1.3.  Výsledky:  
— výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovate ľnosti v mg/l; jednotlivé 
a priemerné hodnoty extrak čných testov pri jednotlivých roztokoch, 
rozdelené pod ľa obsahu polyméru a ne čistôt, prímesí at ď., 
— výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovate ľnosti v 
mg/g polyméru, 
— TOC hodnoty vodných extraktov, hmotnos ť rozpusteného 
podielu a vypo čítané percento, ak bolo stanovené, 
— pH každej vzorky, 
— informácie o hodnotách získaných pri slepých vzorkách, 
— ak je potrebné, aj informácie o chemickej nestálosti testovanej 
látky počas samotného testovania aj analytických postupov, 
— všetky informácie, ktoré môžu ma ť význam pre interpretovanie 
výsledkov.  
4. ODKAZY  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  OXIDA ČNÉ VLASTNOSTI (KVAPALINY)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda je ur čená na meranie potenciálu kvapalnej látky zvýši ť 
rýchlosť alebo intenzitu horenia hor ľavej látky alebo tvori ť 
s horľavou látkou zmes, ktorá sa samovo ľne vznieti, ke ď sa obe 
látky dôkladne zmiešajú. Zakladá sa na teste OSN pre oxidujúce kvapaliny (1) a je s ním rovnocenná. Metóda A.21 je ur čená predo ­
všetkým na splnenie požiadaviek nariadenia (ES) č. 1907/2006, 
vyžaduje sa však porovnanie iba s jednou referen čnou látkou. Ak 
sa očakáva, že výsledky testu sa použijú na iné ú čely, môže by ť 
potrebné testovanie a porovnanie s ďalšími referen čnými látkami (
 1 ). 
Tento test nie je potrebné vykona ť, ak sa na základe posúdenia 
štruktúrneho vzorca nepochybne potvrdí, že látka nie je schopná 
s horľavým materiálom exotermicky reagova ť. 
Pred uskuto čnením testu je užito čné mať predbežné informácie 
o akýchko ľvek potenciálnych výbušných vlastnostiach látky. 
Tento test nie je vhodný pre tuhé látky, plyny, výbušné alebo ve ľmi 
horľavé látky, alebo organické peroxidy. 
Ak sú pre testovanú látku už dostupné výsledky testu OSN pre 
oxidujúce kvapaliny, tento test sa nemusí vykona ť (1). 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Priemerný čas zvýšenia tlaku je priemerná hodnota nameraných 
časov, počas ktorých testovaná zmes spôsobí zvýšenie tlaku od 
690 kPa do 2 070 kPa nad atmosférický tlak.  
1.3. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Ako referen čná látka sa používa vodný roztok kyseliny dusi čnej (65 
hmotnostných %, čistota p. a. – analyticky čistý) (  2 ). ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Napríklad v rámci transportných predpisov OSN. 
( 2 ) Kyselina sa musí titrova ť pred testovaním, aby sa potvrdila jej koncentrácia.
 Nepovinne, ak experimentátor predpokladá, že výsledky tejto skúšky 
sa môžu prípadne použi ť na iné ú čely (  1 ), môže sa tiež vykona ť 
skúška ďalších referen čných látok (  2 ). 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Kvapalina, ktorá sa má testova ť, sa zmieša s vláknitou celulózou 
v hmotnostnom pomere 1:1 a zmes sa nadávkuje do tlakovej nádoby. 
Ak počas zmiešavania alebo dávkovania nastane samovo ľné vznie­
tenie, ďalšie testovanie nie je potrebné. 
Ak samovznietenie nenastane, vykoná sa celý test. Zmes sa 
v tlakovej nádobe zahrieva a stanoví sa priemerný čas zvýšenia 
tlaku od 690 kPa do 2 070 kPa nad atmosférický tlak. Tento čas 
sa porovná s priemerným časom zvýšenia tlaku pre zmes referen čnej 
látky (referen čných látok) a celulózy (1:1).  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
V sérii piatich pokusov na jedenej látke by sa ani jeden výsledok 
nemal odlišova ť od aritmetického priemeru o viac ako 30 %. 
Výsledky, ktoré sa odlišujú od priemeru o viac ako 30 %, sa vylú čia, 
zdokonalí sa postup zmiešavania a dávkovania a testovanie sa zopa ­
kuje.  
1.6. OPIS METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
1.6.1.1.  Horľavá látka  
Ako hor ľavý materiál sa používa vysušená, vláknitá celulóza 
s dĺžkou vlákien medzi 50 μm a 250 μm a priemernou hodnotou 
priemeru 25 μm (  3 ). Celulóza sa suší pri 105  o C počas 4 hodín do 
konštantnej hmotnosti vo vrstve s hrúbkou najviac 25 mm a po čas 
chladnutia a pred použitím sa uchováva v exsikátore so sušidlom. 
Obsah vody vo vysušenej celulóze by mal by ť nižší ako 0,5 % 
suchej hmotnosti (  4 ). Na to, aby sa dosiahla takáto hodnota, sa 
v prípade potreby čas sušenia pred ĺži (  5 ). Počas skúšky je potrebné 
používať rovnakú šaržu celulózy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Napríklad v rámci transportných predpisov OSN. 
( 2 ) Napr.: 50 hmotnostných % (w/w) perchlórovej kyseliny a 40 hmotnostných % chlore č­
nanu sodného sa používa v odkaze (1). 
( 3 ) t. j. celulózový prášok z Whatmanovej st ĺpcovej chromatografie CF 11, katalógové 
č. 4021 050. 
( 4 ) Potvrdené (napr.) Karl-Fisherovou titráciou. 
( 5 ) Alternatívne sa môže tento obsah vody tiež dosiahnu ť (napr.) zahriatím na 105  o C vo 
vákuu na 24 h.
 1.6.1.2.  Aparatúra  
1.6.1.2.1. T l a k o v á n á d o b a 
Používa sa tlaková nádoba. Nádoba pozostáva z oce ľovej tlakovej 
nádoby valcovitého tvaru s d ĺžkou 89 mm a vonkajším priemerom 
60 mm (pozri obrázok 1). Dve plochy na proti ľahlých stranách sú 
opracované (zmenšujúc prierez nádoby na 50 mm), aby bolo možné namontovanie zážihového a odvzduš ňovacieho nástavca. Nádoba má 
vnútorný priemer 20 mm a na oboch koncoch je zoslabená do h ĺbky 
19 mm a opatrená závitom 1'' (1 palec) pod ľa BSP (British Standard 
Pipe) alebo jeho metrickým ekvivalentom. Sníma č tlaku v tvare 
bočného ramena je priskrutkovaný k zaoblenému povrchu tlakovej 
nádoby vo vzdialenosti 35 mm od jedného konca a v 90
 o uhle 
k opracovaným stranám. Príslušný otvor je vyv ŕtaný do h ĺbky 
12 mm a na konci bo čného ramena vybavený závitom na 1/2 
podľa BSP (alebo jeho metrickým ekvivalentom). V prípade potreby 
sa na zabezpe čenie plynotesného utesnenia upevní inertné tesnenie. 
Bočné rameno vy čnieva 55 mm z tlakovej nádoby a má 6 mm vývrt. 
Koniec bo čného ramena je zoslabený a opatrený závitom na pripo ­
jenie membránového sníma ča tlaku. Môže sa použi ť akékoľvek 
zariadenie na meranie tlaku, ktoré je odolné vo či pôsobeniu horúcich 
plynov alebo produktov rozkladu a na rýchlos ť zvýšenia tlaku 
v rozsahu 690 – 2 070 kPa dokáže reagova ť za najviac 5 ms. 
Koniec tlakovej nádoby, ktorý je ďalej od bo čného ramena, je uzat ­
vorený zážihovým nástavcom, ktorý je vybavený dvoma elektró ­
dami, jednou izolovanou od telesa nástavca a druhou uzemnenou k nástavcu. Druhý koniec tlakovej nádoby je uzatvorený poistným diskom (kritický tlak približne 2 200 kPa), upevneným 
v uzatváracom nástavci s 20 mm vývrtom. V prípade potreby sa 
na zabezpe čenie plynotesného utesnenia zážihového nástavca použije 
inertné tesnenie. Po čas používania je zariadenie udržiavané 
v správnej polohe stojanom (obrázok 2). Zvy čajne sa skladá 
z podložky z mäkkej ocele s rozmermi 235 mm × 184 mm × 
6 mm a zo 185 mm dlhého štvorcového dutého profilu ( ďalej len 
„Š.D.P.“) s rozmermi 70 mm × 70 mm × 4 mm. 
Profil je na proti ľahlých stranách jedného konca Š.D.P. zrezaný tak, 
že vznikne konštrukcia s dvoma plochými ramenami, ktoré pre čnie­
vajú o 86 mm nad celým rámom profilu. Konce plochých ramien sú zrezané pod uhlom 60
 o k horizontálnej rovine a privarené 
k podložke. Na jednej strane vrchného konca základne profilu je 
vyrezaný 22 mm široký a 46 mm hlboký otvor tak, aby sa pri vložení tlakovej nádoby do rámu profilu stojana dostal prvý záži ­
hový nástavec a aby bo čné rameno zapadlo do otvoru. Kus ocele, 
široký 30 mm a hrubý 6 mm, ktorý má funkciu rozpery, je privarený 
k dolnej časti vnútornej plochy rámu profilu. Na upevnenie tlakovej 
nádoby slúžia dve 7 mm prítla čné skrutky, ktoré sú priskrutkované 
do protiľahlej strany. Zospodu podopierajú tlakovú nádobu dva 
12 mm široké pásy 6 mm hrubej ocele, privarené k bo čným stranám 
dosadajúcim na rám profilu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. S y s t é m z á ž i h u 
Systém zážihu pozostáva z 25 cm dlhého Ni/Cr drôtu, ktorý má 
priemer 0,6 mm a odpor 3,85 ohm/m. Drôt má špirálovitý tvar 
s vnútorným priemerom 5 mm a je pripojený k elektródam zážiho ­
vého nástavca. Špirála musí by ť usporiadaná jedným zo spôsobov 
zobrazených na obrázku 3. Vzdialenos ť medzi dnom nádoby 
a spodnou časťou zážihovej špirály je 20 mm. Ak nie sú elektródy 
nastaviteľné, konce zážihového drôtu medzi špirálou a dnom nádoby 
musia by ť izolované keramickým obalom. Drôt sa rozžeravuje 
konštantným prúdom najmenej 10 A.  
1.6.2.  Vykonanie testu  ( 1 ) 
Kompletne zmontovaná aparatúra so sníma čom tlaku a zážihovým 
systémom, ale bez vloženého poistného disku, sa pripevní na stojan tak, že zážihový nástavec bude v dolnej časti. V sklenenej kadi čke sa 
sklenenou ty činkou premieša 2,5 g testovanej kvapaliny s 2,5 g sušenej 
celulózy (
 2 ). Z bezpe čnostných dôvodov sa miešanie vykonáva 
s ochranným štítom, ktorý je medzi experimentátorom a zmesou. Ak sa počas miešania alebo plnenia zmes vznieti, ďalšie testovanie nie je 
potrebné. Zmes sa pridáva do tlakovej nádoby v malých dávkach 
poklepávaním do tlakovej nádoby, pri čom sa musí dáva ť pozor na 
to, aby zmes dostato čne pokryla zážihovú špirálu a bola s ňou 
v dobrom kontakte. Je dôležité, aby sa špirála po čas dávkovania nezde ­
formovala, pretože by to mohlo vies ť k chybným výsledkom (
 3 ). Do 
uzatváracieho nástavca sa vloží poistný disk a nástavec sa pevne 
zaskrutkuje. Naplnená nádoba sa presunie do stojanu tak, aby bol poistný disk v hornej polohe, umiestni sa vo vhodnom vystuženom digestore alebo v spa ľovacej komore. Do zážihového nástavca sa 
pripojením na externú zásuvku pustí prúd 10 A. Čas medzi za čiatkom 
miešania a zapnutím prúdu by nemal presiahnu ť 10 minút. 
Signál z tlakového sníma ča sa zaznamenáva na vhodný systém, ktorý 
umožňuje meranie a vytváranie permanentného záznamu získaného 
časového profilu zmeny tlaku (napr. záznamník spojený so zapiso ­
vačom). Zmes sa zahrieva dovtedy, kým nepraskne poistný disk 
alebo neuplynie aspo ň 60 s. Ak poistný disk nepraskne, zmes sa 
pred opatrným rozobratím aparatúry nechá vychladnú ť, pričom je 
potrebné dodržiava ť bezpečnostné opatrenia pre prípad možného 
výskytu zvýšeného tlaku. Vykonáva sa pä ť pokusov s testovanou 
látkou a referen čnou látkou (referen čnými látkami). Zaznamenáva 
sa čas potrebný na zvýšenie tlaku zo 690 kPa na 2 070 kPa nad 
atmosférický tlak. Vypo číta sa priemerný čas zvýšenia tlaku. 
V niektorých prípadoch môžu chemické reakcie látok, ktoré nesú ­
visia s ich oxida čnými vlastnos ťami, spôsobi ť (príliš vysoké alebo 
príliš nízke) zvýšenie tlaku. V takýchto prípadoch môže by ť 
potrebné kvôli objasneniu povahy reakcie zopakova ť test 
s inertnou látkou namiesto celulózy, napr. diatomit (kremelina).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) So zmesami oxida čných činidiel s celulózou sa musí zaobchádza ť ako s potenciálne 
explozívnymi a treba s nimi manipulova ť s náležitou pozornos ťou. 
( 2 ) V praxi sa to dá dosiahnu ť prípravou zmesi testovanej kvapaliny s celulózou v pomere 
1:1 vo vä čšom množstve, ako je potrebné pre test, a do tlakovej nádoby sa nadávkuje 
5 g ± 0,1 g. Pre každý test osobitne sa pripraví čerstvá zmes. 
( 3 ) Je potrebné zabráni ť najmä kontaktu medzi susednými závitmi špirály.
 2. ÚDAJE  
Čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referen čnú látku (referen čné 
látky). Čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku 
a referenčnú látku (referen čné látky). 
Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou 
látkou, ak sa realizovali. 
Niektoré príklady výsledkov sú uvedené v tabu ľke 1.  
Tabuľka 1 
Príklady výsledkov  ( a ) 
Látka (  b ) Priemerný čas zvýšenia tlaku pre zmes s celulózou 
v pomere 1:1 
(ms) 
Dichróman amónny, nasýtený vodný roztok 20 800 
Dusičnan vápenatý, nasýtený vodný roztok 6 700 
Dusičnan železitý, nasýtený vodný roztok 4 133 
Chloristan lítny, nasýtený vodný roztok 1 686 
Chloristan hore čnatý, nasýtený vodný roztok 777 
Dusičnan nikelnatý, nasýtený vodný roztok 6 250 
Kyselina dusi čná, 65 % 4 767 (  c ) 
Kyselina chloristá, 50 % 121 (  c ) 
Kyselina chloristá, 55 % 59 Dusičnan draselný, 30 % vodný roztok 26 690 
Dusičnan strieborný, nasýtený vodný roztok (
 d ) 
Chlorečnan sodný, 40 % vodný roztok 2 555 (  c ) 
Dusičnan sodný, 45 % vodný roztok 4 133  
Inertná látka  
Voda: celulóza (  d ) 
( a ) Priemerná hodnote z medizilaboratórnych porovnácacích skúšok. 
( b ) Maximálny tlak 2 070 kPa nedosiahnutý. 
( c ) Nasýtené roztoky sa pripravujú pri teplote 20  o C. 
( d ) Pozri odkaz (1) na interpretáciu výsledkov pod ľa transportných predpisov OSN pri použití rôznych referen čných 
látok. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste obsahuje tieto informácie: 
— identifikáciu, zloženie, čistotu atď. testovanej látky, 
— koncentráciu testovanej látky, — postup sušenia použitej celulózy, — obsah vody v použitej celulóze, 
— výsledky meraní, 
— výsledky testov s inertnou látkou, ak existujú, — vypočítané priemerné časy zvýšenia tlaku, 
— všetky odchýlky od tejto metódy a ich dôvody, 
— všetky dopl ňujúce poznámky a poznámky dôležité pre interpre ­
táciu výsledkov.
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV (  1 ) 
Výsledky testov sa vyhodnotia na základe: 
a) toho, či sa zmes testovanej látky a celulózy samovo ľne vznieti, a 
b) porovnania priemerného času potrebného na zvýšenie tlaku od 
690 kPa do 2 070 kPa s časom potrebným na zvýšenie tlaku 
v prípade referen čnej látky (referen čných látok). 
Kvapalná látka sa pokladá za oxida čné činidlo, ke ď: 
a) sa zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 samovo ľne 
vznieti alebo 
b) zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 má priemerný 
čas zvýšenia tlaku menší alebo rovnaký ako priemerný čas 
zvýšenia tlaku zmesi vodného roztoku kyseliny dusi čnej 
a celulózy (65 hmotnostných %). 
Na to, aby bol vylú čený falošný pozitívny výsledok, sa v prípade 
potreby pri interpretácii výsledkov zoberú do úvahy aj výsledky získané pri testovaní látky s inertným materiálom.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Pozri odkaz (1) na interpretáciu výsledkov pod ľa transportných predpisov OSN pri 
použití rôznych referen čných látok.
 4. ODKAZY  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publica ­
tion No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, 342. Test O.2: Test for 
oxidizing liquids.  
Obrázok 1  
Tlaková nádoba
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Obrázok 2  
Stojan
  
Obrázok 3  
Systém zážihu
  
Poznámka: Môže sa použi ť ktorákoľvek z týchto zostáv.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  DĹŽKOVÁ HODNOTA GEOMETRICKÉHO VYJADRENIA 
PRIEMERU VLÁKEN  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda opisuje postup merania d ĺžkovej hodnoty geometric ­
kého vyjadrenia priemeru (Length Weighted Geometric Mean 
Diameter – LWGMD) objemu umelých minerálnych vláken (Man Made Mineral Fibres – MMMF). Ke ďže hodnota LWGMD štatistic ­
kého súboru sa bude s 95 % pravdepodobnos ťou nachádza ť medzi 
95 % hladinami spo ľahlivosti vzorky (t. j. LWGMD ± 2 štandardné 
chyby), vykazovaná hodnota (testovacia hodnota) bude na nižšej úrovni 95 % hladiny spo ľahlivosti (napríklad LWGMD – dve štan ­
dardné chyby). Metóda je založená na aktualizácii (jún 1994) návrhu 
postupu HSE (Health and Safty Executive – Výkonný výbor pre 
zdravie a bezpe čnosť), ktorý bol prijatý 26. septembra 1993 na 
stretnutí medzi ECFIA (European Ceramic Fibres Industry Associa ­
tion – Európska asociácia odvetví priemyselných vláken) a HSE 
v Chesteri a bol vyvinutý pri druhej medzilaboratórnej skúške (1,2). 
Táto metóda merania sa môže používa ť na určenie priemeru vlákna 
látok výrobkov obsahujúcich MMMF vrátane oh ňovzdorných kera ­
mických vláken (RCF), umelých sklovitých vláken (MMVF), kryš ­
talických a polykryštalických vláken. 
Dĺžková hmotnos ť vyjadruje nahradenie vplyvu rozloženia na 
priemer v dôsledku porušenia dlhých vláken po čas odoberania, 
prípadne narábania s materiálom. Geometrická štatistika (geome ­
trická hodnota) sa používa na meranie miery rozloženia MMMF 
priemerov, pretože tieto priemery mávajú zvy čajne veľkosť rozlože­
nia, ktorá sa približuje k normálnej polohe. 
Meranie d ĺžky, ako aj priemeru je zd ĺhavé a zárove ň časovo náro čné, 
ale ak sa merajú len tie vlákna, ktoré sa plynulo dotýkajú tenkou 
čiarou po ľa SEM poh ľadu, potom je pravdepodobnos ť výberu 
daného vlákna pomerná k jeho d ĺžke. Takto sa ur čí dĺžka pri výpo č­
toch dĺžkových hodnôt, pri čom jedinou požadovanou hodnotou je 
veľ
kosť priemeru, a LWGMD-2SE sa môže vypo čítať, ako bolo 
uvedené.  
1.2. POJMY  
Zrno : predmet s pomerom d ĺžky k šírke menej ako 3:1.  
Vlákno : Predmet s pomerom d ĺžky k šírke (pomer strán) menej 
ako 3:1.  
1.3. ROZSAH A OBMEDZENIA 
Metóda sa zameriava na zobrazenie rozloženia priemeru, ktorý má 
strednú hodnotu od 0,5 μm do 6 μm. Väčšie priemery sa môžu 
zmerať s použitím menšieho zvýšenia SEM, ale táto metóda bude 
značne obmedzená pri jemnejšom rozložení vlákna a meranie 
pomocou TEM (mikroskop prenosu elektrónov) sa odporú ča 
v prípade, ak je stredná hodnota priemeru nižšia ako 0,5 μm. ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Určité množstvo reprezentatívnej vzorky sa odoberie z vlákninovej 
zóny alebo vo ľne uloženého vlákna. Vo ľné vlákna sa skrátia 
s použitím postupu drvenia a reprezentatívna časť vzorky sa rozptýli 
vo vode. Hmota sa potom oddelí a prefiltruje polykarbonátovým 
filtrom cez sito s okami ve ľkosti 0,2 μm a pripraví na skúšku 
s použitím techniky skenovacieho elektrónového mikroskopu (SEM). Priemer vláken sa odmeria na 10 000-násobne zvä čšenej obrazovke, 
prípadne vä čšom zväčšení (
 1 ) s použitím metódy priese čníka, ktorá 
poskytne nestranný odhad strednej hodnoty priemeru. Vypo číta sa 
spodná hodnota 95 % intervalu spo ľahlivosti (na základe jednostran ­
ného testu) a stanoví sa odhad najnižšej hodnoty geometrického 
vyjadrenia priemeru vláken materiálu.  
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Bezpe čnostné opatrenia  
Priamy kontakt s jemnými vláknami sa musí obmedzi ť na minimum 
a pri narábaní so suchými vláknami je nutné používa ť digestor alebo 
odkladaciu skrinku. Pravidelné monitorovanie kontaktu s látkami sa 
vykonáva na ú čel stanovenia efektívnosti kontrolných metód. Pri 
narábaní s MMMF je nevyhnutné používa ť rukavice na jednorazové 
použitie, aby sa predišlo podráždeniu pokožky a zabránilo krížovej kontaminácii (nakazeniu).
 
1.5.2.  Prístroje/zariadenia  
— lis a farbivo (schopný vyprodukova ť tlak 10 Mpa), 
— polykarbonátové kapilárne pórovité filtre s ve ľkosťou pórov 
0,2 μm (priemer 25 mm), 
— membránový celulózový filter s ve ľkosťou pórov 5 μm, určený 
ako pomocný filter, 
— sklený filtra čný prístroj (alebo jednorazové filtra čné systémy) 
umožňujúce požitie filtrov s priemerom 25 mm (napríklad mili ­
pórová sklená mikroanalýzová sada, typ č. XX10 025 00), 
— čistá destilovaná voda získaná prefiltrovaním cez filter 
s veľkosťou pórov 0,2 μm na účely odstránenia mikroorganiz ­
mov, 
— katódový rozprašova č s anódou zo zlata, prípadne zo zlata či 
paládia, 
— skenovací (rastrovací) elektrónový mikroskop s rozlišovacou 
schopnosťou do 10 nm a pracujúci s 10 000-násobným zvä čše­
ním, 
— rôzne: stierky, skalpel s čepeľou typu 24, kliešti čky, SEM 
tubusy, karbónové lepidlo alebo karbónová lepiaca páska, strie ­
borný skalpel, 
— ultrazvuková sonda alebo ultrazvuková vani čka na doske labora ­
tórneho stola, 
— odobera č vzorky sedimentov alebo korkovrt na odoberanie 
vzoriek z pokrývky MMMF.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Táto hodnota zvä čšenia sa uvádza pre vlákna s priemerom 3 μm, pre vlákna s priemerom 
6 μm je vhodnejšie 5 000-násobné zvä čšenie.
 1.5.3.  Postup pri teste  
1.5.3.1.  Odber vzoriek  
Pri vrchných vrstvách sa na odoberanie vzoriek profilu použije 
25 mm odobera č vzorky sedimentov alebo korkovrt. Mali by by ť 
rovnomerne rozmiestnené po šírke z kratšej strany vrstvy 
alebo v prípade, že sú k dispozícii dlhé d ĺžky vrstiev, sa odoberú 
z náhodných častí. Rovnaké zariadenie možno použi ť na náhodné 
odoberanie vzoriek z uvo ľnených vláken. Malo by sa odobra ť šesť 
vzoriek, aby sa zoh ľadnili priestorové odchýlky objemu materiálu. 
Šesť vzoriek jadra sa pod tlakom 10 Mpa rozdrví v lisovadle 
s priemerom 50 mm. Materiál sa rozmieša pomocou stierky a znovu sa lisuje pod tlakom 10 Mpa. Potom sa materiál odoberie 
z lisovadla a uskladní v hermeticky uzatvorenej sklenej f ľaši.
 
1.5.3.2.  Príprava vzorky  
V nutnom prípade sa organický tmel odstráni umiestnením vlákna 
dovnútra pece pri teplote 450 °C po čas približne jednej hodiny. 
Vytvarujte vzorku do kuže ľa a rozštvr ťte ju (vykonáva sa vnútri 
prachovej skrinky). 
S použitím stierky pridajte malé množstvo (< 0,5 g) vzorky do 
100 ml čerstvo destilovanej vody, ktorá bola prefiltrovaná pomocou 
membránového filtra ve ľkosti 0,2 μm (ak sa použitie ukáže opod ­
statnené, možno použi ť náhradný zdroj ultra čistej vody). Dôkladne 
rozmiešajte s použitím ultrazvukovej sondy pohá ňanej 
100 W zdrojom a nastavenej tak, aby sa vytvorila kavitácia. (V 
prípade, že sonda nie je k dispozícii, použite nasledujúcu metódu: 30 sekúnd ju treba opakovane trias ť a obraca ť; nechať 5 minút 
pôsobiť pod ultrazvukom umiestnením v stolnej ultrazvukovej 
vaničke; potom opakovane trias ť a obraca ť počas ďalších 30 
sekúnd.) 
Okamžite po rozptýlení vlákna je potrebné odobra ť niekoľko častíc 
(napríklad tri pomerné časti 3,6 a 10 ml) pomocou širokootvorovej 
pipety (s objemom 2 – 5 ml). 
Prefiltrujte každú časť cez polykarbonátový filter ve ľkosti otvorov 
0,2 μm s pomocou MEC filtru ve ľkosti pórov 5 μm s použitím 
25 ml skleného filtrovacieho lievika s valcovitým zásobníkom. 
Približne 5 ml prefiltrovanej destilovanej vody by sa malo umiestni ť 
do lievika a častica sa pomaly prekvapkáva do vody, držiac kon ček 
pipety pod ohybom. Pipeta a zásobník sa po prekvapkávaní musia riadne prepláchnu ť z toho dôvodu, že vlákna sa zvy čajne nachádzajú 
viac na povrchu. 
Opatrne odoberte filter a pred umiestnením do sušiacej nádoby ho 
oddeľte od podporného filtra.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Kmitavým pohybom narežte štvrtinu alebo polovicu z prefiltrovanej 
hmoty s použitím skalpovacej čepele typu 24. Opatrne pripevnite 
oddelenú časť k bloku SEM s s použitím lepiaceho uhlíkového štítka 
alebo uhlíkového lepidla. Použite strieborný skalpel najmenej v troch polohách tak, aby sa zlepšil elektrický kontakt okrajov filtra 
a ústrižku. Ke ď lepidlo/strieborný skalpel oschne, oba ľte katódu 
vrstvou 50 nm zlata, prípadne zmesou zlata/paládia na povrchu usadeniny.
 
1.5.3.3.  SEM kalibrácia a postup  
1.5.3.3.1. K a l i b r á c i a 
SEM kalibráciu je potrebné skontrolova ť najmenej raz do týžd ňa 
(najlepšie každodenne) s použitím certifikovanej kalibra čnej mriežky. 
Kalibráciu je nutné porovna ť s certifikovanou normou a v prípade, 
ak meraná hodnota (SEM) nie je v rozpätí ± 2 % certifikovanej hodnoty, musí sa kalibrácia SEM upravi ť a znovu skontrolova ť. 
SEM by malo by ť schopné rozpusti ť prinajmenšom vidite ľný 
priemer 0,2 μm s použitím absolútnej vzorkovej matrice pri 2 000- 
násobnom zvä čšení.
 
1.5.3.3.2. P r a c o v n ý p o s t u p 
Proces SEM sa vykonáva pri 10 000-násobnom zvä čšení (  1 ) za 
podmienok, ktoré umož ňujú dobrú rozlíšite ľnosť prostredníctvom 
obrazu pri nízkych hodnotách skenovania, napríklad 5 sekúnd na 
snímku. Napriek tomu, že pracovné podmienky pri rôznych SEM 
sa môžu odlišova ť, všeobecne platí, že na získanie najlepšej vidite ľ­
nosti a rozlíšenia je pri použití relatívne malého objemu hmoty atómov potrebné použi ť zvyšujúce sa napätie od 5 – 10 keV 
pomocou malého bodového nastavenia a krátkej prevádzkovej vzdia ­
lenosti. Pri realizácii lineárneho prie čneho pohybu sa musí použi ť 
0
 o sklon na ú čely minimalizovania opätovného zaostrenia alebo ak sa 
SEM nachádza v eucentrickej polohe, použije sa eucentrická 
prevádzková vzdialenos ť. Menšie zvä čšenie možno použi ť 
v prípade, ak materiál neobsahuje vlákna s malým priemerom, a pre vlákna s vä čším priemerom (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Meranie ve ľkosti  
1.5.3.4.1. Z h o d n o t e n i e v z o r k y p r e s k ú š a n í m p r i m a l o m 
z v ä č š e n í 
Najskôr sa vzorka preskúša pri malom zvä čšení, aby sa zistil zhluk 
väčších vláken a ich hustota. V prípade nadmerného zhlukovania 
vláken sa odporú ča pripravi ť novú vzorku. 
Štatistická presnos ť si vyžaduje meranie minimálneho po čtu vláken, 
pričom vysoká hustota vláken je výhodnejšia, pretože preskúšavanie 
prázdnych polí je časovo náro čné a nepredstavuje prínos k celkovej 
analýze. Ak je filter preplnený, meranie všetkých merate ľných 
vláken sa stáva náro čným a malé vlákna môžu by ť vynechané, 
lebo sú prekryté vä čšími. ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Pri vláknach 3 μm pozri predchádzajúcu poznámku.
 Ku skresleniu výsledkov nadhodnotením LWGMD môže dôjs ť, ak je 
hustota vláken vä čšia ako 150 vláken na milimeter lineárneho prie č­
neho posunu. Na druhej strane nízka koncentrácia vláken zvyšuje čas 
analýzy a často je efektívnejšie pripravi ť vzorku s hustotou vláken 
bližšou optimálnej hodnote, ako sa spolieha ť na vlákna s nízkou 
koncentráciou. Optimálna hustota vláken sa ur čuje na základe prie ­
meru jedného alebo dvoch po čítateľných vláken na polia zo záberu 
pri 5 000-násobnom zvä čšení. Napriek tomu optimálna hustota závisí 
od veľkosti (priemeru) vláken, takže laborant pri rozhodovaní, či 
hustota vlákna je blízko k optimálnej hodnote, alebo nie, musí 
použiť vlastný odborný úsudok.  
1.5.3.4.2. M e r a n i e d ĺ ž k y p r i e m e r u v l á k e n 
Počítajú sa iba tie vlákna, ktoré sa dotýkajú (alebo pre čnievajú) 
tenkej (plynulej) čiary nazna čenej na obrazovke SEM. Na tento 
účel sa nakreslí horizontálna (alebo vertikálna) čiara idúca stredom 
obrazovky. 
Alternatívou sa ukazuje by ť možnosť umiestnenia jednotlivého bodu 
do stredu obrazovky s plynulým skenovaním jedným smerom krížom 
cez celý filter. Každé vlákno s koeficientom s priemerom 3:1, ktoré sa dotýka tohto bodu alebo ho presahuje, sa potom zmeria a zaznamená.
 
1.5.3.4.3. T r i e d e n i e v l á k e n 
Odporúča sa odmera ť minimálne 300 vláken. Každé vlákno sa 
odmeria iba raz v priese čníku s čiarou alebo bodom nakresleným 
na obraze (alebo blízko k priese čníku, ak sú okraje vlákna prekryté). 
Ak sa objavia vlákna, ktoré majú nerovnomerné prie čne rezy, je 
potrebné použi ť rozmer reprezentujúci priemernú hodnotu priemeru 
vlákna. Opatrne treba ur čiť presný okraj a odmera ť najkratšiu vzdia ­
lenosť medzi okrajmi vlákna. Triedenie možno realizova ť online 
alebo offline s použitím uložených obrázkov alebo fotografií. 
Vzhľadom na úsporu času a zamedzenie chýb pri prepise, ako aj 
kvôli zautomatizovaniu samotného výpo čtu sa odporú ča použiť polo­
automatizovaný snímkovací systém merania, ktorý je schopný 
stiahnuť údaje priamo do tabu ľkovej formy. 
Konce dlhých vláken je potrebné preveri ť pri nízkej hodnote zvä č­ 
šenia, aby sa zamedzilo ich opätovnému zvlneniu do zorného po ľa 
merania a zabezpe čilo, že sa odmerajú iba raz.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Priemery vláken zvy čajne nemajú normálne rozloženie. Napriek 
tomu možno získa ť pri logaritmickej transformácii rozloženie, ktoré 
sa približuje k normálnemu stavu. 
Výpočet aritmetickej hodnoty (stredná hodnota lnD) a štandardnej 
odchýlky (SD  lnD ) od prenosu základne hodnôt e (lnD) z priemerov 
vláken (D).  
stredná lnD ¼ P lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – stredná lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Štandardná odchýlka sa vydelí druhou odmocninou po čtu meraní (n), 
čím vyrátame štandardnú chybu (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD ﬃﬃﬃ n p (3) 
Odpočítajte dvakrát štandardnú chybu od hodnoty a vypo čítajte 
exponenciál tejto hodnoty (stredná hodnota mínus dve štandardné chyby) a dostanete strednú geometrickú hodnotu mínus dve štan ­
dardné chyby.
 
LWGMD – 2SE ¼ e ðstredná lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. NAHLASOVANIE SPRÁV  
PROTOKOL O TESTE 
Protokol o teste musí obsahova ť aspoň nasledujúcu informáciu: 
— hodnotu LWGMD-2SE, — všetky odchýlky a zvláš ť tie, ktoré môžu ma ť vplyv na presnos ť 
a správnos ť výsledkov s patri čným zdôvodnením.
 
4. LITERATÚRA  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research 
and Laboratory Services Division, 1994.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  ROZDE ĽOVACÍ KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): METÓDA 
POMALÉHO MIEŠANIA  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 123 (2006). Hodnoty rozde ľovacieho koeficientu 1-okta ­
nol/voda (P  ow ) až po log P  ow 8,2 boli presne stanovené metódou pomalého 
miešania (1). Ide preto o vhodný experimentálny prístup pre priame stano ­
venie P  ow vysoko hydrofóbnych látok. 
2. Inými metódami na stanovenie rozde ľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda 
(P ow ) sú metóda trepa čkovej banky (2) a stanovenie P  ow z retenčného sprá ­
vania HPLC s reverznou fázou (3). Pri metóde trepa čkovej banky sa zvyknú 
tvoriť vedľajšie produkty z dôvodu prenosu oktanolových mikrokvapô čok 
do vodnej fázy. S narastajúcimi hodnotami P  ow vedie prítomnos ť týchto 
kvapôčok vo vodnej fáze k čoraz vyššiemu nadhodnoteniu koncentrácie 
testovanej látky vo vode. Preto sa jej použitie obmedzuje na látky s log 
P ow < 4. Druhá metóda sa opiera o spo ľahlivé údaje priamo stanovených 
hodnôt P  ow na kalibráciu vz ťahu medzi reten čným správaním HPLC 
a meranými hodnotami P  ow . Na stanovenie rozde ľovacích koeficientov 1- 
oktanol/voda ionizovate ľných látok (4) bolo možné použi ť predbežné 
usmernenia OECD, ktoré sa však už nebudú používa ť. 
3. Túto testovaciu metódu vyvinuli v Holandsku. Presnos ť metód, ktoré sú tu 
opísané, bola potvrdená a optimalizovaná v rámci hodnotiacej štúdie kruho ­
vého testu, na ktorej sa zú častnilo 15 laboratórií (5).  
ÚVODNÉ ÚVAHY  
Význam a použitie  
4. V prípade inertných organických látok boli zistené ve ľmi dôležité vz ťahy 
medzi rozde ľovacími koeficientmi 1-oktanol/voda (P  ow ) a ich bioakumulá ­
ciou v rybách. Okrem toho sa preukázala korelácia P  ow s toxicitou rýb, ako 
aj sorpcia chemikálií do tuhých látok, ako je zemina a sedimenty. Rozsiahly 
prehľad vzťahov sa uvádza v odkaze (6). 
5. Medzi rozde ľovacím koeficientom 1-oktanol/voda a vlastnos ťami iných 
látok bola zistená široká škála vz ťahov, ktoré majú význam pre environ ­
mentálnu toxikológiu a chémiu. V dôsledku toho sa rozde ľovací koeficient 
1-oktanol/voda stal k ľúčovým parametrom pri hodnotení environmentálneho 
rizika chemikálií, ako aj pri predpovedaní osudu chemikálií v životnom 
prostredí.  
Rozsah  
6. Pri pokuse pomalého miešania sa predpokladá nižšia tvorba mikrokvapô čok 
z kvapiek 1-oktanolu vo vodnej fáze. Následne nedochádza k nadhodnoteniu 
vodnej koncentrácie v dôsledku molekúl testovanej látky, ktoré súvisí s takýmito kvapô čkami. Metóda pomalého miešania je preto ve ľmi vhodná 
na stanovenie P
 ow látok s predpokladanými hodnotami log P  ow rovnajúcimi 
sa 5 alebo vyššími, v prípade ktorých zvykne metóda trepa čkovej banky (2) 
viesť k chybným výsledkom.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
VYMEDZENIE POJMU A JEDNOTKY 
7. Rozde ľovací koeficient látky medzi vodou a lipofilickým rozpúš ťadlom 
(1-oktanol) charakterizuje rozloženie rovnováhy chemikálie medzi dvoma fázami. Rozde ľovací koeficient medzi vodou a 1-oktanolom (P
 OW ) je vyme ­
dzený ako pomer rovnovážnych koncentrácií testovanej látky v 1-oktanole 
nasýtenom vodou (C  O ) a vo vode nasýtenej 1-oktanolom (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Keďže ide o pomer, je to bezrozmerné číslo. Najčastejšie sa udáva ako 
logaritmus pri základe 10 (log P  ow ). P  ow závisí od teploty a údaje 
v správe by mali zah ŕňať teplotu merania.  
PRINCÍP METÓDY 
8. Na ú čely stanovenia rozde ľovacieho koeficientu sa voda, 1-oktanol 
a testovaná látka navzájom vyvážia pri konštantnej teplote. Následne sa 
určia koncentrácie testovanej látky v dvoch fázach. 
9. Problémy pokusu súvisiace s tvorbou mikrokvapô čok počas pokusu 
s trepaním banky je možné zníži ť pri pokuse s pomalým miešaním, ktorý 
sa v tomto texte navrhuje. V prípade pokusu s pomalým miešaním sa voda, 1-oktanol a testovaná látka vyvážia v termostatickom miešanom reaktore. Výmena medzi fázami sa urýchli miešaním. Miešaním dochádza k malej 
turbulencii, ktorá napomáha výmene medzi 1-oktanolom a vodou bez vytvá ­
rania mikrokvapô čok (1).
 
POUŽITE ĽNOSŤ TESTU 
10. Keďže prítomnos ť látok iných ako testovaná látka môže ovplyvni ť koefi­
cient aktivity testovanej látky, testovaná látka sa musí testova ť ako čistá 
látka. Pri pokuse stanovenia rozde ľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda sa 
použije komer čne dostupná látka najvyššej čistoty. 
11. Uvedená metóda sa vz ťahuje na čisté látky, ktoré nedisociujú ani sa nespá ­
jajú a ktoré nevykazujú významnú medzipovrchovú aktivitu. Možno ju použiť na stanovenie rozde ľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda takýchto 
látok a zmesí. Ak sa metóda použije v prípade zmesí, stanovené rozde ľo­
vacie koeficienty 1-oktanol/voda sú závislé od chemického zloženia testo ­
vanej zmesi a elektrolytického zloženia vo vodnej fáze. Za predpokladu, že sa prijmú dodato čné opatrenia, možno metódu použi ť aj na disociujúce 
alebo spájajúce sa zlú čeniny (odsek 12). 
12. Vzhľadom na viacnásobné rovnovážne stavy vo vode a 1-oktanole, ktoré 
prispievajú k deleniu disociujúcich látok v systéme 1-oktanol/voda, ako sú organické kyseliny a fenoly, organické bázy a organokovové látky, je 
rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda závislou konštantou, ktorá vo ve ľkej 
miere závisí od elektrolytického zloženia (7) (8). Stanovenie rozde ľovacieho 
koeficientu 1-oktanol/voda preto vyžaduje, aby sa pH a elektrolytické zloženie po čas pokusu kontrolovali a zaznamenali v správe. Pri hodnotení 
týchto rozde ľovacích koeficientov je potrebné opiera ť sa o odborný posu ­
dok. Pomocou hodnoty disocia čnej konštanty (disocia čných konštánt) je 
potrebné vybra ť vhodné hodnoty pH, aby sa pre každý ioniza čný stav 
stanovil rozde ľovací koeficient. Pri testovaní organokovových zlú čenín (8) 
sa musia použi ť nekomplexujúce tlmivé roztoky. Pri zoh ľadnení existujúcich 
znalostí o roztokovej chémii (konštanty stability komplexu, disocia čné 
konštanty) by sa podmienky pokusu mali zvoli ť takým spôsobom, aby 
bolo možné odhadnú ť
 zloženie testovanej látky vo vodnej fáze. Iónová 
sila by mala by ť totožná pri všetkých pokusoch vzh ľadom na použitie 
základného elektrolytu.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Pri teste sa môžu vyskytnú ť problémy v prípade testovania látok s nízkou 
rozpustnos ťou vo vode alebo s vysokým P  ow , lebo koncentrácie vo vode sú 
také nízke, že je náro čné ich stanovi ť s presnos ťou. V rámci tejto testovacej 
metódy sa uvádzajú usmernenia, ako tento problém rieši ť. 
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
14. Chemické reagenty musia ma ť stupeň čistoty – analyticky čistá alebo musia 
byť čistejšie. Odporú ča sa použitie neozna čkovaných testovacích látok so 
známym chemickým zložením a pod ľa možnosti aspo ň 99 % čistoty alebo 
rádioozna čených testovaných látok so známym chemickým zložením 
a rádiochemickej čistoty. V prípade krátkeho pol času rozpadu by sa mali 
aplikovať korekcie na rozpad. V prípade rádioozna čených testovaných látok 
by sa mala použi ť analytická metóda pre konkrétnu chemikáliu, aby sa 
zabezpečilo, že meraná rádioaktivita priamo súvisí s testovanou látkou. 
15. Odhad log P  ow je možné urobi ť pomocou komer čne dostupného softvéru na 
odhadovanie log P  ow alebo pomocou pomeru rozpustností v oboch 
roztokoch. 
16. Pred za čatím pokusu s pomalým miešaním na stanovenie P  ow musia by ť 
k dispozícii tieto informácie o testovanej látke: 
a) štruktúrny vzorec; 
b) vhodné analytické metódy na stanovenie koncentrácie látky vo vode a 1- 
oktanole; 
c) disocia čná konštanta/disocia čné konštanty ionizovate ľných látok [usmer ­
nenie OECD 112 (9)]; 
d) rozpustnos ť vo vode (10); 
e) abiotická hydrolýza (11); 
f) ľahká biodegradovate ľnosť (12); 
g) tlak pary (13).  
OPIS METÓDY  
Zariadenie a prístroje  
17. Vyžaduje sa štandardné laboratórne zariadenie, najmä: 
— magnetické miešadlá a magnetické miešacie ty činky pokryté teflónom sa 
používajú na miešanie vo vodnej fáze, 
— analytické prístroje vhodné na stanovenie koncentrácie testovanej látky 
pri predpokladaných koncentráciách, 
— miešacia nádoba s kohútikom na dne. V závislosti od odhadu log P  ow 
a detekčného limitu (LOD) testovanej zlú čeniny je potrebné zváži ť 
použitie reak čnej nádoby rovnakých geometrických tvarov s objemom 
vyšším ako jeden liter, aby bolo možné získa ť dostatočný objem vody 
na chemickú extrakciu a analýzu. To bude ma ť za následok vyššie 
koncentrácie vo vodnom extrakte, a teda spo ľahlivejšie analytické stano ­
venie. Tabu ľka s odhadmi minimálneho potrebného objemu, detek čným 
limitom zlú čeniny, odhadovaným log P  ow a rozpustnos ťou zlúčeniny vo 
vode je uvedená v dodatku 1. Tabu ľka vychádza zo vz ťahu medzi log 
P ow a pomerom medzi rozpustnos ťou v oktanole a vo vode, ako uvádza 
Pinsuwan a kolektív (14): 
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
kde 
SR ¼ S oct=S w (v molarite), 
a vzťah podľa Lymana (15) na predpovedanie rozpustnosti vo vode. 
Rozpustnos ť vo vode vypo čítaná pomocou rovnice uvedenej 
v dodatku 1 sa považuje za prvý odhad. Treba poznamena ť, že použí ­
vateľ môže odhadnú ť rozpustnos ť vo vode na základe akéhoko ľvek 
vzťahu, ktorý sa považuje za lepšie znázornenie vz ťahu medzi hydrofo ­
bicitou a rozpustnos ťou. V prípade tuhých zlú čenín sa napríklad odpo ­
rúča zahrnutie bodu topenia do predpovede rozpustnosti. V prípade 
použitia upravenej rovnice sa treba uisti ť, že rovnica na výpo čet rozpust ­
nosti v oktanole je stále platná. Schematické znázornenie miešacej nádoby so skleným pláš ťom s objemom približne jeden liter je uvedené 
v dodatku 2. Rozmery nádoby znázornenej v dodatku 2 sa ukázali by ť 
vhodné a v prípade, že sa použije zariadenie inej ve ľkosti, by mali osta ť 
zachované, 
— prostriedky na udržanie konštantnej teploty po čas pokusu s pomalým 
miešaním sú nevyhnutné. 
18. Nádoby by mali by ť vyrobené z inertného materiálu, aby bola adsorpcia na 
povrchu nádoby zanedbate ľná.
 
Príprava testovacích roztokov  
19. P  ow by sa mal stanovi ť s využitím 1-oktanolu najvyššej čistoty, ktorý je 
komerčne dostupný (aspo ň + 99 %). Odporú ča sa purifikácia 1-oktanolu 
extrakciou pomocou kyseliny, bázy a vody a následné vysušenie. Okrem 
toho možno na purifikáciu 1-oktanolu použi ť destiláciu. Purifikovaný 1- 
oktanol sa použije na prípravu štandardných roztokov testovaných látok. Voda, ktorá sa použije na stanovenie P
 ow , by mala by ť destilovaná zo 
skla alebo kreme ňa, alebo získaná zo zariadenia na purifikáciu vody. Takisto 
je možné použi ť vodu HPLC kvality. V prípade destilovanej vody sa vyža ­
duje filtrácia cez 0,22 μm filter. Mali by sa vykona ť aj slepé pokusy na 
kontrolu, či sa v koncentrovaných extraktoch nenachádzajú žiadne prímesi, 
ktoré by mohli prís ť do styku s testovanou látkou. Ak sa použije filter zo 
skleného vlákna, musí sa vy čistiť vypálením aspo ň počas troch hodín pri 
teplote 400 °C. 
20. Obe rozpúš ťadlá sa pred pokusom navzájom nasýtia vyvažovaním 
v dostato čnej veľkej nádobe. Rovnováha sa dosiahne pomalým miešaním 
dvojfázového systému po čas dvoch dní. 
21. Zvolí sa vhodná koncentrácia testovanej látky, ktorá sa rozpustí v 1-oktanole 
(nasýtenom vodou). Rozde ľovací koeficient 1-oktanol/voda sa musí stanovi ť 
v zriedených roztokoch v 1-oktanole a vode. Koncentrácia testovanej látky 
by preto v žiadnej fáze nemala presiahnu ť 70 % svojej rozpustnosti 
s maximálnou koncentráciou 0,1 M (1). Roztoky 1-oktanolu použité pri pokuse nesmú obsahova ť suspendovanú tuhú testovanú látku. 
22. Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom 
vodou). Ak je odhad log P
 ow vyšší ako pä ť, treba dba ť na to, aby roztoky 
1-oktanolu použité pri pokuse neobsahovali suspendovanú tuhú testovanú 
látku. Na tento ú čel sa v prípade chemikálií s odhadovanou hodnotou log 
P ow > 5 postupuje takto: 
— testovaná látka sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou),  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— roztoku sa poskytne dostato čný čas, aby sa suspendovaná tuhá látka 
usadila. Po čas usádzania sa sleduje koncentrácia testovanej látky, 
— potom, ako merané koncentrácie v roztoku 1-oktanolu dosiahnu stabilné 
hodnoty, sa zásobný roztok zriedi vhodným objemom 1-oktanolu, 
— odmeria sa koncentrácia zriedeného zásobného roztoku. Ak nameraná 
koncentrácia zodpovedá zriedeniu, zriedený zásobný roztok možno použiť pri pokuse s pomalým miešaním.
 
Extrakcia a analýza vzoriek  
23. Na skúšku testovanej látky sa použije platná analytická metóda. Výskumníci 
musia predloži ť dôkazy o tom, že koncentrácie v 1-oktanole nasýtenom 
vodou, ako aj vo fáze vody nasýtenej 1-oktanolom po čas pokusu sú vyššie 
ako kvantifika čný limit metódy použitých analytických postupov. Analy ­
tická výťažnosť testovanej látky z vodnej fázy a z 1-oktanolovej fázy sa 
musí stanovi ť pred pokusom v tých prípadoch, v ktorých sú potrebné 
metódy extrakcie. Analytický signál musí by ť korigovaný vzh ľadom na 
slepé pokusy a treba dba ť na to, aby nedošlo k prenosu analytu z jednej 
vzorky do druhej. 
24. Pred analýzou bude pravdepodobne potrebná extrakcia vodnej fázy 
pomocou organického rozpúš ťadla a prekoncentrácia extraktu z dôvodu 
pomerne nízkych koncentrácií hydrofóbnych testovaných látok vo vodnej 
fáze. Z toho istého dôvodu je nevyhnutné zníži ť koncentrácie pri prípadných 
slepých pokusoch. Na tento ú čel treba použi ť rozpúšťadlá vysokej čistoty, 
podľa možnosti rozpúš ťadlá na analýzu rezíduí. Takisto práca s vopred 
dôkladne vy čisteným sklom (napr. umývanie rozpúš ťadlom alebo vypa ľo­
vanie pri zvýšenej teplote) môže pomôc ť zabrániť krížovej kontaminácii. 
25. Odhad log P  ow možno získa ť z programu na odhadovanie alebo z odborného 
posudku. Ak je hodnota vyššia ako šes ť, potom je potrebné dôkladne 
sledovať korekcie vzh ľadom na slepé pokusy a prenos analytu. Podobne 
ak je odhad log P  ow vyšší ako šes ť, je potrebné použi ť náhradný štandard 
na korekciu vý ťažnosti, aby bolo možné dosiahnu ť vysoké prekoncentra čné 
faktory. Na odhadovanie log P  ow je k dispozícii množstvo komer čne dostup ­
ných softvérových programov (  1 ), napr. Clog P (16), KOWWIN (17), 
ProLogP (18) a ACD log P (19). Opisy postupov odhadovania sú uvedené v odkazoch (20 – 22). 
26. Kvantifika čné limity (LOQ) na ur čenie testovanej látky v 1-oktanole a vo 
vode sa stanovia pomocou akceptovaných metód. Pod ľa štandardného 
pravidla možno kvantifika čný limit metódy stanovi ť ako koncentráciu vo 
vode alebo v 1-oktanole, ktorej pomer signálu k šumu má hodnotu desa ť. 
Treba zvoli ť vhodné metódy extrakcie a prekoncentrácie a takisto treba 
špecifikova ť analytickú vý ťažnosť. Po analytickom stanovení sa vyberie 
vhodný prekoncentra čný faktor s cie ľom získať signál požadovanej ve ľkosti.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Táto informácia sa uvádza iba s cie ľom pomôc ť používate ľom. Možno použi ť iné 
rovnocenné po čítačové programy, ak je možné preukáza ť, že sa nimi dosahujú rovnaké 
výsledky.
 27. Na základe parametrov analytickej metódy a predpokladaných koncentrácií 
sa určí približná ve ľkosť vzorky potrebná na presné stanovenie koncentrácie 
zlúčeniny. Treba sa vyhnú ť používaniu vzoriek vody, ktoré sú príliš malé na 
získanie dostato čného analytického signálu. Takisto sa treba vyhnú ť použí­
vaniu nadmerne ve ľkých vzoriek vody, lebo inak sa môže sta ť, že na 
minimálny požadovaný po čet analýz (n = 5) ostane príliš málo vody. 
V dodatku 1 je minimálny objem vzorky uvedený ako funkcia objemu nádoby, LOD testovanej látky a rozpustnosti testovanej látky. 
28. Kvantifikácia testovanej látky sa vykonáva porovnaním s kalibra čnými kriv ­
kami príslušnej zlú čeniny. Koncentrácie v analyzovaných vzorkách musia 
byť ohraničené koncentráciami štandardov. 
29. V prípade testovaných látok s odhadovaným log P
 ow vyšším ako šes ť treba 
náhradný štandard prida ť do vzorky vody pred extrakciou s cie ľom zaregis ­
trovať straty, ku ktorým došlo v priebehu extrakcie a prekoncentrácie 
vzoriek vody. S cie ľom zabezpe čiť presnú korekciu vý ťažnosti musia ma ť 
náhradné látky vlastnosti, ktoré sú ve ľmi podobné alebo totožné 
s vlastnos ťami testovanej látky. Na tento ú čel sa uprednost ňuje použitie 
(stabilných) izotopicky ozna čených analógov k skúmaným látkam (napríklad 
perdeuterovaných alebo ozna čených uhlíkom  13 C). Ak nie je možné použi ť 
označené stabilné izotopy, t. j.  13 C alebo  2 H, treba na základe spo ľahlivých 
údajov z literatúry preukáza ť, že fyzikálno-chemické vlastnosti náhradnej 
látky sú ve ľmi podobné fyzikálno-chemickým vlastnostiam testovanej látky. 
V priebehu extrakcie kvapaliny kvapalinou vo vodnej fáze môže dôjs ť 
k tvorbe emulzií. Možno ich redukova ť pridaním soli a umožnením, aby 
sa emulzia po čas noci usadila. Metódy používané na extrahovanie 
a prekoncentráciu vzoriek treba uvies ť do správy. 
30. Vzorky získané z 1-oktanolovej fázy možno pred analýzou v prípade 
potreby zriedi ť vhodným rozpúš ťadlom. Okrem toho sa použitie náhradných 
štandardov na korekciu vý ťažnosti odporú ča v prípade látok, pri ktorých 
pokusy s vý ťažnosťou preukázali vysoký stupe ň variácie (relatívna smero ­
dajná odchýlka > 10 %). 
31. Podrobné informácie o analytickej metóde sa musia uvies ť v správe. Tieto 
informácie zah ŕňajú metódu extrakcie, prekoncentra čné a zrie ďovacie 
faktory, parametre prístrojov, postup kalibrácie, rozsah kalibrácie, analytickú 
výťažnosť testovanej látky z vody, pridanie náhradných štandardov na 
korekciu vý ťažnosti, hodnoty slepých pokusov, detek čné limity 
a kvantifika čné limity.  
Realizácia testu  
Optimálne pomery objemov 1-oktanol/voda  
32. Pri vo ľbe objemov vody a 1-oktanolu by sa mali zoh ľadniť LOQ 
v 1-oktanole a vo vode, prekoncentra čné faktory použité pri vzorkách 
vody, objemy vzoriek 1-oktanolu a vody a predpokladané koncentrácie. 
Z experimentálnych dôvodov by sa mal objem 1-oktanolu v systéme poma ­
lého miešania zvoli ť tak, aby vrstva 1-oktanolu bola dostato čne hrubá 
(> 0,5 cm) a umož ňovala odber vzoriek po čas 1-oktanolovej fázy bez jej 
narušenia. 
33. Bežné fázové pomery používané na stanovenie zlú čenín s log P  ow rovna­
júcim sa 4,5 alebo vyšším sú 20 – 50 ml 1-oktanolu a 950 – 980 ml vody 
v litrovej nádobe.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Podmienky testovania  
34. V priebehu testu sa reak čná nádoba tepelne stabilizuje, aby teplota nekolí ­
sala o viac ako 1 °C. Skúška sa vykonáva pri teplote 25 °C. 
35. Pokusný systém by mal by ť chránený pred denným svetlom bu ď tak, že sa 
pokus vykoná v tmavej miestnosti, alebo tak, že sa reak čná nádoba prikryje 
hliníkovou fóliou. 
36. Pokus by sa mal vykona ť v bezprašnom prostredí (pokia ľ je to možné). 
37. Systém 1-oktanol-voda sa mieša, až kým sa nedosiahne rovnováha. Pri 
pilotnom pokuse sa posúdi d ĺžka obdobia vyvažovania vykonaním pokusu 
s pomalým miešaním a pravidelným odberom vzorky vody a 1-oktanolu. 
Medzi jednotlivými odbermi vzoriek by malo uplynú ť minimálne pä ť hodín. 
38. Pri každom stanovení P  ow treba vykona ť najmenej tri nezávislé pokusy 
s pomalým miešaním.  
Stanovenie času dosiahnutia rovnováhy  
39. Predpokladá sa, že rovnováha sa dosiahne, ke ď regresná funkcia pomeru 
koncentrácie 1-oktanol/voda v závislosti od času v priebehu štyroch časo­
vých bodov dosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 
výrazne nelíši od nulového sklonu. Minimálny čas dosiahnutia rovnováhy 
je jeden de ň pred začatím odberov vzoriek. Pod ľa štandardného pravidla sa 
môžu vzorky látok s odhadovaným log P  ow nižším ako pä ť odoberať počas 
druhého a tretieho d ňa. Môže sa sta ť, že vyvažovanie sa bude musie ť 
v prípade hydrofóbnych zlú čenín pred ĺžiť. V prípade zlú čeniny s log P  ow 
8,23 (dekachlórbifenyl) sta čilo na dosiahnutie rovnováhy 144 hodín. Rovno ­
váha sa posudzuje prostredníctvom opakovaného odberu z jednej nádoby.  
Začiatok pokusu  
40. Na za čiatku pokusu sa reak čná nádoba naplní vodou nasýtenou 1-oktano ­
lom. Na dosiahnutie stálej teploty by mal by ť k dispozícii dostatok času. 
41. Do reak čnej nádoby sa opatrne pridá želané množstvo testovanej látky (roz ­
pustené v požadovanom objeme 1-oktanolu nasýtenom vodou). Tento krok je v rámci pokusu ve ľmi dôležitý, lebo je potrebné vyhnú ť sa prudkému 
miešaniu dvoch fáz. Na tento ú čel možno 1-oktanolovú fázu pomaly pipetou 
preniesť na stenu testovacej nádoby blízko hladiny vody. Tá následne ste čie 
po sklenej stene a vytvorí nad vodnou fázou film. Vždy treba zabráni ť tomu, 
aby 1-oktanol stekal priamo do banky. Kvapky 1-oktanolu by nemali pada ť 
priamo do vody. 
42. Po za čatí miešania sa rýchlos ť miešania pomaly zvyšuje. Ak miešacie 
motory nemožno vhodne nastavi ť, treba uvažova ť nad použitím transformá ­
tora. Rýchlos ť miešania sa nastaví tak, aby sa na rozhraní medzi vodou a 1- 
oktanolom vytvoril vír s h ĺbkou od 0,5 cm do maximálne 2,5 cm. Rýchlos ť 
miešania by sa mala zníži ť, ak hĺbka víru presiahne 2,5 cm. V opa čnom 
prípade sa z kvapô čok 1-oktanolu vo vodnej fáze môžu vytvori ť mikrokva ­
pôčky, čo bude ma ť za následok nadhodnotenie koncentrácie testovanej 
látky vo vode. Maximálna rýchlos ť miešania pri h ĺbke 2,5 cm je odporú čaná 
na základe zistení potvrdzujúcej štúdie kruhového testu (5). Ide 
o kompromis medzi rýchlym dosiahnutím rovnováhy a zamedzením tvorbe 
1-oktanolových mikrokvapô čok.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Odber a spracovanie vzoriek  
43. Miešadlo sa pred odobratím vzoriek vypne a po čká sa, kým pohyb kvapalín 
neustane. Po dokon čení odberu vzorky sa miešadlo opä ť pomaly spustí, ako 
je opísané vyššie, a následne sa rýchlos ť miešania bude postupne zvyšova ť. 
44. Pri vodnej fáze sa vzorka odoberie z uzatváracieho kohútika na dne reak čnej 
nádoby. Vždy je potrebné odstráni ť mŕtvy objem vody v kohútikoch (pri ­
bližne 5 ml v prípade nádoby znázornenej v dodatku 2). Voda v kohútikoch 
sa nemieša, a preto nie je v rovnováhe s hlavným objemom. Zaznamenajte objem vzoriek vody a uistite sa, že množstvo testovanej látky prítomnej v odstránenej vode sa zoh ľadní pri nastavovaní hmotnostnej bilancie. Straty 
vznikajúce pri odparovaní by sa mali minimalizova ť, a to tak, že sa umožní, 
aby voda pokojne stiekla do odde ľovacieho lievika, čím sa zabráni naru ­ 
šeniu vrstvy voda/1-oktanol. 
45. Vzorky 1-oktanolu sa získajú odobratím malej alikvotnej časti (cca. 100 μl) 
z vrstvy 1-oktanolu 100-mikrolitrovou skleneno-kovovou strieka čkou. Treba 
dbať na to, aby sa nenarušila hranica. Objem odobratej vzorky kvapaliny sa 
zaznamená. Malá alikvotná časť je postačujúca, lebo vzorka 1-oktanolu sa 
zriedi. 
46. Treba sa vyhnú ť zbytočným prenosom vzorky. Na tento ú čel by sa objem 
vzorky mal stanovi ť gravimetricky. V prípade vzoriek vody to možno 
dosiahnuť sústredením vzorky vody v odde ľovacom lieviku, ktorý už obsa ­
huje požadovaný objem rozpúš ťadla.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV 
47. Podľa tejto testovacej metódy sa P  ow stanoví vykonaním troch pokusov 
s pomalým miešaním (tri pokusné jednotky) so skúmanou zlú čeninou pri 
totožných podmienkach. Regresia použitá na preukázanie dosiahnutia rovno ­
váhy by mala vychádza ť z výsledkov aspo ň štyroch stanovení C  O /C W v po 
sebe nasledujúcich časových bodoch. Tým sa umožní výpo čet rozptylu ako 
ukazovate ľa neistoty priemernej hodnoty získanej v prípade každej pokusnej 
jednotky. 
48. P  ow je možné charakterizova ť rozptylom údajov získaných pre každú 
pokusnú jednotku. Tieto informácie sa použijú na výpo čet P  ow ako váženého 
priemeru výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek. Na tento ú čel sa ako 
váha použije inverzná funkcia rozptylu výsledkov získaných z pokusných 
jednotiek. V dôsledku toho majú údaje s vysokou variáciou (vyjadrenou ako rozptyl), a teda nižšou spo ľahlivosťou menší vplyv na výsledok ako údaje 
s nízkym rozptylom. 
49. Analogicky sa vypo číta vážená smerodajná odchýlka. Tá vyjadruje opako ­
vateľnosť merania P
 ow . Nízka hodnota váženej smerodajnej odchýlky 
znamená, že stanovenie P  ow malo v rámci jedného laboratória vysokú 
opakovate ľnosť. Formálne štatistické spracovanie údajov je vysvetlené 
ďalej. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Spracovanie výsledkov  
Preukázanie dosiahnutia rovnováhy  
50. Logaritmus pomeru koncentrácie testovanej látky v 1-oktanole a vo vode 
[log (C  O /C w )] sa vypo číta pri každom odbere vzorky. Dosiahnutie chemickej 
rovnováhy sa preukáže jej grafickým znázornením ako funkcie času. Horná 
hranica (plató) na tomto znázornení, ktoré je založené aspo ň na štyroch po 
sebe nasledujúcich časových bodoch, ukazuje, že rovnováha bola dosiahnutá 
a že zlúčenina sa v 1-oktanole naozaj rozpustila. Ak to tak nie je, test musí 
pokračovať, až kým funkcia v priebehu štyroch po sebe nasledujúcich časo­
vých bodov nedosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 
výrazne nelíši od nulového sklonu, čo znamená, že log C  o /C w nie je závislý 
od času. 
Log P  ow – výpočet 
51. Hodnota log P  ow pokusnej jednotky sa vypo číta ako vážená priemerná 
hodnota log C  o /C w tej časti krivky log C  o /C w ako funkcie času, v ktorej 
sa preukázala rovnováha. Vážený priemer sa vypo číta vážením údajov 
inverznou funkciou rozptylu, aby bol vplyv údajov na kone čný výsledok 
nepriamo úmerný neistote údajov.  
Priemerný log P  ow 
52. Priemerná hodnota log P  ow rôznych pokusných jednotiek sa vypo číta ako 
priemer výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek vážený ich zodpove ­
dajúcim rozptylom. 
Výpočet je takýto: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
kde 
log P  ow,i = hodnota log P  ow individuálnej pokusnej jednotky i, 
log P  ow,Av  = vážená priemerná hodnota individuálnych stanovení log P  ow , 
w i = štatistická váha pripísaná hodnote log P  ow pokusnej jednotky i. 
Recipročná hodnota rozptylu log P  ow,i sa použije ako 
w i ½w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 â. 
53. Chyba priemeru log P  ow sa odhadne ako opakovate ľnosť log C  o /C w stano­
vená počas fázy rovnováhy pri jednotlivých pokusných jednotkách. Je vyja ­
drená ako vážená smerodajná odchýlka log P  ow,Av  (σ log Pow,Av  ), ktorá je zasa 
ukazovate ľom chyby súvisiacej s log P  ow,Av  . Váženú smerodajnú odchýlku 
možno vypo čítať z váženého rozptylu (var  log Pow,Av  ) takto: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Premenná n predstavuje po čet pokusných jednotiek.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Správa o teste  
54. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná látka:  
— bežný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec, (s vyzna ­ 
čením polôh zna čkovania, ak sa používa zna čkovanie rádioaktívnym 
izotopom) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti (pozri odsek 17), 
— čistota (ne čistoty) testovanej látky, 
— čistota zna čky chemických látok zna čených rádioaktívnym izotopom 
a molárna aktivita (ak je to vhodné), 
— predbežný odhad log P  ow , ako aj metóda použitá na odvodenie hodnoty.  
Podmienky testovania:  
— dátumy vykonávania štúdií, 
— teplota po čas pokusu, 
— objem 1-oktanolu a vody na za čiatku testu, 
— objem odobratých vzoriek 1-oktanolu a vody, — objem 1-oktanolu a vody, ktorý ostal v testovacích nádobách, 
— opis použitých testovacích nádob a podmienok miešania (geometria 
miešacej ty činky a testovacej nádoby, výška pri vortexovaní v mm 
a v prípade dostupnosti: rýchlos ť miešania), 
— použité analytické metódy na ur čenie testovanej látky a kvantifika čný 
limit metódy, 
— časy odberu vzoriek, 
— použité pH vodnej fázy a pufrovania, pri čom pH je upravené pre ioni ­
zovateľné molekuly, 
— počet paraleliek.  
Výsledky:  
— opakovate ľnosť a citlivos ť použitých analytických metód, 
— určené koncentrácie testovanej látky v 1-oktanole a vode ako funkcia 
času, 
— demonštrácia hmotnostnej bilancie, 
— teplota a smerodajná odchýlka alebo rozsah teploty po čas pokusu, 
— regresia koncentra čného pomeru v čase, 
— priemerná hodnota log P
 ow,Av  a jej štandardná chyba, 
— rozbor a výklad výsledkov,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— príklady nespracovaných údajov reprezentatívnej vzorky (všetky nespra ­
cované údaje musia by ť uložené v súlade so štandardmi dobrej labora ­
tórnej praxe) vrátane vý ťažnosti náhradných látok a po čtu úrovní použi ­
tých pri kalibrácií (spolu s kritériami korela čného koeficientu kalibra čnej 
krivky) a výsledkov zabezpe čenia kvality a kontroly kvality (QA/QC), 
— v prípade dostupnosti: potvrdzujúca správa o postupe skúšky (ktorá sa 
uvedie v odkazoch).  
LITERATÚRA  
1. De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determi ­
nation of octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring“ method. 
Environ. Toxicol. Chem. 8: 499 – 512. 
2. Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozde ľovací koeficient. 
3. Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozde ľovací koeficient. 
4. OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paríž. 
5. Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01. 
6. Boethling, R. S., Mackay, D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. 
7. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environ ­
mental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. 
8. Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. 
B., Schwarzenbach, R. P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water 
partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  
Environ. Sci. Technol . 31: 2 596 – 2 602. 
9. OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paríž. 
10. Kapitola A.6 tejto prílohy, Rozpustnos ť vo vode. 
11. Kapitola C.7 tejto prílohy, Degradácia – Abiotická degradácia: hydrolýza 
ako funkcia pH. 
12. Kapitola C.4 – časť II – VII (metóda A až F) tejto prílohy, Stanovenie 
„ľahkej“ biodegradovate ľnosti. 
13. Kapitola A.4 tejto prílohy, Tlak pary. 14. Pinsuwan, S., Li A., a Yalkowsky, S. H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623 – 626. 
15. Lyman, W. J. (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., Eds. American 
Chemical Society, Washington, DC, 2-1 až 2-52. 
16. Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA. 
17. Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. 18. Compudrug, L. (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapeš ť. 
19. ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
20. Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman, W. J., 
Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., eds,  Handbook of chemical property esti ­
mation , American Chemical Society, Washington, D.C. 
21. Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: 
An extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther . 14: 
479 – 488. 
22. Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386 – 390.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Dodatok 1  
Tabuľka na výpo čet minimálnych objemov vody požadovaných na zistenie 
testovaných látok s rôznymi hodnotami log P  ow vo vodnej fáze  
Predpoklady: 
— Maximálny objem jednotlivých alikvotných častí = 10 % celkového objemu, 
5 alikvotných častí = 50 % celkového objemu. 
— Koncentrácia testovaných látok  ¼ 0; 7 Ü rozpustnost vkaždej fáze. V prípade 
nižších koncentrácií sa vyžadujú vä čšie objemy. 
— Objem použitý na stanovenie detek čného limitu (LOD) = 100 ml. 
— log P  ow oproti log S  w a log P  ow oproti SR (S  oct /S w ) primerane reprezentujú 
vzťahy testovaných látok.  
Odhad S  w 
log P  ow Rovnica log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E–01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E–01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E–02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E–02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E–03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E–03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E–04  
Odhad S  oct 
log P  ow Rovnica S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Celková hmotnos ť 
testovanej látky 
(mg) Hmotnosť okt / 
hmotnosť voda Hmotnosť H2O 
(mg) Koncentrá ­
cia H2O 
(mg/l) Hmotnosť okt 
(mg) Koncentrácia  okt 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Výpočet objemov  
Minimálny objem požadovaný pre fázu H  2 O pri každej koncentrácii  
log K  ow LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Objem použitý 
pri LOD l) 0,1 
Kľúč pre výpo čty 
Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, jednolitrová nádoba na ustá ­
lenie rovnováhy. 
Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, dvojlitrová nádoba na ustá ­
lenie rovnováhy. 
Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, pä ťlitrová nádoba na ustá ­
lenie rovnováhy. 
Predstavuje < 10 % celkového objemu vodnej fázy, desa ťlitrová nádoba na ustá ­
lenie rovnováhy. 
Presahuje 10 % aj v prípade desa ťlitrovej nádoby na ustálenie rovnováhy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Prehľad požadovaných objemov ako funkcia rozpustnosti vo vode a log P  ow 
Minimálny objem požadovaný pre fázu H  2 O pri každej koncentrácii LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Objem použitý pre LOD l) 0,1  
Dodatok 2  
Príklad testovacej nádoby so skleným pláš ťom pre pokus s pomalým 
miešaním na stanovenie P  ow
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
ČASŤ B: METÓDY NA STANOVENIE TOXIKOLOGICKÝCH 
VLASTNOSTÍ A INÉHO Ú ČINKU NA ZDRAVIE  
OBSAH 
VŠEOBECNÝ ÚVOD 
B.1a. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA STABILNEJ 
DÁVKY 
B.1b. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA TRIEDY 
AKÚTNEJ TOXICITY 
B.2. AKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA 
B.3. AKÚTNA TOXICITA (DERMÁLNA) 
B.4. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE B.5. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA 
B.6. PODRÁŽDENIE POKOŽKY 
B.7. 28-D ŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY PRI HLODAV ­
COCH/TEST V OPAKOVANÝCH DÁVKACH 
B.8. SUBAKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA: 28-D ŇOVÁ ŠTÚDIA 
B.9. TOXICITA PO 28-D ŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE (DER ­
MÁLNA) 
B.10. MUTAGÉNNOS Ť – IN VITRO  TEST CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY U CICAVCOV 
B.11. MUTAGÉNNOS Ť – IN VIVO  TEST CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY V KOSTNEJ DRENI CICAVCOV 
B.12. MUTAGÉNNOS Ť – IN VIVO  TEST MIKROJADRA ERYTRO ­
CYTU U CICAVCOV 
B.13/14. MUTAGÉNNOS Ť: BAKTERIÁLNY TEST REVERZNÝCH 
MUTÁCIÍ 
B.15. TESTOVANIE MUTAGÉNNOSTI A SKRÍNING KARCINO ­
GÉNNOSTI – SKÚŠKA NA GÉNOVÚ MUTÁCIU  U SACCHA ­
ROMYCES CEREVISIAE  
B.16. MITOTICKÁ REKOMBINÁCIA –  SACCHAROMYCESC CERE ­
VISIAE  
B.17. MUTAGÉNNOS Ť – IN VITRO  TEST MUTÁCIÍ GÉNOV 
BUNIEK CICAVCOV 
B.18. POŠKODENIE A OPRAVA DNA – NEPROGRAMOVANÁ 
SYNTÉZA DNA – BUNKY CICAVCOV  IN VITRO  
B.19. TEST VÝMENY SESTERSKÝCH CHROMATÍD  IN VITRO  
B.20. TEST NA ZACHYTENIE RECESÍVNYCH LETÁLNYCH 
MUTÁCIÍ VIAZANÝCH NA POHLAVIE PRI  DROSOPHILA 
MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. TESTY BUNKOVEJ TRANSFORMÁCIE CICAV ČÍCH 
BUNIEK  IN VITRO  
B.22. DOMINANTNÝ LETÁLNY TEST U HLODAVCOV 
B.23. TEST SPERMATOGONÁLNEJ CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY U CICAVCOV 
B.24. SPOT TEST U MYŠÍ 
B.25. DEDI ČNÁ TRANSLOKÁCIA U MYŠÍ 
B.26. TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY: OPAKO ­
VANÁ 90-D ŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY 
U HLODAVCOV/TEST V OPAKOVANÝCH DÁVKACH/ 
B.27. TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY: OPAKO ­
VANÁ 90-D ŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY 
U NEHLODAVCOV 
B.28. ŠTÚDIA SUBCHRONICKEJ DERMÁLNEJ TOXICITY PO 90- 
DŇOVEJ OPAKOVANEJ KOŽNEJ APLIKÁCII 
U HLODAVCOV 
B.29. SUBCHRONICKÁ INHALA ČNÁ TOXICITA: 90-D ŇOVÁ 
ŠTÚDIA 
B.30. ŠTÚDIE CHRONICKEJ TOXICITY B.31. ŠTÚDIA PRENATÁLNEJ VÝVOJOVEJ TOXICITY 
B.32. ŠTÚDIE KARCINOGENITY 
B.33. KOMBINOVANÁ ŠTÚDIA CHRONICKEJ TOXICITY/KARCI ­
NOGENITY 
B.34. JEDNOGENERA ČNÝ REPRODUK ČNÝ TEST TOXICITY 
B.35. DVOJGENERA ČNÁ ŠTÚDIA REPRODUK ČNEJ TOXICITY 
B.36. TOXIKOKINETIKA 
B.37. ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVÝCH 
LÁTOK PO AKÚTNEJ EXPOZÍCII ICH Ú ČINKOM 
B.38. ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVÝCH 
LÁTOK PRI 28-D ŇOVEJ ŠTÚDII OPAKOVANEJ DÁVKY 
B.39. TEST NEPLÁNOVANEJ SYNTÉZY DNA (UNSCHEDULED 
DNA SYNTHESIS – UDS) S PE ČEŇOVÝMI BUNKAMI 
CICAVCOV  IN VIVO  
B.40. POLEPTANIE KOŽE  IN VITRO:  TEST POMOCOU TRANSKU ­
TÁNNEHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER) 
B.40a. POLEPTANIE KOŽE  IN VITRO:  TEST POMOCOU MODELU 
ĽUDSKEJ KOŽE
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. TEST FOTOTOXICITY 3T3 NRU  IN VITRO  
B.42. SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN 
B.43. ŠTÚDIA NEUROTOXICITY U HLODAVCOV B.44. ABSORPCIA KOŽOU: METÓDA  IN VIVO  
B.45. ABSORPCIA KOŽOU: METÓDA  IN VITRO  
B.46. PODRÁŽDENIE KOŽE IN VITRO: TEST NA MODELI 
REKONŠTRUOVANEJ ĽUDSKEJ POKOŽKY 
B.47. TESTOVACIA METÓDA ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI 
HOVÄDZEJ ROHOVKY NA ZIS ŤOVANIE O ČNÝCH 
ŽIERAVÍN A SILNE DRÁŽDIVÝCH LÁTOK 
B.48. TESTOVACIA METÓDA IZOLOVANÉHO KURACIEHO OKA 
NA ZISŤOVANIE O ČNÝCH ŽIERAVÍN A SILNE DRÁŽDI ­
VÝCH LÁTOK 
B.49.  IN VITRO  TEST MIKROJADIER BUNIEK CICAVCOV 
B.50. SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN: DA 
B.51. SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. AKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA – METÓDA AKÚTNEJ 
TOXICKEJ TRIEDY  
▼M5 
B.53. ŠTÚDIA VÝVOJOVEJ NEUROTOXICITY 
B.54. UTEROTROFICKÝ BIOLOGICKÝ TEST U HLODAVCOV: 
KRÁTKODOBÝ SKRÍNINGOVÝ TEST NA ESTROGÉNNE 
VLASTNOSTI 
B.55. HERSHBERGEROV BIOLOGICKÝ TEST U POTKANOV: 
KRÁTKODOBÝ SKRÍNINGOVÝ TEST NA (ANTI)ANDROGÉNNE VLASTNOSTI 
B.56. ROZŠÍRENÁ JEDNOGENERA ČNÁ ŠTÚDIA REPRO ­
DUKČNEJ TOXICITY 
B.57. SKÚŠKA STEROIDOGENÉZY H295R 
B.58. TRANSGÉNNA SKÚŠKA GÉNOVEJ MUTÁCIE NA SOMA ­
TICKÝCH BUNKÁCH HLODAVCOV A SKÚŠKA GÉNOVEJ MUTÁCIE NA ZÁRODO ČNÝCH BUNKÁCH
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
VŠEOBECNÝ ÚVOD  
A. KLASIFIKÁCIA TESTOVANEJ LÁTKY  
Pred začatím toxikologickej štúdie musí by ť známe zloženie testo ­
vanej látky, hlavné ne čistoty a podstatné fyzikálno-chemické vlast ­
nosti vrátane jej stability. 
Fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky poskytujú dôležité 
informácie pri výbere spôsobu použitia, plánovaní každého detailu štúdie a pri manipulácii s testovanou látkou a pri jej skladovaní. 
Začatiu štúdie musí predchádza ť vývoj analytickej metódy pre kvali ­
tatívne a kvantitatívne stanovenie testovanej látky (vrátane hlavných 
nečistôt, ak je možné) v testovanom a biologickom materiáli. 
V správe z testu musia by ť uvedené všetky informácie týkajúce sa 
identifikácie, fyzikálno-chemických vlastností, čistoty a správania 
testovanej látky.
 
B. STAROSTLIVOS Ť O ZVIERATÁ  
Pri toxikologickom testovaní je dôležitá prísna kontrola životných 
podmienok a vhodnej starostlivosti o zvieratá.  
i) Podmienky bývania  
Životné podmienky v experimentálnych zverincoch alebo ohradách 
musia by ť vhodné pre testovaný druh. Pre potkany, myši a mor čatá 
je vhodná teplota miestnosti 22  o C ± 3  o C s relatívnou vlhkos ťou od 
30 % do 70 %. Pre králiky je to teplota 20  o C ± 3  o C s relatívnou 
vlhkosťou od 30 % do 70 %. 
Niektoré experimentálne postupy sú najmä citlivé na teplotu a v 
týchto prípadoch bývajú podrobnosti uvedené v opise metódy testo ­
vania. Pri všetkých sledovaniach toxických ú činkov sa sleduje tiež 
teplota a vlhkos ť, zaznamenáva sa a uvádza sa v závere čnej správe 
štúdie. 
Osvetlenie má by ť umelé v intervaloch 12 hodín svetlo, 12 hodín 
tma. Detaily o vlastnostiach osvetlenia sa zaznamenávajú a uvádzajú 
v záverečnej správe štúdie. 
Zvieratá sa držia jednotlivo alebo sú umiestnené v klietkach 
v malých skupinách toho istého pohlavia, iba ak je to v metóde uvedené; v jednej klietke nesmie by ť umiestnených viac ako pä ť 
zvierat. 
V správe k pokusom so zvieratami sa uvádza spôsob ich umiestnenia 
v klietkach, po čet zvierat v každej klietke aj po čas expozície chemi ­
káliou aj po čas nasledujúceho obdobia pozorovania.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Podmienky k ŕmenia  
Strava musí vyhovova ť výživovým požiadavkám testovaného druhu. 
Ak sa testované látky podávajú zvieratám v strave, môžu sa nutri čné 
hodnoty zníži ť interakciou medzi látkou a zložkami potravy. Pri 
interpretácii výsledkov testu sa musí vzia ť do úvahy možnos ť taký­
chto reakcií. Bežná laboratórna strava sa podáva s neobmedzeným prídelom pitnej vody. Výber potravy môže by ť ovplyvnený potrebou 
zaistenia vhodného prídavku testovanej látky pri použití danej 
metódy. 
Kontaminanty potravy, o ktorých je známe, že vplývajú na toxicitu, 
nesmú by ť prítomné v koncentráciách, ktoré by rušili testovanie.
 
C. ALTERNATÍVNE TESTOVANIE  
Európska únia sa zaviazala podpori ť vývoj a hodnotenie alternatív ­
nych postupov, ktoré poskytnú takú istú úrove ň informácií ako 
súčasné štúdie na zvieratách, ale ktoré používajú menej zvierat, 
spôsobujú menej utrpenia alebo sa vyhýbajú ich použitiu úplne. 
Tieto metódy, tak ako sa zavádzajú, treba bra ť do úvahy všade tam, 
kde možno uskuto čniť charakterizáciu rizika a následnú klasifikáciu 
a opísanie vlastného rizika.  
D. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA  
Po vyhodnotení a interpretovaní testov sa berú do úvahy obmedzenia 
v rozsahu, v ktorom boli výsledky štúdií na zvieratách a štúdií  in 
vitro  extrapolované priamo na človeka, a z toho dôvodu sa dôkaz 
nepriaznivého ú činku na človeka, pokia ľ je prístupný, používa na 
potvrdenie výsledkov testovania.  
E. ODPORÚ ČANÁ LITERATÚRA  
Väčšina uvedených metód sa vyvíja v rámci programu OECD pre 
zásady testovania a uskuto čňuje sa v zhode so zásadami správnej 
laboratórnej praxe s cie ľom zaistenia „vzájomnej akceptácie údajov“ 
v takom rozsahu, ako je len možné. 
Ďalšie informácie sa dajú získa ť v odkazoch uvedených v zásadách 
OECD a v príslušnej inde uvedenej literatúre.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1a.  AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA STABILNEJ 
DÁVKY  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 420 (2001).  
1.1. ÚVOD 
Tradičné metódy na hodnotenie akútnej toxicity využívajú smr ť 
zvierat ako kone čný bod. V roku 1984 Britská toxikologická spolo č­
nosť navrhla novú koncepciu testovania akútnej toxicity založenú na 
podávaní série stabilných dávok (1). Koncepcia nevyužíva smr ť 
zvierat ako kone čný bod a vychádza namiesto toho z pozorovaní 
jasných príznakov toxicity pri jednej zo série stabilných dávok. Po 
validačných štúdiách  in vivo  v Spojenom krá ľovstve (2) a aj 
v medzinárodných štúdiách  in vivo  sa tento postup prijal ako testo ­
vacia metóda v roku 1992. Následne sa štatistické vlastnosti metódy 
stabilnej dávky hodnotili s použitím matematických modelov v rade 
štúdií (4) (5) (6). Štúdie  in vivo  a modelové štúdie spolu názorne 
ukázali, že metóda je reprodukovate ľná, používa sa pri nej menej 
zvierat a spôsobuje menej utrpenia ako tradi čné metódy a umož ňuje 
zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. 
Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný ú čel 
možno nájs ť v Usmer ňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej 
toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (7). Tento usmer ňujúci dokument obsahuje aj dopl ňujúce informácie 
o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1a. 
Princípom tejto metódy je, že v základnej štúdii sa používajú iba 
mierne toxické dávky a že je potrebné vyhýba ť sa podávaniu dávok, 
pri ktorých sa o čakáva, že sú smrte ľné. Nie je tiež potrebné podáva ť 
dávky, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú boles ť a utrpenie 
následkom leptavých alebo silne dráždivých ú činkov. Moribundné 
zvieratá alebo zvieratá so zrejmými boles ťami alebo vykazujúcimi 
známky silného a pretrvávajúceho utrpenia sa humánnym spôsobom usmrtia a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnotia ako zvieratá, 
ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť moribundné 
alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídate ľnej 
alebo nastávajúcej smrti je predmetom samostatného usmer ňovacieho 
dokumentu (8). 
Metóda poskytuje informácie o nebezpe čných vlastnostiach 
a umožňuje, aby sa látka mohla zatriedi ť a klasifikova
ť podľa 
Globálne harmonizovaného systému (GHS) pre klasifikáciu chemi ­
kálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (9). 
Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie 
o testovanej látke pred uskuto čnením štúdie. Takéto informácie 
budú obsahova ť identitu a chemickú štruktúru látky, jej fyzikálno- 
chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných  in vitro  alebo  in 
vivo testov toxicity s látkou, toxikologické údaje o štrukturálne 
príbuzných látkach a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto infor ­
mácie sú potrebné na ubezpe čenie všetkých zainteresovaných, že test 
je relevantný na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej 
počiatočnej dávky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINÍCIE  
Akútna orálna toxicita:  vzťahuje sa na tie nepriaznivé ú činky, ktoré 
sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.  
Oneskorená smr ť: znamená, že zviera neuhynie ani sa nejaví, že je 
moribundné, v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu 14- 
dňového obdobia pozorovania.  
Dávka:  množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako 
hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zviera ťa 
(napr. mg/kg).  
Zrejmá toxicita:  všeobecný termín opisujúci jasné príznaky toxicity 
po podaní testovanej látky [príklady pozri v (3)], ktoré sú také, že pri 
podaní najbližšej najvyššej stabilnej dávky sa dá o čakávať buď silná 
bolesť a pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, moribundný stav 
[kritériá sú uvedené v Humane Endpoints Guidance Document (8)], alebo pravdepodobná mortalita u vä čšiny zvierat.  
GHS:  Globálne harmonizovaný klasifika čný systém pre chemické 
látky a zmesi. Spolo čný projekt OECD (zdravie ľudí a životné 
prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpe čného 
tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebez ­
pečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for 
the Sound Management of Chemicals (IOMC).  
Blížiaca sa smr ť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalším 
plánovaným obdobím pozorovania. Príznaky, ktoré sú prízna čné 
pre tento stav u hlodavcov, by mohli zah ŕňať kŕče, polohu na 
boku, polohu v ľahu a triašku. [ Ďalšie informácie pozri v Humane 
Endpoint Guidance Document (8).]  
LD
 50 (stredná smrte ľná dávka):  je štatistický odvodená jednora ­
zová dávka látky, pri ktorej sa dá o čakávať, že spôsobí úhyn 50 % 
zvierat po orálnom podaní. Hodnota LD  50 je vyjadrená ako hmot ­
nosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zviera ťa 
(mg/kg).  
Limitná dávka:  sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testo ­
vania (2 000 alebo 5 000 mg/kg).  
Moribundný stav:  stav umierania alebo neschopnosti preži ť, 
dokonca aj pri lie čbe. [Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint 
Guidance Document (8).]  
Predvídate ľná smrť: prítomnos ť klinických príznakov charakteris ­
tických pre smr ť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným 
ukončením experimentu, napríklad neschopnos ť prijímať vodu 
alebo jedlo. [ Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance 
Document (8).]  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Skupine zvierat rovnakého pohlavia sa postupne podávajú stabilné 
dávky 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg (výnimo čne sa môže uvažova ť 
o podaní ďalšej stabilnej dávky 5 000 mg/kg, pozri oddiel 1.6.2). 
Na základe predbežnej štúdie sa zvolí po čiatočná dávka, pri ktorej sa 
očakáva, že spôsobí ur čité príznaky toxicity bez toho, aby spôsobila 
vážne toxické ú činky alebo mortalitu. Klinické príznaky 
a podmienky, ktoré sa spájajú s boles ťou, utrpením a blížiacou sa 
smrťou, sú podrobne uvedené v samostatnom usmer ňovacom doku ­
mente OECD (8). Ďalším skupinám zvierat sa môžu podáva ť vyššie 
alebo nižšie stabilné dávky v závislosti od prítomnosti alebo neprí ­
tomnosti príznakov toxicity alebo mortality. Tento postup pokra čuje 
po dávku spôsobujúcu zrejmú toxicitu alebo po zistenie najviac jedného uhynutia, alebo ke ď nie sú vidite ľné žiadne ú činky pri 
najvyššej dávke, alebo ke ď sa vyskytnú uhynutia pri najnižšej dávke.
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Výber druhu zvierat  
Spomedzi živo číchov z druhu hlodavcov sa pokia ľ možno používa 
potkan, aj ke ď sa môže použi ť aj iný druh hlodavca. Zvy čajne sa 
používajú samice (7). Je to preto, že preh ľady bežných LD  50 testov 
uverejnené v odbornej literatúre uvádzajú, že zvy čajne je malý 
rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, ale v tých prípadoch, ke ď sa 
pozorujú rozdiely, sú samice zvy čajne mierne citlivejšie (10). Ak 
však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlast ­
nostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskuto č­ 
ňuje na samcoch, je potrebné uvies ť primerané zdôvodnenie. 
Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných labo ­
ratórnych kme ňov. Samice majú by ť panenské a negravidné. Každé 
zviera má by ť na začiatku dávkovania vo veku od 8 do 12 týžd ňov 
a jeho hmotnos ť má byť v intervale ± 20 % priemernej hmotnosti 
všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.
 
1.4.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá má by ť 22 o C (± 3  o C). Aj keď 
relatívna vlhkos ť má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšova ť 70 %, 
okrem obdobia po čas čistenia miestnosti má dosahova ť 50 % – 60 %. 
Osvetlenie má by ť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. 
Na kŕmenie sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo 
s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu by ť 
v klietkach po skupinách pod ľa dávok, ale po čet zvierat na klietku 
musí umožni ť zreteľné pozorovanie každého zviera ťa. 
1.4.3.  Príprava zvierat  
Zvieratá sú náhodne vybrané, ozna čené tak, aby sa umožnila jednot ­
livá identifikácia, a držia sa v klietkach aspo ň 5 dní pred za čiatkom 
podávania látky, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne 
podmienky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Príprava dávok  
Testované látky sa zvy čajne podávajú v stálom objeme po čas celého 
rozsahu dávok, ktoré sa majú testova ť zmenou koncentrácie dávko ­
vaného prípravku. Ak sa však má testova ť kvapalný kone čný 
produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. pri 
konštantnej koncentrácii, môže by ť vhodnejšie pre následné stano ­
venie rizika tejto látky a požadujú ho niektoré regula čné orgány. 
V každom prípade sa nesmie prevýši ť maximálny objem podávanej 
dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo 
podať, závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. U hlodavcov by 
objem zvy čajne nemal presiahnu ť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti: 
v prípade vodných roztokov sa však môže uvažova ť o 2 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Pokia ľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, 
odporúča sa, pokia ľ je to možné, použitie vodného roztoku/ ­
suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/ ­
emulzia v oleji (napr. kukuri čný olej) a potom prípadne roztok 
v iných nosi čoch. Pre nosi če, ktoré sú iné ako voda, by mali by ť 
známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia by ť pripravené 
tesne pred podávaním, pokia ľ nie je známa a prijate ľná stabilita 
prípravku po čas jeho používania.  
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Podávanie dávok  
Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu 
s použitím žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly. Za 
nezvyčajných okolností, ke ď nie je možná jednorazová dávka, môže 
sa dávka podáva ť v menších množstvách v priebehu maximálne 24 
hodín. 
Zvieratá sa pred podaním dávky vyhladujú (napr. potkanom sa cez 
noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3 – 4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia 
a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa potrava môže 
zadržať na ďalšie 3 – 4 hodiny potkanom alebo myšiam na 1 – 2 
hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach po čas určitého obdobia, 
môže by ť potrebné poskytnú ť zvieratám potravu a vodu 
v závislosti od d ĺžky obdobia.
 
1.5.2.  Predbežná štúdia  
Účelom predbežnej štúdie je umožni ť výber vhodnej po čiatočnej 
dávky pre základnú štúdiu. Testovaná látka sa podáva jednotlivým 
zvieratám postupne pod ľa postupového diagramu v prílohe 
1. Predbežná štúdia je hotová, ke ď možno vykona ť rozhodnutie 
o počiatočnej dávke pre základnú štúdiu (alebo ak sa vyskytne 
uhynutie pri najnižšej stabilnej dávke). 
Počiatočná dávka sa v prípade predbežnej štúdie vyberie zo stabil ­
ných dávok 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg ako dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí zrejmú toxicitu, ktorá je založená pokia ľ 
možno na dôkaze z  in vivo  a in vitro  údajov pre tú istú chemikáliu 
a pre štrukturálne príbuzné chemikálie. Ak takéto informácie chýbajú, bude po čiatočná dávka 300 mg/kg. 
Medzi podaním jednotlivých dávok každému zviera ťu je časový 
interval aspo ň 24 hodín. Všetky zvieratá sa pozorujú aspo ň 14 dní.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných 
regulačných potrieb, sa môže zoh ľadniť použitie ďalšej vyššej 
stabilnej dávky 5 000 mg/kg (pozri prílohu 3). Z dôvodu starostli ­
vosti o zvieratá sa pokusy na zvieratách v rozsahoch GHS kategórie 5 (2 000 – 5 000 mg/kg) neodporú čajú a uvážia sa iba v prípade 
veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu sú bezpro ­
stredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu 
životného prostredia. 
V prípadoch, ke ď zviera testované pri najnižšej stabilnej dávke 
(5 mg/kg) v predbežnej štúdii uhynie, je zvy čajným postupom, že 
štúdia sa ukon čí a látka sa zaradí do GHS kategórie 1 (ako je 
uvedené v prílohe 1). Ak sa však vyžaduje ďalšie potvrdenie klasi ­
fikácie, môže sa vykona ť tento volite ľný doplnkový postup. 
Druhému zviera ťu sa podá dávka 5 mg/kg. Ak toto druhé zviera 
uhynie, potom sa potvrdí GHS kategória 1 a štúdia sa ihne ď ukončí. 
Ak druhé zviera prežije, potom sa maximálne trom ďalším zvieratám 
podá dávka 5 mg/kg. Pre výskyt ve ľkého rizika mortality sa týmto 
zvieratám z dôvodu starostlivosti o zvieratá podá dávka postupne. 
Časový interval medzi podaním dávky každému zviera ťu má by ť 
dostatočný na to, aby sa stanovila pravdepodobnos ť prežitia pred ­
chádzajúceho zviera ťa. Ak sa vyskytne druhé uhynutie, postupnos ť 
podávania dávok sa ihne ď ukončí a žiadnym ďalším zvieratám sa 
dávky nepodajú. Ke ďže výskyt druhého uhynutia (bez oh ľadu na 
počet pokusných zvierat v čase ukončenia) patrí do výsledku A (2 
alebo viac uhynutí), postupuje sa pod ľa klasifika čného pravidla 
prílohy 2 pri stabilnej dávke 5 mg/kg (kategória 1, ak sa vyskytne 
2 alebo viac uhynutí, alebo kategória 2, ak sa nevyskytne viac ako 1 
uhynutie). Okrem toho príloha 4 poskytuje usmernenie pre klasifi ­
káciu v systéme EÚ, až kým sa nezavedie nový GHS.  
1.5.3.  Základná štúdia  
1.5.3.1.  Počet zvierat a dávky  
Opatrenia, ktoré sa majú prija ť po testovaní s po čiatočnou dávkou, 
sa uvádzajú v postupových diagramoch v prílohe 2. Vyžaduje sa jedno z troch opatrení; bu ď sa testovanie ukon čí a priradí príslušná 
trieda klasifikácie nebezpe čenstva, testuje sa pri vyššej stabilnej 
dávke, alebo sa testuje pri nižšej stabilnej dávke. Na ochranu zvierat 
sa však v základnej štúdii nezopakuje dávka, ktorá spôsobila uhynutie v predbežnej štúdii (pozri prílohu 2). Zo skúseností vyplýva, že najpravdepodobnejším výsledkom pri po čiatočnej 
dávke bude to, že látku možno klasifikova ť, a nie je potrebné ďalšie 
testovanie. 
Zvyčajne sa používa celkove pä ť zvierat rovnakého pohlavia pre 
každú skúmanú dávku. K týmto piatim zvieratám patrí jedno zviera 
z predbežnej štúdie, ktorému sa podala zvolená dávka, a ďalšie štyri 
zvieratá (okrem výnimo čného prípadu, ke ď sa dávka použitá 
v základnej štúdii nezahrnula do predbežnej štúdie). 
Časový interval medzi dávkovaním s každou ve ľkosťou dávky je 
určený nástupom, trvaním a závažnos ťou príznakov toxicity. Ďalšia 
dávka sa podá zvieratám až po ubezpe čení, že zvieratá, ktorým sa 
predtým podala dávka, prežili. Pod ľa potreby sa odporú ča interval 3 
alebo 4 dni medzi jednotlivými dávkami, aby sa umožnilo pozoro ­
vanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže nastavi ť podľa 
potreby, napr. v prípade nepresved čivej reakcie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Ak sa uvažuje o použití vyššej stabilnej dávky 5 000 mg/kg, postupuje 
sa podľa postupu uvedeného v prílohe 3 (pozri tiež oddiel 1.6.2).  
1.5.3.2.  Limitný test  
Limitný test sa pokia ľ možno používa v situáciách, ke ď experimen ­
tátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je 
pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, ke ď 
prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu možno získa ť z poznatkov o podobných testo ­
vaných látkach alebo podobných testovaných zmesiach alebo 
produktoch pri zoh ľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je 
známe, že sú toxikologicky významné. V tých situáciách, ke ď je 
málo informácií alebo nie sú informácie o jeho toxicite, alebo 
v ktorých sa o čakáva, že testovaný materiál bude toxický, je 
potrebné vykona ť základný test. 
Pri zvyčajnom postupe sa po čiatočná dávka predbežnej štúdie 2 000 
mg/kg (alebo výnimo čne 5 000 mg/kg) následne podá ďalším štyrom 
zvieratám, čo slúži ako limitný test v prípade tohto usmernenia.
 
1.6. POZOROVANIA 
Zvieratá sa vyšetrujú individuálne po podaní dávky aspo ň raz počas 
prvých 30 minút, pravidelne po čas prvých 24 hodín, osobitne 
pozorne po čas prvých 4 hodín, a potom každý de ň počas celkove 
14 dní okrem prípadu, ke ď je potrebné zvieratá vylú čiť zo štúdie a z 
dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrti ť alebo 
keď sa zistí, že uhynuli. D ĺžka pozorovania by sa však nemala pevne 
určiť. Určí sa na základe toxických reakcií, času nástupu a d ĺžky 
času zotavenia a malo by sa teda umožni ť jej predĺženie, ak sa to 
pokladá za potrebné. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxi ­
city, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (11). Všetky pozorovania sa systematicky 
zaznamenajú, pri čom každé zviera má individuálny záznam. 
Ďalšie vyšetrenia budú potrebné, ak zvieratá na ďalej vykazujú 
príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornos ť zmenám na 
pokožke a srsti, o čiach a slizniciach a tiež respira čnému, obehovému, 
autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornos ť sa 
zameriava na pozorovanie triašky, k ŕčov, slinenia, hna čky, letargie, 
spánku a kómy. Zoh ľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované 
v Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvieratá nachádzajúce sa v moribundnom stave alebo tie, ktoré vykazujú silné bolesti alebo 
pretrvávajúce príznaky ve ľkého utrpenia, sa humánnym spôsobom 
usmrtia. Ke ď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa 
nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamena ť čas 
uhynutia.
 
1.6.1.  Telesná hmotnos ť 
Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanoví krátko pred podaním testo ­
vanej látky a potom aspo ň každý týžde ň. Zmeny hmotnosti sa vypo ­ 
čítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, 
odvážia a potom humánnym spôsobom usmrtia.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patológia  
Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu 
alebo sú vylú čené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá) sa 
podrobia autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny 
u každého zviera ťa sa zaznamenajú. Môže sa uvažova ť aj 
o mikroskopickom vyšetrení orgánov dokazujúcom makroskopické patologické nálezy u zvierat, ktoré prežili 24 alebo viac hodín po podaní po čiatočnej dávky, ktoré môže poskytnú ť užitočné informá ­
cie.
 
2. ÚDAJE  
O jednotlivých zvieratách sa poskytujú informácie. Okrem toho sa 
všetky údaje zosumarizujú vo forme tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet použitých zvierat, po čet zvierat vyka ­
zujúcich príznaky toxicity, po čet zvierat, ktoré sa našli uhynuté 
počas testu, alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas uhynutia 
jednotlivých zvierat, popis časového priebehu toxických ú činkov 
a reverzibility a pitevné nálezy.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí pod ľa potreby obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: — fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno- 
chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje vrátane čísla CAS. 
Nosič (v prípade potreby): 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda. 
Pokusné zvieratá: — použitý druh/kme ň, 
— mikrobiologický stav zvierat, ak je známy, 
— počet, vek a pohlavie zvierat (v prípade potreby vrátane zdôvod ­
nenia, pre čo sa použili samce namiesto samíc), 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Testovacie podmienky: 
— údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej 
forme podávaného materiálu, 
— údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase 
podávania, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, 
zdroja vody), 
— zdôvodnenie výberu po čiatočnej dávky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Výsledky: 
— tabuľkové spracovanie údajov o reakcii a ve ľkosti dávky pre 
každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, povahy, závažnosti a trvania ú činkov), 
— tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmot ­
nosti, 
— hmotnosti jednotlivých zvierat v de ň podania dávky, potom 
v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia, 
— dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia, 
— časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli 
reverzibilné pre každé zviera, 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii. 
Diskusia a interpretácia výsledkov. 
Závery.
 
4. ODKAZY  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85 – 92. 
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of 
substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279 – 291. 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469 – 482. 
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of 
the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313 – 324. 
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the 
fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315 – 323. Human Exptl. Toxicol. 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statis ­
tical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183 – 196. 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asse ­
ssment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, s. 11 [http://webnet1.oecd.org/ ­
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-1]. 
no-24-no-0,FF.html]. 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223 – 231. 
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
PRÍLOHA 1:  
POSTUPOVÝ DIAGRAM PRE PREDBEŽNÚ ŠTÚDlU

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
PRÍLOHA 2  
POSTUPOVÝ DIAGRAM PRE ZÁKLADNÚ ŠTÚDlU

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
Príloha 3  
KRITÉRIÁ KLASIFIKÁCIE TESTOVANÝCH LÁTOK 
S OČAKÁVANÝMI HODNOTAMI LD  50 VYŠŠÍMI AKO 2 000 MG/KG, 
KTORÉ NIE JE POTREBNÉ TESTOVA Ť 
Kritériá pre kategóriu nebezpe čenstva 5 sú ur čené na umožnenie identifikácie 
testovaných látok s relatívne nízkym nebezpe čenstvom akútnej toxicity, ale 
ktoré za ur čitých podmienok môžu predstavova ť nebezpe čenstvo pre zranite ľ­
nejšie skupiny obyvate ľstva. Predpokladá sa, že tieto látky majú orálnu alebo 
dermálnu LD  50 v rozsahu 2 000 – 5 000 mg/kg alebo rovnocennú s dávkami pre 
iné spôsoby podávania. Testované látky sa klasifikujú do kategórie nebezpe čen­
stva, ktorá je definovaná ako: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategória 5 
v GHS) v týchto prípadoch: 
a) ak sú zaradené do tejto kategórie na základe niektorej testovacej schémy 
z prílohy 2 na základe výskytov mortality; 
b) ak je už dostupný spo ľahlivý dôkaz, z ktorého vyplýva, že LD  50 je v rozsahu 
hodnôt kategórie 5, alebo z iných štúdií na zvieratách alebo toxických účinkov u ľudí vyplývajú obavy z akútnych dôsledkov pre zdravie ľudí; 
c) pomocou extrapolácie, odhadu a merania údajov, ak nie je potvrdené zara ­
denie do vyššej triedy nebezpe čenstva, a 
— sú k dispozícii spo ľahlivé informácie, z ktorých vyplývajú závažné 
toxické ú činky u ľudí, alebo 
— sa zistila mortalita pri testovaní s orálnym podávaním dávok až do hodnôt 
kategórie 4, alebo 
— ak expertné posúdenie potvrdí závažné klinické príznaky toxicity pri testo ­
vaní až do hodnôt kategórie 4 okrem hna čky, zježenia alebo neupravenej 
srsti, alebo 
— ak expertné posúdenie potvrdí spo ľahlivé informácie, z ktorých vyplýva na 
základe iných štúdií na zvieratách možnos ť závažných akútnych ú činkov.
 
TESTOVANIE S DÁVKAMI NAD 2 000 MG/KG  
Výnimočne a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regula čných 
potrieb sa môže zoh ľadniť použitie ďalšej vyššej stabilnej dávky 5 000 mg/kg. 
Vzhľadom na potrebu ochrany zvierat sa testovanie s 5 000 mg/kg neodporú ča 
a môže sa uváži ť iba v prípade ve ľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto 
testu by mohli by ť bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat (9).  
Predbežná štúdia  
Pravidlá rozhodnutia upravujúce postupovú metódu uvedenú v prílohe 1 sa 
rozširujú o dávku 5 000 mg/kg. Preto ke ď sa ako po čiatočná dávka 
v predbežnej štúdii použije dávka 5 000 mg/kg, na základe výsledku A (smr ť) 
bude potrebné, aby sa testovalo druhé zviera s dávkou 2 000 mg/kg; výsledky B a C (zrejmá toxicita alebo žiadna toxicita) umožnia, aby sa dávka 5 000 mg/kg 
zvolila ako po čiatočná dávka v základnej štúdii. Podobne ak sa použije iná 
počiatočná dávka ako 5 000 mg/kg, potom testovanie pokra čuje s 5 000 mg/kg 
na základe výsledkov B alebo C pri ve ľkosti dávky 2 000 mg/kg; následne 
výsledok A pri dávke 5 000 mg/kg predur čí počiatočnú dávku v základnej štúdii 
s veľkosťou dávky 2 000 mg/kg a výsledky B a C predur čia počiatočnú dávku 
pre základnú štúdiu s ve ľkosťou 5 000 mg/kg.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Základná štúdia  
Pravidlá rozhodnutia upravujúce postupovú metódu uvedenú v prílohe 2 sa 
rozširujú o dávku 5 000 mg/kg. Preto ke ď sa ako po čiatočná dávka v základnej 
štúdii použije dávka 5 000 mg/kg, na základe výsledku A ( ≥ 2 uhynuté zvieratá) 
bude potrebné, aby sa testovala druhá skupina zvierat s dávkou 2 000 mg/kg; 
výsledok B (zrejmá toxicita a/alebo ≤ 1 uhynuté zviera) alebo C (žiadna toxicita) 
bude mať za následok, že látka sa nebude klasifikova ť podľa GHS. Podobne ak sa 
použije iná po čiatočná dávka ako 5 000 mg/kg, potom testovanie pokra čuje do 
5 000 mg/kg na základe výsledku C pri ve ľkosti dávky 2 000 mg/kg; následne 
výsledok A pri dávke 5 000 mg/kg bude ma ť za následok, že látka sa zaradí do 
kategórie 5 GHS a výsledky B alebo C povedú k tomu, že sa látka nebude klasi ­
fikovať. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
PRÍLOHA 4  
TESTOVACIA METÓDA B.1a  
Usmernenie pre klasifikáciu pod ľa schémy EÚ na prekonanie prechodného obdobia do úplného zavedenia Globálne harmonizovaného klasifika čného systému (GHS)

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1b.  AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA TRIEDY 
AKÚTNEJ TOXICITY  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 423 (2001).  
1.1. ÚVOD 
Metóda triedy akútnej toxicity (1), uvedená v tomto teste, je 
postupnou metódou, pri ktorej sa na každý krok použijú 3 zvieratá rovnakého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo ich moribund ­
ného stavu môžu by ť potrebné priemerne 2 až 4 kroky na posúdenie 
akútnej toxicity testovanej látky. Táto metóda je reprodukovate ľná, 
používa sa pri nej ve ľmi málo zvierat a umož ňuje zatriedi ť látky 
podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. Metóda triedy 
akútnej toxicity je založená na biometrických hodnoteniach (2) (3) (4) (5) so stabilnými dávkami dostato čne odlíšenými, aby umožnili 
zatriedenie látky na klasifika čné účely a posúdenie nebezpe čenstva. 
Metóda, ktorá bola prijatá v roku 1996, bola rozsiahlo validovaná 
pokusmi  in vivo  v porovnaní s údajmi LD
 50 získanými z literatúry, 
tak na národnej (6), ako aj na medzinárodnej úrovni (7). 
Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný ú čel 
možno nájs ť v Usmer ňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej 
toxicity [Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8)]. Tento usmer ňujúci dokument obsahuje aj dopl ňujúce informácie 
o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1b. 
Nie je potrebné podáva ť testované látky pri dávkach, o ktorých je 
známe, že spôsobujú silnú boles ť a utrpenie následkom leptavých 
alebo silne dráždivých ú činkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá 
s bolesťami, alebo zvieratá, ktoré vykazujú príznaky silného 
a trvalého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrcujú a pri inter ­
pretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré 
uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť moribundné alebo 
silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídate ľnej alebo 
nastávajúcej smrti sú predmetom samostatného usmer ňovacieho 
dokumentu (9). 
Metóda využíva vopred stanovené dávky a výsledky umož ňujú, aby 
sa látka mohla zatriedi ť a klasifikova ť podľa Globálne harmonizo ­
vaného systému pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (10). 
Metóda nie je v zásade ur čená na umožnenie výpo čtu presnej hodnoty 
LD
 50 , ale umož ňuje stanovi ť definované rozsahy expozície, kde sa 
očakáva letalita, ke ďže uhynutie časti zvierat je stále najdôležitejším 
konečným bodom tohto testu. Metóda umož ňuje stanovi ť hodnoty 
LD 50 iba v prípade, ke ď v dôsledku podania aspo ň dvoch dávok je 
mortalita vyššia ako 0 % a nižšia ako 100 %. Výber vopred stanove ­
ných dávok bez oh ľadu na testovanú látku s klasifikáciou výlu čne 
viazanou na po čet zvierat vyšetrovaných v rôznych stavoch zlepšuje 
možnosti konzistencie podávania správ a reprodukovate ľnosti medzi 
laboratóriami.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie 
o testovanej látke pred uskuto čnením štúdie. Takéto informácie 
budú zah ŕňať identitu a chemickú štruktúru látky, jej fyzikálno- 
chemické vlastnosti, výsledok všetkých ostatných  in vivo  alebo  in 
vitro  testov toxicity s látkou, toxikologické údaje o štrukturálne 
príbuzných látkach a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto infor ­
mácie sú potrebné na ubezpe čenie všetkých zainteresovaných, že test 
je dôležitý na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere najvhod ­
nejšej počiatočnej dávky.  
1.2. DEFINÍCIE  
Akútna orálna toxicita:  vzťahuje sa na tie nepriaznivé ú činky, ktoré 
sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo 
viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.  
Oneskorená smr ť: znamená, že zviera neuhynie ani sa nejaví ako 
moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu 
vymedzeného 14-d ňového obdobia pozorovania.  
Dávka:  množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako 
hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zviera ťa 
(napr. mg/kg).  
GHS:  Globálne harmonizovaný klasifika čný systém pre chemické 
látky a zmesi. Spolo čný projekt OECD (zdravie ľudí a životné 
prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpe čného 
tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebez ­
pečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for 
the Sound Management of Chemicals (IOMC).  
Blížiaca sa smr ť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalším 
plánovaným obdobím pozorovania. Príznaky, ktoré sú prízna čné 
pre tento stav u hlodavcov by mohli zah ŕňať kŕče, polohu na 
boku, polohu v ľahu a triašku. [ Ďalšie informácie sa nachádzajú 
v Humane Endpoint Guidance Document (9).]  
LD 50 (stredná smrte ľná orálna dávka):  štatistický odvodená 
jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá o čakávať, že spôsobí 
úhyn 50 % zvierat pri orálnom podaní. Hodnota LD  50 je vyjadrená 
ako hmotnos ť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného 
zvieraťa (mg/kg).  
Limitná dávka:  sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testo ­
vania (2 000 alebo 5 000 mg/kg).  
Moribundný stav:  stav umierania alebo neschopnosti preži ť, 
dokonca aj pri lie čbe. [Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane 
Endpoint Guidance Document (9).]  
Predvídate ľná smrť: prítomnos ť klinických príznakov charakteris ­
tických pre smr ť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným 
ukončením experimentu; napríklad neschopnos ť prijímať vodu 
alebo jedlo. [ Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint 
Guidance Document (9).]  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. PRINCÍP TESTU 
Princíp testu spo číva v tom, že na základe metódy postupných 
krokov s použitím minimálneho po čtu zvierat na krok sa získajú 
dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej látky, ktoré 
umožnia jej klasifikáciu. Látka sa podáva orálne skupine pokusných 
zvierat v jednej zo stanovených dávok. Látka sa testuje s použitím metódy postupných krokov, v každom kroku sa použijú tri zvieratá rovnakého pohlavia (zvy čajne samice). Absencia alebo výskyt morta ­
lity súvisiacej s látkou u zvierat, ktorým sa podala dávka v jednom 
kroku, ur čí ďalší krok, t. j.: 
— nie je potrebné ďalšie testovanie, 
— podanie rovnakej dávky trom ďalším zvieratám, 
— podanie najbližšej vyššej alebo najbližšej nižšej dávky trom 
ďalším zvieratám. 
Informácie o postupe testu sú uvedené v prílohe 1. Metóda umožní 
posúdenie vzh ľadom na klasifikáciu testovanej látky do jednej 
z viacerých tried toxicity definovaných pevnými hrani čnými hodno ­
tami LD
 50 . 
1.4. OPIS METÓDY  
1.4.1.  Výber druhu zvierat  
Spomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, hoci sa 
môže použi ť aj iný druh hlodavca. Zvy čajne sa používajú samice (9). 
Je to preto, že preh ľady konven čných LD  50 testov, uverejnené 
v odbornej literatúre, uvádzajú, že hoci je malý rozdiel v citlivosti 
medzi pohlaviami, v tých prípadoch, ke ď sa pozorovali rozdiely, sú 
samice zvy čajne mierne citlivejšie (11). Ak však z poznatkov 
o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne 
príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu by ť citlivejšie, 
potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskuto čňuje na samcoch, 
je potrebné uvies ť primerané zdôvodnenie. 
Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných labo ­
ratórnych kme ňov. Samice majú by ť panenské a negravidné. Každé 
zviera na za čiatku dávkovania má by ť vo veku od 8 do 12 týžd ňov 
a jeho hmotnos ť má byť v rozpätí ± 20 % priemernej hmotnosti 
všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.  
1.4.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22  o C 
(± 3  o C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť by mala by ť aspoň 30 % 
a nemala by prevyšova ť 70 %, okrem obdobia po čas čistenia miest ­
nosti by mala dosahova ť 50 % – 60 %. Osvetlenie by malo by ť 
umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na k ŕmenie sa môže 
používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej 
vody. Zvieratá môžu by ť v klietkach po skupinách pod ľa dávok, ale 
počet zvierat na klietku musí umožni ť zreteľné pozorovanie každého 
zvieraťa. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Príprava zvierat  
Zvieratá sú náhodne vybrané, ozna čené tak, aby sa umožnila jednot ­
livá identifikácia, a držia sa v klietkach aspo ň 5 dní pred za čiatkom 
podávania dávok, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.  
1.4.4.  Príprava dávok  
Testované látky sa zvy čajne podávajú v stálom objeme po čas celého 
intervalu dávkovania, ktoré sa má testova ť na základe zmeny 
koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testova ť 
kvapalný kone čný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej 
látky, t. j. s konštantnou koncentráciou, môže by ť pre následné 
stanovenie rizika tejto látky vhodnejšie a požadujú ho niektoré regu ­
lačné orgány. V každom prípade sa nesmie prekro čiť maximálny 
objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. 
U hlodavcov by objem zvy čajne nemal presiahnu ť 1 ml/100 g telesnej 
hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažova ť 
o 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Pokia ľ ide o zloženie dávkovaného 
prípravku, odporú ča sa vždy, ke ď je to možné, použitie vodného 
roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/ ­
suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuri čný olej), a potom prípadne 
roztok v iných nosi čoch. Pre nosi če, ktoré sú iné ako voda, by mali 
byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia by ť pripra­
vené tesne pred podávaním, pokia ľ nie je známa a prijate ľná stabilita 
prípravku po čas obdobia, ke ď sa bude používa ť.
 
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Podávanie dávok  
Testovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu 
s použitím žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly. Za 
nezvyčajných okolností, ke ď nie je možná jednorazová dávka, sa 
môže dávka podáva ť v menších množstvách v priebehu maximálne 
24 hodín. 
Zvieratá sa pred podávaním dávok vyhladujú (napr. potkanom sa cez 
noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3 – 4 hodiny zadrží 
potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia 
a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa zadrží potrava na ďalšie 3 – 4 hodiny potkanom alebo myšiam na 1 – 2 hodiny. Ak sa 
dávka podáva po častiach po čas určitého obdobia, môže by ť 
potrebné poskytnú ť zvieratám potravu a vodu v závislosti od d ĺžky 
obdobia.
 
1.5.2.  Po čet zvierat a ve ľkosť dávok  
Na každý krok sa použijú tri zvieratá. Ve ľkosť dávky, ktorá sa 
použije ako po čiatočná dávka, sa vyberie z jednej zo štyroch stabil ­
ných hodnôt 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Po čiatočná 
dávka má by ť taká, pri ktorej s najvä čšou pravdepodobnos ťou 
nastane smr ť u niektorých zvierat, ktorým sa dávka podala. Postu ­
pové diagramy v prílohe 1 opisujú postup, ktorý je potrebné dodržiava ť pre každú z po čiatočných dávok. Pritom príloha 4 posky ­
tuje usmernenie ku klasifikácii v schéme EÚ, až kým sa nezavedie 
nový GHS.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Keď z dostupných informácií vyplýva, že úmrtie je nepravdepodobné 
pri najvyššej po čiatočnej dávke (2 000 mg/kg telesnej hmotnosti), 
potom je potrebné vykona ť limitný test. Ak nie sú žiadne informácie 
o látke, ktorá sa má testova ť, z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa 
odporúča použiť počiatočnú dávku 300 mg/kg telesnej hmotnosti. 
Časový interval medzi skupinami dávok je ur čený nástupom, trvaním 
a závažnos ťou príznakov toxicity. Zvieratám sa podá ďalšia dávka až 
po ubezpe čení, že zvieratá, ktorým sa predtým dávka podala, prežili. 
Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných 
regulačných potrieb, sa môže uvažova ť o použití ďalšej vyššej 
stabilnej dávky 5 000 mg/kg telesnej hmotnosti (pozri prílohu 2). 
Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa testy na zvieratách v rozsahu GHS kategórie 5 (2 000 – 5 000 mg/kg) neodporú čajú a uvažuje sa 
o nich iba v prípade ve ľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto 
testu by mohli by ť bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí 
a zvierat alebo ochranu životného prostredia.
 
1.5.3.  Limitný test  
Limitný test sa používa predovšetkým v situáciách, ke ď experimen ­
tátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je 
pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, ke ď 
prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu možno získa ť z poznatkov o podobných testo ­
vaných látkach alebo podobne testovaných zmesiach alebo produk ­
toch pri zoh ľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, 
že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, ke ď existuje 
málo informácií alebo neexistujú žiadne informácie o jeho toxicite, alebo v ktorých sa o čakáva, že testovaný materiál bude toxický, je 
potrebné vykona ť základný test. 
Limitný test s jednou dávkou 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti sa 
môže vykona ť so šiestimi zvieratami (tri zvieratá na každý krok). 
Výnimočne sa môže vykona ť limitný test s jednou dávkou 
5 000 mg/kg s tromi zvieratami (pozri prílohu 2). Ak sa vyskytne 
uhynutie súvisiace s testovanou látkou, môže by ť potrebné vykona ť 
ďalšie testovanie s najbližšou nižšou dávkou.
 
1.6. POZOROVANIA 
Zvieratá sa pozorujú individuálne po podaní dávky aspo ň raz počas 
prvých 30 minút, pravidelne po čas prvých 24 hodín, osobitne 
pozorne po čas prvých 4 hodín a potom každý de ň počas celkove 
14 dní okrem prípadu, ke ď je potrebné zvieratá vylú čiť zo štúdie a z 
dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrti ť alebo 
keď sa zistí, že uhynuli. D ĺžka pozorovania by sa však nemala pevne 
stanoviť. Stanoví sa na základe toxických reakcií, času nástupu 
a dĺžky času zotavenia, a teda sa môže pred ĺžiť, ak sa to pokladá 
za potrebné. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú 
dôležité predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických 
príznakov (12). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, 
pričom každé zviera má individuálny záznam.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Ďalšie pozorovania budú potrebné, ak zvieratá na ďalej vykazujú 
príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornos ť zmenám na 
pokožke a srsti, o čiach a slizniciach a tiež respira čnému, obehovému, 
autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornos ť sa 
zameriava na pozorovanie triašky, k ŕčov, slinenia, hna čky, letargie, 
spánku a kómy. Zoh ľadňujú sa aj zásady a kritériá zosumarizované 
v Humane Endpoints Guidance Document (9). Zvieratá, ktoré sú v moribundnom stave alebo vykazujú silné bolesti alebo pretrváva ­
júce príznaky silného utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. 
Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu 
uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamena ť čas uhynu­
tia.
 
1.6.1.  Telesná hmotnos ť 
Hmotnosť jednotlivých zvierat sa stanovuje krátko pred podaním 
testovanej látky a potom aspo ň každý týžde ň. Zmeny hmotnosti sa 
vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, 
odvážia a humánnym spôsobom usmrtia.  
1.6.2.  Patológia  
Všetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu 
alebo sú vylú čené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá) sa 
podrobujú autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zviera ťa sa zaznamenávajú. Môže sa tiež uvažova ť 
o vykonaní mikroskopického vyšetrenia orgánov, dokazujúceho 
makropatologické nálezy vo zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, ktoré môže poskytnú ť užitočné informácie.
 
2. ÚDAJE  
O jednotlivých zvieratách sa uvádzajú informácie. Okrem toho sa 
všetky údaje zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet použitých zvierat, po čet zvierat vykazujúcich 
príznaky toxicity, po čet zvierat, ktoré sa našli uhynuté po čas testu 
alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých 
zvierat, opis a časový priebeh toxických ú činkov a reverzibility 
a pitevné nálezy.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. Správa o teste  
Správa o teste musí pod ľa potreby obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: — fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno- 
chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje vrátane čísla CAS. 
Nosič (v prípade potreby): 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda. 
Pokusné zvieratá: — použitý druh/kme ň,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— mikrobiologický stav zvierat, ak je známy, 
— počet, vek a pohlavie zvierat (vrátane zdôvodnenia na použitie 
samcov namiesto samíc, ak je potrebné), 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Testovacie podmienky: — údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej 
forme podávaného materiálu, 
— údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase 
podávania, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, 
zdroja vody), 
— zdôvodnenie výberu po čiatočnej dávky. 
Výsledky: 
— tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a ve ľkosti 
dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxi ­
city vrátane mortality, charakteru, závažnosti a trvania ú činkov), 
— tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmot ­
nosti, 
— hmotnosti jednotlivých zvierat v de ň podávania dávok, potom 
v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia, 
— dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia, 
— časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli 
reverzibilné pre každé zviera, 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii. 
Diskusia a interpretácia výsledkov. Závery.
 
4. ODKAZY  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. 
Lett., Suppl. 31, 86. 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336 – 341. 
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559 – 610. 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729 – 734. 
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: 
Alterations to LD/LC
 50 Tests. ALTEX 16, 129 – 134. 
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). 
A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
– An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455 – 470.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659 – 670. 
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asse ­
ssment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FF.html]. 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD
 50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223 – 231. 
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and 
Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
Príloha 1  
POSTUP, KTORÝ JE POTREBNÉ DODRŽIAVA Ť PRE KAŽDÚ 
POČIATOČNÚ DÁVKU  
VŠEOBECNÉ POZNÁMKY  
Pre každú po čiatočnú dávku príslušné testovacie schémy, ako je uvedené v tejto 
prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiava ť. 
— príloha 1 A: po čiatočná dávka je 5 mg/kg telesnej hmotnosti, 
— príloha 1 B: po čiatočná dávka je 50 mg/kg telesnej hmotnosti, 
— príloha 1 C: po čiatočná dávka je: 300 mg/kg telesnej hmotnosti, 
— príloha 1 D: po čiatočná dávka je: 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. 
V závislosti od po čtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých 
sa postup testovania uskuto čňuje podľa naznačených šípok.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Príloha 1 A  
POSTUP TESTOVANIA S PO ČIATOČNOU DÁVKOU 5 MG/KG TELESNEJ HMOTNOSTI

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
Príloha 1 B  
POSTUP TESTOVANIA S PO ČIATOČNOU DÁVKOU 50 MG/KG TELESNEJ HMOTNOSTI

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
Príloha 1 C  
POSTUP TESTOVANIA S PO ČIATOČNOU DÁVKOU 300 MG/KG TELESNEJ HMOTNOSTI

 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
Príloha 1 D  
POSTUP TESTOVANIA S PO ČIATOČNOU DÁVKOU 2 000 MG/KG TELESNEJ HMOTNOSTI

Príloha 2  
KRITÉRIÁ PRE KLASIFIKÁCIU TESTOVANÝCH LÁTOK 
S OČAKÁVANÝMI HODNOTAMI LD  50 VYŠŠÍMI AKO 2 000 MG/KG, 
KTORÉ NIE JE POTREBNÉ TESTOVA Ť 
Kritériá pre kategóriu nebezpe čenstva 5 sú ur čené na to, aby sa umožnila identifi ­
kácia testovaných látok s relatívne nízkym nebezpe čenstvom akútnej toxicity, ale 
ktoré za ur čitých podmienok môžu predstavova ť nebezpečenstvo pre zranite ľnejšie 
skupiny obyvate ľstva. Predpokladá sa, že tieto látky majú orálnu alebo dermálnu 
LD 50 v rozsahu 2 000 – 5 000 mg/kg alebo rovnocennú s dávkami pre iné cesty 
podávania. Testované látky sa klasifikujú do kategórie nebezpe čenstva, ktorá je 
definovaná ako: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategória 5 v GHS) 
v týchto prípadoch: 
a) ak sú zaradené do tejto kategórie na základe niektorej z testovacích schém 
v prílohe 1a – 1d založených na prípadoch úmrtia; 
b) ak je už dostupný spo ľahlivý dôkaz, z ktorého vyplýva, že LD  50 je v rozsahu 
hodnôt kategórie 5; alebo z iných štúdií na zvieratách alebo toxických ú čin­
koch u ľudí vyplývajú akútne dôsledky pre zdravie ľudí. 
c) pomocou extrapolácie, odhadu a merania údajov, ak nie je potvrdené zara ­
denie do vyššej triedy nebezpe čenstva, a 
— sú k dispozícii dostupné spo ľahlivé informácie, z ktorých vyplývajú 
závažné toxické ú činky u ľudí, alebo 
— vyskytla sa mortalita pri testovaní s orálnym podávaním dávok až do 
hodnôt kategórie 4, alebo 
— ak odborné posúdenie potvrdí závažné klinické príznaky toxicity pri testo ­
vaní až do hodnôt kategórie 4, okrem hna čky, zježenia alebo neuprave ­
ného vzh ľadu, alebo 
— ak odborné posúdenie potvrdí spo ľahlivé informácie, z ktorých vyplývajú 
na základe iných štúdií na zvieratách možné závažné akútne ú činky.  
TESTOVANIE S DÁVKAMI NAD 2 000 MG/KG  
Vzhľadom na potrebu ochrany zvierat sa testovanie zvierat v rozsahoch kategórie 
5 (5 000 mg/kg) neodporú ča a môže sa o jeho použití uvažova ť iba v prípade 
veľkej pravdepodobnosti, že by výsledky takéhoto testu mohli by ť bezprostredne 
dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat (10). Nie je potrebné uskuto čniť 
ďalšie testovanie s vyššími dávkami. 
Ak sa pre testovanie vyžaduje dávka 5 000 mg/kg, je potrebný iba jeden krok 
(t. j. tri zvieratá). Ak zviera, ktorému sa najskôr podala dávka, uhynie, potom podávanie dávok pokra čuje s dávkou 2 000 mg/kg v súlade s postupovými 
diagramami v prílohe 1. Ak prvé zviera prežije, dvom ďalším sa podajú dávky. 
Ak uhynie iba jedno z troch zvierat, o čakáva sa, že hodnota LD
 50 bude vyššia 
ako 5 000 mg/kg. Ak obe zvieratá uhynú, potom sa podajú dávky s ve ľkosťou 
2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
Príloha 3  
TESTOVACIA METÓDA B.1 tris: Usmernenie pre klasifikáciu pod ľa schémy EÚ na 
prekonanie prechodného obdobia až do úplného zavedenia Globálne harmonizovaného 
klasifikačného systém (GHS) [prevzaté z odkazu (8)]
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. AKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov TG 403 (2009) (1). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov akútnej inhalácie 403 (TG 403) boli prijaté v roku 1981. Táto revi ­
dovaná testovacia metóda B.2 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmer ­
není TG 403) bola vytvorená s cie ľom zabezpe čiť väčšiu flexibilitu, zníži ť 
využívanie zvierat a vyhovie ť regulačným potrebám. Revidovaná testovacia 
metóda zah ŕňa dva druhy štúdií: tradi čný protokol LC
 50 a protokol koncen ­
trácia × čas (C × t). Základnými črtami tejto testovacej metódy sú schopnos ť 
určiť závislosť koncentrácie a reakcie v rozsahu od neletálnych dôsledkov až 
po smrteľné dôsledky na ú čely odvodenia strednej smrte ľnej koncentrácie 
(LC  50 ), neletálnej prahovej koncentrácie (napr. LC01) a sklonu a zistenia 
potenciálnej vnímavosti pohlaví. Protokol C × t by sa mal použi ť v prípade, 
že existuje konkrétna regula čná alebo vedecká potreba, ktorá vyžaduje testo ­
vanie na zvieratách v priebehu viacerých časových intervalov, ako napríklad 
na účely plánovania núdzovej reakcie [napr. odvodenie hodnôt smerodaj ­
ných úrovní akútnej expozície (AEGL), usmernení pre plánovanie núdzovej 
reakcie (ERPG) alebo prahových úrovní akútnej expozície (AETL)] alebo na plánovanie využitia krajiny. 
2. Usmernenia k vykonaniu a interpretácii štúdií tejto testovacej metódy sú 
k dispozícii v usmer ňovacom dokumente o testovaní akútnej inhala čnej 
toxicity (GD 39) (2). 
3. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je 
uvedené na konci tejto kapitoly a v dokumente GD 39 (2). 
4. Táto testovacia metóda umož ňuje charakterizáciu testovanej chemikálie 
a kvantitatívne posúdenie rizík a umož ňuje, aby boli testované chemikálie 
zoradené a klasifikované pod ľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (3). 
V dokumente GD 39 (2) sa uvádzajú usmernenia k výberu vhodnej metódy 
testovania akútnej toxicity. Ak sa požadujú iba informácie o klasifikácii 
a označovaní, vo všeobecnosti sa odporú ča riadiť sa kapitolou B.52 tejto 
prílohy (4) [pozri dokument GD 39 (2)]. Táto testovacia metóda B.2 nie je špecificky ur čená na testovanie špecializovaných materiálov, ako sú slabo 
rozpustné izometrické alebo vláknité materiály alebo priemyselne vyrábané 
nanomateriály.
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
5. Pred zvažovaním testovania pod ľa tejto testovacej metódy by testovacie 
laboratórium malo zoh ľadniť všetky dostupné informácie o testovanej 
chemikálii vrátane existujúcich štúdií [napr. kapitola B.52 tejto 
prílohy (4)] obsahujúcich údaje, na základe ktorých sa ďalšie testovanie 
neodporú ča s cieľom minimalizova ť využívanie zvierat. Informácie, ktoré 
môžu pomôc ť pri výbere najvhodnejšieho druhu, kme ňa, pohlavia, spôsobu 
expozície a primeraných testovacích koncentrácií, zah ŕňajú identitu, 
chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity  in vitro  alebo  in vivo , predpokladané 
použitia a potenciál expozície človeka, dostupné údaje (Q)SAR 
a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach [pozri dokument 
GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Testovaniu žieravých a/alebo dráždivých testovacích chemikálií 
v koncentráciách, ktoré pod ľa očakávania spôsobia silnú boles ť a/alebo 
utrpenie by sa malo v čo najväčšej možnej miere vyhnú ť. Žieravý/dráždivý 
potenciál by sa mal posúdi ť prostredníctvom odborného posudku s využitím 
takých dôkazov, ako sú skúseností u ľudí a pri zvieratách (napr. zo štúdií 
opakovaných dávok uskuto čnených pri nežieravých/dráždivých koncentrá ­
ciách), existujúce údaje  in vitro  [napr. z kapitol B.40, (5), B.40a (6) tejto 
prílohy alebo dokumentu OECD TG 435 (7)], hodnoty pH, informácie o podobných látkach alebo akéko ľvek iné súvisiace údaje, s cie ľom preskú ­
mať, či je možné vyhnú ť sa ďalšiemu testovaniu. Na špecifické regula čné 
účely (napr. na ú čely núdzového plánovania) možno túto testovaciu metódu 
použiť na expozíciu zvierat týmto materiálom, lebo to poskytne vedúcemu 
štúdie alebo vedúcemu výskumnému pracovníkovi kontrolu nad výberom 
cieľových koncentrácií. Cie ľové koncentrácie by však nemali spôsobova ť 
silné dráždivé/žieravé ú činky, mali by však by ť dostatočné na pred ĺženie 
krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úrove ň, na ktorej sa zabezpe čí 
regulačný a vedecký cie ľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vybera ť 
v závislosti od jednotlivých prípadov a výber koncentrácie by sa mal 
odôvodni ť [pozri dokument GD 39 (2)].
 
PRINCÍP TESTU 
7. Táto revidovaná testovacia metóda B.2 bola vypracovaná s cie ľom získa ť 
dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej chemikálie, aby bolo 
možné ju klasifikova ť a aby sa získali údaje o letalite (napr. LC  50 , LC  01 
a sklon) v prípade jedného alebo oboch pohlaví potrebné na kvantitatívne 
posúdenie rizík. V rámci tejto testovacej metódy sú k dispozícii dve metódy. Prvou metódou je tradi čný protokol, pri ktorom sú skupiny zvierat vysta ­
vené limitnej koncentrácii (limitný test) alebo sérii koncentrácií v rámci 
postupu nieko ľkých krokov vä čšinou v intervaloch trvajúcich štyri hodiny, 
ktoré sa ur čia vopred. Na špecifické regula čné účely možno použi ť iné 
intervaly expozície. Druhou metódou je protokol (C × t), pri ktorom sú 
skupiny zvierat vystavené jednej koncentrácii (limitná koncentrácia) alebo 
sérii viacerých koncentrácií v priebehu viacerých intervalov. 
8. Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zjavnými boles ťami alebo zvieratá, 
ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, by sa mali humánnym 
spôsobom usmrti ť, pričom pri interpretácii výsledku testu sa vyhodnocujú 
rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť 
moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvída ­
teľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmer ňovacieho dokumentu 
OECD č. 19 o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance 
Document) (8).
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
9. Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Najvhodnejším zviera ťom je potkan. Použitie 
iných druhov zvierat je nutné odôvodni ť. 
Príprava zvierat  
10. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné. V de ň 
expozície by zvieratá mali by ť mladé dospelé jedince vo veku od 8 do 12 
týždňov a ich telesná hmotnos ť by mala by ť v rozmedzí ± 20 % strednej 
hmotnosti jednotlivých pohlaví všetkých zvierat toho istého veku, ktoré boli 
exponované skôr. Zvieratá sa vyberajú náhodne a ozna čia sa na ú čely indi­
viduálnej identifikácie. Zvieratá sa umiestnia do klietok najmenej na pä ť dní 
pred začatím testu, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Zvieratá 
by sa na krátky čas pred testovaním mali aklimatizova ť aj na testovacie 
zariadenie, lebo sa tak zníži stres spôsobený uvedením do nového prostredia.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Chov zvierat  
11. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala by ť 22 ± 3 °C. 
Relatívna vlhkos ť by sa v ideálnom prípade mala udržiava ť v rozsahu od 30 
do 70 %, hoci to nemusí by ť možné, ak sa ako nosi č používa voda. Pred 
a po expozícii sú zvieratá zvy čajne umiestnené v klietkach v skupinách 
podľa pohlavia a koncentrácie, ale po čet zvierat v jednej klietke by nemal 
prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zviera ťa, pričom by sa 
mali minimalizova ť straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo 
bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže 
byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce 
pohyb. Skúmavky by nemali zvieratám spôsobova ť neprimeraný stres súvi ­
siaci s fyzikálnymi vlastnos ťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. 
Obmedzenie môže ma ť vplyv na fyziologické sledované parametre, ako 
sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respira čný minútový objem. Ak sú 
k dispozícii všeobecné údaje, pod ľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza 
vo veľkej miere, potom nie je potrebné predchádzajúce prispôsobenie obme ­
dzujúcim skúmavkám. Zvieratá vystavené ú činkom aerosólu celým telom by 
sa mali v priebehu expozície umiestni ť samostatne, aby sa zabránilo filtro ­
vaniu testovaného aerosólu cez srs ť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou 
času trvania expozície sa na k ŕmenie môže používa ť bežné a osved čené 
laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvet ­
lenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín 
tmy. 
Inhalačné komory  
12. Pri výbere inhala čnej komory by sa mal vzia ť do úvahy charakter testovanej 
chemikálie a cie ľ testu. Uprednost ňuje sa expozícia oblasti nosa (pri čom 
tento pojem zah ŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti 
sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzova ť a vytvára ť aerosóly, uprednost ňuje expozícia oblasti nosa. 
Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnu ť použitím expozície celého 
tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodni ť. Na zabezpe ­ 
čenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by 
celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnu ť 5 % objemu komory. 
Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody 
a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).
 
PODMIENKY EXPOZÍCIE  
Podávanie koncentrácií  
13. Expozícia oblasti nosa môže ma ť pri potkanoch akéko ľvek trvanie až do 
šiestich hodín. Ak sa použije expozícia oblasti nosa pri myšiach, vo všeo ­
becnosti by nemala trva ť dlhšie ako štyri hodiny. Ak je potrebné, aby 
expozícia trvala dlhšie, je nutné uvies ť odôvodnenie [pozri dokument GD 
39 (2)]. Zvieratá vystavené pôsobeniu aerosólov v komorách na expozíciu 
celého tela by mali by ť umiestnené samostatne, aby sa zabránilo požitiu 
testovanej chemikálie v dôsledku o čisťovania tela ostatnými zvieratami 
v klietke. Po čas trvania expozície by sa zviera nemalo k ŕmiť. V priebehu 
expozície celého tela sa zviera ťu môže poda ť voda. 
14. Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, 
pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, 
závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne 
testované chemikálie by sa mali testova ť v podmienkach suchého vzduchu. 
Treba dba ť na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Rozdelenie ve ľkosti častíc  
15. Častice by sa mali rozdeli ť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov 
a pár, ktoré môžu kondenzova ť a vytvára ť aerosóly. Na umožnenie expo ­
zície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporú čajú aerosóly 
so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu 
od 1 do 4 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru ( σ g ) 
v rozsahu od 1,5 do 3,0 (2) (9) (10). Hoci by sa malo vynaloži ť značné 
úsilie na dodržanie tejto normy, pokia ľ túto podmienku nie je možné splni ť, 
treba predloži ť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov 
môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a takisto nabité častice, 
vlákna a hygroskopické materiály (ktoré sa vo vlhkom prostredí dýchacej 
sústavy zvä čšujú) môžu túto normu prekra čovať. 
Príprava testovanej chemikálie v nosi či 
16. Na prípravu vhodnej koncentrácie a ve ľkosti častíc testovanej chemikálie 
v ovzduší možno použi ť nosič. Spravidla sa uprednost ňuje voda. Tuhý 
materiál môže by ť podrobený mechanickým procesom s cie ľom dosiahnu ť 
požadovanú distribúciu ve ľkosti častíc, treba však dba ť na to, aby sa testo ­
vaná chemikália nerozložila ani nezmenila. V prípadoch, v ktorých sa 
usudzuje, že sa pôsobením mechanických procesov zmenilo zloženie testo ­
vanej chemikálie (napr. extrémne teploty spôsobené nadmerným mletím v dôsledku trenia), by sa zloženie testovanej chemikálie malo analyticky 
overiť. Treba da ť dostatočný pozor, aby sa testovaná chemikália nezne čis­
tila. Nie je potrebné testova ť nedrobivé granulované materiály, ktoré sa 
účelovo pripravujú tak, aby nebolo možné ich inhalova ť. Na preukázanie, 
že pri manipulácii s granulovaným materiálom nevznikajú dýchate ľné 
častice, by sa mal vykona ť test opotrebovania. Ak pri teste opotrebovania 
nevzniknú dýchate ľné látky, treba uskuto čniť test inhala čnej toxicity.
 
Kontrolné zvieratá  
17. Súbežná negatívna kontrolná skupina (ovzdušia) nie je potrebná. V prípade, 
že sa na vytvorenie testovacieho ovzdušia použije iný nosi č ako voda, sa 
kontrolná skupina nosi ča použije iba vtedy, ak nie sú k dispozícii staršie 
údaje o inhala čnej toxicite. Ak sa pri štúdii toxicity testovanej chemikálie 
pripravenej v nosi či nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosi č pri testo ­
vanej koncentrácii nie je toxický, a teda kontrola nosi ča nie je potrebná.  
MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE  
Prúdenie vzduchu v komore  
18. Prúdenie vzduchu cez komoru by sa po čas každej expozície malo dôkladne 
kontrolova ť, nepretržite monitorova ť a zaznamenáva ť aspoň raz za hodinu. 
Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia (alebo stability) je inte ­
grálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy 
prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických parametrov tvorby 
ovzdušia. Osobitne treba dba ť na to, aby sa zabránilo opätovnému vdých ­
nutiu v komorách na expozíciu oblasti nosa v prípadoch, v ktorých prúdenie vzduchu cez systém expozície nesta čí na zabezpe čenie dynamického 
prúdenia vzduchu s testovanou chemikáliou. Existujú predpísané metodiky, 
prostredníctvom ktorých možno dokáza ť, že v zvolených prevádzkových 
podmienkach nedochádza k opätovnému vdýchnutiu (2) (11). Koncentrácia kyslíka by mala by ť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhli čitého by 
nemala presiahnu ť 1 %. Ak existuje dôvod domnieva ť sa, že tieto normy nie 
je možné splni ť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhli čitého by sa mali zmera ť.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Teplota komory a relatívna vlhkos ť 
19. Komora by sa mala udržiava ť pri teplote 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkos ť 
v dýchacej zóne zvierat, tak v prípade expozície oblasti nosa, ako aj v prípade expozície celého tela, by sa mala monitorova ť a zaznamenáva ť 
minimálne trikrát po čas expozície v trvaní až štyroch hodín a v prípade 
kratšej expozície každú hodinu. Relatívna vlhkos ť by sa ideálne mala 
udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa sta ť, že táto hodnota 
bude nedosiahnute ľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) 
alebo nemerate ľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie 
a testovacej metódy.
 
Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia  
20. Vždy, ke ď je to možné, by sa mala vypo čítať a zaznamena ť nominálna 
koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnos ť 
vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, 
ktorý prešiel systémom komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na 
charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie vypovedá o ú činnosti vytvárania testovacieho systému, a teda 
sa môže použi ť na zistenie problémov s tvorbou.  
Testovaná chemikália: skuto čná koncentrácia  
21. Skuto čná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie v dýchacej 
zóne zvierat v inhala čnej komore. Skuto čné koncentrácie možno získa ť 
špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorp čnými 
alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakteri ­
záciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová 
analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jedno ­
zložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prcha ­
vosťou, pričom je potrebné túto analýzu podloži ť primeranými testovými 
charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. 
Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov možno takisto stanovi ť 
prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie 
sú dostupné, môže by ť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie 
(ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypari ť 
alebo môžu sublimova ť, by sa malo preukáza ť, že všetky fázy sa zhromaž ­
dili pomocou zvolenej metódy. V správe o štúdii by sa mali uvies ť cieľové, 
nominálne a skuto čné koncentrácie. Na výpo čet hodnôt smrte ľných koncen ­
trácií sa však v štatistických analýzach použijú iba skuto čné koncentrácie. 
22. Ak je to možné, mala by sa použi ť jedna dávka testovanej chemikálie, 
pričom testovaná vzorka by sa mala uskladni ť za podmienok, za ktorých 
sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred za čatím štúdie by mala 
byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, 
ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontami ­
nantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukáza ť napríklad týmito 
údajmi: reten čný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnos ť získaná 
pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium 
nenesie zodpovednos ť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspo ň 
čias­
točne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávate ľom (napr. farbu, fyzi ­
kálne skupenstvo at ď.). 
23. Prostredie expozície by malo by ť čo najstálejšie a malo by sa nepretržite 
a/alebo ob časne monitorova ť v závislosti od metódy analýzy. Ak sa použije 
občasný odber vzoriek, vzorky ovzdušia komory by sa mali v priebehu 
štvorhodinovej štúdie odobra ť najmenej dvakrát. Ak to pre nízky prietok 
vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, môže sa v priebehu celého 
intervalu expozície odobra ť jedna vzorka. Ak sa medzi jednotlivými vzor ­
kami vyskytnú výrazné výkyvy, pri ďalších testovaných koncentráciách by  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
sa mali použi ť štyri vzorky z každej expozície. Jednotlivé vzorky koncen ­
trácie komory by sa nemali odchýli ť od strednej koncentrácie o viac ako 
± 10 % v prípade plynov a pár alebo o ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t
 95 ) by sa mal 
vypočítať a zaznamena ť. Interval expozície zah ŕňa čas, keď sa testovaná 
chemikália tvorí, pri čom sa zoh ľadňujú aj časy potrebné na dosiahnutie 
t 95 . Usmernenia k odhadovaniu t  95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2). 
24. V prípade ve ľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov 
(napr. spa ľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií pohá ňaných účelo­
vými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhala čnej komore 
môže každá fáza správa ť inak, takže by sa mala vybra ť aspoň jedna látka 
slúžiaca ako ukazovate ľ (analyt), naj častejšie hlavná aktívna látka v zmesi, 
každej fázy (plyn/para a aerosól). Ak je testovaná chemikália zmes, v správe 
by sa mala uvies ť analytická koncentrácia zmesi, nielen aktívnej látky alebo 
zložky (analytu). Ďalšie informácie týkajúce sa skuto čných koncentrácií sú 
uvedené v dokumente GD 39 (2).  
Testovaná chemikália: rozdelenie ve ľkosti častíc  
25. Rozdelenie ve ľkosti častíc aerosólov by sa malo stanovi ť aspoň dvakrát 
v priebehu každej expozície v trvaní štyroch hodín, a to pomocou kaskádo ­
vého impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc. Ak možno preukáza ť rovnocennos ť výsledkov získaných 
pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alterna ­
tívny prístroj môže používa ť počas celej štúdie. Druhé zariadenie, ako je 
gravimetrický filter alebo impinger/premýva čka, by sa malo použi ť súbežne 
s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej ú činnosti hlavného prístroja. 
Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou ve ľkosti častíc by mala by ť 
v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukáza ť rovnocennos ť 
v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonáva ť ďalšie potvrdzujúce 
merania. V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá 
by sa mali prija ť opatrenia na minimalizáciu nejednozna čných údajov, ktoré 
môžu vies ť k potrebe opakova ť expozíciu. Rozdelenie ve ľkosti častíc by sa 
malo vykona ť v prípade pár, ak existuje možnos ť, že kondenzácia pary môže 
mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice 
s potenciálom zmiešaných fáz (pozri odsek 15).
 
POSTUP 
26. Ďalej v texte sú opísané dva druhy štúdií: tradi čný protokol a protokol 
C × t. Obidva protokoly môžu zah ŕňať predbežnú štúdiu, základnú štúdiu 
a/alebo limitný test (tradi čný protokol) alebo testovanie pri limitnej koncen ­
trácii (C × t). Ak je známe, že jedno pohlavie je vnímavejšie, vedúci štúdie môže rozhodnú ť, že sa na tieto štúdie použije iba vnímavejšie pohlavie. Ak 
sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, 
maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť s cieľom minimalizova ť 
druhovo špecifické utrpenie. Pred za čatím by sa mali zváži ť všetky dostupné 
údaje, aby sa minimalizovalo využívanie zvierat. Napríklad údaje získané s využitím kapitoly B.52 tejto prílohy (4) môžu eliminova ť potrebu pred ­
bežnej štúdie a môžu takisto preukáza ť, či je jedno pohlavie vnímavejšie 
[pozri dokument GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADIČNÝ PROTOKOL  
Všeobecné úvahy: Tradi čný protokol  
27. Pri tradi čnej štúdii sú skupiny zvierat vystavené ú činkom testovanej chemi ­
kálie počas pevne stanoveného obdobia (vo všeobecnosti štyri hodiny) bu ď 
v komore na expozíciu oblasti nosa, alebo v komore na expozíciu celého tela. Zvieratá sú exponované limitnej koncentrácii (limitný test) alebo 
v prípade postupu zah ŕňajúceho viac krokov najmenej trom koncentráciám 
(základná štúdia). Základnej štúdii môže predchádza ť predbežná štúdia, 
pokiaľ neexistujú informácie o testovanej látke, ako je napríklad štúdia 
B.52 uskuto čnená skôr [pozri GD 39 (2)].
 
Predbežná štúdia: Tradi čný protokol  
28. Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie, iden ­
tifikáciu rozdielov medzi pohlaviami, pokia ľ ide o vnímavos ť, a pomoc pri 
výbere úrovní koncentrácie pri expozícii pre základnú štúdiu alebo pre 
limitný test. Pri výbere úrovní koncentrácie na ú čely predbežnej štúdie by 
sa mali použi ť všetky dostupné informácie vrátane údajov (Q)SAR a údajov 
o podobných chemikáliách. Pri každej koncentrácii by sa nemali exponova ť 
viac ako tri samce a tri samice (na stanovenie rozdielov medzi pohlaviami 
môžu byť potrebné tri zvieratá z každého pohlavia). Predbežná štúdia sa 
môže vykonáva ť s využitím jednej koncentrácie, ale v prípade potreby je 
možné testova ť aj viac koncentrácií. V rámci predbežnej štúdie by sa nemal 
testovať taký po čet zvierat a koncentrácií, ktorý by pripomínal základnú 
štúdiu. Namiesto predbežnej štúdie sa môže použi ť štúdia B.52 (4) usku ­
točnená skôr [pozri dokument GD 39 (2)].  
Limitný test: Tradi čný protokol  
29. Limitný test sa používa, ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná 
chemikália je v podstate netoxická, t. j. vyvoláva toxickú reakciu iba pri koncentrácii vyššej, ako je regula čná limitná koncentrácia. Pri limitnom teste 
sa jedna skupina troch samcov a troch samíc exponuje testovanej chemikálii 
pri limitnej koncentrácii. Informácie o toxicite testovanej chemikálie možno 
získať z poznatkov o podobných testovaných chemikáliách pri zoh ľadnení 
identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V situáciách, ke ď existuje málo informácií alebo neexistujú 
žiadne informácie o jej toxicite, alebo ak sa o čakáva, že testovaná chemi ­
kália bude toxická, je potrebné vykona ť základný test. 
30. Výber limitných koncentrácií zvy čajne závisí od regula čných požiadaviek. 
Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade 
plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l 
(alebo maximálna dosiahnute ľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých 
testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže by ť tech­
nicky náro čné pripravi ť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by 
hlavným cie ľom malo by ť dosiahnutie dýchate ľnej veľkosti častíc 
(MMAD 1 – 4 μm). V prípade vä čšiny testovaných chemikálií je túto 
veľkosť možné dosiahnu ť pri koncentrácii 2 mg/l. O testovanie aerosólov 
pri koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúša ť, iba ak je možné 
získať dýchate ľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. 
V nariadení (ES) č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neod ­
porúča testovanie pri koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). 
Limitná koncentrácia by sa mala zvažova ť iba vtedy, ak existuje vysoká 
pravdepodobnos ť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre 
ochranu ľudského zdravia (3), pri č
om do správy o štúdii treba uvies ť 
odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dba ť na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli vies ť 
k výbuchu. S cie ľom zabráni ť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo 
pred limitným testom vykona ť testovacie kolo bez zvierat, aby sa zabezpe ­ 
čilo, že v komore je možné dosiahnu ť podmienky na ú čely limitného testu.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Ak sa pri limitnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, 
výsledky limitného testu môžu slúži ť ako predbežná štúdia pre ďalšie testo ­
vanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemož ňujú dosiahnutie limitnej 
koncentrácie, mala by sa testova ť maximálna dosiahnute ľná koncentrácia. 
Ak sa pri maximálnej dosiahnute ľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia 
ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnu ť 
limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uvies ť vysvetlenie a podloži ť 
ho údajmi. Ak maximálna dosiahnute ľná koncentrácia pary nevyvoláva toxi ­
citu, môže by ť potrebné pripravi ť testovanú chemikáliu ako kvapalný aero ­
sól.
 
Základná štúdia: Tradi čný protokol  
32. Základná štúdia sa zvy čajne vykonáva s využitím piatich samcov a piatich 
samíc (alebo pä ť zvierat vnímavejšieho pohlavia, ak je známe) pri jednej 
úrovni koncentrácie, pri čom sa testujú najmenej tri úrovne koncentrácie. Na 
zabezpečenie dôkladnej štatistickej analýzy by sa mali použi ť dostatočné 
úrovne koncentrácie. Časový interval medzi skupinami expozícií je ur čený 
nástupom, trvaním a závažnos ťou príznakov toxicity. Expozícia zvierat pri 
ďalšej úrovni koncentrácie by sa mala odloži ť, kým sa nenadobudne dosta ­
točná dôvera, že zvieratá, ktoré boli testované, prežijú. To umožní vedú ­
cemu štúdie, aby prispôsobil cie ľovú koncentráciu pre ďalšiu expozi čnú 
skupinu. Z dôvodu závislosti od sofistikovaných technológií to v prípade inhalačných štúdií nemusí by ť vždy možné, takže expozícia zvierat pri 
ďalšej úrovni koncentrácie by mala vychádza ť z predchádzajúcich skúse ­
ností a vedeckého posudku. Pri testovaní zmesí si treba preštudova ť doku­
ment GD 39 (2).
 
PROTOKOL KONCENTRÁCIA × ČAS (C × t)  
Všeobecné úvahy: Protokol C × t  
33. O štúdii C × t pozostávajúcej z viacerých krokov možno pri hodnotení 
inhalačnej toxicity uvažova ť ako o alternatíve k tradi čnému protokolu (12) 
(13) (14). Tento prístup umož ňuje, aby boli zvieratá exponované testovanej 
chemikálii pri viacerých úrovniach koncentrácie a po čas niekoľkých časo­
vých intervalov. Celé testovanie prebieha v komore na expozíciu oblasti nosa (v prípade tohto protokolu nie je možné použi ť komory na expozíciu 
celého tela). Tento protokol je znázornený v tokovom diagrame v dodatku 1. 
Zo simula čnej analýzy vyplynulo, že v prípade tradi čného protokolu, ako aj 
v prípade protokolu C × t možno získa ť spoľahlivé hodnoty LC
 50 , ale 
protokol C × t je všeobecne lepší na získanie spo ľahlivých hodnôt LC  01 
a LC  10 (15). 
34. Simula čná analýza preukázala, že využívanie dvoch zvierat pre jeden 
interval C × t (jedno zviera z každého pohlavia pri použití oboch pohlaví alebo dve zvieratá vnímavejšieho pohlavia) môže by ť vo všeobecnosti 
v prípade základnej štúdie vhodné pri testovaní štyroch koncentrácií 
a piatich intervalov expozície. Za ur čitých okolností sa vedúci štúdie 
môže rozhodnú ť pre použitie dvoch potkanov z každého pohlavia pre 
jeden interval C × t (15). Použitie dvoch zvierat z každého pohlavia na jednu koncentráciu a časový bod môže zníži ť chybu a variabilitu odhadov, 
zvýšiť úspešnos ť odhadu a zvýši ť istotu, pokia ľ ide o rozsah intervalov. 
V prípade nedostato čne presnej zhody s údajmi pre odhad (pri použití 
jedného zviera ťa z každého pohlavia alebo dvoch zvierat vnímavejšieho 
pohlavia) môže posta čovať aj piata expozi čná koncentrácia. Ďalšie usmer ­
nenia týkajúce sa po čtu zvierat a koncentrácií, ktoré sa majú použi ť 
v prípade štúdie C × t, sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Predbežná štúdia: Protokol C × t  
35. Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie a na 
pomoc pri výbere úrovní expozi čných koncentrácií pre základnú štúdiu. Pri 
predbežnej štúdii, pri ktorej sa využívajú až tri zvieratá z každého pohlavia 
na koncentráciu [podrobnejšie informácie sú uvedené v dodatku III doku ­
mentu GD 39 (2)], môže by ť potrebné vybra ť vhodnú po čiatočnú koncen ­
tráciu pre základnú štúdiu a minimalizova ť počet použitých zvierat. Na 
zistenie rozdielov medzi pohlaviami môže by ť nevyhnutné použi ť tri zvie­
ratá z každého pohlavia. Tieto zvieratá by sa mali jednorazovo exponova ť 
zvyčajne počas 240 minút. Otázka, či je možné vytvori ť vhodné testovacie 
ovzdušie, by sa mala posúdi ť v priebehu predbežných technických testov 
bez zvierat. Vo všeobecnosti nie je potrebné vykonáva ť predbežnú štúdiu, 
ak sú k dispozícii údaje o mortalite zo štúdie B.52 (4). Pri výbere po čia­
točnej cieľovej koncentrácie v štúdii B.2 by mal vedúci štúdie zoh ľadniť 
štruktúru mortality pozorovanú pri všetkých dostupných štúdiách B.52 (4) 
pri oboch pohlaviach a pri všetkých testovaných koncentráciách [pozri 
dokument GD 39 (2)].  
Počiatočná koncentrácia: Protokol C × t  
36. Počiatočná koncentrácia (expozi čné kolo I) (dodatok 1) bude bu ď limitná 
koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú vyberie vedúci štúdie na základe 
predbežnej štúdie. Skupiny po jednom zvierati z každého pohlavia sú expo ­
nované tejto koncentrácii po čas niekoľkých intervalov (napr. 15, 30, 60, 120 
alebo 240 minút), čo vedie k celkovému po čtu desiatich zvierat (tzv. expo ­
zičné kolo I) (dodatok 1). 
37. Výber limitných koncentrácií zvy čajne závisí od regula čných požiadaviek. 
Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade 
plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l (alebo maximálna dosiahnute ľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých 
testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže by ť tech­
nicky náro čné pripravi ť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by 
malo byť cieľom dosiahnutie dýchate ľnej veľkosti častíc (t. j. MMAD 1 – 
4 μm) pri limitnej koncentrácii 2 mg/l. Túto ve ľkosť je možné dosiahnu ť 
v prípade vä čšiny testovaných chemikálií. O testovanie aerosólov pri 
koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúša ť, iba ak je možné získa ť 
dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. V nariadení (ES) 
č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporú ča testovanie pri 
koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). Testovanie pri limitnej 
koncentrácii by sa malo zvažova ť iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepo ­
dobnosť
, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu 
ľudského zdravia (3), pri čom do správy o štúdii treba uvies ť odôvodnenie. 
V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dba ť na to, 
aby nenastali podmienky, ktoré by mohli vies ť k výbuchu. S cie ľom 
zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred testovaním pri 
počiatočnej koncentrácii vykona ť testovacie kolo bez zvierat, aby sa zaistilo, 
že v komore je možné zabezpe čiť podmienky na dosiahnutie tejto koncen ­
trácie. 
38. Ak sa pri po čiatočnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, 
výsledky pri tejto koncentrácii môžu slúži ť ako východisko na ďalšie testo ­
vanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemož ňujú dosiahnutie limitnej 
koncentrácie, mala by sa testova ť maximálna dosiahnute ľná koncentrácia. 
Ak sa pri maximálnej dosiahnute ľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia 
ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnu ť 
limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uvies ť vysvetlenie a podloži ť 
ho údajmi. Ak maximálna dosiahnute ľná koncentrácia pary nevyvoláva toxi ­
citu, môže by ť potrebné pripravi ť testovanú chemikáliu ako kvapalný aero ­
sól.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Základná štúdia: Protokol C × t  
39. Počiatočná koncentrácia (expozi čné kolo I) (dodatok 1) testovaná v rámci 
základnej štúdie bude bu ď limitná koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú 
vyberie vedúci štúdie na základe predbežnej štúdie. Ak sa v priebehu alebo 
po kole expozície I pozoruje mortalita, minimálna expozícia (C × t), ktorá 
má za následok mortalitu, sa použije ako smerodajný údaj na stanovenie koncentrácie a intervalov expozície pre kolo expozície II. Každé následné kolo expozície bude závisie ť od predchádzajúceho kola (pozri dodatok 1). 
40. V prípade mnohých testovaných chemikálií budú výsledky získané pri 
počiatočnej koncentrácii spolu s tromi ďalšími kolami expozície 
s využitím hustejšej súradnicovej siete (t. j. geometrického rozloženia inter ­
valov expozície ur čeného faktorom medzi intervalmi, ktoré nasledujú po 
sebe, zvy čajne s hodnotou √2) na stanovenie závislosti mortality v rámci 
štúdie C × t posta čujúce (15). Použitie piatej expozi čnej koncentrácie však 
môže ma ť isté výhody [pozri dodatok 1 a dokument GD 39 (2)]. Matema ­
tická úprava výsledkov protokolu C × t je uvedená v dodatku 1.
 
POZOROVANIA 
41. Zvieratá by sa mali v priebehu trvania expozície pravidelne klinicky pozo ­
rovať. Po expozícii by sa mali klinické pozorovania vykona ť najmenej 
dvakrát v de ň expozície alebo častejšie, ak to indikuje reakcia zvierat na 
testovanie, a následne najmenej raz denne po čas 14 dní. D ĺžka pozorovania 
nie je presne ur čená, ale mala by sa stanovi ť podľa charakteru a času 
nástupu klinických príznakov a d ĺžky obdobia zotavenia. Časy, keď sa 
objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade 
tendencie oneskorenia príznakov toxicity. Všetky pozorovania sa systema ­
ticky zaznamenávajú, pri čom každé zviera má individuálny záznam. Mori ­
bundné zvieratá a zvieratá, ktoré majú o čividne silné bolesti a/alebo vyka ­
zujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali z dôvodu staro ­
stlivosti o zvieratá humánnym spôsobom utrati ť. Pri vyšetrovaní klinických 
príznakov toxicity treba dáva ť pozor, aby sa po čiatočný nepatrný nález 
a krátkodobé zmeny dýchania, ktoré sú dôsledkom expozície, nezamie ňali 
za toxicitu súvisiacu s testovanou chemikáliou, ktorá by vyžadovala pred ­ 
časné utratenie zvierat. Zoh ľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované 
v usmerňujúcom dokumente o humánnych parametroch (Humane Endpoints 
Guidance Document) (GD 19) (7). Ke ď sa zvieratá usmrtia z humánnych 
dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zazna ­
menať čas uhynutia. 
42. Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože, srsti, o čí, slizníc, 
dýchania, krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, 
ako aj somatomotoriky a správania. Ak je to možné, zaznamená sa každý 
rozdiel medzi lokálnymi a systémovými ú činkami. Pozornos ť sa zameriava 
na pozorovanie triašky, k ŕčov, slinenia, hna čky, letargie, spánku a kómy. 
Meraním rektálnej teploty možno získa ť dôkazy sved čiace o reflexnej 
bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu.
 
Telesné hmotnosti  
43. Individuálne hmotnosti zvierat by sa mali zaznamena ť raz počas obdobia 
aklimatizácie, v de ň expozície pred expozíciou (de ň 0), minimálne v d ňoch 
1, 3 a 7 (a následne raz za týžde ň) a v čase uhynutia alebo utratenia, pokia ľ 
k nemu dôjde po dni 1. Telesná hmotnos ť sa považuje za kritický ukazo ­
vateľ toxicity, takže zvieratá, pri ktorých nastane trvalý úbytok hmotnosti 
≥ 20 % v porovnaní s hodnotami pred štúdiou, by sa mali pozorne sledova ť. 
Zvieratá, ktoré prežijú, sa na konci obdobia po expozícii odvážia a humánne 
usmrtia.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patológia  
44. Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu alebo sa 
utratia a vylú čia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú 
autopsii. Ak nie je možné vykona ť autopsiu ihne ď po objavení uhynutého 
zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostato čne nízku teplotu, aby sa 
minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykona ť čo najskôr, zvy čajne 
v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pri čom osobitná pozornos ť sa 
venuje akýmko ľvek zmenám v dýchacej sústave. 
45. Na ú čely zvýšenia výpovednej hodnoty štúdie možno zváži ť ďalšie vyšet ­
renia a priori zahrnuté od za čiatku, ako je meranie hmotnosti p ľúc potkanov, 
ktoré prežili, a/alebo poskytnutie dôkazov o podráždení prostredníctvom 
mikroskopického vyšetrenia dýchacej sústavy. Medzi skúmané orgány môžu patri ť aj orgány, ktoré sved čia o makroskopickej patológii pri zviera ­
tách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, a orgány, o ktorých je známe alebo 
pri ktorých sa predpokladá, že boli zasiahnuté. Mikroskopické vyšetrenie 
celej dýchacej sústavy môže poskytnú ť užitočné informácie o testovaných 
chemikáliách, ktoré reagujú s vodou, ako sú kyseliny a hygroskopické testo ­
vané chemikálie.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
46. Treba uvies ť údaje o telesnej hmotnosti a pitevných nálezoch jednotlivých 
zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa 
uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet použitých zvierat, po čet zvierat 
vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, po čet zvierat, ktoré sa našli 
uhynuté po čas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia 
jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických ú činkov a reverzibility 
a pitevné nálezy.  
Správa o teste  
47. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testované zvieratá a chov:  
— opis podmienok v klietkach vrátane: po čtu (alebo zmeny po čtu) zvierat 
na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, d ĺžky svetlej 
fázy a identifikácie krmiva, 
— použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— metóda randomizácie, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— opis akýchko ľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény 
a liečby chorôb.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické 
vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje a registra čné číslo CAS (Chemical Abstract Servi ­
ces), ak je známe.  
Nosič: 
— odôvodnenie použitia nosi ča a odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako 
voda), 
— historické alebo sú časné údaje preukazujúce, že nosi č nemá vplyv na 
výsledky štúdie.  
Inhalačná komora:  
— opis inhala čnej komory vrátane rozmerov a objemu, 
— zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvo ­
renie ovzdušia, 
— zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, ve ľkosti častíc a skuto čnej 
koncentrácie, 
— zdroj vzduchu a manipulácia s dodaným/extrahovaným vzduchom 
a použitý klimatiza čný systém, 
— metódy použité na kalibráciu zariadenia s cie ľom zabezpe čiť homogénne 
testovacie ovzdušie, 
— rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny), — expozi čné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), 
umiestnenie zvierat v systéme (v prípade expozície celého tela), 
— dočasná homogenita/stabilita testovacieho ovzdušia, 
— umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho 
ovzdušia v komore, 
— hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozi čný otvor 
(v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru 
(v prípade expozície celého tela), 
— informácie o zariadení použitom na meranie kyslíka a oxidu uhli čitého, 
ak sa použilo, 
— čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhala čnej komore (t
 95 ), 
— počet zmien objemu za hodinu, 
— meracie prístroje (ak sa použili).  
Údaje o expozícii:  
— odôvodnenie výberu cie ľovej koncentrácie pre základnú štúdiu, 
— nominálne koncentrácie (celková hmotnos ť testovanej chemikálie apli ­
kovanej do inhala čnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel 
komorou), 
— skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny 
zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupen ­
stvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzova ť samo­
statne,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— všetky koncentrácie ovzdušia sa zaznamenajú v hmotnostných jednot ­
kách (napr. mg/l, mg/m  3 atď.), v zátvorke možno uvies ť aj objemové 
jednotky (napr. ppm, ppb at ď.), 
— rozdelenie ve ľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný 
priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru ( σg) 
vrátane metód ich výpo čtu. Jednotlivé analýzy ve ľkosti častíc sa uvedú 
v správe.  
Podmienky testovania:  
— podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrob ­
ných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie ve ľkosti 
častíc tuhých materiálov alebo na prípravu roztokov testovanej chemi ­
kálie. V prípadoch, v ktorých v dôsledku mechanických procesov mohlo dôjsť k zmene zloženia testovanej chemikálie, sa uvedú výsledky 
analýzy na overenie zloženia testovanej chemikálie, 
— opis (pod ľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvo ­
renie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdu ­ 
šiu, 
— podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o 
overení metódy (vrátane ú činnosti vý ťažnosti testovanej chemikálie 
z prostriedku na odber vzorky), 
— odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.  
Výsledky:  
— tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore, 
— tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skuto čných koncentrá ­
ciách, 
— tabuľkové spracovanie údajov o ve ľkosti častíc vrátane údajov o odbere 
vzoriek na analýzu, o rozdelení ve ľkosti častíc a o výpo čtoch MMAD 
a σ
 g , 
— tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie 
pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane 
mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania ú činkov), 
— telesné hmotnosti jednotlivých zvierat zistené po čas štúdie, dátum a čas 
uhynutia, ak k nemu došlo pred plánovaným utratením, časový priebeh 
nástupu príznakov toxicity a skuto čnosť, či tieto príznaky boli reverzi ­
bilné pre každé zviera, 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii, 
— odhady letality (napr. LC  50 , LD  01 ) vrátane 95 % hranice spo ľahlivosti 
a sklon (ak je v rámci metódy hodnotenia k dispozícii), 
— štatistický vz ťah vrátane odhadu exponenta n (protokol C × t). Uvedie sa 
názov použitého štatistického softvéru.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Rozbor a interpretácia výsledkov:  
— osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií 
tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo ve ľkosti častíc, 
— dýchate ľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak 
nebolo možné splni ť kritériá na ve ľkosť častíc, 
— uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utrati ť 
zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmer ňovacom doku ­
mente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on 
Humane Endpoints) (8), 
— ak bolo testovanie pod ľa kapitoly B.52 tejto prílohy (4) prerušené 
v prospech tejto testovacej metódy B.2, uvedie sa odôvodnenie, 
— konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie a vz ťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii 
sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie, 
— uvedie sa pravdepodobná prí čina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia 
(systémové verzus lokálne).
 
LITERATÚRA  
1. OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline 
for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asse ­
ssment No. 39, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/te ­
stguidelines]. 
3. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí, 
o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene 
a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1). 
4. Kapitola B.52 tejto prílohy, Akútna inhala čná toxicita – metóda akútnej 
toxickej triedy (ATC). 
5. Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože  in vitro : test pomocou transku ­
tánneho elektrického odporu (TER). 
6. Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože  in vitro : test pomocou modelu 
ľudskej kože. 
7. OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]. 
9. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321 – 327. 
10. Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (druhé 
vydanie) Informa Healthcare, New York.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
11. Pauluhn, J., a Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160 
– 167. 
12. Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). 
Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278 – 290. 
13. Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. 
(1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105 – 117. 
14. Ten Berge, W. F., a Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65 – 71. 
15. OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and 
C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
16. Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
Londýn/New York.
 
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Dodatok 1  
Protokol C × t  
1. O štúdii „koncentrácia × čas“ (C × t) pozostávajúcej z viacerých krokov 
možno pri hodnotení inhala čnej toxicity uvažova ť ako o alternatíve 
k tradičnému protokolu (12) (13) (14). Jej vykonanie sa uprednost ňuje, ak 
existuje konkrétna regula čná alebo vedecká potreba, ktorá vyžaduje testo ­
vanie na zvieratách po čas niekoľkých intervalov, ako napr. v prípade pláno ­
vania núdzovej reakcie alebo plánovania využitia krajiny. Tento prístup sa zvyčajne začína testovaním limitnej koncentrácie (kolo expozície I), v rámci 
ktorého sú zvieratá exponované testovanej chemikálii po čas piatich časo­
vých intervalov (napr. 15, 30, 60, 120 a 240 minút), takže jedno kolo 
expozície zah ŕňa väčší počet časových intervalov (pozri obrázok 1). Ak sa 
použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov 
je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l. Tieto 
úrovne možno prekro čiť iba vtedy, ak existuje regula čná alebo vedecká 
potreba testovania pri týchto úrovniach (pozri odsek 37 v hlavnom texte kapitoly B.2). 
2. V situáciách, ke ď je k dispozícii málo informácií o toxicite testovanej 
chemikálie alebo nie sú k dispozícii žiadne informácie, sa vykoná predbežná štúdia, v rámci ktorej sú skupiny maximálne troch zvierat z každého pohlavia exponované cie ľovým koncentráciám, ktoré vyberie vedúci štúdie, 
zvyčajne počas 240 minút. 
3. Ak sa limitná koncentrácia testuje po čas kola expozície I a je pozorovaná 
mortalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak existuje 
regulačná alebo vedecká potreba, aby sa stanovil vz ťah medzi koncentrá ­
ciou, časom a reakciou pri vyšších úrovniach, ako je indikovaná limitná 
koncentrácia, ďalšia expozícia sa vykoná pri vyššej úrovni, napríklad pri 
dvojnásobku limitnej koncentrácie (t. j. 2L na obrázku 1). 
4. Ak sa pri limitnej koncentrácii zistí toxicita, je potrebné ďalšie testovanie 
(základná štúdia). Tieto ďalšie expozície sa vykonajú bu ď pri nižších 
koncentráciách (na obrázku 1: kolá expozície II, III alebo IV‘), alebo pri 
vyšších koncentráciách s využitím kratších časových intervalov (na obrázku 
1: kolo expozície IV), ktoré sú prispôsobené a medzi ktorými nie je ve ľký 
časový odstup. 
5. Test (po čiatočná a ďalšia koncentrácia) sa vykoná s využitím jedného zvie ­
raťa z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod alebo dvoch zvierat 
vnímavejšieho pohlavia na koncentráciu/ časový bod. Za ur čitých okolností 
sa vedúci štúdie môže rozhodnú ť pre použitie dvoch potkanov z každého 
pohlavia na koncentráciu/ časový bod (alebo štyroch zvierat vnímavejšieho 
pohlavia na koncentráciu/ časový bod) (15). Použitie dvoch zvierat 
z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod vo všeobecnosti znižuje 
chybu a variabilitu odhadov, zvyšuje úspešnos ť odhadu a zvyšuje istotu, 
pokiaľ ide o rozsah intervalov v súvislosti s protokolom, ktorý je v tomto 
texte opísaný. Ďalšie informácie sú uvedené v dokumente GD 39 (2). 
6. Podľa možnosti sa každé kolo expozície uskuto ční v jeden de ň. Vďaka tomu 
možno odloži ť ďalšiu expozíciu, kým sa nenadobudne primeraná istota 
prežitia zvierat, a vedúci štúdie môže prispôsobi ť cieľovú koncentráciu 
a intervaly pre ďalšie kolo expozície. Odporú ča sa začať každé kolo expo ­
zície skupinou, ktorá bude exponovaná najdlhšie, napr. skupinou na 240- minútovú expozíciu, po ktorej nasleduje skupina na 120-minútovú expozíciu 
atď. Ak napríklad zvieratá v skupine na 240-minútovú expozíciu hynú po 90 
minútach alebo vykazujú závažné príznaky toxicity (napr. extrémne zmeny v dýchaní, ako je napríklad namáhavé dýchanie), nemá význam exponova ť 
skupinu na 120 minút, lebo mortalita by pravdepodobne dosiahla 100 %. 
Vedúci štúdie preto pre danú koncentráciu zvolí kratšie intervaly expozície 
(napr. 90, 65, 45, 33 a 25 minút).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Koncentrácia v komore sa musí často mera ť, aby sa stanovil časovo vážený 
priemer koncentrácií pre každý interval expozície. Ak je to možné, 
v štatistickej analýze sa použije čas uhynutia každého zviera ťa (nie interval 
expozície). 
8. Výsledky prvých štyroch kôl expozície sa preskúmajú s cie ľom zistiť chýba­
júce údaje na krivke závislosti koncentrácie a času (pozri obrázok 1). 
V prípade nedostato čnej zhody sa môže vykona ť ďalšia expozícia (piata 
koncentrácia). Koncentrácia a intervaly expozície sa v prípade piatej expo ­
zície vyberú tak, aby sa zistili tieto chýbajúce údaje. 
9. Všetky kolá expozície (vrátane prvého kola expozície) sa použijú na výpo čet 
vzťahu medzi koncentráciou, časom a reakciou s využitím štatistickej 
analýzy (16). Ak je to možné, pre každý interval C × t sa použije časovo 
vážený priemer koncentrácií a trvanie expozície až do uhynutia (ak 
k uhynutiu došlo v priebehu expozície).  
Obrázok 1  
Hypotetické znázornenie vz ťahu medzi koncentráciou, časom a mortalitou 
pri potkanoch
  
Prázdne symboly = zvieratá, ktoré prežili; plné symboly = uhynuté zvieratá. 
Trojuholníky = samice; kruhy = samce. 
Plná čiara = hodnoty LC  50 (rozsah 7,5 – 240 min.) pre samce, ak n = 1. 
Prerušovaná čiara = hodnoty LC  50 (rozsah 7,5 – 240 min.) pre samice, ak 
n = 1. 
Bodkované čiary = funkcia hypotetických hodnôt LC  50 pre samce a samice, 
ak n = 2 (12). 
Glosár 
Koncentrácia: 
Čas expozície:  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Ďalej je uvedený príklad postupu pozostávajúceho z viacerých krokov:  
Kolo expozície I – testovanie pri limitnej koncentrácii (pozri obrázok 1)  
— 1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod, spolu desa ť 
zvierat (  a ) 
— cieľová koncentrácia (  b ) = limitná koncentrácia, 
— exponujte pä ť skupín zvierat pri tejto cie ľovej koncentrácii po čas inter­
valov 15, 30, 60, 120 a 240 minút.  
↓ 
Kolo expozície II  ( c ) – základná štúdia  
— 1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod, spolu desa ť 
zvierat, 
— exponujte pä ť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (  d ) (1/2L) po čas 
o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, 
pozri obrázok 1).  
↓ 
Kolo expozície III – základná štúdia  
— 1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod, spolu desa ť 
zvierat, 
— exponujte pä ť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (  d ) (1/4L) po čas 
o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, 
pozri obrázok 1).  
↓ 
Kolo expozície IV‘ – základná štúdia  
— 1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod, spolu desa ť 
zvierat, 
— exponujte pä ť skupín zvierat pri nižšej koncentrácii (  d ) (1/8L) po čas 
o niečo dlhších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, 
pozri obrázok 1).  
↓ alebo  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Ak nie sú k dispozícii informácie o vnímavosti pohlaví, použijú sa potkany oboch 
pohlaví, t. j. jedno zviera z každého pohlavia na koncentráciu. Na základe existujúcich 
informácií alebo ak v priebehu tohto kola expozície vyjde najavo, že jedno pohlavie je 
vnímavejšie, v priebehu ďalšieho testovania sa použije desa ť zvierat vnímavejšieho 
pohlavia (dve zvieratá na koncentráciu/ časový bod) pri každej úrovni koncentrácie., 
( b ) Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 
20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l. V prípade predpokla ­
danej toxicity alebo na základe výsledkov predbežnej štúdie sa zvolia nižšie po čiatočné 
koncentrácie. V prípade regula čnej alebo vedeckej potreby možno použi ť vyššie koncen ­
trácie. 
( c ) Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by sa pod ľa možnosti mala odloži ť, kým 
sa nenadobudne dostato čná istota, že zvieratá, ktoré boli exponované skôr, prežijú. To 
umožní vedúcemu štúdie, aby prispôsobil cie ľovú koncentráciu a intervaly pre ďalšie 
kolo expozície. 
( d ) Minimálna dávka (koncentrácia × čas), ktorá mala za následok mortalitu po čas testovania 
pri počiatočnej koncentrácii (prvé kolo expozície), bude smerodajná pri stanovení ďalšej 
kombinácie koncentrácie a časových intervalov. Koncentrácia sa zvy čajne zníži na polo ­
vicu (1/2L) a zvieratá budú exponované v priebehu nového časového obdobia pri 
hustejšej súradnicovej sieti s využitím geometrického delenia intervalov expozície faktorom 1,4 ( √2; pozri odkaz 11) v čase podľa minimálnej letálnej dávky ( čas × 
koncentrácia) pozorovanej po čas prvej expozície. Na tomto obrázku (obrázok 1) bola 
v kole expozície I pozorovaná mortalita po 15 minútach; intervaly po čas kola II sa teda 
sústredia okolo 30 minút a majú trvanie 15, 21, 30, 42 a 60 minút. Po prvých dvoch 
expozíciách sa dôrazne odporú ča zakresli ť údaje do podobného obrázka, ako je znázor ­
nený vyššie, a overi ť, či funkcia závislosti medzi koncentráciou a časom zviera uhol 45 
stupňov (n = 1) alebo či je funkcia závislosti medzi koncentráciou, časom a reakciou 
menej strmá (napr. n = 2) alebo strmšia (napr. n = 0,8). V druhom prípade sa dôrazne 
odporúča náležite prispôsobi ť ďalšie koncentrácie a intervaly.
 Kolo expozície IV – základná štúdia  
— 1 zviera z každého pohlavia na koncentráciu/ časový bod, spolu desa ť 
zvierat, 
— exponujte pä ť skupín zvierat pri vyššej koncentrácii (  e ) (2L) po čas 
o niečo kratších intervalov expozície (faktor √2 s využitím odstupov, 
pozri obrázok 1).  
Matematická úprava výsledkov protokolu C × t  
11. Pri postupe C × t so štyrmi alebo piatimi expozi čnými koncentráciami 
a piatimi intervalmi sa získa 20 alebo 25 dátových bodov. Pomocou týchto dátových bodov možno s využitím štatistickej analýzy vypo čítať vzťah 
C × t (16):  
rovnica 1: 
ProbitðPÞ ¼ b
 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
kde C = koncentrácia; t = interval expozície, alebo  
rovnica 2: 
Reakcia ¼ ƒðC n tÞ 
kde n ¼ b 1=b 2: 
Pomocou rovnice 1 možno vypo čítať hodnotu LC  50 pre daný časový úsek 
(napr. 4 hodiny, 1 hodina, 30 minút alebo akýko ľvek časový úsek v rámci 
testovaných období) pri P = 5 (50 % reakcia). Haberovo pravidlo možno 
použiť iba v prípade, že n = 1. Hodnotu LC  01 možno vypo čítať pri P = 
2,67. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) V určitých prípadoch môže by ť potrebné zvýši ť koncentráciu (2L) v priebehu nového 
časového obdobia pri hustejšej súradnicovej sieti s využitím geometrického delenia 
intervalov expozície faktorom 1,4 ( √2) v čase podľa minimálnej letálnej úrovne koncen ­
trácie pozorovanej po čas prvej expozície. Minimálne trvanie expozície by pod ľa 
možnosti malo presiahnu ť päť minút; maximálne trvanie expozície by nemalo presiahnu ť 
osem hodín.
 B.3. AKÚTNA TOXICITA (DERMÁLNA)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod, časť B (A).  
1.2. POJMY 
Pozri všeobecný úvod, časť B (B).  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Testovaná látka sa nanáša na kožu v odstup ňovaných dávkach 
viacerým testovaným skupinám, a to jedna dávka na jednu skupinu. Nakoniec sa registrujú pozorované príznaky otravy a prípady úmrtia. Zvieratá, ktoré uhynú po čas testu, ako aj zvieratá, ktoré prežijú do 
konca testu, sa pitvú. 
Zvieratá so silnými a pretrvávajúcimi príznakmi utrpenia a bolesti sa 
môžu pred časne humánne usmrti ť. Látky, o ktorých je známe, že 
týmto spôsobom spôsobujú svojimi žieravými alebo dráždivými 
účinkami výrazné bolesti a utrpenie, sa nemusia testova ť.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
Pred testom sa zvieratá vo svojich pokusných klietkach aklimatizujú 
minimálne pä ť dní na experimentálne chovate ľské a k ŕmne 
podmienky. Pred za čatím testu sa zdravé, mladé dospelé zvieratá 
randomizujú a prira ďujú k jednotlivým testovaným skupinám. Asi 
24 hodín pred za čiatkom testu sa strihaním alebo holením odstráni 
na chrbte pokusných zvierat srs ť. Pri strihaní alebo holení treba bra ť 
ohľad na to, aby sa nepoškodila koža zvierat, pretože by to viedlo 
k zmene priepustnosti. Minimálne 10 % plochy tela je potrebné pripraviť na aplikáciu testovanej látky. Ak sa použijú tuhé látky, 
ktoré možno prípadne rozdrvi ť na prášok, mala by sa testovaná 
látka dostato čne navlhčiť vodou alebo prípadne vhodnou pomocnou 
látkou, aby sa zabezpe čil dobrý kontakt s kožou. Pri použití vehikula 
sa musí zoh ľadniť jeho vplyv na vnikanie testovanej látky do kože. 
Tekuté testované látky sa vo všeobecnosti používajú nezriedené.
 
1.6.2.  Podmienky skúšania  
1.6.2.1.  Pokusné zvieratá  
Môžu sa použi ť dospelé potkany alebo králiky. Môžu sa používa ť aj 
iné zvieratá, ale ich použitie sa musí zdôvodni ť. Je potrebné 
používať známe kmene pokusných zvierat. Pre každé pohlavie by 
nemala by ť odchýlka telesnej hmotnosti zvierat daného testu na 
začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej 
hodnoty.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Počet a pohlavie  
Používajte minimálne 5 zvierat pre každú koncentráciu. Mali by by ť 
rovnakého pohlavia. Ak sa používajú sami čky, nesmú by ť po vrhu 
gravidné. Ak existujú informácie o tom, že jedno pohlavie reaguje 
výrazne citlivejšie, mali by sa používa ť zvieratá tohto pohlavia.  
Poznámka:  Pri testoch akútnej toxicity na zvieratách, ktoré patria 
k vyššiemu rádu ako hlodavce, sa berie oh ľad na použitie menšieho 
počtu zvierat. Dávky by sa mali voli ť starostlivo a ve ľký dôraz by sa 
mal klásť na to, aby sa neprekro čili primerané toxické dávky. Pri 
takýchto testoch by sa malo zabráni ť podávaniu testovanej látky 
v letálnych dávkach.  
1.6.2.3.  Veľkosti dávok  
Počet veľkostí dávok by mal by ť dostatočný, najmenej tri, a dávky 
by mali by ť vhodne odstup ňované, aby vznikli skúšobné skupiny 
s výrazným rozsahom toxických ú činkov a mortality. Pri ur čovaní 
veľkosti dávok by sa mal zoh ľadňovať možný žieravý alebo dráž ­
divý účinok. Získané údaje by mali sta čiť na zobrazenie krivky 
o účinku dávky a tam, kde je to možné, aj na prijate ľné stanovenie 
LD 50 . 
1.6.2.4.  Limitný test  
Môže sa vykona ť limitný test s jednou jedinou dávkou minimálne 
2 000 mg/kg telesnej hmotnosti na jednej skupine s 5 sam čekmi a 5 
samičkami pri použití opísaného postupu. Ak sa zistia prípady úmrtia 
podmienené látkou, mal by sa uváži ť kompletný test.  
1.6.2.5.  Čas pozorovania  
Čas pozorovania by mal trva ť minimálne 14 dní. Nemal by však by ť 
určený dogmaticky. Musí závisie ť od druhu obrazu otravy, časového 
vzniku symptómov a od trvania zotavovacej fázy. Pozorovací čas sa 
musí pred ĺžiť, ak sa to ukáže nevyhnutné. Časový moment, ke ď 
vznikajú a odznievajú príznaky otravy, ich trvanie, ako aj čas 
smrti majú význam hlavne vtedy, ak sú poznate ľné príznaky spoma ­
lenej úmrtnosti.  
1.6.3.  Postup  
Zvieratá by sa mali chova ť v klietkach jednotlivo. Testovaná látka sa 
nanáša jednotne na oblas ť, ktorá zodpovedá asi 10 % plochy tela. Pri 
veľmi toxických látkach môže by ť táto plocha menšia, avšak čo 
možno najvä čšia plocha by mala by ť pokrytá čo možno najtenšou 
a naj rovnomernejšou vrstvou. 
Testovaná látka musí ma ť počas expozi čnej doby 24 hodín kontakt 
s kožou prostredníctvom porózneho gázového obväzu a nedráždivej 
náplaste. Pokusná plocha sa musí okrem toho vhodným spôsobom zakryť, aby sa zafixoval a zaistil gázový obväz a testovaná látka, aby 
zvieratá nemohli orálne prijíma ť testovanú látku. Môžu sa použi ť aj 
prostriedky na obmedzenie slobody pohybu, aby zvieratá nemohli 
orálne prijíma ť testovanú látku, úplná imobilizácia sa však neodporú ča.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Po uplynutí expozi čnej doby sa odstránia zvyšky testovanej látky, 
pokiaľ sa dá, použitím vody alebo iným vhodným postupom na 
čistenie kože. 
Pozorovania sa systematicky zaznamenávajú. Pre každé zviera sa 
vyhotovujú individuálne záznamy. Prvý de ň sa pozorujú zvieratá 
často. Minimálne raz v pracovný de ň by sa malo vykona ť starostlivé 
klinické vyšetrenie. Ostatné denné pozorovania a príslušné opatrenia 
majú za cie ľ obmedzi ť stratu zvierat pre štúdiu, napr. autopsiou 
alebo schladením nájdených uhynutých zvierat a izoláciou alebo humánnym usmrtením slabých alebo umierajúcich zvierat. 
Pozorovania obsahujú zmeny na srsti, koži, o čiach, slizniciach, 
zmeny dýchania a krvného obehu, autonómneho a centrálneho 
nervového systému, ako aj somatomotoriky a správania. Mimoriadnu pozornosť treba venova ť trasu, kŕčom, slineniu, hna čkám, letargii, 
spánku a kóme. Časový moment smrti sa musí zachyti ť čo možno 
najpresnejšie. Zvieratá, ktoré uhynuli po čas testu, a zvieratá, ktoré 
prežili do konca testu, sa pitvú. Všetky patologické zmeny sa musia zaprotokolova ť. Ak je to potrebné, musia sa odobra ť tkanivá na 
histopatologické vyšetrenie.
 
Vyhodnotenie toxicity u druhého pohlavia  
Po ukončení testu so zvieratami jedného pohlavia sa podáva testo ­
vaná látka skupine minimálne s 5 zvieratami iného pohlavia, aby sa zistilo, či tieto zvieratá nereagujú citlivejšie na testovanú látku. Za 
určitých okolností môže by ť oprávnené použitie menšieho po čtu 
zvierat. Ak existuje dostatok dôkazov o tom, že zvieratá skúmaného 
pohlavia reagujú výrazne citlivejšie, možno upusti ť od testu zvierat 
iného pohlavia.
 
2. ÚDAJE  
Údaje sa zhrnú do tabu ľky, z nej musí pre každú testovanú skupinu 
vyplývať počet zvierat na za čiatku testu, čas smrti jednotlivých zvie ­
rat, počet zvierat prejavujúcich iné známky toxicity, opis toxických 
účinkov a sek čné nálezy. Hmotnos ť jednotlivých zvierat sa stanoví 
a zaznamená krátko pred aplikáciou testovanej látky, potom v týždenných intervaloch a v čase smrti; zmeny hmotnosti treba 
stanoviť a zaznamena ť, ak zvieratá prežívajú dlhšie než jeden de ň. 
Zvieratá, ktoré boli humánnym spôsobom usmrtené kvôli utrpeniu a bolesti vyvolanej aplikovanou látkou, sa zaznamenávajú ako uhynutie vyvolané látkou. Hodnota LD
 50 sa vypočíta pomocou uzná ­
vanej metódy. 
Vyhodnotenie údajov by malo, ak je to možné, zah ŕňať vzťah medzi 
podávanou dávkou, ako aj vznik a stupe ň všetkých abnormalít 
vrátane zmien v správaní, klinických symptómov ťažkých poškodení, 
zmien telesnej hmotnosti, úmrtnosti a iných toxikologických ú čin­
kov. 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— druh zvierat, kme ň, pôvod, chovate ľské podmienky, krmivo at ď., 
— podmienky skúšania (vrátane postupu čistenia kože a druhu 
obväzu – okluzívny alebo neokluzívny), 
— veľkosti dávky (s vehikulom, ak sa použije, a koncentrácia), 
— pohlavie exponovaných zvierat, — údaje o reakcii vo forme tabu ľky, podľa pohlavia a koncentrácie 
(počet zvierat uhynutých a humánne usmrtených po čas testu, 
počet zvierat prejavujúcich príznaky toxicity, po čet exponova ­
ných zvierat), 
— čas smrti po aplikácii dávky, dôvody a kritériá na pred časné 
usmrcovanie zvierat, 
— všetky pozorovania, — hodnotu LD
 50 pre pohlavie, u ktorého bola vykonaná úplná 
štúdia, stanovená pre 14-d ňové pozorovanie, s uvedením metódy 
stanovenia, 
— 95 % intervalu spo ľahlivosti pre LD  50 (tam, kde je to možné), 
— krivku dávok/úmrtnosti a sklon tam, kde to metóda stanovenia 
umožňuje, 
— sekčné nálezy, 
— všetky histopatologické nálezy, — výsledky akéhoko ľvek testu na iné pohlavie, 
— diskusiu o výsledkoch (zvláštnu pozornos ť treba venova ť vplyvu, 
aký môže ma ť predčasné humánne usmrtenie zvierat po čas testu 
na vypočítanú hodnotu LD
 50 ), 
— interpretáciu výsledkov.  
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B (D).  
4. ODKAZY  
Pozri všeobecný úvod časť B (E).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 404 (2002).  
1.1. ÚVOD 
Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornos ť veno­
vala možným zlepšeniam v súvislosti so starostlivos ťou o zvieratá 
a posúdeniu všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbyto čnému testovaniu na laboratórnych zvieratách. 
Táto metóda zahrnuje odporú čanie, aby sa pred uskuto čnením opísa ­
ného  in vivo  testu na poleptanie/podráždenie látkou urobila kritická 
analýza existujúcich príslušných údajov. Ak dosta čujúce údaje nie sú 
dostupné, môžu sa získa ť na základe postupného testovania (1). 
Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných  
in vitro  testov a je uvedená ako príloha k tejto metóde. Okrem 
toho sa v prípade potreby odporú ča v počiatočnom in vivo  teste 
použiť postupne, a nie sú časne, tri testovacie náplasti na zviera. 
V záujme vedeckej spo ľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá sa  in 
vivo testovanie nevykonáva, pokia ľ neboli všetky dostupné údaje 
súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením kože látkou 
vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz 
z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, 
dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce 
silnú aciditu alebo alkalitu látky (2) (3) a výsledky z validovaných 
a uznaných  in vitro  alebo  ex vivo  testov (4) (5) (5a). Táto analýza 
zníži potrebu  in vivo  testovania na poleptanie/podráždenie kože 
látkami, pre ktoré už existujú dostato čné dôkazy z iných štúdií 
k uvedeným dvom kone čným bodom. 
Uprednost ňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje 
vykonanie validovaných a uznaných  in vitro  alebo  ex vivo  testov 
na poleptanie/podráždenie, je do tejto metódy zahrnutá ako príloha. 
Stratégia bola vypracovaná a jednomyse ľne odporu čená účastníkmi 
workshopu OECD (6) a bola prijatá ako odporú čaná stratégia testo ­
vania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemic ­
kých látok (GHS) (7). Odporú ča sa, aby sa táto stratégia testovania 
dodržiavala pred uskuto čnením  in vivo  testovania. V prípade nových 
látok sa na získanie vedecky spo ľahlivých údajov o poleptaní/ ­
podráždení látkou odporú ča koncepcia postupného testovania. 
V prípade existujúcich látok s nedosta čujúcimi údajmi o poleptaní/ ­
podráždení kože sa vedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepouži ť koncepciu postupného testovania, je 
potrebné zdôvodni ť. 
Ak sa poleptanie alebo podráždenie nemôže stanovi ť s použitím 
kritickej analýzy, ktorá je konzistentná so stratégiou postupného 
testovania, je potrebné uvažova ť o použití  in vivo  testu (pozri prílo ­
hu).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINÍCIE  
Podráždenie kože:  je vznik reverzibilného poškodenia kože po apli ­
kácii testovanej látky v trvaní do 4 hodín.  
Poleptanie kože: je vznik ireverzibilného poškodenia kože;  
konkrétne ide o vidite ľné nekrózy cez epidermu až do dermy po 
aplikácii testovanej látky v trvaní do štyroch hodín. Pre reakcie na 
poleptanie sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a na konci 
pozorovania po 14 d ňoch strata farby následkom vyblednutia kože, 
kompletné partie bez srsti a jazvy. Na vyhodnotenie nejasných poškodení je potrebné uvažova ť o vykonaní histopatologického 
vyšetrenia.
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Látka, ktorá sa má testova ť, sa aplikuje v jednorazovej dávke na 
kožu pokusného zviera ťa; neošetrené časti kože testovaného zviera ťa 
slúžia ako kontrola. V stanovených intervaloch zistí a vyhodnotí 
stupeň podráždenia/poleptania a následne sa opíše, aby sa zabezpe ­ 
čilo kompletné posúdenie ú činkov. Trvanie štúdie má by ť dostatočné 
na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility pozorovaných ú činkov. 
Zvieratá, ktoré vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/ ­
alebo bolesti v ktoromko ľvek štádiu testu, sa humánnym spôsobom 
usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Kritéria pre rozhod ­
nutie o humánnom spôsobe usmrtenia moribundných a silne trpiacich zvierat je možné nájs ť v odkaze (8).
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Príprava na  in vivo  test  
1.4.1.1.  Výber druhu zvierat  
Ako laboratórne zviera sa prednostne používa králik-albín a použijú 
sa zdravé mladé dospelé králiky. Použitie iných druhov je potrebné 
zdôvodniť. 
1.4.1.2.  Príprava zvierat  
Približne 24 hodín pred testom sa dôkladným ostrihaním na 
chrbtovej časti trupu týchto zvierat odstráni srs ť. Je potrebné 
venovať pozornos ť tomu, aby sa koža neodrala, a použijú sa iba 
zvieratá so zdravou, neporušenou kožou. 
Niektoré druhy králikov majú miesta s hustou srs ťou, ktoré sa obja ­
vujú v ur čitých obdobiach roka. Takéto miesta, zarastené hustou 
srsťou, by sa nemali používa ť ako miesta na testovanie.  
1.4.1.3.  Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
Zvieratá sa umiestnia jednotlivo. Teplota miestnosti pre králiky ako 
pokusné zvieratá má by ť 22  o C (± 3  o C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť 
má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšova ť 70 %, okrem obdobia 
počas čistenia miestnosti má dosahova ť 50 – 60 %. Osvetlenie má 
byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na k ŕmenie sa 
môže používa ť bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou 
pitnej vody.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Postup testu  
1.4.2.1.  Aplikácia testovanej látky  
Testovaná látka sa aplikuje na malé plochy (približne 6 cm2) kože 
a zakryje náplas ťou z gázy, ktorá sa prichytí leukoplastom, ktorý 
nespôsobuje podráždenie. V prípadoch, ke ď nie je možná priama 
aplikácia (napr. kvapaliny alebo niektoré pasty), sa testovaná látka nanesie najskôr na náplas ť z gázy, ktorá sa potom aplikuje na kožu. 
Náplasť sa voľne prichytí, aby mala kontakt s kožou pomocou vhod ­
ného semiokluzívneho obväzu po čas trvania expozície. Ak sa testo ­
vaná látka aplikuje na náplas ť, pripevní sa tak, aby mala dobrý 
kontakt s kožou a aby látka bola na koži rovnomerne rozložená. 
Je potrebné zabráni ť tomu, aby zviera dosiahlo na náplas ť a aby 
požilo alebo vdýchlo testovanú látku. 
Kvapalné testované látky sa zvy čajne používajú neriedené. Pri testo ­
vaní tuhých látok (ktoré sa môžu v prípade potreby rozotrie ť na 
prach) sa testovaná látka navlh čí malým množstvom vody (alebo 
v prípade potreby iným vhodným nosi čom), ktoré bude dostato čné 
na to, aby zabezpe čilo dobrý kontakt s kožou. Ak sa použijú iné 
nosiče ako voda, prípadný vplyv nosi ča na podráždenie kože má by ť 
minimálny. 
Po skončení expozície, ktorá trvá zvy čajne 4 hodiny, sa zvyšná 
testovaná látka odstráni pod ľa potreby s použitím vody alebo vhod ­
ného roztoku bez toho, aby sa pozmenila existujúca reakcia alebo 
integrita epidermy.
 
1.4.2.2.  Veľkosť dávky  
Na testované miesto sa aplikuje dávka o ve ľkosti 0,5 ml kvapaliny 
alebo 0,5 g tuhej látky alebo pasty.  
1.4.2.3.  Počiatočný test ( in vivo  test podráždenia/poleptania kože na jednom 
zvierati)  
Dôrazne sa odporú ča, aby sa v  in vivo  počiatočnom teste použilo 
jedno zviera, najmä ke ď sa predpokladá, že látka môže by ť žieravá. 
Je to v súlade so stratégiou postupného testovania (pozri prílohu 1). 
Keď sa na základe kritickej analýzy usúdi, že látka je žieravá, ďalšie 
testovanie na zvieratách nie je potrebné. Pre vä čšinu látok, o ktorých 
sa predpokladá, že sú žieravé, ďalšie in vivo  testovanie zvy čajne nie 
je potrebné. V tých prípadoch, kde však následkom nedostato čných 
dôkazov chýbajú ďalšie potvrdzujúce údaje, sa môže vykona ť testo­
vanie na zvieratách v obmedzenom rozsahu na základe tohto prístupu: postupne sa aplikujú na zviera tri testovacie náplasti. Prvá náplas ť sa odstráni po troch minútach. Ak sa nezistí závažná 
reakcia kože, aplikuje sa druhá náplas ť a odstráni sa po jednej 
hodine. Ak zo zistení v tomto štádiu vyplýva, že je humánne, aby sa expozícia mohla pred ĺžiť na štyri hodiny, aplikuje sa tretia náplas ť 
a odstráni sa po štyroch hodinách a reakcia sa vyhodnotí. 
Ak sa zistí žieravý ú činok po ktorejko ľvek z troch postupných expo ­
zícií, test sa ihne ď ukončí. Ak sa po odstránení poslednej náplasti 
nezistí žieravý ú činok, zviera sa pozoruje 14 dní, pokia ľ sa polep ­
tanie neprejaví skôr.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
V tých prípadoch, ke ď sa neočakáva, že testovaná látka spôsobí 
poleptanie, ale môže by ť dráždivá, aplikuje sa jediná náplas ť 
jednému zviera ťu na štyri hodiny.  
1.4.2.4.  Potvrdzujúci test ( in vivo  test podráždenia kože na ďalších zviera ­
tách)  
Ak sa nezistí žieravý ú činok v po čiatočnom teste, dráždivá alebo 
negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne dvoch ďalších zvieratách, 
každé s jednou náplas ťou s časom expozície štyri hodiny. Ak sa 
v počiatočnom teste zistí dráždivý ú činok, môže sa vykona ť 
potvrdzujúci test postupným spôsobom alebo expozíciou dvoch 
ďalších zvierat sú časne. Vo výnimo čnom prípade, ke ď sa neusku ­
toční počiatočný test, dvom alebo trom zvieratám sa môže aplikova ť 
jediná náplas ť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách. V prípade, ke ď 
sa použijú dve zvieratá, ak obidve vykazujú rovnakú reakciu, nie je 
potrebné ďalšie testovanie. V opa čnom prípade sa testuje aj tretie 
zviera. Môže by ť potrebné, aby sa nejednozna čné reakcie vyhodno ­
tili na ďalších zvieratách.  
1.4.2.5.  Doba pozorovania  
Dĺžka času pozorovania má by ť dostatočná na celkové posúdenie 
reverzibility zistených ú činkov. Pokus je však potrebné ukon čiť 
vždy, ke ď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti 
alebo utrpenia. Na ur čenie reverzibilných ú činkov sa zvieratá pozo ­
rujú do 14 dní po odstránení náplastí. Ak sa pozoruje reverzibilita pred uplynutím 14 dní, pokus je potrebné v tomto čase ukon čiť.
 
1.4.2.6.  Klinické pozorovania a vyhodnotenie kožných reakcií  
Všetky zvieratá sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (s červenania 
kože) a edému (opuchu) a reakcie po 60 minútach sa vyhodnotia a potom po 24, 48 a 72 hodinách po odstránení náplasti. V prípade počiatočného testu na jednom zvierati sa testované miesto tiež vyšetrí 
bezprostredne po odstránení náplasti. Kožné reakcie sa vyhodnotia 
a zaznamenajú pod ľa stupňov v nižšie uvedenej tabu ľke. Ak sa 
vyskytne poškodenie kože, ktoré nie je možné ozna čiť ako podráž ­
denie alebo poleptanie po 72 hodinách, budú potrebné pozorovania 
až do 14. d ňa, aby sa ur čila reverzibilita ú činkov. Okrem toho na 
pozorovanie podráždenia, všetky lokálne toxické ú činky, ako je 
odmastenie pokožky a všetky systémové nepriaznivé ú činky (napr. 
účinky na klinické príznaky toxicity a telesnú hmotnos ť), sa celkove 
opíšu a zaznamenajú. Na objasnenie nejednozna čných reakcií je 
potrebné uvažova ť o vykonaní histopatologického vyšetrenia. 
Vyhodnotenie kožných reakcií je nevyhnutne subjektívne. Na 
podporu zosúladenia pri vyhodnocovaní kožnej reakcie a na pomoc 
testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskuto č­ 
ňovaní a interpretovaní výsledkov, zamestnanci uskuto čňujúci vyšet ­
renia musia by ť primerane vyškolení na používanie systému hodno ­
tenia. Užito čnou by mohla by ť ilustrovaná príru čka na vyhodnotenie 
podráždenia kože a iných poškodení (9).
 
2. ÚDAJE  
2.1. PREDKLADANIE VÝSLEDKOV 
Výsledky štúdie sa zhrnú v podobe tabuliek v závere čnej správe 
z testu a vz ťahujú sa na všetky body uvedené v oddiele 3.1.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Stupne podráždenia kože sa posudzujú v súvislosti s charakterom 
a závažnos ťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. 
Jednotlivé stupne nepredstavujú pre dráždivé vlastnosti materiálu 
absolútnu normu, ke ďže sa hodnotia aj iné ú činky testovaného mate ­
riálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazera ť ako na refe ­
renčné hodnoty, ktoré sa majú posudzova ť v súvislosti s inými pozo ­
rovaniami zo štúdie. 
Pri hodnotení dráždivých reakcií je potrebné posúdi ť reverzibilitu 
poškodení kože. Ke ď reakcie ako alopécia (obmedzená), hyperkera ­
tóza, hyperplázia a šupinatos ť pretrvávajú do konca 14-denného 
obdobia pozorovania, testovaná látka sa pokladá za dráždivú.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie: 
Zdôvodnenie  in vivo  testovania: kritická analýza údajov 
z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného 
testovania: 
— opis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testova ­
nia, 
— údaje získané v každom štádiu stratégie testovania, 
— opis vykonaných  in vitro  testov, vrátane údajov o postupoch, 
získaných výsledkov s testovanými/referen čnými látkami, 
— kritická analýza pre uskuto čnenie  in vivo  štúdie. 
Testovaná látka: 
— identifika čné údaje (napr. číslo CAS; zdroj; čistota; známe ne čis­
toty; číslo šarže), 
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, 
prchavosť, rozpustnos ť, stabilita), 
— v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel 
zložiek. 
Nosič: 
— identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem, 
— zdôvodnenie výberu nosi ča. 
Pokusné zvieratá: — použitý druh/kme ň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako 
králik – albín, 
— počet zvierat každého pohlavia, 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku a konci testu, 
— vek na za čiatku štúdie, 
— zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo at ď.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Testovacie podmienky: 
— technika prípravy miesta pre náplas ť, 
— údaje o použitých materiáloch na náplas ť a metóda pokrytia 
náplasťou, 
— údaje o príprave testovanej látky, aplikácii a odstránení. 
Výsledky: 
— tabuľkové spracovanie stup ňov reakcie podráždenia/poleptania 
pre každé zviera vo všetkých meraných časoch, 
— opisy všetkých pozorovaných poškodení, — podrobný opis charakteru a stup ňa zisteného podráždenia alebo 
poleptania a všetky histopatologické nálezy, 
— opis iných nepriaznivých lokálnych (napr. odmastenie kože) 
a systémových ú činkov okrem podráždenia kože alebo poleptania, 
— diskusia k výsledkom.
 
4. ODKAZY  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410 – 429. 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19 – 26. 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 2(5, 709 – 720. 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, European 
Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524. 
(5a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože. 
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and 
Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www 1. oecd. org/ehs/te st/b ackground. htm). 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spolo čným zasadaním 
Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, 
november 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asse ­
ssment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides 
and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. 
[Na požiadanie k dispozícii na sekretariáte OECD].
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabuľka I 
STUPNE REAKCIÍ KOŽE  
Vytvorenie erytému alebo chrasty  
Žiadny erytém . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Veľmi slabý erytém (sotva pozorovate ľný) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Jasne ohrani čený erytém . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Mierny až silný erytém . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Výrazný erytém (tmavo červený) až vytvorenie chrasty zabra ňujúcej 
posúdenie erytému . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximálne možný: 4
 
Vytvorenie edému  
Žiadny edém . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Veľmi slabý edém (sotva pozorovate ľný) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Slabý edém (okraje oblasti jasne ohrani čené zreteľným opuchom) . . . 2 
Mierny edém (opuch približne 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Výrazný edém (opuch viac ako 1 mm a presahujúci za oblas ť expozície) 4 
Maximálne možný: 4 
Na objasnenie nejednozna čných reakcií sa môže vykona ť histopatologické vyšet ­
renie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
Príloha  
Stratégia postupného testovania podráždenia a poleptania kože  
VŠEOBECNÉ H ĽADISKÁ  
V záujme vedeckej spo ľahlivosti a starostlivosti o zvieratá je dôležité zabráni ť 
bezdôvodnému používaniu zvierat a minimalizova ť každé testovanie, ktoré môže 
spôsobiť silné reakcie u zvierat. Všetky informácie o látke, týkajúce sa jej 
potenciálu spôsobi ť poleptanie/podráždenie kože, sa posúdia pred uvažovaní 
o použití  in vivo  testovania. Môže sa sta ť, že už existujú dostato čné dôkazy na 
klasifikáciu testovanej látky, pokia ľ ide o jej potenciál spôsobi ť poleptanie alebo 
podráždenie kože bez toho, aby bolo potrebné vykona ť testovanie na laboratór ­
nych zvieratách. Z tohto dôvodu použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania minimalizuje potrebu  in vivo  testovania, najmä ak látka môže spôsobi ť 
silné reakcie. 
Odporúča sa, aby sa kritická analýza používala na posúdenie existujúcich informácií 
týkajúcich sa podráždenia a poleptania kože látkami na zistenie, či je potrebné 
vykonať ďalšie štúdie iné ako  in vivo  dermálne štúdie na charakterizáciu tohto 
potenciálu. Ak sú potrebné ďalšie štúdie, odporú ča sa, aby sa na získanie potreb ­
ných experimentálnych údajov použila stratégia postupného testovania. V prípade látok, ktoré sa ešte netestovali, sa použije stratégia postupného testovania, aby sa 
získali údaje potrebné na vyhodnotenie jej potenciálu spôsobi ť poleptanie/ ­
podráždenie kože. Stratégia testovania opísaná v tejto prílohe bola vyvinutá na workshope OECD (1) a neskôr bola potvrdená a rozšírená v Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances a potvrdená 28. spolo čným zasadaním Výboru pre chemikálie 
a Pracovnej skupiny pre chemikálie v novembri 1998 (2). 
Aj keď táto stratégia postupného testovania nie je integrálnou sú časťou testovacej 
metódy B.4, vyjadruje odporú čaný prístup pre ur čenie charakteristík 
podráždenia/poleptania kože. Tento prístup predstavuje najlepší postup a aj etický štandard pre  in vivo  testovanie na podráždeniee/poleptanie kože. Testovacia 
metóda poskytuje usmernenie na vykonanie  in vivo  testu a sumarizuje faktory, 
ktoré je potrebné preskúma ť pred začatím takéhoto testu. Stratégia poskytuje 
prístup pre vyhodnotenie existujúcich údajov o dráždivých/žieravých vlastnos ­
tiach testovaných látok a viacstup ňový prístup na vytvorenie príslušných údajov 
o látkach, pre ktoré sú potrebné ďalšie štúdie, alebo pre ktoré sa ešte neusku
­
točnili žiadne štúdie. Odporú ča tiež vykonanie validovaných a uznaných  in vitro  
alebo  ex vivo  testov pre poleptanie/podráždenie kože za špecifických podmienok.  
OPIS HODNOTENIA A STRATÉGIE TESTOVANIA  
Pred uskuto čnením testov ako časti stratégie postupného testovania (obrázok) je 
potrebné vyhodnoti ť všetky dostupné informácie na ur čenie, či je potrebné  in 
vivo testovanie kože. Aj ke ď by sa mohli získa ť významné informácie 
z hodnotenia jednotlivých parametrov (napr. extrémna hodnota pH), je potrebné posúdiť úplnosť existujúcich informácií. Všetky dôležité údaje o ú činkoch 
príslušnej látky alebo jej analógov sa vyhodnocujú pri rozhodovaní na základe 
kritickej analýzy a uvedie sa zdôvodnenie tohto rozhodnutia. Dôraz sa prednostne kladie na existujúce údaje o ú činkoch látky na ľudí a zvieratá, za ktorými 
nasledujú výsledky z  in vitro  alebo  ex vivo  testovania. Vždy, ke ď je to možné, 
je potrebné vyhnú ť sa uskuto čneniu  in vivo  štúdií žieravých látok. Hodnotené 
faktory v stratégii testovania zahrnujú:
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Vyhodnotenie existujúcich údajov o ú činkoch látky na ľudí a zvieratá (stupe ň 1). 
Existujúce údaje o ú činkoch na ľudí, napr. klinické alebo štúdie expozície na 
pracovisku a prípadové správy a/alebo údaje z testov na zvieratách, napr. z jednorazových alebo opakovaných štúdií toxicity dermálnej expozície, sa posúdia ako prvé, pretože poskytujú informácie priamo súvisiace s ú činkami 
na kožu. Látky, ktorých dráždivé alebo žieravé ú činky sú známe, a tie látky, 
u ktorých je jasne dokázané, že nemajú žieravé alebo dráždivé ú činky, nie je 
potrebné testova ť v in vivo  štúdiách.  
Analýza súvislostí medzi štruktúrou a aktivitou (ŠAR) (stupe ň 2). Posúdia sa 
výsledky testovania štrukturálne príbuzných látok, ak sú k dispozícii. Ak je k dispozícii dostatok údajov o ú činkoch na ľudí a/alebo zvieratá štrukturálne 
príbuzných látok alebo zmesiach takýchto látok, z ktorých vyplývajú ich 
možné žieravé/dráždivé ú činky na kožu, dá sa predpoklada ť, že hodnotená testo ­
vaná látka vyvolá rovnakú reakciu. V týchto prípadoch sa testovaná látka nemusí testovať. Negatívne údaje zo štúdií štrukturálne príbuzných látok alebo zmesí 
takýchto látok pod ľa stratégie postupného testovania neposkytujú dostato čný 
dôkaz o nežieravých/nedráždivých ú činkoch látky. Validované a uznané SAR 
prístupy sa použijú na identifikáciu potenciálu spôsobi ť poleptanie a aj podráž ­
denie kože.  
Fyzikálno-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (stupe ň 3). Látky vykazujúce 
extrémne hodnoty pH ako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 môžu ma ť veľmi silné lokálne ú činky. Ak 
je extrémna hodnota pH základom pre identifikáciu látky ako žieravú pre kožu, potom jej sa môže tiež zoh ľadniť jej acidita/alkalita (alebo tlmivá kapacita) (3) (4). 
Ak z tlmivej kapacity vyplýva, že látka  nemôže  byť pre kožu žieravá, potom sa 
uskutoční ďalšie testovanie na potvrdenie tejto domnienky, pri čom sa prednostne 
použije validovaný a uznaný  in vitro  alebo  ex vivo  test (pozri stupne 5 a 6).  
Dermálna toxicita (stupe
ň 4). Ak sa dokázalo, že chemikália je ve ľmi toxická 
dermálnou cestou a  in vivo  štúdie podráždenia/poleptania kože nie je možné 
vykonať, pretože množstvo testovanej látky, ktoré sa zvy čajne aplikuje, by 
mohlo prevýši ť veľmi toxickú dávku a následne spôsobi ť uhynutie alebo silné 
utrpenie zvierat. Okrem toho, ak sa štúdie dermálnej toxicity, pri ktorých sa používajú králiky – albíny, už uskuto čnili s limitnou dávkou do 2 000 mg/kg 
telesnej hmotnosti alebo vyššou a nepozorovalo sa žiadne podráždenie alebo 
poleptanie kože, ďalšie testovanie na podráždenie/poleptanie kože sa nemusí 
vykonať. Pri hodnotení akútnej dermálnej toxicity zo skôr uskuto čnených štúdií 
je potrebné pamäta ť na množstvo aspektov. Napríklad informácie uvedené 
v správach o poškodeniach kože môžu by ť neúplné. Testovanie a pozorovania 
sa mohli vykona ť na iných druhoch ako králik a v citlivosti svojich reakcií sa 
môžu druhy zna čne odlišova ť. Aj forma testovanej látky aplikovanej zvieratám 
nemusí by ť vhodná na posúdenie podráždenia/poleptania kože (napr. zriedenie 
látok na testovanie dermálnej toxicity) (5). V tých prípadoch, ke ď sa však usku ­
točnili na králikoch dobre zostavené a vykonané štúdie dermálnej toxicity, môžu 
sa negatívne zistenia posudzova ť ako dostato čný dôkaz, že látka nie je žieravá 
alebo dráždivá.  
Výsledky z in vitro alebo ex vivo testov (stupne 5 a 6).  Látky, ktoré dokázali 
žieravé alebo silne dráždivé vlastnosti vo validovanom a uznanom  in vitro  alebo  
ex vivo  teste (6) (7) ur čenom pre hodnotenie týchto špecifických ú činkov, nie je 
potrebné testova ť na zvieratách. Je možné predpoklada ť, že takéto látky vyvolajú 
podobné závažné ú činky in vivo.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo test na králikoch (stupne 7 a 8).  Ak sa zakladá rozhodnutie, či je potrebné 
vykonať in vivo  testovanie, na kritickej analýze, malo by sa za čať s počiatočným 
testom na jednom zvierati. Ak výsledky tohto testu preukážu, že látka je žieravá pre kožu, nie je potrebné vykona ť ďalšie testovanie. Ak sa nezistí žieravý ú činok 
v počiatočnom teste, dráždivá alebo negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne 
dvoch ďalších zvieratách po dobu expozície štyri hodiny. Ak sa zistí dráždivý 
účinok v po čiatočnom teste, môže sa vykona ť potvrdzujúci test postupným 
spôsobom alebo expozíciou ďalších dvoch zvierat sú časne.
 
ODKAZY  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www 1. oecd. org/ehs/test/b ackground. htm). 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, 
potvrdený 28. spolo čným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej 
skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709 – 720. 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 
19 – 26. 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 
56032-356-6, Chapter 31, 411 – 436. 
(6) Testovacia metóda B.40. (7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., 
Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by 
the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Obrázok  
STRATÉGIA TESTOVANIA A HODNOTENIE PODRÁŽDENIA KOŽE/POLEPTANIA
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 405 (2002).  
1.1. ÚVOD 
Pri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornos ť veno­
vala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existu ­
júcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbyto čnému 
testovaniu na pokusných zvieratách, a tým zoh ľadnila ochrana zvie ­
rat. Táto metóda zahrnuje odporú čanie, aby sa pred uskuto čnením 
opísaného  in vivo  testu poleptania/podráždenia oka látkou uskuto č­
nila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak nie sú 
k dispozícii dosta čujúce údaje, odporú ča sa, aby sa získali na základe 
postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahrnuje vyko ­
nanie validovaných a uznaných  in vitro  testov a je uvedená ako 
príloha k testovacej metóde. Okrem toho sa odporú ča použiť in 
vivo test podráždenia/po leptania kože na predpovedanie poleptania 
oka pred uvážením  in vivo  očného testu. 
V záujme vedeckej spo ľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá nie je 
potrebné uvažova ť o in vivo  testovaní, pokia ľ neboli všetky dostupné 
údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením oka látkou 
vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz 
z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, 
dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce 
silnú aciditu alebo alkalitu látky (4) (5) a výsledky z validovaných 
a uznaných  in vitro  alebo  ex vivo  testov na poleptanie a podráždenie 
kože (6) (6a). Štúdie je možné vykona ť pred kritickou analýzou 
alebo ako jej výsledok. 
V prípade ur čitých látok takáto analýza môže poukáza ť na potrebu  in 
vivo štúdií potenciálu látky spôsobi ť poleptanie/podráždenie oka. Vo 
všetkých takýchto prípadoch sa pred uvažovaním o použití  in vivo  
očného testu pokia ľ možno uskuto ční najskôr štúdia  in vivo  účinkov 
látky na kožu a vyhodnotí sa v súlade s testovacou metódou B.4 (7). Použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania má zníži ť
 
potrebu  in vivo  testovania poleptania/podráždenia oka látkami, pre 
ktoré už existuje dostatok dôkazov z iných štúdií. Ak sa stanovenie poleptania alebo podráždenia oka nedá vykona ť s použitím stratégie 
postupného testovania, ani po uskuto čnení in vivo  štúdie poleptania 
a podráždenia kože, môže sa vykona ť in vivo  test poleptania/ ­
podráždenia oka.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Uprednost ňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje 
vykonanie validovaných a uznaných  in vitro  alebo  ex vivo  testov 
poleptania/podráždenia, je zahrnutá v prílohe k tejto testovacej metóde. Stratégia bola vypracovaná a jednomyse ľne odporu čená 
účastníkmi workshopu OECD (8) a bola prijatá ako odporú čaná 
stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasi ­
fikáciu chemických látok (GHS) (9). Odporú ča sa, aby sa táto stra ­
tégia testovania dodržiavala pred uskuto čnením  in vivo  testovania. 
V prípade nových látok sa na získanie vedecky spo ľahlivých údajov 
o poleptaní/podráždení látkou odporú ča koncepcia postupného testo ­
vania. V prípade existujúcich látok s nedosta čujúcimi údajmi 
o poleptaní/podráždení kože a oka sa uvedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišných stratégií testovania 
alebo testovacieho postupu alebo rozhodnutie nepouži ť koncepciu 
postupného testovania je potrebné zdôvodni ť.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Podráždenie oka:  je vytvorenie zmien na oku po aplikácii testo ­
vanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré sú úplne reverzibilné do 21 
dní po aplikácii.  
Poleptanie oka:  je vytvorenie poškodenia tkaniva oka alebo závažné 
fyzické oslabenie zraku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré nie sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka sa aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka 
pokusného zviera ťa; neošetrené oko slúži ako kontrola. Stupe ň 
podráždenia/po leptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia poškodenia spojoviek, rohovky a dúhovky v špecifických interva ­
loch. Iné ú činky na oku a nepriaznivé systémové ú činky sa tiež 
opíšu, aby sa uviedlo úplné vyhodnotenie ú činkov. Trvanie štúdie 
má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility 
účinkov. 
Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo 
bolesti v ktoromko ľvek štádiu testu sa humánnym spôsobom usmrtia 
a daná látka sa na základe toho zatriedi. Kritéria pre rozhodnutie 
humánnym spôsobom usmrti ť moribundné a silne trpiace zvieratá je 
možné nájs ť v odkaze (10).
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Príprava na  in vivo  test  
1.4.1.1.  Výber druhov  
Ako laboratórne zviera sa pokia ľ možno použije králik – albín 
a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Je potrebné uvies ť 
zdôvodnenie, ak sa použijú iné kmene alebo druhy.  
1.4.1.2.  Príprava zvierat  
Obe oči každého pokusného zviera ťa, predbežne vybratého na testo ­
vanie, sa 24 hodín pred za čatím testovania vyšetria. Nepoužijú sa 
zvieratá vykazujúce podráždenie o čí, očné poruchy alebo predchá ­
dzajúce zranenie rohovky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
Zvieratá majú by ť umiestnené jednotlivo. Teplota miestnosti na 
pokusy s králikmi má by ť 22 o C (± 3  o C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť 
má byť aspoň 30 % a pokia ľ možno, nemala by prevyšova ť 70 %, 
okrem obdobia po čas čistenia miestnosti má dosahova ť 50 – 60 %. 
Osvetlenie má by ť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na 
kŕmenie sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo 
s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.  
1.4.2.  Postup testu  
1.4.2.1.  Aplikácia testovanej látky  
Testovaná látka sa umiestni do spojovkového vaku jedného oka 
každého zviera ťa po jemnom odtiahnutí spodného vie čka od očnej 
gule. Vie čka sa jemne podržia pri sebe asi jednu sekundu, aby sa 
zabránilo stratám materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ošetrené, slúži 
ako kontrola.  
1.4.2.2.  Vymývanie  
Oči testovaných zvierat sa nevymývajú aspo ň 24 hodín po nakvap ­
kaní testovanej látky, okrem tuhých látok (pozri oddiel 1.4.2.3.2), a v 
prípade okamžitých leptavých alebo dráždivých ú činkov. Po 24 hodi ­
nách sa môžu vymy ť, ak sa usúdi, že je to potrebné. 
Použitie ved ľajšej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vymytia sa 
neodporú ča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je potrebná 
súbežná skupina, použijú sa dva králiky. Podmienky vymytia sa 
starostlivo zdokumentujú, napr. čas vymytia; zloženie a teplota 
vymývacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlos ť aplikácie.  
1.4.2.3.  Veľkosť dávky  
1.4.2.3.1.  Testovanie kvapalín  
Pre testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na nakvapkanie látky 
priamo do oka sa nepoužijú pumpi čkové spreje. Tekutina zo spreja sa 
vystrieka a zozbiera v nádobke predtým, ako sa vkvapne do oka 0,1 ml.  
1.4.2.3.2.  Testovanie tuhých látok  
Pri testovaní tuhých látok, pást a látok, ktoré sú tvorené z častíc, 
použité množstvo má ma ť objem 0,1 ml alebo hmotnos ť maximálne 
100 mg. Testovaný materiál sa pomelie na jemný prášok. Objem 
tuhého materiálu sa zmeria po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá látka nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zviera ťa pri prvom zis ťovaní v časovom 
bode 1 hodina po ošetrení, oko sa môže vymy ť fyziologickým 
roztokom alebo destilovanou vodou.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Testovanie aerosólov  
Odporúča sa, aby sa všetky látky v pumpi čkových sprejoch 
a aerosóloch vystriekali a zozbierali pred nakvapkaním do oka. 
Jedinou výnimkou sú látky v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystrieka ť a zozbiera ť kvôli vyparovaniu. 
V takýchto prípadoch sa oko ponechá otvorené a testovaná látka 
sa aplikuje do oka ako jednorazové vstrieknutie približne jednu 
sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo na prednú časť oka. Táto 
vzdialenos ť sa môže meni ť v závislosti od tlaku spreja a jeho 
obsahu. Pozornos ť je potrebné venova ť tomu, aby sa tlakom zo 
spreja nepoškodilo oko. V ur čitých prípadoch môže by ť potrebné 
posúdiť možnosť „mechanického“ poškodenia oka tlakom kvapaliny 
zo spreja. 
Odhad dávky z aerosólu sa môže urobi ť simulovaním testu takto: 
látka sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor o ve ľkosti oka 
králika, ktoré je umiestnené tesne pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých látok sa môže dávka odhadnú ť tak, že sa 
nádobka s materiálom odváži pred odstránením testovaného mate ­
riálu a po ňom.
 
1.4.2.4.  Počiatočný test ( in vivo  test podráždenia/poleptania oka na jednom 
zvierati)  
Ako sa zdôraz ňuje v stratégii postupného testovania (pozri 
prílohu 1), dôrazne sa odporú ča, aby sa v  in vivo  test uskuto čnil 
najskôr na jednom zvierati. 
Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že látka je žieravá alebo silne 
dráždivá pre oko s použitím uvedeného postupu, ďalšie testovanie na 
očnú dráždivos ť nie je potrebné vykona ť. 
1.4.2.5.  Lokálne anestetiká  
Lokálne anestetiká sa môžu použi ť v jednotlivých prípadoch. Ak 
z kritickej analýzy vyplýva, že látka môže spôsobi ť bolesť, alebo 
počiatočné testovanie ukáže, že sa vyskytne bolestivá reakcia, môže 
sa pred nakvapkaním testovanej látky použi ť lokálne anestetikum. Je 
potrebné starostlivo zvoli ť typ, koncentráciu a dávku lokálneho anes ­
tetika, aby sa zabezpe čilo, že rozdiely v reakcii na testovanú látku 
nevzniknú na základe toho, že sa použilo. Kontrolné oko sa rovnako 
ošetrí anestetikom.  
1.4.2.6.  Potvrdzujúci test ( in vivo  test podráždenia oka na ďalších zvieratách)  
Ak sa v po čiatočnom teste nezistí žieravý ú činok, dráždivá alebo 
negatívna reakcia by sa mal potvrdi ť na maximálne dvoch ďalších 
zvieratách. Ak sa zistí silný dráždivý ú činok v po čiatočnom teste, 
z ktorého vyplýva silný (ireverzibilný) ú činok v potvrdzujúcom 
testovaní, odporú ča sa, aby sa potvrdzujúci test uskuto čnil 
postupným spôsobom v danom čase na jednom zvierati, a nie 
súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvie ­
rati prejavia žieravé alebo silne dráždivé ú činky, test sa preruší. 
Ďalšie zvieratá môže by ť potrebné použi ť na potvrdenie slabých 
alebo miernych dráždivých reakcií.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Doba pozorovania  
Dĺžka času pozorovania má by ť dostatočná na celkové posúdenie 
miery a reverzibility zistených ú činkov. Pokus je však potrebné 
ukončiť vždy, ke ď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej 
bolesti alebo utrpenia (9). Na stanovenie reverzibility ú činkov sa 
zvieratá zvy čajne pozorujú spravidla 21 dní po podaní testovanej 
látky. Ak sa zistí reverzibilita pred uplynutím 21 dní, pokus sa v tomto čase ukončí.
 
1.4.2.7.1.  Klinické pozorovania a vyhodnotenie reakcií oka  
Oči sa vyšetria po 1, 24, 48 a 72 hodinách po aplikácii testovanej 
látky. Hne ď ako sa získa kone čná informácia, zvieratá už nie 
potrebné ďalej testova ť. Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky 
silného utrpenia alebo bolesti sa ihne ď humánnym spôsobom usmrtia 
a daná látka sa na základe toho posúdi. Zvieratá, ktoré po nakvap ­
kaní majú tieto poškodenia oka, sa humánnym spôsobom usmrtia: 
perforácia rohovky alebo závažná ulcerácia rohovky vrátane stafy ­
lomu; krvácanie prednej komory oka; neprieh ľadnosť rohovky 4. 
stupňa, ktoré pretrváva 48 hodín; chýbajúca reakcia zreni čiek na 
svetlo (reakcia dúhovky stupe ň 2), ktorá pretrváva 72 hodín; ulce ­
rácia spojovkovej membrány (conjuctivea); nekróza spojoviek alebo tretieho vie čka, alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto 
poškodenia zvy čajne nie sú reverzibilné. 
Zvieratá, u ktorých sa nevyskytlo žiadne poškodenie oka, môžu by ť 
usmrtené najskôr 3 dni po nakvapkaní látky. Zvieratá so slabými až miernymi poškodeniami sa pozorujú, pokia ľ poškodenia nezmiznú, 
alebo 21 dní, ke ď je štúdia ukon čená. Pozorovania sa uskuto čnia na 
7., 14. a 21. de ň na stanovenie stavu poškodení a ich reverzibility 
alebo ireverzibility. 
Stupne reakcií oka (spojovky, rohovky a dúhovky) sa pri každom 
vyšetrení zaznamenajú (tabu ľka I). Každé ďalšie poškodenia oka 
(napr. panus, sfarbenie) alebo systémové nepriaznivé ú činky sa tiež 
zaznamenajú. 
Na vyšetrenie reakcií sa môže použi ť binokulárna lupa, ru čná štrbi­
nová lampa alebo biomikroskop, alebo iný vhodný prístroj. Po tom, 
ako sa zaznamenajú zistenia po 24 hodinách, sa ďalej môžu o či 
vyšetriť fluoresceínom. 
Vyhodnotenie reakcií oka je nevyhnutne subjektívne. Na podporu 
harmonizácie pri vyhodnotení reakcie oka a na pomoc testovacím 
laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskuto čňovaní 
a interpretovaní výsledkov, musia by ť zamestnanci, ktorí uskuto č­ 
ňujú pozorovania, primerane vyškolení na používanie systému 
hodnotenia.
 
2. ÚDAJE  
2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Vyhodnotenie podráždenia oka sa posúdi v súvislosti s charakterom 
a závažnos ťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. 
Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne kritérium pre dráždivé vlastnosti materiálu, ke ďže sa hodnotia aj iné ú činky testovaného 
materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazera ť ako na 
referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, ke ď sú doložené 
celkovým opisom a posúdením všetkých vyšetrení.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Zdôvodnenie pre  in vivo  testovanie: kritická analýza údajov 
z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania: 
— opis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testova ­
nia, 
— údaje získané v každom štádiu stratégie testovania, 
— opis uskuto čnených  in vitro  testov, vrátane údajov o postupoch, 
získaných výsledkov s testovanými/referen čnými látkami, 
— opis  in vivo  uskutočnenej štúdie podráždenia/poleptania kože, 
vrátane získaných výsledkov, 
— kritická analýza pre uskuto čnenie  in vivo  štúdie. 
Testovaná látka: 
— identifika čné údaje (napr. číslo CAS; zdroj, čistota, známe ne čis­
toty, číslo šarže), 
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, 
prchavosť, rozpustnos ť, stabilita, reaktivita s vodou), 
— v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel 
zložiek, 
— ak sa použije lokálne anestetikum, identifikácia, čistota, typ, 
dávka a prípadná interakcia s testovanou látkou. 
Nosič: 
— identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem, — zdôvodnenie výberu nosi ča. 
Pokusné zvieratá: 
— použitý druh/kme ň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako 
králik – albín, 
— vek každého zviera ťa na začiatku štúdie, 
— počet zvierat každého pohlavia v testovaných a kontrolných 
skupinách (v prípade potreby), 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku a konci testu, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Výsledky: 
— opis použitej metódy na hodnotenie podráždenia v každom čase 
vyšetrenia (napr. ru čná štrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein),
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— tabuľkové spracovanie údajov o dráždivých/žieravých ú činkoch 
pre každé zviera v každom čase vyšetrenia až do vylú čenia 
každého zviera ťa z testu, 
— podrobný opis stup ňa zisteného podráždenia alebo poleptania, 
— opis všetkých pozorovaných poškodení oka (napr. vaskularizácia, 
vytvorenie panusu, sfarbenie), 
— opis iných lokálnych a systémových nepriaznivých ú činkov, 
ktoré sa nevyskytujú na oku, a prípadné histopatologické zistenia. 
Diskusia k výsledkom.  
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Extrapolácia výsledkov štúdií podráždenia oka u laboratórnych 
zvierat na ľudí je možná len v obmedzenej miere. V mnohých prípa ­
doch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia. 
Pozornosť je potrebné venova ť interpretácii údajov na vylú čenie 
podráždenia vyplývajúceho zo sekundárnej infekcie.
 
4. ODKAZY  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410 – 429. 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N, Roguet, R, Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H, Gupta, K.C., Hill, RN. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159 – 164. 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161 – 177. 
(4) Young, J.R, How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19 – 26. 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231. 
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524. 
(6a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože. (7) Testovacia metóda B.4. Akútna toxicita: podráždenie/ ­
poleptanie kože. 
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www. 
oecd. org/ehs/test/background. htm).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, potvrdený 28. spolo čným zasadaním 
Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www. oecd. org/ehs/Class/HCL6. htm). 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asse ­
ssment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Envi ­
ronmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabuľka I 
STUPNE POŠKODENIA OKA  
Rohovka  
Nepriehľadnosť (opacita): stupe ň zákalu (od čítava sa od najhustejšej oblasti) (*) 
Žiadna ulcerácia alebo neprieh ľadnosť (opacita) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Roztrúsené alebo difúzne oblasti neprieh ľadnosti (opacity) (iné ako 
ľahký zákal normálneho lesku); zrete ľne viditeľné detaily dúhovky . . 1 
Ľahko rozoznate ľná priehľadná oblas ť; detaily dúhovky mierne zaka ­
lené . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Perleťová oblas ť; nevidite ľné detaily dúhovky, ve ľkosť zreničky ťažko 
rozoznate ľná . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Nepriehľadná rohovka; dúhovka nezistite ľná cez zákal . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximálne možný: 4 
POZNÁMKY  
(*) Veľkosť nepriehľadnej oblasti rohovky sa zaznamená  
Dúhovka  
Normálna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nápadne privreté riasy, prekrvenie, opuch, mierne prekrvenie okolo 
rohovky; alebo injektácia, dúhovka reaguje na svetlo (pomalá reakcia sa pokladá za pozitívnu) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Krvácanie, hrubé poškodenie, bez reakcie na svetlo . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Maximálne možný: 2
 
Spojovky  
Sčervenanie (týka sa palpebrálnych a bulbárnych spojoviek, bez rohovky 
a dúhovky) 
Normálne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Niektoré cievy prekrvené (injektované) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Difúzne karmínové zafarbenie, jednotlivé cievy ťažko rozoznate ľné . . 2 
Difúzna tmavá červeň . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Maximálne možný: 3
 
Chemóza  
Opuch (týka sa vie čok a/alebo tretieho vie čka) 
Normálne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Trocha opuchnuté nad normálom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Zreteľný opuch s čiastočným vyvrátením vie čok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Opuch s polovi čným uzavretím vie čok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Opuch s vä čším ako polovi čným uzavretím vie čok . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximálne možný: 4
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
Príloha  
Stratégia postupného testovania podráždenia a poleptania oka  
VŠEOBECNÉ H ĽADISKÁ  
V záujme vedeckej spo ľahlivosti a starostlivosti o zvieratá je dôležité zabráni ť 
bezdôvodnému používaniu zvierat a minimalizova ť testovanie, ktoré môže 
spôsobiť silné reakcie u zvierat. Všetky informácie o látke, ktoré sa týkajú jej 
potenciálu spôsobi ť poleptanie/podráždenie oka, je potrebné posúdi ť pred uvažo ­
vaní o použití  in vivo  testovania. Môžu už existova ť dostatočné dôkazy na 
klasifikáciu testovanej látky, pokia ľ ide o jej potenciál spôsobi ť poleptanie 
alebo podráždenie oka bez toho, aby bolo potrebné vykona ť testovanie na labo ­
ratórnych zvieratách. Z tohto dôvodu použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania minimalizuje potrebu  in vivo  testovania, najmä ak látka 
môže spôsobi ť silné reakcie. 
Odporúča sa, aby sa použila kritická analýza na posúdenie existujúcich informá ­
cií, týkajúcich sa podráždenia a poleptania oka látkami, a na stanovenie, či je 
potrebné vykona ť ďalšie štúdie iné ako  in vivo  štúdie oka na umožnenie charak ­
terizácie tohto potenciálu. Ak sú potrebné ďalšie štúdie, odporú ča sa, aby sa na 
získanie príslušných experimentálnych údajov použila stratégia postupného testo ­
vania. V prípade látok, ktoré sa ešte netestovali, sa použije stratégia postupného 
testovania, aby sa získali údaje, potrebné na vyhodnotenie jej potenciálu spôsobi ť 
poleptanie/podráždenie oka. Stratégia testovania, opísaná v tejto prílohe, bola vyvinutá na workshope OECD (1). Neskôr bola potvrdená a rozšírená 
v Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Envi ­
ronmental Effects of Chemical Substances a potvrdená 28. spolo čným zasadaním 
Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie v novembri 1998 (2). 
Aj keď táto stratégia testovania nie je integrálnou sú časťou testovacej metódy 
B.5, vyjadruje odporú čaný prístup pre ur čovanie charakteristík podráždenia/ ­
poleptania oka. Tento prístup predstavuje najlepší postup a aj etický štandard 
pre in vivo  testovanie podráždenia/po leptanie oka. Testovacia metóda poskytuje 
usmernenie na vykonanie  in vivo  testu a sumarizuje faktory, ktoré je potrebné 
preskúma ť pred zač
atím takéhoto testu. Stratégia postupného testovania poskytuje 
prístup na základe kritickej analýzy na vyhodnotenie existujúcich údajov 
o dráždivých/žieravých vlastnostiach látok pre oko a viacstup ňový prístup na 
vytvorenie príslušných údajov o látkach, pre ktoré sú potrebné ďalšie štúdie, 
alebo pre ktoré sa ešte neuskuto čnili žiadne štúdie. Stratégia zahrnuje vykonanie 
najskôr validovaných a uznaných  in vitro  alebo  ex vivo  testov a potom testovacej 
metódy B.4 štúdie poškodenia/poleptania kože v špecifických podmienkach (3)(4).  
OPIS STRATÉGIE POSTUPNÉHO TESTOVANIA  
Pred vykonaním testov ako sú časti stratégie postupného testovania (obrázok) sa 
posúdia všetky dostupné informácie na ur čenie, či je potrebné  in vivo  testovanie 
na oku. Aj ke ď by bolo možné získa ť významné informácie z hodnotenia jedno ­
tlivých parametrov (napr. extrémna hodnota pH), je potrebné posúdi ť úplnosť 
existujúcich informácií. Všetky dôležité údaje o ú činkoch príslušnej látky a jej 
štrukturálnych analógov sa vyhodnotia pri rozhodovaní na základe kritickej 
analýzy a uvedie zdôvodnenie rozhodnutia. Prednostne je potrebné zamera ť sa 
na existujúce údaje o ú činkoch látky na ľudí a zvieratá, za ktorými nasledujú 
výsledky z  in vitro  alebo  ex vivo  testovania. Vždy, ke ď je to možné, je potrebné 
zabrániť, aby sa uskuto čňovali  in vivo  štúdie žieravých látok. Hodnotené faktory 
v stratégii testovania zahrnujú:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Vyhodnotenie existujúcich ú činkov látky na ľudí a zvieratá (stupe ň 1). Existujúce 
údaje o ú činkoch na ľudí, napr. klinické štúdie alebo štúdie expozície na praco ­
visku a prípadové správy a/alebo údaje z testovania pri štúdiách na o čiach na 
zvierat sa posúdia ako prvé, pretože poskytujú informácie priamo súvisiace s účinkami na o či. Potom sa posúdia dostupné údaje zo štúdií na ľuďoch a/alebo 
zvieratách, ktorými sa hodnotilo poleptanie/podráždenie kože. Látky, ktorých 
žieravé alebo silne dráždivé ú činky na oko sú známe, sa neaplikujú do o čí zvierat 
a ani tie látky, u ktorých je preukázané, že majú žieravé alebo dráždivé ú činky na 
kožu, takéto látky by sa mali poklada ť za žieravé a/alebo dráždivé aj na o či. 
Látky s dostato čnými dôkazmi o nežieravých a nedráždivých ú činkoch 
z prechádzajúcich štúdií uskuto čnených na o čiach tiež už nie je potrebné testova ť 
v in vivo  štúdiách na o čiach.  
Analýza súvislostí medzi štruktúrou a aktivitou (ŠAR) (stupe ň 2). Je potrebné 
posúdiť výsledky testovania štrukturálne príbuzných chemikálií, ak sú 
k dispozícii. Ak je k dispozícii dostatok údajov o ú činkoch na ľudí a/alebo 
zvieratá o štrukturálne príbuzných látkach alebo zmesiach takýchto látok, 
z ktorých vyplývajú ich možné žieravé/dráždivé ú činky na o či, dá sa predpokla ­
dať, že testovaná látka vyvolá rovnaké reakcie. V týchto prípadoch sa látka 
nemusí testova ť. Negatívne údaje zo štúdií štrukturálne príbuzných látok alebo 
zmesí takýchto látok pod ľa stratégie postupného testovania neposkytujú dosta ­
točný dôkaz o nežieravých/nedráždivých ú činkoch látky. Validované a uznané 
prístupy ŠAR sa použijú na identifikáciu potenciálu spôsobi ť poleptanie 
a podráždenie kože a o čí. 
Fyzikálno-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (stupe
ň 3). Látky vykazujúce 
extrémne hodnoty pH ako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 môžu ma ť veľmi silné lokálne ú činky. 
Ak je extrémna hodnota pH základom pre identifikáciu látky, že spôsobuje 
poleptanie alebo podráždenie o čí, potom sa tiež môže zoh ľadniť jej acidita/ ­
alkalita (alebo tlmivá kapacita) (5) (6). Ak z tlmivej kapacity vyplýva, že látka  
nemôže  spôsobiť poleptanie oka, potom je potrebné vykona ť ďalšie testovanie na 
potvrdenie tejto domnienky, pri čom sa pokia ľ možno použije validovaný 
a uznaný  in vitro  alebo  ex vivo  test (pozri oddiel stupe ň 5 a 6).  
Posúdenie ďalších existujúcich informácií (stupe ň 4). V tomto stupni sa posúdia 
všetky dostupné informácie o systémovej toxicite dermálnou cestou. Tiež sa 
posúdi akútna dermálna toxicita testovanej látky. Ak sa testovaná látka prejavila 
ako veľmi toxická dermálnou cestou, nemusí sa testova ť na oku. Aj ke ď bezpod­
mienečne neexistuje vz ťah medzi akútnou dermálnou toxicitou a podráždením/ ­
poleptaním oka, dá sa predpoklada ť, že ak je látka ve ľmi toxická dermálnou 
cestou, bude vykazova ť vysokú toxicitu aj pri aplikácii do oka. Takéto údaje 
sa tiež môžu hodnoti ť medzi stup ňami 2 a 3.  
Výsledky z in vitro alebo ex vivo testov (stupne 5 a 6).  Látky, ktoré preukázali 
žieravé alebo silne dráždivé vlastnosti v  in vitro  alebo  ex vivo  teste (7) (8), ktoré 
boli validované a uznané na hodnotenie špecifických žieravých/dráždivých účinkov na oko alebo kožu, nie je potrebné testova ť na zvieratách. Dá sa pred ­
pokladať, že takéto látky vyvolajú podobné závažné ú činky in vivo.
 Ak nie sú 
k dispozícii validované a uznané  in vitro/ex vivo  testy, vynechajú sa stupne 5 a 6 
a pristúpi sa priamo k stup ňu 7. 
Posúdenie in vivo dráždivých alebo žieravých ú činkov látky na kožu (stupe ň 7). 
Ak neexistuje dostatok dôkazov na vykonanie presved čivej kritickej analýzy 
potenciálu látky spôsobi ť podráždenie/poleptanie oka založených na údajoch 
z uvedených štúdií, je potrebné najskôr posúdi ť in vivo  potenciál spôsobi ť 
podráždenie/poleptanie kože s použitím testovacej metódy B.4 (4) a k nej 
patriacej prílohy (9). Ak je o látke známe, že spôsobuje poleptanie alebo silné podráždenie kože, pokladá sa za látku so žieravými/dráždivými ú činkami na o či, 
pokiaľ z iných informácií nevyplýva iný záver. Na základe toho nie je potrebné 
vykonať in vivo  očný test. Ak látka nie je žieravá alebo silne dráždivá pre kožu,  
in vivo  očný test je potrebné vykona ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo  test na králikoch  (stupne 8 a 9) . In vivo  testovanie na o čiach je potrebné 
začať počiatočným testom na jednom zvierati. Ak výsledky tohto testu preukážu, 
že látka je silne dráždivá alebo žieravá pre o či, nie je potrebné vykona ť ďalšie 
testovanie. Ak sa nepreukážu žiadne žieravé alebo silne dráždivé ú činky, usku ­
toční sa potvrdzujúci test na dvoch ďalších zvieratách.  
ODKAZY  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 
24. januára 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spolo čným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej 
skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161 – 177. 
(4) Testovacia metóda B.4. Akútna toxicita: podráždenie/poleptanie kože. (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19 – 26. 
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231. 
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483 – 524. 
(8) Testovacia metóda B.40 leptanie kože. 
(9) Príloha k testovacej metóde B.4: Stratégia postupného testovania podráž ­
denia a poleptania kože.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Obrázok  
STRATÉGIA TESTOVANIA A HODNOTENIA PODRÁŽDENIA/POLEPTANIA OKA
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. PODRÁŽDENIE POKOŽKY  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD  
Poznámky:  
Citlivosť a schopnos ť testov zisti ť potenciál senzibilizátorov ľudskej 
pokožky je považovaný v systéme klasifikácie toxicity dôležitej pre 
ľudské zdravie za dôležitý. 
Neexistuje jednoduchá metóda testovania, ktorá by posta čujúco 
rozpoznala všetky látky s potenciálom dráždenia ľudskej pokožky 
a ktorá by bola vhodná pre všetky látky. 
Pri výbere testu sa berú do úvahy také faktory, ako sú fyzikálne 
vlastnosti látky, vrátane jej schopnosti prenika ť do pokožky. 
Skúšky s adjuvansom sú pravdepodobne presnejšie v predpovedi 
pravdepodobného senzibiliza čného účinku na ľudskú pokožku ako 
metódy bez použitia Freundsovho kompletného adjuvansu, a preto sa 
im dáva prednos ť. 
Vyvinuli sa dva typy testov, pri ktorých sa používajú mor čatá: testy 
s pomocnou látkou, v ktorých je alergický stav zosil ňovaný rozpus ­
tením alebo suspendovaním látky v kompletnom Freundsovom adju ­
vanse (FCA), a testy bez pomocnej látky. 
Často používaným typom adjuvansového testu je maximalizovaný 
test morčiat (GPMT). Hoci sa na zistenie potenciálu látky spôsobu ­
júcej precitlivelos ť pokožky používajú aj iné metódy, GPMT sa 
medzi adjuvansovými metódami uprednost ňuje. 
U väčšiny skupín chemikálií sa neadjuvansové metódy (uprednost ­ 
ňuje sa Buehlerov test) považujú za menej citlivé. 
V určitých prípadoch môžu existova ť príčiny pre výber Buehlerovho 
testu, v ktorom sa využíva miestne použitie namiesto intradermál ­
neho vstrekovania využívaného maximalizovaným testom mor čiat 
(GPMT). Pri použití Buehlerovho testu je nevyhnutné vedecké zdôvodnenie jeho použitia. 
V tejto metóde je opísaný maximalizovaný test mor čiat (GPMT) aj 
Buehlerov test. Iné metódy sa môžu použi ť za predpokladu, že sú 
dostatočne overené a vedecky zdôvodnené. 
Ak sa v screeningovom teste zistia pozitívne výsledky, látka sa 
navrhne ako potenciálny senzibilizátor a nie je potrebné uskuto čniť 
ďalšie testovanie s mor čatami. Ak sa v takomto teste zistia negatívne 
výsledky, je nutné uskuto čniť test s mor čatami použitím postupu 
opísaného v tejto testovacej metóde. 
Pozri aj všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINÍCIE  
Precitlivenos ť pokožky:  (alergická kontaktná dermatitída) je imuno ­
logicky sprostredkovaná kožná reakcia na látku. U človeka sú 
reakcie charakterizované svrbením, s červenaním pokožky, edémami, 
bradavicami, vezikulami, bulami alebo ich kombináciou. U iných 
druhov môžu by ť reakcie odlišné a môže sa spozorova ť iba sčerve­
nanie kože a edémy.  
Indukcia expozície:  experimentálna expozícia jedinca testovanou 
látkou s cie ľom vyvolania precitlivelého stavu.  
Doba indukcie:  doba najmenej jeden týžde ň nasledujúca po indukcii 
expozície, po čas ktorej sa vyvinul precitlivelý stav.  
Opakované vyvolanie reakcie expozíciou:  experimentálna expozícia 
jedinca testovanou látkou nasledujúca po dobe indukcie. Zis ťuje sa 
ňou, či jedinec reaguje hypersenzitívne.  
1.3. ODPORÚ ČANÉ LÁTKY 
Citlivosť a spoľahlivosť použitej experimentálnej metódy sa stano ­
vuje každých šes ť mesiacov použitím látok, u ktorých sú známe 
mierne účinky na precitlivenos ť pokožky. 
V správne riadených testoch sa o čakáva u látok s miernymi ú činkami 
na precitlivenos ť pokožky prinajmenšom 30 % odozva 
v adjuvansovom teste a 15 % v neadjuvansovom teste. 
Uprednost ňujú sa nasledujúce látky:  
CAS číslo EINECS číslo EINECS názov Bežný názov  
101-86-0 202-983-3 aldehyd kys. α-hexyl škori ­
covej aldehyd kys. α-hexyl škoricovej 
149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (merkapto ­
benzotiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzokaín nordkaín 
Pri splnení horeuvedených kritérií sa za ur čitých okolností môžu 
použiť s primeraným zdôvodnením aj iné kontrolné látky.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Na začiatku sú testované zvieratá vystavené ú činku testovanej látky 
intradermálnym vstrekovaním a/alebo epidermálnou aplikáciou 
(indukcia expozície). Nasleduje vy čkávacie obdobie perióda 10 až 
14 dní (indukcia expozície), po čas ktorej sa vyvíja imunitná odozva, 
a potom sa zvieratá vystavia ú činku opakovanej dávky. 
U testovaných zvierat sa rozsah a stupe ň reakcie pokožky pri opako ­
vanej expozícii porovná s kontrolnými zvieratami, ktoré boli podro ­
bené simulovanej aplikácii po čas indukcie a bola na nich použitá 
opakovaná expozícia.  
1.5. OPIS TESTOVACÍCH METÓD 
Ak sa považuje za nevyhnutné odstráni ť testovanú látku, uskuto čňuje 
sa to vodou alebo vhodným rozpúš ťadlom bez toho, aby sa tým 
zmenila už existujúca odozva, alebo aby bola porušená celistvos ť 
pokožky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Maximalizovaný test mor čiat (GPMT)  
1.5.1.1. P r í p r a v a 
Mladé zdravé dospelé mor čatá (albíny) sa aklimatizujú na labora ­
tórne podmienky prinajmenšom po čas 5-tich dní pred testom. Pred 
testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srs ť sa 
im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky depiluje. Je nutné chráni ť pokožku pred obrúsením. Pred za čatím 
testu a pri jeho ukon čení sa zvieratá zvážia.
 
1.5.1.2. P o d m i e n k y t e s t o v a n i a  
1.5.1.2.1. Testované zvieratá 
Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov mor čiat. 
1.5.1.2.2. Po čet a pohlavie 
Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice musia to 
byť jedinci, ktoré zatia ľ nerodili, a nie sú tehotné. 
V testovanej skupine sa používa minimálne 10 zvierat a v kontrolnej 
skupine 5 zvierat. Ak sa použije menej ako 20 testovaných a 10 kontrolných mor čiat a nie je možné dôjs ť k záveru, že testovaná 
látka je senzibilizátor, testuje sa s dodato čnými zvieratami, pri čom 
sa výrazne doporu čuje pracova ť s minimálne 20 zvieratami 
v testovanej skupine a 10 zvieratami v kontrolnej skupine.
 
1.5.1.2.3. Hladiny dávok 
Koncentrácia testovanej látky pri každej indukcii expozície musí by ť 
systematicky tolerovaná a musí by ť použitá najvyššia z dávok spôso ­
bujúcich mierne podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyh ­
nutné, vhodné koncentrácie sa ur čia pri pilotnej štúdii používajúcej 
dve alebo tri zvieratá. Pri aplikácii sa používa kompletný Freundsov 
Adjuvans (FCA).
 
1.5.1.3. P o s t u p  
1.5.1.3.1. Indukcia 
Deň 0 – testovaná skupina 
Na oblasť pleca zbaveného srsti sa použijú tri páry intradermálneho 
vstreknutia objemu 0,1 ml. 
Vstrekovanie 1: zmes 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok 
Vstrekovanie 2: vybraná koncentrácia testovanej látky vo vhodnom 
nosiči 
Vstrekovanie 3: vybraná koncentrácia testovanej látky zmiešaná so 
zmesou 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok. 
Pri 3. vstrekovaní sú rozpustné látky rozpustené vo vodnej fáze ešte 
pred zmiešaním s FCA. Lipofilné alebo nerozpustné látky sa suspen ­
dujú v FCA ešte pred spojením s vodnou fázou. Výsledná koncen ­
trácia musí by ť totožná s koncentráciou použitou pri 2. vstrekovaní.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Vstrekovania 1 a 2 sú prevedené blízko seba, a to čo najbližšie 
k hlave, zatia ľ čo vstrekovanie 3 sa prevedie kaudálnym smerom 
na testovanom povrchu. 
Deň 0 – kontrolná skupina 
Na to isté miesto ako u testovanej skupiny sa použijú tri páry intra ­
dermálneho vstreknutia objemu 0,1 ml. 
Vstrekovanie 1: zmes 1: 1 (v/v) FCA/voda alebo fyziologický roztok 
Vstrekovanie 2: neriedený nosi č 
Vstrekovanie 3: zmes 50 % v/v nosi ča v zmesi 1: 1 (v/v) FCA/voda 
alebo fyziologický roztok. 
Deň 5 – 7 – testovaná a kontrolná skupina. 
V prípade látky, ktorá nedráždi pokožku, sa približne dvadsa ť štyri 
hodín pred uskuto čnením indukcie pri lokálnom nanášaní testovaný 
povrch po ostrihaní a/alebo oholení ošetrí 0,5 ml 10 % sodnej soli sulfátu kyseliny laurovej vo vazelíne, čím sa lokálne podráždenie 
vyvolá. 
Deň 6 – 8 – testovaná skupina 
Na testovanej ploche sa opä ť odstráni srs ť. Filtračný papier 
(2 × 4 cm) zmá čaný testovanou látkou vo vhodnom nosi či sa priloží 
na testovaný povrch a po čas 48 hodín sa udržuje s ním v kontakte 
pomocou nepriepustného obväzu alebo nepriepustného obalu. 
Deň 6 – 8 – kontrolná skupina 
Na testovanej ploche sa opä ť odstráni srs ť. Podobným spôsobom sa 
vhodný nosi č priloží na testovaný povrch a po čas 48 hodín sa 
udržuje v kontakte s ním pomocou nepriepustného obväzu alebo 
nepriepustného obalu.
 
1.5.1.3.2. Opakovaná aplikácia 
Deň 20 – 22 – testovaná a kontrolná skupina 
Z bokov testovaných a kontrolných zvierat sa odstráni srs ť. Náplasť 
zmáčaná testovanou látkou sa použije na jeden bok zvierat, a ak je to 
potrebné, na druhý bok sa použije náplas ť zmáčaná samotným nosi ­ 
čom. Náplasti sa po čas 24 hodín udržujú v kontakte s testovaným 
povrchom pomocou nepriepustného obväzu alebo obalu.  
1.5.1.3.3. Pozorovania a odstup ňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina 
— približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch 
vyčistený, ostrihaný a/alebo vyholený a depilovaný, ak je to 
nevyhnutné, 
— približne o 3 hodiny neskôr (približne 48 hodín po za čatí opako ­
vanej aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zazna ­
mená pod ľa stupňov uvedených v dodatku, 
— približne 24 hodín po tomto a druhom (72 hodín) pozorovaní sa 
pozorovanie uskuto ční opäť a zaznamená sa. 
Odporúča sa uskuto čnenie slepého pokusu testovaných aj kontrol ­
ných zvierat. 
Ak je potrebné potvrdi ť výsledky získané opakovanou aplikáciou, 
uskutoční sa opätovná opakovaná aplikácia s použitím novej 
kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týžde ň 
po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa tiež prevádza s pôvodnou 
kontrolnou skupinou.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Všetky kožné reakcie a nezvy čajné nálezy, vrátane systémových 
reakcií, zistené pri metóde induk čnej aj opakovanej aplikácie je 
nutné zaznamena ť podľa klasifika čnej škály Magnusson/Kligman 
(pozri dodatok). Pri objas ňovaní nejednozna čných reakcií sa usku ­
točňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie alebo 
meranie hrúbky zriasenia pokožky.  
1.5.2.  Buehlerov test  
1.5.2.1. P r í p r a v a 
Mladé zdravé dospelé mor čatá (albíny) sa aklimatizujú na labora ­
tórne podmienky prinajmenšom po čas 5-tich dní pred testom. Pred 
testom sú zvieratá náhodne pridelené do testovaných skupín. Srs ť sa 
im v závislosti od použitej metódy ostrihá, oholí alebo chemicky 
depiluje. Je nutné chráni ť pokožku pred obrúsením. Pred za čatím 
testu a pri jeho ukon čení sa zvieratá zvážia.  
1.5.2.2. P o d m i e n k y t e s t o v a n i a  
1.5.2.2.1. Testované zvieratá 
Bežne sa používajú laboratórne kmene albínov mor čiat. 
1.5.2.2.2. Po čet a pohlavie 
Používajú sa samce a/alebo samice. Ak sa používajú samice, musia 
to byť jedince, ktoré zatia ľ nerodili a nie sú tehotné. 
V testovanej skupine sa používa minimálne 20 zvierat a v kontrolnej 
skupine 10 zvierat.  
1.5.2.2.3. Hladiny dávok 
Pri každej indukcii expozície sa používa koncentrácia testovanej 
látky zodpovedajúca najvyššej dávke spôsobujúcej mierne, ale nie nadmerné podráždenie pokožky. Pri opakovanej expozícii sa používa 
najvyššia dávka nespôsobujúca podráždenie. Ak je to nevyhnutné, 
vhodné koncentrácie sa ur čia pri pilotnej štúdii, ktorá používa dve 
alebo tri zvieratá. 
Pre testované látky rozpustné vo vode je vhodné použi ť vodu alebo 
zriedený roztok zmá čadla ako nosi ča. U iných testovaných mate ­
riálov sa uprednost ňuje pri induk čnej aplikácii 80 % etanol/voda 
a pri opakovanej aplikácii acetón.
 
1.5.2.3. P o s t u p  
1.5.2.3.1. Indukcia 
Deň 0 – testovaná skupina 
Jeden bok je vy čistený od srsti (krátkym ostrihaním). Náplasti musia 
byť zmáčané testovanou látkou vo vhodnom nosi či (výber nosi ča 
musí byť oprávnený; ak je to výhodné, môžu by ť kvapalné testované 
látky použité neriedené). 
Náplasť sa použije na testovaný povrch a po čas 6 hodín sa udržuje 
s ním v kontakte pomocou vhodného obväzu alebo obalu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Náplasti musia by ť nepriepustné. Vhodné sú bavlnené vankúšiky 
buď kruhového, alebo štvorcového tvaru ve ľkosti približne 4 – 
6 cm  2 . Uprednost ňuje sa zabezpe čenie pohltenia použitím vhodných 
ochranných materiálov. Pri použití obväzovania je možné, že sa bude musieť použiť doplňujúca expozícia. 
Deň 0 – kontrolná skupina 
Jeden bok je vy čistený od srsti (krátkym ostrihaním). Použije sa iba 
nosič, a to obdobne ako pri kontrolnej skupine. Náplas ť sa počas 6 
hodín udržuje v kontakte s pokožkou pomocou nepriepustného 
obväzu alebo obalu. Ak je dokázané, že nie je nevyhnutné použi ť 
simulovanú kontrolnú skupinu, používa sa oby čajná kontrolná 
skupina. 
Deň 6 – 8 a 13 – 15 – testovaná a kontrolná skupina 
Na tej istej testovanej ploche (ak je to potrebné, vy čistenej) toho 
istého boku sa používa tá istá aplikácia ako v 0. dni aj v 6. – 8. dni a aj v 13. – 15. dni.
 
1.5.2.3.2. Opakovaná aplikácia 
Deň 27 – 29 – testovaná a kontrolná skupina 
Netestovaný bok testovaných a kontrolných zvierat sa vy čistí od srsti 
(krátkym ostrihaním). Vhodné množstvo testovanej látky na neprie ­
pustnom obväze alebo v obale sa použije na zadnú časť netestova ­
ného boku testovaných a kontrolných zvierat. Používa sa maximálna 
koncentrácia, pri ktorej nedochádza k podráždeniu. 
Ak je to vhodné, na predtým netestovanú časť boku testovaných aj 
kontrolných zvierat sa použije nepriepustná náplas ť alebo obal 
s nosičom. Nepriepustná náplas ť alebo obal prichytený vhodným 
obväzom sa udržuje v kontakte s pokožkou po čas 6 hodín.  
1.5.2.3.3. Pozorovania a odstup ňovanie odozvy: testovaná a kontrolná skupina 
— približne 21 hodín po odstránení náplasti je testovaný povrch 
opäť vyčistený od srsti, 
— približne o 3 hodiny neskôr (asi 30 hodín po za čatí opakovanej 
aplikácie) sa sleduje kožná reakcia a pozorovanie sa zaznamená 
podľa stupňov uvedených v dodatku, 
— približne 24 hodín po predchádzajúcom pozorovaní (asi 54 hodín 
po opakovanej aplikácii) sa uskuto ční ďalšie pozorovanie a opä ť 
sa zaznamená. 
Odporúča sa uskuto čnenie slepého pokusu testovaných aj kontrol ­
ných zvierat. 
Ak je potrebné potvrdi ť výsledky získané prvou opakovanou apliká ­
ciou, uskuto ční sa druhá opakovaná aplikácia s použitím novej 
kontrolnej skupiny. Táto aplikácia sa prevádza približne jeden týžde ň 
po prvej. Opätovná opakovaná aplikácia sa uskuto čňuje tiež 
s pôvodnou kontrolnou skupinou.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Všetky kožné reakcie a nezvy čajné nálezy, vrátane systémových 
reakcií, zistené pri metóde induk čnej aj opakovanej aplikácii je 
nutné sledova ť a zaznamena ť podľa klasifika čnej škály Magnusson/ ­
Kligman (pozri prílohu). Pri objas ňovaní nejednozna čných reakcií sa 
uskutočňujú ďalšie postupy, napríklad histopatologické vyšetrenie 
alebo meranie hrúbky zriasenia pokožky.  
2. ÚDAJE (GPMT A BUEHLER)  
Všetky údaje musia by ť zhrnuté v tabu ľkovej forme s každou pozo ­
rovanou reakciou podráždenia pokožky zviera ťa. 
3. SPRÁVA (GPMT A BUEHLER)  
Ak sa pred testom mor čiat uskuto ční screeningová skúška, je 
potrebné uvies ť spolu s výsledkami uskuto čneného testu 
a odporú čanými testovacími látkami aj opis alebo odkaz na scree ­
ningovú skúšku (napríklad skúška lokálnych lymfatických uzlín 
(LLNA), test opuchnutia ucha u myší (MEST)), vrátane podrobností 
o postupoch.  
Správa o teste (GPMT a Buehler)  
Správa o teste má obsahova ť, pokiaľ je to možné, nasledujúce infor ­
mácie: 
Testované zvieratá: — kmeň použitých mor čiat, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky bývania, strava at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu. 
Podmienky testovania: — metódu prípravy náplastí, — podrobnosti o materiáli náplastí a technike ich použitia pri testovaní, — výsledky pilotnej štúdie s vyhodnotením koncentrácií použitých 
pri induk čnej a opakovanej aplikácii, 
— podrobnosti o príprave použitej látky, o jej aplikácii a odstránení, — zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— koncentrácie nosi ča a testovanej látky použité pri induk čnej 
a opakovanej expozícii a celkové množstvo aplikovanej látky použitej pri indukcii aj opakovanej expozícii. 
Výsledky: — zostavenie tabuliek posledných výsledkov precitlivenosti 
a kontrole spo ľahlivosti (pozri 1.3) vrátane informácií 
o testovanej látke, jej koncentrácii a nosi či,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— o každom zvierati vrátane systému stup ňovania dávok, 
— podrobný opis povahy a stup ňa pozorovaných ú činkov, 
— histopatologické nálezy. 
Diskusia 
Záver  
4. ODKAZY  
Táto metóda je obdobná OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Dodatok  
TABUĽKA 
Klasifika čná škála pre vyhodnotenie škodlivých ú činkov vyvolaných škv ŕn 
podľa Magnusson/Kligmana  
0 = žiadne vidite ľné zmeny 
1 = nespojitý alebo škvrnitý erytém (s červenanie kože) 
2 = stredne silný a zlievajúci sa erytém 3 = intenzívny erytém a edém
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. 28-DŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY PRI HLODAVCOCH/ 
TEST V OPAKOVANÝCH DÁVKACH  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov TG 407 (2008). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov 
407 boli prijaté v roku 1981. V roku 1995 bola prijatá revidovaná verzia 
s cieľom získa ť ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii, 
najmä informácie o neurotoxicite and imunotoxicite. 
2. Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou 
s cieľom zrevidova ť existujúce usmernenia k testovaniu a vypracova ť 
nové usmernenia k testovaniu potenciálnych endokrinných disruptorov (8). 
Jednou zložkou tejto aktivity bolo aktualizova ť existujúce usmernenia 
OECD pre „28-d ňovú štúdiu orálnej toxicity pri hlodavcoch/test 
v opakovaných dávkach“ (TG 407) pod ľa parametrov vhodných na zistenie 
endokrinného pôsobenia testovaných chemikálií. Tento postup bol podro ­
bený rozsiahlemu medzinárodnému programu, ktorého ú čelom bolo otes ­
tovať význam a vykonate ľnosť ďalších parametrov, výkonnos ť týchto para ­
metrov pri chemikáliách s (anti)estrogénnym, (anti)androgénnym 
a (anti)tyreoidným pôsobením, intralaboratórnu a interlaboratórnu reprodu ­
kovateľnosť a vzájomnú interferenciu nových parametrov s parametrami 
požadovanými v predchádzajúcom usmer ňovacom dokumente TG 407. 
Týmto spôsobom sa zozbieralo ve ľké množstvo údajov, ktoré sa podrobne 
zhodnotili v súhrnnej správe OECD (9). Táto aktualizovaná testovacia 
metóda B.7 (rovnocenná s TG 407) bola vypracovaná na základe skúseností a výsledkov získaných po čas medzinárodného programu testovania. Táto 
testovacia metóda umož ňuje skúmanie súvislostí medzi ur čitými endokrin ­
nými účinkami a inými toxikologickými ú činkami.
 
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
3. Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxických charakteristík chemikálie 
možno po získaní prvotných informácií o toxicite prostredníctvom testovania akútnej toxicity pomocou opakovaných dávok stanovi ť orálnu toxicitu. Táto 
testovacia metóda je zameraná na preskúmanie ú činkov na ve ľmi širokej 
škále potenciálnych cie ľov toxicity. Poskytuje informácie o možnej nebez ­
pečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expo ­
zícii v priebehu pomerne krátkeho časového obdobia, vrátane ú činkov na 
nervový, imunitný a endokrinný systém. Pokia ľ ide o tieto konkrétne sledo ­
vané parametre, mali by sa pomocou nej identifikova ť chemikálie 
s neurotoxickým potenciálom, čo môže vies ť k ďalšiemu dôkladnému 
skúmaniu tohto aspektu, a chemikálie, ktoré majú vplyv na tyreoidnú fyzio ­
lógiu. Takisto pomocou nej možno získa ť údaje o chemikáliách, ktoré majú 
vplyv na sam čie a/alebo sami čie rozmnožovacie orgány pri mladých dospe ­
lých zvieratách, a možno pomocou nej zisti ť imunologické ú činky. 
4. Výsledky tejto testovacej metódy B.7 sa použijú na identifikáciu nebezpe č­
nosti a na hodnotenie rizík. Výsledky získané pomocou parametrov súvisia ­
cich s endokrinným systémom by sa mali posudzova ť v kontexte Koncep č­
ného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií poškodzujúcich 
endokrinný systém (11). Metóda zah ŕňa základnú štúdiu toxicity pri opako ­
vaných dávkach, ktorú možno použi ť v prípade chemikálií, pri ktorých 
nemožno zaru čiť 90-dňovú štúdiu (napr. ke ď objem produkcie neprekra čuje 
určité limity), alebo ako predbežnú štúdiu k dlhodobej štúdii. Interval expo ­
zície trvá 28 dní.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Medzinárodný program uskuto čnený na overenie parametrov vhodných na 
potenciálne odhalenie endokrinného pôsobenia testovanej chemikálie, 
ukázal, že kvalita údajov získaných touto testovacou metódou B.7 bude vo veľkej miere závisie ť od skúseností testovacieho laboratória. Súvisí to 
najmä s histopatologickým stanovením cyklických zmien pri sami čích 
rozmnožovacích orgánoch a so stanovením hmotnosti malých hormonálnych 
orgánov, ktorých pitva je náro čná. Boli vypracované usmernenia 
k histopatológii (19), ktoré sú k dispozícii na verejnej webovej stránke OECD o usmerneniach k testovaniu. Ich cie ľom je pomôc ť patológom pri 
ich skúmaní a pomôc ť zvýšiť citlivosť skúšky. Pri množstve parametrov sa 
zistilo, že indikujú endokrinnú toxicitu, na základe čoho boli za členené do 
testovacej metódy. Parametre, pre ktoré nie sú k dispozícii dostato čné údaje 
na preukázanie ich užito čnosti alebo pri ktorých bol v rámci programu 
overovania preukázaný iba slabý prínos pri zis ťovaní endokrinných disrup ­
torov, sú navrhnuté ako nepovinné parametre (pozri dodatok 2). 
6. Vzhľadom na údaje získané v rámci procesu overovania treba zdôrazni ť, že 
táto štúdia nie je dostato čne citlivá na identifikáciu všetkých látok 
s (anti)androgénnymi alebo (anti)estrogénnymi ú činkami (9). Testovacia 
metóda sa nevykonáva v životnej fáze, v ktorej je endokrinný systém najcitlivejší na poškodenie. Pomocou testovacej metódy sa však 
v priebehu procesu overovania identifikovali látky slabo alebo silno ovplyv ­ 
ňujúce funkciu štítnej ž ľazy a látky so silným a stredne silným ú činkom na 
endokrinný systém, ktoré pôsobia na estrogénové alebo androgénové recep ­
tory. Na druhej strane vo vä čšine prípadov nebolo možné identifikova ť látky 
s účinkami na endokrinný systém, ktorých pôsobenie na estrogénové alebo 
androgénové receptory je slabé. Testovaciu metódu preto nemožno charak ­
terizovať ako skríningový test endokrinného pôsobenia. 
7. Neexistenciu ú činkov súvisiacich s týmito druhmi pôsobenia následne 
nemožno bra ť ako dôkaz neexistencie ú činkov na endokrinný systém. 
Pokiaľ ide o endokrinné ú činky, charakterizácia látok by preto nemala 
byť založená iba na výsledkoch tejto testovacej metódy, ale mala by sa 
použiť v rámci prístupu váhy dôkazov, ktorý zoh ľ
adňuje všetky existujúce 
údaje o chemikálii na ú čely charakterizácie potenciálneho endokrinného 
pôsobenia. Z tohto dôvodu by regula čné rozhodovanie o endokrinnom pôso ­
bení (charakterizácia látky) malo by ť postavené na širokom základe 
a nemalo by sa opiera ť iba o výsledky aplikácie tejto testovacej metódy. 
8. Uznáva sa, že všetky postupy využívajúce zvieratá musia by ť v súlade 
s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykoná ­
vanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú ma ť 
miestne predpisy prednos ť. Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu 
so zvieratami uvádza organizácia OECD (14). 
9. Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.
 
PRINCÍP TESTU 
10. Nieko ľkým skupinám experimentálnych zvierat sa denne orálne podáva 
testovaná chemikália v odstup ňovaných dávkach spôsobom, pri ktorom sa 
každej skupine podáva jedna dávka po čas 28-dňovej periódy. Po čas periódy 
podávania sa zvieratá pozorne pozorujú, pri čom sa denne kontroluje prítom ­
nosť znakov toxického ú činku. Zvieratá, ktoré po čas testu uhynú alebo sa 
utratia, sú následne pitvané a takisto zvieratá, ktoré prežijú, sú na záver testu  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
utratené a podrobené pitve. 28-d ňová štúdia poskytuje informácie 
o účinkoch orálnej expozície v opakovaných dávkach a môže poukáza ť 
na potrebu ďalších dlhodobejších štúdií. Takisto môže poskytnú ť informácie 
o výbere koncentrácií na ú čely dlhodobejších štúdií. Údaje získané pomocou 
tejto testovacej metódy by mali umožni ť charakterizáciu toxicity testovanej 
chemikálie na zistenie závislosti medzi dávkou a reakciou a na stanovenie 
hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL).  
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
11. Uprednost ňovanými hlodavcami sú potkany, aj ke ď sa môžu použi ť aj iné 
hlodavce. Ak sa parametre uvedené v rámci tejto testovacej metódy B.7 skúmajú pri inom druhu hlodavcov, je potrebné uvies ť podrobné odôvod ­
nenie. Hoci z biologického h ľadiska je hodnoverné, že iné druhy by reago ­
vali na toxikanty podobným spôsobom ako potkany, použitie menších druhov môže ma ť za následok vä čšiu variabilitu z dôvodu technických 
problémov pri pitve menších orgánov. V rámci medzinárodného programu 
overovania na zistenie endokrinných disruptorov sa použili iba potkany. 
Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kme ňov. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá 
a sú negravidné. Dávkovanie sa musí za čať čo najskôr po odstavení mlá ďat 
a skôr než zvieratá dov ŕšia deväť týždňov. Na za čiatku štúdie sú váhové 
odchýlky pri zvieratách minimálne a neprevyšujú ± 20 % priemernej váhy oboch pohlaví. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, uprednost ňuje sa používanie zvierat toho istého kme ňa a z 
toho istého zdroja v oboch štúdiách.
 
Umiestnenie a k ŕmenie  
12. Všetky postupy musia by ť v súlade s miestnymi normami starostlivosti 
o laboratórne zvieratá. Teplota pokusnej miestnosti, kde sú zvieratá umiest ­
nené, by mala by ť 22 °C (± 3 °C). Aj ke ď by relatívna vlhkos ť mala by ť 
aspoň 30 %, a pokia ľ možno by nemala prevyšova ť 70 % okrem obdobia 
počas čistenia miestnosti, cie ľom je, aby relatívna vlhkos ť dosahovala 50 – 
60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 hodín svetla 
a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo 
s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže by ť ovplyv­
nený potrebou zabezpe čiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, ke ď sa 
podáva týmto spôsobom. Zvieratá by mali by ť umiestnené spolu 
v malých skupinách rovnakého pohlavia. Zvieratá možno umiestni ť samo­
statne, ak je to vedecky opodstatnené. Pokia ľ ide o umiestnenie skupín do 
klietok, v jednej klietke by nemalo by ť viac ako pä ť zvierat. 
13. Krmivo treba pravidelne analyzova ť, aby sa zistilo, či neobsahuje kontami ­
nanty. Vzorka krmiva by sa mala zachova ť až do dokon čenia správy.  
Príprava zvierat  
14. Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a pokusných skupín. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzh ľadom na ich umiestnenie. Zvieratá sa jednotlivo ozna ­ 
čia. Zvieratá sa v klietkach aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej 
päť dní pred za čatím testovacej štúdie.
 
Príprava dávok  
15. Testovaná chemikália sa podáva cez sondu priamo do žalúdka alebo 
v potrave alebo v pitnej vode. Metóda orálneho podávania závisí od ú čelu 
štúdie a fyzikálnych, chemických a toxikokinetických vlastností testovanej 
chemikálie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo 
vhodnom nosi či. Odporú ča sa, aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr 
zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuri čnom oleji) a nakoniec prípadného roztoku v iných 
nosičoch. Charakteristiky toxicity nosi čov iných ako voda musia by ť známe. 
Určí sa stabilita testovanej chemikálie v nosi či.
 
POSTUP  
Počet zvierat a ich pohlavie  
17. Na každej hladine dávkovania sa použije prinajmenšom desa ť zvierat (pä ť 
samíc a pä ť samcov). Ak je v pláne utrati ť nejaké zvieratá aj po čas testu, 
počet by mal by ť zvýšený o plánovaný po čet zvierat, ktoré majú by ť utra­
tené pred ukon čením štúdie. Treba zváži ť použitie ďalšej satelitnej skupiny 
desiatich zvierat (pä ť z každého pohlavia) ku kontrolnej skupine a ku 
skupine vystavenej najvyššej dávke na ú čely pozorovaní reverzibility, 
perzistencie alebo oneskorenia toxických ú činkov, a to najmenej po čas 14 
dní po testovaní.  
Dávkovanie  
18. Zvyčajne sa používajú najmenej tri testovacie skupiny a jedna kontrolná 
skupina, ale v prípade, že sa na základe hodnotenia ostatných údajov 
nepredpokladajú ú činky pri dávke 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň, 
môže sa vykona ť limitný test. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, môže 
sa vykona ť štúdia na zistenie rozsahu (zvieratá toho istého kme ňa a z toho 
istého zdroja), aby sa ľahšie stanovili dávky, ktoré sa použijú. So zvieratami 
v kontrolnej skupine sa musí zaobchádza ť takisto ako so zvieratami 
v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosi č, kontrolná skupina 
dostane nosi č v najvyššom používanom objeme. 
19. Pri výbere hladín dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite 
a (toxiko-)kinetike testovanej chemikálie a príbuzných chemikálií. Najvyššia 
dávka sa vyberá tak, aby indukovala toxické ú činky, ale nespôsobovala 
uhynutie zvierat alebo vážne utrpenie. Pod ľa toho sa vyberá aj znižujúca 
sa postupnos ť hladín dávok s cie ľom určiť závislos ť reakcie od dávky 
a stanovi ť hodnotu NOAEL pri najnižšej hladine dávky. Intervaly dávko ­
vania s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho 
dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako 
používanie ve ľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi 
dávkami. 
20. Ak sa pozoruje všeobecná toxicita (napr. zníženie telesnej hmotnosti, ú činky 
na pečeň, srdce, p ľúca alebo obli čky atď.) alebo iné zmeny, ktoré nemusia 
byť toxickou reakciou (napr. nižší príjem potravy, zvä čšenie pečene), pozo ­
rované účinky na imunitné, neurologické alebo endokrinné citlivé parametre 
by sa mali interpretova ť opatrne.
 
Limitný test  
21. Ak sa zistí, že test pri jednej hladine najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmot ­
nosti za de ň, alebo rovnocenné množstvo v percentách v strave alebo 
v pitnej vode (založené na ur čení telesnej hmotnosti) nespôsobil pri testo ­
vaných zvieratách žiadne toxické príznaky, a ak sa toxické ú činky neoča­
kávajú ani na základe údajov štruktúrne príbuzných chemikálií, potom sa nepovažuje za nevyhnutné uskuto čniť celú štúdiu s použitím troch hladín. 
Výnimkou je prípad, ke ď expozícia človeka indikuje potrebu skúmania na 
vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Podávanie dávok  
22. Zvieratám sa podá dávka testovanej chemikálie každý de ň sedem dní 
v týždni po čas 28 dní. Ak je testovaná chemikália podávaná cez sondu, 
musí sa to realizova ť v jednej dávke pre zviera za použitia žalúdo čnej 
trubice alebo vhodnej intuba čnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, 
ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. 
Objem nemá by ť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných 
roztokov, ke ď sa môže použi ť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou 
dráždivých alebo žieravých chemikálií, ktoré zvy čajne pri vyšších koncen ­
tráciách spôsobia zhoršenie ú činkov, variabilita v aplikovanom objeme sa 
minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpe čil stály 
objem vo všetkých dávkach. 
23. V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité 
zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použi ť buď konštantná stravná koncentrácia 
(ppm) alebo konštantná úrove ň dávkovania s oh ľadom na telesnú hmotnos ť 
zvierat; alternatívne používanie je potrebné špecifikova ť. V prípade, ke ď sa 
chemikália podáva sondou, dávka sa podáva približne v rovnaký čas každý 
deň a prispôsobí sa pod ľa potreby, aby sa zachovala stála hladina dávky 
vzhľadom na telesnú hmotnos ť. Ak sa uskuto ční predbežná štúdia pri 
opakovaných dávkach pred uskuto čnením dlhodobej štúdie, je potrebné 
v oboch štúdiách použi ť podobnú potravu.
 
Pozorovania  
24. Pozorovanie trvá 28 dní. Zvieratá v satelitnej skupine, ktoré sa plánujú 
použiť pri ďalšom sledovaní, sa držia najmenej 14 dní bez akéhoko ľvek 
podávania, aby bolo možné zisti ť oneskorené toxické ú činky alebo ich 
perzistenciu, alebo zotavenie sa po nich. 
25. Najmenej raz denne je nutné uskuto čniť všeobecné klinické pozorovania, 
najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol o čakávaných 
účinkov po podaní. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Najmenej 
dvakrát denne si treba všíma ť chorobnos ť a úmrtnos ť zvierat. 
26. Raz pred prvou expozíciou (je dovolené porovnanie jednotlivých zvierat 
medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskuto čňujú pri všetkých 
zvieratách podrobné klinické pozorovania. Uskuto čňujú sa mimo domov ­
ských klietok v štandardnom priestore, pokia ľ možno, vždy v tom istom 
dennom čase. Musia by ť pozorne zaznamenané, s použitím hodnotiaceho 
systému explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné 
zaistiť čo najmenšie zmeny testovacích podmienok a výhodné je, ak pozo ­
rovania vedie pozorovate ľ, ktorý nepozná postup testovania. Medzi 
príznaky, ktoré je potrebné si všíma ť, patria zmeny na koži, srsti, o čiach, 
sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerek ­
cia, veľkosť zreničiek, nezvy čajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú 
vyčerpávajúce. Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako 
aj prítomnos ť klonických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. 
opakované to čenie sa), prílišné ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie 
(napr. chôdza dozadu, sebaznetvorenie), sa takisto musia zaznamena ť (2). 
27. Vo štvrtom týždni expozície sa uskuto čňuje určenie zmyslovej reaktivity 
podnecovanej odlišnými spôsobmi (2) (napríklad zvukovými, zrakovými 
a proprioceptívnymi podnetmi) (3) (4) (5), ur čenie sily zovretia (6) 
a určenie motorickej aktivity (7). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré 
môžu nasledova ť, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použi ť 
aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Funk čné pozorovania v štvrtom týždni expozície sa nemusia uskuto čniť, ak 
je štúdia uskuto čňovaná ako predbežná štúdia subchronickej štúdie (90 dní). 
V tomto prípade sa funk čné pozorovania uskuto čnia v nasledujúcej štúdii. 
Na druhej strane, dostupnos ť údajov o funk čných pozorovaniach zo štúdie 
opakovanej dávky zvyšujú možnos ť výberu úrovní dávkovaných 
v nasledujúcej subchronickej štúdii. 
29. Výnimo čne sa nemusia uskuto čniť funkčné pozorovania ani pri skupinách, 
v ktorých sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli 
významne interferova ť s uskuto čnením funk čných testov. 
30. Pri pitve možno stanovi ť estrálny cyklus všetkých samíc (nepovinné) 
odobratím vaginálnych sterov. Tieto pozorovania poskytnú informácie o fáze estrálneho cyklu v čase utratenia a pomôžu pri histologickom hodno ­
tení tkanív citlivých na estrogény [pozri usmernenia o histopatológii (19)].
 
Telesná hmotnos ť a spotreba potravy/vody  
31. Všetky zvieratá sa musia váži ť najmenej raz za týžde ň. Meranie spotreby 
potravy sa robí najmenej raz za týžde ň. Ak sa testovaná chemikália podáva 
vo vode na pitie, spotrebu vody je takisto potrebné mera ť aspoň raz za 
týždeň. 
Hematológia  
32. Na konci testovacieho obdobia sa uskuto čňujú tieto hematologické testy: 
hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, po čet erytrocytov, retikulocyty, 
celkový a diferenciálny po čet leukocytov, po čet trombocytov a meranie 
času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré sa usku ­
točňujú, ak testovaná chemikália alebo jej predpokladané metabolity majú 
oxidačné vlastnosti alebo ak existuje podozrenie, že majú oxida čné vlast­
nosti, patrí koncentrácia methemoglobínu a Heinzove telieska. 
33. Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred alebo po čas 
postupu utratenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok. Zvieratá 
sa noc pred utratením nek ŕmia (  1 ). 
Klinická biochémia  
34. Klinická biochémia skúma hlavné toxické ú činky v tkanivách a najmä 
účinky na obli čky a pečeň. Vyšetrenie sa uskuto čňuje zo vzoriek krvi, 
ktoré sa odoberajú všetkým zvieratám tesne pred alebo po čas postupu utra ­
tenia zvierat (okrem zvierat uhynutých a/alebo utratených pred dokon čením 
štúdie). Vyšetrenie plazmy alebo séra zah ŕňa sodík, draslík, glukózu, 
celkový cholesterol, mo čovinu, kreatinín, celkové proteíny a albumín, 
najmenej dva enzýmy indukujúce hepatocelulárne ú činky (ako alanín-amino ­
transferáza, aspartát-aminotransferáza, alkalická fosfatáza, γ-glutamyl trans ­
peptidáza a glutamát-dehydrogenáza) a žl čové kyseliny. Meranie ďalších 
enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a bilirubínu môže za ur čitých 
okolností poskytnú ť užitočné informácie. 
35. Nepovinne sa nasledujúce zistenia v analýzach mo ču môžu vykona ť počas 
posledného týžd ňa štúdie a použije sa časový zber objemu mo ču: vzhľad, 
objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, bielkoviny, glukóza a krv/krvné bunky.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Pri mnohých meraniach v sére a plazme, najmä glukózy, sa uprednost ňuje nepodávanie 
potravy cez noc pred odberom. Hlavným dôvodom je zvýšenie pravdepodobnosti kolí ­
sania hodnôt ako nevyhnutný dôsledok prijímania potravy. Môže to vies ť k zakrytiu 
jemnejších ú činkov a s ťaží to interpretáciu. Na druhej strane no čné postenie môže rušivo 
vplývať na celkový metabolizmus zvierat a čiastočne aj na štúdie výživy, a môže to ruši ť 
aj dennú expozíciu testovanou chemikáliou. Ak sa použije no čné postenie, 
klinicko-biochemické vyšetrenie sa uskuto čňuje po funk čných pozorovaniach v štvrtom 
týždni štúdie.
 36. Okrem toho by sa mali bra ť do úvahy aj štúdie na vyšetrovanie plazmových 
alebo sérových markerov v základných poškodených tkanivách. Ostatné 
zisťovanie je možné uskuto čniť, ak poznáme vlastnosti testovanej chemiká ­
lie, ktoré môžu vplýva ť, alebo sa o nich predpokladá, že vplývajú na 
príbuzné metabolické profily zahr ňujúce vápnik, fosfáty, triglyceridy, špeci ­
fické hormóny a cholínesterázu. Je ich potrebné identifikova ť pre chemické 
látky v ur čitých skupinách alebo posúdi ť prípad po prípade. 
37. Hoci v medzinárodnom hodnotení sledovaných parametrov súvisiacich 
s endokrinným systémom nebolo možné jednozna čne preukáza ť jednoz­
načnú výhodu ur čenia hormónov štítnej ž ľazy (T3, T4) a TSH, je vhodné 
zachovať vzorky plazmy alebo séra na meranie T3, T4 a TSH (nepovinné), 
ak je indikovaný ú činok na os hypofýza – štítna ž ľaza. Tieto vzorky možno 
na účely skladovania zmrazi ť na teplotu – 20 °C. Variabilitu a absolútne 
koncentrácie hormonálnych ukazovate ľov môžu ovplyvni ť tieto faktory: 
— čas utratenia z dôvodu každodennej zmeny koncentrácií hormónov, 
— metóda utratenia s cie ľom zabráni ť neprimeranému stresu pre zvieratá, 
ktorý môže ovplyvni ť koncentrácie hormónov, 
— súpravy na testovanie hormonálnych ukazovate ľov, ktoré sa môžu líši ť 
štandardnými krivkami. 
Definitívna identifikácia chemikálií s tyreoidnými ú činkami je spo ľahlivejšia 
na základe histopatologickej analýzy ako na základe hladín hormónov. 
38. Vzorky plazmy špecificky ur čené na stanovenie hladiny hormónov sa 
odoberú po čas porovnate ľných denných časov. Odporú ča sa, aby sa zoh ľad­
nilo stanovenie hladín T3, T4 a TSH ovplyvnených na základe zmien tyreo ­
idnej histopatológie. Číselné hodnoty získané analýzou koncentrácií 
hormónov sa v prípade použitia rozli čných komer čných testovacích súprav 
líšia. Následne nemusí by ť možné zabezpe čiť výkonnostné kritériá založené 
na jednotných historických údajoch. Laboratóriá by sa namiesto toho mali 
usilovať, aby boli kontrolné varia čné koeficienty nižšie ako 25 v prípade T3 
a T4 a nižšie ako 35 v prípade TSH. Všetky koncentrácie sa zaznamenajú v ng/ml. 
39. Ak sú historické bazálne hodnoty nevhodné, zváži sa stanovenie premen ­
ných v oblasti hematológie a klinickej biochémie pred za čatím dávkovania 
alebo pod ľa možnosti na skupine zvierat, ktoré neboli zaradené do pokus ­
ných skupín.
 
PATOLÓGIA  
Makroskopická pitva  
40. Všetky zvieratá v štúdii budú predmetom úplnej detailnej všeobecnej pitvy, 
ktorá zah ŕňa pozorné vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, všetkých teles ­
ných otvorov a lebe čnej, hrudnej, brušnej dutiny a ich obsahu.  Pečeň, 
obličky, nadobli čky, semenníky, nadsemenníky, prostata + semenné mechú ­ 
riky s koagula čnými žľazami ako celok, týmus, slezina, mozog a srdce zo 
všetkých zvierat (okrem tých, ktoré chradnú, a/alebo zvierat, ktoré boli 
utratené pred ukon čením štúdie) by sa mali pitva ť na priľnavej tkanine 
a je potrebné čo najrýchlejšie zisti ť ich mokrú hmotnos ť skôr, ako pri 
pitve vyschnú. Orgány prostaty je nutné pitva ť veľmi opatrne, aby sa zabrá ­
nilo prepichnutiu semenných mechúrikov naplnených tekutinou. Semenné 
mechúriky a prostata sa prípadne môžu pitva ť a vážiť aj po fixácii.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Okrem toho sa nepovinne môžu čo najskôr, aby sa zabránilo vyschnutiu, 
odvážiť ďalšie dve tkanivá: párové vaje čníky (mokrá váha) a maternica 
vrátane kr čka maternice [usmernenie o odstránení a príprave maternicových 
tkanív na meranie hmotnosti sa uvádza v dokumente OECD TG 440 (18)]. 
42. Hmotnos ť štítnej ž ľazy (nepovinné) sa môže ur čiť po fixácii. Úpravu je 
potrebné vykona ť veľmi opatrne a až po fixácii, aby sa predišlo poškodeniu 
tkaniva. Poškodenie tkaniva by mohlo ohrozi ť histopatologickú analýzu. 
43. Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom médiu na 
obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (pozri odsek 47): všetky
 makroskopické poškodenia, mozog (reprezentatívne oblasti 
vrátane ve ľkého mozgu, mozo čka a mosta),  miecha, oko, žalúdok, tenké  
a hrubé črevo (vrátane Peyerových plakov),  pečeň, obličky, nadobli čky, 
slezina, srdce, týmus, štítna ž ľaza, priedušnica a p ľúca (uskladnené nafúk ­
nutím s fixa čným prostriedkom a potom ponorením),  gonády (semenníky  
a vaječníky), ved ľajšie pohlavné orgány (maternica a kr čok maternice, 
nadsemenníky, prostata + semenné mechúriky s koagula čnými žľazami),  
vagína, mo čový mechúr, lymfatické uzliny [okrem najbližšej odvod ňovacej 
uzliny by sa mala odobra ť ešte jedna lymfatická uzlina pod ľa praxe labo ­
ratória (15)],  periférny nerv (sedací alebo tibiálny) pod ľa možnosti čo 
najbližšie k svalu,  kostrový sval a  kosť, s kostnou dre ňou (prierez alebo 
čerstvo odobratá vzorka kostnej drene). Odporú ča sa fixova ť semenníky 
ponorením do Bouinovho alebo modifikovaného Davidsonovho fixa čného 
prostriedku (16) (17). Obal tunica albuginea je potrebné opatrne a plytko 
prepichnú ť ihlou na oboch stranách orgánu, aby sa umožnilo rýchle napus ­
tenie fixa čným prostriedkom. Z klinických a iných nálezov môže vyplynú ť 
potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by sa mali zachova ť 
všetky orgány, ktoré vzh ľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie 
možno považova ť za cieľové orgány. 
44. Tieto tkanivá môžu poskytnú ť cenné údaje o ú činkoch na endokrinný 
systém: gonády (vaje čníky a semenníky), ved ľajšie pohlavné orgány (mater ­
nica vrátane kr čka maternice, nadsemenníky, semenné mechúriky 
s koagula čnými žľazami, dorzolaterálna a ventrálna prostata), vagína, hypo ­
fýza, sam čia prsná ž ľaza, štítna ž ľaza a nadobli čka. Zmeny na sam čích 
prsných ž ľazách nie sú dostato čne zdokumentované, ale tento parameter 
môže byť veľmi citlivý na látky s estrogénovým pôsobením. Pozorovanie 
orgánov/tkanív, ktoré nie sú vymenované v odseku 43, je nepovinné (pozri dodatok 2). 
45. V Usmernení o histopatológii (19) sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o pitvaní, 
fixácii, vykonávaní rezov a histopatológii endokrinných tkanív. 
46. V rámci medzinárodného testovacieho programu boli získané dôkazy o tom, 
že nepatrné endokrinné ú činky chemikálií s nízkou potenciou ú činku na 
homeostázu pohlavných hormónov je možné ur čiť skôr na základe narušenia 
synchronizácie estrálneho cyklu v rôznych tkanivách a menej na základe 
zrejmých histopatologických zmien na sami čích pohlavných orgánoch. Aj 
keď sa nezískal žiadny kone čný dôkaz o takýchto ú
činkoch, pri interpretácii 
histopatológie vaje čníkov (folikulárnych, tekálnych a granulóznych buniek), 
maternice, kr čka maternice a vagíny sa odporú ča brať do úvahy znaky 
možnej asynchrónnosti estrálneho cyklu. Ak sa hodnotí štádium cyklu 
podľa vaginálnych sterov, takisto ho možno zahrnú ť do tohto porovnania.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatológia  
47. Úplná histopatológia sa uskuto ční na uskladnených orgánoch a tkanivách 
všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupinách s vysokými dávkami. Tieto skúšky sa rozšíria o zvieratá zo všetkých skupín s odlišným dávko ­
vaním, ak boli zistené zmeny v skupine s vysokými dávkami. 
48. Preskúmajú sa všetky závažné poškodenia. 
49. Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkanivách 
a orgánoch, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené ú činky.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
50. Je potrebné uvies ť jednotlivé údaje. Navyše všetky údaje sa musia zhrnú ť 
v tabuľkovej forme, pri čom ukazujú pre každú testovanú skupinu po čet 
zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat uhynutých po čas testu alebo utrate ­
ných z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo utratenia jednotlivých zvie ­
rat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili príznaky toxicity, opis pozorova ­
ných príznakov toxicity vrátane nástupu, trvania a závažnosti toxických účinkov, po čet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení, ich závaž ­
nosť a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ 
poškodenia. 
51. Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne 
akceptovate ľnou štatistickou metódou. Porovnávanie ú činkov pod ľa rozsahu 
dávkovania má zamedzi ť používaniu opakovaných t-testov. Štatistické 
metódy by sa mali vybra ť počas prípravnej fázy štúdie. 
52. Na ú čely kontroly kvality sa navrhuje, aby sa zozbierali historické kontrolné 
údaje a aby sa vypo čítali varia čné koeficienty pre číselné údaje, najmä pre 
parametre spojené s detekciou endokrinného disruptora. Tieto údaje sa môžu použiť pre porovnanie, ke ď sa vyhodnocujú jednotlivé štúdie.
 
Správa o teste  
53. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje.  
Nosič (v prípade potreby):  
— odôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda.  
Testovacie zvieratá:  
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu, 
— odôvodnenie výberu druhu, ak je iný ako potkan.  
Podmienky testovania:  
— odôvodnenie vo ľby úrovne dávok, 
— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentrá ­
ciách, stabilite a homogenite prípravku,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— údaje o podávaní testovanej chemikálie, 
— prepo čet koncentrácie testovanej chemikálie v krmive/pitnej vode (ppm) 
na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), ak je to použite ľné, 
— údaje o kvalite potravy a vody.  
Nepovinné skúmané parametre  
— zoznam nepovinných skúmaných parametrov.  
Výsledky:  
— telesná hmotnos ť/zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba krmiva a spotreba vody, ak je to použite ľné, 
— údaje o toxikologickej reakcii pod ľa pohlavia a úrovne dávky vrátane 
príznakov toxicity, 
— povaha, závažnos ť a trvanie klinických pozorovaní (s údajmi 
o reverzibilite), 
— hodnotenie senzorickej aktivity, sily zovretia a motorickej aktivity, — hematologické testy s významnými základnými hodnotami, — testy klinickej biochémie s významnými základnými hodnotami, — telesná hmotnos ť pri utratení a údaje o hmotnosti orgánov, 
— pitevné nálezy, — podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, — absorp čné údaje, ak sú dostupné, 
— štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby.  
Rozbor výsledkov Závery
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV 
Androgenicita  je schopnos ť chemikálie pôsobi ť v organizme cicavcov ako priro ­
dzený androgénny hormón (napr. testosterón).  
Antiandrogenicita  je schopnos ť chemikálie potla čiť v organizme cicavcov pôso ­
benie prirodzeného androgénneho hormónu (napr. testosterónu).  
Antiestrogenicita  je schopnos ť chemikálie potla čiť v organizme cicavcov pôso ­
benie prirodzeného estrogénového hormónu (napr. estradiol 17ß).  
Antityreoidné pôsobenie  je schopnos ť látky potla čiť v organizme cicavcov 
pôsobenie prirodzeného hormónu štítnej ž ľazy (napr. T  3 ). 
Dávkovanie  je všeobecný pojem zah ŕňajúci dávku látky, jej frekvenciu a trvanie 
podávania dávok.  
Dávka  je množstvo podanej testovanej chemikálie. Dávka je vyjadrená ako 
hmotnosť testovanej chemikálie na jednotku telesnej hmotnosti testovaného zvie ­
raťa za deň (napr. mg/kg telesnej hmotnosti/de ň) alebo ako konštantná koncen ­
trácia v potrave.  
Zjavná toxicita  je všeobecný termín opisujúci jasné príznaky toxicity po podaní 
testovanej chemikálie. Tieto príznaky by mali posta čovať na posúdenie nebez ­
pečnosti a pri zvýšení podanej dávky by pod ľa nich malo by ť možné pred ­
pokladať výskyt závažných príznakov toxicity a pravdepodobnej mortality.  
NOAEL  je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého ú činku. Je to 
najvyššia úrove ň dávky, pri ktorej po podaní testovanej chemikálie nie sú pozo ­
rované žiadne nepriaznivé nálezy.  
Estrogenicita  je schopnos ť látky pôsobi ť v organizme cicavcov ako prirodzený 
estrogénový hormón (napr. estradiol 17ß).  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  
Tyreoidné pôsobenie  je schopnos ť látky pôsobi ť v organizme cicavcov ako 
prirodzený hormón štítnej ž ľazy (napr. T  3 ). 
Validácia (overenie)  je vedecký postup navrhnutý s cie ľom opísa ť prevádzkové 
požiadavky a obmedzenia testovacej metódy a dokáza ť jej spo ľahlivosť 
a významnos ť pre konkrétny ú čel. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Dodatok 2  
Parametre odporú čané pre detekciu endokrinných disruptorov (ED) v rámci 
tejto testovacej metódy B.7  
Povinné parametre Nepovinné parametre 
Hmotnosť 
— semenníky 
— nadsemenníky 
— nadobli čky 
— prostata + semenné mechúriky 
s koagula čnými žľazami — vaječníky 
— maternica vrátane kr čka maternice 
— štítna ž ľaza 
Histopatológia  
— gonády: 
— semenníky a — vaječníky 
— vedľajšie pohlavné orgány: 
— nadsemenníky — prostata + semenné mechúriky 
s koagula čnými žľazami 
— maternica vrátane kr čka mater ­
nice 
— nadobli čka 
— štítna ž ľaza 
— vagína — vaginálne stery 
— samčie prsné ž ľazy 
— hypofýza
 
Meranie hormónov  
— cirkula čné hladiny T3, T4 
— cirkula čné hladiny TSH  
LITERATÚRA  
1. OECD (Paríž, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuroto ­
xicity. 
2. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 
3. Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: s. 999 – 1003. 
4. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol Environ. Health 9: s. 691 – 704. 
5. Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: s. 267 – 283. 
6. Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: s. 233 – 236.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
7. Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: s. 599 – 609. 
8. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. – 11. marca 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
9. OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No. 59, ENV/JM/MONO(2006)26. 
10. OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. 
11. OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endo ­
crine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.ht ml. 
12. OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. 
13. OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. 
14. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7. 
15. Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., 
Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position 
Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the 
Immune System. Toxicol Pathol 33: s. 404 – 407. 
16. Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of 
the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52 – 85. 
17. Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). 
Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, s. 524 – 533. 
18. OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N
 o 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties. 
19. OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. SUBAKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA: 28-D ŇOVÁ ŠTÚDIA  
ZHRNUTIE 
Táto revidovaná testovacia metóda B.8 bola vypracovaná s cie ľom dôkladne 
opísať inhalačnú toxicitu testovanej chemikálie po opakovanej expozícii 
v obmedzenom časovom období (28 dní) a poskytnú ť údaje pre kvantitatívne 
hodnotenie inhala čného rizika. Skupiny minimálne pä ť samcov a pä ť samíc 
hlodavcov sú na šes ť hodín denne po čas 28 dní exponované a) testovanej chemi ­
kálii pri troch alebo viacerých úrovniach koncentrácie; b) filtrovanému vzduchu 
(negatívna kontrola) a/alebo c) nosi ču (kontrola pomocou nosi ča). Zvieratá sú 
zvyčajne exponované pä ť dní v týždni, ale je povolená aj expozícia na sedem dní 
v týždni. Testujú sa vždy samce aj samice, môžu však by ť vystavované rôznym 
úrovniam koncentrácie, ak je známe, že jedno z pohlaví je vo či danej testovanej 
chemikálii vnímavejšie. Táto metóda poskytuje vedúcemu štúdie flexibilitu, aby 
mohol zahrnú ť satelitné skupiny (reverzibilita), bronchoalveolárnu laváž (BAL), 
neurologické testy a doplnkové hodnotenia klinickej patológie a histopatologické hodnotenia s cie ľom dôkladnejšie charakterizova ť toxicitu testovanej chemikálie.
 
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov TG 412 (2009). Pôvodné usmernenia na vykonávanie testov subakútnej inhala čnej toxicity 412 (TG 412) boli prijaté v roku 1981 (1). 
Táto testovacia metóda B.8 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení 
TG 412) bola aktualizovaná, aby odrážala stav vedy a sp ĺňala súčasné 
a budúce regula čné potreby. 
2. Táto metóda umož ňuje opísa ť nepriaznivé ú činky po opakovanej dennej 
inhalačnej expozícii testovanej chemikálii po čas 28 dní. Údaje odvodené 
z 28-dňových štúdií subakútnej inhala čnej toxicity sa môžu použi ť pri kvan­
titatívnom hodnotení rizík [ak nenasleduje 90-d ňová štúdia subchronickej 
inhalačnej toxicity (kapitola B.29 tejto prílohy)]. Údaje môžu takisto 
poskytnúť informácie o výbere koncentrácií pre dlhodobejšie štúdie, ako 
je napríklad 90-d ňová štúdia subchronickej inhala čnej toxicity. Táto testo ­
vacia metóda nie je špecificky ur čená na testovanie nanomateriálov. Vyme ­
dzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmer ňovacom dokumente 39 (2).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
3. Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky 
dostupné informácie o testovanej chemikálii s cie ľom zlepši ť kvalitu štúdie 
a minimalizova ť využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôc ť pri 
výbere vhodných testovacích koncentrácií, zah ŕňajú identitu, chemickú 
štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie; výsledky 
všetkých testov toxicity  in vitro  alebo  in vivo ; predpokladané použitie 
(použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí; dostupné údaje (Q)SAR, toxiko ­
logické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a údaje odvodené z testov 
akútnej inhala čnej toxicity. Ak sa o čakávajú alebo ak sa v priebehu štúdie 
objavia príznaky neurotoxicity, vedúci štúdie môže rozhodnú ť o zahrnutí 
vhodných hodnotení, ako je napríklad funk čná pozorovacia batéria (FOB) 
a meranie motorickej aktivity. Aj ke ď je pri ur čitých testoch rozhodujúce 
načasovanie expozícií, tieto dodato čné činnosti nesmú naruši ť základný plán 
štúdie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Riedenie žieravých alebo dráždivých testovaných chemikálií sa môže 
testovať pri koncentráciách, ktoré budú vykazova ť želanú mieru toxicity 
[pozri dokument GD 39 (2)]. Pri vystavovaní zvierat pôsobeniu týchto materiálov musia by ť cieľové koncentrácie dostato čne nízke, aby nespôso ­
bovali výraznú boles ť ani utrpenie, a zárove ň dostatočné na pred ĺženie 
krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úrove ň, na ktorej sa zabezpe čí 
regulačný a vedecký cie ľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vybra ť 
v závislosti od jednotlivých prípadov, pokia ľ možno pod ľa vhodne 
navrhnutej štúdie na zistenie rozsahu, ktorá poskytuje informácie 
o kritickom parametri, každom prahu dráždivosti a čase nástupu príznakov 
(pozri odseky 11 – 13). Je potrebné zdôvodni ť výber koncentrácie. 
5. Moribundné zvieratá alebo zvieratá, ktoré majú o čividne silné bolesti alebo 
vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym 
spôsobom usmrti ť. Moribundné zvieratá sa posudzujú rovnako ako zvieratá, 
ktoré uhynú po čas testovania. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť moribundné 
alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídate ľnej alebo 
nastávajúcej smrti sú predmetom usmer ňovacieho dokumentu OECD 
o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (3).
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
6. Používajú sa zdravé mladé dospelé hlodavce bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Preferovaným druhom je potkan. Použitie iných 
druhov je potrebné zdôvodni ť. 
Príprava zvierat  
7. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné. V de ň 
randomizácie majú by ť zvieratá mladé dospelé jedince vo veku sedem až 
deväť týždňov. Telesná hmotnos ť má byť v rozsahu ± 20 % priemernej 
hmotnosti každého pohlavia. Zvieratá sú náhodne vybraté, ozna čené tak, 
aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspo ň päť 
dní pred za čiatkom testu, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne 
podmienky.  
Chov zvierat  
8. Zvieratá musia by ť jednotlivo identifikované, najlepšie pomocou podkož ­
ných transpondérov, aby sa zjednodušilo pozorovanie a zamedzilo záme ­
nám. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala by ť 22 
± 3 °C. Relatívna vlhkos ť by sa v ideálnom prípade mala udržiava ť 
v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí by ť možné, ak sa ako nosi č 
používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvy čajne umiestnené 
v klietkach v skupinách pod ľa pohlavia a koncentrácie, ale po čet zvierat 
v jednej klietke by nemal prekáža ť bezproblémovému pozorovaniu každého 
zvieraťa, pričom by sa mali minimalizova ť straty súvisiace so vzájomným 
požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia 
oblasti nosa, môže by ť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na 
skúmavky obmedzujúce pohyb. Obmedzujúce skúmavky by nemali zvie ­
ratám spôsobova ť neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnos ťami, 
teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže ma ť vplyv na fyzio ­
logické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo 
respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, pod ľa 
ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo ve ľkej miere, potom obmedzu ­
júce skúmavky nie je potrebné vopred upravi ť. Zvieratá vystavené ú činkom 
aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestni ť samostatne, 
aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srs ť ostatných zvierat 
v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na k ŕmenie môže používa ť 
bežné a osved čené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej 
pitnej vody. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 hodín 
svetla a 12 hodín tmy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalačné komory  
9. Pri výbere inhala čnej komory by sa mal vzia ť do úvahy charakter testovanej 
chemikálie a predmet testu. Uprednost ňuje sa expozícia oblasti nosa (pri čom 
tento pojem zah ŕňa iba expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti 
sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu 
kondenzova ť a vytvára ť aerosóly, uprednost ňuje expozícia oblasti nosa. 
Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnu ť použitím expozície celého 
tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodni ť. Na zabezpe ­ 
čenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by 
celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnu ť 5 % objemu komory. 
Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody 
a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).  
ŠTÚDIE TOXICITY  
Limitné koncentrácie  
10. Na rozdiel od štúdií akútnej toxicity nie sú pre 28-d ňové štúdie subakútnej 
inhalačnej toxicity stanovené žiadne limitné koncentrácie. Pri maximálnej 
testovanej koncentrácii je potrebné zváži ť: 1. maximálnu dosiahnute ľnú 
koncentráciu; 2. najhorší možný prípad úrovne expozície ľudí; 3. potrebu 
zachovať primeraný prísun kyslíka a/alebo 4. otázky týkajúce sa dobrých 
životných podmienok zvierat. V prípade chýbajúcich limitov založených na údajoch sa môžu použi ť akútne limity pod ľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 
(13) (t. j. až do maximálnej koncentrácie 5 mg/l v prípade aerosólov, 
20 mg/l v prípade pár a 20 000 ppm v prípade plynov); pozri dokument 
GD 39 (2). Ak je nutné prekro čiť tieto limity pri testovaní plynov alebo 
vysokoprchavých testovaných chemikálií (napr. chladiace látky), je potrebné uviesť odôvodnenie. Z limitnej koncentrácie by sa mala vyvodi ť jednoz­
načná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres 
alebo aby bola ovplyvnená d ĺžka ich života (3).
 
Štúdia na zistenie rozsahu  
11. Pred za čiatkom základnej štúdie môže by ť potrebné vykona ť štúdiu na 
zistenie rozsahu. Štúdia na zistenie rozsahu je komplexnejšia ako predbežná 
štúdia, lebo sa neobmedzuje na výber koncentrácie. Poznatky získané zo štúdie na zistenie rozsahu môžu vies ť k úspešnej základnej štúdii. Štúdia na 
zistenie rozsahu môže napríklad poskytnú ť technické informácie 
o analytických metódach, rozdelení ve ľkosti častíc, odhalení toxických 
mechanizmov, klinickej patológii a histopatologických údajoch a odhadoch koncentrácií NOAEL a MTC v základnej štúdii. Vedúci štúdie sa môže rozhodnú ť pre štúdiu na zistenie rozsahu s cie ľom identifikova ť 
prah dráždivosti dýchacích ciest (napr. histopatológiou dýchacích ciest, 
testovaním fungovania p ľúc alebo bronchoalveolárnou lavážou), hornú 
koncentráciu tolerovanú bez toho, aby spôsobovala zvieratám neprimeraný stres, a parametre, ktoré najlepšie charakterizujú toxicitu testovanej chemi ­
kálie. 
12. Štúdia na zistenie rozsahu môže pozostáva ť z jednej alebo viacerých úrovní 
koncentrácie. Každej úrovni koncentrácie by mali by ť vystavené nie viac 
ako tri samce a tri samice. Štúdia na zistenie rozsahu by mala trva ť mini­
málne pä ť dní a zvy čajne nie viac ako 14 dní. V správe o štúdii sa uvedú 
dôvody výberu koncentrácií pre základnú štúdiu. Cie ľom základnej štúdie je 
preukázať vzťah koncentrácie a reakcie založený na parametri, ktorý je 
podľa očakávaní najcitlivejší. Nízka koncentrácia by mala ideálne predsta ­
vovať koncentráciu bez pozorovaného ú činku, zatia ľ čo z vysokej koncen ­
trácie by sa mala vyvodi ť jednozna čná toxicita bez toho, aby sa zvieratám 
spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená d ĺžka ich 
života (3).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Pri výbere úrovní koncentrácie pre štúdiu na zistenie rozsahu je potrebné 
zvážiť všetky dostupné informácie vrátane vz ťahov štruktúry a aktivity 
a údajov o podobných látkach (pozri odsek 3). Štúdia na zistenie rozsahu môže potvrdi ť/vyvrátiť parametre, ktoré sa považujú za najcitlivejšie mecha ­
nisticky založené parametre, napr. cholínesterázna inhibícia prostredníctvom 
organofosfátov, tvorba methemoglobínu prostredníctvom erytrocytotoxic ­
kých činiteľov, hormóny štítnej ž ľazy (T
 3 , T 4 ) v prípade látok toxických 
pre štítnu ž ľazu, proteín, LDH alebo neutrofily pri bronchoalveolárnej laváži 
v prípade neškodných slabo rozpustných častíc alebo aerosólov dráždivých 
pre pľúca. 
Základná štúdia  
14. Základná štúdia subakútnej toxicity vo všeobecnosti pozostáva z troch 
úrovní koncentrácie a pod ľa potreby aj zo súbežných negatívnych (vzdu ­
chových) kontrol a/alebo kontrol nosi ča (pozri odsek 17). Pri výbere vhod ­
ných úrovní expozície je potrebné použi ť všetky dostupné údaje vrátane 
výsledkov štúdií systémovej toxicity, metabolizmu a kinetiky (osobitne 
treba dba ť na to, aby sa nepoužívali vysoké úrovne koncentrácie, ktoré 
nasycujú kinetické procesy). Každá testovacia skupina je zložená aspo ň 
z desiatich hlodavcov (piatich samcov a piatich samíc), ktoré sú exponované 
testovanej chemikálii šes ť hodín denne pä ť dní v týždni po čas štyroch 
týždňov (celkové trvanie štúdie 28 dní). Zvieratá môžu by ť pôsobeniu 
chemikálie vystavené aj sedem dní v týždni (napr. pri testovaní inhalova ­
ných liekov). Ak je o jednom z pohlaví známe, že je vo či danej testovanej 
chemikálii vnímavejšie, môžu by ť pohlavia vystavené rôznym úrovniam 
koncentrácie, aby sa optimalizovala reakcia na koncentráciu pod ľa opisu 
v odseku 15. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expo ­
zícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť 
s cieľom minimalizova ť druhovo špecifické utrpenie. Pri použití intervalu 
expozície v trvaní menej ako šes ť hodín denne, alebo ak je potrebné 
vykonať štúdiu expozície celého tela s dlhým intervalom (napr. 22 hodín 
denne), treba uvies ť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (2)]. Po čas 
trvania expozície by sa zviera nemalo k ŕmiť, ak expozícia nepresiahne 
šesť hodín. V priebehu celej expozície celého tela sa zviera ťu môže 
podať voda. 
15. Pomocou vybratých cie ľových koncentrácií by sa mal identifikova ť cieľový 
orgán (orgány) a preukáza ť zrejmá reakcia na koncentráciu: 
— vysoká úrove ň koncentrácie by mala ma ť za následok toxické ú činky, 
ale nemala by spôsobi ť pretrvávajúce príznaky ani letalitu, ktoré by 
znemožnili zmysluplné hodnotenie, 
— stredná úrove ň (úrovne) koncentrácie by sa mala podáva ť v takých 
odstupoch, aby viedla k stup ňovaniu toxických ú činkov medzi dávkami 
nízkej a vysokej koncentrácie, 
— nízka úrove ň koncentrácie by mala vyvola ť malé alebo žiadne príznaky 
toxicity.  
Satelitná štúdia (štúdia reverzibility)  
16. Satelitná štúdia (štúdia reverzibility) sa môže použi ť na pozorovanie rever ­
zibility, pretrvávania alebo oneskoreného výskytu toxicity po čas primerane 
dlhého obdobia po skon čení testovania, najmenej však po čas 14 dní. Sate ­
litné skupiny (reverzibility) pozostávajú z piatich samcov a piatich samíc, ktoré sú exponované súbežne s pokusnými zvieratami v základnej štúdii. Skupiny satelitnej štúdie (reverzibility) sú vystavené pôsobeniu testovanej 
chemikálie pri najvyššej úrovni koncentrácie a súbežne sa pod ľa potreby 
vykonávajú vzduchové kontroly a/alebo kontroly nosi ča (pozri odsek 17).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontrolné zvieratá  
17. S kontrolnými zvieratami súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol sa 
zaobchádza rovnako ako so zvieratami testovacej skupiny s tou výnimkou, že sú vystavené filtrovanému vzduchu a nie testovanej chemikálii. Ak sa pri 
vytváraní testovacieho ovzdušia používa voda alebo iná látka, do štúdie je 
potrebné namiesto negatívnej (vzduchovej) kontrolnej skupiny zahrnú ť 
kontrolnú skupinu nosi ča. Vždy, ke ď je to možné, sa ako nosi č použije 
voda. Ak sa ako nosi č použije voda, kontrolné zvieratá by mali by ť expo­
nované vzduchu s rovnakou relatívnou vlhkos ťou ako exponované skupiny 
exponované testovanej chemikálii. Výber vhodného nosi ča by mal by ť zalo­ 
žený na primerane vykonanej predbežnej štúdii alebo na historických 
údajoch. Ak nie je toxicita nosi ča dostato čne známa, vedúci štúdie sa 
môže rozhodnú ť použiť negatívnu (vzduchovú) kontrolu aj kontrolu nosi ča, 
ale tento postup sa vyslovene neodporú ča. Ak z historických údajov 
vyplýva, že nosi č nie je toxický, negatívna (vzduchová) kontrolná skupina 
nie je potrebná a mala by sa použi ť iba kontrola nosi ča. Ak sa pri pred ­
bežnej štúdii testovanej chemikálie pripravenej v nosi či nezistí žiadna toxi ­
cita, znamená to, že nosi č pri testovanej koncentrácii nie je toxický a táto 
kontrola nosi ča by sa mala použi ť.
 
PODMIENKY EXPOZÍCIE  
Podávanie koncentrácií  
18. Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, 
pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, 
závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne 
testované chemikálie by sa mali testova ť v podmienkach suchého vzduchu. 
Treba dba ť na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie. Tuhé materiály 
môžu byť podrobené mechanickým procesom na zmenšenie ve ľkosti častíc. 
Ďalšie usmernenia sa nachádzajú v dokumente GD 39 (2).
 
Rozdelenie ve ľkosti častíc  
19. Častice my sa mali rozdeli ť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov 
a pár, ktoré môžu kondenzova ť a vytvára ť aerosóly. Na umožnenie expo ­
zície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporú čajú aerosóly 
so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu 
od 1 do 3 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru ( σ g ) 
v rozsahu od 1,5 do 3,0 (4). Hoci by sa malo vynaloži ť primerané úsilie 
na dodržanie tejto normy, pokia ľ túto podmienku nie je možné splni ť, treba 
predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu 
byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a nabité častice a vlákna 
môžu túto normu prekra čovať. 
Príprava testovanej chemikálie v nosi či 
20. V ideálnom prípade sa testovaná chemikália testuje bez nosi ča. Ak je nevyh ­
nutné použi ť nosič, aby sa dosiahla vhodná koncentrácia a ve ľkosť častíc 
testovanej chemikálie, uprednost ňuje sa voda. Vždy, ke ď je testovaná 
chemikália rozpustená v nosi či, je potrebné preukáza ť jej stabilitu.  
MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE  
Prúdenie vzduchu v komore  
21. Prúdenie vzduchu cez expozi čnú komoru by sa po čas každej expozície malo 
dôkladne kontrolova ť, nepretržite monitorova ť a zaznamenáva ť aspoň raz za 
hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia v reálnom čase 
(alebo do časnej stability) je integrálne meranie všetkých dynamických para ­
metrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných 
dynamických inhala čných parametrov. Ak sa koncentrácia monitoruje 
v reálnom čase, frekvencia meraní prúdenia vzduchu sa môže obmedzi ť ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
na jedno meranie na expozíciu za de ň. Je potrebné venova ť osobitnú pozor ­
nosť tomu, aby v komorách na expozíciu oblasti nosa nedochádzalo 
k opätovnému vdychovaniu. Koncentrácia kyslíka by mala by ť minimálne 
19 % a koncentrácia oxidu uhli čitého by nemala presiahnu ť 1 %. Ak 
existuje dôvod domnieva ť sa, že túto normu nie je možné splni ť, koncen­
trácie kyslíka a oxidu uhli čitého by sa mali zmera ť. Ak merania v prvý de ň 
expozície preukážu, že úrovne týchto plynov sú správne, ďalšie merania nie 
sú nutné.  
Teplota komory a relatívna vlhkos ť 
22. Teplotu v komore je potrebné udržiava ť na úrovni 22 ± 3 °C. Relatívnu 
vlhkosť v dýchacej zóne zvierat pri expozícii oblasti nosa aj pri expozícii 
celého tela je potrebné po čas každej expozície nepretržite monitorova ť 
a podľa možnosti raz za hodinu zaznamenáva ť. Relatívna vlhkos ť by sa 
podľa možnosti mala udržiava ť v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa 
stať, že táto hodnota bude nedosiahnute ľná (napr. v prípade testovania 
zmesí na báze vody) alebo nemerate ľná z dôvodu interferencie testovanej 
chemikálie a testovacej metódy.  
Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia  
23. Vždy, ke ď je to možné, by sa mala vypo čítať a zaznamena ť nominálna 
koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnos ť 
vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, 
ktorý prešiel systémom inhala čnej komory. Nominálna koncentrácia sa 
nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o ú činnosti vytvárania testovacieho 
systému, a teda sa môže použi ť na zistenie problémov s tvorbou.
 
Testovaná chemikália: skuto čná koncentrácia  
24. Skuto čná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie odobratej 
z dýchacej zóny zvierat v inhala čnej komore. Skuto čné koncentrácie 
možno získa ť špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, 
adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analy ­
tickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravime ­
trická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba 
v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín 
s nízkou prchavos ťou, pričom je potrebné túto analýzu podloži ť primera­
nými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov 
takisto možno stanovi ť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom 
prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže by ť potrebná opätovná analýza 
testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných 
intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimova ť, by sa malo preukáza ť, že všetky fázy sa 
zhromaždili pomocou zvolenej metódy. 
25. Ak je to možné, po čas celej štúdie by sa mala použi ť jedna dávka testovanej 
chemikálie, pri čom testovaná vzorka by sa mala uskladni ť za podmienok, za 
ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred za čatím štúdie by 
mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej 
čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných 
kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukáza ť napríklad týmito 
údajmi: reten čný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnos ť získaná 
pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednos ť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspo ň čias­
točne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávate ľom (napr. farbu, fyzi ­
kálne skupenstvo at ď.).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Podľa možnosti je potrebné udržiava ť ovzdušie pri expozícii konštantné. Na 
preukázanie stability podmienok expozície sa môže použi ť zariadenie na 
monitorovanie v reálnom čase, ako napríklad aerosólový fotometer pre aero ­
sóly alebo komplexný uh ľovodíkový analyzátor pre pary. Skuto čná koncen ­
trácia v komore by sa mala mera ť aspoň tri razy v každý de ň expozície a pri 
každej úrovni expozície. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke 
koncentrácie nie je možné, je prijate ľný jeden odber vzorky po čas intervalu 
expozície. V takom prípade by sa mala táto vzorka pod ľa možnosti 
odoberať za celé trvanie expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie 
v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýli ť 
o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy 
v komore (t
 95 ) by sa mal vypo čítať a mala by o ňom podať správa. Interval 
expozície zah ŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí. Zoh ľadňuje sa pri 
tom čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v komore (t  95 ) a čas rozpadu. 
Usmernenia k odhadovaniu t  95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2). 
27. V prípade ve ľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov 
(napr. spa ľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií pohá ňaných účelo­
vými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhala čnej komore 
môže každá fáza správa ť inak. Preto by sa pre každú fázu (plyn/para 
a aerosól) mala vybra ť aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovate ľ (analyt), 
obyčajne hlavná aktívna látka v zmesi. Ak je testovaná chemikália zmes, 
v správe by sa mala uvies ť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen 
aktívnej látky alebo látky slúžiacej ako ukazovate ľ (analyt). Ďalšie 
informácie týkajúce sa skuto čných koncentrácií sú uvedené v dokumente 
GD 39 (2).  
Testovaná chemikália: rozdelenie ve ľkosti častíc  
28. Rozdelenie ve ľkosti častíc aerosólov by sa pri každej úrovni koncentrácie 
malo stanovi ť aspoň raz za týžde ň, a to pomocou kaskádového impaktora 
alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc (APS). Ak možno preukáza ť rovnocennos ť výsledkov získaných 
pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alter ­
natívny prístroj môže používa ť počas celej štúdie. 
29. Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premýva čka, by 
sa malo použi ť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej 
účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou 
veľkosti častíc by mala by ť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej 
koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukáza ť rovnocennos ť pri všetkých koncentráciách testovaných 
v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonáva ť ďalšie potvrdzujúce 
merania. V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá 
by sa mali prija ť opatrenia na minimalizáciu nejednozna čných údajov, ktoré 
môžu vies ť k potrebe opakova ť štúdiu. 
30. Rozdelenie ve ľkosti častíc by sa malo vykona ť v prípade pár, ak existuje 
možnosť, že kondenzácia pary môže ma ť za následok tvorbu aerosólu, alebo 
ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz.
 
POZOROVANIA 
31. Zvieratá by sa mali pred, po čas a po skon čení expozície klinicky pozorova ť. 
V závislosti od reakcie zvierat po čas expozície môžu by ť potrebné častejšie 
pozorovania. Ak pozorovaniu zvierat bráni používanie skúmaviek obmedzu ­
júcich pohyb zvierat, slabo osvetlených komôr na expozíciu celého tela alebo neprieh ľadné ovzdušie, zvieratá by sa mali dôkladne preskúma ť po 
skončení expozície. Na základe pozorovaní pred expozíciou v nasledujúcom 
dni možno zhodnoti ť akúkoľvek reverzibilitu alebo zhoršenie toxických 
účinkov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Všetky pozorovania sa zaznamenávajú, pri čom každé zviera má individu ­
álny záznam. Ke ď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu 
uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamena ť čas uhynutia. 
33. Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože a srsti, o čí, slizníc, 
dýchania a krvného obehu, zmeny nervového systému, somatomotoriky 
a správania. Pozornos ť sa zameriava na pozorovanie triašky, k ŕčov, slinenia, 
hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získa ť 
dôkazy sved čiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré 
súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu. Protokol o štúdii môže 
zahŕňať ďalšie hodnotenia, ako je napríklad kinetika, biomonitorovanie, 
funkcia p ľúc, zadržiavanie slabo rozpustných materiálov, ktoré sa hromadia 
v pľúcnom tkanive, a zmeny správania.  
TELESNÉ HMOTNOSTI 
34. Hmotnos ť jednotlivých zvierat je potrebné zaznamena ť krátko pred prvou 
expozíciou (de ň 0), potom dvakrát týždenne (napríklad: piatky a pondelky, 
aby sa preukázalo zotavenie po víkende bez expozícií, alebo v časovom 
intervale, ktorý umož ňuje hodnotenie systémovej toxicity) a v čase uhynutia 
alebo utratenia. Ak sa v prvých dvoch týžd ňoch neobjavia žiadne ú činky, po 
zvyšok štúdie sa môže telesná hmotnos ť merať raz za týžde ň. Satelitné 
zvieratá (na štúdiu reverzibility, ak sa použijú) sa na ďalej vážia raz za 
týždeň počas celého obdobia zotavovania. Na konci štúdie by sa všetky 
zvieratá mali krátko pred utratením odváži ť, aby sa získali neskreslené 
vypočítané pomery hmotnosti orgánov k telu.  
SPOTREBA POTRAVY A VODY 
35. Spotreba potravy by sa mala mera ť raz za týžde ň. Môže sa mera ť aj 
spotreba vody.  
KLINICKÁ PATOLÓGIA 
36. Hodnotenia klinickej patológie sa po utratení vykonávajú pri všetkých zvie ­
ratách vrátane kontrolných a satelitných zvierat. Je potrebné zaznamena ť 
časový interval medzi skon čením expozície a odberom krvi, najmä ak je 
rekonštitúcia sledovaného parametra rýchla. Odber vzoriek po skon čení 
expozície je indikovaný pri tých parametroch, ktoré majú krátky biologický polčas v plazme (napr. COHb, CHE a MetHb). 
37. V tabu ľke 1 sa uvádza zoznam parametrov klinickej patológie, ktoré sa vo 
všeobecnosti požadujú pri všetkých toxikologických štúdiách. Rozbor mo ču 
sa bežne nevyžaduje, ale môže sa vykona ť, ak sa na základe o čakávanej 
alebo pozorovanej toxicity predpokladá, že bude užito čný. Vedúci štúdie sa 
môže rozhodnú ť hodnotiť ďalšie parametre s cie ľom lepšie charakterizova ť 
toxicitu testovanej chemikálie (napr. cholínesteráza, lipidy, hormóny, acido ­
bázická rovnováha, methemoglobín alebo Heinzove telieska, kreatinkináza, pomer myelocytov a erytrocytov, troponíny, plyny v arteriálnej krvi, laktát- 
dehydrogenáza, sorbitol-dehydrogenáza, glutamát-dehydrogenáza a gama- 
glutamyl transpeptidáza).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabuľka 1 
Štandardné parametre klinickej patológie  
Hematológia  
Počet erytrocytov 
Hematokrit 
Koncentrácia hemoglobínu Stredný korpuskulárny hemoglobín 
Stredný korpuskulárny objem 
Koncentrácia stredného korpuskulár ­
neho hemoglobínu 
Retikulocyty Celkový po čet leukocytov 
Diferenciálny po čet leukocytov 
Počet trombocytov 
Potenciál zrážania krvi (vyberte 
jednu z možností): 
— Protrombínový čas 
— Čas zrážania krvi 
— Čiastočný tromboplastínový 
čas
 
Klinická chémia  
Glukóza (*) 
Celkový cholesterol Triglyceridy Dusík z mo čoviny v krvi 
Celkový bilirubín 
Kreatinín Celkový obsah bielkovín 
Albumíny 
Globulíny Alanín-amintransferáza 
Aspartát-aminotransferáza Alkalická fosfatáza Draslík 
Sodík 
Vápnik Fosfor 
Chloridy
 
Rozbor mo ču (nepovinné)  
Vzhľad (farba a zakalenie) 
Objem Špecifická hmotnos ť alebo osmolalita 
pH Celkový obsah bielkovín 
Glukóza Krv/krvinky
 
(*) Keďže dlhé obdobie bez k ŕmenia môže pri pokusných zvieratách v porovnaní 
s kontrolnými zvieratami vies ť k skresleniu meraní glukózy, vedúci štúdie by 
mal určiť, či je primerané, aby sa zvieratá nek ŕmili. Ak sa použije obdobie bez 
kŕmenia, malo by by ť primerané použitému živo číšnemu druhu; pri potkanoch to 
môže byť 16 hodín (no čný pôst). Stanovenie glukózy nala čno sa môže vykona ť 
po nočnom pôste po čas posledného týžd ňa expozície alebo po no čnom pôste pred 
pitvou (v druhom prípade spolu so všetkými ostatnými parametrami klinickej 
patológie).  
38. Ak existuje dôkaz, že hlavným miestom usadzovania a zachytávania sú 
dolné dýchacie cesty (t. j. alveoly), ako metóda kvantitatívnej analýzy hypo ­
tetických parametrov ú činnosti dávky zameranej na hypersenzitívnu pneu ­
monitídu, zápal p ľúc a fosfolipidózu sa môže zvoli ť bronchoalveolárna 
laváž (BAL). Tá umož ňuje primerane preskúma ť priebežné zmeny alveolár ­
neho poškodenia súvisiace so závislos ťou reakcie od dávky. Z tekutiny 
bronchoalveolárnej laváže sa môže analyzova ť celkový a diferenciálny 
počet leukocytov, celkový obsah bielkovín a laktát-dehydrogenáza. Ďalej 
sa môžu zváži ť parametre indikujúce lyzozomálne poškodenie, fosfolipi ­
dózu, fibrózu a dráždivé alebo alergické zápaly, ktoré môžu zah ŕňať stano­
venie zápalových cytokínov/chemokínov. Merania BAL vo všeobecnosti 
dopĺňajú výsledky histopatologických testov, nemôžu ich však nahradi ť. 
Usmernenia o postupe p ľúcnej laváže sú uvedené v dokumente GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MAKROSKOPICKÁ PATOLÓGIA A ORGÁNOVÉ HMOTNOSTI 
39. Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu alebo sa 
vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú úplnému 
vykrveniu (ak je uskuto čniteľné) a makroskopickej autopsii. Pri každom 
zvierati sa zaznamená čas medzi skon čením poslednej expozície 
a utratením. Ak nie je možné vykona ť autopsiu ihne ď po objavení uhynu ­
tého zviera ťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostato čne nízku teplotu, aby 
sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykona ť čo najskôr, 
zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zazna ­
menajú všetky makroskopické patologické zmeny, pri čom osobitná pozor ­
nosť sa venuje akýmko ľvek zmenách v dýchacej sústave. 
40. V tabu ľke 2 sa uvádza zoznam orgánov a tkanív, ktoré je po čas makro ­
skopickej pitvy potrebné zachova ť vo vhodnom médiu na ú čely histopato ­
logického vyšetrenia. O uchovaní orgánov a tkanív [v zátvorke] a všetkých ostatných orgánov a tkanív rozhodne vedúci štúdie. Orgány vyzna čené 
tučným  písmom by sa mali čo najskôr po disekcii upravi ť a odváži ť 
v mokrom stave, aby sa zabránilo ich vyschnutiu. Štítna ž ľaza 
a nadsemenníky by sa mali váži ť iba v prípade potreby, lebo úprava arte ­
faktov môže bráni ť histopatologickému hodnoteniu. Tkanivá a všetky 
orgány sa fixujú v 10 % formalínovom tlmivom roztoku alebo v inom 
vhodnom fixa čnom prostriedku ihne ď po vykonaní autopsie a nie skôr 
ako 24 – 48 hodín pred úpravou v závislosti od použitého fixa čného 
prostriedku.
 
Tabuľka 2 
Orgány a tkanivá zachované po čas makroskopickej pitvy 
Nadobličky 
Kostná dre ň (a/alebo čerstvý aspirát)  
Mozog  (vrátane častí predného mozgu, 
mozočka a pred ĺženej miechy/mosta) 
[Oči (sietnica, o čný nerv) a o čné viečka] 
Srdce Obličky 
Hrtan (tri úrovne, jedna úrove ň má zahŕňať 
základňu epiglotis)  
Pečeň 
Pľúca (všetky laloky na jednej úrovni vrátane 
hlavných priedušiek) 
Lymfatické uzliny z hilovej oblasti p ľúc 
najmä v prípade tuhých testovaných chemi ­
kálií so slabou rozpustnos ťou. Pri detailnej ­ 
ších testoch a/alebo štúdiách s imunolo ­
gickým zameraním sa môžu zváži ť ďalšie 
lymfatické uzliny, napr. z mediastinálnych, 
cervikálnych/submandibulárnych a/alebo auri ­
kulárnych oblastí. 
Nosohltanové tkanivá [aspo ň štyri úrovne; 
jedna úrove ň zahŕňa nosohltanovú trubicu 
a nosové lymfoidné tkanivo (NALT)] 
Pažerák [Čuchový bulbus] 
Vaječníky Semenné mechúriky 
Miecha (kr čná, hrudná a lumbálna)  
Slezina  
Žalúdok  
Semenníky Týmus  
Štítna žľaza 
Priedušnica (aspo ň dve úrovne vrátane 
jedného pozd ĺžneho rezu cez karinu 
a jedného prie čneho rezu) 
[Močový mechúr] 
Maternica Všetky makroskopické poškodenia
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Pľúca by sa mali od ňať neporušené, odváži ť a napusti ť vhodným fixa čným 
prostriedkom pri tlaku 20 – 30 cm vody, aby sa zachovala ich štruktúra (5). 
Je potrebné odobra ť rezy všetkých lalokov na jednej úrovni vrátane hlav ­
ných priedušiek, ale ak sa robí p ľúcna laváž, mali by sa vykona ť rezy 
nelavážovaného laloku na troch úrovniach (nie sériové rezy). 
42. Preskúmajú sa najmenej štyri úrovne nosohltanových tkanív, z ktorých jedna 
by mala obsahova ť nosohltanovú trubicu (5, 6, 7, 8, 9), aby sa umožnilo 
vhodné preskúmanie dlaždicového, prechodného (neriasinkového dýchacie ­
ho), dýchacieho (riasinkového dýchacieho) a čuchového epitelu 
a odvodného lymfatického tkaniva (NALT; 10, 11). Preskúmajú sa tri úrovne hrtana, pri čom jedna z týchto úrovní by mala obsahova ť základňu 
epiglotis (12). Je potrebné preskúma ť aspoň dve úrovne priedušnice vrátane 
jedného pozd ĺžneho rezu cez karinu bifurkácie extrapulmonárnych priedu ­ 
šiek a jedného prie čneho rezu.
 
HISTOPATOLÓGIA 
43. Pri kontrolných skupinách a skupinách s vysokými koncentráciami a pri 
všetkých zvieratách, ktoré uhynú alebo sú utratené po čas štúdie, sa vykoná 
histopatológia všetkých orgánov a tkanív vymenovaných v tabu ľke 2. 
Osobitná pozornos ť by sa mala venova ť dýchacím cestám, cie ľovým 
orgánom a makroskopickým poškodeniam. Orgány a tkanivá, ktoré majú 
poškodenia v skupine s vysokými koncentráciami, sa preskúmajú pri všet ­
kých skupinách. Vedúci štúdie sa môže rozhodnú ť pre vykonanie histopa ­
tologických hodnotení pri ďalších skupinách s cie ľom preukáza ť jednoz­
načnú reakciu na koncentráciu. Ak boli použité satelitné skupiny (reverzi ­
bilita), histopatologické hodnotenie sa vykoná v prípade všetkých tkanív 
a orgánov, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené ú činky. Ak 
v skupine s vysokou expozíciou došlo k nadmernému pred časnému úhynu 
alebo iným problémom, ktoré spochyb ňujú významnos ť údajov, je potrebné 
histopatologicky preskúma ť najbližšiu nižšiu koncentráciu. Sledovanie 
nálezov pitvy by malo korelova ť s mikroskopickými nálezmi.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
44. Je potrebné uvies ť údaje o telesnej hmotnosti, spotrebe potravy, klinickej 
patológii, makroskopickej patológii, orgánových hmotnostiach a histopatológii jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa 
zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet 
použitých zvierat, po čet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, 
počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté po čas testu alebo ich usmrtili 
z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový 
priebeh toxických ú činkov a reverzibility a pitevné nálezy. Všetky výsledky, 
kvantitatívne aj náhodné, sa vyhodnotia primeranou štatistickou metódou. Možno použi ť akúkoľvek všeobecne akceptovanú štatistickú metódu, 
pričom štatistické metódy je potrebné vybra ť počas plánovania štúdie.
 
Správa o teste  
45. Správa o teste by mala pod ľa potreby obsahova ť tieto informácie:  
Testované zvieratá a chov:  
— opis podmienok v klietke vrátane: po čtu (alebo zmeny po čtu) zvierat na 
klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, d ĺžky svetlej 
fázy a identifikácie krmiva,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, 
môže sa uvies ť zdroj a historické údaje, ak sa týkajú zvierat 
v podobných podmienkach expozície, umiestnenia a nek ŕmenia, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— metóda randomizácie, — opis akýchko ľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény 
a liečby chorôb.  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické 
vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje a registra čné číslo CAS (Chemical Abstract Servi ­
ces), ak je známe.  
Nosič: 
— odôvodnenie použitia nosi ča a odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako 
voda), 
— historické alebo paralelne získané údaje preukazujúce, že nosi č nemá 
vplyv na výsledky štúdie.  
Inhalačná komora:  
— podrobný opis inhala čnej komory vrátane objemu a nákresu, 
— zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvo ­
renie ovzdušia, 
— zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, ve ľkosti častíc a skuto čnej 
koncentrácie, 
— zdroj vzduchu a použitý klimatiza čný systém, 
— metódy použité na kalibráciu zariadenia s cie ľom zabezpe čiť homogénne 
testovacie ovzdušie, 
— rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny), — expozi čné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), 
umiestnenie zvierat v komore (v prípade expozície celého tela), 
— stabilita testovacieho ovzdušia, — umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho 
ovzdušia v komore, 
— manipulácia s privádzaným/extrahovaným vzduchom, — hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozi čný otvor 
(v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela), 
— čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhala čnej komore (t95), 
— počet zmien objemu za hodinu, 
— meracie prístroje (ak sa použili),  
Údaje o expozícii:  
— odôvodnenie výberu cie
ľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nominálne koncentrácie (celková hmotnos ť testovanej chemikálie apli ­
kovanej do inhala čnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel 
komorou), 
— skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny 
zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupen ­
stvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzova ť samo­
statne, 
— všetky koncentrácie vzduchu sa udávajú v hmotnostných jednotkách 
(mg/l mg/m  3 atď.), nie v objemových jednotkách (ppm, ppb at ď.), 
— rozdelenie ve ľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný 
priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru ( σ g ) 
vrátane metód ich výpo čtu. Jednotlivé analýzy ve ľkosti častíc sa uvedú 
v správe.  
Podmienky testovania:  
— podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrob ­
ných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie ve ľkosti 
častíc tuhých látok alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie, 
— opis (pod ľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvo ­
renie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdu ­ 
šiu, 
— podrobné informácie o zariadeniach použitých na monitorovanie teploty, 
vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore (napr. vývoj kalibra čnej krivky), 
— podrobné informácie o zariadeniach použitých pri odbere vzoriek na 
stanovenie koncentrácie v komore a rozdelenia ve ľkosti častíc, 
— podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o 
overení metódy (vrátane ú činnosti vý ťažnosti testovanej chemikálie 
z prostriedku na odber vzorky), 
— metóda randomizácie pri pride ľovaní zvierat do testovacích 
a kontrolných skupín, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.  
Výsledky:  
— tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore, 
— tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skuto čných koncentrá ­
ciách, 
— tabuľkové spracovanie údajov o ve ľkosti častíc vrátane údajov o odbere 
vzoriek na analýzu, o rozdelení ve ľkosti častíc a o výpo čtoch MMAD 
a σ g , 
— tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie 
pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane 
mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania ú činkov),  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— tabuľkové spracovanie hmotností jednotlivých zvierat, 
— tabuľkové spracovanie spotreby potravy, 
— tabuľkové spracovanie údajov klinickej patológie, 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii, 
— tabuľkové spracovanie akýchko ľvek ďalších meraných parametrov.  
Rozbor a interpretácia výsledkov:  
— osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií 
tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo ve ľkosti častíc, 
— dýchate ľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak 
nebolo možné splni ť kritériá na ve ľkosť častíc, 
— konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie a vz ťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii 
sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie, 
— uvedie sa pravdepodobná prí čina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia 
(systémové verzus lokálne), 
— uvedie sa odôvodnenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utrati ť 
zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo 
pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmer ňovacom doku ­
mente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (3), 
— identifikuje sa cie ľový orgán (orgány), 
— stanoví sa NOAEL a LOAEL.
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Paríž. 
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asse ­
ssment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž. 
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž. 
4. Whalan, J. E., a Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
5. Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological 
Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. a Brain, J. D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229 – 258. 
6. Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309 – 312. 
7. Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231 – 238.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
8. Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP a Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, s. 215 – 263. 
9. Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). 
Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353 – 372. 
10. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. 
J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The 
role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219 – 224. 
11. Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140 – 141: s. 281 – 285. 
12. Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419 – 428. 
13. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí, 
o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene 
a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOXICITA PO 28–D ŇOVEJ OPAKOVANEJ DÁVKE 
(DERMÁLNA)  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B (A).  
1.2. POJMY 
Pozri všeobecný úvod časť B (B).  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Testovaná látka sa nanáša na kožu denne v odstup ňovaných dávkach 
viacerým skupinám pokusných zvierat, a to jedna dávka na jednu skupinu po čas 28 dní. Po čas trvania testu sa zvieratá denne pozorujú, 
aby sa zistili symptómy toxických ú činkov. Zvieratá, ktoré uhynú 
počas testu, ako aj zvieratá, ktoré prežijú do konca testu, sa pitvú.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS SKÚŠOBNE J METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
Zvieratá si pred za čatím testu zvykajú minimálne 5 dní na experi ­
mentálne chovate ľské a kŕmne podmienky. Pred testom sa zdravé 
mladé zvieratá randomizujú a prira ďujú k jednotlivým exponovaným 
a kontrolným skupinám. Krátko pred za čatím testu sa strihá srs ť na 
chrbte pokusných zvierat. Oholenie srsti je tiež možné, ale dalo by sa 
vykonať 24 hodín pred za čatím testu. Opakované strihanie a holenie 
je zvyčajne potrebné približne v týžd ňových intervaloch. Je potrebné 
dbať na to, aby sa nepoškodila koža. Na aplikáciu sa musí pripravi ť 
minimálne 10 % povrchu kože. Pri ur čovaní oblasti ur čenej na ostri ­
hanie aplika čnej plochy sa zoh ľadňuje hmotnos ť zvierat. Ak sa 
používajú tuhé látky, ktoré sa môžu jemne rozomlie ť na prášok, 
mala by by ť testovaná látka dostato čne navlh čená vodou alebo 
tam, kde je to potrebné, vhodným vehikulom, aby sa zabezpe čil 
dobrý kontakt s kožou. Tekuté testované látky sa vo všeobecnosti používajú nezriedené. Aplikácia sa vykonáva denne 5 až 7 dní za 
týždeň.
 
1.6.2.  Podmienky skúšania  
1.6.2.1.  Pokusné zvieratá  
Môže sa použi ť dospelý potkan, králik alebo mor ča. Môžu sa použi ť 
aj iné druhy, ich použitie sa však musí zdôvodni ť. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Odchýlka telesnej hmotnosti zvierat daného testu by nemala by ť na 
začiatku testu viac ako ± 20 % od príslušnej strednej priemernej 
hodnoty.  
1.6.2.2.  Počet a pohlavie  
Pre každú ve ľkosť dávky sa používa minimálne 10 zvierat (5 
samčekov a 5 sami čiek) so zdravou, nepoškodenou kožou. Sami čky 
musia by ť nezapustené a nesmú by ť gravidné. Ak sa majú po čas 
testu humánne usmrti ť zvieratá, tak sa musí celkový po čet zvierat 
zvýšiť o počet zvierat, ktoré majú by ť humánne usmrtené, ešte pred 
koncom testu. Okrem toho sa môže exponova ť satelitná skupina s 10 
zvieratami (5 zvierat na pohlavie) po čas 28 dní s najvyššou dávkou 
a počas nasledujúcich 14 dní bez ošetrenia sa dbá na reverzibilitu, 
pretrvávanie alebo oneskorený prejav toxických ú činkov. Používa sa 
tiež satelitná skupina s 10 kontrolnými zvieratami (5 zvierat na pohlavie).
 
1.6.2.3.  Veľkosti dávok  
Musia sa zvoli ť minimálne tri dávky, ako aj jedna kontrolná skupina, 
alebo ak sa použije pomocná látka, kontrolná skupina s pomocnou látkou. Čas pôsobenia by mal trva ť minimálne 6 hodín denne. Apli ­
kácia testovanej látky by sa mala vykonáva ť v ten istý čas každý de ň 
a prispôsobenie dávky telesnej hmotnosti sa vykonáva v stanovených intervaloch (raz týždenne alebo dvakrát týždenne), aby sa zachovala konštantná hladina dávky v relácii k telesnej hmotnosti. Odhliadnuc 
od aplikácie testovanej látky, zvieratá kontrolnej skupiny sa ošetrujú 
rovnakým spôsobom ako pokusné zvieratá. Ak sa na u ľahčenie apli­
kácie použije vehikulum, tak sa kontrolnej skupine podáva vehi ­
kulum rovnakým spôsobom ako exponovaným zvieratám, a to 
v množstve, aké dostane skupina s najvyššou dávkou. Najvyššia 
dávka sa volí tak, aby sa v každom prípade prejavili toxické efekty, ale aby zvieratá neuhynuli alebo iba v malom množstve. Najnižšia dávka by nemala vyvoláva ť žiadne príznaky toxicity. Ak existujú 
použiteľné odhady o výške expozície u človeka, tak by mala 
najnižšia dávka túto hodnotu prekra čovať. Podľa možnosti by mala 
stredná dávka spôsobova ť len malé toxické ú činky. Ak sa podávajú 
viaceré medzidávky, tak sa majú voli ť tak, aby došlo k postupnej 
klasifikácii toxických ú činkov. V skupinách s nízkou alebo strednou 
dávkou, ako aj v kontrolných skupinách by mal by ť počet úmrtí 
nízky, aby sa zabezpe čilo kvalitné vyhodnotenie výsledkov. 
Ak aplikácia testovanej látky vedie k silným podráždeniam kože, 
mala by sa koncentrácia zníži ť, čo môže pri vysokej dávke vies ť 
k zníženiu alebo vynechaniu ostatných toxických ú činkov. Ak sa 
okrem toho koža ve ľmi poškodila, je za ur čitých okolností potrebné 
prerušiť test a nanovo ho realizova ť s nižšími koncentráciami.
 
1.6.2.4.  Limitný test  
Ak pri realizácii pred časnej štúdie podanie dávky 1 000 mg/kg alebo 
vyššej dávky, ktorá zodpovedá možnej expozícii u človeka, nespô ­
sobí žiadne toxické ú činky, nie je potrebný ďalší test.  
1.6.2.5.  Čas pozorovania  
Pri všetkých zvieratách sa denne pozorujú symptómy toxických ú čin­
kov. Smr ť a čas vzniku a zániku symptómov sa musia zaznamena ť. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Postup  
Zvieratá sa musia udržiava ť jednotlivo v klietkach. Testovanú látku 
dostávajú sedem dní do týžd ňa počas 28 dní. Zvieratá satelitnej 
skupiny, ktoré sú ur čené na dodato čné pozorovanie, by mali by ť 
ďalších 14 dní bez ošetrenia, aby sa pozorovala reverzibilita alebo 
pretrvávanie toxických ú činkov. Expozi čná doba je minimálne šes ť 
hodín denne. 
Testovaná látka sa nanáša jednotne na oblas ť, ktorá zodpovedá asi 
10 % povrchu tela. Pri ve ľmi toxických látkach sa môže ošetrova ť 
plocha menšia, ale vä čšia plocha by mala by ť exponovaná čo možno 
s najtenšou a najrovnomernejšou vrstvou. 
Testovaná látka sa po čas expozi čnej doby udržiava v kontakte 
s kožou pomocou gázového obväzu a jednej náplasti. Pokusná 
plocha sa musí okrem toho zakry ť vhodným spôsobom, aby sa 
gázový obväz a testovaná látka prichytili a zaistili a aby zvieratá nemohli orálne prija ť testovanú látku. Môžu sa použi ť aj prostriedky 
na obmedzenie slobody pohybu, avšak úplná imobilizácia sa neod ­
porúča. Ako alternatíva sa môže použi ť „manžeta na krk“. 
Po uplynutí expozi čnej doby sa odstráni, pokia ľ je to možné, zvyšok 
testovanej látky, a to použitím vody alebo iným vhodným postupom na čistenie kože. 
Všetky zvieratá sa musia denne sledova ť a zapisova ť príznaky toxic ­
kých účinkov vrátane času vzniku, ako aj stup ňa a trvania. Sledo ­
vania sa majú zameriava ť hlavne na zmeny na koži, srsti, o čiach 
a slizniciach, dýchaní, krvnom obehu, autonómnom a centrálnom nervovom systéme, ako aj na somatomotorike a na správaní. Príjem 
potravy a hmotnos ť zvierat sa ur čujú každý týžde ň. Pravidelné pozo
­
rovanie zvierat je potrebné, aby sa dalo čo najlepšie zabezpe čiť, aby 
zvieratá neuhynuli po čas testu na kanibalizmus, autolýzu tkanív 
alebo chybu pri premiest ňovaní. Po ukon čení testu sa všetky zvie ­
ratá, ktoré prežili, s výnimkou satelitnej skupiny, pitvú. Hynúce zvieratá, ako aj zvieratá, u ktorých sa zistili silné príznaky utrpenia alebo bolesti, sa musia okamžite oddeli ť, humánne usmrti ť a pitvať 
metódou prijate ľnou pre zvieratá. 
Na konci testu sa musia všetky zvieratá, vrátane kontrolných zvierat, 
podrobiť nasledujúcim vyšetreniam: 
1. hematologickému vyšetreniu, ktoré by malo zah ŕňať aspoň určo­
vanie hodnoty hematokrytu a koncentrácie hemoglobínu, po čet 
erytrocytov, celkový a diferenciálny po čet leukocytov, ako aj 
hemokoagula čné parametre; 
2. klinickobiochemickej analýze krvi: na posúdenie funkcie pe čene 
a obličiek by sa mal ur čiť minimálne jeden z týchto parametrov: 
alanín-amino-tranferáza (skôr známa ako sérum-glutamát-pyruvat- 
transamináza), asparta-aminotranferáza (skôr známa ako sérum- 
glutamát-oxalacetát-transamináza), mo čovinový dusík, albumín, 
kreatinín, celkový bilirubín a celkové bielkoviny v sére. 
Ďalšie stanovenia, ktoré môžu by ť potrebné na adekvátne toxikolo ­
gické vyhodnotenie, zah ŕňajú: vápnik, fosfor, chlorid, sodík, draslík, 
glukózu nala čno, lipidy, hormóny, rovnováhu medzi kyselinami 
a zásadami, methemoglobín a aktiviu cholínesterázy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Tam, kde je to potrebné, sa môžu využi ť dodatočné klinickobioche ­
mické analýzy na rozšírenie skúmania pozorovaných ú činkov.  
1.6.4.  Pitva  
Na všetkých zvieratách, ktoré sa zú častnili na teste, sa vykoná 
kompletná autopsia. Aspo ň pečeň, obličky, nadobli čky 
a semenníky sa čo najskôr po sekcii odvážia vlhké, aby sa zabránilo 
ich vysychaniu. Orgány a tkanivá, t. j. neexponovaná a exponovaná koža, pe čeň, obličky, slezina, semenníky, nadobli čky, srdce 
a cieľové orgány (orgány s makroskopickými zmenami alebo 
zmenami ve ľkosti), sa uchovávajú vo vhodnom médiu na možné 
neskoršie histopatologické vyšetrenie.
 
1.6.5.  Histopatologické vyšetrenia  
U všetkých zvierat skupiny s najvyššou dávkou, ako aj u zvierat 
kontrolnej skupiny sa musí vykona ť histologické vyšetrenia konzer ­
vovaných orgánov a tkanív. Všetky orgány a tkanivá, ktoré vykazujú 
v skupinách s najvyššou dávkou poškodenia podmienené testovanou 
látkou, sa musia vyšetri ť aj v ostatných skupinách s nižšou dávkou. 
U zvierat satelitnej skupiny sa musia ve ľmi dôkladne vyšetri ť tie 
orgány a tkanivá, v ktorých sa u ostatných exponovaných skupín 
prejavili príznaky otravy.  
2. ÚDAJE  
Údaje sa zhrnú do tabu ľky, z ktorej musí by ť jasný po čet zvierat pre 
každú testovanú skupinu a kontrolnú skupinu na za čiatku testu 
a počet zvierat s jednotlivými formami poškodenia. 
Všetky zistené výsledky sa vyhodnocujú vhodnou štatistickou metó ­
dou. Môže sa použi ť akákoľvek uznávaná štatistická metóda.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— údaje o zvieratách (druh, kme ň, pôvod, chovate ľské podmienky, 
krmivo at ď.), 
— podmienky skúšania (vrátane druhu obväzu: okluzívny alebo 
neokluzívny), 
— veľkosti dávky (vrátane vehikula, ak sa použilo) a koncentráciu, 
— tam, kde je to možné, „no effect-level“, — údaje o toxických reakciách pod ľa pohlavia a koncentrácie, 
— čas smrti po čas testu alebo údaj, či zvieratá test prežili do konca 
testu, 
— toxické a iné ú činky, 
— čas pozorovania jednotlivých príznakov toxických ú činkov, ich 
ďalší priebeh, 
— údaje o k ŕmení a telesnú hmotnos ť, 
— hematologické testy a ich výsledky,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— klinickobiochemické testy a ich výsledky, 
— pitevné nálezy, — podrobný opis histopatologických nálezov, — štatistické vyhodnotenie výsledkov, — diskusiu o výsledkoch, — interpretáciu výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B (D).  
4. ODKAZY  
Pozri všeobecný úvod časť B (E).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGÉNNOS Ť – IN VITRO  TEST CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY U CICAVCOV  
1. METÓDA  
Táto metóda je duplikátom  in vitro  testu chromozómovej odchýlky 
u cicavcov (1997), ozna čenej OECD TG 473.  
1.1. ÚVOD 
Účelom  in vitro  testu chromozómovej odchýlky u cicavcov je iden ­
tifikovať činidlá, ktoré spôsobujú štrukturálne chromozómové 
odchýlky v pestovaných bunkách cicavcov (1) (2) (3). Štrukturálne 
odchýlky môžu by ť v dvoch typoch, chromozómové alebo chroma ­
tidové. Vä čšina chemických mutagénov vyvoláva chromatidové 
odchýlky, avšak vyskytujú sa tiež chromozómové odchýlky. Nárast 
polyploidie môže nazna čovať, že chemikália má potenciál spôsobi ť 
číselné odchýlky. Táto metóda však nie je ur čená na meranie čísel­
ných odchýlok a bežne sa na tento ú čel nepoužíva. Chromozómové 
mutácie a podobné udalosti sú prí činou mnohých ľudských genetic ­
kých chorôb a existujú dostato čné dôkazy o tom, že chromozómové 
mutácie a podobné udalosti spôsobujúce odchýlky onkogénov a génov na potlá čanie nádorov somatických buniek sú prítomné pri 
vzniku rakoviny u ľudí a pokusných zvierat.  
In vitro  test chromozómovej odchýlky u cicavcov môže obsahova ť 
kultúry preukázaných bunkových línií, bunkové kmene alebo kultúry 
primárnych buniek. Použité bunky sa vyberajú na základe rastovej schopnosti kultúry, stability karyotypu, chromozómového čísla, chro­
mozómovej diverzity a spontánnej frekvencie chromozómových 
odchýlok. 
Testy vykonávané  in vitro  vo všeobecnosti vyžadujú použitie 
exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Tento systém metabo ­
lickej aktivácie nemôže úplne napodobni ť podmienky cicavcov  in 
vivo. Je potrebné sa starostlivo vyhnú ť podmienkam, ktoré by viedli 
k pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú vnútornú mutagénnos ť 
a ktoré môžu pochádza ť zo zmien pH, osmolality alebo vysokých 
hladín cytotoxicity (4) (5). 
Tento test sa používa na zistenie možných mutagénov 
a karcinogénov u cicavcov. Mnohé zlú čeniny, ktoré sú v tomto 
teste pozitívne, sú pre cicavcov karcinogénmi, avšak medzi týmto 
testom a karcinogénnos ťou neexistuje dokonalá korelácia. Korelácia 
závisí od triedy chemikálie a je čoraz viac dôkazov, že existujú 
karcinogény, ktoré tento test neodhalí, pretože pravdepodobne ú čin­
kujú prostredníctvom mechanizmov odlišných od priameho poško ­
denia DNA. 
Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.  
1.2. DEFINÍCIE  
Odchýlka chromatidového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie jednotlivých chromatidov alebo pretrhnutie a opätovné spojenie chromatidov.  
Odchýlka chromozómového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie alebo pretrhnutie 
a opätovné spojenie oboch chromatidov na rovnakom mieste.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikácia:  proces, v ktorom po S perióde replikácie DNA 
jadro neprechádza do mitózy, ale za čína novú S periódu. Výsledkom 
sú chromozómy so 4, 8, 16... chromatidmi.  
Trhlina:  achromatická lézia, menšia ako šírka jedného chromatidu 
s minimálnym posunutím chromatidov.  
Mitotický index:  pomer buniek v metafáze delený celkovým po čtom 
buniek pozorovaných v populácii buniek; náznak stup ňa šírenia tejto 
populácie.  
Číselná (numerická) odchýlka:  zmena v po čte chromozómov 
v porovnaní s normálnou číselnou (numerickou) charakteristikou 
použitých buniek.  
Polyploidia:  násobok haploidného po čtu chromozómov ( n) odlišný 
od počtu diploidov (t. j. 3n, 4n at ď.) 
Štrukturálna odchýlka:  zmena v chromozómovej štruktúre rozpoz ­
nateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia 
buniek, pozorovaná ako vynechania a fragmenty, vnútorné zmeny alebo zámeny.
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Bunkové kultúry sú exponované testovacou látkou s metabolickou 
aktiváciou aj bez nej. Vo vopred ur čených intervaloch po expozícii 
bunkových kultúr testovacou látkou sa spracúvajú látkou zastavu ­
júcou metafázu (napr Colcemidom® alebo colchicínom), zozbierajú 
sa, zafarbia sa a metafázové bunky sa mikroskopicky analyzujú na 
zistenie prítomnosti chromozómových odchýlok.  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Bunky  
Môžu sa použi ť rôzne bunkové línie, kmene alebo primárne bunkové 
kultúry vrátane ľudských buniek (napríklad: fibroblasty čínskych 
morčiat, periférne krvné lymfocyty ľudí alebo iných cicavcov).  
1.4.1.2.  Médiá a podmienky kultúr  
Pri udržiavaní kultúr sa používajú príslušné médiá a inkuba čné 
podmienky (kultiva čné nádoby, koncentrácia CO  2 , teplota 
a vlhkosť). Získané bunkové línie a kmene sa pravidelne kontrolujú 
na stabilitu modálneho chromozómového čísla a absenciu mykoplaz ­
matickej kontaminácie a v prípade kontaminácie sa nepoužívajú. Mal 
by byť známy čas normálneho bunkového cyklu a podmienky použi ­
tých kultúr.  
1.4.1.3.  Príprava kultúr  
Zistené bunkové línie a kmene: bunky sa odoberajú z uskladnených 
kultúr, zasievajú sa do média kultúry v takej hustote, pri ktorej kultúry 
nedosiahnu zhluk pred časom zberu, a inkubujú sa pri teplote 37  o C. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymfocyty: celá krv ošetrená antikoagulantom (napríklad: heparí ­
nom) alebo separované lymfocyty získané od zdravých subjektov 
sa pridávajú do média kultúry obsahujúceho mitogén (napríklad: fytohemaglutinín) a inkubované sa pri teplote 37
 o C. 
1.4.1.4.  Metabolická aktivácia  
Bunky sú exponované testovacou látkou za prítomnosti i za neprí ­
tomnosti príslušného systému metabolickej aktivácie. Najpoužíva ­
nejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofak ­
torom (S 9), pripravená z pe čene hlodavcov ošetrených prípravkami 
na indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (6) (7) (8) (9) 
alebo zmesou fenobarbitonu a beta-naftoflavónu (10) (11) (12). 
Postmitochondriálna frakcia sa zvy čajne používa v koncentráciách 
v rozpätí od 1 % – 10 % v/v v kone čnom testovacom médiu. Stav 
systému metabolickej aktivácie môže závisie ť od triedy testovanej 
chemikálie. V niektorých prípadoch môže by ť vhodné využi ť viac 
než jednu koncentráciu postmitochondriálnej frakcie. 
Pre endogénnu aktiváciu môže poskytnú ť potenciál množstvo situácií 
vrátane vytvorenia geneticky vypestovaných bunkových línií vyja ­
drujúcich špecifické aktiva čné enzýmy. Výber použitých bunkových 
línií by mal by ť vedecky podložený (napríklad: relevantnos ťou cyto­
chrómového P450 izoenzýmu pre metabolizmus testovacej látky).  
1.4.1.5.  Testovacia látka/príprava  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch a rozrie ďujú, ak je to vhodné, pred 
ošetrením buniek. Kvapalné testovacie látky môžu by ť pridané 
priamo do testovacích systémov a/alebo rozriedené pred ošetrením. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje 
o stabilite nepoukazujú na prijate ľnosť uskladnenia.
 
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagova ť s testovacou látkou 
a mali by by ť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9. Ak sa 
používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich použitie by 
malo byť podporené údajmi ozna čujúcimi ich kompatibilitu. Odpo ­
rúča sa, aby sa kedyko ľvek, keď je to možné, zvážilo použitie 
vodného rozpúš ťadla/nosiča. Pri testovaní vo vode nestabilných 
látok by organické rozpúš ťadlá nemali obsahova ť vodu. Vodu 
možno odstráni ť pridaním molekulárneho sitka.  
1.4.2.2.  Koncentrácie pri expozícii  
Medzi kritériá, ktoré treba zváži ť pri určovaní najvyššej koncentrá ­
cie, patrí cytotoxicita, rozpustnos ť v testovacom systéme a zmeny 
pH alebo osmolality. 
Cytotoxicita sa stanovuje s metabolickou aktiváciou a bez metabo ­
lickej aktivácie pri hlavnom pokuse použitím príslušného ozna čenia 
integrity a rastu buniek, ako napríklad stup ňa zhlukovania, po čtu 
životaschopných buniek alebo mitotického indexu. Užito čné môže 
byť stanoviť cytotoxicitu a rozpustnos ť v predbežnom pokuse.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Používajú sa najmenej tri analyzovate ľné koncentrácie. Pri výskyte 
cytotoxicity tieto koncentrácie pokrývajú rozsah od maximálnej po 
malú alebo žiadnu toxicitu; toto zvy čajne znamená, že koncentrácie 
majú byť oddelené najviac koeficientom medzi 2 a √10. V čase 
zberu by mala najvyššia koncentrácia ukazova ť významný pokles 
stupňa zhlukovania, po čtu buniek alebo mitotického indexu (všetky 
viac ako 50 %). Mitotický index je iba nepriamym meradlom cytotoxických/cytostatických ú činkov a závisí od času po ošetrení. 
Mitotický index je však akceptovate ľný pre suspenzné kultúry, 
v ktorých iné merania toxicity môžu by ť náročné a nepraktické. 
Informácie o kinetike bunkových cyklov, ako napríklad priemerný generačný čas (average generation time – AGT), sa môžu použi ť ako 
doplnkové informácie. AGT je však celkovým priemerom, ktorý nie 
vždy odha ľuje existenciu oneskorených subpopulácií, a aj malé 
zvýšenie priemerného genera čného času môže by ť spojené s ve ľmi 
podstatným oneskorením času optimálneho vý ťažku odchýlok. 
Pre relatívne necytotoxické látky sú maximálne testovacie koncen ­
trácie 5 μl/ml (5 mg/ml) alebo 0,01 M, pod ľa toho, ktorá je najnižšia. 
Pre relatívne nerozpustné látky, ktoré nie sú toxické pri koncentrá ­
ciách nižších ako nerozpustné koncentrácie, najvyššia použitá dávka 
je koncentráciou nad limit rozpustnosti v kone čnom médiu kultúry 
na konci ošetrovacieho obdobia. V niektorých prípadoch (napríklad keď sa vyskytne toxicita len na vyššej ako najnižšej nerozpustnej 
koncentrácii) je vhodné testova ť na viac než jednej koncentrácii 
s viditeľným zrážaním. Užito čné môže by ť odhadnú ť rozpustnos ť 
na začiatku a na konci podávania, ke ďže rozpustnos ť sa môže 
zmeniť po
čas priebehu expozície v testovacom systéme pre prítom ­
nosť buniek, séra S9 at ď. Nerozpustnos ť sa dá zisti ť voľným okom. 
Zrazenina hodnoteniu neprekáža.  
1.4.2.3.  Negatívne a pozitívne kontroly  
Každý pokus má obsahova ť pozitívne a negatívne (rozpúš ťadlo alebo 
nosič) kontroly, a to obe s metabolickou aktiváciou a bez metabo ­
lickej aktivácie. Pri použití metabolickej aktivácie je pozitívna 
kontrolná chemikália tá, pri ktorej sa na vznik mutagénnej reakcie 
vyžaduje aktivácia. 
Pozitívne kontroly využívajú známy elastogén s úrov ňami vystave ­
nia, pri ktorých sa o čakáva reprodukovate ľný a zistite ľný nárast na 
pozadí, ktoré preukazuje citlivos ť testovacieho systému. 
Koncentrácie pozitívnej kontrolnej látky sa volia tak, aby boli ú činky 
jasné, ale aby pozorovate ľovi priamo neodha ľovali identitu kódova ­
ných sklí čok. Príklady pozitívnych kontrolných látok:  
Stav metabolickej aktivácie Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
Neprítomnosf exogénnej meta ­
bolickej aktivácie metylmetánsulfonát 66-27-3 200-625-0 
etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Stav metabolickej aktivácie Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
etylnitrozkarbamid 759-73-9 212-072-2 
mytomicín C 50-07-7 200-008-6 
4-nitrochinolín-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Prítomnosf exogénnej metabo ­
lickej aktivácie benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 
cyklofosfamid 
monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Možno použi ť iné vhodné pozitívne kontrolné látky. Pod ľa dostup­
nosti sa tiež zváži použitie príbuzných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v chemickej triede. 
Negatívne kontroly pozostávajúce iba zo samotného rozpúš ťadla 
alebo nosi ča v médiu a ošetrené rovnakým spôsobom ako ošetrované 
kultúry sa zahrnú pre každý čas zberu. Používajú sa tiež neošetrené 
kontrolné látky, pokia ľ neexistujú historické kontrolné údaje pouka ­
zujúce na to, že vybrané rozpúš ťadlo nespôsobuje žiadne rušivé ani 
mutagénne efekty.
 
1.4.3.  Postup  
1.4.3.1.  Pôsobenie testovacej látky  
Na rozširujúce sa bunky pôsobí testovacia látka za prítomnosti aj za 
neprítomnosti systému metabolickej aktivácie. Ošetrenie lymfocytov 
by malo za čať približne 48 hodín po mitogénnej stimulácii. 
1.4.3.2. Pri každej koncentrácii sa používajú duplicitné kultúry a rozhodne sa 
odporúčajú pre negatívne/rozpúš ťadlové kontrolné kultúry. Ak 
možno demonštrova ť minimálnu variáciu medzi duplicitnými kultú ­
rami (13) (14) z historických údajov, môže by ť pre jednotlivé 
kultúry prijate ľné použitie pri každej koncentrácii. 
Plynné alebo prchavé látky sa testujú príslušnými metódami, ako 
napríklad v hermeticky uzavretých nádobách (15) (16).  
1.4.3.3.  Čas zberu kultúry  
Pri prvom pokuse sú bunky vystavené testovacej látke, a to 
s metabolickou aktiváciou aj bez metabolickej aktivácie na 3 – 6 
hodín, a vzorky z nich sa odoberajú v čase rovnajúcom sa približne 
1,5-násobku d ĺžky bežného cyklu buniek po za čatí pokusu (12). Ak 
tento protokol ukáže negatívne výsledky s aktiváciou i bez aktivácie, uskutoční sa ďalší pokus bez aktivácie s neustálym podávaním až po 
odobratie vzorky v čase rovnajúcom sa približne 1,5-násobku d ĺžky 
bežného cyklu buniek. Niektoré chemikálie sa dajú jednoduchšie zistiť pri časoch dlhších ako 1,5-násobok d ĺžky cyklu. Negatívne 
výsledky s metabolickou aktiváciou sa musia potvrdi ť od prípadu 
k prípadu. V tých prípadoch, ke ď sa potvrdenie negatívnych 
výsledkov nepovažuje za potrebné, vypracuje sa zdôvodnenie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Príprava chromozómov  
Bunkové kultúry sa ošetrujú Colcemidom® alebo colchicinom 
zvyčajne 1 – 3 hodiny pred zberom. Každá bunková kultúra sa 
zbiera a spracúva oddelene na prípravu chromozómov. Príprava 
chromozómov zah ŕňa hypotonické ošetrenie buniek, fixáciu 
a sfarbenie.  
1.4.3.5.  Analýza  
Všetky sklí čka vrátane sklí čok s pozitívnymi a negatívnymi kontro ­
lami sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle ozna čia kódmi. 
Keďže fixačné postupy často ústia do pretrhnutia časti metafázových 
buniek so stratou chromozómov, vyhodnocované bunky by preto mali obsahova ť niekoľko centromér rovnajúcich sa modálnemu 
číslu ± 2 pre všetky typy buniek. Na jednu koncentráciu 
a kontrolnú vzorku sa vyhodnocuje najmenej 200 dobre rozšírených metafáz, rovnakým dielom rozdelených medzi duplikátmi. Tento počet možno zníži ť, ak sa pozoruje vysoký po čet odchýlok. 
Hoci účelom tohto testu je zisti ť štrukturálne chromozómové 
odchýlky, je dôležité zaznamena ť polyploidiu a endoreduplikáciu, 
keď sa tieto javy pozorujú.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Experimentálnou jednotkou je bunka, a preto sa hodnotí percentuálny 
podiel buniek so štrukturálnou chromozómovou odchýlkou/odchýlkami. Rôzne typy štrukturálnych chromozómových odchýlok sa uvádzajú 
v zozname s ich číslami a frekvenciami pre pokusné a kontrolné kultúry. 
Trhliny sa zaznamenávajú oddelene a uvádzajú sa, ale zvy čajne sa 
nezahŕňajú do celkovej frekvencie odchýlok. 
Zaznamenávajú sa tiež súbežné merania cytotoxicity pre všetky 
ošetrené a negatívne kontrolné kultúry pri hlavných pokusoch. 
Uvádzajú sa údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa tiež 
sumarizujú v tabu ľkovej forme. 
Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej reakcie. Nejasné 
výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním, najmä využitím modifi ­
kácie pokusných podmienok. Potreba potvrdenia negatívnych výsledkov bola uvedená v bode 1.4.3.3. Modifikácia študijných para ­
metrov na rozšírenie rozsahu hodnotených podmienok sa zváži pri 
dodatočných pokusoch. Študijné parametre, ktoré sa môžu modifiko ­
vať, zahŕňajú koncentráciu a podmienky metabolickej aktivácie.
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast spojený s koncentráciou alebo reprodukovate ľný 
nárast po čtu buniek s chromozómovými odchýlkami. Najprv sa 
zvažuje biologická relevantnos ť výsledkov. Ako pomôcka sa pri 
hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (3) (13). 
Štatistický význam nie je pre pozitívnu reakciu jediným ur čujúcim 
faktorom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Nárast po čtu polyploidných buniek môže nazna čovať, že testovacia 
látka má potenciál brzdi ť mitotické procesy a indukova ť numerické 
chromozómové odchýlky. Nárast po čtu buniek 
s endoreduplikovanými chromozómami môže nazna čovať, že testo ­
vacia látka má potenciál brzdi ť priebeh bunkového cyklu (17) (18). 
Testovacia látka, pre ktorú výsledky nesp ĺňajú vyššie uvedené krité ­
riá, sa v tomto systéme považuje za nemutagénnu. 
Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne 
výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylú či 
konečný verdikt o aktivite testovacej látky. Výsledky môžu osta ť 
nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní 
pokusu. 
Pozitívne výsledky  in vitro  testu chromozómovej odchýlky 
u cicavcov nazna čujú, že testovacia látka vyvoláva štrukturálne chro ­
mozómové odchýlky v kultúrach somatických buniek cicavcov. Negatívne výsledky nazna čujú, že v testovacích podmienkach testo ­
vacia látka neindukuje chromozómové odchýlky v kultúrach soma ­
tických buniek cicavcov.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Bunky: — typ a zdroj buniek, 
— karyotyp a vhodnos ť použitého typu bunky, 
— neprítomnos ť mykoplazmy, ak je to vhodné, 
— informácie o d ĺžke cyklu bunky, 
— pohlavie darcov krvi, celej krvi alebo separovaných lymfocytov, 
použitý mitogén, 
— počet prechodov, ak je to vhodné, 
— metódy udržiavania bunkovej kultúry, ak je to vhodné, — modálne číslo chromozómov. 
Podmienky testov: 
— identita látky zadržiavajúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie 
expozície bunky, 
— zdôvodnenie výberu koncentrácií a po čtu kultúr vrátane napríklad 
údajov o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti, ak sú dostupné, 
— skladba média, koncentrácia CO
 2 , ak je to vhodné,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— koncentrácia testovacej látky, 
— objem nosi ča a pridanej testovacej látky, 
— inkuba čná teplota, 
— inkuba čná doba, 
— trvanie ošetrovania, — hustota buniek pri vysádzaní, ak je to vhodné, 
— typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií 
prijateľnosti, 
— pozitívne a negatívne kontrolné kultúry, 
— metódy prípravy vzoriek, — kritériá na hodnotenie odchýlok, — počet analyzovaných metafáz, 
— metódy merania toxicity, 
— kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné. 
Výsledky: — známky toxicity, napríklad stupe ň hromadenia, údaje o cykle 
bunky, po čty buniek, mitotický index, 
— príznaky zrážania, 
— údaje o pH a osmolalite média, ak sú stanovené, 
— definícia odchýlok vrátane trhlín, — počet buniek s chromozómovými odchýlkami a typ chromozó ­
mových odchýlok uvedené oddelene pre každú ošetrenú a kontrolnú kultúru, 
— zmeny v ploidii, ak sa pozorujú, — vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— štatistické analýzy, ak existujú, 
— údaje o negatívnej (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnej kultúre, 
— historické údaje o negatívnej (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnej 
kultúre, s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýl ­
kami. 
Rozbor výsledkov Závery
 
4. ODKAZY  
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, in: Chemical Mutagens, Principles and 
Methods for Their Detection, vol. 4, Hollander, A. (ed), Plenum Press, New York a Londýn, s. 1 – 29. 
(2) Ishidate, M. Jr. a Sofumi, T. (1985), The  In Vitro  Chromo ­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, 
vol. 5, Ashby, J. et al. (eds), Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam – New York – Oxford, s. 427 – 432.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. a Zeiger, E. (1978), Chromosome Aberration and Sister Chromatic Exchanges in Chinese Hamster Ovary 
Cells: Evaluation of 108 chemicals, Environ, Molec. Mutagen, 
10 (suppl. 10) s. 1-175. 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R R, Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. a Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, s. 147 – 204. 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. a Okumura, K. (1992), 
Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation. Res., 268, s. 297 – 305. 
(6) Ames, B. N, McCann, J. a Yamasaki, E. (1975), Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, s. 347 – 364. 
(7) Maron, D. M a Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, 
s. 173 – 215. 
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meyers, M. 
a de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/ ­
Carcinogens after Activation in a Microsomal System  In Vitro,  
I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid 
Exchange by Dietylnitrozamine (DEN) a Dimetylnitrozamine 
(DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat Liver Microso ­
mes, Mutation Res., 37, s. 83 – 90. 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. a Ishidate, M. Jr. (1979), Chromo ­
somal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix in Vitro , Mutation Res., 66, s. 277 – 290. 
(10) Elliot, B. M., Combes, R D. Elcombe, C. R, Gatehouse, D. G., 
Gibson, G. G., Mackay, J. M. a Wolf, R. C. (1992), Report of 
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tive to Aroclor 1254-Induced S9,  In Vitro  Genotoxicity 
Assays, Mutagenesis, 7, s. 175 – 177. 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. a Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyl as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J, 
Fouts, J. R, Bend, J. R a Philpot, R M (eds), In Vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis testing, Elsevier, North 
Holland, s. 85 – 88. 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. I, Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994) 
Report from Working Group on  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation Res., 312, s. 241 – 261. 
(13) Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. a Phillips, B. (1989), Analysis of Data from  In 
Vitro  Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity test Data, Kirkland, D. J. (ed), Cambridge University 
Press, Cambridge, s. 141 – 154. 
(14) Soper, K. A. a Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  in Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells, Mutation Res., 312, s. 139 – 149. 
(15) Krahn, D. F. Barsky, F. C. a McCooey, K. T. (1982), CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile 
Liquids, in: Tice, R R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds.), Geno ­
toxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, s. 91 – 103.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. a Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Muta ­
gens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, s. 795 – 801. 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese 
Hamster cells during Alpha Radiation Induced G2 arrest, 
Mutation Res., 119, s. 403 – 413. 
(18) Huang, Y., Change, C, Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, s. 1362 – 1364.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGÉNNOS Ť – IN VIVO  TEST CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY V KOSTNEJ DRENI CICAVCOV  
1. METÓDA  
Táto metóda je obdobou metódy OECD TG 475  in vivo  testu chro ­
mozómovej odchýlky v kostnej dreni cicavcov (1997).  
1.1. ÚVOD  
In vivo  test chromozómovej odchýlky sa používa na zis ťovanie 
štrukturálnych chromozómových odchýlok vyvolaných testovacou látkou v kostnej dreni zvierat, zvy čajne hlodavcov (1) (2) (3) (4). 
Štrukturálne chromozómové odchýlky sa vyskytujú v dvoch typoch, 
chromozómové alebo chromatidové. Zvýšenie hladiny polyploidie môže nazna čovať, že chemikália má potenciál indukova ť numerické 
odchýlky. Vä čšina chemických mutagénov indukuje odchýlky chro ­
matidového typu, vyskytujú sa však aj odchýlky chromozómového 
typu. Chromozómové mutácie a podobné udalosti sú prí činou 
mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostato čné dôkazy 
o tom, že chromozómové mutácie a podobné udalosti spôsobujúce 
zmeny onkogénov a génov na potlá čanie nádorov sú prítomné pri 
výskyte rakoviny u ľudí a v pokusných systémoch. 
Pri tomto teste sa zvy čajne používajú hlodavce. Cie ľovým tkanivom 
pri teste je kostná dre ň, pretože je to vysoko vaskularizované tkanivo 
a obsahuje populáciu rýchlo cyklujúcich buniek, ktoré sa dajú jedno ­
ducho oddeli ť a spracova ť. Iné druhy a cie ľové tkanivá sa pri tomto 
teste nepoužívajú. 
Tento test chromozómovej odchýlky je osobitne relevantný pre 
hodnotenie mutagénnych rizík, pretože umož ňuje zváženie faktorov  
in vivo  metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA, 
hoci tieto sa môžu od druhu k druhu a od tkaniva k tkanivu líši ť. In 
vivo test je tiež užito čný pre ďalšie skúmanie mutagénnych ú činkov 
zistených  in vitro  testom. 
Ak existujú dôkazy, že testovacia látka alebo reaktívny metabolit 
nedosiahne cie ľové tkanivo, nie je vhodné tento test použi ť. 
Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Odchýlka chromatidového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie jednotlivých chromatidov alebo pretrhnutie a spojenie medzi chromatidmi.  
Odchýlka chromozómového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie alebo pretrhnutie 
a opätovné spojenie oboch chromatidov na rovnakom mieste.  
Endoreduplikácia:  proces, v ktorom po S perióde replikácie DNA 
jadro neprechádza do mitózy, ale za čína novú S periódu. Výsledkom 
sú chromozómy so 4, 8, 16... chromatidmi.  
Trhlina:  achromatická lézia, menšia ako šírka jedného chromatidu, 
s minimálnym posunutím chromatidov.  
Číselná (numerická) odchýlka:  zmena v po čte chromozómov 
v porovnaní s normálnou číselnou (numerickou) charakteristikou 
použitých buniek.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polyploidia:  násobok haploidného po čtu chromozómov ( n) odlišný 
od počtu diploidov (t. j. 3n, 4n at ď.) 
Štrukturálna odchýlka:  zmena v chromozómovej štruktúre rozpoz ­
nateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia 
buniek, pozorovaná ako vynechania a fragmenty, vnútorné zmeny 
alebo zámeny.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Zvieratá sa exponujú testovacej látke vhodnou expozíciou a utratia sa 
vo vhodnom čase po ošetrení. Pred utratením sa zvieratá ošetria 
prostriedkom zastavujúcim metafázu (napríklad Colcemidom® 
alebo colchicinom). Následne sa z kostnej drene urobia chromozó ­
mové prípravky, zafarbia sa a pri metafázových bunkách sa analy ­
zujú chromozómové odchýlky.  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Výber živo číšnych druhov  
Bežne sa používajú krysy, myši a čínske mor čatá, hoci použi ť sa 
dajú akéko ľvek vhodné druhy cicavcov. Vyberajú sa bežne použí ­
vané laboratórne rody mladých zdravých dospelých zvierat. Na 
začiatku štúdie by mala by ť hmotnostná variácia zvierat minimálna 
a nemala by presiahnu ť ± 20 % strednej hmotnosti každého pohlavia.  
1.4.1.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode 
k časti B, cie ľovou hodnotou pre vlhkos ť je 50 % – 60 %.  
1.4.1.3.  Príprava zvierat  
Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a pokusných skupín. Klietky sú umiestnené tak, aby sa minimalizo ­
vali možné ú činky vyplývajúce z rozmiestnenia klietok. Zvieratá sa 
jednotlivo ozna čia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne 
podmienky najmenej pä ť dní.  
1.4.1.4.  Príprava dávok  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch, a ak je to vhodné, rozrie ďujú sa pred 
podávaním dávok zvieratám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú 
priamo alebo pred podávaním rozriedené. Používajú sa čerstvé 
prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje o stabilite nepoukazujú na 
vhodnosť uskladnenia.  
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemalo ma ť toxické ú činky v používaných 
úrovniach dávok a nemali by chemicky reagova ť s testovacou látkou. 
Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich 
použitie by malo by ť podporené referen čnými údajmi ozna čujúcimi 
ich kompatibilitu. Odporú ča sa zváži ť, pokiaľ je to možné, použitie 
vodného rozpúš ťadla/nosiča. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrolné skupiny  
Pri každom pokuse sa pre každé pohlavie vytvoria pozitívne 
a negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolné skupiny. Okrem podávania 
testovacej látky sa so zvieratami v kontrolných skupinách zaob ­
chádza rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami. 
Pozitívna kontrolná skupina vytvára štrukturálne odchýlky  in vivo  pri 
úrovniach expozície, pri ktorých sa o čakáva zistite ľný nárast na 
pozadí. Dávky pozitívnej kontrolnej skupiny sa volia tak, aby ú činky 
boli zjavné, ale aby pozorovate ľovi priamo neodha ľovali identitu 
kódovaných vzoriek. Je prijate ľné, aby sa pozitívnym kontrolným 
skupinám látky podávali spôsobom odlišným od testovacej látky a vzorky z nich sa odoberali iba raz. Možno zváži ť použitie 
príbuzných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede 
chemikálií. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú skupinu látok:
 
Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
etyl metánsulfonát 62-50-0 200-536-7 
etylnitrozmo čovina 759-73-9 212-072-2 
mytomicin C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid 
monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
trietylénmelamín 51-18-3 200-083-5 
Pre každý odber vzoriek sa odoberú vzorky aj z negatívnych kontrol ­
ných skupín ošetrených rozpúš ťadlom alebo nosi čom a inak ošetro ­
vaných rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny, pokia ľ nie sú 
z historických kontrolných údajov dostupné údaje o variabilite 
medzi zvieratami a frekvenciách buniek s chromozómovou odchýl ­
kou. Ak sa pre negatívne kontrolné skupiny používa jeden odber vzorky, najvhodnejším časom je prvý čas odberu. Používajú sa aj 
neošetrené kontrolné skupiny, pokia ľ neexistujú historické kontrolné 
údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúš ťadlo alebo nosi č nespôso­
bujú žiadne rušivé alebo mutagénne ú činky.
 
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Každá pokusná a kontrolná skupina obsahuje najmenej pä ť analyzo­
vateľných zvierat každého pohlavia. Ak v čase uskuto čnenia štúdie 
sú dostupné údaje zo štúdií rovnakých druhov a používajúce rovnaké cesty expozície, ktoré ukazujú, že neexistujú významné rozdiely v toxicite medzi pohlaviami, sta čí aj testovanie jedného pohlavia. 
Ak je expozícia chemikálií na ľudí závislá od pohlavia, ako 
napríklad pri niektorých farmaceutických prípravkoch, test sa usku ­
toční na zvieratách príslušného pohlavia.
 
1.5.2.  Harmonogram ošetrovania  
Testovacie látky sa podávajú pri jednom ošetrení. Testovacie látky sa 
tiež môžu podáva ť v dvoch dávkach, t. j. dve ošetrenia v ten istý de ň 
niekoľko hodín po sebe na u ľahčenie podania ve ľkého objemu látky. 
Iné dávkovacie režimy sa vedecky zdôvodnia.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Vzorky sa odoberajú v dvoch rôznych časoch po ošetrení v jeden 
deň. Pre hlodavce je prvým intervalom odberu vzorky 1,5-násobok 
dĺžky bežného bunkového cyklu (zvy čajne 12 – 18 hodín) po ošet ­
rení. Keďže čas potrebný na strávenie a metabolizmus testovacej 
látky, ako aj jej ú činky na kinetiku bunkového cyklu môžu 
ovplyvniť optimálny čas na zistenie chromozómovej odchýlky, 
odporúča sa neskoršie odobratie vzorky 24 hodín po prvom čase 
odberu vzorky. Ak sa používajú dávkovacie režimy dlhšie ako jeden deň, používa sa jeden odber vzorky pri 1,5-násobku d ĺžky 
bežného bunkového cyklu po poslednom ošetrení. 
Pred utratením sa zvieratám podáva injek čne intraperitoneálne 
potrebná dávka prostriedku zastavujúceho metafázu (napríklad Colcemid® alebo colchicin). Po uplynutí potrebného času sa 
následne odoberajú od zvierat vzorky. Pre myši je tento čas približne 
3 – 5 hodín; pre čínske mor čatá približne 4 – 5 hodín. Bunky sa 
zbierajú z kostnej drene a analyzujú sa chromozómové odchýlky.
 
1.5.3.  Úrovne dávok  
Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskuto ční štúdia na 
zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu s použitím rovnakého druhu, rodu, pohlavia a dávkovacieho režimu ako v hlavnej štúdii (5). Ak sa vyskytuje toxicita, pre prvý odber vzorky 
sa používajú tri úrovne dávok. Tieto úrovne dávok pokrývajú rozsah 
od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu. Pri neskoršom odbere vzorky sa používa len najvyššia dávka. Najvyššia dávka sa definuje ako známky toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie úrovne 
dávkovania založené na rovnakom dávkovacom režime by pravde ­
podobne spôsobili úmrtnos ť. Látky so špecifickými biologickými 
aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) môžu by ť výnimkou kritéria stanovenia dávky 
a hodnotia sa z prípadu na prípad. Najvyššia dávka sa tiež definuje 
ako dávka, ktorá spôsobuje ur čité známky toxicity v kostnej dreni 
(napríklad: vyššie ako 50 % zníženie mitotického indexu).
 
1.5.4.  Limitný test  
Ak test pri jednej úrovni dávky najmenej 2 000 mg/kg telesnej hmot ­
nosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden de ň 
nevyvoláva žiadne toxické ú činky a ak sa neo čakáva genotoxicita 
na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia pri 
použití troch úrovní dávkovania sa nepovažuje za potrebnú. Pre 
štúdie s dlhším trvaním je limitnou dávkou 2 000 mg/kg/telesná hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce maximálne 14 dní a 1 000 mg/ ­
kg/telesná hmotnos ť/deň pre podávanie trvajúce viac ako 14 dní. 
Očakávaná expozícia ľudí môže nazna čovať potrebu vyššej úrovne 
dávky pri použití limitného testu.
 
1.5.5.  Podávanie dávok  
Testovacia látka sa zvy čajne podáva plnením žalúdka sondou 
s použitím žalúdo čnej rúrky alebo vhodnej intuba čnej kanyly, 
alebo intraperitoneálnou injekciou. Iné cesty expozície sú prijate ľné 
len so zdôvodnením. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podáva ť žalúdočnou sondou alebo injekciou závisí od ve ľkosti 
testovacieho zviera ťa. Objem by nemal presiahnu ť 2 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Použitie vyšších objemov sa musí zdôvodni ť. 
Okrem dráždivých alebo žieravých látok, ktoré bežne odhalia zhor ­ 
šené účinky s vyššími koncentráciami, sa variabilita testovacieho 
objemu minimalizuje upravením koncentrácie na zabezpe čenie 
stáleho objemu na všetkých úrovniach dávok.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Príprava chromozómov  
Ihneď po utratení sa získava kostná dre ň, ktorá sa vystaví hypoto ­
nickému roztoku a fixuje sa. Bunky sa potom umiestnia na sklí čka 
a zafarbia.  
1.5.7.  Analýza  
Mitotický index sa stanovuje ako meradlo cytotoxicity aspo ň na 
1 000 bunkách na jedno zviera pre všetky pokusné zvieratá (vrátane pozitívnej kontrolnej skupiny) a pre neošetrené negatívne kontrolné zvieratá. 
Pre každé zviera sa analyzuje najmenej 100 buniek. Tento po čet 
možno zníži ť pri pozorovaní vysokého po čtu odchýlok. Všetky 
sklíčka vrátane sklí čok z negatívnych a pozitívnych kontrolných 
skupín sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle ozna čia kódmi. 
Keďže postupy prípravy sklí čok často ústia do pretrhnutia časti meta­
fázy so stratou chromozómov, ozna čené bunky by mali obsahova ť 
počet centromér rovnajúci sa hodnote 2n ± 2.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabu ľkovej forme. 
Experimentálnou jednotkou je jedno zviera. Pre každé zviera sa 
hodnotí po čet buniek, po čet odchýlok na bunku a percento buniek 
so štrukturálnou chromozómovou odchýlkou/odchýlkami. Rôzne typy štrukturálnych chromozómových odchýlok sa uvádzajú 
v zozname s ich číslami a frekvenciami pre experimentálne 
a kontrolné kultúry. Trhliny sa zaznamenávajú oddelene a uvádzajú sa, ale zvy čajne sa neudávajú pri celkovej frekvencii 
odchýlok. Ak neexistujú dôkazy rozdielov medzi reakciami rôznych 
pohlaví, údaje z oboch pohlaví sa môžu kombinova ť pre štatistickú 
analýzu.
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast relatívneho po čtu buniek s chromozómovými 
odchýlkami spojený s dávkou alebo jasný nárast po čtu buniek 
s odchýlkami v jednej dávkovacej skupine pri jednom odbere 
vzorky. Najprv sa zvažuje biologická relevantnos ť výsledkov. Ako 
pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (6). Nejasné výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním, 
najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. 
Nárast polyploidie môže nazna čovať, že testovacia látka má poten ­
ciál indukova ť číselné chromozómové odchýlky. Nárast endoredupli ­
kácie môže nazna čovať, že testovacia látka má potenciál brzdi ť 
priebeh bunkového cyklu (7) (8). 
Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne 
výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vylú čia konečný verdikt 
o aktivite testovacej látky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Výsledky môžu osta ť nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na 
počet opakovaní pokusu. 
Pozitívne výsledky  in vivo  testu chromozómovej odchýlky nazna ­ 
čujú, že ur čitá látka vyvoláva štrukturálne chromozómové odchýlky 
v kostnej dreni testovaného druhu. 
Negatívne výsledky nazna čujú, že v testovacích podmienkach testo ­
vacia látka neindukuje chromozómové odchýlky v kostnej dreni 
testovaného druhu.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— rozpustnos ť a stálosť testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Testované zvieratá: 
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky chovu, strava at ď., 
— individuálna hmotnos ť zvierat na za čiatku testu vrátane rozsahu 
telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre každú skupinu. 
Podmienky testov: 
— pozitívne a negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolné skupiny, 
— údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa uskuto čnila, 
— zdôvodnenie výberu kone čnej úrovne, 
— podrobnosti o príprave testovacej látky, — podrobnosti o podávaní testovacej látky, 
— zdôvodnenie výberu spôsobu podávania, 
— metódy overovania, že testovacia látka dosiahla všeobecný 
vnútorný obeh alebo cie ľové tkanivo, ak je to vhodné, 
— konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na 
samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnos ť/deň), ak je to vhodné, 
— podrobnosti o kvalite stravy a vody, 
— metódy merania toxicity,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— identita látky zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie 
podávania, 
— metódy prípravy sklí čok, 
— kritériá na hodnotenie odchýlok, — počet analyzovaných buniek na jedno zviera, 
— kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné. 
Výsledky: 
— známky toxicity, — mitotický index, — typ a po čet odchýlok uvedený jednotlivo za každé zviera, 
— celkový po čet odchýlok na skupinu so strednou hodnotou 
a štandardnou odchýlkou, 
— počet buniek s odchýlkami na skupinu so strednou hodnotou 
a štandardnou odchýlkou, 
— zmeny v ploidii, ak sa pozorovali, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— štatistické analýzy, ak sa použili, — údaje o negatívnych kontrolných skupinách, 
— historické údaje o negatívnych kontrolných skupinách 
s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami, 
— údaje o pozitívnych kontrolných skupinách. 
Rozbor výsledkov Závery
 
4. ODKAZY  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests In Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt a J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, s. 275 – 306. 
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. a Shelby, M. (1987), Mammalian  in vivo  Cytogenetic Assays. 
Analysis of Chromosome Aberration in Bone Marrow Cells, in: 
Mutation Res., 189, s. 157 – 165. 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Boot ­
man, J. a Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays, in: 
D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part I revised, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, new York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, s. 115 – 141. 
(4) Tice, R. R, Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H, Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H, Soutou, S. a Vannier, B., (1994) Report from the Working 
Group on the  in vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosom 
Aberration Test, Mutation Res., 312, s. 305 – 312. 
(5) Fielder, R I, Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, I, 
Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. a Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose Setting in  In vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, s. 313 – 319.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R, Richold, M., Papworth, D. G. 
a Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  in vivo  Cyto­
genetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III, Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed), Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, s. 184 – 232. 
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese Hamster 
Cells during Alpha Radiation Induced G2 Arrest, Mutation Res., 119, s. 403 – 413. 
(8) Huang, Y., Change, C. a Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin 
Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells, Cancer 
Res., 43, s. 1362 – 1364.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGÉNNOS Ť – IN VIVO  TEST MIKROJADRA 
ERYTROCYTU U CICAVCOV  
1. METÓDA  
Táto metóda je obdobou OECD TG 474  in vivo  testu mikrojadra 
erytrocytu u cicavcov (1997).  
1.1. ÚVOD  
In vivo  test mikrojadra erytrocytu u cicavcov sa používa na zis ťo­
vanie poškodenia vyvolaného testovacou látkou na chromozómoch 
alebo mitotickom aparáte erytroblastov analýzou erytrocytov odobra ­
tých z kostnej drene a/alebo periferálnych krvných buniek zvierat, zvyčajne hlodavcov. 
Účelom testu mikrojadra je identifikova ť látky, ktoré spôsobujú cyto ­
genetické poškodenie s tvorbou mikrojadier obsahujúcich zaostáva ­
júce chromozómové fragmenty alebo celé chromozómy. 
Keď sa erytroblast kostnej drene vyvinie na polychromatický erytro ­
cyt, hlavné jadro sa odpudzuje; akýko ľvek mikronukleus, ktorý sa 
vytvoril, môže osta ť pozadu v inak anukleovanej cytoplazme. Vizua ­
lizácia mikrojadier je v týchto bunkách jednoduchšia, pretože nemajú hlavné jadro. Nárast frekvencie mikronukleovaných polychromatic ­
kých erytrocytov u pokusných zvierat je indikáciou vyvolaného chro ­
mozómového poškodenia. 
Pri tomto teste sa zvy čajne používa kostná dre ň hlodavcov, ke ďže 
polychromatické erytrocyty sa tvoria v tomto tkanive. Meranie 
mikronukleovaných nezrelých (polychromatických) erytrocytov 
v periférnej krvi je rovnako prijate ľné pre akéko ľvek druhy, pri 
ktorých sa preukázala neschopnos ť sleziny odstra ňovať mikronukleo ­
vané erytrocyty alebo ktoré vykázali rovnakú citlivos ť na zistenie 
činiteľov, ktoré spôsobujú štrukturálne alebo numerické chromozó ­
mové odchýlky. Mikrojadrá sa dajú rozlíši ť podľa niekoľkých krité ­
rií. Ide napríklad o identifikáciu prítomnosti alebo neprítomnosti kinetochoru alebo centromerickej DNA v mikrojadrách. Frekvencia 
mikronukleovaných nezrelých (polychromatických) erytrocytov je 
principiálnym hlavným parametrom. Po čet zrelých (normochromatic ­
kých) erytrocytov v periférnej krvi, ktorá obsahuje mikrojadrá medzi daným po čtom zrelých erytrocytov, sa tiež môže použi ť ako para ­
meter pokusu, ak tento prebieha štyri a viac týžd ňov. 
Tento  in vivo  test mikrojadra cicavcov je pre hodnotenie mutagén ­
neho rizika osobitne relevantný, pretože umož ňuje zváženie faktorov  
in vivo
 metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA, 
hoci tieto sa môžu z druhu na druh, z tkaniva na tkanivo a z géna na 
gén líšiť. In vivo  test je tiež užito čný pre ďalšie skúmanie mutagén ­
nych účinkov zistených  in vitro  systémom. 
Ak existujú dôkazy, že testovacia látka alebo reaktívny metabolit 
nedosiahne cie ľové tkanivo, nie je vhodné tento test použi ť. 
Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINÍCIE  
Centromera (kinetochora):  oblasť/oblasti chromozómu, s ktorými 
sú spojené vretenové vlákna po čas delenia buniek, umož ňujúce 
riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek.  
Mikrojadrá:  malé jadrá oddelené od hlavných jadier buniek 
a pridaných k nim, vytvárané po čas telofázy mitózy (meiózy) zaostá ­
vajúcimi chromozómovými fragmentmi alebo celými chromozó ­
mami.  
Normochromatický erytrocyt:  zrelý erytrocyt, ktorý neobsahuje 
ribozómy a od nezrelých polychromatických erytrocytov sa líši 
škvrnami typickými pre ribozómy.  
Polychromatický erytrocyt:  nezrelý erytrocyt v medzištádiu vývoja, 
ktorý stále obsahuje ribozómy, a preto sa od zrelých normochroma ­
tických erytrocytov líši škvrnami typickými pre ribozómy.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Zvieratá sú vystavené testovacej látke príslušným spôsobom. Ak sa 
používa kostná dre ň, zvieratá sa utratia vo vhodnom čase po podaní 
látky, kostná dre ň sa vyberie a prípravky (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) sa 
zhotovia a zafarbia. Ak sa používa periférna krv, odoberá sa vo 
vhodnom čase po podaní látky a prípravky (4) (8) (9) (10) sa 
zhotovia a zafarbia. Pre štúdie s periférnou krvou by medzi poslednou expozíciou a zberom buniek mal ubehnú ť minimálny 
čas. Preparáty sa analyzujú na prítomnos ť mikrojadier.
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Výber živo číšneho druhu  
Ak sa používa kostná dre ň, odporúča sa použi ť krysy a myši, hoci 
použiť sa dajú akéko ľvek vhodné druhy cicavcov. Ak sa používa 
periférna krv, odporú ča sa použi ť myši. Použi ť sa však dajú 
akékoľvek vhodné druhy cicavcov za predpokladu, že ide o druh, 
v ktorom slezina neodstra ňuje mikronukleované erytrocyty, alebo 
druh, ktorý vykazuje primeranú citlivos ť na zistenie činiteľov, 
ktoré spôsobujú štrukturálne alebo číselné chromozómové odchýlky. 
Vyberajú sa bežne používané laboratórne kmene mladých zdravých 
dospelých zvierat. Na za čiatku štúdie by mala by ť hmotnostná 
variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnu ť ± 20 % strednej 
hmotnosti každého pohlavia.  
1.4.1.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode 
k časti B, cie ľovou hodnotou pre vlhkos ť je 50 % – 60 %.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Príprava zvierat  
Zdravé mladé dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a pokusných skupín. Zvieratá sa jednotlivo ozna čia. Zvieratá sa 
aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej pä ť dní. Klietky 
sú umiestnené tak, aby sa minimalizovali možné ú činky vyplývajúce 
z rozmiestnenia klietok.  
1.4.1.4.  Príprava dávok  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch, a ak je to vhodné, rozrie ďujú sa pred 
podávaním dávok zvieratám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú 
priamo alebo pred podávaním rozriedené. Používajú sa čerstvé 
prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje o stabilite nepoukazujú na 
vhodnosť uskladnenia.  
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemal vyvoláva ť toxické ú činky 
v používaných úrovniach dávok a nemal by chemicky reagova ť 
s testovacou látkou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podpori ť referenčné údaje 
označujúce ich kompatibilitu. Odporú ča sa zváži ť, pokiaľ je to 
možné, použitie vodného rozpúš ťadla/nosiča.
 
1.4.2.2.  Kontrolné skupiny  
Pri každom pokuse sa pre každé pohlavie vytvoria pozitívne 
a negatívne (rozpúš ťadlo alebo nosi č) kontrolné skupiny. Okrem 
podávania testovacej látky sa so zvieratami v kontrolných skupinách 
zaobchádza rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami. 
Pozitívne kontrolné skupiny vytvárajú mikrojadrá  in vivo  
v úrovniach expozície, pri ktorých sa o čakáva zistite ľný nárast na 
pozadí. Dávky pozitívnej kontrolnej skupiny sa volia tak, aby ú činky 
boli zjavné, ale aby pozorovate ľovi priamo neodha ľovali identitu 
kódovaných vzoriek. Je prijate ľné, aby sa pozitívnym kontrolným 
skupinám podávali látky spôsobom odlišným od testovacej látky a vzorky z nich sa odoberali iba raz. Možno zváži ť použitie príbuz ­
ných chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede chemikálií, 
ak sú tieto dostupné. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú skupinu:
 
Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 
N-etyl-N-nitrozmo čovina 759-73-9 212-072-2 
mytomycín C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid 
monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 
055-19-2 200-015-4 
trietylénmelamín 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Pre každý odber vzoriek sa odoberú aj vzorky z negatívnych kontrol ­
ných skupín ošetrených rozpúš ťadlom alebo nosi čom a inak ošetro ­
vaných rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny, pokia ľ nie sú 
z historických kontrolných údajov dostupné údaje o variabilite medzi zvieratami a frekvenciách buniek s chromozómovou odchýl ­
kou. Ak sa pre negatívne kontrolné skupiny používa jeden odber 
vzorky, najvhodnejším časom je prvý odber. Používajú sa aj neoše ­
trené kontrolné skupiny, pokia ľ neexistujú historické kontrolné údaje 
demonštrujúce, že vybrané rozpúš ťadlo alebo nosi č nespôsobujú 
žiadne rušivé alebo mutagénne efekty. 
Ak sa používa periférna krv, prijate ľná je tiež vzorka pred podaním 
látky ako súbežná negatívna kontrola, ale len v prípadoch krátkych štúdií periférnej krvi (napríklad: 1 – 3 dávky), ke ď výsledné údaje sú 
v očakávanom rozsahu pre historickú kontrolu.
 
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Každá pokusná a kontrolná skupina obsahuje najmenej pä ť analyzo­
vateľných zvierat každého pohlavia. Ak v čase uskuto čnenia štúdie 
sú dostupné údaje zo štúdií rovnakých druhov a používajúce rovnaké 
spôsoby vystavenia, ktoré ukazujú, že neexistujú významné rozdiely v toxicite medzi pohlaviami, sta čí aj testovanie jedného pohlavia. Ak 
expozícia chemikálií na ľudí je závislá od pohlavia, ako napríklad pri 
niektorých farmaceutických prípravkoch, test sa uskuto ční na zvie ­
ratách príslušného pohlavia.
 
1.5.2.  Harmonogram podávania  
Nedá sa odporu čiť žiadny štandardný (t. j. jedna, dve alebo tri 
podania v 24-hodinových intervaloch) harmonogram podávania. 
Vzorky z pred ĺžených dávkovacích režimov sú prijate ľné, pokia ľ 
bol pre túto štúdiu preukázaný pozitívny ú činok alebo pokia ľ bola 
pri negatívnej štúdii preukázaná toxicita, alebo ak sa použila limitná 
dávka a dávkovanie pokra čovalo až do času odberu vzorky. Testo ­
vacie látky sa tiež môžu podáva ť v dvoch dávkach, t. j. dve ošetrenia 
v ten istý de ň niekoľko hodín po sebe na u ľahčenie podania ve ľkého 
objemu látky. 
Test sa môže uskuto čniť dvoma spôsobmi: 
a) zvieratám sa testovacia látka podá raz. Vzorky kostnej drene sa 
odoberú minimálne dvakrát, nie skôr ako 24 hodín po podaní, ale nie neskôr ako 48 hodín po podaní s primeranými intervalmi 
medzi odbermi. Uskuto čnenie odberu skôr ako 24 hodín po 
podaní sa zdôvodní. Vzorky periférnej krvi sa odoberú minimálne dvakrát, minimálne 36 hodín po podaní s primeranými intervalmi po odbere, ale nie neskôr ako po 72 hodinách. Pri zistení pozi ­
tívnej reakcie pri niektorom odbere nie je ďalší odber vzorky 
potrebný;
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) ak sa použijú dve alebo viac dávok za de ň (napríklad dve alebo 
viac dávok v 24-hodinových intervaloch), vzorky sa odoberajú 
raz medzi 18. a 24. hodinou nasledujúcou po poslednej dávke pri kostnej dreni a raz medzi 36. a 48. hodinou po poslednej dávke pri periférnej krvi (12). 
Ak je to relevantné, použijú sa ďalšie intervaly odberu vzoriek.
 
1.5.3.  Úrovne dávok  
Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskuto ční štúdia na 
zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu s použitím rovnakého druhu, rodu, pohlavia a dávkovacieho režimu ako 
v hlavnej štúdii (13). Ak sa vyskytuje toxicita, pre prvý odber 
vzorky sa používajú tri úrovne dávok. Tieto úrovne dávok pokrývajú rozsah od maximálnej po malú alebo žiadnu toxicitu. Pri neskoršom odbere vzorky sa používa len najvyššia dávka. Najvyššia dávka sa 
definuje ako známky toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie 
úrovne dávok založené na rovnakom dávkovacom režime by prav ­
depodobne spôsobili úmrtnos ť. Látky so špecifickými biologickými 
aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny 
a mitogény) môžu by ť výnimkou z kritéria stanovenia dávky 
a hodnotia sa z prípadu na prípad. Najvyššia dávka sa tiež definuje ako dávka, ktorá spôsobuje ur čité známky toxicity v kostnej dreni 
(napríklad zníženie podielu nezrelých erytrocytov na celkovom po čte 
erytrocytov v kostnej dreni alebo periférnej krvi).
 
1.5.4.  Limitný test  
Ak test pri jednej úrovni dávky najmenej 2 000 mg/kg telesnej hmot ­
nosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden de ň 
nevyvoláva žiadne toxické ú činky a ak sa neo čakáva genotoxicita 
na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia pri 
použití troch objemov dávok sa nepovažuje za potrebnú. Pre štúdie s dlhším trvaním je limitnou dávkou 2 000 mg/kg/telesná hmotnos ť/­
deň pre podávanie trvajúce maximálne 14 dní a 1 000 mg/kg/telesná 
hmotnosť/deň pre podávanie trvajúce viac ako 14 dní. O čakávaná 
expozícia na ľudí môže nazna čovať potrebu vyššej úrovne dávok pri 
použití limitného testu.
 
1.5.5.  Podávanie dávok  
Testovacia látka sa zvy čajne podáva plnením žalúdka sondou 
s použitím žalúdo čnej rúrky alebo vhodnej intuba čnej kanyly, 
alebo intraperitoneálnou injekciou. Iné spôsoby expozície sú prija ­
teľné len so zdôvodnením. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa 
môže naraz podáva ť žalúdočnou sondou alebo injekciou, závisí od 
veľkosti testovacieho zviera ťa. Objem by nemal presiahnu ť 2 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Použitie vyšších objemov sa musí zdôvodni ť. 
Okrem dráždivých alebo žieravých látok, ktoré bežne odhalia zhor ­ 
šené účinky s vyššími koncentráciami, sa variabilita testovacieho 
objemu minimalizuje upravením koncentrácie na zabezpe čenie 
stáleho objemu na všetkých úrovniach dávok.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Príprava kostnej drene/krvi  
Bunky kostnej drene sa zvy čajne získavajú zo stehennej kosti 
(femur) alebo holennej kosti (tibia) ihne ď po utratení. Zvy čajne sa 
bunky z týchto kostí odoberú, pripravia a zafarbia použitím bežných 
metód. Periférna krv sa získava z chvostovej žily alebo inej vhodnej 
žily. Krvné bunky sa ihne ď supravitálne zafarbia (8) (9) (10) alebo 
sa urobia škvrnové prípravky, ktoré sa následne zafarbia. Použitie špecifického farbiva DNA [napríklad akridínová oranž (14) alebo 
Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)] môže odstráni ť niektoré 
umelo vzniknuté štruktúry buniek spojené s používaním nešpecific ­
kého farbiva DNA. Táto výhoda nedáva predpoklad používania 
konvenčných farbív (napríklad Giemsa). Použi ť sa tiež môžu doda ­
točné systémy [napríklad celulózne st ĺpce na odstránenie nukleova ­
ných buniek (16)], a to za predpokladu, že tieto systémy vykazujú v laboratórnych podmienkach primerané výsledky pri príprave 
mikrojadier.
 
1.5.7.  Analýza  
Pre každé zviera sa stanovuje podiel nezrelých erytrocytov na 
celkovom po čte erytrocytov (zrelých plus nezrelých) spo čítaním 
celkovo najmenej 200 erytrocytov pre kostnú dre ň a 1 000 erytro ­
cytov pre periférnu krv (17). Všetky sklí čka vrátane sklí čok 
z negatívnych a pozitívnych kontrolných skupín sa pred mikrosko ­
pickou analýzou nezávisle ozna čia kódmi. Na výskyt mikronukleo ­
vaných nezrelých erytrocytov sa po číta minimálne 2 000 nezrelých 
erytrocytov na jedno zviera. Dodato čné informácie možno získa ť 
zaznamenávaním zrelých erytrocytov na mikrojadrách. Pri analýze sklíčok by podiel nezrelých erytrocytov na celkovom po čte erytro­
cytov nemal by ť menej ako 20 % kontrolnej hodnoty. Ak podávanie 
trvá bez prestávky štyri a viac týžd ňov, na výskyt mikrojadier sa 
počíta minimálne 2 000 zrelých erytrocytov na jedno zviera. Systémy 
na automatickú analýzu (vizuálna analýza a toková cytometrická 
analýza bunkových suspenzií) sú prijate ľnou alternatívou manuál ­
neho hodnotenia, ak sa príslušne zdôvodnia a potvrdia.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabu ľkovej forme. 
Experimentálnou jednotkou je jedno zviera. Pre každé zviera sa 
jednotlivo uvádza po čet nezrelých erytrocytov, po čet mikronukleo ­
vaných nezrelých erytrocytov a podiel nezrelých erytrocytov na celkovom po čte erytrocytov. Ak podávanie prebieha bez prestávky 
štyri a viac týžd ňov, udávajú sa tiež údaje o zrelých erytrocytoch, ak 
sa zhromaž ďovali. Pre každé zviera sa udáva podiel nezrelých 
erytrocytov na celkovom po čte erytrocytov, a ak je to vhodné, 
percentuálny podiel mikronukleovaných erytrocytov. Ak neexistujú 
dôkazy o rozdieloch medzi reakciami rôznych pohlaví, údaje z oboch 
pohlaví sa môžu kombinova ť pre štatistickú analýzu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast relatívneho po čtu buniek s chromozómovými 
odchýlkami spojený s dávkou alebo jasný nárast po čtu buniek 
s odchýlkami v jednej dávkovacej skupine pri jednom odbere 
vzorky. Najprv sa zvažuje biologická relevantnos ť výsledkov. Ako 
pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (18) (19). Nejasné výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním, 
najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. 
Testovacia látka, pre ktorú nesp ĺňajú výsledky vyššie uvedené krité ­
riá, sa pre tento test považuje za nemutagénnu. 
Hoci väčšina pokusov poskytne jednozna čne pozitívne alebo nega ­
tívne výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vylú čia konečný 
verdikt o aktivite testovacej látky. Výsledky môžu osta ť nejasné 
alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní pokusu. 
Pozitívne výsledky testu mikrojadier nazna čujú, že ur čitá látka vyvo ­
láva mikrojadrá, ktoré sú výsledkom chromozómového poškodenia alebo poškodenia mitotického aparátu v erytroblastoch testovaného druhu. 
Negatívne výsledky nazna čujú, že v testovacích podmienkach testo ­
vacia látka v nezrelých erytrocytoch testovaného druhu mikrojadrá nevytvára.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Testovacie zvieratá: 
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky chovu, strava at ď., 
— individuálna hmotnos ť zvierat na za čiatku testu vrátane rozsahu 
telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre každú skupinu. 
Podmienky testov: 
— pozitívne a negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolné skupiny, 
— údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa uskuto čnila,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— zdôvodnenie vo ľby úrovne dávok, 
— podrobnosti o príprave testovacej látky, — podrobnosti o podávaní testovacej látky, 
— zdôvodnenie spôsobu podávania, 
— metódy overovania, že testovacia látka dosiahla všeobecný 
vnútorný obeh alebo cie ľové tkanivo, ak je to vhodné, 
— konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na 
samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnos ť/deň), ak je to vhodné, 
— podrobnosti o kvalite stravy a vody, — podrobný opis harmonogramov podávania a odoberania vzoriek, 
— metódy prípravy sklí čok, 
— metódy merania toxicity, — kritériá po čítania mikronukleovaných nezrelých erytrocytov, 
— počet analyzovaných buniek na jedno zviera, 
— kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné. 
Výsledky — známky toxicity, — podiel nezrelých erytrocytov na celkovom po čte erytrocytov, 
— počet mikronukleovaných nezrelých erytrocytov jednotlivo pre 
každé zviera, 
— ± stredná hodnota štandardnej odchýlky mikronukleovaných 
nezrelých erytrocytov na skupinu, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— použité štatistické analýzy a metódy, — údaje o negatívnych kontrolných skupinách, 
— údaje o pozitívnych kontrolných skupinách. 
— Rozbor výsledkov — Závery
 
4. ODKAZY  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, s. 187 – 190. 
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
s. 9 – 15. 
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J. G. a Newell, G. W. (1983), 
The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res., 123, s. 61 – 118. 
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H, Cimino, M. C, Salamone, M. 
F. a Heddle, J. A. (1990), The  In vivo  Micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A Report of 
the US Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, s. 29 – 80.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R, Choy, W. N. a Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developmentsin Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell a T. S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, s. 555 – 558. 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G H., 
Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R. a Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189. 
s. 103 – 112. 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R a Shelby, M. E. 
(1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol 14, s. 513 – 522. 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. a Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, s. 245 – 249. 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryt ­
hrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The 
Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/ JEMMS, Mutation Res., 278, s. 83 – 98. 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), 
Protocol Recommended for the Short-term Mouse Peripheral Blood Micronucleus test, Mutagenesis, 10, s. 53 – 159. 
(11) Hayashi, M., Tice, R. R, MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H, Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr., F. B., Pacchi ­
crotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Soutou, S. a Vannier, B. 
(1994),  In vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Muta ­
tion Res., 312, s. 293 – 304. 
(12) Higashikuni, N. a Soutou, S. (1995), An Optimal Generalised 
Sampling Time of 30 ± 6 h after Double Dosing in the Mouse 
Peripheral Micronucleus Test, Mutagenesis, 10, s. 313 – 319. 
(13) Fielder, R I, Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, I, 
Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J. a Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose Setting  in In vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, s. 313 – 319. 
(14) Hayashi, M., Sofumi, T. a Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, s. 241 – 247. 
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. a Langlois, R. G (1983), 
A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei 
and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, s. 269 – 275. 
(16) Romagna, F. a Staniforth, C. D. (1989), The Automated Bone 
Marrow Micronucleus Test, Mutation Res., 213, s. 91 – 104. 
(17) Gollapudi, B. a McFadden, L. G (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, s. 97 – 99.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G, Boot ­
man, J. a Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, 
Cambridge Uniersity Press, Cambridge, New York, Port Ches ­
ter, Melbourne, Sydney, s. 115 – 141. 
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G E., 
Clare, G, Ferguson, R, Richold, M., Papworth, D. G. a Savage, J. R. K, (1989) Statistical Analysis of  in vivo  Cyto­
genetic Assays, in:D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenecity test Data. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, D. J. Kirkland (ed), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Mellbourne, Sydney, s. 184 – 232.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGÉNNOS Ť: BAKTERIÁLNY TEST REVERZNÝCH 
MUTÁCIÍ  
1. METÓDA  
Táto metóda je obdobou metódy OECD TG 471 bakteriálneho testu 
reverzných mutácií (1997).  
1.1. ÚVOD 
Bakteriálny test reverzných mutácií používa aminokyseliny vyžadu ­
júce kmene  Salmonella typhimurium  a Escherichia coli  na zistenie 
bodových mutácií, ktoré zah ŕňajú nahradenie, pridanie alebo vyma ­
zanie jednej alebo nieko ľkých bázových párov DNA (1) (2) (3). 
Princípom bakteriálneho testu reverzných mutácií je, že zis ťuje mutá­
cie, ktoré vracajú do pôvodného stavu mutácie prítomné v testovacích kme ňoch a obnovujú funk čnú schopnos ť baktérií synte ­
tizovať esenciálne aminokyseliny. Reverzné baktérie sa zis ťujú 
prostredníctvom ich schopnosti rás ť v neprítomnosti aminokyseliny 
vyžadovanej rodi čovským testovacím kme ňom. 
Bodové mutácie sú prí činou mnohých ľudských genetických chorôb 
a existujú dostato čné dôkazy, že bodové mutácie onkogénov a génov 
na potláčanie nádorov somatických buniek sú prítomné pri výskyte 
rakoviny u ľudí a pokusných zvierat. Bakteriálny test reverzných 
mutácií je rýchly, lacný a relatívne ľahko uskuto čniteľný. Mnohé 
z testovacích kme ňov majú viacero vlastností, ktoré spôsobujú ich 
väčšiu citlivos ť na zistenie mutácií vrátane reaktívnych DNA 
sekvencií na reverzných miestach, zvýšenej bunkovej permeability 
na veľké molekuly a eliminácie opravných systémov DNA alebo 
zlepšenia opravných procesov DNA náchylných na chyby. Špecific ­
kosť testovacích kme ňov môže poskytnú ť užitočné informácie 
o typoch mutácií, ktoré sú vyvolané genotoxickými činiteľmi. 
Dostupná je ve ľká databáza výsledkov pre rôzne štruktúry pre bakte ­
riálny test reverzných mutácií a boli vyvinuté dobré metódy na testovanie chemikálií s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnos ťami 
vrátane prchavých zmesí. 
Pozri tiež všeobecný úvod čas
ť B. 
1.2. DEFINÍCIE  
Test reverzných mutácií  buď v Salmonella typhimurium , alebo  
Escherichia coli  zisťuje mutáciu v kmeni vyžadujúcom aminokyse ­
linu (histidín alebo tryptofán) na vytvorenie kme ňa nezávislého od 
vonkajšieho prívodu aminokyseliny.  
Substitučné mutagény bázového páru  sú činitele, ktoré spôsobujú 
bázovú zmenu DNA. V teste reverzných mutácií sa môže táto zmena odohrať na mieste pôvodnej mutácie alebo na inom mieste bakteriál ­
neho genómu.  
Konštruk čné mutagény  sú činitele, ktoré spôsobujú pridanie alebo 
vymazanie jedného alebo viacerých bázových párov DNA, čím 
menia čítaciu konštrukciu DNA.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. ÚVODNÉ ÚVAHY 
Bakteriálny test reverzných mutácií využíva prokaryotické bunky, 
ktoré sa od buniek cicavcov odlišujú vo faktoroch, ako je vstrebá ­
vanie, metabolizmus, chromozómová štruktúra a opravné procesy 
DNA. Testy uskuto čnené  in vitro  vo všeobecnosti vyžadujú použitie 
exogénneho zdroja metabolickej aktivácie.  In vitro  systémy metabo ­
lickej aktivácie nemôžu plne napodobni ť in vivo  podmienky cicav ­
cov. Test preto neposkytuje priame informácie o mutagénnej 
a karcinogénnej potencii látky u cicavcov. 
Bakteriálny test reverzných mutácií sa bežne používa ako po čiatočný 
prieskum genologickej aktivity, a najmä aktivity vyvolávajúcej 
bodové mutácie. Rozsiahla databáza ukázala, že mnohé chemikálie, 
ktoré sú v tomto teste pozitívne, tiež vykazujú mutagénnu aktivitu v iných testoch. Existujú príklady mutagénnych činiteľov, ktoré sa 
nezistili týmto testom; prí čina týchto chýb sa dá pripísa ť špecifickej 
povahe zisteného stavu, rozdielom v metabolickej aktivácii alebo 
rozdielom v biodostupnosti. Na druhej strane faktory, ktoré zvyšujú citlivosť bakteriálneho testu reverzných mutácií, môžu vies ť 
k preceneniu mutagénnej aktivity. 
Bakteriálny test reverzných mutácií nemusí by ť vhodný na hodno ­
tenie určitých tried chemikálií, napríklad vysoko baktericídnych 
zlúčenín (napríklad ur čitých antibiotík) a tých, o ktorých sa pred ­
pokladá (alebo je o nich známe), že špecificky narúšajú replika čný 
systém buniek cicavcov (napríklad niektoré inhibítory topoizomerázy 
a niektoré nukleozidové napodobeniny). V takýchto prípadoch sú vhodnejšie testy mutácií u cicavcov. 
Hoci mnohé zlú čeniny, ktoré sú v tomto teste pozitívne, sú karcino ­
génmi u cicavcov, korelácia nie je absolútna. Závisí to od triedy 
chemikálie a existujú karcinogény, ktoré sa týmto testom nezistia, pretože pôsobia prostredníctvom iných negenotoxických mecha ­
nizmov alebo mechanizmov neprítomných v bunkách baktérií.
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Suspenzie bakteriálnych buniek sú vystavené testovacej látke 
v prítomnosti a neprítomnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Pri metóde použitia misiek sa tieto suspenzie zmiešajú s krycím agarom a umiestnia sa na ve ľmi malé médium. Pri metóde 
predinkubácie sa dávkovaná zmes inkubuje a potom zmieša s krycím 
agarom pred umiestnením na ve ľmi malé médium. Pri oboch tech ­
nikách sa po dvoch alebo troch d ňoch inkubácie spo čítajú reverzné 
kolónie a porovnajú sa s po čtom spontánnych kolónií revertantov na 
kontrolných miskách. 
Boli opísané viaceré postupy uskuto čnenia bakteriálneho testu reverz ­
ných mutácií. Medzi bežne používané patrí metóda použitia misiek (1) (2) (3) (4), predinkuba čná metóda (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktua čná 
metóda (9) (10) a suspenzná metóda (11). Opísané boli aj modifikácie 
testovania plynov a pár (12).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Postupy opísané v tejto metóde sa týkajú najmä metódy použitia misky 
a predinkuba čnej metódy. Obe sú prijate ľné pre uskuto čňovanie 
pokusov s metabolickou aktiváciou aj bez nej. Niektoré látky sa dajú efektívnejšie zisti ť použitím predinkuba čnej metódy. Tieto látky patria 
do tried chemikálií, ktoré zah ŕňajú alifatické nitrozamíny s krátkymi 
reťazcami, bivalentné kovy, aldehydy, azofarbivá a diazozlú čeniny, 
pyrolizidínové alkaloidy, alylové zlú čeniny a nitrozlú čeniny (3). Zistilo 
sa, že niektoré triedy mutagénov sa nie vždy objavia s použitím štan ­
dardných postupov, ako napríklad metódou použitia misky alebo pred ­
inkubačnou metódou. Tieto mutagény sa považujú za „osobitné 
prípady“ a na ich zistenie sa dôrazne odporú ča použitie alternatívnych 
postupov. Identifikované boli nasledujúce „osobitné prípady“ (spolu s príkladmi postupov, ktoré by sa dali použi ť na ich zistenie): 
azofarbivá a diazozlú čeniny (3) (5) (6) (13), plyny a prchavé 
chemikálie (12) (14) (15) (16) a glykozidy (17) (18). Odchýlka od štandardného postupu sa musí vedecky zdôvodni ť.
 
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Prípravné práce  
1.5.1.1.  Baktérie  
Čerstvé kultúry baktérií sa nechajú vyrás ť do neskorého exponen ­
ciálneho alebo skorého stacionárneho štádia rastu (približne 10  9 
buniek na ml). Kultúry v neskorom stacionárnom štádiu sa nepouží ­
vajú. Je dôležité, aby kultúry použité pri pokuse obsahovali vysoký 
podiel životaschopných baktérií. Podiel sa dá preukáza ť buď 
z minulých kontrolných údajov o rastových krivkách, alebo pri každom pokuse prostredníctvom ur čenia počtu životaschopných 
buniek miskovým pokusom. 
Odporúčaná inkuba čná teplota je 37
 o C. 
Používa sa najmenej pä ť kmeňov baktérií. Tieto zah ŕňajú štyri 
kmene  S. typhimurium  (TA 1535; TA 1537 alebo TA 97a alebo 
TA 97, TA 98 a TA 100), ktoré boli v laboratóriách preukázate ľne 
spoľahlivé a reproduktívne reaktívne. Tieto štyri kmene  S. typhimu ­
rium  majú GC bázové páry na primárnom reverznom mieste a je 
známe, že nemusia zisti ť určité oxidujúce mutagény, medzispájacie 
činitele a hydrazíny. Takéto látky sa dajú zisti ť pomocou kme ňov E. 
coli WP2 alebo  S. typhimurium  TA 102 (19), ktoré majú AT bázu na 
primárnom reverznom mieste. Odporú čanou kombináciou kme ňov je 
preto: 
— S. typhimurium  TA 1535 a 
— S. typhimurium  TA 1537 alebo TA 97, alebo TA 97a a 
— S. typhimurium  TA 98 a 
— S. typhimurium  TA 100 a 
— E. coli  WP2 uvrA alebo  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), alebo  S. 
typhimurium  TA 102. 
Na zistenie spájacích mutagénov je vhodnejšie použi ť TA 102 alebo 
pridať kmeň E. coli  [napríklad  E. coli  WP2 alebo  E. coli  WP2 
(pKMIOl)], ktorý dokonale opravuje DNA.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Na prípravu kultúr, overovanie bunkových znakov a uskladnenie sa 
používajú overené postupy. Požiadavka na aminokyselinu pre rast sa 
preukazuje pre každý prípravok zmrznutej kultúry (histidín pre kmene  S. typhimurium  a tryptofán pre kmene  E. coli ). Podobným 
spôsobom sa overujú iné fenotypové charakteristiky, menovite ak je 
potrebná prítomnos ť alebo neprítomnos ť R-faktorových plazmidov 
[napríklad odolnos ť proti ampicilínu v kme ňoch TA 98, TA 100 
a TA 97a alebo TA 97, WP2 uvrA alebo WP2 uvrA (pKM101) a odolnos ť proti ampicilínu a tetracyklínu v kmeni TA102]; prítom ­
nosť charakteristických mutácií (t. j. rfa mutácia  S. typhimurium  
prostredníctvom citlivosti na kryštálovo fialovú a uvrA mutáciu  E. 
coli alebo uvrB mutáciu  S. typhimurium  prostredníctvom citlivosti na 
ultrafialové svetlo) (2) (3). Kmene by tiež mali dosahova ť spontánne 
počty revertantných kolónií v rámci frekven čných rozsahov o čaká­
vaných pod ľa historických kontrolných údajov laboratória, najlepšie 
v rozsahu uvedenom v literatúre.
 
1.5.1.2.  Médium  
Používa sa vhodné minimálne množstvo agaru (napríklad obsahujúci 
Vogelovo-Bonnerovo minimálne médium E a glukózu) a krycí agar obsahujúci histidín a biotín alebo tryptofán umož ňujúci malý po čet 
delení buniek (1) (2) (9).
 
1.5.1.3.  Metabolická aktivácia  
Baktérie sa vystavia testovacej látke v prítomnosti i v neprítomnosti 
vhodného systému metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším 
systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofaktorom 
(S9), pripravená z pe čene hlodavcov ošetrených prípravkami na 
indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (1) (2) alebo kombináciou fenobarbitonu a betanaftoflavónu (18) (20) (21). 
Postmitochondriálna frakcia sa zvy čajne používa v koncentrácii 
v rozsahu od 5 % do 30 % v/v v zmesi S9. Výber a stav systému metabolickej aktivácie môže závisie ť od triedy testovanej chemikálie. 
V niektorých prípadoch je vhodné využi ť viac než jednu koncen ­
tráciu postmitochondriálnej frakcie. Pre azofarbivá a diazozmesi je 
vhodnejšie použi ť redukčný systém metabolickej aktivácie (6) (13).
 
1.5.1.4.  Testovacia látka/prípravok  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch, a ak je to potrebné, rozrie ďujú sa pred 
podávaním baktériám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú priamo alebo rozriedené pred podávaním. Používajú sa čerstvé prípravky 
testovacej látky, pokia ľ údaje o stabilite nepoukazujú na vhodnos ť 
uskladnenia. 
Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagova ť s testovacou látkou 
a mali by by ť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9 (22). Ak 
sa používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich použitie 
by mali podpori ť údaje ozna čujúce ich kompatibilitu. Odporú ča sa 
zvážiť, ak je to možné, použitie vodného rozpúš ťadla/nosiča. Pri 
testovaní vo vode nestabilných látok by organické rozpúš ťadla 
nemali obsahova ť vodu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Podmienky testov  
1.5.2.1.  Testovacie kmene (pozri 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Koncentrácie dávok  
Medzi kritériá, ktoré je potrebné bra ť do úvahy pri stanovovaní 
najvyššieho množstva použitej testovacej látky, patrí cytotoxicita 
a rozpustnos ť v konečnej zmesi. 
Je užitočné stanovi ť toxicitu a nerozpustnos ť pri predbežnom 
pokuse. Cytotoxicita sa dá zisti ť redukciou v množstve revertantných 
kolónií, vyjasnením alebo redukciou pozadia, alebo stup ňom prežitia 
ošetrených kultúr. Cytotoxicita látky sa môže meni ť v prítomnosti 
systémov metabolickej aktivácie. Nerozpustnos ť by sa mala ur čiť 
ako vyzrážanie v kone čnej zmesi za skuto čných podmienok testu 
a musí by ť viditeľná voľným okom. 
Odporúčaná maximálna testovacia koncentrácia rozpustných necyto ­
toxických látok je 5 mg/miska alebo 5 μl/miska. V prípade necyto ­
toxických látok, ktoré nie sú rozpustné pri 5 mg/miska alebo 5 μl/­
miska, má by ť v konečnej zmesi nerozpustná jedna alebo viac testo ­
vaných koncentrácií. Testované látky, ktoré sú cytotoxické už pod 
5 mg/miska alebo 5 μl/miska, sa majú testova ť až po cytotoxickú 
koncentráciu. Zrazenina by nemala prekáža ť vyhodnoteniu. 
Malo by sa použi ť aspoň päť rôznych analyzovate ľných koncentrácií 
testovanej látky s intervalmi približne pol log (t. j. √10) medzi 
testovanými miestami v po čiatočnom experimente. Menšie intervaly 
môžu byť vhodné vtedy, ak sa skúma vz ťah koncentrácia/reakcia. 
Možno zváži ť testovanie nad koncentráciu 5 mg/miska alebo 5 μl/­
miska, ak sa vyhodnocujú látky obsahujúce významné množstvá 
potenciálne mutagénnych ne čistôt.  
1.5.2.3.  Negatívne a pozitívne kontroly  
Pri každej skúške sa zahrnú súbežne pod ľa kmeňa špecifické pozi ­
tívne a negatívne (rozpúš ťadlo alebo nosi č) kontrolné kultúry, a to 
s metabolickou aktiváciou i bez nej. Koncentrácie pri pozitívnych 
kontrolných kultúrach sa volia tak, aby pri každej skúške vykazovali 
efektívny výkon. 
Pri pokusoch s použitím systému metabolickej aktivácie sa refe ­
renčné látky pozitívnej kontrolnej kultúry vyberajú na báze použi ­
tého typu bakteriálnych kme ňov. 
Nasledujúce látky sú príkladmi látok vhodných pre pozitívne 
kontrolné kultúry pri pokusoch s metabolickou aktiváciou.  
Číslo CAS Číslo EINECS Látka  
781-43-1 212-308-4 9,10-dimetylantracén 
57-97-6 200-359-5 7,12-dimetylbenz[a]anthracén 
50-32-8 200-028-5 benzo[a]pyrén 
613-13-8 210-330-9 2-aminoantracén  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Číslo CAS Číslo EINECS Látka  
50-18-0 cyklofosfamid 
6055-19-2 200-015-4 cyklofosfamid monohydrát 
Nasledujúca látka je vhodná pre pozitívne kontrolné kultúry pri 
metóde reduk čnej metabolickej aktivácie:  
Číslo CAS Číslo EINECS Látka  
573-58-0 209-358-4 Congo Red ( červeň Congo) 
2-aminoantracén by nemal by ť jediným indikátorom efektívnosti 
zmesi S9. Ak sa používa 2-aminoantracén, každá dávka S9 by tiež 
mala byť charakterizovaná mutagénom, ktorý vyžaduje metabolickú 
aktiváciu mikrozomálnymi enzýmami, napríklad benzo[a]pyrén, 
dimetylbenzantracén. 
Nasledujúce látky sú príkladmi pozitívnych kontrolných kultúr pod ľa 
kmeňov pre skúšky bez exogénneho systému metabolickej aktivácie:  
Číslo CAS Číslo EINECS Látka Kme ň 
26628-22-8 247-852-1 azid sodný TA 1535 a TA 100 
607-57-8 210-138-5 2-nitrofluorén TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-aminoakridín TA 1537, TA 97 a TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 a TA 97a 
80-15-9 201-254-7 kumén hydroperoxid TA 102 
50-07-7 200-008-6 mitomycín C WP2 uvrA a TA 102 70-25-7 200-730-1 N-etyl-N-nitro-N-nitrozgua ­
nidín WP2, WP2uvrA 
a WP2uvrA(pKM101) 
56-57-5 200-281-1 4-nitrochinolín-1-oxid WP2, WP2uvrA 
a WP2uvrA(pKM101) 
3688-53-7 furylfuramid (AF2) kmene obsahujúce plazmid 
Pre pozitívne kontrolné kultúry sa môžu použi ť aj ďalšie vhodné 
referenčné látky. Pod ľa dostupnosti sa zváži použitie chemikálií 
príbuzných triede chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu. 
Použijú sa tiež negatívne kontrolné vzorky pozostávajúce len 
z rozpúšťadla alebo nosi ča, bez testovacej látky a inak ošetrované 
rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny. Používajú sa aj neoše ­
trené kontrolné vzorky, pokia ľ neexistujú historické kontrolné údaje 
demonštrujúce, že vybrané rozpúš ťadlo nespôsobuje žiadne škodlivé 
alebo mutagénne ú činky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Postup  
Pri metóde s použitím misiek (1) (2) (3) (4) bez metabolickej akti ­
vácie sa zvy čajne zmieša 0,05 ml alebo 0,1 ml testovacích roztokov, 
0,1 ml čerstvej bakteriálnej kultúry (obsahujúcej približne 10  8 života­
schopných buniek) a 0,5 ml sterilného tlmiaceho roztoku s 2,0 ml 
krycieho agaru. Pri skúške s metabolickou aktiváciou sa zvy čajne 
zmieša 0,5 ml roztoku metabolickej aktivácie obsahujúceho vhodné množstvo postmitochondriálnej frakcie (v rozmedzí od 5 % do 30 % 
v/v v roztoku na metabolickú aktiváciu) s krycím agarom (2,0 ml), 
s baktériami a testovacou látkou/testovacím roztokom. Obsah oboch skúmaviek sa zmieša a vyleje sa na povrch ve ľmi malej agarovej 
misky. Krycí agar sa pred inkubáciou nechá vytvrdnú ť. 
Pri predinkuba čnej metóde (2) (3) (5) (6) sa testovacia látka/testovací 
roztok predinkubuje s testovacím kme ňom (obsahujúcim približne 
10
 8 životaschopných buniek) a sterilným tlmiacim roztokom alebo 
systémom metabolickej aktivácie (0,5 ml) zvy čajne na 20 minút 
alebo viac pri teplote 30  o C – 37  o C pred zmiešaním s krycím 
agarom a vyliatím na povrch ve ľmi malej agarovej misky. Zvy čajne 
sa mieša 0,05 alebo 0,1 ml testovacej látky/testovacieho roztoku, 0,1 
ml baktérií a 0,5 ml zmesi S9 alebo sterilného tlmiaceho roztoku s 2,0 ml krycieho agaru. Skúmavky sa po čas predinkubácie vetrajú 
použitím miešadla. 
Pri každej úrovni dávok sa kvôli primeranému odhadu variácie 
používajú tri misky. Použitie dvoch misiek je prijate ľné 
s vedeckým zdôvodnením. Ob časná strata misky pokus neznehodno ­
cuje. 
Plynné alebo prchavé látky sa testujú vhodnými metódami, ako 
napríklad vo vzduchotesne uzatvorených nádobách (12) (14) (15) (16).
 
1.5.4.  Inkubácia  
V danom pokuse sa misky inkubujú pri teplote 37  o C počas 48 – 72 
hodín. Po uplynutí inkuba čnej doby sa zráta po čet revertantných 
kolónií na misku.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje sa uvádzajú ako po čet revertantných kolónií na misku. Udáva 
sa tiež po čet revertantných kolónií pri negatívnych (kontrola rozpúš ť­
adlom a bez ošetrenia, ak sa použili) a pozitívnych kontrolných kultúrach. Jednotlivé po čty na miskách, stredná hodnota revertant ­
ných kolónií na misku a štandardná odchýlka sa uvádzajú pre testo ­
vaciu látku aj pre pozitívne a negatívne kontrolné kultúry (bez ošet ­
renia a/alebo s rozpúš ťadlom). 
Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasných pozitívnych reakcií. 
Nejasné výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním, najlepšie použitím 
modifikácie pokusných podmienok. Negatívne výsledky sa musia potvrdiť od prípadu k prípadu. V prípadoch, ke ď sa potvrdenie 
negatívnych výsledkov nepovažuje za potrebné, sa poskytne zdôvod ­
nenie. Modifikácia parametrov štúdie na rozšírenie rozsahu hodnote ­
ných podmienok sa posudzuje pri následných pokusoch. Parametre štúdie, ktoré sa dajú modifikova ť, zahŕňajú rozsahy koncentrácií, 
metódu aplikácie látky (použitie misky alebo kvapalná predinkubá ­
cia) a podmienky metabolickej aktivácie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast oproti testovanému rozsahu spojený s koncentráciou a/alebo reprodukovate ľný nárast pri jednej alebo viacerých koncen ­
tráciách po čtu revertantných kolónií na misku najmenej v jednom 
kmeni so systémom metabolickej aktivácie alebo bez systému meta ­
bolickej aktivácie (23). Najprv sa zvažuje biologická relevantnos ť 
výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov použí ­
vajú štatistické metódy (24). Štatistická významnos ť však nie je 
jediným ur čujúcim faktorom pozitívnej reakcie. 
Testovacia látka, pre ktorú nesp ĺňajú výsledky vyššie uvedené krité ­
riá, sa pre tento test považuje za nemutagénnu. 
Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne 
výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylú či 
jednoznačné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu 
ostať nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní 
pokusu. 
Pozitívne výsledky bakteriálneho testu reverzných mutácií nazna čujú, 
že určitá látka vyvoláva bodové mutácie prostredníctvom základných 
substitúcií alebo konštruk čných posunov genómu  Salmonella typhi ­
murium  a/alebo  Escherichia coli.  Negatívne výsledky nazna čujú, že 
testovacia látka nie je v testovacích podmienkach pre testované 
druhy mutagénna.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— rozpustnos ť a stálosť testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Kmene: 
— použité kmene, 
— počet buniek v kultúre, 
— charakteristiky kme ňa. 
Podmienky testov: 
— množstvo testovacej látky na misku (mg/miska alebo μl/miska) 
so zdôvodnením vo ľby dávky a po čtu misiek na koncentráciu, 
— použité médiá, 
— typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií 
prijateľnosti, 
— postupy dávkovania. Výsledky: — známky toxicity, 
— známky zrážania, 
— počty na jednotlivých miskách,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— stredná hodnota revertantných kolónií na misku a štandardná 
odchýlka, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— štatistické analýzy, ak sa uskuto čnili, 
— súbežné údaje o negatívnych (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnych 
kontrolných kultúrach s rozsahmi, strednými hodnotami 
a štandardnými odchýlkami, 
— historické údaje o negatívnych (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnych 
kontrolných kultúrach s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami. 
Rozbor výsledkov. 
Závery.
 
4. ODKAZY  
(1) Ames, B. N., McCann, J. a Yamasaki, E. (1975) Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 
31, s. 347 – 364. 
(2) Maron, D. M. a Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, s. 173 – 215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. a Zeiger, E. 
(1994) Recommendations for the Perfomance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, s. 217 – 233. 
(4) Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Príval, M., Rao, T. K. a Ray, V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: 
A Report of the US Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res., 168, s. 69 – 240. 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. a Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer letters 1, s. 91 – 96. 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. a Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Test, in: Short-term Test Systems for Detecting 
Carcinogens, ed. Norpoth, K. H. a Garner, R C, Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, s. 273 – 285. 
(7) Gatehouse, D. G, Rowland, I. R, Wilcox, P., Callender, R D. 
a Foster, R (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Muta ­
genicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cmabridge University Press, s. 13 – 61. 
(8) Aeschacher, H. U, Wolleb, U. a Porchet, L. (1987), Liquid 
Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, s. 167 – 177. 
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. a Bridges, B. A. (1976), Use of 
a Simplified Fluctuation Test to Detect Low Levels of Muta ­
gens, Mutation Res., 38, s. 33 – 42. 
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. a Bridges, J. 
W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2. vydanie, ed. Kilbey, B. J., 
Legator, M., Nichols, W. a Ramel, C, Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, s. 141 – 161.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thomson, E. D. a Melampy, P. J. (1981), An Examination of 
the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium , Environmental Mutagene ­
sis, 3, s. 453 – 465. 
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. a Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, s. 335 – 344. 
(13) Príval, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D a 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, s. 33 – 47. 
(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. 
a Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. 
Results from the Testing of 311 Chemicals (Testy mutagén ­
nosti samonelly, výsledky testovania 311 chemikálií), Environ. Mol. Mutagen., 19, s. 2 – 141. 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. a Tardiff, R. G (1977), Mutagenic 
Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in: Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges a F. Soebels (eds), Elsevier, Amsterdam, s. 249 – 258. 
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. a Claxton, L. D. 
(1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, s. 421 – 441. 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. 
a Sugimura, T. (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cyasin and Synthetic Metylazoxy Methane Conju ­
gates in  Salmonella typhimurium , Cancer Res., 39, s. 3780 – 
3782. 
(18) Tamura, G, Gold, C, Ferro-Luzzi, A. a Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
77, s. 4961 – 4965. 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., a Gatehouse, D. 
G (1990), Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 
with Escherichia Coli  WP2 Tester Strains, Mutagenesis, 5, 
s. 285 – 291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. a Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyl as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis testing, de Serres a kol. (eds), Elsevier, North Holland, s. 85 – 88. 
(21) Elliot, B. M., Combes, R D. Elcombe, C. R, Gatehouse, D. G, 
Gibson, G. G, Mackay, J. M. a Wolf, R. C. (1992), Alternative 
to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity Assays, 
Mutagenesis, 7, s. 175 – 177. 
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. a Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ ­
Microsome Test, Mutation Res., 88, s. 343 – 350. 
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K, 
Nestmann, E. a Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium/Mammalian  Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity, Mutation Res., 189, s. 83 – 91.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. a Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part II, Statis ­
tical Evaluation of Mutagenicity test Data, ed. Kirkland, D. J., 
Cambridge University Press, Cambridge, s. 28 – 65.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  TESTOVANIE MUTAGÉNNOSTI A SKRÍNING 
KARCINOGÉNNOSTI – SKÚŠKA NA GÉNOVÚ MUTÁCIU 
U SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIE 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Na zisťovanie vzniku génových mutácií indukovaných chemickými 
agensmi sa používa množstvo haploidných a diploidných kme ňov 
kvasiniek  Saccharomyces cerevisiae  buď s metabolickou aktiváciou, 
alebo bez nej. 
Môže sa použi ť systém priamych mutácií v haploidných kme ňoch 
(ade-1  alebo  ade-2),  ktoré sú červené a ďalšou mutáciou sa menia na 
dvojité biele mutanty, alebo selektívny systém, ako je indukcia rezis ­
tencie na kanavanín a cykloheximid. 
Prevažne sa však používa overený systém reverzných mutácií 
s haploidným kme ňom XV 185-14C, ktorý nesie „ochre nonsens“ 
mutácie  ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48.  Tieto mutácie sú 
reverzibilné bázovou substitúciou s použitím mutagénov, ktoré indu ­
kujú „site“ špecifické mutácie alebo „ochre“ supresorové mutácie. XV 185-14C nesie tiež  his 1-7  marker. Je to „missens“ mutácia, 
ktorá je vä čšinou reverzibilná druhou „site“ mutáciou. Takisto 
nesie ďalší marker  hom 3-10,  ktorý je reverzibilný „frameshift“ 
mutagénmi. 
Z diploidných kme ňov S. cerevisiae  sa prevažne používa kme ň D
 7 , 
ktorý je homozygotný v  ilv 1-92.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
Roztoky testovaných chemikálií a kontroly by sa mali pripravova ť 
tesne pred testovaním s použitím vhodných rozpúš ťadiel. V prípade 
organických zlú čenín, ktoré nie sú rozpustné vo vode, malo by sa 
použiť organické rozpúš ťadlo ako etanol, acetón alebo dimetylsul ­
foxid (DMSO), najviac 2 % roztok v/v. Výsledná koncentrácia 
rozpúšťadla by nemala výrazne ovplyv ňovať životaschopnos ť buniek 
a rastové parametre.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l i c k á a k t i v á c i a 
Bunky by mali by ť ovplyvnené testovanou látkou bez prítomnosti 
a s prítomnos ťou vhodného exogénneho metabolického aktiva čného 
systému. 
Najbežnejšie používaný systém je postmitochondriálna frakcia 
z pečene hlodavcov doplnená kofaktormi, vopred ovplyvnená 
látkami indukujúcimi enzýmy. Na metabolickú aktiváciu môže by ť 
vhodné použitie aj iných druhov, tkanív, postmitochondriálnych 
frakcií alebo iných postupov.  
Podmienky testovania  
T e s t o v a c i e k m e n e 
Pre testy génových mutácií je najpoužívanejší haploidný kme ň XV 
185-14C a diploidný kme ň D 7 . Vhodné môžu by ť aj iné kmene.  
M é d i á 
Pre stanovenie prežívania a po čtu mutantov sa používajú vhodné 
kultivačné médiá.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n y c h a p o z i t í v n y c h k o n t r o l 
Súbežne by sa mali použi ť pozitívne kontroly, neovplyvnené 
kontroly a kontroly s rozpúš ťadlom. Pre každý špecifický typ 
mutácií by sa mala použi ť vhodná chemikália ako pozitívna kontrola.  
K o n c e n t r á c i e v y s t a v e n i a 
Malo by sa použi ť aspoň päť primerane odstup ňovaných koncen ­
trácií testovanej látky. Pri toxických látkach by nemala najvyššia 
testovaná koncentrácia znižova ť prežívanie pod 5 % až 10 %. 
Látky relatívne nerozpustné vo vode by sa mali testova ť až do 
hranice ich rozpustnosti s použitím vhodných metód. Pri netoxických látkach vo ľne rozpustných vo vode by sa mala najvyššia použitá 
koncentrácia stanovi ť z prípadu na prípad.
 
I n k u b a č n é p o d m i e n k y 
Platne sú inkubované štyri až sedem dní pri 28  o C a 30  o C v tme.  
F r e k v e n c i a s p o n t á n n y c h m u t á c i í 
Mali by sa použi ť monokultúry s frekvenciou spontánnych mutácií 
v prijateľnom rozsahu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
P o č e t o p a k o v a n í 
Pri testovaní vzniku prototrofov génovou mutáciou a pre stanovenie 
prežívania buniek by sa mali použi ť najmenej tri opakovania pre 
každú koncentráciu. V prípade experimentov používajúcich markery ako hom 3-10  s nízkou muta čnou frekvenciou sa množstvo použitých 
platní má zvýši ť tak, aby poskytovalo štatisticky významné údaje.
 
Postupy  
Ovplyvňovanie  S. cerevisiae  sa bežne robí v tekutom prostredí 
s použitím stacionárnych alebo rastúcich buniek. Za čiatočné experi ­
menty by sa mali robi ť na rastúcich bunkách: bunky s koncentráciou 
1 – 5 × 10  7 /ml sú ovplyvnené testovanou chemikáliou maximálne 18 
hodín pri 28  o C až 37  o C pri neustálom prevzduš ňovaní; ak je 
potrebné, pridá sa po čas experimentu primerané množstvo metabo ­
lického aktivátora. Na konci ovplyvnenia sú bunky zcentrifugované, 
premyté a vysiate na vhodné kultiva čné médium. Po inkubácii sa 
platne vyhodnotia na prežívanie a indukciu génových mutácií. Ak je prvý experiment negatívny, v druhom experimente by sa mali použi ť 
bunky stacionárnej fázy. Ak je prvý experiment pozitívny, malo by 
sa to potvrdi ť vo vhodnom nezávislom experimente.
 
2. ÚDAJE  
Údaje by sa mali prezentova ť v tabuľke a udáva ť počet kolónií, 
počet mutantov, prežívania a frekvenciu mutantov. Všetky výsledky 
by sa mali potvrdi ť v nezávislom experimente. Výsledky by sa mali 
vyhodnoti ť vhodnou štatistickou metódou.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu má pod ľa možnosti obsahova ť tieto informácie: 
— použité kmene, — podmienky pri teste: rastúce bunky alebo bunky stacionárnej 
fázy, zloženie médií, trvanie inkubácie a inkuba čnú teplotu, 
metabolický aktiva čný systém, 
— podmienky vystavenia: použité koncentrácie, metódy a čas vysta­
venia a teplotu pri vystavení, pozitívne a negatívne kontroly, 
— spočítaný počet kolónií, po čet mutantov, prežívanie a frekvencia 
mutantov, vz ťah dávka/odpove ď ak je to reálne, štatistické 
vyhodnotenie údajov, 
— diskusiu o výsledkoch, 
— interpretáciu výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOTICKÁ REKOMBINÁCIA –  SACCHAROMYCESC 
CEREVISIAE  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIE 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Mitotická rekombinácia v  Saccharomyces cerevisiae  môže by ť dete­
kovaná medzi génmi (alebo všeobecnejšie medzi génom a jeho centromérou) a vnútri génov. Prvý dej sa nazýva mitotický cros ­
sing-over a vytvára recipro čné produkty, zatia ľ čo druhý dej je 
najčastejšie nerecipro čný a nazýva sa génová konverzia. 
V crossing-overe je všeobecne hodnotené množstvo recesívne homo ­
zygotných kolónií alebo sektorov vzniknutých v heterozygotnom 
kmeni, zatia ľ čo v génovej konverzii je hodnotené množstvo proto ­
trofných revertantov vzniknutých v auxotrofnom heteroalelickom kmeni, ktorý nesie dve rozdielne defektné alely v tom istom géne. 
Najbežnejšie používané kmene pre detekciu mitotickej génovej 
konverzie sú D
 4 (heteroalelický v  ade 2  a trp 5),  D 7 (heteroalelický 
v trp 5),  BZ  34 (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v  his 4  
a trp 5).  Mitotický crossing-over vytvárajúci červené a ružové homo ­
zygotné sektory môže by ť testovaný v D  5 alebo v D  7 , (v ktorom 
môžeme takisto detekova ť mitotickú génovú konverziu a reverzné 
mutácie v  ilv 1-92),  oba kmene sú heteroalelické pre komplemen ­
táciu alel  ade 2.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
Roztoky testovaných chemikálií a kontroly alebo referen čné zlúče­
niny by mali by ť pripravované tesne pred testovaním s použitím 
vhodných rozpúš ťadiel. V prípade organických zlú čenín, ktoré nie 
sú rozpustné vo vode, by sa malo použi ť organické rozpúš ťadlo ako 
etanol, acetón alebo dimetylsulfoxid (DMSO) nie viac ako 2 % 
roztok v/v. Výsledná koncentrácia rozpúš ťadla by nemala výrazne 
ovplyvňovať životaschopnos ť buniek a rastové parametre.  
M e t a b o l i c k á a k t i v á c i a 
Bunky by mali by ť ovplyvnené testovanou látkou bez prítomnosti 
a s prítomnos ťou vhodného exogénneho metabolického aktiva čného 
systému. Najbežnejšie používaný systém je post-mitochondriálna frakcia z pe čene hlodavcov doplnená kofaktormi vopred ovplyvnená 
latkami indukujúcimi enzýmy. Na metabolickú aktiváciu môže by ť 
vhodné použitie aj iných druhov, tkanív, post-mitochondriálnych 
frakcií alebo iných postupov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Testovacie podmienky  
T e s t o v a c i e k m e n e 
Najviac používanými kme ňmi sú diploidy D  4 , D 5 , D 7 a JD1. Môžu 
sa použiť aj iné kmene.  
M é d i á 
Na stanovenie prežívania a frekvencie mitotickej rekombinácie sa 
používajú vhodné kultiva čné médiá.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n y c h a p o z i t í v n y c h k o n t r o l 
Súbežne by mali by ť použité pozitívne, neovplyvnené kontroly 
a kontroly s rozpúš ťadlom. Pre každý špecifický typ mutácií by sa 
mala použi ť vhodná chemikália ako pozitívna kontrola.  
K o n c e n t r á c i e v y s t a v e n i a 
Malo by sa použi ť aspoň päť primerane odstup ňovaných koncen ­
trácií testovanej látky. Medzi faktormi, ktoré treba bra ť do úvahy, 
je cytotoxicita a rozpustnos ť. Najnižšia koncentrácia nemá ma ť efekt 
na životaschopnos ť buniek. Pri toxických chemikáliách by nemala 
najvyššia testovaná koncentrácia znižova ť prežívanie pod 5 až 10 %. 
Látky relatívne nerozpustné vo vode by mali by ť testované až do 
hranice ich rozpustnosti použitím vhodných metód. Pri netoxických látkach vo ľne rozpustných vo vode by sa mala najvyššia použitá 
koncentrácia stanovi ť z prípadu na prípad. 
Bunky môžu by ť vystavené testovanej chemikálii bu ď v stacionárnej 
fáze, alebo v rastovej fáze maximálne 18 hodín. Pri dlhšom vysta ­
vení by sa malo v kultúrach sledova ť formovanie spór, prítomnos ť 
ktorých znehodnocuje test.
 
I n k u b a č n é p o d m i e n k y 
Platne sú inkubované štyri až sedem dní pri 28 – 30  o C v tme. Platne 
použité pre testovanie červených a ružových homozygotných 
sektorov vzniknutých mitotickým crossing-overom by mali by ť po 
skončení experimentu držané v chladni čke (okolo 4  o C) ďalšie jeden 
až dva dni pred vyhodnotením, čo umožní vytvorenie hodnotite ľných 
pigmentovaných kolónií.  
F r e k v e n c i a s p o n t á n n e j m i t o t i c k e j r e k o m b i n á c i e 
Mali by by ť použité monokultúry s frekvenciou spontánnej mito ­
tickej rekombinácie v prijate ľnom rozsahu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
P o č e t o p a k o v a n í 
Pri testovaní vzniku prototrofov mitotickou génovou konverziou 
a pre stanovenie prežívania buniek by mali by ť použité najmenej 
tri opakovania pre každú koncentráciu. V prípade testovania recesív ­
nych homozygotov vzniknutých mitotickým crossing-overom sa 
množstvo použitých platní má zvýši ť tak, aby poskytovalo primerané 
množstvo kolónií.  
Postupy  
Ovplyvňovanie  S. cerevisiae  sa bežne robí v tekutom prostredí 
použitím stacionárnych alebo rastúcich buniek. Za čiatočné experi ­
menty by sa mali robi ť na rastúcich bunkách: bunky 
s koncentráciou 1 – 5 × 10  7 /ml sú vystavené testovanej chemikálii 
maximálne 18 hodín pri 28 až 37  o C pri neustálom prevzduš ňovaní; 
ak je potrebné, pridá sa po čas experimentu primerané množstvo 
metabolického aktivátora. 
Na konci ovplyvnenia sú bunky zcentrifugované, premyté a vysiate 
na vhodné kultiva čné médium. Po inkubácii sú platne vyhodnotené 
na prežívanie a indukciu mitotickej rekombinácie. 
Ak je prvý experiment negatívny, v druhom experimente by sa mali 
použiť bunky stacionárnej fázy. Ak je prvý experiment pozitívny, 
malo by sa to potvrdi ť vo vhodnom nezávislom experimente.  
2. ÚDAJE  
Údaje by mali by ť prezentované v tabu ľke a udáva ť počet kolónií, 
počet rekombinantov, prežívanie a frekvenciu rekombinantov. 
Výsledky by mali by ť potvrdené v nezávislom experimente. 
Údaje by mali by ť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu má pod ľa možnosti obsahova ť tieto informácie: 
— použité kmene, 
— podmienky pri teste: bunky stacionárnej fázy alebo rastúce 
bunky, zloženie médií, inkuba čná teplota a trvanie inkubácie, 
metabolický aktiva čný systém, 
— podmienky ovplyv ňovania: použité koncentrácie, metódy 
a trvanie ovplyvnenia, teplota pri ovplyvnení, pozitívne a negatívne kontroly, 
— spočítaný po čet kolónií, po čet rekombinantov, prežívanie 
a frekvencia rekombinantov, vz ťah dávka/odpove ď ak je to 
reálne, štatistické vyhodnotenie údajov, 
— diskusiu o výsledkoch, 
— interpretáciu výsledkov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGÉNNOS Ť – IN VITRO  TEST MUTÁCIÍ GÉNOV 
BUNIEK CICAVCOV  
1. METODA  
Táto metóda je obdobou OECD TG 476,  in vitro  test mutácií génov 
buniek cicavcov (1997).  
1.1. ÚVOD  
In vitro  test mutácií génov buniek cicavcov sa používa na zistenie 
mutácií vyvolaných chemickými látkami. Vhodné bunkové línie zahŕňajú L5178Y lymfómové  (lymphoma)  bunky myší, CHO, 
CHO-AS52 a V79 línie buniek čínskych mor čiat a TK6 lymfoblas ­
toidné bunky ľudí (1). V týchto bunkových líniách najbežnejšie 
používané genetické merania merajú mutácie na timidínovej kináze (TK) a hypoxantino-guanínovej fosforibosilovej transferáze (HPRT) 
a transgén xantínovo-guanínovej fosforibozylovej transferáze 
(XPRT). Testy mutácií TK, HPRT a XPRT zis ťujú rôzne spektrum 
genetických udalostí. Autozomálna poloha TK a XPRT môže umož ­ 
ňovať zistenie genetických udalostí (napríklad: ve ľké vymazania), 
nezistené v mieste HPRT na X chromozómoch (2)(3)(4)(5)(6). 
V in vitro  teste mutácií génov buniek cicavcov sa používajú kultúry 
ujatých bunkových línií alebo bunkových kme ňov. Použité bunky sa 
vyberajú na základe rastovej schopnosti kultúry a stability frekvencie spontánnych mutácií. 
Testy vykonávané  in vitro  vo všeobecnosti vyžadujú použitie 
exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Tento systém metabo ­
lickej aktivácie nemôže úplne napodobni ť podmienky  in vivo  cicav­
cov. Je potrebná opatrnos ť pri vyhýbaní sa podmienkam, ktoré by 
viedli k pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú vnútornú mutagén ­
nosť. Pozitívne výsledky, ktoré neodrážajú vnútornú mutagénnos ť, 
môžu pochádza ť zo zmien pH, osmolality alebo vysokých hladín 
cytotoxicity (7). 
Tento test sa používa na zistenie možných mutagénov 
a karcinogénov u cicavcov. Mnohé zmesi, ktoré sú v tomto teste 
pozitívne, sú pre cicavcov karcinogénmi, avšak neexistuje dokonalá 
korelácia medzi týmto testom a karcinogénnos ťou. Korelácia závisí 
od triedy chemikálie a je stále viac dôkazov, že existujú karcinogény, ktoré tento test neodhalí, pretože pravdepodobne ú činkujú prostred ­
níctvom odlišných negenotoxických mechanizmov alebo mecha ­
nizmov neprítomných v bunkách baktérií (6). 
Pozri tiež všeobecný úvod, časť B.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Predná mutácia:  génová mutácia z rodi čovského typu mutantných 
foriem, ktorá umož ňuje zmenu alebo stratu enzymatickej aktivity 
funkcie kódovaného proteínu.  
Mutagény substituujúce bázové páry:  látky, ktoré spôsobujú 
substitúciu jedného alebo viacerých bázových párov v DNA.  
Konštruk čné mutagény:  sú činiteľmi, ktoré v molekule DNA 
spôsobujú pridanie alebo vymazanie jedného alebo viacerých základ ­
ných párov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Doba fenotypického prejavu:  obdobie, po čas ktorého sú nezmenené 
génové produkty vy čerpané z novomutovaných buniek.  
Mutačná frekvencia:  pozorovaný po čet mutantných buniek delený 
počtom životaschopných buniek.  
Relatívny celkový rast:  zvýšenie po čtu buniek v čase v porovnaní 
s kontrolnou populáciou buniek; vypo čítava sa ako výsledok rastu 
suspenzie v pomere k času negatívnej kontrolnej kultúry krát klono ­
vacia efektívnos ť v pomere k negatívnej kontrolnej kultúre.  
Relatívny suspenzný rast:  zvýšenie po čtu buniek v porovnaní 
s časom prejavu v pomere k negatívnej kontrolnej kultúre.  
Životaschopnos ť: klonovacia efektívnos ť ošetrených buniek v čase 
umiestnenia na misky v selektívnych podmienkach po čase prejavu.  
Prežitie:  klonovacia efektívnos ť ošetrených buniek pri umiestnení na 
misky na konci doby podávania; prežitie sa oby čajne vyjadruje 
v pomere k prežitiu populácie kontrolných buniek.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Bunky s nedostatkom tymidínovej kinázy (TK) z dôvodu mutácie 
TK +/- -> TK  -/- sú odolné vo či cytotoxickým ú činkom pyrimidínovej 
obdoby trifluoro ťnymidínu (TFT). Bunky s dostatkom tymidínovej 
kinázy sú citlivé na TFT, ktorý spôsobuje inhibíciu bunkového meta ­
bolizmu a zastavuje ďalšie delenie buniek. Tieto mutantné bunky sú 
schopné rozširova ť sa za prítomnosti TFT, zatia ľ čo normálne bunky, 
ktoré obsahujú tymidínovú kinázu, nie sú. Podobne aj bunky s nedostatkom HPRT alebo XPRT sa vyberajú pod ľa odolnosti 
voči 6-thioguanínu (TG) alebo 8-azaguanínu (AG). Vlastnosti testo ­
vacej látky je potrebné zváži ť v prípadoch, ke ď sa bázová obdoba 
alebo zlú čenina príbuzná so selektívnym činidlom testujú 
v akýchko ľvek testoch mutácií génov buniek cicavcov. Potrebné je 
napríklad preskúma ť akúkoľvek predpokladanú selektívnu toxicitu 
testovacej látky pre mutantné a nemutantné bunky. Pri testovaní 
chemikálií štrukturálne príbuzných so selektívnym činidlom je 
preto nutné overi ť výkon selektívneho systému/ činidla (8). 
Bunky v suspenzii alebo jednovrstvovej kultúre sa vystavia testo ­
vacej látke s metabolickou aktiváciou i bez metabolickej aktivácie 
na vhodnú dobu a subkultivujú sa na stanovenie cytotoxicity a na 
umožnenie fenotypického prejavu pred mutantnou selekciou (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxicita sa zvy čajne stanovuje meraním relatívnej 
klonovacej efektívnosti (prežitie) alebo relatívneho celkového rastu 
kultúr po dobe podávania. Ošetrené kultúry sa vhodnú dobu, charak ­
teristickú pre každý vybraný lokus a typ buniek, udržiavajú v rastovom médiu, čo umožní takmer optimálny fenotypický prejav 
indukovaných mutácií. Muta čná frekvencia sa stanovuje zasadením 
známeho po čtu buniek do média obsahujúceho selektívne činidlo na 
zistenie mutantných buniek a do média bez selektívneho činidla na 
stanovenie klonovacej efektívnosti (životaschopnosti). Po vhodnej inkubačnej dobe sa kolónie zrátajú. Muta čná frekvencia sa odvodzuje 
od počtu mutantných kolónií v selektívnom médiu a po čtu kolónií 
v neselektívnom médiu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Bunky  
Pre použitie v tomto teste sú dostupné rôzne bunkové typy, vrátane 
subklonov buniek L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 alebo 
TK6. Typy buniek použité v tomto teste majú preukázanú citlivos ť 
na chemické mutagény, vysokú klonovaciu efektívnos ť a stabilnú 
frekvenciu spontánnych mutácií. Bunky sa kontrolujú na kontami ­
náciu mykoplazmou a pri jej zistení sa nepoužívajú. 
Test by sa mal formulova ť tak, aby mal vopred ur čenú citlivos ť 
a silu. Po čet použitých buniek, kultúr a koncentrácií testovacej 
látky odráža tieto definované parametre (14). Minimálny po čet živo­
taschopných buniek, ktoré prežijú podávanie a ktoré sa použijú 
v každom štádiu testu, je založený na frekvencii spontánnych mutá ­
cií. Všeobecným pravidlom je použi ť počet buniek, ktorý je 
najmenej 10-krát taký ve ľký, ako prevrátená hodnota frekvencie 
spontánnych mutácií. Odporú ča sa však použi ť najmenej 10  6 buniek. 
Na znázornenie konzistentného výkonu testu by mali by ť dostupné 
historické údaje o použitom systéme buniek  
1.4.1.2.  Médiá a podmienky kultúr  
Používajú sa príslušné médiá a inkuba čné podmienky (nádoby, 
koncentrácia CO  2 , teplota a vlhkos ť). Médiá sa vyberajú pod ľa 
selektívnych systémov a typu buniek použitých po čas testu. Osobitne 
dôležité je zvoli ť podmienky kultúr tak, aby bol zabezpe čený opti­
málny rast buniek po čas obdobia prejavu a schopnos ť formovania 
kolónií mutantných aj nemutantných buniek.  
1.4.1.3.  Príprava kultúr  
Bunky sa odoberajú z kultúr vysadených v médiu a inkubovaných 
pri teplote 37  o C. Pred použitím v tomto teste sa kultúry pod ľa 
potreby pre čistia od existujúcich mutantných buniek.  
1.4.1.4.  Metabolická aktivácia  
Bunky sa vystavia testovacej látke za prítomnosti aj za neprítomnosti 
vhodného systému metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená kofaktorom (S9) pripravená z pe čene hlodavcov a ošetrená prípravkami na indukciu 
enzýmov ako napríklad Aroclorom 1254 (15) (16) (17) (18) alebo 
kombinácia fenobarbitonu a beta-naftoflavónu(19)(20). 
Postmitochondriálna frakcia sa zvy čajne používa v koncentráciách 
v rozpätí od 1 – 10 % v/v v kone čnom testovacom médiu. Výber 
a stav systému metabolickej aktivácie závisí od triedy testovanej 
chemikálie. V niektorých prípadoch je vhodné využi ť viac než 
jednu koncentráciu postmitochondriálnej frakcie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Množstvo situácií, vrátane vytvorenia geneticky vypestovaných 
bunkových línií vyjadrujúcich špecifické aktiva čné enzýmy, môže 
poskytnúť potenciál pre endogénnu aktiváciu. Výber použitých bunko ­
vých línií sa vedecky zdôvod ňuje (napríklad: relevantnos ťou cytochró ­
mového P450 izoenzýmu pre metabolizmus testovacej látky).  
1.4.1.5.  Príprava testovacej látky  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch a rozrie ďujú, ak je to potrebné pred 
ošetrením buniek. Kvapalné testovacie látky môžu by ť pridané 
priamo do testovacích systémov a/alebo rozriedené pred ošetrením. Používajú sa čerstvé prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje 
o stabilite nepoukazujú na vhodnos ť uskladnenia.
 
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemali chemicky reagova ť s testovacou látkou 
a mali by by ť kompatibilné s prežitím buniek a aktivitou S9. Ak sa 
používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich použitie by 
malo by ť podporené údajmi ozna čujúcimi ich kompatibilitu. 
Odporúča sa zváži ť, pokiaľ je to možné, použitie vodného 
rozpúšťadla/nosiča. Pri testovaní látok vo vode nestálych by orga ­
nické rozpúš ťadlá nemali obsahova ť vodu. Vodu je možné odstráni ť 
pridaním molekulárneho sitka.  
1.4.2.2.  Koncentrácie  
Medzi kritériá, ktoré treba zváži ť pri určovaní najvyššej koncentrá ­
cie, patria cytotoxicita, rozpustnos ť v testovacom systéme a zmeny 
pH alebo osmolality. 
Cytotoxicita sa stanovuje s metabolickou aktiváciou a bez metabo ­
lickej aktivácie pri hlavnom pokuse s použitím príslušného ozna čenia 
integrity a rastu buniek, ako napríklad relatívnej klonovacej efektív ­
nosti (prežitie) alebo relatívneho celkového rastu. Užito čné je stano ­
venie cytotoxicity a rozpustnosti v predbežnom pokuse. 
Používať by sa mali najmenej štyri analyzovate ľné koncentrácie. Pri 
výskyte cytotoxicity tieto koncentrácie pokrývajú rozsah od maxi ­
málnej po malú alebo žiadnu toxicitu; toto zvy čajne znamená, že 
koncentrácie sú oddelené nie viac ako jedným koeficientom medzi 
2 a √10. Ak je najvyššia koncentrácia založená na cytotoxicite, jej 
výsledkom je približne 10 – 20 % (avšak nie menej ako 10 %) relatívneho prežitia (relatívna klonovacia efektívnos ť) alebo relatív ­
neho celkového rastu. Pre relatívne necytotoxické látky sú maxi ­
málne testovacie koncentrácie 5 mg/ml, 5 μl/ml alebo 1,01 M, 
podľa toho, ktorá je najnižšia.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Relatívne nerozpustné látky sa testujú po limit rozpustnosti 
v podmienkach kultúry. V kone čnom médiu, ktorému sú bunky 
vystavené, sa stanovujú dôkazy nerozpustnosti. Užito čné je 
odhadnúť rozpustnos ť na začiatku a na konci podávania, ke ďže 
rozpustnos ť sa môže zmeni ť počas priebehu vystavenia 
v testovacom systéme kvôli prítomnosti buniek, séra S9 at ď. Neroz­
pustnosť sa zisťuje voľným okom. Zrazenina hodnoteniu neprekáža.  
1.4.2.3.  Kontrolné kultúry  
Pri každom pokuse sa vytvoria pozitívne a negatívne (rozpúš ťadla 
alebo nosi ča) kontrolné kultúry s metabolickou aktiváciou i bez 
metabolickej aktivácie. Pri použití metabolickej aktivácie by pozi ­
tívna kontrolná kultúra mala by ť tá, pri ktorej sa na vznik muta ­
génnej reakcie vyžaduje aktivácia. 
Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú kultúru:  
Stav metabolickej 
aktivácie Miesto Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
neprítomnos ťexo­
génnej metabo ­
lickej aktivácie HPRT etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 
etylnitrozmo čovina 759-73-9 212-072-2 
TK (malé 
a veľké koló­
nie) metylmetánsulfonát 66-27-3 200-625-0 
XPRT etylmetánsulfonát 62-50-0 200-536-7 
etylnitrozmo čovina 759-73-9 212-072-2 
prítomnos ť 
exogénnej meta ­
bolickej aktivácie HPRT 3 -metylcholanthrén 56-49-5 200-276-4 
N-nitrozodimetylamín 62-75-9 200-549-8 
7,12-dimetylbenzanthracén 57-97-6 200-359-5 
TK (malé 
a veľké koló­
nie) cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
monohydrát cyklofosfamidu 6055-19-2 benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 3-mety lcho lanthén 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrozodimetylamín (pre vysoké 
dávky S9) 62-75-9 200-549-8 
benzo[a]pyrén 50-32-8 200-028-5 
Na pozitívnu kontrolnú kultúru sa môžu použi ť aj iné vhodné látky, 
napríklad: ak laboratórium má historickú databázu o 5-bromo 2'- deoxyuridíne (CAS č. 59-14-3, Einecs č. 200-415-9), použije sa aj 
táto referen čná látka. Pod ľa dostupnosti sa tiež zváži použitie chemi ­
kálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu v triede príbuzných chemikálií.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Použijú sa negatívne kontrolné kultúry, pozostávajúce iba zo samot ­
ného rozpúš ťadla alebo nosi ča v médiu, a ošetrené rovnakým 
spôsobom ako ošetrované kultúry. Použijú sa aj neošetrené kontrolné kultúry, pokia ľ neexistujú historické kontrolné údaje demonštrujúce, 
že vybrané rozpúš ťadlo nespôsobuje žiadne škodlivé alebo muta ­
génne efekty.
 
1.4.3.  Postup  
1.4.3.1.  Podávanie testovacej látky  
Rozširujúce sa bunky sa exponujú testovacej látke s metabolickou 
aktiváciou i bez metabolickej aktivácie. Exponovanie trvá vhodnú dobu (efektívnych je zvy čajne 3-6 hodín). Doba expozície sa môže 
predĺžiť počas jedného alebo viacerých bunkových cyklov. 
Pri každej testovanej koncentrácii sa môžu použi ť duplicitné alebo 
jednotlivé ošetrené kultúry. Pri použití jednotlivých kultúr sa po čet 
koncentrácií zvýši na zabezpe čenie primeraného po čtu kultúr na 
analýzu (napríklad: minimálne 8 analyzovate ľných koncentrácií). 
Používajú sa duplicitné negatívne (s rozpúš ťadlom) kontrolné 
kultúry. 
Plynné alebo prchavé látky sa testujú príslušnými metódami, ako 
napríklad vo vzduchotesne uzavretých nádobách (21),(22).
 
1.4.3.2.  Meranie prežitia, životaschopnosti a muta čnej frekvencie  
Na konci expozi čného obdobia sa bunky o čistia a kultivujú na stano ­
venie prežitia a na umožnenie prejavu mutantného fenotypu. Meranie 
cytotoxicity stanovením relatívnej klonovacej frekvencie (prežitie) 
alebo relatívneho celkového rastu kultúr sa zvy čajne uskuto ční po 
dobe podávania. 
Každé miesto má definovanú požiadavku na minimálnu dobu na 
umožnenie takmer optimálneho fenotypického prejavu novoinduko ­
vaných mutantov (HPRT a XPRT vyžadujú najmenej 6 – 8 dní a TK 
najmenej 2 dni). Bunky rastú v médiu so selektívnym činiteľom aj 
bez selektívneho činiteľa/činiteľov na stanovenie po čtu mutantov 
a klonovacej efektívnosti. Meranie životaschopnosti (používa sa na výpočet mutačnej frekvencie) sa uskuto čňuje na konci obdobia 
prejavu umiestnením na misky s neselektívnym médiom. 
Ak je testovacia látka v L5178Y TK
 +/- teste pozitívna, meranie 
veľkosti kolónie sa uskuto ční minimálne na jednej testovanej kultúre 
(najvyššia pozitívna koncentrácia) a na negatívnych a pozitívnych kontrolných kultúrach. Ak je testovacia látka v L5178Y TK
 +/- teste 
negatívna, meranie ve ľkosti kolónie sa uskuto ční na negatívnych 
a pozitívnych kontrolných kultúrach. Meranie kolónií sa tiež môže 
uskutočniť pri štúdiách používajúcich TK6TK  +/- . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje zah ŕňajú stanovenie cytotoxicity a životaschopnosti, po čet 
kolónií a muta čné frekvencie pre ošetrované a kontrolné kultúry. 
V prípade pozitívnej reakcie v teste L5178TK  +/- sa kolónie hodnotia 
použitím kritérií malých a ve ľkých kolónií na najmenej jednej 
koncentrácii testovacej látky (najvyššia pozitívna koncentrácia) a na negatívnych a pozitívnych kontrolných kultúrach. Podrobne 
bola preskúmaná molekulárna a cytogenetická povaha ve ľkých 
a malých kolónií mutácií (23), (24). V teste TK
 +/- sa kolónie 
hodnotia použitím kritérií pre kolónie s normálnym rastom (ve ľké) 
a pomalým rastom (malé) (25). Mutantné bunky, ktoré utrpeli 
najväčšie genetické poškodenie, majú pred ĺžené časy delenia, 
a preto tvoria malé kolónie. Toto poškodenie je zvy čajne 
v rozsahu od straty celého génu po karyotypicky vidite ľné chromo ­
zómové odchýlky. Vznik mutovaných malých kolónií sa spája 
s chemikáliami, ktoré indukujú ve ľké chromozómové odchýlky 
(26). Menej vážne ovplyvnené mutantné bunky rastú rýchlos ťou 
podobnou ako rodi čovské bunky a tvoria ve ľké kolónie. 
Uvádza sa prežitie (relatívna klonovacia efektívnos ť) alebo relatívny 
celkový rast. Muta čná frekvencia sa vyjadruje ako po čet mutantných 
buniek na po čet prežitých buniek. 
Uvádzajú sa údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa tiež 
sumarizujú v tabu ľkovej forme. 
Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasnej pozitívnej reakcie. 
Nejasné výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním najmä využitím 
modifikácie pokusných podmienok. Negatívne výsledky sa musia potvrdiť z prípadu na prípad. V prípadoch, ke ď sa potvrdenie nega ­
tívnych výsledkov nepovažuje za potrebné, poskytne sa zdôvodne ­
nie. Modifikácia parametrov štúdie na rozšírenie rozsahu hodnote ­
ných podmienok sa posudzuje pri následných pokusoch, a to bu ď pri 
nejasných alebo negatívnych výsledkoch. Parametre štúdie, ktoré sa 
môžu modifikova ť, zahŕňajú koncentráciu a podmienky metabolickej 
aktivácie.
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast spojený s koncentráciou alebo reprodukovate ľný 
nárast muta čnej frekvencie. Najprv sa zvažuje biologická relevant ­
nosť výsledkov. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov 
používajú štatistické metódy. Štatistický význam nie je jediným 
určujúcim faktorom pre pozitívnu reakciu. 
Testovacia látka, pre ktorú výsledky nesp ĺňajú vyššie uvedené krité ­
riá, sa v tomto systéme považuje za nemutagénnu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Hoci väčšina pokusov poskytne jednozna čne pozitívne alebo nega ­
tívne výsledky, v zriedkavých prípadoch súbor údajov vopred vylú či 
jednoznačné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu 
ostať nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní 
pokusu. Pozitívne výsledky  in vitro  testu mutácií génov buniek 
cicavcov nazna čujú, že testovacia látka vyvoláva génové mutácie 
v použitých kultúrach buniek cicavcov. Najdôležitejšou je reprodu ­
kovateľná pozitívna reakcia na koncentráciu. Negatívne výsledky 
naznačujú, že v testovacích podmienkach testovacia látka neindukuje 
génové mutácie v použitých kultúrach buniek cicavcov.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Bunky: 
— typ a zdroj buniek, 
— počet bunkových kultúr, 
— počet bunkových prechodov, ak je to vhodné, 
— metódy udržiavania bunkovej kultúry, ak je to vhodné, 
— neprítomnos ť mykoplazmy. 
Podmienky testov: 
— zdôvodnenie výberu koncentrácií a po čtu kultúr vrátane napríklad 
údajov o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti, ak sú dostupné, 
— skladba média, koncentrácia CO
 2 , 
— koncentrácia testovacej látky, 
— objem nosi ča a pridanej testovacej látky, 
— inkuba čná teplota, 
— inkuba čná doba, 
— trvanie podávania, 
— hustota buniek pri vysádzaní, 
— typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií 
prijateľnosti, 
— pozitívne a negatívne kontrolné kultúry,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— dĺžka obdobia prejavu (vrátane po čtu vysadených buniek, 
subkultúr a harmonogramov k ŕmenia, ak je to vhodné), 
— selektívne činitele, 
— kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné, 
— metódy použité na stanovenie po čtu životaschopných 
a mutantných buniek, 
— definícia kolónií, hodnotí sa ve ľkosť a typ (vrátane kritérií na 
„malé“ a „ve ľké“, ak je to vhodné). 
Výsledky: — známky toxicity, 
— známky zrážania, 
— údaje o pH a osmolalite po čas vystavenia testovacej látke, ak sú 
stanovené, 
— veľkosť kolónie, ak sa hodnotí, prinajmenšom pre negatívne 
a pozitívne kontrolné kultúry, 
— primeranos ť laboratória na zistenie malých mutantných kolónií so 
systémom L5178TK
 +/- , ak je to vhodné, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho ur čiť, 
— štatistické analýzy, ak existujú, — súčasné údaje o negatívnej (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnej 
kultúre, 
— historické údaje o negatívnej (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnej 
kultúre, s rozsahmi, modusmi a štandardnými odchýlkami, 
— mutačná frekvencia. 
Rozbor výsledkov 
Závery
 
4. LITERATÚRA  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, FJ. and Tindall, 
K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 
(2) Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Gene ­
tics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro,  Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 
61, 1306 – 1312. 
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G (1982). Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. 
Mutation Res., 94, 467 – 485. 
(4) Moore, M.M., Harington – Brock, K, Doerr, C.L. and Dear ­
field, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 
4, 394 – 403.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121 – 128. 
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G, Glatt, H.R, Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). 
Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312. 235 – 239. 
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, RR, Ishidate, M., Brusick, 
D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task 
Group 9. Mutation Res., 257, 147 – 204. 
(8) Clive, D., McCuen, R, Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene – Tox Program. Mutation Res., 115. 225 – 251. 
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, RH. and Wasson, IS. (1988). 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ ­
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of 
Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene – 
Tox Program. Mutation Res., 196, 17 – 36. 
(10) Li, A.P., Carver, J.H, Choy, W.N, Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O'Neill, LP., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. 
and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine – Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation 
Res., 189, 135 – 141. 
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). 
A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT 
Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9 – 17. 
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R and Hsie, A.W. (1986). 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate – and ICR 191 – Induced Molecular Analyses of Ethyl 
Methanosulphonate – and ICR 191 – Induced Mutation in 
AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133 – 147. 
(13) Turner, N.T., Batson, A.G and Clive, D. (1984). Procedures 
for the L5178Y/TK
 +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Muta ­
genicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239 – 268. 
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell 
Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66 – 101. 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G, Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6 – Thioguanine – Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse – Liver Microsome – Activated Dimethylnitrosamine. Mutation 
Res., 46, 365 – 373. 
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian – Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 
31, 347 – 364.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of 
the L5178Y/TK+/– Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61 – 108. 
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173 – 215. 
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R, Gatehouse, D.G, 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254 – Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, 175 – 177. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, 
J.R., Bend, J.R. and Philpot, RM. (eds), Elsevier, North – Holland, pp. 85 – 88. 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
pp. 91 – 103. 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 
795 – 801. 
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51 – 55. 
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, 
A.G, Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluo ­
rothymidine – Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK
 +/- 
Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161 – 174. 
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous 
Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229. 89 – 
102. 
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small – Colony TK – Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- – 3.7.2C 
Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609 – 614.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B. 18.  POŠKODENIE A OPRAVA DNA – NEPROGRAMOVANÁ 
SYNTÉZA DNA – BUNKY CICAVCOV  IN VITRO  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test neprogramovanej syntézy DNA (UDS) meria repara čnú syntézu 
DNA po vyštiepení a odstránení úseku DNA, ktorý obsahuje oblas ť 
poškodenia vyvolaného chemickými a fyzikálnymi agensmi. Test je 
založený na inkorporácii tymidínu zna čeného tri ciom (  3 H -TdR) do 
DNA buniek cicavcov, ktoré sa nenachádzajú v S fáze bunkového 
cyklu. Príjem  3 H -TdR sa môže determinova ť autorádiografiou alebo 
meraním DNA z ovplyvnených buniek v scintila čnej kvapaline 
(LSC). Cicav čie bunky v kultúre, pokia ľ sa nepoužívajú primárne 
hepatocyty potkanov, sa ovplyv ňujú testovaným agensom 
v prítomnosti, ako aj neprítomnosti exogénneho metabolického akti ­
vačného systému. UDS sa tiež môže mera ť v in vivo  systémoch.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava 
Testované chemikálie a kontrolné alebo odporú čané látky by sa mali 
pripraviť v rastovom médiu alebo rozpusti ť, alebo rozsuspendova ť 
vo vhodnom nosi či, a potom ďalej rozriedi ť v rastovom médiu na 
použitie v skúšobnom teste. Kone čná koncentrácia nosi ča by nemala 
ovplyvňovať životaschopnos ť buniek. 
V skúšobnom teste sa môžu použi ť primárne kultúry potkaních hepa ­
tocytov, ľudských lymfocytov alebo stabilných bunkových línií 
(napr. ľudských diploidných fibroblastov). 
Bunky sa vystavujú pôsobeniu testovanej chemikálie tak 
v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického akti ­
vačného systému.  
Testovacie podmienky  
P o č e t k u l t ú r 
Pre každý krok experimentu sa používajú minimálne dve bunkové 
línie na autorádiografiu a šes ť kultúr (alebo menej, ak je to vedecky 
overené) na stanovenie UDS pomocou LSC.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
P o u ž i t i e n e g a t í v n e j a p o z i t í v n e j k o n t r o l y 
Ku každému experimentu sa pripájajú súbežné pozitívne a negatívne 
(neovplyvnené vzorky a/alebo vzorka s nosi čom) kontroly s alebo 
bez metabolickej aktivácie. 
Príklady pozitívnych kontrol pre test potkaních hepatocytov zah ŕňajú 
7,12-dimetylbenzantracén (7,12-DMBA) alebo 2-acetylaminofluorén 
(2-AAF). V prípade stabilných bunkových línií je príkladom pozi ­
tívnej kontroly 4-nitrochinolín-N-oxid (4-NQO) ako pre autorádio ­
grafický, tak aj pre LSC test vykonaný bez metabolickej aktivácie; N-dimetylnitrózamín je príkladom pozitívnej kontrolnej zlú čeniny, ak 
sa používa metabolický aktiva čný systém.
 
K o n c e n t r á c i e v y s t a v e n i a 
Používajú sa mnohonásobné koncentrácie testovanej látky v rozsahu 
primeranom na definovanie odpovede. Najvyššia koncentrácia by 
mala vyvola ť určité cytotoxické ú činky. Vo vode ťažko rozpustné 
zlúčeniny by sa mali testova ť až do hranice rozpustnosti. V prípade 
vo ľahko vode rozpustných netoxických chemikálií sa horná koncen ­
trácia testovanej chemikálie ur čuje od prípadu k prípadu.  
B u n k y 
Na udržiavanie kultúr musia by ť použité vhodné rastové médiá, 
koncentrácia CO  2 , teplota a vlhkos ť. Stabilné bunkové línie sa perio ­
dicky kontrolujú na kontamináciu mykoplazmou.  
M e t a b o l i c k á a k t i v á c i a 
Metabolický aktiva čný systém sa nepoužíva v kultúrach primárnych 
hepatocytov. Stabilné bunkové línie a lymfocyty sa vystavia testo ­
vanej látke tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného 
metabolického aktiva čného systému.  
Postup  
P r í p r a v a k u l t ú r 
Stabilné bunkové línie sa získajú zo zásobnej kultúry (napr. trypsi ­
nizáciou alebo pretrepávaním), nao čkujú do kultiva čných nádob 
v primeranej hustote a inkubujú pri 37  o C. 
Krátkodobé kultúry potkaních hepatocytov sa získajú tak, že čerstvo 
disociovaným hepatocytom sa umožní vo vhodnom médiu pripevni ť 
sa na rastový povrch. 
Kultúry ľudských lymfocytov sa zakladajú s použitím primeranej 
techniky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
V y s t a v e n i e k u l t ú r t e s t o v a n e j l á t k e  
Primárne potkanie hepatocyty  
Čerstvo izolované hepatocyty potkanov sa vystavia testovanej látke 
v médiu obsahujúcom  3 H-TdR po čas primeraného časového inter ­
valu. Na konci obdobia vystavenia sa bunky zbavia média, potom 
premyjú, fixujú a vysušia. Sklí čka sa ponoria do autorádiografickej 
emulzie (prípadne sa môže použi ť „stripping“ film), exponujú, vyvo ­
lajú, farbia a spo čítajú.  
Stabilné bunkové línie a lymfocyty  
Autorádiografické techniky: Bunkové kultúry sa ovplyv ňujú testo­
vanou látkou na primeraný čas, po ktorom nasleduje ovplyvnenie 
s 3 H-TdR. Časy ovplyvnenia sa ur čia povahou látky, aktivitou meta ­
bolických systémov a typom buniek. Na ur čenie vrcholu UDS sa 
pridáva  3 H-TdR bu ď súčasne s testovanou látkou, alebo po čas 
niekoľkých minút po vystavení testovanej látke. Výber medzi týmito 
dvoma postupmi bude ovplyvnený možnými interakciami medzi 
testovanou látkou a  3 H-TdR. Na odlíšenie UDS od semikonzerva ­
tívnej replikácie DNA sa môže táto inhibova ť, napríklad použitím 
arginín-deficitného média, nízkeho obsahu séra alebo pomocou hydroxyurei v kultiva čnom médiu. 
LSC meranie UDS: Pred ovplyvnením testovanou látkou sa vyššie 
opísaným spôsobom blokuje vstup buniek do S fázy; bunky sa potom vystavia testovanej chemikálii spôsobom opísaným pri autorá ­
diografii. Na konci inkuba čnej doby sa z buniek izoluje DNA a stanoví 
sa celkový obsah DNA a množstvo inkorporovaného
 3 H-TdR. 
Je potrebné pripomenú ť, že pri použití ľudských lymfocytov vo 
vyššie opísanej technike sa nevyžaduje potla čenie semikonzerva ­
tívnej replikácie DNA v nestimulovaných bunkách.  
Analýza  
A u t o r á d i o g r a f i c k é s t a n o v e n i a  
Pri stanovení UDS v bunkách kultúry sa nezapo čítavajú jadrá v S 
fáze. Počíta sa minimálne 50 buniek na koncentráciu. Sklí čka sa 
musia pre po čítaním ozna čiť. Na každom sklí čku je potrebné po čítať 
niekoľko ďaleko od seba uložených, samostatných náhodných polí. 
Úroveň začlenenia  3 H-TdR v cytoplazme by sa mala ur čiť zrátaním 
oblastí trojnásobnej ve ľkosti jadra v cytoplazme každej rátanej 
bunky.  
S t a n o v e n i e L S C 
Pri stanovení UDS pomocou LSC sa používa primeraný po čet kultúr 
pre každú koncentráciu a v kontrolách.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Všetky výsledky je potrebné potvrdi ť v nezávislom experimente.  
2. ÚDAJE  
Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek.  
2.1. AUTORÁDIOGRAFICKÉ STANOVENIA 
Rozsah inkorporácie  3 H-TdR do cytoplazmy a množstvo z ŕn 
nájdených v bunkovom jadre sa zaznamenávajú osobitne. 
Priemer, medián a modus sa môžu použi ť na opis distribúcie rozsahu 
inkorporácie  3 H-TdR do cytoplazmy a množstva granúl na jadro.  
2.2. STANOVENIA LSC 
Na stanovenie LSC sa inkorporácia  3 H-TdR udáva dpm/ μg DNA. Na 
opis rozdelenia inkorporácie sa môže použi ť priemerná hodnota 
dpm/μg DNA so štandardnou odchýlkou. 
Dáta sa hodnotia pomocou vhodných štatistických metód.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie: 
— použité bunky, hustota a číslo pasážovania v čase vystavenia, 
počet bunkových kultúr, 
— metódy používané na udržiavanie bunkových kultúr zah ŕňajúce 
živnú pôdu, teplotu a koncentráciu CO  2 , 
— testovanú látka, nosi č, koncentrácie a podklady pre výber použi ­
tých koncentrácií v teste, 
— podrobnosti o metabolických aktiva čných systémoch, 
— rozvrh ovplyvnenia, 
— pozitívne a negatívne kontroly, 
— použité autorádiografické metódy, 
— postupy použité na zablokovanie vstupu buniek do S fázy, 
— postupy na extrakciu DNA a stanovenie celkového obsahu DNA 
pri určení LSC, 
— ak je to možné, vz ťah dávka/efekt, 
— štatistické vyhodnotenie, 
— diskusiu o výsledkoch, 
— interpretáciu výsledkov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  TEST VÝMENY SESTERSKÝCH CHROMATÍD  IN VITRO  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test výmeny sesterských chromatíd (SCE) je krátkodobý test na 
určenie recipro čnej výmeny DNA medzi dvomi sesterskými chroma ­
tídami duplikovaných chromozómov. SCE predstavuje výmenu produktov DNA replikácie v zdanlivo homo logických lokusoch. Proces výmeny pravdepodobne zah ŕňa zlom DNA a znovuspojenie, 
hoci o jeho molekulárnom mechanizme existuje málo poznatkov. 
Stanovenie SCE vyžaduje niektoré techniky odlišne zna čených 
sesterských chromatíd, čo sa dá dosiahnu ť inkorporáciou brómdeo ­
xyuridínu (BrdU) do chromozomálnej DNA po čas dvoch bunkových 
cyklov. 
Ak je to vhodné, cicav čie bunky sa  in vitro  vystavia testovanej 
chemikálii tak v prítomnosti ako aj v neprítomnosti cicav čieho 
exogénneho metabolického aktiva čného systému a inkubujú sa 
počas dvoch kôl replikácie v médiu obsahujúcom BrdU. Po ovplyv ­
není inhibítorom deliaceho vretienka (napr. kolchicínom), s cie ľom 
nahromadenia buniek v štádiu podobnom metafáze mitózy (c-meta ­
fáza), sa bunky zozbierajú a vykoná sa izolácia chromozómov.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
— Primárne kultúry ( ľudské lymfocyty) alebo stabilné bunkové línie 
(napr. bunky vaje čníkov čínskeho škre čka) sa používajú v teste. 
Bunkové línie sa musia kontrolova ť na kontamináciu mykoplaz ­
mou. 
— Používajú sa vhodné kultiva čné médiá a inkuba čné podmienky 
(napr. teplota, kultiva čné nádoby, koncentrácia CO  2 a vlhkosť). 
— Pred vystavením buniek môžu by ť testované látky pripravené 
v kultiva čnom médiu alebo rozpustené, alebo rozsuspendované 
vo vhodnom nosi či. Konečná koncentrácia nosi ča v kultiva čnom 
systéme by nemala významne ovplyv ňovať životaschopnos ť 
buniek alebo rýchlos ť rastu a vplyvy na frekvenciu SCE sa 
musia monitorova ť kontrolou s rozpúš ťadlom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Bunky sa vystavujú testovanej látke ako v prítomnosti, tak i v 
neprítomnosti exogénneho cicav čieho metabolického aktiva čného 
systému. Ak sa eventuálne používajú typy buniek s endogénnou metabolickou aktivitou, miera a podstata aktivity by mala by ť 
primeraná testovanej triede chemikálií.
 
1.6.2.  Testovacie podmienky  
P o č e t k u l t ú r 
Pre každý bod experimentu sa musia použi ť minimálne zdvojené 
kultúry.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n y c h a p o z i t í v n y c h k o n t r o l 
Do každého experimentu by sa mali zahrnú ť pozitívne kontroly 
využívajúce priamo pôsobiace zlú čeniny, ako aj zlú čeniny vyžadu ­
júce metabolickú aktiváciu; tiež sa musí použi ť nosičová kontrola. 
Nasledujú príklady látok, ktoré sa môžu použi ť ako pozitívna 
kontrola: 
— priamo pôsobiaca zlú čenina, 
— etylmetánsulfonát, 
— nepriamo pôsobiaca zlú čenina, 
— cyklofosfamid. 
V prípade, že je to vhodné, môže sa zahrnú ť ďalšia pozitívna 
kontrola rovnakej chemickej triedy ako testovaná chemikália.  
E x p o z i č n é k o n c e n t r á c i e 
Mali by sa použi ť minimálne tri zodpovedajúco rozložené koncen ­
trácie testovanej látky. Najvyššia koncentrácia by mala vyvola ť 
významný toxický ú činok, ale napriek tomu musí umožni ť uskutoč­
nenie bunkového delenia. Vo vode ťažko rozpustné látky by sa mali 
testovať až do hranice rozpustnosti použitím vhodných procedúr. Pre 
ľahko rozpustné netoxické látky by horná koncentrácia testovanej 
látky mala by ť určená od prípadu k prípadu.  
1.6.3.  Postup  
P r í p r a v a k u l t ú r 
Stabilné bunkové línie sa získajú zo zásobnej kultúry (napr. trypsi ­
nizáciou alebo pretrepávaním), nao čkujú do kultiva čnej nádoby 
v primeranej hustote a inkubujú pri 37  o C. Pri monovrstvových 
kultúrach sa po čet buniek v kultiva čnej nádobe prispôsobí tak, aby 
kultúry v období zberania neboli splynuté na viac ako 50 %. Bunky sa prípadne môžu použi ť v suspenznej kultúre. Kultúry ľudských 
lymfocytov sa zakladajú z heparinizovanej krvi pri použití primera ­
ných techník a inkubujú pri 37
 o C. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
V y s t a v e n i e 
Bunky v exponenciálnej fáze rastu sa vystavia testovanej látke na 
vhodnú dobu; vo vä čšine prípadov môžu by ť účinné jednu až dve 
hodiny, ale v niektorých prípadoch sa môže čas vystavenia pred ĺžiť 
až na dva úplné bunkové cykly. Bunky bez dostato čnej endogénnej 
metabolickej aktivity by sa mali vystavi ť testovanej chemikálii 
v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti vhodného metabolického akti ­
vačného systému. Na konci fázy vystavenia sa bunky premyjú 
a zbavia testovanej látky a kultivujú na dve kolá replikácie 
v prítomnosti BrdU. Ako alternatívny postup môžeme bunky 
vystaviť súčasne testovanej látke a BrdU na celý kultiva čný čas 
dvoch cyklov. 
Kultúry ľudských lymfocytov sa vystavia, pokia ľ sa nachádzajú 
v semisynchrónnych podmienkach. 
Bunky sa analyzujú po čas ich druhého delenia po vystavení tak, aby 
sa zaručilo, že vä čšina citlivých fáz bunkového cyklu bola vystavená 
chemikálii. Všetky kultúry, ku ktorým je pridaný BrdU, sa musia spracováva ť až do zberania buniek v tme alebo pri tlmenom osvet ­
lení zo žiarivkových lámp tak, aby sa minimalizovala fotolýza DNA 
obsahujúcej BrdU.
 
Z b e r a n i e b u n i e k 
Bunkové kultúry sa vystavia inhibítorom deliaceho vretienka (napr. 
kolchicínom) na jednu až štyri hodiny pred zberom. Každá kultúra sa samostatne zozbiera a spracuje na izoláciu chromozómov.
 
I z o l á c i a c h r o m o z ó m o v a f a r b e n i e 
Izolácia chromozómov sa vykoná štandardnými cytogenetickými 
postupmi. Farbenie sklí čok na dôkaz SCE sa môže vykona ť niekoľ­
kými postupmi (napr. fluorescencia plus Giemsova metóda).  
A n a l ý z a 
Počet analyzovaných buniek by sa mal zaklada ť na spontánnej 
kontrolnej frekvencii SCE. Zvy čajne sa na výskyt SCE analyzuje 
minimálne 25 dobre rozprestrených metafáz na kultúru. Sklí čka sa 
pred analýzou ozna čia. V ľudských lymfocytoch sa analyzujú iba 
metafázy obsahujúce 46 centromér. V stabilných bunkových líniách sa analyzujú iba metafázy obsahujúce ± 2 centroméry zvy čajného 
počtu. Je potrebné stanovi ť, či je, alebo nie je zarátaná zmena farieb 
v oblasti centromér ako SCE. Výsledky sa potvrdia nezávislým expe ­
rimentom.
 
2. ÚDAJE  
Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek. Po čet SCE pre každú meta ­
fázu a po čet SCE pre chromozóm každej metafázy sa uvedie 
osobitne pre všetky ovplyvnené a kontrolné kultúry. 
Údaje by mali by ť vyhodnotené vhodnou štatistickou metódou.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie: 
— použité bunky, metódy na udržiavanie bunkových kultúr, — testovacie podmienky: zloženie živných pôd, koncentrácia CO
 2 , 
koncentrácia testovanej látky, použitý nosi č, inkubačná teplota, 
čas ovplyvnenia, použitý inhibítor deliaceho vretienka, jeho 
koncentrácia a trvanie ovplyvnenia, typ použitého cicav čieho 
aktivačného systému, pozitívnu a negatívnu kontrolu, 
— počet bunkových kultúr na každý krok experimentu, 
— podrobnosti o technikách použitých na preparáciu sklí čok, 
— počet analyzovaných metafáz (údaje dané samostatne pre každú 
kultúru), 
— priemerný po čet SCE na bunku a na chromozóm (údaje dané 
samostatne pre každú kultúru), 
— kritéria pre ur čovanie SCE, 
— podklady pre výber dávok, — ak je možné, vz ťah dávka/efekt, 
— štatistické vyhodnotenie, — diskusiu o výsledkoch, — interpretáciu výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  TEST NA ZACHYTENIE RECESÍVNYCH LETÁLNYCH 
MUTÁCIÍ VIAZANÝCH NA POHLAVIE PRI  DROSOPHILA 
MELANOGASTER  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test na zachytenie recesívnych letálnych mutácií viazaných na 
pohlavie (SLRL) využívajúci  Drosophila melanogaster  zisťuje 
výskyt mutácií, bodových mutácií aj malých delécií v zárodo čných 
líniách tohto hmyzu. Tento test je testom na priame mutácie, ktorý umožňuje skríning mutácií v približne 800 lokusoch na X-chromo ­
zóme; toto reprezentuje okolo 80 % všetkých lokusov X-chromo ­
zómu. X-chromozóm predstavuje približne jednu pätinu celého haploidného genómu. 
Mutácie na X-chromozóme  Drosophila melanogaster  sa fenotypovo 
exprimujú u sam čích nosičov mutantného génu. Ak je letálna 
mutácia v hemizygotných podmienkach, jej prítomnos ť sa vyvodzuje 
z neprítomnosti jednej triedy z dvoch tried sam čích potomkov, ktoré 
sa normálne vytvárajú z heterozygotnej sami čky. SLRL test využíva 
výhody tohto faktu prostredníctvom špeciálne ozna čených 
a upravených chromozómov.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
L í n i e 
Používajú sa samce dobre charakterizovanej štandardnej línie 
a samičky línie Muller-5. Použi ť sa môžu aj iné vhodne ozna čené 
samičie línie s mnohonásobne invertovanými X-chromozómami.  
T e s t o v a n á l á t k a 
Testované látky sa musia rozpusti ť vo vode. Látky, ktoré nie sú 
rozpustné vo vode, sa môžu rozpusti ť alebo rozsuspendova ť vo 
vhodnom nosi či (napr. zmesi etanolu a Tween-60 alebo 80) a pred 
podávaním rozriedi ť vo vode alebo v roztoku soli. Ako nosi č by sa 
nemal použi ť dimetylsulfoxidu (DMSO).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
P o č e t z v i e r a t 
Test by sa mal zostavi ť s vopred ur čenou citlivos ťou a silou. Na 
počet ovplyvnených chromozómov, ktorý sa musí analyzova ť, bude 
výrazne vplýva ť spontánna muta čná frekvencia pozorovaná vo 
vhodnej kontrole.  
S p ô s o b p o d á v a n i a 
Vystavenie sa môže uskuto čniť orálne, injekciou alebo prostredníc ­
tvom vystavenia plynom alebo parám. Podávanie testovanej látky 
kŕmením sa môže uskuto čniť pridaním látky do cukrového roztoku. 
Ak je to nutné, látky sa môžu rozpusti ť v 0,7 % NaCl roztoku 
a injekciou vpravi ť do hrude alebo do bruška.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n e j a p o z i t í v n e j k o n t r o l y 
Do testu by sa mala zahrnú ť negatívna (nosi č) a pozitívna kontrola. 
Ak sú však dostupné vhodné laboratórne údaje o kontrolách z minulosti, nie je potrebná žiadna súbežná kontrola.
 
H o d n o t y v y s t a v e n i a 
Použiť by sa mali tri expozi čné hodnoty. Na predbežné stanovenie sa 
môže použi ť jedna expozi čná hodnota testovanej látky. Vtedy expo ­
zičná hodnota je bu ď maximálna tolerovaná hodnota, alebo taká, 
ktorá má za následok ur čitý náznak toxicity. Pre netoxické látky 
by sa mala použi ť expozícia na maximálnu používanú koncentráciu.  
P o s t u p 
Samce štandardného fenotypu (starí tri až pä ť dní) sa ovplyv ňujú 
testovanými látkami a jednotlivo sa pária s množstvom panenských 
samičiek z línie Muller-5 alebo z inej vhodne ozna čenej línie (s 
mnohonásobne invertovanými X-chromozómami). Každé dva až tri dni sa sami čky nahradia novými panenskými sami čkami s cie ľom 
pokryť celý zárodo čný bunkový cyklus. Potomstvo týchto sami čiek 
sa vyhodnotí vzh ľadom na letálne vplyvy zodpovedajúce vplyvom 
na zrelú spermiu, stredným alebo neskorým stavom spermatid, skorým spermatidám, spermatocytom a spermatogóniam v čase 
ovplyvňovania. 
Heterozygotným F
 1 samičkám z vyššie uvedených krížení sa umož ­ 
ňuje páriť sa jednotlivo (t. j. jedna sami čka na nádobku) s ich bratmi. 
V F  2 generácii sa každá kultúra je vyhodnotí vzh ľadom na neprí ­
tomnosť štandardných sam čích typov. Ak sa zdá, že kultúra vyrástla 
z F 1 samičky nesúcej letálnu mutáciu v rodi čovskom X-chromozóme 
(t. j. nepozorujú sa žiadne samce s ovplyvneným chromozómom), dcéry tejto sami čky s rovnakým genotypom sa musia testova ť, aby 
sme zistili, či sa letalita opakuje v nasledujúcej generácii.
 
2. ÚDAJE  
Údaje sa znázornia do tabu ľky s cieľom ukáza ť počet testovaných X- 
chromozómov, po čet neplodných samcov, po čet letálnych chromo ­
zómov v každej expozi čnej koncentrácii a pre každú periódu párenia 
na každého skúmaného samca. Dokumentova ť sa musí po čet 
zhlukov rozdielnych ve ľkostí vzh ľadom na jedného samca. Tieto 
výsledky sa potvrdia nezávislým experimentom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Pri vyhodnocovaní testov na pohlavie viazanú recesívnu letalitu by 
sa mali použi ť vhodné štatistické metódy. Zhlukovanie recesívnych 
letálnych mutácií pochádzajúcich z jedného samca sa skúma a vyhodnocuje vhodným štatistickým spôsobom.
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie: 
— zásobná línia: použité línie  Drosophila  alebo kmene, vek hmyzu, 
počet ovplyvnených samcov, po čet sterilných samcov, po čet 
stabilných F  2 kultúr, po čet F  2 kultúr bez potomstva, po čet chro­
mozómov nesúcich letálnu mutáciu, ktoré sú zistené v každom zárodočnom bunkovom štádiu, 
— kritériá pre vytvorenie ve ľkosti ovplyv ňovaných skupín, 
— testovacie podmienky: podrobný opis ovplyv ňovania a odberu 
náhodných vzoriek, expozi čné koncentrácie, údaje o toxicite, 
prípadne negatívne (rozpúš ťadlo) a pozitívne kontroly, 
— kritériá vyhodnocovania letálnych mutácii, — vzťah expozícia/efekt tam, kde je to možné, 
— zhodnotenie dát, — diskusiu o výsledkoch, — interpretáciu výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  TESTY BUNKOVEJ TRANSFORMÁCIE CICAV ČÍCH BUNIEK  
IN VITRO  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Systémy kultúr cicav čích buniek sa používajú na ur čenie fenotypo ­
vých zmien indukovaných  in vitro  chemickými látkami, ktoré súvisia 
s malígnou transformáciou  in vivo.  Medzi často používané bunky 
patria C3H10T  1/2 , 3T3, SHE, Fischer bunky potkanov. Testy sa 
zakladajú na zmenách bunkovej morfológie, vytváraní ohnísk alebo zmenách v schopnosti pri ľnúť na polopevnom agare. Existujú aj 
menej používané systémy, ktoré detekujú iné fyziologické 
a morfologické zmeny v bunkách, vznikajúce ako dôsledok vysta ­
venia karcinogénnym chemikáliám. Žiadny zo záverov  in vitro  testov 
nepreukázal mechanické spojenie s rakovinou. Niektoré z testovacích 
systémov majú schopnos ť odhaľovať nádorové promótory. Cytoto ­
xicita sa môže ur čiť meraním vplyvu testovaného materiálu na 
schopnosti tvorby kolónií (klonovacia ú činnosť) alebo meraním 
rýchlosti rastu kultúr. Meranie cytotoxicity má za cie ľ preukáza ť, 
že vystavenie testovanej chemikálii bolo toxikologicky závažné, ale 
nemôže sa použi ť na výpo čet frekvencie transformácií vo všetkých 
testoch, ke ďže niektoré môžu vyžadova ť predĺženú inkubáciu a/alebo 
opätovné nao čkovanie.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
B u n k y 
Dostupné sú rozmanité bunkové línie alebo primárne bunky a to 
v závislosti od použitého transforma čného testu. Výskumník musí 
zaručiť, aby bunky v uskuto čňovanom teste vykazovali vhodnú 
zmenu fenotypu po vystavení známym karcinogénom a aby test 
v laboratóriu výskumníka bol dokázate ľne platný, spo ľahlivý 
a zdokumentovaný.  
M é d i u m 
Používajú sa médiá a experimentálne podmienky, ktoré zodpovedajú 
používanému transforma čnému testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
T e s t o v a n á l á t k a 
Testované látky sa môžu pripravi ť v kultiva čnom médiu alebo 
rozpustiť, alebo rozsuspendova ť vo vhodnom nosi či predtým, ako 
dôjde k ovplyvneniu buniek. Kone čná koncentrácia nosi ča 
v kultiva čnom systéme by nemala ovplyv ňovať životaschopnos ť 
bunky, rýchlos ť rastu alebo výskyt transformácií.  
M e t a b o l i c k á a k t i v á c i a 
Bunky majú by ť vystavené testovanej látke tak v prítomnosti, ako aj 
v neprítomnosti vhodného metabolického aktiva čného systému. 
V eventuálnom prípade, ke ď sa používajú typy buniek 
s endogénnou metabolickou aktivitou, by malo by ť známe, že 
povaha aktivity je vhodná pre testované chemické triedy.  
Testovacie podmienky  
P o u ž i t i e n e g a t í v n y c h a p o z i t í v n y c h k o n t r o l 
Pozitívne kontroly, ktoré využívajú priamo pôsobiace zlú čeniny 
a zlúčeniny vyžadujúce metabolickú aktiváciu, majú by ť súčasťou 
každého experimentu; negatívnu kontrolu (nosi č) je taktiež potrebné 
použiť. 
Nasledujú príklady látok, ktoré môžu by ť použité ako pozitívna 
kontrola: 
— priamo pôsobiace chemikálie: 
— etylmetánsulfonát, — β-propiolaktón, 
— zlúčeniny vyžadujúce metabolickú aktiváciu: 
— 2-acetylaminofluorén, 
— 4-dimetylaminoazobenzén, — 7,12-dimetylbenzantracén. 
V prípade, že je to primerané, mala by sa zahrnú ť ďalšia pozitívna 
kontrola rovnakej chemickej triedy, ako je testovaná látka.
 
K o n c e n t r á c i e v y s t a v e n i a 
Používa sa nieko ľko koncentrácií testovanej látky. Tieto koncentrácie 
majú poskytova ť toxický efekt spôsobený koncentráciou, najvyššia 
koncentrácia spôsobujúca nízku úrove ň prežívania a prežívanie pri 
najnižšej koncentrácii by malo by ť približne rovnaké ako pri nega ­
tívnej kontrole. Vo vode ťažko rozpustné látky sa majú testova ť až 
do úrovne rozpustnosti s použitím vhodných postupov. Pre vo ľne 
rozpustné netoxické látky sa horná koncentrácia testovanej látky 
určuje od prípadu k prípadu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Postup  
Na základe použitého testovacieho systému sa bunky ovplyv ňujú 
počas primeraného časového intervalu a ak je vystavenie pred ĺžené, 
môže zah ŕňať opätovné vystavenie sprevádzané výmenou živnej 
pôdy (a ak je nevyhnutné, čerstvou zmesou metabolického aktiváto ­
ra). Bunky bez dostato čnej endogénnej metabolickej aktivity sa 
vystavujú testovanej látke ako v prítomnosti tak aj v neprítomnosti vhodného metabolického aktiva čného systému. Na konci doby vysta ­
venia sa bunky premyjú, zbavia testovanej látky a kultivujú za 
podmienok vhodných na monitorovanie transformovaného fenotypu 
a stanoví sa rozsah zistených transformácií. Všetky výsledky sa potvrdia nezávislým experimentom.
 
2. ÚDAJE  
Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek v rôznych formách 
v závislosti na uskuto čnenom teste, napr. zhodnotenie platní, pozi ­
tívne platne alebo po čet transformovaných buniek. V prípadoch, kde 
je to možné, prežívanie sa má vyjadri ť ako percento úrovne hodnôt 
kontrolných vzoriek a frekvencia transformácie sa má vyjadri ť ako 
počet transformantov na po čet prežívajúcich buniek. Údaje sa vyhod ­
nocujú pomocou vhodných štatistických metód.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje nasledujúce 
informácie: 
— použitý typ buniek, po čet bunkových kultúr, metódy na udržia ­
vanie bunkových kultúr, 
— testovacie podmienky, koncentrácia testovanej látky, použitý 
nosič, inkuba čný čas, trvanie a frekvenciu ovplyv ňovania, 
hustotu buniek po čas ovplyv ňovania, typ použitého exogénneho 
metabolického aktiva čného systému, pozitívne a negatívne 
kontroly, špecifikáciu sledovaného fenotypu, použitý selek čný 
systém (ak je potrebný), odôvodnenie výberu dávok, 
— použité metódy na výpo čet počtu životaschopných 
a transformovaných buniek, 
— štatistické vyhodnotenie, 
— diskusiu o výsledkoch, — interpretáciu výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  DOMINANTNÝ LETÁLNY TEST U HLODAVCOV  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Dominantné letálne vplyvy spôsobujú smr ť embrya alebo plodu. 
Vyvolanie dominantných letálnych mutácií ovplyvnením chemickou 
látkou nazna čuje, že látka ovplyvnila zárodo čné tkanivá testovaného 
druhu. Všeobecne sa usudzuje, že dominantné letálne mutácie majú pôvod v poškodeniach chromozómov (štrukturálnych a numerických anomáliách). Smr ť embrya ovplyvnených sami čiek môže by ť tiež 
výsledkom toxických vplyvov. 
Vo všeobecnosti sa sam čí jedinci vystavia testovanej zlú čenine a pária 
sa s neovplyvnenými panenskými sami čkami. Samostatne sa môžu 
testovať rozličné štádiá zárodo čných buniek s využitím postupných 
intervalov kríženia. Zvýšenie po čtu mŕtvych implantátov na sami čku 
v ovplyvnenej skupine v porovnaní s po čtom mŕtvych implantátov na 
samičku v kontrolnej skupine odráža postimplanta čné straty. Pred ­
implantačné straty sa môžu stanovi ť na základe po čítania žltých 
teliesok  (corpora luted)  alebo porovnaním všetkých implantátov na 
samičku vo vystavenej a v kontrolnej skupine. Celkový dominantný 
letálny vplyv je sú čet pred a postimplanta čných strát. Výpo čet 
celkového dominantného letálneho vplyvu je založený na porovnaní počtu živých implantátov na sami čku v testovanej skupine k po čtu 
živých implantátov na sami čku v kontrolnej skupine. Zníženie po čtu 
implantátov v ur čitých obdobiach môže by ť výsledkom usmrtenia 
buniek (napr. spermatocytov a/alebo spermatogónií).
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
V prípade, že je to možné, sa testované látky rozpustia alebo rozsus ­
pendujú vo fyziologickom roztoku. Chemikálie vo vode nerozpustné sa rozpustia alebo rozsuspendujú vo vhodných nosi čoch. Použitý 
nosič nesmie ovplyv ňovať testovanú chemikáliu, ani spôsobova ť 
toxické ú činky. Vykonaná musí by ť čerstvá príprava testovanej 
chemikálie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Podmienky testu  
S p ô s o b p o d á v a n i a 
Vo všeobecnosti sa testovaná látka podáva iba raz. Na základe toxi ­
kologických informácií možno použi ť opakovaný harmonogram 
vystavenia. Zvy čajný spôsob podávania je orálna intubácia alebo 
intraperitoneálna injekcia. Vhodnými môžu by ť aj iné spôsoby podá ­
vania.  
E x p e r i m e n t á l n e z v i e r a t á 
Ako testovacie druhy sa preferujú potkany alebo myši. Zdravé 
a pohlavne zrelé zvieratá sa náhodne roztriedia do skupiny na vysta ­
venie a do kontrolnej skupiny.  
P o č e t a p o h l a v i e 
Mal by sa použi ť primeraný po čet vystavených samcov, berúc 
pritom do úvahy spontánnu zmenu hodnoteného biologického druhu. Zvolený po čet by mal vychádza ť z vopred ur čenej citlivosti detekcie 
a sile významnosti. V typickom teste napríklad by mal po čet samcov 
v skupine každej dávky sta čiť na dosiahnutie 30 až 50 gravidných 
samíc v danom intervale kríženia.
 
P o u ž i t i e n e g a t í v n e j a p o z i t í v n e j k o n t r o l y 
Do každého experimentu sa zah ŕňajú súbežné pozitívne a negatívne 
kontroly. Ak sú k dispozícii akceptovate ľné výsledky pozitívnej 
kontroly z nedávno uskuto čnených experimentov v rovnakom labo ­
ratóriu, je možné použi ť tieto výsledky miesto súbežnej pozitívnej 
kontroly. Na preukázanie citlivosti testu sa používajú látky pozitívnej 
kontroly v prijate ľne nízkej dávke (napr. MMS, intraperitoneálne, 
10 mg/kilogram).  
Ú r o v n e d á v o k 
Zvyčajne sa používajú tri rôzne dávky. Vysoká dávka by mala 
poskytova ť dôkazy o toxicite alebo redukovanej plodnosti ovplyvne ­
ných zvierat. V niektorých prípadoch posta čuje jediná vysoká dávka.  
H r a n i č n ý t e s t 
Pri jednorazovom podaní sa netoxické látky testujú pri 5 g/kilogram 
alebo pri opakovanom podávaní pri 1 g/kilogram/de ň. 
Postup  
Existuje nieko ľko harmonogramov vystavenia. Jednorazové podanie 
testovanej látky je najrozšírenejšie. Môžu sa použi ť aj iné harmono ­
gramy ovplyv ňovania. 
Jednotlivé samce sa postupne pária s jednou alebo dvoma neovplyv ­
nenými panenskými samicami vo vhodných časových obdobiach po 
ovplyvnení. Samice sa musia ponecha ť so samcami po dobu trvania 
aspoň jedného ovula čného cyklu alebo pokým nedôjde k páreniu, 
toto sa stanoví na základe prítomnosti spermií vo vagíne alebo 
prítomnos ťou vaginálnej zátky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Počet párení po ovplyvnení je daný harmonogramom ovplyvnenia 
a musí zabezpe čovať, že sa po ovplyvnení zachytia všetky štádiá 
zárodočných buniek. 
Samice sa usmrtia v druhej polovici gravidity a vyšetrí sa obsah 
maternice tak, aby sa stanovil po čet mŕtvych a živých implantátov. 
Vaječníky sa môžu vyšetri ť na stanovenie po čtu žltých teliesok.  
2. ÚDAJE  
Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek, ktoré ukazujú po čet samcov, 
počet gravidných samíc a po čet negravidných samíc. Výsledky 
každého kríženia zah ŕňajúce pôvod každého samca a samice by sa 
mali zachyti ť samostatne. U každej samice je potrebné opísa ť týždeň 
párenia, dávku, ktorou bol ovplyvnený samec, frekvenciu živých implantátov a frekvenciu m ŕtvych implantátov. 
Výpočet celkového dominantného letálneho vplyvu je založený na 
porovnaní po čtu živých implantátov na samicu v testovanej skupine 
k počtu živých implantátov v kontrolnej skupine. Na stanovenie 
postimplanta čných strát sa analyzuje pomer m ŕtvych a živých 
implantátov z ovplyvnenej skupiny porovnaný s rovnakým pomerom 
z kontrolnej skupiny. 
V prípade, že sú údaje zaznamenané ako skorá a neskorá smr ť, musí 
sa na to poukáza ť v tabuľkách. Je potrebné uvies ť, či sú odhadnuté 
predimplanta čné straty. Predimplanta čné straty sa vypo čítajú ako 
rozdiel medzi po čtom žltých teliesok a po čtom implantátov alebo 
ako zníženie priemerného po čtu implantátov na maternicu 
v porovnaní s kontrolnými páreniami. 
Údaje sú vyhodnocované pomocou vhodných štatistických metód.
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie: 
— druh, kme ň, vek a hmotnos ť použitých zvierat, po čet zvierat 
každého pohlavia v experimentálnej a kontrolnej skupine, 
— testovaná látka, nosi č, testované dávky a podklady pre výber 
dávok, negatívna a pozitívna kontrola, údaje o toxicite, 
— spôsob podávania a harmonogram ovplyv ňovania, 
— harmonogram párenia, 
— metódy použité na dôkaz, že sa uskuto čnilo párenie, 
— čas usmrtenia, 
— kritériá na stanovenie dominantných letálnych mutácií, 
— ak je to možné, vz ťah dávka/efekt,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— štatistické vyhodnotenie, 
— diskusia o výsledkoch, — interpretácia výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  TEST SPERMATOGONÁLNEJ CHROMOZÓMOVEJ 
ODCHÝLKY U CICAVCOV  
1. METÓDA  
Táto metóda je obdobou OECD TG 483, testu spermatogonálnej 
chromozómovej odchýlky u cicavcov (1997).  
1.1. ÚVOD 
Účelom testu spermatogonálnej chromozómovej odchýlky u cicavcov 
je identifikova ť látky, ktoré spôsobujú štrukturálne chromozómové 
odchýlky v spermatogonálnych bunkách cicavcov (1) (2) (3) (4)(5). 
Štrukturálne chromozómové odchýlky sa vyskytujú v dvoch typoch, 
chromozómové alebo chromatidové. Vä čšina chemických mutagénov 
indukuje odchýlky chromatidového typu, vyskytujú sa však aj odchýlky chromozómového typu. Táto metóda nie je ur čená na 
meranie numerických odchýlok a na tento ú čel sa bežne nepoužíva. 
Chromozómové mutácie a podobné udalosti sú prí činou mnohých 
ľudských genetických chorôb. 
Tento test meria chromozómové udalosti v spermatogonálnych záro ­
dočných bunkách, a preto sa predpokladá, že predpovedá vznik 
dedičných mutácií v zárodo čných bunkách. 
Pri tomto teste sa zvy čajne používajú hlodavce. Tento  in vivo  cyto­
genetický test zis ťuje chromozómové odchýlky v spermatogonálnych 
mitózach. Iné cie ľové bunky tomuto testu nepodliehajú. 
Na zistenie odchýlok chromatidového typu v spermatogonálnych 
bunkách sa skúma prvé delenie mitotických buniek po podaní ešte 
predtým, ako sa tieto lézie stratia v následných deleniach buniek. 
Dodatočné informácie z ošetrených spermatogonálnych kme ňových 
buniek sa získavajú analýzou meiotických chromozómov na 
odchýlky chromozómového typu pri diakinetickej metafáze I, ke ď 
sa ošetrené bunky stanú spermatocytmi. 
Tento  in vivo  test skúma, či mutagény somatických buniek sú tiež 
aktívne v zárodo čných bunkách. Spermatogonálny test je ďalej rele­
vantný pre hodnotenie mutagénneho rizika tým, že umož ňuje posú­
denie faktorov  in vivo  metabolizmu, farmakokinetiky a opravných 
procesov DNA. V semenníkoch je prítomné množstvo generácií spermatogónií so spektrom citlivosti na chemické látky. 
Zistené odchýlky preto predstavujú celkovú reakciu vystavených 
populácií spermatogonálnych buniek s prevládajúcimi po četnejšími 
diferencovanými spermatogonálnymi bunkami. Rôzne generácie 
spermatogónií sú alebo nie sú exponované všeobecnou cirkuláciou v závislosti od ich pozície v semenníkoch, kvôli fyzickej a fyziologickej bariére Sertoliho buniek a bariére krvi 
v semenníkoch. 
Ak existujú dôkazy, že testovacia látka alebo reaktívny metabolit 
nedosiahne cie ľové tkanivo, nie je vhodné tento test použi ť. 
Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINÍCIE  
Odchýlka chromatidového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie jednotlivých chromatidov alebo pretrhnutie a opätovné spojenie medzi chromatidmi.  
Odchýlka chromozómového typu:  štrukturálne chromozómové 
poškodenie prejavujúce sa ako pretrhnutie alebo pretrhnutie 
a opätovné spojenie oboch chromatidov na rovnakom mieste.  
Trhlina:  achromatická lézia menšia ako šírka jedného chromatidu 
s minimálnym posunutím chromatidov.  
Numerická odchýlka:  zmena v po čte chromozómov v porovnaní 
s normálnou numerickou charakteristikou použitých buniek.  
Polyploidia:  násobok haploidného chromozómového čísla n) odliš ­
ného od diploidného čísla (t. j. 3n, 4n at ď.) 
Štrukturálna odchýlka:  zmena v chromozómovej štruktúre rozpoz ­
nateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia 
buniek, pozorovaná ako delenia a fragmenty, intrazmeny alebo interzmeny.
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Zvieratá sú exponované príslušným spôsobom testovacou látkou 
a utratené vo vhodnom čase po podaní látky. Pred utratením sa 
zvieratá ošetria prostriedkom zastavujúcim metafázu (napr Colcemi ­
dom® alebo colchicinom). Následne sa zo zárodo čných buniek 
urobia chromozómové prípravky, zafarbia sa a metafázové bunky sa analyzujú na chromozómové odchýlky.
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Výber živo číšnych druhov  
Najbežnejšie sa používajú samce čínskych mor čiat a myší. Použi ť sa 
dajú samce iného vhodného druhu cicavcov. Vyberajú sa bežne 
používané laboratórne rody mladých zdravých dospelých zvierat. 
Na začiatku štúdie by mala by ť hmotnostná variácia zvierat mini ­
málna a nemala by presiahnu ť ± 20 % strednej hmotnosti každého 
pohlavia.  
1.4.1.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode 
k časti B, cie ľovou hodnotou vlhkosti je 50 % až 60 %.  
1.4.1.3.  Príprava zvierat  
Zdravé mladé dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a pokusných skupín. Klietky sú umiestnené tak, aby sa minimalizo ­
vali možné ú činky vyplývajúce z rozmiestnenia klietok. Zvieratá sa 
jednotlivo ozna čia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne 
podmienky najmenej pä ť dní pred za čatím štúdie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Príprava dávok  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú alebo ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch, a ak je to vhodné, rozrie ďujú pred 
podávaním dávok zvieratám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú 
priamo alebo pred podávaním rozriedené. Používajú sa čerstvé 
prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje o stabilite nepoukazujú na 
vhodnosť uskladnenia.  
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvoláva ť toxické ú činky na používa ­
ných úrovniach dávok. Nemali by chemicky reagova ť s testovacou 
látkou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich 
použitie by malo by ť podporené údajmi ozna čujúcimi ich kompati ­
bilitu. Odporú ča sa zváži ť, ak je to možné, použitie vodného 
rozpúšťadla/nosiča. 
1.4.2.2.  Kontrolné skupiny  
Pri každom pokuse sa vytvoria pozitívne a negatívne (rozpúš ťadlo/­
nosič) kontrolné skupiny. Okrem podania testovacej látky sa so 
zvieratami v kontrolných skupinách zaobchádza rovnakým spôsobom 
ako s pokusnými zvieratami. 
Pozitívna kontrolná skupina vytvára štrukturálne odchýlky  in vivo  
v spermatogonálnych bunkách pri podaní na úrovniach expozície, pri ktorých sa o čakáva zistite ľný nárast na pozadí. 
Dávky pozitívnej kontrolnej skupiny sa volia tak, aby boli ú činky 
zjavné, ale aby pozorovate ľovi priamo neodha ľovali identitu kódo ­
vaných vzoriek. Je prijate ľné, aby pozitívnym kontrolným skupinám 
boli látky podávané spôsobom odlišným od testovacej látky a vzorky 
z nich boli odoberané iba raz. Ak sú dostupné, môže sa zváži ť 
použitie chemikálií pre pozitívnu kontrolnú skupinu príbuzných v triede chemikálií. Príklady látok pre pozitívnu kontrolnú skupinu:
 
Látka Číslo CAS Číslo EINECS  
Cyklofosfamid 
monohydrát cyklofosfamidu 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyklohexamin 108-91-8 203-629-0 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Monomerický akrylamid 79-06-1 201-173-7 
Trietylénmelamín 51-18-3 200-083-5 
Pre každý odber vzoriek sa odoberú vzorky aj z negatívnych kontrol ­
ných skupín, iba s rozpúš ťadlom alebo nosi čom, a inak ošetrovaných 
rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny, pokia ľ nie sú 
z historických kontrolných údajov dostupné údaje o variabilite medzi zvieratami a frekvenciách buniek s chromozómovou odchýl ­
kou. Používajú sa aj neošetrené kontrolné skupiny, pokia ľ neexistujú 
historické kontrolné údaje demonštrujúce, že vybrané rozpúš ťadlo 
alebo nosi č nespôsobujú žiadne rušivé alebo mutagénne efekty.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Po čet zvierat  
Každá pokusná a kontrolná skupina obsahuje najmenej pä ť analyzo­
vateľných zvierat.  
1.5.2.  Harmonogram ošetrovania  
Testovacie látky sa podávajú jeden alebo dvakrát (t. j. ako jedno 
podanie alebo dve podania). Testovacie látky môžu by ť podávané 
aj v dvoch dávkach, t. j. dve podania v jeden de ň po nieko ľkých 
hodinách po sebe na u ľahčenie podania ve ľkého objemu látky. Iné 
dávkovacie režimy sa vedecky zdôvodnia. 
V skupine s najvyššou dávkou sa uskuto čnia dva odbery vzoriek. 
Keďže kinetika bunkového cyklu môže by ť ovplyvnená testovacou 
látkou, vzorky sa odoberajú v dvoch rôznych časoch po ošetrení, prvý ­
krát skôr a druhýkrát neskôr, približne 24 a 48 hodín po podaní. Pre dávky prekra čujúce najvyššiu dávku sa odber uskuto ční po 24 hodi ­
nách alebo pri 1,5 násobku d ĺžky bežného bunkového cyklu po podaní, 
pokiaľ nie je známe, že pre zistenie ú činkov je vhodnejší iný čas (6). 
Vzorky sa môžu ďalej odobera ť v iných časoch. Napríklad v prípade 
chemikálií, ktoré môžu indukova ť zaostávanie chromozómov alebo 
vyvolávať účinky nezávislé od S, sú vhodné skoršie časy odberu 
vzoriek (1). 
Vhodnosť opakovaného harmonogramu podávania sa identifikuje 
z prípadu na prípad. Po opakovanom harmonograme podávania sa zvieratá utratia po 24 hodinách (1,5 násobok d ĺžky bunkového 
cyklu) od posledného podania. Kde je to vhodné, môžu sa usku ­
točniť ďalšie odbery vzoriek. 
Pred utratením sa zvieratám injek čne intraperitoneálne podáva 
vhodná dávka prostriedku zastavujúceho metafázu (napr Colcemid® 
alebo colchicin). Po vhodnom čase sa následne zo zvierat odoberajú 
vzorky. U myší je tento interval približne 3 – 5 hodín; u čínskych 
morčiat približne 4 – 5 hodín.
 
1.5.3.  Úrovne dávok  
Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskuto ční štúdia na 
zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu, za použitia rovnakého druhu, kme ňa, pohlavia a dávkovacieho režimu ako 
v hlavnej štúdii (7). Ak sa vyskytuje toxicita, pre prvý odber vzorky 
sa používajú tri úrovne dávok. Tieto úrovne dávok pokrývajú rozsah 
od maximálnej po malú, rsp. žiadnu toxicitu. Pri neskoršom odbere vzorky sa používa len najvyššia dávka. Najvyššia dávka sa definuje ako známka toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie úrovne 
dávkovania založené na rovnakom dávkovacom režime by pravde ­
podobne spôsobili úmrtnos ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Látky so špecifickými biologickými aktivitami pri nízkych netoxic ­
kých dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) môžu by ť 
výnimkou kritéria stanovenia dávky a hodnotia sa z prípadu na prípad. Najvyššia dávka sa tiež definuje ako dávka, ktorá spôsobí určité príznaky toxicity v spermatogonálnych bunkách (napríklad: 
zníženie pomeru spermatogonálnej mitózy k prvej a druhej meio ­
tickej metafáze; toto zníženie by nemalo presiahnu ť 50 %).
 
1.5.4.  Limitný test  
Ak test pri jednom objeme dávky najmenej 2 000 mg/kg telesnej 
hmotnosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden deň nevyvoláva žiadne toxické ú činky a ak sa neo čakáva genotoxi ­
cita na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia 
pri použití troch hladín dávkovania sa nepovažuje za potrebnú. Očakávaná expozícia na ľudí môže nazna čovať potrebu vyššieho 
objemu dávky pri použití limitného testu.
 
1.5.5.  Podávanie dávok  
Testovacia látka sa zvy čajne podáva plnením žalúdka sondou 
s použitím žalúdo čnej rúrky alebo vhodnej intuba čnej kanyly alebo 
intraperitoneálnou injekciou. Iné cesty expozície sú prijate ľné len so 
zdôvodnením. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od ve ľkosti testovacieho 
zvieraťa. Objem by nemal presiahnu ť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. 
Použitie objemov vyšších ako tento sa musí zdôvodni ť. Okrem dráž ­
divých alebo žieravých látok, ktoré bežne odhalia zhoršené ú činky 
s vyššími koncentráciami, sa variabilita testovacieho objemu mini ­
malizuje upravením koncentrácie na zabezpe čenie stáleho objemu na 
všetkých úrovniach dávok.
 
1.5.6.  Príprava chromozómov  
Ihneď po utratení sa získavajú bunkové suspenzie z jedného alebo 
oboch testov, ktoré sa vystavia hypotonickému roztoku a fixujú sa. Bunky sa potom umiestnia na sklí čka a zafarbia.
 
1.5.7.  Analýza  
Od každého zviera ťa sa analyzuje najmenej 100 dobre rozšírených 
metafáz (t. j. minimálne 500 metafáz na skupinu). Tento po čet je 
možné zníži ť pri pozorovaní vysokého po čtu odchýlok. Všetky 
sklíčka, vrátane sklí čok z negatívnych a pozitívnych kontrolných 
skupín, sa pred mikroskopickou analýzou nezávisle ozna čia kódmi. 
Keďže postupy fixácie často ústia do pretrhnutia časti metafázy so 
stratou chromozómov, ozna čené bunky by mali obsahova ť počet 
centromér rovnajúci sa hodnote 2  n ± 2.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabu ľkovej forme. 
Experimentálnou jednotkou je jedno zviera. Pre každé zviera sa 
hodnotí po čet buniek so štrukturálnymi chromozómovými odchýl ­
kami a po čet chromozómových odchýlok na bunku. Rôzne typy 
štrukturálnych chromozómových odchýlok sa uvádzajú v zozname s ich číslami a frekvenciami pre pokusné a kontrolné skupiny. 
Trhliny sa zaznamenávajú oddelene a uvádzajú sa, ale zvy čajne sa 
neudávajú pri celkovej frekvencii odchýlok.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Ak je pozorovaná mitóza i meióza, pomer spermatogonálnych mitóz 
k prvej a druhej meiotickej metafáze sa stanoví ako meranie cytoto ­
xicity pre všetky pokusné a negatívne kontrolné zvieratá pri celkovej vzorke 100 deliacich sa buniek na jedno zviera na ú čely stanovenia 
možného cytotoxického ú činku. Ak je pozorovaná len mitóza, mito ­
tický index sa stanovuje pre najmenej 1 000 buniek na jedno zviera.
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Pre stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast relatívneho po čtu buniek s chromozómovými 
odchýlkami spojený s dávkou alebo zjavný nárast po čtu buniek 
s odchýlkami pri jednej dávke pri jednom odbere vzorky. Najprv 
sa zvažuje biologická relevantnos ť výsledkov. Ako pomôcka sa pri 
hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy (8). Štatis ­
tický význam nie je jediným ur čujúcim faktorom pre pozitívnu reak ­
ciu. Nejednozna čné výsledky sa objas ňujú ďalším testovaním, 
najlepšie použitím modifikácie pokusných podmienok. 
Testovacia látka s výsledkami, ktoré nesp ĺňajú vyššie uvedené krité ­
riá, sa v tomto systéme považuje za nemutagénnu. 
Hoci väčšina pokusov poskytne jednozna čne pozitívne alebo nega ­
tívne výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vopred vylú čia 
jednoznačné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu 
ostať nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní 
pokusu. 
Pozitívne výsledky  in vivo  testu spermatogonálnej chromozómovej 
odchýlky nazna čujú, že ur čitá látka vyvoláva štrukturálne chromozó ­
mové odchýlky v zárodo čných bunkách testovaného druhu. Nega ­
tívne výsledky nazna čujú, že v testovacích podmienkach testovacia 
látka neindukuje chromozómové odchýlky v zárodo čných bunkách 
testovaného druhu. 
Pravdepodobnos ť, že testovacia látka alebo jej metabolity dosiahnu 
cieľové tkanivo, je predmetom diskusie.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledujúce informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Testovacie zvieratá: — použitý druh/kme ň, 
— počet a vek zvierat, 
— zdroj, podmienky chovu, strava at ď., 
— individuálna hmotnos ť zvierat na za čiatku testu, vrátane rozsahu 
telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre 
každú skupinu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Podmienky testov: 
— údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak bola uskuto čnená, 
— zdôvodnenie vo ľby úrovne dávok, 
— zdôvodnenie vo ľby spôsobu podávania, 
— podrobnosti o príprave testovacej látky, 
— podrobnosti o podávaní testovacej látky, 
— zdôvodnenie času utratenia, 
— konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na 
samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnos ť/deň), ak je to vhodné, 
— podrobnosti o kvalite stravy a vody, — podrobný opis harmonogramu podávania a odberu vzoriek, — metódy merania toxicity, 
— identita látky zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie 
podávania, 
— metódy prípravy sklí čok, 
— kritériá pre hodnotenie odchýlok, 
— počet analyzovaných buniek na jedno zviera, 
— kritériá na hodnotenie pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné. 
Výsledky: — známky toxicity, — mitotický index, — pomer buniek spermatogonálnej mitózy k prvej a druhej meio ­
tickej metafáze, 
— typ a po čet odchýlok uvádzaný samostatne na každé zviera, 
— celkový po čet odchýlok na skupinu, 
— počet buniek s odchýlkami na skupinu, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— štatistické analýzy, ak boli použité, — súčasné údaje o negatívnych kontrolných skupinách, 
— historické údaje o negatívnych kontrolných skupinách, 
s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami, 
— súčasné údaje o pozitívnych kontrolných skupinách, 
— zmeny ploidie, ak boli pozorované. 
Rozbor výsledkov Závery
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. LITERATÚRA  
(1) Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477 – 484. 
(2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. 
Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275 – 306. 
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, 289 – 294. 
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G and 
Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115 – 141. 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. 
Mutation Res., 52, 207 – 209. 
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, 313 – 318. 
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R, Botham, P.A., Doe, I, 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G, Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, DJ. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, 313 – 319. 
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G.E., Clare, 
G, Ferguson, R, Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.RK. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic Assays In: D. 
J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test 
Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 
184 – 232.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  SPOT TEST U MYŠÍ  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť E. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť E. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Predkladaný test je  in vivo  test u myší, pri ktorom sa vyvíjajúce 
embryo vystaví chemikáliám. Cie ľovými bunkami vo vyvíjajúcom 
sa embryu sú melanoblasty a cie ľovými génmi sú také gény, ktoré 
podmieňujú pigmentáciu srsti. Vyvíjajúce sa embryá sú heterozy ­
gotné pre mnohé gény podmie ňujúce sfarbenie srsti. Mutácia alebo 
strata (následkom rôznych genetických udalostí) dominantnej alely takéhoto génu v melanoblaste spôsobuje expresiu recesívneho feno ­
typu v bunkách potomstva, vytvárajúc tak škvrny zmenenej farby na 
srsti vzniknutej myši. Spo číta sa počet potomkov s týmito škvrnami, 
mutáciami a porovná sa ich frekvencia medzi potomstvom vznik ­
nutým z embryí ovplyvnených iba rozpúš ťadlom. Spot test u myší 
určuje predpokladané somatické mutácie vo fetálnych bunkách.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
Ak je to možné, testované látky sa rozpustia alebo rozsuspendujú vo 
fyziologickom roztoku. Chemikálie nerozpustné vo vode sa rozpustia 
alebo rozsuspendujú vo vhodnom nosi či. Použitý nosi č nesmie 
reagovať s testovanou látkou ani spôsobova ť toxické ú činky. 
Používa sa čerstvo pripravený roztok testovanej chemikálie.  
P o k u s n é z v i e r a t á 
Myši kme ňa T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c  ch p/c ch p; 
brown, b/b, dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) sú 
párované bu ď s kmeňom HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa 
a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl, pe/pe), alebo s kmeňom C57BL (nonagouti, a/a). Ďalšie vhodné kríženia, akým 
je kríženie medzi kme ňom NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) 
a kmeňon DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) sa môžu 
použiť v prípade, že ich výsledkom je nonagouti potomstvo.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
P o č e t a p o h l a v i e 
Dostatočný počet gravidných samíc sa ovplyv ňuje tak, aby sa získal 
primeraný po čet potomkov pre každú použitú dávku. Vhodná 
veľkosť vzorky je daná po čtom škvŕn pozorovaných u vystavených 
myší a rozsahom kontrolných dát. Negatívny výsledok je prijate ľný 
iba v tom prípade, ak bolo hodnotených minimálne 300 potomkov 
samíc ovplyvnených najvyššou dávkou.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n e j a p o z i t í v n e j k o n t r o l y 
K dispozícii by mali by ť súbežné kontrolné údaje z myší vystave ­
ných len nosi čom (negatívna kontrola). Prida ť sa môžu historické 
kontrolné údaje z rovnakého laboratória tak, aby sa zvýšila citlivos ť 
testu pod podmienkou, že sú homogénne. V prípade, že nie je zistený žiadny mutagénny ú činok testovanej chemikálie, mali by 
byť dostupné údaje pozitívnej kontroly z vystavenia chemikálii, 
u ktorej bol dokázaný mutagénny ú činok v tomto teste, nedávno 
získané v rovnakom laboratóriu.
 
S p ô s o b p o d á v a n i a 
Zvyčajné spôsoby podávania sú orálna intubácia alebo peritoneálna 
injekcia gravidných samíc. Ak je to vhodné, používa sa ovplyvnenie 
inhaláciou alebo iné spôsoby podávania.  
Ú r o v n e d á v o k 
Používajú sa aspo ň dve úrovne dávok, z ktorých jedna vykazuje 
známky toxicity alebo zmenšenej ve ľkosti vrhu. Pre netoxické 
chemikálie by sa malo použi ť vystavenie až do maximálnej dosiah ­
nuteľnej dávky.  
Postup  
Jednorazové ovplyvnenie sa zvy čajne podáva na 8., 9. alebo 10. de ň 
gravidity, pri čom ako de ň 1 sa uvažuje de ň, keď je prvýkrát pozo ­
rovaná vaginálna zátka. Tieto dni zodpovedajú 7,25, 8,25 a 9,25 dňom po po čatí. Počas týchto dní sa môžu použi ť po sebe idúce 
ovplyvnenia.
 
A n a l ý z a 
Potomstvo je ozna čené a spo čítané sú škvrny v čase medzi tretím 
a štvrtým týžd ňom po narodení. Rozlišujú sa tri triedy škv ŕn: 
a) biele škvrny do 5 mm od strednej ventrálnej línie, o ktorých sa 
predpokladá, že sú výsledkom odumierania buniek (WMVS); 
b) žlté, aguti podobné, škvrny v oblastiach bradaviek, genitálií, 
v krčných, podpazušných a trieslových oblastiach a na strede 
čela, o ktorých sa predpokladá, že sú výsledkom chybnej diferen ­
ciácie (MDS), a 
c) pigmentované a biele škvrny náhodne distribuované na srsti, 
o ktorých sa predpokladá, že sú výsledkom somatických 
mutácií (RS).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Všetky tri triedy sa vyhodnotia, ale iba posledná, RS, je geneticky 
významná. Problémy v rozlíšení medzi MDS a RS sa môžu vyrieši ť 
fluorescen čnou mikroskopiou vzoriek chlpov. 
Mali by sa zaznamena ť zjavné hrubé morfologické abnormality 
potomstva.  
2. ÚDAJE  
Údaje sa predkladajú ako celkový po čet hodnotených potomkov 
a počet tých, ktorí majú jednu alebo viacero predpokladaných soma ­
tických muta čných škv ŕn. Ovplyv ňovanie a negatívna kontrola sa 
porovnajú pomocou vhodných metód. Údaje sa uvádzajú pod ľa 
vrhov.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu bude obsahova ť tieto 
informácie: 
— kmene použité pri krížení, — počet gravidných samíc v experimentálnej skupine a v kontrole, 
— priemerná ve ľkosť vrhu v experimentálnej a v kontrolnej skupine 
pri narodení a po odstavení, 
— úrove ň (úrovne) dávky testovanej chemikálie, 
— použité rozpúš ťadlo, 
— deň gravidity, v ktorom bolo prevedené ovplyvnenie, 
— spôsob ovplyvnenia, — celkové množstvo hodnoteného potomstva a po čet tých jedincov 
v experimentálne a kontrolnej skupine, ktoré majú WMVS, MDS a RS, 
— hrubé morfologické abnormality, — v prípade, že je to možné, vz ťah dávka/efekt pri RS, 
— štatistické vyhodnotenie, — diskusia o výsledkoch, — interpretácia výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  DEDI ČNÁ TRANSLOKÁCIA U MYŠÍ  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test dedi čnej translokácie u myší zis ťuje štrukturálne a numerické 
chromozómové zmeny v cicav čích zárodo čných bunkách po objavení 
sa v prvej generácii potomkov. Zistené typy chromozómových zmien sú recipro čné translokácie a chromozómové straty v prípade, že je 
obsiahnuté sami čie potomstvo. Nosi či translokácie a XO-samice 
vykazujú zníženú plodnos ť, ktorá sa používa na selekciu F
 1 potom­
stva pre cytogenetickú analýzu. Úplná neplodnos ť je spôsobená 
istými typmi translokácií (X-autozóm, a c-t typ). Translokácie sa 
cytogeneticky pozorujú v meiotických bunkách v diakinéze metafázy 
I samčích jedincov, a to bu ď F 1 samcov, alebo sam čieho potomstva 
F 1 samíc. XO-samice sa cytogeneticky identifikujú prostredníctvom 
prítomnosti iba 39 chromozómov v mitózach kostnej drene.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
Testované chemikálie sa rozpustia v fyziologickom roztoku. Ak sú 
nerozpustné, rozpúš ťajú sa alebo rozsuspendujú vo vhodnom nosi či. 
Využívajú sa čerstvo pripravené roztoky testovanej zlú čeniny. Ak je 
na uľahčenie dávkovania použitý nosi č, nesmie vzájomne reagova ť 
s testovanou zlú čeninou alebo spôsobova ť toxické efekty.  
S p ô s o b p o d á v a n i a 
Orálna intubácia alebo intraperitoneálna injekcia sú zvy čajnými 
spôsobmi podávania. Vhodné sú aj iné spôsoby podávania.  
P o k u s n é z v i e r a t á 
Pre prípad rozmnožovania a cytologického overovania sa pokusy 
vykonávajú s myšou. Nevyžaduje sa žiaden špecifický kme ň. Prie­
merná ve ľkosť vrhu kme ňa by však mala by ť väčšia ako osem 
a mala by by ť relatívne stála. 
Používajú sa zdravé a pohlavne zrelé zvieratá.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
P o č e t z v i e r a t 
Nevyhnutný po čet zvierat závisí od frekvencie spontánnych translo ­
kácií a na získanie pozitívnych výsledkov sa vyžaduje minimálna rýchlosť indukcie. 
Test sa zvy čajne vykonáva analýzou sam čieho F
 1 potomstva. Pre 
jednu dávkovú skupinu by sa malo testova ť aspoň 500 sam čích F  1 
potomkov, 300 samcov a 300 sami čiek sa požaduje v prípade, že sa 
zahŕňa samičie F  1 potomstvo.  
P o u ž i t i e n e g a t í v n e j a p o z i t í v n e j k o n t r o l y 
Dostupné by mali by ť zodpovedajúce kontrolné dáta odvodené zo 
súbežnej a historickej kontroly. V prípade, že na základe sú časných 
pokusov prevedených v tom istom laboratóriu sú k dispozícii prija ­
teľné výsledky pozitívnej kontroly, tieto výsledky sa môžu použi ť 
miesto súbežnej pozitívnej kontroly.  
Ú r o v n e d á v o k 
Testuje sa jedna úrove ň dávky, zvy čajne najvyššia dávka spojená 
s produkciou minimálnych toxických efektov, ale bez vplyvu na 
reprodukčné správanie alebo prežívanie. Na zabezpe čenie vzťahu 
dávky/efekt sa požadujú ďalšie dve nižšie dávky. Pre netoxické 
chemikálie by sa malo použi ť vystavenie maximálnej dosiahnute ľnej 
dávke.  
Postup  
O v p l y v ň o v a n i e a p á r e n i e 
K dispozícii sú dva harmonogramy ovplyv ňovania. Jednorazové 
podávanie testovanej látky sa používa naj častejšie. Taktiež sa môže 
použiť podávanie testovanej látky v siedmy de ň každého týžd ňa 
počas 35 dní. Po čet párení nasledujúcich po ovplyvnení sa riadi 
harmonogramom ovplyv ňovania a mal by zabezpe čiť, že sa zachytia 
všetky štádiá zárodo čných buniek. Na konci obdobia párenia sa 
samičky jednotlivo umiestnia do klietok. Ke ď samičky vrhnú, zazna ­
mená sa dátum, ve ľkosť vrhu a pohlavie potomstva. Všetko sam čie 
potomstvo sa odstaví a všetky sami čie potomstvá sa odstránia, 
pokiaľ sa nepoužijú v pokuse.  
T e s t o v a n i e t r a n s l o k a č n e j h e t e r o z y g o z i t y 
Používa sa jedna z dvoch možných metód: 
— testovanie plodnosti F  1 potomstva a následné overenie možných 
nosičov translokácií pomocou cytogenetickej analýzy, 
— cytogenetická analýza všetkých sam čích F  1 potomkov bez pred ­
chádzajúcej selekcie testom plodnosti. 
a) Testovanie plodnosti 
Znížená plodnos ť F 1 jedinca sa môže stanovi ť pozorovaním 
veľkosti vrhu a/alebo analýzou obsahov maternice sami čích 
krížencov. 
Pre každý myší kme ň sa musia stanovi ť kritériá pre ur čovanie 
normálnej a zníženej plodnosti.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Pozorovanie ve ľkosti vrhu: testované F  1 samce sa umiestnia 
jednotlivo do klietok so sami čkami z toho istého pokusu alebo 
kolónie. Klietky sa prezerajú denne po čnúc po 18. d ňoch od 
párenia. Ve ľkosť vrhu a pohlavie F  2 potomstva sa zaznamená 
pri narodení a vrhy sú následne zni čené. Ak sa testujú sami čie 
F 1 potomstvá, F  2 potomstvá malých vrhov sa ponechajú pre 
ďalšie testovanie. Nosi či samičích translokácií sa overia cytoge ­
netickou analýzou translokácie pre ich každého sam čieho 
potomka. XO-sami čky sa rozpoznajú prostredníctvom zmeny 
v pohlavnom pomere spomedzi ich potomstva od hodnoty 1: 1 
na 1: 2 samcov vs. samíc. V nasledujúcom kroku postupu sa F  1 
zvieratá vylú čia z ďalšieho testovania v prípade, že prvý F  2 vrh 
dosiahne alebo prekro čí predurčenú normálnu hodnotu. Inak sa 
pozoruje druhý alebo tretí F  2 vrh. 
F 1 zvieratá, ktoré sa po pozorovaní až do tretieho vrhu nemôžu 
klasifikova ť ako normálne, sa bu ď ďalej testujú analýzou obsahu 
maternice sami čích krížencov, alebo sú priamo podrobené cyto ­
genetickej analýze. 
Analýza maternicového obsahu: Zníženie ve ľkosti vrhu nosi čov 
translokácií je spôsobené odumretím embryí, takže vysoký po čet 
mŕtvych implantátov nazna čuje prítomnos ť translokácií 
u testovaného zviera ťa. Každý testovaný samec F  1 sa pári 
s dvomi alebo tromi samicami. Po čatie sa stanovuje denne 
ranným vyšetrením vaginálnej zátky. Samice sa usmrtia po uply ­
nutí 14 až 16 dní a zaznamenajú sa žijúce a m ŕtve implantáty, 
ktoré sa nachádzajú v ich maternici. 
b) Cytogenetická analýza 
Preparáty semenníkov sa vytvoria pomocou techniky sušenia na 
vzduchu. Nosi či translokácií sa ur čia pomocou prítomnosti multi ­
valentných konfigurácií po čas diakinézy metafázy I v primárnych 
spermatocytoch. Pozorovania aspo ň dvoch buniek 
s multivalentnými vz ťahmi sú základom požadovaného dôkazu, 
že testované zviera je nosi čom translokácie. 
Ak sa nevykonala selekcia vrhu, všetky samce F  1 sa vyšetria 
cytogeneticky. Mikroskopicky sa musí vyhodnoti ť minimálne 
25 buniek v štádiu diakinézy metafázy I na jedného samca. Pri samčekoch F
 1 s malými semenníkmi a prerušením meiózy pred 
diakinézou alebo pri sami čkách F  1 s podozrením na XO sa vyža ­
duje vyšetrenie mitotických metafáz v spermatogóniách alebo 
kostnej dreni. Prítomnos ť nezvyčajne dlhého a/alebo krátkeho 
chromozómu v každej z 10 buniek je dôkazom ur čitej translo ­
kácie sam čej sterility (c-t typ). Niektoré translokácie X-auto ­
zómu, ktoré spôsobujú sam čiu sterilitu, sa dajú identifikova ť 
iba prúžkovacou analýzou mitotických chromozómov. Prítom ­
nosť 39 chromozómov vo všetkých 10 mitózach je dôkazom 
pre XO stav samice.  
2. ÚDAJE  
Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek. 
Pre každé obdobie párenia sa zaznamená priemerná ve ľkosť vrhu 
a pomer pohlaví z krížení rodi čov pri narodení a pri odstavení.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Na potvrdenie plodnosti zvierat F  1 generácie sa uvádza priemerná 
veľkosť vrhu všetkých normálnych párení a ve ľkosť každého jedno ­
tlivého vrhu nosi čov translokácie F  1 . Na analýzu obsahu maternice 
sa uvádza priemerný po čet žijúcich a m ŕtvych implantátov pri 
normálnych páreniach a jednotlivé po čty žijúcich a m ŕtvych implan ­
tátov pri každom párení nosi čov F  1 translokácie. 
Na cytogenetickú analýzu diakinézy metafázy I sa pre každého 
nosiča translokácie uvádza po čet typov multivalentných konfigurácií 
a celkový po čet buniek. 
Pre sterilných F  1 jedincov sa uvádza celkový po čet párení a trvanie 
obdobia párenia. Uvedená je hmotnos ť semenníkov a podrobnosti 
cytogenetickej analýzy. 
Pre XO samice je uvedená priemerná ve ľkosť vrhu, pomer pohlaví 
v F  1 potomstve a výsledky cytogenetickej analýzy. 
Ak je to možné, nosi či F 1 translokácií sa vopred selektujú testmi 
plodnosti. Tabu ľky musia zah ŕňať informácie o tom, pri ko ľkých 
z nich sa potvrdila transloka čná heterozygozita. 
Uvádzané sú údaje z experimentov s negatívnou a pozitívnou kontro ­
lou. 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
V prípade, že je to možné, správa z testu obsahuje tieto informácie: 
— kmeň myší, vek zvierat, hmotnos ť ovplyvnených zvierat, 
— počet rodičovských zvierat každého pohlavia v experimentálnej 
a kontrolnej skupine, 
— podmienky testu, podrobný opis ovplyvnenia, úrovne dávok, 
rozpúšťadlá, harmonogram párenia, 
— počet a pohlavie potomkov na samicu, po čet a pohlavie 
potomkov zohraných na analýzu translokácie, 
— čas a kritériá analýzy translokácie, 
— ak je to možné, po čet a podrobný opis nosi čov translokácie 
zahŕňajúci údaje o chove a údaje o obsahu maternice, 
— cytogenetické metódy a podrobnosti o mikroskopickej analýze, 
pokiaľ možno s obrázkami, 
— štatistické vyhodnotenie, 
— diskusiu o výsledkoch, 
— interpretáciu výsledkov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY 90-D ŇOVÁ 
ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY U HLODAVCOV/TEST 
V OPAKOVANÝCH DÁVKACH  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda subchronickej toxicity je kópia OECD TG 
408 (1998).  
1.1. ÚVOD 
Stanovenie a vyhodnotenie charakteristík toxicity danej chemickej 
látky, zistenie subchronickej orálnej toxicity metódou opakovaných 
dávok sa dá vykona ť až po získaní východiskových informácií 
o toxicite z krátkodobých alebo 28-d ňových testov. Táto 90-d ňová 
štúdia poskytuje informácie o možných rizikách ohrozenia zdravia, 
ktoré pravdepodobne vznikajú vplyvom opakovaného pôsobenia 
počas dlhšieho časového obdobia, ktoré zah ŕňa post-doj čiace, dospie ­
vanie a vývoj až do dospelosti. Štúdia poskytuje informácie o závažných toxických ú činkoch, indikuje zasiahnuté orgány 
a možnosti akumulácie a umož ňuje odhadnú ť stupeň pôsobenia 
nezistených škodlivých ú činkov, ktorý sa dá následne využi ť pri 
výbere objemu dávok na dlhodobé štúdie a pri stanovení bezpe čnost­
ných kritérií oh ľadom ich pôsobenia na človeka. 
Táto metóda kladie dodato čný dôraz na neurologické koncové body 
a ponúka indikáciu imunologických a reproduktívnych ú činkov. 
Taktiež sa v nej zdôraz ňuje nutnos ť dôkladných klinických pozoro ­
vaní zvierat s cie ľom získať čo najväčšie množstvo informácií. Táto 
štúdia umož ňuje, aby sa pri identifikácii chemických látok bral do 
úvahy aj ich potenciál vplýva ť na orgány neurotoxickými, imunolo ­
gickými ú činkami a taktiež ú činkami na reprodukciu, z čoho vyplýva 
následné h ĺbkové skúmanie. 
Pozri Všeobecný úvod časť B.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Dávka:  množstvo podávanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená 
ako hmotnos ť (g, mg) alebo ako hmotnos ť testovanej látky na 
jednotkovú hmotnos ť testovaného zviera ťa (napr. mg/kg) alebo 
konštantné dietetické koncentrácie (ppm).  
Dávkovanie:  všeobecný pojem, ktorý zah ŕňa dávku, jej frekvenciu 
a trvanie.  
NOAEL:  skratka pre stupe ň nezistených škodlivých ú činkov, je 
najvyššou možnou dávkou, pri ktorej sa neobjavili žiadne škodlivé nálezy v súvislosti s lie čbou.
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka sa podáva denne nieko ľkým skupinám pokusných 
zvierat vo zvýšených dávkach, každá skupina zvierat dostáva ur čitú 
dávku po čas 90 dní. V priebehu tohto obdobia sa na zvieratách 
dôkladne skúmajú príznaky toxicity. Zvieratá, ktoré po čas testu 
uhynú, sú následne pitvané a taktiež zvieratá, ktoré prežijú, sú na 
záver testu usmrtené a podrobené pitve.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Príprava zvierat  
Na test sa použijú zdravé zvieratá, ktoré sa aspo ň päť dní aklimati ­
zovali na laboratórne podmienky a ktoré neboli predtým podrobené 
žiadnym pokusom. Druh, rod, pôvod, pohlavie, váhu a/alebo vek 
zvierat sú presne stanovené. Do skupín budú zvieratá zadelené náhodným výberom a na takomto princípe sa budú vybera ť aj na 
kontrolu. Klietky sa umiestnia v takom poradí, aby sa možné ú činky 
vzhľadom na umiestnenie klietky minimalizovali. Každému zviera ťu 
sa pridelí identifika čné číslo.
 
1.4.2.  Príprava dávok  
Testovaná látka sa podáva cez trubicu priamo do žalúdka alebo 
v potrave alebo v pitnej vode. Metóda orálneho podávania závisí 
od účelu štúdie a fyzikálno-chemických vlastností testovanej látky. 
Látka sa podáva bu ď rozpustená alebo rozptýlená vo vhodnom mate ­
riáli. Odporú ča sa, ak je to potrebné, uvažova ť o použití vodných 
roztokov/suspenzií ako prvých v poradí, následne o roztokoch/ ­
emulziách v oleji (napr. kukuri čnom) a až potom o roztokoch 
v iných materiáloch. Pri iných materiáloch ako voda je vhodné zisti ť 
ich toxickú charakteristiku. Po čas podávania testovanej látky je 
nevyhnutné zaisti ť jej stálos ť. 
1.4.3.  Podmienky testu  
1.4.3.1.  Pokusné zvieratá  
Najvhodnejším zviera ťom je potkan, hoci sa môžu použi ť aj iné 
hlodavce, napr. myši. Bežne sa používajú laboratórne druhy mladých 
zdravých dospelých zvierat. Sami čky musia by ť neplodné 
a neoplodnené. Dávkovanie musí za čať čo najskôr po odstavení 
mláďat a skôr než zvieratá dov ŕšia deväť týždňov. Na za čiatku štúdie 
váhové odchýlky u zvierat sú minimálne a neprevyšujú ± 20 % 
priemernej váhy oboch pohlaví. Ak sa táto štúdia uskuto čňuje ako 
predbežná k dlhodobej štúdii chronickej toxicity, v oboch štúdiách by sa mali použi ť zvieratá toho istého druhu.
 
1.4.3.2.  Množstvo a pohlavie  
Na každej úrovni podávania dávok by sa malo použi ť aspoň 20 
zvierat (10 sami čiek a 10 sam čekov). Ak sa medzitým naplánuje 
usmrtenie nejakých zvierat, mal by sa pred ukon čením štúdie po čet 
o tieto doplni ť do pôvodného množstva pred usmrtením zvierat. Na 
základe doposia ľ získaných znalostí o danej chemickej látke alebo 
inej príbuznej látke sa odporú ča po uplynutí testovaného obdobia 
venovať pozornos ť, vrátane ďalšej satelitnej skupiny 10 zvierat (po 
piatich z každého pohlavia), kontrole a pozorovaniam skupiny s najvyššími dávkami, vratnosti a trvácnosti akýchko ľvek toxických 
účinkov. Trvanie tohto obdobia sa presne stanoví po uplynutí expo ­
zície s oh ľadom na spozorované ú činky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Úrovne dávkovania  
Bolo by vhodné absolvova ť tento test aspo ň na troch úrovniach so 
súbežnou kontrolou, okrem prípadov, v ktorých prebieha limitný test (pozri 1.4.3.4). Výšky dávkovania sa môžu zaklada ť na výsledkoch 
opakovaného dávkovania alebo mnohých zis ťovacích štúdií a je 
potrebné prihliada ť aj na jestvujúce toxikologické 
a toxickokinetické údaje, ktoré sú o testovanej látke alebo príbuz ­
ných látkach k dispozícii. Ak to nie je obmedzené fyzikálno- 
chemickou podstatou alebo biologickými ú činkami testovanej látky, 
najvyššia hladina dávky by sa mala vybra ť s cieľom vyvola ť toxi­
citu, ale nie smrte ľné alebo kruté utrpenie. Potom by sa malo prejs ť 
na zostupnú postupnos ť objemu dávkovania so zámerom preukáza ť, 
že každá dávka má za následok ú činok a že nebol spozorovaný 
škodlivý ú činok pri najnižšej úrovni dávkovania (NOAEL). Na 
stanovenie zostupného dávkovania sú optimálne dvoj- až trojnásobné 
intervaly a pri štvrtej testovanej skupine sa odporú ča dodržať veľmi 
veľké intervaly (napr. viac ako faktor 6-10) medzi dávkami. 
Kontrolná skupina by mala by ť neexponovaná skupina alebo skupina 
na kontrolu nosi ča, ak sa nosi č používa pri podávaní testovanej 
látky. Bez oh ľadu na aplikovanie testovanej látky, so zvieratami 
v kontrolnej skupine by sa malo zaobchádza ť rovnakým spôsobom 
ako s tými, ktoré sú v testovanej skupine. Ak sa použije nosi č, 
kontrolná skupina dostane tento v čo najväčšom množstve. Ak sa 
testovaná látka podáva v potrave a spôsobuje redukciu príjmu 
potravy, potom je vhodné použi ť dve súčasne kŕmené kontrolné 
skupiny na odlíšenie redukcie zaprí činenej nechutenstvom alebo toxi ­
kologickými zmenami testovanej vzorky. 
Náležitá pozornos ť by sa mala venova ť nasledujúcim vlastnostiam 
nosič
a a ostatným aditívam: ú činky na absorpciu, distribúciu, meta ­
bolizmus alebo retencia testovanej látky; ú činky na chemické vlast ­
nosti testovanej látky, ktoré môžu pozmeni ť jej toxické vlastnosti 
a vplyvy na spotrebu krmiva a vody alebo na stav výživy zvierat.  
1.4.3.4.  Limitný test  
Ak sa po čas testu pri jednej úrovni dávkovania, s dávkami aspo ň 
1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň a pri dodržaní postupov opísa ­
ných v tejto štúdii, nezískajú žiadne údaje o škodlivých ú činkoch 
a ak toxicita nedosiahne o čakávanú úrove ň na základe údajov na 
štrukturálne príbuzné látky, potom vôbec nie je potrebné uvažova ť 
o komplexnej štúdii s tromi úrov ňami. Limitný test sa nepoužije 
v prípadoch, ak pôsobenie látky na človeka indikuje potrebu vyššej 
úrovne dávkovania.  
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Podávaná dávka  
Zvieratám sa podáva dávka s testovanou látkou denne po čas sied­
mich dní v týždni po obdobie 90 dní. Použitie každého iného režimu 
dávkovania, napr. pä ť dní v týždni, musí by ť opodstatnené. Ak je 
testovaná látka podávaná trubicou, musí sa toto vykona ť v jednej 
dávke pre zviera, s použitím žalúdo čnej trubice alebo vhodnej intu ­
bačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorý môže by ť naraz 
podaný, závisí od ve ľkosti testovaného zviera ťa. Objem nesmie 
presiahnu ť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, s výnimkou prípadu 
vodných roztokov, kde sa môže použi ť dávkovanie 2 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Variabilita testovaných objemov sa zminimali ­
zuje nastavením/adjustáciou/koncentrácií s cie ľom zaistenia konštant ­
ných objemov vo všetkých úrovniach dávkovania. S výnimkou dráž ­
divých alebo žieravých látok, ktoré za normálnych okolností preuka ­
zujú zhoršujúci sa ú činok vo vysokých koncentráciách, variabilita/ ­
odlišnosti/testovaných objemov sa minimalizuje ur čením koncentrácií 
tak, aby sa zaistil konštantný objem na všetky hladiny dávkovania.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Pre látky, ktoré sú podávané spolu s potravou alebo pitnou vodou, je 
dôležité zabezpe čiť, aby množstvo obsiahnutých testovaných látok 
neinterferovalo s normálnou nutri čnou hodnotou alebo vodnou 
rovnováhou. Ak je testovaná látka podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia, (ppm) alebo konštantná 
úroveň dávkovania s oh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa; alter­
natívne používanie je potrebné špecifikova ť. Dávka látok podáva ­
ných cez trubicu sa musí podáva ť každý de ň v rovnakom čase 
a musí sa regulova ť tak, aby sa udržiavala konštantná úrove ň dávko­
vania so zrete ľom na telesnú hmotnos ť zvieraťa. Ak sa uplat ňuje 90- 
dňová štúdia ako predbežná k dlhodobej štúdii chemickej toxicity, je 
potrebné použi ť rovnakú potravu v oboch štúdiách.
 
1.5.2.  Pozorovania  
Doba pozorovania by mala trva ť aspoň 90 dní. Zvieratá v satelitných 
skupinách, ur čené podľa plánu na kontrolné pozorovania, by na 
určitý čas nemali by ť vystavené pôsobeniu testovanej látky, aby sa 
detegovala stálos ť alebo aby sa zotavili z toxických ú činkov. 
Všeobecné klinické pozorovania by sa mali vykonáva ť najmenej raz 
denne, najmä v rovnakom čase každý de ň, berúc do úvahy vrchol 
doby predvídaných ú činkov po dávkovaní. Klinické podmienky 
zvierat musia by ť zaznamenané. Všetky zvieratá sa podrobia 
kontrole patologických zmien a mortality najmenej dvakrát denne, obvykle na za čiatku a konci každého d ňa. 
Detailné klinické pozorovania na všetkých zvieratách vykonáme 
najmenej raz pred prvou expozíciou (aby sa umožnilo porovnanie 
v rámci subjektov) a raz za týžde ň po expozícií. Tieto pozorovania 
sa vykonávajú mimo domu, klietky, radšej v štandardnej aréne a v podobnom čase pri každej príležitosti. Musia by ť pozorne zazname ­
nané, s použitím hodnotiaceho systému explicitne definovaného 
testovacím laboratóriom. Je potrebné minimalizova ť odlišnosti 
v podmienkach pozorovaní. Pozorované znaky zah ŕňajú, ale nie sú 
limitované, zmeny na koži, kožušine, o čiach, slizniciach, výskyt 
sekrécie a vylu čovania autonómnej aktivity (ako napr. slzenie, piloe ­
rekcia, ve ľkosť zreníc, neobvyklé dýchanie). Zmeny v chôdzi, držaní 
tela a odozve na zaobchádzanie, ako aj prítomnos ť kónických alebo 
napätých pohybov, stereotypov (napr. opakované to čenie sa), prílišné 
ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaz ­
netvorenie) musia by ť tiež zaznamenané. 
Oftalmologické vyšetrenia, pri ktorých sa používajú oftalmoskopy 
alebo iné ekvivalentné vhodné zariadenia, sa vykonávajú pred 
podaním testovanej látky a po ukon čení štúdie najlepšie na všetkých 
zvieratách, ale najmenej v skupine s vysokou dávkou a v kontrolnej skupine. Ak sa zistia zmeny na o čiach, musia by ť všetky zvieratá 
otestované. 
Ku koncu expozi čnej periódy a v žiadnom prípade nie skôr ako 
v jedenástom týždni sa skontroluje senzorická reaktivita na stimu
­
láciu rôznych typov (1), napr. zvuková, vizuálna a proprioceptívna stimulácia (2), (3), (4), odhadnutie intenzity zovretia (5) a odhad motorickej aktivity (6). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré 
môžu nasledova ť, sú dané v uvedenej použitej literatúre. Je možné 
použiť aj iné alternatívne postupy k tomu, čo tu bolo doposia ľ 
napísané. 
Pozorovanie funk čných porúch vykonávané ku koncu štúdie možno 
vynechať, ak sú údaje o pozorovaní funk čných porúch dostupné 
z iných štúdií a ak denné klinické pozorovanie neprekáža žiadnej 
funkčnej poruche.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Výnimočne je možné vynecha ť funkčné pozorovania pre skupiny 
s inými znakmi stup ňa toxicity, zna čne interferujú s funk čným 
testom na ú činnosť. 
1.5.2.1.  Telesná hmotnos ť a spotreba potravy/vody  
Všetky zvieratá sa musia váži ť najmenej raz za týžde ň. Meranie 
spotreby potravy sa robí najmenej raz za týžde ň. Ak sa testovaná 
látka podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa musí mera ť raz za 
týždeň. Spotreba má tiež význam pre dietetické štúdie alebo štúdie 
s použitím trubice, po čas ktorých sa môže meni ť. 
1.5.2.2.  Hematológia a klinická biochémia  
Krvné vzorky sa odoberajú z ozna čených miest a uložia sa za vhod ­
ných podmienok. Na konci testovacej periódy sa vzorky zozbierajú 
práve pred utratením alebo ako časť procedúry utratenia zvierat. 
Nasledujúce hematologické vyšetrenia sa vykonávajú na konci testo ­
vacej doby, ak sú všetky predbežné vzorky zozbierané: hematorit, koncentrácia hemoglobínu, po čet erytrocytov, celkový diferenciálny 
počet leukocytov, po čet krvných došti čiek, meranie zrážanlivosti 
krvi/potenciál. 
Klinické biochemické stanovenia vyšetrujúce hlavné toxické ú činky 
v tkanive a špecifický vplyv na obli čky a pečeň sa vykonávajú na 
krvných vzorkách získaných od každého zviera ťa práve pred utra ­
tením alebo ako sú časť procedúry utratenia zvierat (okrem zistených 
ako umierajúcich a/alebo zabitých). V podobných metódach hema ­
tologických vyšetrení sa môže vykona ť predložené vzorkovanie na 
klinické biochemické testy. Odporú ča sa, aby sa zvieratá pred 
odobratím vzoriek krvi cez noc postili (
 1 ). Zisťovanie v plazme 
alebo sére zah ŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, mo čo­
vinu, dusík z mo čoviny v krvi, kreatín, celkové bielkoviny a albumín 
a viac ako dva indikujúce hepatocelulárne (ú činky na pe čeňové 
bunky) ú činky ako napr. alanín, amini-transferázy, aspartát amino ­
transferázy, alkalická fosfatáza, gama glutamyl transpeptidáza a sorbitol dehydrogenáza. Za istých okolností sem môžeme zahrnú ť 
aj merania ďalších enzýmov (hepatické alebo iného pôvodu) 
a žlčových kyselín, ktoré môžu poskytnú ť užitočné informácie. 
Podľa potreby sa nasledujúce zistenia v analýzach mo ču môžu 
vykonať počas posledného týžd ňa štúdie a použije sa časový zber 
objemu mo ču: vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, 
bielkoviny, glukóza a krv/krvné bunky. 
Okrem toho by sa mali bra ť do úvahy aj štúdie na vyšetrovanie 
sérových markerov v základných poškodených tkanivách. Ostatné zisťovanie je možné uskuto čniť, ak poznáme vlastnosti, ktoré 
môžu alebo sa o nich predpokladá, že vplývajú na príbuzné meta ­
bolické profily zahr ňujúce vápnik, fosfor urých ľovacie triglyceridy, 
špecifické hormóny, methemoglobín a cholinesterázu. Preto je ich nutné identifikova ť ako chemické látky v ur čitých triedach alebo 
ako individuálne v závislosti od prípadu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Pri množstve meraní v sére a plazme, najvýznamnejšie na meranie glukózy, sa preferuje 
nechať zvierat cez noc bez potravy. Hlavný dôvod tohto uprednost ňovania je, že zvýšená 
variabilita, ktorá je nutným následkom pri podávaní stravy/nepostení sa/, môže ma ť 
tendenciu zakry ť nepatrné ú činky, a tým s ťažiť následné vyhodnotenie. Na druhej strane, 
hoci celono čný pôst môže interferova ť s obecným metabolizmom zvierat a predovšetkým 
v štúdiách o k ŕmení, denné pôsobenie testovanej látky sa týmto môže naruši ť. Ak sa 
pristúpi na celono čný pôst, klinické biochemické stanovenia sa vykonajú po kontrole 
funkčných pozorovaní štúdie.
 Celkove je potrebný flexibilný prístup, ktorý závisí od druhov 
a pozorovaných a/alebo o čakávaných ú činkov danej látky. 
Ak sú historické základné údaje neprimerane, je treba zváži ť, či 
premenné hematologické a premenné klinickej biochémie je potrebné stanoviť pred začatím dávkovania, nie je všeobecne odporu čené, aby 
tieto údaje boli zis ťované pred lie čbou.
 
1.5.2.3.  Všeobecná pitva  
Všetky zvieratá v štúdií budú predmetom úplnej detailnej pitvy, 
ktorá zah ŕňa podrobné vyšetrenie externého povrchu tela 
a všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny. 
Pečeň, obličky, nadobli čky, semenníky, nadsemenníky, maternica, 
vaječníky, týmus, slezina, mozog a srdce zo všetkých zvierat (okrem 
tých, ktoré chradnú a/alebo zvierat, ktoré boli predtým utratené) by sa mali pitva ť na nejakej pri ľnavej tkanine a je potrebné čo 
najrýchlejšie zisti ť ich mokrú hmotnos ť skôr, ako pri pitve vyschnú. 
Nasledujúce tkanivá by mali uchováva ť v čo najvhodnejšom 
fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na následné histopatolo ­
gické skúšky: všetky závažné poškodenia, mozog/reprezentatívne oblasti, zahr ňujúce veľký mozog, mozo ček, Varolov most/, miecha 
(v troch úrovniach: kr čná, hrudná, bedrová), hypofýza, štítna ž ľaza, 
prištítna ž ľaza, týmus, pažerák, slinné ž ľazy, žalúdok, tenké a hrubé 
črevo, Peyerove ž ľazy, pečeň, obličky, pankreas, nadobli čky, slezina, 
srdce, priedušnica a p ľúcne laloky (ochránené nafúknutím, fixáciou 
a potom ponorením), aorta, gonády, maternica, prídavné pohlavné 
orgány, sami čie mliečne žľazy, prostata, mo čový mechúr, žl čník, 
lymfatické uzliny (uprednost ňujúc jednu lymfatickú uzlinu pokrýva ­
júcu cestu šírenia a druhú, vzdialenú od tejto cesty šírenia na 
pokrytie systémového vplyvu), periférne nervy (sedacie alebo 
holenné) najlepšie v tesnej blízkosti svalov, časť kostnej drene 
(a/alebo získa ť
 čerstvú kostnú dre ň), koža a o či (ak boli zistené 
zmeny po čas oftalmologických vyšetrení). Z klinických a iných 
nálezov môže vyplynú ť potreba vyšetrenia ďalších dodato čných 
tkanív. Takisto by mali osta ť zachované orgány považované za 
cieľové orgány, založené na známych vlastnostiach testovanej látky.  
1.5.2.4.  Histopatológia  
Úplná histopatológia sa uskuto ční na uskladnených orgánoch 
a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupinách 
s vysokými dávkami. Tieto skúšky sa rozšíria o zvieratá zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, ak boli zistené zmeny v skupine s vysokými dávkami. 
Preskúmajú sa všetky závažné poškodenia. 
Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkani ­
vách a orgánoch identifikovaných ako vykazujúce ú činky 
v spracovaných skupinách.
 
1.5.2.5.  Preskúmajú sa všetky závažné poškodenia.  
Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkani ­
vách a orgánoch identifikovaných ako vykazujúce ú činky 
v spracovaných skupinách.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. ÚDAJE A HLÁSENIE  
2.1. ÚDAJE 
Po získaní jednotlivých údajov sa všetky tieto následne zosumarizujú 
v tabuľkovej forme, vykazujúcej na každú testovanú skupinu po čet 
zvierat na za čiatku testu, po čet nájdených m ŕtvych zvierat po čas 
testu alebo usmrtených z humanitných dôvodov a čas smrti alebo 
čas usmrtenia z humanitných dôvodov, po čet vykázaných znakov 
toxicity, opis zistených znakov toxicity, zahr ňujúcich čas vzniku, 
trvanie sily toxických ú činkov, po čet zvierat vykazujúcich lézie 
(poškodenia), typ lézií a percento zvierat vykazujúcich každý typ lézie. 
Ak je to možné, numerické výsledky sa vyhodnotia vhodnou 
a všeobecne uplatnite ľnou metódou. Štatistické metódy a údaje, 
ktoré sa podrobia analýze, sa vyberú po čas prípravy koncepcie 
štúdie.
 
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  
2.2.1.  Testovaná látka:  
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje, 
— nosič (ak je to vhodné): opodstatnenos ť výberu nosi ča, ak je iný 
ako voda.  
2.2.2.  Testovaný druh:  
— druhy a rody používaných zvierat, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky usklad ňovania, potrava at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu.  
2.2.3.  Podmienky testu:  
— odôvodnenie na výber úrovne hladiny dávky, 
— podrobnosti formulácie testovanej látky/príprav a potravy, 
dosiahnutá koncentrácia, stabilita a homogenita prípravy, 
— podrobnosti o podávaní testovanej látky, 
— aktuálne dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň) a faktov 
konverzie z potravy/pitnej vody, testovanej látky, koncentrácia 
na aktuálnu dávku, 
— detaily o kvalite potravy a vody.  
2.2.4.  Výsledky:  
— telesná hmotnos ť a zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba potravy a spotreba vody, ak je to možné, — údaje o toxikologickej reakcii pod ľa pohlavia a úrovne dávky, 
zahrňujúce známky toxicity,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— charakter, prudkos ť a trvanie klinických pozorovaní ( či sú rever ­
zibilné alebo nie), 
— výsledky oftalmologických vyšetrení, 
— odhad senzorickej aktivity, intenzity stla čenia, zovretia 
a motorickej aktivity (ak sú informácie k dispozícii), 
— hematologické testy s významnými základnými hodnotami, 
— klinické biochemické vyšetrenia s príslušnými výstupnými 
normálnymi hodnotami, 
— konečná telesná hmotnos ť, hmotnos ť orgánov a pomer hmotnosti 
orgánov k telesnej hmotnosti, 
— pitevné nálezy, — detailné opisy všetkých histopatologických nálezov, 
— absorp čné údaje, ak sú dostupné, 
— štatisticky spracované výsledky, ak je to vhodné. Diskusia o výsledkoch Závery
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No. 60. 
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999 – 1003. 
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691 – 704. 
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. 
Appl. Pharmacol, 108, 267 – 283. 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233 – 236. 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H. A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599 – 609. 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety 
Studies“, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198 – 201.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  TEST SUBCHRONICKEJ ORÁLNEJ TOXICITY: 
OPAKOVANÁ 90-D ŇOVÁ ŠTÚDIA ORÁLNEJ TOXICITY 
U NEHLODAVCOV  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda subchronickej orálnej toxicity je kópiou 
OECD TG 409 (1998).  
1.1. ÚVOD 
Stanovenie a vyhodnotenie toxických charakteristík toxicity chemi ­
kálie, stanovenie subchronickej orálnej toxicity metódou opakova ­
ných dávok, môže by ť vykonané až po získaní východiskových 
informácií o toxicite z krátkodobých alebo 28-d ňových testov 
metódou opakovaných dávok. 90-d ňová štúdia poskytuje informácie 
o možných rizikách ohrozenia zdravia, ktoré môžu vzniknú ť pri 
opakovanom vystavení sa po čas obdobia rýchleho rastu a do mladej 
dospelosti: Štúdia poskytuje informácie o hlavných toxických ú čin­
koch, určuje cieľové orgány a možnosti akumulácie. Ďalej umož ňuje 
odhad úrovne nezistených nepriaznivých ú činkov pôsobenia látky, 
ktoré je možné použi ť pri výbere úrovne dávok na dlhodobé štúdie 
a na ustanovenie bezpe čnostných kritérií s oh ľadom na ich vplyv na 
človeka. 
Testovacia metóda umož ňuje identifikáciu nepriaznivých ú činkov 
pôsobenia na druhy nehlodavcov a používa sa iba: 
— ak účinky zistené inými štúdiami indikujú potrebu vyjasnenia/ ­
charakterizácie v druhom druhu nehlodavcov alebo 
— ak toxiko-kinetická štúdia indikuje, že použitie špecifických 
nehlodavých druhov je najdôležitejším výberom laboratórnych zvierat, alebo 
— ak iné špecifické dôvody zdôvod ňujú použite nehlodavých 
druhov. 
Pozri všeobecný úvod časť B.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Dávka:  množstvo podávanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená 
ako hmotnos ť (g, mg) alebo ako hmotnos ť testovanej látky per 
jednotkovú hmotnos ť testovaného zviera ťa (napr. mg/kg) alebo 
konštantné dietetické koncentrácie (ppm).  
Dávkovanie:  všeobecný pojem, ktorý zah ŕňa dávku, jej frekvenciu 
a trvanie.  
NOAEL:  skratka pre stupe ň nezistených škodlivých ú činkov a je 
najvyššou možnou dávkou, pri ktorej sa neobjavili žiadne škodlivé 
nálezy v súvislosti s lie čbou. 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka je podávaná denne, orálne, v odstup ňovaných 
dávkach nieko ľkým skupinám testovaných zvierat, jedna úrove ň 
dávky na skupinu po čas 90-tich dní. Po čas tohto obdobia sú na 
zvieratách dôkladne pozorované prípadné znaky toxicity látok. Zvie ­
ratá, ktoré uhynú alebo sú usmrtené po čas testu, sú pitvané a na 
záver testu sú usmrtené a pitvané aj zvieratá, ktoré prežili.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Výber druhov zvierat  
Obvykle používaný druh nehlodavcov je pes, ktorý by mal ma ť 
definované plemeno, často je používaný druh malého stava ča. 
Môžeme tiež použi ť aj iné druhy ako napr. ošípané, mini-prasiatka. 
Primáty sa neodporú čajú a ich použitie musí by ť odôvodnené. Použí ­
vajú sa mladé zdravé zvieratá a v prípade psov dávkovanie za čína 
v 4 – 6. mesiaci a nie neskôr ako v 9. mesiaci veku psa. Ak je štúdia 
usmerňovaná ako predbežná dlhodobá štúdia chronickej toxicity, 
musia sa použi ť v obidvoch štúdiách rovnaké plemená/druhy.  
1.4.2.  Príprava zvierat  
Môžu sa použi ť mladé zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali 
v laboratórnych podmienkach a neboli predmetom predchádzajúcich experimentálnych postupov. D ĺžka aklimatizácie závisí od vybraných 
testovaných druhov a ich zdrojov. Odporú ča sa najmä 5 dní pre psov 
alebo účelovo chované ošípané s rezidentských kolónií a najmenej 
dva týždne pre tie zvieratá, ktoré sú z vonkajších zdrojov. Testované zvieratá majú by ť charakterizované pod ľa druhu, rodu, zdroja, pohla ­
via, hmotnosti a/alebo veku. Zvieratá by mali by ť postupne zadelené 
do kontrolných a lie čebných skupín. Klietky by mali by ť umiestnené 
takým spôsobom, aby sa minimalizoval vplyv vzh ľadom na ich 
rozmiestnenie. Každé zviera by malo by ť označené svojim identifi ­
kačným číslom.
 
1.4.3.  Príprava dávok  
Testovaná dávka sa podáva v potrave alebo v pitnej vode cez trubicu 
priamo do žalúdka alebo v kapsulách. Metóda orálneho podávania 
závisí od ú čelu štúdie a fyzikálno-chemických vlastností testovaného 
materiálu. 
V prípade potreby sa testovaná látka rozpustí alebo vytvorí suspenziu 
vo vhodnom nosi či. Odporú ča sa, aby sa vždy, ak je to možné, 
uvažovalo o použití vodných roztokov/suspenzií ako prvých v poradí, nasledovaných vážením roztoku/emulzie v oleji (napr. 
kukuričný olej) a až potom o možných roztokoch v iných nosi čoch. 
Charakteristiky toxicity nosi čov iných ako voda musia by ť známe. 
Stanoví sa stabilita testovanej látky za podmienok podávania.
 
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Pre každú úrove ň dávky sa použije aspo ň 8 zvierat (štyri samice 
a štyri samce). Ak sa plánujú predbežné usmrtenia, po čet zvierat 
by mal by ť zvýšený o plánovaný po čet zvierat, ktoré majú by ť 
usmrtené pred kompletizáciou štúdie. Po čet zvierat, ktoré ukon čia 
štúdiu, musí by ť primeraný na zmysluplné vyhodnotenie toxických 
účinkov. Na základe predošlých znalostí o látke alebo jej blízkych 
analógoch dôraz sa kladie na zahrnutie doplnkových satelitných 
skupín s ôsmimi zvieratami (štyri na každé pohlavie) v kontrolnej skupine a v skupine s najvyšším dávkovaním na pozorovanie rever ­
zibility po období, ak boli podrobené vplyvu nejakých toxických 
účinkov. Trvanie tohto obdobia po vystavení ú činkom sa stanoví 
s ohľadom na zistené vplyvy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dávkovanie  
Tento test je vhodné vykona ť najmenej v troch hladinách dávky 
a súbežne kontrolova ť, s výnimkou testov, v ktorých sa prevádza 
limitný test (pozri 1.5.3). Úrove ň dávky sa môže zaklada ť na výsled ­
koch štúdií opakovaného dávkovania alebo štúdií rozsahu nálezov 
a malo by sa prihliada ť na existujúce toxikologické a toxikokinetické 
údaje dostupné na testovanú zlú čeninu alebo príbuzné materiály. Ak 
to nie je limitované fyzikálno-chemickou podstatou alebo biologic ­
kými účinkami testovanej látky, najvyššia dávka by sa mala vybra ť 
s cieľom vyvola ť toxicitu, ale nie úhyn alebo kruté utrpenie. Potom 
prejdeme na klesajúcu postupnos ť úrovne hladín dávkovania so 
zámerom preukáza ť, že každá dávka má za následok reakciu, odozvu 
a že nebol pozorovaný škodlivý ú činok pri najnižšej hladine dávko ­
vania (NOAEL). Dvoj- až štvornásobné intervaly sú často optimálne 
pri stanovení zostupných hladín dávkovania a pre dodato čnú štvrtú 
testovanú skupinu sa často dodržiavajú ve ľmi veľké odstupy (napr. 
viac ako faktor 6-10) medzi dávkami. 
Kontrolná skupina je skupina, ktorá nebola podrobená ú činkom 
testovaných materiálov, alebo skupina kontroly nosi ča, ak bol 
nosič používaný pri podávaní testovanej látky. Bez oh ľadu na apli ­
kovanie testovanej látky, so zvieratami v kontrolnej skupine zaob ­
chádzame rovnakým spôsobom ako s tými, ktoré sú v testovanej skupine. Ak sa použije nosi č, kontrolná skupina ho dostane v čo 
najväčšom množstve. Ak sa testovaná látka podáva v potrave 
a spôsobuje redukciu príjmu potravy, potom je vhodné použi ť dve 
súčasne kŕmené skupiny na rozlíšenie zníženia príjmu potravy kvôli 
nechutenstvu alebo toxikologickým zmenám v testovacom modeli. 
Je potrebné venova ť náležitú pozornos ť nasledujúcim vlastnostiam 
nosiča a iných aditív: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus 
alebo zadržiavanie testovanej látky, vplyvy na chemické vlastnosti testovanej látky, ktoré môžu zmeni ť svoje toxické vlastnosti, vplyv 
na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat.  
1.5.3.  Limitný test  
Ak test pri jednej hladine dávkovania ekvivalentnej najmenej 1 000 
mg/kg telesnej hmotnosti/de ň, ktorý využíva postupy opísané v tejto 
štúdií, neposkytne údaje o zistených škodlivých ú činkoch a ak ich 
toxicita nebola na o čakávanej úrovni na základe z údajov pre látky 
s príbuznou štruktúrou, potom nie je potrebné uvažova ť o úplnej 
štúdii, ktorá využíva tri hladiny dávkovania. Limitný test sa uplat ­ 
ňuje, ak pôsobenie na človeka poukazuje potrebu použitia vyššej 
hladiny dávkovania.  
1.5.4.  Podávanie dávok  
Zvieratám sa aplikuje dávka s testovacou látkou denne po čas sied­
mich dní v týždni v období 90-tich dní. Použitie každého iného 
režimu dávkovania, napr. 5 dní v týždni, musí by ť opodstatnené. 
Ak je testovaná látka podávaná cez trubicu, musí sa to realizova ť 
v jednej dávke pre zviera za použitia žalúdo čnej trubice alebo 
vhodnej intuba čnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorý 
môže byť naraz podaný, závisí od ve ľkosti testovaného zviera ťa. 
Obvykle je objem čo najmenší. S výnimkou dráždivých alebo koro ­
zívnych látok, ktoré bežne preukazujú zhoršujúci sa ú činok vo vyso ­
kých koncentráciách, variabilita testovaných objemov sa minimali ­
zuje nastavením koncentrácií tak, aby sa zaistil konštantný objem pre 
všetky hladiny dávkovania.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Pre látky, ktoré sú podávané ako sú časť potravy alebo pitnej vody, je 
dôležité zaisti ť, aby množstvo obsiahnutej testovanej látky neinterfe ­
rovalo s normálnou nutri čnou hodnotou alebo vodnou rovnováhou. 
Ak je testovaná látka podávaná v potrave, je možné použi ť buď 
konštantnú dietetickú koncentráciu (ppm), alebo konštantnú hladinu 
dávkovania s oh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa. Látky podá ­
vané cez trubicu alebo v kapsuliach podávame každý de ň 
v rovnakom čase a nastavíme ich dávkovanie tak, aby sa dodržalo 
konštantné dávkovanie vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa. Ak 
sa 90-dňová štúdia použije ako predbežná štúdia na dlhodobú štúdiu 
chronickej toxicity, podávame podobnú potravu v obidvoch štúdiách.  
1.5.5.  Pozorovania  
Doba pozorovania má by ť najmenej 90 dní. Zvieratá v satelitných 
skupinách, naplánované na nasledujúce pozorovania, budú ur čitú 
dobu bez vystavenia ú činkom testov s cie ľom detegova ť stálosť 
alebo zotavenie sa z toxických ú činkov. 
Všeobecné klinické pozorovania sa budú vykonáva ť najmenej raz 
denne, najlepšie každý de ň v rovnakom čase, s oh ľadom na vrchol 
doby očakávaných ú činkov po dávkovaní. Klinické podmienky 
zvierat musia by ť zaznamenané najmenej dvakrát denne, obvykle 
na začiatku a konci d ňa sú zvieratá podrobené kontrole patologic ­
kých zmien a úmrtnosti. 
Detailné klinické pozorovania na všetkých zvieratách sa vykonajú 
najmenej jedenkrát pred prvou expozíciou (aby sa umožnilo v rámci subjektov porovnanie), raz za týžde ň po expozícií. Tieto 
pozorovania sa vykonávajú v domovskej klietke v štandardnej 
aréne a najlepšie v rovnakom čase pri každej príležitosti. Je potrebné 
minimalizova ť odlišnosti v podmienkach pozorovaním. Známky 
toxicity musia by ť podrobne zaznamenané, musia zah ŕňať čas nasa­
denia, stupe ň a trvanie. Ak nie sú pozorovania limitované, musia 
obsahova ť zmeny na pokožke, kožušine, o čiach, slizniciach, výskyt 
sekrétov a vylu čovanie a automatické činnosti (napr. lakrimácia, 
pilo-erekcia, ve ľkosť zreníc, neobvyklé dýchanie). Zaznamenané 
budú: zmeny v chôdzi, držaní tela, v reakcii na manipuláciu, ako 
aj prítomnos ť klonických alebo napätých pohybov, stereotypy (napr. 
točenie, nadmerné čistenie) alebo iné zvláštne správanie. 
Oftalmologické vyšetrenia, pri ktorých sa používajú oftalmoskopy 
a iné ekvivalentné vhodné zariadenia, sa vykonávajú pred podávaním testovanej látky a po ukon čení štúdie, najlepšie na všetkých zviera ­
tách, ale najmenej v skupine s vysokými dávkami a v kontrolnej 
skupine. Ak sa po vystavení zvierat ú činkom látky zistia zmeny na 
očiach, musia by ť vyšetrené všetky zvieratá.  
1.5.5.1.  Telesná hmotnos ť, spotreba vody a potravy  
Všetky zvieratá sa musia váži ť najmenej raz za týžde ň. Meranie 
spotreby potravy sa robí týždenne. Ak sa testovaná látka podáva vo vode na pitie, spotrebu vody je tiež potrebné mera ť raz za týžde ň. 
Spotreba vody môže by ť tiež významná na dietetické štúdie alebo 
štúdie s použitím trubice, po čas ktorých je možné túto meni ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematológia a klinická biochémia  
Krvné vzorky sa odoberajú z ozna čených miest a uložia sa za vhod ­
ných podmienok. Na konci testovacej periódy sa vzorky zozbierajú práve pred alebo ako sú časť procedúry utratenia zvierat. 
Hematológia vrátane hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, po čet 
erytrocytov, celkový a diferenciálny po čet leukocytov, po čet krvných 
doštičiek a meranie potenciálu zrážanlivosti, ako napríklad doba 
zrážanlivosti, doba protrombínu alebo tromboplastov, sa vyšetruje 
na začiatku štúdie, potom v mesa čných intervaloch alebo 
v polovici testovacej periódy a na konci testovacej periódy. 
Klinické biochemické vyšetrenia, ktoré skúmajú hlavne toxické 
vplyvy na tkanivá a špecifický ú činok na pe čeň alebo obli čky, sa 
vykonajú na krvných vzorkách, získaných od zvierat na za čiatku, 
potom v mesa čných intervaloch alebo v polovici testovacej periódy 
a na konci testovacej periódy. Pozornos ť sa upriami najmä na tieto 
testované parametre: rovnováha elektrolytov, metabolizmus karbohy ­
drátov, funkcia pe čene a obli čiek. Výber špecifických testov ovplyv ­ 
ňuje pozorovania druhov reakcií na testovanú látku. Zvieratá by sa 
mali posti ť pred odberom krvných vzoriek, po čas obdobia vhodného 
na daný druh. Navrhované vyšetrenia zah ŕňajú stanovenie vápnika, 
fosforu, chloridov, sodíka, draslíka, glukózy, alanínaminotransferázy, aspartátu aminotransferázy, ornithínu, dekarboxylázy, gama-gluta ­
myl, transpeptidázy, mo čovinového dusíka, albumínu, krvného krea ­
tínu, celkového bilirubínu a celkový protein v sére. 
Vyšetrenia mo ču sa vykonávajú najmenej na za čiatku, potom 
v strede a na konci štúdie, pri ktorej sa využíva časový zber objemu 
moču. Vyšetrenia zah ŕňajú vzhľad, objem, osmolalitu alebo špeci ­
fickú hmotnos ť, pH, bielkovinu, glukózu a krv alebo krvné bunky. 
Dodatočné parametre môžu by ť vyšetrované, ak je potrebné rozšíri ť
 
vyšetrovanie získaných ú činkov. 
Okrem toho sa zvažuje vykonanie štúdie vyšetrujúcej markery 
základných poškodených tkanív. Iné stanovenia, ktoré môžu by ť 
potrebné na primerané toxikologické vyhodnotenie, zah ŕňajú analýzu 
lipidov, hormónov, acido/bazickú rovnováhu, methemoglobín a inhibíciu cholinesterázy. Dodato čne sa môže uskuto čniť aj ďalšia 
klinická biochémia, ak je potrebné rozšíri ť vyšetrenie zistených ú čin­
kov. Je ich potrebné identifikova ť pre chemické látky v ur čitých 
skupinách alebo posúdi ť prípad po prípade. 
Celkovo sa požaduje flexibilný prístup, ktorý závisí od druhu zvierat 
a pozorovaných a/alebo o čakávaných ú činkov danej látky.
 
1.5.5.3.  Všeobecná, celková pitva  
Všetky zvieratá v štúdii budú predmetom úplnej detailnej všeobecnej 
pitvy, ktorá zah ŕňa pozorné vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, 
všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej, brušnej dutiny 
a ich obsahu. Pe čeň, žlčník, obli čky, nadobli čky, semenníky, 
nadsemenníky, vaje čníky, maternica, štítna ž ľaza spolu s prištítnou 
žľazou, týmus, slezina, mozog a srdce zo všetkých zvierat (okrem 
tých, u ktorých sa zistilo chradnutie alebo predchádzajúce utratenie) 
by mali by ť upravené na nejakej pri ľnavej tkanine a ich mokrá 
hmotnosť sa zistí čo najskôr, kým orgány pri pitve nevyschnú.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom 
médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické skúšky: 
všetky závažné poškodenia, mozog (reprezentatívne oblasti zahr ňu­
júce veľký mozog, mozo ček, Varolov most, miecha (v troch úrov ­
niach: kr čná, hrudná, bedrová), hypofýza, štítna ž ľaza, prištítna 
žľaza, týmus, pažerák, slinné ž ľazy, žalúdok, tenké a hrubé črevo, 
Peyerove ž ľazy, pečeň, pankreas, obli čky, nadobli čky, slezina, srdce, 
priedušnica a p ľúcne laloky (ochránené nafúknutím, fixáciou 
a potom ponorením), aorta, gonády, maternica, prídavné pohlavné 
orgány, sami čie mliečne žľazy, prostata, mo čový mechúr, žl čník, 
lymfatické uzliny (uprednost ňujúc jednu lymfatickú uzlinu pokrýva ­
júcu cestu šírenia a druhú, vzdialenú od tejto cesty, šírenia pokrytia systematických ú činkov), periférne nervy (sedacie alebo holenné), 
najlepšie v tesnej blízkosti svalov, časť kostnej drene (a/alebo získa ť 
čerstvú kostnú dre ň), koža a o či (ak boli zistené zmeny po čas oftal­
mologických vyšetrení). Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by 
sa mali zachova ť orgány považované za cie ľové orgány, založené na 
známych vlastnostiach testovanej látky.
 
1.5.5.4.  Histopatológia  
Úplná histopatológia sa uskuto ční na uskladnených orgánoch 
a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupinách 
s vysokými dávkami. Tieto skúšky sa rozšíria o zvieratá zo všetkých 
skupín s odlišným dávkovaním, ak boli zistené zmeny v skupine s vysokými dávkami. 
Všetky závažné poškodenia budú preskúmané. 
Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkani ­
vách a orgánoch identifikovaných ako vykazujúce ú činky 
v spracovaných skupinách.
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
2.1. ÚDAJE 
Po získaní jednotlivých údajov sa tieto zosumarizujú v tabu ľkovej 
forme, vykazujúcej pre každú testovanú skupinu po čet zvierat na 
začiatku testu, po čet nájdených m ŕtvych zvierat po čas testu alebo 
usmrtených z humanitných dôvodov a čas smrti alebo čas usmrtenia 
z humanitných dôvodov, po čet vykázaných znakov toxicity, opis 
zistených znakov toxicity, zahr ňujúcich čas vzniku, trvanie sily 
toxických ú činkov, po čet zvierat vykazujúcich lézie (poškodenia), 
typ lézií a percento zvierat vykazujúcich každý typ lézie. 
Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodne 
a všeobecne uplatnite ľnou metódou. Štatistické metódy a údaje, 
ktoré budú analyzované, budú vybraté po čas tvorby dizajnu štúdie.  
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Testovaná látka:  
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje, 
— nosič (ak je to vhodné): opodstatnenie výberu nosi ča, ak je iný 
ako voda.  
2.2.2.  Testovaný druh:  
— druhy a rody používaných zvierat, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky uskladnenia, potrava at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu.  
2.2.3.  Podmienky skúšky (testu):  
— odôvodnenie na výber hladiny dávky, 
— detaily o testovanej látke, formulácia/príprava potravy, dosiah ­
nuté koncentrácie, stabilita a homogenita prípravy, 
— detaily o podávaní testovanej látky, — aktuálne dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), faktor konverzie 
z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej látky v (ppm), ak je to možné, 
— detaily o kvalite potravy a vody.
 
2.2.4.  Výsledky:  
— telesná hmotnos ť a zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba potravy a spotreba vody, ak je to možné, — údaje o toxikologickej reakcii pod ľa pohlavia a úrovne dávky, 
zahrňujúce známky toxicity, 
— charakter, tvrdos ť a trvanie klinických pozorovaní ( či sú reverzi ­
bilné alebo nie), 
— výsledky oftalmologických vyšetrení, — hematologické testy s významnými základnými hodnotami, — odkazy senzorickej aktivity, intenzity stla čenia, zovretia 
a motorickej aktivity (ak sú dostupné), 
— konečná telesná hmotnos ť, hmotnos ť orgánov a pomer hmotnosti 
orgánov k telesnej hmotnosti, 
— pitevné nálezy, — detailné opisy všetkých histopatologických nálezov, — absorp čné údaje, ak sú dostupné, 
— štatisticky spracované výsledky, ak je to vhodné. Diskusia o výsledkoch Závery
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  ŠTÚDIA SUBCHRONICKEJ DERMÁLNEJ TOXICITY PO 
90-DŇOVEJ OPAKOVANEJ KOŽNEJ APLIKÁCII 
U HLODAVCOV  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PODSTATA SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Testovaná látka sa denne nanáša na kožu, v odstup ňovaných 
dávkach nieko ľkým skupinám pokusných zvierat, každej skupine 
jedna úrove ň dávky 90 dní. V priebehu obdobia podávania sa zvie ­
ratá každý de ň pozorujú, aby sa zistili príznaky toxicity. Zvieratá, 
ktoré počas skúšky uhynuli, a aj zvieratá, ktoré do konca skúšky 
prežili, sa pitvú.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Neustanovené.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Príprava  
Najmenej pä ť dní pred testom si zvieratá zvykajú na chovate ľské 
a vyživovacie podmienky, v ktorých budú po čas experimentu. Pred 
testom sa zdravé mladé zvieratá randomizujú a priradia sa k pokusným a kontrolným skupinám. Krátko pred za čatím testu sa 
zvieratám ostrihá srs ť na chrbte. Vyholenie srsti je tiež prípustné, 
malo by sa však uskuto čniť asi 24 hodín pred testom. Ostrihanie 
alebo oholenie je zvy čajne potrebné opakova ť približne 
v týždenných intervaloch. Pri strihaní alebo holení srsti je potrebné 
dať pozor na to, aby sa neporanila koža. Pre aplikáciu testovanej 
látky sa pripraví najmenej 10 % povrchu tela. Pri rozhodovaní o veľkosti pripravovanej plochy kože, ktorá má by ť zbavená srsti 
a o veľkosti krycieho obväzu treba vzia ť do úvahy hmotnos ť zvierat. 
Pri testoch pevných látok, ktoré môžu by ť v prípade potreby 
rozdrvené na prach, sa testovaná látka dostato čne navlhčí vodou, 
poprípade vhodnou pomocnou látkou, aby bol zaistený dostato čný 
styk s kožou. Kvapalné testované látky sa spravidla aplikujú nerie ­
dené. Aplikácia sa uskuto čňuje päť až sedem dní v týždni.
 
Podmienky testovania  
P o k u s n é z v i e r a t á 
Je možné použi ť potkana, králika alebo mor ča. Je možné použi ť aj 
iné živočíšne druhy, ale ich použitie musí by ť zdôvodnené. Na 
začiatku testu by nemali by ť odchýlky hmotnosti použitých zvierat 
viac ako ± 20 % od prispôsobenej strednej priemernej hodnoty. Ak sa uprednost ňuje subchronická dermálna štúdia ako predbežná štúdia 
pred dlhodobou štúdiou, mal by by ť v oboch štúdiách použitý 
rovnaký druh zvierat a rovnaký kme ň.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
P o č e t a p o h l a v i e 
Pre každú pokusnú skupinu by sa malo použi ť minimálne 20 zvierat 
(10 samičiek a 10 sam čekov) so zdravou kožou. Sami čky nesmú by ť 
ani po vrhu a ani nesmú by ť gravidné. Ak majú by ť počas testu 
usmrtené zvieratá, zvýši sa celkový po čet zvierat o po čet zvierat, 
ktoré majú by ť usmrtené ešte pred koncom testu. Okrem toho sa 
môže vystavi ť aj dodato čná skupina (satelitná skupina) s 20 zviera ­
tami (10 sami čiek a 10 sam čekov) počas 90 dní najvyššej dávke, aby 
sa počas 28 dní po vystavení mohla sledova ť reverzibilita, pretrvá ­
vanie alebo oneskorený prejav toxických ú činkov.  
E x p o z i č n é k o n c e n t r á c i e 
Potrebné sú minimálne tri koncentrácie a jedna kontrolná skupina. 
Odhliadnuc od aplikácie testovanej látky sa zvieratá v kontrolnej skupine musia vystavi ť rovnako ako pokusné zvieratá. Ak sa pre 
uľahčenie dávkovania používa pomocná látka, podáva sa kontrolnej 
skupine rovnakým spôsobom ako pokusným zvieratám, a to v rovnakom množstve, aké prijme skupina, ktorej sa aplikuje najvyššia dávka. Doba vystavenia by mala by ť najmenej šes ť 
hodín denne. Testovaná látka by sa mala aplikova ť každý de ň 
približne v rovnakom čase a dávkovanie by malo by ť pravidelne 
(týždenne alebo každých štrnás ť dní) prispôsobené, aby bolo 
konštantné vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa. Najvyššia 
koncentrácia sa volí tak, aby v každom prípade došlo k toxickému 
účinku, ale aby zvieratá nehynuli alebo iba v malom množstve. 
Najnižšia koncentrácia by nemala spôsobova ť žiadne príznaky toxi ­
city. Ak existujú použite ľné odhady o úrovni vystavenia u človeka, 
najnižšia dávka by mala túto hodnotu prekro čiť. V ideálnom prípade 
by mala stredná dávka spôsobi ť len nízke toxické ú činky. Ak sa 
podávajú viaceré medzikoncentrácie, musia sa voli ť tak, aby došlo 
k postupnej klasifikácii toxických ú činkov. V skupinách s nízkou 
a strednou koncentráciou, ako aj v kontrolných skupinách, by mal 
byť počet úmrtí nízky, aby sa umožnilo výrazne vyhodnotenie 
výsledkov. 
Ak aplikácia testovanej látky smeruje k závažnému podráždeniu 
kože, je potrebné zníži ť dávku, čo u vysokej koncentrácie môže 
viesť k obmedzeniu alebo eliminácii iných toxických ú činkov. Ak 
už došlo k závažnému poškodeniu kože, je potrebné test ukon čiť 
a uskutočniť ho znova s nižšími koncentráciami.
 
L i m i t n ý t e s t 
Ak predbežná štúdia pri koncentrácii 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti 
za deň alebo pri vyššej koncentrácii zodpovedajúcej prispôsobenej 
vystaveniu u človeka, ak je táto známa, nevyvolá žiadne toxické 
účinky, nie je ďalšie testovanie nutné.  
D o b a p o z o r o v a n i a 
Zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxicity, 
včítane času úmrtia a času, v ktorom sa objavili a znova odzneli 
toxické ú činky. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
Postup  
Zvieratá sa chovajú jednotlivo v klietkach. Testovaná látka sa 
v ideálnom prípade zvieratám podáva sedem dní v týždni po dobu 90 dní. 
Zvieratá satelitnej skupiny, ktoré sú ur čené na dodato čné pozorova ­
nie, by nemali by ť ďalších 28 dní vystavené, aby sa dala zisti ť 
reverzibilita toxických ú činkov alebo pretrvávanie toxických ú čin­
kov. Doba vystavenia by mala by ť najmenej šes ť hodín denne. 
Testovaná látka sa nanesie rovnomerne na plochu, ktorá sa rovná asi 
10 % celkového povrchu tela. V prípade vysokotoxických látok 
môže byť táto plocha menšia, no mala by sa však pokry ť čo najväčší 
časť tejto plochy čo najslabšou a naj rovnomernejšou vrstvou. 
Počas vystavenia sa testovaná látka udržuje v styku s kožou pomocou 
porézneho mulového obväzu a nedráždivej náplasti. Testovaná plocha sa ďalej vhodným spôsobom prekryje, aby sa mulový obväz 
a testovaná látka fixovali a aby zvieratá testovanú látku nepožili. 
K zamedzeniu požitia látky je možné použi ť aj prostriedky pre obme ­
dzenie vo ľnosti pohybu, celkové znehybnenie sa však neodporú ča. 
Po uplynutí doby vystavenia sa odstránia zvyšky testovanej látky, 
pokiaľ možno vodou alebo iným vhodným spôsobom o čistenia kože. 
Všetky zvieratá sa pozorujú denne a zaznamenávajú sa prejavy toxi ­
city, vrátane času nástupu, závažnosti a trvania. Pozorovanie 
v klietke zah ŕňa zmeny kože, srsti, o čí, slizníc, dýchacieho systému 
a krvného obehu, zmeny funkcie autonómnej a centrálnej nervovej sústavy, somatomotoriky a správania. Meranie spotreby potravy 
a hmotnosti zvierat sa uskuto čňuje týždenne. Je nutné zaisti ť pravi­
delnú kontrolu zvierat, aby pokia ľ možno po čas testu nedochádzalo 
k stratám zvierat, napr. v dôsledku kanibalizmu, autolýzy tkanív alebo chybou pri premiest ňovaní zvierat. Po ukon čení fázy vysta ­
venia sa všetky zvieratá, ktoré prežili, s výnimkou zvierat satelitnej 
skupiny, pitvú. Zvieratá, ktoré sú pred smr ťou, by sa mali vytriedi ť
, 
humánne usmrti ť a pitvať. 
U všetkých zvierat, v čítane kontrolných, sa zvy čajne uskuto čňujú 
nasledujúce vyšetrenia: 
a) Oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopom alebo rovna ­
kého vhodného prístroja by sa malo vykona ť pred vystavením 
testovanej látke a na konci štúdie, najlepšie u všetkých zvierat, 
aspoň však v skupine s najvyššou dávkou a v kontrolnej skupine. 
Ak sa na konci testu zistia zmeny na o čiach, vyšetria sa všetky 
zvieratá. 
b) Na konci testu sa musia vykona ť hematologické vyšetrenia, ktoré 
majú zah ŕňať hodnotu hematokrytu, koncentráciu hemoglobínu, 
počet erytrocytov, leukocytov, diferenciálny obraz, hemokoagu ­
lačné parametre ako testy zrážania krvi, zmeria sa napríklad čas 
zrážania, protrombínový čas, tromboplastínový čas alebo po čet 
trombocytov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Na konci testu by sa mali vykona ť biochemické analýzy krvi. Pre 
tieto štúdie je vhodné analyzova ť koncentráciu elektrolytov, meta ­
bolizmus glycidov, funkciu pe čene a ľadvín. Výber špecifických 
testov bude odvodený z pozorovania spôsobu ú činku látky. 
Navrhované vyšetrenia zah ŕňajú stanovenie vápniku, fosforu, 
chloridov, sodíku, draslíku, glukózy na la čno (s pôstnou periodou 
určenou pre druh zviera ť a), hladiny sérovej glutamát-pyruvát 
transaminázy (  1 ), glutamátoxalacetáttransaminázy (  2 ), ornitínde ­
karboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku mo čoviny, 
albumínu, kreatinínu, celkového bilirubínu a celkových sérových 
bielkovín. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré môžu by ť nevyhnutné 
pre správne toxikologické hodnotenie, patrí stanovenie lipidov, hormónov, rovnováhy kyselín a zásad, methemoglobínu 
a aktivity cholinesterázy. Dodato čné biochemické analýzy môžu 
byť použité, ak je nevyhnutné preh ĺbenie vyšetrenia pozorova ­
ných toxických ú činkov. 
d) Analýza mo ču nie je spravidla potrebná, potrebná je vtedy, ak sa 
očakáva alebo pozoruje toxický ú činok. 
Ak údaje z predošlých testov boli nepreukázané, mal by sa bra ť 
ohľad na hematologické a biochemické parametre ešte pred 
začiatkom testu.
 
A u t o p s i a 
U všetkých zvierat zú častňujúcich sa na teste sa musí vykona ť 
kompletná autopsia skladajúca sa z vonkajšej prehliadky povrchu 
tela, všetkých telesných otvorov, lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny, 
včítane ich obsahu. Pe čeň, obličky, nadobli čky a semenníky sa musia 
čo najskôr po sekcii odváži ť vlhké, aby sa predišlo vysušeniu. Nasle ­
dujúce orgány a tkanivá je nutné uchova ť vo vhodnom médiu pre 
prípadné neskoršie histopatologické vyšetrenia: všetky orgány 
s makroskopickými zmenami, mozog – vrátane medula/pons, kôry malého a ve ľkého mozgu, hypofýza, štítna ž ľaza/prištitna ž ľaza, 
všetky týmusové tkanivá, (priedušnice), p ľúca, srdce, aorta, slinné 
žľazy, pečeň, slezina, obli čky, nadobli čky, pankreas, gonády, mater ­
nica, akcesórne pohlavné orgány, žl čník (ak je prítomný), ezofagus, 
žalúdok, dvanástnik, jejunum, ileum, caecum, kolon, rektum, močový mechúr, reprezentatívne lymfatické uzliny, (sami čie prsné 
žľazy), (svalstvo stehna), nervy periférneho systému, (o či), (hrudná 
kosť s kostnou dre ňou), (femur v čítane povrchu k ĺbu), (miecha 
v troch úrovniach – oblas ť krku, toraxu a bedier) a (extraorbitálna 
slzná žľaza). Tkanivá uvedené v zátvorkách sa vyšetrujú iba 
v prípade, ak je možné na ich postihnutie usudzova ť na základe 
príznakov toxicity alebo pokia ľ súvisia s cie ľovým orgánom.
 
H i s t o p a t o l o g i c k é v y š e t r e n i e 
a) Kompletné histopatologické vyšetrenie normálnej a exponovanej 
kože, orgánov a tkanív sa uskuto ční u všetkých zvierat kontrolnej 
skupiny a u zvierat skupiny, ktorým bola aplikovaná najvyššia dávka. 
b) Vyšetria sa všetky orgány s makroskopickými zmenami.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) V súčasnosti známa ako sérová alanín aminotransferáza. 
( 2 ) V súčasnosti známa ako sérová aspartát aminotransferáza.
 c) Vyšetria sa cie ľové orgány zvierat ostatných dávkových skupín. 
d) Ak sa použijú potkany, p ľúca zvierat v skupinách s nízkou 
a strednou koncentráciou sa histopatologicky vyšetria k zisteniu 
príznakov infekcie, aby to umožnilo vhodné posúdenie zdravot ­
ného stavu zvierat. Uváži sa vhodnos ť histopatologického vyšet ­
renia pečene a obli čiek u zvierat týchto skupín. Ďalšie histopato ­
logické vyšetrenie sa u zvierat týchto skupín nesmie uskuto č­ 
ňovať rutinne, musí sa však uskuto čniť vždy na orgánoch, na 
ktorých boli zistené zmeny v skupine s najvyššou koncentráciou. 
e) U zvierat satelitnej skupiny sa musia histopatologicky vyšetri ť tie 
tkanivá a orgány, ktoré vo vystavených skupinách reagujú na testovanú látku.
 
2. ÚDAJE  
Údaje by sa mali zhrnú ť do tabu ľky, pričom sa uvedie u každej 
pokusnej skupiny po čet zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat so 
zmenami, druh zmien, ako aj percento zvierat pre každý druh zmeny. Výsledky sa vyhodnotia vhodným štatistickým postupom. Môže by ť 
použitá akáko ľvek uznávaná štatistická metóda.
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu obsahuje, pokia ľ možno, tieto informácie: 
— živočíšny druh, kme ň, pôvod, chovate ľské podmienky, krmivo, 
— podmienky testu, — expozi čné koncentrácie (v čítane pomocnej látky, ak je použitá) 
a koncentrácie, 
— údaje o toxických reakciách pod ľa pohlavia a dávky, 
— koncentrácie bez ú činku, pokia ľ je možné ju stanovi ť, 
— čas úmrtia po čas experimentu, prípadne údaj o prežití zvierat do 
konca testu, 
— opis toxických alebo iných ú činkov, 
— čas, keď boli pozorované jednotlivé abnormálne príznaky a ich 
ďalší vývoj, 
— údaje o spotrebe potravy a o telesnej hmotnosti, — oftalmologické nálezy, — uskuto čnené hematologické vyšetrenia a ich výsledky, 
— uskuto čnené biochemické vyšetrenia a ich výsledky (v čítane 
výsledkov prípadných analýz mo ču), 
— sekčné nálezy,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, 
— štatistické vyhodnotenie výsledkov tam, kde je to možné, — diskusia k výsledkom, — vyhodnotenie výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. LITERATÚRA  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  SUBCHRONICKÁ INHALA ČNÁ TOXICITA: 90-D ŇOVÁ ŠTÚDIA  
ZHRNUTIE 
Táto revidovaná testovacia metóda B.29 bola vypracovaná s cie ľom dôkladne 
opísať inhalačnú toxicitu testovanej chemikálie po čas subchronického trvania (90 
dní) a poskytnú ť podrobné údaje pre kvantitatívne hodnotenie inhala čného rizika. 
Skupiny desiatich samcov a desiatich samíc hlodavcov sú na šes ť hodín denne 
počas 90 dní (13 týžd ňov) exponované a) testovanej chemikálii pri troch alebo 
viacerých úrovniach koncentrácie, b) filtrovanému vzduchu (negatívna kontrola) a/alebo c) nosi ču (kontrola pomocou nosi ča). Zvieratá sú zvy čajne exponované 
päť dní v týždni, ale je povolená aj expozícia na sedem dní v týždni. Testujú sa 
vždy samce aj samice, môžu však by ť vystavované rôznym úrovniam koncen ­
trácie, ak je známe, že jedno z pohlaví je vo či danej testovanej chemikálii 
vnímavejšie. Táto metóda poskytuje vedúcemu štúdie flexibilitu, aby mohol 
zahrnúť satelitné skupiny (reverzibilita), priebežné utratenie, bronchoalveolárnu 
laváž (BAL), neurologické testy a doplnkové hodnotenia klinickej patológie a histopatologické hodnotenia s cie ľom dôkladnejšie charakterizova ť toxicitu 
testovanej chemikálie.
 
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov TG 413 (2009). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov 
subchronickej inhala čnej toxicity 413 (TG 413) boli prijaté v roku 1981 (1). 
Táto testovacia metóda B.29 [ako rovnocenná verzia revidovaných usmer ­
není TG 413 (2009)] bola aktualizovaná, aby odrážala stav vedy a sp ĺňala 
súčasné a budúce regula čné potreby. 
2. Štúdie subchronickej inhala čnej toxicity sa primárne využívajú na odvodenie 
regulačných koncentrácií pre hodnotenie rizík pre pracovníkov v prostredí 
pracoviska. Používajú sa aj na hodnotenie rizík súvisiacich s bývaním ľudí, 
ich prepravou a životným prostredím. Táto metóda umož ňuje opísa ť 
nepriaznivé ú činky po opakovanej dennej inhala čnej expozícii testovanej 
chemikálii po čas 90 dní (približne 10 % d ĺžky života potkana). Údaje odvo ­
dené zo štúdií subchronickej inhala čnej toxicity možno použi ť pri kvantita ­
tívnom hodnotení rizík a pri výbere koncentrácií pre chronické štúdie. Táto testovacia metóda nie je špecificky ur čená na testovanie nanomateriálov. 
Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je 
uvedené na konci tejto kapitoly a v usmer ňovacom dokumente (GD) 39 (2).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
3. Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky 
dostupné informácie o testovanej chemikálii s cie ľom zlepši ť kvalitu štúdie 
a minimalizova ť využívanie zvierat. Informácie, ktoré pomôžu pri výbere 
vhodných testovacích koncentrácií, zah ŕňajú identitu, chemickú štruktúru 
a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie; výsledky všetkých 
testov toxicity  in vitro  alebo  in vivo ; predpokladané použitie (použitia) 
a potenciál pre expozíciu ľudí; dostupné údaje (Q)SAR, toxikologické 
údaje o štrukturálne príbuzných látkach a údaje odvodené z iných štúdií 
opakovanej expozície. Ak sa o čakávajú alebo ak sa v priebehu štúdie 
objavia príznaky neurotoxicity, vedúci štúdie môže rozhodnú ť o zahrnutí 
vhodných hodnotení, ako je napríklad funk čná pozorovacia batéria (FOB) 
a meranie motorickej aktivity. Aj ke ď je pri ur čitých testoch rozhodujúce 
načasovanie expozícií, tieto dodato čné činnosti nesmú naruši ť základný plán 
štúdie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Riedenie žieravých alebo dráždivých testovaných chemikálií sa môže 
testovať pri koncentráciách, ktoré budú vykazova ť želanú mieru toxicity. 
Bližšie informácie sú k dispozícii v dokumente GD 39 (2). Pri vystavovaní zvierat pôsobeniu týchto materiálov musia by ť cieľové koncentrácie dosta ­
točne nízke, aby nespôsobovali výraznú boles ť ani utrpenie, a zárove ň 
dostatočné na pred ĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na 
úroveň, na ktorej sa zabezpe čí regulačný a vedecký cie ľ testu. Tieto koncen ­
trácie by sa mali vybra ť v závislosti od jednotlivých prípadov, pokia ľ 
možno pod ľa vhodne navrhnutej štúdie na zistenie rozsahu, ktorá poskytuje 
informácie o kritickom parametri, každom prahu dráždivosti a čase nástupu 
príznakov (pozri odseky 11 – 13). Je potrebné zdôvodni ť výber koncentrá ­
cie. 
5. Moribundné zvieratá alebo zvieratá, ktoré majú o čividne silné bolesti alebo 
vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrti ť. Moribundné zvieratá sa posudzujú rovnako ako zvieratá, 
ktoré uhynú po čas testovania. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť moribundné 
alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídate ľnej alebo 
nastávajúcej smrti sú predmetom usmer ňovacieho dokumentu OECD 
o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (3).
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
6. Používajú sa zdravé mladé dospelé hlodavce bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Preferovaným druhom je potkan. Použitie iných 
druhov je potrebné zdôvodni ť. 
Príprava zvierat  
7. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné. V de ň 
randomizácie majú by ť zvieratá mladé dospelé jedince vo veku sedem až 
deväť týždňov. Telesná hmotnos ť má byť v rozsahu ± 20 % priemernej 
hmotnosti každého pohlavia. Zvieratá sú náhodne vybraté, ozna čené tak, 
aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspo ň päť 
dní pred za čiatkom testu, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne 
podmienky.  
Chov zvierat  
8. Zvieratá musia by ť jednotlivo identifikované, najlepšie pomocou podkož ­
ných transpondérov, aby sa zjednodušilo pozorovanie a zamedzilo záme ­
nám. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala by ť 22 
± 3 °C. Relatívna vlhkos ť by sa v ideálnom prípade mala udržiava ť 
v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí by ť možné, ak sa ako nosi č 
používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvy čajne umiestnené 
v klietkach v skupinách pod ľa pohlavia a koncentrácie, ale po čet zvierat 
v jednej klietke by nemal prekáža ť bezproblémovému pozorovaniu každého 
zvieraťa, pričom by sa mali minimalizova ť straty súvisiace so vzájomným 
požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia 
oblasti nosa, môže by ť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na 
skúmavky obmedzujúce pohyb. Obmedzujúce skúmavky by nemali zvie ­
ratám spôsobova ť neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnos ťami, 
teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže ma ť vplyv na fyzio ­
logické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo 
respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, pod ľa 
ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo ve ľkej miere, potom skúmavky 
nie je potrebné vopred prispôsobi ť. Zvieratá vystavené ú činkom aerosólu 
celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestni ť samostatne, aby sa 
zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srs ť ostatných zvierat 
v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na k ŕmenie môže používa ť 
bežné a osved čené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej 
pitnej vody. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 hodín 
svetla a 12 hodín tmy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalačné komory  
9. Pri výbere inhala čnej komory by sa mal vzia ť do úvahy charakter testovanej 
chemikálie a predmet testu. Uprednost ňuje sa expozícia oblasti nosa (pri čom 
tento pojem zah ŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa 
pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu konden ­
zovať a vytvára ť aerosóly, uprednost ňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne 
ciele štúdie možno lepšie dosiahnu ť použitím expozície celého tela, ale tento 
krok je potrebné v správe o štúdii odôvodni ť. Na zabezpe čenie stability 
prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový 
objem testovaných zvierat nemal presiahnu ť 5 % objemu komory. Princípy 
metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody 
a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).  
ŠTÚDIE TOXICITY  
Limitné koncentrácie  
10. Na rozdiel od štúdií akútnej toxicity nie sú pre štúdie subchronickej inha ­
lačnej toxicity stanovené žiadne limitné koncentrácie. Pri maximálnej testo ­
vanej koncentrácii je potrebné zváži ť: 1. maximálnu dosiahnute ľnú koncen ­
tráciu; 2. najhorší možný prípad úrovne expozície ľudí; 3. potrebu zachova ť 
primeraný prísun kyslíka a/alebo 4. otázky týkajúce sa dobrých životných 
podmienok zvierat. V prípade chýbajúcich limitov založených na údajoch sa môžu použi ť akútne limity pod ľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (13) (t. j. až 
do maximálnej koncentrácie 5 mg/l v prípade aerosólov, 20 mg/l v prípade 
pár a 20 000 ppm v prípade plynov); pozri dokument GD 39 (2). Ak je 
nutné prekro čiť tieto limity pri testovaní plynov alebo vysokoprchavých 
testovaných chemikálií (napr. chladiace látky), je potrebné uvies ť odôvod­
nenie. Z limitnej koncentrácie by sa mala vyvodi ť jednozna čná toxicita bez 
toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyv ­
nená dĺžka ich života (3).
 
Štúdia na zistenie rozsahu  
11. Pred za čiatkom základnej štúdie je zvy čajne potrebné vykona ť štúdiu na 
zistenie rozsahu. Štúdia na zistenie rozsahu je komplexnejšia ako predbežná 
štúdia, lebo sa neobmedzuje na výber koncentrácie. Poznatky získané zo štúdie na zistenie rozsahu môžu vies ť k úspešnej základnej štúdii. Štúdia na 
zistenie rozsahu môže napríklad poskytnú ť technické informácie 
o analytických metódach, rozdelení ve ľkosti častíc, odhalení toxických 
mechanizmov, klinickej patológii a histopatologických údajoch a odhadoch koncentrácií NOAEL a MTC v základnej štúdii. Vedúci štúdie sa môže rozhodnú ť pre štúdiu na zistenie rozsahu s cie ľom identifikova ť 
prah dráždivosti dýchacích ciest (napr. histopatológiou dýchacích ciest, 
testovaním fungovania p ľúc alebo bronchoalveolárnou lavážou), hornú 
koncentráciu tolerovanú bez toho, aby spôsobovala zvieratám neprimeraný stres, a parametre, ktoré najlepšie charakterizujú toxicitu testovanej chemi ­
kálie. 
12. Štúdia na zistenie rozsahu môže pozostáva ť z jednej alebo viacerých úrovní 
koncentrácie. V závislosti od zvolených parametrov sa každej úrovni 
koncentrácie vystaví tri až šes ť samcov a tri až šes ť samíc. Štúdia na 
zistenie rozsahu by mala trva ť minimálne pä ť dní a zvy čajne nie viac ako 
28 dní. V správe o štúdii sa uvedú dôvody výberu koncentrácií pre základnú 
štúdiu. Cie ľom základnej štúdie je preukáza ť vzťah koncentrácie a reakcie 
založený na parametri, ktorý je pod ľa očakávaní najcitlivejší. Nízka koncen ­
trácia by mala ideálne predstavova ť hladinu bez pozorovaného nepriazni ­
vého účinku, zatia ľ čo z vysokej koncentrácie by sa mala vyvodi ť jednoz­
načná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres 
alebo aby bola ovplyvnená d ĺžka ich života (3).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Pri výbere úrovní koncentrácie pre štúdiu na zistenie rozsahu je potrebné 
zvážiť všetky dostupné informácie vrátane vz ťahov štruktúry a aktivity 
a údajov o podobných látkach (pozri odsek 3). Štúdia na zistenie rozsahu môže potvrdi ť/vyvrátiť parametre, ktoré sa považujú za najcitlivejšie mecha ­
nisticky založené parametre, napr. cholínesterázna inhibícia prostredníctvom 
organofosfátov, tvorba methemoglobínu prostredníctvom erytrocytotoxic ­
kých činiteľov, hormóny štítnej ž ľazy (T
 3 , T 4 ) v prípade látok toxických 
pre štítnu ž ľazu, proteín, LDH alebo neutrofily pri bronchoalveolárnej laváži 
v prípade neškodných slabo rozpustných častíc alebo aerosólov dráždivých 
pre pľúca. 
Základná štúdia  
14. Základná štúdia subchronickej toxicity vo všeobecnosti pozostáva z troch 
úrovní koncentrácie a pod ľa potreby aj zo súbežných negatívnych (vzdu ­
chových) kontrol a/alebo kontrol nosi ča (pozri odsek 18). Pri výbere vhod ­
ných úrovní expozície je potrebné použi ť všetky dostupné údaje vrátane 
výsledkov štúdií systémovej toxicity, metabolizmu a kinetiky (osobitne 
treba dba ť na to, aby sa nepoužívali vysoké úrovne koncentrácie, ktoré 
nasycujú kinetické procesy). Každá testovacia skupina je zložená z desiatich samcov a desiatich samíc hlodavcov, ktoré sú exponované testo ­
vanej chemikálii šes ť hodín denne pä ť dní v týždni po čas 13 týžd ňov 
(celkové trvanie štúdie 90 dní). Zvieratá môžu by ť pôsobeniu chemikálie 
vystavené aj sedem dní v týždni (napr. pri testovaní inhalovaných liekov). Ak je jedno z pohlaví vnímavejšie na testovanú chemikáliu, môžu by ť obe 
pohlavia vystavené rôznym úrovniam koncentrácie, aby sa optimalizovala 
reakcia na koncentráciu pod ľa opisu v odseku 15. Ak sa v prípade iných 
hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť s cieľom minimalizova ť druhovo špecifické 
utrpenie. Pri použití intervalu expozície v trvaní menej ako šes ť hodín denne 
alebo ak je potrebné vykona ť štúdiu expozície celého tela s dlhým inter ­
valom (napr. 22 hodín denne), treba uvies ť odôvodnenie (pozri dokument 
GD 39) (2). Po čas trvania expozície by sa zviera nemalo k ŕmiť, ak expozícia 
nepresiahne šes ť hodín. V priebehu expozície celého tela sa zviera ťu môže 
podať voda. 
15. Pomocou vybratých cie ľových koncentrácií by sa mal identifikova ť cieľový 
orgán (orgány) a preukáza ť zrejmá reakcia na koncentráciu: 
— vysoká úrove ň koncentrácie by mala ma ť za následok toxické ú činky, 
ale nemala by spôsobi ť pretrvávajúce príznaky ani letalitu, ktoré by 
znemožnili zmysluplné hodnotenie, 
— stredná úrove ň (úrovne) koncentrácie by sa mala podáva ť v takých 
odstupoch, aby viedla k stup ňovaniu toxických ú
činkov medzi dávkami 
nízkej a vysokej koncentrácie, 
— nízka úrove ň koncentrácie by mala vyvola ť malé alebo žiadne príznaky 
toxicity.  
Priebežné utratenie  
16. Ak sa plánuje priebežné utrácanie zvierat, po čet zvierat pri každej úrovni 
expozície by sa mal zvýši ť o počet, ktorý sa má utrati ť pred dokon čením 
štúdie. Priebežné utrácanie zvierat treba odôvodni ť, pričom tento postup by 
mal byť náležite podložený štatistickými analýzami.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satelitná štúdia (štúdia reverzibility)  
17. Satelitná štúdia (štúdia reverzibility) sa môže použi ť na pozorovanie rever ­
zibility, pretrvávania alebo oneskoreného výskytu toxicity po čas primerane 
dlhého obdobia po skon čení testovania, najmenej však po čas 14 dní. Sate ­
litné skupiny (reverzibility) pozostávajú z desiatich samcov a desiatich 
samíc, ktoré sú exponované súbežne s pokusnými zvieratami v základnej štúdii. Skupiny satelitnej štúdie (reverzibility) sú vystavené pôsobeniu testo ­
vanej chemikálie pri najvyššej úrovni koncentrácie a súbežne sa pod ľa 
potreby vykonávajú vzduchové kontroly a/alebo kontroly nosi ča (pozri 
odsek 18).
 
Kontrolné zvieratá  
18. S kontrolnými zvieratami súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol sa 
zaobchádza rovnako ako so zvieratami testovacej skupiny s tou výnimkou, že sú vystavené filtrovanému vzduchu a nie testovanej chemikálii. Ak sa pri vytváraní testovacieho ovzdušia používa voda alebo iná látka, do štúdie je 
potrebné namiesto negatívnej (vzduchovej) kontrolnej skupiny zahrnú ť 
kontrolnú skupinu nosi ča. Vždy, ke ď je to možné, sa ako nosi č použije 
voda. Ak sa ako nosi č použije voda, kontrolné zvieratá by mali by ť expo­
nované vzduchu s rovnakou relatívnou vlhkos ťou ako skupiny exponované 
testovanej chemikálii. Výber vhodného nosi ča by mal by ť založený na 
riadne vykonanej predbežnej štúdii alebo na historických údajoch. Ak nie je toxicita nosi ča dostato čne známa, vedúci štúdie sa môže rozhodnú ť 
použiť negatívnu (vzduchovú) kontrolu aj kontrolu nosi ča, ale tento postup 
sa vyslovene neodporú ča. Ak z predchádzajúcich údajov vyplýva, že nosi č 
nie je toxický, negatívna (vzduchová) kontrolná skupina nie je potrebná a mala by sa použi ť iba kontrola nosi ča. Ak sa pri predbežnej štúdii testo ­
vanej chemikálie pripravenej v nosi či nezistí žiadna toxicita, znamená to, že 
nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický a táto kontrola nosi ča by sa 
mala použi ť.
 
PODMIENKY EXPOZÍCIE  
Podávanie koncentrácií  
19. Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, 
pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, 
závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolených 
koncentrácií a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testova ť v podmienkach suchého vzduchu. 
Treba dba ť na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie. Tuhé materiály 
môžu byť podrobené mechanickým procesom na zmenšenie ve ľkosti častíc. 
Ďalšie usmernenia sa nachádzajú v dokumente GD 39 (2).
 
Rozdelenie ve ľkosti častíc  
20. Častice by sa mali rozdeli ť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov 
a pár, ktoré môžu kondenzova ť a vytvára ť aerosóly. Na umožnenie expo ­
zície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporú čajú aerosóly 
so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu 
od 1 do 3 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru ( σ g ) 
v rozsahu od 1,5 do 3,0 (4). Hoci by sa malo vynaloži ť primerané úsilie 
na dodržanie tejto normy, pokia ľ túto podmienku nie je možné splni ť, treba 
predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov budú 
častice menšie, ako stanovuje táto norma, a nabité častice a vlákna môžu 
túto normu prekra čovať. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Príprava testovanej chemikálie v nosi či 
21. V ideálnom prípade sa testovaná chemikália testuje bez nosi ča. Ak je nevyh ­
nutné použi ť nosič, aby sa dosiahla vhodná koncentrácia a ve ľkosť častíc 
testovanej chemikálie, uprednost ňuje sa voda. Vždy, ke ď je testovaná 
chemikália rozpustená v nosi či, je potrebné preukáza ť jej stabilitu.  
MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE  
Prúdenie vzduchu v komore  
22. Prúdenie vzduchu cez expozi čnú komoru by sa po čas každej expozície malo 
dôkladne kontrolova ť, nepretržite monitorova ť a zaznamenáva ť aspoň raz za 
hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia v reálnom čase 
(alebo do časnej stability) je integrálne meranie všetkých dynamických para ­
metrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických inhala čných parametrov. Ak sa koncentrácia monitoruje 
v reálnom čase, frekvencia meraní prúdenia vzduchu sa môže obmedzi ť 
na jedno meranie na expozíciu za de ň. Je potrebné venova ť osobitnú pozor ­
nosť tomu, aby v komorách na expozíciu oblasti nosa nedochádzalo 
k opätovnému vdychovaniu. Koncentrácia kyslíka by mala by ť minimálne 
19 % a koncentrácia oxidu uhli čitého by nemala presiahnu ť 1 %. Ak 
existuje dôvod domnieva ť sa, že túto normu nie je možné splni ť, koncen­
trácie kyslíka a oxidu uhli čitého by sa mali zmera ť. Ak merania v prvý de ň 
expozície preukážu, že úrovne týchto plynov sú správne, ďalšie merania nie 
sú nutné.
 
Teplota komory a relatívna vlhkos ť 
23. Teplotu v komore je potrebné udržiava ť na úrovni 22 ± 3 °C. Relatívnu 
vlhkosť v dýchacej zóne zvierat pri expozícii oblasti nosa aj pri expozícii 
celého tela je potrebné po čas každej expozície nepretržite monitorova ť 
a podľa možnosti raz za hodinu zaznamenáva ť. Relatívna vlhkos ť by sa 
podľa možnosti mala udržiava ť v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa 
stať, že táto hodnota bude nedosiahnute ľná (napr. v prípade testovania 
zmesí na báze vody) alebo nemerate ľná z dôvodu interferencie testovanej 
chemikálie a testovacej metódy.  
Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia  
24. Vždy, ke ď je to možné, by sa mala vypo čítať a zaznamena ť nominálna 
koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnos ť 
vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom inhala čnej komory. Nominálna koncentrácia sa 
nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej 
a skutočnej koncentrácie vypovedá o ú činnosti vytvárania testovacieho 
systému, a teda sa môže použi ť na zistenie problémov s tvorbou.
 
Testovaná chemikália: skuto čná koncentrácia  
25. Skuto čná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie odobratej 
z dýchacej zóny zvierat v inhala čnej komore. Skuto čné koncentrácie 
možno získa ť špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, 
adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analy ­
tickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravime ­
trická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavos ťou, pričom je potrebné túto analýzu podloži ť primera­
nými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa 
konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
takisto možno stanovi ť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom 
prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré preukazujú, že zloženie 
materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže by ť potrebná opätovná analýza 
testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných 
intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu 
vypariť alebo môžu sublimova ť, by sa malo preukáza ť, že všetky fázy sa 
zhromaždili pomocou zvolenej metódy. 
26. Ak je to možné, po čas celej štúdie by sa mala použi ť jedna dávka testovanej 
chemikálie, pri čom testovaná vzorka by sa mala uskladni ť za podmienok, za 
ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred za čatím štúdie by 
mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej 
čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných 
kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukáza ť napríklad týmito 
údajmi: reten čný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnos ť získaná 
pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium 
nenesie zodpovednos ť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspo ň čias­
točne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávate ľom (napr. farbu, fyzi ­
kálne skupenstvo at ď.). 
27. Podľa možnosti je potrebné udržiava ť ovzdušie pri expozícii konštantné. Na 
preukázanie stability podmienok expozície sa môže použi ť zariadenie na 
monitorovanie v reálnom čase, ako napríklad aerosólový fotometer pre aero ­
sóly alebo komplexný uh ľovodíkový analyzátor pre pary. Skuto čná koncen ­
trácia v komore by sa mala mera ť aspoň tri razy v každý de ň expozície a pri 
každej úrovni expozície. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, je prijate ľný jeden odber vzorky po čas intervalu 
expozície. V takom prípade by sa mala táto vzorka pod ľa možnosti 
odoberať
 za celé trvanie expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie 
v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýli ť 
o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy 
v komore (t
 95 ) by sa mal vypo čítať a zaznamena ť. Interval expozície zah ŕňa 
čas, keď sa testovaná chemikália tvorí. Zoh ľadňuje sa pri tom čas potrebný 
na dosiahnutie rovnováhy v komore (t  95 ) a čas rozpadu. Usmernenia 
k odhadovaniu t  95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2). 
28. V prípade ve ľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov 
(napr. spa ľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií pohá ňaných účelovými 
výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhala čnej komore môže 
každá fáza správa ť inak. Preto by sa pre každú fázu (plyn/para a aerosól) 
mala vybra ť aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovate ľ (analyt), oby čajne 
hlavná aktívna zložka v zmesi. Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uvies ť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky 
alebo látky slúžiacej ako ukazovate ľ (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa 
skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
 
Testovaná chemikália: rozdelenie ve ľkosti častíc  
29. Rozdelenie ve ľkosti častíc aerosólov by sa pri každej úrovni koncentrácie 
malo stanovi ť aspoň raz za týžde ň, a to pomocou kaskádového impaktora 
alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc (APS). Ak možno preukáza ť rovnocennos ť výsledkov získaných 
pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alter ­
natívny prístroj môže používa ť počas celej štúdie.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premýva čka, by 
sa malo použi ť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej 
účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou 
veľkosti častíc by mala by ť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej 
koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak 
možno preukáza ť rovnocennos ť pri všetkých koncentráciách testovaných 
v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonáva ť ďalšie potvrdzujúce 
merania. V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá 
by sa mali prija ť opatrenia na minimalizáciu nejednozna čných údajov, ktoré 
môžu vies ť k potrebe opakova ť štúdiu. 
31. Rozdelenie ve ľkosti častíc by sa malo vykona ť v prípade pár, ak existuje 
možnosť, že kondenzácia pary môže ma ť za následok tvorbu aerosólu, alebo 
ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz.  
POZOROVANIA 
32. Zvieratá by sa mali pred, po čas a po skon čení expozície klinicky pozorova ť. 
V závislosti od reakcie zvierat po čas expozície môžu by ť potrebné častejšie 
pozorovania. Ak pozorovaniu zvierat bráni používanie skúmaviek obmedzu ­
júcich pohyb zvierat, slabo osvetlených komôr na expozíciu celého tela alebo neprieh ľadné ovzdušie, zvieratá by sa mali dôkladne preskúma ť po 
skončení expozície. Na základe pozorovaní pred expozíciou v nasledujúcom 
dni možno zhodnoti ť akúkoľvek reverzibilitu alebo zhoršenie toxických 
účinkov. 
33. Všetky pozorovania sa zaznamenávajú, pri čom každé zviera má individu ­
álny záznam. Ke ď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu 
uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamena ť čas uhynutia. 
34. Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože a srsti, o čí, slizníc, 
dýchania a krvného obehu, zmeny nervového systému a zmeny somatomo ­
toriky a správania. Pozornos ť sa zameriava na pozorovanie triašky, k ŕčov, 
slinenia, hna čky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno 
získať dôkazy sved čiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, 
ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu. Protokol o štúdii 
môže zah ŕňať ďalšie hodnotenia, ako je napríklad kinetika, biomonitorova ­
nie, funkcia p ľúc, zadržiavanie slabo rozpustných materiálov, ktoré sa 
hromadia v p ľúcnom tkanive, a zmeny správania.
 
TELESNÉ HMOTNOSTI 
35. Hmotnos ť jednotlivých zvierat je potrebné zaznamena ť krátko pred prvou 
expozíciou (de ň 0), potom dvakrát týždenne (napríklad: piatky a pondelky, 
aby sa preukázalo zotavenie po víkende bez expozícií, alebo v časovom 
intervale, ktorý umož ňuje hodnotenie systémovej toxicity) a v čase uhynutia 
alebo utratenia. Ak sa v prvých štyroch týžd ňoch neobjavia žiadne ú činky, 
po zvyšok štúdie sa môže telesná hmotnos ť merať raz za týžde ň. Satelitné 
zvieratá (na štúdiu reverzibility, ak sa použijú) sa na ďalej vážia raz za 
týždeň počas celého obdobia zotavovania. Na konci štúdie by sa všetky 
zvieratá mali krátko pred utratením odváži ť, aby sa získali neskreslené 
vypočítané pomery hmotnosti orgánov k telu.  
SPOTREBA POTRAVY A VODY 
36. Spotreba potravy by sa mala mera ť raz za týžde ň. Môže sa mera ť aj 
spotreba vody.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINICKÁ PATOLÓGIA 
37. Hodnotenia klinickej patológie sa po utratení vykonávajú pri všetkých zvie ­
ratách vrátane kontrolných a satelitných zvierat (na štúdiu reverzibility). Je potrebné zaznamena ť časový interval medzi skon čením expozície a odberom 
krvi, najmä ak je rekonštitúcia sledovaného parametra rýchla. Odber vzoriek 
po skončení expozície je indikovaný pri tých parametroch, ktoré majú 
krátky biologický pol čas v plazme (napr. COHb, CHE a MetHb). 
38. V tabu ľke 1 sa uvádza zoznam parametrov klinickej patológie, ktoré sa vo 
všeobecnosti požadujú pri všetkých toxikologických štúdiách. Rozbor mo ču 
sa bežne nevyžaduje, ale môže sa vykona ť, ak sa na základe o čakávanej 
alebo pozorovanej toxicity predpokladá, že bude užito čný. Vedúci štúdie sa 
môže rozhodnú ť hodnotiť ďalšie parametre s cie ľom lepšie charakterizova ť 
toxicitu testovanej chemikálie (napr. cholínesteráza, lipidy, hormóny, acido ­
bázická rovnováha, methemoglobín alebo Heinzove telieska, kreatinkináza, 
pomer myelocytov a erytrocytov, troponíny, plyny v arteriálnej krvi, laktát- dehydrogenáza, sorbitol-dehydrogenáza, glutamat-dehydrogenáza a gama- 
glutamyl transpeptidáza).
 
Tabuľka 1 
Štandardné parametre klinickej patológie  
Hematológia  
Počet erytrocytov 
Hematokrit 
Koncentrácia hemoglobínu Stredný korpuskulárny hemoglobín 
Stredný korpuskulárny objem 
Koncentrácia stredného korpuskulár ­
neho hemoglobínu 
Retikulocyty Celkový po čet leukocytov 
Diferenciálny po čet leukocytov 
Počet trombocytov 
Potenciál zrážania krvi (vyberte 
jednu z možností): 
— Protrombínový čas 
— Čas zrážania krvi 
— Čiastočný tromboplastínový 
čas
 
Klinická chémia  
Glukóza (*) 
Celkový cholesterol 
Triglyceridy Dusík z mo čoviny v krvi 
Celkový bilirubín 
Kreatinín 
Celkový obsah bielkovín Albumíny 
Globulíny Alanín-amintransferáza 
Aspartát-aminotransferáza 
Alkalická fosfatáza Draslík Sodík 
Vápnik 
Fosfor Chloridy
 
Rozbor mo ču (nepovinné)  
Vzhľad (farba a zakalenie) 
Objem 
Špecifická hmotnos ť alebo osmolalita 
pH Celkový obsah bielkovín 
Glukóza 
Krv/krvinky  
(*) Keďže dlhé obdobie bez k ŕmenia môže pri pokusných zvieratách v porovnaní 
s kontrolnými zvieratami vies ť k skresleniu meraní glukózy, vedúci štúdie by 
mal určiť, či je primerané, aby sa zvieratá nek ŕmili. Ak sa použije obdobie bez 
kŕmenia, malo by by ť primerané použitému živo číšnemu druhu; pri potkanoch to 
môže byť 16 hodín (no čný pôst). Stanovenie glukózy nala čno sa môže vykona ť 
po nočnom pôste po čas posledného týžd ňa expozície alebo po no čnom pôste pred 
pitvou (v druhom prípade spolu so všetkými ostatnými parametrami klinickej 
patológie).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Ak existuje dôkaz, že hlavným miestom usadzovania a zachytávania sú 
dolné dýchacie cesty (t. j. alveoly), ako metóda kvantitatívnej analýzy hypo ­
tetických parametrov ú činnosti dávky zameranej na hypersenzitívnu pneu ­
monitídu, zápal p ľúc a fosfolipidózu sa môže zvoli ť bronchoalveolárna 
laváž (BAL). Tá umož ňuje primerane preskúma ť priebežné zmeny alveolár ­
neho poškodenia súvisiace so závislos ťou reakcie od dávky. Z tekutiny 
bronchoalveolárnej laváže sa môže analyzova ť celkový a diferenciálny 
počet leukocytov, celkový obsah bielkovín a laktát-dehydrogenáza. Ďalej 
sa môžu zváži ť parametre indikujúce lyzozomálne poškodenie, fosfolipi ­
dózu, fibrózu a dráždivé alebo alergické zápaly, ktoré môžu zah ŕňať stano­
venie zápalových cytokínov/chemokínov. Merania BAL vo všeobecnosti dopĺňajú výsledky histopatologických testov, nemôžu ich však nahradi ť. 
Usmernenia o postupe p ľúcnej laváže sú uvedené v dokumente GD 39 (2).
 
OFTALMOLOGICKÉ VYŠETRENIE 
40. Pomocou oftalmoskopu alebo podobného vhodného zariadenia sa vykoná 
oftalmologické vyšetrenie o čného pozadia, refrak čného systému oka, 
dúhovky a spojoviek pri všetkých zvieratách pred podaním testovanej 
chemikálie a po skon čení expozície pri všetkých skupinách s vysokými 
koncentráciami a pri kontrolných skupinách. Ak sa zistia zmeny na oku, 
vyšetria sa všetky zvieratá v ostatných skupinách vrátane satelitnej skupiny 
(reverzibilita).  
MAKROSKOPICKÁ PATOLÓGIA A ORGÁNOVÉ HMOTNOSTI 
41. Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu alebo sa 
vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú úplnému 
vykrveniu (ak je uskuto čniteľné) a makroskopickej autopsii. Pri každom 
zvierati sa zaznamená čas medzi skon čením poslednej expozície 
a utratením. Ak nie je možné vykona ť autopsiu ihne ď po objavení uhynu ­
tého zviera ťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostato čne nízku teplotu, aby 
sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykona ť čo najskôr, 
zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zazna ­
menajú všetky makroskopické patologické zmeny, pri čom osobitná pozor ­
nosť sa venuje akýmko ľvek zmenám v dýchacej sústave. 
42. V tabu ľke 2 sa uvádza zoznam orgánov a tkanív, ktoré je po čas makro ­
skopickej pitvy potrebné zachova ť vo vhodnom médiu na ú čely histopato ­
logického vyšetrenia. O uchovaní orgánov a tkanív [v zátvorke] a všetkých 
ostatných orgánov a tkanív rozhodne vedúci štúdie. Orgány vyzna čené 
tučným písmom  by sa mali čo najskôr po disekcii upravi ť a odváži ť 
v mokrom stave, aby sa zabránilo ich vyschnutiu. Štítna ž ľaza 
a nadsemenníky by sa mali váži ť iba v prípade potreby, lebo úprava arte ­
faktov môže bráni ť histopatologickému hodnoteniu. Tkanivá a všetky 
orgány sa fixujú v 10 % formalínovom tlmivom roztoku alebo v inom vhodnom fixa čnom prostriedku ihne ď po vykonaní autopsie a nie skôr 
ako 24 – 48 hodín pred úpravou v závislosti od použitého fixa čného 
prostriedku.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Tabuľka 2 
Orgány a tkanivá zachované po čas makroskopickej pitvy 
Nadobličky 
Srdcovnica 
Kostná dre ň (a/alebo čerstvý aspirát)  
Mozog  (vrátane častí predného mozgu, 
mozočka a pred ĺženej miechy/mosta) 
Slepé črevo 
Hrubé črevo 
Dvanástnik 
[Nadsemenníky ] 
[Oči (sietnica, o čný nerv) a o čné viečka] 
Stehnová kos ť a kolenný k ĺb 
Žlčník 
[Harderove ž ľazy] 
Srdce  
Ileum 
Lačník 
Obličky 
[Slzné žľazy (extraorbitálne)] 
Hrtan (tri úrovne vrátane základne epiglotis)  
Pečeň 
Pľúca (všetky laloky na jednej úrovni vrátane 
hlavných priedušiek) 
Lymfatické uzliny z hilovej oblasti p ľúc, 
najmä v prípade tuhých testovaných chemi ­
kálií so slabou rozpustnos ťou. Pri detailnej ­ 
ších testoch a/alebo štúdiách s imunolo ­
gickým zameraním sa môžu zváži ť ďalšie 
lymfatické uzliny, napr. z mediastinálnych, cervikálnych/submandibulárnych a/alebo auri ­
kulárnych oblastí. 
Lymfatické uzliny (distálne od brány vstupu) 
Prsná žľaza (sami čia) 
Sval (stehenný) 
Nosohltanové tkanivá (aspo ň štyri úrovne; 
jedna úrove ň zahŕňa nosohltanovú trubicu 
a nosové lymfoidné tkanivo (NALT)) Pažerák 
[Čuchový bulbus]  
Vaječníky  
Pankreas 
Prištítne telieska 
Periférny nerv (sedací alebo tibiálny, pod ľa 
možnosti blízko svalu) 
Hypofýza 
Prostata 
Rektum 
Slinné žľazy 
Semenné mechúriky 
Koža Miecha (kr čná, hrudná a lumbálna)  
Slezina  
Hrudná kos ť 
Žalúdok 
Zuby  
Semenníky 
Týmus 
Štítna žľaza 
[Jazyk] Priedušnica (najmenej dve úrovne vrátane 
jedného pozd ĺžneho rezu cez karinu 
a jedného prie čneho rezu) 
Močovod 
Močová rúra 
Močový mechúr  
Maternica  
Cieľové orgány 
Všetky makroskopické poškodenia a hmot ­
nosti
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Pľúca by sa mali od ňať neporušené, odváži ť a napusti ť vhodným fixa čným 
prostriedkom pri tlaku 20 – 30 cm vody, aby sa zachovala ich štruktúra (5). 
Je potrebné odobra ť rezy všetkých lalokov na jednej úrovni vrátane hlav ­
ných priedušiek, ale ak sa robí p ľúcna laváž, mali by sa vykona ť rezy 
nelavážovaného laloku na troch úrovniach (nie sériové rezy). 
44. Preskúmajú sa najmenej štyri úrovne nosohltanových tkanív, z ktorých jedna 
by mala obsahova ť nosohltanovú trubicu (5) (6) (7) (8) (9), aby sa umožnilo 
vhodné preskúmanie dlaždicového, prechodného (neriasinkového dýchacie ­
ho), dýchacieho (riasinkového dýchacieho) a čuchového epitelu 
a odvodného lymfatického tkaniva (NALT) (10) (11). Preskúmajú sa tri úrovne hrtana, pri čom jedna z týchto úrovní by mala obsahova ť základňu 
epiglotis (12). Je potrebné preskúma ť aspoň dve úrovne priedušnice vrátane 
jedného pozd ĺžneho rezu cez karinu bifurkácie extrapulmonárnych priedu ­ 
šiek a jedného prie čneho rezu.
 
HISTOPATOLÓGIA 
45. Pri kontrolných skupinách a skupinách s vysokými koncentráciami a pri 
všetkých zvieratách, ktoré uhynú alebo sú utratené po čas štúdie, sa vykoná 
histopatológia všetkých orgánov a tkanív vymenovaných v tabu ľke 2. 
Osobitná pozornos ť by sa mala venova ť dýchacím cestám, cie ľovým 
orgánom a makroskopickým poškodeniam. Orgány a tkanivá, ktoré majú 
poškodenia v skupine s vysokými koncentráciami, sa preskúmajú pri všet ­
kých skupinách. Vedúci štúdie sa môže rozhodnú ť pre vykonanie histopa ­
tologických hodnotení pri ďalších skupinách s cie ľom preukáza ť jednoz­
načnú reakciu na koncentráciu. Ak boli použité satelitné skupiny (reverzi ­
bilita), histopatologické hodnotenie sa vykoná v prípade všetkých tkanív 
a orgánov, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené ú činky. Ak 
v skupine s vysokou expozíciou došlo k nadmernému pred časnému úhynu 
alebo iným problémom, ktoré spochyb ňujú významnos ť údajov, je potrebné 
histopatologicky preskúma ť najbližšiu nižšiu koncentráciu. Sledovanie 
nálezov pitvy by malo korelova ť s mikroskopickými nálezmi.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
46. Je potrebné uvies ť údaje o telesnej hmotnosti, spotrebe potravy, klinickej 
patológii, makroskopickej patológii, orgánových hmotnostiach a histopatológii jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa 
zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet 
použitých zvierat, po čet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, 
počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté po čas testu alebo ich usmrtili 
z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový 
priebeh toxických ú činkov a reverzibility a pitevné nálezy. Všetky výsledky, 
kvantitatívne aj náhodné, sa vyhodnotia primeranou štatistickou metódou. Možno použi ť akúkoľvek všeobecne akceptovanú štatistickú metódu, 
pričom štatistické metódy je potrebné vybra ť počas plánovania štúdie.
 
Správa o teste  
47. Správa o teste by mala pod ľa potreby obsahova ť tieto informácie:  
Testované zvieratá a chov:  
— opis podmienok v klietkach vrátane: po čtu (alebo zmeny po čtu) zvierat 
na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, d ĺžky svetlej 
fázy a identifikácie krmiva,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, 
môže sa uvies ť zdroj a historické údaje, ak sa týkajú zvierat 
v podobných podmienkach expozície, umiestnenia a k ŕmenia, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— metóda randomizácie, — opis akýchko ľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény 
a liečby chorôb.  
Testovaná chemická látka:  
— fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické 
vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje a registra čné číslo CAS (Chemical Abstract Servi ­
ces), ak je známe.  
Nosič: 
— odôvodnenie použitia nosi ča a odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako 
voda), 
— historické alebo sú časné údaje preukazujúce, že nosi č nemá vplyv na 
výsledky štúdie.  
Inhalačná komora:  
— podrobný opis inhala čnej komory vrátane objemu a nákresu, 
— zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvo ­
renie ovzdušia, 
— zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, ve ľkosti častíc a skuto čnej 
koncentrácie, 
— zdroj vzduchu a použitý klimatiza čný systém, 
— metódy použité na kalibráciu zariadenia s cie ľom zabezpe čiť homogénne 
testovacie ovzdušie, 
— rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny), — expozi čné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), 
umiestnenie zvierat v komore (v prípade expozície celého tela), 
— stabilita testovacieho ovzdušia, — umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho 
ovzdušia v komore, 
— manipulácia s privádzaným/extrahovaným vzduchom, — hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozi čný otvor 
(v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela), 
— čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhala čnej komore (t95), 
— počet zmien objemu za hodinu, 
— meracie prístroje (ak sa použili).  
Údaje o expozícii:
 
— odôvodnenie výberu cie ľovej koncentrácie pre základnú štúdiu,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nominálne koncentrácie (celková hmotnos ť testovanej chemikálie apli ­
kovanej do inhala čnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel 
komorou), 
— skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny 
zvierat, v prípade zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzikálne skupen ­
stvá (plyny, pary, aerosóly) možno každé skupenstvo analyzova ť samo­
statne, 
— všetky koncentrácie vzduchu sa udávajú v hmotnostných jednotkách 
(mg/l mg/m  3 atď.), nie v objemových jednotkách (ppm, ppb at ď.), 
— rozdelenie ve ľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný 
priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru ( σ g ) 
vrátane metód ich výpo čtu. Jednotlivé analýzy ve ľkosti častíc sa uvedú 
v správe.  
Podmienky testovania:  
— podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrob ­
ných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie ve ľkosti 
častíc tuhých materiálov alebo na prípravu roztokov testovanej chemi ­
kálie, 
— opis (pod ľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvo ­
renie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdu ­ 
šiu, 
— podrobné informácie o zariadeniach použitých na monitorovanie teploty, 
vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore (t. j. vývoj kalibra čnej krivky), 
— podrobné informácie o zariadeniach použitých pri odbere vzoriek na 
stanovenie koncentrácie v komore a rozdelenia ve ľkosti častíc, 
— podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o 
overení metódy (vrátane ú činnosti vý ťažnosti testovanej chemikálie 
z prostriedku na odber vzorky), 
— metóda randomizácie pri pride ľovaní zvierat do testovacích 
a kontrolných skupín, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.  
Výsledky:  
— tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore, 
— tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skuto čných koncentrá ­
ciách, 
— tabuľkové spracovanie údajov o ve ľkosti častíc vrátane údajov o odbere 
vzoriek na analýzu, o rozdelení ve ľkosti častíc a o výpo čtoch MMAD 
a σ g , 
— tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie 
pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane 
mortality, charakteru, závažnosti, času nástupu a trvania ú činkov),  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— tabuľkové spracovanie hmotností jednotlivých zvierat, 
— tabuľkové spracovanie spotreby potravy, 
— tabuľkové spracovanie údajov klinickej patológie, 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii.  
Rozbor a interpretácia výsledkov:  
— osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií 
tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo ve ľkosti častíc, 
— dýchate ľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak 
nebolo možné splni ť kritériá na ve ľkosť častíc, 
— konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie a vz ťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii 
sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie, 
— uvedie sa pravdepodobná prí čina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia 
(systémové či lokálne), 
— uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utrati ť 
zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo 
pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmer ňovacom doku ­
mente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (3), 
— identifikuje sa cie ľový orgán (orgány), 
— stanoví sa NOAEL a LOAEL.
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Paríž. 
2. OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asse ­
ssment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž. 
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž. 
4. Whalan, J. E., a Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency. 
5. Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological 
Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology 
of Inhaled Material , Witschi, H. P., a Brain, J. D. (eds), Springer Verlag 
Heidelberg, s. 229 – 258. 
6. Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309 – 312. 
7. Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231 
– 238.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
8. Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes, M. P., a Ward, J. M. (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, s. 215 – 263. 
9. Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). 
Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353 – 372. 
10. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. 
J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The 
role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219 –224. 
11. Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140 – 141: 281 – 285. 
12. Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419 – 428. 
13. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí, 
o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene 
a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  ŠTÚDIE CHRONICKEJ TOXICITY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 452 (2009). Pôvodné usmernenia TG 452 boli prijaté 
v roku 1981. Vypracovanie tejto revidovanej testovacej metódy B.30 sa 
považovalo za potrebné na zoh ľadnenie najnovšieho vývoja v oblasti staro ­
stlivosti o zvieratá a regula čných požiadaviek (1) (2) (3) (4). Aktualizácia 
tejto testovacej metódy B.30 bola vykonaná súbežne s revíziou 
kapitoly B.32 tejto prílohy, Štúdie karcinogenity, a kapitoly B.33 tejto 
prílohy, Kombinované štúdie chronickej toxicity/karcinogenity, s cie ľom 
získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii a poskytnú ť 
ďalšie podrobné údaje o výbere dávky. Táto testovacia metóda je vypraco ­
vaná pre testovanie širokej škály chemikálií vrátane pesticídov 
a priemyselných chemikálií. 
2. Väčšina štúdií chronickej toxicity sa vykonáva na hlodavcoch a táto testo ­
vacia metóda sa preto primárne vz ťahuje na štúdie vykonávané na týchto 
živočíšnych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadova ť v prípade nehlo ­
davcov, takisto sa s príslušnými úpravami môžu uplatni ť princípy a postupy 
uvedené v tejto testovacej metóde spolu s princípmi a postupmi uvedenými v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-d ňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodav ­
coch v opakovaných dávkach (5), ako sa uvádza v Usmer ňovacom doku ­
mente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity 
a karcinogenity (6). 
3. Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách chronickej toxicity sú 
orálne, dermálne a inhala čné podávanie. Výber spôsobu podávania závisí od 
fyzikálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie a naj častejšieho 
spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere spôsobu expozície 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente OECD č. 116 (6). 
4. Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách 
chronickej toxicity používa naj častejšie. Hoci dlhodobé štúdie chronickej 
toxicity využívajúce dermálnu alebo inhala čnú expozíciu môžu by ť takisto 
potrebné na hodnotenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu 
vyžadova ť v určitých regula čných režimoch, oba spôsoby expozície sú do 
značnej miery technicky zložité. Takéto štúdie budú musie ť byť pripravené 
v závislosti od jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu 
uvádza na posúdenie a vyhodnotenie chronickej toxicity pri orálnom podá ­
vaní, by mohla slúži ť ako základ protokolu pre inhala čné a/alebo dermálne 
štúdie vzh ľadom na odporú čania týkajúce sa období testovania, klinických 
a patologických parametrov at ď. K dispozícii sú usmernenia OECD 
o podávaní testovaných chemikálií inhala čným (6) (7) a dermálnym 
spôsobom (6). Pri príprave dlhodobejších štúdií zah ŕňajúcich inhala čnú 
expozíciu je nutné si preštudova ť najmä kapitolu B.8 tejto prílohy (8) 
a kapitolu B.29 tejto prílohy (9) spolu s Usmer ňovacím dokumentom 
OECD o testovaní akútnej inhala čnej toxicity (7). Kapitolu B.9 tejto 
prílohy (10) je nutné konzultova ť v prípade testovania dermálnej expozície.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Štúdia chronickej toxicity poskytuje informácie o možnej nebezpe čnosti pre 
zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii 
v priebehu významnej časti dĺžky života použitého živo číšneho druhu. 
Štúdia poskytne informácie o toxických ú činkoch testovanej chemikálie, 
indikuje cie ľové orgány a možnos ť akumulácie. Môže takisto zabezpe čiť 
odhad hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku, ktorý možno použi ť 
na stanovenie bezpe čnostných kritérií týkajúcich sa expozície človeka. 
Takisto sa v nej zdôraz ňuje nutnos ť dôkladných klinických pozorovaní 
zvierat s cie ľom získať čo najväčšie množstvo informácií. 
6. Medzi ciele štúdie v rámci tejto testovacej metódy patrí: 
— identifikácia chronickej toxicity testovanej chemikálie, — identifikácia cie ľových orgánov, 
— charakterizácia vz ťahu medzi dávkou a reakciou, 
— identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL) 
alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD), 
— predpovedanie ú činkov chronickej toxicity na úrovniach expozície 
človeka, 
— poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu 
pôsobenia (6).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
7. Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxikologických vlastností testovanej 
chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cie ľom zamera ť prípravu 
štúdie na ú činnejšie testovanie potenciálu chronickej toxicity 
a minimalizova ť využívanie zvierat. Informácie, ktoré pomôžu pri príprave 
štúdie, zah ŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti 
testovanej chemikálie, akéko ľvek informácie o druhu pôsobenia, výsledky 
všetkých testov toxicity  in vitro  alebo  in vivo , predpokladané použitie/po ­
užitia a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné údaje (Q)SAR 
a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika pri jednej dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je k dispozícii) a údaje získané z iných štúdií opakovanej 
expozície. Stanovenie chronickej toxicity sa vykoná až po získaní prvotných 
informácií o toxicite z 28-d ňového a/alebo 90-d ňového testu toxicity 
v opakovaných dávkach. Stratégiu fázového testovania pri testovaní chro ­
nickej toxicity treba zváži ť ako súčasť celkového hodnotenia potenciálnych 
nepriaznivých zdravotných ú činkov danej testovanej chemikálie (11) (12) 
(13) (14). 
8. Štatistické metódy, ktoré sú vzh ľadom na prípravu pokusu a ciele na 
analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred za čatím štúdie. Je 
potrebné zváži ť, či by štatistiky nemali zah ŕňať úpravu vzh ľadom na prežitie 
zvierat a analýzu v prípade pred časného konca jednej alebo viacerých 
skupín. Usmernenia o vhodných štatistických analýzach a k ľúčové odkazy 
na medzinárodne uznávané štatistické metódy sú uvedené v usmer ňovacom 
dokumente č. 116 (6), ako aj v Usmer ňovacom dokumente č. 35 o analýze 
a hodnotení štúdií chronickej toxicity a karcinogenity (15).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Pri vykonávaní štúdie chronickej toxicity je vždy nutné sa riadi ť hlavnými 
zásadami a úvahami uvedenými v Usmer ňovacom dokumente OECD č. 19 
o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpe čnosti 
(16), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že „ak v štúdiách 
s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progre ­
sívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií 
rozhodnú ť, či sa má zviera humánne usmrti ť alebo nie. Pri rozhodovaní 
treba zváži ť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním 
zvieraťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. 
Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zviera ťa bude pokra čovať, frek­
vencia pozorovaní by sa mala pod ľa potreby zvýši ť. Takisto je možné, 
bez toho, aby to malo negatívny vplyv na ú čel testu, do časne pozastavi ť 
podávanie dávok, ak sa tým zviera ťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo 
znížiť testovaciu dávku.“ 
10. Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej 
toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (6), 
ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied 
(International Life Sciences Institute) (17) (18). Základná stratégia výberu dávky závisí od primárneho cie ľa alebo cie ľov štúdie (odsek 6). Pri výbere 
vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnu ť rovnováhu medzi skríningom 
nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky 
a jej významu na druhej strane. To má význam najmä v prípade kombino ­
vanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy, 
odsek 11). 
11. Treba zváži ť vykonanie kombinovanej štúdie chronickej toxicity 
a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) namiesto samostatného vyko ­
nania štúdie chronickej toxicity (táto testovacia metóda B.30) a štúdie karci ­
nogenity (kapitola B.32 tejto prílohy). Kombinovaným testom sa zabezpe čí 
vyššia účinnosť, pokiaľ ide o č
as a náklady, ako v prípade vykonania dvoch 
samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či už vo fáze 
chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej 
štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) však 
treba náležite zoh ľadniť zásady výberu dávky (odseky 9 a 20 – 25), pri čom 
sa takisto pripúš ťa, že v ur čitých regula čných rámcoch sa môže vyžadova ť 
vykonanie samostatných štúdií. 
12. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou 
je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmer ňovacom dokumente (GD) 
č. 116 (6).  
PRINCÍP TESTU 
13. Testovaná chemikália sa podáva denne v odstup ňovaných dávkach 
niekoľkým skupinám pokusných zvierat, zvy čajne počas 12 mesiacov, 
hoci v závislosti od regula čných požiadaviek možno zvoli ť aj dlhšie alebo 
kratšie obdobia (pozri odsek 33). Vybraté obdobie by malo by ť dostatočne 
dlhé, aby sa mohli prejavi ť účinky kumulatívnej toxicity, ale bez toho, aby 
testovanie zmarili zmeny súvisiace so starnutím zvierat. Odchýlky od 12- 
mesačného trvania expozície je potrebné odôvodni ť, najmä v prípade krat ­ 
ších trvaní. Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva orálne, aj ke ď môže 
byť vhodné aj testovanie inhala čnej alebo dermálnej expozície. Plán štúdie 
môže zah ŕňať aj jedno alebo viaceré priebežné utratenia, napr. po troch 
a šiestich mesiacoch, pri čom na doplnenie po čtu je možné použi ť ďalšie 
skupiny zvierat (pozri odsek 19). Po čas tohto obdobia sú na zvieratách 
dôkladne pozorované prípadné znaky toxicity látok. Pitva sa uskuto ční na 
zvieratách uhynutých alebo usmrtených po čas testovania a aj po ukon čení 
testu na zvieratách, ktoré test prežijú.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
14. Táto testovacia metóda primárne zah ŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie 
chronickej toxicity pri hlodavcoch (pozri odsek 2), hoci sa pripúš ťa, že 
v určitých regula čných režimoch sa môžu vyžadova ť podobné štúdie pri 
nehlodavcoch. Výber druhu zvierat je potrebné odôvodni ť. Príprava 
a vykonanie štúdií chronickej toxicity pri nehlodavcoch, ak sa požadujú, 
by mali by ť založené na zásadách uvedených v tejto testovacej metóde, 
ako aj na zásadách uvedených v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-d ňová štúdia 
orálnej toxicity pri nehlodavcoch v opakovaných dávkach (5). Ďalšie infor ­
mácie o výbere druhov a kme ňa zvierat sú uvedené v usmer ňovacom doku ­
mente č. 116 (6). 
15. V rámci tejto testovacej metódy je najvhodnejším hlodavcom potkan, hoci 
sa môžu použi ť aj iné hlodavce, napr. myši. Potkany a myši sú uprednost ­ 
ňované pokusné modely vzh ľadom na ich pomerne krátku d ĺžku života, ich 
rozsiahle využívanie vo farmakologických a toxikologických štúdiách, ich náchylnos ť na indukciu nádoru a dostupnos ť dostato čne 
charakterizovaných kme ňov. Vzh ľadom na tieto charakteristiky je 
k dispozícii ve ľké množstvo informácií o ich fyziológii a patológii. Použí ­
vajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kme ňov. Štúdiu chronickej toxicity možno vykona ť pri zvie­
ratách z toho istého kme ňa a zdroja, ako sú zvieratá, ktoré sa použili 
v predbežnej štúdii (štúdiách) toxicity s kratším trvaním. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné.
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
16. Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovna ­
kého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zváži ť iba 
v prípade, že je to vedecky opodstatnené (19) (20) (21). Klietky sa uspo ­
riadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzh ľadom na ich umiest ­
nenie. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 °C (± 
3 °C). Hoci relatívna vlhkos ť by mala by ť najmenej 30 % a prednostne 
by nemala presiahnu ť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cie ľom by 
mala byť 50 – 60 % vlhkos ť. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by 
sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže používa ť 
bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Potrava 
musí vyhovova ť všetkým výživovým požiadavkám pre testované druhy 
zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, perzis ­
tentných organických zne čisťujúcich látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, 
mykotoxínov a iných kontaminantov, ktoré môžu ma ť vplyv na výsledky 
testu, musí by ť čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín 
a kontaminantov potravy by sa mali získava ť priebežne, aspo ň na začiatku 
štúdie a pri zmene používanej šarže, a mali by sa uvies ť v závere čnej 
správe. Podobne treba uvies ť analytické informácie o pitnej vode použitej 
v štúdii. Výber krmiva môže by ť ovplyvnený potrebou zabezpe čiť vhodnú 
prímes testovanej chemikálie a potrebou splni ť výživové požiadavky pri 
zvieratách v prípade, že sa testovaná chemikália podáva v potrave.  
Príprava zvierat  
17. Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky 
aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade 
hlodavcov sa musí dávkovanie za čať čo najskôr po odstavení mlá ďat 
a aklimatizácii a pod ľa možnosti skôr, než zvieratá dov ŕšia vek ôsmich 
týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kme ňa, 
zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na za čiatku štúdie má by ť rozdiel 
medzi hmotnos ťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny 
a pre každé pohlavie zvláš ť nemá presahova ť ± 20 % priemernej hmotnosti  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá by mali by ť postupne zadelené do 
kontrolných skupín a skupín, ktorým sa podáva látka. Po randomizácii by 
medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali by ť 
výrazné rozdiely v priemernej telesnej hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, randomizácia by sa pod ľa možnosti mala zopakova ť. 
Každému zviera ťu sa pridelí jedine čné identifika čné číslo, ktorým sa zviera 
trvalo ozna čí tetovaním, mikro čipovým implantátom alebo inou vhodnou 
metódou.
 
POSTUP  
Počet zvierat a ich pohlavie  
18. Použijú sa obe pohlavia. Mal by sa použi ť dostatočný počet zvierat, aby bol 
na konci štúdie v každej skupine k dispozícii dostatok zvierat na dôkladné 
biologické a štatistické hodnotenie. V prípade hlodavcov sa zvy čajne použije 
minimálne 20 zvierat z každého pohlavia na skupinu pri každej úrovni dávky, zatiaľ čo pri nehlodavcoch sa odporú ča použitie minimálne štyroch zvierat 
z každého pohlavia na skupinu. V štúdiách, v ktorých sa využívajú myši, 
môže byť na uskuto čnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení 
potrebné použi ť v každej skupine s dávkou viac zvierat.
 
Zabezpečenie priebežného utrácania, satelitných skupín a sentinelových 
zvierat  
19. Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže po čítať s priebežným 
utrácaním (najmenej desa ť zvierat z každého pohlavia na skupinu), napr. 
po šiestich mesiacoch, s cie ľom získa ť informácie o progresii toxikologic ­
kých zmien a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie o testovanej chemikálii sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity v opakovaných dávkach, priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opod ­
statnené. Takisto je možné použi ť satelitné skupiny na monitorovanie rever ­
zibility akýchko ľvek toxikologických zmien vyvolaných skúmanou testo ­
vanou chemikáliou. Tieto skupiny sa zvy čajne obmedzujú na najvyššiu 
úroveň dávky použitej v štúdii a na kontrolu. Na monitorovanie stavu 
choroby možno po čas štúdie v prípade potreby použi ť aj ďalšiu skupinu 
sentinelových zvierat (zvy čajne päť zvierat z každého pohlavia) (22). Ak sa 
plánuje priebežné utrácanie zvierat alebo použitie satelitných alebo sentine ­
lových skupín, po čet zvierat zahrnutých v pláne štúdie by mal by ť zvýšený 
o plánovaný po čet zvierat, ktoré majú by ť utratené pred ukon čením štúdie. 
Tieto zvieratá sa zvy čajne podrobia tým istým pozorovaniam vrátane pozo ­
rovaní telesnej hmotnosti, spotreby potravy/vody, hematologickým mera ­
niam a meraniam klinickej biochémie a patologickým vyšetreniam ako zvie ­
ratá vo fáze chronickej toxicity v rámci základnej štúdie, hoci sa takisto môže zabezpe čiť, aby sa (v skupinách, v ktorých sa plánuje priebežné 
utrácanie zvierat) merania obmedzili na špecifické k ľúčové ukazovatele, 
ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita.
 
Skupiny s dávkami a dávkovanie  
20. Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jedno ­
tlivými úrov ňami dávok sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č.116 (6). 
Použijú sa aspo ň tri úrovne dávky a súbežná kontrola s výnimkou prípadov, 
keď sa vykonáva limitný test (pozri odsek 27). Úrove ň dávky zvy čajne 
vychádza z výsledkov krátkodobých štúdií v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pri čom je potrebné prihliada ť na existujúce toxi ­
kologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú o testovanej chemikálii alebo 
príbuzných chemikáliách k dispozícii.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Pokia ľ to dovo ľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické ú činky 
testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cie ľových orgánov 
a toxických ú činkov by sa mala vybra ť najvyššia úrove ň dávky, ktorá 
súčasne nebude ma ť za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu 
alebo uhynutie. Pri sú časnom zoh ľadnení faktorov uvedených v odseku 22 
by sa mala vybra ť najvyššia úrove ň dávky preukazujúca toxicitu, o ktorej 
svedčí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (o približne 10 %). 
22. V závislosti od cie ľov štúdie (pozri odsek 6) však možno vybra ť najvyššiu 
dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca toxicitu, napr. ak dávka 
vyvoláva daný nepriaznivý ú činok, ktorý má však malý vplyv na d ĺžku 
života alebo na telesnú hmotnos ť. Najvyššia dávka by nemala presiahnu ť 
1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň (limitná dávka, pozri odsek 27). 
23. Úrovne dávok a odstupy medzi úrov ňami dávok možno vybra ť s cieľom 
určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a hladinu NOAEL alebo iný pláno ­
vaný výsledok štúdie, napr. BMD (pozri odsek 25) pri najnižšej úrovni 
dávky. Medzi faktory, ktoré by sa mali zváži ť pri podávaní nižších dávok, 
patrí predpokladaný sklon krivky závislosti reakcie od dávky, dávky, pri ktorých môže dochádza ť k významným zmenám v metabolizme, alebo 
druhu toxického pôsobenia, ke ď sa očakáva prahová hodnota alebo ke ď 
sa očakáva východisko pre extrapoláciu nízkej dávky. 
24. Vybraté odstupy medzi úrov ňami dávok budú závisie ť od vlastností testo ­
vanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy predpísa ť, 
ale dobrá ú činnosť testov sa 
často dosahuje, ak sa na stanovenie zostupného 
dávkovania použijú intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri, pri čom 
pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie ve ľmi 
veľkých intervalov (napr. s faktorom vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. 
Vo všeobecnosti by sa nemali používa ť faktory vyššie ako 10 a v prípade, 
že sa použijú, je nutné tento postup odôvodni ť. 
25. Ako sa ďalej uvádza v usmer ňovacom dokumente č.116 (6), pri výbere 
dávky je potrebné zváži ť tieto body: 
— známe alebo predpokladné nelinearity alebo inflexné body krivky závi ­
slosti reakcie od dávky, 
— toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza 
k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými 
a internými dávkami, 
— prekurzorné poškodenia, markery ú činkov alebo ukazovatele prebiehajú ­
cich kľúčových základných biologických procesov, 
— kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, 
pri ktorých za čína vznika ť cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, 
preťažujú sa homeostatické mechanizmy at ď., 
— oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný ve ľmi 
podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo pred ­
pokladanej prahovej úrovne, 
— zváženie o čakávaných úrovní expozície človeka.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená ú činkom chemiká ­
lie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosi č, ak sa pri podávaní testovanej 
chemikálie používa nosi č. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaob ­
chádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou 
aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosi č, kontrolná skupina 
dostane nosi č v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách 
s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá 
poslúži ako vhodnejšia kontrola. 
27. Ak na základe informácií z predbežných štúdií možno predpoklada ť, že test 
pri jednej úrovni dávky dosahujúcej najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmot ­
nosti/deň s využitím postupov opísaných pre túto štúdiu pravdepodobne 
nebude ma ť nepriaznivé ú činky a ak sa na základe údajov o štrukturálne 
príbuzných chemikáliách neo čakáva toxicita, potom sa úplná štúdia 
s využitím troch úrovní dávok nepovažuje za potrebnú. Uplat ňuje sa limit 
1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň s výnimkou prípadu, ke ď expozícia 
človeka indikuje potrebu použitia vyššej úrovne dávky.
 
Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie  
28. Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej 
vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (6). Spôsob a metóda podá ­
vania závisí od ú čelu štúdie, fyzikálnych/chemických vlastností testovanej 
chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodni ť. 
V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna 
sonda zvy čajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda 
podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. 
v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce pesticídy sa zvy čajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V ur čitých 
prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže by ť vhod­
nejšie podanie iným spôsobom. 
29. Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo 
vhodnom nosi či. Náležitá pozornos ť by sa mala venova ť nasledujúcim vlast ­
nostiam nosi ča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, meta ­
bolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeni ť svoje toxické vlastnosti, 
vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporú ča sa, 
aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/ 
suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuri čný olej) a nakoniec 
prípadného roztoku v iných nosi čoch. Charakteristiky toxicity nosi čov iných 
ako voda musia by ť známe. Musia by ť k dispozícii informácie o stabilite 
testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív (podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave). 
30. V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité 
zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvy čajne nemala presiahnu ť horný limit 5 % 
z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutri čnej nevyváženosti. 
Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použi ť buď 
konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm) alebo konštantná úrove ň
 dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa (mg/kg 
telesnej hmotnosti), ktorá sa vypo číta každý týžde ň. Použitú alternatívu je 
potrebné špecifikova ť. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej 
chemikálie denne (sedem dní v týždni), zvy čajne počas 12 mesiacov (pozri 
aj odsek 33), hoci v závislosti od regula čných požiadaviek sa môže poža ­
dovať dlhšie obdobie. Použitie každého iného režimu dávkovania, napr. pä ť 
dní v týždni, sa musí odôvodni ť. V prípade podávania cez kožu sa zvie ­
ratám zvy čajne aplikuje testovaná chemikália najmenej šes ť hodín denne, 
sedem dní v týždni, ako je uvedené v kapitole B.9 tejto prílohy (10), po čas 
12 mesiacov. Inhala čná expozícia sa vykonáva šes ť hodín denne, sedem dní 
v týždni, ale ak je to odôvodnené, môže sa použi ť aj expozícia po čas piatich 
dní v týždni. Obdobie expozície zvy čajne trvá 12 mesiacov. Ak sa v prípade 
iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť s cieľom minimalizova ť druhovo 
špecifické utrpenie. Ak sa použije expozícia v trvaní menej ako šes ť 
hodín denne, treba uvies ť odôvodnenie. Pozri aj kapitolu B.8 tejto 
prílohy (8). 
32. Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva pomocou sondy, podáva sa 
prostredníctvom žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly približne 
v rovnakom čase každý de ň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za de ň. 
Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachova ť dennú 
dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maxi ­
málny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od 
veľkosti pokusného zviera ťa. Objem by mal by ť podľa možnosti čo najnižší 
a v prípade hlodavcov by zvy čajne nemal presahova ť 1 ml/100 g telesnej 
hmotnosti (22). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa 
koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpe čil stály objem vo všetkých 
dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, 
ktoré je nutné zriedi ť, aby sa predišlo závažným lokálnym ú činkom. Nemalo 
by sa testova ť pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo 
dráždivé pre gastrointestinálny trakt.  
Trvanie štúdie  
33. Hoci táto testovacia metóda je primárne navrhnutá ako 12-mesa čná štúdia 
chronickej toxicity, plán štúdie možno použi ť aj pri štúdiách s kratším (napr. 
šesť alebo devä ť mesiacov) alebo dlhším trvaním (napr. 18 alebo 24 mesia ­
cov) v závislosti od požiadaviek konkrétnych regula čných režimov alebo 
špecifických mechanistických ú čelov. Odchýlky od 12-mesa čného trvania 
expozície je potrebné odôvodni ť, najmä v prípade kratších trvaní. Satelitné 
skupiny zahrnuté s cie ľom monitorova ť reverzibilitu všetkých toxikologic ­
kých zmien spôsobených skúmanou testovanou chemikáliou by sa mali 
zachovať bez dávkovania najmenej po čas štyroch týžd ňov a najviac po čas 
jednej tretiny celkového trvania štúdie po ukon čení expozície. Ďalšie usmer ­
nenia vrátane úvah o prežití v štúdii sú uvedené v usmer ňovacom doku ­
mente č. 116 (6).  
POZOROVANIA 
34. Pri všetkých zvieratách si treba všíma ť morbiditu alebo mortalitu, zvy čajne 
na začiatku a na konci každého d ňa vrátane víkendov a sviatkov. Všeobecné 
klinické pozorovania sa vykonávajú najmenej raz denne, najlepšie každý 
deň v rovnakom čase, vzhľadom na časový vrchol o čakávaných ú činkov 
po dávkovaní v prípade podávania cez sondu.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Všetky zvieratá sa pred prvou expozíciou najmenej raz podrobia dôkladným 
klinickým pozorovaniam (aby sa umožnilo porovnávanie jednotlivých 
zvierat navzájom), potom na konci prvého týžd ňa štúdie a následne každý 
mesiac. Protokol o pozorovaniach musí by ť pripravený tak, aby sa rozdiely 
medzi jednotlivými pozorovate ľmi minimalizovali a neboli závislé od testo ­
vacej skupiny. Tieto pozorovania sa vykonávajú mimo domovskej klietky, 
radšej v štandardnej aréne a v podobnom čase pri každej príležitosti. Musia 
byť pozorne zaznamenané, s použitím hodnotiaceho systému explicitne 
vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné minimalizova ť odlišnosti 
v podmienkach pozorovaní. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všíma ť, 
patria zmeny na koži, srsti, o čiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie 
a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, ve ľkosť zreničiek 
a nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vy čerpávajúce. 
Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnos ť 
kónických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. nadmerné o čisťo­
vanie tela, opakované to čenie sa) alebo zvláštne správanie (napr. chôdza 
dozadu, sebaznetvorenie) sa takisto musia zaznamena ť (24). 
36. Pred prvým podaním testovanej chemikálie sa pri všetkých zvieratách 
vykoná oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo iného vhod ­
ného zariadenia. Na konci štúdie sa toto vyšetrenie pod ľa možnosti vykoná 
pri všetkých zvieratách, ale minimálne pri zvieratách v skupine s vysokou dávkou a zvieratách v kontrolnej skupine. Ak sa po vystavení zvierat 
účinkom látky zistia zmeny na o čiach, musia by ť vyšetrené všetky zvieratá. 
Ak štrukturálna analýza alebo iné informácie indikujú toxicitu o čí, potom je 
potrebné zvýši ť frekvenciu o čných vyšetrení. 
37. V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-d ňové a/alebo 90- 
dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvola ť 
neurotoxické ú činky, sa môže nepovinne vykona ť určenie zmyslovej reak ­
tivity podnecovanej rôznymi spôsobmi (24) (napr. zvukovými, zrakovými 
a proprioceptívnymi podnetmi) (25) (26) (27), hodnotenie sily zovretia (28) a hodnotenie motorickej aktivity (29), a to pred za čiatkom štúdie a každé tri 
mesiace po za čatí štúdie po
čas až 12 mesiacov, ako aj pri ukon čení štúdie 
(ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). Ďalšie podrobnosti o postupoch, 
ktoré môžu nasledova ť, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však 
použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané. 
38. V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-d ňové a/alebo 90- 
dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvola ť 
imunotoxické ú činky, možno nepovinne na konci testu vykona ť ďalšie 
vyšetrenia tohto parametra.  
Telesná hmotnos ť, spotreba potravy/vody a ú činnosť krmiva  
39. Všetky zvieratá sa odvážia na za čiatku testu, najmenej raz týždenne po čas 
prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy 
a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týžde ň počas prvých 13 
týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa chemikália podáva vo 
vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týžde ň počas prvých 
13 týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania spotreby vody by sa 
mali zváži ť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení pitný režim.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematológia a klinická biochémia  
40. V štúdiách využívajúcich hlodavce sa hematologické vyšetrenia vykonajú 
najmenej pri desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine, a to po 3, 6 a 12 mesiacoch, a takisto na konci štúdie (ak štúdia trvá dlhšie ako 
12 mesiacov), pri čom sa vždy použijú tie isté zvieratá. V prípade myší môžu 
byť na uskuto čnenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení 
potrebné satelitné zvieratá (pozri odsek 18). V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu po čtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov 
štyrom zvieratám z každého pohlavia v každej skupine), a to 
v priebežných časoch na odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa 
uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je 
nutné vykona ť merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-d ňovej 
štúdii vykonanej pri porovnate ľných úrovniach dávok nebol na hematolo ­
gických parametroch pozorovaný žiadny ú činok. Vzorky krvi sa odoberajú 
v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo 
zadnej očnicovej dutiny. 
41. Je potrebné vyšetri ť tieto parametre (30): celkový a diferenciálny po čet 
leukocytov, po čet erytrocytov, po čet trombocytov, koncentrácia hemoglo ­
bínu, hematokrit, stredný objem erytrocytu (MCV), stredná koncentrácia 
hemoglobínu v erytrocyte (MCH), stredná farebná koncentrácia hemoglobínu (MCHC), protrombínový čas a aktivovaný parciálny trombo ­
plastínový čas. Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemi ­
kálie môžu mera ť ďalšie hematologické parametre, ako sú Heinzove telieska 
alebo iná atypická morfológia erytrocytov alebo methemoglobín. Vo všeo ­
becnosti treba zauja ť flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo 
očakávaného ú činku danej testovanej chemikálie. Ak má testovaná chemi ­
kália vplyv na hematopoetický systém, môže by ť indikovaný aj po čet reti­
kulocytov a cytológia kostnej drene, hoci tieto vyšetrenia sa bežne nemusia vykonáva ť. 
42. Klinická biochémia skúma hlavné toxické ú činky na tkanivá a najmä ú činky 
na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskuto čňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa 
odoberú aspo ň desiatim samcom a desiatim samiciam z každej skupiny 
v tých istých časových intervaloch, ako je špecifikované pre hematologické 
vyšetrenia, pri čom sa vždy použijú tie isté zvieratá. V prípade myší môžu 
byť na uskuto čnenie všetkých požadovaných vyšetrení klinickej biochémie 
potrebné satelitné zvieratá. V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu po čtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám 
z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na 
odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa uvádza pri štúdiách hlodav ­
cov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcov nie je nutné vykona ť merania po troch 
mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-d ňovej štúdii vykonanej pri porovna ­
teľných úrovniach dávok nebol na parametroch klinickej biochémie pozoro ­
vaný žiadny ú činok. Odporú ča sa, aby sa zvieratá (s výnimkou myší) noc 
pred odobratím vzoriek krvi nek ŕmili. Je potrebné vyšetri ť tieto parametre 
(30): glukóza, mo čovina (mo čovinový dusík), kreatinín, celkový obsah biel ­
kovín, albumín, vápnik, sodík, draslík, celkový cholesterol, najmenej dva 
vhodné testy na hepatocelulárne hodnotenie (alanín-aminotransferáza, aspar ­
tát-aminotransferáza, glutamát-dehydrogenáza, celkový obsah žl čových 
kyselín) (31) a najmenej dva vhodné testy na hepatobiliárne hodnotenie 
(alkalín-fosfatáza, gama-glutamyl-transferáza, 5-nukleotidáza, celkový biliru ­
bín, celkový obsah žl čových kyselín) (31). Pod ľa potreby sa v závislosti od 
toxicity testovanej chemikálie môžu mera ť ďalšie parametre klinickej 
chémie, ako je hladina triglyceridov nala čno, špecifické hormóny 
a cholínsteráza. Vo všeobecnosti treba zauja ť flexibilný postoj v závislosti 
od pozorovaného a/alebo o čakávaného ú činku danej testovanej chemikálie.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Rozbor mo ču sa vykonáva najmenej pri desiatich samcoch a desiatich sami ­
ciach v každej skupine zo vzoriek odobratých v rovnakých intervaloch ako 
v prípade hematológie a klinickej chémie. Nie je nutné vykona ť merania po 
troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-d ňovej štúdii vykonanej pri 
porovnate ľných úrovniach dávok nebol v rozbore mo ču pozorovaný žiadny 
účinok. Do odborného odporú čania pre štúdie klinickej patológie bol 
zahrnutý tento zoznam parametrov (30): vzh ľad, objem, osmolalita alebo 
špecifická váha, pH, celkový obsah bielkovín a glukóza. Medzi ostatné parametre patria ketón, urobilinogén, bilirubín a okultné krvácanie. Ďalšie 
parametre sa môžu použi ť, ak je potrebné rozšíri ť vyšetrovanie pozorova ­
ných účinkov. 
44. Vo všeobecnosti je potrebné ur čiť základné hematologické ukazovatele 
a ukazovatele klinickej biochémie pred za čatím testovania v štúdiách 
psov, ale nemusia sa ur čiť v štúdiách hlodavcov (30). Ak však historické 
základné údaje (pozri odsek 50) nie sú vhodné, treba uvažova ť o získaní 
týchto údajov.
 
Patológia  
Makroskopická pitva  
45. Všetky zvieratá v štúdii sa zvy čajne podrobujú kompletnej podrobnej 
makroskopickej pitve, ktorá zah ŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu 
tela, všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich 
obsahu. Môžu sa však takisto zabezpe čiť (v prípade priebežného utrácania 
alebo satelitných skupín), aby sa merania obmedzovali na špecifické 
kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita (pozri 
odsek 19). Tieto zvieratá sa nemusia podrobi ť pitve ani ďalším postupom 
opísaným v nasledujúcich odsekoch. Pri sentinelových zvieratách môže by ť 
v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne 
vedúci štúdie. 
46. Orgánové hmotnosti by sa mali zisti ť pri všetkých zvieratách, s výnimkou 
tých, ktoré sú vylú čené podľa ďalšej časti odseku 45. Nadobli čky, mozog, 
nadsemenníky, srdce, obli čky, pečeň, vaječníky, slezina, semenníky, štítna 
žľaza (vážená po fixácii, s prištítnymi telieskami) a maternica zo všetkých 
zvierat (okrem tých, pri ktorých sa zistilo chradnutie alebo ktoré sa prie ­
bežne utratili) by sa mali upravi ť na priľnavej tkanine a je potrebné čo 
najrýchlejšie po disekcii zisti ť ich mokrú hmotnos ť, aby sa zabránilo 
vyschnutiu. V štúdii myší nie je povinné váži ť nadobličky. 
47. Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom médiu na 
obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (32) (vyšet ­
renia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné): 
Všetky makroskopické 
poškodenia srdce pankreas žalúdok (predný žalúdok, 
žľaznatý žalúdok) 
nadoblička ileum prištítne teliesko [zuby] 
aorta la čník periférny nerv semenníky 
mozog (vrátane častí pred­
ného mozgu, mozo čka 
a predĺženej miechy/mosta) oblička hypofýza týmus 
slepé črevo slzná ž ľaza (extraorbi ­
tálna) prostata štítna ž ľaza 
krčok maternice pe čeň rektum [jazyk]  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
koagulačná žľaza p ľúca slinná ž ľaza priedušnica 
hrubé črevo lymfatické uzliny 
(povrchové aj hlboké) semenný mechúrik mo čový mechúr 
dvanástnik prsná ž ľaza (povinné pri 
samiciach, a ak je 
zrejmé, že možno urobi ť 
disekciu, aj pri samcoch) kostrové svaly maternica (vrátane kr čka 
maternice) 
nadsemenníky [horný dýchací trakt 
vrátane nosa, nosových 
mušlí a prínosových dutín] koža [mo čovod] 
oko (vrátane sietnice) pažerák miecha (na troch úrov ­
niach: kr čnej, hrudnej 
a lumbálnej) [močová rúra] 
[stehnová kos ť s kĺbom] [ čuchový bulbus] slezina vagína 
žlčník (v prípade iných 
druhov zvierat ako potkany) vaječníky [hrudná kos ť] prierez kostnej drene a/alebo 
čerstvý aspirát kostnej drene 
Harderova ž ľaza 
V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky a nadobli čky, sa 
zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynú ť 
potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachova ť všetky 
orgány, ktoré vzh ľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno 
považova ť za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva 
dermálne, je zoznam orgánov rovnaký ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože z miesta 
aplikácie chemikálie. V inhala čných štúdiách sa zoznam zachovaných 
a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporú čaní 
kapitoly B.8 tejto prílohy (8) a kapitoly B.29 tejto prílohy (9). Pokia ľ ide 
o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho 
traktu), je potrebné vyšetri ť
 tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.  
Histopatológia  
48. K dispozícii sú usmernenia o najlepších postupoch na vykonávanie štúdií 
toxikologickej patológie (32). Histopatologickým vyšetreniam sa podrobia 
minimálne: 
— všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín, 
— všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu 
štúdie, 
— všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality, — cieľové tkanivá alebo tkanivá, ktoré v skupinách s vysokou dávkou 
vykazujú zmeny spôsobené aplikáciou chemikálie, zo všetkých zvierat zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, 
— v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky alebo nadobli čky, 
sa vyšetria obidva orgány.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
49. Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvie ­
ratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnú ť v tabuľkovej forme, pri čom 
ukazujú pre každú testovanú skupinu po čet zvierat na za čiatku testu, po čet 
zvierat uhynutých po čas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas 
uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, po čet zvierat, pri 
ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nástupu, času a prudkosti toxických ú činkov, po čet zvierat vykazu ­
júcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri 
ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabu ľkách musia 
okrem stup ňa poškodení udáva ť priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade 
priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické ú činky 
alebo poškodenia. 
50. Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu by ť užitočné historické kontrolné 
údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. 
V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo pred ­
ložiť to isté laboratórium a mali by sa vz ťahovať na zvieratá rovnakého 
veku a z toho istého kme ňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré 
danej štúdii predchádzali. 
51. Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodnou a všeobecne 
uplatniteľnou štatistickou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú 
analyzované, sa vyberú po čas plánovania štúdie (odsek 8). Výber musí 
v prípade potreby po čítať s úpravami vzh ľadom na prežitie.
 
Správa o teste  
52. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje, 
— zdroj chemikálie, 
— číslo šarže, 
— certifikát chemickej analýzy.  
Nosič (v prípade potreby):  
— odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako voda).  
Testovacie zvieratá:  
— použitý druh/kme ň a odôvodnenie výberu, 
— počet, vek a pohlavie zvierat na za čiatku testu,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu.  
Podmienky testovania:  
— odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky, 
— ak je to použite ľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov, 
— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, 
— analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite 
prípravku, 
— spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie, 
— v prípade inhala čných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo 
expozíciu celého tela, 
— skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), faktor konverzie 
z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo ppm), ak je to použite ľné, 
— podrobné informácie o kvalite potravy a vody.  
Výsledky (predloží sa tabu ľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých 
zvieratách):  
— údaje o prežití, 
— telesná hmotnos ť a zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba potravy, výpo čty účinnosti krmiva, pokia ľ sa vykonali, 
a spotreba vody, ak je to použite ľné, 
— údaje o toxikologickej reakcii pod ľa pohlavia a úrovne dávky vrátane 
príznakov toxicity, 
— povaha, rozsah (a ak sa hodnotí, závažnos ť) a trvanie klinických pozo ­
rovaní (či už prechodných alebo stálych), 
— oftalmologické vyšetrenia, 
— hematologické testy, 
— testy klinickej biochémie, — testy rozboru mo ču, 
— výsledky všetkých vyšetrení neurotoxicity alebo imunotoxicity, 
— konečná telesná hmotnos ť, 
— orgánové hmotnosti (a ich pomery, ak je to použite ľné), 
— pitevné nálezy, 
— podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich 
s aplikáciou chemikálie, 
— absorp čné údaje, ak sú dostupné.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby 
Rozbor výsledkov zah ŕňajúci:  
— vzťah medzi dávkou a reakciou, 
— zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia, 
— rozbor všetkých prístupov modelovania, 
— stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL, 
— historické kontrolné údaje, 
— význam pre človeka.  
Závery  
LITERATÚRA  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paríž. 
2. Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163 – 208. 
3. Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W. a kol. (2002). Hazard identifi ­
cation by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145 – 191. 
4. Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445. 
5. Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 
90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov. 
6. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, 
dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykoná ­
vanie testov na adrese www.oecd.org/env/testguidelines. 
7. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, 
Paríž. 
8. Kapitola B.8 tejto prílohy, Subakútna inhala čná toxicita: 28-d ňová štúdia. 
9. Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhala čná toxicita: 90-d ňová štúdia 
10. Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–d ňovej opakovanej dávke (der ­
málna). 
11. Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R. a kol. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1 – 7. 
12. Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxi ­
cology 36: 9 – 35. 
13. Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A. a kol. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37 – 68.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
14. Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M. a kol. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69 – 98. 
15. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž. 
16. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž. 
17. Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the 
Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in 
Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. 
18. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
19. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 
o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely (Ú. v. EÚ L 276, 
20.10.2010, s. 33). 
20. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
21. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. 
22. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versu ­
chstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
23. Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15 – 23. 
24. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60. 
25. Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999 – 1003. 
26. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691 – 704. 
27. Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267 – 283. 
28. Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233 – 236. 
29. Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. 
Neurotoxicol. Teratol. 13: 599 – 609.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
30. Weingand, K., Brown, G., Hall R. a kol. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. 
Toxicol. 29: 198 – 201. 
31. EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
32. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guide ­
line: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  ŠTÚDIA PRENATÁLNEJ VÝVOJOVEJ TOXICITY  
1. METÓDA  
Táto metóda zodpovedá OECD TG 414 (2001).  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda na testovanie vývojovej toxicity je ur čená na poskyt ­
nutie všeobecnej informácie týkajúcej sa ú činkov prenatálnej expo ­
zície na gravidné pokusné zviera a na vývoj organizmu v utere; sem môže patri ť hodnotenie ú činkov na matku, ako aj uhynutie, štruktu ­
rálne abnormality alebo poruchy rastu plodu. Funk čné poruchy, aj 
keď sú dôležitou časťou vývoja, nie sú integrálnou časťou tejto 
testovacej metódy. Môžu by ť testované na tieto ú činky v oddelenej 
štúdii alebo ako doplnok k tejto štúdii, s použitím testovacej metódy 
pre vývojovú neurotoxicitu. Informácie o testovaní funk čných porúch 
a iných postnatálnych ú činkov sa dajú v prípade potreby získa ť 
z testovacej metódy pre dvojgenera čnú štúdiu reproduk čnej toxicity 
a štúdiu vývojovej neurotoxicity. 
Táto testovacia metóda môže vyžadova ť, aby sa jednotlivé testy 
osobitne upravili na základe konkrétnych poznatkov napr. o fyzikálno-chemických alebo toxikologických vlastnostiach testo ­
vanej látky. Takáto úprava je prípustná, ak na základe presved čivého 
vedeckého dôkazu vyplýva, že úprava vedie k spo ľahlivejšiemu 
testu. V takomto prípade sa tento vedecký dôkaz starostlivo zdoku ­
mentuje v správe zo štúdie.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Vývojová toxikológia:  štúdia nepriaznivých ú činkov na vyvíjajúci 
sa organizmus, ktoré môže zaprí činiť expozícia pred po čatím, počas 
prenatálneho vývoja alebo postnatálne do obdobia sexuálnej zrelosti. 
K hlavným prejavom vývojovej toxicity patrí 1. smr ť organizmu, 2. 
štrukturálna abnormalita, 3. poruchy rastu a 4. funk čné poruchy. 
Vývojová toxikológia sa predtým ozna čovala ako teratológia.  
Nepriaznivý ú činok:  každá zmena vo či normálnemu stavu 
v súvislosti s ošetrením, ktorá znižuje schopnos ť organizmu preži ť, 
reprodukova ť sa alebo prispôsobova ť sa prostrediu. V širšom zmysle 
vývojová toxikológia zahrnuje každý ú činok, ktorý vplýva na 
normálny vývoj zárodku ako pred narodením, tak aj a po narodení.  
Porucha rastu:  zmena hmotnosti alebo ve ľkosti orgánov, alebo tela 
potomstva.  
Zmeny (anomálie):  štrukturálne zmeny vo vývoji, ktoré zahrnujú 
malformácie a aj odchýlky (28).  
Malformácia/ve ľká abnormalita:  Štrukturálna zmena, ktorá sa 
pokladá za škodlivú pre zviera (môže by ť tiež smrte ľná) a je 
zvyčajne zriedkavá.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Odchýlka/malá abnormalita:  štrukturálna zmena, o ktorej sa 
usudzuje, že má malý alebo žiadny škodlivý ú činok na zviera; 
môže by ť prechodná a môže sa vyskytova ť pomerne často 
v kontrolnej populácii.  
Zárodok:  suma derivátov oplodneného vají čka v každom štádiu 
vývoja od oplodnenia do narodenia vrátane extraembryonálnych membrán, ako aj embrya alebo plodu.  
Implantácia (nidácia):  uchytenie blastocysty v epitelovej výstelke 
uteru, vrátane jej penetrácie cez epitel utera a jej zahniezdenie do endometria.  
Embryo:  skoré štádium alebo vývojové štádium každého organizmu, 
najmä vyvíjajúceho sa produktu oplodnenia vají čka po vzniku 
pozdĺžnej osi a pokia ľ nie sú prítomné všetky hlavné štruktúry.  
Embryotoxicita:  škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast 
a/alebo životaschopnos ť embrya.  
Plod:  nenarodené potomstvo v postembryonálnom období.  
Fetotoxicita:  škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast a/alebo 
životaschopnos ť plodu.  
Potrat:  predčasné vypudenie produktov oplodnenia z uteru: embrya 
alebo neživotaschopného plodu.  
Resorpcia:  zárodok, ktorý po implantovaní do uteru uhynul 
a vstrebáva sa alebo sa vstrebal.  
Skorá resorpcia:  dôkaz implantácie bez toho, aby sa dalo embryo/ 
plod rozozna ť. 
Neskorá resorpcia:  mŕtve embryo alebo plod s vonkajšími degene ­
ratívnymi zmenami.  
NOAEL:  skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého 
účinku, je to najvyššia dávka alebo úrove ň expozície, pri ktorej sa 
nepozorujú žiadne nepriaznivé zistenia v súvislosti s ošetrením.
 
1.3. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Žiadna.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka sa zvy čajne podáva gravidným zvieratám v dobe 
aspoň od implantácie do jedného d ňa pred naplánovaným d ňom 
usmrtenia, ktorý má by ť čo možno najbližšie k zvy čajnému d ňu 
pôrodu bez ohrozenia straty údajov následkom pred časnému pôrodu. 
Testovacia metóda nie je ur čená iba na skúmanie obdobia organo ­
genézy (t. j. 5 – 15 dní u hlodavcov (myši, potkany, škre čky) 
a 6 – 18 dní u králikov), ale aj ú činkov od obdobia preimplantácie, 
v prípade potreby, po čas celého obdobia gravidity do d ňa, keď sa 
uskutoční cisársky rez. Tesne pred uskuto čnením cisárskeho rezu sa 
samice usmrtia, obsah uteru sa vyšetrí a posúdia sa vonkajšie vidi ­
teľné anomálie na plodoch a zmeny na mäkkých tkanivách a kostre.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Výber druhu zvierat  
Odporúča sa, aby sa testovanie uskuto čnilo na najvhodnejších 
druhoch a aby sa použili laboratórne druhy a kmene, ktoré sa 
zvyčajne používajú pri testovaní prenatálnej vývojovej toxicity. 
Z hlodavcov sa uprednost ňuje potkan a z nehlodavcov králik. 
Použitie iných druhov je potrebné zdôvodni ť. 
1.5.2.  Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22  o C 
(± 3  o C) pre hlodavce a 18  o C (± 3  o C) pre králiky. Aj ke ď relatívna 
vlhkosť by mala by ť aspoň 30 % a pokia ľ možno nemala by prevy ­ 
šovať 70 %, okrem obdobia po čas čistenia miestnosti by mala dosa ­
hovať 50 – 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé, v rytme 12 hodín 
svetlo, 12 hodín tma. Na k ŕmenie sa môže používa ť bežné labora ­
tórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. 
Párenie sa uskuto ční v klietkach vhodných na tento ú čel. Aj keď sa 
uprednost ňuje jednotlivé umiestnenie spárených zvierat, spolo čné 
umiestnenie v malých po čtoch je tiež prípustné.  
1.5.3.  Príprava zvierat  
Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne 
podmienky aspo ň 5 dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným expe ­
rimentom. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, 
kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a/alebo veku. Zvieratá vo všet ­
kých pokusných skupinách majú ma ť, pokiaľ je to možné, rovnakú 
hmotnosť a vek. Na každú ve ľkosť dávky sa použijú mladé dospelé, 
panenské samice. Samice sa spária so samcami rovnakého druhu 
a kmeňa a je potrebné zabráni ť páreniu medzi súrodencami. Pre 
hlodavce je de ň 0 gravidity d ňom, keď sa zistila vaginálna zátka 
a/alebo sperma; pre králiky de ň 0 je zvyčajne deň, keď sa uskuto čnil 
koitus alebo umelé oplodnenie, ak sa použila táto technika. Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolnej a pokusnej skupiny. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy 
kvôli umiestneniu klietok. Každému zviera ťu sa priradí vlastné iden ­
tifikačné číslo. Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolnej 
a ošetrenej skupiny a ak sa samice párili v skupinách, zvieratá v každej skupine sa rovnomerne rozdelia do uvedených skupín. 
Podobne sa rovnomerne rozdelia do skupín samice oplodnené 
rovnakým samcom.
 
1.6. POSTUP  
1.6.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Každá pokusná a kontrolná skupina by mala obsahova ť dostatočný 
počet samíc tak, aby bolo k dispozícii približne 20 samíc 
s implanta čnými miestami na autopsiu. Skupiny, ktoré majú menej 
ako 16 zvierat s implanta čnými miestami, sú nevhodné. Úmrtnos ť 
materských zvierat nevedie nevyhnutne k tomu, že štúdia je neplatná, 
ak nedosahuje viac ako 10 %.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Príprava dávok  
Ak sa na u ľahčenie dávkovania používa nosi č alebo iná prídavná 
látka, je potrebné venova ť pozornos ť týmto charakteristikám: ú činky 
na absorpciu, distribúciu, metabolizmus a retenciu alebo vylú čenie 
testovanej látky; metódy na chemické vlastnosti testovanej látky, 
ktorý môže zmeni ť jej toxické vlastnosti; a vplyv najvhodnejších 
spotrebu potravy a vody alebo nutri čný stav zvierat. Nosi č by 
nemal spôsobova ť vývojovú toxicitu, ani by nemal ma ť vplyv na 
reprodukciu.  
1.6.3.  Dávkovanie  
Testovaná dávka sa zvy čajne podáva každý de ň od implantácie 
(napr. 5 dní po párení) do d ňa naplánovaného uskuto čnenia cisár ­
skeho rezu. Ak predbežné štúdie, ktoré sú prípadne dispozícii, neuvádzajú ve ľkú pravdepodobnos ť preimplanta čných strát, ošetrenie 
sa môže pred ĺžiť na celé obdobie gravidity, od párenia do d ňa naplá­
novaného usmrtenia. Je dobre známe, že nevhodné zaobchádzanie alebo stres po čas gravidity môžu ma ť za následok prenatálne straty. 
Na ochranu proti prenatálnym stratám zaprí čineným faktormi, ktoré 
nesúvisia s ošetrením, je potrebné zabráni ť zbytočnej manipulácii 
s gravidnými zvieratami, ako aj stresu spôsobenému vonkajšími faktormi, ako napríklad hluk. 
Použijú sa aspo ň tri veľkosti dávok a uskuto ční sa paralelná 
kontrola. Zdravé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolnej a pokusnej skupiny. Dávky sa rozložia tak, aby sa toxické ú činky 
zvyšovali. Pokia ľ neexistujú žiadne obmedzenia na základe 
fyzikálneho/chemického charakteru a biologických vlastností testo ­
vanej látky, zvolí sa najvyššia dávka s cie ľom vyvola ť nejakú vývo ­
jovú toxicitu a/alebo toxicitu u matiek (klinické príznaky alebo 
úbytok telesnej hmotnosti), ale nie uhynutie alebo silné utrpenie. Aspoň jedna zo prechodných dávok má vies ť k minimálnym vidi ­
teľným toxickým ú činkom. Najnižšia dávka by nemala spôsobi ť 
žiadny prejav toxicity u materských zvierat, ani vývojovej toxicity. 
Klesajúca postupnos ť dávok sa zvolí tak, aby sa preukázala každá 
reakcia v závislosti od dávkovania a hladina bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL). Intervaly dávkovania s faktorom 
sperma; až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávko ­
vania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako 
používanie ve ľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) 
medzi dávkami. Aj ke ď stanovenie NOAEL u matiek je cie
ľom, 
štúdie, pri ktorých sa nestanovuje táto hladina, môžu by ť tiež 
prípustné (1). 
Veľkosti dávok sa zvolia tak, aby zoh ľadnili všetky existujúce údaje 
o toxicite, párili aj ďalšie informácie o metabolizme a toxikokinetike 
testovanej látky alebo príbuzných materiálov. Tieto informácie napo ­
môžu aj pri preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania. 
Použije sa paralelná kontrolná skupina. Touto skupinou bude zdanlivo 
ošetrovaná kontrolná skupina alebo kontrolná skupina ošetrovaná nosi ­ 
čom, ak sa používa nosi č na podávanie testovanej látky. Všetkým 
skupinám sa podáva rovnaký objem bu ď testovanej látky alebo nosi ča. 
So zvieratami v kontrolnej(-ých) skupine(-ách) sa zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v pokusných skupinách. 
Kontrolné skupiny, ktorým sa podáva nosi č, viac nosi č v najvyššej 
používanej dávke (ako v skupine s najnižším dávkovaním).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4  Limitný test  
Ak sa na základe testu s orálne podanou jednou dávkou minimálne 
1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň s použitím postupov uvedených 
pre túto štúdiu nezistí žiadna pozorovate ľná toxicita bu ď 
u gravidných zvierat, alebo ich potomkoch a ak sa ú činok neočakáva 
na základe existujúcich údajov (napr. zo štrukturálne a/alebo meta ­
bolický príbuzných látok), potom sa môže upusti ť od úplnej štúdie 
s použitím troch dávok. Z predpokladanej expozície ľudí môže 
vyplývať potreba, aby sa v limitnom teste použili vyššie orálne 
dávky. Pri iných typoch podávania, ako napr. vdychovaním alebo aplikáciou cez kožu, fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky 
často môžu poukáza ť a limitova ť maximálnu prípustnú úrove ň expo­
zície (napríklad aplikácia cez kožu by nemala spôsobi ť silnú lokálnu 
toxicitu).
 
1.6.5.  Podávanie dávok  
Testovaná látka alebo nosi č sa zvyčajne podáva orálne pomocou 
intubácie. Ak sa použije iná cesta podávania, je potrebné, aby expe ­
rimentátor uviedol zdôvodnenie a argumenty pre túto vo ľbu a môžu 
byť potrebné príslušné úpravy (2) (3) (4). Testovaná látka sa podáva 
každý deň približne v rovnakom čase. 
Dávka pre jednotlivé zvieratá sa zvy čajne zakladá na naposledy 
zistenej telesnej hmotnosti. Je však potrebné venova ť pozornos ť pri 
nastavovaní dávky po čas posledného trimestra gravidity. Je potrebné 
použiť existujúce údaje na výber dávky, aby sa zabránilo nadmernej 
toxicite matky. Ak sa však zaznamená nadmerná toxicita 
u ošetrených matiek, tieto zvieratá sa humánnym spôsobom usmrtia. 
Ak niektoré gravidné zvieratá vykazujú príznaky nadmernej toxicity, je potrebné zváži ť usmrtenie celej skupiny s touto dávkou. Ak sa 
látka podáva cez sondu, pokia ľ možno sa podá zvieratám ako jedno ­
razová dávka s použitím žalúdkovej sondy alebo vhodnej intuba čnej 
kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. Objem nemá by ť 
vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, 
keď sa môže použi ť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Ak sa použije 
ako nosič kukuričný olej, objem nemá by ť vyšší ako 0,4 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú 
tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpe čil stály objem 
vo všetkých dávkach.
 
1.6.6.  Pozorovanie matiek  
Klinické vyšetrenie sa uskuto ční a zaznamená aspo ň raz za de ň, pokiaľ 
možno v rovnakom(-ých) čase(-och) každý de ň pri zohľadnení obdo ­
bia, keď sa predpokladajú maximálne ú činky po podaní dávky. Stav 
zvierat sa zaznamená, vrátane mortality, moribundného stavu, trvalých 
zmien v správaní a všetkých príznakov zjavnej toxicity.  
1.6.7.  Telesná hmotnos ť a spotreba potravy  
Zvieratá sa odvážia v 0. de ň gravidity alebo najneskôr na 3. de ň 
gravidity, ak sú dodané zvieratá od externého chovate ľa spárené na 
základe časových údajov, v prvý de ň dávkovania, aspo ň každé 3 dni 
počas obdobia dávkovania a v de ň naplánovaného usmrtenia.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Spotreba potravy sa zaznamená v trojd ňových intervaloch a má sa 
zhodovať s dňami, keď sa zisťuje telesná hmotnos ť. 
1.6.8.  Vyšetrenie post mortem  
Samice sa usmrtia jeden de ň pred očakávaným d ňom vrhu. Samice, 
ktoré vykazujú príznaky potratu alebo pred časného pôrodu pred 
naplánovaným usmrtením, sa usmrtia a podrobia dôkladnému makro ­
skopickému vyšetreniu. 
V čase usmrtenia alebo uhynutia po čas štúdie sa matka vyšetrí 
makroskopicky na všetky štrukturálne abnormality alebo patologické 
zmeny. Posúdenie matiek po čas cisárskeho rezu a následná analýza 
plodov sa uskuto ční podľa možnosti bez vedomosti o tom, či ide 
o ošetrovanú skupina, aby sa minimalizovalo ovplyvnenie.  
1.6.9.  Vyšetrenie obsahu uteru  
Bezprostredne po usmrtení alebo čo najskôr po uhynutí sa odoberie 
uterus a zistí sa stav gravidity u zvierat. Ak uterus nevykazuje graviditu, je potrebné ho ďalej vyšetri ť (napr. farbením sírnikom 
amónnym pre hlodavce a Salewského farbením alebo vhodnou alter ­
natívnou metódou pre králiky) na potvrdenie negravidného stavu (5). 
Gravidný uterus, vrátane cervixu, sa odváži. Nie je potrebné zis ťovať 
hmotnosť gravidného uteru u zvierat, ktoré uhynuli po čas štúdie. 
Pri gravidných zvieratách sa ur čí počet žltých teliesok (corpora 
lutea). 
Obsah uteru sa vyšetrí na po čet mŕtvych embryí alebo plodov alebo 
počet životaschopných plodov. Stupe ň resorpcie sa opíše, aby sa 
mohol odhadnú ť relatívny čas uhynutia zárodku (pozri oddiel 1.2).
 
1.6.10.  Vyšetrenie plodov  
Určí sa pohlavie a telesná hmotnos ť každého plodu. 
Každý plod sa vyšetrí na vonkajšie zmeny (6). 
Plody sa vyšetria na zmeny na skelete a mäkkých tkanivách (napr. 
odchýlky a malformácie alebo anomálie) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 
(13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Katego ­
rizácia fetálnych zmien sa odporú ča, ale nevyžaduje. Ke ď sa usku­
toční kategorizácia, jasne sa stanovia kritériá definujúce každú kate ­
góriu. Je potrebné venova ť osobitnú pozornos ť reproduk čnému 
traktu, ktorý by sa mal vyšetri ť na príznaky zmien vo vývoji. 
V prípade hlodavcov sa pripraví približne polovica vrhu a vyšetrí na 
zmeny na skelete. Zvyšok sa pripraví a vyšetrí na zmeny mäkkých 
tkanív s použitím uznaných alebo vhodných metód sériových rezov 
alebo dôkladných pitevných techník.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
V prípade nehlodavcov, napr. králiky, sa všetky plody vyšetria na 
zmeny mäkkých tkanív a aj na zmeny na skelete. Telá týchto plodov 
sa podrobia dôkladnej autopsii na vyšetrenie zmien mäkkých tkanív, ktoré môžu zahrnova ť postupy pre ďalšie posúdenie internej štruk ­
túry srdca (25). Hlavy jednej polovice plodov vyšetrených týmto 
spôsobom sa odstránia a spracujú, aby sa posúdili zmeny mäkkých 
tkanív (vrátane o čí, mozgu, nosového priechodu a jazyka) s použitím 
štandardných metód sériových rezov (26) alebo rovnako citlivou metódou. Telá týchto plodov a zvyšné neporušené plody sa spracujú 
a vyšetria na zmeny na skelete s použitím rovnakých metód, ako boli 
opísané pre hlodavce.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje sa zaprotokolujú jednotlivo pre matky, ako aj pre ich potom ­
stvo a zosumarizujú vo forme tabuliek a uvedie sa pre každú pokusnú skupinu a každú generáciu po čet zvierat na za čiatku testu, 
počet zvierat, ktoré uhynuli po čas testu, alebo sa usmrtili 
z humánnych dôvodov, čas každého úmrtia alebo humánneho 
usmrtenia, po čet gravidných samíc, po čet zvierat vykazujúcich 
príznaky toxicity, opis zistených príznakov toxicity, vrátane času 
nástupu, trvania a závažnosti všetkých toxických ú činkov, typy 
vyšetrení embrya/plodu a všetky údaje týkajúce sa vrhu. 
Číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou štatistickou metódou, 
pričom sa na analýzu údajov ako jednotka použije vrh. Použije sa 
všeobecne uznávaná štatistická metóda; štatistické metódy sa zvolia 
ako súčasť plánu štúdie a zdôvodnia sa. Údaje týkajúce sa zvierat, 
ktoré neprežili do naplánovaného usmrtenia, sa tiež zaznamenajú. Tieto údaje sa môžu zahrnú ť do tej skupiny priemerov zvierat, ktorej 
sa týkajú. Závažnos ť údajov, získaných od takýchto zvierat, a teda 
zahrnutie alebo vylú čenie z priemeru(-ov) ktorejko ľvek skupiny sa 
zdôvodní a individuálne posúdi.
 
2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Zistenia štúdie prenatálnej vývojovej toxicity sa vyhodnotia na 
základe zistených ú činkov. Hodnotenie bude obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— výsledky testu na matkách a embryách/plodoch, vrátane posú ­
denia vz ťahu alebo neprítomnosti vz ťahu medzi expozíciou 
zvierat testovanou látkou a výskytom a závažnos ťou všetkých 
zistení, 
— kritériá použité na kategorizáciu vonkajších zmien na plode, 
mäkkých tkanivách a skelete, ak sa uskuto čnila kategorizácia,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— v prípade potreby historické kontrolné údaje na podporu inter ­
pretácie výsledkov štúdie, 
— počty použité pri výpo čte všetkých percent alebo indexov, 
— vhodnú štatistickú analýzu zistení zo štúdie, ktoré by v prípade 
potreby mohli zahrnova ť dostatočné informácie o analytickej 
metóde tak, aby nezávislý kontrolór/štatistik mohol prehodnoti ť 
a zrekonštruova ť analýzu. 
V každej štúdii, pri ktorej sa nepreukázali žiadne toxické ú činky, je 
potrebné zváži ť ďalšie vyšetrenia na stanovenie absorpcie 
a biologickej dostupnosti testovanej látky.  
2.3. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Štúdia prenatálnej vývojovej toxicity poskytne informácie o ú činkoch 
opakovanej expozície látkou po čas gravidity na matkách a na vnútro ­
maternicový vývoj ich potomstva. Výsledky štúdie sa interpretujú v spojitosti so zisteniami zo subchronických, reproduk čných, toxiko ­
kinetických a iných štúdií. Aj ke ď sa dôraz kladie na všeobecnú 
toxicitu, pokia ľ ide o toxicitu u matky a aj vývojovú toxicitu, 
výsledky štúdie umožnia do ur čitej miery rozlíšenie medzi ú činkami 
na vývoj, ktoré sa vyskytnú pri neprítomnosti všeobecnej toxicity, a tých účinkov, ktoré sú vyvolané dávkami, ktoré sú toxické aj pre 
materské zviera (27).
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto konkrétne informácie: 
Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlast ­
nosti, 
— identifikácia vrátane čísla CAS, ak je známe/stanovené, 
— čistota. 
Nosič (v prípade potreby): 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda. 
Pokusné zvieratá: 
— použitý druh a kme ň, 
— počet a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu. 
Podmienky testu: — zdôvodnenie výberu ve ľkosti dávok, 
— údaje o zložení testovanej látky/príprave krmiva, dosiahnutej 
koncentrácii, stabilite a homogenite prípravku,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— údaje o podávaní testovanej látky, 
— prepo čet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode 
(ppm) na skuto čnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), ak je 
potrebné, 
— podmienky prostredia, 
— údaje o kvalite krmiva a vody. Výsledky: Údaje toxickej reakcie matky pod ľa dávky okrem iného: 
— počet zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat, ktoré prežili, po čet 
gravidných zvierat a po čet zvierat, ktoré potratili, po čet zvierat, 
ktoré pred časne porodili, 
— deň uhynutia po čas štúdie, alebo či zvieratá prežili do usmrtenia, 
— údaje o zvieratách, ktoré neprežili do naplánovaného usmrtenia, 
sa zaprotokolujú, ale sa nezahrnú do štatistických porovnaní medzi skupinami, 
— deň zistenia každého nezvy čajného klinického príznaku a jeho 
ďalší priebeh, 
— telesná hmotnos ť, zmena telesnej hmotnosti a hmotnos ť gravid­
ného uteru, nepovinne vrátane zmeny telesnej hmotnosti upra ­
venej o hmotnos ť gravidného uteru, 
— spotreba potravy, a ak sa meria, spotreba vody, 
— pitevné nálezy, vrátane hmotnosti uteru, — zaznamenajú sa hodnoty NOAEL pre ú činky na matku a vývoj. 
Vývojové údaje o vrhu s implantátmi, vrátane: — počtu žltých teliesok (corpora lutea), 
— počtu implantácií, po čtu a percenta živých a m ŕtvych plodov 
a resorpcií, 
— počtu a percenta predimplata čných a poimplanta čných strát. 
Vývojové údaje o vrhu so živými plodmi, vrátane: 
— počtu a percenta živého potomstva, 
— pomeru pohlaví, — telesnej hmotnosti plodu, pokia ľ možno pod ľa pohlavia a pre obe 
pohlavia spolu, 
— vonkajšie malformácie, malformácie mäkkých tkanív a skeletu 
a iné závažné zmeny, 
— kritériá pre kategorizáciu v prípade potreby,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— celkový po čet a percento plodov a vrhov s každou vonkajšou 
zmenou, zmenou mäkkých tkanív alebo skeletu, ako aj typy 
výskytov jednotlivých anomálií a iných závažných zmien. 
Diskusia k výsledkom Závery
 
4. ODKAZY  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399 – 410. 
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386 – 398. 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1 – 8. 
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation 
Developmental Toxicity Study. 
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mente lle Pathologie 247367.  
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY. 
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171 – 173. 
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; 381 – 391. 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47; 229 – 242. 
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476. 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127; 291 – 306. 
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313 – 320. 
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398 – 408. 
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309 – 316. 
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169 – 181.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual,  pp. 163 – 173. 
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41; 411 – 445. 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61 – 63. 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) 
Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313 – 355. 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181 – 188. 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL. 
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251 – 277. 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY. 
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233 – 239. 
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; 37 – 38. 
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, pp. 126 – 144. 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798 – 63826. 
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55; 249 – 292.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  ŠTÚDIE KARCINOGENITY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 451 (2009). Pôvodné usmernenia TG 451 o štúdiách karcinogenity boli prijaté v roku 1981. Vypracovanie tejto revidovanej testo ­
vacej metódy B.32 sa považovalo za potrebné na zoh ľadnenie najnovšieho 
vývoja v oblasti starostlivosti o zvieratá a regula čných požiadaviek (2) (3) 
(4) (5) (6). Aktualizácia tejto testovacej metódy B.32 bola vykonaná súbežne s revíziou kapitoly B.30 tejto prílohy, Štúdie chronickej toxicity, 
a kapitoly B.33 tejto prílohy, Kombinované štúdie chronickej toxicity/kar ­
cinogenity, s cie ľom získa ť ďalšie informácie pomocou zvierat použitých 
v štúdii a poskytnú ť ďalšie podrobné údaje o výbere dávky. Táto testovacia 
metóda B.32 je vypracovaná na testovanie širokej škály chemikálií vrátane 
pesticídov a priemyselných chemikálií. Treba však poznamena ť, že 
v prípade liekov sa niektoré podrobnosti a požiadavky môžu líši ť [pozri 
usmernenia S1B Medzinárodnej konferencie o zosúladení (ICH) o testovaní karcinogenity liekov]. 
2. Väčšina štúdií karcinogenity sa vykonáva na hlodavcoch a táto testovacia 
metóda sa preto primárne vz ťahuje na štúdie vykonávané na týchto živo číš­
nych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadova ť v prípade nehlodavcov, 
takisto by sa s príslušnými úpravami mali uplatni ť princípy a postupy 
uvedené v tejto testovacej metóde spolu s princípmi a postupmi uvedenými v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-d ňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodav ­
coch v opakovaných dávkach (6). Ďalšie usmernenia sú k dispozícii 
v Usmerňovacom dokumente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií 
chronickej toxicity a karcinogenity (7). 
3. Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách karcinogenity sú orálne, 
dermálne a inhala čné podávanie. Výber spôsobu podávania závisí od fyzi ­
kálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie a naj častejšieho 
spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere spôsobu expozície 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). 
4. Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách 
karcinogenity používa naj častejšie. Hoci štúdie karcinogenity využívajúce 
dermálnu alebo inhala čnú expozíciu môžu by ť takisto potrebné na hodno ­
tenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu vyžadova ť v určitých 
regulačných režimoch, oba spôsoby expozície sú do zna
čnej miery tech ­
nicky zložité. Takéto štúdie budú musie ť byť pripravené v závislosti od 
jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu uvádza na posu ­
dzovanie a vyhodnocovanie karcinogenity pri orálnom podávaní, by mohla 
slúžiť ako základ protokolu pre inhala čné a/alebo dermálne štúdie vzh ľadom 
na odporú čania týkajúce sa období testovania, klinických a patologických 
parametrov at ď. K dispozícii sú usmernenia OECD o podávaní testovaných 
chemikálií dermálnym (7) a inhala čným spôsobom (7) (8). Pri príprave 
dlhodobejších štúdií zah ŕňajúcich inhala čnú expozíciu je nutné si preštu ­
dovať najmä kapitolu B.8 tejto prílohy (9) a kapitolu B.29 tejto 
prílohy (10) spolu s Usmer ňovacím dokumentom OECD o testovaní akútnej 
inhalačnej toxicity (8). Kapitolu B.9 tejto prílohy (11) je nutné konzultova ť 
v prípade testovania dermálnej expozície.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Štúdia karcinogenity poskytuje informácie o možnej nebezpe čnosti pre zdra ­
vie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu 
celej dĺžky života použitého živo číšneho druhu. Štúdia poskytne informácie 
o toxických ú činkoch testovanej chemikálie vrátane potenciálnej karcinoge ­
nity a môže indikova ť cieľové orgány a možnos ť akumulácie. Môže zabez ­
pečiť odhad hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku pre toxické 
účinky a v prípade negenotoxických karcinogénov pre reakcie na nádory, 
ktorý možno použi ť na stanovenie bezpe čnostných kritérií týkajúcich sa 
expozície človeka. Takisto sa v nej zdôraz ňuje nutnos ť dôkladných klinic ­
kých pozorovaní zvierat s cie ľom získať čo najväčšie množstvo informácií. 
6. Medzi ciele štúdie karcinogenity v rámci tejto testovacej metódy patrí: 
— identifikácia karcinogénnych vlastností testovanej chemikálie, ktoré vedú 
k zvýšenému výskytu nádorov, zvýšenému podielu zhubných nádorov 
alebo k skráteniu času do výskytu nádorov v porovnaní so súbežnými 
kontrolnými skupinami, 
— identifikácia cie ľových orgánov karcinogenity, 
— identifikácia času do výskytu nádorov, 
— charakterizácia vz ťahu medzi dávkou a reakciou v prípade nádorov, 
— identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL) 
alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD), 
— extrapolácia karcinogénnych ú činkov na úrovne expozície človeka pri 
nízkych dávkach, 
— poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu pôsobenia 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).  
ÚVODNÉ ÚVAHY 
7. Pri posudzovaní a vyhodnocovaní potenciálnej karcinogenity testovanej 
chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky 
dostupné informácie o testovanej chemikálii s cie ľom zamera ť prípravu 
štúdie na ú činnejšie testovanie karcinogénneho potenciálu a minimalizova ť 
využívanie zvierat. Informácie a úvahy o druhu pôsobenia podozrivého karcinogénu (2) (7) (12) (13) (14) (15) sú mimoriadne dôležité, lebo opti ­
málne plánovanie sa môže líši ť v závislosti od toho, či je testovaná chemi ­
kália známym alebo podozrivým genotoxickým karcinogénom. Ďalšie 
usmernenia k úvahám o druhu pôsobenia sú uvedené v usmer ňovacom 
dokumente č.116 (7). 
8. Informácie, ktoré pomôžu pri príprave štúdie, zah ŕňajú identitu, chemickú 
štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity  in vitro  alebo  in vivo  vrátane testov genotoxicity, 
predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné 
údaje (Q)SAR, údaje o mutagenite/genotoxicite a iné toxikologické údaje 
o štrukturálne príbuzných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
(kinetika pri jednej dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je 
k dispozícii) a údaje získané z iných štúdií opakovanej expozície. Hodno ­
tenie karcinogenity sa vykoná po získaní prvotných informácií o toxicite z 28-dňového a/alebo 90-d ňového testu toxicity v opakovaných dávkach. 
Krátkodobé testy nástupu a šírenia rakoviny by takisto mohli prinies ť 
užitočné informácie. Stratégiu fázového testovania pri testovaní karcinoge ­
nity treba zváži ť ako súčasť celkového hodnotenia potenciálnych nepriazni ­
vých zdravotných ú činkov danej testovanej chemikálie (16) (17) (18) (19). 
9. Štatistické metódy, ktoré sú vzh ľadom na prípravu pokusu a ciele na 
analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred za čatím štúdie. Je 
potrebné zváži ť, či by štatistiky nemali zah ŕňať úpravu vzh ľadom na prežitie 
zvierat, analýzu kumulatívnych nádorových rizík súvisiacich s d ĺžkou preži ­
tia, analýzu času do progresie nádoru a analýzu v prípade pred časného 
konca jednej alebo viacerých skupín. Usmernenia o vhodných štatistických 
analýzach a k ľúčové odkazy na medzinárodne uznané štatistické metódy sú 
uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v Usmer ňovacom 
dokumente č. 35 o analýze a hodnotení štúdií chronickej toxicity 
a karcinogenity (20). 
10. Pri vykonávaní štúdie karcinogenity je vždy nutné sa riadi ť hlavnými zása ­
dami a úvahami uvedenými v Usmer ňovacom dokumente OECD č. 19 
o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych 
parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpe čnosti 
(21), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že „ak v štúdiách s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progre ­
sívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií 
rozhodnú ť, či sa má zviera humánne usmrti ť alebo nie. Pri rozhodovaní 
treba zváži ť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním 
zviera
ťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. 
Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zviera ťa bude pokra čovať, frek­
vencia pozorovaní by sa mala pod ľa potreby zvýši ť. Takisto je možné, 
bez toho, aby to malo negatívny vplyv na ú čel testu, do časne pozastavi ť 
podávanie dávok, ak sa tým zviera ťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo 
znížiť testovaciu dávku.“ 
11. Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej 
toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), 
ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied 
(International Life Sciences Institute) (22) (23). Základná stratégia výberu 
dávky závisí od primárneho cie ľa alebo cie ľov štúdie (odsek 6). Pri výbere 
vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnu ť rovnováhu medzi skríningom 
nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky 
a jej významu na druhej strane. To má význam najmä v prípade kombino ­
vanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy, odsek 12). 
12. Treba zváži ť vykonanie kombinovanej štúdie chronickej toxicity 
a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) namiesto samostatného vyko ­
nania štúdie chronickej toxicity (kapitola B.30 tejto prílohy) a štúdie karci ­
nogenity (táto testovacia metóda B.32). Kombinovaným testom sa zabezpe čí 
vyššia účinnosť, pokiaľ ide o čas a náklady, ako v prípade vykonania dvoch 
samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či už vo fáze 
chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 tejto prílohy) však treba náležite zoh ľadniť zásady výberu dávky (odseky 11 a 22 – 25), pri čom 
sa takisto pripúš ťa, že v ur čitých regula čných rámcoch sa môže vyžadova ť 
vykonanie samostatných štúdií.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou 
je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmer ňovacom dokumente (GD) 
č. 116 (7).  
PRINCÍP TESTU 
14. Nieko ľkým skupinám pokusných zvierat sa denne zvy čajne orálne podáva 
testovaná chemikália v odstup ňovaných dávkach po vä čšinu dĺžky ich 
života. Testovanie inhala čným alebo dermálnym spôsobom môže by ť takisto 
vhodné. Na zvieratách sa dôkladne pozorujú príznaky toxicity a tvorba 
nádorových poškodení. Pitva sa uskuto ční aj na zvieratách uhynutých 
alebo usmrtených po čas testovania, tak aj po ukon čení testu na zvieratách, 
ktoré test prežijú.  
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
15. Táto testovacia metóda primárne zah ŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie 
karcinogenity pri hlodavcoch (odsek 2). Použitie nehlodavcov sa môže zvážiť, ak z dostupných údajov vyplýva, že to má pre predpovedanie zdra ­
votných ú činkov u ľudí väčší význam. Výber druhu zvierat je potrebné 
odôvodni ť. Najvhodnejším hlodavcom je potkan, hoci sa môžu použi ť aj 
iné hlodavce, napr. myši. Hoci používanie myší pri testovaní karcinogenity môže ma ť obmedzený význam (24) (25) (26), niektoré sú časné regula čné 
programy stále vyžadujú testovanie karcinogenity na myšiach, pokia ľ sa 
nestanoví, že takáto štúdia nie je z vedeckého h ľadiska potrebná. Potkany 
a myši sú uprednost ňované pokusné modely vzh ľadom na ich pomerne 
krátku d ĺžku života, ich rozsiahle využívanie vo farmakologických 
a toxikologických štúdiách, ich náchylnos ť na indukciu nádoru 
a dostupnos ť dostatočne charakterizovaných kme ňov. Vzhľadom na tieto 
charakteristiky je k dispozícii ve ľké množstvo informácií o ich fyziológii 
a patológii. Ďalšie informácie o výbere druhov a kme ňa zvierat sú uvedené 
v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). 
16. Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Štúdia karcinogenity sa pod ľa možnosti vykonáva 
na zvieratách z toho istého kme ňa a zdroja, ako sú zvieratá použité 
v predbežnej štúdii/štúdiách toxicity v kratšom trvaní, hoci ak je známe, 
že pri zvieratách z tohto istého kme ňa a zdroja sa pri dlhodobých štúdiách 
problematicky dosahujú bežne akceptované kritériá prežitia [pozri usmer ňo­
vací dokument č. 116 (7)], je nutné zváži ť použitie kme ňa zvierat 
s prijateľnou mierou prežitia v dlhodobej štúdii. Používajú sa samice, 
ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné.
 
Umiestnenie a k ŕmenie  
17. Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovna ­
kého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zváži ť iba 
v prípade, že je to vedecky opodstatnené (27) (28) (29). Klietky sa uspo ­
riadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzh ľadom na ich umiest ­
nenie. Teplota pokusnej miestnosti, kde sú zvieratá umiestnené, by mala by ť 
22 °C (± 3 °C). Hoci relatívna vlhkos ť by mala by ť najmenej 30 % a pod ľa 
možnosti by nemala presiahnu ť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, 
cieľom by mala by ť 50 – 60 % vlhkos ť. Osvetlenie by malo by ť umelé 
a malo by sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže 
používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. 
Potrava musí vyhovova ť všetkým výživovým požiadavkám pre testované  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
druhy zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, 
perzistentných organických látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, mykoto ­
xínov a iných kontaminantov, ktoré môžu ma ť vplyv na výsledky testu, 
musí by ť čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín 
a kontaminantov potravy by sa mali získava ť priebežne, aspo ň na začiatku 
štúdie a pri zmene používanej šarže, a mali by sa uvies ť v závere čnej 
správe. Podobne treba uvies ť analytické informácie o pitnej vode použitej 
v štúdii. Výber krmiva môže by ť ovplyvnený potrebou zabezpe čiť vhodnú 
prímes testovanej chemikálie a potrebou splni ť výživové požiadavky pri 
zvieratách v prípade, že sa testovaná chemikália podáva v potrave.  
Príprava zvierat  
18. Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky 
aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade 
hlodavcov sa musí dávkovanie za čať čo najskôr po odstavení mlá ďat 
a aklimatizácii a pod ľa možnosti skôr, než zvieratá dov ŕšia vek ôsmich 
týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kme ňa, 
zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na za čiatku štúdie má by ť rozdiel 
medzi hmotnos ťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny 
a pre každé pohlavie zvláš ť nemá presahova ť ± 20 % priemernej hmotnosti 
všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá sa náhodne zadelia do kontrolných skupín 
a testovaných skupín. Po randomizácii by medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali by ť výrazné rozdiely v priemernej telesnej 
hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, randomizácia by sa 
podľa možnosti mala zopakova ť. Každému zviera ťu sa pridelí jedine čné 
identifika čné číslo, ktorým sa zviera trvalo ozna čí tetovaním, mikro čipovým 
implantátom alebo inou vhodnou metódou.
 
POSTUP  
Počet zvierat a ich pohlavie  
19. Použijú sa obe pohlavia. Použije sa dostato čný počet zvierat, aby bolo 
možné dôkladné biologické a štatistické hodnotenie. V každej skupine s dávkou a v súbežnej kontrolnej skupine by preto malo by ť minimálne 
50 zvierat z každého pohlavia. V závislosti od cie ľa štúdie je možné zvýši ť 
štatistickú významnos ť kľúčových odhadov tak, že sa zvieratá nerovno ­
merne rozdelia do jednotlivých skupín s dávkami, pri čom v skupinách 
s nízkou dávkou bude viac ako 50 zvierat, napr. pri odhadovaní karcino ­
génneho potenciálu pri nízkych dávkach. Treba však uzna ť, že miernym 
zvýšením po čtu zvierat v skupine sa dosiahne pomerne nízke zvýšenie 
štatistickej významnosti štúdie. Ďalšie informácie o štatistickom plánovaní 
štúdie a výbere úrovní dávok s cie ľom maximalizova ť štatistickú význam ­
nosť sú k dispozícii v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7).
 
Zabezpečenie priebežného utrácania a satelitných (sentinelových) 
skupín  
20. Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže po čítať s priebežným 
utrácaním, napr. po 12 mesiacoch, s cie ľom získa ť informácie o progresii 
nádorových zmien a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie 
o testovanej chemikálii sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity 
v opakovaných dávkach, priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opod ­
statnené. Ak sa v rámci štúdie plánuje priebežné utrácanie zvierat, v každej skupine s dávkou, v ktorej sa plánuje utratenie, je zvy čajne desa ť zvierat 
z každého pohlavia, pri čom celkový po čet zvierat zahrnutých v pláne štúdie 
by sa mal zvýši ť o počet zvierat, ktoré majú by ť utratené pred dokon čením 
štúdie. Na monitorovanie stavu choroby možno po čas štúdie v prípade 
potreby použi ť ďalšiu skupinu sentinelových zvierat (zvy čajne päť zvierat 
z každého pohlavia) (30). Ďalšie usmernenia sú uvedené v usmer ňovacom 
dokumente č. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Skupiny s dávkami a dávkovanie  
21. Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jedno ­
tlivými úrov ňami dávok sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). 
Použijú sa aspo ň tri veľkosti dávok a uskuto ční sa paralelná kontrola. 
Úroveň dávky zvy čajne vychádza z výsledkov krátkodobejších štúdií 
v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pri čom je potrebné 
prihliadať na existujúce toxikologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú 
o testovanej chemikálii alebo príbuzných chemikáliách k dispozícii. 
22. Pokia ľ to dovo ľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické ú činky 
testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cie ľových orgánov 
a toxických ú činkov by sa mala vybra ť najvyššia úrove ň dávky, ktorá 
súčasne nebude ma ť za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu 
alebo uhynutie. Pri sú časnom zoh ľadnení faktorov uvedených v odseku 23 
by sa mala zvy čajne vybra ť najvyššia úrove ň dávky preukazujúca toxicitu, 
o ktorej sved čí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (približne 
o 10 %). V závislosti od cie ľov štúdie (pozri odsek 6) však možno vybra ť 
najvyššiu dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca toxicitu, napr. ak dávka vyvoláva daný nepriaznivý ú činok, ktorý má však malý vplyv na 
dĺžku života alebo na telesnú hmotnos ť. 
23. Úrovne dávok a odstupy medzi úrov ňami dávok možno vybra ť s cieľom 
určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a v závislosti od druhu pôsobenia 
testovanej chemikálie hladinu NOAEL alebo iný plánovaný výsledok štúdie, 
napr. BMD (pozri odsek 25) pri najnižšej úrovni dávky. Medzi faktory, 
ktoré by sa mali zváži ť pri podávaní nižších dávok, patrí predpokladaný 
sklon krivky závislosti reakcie od dávky, dávky, pri ktorých môže dochá
­
dzať k významným zmenám v metabolizme alebo druhu toxického pôsobe ­
nia, keď sa očakáva prahová hodnota alebo ke ď sa očakáva východisko na 
extrapoláciu nízkej dávky. 
24. Vybraté odstupy medzi úrov ňami dávok budú závisie ť od vlastností testo ­
vanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy predpísa ť, 
ale dobrá ú činnosť testov sa často dosahuje, ak sa na stanovenie zostupného 
dávkovania použijú intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri, pri čom 
pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie ve ľmi 
veľkých intervalov (napr. s faktorom vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. 
Vo všeobecnosti by sa nemali používa ť faktory vyššie ako 10 a v prípade, 
že sa použijú, je nutné tento postup odôvodni ť. 
25. Ako sa ďalej uvádza v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), pri výbere 
dávky je potrebné zváži ť tieto body: 
— známe alebo predpokladné nelinearity alebo inflexné body krivky závi ­
slosti reakcie od dávky, 
— toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza 
k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými a internými dávkami, 
— prekurzorné poškodenia, markery ú činkov alebo ukazovatele prebiehajú ­
cich kľúčových základných biologických procesov, 
— kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, 
pri ktorých za čína vznika ť cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, 
preťažujú sa homeostatické mechanizmy at ď.,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný ve ľmi 
podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo pred ­
pokladanej prahovej úrovne, 
— zváženie o čakávaných úrovní expozície človeka. 
26. Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená ú činkom chemiká ­
lie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosi č, ak sa pri podávaní testovanej 
chemikálie používa nosi č. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaob ­
chádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou 
aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosi č, kontrolná skupina 
dostane nosi č v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách 
s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá 
poslúži ako vhodnejšia kontrola.
 
Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie  
27. Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej 
vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). Spôsob a metóda podá ­
vania závisí od ú čelu štúdie, fyzikálno-chemických vlastností testovanej 
chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodni ť. 
V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna 
sonda zvy čajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda 
podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. 
v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce 
pesticídy sa zvy čajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V ur čitých 
prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže by ť vhod­
nejšie podanie iným spôsobom. 
28. Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo 
vhodnom nosi či. Náležitá pozornos ť by sa mala venova ť nasledujúcim vlast ­
nostiam nosi ča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, meta ­
bolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické 
vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeni ť svoje toxické vlastnosti, 
vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporú ča sa, 
aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/ 
suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuri čný olej) a nakoniec 
prípadného roztoku v iných nosi čoch. Charakteristiky toxicity iných nosi čov 
ako voda musia by ť známe. Musia by ť k dispozícii informácie o stabilite 
testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív 
(podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave). 
29. V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité 
zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvy čajne nemala presiahnu ť horný limit 5 % 
z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutri čnej nevyváženosti. 
Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použi ť buď
 
konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm), alebo konštantná úrove ň dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa (mg/kg 
telesnej hmotnosti), ktorá sa vypo číta každý týžde ň. Použitú alternatívu je 
potrebné špecifikova ť.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej 
chemikálie denne (sedem dní v týždni), v prípade hlodavcov zvy čajne 
počas 24 mesiacov (pozri aj odsek 32). Použitie každého iného režimu 
dávkovania, napr. pä ť dní v týždni, sa musí odôvodni ť. V prípade podávania 
cez kožu sa zvieratám zvy čajne aplikuje testovaná chemikália najmenej šes ť 
hodín denne, sedem dní v týždni, ako je uvedené v kapitole B.9 tejto 
prílohy (11), po čas 24 mesiacov. Inhala čná expozícia sa vykonáva šes ť 
hodín denne, sedem dní v týždni, ale ak je to odôvodnené, môže sa použi ť 
aj expozícia po čas piatich dní v týždni. Obdobie expozície zvy čajne trvá 24 
mesiacov. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia 
oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť s cieľom 
minimalizova ť druhovo špecifické utrpenie. Ak sa použije expozícia v trvaní 
menej ako šes ť hodín denne, treba uvies ť odôvodnenie. Pozri aj kapitolu 
B.8 tejto prílohy (9). 
31. Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva cez sondu, podáva sa 
prostredníctvom žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly približne 
v rovnakom čase každý de ň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za de ň. 
Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachova ť dennú 
dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maxi ­
málny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od 
veľkosti pokusného zviera ťa. Objem by mal by ť podľa možnosti čo najnižší 
a v prípade hlodavcov by zvy čajne nemal presahova ť 1 ml/100 g telesnej 
hmotnosti (31). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpe čil stály objem vo všetkých 
dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, 
ktoré je nutné zriedi ť, aby sa predišlo závažným lokálnym ú činkom. Nemalo 
by sa testova ť
 pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo 
dráždivé pre gastrointestinálny trakt.  
Trvanie štúdie  
32. Štúdia v prípade hlodavcov zvy čajne trvá 24 mesiacov, čo predstavuje 
väčšiu časť normálnej d ĺžky života zvierat, ktoré sa majú použi ť. 
V závislosti od d ĺžky života kme ňa živočíšneho druhu v štúdii možno 
použiť aj kratšie alebo dlhšie trvanie, ale tento postup je nutné odôvodni ť. 
V prípade ur čitých kme ňov myší, napr. kme ňov AKR/J, C3H/J alebo 
C57BL/6J, môže by ť vhodná štúdia v trvaní 18 mesiacov. Nasledujúce 
informácie poskytujú usmernenia k trvaniu, ukon čeniu štúdie a prežitiu. 
Ďalšie usmernenia vrátane úvah o prijate ľnosti negatívnej štúdie karcinoge ­
nity v súvislosti s prežitím po čas štúdie sú uvedené v Usmer ňovacom doku ­
mente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity 
a karcinogenity (7). 
— Ukon čenie štúdie treba zváži ť, ak počet zvierat, ktoré prežili v skupinách 
s nižšou dávkou alebo v kontrolnej skupine, klesne pod 25 %. 
— Ak v dôsledku toxicity pred časne uhynie iba skupina s vysokou dávkou, 
štúdia by sa nemala ukon čiť. 
— Prežitie sa pri jednotlivých pohlaviach posudzuje samostatne. — Trvanie štúdie by nemalo presiahnu ť hranicu, pri ktorej už údaje získané 
pomocou štúdie neposta čujú na vykonanie štatisticky platného vyhodno ­
tenia.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
POZOROVANIA 
33. Pri všetkých zvieratách si treba všíma ť morbiditu alebo mortalitu, zvy čajne 
na začiatku a na konci každého d ňa vrátane víkendov a sviatkov. Pri zvie ­
ratách sa navyše denne kontrolujú špecifické príznaky, ktoré majú toxiko ­
logický význam, pri čom sa zoh ľadňuje časový vrchol o čakávaných ú činkov 
po dávkovaní v prípade podávania cez sondu. Osobitnú pozornos ť treba 
venovať tvorbe nádorov. Čas nástupu nádoru, lokalizáciu, rozmery, vzh ľad 
a progresiu každého výrazne vidite ľného alebo hmatate ľného nádoru je 
nutné zaznamena ť. 
Telesná hmotnos ť, spotreba potravy/vody a ú činnosť krmiva  
34. Všetky zvieratá sa odvážia na za čiatku testu, najmenej raz týždenne po čas 
prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy 
a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týžde ň počas prvých 13 
týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália 
podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týžde ň 
počas prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania 
spotreby vody by sa mali zváži ť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení 
pitný režim.  
Hematológia, klinická biochémia a iné merania  
35. S cie ľom maximalizova ť informácie získané pomocou štúdie, najmä pokia ľ 
ide o úvahy týkajúce sa druhu pôsobenia, možno odobra ť vzorky krvi na 
hematológiu a klinickú biochémiu, pri čom rozhodnutie o tomto kroku ostáva 
na vedúcom štúdie. Takisto môže by ť vhodné urobi ť rozbor mo ču. Ďalšie 
usmernenia o význame odberu takýchto vzoriek v rámci štúdie karcinoge ­
nity sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). Ak je to vhodné, 
odber vzoriek krvi na hematologické vyšetrenia, vyšetrenia klinickej biochémie a rozbor mo ču sa môže vykona ť ako súčasť priebežného utrá ­
cania (odsek 20) a na konci štúdie pri minimálne desiatich zvieratách 
z každého pohlavia v každej skupine. Vzorky krvi sa odoberajú 
v anestézii zo stanoveného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej očnicovej dutiny, a pod ľa možnosti sa uchovávajú v primeraných 
podmienkach. Takisto je možné na vyšetrenie pripravi ť krvné stery, najmä 
ak sa zdá, že kostná dre ň je cieľovým orgánom, hoci význam takéhoto 
vyšetrenia pri hodnotení karcinogénneho/onkogénneho potenciálu sa spochybňuje (32).
 
PATOLÓGIA  
Makroskopická pitva  
36. Všetky zvieratá v štúdii s výnimkou sentinelových zvierat (pozri odsek 20) 
a ostatných satelitných zvierat sa podrobujú kompletnej podrobnej makro ­
skopickej pitve, ktorá zah ŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, 
všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich 
obsahu. Pri sentinelových a ostatných satelitných zvieratách môže by ť 
v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne 
vedúci štúdie. Orgánové hmotnosti vä čšinou nie sú sú časťou štúdie karci ­
nogenity, ke ďže geriatrické zmeny a v neskorších štádiách tvorba nádorov 
znehodnocujú užito čnosť údajov o orgánových hmotnostiach. Môžu však 
mať veľký význam pri hodnotení váhy dôkazov, najmä v rámci úvah 
o druhu pôsobenia. Ak sú sú časťou satelitnej štúdie, zozbierajú sa najneskôr 
do jedného roka od za čatia štúdie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom médiu na 
obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (33) (vyšet ­
renia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné): 
Všetky makroskopické 
poškodenia srdce pankreas žalúdok (predný žalúdok, 
žľaznatý žalúdok) 
nadoblička ileum prištítne teliesko [zuby] 
aorta la čník periférny nerv semenníky 
mozog (vrátane častí pred­
ného mozgu, mozo čka 
a predĺženej miechy/mosta) oblička hypofýza týmus 
slepé črevo slzná ž ľaza (extraorbi ­
tálna) prostata štítna ž ľaza 
krčok maternice pe čeň rektum [jazyk] 
koagulačná žľaza p ľúca slinná ž ľaza priedušnica 
hrubé črevo lymfatické uzliny 
(povrchové aj hlboké) semenný mechúrik mo čový mechúr 
dvanástnik prsná ž ľaza (povinné pri 
samiciach, a ak je 
zrejmé, že možno urobi ť 
disekciu, aj pri samcoch) kostrové svaly maternica (vrátane kr čka 
maternice) 
nadsemenníky [horný dýchací trakt 
vrátane nosa, nosových mušlí a prínosových 
dutín] koža [mo čovod] 
oko (vrátane sietnice) pažerák miecha (na troch úrov ­
niach: kr čnej, hrudnej 
a lumbálnej) [močová rúra] 
[stehnová kos ť s kĺbom] [
čuchový bulbus] slezina vagína 
žlčník (v prípade iných 
druhov zvierat ako potkany) vaječníky [hrudná kos ť] prierez kostnej drene a/alebo 
čerstvý aspirát kostnej drene 
Harderova ž ľaza 
V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky a nadobli čky, sa 
zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynú ť 
potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by sa mali zachova ť 
všetky orgány, ktoré vzh ľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie 
možno považova ť za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália 
podáva dermálne, je zoznam orgánov rovnaký ako v prípade orálneho podá ­
vania, pri čom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože 
z miesta aplikácie chemikálie. V inhala čných štúdiách sa zoznam zachova ­
ných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporú čaní 
kapitoly B.8 a kapitoly B.29 tejto prílohy. Pokia ľ ide o orgány/tkanivá (a 
popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné 
vyšetriť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatológia  
38. K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikolo ­
gickej patológie (33). Vyšetreniam sa podrobia minimálne tieto tkanivá: 
— všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín, 
— všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu 
štúdie, 
— všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality vrátane nádorov, 
— ak sú v skupine s vysokou dávkou pozorované histopatologické zmeny 
súvisiace s aplikáciou chemikálie, tie isté tkanivá sa vyšetria pri všet ­
kých zvieratách zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, 
— v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky alebo nadobli čky, 
sa vyšetria obidva orgány.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
39. Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvie ­
ratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnú ť v tabuľkovej forme, pri čom 
ukazujú pre každú testovanú skupinu po čet zvierat na za čiatku testu, po čet 
zvierat uhynutých po čas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas 
uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, po čet zvierat, pri 
ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity 
vrátane nábehu, času a prudkosti toxických ú činkov, po čet zvierat vykazu ­
júcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabu ľkách musia 
okrem stup ňa poškodení udáva ť priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade 
priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické ú činky 
alebo poškodenia. 
40. Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu by ť užitočné historické kontrolné 
údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci 
súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo pred ­
ložiť to isté laboratórium a mali by sa vz ťahovať na zvieratá rovnakého 
veku a z toho istého kme ňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré 
danej štúdii predchádzali. 
41. Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodne a všeobecne 
uplatniteľnou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú analyzované, 
sa vyberú po čas plánovania štúdie (odsek 9). Výber musí v prípade potreby 
počítať s úpravami vzh ľadom na prežitie.
 
Správa o teste  
42. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— zdroj chemikálie, 
— číslo šarže, 
— certifikát chemickej analýzy.  
Nosič (v prípade potreby):  
— odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako voda).  
Testovacie zvieratá:  
— použitý druh/kme ň a odôvodnenie výberu, 
— počet, vek a pohlavie zvierat na za čiatku testu, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu.  
Podmienky testovania:  
— odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky, — ak je to použite ľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov, 
— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, — analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite 
prípravku, 
— spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie, — v prípade inhala čných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo 
expozíciu celého tela, 
— skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), faktor konverzie 
z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo 
ppm), ak je to použite ľné, 
— údaje o kvalite potravy a vody.  
Výsledky (predloží sa tabu ľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých 
zvieratách) 
Všeobecné informácie:  
— údaje o prežití, — telesná hmotnos ť a zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba potravy, výpo čty účinnosti krmiva, pokia ľ sa vykonali, 
a spotreba vody, ak je to použite ľné, 
— toxikokinetické údaje (ak sú dostupné), — oftalmoskopia (ak je dostupná), — hematológia (ak je dostupná), — klinická chémia (ak je dostupná).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinické nálezy:  
— príznaky toxicity, — rozsah (a ak sa hodnotí, závažnos ť) každej abnormality, 
— povaha, závažnos ť a trvanie klinických pozorovaní ( či už prechodných 
alebo stálych).  
Údaje o pitve:  
— konečná telesná hmotnos ť, 
— orgánové hmotnosti a ich pomery, ak je to použite ľné, 
— pitevné nálezy, rozsah a závažnos ť abnormalít.  
Histopatológia:  
— nenádorové histopatologické nálezy, 
— nádorové histopatologické nálezy, 
— korelácia medzi makroskopickými a mikroskopickými nálezmi, 
— podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich 
s aplikáciou chemikálie vrátane stup ňa závažnosti, 
— správa o všetkých partnerských hodnoteniach preparátov (sklí čok). 
Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby 
Rozbor výsledkov zah ŕňajúci:  
— rozbor všetkých prístupov modelovania, 
— vzťahy medzi dávkou a reakciou, 
— historické kontrolné údaje, — zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia, 
— stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL, 
— význam pre človeka.  
Závery
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paríž. 
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
3. Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163 – 208. 
4. Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., a kol. (2002). Hazard identifi ­
cation by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 
145 – 191. 
5. Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
6. Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 
90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov. 
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 a 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykonávanie testov 
na adrese www.oecd.org/env/testguidelines. 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž. 
9. Kapitola B.8 tejto prílohy, Subakútna inhala čná toxicita: 28-d ňová štúdia. 
10. Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhala čná toxicita: 90-d ňová 
štúdia. 
11. Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–d ňovej opakovanej dávke (der ­
málna). 
12. Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., 
Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analy ­
zing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793 – 801. 
13. Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., a Fenner-Crisp, P. 
A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581 – 589. 
14. Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., 
Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 
89: 51 – 56. 
15. Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., 
Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591 – 653. 
16. Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., a kol. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1 – 7. 
17. Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxi ­
cology 36: 9 – 35. 
18. Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., a kol. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37 – 68. 
19. Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., a kol. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69 – 98. 
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž. 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paríž.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
22. Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., 
Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in 
Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC. 
24. Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., a Lumley, C. E. (1994). 
The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. 
25. Usui, T., Griffiths, S. A., a Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse 
for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In 
D’Arcy P. O. F. & Harron D. W. G. (eds). Proceedings of the Third Inter ­
national Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279 – 284. 
26. Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196 – 1203. 
27. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 
o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely, Ú. v. EÚ L 276, 
20.10.2010, s. 33. 
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services. 
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versu ­
chstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
31. Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15 – 23. 
32. Weingand, K. a kol. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198 – 201. 
33. Crissman, J., Goodman, D., Hildebrandt, P. a kol. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B. 33.  KOMBINOVANÁ ŠTÚDIA CHRONICKEJ TOXICITY/KARCINO ­
GENITY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 453 (2009). Pôvodné usmernenia TG 453 boli prijaté 
v roku 1981. Vypracovanie tejto aktualizovanej testovacej metódy B.33 sa považovalo za potrebné na zoh ľadnenie najnovšieho vývoja v oblasti staro ­
stlivosti o zvieratá a regula čných požiadaviek (1) (2) (3) (4) (5). Aktuali ­
zácia tejto testovacej metódy B.33 bola vykonaná súbežne s revíziou 
kapitoly B.32 tejto prílohy, Štúdie karcinogenity, a kapitoly B.30 tejto prílohy, Štúdie chronickej toxicity, s cie ľom získa ť ďalšie informácie 
pomocou zvierat použitých v štúdii a poskytnú ť ďalšie podrobné údaje 
o výbere dávky. Táto testovacia metóda je vypracovaná na testovanie širokej 
škály chemikálií vrátane pesticídov a priemyselných chemikálií. Treba však poznamena ť, že v prípade liekov sa niektoré podrobnosti a požiadavky 
môžu líši ť (pozri usmernenia S1B Medzinárodnej konferencie 
o zosúladení (ICH) o testovaní karcinogenity liekov). 
2. Väčšina štúdií chronickej toxicity a karcinogenity sa vykonáva na hlodav ­
coch a táto testovacia metóda sa preto primárne vz ťahuje na štúdie vyko ­
návané na týchto živo číšnych druhoch. Ak sa takéto štúdie budú vyžadova ť 
v prípade nehlodavcov, takisto sa s príslušnými úpravami môžu uplatni ť 
uvedené princípy a postupy spolu s princípmi a postupmi uvedenými 
v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-d ňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodav ­
coch v opakovaných dávkach (6), ako sa uvádza v Usmer ňovacom doku ­
mente OECD č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chronickej toxicity 
a karcinogenity (7). 
3. Tri hlavné spôsoby podávania používané v štúdiách chronickej toxicity/kar ­
cinogenity sú orálne, dermálne a inhala čné podávanie. Výber spôsobu podá ­
vania závisí od fyzikálnych a chemických vlastností testovanej chemikálie 
a najčastejšieho spôsobu expozície u človeka. Ďalšie informácie o výbere 
spôsobu expozície sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). 
4. Táto testovacia metóda je zameraná na orálnu expozíciu, ktorá sa v štúdiách 
chronickej toxicity a karcinogenity používa naj častejšie. Hoci dlhodobé 
štúdie využívajúce dermálnu alebo inhala čnú expozíciu môžu by ť takisto 
potrebné na hodnotenie zdravotných rizík pre človeka a/alebo sa môžu 
vyžadova ť v určitých regula čných režimoch, oba spôsoby expozície sú do 
značnej miery technicky zložité. Takéto štúdie budú musie ť byť pripravené 
v závislosti od jednotlivých prípadov, hoci testovacia metóda, ktorá sa tu uvádza na posudzovanie a vyhodnocovanie chronickej toxicity 
a karcinogenity pri orálnom podávaní, by mohla slúži ť ako základ protokolu 
pre inhala čné a/alebo dermálne štúdie vzh ľadom na odporú čania týkajúce sa 
období testovania, klinických a patologických parametrov at ď. K dispozícii 
sú usmernenia OECD o podávaní testovaných chemikálií inhala čným (7) (8) 
a dermálnym spôsobom (7). Pri príprave dlhodobejších štúdií zah ŕňajúcich 
inhalačnú expozíciu je nutné si preštudova ť najmä kapitolu B.8 tejto 
prílohy (9) a kapitolu B.29 tejto prílohy (10) spolu s Usmer ňovacím doku ­
mentom OECD o testovaní akútnej inhala čnej toxicity (8). Kapitolu B.9 
tejto prílohy (11) je nutné konzultova ť v prípade testovania dermálnej 
expozície.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Kombinovaná štúdia chronickej toxicity/karcinogenity poskytuje informácie 
o možnej nebezpe čnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri 
opakovanej expozícii v priebehu celej d ĺžky života použitého živo číšneho 
druhu. Štúdia poskytne informácie o toxických ú činkoch testovanej chemi ­
kálie vrátane potenciálnej karcinogenity, indikuje cie ľové orgány a možnos ť 
akumulácie. Môže zabezpe čiť odhad hladiny bez pozorovaného nepriazni ­
vého účinku pre toxické ú činky a v prípade negenotoxických karcinogénov 
pre reakcie na nádory, ktorý možno použi ť na stanovenie bezpe čnostných 
kritérií týkajúcich sa expozície človeka. Takisto sa v nej zdôraz ňuje nutnos ť 
dôkladných klinických pozorovaní zvierat s cie ľom získa ť čo najväčšie 
množstvo informácií. 
6. Medzi ciele štúdie chronickej toxicity/karcinogenity v rámci tejto testovacej 
metódy patrí: 
— identifikácia karcinogénnych vlastností testovanej chemikálie, ktoré vedú 
k zvýšenému výskytu nádorov, zvýšenému podielu zhubných nádorov alebo k skráteniu času do výskytu nádorov v porovnaní so súbežnými 
kontrolnými skupinami, 
— identifikácia času do výskytu nádorov, 
— identifikácia chronickej toxicity testovanej chemikálie, 
— identifikácia cie ľových orgánov chronickej toxicity a karcinogenity, 
— charakterizácia vz ťahu medzi dávkou a reakciou, 
— identifikácia hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL) 
alebo východiska na stanovenie porovnávacej dávky (BMD), 
— extrapolácia karcinogénnych ú činkov na úrovne expozície človeka pri 
nízkych dávkach, 
— predpovedanie ú činkov chronickej toxicity na úrovniach expozície 
človeka, 
— poskytnutie údajov na testovanie hypotéz týkajúcich sa druhu pôsobenia 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
7. Pri posudzovaní a vyhodnocovaní potenciálnej karcinogenity a chronickej 
toxicity testovanej chemikálie testovacie laboratórium pred vykonaním štúdie zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cie ľom 
zamerať prípravu štúdie na ú činnejšie testovanie jej toxikologických vlast ­
ností a minimalizova ť využívanie zvierat. Informácie a úvahy o druhu pôso ­
benia podozrivého karcinogénu (2)(7) (12) (13) (14) (15) sú mimoriadne dôležité, lebo optimálne plánovanie sa môže líši ť v závislosti od toho, či je 
testovaná chemikália známym alebo podozrivým genotoxickým karcinogé ­
nom. Ďalšie usmernenia k úvahám o druhu pôsobenia sú uvedené 
v usmerňovacom dokumente č.116 (7). 
8. Informácie, ktoré pomôžu pri príprave štúdie, zah ŕňajú identitu, chemickú 
štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, akéko ľvek 
informácie o druhu pôsobenia, výsledky všetkých testov toxicity  in vitro  
alebo  in vivo  vrátane testov genotoxicity, predpokladané použitie (použitia) 
a potenciál pre expozíciu ľudí, dostupné údaje (Q)SAR, údaje 
o mutagenite/genotoxicite a iné toxikologické údaje o štrukturálne príbuz ­
ných chemikáliách, dostupné toxikokinetické údaje (kinetika pri jednej 
dávke a takisto pri opakovaných dávkach, ak je k dispozícii) a údaje získané
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
z iných štúdií opakovanej expozície. Stanovenie chronickej toxicity/karcino ­
genity sa vykoná až po získaní prvotných informácií o toxicite z 28-d ňového 
a/alebo 90-d ňového testu toxicity v opakovaných dávkach. Krátkodobé testy 
nástupu a šírenia rakoviny by takisto mohli prinies ť užitočné informácie. 
Stratégiu fázového testovania pri testovaní karcinogenity treba zváži ť ako 
súčasť celkového hodnotenia potenciálnych nepriaznivých zdravotných 
účinkov danej testovanej chemikálie (16) (17) (18) (19). 
9. Štatistické metódy, ktoré sú vzh ľadom na prípravu pokusu a ciele na 
analýzu výsledkov najprimeranejšie, sa stanovia pred za čatím štúdie. Je 
potrebné zváži ť, či by štatistiky nemali zah ŕňať úpravu vzh ľadom na prežitie 
zvierat, analýzu kumulatívnych nádorových rizík súvisiacich s d ĺžkou preži ­
tia, analýzu času do progresie nádoru a analýzu v prípade pred časného 
konca jednej alebo viacerých skupín. Usmernenia o vhodných štatistických 
analýzach a k ľúčové odkazy na medzinárodne uznávané štatistické metódy 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), ako aj v Usmer ňovacom 
dokumente č. 35 o analýze a hodnotení štúdií chronickej toxicity 
a karcinogenity (20). 
10. Pri vykonávaní štúdie karcinogenity je vždy nutné sa riadi ť hlavnými zása ­
dami a úvahami uvedenými v Usmer ňovacom dokumente OECD 
o rozpoznaní, hodnotení a použití klinických príznakov ako humánnych parametrov pre pokusné zvieratá používané pri hodnotení bezpe čnosti 
(21), najmä v odseku 62. V tomto odseku sa uvádza, že „ak v štúdiách 
s opakovanými dávkami zviera vykazuje klinické príznaky, ktoré sú progre ­
sívne a vedú k ďalšiemu zhoršeniu stavu, je potrebné na základe informácií 
rozhodnú ť, či sa má zviera humánne usmrti ť alebo nie. Pri rozhodovaní 
treba zváži ť hodnotu informácií, ktoré by sa získali ďalším udržiavaním 
zvieraťa pri živote v rámci štúdie, v spojitosti s jeho celkovým stavom. 
Ak sa prijme rozhodnutie, že testovanie zviera ť
a bude pokra čovať, frek­
vencia pozorovaní by sa mala pod ľa potreby zvýši ť. Takisto je možné, 
bez toho, aby to malo negatívny vplyv na ú čel testu, do časne pozastavi ť 
podávanie dávok, ak sa tým zviera ťu uľaví od bolesti alebo utrpenia, alebo 
znížiť testovaciu dávku.“ 
11. Podrobné usmernenia a rozbor zásad výberu dávky v štúdiách chronickej 
toxicity a karcinogenity sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), 
ako aj v dvoch publikáciách Medzinárodného inštitútu prírodných vied (International Life Sciences Institute) (22) (23). Základná stratégia výberu 
dávky závisí od primárneho cie ľa alebo cie ľov štúdie (odsek 6). Pri výbere 
vhodných úrovní dávky je potrebné dosiahnu ť rovnováhu medzi skríningom 
nebezpečnosti na jednej strane a charakterizáciou reakcie na nízke dávky 
a jej významu na druhej strane. To je v prípade tejto kombinovanej štúdie 
chronickej toxicity a karcinogenity ve ľmi dôležité. 
12. Treba zváži ť vykonanie tejto kombinovanej štúdie chronickej toxicity 
a karcinogenity namiesto samostatného vykonania štúdie chronickej toxicity 
(kapitola B.30 tejto prílohy) a štúdie karcinogenity (kapitola B.32 tejto prílohy). Kombinovaným testom sa zabezpe čí vyššia ú činnosť, pokiaľ ide 
o čas a náklady, a o nie čo menšie využívanie zvierat ako v prípade vyko ­
nania dvoch samostatných štúdií bez toho, aby sa znížila kvalita údajov, či 
už vo fáze chronickej toxicity alebo vo fáze karcinogenity. V prípade kombinovanej štúdie chronickej toxicity a karcinogenity však treba náležite zohľadniť zásady výberu dávky (odseky 11 a 22 – 26), pri čom sa takisto 
pripúšťa, že v ur čitých regula čných rámcoch sa môže vyžadova ť vykonanie 
samostatných štúdií. Ďalšie usmernenia o príprave kombinovanej štúdie 
chronickej toxicity a karcinogenity s cie ľom dosiahnu ť maximálnu ú činnosť 
štúdie v súvislosti s možnos ťami zníženia po
čtu použitých zvierat, ako aj 
prostredníctvom zefektívnenia jednotlivých experimentálnych postupov sú 
uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou 
je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmer ňovacom dokumente (GD) 
č. 116 (7).  
PRINCÍP TESTU 
14. Plán štúdie pozostáva z dvoch paralelných fáz, fázy chronickej toxicity 
a fázy karcinogenity (ich trvania sú uvedené v odsekoch 34 a 35). Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva orálne, aj ke ď môže by ť vhodné aj testo ­
vanie inhala čnej alebo dermálnej expozície. Po čas fázy chronickej toxicity 
sa testovaná chemikália podáva denne v odstup ňovaných dávkach 
niekoľkým skupinám testovacích zvierat (jedna úrove ň dávky na skupinu), 
zvyčajne počas 12 mesiacov, hoci v závislosti od regula čných požiadaviek 
možno zvoli ť aj dlhšie alebo kratšie obdobia (pozri odsek 34). Vybraté 
obdobie by malo by ť dostatočne dlhé, aby sa mohli prejavi ť účinky kumu ­
latívnej toxicity, ale bez toho, aby testovanie zmarili zmeny súvisiace so starnutím zvierat. Plán štúdie môže zah ŕňať aj jedno alebo viaceré priebežné 
utratenia, napr. po troch a šiestich mesiacoch, pri čom na doplnenie po čtu je 
možné použi ť ďalšie skupiny zvierat (pozri odsek 20). Po čas fázy karcino ­
genity sa testovaná chemikália podáva denne nieko ľkým skupinám testova ­
cích zvierat po vä čšinu dĺžky ich života. Na zvieratách sa v oboch fázach 
dôkladne pozorujú príznaky toxicity a tvorba nádorových poškodení. Pitva 
sa uskuto ční na zvieratách uhynutých alebo usmrtených po čas testovania, 
ako aj po ukon čení testu na zvieratách, ktoré test prežijú.
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
15. Táto testovacia metóda primárne zah ŕňa posudzovanie a vyhodnocovanie 
chronickej toxicity karcinogenity pri hlodavcoch (odsek 2). Použitie nehlo ­
davcov sa môže zváži ť, ak z dostupných údajov vyplýva, že to má pre 
predpovedanie zdravotných ú činkov u ľudí väčší význam. Výber druhu 
zvierat je potrebné odôvodni ť. Najvhodnejším hlodavcom je potkan, hoci 
sa môžu použi ť aj iné hlodavce, napr. myši. Hoci používanie myší pri 
testovaní karcinogenity môže ma ť obmedzený význam (24) (25) (26), niek ­
toré súčasné regula čné programy stále vyžadujú testovanie karcinogenity na 
myšiach, pokia ľ sa nestanoví, že takáto štúdia nie je z vedeckého h ľadiska 
potrebná. Potkany a myši sú uprednost ňované pokusné modely vzh ľadom na 
ich relatívne krátku d ĺžku života, ich rozsiahle využívanie vo farmakologic ­
kých a toxikologických štúdiách, ich náchylnos ť na indukciu nádoru 
a dostupnos ť dostatočne charakterizovaných kme ňov. Vzhľadom na tieto 
charakteristiky je k dispozícii ve ľké množstvo informácií o ich fyziológii 
a patológii. Príprava a vykonanie štúdií chronickej toxicity/karcinogenity pri 
nehlodavcoch, ak sa požadujú, by mali by ť založené na zásadách uvedených 
v tejto testovacej metóde, ako aj na zásadách uvedených v kapitole B.27 tejto prílohy, 90-d ňová štúdia orálnej toxicity pri nehlodavcoch 
v opakovaných dávkach (6). Ďalšie informácie o výbere druhov a kme ňa 
zvierat sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). 
16. Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Kombinovaná štúdia chronickej toxicity/karcinoge ­
nity sa vykonáva na zvieratách z toho istého kme ňa a zdroja, ako sú zvieratá 
použité v predbežnej štúdii (štúdiách) toxicity v kratšom trvaní, hoci ak je 
známe, že pri zvieratách z tohto istého kme ňa a zdroja sa pri dlhodobých 
štúdiách problematicky dosahujú bežne akceptované kritériá prežitia [pozri usmerňovací dokument č. 116 (7)], je nutné zváži ť použitie kme ňa zvierat 
s prijate
ľnou mierou prežitia v dlhodobej štúdii. Používajú sa samice, ktoré 
nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
17. Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovna ­
kého pohlavia v klietkach. Samostatné umiestnenie by sa malo zváži ť iba 
v prípade, že je to vedecky opodstatnené (27) (28) (29). Klietky sa uspo ­
riadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzh ľadom na ich umiest ­
nenie. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 °C (± 
3 °C). Hoci relatívna vlhkos ť by mala by ť najmenej 30 % a prednostne 
by nemala presiahnu ť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cie ľom by 
mala byť 50 – 60 % vlhkos ť. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by 
sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže používa ť 
bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Potrava 
musí vyhovova ť všetkým výživovým požiadavkám pre testované druhy 
zvierat a obsah kontaminantov potravy vrátane rezíduí pesticídov, perzis ­
tentných organických látok, fytoestrogénov, ťažkých kovov, mykotoxínov 
a iných kontaminantov, ktoré môžu ma ť vplyv na výsledky testu, musí by ť 
čo najnižší. Analytické informácie o úrovni živín a kontaminantov potravy 
by sa mali získava ť priebežne, aspo ň na začiatku štúdie a pri zmene použí ­
vanej šarže, a mali by sa uvies ť v závere čnej správe. Podobne treba uvies ť 
analytické informácie o pitnej vode použitej v štúdii. Výber krmiva môže 
byť ovplyvnený potrebou zabezpe čiť vhodnú prímes testovanej chemikálie 
a potrebou splni ť výživové požiadavky pri zvieratách v prípade, že sa 
testovaná chemikália podáva v potrave.  
Príprava zvierat  
18. Použijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky 
aspoň sedem dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. V prípade 
hlodavcov sa musí dávkovanie za čať čo najskôr po odstavení mlá ďat 
a aklimatizácii a pod ľa možnosti skôr, než zvieratá dov ŕšia vek ôsmich 
týždňov. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kme ňa, 
zdroja, pohlavia, hmotnosti a veku. Na za čiatku štúdie má by ť rozdiel 
medzi hmotnos ťami použitých zvierat z každého pohlavia minimálny 
a pre každé pohlavie zvláš ť nemá presahova ť ± 20 % priemernej hmotnosti 
všetkých zvierat v štúdii. Zvieratá by mali by ť postupne zadelené do 
kontrolných a testovaných skupín. Po randomizácii by medzi jednotlivými skupinami v rámci každého pohlavia nemali by ť výrazné rozdiely 
v priemernej telesnej hmotnosti. Ak existujú štatisticky významné rozdiely, 
randomizácia by sa pod ľa možnosti mala zopakova ť. Každému zviera ťu sa 
pridelí jedine čné identifika čné číslo, ktorým sa zviera trvalo ozna čí tetova­
ním, mikro čipovým implantátom alebo inou vhodnou metódou.
 
POSTUP  
Počet zvierat a ich pohlavie  
19. Použijú sa obe pohlavia. Použije sa dostato čný počet zvierat, aby bolo 
možné dôkladné biologické a štatistické hodnotenie. V prípade hlodavcov 
by preto v každej skupine s dávkou (ako sa uvádza v odseku 22) a v 
súbežnej kontrolnej skupine ur čenej pre fázu karcinogenity tejto štúdie 
malo byť minimálne 50 zvierat z každého pohlavia. V závislosti od cie ľa 
štúdie je možné zvýši ť štatistickú významnos ť kľúčových odhadov tak, že 
sa zvieratá nerovnomerne rozdelia do jednotlivých skupín s dávkami, pri čom 
v skupinách s nízkou dávkou bude viac ako 50 zvierat, napr. pri odhadovaní karcinogénneho potenciálu pri nízkych dávkach. Treba však uzna ť, že 
miernym zvýšením po čtu zvierat v skupine sa dosiahne pomerne nízke 
zvýšenie štatistickej významnosti štúdie. V každej skupine s dávkou (ako 
sa uvádza v odseku 22) a v súbežnej kontrolnej skupine ur čenej pre fázu
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
chronickej toxicity štúdie by v prípade hlodavcov malo by ť minimálne desa ť 
zvierat z každého pohlavia. Treba poznamena ť, že tento po čet je nižší ako 
pri štúdii chronickej toxicity (kapitola B.30 tejto prílohy). Interpretácia údajov zo zníženého po čtu zvierat v skupine vo fáze chronickej toxicity 
tejto kombinovanej štúdie však bude podložená údajmi z vä čšieho počtu 
zvierat vo fáze karcinogenity štúdie. V štúdiách, v ktorých sa využívajú 
myši, môže by ť na uskuto čnenie všetkých požadovaných hematologických 
vyšetrení potrebné vo fáze chronickej toxicity použi ť v každej skupine 
s dávkou viac zvierat. Ďalšie informácie o štatistickom plánovaní štúdie 
a výbere úrovní dávok s cie ľom maximalizova ť štatistickú významnos ť sú 
k dispozícii v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7).
 
Zabezpečenie priebežného utrácania, satelitnej skupiny a sentinelových 
zvierat  
20. Ak je to vedecky opodstatnené, v štúdii sa môže po čítať s priebežným 
utrácaním, napr. po šiestich mesiacoch pre fázu chronickej toxicity, s cieľom získa ť informácie o progresii nenádorových zmien 
a mechanistické informácie. Ak už takéto informácie o testovanej chemikálii 
sú k dispozícii z predchádzajúcich štúdií toxicity v opakovaných dávkach, 
priebežné utrácanie zvierat nie je vedecky opodstatnené. Zvieratá použité vo fáze chronickej toxicity štúdie, zvy čajne v trvaní 12 mesiacov (odsek 34), 
poskytujú údaje o priebežnom utrácaní pre fázu karcinogenity štúdie, čím sa 
dosiahne zníženie celkového po čtu použitých zvierat. Vo fáze chronickej 
toxicity štúdie možno použi ť aj satelitné skupiny na monitorovanie reverzi ­
bility akýchko ľvek toxikologických zmien spôsobených skúmanou testo ­
vanou chemikáliou. Tieto skupiny sa môžu obmedzova ť na najvyššiu úrove ň 
dávky v štúdii a na kontrolu. Na monitorovanie stavu choroby možno po čas 
štúdie v prípade potreby použi ť ďalšiu skupinu sentinelových zvierat (zvy ­ 
čajne päť zvierat z každého pohlavia) (30). Ďalšie usmernenia o príprave 
štúdie s cie ľom zahrnú ť priebežné utrácanie, satelitné a sentinelové zvieratá 
a súčasne minimalizova ť celkový po čet použitých zvierat sú uvedené 
v usmerňovacom dokumente č. 116 (7). 
21. Ak sa v rámci štúdie plánuje použitie satelitných zvierat a/alebo priebežné 
utrácanie zvierat, v každej skupine s dávkou zahrnutej na tento ú čel je 
zvyčajne desa ť zvierat z každého pohlavia, pri čom celkový po čet zvierat 
zahrnutých v pláne štúdie by sa mal zvýši ť o počet zvierat, ktoré majú by ť 
utratené pred dokon čením štúdie. Priebežne utratené zvieratá a satelitné 
zvieratá sa zvy čajne podrobia tým istým pozorovaniam vrátane pozorovaní 
telesnej hmotnosti, spotreby potravy/vody, hematologickým meraniam 
a meraniam klinickej biochémie a patologickým vyšetreniam ako zvieratá 
vo fáze chronickej toxicity v rámci základnej štúdie, hoci sa takisto môže 
zabezpečiť, aby sa (v skupinách, v ktorých sa plánuje priebežné utrácanie 
zvierat) merania obmedzili na špecifické k ľúčové ukazovatele, ako je neuro ­
toxicita alebo imunotoxicita.  
Skupiny s dávkami a dávkovanie  
22. Usmernenia o všetkých aspektoch výberu dávky a odstupoch medzi jedno ­
tlivými úrov ňami dávok sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). 
Pre fázu chronickej toxicity aj fázu karcinogenity sa použijú aspo ň tri 
veľkosti dávok a vykoná sa paralelná kontrola. Úrove ň dávky zvy čajne 
vychádza z výsledkov krátkodobých štúdií v opakovaných dávkach alebo štúdií na zistenie rozsahu, pri čom je potrebné prihliada ť na existujúce toxi ­
kologické a toxikokinetické údaje, ktoré sú o testovanej chemikálii alebo 
príbuzných chemikáliách k dispozícii.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Pre fázu chronickej toxicity štúdie nemusí by ť potrebné vykona ť kompletnú 
štúdiu s využitím troch úrovní dávok, ak sa predpokladá, že test pri jednej 
úrovni dávky zodpovedajúcej najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň 
pravdepodobne nespôsobí nepriaznivé ú činky. Toto rozhodnutie musí by ť 
založené na informáciách z predbežných štúdií a zvážení skuto čnosti, že 
podľa údajov o štrukturálne príbuzných chemikáliách sa toxicita neo čakáva. 
Uplatňuje sa limit 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň s výnimkou prípadu, 
keď expozícia človeka indikuje potrebu použitia vyššej úrovne dávky. 
24. Pokia ľ to dovo ľuje fyzikálno-chemický charakter alebo biologické ú činky 
testovanej chemikálie, na identifikáciu hlavných cie ľových orgánov 
a toxických ú činkov by sa mala vybra ť najvyššia úrove ň dávky, ktorá 
súčasne nebude ma ť za následok utrpenie, závažnú toxicitu, morbiditu 
alebo uhynutie. Zvy čajne sa vyberie najvyššia úrove ň dávky preukazujúca 
toxicitu, o ktorej sved čí napríklad pokles prírastku telesnej hmotnosti (o 
približne 10 %). V závislosti od cie ľov štúdie (pozri odsek 6) však 
možno vybra ť najvyššiu dávku, ktorá je nižšia ako dávka preukazujúca 
toxicitu, napr. ak dávka vyvoláva daný nepriaznivý ú činok, ktorý má však 
malý vplyv na d ĺžku života alebo na telesnú hmotnos ť. 
25. Úrovne dávok a odstupy medzi úrov ňami dávok možno vybra ť s cieľom 
určiť vzťah medzi dávkou a reakciou a v závislosti od druhu pôsobenia 
testovanej chemikálie hladinu NOAEL alebo iný plánovaný výsledok štúdie, napr. BMD (pozri odsek 27). Medzi faktory, ktoré by sa mali zváži ť pri 
podávaní nižších dávok, patrí predpokladaný sklon krivky závislosti reakcie 
od dávky, dávky, pri ktorých môže dochádza ť k významným zmenám 
v metabolizme alebo druhu toxického pôsobenia, ke ď sa o
čakáva prahová 
hodnota alebo ke ď sa očakáva východisko pre extrapoláciu nízkej dávky. Pri 
kombinovanej štúdii karcinogenity/chronickej toxicity je primárnym cie ľom 
získať informácie na ú čely hodnotenia rizika karcinogenity, pri čom infor­
mácie o chronickej toxicite sú zvy čajne vedľajším cieľom. Tento fakt treba 
mať pri výbere úrovní dávok a odstupov medzi úrov ňami dávok v štúdii na 
pamäti. 
26. Vybraté odstupy medzi úrov ňami dávok budú závisie ť od cieľov štúdie 
a vlastností testovanej chemikálie a nemožno ich v rámci tejto testovacej metódy podrobne predpísa ť, ale dobrá ú činnosť testov sa často dosahuje, ak 
sa na stanovenie zostupného dávkovania použijú intervaly dávkovania 
s faktorom dva až štyri, pri čom pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často 
vhodnejšie ako používanie ve ľmi veľkých intervalov (napr. s faktorom 
vyšším ako 6 – 10) medzi dávkami. Vo všeobecnosti by sa nemali používa ť 
faktory vyššie ako 10 a v prípade, že sa použijú, je nutné tento postup 
odôvodni ť. 
27. Ako sa ďalej uvádza v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7), pri výbere 
dávky je potrebné zváži ť tieto body: 
— známe alebo predpokladané nelinearity alebo inflexné body krivky závi ­
slosti reakcie od dávky, 
— toxikokinetika a rozsahy dávok, pri ktorých dochádza alebo nedochádza 
k metabolickej indukcii, nasýteniu alebo nelinearite medzi externými 
a internými dávkami, 
— prekurzorné poškodenia, markery ú činkov alebo ukazovatele prebiehajú ­
cich kľúčových základných biologických procesov,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— kľúčové (alebo predpokladané) aspekty druhu pôsobenia, ako sú dávky, 
pri ktorých za čína vznika ť cytotoxicita, narúšajú sa hormonálne hladiny, 
preťažujú sa homeostatické mechanizmy at ď., 
— oblasti krivky závislosti reakcie od dávky, kde je potrebný ve ľmi 
podrobný odhad, napr. v oblasti predpokladanej dávky BMD alebo pred ­
pokladanej prahovej úrovne, 
— zváženie o čakávaných úrovní expozície človeka, najmä pri výbere stred ­
ných a nízkych dávok. 
28. Kontrolnou skupinou je skupina, ktorá nebola vystavená ú činkom chemiká ­
lie, alebo skupina, ktorej sa podáva nosi č, ak sa pri podávaní testovanej 
chemikálie používa nosi č. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaob ­
chádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou 
aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa použije nosi č, kontrolná skupina 
dostane nosi č v najvyššom objeme, aký bol použitý pri skupinách 
s dávkami. Ak sa testovaná chemikália podáva v potrave a vedie k výraznému zníženiu príjmu potravy v dôsledku zvýšeného nechutenstva, 
môže byť užitočné použiť ďalšiu súčasne kŕmenú kontrolnú skupinu, ktorá 
poslúži ako vhodnejšia kontrola.
 
Príprava dávok a podávanie testovanej chemikálie  
29. Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva orálne, v potrave alebo pitnej 
vode alebo cez sondu. Ďalšie informácie o spôsoboch a metódach podávania 
sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). Spôsob a metóda podá ­
vania závisí od ú čelu štúdie, fyzikálnych/chemických vlastností testovanej 
chemikálie, jej biodostupnosti a prevládajúceho spôsobu a metódy expozície 
u človeka. Vybratý spôsob a metódu podávania je potrebné odôvodni ť. 
V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá sa orálna 
sonda zvy čajne zvolí iba v prípade látok, pri ktorých spôsob a metóda 
podávania primerane reprezentuje potenciálnu expozíciu u človeka (napr. 
v prípade liekov). Potravinové alebo environmentálne chemikálie obsahujúce pesticídy sa zvy čajne podávajú v potrave alebo v pitnej vode. V ur čitých 
prípadoch, napr. v prípade expozície na pracovisku, však môže by ť vhod­
nejšie podanie iným spôsobom. 
30. Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo 
vhodnom nosi či. Náležitá pozornos ť by sa mala venova ť nasledujúcim vlast ­
nostiam nosi ča a ostatným aditívam: vplyv na absorpciu, distribúciu, meta ­
bolizmus alebo zadržiavanie testovanej chemikálie, vplyvy na chemické 
vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeni ť svoje toxické vlastnosti, 
vplyv na spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Odporú ča sa, 
aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/ 
suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuri čný olej) a nakoniec 
prípadného roztoku v iných nosi čoch. Charakteristiky toxicity nosi čov iných 
ako voda musia by ť známe. Musia by ť k dispozícii informácie o stabilite 
testovanej chemikálie a homogenite dávkovacích roztokov alebo krmív (podľa potreby) v podmienkach podávania (napr. v potrave). 
31. V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité 
zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. V dlhodobých štúdiách toxicity, pri ktorých sa využíva podávanie v potrave, by koncentrácia testovanej chemikálie v krmive zvy čajne nemala presiahnu ť horný limit 5 % 
z celkového množstva krmiva, aby sa zabránilo nutri čnej nevyváženosti. 
Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použi ť buď 
konštantná stravná koncentrácia (mg/kg potravy alebo ppm) alebo 
konštantná úrove ň dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa (mg/kg 
telesnej hmotnosti), ktorá sa vypo číta každý týžde ň. Použitú alternatívu je 
potrebné špecifikova ť. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. V prípade orálneho podávania sa zvieratám podávajú dávky testovanej 
chemikálie denne (sedem dní v týždni) po čas 12 mesiacov (fáza chronickej 
toxicity) alebo 24 mesiacov (fáza karcinogenity), pozri aj odseky 33 a 34. Použitie každého iného režimu dávkovania, napr. pä ť dní v týždni, sa musí 
odôvodni ť. V prípade podávania cez kožu sa zvieratám zvy čajne aplikuje 
testovaná chemikália najmenej šes ť hodín denne, sedem dní v týždni, ako je 
uvedené v kapitole B.9 tejto prílohy (11), po čas 12 mesiacov (fáza chro ­
nickej toxicity) alebo 24 mesiacov (fáza karcinogenity). Inhala čná expozícia 
sa vykonáva šes ť hodín denne, sedem dní v týždni, ale ak je to odôvodnené, 
môže sa použi ť aj expozícia po čas piatich dní v týždni. Obdobie expozície 
zvyčajne trvá 12 mesiacov (fáza chronickej toxicity) alebo 24 mesiacov 
(fáza karcinogenity). Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť 
s cieľom minimalizova ť druhovo špecifické utrpenie. Ak sa použije expo ­
zícia v trvaní menej ako šes ť hodín denne, treba uvies ť odôvodnenie. Pozri 
aj kapitolu B.8 tejto prílohy (9). 
33. Ak sa testovaná chemikália zvieratám podáva cez sondu, podáva sa 
prostredníctvom žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly približne 
v rovnakom čase každý de ň. Zvyčajne sa podáva jedna dávka raz za de ň. 
Ak je napríklad chemikália lokálne dráždivá, je možné zachova ť dennú 
dávku tak, že sa rozdelí a podá v dvoch častiach (dvakrát denne). Maxi ­
málny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od 
veľkosti pokusného zviera ťa. Objem by mal by ť podľa možnosti čo najnižší 
a v prípade hlodavcov by zvy čajne nemal presahova ť 1 ml/100 g telesnej 
hmotnosti (31). Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa 
koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpe čil stály objem vo všetkých 
dávkach. Výnimkou sú potenciálne žieravé alebo dráždivé chemikálie, ktoré je nutné zriedi ť, aby sa predišlo závažným lokálnym ú činkom. Nemalo 
by sa testova ť
 pri koncentráciách, ktoré sú pravdepodobne žieravé alebo 
dráždivé pre gastrointestinálny trakt.  
Trvanie štúdie  
34. Obdobie dávkovania a trvanie fázy chronickej toxicity je zvy čajne 12 mesia ­
cov, hoci plán štúdie možno použi ť aj pri štúdiách s kratším (napr. šes ť 
alebo devä ť mesiacov) alebo dlhším trvaním (napr. 18 alebo 24 mesiacov) 
v závislosti od požiadaviek konkrétnych regula čných režimov alebo špeci ­
fických mechanistických ú čelov. Odchýlky od 12-mesa čného trvania expo ­
zície je potrebné odôvodni ť, najmä v prípade kratších trvaní. Všetky skupiny 
s dávkami umiestnené v tejto fáze budú ukon čené v plánovanom čase na 
účely hodnotenia chronickej toxicity a nenádorovej patológie. Satelitné 
skupiny zahrnuté s cie ľom monitorova ť reverzibilitu všetkých toxikologic ­
kých zmien spôsobených skúmanou testovanou chemikáliou by sa mali zachovať bez dávkovania po čas najmenej štyroch týžd ňov a najviac po čas 
jednej tretiny celkového trvania štúdie po ukon čení expozície. 
35. Fáza karcinogenity tejto štúdie v prípade hlodavcov zvy čajne trvá 24 mesia ­
cov, čo predstavuje vä čšiu časť normálnej d ĺžky života zvierat, ktoré sa 
majú použi ť. V závislosti od d ĺžky života kme ňa živočíšneho druhu 
v štúdii možno použi ť aj kratšie alebo dlhšie trvanie, ale tento postup je 
nutné odôvodni ť. V prípade ur čitých kme ňov myší, napr. kme ňov AKR/J, 
C3H/J alebo C57BL/6J, môže by ť vhodná štúdia v trvaní 18 mesiacov. 
Nasledujúce informácie poskytujú usmernenia k trvaniu, ukon čeniu štúdie 
a prežitiu. Ďalšie usmernenia vrátane úvah o prijate ľnosti negatívnej štúdie 
karcinogenity v súvislosti s prežitím po čas štúdie sú uvedené 
v Usmerňovacom dokumente č. 116 o príprave a vykonávaní štúdií chro ­
nickej toxicity a karcinogenity (7):  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Ukon čenie štúdie treba zváži ť, ak počet zvierat, ktoré prežili v skupinách 
s nižšou dávkou alebo v kontrolnej skupine, klesne pod 25 %. 
— Ak v dôsledku toxicity pred časne uhynie iba skupina s vysokou dávkou, 
štúdia by sa nemala ukon čiť. 
— Prežitie sa pri jednotlivých pohlaviach posudzuje samostatne. — Trvanie štúdie by nemalo presiahnu ť hranicu, pri ktorej už údaje získané 
pomocou štúdie neposta čujú na vykonanie štatisticky platného hodnote ­
nia.
 
POZOROVANIA (FÁZA CHRONICKEJ TOXICITY) 
36. Pri všetkých zvieratách si treba všíma ť morbiditu alebo mortalitu, zvy čajne 
na začiatku a na konci každého d ňa vrátane víkendov a sviatkov. Všeobecné 
klinické pozorovania sa vykonávajú najmenej raz denne, najlepšie každý 
deň v rovnakom čase, vzhľadom na časový vrchol o čakávaných ú činkov 
po dávkovaní v prípade podávania cez sondu. 
37. Všetky zvieratá sa pred prvou expozíciou najmenej raz podrobia dôkladným 
klinickým pozorovaniam (aby sa umožnilo porovnávanie jednotlivých 
zvierat navzájom), potom na konci prvého týžd ňa štúdie a následne každý 
mesiac. Protokol o pozorovaniach musí by ť pripravený tak, aby sa rozdiely 
medzi jednotlivými pozorovate ľmi minimalizovali a neboli závislé od testo ­
vacej skupiny. Tieto pozorovania sa vykonávajú mimo domovskej klietky, 
radšej v štandardnej aréne a v podobnom čase pri každej príležitosti. Musia 
byť pozorne zaznamenané, pokia ľ možno s použitím hodnotiaceho systému 
explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné minimalizova ť 
odlišnosti v podmienkach pozorovaní. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si 
všímať, patria zmeny na koži, srsti, o čiach, sliznici, výskyt sekrécie, 
exkrécie a vegetatívnej aktivity (napr. slzenie, piloerekcia, ve ľkosť zreničiek, 
nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vy čerpávajúce. Zmeny 
v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnos ť klonic­
kých alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. opakované to čenie sa), 
prílišné ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaz ­
netvorenie) sa takisto musia zaznamena ť (32). 
38. Pred prvým podaním testovanej chemikálie sa pri všetkých zvieratách 
vykoná oftalmologické vyšetrenie pomocou oftalmoskopu alebo iného vhod ­
ného zariadenia. Na konci štúdie sa toto vyšetrenie pod ľa možnosti vykoná 
pri všetkých zvieratách, ale minimálne pri zvieratách v skupine s vysokou dávkou a zvieratách v kontrolnej skupine. Ak sa po vystavení zvierat účinkom látky zistia zmeny na o čiach, musia by ť vyšetrené všetky zvieratá. 
Ak štrukturálna analýza alebo iné informácie indikujú toxicitu o čí, potom je 
potrebné zvýši ť frekvenciu o č
ných vyšetrení. 
39. V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-d ňové a/alebo 90- 
dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvola ť 
neurotoxické ú činky, sa môže nepovinne vykona ť určenie zmyslovej reak ­
tivity podnecovanej rôznymi spôsobmi (32) (napr. zvukovými, zrakovými 
a proprioceptívnymi podnetmi) (33) (34) (35), hodnotenie sily zovretia (36) 
a hodnotenie motorickej aktivity (37), a to pred za čiatkom štúdie a každé tri 
mesiace po za čatí štúdii po čas až 12 mesiacov, ako aj pri ukon čení štúdie 
(ak štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). Ďalšie podrobnosti o postupoch, 
ktoré môžu nasledova ť, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však 
použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. V prípade chemikálií, pri ktorých predchádzajúce 28-d ňové a/alebo 90- 
dňové testy toxicity v opakovaných dávkach indikovali potenciál vyvola ť 
imunotoxické ú činky, možno nepovinne na konci testu vykona ť ďalšie 
vyšetrenia tohto parametra.  
Telesná hmotnos ť, spotreba potravy/vody a ú činnosť krmiva  
41. Všetky zvieratá sa odvážia na za čiatku testu, najmenej raz týždenne po čas 
prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy 
a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týžde ň počas prvých 13 
týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália 
podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týžde ň 
počas prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania 
spotreby vody by sa mali zváži ť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení 
pitný režim.  
Hematológia a klinická biochémia  
42. V štúdiách využívajúcich hlodavce sa hematologické vyšetrenia vykonajú 
pri všetkých zvieratách v štúdii (desiatich samcoch a desiatich samiciach v každej skupine), a to po 3, 6 a 12 mesiacoch, a takisto na konci štúdie (ak 
štúdia trvá dlhšie ako 12 mesiacov). V prípade myší môžu by ť na uskuto č­
nenie všetkých požadovaných hematologických vyšetrení potrebné satelitné zvieratá (pozri odsek 19). V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu po čtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám 
z každého pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na 
odber vzoriek a na konci štúdie, podobne ako sa uvádza pri štúdiách hlodav ­
cov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je nutné vykona ť merania po 
troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 90-d ňovej štúdii vykonanej pri 
porovnate ľných úrovniach dávok nebol na hematologických parametroch 
pozorovaný žiadny ú činok. Vzorky krvi sa odoberajú v anestézii zo stano ­
veného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej o čnicovej 
dutiny. 
43. Je potrebné vyšetri ť tieto parametre (38): celkový a diferenciálny po čet 
leukocytov, po čet erytrocytov, po čet trombocytov, koncentrácia hemoglo ­
bínu, hematokrit, stredný objem erytrocytu (MCV), stredná koncentrácia 
hemoglobínu v erytrocyte (MCH), stredná farebná koncentrácia hemoglobínu (MCHC), protrombínový čas a aktivovaný parciálny trombo ­
plastínový čas. Podľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej chemi ­
kálie môžu mera ť ďalšie hematologické parametre, ako sú Heinzove telieska 
alebo iná atypická morfológia erytrocytov alebo methemoglobín. Vo všeo ­
becnosti treba zauja ť flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo 
očakávaného ú činku danej testovanej chemikálie. Ak má testovaná chemi ­
kália vplyv na hematopoetický systém, môže by ť indikovaný aj po čet reti­
kulocytov a cytológia kostnej drene, hoci tieto vyšetrenia sa bežne nemusia vykonáva ť. 
44. Klinická biochémia skúma hlavné toxické ú činky na tkanivá a najmä ú činky 
na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskuto čňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa 
odoberú všetkým zvieratám v štúdii (desiatim samcom a desiatim samiciam 
z každej skupiny) v tých istých časových intervaloch, ako je špecifikované 
pre hematologické vyšetrenia. V prípade myší môžu by ť
 na uskuto čnenie 
všetkých požadovaných vyšetrení klinickej biochémie potrebné satelitné zvieratá. V prípade štúdií nehlodavcov sa vzorky odoberú menšiemu 
počtu zvierat (napr. v prípade štúdií psov štyrom zvieratám z každého 
pohlavia v každej skupine), a to v priebežných časoch na odber vzoriek 
a na konci štúdie, ako sa uvádza pri štúdiách hlodavcov. Pri hlodavcoch ani nehlodavcoch nie je nutné vykona ť merania po troch mesiacoch, ak 
v predchádzajúcej 90-d ňovej štúdii vykonanej pri porovnate ľných úrovniach 
dávok nebol na parametroch klinickej biochémie pozorovaný žiadny ú činok.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
Odporúča sa, aby sa zvieratá (s výnimkou myší) noc pred odobratím vzoriek 
krvi nekŕmili (  1 ). Je potrebné vyšetri ť tieto parametre (38): glukóza, mo čo­
vina (mo čovinový dusík), kreatinín, celkový obsah bielkovín, albumín, 
vápnik, sodík, draslík, celkový cholesterol, najmenej dva vhodné testy na hepatocelulárne hodnotenie (alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotrans ­
feráza, glutamát-dehydrogenáza, celkový obsah žl čových kyselín) (39) 
a najmenej dva vhodné testy na hepatobiliárne hodnotenie (alkalín-fosfatáza, gama-glutamyl-transferáza, 5-nukleotidáza, celkový bilirubín, celkový obsah žlčových kyselín) (39). Pod ľa potreby sa v závislosti od toxicity testovanej 
chemikálie môžu mera ť ďalšie parametre klinickej chémie, ako je hladina 
triglyceridov nala čno, špecifické hormóny a cholínsteráza. Vo všeobecnosti 
treba zauja ť flexibilný postoj v závislosti od pozorovaného a/alebo o čaká­
vaného ú činku danej testovanej chemikálie. 
45. Rozbor mo ču sa vykonáva pri všetkých zvieratách v štúdii (desiatich 
samcoch a desiatich samiciach v každej skupine) zo vzoriek odobratých 
v rovnakých intervaloch ako v prípade hematológie a klinickej chémie. 
Nie je nutné vykona ť merania po troch mesiacoch, ak v predchádzajúcej 
90-dňovej štúdii vykonanej pri porovnate ľných úrovniach dávok nebol 
v rozbore mo ču pozorovaný žiadny ú činok. Do odborného odporú čania 
pre štúdie klinickej patológie bol zahrnutý tento zoznam parametrov (38): 
vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, celkový obsah biel ­
kovín a glukóza. Medzi ostatné parametre patria ketón, urobilinogén, bili ­
rubín a okultné krvácanie. Ďalšie parametre sa môžu použi ť, ak je potrebné 
rozšíriť vyšetrovanie pozorovaných ú činkov. 
46. Vo všeobecnosti je potrebné ur čiť základné hematologické ukazovatele 
a ukazovatele klinickej biochémie pred za čatím testovania v štúdiách 
psov, ale nemusia sa ur čiť v štúdiách hlodavcov (38). Ak však historické 
základné údaje (pozri odsek 58) nie sú adekvátne, treba uvažova ť o získaní 
týchto údajov.
 
PATOLÓGIA  
Makroskopická pitva  
47. Všetky zvieratá v štúdii sa zvy čajne podrobujú kompletnej podrobnej 
makroskopickej pitve, ktorá zah ŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu 
tela, všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich 
obsahu. Môžu sa však takisto zabezpe čiť (v prípade priebežného utrácania 
alebo satelitných skupín), aby sa merania obmedzovali na špecifické 
kľúčové ukazovatele, ako je neurotoxicita alebo imunotoxicita (pozri 
odsek 21). Tieto zvieratá sa nemusia podrobi ť pitve ani ďalším postupom 
opísaným v nasledujúcich odsekoch. Pri sentinelových zvieratách môže by ť 
v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne 
vedúci štúdie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Pri mnohých meraniach v sére a plazme, najmä glukózy, sa uprednost ňuje nepodávanie 
potravy cez noc pred odberom. Hlavným dôvodom je zvýšenie pravdepodobnosti kolí ­
sania hodnôt ako nevyhnutný dôsledok prijímania potravy. Môže to vies ť k zakrytiu 
jemnejších ú činkov a s ťaží to interpretáciu. Treba však poznamena ť, že nočný pôst 
môže rušivo vplýva ť na celkový metabolizmus zvierat a čiastočne aj na štúdie výživy, 
a môže to ruši ť aj dennú expozíciu testovanej chemikálii. Všetky zvieratá by sa mali 
posudzova ť v rovnakých fyziologických podmienkach, a preto by sa podrobné alebo 
neurologické hodnotenia pod ľa možnosti mali naplánova ť na iný de ň ako odber vzoriek 
na klinickú biochémiu.
 48. Orgánové hmotnosti by sa mali zisti ť pri všetkých zvieratách, s výnimkou 
tých, ktoré sú vylú čené podľa ďalšej časti odseku 47. Nadobli čky, mozog, 
nadsemenníky, srdce, obli čky, pečeň, vaječníky, slezina, semenníky, štítna 
žľaza (vážená po fixácii, s prištítnymi telieskami) a maternica zo všetkých 
zvierat (okrem tých, pri ktorých sa zistilo chradnutie alebo ktoré sa prie ­
bežne utratili) by sa mali upravi ť na priľnavej tkanine a je potrebné čo 
najrýchlejšie po disekcii zisti ť ich mokrú hmotnos ť, aby sa predišlo 
vyschnutiu. 
49. Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom médiu na 
obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (40) (vyšet ­
renia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné): 
Všetky makroskopické 
poškodenia srdce pankreas žalúdok (predný žalúdok, 
žľaznatý žalúdok) 
nadoblička ileum prištítne teliesko [zuby] 
aorta la čník periférny nerv semenníky 
mozog (vrátane častí pred­
ného mozgu, mozo čka 
a predĺženej miechy/mosta) oblička hypofýza týmus 
slepé črevo slzná ž ľaza (extraorbi ­
tálna) prostata štítna ž ľaza 
krčok maternice pe čeň rektum [jazyk] 
koagulačná žľaza p ľúca slinná ž ľaza priedušnica 
hrubé črevo lymfatické uzliny 
(povrchové aj hlboké) semenný mechúrik mo čový mechúr 
dvanástnik prsná ž ľaza (povinné pri 
samiciach, a ak je 
zrejmé, že možno urobi ť 
disekciu, aj pri samcoch) kostrové svaly maternica (vrátane kr čka 
maternice) 
nadsemenníky [horný dýchací trakt 
vrátane nosa, nosových 
mušlí a prínosových dutín] koža [mo čovod] 
oko (vrátane sietnice) pažerák miecha (na troch úrov ­
niach: kr čnej, hrudnej 
a lumbálnej) [močová rúra] 
[stehnová kos ť s kĺbom] [ čuchový bulbus] slezina vagína 
žlčník (v prípade iných 
druhov zvierat ako potkany) vaječníky [hrudná kos ť] prierez kostnej drene a/alebo 
čerstvý aspirát kostnej drene 
Harderova ž ľaza
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky a nadobli čky, sa 
zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynú ť 
potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachova ť všetky 
orgány, ktoré vzh ľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno 
považova ť za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva 
dermálne, sa vyšetria tie isté orgány ako v prípade orálneho podávania, 
pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože 
z miesta aplikácie chemikálie. V inhala čných štúdiách sa zoznam zachova ­
ných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporú čaní 
kapitoly B.8 tejto prílohy (9) a kapitoly B.29 tejto prílohy (10). Pokia ľ ide 
o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho traktu), je potrebné vyšetri ť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
 
Histopatológia  
50. K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikolo ­
gickej patológie (40). Histopatologickým vyšetreniam sa podrobia mini ­
málne: 
— všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín, 
— všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu 
štúdie, 
— všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality, 
— cieľové tkanivá alebo tkanivá, ktoré v skupinách s vysokou dávkou 
vykazujú zmeny spôsobené aplikáciou chemikálie, zo všetkých zvierat 
zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, 
— v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky alebo nadobli čky, 
sa vyšetria obidva orgány.  
POZOROVANIA (FÁZA KARCINOGENITY) 
51. Pri všetkých zvieratách si treba všíma ť morbiditu alebo mortalitu, zvy čajne 
na začiatku a na konci každého d ňa vrátane víkendov a sviatkov. Pri zvie ­
ratách sa navyše raz denne kontrolujú špecifické príznaky, ktoré majú toxi ­
kologický význam. V prípade štúdií, v ktorých sa chemikália podáva cez 
sondu, sa zvieratá kontrolujú okamžite po podaní dávky. Osobitnú pozor ­
nosť treba venova ť tvorbe nádorov. Čas nástupu nádoru, lokalizáciu, 
rozmery, vzh ľad a progresiu každého výrazne vidite ľného alebo hmatate ľ­
ného nádoru je nutné zaznamena ť. 
52. Všetky zvieratá sa odvážia na za čiatku testu, najmenej raz týždenne po čas 
prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Spotreba potravy 
a účinnosť krmiva sa merajú najmenej raz za týžde ň počas prvých 13 
týždňov a následne najmenej raz za mesiac. Ak sa testovaná chemikália 
podáva vo vode na pitie, spotreba vody sa meria najmenej raz za týžde ň 
počas prvých 13 týžd ňov a následne najmenej raz za mesiac. Merania 
spotreby vody by sa mali zváži ť aj v prípade štúdií, pri ktorých sa mení 
pitný režim.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematológia, klinická biochémia a iné merania  
53. S cie ľom maximalizova ť informácie získané pomocou štúdie, najmä pokia ľ 
ide o úvahy týkajúce sa druhu pôsobenia, možno odobra ť vzorky krvi na 
hematológiu a klinickú biochémiu, pri čom rozhodnutie o tomto kroku ostáva 
na vedúcom štúdie. Takisto môže by ť vhodné urobi ť rozbor mo ču. Údaje 
o zvieratách použitých vo fáze chronickej toxicity štúdie, zvy čajne v trvaní 
12 mesiacov (odsek 34), o týchto parametroch poskytnú informácie. Ďalšie 
usmernenia o význame odberu takýchto vzoriek v rámci štúdie karcinoge ­
nity sú uvedené v usmer ňovacom dokumente č. 116 (7). Ak sa odoberú 
vzorky krvi, mali by sa odobera ť na konci testovacieho obdobia hne ď pred 
utratením alebo po čas utrácania zvierat. Odoberajú sa v anestézii zo stano ­
veného miesta, napríklad vpichom do srdca alebo zo zadnej o čnicovej 
dutiny. Takisto je možné na vyšetrenie pripravi ť krvné stery, najmä ak sa 
zdá, že kostná dre ň je cieľovým orgánom, hoci význam takéhoto vyšetrenia 
krvných sterov vo fáze karcinogenity pri hodnotení karcinogénneho/onko ­
génneho potenciálu sa spochybnil (38).  
PATOLÓGIA  
Makroskopická pitva  
54. Všetky zvieratá v štúdii s výnimkou sentinelových zvierat a ostatných sate ­
litných zvierat (pozri odsek 20) sa podrobujú kompletnej podrobnej makro ­
skopickej pitve, ktorá zah ŕňa dôkladné skúmanie vonkajšieho povrchu tela, 
všetkých telesných otvorov a lebe čnej, hrudnej a brušnej dutiny a ich 
obsahu. Pri sentinelových a ostatných satelitných zvieratách môže by ť 
v závislosti od konkrétneho prípadu potrebná pitva, o ktorej rozhodne 
vedúci štúdie. Orgánové hmotnosti zvy čajne nie sú sú časťou štúdie karci ­
nogenity, ke ďže geriatrické zmeny a v neskorších štádiách tvorba nádorov 
znehodnocujú užito čnosť údajov o orgánových hmotnostiach. Môžu však 
mať veľký význam pri hodnotení váhy dôkazov, najmä v rámci úvah 
o druhu pôsobenia. Ak sú sú časťou satelitnej štúdie, zozbierajú sa najneskôr 
do jedného roka od za čatia štúdie. 
55. Tieto tkanivá by sa mali uchováva ť v čo najvhodnejšom fixa čnom médiu na 
obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (40) (vyšet ­
renia tkanív v hranatých zátvorkách sú nepovinné): 
Všetky makroskopické 
poškodenia srdce pankreas žalúdok (predný žalúdok, 
žľaznatý žalúdok) 
nadoblička ileum prištítne teliesko [zuby] 
aorta la čník periférny nerv semenníky 
mozog (vrátane častí pred­
ného mozgu, mozo čka 
a predĺženej miechy/mosta) oblička hypofýza týmus 
slepé črevo slzná ž ľaza (extraorbi ­
tálna) prostata štítna ž ľaza 
krčok maternice pe čeň rektum [jazyk] 
koagulačná žľaza p ľúca slinná ž ľaza priedušnica 
hrubé črevo lymfatické uzliny 
(povrchové aj hlboké) semenný mechúrik mo čový mechúr  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
dvanástnik prsná ž ľaza (povinné pri 
samiciach, a ak je 
zrejmé, že možno urobi ť 
disekciu, aj pri samcoch) kostrové svaly maternica (vrátane kr čka 
maternice) 
nadsemenníky [horný dýchací trakt 
vrátane nosa, nosových 
mušlí a prínosových 
dutín] koža [mo čovod] 
oko (vrátane sietnice) pažerák miecha (na troch úrov ­
niach: kr čnej, hrudnej 
a lumbálnej) [močová rúra] 
[stehnová kos ť s kĺbom] [ čuchový bulbus] slezina vagína 
žlčník (v prípade iných 
druhov zvierat ako potkany) vaječníky [hrudná kos ť] prierez kostnej drene a/alebo 
čerstvý aspirát kostnej drene 
Harderova ž ľaza 
V prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky a nadobli čky, sa 
zachovajú obidva orgány. Z klinických a iných nálezov môže vyplynú ť 
potreba vyšetrenia ďalších tkanív. Takisto by sa mali zachova ť všetky 
orgány, ktoré vzh ľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno 
považova ť za cieľové orgány. V štúdiách, v ktorých sa chemikália podáva 
dermálne, sa vyšetria tie isté orgány ako v prípade orálneho podávania, pričom je nevyhnutný špecifický odber vzorky a zachovanie kože 
z miesta aplikácie chemikálie. V inhala čných štúdiách sa zoznam zachova ­
ných a skúmaných tkanív dýchacieho traktu zostaví na základe odporú čaní 
kapitoly B.8 tejto prílohy (8) a kapitoly B.29 tejto prílohy (9). Pokia ľ ide 
o orgány/tkanivá (a popri špecificky uchovávaných tkanivách dýchacieho 
traktu), je potrebné vyšetri ť tie isté orgány ako v prípade orálnej expozície.
 
Histopatológia  
56. K dispozícii sú usmernenia o dobrej praxi na vykonávanie štúdií toxikolo ­
gickej patológie (40). Vyšetreniam sa podrobia minimálne tieto tkanivá: 
— všetky tkanivá zo skupín s vysokou dávkou a kontrolných skupín, 
— všetky tkanivá zo zvierat, ktoré uhynuli alebo boli utratené v priebehu 
štúdie, 
— všetky tkanivá vykazujúce makroskopické abnormality vrátane nádorov, 
— ak sú v skupine s vysokou dávkou pozorované histopatologické zmeny 
súvisiace s aplikáciou chemikálie, tie isté tkanivá sa vyšetria pri všet ­
kých zvieratách zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, 
— v prípade párových orgánov, ako sú napríklad obli čky alebo nadobli čky, 
sa vyšetria obidva orgány.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV (KARCINOGENITA A CHRONICKÁ 
TOXICITA)  
Údaje  
57. Pri všetkých hodnotených parametroch sa uvedú údaje o jednotlivých zvie ­
ratách. Navyše všetky údaje sa musia zhrnú ť v tabuľkovej forme, pri čom 
ukazujú pre každú testovanú skupinu po čet zvierat na za čiatku testu, po čet 
zvierat uhynutých po čas testu alebo usmrtených z humánnych dôvodov, čas 
uhynutia alebo humánneho usmrtenia jednotlivých zvierat, po čet zvierat, pri 
ktorých sa prejavili známky toxicity, opis pozorovaných známok toxicity vrátane nábehu, času a prudkosti toxických ú činkov, po čet zvierat vykazu ­
júcich poškodenie, typy poškodení a percentuálne množstvo zvierat, pri 
ktorých sa prejavil daný typ poškodenia. Zhrnuté údaje v tabu ľkách musia 
okrem stup ňa poškodení udáva ť priemer a smerodajnú odchýlku (v prípade 
priebežných údajov o teste) pri zvieratách vykazujúcich toxické ú činky 
alebo poškodenia. 
58. Pri interpretácii výsledkov štúdie môžu by ť užitočné historické kontrolné 
údaje, napr. v prípade, ak existujú indikácie, že údaje získané v rámci súbežných kontrol sa výrazne odlišujú v porovnaní s novými údajmi pri 
kontrolných zvieratách z rovnakého testovacieho zariadenia/kolónie. 
V prípade hodnotenia historických kontrolných údajov by ich malo pred ­
ložiť to isté laboratórium a mali by sa vz ťahovať na zvieratá rovnakého 
veku a z toho istého kme ňa vytvoreného v priebehu piatich rokov, ktoré 
danej štúdii predchádzali. 
59. Ak je to možné, numerické výsledky budú spracované vhodne a všeobecne 
uplatniteľnou štatistickou metódou. Štatistické metódy a údaje, ktoré budú 
analyzované, sa vyberú po čas plánovania štúdie (odsek 9). Výber musí 
v prípade potreby po čítať s úpravami vzh ľadom na prežitie. 
60. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje, 
— zdroj chemikálie, — číslo šarže, 
— certifikát chemickej analýzy.  
Nosič
 (v prípade potreby):  
— odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako voda).  
Testovacie zvieratá:  
— použitý druh/kme ň a odôvodnenie výberu, 
— počet, vek a pohlavie zvierat na za čiatku testu, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Podmienky testovania:  
— odôvodnenie spôsobu podávania a výberu dávky, — ak je to použite ľné, štatistické metódy použité na analýzu údajov, 
— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, 
— analytické údaje o dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite 
prípravku, 
— spôsob podávania a údaje o podávaní testovanej chemikálie, — v prípade inhala čných štúdií, či ide o expozíciu oblasti nosa alebo 
expozíciu celého tela, 
— skutočné dávky (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), faktor konverzie 
z potravy/pitnej vody, koncentrácia testovanej chemikálie (mg/kg alebo 
ppm), ak je to použite ľné, 
— údaje o kvalite potravy a vody.  
Výsledky (predloží sa tabu ľkové zhrnutie údajov a údaje o jednotlivých 
zvieratách) 
Všeobecné informácie:  
— údaje o prežití, — telesná hmotnos ť a zmeny telesnej hmotnosti, 
— spotreba potravy, výpo čty účinnosti krmiva, pokia ľ sa vykonali, 
a spotreba vody, ak je to použite ľné, 
— toxikokinetické údaje, ak sú dostupné, — oftalmoskopia (ak je dostupná), — hematológia (ak je dostupná), — klinická chémia (ak je dostupná).  
Klinické nálezy:  
— príznaky toxicity, — rozsah (a ak sa hodnotí, závažnos ť) každej abnormality, 
— povaha, závažnos ť a trvanie klinických pozorovaní ( či už prechodných 
alebo stálych).  
Údaje o pitve:  
— konečná telesná hmotnos ť, 
— orgánové hmotnosti a ich pomery, ak je to použite ľné, 
— pitevné nálezy, rozsah a závažnos ť abnormalít.  
Histopatológia:  
— nenádorové histopatologické nálezy, — nádorové histopatologické nálezy,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— korelácia medzi makroskopickými a mikroskopickými nálezmi, 
— podrobný opis všetkých histopatologických nálezov súvisiacich 
s aplikáciou chemikálie vrátane stup ňa závažnosti, 
— správa o všetkých partnerských hodnoteniach preparátov (sklí čok). 
Štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby Rozbor výsledkov zah ŕňajúci:  
— rozbor všetkých prístupov modelovania, — vzťah medzi dávkou a reakciou, 
— historické kontrolné údaje, — zváženie všetkých informácií o druhu pôsobenia, — stanovenie BMD, NOAEL alebo LOAEL, — význam pre človeka.  
Závery
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rím, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paríž. 
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
3. Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163 – 208 
4. Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., a kol. (2002). Hazard identifi ­
cation by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 
145 – 191 
5. Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437 – 445. 
6. Kapitola B.27 tejto prílohy, Test subchronickej orálnej toxicity: opakovaná 
90-dňová štúdia orálnej toxicity u nehlodavcov. 
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druhé vydanie. Series on Testing and Assessment No. 116, dostupné na verejnej webovej stránke OECD s usmerneniami na vykoná ­
vanie testov na adrese www.oecd.org/env/testguidelines. 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž. 
9. Kapitola B.8 tejto prílohy. Subakútna inhala čná toxicita: 28-d ňová štúdia. 
10. Kapitola B.29 tejto prílohy, Subchronická inhala čná toxicita: 90-d ňová 
štúdia. 
11. Kapitola B.9 tejto prílohy, Toxicita po 28–d ňovej opakovanej dávke (der ­
málna).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
12. Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., 
Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analy ­
zing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793 – 801. 
13. Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., Fenner-Crisp, PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581 – 589. 
14. Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., 
Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in 
Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51 – 56. 
15. Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., 
Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton 
D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on 
Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591 – 653. 
16. Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R. a kol. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1 – 7. 
17. Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T. a kol. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9 
– 35. 
18. Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A. a kol. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37 – 68. 
19. Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M. a kol. (2006). A Tiered Approach 
to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 69 – 98. 
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paríž. 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paríž. 
22. Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., 
Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, 
O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in 
the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 
(9): 729 – 837. 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC. 
24. Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., a Lumley, C. E. (1994). 
The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. 
25. Usui, T., Griffiths, S. A., a Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse 
for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In 
D’Arcy, P. O. F., & Harron, D. W. G. (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279 – 284. 
26. Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Signi ­
ficance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105: 1196 – 1203.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
27. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2012 
o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely (Ú. v. EÚ L 276, 
20.10.2010, s. 33). 
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versu ­
chstierkunde, december 1989). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-06-9. 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versu ­
chstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. 
31. Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, 
D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. (2001). A good practice guide to 
the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15 – 23. 
32. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 
33. Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999 – 1003. 
34. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxico ­
logy. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691 – 704. 
35. Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267 – 283. 
36. Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method 
for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233 – 236. 
37. Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., 
Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor 
Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599 – 609. 
38. Weingand, K., Brown, G., Hall, R. a kol. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. 
Toxicol. 29: 198 – 201. 
39. EMEA (návrh) dokument „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
40. Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K. a kol. (2004). Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126 – 131.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  JEDNOGENERA ČNÝ REPRODUK ČNÝ TEST TOXICITY  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIE 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka je podávaná v odstup ňovaných dávkach 
v niekoľkých skupinách samcov a samíc. Samce by mali by ť ovplyv­ 
ňované po čas rastu a najmenej jeden úplný cyklus spermatogenézy 
(približne 56 dní u myší a 70 dní u potkanov) s cie ľom vyvola ť 
testovanou látkou nepriaznivé ú činky na spermatogenézu. 
Samice parentálnej (P) generácie by mali by ť vystavené po dobu 
aspoň dvoch kompletných ovula čných cyklov s cie ľom vyvola ť 
testovanou látkou nepriaznivé ú činky na ovuláciu. Potom sa zvieratá 
spária. Testovaná látka sa podáva obom pohlaviam po čas periódy 
párenia a potom len samiciam po čas gravidity a po čas laktácie. Pre 
inhalačné vystavenie je potrebné túto metódu modifikova ť. 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Žiadne.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
Pred testom sú zdravé mladé dospelé zvieratá náhodne rozdelené do 
skupín vystavenia a kontrolných skupín a ozna čené. Zvieratá sú 
držané v experimentálnych laboratórnych podmienkach aspo ň 5 dní 
pred testom. Odporú ča sa podáva ť testovanú látku v potrave alebo 
v pitnej vode. Ostatné spôsoby podávania sú tiež prijate ľné. Všetky 
zvieratá by mali by ť vystavené rovnakým spôsobom po čas prime­
ranej doby experimentu. Ak sú nosi če alebo ďalšie pomocné látky 
použité pri dávkovaní, nemali by ma ť toxický efekt. Dávkovanie by 
malo byť sedem dní v týždni.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2. P o k u s n é z v i e r a t á 
Výber druhov Preferované druhy sú myš a potkan. Mali by by ť 
použité zdravé zvieratá, ktoré neboli predmetom žiadnych testov. Nemali by by ť použité kmene s nízkou plodnos ťou. Zvieratá by 
mali byť charakterizované vo vz ťahu k druhu, kme ňu, pohlaviu, 
hmotnosti a/alebo veku. 
Samce aj samice by mali by ť primerane vyšetrené na stanovenie 
plodnosti. Všetky testované aj kontrolné zvieratá by mali pred začiatkom podávania testovanej látky odstavené od matky.
 
Počet a pohlavie 
Každá vystavená aj kontrolná skupina by mala obsahova ť dostatočný 
počet zvierat, čo znamená asi 20 gravidných samíc v čase vrhu alebo 
krátko pred ním. 
Cieľom je získa ť dosť gravidít a potomstva pre zabezpe čenie 
zmysluplného vyhodnotenia potenciálneho ú činku testovanej látky 
na plodnos ť, graviditu a správanie matky v P generácii a na kojené 
mláďatá, rast a vývin F  1 potomstva po odstavení od matky.  
1.6.3. P o d m i e n k y t e s t u 
Potrava a voda by sa mali poskytova ť ľubovoľne (ad libidum). Tesne 
pred vrhom by mali by ť samice separované v pôrodných klietkach 
alebo v klietkach pre matky s poskytnutým materiálom pre hniezdenie.  
1.6.3.1. T e s t o v a n é d á v k y 
Mali by by ť použité aspo ň tri testované dávky a kontrola. Ak je 
nosič použitý pre podávanie testovanej látky, kontrolná skupina by 
mala dostáva ť nosič v najväčšom použitom objeme. Ak testovaná 
látka spôsobuje redukciu príjmu potravy alebo jej metabolizmu, je 
potrebné pouvažova ť o použití zodpovedajúcej kontrolnej skupiny. 
V ideálnom prípade, ak neexistuje nejaké obmedzenie kvôli fyzikálnej/chemickej povahe alebo biologickým vlastnostiam testo ­
vanej látky, najvyššia dávka by mala indukova ť toxické príznaky, 
ale nie mortalitu v parentálnej (P) generácii. Stredná dávka alebo 
dávky by mali indukova ť minimálne toxické príznaky spôsobené 
testovanou látkou a najnižšia dávka by nemala indukova ť žiadne 
pozorovate ľné nepriaznivé ú činky na rodi čov alebo potomkov. Ak 
sa určená dávka podáva sondou alebo v kapsuliach, dávka by mala 
byť závislá na individuálnej hmotnosti zvierat a prispôsobovaná 
každý týžde ň zmenám hmotnosti. Pre samice po čas gravidity môže 
dávka závisie ť od hmotnosti v nultom alebo šiestom dni gravidity, ak 
je potrebné.
 
1.6.3.2. L i m i t n ý t e s t 
V prípade látky s nízkou toxicitou, ak dávka aspo ň 1 000 mg/kg 
neindukuje žiadne negatívne vplyvy na reproduk čnú schopnos ť, 
sledovanie ďalších dávok nie je nevyhnutné. Ak predbežné pokusy 
s najvyššou dávkou a jasnými toxickými príznakmi na matku nevy ­
kazujú nepriaznivý ú činok na plodnos ť, sledovanie ďalších dávok 
nie je nevyhnutné.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3.  Vykonanie testu  
E x p e r i m e n t á l n y p l á n 
Začiatok denného dávkovania samcom parentálnej (P) generácie by 
mal byť v piatom až deviatom týždni života, ke ď by mali by ť 
odstavení od matky a aklimatizovaní aspo ň päť dní. U potkanov 
dávkovanie pokra čuje 10 týžd ňov do periódy párenia (pre myši 
osem týžd ňov). Samce môžu by ť utratené a vyšetrené na konci 
periódy párenia alebo môžu by ť držané na testovanej diéte pre 
možnosť druhého vrhu a môžu by ť utratené a vyšetrené niekedy 
na konci pozorovania. Pre parentálne (P) samice sa dávkovanie 
začína aspoň po piatich d ňoch aklimatizácie a pokra čuje aspoň dva 
týždne pred párením. Denné dávkovanie P samíc by malo pokra ­ 
čovať počas trojtýžd ňovej periódy párenia, gravidity až do odsta ­
venia F  1 potomstva. Do úvahy by sa mala bra ť modifikácia dávko ­
vacieho plánu na základe iných dostupných informácií o testovanej látke, ako je indukcia metabolizmu alebo bioakumulácia.
 
P o s t u p p r i p á r e n í 
V reproduk čnom teste toxicity sa môžu použi ť pomery párenia 1:1 
(jeden samec a jedna samica) alebo 1:2 (jeden samec a dve samice). 
Pri pomere párenia 1:1 samica môže by ť umiestnená s tým istým 
samcom, kým sa neprejaví gravidita alebo uplynú tri týždne. Každé 
ráno by mali by ť samice vyšetrené na prítomnos ť spermií alebo 
vaginálnej zátky. De ň 0 gravidity je definovaný ako de ň, keď je 
spozorovaná vaginálna zátka alebo spermie. 
Pri bezvýslednom párení by mali by ť zvieratá vyšetrené na prí činu 
neplodnosti. 
To znamená možnos ť ďalšieho párenia s inými samcami alebo sami ­
cami, prípadne mikroskopické vyšetrenie reproduk čných orgánov 
a overenie ovula čného cyklu alebo spermatogenézy.  
V e ľ k o s ť v r h u 
Ovplyvňovanie zvierat po čas testu poskytuje normálnu možnos ť 
vrhu a výchovu potomstva do štádia odstavenia od matky bez štan ­
dardizácie vrhov. 
Ak je urobená štandardizácia, predpokladajú sa nasledovné postupy. 
Medzi dňom 1 a 4 po narodení je ve ľkosť každého vrhu upravená 
elimináciou plodov navyše, a to selekciou štyroch samcov a štyroch samíc v jednom vrhu. 
Ak počet samcov a samíc neumož ňuje získa ť štyri zvieratá 
z každého pohlavia v jednom vrhu, je akceptovate ľná čiastočná 
úprava (napríklad pä ť samcov a tri samice). Úprava je nereálna pre 
vrhy s menej ako ôsmimi plodmi.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4. P o z o r o v a n i a 
Počas testovacieho obdobia by malo by ť každé zviera pozorované 
denne aspo ň raz. Mali by by ť zaznamenané nápadné zmeny správa ­
nia, príznaky ťažkého alebo oneskoreného vrhu a všetky toxické 
príznaky, vrátane úmrtnosti. V období pred párením a po čas párenia 
by mala by ť denne meraná spotreba potravy. Po vrhu a po čas 
laktácie by mala by ť meraná spotreba potravy (a spotreba vody ak 
je testovaná látka podávaná v pitnej vode) v ten istý de ň ako váženie 
vrhu. P samce a samice by mali by ť odvážené prvý de ň dávkovania 
a potom raz týždenne. Tieto pozorovania by mali by ť zaznamená ­
vané individuálne pre každé dospelé zviera. 
Trvanie gravidity sa po číta odo dňa 0 gravidity. Každý vrh by sa mal 
čo najskôr po pôrode vyšetri ť a stanovi ť množstvo a pohlavie 
plodov, potratov (m ŕtvych plodov) živých plodov a prítomnos ť 
výrazných anomálií. 
Mŕtve plody a plody utratené v de ň 4 by sa mali fixova ť a vyšetri ť 
na možné defekty. Živé plody by sa mali spo čítať a vrhy odváži ť 
ráno hneď po narodení, na 4. a 7. de ň a potom raz za týžde ň do 
konca pozorovania, ke ď by mali by ť zvieratá odvážené individuálne. 
Mali by sa zaznamena ť fyzické abnormality a poruchy správania 
samíc alebo potomstva.  
1.6.5. P a t o l ó g i a  
1.6.5.1. P i t v a 
Zvieratá P generácie by sa mali makroskopicky vyšetri ť v čase utra­
tenia alebo uhynutia po čas testu na všetky štruktúrne abnormality 
alebo patologické zmeny so špeciálnou pozornos ťou na reproduk čné 
orgány. M ŕtve a chradnúce plody by sa mali vyšetri ť na defekty.  
1.6.5.2. H i s t o p a t o l ó g i a 
Pre mikroskopické vyšetrenie by sa mali fixova ť vaječníky, mater ­
nica, krček maternice, vagína, semenníky, nadsemenníky, semenné 
váčky, prostata, koagula čná žľaza, hypofýza, a zasiahnuté orgány 
všetkých P zvierat. V prípade že tieto orgány neboli vyšetrené 
v iných testoch s viacerými dávkami, mali by by ť mikroskopicky 
vyšetrené zo všetkých zvierat zo skupiny s najvyššou dávkou a z kontrolnej skupiny a zo zvierat, ktoré uhynuli po čas pozorovania. 
Orgány vykazujúce abnormality v týchto zvieratách by mali by ť 
potom vyšetrené vo všetkých ostatných P zvieratách. Za týchto okol ­
ností by malo by ť urobené mikroskopické vyšetrenie všetkých tkanív 
vykazujúcich výrazné patologické zmeny. Ak sa po čas párenia zistila 
neplodnos ť, mali by by ť podrobené mikroskopickému vyšetreniu 
reprodukčné orgány zvierat.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. ÚDAJE  
Údaje by mali by ť zhrnuté v tabu ľke a udáva ť pre každú testovaciu 
skupinu po čet zvierat na za čiatku testu, po čet plodných samcov, 
počet gravidných samíc, typy zmien a percento zvierat so všetkými 
typmi zmien. 
Ak je to možné, výsledky by mali by ť vyhodnotené vhodnou štatis ­
tickou metódou. Môže by ť použitá hociktorá uznaná štatistická 
metóda.  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu má pod ľa možnosti obsahova ť nasledujúce informá ­
cie: 
— použitý druh/kme ň, 
— údaje o toxickej reakcii pri jednotlivých pohlaviach, dávkach, 
vrátane plodnosti, gravidity a životaschopnosti, 
— časy úmrtí po čas pozorovania alebo údaje, či zvieratá prežili do 
plánovaného času na utratenie, alebo do ukon čenia testu, 
— tabuľku uvádzajúcu údaje o hmotnosti každého vrhu, priemernú 
hmotnosť plodov a individuálnu hmotnos ť plodov na konci testu, 
— toxické alebo iné príznaky na reprodukciu, potomstvo 
a postnatálny rast, 
— čas objavenia každého abnormálneho príznaku a jeho ďalší 
vývoj, 
— údaje o hmotnosti pre P zvieratá, — nálezy pitvy, — detailný opis všetkých mikroskopických nálezov, — štatistické spracovanie výsledkov, kde je to vhodné, — diskusia o výsledkoch, — interpretácia výsledkov.
 
3.2. VYHODNOTENIE A INTERPRETÁCIA 
Pozri všeobecný úvod časť B. 
4. ODKAZY  
Pozri všeobecný úvod časť B. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  DVOJGENERA ČNÁ ŠTÚDIA REPRODUK ČNEJ TOXICITY  
1. METÓDA  
Táto metóda zodpovedá OECD TG 416 (2001).  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda pre dvojgenera čné reproduk čné testovanie je navrhnutá 
tak, aby poskytla všeobecné informácie, ktoré sa týkajú ú činkov 
testovanej látky na integritu a činnosť samčích a sami čích reproduk č­
ných systémov, vrátane funkcie pohlavných žliaz, estrálneho cyklu, rozmnožovacieho správania, po čatia, gravidity, pôrodu, laktácie 
a odstavenia a rastu a vývoja potomstva. Štúdia môže poskytnú ť 
informácie aj o ú činkoch testovanej látky na neonatálnu morbiditu, 
mortalitu a predbežné údaje o prenatálnej a postnatálnej vývojovej toxicite a slúži ako usmernenie pre ďalšie testy. Okrem pozorovania 
rastu a vývoja F
 1 generácie je táto testovacia metóda ur čená aj na 
posúdenie integrity a činnosti sam čích a sami čích reproduk čných 
systémov, ako aj rastu a vývoja F  2 generácie. Za ú čelom získania 
ďalších informácií o vývojovej toxicite a funk čných poruchách je 
možné do tohto protokolu zapracova ť tiež ďalšie časti štúdie 
s použitím metód pre vývojovú toxicitu a/alebo v prípade potreby vývojovú neurotoxicitu, alebo by sa tieto kone čné body mohli 
skúmať v samostatných štúdiách s použitím vhodných testovacích 
metód.
 
1.2. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka sa podáva viacerým skupinám sam čích a sami čích 
pokusných zvierat v odstup ňovaných dávkach. Samcom P generácie 
sa podáva testovaná látka po čas rastu a minimálne po čas jedného 
úplného cyklu spermatogenézy (približne 56 dní u myši a 70 dní 
u potkana), aby sa zistili nepriaznivé ú činky na spermatogenézu. 
Účinky na spermie sa stanovujú na základe množstva parametrov 
pre spermie (napr. morfológia spermie a pohyblivos ť) a v prepará ­
toch tkanív dôkladným histopatologickým vyšetrením. Ak sú dostupné údaje o spermatogenéze z predchádzajúcej štúdie pri opakovaných dávkach s dostato čným trvaním, napr. 90-d ňová štúdia, 
nie je potrebné do štúdie zahrnú ť samce P generácie. Odporú ča sa 
však, aby sa uchovali vzorky alebo digitálne záznamy spermy P generácie na umožnenie neskoršieho posúdenia. Samiciam P generácie sa podáva testovaná látka po čas rastu a v priebehu 
niekoľkých úplných estrálnych cyklov, aby sa dali stanovi ť všetky 
nepriaznivé ú činky testovanej látky na normálny priebeh estrálneho 
cyklu. Testovaná látka sa podáva rodi čom (P) po čas ich párenia, 
počas výslednej gravidity a po čas odstavenia ich F
 1 potomstva. Po 
odstavení pokra čuje podávanie látky F  1 potomstvu po čas ich rastu do 
dospelosti, párenia a narodenia F  2 generácie až do odstavenia F  2 
generácie. 
Klinické pozorovania a patologické vyšetrenia sa vykonajú na všet ­
kých zvieratách na príznaky toxicity s osobitným dôrazom na ú činky 
na integritu a činnosť samčích a sami čích reproduk čných systémov 
a na rast a vývoj potomstva.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.3.1.  Výber druhu zvierat  
Na testovanie sa prednostne používa potkan. Je potrebné zdôvodni ť 
použitie iných druhov a budú potrebné príslušné úpravy. Kmene 
s nízkou plodnos ťou, alebo o ktorých je známe, že majú vysoký 
výskyt vývojových porúch, sa nemajú používa ť. Na začiatku štúdie 
má byť rozdiel medzi hmotnos ťami použitých zvierat minimálny 
a nemá by ť vyšší ako 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.  
1.3.2.  Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22  o C 
(± 3  o C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť by mala by ť aspoň 30 %, 
a pokiaľ možno, nemala by prevyšova ť 70 %, okrem obdobia 
počas čistenia miestnosti by mala dosahova ť 50 – 60 %. Osvetlenie 
by malo by ť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na 
kŕmenie sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo 
s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže by ť 
ovplyvnený potrebou zabezpe čiť vhodnú primes testovanej látky, 
keď sa podáva týmto spôsobom. 
Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách 
rovnakého pohlavia v klietkach. Párenie sa uskuto ční v klietkach, 
ktoré sú vhodné na tento ú čel. Po zaznamenaní kopulácie sa spárené 
samice umiestnia jednotlivo do pôrodných klietok alebo do klietok pre matky. Spárené potkany sa môžu drža ť aj v malých skupinách 
a oddeliť jeden alebo dva dni pred pôrodom. Krátko pre termínom 
vrhu sa spáreným zvieratám poskytne vhodný a definovaný hniez ­
diaci materiál.
 
1.3.3.  Príprava zvierat  
Použijú sa zdravé mladé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na labora ­
tórne podmienky aspo ň 5 dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným 
pokusom. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a/alebo veku. Je potrebné, aby 
boli známe všetky súrodenecké vz ťahy medzi zvieratami, aby sa 
zabránilo páreniu medzi súrodencami. Zvieratá sa náhodne rozdelia 
do kontrolnej a ošetrovanej skupiny (odporú ča sa rozdelenie pod ľa 
telesnej hmotnosti). Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizo ­
vali prípadné vplyvy kvôli umiestneniu klietok. Každému zviera ťu sa 
priradí vlastné identifika čné číslo. V prípade P generácie sa to usku ­
toční pred za čiatkom dávkovania. V prípade F
 1 generácie sa to 
uskutoční po odstavení zvierat vybratých na párenie. Pre všetky 
vybraté F1 zvieratá sa uchovajú záznamy s uvedením vrhu, 
z ktorého pochádzajú. Okrem toho sa odporú ča individuálna identi ­
fikácia mlá ďat čo najskôr po narodení, ke ď sa posudzuje váženie 
jednotlivých mlá ďat alebo funk čné testy. 
Rodičia (P) majú by ť na začiatku dávkovania vo veku 5 až 9 týžd ­ 
ňov. Zvieratá vo všetkých pokusných skupinách majú ma ť, pokiaľ je 
to možné, rovnakú hmotnos ť a vek.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. POSTUP  
1.4.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Každá pokusná a kontrolovaná skupina by mala obsahova ť dosta­
točný počet zvierat tak, aby bolo k dispozícii pokia ľ možno 20 
gravidných samíc, ktoré rodia, alebo čoskoro budú rodi ť. 
V prípade látok, ktoré spôsobujú neželate ľné účinky v súvislosti 
s ošetrením (napr. sterilitu, nadmernú toxicitu pri vysokej dávke), toto nie je možné. Cie ľom je dosiahnu ť dostatok gravidít, aby sa 
zabezpečilo zmysluplné posúdenie potenciálu látky ovplyvni ť ferti­
litu, graviditu a správanie matky a doj čenie, rast a vývoj F
 1 potom­
stva od po čatia do zrelosti a vývoj ich potomstva (F  2 ) do odstavenia. 
Preto prípad, ke ď sa nedosiahne potrebný po čet gravidných zvierat 
(t. j. 20), nevedie nevyhnutne k neplatnosti štúdie a posudzuje sa na základe jednotlivých prípadov.
 
1.4.2.  Príprava dávok  
Odporúča sa, aby sa testovaná látka podávala orálne (v krmive, 
pitnej vode alebo sondou), pokia ľ sa iná cesta podávania (napr. 
dermálna alebo inhala čná) nepokladá za vhodnejšiu. 
V prípade potreby sa testovaná látka rozpustí alebo rozptýli vo 
vhodnom nosi či. Odporú ča sa, aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr 
zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie 
v oleji (napr. kukuri čný olej) a nakoniec prípadného roztoku v iných 
nosičoch. Pre nosi če, ktoré sú iné ako voda, musia by ť známe 
toxické charakteristiky. Ur čí sa stabilita testovanej látky v nosi či. 
1.4.3.  Dávkovanie  
Použijú sa aspo ň tri veľkosti dávky a uskuto ční sa paralelná 
kontrola. Pokia ľ to fyzikálno-chemické vlastnosti alebo biologické 
účinky testovanej látky pripúš ťajú, zvolí sa najvyššia dávka tak, 
aby spôsobila toxicitu, ale nespôsobila úmrtie alebo silné utrpenie. V prípade ne čakanej úmrtnosti, štúdie s mierou úmrtnosti menej ako 
približne 10 % u rodi čov (P) sú zvy čajne ešte stále akceptovate ľné. 
Klesajúca postupnos ť veľkosti dávok sa zvolí tak, aby sa preukázala 
každá reakcia v závislosti od dávkovania a hladina bez pozorova ­
ného nepriaznivého ú činku (NOAEL). Intervaly dávkovania 
s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho 
dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie 
ako používanie ve ľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) 
medzi dávkami. V prípade štúdií týkajúcich sa výživy interval medzi 
dávkami nemá ma ť vyšší faktor ako 3. Ve ľkosti dávok sa zvolia pri 
zohľadnení všetkých existujúcich údajov o toxicite, najmä výsledky 
zo štúdií pri opakovaných dávkach. Posúdia sa aj všetky dostupné informácie o metabolizme a kinetike testovanej látky alebo príbuz ­
ných materiáloch. Okrem toho napomôžu tieto informácie aj pri 
preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolnou skupinou môže by ť neošetrená skupina alebo skupina, 
ktorej sa podáva nosi č, ak sa pri podávaní testovanej látky používa 
nosič. Okrem ošetrenia s testovanou látkou sa so zvieratami 
v kontrolnej skupine zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvie ­
ratami v pokusnej skupine. Ak sa používa nosi č, kontrolná skupina 
dostane nosi č v najvyššom používanom objeme. Ak sa testovaná 
látka podáva v krmive a spôsobuje znížený príjem potravy alebo jej využitia, potom sa usudzuje, že je potrebné použi ť paralelne 
kŕmenú kontrolnú skupinu. Údaje z kontrolných štúdií, ur čených 
na posúdenie ú činkov zníženej spotreby potravy na reproduk čné 
parametre, sa alternatívne môžu použi ť namiesto paralelne k ŕmenej 
kontrolnej skupiny. 
Je potrebné venova ť pozornos ť týmto charakteristikám nosi ča 
a iných prídavných látok: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabo ­
lizmus alebo retenciu testovanej látky; vplyv na chemické vlastnosti testovanej látky, ktorý môže meni ť jej toxické vlastnosti; a vplyv na 
spotrebu potravy a vody alebo nutri čný stav zvierat.
 
1.4.4.  Limitný test  
Ak v orálnej štúdii s jednou dávkou s ve ľkosťou minimálne 
1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň alebo pri podávaní v krmive 
alebo pitnej vode rovnaký percentuálny podiel v krmive alebo pitnej 
vode s použitím postupov opísaných pre túto štúdiu nespôsobí žiadne 
pozorovate ľné toxické ú činky ani u rodi čov, ani u ich potomstva 
a ak sa toxicita neo čakáva na základe údajov zo štrukturálne a/alebo 
metabolicky príbuzných látok, potom sa môže upusti ť od úplnej 
štúdie s použitím viacerých ve ľkostí dávok. Limitný test sa uplat ňuje 
s výnimkou prípadu, ke ď z expozície ľudí vyplýva, že je potrebné 
použiť vyššiu orálnu dávku. Pre iné typy podávania, ako je napr. 
inhalácia alebo dermálna aplikácia z fyzikálno-chemických vlastností 
testovanej látky, ako je napr. rozpustnos ť, často môže vyplýva ť 
a byť limitovaná maximálna prípustná úrove ň expozície.  
1.4.5.  Podávanie dávok  
Zvieratám sa podáva testovaná dávka 7 dní v týždni. Uprednost ňuje 
sa orálna cesta podávania (krmivo, pitná voda alebo sonda). Ak sa 
použije iný spôsob podávania, uvedie sa zdôvodnenie a môžu by ť 
potrebné príslušné úpravy. Všetkým zvieratám sa podáva látka rovnakým spôsobom po čas príslušného obdobia pokusu. Ak sa testo ­
vaná látka podáva sondou, je potrebné použi ť žalúdočnú sondu. 
Objem kvapaliny podanej jednorázovo nesmie by ť vyšší ako 1 ml/ ­
100 g telesnej hmotnosti (0,4 ml/100 g telesnej hmotnosti je maximum pre kukuri čný olej), s výnimkou vodných roztokov, ke ď 
sa môže použi ť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždi ­
vých alebo žieravých látok, ktoré zvy čajne pri vyšších koncentrá ­
ciách spôsobia zhoršenie ú činkov, variabilita v aplikovanom objeme 
sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabez ­
pečil stály objem vo všetkých dávkach. V štúdiách, pri ktorých sa 
používa sonda, mlá ďatá zvyčajne dostávajú testovanú látku iba 
nepriamo v mlieku, pokia ľ sa im po odstavení neza čne látka podáva ť 
priamo. V štúdiách, pri ktorých sa látka podáva v krmive alebo 
pitnej vode, mlá ďatá dostanú dodato čne testovanú látku priamo, 
keď začnú jesť samostatne po čas posledného obdobia laktácie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Pre látky podávané v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpe ­ 
čiť, aby množstvá použitej testovanej látky neinterferovalo 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Ke ď sa testovaná 
látka podáva v krmive môže sa použi ť buď stála koncentrácia 
v krmive (ppm) alebo stála ve ľkosť dávky vzh ľadom na telesnú 
hmotnosť zvieraťa; použitá alternatíva sa musí špecifikova ť. 
V prípade, ke ď sa látka podáva sondou, látka sa podáva približne 
v rovnaký čas každý de ň a prispôsobí sa aspo ň raz za týžde ň, aby sa 
zachovala stála ve ľkosť dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť. Infor­
mácie, ktoré sa týkajú placentárnej distribúcie, sa posudzujú pri 
prispôsobení ve ľkosti dávky cez sondu založenej na hmotnosti.  
1.4.6.  Priebeh pokusu  
Denné podávanie testovanej látky sam čej a sami čej rodičovskej 
generácii (P) sa za čína, keď sú vo veku 5 až 9 týžd ňov. Denné 
podávanie testovanej látky F  1 generácii samcov a samíc sa za čína 
po odstavení; je potrebné pamäta ť na to, že v prípade, ke ď sa testo­
vaná látka podáva v krmive alebo pitnej vode, priama expozícia F  1 
mláďat testovanou látkou sa môže vyskytnú ť už počas laktačného 
obdobia. Pre obidve pohlavia (P a F  1 ) pokračuje podávanie látky 
minimálne 10 týžd ňov pred obdobím párenia. Podávanie látky pokra ­ 
čuje u oboch pohlaví po čas 2-týždňového obdobia párenia. Samce sa 
humánnym spôsobom usmrtia a vyšetria, ak už nie sú potrebné na 
hodnotenie ú činkov na reprodukciu. Rodi čovskej generácii samíc (P) 
pokračuje podávanie látky po čas gravidity a až do odstavenia F  1 
potomstva. Je potrebné venova ť pozornos ť úpravám harmonogramu 
dávkovania založeným na dostupných informáciách o testovanej 
látke vrátane existujúcich údajov o toxicite, vplyve na metabolizmus 
alebo bioakumulácii. Dávka pre jednotlivé zviera sa zvy čajne 
zakladá na naposledy zistenej telesnej hmotnosti. Je však potrebné 
venovať pozornos ť pri nastavovaní dávky po čas posledného trimestra 
gravidity. 
Ošetrovanie samcov a samíc generácie P a F  l pokračuje až do ukon ­ 
čenia. Všetky dospelé samce a samice generácie P a F  l sa humánnym 
spôsobom usmrtia, ak už viac nie sú potrebné na hodnotenie ú činkov 
na reprodukciu. Potomstvo generácie F  l , ktoré sa nevyberie na páre ­
nie, a celé potomstvo generácie F  2 sa po odstavení humánnym 
spôsobom usmrtí.  
1.4.7.  Párenie  
1.4.7.1.  Párenie rodi čov (P)  
V prípade každého párenia sa umiestni každá samica s jedným 
samcom z rovnakej dávkovej skupiny (párenie 1:1), pokia ľ sa 
neuskutoční kopulácia, alebo neuplynú 2 týždne. Každý de ň sa 
samice vyšetria na prítomnos ť spermy alebo vaginálnej zátky. Za 
0. deň gravidity sa ur čí deň, kedy sa zistil výskyt vaginálnej zátky 
alebo spermy. V prípade neúspešného párenia sa zváži opätovné párenie samíc so samcami z rovnakej skupiny s preukázanou plod ­
nosťou. Vzájomne spárené páry sa v údajoch zrete ľne identifikujú. Je 
potrebné zabráni ť páreniu súrodencov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Párenie F  l generácie  
Pre párenie F  l potomstva sa z každého vrhu po odstavení vyberie 
aspoň jeden samec a jedna samica na párenie s mlá ďatami tej istej 
dávkovej skupiny, ale z iného vrhu, aby sa vytvorila F  2 generácia. 
Výber mlá ďat z každého vrhu je náhodný, ak sa nezistili žiadne 
významné odlišnosti telesnej hmotnosti alebo vzh ľade zvierat 
z vrhu. V prípade, že sa zistia tieto odlišnosti, vyberú sa najlepší zástupcovia z každého vrhu. Prakticky je to najlepšie na základe 
telesnej hmotnosti, ale môže to by ť vhodnejšie na základe vzh ľadu. 
F
 1 potomstvo by sa nemalo pari ť, pokiaľ nedosiahne úplnú pohlavnú 
zrelosť. 
Páry bez potomstva sa vyšetria, aby sa ur čila zjavná prí čina neplod ­
nosti. Toto môže zahrnova ť také postupy, ako napr. ďalšie možnosti 
pariť sa s inými samcami alebo samicami s preukázanou plodnos ťou, 
mikroskopické vyšetrenie reproduk čných orgánov a vyšetrenie estrál ­
nych cyklov alebo spermatogenézy.  
1.4.7.3.  Druhé párenie  
V určitých prípadoch, ako napr. zmeny vo ve ľkosti vrhu súvisiace 
s ošetrením alebo zistenie nejednozna čného účinku pri prvom párení, 
sa odporú ča, aby sa dospelé zvieratá P alebo F  1 generácie opätovne 
spárili na vytvorenie druhého vrhu. Odporú ča sa opätovné spárenie 
samíc alebo samcov, ktoré nevytvorili vrh so zvieratami opa čného 
pohlavia s preukázanou plodnos ťou. Ak sa pokladá za potrebné, aby 
sa uskuto čnil druhý vrh v ktorejko ľvek generácii, zvieratá sa 
opätovne spária jeden týžde ň po odstavení posledného vrhu.  
1.4.7.4.  Veľkosť vrhu  
Zvieratám sa umožní, aby vrhli prirodzeným spôsobom 
a vychovávali svoje potomstvo až do odstavenia. Štandardizácia 
veľkostí vrhu je nepovinná. Ak sa uskuto ční štandardizácia, použitá 
metóda sa detailne popíše.  
1.5. POZOROVANIA  
1.5.1.  Klinické vyšetrenia  
Všeobecné klinické vyšetrenie sa uskuto ční každý de ň a v prípade 
podávania dávok cez sondu je potrebné, aby na časovanie zoh ľadnilo 
predpokladané maximálne ú činky po podaní dávky. Zmeny 
v správaní, príznaky ťažkého alebo dlhotrvajúceho pôrodu a všetky 
príznaky toxicity sa zaznamenajú. Ďalšie podrobnejšie vyšetrenie 
každého zviera ťa sa uskuto ční aspoň raz do týžd ňa a môže sa to 
zvyčajne urobi ť počas váženia zviera ťa. Dvakrát za de ň, počas 
víkendu raz za de ň sa v prípade potreby u všetkých zvierat zis ťuje 
morbidita a mortalita.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Telesná hmotnos ť a spotreba potravy/vody rodi čovských zvierat  
Rodičovské zvieratá (P a F  1 ) sa odvážia v prvý de ň po podaní látky 
a potom aspo ň raz za týžde ň. Rodičovské samice (P a F  l ) sa odvážia 
minimálne v d ňoch gravidity 0, 7, 14 a 20 alebo 21 a po čas laktácie 
v rovnaké dni ako sa vážia mlá ďatá z vrhov a v de ň, keď sa zvieratá 
usmrtia. Tieto zistenia sa zaznamenajú jednotlivo pre každé dospelé zviera. V čase pred obdobím párenia a graviditou sa spotreba krmiva 
meria minimálne raz za týžde ň. Spotreba vody sa meria minimálne 
raz do týžd ňa, ak sa testovaná látka podáva vo vode.
 
1.5.3.  Estrálny cyklus  
Dĺžka estrálneho cyklu a normálny priebeh sa zis ťuje u samíc P a F  l 
generácie vaginálnymi výtermi pred párením a nepovinne po čas 
párenia, pokia ľ sa nepotvrdí spárenie. Pri odbere vaginálnych/ ­
cervikálnych buniek je potrebné venova ť pozornos ť, aby sa neporu ­ 
šila sliznica a následne nevyvolala pseudogravidita (1).  
1.5.4.  Parametre spermií  
Pre všetky samce P a F  l generácie sa po usmrtení zaznamená hmot ­
nosť semenníkov a nadsemenníkov a odloží sa po jednom z každého 
orgánu na histopatologické vyšetrenie (pozri oddiel 1.5.7, 1.5.8.1). Z časti pozostávajúcej z aspo ň desiatich samcov z každej skupiny 
samcov generácie P a F
 l sa zostávajúce semenníky a nadsemenníky 
použijú na zistenie po čtu spermatidov homogeniza čne rezistentných, 
prípadne zásob spermií z chvostovej časti nadsemenníkov. V prípade 
tejto istej časti samcov, sa spermie z chvostovej časti nadsemenníkov 
alebo semenovodu odoberú na vyšetrenie pohyblivosti a morfológie 
spermií. Ak sa zistia ú činky v súvislosti s ošetrením, alebo ak 
existuje dôkaz z iných štúdií o možných ú činkoch na spermatoge ­
nézu, hodnotenie spermií sa uskuto ční u všetkých samcov v každej 
dávkovej skupine; v opa čnom prípade sa môže výpo čet obmedzi ť na 
samce P a F  l generácie z kontrolnej skupiny a skupiny s vysokými 
dávkami. 
Zistí sa celkový po čet homogeniza čne rezistentných spermatidov 
a spermií z chvostovej časti nadsemenníkov (2) (3). Zásoby spermií 
z chvostovej časti nadsemenníkov sa odvodia na základe koncen ­
trácie a objemu spermií v suspenzii použitej na doplnenie kvalitatív ­
nych hodnotení a po čtu spermií získaných následným pomletím a/ ­
alebo homogenizáciou zvyšného tkaniva chvostovej časti. Počet sa 
zistí u vybratej podskupiny samcov všetkých dávkových skupín 
bezprostredne po usmrtení zvierat, pokia ľ sa neurobia video alebo 
digitálne záznamy, alebo pokia ľ sa vzorky nezamrazia a neanalyzujú 
neskôr. V týchto prípadoch sa môže ako prvá analyzova ť kontrolná 
skupina a skupina s vysokou dávkou. Ak sa nezistia žiadne ú činky 
v súvislosti s ošetrením (napr. ú činky na po čet spermií, pohyblivos ť 
alebo morfológiu), ostatné dávkové skupiny nie je potrebné analy ­
zovať. Ak sa zaznamenajú ú činky v súvislosti s ošetrením v skupine 
s vysokými dávkami, potom sa skupiny s nižšími dávkami tiež 
posúdia.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Posúdi sa pohyblivos ť spermií v nadsemenníkoch (alebo semenovo ­
de), alebo sa zaznamená na video pásku bezprostredne po usmrtení. 
Spermie sa odoberú tak, aby sa minimalizovalo poškodenie a zriedia, aby sa mohla vykona ť analýza pohyblivosti s použitím uznaných 
metód (4). Percento progresívne pohybujúcich sa spermií sa stanoví 
buď subjektívne alebo objektívne. Ak sa uskuto čňuje počítačová 
analýza pohyblivosti (5) (6) (7) (8) (9) (10), odvodenie progresívnej pohyblivosti sa zakladá na maximálnych hodnotách definovaných užívateľom pre priemernú rýchlos ť dráhy a priamos ť alebo lineárny 
index. Ak sa vzorky nahrávajú na videopásky (11), alebo sa obrazy 
inak zaznamenávajú po čas autopsie, môže sa vykona ť následná 
analýza iba kontrolnej skupiny a skupiny s vysokými dávkami samcov generácie P a F
 1 , pokiaľ sa nezistia ú činky v súvislosti 
s ošetrením; v takomto prípade sa posúdia aj skupiny s nižšími 
dávkami. Pri neprítomnosti video alebo digitálnych záznamov sa všetky vzorky vo všetkých ošetrovaných skupinách analyzujú pri autopsii. 
Uskutoční sa morfologické vyšetrenie spermií zo vzorky 
z nadsemenníkov (alebo semenovodu). Spermie (minimálne 200 na 
vzorku) sa vyšetria ako fixné, mokré preparáty (12) a zatriedia sa 
ako buď normálne alebo abnormálne. Vzorky morfologických abnor ­
malít spermií zahrnujú fúziu, oddelené hlavi čky a zdeformované 
hlavičky a/alebo bi číky. Vyšetrenie sa vykoná na vybratej podsku ­
pine samcov všetkých dávkových skupín bu ď bezprostredne po 
usmrtení zvierat, alebo neskôr na základe video alebo digitálnych záznamov. Stery po fixovaní sa tiež môžu posúdi ť neskôr. 
V týchto prípadoch sa môže ako prvá analyzova ť kontrolná skupina 
a skupina s vysokou dávkou. Ak sa nepozorujú žiadne ú činky 
v súvislosti s ošetrením (napr. ú činky na morfológiu spermií), ostatné 
dávkové skupiny nie je potrebné analyzova ť. Ak sa zaznamenajú 
účinky v súvislosti s ošetrením v skupine s vysokými dávkami, 
potom sa skupiny s nižšími dávkami tiež posúdia. 
Ak sa horeuvedené parametre hodnotenia spermií už preskúmali ako 
súčasť štúdie systémovej toxicity o d ĺžke aspoň 90 dní, nie je ich 
potrebné zopakova ť v dvojgenera čnej štúdii. Odporú ča sa však, aby 
sa uchovali vzorky alebo digitálne záznamy spermií P generácie na umožnenie neskoršieho posúdenia v prípade potreby.
 
1.5.5.  Potomstvo  
Každý vrh sa vyšetrí čo najskôr po pôrode (0. de ň laktácie), aby sa 
zistil počet a pohlavie potomstva, m ŕtvo narodené a živo narodené 
jedince a výskyt nápadných anomálií. Mlá ďatá, ktoré sa našli m ŕtve 
v deň 0, ak nie sú macerované, sa prednostne vyšetria na možné 
poruchy a prí činu uhynutia a sa zakonzervujú. Živé mlá ďatá sa 
spočítajú a každé sa jednotlivo po narodení odváži (0. de ň laktácie) 
alebo na 1. de ň a potom pravidelne v de ň váženia, napr. na 4., 7., 
14. a 21. de ň laktácie. Fyzické abnormality a poruchy správania 
pozorované u matiek alebo potomstva sa zaznamenajú.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Fyzický vývoj potomstva sa zaznamená najmä na základe prírastku 
telesnej hmotnosti. Ostatné fyzické parametre (napr. otvorenie o čí 
a uší, prerezanie zubov, rast srsti) môžu poskytnú ť doplňujúce infor ­
mácie, ale tieto údaje sa hodnotia prednostne v súvislosti s údajmi o sexuálnej zrelosti (napr. vek a telesná hmotnos ť v čase otvorenia 
vagíny alebo oddelenia žalu ďa a predkožky) (13). Vyšetrenia funk č­
nosti (napr. motorická aktivita, zmyslové funkcie, reflexná ontogené ­
zia) F
 1 potomstva pred a/alebo po odstavení predovšetkým tie, ktoré sa 
týkajú sexuálnej zrelosti, sa odporú čajú, ak takéto vyšetrenia nie sú 
zahrnuté v samostatných štúdiách. Vek v čase vaginálneho otvorenia 
a oddelenia predkožky sa ur čí pre odstavené zvieratá generácie F  1 
vybraté pre párenie. Anogenitálna vzdialenos ť sa zmeria v de ň 0 po 
narodení u mlá ďat generácie F  2 , ak sa vyskytnú zmeny v pomere 
pohlaví u generácie F  1 alebo v čase pohlavnej zrelosti. 
Vyšetrenia funk čnosti sa môžu vynecha ť v skupinách, v ktorých sa iným 
spôsobom prejavili jasné príznaky nepriaznivých ú činkov (napr. 
významný pokles prírastku hmotnosti at ď.). Ak sa uskuto čňujú vyšet­
renia funk čnosti, neuskuto čnia sa na mlá ďatách vybratých na párenie.  
1.5.6.  Autopsia  
V čase usmrtenia alebo uhynutia po čas štúdie sa všetky rodi čovské 
zvieratá (P a F  l generácie), všetky mlá ďatá s externými abnormali ­
tami alebo klinickými príznakmi, ako aj po jednom náhodne 
vybratom mlá ďati/pohlaví/vrhu z F  l a aj F  2 generácie vyšetria makro ­
skopicky na všetky štrukturálne abnormality alebo patologické 
zmeny. Osobitná pozornos ť sa venuje orgánom reproduk čného 
systému. Moribundné mlá ďatá sa humánnym spôsobom usmrtia 
a uhynuté mlá ďatá, ak nie sú macerované, sa vyšetria na možné 
defekty a/alebo prí činu uhynutia a zakonzervujú. 
Maternice všetkých samíc, ktoré prvý raz rodili, sa vyšetria spôso ­
bom, ktorý neovplyvní histopatologické vyšetrenie, na výskyt 
a počet implanta čných miest.  
1.5.7.  Hmotnos ť orgánov  
V čase usmrtenia sa zistí telesná hmotnos ť týchto orgánov všetkých 
rodičovských zvierat P a F  1 generácie (párové orgány sa vážia 
jednotlivo): 
— uterus, vaje čníky, 
— semenníky, nadsemenníky (celé a chvostová časť), 
— prostata, — semenné va čky s koagula čnými žľazami a ich tekutiny a prostata 
(ako jedna jednotka), 
— mozog, pe čeň, obličky, slezina, hypofýza, štítna ž ľaza 
a nadobli čky a známe cie ľové orgány. 
Zistia sa kone čné telesné hmotnosti mlá ďat generácie F
 1 a F 2 vybra­
tých na autopsiu. U jedného náhodne vybratého mlá ďaťa/pohlavia/ ­
vrhu sa odvážia tieto orgány (pozri časť 1.5.6): mozog, slezina 
a týmus.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Výsledky autopsie a hmotnosti orgánov sa posúdia v súvislosti so 
zisteniami z iných štúdií pri opakovaných dávkach, ak je to možné.  
1.5.8.  Histopatológia  
1.5.8.1.  Rodi čovské zvieratá  
Tieto orgány a tkanivá rodi čovských zvierat (P a F  1 ) alebo ich 
reprezentatívne vzorky sa fixujú a uchovajú vo vhodnom médiu na 
histopatologické vyšetrenie: 
— vagína, uterus s cervixom a vaje čníky (zakonzervované vo 
vhodnom fixa čnom prostriedku), 
— jeden semenník (konzervovaný v Bouinovom roztoku alebo 
porovnate ľnom fixa čnom prostriedku), jeden nadsemenník, 
semenné va čky, prostata a koagula čná žľaza, 
— predtým identifikovaný cie ľový orgán(-y) zo všetkých zvierat P a 
F l generácie vybratých na párenie. 
Úplné histopatologické vyšetrenie zakonzervovaných hore uvede ­
ných orgánov a tkanív sa uskuto ční u všetkých zvierat zo skupiny 
s vysokými dávkami a z kontrolnej skupiny generácie P a F  l vybra­
tých na párenie. Vyšetrenie vaje čníkov zvierat P generácie je nepo ­
vinné. Orgány vykazujúce zmeny v súvislosti s ošetrením sa tiež 
vyšetria v skupinách s nízkymi a strednými dávkami na pomoc pri stanovení NOAEL. Ďalej sa podrobia histopatologickému vyšetreniu 
reprodukčné orgány zvierat zo skupín s nízkymi a strednými 
dávkami s podozrením na zníženú fertilitu, napr. tie, ktoré zlyhali 
pri párení, po čatí, plodení alebo vrhnutí zdravého potomstva, alebo 
u ktorých bol ovplyvnený estrálny cyklus alebo po čet spermií, pohy ­
blivosť alebo morfológia. Všetky makroskopické lézie ako napr. 
atrofia alebo tumory sa vyšetria. 
Semenníky sa podrobne histopatologicky vyšetria (napr. s použitím 
Bouinovho fixa čného prostriedku, zaliatia v parafíne 
a transverzálnych rezov s hrúbkou 4 – 5 um) na identifikáciu ú čin­
kov, ktoré boli spôsobené v súvislosti s ošetrením, ako sú napr. 
retencia spermatidov, chýbajúce vrstvy zárodo čných buniek alebo 
typy, mnohojadrové obrovské bunky alebo olupovanie spermatogén ­
nych buniek do lumenu (14). Vyšetrenie intaktných nadsemenníkov 
zahrnuje hlavu, telo a chvostovú časť, ktoré sa môže vykona ť na 
základe posúdenia pozd ĺžneho rezu. Nadsemenníky sa vyšetria na 
infiltráciu leukocytov, zmenu prevalencie typov buniek, aberantných typov buniek a fagocytózu spermií. PAS a farbenie hematoxylínom 
sa môže použi ť na vyšetrenie sam čích reproduk čných orgánov. 
Vaječník po odstavení má obsahova ť primordiálne a rastúce folikuly, 
ako aj ve ľké žlté teliesko obdobia laktácie. Histopatologickým vyšet ­
rením sa má zisti ť kvalitatívny úbytok primordiálnych folikúl. Kvan ­
titatívne hodnotenie primordiálnych folikúl sa uskuto ční pre samice 
F1 generácie; po čet zvierat, výber rezu vaje čníkov a výber ve ľkosti 
vzoriek má by ť štatisticky primeraný na posúdenie použitej metódy. 
Do vyšetrenia sa zahrnie stanovenie po čtu primordiálnych folikúl, 
ktoré sa môžu kombinova ť s malými rastúcimi folikulami na porov ­
nanie ošetrených a kontrolných vaje čníkov (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Odstavené zvieratá  
Makroskopicky abnormálne tkanivo a cie ľové orgány zo všetkých 
mláďat s vonkajšími abnormalitami alebo klinickými príznakmi, ako 
aj na jednom z náhodne vybratom mlá ďati/pohlaví/vrhu z oboch 
generácií F  1 a F  2 , ktoré neboli vybraté na párenie, sa zafixuje 
a uchová vo vhodnom médiu na histopatologické vyšetrenie. Úplná histopatologická charakterizácia zakonzervovaného tkaniva sa usku ­
toční s osobitným dôrazom na orgány reproduk čného systému.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Údaje sa zaprotokolujú jednotlivo a zosumarizujú vo forme tabuliek 
a uvedie sa pre každú pokusnú skupinu a každú generáciu po čet 
zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat, ktoré sa našli uhynuté 
počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas každého 
úmrtia alebo humánneho usmrtenia, po čet fertilných samíc, po čet 
gravidných samíc, po čet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, 
popis zistených príznakov toxicity, vrátane času nástupu, trvania 
a závažnosti každého toxického ú činku, typy vyšetrení rodi čov 
a potomstva, typy histopatologických zmien a všetky údaje, ktoré sa týkajú vrhu. 
Číselné výsledky sa vyhodnotia príslušnou všeobecne uznávanou 
štatistickou metódou; ako sú časť plánu štúdie by sa mali zvoli ť 
štatistické metódy, ktoré by sa mali zdôvodni ť. Na analýzu údajov 
môžu by ť užitočné štatistické modely reakcie na podanie dávky. 
Správa by mala obsahova ť dostatok informácií o analytickej metóde 
a použitom po čítačovom programe, aby nezávislý kontrolór/štatistik 
mohol prehodnoti ť a zrekonštruova ť analýzu.
 
2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Zistenia z tejto štúdie dvojgenera čnej reproduk čnej toxicity by sa 
mali vyhodnoti ť na základe zistených ú činkov vrátane autopsie 
a mikroskopických nálezov. Hodnotenie bude zahrnova ť vzťah 
alebo jeho absenciu medzi dávkou testovanej látky a prítomnos ť 
alebo absenciu výskytu a závažnosti abnormalít, vrátane makrosko ­
pických lézií, identifikovaných cie ľových orgánov, ovplyvnenej ferti ­
lity, klinických abnormalít, ovplyvnenej reproduk čnej činnosti 
a schopnosti vrhnú ť, zmien telesnej hmotnosti, ú činkov na mortalitu 
a iných toxických ú činkov. Pri hodnotení výsledkov testu by sa mali 
zohľadniť fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky a, ak sú 
dostupné, toxikokinetické údaje. 
Riadne vykonaný test reproduk čnej toxicity by mal poskytnú ť uspo­
kojivé stanovenie hladiny, ktorá nevyvoláva ú činky, a umožni ť 
pochopenie nepriaznivých ú činkov na reprodukciu, pôrod, laktáciu, 
postnatálny vývoj vrátane rastu a sexuálneho vývoja.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Štúdia dvojgenera čnej reproduk čnej toxicity poskytne informácie 
o účinkoch opakovanej expozície látkou po čas všetkých fáz repro ­
dukčného cyklu. Štúdia poskytuje informácie predovšetkým 
o reproduk čných parametroch a o vývoji, raste, dozrievaní 
a prežívaní potomstva. Výsledky štúdie by sa mali interpretova ť 
v spojitosti so zisteniami zo subchronických štúdií, štúdií prenatál ­
neho vývoja, toxikokinetických a iných dostupných štúdií. Výsledky 
tejto štúdie sa môžu použi ť pri posudzovaní potreby ďalšieho testo ­
vania chemikálie. Extrapolácia výsledkov štúdie na človeka platí len 
obmedzene. Najlepšie slúžia na poskytnutie informácií o NOAEL 
a prípustnej expozície ľudí (20) (21) (22) (23).  
3. PODÁVANIE SPRAV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlast ­
nosti, 
— identifika čné údaje, 
— čistota. 
Nosič (v prípade potreby): 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda.  
Pokusné zvieratá:  
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo, hniezdiaci materiál at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu.  
Podmienky testu:  
— zdôvodnenie výberu ve ľkosti dávok; 
— údaje o príprave zloženia testovanej látky/krmiva, dosiahnutých 
koncentráciách; 
— stabilita a homogenita prípravku, 
— údaje o podávaní testovanej látky, 
— prepo čet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode 
(ppm) na dosiahnutú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), ak 
je potrebné, 
— údaje o kvalite krmiva a vody.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Výsledky: 
— spotreba potravy a spotreba vody, ak sú k dispozícii, ú činnosť 
krmiva (prírastok telesnej hmotnosti na gram skonzumovanej 
potravy) a spotreba testovaného materiálu pre zvieratá generácie P a F
 1 , okrem obdobia párenia a aspo ň posledných troch 
mesiacov laktácie, 
— údaje o absorpcii (ak sú k dispozícii), 
— údaje o telesnej hmotnosti zvierat P a F  l generácie vybratých na 
párenie, 
— údaje o hmotnosti vrhu a mlá ďat, 
— telesná hmotnos ť pri usmrtení a údaje o absolútnych 
a relatívnych hmotnostiach orgánov rodi čov, 
— povaha, závažnos ť a trvanie klinických vyšetrení (s údajmi 
o reverzibilite), 
— čas uhynutia po čas štúdie, alebo či zvieratá prežili do usmrtenia, 
— údaje o toxickej reakcii pod ľa pohlavia a dávky, vrátane indexov 
pre párenie, fertilitu, graviditu, pôrod, životaschopnos ť a laktáciu; 
v správe je potrebné uvies ť čísla použité na výpo čet týchto inde ­
xov, 
— toxické alebo iné ú činky na reprodukciu, potomstvo, postnatálny 
rast atď., 
— nálezy z autopsie, — podrobný popis všetkých histopatologických nálezov, — počet samíc generácie P a F
 l s normálnym cyklom a trvanie 
cyklu, 
— celkový po čet spermií z chvostovej časti nadsemenníkov, 
percento progresívne sa pohybujúcich spermií, percento morfolo ­
gicky normálnych spermií a percento spermií s každou identifi ­
kovanou abnormalitou, 
— čas do inseminácie, vrátane po čtu dní do inseminácie, 
— dĺžka gravidity, 
— počet implantátov, žlté telieska (corpora lutea), ve ľkosť vrhu, 
— počet živo narodených zvierat a straty po implantácii, 
— počet mláďat s makroskopicky vidite ľnými abnormalitami, ak je 
zistený po čet nevyvinutých jedincov je potrebné uvies ť, 
— údaje o fyzických medzníkoch vo vývoji mlá ďat a iné postna ­
tálne údaje o vývoji; hodnotené fyzické medzníky sa zdôvodnia, 
— údaje o vyšetreniach funk čnosti u mlá ďat a dospelých, ak je 
možné, 
— štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Diskusia k výsledkom. 
Závery, vrátane hodnôt NOAEL pre matku a potomstvo.  
4. ODKAZY  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduc ­
tion in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston 
and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York. 
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of 
Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Develop ­
ment and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxi ­
cology  12: 92–108. 
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54: 103–107. 
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5: 39–44. 
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: 
a Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3): 237–244. 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6: 267–273. 
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13: 409–421. 
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5: 449–458. 
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using 
the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxi ­
cology , Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319–333. 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admini ­
stration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401–415. 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomi ­
crographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8: 330–337. 
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive 
Toxicants. Reproductive Toxicology 6: 491–505. 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. 
Biological Reproduction 17: 298–303. 
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, 
Florida. 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida. 
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421–426. 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5: 379–383. 
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C. A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC. 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. 
Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York. 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven Press, New York. 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York. 
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOXIKOKINETIKA  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 417 (2010). Štúdie 
skúmajúce toxikokinetiku (TK) testovanej chemikálie sa vykonávajú s cieľom získa ť primerané informácie o jej absorpcii, distribúcii, biotrans ­
formácii (t. j. metabolizme) a exkrécii, aby bolo možné ľahšie priradi ť 
koncentráciu alebo dávku k pozorovanej toxicite a lepšie pochopi ť jej 
mechanizmus toxicity. TK môže pomôc ť porozumie ť toxikologickým 
štúdiám tak, že preukáže, že pokusné zvieratá sú systémovo vystavené 
účinkom testovanej chemikálie, a zistí cirkulujúce podiely (materská chemi ­
kália/metabolity). Základné TK parametre ur čené na základe týchto štúdií 
poskytnú aj informácie o potenciáli akumulácie testovanej chemikálie v tkanivách a/alebo v orgánoch a o potenciáli indukcie biotransformácie 
ako dôsledku expozície testovanej chemikálii. 
2. TK údaje môžu pomôc ť pri hodnotení vhodnosti a významnosti údajov 
o toxicite pri zvieratách na ú čely extrapolácie hodnotenia nebezpe čnosti 
a/alebo rizík pre človeka. Okrem toho toxikokinetické štúdie môžu prinies ť 
užitočné informácie na stanovenie úrovní dávok pre štúdie toxicity (lineárna 
alebo nelineárna kinetika), zistenie ú činkov spôsobu podávania, biodostup ­
nosti a otázok spojených s prípravou štúdie. Niektoré druhy TK údajov 
možno použi ť pri vývoji fyziologicky založených 
toxikokinetických (PBTK) modelov. 
3. Dôležité využitie údajov o metabolitoch/TK údajov predstavuje napríklad 
predpovedanie možnej toxicity a druhu pôsobenia a ich vz ťahu k úrovni 
dávky a spôsobu expozície. Okrem toho môžu údaje o metabolizme poskytnúť informácie, ktoré sú užito čné pri hodnotení toxikologického 
významu expozície pre exogénne vytvárané metabolity testovanej chemiká ­
lie. 
4. Vhodné toxikokinetické údaje sú užito čné pri zabezpe čovaní ďalšej prijate ľ­
nosti a použite ľnosti kvantitatívnych vz ťahov štruktúry a aktivity, krížových 
alebo skupinových prístupov pri hodnotení bezpe čnosti chemikálií. Kine ­
tické údaje sa môžu využi ť aj pri hodnotení toxikologickej významnosti 
iných štúdií (napr.  in vivo /in vitro ). 
5. Pokia ľ sa neuvádza iný spôsob podávania (pozri najmä odseky 74 – 78), 
táto testovacia metóda sa používa v prípade orálneho podávania testovanej chemikálie.
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
6. Regula čné systémy majú na rôzne triedy chemikálií (napr. pesticídy, 
biocídy, priemyselné chemikálie) rôzne požiadavky a potreby týkajúce sa merania ukazovate ľov a parametrov súvisiacich s toxikokinetikou. Na 
rozdiel od vä čšiny testovacích metód je v tejto testovacej metóde opísané 
testovanie toxikokinetiky, ktoré zah ŕňa viacero meraní a parametrov. 
V budúcnosti môžu by ť vypracované nové testovacie metódy a/alebo usmer ­ 
ňovacie dokumenty, ktoré budú opisova ť každý parameter samostatne 
a podrobnejšie. V prípade tejto testovacej metódy závisí otázka, ktoré 
testy alebo hodnotenia sa vykonávajú, od požiadaviek a/alebo potrieb jedno ­
tlivých regula čných systémov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Existuje mnoho štúdií, ktoré sa môžu vykona ť na regula čné účely s cieľom 
posúdiť TK správanie testovanej chemikálie. V závislosti od konkrétnych 
regulačných potrieb alebo situácií však nemusia by ť všetky tieto štúdie na 
posúdenie testovanej chemikálie nutné. Pri príprave toxikokinetických štúdií je potrebná flexibilita, pri čom sa zoh ľadnia charakteristiky skúmanej testo ­
vanej chemikálie. V niektorých prípadoch môže by ť na zistenie nebezpe č­
nosti a rizík spojených s testovanou chemikáliou potrebné preskúma ť iba 
určitý súbor otázok. V ur čitých situáciách možno údaje TK zozbiera ť 
v rámci hodnotenia v iných toxikologických štúdiách. V iných situáciách 
môžu byť potrebné ďalšie a/alebo rozsiahlejšie TK štúdie v závislosti od 
regulačných potrieb a/alebo v prípade, že sa v rámci hodnotenia testovanej 
chemikálie objavia nové otázky. 
8. Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky 
dostupné informácie o testovanej chemikálii, relevantných metabolitoch 
a analógoch s cie ľom zlepši ť kvalitu štúdie a predís ť zbytočnému využí ­
vaniu zvierat. Toto zváženie sa môže týka ť údajov získaných pomocou 
iných relevantných testovacích metód (štúdie  in vivo , štúdie  in vitro  a/alebo 
hodnotenia  in silico ). Fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je napríklad 
rozdeľovací koeficient oktanol – voda (vyjadrený ako log P
 ow ), pKa, 
rozpustnos ť vo vode, tlak pary a molekulová hmotnos ť chemikálie, môžu 
byť užitočné pri plánovaní štúdie a interpretácii výsledkov. Možno ich 
stanoviť pomocou vhodných metód, ktoré sú opísané v príslušných testova ­
cích metódach.  
OBMEDZENIA 
9. Táto testovacia metóda nie je ur čená pre prípad osobitných okolností, ako sú 
gravidné zvieratá alebo zvieratá v laktácii a mlá ďatá, ani na hodnotenie 
potenciálnych rezíduí pri exponovaných zvieratách ur čených na produkciu 
potravín. Údaje získané pomocou štúdie B.36 však môžu poskytnú ť 
základné informácie na plánovanie konkrétnych štúdií na ú čely takéhoto 
vyšetrovania. Táto testovacia metóda nie je ur čená na testovanie nanomate ­
riálov. Zo správy o predbežnej revízii usmernení OECD na vykonávanie testov, pokia ľ ide o ich použite ľnosť v prípade nanomateriálov, vyplýva, 
že usmernenia TG 417 (rovnocenné s touto testovacou metódou B.36) nie je 
možné použi ť v prípade nanomateriálov (1).
 
VYMEDZENIE POJMOV 
10. Vymedzenie pojmov použitých na ú čely tejto testovacej metódy je uvedené 
v dodatku.  
OTÁZKA DOBRÝCH ŽIVOTNÝCH PODMIENOK ZVIERAT 
11. Usmernenia o humánnom zaobchádzaní so zvieratami sú k dispozícii 
v usmerňovacom dokumente OECD (GD) č. 19 (2). Odporú ča sa preštu ­
dovať si dokument OECD GD 19 v prípade všetkých štúdií  in vivo  a in 
vitro  opísaných v rámci tejto testovacej metódy.  
OPIS METÓD  
Pilotné štúdie  
12. Pri výbere experimentálnych parametrov pre štúdie toxikokinetiky (napr. 
metabolizmus, hmotnostná bilancia, analytické postupy, stanovenie dávok, exhalácia CO
 2 atď.) sa dôrazne odporú ča použitie pilotných štúdií. Na 
charakterizáciu niektorých týchto parametrov nemusí by ť potrebné použitie 
rádioozna čených chemikálií.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Výber zvierat  
Druh  
13. Druh (a kme ň) zvierat použitých na TK testovanie by pod ľa možnosti mal 
byť rovnaký ako druh (a kme ň) použitý v ostatných toxikologických 
štúdiách vykonaných s použitím skúmanej testovanej chemikálie. Zvy čajne 
sa používa potkan, lebo tento druh sa pri toxikologických štúdiách využíva 
vo veľkej miere. Iné alebo ďalšie druhy sa môžu použi ť, ak kritické toxi ­
kologické štúdie pri týchto druhoch preukazujú významnú toxicitu alebo ak sa preukáže, že ich toxicita/toxikokinetika má vä čší význam pre ľudí. Výber 
druhu a kme ňa zvierat je potrebné odôvodni ť. 
14. Pokia ľ nie je uvedené inak, v tejto testovacej metóde je testovaným živo ­ 
číšnym druhom potkan. Ur čité aspekty metódy sa možno v prípade použitia 
iného testovacieho druhu budú musie ť pozmeni ť.
 
Vek a kme ň 
15. Použijú sa mladé zdravé dospelé zvieratá (zvy čajne vo veku 6 – 12 týžd ňov 
v čase dávkovania) (pozri aj odseky 13 a 14). Použitie zvierat, ktoré nie sú 
mladé a dospelé jedince, je potrebné odôvodni ť. Všetky zvieratá by mali 
mať na začiatku štúdie približne rovnaký vek. Variácia hmotnosti jednotli ­
vých zvierat by nemala presiahnu ť ± 20 % strednej hmotnosti v testovacej 
skupine. Pod ľa možnosti by použitý kme ň mal byť rovnaký ako kme ň 
použitý pri tvorbe toxikologickej databázy pre testovanú chemikáliu.  
Počet a pohlavie zvierat  
16. Pri každej testovanej dávke sa použijú najmenej štyri zvieratá z jedného 
pohlavia. Výber pohlavia použitých zvierat je potrebné odôvodni ť. Použitie 
oboch pohlaví (štyri samce a štyri samice) sa zváži, ak existujú dôkazy svedčiace o významných rozdieloch v toxicite, ktoré súvisia s pohlavím.
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
17. Zvieratá sú po čas obdobia testovania zvy čajne umiestnené samostatne. Za 
osobitných okolností môže by ť opodstatnené umiestnenie v skupinách. 
Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 
hodín tmy. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 °C 
(± 3 °C) a relatívna vlhkos ť by mala by ť 30 – 70 %. Na k ŕmenie sa 
môže používa ť bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej 
vody.  
Testovaná chemikália  
18. V prípade aspektov štúdie súvisiacich s hmotnostnou bilanciou 
a identifikáciou metabolitov sa použije testovaná chemikália rádioozna čená 
pomocou  14 C. Ak však možno preukáza ť, že: 
— hmotnostnú bilanciu a identifikáciu metabolitov možno primerane 
posúdiť pomocou neozna čenej testovanej chemikálie, 
— analytická špecifickos ť a citlivos ť použitej metódy s využitím nerádioak ­
tívnej testovanej chemikálie je rovnaká alebo vä čšia ako analytická 
špecifickos ť a citlivos ť, ktorú možno získa ť pomocou rádioozna čenej 
testovanej chemikálie,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
potom sa nemusí použi ť rádioozna čená testovaná chemikália. Okrem toho 
možno použi ť iné rádioaktívne a stabilné izotopy, najmä ak daný prvok 
vyvoláva alebo prispieva k toxickej zložke testovanej chemikálie. Ak je to možné, rádioozna čenie by sa malo nachádza ť v ústrednej časti molekuly, 
ktorá je metabolicky stabilná (nie je zamenite ľná, neodstráni sa metabolicky 
ako CO
 2 a nestane sa sú časťou jednouhlíkového lôžka organizmu). Ozna ­ 
čenie viacerých miest alebo špecifických oblastí molekuly môže by ť 
potrebné pri sledovaní metabolickej premeny testovanej chemikálie. 
19. Rádioozna čené testované chemikálie a testované chemikálie, ktoré nie sú 
rádioozna čené, sa analyzujú pomocou vhodných metód na ur čenie ich 
čistoty a identity. Rádio čistota rádioaktívnej testovanej chemikálie by mala 
byť najvyššia, ktorú možno pri danej testovanej chemikálii dosiahnu ť (v 
ideálnom prípade by mala by ť vyššia ako 95 %), pri čom by sa malo vyna ­
ložiť primerané úsilie na identifikáciu prímesí tvoriacich 2 % alebo viac. 
Čistota spolu s identitou a podielom všetkých prímesí, ktoré boli identifi ­
kované, sa uvedú v správe. V rámci jednotlivých regula čných programov 
môžu by ť k dispozícii ďalšie usmernenia na u ľahčenie vymedzenia 
a špecifikácií testovaných chemikálií zložených zo zmesí a metódy na určenie čistoty.
 
Výber dávky  
Pilotná štúdia  
20. Zvyčajne na ú čely pilotnej štúdie posta čuje jednorazová orálna dávka. 
Dávka by mala by ť netoxická, ale dostato čne vysoká, aby umožnila identi ­
fikáciu metabolitov v exkrétoch (a v plazme, ak je to vhodné), ako aj splnenie stanoveného ú čelu pilotnej štúdie, ako sa uvádza v odseku 12 
tejto testovacej metódy.
 
Základné štúdie  
21. V prípade základných štúdií sa uprednost ňujú minimálne dve dávky, lebo 
informácie získané pomocou najmenej dvoch skupín s dávkou môžu by ť 
užitočné pri stanovení dávky v ďalších štúdiách toxicity a pri hodnotení 
vzťahu dávky a reakcie v rámci testov toxicity, ktoré sú už k dispozícii. 
22. Ak sa podajú dve dávky, obidve dávky by mali by ť dostatočne vysoké, aby 
bolo možné identifikova ť metabolity v exkrétoch (a v plazme, ak je to 
vhodné). Pri výbere dávok treba zváži ť informácie získané z dostupných 
údajov o toxicite. Ak takéto informácie nie sú k dispozícii (napr. zo štúdií akútnej orálnej toxicity s údajmi o klinických príznakoch toxicity alebo zo 
štúdií toxicity v opakovaných dávkach), možno zváži ť použitie takej 
hodnoty vyššej dávky, ktorá je nižšia ako odhadovaná dávka LD
 50 (orálny 
a dermálny spôsob podávania) alebo odhadovaná koncentrácia LC  50 (inha­
lačný spôsob podávania) alebo ktorá je pod úrov ňou nižšej hodnoty odhadu 
rozsahu akútnej toxicity. Nižšia dávka by mala by ť zlomkom vyššej dávky. 
23. Ak sa skúma iba jedna úrove ň dávky, pod ľa možnosti by dávka mala by ť 
dostatočne vysoká, aby bolo možné identifikova ť metabolity v exkrétoch (a 
v plazme, ak je to vhodné), ale sú časne by nemala vies ť k zjavnej toxicite. 
Nepoužitie druhej úrovne dávky je potrebné odôvodni ť. 
24. Ak je potrebné zisti ť účinok dávky na kinetické procesy, dve dávky nemusia 
postačovať a aspoň jedna dávka by mala by ť dostatočne vysoká na nasý ­
tenie týchto procesov. Ak plocha pod krivkou závislosti koncentrácie a času (AUC) medzi dvoma úrov ňami dávky použitými v základnej štúdii 
nie je lineárna, je zrejmé, že k nasýteniu jedného alebo dvoch kinetických 
procesov dochádza niekde medzi týmito dvomi úrov ňami dávky.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. V prípade testovaných chemikálií s nízkou toxicitou sa použije maximálna 
dávka na úrovni 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti (orálny a dermálny spôsob 
podávania) (usmernenia pre inhala čný spôsob podávania sú k dispozícii 
v kapitole B.2 tejto prílohy; táto dávka zvy čajne nepresahuje 2 mg/l). 
V rámci úvah týkajúcich sa chemikálie môže by ť v závislosti od regula č­
ných potrieb potrebná vyššia dávka. Výber dávky treba vždy odôvodni ť. 
26. Na stanovenie potenciálu akumulácie a/alebo perzistencie môžu by ť vhodné 
toxikokinetické údaje a údaje o rozdelení tkanív týkajúce sa jednorazovej 
dávky. Za ur čitých okolností však môže by ť nutné podanie v opakovaných 
dávkach i) na ú čely komplexnejšieho stanovenia potenciálu akumulácie 
a/alebo perzistencie alebo zmien v TK (t. j. napríklad enzýmovej indukcie 
a inhibície) alebo ii) na základe požiadaviek príslušného regula čného 
systému. Hoci v štúdiách v opakovaných dávkach vä čšinou posta čuje 
opakované podanie nízkej dávky, za ur čitých okolností môže by ť nutné aj 
opakované podanie vysokej dávky (pozri odsek 57).  
Podávanie testovanej chemikálie  
27. Testovaná chemikália sa rozpustí alebo homogénne suspenduje v rovnakom 
nosiči, aký bol použitý v štúdiách orálnej toxicity pri podávaní danej testo ­
vanej chemikálie cez sondu, ak sú tieto informácie o nosi či k dispozícii. 
Výber nosi ča je potrebné odôvodni ť. Výber nosi ča a objemu dávkovania by 
sa mal zváži ť v pláne štúdie. Chemikália sa zvy čajne podáva cez sondu. 
Podávanie formou želatínových kapsúl alebo ako zmes krmiva však môže 
mať v určitých situáciách výhody (v oboch prípadoch je potrebné uvies ť 
odôvodnenie). Treba overi ť, či bola každému zviera ťu podaná skuto čná 
dávka. 
28. Maximálny objem tekutiny, ktorá sa jednorazovo podá cez orálnu sondu, 
závisí od ve ľkosti testovacích zvierat, druhu nosi ča dávky a od skuto čnosti, 
či sa pred podaním testovanej chemikálie zviera k ŕmilo alebo nie. Podávanie 
alebo obmedzenie krmiva pred dávkovaním je potrebné odôvodni ť. Objem 
by za bežných okolností mal by ť podľa možnosti čo najnižší v prípade 
vodných, ako aj v prípade bezvodých nosi čov. Objemy dávok by 
v prípade hlodavcov normálne nemal presahova ť 10 ml/kg telesnej hmot ­
nosti. Objemy nosi čov použitých v prípade lipofilnejších testovaných chemi ­
kálií sa môžu za čínať na úrovni 4 ml/kg telesnej hmotnosti. V prípade 
opakovaných dávok, ke ď je kontraindikovaný denný pôst, je potrebné 
zvážiť nižšie objemy dávok (napr. 2 – 4 ml/kg telesnej hmotnosti). Pod ľa 
možnosti by sa malo zváži ť použitie takého objemu dávky, ktorý je konzis ­
tentný s objemom použitým v iných štúdiách orálnej toxicity testovanej chemikálie pri podávaní cez sondu. 
29. Intravenózne (IV) podávanie testovanej chemikálie a meranie testovanej 
chemikálie v krvi a/alebo v exkrétoch možno použi ť na stanovenie biodo ­
stupnosti alebo relatívnej orálnej absorpcie. V prípade IV štúdie sa pomocou vhodného nosi ča podá jedna dávka (zvy č
ajne rovnaká, ale nie vyššia ako 
nižšia orálna dávka – pozri výber dávky) testovanej chemikálie. Tento 
materiál sa vo vhodnom objeme (napr. 1 ml/kg telesnej hmotnosti) aplikuje 
na vybraté miesto najmenej štyrom zvieratám príslušného pohlavia (ak je to opodstatnené, možno použi ť obidve pohlavia, pozri odsek 16). Pri IV podá ­
vaní testovanej chemikálie je potrebná príprava úplne rozpustenej alebo 
suspendovanej dávky. Nosi č by pri IV podávaní nemal interferova ť 
s integritou krvi alebo s prietokom krvi. Ak sa testovaná chemikália podáva
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
infúzne, dávka podaná infúziou by sa mala uvies ť v správe a medzi jedno ­
tlivými zvieratami by mala by ť štandardizovaná, za predpokladu, že sa 
použije infúzna pumpa. Kanylovanie hrdelnej žily (na podanie testovanej chemikálie a/alebo na odber krvi) alebo podanie cez femorálnu artériu sa vykonáva v anestézii. Druh anestézie treba dôkladne zváži ť, lebo môže 
ovplyvniť toxikokinetiku. Zvieratám by sa pred podaním testovanej chemi ­
kálie s nosi čom malo umožni ť, aby sa dostato čne zotavili. 
30. Iné spôsoby podávania, ako je dermálne alebo inhala čné podávanie (pozri 
odseky 74 – 78), možno použi ť v prípade ur čitých testovaných chemikálií 
po zvážení ich fyzikálno-chemických vlastností a predpokladaného použitia 
a expozície u ľudí.
 
Merania  
Hmotnostná bilancia  
31. Hmotnostná bilancia sa stanoví s čítaním percenta podanej (rádioaktívnej) 
dávky vylú čenej v mo či, výkaloch a vydychovanom vzduchu a percenta 
prítomného v tkanivách, zostávajúcich častiach m ŕtveho tela a zvyškoch 
v klietke (pozri odsek 46). Vo všeobecnosti sa celková vý ťažnosť podanej 
testovanej chemikálie (rádioaktivita) v rozsahu > 90 % považuje za prime ­
ranú.  
Absorpcia  
32. Počiatočný odhad absorpcie možno získa ť odčítaním percenta dávky 
v gastrointestinálnom trakte a/alebo výkaloch od ukazovate ľa hmotnostnej 
bilancie. Pre výpo čet percenta absorpcie pozri odsek 33 Pre vyšetrovanie 
exkrétov pozri odseky 44 – 49. Ak presný rozsah absorpcie nasledujúcej po 
orálnom dávkovaní nie je možné ur čiť pomocou štúdií hmotnostnej bilancie 
(napr. ak je vo výkaloch prítomných viac ako 20 % podanej dávky), mohli by byť potrebné ďalšie vyšetrenia. Tieto štúdie môžu zah ŕňať buď 1. orálne 
podávanie testovanej chemikálie a meranie testovanej chemikálie v žl či, 
alebo 2. orálne a IV podávanie testovanej chemikálie a meranie čistej testo ­
vanej chemikálie prítomnej v mo či, vo vydychovanom vzduchu a v m ŕtvom 
tele v prípade oboch spôsobov podávania. Pri oboch plánoch štúdie sa 
vykoná meranie rádioaktivity ako zástupná metóda chemicky špecifickej 
analýzy testovanej chemikálie a metabolitov. 
33. Ak sa vykonáva štúdia exkrécie žl čou, zvyčajne sa použije orálne podáva ­
nie. V tejto štúdii sa kanylujú žl čovody najmenej štyroch zvierat príslušného 
pohlavia (alebo oboch pohlaví, ak je to opodstatnené) a podá sa jednorazová dávka testovanej chemikálie. Po podaní testovanej chemikálie sa sleduje exkrécia rádioaktivity/testovanej chemikálie v žl či tak dlho, ako je potrebné 
na odhad percenta podanej dávky, ktorá sa vylú či touto cestou. Odhad 
možno použi ť na priamy výpo čet rozsahu orálnej absorpcie takto: 
percento absorpcie  ¼ ðmnožstvo v žl či þ moči þ vydychovanom vzduchu  
þ mŕtvom tele bez obsahu gastrointestinálneho traktu Þ= 
podané množstvo Ü 100 
34. V prípade niektorých tried testovanej chemikálie môže dôjs ť k priamej 
sekrécii absorbovanej dávky cez 
črevné membrány. V takých prípadoch sa 
meranie percentuálnej dávky vo výkaloch po orálnom podaní dávky pri potkanovi s kanylovaným žl čovodom nepovažuje za reprezentatívne 
percento neabsorbovanej dávky. V prípade, že sa o čakáva črevná sekrécia, 
sa odporú ča, aby bolo percento absorbovanej dávky založené na absorpcii 
vypočítanej na základe porovnania exkrécie pri orálnom a IV podaní (potkan 
s neporušeným alebo s kanylovaným žl čovodom) (pozri odsek 35). Takisto 
sa odporú ča, aby sa v prípade, ke ď sa kvantifikácia črevnej sekrécie pova ­ 
žuje za nevyhnutnú, odmerala exkrécia v kanylovanom žl čovode potkana po 
IV podaní dávky.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biodostupnos ť 
35. Biodostupnos ť možno stanovi ť z kinetiky plazmy/krvi pri skupinách 
s orálnym a IV podávaním, ako sa uvádza v odsekoch 50 – 52, pomocou špecifickej chemickej analýzy testovanej chemikálie a/alebo príslušného 
metabolitu/metabolitov. Nevyžaduje sa teda rádioozna čená testovaná chemi ­
kália. Biodostupnos ť (F) testovanej chemikálie alebo príslušného metabolitu/ 
metabolitov možno vypo čítať takto: 
F ¼ ðAUC
 exp=AUC  IV Þ Ü ðDávka  IV=Dávka  exp Þ 
kde AUC je oblas ť pod krivkou závislosti koncentrácie plazmy a času a exp 
je experimentálny spôsob podávania (orálny, dermálny alebo inhala čný). 
36. Na ú čely hodnotenia rizík systémových ú činkov sa vo všeobecnosti pri 
porovnávaní systémových koncentrácií zo štúdií zvierat s analogickými biomonitorovacími údajmi zo štúdií expozície pracovníkov uprednost ňuje 
biodostupnos ť toxickej zložky pred percentom absorpcie. Situácia môže 
byť ešte zložitejšia, ak sú dávky v nelineárnom rozsahu, preto je dôležité, 
aby sa v rámci toxikokinetického skríningu stanovili dávky v lineárnom rozsahu.
 
Distribúcia v tkanivách  
37. Poznatky o distribúcii testovanej chemikálie a/alebo jej metabolitov 
v tkanivách sú dôležité na identifikáciu cie ľových tkanív a na pochopenie 
hlavných mechanizmov toxicity, ako aj na získanie informácií o potenciáli akumulácie a perzistencie testovanej chemikálie a metabolitov. Percento 
celkovej (rádioaktívnej) dávky v tkanivách, ako aj vo zvyšných častiach 
mŕtveho tela by sa malo odmera ť aspoň na konci pokusu s exkréciou (napr. 
zvyčajne do siedmich dní po dávke alebo skôr, v závislosti od špecifického 
správania testovanej chemikálie). Ak sa na konci štúdie v tkanivách nezistí 
testovaná chemikália (napr. z dôvodu, že testovaná chemikália mohla by ť 
eliminovaná pred ukon čením štúdie pre krátky pol čas), treba da ť pozor, aby 
sa predišlo nesprávnej interpretácii údajov. V takejto situácii treba vyšetri ť 
distribúciu v tkanivách v čase, keď má testovaná chemikália (a/alebo meta ­
bolit) najvyššiu koncentráciu v plazme/krvi (T
 max ) alebo v čase najvyššej 
močovej exkrécie (pozri odsek 38). Okrem toho môže by ť potrebný odber 
tkanív v iných časoch s cie ľom určiť distribúciu testovanej chemikálie 
a/alebo jej metabolitov v tkanivách na ú čely posúdenia závislosti od času 
(ak je to vhodné), pomôc ť pri stanovení hmotnostnej bilancie a/alebo vyho ­
vieť požiadavkám príslušného orgánu. Medzi tkanivá, ktoré treba odobra ť, 
patrí pečeň, tuk, gastrointestinálny trakt, obli čky, slezina, celá krv, zvyšné 
časti mŕtveho tela, tkanivá cie ľových orgánov a všetky ostatné tkanivá (napr. 
štítna žľaza, erytrocyty, rozmnožovacie orgány, koža, o či – najmä pri zvie ­
ratách s pigmentáciou), ktoré majú potenciálny význam pre toxikologické hodnotenie testovanej chemikálie. Pre maximalizáciu využite ľnosti zvierat 
a v prípade, že je v štúdiách subchronickej alebo chronickej toxicity pozo ­
rovaná toxicita cie ľového orgánu, by sa mala zváži ť analýza ďalších tkanív 
v tých istých časoch. Do správy sa uvedie aj koncentrácia (rádioaktívnych) 
rezíduí a pomer tkaniva a plazmy (krvi). 
38. Hodnotenie distribúcie v tkanivách v ďalších časoch, ako je čas najvyššej 
koncentrácie v plazme/krvi (napr. T
 max ) alebo čas najvyššej mo čovej exkré ­
cie, získané pomocou príslušných pokusov týkajúcich sa kinetiky plazmy/ 
krvi alebo exkrécie môže by ť takisto potrebné alebo ho môže požadova ť 
príslušný orgán. Tieto informácie môžu by ť užitočné na pochopenie toxicity 
a potenciálu akumulácie a perzistencie testovanej chemikálie a jej metabo ­
litov. Je potrebné uvies ť odôvodnenie výberu vzoriek. Vzorky na analýzu by 
vo všeobecnosti mali by ť rovnaké ako vzorky uvedené vyššie (pozri 
odsek 37).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Rádioaktivitu možno v štúdiách distribúcie v tkanivách kvantifikova ť 
pomocou disekcie orgánov, homogenizácie, horenia a/alebo rozpustenia 
a následnej kvapalinovej scintila čnej spektroskopie (LSC) zachytených rezí ­
duí. Určité metódy, ktoré sú v sú časnosti v rôznych štádiách vývoja, napr. 
kvantitatívna autorádiografia celého tela a receptorová mikroskopická auto ­
rádiografia, môžu preukáza ť užitočnosť pri zisťovaní distribúcie testovanej 
chemikálie v orgánoch a/alebo v tkanivách (3) (4). 
40. V prípade iného ako orálneho spôsobu expozície sa odoberú a analyzujú 
konkrétne tkanivá, ako sú p ľúca v prípade inhala čných štúdií alebo koža 
v prípade dermálnych štúdií. Pozri odseky 74 – 78.  
Metabolizmus  
41. Exkréty (a plazma, ak je to vhodné) sa odoberú na ú čely identifikácie 
a kvantifikácie nezmenenej testovanej chemikálie a metabolitov, ako sa uvádza v odsekoch 44 – 49. Zhromaž ďovanie exkrétov s cie ľom uľahčiť 
identifikáciu metabolitov v rámci danej skupiny s dávkou je prípustné. Pri 
každom čase odberu sa odporú ča profilovanie metabolitov. Ak tomu však 
bráni nedostatok vzoriek a/alebo rádioaktivity, je prípustný odber mo ču 
a výkalov v rôznych časoch. Odber od rôznych pohlaví alebo zvierat 
s rôznymi dávkami však prípustný nie je. Na vyšetrenie mo ču, výkalov, 
vydychovanej rádioaktivity zo zvierat, ktorým bola podaná dávka, a, ak je 
to vhodné, žl če by sa mali použi ť vhodné kvalitatívne a kvantitatívne 
metódy. 
42. Je potrebné vynaloži ť primerané úsilie na identifikáciu všetkých metaboli ­
tov, ktoré predstavujú 5 % alebo viac podanej dávky, a zisti ť metabolickú 
schému testovanej chemikálie. Je nutné identifikova ť testované chemikálie, 
ktoré v exkrétoch predstavujú 5 % alebo viac podanej dávky. Identifikácia 
znamená presné štrukturálne ur čenie zložiek. Identifikácia sa naj častejšie 
vykonáva bu ď súbežnou chromatografiou metabolitu s využitím známych 
štandardov pomocou dvoch rôznych systémov, alebo metódami, pri ktorých možno zabezpe čiť pozitívnu identifikáciu štruktúry, ako je hmotnostná spek ­
trometria, jadrová magnetická rezonancia (NMR) at ď. V prípade súbežnej 
chromatografie sa chromatografické metódy využívajúce rovnakú stacio ­
nárnu fázu pri dvoch rôznych systémoch rozpúš ťania nepovažujú za vhodnú 
dvojmetódovú verifikáciu identity metabolitu, lebo tieto metódy nie sú nezá ­
vislé. Identifikácia pomocou súbežnej chromatografie by sa mala vykona ť 
pomocou dvoch odlišných, analyticky nezávislých systémov, ako je chro ­
matografia na tenkej vrstve (TLC) s reverznou a normálnou fázou a vysokoú činná kvapalinová chromatografia (HPLC). Za predpokladu, že 
chromatografická separácia má dostato čnú kvalitu, nie je potrebné ďalšie 
overenie spektroskopickými prostriedkami. Jednozna čnú identifikáciu 
možno prípadne zabezpe čiť aj pomocou metód, ktoré poskytujú informácie 
o štruktúre, ako sú: kvapalinová chromatografia – hmotnostná spektrometria 
(LC-MS) alebo kvapalinová chromatografia – tandemová hmotnostná spek ­
trometria (LC-MS/MS), plynová chromatografia s hmotnostnou spektrome ­
triou (GC-MS) a spektrometria NMR. 
43. Ak identifikácia metabolitov predstavujúcich 5 % alebo viac podanej dávky 
nie je možná, v závere čnej správe treba uvies ť odôvodnenie/vysvetlenie. 
Môže by ť vhodné identifikova ť metabolity predstavujúce menej ako 5 % 
podanej dávky s cie ľom lepšie pochopi ť metabolickú premenu na ú čely 
hodnotenia nebezpe čnosti a/alebo rizík testovanej chemikálie. Ak je to 
možné, vždy treba uvies ť potvrdenie štruktúry. To môže zah ŕňať profilo­
vanie v plazme, krvi alebo v iných tkanivách.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Exkrécia  
44. Miera a rozsah exkrécie podanej dávky by sa mala stanovi ť na základe 
merania percenta (rádioaktívnej) dávky získanej z mo ču, výkalov 
a vydychovaného vzduchu. Tieto údaje budú užito čné aj pri stanovovaní 
hmotnostnej bilancie. Množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) odstrá ­
nenej prostredníctvom mo ču, výkalov a vydychovaného vzduchu sa stanovia 
v príslušných časových intervaloch (pozri odseky 47 – 49). Pokusy 
v opakovaných dávkach by mali by ť vhodne naplánované, aby bolo 
možné zozbiera ť údaje o exkrécii a splni ť ciele opísané v odseku 26. To 
umožní porovnanie s pokusmi v jednorazových dávkach. 
45. Ak pilotná štúdia preukáže, že nedošlo k exkrécii významného množstva 
testovanej chemikálie (rádioaktivity) (pod ľa odseku 49) vo vydychovanom 
vzduchu, potom v kone čnej štúdii nie je potrebný odber vydychovaného 
vzduchu. 
46. Každé zviera sa umiestni do samostatnej metabolickej jednotky na odber 
exkrétov (mo ču, výkalov a vydychovaného vzduchu). Na konci každého 
obdobia odberu (pozri odseky 47 – 49) sa metabolické jednotky vy čistia 
vhodným rozpúš ťadlom (tento krok sa nazýva „ čistenie klietky“), aby sa 
zabezpečila maximálna vý ťažnosť testovanej chemikálie (rádioaktivity). 
Odber exkrétov sa ukon čí po siedmich d ňoch alebo po tom, ako sa zozbiera 
aspoň 90 % podanej dávky, pod ľa toho, čo nastane skôr. 
47. Celkové množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) v mo či sa stanovia 
najmenej v dvoch časoch v prvý de ň odberu, pri čom jedno stanovenie by sa 
malo vykona ť 24 hodín po dávkovaní, a následne každý de ň až do konca 
štúdie. V prvý de ň sa odporú ča zvoliť si viac ako dva časy odberu (napr. po 
6, 12 a 24 hodinách). V rámci výsledkov pilotných štúdií sa analyzujú 
informácie o alternatívnych alebo ďalších časoch odberu. Plán odberov je 
potrebné odôvodni ť. 
48. Celkové množstvá testovanej chemikálie (rádioaktivity) vo výkaloch sa 
stanovia na dennej báze, pri čom prvý odber sa vykoná 24 hodín po dávko ­
vaní a odbery budú pokra čovať až do konca štúdie, pokia ľ z pilotných štúdií 
nevyplýva, že by bolo vhodnejšie použi ť alternatívne alebo ďalšie časy 
odberov. Plánovanie alternatívnych plánov odberu je potrebné odôvodni ť. 
49. Odber vydychovaného CO  2 a iných prchavých materiálov možno v rámci 
pokusu danej štúdie preruši ť v prípade, že sa po čas 24-hodinového obdobia 
odberu vo vydychovanom vzduchu zistí menej ako 1 % podanej dávky.  
Štúdie časového priebehu  
Kinetika plazmy/krvi  
50. Účelom týchto štúdií je získa ť odhady základných TK parametrov [napr. 
C max , T max , polčas (t  1/2 ), AUC] testovanej chemikálie. Tieto štúdie sa môžu 
vykonáva ť s využitím jednej dávky alebo častejšie s využitím dvoch alebo 
viacerých dávok. Dávky sa stanovia na základe charakteru pokusu a/alebo 
otázky, ktorá sa skúma. Kinetické údaje môžu by ť potrebné na riešenie 
otázok, ako je biodostupnos ť testovanej chemikálie, a/alebo na objasnenie 
účinku dávky na klírens (napr. na objasnenie, či dôjde k nasýteniu klírensu 
v závislosti od dávky). 
51. Pre tieto štúdie sa v každej skupine s dávkou použijú najmenej štyri zvieratá 
z jedného pohlavia. Výber pohlavia použitých zvierat je potrebné odôvod ­
niť. Použitie oboch pohlaví (štyri samce a štyri samice) sa zváži, ak existujú 
dôkazy sved čiace o významných rozdieloch v toxicite, ktoré súvisia 
s pohlavím.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Po podaní (rádioozna čenej) testovanej chemikálie sa pomocou vhodnej 
metodiky odberu v primeraných časoch z každého zviera ťa odoberú vzorky 
krvi. Objem a po čet vzoriek krvi, ktoré možno odobra ť z každého zviera ťa, 
môže by ť obmedzený potenciálnymi ú činkami opakovaných odberov na 
zdravie/fyziológiu zvierat a/alebo citlivos ťou analytickej metódy. Vzorky 
sa analyzujú v prípade každého zviera ťa. Za určitých okolností (napr. pri 
charakterizácii metabolitov) môže by ť nutné odobra ť vzorky z viac ako 
jedného zviera ťa. Odobraté vzorky sa jasne identifikujú, pri čom sa uvedie 
odôvodnenie odberu. Ak sa použije rádioozna čená testovaná chemikália, 
môže by ť vhodné uvies ť analýzu celkovej prítomnej rádioaktivity. 
V takom prípade sa celková rádioaktivita analyzuje v celej krvi a v plazme alebo v plazme a v červených krvinkách, čo umožní výpo čet pomeru krvi 
a plazmy. Za iných okolností môžu by ť potrebné konkrétnejšie vyšetrenia, 
ktoré si vyžadujú identifikáciu materskej zlú čeniny a/alebo metabolitov, 
alebo vyšetrenia na ú čely hodnotenia bielkovinových väzieb.
 
Kinetika ostatných tkanív  
53. Účelom týchto štúdií je získa ť informácie o časovom priebehu na objasnenie 
otázok súvisiacich s problémami, ako sú druh toxického pôsobenia, bioaku ­
mulácia a bioperzistencia, a to prostredníctvom stanovenia úrovne testovanej 
chemikálie v jednotlivých tkanivách. Výber tkanív a po čet hodnotených 
časových bodov bude závisie ť od skúmaného problému a toxikologickej 
databázy testovanej chemikálie. Pri plánovaní týchto dodato čných štúdií 
kinetiky tkanív treba zoh ľadniť zozbierané informácie, ako sa uvádza 
v odsekoch 37 – 40. Tieto štúdie sa môžu vykonáva ť s využitím jednora ­
zovej dávky alebo opakovaných dávok. Použitý prístup je potrebné podrobne odôvodni ť. 
54. Dôvody na vykonanie ďalších kinetických štúdií tkanív môžu zah ŕňať: 
— dôkazy o pred ĺženom pol čase krvi, ktoré sved čia o možnej akumulácii 
testovanej chemikálie v jednotlivých tkanivách, alebo 
— záujem zisti ť, či sa dosiahla stabilná úrove ň v konkrétnych tkanivách 
(napr. v štúdiách v opakovaných dávkach aj v prípade, že sa zdanlivo dosiahla stabilná úrove ň testovanej chemikálie v krvi, môže by ť záujem 
uistiť sa, či sa stabilná úrove ň dosiahla aj v cie ľových orgánoch). 
55. Pri týchto druhoch štúdií časového priebehu sa orálne podá vhodná dávka 
testovanej chemikálie najmenej štyrom zvieratám v každej skupine s dávkou 
v každom časovom bode, pri čom sa monitoruje časový priebeh distribúcie 
vo vybratých tkanivách. Ak nie je pozorovaná toxicita prízna čná pre niek ­
toré pohlavie, možno použi ť iba jedno pohlavie. To, či sa bude analyzova ť 
celková rádioaktivita alebo materská chemikália a/alebo metabolity, bude 
takisto závisie ť od skúmaného problému. Hodnotenie distribúcie 
v tkanivách by sa malo vykona ť s využitím primeraných metód.
 
Enzýmová indukcia/inhibícia  
56. Štúdie skúmajúce možné ú činky enzýmovej indukcie/inhibície alebo 
biotransformáciu skúmanej testovanej chemikálie môžu by ť potrebné 
v jednom alebo vo viacerých z uvedených prípadov: 
1. dostupné dôkazy indikujú vz ťah medzi biotransformáciou testovanej 
chemikálie a zvýšenou toxicitou; 
2. dostupné údaje o toxicite indikujú nelineárny vz ťah medzi dávkou 
a metabolizmom;  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. výsledky štúdií identifikácie metabolitov ukazujú identifikáciu poten ­
ciálne toxických metabolitov, ktoré mohli vzniknú ť enzýmovým pôso ­
bením indukovaným testovanou chemikáliou; 
4. pri vysvet ľovaní účinkov, pri ktorých sa predpokladá súvislos ť 
s enzýmovou indukciou; 
5. ak sa pozorujú toxikologicky významné zmeny v metabolickom profile 
testovanej chemikálie na základe pokusov  in vitro  alebo  in vivo  
s využitím rôznych druhov zvierat alebo podmienok, môže by ť potrebná 
charakterizácia pôsobiaceho enzýmu (enzýmov) (napr. enzýmov fázy I, 
ako sú izoenzýmy cytochróm P450 monooxygenázového systému, 
enzýmy fázy II, ako sú izoenzýmy sulfotransferázy alebo uridín-difos ­
fát-glukuronosyltransferázy, alebo akýchko ľvek iných relevantných enzý ­
mov). Tieto informácie možno použi ť pri hodnotení vhodnosti živo číš­
nych druhov pre extrapoláciu druhov. 
57. Na hodnotenie testovanej chemikálie v súvislosti so zmenami v TK sa 
použijú vhodné protokoly k štúdii, ktoré sú náležite overené a odôvodnené. Príklady plánov štúdií pozostávajú z opakovaného dávko ­
vania neozna čenej testovanej chemikálie, po ktorom nasleduje jednorazová 
rádioozna čená dávka v de ň 14 alebo opakované dávkovanie rádioozna čenej 
testovanej chemikálie a odber vzoriek v d ňoch 1, 7 a 14 na stanovenie 
profilov metabolitov. Pomocou opakovaného dávkovania rádioozna čenej 
testovanej chemikálie možno získa ť aj informácie o bioakumulácii (pozri 
odsek 26).
 
DOPLŇUJÚCE PRÍSTUPY 
58. Dopl ňujúce prístupy presahujúce rámec pokusov  in vivo  opísaných v tejto 
testovacej metóde môžu prinies ť užitočné informácie o absorpcii, distribúcii, 
metabolizme alebo eliminácii testovanej chemikálie pri ur čitých živo číšnych 
druhoch.  
Použitie informácií  in vitro  
59. Pomocou vhodných testovacích systémov možno v štúdiách  in vitro  
objasniť viaceré otázky týkajúce sa metabolizmu testovanej chemikálie. 
Čerstvo izolované alebo kultivované hepatocyty a subcelulárne frakcie 
(napr. mikrozómy a cytosól alebo frakcia S9) z pe čene možno použi ť na 
štúdium možných metabolitov. Pre hodnotenie rizík môže by ť zaujímavý 
lokálny metabolizmus v cie ľovom orgáne, napr. v p ľúcach. Na tieto ú čely 
môžu by ť užitočné mikrozómové frakcie cie ľových tkanív. Štúdie 
s mikrozómami môžu by ť prínosné pri riešení potenciálnych rozdielov 
medzi pohlaviami a životnými fázami a pri charakterizácii enzýmových 
parametrov (K  m a V  max ), ktoré môžu pomôc ť pri hodnotení závislosti meta ­
bolizmu od dávky v súvislosti s úrov ňami expozície. Okrem toho môžu by ť 
mikrozómy užito čné pri identifikácii špecifických mikrozómových enzýmov 
podieľajúcich sa na metabolizme testovanej chemikálie, ktoré môžu ma ť 
význam pri extrapolácii živo číšnych druhov (pozri aj odsek 56). Takisto 
potenciál indukcie biotransformácie možno preskúma ť pomocou pe čeňových 
subcelulárnych frakcií (napr. mikrozómov a cytosólu) zvierat, ktoré boli skúmanej testovanej chemikálii vystavené skôr,  in vitro  prostredníctvom 
štúdií hepatocytovej indukcie alebo zo špecifických bunkových línií vyja ­
drujúcich relevantné enzýmy. Za ur čitých okolností a v primeraných 
podmienkach možno pri ur čovaní potenciálnych rozdielov 
v biotransformácii medzi živo číšnymi druhmi zváži ť použitie subcelulárnych 
frakcií pochádzajúcich z ľudských tkanív. Výsledky z vyšetrení  in vitro  
môžu byť užitočné aj pri vývoji modelov PBTK (5).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Štúdie dermálnej absorpcie  in vitro  môžu prinies ť doplňujúce informácie na 
účely charakterizácie absorpcie (6). 
61. Primárne bunkové kultúry z pe čeňových buniek a čerstvé plátky tkanív 
možno použi ť na zodpovedanie podobných otázok ako v prípade pe čeňo­
vých mikrozómov. V ur čitých prípadoch je možné zodpoveda ť konkrétne 
otázky pomocou bunkových línií s vymedzeným vyjadrením relevantného enzýmu alebo pomocou kultivovaných bunkových línií. V ur čitých prípa ­
doch môže by ť užitočné študova ť inhibíciu a indukciu špecifických cyto ­
chróm P450 izozýmov (napr. CYP1A1, 2E1, 1A2 a iných) a/alebo enzýmov 
fázy II materskej zlú čeniny s využitím štúdií  in vitro . Získané informácie 
môžu ma ť význam v prípade zlú čenín s podobnou štruktúrou.
 
Použitie toxikokinetických údajov zo štúdií toxicity ako dopl ňujúcich 
informácií  
62. Analýza vzoriek krvi, tkanív a/alebo exkrétov odobratých v priebehu 
akýchkoľvek iných štúdií toxicity môže prinies ť údaje o biodostupnosti, 
zmenách koncentrácií v plazme v závislosti od času (AUC, C  max ), potenciáli 
bioakumulácie, klírense a zmenách súvisiacich s pohlavím alebo pol časom 
v metabolizme a kinetike. 
63. Úvahy o pláne štúdie možno použi ť na zodpovedanie otázok týkajúcich sa: 
nasýtenia absorpcie, ciest biotransformácie alebo exkrécie pri vyšších úrov ­
niach dávky, pôsobenia nových metabolických ciest pri vyšších dávkach a obmedzenia toxických metabolitov na vyššie dávky. 
64. Ostatné úvahy v rámci hodnotenia nebezpe čnosti môžu zah ŕňať otázky, ako 
napríklad: 
— citlivos ť súvisiaca s vekom v dôsledku rozdielov stavu hematoencefa ­
lickej bariéry, obli čiek a/alebo detoxifika čných schopností, 
— citlivos ť subpopulácie v dôsledku rozdielov medzi schopnos ťami 
biotransformácie alebo iných TK rozdielov, 
— rozsah expozície plodu v dôsledku transplacentárneho prenosu chemi ­
kálií alebo expozície novorodenca prostredníctvom laktácie.
 
Použitie toxikokinetického modelovania  
65. Toxikokinetické modely môžu by ť užitočné pri rôznych aspektoch hodno ­
tenia nebezpe čnosti a rizík, ako napríklad pri predpovedaní systémovej 
expozície a dávky vo vnútorných tkanivách. Okrem toho sa môžu vyše ­
trovať konkrétne otázky týkajúce sa druhu pôsobenia, pri čom tieto modely 
môžu predstavova ť základ pre extrapoláciu živo číšnych druhov, spôsoby 
expozície, štruktúry dávkovania a hodnotenie rizík pre človeka. Údaje 
užitočné pre vývoj PBTK modelov pre testovanú chemikáliu pri akom ­
koľvek živočíšnom druhu zah ŕňajú 1. rozde ľovacie koeficienty; 2. bioche ­
mické konštanty a fyziologické parametre; 3. absorp čné parametre pre 
konkrétne cesty a 4. kinetické údaje  in vivo  pre hodnotenie modelov [napr. 
parametre klírensu pre relevantné (> 10 %) vylu čovacie cesty, K  m a V  max 
pre metabolizmus]. Experimentálne údaje použité pri vývoji modelov by sa 
mali získa ť metódami, ktoré sú z vedeckého h ľadiska primerané, pri čom 
výsledky modelov treba overi ť. Na uľahčenie vývoja nekompartmentových 
fyziologicky založených modelov sa často stanovujú parametre špecifické 
pre testovanú chemikáliu a živo číšny druh, ako je miera absorpcie, rozde ľo­
vacia konštanta krv – tkanivo a konštanta miery metabolizmu (7).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV 
66. Odporú ča sa, aby správa o štúdii zah ŕňala obsah.  
Hlavná časť správy  
67. Hlavná časť správy zah ŕňa informácie získané pomocou tejto testovacej 
metódy, ktoré sú rozdelené do oddielov a odsekov takto:  
Zhrnutie  
68. Tento oddiel správy o štúdii obsahuje zhrnutie plánu štúdie a opis použitých 
metód. Takisto by mal poukazova ť na hlavné zistenia týkajúce sa hmot ­
nostnej bilancie, charakteru a ve ľkosti metabolitov, zvyškov tkanív, klírensu, 
potenciálu bioakumulácie, rozdielov medzi pohlaviami at ď. Zhrnutie by 
malo byť dostatočne podrobné, aby umožnilo hodnotenie zistení.  
Úvod  
69. Tento oddiel správy obsahuje ciele, odôvodnenie a plán štúdie, ako aj 
príslušné odkazy a akéko ľvek informácie o skuto čnostiach, ktoré štúdii 
predchádzali.  
Materiály a metódy  
70. Tento oddiel správy obsahuje podrobné opisy všetkých súvisiacich infor ­
mácií vrátane týchto údajov: 
a) Testovaná chemikália 
Tento pododdiel zah ŕňa identifikáciu testovanej chemikálie: chemický 
názov, molekulárnu štruktúru, kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie jej chemického zloženia, chemickú čistotu a, ak je to možné, druh 
a množstvá všetkých prímesí. Takisto zah ŕňa informácie o fyzikálno- 
chemických vlastnostiach vrátane fyzikálneho skupenstva, farby, makro ­
skopickej rozpustnosti a/alebo rozde ľovacieho koeficientu, stability a, ak 
je to vhodné, žieravosti. Pod ľa potreby sa uvedú informácie o izoméroch. 
Ak je testovaná chemikália rádioozna čená, tento pododdiel bude obsa ­
hovať tieto informácie: druh rádionuklidu, umiestnenie zna čky, špeci ­
fická aktivita a rádiochemická čistota. 
Uvedie sa druh alebo opis všetkých nosi čov, riedidiel, suspenzných látok 
a emulzifikátorov alebo iných materiálov použitých pri podávaní testo ­
vanej chemikálie. 
b) Pokusné zvieratá 
Tento pododdiel obsahuje informácie o pokusných zvieratách vrátane 
výberu živo číšneho druhu a odôvodnenia, kme ňa a veku na za čiatku 
štúdie, pohlavia, ako aj telesnej hmotnosti, zdravotného stavu a chovu 
zvierat. 
c) Metódy 
Tento pododdiel obsahuje informácie o pláne štúdie a použitej metodike. 
Zahŕňa tieto údaje: 
1. odôvodnenie akýchko ľvek zmien spôsobu expozície a podmienok 
expozície, ak je to vhodné;
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2. odôvodnenie výberu úrovní dávok; 
3. opis pilotných štúdií použitých v experimentálnom pláne následných 
štúdií, ak je to vhodné, pri čom sa predložia dopl ňujúce údaje 
o pilotných štúdiách; 
4. postup prípravy dávkovacieho roztoku a druh rozpúš ťadla alebo 
nosiča, ak sa použil; 
5. počet skupín, ktorým sa aplikovala chemikália, a po čet zvierat 
v skupine; 
6. úrovne a objem dávkovania (a špecifická aktivita dávky, ak sa 
použila rádioaktivita); 
7. spôsob (spôsoby) a metódy podávania; 
8. frekvencia dávkovania; 
9. obdobie pôstu (ak sa použilo); 
10. celková rádioaktivita na jedno zviera; 
11. zaobchádzanie so zvieratami; 
12. odber vzoriek a manipulácia s nimi; 13. analytické metódy použité na separáciu, kvantifikáciu a identifikáciu 
metabolitov; 
14. detek čný limit pre použité metódy; 
15. iné pokusné merania a postupy, ktoré sa použili (vrátane overenia 
metód analýzy metabolitov). 
d) Štatistická analýza 
Ak sa na analyzovanie zistení štúdie použije štatistická analýza, je 
potrebné uvies ť dostatočné informácie o použitej metóde analýzy a o 
počítačovom programe, aby mohol analýzu opätovne vyhodnoti ť 
a zrekonštruova ť nezávislý kontrolór/štatistik. 
V prípade štúdií modelovania systémov, ako je PBTK, by prezentácia 
modelov mala zah ŕňať kompletný opis modelu, ktorý umožní nezávislú 
rekonštrukciu a overenie modelu (pozri odsek 65 a dodatok: Vymedzenie pojmov).
 
Výsledky  
71. Všetky údaje sa zhrnú do tabuliek s príslušným štatistickým hodnotením 
a opíšu sa v texte v rámci tohto oddielu. Výpo čtové údaje o rádioaktivite sa 
zhrnú a uvedú v závislosti od štúdie, zvy čajne ako mikrogramové alebo 
miligramové ekvivalenty na hmotnos ť vzorky, hoci je možné použi ť aj 
iné jednotky. Tento oddiel zah ŕňa grafické znázornenia zistení, reprodukciu 
reprezentatívnych chromatografických a spektrometrických údajov, identifi ­
káciu/kvantifikáciu metabolitov a navrhované metabolické cesty vrátane molekulárnej štruktúry metabolitov. Okrem toho sa v tomto oddiele pod ľa 
možnosti uvedú tieto informácie: 
1. Množstvo a percentuálna vý ťažnosť rádioaktivity v mo či, výkaloch, 
vydychovanom vzduchu a v mo či a výkaloch zo zvyškov v klietke: 
— v prípade dermálnych štúdií sa uvedú aj údaje o vý ťažnosti testovanej 
chemikálie z kože po aplikácii chemikálie, z omytia kože a údaje o reziduálnej rádioaktivite v krycom obväze kože a metabolickej 
jednotke, ako aj výsledky štúdie dermálneho omytia. Ďalšie infor ­
mácie sú uvedené v odsekoch 74 – 77,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— v prípade inhala čných štúdií sa uvedú aj údaje o vý ťažnosti testo ­
vanej chemikálie z p ľúc a nosových tkanív (8). Ďalšie informácie sú 
uvedené v odseku 78; 
2. distribúcia v tkanivách uvádzaná ako percento podanej dávky 
a koncentrácia (mikrogramové ekvivalenty na gram tkaniva) a pomery tkanivo – krv alebo tkanivo – plazma; 
3. materiálová bilancia získaná z každej štúdie vrátane vyšetrenia telesných 
tkanív a exkrétov; 
4. koncentrácie plazmy a toxikokinetické parametre (biodostupnos ť, AUC, 
Cmax, Tmax, klírens, pol čas) po podaní príslušným spôsobom (spô ­
sobmi) expozície; 
5. rýchlos ť a rozsah absorpcie testovanej chemikálie po podaní príslušným 
spôsobom (spôsobmi) expozície; 
6. množstvá testovanej chemikálie a metabolitov (uvádzané ako percento 
podanej dávky) získané z exkrétov; 
7. odkaz na dodatky, ktoré obsahujú údaje o všetkých meraných parame ­
troch pri jednotlivých zvieratách (napr. podávanie dávok, percentuálna výťažnosť, koncentrácie, TK parametre at ď.); 
8. obrázok s navrhovanými metabolickými cestami a molekulárnou štruk ­
túrou metabolitov.
 
Rozbor a závery  
72. V tomto oddiele autor/autori: 
1. uvedie/uvedú navrhovanú metabolickú cestu na základe výsledkov meta ­
bolizmu a charakteru testovanej chemikálie; 
2. analyzuje/analyzujú všetky potenciálne živo číšne druhy a rozdiely medzi 
pohlaviami týkajúce sa charakteru a/alebo biotransformácie testovanej chemikálie; 
3. uvedie/uvedú v tabu ľkách a zanalyzuje/zanalyzujú identifikáciu a ve ľkosť 
metabolitov, klírens, potenciál bioakumulácie a úrove ň tkanivových 
rezíduí materskej chemikálie a/alebo metabolitu (metabolitov), ako aj možné zmeny v TK parametroch súvisiace s dávkou; 
4. začlení/začlenia do tohto oddielu všetky relevantné TK údaje získané 
v priebehu štúdií toxicity; 
5. uvedie/uvedú stru čný záver, ktorý možno podloži ť zisteniami štúdie; 
6. vloží/vložia oddiely (pod ľa potreby). 
73. Na uvedenie podkladových bibliografických informácií, tabuliek, obrázkov, 
dodatkov at ď. možno použi ť ďalšie oddiely.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATÍVNE SPÔSOBY EXPOZÍCIE  
Dermálna  
Dermálna aplikácia  
74. V tomto oddiele sa uvádzajú špecifické informácie o vyšetrení toxikokine ­
tiky testovanej chemikálie pri dermálnom spôsobe podávania. V prípade 
dermálnej absorpcie je potrebné si preštudova ť kapitolu B.44 tejto 
prílohy [Absorpcia kožou: metóda  in vivo  (9)]. Na ostatné parametre, ako 
je distribúcia a metabolizmus, možno použi ť túto testovaciu metódu B.36. 
V prípade dermálnej aplikácie sa použije jedna alebo viac úrovní dávok 
testovanej chemikálie. Testovaná chemikália (napríklad čistý, zriedený 
alebo vytvorený materiál obsahujúci testovanú chemikáliu, ktorá sa aplikuje na kožu) by mala by ť rovnaká (prípadne realisticky zástupná) ako chemi ­
kália, ktorej môže by ť vystavený človek alebo iný potenciálny cie ľový 
živočíšny druh. Úrove ň/úrovne dávky sa vyberie/vyberú pod ľa odsekov 20 
– 26 tejto testovacej metódy. Medzi faktory, ktoré možno vzia ť pri výbere 
dermálnej dávky do úvahy, patrí predpokladaná expozícia človeka a/alebo 
dávky, pri ktorých bola v iných štúdiách toxicity pozorovaná toxicita. 
Dermálna/dermálne dávka/dávky sa pod ľa potreby rozpustí/rozpustia vo 
vhodnom nosi či a aplikujú v objeme primeranom na podávanie dávok. 
Krátko pred za čatím testu sa pokusným zvieratám ostrihá srs ť na chrbte. 
Vyholenie srsti je takisto prípustné, malo by sa však uskuto čniť asi 24 hodín 
pred testom. Pri strihaní alebo holení treba bra ť ohľad na to, aby sa nepo ­ 
škodila koža zvierat, lebo by to viedlo k zmene priepustnosti. Na ú čely 
aplikácie testovanej chemikálie sa približne 10 % povrchu tela zbaví srsti. 
V prípade vysokotoxických chemikálií môže povrchová plocha predstavova ť 
menej ako približne 10 %, ale čo najväčšia časť tejto plochy sa pokryje 
tenkým a rovnomerným filmom. Vo všetkých skupinách dermálneho testo ­
vania sa na aplikáciu použije tá istá povrchová plocha. Plochy, na ktoré bola 
chemikália aplikovaná, sa prikryjú vhodným krycím obväzom, ktorý sa 
upevní na dané miesto. Zvieratá sa umiestnia samostatne. 
75. Na posúdenie množstva aplikovanej dávky testovanej chemikálie, ktorú 
možno z kože odstráni ť omytím ošetrenej plochy kože šetrným mydlom 
a vodou, by sa mala vykona ť štúdia dermálneho omytia. Táto štúdia 
môže byť užitočná aj pri stanovovaní hmotnostnej bilancie v prípade, že 
sa testovaná chemikálie podáva cez kožu. V tejto štúdii dermálneho omytia 
sa dvom zvieratám jednorazovo aplikuje dávka testovanej chemikálie. 
Úroveň dávky sa vyberie pod ľa odseku 23 tejto testovacej metódy (pre 
rozbor času kontaktu s kožou pozri aj odsek 76). Množstvá testovanej 
chemikálie získané z omytia sa stanovia s cie ľom posúdi ť efektívnos ť elimi­
nácie testovanej chemikálie prostredníctvom omytia. 
76. Pokia ľ tomu nebráni žieravos ť, testovaná chemikália sa aplikuje a nechá 
pôsobiť na koži minimálne šes ť hodín. V čase odstránenia krycieho obväzu 
sa ošetrená plocha umyje pod ľa postupu uvedeného v štúdii dermálneho 
omytia (pozri odsek 75). Krycí obväz aj zmytý materiál sa analyzujú s cieľom zistiť, či neobsahujú zvyšky testovanej chemikálie. Na konci štúdií 
sa každé zviera humánne utratí pod ľa bodu (2) a ošetrená koža sa odstráni. 
Na určenie rezíduí testovanej chemikálie (rádioaktivity) sa analyzuje vhodný 
rez ošetrenej kože. 
77. Na ú čely toxikokinetického hodnotenia liekov môžu by ť potrebné odlišné 
postupy, ktoré sú v súlade s príslušným regula čným systémom.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalačná 
78. Použije sa jedna koncentrácia (alebo pod ľa potreby viac koncentrácií) testo ­
vanej chemikálie. Koncentrácia/koncentrácie sa vyberie/vyberú pod ľa 
odsekov 20 – 26 tejto testovacej metódy. Inhala čná aplikácia sa vykoná 
pomocou nosového kónu alebo zariadenia na oblas ť hlavy, aby sa predišlo 
absorpcii inými expozi čnými cestami (8). Ak sa pri inhala čnej expozícii 
použijú iné podmienky, je potrebné v dokumentácii uvies ť odôvodnenie 
tejto zmeny. Je potrebné vymedzi ť trvanie expozície inhaláciou. Expozícia 
zvyčajne trvá štyri až šes ť hodín.  
LITERATÚRA  
1. OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paríž. 
2. OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paríž. 
3. Solon, E. G., Kraus, L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73 – 81. 
4. Stumpf, W. E. (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25 – 40. 
5. Loizou, G., Spendiff, M., Barton, H. A., Bessems, J., Bois, F. Y., d’Yvoire, 
M. B., Buist, H., Clewell, H. J. 3rd, Meek, B., Gundert-Remy, U., Goerlitz, 
G., Schmitt, W. (2008). Development of good modelling practice for physio ­
logically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. 
6. Kapitola B.45 tejto prílohy, Absorpcia kožou: metóda in vitro. 7. IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Ženeva, Svetová zdravotnícka orga ­
nizácia, Medzinárodný program chemickej bezpe čnosti. 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paríž. 
9. Kapitola B.44 tejto prílohy, Absorpcia kožou: metóda in vivo. 
10. Barton, H. A. a kol. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9 – 35. 
11. Gibaldi, M., a Perrier, D., (1982), Pharmacokinetics, druhé vydanie, Marcel 
Dekker, Inc., New York.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Dodatok  
VYMEDZENIE POJMOV  
Absorpcia : proces (procesy) vstrebávania chemikálií do tkanív alebo cez tkanivá. 
Absorpcia sa vz ťahuje na materskú zlú čeninu a všetky jej metabolity. Nesmie sa 
zamieňať s „biodostupnos ťou“. 
Akumulácia  (bioakumulácia): priebežné zvyšovanie množstva testovanej chemi ­
kálie v tkanivách (zvy čajne v tukových tkanivách po opakovanej expozícii). Ak 
je príjem testovanej chemikálie do tela vyšší ako rýchlos ť, ktorou sa chemikália 
odstraňuje, organizmus testovanú chemikáliu hromadí a môže dôjs ť k vzniku 
toxických koncentrácií testovanej chemikálie.  
ADME : skratka pre „absorpciu, distribúciu, metabolizmus a exkréciu“.  
AUC : (plocha pod krivkou závislosti koncentrácie v plazme a času): plocha pod 
krivkou v znázornení koncentrácie testovanej chemikálie v plazme za čas. Pred­
stavuje celkové množstvo testovanej chemikálie, ktorú telo absorbovalo po čas 
vopred stanoveného obdobia. V lineárnych podmienkach je krivka AUC (od 
nulového času po nekone čno) priamo úmerná celkovému množstvu testovanej 
chemikálie absorbovanej telom bez oh ľadu na mieru absorpcie.  
Autorádiografia : (autorádiografia celého tela): používa sa na kvalitatívnu a/alebo 
kvantitatívnu lokalizáciu rádioaktívnej testovanej chemikálie v tkanivách. Táto metóda využíva röntgenový film alebo najnovšie digitálny phosphorimaging (fos ­
forové zobrazovanie) na vizualizáciu rádioaktívne zna čených molekúl alebo frag ­
mentov molekúl prostredníctvom zaznamenávania žiarenia emitovaného v rámci 
objektu, ktorý je predmetom štúdie. Kvantitatívna autorádiografia celého tela v porovnaní s disekciou orgánov môže ma ť výhody pri hodnotení distribúcie 
testovanej chemikálie a pri hodnotení celkovej vý ťažnosti a rozkladu rádioaktív ­
neho materiálu v tkanivách. Významnou výhodou je napríklad možnos ť využitia 
na modeli zviera ťa s pigmentáciou na ú čely hodnotenia možnej súvislosti testo ­
vanej chemikálie s melanínom, ktorý môže viaza ť určité molekuly. Hoci táto 
metóda môže zabezpe čiť vhodné zobrazenia celého tela s miestami viazania 
s vysokou kapacitou a nízkou afinitou, môže ma ť obmedzenia pri detegovaní 
špecifických cie ľových miest, ako sú miesta viazania receptorov, kde je na 
detekciu potrebné pomerne vysoké rozlíšenie a vysoká citlivos ť
. Ak sa použije 
autorádiografia, pokusy ur čené na stanovenie hmotnostnej bilancie podanej zlú če­
niny sa vykonajú ako samostatná skupina alebo v rámci samostatnej štúdie 
oddelenej od pokusu na zistenie distribúcie v tkanivách, kde sa všetky exkréty (ktoré môžu zah ŕňať aj vydychovaný vzduch) a celé m ŕtve telá homogenizujú 
a vyšetria pomocou kvapalinovej scintila čnej spektroskopie.  
Exkrécia žl čou: exkrécia prostredníctvom žl čovodu.  
Bioakumulácia : pozri „akumulácia“.  
Biodostupnos ť: časť podanej dávky, ktorou sa dosahuje systémový obeh alebo 
ktorá je dostupná na mieste fyziologickej aktivity. Zvy čajne sa biodostupnos ť 
testovanej chemikálie vz ťahuje na materskú zlú čeninu, ale môže sa vz ťahovať aj 
na jej metabolit. Zoh ľadňuje iba jednu chemickú formu.  Poznámka  biodostup ­
nosť a absorpcia nie je to isté. Rozdiel medzi napríklad orálnou absorpciou (t. j. 
prítomnos ťou v črevnej stene a v portálnom obehu) a biodostupnos ťou (t. j. 
prítomnos ťou v systémovej krvi a v tkanivách) môže vzniknú ť v súvislosti 
s chemickým rozkladom v dôsledku metabolizmu črevnej steny alebo 
v dôsledku spätného odtoku do črevného lumenu alebo predsystémového meta ­
bolizmu v pe čeni okrem iných faktorov (10). Biodostupnos ť toxickej zložky 
(materskej zlú čeniny alebo metabolitu) je kritický parameter pri hodnotení rizika 
pre človeka (extrapolácia vysokých a nízkych dávok, extrapolácia jednotlivých 
spôsobov expozície) na odvodenie internej hodnoty z externej úrovne NOAEL 
alebo BMD (aplikovanej dávky). Na vznik ú činkov na pe čeň po orálnom podaní 
je postač
ujúca orálna absorpcia. V prípade každého ú činku, ktorý sa prejaví inde 
ako pri vstupnej bráne, je však vo všeobecnosti spo ľahlivejším parametrom, 
ktorý možno ďalej použi ť pri hodnotení rizík, biodostupnos ť, nie absorpcia.  
Bioperzistencia : pozri „perzistencia“.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biotransformácia : (zvyčajne enzýmová) chemická premena skúmanej testovanej 
chemikálie na inú chemikáliu v tele. Synonymom je „metabolizmus“.  
C max : buď maximálna (vrcholová) koncentrácia v krvi (v plazme/sére) po podaní 
alebo maximálna (vrcholová) exkrécia (v mo či alebo vo výkaloch) po podaní.  
Klírens : kvantitatívny ukazovate ľ rýchlosti, ktorou sa testovaná chemikália 
odstraňuje z krvi, plazmy alebo ur čitého tkaniva za jednotku času. 
Kompartment : štrukturálna alebo biochemická zložka (alebo jednotka) tela, 
tkaniva alebo bunky, ktorá ja oddelená od zvyšku.  
Detoxifika čné cesty : súbor krokov, ktoré vedú k odstráneniu toxických chemi ­
kálií z tela bu ď metabolickou premenou, alebo exkréciou.  
Distribúcia : disperzia testovanej chemikálie a jej derivátov v organizme.  
Enzýmy/izozýmy : bielkoviny, ktoré katalyzujú chemické reakcie. Izozýmy sú 
enzýmy, ktoré katalyzujú podobné chemické reakcie, ale líšia sa svojou sekven ­
ciou aminokyselín.  
Enzýmové parametre : K m : Michaelisova konštanta a V  max : maximálna rýchlos ť. 
Exkrécia : proces/procesy, ktorým/ktorými sa podaná testovaná chemikália 
a/alebo jej metabolity odstra ňujú z tela.  
Exogénne : zavedené z prostredia mimo organizmu alebo systému alebo vytvo ­
rené v prostredí mimo organizmu alebo systému.  
Extrapolácia : odvodenie jednej alebo viacerých neznámych hodnôt na základe 
toho, čo je známe alebo bolo pozorované.  
Polčas (t  1/2 ): čas potrebný na pokles koncentrácie testovanej chemikálie 
v kompartmente na polovicu. Zvy čajne sa vz ťahuje na koncentráciu v plazme 
alebo na množstvo testovanej chemikálie v celom tele.  
Indukcia/enzýmová indukcia : enzýmová syntéza ako reakcia na environmen ­
tálny podnet alebo induktorovú molekulu.  
Linearita/lineálna kinetika : proces je lineárny z h ľadiska kinetiky, ak sú všetky 
rýchlosti prechodu medzi kompartmentmi priamo úmerné prítomným množstvám 
alebo koncentráciám, t. j. sú prvého rádu. Následne sú klírens a objemy distri ­
búcie konštantné, rovnako ako pol časy. Dosiahnuté koncentrácie sú priamo 
úmerné miere dávkovania (expozícii) a akumulácia sa dá ľahšie predpoveda ť. 
Linearitu/nelinearitu možno hodnoti ť porovnaním príslušných parametrov, napr. 
AUC, po rôznych dávkach alebo po jednorazovej a opakovanej expozícii. Chýba ­
júca závislos ť od dávky môže indikova ť nasýtenie enzýmov podie ľajúcich sa na 
metabolizme zlú čeniny, rast krivky AUC po opakovanej expozícii v porovnaní 
s jednorazovou expozíciou môže indikova ť inhibíciu metabolizmu a klesanie 
krivky AUC môže indikova ť indukciu metabolizmu [pozri aj bod (11)].  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Hmotnostná bilancia : započítanie vstupov a výstupov testovanej chemikálie 
do/zo systému.  
Materiálová bilancia : pozri „hmotnostná bilancia“.  
Mechanizmus (druh) toxicity/mechanizmus (druh) pôsobenia : mechanizmus 
pôsobenia sa vz ťahuje na špecifické biochemické interakcie, prostredníctvom 
ktorých testovaná chemikália vytvára svoj ú činok. Druhom pôsobenia sa myslia 
bežné cesty vedúce k toxicite testovanej chemikálie.  
Metabolizmus : synonymom je „biotransformácia“.  
Metabolity : produkty metabolizmu alebo metabolických procesov.  
Orálna absorpcia : percento dávky testovanej chemikálie absorbované z miesta 
podania (t. j. z gastrointestinálneho traktu). Tento kritický parameter možno 
použiť na zistenie frakcie podanej testovanej chemikálie, ktorá sa dostane do 
vrátnice a následne do pe čene. 
Rozdeľovací koeficient : takisto známy ako distribu čný koeficient, je ukazovate ľ 
diferenčnej rozpustnosti chemikálie v dvoch rozpúš ťadlách.  
Vrcholové úrovne v krvi (plazme/sére) : maximálna (vrcholová) koncentrácia 
v krvi (plazme/sére) po podaní (pozri aj „C  max “). 
Perzistencia (bioperzistencia) : dlhodobá prítomnos ť chemikálie (v biologickom 
systéme) v dôsledku rezistencie vo či rozkladu/eliminácii.  
Krížový prístup : informácie o parametri jednej alebo viacerých chemikálií sa 
použijú na predpovedanie parametra cie ľovej chemikálie.  
Receptorová mikroskopická autorádiografia  (alebo receptorová mikroautorá ­
diografia): túto metódu možno použi ť na zistenie xenobiotickej interakcie so 
špecifickými miestami tkanív alebo s bunkovými populáciami, ako napríklad pri štúdiách viazania receptorov alebo špecifického druhu pôsobenia, ktoré môžu vyžadova ť vysoké rozlíšenie a vysokú citlivos ť, ktoré nemožno dosiahnu ť 
inými metódami, ako je napríklad autorádiografia celého tela.  
Spôsob podania  (orálny, IV, dermálny, inhala čný atď.): vzťahuje sa na spôsob, 
akým sa chemikálie podajú do tela (napr. orálne cez sondu, orálne v krmive, 
dermálne, inhaláciou, intravenózne at ď.). 
Nasýtenie : stav, v ktorom jeden alebo viacero kinetických (napr. absorpcia, 
metabolizmus alebo klírens) procesov dosiahli maximum (teda „sú nasýtené“).  
Citlivosť: schopnos ť metódy alebo nástroja rozlišova ť medzi reakciami merania 
predstavujúcimi rôzne úrovne skúmanej premennej.  
Stabilné úrovne v krvi (plazme) : nerovnovážny stav otvoreného systému, 
v ktorom sú všetky sily pôsobiace na systém presne vyvážené protichodnými 
silami takým spôsobom, že jeho zložky majú stabilnú koncentráciu, hoci 
dochádza k toku čiastočiek cez systém.  
Modelovanie systémov  (fyziologicky založené toxikokinetické, farmakokineticky 
založené, fyziologicky založené farmakokinetické, biologicky založené at ď.): 
abstraktný model, ktorý využíva matematický jazyk na opis správania systému.  
Cieľové tkanivo : tkanivo, v ktorom sa preukazuje hlavný nepriaznivý ú činok 
toxikantu.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Testovaná chemikália : akákoľvek chemikália alebo zmes testovaná pomocou 
tejto testovacej metódy.  
Distribúcia v tkanivách : reverzibilný pohyb testovanej chemikálie z jedného 
miesta v tele na iné miesto. Distribúciu v tkanivách možno študova ť pomocou 
disekcie orgánov, homogenizácie, horenia a kvapalinovej scintila čnej spektro ­
skopie alebo kvalitatívnej a/alebo kvantitatívnej autorádiografie celého tela. Prvý spôsob je užito čný na získanie koncentrácie a percenta vý ťažnosti 
z tkanív a zvyškov m ŕtveho tela tých istých zvierat, ale nemusí zabezpe čovať 
dostatočné rozlíšenie pre všetky tkanivá a môže ma ť nižšiu ako ideálnu celkovú 
výťažnosť (< 90 %). Vymedzenie druhej metódy pozri vyššie.  
T
 max : čas na dosiahnutie C  max . 
Toxikokinetika  (farmakokinetika): štúdia absorpcie, distribúcie, metabolizmu 
a exkrécie chemikálií za ur čitý čas. 
Validácia (overenie) modelov : proces hodnotenia vhodnosti modelu s cie ľom 
konzistentne opísa ť dostupné toxikokinetické údaje. Modely možno hodnoti ť 
prostredníctvom štatistického a vizuálneho porovnania predpovedí modelov 
s experimentálnymi hodnotami a spolo čnej nezávislej premennej (napr. času). 
Rozsah hodnotenia je potrebné odôvodni ť v súvislosti s plánovaným využitím 
modelu.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVYCH 
LÁTOK PO AKÚTNEJ EXPOZÍCII ICH Ú ČINKOM  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Pri stanovení a vyhodnotení toxických ú činkov látok je dôležité 
zvážiť potenciál ur čitých skupín látok spôsobujúcich špecifické 
druhy neurotoxicity, ktoré nemusia by ť zistené (objavené) v iných 
štúdiách toxicity. U ur čitých organofosforových zlú čenín sa zistilo, 
že spôsobujú oneskorenú neurotoxicitu a je nutné ich z tohto 
hľadiska hodnoti ť. 
Látky, ktoré môžu spôsobova ť oneskorenú polyneuropatiu sa identi ­
fikujú pri použití screeningových testov  in vitro ; pravdaže, negatívne 
výsledky z  in vitro  štúdií neposkytujú dôkaz, že testovaná látka nie 
je neurotoxická. 
Pozri aj všeobecný úvod časť B. 
1.2. DEFINÍCIE 
Organofosforové zlú čeniny zah ŕňajú nenabité organofosforové 
estery, tioestery alebo anhydridy organofosfore čných, organofosfóno ­
vých alebo organofosforamidových kyselín, alebo príbuzných tiolfos ­
forových, tiónfosforových, tiolfosfónových, tiónfosfónových alebo 
fosforotioamínových kyselín, alebo iné látky spôsobujúce onesko ­
renú neurotoxicitu ob čas pozorovanú v tejto kategórie látok. 
Oneskorená neurotoxicita je syndróm spájaný s pred ĺženým onesko ­
rením nábehu ataxie, distálnej axonopatie v mieche a periférnom 
nervstve, a inhibíciou a starnutím neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) v nervových tkanivách.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LATKY 
Referenčná látka sa môže testova ť s pozitívnou kontrolnou skupinou 
ako prostriedok dôkazu, že za daných laboratórnych testovacích podmienok sa odozva testovaných druhov zvierat významne nemení. 
Ako príklad široko používaného neurotoxikantu slúži tri-o-tolylfosfát 
(CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS názov: fosfore čná kyselina, 
tris(2-metylfenyl)ester, známy tiež ako tris-o-krezylfosfát.
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Skupine sliepok domácich, ktoré sú (ak je to vhodné) chránené od 
akútneho cholinergného ú činku, sa orálne podáva jedna dávka testo ­
vanej látky. Zvieratá sa pozorujú 21 dní, pri čom sa sledujú abnormality 
v správaní, ataxia, a paralýza. Biochemické merania a najmä inhibícia neuropatiou postihnutej esterázy (NTE) sa vykonávajú na náhodne vybraných sliepkach každej skupiny, bežne 24 a 48 hodín po podaní 
látky. 21 dní po expozícii sa zvyšok sliepok usmrtí a uskuto ční sa 
histopatologické vyšetrenie vybraných nervových tkanív.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. POPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Príprava  
Náhodne sa vyberú mladé zdravé dospelé sliepky, ktoré netrpia 
vírovou chorobou a nie sú podrobené lekárskej terapii, ktoré by rušili 
pozorovania, a zaradia sa do testovanej a kontrolnej skupiny. 
Najmenej 5 dní pred za čiatkom testovania sa aklimatizujú na labo ­
ratórne podmienky. 
Použijú sa dostato čne veľké klietky alebo ohrady, aby umož ňovali 
voľný pohyb sliepok a jednoduché pozorovanie chôdze. 
Orálne dávkovanie testovanej látky sa bežne uskuto čňuje pomocou 
žalúdočnej sondy, želatínových kapsúl alebo porovnate ľným spôso ­
bom. Kvapaliny sa dávkujú neriedené alebo rozpustené vo vhodnom 
nosiči (napríklad kukuri čný olej); Pevné látky sa rozpustia, ak je to 
možné vzh ľadom na ve ľkosť dávky, v želatínových kapsulách, čím 
nemusí by ť zabezpečená účinná absorpcia. Toxické vlastnosti nevod ­
ných nosi čov by mali by ť známe a ak nie sú, musia by ť pred 
testovaním stanovené.  
1.5.2.  Podmienky testovania  
1.5.2.1.  Testované zvieratá  
Doporučujú sa mladé dospelé domáce sliepky  (Gallus gallus domes ­
ticus)  vo veku 8 až 12 mesiacov. Používa sa štandardná ve ľkosť 
chovov a pokolení a sliepky musia by ť chované za podmienok 
umožňujúcich im vo ľný pohyb.  
1.5.2.2.  Počet a pohlavie  
Okrem testovanej skupiny sa používa aj kontrolná skupina s nosi čom 
aj pozitívna kontrolná skupina. Kontrolná skupina s nosi čom je testo ­
vaná rovnako ako testovaná skupina s tým rozdielom, že sa im nepodáva testovaná látka. 
Vhodný po čet vtákov v každej skupine sa ur čí tak, že najmenej šes ť 
jedincov môže by ť usmrtených na biochemické stanovenia (tri 
v obidvoch časových bodoch) a šes ť musí preži ť 21 dní pozorova ­
cieho obdobia na patologické vyšetrenie. 
Pozitívna kontrolná skupina sa sleduje sú časne alebo v nedávnej 
minulosti. Má obsahova ť minimálne šes ť sliepok, ktoré sú testované 
známym oneskorovacím neurotoxikantom. Tri sliepky sa použijú na 
biochemické stanovenia a tri na patologické vyšetrenie. Doporu čuje 
sa periodické obnovovanie údajov z minulosti. Nové pozitívne kontrolné údaje sa získavajú vtedy, ak sa v testovacom laboratóriu 
zmení niektorá podstatná riadiaca zložka testu (pokolenie, potrava, 
podmienky ubytovania).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Úrovne dávok  
Stanovenie úrovne dávky neskôr použitej v hlavnej štúdii sa usku ­
točňuje v predbežnej štúdii, pri ktorej sa používa vhodný po čet 
sliepok a hladín. Vä čšinou je v predbežnej štúdii nevyhnutné úmrtie, 
aby sa zistila posta čujúca dávka pre hlavnú štúdiu. Zabráni ť úmrtiu 
spôsobenému akútnym cholinergickým ú činkom sa môže využitím 
atropínu alebo iných ochranných činidiel, o ktorých je známe, že 
rušivo nevplývajú na oneskorené neurotoxické reakcie. Na odhad 
maximálnej neletálnej dávky testovanej látky je k dispozícii množ ­
stvo testovacích metód (pozri metódu B.1 bis). Pri výbere dávky pomáhajú tiež údaje získané testovaním sliepok z minulosti a iné 
toxikologické informácie. 
Dávka testovanej látky v hlavnej štúdii má by ť tak vysoká ako je len 
možné, s oh ľadom na výsledky výberu dávky predbežnej štúdie 
a najvyššiu limitnú dávku 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Možné 
úmrtie by nemalo rušivo vplýva ť s postačujúcim po čtom prežitých 
zvierat na biochemické vyšetrenie (šes ť) a histológiu (šes ť) po 21 
dňoch. Atropín alebo iné ochranné činidlá, o ktorých je známe, že 
rušivo nevplývajú na oneskorené neurotoxické reakcie, by mal by ť 
použitý, aby sa predišlo úmrtiu testovaných zvierat v dôsledku akút ­
neho cholinergického ú činku.
 
1.5.2.4.  Limitný test  
Ak sa test na úrovni dávky 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň 
uskutočňuje použitím postupov popísaných v tejto štúdii a neboli 
pozorované žiadne toxické ú činky, a ak sa neo čakáva toxicita ani 
na základe údajov štruktúrne príbuzných zlú čenín, potom štúdia pri 
vyššej hladine nie je nevyhnutná. Výnimkou je prípad, ke ď expo­
zícia človeka indikuje potrebnos ť skúmania na vyššej hladine, 
a vtedy sa používa limitný test.  
1.5.2.5.  Doba pozorovania  
Doba pozorovania je 21 dní.  
1.5.3.  Postup  
Po použití ochranného činidla na zabránenie úmrtia v dôsledku akút ­
neho cholinergického ú činku sa podáva testovaná látka v jednej 
dávke.  
1.5.3.1. Celkové pozorovania 
Pozorovania za čínajú ihne ď po expozícii. Všetky sliepky sa starost ­
livo pozorujú nieko ľkokrát po čas prvých dvoch dní a potom 
najmenej raz denne po čas 21 dní alebo do plánovaného usmrtenia. 
Všetky toxické príznaky sa zaznamenávajú, vrátane času nábehu, 
druhu, prudkosti a d ĺžky trvania abnormalít správania. Ataxia sa 
meria v rádovej odstup ňovanej mierke na najmenej štyroch úrov ­
niach a sleduje sa paralýza. Najmenej dvakrát za týžde ň sú sliepky 
určené na patologické vyšetrenie vybrané z klietok a podrobené 
cyklu vynútenej motorickej aktivity, ako je vyliezame po rebríku, s cieľom umožni ť pozorovanie minimálnych toxických ú činkov. 
Umierajúce zvieratá a zvieratá vidite ľne trpiace alebo vidite ľne poci­ 
ťujúce boles ť sa odstránia, humánne usmrtia a prevedie sa ich pitva.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2. Telesná hmotnos ť 
Všetky sliepky sa vážia krátko pred podaním testovanej látky 
a najmenej každý týžde ň potom.  
1.5.3.3. Biochémia 
Šesť sliepok náhodne vybraných z každej testovanej a kontrolnej 
skupiny s nosi čom, a tri sliepky z pozitívnej kontrolnej skupiny 
(ak je táto skupina testovaná sú časne) sa usmrtí do nieko ľkých dní 
po expozícii. Mozog a miecha sa pripravia a analyzujú na neuropatiu inhibície aktivity cie ľovej esterázy. Naviac môžu by ť použité na 
prípravu a analýzu neuropatie inhibície aktivity cie ľovej esterázy 
sedacieho ischiatického nervového tkaniva. Normálne sa po 24 hodi ­
nách usmrtia tri sliepky kontrolnej a každej testovanej skupiny a tri po 48 hodinách, zatia ľ čo po 24 hodinách sa usmrtia tri sliepky 
pozitívnej kontrolnej skupiny. Ak pozorovania klinických príznakov 
intoxikácie (tie bývajú často zistené pozorovaním času nábehu choli ­
nergických príznakov) nazna čujú, že zvieratá sa toxického činidla 
zbavujú ve ľmi pomaly, potom sa uprednost ňuje odoberanie vzoriek 
tkanív z troch vtákov po 24 a až 72 hodinách po podaní. 
Pokiaľ sa usúdi, že to je potrebné, tieto vzorky sa používajú aj na 
analýzu acetylcholínesterázy (AchE). Spontánna reaktivácia AchE však môže nasta ť aj in vivo , čo vedie k podhodnoteniu potenciálu 
látky ako inhibítora AchE.
 
1.5.3.4. Makroskopická pitva 
Pitva všetkých zvierat (plánovane usmrtených aj usmrtených 
z dôvodu umierania) zah ŕňa pozorovanie vzh ľadu mozgu a miechy.  
1.5.3.5. Histopatologické vyšetrenie 
Nervové tkanivo zo zvierat, ktoré prežili pozorovaciu periódu 
a neboli použité na biochemické štúdie, sa podrobí mikroskopickému vyšetreniu. Tkanivá musia by ť fixované použitím premývacích 
metód  in situ . Časti zahŕňajú mozo ček (stredne pozd ĺžna úrove ň), 
predĺženú miechu, miechu, a periférne nervy. Časti miechy sa zoberú 
z horného kr čného úseku, strednej hrudníkovej a bedrovokrížovej 
oblasti. Berú sa aj časti distálnej oblasti holenných nervov a ich 
vetvy vedúcich k dvojhlavému lýtkovému svalu a sedacie nervy. Sekcie sa zafarbia vhodným myelínom a axonovo ur čitými farbi ­
vami.
 
2. ÚDAJE  
Negatívne výsledky vybraných parametrov tejto metódy (biochémia, 
histopatológia a pozorovanie správania) normálne nevyžadujú ďalšie 
testovanie na oneskorenú neurotoxicitu. Nejednozna čné alebo 
nepresved čivé výsledky týchto parametrov si môžu vyžadova ť ďalšie 
vyhodnotenie. 
Musia sa zabezpe čiť individuálne údaje. Naviac musia by ť všetky 
údaje zhrnuté v tabu ľkovej forme pre každú testovanú skupinu 
s počtom použitých zvierat na za čiatku testu, po čtom zvierat, 
u ktorých sa prejavili známky poškodenia, ú činkov na správanie 
alebo biochemických ú činkov, typy a prudkos ť týchto poškodení 
alebo účinkov, percentuálne množstvo zvierat prejavujúcich jednot ­
livý typ a prudkos ť poškodenia alebo ú činku. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Nálezy pochádzajúce z tejto štúdie sa vyhodnotia z h ľadiska rozsahu, 
intenzity a korelácie so správaním, biochemických a histopatologických 
účinkov, a ďalších pozorovaných ú činkov u testovanej a kontrolnej 
skupiny. 
Ak je to možné, numerické výsledky sa vyhodnotia vhodnou 
a všeobecne prijate ľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa 
vyberá po čas plánovania štúdie.  
3. SPRÁVA  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu má obsahova ť, pokiaľ je to možné, nasledujúce infor ­
mácie: 
3.1. Testované zvieratá: 
— použitý kme ň, 
— počet a vek zvierat, 
— zdroj, podmienky bývania, at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu. 
3.2. Testovacie podmienky: 
— podrobnosti o príprave testovanej látky, jej stabilite 
a homogenite, pokia ľ je to možné, 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— podrobnosti o podávaní testovanej látky, — podrobnosti o kvalite krmiva a pitnej vody, — zdôvodnenie vo ľby výberu dávky, 
— spresnenie podávaných dávok, vrátane podrobností o nosi či, 
objeme a fyzikálnej forme podávanej látky, 
— totožnos ť a podrobnosti o podávanom ochrannom činidle. 
3.3. Výsledky: 
— údaje o telesných hmotnostiach, 
— toxické reakcie pod ľa úrovne dávky, vrátane úmrtnosti, 
— povaha, intenzita a d ĺžka trvania klinických pozorovaní ( či boli 
reverzibilné alebo nie), 
— podrobný opis biochemických metód a zistení, 
— pitevné nálezy, — podrobný popis všetkých histopatologických nálezov, — štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné. Diskusia. Záver.
 
4. ODKAZY  
Táto metóda je obdobná OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  ONESKORENÁ NEUROTOXICITA ORGANOFOSFOROVYCH 
LÁTOK PRI 28-D ŇOVEJ ŠTÚDII OPAKOVANEJ DÁVKY  
1. METODA  
1.1. ÚVOD 
Pri stanovení a vyhodnotení toxických ú činkov látok je dôležité 
zvážiť potenciál ur čitých kategórií látok spôsobujúcich ur čité druhy 
neurotoxicity, ktoré nemusia by ť zistené v iných štúdiách toxicity. 
U určitých organofosforových látok sa zistilo, že spôsobujú onesko ­
renú neurotoxicitu a je nutné ich z tohto h ľadiska hodnoti ť. 
Látky, ktoré môžu spôsobova ť oneskorenú polyneuropatiu sa identi ­
fikujú pri použití screeningových testov  in vitro ; pravdaže, negatívne 
výsledky z  in vitro  štúdií neposkytujú dôkaz, že testovaná látka nie 
je neurotoxická. 
28-dňový test oneskorenej neurotoxicity poskytuje informácie 
o možných zdravotných rizikách, pravdepodobne sa zvyšujúcich po opakovanej expozícii cez obmedzené časové obdobie. Test poskytuje 
informácie o odozve na dávku a môže tiež umož ňovať odhad 
hodnoty nepozorovaných žiadnych nepriaznivých ú činkov, na 
základe ktorej je možné stanovi ť kritérium bezpe čnosti expozície. 
Pozri aj všeobecný úvod časť B.
 
1.2. DEFINÍCIE 
Organofosforové látky zah ŕňajú nenabité organofosforové estery, 
tioestery alebo anhydridy organofosfore čných, organofosfónových 
alebo organofosforamidových kyselín, alebo príbuzných tiolfosforo ­
vých, tiónfosforových, tiolfosfónových, tiónfosfónových alebo fosfo ­
rotioamidových kyselín, alebo iné látky spôsobujúce oneskorenú 
neurotoxicitu ob čas pozorovanú v tejto kategórie látok. 
Oneskorená neurotoxicita je syndróm spájaný s pred ĺženým onesko ­
rením nábehu ataxie, distálnej axonopatie v mieche a periférnom 
nervstve, a inhibíciou a starnutím neuropatiou postihnutej esterázy 
(NTE) v nervových tkanivách.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Denné dávky testovanej látky sa orálne podávajú sliepkam domácim 
počas 28 dní. Zvieratá sa pozorujú prinajmenšom denne a sledujú sa 
abnormality správania, ataxia a paralýza až do 14 dní po poslednej 
dávke: Biochemické merania a najmä inhibícia neuropatiou postih ­
nutej esterázy (NTE) sa vykonávajú na náhodne vybraných sliepkach každej skupiny, bežne 24 a 48 hodín po podaní látky. Dva týždne po 
poslednej dávke sa zvyšok sliepok usmrtí a uskuto ční sa histopato ­
logické vyšetrenie vybraných nervových tkanív.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. POPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Príprava  
Náhodne sa vyberú mladé zdravé dospelé sliepky, ktoré netrpia 
vírovou chorobou a nie sú podrobené lekárskej terapii, a bez abnor ­
malít chôdze, čo by rušilo pozorovania, a zaradia sa do testovanej 
a kontrolnej skupiny. Najmenej 5 dní pred za čiatkom testovania sa 
aklimatizujú na laboratórne podmienky. 
Použijú sa dostato čne veľké klietky alebo výbehy, aby umož ňovali 
voľný pohyb sliepok a jednoduché pozorovanie chôdze. 
Orálne sa dávkuje každý de ň, 7 dní do týžd ňa a uprednost ňuje sa 
podávanie pomocou žalúdo čnej sondy alebo želatínových kapsúl. 
Tekutiny sa dávkujú neriedené alebo rozpustené vo vhodnom nosi či 
(napríklad kukuri čný olej). Pevné látky sa rozpustia, ak je to možné 
vzhľadom na ve ľkosť dávky, v želatínových tobolkách, čím nemusí 
byť zabezpe čená účinná absorpcia. Toxické vlastnosti nevodných 
nosičov by mali by ť známe a ak nie sú, musia by ť pred testovaním 
stanovené.  
1.4.2.  Podmienky testovania  
1.4.2.1.  Testované zvieratá  
Oporučujú sa mladé dospelé domáce sliepky ( Gallus gallus domes ­
ticus ) vo veku 8 až 12 mesiacov. Používa sa štandardná ve ľkosť 
chovov a pokolení a sliepky musia by ť chované za podmienok 
umožňujúcich im vo ľný pohyb.  
1.4.2.2.  Počet a pohlavie  
Všeobecne sa používajú najmenej tri testované skupiny a kontrolná 
skupina s nosi čom. Kontrolná skupina s nosi čom je testovaná 
rovnako ako testovaná skupina s tým rozdielom, že sa im nepodáva testovaná látka. 
Vhodný po čet sliepok v každej skupine sa ur čí tak, že najmenej šes ť 
jedincov môže by ť usmrtených na biochemické stanovenia (tri 
v obidvoch časových bodoch) a šes ť musí preži ť 14 dní pozorova ­
cieho obdobia na patologické vyšetrenie.
 
1.4.2.3.  Hladiny dávok  
Dávky sa vyberajú so zrete ľom na tri výsledky získané pri akútnom 
teste oneskorenej neurotoxicity a ďalších prístupných údajov 
o toxicite alebo kinetike testovanej látky. Najvyššia dávka sa vyberá 
s cieľom indukovania toxických ú činkov, pri čom sa uprednost ňuje 
oneskorená neurotoxicita, ale bez toho, aby spôsobovala uhynutie alebo očividné trápenie zvierat. Pod ľa toho sa vyberá zostupujúca 
postupnos ť dávok so zámerom dokáza ť závislosť odozvy od dávky 
a pri najnižšej dávke dokáza ť aj hladinu, pri ktorej nebol pozorovaný 
žiadny nepriaznivý ú činok.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Limitný test  
Ak sa test na úrovni dávky 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň 
uskutočňuje použitím postupov popísaných v tejto štúdii a neboli 
pozorované žiadne toxické ú činky, a ak sa neo čakáva toxicita ani 
na základe údajov štruktúrne príbuzných zlú čenín, potom štúdia pri 
vyššej hladine nie je nevyhnutná. Výnimkou je prípad, ak expozícia človeka indikuje potrebnos ť skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa 
používa limitný test.
 
1.4.2.5.  Doba pozorovania  
Všetky zvieratá sa pozorujú prinajmenšom denne po čas expozi čného 
obdobia a 14 dní potom, s výnimkou plánovanej pitvy.  
1.4.3.  Postup  
Zvieratám sa podáva testovaná látka sedem dní v týždni po čas 
obdobia 28 dní.  
1.4.3.1.  Celkové pozorovania  
Pozorovania za čínajú ihne ď po začatí expozície. Všetky sliepky sa 
starostlivo pozorujú prinajmenšom raz denne po čas 28 dní a potom 
14 dní alebo až do plánovaného usmrtenia. Všetky toxické príznaky sa zaznamenávajú, vrátane času nábehu, druhu, intenzity a d ĺžky 
trvania príznakov. Do pozorovaní sa zah ŕňa sledovanie abnormalít 
správania, ale aj ďalšie príznaky. Ataxia sa meria v rádovej odstup ­ 
ňovanej mierke na najmenej štyroch úrovniach a sleduje sa paralýza. 
Najmenej dvakrát za týžde ň sú sliepky, ur čené na patologické vyšet ­
renie, vybrané z klietok a podrobené cyklu vynútenej motorickej 
aktivity, ako je vyliezanie po rebríku, s cie ľom umožni ť pozorovanie 
minimálnych toxických ú činkov. Umierajúce zvieratá a zvieratá vidi ­
teľne trpiace alebo vidite ľne pociťujúce boles ť sa odstránia, humánne 
usmrtia a prevedie sa ich pitva.
 
1.4.3.2.  Telesná hmotnos ť 
Všetky sliepky sa zvážia krátko pred prvým podaním testovanej 
látky a najmenej každý týžde ň potom.  
1.4.3.3.  Biochémia  
Šesť sliepok náhodne vybraných z každej testovanej a kontrolnej 
skupiny s nosi čom sa usmrtí do nieko ľkých dní po poslednej dávke. 
Mozog a bedrová miecha sa pripravia a analyzujú na neuropatiu 
inhibície aktivity cie ľovej esterázy (NTE). Naviac môžu by ť použité 
na prípravu a analýzu neuropatie inhibície aktivity cie ľovej esterázy 
sedacieho ischiatického nervového tkaniva na neuropatiu inhibície aktivity cie ľovej esterázy (NTE). Normálne sa po 24 hodinách 
usmrtia tri sliepky kontrolnej a každej testovanej skupiny a tri po 
48 hodinách po poslednej dávke. Ak údaje získané pri akútnej štúdii alebo pri iných štúdiach (napríklad toxikokinetiky) nazna čujú, že je 
výhodnejší iný čas usmrtenia zvierat po podaní poslednej dávky, 
potom sa použije tento čas a zdôvodní sa. 
Pokiaľ sa usúdi, že to je potrebné, tieto vzorky sa používajú aj na 
analýzu acetylcholínesterázy (AchE). Spontánna reaktivácia AchE 
však môže nasta ť aj in vivo , čo vedie k podhodnoteniu potenciálu 
látky ako inhibítora AchE.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Makroskopická pitva  
Pitva všetkých zvierat (plánovane usmrtených aj usmrtených 
z dôvodu umierania) zah ŕňa pozorovanie vzh ľadu mozgu a miechy.  
1.4.3.5.  Histopatologické vyšetrenie  
Nervové tkanivo zo zvierat, ktoré prežili pozorovaciu periódu 
a neboli použité na biochemické štúdie, sa podrobí mikroskopickému vyšetreniu. Tkanivá musia by ť fixované použitím premývacích 
metód  in situ . Časti zahŕňajú mozo ček (stredne pozd ĺžna úrove ň), 
predĺženú miechu, miechu, a periférne nervy. Časti miechy sa 
odoberú z horného kr čného úseku, strednej hrudníkovej 
a bedrovokrížovej oblasti. Odoberú sa aj časti distálnej oblasti holen ­
ných nervov a ich vetvy do dvojhlavých lýtkových svalov a sedacie 
ischiatické nervy. Sekcie sa zafarbia vhodným myelínom a axónovo určitými farbivami. Zo za čiatku sa mikroskopické vyšetrenie usku ­
točňuje s konzervovanými tkanivami všetkých zvierat kontrolnej 
skupiny a skupiny testovanej pri vysokej dávke. Ak je mikrosko ­
pické vyšetrenie na prítomnos ť účinkov pozitívne, uskuto ční sa aj 
u sliepok zo skupín testovaných so strednou a nízkou dávkou.
 
2. ÚDAJE  
Negatívne výsledky vybraných parametrov tejto metódy (biochémia, 
histopatológia a pozorovanie správania) normálne nevyžadujú ďalšie 
testovanie na oneskorenú neurotoxicitu. Nejednozna čné alebo 
nepresved čivé výsledky týchto parametrov si môžu vyžadova ť ďalšie 
vyhodnotenie. 
Musia sa zabezpe čiť individuálne údaje. Naviac musia by ť všetky 
údaje zhrnuté v tabu ľkovej forme pre každú testovanú skupinu 
s počtom použitých zvierat na za čiatku testu, po čtom zvierat, 
u ktorých sa prejavili známky poškodenia, ú činkov na správanie 
alebo biochemických ú činkov, typy a intenzitu týchto poškodení, 
alebo účinkov, a percentuálne množstvo zvierat vykazujúce jednot ­
livý typ a prudkos ť poškodenia alebo ú činku. 
Nálezy pochádzajúce z tejto štúdie sa vyhodnotia z h ľadiska rozsahu, 
intenzity a korelácie so správaním, biochemických a histopatologických 
účinkov, a ďalších pozorovaných ú činkov u každej testovanej 
a kontrolnej skupiny. 
Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou 
a všeobecne prijate ľnou štatistickou metódou. Štatistická metóda sa 
vyberá po čas plánovania štúdie.  
3. SPRÁVA  
SPRÁVA Z TESTU  
Správa z testu má obsahova ť, pokiaľ je to možné, nasledujúce infor ­
mácie: 
3.1. Testované zvieratá: 
— použitý kme ň, 
— počet a vek zvierat, 
— zdroj, podmienky bývania, at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Testovacie podmienky: 
— podrobnosti o príprave testovanej látky, jej stabilite 
a homogenite, pokia ľ je to možné, 
— zdôvodnenie výberu nosi ča, 
— podrobnosti o podávaní testovanej látky, — podrobnosti o kvalite krmiva a pitnej vody, — zdôvodnenie vo ľby výberu dávky, 
— spresnenie podávaných dávok, vrátane podrobností o nosi či, 
objeme a fyzikálnej forme podávanej látky, 
— zdôvodnenie vo ľby pre výber iných časov biochemického stano ­
venia ako je 24 a 48 hodín. 
3.3. Výsledky: 
— údaje o telesných hmotnostiach, — toxické reakcie pod ľa úrovne dávky, vrátane úmrtnosti, 
— hodnota nepozorovaných žiadnych nepriaznivých ú činkov, 
— povaha, intenzita a d ĺžka trvania klinických pozorovaní ( či boli 
reverzibilné alebo nie), 
— podrobný opis biochemických metód a zistení, — pitevné nálezy, — podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, — štatistické spracovanie výsledkov, ak je vhodné. Diskusia. 
Záver.
 
4. ODKAZY  
Táto metóda je obdobná OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  TEST NEPLÁNOVANEJ SYNTÉZY DNA (UNSCHEDULED 
DNA SYNTHESIS – UDS) S PE ČEŇOVÝMI BUNKAMI 
CICAVCOV  IN VIVO  
1. METODA  
Táto metóda je obdobou OECD TG 486, testu neplánovanej syntézy 
DNA (Unscheduled DNA Synthesis – UDS) s pe čeňovými bunkami 
cicavcov  in vivo  (1997).  
1.1. ÚVOD 
Účelom testu neplánovanej syntézy DNA (Unscheduled DNA Synt ­
hesis – UDS) s pe čeňovými bunkami cicavcov  in vivo  je identifi ­
kovať testovacie látky, ktoré indukujú opravu DNA v pe čeňových 
bunkách pokusných zvierat (1) (2) (3) (4). 
Tento  in vivo  test poskytuje metódu na skúmanie genotoxických 
účinkov chemikálií v pe čeni. Meraným parametrom je dôkaz poško ­
denia DNA a následná oprava v pe čeňových bunkách. Pe čeň je 
zvyčajne hlavným miestom metabolizmu absorbovaných zmesí. 
Poškodenia DNA je preto vhodné mera ť in vivo.  
Ak existujú dôkazy, že testovacia látka nedosiahne cie ľové tkanivo, 
nie je vhodné tento test použi ť. 
Koncový bod neplánovanej syntézy DNA (UDS) sa meria stano ­
vením absorpcie ozna čených nukleozidov v bunkách, ktoré nepre ­
chádzajú plánovanou (S-fáza) syntézou DNA. Najpoužívanejšou 
technikou je stanovenie absorpcie trítiom ozna čeného tymidínu 
( 3 H-TdR) autorádiografiou. Pre  in vivo  testy UDS sa používajú 
najmä krysie pe čene. Použi ť sa môžu aj iné ako pe čeňové tkanivá, 
tie ale nie sú predmetom tejto metódy. 
Zistenie UDS závisí od po čtu báz DNA odstránených a nahradených 
na mieste poškodenia. Test UDS je preto osobitne hodnotný na 
zistenie „dlhej opravy“ (20–30 báz) indukovanej látkou. „Krátka 
oprava“ (jedna až tri bázy) sa naopak zis ťuje s omnoho menšou 
citlivosťou. Z dôvodu neopravenia, nesprávnej opravy alebo 
nesprávnej replikácie lézií DNA môžu vzniknú ť mutagénne udalosti. 
Rozsah reakcie UDS neposkytuje žiadny náznak kvality opravného 
procesu. Je ďalej možné, že mutagén reaguje s DNA, ale poškodenie 
DNA nie je opravené odstra ňovacím opravným procesom. Nedo ­
statok špecifických informácií o mutagénnej aktivite poskytnutý 
testom UDS je kompenzovaný potenciálnou citlivos ťou tohto para ­
metra, pretože sa meria na celom genóme. 
Pozri tiež všeobecný úvod k časti B.  
1.2. DEFINÍCIE  
Opravované bunky:  čisté jadrové vlákno (net nuclear grain – NNG) 
vyššie ako stanovená hodnota, adjustuje sa v laboratóriu vykonáva ­
júcom test.  
Čisté jadrové vlákno (net nuclear grain – NNG):  kvantitatívny 
ukazovate ľ aktivity UDS buniek pri autorádiografických testoch 
UDS vypo čítaný odpo čítaním priemerného po čtu cytoplazmatických 
vlákien v cytoplazmatických oblastiach ekvivalentných jadru (CG) od počtu jadrových vlákien (NG): NNG = NG – CG. Po čty NNG sa 
vypočítavajú pre jednotlivé bunky a potom spo čítavajú pre bunky 
v kultúre, v paralelných kultúrach, at ď.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Neplánovaná syntéza DNA (UDS):  opravná syntéza DNA po 
odstránení časti DNA obsahujúcej oblas ť poškodenia indukovaného 
chemickými látkami alebo fyzikálnymi činiteľmi. 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test UDS s pe čeňovými bunkami cicavcov nazna čuje opravnú 
syntézu DNA po odstránení časti DNA obsahujúcej oblas ť poško­
denia indukovaného chemickými látkami alebo fyzikálnymi čini­
teľmi. Test je zvy čajne založený na aplikácii  3 H-TdR do pe čeňových 
buniek DNA, ktoré majú nízku frekvenciu buniek v S-fáze bunko ­
vého cyklu. Absorpcia  3 H-TdR sa zvy čajne stanovuje autorádiogra ­
fiou, keďže táto metóda nie je tak citlivá na rušenie z buniek v S- 
fáze, ako napríklad po čítanie kvapalnej scintilácie.  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Prípravné práce  
1.4.1.1.  Výber živo číšnych druhov  
Bežne sa používajú krysy, hoci použi ť sa dajú aj iné vhodné druhy 
cicavcov. Vyberajú sa bežne používané laboratórne kmene mladých 
zdravých dospelých zvierat. Na za čiatku štúdie by mala by ť hmot­
nostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnu ť ± 20 % 
strednej hmotnosti každého pohlavia.  
1.4.1.2.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Používajú sa všeobecné podmienky uvedené vo všeobecnom úvode 
k časti B, cie ľovou hodnotou vlhkosti je 50 % až 60 %.  
1.4.1.3.  Príprava zvierat  
Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a pokusných skupín. Klietky sú umiestnené tak, aby sa minimalizo ­
vali možné ú činky vyplývajúce z rozmiestnenia klietok. Zvieratá sa 
jednotlivo ozna čia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne 
podmienky najmenej pä ť dní pred za čatím štúdie.  
1.4.1.4.  Príprava dávok  
Pevné testovacie látky sa rozpúš ťajú a ukladajú v príslušných 
rozpúšťadlách alebo nosi čoch, a ak je potrebné, rozrie ďujú sa pred 
podávaním dávok zvieratám. Kvapalné testovacie látky sa podávajú priamo, alebo rozriedené pred podávaním. Používajú sa čerstvé 
prípravky testovacej látky, pokia ľ údaje o stabilite nepoukazujú na 
vhodnosť uskladnenia.
 
1.4.2.  Podmienky testov  
1.4.2.1.  Rozpúš ťadlo/nosič 
Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvoláva ť toxické ú činky 
v používaných úrovniach dávok a nemali by chemicky reagova ť 
s testovacou látkou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by malo by ť podporené údajmi 
označujúcimi ich kompatibilitu. Odporú ča sa zváži ť, kedykoľvek je 
to možné, použitie vodného rozpúš ťadla/nosiča.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrolné skupiny  
Pri každej nezávisle uskuto čňovanej časti pokusu sa vytvoria pozi ­
tívne a negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolné skupiny. Okrem 
podania testovacej látky sa so zvieratami v kontrolných skupinách 
zaobchádza rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami. 
Pozitívnym kontrolným skupinám sa podávajú látky, u ktorých je 
známa tvorba UDS pri podaní na úrovni expozície, pri ktorej sa očakáva zistite ľný nárast proti pozadiu. Pozitívne kontrolné skupiny 
vyžadujúce metabolickú aktiváciu sa používajú pri dávkach vyvolá ­
vajúcich mierne reakcie (4). Dávky sa volia tak, aby boli ú činky 
zjavné, ale aby pozorovate ľovi priamo neodha ľovali identitu kódo ­
vaných vzoriek. Príklady látok pre pozitívne kontrolné skupiny:
 
Odber vzorky Latka č. CAS č. EINECS  
skorý odber (2–4 hodiny) N-nitrozodimetylamín 62-75-9 200-249-8 
neskorý odber (12–16 hodin) N-2-fluorenylacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6 
Pre pozitívne kontrolné skupiny sa môžu použi ť aj iné vhodné látky. 
Je prijateľné, aby pozitívnym kontrolným skupinám boli látky podá ­
vané spôsobom odlišným od testovacej látky.  
1.5. POSTUP  
1.5.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Používa sa primeraný po čet zvierat tak, aby bola zoh ľadnená priro ­
dzená biologická variácia pri reakcii na test. Po čet zvierat činí 
najmenej tri analyzovate ľné zvieratá na skupinu. Ak existujú dosta ­
točné historické údaje, pre sú časné negatívne a pozitívne kontrolné 
skupiny sa vyžaduje jedno alebo dve zvieratá. 
Ak v čase uskuto čnenia štúdie sú dostupné údaje zo štúdií rovnakých 
druhov používajúce rovnaké spôsoby expozície, ktoré ukazujú, že neexistujú významné rozdiely v toxicite medzi pohlaviami, posta čuje 
aj testovanie jedného pohlavia, najlepšie samcov. Ak je expozícia 
chemikálií na ľudí závislá od pohlavia, ako napríklad pri niektorých 
farmaceutických prípravkoch, test sa uskuto ční na zvieratách prísluš ­
ného pohlavia.
 
1.5.2.  Harmonogram ošetrovania  
Testovacie látky sa podávajú jedenkrát.  
1.5.3.  Úrovne dávok  
Zvyčajne sa používajú minimálne dve úrovne dávok. Najvyššia 
dávka sa definuje ako známky toxicity z dávky na takej úrovni, že vyššie úrovne dávok založené na rovnakom dávkovacom režime by 
pravdepodobne spôsobili úmrtnos ť. Vo všeobecnosti by najnižšia 
dávka mala by ť 50 % až 25 % najvyššej dávky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Látky so špecifickými biologickými aktivitami pri nízkych netoxic ­
kých dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) môžu by ť 
výnimkou kritéria stanovenia dávky a hodnotia sa z prípadu na prípad. Ak sa z dôvodu nedostatku vhodných údajov uskuto ční 
štúdia na zistenie rozsahu, vykoná sa v rovnakom laboratóriu, za 
použitia rovnakého druhu, rodu, pohlavia a dávkovacieho režimu 
ako v hlavnej štúdii. 
Najvyššia dávka sa definuje ako dávka, ktorá spôsobuje známky 
toxicity v pe čeni (napríklad: pyknotické jadrá).
 
1.5.4.  Limitný test  
Ak test pri jednej úrovni dávky najmenej 2 000 mg/kg telesnej hmot ­
nosti pri jednom podaní alebo pri dvoch podaniach v jeden de ň 
nevyvoláva žiadne toxické ú činky a ak sa neo čakáva genotoxicita 
na základe údajov zo štrukturálne príbuzných látok, úplná štúdia pri 
použití troch hladín dávkovania sa nepovažuje za potrebnú. O čaká­
vaná expozícia na ľudí môže nazna čovať potrebu vyššej úrovne 
dávky pri použití limitného testu.  
1.5.5.  Podávanie dávok  
Testovacia látka sa zvy čajne podáva plnením žalúdka sondou 
s použitím žalúdo čnej rúrky alebo vhodnej intuba čnej kanyly alebo 
intraperitoneálnou injekciou. Iné spôsoby expozície sú prijate ľné len 
so zdôvodnením. Intraperitoneálna cesta sa však neodporú ča, pretože 
pečeň by mohla by ť vystavená testovacej látke priamo a nie 
prostredníctvom obehového systému. Maximálny objem kvapaliny, 
ktorá sa môže naraz podáva ť sondou alebo injekciou závisí od 
veľkosti testovacieho zviera ťa. Objem by nemal presiahnu ť 2 ml/100 
g telesnej hmotnosti. Použitie objemov vyšších ako tento sa musí 
zdôvodniť. Okrem dráždivých alebo žieravých látok, ktoré bežne 
odhalia zhoršené ú činky s vyššími koncentráciami, sa variabilita 
testovacieho objemu minimalizuje upravením koncentrácie na zabez ­
pečenie stáleho objemu na všetkých úrovniach dávok.  
1.5.6.  Príprava pe čeňových buniek  
Pečeňové bunky sa pripravujú z pokusných zvierat zvy čajne po 12 
až 16 hodinách od podania. Vo všeobecnosti je potrebný aj ďalší 
odber vzorky (zvy čajne po dvoch až štyroch hodinách od podania 
dávky), pokia ľ neexistuje jasná pozitívna reakcia po 12 až 16 hodi ­
nách. Odber vzoriek sa môže uskuto čniť aj v inom čase, ak je to 
zdôvodnené na základe toxikokinetických údajov. 
Krátkodobé kultúry pe čeňových buniek cicavcov sa zvy čajne tvoria 
perfúzovaním pe čene in situ kolagenázou a umožnením čerstvo 
oddelených pe čeňových buniek zachyti ť sa na vhodnom povrchu. 
Pečeňové bunky z negatívnych kontrolných skupín zvierat by mali 
mať životaschopnos ť (5) najmenej 50 %.  
1.5.7.  Stanovenie UDS  
Čerstvo izolované pe čeňové bunky cicavcov sa inkubujú s médiom 
obsahujúcim  3 H-TdR primerane dlho, napríklad: tri až osem hodín. 
Na konci inkuba čnej doby sa oddelí médium od buniek, pri čom tieto 
môžu byť inkubované s médiom obsahujúcim nadbyto čný neozna ­ 
čený tymidín na zníženie neprirodzenej rádioaktivity („studený lov“). 
Bunky sa následne o čistia, fixujú a nechajú vysuši ť. Pri dlhších 
inkubačných časoch nie je studený lov potrebný. Sklí čka sa namo čia 
do autorádiografickej emulzie, vystavia do tmy (napríklad: pri chla ­
dení počas 7 až 14 dní), vyvolajú, zafarbia a následne sa spo čítajú 
exponované striebristé vlákna. Z každého zviera ťa sa pripravujú dve 
až tri sklí čka. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analýza  
Sklíčka obsahujú dostato čný počet buniek s normálnou morfológiou 
na umožnenie cieleného hodnotenia UDS. Preparáty sa mikrosko ­
picky skúmajú na známky otvorenej cytotoxicity (napríklad: 
pyknóza, znížené hodnoty v členenia rádioaktívnych alebo ťažkých 
izotopov). 
Sklíčka sa pred rátaním vlákien ozna čia kódmi. Z každého zviera ťa sa 
z minimálne dvoch sklí čok hodnotí 100 buniek; hodnotenie menej ako 
100 buniek/zviera sa zdôvodní. Po čty vlákien sa nehodnotia na S- 
fázové jadrá, avšak je možné zaznamena ť podiel S-fázových buniek. 
Množstvo aplikovaného  3 H-TdR do jadra a cytoplazmy morfolo ­
gicky normálnych buniek pod ľa rozloženia striebristých vlákien sa 
stanovuje vhodnou metódou.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Uvádzajú sa údaje za každé zviera a sklí čko. údaje o jednotlivých 
zvieratách sa uvádzajú v tabu ľkovej forme. Po čet čistých jadrových 
vlákien (NNG) sa vypo čítava pre každú bunku, pre každé zviera 
a pre každú dávku a čas odpočítaním po čtu CG od po čtu NG. Ak 
sa počítajú „opravované bunky“, kritériá pre definovanie „opravova ­
ných buniek“ sa zdôvodnia a založia na historických alebo sú čas­
ných údajoch o negatívnych kontrolných skupinách. Numerické 
výsledky sa môžu hodnoti ť štatistickými metódami. Ak sa použijú 
štatistické testy, vyberajú sa a zdôvod ňujú pred uskuto čnením štúdie.  
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Príklady kritérií pre pozitívne/negatívne reakcie zah ŕňajú: 
pozitívne i) hodnoty NNG nad stanovenou hranicou, ktorá 
je zdôvodnená na základe laboratórnych histo ­
rických údajov, 
alebo ii) hodnoty NNG ove ľa vyššie ako hodnoty 
súčasnej kontrolnej skupiny; 
negatívne i) hodnoty NNG v rámci/pod historickou 
prahovou hodnotou kontrolnej skupiny 
alebo ii) hodnoty NNG nie ove ľa vyššie ako hodnoty 
súčasnej kontrolnej skupiny.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Zvažuje sa biologická relevantnos ť výsledkov, t. j. do úvahy sa berú 
parametre ako variácia medzi zvieratami, vz ťah medzi dávkou 
a reakciou a cytotoxicita. Ako pomôcka sa pri hodnotení výsledkov testov používajú štatistické metódy. Štatistický význam nie je jediným ur čujúcim faktorom pre pozitívnu reakciu. 
Hoci väčšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne 
výsledky, v zriedkavých prípadoch údaje vopred vylú čia jednoz ­
načné posúdenie aktivity testovacej látky. Výsledky môžu osta ť 
nejasné alebo spochybnite ľné bez oh ľadu na po čet opakovaní 
pokusu. 
Pozitívne výsledky testu UDS s pe čeňovými bunkami cicavcov  in 
vivo naznačujú, že testovacia látka vyvoláva poškodenie DNA 
v pečeňových bunkách  in vivo , ktoré sa dajú opravi ť neplánovanou 
syntézou DNA  in vitro.  Negatívne výsledky nazna čujú, že 
v testovacích podmienkach testovacia látka neindukuje poškodenie 
DNA zistite ľné týmto testom. 
Mala by sa prediskutova ť pravdepodobnos ť, že testovacia látka 
dosiahne všeobecnú obehovú sústavu alebo špecificky cie ľové 
tkanivo (napríklad: systémová toxicita).
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu zah ŕňa nasledovné informácie: 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovacej látky v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa. 
Testovacie zvieratá: 
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky chovu, strava at ď., 
— individuálna hmotnos ť zvierat na za čiatku testu, vrátane rozsahu 
telesnej hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre 
každú skupinu. 
Podmienky testov: 
— pozitívne a negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolné skupiny, 
— údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak bola uskuto čnená, 
— zdôvodnenie vo ľby úrovne dávok, 
— podrobnosti o príprave testovacej látky, 
— podrobnosti o podávaní testovacej látky, 
— zdôvodnenie vo ľby spôsobu podávania, 
— metódy overenia, že testovacia látka dosiahla všeobecnú obehovú 
sústavu alebo cie ľové tkanivo, ak je to vhodné,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— konverzia z koncentrácie testovacej látky v strave/vode (ppm) na 
samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnos ť/deň), ak je to vhodné, 
— podrobnosti o kvalite stravy a vody, — podrobný opis harmonogramu podávania a odberu vzoriek, — metódy merania toxicity, 
— metóda prípravy pe čeňových buniek a kultúr, 
— použitá autorádiografická technika, — počet pripravených sklí čok a počet hodnotených buniek, 
— hodnotiace kritériá, 
— kritériá hodnotenia pokusov ako pozitívne, negatívne alebo 
nejasné. 
Výsledky: — stredné hodnoty jadrových vlákien, cytoplazmatických vlákien 
a čistých jadrových vlákien pod ľa jednotlivých sklí čok, zvierat 
a skupín, 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je to možné, 
— štatistické analýzy, ak boli použité, 
— známky toxicity, 
— súčasné údaje o negatívnych (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnych 
kontrolných skupinách, 
— historické údaje o negatívnych (rozpúš ťadlo/nosič) a pozitívnych 
kontrolných skupinách s rozsahmi, strednými hodnotami 
a štandardnými odchýlkami, 
— počet „opravovaných buniek“, ak bol stanovený, 
— počet buniek v S-fáze, ak bol stanovený, 
— životaschopnos ť buniek. 
Rozbor výsledkov. Závery.
 
4. LITERATÚRA  
Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985). An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, 1 – 18. 
Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, 
J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the  
In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res., 189, 
123 – 133. 
Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) 
Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutageni ­
city Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, 
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 52 – 77.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., 
Doolittle, D.J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In  Vivo.  Mutation Res., 312, 263 – 285. 
Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C. 
(1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for 
the In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, 
21 – 27. 
Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  Hepatocyte 
DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, 553 – 562.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  POLEPTANIE KOŽE  IN VITRO:  TEST POMOCOU 
TRANSKUTÁNNEHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER)  
1. METODA  
Táto testovacia metóda je ekvivalentná OECD TG 430 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Poleptaním kože sa rozumie nevratné poškodenie tkaniva kože po 
aplikácii testovaného materiálu [v znení definície pod ľa Globálne 
harmonizovaného systému klasifikácie a ozna čovania chemických 
látok a zmesí (GHS)] (1). Táto metóda poskytuje postup posudzo ­
vania žieravosti, ktorý sa nevykonáva na živých zvieratách. 
Posudzovanie žieravých ú činkov na kožu sa zvy čajne vykonávalo na 
laboratórnych zvieratách (2). Snaha o obmedzenie bolesti a utrpenia 
zvierat v súvislosti s týmto postupom viedla k takej revízii testovacej 
metódy B.4, ktorou sa umož ňuje stanovi ť poleptanie kože pomocou 
alternatívnych metód  in vitro,  čo umožňuje vylúčiť bolesť a utrpenie 
zvierat. 
Prvým krokom k vymedzeniu alternatívnych testov, ktorými by sa 
umožnilo testova ť žieravé ú činky na kožu na ú čely regulácie, bolo 
uskutočnenie prevalida čných štúdií (3). Potom sa vykonala riadna 
validačná štúdia metód  in vitro  (6) (7) (8) na posúdenie poleptania 
kože (4) (5). Výsledky z týchto štúdií a z ďalších publikácií viedli 
k odporú čaniu, že na posúdenie žieravých ú činkov na kožu  in vivo  
by sa mohli použi ť tieto testy (9) (10) (11): test na modeli ľudskej 
kože (pozri testovaciu metódu B.40bis) a test transkutánneho elek ­
trického odporu (táto metóda). 
Vo valida čnej štúdii a ďalších publikovaných štúdiách sa uvádza, že 
skúškou na transkutánny elektrický odpor (TER) potkanej kože (12) (13) je možné spo ľahlivo rozlišova ť medzi známymi látkami so žiera ­
vými účinkami na kožu a látkami, ktoré nemajú žieravé ú činky (5) (9). 
Testom opísaným v tejto metóde sa umož ňuje identifikova ť žieravé 
chemické látky a zmesi. Ďalej sa ním umož ňuje identifikova ť
 nežieravé 
látky a zmesi, ak sa podporí dôkaznými stanoveniami založenými na 
ďalších existujúcich údajoch (napr. pH, vz ťahy medzi štruktúrou 
a aktivitou, údaje o vplyve na človeka a/alebo na zvieratá) (1) (2) 
(11) (14). Test neposkytuje údaje o dráždivých ú činkoch na kožu, 
ani neumož ňuje ďalšiu kategorizáciu žieravých látok, ako to umož ňuje 
Globálne harmonizovaný systém klasifikácie (GHS) (1). 
Na úplné vyhodnotenie lokálnych ú činkov na kožu po jednorazovej 
expozícii pokožky sa odporú ča dodržiava ť stratégiu sekven čného 
testovania, ako je uvedené v testovacej metóde B.4 (2) a ako je stanovené v Globálne harmonizovanom systéme (1). Táto stratégia testovania zah ŕňa vykonávanie testov poleptanie kože  in vitro  (ako je 
opísané v tejto metóde) a dráždivos ť pre kožu pred zvážením testo ­
vania na živých zvieratách.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Poleptanie kože  in vivo:  je vznik nevratného poškodenia kože: 
najmä vidite ľná nekróza postihujúca epidermu a zasahujúca do 
dermy, ktorá nastane do štyroch hodín po aplikácii testovanej látky. 
Typickými reakciami na poleptanie sú vredy, krvácanie, krvavé 
chrasty a na konci štrnás ťdňového pozorovania strata farby 
v dôsledku vyblednutia kože, úplné ložiská alopécie a jazvy. Na vyhodnotenie problematických lézií by sa malo uvažova ť 
o histopatológii.  
Transkutánny elektrický odpor (TER):  je miera elektrickej impe ­
dancie kože vyjadrená ako hodnota odporu v kiloohmoch. Jedno ­
duchá a robustná metóda posúdenia bariérovej funkcie spo číva 
v zaznamenávaní prechodu iónov cez kožu s použitím aparatúry 
s Wheatstonovým mostíkom.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY  
Tabuľka 1 
Referenčné chemické látky  
Názov Č. EINECS Č. CAS  
propan-l,2-diamin 201-155-9 78-90-0 silno žieravý 
kyselina akrylova 201-177-9 79-10-7 silno žieravá  
2-terc-  butylfenol 201-807-2 88-18-6 žieravý 
hydroxid draselny (10 %) 215-181-3 1310-58-3 žieravý 
kyselina sirova (10 %) 231-639-5 7664-93-9 žieravá kyselina oktanova (kaprylova) 204-677-5 124-07-02 žieravá  
4H- 1 ,2,4-triazol-4-ylamin 209-533-5 584-13-4 nežieravý 
eugenol 202-589-1 97-53-0 nežieravý fenetylbromid 203-130-8 103-63-9 nežieravý 
tetrachloretylen 204-825-9 27-18-4 nežieravý 
kyselina izostearova 250-178-0 30399-84-9 nežieravá 4-(metylsulfanyl)benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 nežieravý 
Väčšina z uvedených chemických látok je prevzatá zo zoznamu 
chemických látok vybratých pre medzinárodnú valida čnú štúdiu 
ECVAM (4). Ich výber sa zakladá na týchto kritériách: 
i) rovnaký po čet žieravých a nežieravých látok;
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) komer čne dostupné látky, ktoré sa vz ťahujú na vä čšinu relevant ­
ných tried chemických látok; 
iii) zahrnutie silno žieravých aj menej žieravých látok s cie ľom 
umožniť rozlišovanie na základe schopnosti lepta ť; 
iv) voľba chemických látok, s ktorými možno manipulova ť 
v laboratóriu bez vážnych nebezpe čenstiev iných ako je žieravos ť. 
1.4. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaný materiál sa aplikuje až 24 hodín na epidermálny povrch 
kožných ter číkov v dvojkomorovom testovacom systéme, v ktorom 
tieto kožné ter číky majú funkciu deliacej steny medzi komorami. 
Kožné ter číky sa odoberú z potkanov vo veku 28 až 30 dní, ktoré 
boli usmrtené šetrným spôsobom. Žieravé materiály sa identifikujú 
podľa ich schopnosti spôsobova ť stratu normálnej integrity 
a bariérovej funkcie rohovitej vrstvy  (stratum corneum),  ktorá sa 
meria ako zníženie TER pod prahovú úrove ň (12). Pre potkanov 
bola vybratá ako referen čná prahová hodnota TER 5 k' Ω na základe 
rozsiahlych údajov pre široký okruh chemických látok, pre ktoré hodnota TER v prevažnej vä čšine prípadov bola bu ď značne nad 
touto hodnotou ( často > 10 k Ω), alebo zna čne pod ňou (často < 3 
kΩ) (12). Všeobecne povedané, materiály, ktoré nie sú žieravé pre 
zvieratá, ale sú dráždivé alebo nedráždivé, neznižujú TER pod túto referenčnú prahovú hodnotu. Okrem toho, používanie iných kožných 
prípravkov alebo iného zariadenia si môže vynúti ť zmenu vo ľby 
referenčnej prahovej hodnoty a jej ďalšiu validáciu. 
Do testovacieho postupu je na potvrdenie pozitívnych výsledkov 
vrátane hodnôt TER okolo 5 k Ω zaradený krok na stanovenie 
viazania farbiva. Týmto krokom viazania farbiva sa stanovuje, či 
zvýšenie priepustnosti iónov je v dôsledku fyzického porušenia roho ­
vitej vrstvy  (stratum corneum).  Ukázalo sa, že metóda TER 
s využitím kože potkana umož ňuje predvída ť výsledky zis ťovania 
žieravosti  in vivo  s králikmi pod ľa testovacej metódy B.4 (2). 
Malo by sa uvies ť, že test  in vivo  na králikoch je ve ľmi konzerva ­
tívny vzh ľadom na žieravé a dráždivé ú činky na kožu v porovnaní 
s testom na 
ľudskej koži pomocou náplasti (15).  
1.5. POPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Zvieratá  
Vybratým živo číšnym druhom sú potkany, pretože citlivos ť ich kože 
na chemické látky sa v tomto teste v minulosti preukázala (10). Vek (v čase odberu kože) a kme ň potkanov sú osobitne dôležité na 
zabezpečenie toho, aby folikuly chlpov boli v latentnej fáze, predtým 
než začne rast zrelej srsti.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Chrbtová a bo čná srsť mladých, približne 22-denných samcov alebo 
samíc potkanov (z kme ňa príbuzného Wistaru alebo porovnate ľného 
kmeňa) sa opatrne odstráni malými nožnicami. Zvieratá sú potom 
umyté opatrným utieraním, pri čom sa ostrihaná oblas ť ponára do 
antibiotického roztoku (obsahujúceho napríklad streptomycín, peni ­
cilín, chloramfenikol a amfotericín v koncentráciách ú činne inhibu ­
júcich rast baktérií). Zvieratá sa na tretí alebo štvrtý de ň po prvom 
omytí znova omyjú antibiotikami a použijú sa do 3 dní po druhom omytí, ke ď sa rohovitá vrstva  (stratum corneum)  po odstránení srsti 
zregeneruje.
 
1.5.2.  Príprava kožných ter číkov 
Zvieratá sa šetrným spôsobom usmrtia vo veku 28 až 30 dní; tento 
vek je kritický. Z každého zviera ťa sa potom odstráni chrbtová 
a bočná koža a nadbyto čný podkožný tuk sa z kože opatrne 
zoškrabe. Odoberú sa kožné ter číky, z ktorých každý má priemer 
približne 20 mm. Koža sa pred použitím ter číkov môže uchováva ť, 
ak sa preukázalo, že pozitívne a negatívne kontrolné údaje sú rovno ­
cenné s tými, ktoré sa získali s čerstvou kožou. 
Každý kožný ter čík sa preloží cez jeden z koncov teflónov ej 
trubičky z PTFE (polytetrafluóretylén) tak, aby epidermálny povrch 
bol v kontakte trubi čkou. Cez koniec trubi čky sa natesno prevle čie 
gumený tesniaci krúžok, aby sa koža nepohybovala, a nadbyto čné 
tkanivo sa oreže. Rozmery trubi čky a tesniaceho krúžku sú uvedené 
na obrázku 2. Gumený tesniaci krúžok sa potom na koniec tefló ­
novej (PTFE) trubi čky opatrne a utesní vazelínou. Trubi čku 
pridržiava v receptorovej komore obsahujúcej roztok MgSO  4 
(154 mM) pružinová svorka (obrázok 1). Kožný ter čík by sa mal 
úplne ponori ť do roztoku MgSO  4 . Z jednej kože potkana možno 
získať 10 až 15 kožných ter číkov. 
Pre každú zvieraciu kožu sa pred za čatím testovania zmeria elek ­
trický odpor dvoch kožných ter číkov ako postup kontroly kvality. 
Ak sa pri tomto teste majú použi ť ostatné ter číky, pre obidva ter číky 
by mala by ť nameraná hodnota odporu vä čšia ako 10 kQ. Ak je 
hodnota odporu nižšia ako 10 kQ, zvyšné ter číky z tejto kože by 
sa mali z testov vyradi ť. 
1.5.3.  Aplikácia testovaných a kontrolných látok  
Pre každú štúdiu by sa mali súbežne použi ť pozitívne a negatívne 
kontroly, aby sa zaru čila dostato čná účinnosť daného experimentál ­
neho modelu. Mali by sa použi ť kožné ter číky z toho istého zviera ťa. 
Navrhovanými látkami pre pozitívnu kontrolu je 10 M kyselina chlo ­
rovodíková a pre negatívnu kontrolu destilovaná voda. 
Na epidermálny povrch vnútri trubi čky sa rovnomerne aplikujú 
tekuté testované látky (150 μl). Pri testovaní tuhých materiálov sa 
na terčík rovnomerne aplikuje dostato čné množstvo tuhej látky, aby 
bol pokrytý celý povrch epidermy. Na vrch tuhej látky sa pridá deionizovaná voda (150 μl) a trubička sa jemne pretrepe. S cie ľom 
zaistiť maximálny styk látky s kožou môže vzniknú ť potreba zohria ť 
tuhé látky na 30
 o C, aby sa testovaná látka roztavila alebo zmäkla, 
alebo ju treba pomlie ť na zrnitý materiál alebo prášok.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Pre každú testovanú a kontrolnú látku sa použijú tri kožné ter číky. 
Testované látky sa aplikujú po čas 24 hodín pri teplote 20 – 23  o C. 
Testovaná látka sa celkom odstráni umytím prúdom vody z vodovodu s teplotou do 30
 o C. 
1.5.4.  Merania TER  
Impedancia kože sa meria ako TER. TER sa meria použitím nízkona ­
päťového, Wheatstonovho meracieho mostíka na striedavý prúd (13). 
Všeobecné špecifikácie tohto mostíka: prevádzkové napätie 1 – 3 
volty, sínusový alebo pravouhlý tvar kmitov striedavého prúdu 
s frekvenciou 50 – 1 000 Hz a rozsah merania najmenej 0,1 – 30 k Merací mostík použitý vo valida čnej štúdii meria induktanciu, kapa ­
citanciu a odpor až do hodnôt 2 000 H, 2 000 μF, a 2 MΩ pri frekven ­
ciách 100 Hz alebo 1 kHz, s použitím sériových alebo paralelných 
hodnôt. Na ú čely merania TER v rámci skúšky žieravosti sa zazname ­
návajú hodnoty odporu pri frekvencii 100 Hz a s použitím sériových hodnôt. Pred meraním elektrického odporu sa povrchové napätie kože 
zníži pridaním dostato čného množstva 70 % etanolu tak, aby sa 
epiderma zakryla. Po nieko ľkých sekundách sa etanol z trubi čky 
odstráni a tkanivo sa potom zvlh čí pridaním 3 ml roztoku MgSO
 4 
(154 mM). Elektródy meracieho mostíka sa umiestnia na obe strany 
kožného ter číka a zmeria sa odpor v k Ω/kožný ter čík (obrázok 1). 
Rozmery elektródy a d ĺžka exponovanej elektródy pod krokosvorkami 
sú uvedené na obrázku 2. Svorka vnútornej elektródy je po čas merania 
opretá o horný koniec teflónovej trubi čky, aby sa zaistilo, že sa d ĺžka 
časti elektródy ponorenej v roztoku MgSO  4 nemení. Vonkajšia elek ­
tróda je umiestnená vo vnútri receptorovej komory tak, aby spo čívala 
na dne komory. Vzdialenos ť medzi pružinovou svorkou a dnom tefló ­
novej trubi čky sa udržiava konštantná (obrázok 2), pretože táto vzdia ­
lenosť má vplyv na nameranú hodnotu odporu. V dôsledku toho by 
vzdialenos ť medzi vnútornou elektródou a kožným ter číkom mala by ť 
konštantná a minimálna (1 – 2 mm). 
Ak je nameraná hodnota odporu vyššia ako 20 k Ω, môže to by ť 
spôsobené zvyškami testovanej látky na epidermálnej strane kožného 
terčíka. O ďalšie odstránenie tohto nánosu sa možno pokúsi ť 
napríklad tak, že sa teflónová trubi čka zakryje palcom chráneným 
v rukavici a pretrepáva sa ňou približne 10 sekúnd; roztok MgSO  4 sa 
odstráni a meranie odporu sa opakuje s čerstvým MgSO  4 . 
Vlastnosti a rozmery testovacej aparatúry a použitý experimentálny 
postup môžu ma ť vplyv na namerané hodnoty TER. Referen čná 
prahová hodnota 5 k Ω pre leptavé ú činky bola odvodená na základe 
údajov zistených špecifickou aparatúrou a postupom opísaným v tejto metóde. Ak sa zmenia podmienky testovania alebo sa použije iná aparatúra, môžu sa použi ť iné prahové a kontrolné hodnoty. 
Preto je potrebné kalibrova ť metodiku a prahové hodnoty odporu 
testovaním série referen čných štandardných materiálov vybratých 
z chemických látok použitých vo valida čnej štúdii (4, 5), alebo 
z tried chemických látok podobných skúmaným chemikáliám. 
Súbor vhodných referen čných chemických látok sa uvádza 
v tabuľke 1.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Metódy stanovenia viazania farbiva  
Expozícia kože ur čitým nežieravým materiálom môže ma ť za 
následok zníženie odporu pod prahovú hodnotu 5 k Ω, v dôsledku 
čoho sa umožní prienik iónov cez rohovitú vrstvu  (stratum corneum)  
a znižuje sa elektrický odpor (5). Napríklad neutrálne organické látky 
a chemické látky (vrátane detergentov, emulzifikátorov a ostatných povrchovo aktívnych činidiel), ktoré majú povrchovo aktívne vlast ­
nosti, môžu vies ť k odstráneniu kožných lipidov, čím sa bariéra 
stane pre ióny priepustnejšia. Preto, ak sú hodnoty TER testovaných 
látok nižšie ako 5 k Ω, alebo sa pohybujú okolo 5 k Ω, a nie je 
viditeľné poškodenie, malo by sa vykona ť posúdenie prieniku 
farbiva na kontrolných a upravených tkanivách, aby sa zistilo, či 
sú namerané hodnoty TER výsledkom zvýšenej priepustnosti kože alebo poleptania kože (3, 5). V prípade poleptania kože, ke ď sa 
stratum corneum  poruší, farbivo sulforodamín B pri aplikácii na 
povrch kože rýchlo ňou preniká a sfarbuje podkladové tkanivo. 
Toto konkrétne farbivo je stabilné v prostredí širokého rozsahu chemických látok a nemá na ň vplyv extrak čný postup opísaný ďalej.
 
1.5.5.1.  Aplikácia a odstránenie farbiva sulforodamínu B  
Po posúdení TER sa síran hore čnatý odstráni z trubi čky a koža sa 
pozorne preskúma, či nie je vidite ľne poškodená. Ak zrete ľné veľké 
poškodenie nie je vidite ľné, aplikuje sa na epidermálnu stranu 
každého kožného ter číka počas 2 hodín 150 μl 10 % roztoku 
(m/V) farbiva sulforodamínu B (Acid Red 52; C.I. 45100; č. EINECS 222-529-8; č. CAS 3520-42-1) v destilovanej vode. 
Tieto kožné ter číky sa potom asi 10 sekúnd omývajú te čúcou 
vodou pri teplote zodpovedajúcej najviac izbovej teplote, aby sa 
odstránilo všetko nadbyto čné/neviazané farbivo. Všetky kožné 
terčíky sa opatrne odoberú z teflónovej trubi čky a umiestnia sa do 
liekovky (napr. sklenej scintila čnej liekovky s objemom 20 ml) obsa ­
hujúcej deionizovanú vodu (8 ml). Liekovky sa 5 minút ľahko 
pretrepávajú, aby sa odstránilo akéko ľvek nadbyto čné neviazané 
farbivo. Tento postup oplachovania sa zopakuje a potom sa kožné terčíky vyberú a vložia do liekoviek obsahujúcich 5 ml 30 % (hm/ ­
obj.) laurylsíranu sodného (SDS) v destilovanej vode a cez noc sa 
inkubujú pri teplote 60
 o C. 
Po inkubácii sa všetky kožné ter číky odstránia a zlikvidujú 
a zostávajúci roztok sa odstre ďuje 8 minút pri teplote 21  o C (pri 
relatívnej odstredivej sile ~175 × g). Vzorka supernatantu s objemom 
1 ml sa zriedi v pomere 1:5 (v/v) (t.j. 1 ml + 4 ml) s 30 % (w/v) 
SDS v destilovanej vode. Optická hustota (OD) roztoku sa meria pri 565 nm.
 
1.5.5.2.  Výpo čet obsahu farbiva  
Obsah farbiva sulforodamínu B v kožnom ter číku sa vypo číta 
z hodnôt OD (5) (mólový extink čný koeficient sulforodamín B pri 
565 nm = 8,7 × l0  4 ; molekulová hmotnos ť = 580). Obsah farbiva sa 
stanoví pre každý kožný ter čík s využitím vhodnej kalibra čnej krivky 
a potom sa vypo číta priemerný obsah farbiva pre replikáty.  
2. ÚDAJE  
Hodnoty odporu (k Ω) a prípadne hodnoty stredného obsahu farbiva 
(μg/terčík), pre testovaný materiál, ako aj pre pozitívne a negatívne 
kontroly by sa mali uvies ť v podobe tabu ľky (jednotlivé údaje 
z jednotlivých pokusov ich stredné hodnoty s ich ± smerodajnou 
odchýlkou), vrátane údajov o duplicitných/opakovaných experimen ­
toch, a ich stredné a jednotlivé hodnoty.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Stredné hodnoty výsledkov TER sú prijate ľné, ak súbežne namerané 
hodnoty pre pozitívnu aj negatívnu kontrolu patria do prijate ľného 
rozmedzia danej metódy v danom testovacom laboratóriu. Pre 
opísanú metodiku a aparatúru sú prijate ľné hodnoty rozmedzia 
odporu uvedené v tejto tabu ľke: 
Kontrola Látka Rozsah odporu 
(kΩ) 
pozitívna 10M kyselina chlorovodíková 0,5 – 1,0 
negatívna destilovaná voda 10 – 25 
Výsledné stredné hodnoty viazania farbiva sú prijate ľné, ak hodnoty 
pre súbežné kontroly spadajú do prijate ľných rozmedzí danej 
metódy. Pre opísanú metodiku a aparatúru sú odporú čané prijate ľné 
rozmedzia obsahu farbiva pre kontrolné látky uvedené v tejto tabuľke:
 
Kontrola Látka Rozsah obsahu 
farbiva 
(μg/terčík) 
pozitívna 10M kyselina chlorovodíková 40 – 100 
negatívna destilovaná voda 15 – 35 
Testovaná látka sa pokladá za látku, ktorá nie je žieravá pre kožu: 
i) ak je stredná hodnota TER zmeraná pre testovanú látku vyššia 
než 5 kΩ, alebo 
ii) ak je stredná hodnota TER nižšia alebo sa rovná 5 k Ω, a 
— kožný ter čík nevykazuje zrete ľné poškodenie a 
— stredný obsah farbiva na ter čík je omnoho nižší než stredný 
obsah farbiva na ter čík stanovený súbežnou pozitívnou 
kontrolou s 10M HCl. 
Testovaná látka sa pokladá za látku žieravú pre kožu: 
i) ak je stredná hodnota TER nižšia alebo sa rovná 5 k Ω a kožný 
terčík je zrete ľne poškodený, alebo 
ii) ak je stredná hodnota TER nižšia, alebo sa rovná 5 k Ω a 
— kožný ter čík nie je zjavne poškodený, ale 
— priemerný obsah farbiva je pre testovanú látku vyšší alebo sa 
rovná strednému obsahu farbiva na ter čík stanovenému 
súbežnou pozitívnou kontrolou s 10M HCl.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Testované a kontrolné látky: — chemický názov (chemické názvy) ako napríklad názov pod ľa 
IUPAC alebo CAS a číslo CAS, ak je známe, 
— čistota a zloženie látky alebo prípravku (v hmotnostných percen ­
tách) a fyzikálne vlastnosti, 
— fyzikálno-chemické vlastnosti ako napríklad fyzikálny stav, pH, 
stabilita, rozpustnos ť vo vode, relevantné pre vykonanie štúdie, 
— úprava testovaných/kontrolných látok pred testovaním, pokia ľ je 
to vhodné (napr. zahriatie, rozomletie), 
— stabilita, ak je známa. Pokusné zvieratá: — použitý kme ň a pohlavie, 
— vek zvierat, ak sú použité ako darcovské zvieratá, — zdroj, podmienky umiestnenia zvierat, výživa at ď., 
— podrobnosti o príprave kože. 
Testovacie podmienky: 
— kalibra čné krivky na testovacia aparatúra, 
— kalibra čné krivky na vykonanie testu ú činnosti viazania farbiva, 
— podrobnosti o použitom testovacom postupe na meranie TER, — podrobnosti o testovacom postupe použitom na posúdenie 
viazania farbiva, v prípade potreby; 
— opis všetkých modifikácií testovacích postupov, — opis použitých hodnotiacich kritérií. 
Výsledky: 
— tabuľky s údajmi z merania hodnôt TER a prípadne obsahu 
viazaného farbiva pre jednotlivé zvieratá a jednotlivé vzorky kože; 
— opis všetkých pozorovaných ú činkov. 
Rozbor výsledkov 
Závery
 
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono 
(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion. 
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219 – 255. 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471 – 482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483 – 524. 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp. 
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129 – 147. 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxico logical Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf 
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275 – 280. (10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02–4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddoc s/epis_brd.pdf. 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
- 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507 – 512.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191 – 194. 
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709 – 720. 
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845 – 852. 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7 – 17.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Obrázok 1  
Aparatúra na meranie TER potkanej kože
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Obrázok 2  
Rozmery teflónovej a receptorovej trubi čky a použitých elektród
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Rozhodujúce faktory zobrazenej aparatúry:  
— vnútorný priemer trubi čky z PTFE, 
— dĺžka elektród vzh ľadom na trubi čku z PTFE a trubi čku receptora 
taká, že elektródy nedosahujú ku kožnému ter číku a elektróda so 
štandardnou d ĺžkou je v kontakte s roztokom MgSO  4 , 
— objem roztoku MgSO  4 v trubičke receptora by mal zaisti ť hĺbku 
vrstvy tekutiny vzh ľadom na úrove ň trubičky z PFTE, ako je 
znázornené na obrázku 1, 
— kožný ter čík by mal by ť k trubičke z PFTE pripevnený tak, aby 
elektrický odpor predstavoval skuto čnú mieru vlastnosti kože.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 BIS.  POLEPTANIE KOŽE  IN VITRO:  TEST POMOCOU 
MODELU ĽUDSKEJ KOŽE  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je ekvivalentná OECD TG 431 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Poleptaním kože a rozumie nevratné poškodenie tkaniva kože po 
aplikácii testovaného materiálu [v znení definície pod ľa Globálne 
harmonizovaného systému klasifikácie a ozna čovania chemických 
látok a zmesí (GHS)] (1). Pri tejto testovacej metóde nie sú na 
posúdenie žieravosti pre kožu potrebné živé zvieratá ani tkanivá 
zvierat. 
Posudzovanie žieravosti pre kožu sa zvy čajne vykonávalo na labo ­
ratórnych zvieratách (2). Snaha o obmedzenie bolesti a utrpenia zvierat v súvislosti s týmto postupom viedla k takej revízii testovacej 
metódy B.4, ktorou sa umož ňuje stanovi ť poleptanie kože pomocou 
alternatívnych metód  in vitro,  čo umožňuje vylúčiť bolesti a utrpenie 
zvierat. 
Prvým krokom k vymedzeniu alternatívnych testov, ktorými by sa 
umožnilo testovanie žieravých ú činkov na kožu na ú čely regulácie, 
bolo vykonanie prevalida čných štúdií (3). Po nich sa vykonala riadna 
validačná štúdia metód  in vitro  (6), (7), (8) na posúdenie poleptania 
kože (4), (5). Výsledky z týchto štúdií a z iných publikácií (9) viedli k odporú čaniu, že na posúdenie žieravosti pre kožu  in vivo  by sa 
mohli použi ť tieto testy (10), (11), (12), (13): test na modeli ľudskej 
kože (táto metóda) atest transkutánneho elektrického odporu (pozri testovaciu metódu B.40). 
Vo valida čných štúdiách sa uvádza, že testy s využitím modelov 
ľudskej kože (3), (4), (5), (9) umož ňujú spoľahlivo rozlišova ť 
medzi známymi látkami so žieravým ú činkom na kožu a látkami, 
ktoré nemajú žieravé ú činky. V protokole o teste sa takisto uvádza 
rozdiel medzi látkami so silnými a menej silnými žieravými ú čin­
kami na kožu. 
Testom opísaným v tejto metóde sa umož ňuje identifikova ť žieravé 
chemické látky a zmesi. Takisto sa ním umož ňuje identifikova ť 
nežieravé látky a zmesi, ak sa podporí dôkaznými stanoveniami založenými na ďalších existujúcich informáciách (napríklad pH, 
vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou, údaje o vplyve na človeka/­
zvieratá) (1), (2), (13), (14). Test bežne neposkytuje dostato
čné 
údaje o dráždivých ú činkoch na kožu, ani neumož ňuje ďalšiu kate ­
gorizáciu žieravých látok, ako to umož ňuje Globálne harmonizovaný 
systém klasifikácie (GHS)(1). 
Na úplné vyhodnotenie lokálnych ú činkov na kožu po jednorazovej 
expozícii pokožky sa odporú ča dodržiava ť stratégiu sekven čného 
testovania, ako je uvedené v testovacej metóde B.4 (2) a ako je stano ­
vené v Globálne harmonizovanom systéme klasifikácie (GHS) (1). Táto stratégia testovania zah ŕňa vykonávanie testov  in vitro  s cieľom 
zistiť poleptanie kože (ako je opísané v tejto metóde) a dráždivos ť pre 
kožu pred zvážením testovania na živých zvieratách.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Poleptanie kože  in vivo:  je vznik nevratného poškodenia kože: najmä 
viditeľná nekróza postihujúca epidermu a zasahujúca do dermy, ktorá 
nastane do štyroch hodín po aplikácii testovanej látky. Typickými 
reakciami na poleptanie sú vredy, krvácanie, krvavé chrasty a na 
konci štrnás ťdňového pozorovania strata farby v dôsledku vyblednutia 
kože, úplné ložiská alopécie a jazvy. Na vyhodnotenie problematic ­
kých lézií by sa malo uvažova ť histopatológii.  
Životaschopnos ť buniek:  parameter, ktorým sa meria celková akti ­
vita bunkovej populácie (napr. schopnos ť bunkových mitochondriál ­
nych dehydrogenáz redukova ť vitálne farbivo MMT) a ktorý 
v závislosti od posledného merania a od použitom usporiadaní testu je v korela čnom vzťahu s celkovým po čtom buniek a/alebo 
s ich vitalitou.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LATKY  
Tabuľka 1 
Referenčné chemické látky  
Názov Číslo EINECS Číslo CAS  
propán-l,2-diamín 201-155-9 78-90-0 silno žieravý 
kyselina akrylová 201-177-9 79-10-7 silno žieravá  
2-terc-  butylfenol 201-807-2 88-18-6 žieravý 
hydroxid draselný (10 %) 215-181-3 1310-58-3 žieravý 
kyselina sírová (10 %) 231-639-5 7664-93-9 žieravá kyselina oktánová (kaprylová) 204-677-5 124-07-02 žieravá  
4H-1 ,2,4-triazoM-ylamín 209-533-5 584-13-4 nežieravý 
eugenol 202-589-1 97-53-0 nežieravý fenetylbromid 203-130-8 103-63-9 nežieravý tetrachlóretylén 204-825-9 27-18-4 nežieravý 
kyselina izostearová 250-178-0 30399-84-9 nežieravá 
4-(metylsulfanyl)benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 nežieravý 
Väčšina z uvedených chemických látok je prevzatá zo zoznamu 
chemických látok vybratých pre medzinárodnú valida čnú štúdiu 
ECVAM (4). Ich výber sa zakladá na týchto kritériách: 
i) rovnaký po čet žieravých a nežieravých látok; 
ii) komer čne dostupné látky, ktoré sa vz ťahujú na vä čšinu relevant ­
ných tried chemických látok; 
iii) zahrnutie silno žieravých a menej žieravých látok, aby sa umož ­
nilo rozlíšenie na základe možného žieravého ú činku;
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) výber chemických látok, s ktorými možno manipulova ť 
v laboratóriu bez vážnych nebezpe čenstiev, iných ako je žieravos ť. 
1.4. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaný materiál sa lokálne aplikuje na trojrozmerný model 
ľudskej kože pozostávajúci aspo ň z rekonštruovanej epidermy 
s funkčnou rohovitou vrstvou  (stratum corneum).  Žieravé materiály 
sa identifikujú na základe schopnosti spôsobi ť pri špecifikovanej 
expozičnej dobe pokles životaschopnosti buniek [stanovený 
napríklad pomocou skúšky redukcie MTT (15)] pod definovanú 
prahovú úrove ň. Podstata skúšky pomocou modelu ľudskej kože sa 
zakladá na hypotéze, že žieravé chemikálie sú tie, ktoré sú schopné preniknúť rohovitou vrstvou  (stratum corneum)  difúziou alebo 
eróziou a sú cytotoxické pre bunky v hlbších bunkových vrstvách.
 
1.4.1.  Postup  
1.4.1.1.  Modely ľudskej kože  
Modely ľudskej kože možno vyrobi ť alebo získa ť komerčne (napr. 
modely EpiDerm™ a EPISKIN™) (16), (17), (18), (19) alebo ich 
možno pripravi ť či vyrobiť v testovacom laboratóriu (20), (21). 
Uznáva sa, že využitie ľudskej kože podlieha vnútroštátnym 
a medzinárodným etickým zrete ľom a podmienkam. Každý nový 
model by mal by ť validovaný (aspo ň v rozsahu uvedenom 
v 1.4.1.1.2). Modely ľudskej kože použité pre tento test musia sp ĺňať 
tieto podmienky:  
1.4.1.1.1. V š e o b e c n é p o d m i e n k y m o d e l u : 
Na zostavenie epitelu by sa mali použi ť ľudské keratinocyty. Pod 
funkčnou rohovitou vrstvou  (stratum corneum)  by malo by ť viac 
vrstiev životaschopných epitelových buniek. Model kože môže ma ť 
takisto ako zložku stromálnu vrstvu. Rohovitá vrstva  (stratum 
corneum)  by mala by ť viacvrstvová a s potrebným profilom lipidov, 
aby sa umožnila funkcia robustnej bariéry odolávajúcej rýchlemu prenikaniu cytotoxických markerov. Izola čné vlastnosti modelu by 
mali zabráni ť prenikaniu materiálu okolo  stratum corneum  do života ­
schopného tkaniva. Preniknutie testovaných chemických látok okolo  
stratum corneum  povedie k chybnému modelovaniu expozície kože. 
Model kože by nemal by ť kontaminovaný baktériami (vrátane myko ­
plazmy) ani hubami.
 
1.4.1.1.2 P o d m i e n k y f u n k č n é h o m o d e l u : 
Rozsah životaschopnosti sa oby čajne stanovuje na základe MTT 
alebo iných metabolicky premenených vitálnych farbív. V týchto prípadoch by optická hustota (optical density – OD) extrahovaného (solubilizovaného) farbiva negatívneho kontrolného tkaniva mala by ť 
aspoň 20-násobne vyššia ako OD samotného extrak čného rozpúš ť­
adla [pozri preh ľad v (22)]. Negatívne kontrolné tkanivo by malo 
byť stabilné v kultúre (malo by vies ť k podobným výsledkom 
merania životaschopnosti) po čas expozi čnej doby testu.  Stratum 
corneum  musí by ť dostatočne robustné, aby odolalo rýchlemu prie ­
niku určitých cytotoxických markerových chemikálií (napríklad 1 % 
Triton X-100). Túto vlastnos ť možno odhadnú ť pomocou expozi čnej 
doby potrebnej na zníženie životaschopnosti buniek o 50 % (ET
 50 ) 
(napr. pri modeloch EpiDerm  TM a EPISKIN  TM je to > 2 hod.). 
Tkanivo by malo by ť preukázate ľne schopné reprodukovate ľnosti 
v čase a prednostne aj medzilaboratórne. Okrem toho by malo 
umožniť predikciu potenciálu žieravosti referen čných chemických 
látok (pozri tabu ľku 1), ak sa používa vo zvolenom testovacom 
protokole.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Aplikácia testovaných a kontrolných látok  
Pre každý experiment (expozi čný čas), vrátane kontrolných, sa použijú 
dve repliky tkaniva. Pri tekutých materiáloch sa musí aplikova ť dosta­
točné množstvo testovanej látky, aby sa povrch kože rovnomerne 
pokryl: malo by sa použi ť najmenej 25 μl/cm2. Pri tuhých materiáloch 
sa musí aplikova ť dostatočné množstvo testovanej látky, aby koža bola 
rovnomerne pokrytá, a testovaná látka by mala by ť zvlhčená deionizo ­
vanou alebo destilovanou vodou, aby bol zaistený dobrý styk s kožou. 
Tuhé materiály by sa mali pod ľa potreby pred aplikáciou zomlie ť na 
prášok. Metóda aplikácie by mala by ť pre testovanú látku vhodná 
(pozri napr. odkaz 5). Na konci expozi čnej doby sa testovaný materiál 
musí dôkladne zmy ť z povrchu kože pomocou vhodného pufra alebo 
0,9 % roztokom NaCl. 
Pre každú štúdiu by sa mali súbežne vykona ť pozitívne a negatívne 
kontroly na zabezpe čenie dostato čnej funkčnosti daného experimen ­
tálneho modelu. Odporú čanými látkami pre pozitívnu kontrolu sú 
ľadová kyselina octová alebo 8N KOH. Odporú čanými látkami pre 
negatívnu kontrolu sú 0,9 % roztok NaCl alebo voda.  
1.4.1.3.  Meranie životaschopnosti buniek  
Na meranie životaschopnosti buniek sa môžu používa ť len valido ­
vané kvantitatívne metódy. Ďalej, miera životaschopnosti musí by ť 
zlučiteľná s využívaním v trojrozmernom modeli tkaniva. Nešpeci ­
fické viazanie farbiva nesmie interferova ť s meraním životaschop ­
nosti. Preto nie sú vhodné farbivá viažuce bielkoviny a farbivá nepodliehajúce metabolickej konverzii (napr. neutrálna červeň). 
Najčastejšie používanou skúškou je stanovenie redukcie MTT 
[3-(4,5-dimetyltiazol-2yl)-2,5-difenyltetrazólium bromid, tiazolylová modrá: číslo EINECS 206-069-5, číslo CAS 298-93-1)], pre ktorú 
bolo preukázané, že poskytuje presné a reprodukovate ľné výsledky 
(5), ale možno použi ť aj iné. Vzorka kože sa umiestni do roztoku 
MTT s vhodnou koncentráciou (napr. 0,3 až 1 mg/ml) a inkubuje sa pri vhodnej teplote po čas 3 hodín. Pomocou rozpúš ťadla (izopropa ­
nol) sa potom extrahuje zrazenina modrého formazánového 
produktu, pri čom koncentrácia formazánu sa meria na základe stano ­
venia OD pri vlnovej d ĺžke medzi 540 a 595 nm. 
Chemický ú činok testovaného materiálu na vitálne farbivo môže 
imitovať účinok bunkového metabolizmu, čo vedie k nesprávnemu 
odhadu životaschopnosti. K tomu preukázate ľne dochádza, ke ď sa 
testovaný materiál úplne neopláchne z kože (9). Ak testovaný mate ­
riál pôsobí priamo na vitálne farbivo, musia sa použi ť ďalšie 
kontroly, aby zistilo, či testované látky neinterferujú s meraním živo ­
taschopnosti, a prípadné výsledky korigova ť (9), (23).
 
2. ÚDAJE  
Pre každé tkanivo je potrebné do tabu ľky zaznamena ť hodnoty OD 
a vypočítaný percentuálny podiel životaschopnosti buniek pre testo ­
vaný materiál a pre pozitívne aj negatívne kontroly, vrátane údajov 
o duplicitných alebo opakovaných experimentoch, a prípadne ich 
stredné a individuálne hodnoty.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Hodnoty OD namerané pre každú testovaciu vzorku sa môžu použi ť 
na výpočet percentuálneho podielu životaschopnosti vzh ľadom na 
výsledok negatívnej kontroly, ktorý je dohodou stanovený na úrove ň 
100 %. Referen čná prahová hodnota percentuálneho podielu života ­
schopnosti buniek umož ňujúca rozlišova ť žieravé a nežieravé testo ­
vané materiály (alebo rozlišova ť medzi rôznymi triedami žieravých), 
alebo štatistické postupy použité na vyhodnotenie výsledkov 
a identifikáciu žieravých materiálov, musia by ť jasne definované, 
zdokumentované, a musí sa preukáza ť ich vhodnos ť. Vo všeobec ­
nosti sa tieto referen čné prahové hodnoty ur čujú počas optimalizácie 
testu, ich testovaním predvalida čnej fázy a potvrdzujú sa valida čnou 
štúdiou. Predikcia žieravosti je v spojení s modelom EpiDerm™ daná napríklad takto (9): 
Testovaná látka sa pokladá za žieravú pre kožu: 
i) ak po 3 minútach expozície je životaschopnos ť nižšia ako 50 %, 
alebo 
ii) ak po 3 minútach expozície je životaschopnos ť vyššia ako 50 % 
alebo sa rovná 50 % a životaschopnos ť po 1 hodine expozície je 
nižšia ako 15 %. 
Testovaná látka sa pokladá za látku nežieravú pre kožu: 
i) ak po 3 minútach expozície je životaschopnos ť vyššia ako 50 % 
alebo sa rovná 50 % a životaschopnos ť po 1 hodine expozície je 
vyššia ako 15 % alebo sa rovná 15 %.
 
3. SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná a kontrolná látka: 
— chemický názov (chemické názvy), ako napríklad názov pod ľa 
IUPAC alebo CAS a číslo CAS, ak je známe, 
— čistota a zloženie látky alebo prípravku (v hmotnostných 
percentách), 
— fyzikálno-chemické vlastnosti ako napríklad fyzikálny stav, pH, 
stabilita, rozpustnos ť vo vode, relevantné pre vykonanie štúdie, 
— prípadná úprava testovaných/kontrolných látok pred testovaním 
(napr. zahriatie, rozomletie), 
— stabilita, ak je známa. 
Zdôvodnenie modelu kože a použitého protokolu. 
Testovacie podmienky: — použitý bunkový systém, 
— údaje o kalibrácii zariadenia použitého na meranie životaschop ­
nosti buniek (napr. spektrofotometer),
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— úplné podkladové údaje pre konkrétny použitý model kože 
vrátane jeho validity, 
— podrobnosti o použitom testovacom postupe, 
— použité testovacie dávky, — opis všetkých modifikácií testovacieho postupu, — odkaz na minulé údaje o danom modeli, — opis použitých hodnotiacich kritérií. 
Výsledky: 
— údaje z individuálnych testovacích vzoriek, spracované v podobe 
tabuľky, 
— opis ďalších pozorovaných ú činkov. 
Rozbor výsledkov. Záver
 
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asse ­
ssment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. 
olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6. 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion. 
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. 
The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, 219 – 255. 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471 – 482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team.  Toxic. In Vitro 12, 483 – 524.  
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp. 
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129 – 147. 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp. 371 – 401. 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275 – 280. 
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365 – 67. (12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemi ­
cals. NTH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
- 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709 – 720. 
(15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55 – 63. 
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic. In Vitro 8, 889 – 891. 
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211 – 225. 
(18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133 – 140 
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post-transplantation differentia ­
tion of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: 310 – 319 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human 
skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. 
Cytotechnology 9, 163 – 171. 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, 747 – 756.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical asse ­
ssment of the use of microculture tetrazolium assays to measure 
cell growth and function. Growth Regulation 5, 69 – 84. 
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 15, 57 – 93.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  TEST FOTOTOXICITY 3T3 NRU  IN VITRO  
1. METÓDA  
Táto metóda je ekvivalentná OECD TG 432 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Fototoxicita sa definuje ako toxická odozva na látku aplikovanú na 
telo, ktorá je bu ď vyvolaná, alebo zvýšená (je zjavná pri nižších 
úrovniach dávok) po následnej expozícii svetlu, alebo ktorá je vyvo ­
laná ožiarením kože po systémovom podaní chemickej látky. 
Test fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  sa používa na identifikáciu foto ­
toxického potenciálu testovanej látky vyvolaného chemickou látkou excitovanou po expozícii svetlu. Týmto testom sa vyhodnocuje foto- 
cytotoxicita pomocou relatívneho zníženia životaschopnosti buniek 
exponovaných ú činkom chemickej látky jednak v prítomnosti 
a jednak v neprítomnosti svetla. Látky identifikované týmto testom sú pravdepodobne fototoxické  in vivo  po systémovej aplikácii 
a distribúcii do kože, alebo po lokálnej aplikácii. 
Uvádza sa, že mnohé druhy chemických látok indukujú fototoxické 
účinky (1), (2), (3), (4). Spolo čnou črtou je ich schopnos ť absor­
bovať svetelnú energiu slne čného svetla. Pod ľa prvého fotochemic ­
kého zákona (Grotthaus-Draperov zákon) je fotoreakcia podmienená dostatočnou absorpciou svetelných kvánt. Pred zvažovaním biologic ­
kého testovania sa preto musí stanovi ť absorpčné spektrum testo ­
vanej chemickej látky v oblasti U V/vidite ľného svetla v súlade 
s usmernením OECD Test Guideline 101. Vychádza sa z toho, že ak je mólový extink čný/absorp čný koeficient nižší ako 10 litrov × 
mol
 -1 × cm  -1 , daná chemická látka pravdepodobne nie je fotoreak ­
tívna. Takúto chemickú látku nie je potrebné testova ť testom foto ­
toxicity 3T3 NRU  in vitro  ani iným biologickým testom na nepriaz ­
nivé fotochemické ú činky (1), (5). Pozri aj prílohu 1. 
Nedávno boli vyhodnotené spo ľahlivosť a význam testu fototoxicity 
3T3 NRU  in vitro  (6), (7), (8), (9). Ukázalo sa, že test fototoxicity 
3T3 NRU  in vitro  je prediktívny, pokia ľ ide o akútne fototoxické 
účinky na zvieratá a ľudí in vivo.  Test nie je ur čený na predikciu 
ďalších nepriaznivých ú činkov, ktoré môžu vzniknú ť zo spolo čného 
pôsobenia chemickej látky a svetla, napr. neumož ňuje skúma ť foto­
genotoxicitu, fotoalergiu ani fotokarcinogenitu, ani neumož ňuje 
posúdiť fototoxický potenciál. Okrem toho tento test nie je ur čený 
na riešenie nepriamych mechanizmov fototoxicity ani ú činkov meta ­
bolitov testovanej látky alebo ú činkov zmesí. 
Keďže použitie metabolizujúcich systémov je všeobecnou požia ­
davkou pri všetkých testoch  in vitro  určených na predikciu genoto ­
xického a karcinogénneho potenciálu, v prípade fototoxikológie 
existujú iba zriedkavé prípady, ke ď je potrebná metabolická trans ­
formácia na to, aby chemická látka pôsobila ako fototoxín  in vivo  
alebo  in vitro.  Nepokladá sa teda za potrebné ani za vedecky opod ­
statnené, aby sa tento test vykonával s použitím systému metabo ­
lickej aktivácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Intenzita ožiarenia:  intenzita ultrafialového (UV) alebo vidite ľného 
svetla dopadajúceho na povrch, meraná v jednotkách W/m  2 alebo 
mW/cm  2 . 
Dávka svetla:  množstvo (= intenzita × čas) ultrafialového (UV) 
alebo vidite ľného žiarenia dopadajúceho na povrch a vyjadreného 
v jouloch (= W × s) na plochu povrchu, napr. J/m  2 alebo J/cm  2 . 
Vlnové pásma UV svetla:  označenia odporú čané CIE (Medziná ­
rodná komisia pre osvetlenie – Commission Internationale de L'Ec ­
lairage) sú tieto: UVA (315 – 400 nm), UVB (280 – 315 nm) a UVC (100 – 280 nm). Používajú sa aj iné ozna čenia; rozlíšenie medzi 
UVB a UVA sa často kladie na 320nm a UVA možno rozdeli ť na 
UV-A1 a UV-A2 s hranicou približne na 340 nm.  
Životaschopnos ť buniek:  parameter, ktorým sa meria celková akti ­
vita bunkovej populácie (napr. absorbovanie vitálneho farbiva 
neutrálna červeň do bunkových lyzozómov), ktorý v závislosti od 
posledného merania a použitej testovacej metódy je v korela čnom 
vzťahu s celkovým po čtom buniek a/alebo ich vitalitou.  
Relatívna životaschopnos ť buniek:  životaschopnos ť buniek vyja ­
drená vo vz ťahu k rozpúš ťadlovým (negatívnym) kontrolným vzor ­
kám, ktoré boli odoberané po čas celého testovacieho postupu (bu ď 
+Irr, alebo –Irr), ale bez aplikovania testovanej chemickej látky.  
PIF (Photo-Irritation-Factor – koeficient svetelnej dráždivosti):  
koeficient vytvorený porovnaním dvoch rovnako ú činných cytotoxic ­
kých koncentrácií (IC
 50 ) testovanej chemickej látky získanej za 
neprítomnosti (-Irr) a za prítomnosti (+Irr) necytotoxického ožiarenia UV A/vis svetlom.  
IC
 50 : koncentrácia testovanej chemickej látky, ktorou sa života ­
schopnosť bunky zníži o 50 %.  
MPE  (Mean-Photo-Effect –  stredný svetelný ú činok):  veličina 
odvodená z matematickej analýzy priebehu kriviek odozvy na koncentráciu, získaných za neprítomnosti (–Irr) a za prítomnosti 
(+Irr) necytotoxického žiarenia UV A/vis svetlom.  
Fototoxicita:  akútna toxická odozva, ktorá je vyvolaná po prvej 
expozícii kože ur čitým chemikáliám a následnej expozícii svetlu, 
alebo ktorá je podobne vyvolaná ožiarením kože po systémovom 
podávaní chemickej látky.
 
1.3. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Test fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  je založený na porovnaní cyto ­
toxicity chemickej látky pri testovaní s expozíciou necytotoxickej dávky simulovaného slne čného svetla a bez tejto expozície. Cytoto ­
xicita je v tomto teste vyjadrená ako koncentra čne závislé zníženie 
absorpcie vitálneho farbiva neutrálna červeň (NR), meraná 24 hodín 
po pôsobení testovanej chemickej látky a ožiarenia (10). NR je slabé katiónové farbivo, ktoré ľahko preniká cez bunkové membrány nedi ­
fúznym spôsobom, pri čom sa akumuluje vnútrobunkovo 
v lyzozómoch. Zmeny bunkového povrchu citlivej lyzozomálnej 
membrány vedú k lámavosti lyzozómov a iným zmenám, ktoré sa postupne stávajú nevratnými. Také zmeny vyvolané pôsobením xenobiotík vedú k zníženiu absorpcie a viazaniu NR. Preto je 
možné rozlišova ť medzi životaschopnými a poškodenými alebo 
mŕtvymi bunkami, čo je základom tohto testu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Bunky Balb/c 3T3 sa kultivujú po čas 24 hodín, aby sa vytvorili 
monomolekulové vrstvy. Dve 96-jamkové došti čky na jednu testo ­
vanú chemickú látku sa 1 hodinu predinkubujú ôsmimi rôznymi koncentráciami testovanej látky. Potom sa jedna z týchto dvoch doštičiek exponuje najvyššej necytotoxickej dávke ožiarenia, kým 
druhá došti čka sa udržiava v tme. V obidvoch došti čkách sa 
potom pôsobiace médium nahradí kultiva čným médiom a po ďalších 
24 hodinách inkubácie sa stanoví životaschopnos ť buniek pomocou 
absorpcie neutrálnej červene. Životaschopnos ť buniek sa vyjadruje 
ako percentuálny podiel vzh ľadom na výsledok neupravenej rozpúš ť­
adlovej kontrolnej vzorky a vypo číta sa pre každú z testovacích 
koncentrácií. Na predikciu fototoxického potenciálu sa porovnajú odozvy koncentrácií získané pri ožiarení a bez ožiarenia, zvy čajne 
na úrovni IC
 50 , t. j. pri koncentrácii, ktorou sa znižuje životaschop ­
nosť buniek na 50 % v porovnaní s neupravovanými kontrolnými 
vzorkami.  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1  Prípravne práce  
1.4.1.1.  Bunky  
Pri valida čnej štúdii sa použila permanentná myšia fibroplastová 
bunková línia Balb/c 3T3, klon 31, bu ď z banky kultúr amerického 
typu (ATCC – American Type Culture Collection), Manassas, Vigí ­
nia, USA, alebo z európskej banky bunkových kultúr (ECACC – 
European Collection of Cell Cultures), Salisbury, grófstvo Wiltshire, 
Spojené Krá ľovstvo, a preto sa odporú ča získať bunky z riadne 
kvalifikovaného depozitára buniek. Pri tom istom testovacom procese sa môžu použi ť iné bunky alebo bunkové línie, ak sú kulti ­
vačné podmienky prispôsobené špecifickým potrebám buniek, ale 
musí byť preukázaná ich rovnocennos ť. 
Bunky by sa mali pravidelne kontrolova ť, či nedošlo 
k mykoplazmovej kontaminácii a použi ť iba vtedy, ak sa kontami ­
nácia nezistí (11). 
Je dôležité pravidelne kontrolova ť citlivosť buniek na UV pod ľa 
postupu kontroly kvality opísanom v tejto metóde. Ke ďže citlivos ť 
buniek na UVA môže s po čtom pasáží stúpa ť, mali by sa použi ť 
bunky Balb/c 3T3 s najnižším dosiahnute ľným počtom pasáží, 
najlepšie menej ako 100. (Pozri 1.4.2.2.2. a prílohu 2.)
 
1.4.1.2.  Médiá a kultiva čné podmienky  
Na rutinné pasážovanie buniek a po čas testovacieho postupu by sa 
mali používa ť vhodné kultiva čné médiá a inkuba čné podmienky, 
napr. pre bunky Balb/c 3T3 sú to DMEM (Dulbeccova modifikácia 
Eagleovho média – Dulbecco's Modified Eagle's Medium) obohatenú 10 % sérom z novonarodeného te ľaťa, 4 mM glutamínom, penici ­
línom (100 IU), a streptomycínom (100 μg/ml), a o inkubáciu 
v zvlhčenom prostredí pri 37
 o C s 5 – 7,5 % CO  2 v závislosti od 
použitého pufra (pozri časť 1.4.1.4 druhý pododsek). Osobitne dôle ­ 
žité je kultiva čnými podmienkami bunky zabezpe čiť, aby bunkový 
časový cyklus bol v rámci bežného doterajšieho rozsahu pre použité 
bunky alebo bunkovú líniu.  
1.4.1.3  Príprava kultúr  
Bunky zo zmrazených kme ňových kultúr sa nasadia do kultiva čného 
média v primeranej hustote a pred použitím v teste fototoxicity 3T3 
NRU  in vitro  sa najmenej raz subkultivujú.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Bunky používané pri teste fototoxicity sa nasadia do kultiva čného 
média v primeranej hustote tak, aby do konca testu nedošlo ku 
konfluencii kultúr, t. j. do okamihu, ke ď sa po 48 hodinách od 
nasadenia stanovuje životaschopnos ť buniek. V prípade buniek 
Balb/c 3T3, ktoré sa pestujú v 96-jamkových došti čkách, sa odpo ­
rúča hustota nasadenia 1 × 10  4 buniek na jamku. 
Pre každú testovanú chemickú látku sa bunky rovnakým spôsobom 
nasadia do dvoch samostatných 96-jamkových došti čiek, ktoré sa 
potom súbežne podrobia celému testovaciemu postupu za rovnakých kultivačných podmienok, s výnimkou času, keď sa jedna z došti čiek 
ožiari (+Irr) a druhá sa ponechá v tme (–Irr).
 
1.4.1.4  Príprava testovanej látky  
Testované látky musia by ť tesne pred použitím čerstvo pripravené, 
pokiaľ sa však údajmi nepreukáže ich stabilita pri skladovaní. Odpo ­
rúča sa, aby sa každá manipulácia s chemikáliami a po čiatočné ošet­
renie buniek vykonávali za takých svetelných podmienok, ktoré by 
pred ožiarením zabránili fotoaktivácii alebo degradácii testovanej 
látky. 
Testované chemické látky sa rozpustia v pufrovaných so ľných 
roztokoch, napr. v Earlovom rovnovážnom so ľnom roztoku (EBSS), 
alebo v iných fyziologicky rovnovážnych pufrových roztokoch, ktoré 
nesmú obsahova ť bielkovinové zložky, zložky absorbujúce svetlo, 
(napr. pH indikátory farby a vitamíny), aby sa predišlo interferencii počas ožarovania. Ke ďže bunky sa po čas ožarovania držia približne 
50 minút mimo inkubátora v atmosfére obsahujúcej CO
 2 , je potrebné 
dbať na to, aby sa zabránilo alkalizácii. Ak sa používajú slabé pufre 
ako napr. EBSS, možno to dosiahnu ť inkubovaním buniek 
v atmosfére obsahujúcej 7,5 % CO  2 . Ak sú bunky inkubované 
v atmosfére obsahujúcej iba 5 % CO  2 , mal by sa zvoli ť silnejší 
pufer. 
Testované chemické látky s obmedzenou rozpustnos ťou vo vode by 
mali byť rozpustené vo vhodnom rozpúš ťadle. Ak sa použije 
rozpúšťadlo, musí by ť prítomné v konštantnom objeme vo všetkých 
kultúrach, t. j. v negatívnych (rozpúš ťadlových) kontrolných vzor ­
kách, ako aj vo všetkých koncentráciách testovanej chemickej látky 
a pri tejto koncentrácii musí by ť necytotoxické. Koncentrácie testo ­
vanej chemickej látky by sa mali zvoli ť tak, aby sa zabránilo 
zrážaniu alebo zakaleniu roztoku. 
Odporúčanými rozpúš ťadlami sú dimetylsulfoxid (DMSO) a etanol 
(ETOH). Vhodné môžu by ť aj iné rozpúš ťadlá s nízkou cytotoxici ­
tou. Všetky rozpúš ťadlá by sa pred použitím mali posúdi ť z hľadiska 
ich špecifických vlastností, napr. reakcie s testovanou chemickou látkou, zmier ňovania fototoxického ú činku, vlastnosti v súvislosti 
so zachytávaním radikálov a/alebo chemickej stability v rozpúš ťadle. 
Rozpúšťanie sa môže u ľahčiť vírivým miešaním a/alebo pôsobením 
ultrazvuku, a/alebo zahriatím na príslušné teploty, pokia ľ sa to 
nedotkne stability testovanej chemickej látky.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Podmienky ožarovania  
1.4.1.5.1. Z d r o j s v e t l a 
Pri testovaní fototoxicity je rozhodujúcim faktorom výber vhodného 
svetelného zdroja a filtrov. Svetlo v pásme UVA a vo vidite ľnom 
pásme sa zvy čajne spája s fototoxickými reakciami  in vivo  (3), (12), 
zatiaľ čo žiarenie v pásme UVB je menej relevantné, ale je ve ľmi 
cytotoxické; cytotoxicita sa zvyšuje 1 000-krát pri posune vlnovej 
dĺžky z 313 na 280 nm (13). Kritériá výberu vhodného svetelného 
zdroja musia zah ŕňať požiadavku, aby svetelný zdroj vysielal svetlo 
s vlnovými d ĺžkami, ktoré testovaná chemická látka absorbuje 
(absorpčné spektrum) a aby dávka svetla (dosiahnute ľná 
v priebehu primeraného expozi čného času) bola dostato čná na 
detekciu známych fotocytotoxických chemických látok. Ďalej, 
použité vlnové d ĺžky a dávky by nemali ma ť neprimerane zhubné 
účinky na testovací systém, napr. emisiou tepla (infra červená oblas ť). 
Za optimálny zdroj umelého svetla sa pokladá simulácia slne čného 
svetla pomocou solárnych simulátorov. Distribúcia ožarovacieho 
výkonu filtrovaného solárneho simulátora by mala by ť blízka 
vonkajšiemu dennému svetlu uvedenému v (14). V solárnych simu ­
látoroch sa používajú jednak xenónové výbojky, a jednak vysoko ­
tlakové ortu ťovo-kovové halogénové výbojky (15). Druhá z nich má 
tú výhodu, že vyžaruje menej tepla a je lacnejšia, ale slne čné svetlo 
napodobňuje menej dokonale než xenónová výbojka. Pretože všetky 
solárne simulátory vyžarujú významné množstvá UVB žiarenia, mali 
by byť vhodným spôsobom filtrované s cie ľom stlmiť vysoko cyto ­
toxické vlnové d ĺžky UVB. Vzh ľadom na to, že bunkové kultúry 
plastových materiálov obsahujú UV stabilizátory, spektrum by sa malo mera ť pomocou rovnakého druhu veka 96-jamkovej došti čky, 
ako sa bude používa ť pri skúške. Bez oh ľadu na opatrenia prijaté na 
stlmenie častí spektra pomocou filtrovania alebo filtra čnými účin­
kami zariadenia, ktorým sa nemožno vyhnú ť, spektrum zaznamenané 
pod týmito filtrami by sa nemalo líši ť od normalizovaného denného 
svetla vo vonkajšom prostredí (14). Príklad distribúcie spektrálneho 
vyžarovania filtrovaného solárneho simulátora použitého vo vali ­
dačnej štúdii testu fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  sa uvádza 
v literatúre (8), (16). Pozri aj prílohu 2 obrázok 1.  
1.4.1.5.2. D o z i m e t r i a 
Intenzita svetla (intenzita ožarovania) by sa mala pravidelne kontro ­
lovať pred každým testom fototoxicity s použitím vhodného široko ­
pásmového UV-mera ča. Táto intenzita by sa mala mera ť cez rovnaký 
druh veka 96-jamkovej došti čky, aký sa použije po čas skúšky. Tento 
UV-mera č musí byť kalibrovaný na zdroj. Funk čnosť UV-mera ča by 
sa mala kontrolova ť a na tento ú čel sa odporú ča použiť druhý, 
referenčný UV-mera č rovnakého druhu s totožnou kalibráciou. 
V ideálnom prípade by sa mal v dlhších časových odstupoch použi ť 
spektrorádiometer na zmeranie spektrálneho vyžarovania filtrovaného 
svetelného zdroja a na kontrolu kalibrácie širokopásmového UV- merača. 
Dávka 5 J/cm
 2 (meraná v pásme UVA) bola stanovená ako necyto ­
toxická pre bunky Balb/c 3T3 a ako dostato čne silná na excitáciu 
chemických látok tak, aby vyvolávali fototoxické reakcie (6), (17), napr. na dosiahnutie 5 J/cm
 2 počas 50 minút bolo vyžarovanie upra ­
vené na hodnotu 1,7 mW/cm  2 . Pozri prílohu 2 obrázok 2. Ak sa 
používa iná bunková línia alebo odlišný svetelný zdroj, je možné, že dávka vyžarovania sa bude musie ť kalibrova ť tak, aby sa mohol 
zvoliť režim dávkovania, ktorý nebude ma ť zhubný ú činok na 
bunky, ale bude dostato čný na excitovanie štandardných fototoxínov. 
Čas svetelnej expozície sa vypo číta týmto spôsobom:
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
t ðminÞ ¼ dávka ožiarenia ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
ožiarenie ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2.  Testovacie podmienky  
1.4.2.1.  Koncentrácie testovanej látky  
Rozmedzia koncentrácií chemickej látky testovanej so svetlom (+Irr) 
a bez svetla (–Irr) by mali by ť vhodne stanovené v rámci experi ­
mentov na zistenie rozsahu dávky. Môže by ť užitočné posúdi ť 
rozpustnos ť na začiatku a po 60 minútach (alebo pod ľa toho, aký 
čas úpravy sa používa), ke ďže rozpustnos ť sa môže meni ť v čase 
alebo v priebehu expozície. Hodnota pH bunkových kultúr s pridanou testovanou chemickou látkou mala by ť v rozsahu 6,5 – 
7,8, aby bola vylú čená toxicita vyvolaná nevhodnými kultiva čnými 
podmienkami alebo vysoko kyslými či zásaditými chemickými 
látkami. 
Najvyššia koncentrácia testovanej látky by sa mala by ť zlučiteľná 
s fyziologickými testovacími podmienkami, napr. mal by by ť vylú­ 
čený osmotický stres a stres z pH. V závislosti od testovanej 
chemickej látky môže by ť potrebné vzia ť do úvahy ďalšie fyzi ­
kálno-chemické vlastnosti ako sú faktory obmedzujúce najvyššiu testovaciu koncentráciu. V prípade relatívne nerozpustných látok, 
ktoré nie sú toxické pri koncentráciách až do bodu nasýtenia, mala 
by sa testova ť najvyššia dosiahnute ľná koncentrácia. Vo všeobec ­
nosti by sa malo vylú čiť zrážanie testovanej chemickej látky pri 
akýchkoľvek testovacích koncentráciách. Maximálna koncentrácia 
testovanej látky by nemala presiahnu ť 1 000 μg/ml; osmolarita by 
nemala presiahnu ť 10 mmol. Mali by sa použi ť geometrické rady 
riedenia 8 koncentrácií testovanej látky s konštantným faktorom riedenia (pozri časť 2.1 druhý odsek). 
Ak existujú údaje (z experimentu na zistenie rozsahu), že testovaná 
chemická látka nie je cytotoxická až do limitnej koncentrácie pri pokuse v tme (–Irr), ale je vysoko cytotoxická pri ožiarení (+Irr), rozsahy koncentrácií, ktoré sa musia zvoli ť
 na pokus (+Irr), sa môžu 
líšiť od rozsahov zvolených pre (–Irr) pokus, aby sa splnila požia ­
davka dostato čnej kvality údajov.  
1.4.2.2.  Kontroly  
1.4.2.2.1. R a d i a č n á c i t l i v o s ť b u n i e k , z i s t e n i e d o t e r a j š í c h 
ú d a j o v : 
Citlivosť buniek na svetelný zdroj by sa mala pravidelne kontrolova ť 
(približne každý piata pasáž) pomocou posúdenia ich životaschop ­
nosti po expozícii narastajúcim dávkam ožiarenia. Pri tomto posu ­
dzovaní by sa malo použi ť niekoľko dávok ožiarenia vrátane úrovní 
podstatne vyšších, ako sú úrovne používané pri teste fototoxicity 3T3 NRU. Tieto dávky sú naj ľahšie stanovite ľné meraniami UV častí 
svetelného zdroja. Bunky sa nasadia pri hustote používanej pri 
teste fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  a ožarujú sa nasledujúci de ň. 
Životaschopnos ť bunky sa potom stanoví o de ň neskôr s použitím 
absorpcie neutrálnej červene. Malo by preukáza ť, že výsledná 
najvyššia necytotoxická dávka (napr. v rámci valida čnej štúdie: 5 
J/cm
 2 [UVA]) bola dostato čná na správnu klasifikáciu referen čných 
chemických látok (tabu ľka 1).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. R a d i a č n á c i t l i v o s ť , k o n t r o l a p r e b i e h a j ú c e h o 
t e s t u : 
Test spĺňa kritériá kvality, ke ď ožiarené negatívne/rozpúš ťadlové 
kontrolné vzorky vykazujú životaschopnos ť vyššiu ako 80 % 
v porovnaní s experimentom v tme s neožiarenou negatívnou/ ­
rozpúšťadlovou kontrolnou vzorkou.  
1.4.2.2.3. Ž i v o t a s c h o p n o s ť k o n t r o l n ý c h v z o r i e k r o z p ú š ť ­
a d l a : 
Absolútna optická hustota (OD  540 NRU  ) neutrálnej červene extraho ­
vanej z kontrolných vzoriek rozpúš ťadla udáva, či 1 × 10  4 buniek 
nasadených do každej jamky vyrástlo v bežnom čase zdvojnásobenia 
počas dvoch dní skúšky. Test sp ĺňa kritériá prijate ľnosti, ak je 
stredná hodnota OD  540 NRU  pre neexponované vzorky ≥ 0,4 (t. j. 
približne dvadsa ťnásobok absorbancie rozpúš ťadlového pozadia).  
1.4.2.2.4. P o z i t í v n a k o n t r o l a : 
Známa fototoxická chemická látka sa testuje súbežne s každým 
testom fototoxicity 3T3 NRU  in vitro.  Odporúča sa chlórpromazín 
(CPZ). Pre CPZ testovaný pod ľa štandardného protokolu pri teste 
fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  sa definovali tieto kritériá prijate ľnosti 
testu: pre CPZ ožiarený (+Irr): IC  50 = 0,1 až 2,0 μg g/ml, pre CPZ 
neožiarený (–Irr): IC  50 = 7,0 až 90,0 μg/ml. Koeficient svetelnej 
dráždivosti (PIF) by mal by ť > 6. Mala by sa monitorova ť predchá­
dzajúca funk čnosť tejto pozitívnej kontroly. 
Namiesto chlórpromazínu sa môžu používa ť ako súbežné pozitívne 
porovnávacie vzorky aj iné fototoxické chemické látky, vhodné pre chemickú triedu alebo vlastnosti rozpustnosti vyhodnocovanej 
chemickej látky.
 
1.4.3.  Postup testovania (6), (7), (8), (16), (17):  
1.4.3.1.  Prvý de ň: 
Do obvodových jamiek 96-jamkovej mikrotitra čnej doštičky tkanivo ­
vých kultúr sa odpipetuje 100 μl kultivačného média (= slepé vzor ­
ky). Do zostávajúcich jamiek sa nadávkuje 100 μl bunkovej 
suspenzie s koncentráciou 1 × 10  5 buniek/ml do kultiva čného 
média (= 1 × 10  4 buniek/jamka). Pre každú sériu koncentrácií jedno ­
tlivej testovanej látky a pre rozpúš ťadlové a pozitívne porovnávacie 
vzorky by sa mali pripravi ť dve došti čky. 
Bunky sa inkubujú 24 hodín (pozri časť 1.4.1.2), až kým nevytvoria 
polosplývajúcu monomolekulovú vrstvu. Táto doba inkubácie umož ­ 
ňuje regeneráciu buniek, ich pri ľnavosť a exponenciálny rast.  
1.4.3.2.  Druhý de ň: 
Po inkubácii sa kultiva čné médium z buniek dekantuje a opatrne 
premyje so 150 μl pufrovaného roztoku použitého na inkubáciu. 
Pridá sa 100 μl pufira obsahujúceho vhodnú koncentráciu testovanej 
chemickej látky alebo rozpúš ťadla (kontrola rozpúš ťadlom). Aplikuje 
sa 8 rôznych koncentrácií testovanej chemickej látky. Bunky sa 
testovanou chemickou látkou inkubujú v tme po čas 60 minút (pozri 
časť 1.4.1.2 a druhý odsek v časti 1.4.1.4). 
Vyberie sa jedna z dvoch došti čiek pripravených na každú sériu 
koncentrácií testovanej látky a porovnávacích vzoriek, spravidla 
náhodne, na stanovenie cytotoxicity (–Irr) (t. j. kontrolná došti čka), 
a jedna (expozi čná doštička) na stanovenie fotocytotoxicity (+Irr).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Na vykonanie expozície +Irr sa bunky pri izbovej teplote po čas 
50 minút ožarujú cez veko 96-jamkovej došti čky najvyššou dávkou 
žiarenia, ktorá je necytotoxická (pozri taktiež prílohu 2). Neožiarené doštičky (–Irr) sa uchovávajú pri izbovej teplote v tmavej škatuli 
50 minút (= doba expozície ú činkom svetla). 
Testovací roztok sa dekantuje a dôkladne dvakrát premyje so 150 ul 
pufrovaného roztoku použitého na inkubáciu, ale neobsahujúceho testovaný materiál. Pufer sa nahradí kultiva čným médiom 
a inkubuje sa (pozri časť 1.4.1.2) cez noc (18 – 22 hodín).
 
1.4.3.3  Tretí de ň: 
1.4.3.3.1. V y h o d n o t e n i e m i k r o s k o p o m 
Bunky by sa mali preskúma ť pomocou mikroskopu s fázovým 
kontrastom vzh ľadom na ich rast, morfológiu a integritu monomole ­
kulovej vrstvy. Zmeny v morfológii bunky a ú činky na rast bunky 
by sa mali zaznamena ť. 
1.4.3.3.2. T e s t a b s o r p c i e n e u t r á l n e j č e r v e n e 
Bunky sa premyjú so 150 μl predhriateho pufira. Premývací roztok 
sa odstráni jemným poklepávaním. Pridá sa 100 μl neutrálnej 
červene s koncentráciou 50 μg/ml neutrálnej červene (NR)  (N8, 
N8, 3-trimetyl-2, 8-fenazíndiamín monohydrochlorid, EINECS číslo 
209-035-8; CAS číslo 553-24-2; C.I. 50040) do média bez séra (16) 
a 3 hodiny sa inkubuje spôsobom opísaným v časti 1.4.1.2. Po 
inkubácii sa médium NR odstráni a bunky sa premyjú so 150 μl 
pufra. Ten sa dekantuje a prebyto čný pufer sa odstráni odsatím alebo 
odstredením. 
Pridá sa presne 150 μl desorbčného roztoku NR ( čerstvo pripravený 
v zložení 49 dielov vody + 50 dielov etanolu + 1 diel kyseliny 
octovej). 
Mikrotitra čná doštička sa jemne trepe na trepa čke mikrotitra čných 
doštičiek počas 10 minút, až do vy extrahovaní a NR z buniek 
a vytvorenia homogénneho roztoku. 
Spektrofotometrom sa zmeria optická hustota extraktu NR pri 
540 nm, pri čom sa na porovnanie použije slepá skúška. Údaje sa 
uložia vo vhodnom formáte elektronického súboru na ú čely 
následnej analýzy.  
2. ÚDAJE  
2.1. KVALITA A KVANTITA ÚDAJOV 
Údaje z testovania by mali umožni ť zmysluplnú analýzu závislosti 
odozvy na koncentrácii získanej pri ožarovaní a bez neho, a pokia ľ 
je to možné, koncentrácii testovanej chemickej látky, pri ktorej je životaschopnos ť buniek znížená na 50 % (IC
 50 ). Ak sa zistí cytoto ­
xicita, mal by sa rozsah koncentrácií a interval medzi jednotlivými 
koncentráciami nastavi ť tak, aby to umožnilo zladi ť krivku 
s experimentálnymi údajmi. 
Pre jasne pozitívne ako aj pre jasne negatívne výsledky (pozri časť 
2.3 prvý odsek) môže posta čovať primárny experiment podporený 
jedným alebo viacerými predbežnými experimentmi na stanovenie 
rozsahu dávok.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Nepreukazné, hrani čné alebo nejasné výsledky by sa mali objasni ť 
ďalším testovaním (pozri aj časť 2.4 druhý odsek). V takýchto prípa ­
doch by sa mala zváži ť modifikácia experimentálnych podmienok. 
Medzi experimentálne podmienky, ktoré by sa možno mohli modi ­
fikovať, patrí rozsah či odstup koncentrácií, čas predinkubácie a čas 
expozície ožiareniu. Pre chemické látky nestabilné vo vode môže by ť 
vhodný kratší expozi čný čas. 
2.2. VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Na umožnenie vyhodnotenia údajov sa môže vypo čítať koeficient 
svetelnej dráždivosti (PIF) alebo stredný svetelný ú činok (MPE). 
Pri výpo čte parametrov fotocytotoxicity (pozri ďalej) sa súbor 
diskrétnych hodnôt závislost odozvy na koncentrácii musí aproxi ­
movať s použitím vhodnej spojitej krivky koncentra čnej závislosti 
odozvy (vhodným modelom). Zladenie krivky s údajmi sa zvy čajne 
vykonáva metódou nelineárnej regresie (18). Na posúdenie vplyvu variability údajov na zladenú krivku sa odporú ča samozavádzací 
postup  (bootstrap).  
Koeficient svetelnej dráždivosti (PIF) sa vypo číta pomocou tohto 
vzorca:
 
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Ak IC  50 za prítomnosti alebo za neprítomnosti svetla nemožno vypo ­ 
čítať, nemožno pre testovaný materiál stanovi ť PIF. Stredný svetelný 
účinok (MPE) je založený na porovnaní úplných kriviek závislosti 
odozvy na koncentrácii (19). Je definovaný ako vážený priemer 
celého reprezentatívneho súboru hodnôt svetelného ú činku.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Svetelný ú činok PE  c pri každej koncentrácii C sa definuje ako sú čin 
účinku odozvy RE  c a účinku koncentrácie DE  c , t. j. PE  c = RE  c × 
DE c . Účinok odozvy RE  c predstavuje rozdiel medzi odozvami pozo ­
rovanými za prítomnosti a za neprítomnosti svetla, t. j. RE  c = R  c 
(–Irr) – R  c (+Irr). Účinok dávky je daný vz ťahom  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
pričom C* predstavuje koncentráciu ekvivalencie, t. j. koncentráciu, 
pri ktorej je odozva na +Irr rovnaká ako odozva na –Irr pri koncen ­
trácii C. Ak C* nemožno stanovi ť, pretože hodnoty odozvy krivky 
+Irr sú sústavne vyššie alebo nižšie ako hodnoty R  c (–Irr), tak 
hodnota ú činku dávky sa stanoví na hodnotu 1. Váhové faktory wi 
sú dané najvyššou hodnotou odozvy, t. j. w  i = MAX {R  i (+Irr), R  i 
(–Irr) }. Súradnicová sie ť pre koncentrácie C; sa zvolí tak, aby 
v koncentra čnom intervale definovanom hodnotami koncentrácií 
použitými v rámci experimentu bol rovnaký po čet bodov. Výpo čet 
MPE je obmedzený na maximálnu hodnotu koncentrácie, pri ktorej aspoň jedna z dvoch kriviek stále vykazuje hodnotu odozvy 
najmenej 10 %. Ak je táto maximálna koncentrácia vyššia ako 
najvyššia koncentrácia použitá v rámci +Irr experimentu, zvyšná časť + Irr krivky sa nastaví na hodnotu odozvy „0“. V závislosti 
od toho, či je, alebo nie je MPE hodnota vyššia ako riadne zvolená 
hraničná hodnota (MPE
 c 0,15), chemická látka je alebo nie je klasi ­
fikovaná ako fototoxická.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Program na výpo čet PIF a MPE je dostupný v (20).  
2.3. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Na základe valida čnej štúdie (8) sa pri testovanej látke s PIF < 2 
alebo MPE < 0,1 predikuje: „žiadna fototoxicita“. PIF > 2 a < 5 
alebo MPE > 0,1 a < 0,15 predikuje: „pravdepodobná fototoxicita“ a PIF > 5 alebo MPE > 0,15 predikuje: „fototoxicita“. 
Pre každé laboratórium zavádzajúce po prvýkrát túto skúšku by sa 
mali referen čné materiály uvedené v tabu ľke 1 testova ť pred testo ­
vaním testovaných chemických látok na posúdenie fototoxicity. Hodnoty PIF alebo MPE by sa mali približova ť hodnotám uvedeným 
v tabuľke 1.
 
Tabuľka 1  
Chemický názov Číslo EINECS Číslo CAS PIF MPE Najvyššia 
úroveň 
absorpcie Rozpúšťadlo (  1 ) 
aminodaron 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] >3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(rameno) etanol 
chloropromazín 
HCL 200-701-3 [69-09-0] >14,4 0,33-0,63 309 nm etanol 
norfloxacín 274-614-4 [70458-96-7] >71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitril 
antracén 204-371-1 [120-12-7] >18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitril protoporfyrin 
IX, dvojsodný 256-815-9 [50865-01-5] >45,3 0,54-0,74 402 nm etanol 
L-histidín [7006-35-1] bez PIF 0,05-0,10 211 nm voda 
hexacholorofén 200-733-8 [70-30-4] 1,1–1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(rameno) etanol 
laurylsulfát 
sodný 205-788-1 [151-21-3] 1,0–1,9 0,00-0,05 bez 
absorpcie voda
 
( 1 ) Rozpúš ťadlo použité na meranie absorpcie.  
2.4. INTERPRETÁCIA ÚDAJOV 
Ak sa fototoxické ú činky pozorujú iba pri najvyššej testovacej 
koncentrácii, (najmä v prípade testovaných chemických látok 
rozpustných vo vode) na posúdenie nebezpe čnosti môžu by ť 
potrebné ďalšie odhady. Tie sa môžu týka ť údajov o absorpcii 
kožou a akumulácii chemikálie v koži a/alebo údajov z iných testov, 
napr. z testovania chemickej látky na zvieracej alebo ľudskej koži  in 
vitro,  alebo na modeloch kože.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Ak sa nepreukáže toxicita (+Irr a –Irr) a ak sú koncentrácie, ktoré sa 
mohli testova ť, obmedzené malo rozpustnos ťou, tak sa môže 
spochybni ť kompatibilita testovanej látky s testom a malo by sa 
uvažovať o potvrdzujúcom testovaní s použitím napr. iného modelu.  
3. SPRÁVY  
SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť aspoň tieto informácie: 
Testovaná látka: — identifika čné údaje, bežné generické názvy a čísla IUPAC 
a CAS, ak sú známe, 
— fyzikálna povaha a čistota, 
— fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie, 
— absorp čné spektrum UV/vis, 
— stabilita a fotostabilita, ak sú známe. 
Rozpúšťadlo: 
— zdôvodnenie výberu rozpúš ťadla, 
— rozpustnos ť testovanej chemickej látky v rozpúš ťadle, 
— percentuálny podiel rozpúš ťadla prítomného v aplika čnom 
médiu. 
Bunky: 
— typ a zdroj buniek, 
— neprítomnos ť mykoplazmy, 
— počet bukových pasáží, ak je známy, 
— radiačná citlivos ť buniek stanovená ožarovacím zariadením 
použitým pri teste fototoxicity 3T3 NRU  in vitro.  
Testovacie podmienky (1);  inkubáciapred aplikáciou a po nej:  
— typ a zloženie kultiva čného média, 
— inkuba čné podmienky (koncentrácia CO
 2 ; teplota; vlhkos ť), 
— trvanie inkubácie (predinkuba čné kroky; poinkuba čné kroky). 
Testovacie podmienky (2);  aplikácia chemickej látky:  
— zdôvodnenie výberu koncentrácií testovaných chemických látok 
používaných pri ožarovaní a bez neho, 
— v prípade obmedzenej rozpustnosti testovanej chemickej látky 
a pri neprítomnosti cytotoxicity: zdôvodnenie najvyššej testo ­
vanej koncentrácie, 
— typ a zloženie aplika čného média (pufrovaný so ľný roztok), 
— trvanie aplikácie chemickej látky. 
Testovacie podmienky (3);  ožarovanie:  
— zdôvodnenie výberu použitého svetelného zdroja,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— výrobca a typ svetelného zdroja a rádiometra, 
— spektrálna charakteristika žiarenia svetelného zdroja, — transmisné a absorp čné charakteristiky použitého filtra (použitých 
filtrov), 
— charakteristiky rádiometra a podrobnosti o jeho kalibrácii, 
— vzdialenos ť svetelného zdroja od testovacieho systému, 
— intenzita UVA ožiarenia v tejto vzdialenosti, vyjadrená v mW/cm
 2 , 
— trvanie expozície UV/vis svetlu, 
— dávka UVA (ožiarenie x čas) vyjadrená v J/cm  2 , 
— teplota bunkových kultúr po čas ožarovania a bunkových kultúr 
súbežne uchovávaných v tme. 
Testovacie podmienky (4);  test životaschopnosti príjmom neutrálnej 
červene:  
— zloženie pôsobiaceho média neutrálnej červene, 
— trvanie inkubácie neutrálnej červene, 
— inkuba čné podmienky (koncentrácia CO  2 ; teplota; vlhkos ť), 
— podmienky extrakcie neutrálnej červene (extrak čné činidlo; trva ­
nie), 
— vlnová d ĺžka použitá na spektrofotometrické od čítanie optickej 
hustoty neutrálnej červene, 
— druhá vlnová d ĺžka (referen čná), ak sa použije, 
— obsah slepého roztoku pre spektrofotometriu, ak sa použije. 
Výsledky: — životaschopnos ť bunky získaná pri každej koncentrácii testovanej 
chemickej látky, vyjadrená v percentách strednej životaschop ­
nosti súbežných kontrolných vzoriek rozpúš ťadla, 
— krivky koncentra čnej závislosti odozvy (koncentrácia testovanej 
chemickej látky proti relatívnej životaschopnosti bunky) získané pri súbežných +Irr a –Irr pokusoch, 
— analýza kriviek koncentra čnej závislosti odozvy: ak je to možné, 
tak približný výpo čet hodnôt IC
 50 (+Irr) a IC  50 (–Irr), 
— porovnanie obidvoch kriviek koncentra čnej závislosti na odozvu 
získaných s ožarovaním a bez neho, a to bu ď vypočítaním koefi ­
cientu svetelnej dráždivosti (PIF), alebo vypo čítaním stredného 
svetelného ú činku (MPE), 
— kritériá prijate ľnosti testu; súbežná kontrola rozpúš ťadlom, 
— absolútna životaschopnos ť (optická hustota extraktu neutrálnej 
červene) ožiarených a neožiarených buniek, 
— doterajšie údaje pre negatívnu kontrolnú vzorku a kontrolnú 
vzorku rozpúš ťadla; stredné hodnoty a smerodajné odchýlky, 
— kritériá prijate ľnosti testu; súbežná pozitívna kontrola,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+Irr) a IC  50 (–Irr) a PIF/MPE pozitívnej kontrolnej 
chemickej látky, 
— doterajšie údaje pozitívnej kontrolnej chemickej látky: IIC  50 
(+Irr) a IC  50 (–Irr) a PIF/MPE; stredné hodnoty a smerodajné 
odchýlky. 
Rozbor výsledkov Závery
 
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95 – 102. 
(2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p XI – XXXV. 
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314 – 348. 
(4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p 79 – 110. 
(5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No. 7 „Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris. 
(6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and 
Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793 – 796. 
(7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3. November 1997, ATLA, 26, 7 – 8. 
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., 
Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/ ­
COLIPA  In vitro  phototoxicity validation study: results of 
phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. 
Toxic. In Vitro 12, 305 – 327. 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, 
Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon 
request from the Secretariat. 
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119 – 124. 
(11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control 
for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225 – 237.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515 – 530. 
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825 – 1829. 
(14) ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability. 
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, 
Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275 
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 
7 September, 1998. 18 pgs. 
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter 
chemicals from Annex VII of the European Union  Directive 
76/768/EEC,  in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. 
ATLA 26, 679 – 708. 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. 
Systems 3, 127 – 138. 
(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 
25, 445 – 462. 
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34 377_ 
2349687_1_1_1_1,00.htm 1
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
Príloha 1  
Úloha testu fototoxicity 3T3 NRU v sekven čnom prístupe na testovanie fototoxicity 
chemických látok
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
Príloha 2  
Obrázok 1  
Spektrálna distribúcia výkonu solárneho simulátora s filtrom
  
(pozri časť 1.4.1.5 druhý odsek) 
Na obrázku 1 je uvedený príklad prijate ľnej spektrálnej distribúcie intenzity žiarenia solárneho 
simulátora s filtrom. Je zo zdroja dopovaného kovovým halogenidom, použitého pri valida čnej 
štúdii skúšky fototoxicity 3T3 NRU (6), (8), (17). Je znázornený ú činok dvoch rôznych filtrov 
a účinok ďalšieho filtrovania veka 96-jamkovej došti čky na bunkové kultúry. Filter H2 sa použil iba 
pri testovacích systémoch tolerantných k vyššej dávke UVB (test na modeli kože a foto-hemoly ­
tický test červených krviniek). Pri teste 3T3 NRU sa použil filter H1. Na obrázku je znázornené, že 
dodatočný filtrovací ú činok veka došti čky je pozorovaný predovšetkým v oblasti UVB, pri čom 
vekom preniká ešte stále dostato čné množstvo UVB zo spektra intenzity žiarenia na excitovanie 
chemických látok absorbujúcich v oblasti UVB, ako je amiodarón (pozri tabu ľku 1).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Obrázok 2  
Citlivosť buniek Balb/c 3T3 na ožiarenie (meraná v oblasti UVA)  
Životaschopnos ť buniek ( % absorpcie neutrálnej červene v porovnávacích vzorkách bez svetla)
  
(pozri časť 1.4.1.5.2 druhý odsek, 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2) 
Citlivosť buniek Balb/c 3T3 na ožiarenie solárnym simulátorom použitým pri valida čnom pokuse 
testu fototoxicity 3T3 NRU, nameraná v oblasti UVA. Na obrázku sú znázornené výsledky získané v rámci predvalida čnej štúdie v siedmich rôznych laboratóriách (1). Zatia ľ čo dve krivky ozna čené 
neplnými symbolmi boli získané so staršími bunkami (s vysokým po čtom pasáží), ktoré sa museli 
nahradiť novými bunkovými materiálmi, krivky s plnými symbolmi znázor ňujú bunky s prijate ľnou 
toleranciou k ožiareniu. 
Z týchto údajov bola odvodená najvyššia necytotoxická dávka ožiarenia 5 J/cm
 2 (vertikálna preru ­ 
šovaná čiara). Horizontálna prerušovaná čiara predstavuje popritom maximálny prijate ľný účinok 
ožiarenia uvedený v časti 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B. 42.  SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN  
ÚVOD 
1. Usmernenia Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) na 
testovanie chemikálií a testovacie metódy EÚ vychádzajúce z týchto 
usmernení sa pravidelne revidujú vzh ľadom na vedecký pokrok, zmeny 
regulačných potrieb a dobré životné podmienky zvierat. Pôvodná testo ­
vacia metóda (TM) na ur čenie senzibilizácie kože u myší, tzv. lokálna 
skúška lymfatických uzlín (LLNA; usmernenie OECD na vykonávanie 
testov 429; kapitola B.42 tejto prílohy) už bola prijatá (1). Podrobnosti validácie LLNA a revízia prác v tejto oblasti boli uverejnené v (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Aktualizovaná LLNA je založená na hodno ­
tení skúseností a vedeckých údajov (12). Táto testovacia metóda je druhou 
testovacou metódou vytvorenou na posúdenie potenciálu chemikálií (látok a zmesí) spôsobi ť senzibilizáciu kože u zvierat. Prvá testovacia metóda (t. 
j. usmernenie OECD na vykonávanie testov 406; kapitola B.6 tejto 
prílohy) využíva testy s mor čatami, a to maximaliza čný test mor čiat 
a Buehlerov test (13). LLNA poskytuje výhody v porovnaní s metódou B.6 a usmernením OECD na vykonávanie testov 406 (13), pokia ľ ide 
o dobré životné podmienky zvierat. Táto aktualizovaná testovacia metóda 
LLNA zah ŕňa súbor noriem výkonnosti (PS) (dodatok 1), ktoré možno 
použiť na hodnotenie stavu validácie nových a/alebo upravených testova ­
cích metód, ktoré sú z funk čného a mechanického h ľadiska podobné 
LLNA v súlade so zásadami usmer ňujúceho dokumentu OECD č. 34 (14). 
2. LLNA skúma induk čnú fázu senzibilizácie kože a poskytuje kvantitatívne 
údaje vhodné na hodnotenie odozvy na dávku. Treba poznamena ť, že 
ľahké/mierne senzibilizátory, ktoré sa odporú čajú ako vhodné chemikálie 
na pozitívnu kontrolu v testovacích metódach na mor čatách (t. j. kapitola 
B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov č. 406) (13), sú tiež vhodné 
na použitie pri LLNA (6) (8) (15). Redukovaná lokálna skúška lymfatic ­
kých uzlín (rLLNA), pri ktorej by sa mohlo využíva ť až o 40 % menej 
zvierat, je v tejto testovacej metóde tiež opísaná ako jedna z možností (16) (17) (18). Metódu rLLNA možno použi ť v prípade, ak vznikla regula čná 
potreba potvrdi ť negatívny predpoklad potenciálu senzibilizácie kože, za 
predpokladu, že existuje súlad so všetkými ostatnými špecifikáciami proto ­
kolov LLNA, ako je to opísané v tejto testovacej metóde. Predpoklad negatívneho výsledku by sa mal urobi ť na základe všetkých dostupných 
informácií, ako je opísané v odseku 4. Pred použitím metódy rLLNA je 
potrebné poskytnú ť jasné a vedecké odôvodnenia použitia tejto metódy. 
Ak sa pri rLLNA napriek o čakávaniam dosiahne pozitívny alebo nejasný 
výsledok, možno bude potrebné vykona ť ďalšie testovanie, aby bola 
možná interpretácia alebo objasnenie zistenia. Skúška rLLNA by sa 
nemala využíva ť na identifikáciu nebezpe č
nosti testovaných látok, ktoré 
spôsobujú senzibilizáciu kože v prípade, ke ď sú potrebné informácie 
o odozve na dávku, ako napríklad ďalšia kategorizácia pre 
nariadenie (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok 
a zmesí a globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania 
chemických látok Organizácie Spojených národov (OSN).  
VYMEDZENIE POJMOV 
3. Použité definície sú uvedené v dodatku 2.  
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
4. LLNA poskytuje alternatívnu metódu na identifikáciu možných chemikálií 
spôsobujúcich senzibilizáciu kože. Neznamená to nevyhnutne, že vo všet ­
kých prípadoch sa má použi ť LLNA namiesto testu s mor čatami (t. j. 
metóda B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13), ale 
skôr to, že táto skúška je rovnako hodnotná a môže sa použi ť ako alter ­
natíva, v ktorej pozitívne a negatívne výsledky vo všeobecnosti nevyža ­
dujú ďalšie potvrdenie. Testovacie laboratórium by malo posúdi ť všetky 
dostupné informácie o testovanej látke pred uskuto čnením štúdie. Takéto 
informácie budú obsahova ť identitu a chemickú štruktúru testovanej látky,  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných  in vitro  
alebo  in vivo  testov toxicity s testovanou látkou a toxikologické údaje 
o štruktúrne príbuzných chemikáliách. Tieto informácie treba vzia ť do 
úvahy pri stanovovaní, či LLNA je pre danú látku vhodná (vzh ľadom 
na nezlu čiteľnosť obmedzených druhov chemikálií s LLNA – pozri 
odsek 5), a ako pomoc pri výbere dávok. 
5. LLNA je metóda  in vivo , a to znamená, že pri posúdení aktivity alergickej 
kontaktnej senzibilizácie sa nevylu čuje používanie zvierat. Môže však 
umožniť zníženie po čtu zvierat potrebných na tento ú čel. Okrem toho 
LLNA ponúka zna čné zjemnenie spôsobu, akým sa zvieratá používajú 
na testy alergickej kontaktnej senzibilizácie (znižuje boles ť a utrpenie zvie ­
rat). LLNA sa zakladá na posudzovaní imunologických reakcií vyvolaných 
chemikáliami po čas indukčnej fázy senzibilizácie. Na rozdiel od testov 
s morčatami (t. j. metóda B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 
406) (13) LLNA nevyžaduje, aby sa vyvolali reakcie dermálnej hypersen ­
zitivity. Okrem toho LLNA nevyžaduje použitie adjuvansu ako v prípade 
maximaliza čného testu mor čiat (13). Tým LLNA znižuje boles ť a utrpenie 
zvierat. Napriek výhodám, ktoré LLNA má v porovnaní s metódou B.6 
a usmernením OECD na vykonávanie testov 406, je potrebné uzna ť, že 
existujú ur čité obmedzenia, v prípade ktorých by sa mohlo vyžadova ť 
použitie metódy B.6 alebo usmernenia OECD na vykonávanie testov 406 (13) [napr. falošné negatívne zistenia v LLNA s ur čitými kovmi, 
falošné pozitívne zistenia s ur čitými kožnými dráždivými látkami (ako 
napríklad niektoré druhy povrchovo aktívnych chemikálií) (19) (20) alebo rozpustnos ť testovanej látky]. Okrem toho chemické skupiny alebo 
látky, ktoré obsahujú potenciálne zmäto čné funkčné skupiny (21), si tiež 
môžu vyžadova ť použitie testov s mor čatami (t. j. B.6; usmernenie OECD 
na vykonávanie testov 406 (13). Ďalej na základe obmedzenej valida čnej 
databázy, ktorá sa skladá predovšetkým z prípravkov na ochranu rastlín, pri LLNA je pravdepodobnejšie, že pri týchto druhoch testovacích látok sa 
dosiahne pozitívny výsledok ako pri teste s mor čatami (22). Pri testovaní 
prípravkov by sa však malo vzia ť
 do úvahy zahrnutie podobných látok so 
známymi výsledkami ako referen čných látok na preukázanie toho, že 
LLNA riadne funguje (pozri odsek 16). Okrem takto identifikovaných 
obmedzení by sa LLNA mala uplat ňovať pri testovaní všetkých látok 
okrem prípadov, ke ď tieto látky majú vlastnosti, ktoré by mohli narúša ť 
presnosť LLNA.  
PRINCÍP TESTU 
6. Základným princípom, na ktorom sa LLNA zakladá, je, že senzibilizátory 
vyvolávajú primárnu proliferáciu lymfocytov v lymfatickej uzline 
v drénovanom mieste aplikácie testovanej látky. Táto proliferácia je 
úmerná dávke a ú činnosti aplikovaného alergénu a poskytuje jednoduchý 
prostriedok na získanie kvantitatívneho merania senzibilizácie. Proliferácia sa meria porovnávaním priemeru proliferácie v každej pokusnej skupine 
s priemerom proliferácie v kontrolnej skupine, ktorej sa podáva 
nosič (VC). Stanoví sa pomer priemernej proliferácie v každej ošetrenej 
skupine a priemernej proliferácie v súbežnej kontrolnej skupine s nosi čom, 
ktorý sa ozna čuje ako stimula čný index (SI), a musí ma ť hodnotu aspo ň tri 
pred ďalším prípadným vyhodnotením testovanej látky ako potenciálneho 
senzibilizátora kože. Uvedené metódy sa zakladajú na používaní rádioak ­
tívneho zna čenia in vivo  na meranie proliferácie zvýšeného po čtu buniek 
v drénovaných ušných lymfatických uzlinách. Môžu sa však použi ť iné 
koncové body na posúdenie po čtu proliferujúcich buniek za predpokladu, 
že budú úplne splnené požiadavky na normy výkonnosti (dodatok 1).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
OPIS SKÚŠKY  
Výber druhov zvierat  
7. Vybraným druhom pre tento test je myš. Použijú sa mladé dospelé negra ­
vidné samice myši, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá, kmeňa CBA/Ca alebo 
CBA/J. Na za čiatku štúdie by zvieratá mali by ť vo veku 8 – 12 týžd ňov 
a rozdiel medzi hmotnos ťami zvierat má by ť minimálny a nemá by ť vyšší 
ako 20 % priemernej hmotnosti. Alternatívne sa môžu použi ť iné kmene 
a samce, ak sa na základe získaných údajov dá uspokojivo dokáza ť, že 
neexistujú významné odlišnosti špecifické pre kme ň a/alebo pohlavie 
v odozve na LLNA.  
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
8. Myši by sa mali umiestni ť v skupinách (23), pokia ľ sa neposkytne prime ­
rané vedecké odôvodnenie ich umiestnenia jednotlivo. Teplota miestnosti 
pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 ± 3 °C. Aj ke ď relatívna vlhkos ť by 
mala byť aspoň 30 % a pokia ľ možno by nemala prevyšova ť 70 %, okrem 
obdobia po čas čistenia miestnosti, cie ľom je, aby relatívna vlhkos ť dosa­
hovala 50 % – 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 
12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže používa ť bežné 
laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.  
Príprava zvierat  
9. Zvieratá sa vyberú náhodne a sú ozna čené tak, aby sa umožnila jednotlivá 
identifikácia (ale nie formou ušných zna čiek), a držia sa v klietkach aspo ň 
5 dní pred za čiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na labora ­
tórne podmienky. Pred za čatím ošetrenia sa všetky zvieratá vyšetria, aby 
sa zaistilo, že nemajú žiadne vidite ľné kožné poranenia.  
Príprava dávok  
10. Chemikálie v tuhom skupenstve by sa pred podaním dávky do ucha myši 
mali rozpusti ť alebo suspendova ť v rozpúš ťadlách alebo nosi čoch, a ak je 
to vhodné, rozriedi ť. Kvapalné chemikálie možno podáva ť priamo alebo 
pred podaním rozriedi ť. V prípade nerozpustných chemikálií, ako 
napríklad tých, ktoré sa vo všeobecnosti používajú ako zdravotnícke 
pomôcky, by sa pred podaním dávky do ucha myši mala uskuto čniť 
zvýšená extrakcia vo vhodnom rozpúš ťadle, aby sa odhalili všetky extra ­
hovateľné zložky, ktoré sa budú testova ť. Testované látky sa pripravujú 
každý de ň okrem prípadu, ke ď údaje o stabilite preukazujú prijate ľnosť 
uskladnenia.  
Kontrola spo ľahlivosti  
11. Riadne vykonanie skúšky sa dokazuje pomocou pozitívnych kontrolných 
chemikálií, ktoré reagujú primeranou a reprodukovate ľnou citlivos ťou ako 
senzibilizujúce testované látky, pre ktoré je dobre charakterizovaná šírka odozvy. Odporú ča sa zahrnú ť súbežnú pozitívnu kontrolu, pretože to doka ­
zuje kompetenciu laboratória úspešne vykona ť každú skúšku a umož ňuje 
posúdenie vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti 
a porovnate ľnosti. Pozitívnu kontrolu v každej štúdii vyžadujú aj niektoré 
regulačné orgány, a preto by používatelia mali pred vykonaním skúšky 
LLNA konzultova ť s príslušnými orgánmi. Rutinné použitie súbežnej pozi ­
tívnej kontroly sa podporuje aj preto, aby sa predišlo potrebe ďalšieho testo ­
vania na zvieratách s cie ľom splni ť také požiadavky, ktoré by mohli 
vyplynúť z použitia periodickej pozitívnej kontroly (pozri odsek 12). 
Pozitívna kontrola by mala spôsobi ť pozitívnu odozvu na LLNA pri úrovni 
expozície, pri ktorej sa o čakáva nárast stimula čného indexu (SI) > 3 
v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Dávka pozitívnej kontroly
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
by sa mala zvoli ť tak, aby nespôsobila nadmerné podráždenie kože alebo 
systémovú toxicitu a aby indukcia bola reprodukovate ľná, ale nie nadmerná 
(t. j. SI > 20 by bola nadmerná indukcia). Vhodnými pozitívnymi kontrolami sú 25 % 3-fenyl-2-hexylpropenál [ číslo CAS (Chemical Abstracts Service) 
101-86-0] v acetóne, olivový olej (v pomere 4: 1, objemové percentá) a 5 % 
benzotiazol-2-tiol ( číslo CAS 149-30-4) v  N,N -dimetylformamide 
(pozri dodatok 1 tabu ľku 1). Môžu sa vyskytnú ť okolnosti, ke ď sa 
v riadne zdôvodnených prípadoch môžu použi ť iné pozitívne kontroly, 
ktoré spĺňajú uvedené kritériá. 
12. Hoci sa odporú ča súbežná pozitívna kontrolná skupina, môžu sa vyskytnú ť 
situácie, ke ď môže by ť vhodné periodické testovanie (t. j. v intervaloch 
najviac 6 mesiacov) pozitívnych kontrol v prípade tých laboratórií, ktoré vykonávajú LLNA pravidelne (t. j. LLNA vykonávajú v priebehu jedného mesiaca aspo ň raz) a ktoré majú zavedenú historickú databázu pozitívnych 
kontrol, ktorá preukazuje schopnos ť laboratória dosahova ť reprodukova ­
teľné a presné výsledky s pozitívnymi kontrolami. Primeranú odbornos ť 
s použitím LLNA možno úspešne preukáza ť dosiahnutím konzistentných 
pozitívnych výsledkov s pozitívnou kontrolou najmenej v 10 nezávislých 
testoch uskuto čnených v ur čitom primeranom období (t. j. v období 
kratšom ako jeden rok). 
13. Súbežná pozitívna kontrolná skupina by sa mala zahrnú ť vždy, ke ď dôjde 
k procedurálnej zmene v súvislosti s LLNA (napr. k zmene vyškoleného 
personálu, zmene materiálov a/alebo reagentov používaných pri testovacej 
metóde, zmene nástrojov používaných pri testovacej metóde, zmene zdroja testovaných zvierat), a takéto zmeny je potrebné zaznamena ť 
v laboratórnych správach. Je potrebné zváži ť vplyv týchto zmien na prime ­
ranosť predtým zriadenej historickej databázy pri ur čovaní potreby zria ­
denia novej historickej databázy na zaznamenávanie konzistentnosti výsledkov pozitívnej kontroly. 
14. Výskumní pracovníci by si mali uvedomi ť, že rozhodnutie vykona ť štúdiu 
pozitívnych kontrol na periodickom základe namiesto súbežných pozitív ­
nych kontrol môže ma ť následky na primeranos ť a prijate ľnosť negatív­
nych výsledkov štúdie získaných bez súbežnej pozitívnej kontroly po čas 
intervalu medzi každou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly. Ak sa 
dosiahne napríklad falošný negatívny výsledok v periodickej štúdii pozi ­
tívnej kontroly, negatívne výsledky získané s testovanou látkou v intervale medzi poslednou prijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly 
a neprijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly možno spochyb ­
niť. Dôsledky týchto výsledkov treba dôkladne zváži ť pri určovaní toho, či 
vykonať súbežné pozitívne kontroly alebo iba periodické pozitívne 
kontroly. Treba tiež zváži ť použitie menšieho po čtu zvierat v súbežnej 
pozitívnej kontrolnej skupine, ak je to vedecky odôvodnené a ak labora ­
tórium na základe konkrétnych laboratórnych historických údajov 
preukáže, že možno použi ť menší po čet myší (12). 
15. Aj ke ď by sa pozitívna kontrola mala testova ť v nosiči, o ktorom je 
známe, že vyvoláva konzistentnú odozvu (napr. acetón: olivový olej 
v pomere 4: 1, objemové percentá), môžu sa vyskytnú ť určité regula čné 
situácie, v ktorých bude potrebné vykona ť aj testovanie v neštandardnom 
nosiči (klinicky/chemicky zodpovedajúcom roztoku) (24). Ak sa súbežná 
pozitívna kontrola testuje v odlišnom nosi či ako testovaná látka, potom 
treba do testu súbežnej pozitívnej kontroly zahrnú ť samostatnú kontrolnú 
skupinu, ktorej sa podáva nosi č. 
16. V prípadoch hodnotenia testovaných látok, ktoré patria do konkrétnej 
chemickej triedy, alebo rozsahu odoziev môžu by ť užitočné aj referen čné 
látky, aby sa preukázalo, že testovacia metóda na zis ťovanie potenciálu 
týchto druhov testovaných látok spôsobi ť senzibilizáciu kože funguje 
riadne. Vhodné referen čné látky majú ma ť tieto vlastnosti: 
— štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou testovanej látky, ktorá je 
predmetom testovania, 
— známe fyzikálne/chemické vlastnosti, — podporné údaje z LLNA, — podporné údaje z ďalších zvieracích a/alebo ľudských modelov.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
TESTOVACÍ POSTUP  
Počet zvierat a ve ľkosť dávky  
17. Na dávkovú skupinu sa používajú aspo ň štyri zvieratá, aspo ň tri koncen ­
trácie testovanej látky a k tomu súbežná negatívna kontrolná skupina, 
ktorej sa podáva iba nosi č pre testovanú látku, a pozitívna kontrola 
(súbežná alebo nedávna, pod ľa laboratórnych pravidiel s prihliadnutím 
na odseky 11 – 14). Treba zváži ť testovanie viacerých dávok pozitívnej 
kontroly, najmä ak sa testuje na prerušovanej báze. So zvieratami v kontrolných skupinách by sa malo zaobchádza ť rovnakým spôsobom 
ako s pokusnými zvieratami okrem prípadov, ke ď sa ošetrovanie testo ­
vanou látkou nevykonáva. 
18. Výber dávky a nosi ča by mal by ť založený na odporú čaniach uvedených 
v odkazoch (3) a (5). Následné dávky sa zvy čajne vyberajú z vhodných 
sérií koncentrácií, napr. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % 
atď. Výber zo sérií koncentrácií je potrebné primerane vedecky zdôvodni ť. 
Všetky existujúce informácie o toxicite (napr. akútnej toxicite a podráždení kože), ako aj štrukturálne a fyzikálno-chemické informácie o predmetnej testovanej látke (a/alebo štrukturálne príbuzných látkach) by sa mali 
prípadne posúdi ť výberom troch po sebe idúcich koncentrácií tak, aby 
najvyššia koncentrácia maximalizovala expozíciu, pri čom by sa však 
zabránilo systémovej toxicite a/alebo nadmernému lokálnemu podráždeniu kože (3) (25). Ak tieto informácie nie sú k dispozícii, možno bude 
potrebné vykona ť počiatočný predbežný skríningový test (pozri odseky 
21 – 24). 
19. Nosi č by nemal ovplyv ňovať výsledok testu a mal by sa vybra ť na základe 
maximalizácie rozpustnosti s cie ľom získa ť najvyššiu dosiahnute ľnú 
koncentráciu, pri čom vznikne roztok/suspenzia vhodná na aplikáciu testo ­
vanej látky. Odporú čané nosiče sú: acetón: olivový olej (4: 1, objemové 
percentá),  N,N -dimetylformamid, metyletylketón, propylénglykol 
a dimetylsulfoxid (19), ale môžu sa použi ť aj iné nosi če, ak sa uvedie 
uspokojivé vedecké zdôvodnenie. V ur čitých situáciách môže by
ť potrebné 
použiť ako ďalšiu kontrolu klinicky vhodný roztok alebo komer čný prípra­
vok, v ktorom sa testovaná látka predáva. Osobitnú pozornos ť je potrebné 
venovať zabezpečeniu toho, aby sa hydrofilné testované látky zabudovali 
do systému nosi ča, ktorý zvlh čuje pokožku, a rýchlo neunikli, a to za čle­
nením vhodných rozpúš ťadiel (napr. 1 % Pluronic® L92). Preto je 
potrebné vyhýba ť sa použitiu čisto vodných nosi čov. 
20. Spracovanie lymfatických uzlín jednotlivých myší umož ňuje posúdi ť 
variabilitu medzi zvieratami a štatisticky porovna ť rozdiel medzi mera ­
niami testovanej látky a kontrolnej skupiny, ktorej sa podáva nosi č (pozri 
odsek 35). Okrem toho sa po poskytnutí informácií o jednotlivých zvie ­
ratách môže prehodnoti ť možnos ť zníženia po čtu myší v pozitívnej 
kontrolnej skupine (12). Navyše niektoré regula čné orgány požadujú 
zber údajov o jednotlivých zvieratách. Niektoré regula čné orgány však 
môžu považova ť za prijate ľné aj spojené údaje o zvieratách a v takejto 
situácii majú používatelia možnos ť zbierať buď údaje o jednotlivých zvie ­
ratách, alebo spojené údaje o zvieratách.  
Predbežný skríningový test  
21. V prípade, že nie sú k dispozícii informácie na stanovenie najvyššej dávky 
testovanej látky (pozri odsek 18), treba vykona ť predbežný skríningový 
test s cie ľom stanovi ť primeranú úrove ň testovanej dávky na použitie 
v LLNA. Cie ľom predbežného skríningového testu je poskytnú ť usmer­
nenie na výber maximálnej úrovne dávky na použitie v hlavnej štúdii 
LLNA v prípade, že nie sú dostupné informácie o koncentrácii, ktorá spôsobuje systémovú toxicitu (pozri odsek 23) a/alebo nadmerné lokálne podráždenie kože (pozri odsek 24). Maximálna úrove ň testovanej dávky 
by mala obsahova ť 100 % testovanej látky v prípade kvapalín alebo maxi ­
málnu možnú koncentráciu v prípade tuhých látok alebo suspenzií.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Predbežný skríningový test sa vykonáva za podmienok, ktoré sú identické 
s hlavnou štúdiou LLNA, s tým rozdielom, že sa neposudzuje proliferácia 
lymfatickej uzliny a môže sa použi ť menší po čet zvierat na dávkovú 
skupinu. Navrhuje sa jedno alebo dve zvieratá na dávkovú skupinu. U všetkých myší sa každý de ň pozorujú klinické príznaky systémovej 
toxicity alebo lokálneho podráždenia v mieste aplikácie. Telesné hmotnosti 
zvierat sa zaznamenajú na za čiatku testu a pred usmrtením (de ň 6). Obidve 
uši každej myši sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (s červenania 
kože), a vyhodnotia sa pod ľa tabuľky 1 (25). Hrúbka ucha sa meria 
pomocou meradla hrúbky (napr. digitálnym mikrometrom alebo meradlom 
hrúbky Peacock Dial) v de ň 1 (pred aplikáciou dávky), v de ň 3 (približne 
48 hodín po prvej dávke) a v de ň 6. Okrem toho možno hrúbku ucha 
v deň 6 určiť na základe meraní vážením vzoriek uší, ktoré by sa malo 
vykonať po humánnom usmrtení zvierat. Nadmerné lokálne podráždenie 
kože indikuje hodnota erytému ≥ 3 a/alebo zvýšenie hrúbky ucha o ≥ 25 % 
v ktorýko ľvek deň merania (26) (27). Najvyššia dávka vybraná pre hlavnú 
štúdiu LLNA bude najbližšia nižšia dávka z predbežných skríningových 
sérií koncentrácií (pozri odsek 18), ktorá nespôsobuje systémovú toxicitu 
a/ani nadmerné lokálne podráždenie kože.
 
Tabuľka 1 
Hodnotenia erytému  
Pozorovanie Hodnotenie  
Žiadny erytém 0 
Veľmi slabý erytém (sotva pozorovate ľný) 1 
Jasne ohrani čený erytém 2 
Mierny až silný erytém 3 Výrazný erytém (tmavo červený) až vytvorenie chrasty zabra ­ 
ňujúcej posúdeniu erytému 4 
23. Okrem 25 % zvýšenia hrúbky ucha (26) (27) sa štatisticky významné 
zvýšenie hrúbky ucha v testovanej skupine myší v porovnaní 
s kontrolnou skupinou myší použilo aj na identifikáciu dráždivých látok 
v LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Štatisticky významné zvýšenie hrúbky ucha môže nasta ť aj vtedy, ke ď dôjde k menšiemu zvýšeniu ako 
25 %, nespája sa však konkrétne s nadmerným podráždením kože (30) 
(32) (33) (34). 
24. Nasledujúce klinické pozorovania môžu indikova ť systémovú toxicitu (35) 
(36), ak sú sú časťou integrovaného posudzovania, to znamená, že môžu 
indikovať maximálnu úrove ň dávky na použitie v hlavnej štúdii LLNA: 
zmeny funkcie nervového systému (napr. piloerekcia, ataxia, triaška 
a kŕče); zmeny správania (napr. agresia, zmena pri čistení, výrazná 
zmena stup ňa aktivity); zmena dýchania (t. j. zmena frekvencie alebo 
intenzity dýchania, ako napríklad zadúšanie, dýchavi čnosť a šelest) 
a zmeny spotreby potravy a vody. Okrem toho treba v hodnotení zváži ť 
príznaky letargie a/alebo apatie a akéko ľvek klinické príznaky silnejšej 
alebo dlhodobejšej bolesti a utrpenia alebo viac ako 5 % zníženie telesnej hmotnosti medzi d ňom 1 a 6 a úmrtnos ť. Umierajúce zvieratá alebo zvie ­
ratá, ktoré majú o čividne silné bolesti alebo vykazujú pretrvávajúce 
príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrti ť (37).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Harmonogram pokusov v hlavnej štúdii  
25. Harmonogram pokusov v rámci skúšky je takýto: 
— Deň 1: Ozna čte každé zviera a zaznamenajte jeho hmotnos ť 
a akékoľvek klinické pozorovania. Za čnite s aplikáciou 25 μl 
z príslušného zriedenia testovanej látky, samotného nosi ča alebo pozi ­
tívnej kontroly (súbežnej alebo sú časnej, pod ľa laboratórnych pravi ­
diel s prihliadnutím na odseky 11 – 15) na zadnú stranu každého 
ucha. 
— Dni 2 a 3: Zopakujte aplika čný postup uskuto čnený v de ň 1. 
— Dni 4 a 5: Žiadne ošetrenie. — Deň 6: Zaznamenajte hmotnos ť každého zviera ťa. Injekčne podajte 
všetkým pokusným a kontrolným myšiam 250 μl sterilného fosfátom 
tlmeného fyziologického roztoku (PBS) obsahujúceho 20 μCi 
(7,4 × 10
 5 Bq)  3 H-metyltymidínu cez chvostovú žilu. Alternatívne 
injekčne podajte všetkým myšiam 250 μl sterilného PBS obsahujúceho 
2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jódodeoxyuridínu a 10  –5 M-fluorodeoxyuri ­
dínu cez chvostovú žilu. O pä ť hodín sa zvieratá humánne usmrtia. 
Drénované ušné lymfatické uzliny sa odstránia z každého ucha myši 
a spracujú sa spolo čne v PBS pre každé zviera (metóda jednotlivých 
zvierat) alebo sa lymfatické uzliny odstránia z každého ucha a spoločne spracujú v PBS pre každú pokusnú skupinu (metóda spoje ­
ných pokusných skupín). Údaje a diagramy identifikácie a disekcie 
lymfatických uzlín možno nájs ť v odkaze (12). Pri ďalšom monitoro ­
vaní lokálnej odozvy kože v hlavnej štúdii možno do protokolu štúdie zahrnúť ďalšie parametre, ako napríklad hodnotenie erytému ucha 
alebo merania hrúbky ucha (získané pomocou meradla hrúbky alebo 
vážením vzoriek uší pri pitve).
 
Príprava bunkových suspenzií  
26. Jednobunková suspenzia buniek lymfatických uzlín (LNC), odobraná bila ­
terálne s použitím metódy jednotlivých zvierat alebo alternatívnej metódy spojenej pokusnej skupiny, sa pripravuje jemným mechanickým pretla ­ 
čením cez sitko z nerezovej ocele so šírkou oka 200 μm alebo inou 
prijateľnou technikou na prípravu jednobunkovej suspenzie. Bunky lymfa ­
tických uzlín sa dvakrát premyjú v prebytku PBS a DNA sa vyzráža 5 % kyselinou trichlóroctovou (TCA) pri 4 °C po čas 18 hod. (3). Pelety sa bu ď 
opätovne suspendujú v 1 ml TCA a prenesú do scintila čných fľaštičiek 
obsahujúcich 10 ml scintila čnej kvapaliny na čítanie
 3 H, alebo sa prenesú 
priamo do gamma čítacích túb na čítanie  125 I. 
Stanovenie proliferácie buniek (naviazaná rádioaktivita)  
27. Začlenenie  3 H-metyltymidínu sa meria β-scintilačným čítaním ako dezin ­
tegrácia za minútu (DPM). Za členenie  125 I-jododeoxyuridínu sa meria 
čítaním  125 I a tiež sa vyjadruje ako dezintegrácia za minútu (DPM). 
V závislosti od použitej metódy sa za členenie vyjadrí ako DPM/myš 
(metóda jednotlivých zvierat) alebo DPM/pokusná skupina (metóda 
spojenej pokusnej skupiny).  
Redukovaná LLNA  
28. V ur čitých situáciách, ke ď vznikne regula čná potreba potvrdi ť negatívny 
predpoklad potenciálu senzibilizácie kože, možno použi ť voliteľný 
protokol rLLNA (16) (17) (18) s použitím menšieho po čtu zvierat, ak 
existuje súlad so všetkými ostatnými špecifikáciami protokolov LLNA v tejto testovacej metóde. Pred použitím metódy rLLNA je potrebné poskytnúť jasné a vedecké odôvodnenia použitia tejto metódy. Ak sa 
dosiahne pozitívny alebo nejasný výsledok, možno bude potrebné vykona ť 
ďalšie testovanie, aby bola možná interpretácia alebo objasnenie zistenia.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Zníženie po čtu dávkových skupín je jediný rozdiel medzi protokolmi testo ­
vacích metód LLNA a rLLNA a z tohto dôvodu rLLNA neposkytuje 
informácie o odozve na dávku. Preto by sa rLLNA nemala používa ť 
v prípadoch, ke ď sú potrebné informácie o odozve na dávku. Podobne 
ako pri viacdávkovej LLNA by koncentrácia testovanej látky hodnotenej 
v rLLNA mala by ť maximálnou koncentráciou, ktorá nespôsobuje zjavnú 
systémovú toxicitu a/ani nadmerné lokálne podráždenie kože myši (pozri odsek 18).
 
POZOROVANIA  
Klinické pozorovania  
30. Každá myš sa starostlivo vyšetrí aspo ň jedenkrát denne na všetky klinické 
príznaky, či už ide o lokálne podráždenie v mieste aplikácie, alebo systé ­
movú toxicitu. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, 
pričom každá myš má individuálny záznam. Plány na monitorovanie by 
mali zahŕňať kritériá na rýchlu identifikáciu tých myší, ktoré vykazujú 
systémovú toxicitu, nadmerné lokálne podráždenie alebo poleptanie kože 
a ktoré majú by ť humánne usmrtené (37).  
Telesné hmotnosti  
31. Ako sa uvádza v odseku 25, telesné hmotnosti jednotlivých zvierat by sa 
mali odmera ť na začiatku testu a pri naplánovanom usmrtení zvierat.  
VÝPOČET VÝSLEDKOV 
32. Výsledky sa vyjadrujú ako stimula čný index (SI). Pri použití metódy 
jednotlivých zvierat sa SI získa vydelením priemernej hodnoty DPM/myš v rámci každej skupiny, ktorej sa podávala testovaná látka, a pozitívnej kontrolnej skupiny priemernou hodnotou DPM/myš kontrolnej skupiny, 
ktorej sa podávalo rozpúš ťadlo/nosič. Priemerná hodnota SI kontrolných 
skupín, ktorým sa podával nosi č, je potom 1. Pri použití metódy spojenej 
pokusnej skupiny sa SI získa vydelením hodnoty spojeného rádioaktívneho začlenenia v každej pokusnej skupine hodnotou za členenia v spojenej 
kontrolnej skupine s nosi čom; a tým sa získa priemerná hodnota SI. 
33. V rozhodovacom procese sa za pozitívny výsledok považuje stimula čný 
index ≥ 3. Pri ur čovaní toho, či je hrani čný výsledok pozitívny, sa však 
môže použi ť aj sila odozvy na dávku, štatistický význam a konzistentnos ť 
odoziev na rozpúš ťadlo/nosič a odoziev na pozitívnu kontrolu (4), (5), (6). 
34. Ak je potrebné vysvetli ť získané výsledky, pozornos ť by sa mala venova ť 
rôznym vlastnostiam testovanej látky vrátane toho, či má štrukturálny 
vzťah k látkam, ktoré sú známymi senzibilizátormi kože, či spôsobuje 
nadmerné lokálne podráždenie kože, a charakteru pozorovanej odozvy 
na dávku. Tieto a ostatné h ľadiská sa podrobne rozoberajú inde (7). 
35. Zbieranie údajov o rádioaktivite na úrovni jednotlivých myší umožní 
vykonať štatistickú analýzu prítomnosti a úrovne vz ťahu medzi dávkou 
a odozvou. Každé štatistické posúdenie by mohlo zah ŕňať hodnotenie 
vzťahu medzi dávkou a odozvou, ako aj vhodne upravené porovnávania 
pokusných skupín (napr. porovnávania v pároch skupiny, ktorej sa podáva 
dávka, a súbežnej kontrolnej skupiny s nosi čom). Štatistické analýzy môžu 
zahŕňať napr. lineárnu regresiu alebo Williamsov test na posúdenie trendov 
vo vzťahu medzi dávkou a odozvou a Dunnettov test na porovnávanie 
v pároch. Pri výbere vhodnej metódy štatistickej analýzy by si výskumný 
pracovník mal uvedomova ť možné nerovnosti rozdielov a ďalšie súvisiace 
problémy, ktoré si môžu vyžadova ť premenu údajov alebo štatistickú 
analýzu založenú na iných ako parametrických údajoch. Výskumný 
pracovník bude možno v každom prípade musie ť vykonať výpočty SI 
a štatistické analýzy s ur čitými dátovými bodmi a bez nich (niekedy sa 
tieto údaje nazývajú „extrémne hodnoty“).  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
36. Údaje by sa mali uvádza ť v tabuľkovej podobe. Pri použití metódy jedno ­
tlivých zvierat sa v tabu ľke uvedú hodnoty DPM u jednotlivých zvierat, 
skupinová priemerná hodnota DPM/zviera, súvisiaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) a priemerná hodnota SI každej dávkovej skupiny v porovnaní 
so súbežnou kontrolnou skupinou s nosi čom. Pri použití metódy spojenej 
pokusnej skupiny sa v tabu ľke uvedie priemerná/prostredná hodnota DPM 
a priemerná hodnota SI každej dávkovej skupiny v porovnaní so súbežnou kontrolnou skupinou s nosi čom.
 
Správa o teste  
37. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie: 
Testované a kontrolné látky: 
— identifika čné údaje (napr. čísla CAS, čísla EC, ak sú k dispozícii, 
zdroj, čistota; známe ne čistoty, číslo šarže), 
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. prchavos ť, 
stabilita, rozpustnos ť), 
— v prípade zmesi zloženie a relatívny percentuálny podiel zložiek. Rozpúšťadlo/nosič: 
— identifika čné údaje ( čistota, v prípade potreby koncentrácia, použitý 
objem), 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča. 
Testovacie zvieratá: — použitý kme ň myší CBA, 
— mikrobiologický stav zvierat, ak je známy, — počet a vek zvierat, 
— zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Podmienky testu: — informácie o príprave a aplikácii testovanej látky, — zdôvodnenie výberu dávky (vrátane výsledkov z predbežného skrínin ­
gového testu, ak sa uskuto čnil), 
— použité koncentrácie nosi ča a testovanej látky a celkové množstvo 
aplikovanej testovanej látky, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— podrobný opis harmonogramu podávania dávok a odberu vzoriek, — metódy merania toxicity, — kritériá na hodnotenie štúdií ako pozitívnych alebo negatívnych, — informácie o akýchko ľvek odchýlkach od protokolu a vysvetlenie, ako 
odchýlky ovplyv ňujú návrh a výsledky štúdie. 
Kontrola spo ľahlivosti: 
— súhrn výsledkov poslednej kontroly spo ľahlivosti vrátane informácií 
o testovanej látke, koncentrácii a použitom nosi či, 
— údaje o súbežnej a/alebo historickej pozitívnej kontrole a súbežnej 
negatívnej kontrole testovacieho laboratória,
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— ak nebola zahrnutá súbežná pozitívna kontrola, dátum a laboratórna 
správa o najaktuálnejšej periodickej pozitívnej kontrole a správa 
s historickými údajmi o pozitívnej kontrole, ktorými laboratórium zdôvodňuje nevykonanie súbežnej pozitívnej kontroly. 
Výsledky: — hmotnosti jednotlivých myší na za čiatku podávania dávky a pri naplá ­
novanom usmrtení, ako aj priemerný a súvisiaci rozsah chyby (napr. SD a SEM) pre každú pokusnú skupinu, 
— časový priebeh nástupu príznakov toxicity u každého zviera ťa vrátane 
podráždenia kože na mieste podania látky, ak sa vyskytnú, 
— tabuľka hodnôt DPM a SI u jednotlivých myší (metóda jednotlivých 
zvierat) alebo priemerných/prostredných hodnôt DPM a SI (metóda spojenej pokusnej skupiny) v každej pokusnej skupine, 
— priemerný a súvisiaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) v súvislosti 
s hodnotou DPM/myš v každej pokusnej skupine a výsledky analýzy 
extrémnej hodnoty v každej pokusnej skupine pri použití metódy 
jednotlivých zvierat, 
— výpočet SI a vhodná miera variability, ktorá berie do úvahy variabilitu 
medzi zvieratami v skupinách, ktorým sa podáva testovaná látka, a v kontrolných skupinách pri použití metódy jednotlivých zvierat, 
— vzťah medzi dávkou a odozvou, 
— v prípade potreby štatistické analýzy. Rozbor výsledkov: — stručný komentár v súvislosti s výsledkami, analýza odozvy na dávku, 
štatistické analýzy, ak existujú, s uvedením záveru, či by sa testovaná 
látka mala považova ť za látku spôsobujúcu senzibilizáciu kože.
 
LITERATÚRA 
1. OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guide ­
line for the Testing of Chemicals No 429, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
2. Kimber, I. and Basketter, D. A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. Toxi ­
col., 30, 165 – 169. 
3. Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. and Basketter, D. A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol. , 93, 13 – 31. 
4. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basket ­
ter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. and Hastings, K. L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  
J. Toxicol. Environ. Healt. , 53, 563 – 579. 
5. Chamberlain, M. and Basketter, D. A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol. , 34, 999 – 1002. 
6. Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. and Loveless, S. E. (1996), 
The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol. , 34, 985 – 997. 
7. Basketter, D. A., Gerberick, G. F. and Kimber, I. (1998), Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food 
Chem. Toxicol. , 36, 327 – 333.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
8. Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins,  Toxicol. , 146, 49 – 59. 
9. Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., 
Stokes, W. S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node 
assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific 
peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmaco. , 34, 258 – 273. 
10. Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmaco. , 34, 274 – 286. 
11. Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process,  Reg. Toxicol. Pharmaco. , 34, 249 – 257. 
12. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii 
na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]. 
13. OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemicals 
No 406, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]. 
14. OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment 
No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
15. Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D. A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol. , 18, 281 – 284. 
16. Kimber, I., Dearman, R. J., Betts, C. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Kern, 
P. S., Patlewicz, G. Y. and Basketter, D. A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181 – 185. 
17. ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. K dispozícii na stránke: 
[http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]. 
18. ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The 
Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]. 
19. ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency 
Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna/llnarep.pdf].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
20. Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896 – 1904. 
21. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., 
Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Applica ­
tion of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90 – 96. 
22. ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam. niehs.nih.gov/]. 
23. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 
24. McGarry, H. F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71 – 89. 
25. OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No 404, Paris, France. K dispozícii na stránke: 
http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34 377_ 
37051368_1_1_1_1,00.html]. 
26. Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. and DeGeorge, G. L. 
(2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify 
irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. 
27. ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
28. Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. and Meade, B. J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195 – 206. 
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P. and Vohr, V. W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, 83 – 94. 
30. Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. and Meade, B. J. (1998), A combined 
murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth. , 8, 245 – 256. 
31. Hayes, B. B. and Meade, B. J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol. , 22, 491 – 506. 
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H. W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol. , 212, 60 – 68. 
33. Vohr, H. W. and Ahr, H. J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol. , 79, 721 – 728. 
34. Patterson, R. M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect. , 115, 
1023 – 1028. 
35. OECD (1987),  Acute Dermal Toxicit. , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. K dispozícii na stránke: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
36. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In 
Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm]. 
37. OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluatio. , Environmental Health and Safety Monograph, Series on 
Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Dodatok 1  
Normy výkonnosti na posudzovanie navrhovaných podobných alebo 
upravených testovacích metód LLNA na senzibilizáciu kože  
ÚVOD 
1. Cieľom noriem výkonnosti (PS) je oznámi ť základ, na ktorom možno ur čiť, 
že nové testovacie metódy, či už chránené (t. j. chránené autorským právom, 
obchodnou zna čkou, registrované), alebo nechránené, sú dostato čne presné 
a spoľahlivé na konkrétne ú čely testovania. Tieto normy výkonnosti sú 
založené na validovaných a akceptovaných testovacích metódach a možno 
ich použi ť na hodnotenie spo ľahlivosti a presnosti ďalších podobných metód 
(hovorovo nazývaných testy „me-too“), ktoré sú založené na podobných vedeckých zásadách a merajú alebo prognózujú rovnaký biologický alebo toxický ú činok (14). 
2. Pred prijatím upravených metód (t. j. navrhnutých potenciálnych zlepšení 
schválenej testovacej metódy) je potrebné vykona ť hodnotenie s cie ľom 
určiť účinok navrhnutých zmien na výkonnos ť testu a rozsah, v akom takéto 
zmeny ovplyv ňujú informácie dostupné pre ďalšie zložky procesu validácie. 
V závislosti od po čtu a povahy navrhovaných zmien, získaných údajov 
a sprievodnej dokumentácie k týmto zmenám by sa na ne mal vz ťahovať 
buď rovnaký proces validácie, akým prechádza nový test, alebo prípadne 
obmedzené posúdenie spo ľahlivosti a relevantnosti na základe zavedených 
noriem výkonnosti (14). 
3. Podobné alebo upravené metódy navrhnuté na použitie v tejto testovacej 
metóde by sa mali posúdi ť s cieľom určiť ich spoľahlivosť a presnos ť pri 
použití chemikálií, ktoré zastupujú celý rozsah hodnotení LLNA. S cie ľom 
zabrániť neoprávnenému použitiu zvierat sa dôrazne odporú ča, aby tvor ­
covia modelov konzultovali s príslušnými orgánmi pred za čatím valida čných 
štúdií v súlade s normami výkonnosti a usmernením uvedeným v tejto 
testovacej metóde. 
4. Tieto normy výkonnosti sú založené na zosúladených normách výkonnosti 
amerického medziagentúrneho koordina čného výboru pre validáciu alterna ­
tívnych metód (US-ICCVAM), Európskeho centra pre validáciu alternatív ­
nych metód (ES-ECVAM) a japonského centra pre validáciu alternatívnych metód (JaCVAM) (12), na základe ktorých sa hodnotí platnos ť podobných 
alebo upravených verzií LLNA. Do noriem výkonnosti patria nevyhnutné 
zložky testovacej metódy, odporú čané referen čné chemikálie a normy pres ­
nosti a spo ľahlivosti, ktoré by navrhnutá metóda mala dosiahnu ť alebo 
presiahnu ť.
 
I. Nevyhnutné zložky testovacej metódy  
5. S cie ľom zabezpe čiť, že podobná alebo upravená metóda LLNA bude 
z funkčného a mechanického h ľadiska podobná metóde LLNA a bude 
merať rovnaký biologický ú činok, do protokolu testovacej metódy by sa 
mali zahrnú ť tieto zložky: 
— Testovacia látka by sa mala lokálne aplikova ť na obe uši myši. 
— Proliferácia lymfocytov by sa mala mera ť v lymfatickej uzline 
v drénovanom mieste aplikácie testovanej látky. 
— Proliferácia lymfocytov by sa mala mera ť počas indukčnej fázy senzi ­
bilizácie kože.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Zvolená najvyššia dávka testovanej látky by mala obsahova ť maximálnu 
koncentráciu látky, ktorá nespôsobuje systémovú toxicitu a/ani nadmerné 
lokálne podráždenie kože myši. Najvyššia dávka pozitívnych referen č­
ných chemikálií by mala by ť prinajmenšom taká vysoká ako hodnoty 
LLNA EC3 zodpovedajúcich referen čných chemikálií (pozri tabu ľku 1), 
ktoré nespôsobujú systémovú toxicitu a/ani nadmerné lokálne podráž ­
denie kože myši. 
— Každá štúdia by mala obsahova ť súbežnú kontrolnú skupinu, ktorej sa 
podáva nosi č, a v prípade potreby by sa mala použi ť aj súbežná pozi ­
tívna kontrola. 
— V skupine, ktorej sa podáva dávka, by mali by ť minimálne štyri zvieratá. 
— Možno zbiera ť údaje o jednotlivých zvieratách alebo spojené údaje 
o zvieratách. 
Ak nebude splnené niektoré z týchto kritérií, potom tieto normy výkonnosti 
nemožno použi ť na validáciu podobnej alebo upravenej metódy.  
II. Minimálny zoznam referen čných látok  
6. Zosúladené normy výkonnosti US-ICCVAM, ES-ECVAM a japonského 
JaCVAM (12) identifikovali 18 minimálnych referen čných chemikálií, 
ktoré by sa mali použi ť, a štyri nepovinné referen čné chemikálie [t. j. látky, 
s ktorými sa v LLNA dosiahli falošné pozitívne alebo falošné negatívne výsledky v porovnaní s výsledkami, ktoré sa dosiahli u ľudí a mor čiat (B.6 
alebo usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13), a preto poskytujú 
príležitosť na dosiahnutie rovnakej alebo lepšej výkonnosti ako LLNA], 
ktoré sú zahrnuté do noriem výkonnosti LLN. Kritériá výberu na identifi ­
káciu týchto chemikálií boli: 
— zoznam referen čných chemikálií zastupujúcich druhy látok, ktoré sa 
zvyčajne testujú v súvislosti s ich potenciálom spôsobi ť senzibilizáciu 
kože, a rozsah odoziev, ktoré LLNA dokáže mera ť alebo prognózova ť, 
— látky mali dobre vymedzené chemické štruktúry, — pre každú látku boli dostupné údaje z LLNA testov na mor čatách (t. j. 
B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13) a (ak existujú) údaje z testov na ľuďoch a 
— látky boli ľahko dostupné z komer čného zdroja. 
Odporúčané referen čné chemikálie sú uvedené v tabu ľke 1. Štúdie, 
v ktorých sa používajú navrhnuté referen čné chemikálie, by sa mali 
hodnotiť v nosiči, s ktorým sú uvedené v tabu ľke 1. V situáciách, ke ď 
uvedená látka nie je dostupná, môžu sa použi ť iné látky, ktoré sp ĺňajú 
uvedené kritériá výberu, a tento výber sa musí dostato čne zdôvodni ť.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabuľka 1 
Odporúčané referen čné chemikálie pre normy výkonnosti LLNA  
Číslo Chemikálie (  1 ) Číslo CAS Forma Nosi č ( 2 ) EC3 % (  3 ) P (  4 ) 0,5x – 2,0x 
EC3 Skutočný 
rozsah EC3 LLNA/mor ča LLNA/ 
človek  
1. 5-chlór-2-metyl-4-izotiazolín-3-ón (CMI)/ 
2-metyl-4-izotiazolín-3-ón (MI) (  5 ) 26172-55-4/2682-20-4 kvap. DMF 0,009 1 0,0045 – 
0,018 NC +/+ +/+ 
2. DNCB 97-00-7 tuhá AOO 0,049 15 0,025 – 
0,099 0,02 – 
0,094 +/+ +/+ 
3. 4-fenyléndiamín 106-50-3 tuhá AOO 0,11 6 0,055 – 
0,22 0,07 –0,16 +/+ +/+ 
4. chlorid kobaltnatý 7646-79-9 tuhá DMSO 0,6 2 0,3 –1,2 0,4 – 0,8 +/+ +/+ 
5. izoeugenol 97-54-1 kvap. AOO 1,5 47 0,77 – 3,1 0,5 – 3,3 +/+ +/+ 6. 2-merkaptobenzotiazol 149-30-4 tuhá DMF 1,7 1 0,85 – 3,4 NC +/+ +/+ 
7. citral 5392-40-5 kvap. AOO 9,2 6 4,6 – 18,3 5,1 – 13 +/+ +/+ 
8. HCA 101-86-0 kvap. AOO 9,7 21 4,8 – 19,5 4,4 – 14,7 +/+ +/+ 9. eugenol 97-53-0 kvap. AOO 10,1 11 5,05 – 
20,2 4,9 – 15 +/+ +/+ 
10. fenyl-benzoát 93-99-2 tuhá AOO 13,6 3 6,8 – 27,2 1,2 – 20 +/+ +/+ 
11. škoricový alkohol 104-54-1 tuhá AOO 21 1 10,5 – 42 NC +/+ +/+ 
12. imidazolidinyl mo čovina 39236-46-9 tuhá DMF 24 1 12 – 48 NC +/+ +/+ 
13. metyl-metakrylát 80-62-6 kvap. AOO 90 1 45 – 100 NC +/+ +/+ 14. chlórbenzén 108-90-7 kvap. AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15. izopropanol 67-63-0 kvap. AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Číslo Chemikálie (  1 ) Číslo CAS Forma Nosi č ( 2 ) EC3 % (  3 ) P (  4 ) 0,5x – 2,0x 
EC3 Skutočný 
rozsah EC3 LLNA/mor ča LLNA/ 
človek  
16. kyselina mlie čna 50-21-5 kvap. DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17. metyl salicylát 119-36-8 kvap. AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18. kyselina salicylová 69-72-7 tuhá AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Nepovinné látky na preukázanie lepšej výkonnosti vo vz ťahu k LLNA 
19. laurylsulfát sodný 151-21-3 tuhá DMF 8,1 5 4,05 – 
16,2 1,5 – 17,1 +/– +/– 
20. etylénglykol dimetakrylát 97-90-5 kvap. MEK 28 1 14 – 56 NC +/– +/+ 
21. xylén 1330-20-7 kvap. AOO 95,8 1 47,9 – 100 NC +/ (**) +/– 22. chlorid nikelnatý 7718-54-9 tuhá DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Skratky: AOO = acetón: olivový olej (4: 1, objemové percentá); číslo CAS = Chemical Abstracts Service Number; DMF =  N,N -dimetylformamid; DMSO = dimetylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlórbenzén; EC3 = odhadovaná 
koncentrácia, ktorá je potrebná na dosiahnutie stimula čného indexu 3; mor ča = výsledok testu s mor čaťom (t. j. B.6 alebo usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13); HCA = 3-fenyl-2-hexylpropanál; kvap. = kvapalná 
forma; LLNA = výsledok lokálnej skúšky lymfatických uzlín myší (t. j. B.42 alebo usmernenie OECD na vykonávanie testov 429) (1) ; MEK = metyletyl ketón; NA = neuplat ňuje sa, pretože stimula čný index je nižší ako 3; 
NC = nie je vypo čítaný, pretože údaje boli získané z jedinej štúdie; tuhá = tuhá forma látky; nosi č = testovaný nosi č. 
(*) Považuje sa za látku, ktorá nespôsobuje senzibilizáciu kože u ľudí vzhľadom na skuto čnosť, že v klinických náplas ťových testoch neboli zistené žiadne výsledky, látka nie je sú časťou náplas ťových testov ako jeden 
z alergénov a neboli zistené žiadne prípady senzibilizácie u ľudí. 
(**) Údaje z testov s mor čatami nie sú dostupné. 
( 1 ) Chemikálie by sa mali pripravova ť každý de ň okrem prípadu, ke ď údaje o stabilite preukazujú prijate ľnosť uskladnenia. 
( 2 ) Vzhľadom na pravdepodobný vplyv rôznych nosi čov na výkonnos ť LLNA by sa mal pre každú referen čnú chemikáliu použi ť odporúčaný nosič (24) (32). 
( 3 ) Priemerná hodnota sa používa v prípade, že je k dispozícii viac ako jedna hodnota EC3. Pri negatívnych látkach (t. j. so stim ulačným indexom < 3) sa vyjadruje najvyššia testovaná koncentrácia. 
( 4 ) Počet štúdii LLNA, z ktorých boli získané údaje. 
( 5 ) Komer čne dostupné ako Kathon CG ( číslo CAS 55965-84-9), čo je zmes CMI a MI v pomere 3: 1. Relatívne koncentrácie každej zložky sa pohybujú v rozmedzí od 1,1 % do 1,25 % (CMI) a od 0,3  % do 0,45 % (MI). 
Neaktívne zložky sú magnéziové soli (21,5 % až 24 %) a dusi čnan meďnatý (0,15 % až 0,17 %), pri čom zvyšok tvorí 74 % až 77 % vody. Kathon CG je k dispozícii prostredníctvom spolo čnosti Sigma-Aldrich a Rohm and 
Haas (teraz sa spolo čnosť nazýva Dow Chemical Corporation).
 III. Vymedzené normy spo ľahlivosti a presnosti  
7. Presnos ť podobnej alebo upravenej metódy LLNA by mala splni ť alebo 
presiahnu ť výkonnostnú normu LLNA, ak sa posudzuje s použitím mini ­
málne 18 referen čných chemikálií, ktoré sa majú použi ť. Nová alebo upra ­
vená metóda by mala vies ť k správnej klasifikácii založenej na rozhodovaní 
typu „áno/nie“. Nová alebo upravená metóda však nemusí správne klasifi ­
kovať všetky minimálne referen čné chemikálie, ktoré sa majú použi ť. Ak 
bol napríklad jeden zo slabých senzibilizátorov nesprávne klasifikovaný, na preukázanie rovnakej výkonnosti by sa mohla zváži ť možnosť zdôvodni ť 
túto nesprávnu klasifikáciu a poskytnú ť ďalšie primerané údaje (napr. 
výsledky testov, ktoré správne klasifikujú ostatné látky s podobnými fyzi ­
kálnymi, chemickými a senzibiliza čnými vlastnos ťami, aké majú tie látky, 
ktoré boli nesprávne klasifikované). Za týchto okolností by sa stav validácie novej alebo upravenej testovacej metódy LLNA posudzoval od prípadu 
k prípadu.
 
Vnútrolaboratórna reprodukovate ľnosť 
8. Na ur čenie vnútrolaboratórnej reprodukovate ľnosti by sa nová alebo upra ­
vená metóda LLNA mala posudzova ť s použitím senzibilizujúcej látky, 
ktorá je v LLNA dobre charakterizovaná. Preto sú normy výkonnosti LLNA založené na variabilite výsledkov z opakovaných testov s 3-fenyl- 
2-hexylpropanálom (HCA). Na posúdenie vnútrolaboratórnej spo ľahlivosti 
by sa prahové hodnoty odhadovanej koncentrácie (ECt) HCA mali ur čiť 
pri štyroch osobitných príležitostiach, pri čom medzi jednotlivými testami 
je časový rozdiel aspo ň jeden týžde ň. Prijateľnú vnútrolaboratórnu reprodu ­
kovateľnosť indikuje schopnos ť laboratória získa ť v každom teste s HCA 
hodnoty ECt medzi 5 % a 20 %, čo predstavuje rozsah 0,5 – 2,0-násobku 
priemernej hodnoty EC3 definovanej pre HCA (10 %) v LLNA (pozri tabuľku 1).
 
Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť 
9. Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť novej alebo upravenej metódy LLNA 
by sa mala posudzova ť s použitím dvoch senzibilizujúcich látok, ktoré sú 
v LLNA dobre charakterizované. Normy výkonnosti LLNA sú založené na variabilite výsledkov testov s HCA a 2,4-dinitrochlórbenzénom (DNCB) v rôznych laboratóriách. Hodnoty ECt by sa mali ur čiť nezávisle z jednej 
štúdie vykonanej minimálne v troch rôznych laboratóriách. Na preukázanie 
prijateľnej medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti by každé laboratórium 
malo získa ť hodnoty ECt medzi 5 % a 20 % pri HCA a 0,025 % až 
0,1 % pri DNCB, čo predstavuje rozsah 0,5 – 2,0-násobku priemerných 
koncentrácií EC3 definovaných pre HCA (10 %) a DNCB (0,05 %) 
v LLNA (pozri tabu ľku 1).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 620
Dodatok 2  
Vymedzenie pojmov  
Presnosť: Miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referen č­
nými hodnotami. Ide o opatrenie výkonnosti testovacej metódy a jeden z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa ako synonymum 
s pojmom „zhoda“ a ozna čuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (14).  
Referenčná látka:  Látka spôsobujúca alebo nespôsobujúca senzibilizáciu, ktorá 
sa používa ako štandardná látka na porovnávanie s testovanou látkou. Referen čná 
látka by mala ma ť tieto vlastnosti: i) konzistentný(-é) a spo ľahlivý(-é) zdroj(-e); 
ii) štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou látok, ktoré sa budú testova ť; iii) 
známe fyzikálno-chemické vlastnosti; iv) podporné údaje o známych ú činkoch 
a v) známu potenciu v rozsahu želanej odozvy.  
Prahová hodnota odhadovanej koncentrácie (ECt):  Odhadovaná koncentrácia 
testovanej látky potrebná na dosiahnutie stimula čného indexu, ktorý nazna čuje 
pozitívnu odozvu.  
Odhadovaná koncentrácia tri (EC3):  Odhadovaná koncentrácia testovanej látky 
potrebná na dosiahnutie stimula čného indexu 3.  
Falošný negatívny výsledok:  Testovaná látka je testovanou metódou nesprávne 
identifikovaná ako negatívna alebo neaktívna, pri čom v skuto čnosti je pozitívna 
alebo aktívna.  
Falošný pozitívny výsledok:  Testovaná látka je testom nesprávne identifikovaná 
ako pozitívna alebo aktívna, pri čom v skuto čnosti je negatívna alebo neaktívna.  
Nebezpečnosť: Potenciál škodlivého ú činku na zdravie alebo životné prostredie. 
Škodlivý ú činok sa prejavuje až pri dostato čnej hladine expozície.  
Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť: Miera, do akej rôzne kvalifikované labo ­
ratóriá, ktoré používajú rovnaký protokol a testujú rovnaké testovacie látky, dokážu 
dosiahnuť kvalitatívne a kvantitatívne podobné výsledky. Medzilaboratórna repro ­
dukovateľnosť
 sa určuje počas postupov pred validáciou a v rámci postupov vali ­
dácie a znamená mieru, do akej možno test úspešne prenáša ť medzi laboratóriami. 
Takisto je známa ako reprodukovate ľnosť medzi laboratóriami (14).  
Vnútrolaboratórna reprodukovate ľnosť: Určenie miery, do akej kvalifikovaní 
pracovníci v rámci jedného laboratória dokážu úspešne opakova ť výsledky 
s použitím konkrétneho protokolu v rôznom čase. Takisto je známa ako repro ­
dukovateľnosť v rámci laboratória (14).  
Test me-too:  Hovorový názov testovacej metódy, ktorá je štrukturálne a funk čne 
podobná validovanej a akceptovanej referen čnej testovacej metóde. Takáto testo ­
vacia metóda by bola kandidátom na ďalšiu validáciu. Môže sa používa ť 
namiesto podobnej testovacej metódy (14).  
Extrémna hodnota:  Extrémna hodnota je pozorovanie, ktoré je zna čne odlišné od 
ostatných hodnôt v náhodnej vzorke z populácie.  
Normy výkonnosti (PS):  Normy založené na validovanej testovacej metóde, ktoré 
slúžia ako základ na hodnotenie porovnate ľnosti navrhovanej testovacej metódy, 
ktorá je funk čne a mechanicky podobná. Patria sem: i) nevyhnutné zložky testo ­
vacej metódy; ii) minimálny zoznam referen čných chemikálií vybraných 
spomedzi látok používaných na preukázanie prijate ľnej výkonnosti validovanej 
testovacej metódy a iii) porovnate ľné úrovne presnosti a spo ľahlivosti založené 
na tom, čo sa získalo pre validovanú testovaciu metódu a čo by navrhovaná 
testovacia metóda mala preukáza ť pri hodnotení pomocou minimálneho zoznamu 
referenčných chemikálií (14).  
Chránená testovacia metóda:  Testovacia metóda, ktorej výrobu a distribúciu 
obmedzujú patenty, autorské práva, obchodné zna čky atď. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Zabezpečovanie kvality:  Riadiaci proces, v ktorom jednotlivci nezávislí od osôb 
vykonávajúcich testy posudzujú súlad s laboratórnymi testovacími normami, 
požiadavkami a postupmi vedenia záznamov, ako aj presnos ť prenosu údajov.  
Referenčné chemikálie:  Chemikálie vybrané na použitie v procese validácie, pre 
ktoré už sú známe odozvy v referen čnom testovacom systéme  in vitro  alebo  in 
vivo alebo odozvy u daných druhov zvierat. Tieto chemikálie by mali by ť zástup­
cami tried chemikálií, v súvislosti s ktorými sa o čakáva použitie testovacej 
metódy, a mali by zastupova ť celý rozsah odoziev od silných po slabé alebo 
negatívne odozvy, ktoré možno o čakávať od chemikálií, pri ktorých sa môže 
metóda použi ť. Rôzne skupiny referen čných chemikálií sa môžu vyžadova ť 
v rôznych štádiách procesu validácie a pre rôzne testovacie metódy a použitia 
testov (14).  
Relevantnos ť: Opis vz ťahu testu k ú činku, ktorý je predmetom záujmu, a či je 
tento účinok zmysluplný a užito čný na konkrétny ú čel. Ide o mieru, do akej test 
správne meria alebo prognózuje biologický ú činok, ktorý je predmetom záujmu. 
Relevantnos ť zohľadňuje presnos ť (zhodu) testovacej metódy (14).  
Spoľahlivosť: Meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda po čas 
istého časového obdobia opakovane vykonáva ť v rámci laboratórií a medzi nimi 
navzájom, pri čom sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypo čítaním vnútro ­
laboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti (14).  
Senzibilizácia kože:  Imunologický proces, ku ktorému dochádza po lokálnom 
vystavení náchylného jednotlivca chemickému alergénu, ktorý vyvoláva kožnú 
imunitnú odozvu, ktorá môže vies ť k vytvoreniu kontaktnej senzibilizácie.  
Stimulačný index (SI):  Hodnota vypo čítaná na posúdenie potenciálu testovanej 
látky spôsobi ť senzibilizáciu kože; ide teda o pomer proliferácie v pokusných 
skupinách a proliferácie v súbežných kontrolných skupinách, ktorým sa podáva nosič. 
Testovaná látka (tiež sa nazýva testovaná chemikália):  Akákoľvek látka alebo 
zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.  
Validovaná testovacia metóda:  Testovacia metóda, v súvislosti s ktorou sa ukon ­ 
čili valida čné štúdie na stanovenie relevantnosti (vrátane presnosti) 
a spoľahlivosti na konkrétny ú čel. Je dôležité poznamena ť, že validovaná testo ­
vacia metóda nemusí ma ť dostatočnú výkonnos ť, pokiaľ ide o presnos ť 
a spoľahlivosť, aby bola prijate ľná pre navrhovaný ú čel (14).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  ŠTÚDIA NEUROTOXICITY U HLODAVCOV  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 424 (1997). 
Táto testovacia metóda bola vyvinutá na získanie informácií, ktoré sú 
potrebné na potvrdenie potenciálnej neurotoxicity chemikálií 
u dospelých zvierat alebo jej ďalšiu charakterizáciu. Môže sa bu ď 
kombinova ť s existujúcimi testovacími metódami pre štúdie toxicity 
pri opakovanej dávke, alebo sa môže vykona ť ako samostatná štúdia. 
Pri plánovaní štúdií, ktoré sú založené na tejto testovacej metóde, sa 
odporúča, aby sa na pomoc nahliadlo do OECD Guidance Document 
on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1). Toto je dôle ­ 
žité najmä, ke ď sa zvažujú modifikácie vyšetrení a testovacích 
postupov odporú čaných pre bežné používanie tejto metódy. The 
Guidance Document bol pripravený, aby u ľahčil výber iných testo ­
vacích postupov na použitie za špecifických podmienok. 
Posúdenie vývojovej neurotoxicity nie je predmetom tejto metódy.  
1.1. ÚVOD 
Pri posudzovaní a hodnotení toxických vlastností chemikálií je dôle ­ 
žité posúdi ť potenciál vyvola ť neurotoxické ú činky. Práve testovacia 
metóda pre systémovú toxicitu pri opakovanej dávke zahrnuje vyšet ­
renia, ktoré skúmajú potenciálnu neurotoxicitu. Táto testovacia 
metóda sa môže použi ť na zostavenie štúdie, ktorou sa získajú 
alebo potvrdia ďalšie informácie o neurotoxických ú činkoch 
v štúdiách systémovej toxicity pri opakovanej dávke. Posúdenie 
potenciálnej neurotoxicity ur čitých tried chemikálií by však mohlo 
viesť k tomu, že sa môžu lepšie posudzova ť s použitím tejto metódy 
bez predchádzajúcej indikácie potenciálnej neurotoxicity zo štúdií 
systémovej toxicity pri opakovanej dávke. Takéto posudzovanie 
zahrnuje napríklad: 
— pozorovanie neurologických príznakov alebo neuropatologických 
lézií v iných štúdiách toxicity ako sú štúdie systémovej toxicity pri opakovanej dávke, alebo 
— štrukturálnu príbuznos ť alebo iné informácie, ktoré ich spájajú so 
známymi neurotoxikantami. 
Okrem toho sa môžu vyskytnú ť aj iné príklady, ke ď je vhodné použitie 
tejto testovacej metódy; ďalšie informácie pozri v odkaze (1). 
Táto metóda bola vyvinutá tak, aby sa dala prispôsobi ť osobitným 
potrebám na potvrdenie špecifickej histopatologickej a behaviorálnej 
neurotoxicity chemikálie, ako aj na umožnenie charakterizácie a kvantifikácie neurotoxických reakcií. V minulosti sa neurotoxicita stotožňovala s neuropatiou, ktorá zahrnuje neuropatologické lézie 
alebo neurologické dysfunkcie, ako sú záchvat, paralýza alebo 
triaška.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Aj keď neuropatia je dôležitým prejavom neurotoxicity, teraz je 
zrejmé, že existuje mnoho ďalších príznakov nervovej systémovej 
toxicity (napr. strata motorickej koordinácie, senzorické deficity, dysfunkcie týkajúce sa schopnosti sa u čiť a pamäte), ktoré sa 
nemôžu prejavi ť v štúdiách neuropatie alebo iných typoch štúdií. 
Táto testovacia metóda na dôkaz neurotoxicity je vyvinutá na stano ­
venie hlavných neurobehaviorálnych a neuropatologických ú činkov 
u dospelých hlodavcov. Hoci ú činky na správanie, aj ke ď pri neprí ­
tomnosti morfologických zmien, môžu odráža ť nepriaznivý vplyv na 
organizmus, nie všetky zmeny v správania sú špecifické pre nervový 
systém. Preto je potrebné všetky pozorované zmeny hodnoti ť 
v súvislosti s korela čnými histopatologickými, hematologickými 
alebo biochemickými údajmi, ako aj údajmi o iných typoch systémovej 
toxicity. Testovanie uvádzané v tejto metóde na umožnenie charakte ­
rizácie a kvantifikácie neurotoxických reakcií zahrnuje špecifické histopatologické a behaviorálne postupy, ktoré sa môžu ďalej opiera ť 
o elektrofyziologické a/alebo biochemické vyšetrenia (1), (2), (3), (4). 
Neurotoxikanty môžu pôsobi ť na množstvo cie ľov v nervovom 
systéme a rozli čnými mechanizmami. Ke ďže žiadny samostatný 
súbor testov nie je schopný dôkladne posúdi ť neurotoxický potenciál 
všetkých látok, môže by ť potrebné využi ť iné in vivo  alebo  in vitro  
testy, ktoré sú špecifické pre zistený alebo predpokladaný typ neuro ­
toxicity. 
Táto testovacia metóda sa môže tiež použi ť v spojení s usmernením 
uvedeným v OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) na zostavenie štúdií ur čených na ďalšiu 
charakterizáciu alebo zvýšenie citlivosti kvantifikácie reakcie na 
dávku, na lepšie stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého 
účinku alebo na dokázanie známych alebo podozrivých rizík chemi ­
kálie. Napríklad sa môžu zostavi ť štúdie na identifikáciu a posúdenie 
neurotoxického(-ých) mechanizmu(-ov) alebo na doplnenie údajov, 
ktoré sú už k dispozícii z použitých základných neurobehaviorálnych 
a neuropatologických vyšetrovacích postupov. Takéto štúdie nevyža ­
dujú opakované údaje, ktoré by sa získali na základe použitia štan ­
dardných postupov odporú čaných v tejto metóde, ak sú už takéto 
údaje k dispozícii a nepokladajú sa za potrebné pre interpretáciu 
výsledkov štúdie. 
Táto štúdia neurotoxicity, použitá samostatne alebo v kombinácii, 
poskytuje informácie, ktoré môžu: 
— identifikova
ť, či nervový systém je permanentne alebo reverzi ­
bilne ovplyvnený testovanou chemikáliou, 
— prispie ť ku charakterizácii zmien nervového systému spojených 
s vystavením sa pôsobeniu chemikálie a k pochopeniu prísluš ­
ného mechanizmu,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— určiť vzťahy medzi dávkou a reakciou v závislosti od času na 
stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku 
(ktorá sa môže použi ť na stanovenie bezpe čnostných kritérií 
pre chemikáliu). 
Pri tejto metóde testovania sa testovaná látka podáva orálne. Iné 
cesty podávania (napr. dermálna alebo inhala čná) môžu by ť vhod­
nejšie a môžu vyžadova ť úpravu odporú čaných postupov. Rozhod ­
nutie o tom akou cestou sa látka bude podáva ť závisí na profile 
expozície ľudí a na dostupných toxikologických alebo kinetických 
informáciách.  
1.2. DEFINÍCIE  
Nepriaznivý ú činok:  každá zmena v súvislosti s ošetrením od 
normálneho stavu, ktorá znižuje schopnos ť organizmu preži ť, repro­
dukovať sa alebo prispôsobi ť sa prostrediu.  
Dávka:  je množstvo podanej testovanej látky. Dávka sa vyjadruje 
ako hmotnos ť (g, mg) alebo ako hmotnos ť testovanej látky na 
jednotku hmotnosti testovaného zviera ťa (napr. mg/kg) alebo ako 
konštantné koncentrácie v krmive (ppm).  
Dávkovanie:  je všeobecný termín zahrnujúci podávanie látky, jej 
frekvenciu a trvanie podávania dávok.  
Neurotoxicita:  nepriaznivá zmena v štruktúre alebo funkcii nervo ­
vého systému, ktorá vzniká v dôsledku vystavenia chemickému, 
biologickému alebo fyzikálnemu činiteľu. 
Neurotoxikant:  je každý chemický, biologický alebo fyzikálny čini­
teľ, ktorý môže spôsobi ť neurotoxicitu.  
NOAEL:  je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého 
účinku a je to najvyššia dávka, pri ktorej sa nepozorujú žiadne 
nepriaznivé zistenia v súvislosti s ošetrením.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná chemikália sa podáva orálnou cestou v rade dávok 
niekoľkým skupinám laboratórnych hlodavcov. Zvy čajne sa vyža ­
dujú opakované dávky a režim podávania dávok môže by ť 28 dní, 
pre subchronickú (90 dní) alebo chronickú toxicitu (1 rok alebo 
viac). Postupy uvedené v tejto testovacej metóde sa môžu použi ť 
aj pre štúdiu akútnej neurotoxicity. Zvieratá sa testujú na umožnenie detekcie alebo charakterizácie behaviorálnych a/alebo neurologic ­
kých abnormalít. V priebehu každého obdobia pozorovania sa 
hodnotí rozsah behaviorálnych aspektov, ktoré by mohli by ť ovplyv­
nené neurotoxikantami. Na konci testu sa časť zvierat každého 
pohlavia z každej skupiny pomocou perfúzie fixuje in situ a rezy tkaniva mozgu, miechy a periferálnych nervov sa pripravia 
a vyšetria. 
Keď sa štúdia uskuto čňuje ako samostatná štúdia na zistenie neuro ­
toxicity alebo na charakterizáciu neurotoxických ú činkov, zvieratá 
v každej skupine, ktoré sa nepoužili na perfúziu a následnú histopa ­
tológiu (pozri tabu ľku 1), sa môžu použi ť na špecifické neurobeha ­
viorálne, neuropatologické, neurochemické alebo elektrofyziologické postupy, ktoré môžu doplni ť údaje získané pri štandardných vyšet ­
reniach vyžadovaných touto metódou (1). Tieto dodato čné postupy 
môžu by ť osobitne užito čné, keď empirické pozorovania alebo 
očakávané ú činky indikujú špecifický typ alebo cie ľové tkanivo 
v prípade neurotoxicity spôsobenej chemikáliou. Alternatívne sa môžu zvyšné zvieratá použi ť na také hodnotenie, ako sa vyžaduje 
v testovacích metódach pre štúdie toxicity pri opakovanej dávke 
u hlodavcov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Ak sa postupy tejto testovacej metódy kombinujú s postupmi iných 
testovacích metód, je potrebný dostato čný počet zvierat na splnenie 
požiadaviek pre vyšetrenia v oboch štúdiách.  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Výber druhu zvierat  
Spomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, aj ke ď je 
možné použi ť aj iný druh hlodavca. Použijú sa mladé dospelé zdravé 
zvieratá bežne používaných laboratórnych kme ňov. Samice by mali 
byť panenské a negravidné. Dávkovanie by sa malo za čať čo najskôr 
po odstavení, pokia ľ možno nie neskôr ako vo veku šes ť týždňov, 
a v každom prípade pred dosiahnutím deviatich týžd ňov. Keď sa 
však táto štúdia kombinuje s inými štúdiami, môže by ť potrebné 
túto vekovú požiadavku upravi ť. Na začiatku štúdie rozdiel medzi 
hmotnosťami použitých zvierat nemá by ť vyšší ako ± 20 % prie ­
mernej hmotnosti každého pohlavia. Ke ď sa uskuto ční predbežná 
krátkodobá štúdia pri opakovaných dávkach pred uskuto čnením 
dlhodobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použi ť zvieratá 
z rovnakého kme ňa a zdroja.  
1.4.2.  Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22  o C (± 
3 o C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť by mala by ť aspoň 30 %, 
a pokiaľ možno, nemala by prevyšova ť 70 %, okrem obdobia 
počas čistenia miestnosti by mala dosahova ť 50 – 60 %. Osvetlenie 
by malo by ť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Je 
potrebné obmedzi ť na minimum krátkodobý silný hluk. Na k ŕmenie 
sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou 
dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže by ť ovplyvnený potrebou 
zabezpečiť vhodnú primes testovanej látky, ke ď sa podáva týmto 
spôsobom. Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo 
v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach.  
1.4.3.  Príprava zvierat  
Zdravé mladé zvieratá sa náhodne rozdelia do ošetrovanej 
a kontrolnej skupiny. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizo ­
vali prípadné vplyvy kvôli umiestneniu klietok. Zvieratá sa jednoz ­
načne označia a držia vo svojich klietkach aspo ň (5) päť dní pred 
začiatkom štúdie, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.  
1.4.4.  Cesta podávania a príprava dávok  
Pri tejto metóde testovania sa testovaná látka podáva výlu čne orálne. 
Orálne podávanie môže by ť cez sondu, v krmive, v pitnej vode alebo 
kapsulami. Iné cesty podávania (napr. dermálna alebo inhala čná) sa 
môžu použi ť, ale môže by ť potrebné upravi ť odporúčané postupy. 
Rozhodnutie o tom akou cestou sa látka bude podáva ť závisí na 
profile expozície ľudí a dostupných toxikologických alebo kinetic ­
kých informáciách. Je potrebné uvies ť zdôvodnenie výberu cesty 
podávania, ako aj výsledné modifikácie postupov tejto testovacej 
metódy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
V prípade potreby sa testovaná látka môže rozpusti ť alebo rozptýli ť 
vo vhodnom nosi či. Odporú ča sa, aby sa najskôr zvážilo použitie 
vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku/suspenzie v inom 
nosiči. Toxické vlastnosti nosi ča musia by ť známe. Okrem toho je 
potrebné venova ť pozornos ť týmto charakteristikám nosi ča: vplyv 
nosiča na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo retenciu testo ­
vanej látky, ktoré môžu zmeni ť jej toxické vlastnosti; a vplyv na 
spotrebu potravy alebo vody alebo nutri čný stav zvierat.
 
1.5. POSTUPY  
1.5.1.  Po čet a pohlavie zvierat  
Keď sa štúdia uskuto čňuje ako samostatná štúdia, je potrebné použi ť 
aspoň 20 zvierat (10 samíc a 10 samcov) v každej dávkovej 
a kontrolnej skupine na vyhodnotenie klinických a funk čných vyšet ­
rení. Aspo ň päť samcov a pä ť samíc, vybratých z týchto 10 samcov 
a 10 samíc, sa pomocou perfúzie fixuje in situ a použije na podrobnú neurohistopatológiu na konci štúdie. V prípade, ke ď sa iba obme ­
dzený po čet zvierat v danej dávkovej skupine vyšetrí na príznaky 
neurotoxických ú činkov, je potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby 
sa tieto zvieratá zahrnuli k tým, ktoré boli vybraté na perfúziu. Ak sa štúdia uskuto čňuje v kombinácii so štúdiou toxicity pri opakovanej 
dávke, použijú sa vhodné po čty zvierat, aby zodpovedali cie ľom 
oboch štúdií. Minimálny po čet zvierat na skupinu pre rôzne kombi ­
nácie štúdií je uvedený v tabu ľke 1. Ak sa po ošetrení plánuje 
predčasné usmrtenie, alebo sa plánujú skupiny na regeneráciu, aby 
sa pozorovala reverzibilita, pretrvávanie alebo oneskorený výskyt 
toxických ú činkov, alebo ke ď sa zvažujú dodato čné vyšetrenia, 
potom by sa po čet zvierat mal zvýši ť, aby sa zabezpe čilo, že je 
k dispozícii potrebný po čet zvierat na vyšetrenie a histopatológiu.
 
1.5.2.  Ošetrovaná a kontrolná skupina  
Zvyčajne sa použijú aspo ň tri dávkové skupiny a kontrolná skupina, 
ale ak sa na základe hodnotenia ďalších údajov neo čakávajú žiadne 
účinky pri opakovanej dávke 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň, 
môže sa vykona ť limitný test. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, 
môže sa vykona ť štúdia na zistenie rozsahu dávkovania, aby umož ­
nila stanovi ť dávky, ktoré sa majú použi ť. Okrem ošetrenia 
s testovanou látkou sa zvieratá v kontrolnej skupine ošetria rovnakým spôsobom ako zvieratá v pokusnej skupine. Ak sa používa nosič pri podávaní testovanej látky, kontrolná skupina dostane nosi č 
v najvyššom používanom objeme.
 
1.5.3.  Kontrola spo ľahlivosti  
Laboratórium, ktoré vykonáva štúdiu, predloží údaje, ktoré dokazujú 
jeho spôsobilos ť vykonať túto štúdiu a citlivos ť použitých postupov. 
Takéto údaje poskytnú dôkaz schopnosti zis ťovať a kvantifikova ť 
podľa potreby zmeny v rozli čných kone čných bodoch, odporú čaných 
pre pozorovanie, ako napr. autonómne príznaky, senzorická reakti ­
vita, sila uchopenia kon čatín a motorická aktivita. Informácie 
o chemikáliách, ktoré spôsobujú rôzne typy neurotoxických reakcií a ktoré by sa mohli použi ť ako pozitívne kontrolné látky je možné 
nájsť v odkazoch 2 až 9. Môžu sa použi ť predchádzajúce údaje, ak 
základné aspekty experimentálnych postupov zostávajú rovnaké. Odporúča sa pravidelná aktualizácia predchádzajúcich údajov. Ak 
vykonávacie laboratórium zmenilo ur čitý základný prvok pri usku ­
točňovaní testu alebo postupov, je potrebné zisti ť nové údaje 
potvrdzujúce nezmenenú citlivos ť postupov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Výber dávky  
Veľkosti dávok sa zvolia na základe posúdenia každej už zistenej 
toxicity a dostupných kinetických údajov pre testovanú látku alebo príbuzné materiály. Najvyššia dávka sa zvolí s cie ľom vyvola ť 
neurotoxické ú činky alebo jasné ú činky systémovej toxicity. Potom 
sa klesajúca postupnos ť hladín dávok zvolí tak, aby sa preukázala 
každá reakcia súvisiaca s dávkou a najnižšia hladina bez pozorova ­
ného nepriaznivého ú činku (NOAEL). V zásade sa hladiny dávok 
stanovia tak, aby sa primárne toxické ú činky na nervový systém dali 
odlíšiť od účinkov súvisiacich so systémovou toxicitou. Intervaly 
dávkovania s faktorom dva až tri sú často optimálne a pridanie 
štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie ve ľmi 
veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami. Ak 
existuje realistický odhad expozície ľudí, tiež sa zoh ľadní.
 
1.5.5.  Limitný test  
Ak sa na základe štúdie s jednou dávkou aspo ň 1 000 mg/kg telesnej 
hmotnosti/de ň s použitím postupov, uvedených pre túto štúdiu, nezistia 
žiadne pozorovate ľné neurotoxické ú činky a ak sa neo čakáva toxicita 
na základe údajov o štrukturálne príbuzných látkach, potom sa môže 
upustiť od úplnej štúdie s použitím troch dávok. Z o čakávanej expo ­
zície ľudí môže vyplýva ť potreba, aby sa v limitnom teste použili 
vyššie orálne dávky. V prípade iných druhov podávania, ako je napr. 
inhalácia alebo dermálna aplikácia, fyzikálno-chemické vlastností 
testovanej látky často môžu ur čovať maximálnu prípustnú úrove ň 
expozície. Pre uskuto čnenie orálnej akútnej štúdie má by ť dávka pre 
limitný test minimálne 2 000 mg/kg.  
1.5.6.  Podávanie dávok  
Zvieratám sa podáva testovaná dávka každý de ň, 7 dní v týždni 
počas obdobia minimálne 28 dní; použitie pä ťdňového režimu 
dávkovania alebo kratšiu dobu expozície je potrebné zdôvodni ť. 
Ak sa testovaná látka podáva cez sondu, podáva sa ako jednorazová dávka s použitím žalúdo čnej sondy alebo vhodnej intuba čnej kanyly. 
Maximálny objem kvapaliny, ktorý sa môže jednorázovo poda ť 
závisí od ve ľkosti pokusných zvierat. Objem nebude vyšší ako 1 ml/ ­
100 g telesnej hmotnosti. V prípade vodných roztokov sa však môže uvážiť použitie do 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráž ­
divých alebo žieravých látok, ktoré zvy čajne pri vyšších koncentrá ­
ciách spôsobia zhoršenie ú činkov, variabilita v aplikovanom objeme 
sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabez ­
pečil stály objem vo všetkých dávkach. 
Pre látky podávané v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpe ­ 
čiť, aby množstvá použitej testovanej látky neinterferovali 
s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Ke ď sa testovaná 
látka podáva v krmive, môže sa použi ť buď stála koncentrácia 
v krmive (ppm) alebo stála ve ľkosť dávky vzh ľadom na telesnú 
hmotnosť zvieraťa; iné možnosti sa musia špecifikova ť. V prípade, 
keď sa látka podáva sondou, látka sa podáva približne v rovnaký čas 
každý de ň a prispôsobí sa pod ľa potreby, aby sa zachovala stála 
veľkosť dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť. Ak sa uskuto ční 
predbežná štúdia pri opakovaných dávkach pred uskuto čnením dlho ­
dobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použi ť
 podobné krmivo. 
V prípade akútnych štúdií, ke ď nie je možná jednorazová dávka, sa 
dávka môže podáva ť v menších množstvách v priebehu maximálne 
24 hodín.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. POZOROVANIE  
1.6.1.  Frekvencia vyšetrení a testy  
V štúdiách pri opakovaných dávkach vymedzený čas pozorovania 
pokrýva obdobie dávkovania. V štúdiách akútnej toxicity sa sleduje 
14-denné obdobie po ošetrení. V prípade zvierat vo ved ľajších skupi ­
nách, ktoré sa držia bez expozície po čas obdobia po ošetrení, vyme ­
dzený čas pozorovania pokrýva aj toto obdobie. 
Vyšetrenia sa uskuto čnia dostato čne často, aby sa dosiahla maxi ­
málna pravdepodobnos ť zistenia všetkých behaviorálnych a/alebo 
neurologických abnormalít. Vyšetrenia sa uskuto čnia pokia ľ možno 
v rovnaký čas každý de ň pri zohľadnení obdobia, ke ď sa predpokla ­
dajú maximálne ú činky po dávkovaní. Frekvencia klinických vyšet ­
rení a funk čných testov je zosumarizovaná v tabu ľke 2. Ak 
z kinetických alebo iných údajov z predchádzajúcich štúdií vyplýva potreba použi ť odlišné časové body pre vyšetrenia, testy alebo 
obdobia po vyšetrení, prijme sa alternatívny harmonogram, aby sa 
získalo maximálne množstvo informácií. Uvedie sa zdôvodnenie 
zmien harmonogramu.
 
1.6.1.1.  Pozorovania všeobecného zdravotného stavu a mortality/morbidity  
Zdravotný stav všetkých zvierat sa pozorne vyšetrí aspo ň raz denne, 
morbidita a mortalita sa zis ťuje aspoň dvakrát denne.  
1.6.1.2.  Podrobné klinické vyšetrenia  
Všetky zvieratá vybraté na tento ú čel sa podrobne klinicky vyšetria 
(pozri tabu ľku 1), jedenkrát pred prvou expozíciou (na umožnenie 
porovnaní medzi pokusnými zvieratami) a potom v rôznych interva ­
loch v závislosti na trvaní štúdie (pozri tabu ľku 2). Podrobné 
klinické vyšetrenia ved ľajších skupín na regeneráciu sa vykonajú 
na konci obdobia regenerácie. Podrobné klinické vyšetrenia sa vyko ­
najú mimo domácej klietky v zvy čajnej vyšetrovacej miestnosti. 
Starostlivo sa zaznamenajú s použitím systému hodnotenia, ktorý zahrnuje kritériá alebo stupnicu hodnotenia pre každé meranie pri vyšetreniach. Použité kritériá alebo stupnice explicitne definuje testo ­
vacie laboratórium. Je potrebné vynaloži ť úsilie na zabezpe čenie, aby 
zmeny testovacích podmienok boli minimálne (nie systematicky súvisiace s ošetrením) a aby pozorovania vykonávali vyškolení pracovníci, ktorí nie sú oboznámení o prebiehajúcom ošetrení. 
Odporúča sa, aby sa pozorovania vykonávali štruktúrovanej podobe, 
pri ktorej sa presne definované kritéria (vrátane definície normálneho 
„rozsahu“) systematicky uplat ňujú na každé zviera v každom čase 
pozorovania. „Normálny rozsah“ sa príslušne zdokumentuje. Všetky pozorované príznaky sa zaznamenajú. Vždy, ke ď je to možné, zazna ­
mená sa aj závažnos ť pozorovaných príznakov. Klinicky sa pozorujú 
okrem iného zmeny na koži, srsti, o čiach, slizniciach, výskyt 
sekrétov a sekrétov a autonómnu aktivitu (napr. slzenie, zježenie, veľkosť zreničky, nezvy čajný priebeh dýchania a/alebo dýchanie 
ústami, všetky nezvy čajné príznaky pri mo čení alebo vyprázd ňovaní 
a bezfarebný mo č).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Všetky nezvy čajné reakcie, pokia ľ ide o polohu tela, stupe ň aktivity 
(napr. zvýšený alebo znížený záujem o preskúmanie zvy čajného 
priestoru) a koordinácia pohybu, sa tiež zaznamenajú. Zmeny chôdze (napr. tackavá chôdza, ataxia), poloha (napr. zhrbená) a reaktivita na zaobchádzanie, premiestnenie alebo iné podnety z prostredia, ako aj 
výskyt klonických alebo tonických pohybov, k ŕče alebo triaška, 
stereotypy (napr. nadmerná starostlivos ť o srsť, nezvyčajné pohyby 
hlavou, opakovaný beh dokola) alebo zvláštne správanie (napr. hryzenie alebo nadmerné olizovanie, sebamrza čenie, chôdza dozadu, 
vydávanie zvukov) alebo agresia sa zaznamenajú.
 
1.6.1.3.  Funk čné testy  
Podobne ako pri podrobných klinických pozorovania, uskuto čnia sa 
funkčné testy raz pred expozíciou a opakovane potom u všetkých 
zvierat, vybratých na tento ú čel (pozri tabu ľku 1). Frekvencia funk č­
ných testov závisí aj od trvania štúdie (pozri tabu ľku 2). Okrem 
období pozorovania, ako je uvedené v tabu ľke 2, sa vykonajú 
funkčné vyšetrenia ved ľajších regenerujúcich skupín čo možno 
najbližšie k času kone čného usmrtenia. Funk čné testy by mali 
zahrnovať senzorickú reaktivitu na rôznorodé podnety [napr. 
sluchové, vizuálne a proprioceptívne podnety (5), (6), (7)], hodno ­
tenie sily uchopenia kon čatín (8) a hodnotenie motorickej aktivity 
(9). Motorická aktivita sa zmeria automatickým prístrojom, ktorým je 
možné stanovi ť poklesy aj nárasty aktivity. Ak sa použije iný defi ­
novaný systém, je potrebné, aby bol kvantitatívny a jeho citlivos ť 
a spoľahlivosť preukázaná. Každý prístroj by mal by ť testovaný, aby 
sa zaručila dlhodobá spo ľahlivosť a porovnate ľnosť prístrojov. 
Ďalšie údaje o postupoch, ktoré je možné použi ť, sú uvedené 
v príslušných odkazoch. Ak neexistujú žiadne údaje (napr. štruktu ­
rálna aktivita, epidemiologické údaje, iné toxikologické štúdie), 
z ktorých by vyplývali potenciálne neurotoxické ú činky, je potrebné 
zvážiť zahrnutie špecializovanej ší ch testov citlivosti a motorickej 
funkcie alebo schopnosti u čiť sa a pamäta ť si na podrobnejšie preskú ­
manie týchto možných ú činkov. Viac informácií o špecializovanejších 
testoch a ich používaní sa nachádza v odkaze (1). 
Vo výnimo čných prípadoch sa zvieratá, ktoré vykazujú príznaky 
toxicity v miere, ktorá by mohla významne ovplyvni ť funkčný 
test, môžu vylú čiť z takého testu. Uvedie sa zdôvodnenie 
v prípade vylú čenia zvierat z funk čného testu.  
1.6.2.  Telesná hmotnos ť a spotreba potravy/vody  
Pri štúdiách s trvaním do 90 dní by sa všetky zvieratá mali odváži ť 
aspoň raz za týžde ň a spotreba potravy (spotreba vody, ke ď sa 
testovaná látka podáva cez toto médium) by sa mala zmera ť aspoň 
raz za týžde ň. Pri dlhodobých štúdiách by sa všetky zvieratá mali 
odvážiť aspoň raz za týžde ň v prvých 13 týžd ňoch a potom aspo ň 
raz za každé 4 týždne. Spotreba potravy (spotreba vody, ke ď sa 
testovaná látka podáva cez toto médium) by sa mala zmera ť aspoň 
raz za týžde ň v prvých 13 týžd ňoch a potom približne 
v trojmesa čných intervaloch, pokia ľ sa nevyžaduje inak na základe 
zdravotného stavu alebo telesnej hmotnosti.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmológia  
Pri štúdiách, ktoré trvajú viac ako 28 dní, sa oftalmologicky vyšetria 
s použitím oftalmoskopu, alebo porovnate ľného prístroja, pred 
podaním testovanej látky a pri ukon čení štúdie pokia ľ možno všetky 
zvieratá alebo aspo ň zvieratá v skupinách s vysokými dávkami 
a kontrolných skupinách. Ak sa zistia zmeny na o čiach, alebo ak 
je to potrebné na základe klinických príznakov, vyšetria sa všetky zvieratá. Pri dlhodobých štúdiách sa oftalmologické vyšetrenie 
vykoná aj po 13 týžd ňoch. Oftalomologické vyšetrenia nieje 
potrebné vykona ť, ak sú už tieto údaje dostupné z iných štúdií, 
ktoré majú podobné trvanie a podobné ve ľkosti dávok.
 
1.6.4.  Hematológia a klinická biochémia  
Ak sa štúdia neurotoxicity uskuto čňuje v kombinácii so štúdiou 
systémovej toxicity pri opakovanej dávke, vykonajú sa hematolo ­
gické a klinicko-biochemické vyšetrenia, ako je uvedené 
v príslušnej metóde štúdie systémovej toxicity. Vzorky sa získajú 
tak, aby sa minimalizovali akéko ľvek prípadné ú činky na neurolo ­
gické správanie.  
1.6.5.  Histopatológia  
Neuropatologické vyšetrenie sa zameria na doplnenie a rozšírenie 
pozorovaní uskuto čnených po čas in vivo  fázy štúdie. Tkanivá od 
aspoň 5 zvierat/pohlavie/skupinu (pozri tabu ľku 1 a ďalší odsek) sa 
fixujú  in situ  s použitím všeobecne uznaných perfúznych a fixa čných 
techník (pozri odkaz 3, kapitola 5 a odkaz 4, kapitola 50). Všetky viditeľné makroskopické zmeny sa zaznamenávajú. Ke ď sa štúdia 
uskutoční ako samostatná štúdia na zistenie neurotoxicity alebo na 
charakterizáciu neurotoxických ú činkov, zvyšné zvieratá sa môžu 
použiť buď na špecifické neurobehaviorálne (10), (11), neuropatolo ­
gické (10), (11), (12), (13), neurochemické (10), (11), (14), (15) alebo elektrofyziologické (10), (11), (16), (17) vyšetrenia, ktoré môžu 
doplniť postupy a vyšetrenia uvedené v tomto materiáli, alebo na 
zvýšenie po čtu histopatologicky vyšetrených jedincov. Tieto doda ­
točné postupy môžu by ť osobitne užito čné, keď empirické pozorovania 
alebo očakávané ú činky indikujú špecifický typ alebo cie ľové tkanivo 
v prípade neurotoxicity (2), (3). Podobe sa zvyšné zvieratá môžu 
použiť aj na bežné patologické hodnotenia, ako je uvedené v metóde 
pre štúdie pri opakovaných dávkach. 
Všetky vzorky tkanív zaliate v parafíne sa zafarbia zvy čajnou metó ­
dou, ako je hematoxylín a eozín (H&E), a mikroskopicky vyšetria. Ak sa zistia alebo predpokladajú príznaky periferálnej neuropatie, vyšetria sa vzorky periferálnych nervov zaliate v umelej hmote. 
Klinické príznaky môžu tiež poukáza ť na ďalšie miesta, ktoré je 
potrebné vyšetri ť, alebo na použitie špeciálneho postupu farbenia. 
Usmernenie o ďalších miestach, ktoré je potrebné vyšetri ť, je 
možné nájs ť v odkazoch (3), (4). Vhodné špeciálne farbivá na 
dôkaz špecifických typov patologických zmien môžu by ť tiež 
užitočné (18).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Reprezentatívne rezy tkanív centrálneho a periferálneho nervového 
systému sa histologicky vyšetria (pozri odkaz 3, kapitola 5, a odkaz 
4, kapitola 50). Zvy čajne sa vyšetria tieto oblasti: predný mozog, 
stred veľkého mozgu vrátane rezu cez hipokampus, stredný mozog, 
malý mozog, most, pred ĺžená miecha, oko s o čným nervom 
a sietnica, zvä čšenie miechy na kr čných a bedrových častiach, 
chrbtové kore ňové uzliny, tkanivá chrbtové a dutiny, proximálny 
sedací nerv, proximálny tibiálny nerv (na kolene) a tibiálne vetvy nervu lýtkového svalu. Rezy tkanív miechy a periferálnych nervov 
budú obsahova ť ako krížové, tak aj prie čne a pozd ĺžne rezy. Je 
potrebné venova ť pozornos ť cievnatosti nervového systému. Vzorka 
kostrového svalu, predovšetkým lýtkového svalu sa tiež vyšetrí. Osobitnú pozornos ť je potrebné venova ť oblastiam s bunkovou 
a vláknitou štruktúrou a vzorke v CNS a PNS, o ktorých je známe, 
že sú osobitne náchylné na neurotoxikanty. 
Poznámky o neuropatologických zmenách, ktoré sú typické na základe 
expozície toxickej látky, je možné nájs ť v odkazoch (3), (4). Odporú ča 
sa postupné vyšetrenie vzoriek tkanív, pri ktorých sa rezy zo skupiny s vysokou dávkou najskôr porovnajú s rezmi z kontrolnej skupiny. Ak sa nezistia žiadne neuropatologické zmeny vo vzorkách z týchto 
skupín, nie je potrebná ďalšia analýza. Ak sa neuropatologické zmeny 
zistia v skupine s vysokou dávkou, vzorka z každého potenciálne zasiahnutého tkaniva zo skupín so strednými a nízkymi dávkami sa potom zakóduje a následne vyšetrí. 
Ak sa zistí akýko ľvek dôkaz neuropatologických zmien pri kvalita ­
tívnom vyšetrení, vykoná sa druhé vyšetrenie všetkých oblastí nervo ­
vého systému, kde sa tieto zmeny vyskytnú. Rezy zo všetkých 
dávkových skupín zo všetkých potenciálne zasiahnutých oblastí sa 
zakódujú a náhodne vyšetria bez informácií o kóde. Zaznamená sa frekvencia a závažnos ť každého poškodenia. Po posúdení všetkých 
oblastí zo všetkých dávkových skupín sa môže kódovanie zruši ť 
a môže sa vykona ť štatistická analýza na vyhodnotenie vz ťahov 
medzi dávkou a reakciou. Je potrebné opísa ť príklady rôznych 
stupňov závažnosti každého poškodenia. 
Neuropatologické zistenia by sa mali vyhodnocova ť v súvislosti 
s pozorovaniami a meraniami správania, ako aj s inými údajmi z predchádzajúcich a sú časných štúdií systémovej toxicity testovanej 
látky.
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Je potrebné uvies ť jednotlivé údaje. Okrem toho by sa všetky údaje 
mali zhrnú ť v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú 
a kontrolnú skupinu po čet zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat, 
ktoré sa našli uhynuté po čas testu, alebo sa usmrtili z humánnych 
dôvodov, čas každého uhynutia alebo humánneho usmrtenia, popis 
príznakov zistenej toxicity, vrátane času nástupu, trvania, typu 
a závažnosti toxických ú činkov, po čet zvierat vykazujúcich poško ­
denia, vrátane typu a závažnosti poškodení.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Zistenia zo štúdie sa vyhodnocujú na základe výskytu, závažnosti 
a vzájomného vz ťahu medzi neurobehaviorálnymi 
a neuropatologickými ú činkami (aj neurochemické alebo elektrofy ­
ziologické ú činky, ak sa vykonali aj ďalšie vyšetrenia) a všetky 
ostatné zistené nepriaznivé ú činky. Ak je to možné číselné výsledky 
sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne akceptovate ľnou štatistickou 
metódou. Štatistické metódy by sa mali vybra ť počas prípravnej 
fázy štúdie.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter (vrátane izomerizácie, čistoty a fyzikálno- 
chemických vlastností), 
— identifika čné údaje. 
Nosič (v prípade potreby): 
— zdôvodnenie výberu nosi ča. 
Pokusné zvieratá: — použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, aklimatizácia, krmivo at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu. 
Testovacie podmienky: 
— údaje o príprave testovanej látky/krmiva, dosiahnutých koncen ­
tráciách, stabilite a homogenite prípravku, 
— špecifikácia podávaných dávok, vrátane údajov o nosi či, objeme 
a fyzikálnej forme podávaného materiálu, 
— údaje o podávaní testovanej látky, 
— zdôvodnenie výberu ve ľkosti dávok, 
— zdôvodnenie cesty podávania a trvania expozície, — prepo čet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode 
(ppm) na skuto čnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), ak je 
potrebné, 
— údaje o kvalite krmiva a vody. Pozorovania a postupy testovania: — údaje o zaradení zvierat v jednotlivých skupinách do podskupín 
na perfúzne fixovanie, 
— údaje o systémoch hodnotenia, vrátane kritérií a stupníc hodno ­
tenia pre každé meranie v podrobných klinických vyšetreniach,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— údaje o funk čných testoch na senzorickú reaktivitu na rôznorodé 
podnety (napr. sluchové, vizuálne a proprioceptívne podnety); na 
hodnotenie sily uchopenia kon čatín a na hodnotenie motorickej 
aktivity (vrátane údajov o automatických prístrojoch na zistenie aktivity) a iné použité postupy, 
— údaje o oftalmologických vyšetreniach a v prípade potreby hema ­
tologických vyšetreniach a klinicko-biochemických testoch s príslušnými základnými hodnotami, 
— údaje pre špecifické neurobehaviorálne, neuropatologické, neuro ­
chemické alebo elektrofyziologické postupy. 
Výsledky: 
— telesná hmotnos ť/zmeny telesnej hmotnosti, vrátane telesnej 
hmotnosti v čase usmrtenia, 
— spotreba potravy a vody, pod ľa potreby, 
— údaje o toxickej reakcii pod ľa pohlavia a dávky, vrátane 
príznakov toxicity alebo mortality, 
— charakter, závažnos ť a trvanie ( čas nástupu a následný priebeh) 
podrobných klinických vyšetrení (s údajmi o reverzibilite), 
— podrobný popis všetkých výsledkov funk čných testov, 
— nálezy z autopsie, — podrobný popis všetkých neurobehaviorálnych, neuropatologic ­
kých a neurochemických alebo elektrofyziologických nálezov, 
ak sú k dispozícii, 
— údaje o absorpcii a metabolizme, ak sú k dispozícii, 
— štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby. 
Diskusia k výsledkom: 
— informácie o reakcii na dávku, 
— vzťah medzi inými toxickými ú činkami pre výsledné posúdenie 
neurotoxického potenciálu testovanej chemikálie, 
— hladina bez pozorovaného nepriaznivého ú činku. 
Závery: 
— potrebné je konkrétne stanovisko k celkovej neurotoxicite testo ­
vanej chemikálie.
 
4. ODKAZY  
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation. 
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation. 
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals. 
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999 – 
1003. 
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691 – 704. 
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267 – 283. 
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., 1, 233 – 236. 
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599 – 609. 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York. 
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York. 
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689 – 695. 
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343 – 352. 
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 
10, 445 – 452. 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368 – 378. 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299 – 335. 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co.,. Baltimore, London, pp. 726 – 742. 
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techni ­
ques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabuľka 1 
Minimálny po čet zvierat potrebných na skupinu, ke ď sa štúdia neurotoxicity uskuto čňuje samostatne alebo 
v kombinácii s inými štúdiami  
ŠTÚDIA NEUROTOXICITY SA USKUTO ČŇUJE AKO: 
Samostatná štúdia Kombinovaná štúdia 
s 28-dennou štúdiou Kombinovaná štúdia 
s 90-dennou štúdiou Kombinovaná štúdia so 
štúdiou chronickej 
toxicity  
Celkový po čet zvierat na 
skupinu 10 samcov a 10 
samíc 10 samcov a 10 
samíc 15 samcov a 15 
samíc 25 samcov a 25 
samíc 
Počet zvierat vybratých na 
funkčné testovanie, vrátane 
podrobných klinických vyšetrení 10 samcov a 10 
samíc 10 samcov a 10 
samíc 10 samcov a 10 
samíc 10 samcov a 10 
samíc 
Počet zvierat vybratých na 
perfúznu fixáciu  in situ  
a neurohistopatológiu 5 samcov a 5 samíc 5 samcov a 5 samíc 5 samcov a 5 samíc 5 samcov a 5 samíc 
Počet zvierat vybratých na 
vyšetrenia toxicity pri opakovanej dávke/subchro ­
nickej/chronickej toxicity, 
hematológiu, klinickú 
biochémiu, histopatológiu atď., ako sa uvádza 
v príslušných usmerneniach 
(Guidelines ) 5 samcov a 5 samíc 10 samcov † a 10 
samíc † 20 samcov † a 20 
samíc † 
Doplňujúce vyšetrenia, 
podľa potreby 5 samcov a 5 samíc
 
† Vrátane piatich zvierat vybratých na funk čné testovanie a podrobné klinické vyšetrenia ako sú časť štúdie neurotoxicity.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabuľka 2 
Frekvencia klinických vyšetrení a funk čné testy  
Typ vyšetrení Trvanie štúdie 
Akútna 28-denná 90-denná Chronická  
U všetkých zvierat Všeobecný zdra ­
votný stav denne denne denne denne 
Mortalita/morbi ­
dita dvakrát denne dvakrát denne dvakrát denne dvakrát denne 
U zvierat vybratých 
na funkčné vyšet­
renia Podrobné 
klinické vyšet ­
renia — pred prvou 
expozíciou 
— počas 8 
hodín po 
podaní 
dávky v čase 
očakávaného 
maximál­
neho účinku 
— v deň 7 a 14 
po podaní dávky — pred prvou 
expozíciou 
— potom 
jedenkrát 
týždne — pred prvou 
expozíciou 
— počas 
prvého alebo 
druhého 
týždňa expo­
zície 
— potom 
mesačne — pred prvou 
expozíciou 
— jedenkrát na 
konci prvého 
mesiaca 
expozície 
— potom každé 
tri mesiace 
Funkčné testy — pred prvou 
expozíciou 
— počas 8 
hodín po podaní 
dávky v čase 
očakávaného 
maximál­
neho účinku 
— v deň 7 a 14 
po podaní dávky — pred prvou 
expozíciou 
— počas 
štvrtého týždňa ošet
­
renia čo 
možno najbližšie ku koncu 
obdobia 
expozície — pred prvou 
expozíciou 
— jedenkrát 
počas 
prvého alebo 
druhého 
týždňa expo­
zície 
— potom 
mesačne — pred prvou 
expozíciou 
— jedenkrát na 
konci prvého mesiaca 
expozície 
— potom každé 
tri mesiace
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORPCIA KOŽOU: METÓDA  IN VIVO  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je ekvivalentná OECD TG 427 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Mnohé chemické látky pôsobia predovšetkým cez kožu, zatia ľ čo vo 
väčšine toxikologických štúdií na laboratórnych zvieratách sa 
používa perorálny spôsob podania. Štúdia perkutánnej absorpcie  in 
vivo stanovená týmto usmernením poskytuje prepojenie potrebné pre 
extrapoláciu perorálnych štúdií, ke ď sa vykonáva posudzovanie 
bezpečnosti po dermálnej expozícii. 
Kým sa látka môže dosta ť do krvného obehu, musí preniknú ť cez 
veľký počet bunkových vrstiev. Vrstva ur čujúca rýchlos ť je pre 
väčšinu látok  stratum corneum  pozostávajúca z m ŕtvych buniek. 
Priepustnos ť cez kožu závisí tak od lipofility chemickej látky, ako 
aj od hrúbky vonkajšej vrstvy epidermy a od faktorov, ako sú 
napríklad molekulová hmotnos ť a koncentrácia látky. Vo všeobec ­
nosti je koža potkanov a králikov priepustnejšia ako koža človeka, 
kým priepustnos ť kože mor čiat a opíc sa vä čšmi podobá priepust ­
nosti ľudskej kože. 
Metódy merania perkutánnej absorpcie možno rozdeli ť do dvoch kate ­
górií;  in vivo  a in vitro.  Metóda  in vivo  dokáže poskytnú ť dobré infor ­
mácie o absorpcii kožou pri rôznych druhoch laboratórnych zvierat. 
Nedávno sa vyvinuli metódy  in vitro.  Tieto metódy využívajú transport 
cez celú alebo čiastočnú hrúbku kože zviera ťa alebo človeka do zásob ­
níka tekutiny. Metóda  in vitro  je opísaná v samostatnej testovacej 
metóde (1). Na pomoc pri výbere najvhodnejšej metódy v danej situácii 
sa odporú ča preštudova ť OECD Guidance Document for the Conduct 
of Skin Absorption Studies  (2), pretože uvádza sa tam viac podrobností 
o vhodnosti metód  in vivo,  ako aj  in vitro.  
Pri metóde  in vivo,  ktorá sa tu opisuje, je možné ur čiť prienik testovanej 
látky cez kožu do krvného obehu. Táto technika sa široko používa mnoho rokov (3), (4), (5), (6), (7). Hoci štúdie perkutánnej absorpcie  
in vitro  môžu by ť v mnohých prípadoch vhodné, môžu sa vyskytnú ť 
situácie, ke ď potrebné údaje môže poskytnú ť iba štúdia  in vivo.  
Výhody metódy  in vivo  sú, že používa fyziologicky a metabolicky 
nedotknutý systém, používa živo číšne druhy spolo čné mnohým 
štúdiám toxicity a možno ju modifikova ť na použitie s inými živo ­ 
číšnymi druhmi. Nevýhodami sú používanie živých zvierat, potreba 
rádioaktívne ozna čeného materiálu na dosiahnutie spo ľahlivých 
výsledkov, ťažkosti pri stanovovaní po čiatočnej fázy absorpcie 
a rozdiely v priepustnosti kože uprednost ňovaných druhov (potkan) 
a ľudskej kože. Zvieracia koža je vo všeobecnosti priepustnejšia, 
a preto v prípade človeka môže dôjs ť k nadhodnoteniu perkutánnej 
absorpcie (6), (8), (9). Leptavé/žieravé látky by sa nemali testova ť na 
živých zvieratách.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Neabsorbovaná dávka:  predstavuje dávku zmytú z povrchu kože po 
expozícii a akéko ľvek množstvo prítomné na neokluzívnom krycom 
materiáli, vrátane akejko ľvek dávky, ktorá sa preukázate ľne odparila 
z kože po čas expozície.  
Absorbovaná dávka (in vivo):  dávka prítomná v mo či, vo zvyškoch 
v klietke, výkaloch, vydychovanom vzduchu (ak sa meria), krvi, tkanivách (ak sa odoberajú) a v zostávajúcich častiach m ŕtveho 
tela po odstránení kože z miesta aplikácie.  
Absorbovate ľná dávka:  je dávka, ktorá je prítomná na koži alebo 
v koži po omytí.
 
1.3. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka, prednostne rádioaktívne ozna čená, sa nanesie na ostri ­
hanú kožu zvierat v jednej úrovni dávky alebo vo viacerých primera ­
ných úrovniach dávok v podobe reprezentatívnej vzorky používaného prípravku. Testovací prípravok možno ponecha ť v styku s kožou na 
vopred ur čený čas pod vhodným krycím materiálom (neokluzívnym, 
polookluzívnym alebo okluzívnym), aby sa zabránilo požitiu testova ­
cieho prípravku. Po uplynutí času pôsobenia sa krycí materiál odstráni 
a koža sa vy čistí vhodným čistiacim činidlom, krycí materiál a čistiaci 
materiál sa uchovajú na analýzu a aplikuje sa nový krycí materiál. 
Zvieratá sú pred dobou expozície, po čas nej a po nej umiestnené 
v jednotlivých metabolických klietkach a exkrementy a vydychovaný 
vzduch sa po čas tejto doby odoberajú na analýzu. Zber vydýchaného 
vzduchu možno vynecha ť, ak sú dostato čné informácie o tom, že sa 
vytvára málo prchavý rádioaktívny metabolit alebo sa nevytvára. Každá štúdia bude zvy čajne obsahova ť niekoľko skupín zvierat, 
ktoré budú exponované testovaciemu prípravku. Jedna skupina bude 
na konci expozi čnej doby usmrtená. Ostatné skupiny budú usmrtené 
v naplánovaných časových intervaloch (2). Po uplynutí času odberu 
vzoriek sa usmrtia ostatné zvieratá, na analýzu sa odoberie ich krv, 
miesto aplikácie sa odoberie na analýzu a m ŕtve telá sa analyzujú so 
zreteľom na prítomnos ť nevylúčeného materiálu. Vzorky sa analyzujú 
vhodnými prostriedkami a vykoná sa odhad miery perkutánnej absorpcie (6), (8), (9).
 
1.4. OPIS METÓDY  
1.4.1.  Výber živo číšnych druhov  
Najčastejšie používaným živo číšnym druhom je potkan, možno však 
použiť aj kmene bez srsti a druhy zvierat, ktorých absorpcia kožou 
sa väčšmi podobná absorpcii ľudskou kožou (3), (6), (7), (8), (9). 
Mali by sa používa ť mladé dospelé zdravé zvieratá rovnakého 
pohlavia (automatiky zvoleným pohlavím sú samce) kme ňov bežne 
využívaných v laboratóriách. Na za čiatku štúdie by hmotnostné 
odchýlky medzi použitými zvieratami nemali prevyšova ť priemernú 
hmotnosť o viac než ± 20 %. Vhodní sú napríklad samce potkanov 
s hmotnos ťou 200 g – 250 g, najmä samce v hornej polovici tohto 
hmotnostného rozsahu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Po čet zvierat a ich pohlavie  
Pre každý testovací prípravok a pre každý stanovený čas skončenia 
treba použi ť skupinu najmenej štyroch zvierat rovnakého pohlavia. 
Každá skupina zvierat bude usmrtená po inom časovom intervale, 
napríklad na konci expozície (zvy čajne 6 alebo 24 hodín) a pri 
následných príležitostiach (napr. 48 a 72 hodín). Ak sú dostupné údaje, ktoré predstavujú podstatné rozdiely v dermálnej toxicite medzi samcami a samicami, malo by sa vybra ť pohlavie, ktoré je 
citlivejšie. Ak takéto údaje nie sú dostupné, možno použi ť hociktoré 
pohlavie.
 
1.4.3.  Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
Teplota experimentálnej miestnosti, kde sú zvieratá umiestnené, by 
mala byť 22  o C (± 3  o C). Hoci relatívna vlhkos ť by mala by ť 
najmenej 30 % a prednostne by nemala presiahnu ť 70 %, okrem 
času čistenia miestnosti, cie ľom by mala by ť 50 – 60 % vlhkos ť. 
Osvetlenie by malo by ť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 
hodín tmy. Na k ŕmenie možno použi ť konvenčnú laboratórnu 
potravu, ktorá by mala by ť voľne dostupná spolu s neobmedzenou 
dodávkou pitnej vody. Po čas vykonávania štúdie a prednostne takisto 
počas aklimatizácie sa zvieratá umiestnia jednotlivo do metabolic ­
kých klietok. Ke ďže rozsypaná potrava a rozliata voda by mohli 
ohroziť kvalitu výsledkov, mala by sa minimalizova ť pravdepodob ­
nosť takýchto udalostí.  
1.4.4.  Príprava zvierat  
Zvieratá sú ozna čené spôsobom, ktorým sa umož ňuje ich individu ­
álna identifikácia, a umiestnia sa do klietok minimálne pä ť dní pred 
začiatkom štúdie, aby sa umožnila ich aklimatizácia na laboratórne 
podmienky. 
Po uplynutí aklimatiza čného obdobia a približne 24 hodín pred apli ­
káciou dávok sa na každom zvierati ostrihá z kože srs ť v oblasti 
pliec a chrbta. Vlastnosti priepustnosti poškodenej a nepoškodenej kože sa líšia a treba dba ť na to, aby sa zabránilo odieraniu kože. Po 
odstránení srsti a približne 24 hodín pred aplikovaním testovanej 
látky na kožu (pozri oddiel 1.4.7) treba povrch kože utrie ť acetónom, 
aby sa odstránil kožný maz. Ďalšie umytie mydlom a vodou sa 
neodporú ča, pretože akýko ľvek zvyšok mydla by mohol podpori ť 
absorpciu testovanej látky. Plocha aplikácie musí by ť dostatočne 
veľká, aby bolo možné spo ľahlivo vypo čítať absorbované množstvo 
testovanej chemickej látky na cm
 2 kože, prednostne najmenej na 
10 cm  2 . Takáto plocha je prakticky možná v prípade potkanov 
s telesnou hmotnos ťou 200 – 250 g. Po príprave sú zvieratá vrátené 
do metabolických klietok.  
1.4.5.  Testovaná látka  
Testovaná látka je entita, ktorej penetra čné vlastnosti sa majú zis ťo­
vať. V ideálnom prípade by testovaná látka mala by ť rádioaktívne 
označená. 
1.4.6.  Testovací prípravok  
Príprava testovanej látky (napr. čistý, zriedený alebo pod ľa receptu 
pripravený materiál obsahujúci testovanú chemickú látku, ktorá sa aplikuje na kožu) by mala by ť rovnaká (alebo by mala by ť realis­
tickou náhradkou) ako v prípade látky, ktorej môžu by ť exponovaní 
ľudia alebo iné potenciálne cie ľové živo číšne druhy. Akéko ľvek 
odchýlky od „používaného“ prípravku, sa musia zdôvodni ť. Ak je 
to potrebné, testovaná látka sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom prenáša či. V prípade prenáša čov odlišných od vody by 
mali byť známe absorp čné charakteristiky a potenciálna interakcia 
s testovanou látkou.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Aplikácia na kožu  
Na povrchu kože sa vymedzí miesto aplikácie so špecifickou ve ľko­
sťou povrchu. Potom sa na toto miesto rovnomerne aplikuje známe 
množstvo testovacieho prípravku. Toto množstvo by zvy čajne malo 
imitovať množstvo, ktorému je potenciálne exponovaný človek, 
zvyčajne 1 – 5 mg/cm  2 pre tuhú látku alebo do 10 μl/cm  2 pre 
tekutiny. Akéko ľvek iné množstvá by sa mali zdôvodni ť predpokla ­
danými podmienkami používania, cie ľmi štúdie alebo fyzikálnymi 
vlastnosťami testovacieho prípravku. Po aplikácii musí by ť takto 
ošetrené miesto chránené pred zotretím. Príklad typického zariadenia je uvedený na obrázku 1. Miesto aplikácie sa zvy čajne chráni 
neokluzívnym krycím materiálom (napr. krycí materiál 
z priepustnej nylonovej gázy). Pri neur čitých aplikáciách však 
treba miesto aplikácie uzavrie ť. V prípade, že vyparovaním stredne 
prchavých testovaných látok sa miera vý ťažnosti testovanej látky 
znižuje na neprijate ľnú úroveň (pozri tiež oddiel 1.4.10 prvý odsek), 
vyparenú látku je potrebné zachyti ť vo filtri z aktívneho uhlia pokrý ­
vajúcim aplika čné zariadenie (pozri obrázok 1). Dôležité je, aby 
aplikačné zariadenie nepoškodzovalo kožu a aby neabsorbovalo 
testovací prípravok a nereagovalo s ním. Zvieratá sú vrátené do 
jednotlivých metabolických klietok na zber exkrementov.
 
1.4.8.  Trvanie expozície a odber vzoriek  
Trvanie expozície predstavuje časový interval medzi aplikáciou 
a odstránením testovacieho prípravku omytím kože. Mala by sa používať vhodná expozi čná doba (zvy čajne 6 alebo 24 hodín) na 
základe predpokladanej d ĺžky expozície človeka. Po expozi čnej 
dobe sa zvieratá držia v metabolických klietkach až do stanoveného skončenia štúdie. Zvieratá treba pozorova ť v pravidelných interva ­
loch počas celého trvania štúdie, či nevykazujú príznaky toxicity/ ­
abnormálnych reakcií. Na konci expozi čnej doby by sa ošetrená koža 
mala prehliadnu ť, či sú na nej vidite ľné znaky podráždenia. 
Metabolické klietky by mali po čas štúdie umož ňovať samostatný 
odber mo ču a fekálií. Mali by tiež umož ňovať odber oxidu uhli čitého
 
14 C a prchavých zlú čenín uhlíka  14 C, ktoré by sa mali analyzova ť, 
ak sa vytvárajú vo ve ľkom množstve (> 5 %). Mo č, fekálie 
a zachytené tekutiny (napr. oxid uhlíka  14 C a prchavé zlú čeniny  
14 C) by sa mali jednotlivo zbera ť pri každej skupine v každom 
čase odberu vzoriek. Ak existuje dostatok informácií o tom, že sa 
vytvára iba málo prchavý rádioaktívny metabolit alebo sa nevytvára, 
môžu sa použi ť otvorené klietky. 
Exkrementy sa zbierajú po čas doby pôsobenia do 24 hodín od 
prvého styku s kožou a potom denne do konca experimentu. Hoci zvyčajne budú sta čiť tri intervaly zberu exkrementov, predpokladaný 
účel testovacieho prípravku alebo existujúce kinetické údaje môžu 
naznačiť vhodnejšie alebo ďalšie časy pre štúdiu. 
Na konci expozi čnej doby sa ochranné zariadenie odstráni z každého 
zvieraťa a odloží sa oddelene na vykonanie analýzy. Exponovaná 
koža všetkých zvierat by sa mala omy ť najmenej trikrát čistiacim 
činidlom s použitím vhodných tampónov. Musí sa postupova ť 
opatrne, aby nedošlo ku kontaminácii ostatných častí tela. Čistiacim 
činidlom by mal by ť prostriedok používaný na bežnú hygienu, napr. 
vodný roztok mydla. Nakoniec by sa koža mala vysuši ť. Všetky 
tampóny a činidlá použité na omývanie, sa musia odloži ť na analýzu. 
Zvieratám v skupinách, ktoré budú zachované na neskoršie pozoro ­
vanie, treba pred ich vrátením do jednotlivých klietok aplikova ť 
čerstvý kryt na ochranu exponovaného miesta.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Závere čné postupy  
Jednotlivé zvieratá z každej skupiny by sa mali usmrti ť 
v plánovanom čase a mala by sa odobra ť krv na analýzu. Ochranné 
zariadenie alebo krycí materiál treba odobra ť na analýzu. Z každého 
zvieraťa by sa na osobitnú analýzu mala odobra ť koža z miesta 
aplikácie a vzorka neošetrenej kože z podobnej oblasti zbavenej srsti. Miesto aplikácie možno rozdeli ť oddelením  stratum corneum  od 
spodnej epidermy, aby sa získalo viac údajov o distribúcii testovanej 
látky. Stanovenie časovej závislosti tejto distribúcie po expozi čnej 
dobe by malo poskytnú ť niektoré údaje o osude testovanej chemickej 
látky v  stratum corneum.  Na uľahčenie rozdelenia kože (po 
konečnom omytí kože a usmrtení zviera ťa) sa odstránia všetky 
ochranné kryty. Z potkana s vyreže koža v mieste aplikácie vrátane kruhového okraja kože a prišpendlí sa na dosku. Na povrch kože sa pomocou jemného tlaku pritla čí prúžok lepiacej pásky a táto páska 
sa potom odstráni spolu s časťou stratum corneum.  Postupne sa 
aplikujú ďalšie prúžky pásky, až kým sa už páska nelepí na povrch 
kože a celá vrstva  stratum corneum  je odstránená Pre každé zviera 
možno všetky prúžky pásky vloži ť spolu do jedného zásobníka, do 
ktorého sa pridá činidlo na rozpad tkanív, ktorým sa rozpustí  stratum 
corneum.  Všetky potenciálne cie ľové tkanivá možno odobra ť na 
samostatné meranie skôr, ako sa analyzujú telesné zvyšky so zreteľom na dávku absorbovanú m ŕtvym telom. M ŕtve telá jednotli ­
vých zvierat by sa mali odloži ť na analýzu. Zvy čajne stačí analýza 
celkového obsahu. Cie ľové orgány sa môžu odobra ť na samostatnú 
analýzu (ak to indikujú iné štúdie). Mo č, ktorý sa nachádza 
v mo
čovom mechúre v čase usmrtenia, by sa mal prida ť k moču 
odobratému predtým. Po zbere exkrementov z metabolických klietok 
v plánovanom čase usmrtenia by sa klietky a ich príslušenstvo mali 
umyť vhodným rozpúš ťadlom. Podobne by sa malo analyzova ť 
ostatné potenciálne kontaminované vybavenie.  
1.4.10.  Analýza  
Vo všetkých štúdiách treba dosiahnu ť adekvátnu vý ťažnosť (t. j. 
stredné hodnoty 100 ± 10 % rádioaktivity). Vý ťažnosť mimo tohto 
rozsahu sa musí zdôvodni ť. Množstvo podanej dávky v každej 
vzorke by sa malo analyzova ť pomocou vhodne validovaných postu ­
pov. 
Štatistické hodnotenie by malo obsahova ť mieru rozptylu opakova ­
ných meraní pre každú aplikáciu.  
2. ÚDAJE  
Na každom zvierati, v každom stanovenom čase odberu vzorky by sa 
pre testovanú chemickú látku a/alebo metabolity mali vykona ť nasle­
dujúce merania. Okrem jednotlivých údajov by sa mali hlási ť stredné 
hodnoty údajov zoskupených pod ľa časov odberu vzoriek. 
— množstvo spojené s ochrannými prostriedkami, 
— množstvo, ktoré možno uvo ľniť z kože, 
— množstvo v/na koži, ktoré nemožno zmy ť z kože,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— množstvo obsiahnuté v odobratej vzorke krvi, 
— množstvo obsiahnuté v exkrementoch a vo vydychovanom 
vzduchu (ak je to relevantné), 
— množstvo, ktoré zostalo v m ŕtvom tele a vo všetkých orgánoch 
odobratých na samostatnú analýzu. 
Množstvo testovanej látky a/alebo metabolitov v exkrementoch, 
vydychovanom vzduchu, krvi a v m ŕtvom tele umožní stanovi ť 
celkové množstvo absorbované v každom čase odberu vzoriek. 
Možno urobi ť aj výpo čet množstva testovanej látky absorbovanej 
jedným cm  2 kože exponovanej testovanej látke po čas expozi čnej 
doby.  
3. SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí zah ŕňať požiadavky stanovené v protokole 
vrátane zdôvodnenia použitého testovacieho systému a mala by obsa ­
hovať tieto údaje: 
Testovaná látka: 
— identifika čné údaje [napr. číslo CAS, ak je k dispozícii; zdroj; 
čistota (rádiochemická čistota); známe ne čistoty; číslo šarže], 
— fyzikálna povaha, fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, 
prchavosť, rozpustnos ť, stabilita, molekulová hmotnos ť a log P  ow . 
Testovací prípravok: 
— zloženie a zdôvodnenie použitia, 
— podrobnosti o testovacom prípravku, aplikované množstvo, 
dosiahnutá koncentrácia, prenáša č, stabilita a homogénnos ť. 
Pokusné zvieratá: 
— použitý živo číšny druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, diéta at ď., 
— hmotnos ť jednotlivých zvierat na za čiatku testu. 
Podmienky na vykonanie testu: 
— podrobnosti o podaní testovacieho prípravku (miesto aplikácie, 
analytické metódy, okluzívne/neokluzívne, objem, extrakcia, 
detekcia, 
— podrobnosti o kvalite potravy a vody. 
Výsledky: 
— všetky príznaky toxicity, 
— údaje o absorpcii v tabu ľkovej forme (vyjadrené ako rýchlos ť, 
množstvo alebo percentuálny podiel),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— celková vý ťažnosť experimentu, 
— interpretácia výsledkov, porovnanie so všetkými dostupnými 
údajmi o perkutánnej absorpcii testovacej zlú čeniny. 
Rozbor výsledkov Závery
 
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method. 
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
(3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20. 
(4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829 – 835. 
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA 
(6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health 
and Environmental Assessment. 
(7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances. 
(8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason 
R (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingre ­
dients in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 
369 – 373. 
(9) Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399 – 404.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Obrázok 1  
Príklad konštruk čného riešenia typického zariadenia používaného na vymedzenie 
a ochranu miesta dermálnej aplikácie po čas štúdií perkutánnej absorpcie  in vivo
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORPCIA KOŽOU: METÓDA  IN VITRO  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je ekvivalentná OECD TG 428 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda je ur čená na poskytnutie informácií o absorpcii testovanej 
chemickej látky aplikovanej na vyrezanú kožu. Možno ju kombinova ť 
buď s metódou pre absorpciu kože: metóda  in vivo  (1), alebo sa môže 
použiť samostatne. Odporú ča sa prečítať si Usmer ňovaci dokument 
OECD (OECD Guidance Document) pre vykonávanie štúdií kožnej 
absorpcie (2), ktorý slúži ako pomôcka pri príprave štúdií založených 
na tejto metóde. Usmer ňovaci dokument bol pripravený s cie ľom 
uľahčiť výber vhodných postupov  in vitro  na použitie v konkrétnych 
podmienkach, aby sa zaistila spo ľahlivosť výsledkov získaných 
pomocou tejto metódy. 
Metódy ur čené na meranie kožnej absorpcie a prestupu látky kožou je 
možné rozdeli ť do dvoch kategórií:  in vivo a in vitro.  Metódy merania 
kožnej absorpcie  in vivo  sú dobre zavedené a poskytujú farmakokine ­
tické informácie v rozsahu živo číšnych druhov. Metóda  in vivo je samo ­
statne opísaná v inej testovacej metóde (1). Metódy  in vitro  sa taktiež 
používajú mnoho rokov na meranie kožnej absorpcie. Hoci sa formálne validačné štúdie metód  in vitro,  ktoré sú zahrnuté v tejto testovacej 
metóde, dosia ľ nevykonali, odborníci OECD sa v r. 1999 zhodli, že 
bolo vyhodnotených dostato čné množstvo údajov na podporu metódy  
in vitro  (3). V Usmer ňovacom dokumente OECD (2) sú uvedené ďalšie 
podrobné informácie na podporu metód  in vitro,  vrátane ve ľkého počtu 
priamych porovnaní metód  in vitro a in vivo.  Existuje ve ľa monografií 
zaoberajúcich s touto problematikou, ktoré poskytujú podrobné základné 
informácie o používaní metódy  in vitro  (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), 
(11), (12). Pri metódach  in vitro  sa meria difúzia chemických látok do 
kože a ich prienik cez kožu do rezervoáru s tekutinou a môže sa použi ť aj 
neživá koža iba na meranie difúzie, alebo čerstvá metabolicky aktívna 
koža na súbežné meranie difúzie metabolizmu kože. Tieto metódy našli svoje konkrétne využitie najmä pri porovnávaní prestupu chemických látok do kože a cez kožu z rozli čných prípravkov, pri čom môžu takisto 
slúžiť ako užito čné modely na posúdenie perkutánnej absorpcie 
u človeka. 
Táto metóda  in vitro  sa nemôže použi ť vo všetkých situáciách a pri 
všetkých triedach chemických látok. Na úvodné kvalitatívne hodno ­
tenie prieniku látky kožou je možné použi ť testovaciu metódu  in 
vitro.  V niektorých prípadoch môže by ť potrebné pokra čovať ďalej 
s údajmi získanými pomocou metódy  in vivo.  Na ďalšie posúdenie 
situácií, pre ktoré môže by ť vhodná metóda  in vitro,  by sa malo 
postupova ť podľa usmerňovacieho dokumentu (2). Ďalšie podrobné 
informácie na podporu rozhodnutia sú uvedené v (3). 
Táto metóda uvádza všeobecné zásady na meranie dermálnej 
absorpcie a dopl ňovania testovanej látky s použitím vyrezanej 
kože. Možno použi ť kožu z mnohých cicavcov vrátane človeka. 
Priepustnos ť kože sa zachováva aj po vyrezaní z tela, pretože 
hlavnou difúznou bariérou je neživá rohovitá vrstva kože  (stratum 
corneum);  aktívny prenos chemikálií cez kožu sa dosia ľ nedokázal. 
Ukázalo sa, že koža má schopnos ť metabolizova ť niektoré chemi ­
kálie počas perkutánnej absorpcie (6), ale tento proces nie je limitu ­
júci v zmysle skuto čne absorbovanej dávky, aj ke ď môže ma ť vplyv 
na povahu materiálu prechádzajúceho do krvného obehu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Neabsorbovaná dávka:  predstavuje dávku, ktorá sa zmyla 
z povrchu kože po expozícii, a každú prítomnú na neokluzívnom pokrytí vrátane každej dávky, ktorá sa odparila z kože po čas expo­
zície.  
Absorbovaná dávka  (in vitro):  hmota testovanej látky, ktorá sa 
počas určeného času dostala do receptorovej kvapaliny alebo do 
krvného obehu.  
Absorbovate ľná dávka  (in vitro):  predstavuje dávku prítomnú na 
koži alebo v koži po omytí.
 
1.3. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Testovaná látka, ktorá môže by ť rádioaktívne ozna čená, sa nanesie 
na povrch vzorky kože odde ľujúcej dve komôrky difúznej bunky. 
Prv ako sa daná chemická látka odstráni vhodným čistiacim postu ­
pom, zostáva na koži po čas stanoveného času a za ur čených podmie ­
nok. Počas experimentu sa v stanovených časových bodoch odobe ­
rajú vzorky receptorovej kvapaliny a analyzujú z h ľadiska prítom ­
nosti testovanej chemickej látky a/alebo metabolitov. 
Ak sa používajú metabolicky aktívne systémy, pomocou príslušných 
metód je možné analyzova ť metabolity testovaných chemických 
látok. Na konci experimentu sa prípadne môže vypo čítať distribúcia 
testovanej chemickej látky a jej metabolitov. 
Vo vhodných podmienkach, ktoré sú opísané v tejto metodike 
a usmerňovacom dokumente (2), sa meria absorpcia testovanej 
látky po čas stanoveného obdobia pomocou analýzy tekutiny 
v receptorovej kvapaline a ošetrenej kože. Testovaná látka, ktorá zostala v koži, by sa mala poklada ť za absorbovanú, ak nemožno 
preukázať, že absorpciu možno stanovi ť na základe hodnôt namera ­
ných v receptorovej kvapaline. Analýza ďalších komponentov (mate ­
riál zmytý s kože a zostávajúci vo vrstvách kože) umož ňuje vyhod ­
notenie ďalších údajov, vrátane celkovej distribúcie testovanej látky 
a percentuálneho podielu vý ťažnosti testovanej látky. 
Na preukázanie funk čnosti a spo ľahlivosti testovacieho systému 
v realizačnom laboratóriu by mali by ť dostupné výsledky príslušných 
referenčných chemických látok a tieto výsledky by mali by ť v súlade 
s uverejnenou literatúrou pre použitú metódu. Túto požiadavku možno splni ť testovaním vhodnej referen čnej látky (pod ľa možnosti 
s lipofíliou podobnou ako má testovaná látka) sú časne s testovanou 
látkou alebo poskytnutím adekvátnych údajov z minulosti o mnohých referen čných látkach s rôznou lipofíliou (napr. kofeín, 
kyselina benzoová a testosterón).  
1.4. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.4.1.  Difuzér  
Difuzér pozostáva z donorovej komory a receptorovej komory, medzi 
ktoré sa vkladá koža (príklad typického riešenia difuzéra je zobrazený na obr. 1). Difuzér by mal poskytova ť dobré utesnenie okolo kože, 
umožňovať ľahké odoberanie vzoriek, dobré miešanie receptorového 
roztoku, ktorý je v kontakte so spodnou stranou kože, a dobrú reguláciu 
teploty difuzéra a jeho obsahu. Prijate ľné sú jednak statické a jednak 
prietokové difuzéry. Donorové komory sa zvy čajne ponechávajú po čas 
expozície neuzavreté do kone čnej dávky testovacieho prípravku. Pri 
nekonečných aplikáciách a pri niektorých scenároch kone čných dávok 
je však možné donorové komory uzavrie ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Receptorová kvapalina  
Uprednost ňuje sa použitie fyziologicky vodivej receptorovej kvapa ­
liny, hoci sa môžu použi ť aj iné, ak sa to zdôvodní. Treba uvies ť 
presné zloženie receptorovej kvapaliny. Mala by sa preukáza ť adek­
vátna rozpustnos ť testovanej chemickej látky v receptorovej kvapa ­
line, aby nepôsobila ako prekážka pre absorpciu. Okrem toho by receptorová kvapalina nemala ma ť vplyv na integritu kožného prepa ­
rátu. Rýchlos ť prietoku v prietokovom systéme nesmie bráni ť difúzii 
testovanej látky do receptorovej kvapaliny. V systéme statického 
difuzéra by sa kvapalina mala neustále mieša ť a mali by sa z nej 
pravidelne odobera ť vzorky. Ak sa skúma metabolizmus, receptorová 
kvapalina musí podporova ť životaschopnos ť kože po čas celého 
experimentu.
 
1.4.3.  Kožné preparáty  
Na prípravu kožného preparátu možno použi ť kožu človeka alebo 
iných živo číchov. Je známe, že použitie ľudskej kože je predmetom 
vnútroštánych a medzinárodných etických úvah a podmienok. Hoci 
sa uprednost ňuje použitie živej kože, možno použi ť neživú kožu za 
predpokladu, že je možné preukáza ť integritu kože. Prijate ľné sú ako 
epidermálne membrány (oddelené enzymaticky, teplom alebo 
chemicky), tak aj koža rozdelená po hrúbke (zvy čajne v hrúbke 
200 – 400 μm), získaná pomocou dermatómu. Možno použi ť kožu 
v celej hrúbke, ale malo by sa zabráni ť použitiu kože s nadmernou 
hrúbkou  (cca.  1 mm), ak sa to osobitne nevyžaduje na stanovenie 
testovanej chemickej látky v jednotlivých vrstvách kože. Výber živo ­ 
číšnych druhov, anatomického miesta a prepara čnej techniky sa musí 
zdôvodniť. Vyžadujú sa prijate ľné údaje z minimálne štyroch opako ­
vaných vzoriek na jeden testovací preparát.  
1.4.4.  Integrita kožného preparátu  
Je dôležité, aby koža bola vhodne pripravená. Nevhodná manipulácia 
môže vies ť k poškodeniu rohovitej vrstvy kože  (stratum corneum) , 
a preto sa musí skontrolova ť integrita kožného preparátu. Pri 
skúmaní metabolizmu kože by sa mala použi ť čerstvo vyrezaná 
koža čo najskôr a za podmienok, o ktorých sa vie, že podporujú 
metabolickú aktivitu. Všeobecne povedané, čerstvo vyrezaná koža by 
sa mala použi ť v priebehu 24 hodín, ale prijate ľná dĺžka času skla­
dovania sa môže líši ť v závislosti od enzymatického systému podie ­ 
ľajúceho sa na metabolizme a od teploty skladovania (13). Ak sa 
pred použitím kožné preparáty skladujú, je potrebné dokáza ť, že 
bariérová funkcia sa zachovala.  
1.4.5.  Testovaná látka  
Testovaná látka je látka, ktorej penetra čné vlastnosti sa skúmajú. 
V ideálnom prípade je testovaná látka rádioaktívne ozna čená. 
1.4.6.  Testovaný prípravok  
Prípravok testovanej látky (napríklad čistý, zriedený alebo vytvorený 
materiál obsahujúci testovanú látku, ktorá sa aplikuje na kožu) by mal byť rovnaký (prípadne realisticky zástupný) ako prípravok, 
ktorému môže by ť exponovaný človek alebo iný potenciálny živo ­ 
číšny druh. Každú odchýlku od „používaného“ prípravku je potrebné 
zdôvodniť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Koncentrácie a zloženie testovaných látok  
Zvyčajne sa používa viac ako jedna koncentrácia testovanej látky 
obsahujúcej horný rozsah potenciálnych expozícií ľudí. Podobe by 
sa malo zváži ť testovanie rozsahu typických zložení.  
1.4.8.  Aplikácia na kožu  
Pri bežných podmienkach expozície ľudí chemickým látkam sa 
obyčajne stretávame s kone čnými dávkami. Z tohto dôvodu sa pri 
teste musí použi ť aplikácia, ktorá napodob ňuje expozíciu človeka, 
zvyčajne 1 – 5 mg/cm  2 pri tuhých látkach a maximálne 10 μl/cm  2 pri 
kvapalinách. Množstvo treba zdôvodni ť očakávanými podmienkami 
použitia, cie ľmi štúdie či fyzikálnymi charakteristikami testovacieho 
prípravku. Napríklad aplikácia na povrch kože môže by ť nekonečná, 
ak sa aplikujú ve ľké množstvá na jednotku plochy.  
1.4.9.  Teplota  
Teplota ovplyv ňuje pasívnu difúziu chemikálií (a tým aj ich 
absorpciu kožou). Difúzna komora a koža by sa mali udržiava ť pri 
konštantnej teplote blízko normálnej teploty kože 32  o C ± 1  o C. Pre 
rôzne vzh ľadové riešenia difuzérov sa vyžadujú rôzne vodné kúpele 
či teploty nahrievacích blokov na zaistenie toho, že receptor/koža je 
vo svoje fyziologickej norme. Odporú čaná vlhkos ť by mala by ť 
v rozsahu medzi 30 a 70 %.  
1.4.10.  Dĺžka trvania expozície a odber vzoriek  
Expozícia kože testovaciemu prípravku môže trva ť počas celého 
experimentu alebo kratšie (t. j. na napodobnenie špecifického typu expozície človeka). Nadbyto čné množstvo testovacieho prípravku sa 
musí z kože zmy ť pomocou vhodného čistiaceho prostriedku 
a opláchnutá tekutina sa pozbiera na analýzu. Postup odstránenia testovacieho prípravku z kože bude závisie ť od očakávaných 
podmienok použitia a treba ho zdôvodni ť. Zvyčajne sa vyžaduje 
odber vzoriek každých 24 hodín, aby sa umožnila adekvátna charak ­
terizácia absorp čného profilu. Ke ďže integrita kože sa môže za čať po 
24 hodinách narušova ť, čas odberu vzoriek by zvy čajne nemal 
presiahnu ť 24 hodín. Pri testovaných látkach, ktoré rýchlo prenikajú 
kožou, to nemusí by ť potrebné, ale dlhší časový úsek odberu vzoriek 
môže byť potrebný v prípade látok, ktoré prenikajú kožou pomaly. 
Frekvencia odberu vzoriek receptorovej kvapaliny by mala umožni ť 
grafické vyjadrenie absorp čného profilu testovanej látky.
 
1.4.11.  Závere čné postupy  
Všetky zložky testovacieho systému sa musia analyzova ť, pričom je 
potrebné stanovi ť výťažnosť. To zahŕňa donorovú komoru, oplacho ­
vanie povrchu kože, kožný preparát a receptorovú kvapalinu/komoru. V niektorých prípadoch možno kožu rozdeli ť na exponovanú oblas ť 
kože a na oblas ť kože pod prírubou difuzéra a na  stratum corneum,  
epidermu a dermu na ú čely osobitnej analýzy.
 
1.4.12.  Analýza  
Vo všetkých štúdiách je potrebné dosiahnu ť adekvátnu vý ťažnosť 
(cieľom by malo by ť priemerne 100 – 10 % rádioaktivity, pri čom 
všetky odchýlky je potrebné zdôvodni ť). Pomocou vhodnej techniky 
sa analyzuje množstvo testovanej látky v receptorovej kvapaline, 
kožnom preparáte, tekutine, s ktorou sa opláchla koža, a všetky 
použité pomôcky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. ÚDAJE  
Je potrebné zaznamena ť analýzu receptorovej kvapaliny, distribúcie 
testovanej chemickej látky v testovacom systéme a absorp čného 
profilu látky v čase. Pri použití podmienok kone čnej dávky expozície 
by sa malo vypo čítať množstvo látky opláchnutej z kože, množstvo 
asociované s kožou (a v jednotlivých vrstvách kože, ak sa analyzujú) a množstvo prítomné v receptorovej kvapaline (prietok a množstvo či 
percentuálny podiel aplikovanej dávky). Absorpcia kožou môže by ť 
niekedy vyjadrená pomocou samotných údajov týkajúcich sa recep ­
torovej kvapaliny. Ak však testovaná látka ostáva na konci štúdie v koži, možno ju bude potrebné zahrnú ť do celkového absorbova ­
ného množstva (pozri odsek 66 v odkaze na literatúru 3). Ke ď sa 
použijú podmienky kone čnej dávky expozície, na základe údajov 
bude možné vypo čítať konštantu priepustnosti (Kp). V tomto prípade 
nie je dôležitý percentuálny podiel absorbovanej látky.
 
3. SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí zah ŕňať požiadavky stanovené v protokole 
vrátane zdôvodnenia použitého testovacieho systému a musí obsa ­
hovať tieto údaje: 
Testovaná látka: 
— fyzikálna povaha, fyzikálno-chemické vlastnosti (aspo ň moleku­
lová hmotnos ť a pod. a log P  ow ), čistota (rádiochemická čistota), 
— identifika čné údaje (napr. číslo šarže), 
— rozpustnos ť v receptorovej kvapaline. 
Testovací prípravok: — zloženie a zdôvodnenie použitia, — homogenita. 
Testovacie podmienky: 
— zdroje a anatomické miesto odberu kože, spôsob prípravy, 
podmienky skladovania pred použitím, predchádzajúca expozícia (čistiace látky, antibiotické ošetrenia a pod.), meranie integrity 
kože, metabolický stav, zdôvodnenie použitia, 
— konštruk čné riešenie difuzéra, zloženie receptorovej kvapaliny, 
rýchlosť prietoku receptorovej kvapaliny či intervaly a postupy 
odberu vzoriek, 
— podrobnosti o aplikácii testovacieho prípravku a kvantifikácia 
aplikovanej dávky, 
— dĺžka expozície, 
— podrobnosti o odstra ňovaní testovacieho prípravku z kože, napr. 
oplachovanie kože, 
— podrobnosti o analýze kože a všetkých frak čných technikách 
použitých na preukázanie distribúcie látky v koži,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— postupy umývania difuzéra a zariadenia, 
— testovacie metódy, extrak čné techniky, limity detekcie a validácia 
analytickej metódy. 
Výsledky 
— celková vý ťažnosť experimentu (aplikovaná dávka = opláchnutie 
z kože + koža + receptorová kvapalina + opláchnutia difuzéra), 
— zaznamenanie jednotlivých hodnôt vý ťažnosti z každého odde ­
lenia difuzéra do tabu ľky, 
— absorp čný profil, 
— zaznamenanie údajov o absorpcii do tabu ľky (vyjadrené ako 
rýchlosť, množstvo či percentuálny podiel). 
Rozbor výsledkov 
Záver  
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method. 
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
(3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris. 
(4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton. 
(5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, 
pp. 237 – 241. 
(6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton. 
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels. 
(8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191 – 205. 
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65. 
(10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel. 
(12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York. 
(13) Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitro ­
chlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356 – 365.  
Obrázok 1  
Príklad typického riešenia statického difuzéra používaného pri štúdiách 
perkutánnej absorpcie  in vitro
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  PODRÁŽDENIE KOŽE  IN VITRO : TEST NA MODELI 
REKONŠTRUOVANEJ ĽUDSKEJ POKOŽKY  
ÚVOD 
1. Podráždením kože sa rozumie reverzibilné poškodenie kože po aplikácii 
testovanej chemikálie maximálne na štyri hodiny [v znení definície pod ľa 
globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a ozna čovania chemic ­
kých látok (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN) a nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 
2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí (1) (3)]. Touto 
testovacou metódou (TM) sa zabezpe čuje postup  in vitro , ktorý možno 
použiť na identifikáciu nebezpe čnosti dráždivých chemikálií (látok 
a zmesí) v súlade s kategóriou 2 GHS OSN a CLP EÚ (1) (2) (3). 
V EÚ a v ďalších regiónoch, ktoré neprijali nepovinnú kategóriu 3 GHS 
OSN (látky spôsobujúce mierne podráždenie), túto testovaciu metódu možno použi ť aj na identifikáciu chemikálií, ktoré nie sú klasifikované, 
t. j. sú „bez kategórie“ v zmysle GHS OSN a CLP EÚ (1) (3). Táto 
testovacia metóda sa môže použi ť na určenie podráždenia pokožky chemi ­
káliami ako nezávislý test, ktorý slúži ako náhrada za testy podráždenia kože  in vivo  v rámci stratégie testovania na viacerých úrovniach (4 
a kapitola B.4 tejto prílohy). 
2. Posudzovanie podráždenia kože sa zvy čajne vykonáva na laboratórnych 
zvieratách [usmernenie OECD na vykonávanie testov 404; kapitola B.4 
tejto prílohy] (4). Pokia ľ ide o obavy o dobré životné podmienky zvierat, 
metóda B.4 bola v roku 2004 zrevidovaná a umož ňuje určiť poleptanie/ 
podráždenie kože pomocou stratégie testovania na viacerých úrovniach 
s použitím validovaných testovacích metód  in vitro  alebo  ex vivo , vďaka 
čomu sa vylú či bolesť a utrpenie zvierat. Tri validované testovacie metódy  
in vitro  boli prijaté ako usmernenia OECD na vykonávanie testov 430, 431 
a 435 (5) (6) (7) a dve z nich ako kapitoly B.40 a B.40a tejto 
prílohy a budú sa používa ť pri tej časti stratégie testovania na viacerých 
úrovniach metódy B.4 alebo usmernenia OECD na vykonávanie testov 404, ktorá sa týka poleptania (4). 
3. Táto testovacia metóda sa týka koncového bodu podráždenia kože pre 
ľudské zdravie. Je založená na modeloch rekonštruovanej ľudskej 
pokožky, ktoré svojím celkovým usporiadaním (použitie netransformova ­
ných keratinocytov získaných z ľudskej pokožky ako zdroja buniek 
a použitie reprezentatívneho tkaniva a cytoarchitektúry) dôkladne napo ­
dobňujú biochemické a fyziologické vlastnosti vrchnej časti ľudskej 
kože, t. j. epidermy. Táto testovacia metóda tiež zah ŕňa súbor noriem 
výkonnosti (PS) (dodatok 2) na posudzovanie podobných a upravených testovacích metód založených na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky 
(RhE) Európskym centrom pre potvrdzovanie alternatívnych metód 
ES (ECVAM) (8) v súlade so zásadami usmer ňujúceho dokumentu 
OECD č. 34 (9). 
4. Požiadavkám tejto testovacej metódy vyhovujú tri validované metódy. 
Ukončili sa štúdie týkajúce sa postupov pred validáciou, optimalizácie 
a validácie pre metódu  in vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) 
(18) (19) (20), ktorá používa model rekonštruovanej ľudskej pokožky a je 
komerčne dostupná ako EpiSkin
 TM (označuje sa ako validovaná referen čná 
metóda – VRM). Ďalšie dve komer čne dostupné metódy na podráždenie 
kože  in vitro , a to metódy EpiDerm  TM SIT (EPI-200) a SkinEthic  TM RHE 
(22), používajú modely rekonštruovanej ľudskej pokožky a vykázali 
podobné výsledky ako validovaná referen čná metóda pod ľa validácie 
založenej na normách výkonnosti (22).  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Skôr ako sa na ú čely regulácie použije navrhovaná podobná alebo upra ­
vená metóda  in vitro  založená na modeli RhE, ktorá je iná ako validovaná 
referenčná metóda alebo metódy založené na modeli RhE EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) alebo SkinEthic  TM , mala by sa stanovi ť jej spoľahlivosť, rele­
vantnosť (presnos ť) a obmedzenia jej navrhovaného používania, aby sa 
zabezpečila jej porovnate ľnosť s validovanou referen čnou metódou 
v súlade s požiadavkami noriem výkonnosti stanovenými v tejto testovacej metóde (dodatok 2). Okrem toho pred vytvorením alebo validovaním podobnej alebo upravenej metódy  in vitro  založenej na modeli RhE 
a jej predložením na prijatie regula čným orgánom (23) sa odporú ča 
konzultova ť dokument OECD, ktorý vysvet ľuje základné informácie 
o testovaní podráždenia kože  in vitro .
 
VYMEDZENIE POJMOV 
6. Použité definície sú uvedené v dodatku 1.  
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
7. Ako preukazuje valida čná štúdia (16), obmedzením testovacej metódy je, 
že neumož ňuje klasifikáciu chemikálií do nepovinnej kategórie 3 (látky 
spôsobujúce mierne podráždenie) v zmysle GHS OSN (1). Ke ď sa táto 
metóda používa ako čiastočný náhradný test, možno bude potrebné 
vykonať následný test  in vivo , aby sa dal úplne charakterizova ť potenciál 
podráždenia kože (4 a kapitola B.4 tejto prílohy). Uznáva sa, že použitie 
ľudskej pokožky podlieha vnútroštátnym a medzinárodným etickým 
zásadám a podmienkam. 
8. Táto testovacia metóda sa týka zložky podráždenia kože  in vitro  v rámci 
stratégie testovania na viacerých úrovniach metódy B.4 (usmernenie OECD o vykonávaní testov 404) týkajúcej sa podráždenia/poleptania 
kože (4). Ke ďže táto testovacia metóda neposkytuje dostatok informácií 
o poleptaní kože, treba poznamena ť, že kapitola B.40a (usmernenie OECD 
o vykonávaní testov 431) o poleptaní kože je založená na tom istom systéme testovania na modeli RhE, no používa iný protokol (kapitola 
B.40a). Táto metóda je založená na modeloch rekonštruovanej ľudskej 
pokožky a používa ľudské keratinocyty, a preto predstavuje  in vitro  
cieľový orgán druhov, ktoré sú predmetom záujmu. Okrem toho sa priamo 
vzťahuje na po čiatočný krok zápalovej kaskády/zápalového ak čného 
mechanizmu (poškodenie buniek a tkanív vedúce k lokálnej traume), ku 
ktorým dochádza po čas podráždenia  in vivo . V rámci validácie, ktoré je 
základom tejto testovacej metódy, bol otestovaný celý rad chemikálií a empirická databáza valida čnej štúdie obsahuje celkovo 58 chemikálií 
(16) (18) (23). To platí pre tuhé látky, kvapaliny, polotuhé látky 
a vosky. Kvapaliny môžu by ť vodné alebo nevodné, tuhé látky môžu 
byť rozpustné alebo nerozpustné vo vode. Ak je to možné, tuhé látky sa 
pred aplikáciou rozdrvia na jemný prášok; iná predpríprava vzorky nie je 
potrebná. Plyny a aerosóly ešte neboli posúdené vo valida čnej štúdii (24). 
Aj keď je možné, že tieto látky sa môžu testova ť technológiou RhE, 
súčasná testovacia metóda neumož ňuje testovanie plynov a aerosólov. 
Treba tiež poznamena ť, že silno sfarbené chemikálie môžu narúša ť 
merania životaschopnosti bunky a vyžadujú si použitie prispôsobených 
kontrol na korekcie (pozri odseky 24 – 26). 
9. Jeden pokus, ktorý sa skladá z troch replík tkaniva, by mal by ť postačujúci 
na testovanie chemikálie, ak je jej klasifikácia jednozna
čná. V prípadoch 
s hraničnými výsledkami, napríklad ak sa nezhodujú merania replík 
a/alebo ak sa percentuálny priemer životaschopnosti rovná 50 ± 5 %, 
treba zváži ť vykonanie druhého pokusu, ako aj tretieho pokusu, ak sa 
výsledky z prvých dvoch pokusov nezhodujú.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCÍP TESTU 
10. Testovaná chemikália sa lokálne aplikuje na trojrozmerný model RhE 
pozostávajúci z netransformovaných keratinocytov získaných z ľudskej 
pokožky, ktoré sa vykultivovali tak, aby vytvorili viacvrstvový, vysoko diferencovaný model ľudskej pokožky. Pozostáva z organizovanej bazálnej 
vrstvy, vrstvy ostnitých buniek a vrstvy zrnitých buniek a viacvrstvovej 
rohovitej vrstvy ( stratum corneum ) obsahujúcej medzibunkové lipidové 
lamelové vrstvy predstavujúce hlavné triedy lipidov, ktoré sú analogické vrstvám nachádzajúcim sa  in vivo . 
11. Podráždenie kože vyvolané chemikáliou, ktoré sa prejavuje erytémom 
a edémom, je výsledkom kaskády udalostí, ktoré sa za čínajú prienikom 
do stratum corneum  a poškodením hlbšie ležiacich vrstiev keratinocytov. 
Hynúce keratinocyty uvo ľňujú mediátory, ktoré za čnú zápalovú kaskádu 
pôsobiacu na bunky kože, najmä na stromálne a endotelové bunky. Dila ­
tácia a zvýšená permeabilita endotelových buniek spôsobuje príznaky 
erytému a edému (24). Metódy založené na RhE merajú po čiatočné 
udalosti v kaskáde. 
12. Životaschopnos ť buniek v modeloch RhE sa meria enzymatickou 
premenou vitálneho farbiva MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylte ­
trazólium-bromid, tiazolylová modrá, číslo CAS 298-93-1)] na modrú 
formazánovú so ľ, ktorá sa kvantitatívne meria po extrakcii z tkanív (25). 
Dráždivé chemikálie sa identifikujú na základe ich schopnosti spôsobi ť 
pokles životaschopnosti buniek pod vymedzenú prahovú úrove ň (t. j. ≤ 
50 % pre kategóriu 2 GHS OSN/EÚ CLP). V závislosti od regula čného 
rámca, v ktorom sa výsledky tejto testovacej metódy používajú, chemiká ­
lie, ktoré spôsobujú zvýšenie životaschopnosti buniek nad vymedzenú prahovú úrove ň, možno považova ť za nedráždivé látky (t. j. > 50 %, 
bez kategórie).
 
PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI 
13. Predtým, ako sa za čne bežne používa ť ktorákoľvek z troch validovaných 
metód, ktorá vyhovuje požiadavkám tejto testovacej metódy, laboratóriá by mali preukáza ť technickú spôsobilos ť pomocou desiatich referen čných 
chemikálií uvedených v tabu ľke 1. Pri podobných metódach vyvinutých 
v rámci tejto testovacej metódy alebo pri úpravách ktorejko ľvek z troch 
validovaných metód by sa mali splni ť požiadavky noriem výkonnosti 
opísané v dodatku 2 k tejto testovacej metóde predtým, ako sa za čnú 
používať na regula čné testovanie. 
14. Ako sú časť postupu overovania spôsobilosti sa odporú ča, aby používate ľ 
overil bariérové vlastnosti tkanív po ich prijatí, ako to stanovuje tvorca modelu RhE. To je dôležité najmä vtedy, ak sa tkanivá zasielajú na ve ľkú 
vzdialenos ť alebo po čas dlhého časového obdobia. Po úspešnom stanovení 
metódy a preukázaní spôsobilosti na jej použitie už takéto overovanie nebude bežne potrebné. Pri pravidelnom používaní metódy sa však odpo ­
rúča naďalej posudzova ť bariérové vlastnosti v pravidelných intervaloch.
 
Tabuľka 1 
Referenčné chemikálie  ( 1 ) 
Chemikália Číslo CAS Hodnota  in vivo  ( 2 ) Fyzikálny stav Kategória GHS 
OSN/EÚ CLP  
Kyselina naftalénoctová 86-87-3 0 tuhá látka bez kategórie 
Izopropanol 67-63-0 0,3 kvapalina bez kategórie  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Chemikália Číslo CAS Hodnota  in vivo  ( 2 ) Fyzikálny stav Kategória GHS 
OSN/EÚ CLP  
Metyl-stearát 112-61-8 1 tuhá látka bez kategórie 
Heptyl-butyrát 5870-93-9 1,7 kvapalina bez kategórie 
(nepovinná 
kat. 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
Hexyl-salicylát 6259-76-3 2 kvapalina bez kategórie 
(nepovinná 
kat. 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
3-p-kumenyl-2-metylpropanál 103-95-7 2,3 kvapalina kat. 2 1-brómhexán 111-25-1 2,7 kvapalina kat. 2 
Hydroxid draselný (5 % roztok) 1310-58-3 3 kvapalina kat. 2 
1-metyl-3-fenyl-1-piperazín 5271-27-2 3,3 tuhá látka kat. 2 Heptanál 111-71-7 3,4 kvapalina kat. 2
 
( 1 ) Tieto referen čné chemikálie patria do podskupiny referen čných chemikálií použitých vo valida čnej štúdii. 
( 2 ) Hodnotenie  in vivo  v súlade s kapitolou B.4 a usmernením OECD na vykonávanie testov 404 (4). 
( 3 ) V rámci tejto testovacej metódy sa nepovinná kategória 3 (látky spôsobujúce mierne podráždenie) v zmysle GHS OSN (1) 
považuje za kategóriu „bez kategórie“. 
( 4 ) Nepovinná kategória 3 v zmysle GHS OSN sa v rámci EÚ CLP neuplat ňuje. 
POSTUP 
15. Nasleduje opis zložiek a postupov metódy RhE na posúdenie podráždenia 
kože. Model RhE by sa mal zrekonštruova ť a možno ho pripravi ť interne 
alebo získa ť komerčne. K dispozícii sú štandardné pracovné 
postupy (SOP) pre EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) a SkinEthic  TM 
RHE (26) (27) (28). Testovanie by sa malo vykona ť takto:  
Zložky testovacej metódy RhE  
Všeobecné podmienky  
16. Na rekonštrukciu epitelu by sa mali použi ť netransformované ľudské kera ­
tinocyty. Pod funk čnou vrstvou  stratum corneum  by sa malo nachádza ť 
viac vrstiev životaschopných epitelových buniek (bazálna vrstva,  stratum 
spinosum , stratum granulosum ). Stratum corneum  by mala by ť viac­
vrstvová a obsahova ť potrebný profil lipidov, aby sa vytvorila silná 
funkčná bariéra, ktorá odolá rýchlemu prenikaniu cytotoxických markero ­
vých chemikálií, ku ktorým patrí napr. dodecylsulfát sodný (SDS) alebo 
Triton X-100. Bariérovú funkciu treba preukáza ť a môže sa posudzova ť 
buď stanovením koncentrácie, pri ktorej markerová chemikália znižuje 
životaschopnos ť tkanív o 50 % (IC  50 ) po pevne stanovenom expozi čnom 
čase, alebo stanovením expozi čného času, ktorý je potrebný na zníženie 
životaschopnosti buniek o 50 % (ET  50 ) po aplikácii markerovej chemikálie 
v určitej pevne stanovenej koncentrácii. Izola čné vlastnosti modelu RhE by 
mali zabráni ť prieniku materiálu okolo  stratum corneum  do životaschop ­
ného tkaniva, čo by viedlo k chybnému modelovaniu expozície kože. 
Model RhE by nemal by ť kontaminovaný baktériami, vírusmi, mykoplaz ­
mami ani hubami.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funkčné podmienky  
Životaschopnos ť 
17. Skúška použitá na stanovenie stup ňa životaschopnosti je skúška MTT (25). 
Používatelia modelu RhE by sa mali ubezpe čiť, že každá šarža modelu 
RhE spĺňa kritériá stanovené pre negatívnu kontrolu (NC). Optická 
hustota (OD) samotného extrak čného rozpúš ťadla by mala by ť dostatočne 
malá, t. j. OD < 0,1. Rozsah prijate ľnosti (horná a dolná hranica) pre 
hodnoty optickej hustoty pri negatívnej kontrole (v podmienkach testo ­
vacej metódy na podráždenie kože) stanovuje tvorca/dodávate ľ modelu 
RhE a rozsahy prijate ľnosti pre 3 validované metódy sú uvedené 
v tabuľke 2. Malo by sa zaznamena ť, že tkanivá ošetrené negatívnou 
kontrolou sú po čas expozi čného obdobia testu stabilné v kultúre (zabez ­
pečujú podobné výsledky merania životaschopnosti).  
Tabuľka 2 
Rozsahy prijate ľnosti hodnôt optickej hustoty pri negatívnej kontrole  
Dolná hranica prijate ľnosti Horná hranica prijate ľnosti 
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Bariérová funkcia 
18. Stratum corneum  a zloženie jej lipidov by mali by ť schopné zabráni ť 
rýchlemu prieniku cytotoxických markerových chemikálií, ku ktorým 
patrí napr. SDS alebo Triton X-100, pod ľa odhadu pomocou IC  50 alebo 
ET 50 (tabuľka 3).  
Morfológia 
19. Model RhE by sa mal histologicky preskúma ť, aby sa preukázalo, že má 
štruktúru podobnú ľudskej pokožke (vrátane viacvrstvovej  stratum 
corneum ). 
Reprodukovate ľnosť 
20. Výsledky pozitívnej kontroly (PC) a negatívnych kontrol (NC) testovacej 
metódy by mali preukáza ť reprodukovate ľnosť v čase. 
Kontrola kvality (QC) 
21. Tvorca/dodávate ľ modelu RhE by mal zabezpe čiť a preukáza ť, že každá 
šarža použitého modelu RhE sp ĺňa stanovené kritériá na uvo ľnenie do 
obehu, v rámci ktorých sú najvýznamnejšie kritériá životaschopnosti (odsek 17), bariérovej funkcie (odsek 18) a morfológie (odsek 19). Tieto údaje by sa mali poskytnú ť používate ľom metódy, aby mohli túto infor ­
máciu zahrnú ť do správy o teste. Rozsah prijate ľnosti (horná a dolná 
hranica) pre IC
 50 alebo ET  50 by mal stanovi ť tvorca/dodávate ľ modelu 
RhE (alebo výskumný pracovník v prípade použitia interného modelu). Na spoľahlivú prognózu klasifikácie podráždenia sú prijate ľné len tie 
výsledky, ktoré sa získali z kvalifikovaných tkanív. Ako príklad sa 
v tabuľke 3 uvádzajú rozsahy prijate ľnosti pre tri validované metódy.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabuľka 3 
Príklady kritérií kontroly kvality na uvo ľnenie šarží do obehu  
Dolná hranica prijate ľnosti Horná hranica prijate ľnosti 
EpiSkin  TM (SM) 
(18-hodinové ošetrenie SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 hod. ET  50 = 8,7 hod. 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 hod. ET  50 = 9,0 hod.  
Aplikácia testovaných a kontrolných chemikálií  
22. Pri každej testovanej chemikálii a kontrolách by sa mali použi ť aspoň tri 
repliky na jeden pokus. V prípade kvapalných aj pevných látok je potrebné 
na celý povrch kože rovnomerne nanies ť dostatočné množstvo testovacej 
chemikálie, pri čom je nutné sa vyhýba ť nekonečnej dávke, t. j. malo by sa 
použiť minimálne 25 μL/cm  2 alebo 25 mg/cm  2 . V prípade tuhých látok by sa 
mal pred aplikáciou povrch pokožky zvlh čiť deionizovanou alebo destilo ­
vanou vodou, aby sa tak zlepšil kontakt testovanej chemikálie s povrchom pokožky. Ak je to možné, tuhé látky by sa mali vždy testova ť vo forme 
jemného prášku. Na konci expozi čného času by sa testovaná chemikália 
mala dôkladne zmy ť z povrchu pokožky tlmivým roztokom alebo 0,9 % 
roztokom NaCl. V závislosti od toho, ktorá z troch validovaných metód RhE sa použije, expozi čný čas sa môže pohybova ť v rozmedzí od 15 do 
60 minút a inkuba čná teplota v rozmedzí od 20 °C do 37 °C. Tento expozi čný 
čas a teploty sa optimalizujú pre každú metódu RhE a zastupujú rôzne priro ­
dzené vlastnosti týchto metód. Ďalšie informácie sa nachádzajú 
v štandardných pracovných postupoch pre metódy (26) (27) (28). 
23. V každom pokuse by sa mali súbežne vykona ť negatívne a pozitívne 
kontroly, aby sa preukázalo, že životaschopnos ť (negatívna kontrola), 
bariérová funkcia a výsledná tkanivová citlivos ť tkanív (pozitívna 
kontrola) sú v rámci stanoveného historického rozsahu prijate ľnosti. 
Navrhovanou chemikáliou na pozitívnu kontrolu je 5 % vodný dodecyl ­
sulfát sodný (SDS). Navrhovanými chemikáliami na negatívnu kontrolu sú voda alebo fosfátom tlmený fyziologický roztok (PBS).
 
Merania bunkovej životaschopnosti  
24. Najdôležitejším prvkom testovacieho postupu je to, že merania života ­
schopnosti sa nevykonávajú ihne ď po expozícii testovaným chemikáliám, 
ale až po dostato čne dlhom inkuba čnom čase po ošetrení opláchnutých 
tkanív v čerstvom médiu. Tento čas umožňuje regeneráciu po slabých 
cytotoxických ú činkoch, ako aj výskyt jasných cytotoxických ú činkov. 
Počas fázy optimalizácie testu (11) (12) (13) (14) (15) sa ako optimálny 
ukázal by ť 42-hodinový inkuba čný čas po ošetrení. 
25. Skúška MTT je validovaná kvantitatívna metóda, ktorá by sa mala 
používať na meranie životaschopnosti buniek v rámci tejto testovacej 
metódy. Je vhodná na použitie v trojrozmernom modeli tkaniva. Vzorka 
tkaniva sa na 3 hodiny vloží do roztoku MTT s vhodnou koncentráciou 
(napr. 0,3 – 1 mg/mL). Pomocou rozpúš ťadla (napr. izopropanol, kyslý 
izopropanol) sa potom z tkaniva extrahuje vyzrážaný modrý formazánový produkt, pri čom koncentrácia formazánu sa odmeria stanovením 
optickej hustoty pri 570 nm pomocou priepustného pásmového filtra maxi ­
málne ± 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Optické vlastnosti testovanej chemikálie alebo jej chemický ú činok na 
MTT môžu interferova ť so skúškou, čo vedie k nesprávnemu odhadu 
životaschopnosti (ke ďže testovaná chemikália môže zabra ňovať procesu 
tvorby farby alebo ho zvráti ť, ale rovnako ho môže aj spôsobova ť). 
K tomu môže dôjs ť, keď sa špecifická testovacia chemikália úplne neod ­
stráni z tkaniva pri oplachovaní alebo ke ď prenikne cez pokožku. Ak 
testovaná chemikália pôsobí priamo na MTT (redukcia MTT), je priro ­
dzene zafarbená alebo sa zafarbí pri ošetrovaní tkaniva, mali by sa použi ť 
ďalšie kontroly, aby sa zistilo, či nedochádza k interferencii testovanej 
chemikálie s technikou merania životaschopnosti, a aby sa táto prípadná 
interferencia upravila. Podrobný opis opravy priamej redukcie MTT a interferencií s farbivami sa nachádza v štandardných pracovných postu ­
poch pre tri validované metódy (26) (27) (28).
 
Kritériá prijate ľnosti  
27. Pri každej metóde, pri ktorej sa používajú validované šarže modelu RhE 
(pozri odsek 21), by tkanivá ošetrené negatívnou kontrolou mali vykáza ť 
optickú hustotu, ktorá odráža kvalitu tkanív po všetkých krokoch zaslania a prijatia a po všetkých procesoch protokolu. Hodnoty optickej hustoty pri 
kontrole by nemali by ť nižšie ako historicky stanovené hranice. Podobne 
by tkanivá ošetrené pozitívnou kontrolou, t. j. 5 % vodným SDS, mali odrážať ich schopnos ť reagovať na dráždivú chemikáliu v podmienkach 
testovacej metódy (26) (27) (28). Mali by sa stanovi ť súvisiace a vhodné 
opatrenia variability medzi replikami tkaniva [napr. ak sa použijú štan ­
dardné odchýlky (SD), mali by sa nachádza ť v rámci jednostranného 
95 % intervalu tolerancie, ktorý sa vypo číta z historických údajov pre 
SD validovanej referen čnej metódy (VRM SD) < 18 %].
 
Interpretácia výsledkov a model na prognózy  
28. Hodnoty optickej hustoty namerané pre každú testovanú chemikáliu sa 
môžu použi ť na výpo čet percentuálneho podielu životaschopnosti norma ­
lizovanej na negatívnu kontrolu, ktorá je stanovená na 100 %. Je potrebné 
jasne definova ť, zdokumentova ť a preukáza ť hraničnú percentuálnu 
hodnotu životaschopnosti buniek, ktorá rozlišuje medzi dráždivými chemi ­
káliami a testovanými chemikáliami, ktoré nie sú klasifikované, a štatistickým(-i) postupom(-mi) použitým(-i) pri hodnotení výsledkov 
a identifikácii dráždivých chemikálií. Hrani čné hodnoty prognózy podráž ­
denia sú uvedené ďalej v texte: 
— Testovaná chemikália sa pokladá za dráždivú pre kožu v súlade 
s kategóriou 2 GHS OSN/CLP EÚ, ak životaschopnos ť tkaniva po 
expozícii a inkubácii po ošetrení je menšia alebo sa rovná ( ≤) 50 %. 
— V závislosti od regula čného rámca, v ktorom sa výsledky tejto testo ­
vacej metódy používajú, testovanú chemikáliu možno považova ť za 
nedráždivú pre kožu patriacu do kategórie „bez kategórie“ pod ľa 
GHS OSN/CLP EÚ, ak životaschopnos ť tkaniva po expozícii 
a inkubácii po ošetrení je vä čšia ako (>) 50 %.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
29. Pri každom pokuse je potrebné do tabu ľky zaznamena ť údaje 
z jednotlivých replík tkanív (napr. hodnoty optickej hustoty a vypo čítaný 
percentuálny podiel životaschopnosti buniek pre každú testovanú chemi ­
káliu vrátane klasifikácie) vrátane údajov o opakovaných pokusoch, ak je to vhodné. Okrem toho by sa mali pre každý pokus uvádza ť aj stredné 
hodnoty ± štandardnej odchýlky (SD). Pozorované interakcie s reagentom 
MTT a zafarbenými testovanými chemikáliami by sa mali oznamova ť pre 
každú testovanú chemikáliu.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Správa o teste  
30. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie: 
Testované a kontrolné chemikálie: 
— chemický názov (chemické názvy), ako napríklad názov pod ľa CAS 
a číslo CAS, názov pod ľa EC a číslo EC, ak je známe, 
— čistota a zloženie chemikálie (v hmotnostných percentách), 
— fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie (napr. 
fyzikálny stav, stabilita, prchavos ť, hodnota pH a rozpustnos ť vo 
vode, ak je známa), 
— prípadná úprava testovaných/kontrolných chemikálií pred testovaním 
(napr. zahriatie, rozomletie), 
— podmienky skladovania. Zdôvodnenie použitého modelu RhE a protokolu Podmienky testovania: — použitý bunkový systém, 
— úplné podporné údaje o použitom osobitnom modeli RhE vrátane jeho 
výkonnosti. K nim by mala patri ť predovšetkým: 
i) životaschopnos ť; 
ii) bariérová funkcia; 
iii) morfológia; 
iv) reprodukovate ľnosť a predvídate ľnosť; 
v) kontroly kvality modelu (QC), 
— podrobné informácie o použitom postupe testovania, — použité testovacie dávky, trvanie expozície a inkubácie po ošetrení, — opis všetkých modifikácií testovacieho postupu, 
— odkaz na historické údaje o modeli. K nim by mali patri ť predovšet ­
kým: 
i) prijateľnosť údajov o kontrole kvality s odkazom na historické 
údaje o šaržiach; 
ii) prijate ľnosť hodnôt pozitívnych a negatívnych kontrol s odkazom 
na prostriedky a rozpätia pozitívnych a negatívnych kontrol, 
— opis použitých hodnotiacich kritérií vrátane zdôvodnenia výberu 
hraničného bodu (hrani čných bodov) pre model na prognózy, 
— odkaz na historické kontrolné údaje.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Výsledky: 
— údaje z individuálnych testovaných chemikálií pre meranie každého 
pokusu a každej repliky, 
— indikácie kontrol použitých na priamu redukciu MTT a/alebo na zafar ­
benie testovaných chemikálií, 
— opis ďalších pozorovaných ú činkov. 
Rozbor výsledkov 
Záver  
LITERATÚRA 
1. UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and 
Geneva. K dispozícii na stránke: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ 
ghs/ghs_rev03/03files_e.html]. 
2. EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of three  
in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference 
Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation 
Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
3. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí, 
o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene 
a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1). 
4. OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No 404, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
5. OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 430, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
6. OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 431, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
7. OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 435, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
8. EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? K dispozícii na 
stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
9. OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No 34, OECD, Paris. 
K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
10. Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, 
J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M. and Botham, P. (2001), 
A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57 – 93. 
11. Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of 
the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: 
follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765 – 770.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
12. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. 
and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the 
upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, ALTEX 
21, 107 – 114. 
13. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351 – 367. 
14. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329 – 349. 
15. Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. 
D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin 
irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods 
Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109 – 129. 
16. Spielmann, H., mailto: Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto: Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: Report 
on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity 
function test, ATLA 35, 559 – 601. 
17. Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
18. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests 
for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603 – 619. 
19. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – 
Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351 – 358. 
20. EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 
27 April 2007. K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
21. EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models 
to in vitro  skin irritation testing. K dispozícii na stránke: [http://ecvam. 
jrc.ec.europa.eu]. 
22. EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. K dispozícii na stránke: [http://ecvam. 
jrc.ec.europa.eu]. 
23. OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and Asse ­
ssment, No 137, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/ document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]. 
24. Welss, T., Basketter, D. A. and Schröder, K. R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231 – 243.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
25. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survi ­
val: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 
65, 55 – 63. 
26. EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Vali ­
dation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min. – 42 hours 
for the prediction of acute skin irritation of chemicals. K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
27. EpiDerm
 TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
28. SkinEthic
 TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irrita ­
tion test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of 
chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. K dispozícii 
na stránke: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]. 
29. Harvell, J. D., Lamminstausta, K., and Maibach, H. I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York. 
30. Smernica Komisie 2001/59/ES zo 6. augusta 2001, ktorou sa po 28-krát 
prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS 
o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení 
týkajúcich sa klasifikácie, balenia a ozna čenia nebezpe čných látok (Ú. v. 
ES L 225, 21.8.2001, s. 1). 
31. Basketter, D. A., York, M., McFadden, J. P. and Robinson, M. K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact 
Dermatitis 51, 1 – 4. 
32. Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation 
and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal  in 
vivo data, ALTEX, 14, 359 – 365. 
33. Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch 
test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109 – 116.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Dodatok 1  
Vymedzenie pojmov  
Presnosť: Miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referen č­
nými hodnotami. Ide o opatrenie výkonnosti testovacej metódy a jeden 
z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa ako synonymum 
pojmu „zhoda“ a ozna čuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (9).  
Životaschopnos ť buniek:  Parameter na meranie celkovej aktivity bunkovej popu ­
lácie, ako napríklad schopnos ť bunkových mitochondriálnych dehydrogenáz 
redukovať vitálne farbivo MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium 
bromid, tiazolylová modrá)], ktorý v závislosti od posledného meraného konco ­
vého bodu a od použitej koncepcie testu zodpovedá celkovému po čtu a/alebo 
vitalite živých buniek.  
Zhoda:  Ide o mieru výkonnosti testovacej metódy pre testovacie metódy, ktoré 
poskytujú kategoriza čné výsledky, a jeden z aspektov relevantnosti. Tento pojem 
sa používa ako synonymum pojmu presnos ť a je vymedzený ako podiel všetkých 
testovaných chemikálií, ktoré sú správne klasifikované ako pozitívne alebo nega ­
tívne (9).  
ET 50 : Môže sa odhadnú ť stanovením expozi čného času potrebného na zníženie 
životaschopnosti buniek o 50 % pri použití markerovej chemikálie v špecifickej pevne určenej koncentrácii (pozri takisto IC
 50 ). 
CLP EÚ (nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí):  Zavádza 
v Európskej únii (EÚ) systém GHS OSN klasifikácie a ozna čovania chemických 
látok (látok a zmesí) (3).  
GHS [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania chemických 
látok Organizáciou Spojených národov (OSN)]:  Systém navrhovania klasifikácie 
chemikálií (látok a zmesí) pod ľa štandardizovaných typov a úrovní fyzickej, 
zdravotnej a environmentálnej nebezpe čnosti a ozna čovania pomocou príslušných 
komunika čných prvkov, ako sú piktogramy, signaliza čné slová, výstražné 
upozornenia, bezpe čnostné upozornenia a karty bezpe čnostných údajov, ktoré 
obsahujú informácie o ich škodlivých ú činkoch z h ľadiska ochrany ľudí (vrátane 
zamestnávate ľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebite ľov a záchranných zložiek) 
a životného prostredia (1).  
IC 50 : Môže sa odhadnú ť stanovením koncentrácie, pri ktorej markerová chemi ­
kália znižuje životaschopnos ť tkanív o 50 % (IC  50 ) po pevne stanovenom expo ­
zičnom čase (pozri takisto ET  50 ). 
Nekonečná dávka:  Množstvo testovanej chemikálie aplikovanej na pokožku, 
ktoré prekra čuje množstvo potrebné na úplné a rovnomerné pokrytie povrchu 
pokožky.  
Test me-too:  Hovorový názov testovacej metódy, ktorá je štrukturálne a funk čne 
podobná validovanej a akceptovanej referen čnej testovacej metóde. Takáto testo ­
vacia metóda by bola kandidátom na ďalšiu validáciu. Môže sa používa ť 
namiesto podobnej testovacej metódy (9).  
Normy výkonnosti (PS):  Normy založené na validovanej testovacej metóde, ktoré 
slúžia ako základ na hodnotenie porovnate ľnosti navrhovanej testovacej metódy, 
ktorá je mechanicky a funk čne podobná. Patria sem: i) nevyhnutné zložky testo ­
vacej metódy; ii) minimálny zoznam referen čných chemikálií vybraných 
spomedzi látok používaných na preukázanie prijate ľnej výkonnosti validovanej 
testovacej metódy a iii) porovnate ľné úrovne presnosti a spo ľahlivosti založené 
na tom, čo sa získalo pre validovanú testovaciu metódu a čo by navrhovaná 
testovacia metóda mala preukáza ť pri hodnotení pomocou minimálneho zoznamu 
referenčných chemikálií (9).  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referenčné chemikálie:  Chemikálie vybrané na použitie v procese validácie, pre 
ktorý už sú známe odozvy v referen čnom testovacom systéme  in vitro  alebo  in 
vivo alebo odozvy u daných druhov zvierat. Tieto chemikálie by mali by ť zástup­
cami tried chemikálií, v súvislosti s ktorými sa o čakáva použitie testovacej 
metódy, a mali by zastupova ť celý rozsah odoziev od silných po slabé alebo 
negatívne odozvy, ktoré možno o čakávať od chemikálií, pri ktorých sa môže 
metóda použi ť. Rôzne skupiny referen čných chemikálií sa môžu vyžadova ť 
v rôznych štádiách procesu validácie a pre rôzne testovacie metódy a použitia testov (9).  
Relevantnos ť: Opis vz ťahu testu k ú činku, ktorý je predmetom záujmu, a či je 
tento účinok zmysluplný a užito čný na konkrétny ú čel. Ide o mieru, do akej test 
správne meria alebo prognózuje biologický ú činok, ktorý je predmetom záujmu. 
Relevantnos ť zohľadňuje presnos ť (zhodu) testovacej metódy (9).  
Spoľahlivosť: Meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda po čas 
istého časového obdobia opakovane vykonáva ť v rámci laboratórií a medzi nimi 
navzájom, pri čom sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypo čítaním vnútro ­
laboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti (9).  
Náhradný test:  Test, ktorý predstavuje náhradu za test, ktorý sa bežne používa 
a je schválený na identifikáciu nebezpe čnosti a/alebo hodnotenie rizika a o 
ktorom sa rozhodlo, že poskytuje rovnakú alebo zlepšenú úrove ň ochrany zdravia 
ľudí alebo zvierat alebo životného prostredia v porovnaní so schváleným testom 
pre všetky možné testovacie situácie a chemikálie (9).  
Citlivosť: Podiel všetkých pozitívnych/aktívnych testovaných chemikálií, ktoré sa 
testom správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá 
poskytuje kategoriza čné výsledky, a ide o dôležité h ľadisko pri hodnotení rele ­
vantnosti testovacej metódy (9).  
Podráždenie kože:  Vytvorenie reverzibilného poškodenia kože po aplikácii testo ­
vanej chemikálie v trvaní do štyroch hodín. Podráždenie kože je lokálne vznik ­
nutá, neimunogenetická reakcia, ktorá sa objaví krátko po stimulácii (29). Jeho 
charakteristickou vlastnos ťou je reverzibilný proces, ku ktorému patria zápalové 
reakcie a vä čšina klinických prejavov podráždenia charakteristických pre zápa ­
lový proces (erytém, edém, svrbenie a boles ť). 
Špecifickos ť: Podiel všetkých negatívnych/neaktívnych testovaných chemikálií, 
ktoré sa testom správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, 
ktorá poskytuje kategoriza čné výsledky, a ide o dôležité h ľadisko pri hodnotení 
relevantnosti testovacej metódy (9).  
Stratégia testovania na viacerých úrovniach:  Testovanie, ktoré používa testo ­
vacie metódy na základe postupnosti; o testovacích metódach vybraných na každej po sebe nasledujúcej úrovni sa rozhoduje pod ľa výsledkov na predchá ­
dzajúcej úrovni testovania (9).  
Testovaná chemikália (nazývaná aj testovaná látka):  Akákoľvek látka alebo 
zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Dodatok 2  
Normy výkonnosti na posudzovnie navrhnutých podobných alebo upravených 
metód na podráždenie kože in vitro založených na modeli rekonštruovanej 
ľudskej pokožky (RhE)  
ÚVOD 
1. Cie ľom noriem výkonnosti (PS) je oznámi ť základ, na ktorom možno 
určiť, že nové testovacie metódy, chránené (t. j. chránené autorským 
právom, obchodnou zna čkou, registrované), ako aj nechránené sú dosta ­
točne presné a spo ľahlivé na konkrétne ú čely testovania. Tieto normy 
výkonnosti sú založené na validovaných a akceptovaných testovacích metódach a možno ich použi ť na hodnotenie spo ľahlivosti a presnosti 
ďalších podobných metód (hovorovo nazývaných testy „me-too“), ktoré 
sú založené na podobných vedeckých zásadách a merajú alebo prognózujú rovnaký biologický alebo toxický ú činok (9). 
2. Pred prijatím upravených metód (t. j. navrhnutých potenciálnych zlepšení 
schválenej metódy) je potrebné vykona ť hodnotenie s cie ľom stanovi ť 
účinok navrhnutých zmien na výkonnos ť testu a rozsah, v akom takéto 
zmeny ovplyv ňujú informácie dostupné pre ďalšie zložky procesu validá ­
cie. V závislosti od po čtu a povahy navrhovaných zmien, získaných 
údajov a sprievodnej dokumentácie k týmto zmenám by sa na ne mal 
vzťahovať rovnaký proces validácie, akým prechádza nový test, alebo 
prípadne obmedzené posúdenie spo ľahlivosti a relevantnosti na základe 
zavedených noriem výkonnosti (9). 
3. Podobné (me-too) alebo upravené metódy jednej z troch validovaných 
metód [EpiSkin™ (validovaná referen čná metóda – VRM), EpiDerm™ 
SIT (EPI-200) a SkinEthic™ RHE] navrhnuté v rámci tejto testovacej 
metódy by sa mali posúdi ť s cieľom určiť ich spoľahlivosť a presnos ť 
s použitím chemikálií, ktoré zastupujú celý rozsah výsledkov dráždivosti Draizovho testu. Pri hodnotení navrhovaných podobných alebo uprave ­
ných metód pomocou 20 odporú čaných referen čných chemikálií noriem 
výkonnosti (tabu ľka 1) by tieto metódy mali ma ť hodnoty spo ľahlivosti 
a presnosti, ktoré sú porovnate ľ
né alebo lepšie ako hodnoty odvodené 
z validovaných referen čných metód (tabu ľka 2) (2) (16). Hodnoty pres ­
nosti a spo ľahlivosti, ktoré by sa mali dosiahnu ť, sa uvádzajú v odsekoch 
8 až 12 tohto dodatku. Zara ďujú sa sem neklasifikované („bez kategórie“ 
podľa GHS OSN/CLP EÚ) aj klasifikované chemikálie (kategória 2 GHS 
OSN/CLP EÚ) (1), ktoré zastupujú rôzne chemické triedy, aby sa spo ľa­
hlivosť a presnos ť (citlivosť, špecifickos ť a celková presnos ť) navrhovanej 
metódy mohli porovna ť s hodnotami validovanej referen čnej metódy. Pred 
použitím metódy pri testovaní nových chemikálií je potrebné stanovi ť jej 
spoľahlivosť, ako aj jej schopnos ť správne identifikova ť dráždivé chemi ­
kálie kategórie 2 GHS OSN/CLP EÚ a v závislosti od regula čného rámca, 
pre ktorý sa získavajú údaje, aj jej schopnos ť správne identifikova ť chemi­
kálie „bez kategórie“ pod ľa GHS OSN/CLP EÚ. 
4. Tieto normy výkonnosti sú založené na normách výkonnosti ES ECVAM 
(8), ktoré boli aktualizované pod ľa systémov klasifikácie a ozna čovania 
GHS OSN a CLP EÚ (1) (3). Pôvodné normy výkonnosti boli vymedzené 
po dokon čení valida čnej štúdie (21) a sú založené na klasifika čnom 
systéme EÚ, ako ustanovuje smernica Komisie 2001/59/ES zo 6. augusta 2001, ktorou sa po 28-krát prispôsobuje technickému pokroku 
smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych pred ­
pisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a ozna čenia 
nebezpečných látok (
 1 ). V dôsledku prijatia systému GHS OSN klasifikácie 
a označovania v EÚ (CLP EÚ) (3), ku ktorému došlo medzi ukon čením 
validačnej štúdie a dokon čením tejto testovacej metódy, sa normy výkonnosti  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) Ú. v. ES L 225, 21.8.2001, s. 1.
 aktualizovali (8). Táto aktualizácia sa týka najmä zmien: i) v skupine refe ­
renčných chemikálií v rámci noriem výkonnosti a ii) vymedzených hodnôt 
spoľahlivosti a presnosti (2) (23).  
NORMY VÝKONNOSTI TESTOVACÍCH METÓD RHE NA PODRÁŽDENIE 
KOŽE  IN VITRO  
5. Normy výkonnosti zah ŕňajú tieto tri zložky (9): 
I. Nevyhnutné zložky testovacej metódy 
II. Minimálny zoznam referen čných chemikálií 
III. Vymedzené hodnoty spo ľahlivosti a presnosti.  
I. Nevyhnutné zložky testovacej metódy  
6. Skladajú sa z dôležitých štrukturálnych, funk čných a procedurálnych 
prvkov validovanej metódy, ktoré by mali by ť zahrnuté do protokolu 
navrhovanej mechanicky a funk čne podobnej alebo upravenej metódy. 
Tieto zložky zah ŕňajú jedine čné charakteristiky metódy, kritické procedu ­
rálne podrobnosti a opatrenia v oblasti kontroly kvality. Súlad s nevyhnutnými zložkami testovacej metódy prispeje k zabezpe čeniu 
toho, aby podobná alebo upravená metóda bola založená na rovnakých 
koncepciách ako zodpovedajúca validovaná referen čná metóda (VRM) (9). 
Nevyhnutné zložky testovacej metódy sú podrobne opísané v odsekoch 16 až 21 testovacej metódy a testovanie by sa malo vykona ť takto: 
— Všeobecné podmienky (odsek 16) 
— Funkčné podmienky, ktoré zah ŕňajú: 
— životaschopnos ť (odsek 17), 
— bariérovú funkciu (odsek 18), 
— morfológiu (odsek 19), — reprodukovate ľnosť (odsek 20) a 
— kontrolu kvality (odsek 21).
 
II. Minimálny zoznam referen čných chemikálií  
7. Referen čné chemikálie sa používajú na ur čenie toho, či spoľahlivosť 
a presnos ť navrhovanej podobnej alebo upravenej metódy, o ktorej sa 
dokázalo, že sa štrukturálne a funk čne dostato čne podobá validovanej 
referenčnej metóde alebo mierne upravuje jednu z troch validovaných 
metód, sú porovnate ľné alebo lepšie ako spo ľahlivosť a presnos ť valido­
vanej referen čnej metódy (2) (8) (16) (23). V tabu ľke 1 je zahrnutých 20 
odporúčaných referen čných chemikálií, ktoré zastupujú rôzne chemické 
triedy (t. j. chemické kategórie založené na funk čných skupinách), ako 
aj celý rozsah výsledkov dráždivosti Draizovho testu (od nedráždiacich až po silne dráždiace chemikálie). Chemikálie zahrnuté do tohto zoznamu 
pozostávajú z 10 chemikálií kategórie 2 pod ľa GHS OSN/CLP EÚ a 10 
chemikálií „bez kategórie“, z ktorých 3 patria do nepovinnej kategórie 3 v zmysle GHS OSN. V rámci tejto testovacej metódy sa nepovinná kate ­
gória 3 považuje za kategóriu „bez kategórie“. Chemikálie uvedené 
v tabuľke 1 sú vybrané z chemikálií použitých vo fáze optimalizácie, 
ktorá nasledovala po fáze pred validáciou, a vo valida čnej štúdii valido ­
vanej referen čnej metódy, pokia ľ ide o funk čný a fyzikálny stav chemi ­
kálie (14) (18). Tieto referen čné chemikálie zastupujú minimálny po čet 
chemikálií, ktoré by sa mali použi ť na hodnotenie presnosti 
a spoľahlivosti navrhovanej podobnej alebo upravenej metódy, ale nemali
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
by sa používa ť na vývoj nových metód. V prípade, ke ď uvedená chemi ­
kália nie je k dispozícii, môžu sa použi ť iné chemikálie, pre ktoré existujú 
dostatočné referen čné údaje  in vivo , najmä chemikálie, ktoré boli použité 
vo fáze optimalizácie nasledujúcej po fáze pred validáciou alebo vo vali ­
dačnej štúdii validovanej referen čnej metódy. Ak je to žiaduce, môžu sa 
do minimálneho zoznamu referen čných chemických látok doplni ť ďalšie 
chemikálie, ktoré predstavujú ostatné chemické triedy a pre ktoré sú dostupné dostato čné referen čné údaje  in vivo , aby sa tak mohla ďalej 
hodnotiť presnosť navrhovanej metódy.
 
Tabuľka 1 
Minimálny zoznam referen čných chemických látok na stanovenie hodnôt presnosti a spo ľahlivosti podobných 
alebo upravených metód na podráždenie kože založených na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky  ( 1 ) 
Chemikália Číslo CAS Fyzikálny stav Hodnota  in vivo  VRM kat.  in 
vitro  GHS OSN/CLP EÚ 
kat. in vivo  
1-bróm-4-chlórbután 6940-78-9 kvapalina 0 kat. 2 bez kategórie 
Dietylftalát 84-66-2 kvapalina 0 bez kategórie bez kategórie Kyselina naftalénoctová 86-87-3 tuhá látka 0 bez kategórie bez kategórie Alyl-fenoxyacetát 7493-74-5 kvapalina 0,3 bez kategórie bez kategórie Izopropanol 67-63-0 kvapalina 0,3 bez kategórie bez kategórie 4-(metylsulfanyl)benzaldehyd 3446-89-7 kvapalina 1 kat. 2 bez kategórie Metyl-stearát 112-61-8 tuhá látka 1 bez kategórie bez kategórie Heptyl-butyrát 5870-93-9 kvapalina 1,7 bez kategórie bez kategórie Hexyl-salicylát 6259-76-3 kvapalina 2 bez kategórie bez kategórie (E)-3-fenylpropenál 104-55-2 kvapalina 2 kat. 2 bez kategórie 
(nepovinná 
kat. 3 ) (
 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1 kvapalina 2,3 kat. 2 kat. 2  
3-p-kumenyl-2-metylpropanál 103-95-7 kvapalina 2,3 kat. 2 kat. 2 1-brómhexán 111-25-1 kvapalina 2,7 kat. 2 kat. 2 2-chlórmetyl-3,5-dimetyl-4- 
metoxypyridín HCl 86604-75-3 tuhá látka 2,7 kat. 2 kat. 2  
Dipropyldisulfán  (
 2 ) 629-19-6 kvapalina 3 bez kategórie kat. 2  
Hydroxid draselný (5 % 
roztok) 1310-58-3 kvapalina 3 kat. 2 kat. 2 
Benzénetiol, 5-(1,1 dimetyle ­
tyl)-2-metyl 7340-90-1 kvapalina 3,3 kat. 2 kat. 2 
1-metyl-3-fenyl-1-piperazín 5271-27-2 tuhá látka 3,3 kat. 2 kat. 2  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Chemikália Číslo CAS Fyzikálny stav Hodnota  in vivo  VRM kat.  in 
vitro  GHS OSN/CLP EÚ 
kat. in vivo  
Heptanál 111-71-7 kvapalina 3,4 kat. 2 kat. 2 
Tetrachlóretylén 127-18-4 kvapalina 4 kat. 2 kat. 2  
( 1 ) Výber chemikálií je založený na týchto kritériách: i) chemikálie sú komer čne dostupné; ii) zastupujú celý rad výsledkov dráždivosti 
Draizovho testu (od nedráždiacich až po silne dráždiace); iii) majú dobre definovanú chemickú štruktúru; iv) reprezentujú chemi ckú 
funkčnosť použitú v procese validácie a v) nesúvisia s extrémne toxickým profilom (napr. karcinogénnym alebo toxickým pre 
reprodukčný systém) a nesúvisia s obmedzujúcimi nákladmi na zneškodnenie. 
( 2 ) Chemikálie, ktoré spôsobujú podráždenie u králikov, ale u ktorých je spo ľahlivo dokázané, že nespôsobujú podráždenie u ľudí (31) (32) (33). 
( 3 ) Podľa GHS OSN, nie pod ľa EÚ CLP.  
III. Vymedzené hodnoty spo ľahlivosti a presnosti  
8. Na ú čely stanovenia spo ľahlivosti a relevantnosti navrhovaných podob ­
ných alebo upravených metód, ktoré by sa mali prenáša ť medzi laborató ­
riami, je potrebné aspo ň v troch laboratóriách otestova ť všetkých 20 refe ­
renčných chemikálií, ktoré sú uvedené v tabu ľke 1. Ak sa však navrho ­
vaná metóda má používa ť iba v jednom laboratóriu, multilaboratórne testo ­
vanie nebude na jej validáciu potrebné. Je však nevyhnutné, aby takéto validačné štúdie nezávisle posúdili medzinárodne uznávané valida čné 
orgány v súlade s medzinárodnými usmerneniami (9). V každom labora ­
tóriu by sa všetkých 20 referen čných chemikálií malo testova ť v troch 
nezávislých pokusoch vykonaných s rôznymi šaržami tkaniva v dostatočných časových odstupoch. Každý pokus by mal obsahova ť mini­
málne tri súbežne testované repliky tkaniva pre každú zapojenú testovanú 
chemikáliu, negatívnu kontrolu a pozitívnu kontrolu. 
9. Pri výpo čte hodnôt spo ľahlivosti a presnosti navrhovanej metódy by sa 
mali spolo čne zvážiť všetky štyri kritériá uvedené nižšie, čím sa zabezpe čí, 
že hodnoty spo ľahlivosti a relevantnosti sú vypo čítané vopred vyme ­
dzeným a konzistentným spôsobom: 
1. Na výpo čet variability a schopnosti prognózy (presnosti) metódy 
v rámci laboratória a medzi laboratóriami sa použijú iba tie údaje, ktoré pochádzajú z úplnej série pokusov. 
2. Konečná klasifikácia každej referen čnej chemikálie v každom zú čast­
nenom laboratóriu by sa mala získa ť použitím strednej hodnoty života ­
schopnosti po čas rôznych pokusov v rámci úplnej série pokusov. 
3. Na výpo čet medzilaboratórnej variability metódy sa použijú iba údaje 
pre tie chemikálie, s ktorými boli vykonané úplné série pokusov vo 
všetkých zú častnených laboratóriách. 
4. Výpočet hodnôt presnosti by mal by ť založený na jednotlivých labora ­
tórnych prognózach získaných pre 20 referen čných chemikálií 
v rôznych zú častnených laboratóriách. 
V tomto kontexte sa  séria pokusov  skladá z troch nezávislých pokusov 
s jednou testovanou chemikáliou z jedného laboratória.  Úplná séria 
pokusov  je séria pokusov s jednou testovanou chemikáliou z jedného 
laboratória, pri čom všetky tri pokusy sú platné. To znamená, že jediný 
neplatný pokus ruší platnos ť celej série troch pokusov.  
Vnútrolaboratórna reprodukovate ľnosť 
10. Hodnotenie vnútrolaboratórnej reprodukovate ľnosti by malo dokáza ť súlad 
s klasifikáciami (kategória 2 a „bez kategórie“ v zmysle GHS OSN/CLP EÚ) 
získanými pri iných, nezávislých pokusoch s 20 referen čnými chemikáliami 
v rámci jedného laboratória, ktorý je vyšší ako alebo sa rovná ( ≥) 90 %.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť 
11. Hodnotenie medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti nie je nevyhnutné, ak 
sa navrhovaná metóda používa len v jednom laboratóriu. Pre metódy, 
ktoré sa budú prenáša ť medzi laboratóriami, by mal by ť súlad 
s klasifikáciami (kategória 2/„bez kategórie“ v zmysle GHS OSN/CLP EÚ) získanými pri rôznych, nezávislých pokusoch s 20 referen čnými 
chemikáliami najlepšie medzi minimálne tromi laboratóriami vyšší ako 
alebo sa rovna ť (≥) 80 %.
 
Schopnos ť prognózy (presnos ť) 
12. Presnos ť (citlivosť, špecifickos ť a celková presnos ť) navrhovanej podobnej 
alebo upravenej metódy by mala by ť porovnate ľná alebo lepšia ako pres ­
nosť validovanej referen čnej metódy, pri čom sa berú do úvahy dodato čné 
informácie týkajúce sa relevantnosti pri druhoch, ktoré sú predmetom záujmu (tabu ľka 2). Citlivos ť by sa mala rovna ť alebo by mala by ť väčšia 
(≥) ako 80 % (2) (8) (23). Citlivosti navrhovanej metódy  in vitro  sa však 
týka ďalšie konkrétne obmedzenie vzh ľadom na to, že len dve chemikálie  
in vivo  kategórie 2, 1-dekanol a dipropyldisulfán, môžu by ť viac ako 
jedným zú častneným laboratóriom nesprávne klasifikované ako chemikálie 
„bez kategórie“. Špecifickos ť by sa mala rovna ť alebo by mala by ť väčšia 
(≥) ako 70 % (2) (8) (23). Neexistuje ďalšie obmedzenie, pokia ľ ide 
o špecifickos ť navrhnutej metódy  in vitro , t. j. každé zú častnené labora ­
tórium môže nesprávne klasifikova ť ktorúkoľvek chemikáliu  in vivo  ako 
chemikáliu „bez kategórie“, pokia ľ sa kone čná špecifickos ť testovacej 
metódy nachádza v prijate ľnom rozsahu. Celková presnos
ť by sa mala 
rovnať alebo by mala by ť väčšia (≥) ako 75 % (2) (8) (23). Aj ke ď 
citlivosť validovanej referen čnej metódy vypo čítaná pre 20 referen čných 
chemikálií uvedených v tabu ľke 1 sa rovná 90 %, vymedzená hodnota 
minimálnej citlivosti požadovanej pre akúko ľvek podobnú alebo upravenú 
metódu, ktorá sa má považova ť za validovanú, je stanovená na 80 %, 
keďže 1-dekanol (hrani čná chemikália) aj dipropyldisulfán (falošný nega ­
tívny výsledok validovanej referen čnej metódy) sú známe tým, že nespô ­
sobujú podráždenie kože u ľudí (31) (32) (33), aj ke ď boli identifikované 
ako dráždivé v teste s králikmi. Ke ďže modely RhE sú založené na 
bunkách ľudského pôvodu, môže sa predpoklada ť, že tieto chemikálie 
nespôsobujú podráždenie („bez kategórie“ v zmysle GHS OSN/CLP EÚ).  
Tabuľka 2 
Požadované predpokladané hodnoty citlivosti, špecifickosti a celkovej presnosti potrebné na 
to, aby sa každá podobná alebo upravená metóda mohla považova ť za validovanú  
Citlivosť Špecifickos ť Celková presnos ť 
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Kritériá schválenia štúdie  
13. Je možné, že jeden alebo viacero testov týkajúcich sa jednej alebo viace ­
rých testovaných chemikálií nesp ĺňa kritériá na schválenie testu 
a kontrolných chemikálií alebo nie je prijate ľný(-ých) z iných dôvodov. 
Na doplnenie chýbajúcich údajov pri každej testovanej chemikálii sú prija ­
teľné maximálne dva dopl ňujúce testy („opakované testovanie“). Pres ­
nejšie povedané, ke ďže v prípade opakovaného testovania je potrebné 
súbežne testova ť aj negatívne a pozitívne kontroly, možno vykona ť maxi­
málne dva ďalšie pokusy pre každú testovanú chemikáliu. 
14. Je možné, že ani po opakovanom testovaní sa nepodarí získa ť minimálny 
počet troch platných pokusov požadovaných pre každú testovanú chemi ­
káliu v prípade každej referen čnej chemikálie v každom zú častnenom 
laboratóriu, čo bude vies ť k neúplnej matici údajov. V takýchto prípadoch, 
aby bolo možné považova ť tieto súbory údajov za prijate ľné, treba splni ť 
všetky tieto tri kritériá: 
1. So všetkými 20 referen čnými chemikáliami by mala by ť vykonaná 
aspoň jedna úplná séria pokusov.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. V každom z minimálne troch zú častnených laboratórií musia úplné 
série pokusov predstavova ť aspoň 85 % (pre 20 chemikálií, t. j. 3 
neplatné série pokusov v jednom laboratóriu sú prijate ľné). 
3. Minimálne v troch laboratóriách musí zo všetkých možných sérií 
pokusov aspo ň 90 % predstavova ť úplné série pokusov (pre 20 chemi ­
kálií testovaných v troch laboratóriách; t. j. 6 neplatných sérií pokusov v jednom laboratóriu je prijate ľných).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  TESTOVACIA METÓDA ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI HOVÄ ­
DZEJ ROHOVKY NA ZIS ŤOVANIE O ČNÝCH ŽIERAVÍN 
A SILNE DRÁŽDIVÝCH LÁTOK  
ÚVOD 
1. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je testovacia 
metóda  in vitro , ktorá sa môže používa ť za určitých okolností a so špeci ­
fickými obmedzeniami na klasifikáciu látok a zmesí ako „o čných žieravín 
a silne dráždivých látok“ (1) (2) (3). Na ú čely tejto testovacej metódy sa 
silne dráždivé látky vymedzujú ako dráždivé látky vyvolávajúce o čné 
lézie, ktoré u králikov pretrvávajú najmenej 21 dní po podaní. Hoci sa nepovažuje za platnú a plnohodnotnú náhradu  in vivo  testu králi čích očí, 
na účely regula čnej klasifikácie a ozna čovania v rámci ur čitej sféry použi ­
teľnosti sa odporú ča používa ť testovaciu metódu zákalu a priepustnosti 
hovädzej rohovky ako sú časť stratégie postupného testovania (4) (5). 
Testované látky a zmesi (6) možno klasifikova ť ako očné žieraviny 
alebo silne dráždivé látky bez ďalšieho testovania na králikoch. Látka, 
ktorej testovanie je negatívne, by sa musela testova ť na králikoch 
s využitím stratégie sekven čného testovania, ako sa ustanovuje 
v usmernení OECD pre testy 405 (7) (kapitola B.5 tejto prílohy). 
2. Účelom tejto metódy je opis postupov, ktoré sa používajú na posudzovanie 
možnej o čnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky meraním 
jej schopnosti vyvola ť zákal a zvýšenú priepustnos ť v izolovanej hovädzej 
rohovke. Toxické ú činky na rohovku sa merajú: i) zníženým prestupom 
svetla (zákal) a ii) zvýšeným prechodom farbiva fluoresceínu sodného 
(priepustnos ť). Hodnotenia zákalu a priepustnosti rohovky po vystavení 
pôsobeniu testovanej látky sa zlú čia a odvodí sa hodnotiace číslo in 
vitro  (In Vitro  Irritancy Score, ďalej len „IVIS“), ktoré sa používa na 
klasifikáciu úrovne dráždivosti testovanej látky. 
3. Očné dráždivé látky vyvolávajúce lézie, ktoré ustúpia za menej ako 21 dní, 
a nedráždivé látky sa takisto testovali s využitím testovacej metódy zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky. Presnos ť
 a spoľahlivosť testovacej 
metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pre látky v týchto kate ­
góriách sa však formálne neposudzovala. 
4. Vymedzenie pojmov sa uvádza v dodatku 1.  
POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
5. Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky medziagentúrneho koordina čného výboru 
pre overovanie alternatívnych metód (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ďalej len „ICCVAM“) (8), ktorý 
bol vytvorený pod ľa medzinárodnej hodnotiacej štúdie (4)(5)(9) 
s príspevkami od Európskeho centra pre validáciu alternatívnych metód a japonského centra pre overovanie alternatívnych metód. Tento protokol vychádza z informácií získaných od Inštitútu pre vedy  in vitro  a z proto ­
kolu INVITTOX 124 (10), ktorý predstavuje protokol používaný pri 
rozbore predbežnej hodnotiacej štúdie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, ktorú financovalo Európske spolo čen­
stvo a ktorá prebehla v rokoch 1997 –1998. Obidva protokoly vychádzajú 
z metodiky rozboru testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej 
rohovky, ktorú prvýkrát zverejnil Gautheron a kolektív (11).
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vychádzajú z vysokých mier 
falošnej pozitivity na alkoholy a ketóny a z vysokej miery falošnej nega ­
tivity na tuhé látky zaznamenané v overovacej databáze (pozri odsek 44) (5). Keď sa látky týchto chemických a fyzikálnych tried vylú čia 
z databázy, presnos ť testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej 
rohovky v klasifika čných systémoch EÚ, Agentúry na ochranu životného 
prostredia ( ďalej len „EPA“) a Globálneho harmonizovaného systému 
klasifikácie a ozna čovania chemických látok a zmesí ( ďalej len „GHS“) 
sa výrazne zlepší (5). Vzh ľadom na ú čely tohto rozboru (t. j. iba na 
zisťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) nie sú miery falošnej 
negativity rozhodujúce, pretože takéto látky by sa následne testovali na králikoch alebo inými vhodne overenými testami  in vitro  v závislosti od 
regulačných požiadaviek s použitím stratégie sekven čného testovania, 
ktorá vychádza z prístupu pod ľa závažnosti dôkazov. Okrem toho aktuálna 
overovacia databáza neumož ňuje primerané posúdenie niektorých chemic ­
kých tried alebo tried výrobkov (napr. zmesí). Výskumníci by však mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy pre všetky druhy testovaných mate ­
riálov (vrátane zmesí), pri čom pozitívny výsledok by sa mohol akceptova ť 
ako údaj, ktorý nazna čuje reakciu vo forme o čnej žieravosti alebo silného 
podráždenia. Pozitívny výsledok získaný pre alkoholy alebo ketóny by sa však mal interpretova ť opatrne pre riziko nadsadenej predpovede. 
7. Všetky postupy s hovädzími o čami a s hovädzími rohovkami by mali 
zodpoveda ť platným nariadeniam pre dané testovacie zariadenie 
a postupom na narábanie s materiálom živo číšneho pôvodu, medzi ktoré, 
okrem iných, patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporú čajú sa všeobecne 
platné laboratórne bezpe čnostné opatrenia (12). 
8. Obmedzením tejto testovacej metódy je, že i ke ď sa pri nej zoh ľadňujú 
niektoré ú činky na o či, ktoré sa posudzujú metódou testovania o čnej dráž­
divosti králikov, a do istej miery aj ich závažnos ť, neprihliada sa na 
poškodenia spojiviek a dúhovky. I ke ď sa vratnos
ť lézií rohovky nemôže 
pri rozbore zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky posudzova ť samo­
statne, na základe štúdií o čí králikov sa takisto podal návrh, aby sa hodno ­
tenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používa ť na rozlišo ­
vanie nevratných a vratných ú činkov (13). A napokon, testovanie zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky neumož ňuje vykona ť hodnotenie poten ­
ciálnej systémovej toxicity súvisiacej s expozíciou o čí. 
9. Práce na charakterizovaní použite ľnosti a obmedzení rozboru zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky pri zis ťovaní slabo dráždivých 
a nedráždivých látok (pozri aj odsek 45) pokra čujú. Používate ľom sa 
takisto odporú ča, aby poskytli vzorky a/alebo údaje hodnotiacim organi ­
záciám na formálne posúdenie možných budúcich spôsobov použitia testo ­
vacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky aj na zis ťovanie 
slabo dráždivých a nedráždivých látok. 
10. V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát zavádza tento rozbor, by sa mali 
použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 2. Labo ­
ratórium môže použi ť tieto chemikálie na preukázanie svojej technickej 
spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky prv, ako predloží údaje z rozboru zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky na ú čely klasifikácie nebezpe čenstva 
podľa predpisov.
 
PRINCÍP TESTU 
11. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je organoty ­
pický model, ktorý poskytuje krátkodobé zachovanie normálnej fyziolo ­
gickej a biochemickej funkcie hovädzej rohovky  in vitro . Pri tejto testo ­
vacej metóde sa poškodenie testovanou látkou hodnotí kvantitatívnymi 
meraniami zmien zákalu a priepustnosti rohovky opacitometrom, resp. 
spektrofotometrom vo vidite ľnej oblasti svetla. Obidve merania sa použí ­
vajú na výpo čet hodnotiaceho čísla in vitro , ktoré sa používa na priradenie 
klasifikačnej kategórie nebezpe čenstva podráždenia  in vitro  na predvídanie 
schopnosti testovanej látky vyvola ť očné podráždenie  in vivo  (pozri časť 
Rozhodovacie kritériá).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú 
izolované rohovky z o čí čerstvo zabitých zvierat. Zákal rohovky sa kvan ­
titatívne meria ako množstvo svetla prepusteného cez rohovku. Priepust ­
nosť sa kvantitatívne stanovuje ako množstvo farbiva fluoresceínu 
sodného, ktoré prejde cez celú hrúbku rohovky, a meria sa v médiu zadnej 
komory. Testované látky sa nanášajú na epiteliálny povrch rohovky 
pridaním do prednej komory držiaka rohovky. Dodatok 3 obsahuje opis a schému držiaka rohovky, ktorý sa používa v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Držiaky rohovky sa dajú zakúpi ť 
z rôznych zdrojov alebo sa dajú zhotovi ť.
 
Zdroj a vek hovädzích o čí a výber druhov zvierat  
13. Dobytok odoslaný na bitúnky sa zvy čajne zabíja pre ľudskú spotrebu 
alebo pre iné komer čné spôsoby použitia. Ako zdroj rohoviek pre testo ­
vanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú iba zdravé zvieratá, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového 
reťazca. Keďže rozsah hmotnosti dobytka je široký v závislosti od spôsobu 
chovu, veku a pohlavia, neexistuje žiadne odporú čanie pre hmotnos ť zvie­
raťa v čase zabitia. 
14. Pri použití o čí zo zvierat v rôznom veku môžu by ť rozmery rohoviek 
rôzne. Rohovky s vodorovným priemerom > 30,5 mm a s hodnotami stredovej hrúbky rohovky ≥ 1 100 μm sa vo všeobecnosti získavajú 
z dobytka staršieho ako osem rokov, zatia ľ čo rohovky s vodorovným 
priemerom < 28,5 mm a s hodnotami stredovej hrúbky rohovky < 900 μm sa vo všeobecnosti získavajú z dobytka mladšieho ako pä ť 
rokov (14). Z toho dôvodu sa o či dobytka staršieho ako 60 mesiacov 
zvyčajne nepoužívajú. O či dobytka mladšieho ako 12 mesiacov sa takisto 
tradične nepoužívajú, pretože tieto o či sa ešte vyvíjajú a hrúbka rohovky 
a priemer rohovky sú zna čne menšie, ako sa uvádza v prípade o čí dospe­
lého dobytka. Použitie rohoviek mladých zvierat (t. j. 6 až 12 mesa čných) 
je však prípustné, pretože to má nieko ľko výhod, ako je vyššia dostup ­
nosť, užší vekový interval a menšie nebezpe čenstvo súvisiace 
s potenciálnym vystavením pracovníkov bovinnej spongiformnej encefalo ­
patii (15). Ke ďže ďalšie posúdenie vplyvu ve ľkosti alebo hrúbky rohovky 
na schopnos ť reagovať na žieravé a dráždivé látky by bolo prínosné, 
odporúča sa, aby používatelia oznámili odhadovaný vek a/alebo hmotnos
ť 
zvierat, od ktorých rohovky použité v štúdii pochádzajú.  
Odber a doprava o čí do laboratória  
15. Odber o čí vykonávajú zamestnanci bitúnkov. V snahe minimalizova ť 
mechanické a iné druhy poškodenia o čí by sa o či mali vylúpnu ť čo 
najskôr po zabití. Zamestnanci bitúnkov by pri oplachovaní hlavy zviera ťa 
nemali použi ť žiadny detergent, aby sa predišlo vystaveniu o čí pôsobeniu 
potenciálne dráždivých látok. 
16. Oči by sa mali úplne ponori ť do Hankovho vyváženého so ľného roztoku 
(ďalej len „HBSS“) v nádrži vhodnej ve ľkosti a dopravi ť do laboratória 
takým spôsobom, aby sa minimalizovalo poškodenie a/alebo kontaminácia 
baktériami. Ke ďže odber o čí sa vykonáva po čas zabíjania, tieto o či môžu 
byť vystavené styku s krvou alebo inými biologickými látkami vrátane 
baktérií a iných mikroorganizmov. Preto je dôležité minimalizova ť nebez­
pečenstvo kontaminácie (napr. uložením nádrže s o čami na ľad, pridaním 
antibiotík do HBSS, ktorý sa používa na skladovanie o čí pri preprave 
[napr. dávkou penicilínu 100 IU/ml a streptomycínu 100 mg/ml]).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Časový interval medzi odberom o čí a použitím rohoviek na testovanie 
zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mal minimalizova ť (zvy­ 
čajne sa odber a použitie vykoná v jednom dni) a mal by by ť preukáza ­
teľný, aby sa nedali spochybni ť výsledky rozboru. Základom pre tieto 
výsledky sú výberové kritériá na o či, ako aj reakcie pri pozitívnej 
a negatívnej kontrole. Všetky o či použité na rozbor by mali by ť 
z jednej skupiny o čí pochádzajúcich z odberu v ur čitý deň. 
Výberové kritériá na o či používané na testovanie zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky  
18. Ke ď sa oči dopravia do laboratória, pozorne sa prekontrolujú s oh ľadom 
na poškodenia vrátane zvýšeného zákalu, škrabancov a prekrvenia. Môžu 
sa použiť iba rohovky z o čí bez takýchto chýb. 
19. V ďalších krokoch rozboru sa takisto posudzuje kvalita každej rohovky. 
Rohovky, ktoré majú po prvej hodine usta ľovania zákal vä čší ako sedem 
zákalových jednotiek, sa majú vyradi ť (POZNÁMKA: opacitometer by sa 
mal kalibrova ť podľa noriem zákalu, ktoré sa používajú na stanovenie 
zákalových jednotiek, pozri dodatok 3). 
20. Skupina pre každú úpravu (testovaná látka, súbežné negatívne a pozitívne 
kontroly) sa skladá minimálne z troch o čí. Tri rohovky by sa mali použi ť 
na negatívnu kontrolu pri rozbore testovania zákalu a priepustnosti hovä ­
dzej rohovky. Ke ďže odobrané rohovky pochádzajú z celých o čných gulí 
a tieto sa inštalujú do komôr na rohovky, existuje tu možnos ť, že táto 
manipulácia môže ovplyvni ť jednotlivé hodnoty zákalu a priepustnosti 
rohovky (vrátane negatívnej kontroly). Okrem toho hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek z negatívnej kontroly sa používajú na korigovanie 
testovaného predmetu a hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek 
z pozitívnej kontroly pri výpo čtoch IVIS.
 
POSTUP  
Príprava o čí 
21. Rohovky bez chýb sa vyrežú s 2 až 3 mm prúžkom skléry, ktorá pomáha pri 
následnej manipulácii, pri čom sa postupuje opatrne, aby nedošlo 
k poškodeniu epitelu a endotelu rohovky. Oddelené rohovky sa nainštalujú 
do špeciálne navrhnutých držiakov rohovky pozostávajúcich z prednej a zadnej priehradky, ktoré sa dotýkajú epiteliálnej, resp. endoteliálnej strany rohovky v uvedenom poradí. Obidve komory sa naplnia prebytkom pred ­
hriateho minimálneho základného média Eagle (Eagle's Minimum Essential 
Medium, ďalej len „EMEM“) (najprv zadná komora), čím sa zabezpe čí, že sa 
nevytvoria žiadne bubliny. Zariadenie sa potom usta ľuje pri teplote 32 ± 1 °C 
aspoň jednu hodinu, čím sa umožní, aby sa rohovky dostali do rovnováhy 
s médiom a dosiahli bežnú metabolickú aktivitu v najvä čšej možnej miere 
(približná teplota povrchu rohovky  in vivo  je 32 °C). 
22. Po dobe usta ľovania sa do obidvoch komôr pridá čerstvé predhriate 
EMEM a pre každú rohovku sa od čítajú základné údaje o zákale. Všetky 
rohovky, ktoré vykazujú makroskopické poškodenie tkaniva (napr. škra ­
bance, pigmentáciu, neovaskularizáciu) alebo zákal > 7 zákalových jedno ­
tiek, sa vyradia. Vypo čítajú sa priemerné hodnoty zákalu všetkých ustále ­
ných rohoviek. Minimálne tri rohovky s hodnotami zákalu blízkymi strednej hodnote všetkých rohoviek sa vyberú ako rohovky na negatívnu 
kontrolu (alebo kontrolu rozpúš ťadla). Zvyšné rohovky sa potom rozdelia 
do skupín na úpravu a pozitívnu kontrolu.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Ke ďže tepelná kapacita vody je vyššia ako tepelná kapacita vzduchu, voda 
poskytuje stabilnejšie teplotné podmienky inkubácie. Preto sa odporú ča 
použiť vodný kúpe ľ na udržiavanie držiaka rohovky a jeho obsahu na 
teplote 32 ± 1 °C. Vzdušné inkubátory sa však takisto môžu používa ť, 
pričom sa predpokladajú opatrenia na udržiavanie stabilnej teploty (napr. 
predhriatím držiakov a médií).  
Nanesenie testovanej látky  
24. Používajú sa dva rôzne protokoly na úpravu, jeden na kvapaliny 
a povrchovo aktívne látky (tuhé látky alebo kvapaliny) a jeden na 
povrchovo neaktívne tuhé látky. 
25. Kvapaliny sa testujú nezriedené, zatia ľ čo povrchovo aktívne látky sa 
testujú pri koncentrácii 10 % m/V v 0,9 % roztoku chloridu sodného, 
v destilovanej vode alebo v inom rozpúš ťadle, o ktorom sa preukázalo, 
že nemá žiadne nepriaznivé ú činky na testovací systém. Polotuhé látky, 
pasty a vosky sa zvy čajne testujú ako kvapaliny. Pre alternatívne koncen ­
trácie zriedenia by sa mali uvies ť príslušné dôvody. Rohovky sa vystavia 
pôsobeniu kvapalín a povrchovo aktívnych látok po čas 10 minút. Pri 
použití inej d ĺžky expozície by sa malo uvies ť primerané vedecké zdôvod ­
nenie. 
26. Povrchovo neaktívne tuhé látky sa zvy čajne testujú ako roztoky alebo 
suspenzie s koncentráciou 20 % v 0,9 % roztoku chloridu sodného, 
v destilovanej vode alebo v inom rozpúš ťadle, o ktorom sa preukázalo, 
že nemá žiadne nepriaznivé ú činky na testovací systém. Za ur čitých okol ­
ností a pri riadnom vedeckom zdôvodnení sa tuhé látky môžu testova ť aj 
čisté priamym nanesením na povrch rohovky s použitím metódy otvorenej 
komory (pozri odsek 29). Rohovky sa vystavia pôsobeniu tuhých látok na 
štyri hodiny, ale podobne ako pri kvapalinách a povrchovo aktívnych látkach môžu sa použi ť iné dĺžky expozície s primeraným vedeckým 
zdôvodnením. 
27. V závislosti od fyzikálnej povahy a chemických vlastností (napr. tuhé 
látky, kvapaliny, viskózne či neviskózne kvapaliny) testovanej látky sa 
môžu používa ť rôzne metódy úpravy. Najdôležitejšie je zabezpe čiť, aby 
testovaná látka primerane pokrývala epiteliálny povrch a aby sa pri opla ­
chovaní primerane odstránila. Metóda uzavretej komory sa zvy čajne 
používa na neviskózne až mierne viskózne kvapalné testované látky, zatia ľ 
čo metóda otvorenej komory sa zvy čajne používa na poloviskózne 
a viskózne kvapalné testované látky a na čisté tuhé látky. 
28. Pri metóde uzavretej komory sa do prednej komory cez dávkovacie otvory 
na hornej strane komory zavedie dostato čné množstvo testovanej látky 
(750 μl) tak, aby sa ňou pokryla epiteliálna strana rohovky, a otvory 
komory sa následne uzavrú zátkami na čas expozície. Dôležité je zabez ­
peč
iť, aby každá rohovka bola vystavená pôsobeniu testovanej látky po čas 
primeraného obdobia. 
29. Pri metóde otvorenej komory sa pred úpravou vyberie prstencový zámok 
okna a sklenené okno z prednej komory. Kontrolná alebo testovaná látka 
(750 μl alebo dostato čné množstvo testovanej látky na úplné pokrytie 
rohovky) sa nanesie priamo na epiteliálny povrch rohovky pomocou mikropipety. Ak sa testovaná látka ťažko pipetuje, môže sa na u ľahčenie 
dávkovania naplni ť do piestovej pipety pod tlakom. Špi čka piestovej 
pipety sa vloží do dávkovacieho hrotu strieka čky tak, aby sa materiál 
mohol zavies ť do vytlá čacieho hrotu pod tlakom. Sú časne s posúvaním 
piestu pipety nahor sa tla čí na piest strieka čky. Ak sa v špi čke pipety 
objavia vzduchové bubliny, testovaný materiál sa odstráni (vytla čí) 
a postup sa opakuje, pokia ľ sa špička nenaplní bez vzduchových bublín. 
Ak je potrebné, môže sa použi ť obyčajná strieka čka (bez ihly), pretože 
umožňuje odmera ť presný objem testovanej látky a jej ľahšie nanesenie na 
epiteliálny povrch rohovky. Po dávkovaní sa sklenené okno vráti na svoje 
miesto v prednej komore a tým sa systém znova uzavrie.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Poexpozi čná inkubácia  
30. Po uplynutí expozi čného obdobia sa testovaná látka, látka na negatívnu 
kontrolu alebo na pozitívnu kontrolu odstránia z prednej komory a epitel 
sa prepláchne aspo ň trikrát (alebo pokia ľ nie sú vidite ľné žiadne znaky 
prítomnosti testovanej látky) s EMEM (obsahujúcim fenolovú červeň). 
Médium s obsahom fenolovej červene sa používa na oplachovanie, lebo 
zmena farby fenolovej červene sa môže monitorova ť, čím sa zistí ú činnosť 
oplachovania kyslých alebo zásaditých materiálov. Rohovky sa umývajú viac ako trikrát, pokia ľ je farba fenolovej červene zmenená (na žltú alebo 
fialovú) alebo je testovaná látka stále vidite ľná. Keď médium neobsahuje 
testovanú látku, rohovky sa opláchnu posledný krát s EMEM (bez feno ­
lovej červene). EMEM (bez fenolovej červene) sa používa na kone čné 
opláchnutie, aby sa zabezpe čilo odstránenie fenolovej červene z prednej 
komory pred meraním zákalu. Predná komora sa potom znova naplní 
čerstvým EMEM bez fenolovej červene. 
31. V prípade kvapalín alebo povrchovo aktívnych látok sa rohovky po 
opláchnutí inkubujú ďalšie dve hodiny pri teplote 32 ± 1 °C. Dlhší poex ­
pozičný čas môže by ť za určitých podmienok užito čný a mohlo by sa 
o ňom v jednotlivých prípadoch uvažova ť. Rohovky upravené tuhou 
látkou sa na konci štvorhodinového expozi čného obdobia dôkladne 
opláchnu, ale nevyžaduje sa ďalšia inkubácia. 
32. Na konci poexpozi čného inkuba čného obdobia, v prípade kvapalín 
a povrchovo aktívnych látok, a na konci štvorhodinového expozi čného 
obdobia, v prípade povrchovo neaktívnych tuhých látok, sa zaznamená 
zákal a priepustnos
ť každej rohovky. Každá rohovka sa takisto vizuálne 
prehliadne a prípadné pozorovania sa zaznamenajú (napr. zlupovanie 
tkaniva, zvyšky testovanej látky, vzorky s nerovnomerným zákalom). 
Tieto pozorovania by mohli by ť dôležité, lebo sa môžu prejavi ť 
v kolísaní údajov opacitometra.  
Kontrolné látky  
33. Súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúš ťadla/nosiča a pozitívne 
kontroly sú sú časťou každého pokusu. 
34. Ke ď sa testuje kvapalná látka s koncentráciou 100 %, do testovacej 
metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa za čleňuje súbežná 
negatívna kontrola (napr. 0,9 % roztok chloridu sodného alebo destilovaná voda), aby sa dali zisti ť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby 
sa poskytol základ na koncové body rozboru. Tým sa takisto zabezpe čuje, 
aby v dôsledku podmienok rozboru nedošlo k neprimeranej reakcii vo forme podráždenia. 
35. Ke ď sa testuje zriedená kvapalina, povrchovo aktívna látka alebo tuhá 
látka, do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa 
začleňuje súbežná kontrolná skupina rozpúš ťadla/nosiča, aby sa dali zisti ť 
nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ na koncové body rozboru. Môže sa použi ť iba také rozpúš ťadlo/nosič, 
u ktorého sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé ú činky na testovací 
systém. 
36. Do každého pokusu sa za čleňuje nejaká známa o čná dráždivá látka ako 
súbežná pozitívna kontrola a tým sa overuje vyvolanie primeranej reakcie. 
Keďže rozbor zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používa v tejto 
testovacej metóde na zis ťovanie žieravých alebo silne dráždivých látok, 
v ideálnom prípade by sa na pozitívnu kontrolu mala použi ť referenčná 
látka, ktorá v tejto testovacej metóde vyvoláva závažnú reakciu. V snahe 
zabezpečiť možnos ť vyhodnoti ť premenlivos ť reakcie pri pozitívnej 
kontrole v čase by však závažnos ť dráždivej reakcie nemala by ť extrémne 
silná. 
37. Príklady pozitívnych kontrol na kvapalné testované látky sú dimetylfor ­
mamid alebo 1 % hydroxid sodný. Príkladom pozitívnej kontroly na tuhé 
testované látky je 20 % (hmotnos ť na objem) roztok imidazolu v 0,9 % 
roztoku chloridu sodného.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Referen čné látky sú užito čné na posudzovanie potenciálu o čnej dráždivosti 
neznámych chemikálií ur čitej chemickej triedy alebo triedy výrobkov 
alebo na posudzovanie potenciálu pomernej dráždivosti o čnej dráždivej 
látky v rámci ur čitého rozsahu dráždivých reakcií.  
Namerané koncové body  
39. Zákal ur čuje množstvo svetla prepusteného cez rohovku. Zákal rohovky sa 
kvantitatívne meria pomocou opacitometra a výsledkom sú hodnoty zákalu merané na spojitej stupnici. 
40. Priepustnos ť určuje množstvo farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde 
cez všetky bunkové vrstvy rohovky (t. j. od epitelu na vonkajšom povrchu rohovky cez endotel na vnútornom povrchu rohovky). 1 ml roztoku fluo ­
resceínu sodného (4 alebo 5 mg/ml, ke ď sa testujú kvapaliny a povrchovo 
aktívne látky, resp. povrchovo neaktívne tuhé látky) sa pridá do prednej komory držiaka rohovky, ktorá sa dotýka epiteliálnej strany rohovky, zatiaľ čo zadná komora, ktorá sa dotýka endoteliálnej strany rohovky, sa 
naplní čerstvým EMEM. Držiak sa potom inkubuje vo vodorovnej polohe 
počas 90 ± 5 minút pri teplote 32 ± 1 °C. Množstvo fluoresceínu sodného, 
ktorý prejde do zadnej komory, sa kvantitatívne odmeria pomocou ultra ­
fialovej/vidite ľnej spektrofotometrie. Spektrofotometrické merania stano ­
vené pri 490 nm sa zaznamenajú ako hodnoty optickej hustoty (OD
 490 ) 
alebo absorbancie, ktoré sa merajú na spojitej stupnici. Hodnoty priepust ­
nosti fluoresceínu sa stanovia z hodnôt OD  490 nameraných spektrofotome ­
trom pri vidite ľnom svetle s použitím štandardnej optickej d ĺžky 1 cm. 
41. Alternatívne sa môže použi ť snímač 96-jamkových mikrotitra čných platní 
za predpokladu, že i) je možné vytvori ť lineárny rozsah sníma ča platní na 
stanovenie hodnôt OD  490 pre fluoresceín a ii) použijú sa správne objemy 
vzoriek fluoresceínu na 96-jamkovej platni čke, aby výsledkom boli 
hodnoty OD  490 , ktoré sa rovnajú štandardnej optickej d ĺžke 1 cm (to by 
mohlo vyžadova ť kompletné naplnenie jamky [oby čajne 360ml]).  
ÚDAJE A SPRÁVA  
Vyhodnotenie údajov  
42. Ke ď sa vykoná korekcia hodnôt zákalu a priemernej priepustnosti (OD  490 ) 
vzhľadom na zákal pozadia a hodnoty priepustnosti OD  490 negatívnej 
kontroly, priemerné hodnoty zákalu a priepustnosti OD  490 pre každú upra ­
venú skupinu by sa mali dosadi ť do empiricky odvodeného vzorca na 
výpočet hodnotiaceho čísla dráždivosti  in vitro  (ďalej len „IVIS“) pre 
každú upravenú skupinu takto: 
IVIS = priemerná hodnota zákalu + (15 × priemerná hodnota 
priepustnosti OD  490 ) 
Sina a kol. (16) oznámili, že tento vzorec bol odvodený pri vnútrolabora ­
tórnych a medzilaboratórnych štúdiách. Údaje vypo čítané na súbor 36 
zlúčenín v rámci štúdie za ú časti viacerých laboratórií sa podrobili analýze 
podľa viacerých náhodných premenných s cie ľom určiť rovnicu, ktorá by 
najlepšie vyjadrovala vz ťah medzi údajmi  in vivo  a in vitro . Túto analýzu 
vykonali vedci v dvoch nezávislých spolo čnostiach a odvodili takmer 
totožné rovnice. 
43. Hodnoty zákalu a priepustnosti by sa mali posudzova ť aj samostatne, aby 
sa zistilo, či testovaná látka vyvolala žieravý ú činok, alebo silné podráž ­
denie iba prostredníctvom jednej z dvoch koncových hodnôt (pozri 
Rozhodovacie kritériá).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Rozhodovacie kritériá  
44. Látka, ktorá vyvoláva IVIS ≥ 55,1, sa vymedzuje ako žieravá alebo silne 
dráždivá. Ako sa uvádza v odseku 1, ak sa testovaná látka nepreukáže ako 
očná žieravina alebo silne dráždivá látka, malo by sa vykona ť ďalšie 
testovanie na ú čely klasifikácie a ozna čovania. Testovacia metóda zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky má celkovú presnos ť 79 % (113/143) až 
81 % (119/147), mieru falošnej pozitivity 19 % (20/103) až 21 % (22/103) 
a mieru falošnej negativity 16 % (7/43) až 25 % (10/40) v porovnaní s údajmi metódy na testovanie o čí králikov  in vivo  klasifikovanej pod ľa 
klasifikačného systému EPA (1), EÚ (2) alebo GHS (3). Ke ď sa látky 
v rámci ur čitých chemických tried (t. j. alkoholy, ketóny) alebo fyzikál ­
nych tried (t. j. tuhé látky) vylú čia z databázy, presnos ť testovania zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky v klasifika čných systémoch EÚ, EPA 
a GHS je v rozsahu 87 % (72/83) až 92 % (78/85), miera falošnej pozi ­
tivity je v rozsahu 12 % (7/58) až 16 % (9/56) a miera falošnej negativity 
je v rozsahu 0 % (0/27) až 12 % (3/26). 
45. Aj ke ď sa nezíska klasifikácia o čnej žieravosti alebo silnej dráždivosti 
testovanej látky, údaje testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky 
môžu byť užitočné v spojení s testovacími údajmi z testu o čí králikov  in 
vivo alebo z vhodne overeného testu  in vitro  na ďalšie posúdenie použi ­
teľnosti a obmedzení testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej 
rohovky na zis ťovanie slabo dráždivých alebo nedráždivých látok (usmer ­
nenie na používanie testovacích metód o čnej toxicity  in vitro  je v štádiu 
vývoja).
 
Kritériá prijate ľnosti štúdie  
46. Test sa považuje za prijate ľný, ak výsledkom pozitívnej kontroly je IVIS, 
ktoré patrí do rozsahu dvoch štandardných odchýlok aktuálneho historic ­
kého priemeru, ktorý sa má aktualizova ť najmenej každé tri mesiace alebo 
vždy, keď sa vykoná nejaký prijate ľný test v laboratóriách, kde sa testy 
vykonávajú zriedkavo (t. j. menej ako jedenkrát za mesiac). Výsledkom reakcií negatívnej kontroly alebo kontroly rozpúš ťadla/nosiča by mali by ť 
hodnoty zákalu a priepustnosti, ktoré sú menšie ako stanovené horné 
hranice hodnôt zákalu a priepustnosti pozadia pre hovädzie rohovky upra ­
vené príslušnou negatívnou kontrolou alebo kontrolou rozpúš ťadla/nosiča.
 
Správa o testovaní  
47. Správa o testovaní by mala obsahova ť tieto informácie, ak sú dôležité na 
vykonanie štúdie:  
Testované a kontrolné látky  
Názov chemikálie (názvy chemikálií), ako je štrukturálny názov, ktorý 
používa služba Chemical Abstracts Service ( ďalej len „CAS“), po ktorom 
nasledujú iné názvy, ak sú známe; 
registračné číslo CAS, ak je známe; 
čistota a zloženie látky alebo zmesi (v hmotnostných percentách), pokia ľ 
je táto informácia k dispozícii; 
fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je fyzikálny stav, prchavos ť, pH, stabi ­
lita, chemická trieda, rozpustnos ť vo vode dôležitá na vykonanie štúdie; 
prípadná úprava testovaných/kontrolných látok pred testovaním (napr. 
zahrievanie, drvenie); 
stabilita, ak je známa.  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informácie týkajúce sa objednávate ľa a testovacieho zariadenia  
Meno a adresa objednávate ľa, testovacieho zariadenia a vedúceho štúdie; 
identifikácia zdroja o čí (t. j. zariadenie, v ktorom sa vykonal ich odber); 
podmienky skladovania a dopravy o čí (napr. dátum a čas odberu o čí, 
časový interval pred za čiatkom testovania, dopravné médiá a teplotné 
podmienky, všetky použité antibiotiká); 
osobitné charakteristiky zvierat, od ktorých sa vykonal odber o čí (napr. 
vek, pohlavie, hmotnos ť darcovského zviera ťa), ak sú k dispozícii.  
Zdôvodnenie testovacej metódy a použitý protokol  
Integrita testovacej metódy  
Postup, ktorý sa používa na zabezpe čenie integrity (t. j. presnosti 
a spoľahlivosti) testovacej metódy v čase (napr. pravidelné testovanie 
látok na preukázanie spôsobilosti, používanie historických negatívnych a pozitívnych kontrolných údajov).
 
Kritériá na prijate ľný test  
Prijateľné rozsahy súbežnej pozitívnej a negatívnej kontroly na základe 
historických údajov; 
prijateľné rozsahy prípadných súbežných referen čných kontrol na základe 
historických údajov.  
Podmienky testovania  
Opis použitého testovacieho systému; 
použitý typ držiaka rohovky; 
informácie o kalibrácii zariadení použitých na meranie zákalu 
a priepustnosti (napr. opacitometra a spektrofotometra); 
informácie o použitých hovädzích rohovkách, vrátane prehlásenia o ich 
kvalite; 
podrobnosti o použitom testovacom postupe; 
koncentrácia (koncentrácie) použitej testovanej látky (látok); opis všetkých úprav testovacieho postupu; odkaz na historické údaje modelu (napr. negatívne a pozitívne kontroly, 
látky na preukázanie spôsobilosti, referen čné látky); 
opis použitých hodnotiacich kritérií.
 
Výsledky  
Tabuľka údajov o jednotlivých testovaných vzorkách (napr. hodnoty 
zákalu a OD  490 a vypočítané IVIS na testované látky a pozitívne, nega ­
tívne a referen čné kontroly [ak sú zahrnuté] uvedené vo forme tabuliek, 
vrátane údajov z prípadných replikovaných a opakovaných pokusov a priemerné hodnoty ± štandardná odchýlka pre každý pokus); 
opis iných pozorovaných ú činkov.
 
Diskusia  
Záver  
LITERATÚRA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual (Príru čka na kontrolu ozna ­ 
čení): 2. vydanie. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Envi ­
ronmental Protection Agency (Agentúra USA pre ochranu životného 
prostredia).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok 
a zmesí, o zmene a doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006. 
Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1. 
(3) OSN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS) [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania chemikálií ( ďalej len „GHS“)]. Druhé 
prepracované vydanie, New York a Ženeva: United Nations Publi ­
cations, 2007. Dostupné na: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html] 
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants (Oznámenie o záveroch retrospektívnej štúdie ICCVAM o organotypických rozboroch  in vitro  ako kontrolných testoch na zis ťovanie potenciálnych 
očných žieravín a silne dráždivých látok). Dostupné na: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxi ­
city Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives 
(Správa o hodnotení testovacích metód – testovacie metódy o čnej toxicity  
in vitro  na zisťovanie očných silne dráždivých a žieravých látok). Medzia ­
gentúrny koordina čný výbor pre overovanie alternatívnych metód 
a národný toxikologický program ( ďalej len „NTP“) medziagentúrneho 
strediska pre overovanie alternatívnych toxikologických metód ( ďalej len 
„NICEATM“). Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(6) Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 
z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej 
agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení naria ­
denia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, 
smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 
93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405 (Usmernenie na testovanie 405). 
OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/cor ­
rosion (Usmernenie OECD na testovanie chemikálií. Akútne podráž ­
denie očí/žieravos ť). Dostupné na: 
[http://www.oecd.org/document/40/ 
0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.htm l] 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol (Protokol testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky odporú čaný výborom ICCVAM). In: ICCVAM Test Method 
Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxicity Test Methods for Identifying 
Ocular Severe Irritants and Corrosives (V: Správa ICCVAM o hodnotení 
testovacej metódy – testovacie metódy o čnej toxicity  in vitro
 na zisťo­
vanie očných silne dráždivých látok a žieravín). Medziagentúrny koordi ­
načný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikolo ­
gický program medziagentúrneho strediska na overovanie alternatívnych 
toxikologických metód. Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method (Sú časný stav testovacích 
metód  in vitro  na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých 
látok: testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). 
Publikácia NIH č.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxi ­
cology Program. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. (Pro ­
tokol 124: rozbor zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky – ŠPP 
Microbiological Associates Ltd.), Ispra, Taliansko: Európske centrum 
pre validáciu alternatívnych metód ( ďalej len „ECVAM“).
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. a Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy (Testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky: rozbor dráždivosti o čí in vitro ). Fundam. Appl. Toxicol.  18:442 – 449. 
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. a the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (Poradný výbor pre postupy kontroly nákaz v zdravotnej starostlivosti) (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings (Usmernenie na izola čné 
opatrenia: predchádzanie prenosu pôvodcov nákaz v organizáciách zdravotnej starostlivosti). Dostupné na: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf]. 
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. a Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays (Rozsah poranení rohovky ako mechanický základ podráždenia o čí: hlavné 
zistenia a odporú čania na vývoj alternatívnych rozborov).  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106 – 117. 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. a Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse 
(Anatómia a morfológia rohoviek hovädzích o čí z bitúnka).  Can. 
J. Zool.  73:2159 – 2165. 
(15) Collee, J. a Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I (BSE: 
o desaťročie ďalej – časť I). The Lancet 349:636 – 641. 
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., a Miller, K. (1995). 
A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates (Spolupráca pri posudzovaní siedmich alternatív k Draize testu dráždivosti o čí 
s použitím farmaceutických medziproduktov).  Fundam Appl Toxicol  
26:20 – 31. 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method (Informa čný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích 
metód  in vitro  na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých 
látok: testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. (Informa čný 
dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích metód  in vitro  na 
zisťovanie o čných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia 
metóda izolovaného kuracieho oka). Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm]
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV  
Presnosť: blízkosť zhody výsledkov testovacej metódy s prijatými referen čnými 
hodnotami. Je to miera výkonnosti testovacej metódy a jeden z aspektov „výz ­
namnosti“. Tento pojem sa často používa ako zamenite ľný s pojmom „zhoda“ 
a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy.  
Referenčná látka:  látka, ktorá sa používa ako štandard na porovnávanie 
s testovanou látkou. Referen čná látka by mala ma ť tieto vlastnosti: i) stály 
a spoľahlivý zdroj (zdroje); ii) štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou látok, 
ktoré sa testujú; iii) známe fyzikálne/chemické vlastnosti; iv) podporné infor ­
mácie o známych ú činkoch a v) známu ú činnosť v rozsahu žiadanej reakcie.  
Rohovka:  priehľadná časť prednej strany o čnej gule, ktorá pokrýva dúhovku 
a zrenicu a prepúš ťa svetlo do vnútra oka.  
Zákal rohovky:  miera rozsahu zakalenia rohovky po vystavení pôsobeniu testo ­
vanej látky. Zvýšený zákal rohovky je príznakom poškodenia rohovky. Zákal sa 
môže posudzova ť subjektívne, ako je to pri Draize teste o čí králikov, alebo 
objektívne pomocou prístroja napr. opacitometra.  
Priepustnos ť rohovky:  kvantitatívne meranie poškodenia epitelu rohovky 
stanovením množstva farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde cez všetky 
bunkové vrstvy rohovky.  
EPA kategória 1:  žieravé (nevratné zni čenie očného tkaniva) alebo postihnutie 
rohovky alebo podráždenie, ktoré pretrváva viac ako 21 dní (1).  
EÚ kategória R41:  vznik poškodenia tkaniva v oku alebo závažné fyzické 
zhoršenie videnia po nanesení testovanej látky na predný povrch oka, ktoré nie je úplne vratné do 21 dní od nanesenia (2).  
Miera falošnej negativity:  podiel všetkých pozitívnych látok, ktoré sú testo ­
vacou metódou nesprávne identifikované ako negatívne. Je to jeden 
z ukazovate ľov výkonnosti testovacej metódy.  
Miera falošnej pozitivity:
 podiel všetkých negatívnych látok, ktoré sú testo ­
vacou metódou nesprávne identifikované ako pozitívne. Je jedným 
z ukazovate ľov výkonnosti testovacej metódy.  
GHS (globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania chemic ­
kých látok):  systém navrhovania klasifikácie chemikálií (látok a zmesí) pod ľa 
štandardizovaných typov a stup ňov fyzických, zdravotných a environmentálnych 
nebezpečenstiev a ozna čovania pomocou príslušných komunika čných prvkov, 
ako sú piktogramy, signaliza čné slová, upozornenia na nebezpe čenstvo, bezpe č­
nostné upozornenia a karty bezpe čnostných údajov na sprostredkovanie infor ­
mácií o ich nepriaznivých ú činkoch s cie ľom chráni ť ľudí (vrátane zamestnan ­
cov, pracujúcich, dopravcov, spotrebite ľov a subjekty zodpovedné za riešenie 
núdzových situácií) a životné prostredie (3).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS kategória 1:  vznik poškodenia tkaniva v oku alebo závažného fyzického 
zhoršenia videnia po nanesení testovanej látky na predný povrch oka, ktoré nie je 
úplne vratné do 21 dní po nanesení (3).  
Nebezpečenstvo:  vnútorná vlastnos ť činidla alebo situácia, ktorá má schopnos ť 
vyvolať nepriaznivé ú činky pri vystavení organizmu, systému alebo obyvate ľstva 
(skupiny obyvate ľov) pôsobeniu tohto činidla.  
Hodnotiace číslo dráždivosti  in vitro  (ďalej len „IVIS“):  empiricky odvodený 
vzorec, ktorý sa používa pri rozbore zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, 
pričom sa priemerné hodnoty zákalu a priepustnosti za každú ošetrenú skupinu 
zlúčia do jediného hodnotiaceho čísla in vitro  na každú ošetrenú skupinu.  IVIS  = 
priemerná hodnota zákalu + (15 x priemerná hodnota priepustnosti).  
Negatívna kontrola:  neupravená replika, ktorá obsahuje všetky zložky testova ­
cieho systému. Táto vzorka sa spracuje so vzorkami upravenými testovanou látkou a s inými kontrolnými vzorkami s cie ľom zistiť, či rozpúšťadlo 
a testovací systém na seba navzájom pôsobia.  
Nedráždivá látka:  látka, ktorá v EPA kategórii I, II ani III; v EÚ kategórii R41 
ani R36 ani v GHS kategórii 1, 2A ani 2B nie je klasifikovaná ako o čná dráždivá 
látka.  
Očná žieravina:  a) látka, ktorá spôsobuje nevratné poškodenie tkaniva oka; b) 
látka, ktorá je v GHS kategórii 1, v EPA kategórii I alebo v EÚ kategórii R41 klasifikovaná ako o čná žieravina (1) (2) (3).  
Očná dráždivá látka:  a) látka, ktorá po nanesení na predný povrch oka vyvo ­
láva nevratnú zmenu v oku; b) látka, ktorá je v EPA kategórii II alebo III, v EÚ kategórii R36 alebo v GHS kategórii 2A alebo 2B klasifikovaná ako o čná dráž­
divá látka (1) (2) (3).  
Očná silne dráždivá látka:  a) látka, ktorá po nanesení na predný povrch oka 
vyvoláva poškodenie o čného tkaniva, ktoré neustúpi do 21 dní po nanesení, 
alebo spôsobuje závažné fyzické zhoršenie videnia; b) látka, ktorá je v GHS 
kategórii 1, v EPA kategórii I alebo v EÚ kategórii R41 klasifikovaná ako 
očná dráždivá látka (1) (2) (3).  
Opacitometer:  prístroj na meranie „zákalu rohovky“ kvantitatívnym vyhodno ­
tením prestupu svetla cez rohovku. Typický prístroj má dve priehradky, z ktorých každá má vlastný zdroj svetla a fotobunku. Jedna priehradka sa používa na upravenú rohovku, zatia ľ čo druhá sa používa na kalibrovanie a vynulovanie 
prístroja. Svetlo z halogénovej lampy sa vyšle cez kontrolnú priehradku (prázdna 
komora bez okien alebo kvapaliny) do fotobunky a porovná sa so svetlom vyslaným do fotobunky cez pokusnú priehradku, v ktorej je umiestnená komora obsahujúca rohovku. Rozdiel v prestupe svetla z fotobuniek sa porovná a na 
číslicovej zobrazovacej jednotke sa ukáže číselná hodnota zákalu.  
Pozitívna kontrola:  replika obsahujúca všetky zložky testovacieho systému 
a upravená látkou, o ktorej sa vie, že vyvoláva pozitívnu reakciu. S cie ľom 
zabezpečiť možnosť vyhodnoti ť premenlivos ť reakcie pri pozitívnej kontrole 
v čase by však závažnos ť reakcie nemala by ť extrémne silná.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Spoľahlivosť: miera rozsahu, v ktorom sa testovacia metóda môže opakovane 
vykonáva ť v čase v laboratóriu a medzi laboratóriami, pri čom sa používa 
rovnaký protokol. Hodnotí sa vypo čítaním vnútrolaboratórnej 
a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti a vnútrolaboratórnej opakovate ľnosti.  
Kontrola rozpúš ťadla/nosi ča: neupravená vzorka, ktorá obsahuje všetky 
zložky testovacieho systému, vrátane rozpúš ťadla alebo nosi ča, ktorá sa spracuje 
so vzorkami upravenými testovanou látkou a s inými kontrolnými vzorkami, 
a zistí sa základná reakcia vzoriek upravených testovanou látkou rozpustenou 
v tom istom rozpúš ťadle alebo nosi či. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou 
negatívnou kontrolou, preukazuje sa aj to, či rozpúšťadlo, alebo nosi č a testovací 
systém na seba navzájom pôsobia.  
Postupné testovanie:  stratégia postupného testovania, pri ktorej sa všetky existu ­
júce informácie o testovanej látke kontrolujú v ur čitom poradí, s použitím postupu 
posudzovania závažnosti dôkazov v každom stupni a zis ťuje sa, či je k dispozícii 
dostatok informácií na rozhodnutie o klasifikácii nebezpe čenstva pred postupom do 
ďalšieho stup ňa. Ak sa dráždivý potenciál testovanej látky môže stanovi ť na 
základe existujúcich informácií, nevyžaduje sa žiadne ďalšie testovanie. Ak dráž ­
divý potenciál testovanej látky nie je možné stanovi ť na základe existujúcich 
informácií, vykonáva sa testovanie metódou postupných krokov na zvieratách, až kým sa nedá urobi ť jednozna čná klasifikácia.  
Overená testovacia metóda:  testovacia metóda, v prípade ktorej sa ukon čili 
hodnotiace štúdie na ur čenie významnosti (vrátane presnosti) a spo ľahlivosti na 
určitý účel. Je dôležité poznamena ť, že overená testovacia metóda nemusí ma
ť 
dostatočnú výkonnos ť z hľadiska presnosti a spo ľahlivosti, aby sa mohla pova ­ 
žovať za prijate ľnú na navrhnutý ú čel. 
Posudzovanie závažnosti dôkazov:  postup posudzovania silných a slabých 
stránok rôznych informácií na dosiahnutie a podporu záveru, pokia ľ ide 
o potenciál nebezpe čnosti nejakej látky.  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Dodatok 2  
Látky na preukazovanie spôsobilosti pre testovaciu metódu zákalu 
a priepustnosti hovädzej rohovky  
Pred rutinným používaním testovacej metódy, ktorá zodpovedá tejto testovacej 
metóde, laboratóriá môžu preukáza ť svoju technickú spôsobilos ť správnym 
stanovením klasifikácie o čnej žieravosti 10 látok odporú čaných v tabu ľke 1. 
Výber týchto látok sa vykonal tak, aby zastupovali ten rozsah reakcií lokálneho podráždenia oka/žieravého ú činku na oko, ktorý vychádza z výsledkom testov o čí 
králikov  in vivo  (TG 405) (t. j. kategórie 1, 2A, 2B alebo neklasifikované 
a označené podľa GHS OSN (3) (7). Vzh ľadom na overenú použite ľnosť týchto 
rozborov (t. j. iba na zis ťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) tu však 
existujú len dva výsledky testov na ú čely klasifikácie (žieravina/silne dráždivá 
látka alebo nežieravina/slabo dráždivá látka) na preukázanie spôsobilosti. Ďalším 
kritériom na výber bola komer čná dostupnos ť látok, dostupnos ť vysoko kvalit ­
ných referen čných údajov  in vivo  a existencia vysoko kvalitných údajov z dvoch 
metód  in vitro , pre ktoré sa pripravujú usmernenia na testovanie. Z toho dôvodu 
sa dráždivé látky vybrali zo zoznamu 122 referen čných látok, ktoré odporu čil 
výbor ICCVAM na overovanie testovacích metód o čnej toxicity  in vitro  (pozri 
dodatok H: Referen čné látky odporú čané ICCVAM) (5). Referen čné údaje sú 
dostupné v podkladových kontrolných dokumentoch ICCVAM pre testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky a testovaciu metódu izolovaného 
kuracieho oka (17) (18).
 
Tabuľka 1 
Odporúčané látky na preukazovanie technickej spôsobilosti na testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky  
Látka CASRN Chemická trieda (  1 ) Fyzikálna 
forma Klasifikácia  in 
vivo ( 2 ) Klasifikácia  in vitro  ( 3 ) 
Benzalkónium 
chlorid (5 %) 8001-54-5 Óniová zlú čenina Kvapalina Kategória 1 Žieravá/silne dráždivá látka 
Chlórhexidín 55-56-1 Amín, amidín Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne dráždivá látka 
Kyselina 
dibenzoyl-L-vinná 2743-38-6 Karboxylová 
kyselina, ester Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne dráždivá látka 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklická 
zlúčenina Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne dráždivá látka 
Kyselina trichló ­
roctová (30 %) 76-03-9 Karboxylová 
kyselina Kvapalina Kategória 1 Žieravá/silne dráždivá látka 
2,6-dichlórbenzoyl 
chlorid 4659-45-4 Acylhalogenid Kvapalina Kategória 
2A Nežieravá/slabo dráždivá 
látka 
Etyl-2-metylaceto- 
octan 609-14-3 Ketón, ester Kvapalina Kategória 
2B Nežieravá/slabo dráždivá 
látka 
Dusičnan amónny 6484-52-2 Anorganická so ľ Tuhá látka Kategória 
2A Nežieravá/slabo dráždivá 
látka ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Látka CASRN Chemická trieda (  1 ) Fyzikálna 
forma Klasifikácia  in 
vivo ( 2 ) Klasifikácia  in vitro  ( 3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Kvapalina Neozna čená Nežieravá/slabo dráždivá 
látka 
n-hexán 110-54-3 Uh ľovodík 
(acyklický) Kvapalina Neozna čená Nežieravá/slabo dráždivá 
látka  
Skratky: CASRN = Registra čné číslo Chemical Abstracts Service 
( 1 ) Chemické triedy sa stanovili pre každú testovanú látku s použitím štandardnej klasifika čnej schémy na základe klasifika čného 
systému National Library of Medicine Medical Subject Headings (dostupné na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na základe výsledkov testu o čí králikov  in vivo  (OECD TG 405) a s použitím GHS OSN (3)(7). 
( 3 ) Na základe výsledkov testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky a izolovaného kuracieho oka.  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Dodatok 3  
DRŽIAK ROHOVKY NA TESTOVANIE ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI 
HOVÄDZEJ ROHOVKY 
1. Držiaky rohoviek na testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sú 
vyrobené z inertného materiálu (napr. z polypropylénu). Držiaky sa skladajú z dvoch polovíc (prednej a zadnej komory) a majú dve podobné valcovité 
vnútorné komory. Obidve komory majú objem 5 ml a sú ukon čené skle­
neným oknom, cez ktoré sa zaznamenávajú namerané údaje zákalu. Obidve vnútorné komory majú priemer 1,7 cm a h ĺbku 2,2 cm (
 1 ). Tesniaci krúžok 
umiestnený na zadnej komore sa používa proti presakovaniu cez netesnosti. 
Rohovky sa umiest ňujú endoteliálnou stranou nadol na tesniaci krúžok 
zadnej komory a predná komora sa položí na epiteliálnu stranu rohovky. Komory sú zafixované na mieste tromi nehrdzavejúcimi skrutkami na vonkajšej hrane komory. Na konci každej komory je sklenené okno, ktoré 
sa môže vybra ť, aby sa zabezpe čil ľahší prístupu k rohovke. Tesniaci krúžok 
sa takisto nachádza medzi skleneným oknom a komorou a bráni presako ­
vaniu cez netesnosti. Dva otvory na vrchnej strane každej komory umož ňujú 
zavedenie a odstránenie média a testovaných zlú čenín. V čase úpravy 
a inkubácie sú uzavreté gumovými zátkami.
 
Glosár  
Glass disc: sklenený kotú č 
PTFE-O-ring: teflónový tesniaci krúžok Refill: plniaci otvor 
Hanger: záves 
Cap: zátka Nut: matica 
O-ring: tesniaci krúžok 
Posterior compartment: zadná priehradka Anterior compartment: predná priehradka 
Fixing screws: fixa čné skrutky
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Rozmery sú uvedené pre držiak rohovky, ktorý sa používa pre kravy vo veku 12 až 60 
mesiacov. V prípade, že sa používajú 6 až 12-mesa čné zvieratá, držiak sa musí navrhnú ť 
tak, aby každá komora mala objem 4 ml a aby každá vnútorná komora mala priemer 
1,5 cm a h ĺbku 2,2 cm. Pri novom návrhu držiaka rohovky je ve ľmi dôležité, aby pomer 
vystavenej plochy povrchu rohovky k objemu zadnej komory bol taký istý ako tento 
pomer vo zvy čajne používanom držiaku rohovky. Je to potrebné preto, aby sa zabezpe ­ 
čilo správne ur čenie hodnôt priepustnosti na výpo čet IVIS pod ľa navrhnutého vzorca.
 OPACITOMETER 
2. Opacitometer je zariadenie na meranie prestupu svetla. Svetlo z halogénovej 
lampy sa vyšle cez kontrolnú priehradku (prázdna komora bez okien alebo 
kvapaliny) do fotobunky a porovná sa so svetlom vyslaným do fotobunky cez pokusnú priehradku, v ktorej je umiestnená komora s rohovkou. Rozdiel v prestupe svetla z fotobuniek sa porovná a číselná hodnota zákalu sa 
vysvieti na zobrazovacej jednotke. Zákalové jednotky sú stanovené. 
3. Opacitometer by mal poskytova ť lineárnu reakciu v ur čitom rozsahu údajov 
zákalu, ktoré patria do intervalov používaných pre rôzne klasifikácie opísané v prognostickom modeli (t. j. až po interval, ktorým sa ur čuje žieravos ť/silná 
dráždivos ť). V snahe zabezpe čiť lineárne a presné údaje až do 75 – 80 
zákalových jednotiek je potrebné vykona ť kalibráciu opacitometra 
s použitím súboru kalibra čných materiálov. Kalibra čné materiály (matné 
polyesterové fólie) sa vložia do kalibra čnej komory (komora na rohovku 
určená na uloženie kalibra čných materiálov) a od číta sa údaj na opacito ­
metri. Kalibra čná komora je navrhnutá tak, aby kalibra čné materiály boli 
v nej uložené približne v rovnakej vzdialenosti medzi svetlom a fotobunkou ako rohovky pri meraní zákalu. Opacitometer sa najprv kalibruje na zákal 0 zákalových jednotiek s použitím kalibra čnej komory bez kalibra čného mate ­
riálu. Potom sa do kalibra čnej komory vložia tri rôzne kalibra čné materiály 
po sebe a odmerajú sa zákaly. Výsledkom merania kalibra čných materiálov 
1, 2 a 3 by mali by ť údaje zákalu, ktoré sa rovnajú ich nastaveným 
hodnotám 75, 150, resp. 225 zákalových jednotiek ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B 48  TESTOVACIA METÓDA IZOLOVANÉHO KURACIEHO OKA NA 
ZISŤOVANIE O ČNÝCH ŽIERAVÍN A SILNE DRÁŽDIVÝCH 
LÁTOK  
ÚVOD 
1. Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka je testovacia metóda  in 
vitro , ktorá sa môže používa ť za určitých okolností a s ur čitými obmedze ­
niami na klasifikáciu látok a zmesí ako o čných žieravín a silne dráždivých 
látok (1) (2) (3). Na ú čely tejto testovacej metódy sa silne dráždivé látky 
vymedzujú ako látky vyvolávajúce o čné lézie, ktoré u králikov pretrvávajú 
najmenej 21 dní po podaní. I ke ď sa nepovažuje za platnú a plnohodnotnú 
náhrada testu králi čích očí in vivo , odporú ča sa používa ť testovaciu 
metódu izolovaného kuracieho oka ako sú časť stratégie postupného testo ­
vania pre regula čnú klasifikáciu a na ozna čovanie v rámci ur čitej sféry 
použiteľnosti (4) (5). Testované látky a zmesi (6), ktoré sú v tomto rozbore 
pozitívne, možno klasifikova ť ako očné žieraviny alebo silne dráždivé 
látky bez ďalšieho testovania na králikoch. Látka, ktorej testovanie je 
negatívne, sa musí testova ť na králikoch s využitím stratégie sekven čného 
testovania, ako sa ustanovuje v usmernení OECD na testy 405 (7) (kapi ­
tola B.5 tejto prílohy). 
2. Účelom tejto metódy je opísa ť postupy, ktoré sa používajú na posudzo ­
vanie potenciálnej o čnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky 
meraním jej schopnosti vyvola ť toxicitu vo vylúpnutom kuracom oku. 
Toxické ú činky na rohovku sa merajú: i) kvalitatívnym hodnotením 
zákalu, ii) kvalitatívnym hodnotením poškodenia epitelu na základe nane ­
senia fluoresceínu do oka (zadržania fluoresceínu), iii) kvantitatívnym 
meraním zvä čšenej hrúbky (zdurenia) a iv) kvalitatívnym posudzovaním 
makroskopického morfologického poškodenia povrchu. Zákal rohovky, zdurenie a hodnotenie poškodenia po vystavení pôsobeniu testovanej 
látky sa hodnotia jednotlivo a potom sa zlú čia a odvodí sa klasifikácia 
očného podráždenia. 
3. Očné dráždivé látky vyvolávajúce lézie, ktoré ustúpia za menej ako 21 dní, 
a nedráždivé látky sa takisto testovali s využitím testovacej metódy izolo ­
vaného kuracieho oka. Presnos ť a spoľahlivosť testovacej metódy izolo ­
vaného kuracieho oka na látky v týchto kategóriách sa však formálne neposudzovala. 
4. Vymedzenia sú uvedené v dodatku 1.
 
POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
5. Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy izolova ­
ného kuracieho oka medziagentúrneho koordina čného výboru pre overo ­
vanie alternatívnych metód ( ďalej len „ICCVAM“) (8), ktorý bol vytvo ­
rený podľa medzinárodnej hodnotiacej štúdie (4) (5) (9) s príspevkami od 
Európskeho centra pre validáciu alternatívnych metód, japonského centra 
pre overovanie alternatívnych metód a z Odboru toxikológie a aplikovanej farmakológie Organizácie pre aplikovaný prírodovedecký výskum pre kvalitu života ( ďalej len „TNO“) (Holandsko). Tento protokol vychádza 
z informácií získaných zo zverejnených protokolov, ako aj z aktuálneho 
protokolu, ktorý používa TNO (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vychádzajú z vysokej miery 
falošnej pozitivity na alkoholy a z vysokých mier falošnej negativity na 
tuhé látky a povrchovo aktívne látky (pozri odsek 47) (4). Ke ď sa látky 
týchto chemických a fyzikálnych tried vylú čia z údajovej základne, pres ­
nosť testovacej metódy izolovaného kuracieho oka v klasifika čných systé ­
moch EÚ, EPA a GHS sa výrazne zlepší (4). Na základe ú čelu tohto 
rozboru (t. j. iba na zis ťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) 
miery falošnej negativity nie sú rozhodujúce, pretože takéto látky sa následne testujú na králikoch alebo inými vhodne overenými testami  in 
vitro  v závislosti od regula čných požiadaviek s použitím stratégie sekven č­
ného testovania, ktorá vychádza z prístupu pod ľa závažnosti dôkazov. 
Okrem toho aktuálna overovacia databáza neumož ňuje primerané posú ­
denie niektorých chemických tried alebo tried výrobkov (napr. zmesí). 
Výskumníci by však mohli zváži ť použitie tejto testovacej metódy na 
testovanie všetkých druhov materiálov (vrátane zmesí), pri čom pozitívny 
výsledok by sa mohol akceptova ť ako údaj, ktorý nazna čuje reakciu vo 
forme očnej žieravosti alebo silného podráždenia. Pozitívny výsledok 
získaný pre alkoholy by sa však mal interpretova ť opatrne pre riziko 
nadsadenej predpovede. 
7. Všetky postupy s kuracími o čami a s hovädzími rohovkami by mali vyho ­
vovať platným nariadeniam daného testovacieho zariadenia a postupom na 
narábanie s materiálmi pochádzajúcimi z ľudí alebo zo zvierat, medzi ktoré 
okrem iných patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporú čajú sa všeobecne 
platné laboratórne bezpe čnostné opatrenia (15). 
8. Obmedzením tejto testovacej metódy je, že i ke ď sa zohľadňujú niektoré 
účinky na o či, ktoré sa posudzujú metódou testovania o čnej dráždivosti 
králikov, a do istej miery aj ich závažnos ť, neprihliada sa na poškodenia 
spojiviek a dúhovky. I ke ď sa samotná vratnos ť lézií rohovky nemôže 
posudzova ť testovacou metódou izolovaného kuracieho oka, na základe 
štúdií očí králikov bol takisto podaný návrh, aby sa hodnotenie po
čiatočnej 
hĺbky poškodenia rohovky mohlo používa ť na rozlišovanie nevratných 
a vratných ú činkov (16). A nakoniec, testovacia metóda izolovaného kura ­
cieho oka neumož ňuje vykona ť hodnotenie potenciálu pre systémovú toxi ­
citu súvisiacu s expozíciou o čí. 
9. Pokra čujú práce na ďalšom charakterizovaní použite ľnosti a obmedzení 
testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na zis ťovanie slabo dráždi ­
vých a nedráždivých látok (pozri aj odsek 48). Používate ľom sa takisto 
odporúča, aby poskytli vzorky a/alebo údaje overovacím organizáciám na 
formálne posúdenie možných budúcich spôsobov použitia testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, vrátane zis ťovania očných slabo dráž ­
divých a nedráždivých látok. 
10. V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát zavádza tento rozbor, by sa mali 
použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 2. Labo ­
ratórium môže použi ť tieto chemikálie na preukázanie svojej technickej 
spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy izolovaného kuracieho oka prv, ako predloží údaje z testovania izolovaného kuracieho oka na ú čely 
regulačnej klasifikácie nebezpe čenstva.
 
PRINCÍP TESTU 
11. Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka je organotypický model, 
ktorý poskytuje krátkodobé zachovanie kuracieho oka  in vitro . Pri tejto 
testovacej metóde sa poškodenie testovanou látkou hodnotí stanovením 
zdurenia rohovky, zákalu rohovky a zadržania fluoresceínu v rohovke. Zatiaľ čo posledné dva parametre vyžadujú kvalitatívne hodnotenie, 
analýza zdurenia rohovky poskytuje kvantitatívne hodnotenie. Každé 
meranie sa prevedie na kvantitatívny údaj, ktorý sa použije na výpo čet 
celkového indexu podráždenia, alebo sa priradí kvalitatívna kategória, ktorá sa použije na priradenie klasifikácie o čnej žieravosti a silnej dráždi ­
vosti  in vitro . Každý z týchto výsledkov sa potom môže použi ť na pred­
vídanie potenciálu testovanej látky pôsobi ť ako žieravina a silne dráždivá 
látka  in vivo  (pozri Rozhodovacie kritériá).
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Zdroj a vek kuracích o čí 
12. Historicky sa na tento rozbor používali o či pochádzajúce z kur čiat 
z bitúnkov, kde sa zabíjajú na ľudskú spotrebu, čím sa odstránila potreba 
laboratórnych zvierat. Používajú sa iba o či zo zdravých zvierat, ktoré sa 
považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového re ťazca. 
13. I ke ď sa ešte nevykonala žiadna kontrolovaná štúdia na posúdenie opti ­
málneho veku kur čiat, vek a hmotnos ť kurčiat, ktoré sa používajú histo ­
ricky na túto testovaciu metódu, zodpovedajú veku a hmotnosti jarných 
kurčiat spracovávaných tradi čne na hydinových bitúnkoch (t. j. približne 7 
týždňov, 1,5 – 2,5 kg).  
Odber a doprava o čí do laboratória  
14. Hlavy by sa mali odobera ť hneď po znehybnení kur čiat zvyčajne elek ­
trickým šokom alebo narezaním krku s následným vykrvácaním. Miestny 
zdroj kurčiat v blízkosti laboratória by mal by ť situovaný tak, aby sa hlavy 
mohli dopravi ť z bitúnka do laboratória dostato čne rýchlo, čím sa mini ­
malizuje zhoršenie ich kvality a/alebo kontaminácia baktériami. Časový 
interval medzi odberom kuracích hláv a použitím o čí v testovacej metóde 
izolovaného kuracieho oka by mal by ť čo najmenší (zvy čajne do dvoch 
hodín) a mal by by ť preukázate ľný, aby sa nedali spochybni ť výsledky 
rozboru. Základom týchto výsledkov sú výberové kritériá na o či, ako aj 
reakcie na pozitívne a negatívne kontroly. Všetky o či použité na rozbor by 
mali byť z jednej skupiny o čí pochádzajúcich z odberu v ur čitý deň. 
15. Ke ďže oči sa odoberajú v laboratóriu, neporušené hlavy sa dopravujú 
z bitúnka pri teplote okolitého prostredia v plastových boxoch 
a zvlhčujú sa utierkami namo čenými do izotonického fyziologického 
roztoku.  
Výberové kritériá na o či používané na testovanie izolovaného kura ­
cieho oka  
16. Oči, ktoré majú po vylúpnutí vysoké po čiatočné sfarbenie fluoresceínom 
(t. j. > 0,5) alebo vysokú hodnotu zakalenia rohovky (t. j. > 0,5), sa 
vyradia. 
17. Každá skupina na úpravu a súbežnú pozitívnu kontrolu sa skladá najmenej 
z troch o čí. Skupina na negatívnu kontrolu alebo na kontrolu rozpúš ťadla 
(ak sa používa iné rozpúš ťadlo ako fyziologický roztok) obsahuje mini ­
málne jedno oko.  
POSTUP  
Príprava o čí 
18. Očné viečka sa opatrne odrežú, pri čom sa dbá na to, aby sa nepoškodila 
rohovka. Celistvos ť rohovky sa rýchlo vyhodnotí kvapkou 2 % (m/V) 
fluoresceínu sodného, ktorá sa nanesie na povrch rohovky na nieko ľko 
sekúnd a potom sa opláchne izotonickým fyziologickým roztokom. O či 
ošetrené fluoresceínom sa potom prehliadnu pod biomikroskopom, aby sa potvrdilo, že rohovka je nepoškodená (t. j. hodnota zadržania fluoresceínu a zákalu rohovky ≤ 0,5). 
19. Ak je rohovka nepoškodená, oko sa vyreže z lebky a dbá sa na to, aby sa 
nepoškodila rohovka. O čná guľa sa vytiahne z o čnej jamky, pri čom sa 
tretie vie čko pevne zachytí chirurgickými klieš ťami a o čné svaly sa 
prestrihnú ohnutými nožnicami s tupými hrotmi. Dôležité je zabráni ť 
poškodeniu rohovky nadmerným tlakom (napr. kompresnými predmetmi). 
20. Ke ď sa oko vyberie z o čnej jamky, mala by sa na ňom ponecha ť viditeľná 
časť očného nervu. Po vybratí z o čnej jamky sa oko položí na absorp čnú 
podložku a odreže sa tretie vie čko a iné spojovacie tkanivá.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Vylúpnuté oko sa upevní do svorky z nehrdzavejúcej ocele tak, aby 
rohovka bola v kolmej polohe. Svorka sa potom prenesie do komory 
superfúzneho prístroja (16). Svorky by sa mali do superfúzneho prístroja vložiť tak, aby celá rohovka bola ponorená v izotonickom fyziologickom 
roztoku. Komory superfúzneho prístroja by mali ma ť riadenú teplotu 
32 ± 1,5 °C. V dodatku 3 je uvedená schéma typického superfúzneho 
prístroja a o čných svoriek, ktoré je možné kúpi ť alebo zhotovi ť. Prístroj 
sa môže upravi ť tak, aby vyhovoval potrebám konkrétneho laboratória 
(napr. na uloženie rôzneho po čtu očí). 
22. Po vložení do superfúzneho prístroja sa o či znova prehliadnu pod biomi ­
kroskopom a skontroluje sa, či počas resekcie nedošlo k ich poškodeniu. 
Súčasne by sa mala odmera ť aj hrúbka rohovky na vrchole rohovky 
s použitím meracieho zariadenia na biomikroskope. O či s i) hodnotou 
zadržania fluoresceínu > 0,5; ii) hodnotou zákalu rohovky > 0,5 alebo iii) s akýmiko ľvek inými znakmi poškodenia by sa mali nahradi ť inými. 
Spomedzi o čí, ktoré sa nevyradia na základe niektorého z týchto kritérií, sa 
musia vyradi ť oči s hrúbkou rohovky, ktorá má odchýlku viac ako 10 % 
z priemernej hodnoty za všetky o či. Používatelia by mali vedie ť, že biomi ­
kroskopy môžu poskytova ť rôzne namerané údaje hrúbky rohovky, ak je 
nastavená rôzna šírka štrbiny. Šírka štrbiny by mala by ť nastavená na 
0,095 mm. 
23. Ke ď sa všetky o či prezrú a sú vyhovujúce, inkubujú sa asi 45 až 60 minút, 
aby sa dostali do ustáleného stavu s testovacím systémom pred dávkova ­
ním. Po dobe usta ľovania sa zaznamená nulové referen čné meranie na 
hrúbku a zákal rohovky, ktoré slúži ako základný stav (t. j. čas = 0). 
Hodnota fluoresceínu stanovená pri resekcii sa používa ako základné 
meranie tohto kone čného výsledku.
 
Nanesenie testovanej látky  
24. Hne ď po nulových referen čných meraniach sa oko (v držiaku) vyberie zo 
superfúzneho prístroja, uloží sa do vodorovnej polohy a na rohovku sa nanesie testovaná látka. 
25. Kvapalné testované látky sa zvy čajne testujú nezriedené, ale ak sa to 
považuje za potrebné, môžu sa zriedi ť (napr. ako sú časť návrhu štúdie). 
Ako rozpúš ťadlo pre zriedené látky sa uprednost ňuje fyziologický roztok. 
V riadených podmienkach sa však môžu používa ť aj iné rozpúš ťadlá, ale 
mala by sa preukáza ť vhodnos ť iných rozpúš ťadiel použitých namiesto 
fyziologického roztoku. 
26. Kvapalné testované látky sa nanesú na rohovku tak, aby celý povrch rohovky 
bol rovnomerne pokrytý testovanou látkou; štandardný objem je 0,03 ml. 
27. Ak je to možné, tuhé látky by sa mali čo najjemnejšie rozdrvi ť tĺčikom 
v trecej miske alebo podobným drviacim nástrojom. Prášok sa potom nanesie na rohovku tak, aby povrch bol rovnomerne pokrytý testovanou látku; štandardné množstvo je 0,03 g. 
28. Testovaná látka (kvapalná alebo tuhá) sa nanesie na 10 sekúnd a potom sa 
opláchne z oka izotonickým fyziologickým roztokom (približne 20 ml) pri 
teplote okolitého prostredia. Oko (v držiaku) sa následne vráti do super ­
fúzneho prístroja do pôvodnej zvislej polohy.
 
Kontrolné látky  
29. Súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúš ťadla/nosiča a pozitívne 
kontroly by sa mali za členiť do každého pokusu.  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Ke ď sa testujú kvapaliny s koncentráciou 100 % alebo tuhé látky, 
v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa používa fyziologický 
roztok ako súbežná negatívna kontrola na zis ťovanie nešpecifických zmien 
v testovacom systéme a aby sa zabezpe čilo, že podmienky rozboru nevy ­
volajú nežiaducu reakciu vo forme podráždenia. 
31. Ke ď sa testujú nezriedené kvapaliny, súbežná skupina na kontrolu 
rozpúšťadla/nosiča sa začlení do testovacej metódy, aby sa zistili nešpeci ­
fické zmeny v testovacom systéme a aby sa zabezpe čilo, že podmienky 
rozboru nevyvolajú nežiaducu reakciu vo forme podráždenia. Ako sa uvádza v odseku 25, môže sa použi ť iba také rozpúš ťadlo/nosič, 
o ktorom sa preukázalo, že nemá nepriaznivé ú činky na testovací systém. 
32. Do každého pokusu sa za člení známa o čná dráždivá látka ako súbežná 
pozitívna kontrola, aby sa overilo, že sa vyvolala náležitá reakcia. Ke ďže 
v tejto testovacej metóde sa používa rozbor izolovaného kuracieho oka na zisťovanie žieravín alebo silne dráždivých látok, na pozitívnu kontrolu by 
sa mala použi ť referenčná látka, ktorá pri tejto testovacej metóde vyvoláva 
silnú reakciu. Aby sa však umožnilo vyhodnotenie premenlivosti reakcie 
pri pozitívnej kontrole v čase, závažnos ť dráždivej reakcie by nemala by ť 
extrémne silná. Mali by sa vygenerova ť dostatočné údaje  in vitro  na 
pozitívnu kontrolu, aby bolo možné vypo čítať štatisticky vymedzený prija ­
teľný rozsah pre pozitívnu kontrolu. Ak na ur čitú pozitívnu kontrolu nie sú 
k dispozícii primerané historické údaje testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, môže by ť potrebné vykona ť štúdie, ktoré by tieto infor ­
mácie poskytli. 
33. Príkladom pozitívnych kontrol na kvapalné testované látky je 10 % kyse ­
lina octová alebo 5 % benzalkónium chlorid, zatia ľ čo príkladom pozitív ­
nych kontrol na tuhé testované látky je hydroxid sodný alebo imidazol. 
34. Referen čné látky sú užito čné na posudzovanie schopnosti neznámych 
chemikálií ur
čitých chemických tried alebo tried výrobkov spôsobova ť 
očné podráždenie alebo na posudzovanie pomerného dráždivého poten ­
ciálu očnej dráždivej látky v ur čitom rozsahu dráždivých reakcií.  
Meranie kone čných výsledkov  
35. Merané rohovky sa posudzujú pred úpravou a 30, 75, 120, 180 a 240 
minút (± 5 minút) po opláchnutí po testovanej látke. Tieto časové body 
poskytujú primeraný po čet meraní po čas 4 hodín ošetrenia, pri čom medzi 
meraniami zostáva dostatok času na vykonanie predpísaných pozorovaní 
pre všetky o či. 
36. Posudzované kone čné výsledky sú zákal rohovky, zdurenie rohovky, 
zadržanie fluoresceínu v rohovke a morfologické ú činky (napr. tvorba 
jamiek alebo uvo ľnenie epitelu). Všetky kone čné výsledky, s výnimkou 
zadržania fluoresceínu (ktoré sa stanovuje iba pred úpravou a 30 minút po 
vystavení pôsobeniu testovanej látky), sa stanovujú v každom z uvedených časových bodov. 
37. Odporú ča sa vyhotovi ť fotografie na zdokumentovanie zákalu rohovky, 
zadržania fluoresceínu, morfologických ú činkov a histopatológie, ak sa 
vykoná. 
38. Po poslednom prehliadnutí po štyroch hodinách sa používate ľom odpo ­
rúča, aby oči uložili do vhodného fixa čného roztoku (napr. neutrálneho 
tlmivého roztoku formalínu) pre prípadné histopatologické skúmanie.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Zdurenie rohovky sa stanovuje meraním hrúbky rohovky optickým pachy ­
metrom na biomikroskope. Vyjadruje sa v percentách a vypo číta sa 
z nameraných údajov hrúbky rohovky pod ľa tohto vzorca:  
8 
> > > : hrëbka rohovky v čase t Ä hrëbka rohovky v čase ¼ 0 
hrëbka rohovky rohovky čase ¼ 0 9 
> > > ; Ü 100 
40. Priemerná percentuálna hodnota zdurenia rohovky za všetky testované o či 
sa vypočíta pre všetky časové body merania. Na základe najvyššej prie ­
mernej hodnoty zdurenia rohovky, nameranej v každom časovom bode, sa 
potom ur čí celková hodnota kategórie na každú testovanú látku. 
41. Zákal rohovky sa vypo číta tak, že na hodnotenie sa použije časť rohovky, 
ktorá je najhustejšie zakalená. Priemerná hodnota zákalu rohovky za 
všetky testované o či sa vypo číta pre všetky časové body merania. Na 
základe najvyššej priemernej hodnoty zákalu rohovky, nameranej v každom časovom bode, sa potom ur čí celková hodnota kategórie pre 
každú testovanú látku (tabu ľka 1).
 
Tabuľka 1 
Hodnoty zákalu rohovky  
Hodnota Vyhodnotenie pozorovania  
0 Bez zákalu 
0,5 Ve ľmi slabý zákal 
1 Roztrúsené alebo rozptýlené plochy; detaily dúhovky sú jasne vidite ľné 
2 Ľahko rozpoznate ľná priehľadná plocha; detaily dúhovky sú mierne zatemnené 
3 Silný zákal rohovky; žiadne špecifické detaily dúhovky nie sú vidite ľné; veľkosť 
zrenice je sotva rozpoznate ľná 
4 Úplný zákal rohovky; dúhovka nie je vidite ľná 
42. Priemerná hodnota zadržania fluoresceínu za všetky testované o či sa vypo­ 
číta len na meranie v časovom bode 30 minút a použije sa na ur čenie 
celkovej hodnoty kategórie na každú testovanú látku (tabu ľka 2).  
Tabuľka 2 
Hodnoty zadržania fluoresceínu  
Hodnota Vyhodnotenie pozorovania  
0 Žiadne zadržanie fluoresceínu 
0,5 Ve ľmi malá škvrna na jednej bunke 
1 Škvrny na jednej bunke rozptýlené po celej ošetrenej ploche rohovky 2 Ložiská alebo splývajúce škvrny na jednej bunke 3 Splývajúce ve ľké plochy rohovky zadržiavajúce fluoresceín
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Medzi morfologické ú činky patrí „jamkovanie“ buniek epitelu rohovky, 
„uvoľnenie“ epitelu, „zdrsnenie“ povrchu rohovky a „pri ľnutie“ testovanej 
látky k rohovke. Tieto zistenia môžu by ť rôzne, pokia ľ ide o ich závaž ­
nosť, a môžu sa vyskytova ť súčasne. Klasifikácia týchto zistení je subjek ­
tívna pod ľa výkladu výskumníka.  
ÚDAJE A SPRÁVA  
Vyhodnotenie údajov  
44. Výsledné hodnoty zákalu rohovky, zdurenia rohovky a zadržania fluores ­
ceínu by sa mali posudzova ť osobitne, aby sa stanovila trieda izolovaného 
kuracieho oka pre každý kone čný výsledok. Triedy izolovaného kuracieho 
oka pre každý kone čný výsledok sa potom zlú čia a stanoví sa klasifikácia 
dráždivosti na každú testovanú látku.  
Rozhodovacie kritériá  
45. Ke ď sa posúdi každý kone čný výsledok, môžu sa priradi ť triedy izolovaného 
kuracieho oka na základe vopred ur čeného rozsahu. Výklad hrúbky rohovky 
(tabuľka 3), zákalu (tabu ľka 4) a zadržania fluoresceínu (tabu ľka 5) 
s použitím štyroch tried izolovaného kuracieho oka sa robí pod ľa týchto 
stupníc:  
Tabuľka 3 
Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na hrúbku rohovky  
Priemerné zdurenie rohovky (%) (*) Trieda izolovaného kuracieho oka  
0 až 5 I 
> 5 až 12 II 
> 12 až 18 (> 75 minút po ošetrení) II 
> 12 až 18 ( ≤ 75 minút po ošetrení) III 
> 18 až 26 III > 26 až 32 (> 75 minút po ošetrení) III > 26 až 32 ( ≤ 75 minút po ošetrení) IV 
> 32 IV
 
(*) Tieto hodnoty zdurenia rohovky platia iba vtedy, ak sa hrúbka meria biomikroskopom Haag-Streit BP900 
so zariadením na meranie h ĺbky č. I a pri nastavení šírky štrbiny 9½, ktorá sa rovná 0,095 mm. Použí ­
vatelia by mali vedie ť, že biomikroskopy môžu dáva ť rôzne namerané hodnoty hrúbky rohovky, ak je 
nastavená rôzna šírka štrbiny.  
Tabuľka 4 
Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na zákal  
Priemerná hodnota pre maximálny zákal (*) Trieda izolovaného kuracieho oka  
0,0 – 0,5 I 
0,6 – 1,5 II 1,6 – 2,5 III 2,6 – 4,0 IV
 
(*) Pozri tabu ľku 1. ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabuľka 5 
Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na priemerné zadržanie fluoresceínu  
Priemerná hodnota zadržania fluoresceínu 30 minút 
po ošetrení (*) Trieda izolovaného kuracieho oka  
0,0 – 0,5 I 
0,6 – 1,5 II 1,6 – 2,5 III 2,6 – 3,0 IV
 
(*) Pozri tabu ľku 2.  
46. Celková klasifikácia dráždivosti  in vitro  na testovanú látku sa hodnotí 
pomocou klasifikácie dráždivosti, ktorá zodpovedá kombinácii kategórií získaných pre zdurenie rohovky, zákal rohovky a zadržanie fluoresceínu a použitím schémy uvedenej v tabu ľke 6.
 
Tabuľka 6 
Celková klasifikácia dráždivosti  in vitro  
Klasifikácia Kombinácie 3 kone čných výsledkov  
Žieravina/silne dráždivá látka 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) 
Zákal rohovky ≥ 3 po 30 minútach (aspo ň v 2 
očiach) 
Zákal rohovky = 4 v ktoromko ľvek časovom 
bode (aspo ň v 2 očiach) 
Závažné uvo ľnenie epitelu (aspo ň v 1 oku)
 
(*) Kombinácie, ktorých výskyt je menej pravdepodobný.  
47. Ako sa uvádza v odseku 1, ak sa testovaná látka nepreukáže ako o čná 
žieravina alebo silne dráždivá látka, malo by sa vykona ť ďalšie testovanie 
na účely klasifikácie a ozna čovania. Testovacia metóda izolovaného kura ­
cieho oka má celkovú presnos ť 83 % (120/144) až 87 % (134/154), mieru 
falošnej pozitivity 6 % (7/122) až 8 % (9/116) a mieru falošnej negativity 
41 % (13/32) až 50 % (15/30) na zis ťovanie očných žieravín a silne dráždi ­
vých látok v porovnaní s údajmi metódy na testovanie o čí králikov  in vivo  
klasifikovanej pod ľa klasifika čného systému EPA (1), EÚ (2) alebo GHS (3). 
Keď sa látky v rámci ur čitých chemických tried (t. j. alkoholy a povrchovo 
aktívne látky) a fyzikálnych tried (t. j. tuhé látky) vylú čia z databázy, pres ­
nosť testovania izolovaného kuracieho oka v klasifika čných systémoch EÚ, 
EPA a GHS je v rozsahu 91 % (75/82) až 92 % (69/75), miery falošnej 
pozitivity sú v rozsahu 5 % (4/73) až 6 % (4/70) a miery falošnej negativity 
sú v rozsahu 29 % (2/7) až 33 % (3/9) (4). 
48. Aj ke ď sa nezíska klasifikácia o čnej žieravosti alebo silnej dráždivosti 
testovanej látky, údaje testovania izolovaného kuracieho oka môžu by ť 
užitočné v spojení s testovacími údajmi z testu o čí králikov  in vivo  
alebo z vhodne overeného testu  in vitro  na ďalšie posúdenie použite ľnosti 
a obmedzení testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na zis ťovanie 
slabo dráždivých a nedráždivých látok (usmernenie na používanie testova ­
cích metód o čnej toxicity  in vitro  je v štádiu vývoja).  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Kritériá prijate ľnosti štúdie  
49. Test sa považuje za prijate ľný, ak výsledkom súbežných negatívnych 
kontrol a kontrol rozpúš ťadla/nosiča a súbežných pozitívnych kontrol je 
klasifikácia dráždivosti, ktorá patrí do triedy nedráždivých látok, resp. silne dráždivých látok/žieravín.
 
Správa o testovaní  
50. Správa o testovaní by mala obsahova ť tieto informácie, ak sú dôležité na 
vykonanie štúdie:  
Testované a kontrolné látky  
Názov chemikálie (názvy chemikálií), ako je štrukturálny názov, ktorý 
používa služba Chemical Abstracts Service ( ďalej len „CAS“), po ktorom 
nasledujú iné názvy, ak sú známe; 
registračné číslo CAS, ak je známe; 
čistota a zloženie látky alebo zmesi (v hmotnostných percentách), pokia ľ 
je táto informácia k dispozícii; 
fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je fyzikálny stav, prchavos ť, pH, stabi ­
lita, chemická trieda, rozpustnos ť vo vode dôležitá na vykonanie štúdie; 
prípadná úprava testovaných/kontrolných látok pred testovaním (napr. 
zahrievanie, drvenie); 
stabilita, ak je známa.  
Informácie týkajúce sa objednávate ľa a testovacieho zariadenia  
Meno a adresa objednávate ľa, testovacieho zariadenia a vedúceho štúdie; 
identifikácia zdroja o čí (t. j. zariadenie, v ktorom sa vykonal ich odber); 
podmienky skladovania a dopravy o čí (napr. dátum a čas odberu o čí, 
časový interval pred za čiatkom testovania); 
osobitné charakteristiky zvierat, od ktorých sa vykonal odber o čí (napr. 
vek, pohlavie, hmotnos ť darcovského zviera ťa), ak sú k dispozícii.  
Zdôvodnenie testovacej metódy a použitý protokol  
Integrita testovacej metódy  
Postup, ktorý sa používa na zabezpe čenie integrity (t. j. presnosti 
a spoľahlivosti) testovacej metódy v čase (napr. pravidelné testovanie 
látok na preukázanie spôsobilosti, používanie historických negatívnych a pozitívnych kontrolných údajov).
 
Kritériá pre prijate ľný test  
Prijateľné rozsahy prípadných súbežných referen čných kontrol na základe 
historických údajov.  
Podmienky testovania  
Opis použitého testovacieho systému; 
použitý typ biomikroskopu (napr. ozna čenie modelu); 
nastavenia použitého biomikroskopu; 
informácie o použitých kuracích o čiach, vrátane prehlásenia o ich kvalite;  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
podrobnosti o použitom testovacom postupe; 
koncentrácia (koncentrácie) použitej testovanej látky (látok); 
opis všetkých úprav testovacieho postupu; 
odkaz na historické údaje modelu (napr. negatívne a pozitívne kontroly, 
látky na preukázanie spôsobilosti, referen čné látky); 
opis použitých hodnotiacich kritérií.  
Výsledky  
Opis iných pozorovaných ú činkov; 
prípadne fotografie oka.  
Diskusia  
Záver  
LITERATÚRA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual (Príru čka na kontrolu ozna ­ 
čení): 2. vydanie. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environ ­
mental Protection Agency (Agentúra USA pre ochranu životného prostredia). 
(2) Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok 
a zmesí, o zmene a doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS 
a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006. 
Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1. 
(3) Organizácia Spojených národov (OSN) (2007). Globally Harmonized 
System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) [Glo ­
bálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania chemikálií 
(ďalej len „GHS“)]. Druhé prepracované vydanie, OSN New York 
a Ženeva, 2007. Dostupné na: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html] 
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives (Správa o hodnotení testovacích metód –testovacie metódy očnej toxicity  in vitro  na zisťovanie o čných silne dráždivých 
a žieravých látok). Medziagentúrny koordina čný výbor pre overo ­
vanie alternatívnych metód a národný toxikologický program ( ďalej 
len „NTP“) medziagentúrneho strediska pre overovanie alternatívnych toxikologických metód ( ďalej len „NICEATM“). Publikácia NIH č.: 
07-4517. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Ozná ­
menie o závere retrospektívnej štúdie ICCVAM o organotypických 
rozboroch  in vitro  ako kontrolných testoch na zis ťovanie potenciál ­
nych očných žieravín a silne dráždivých látok). Dostupné na: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(6) Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 
z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii 
a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej 
chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) 
č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 
91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Ú. v. 
EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1. 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405 (Usmernenie na testovanie 405). 
OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/cor ­
rosion (Usmernenie OECD na testovanie chemikálií. Akútne podráž ­
denie očí/žieravos ť). Dostupné na: 
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol (Protokol testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej 
rohovky odporú čaný výborom ICCVAM). In: ICCVAM Test Method 
Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxicity Test Methods for Identifying 
Ocular Severe Irritants and Corrosives (V: Správa ICCVAM o hodnotení 
testovacej metódy – testovacie metódy o čnej toxicity  in vitro  na zisťo­
vanie očných silne dráždivých látok a žieravín). Medziagentúrny koordi ­
načný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikolo ­
gický program medziagentúrneho strediska na overovanie alternatívnych 
toxikologických metód. Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method (Sú časný stav testovacích metód  in vitro  na zisťovanie 
očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda izolova ­
ného kuracieho oka). Publikácia NIH č.: 06-4513. Research Triangle 
Park: National Toxicology Program. Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) Prinsen, M.K. a Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative 
to the Draize eye irritation test with rabbits (Dôvody na testovanie vylúpnutých o čí na očiach jatočných zvierat ako alternatívy k Draize 
testu dráždivosti na králikoch).  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76. 
(11) INVITTOX (1994). Chicken enucleated eye test (CEET). (Protokol 80: 
Testovanie vylúpnutých kuracích o čí). Dostupné na: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. a Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test (Medzinárodná hodnotiaca štúdia ES/humanitárnych organizácií o alternatívach k Draize testu o čnej dráždivosti).  Toxicol. 
In Vitro  9:871-929. 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): 
A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials [Testovanie vylúpnutých kuracích o čí: prak­
tická (predbežná) kontrola na hodnotenie schopnosti testovaných materiálov vyvola ť očné podráždenie/žieravý ú činok].  Food Chem. 
Toxicol . 34:291 – 296. 
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. a Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pred ­
iction of ocular irritation (Organotypické modely na hodnotenie/pred ­
vídanie o čného podráždenia).  Food Chem. Toxicol.
 35:23 – 37. 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., a the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (Poradný výbor pre postupy na kontrolu nákaz v zdravotnej starostlivosti) (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infec ­
tious Agents in Healthcare Settings (Usmernenie pre izola čné opatre ­
nia: predchádzanie prenosu pôvodcov nákaz v organizáciách zdra ­
votnej starostlivosti). Dostupné na: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf]. 
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. a Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays (Rozsah poranení rohovky ako mechanický základ podráždenia o čí: 
hlavné zistenia a odporú čania na vývoj alternatívnych rozborov).  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106 – 117. 
(17) Burton, A.B.G., M. York a R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  asse­
ssment of severe irritants (Hodnotenie silne dráždivých látok  in vitro) . 
Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471 – 480.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method (Informa čný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích 
metód  in vitro  na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: 
testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). 
Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm]. 
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method (Informa čný doku­
ment o kontrole, aktuálny stav testovacích metód  in vitro  na zisťo­
vanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda 
izolovaného kuracieho oka). Dostupné na: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm].
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV  
Presnosť: blízkosť zhody výsledkov testovacej metódy s prijatými referen čnými 
hodnotami. Je to miera výkonnosti testovacej metódy a jeden z aspektov „výz ­
namnosti“. Tento pojem sa často používa ako zamenite ľný s pojmom „zhoda“ 
a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy.  
Referenčná látka:  látka, ktorá sa používa ako štandard na porovnávanie 
s testovanou látkou. Referen čná látka by mala ma ť tieto vlastnosti: i) stály 
a spoľahlivý zdroj (zdroje); ii) štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou látok, 
ktoré sa testujú; iii) známe fyzikálne/chemické vlastnosti; iv) podporné infor ­
mácie o známych ú činkoch a v) známu ú činnosť v rozsahu žiadanej reakcie.  
Rohovka:  priehľadná časť prednej strany o čnej gule, ktorá pokrýva dúhovku 
a zrenicu a prepúš ťa svetlo do vnútra oka.  
Zákal rohovky:  miera rozsahu zakalenia rohovky po vystavení pôsobeniu testo ­
vanej látky. Zvýšený zákal rohovky je príznakom poškodenia rohovky.  
Zdurenie rohovky:  pri testovaní izolovaného kuracieho oka objektívne meranie 
rozsahu roztiahnutia rohovky po vystavení pôsobeniu testovanej látky. Vyjadruje sa v percentách a vypo číta sa zo základných (pred dávkovaním) meraní hrúbky 
rohovky a hrúbky zaznamenanej po vystavení pôsobeniu testovaného materiálu 
pri testovaní izolovaného kuracieho oka. Miera zdurenia rohovky je príznakom 
poškodenia rohovky.  
EPA kategória 1:  žieravé (nevratné zni čenie očného tkaniva) alebo postihnutie 
rohovky alebo podráždenie, ktoré pretrváva viac ako 21 dní (1).  
EÚ kategória R41:  vznik poškodenia tkaniva v oku alebo závažné fyzické 
zhoršenie videnia po nanesení testovanej látky na predný povrch oka, ktoré nie je úplne vratné do 21 dní od nanesenia (2).  
Miera falošnej negativity:  podiel všetkých pozitívnych látok, ktoré sú testo ­
vacou metódou nesprávne identifikované ako negatívne. Je to jeden z ukazovate ľov výkonnosti testovacej metódy.  
Miera falošnej pozitivity:  podiel všetkých negatívnych látok, ktoré sú testo ­
vacou metódou nesprávne identifikované ako pozitívne. Je jedným 
z ukazovate ľ
ov výkonnosti testovacej metódy.  
Zadržanie fluoresceínu:  pri testovaní izolovaného kuracieho oka subjektívne 
meranie množstva fluoresceínu sodného, ktorý zadržia epiteliálne bunky 
v rohovke po vystavení pôsobeniu testovanej látky. Miera zadržania fluoresceínu je príznakom poškodenia epitelu rohovky.  
GHS (globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania chemic ­
kých látok):  systém navrhovania klasifikácie chemikálií (látok a zmesí) pod ľa 
štandardizovaných typov a stup ňov fyzických, zdravotných a environmentálnych 
nebezpečenstiev a ozna čovania pomocou príslušných komunika čných prvkov, 
ako sú piktogramy, signaliza čné slová, upozornenia na nebezpe čenstvo, bezpe č­
nostné upozornenia a karty bezpe čnostných údajov na sprostredkovanie infor ­
mácií o ich nepriaznivých ú činkoch s cie ľom chráni ť ľudí (vrátane zamestnan ­
cov, pracujúcich, dopravcov, spotrebite ľov a subjekty zodpovedné za riešenie 
núdzových situácií) a životné prostredie (3).
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS kategória 1:  vznik poškodenia tkaniva v oku alebo závažné fyzické zhor ­ 
šenie videnia po nanesení testovanej látky na predný povrch oka, ktoré nie je 
úplne vratné do 21 dní po nanesení (3).  
Nebezpečenstvo:  vnútorná vlastnos ť činidla alebo situácia, ktorá má schopnos ť 
vyvolať nepriaznivé ú činky pri vystavení organizmu, systému alebo obyvate ľstva 
(skupiny obyvate ľov) pôsobeniu tohto činidla.  
Negatívna kontrola:  neupravená replika, ktorá obsahuje všetky zložky testova ­
cieho systému. Táto vzorka sa spracuje so vzorkami upravenými testovanou 
látkou a s inými kontrolnými vzorkami s cie ľom zistiť, či rozpúšťadlo 
a testovací systém na seba navzájom pôsobia.  
Nedráždivá látka:  látka, ktorá v EPA kategórii I, II ani III; v EÚ kategórii R41 
ani R36, ani v GHS kategórii 1, 2A ani 2B nie je klasifikovaná ako o čná 
dráždivá látka (1) (2) (3).  
Očná žieravina:  a) látka, ktorá spôsobuje nevratné poškodenie tkaniva oka; b) 
látka, ktorá je v GHS kategórii 1, v EPA kategórii I alebo v EÚ kategórii R41 klasifikovaná ako o čná žieravina (1) (2) (3).  
Očná dráždivá látka:  a) látka, ktorá vyvoláva nevratnú zmenu v oku po nane ­
sení na predný povrch oka; b) látka, ktorá je v EPA kategórii II alebo III, v EÚ 
kategórii R36 alebo v GHS kategórii 2A alebo 2B klasifikovaná ako o čná dráž­
divá látka (1) (2) (3).  
Očná silne dráždivá látka:  a) látka, ktorá po nanesení na predný povrch oka 
vyvoláva poškodenie o čného tkaniva, ktoré neustúpi do 21 dní po nanesení, 
alebo spôsobuje závažné fyzické zhoršenie videnia; b) látka, ktorá je v GHS kategórii 1, v EPA kategórii I alebo v EÚ kategórii R41 klasifikovaná ako očná dráždivá látka (1) (2) (3).  
Pozitívna kontrola:  replika obsahujúca všetky zložky testovacieho systému 
a upravená látkou, o ktorej sa vie, že vyvoláva pozitívnu reakciu. S cie ľom 
zabezpečiť možnosť vyhodnoti ť premenlivos ť reakcie pri pozitívnej kontrole 
v 
čase by však závažnos ť reakcie nemala by ť extrémne silná.  
Spoľahlivosť: miera rozsahu, v ktorom sa testovacia metóda môže opakovane 
vykonáva ť v čase v laboratóriu a medzi laboratóriami, pri čom sa používa 
rovnaký protokol. Hodnotí sa vypo čítaním vnútrolaboratórnej 
a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti a vnútrolaboratórnej opakovate ľnosti.  
Biomikroskop:  prístroj používaný na priame preskúmanie oka pri zvä čšení 
binokulárnym mikroskopom s vytvorením stereoskopického vzpriameného obrazu. V testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa tento prístroj používa 
na prehliadanie predných štruktúr kuracieho oka, ako aj na objektívne meranie 
hrúbky rohovky pomocou pripojeného zariadenia na meranie h ĺbky. 
Kontrola rozpúš ťadla/nosi ča: neupravená vzorka, ktorá obsahuje všetky 
zložky testovacieho systému, vrátane rozpúš ťadla alebo nosi ča, ktorá sa spracuje 
so vzorkami upravenými testovanou látkou a s inými kontrolnými vzorkami, a zistí sa základná reakcia vzoriek upravených testovanou látkou rozpustenou v tom istom rozpúš ťadle alebo nosi či. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou 
negatívnou kontrolou, preukazuje sa aj to, či rozpúšťadlo, alebo nosi č a testovací 
systém na seba navzájom pôsobia.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Postupné testovanie:  stratégia postupného testovania, pri ktorej sa všetky 
existujúce informácie o testovanej látke kontrolujú v ur čitom poradí, 
s použitím postupu posudzovania závažnosti dôkazov v každom stupni a zisťuje sa, či je k dispozícii dostatok informácií na rozhodnutie o klasifikácii 
nebezpečenstva pred postupom do ďalšieho stup ňa. Ak sa dráždivý potenciál 
testovanej látky môže stanovi ť na základe existujúcich informácií, nevyžaduje sa 
žiadne ďalšie testovanie. Ak dráždivý potenciál testovanej látky nemožno stanovi ť 
na základe existujúcich informácií, vykonáva sa testovanie metódou postupných krokov na zvieratách, až kým sa nedá urobi ť jednozna čná klasifikácia.  
Overená testovacia metóda:  testovacia metóda, pre ktorú sa ukon čili hodno ­
tiace štúdie a zistila sa významnos ť (vrátane presnosti) a spo ľahlivosť na určitý 
účel. Je dôležité poznamena ť, že overená testovacia metóda nemusí ma ť dosta­
točnú výkonnos ť z hľadiska presnosti a spo ľahlivosti, aby sa mohla považova ť za 
prijateľnú na navrhnutý ú čel. 
Posudzovanie závažnosti dôkazov:  postup posudzovania silných a slabých 
stránok rôznych informácií na dosiahnutie a podporu záveru, ktorý sa týka poten ­
ciálu nebezpe čnosti nejakej látky.
 ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Dodatok 2  
LÁTKY NA PREUKAZOVANIE SPÔSOBILOSTI PRE TESTOVACIU 
METÓDU IZOLOVANÉHO KURACIEHO OKA 
Pred rutinným používaním testovacej metódy, ktorá zodpovedá tejto testovacej 
metóde, môžu laboratóriá preukáza ť svoju technickú spôsobilos ť správnym 
stanovením klasifikácie o čnej žieravosti 10 látok odporú čaných v tabu ľke 1. 
Výber týchto látok sa vykonal tak, aby zastupovali ten rozsah reakcií lokálneho podráždenia oka/žieravého ú činku na oko, ktorý vychádza z výsledkom testov o čí 
králikov  in vivo  (TG 405) (t. j. kategórie 1, 2A, 2B alebo látky neklasifikované 
alebo ozna čené podľa GHS OSN) (3) (7). Vzh ľadom na overenú použite ľnosť 
týchto rozborov (t. j. iba na zis ťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) tu 
však existujú len dva výsledky testov na ú čely klasifikácie (žieravina/silne dráž ­
divá látka alebo nežieravina/slabo dráždivá látka) na preukázanie spôsobilosti. 
Ďalším kritériom na výber bola komer čná dostupnos ť látok, dostupnos ť vysoko 
kvalitných referen čných údajov  in vivo  a existencia vysoko kvalitných údajov 
z dvoch metód  in vitro , pre ktoré sa pripravujú usmernenia na testovanie. Z toho 
dôvodu sa dráždivé látky vybrali zo zoznamu 122 referen čných látok, ktoré 
odporučil výbor ICCVAM na overovanie testovacích metód o čnej toxicity  in 
vitro  (pozri dodatok H: Zoznam referen čných látok odporú čaných ICCVAM) 
(4). Referen čné údaje sú dostupné v podkladových kontrolných dokumentoch 
ICCVAM pre testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky 
a testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka (18) (19).
 
Tabuľka 1 
Odporúčané látky na preukazovanie technickej spôsobilosti na testovanie izolovaného kuracieho oka  
Chemikália CASRN Chemická trieda (  1 ) Fyzikálna forma Klasifikácia (  2 ) in 
vivo Klasifikácia (  3 ) in vitro  
Benzalkónium 
chlorid (5 %) 8001-54-5 Óniová zlú če­
nina Kvapalina Kategória 1 Žieravá/silne 
dráždivá látka 
Chlórhexidín 55-56-1 Amín, amidín Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne 
dráždivá látka 
Kyselina 
dibenzoyl-L-vinná 2743-38-6 Karboxylová 
kyselina, ester Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne 
dráždivá látka 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklická 
zlúčenina Tuhá látka Kategória 1 Žieravá/silne 
dráždivá látka 
Kyselina trichlóroc ­
tová (30 %) 76-03-9 Karboxylová 
kyselina Kvapalina Kategória 1 Žieravá/silne 
dráždivá látka 
2,6-dichlórbenzoyl 
chlorid 4659-45-4 Acylhalogenid Kvapalina Kategória 2A Nežieravá/slabo 
dráždivá látka 
Etyl-2-metylaceto- 
octan 609-14-3 Ketón, ester Kvapalina Kategória 2B Nežieravá/slabo 
dráždivá látka 
Dusičnan amónny 6484-52-2 Anorganická 
soľ Tuhá látka Kategória 2A Nežieravá/slabo 
dráždivá látka  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Chemikália CASRN Chemická trieda (  1 ) Fyzikálna forma Klasifikácia (  2 ) in 
vivo Klasifikácia (  3 ) in vitro  
Glycerol 56-81-5 Alkohol Kvapalina Neozna čená Nežieravá/slabo 
dráždivá látka 
n-hexán 110-54-3 Uh ľovodík 
(acyklický) Kvapalina Neozna čená Nežieravá/slabo 
dráždivá látka  
Skratky: CASRN = Registra čné číslo Chemical Abstracts Service 
( 1 ) Chemické triedy sa stanovili na každú testovanú látku s použitím štandardnej klasifika čnej schémy na základe klasifika čného 
systému National Library of Medicine Medical Subject Headings (dostupné na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Na základe výsledkov testu o čí králikov  in vivo  (OECD TG 405) a s použitím GHS OSN (3)(7). 
( 3 ) Na základe výsledkov testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky a izolovaného kuracieho oka.  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Dodatok 3  
Schémy superfúzneho prístroja na o či a očných svoriek  
[Ďalší generický všeobecný opis superfúzneho prístroja a o čnej svorky 
pozri v publikácii Burton et al. (17)]
  ▼M2 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO  TEST MIKROJADIER BUNIEK CICAVCOV  
ÚVOD 
1. In vitro  skúška mikrojadier (MNvit) je genotoxický test, ktorého cie ľom je 
zistiť prítomnos ť mikrojadier (MN) v cytoplazme buniek v interfáze. 
Mikrojadrá môžu pochádza ť z acentrických fragmentov chromozómov (t. 
j. bez centroméry) alebo z celých chromozómov, ktoré po čas anafázy 
delenia bunky nie sú schopné migrova ť k pólom. Skúška zis ťuje aktivitu 
klastogénnych a aneugénnych chemikálií (látok a zmesí) (1) (2) 
v bunkách, ktoré prešli bunkovým delením po čas expozície testovanej 
látke alebo po nej. Táto testovacia metóda (TM) umož ňuje využíva ť proto­
koly s inhibítorom polymerizácie aktínu, ktorý sa nazýva cytochalasín B (cytoB), a bez neho. Pridanie cytoB pred cie ľovou mitózou umož ňuje 
identifikova ť a selektívne analyzova ť frekvenciu mikrojadier v bunkách, 
ktoré ukon čili jednu mitózu, ke ďže tieto bunky sú dvojjadrové (3) (4). 
Táto testovacia metóda tiež umož ňuje využi ť protokoly bez blokovania 
cytokinézy, ak existuje dôkaz, že populácia analyzovaných buniek prešla 
mitózou. 
2. Okrem použitia skúšky MNvit na identifikáciu chemikálií (látok a zmesí), 
ktoré indukujú mikrojadrá, môže použitie inhibítorov cytokinézy, imuno ­
chemického ozna čovania kinetochorov alebo hybridizácia s centromérový ­
mi/telomérovými sondami [fluorescen čná hybridizácia  in situ  (FISH)] tiež 
poskytnúť informácie o mechanizmoch poškodenia chromozómov a tvorbe 
mikrojadier (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postupy 
označovania a hybridizácie možno použi ť, ak dôjde k zvýšenej miere 
tvorby mikrojadier a výskumník chce ur čiť, či je tento nárast výsledkom 
klastogénnych a/alebo aneugénnych procesov. 
3. Mikrojadrá predstavujú poškodenie, ktoré sa prenáša na dcérske bunky, 
zatiaľ čo chromozómové odchýlky zaznamenané v bunkách v metafáze 
nemožno prenies ť. Keďže mikrojadrá v bunkách v interfáze možno 
hodnotiť relatívne objektívne, pracovníci laboratória musia ur čiť
 len to, 
či bunky prešli, alebo neprešli delením a ko ľko buniek obsahuje mikro ­
jadro. Následne možno preparáty pomerne rýchlo vyhodnoti ť a analýzu 
možno vykona ť automaticky. Takto sa po čas jedného ošetrenia môžu 
vyhodnoti ť prakticky tisíce, a nielen stovky buniek, čím sa zvyšuje ú čin­
nosť skúšky. Nakoniec ke ďže mikrojadrá môžu vzniknú ť v dôsledku 
spomalenia vzniku chromozómov, existuje možnos ť zistiť činitele induku ­
júce aneuploidy, ktoré je zložité skúma ť pomocou bežných testov chro ­
mozómových odchýlok, napr. usmernenie OECD o vykonávaní testov 473 (kapitola B.10 tejto prílohy) (17). Skúška MNvit však neumož ňuje 
rozlišovať chemikálie indukujúce vznik polyploidov od tých chemikálií, 
ktoré indukujú klastogenicitu bez použitia špeciálnych postupov, ako napríklad fluorescen čnej hybridizácie  in situ  (FISH) opísanej v odseku 2. 
4. Skúška MNvit je metóda  in vitro , ktorá bežne využíva kultivované ľudské 
bunky alebo bunky hlodavcov. Poskytuje komplexný základ skúmania potenciálu poškodenia chromozómov  in vitro , keďže možno zisti ť aneu­
gény, ako aj klastogény. 
5. Skúška MNvit je spo ľahlivá a ú činná v prípade rôznych druhov buniek, 
a to s použitím alebo bez použitia cytoB. Platnos ť skúšky MNvit 
podporuje množstvo údajov získaných z rôznych bunkových línií 
hlodavcov (CHO, V79, CHL/IU, a L5178Y) a ľudských lymfocytov 
(18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Tieto údaje zah ŕňajú najmä medzinárodné valida čné štúdie, ktoré koordi ­
novalo združenie Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) 
(19) (20) (21) (22), a správy z medzinárodného seminára o testovaní
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
genotoxicity (International Workshop on Genotoxicity Testing) (4) (16). 
Dostupné údaje boli opätovne prehodnotené vzh ľadom na závažnos ť 
dôkazov retrospektívnej valida čnej štúdie, ktorú uskuto čnilo Európske 
centrum pre validáciu alternatívnych metód (ECVAM) Európskej komisie, pričom táto testovacia metóda bola Vedeckým poradným výborom 
ECVAM (ESAC) schválená ako vedecky platná (32) (33) (34). Použitie 
ľudskej lymfoblastoidnej bunkovej línie TK6 (35), buniek HepG2 (36) 
(37) a primárnych embryonálnych buniek škre čka sýrskeho (38) bolo 
síce opísané, neboli však použité vo valida čných štúdiách.
 
VYMEDZENIE POJMOV 
6. Použité definície sú uvedené v dodatku 1.  
ÚVODNÉ ÚVAHY 
7. Testy, ktoré sa vykonávajú  in vitro , si zvyčajne vyžadujú použitie exogén ­
neho zdroja metabolickej aktivácie okrem prípadov, ke ď sú bunky 
v súvislosti s testovanými látkami metabolicky spôsobilé. Exogénny 
systém metabolickej aktivácie napodob ňuje v plnej miere podmienky  in 
vivo. Rovnako je potrebné predchádza ť podmienkam, ktoré by viedli 
k falošným pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú vnútornú mutagenitu 
a môžu vzniknú ť v dôsledku takých faktorov, ako napríklad výrazné 
zmeny v hodnotách pH alebo osmolality alebo z dôvodu vysokej úrovne cytotoxicity (39) (40) (41). Ak testovaná chemikália spôsobí zmenu 
v hodnote pH média v čase pridania, je potrebné pH upravi ť tlmením 
zásobného roztoku tak, aby všetky objemy pri všetkých testovacích koncentráciách a pri všetkých kontrolách ostali rovnaké. 
8. Pri analýze indukcie mikrojadier je dôležité, aby mitóza prebehla 
v ošetrených aj v neošetrených kultúrach. Najinformatívnejšie štádium 
pre hodnotenie mikrojadier je v bunkách, ktoré ukon čili jednu mitózu 
počas ošetrenia testovanou látky alebo po ošetrení.
 
PRINCÍP TESTU 
9. Bunkové kultúry ľudského pôvodu alebo pochádzajúce z cicavcov sú 
vystavené testovanej látke s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie aj bez neho okrem prípadu, ak sú použité bunky s dostato čnou schopno ­
sťou metabolizácie. Sú časťou každého testu sú chemikálie na súbežné 
kontroly s rozpúš ťadlom/nosi čom (VC) a chemikálie na pozitívnu 
kontrolu (PC). 
10. Počas expozície testovanej látke alebo po expozícii sa bunky pestujú 
dostatočne dlho na to, aby sa umožnilo, že poškodenie chromozómov 
alebo deliaceho vretienka povedie k vytvoreniu mikrojadier v bunkách 
v interfáze. Na indukciu aneuploídie je zvy čajne potrebné, aby bola testo ­
vaná látka prítomná po čas mitózy. Získané a zafarbené bunky v interfáze 
sa analyzujú na prítomnos ť mikrojadier. V ideálnom prípade by sa mali 
mikrojadrá hodnoti ť len v tých bunkách, ktoré po čas expozície testovanej 
látke alebo v čase po expozícii ukon čili mitózu. Ak boli kultúry ošetrené 
blokátorom cytokinézy, rovnaký výsledok sa dosiahne hodnotením len dvojjadrových buniek. Ak sa blokátor cytokinézy nepoužije, je dôležité 
preukázať, že analyzované bunky pravdepodobne prešli delením po čas 
expozície testovanej látke alebo po nej. Pri všetkých protokoloch je dôle ­ 
žité preukáza ť, že došlo k proliferácii buniek v kontrolných, ako aj 
v ošetrených kultúrach, a rozsah cytotoxicity alebo cytostázy, ktorú vyvo ­
lala testovaná látka, je potrebné posúdi ť v rámci kultúr (alebo v súbežných 
kultúrach), ktoré sa hodnotia z h ľadiska mikrojadier.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
OPIS SKÚŠKY  
Prípravy  
11. Môžu sa použi ť kultivované primárne ľudské periférne krvné lymfocyty 
(5) (19) (42) (43) a rôzne bunkové línie hlodavcov, ako napríklad bunky 
CHO, V79, CHL/IU a L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Použitie iných bunkových línií a typov je potrebné zdôvodni ť na 
základe ich preukázanej výkonnosti v skúške, ako sa uvádza v oddiele 
Kritériá prijate ľnosti. Ke ďže pozaďová frekvencia mikrojadier ovplyvní 
citlivosť skúšky, odporú ča sa použi ť druhy buniek, ktoré majú nízku, 
stabilnú poza ďovú frekvenciu tvorby mikrojadier. 
12. Ľudské periférne krvné lymfocyty je potrebné získa ť od mladých (od 18 
do 35 rokov) zdravých nefaj čiarov, ktorí v poslednom čase neboli vysta ­
vení genotoxickým chemikáliám alebo radiácii. Ak sa pre jedno použitie 
spoja bunky od viacerých darcov, mal by sa uvies ť ich počet. Frekvencia 
mikrojadier sa s vekom zvyšuje, pri čom tento trend je viac vidite ľný 
u žien než u mužov (44) a treba to zoh ľadniť pri výbere darcovských 
buniek na spájanie.
 
Médiá a podmienky kultivácie 
13. Na udržiavanie kultúr sú potrebné vhodné kultiva čné médiá a inkuba čné 
podmienky (kultiva čné nádoby, koncentrácia CO  2 , teplota a vlhkos ť). 
Získané bunkové línie a kmene by sa mali pravidelne kontrolova ť, pokiaľ 
ide o stabilitu modálneho po čtu chromozómov a o to, či nedošlo ku 
kontaminácii mykoplazmou. V prípade kontaminácie alebo zmeny modál ­
neho počtu chromozómov by sa nemali používa ť. Mal by by ť známy čas 
bežného bunkového cyklu pre podmienky použitých kultúr v testovacom laboratóriu. Ak sa použije metóda blokovania cytokinézy, je potrebné optimalizova ť koncentráciu inhibítora cytokinézy vzh ľadom na príslušný 
druh bunky a mala by vykazova ť tvorbu dostato čného počtu dvojjadro ­
vých buniek na hodnotenie.
 
Príprava kultúr 
14. Zistené bunkové línie a kmene: bunky sa odoberú z uskladnených kultúr, 
zapustia sa do kultiva čného média v takej hustote, pri ktorej kultúry 
nedosiahnu zhluk v monovrstvách, a suspenzné kultúry nedosiahnu nadmernú hustotu pred časom zberu a inkubujú sa pri teplote 37 °C. 
15. Lymfocyty: celá krv ošetrená antikoagulantom (napr. heparínom) alebo 
oddelené lymfocyty sa pred expozíciou testovanej látke a cytoB kultivujú 
v prítomnosti mitogénu (napr. fytohemaglutinínu).
 
Metabolická aktivácia 
16. Ak sa použijú bunky s nedostato čnou endogénnou metabolickou kapaci ­
tou, je potrebné použi ť exogénny systém metabolickej aktivácie. Najpou ­ 
žívanejším systémom je postmitochondriálna frakcia podporená spolufak ­
torom (S9), pripravená z pe čene hlodavcov ošetrených činidlami na 
indukciu enzýmov, ako je napríklad Aroclor 1254 (45) (46) alebo zmes 
fenobarbitonu a β-naftoflavónu (46) (47) (48) (49). Druhá kombinácia nie 
je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (50) ani nariadením (ES) č. 850/2004 o perzistentných organických 
znečisťujúcich látkach (66), pri čom sa pri indukovaní oxidáz so zmieša ­
nými funkciami preukázala ako rovnako ú činná ako Aroclor 1254 (46) 
(47) (48) (49). Frakcia S9 sa v kone čnom testovacom médiu zvy čajne 
používa v koncentráciách v rozpätí od 1 % – 10 % (objemové percentá). Stav systému metabolickej aktivácie môže závisie ť od triedy testovanej 
chemikálie. V niektorých prípadoch môže by ť vhodné využi ť viac než 
jednu koncentráciu S9.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Geneticky získané bunkové línie vyjadrujúce špecifické ľudské aktiva čné 
enzýmy alebo aktiva čné enzýmy hlodavcov môžu zníži ť potrebu exogén ­
neho systému metabolickej aktivácie a možno ich použi ť ako testovacie 
bunky. V takýchto prípadoch by mal by ť výber použitých bunkových línií 
vedecky podložený, napr. relevantnos ťou oxidáz so zmiešanými funkciami 
pre metabolizmus testovanej látky (51) a ich schopnos ťou odozvy na 
známe klastogény a aneugény (pozri samostatný oddiel Kritériá prijate ľ­
nosti). Je potrebné uvies ť, že testovanú látku nemusí(-ia) nevyhnutne meta ­
bolizovať vyjadrená(-é) oxidáza(-y) so zmiešanými funkciami. V tomto 
prípade by negatívne výsledky nesved čili o tom, že testovaná látka nie 
je schopná indukova ť mikrojadrá.  
Príprava testovanej látky 
18. Chemikálie v tuhom skupenstve by sa pred ošetrením buniek mali 
rozpustiť v príslušných rozpúš ťadlách alebo nosi čoch a v prípade potreby 
rozriediť. Kvapalné chemikálie sa pred ošetrením môžu prida ť priamo do 
testovacích systémov a/alebo rozriedi ť. Plyny alebo prchavé chemikálie by 
sa mali testova ť pomocou vhodných úprav štandardných protokolov, ako 
napríklad ošetrenie v uzavretých nádobách (52) (53). Používajú sa čerstvé 
preparáty testovanej látky okrem prípadu, ke ď údaje o stabilite preukazujú 
prijateľnosť uskladnenia.  
Podmienky testu  
Rozpúšťadlá/nosiče 
19. Rozpúš ťadlo/nosič by nemal reagova ť s testovanou látkou a nemal by by ť 
ani nekompatibilný s prežitím buniek alebo so zachovaním aktivity S9 pri použitej koncentrácii. Ak sa používajú iné ako riadne zaužívané rozpúš ť­
adlá/nosiče (napríklad voda, bunkové kultiva čné médium, dimetylsulfo ­
xid), ich použitie by malo by ť podložené údajmi ozna čujúcimi ich kompa ­
tibilitu s testovanou látkou a absenciu genetickej toxicity. Odporú ča sa, 
aby sa vždy, ke ď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného rozpúš ť­
adla/nosiča.
 
Použitie cytoB ako blokátora cytokinézy 
20. Jedným z najdôležitejších faktorov pri skúške MNvit je zaistenie toho, aby 
hodnotené bunky prešli mitózou po čas ošetrenia alebo v inkuba čnej dobe po 
ošetrení, ak sa použije. CytoB je najbežnejšie používané činidlo na bloko ­
vanie cytokinézy, pretože tlmí vytváranie aktínu, a tým zabra ňuje rozde ľo­
vaniu dcérskych buniek po mitóze, čo vedie k vytváraniu dvojjadrových 
buniek (5) (54) (55). Hodnotenie mikrojadier preto možno obmedzi ť len 
na tie bunky, ktoré prešli mitózou po čas ošetrenia alebo po ňom. Zárove ň 
je možné mera ť účinok testovanej látky na kinetiku proliferácie buniek. 
CytoB sa používa na blokovanie cytokinézy pri použití ľudských lymfocy ­
tov, pretože v rámci kultúr, ako aj medzi rôznymi darcami sú d ĺžky bunko ­
vých cyklov nepravidelné a nie všetky lymfocyty reagujú na PHA. Pri testo ­
vaní bunkových línií s cie ľom stanovi ť, či sa hodnotené bunky delili, boli 
použité iné metódy, ktoré sú uvedené nižšie (pozri odsek 26). 
21. Vhodnú koncentráciu cytoB pre každý druh buniek by malo stanovi ť 
laboratórium a tak sa dosiahne optimálna frekvencia dvojjadrových buniek 
v kontrolných kultúrach s rozpúš ťadlom/nosi čom. Vhodná koncentrácia 
cytoB je zvy čajne medzi 3 až 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Meranie proliferácie buniek a cytotoxicity a výber expozi čných koncen ­
trácií 
22. Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej látky je potrebné vyhýba ť 
sa koncentráciám, ktoré majú schopnos ť vyvolať falošné pozitívne odozvy, 
ako napríklad vytváranie nadmernej cytotoxicity, zrážanie kultiva čného 
média a výrazné zmeny v hodnote pH alebo osmolality (39) (40) (41). 
23. Vykonávajú sa merania proliferácie buniek, aby sa zaistilo, že ošetrené 
bunky prešli mitózou po čas skúšky a že ošetrenia sa vykonali na vhodných 
úrovniach cytotoxicity (pozri odsek 29). Cytotoxicita by sa mala stanovi ť 
pomocou metabolickej aktivácie a bez nej v bunkách, ktoré si vyžadujú 
metabolickú aktiváciu s použitím relatívneho zvýšenia po čtu 
buniek (RICC) alebo relatívneho zdvojenia populácie (RPD) (pozri vzorce v dodatku 2), okrem prípadov, ke ď sa použije cytoB. Ak sa použije cytoB, 
možno stanovi ť cytotoxicitu pomocou indexu replikácie (RI) (pozri vzorec 
v dodatku 2). 
24. Ošetrenie kultúr pomocou cytoB a meranie relatívnych frekvencií jednoja ­
drových, dvojjadrových a viacjadrových buniek v kultúre predstavuje presnú metódu kvantifikácie ú činku na proliferáciu buniek a cytotoxickej 
alebo cytostatickej aktivity ošetrenia (5) a zabezpe čuje, že sú hodnotené 
len tie bunky, ktoré sa delili po čas ošetrenia alebo po ňom. 
25. V rámci štúdií využívajúcich cytoB možno kvantifikova ť cytostázu/cyto ­
toxicitu pomocou prolifera čného indexu blokovania cytokinézy (CBPI) (5) 
(26) (56) alebo ich možno odvodi ť pomocou indexu replikácie (RI) 
z minimálneho po čtu 500 buniek na kultúru (pozri vzorce v dodatku 2). 
Ak sa cytoB použije na posúdenie proliferácie buniek, CBPI alebo RI by 
sa mali stanovi ť z minimálneho po čtu 500 buniek na kultúru. Tieto 
merania možno okrem iného použi ť na odhadovanie cytotoxicity, a to 
porovnaním hodnôt ošetrených a kontrolných kultúr. Posúdenie iných markerov cytotoxicity (napr. zhluky, po čet buniek, apoptóza, nekróza, 
počet metafáz) môže poskytnú ť užitočné informácie. 
26. V rámci štúdií, ktoré nevyužívajú cytoB, je potrebné preukáza ť, že bunky, 
ktoré sa v kultúre vyhodnocujú, prešli delením po čas ošetrenia testovanou 
látkou alebo po ošetrení, v opa čnom prípade môžu vzniknú ť falošné nega ­
tívne odozvy. Metódy, ktoré sa využívajú na zabezpe čenie toho, aby sa 
hodnotili delené bunky, zah ŕňajú začlenenie a následnú detekciu brómdeo
­
xyuridínu (BrdU) na identifikáciu replikovaných buniek (57), tvorbu klonov, ke ď sa bunky z permanentných bunkových línií ošetrili 
a vyhodnotili  in situ  na mikroskopickom sklí čku [prolifera čný 
index (PI)] (25) (26) (27) (28), alebo meranie relatívneho zdvojenia populácie (RPD), relatívneho zvýšenia po čtu buniek (RICC) alebo iné 
validované metódy (16) (56) (58) (59) (pozri vzorce v dodatku 2). Posú ­
denie iných markerov cytotoxicity alebo cytostázy (napr. zhluky, po čet 
buniek, apoptóza, nekróza, po čet metafáz) môže poskytnú ť užitočné infor­
mácie. 
27. Mali by sa hodnoti ť minimálne tri analyzovate ľné testovacie koncentrácie. 
Na tento ú čel bude možno potrebné vykona ť pokus s použitím vä čšieho 
počtu koncentrácií s tesným odstupom a analyzova ť tvorbu mikrojadier 
v týchto koncentráciách, ktoré poskytujú vhodný rozsah cytotoxicity. Alternatívne možno vykona ť predbežný test cytotoxicity s cie ľom zúžiť 
rozsah pre kone čné testovanie. 
28. Najvyššia koncentrácia by mala vyvola ť 55 ± 5 % cytotoxicitu. Vyššie 
úrovne môžu ako ved ľajší účinok cytotoxicity indukova ť poškodenie chro ­
mozómov (60). Pri výskyte cytotoxicity by vybrané testované koncentrácie 
mali pokrýva ť rozsah od koncentrácie, ktorá vyvolá 55 ± 5 % cytotoxicitu, 
až po koncentrácie, ktoré vyvolajú malú alebo žiadnu toxicitu.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Ak nie je pozorovaná žiadna cytotoxicita ani zrazenina, mala by sa 
najvyššia testovaná koncentrácia rovna ť 0,01 M, 5 mg/mL alebo 5 μl/mL, 
podľa toho, ktorá je najnižšia. Medzi koncentráciami vybranými na 
analýzu by vo všeobecnosti mal by ť odstup, ktorý nie je vä čší ako 10. 
Pri testovaných látkach, ktoré sa vyzna čujú strmou krivkou odozvy na 
koncentráciu, by odstup medzi koncentráciami testovaných látok mal 
byť menší, aby bolo možné hodnoti ť aj kultúry s miernym a malým 
rozsahom toxicity. 
30. Ak je obmedzujúcim faktorom rozpustnos ť, mala by by ť maximálnou 
koncentráciou – ak nie je obmedzená cytotoxicitou – najnižšia koncentrá ­
cia, pri ktorej je v kultúrach pozorovate ľné minimálne zrážanie za pred ­
pokladu, že nenarúša hodnotenie. Hodnotenie zrážania by sa malo vyko ­
návať pomocou metód, ako je napríklad svetelná mikroskopia, pri čom sa 
zaznamenáva pretrvávajúca zrazenina alebo zrazenina, ktorá sa objaví 
počas kultivácie (na konci ošetrenia).  
Kontroly 
31. Každý pokus má obsahova ť súbežné pozitívne kontroly a kontroly 
s rozpúšťadlom/nosi čom s metabolickou aktiváciou i bez nej. 
32. Pozitívne kontroly sú potrebné na preukázanie schopnosti použitých 
buniek a testovacieho protokolu identifikova ť klastogény a aneugény 
a potvrdi ť metabolickú schopnos ť preparátu S9. Pozitívne kontroly by 
mali využíva ť známe látky, ktoré indukujú tvorbu mikrojadier pri koncen ­
tráciách, pri ktorých sa o čakáva malý, ale reprodukovate ľný nárast na 
pozadí, a ktoré preukážu citlivos ť testovacieho systému. Koncentrácie 
pozitívnej kontroly by sa mali voli ť tak, aby boli ú činky jasné, ale aby 
pozorovate ľovi neodha ľovali ihne ď identitu kódovaných sklí čok. 
33. Klastogén, ktorý si vyžaduje metabolickú aktiváciu (napríklad cyklofosfa ­
mid; benzo[a]pyrén), by sa mal použi ť na preukázanie metabolickej schop ­
nosti, ako aj schopnosti testovacieho systému detekova ť klastogény. 
V prípade opodstatnenosti možno použi ť aj iné pozitívne kontroly. 
Keďže niektoré pozitívne kontroly, ktoré si vyžadujú metabolickú aktivá ­
ciu, môžu by ť za určitých podmienok ošetrovania alebo v ur čitých bunko ­
vých líniách aktívne aj bez exogénnej metabolickej aktivácie, mala by sa 
otestovať potreba metabolickej aktivácie a aktivita preparátu S9 vo 
vybranej bunkovej línii a pri vybraných koncentráciách. 
34. V sú časnosti nie sú známe žiadne aneugény, ktoré si vyžadujú metabolickú 
aktiváciu svojej genotoxickej aktivity (16). Momentálne akceptované pozi ­
tívne kontroly pre aneugenickú aktivitu sú napríklad: kolchicín a vinblastín. Iné chemikálie sa môžu použi ť, ak indukujú tvorbu mikroja ­
dier iba pomocou aneugenickej aktivity alebo predovšetkým pomocou nej. 
Aby sa predišlo potrebe použi ť dve pozitívne kontroly (pre klastogenicitu 
a aneugenicitu) bez metabolickej aktivácie, môže kontrola pre aneugenicitu slúžiť ako pozitívna kontrola bez S9 a kontrola pre klastogenicitu ako test 
primeranosti použitého systému metabolickej aktivácie. Pozitívna kontrola 
pre klastogenicitu, ako aj aneugenicitu by sa mala použi ť pri tých 
bunkách, ktoré si nevyžadujú použitie S9. Navrhované pozitívne kontroly sú uvedené v dodatku 3. 
35. Použitie pozitívnych kontrol týkajúcich sa chemických tried možno zváži ť, 
ak sú dostupné vhodné chemikálie. Všetky použité pozitívne kontroly by 
mali byť
 vhodné pre konkrétny bunkový typ a podmienky aktivácie.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Do každého odberu by sa mali zahrnú ť kontroly s rozpúš ťadlom/nosi čom. 
Zároveň by sa mali použi ť aj neošetrené negatívne kontroly (bez rozpúš ť­
adla/nosiča) okrem prípadov, ke ď existujú zverejnené alebo laboratórne 
historické kontrolné údaje, ktoré potvrdzujú, že vybrané rozpúš ťadlo pri 
použitej koncentrácii nemá genotoxické ani iné škodlivé ú činky.  
TESTOVACÍ POSTUP  
Harmonogram ošetrovania  
37. S cie ľom maximalizova ť pravdepodobnos ť detekcie aktivity aneugénu 
alebo klastogénu ú činkujúceho v konkrétnom štádiu bunkového cyklu je 
dôležité, aby po čas všetkých štádií bunkového cyklu bol ošetrený dosta ­
točný počet buniek testovanou látkou. Harmonogram ošetrovania bunko ­
vých línií a primárnych bunkových kultúr sa teda môže mierne odlišova ť 
od harmonogramu ošetrovania lymfocytov, ktoré si vyžadujú mitogénnu 
stimuláciu na to, aby sa za čal ich bunkový cyklus, a tieto sú uvedené 
v odsekoch 41 – 43 (16). 
38. Teoretické úvahy, ako aj zverejnené údaje (18) nazna čujú, že vä čšinu 
aneugénov a klastogénov možno ur čiť na základe krátkodobého ošetrenia 
počas 3 až 6 hodín s použitím S9 a bez použitia S9, po ktorom nasleduje 
odobranie testovanej látky a rastové obdobie trvajúce 1,5 – 2,0-násobok bunkových cyklov (6). Z buniek sa odoberajú vzorky v čase približne 1,5 
– 2,0-násobku d ĺžky bežného (t. j. neošetreného) bunkového cyklu, a to na 
začiatku alebo na konci ošetrenia (pozri tabu ľku 1). Čas odberu vzoriek 
alebo čas regenerácie možno pred ĺžiť, ak je známe alebo ak existuje podo ­
zrenie, že testovaná látka ovplyv ňuje čas bunkového cyklu (napríklad pri 
testovaní nukleozidových analógov). 
39. Kvôli možnej cytotoxicite preparátu S9 pre kultivované bunky cicavcov sa 
predĺžené expozi čné ošetrenie po čas 1,5 – 2,0-násobku bežného bunko ­
vého cyklu použije len bez S9. Pri pred ĺženom ošetrení možno ošetri ť 
bunky testovanou chemikáliou s použitím alebo bez použitia cytoB. Tieto možnosti sa vz ťahujú na situácie, pri ktorých môže existova ť obava, 
že dôjde k možným interakciám medzi testovanou látkou a cytoB. 
40. Navrhovaný harmonogram ošetrovania buniek je uvedený v tabu ľke 1. 
Tento všeobecný harmonogram ošetrovania možno upravi ť v závislosti 
od stability alebo reaktivity testovanej látky alebo od konkrétnych charak ­
teristík rastu použitých buniek. Všetky ošetrenia by sa mali za č
ať 
a ukončiť počas exponenciálneho rastu buniek. Harmonogram je detail ­
nejšie opísaný v odsekoch 41 – 47.  
Tabuľka 1 
Čas ošetrovania a zberu buniek pri skúške MNvit  
Lymfocyty, primárne bunky a bunkové línie 
ošetrené cytoB + S9 ošetrujte 3 – 6 hodín s použitím S9; 
odstráňte S9 a ošetrovacie médium; 
pridajte čerstvé médium a cytoB; 
bunky odoberte po 1,5 – 2,0-násobku bežného 
bunkového cyklu 
– S9 
krátka expozícia ošetrujte 3 – 6 hodín; 
odstráňte ošetrovacie médium; 
pridajte čerstvé médium a cytoB; 
bunky odoberte po 1,5 – 2,0-násobku bežného 
bunkového cyklu  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
predĺžená expozícia  možnosť A:  ošetrujte 1,5 – 2,0-násobok 
bežného bunkového cyklu s použitím cytoB; 
bunky odoberte na konci expozi čného času; 
možnosť B:  ošetrujte 1,5 – 2,0-násobok 
bežného bunkového cyklu; 
odstráňte testovanú látku; 
pridajte čerstvé médium a cytoB; 
bunky odoberte po 1,5 – 2,0-násobku bežného 
bunkového cyklu 
Bunkové línie ošetrené  bez cytoB 
(Rovnaký postup ako pri harmonograme ošetrovania uvedenom vyššie s tou výnimkou, že sa nepridáva cytoB)  
Lymfocyty, primárne bunky a bunkové línie s použitím cytoB  
41. Najú činnejší prístup pri lymfocytoch je za čať expozíciu testovanej látke 
44 – 48 hodín po stimulácii PHA, ke ď sa synchronizácia cyklu stratí (5). 
V počiatočnej skúške sa bunky ošetrujú 3 až 6 hodín testovanou látkou 
bez S9 a s použitím S9. Ošetrovacie médium sa odstráni a nahradí čerstvým médiom, ktoré obsahuje cytoB, a bunky sa odoberú po 1,5 – 
2-násobku bežného bunkového cyklu. 
42. Ak sú obidva po čiatočné testy krátkeho ošetrenia (3 – 6 hodín) negatívne 
alebo nejasné, v následnom pred ĺženom expozi čnom ošetrení sa S9 nepou ­ 
žije. K dispozícií sú dve možnosti ošetrenia a sú rovnako prijate ľné. Môže 
byť však vhodnejšie postupova ť pri stimulácii lymfocytov pod ľa možnosti 
A, kde sa exponenciálny rast môže 96 hodín po stimulácii znižova ť. 
Okrem toho by kultúry buniek do finálneho odberu vzoriek v možnosti B nemali dosiahnu ť zhluk. 
— Možnos ť A: Bunky sú ošetrované testovanou látkou po čas 1,5 – 2,0- 
násobku bežného bunkového cyklu a odobrané na konci obdobia ošet ­
renia. 
— Možnos ť B: Bunky sú ošetrované testovanou látkou po čas 1,5 – 2,0- 
násobku bežného bunkového cyklu. Ošetrovacie médium sa odstráni 
a nahradí čerstvým médiom a bunky sa odoberú po ďalšom 1,5 – 2- 
násobku bežného bunkového cyklu. 
43. Primárne bunky a bunkové línie by sa mali ošetri ť podobným spôsobom 
ako lymfocyty s výnimkou toho, že stimulácia PHA 44 – 48 hodín nie je 
potrebná. Iné bunky ako lymfocyty by mali by ť vystavené tak, aby sa 
bunky v čase ukončenia štúdie stále nachádzali v log fáze rastu.
 
Bunkové línie bez cytoB  
44. Bunky by sa mali ošetri ť počas 3 – 6 hodín s použitím aj bez použitia S9. 
Ošetrovacie médium sa odstráni a nahradí čerstvým médiom a bunky sa 
odoberú po 1,5 – 2-násobku bežného bunkového cyklu.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Ak sú obidva po čiatočné testy krátkeho ošetrenia (3 – 6 hodín) negatívne 
alebo nejasné, nasleduje pred ĺžené expozi čné ošetrenie (bez S9). 
K dispozícií sú dve možnosti ošetrenia, z ktorých obidve sú rovnako prijateľné: 
— Možnos ť A: Bunky sú ošetrované testovanou látkou po čas 1,5 – 2,0- 
násobku bežného bunkového cyklu a odobrané na konci obdobia ošet ­
renia. 
— Možnos ť B: Bunky sú ošetrované testovanou látkou po čas 1,5 – 2,0- 
násobku bežného bunkového cyklu. Ošetrovacie médium sa odstráni a nahradí čerstvým médiom a bunky sa odoberú po ďalšom 1,5 – 2- 
násobku bežného bunkového cyklu. 
46. V monovrstvách môžu by ť na konci 3 – 6-hodinového ošetrenia prítomné 
mitotické bunky (možno ich identifikova ť ako okrúhle a odde ľujúce sa od 
povrchu). Ke ďže tieto mitotické bunky sa dajú jednoducho oddeli ť, je 
možné, že sa pri odstra ňovaní média obsahujúceho testovanú látku stratia. 
Preto ich pri umývaní kultúr treba opatrne odobra ť a následne vráti ť ku 
kultúram s cie ľom predís ť strate buniek v mitóze a riziku pre mikrojadrá 
v čase zberu.
 
Počet kultúr  
47. Duplicitné kultúry by sa mali použi ť pre každú koncentráciu testovanej 
látky a pre kultúry s rozpúš ťadlom/nosi čom a kultúry na negatívnu 
kontrolu. Ak z historických laboratórnych údajov možno preukáza ť mini­
málnu variáciu medzi duplicitnými kultúrami, môže by ť prijateľné použitie 
jednotlivých kultúr. Ak sú použité jednotlivé kultúry, odporú ča sa, aby sa 
analyzoval zvýšený po čet koncentrácií.  
Odber buniek a príprava sklí čok 
48. Každá kultúra sa odoberá a spracúva samostatne. Príprava buniek môže 
zahŕňať hypotonické ošetrenie, ale tento krok nie je potrebný, ak sa prime ­
rané šírenie buniek dosiahne iným spôsobom. Pri príprave sklí čok možno 
použiť rôzne techniky za predpokladu, že sa získajú vysokokvalitné 
bunkové preparáty. Cytoplazma bunky by sa mala zachova ť, aby bola 
možná detekcia mikrojadier a (pri metóde blokovania cytokinézy) spo ľah­
livá identifikácia dvojjadrových buniek. 
49. Sklí čka možno zafarbi ť rôznymi metódami, napríklad farbivom Giemsa 
alebo fluorescen čným farbivom špecifickým pre DNA (59). Použitie špeci ­
fického farbiva DNA [napríklad akridínová oranžová (61) alebo Hoechst 
33258 plus pyronín-Y (62)] môže eliminova ť niektoré umelo vzniknuté 
štruktúry buniek spojené s používaním farbiva nešpecifického pre DNA. 
Protilátky kinetochoru, FISH (fluorescen čná hybridizácia  in situ ) s pan- 
centromerérovými sondami DNA alebo zna čenie in situ  pomocou 
primerov špecifických pre pancentroméru spolu s vhodným odfarbovacím roztokom DNA možno použi ť na identifikáciu obsahov mikrojadier (chro ­
mozómy/fragmenty chromozómov), ak sú predmetom záujmu mechanické 
informácie o ich tvorbe (15) (16). Na rozlišovanie medzi klastogénmi a aneugénmi možno použi ť aj iné metódy, ak sa ukázalo, že sú ú činné.
 
Analýza  
50. Všetky sklí čka vrátane sklí čok s rozpúš ťadlom/nosi čom a kontrolami by sa 
pred mikroskopickou analýzou mali nezávisle ozna čiť kódmi. Prípadne sa 
kódované vzorky môžu analyzova ť pomocou validovaného systému na 
automatickú tokovú cytometrickú alebo vizuálnu analýzu.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. V kultúrach ošetrených cytoB by sa frekvencie mikrojadier mali analy ­
zovať aspoň v 2 000 dvojjadrových bunkách na jednu koncentráciu (aspo ň 
1 000 dvojjadrových buniek na kultúru; dve kultúry na jednu koncentrá ­
ciu). Ak sa použijú jednotlivé kultúry, malo by sa z jednej kultúry vyhod ­
notiť aspoň 2 000 dvojjadrových buniek na jednu koncentráciu. Ak je na 
hodnotenie k dispozícii podstatne menej ako 1 000 dvojjadrových buniek 
na kultúru alebo menej ako 2 000 dvojjadrových buniek, ak sa použije jediná kultúra a ak sa nezistí významné zvýšenie mikrojadier, test by sa mal zopakova ť s použitím viacerých buniek alebo pri koncentráciách 
s menšou toxicitou, pod ľa toho, ktorá možnos ť je vhodná. Malo by sa 
dbať na to, aby sa nehodnotili dvojjadrové bunky nepravidelného tvaru ani 
bunky, ktorých jadrá sa výrazne odlišujú ve ľkosťou. Malo by sa dba ť aj na 
to, aby nedošlo k zámene dvojjadrových buniek za mnohojadrové bunky, 
ktorých šírenie bolo nedostato čné. Bunky obsahujúce viac ako dve hlavné 
jadrá by sa nemali analyzova ť na prítomnos ť mikrojadier, ke ďže základná 
frekvencia mikrojadra môže by ť v týchto bunkách vyššia (63) (64). 
Hodnotenie jednojadrových buniek je prijate ľné v prípade, ak testovaná 
látka interferuje s aktivitou cytoB. 
52. V bunkových líniách analyzovaných bez ošetrenia cytoB by sa mikrojadrá 
mali hodnoti ť aspoň v 2 000 bunkách na jednu koncentráciu (aspo ň 
v 1 000 bunkách na kultúru, dve kultúry na jednu koncentráciu). Ak sa 
použije iba jedna kultúra na koncentráciu, malo by sa z nej vyhodnoti ť 
aspoň 2 000 buniek. 
53. Pri použití cytoB by sa mal ur čiť index CBPI alebo RI, aby sa posúdila 
proliferácia bunky (pozri dodatok 2) s použitím aspo ň 500 buniek na 
kultúru. Pri ošetrení bez použitia cytoB je nevyhnutné poskytnú ť dôkaz, 
že vyhodnocované bunky proliferovali, ako sa uvádza v odsekoch 24 – 27.
 
Kritériá prijate ľnosti  
54. Laboratórium, ktoré navrhuje použi ť skúšku MNvit opísanú v tejto testo ­
vacej metóde, by malo preukáza ť svoju schopnos ť spoľahlivo a presne 
zisťovať chemikálie so známou aneugénnou a klastogénnou aktivitou, či 
už s metabolickou aktiváciou, alebo bez nej, ako aj známe negatívne chemikálie pomocou referen čných chemikálií uvedených v dodatku 3. 
Ako dôkaz schopnosti správne vykona ť túto testovaciu metódu by labora ­
tórium malo poskytnú ť dôkaz, že bunky, v ktorých sa hodnotí tvorba 
mikrojadra, ukon čili jedno jadrové delenie, ak sa test vykonáva bez 
použitia cytoB. 
55. Chemikálie uvedené v dodatku 3 sa odporú čajú na použitie ako referen čné 
chemikálie. Náhradné alebo dopl ňujúce chemikálie možno zahrnú ť, ak je 
ich aktivita známa, ak vytvárajú mikrojadrá rovnakými mechanizmami pôsobenia a ak sa ukážu ako relevantné v porovnaní s chemikáliami, 
ktoré sa budú testova ť postupom MNvit. Odôvodnenie by mohlo zah ŕňať 
validačnú štúdiu, ktorá zapája ve ľké množstvo látok alebo sa sústredí na 
užšie spektrum založené na štúdii chemickej triedy testovanej látky alebo mechanizmu poškodenia. 
56. Kontrolné kultúry s rozpúš ťadlom/nosi čom a neošetrené kultúry by mali 
mať z hľadiska reprodukovate ľnosti a konzistentnosti nízke frekvencie 
mikrojadier (zvy čajne 5 – 25 mikrojadier/1 000 buniek, ktoré patria do 
druhov buniek uvedených v odseku 11). Ostatné druhy buniek môžu 
mať rôzny rozsah odoziev, čo by sa malo ur čiť pri validácii ich vhodnosti 
na použitie v skúške MNvit. Údaje z negatívnej kontroly, kontroly s rozpúšťadlom a z pozitívnej kontroly by sa mali použi ť na stanovenie 
historických kontrolných rozsahov. Tieto hodnoty by sa mali použi ť pri 
rozhodovaní o primeranosti súbežnej pozitívnej/negatívnej kontroly 
v pokuse.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Ak sa navrhnú menšie zmeny protokolu skúšky (napr. použitie automatic ­
kých namiesto manuálnych techník hodnotenia či použitie nového druhu 
bunky), je potrebné preukáza ť účinnosť zmeny skôr, ako takto upravený 
protokol možno považova ť za prijate ľný na použitie. Preukázanie ú činnosti 
zahŕňa preukázanie schopnosti zis ťovať hlavné mechanizmy chromozómo ­
vého zlomu, nadbytku alebo straty a dosiahnu ť vhodné pozitívne 
a negatívne výsledky pre triedu jednotlivej látky alebo pre celý rad látok, ktoré sa majú testova ť.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
58. Ak sa použije metóda blokovania cytokinézy, pri hodnotení indukcie 
mikrojadier sa používajú iba frekvencie dvojjadrových buniek 
s mikrojadrami (bez oh ľadu na po čet mikrojadier v bunke). Hodnotenie 
počtu buniek s jedným mikrojadrom, s dvoma alebo viacerými mikroja ­
drami by mohlo poskytnú ť užitočné informácie, ale nie je povinné. 
59. Mali by sa ur čiť súbežné opatrenia v súvislosti s cytotoxicitou a/alebo 
cytostázou pre všetky ošetrené kultúry a kontrolné kultúry s rozpúšťadlom/nosi čom (58). Pri všetkých ošetrených a kontrolných 
kultúrach by sa mali vypo čítať indexy CBPI alebo RI, ktoré merajú 
oneskorenie bunkového cyklu pri použití metódy blokovania cytokinézy. 
V prípade, že sa nepoužíva cytoB, mali by sa použi ť RDP alebo RICC, 
alebo index PI (pozri dodatok 2). 
60. Mali by sa uvádza ť údaje o jednotlivých kultúrach. Okrem toho by sa 
všetky údaje mali uvádza ť v tabuľkovej podobe. 
61. Chemikálie, ktoré indukujú mikrojadrá v skúške MNvit, tak môžu urobi ť, 
pretože indukujú chromozómový zlom, stratu chromozómu alebo ich kombináciu. Ďalšiu analýzu, ktorá využíva protilátky kinetochoru, sondy  
in situ  špecifické pre centroméry alebo iné metódy, možno použi ť na 
určenie toho, či mechanizmus indukcie mikrojadra je následkom klasto ­
génnej a/alebo aneugénnej aktivity.
 
Vyhodnocovanie a interpretácia výsledkov  
62. Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej 
odozvy ďalším testovaním. Nejasné výsledky možno objasni ť analýzou 
ďalších 1 000 buniek zo všetkých kultúr s cie ľom zabráni ť strate slepých 
testov. Ak sa týmto prístupom výsledok neobjasní, treba vykona ť ďalšie 
testy. Modifikácia parametrov štúdie z dôvodu rozšírenia alebo zúženia rozsahu podmienok by sa mala zváži ť pri následných pokusoch, ak je to 
vhodné. Parametre štúdie, ktoré by sa mohli modifikova ť, zahŕňajú odstup 
medzi testovanými koncentráciami, na časovanie ošetrenia a zber buniek 
a/alebo podmienky metabolickej aktivácie. 
63. Na stanovenie pozitívneho výsledku existuje nieko ľko kritérií, ako 
napríklad nárast súvisiaci s koncentráciou alebo štatisticky významné zvýšenie po čtu buniek obsahujúcich mikrojadrá. Najskôr sa zvažuje biolo ­
gická relevantnos ť výsledkov. Zváženie toho, či pozorované hodnoty sú 
v rozsahu historickej kontroly alebo mimo neho, môže poskytnú ť usmer­
nenie pri hodnotení biologického významu odozvy. Ako pomôcky pri hodnotení výsledkov testov možno používa ť primerané štatistické metódy 
(65). Výsledky štatistických testov by sa však mali hodnoti ť vzhľadom na 
vzťah medzi dávkou a odozvou. Mala by sa zoh ľadniť aj reprodukovate ľ­
nosť a historické údaje.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Hoci vä čšina pokusov poskytne jasne pozitívne alebo negatívne výsledky, 
v niektorých prípadoch súbor údajov vopred vylú či jednozna čné posúdenie 
aktivity testovanej látky. Tieto nejasné alebo spochybnite ľné odozvy môžu 
nastať bez ohľadu na po čet opakovaní pokusu. 
65. Pozitívne výsledky skúšky MNvit nazna čujú, že testovaná látka vyvoláva 
chromozómový zlom alebo stratu chromozómu v kultivovaných bunkách cicavcov. Negatívne výsledky nazna čujú, že testovaná látka nevyvoláva 
v testovacích podmienkach chromozómové zlomy a/ani ich nadbytok či 
stratu v kultivovaných bunkách cicavcov.
 
Správa o teste  
66. Správa o teste by mala obsahova ť aspoň tieto informácie, ak sú relevantné 
pre uskuto čnenie štúdie:  
Testovaná chemikália:  
— identifika čné údaje a registra čné číslo CAS (Chemical Abstract Servi ­
ces) a číslo EC, 
— fyzikálna povaha a čistota, 
— fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné pre uskuto čnenie štúdie, 
— reaktivita testovanej chemikálie v kultiva čnom médiu 
s rozpúšťadlom/nosi čom alebo v bunkovom kultiva čnom médiu.  
Rozpúšťadlo/nosič: 
— zdôvodnenie výberu rozpúš ťadla/nosiča, 
— rozpustnos ť a stabilita testovanej látky v rozpúš ťadle/nosiči. 
Bunky:  
— typ a zdroj použitých buniek, 
— vhodnos ť použitého typu bunky, 
— neprítomnos ť mykoplazmy, ak je to vhodné, 
— informácie o d ĺžke bunkového cyklu, násobení času alebo prolife ­
račnom indexe, 
— pri použití lymfocytov pohlavie, vek a po čet darcov krvi, ak je to 
vhodné, 
— pri použití lymfocytov informácia o tom, či je vystavená celá krv, 
alebo oddelené lymfocyty, 
— počet prechodov, ak je to vhodné, 
— metódy udržiavania bunkových kultúr, ak je to vhodné, — modálny po čet chromozómov, 
— trvanie bežného bunkového cyklu (negatívna kontrola).  
Podmienky testovania:  
— identita látky blokujúcej cytokinézu (napr. cytoB), ak je použitá, jej 
koncentrácia a trvanie expozície bunky, 
— zdôvodnenie výberu koncentrácií a po č
tu kultúr vrátane údajov 
o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti, ak sú dostupné, 
— skladba média, koncentrácia CO  2 , ak je to vhodné, 
— koncentrácie testovanej látky,  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— koncentrácia (a/alebo objem) nosi ča a pridanej testovanej látky, 
— inkuba čná teplota a inkuba čná doba, 
— trvanie ošetrenia, 
— čas zberu po ošetrení, 
— hustota buniek pri zapustení, ak je to vhodné, — typ a zloženie systému metabolickej aktivácie vrátane kritérií prijate ľ­
nosti, 
— chemikálie na pozitívne kontroly a negatívne kontroly, 
— použité metódy prípravy sklí čok a metóda farbenia, 
— kritériá na identifikáciu mikrojadier, 
— počet analyzovaných buniek, 
— metódy merania cytoxicity, — všetky dopl ňujúce informácie týkajúce sa cytotoxicity, 
— kritériá hodnotenia štúdií ako pozitívnych, negatívnych alebo nejas ­
ných, 
— metóda(-y) použitej štatistickej analýzy, 
— metódy, ako napríklad použitie protilátky kinetochoru s cie ľom charak ­
terizovať, či mikrojadrá obsahujú celé chromozómy, alebo fragmenty 
chromozómov, ak je to vhodné.  
Výsledky:  
— meranie použitej cytotoxicity, napr. CBPI alebo RI, v prípade použitia 
metódy blokovania cytokinézy, RICC, RPD alebo PI, ke ď sa metódy 
blokovania cytokinézy nepoužívajú, ďalšie pozorovania, ak je to 
vhodné, napr. zhluk buniek, apoptóza, nekróza, po čítanie metafáz, 
frekvencia dvojjadrových buniek, 
— príznaky zrážania, 
— údaje o hodnotách pH a osmolality ošetrovacieho média, ak sú stano ­
vené, 
— definovanie buniek prijate ľných na analýzu, 
— distribúcia jednojadrových, dvojjadrových a viacjadrových buniek pri 
použití metódy blokovania cytokinézy, 
— počet buniek s mikrojadrami uvedený oddelene pre každú ošetrenú 
a kontrolnú kultúru a stanovenie, či pochádzajú z dvojjadrových, 
alebo jednojadrových buniek, ak je to potrebné, 
— vzťah medzi koncentráciou a odozvou, ak ho možno ur čiť, 
— údaje o chemikáliách na súbežné negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) 
a pozitívne kontroly (koncentrácie a rozpúš ťadlá), 
— historické údaje o chemikáliách na negatívne (rozpúš ťadlo/nosič) 
a pozitívne kontroly obsahujúce rozsahy, stredné hodnoty 
a štandardnú odchýlku a stupe ň spoľahlivosti (napr. 95 %), 
— štatistická analýza, p-hodnoty, ak existujú.  
Rozbor výsledkov 
Závery
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LITERATÚRA 
1. Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1 – 4. 
2. Parry, J. M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3 – 15. 
3. Fenech, M. and Morley, A. A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233 – 246. 
4. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen. , 35, 167 – 172. 
5. Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084 – 1104. 
6. Fenech, M. and Morley, A. A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193 – 198. 
7. Eastmond, D. A. and Tucker, J. D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes 
and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34 – 43. 
8. Eastmond, D. A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  
in-situ  hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation 
Res., 234, 9 – 20. 
9. Miller, B. M., Zitzelsberger, H. F., Weier, H. U. and Adler, I. D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent stai ­
ning using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with bioti ­
nylated gamma satellite DNA,  Mutagenesi. , 6, 297 – 302. 
10. Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A. T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesi. , 8, 329 – 334. 
11. Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with 
a centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205 – 213. 
12. Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by anti ­
kinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesi. , 8, 519 – 525. 
13. Eastmond, D. A, Rupa, D. S. and Hasegawa, L. S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluo ­
rescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 9 – 20. 
14. Marshall, R. R., Murphy, M., Kirkland, D. J. and Bentley, K. S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centro ­
meric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233 – 245. 
15. Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 372, 
211 – 219. 
16. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153 – 163.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
17. OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Tes. , Test 
Guideline No 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. K dispozícii na stránke: [www.oecd.org/env/testguidelines]. 
18. Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M. J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  
Mutation Res. , 607, 13 – 36. 
19. Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L. C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37 – 60. 
20. Aardema, M. J., Snyder, R. D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R. 
J., Gibson, D. P., Soelter, S., Curry, P. T., Thybaud, V., Lorenzon, G., 
Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 
607, 61 – 87. 
21. Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, 
K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., 
Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88 – 124. 
22. Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125 – 152. 
23. Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A. A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187 – 208. 
24. Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Compa ­
rative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  chromosome 
aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45 – 59. 
25. Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alterna ­
tive to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81 – 116. 
26. Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically 
induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different 
test approaches,  Mutation Res.  439, 183 – 190. 
27. Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S. Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55 – 71. 
28. von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H. G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells – results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res. , 468, 137 – 163. 
29. Garriott, M. L., Phelps, J. B. and Hoffman, W. P. (2002), A protocol for the  
in vitro
 micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 517, 123 – 134. 
30. Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K. F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in 
a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesi. , 14, 569 – 580.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
31. Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International colla ­
borative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1 – 152. 
32. ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to the  
in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25. stretnutie 
ESAC, 16. a 17. novembra 2006. K dispozícii na stránke: [http://ecvam.jrc.it/ index.htm]. 
33. ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. K dispozícii na 
stránke: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
34. Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesi. , 23, 271 – 283. 
35. Zhang, L. S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105 – 115. 
36. Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B
 1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesi. , 17, 257 – 260. 
37. Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W. W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B. J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315 – 328. 
38. Gibson, D. P., Brauninger, R., Shaffi, H. S., Kerckaert, G. A., LeBoeuf, R. 
A., Isfort, R. J. and Aardema, M. J. (1997), Induction of micronuclei in 
Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell trans ­
formation assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation 
Res., 392, 61 – 70. 
39. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147 – 205. 
40. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of 
low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297 – 305. 
41. Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen. , 8, 789 – 886. 
42. Fenech, M. and Morley, A. A. (1985), Measurement of micronuclei in 
lymphocytes,  Mutation Res. , 147, 29 – 36. 
43. Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11 – 18. 
44. Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y. P., Ceppi, M., Chang, W. P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M. P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L. R., Fucic, A., Lima, O. G., Hrelia, P., Krishnaja, A. P., Lee, T. K., Migliore, L., Mikhalevich, L., 
Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W. U., Odagiri, Y., Scarffi, M. R., 
Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman Micro ­
Nucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31 – 45.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
45. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173 – 215. 
46. Ong, T.-M., Mukhtar, M., Wolf, C. R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 4, 
55 – 65. 
47. Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. 
G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- 
induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175 – 177. 
48. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activa ­
tion Systems,  In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. 
(eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, s. 85 – 88. 
49. Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. and Galloway, S. M. (1996), Human 
liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and compa ­
rison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51 – 59. 
50. UNEP (2001), Štokholmský dohovor o perzistentných organických látkach, 
Program OSN pre životné prostredie (UNEP). K dispozícii na stránke: [http://www.pops.int/]. 
51. Doherty, A. T., Ellard, S., Parry, E. M. and Parry, J. M. (1996), An investiga ­
tion into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to geno ­
toxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesi. , 11, 247 – 274. 
52. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT 
Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R. 
R., Costa, D. L. and Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91 – 103. 
53. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evalua ­
tion of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795 – 801. 
54. Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed 
description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35 – 44. 
55. Phelps, J. B., Garriott, M. L., and Hoffman, W. P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 521, 103 – 112. 
56. Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to 
„Report from the  in vitro  micronucleus assay working group“,  Mutation 
Res., 564, 97 – 100. 
57. Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61 – 65. 
58. Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1 – 3. 
59. Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in 
whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169 – 184. 
60. Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191 – 201.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
61. Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241 – 247. 
62. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269 – 275. 
63. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241 – 247. 
64. Fenech, M., Chang, W. P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65 – 75. 
65. Hoffman, W. P., Garriott, M. L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, s. 463 – 467. 
66. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 850/2004 z 29. apríla 
2004 o perzistentných organických zne čisťujúcich látkach, ktorým sa mení 
a dopĺňa smernica 79/117/EHS (Ú. v. EÚ L 229, 30.4.2004, s. 5).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Dodatok 1  
Vymedzenie pojmov  
Aneugén: každá látka alebo proces, ktorý vzájomne pôsobí so zložkami cyklu 
mitotického a meiotického delenia buniek, a tým vedie k aneuploidii v bunkách alebo organizmoch. 
Aneuploidia: akáko ľvek odchýlka od bežného diploidného (alebo haploidného) 
počtu chromozómov vo forme jedného alebo viacerých chromozómov, ktoré 
netvoria celý(-é) súbor(-y) chromozómov (polyploidia). 
Apoptóza: programovaná bunková smr ť charakterizovaná sériou krokov, ktoré 
vedú k rozpadu buniek na častice spojené membránou, ktoré sú následne 
pohltené fagocytózou alebo uvo ľnené. 
Proliferácia buniek: zvýšenie po čtu buniek v dôsledku mitotického delenia 
bunky. 
Centroméra: oblas ť chromozómu DNA, kde sa spájajú obe chromatídy a kde sú 
vedľa seba viazané oba kinetochory. 
Klastogén: akáko ľvek látka alebo proces, ktoré spôsobujú štrukturálne chromo ­
zómové odchýlky v populáciách buniek alebo organizmov. 
Cytokinéza: proces delenia bunky, ktorý nasleduje ihne ď po mitóze a v ktorom 
vznikajú dve dcérske bunky – každá s jedným jadrom. 
Proliferačný index blokovania cytokinézy (CBPI): pomer druhého delenia buniek 
v ošetrenej populácii vo vz ťahu k neošetrenej kontrole (pozri vzorec v dodatku 2). 
Cytostáza: inhibícia rastu buniek (pozri vzorec v dodatku 2). Cytotoxicita: škodlivé ú činky na štruktúru alebo funkciu bunky, ktoré postupne 
spôsobia jej smr ť. 
Genotoxický: všeobecný výraz, ktorý zah ŕňa všetky typy poškodenia DNA alebo 
chromozómov vrátane zlomov, aduktov, zmien usporiadania, mutácií, chromozó ­
mových odchýlok a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických ú činkov majú za 
následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómu. 
Bunky v interfáze: bunky, ktoré nie sú v štádiu mitotického delenia. Kinetochor: štruktúra obsahujúca bielkoviny, ktorá sa zhromaž ďuje na centro ­
mére chromozómu, na ktorú sa po čas delenia buniek viažu vlákna deliaceho 
vretienka umož ňujúce riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych 
buniek. 
Mikrojadrá: samostatné malé jadrá dopl ňujúce hlavné jadrá buniek, ktoré sa 
vytvárajú po čas telofázy mitózy alebo meiózy zo zaostávajúcich chromozómo ­
vých fragmentov alebo celých chromozómov. 
Mitóza: rozdelenie bunkového jadra, ktoré sa zvy čajne delí na profázu, prome ­
tafázu, metafázu, anafázu a telofázu. 
Mitotický index: pomer buniek v metafáze delený celkovým po čtom buniek 
pozorovaných v populácii buniek; náznak stup ňa proliferácie buniek tejto popu ­
lácie. 
Mutagénny: produkujúci dedi čnú zmenu série(-í) bázových párov DNA v génoch 
alebo štruktúry chromozómov (chromozómové odchýlky).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nerozpojenie: chyba pri rozde ľovaní spárovaných chromatíd, ktorá spôsobí, že 
vznikajúce dcérske bunky sa riadne neoddelia, následkom čoho vznikajú dcérske 
bunky s abnormálnym po čtom chromozómov. 
Polyploidia: po četné chromozómové odchýlky v bunkách alebo organizmoch, 
ktoré zah ŕňajú celý(-é) súbor(-y) chromozómov na rozdiel od jednotlivého chro ­
mozómu alebo chromozómov (aneuploidia). 
Proliferačný index (PI): metóda merania cytotoxicity, pri ktorej sa nepoužíva 
cytoB (pozri vzorec v dodatku 2). 
Relatívne zvýšenie po čtu buniek (RICC): metóda merania cytotoxicity, pri ktorej 
sa nepoužíva cytoB (pozri vzorec v dodatku 2). 
Relatívne zdvojenie populácie (RPD): metóda merania cytotoxicity, pri ktorej sa 
nepoužíva cytoB (pozri vzorec v dodatku 2). 
Index replikácie (RI): pomer cyklov delenia buniek, ktoré boli dokon čené 
v ošetrenej kultúre, vo vz ťahu k neošetrenej kontrole po čas obdobia expozície 
a regenerácie (pozri vzorec v dodatku 2). 
Testovaná chemikália (tiež sa nazýva testovaná látka): Akáko ľvek látka alebo 
zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Dodatok 2  
Vzorce na hodnotenie cytotoxicity  
1. Pri použití cytoB  by hodnotenie cytotoxicity malo by ť založené na prolife ­
račnom indexe blokovania cytokinézy (CBPI) alebo na indexe replikácie (RI) 
(16) (58). CBPI nazna čuje priemerný po čet bunkových cyklov na bunku po čas 
obdobia expozície cytoB a môže sa použi ť na výpo čet proliferácie buniek. RI 
indikuje relatívny po čet jadier v ošetrených kultúrach v porovnaní s kontrolnými 
kultúrami a možno ho použi ť na percentuálny výpo čet cytostázy: 
Cytostáza % = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)} 
pričom: 
T = kultúra ošetrená testovanou chemikáliou C = kontrolná kultúra s nosi čom, 
kde: 
CBPI ¼ ððpočet jednojadrových buniek Þ þ
 
ð2 Ü počet dvojjadrových buniek Þ þ ð3 Ü počet viacjadrových buniek ÞÞ 
ðcelkový po četbuniekÞ 
Preto ak CBPI je 1 (všetky bunky sú jednojadrové), rovná sa 100 % cytostáze. 
Cytostáza = 100 – RI 
RI ¼ ððpočet dvojjadrových buniek Þ þ ð2 Ü počet viacjadrových buniek ÞÞ ö ðcelkový po čet buniekÞ T 
ððpočet dvojjadrových buniek Þ þ ð2 Ü počet viacjadrových buniek ÞÞ ö ðcelkový po čet buniekÞ C Ü 100 
T = ošetrené kultúry 
C = kontrolné kultúry. 2. Preto ak RI je 53 %, znamená to, že v porovnaní s po čtom buniek, ktorých 
delením vznikli dvojjadrové a viacjadrové bunky v kontrolnej kultúre, len 53 % tohto počtu sa delilo v ošetrenej kultúre, t. j. cytostáza je 47 %. 
3. Bez použitia cytoB  sa odporú ča hodnotenie cytotoxicity založené na rela ­
tívnom zvýšení po čtu buniek (RICC) alebo na relatívnom zdvojení 
populácie (RPD) (58), pretože v obidvoch prípadoch sa zoh ľadňuje pomer popu ­
lácie delených buniek. 
RICC ¼
 ðzvýšenie po čtu buniek v ošetrených kultúrach  ðkonečné – počiatočnééÞÞ 
ðzvýšenie po čtu buniek v kontrolných kultúrach  ðkonečné – počiatočnééÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðpočet zdvojených populácií v ošetrených kultúrach Þ 
ðpočet zdvojených populácií v kontrolných kultúrach Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
kde: 
Zdvojenie populácie = [log (po čet buniek po ošetrení ÷ po čiatočný počet 
buniek)] ÷ log 2. 
4. Preto 53 % RICC alebo RDP indikuje 47 % cytotoxicitu/cytostázu. 5. Pri použití indexu proliferácie (PI) môže by ť cytotoxicita hodnotená 
pomocou po čítania počtu klonov obsahujúcich jednu bunku (cl1), 2 bunky (cl2), 
3 až 4 bunky (cl4) a 5 až 8 buniek (cl8) 
PI ¼
 ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI sa používa ako hodnotný a spo ľahlivý parameter cytotoxicity aj pri bunko ­
vých líniách kultivovaných  in situ  bez použitia cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Dodatok 3  
Referenčné chemikálie odporú čané na hodnotenie výkonnosti  ( 1 ) 
Kategória Chemikália Číslo CAS Číslo EC  
1. Klastogény aktívne bez metabolickej aktivácie 
cytozín arabinozid 147-94-4 205-705-9 mitomycín C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogény vyžadujúce metabolickú aktiváciu 
benzo(a)pyrén 50-32-8 200-028-5 
cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugény 
kolchicín 64-86-8 200-598-5 vinblastín 143-67-9 205-606-0 
4. Negatívne látky 
di(2-etylhexyl)ftalát 117-81-7 204-211-0 
kyselina nalidixová 389-08-2 206-864-7 pyrén 129-00-0 204-927-3 chlorid sodný 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Referen čné chemikálie sú odporú čané chemikálie na použitie. Nahradi ť alebo doplni ť chemikálie do zoznamu referen čných 
chemikálií možno v prípade, ak je ich aktivita známa, ak indukujú mikrojadrá rovnakými mechanizmami pôsobenia a ak sa 
ukážu ako relevantné v porovnaní s chemikáliami, ktoré sa budú testova ť postupom MNvit. Odôvodnenie by v závislosti od 
účelu mohlo zah ŕňať validačnú štúdiu, ktorá zapája ve ľké množstvo látok alebo sa sústredí na užšie spektrum založené na štúdii 
chemickej triedy testovanej látky alebo mechanizmu poškodenia.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 730
B. 50.  SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN: DA  
ÚVOD 
1. Usmernenia Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) na 
testovanie chemikálií a testovacie metódy EÚ sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regula čných potrieb a dobré životné 
podmienky zvierat. Prvá testovacia metóda (TM) (B.42) na stanovenie 
senzibilizácie kože u myší, tzv. lokálna skúška lymfatických uzlín (LLNA; usmernenie OECD na vykonávanie testov 429), bola zrevidovaná (1). Podrobnosti validácie LLNA a revízia prác v tejto oblasti boli uverejnené 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Pri LLNA sa na meranie proliferácie lymfo ­
cytov používa rádioizotopický tymidín alebo jód, a preto má táto skúška obmedzené použitie v tých prípadoch, kde je problematické získavanie, použitie alebo likvidácia rádioaktívnych látok. LLNA: DA (vyvinutá 
spoločnosťou Daicel Chemical Industries, Ltd.) je nerádioaktívnou modi ­
fikáciou LLNA, ktorá kvantifikuje obsah adenozín-trifosfátu (ATP) prostredníctvom bioluminiscencie, ktorá je ukazovate ľom proliferácie 
lymfocytov. LLNA: Testovacia metóda DA bola validovaná 
a zrevidovaná a odporú ča ju medzinárodný panel pre partnerské preskú ­
manie ako užito čnú metódu na identifikáciu chemikálií spôsobujúcich 
alebo nespôsobujúcich senzibilizáciu kože s ur čitými obmedzeniami (10) 
(11) (12) (13). Táto testovacia metóda je vytvorená na posúdenie poten ­
ciálu chemikálií (látok a zmesí) spôsobi ť senzibilizáciu kože u zvierat. 
Metóda opísaná v kapitole B.6 tejto prílohy a usmernení OECD na vyko ­
návanie testov 406 využíva testy s mor čatami, konkrétne maximaliza čný 
test morčiat a Buehlerov test (14). LLNA (kapitola B.42 tejto prílohy; 
usmernenie OECD na vykonávanie testov 429) a dve nerádioaktívne modi ­
fikácie LLNA: DA (kapitola B.50 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykonávanie testov 442 A) a LLNA: BrdU-ELISA (kapitola B.51 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykonávanie testov 442 B) poskytujú 
výhodu v porovnaní s testami na mor čatách opísanými v kapitole B.6 
a usmernení OECD na vykonávanie testov 406 (14), a to pokia ľ ide 
o obmedzenie a zdokonalenie využívania zvierat. 
2. Podobne ako LLNA, LNNA: DA skúma induk čnú fázu senzibilizácie kože 
a poskytuje kvantitatívne údaje vhodné na posúdenie odozvy na dávku. Okrem toho schopnos ť identifikova ť látky spôsobujúce senzibilizáciu kože 
bez potreby používania rádioaktívneho zna čenia DNA znižuje potenciál 
expozície rádioaktivite pri práci a problémy v súvislosti s likvidáciou 
odpadu. To môže následne umožni ť zvýšené využívanie myší na identifi ­
káciu látok spôsobujúcich senzibilizáciu kože, čo by ďalej mohlo zníži ť 
využívanie mor čiat na testovanie potenciálu senzibilizácie kože (t. j. B.6; 
usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (14).
 
VYMEDZENIE POJMOV 
3. Použité definície sú uvedené v dodatku 1.  
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
4. LLNA: DA je upravenou metódou LLNA na identifikáciu potenciálu 
chemikálií spôsobi ť senzibilizáciu kože, ktorá má ur čité obmedzenia. 
Neznamená to nevyhnutne, že vo všetkých prípadoch sa má použi ť 
LLNA: DA namiesto testu LLNA alebo testov s mor čatami (t. j. metóda 
B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (14), ale skôr to, že 
táto skúška je rovnako hodnotná a môže sa použi ť ako alternatíva, v ktorej 
pozitívne a negatívne výsledky vo všeobecnosti nevyžadujú ďalšie 
potvrdenie (10) (11). Testovacie laboratórium by malo posúdi ť všetky 
dostupné informácie o testovanej látke pred uskuto čnením štúdie. Takéto 
informácie budú obsahova ť identitu a chemickú štruktúru testovanej látky,  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných  in vitro  
alebo  in vivo  testov toxicity s testovanou látkou a toxikologické údaje 
o štruktúrne príbuzných chemikáliách. Tieto informácie treba vzia ť do 
úvahy pri ur čovaní, či LLNA: DA je pre testovanú látku vhodná 
[vzhľadom na nezlu čiteľnosť obmedzených druhov chemikálií s LLNA: 
DA (pozri odsek 5)], a ako pomoc pri výbere dávok. 
5. LLNA: DA je metóda  in vivo , a to znamená, že pri hodnotení aktivity 
alergickej kontaktnej senzibilizácie sa nevylu čuje používanie zvierat. Má 
však potenciál obmedzi ť používanie zvierat na tento ú čel pri porovnaní 
s testami na mor čatách (B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 
406) (14). Okrem toho LLNA: DA ponúka zna čné zjemnenie spôsobu, 
akým sa zvieratá používajú na testy alergickej kontaktnej senzibilizácie 
(znižuje boles ť a utrpenie zvierat), ke ďže na rozdiel od metódy B.6 
a usmernenia OECD na vykonávanie testov 406 LLNA: DA nevyžaduje, aby sa vyvolali reakcie dermálnej hypersenzitivity. Napriek výhodám, ktoré má LLNA: DA v porovnaní s metódou B.6 a usmernením OECD 
na vykonávanie testov 406 (14), existujú ur čité obmedzenia, ktoré by si 
mohli vyžadova ť použiť metódu B.6 alebo usmernenie OECD na vykoná ­
vanie testov 406 [napr. testovanie ur čitých kovov, falošné pozitívne 
zistenia s ur čitými kožnými dráždivými látkami (ako napríklad niektoré 
povrchovo aktívne látky) (6) (1 a kapitola B.42 tejto prílohy), rozpustnos ť 
testovanej látky]. Okrem toho chemické triedy alebo látky, ktoré obsahujú potenciálne zmäto čné funkčné skupiny (16), si tiež môžu vyžadova ť 
použitie testov s mor čatami [t. j. B.6, usmernenie OECD na vykonávanie 
testov 406 (14)]. Obmedzenia, ktoré boli identifikované pre LLNA (1 a kapitola B.42 tejto prílohy), sa odporú čajú aj pre LLNA: DA (10). 
Okrem toho použitie LLNA: DA nemusí by ť vhodné na testovanie látok, 
ktoré ovplyv ňujú úrovne ATP (napr. látky, ktoré fungujú ako inhibítory 
ATP), alebo látok, ktoré ovplyv ňujú presné meranie vnútrobunkového 
ATP (napr. prítomnos ť enzýmov spôsobujúcich degradáciu ATP, prítom ­
nosť ATP v mimobunkovom priestore lymfatickej uzliny). Okrem takto 
identifikovaných obmedzení by sa LLNA: DA mala uplat ňovať pri testo
­
vaní všetkých látok okrem prípadov, ke ď tieto látky majú vlastnosti, ktoré 
by mohli narúša ť presnosť LLNA: DA. Okrem toho by sa mala zváži ť 
možnosť hraničných pozitívnych výsledkov v prípade, ke ď sa dosiahnu 
hodnoty stimula čného indexu (SI) od 1,8 do 2,5 (pozri odseky 31 a 32). 
To je založené na valida čnej databáze 44 látok s použitím SI ≥ 1,8 (pozri 
odsek 6), pre ktoré LLNA: DA správne identifikovala 32 látok spôsobu ­
júcich senzibilizáciu pod ľa LLNA, ale nesprávne identifikovala tri z 12 
látok nespôsobujúcich senzibilizáciu pod ľa LLNA s hodnotami SI od 1,8 
do 2,5 (t. j. hrani čný pozitívny výsledok) (10). Ke ďže sa však na stano ­
venie hodnôt SI a výpo čet predpokladaných vlastností testu použil rovnaký 
súbor údajov, stanovené údaje môžu by ť nadhodnotením skuto čných pred ­
iktívnych vlastností.  
PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
6. Základným princípom, na ktorom sa LLNA: DA zakladá, je, že senzibili ­
zátory vyvolávajú proliferáciu lymfocytov v lymfatickej uzline 
v drénovanom mieste aplikácie testovanej látky. Táto proliferácia je úmerná dávke a ú činnosti aplikovaného alergénu a poskytuje jednoduchý 
prostriedok na získanie kvantitatívneho merania senzibilizácie. Proliferácia 
sa meria porovnávaním priemeru proliferácie v každej pokusnej skupine 
s priemerom proliferácie v kontrolnej skupine, ktorej sa podáva nosič (VC). Ur čí sa pomer priemernej proliferácie v každej ošetrenej 
skupine a priemernej proliferácie v súbežnej kontrolnej skupine 
s nosičom, ktorý sa ozna čuje ako stimula čný index (SI) a mal by ma ť 
hodnotu ≥ 1,8 pred ďalším prípadným vyhodnotením testovanej látky ako
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
potenciálneho senzibilizátora kože. Uvedené metódy sú založené na 
meraní obsahu ATP pomocou bioluminiscencie (ktoré koreluje s po čtom 
živých buniek) (17) na preukázanie proliferácie zvýšeného po čtu buniek 
v drénovaných ušných lymfatických uzlinách (18) (19). Metóda biolumi ­
niscencie využíva enzým luciferáza na katalýzu tvorby svetla z ATP 
a luciferínu pod ľa tejto reakcie:  
ATP + luciferin  + O 2
 oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + 
svetlo  
Intenzita vyžarovaného svetla priamo súvisí s koncentráciou ATP a meria 
sa pomocou luminometra. Skúška luciferínu – luciferázy je citlivá metóda 
kvantifikácie ATP, ktorá sa používa v mnohých rôznych aplikáciách (20).  
OPIS SKÚŠKY  
Výber druhov zvierat  
7. Vybraným druhom pre tento test je myš. Valida čné štúdie LLNA: DA sa 
vykonávali výlu čne s myšami kme ňa CBA/J, ktorý sa preto považuje za 
preferovaný kme ň (12) (13). Použijú sa mladé dospelé negravidné samice 
myši, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá. Na za čiatku štúdie by zvieratá mali by ť 
vo veku 8 – 12 týžd ňov a rozdiel medzi hmotnos ťami zvierat má by ť 
minimálny a nemá by ť vyšší ako 20 % priemernej hmotnosti. Alternatívne 
sa môžu použi ť iné kmene a samce, ak sa na základe údajov dá uspoko ­
jivo dokáza ť, že neexistujú významné odlišnosti špecifické pre kme ň 
a/alebo pohlavie v odozve na LLNA: DA.  
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
8. Myši by sa mali umiestni ť v skupinách (21), pokia ľ sa neposkytne prime ­
rané vedecké odôvodnenie ich umiestnenia jednotlivo. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 ± 3 °C. Aj ke ď relatívna vlhkos ť by 
mala byť aspoň 30 % a pokia ľ možno by nemala prevyšova ť 70 % okrem 
obdobia po čas čistenia miestnosti, cie ľom je, aby relatívna vlhkos ť dosa­
hovala 50 % – 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 
12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže používa ť bežné 
laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.
 
Príprava zvierat  
9. Zvieratá sa vyberú náhodne a sú ozna čené tak, aby sa umožnila jednotlivá 
identifikácia (ale nie formou ušných zna čiek), a držia sa v klietkach aspo ň 
5 dní pred za čiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na labora ­
tórne podmienky. Pred za čatím ošetrenia sa všetky zvieratá vyšetria, aby 
sa zaistilo, že nemajú žiadne vidite ľné kožné poranenia.  
Príprava dávok  
10. Chemikálie v tuhom skupenstve by sa pred podaním dávky do ucha myši 
mali rozpusti ť alebo suspendova ť v rozpúš ťadlách alebo nosi čoch, a ak je 
to vhodné, rozriedi ť. Kvapalné chemikálie možno podáva ť priamo alebo 
pred podaním rozriedi ť. V prípade nerozpustných chemikálií, ako 
napríklad tých, ktoré sa vo všeobecnosti používajú ako zdravotnícke 
pomôcky, by sa pred podaním dávky do ucha myši mala uskuto čniť 
zvýšená extrakcia vo vhodnom rozpúš ťadle, aby sa odhalili všetky extra ­
hovateľné zložky, ktoré sa budú testova ť. Testované látky sa pripravujú 
každý de ň okrem prípadu, ke ď údaje o stabilite preukazujú prijate ľnosť 
uskladnenia.  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Kontrola spo ľahlivosti  
11. Riadne vykonanie skúšky sa dokazuje pomocou chemikálií na pozitívne 
kontroly (PC), ktoré reagujú primeranou a reprodukovate ľnou citlivos ťou 
na senzibilizujúcu testovanú látku, pre ktorú je dobre charakterizovaná šírka odozvy. Odporú ča sa zahrnú ť súbežnú pozitívnu kontrolu, pretože 
to dokazuje kompetenciu laboratória úspešne vykona ť každú skúšku 
a umožňuje posúdenie vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reproduko ­
vateľnosti a porovnate ľnosti. Pozitívnu kontrolu v každej štúdii vyžadujú 
aj niektoré regula čné orgány, a preto by používatelia mali pred vykonaním 
LLNA: DA konzultova ť s príslušnými orgánmi. Rutinné použitie súbežnej 
pozitívnej kontroly sa podporuje aj preto, aby sa predišlo potrebe ďalšieho 
testovania na zvieratách, s cie ľom splniť také požiadavky, ktoré by mohli 
vyplynúť z použitia periodickej pozitívnej kontroly (pozri odsek 12). Pozi ­
tívna kontrola by mala spôsobi ť pozitívnu odozvu na LLNA: DA pri 
úrovni expozície, pri ktorej sa o čakáva nárast stimula čného indexu (SI) 
> 1,8 v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Dávka chemickej látky na pozitívnu kontrolu by sa mala zvoli ť tak, aby nespôsobila 
nadmerné podráždenie kože ani systémovú toxicitu a aby indukcia bola 
reprodukovate ľná, ale nie nadmerná (napr. SI > 10 by bol nadmerný). 
Vhodnými chemikáliami na pozitívnu kontrolu sú 25 % 3-fenyl-2-hexyl ­
propanál ( číslo CAS 101-86-0) a 25 % eugenol ( číslo CAS 97-53-0) 
v acetóne: olivový olej (4: 1, objemové percentá). Môžu sa vyskytnú ť 
okolnosti, ke ď sa v riadne zdôvodnených prípadoch môžu použi ť iné 
pozitívne kontroly, ktoré sp ĺňajú uvedené kritériá. 
12. Hoci sa odporú ča súbežná pozitívna kontrolná skupina, môžu sa vyskytnú ť 
situácie, ke ď môže by ť vhodné periodické testovanie (t. j. v intervaloch 
najviac 6 mesiacov) pozitívnych kontrol v prípade tých laboratórií, ktoré vykonávajú LLNA: DA pravidelne (t. j. LLNA: DA vykonávajú 
v priebehu jedného mesiaca aspo ň raz) a ktoré majú zavedenú historickú 
databázu pozitívnych kontrol, ktorá preukazuje schopnos ť laboratória dosa ­
hovať reprodukovate ľ
né a presné výsledky s pozitívnymi kontrolami. 
Primeranú odbornos ť s použitím LLNA: DA možno úspešne preukáza ť 
dosiahnutím konzistentných pozitívnych výsledkov s pozitívnou kontrolou 
najmenej v 10 nezávislých testoch uskuto čnených v ur čitom primeranom 
období (t. j. v období kratšom ako jeden rok). 
13. Súbežná pozitívna kontrolná skupina by sa mala zahrnú ť vždy, ke ď dôjde 
k procedurálnej zmene v súvislosti s LLNA: DA (napr. k zmene vyško ­
leného personálu, zmene materiálov a/alebo reagentov používaných pri 
testovacej metóde, zmene nástrojov používaných pri testovacej metóde, 
zmene zdroja testovaných zvierat), a takéto zmeny je potrebné zaznamena ť 
v laboratórnych správach. Je potrebné zváži ť vplyv týchto zmien na prime ­
ranosť predtým zriadenej historickej databázy pri ur čovaní potreby zria ­
denia novej historickej databázy na zaznamenávanie konzistentnosti 
výsledkov pozitívnej kontroly. 
14. Výskumní pracovníci by si mali uvedomi ť, že rozhodnutie vykona ť štúdiu 
pozitívnych kontrol na periodickom základe namiesto súbežných pozitív ­
nych kontrol môže ma ť následky na primeranos ť a prijateľnosť výsledkov 
negatívnej štúdie získaných bez súbežnej pozitívnej kontroly po čas inter­
valu medzi každou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly. Ak sa 
dosiahne napríklad falošný negatívny výsledok v periodickej štúdii pozi ­
tívnej kontroly, negatívne výsledky získané s testovanou látkou v intervale medzi poslednou prijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly 
a neprijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly možno spochyb ­
niť. Dôsledky týchto výsledkov treba dôkladne zváži ť pri určovaní toho, či 
vykonať súbežné pozitívne kontroly alebo iba periodické pozitívne 
kontroly. Treba tiež zváži ť použitie menšieho po čtu zvierat v súbežnej 
pozitívnej kontrolnej skupine, ak je to vedecky odôvodnené a ak labora ­
tórium na základe konkrétnych laboratórnych historických údajov 
preukáže, že možno použi ť menší po čet myší (22).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Aj ke ď by sa pozitívna kontrola mala testova ť v nosiči, o ktorom je 
známe, že vyvoláva konzistentnú odozvu (napr. acetón: olivový olej 
v pomere 4: 1, objemové percentá), môžu sa vyskytnú ť určité regula čné 
situácie, v ktorých bude potrebné vykona ť aj testovanie v neštandardnom 
nosiči (klinicky/chemicky zodpovedajúcom roztoku) (23). Ak sa súbežná 
pozitívna kontrola testuje v odlišnom nosi či ako testovaná látka, potom 
treba do testu súbežnej pozitívnej kontroly zahrnú ť samostatnú kontrolnú 
skupinu, ktorej sa podáva nosi č. 
16. V prípadoch hodnotenia látok, ktoré patria do konkrétnej chemickej triedy 
alebo ktoré zastupujú konkrétny rozsah odoziev, môžu by ť tiež užito čné 
referenčné látky, aby sa preukázalo, že testovacia metóda na zis ťovanie 
potenciálu týchto druhov látok spôsobi ť senzibilizáciu kože riadne funguje. 
Vhodné referen čné látky majú ma ť tieto vlastnosti: 
— štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou testovanej látky, ktorá je 
predmetom testovania, 
— známe fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— podporné údaje z LLNA: DA, — podporné údaje z ďalších zvieracích a/alebo ľudských modelov.
 
TESTOVACÍ POSTUP  
Počet zvierat a ve ľkosť dávky  
17. Na dávkovú skupinu sa používajú aspo ň štyri zvieratá, aspo ň tri koncen ­
trácie testovanej látky a k tomu súbežná negatívna kontrolná skupina, ktorej sa podáva iba nosi č testovanej látky, a pozitívna kontrola (súbežná 
alebo nedávna, pod ľa laboratórnych pravidiel s prihliadnutím na odseky 11 
– 15). Treba zváži ť testovanie viacerých dávok pozitívnej kontroly, najmä 
ak sa testuje na prerušovanej báze. So zvieratami v kontrolných skupinách by sa malo zaobchádza ť rovnakým spôsobom ako s pokusnými zvieratami 
okrem prípadov, ke ď sa ošetrovanie testovanou látkou nevykonáva. 
18. Výber dávky a nosi ča by mal by ť založený na odporú čaniach uvedených 
v odkazoch (2) a (24). Následné dávky sa zvy čajne vyberajú z vhodných 
sérií koncentrácií, napr. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % atď. Výber zo sérií koncentrácií je potrebné primerane vedecky zdôvodni ť. 
Všetky existujúce informácie o toxicite (napr. akútnej toxicite a podráždení 
kože), ako aj štrukturálne a fyzikálno-chemické informácie o predmetnej 
testovanej látke (a/alebo štrukturálne príbuzných látkach) by sa mali prípadne posúdi ť výberom troch po sebe idúcich koncentrácií tak, aby 
najvyššia koncentrácia maximalizovala expozíciu, pri čom by sa však 
zabránilo systémovej toxicite a/alebo nadmernému lokálnemu podráždeniu 
kože (24) (25). Ak tieto informácie nie sú k dispozícii, možno bude potrebné vykona ť predbežný skríningový test (pozri odseky 21 – 24). 
19. Nosi č by nemal ovplyv ňovať výsledok testu a mal by sa vybra ť na základe 
maximálnej rozpustnosti s cie ľom získať najvyššiu dosiahnute ľnú koncen ­
tráciu, pri čom vznikne roztok/suspenzia vhodná na aplikáciu testovanej 
látky. Odporú čané nosiče sú acetón: olivový olej (4: 1, objemové percentá),  
N,N-dimetylformamid, metyletylketón, propylénglykol a dimetylsulfoxid 
(6), ale môžu sa použi ť aj iné nosi če, ak sa uvedie uspokojivé vedecké 
zdôvodnenie. V ur čitých situáciách môže by ť potrebné použi ť ako ďalšiu 
kontrolu klinicky vhodný roztok alebo komer č
ný prípravok, v ktorom sa 
testovaná látka predáva. Osobitnú pozornos ť je potrebné venova ť zabezpe­ 
čeniu, aby sa hydrofilné testované látky za členili do systému nosi ča, ktorý 
zvlhčuje pokožku, a rýchlo neunikli, a to za členením vhodných rozpúš ťadiel 
(napr. 1 % Pluronic® L92). Preto je potrebné vyhýba ť sa použitiu čisto 
vodných nosi čov. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Spracovanie lymfatických uzlín jednotlivých myší umož ňuje posúdi ť 
variabilitu medzi zvieratami a štatisticky porovna ť rozdiel medzi mera ­
niami testovanej látky a kontrolnej skupiny, ktorej sa podáva nosi č (pozri 
odsek 33). Okrem toho sa zníženie po čtu myší v pozitívnej kontrolnej 
skupine môže prehodnoti ť len po poskytnutí informácií o jednotlivých 
zvieratách (22). Navyše niektoré regula čné orgány požadujú zber údajov 
o jednotlivých zvieratách. Pravidelný zber údajov o jednotlivých zviera ­
tách poskytuje výhodu, pokia ľ ide o dobré životné podmienky zvierat, 
pretože sa predchádza duplicitnému testovaniu, ktoré by bolo potrebné 
v prípade, ak by výsledky testovanej látky pôvodne získané jedným 
spôsobom (napr. prostredníctvom spojených údajov o zvieratách) museli neskôr posúdi ť regulačné orgány pod ľa iných požiadaviek (napr. prostred ­
níctvom údajov o jednotlivých zvieratách).
 
Predbežný skríningový test  
21. V prípade, ak nie sú k dispozícii informácie na stanovenie najvyššej dávky 
testovanej látky (pozri odsek 18), treba vykona ť predbežný skríningový 
test s cie ľom stanovi ť primeranú úrove ň testovanej dávky na použitie 
v LLNA: DA. Cie ľom predbežného skríningového testu je poskytnú ť 
usmernenie na výber maximálnej úrovne dávky na použitie v hlavnej 
štúdii LLNA: DA v prípade, že nie sú dostupné informácie 
o koncentrácii, ktorá spôsobuje systémovú toxicitu (pozri odsek 24) a/alebo nadmerné lokálne podráždenie kože (pozri odsek 23). Maximálna 
úroveň testovanej dávky by mala obsahova ť 100 % testovanej látky 
v prípade kvapalín alebo maximálnu možnú koncentráciu v prípade tuhých látok alebo suspenzií. 
22. Predbežný skríningový test sa vykonáva za podmienok, ktoré sú identické 
s hlavnou štúdiou LLNA: DA s tým rozdielom, že sa neposudzuje proli ­
ferácia lymfatickej uzliny a môže sa použi ť menší po čet zvierat na 
dávkovú skupinu. Navrhuje sa jedno alebo dve zvieratá na dávkovú skupinu. U všetkých myší sa každý de ň pozorujú klinické príznaky systé ­
movej toxicity alebo lokálneho podráždenia v mieste aplikácie. Telesné 
hmotnosti zvierat sa zaznamenajú na za čiatku testu a pred usmrtením (de ň 
8). Obidve uši každej myši sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (s čer­
venania kože), a vyhodnotia sa pod ľa tabuľky 1 (25). Hrúbka ucha sa 
odmeria pomocou meradla hrúbky (napr. digitálnym mikrometrom alebo 
meradlom hrúbky Peacock Dial) v de ň 1 (pred aplikáciou dávky), v de ň 3 
(približne 48 hodín po prvej dávke), v de ň 7 (24 hodín pred usmrtením) 
a v deň 8. Okrem toho možno hrúbku ucha v de ň 8 určiť na základe 
meraní vážením vzoriek uší, ktoré by sa malo vykona ť po humánnom 
usmrtení zvierat. Nadmerné lokálne podráždenie kože indikuje hodnotenie 
erytému ≥ 3 a/alebo zvýšenie hrúbky ucha o ≥ 25 % v ktorýko ľvek deň 
merania (26) (27). Najvyššia dávka vybraná pre hlavnú štúdiu LLNA: DA bude najbližšia nižšia dávka z predbežných skríningových sérií koncen ­
trácií (pozri odsek 18), ktorá nespôsobuje systémovú toxicitu a/ani 
nadmerné lokálne podráždenie kože.
 
Tabuľka 1 
Hodnotenia erytému  
Pozorovanie Hodnotenie  
Žiadny erytém 0 
Veľmi slabý erytém (sotva pozorovate ľný) 1 
Jasne ohrani čený erytém 2  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Pozorovanie Hodnotenie  
Mierny až silný erytém 3 
Výrazný erytém (tmavo červený) až vytvorenie chrasty zabra ňujúcej posú ­
deniu erytému 4 
23. Okrem 25 % zvýšenia hrúbky ucha (26) (27) sa štatisticky významné 
zvýšenie hrúbky ucha v testovanej skupine myší v porovnaní s kontrolnou skupinou myší použilo aj na identifikáciu dráždivých látok v LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Štatisticky významné zvýšenie 
hrúbky ucha môže nasta ť aj vtedy, ke ď dôjde k zvýšeniu menšiemu ako 
25 %, nespája sa však konkrétne s nadmerným podráždením kože (30) (31) (32) (33) (34). 
24. Nasledujúce klinické pozorovania môžu indikova ť systémovú toxicitu 
(35), ak sú sú časťou integrovaného posudzovania, to znamená, že môžu 
indikovať maximálnu úrove ň dávky na použitie v hlavnej štúdii LLNA: 
DA: zmeny funkcie nervového systému (napr. piloerekcia, ataxia, triaška 
a kŕče); zmeny správania (napr. agresia, zmena pri čistení, výrazná zmena 
stupňa aktivity); zmena dýchania (t. j. zmena frekvencie alebo intenzity 
dýchania, ako napríklad zadúšanie, dýchavi čnosť a šelest) a zmeny 
spotreby potravy a vody. Okrem toho treba v hodnotení zváži ť príznaky 
letargie a/alebo apatie a akéko ľvek klinické príznaky silnejšej alebo dlho ­
dobejšej bolesti a utrpenia alebo viac ako 5 % zníženie telesnej hmotnosti medzi dňom 1 a 8 a úmrtnos ť. Umierajúce zvieratá alebo zvieratá, ktoré 
majú zjavne silné bolesti alebo vykazujú príznaky silného utrpenia, by sa 
mali humánnym spôsobom usmrti ť (36).
 
Harmonogram pokusov v hlavnej štúdii  
25. Harmonogram pokusov v rámci skúšky je takýto: 
— Deň 1: Ozna čte každé zviera a zaznamenajte jeho hmotnos ť 
a akékoľvek klinické pozorovania. Aplikujte 1 % vodný roztok lauryl ­
sulfátu sodného (SLS) na zadnú stranu každého ucha štyrmi až piatimi 
ťahmi kefky namo čenej v roztoku SLS tak, aby bola pokrytá celá 
zadná strana každého ucha. Hodinu po aplikácii SLS za čnite 
s aplikáciou 25 μL z príslušného zriedenia testovanej látky, samotného 
nosiča alebo pozitívnej kontroly (súbežnej alebo nedávnej, pod ľa labo­
ratórnych pravidiel s prihliadnutím na odseky 11 – 15) na zadnú stranu každého ucha. 
— Dni 2, 3 a 7: Zopakujte predbežné ošetrenie 1 % vodným roztokom 
SLS a postup aplikácie testovanej látky vykonaný v prvom dni. 
— Dni 4, 5 a 6: Žiadne ošetrenie. 
— Deň 8: Zaznamenajte hmotnos ť každého zviera ťa a akéko ľvek klinické 
príznaky. Približne 24 až 30 hodín po za čatí aplikácie v de ň 7 sa 
zvieratá humánne usmrtia. Drénované ušné lymfatické uzliny sa odstránia z každého ucha myši a jednotlivo sa spracujú vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (PBS) pre každé zviera. Údaje 
a diagramy identifikácie a disekcie lymfatických uzlín možno nájs ť 
v odkaze (22). Pri ďalšom monitorovaní lokálnej odozvy kože 
v hlavnej štúdii možno do protokolu štúdie zahrnú ť ďalšie parametre, 
ako napríklad hodnotenie erytému ucha alebo merania hrúbky ucha 
(získané pomocou meradla hrúbky alebo vážením vzoriek uší pri 
pitve).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Príprava bunkových suspenzií  
26. Jednobunková suspenzia buniek lymfatických uzlín (LNC) odobraná bila ­
terálne z každej myši sa pripravuje tak, že lymfatické uzliny sa uložia 
medzi dve podložné sklí čka, ktoré sa mierne stla čia, aby sa uzliny 
rozdrvili. Presved čte sa, že tkanivo je rovnomerne rozložené, a potom 
podložné sklí čka oddeľte. Rozpustite tkanivo na oboch sklí čkach vo 
fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku; každé sklí čko držte v ur čitom 
uhle nad Petriho miskou a opláchnite roztokom PBS, pri čom súbežne 
škrabkou na bunky odoberte tkanivo zo sklí čka. Navyše ke ďže lymfatické 
uzliny zvierat v negatívnej kontrole sú malé, dôležité je opatrné zaobchá ­
dzanie, aby sa predišlo umelým ú činkom na hodnoty SI. Na opláchnutie 
obidvoch sklí čok by sa mal použi ť celkový objem 1 ml roztoku PBS. 
Suspenzia buniek lymfatických uzlín v Petriho miske by sa mala mierne homogenizova ť škrabkou na bunky. Následne sa zo suspenzie buniek 
lymfatických uzlín mikropipetou odoberie alikvotná časť 20 μl, pričom 
sa dbá na to, aby sa neodobrala okom vidite ľná membrána, a táto alik ­
votná časť sa zmieša s 1,98 ml roztoku PBS tak, aby sa získali 2 ml 
vzorky. Druhá 2 ml vzorka sa potom pripraví rovnakým postupom, 
takže pre každé zviera sa pripravia dve vzorky.
 
Stanovenie proliferácie buniek (meranie obsahu ATP v lymfocytoch)  
27. Zvýšenie obsahu ATP v lymfatických uzlinách sa meria metódou, ktorá 
využíva luciferín/luciferázu a súpravu na meranie ATP, ktorá meria biolu ­
miniscenciu v jednotkách relatívnej luminiscencie (RLU). Čas skúšky od 
času usmrtenia zviera ťa po meranie obsahu ATP má by ť jednotný 
u každého zviera ťa a má trva ť približne 30 minút, pretože obsah ATP 
sa zrejme po usmrtení zviera ťa postupne znižuje (12). Preto by sa séria 
postupov od odobrania ušných lymfatických uzlín až po meranie ATP 
mala dokon čiť do 20 minút pod ľa vopred ur čeného časového plánu, 
ktorý je rovnaký pre každé zviera. Luminiscencia ATP by sa mala merať v každej 2 ml vzorke tak, aby sa získali dva výsledky meraní 
ATP pre každé zviera. Následne sa ur čí priemerná luminiscencia ATP, 
ktorá sa použije v ďalších výpo čtoch (pozri odsek 30).
 
POZOROVANIA  
Klinické pozorovania  
28. Každá myš sa starostlivo vyšetrí aspo ň jedenkrát denne na všetky klinické 
príznaky, či už ide o lokálne podráždenie v mieste aplikácie, alebo 
o systémovú toxicitu. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, 
pričom každá myš má individuálny záznam. Plány na monitorovanie by 
mali zahŕňať kritériá na rýchlu identifikáciu tých myší, ktoré vykazujú 
systémovú toxicitu, nadmerné lokálne podráždenie alebo poleptanie kože a ktoré majú by ť humánne usmrtené (36).
 
Telesné hmotnosti  
29. Ako sa uvádza v odseku 25, telesné hmotnosti jednotlivých zvierat by sa 
mali odmera ť na začiatku testu a pri naplánovanom usmrtení zvierat.  
VÝPOČET VÝSLEDKOV 
30. Výsledky v každej pokusnej skupine sa vyjadrujú ako priemerná hodnota 
stimulačného indexu (SI). SI sa získa vydelením priemernej hodnoty 
RLU/myš v rámci každej skupiny, ktorej sa podávala testovaná látka, a pozitívnej kontrolnej skupiny priemernou hodnotou RLU/myš 
v kontrolnej skupine, ktorej sa podávalo rozpúš ťadlo/nosič. Priemerná 
hodnota SI kontrolných skupín, ktorým sa podával nosi č, je potom 1.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. V rozhodovacom procese sa za pozitívny výsledok považuje stimula čný 
index ≥ 1,8 (10). Pri ur čovaní toho, či hraničný výsledok (t. j. hodnota SI 
v rozmedzí od 1,8 do 2,5) je pozitívny, sa však môže použi ť aj sila vz ťahu 
medzi dávkou a odozvou, štatistický význam a konzistentnos ť rozpúšťadla/ 
nosiča a odoziev pozitívnej kontroly (2) (3) (37). 
32. Pri hrani čnej pozitívnej odozve, ke ď sa SI pohybuje medzi 1,8 a 2,5, môžu 
používatelia na potvrdenie toho, že takéto výsledky sú pozitívne, zváži ť 
doplňujúce informácie, ako napríklad vz ťah medzi dávkou a odozvou, 
dôkazy systémovej toxicity alebo nadmerného podráždenia a v prípade potreby štatistický význam spolu s hodnotami SI (10). Pozornos ť by sa 
mala venova ť aj rôznym vlastnostiam testovanej látky vrátane toho, či má 
štrukturálny vz ťah k látkam, ktoré sú známymi senzibilizátormi kože, či 
spôsobuje nadmerné podráždenie kože myši, a vrátane charakteru pozoro ­
vanej odozvy na dávku. Tieto a ostatné h ľadiská sa podrobne rozoberajú 
inde (4). 
33. Zber údajov na úrovni jednotlivých myší umožní vykona ť štatistickú 
analýzu prítomnosti a úrovne vz ťahu medzi dávkou a odozvou 
v údajoch. Každé štatistické posúdenie by mohlo zah ŕňať hodnotenie 
vzťahu medzi dávkou a odozvou, ako aj vhodne upravené porovnávania 
testovaných skupín (napr. porovnávania v pároch skupiny, ktorej sa podáva dávka, a súbežnej kontrolnej skupiny s rozpúš ťadlom/nosi čom). 
Štatistické analýzy môžu zah ŕňať napr. lineárnu regresiu alebo Williamsov 
test na posúdenie trendov vo vz ťahu medzi dávkou a odozvou a Dunnettov 
test na porovnávanie v pároch. Pri výbere vhodnej metódy štatistickej analýzy by si výskumný pracovník mal uvedomova ť možné nerovnosti 
rozdielov a ďalšie súvisiace problémy, ktoré si môžu vyžadova ť premenu 
údajov alebo štatistickú analýzu založenú na iných ako parametrických údajoch. Výskumný pracovník bude možno v každom prípade musie ť 
vykonať výpočty SI a štatistické analýzy s ur
čitými dátovými bodmi 
a bez nich (niekedy sa tieto údaje nazývajú „extrémne hodnoty“).  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
34. Údaje by sa mali zhrnú ť vo forme tabu ľky, v ktorej sa uvádzajú hodnoty 
RLU jednotlivých zvierat, skupinová priemerná hodnota RLU/zviera, súvi ­
siaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) a stredná hodnota SI pre každú dávkovú skupinu v porovnaní so súbežnou kontrolnou skupinou 
s rozpúšťadlom/nosi čom.
 
Správa o teste  
35. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie: 
Testované a kontrolné chemické látky: 
— identifika čné údaje (napr. čísla CAS, čísla EC, ak sú k dispozícii, 
zdroj, čistota, známe ne čistoty, číslo šarže), 
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. prchavos ť, 
stabilita, rozpustnos ť), 
— v prípade zmesi zloženie a relatívny percentuálny podiel zložiek. 
Rozpúšťadlo/nosič: 
— identifika čné údaje ( čistota, v prípade potreby koncentrácia, použitý 
objem), 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Testovacie zvieratá: 
— použitý kme ň myší CBA, 
— mikrobiologický stav zvierat, ak je známy, — počet a vek zvierat, 
— zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Podmienky testu: — zdroj, číslo šarže a kontrolné údaje výrobcu o kvalite/presnosti súpravy 
ATP, 
— informácie o príprave a aplikácii testovanej látky, — zdôvodnenie výberu dávky (vrátane výsledkov z predbežného skrínin ­
gového testu, ak sa uskuto čnil), 
— použité koncentrácie nosi ča a testovanej látky a celkové množstvo 
aplikovanej testovanej látky, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— podrobný opis harmonogramu podávania dávok a odberu vzoriek, — metódy merania toxicity, — kritériá na hodnotenie štúdií ako pozitívnych alebo negatívnych, — informácie o akýchko ľvek odchýlkach od protokolu a vysvetlenie, ako 
odchýlky ovplyv ňujú návrh a výsledky štúdie. 
Kontrola spo ľahlivosti: 
— súhrn výsledkov poslednej kontroly spo ľahlivosti vrátane informácií 
o testovanej látke, koncentrácii a použitom nosi či, 
— súbežné a/alebo historické kontrolné údaje o pozitívnej a súbežnej 
negatívnej kontrole (s rozpúš ťadlom/nosi čom) pre testovacie laborató ­
rium, 
— ak nebola zahrnutá súbežná pozitívna kontrola, dátum a laboratórna 
správa o najaktuálnejšej periodickej pozitívnej kontrole a správa 
s historickými údajmi o pozitívnej kontrole, ktorými laboratórium zdôvodňuje nevykonanie súbežnej pozitívnej kontroly. 
Výsledky: — hmotnosti jednotlivých myší na za čiatku podávania dávky a pri naplá ­
novanom usmrtení, ako aj priemerný a súvisiaci rozsah chyby (napr. SD a SEM) pre každú pokusnú skupinu, 
— časový priebeh nástupu príznakov toxicity u každého zviera ťa vrátane 
podráždenia kože v mieste podania látky, ak sa vyskytnú, 
— čas usmrtenia zviera ťa a čas merania ATP u každého zviera ťa, 
— tabuľka hodnôt RLU jednotlivých myší a hodnoty SI každej pokusnej 
skupiny s dávkou, 
— priemerný a súvisiaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) v súvislosti 
s hodnotami RLU/myš každej pokusnej skupiny a výsledky analýzy 
extrémnej hodnoty v každej pokusnej skupine,
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— výpočet SI a vhodné opatrenie variability, ktoré berie do úvahy variabilitu 
medzi zvieratami v skupinách, ktorým sa podáva testovaná látka, a v 
kontrolných skupinách, 
— vzťah medzi dávkou a odozvou, 
— v prípade potreby štatistické analýzy. Rozbor výsledkov: — stručný komentár v súvislosti s výsledkami, analýza odozvy na dávku, 
štatistické analýzy, ak existujú, s uvedením záveru, či by sa testovaná 
látka mala považova ť za látku spôsobujúcu senzibilizáciu kože.
 
LITERATÚRA 
1. Chamberlain, M. and Basketter, D. A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol. , 34, 999 – 1002. 
2. OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii 
na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
3. Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. and Loveless, S. E. (1996), 
The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol. , 34, 985 – 997. 
4. Basketter, D. A., Gerberick, G. F. and Kimber, I. (1998), Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food 
Chem. Toxicol. , 36, 327 – 333. 
5. Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol. , 146, 49 – 59. 
6. ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No 99-4494. Research Triangle Park, N.C. K dispozícii na stránke: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]. 
7. Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., 
Stokes, W. S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258 – 273. 
8. Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data 
analyses completed by the national toxicology program interagency center 
for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. Phar ­
macol. 34 , 274 – 286. 
9. Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249 – 257. 
10. ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No 10- 7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental 
Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/met ­
hods/immunotox/llna-DA/TMER.htm].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
11. ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis poten ­
tial of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]. 
12. Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1 – 10. 
13. Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay 
based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 
58, 11 – 26. 
14. OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No 406, Guidelines 
for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www. 
oecd.org/env/testguidelines]. 
15. Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol. , 46, 1896 – 1904. 
16. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J. C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant 
sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharmacol. , 
55, 90 – 96. 
17. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  
J. Immunol. Meth. , 160, 81 – 88. 
18. Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  J. Immunol. Meth. , 72, 127 – 132. 
19. Dexter, S. J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K. M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial 
cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27 – 34. 
20. Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, 
enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol. , 305, 346 – 370. 
21. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
22. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]. 
23. McGarry, H. F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol. , 238, 71 – 89. 
24. Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W., and Basketter, D. A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol. , 93, 13 – 31. 
25. OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
26. Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. and DeGeorge, G. L. 
(2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify 
irritants and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
27. ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
28. Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. and Meade, B. J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol. , 21, 195 – 206. 
29. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P., and Vohr, V. W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83 – 94. 
30. Woolhiser, M. R., Hayes, B. B., and Meade, B. J. (1998), A combined 
murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and 
irritancy potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245 – 256. 
31. Hayes, B. B., and Meade, B. J. (1999), Contact sensitivity to selected acry ­
late compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods.  Drug Chem. Toxicol. , 22, 491 – 506. 
32. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R., and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol. , 
212, 60 – 68. 
33. Vohr, H. W., and Ahr, H. J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol. , 79, 721 – 728. 
34. Patterson, R. M., Noga, E., and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect. , 115, 
1023 – 1028. 
35. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm]. 
36. OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
37. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basket ­
ter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. and Hastings, 
K. L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  
J. Toxicol. Environ. Healt. , 53 563 – 579. 
38. OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessmen. , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV  
Presnosť: Miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referen č­
nými hodnotami. Ide o opatrenie výkonnosti testovacej metódy a jeden 
z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často zamie ňa s pojmom „zhoda“ 
a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (38).  
Referenčná látka:  Látka spôsobujúca alebo nespôsobujúca senzibilizáciu, ktorá 
sa používa ako štandardná látka na porovnávanie s testovanou látkou. Referen čná 
látka by mala ma ť tieto vlastnosti: i) konzistentný(-é) a spo ľahlivý(-é) zdroj(-e); 
ii) štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou látok, ktoré sa budú testova ť; iii) 
známe fyzikálno-chemické vlastnosti; iv) podporné údaje o známych ú činkoch 
a v) známu potenciu v rozsahu želanej odozvy.  
Falošný negatívny výsledok:  Látka je testovanou metódou nesprávne identifiko ­
vaná ako negatívna alebo neaktívna, pri čom v skuto čnosti je pozitívna alebo 
aktívna.  
Falošný pozitívny výsledok:  Látka je testom nesprávne identifikovaná ako pozi ­
tívna alebo aktívna, pri čom v skuto čnosti je negatívna alebo neaktívna.  
Nebezpečnosť: Potenciál škodlivého ú činku na zdravie alebo životné prostredie. 
Škodlivý ú činok sa prejavuje až pri dostato čnej hladine expozície.  
Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť: Miera, do akej rôzne kvalifikované labo ­
ratóriá, ktoré používajú rovnaký protokol a testujú rovnaké testovacie látky, dokážu dosiahnuť kvalitatívne a kvantitatívne podobné výsledky. Medzilaboratórna repro ­
dukovateľnosť sa určuje počas postupov pred validáciou a v rámci postupov vali ­
dácie a znamená mieru, do akej možno test úspešne prenáša ť medzi laboratóriami. 
Takisto je známa ako reprodukovate ľ
nosť medzi laboratóriami (38).  
Vnútrolaboratórna reprodukovate ľnosť: Určenie miery, do akej kvalifikovaní 
pracovníci v rámci jedného laboratória dokážu úspešne opakova ť výsledky 
s použitím konkrétneho protokolu v rôznom čase. Takisto je známa ako repro ­
dukovateľnosť v rámci laboratória (38).  
Extrémna hodnota:  Extrémna hodnota je pozorovanie, ktoré je zna čne odlišné od 
ostatných hodnôt v náhodnej vzorke z populácie.  
Zabezpečovanie kvality:  Riadiaci proces, v ktorom jednotlivci nezávislí od osôb 
vykonávajúcich testy posudzujú súlad s laboratórnymi testovacími normami, požiadavkami a postupmi vedenia záznamov, ako aj presnos ť prenosu údajov.  
Spoľahlivosť: Meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda po čas 
istého časového obdobia opakovane vykonáva ť v rámci laboratórií a medzi nimi 
navzájom, pri čom sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypo čítaním vnútro ­
laboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti (38).  
Senzibilizácia kože:  Imunologický proces, ku ktorému dochádza po lokálnom 
vystavení náchylného jednotlivca chemickému alergénu, ktorý vyvoláva kožnú 
imunitnú reakciu, ktorá môže vies ť k vytvoreniu kontaktnej senzibilizácie.  
Stimulačný index (SI):  Hodnota vypo čítaná na posúdenie potenciálu testovanej 
látky spôsobi ť senzibilizáciu kože; ide teda o pomer proliferácie v pokusných 
skupinách a proliferácie v súbežných kontrolných skupinách, ktorým sa podáva nosič. 
Testovaná látka (tiež sa nazýva testovaná chemikália):  Akákoľvek látka alebo 
zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B. 51.  SENZIBILIZÁCIA KOŽE: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATIC ­
KÝCH UZLÍN: BRDU-ELISA  
ÚVOD 
1. Usmernenia Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) na 
testovanie chemikálií a testovacie metódy EÚ sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regula čných potrieb a dobré životné 
podmienky zvierat. Prvá testovacia metóda (TM) (B.42) na stanovenie 
senzibilizácie kože u myší, tzv. lokálna skúška lymfatických uzlín (LLNA; usmernenie OECD na vykonávanie testov 429) bola zrevidovaná (1 a kapitola B.42 v tejto prílohe). Podrobnosti validácie LLNA a revízia 
prác v tejto oblasti boli uverejnené (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Pri 
LLNA sa na meranie proliferácie lymfocytov používa rádioizotopický tymidín alebo jód, a preto má táto skúška obmedzené použitie v tých prípadoch, kde je problematické získavanie, použitie alebo likvidácia rádi ­
oaktívnych látok. LLNA: BrdU-ELISA [enzýmová imunoskúška] je nerá ­
dioaktívna modifikácia testovacej metódy LLNA, ktorá na meranie proli ­
ferácie lymfocytov využíva 5-bróm-2-deoxyuridín (BrdU) ( číslo CAS 59- 
14-3) v systéme testovania založenom na ELISA. LLNA: BrdU-ELISA 
bola validovaná a zrevidovaná a odporú ča ju medzinárodný nezávislý 
vedecký panel pre partnerské preskúmanie ako užito čnú metódu na iden ­
tifikáciu chemikálií spôsobujúcich alebo nespôsobujúcich senzibilizáciu kože s ur čitými obmedzeniami (10) (11) (12). Táto testovacia metóda je 
vytvorená na posúdenie potenciálu chemikálií (látok a zmesí) spôsobi ť 
senzibilizáciu kože u zvierat. Metóda opísaná v kapitole B.6 tejto prílohy a usmernení OECD na vykonávanie testov 406 využíva testy s morčatami, a to maximaliza čný test mor čiat a Buehlerov test (13). 
LLNA (kapitola B.42 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykonávanie 
testov 429) a dve nerádioaktívne modifikácie LLNA: BrdU-ELISA (kapi ­
tola B.51 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykonávanie testov 442 B) a LLNA: DA (kapitola B.50 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykoná ­
vanie testov 442 A) poskytujú výhodu v porovnaní s testami na mor čatách 
opísanými v kapitole B.6 a usmernení OECD na vykonávanie testov 406 (13), a to pokia ľ ide o obmedzenie a zdokonalenie využívania zvierat. 
2. Podobne ako LLNA, LNNA: BrdU-ELISA skúma induk čnú fázu senzibi ­
lizácie kože a poskytuje kvantitatívne údaje vhodné na posúdenie odozvy na dávku. Okrem toho schopnos ť identifikova ť látky spôsobujúce senzibi ­
lizáciu kože bez potreby používania rádioaktívneho zna čenia DNA znižuje 
potenciál expozície rádioaktivite pri práci a problémy v súvislosti s likvidáciou odpadu. To môže následne umožni ť zvýšené využívanie 
myší na identifikáciu látok spôsobujúcich senzibilizáciu kože, čo by 
ďalej mohlo zníži ť využívanie mor čiat na testovanie potenciálu senzibili ­
zácie kože (t. j. B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13).
 
VYMEDZENIE POJMOV 
3. Použité definície sú uvedené v dodatku 1.  
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
4. LLNA: BrdU-ELISA je upravená metóda LLNA na identifikáciu poten ­
ciálu chemikálií spôsobi ť senzibilizáciu kože, ktorá má ur čité obmedzenia. 
Neznamená to nevyhnutne, že vo všetkých prípadoch sa má použi ť LLNA: 
BrdU-ELISA namiesto testu LLNA alebo testov s mor čatami (t. j. metóda 
B.6; usmernenie OECD na vykonávanie testov 406) (13), ale skôr to, že táto skúška je rovnako hodnotná a môže sa použi ť ako alternatíva, v ktorej 
pozitívne a negatívne výsledky vo všeobecnosti nevyžadujú ďalšie 
potvrdenie. Testovacie laboratórium by malo posúdi ť všetky dostupné 
informácie o testovanej látke pred uskuto čnením štúdie. Takéto informácie
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
budú obsahova ť identitu a chemickú štruktúru testovanej látky, jej fyzi ­
kálno-chemické vlastnosti, výsledky všetkých ostatných  in vitro  alebo  in 
vivo testov toxicity s testovanou látkou a toxikologické údaje o štruktúrne 
príbuzných chemikáliách. Tieto informácie treba vzia ť do úvahy pri ur čo­
vaní, či LLNA: BrdU-ELISA je pre testovanú látku vhodná [vzh ľadom na 
nezlučiteľnosť obmedzených druhov chemikálií s LLNA: BrdU-ELISA 
(pozri odsek 5)] a ako pomoc pri výbere dávok. 
5. LLNA: BrdU-ELISA je metóda  in vivo , a to znamená, že pri posudzovaní 
aktivity alergickej kontaktnej senzibilizácie sa nevylu čuje používanie zvie ­
rat. Má však potenciál obmedzi ť používanie zvierat na tento ú čel pri 
porovnaní s testami na mor čatách (B.6; usmernenie OECD na vykonávanie 
testov 406) (13). Okrem toho LLNA: BrdU-ELISA ponúka zna čné zjem­
nenie spôsobu, akým sa zvieratá používajú na testy alergickej kontaktnej 
senzibilizácie, ke ďže na rozdiel od metódy B.6 a usmernenia OECD na 
vykonávanie testov 406 LLNA: BrdU-ELISA nevyžaduje, aby sa vyvolali reakcie dermálnej hypersenzitivity. Okrem toho LLNA: BrdU-ELISA 
nevyžaduje použitie adjuvansu ako v prípade maximaliza čného testu 
morčiat (kapitola B.6 tejto prílohy, 13). Testovacia metóda LLNA: 
BrdU-ELISA tak znižuje utrpenie zvierat. Napriek výhodám, ktoré 
LLNA: BrdU-ELISA má v porovnaní s metódou B.6 a usmernením 
OECD na vykonávanie testov 406 (13), existujú ur čité obmedzenia, pre 
ktoré možno bude potrebné používa ť B.6 alebo usmernenie OECD na 
vykonávanie testov 406 [napr. testovanie ur čitých kovov, falošné pozitívne 
zistenia s ur čitými kožnými dráždivými látkami (ako napríklad niektoré 
povrchovo aktívne látky) (6) (1 a kapitola B.42 tejto prílohy) alebo rozpustnos ť testovanej látky]. Okrem toho chemické triedy alebo látky, 
ktoré obsahujú potenciálne zmäto čné funkčné skupiny (15), si tiež môžu 
vyžadova ť použitie testov s mor čatami (t. j. B.6; usmernenie OECD na 
vykonávanie testov 406) (13). Obmedzenia, ktoré boli identifikované pre LLNA (1 a kapitola B.42 tejto prílohy), sa odporú čajú aj pre LLNA: 
BrdU-ELISA (10). Okrem takto identifikovaných obmedzení by sa 
LLNA: BrdU-ELISA mala uplat ňovať pri testovaní akýchko ľvek chemi ­
kálií okrem prípadu, ke ď
 tieto chemikálie majú vlastnosti, ktoré by mohli 
narúšať presnosť LLNA: BrdU-ELISA. Okrem toho by sa mala zváži ť 
možnosť hraničných pozitívnych výsledkov v prípade, že sa dosiahnu 
hodnoty stimula čného indexu (SI) od 1,6 do 1,9 (pozri odseky 31 a 32). 
To je založené na valida čnej databáze 43 látok s použitím SI ≥ 1,6 (pozri 
odsek 6), pre ktoré LLNA: BrdU-ELISA správne identifikovala všetkých 32 látok spôsobujúcich senzibilizáciu pod ľa LLNA, ale nesprávne identi ­
fikovala dve z 11 látok nespôsobujúcich senzibilizáciu pod ľa LLNA 
s hodnotami SI od 1,6 do 1,9 (t. j. hrani čný pozitívny výsledok) (10). 
Keďže sa však na stanovenie hodnôt SI a výpo čet predpokladaných vlast ­
ností testu použil rovnaký súbor údajov, stanovené údaje môžu by ť 
nadhodnotením skuto čných prediktívnych vlastností.
 
PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
6. Základným princípom, na ktorom sa LLNA: BrdU-ELISA zakladá, je, že 
senzibilizátory vyvolávajú proliferáciu lymfocytov v lymfatickej uzline 
v drénovanom mieste aplikácie testovanej látky. Táto proliferácia je úmerná dávke a ú činnosti aplikovaného alergénu a poskytuje jednoduchý 
prostriedok na získanie kvantitatívneho merania senzibilizácie. Proliferácia 
sa meria porovnávaním priemernej proliferácie v každej pokusnej skupine 
s priemernou proliferáciou v kontrolnej skupine, ktorej sa podáva nosič. Určí sa pomer priemernej proliferácie v každej ošetrenej skupine 
a priemernej proliferácie v súbežnej kontrolnej skupine s nosi čom, ktorý sa 
označuje ako stimula čný index (SI), a mal by ma ť hodnotu ≥ 1,6 pred 
ďalším prípadným vyhodnotením testovanej látky ako potenciálneho
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
senzibilizátora kože. Uvedené metódy sú založené na meraní obsahu BrdU 
na preukázanie proliferácie zvýšeného po čtu buniek v drénovaných ušných 
lymfatických uzlinách. BrdU je podobný tymidínu a je podobne za členený 
do DNA proliferujúcich buniek. Za členenie BrdU sa meria metódou 
ELISA, ktorá využíva peroxidázou ozna čenú protilátku špecifickú pre 
BrdU. Peroxidáza po pridaní substrátu reaguje so substrátom produkujúcim 
sfarbený produkt, ktorý sa kvantifikuje pri konkrétnej absorbancii na mikrotitra čnej platni čke.
 
OPIS SKÚŠKY  
Výber druhov zvierat  
7. Vybraným druhom pre tento test je myš. Valida čné štúdie LLNA: 
BrdU-ELISA sa vykonávali výlu čne s myšami kme ňa CBA/JN, ktorý sa 
preto považuje za preferovaný kme ň (10) (12). Použijú sa mladé dospelé 
negravidné samice myši, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá. Na za čiatku štúdie 
by zvieratá mali by ť vo veku 8 – 12 týžd ňov a rozdiel medzi hmotnos ťami 
zvierat má by ť minimálny a nemá by ť vyšší ako 20 % priemernej hmot ­
nosti. Alternatívne sa môžu použi ť iné kmene a samce, ak sa na základe 
údajov dá uspokojivo dokáza ť, že neexistujú významné odlišnosti špeci ­
fické pre kme ň a/alebo pohlavie v odozve na LLNA: BrdU-ELISA.  
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
8. Myši by sa mali umiestni ť v skupinách (16) okrem prípadu, ak sa 
poskytne primerané vedecké odôvodnenie ich umiestnenia jednotlivo. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 ± 3 °C. Aj ke ď 
by relatívna vlhkos ť mala by ť aspoň 30 % a pokia ľ možno by nemala 
prevyšova ť 70 % okrem obdobia po čas čistenia miestnosti, cie ľom je, aby 
relatívna vlhkos ť dosahovala 50 % – 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé 
a malo by sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na k ŕmenie sa môže 
používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej 
vody.
 
Príprava zvierat  
9. Zvieratá sa vyberú náhodne a sú ozna čené tak, aby sa umožnila jednotlivá 
identifikácia (ale nie formou ušných zna čiek), a držia sa v klietkach aspo ň 
5 dní pred za čiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na labora ­
tórne podmienky. Pred za čatím ošetrenia sa všetky zvieratá vyšetria, aby 
sa zaistilo, že nemajú žiadne vidite ľné kožné poranenia.  
Príprava dávok  
10. Chemikálie v tuhom skupenstve by sa pred podaním dávky do ucha myši 
mali rozpusti ť alebo suspendova ť v rozpúš ťadlách alebo nosi čoch, a ak je 
to vhodné, rozriedi ť. Kvapalné chemikálie možno podáva ť priamo alebo 
pred podaním rozriedi ť. V prípade nerozpustných chemikálií, ako 
napríklad tých, ktoré sa vo všeobecnosti používajú ako zdravotnícke pomôcky, by sa pred podaním dávky do ucha myši mala uskuto čniť 
zvýšená extrakcia vo vhodnom rozpúš ťadle, aby sa odhalili všetky extra ­
hovateľné zložky, ktoré sa budú testova ť. Testované látky sa pripravujú 
každý de ň okrem prípadu, ke ď údaje o stabilite preukazujú prijate ľnosť 
uskladnenia.
 
Kontrola spo ľahlivosti  
11. Riadne vykonanie skúšky sa dokazuje pomocou pozitívnych kontrolných 
chemikálií, ktoré reagujú primeranou a reprodukovate ľnou citlivos ťou ako 
senzibilizujúce testované látky, pre ktoré je dobre charakterizovaná šírka odozvy. Odporú ča sa zahrnú ť súbežnú pozitívnu kontrolu, pretože to doka ­
zuje kompetenciu laboratória úspešne vykona ť každú skúšku a umož ňuje 
posúdenie vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti 
a porovnate ľnosti. Pozitívnu kontrolu v každej štúdii vyžadujú aj niektoré
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
regulačné orgány, a preto by používatelia mali pred vykonaním LLNA: 
BrdU-ELISA konzultova ť s príslušnými orgánmi. Rutinné použitie súbežnej 
pozitívnej kontroly sa podporuje aj preto, aby sa predišlo potrebe ďalšieho 
testovania na zvieratách s cie ľom splniť také požiadavky, ktoré by mohli 
vzniknúť z použitia periodickej pozitívnej kontroly (pozri odsek 12). Pozi ­
tívna kontrola by mala spôsobi ť pozitívnu odozvu na LLNA: BrdU-ELISA 
pri úrovni expozície, pri ktorej sa o čakáva nárast stimula čného indexu (SI) 
> 1,6 v porovnaní s negatívnou kontrolnou (NC) skupinou. Dávka chemickej látky na pozitívnu kontrolu by sa mala zvoli ť tak, aby nespôsobila nadmerné 
podráždenie kože ani systémovú toxicitu a aby indukcia bola reprodukova ­
teľná, ale nie nadmerná (napr. SI > 14 by bol nadmerný). Vhodnými chemi ­
káliami na pozitívnu kontrolu sú: 25 % 3-fenyl-2-hexylpropanál ( číslo CAS 
101-86-0) a 25 % eugenol ( číslo CAS 97-53-0) v acetóne: olivový olej (4: 1, 
objemové percentá). Môžu sa vyskytnú ť okolnosti, ke ď sa v riadne zdôvod ­
nených prípadoch môžu použi ť iné pozitívne kontroly, ktoré sp ĺňajú uvedené 
kritériá. 
12. Hoci sa odporú ča zahrnutie súbežnej pozitívnej kontrolnej skupiny, môžu 
sa vyskytnú ť situácie, ke ď periodické testovanie (v intervaloch ≤ 6 mesia­
cov) s pozitívnou kontrolou môže by ť vhodné v prípade tých laboratórií, 
ktoré vykonávajú LLNA: BrdU-ELISA pravidelne (t. j. vykonávajú 
LLNA: BrdU-ELISA v priebehu jedného mesiaca aspo ň raz) a ktoré 
majú zavedenú historickú databázu pozitívnych kontrol, ktorá preukazuje schopnosť laboratória dosahova ť reprodukovate ľné a presné výsledky 
v pozitívnych kontrolách. BrdU-ELISA možno úspešne preukáza ť dosiah­
nutím konzistentných pozitívnych výsledkov v pozitívnej kontrole najmenej v 10 nezávislých testoch uskuto čnených v ur čitom primeranom 
období (t. j. v období kratšom ako jeden rok). 
13. Súbežná pozitívna kontrolná skupina sa má zahrnú ť vždy, ke ď dôjde 
k procedurálnej zmene v súvislosti s LLNA: BrdU-ELISA (napr. 
k zmene vyškoleného personálu, zmene materiálov a/alebo reagentov 
používaných pri testovacej metóde, zmene nástrojov používaných pri testo ­
vacej metóde alebo zmene zdroja testovaných zvierat), a takéto zmeny je potrebné zaznamena ť v laboratórnych správach. Je potrebné zváži
ť vplyv 
týchto zmien na primeranos ť predtým zriadenej historickej databázy pri 
určovaní potreby zriadenia novej historickej databázy na zaznamenávanie 
konzistentnosti výsledkov pozitívnej kontroly. 
14. Výskumní pracovníci by si mali uvedomi ť, že rozhodnutie vykona ť štúdiu 
pozitívnych kontrol na periodickom základe namiesto súbežných pozitív ­
nych kontrol môže ma ť následky na primeranos ť a prijateľnosť výsledkov 
negatívnej štúdie získaných bez súbežnej pozitívnej kontroly po čas inter­
valu medzi každou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly. Ak sa dosiahne napríklad falošný negatívny výsledok v periodickej štúdii pozi ­
tívnej kontroly, negatívne výsledky získané s testovanou látkou v intervale 
medzi poslednou prijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly 
a neprijate ľnou periodickou štúdiou pozitívnej kontroly možno spochyb ­
niť. Dôsledky týchto výsledkov treba dôkladne zváži ť pri určovaní toho, či 
vykonať súbežné pozitívne kontroly, alebo iba periodické pozitívne 
kontroly. Treba tiež zváži ť použitie menšieho po čtu zvierat v súbežnej 
pozitívnej kontrolnej skupine, ak je to vedecky odôvodnené a ak labora ­
tórium na základe konkrétnych laboratórnych historických údajov preukáže, že možno použi ť menší po čet myší (17). 
15. Aj ke ď by sa pozitívna kontrola mala testova ť v nosiči, o ktorom je 
známe, že vyvoláva konzistentnú odozvu (napr. acetón: olivový olej 
v pomere 4: 1, objemové percentá), môžu sa vyskytnú ť určité regula čné 
situácie, v ktorých bude potrebné vykona ť aj testovanie v neštandardnom 
nosiči (klinicky/chemicky zodpovedajúcom roztoku) (18). Ak sa súbežná 
pozitívna kontrola testuje v odlišnom nosi či ako testovaná látka, potom 
treba do testu súbežnej pozitívnej kontroly zahrnú ť samostatnú kontrolnú 
skupinu, ktorej sa podáva nosi č.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. V prípadoch hodnotenia testovaných látok, ktoré patria do konkrétnej 
chemickej triedy, alebo rozsahu odoziev môžu by ť užitočné aj referen čné 
látky, aby sa preukázalo, že testovacia metóda na zis ťovanie potenciálu 
týchto druhov testovaných látok spôsobi ť senzibilizáciu kože funguje 
riadne. Vhodné referen čné látky majú ma ť tieto vlastnosti: 
— štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou testovanej látky, ktorá je 
predmetom testovania, 
— známe fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— podporné údaje z LLNA: BrdU-ELISA, 
— podporné údaje z ďalších zvieracích a/alebo ľudských modelov.  
TESTOVACÍ POSTUP  
Počet zvierat a ve ľkosť dávky  
17. Na dávkovú skupinu sa používajú aspo ň štyri zvieratá, aspo ň tri koncen ­
trácie testovanej látky a k tomu súbežná negatívna kontrolná skupina, ktorej sa podáva iba nosi č pre testovanú látku, a pozitívna kontrolná 
skupina (súbežná alebo sú časná, pod ľa laboratórnych pravidiel 
v súvisiacich odsekoch 11 – 15). Treba zváži ť testovanie viacerých 
dávok pozitívnej kontroly, najmä ak sa testuje na prerušovanej báze. So zvieratami v kontrolných skupinách by sa malo zaobchádza ť rovnakým 
spôsobom ako s pokusnými zvieratami okrem prípadov, ke ď sa ošetro ­
vanie testovanou látkou nevykonáva. 
18. Výber dávky a nosi ča by mal by ť založený na odporú čaniach uvedených 
v odkazoch 2 a 19. Následné dávky sa zvy čajne vyberajú z vhodných sérií 
koncentrácií, napr. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % at ď. 
Výber zo sérií koncentrácií je potrebné primerane vedecky zdôvodni ť. 
Všetky existujúce informácie o toxicite (napr. akútna toxicita 
a podráždenie kože), ako aj štrukturálne a fyzikálno-chemické informácie 
o testovanej látke, ktorá je predmetom záujmu (a/alebo štrukturálne príbuz ­
ných látkach), ak sú k dispozícii, by sa mali posúdi ť výberom troch po 
sebe idúcich koncentrácií tak, aby najvyššia koncentrácia maximalizovala 
expozíciu, pri čom by sa však zabránilo systémovej toxicite a/alebo 
nadmernému lokálnemu podráždeniu kože (19) (20 a kapitola B.4 tejto prílohy). Ak tieto informácie nie sú k dispozícii, možno bude potrebné vykonať predbežný skríningový test (pozri odseky 21 – 24). 
19. Nosi č by nemal ovplyv ňovať výsledok testu a mal by sa vybra ť na základe 
maximálnej rozpustnosti s cie ľom získať najvyššiu dosiahnute ľnú koncen ­
tráciu, pri čom vznikne roztok/suspenzia vhodná na aplikáciu testovanej 
látky. Odporú čané nosiče sú: acetón: olivový olej (4: 1, objemové percentá),  
N,N-dimetylformamid, metyletylketón, propylénglykol a dimetylsulfoxid 
(6), ale môžu sa použi ť aj iné, ak sa uvedie uspokojivé vedecké zdôvodnenie. 
V určitých situáciách môže by ť potrebné použi ť
 ako ďalšiu kontrolu klinicky 
vhodný roztok alebo komer čný prípravok, v ktorom sa testovaná látka 
predáva. Osobitnú pozornos ť je potrebné venova ť zabezpečeniu toho, aby 
sa hydrofilné testované látky za členili do systému nosi ča, ktorý zvlh čuje 
pokožku, a rýchlo neunikli, a to za členením vhodných rozpúš ťadiel (napr. 
1 % Pluronic® L92). Preto je potrebné vyhýba ť sa použitiu čisto vodných 
nosičov. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Spracovanie lymfatických uzlín jednotlivých myší umož ňuje posúdi ť 
variabilitu medzi zvieratami a štatisticky porovna ť rozdiel medzi mera ­
niami testovanej látky a kontrolnej skupiny, ktorej sa podáva nosi č (pozri 
odsek 33). Okrem toho sa zníženie po čtu myší v pozitívnej kontrolnej 
skupine môže prehodnoti ť len po poskytnutí informácií o jednotlivých 
zvieratách (17). Navyše niektoré regula čné orgány požadujú zber údajov 
o jednotlivých zvieratách. Pravidelný zber údajov o jednotlivých zviera ­
tách poskytuje výhodu, pokia ľ ide o dobré životné podmienky zvierat, 
pretože sa predchádza duplicitnému testovaniu, ktoré by bolo potrebné 
v prípade, ak by výsledky testovanej látky pôvodne získané jedným 
spôsobom (napr. prostredníctvom spojených údajov o zvieratách) museli neskôr posúdi ť regulačné orgány pod ľa iných požiadaviek (napr. prostred ­
níctvom údajov o jednotlivých zvieratách).
 
Predbežný skríningový test  
21. V prípade, ak nie sú k dispozícii informácie na stanovenie najvyššej dávky 
testovanej látky (pozri odsek 18), treba vykona ť predbežný skríningový 
test s cie ľom stanovi ť primeranú úrove ň testovanej dávky na použitie 
v LLNA: BrdU-ELISA. Cie ľom predbežného skríningového testu je 
poskytnúť usmernenie na výber maximálnej úrovne dávky na použitie 
v hlavnej štúdii LLNA: BrdU-ELISA v prípade, že nie sú dostupné infor ­
mácie o koncentrácii, ktorá spôsobuje systémovú toxicitu (pozri odsek 24) a/alebo nadmerné lokálne podráždenie kože (pozri odsek 23). Maximálna 
úroveň testovanej dávky by mala obsahova ť 100 % testovanej látky 
v prípade kvapalín alebo maximálnu možnú koncentráciu v prípade tuhých látok alebo suspenzií. 
22. Predbežný skríningový test sa vykonáva za podmienok, ktoré sú identické 
s hlavnou štúdiou LLNA: BrdU-ELISA, s tým rozdielom, že sa neposu ­
dzuje proliferácia lymfatickej uzliny a môže sa použi ť menší po čet zvierat 
na dávkovú skupinu. Navrhuje sa jedno alebo dve zvieratá na dávkovú skupinu. U všetkých myší sa každý de ň pozorujú klinické príznaky systé ­
movej toxicity alebo lokálneho podráždenia v mieste aplikácie. Telesné 
hmotnosti zvierat sa zaznamenajú na za čiatku testu a pred usmrtením (de ň 
6). Obidve uši myší sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (s červenania 
kože), a vyhodnotia sa pod ľa tabuľky 1 (20 a kapitola B.4 tejto prílohy). 
Hrúbka ucha sa meria pomocou meradla hrúbky (napr. digitálnym mikro ­
metrom alebo meradlom hrúbky Peacock Dial) v de ň 1 (pred aplikáciou 
dávky), v de ň 3 (približne 48 hodín po prvej dávke) a v de ň 6. Okrem 
toho možno hrúbku ucha v de ň 6 určiť na základe meraní vážením vzoriek 
uší, ktoré by sa malo vykona ť po humánnom usmrtení zvierat. Nadmerné 
lokálne podráždenie kože indikuje hodnotenie erytému ≥ 3 a/alebo 
zvýšenie hrúbky ucha o ≥ 25 % v ktorýko ľvek deň merania (21) (22). 
Najvyššia dávka vybraná pre hlavnú štúdiu LLNA: BrdU-ELISA bude najbližšia nižšia dávka z predbežných skríningových sérií koncentrácií 
(pozri odsek 18), ktorá nespôsobuje systémovú toxicitu a/ani nadmerné 
lokálne podráždenie kože.
 
Tabuľka 1 
Hodnotenia erytému  
Pozorovanie Hodnotenie  
Žiadny erytém 0 
Veľmi slabý erytém (sotva pozorovate ľný) 1 
Jasne ohrani čený erytém 2  ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Pozorovanie Hodnotenie  
Mierny až silný erytém 3 
Výrazný erytém (tmavo červený) až vytvorenie chrasty zabra ­ 
ňujúcej posúdeniu erytému 4 
23. Okrem 25 % zvýšenia hrúbky ucha (21) (22) sa štatisticky významné 
zvýšenie hrúbky ucha v testovanej skupine myší v porovnaní s kontrolnou skupinou myší tiež použilo na identifikáciu dráždivých látok v skúške LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Kým štatisticky 
významné zvýšenia môžu nasta ť, aj keď dôjde k zvýšeniu hrúbky ucha 
menšiemu ako 25 %, nie sú však konkrétne spájané s nadmerným podráž ­
dením kože (25) (26) (27) (28) (29). 
24. Nasledujúce klinické pozorovania môžu indikova ť systémovú toxicitu 
(30), ak sú sú časťou integrovaného posudzovania, to znamená, že môžu 
indikovať maximálnu dávku na použitie v hlavnej LLNA: BrdU-ELISA: 
zmeny funkcie nervového systému (napr. piloerekcia, ataxia, triaška a kŕče), zmeny správania (napr. agresia, zmena pri čistení, výrazná 
zmena stup ňa aktivity), zmena dýchania (t. j. zmena frekvencie alebo 
intenzity dýchania, ako napríklad zadúšanie, dýchavi čnosť a šelest) 
a zmeny spotreby potravy a vody. Okrem toho treba v hodnotení zváži ť 
príznaky letargie a/alebo apatie a akéko ľvek klinické príznaky silnejšej 
alebo dlhodobejšej bolesti a utrpenia alebo viac ako 5 % zníženie telesnej 
hmotnosti medzi d ňom 1 a 6 a úmrtnos ť. Umierajúce zvieratá alebo zvie ­
ratá, ktoré majú zjavne silné bolesti alebo vykazujú príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrti ť (31).
 
Harmonogram pokusov v hlavnej štúdii  
25. Harmonogram pokusov v rámci skúšky je takýto: 
— Deň 1: Ozna čte každé zviera a zaznamenajte jeho hmotnos ť 
a akékoľvek klinické pozorovania. Za čnite s aplikáciou 25 μl 
z príslušného zriedenia testovanej látky, samotného nosi ča alebo pozi ­
tívnej kontroly (súbežnej alebo nedávnej, pod ľa laboratórnych pravidiel 
s prihliadnutím na odseky 11 – 15) na zadnú stranu každého ucha. 
— Dni 2 a 3: Zopakujte aplika čný postup uskuto čnený v de ň 1. 
— Deň 4: Žiadne ošetrenie. 
— Deň 5: Intraperitoneálnou injekciou aplikujte 0,5 ml (5 mg/myš) 
roztoku BrdU (10 mg/ml). 
— Deň 6: Zaznamenajte hmotnos ť každého zviera ťa a akéko ľvek klinické 
príznaky. Približne o 24 hodín po injek čnej aplikácii roztoku BrdU sa 
zvieratá humánne usmrtia. Drénované ušné lymfatické uzliny sa odstránia z každého ucha myši a jednotlivo sa spracujú vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (PBS) pre každé zviera. Údaje 
a diagramy identifikácie lymfatických uzlín a disekcie možno nájs ť 
v odkaze (17). Pri ďalšom monitorovaní lokálnej odozvy kože 
v hlavnej štúdii možno do protokolu štúdie zahrnú ť ďalšie parametre, 
ako napríklad hodnotenie erytému ucha alebo merania hrúbky ucha 
(získané pomocou meradla hrúbky alebo vážením vzoriek uší pri 
pitve).
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Príprava bunkových suspenzií  
26. Jednobunková suspenzia buniek lymfatických uzlín (LNC) odobraná bila ­
terálne z každej myši sa pripravuje jemným mechanickým pretla čením cez 
sitko z nerezovej ocele so šírkou oka 200 μm alebo inou prijate ľnou 
technikou na prípravu jednobunkovej suspenzie (napr. pomocou plasto ­
vého mažiara na jedno použitie, ktorým sa lymfatické uzliny rozdrvia 
a následne prepasírujú cez nylonové sitko #70.) Postup na prípravu 
suspenzie buniek lymfatických uzlín je v tejto skúške ve ľmi dôležitý, 
a preto by každý odborník mal by ť v tomto postupe vopred vyškolený. 
Navyše ke ďže lymfatické uzliny zvierat v negatívnej kontrole sú malé, 
dôležité je opatrné zaobchádzanie, aby sa predišlo umelým ú činkom na 
hodnoty SI. V každom prípade by sa cie ľový objem suspenzie buniek 
lymfatických uzlín mal prispôsobi ť stanovenému optimalizovanému objemu 
(približne 15 ml). Optimalizovaný objem je založený na dosiahnutí prie ­
mernej absorbancie v negatívnej kontrolnej skupine v rozmedzí 0,1 – 0,2.  
Stanovenie proliferácie buniek (meranie obsahu BrdU v DNA lymfocytov)  
27. BrdU sa meria metódou ELISA pomocou komer čnej testovacej súpravy 
(napr. Roche Applied Science, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 11 
647 229 001). V skratke 100 μl suspenzie buniek lymfatických uzlín sa 
trikrát pridá do jamiek mikroplatni čky. Po fixácii a denaturácii buniek 
lymfatických uzlín sa do každej jamky pridá protilátka BrdU a čaká sa 
na reakciu. Následne sa protilátka BrdU odstráni umytím, pridá sa substrá ­
tový roztok a čaká sa na tvorbu chromogénu. Odmeria sa absorbancia 370 
nm s referen čnou vlnovou d ĺžkou 492 nm. Vo všetkých prípadoch by sa 
testovacie podmienky skúšky mali optimalizova ť (pozri odsek 26).  
POZOROVANIA  
Klinické pozorovania  
28. Každá myš sa starostlivo vyšetrí aspo ň jedenkrát denne na všetky klinické 
príznaky, či už ide o lokálne podráždenie v mieste aplikácie, alebo systé ­
movú toxicitu. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každá myš má individuálny záznam. Plány na monitorovanie by 
mali zahŕňať kritériá na rýchlu identifikáciu tých myší, ktoré vykazujú 
systémovú toxicitu, nadmerné lokálne podráždenie alebo poleptanie kože a ktoré majú by ť humánne usmrtené (31).
 
Telesné hmotnosti  
29. Ako sa uvádza v odseku 25, hmotnosti jednotlivých zvierat by sa mali 
odmerať na začiatku testu a pri naplánovanom humánnom usmrtení zvie ­
rat. 
VÝPOČET VÝSLEDKOV 
30. Výsledky v každej pokusnej skupine sa vyjadrujú ako priemerná hodnota 
stimulačného indexu (SI). SI sa vypo číta vydelením priemerného indexu 
označenia BrdU/myš v rámci každej skupiny, ktorej sa podáva testovaná 
látka, a pozitívnej kontrolnej skupiny priemerným indexom ozna čenia 
BrdU v kontrolnej skupine s rozpúš ťadlom/nosi čom. Priemerná hodnota 
SI kontrolných skupín, ktorým sa podával nosi č, je potom 1. 
Index ozna čenia BrdU sa definuje ako: 
Index ozna čenia BrdU = (ABS  em – ABS prázdny  em ) – (ABS  ref – ABS 
prázdny  ref ), 
kde: em = emisná vlnová d ĺžka a ref = referen čná vlnová d ĺžka. ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. V rozhodovacom procese sa za pozitívny výsledok považuje stimula čný 
index ≥ 1,6 (10). Pri ur čovaní toho, či hraničný výsledok (napr. hodnota SI 
v rozmedzí od 1,6 do 1,9) je pozitívny, sa však môže použi ť aj sila vz ťahu 
medzi dávkou a odozvou, štatistický význam a konzistentnos ť rozpúšťadla/ 
nosiča a odoziev pozitívnej kontroly (3) (6) (32). 
32. Pri hrani čnom výsledku SI od 1,6 do 1,9 môžu používatelia na potvrdenie 
toho, že také výsledky sú pozitívne, zváži ť doplňujúce informácie, ako 
napríklad vz ťah medzi dávkou a odozvou, dôkazy systémovej toxicity 
alebo nadmerného podráždenia a v prípade potreby štatistický význam spolu s hodnotami SI (10). Pozornos ť by sa mala venova ť aj rôznym 
vlastnostiam testovanej látky vrátane toho, či má štrukturálny vz ťah 
k látkam, ktoré sú známymi senzibilizátormi, či spôsobuje nadmerné 
podráždenie kože, a vrátane charakteru pozorovanej odozvy na dávku. Tieto a ostatné h ľadiská sa podrobne rozoberajú inde (4). 
33. Zber údajov na úrovni jednotlivých myší umožní vykona ť štatistickú 
analýzu prítomnosti a úrovne vz ťahu medzi dávkou a odozvou 
v údajoch. Každé štatistické posúdenie by mohlo zah ŕňať hodnotenie 
vzťahu medzi dávkou a odozvou, ako aj vhodne upravené porovnávania 
testovaných skupín (napr. porovnávania v pároch skupiny, ktorej sa 
podáva dávka, a súbežnej kontrolnej skupiny s rozpúš ťadlom/nosi čom). 
Štatistické analýzy môžu zah ŕňať napr. lineárnu regresiu alebo Williamsov 
test na posúdenie trendov vo vz ťahu medzi dávkou a odozvou a Dunnettov 
test na porovnávanie v pároch. Pri výbere vhodnej metódy štatistickej 
analýzy by si výskumný pracovník mal uvedomova ť možné nerovnosti 
rozdielov a ďalšie súvisiace problémy, ktoré si môžu vyžadova ť premenu 
údajov alebo štatistickú analýzu založenú na iných ako parametrických 
údajoch. Výskumný pracovník bude možno v každom prípade musie ť 
vykonať výpočty SI a štatistické analýzy s ur čitými dátovými bodmi 
a bez nich (niekedy sa tieto údaje nazývajú „extrémne hodnoty“).  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
34. Údaje by sa mali zhrnú ť vo forme tabu ľky, v ktorej sa uvádzajú hodnoty 
indexu ozna čenia BrdU jednotlivých zvierat, priemerný skupinový index 
označenia BrdU/zviera, súvisiaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) a stredná 
hodnota SI pre každú skupinu s dávkou v porovnaní so súbežnou 
kontrolnou skupinou s rozpúš ťadlom/nosi čom. 
Správa o teste  
35. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie: 
Testované a kontrolné chemické látky: 
— identifika čné údaje (napr. čísla CAS, čísla EC, ak sú k dispozícii, 
zdroj, čistota, známe ne čistoty, číslo šarže), 
— fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. prchavos ť, 
stabilita, rozpustnos ť), 
— v prípade zmesi zloženie a relatívny percentuálny podiel zložiek. Rozpúšťadlo/nosič: 
— identifika čné údaje ( čistota, v prípade potreby koncentrácia, použitý 
objem), 
— zdôvodnenie vo ľby nosiča.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Testovacie zvieratá: 
— použitý kme ň myší CBA, 
— mikrobiologický stav zvierat, ak je známy, — počet a vek zvierat, 
— zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo at ď. 
Podmienky testu: — zdroj, číslo šarže a kontrolné údaje výrobcu o kvalite/presnosti (citli ­
vosť a špecifickos ť protilátky a limit detekcie) pre súpravu ELISA, 
— informácie o príprave a aplikácii testovanej látky, — zdôvodnenie výberu dávky (vrátane výsledkov z predbežného skrínin ­
gového testu, ak sa uskuto čnil), 
— použité koncentrácie nosi ča a testovanej látky a celkové množstvo 
aplikovanej testovanej látky, 
— údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— podrobný opis harmonogramu podávania dávok a odberu vzoriek, — metódy merania toxicity, — kritériá na hodnotenie štúdií ako pozitívnych alebo negatívnych, — informácie o akýchko ľvek odchýlkach od protokolu a vysvetlenie, ako 
odchýlky ovplyv ňujú návrh a výsledky štúdie. 
Kontrola spo ľahlivosti: 
— súhrn výsledkov poslednej kontroly spo ľahlivosti vrátane informácií 
o testovanej látke, koncentrácii a použitom nosi či, 
— súbežné a/alebo historické kontrolné údaje o pozitívnej a súbežnej 
negatívnej kontrole (s rozpúš ťadlom/nosi čom) pre testovacie laborató ­
rium, 
— ak nebola zahrnutá súbežná pozitívna kontrola, dátum a laboratórna 
správa o najaktuálnejšej periodickej pozitívnej kontrole a správa s historickými údajmi o pozitívnej kontrole, ktorými laboratórium zdôvodňuje nevykonanie súbežnej pozitívnej kontroly. 
Výsledky: — hmotnosti jednotlivých myší na za čiatku podávania dávky a pri naplá ­
novanom humánnom usmrtení, ako aj priemerný a súvisiaci rozsah 
chyby (napr. SD a SEM) pre každú pokusnú skupinu, 
— časový priebeh nástupu príznakov toxicity u každého zviera ťa vrátane 
podráždenia kože v mieste podania látky, ak sa vyskytnú, 
— tabuľka indexov ozna čenia BrdU u jednotlivých myší a hodnoty SI 
v každej pokusnej skupine, 
— priemerný a súvisiaci rozsah chyby (napr. SD, SEM) v súvislosti 
s indexom ozna čenia BrdU/myš v každej pokusnej skupine 
a výsledky analýzy extrémnej hodnoty v každej pokusnej skupine,
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— výpočet SI a vhodné opatrenie variability, ktoré berie do úvahy varia ­
bilitu medzi zvieratami v skupinách, ktorým sa podáva testovaná látka, 
a v kontrolných skupinách, 
— vzťah medzi dávkou a odozvou, 
— v prípade potreby štatistické analýzy. Rozbor výsledkov: — stručný komentár v súvislosti s výsledkami, analýza odozvy na dávku, 
štatistické analýzy, ak existujú, s uvedením záveru, či by sa testovaná 
látka mala považova ť za látku spôsobujúcu senzibilizáciu kože.
 
LITERATÚRA 
1. OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline 
No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
2. Chamberlain, M. and Basketter, D. A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999 – 1002. 
3. Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. and Loveless, S. E. (1996), 
The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985 – 997. 
4. Basketter, D. A., Gerberick, G. F. and Kimber, I. (1998), Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food 
Chem. Toxicol., 36, 327 – 333. 
5. Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49 – 59. 
6. ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No 99-4494. Research Triangle Park, N.C. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]. 
7. Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., 
Stokes, W. S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258 – 273. 
8. Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data 
analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274 – 286. 
9. Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249 – 257. 
10. ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: 
National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
11. ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis poten ­
tial of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPR ept2009.pdf]. 
12. Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129 – 134. 
13. OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]. 
14. Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896 – 1904. 
15. Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., 
Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Applica ­
tion of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation 
datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90 – 96. 
16. ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
17. ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]. 
18. McGarry, H. F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71 – 89. 
19. Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes E. W. and Basketter, D. A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13 
– 31. 
20. OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
21. Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L., and DeGeorge, G. L. 
(2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify 
irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 
22. ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
23. Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S., and Meade, B. J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in 
female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195 – 206. 
24. Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, 
H. J., Lehmann, P. and Vohr, V. W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83 – 94. 
25. Woolhiser, M. R., Hayes, B. B., and Meade, B. J. (1998), A combined 
murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and 
irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245 – 256.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
26. Hayes, B. B., and Meade, B. J. (1999), Contact sensitivity to selected acry ­
late compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491 – 506. 
27. Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R., and Vohr, H. W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60 – 68. 
28. Vohr, H. W. and Ahr, H. J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721 – 728. 
29. Patterson, R. M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023 – 1028. 
30. ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. K dispozícii na stránke: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acu ­
tetox/Tox_workshop.htm]. 
31. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
32. Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basket ­
ter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E., and 
Hastings, K. L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563 – 579. 
33. OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Envi ­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozícii na stránke: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
DODATOK 1  
VYMEDZENIE POJMOV  
Presnosť: Miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referen č­
nými hodnotami. Ide o opatrenie výkonnosti testovacej metódy a jeden 
z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa ako synonymum 
s pojmom „zhoda“ a ozna čuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (33).  
Referenčná látka:  Látka spôsobujúca alebo nespôsobujúca senzibilizáciu, ktorá 
sa používa ako štandardná látka na porovnávanie s testovanou látkou. Referen čná 
látka by mala ma ť tieto vlastnosti: i) konzistentný(-é) a spo ľahlivý(-é) zdroj(-e); 
ii) štrukturálnu a funk čnú podobnos ť s triedou látok, ktoré sa budú testova ť; iii) 
známe fyzikálno-chemické vlastnosti; iv) podporné údaje o známych ú činkoch 
a v) známu potenciu v rozsahu želanej odozvy.  
Falošný negatívny výsledok:  Testovaná látka je testovanou metódou nesprávne 
identifikovaná ako negatívna alebo neaktívna, pri čom v skuto čnosti je pozitívna 
alebo aktívna (33).  
Falošný pozitívny výsledok:  Testovaná látka je testom nesprávne identifikovaná 
ako pozitívna alebo aktívna, pri čom v skuto čnosti je negatívna alebo neaktívna (33).  
Nebezpečnosť: Potenciál škodlivého ú činku na zdravie alebo životné prostredie. 
Škodlivý ú činok sa prejavuje až pri dostato čnej hladine expozície.  
Medzilaboratórna reprodukovate ľnosť: Miera, do akej rôzne kvalifikované labo ­
ratóriá, ktoré používajú rovnaký protokol a testujú rovnaké testovacie látky, dokážu dosiahnuť kvalitatívne a kvantitatívne podobné výsledky. Medzilaboratórna repro ­
dukovateľnosť sa určuje počas postupov pred validáciou a v rámci postupov vali ­
dácie a znamená mieru, do akej možno test úspešne prenáša ť medzi laboratóriami. 
Takisto je známa ako reprodukovate ľnosť medzi laboratóriami (33).  
Vnútrolaboratórna reprodukovate ľnosť: Určenie miery, do akej kvalifikovaní 
pracovníci v rámci jedného laboratória dokážu úspešne opakova ť výsledky 
s použitím konkrétneho protokolu v rôznom čase. Takisto je známa ako repro ­
dukovateľnosť v rámci laboratória (33).  
Extrémna hodnota:  Extrémna hodnota je pozorovanie, ktoré je zna čne odlišné od 
ostatných hodnôt v náhodnej vzorke z populácie.  
Zabezpečovanie kvality:  Riadiaci proces, v ktorom jednotlivci nezávislí od osôb 
vykonávajúcich testy posudzujú súlad s laboratórnymi testovacími normami, 
požiadavkami a postupmi vedenia záznamov, ako aj presnos ť prenosu údajov.  
Spoľahlivosť: Meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda po čas 
istého časového obdobia opakovane vykonáva ť v rámci laboratórií a medzi nimi 
navzájom, pri čom sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypo čítaním vnútro ­
laboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti (33).  
Senzibilizácia kože:  Imunologický proces, ku ktorému dochádza po lokálnom 
vystavení náchylného jednotlivca chemickému alergénu, ktorý vyvoláva kožnú imunitnú odozvu, ktorá môže vies ť k vzniku kontaktnej senzibilizácie.  
Stimulačný index (SI):  Hodnota vypo čítaná na posúdenie potenciálu testovanej 
látky spôsobi ť senzibilizáciu kože; ide teda o pomer proliferácie v pokusných 
skupinách a proliferácie v súbežných kontrolných skupinách, ktorým sa podáva nosič. 
Testovaná látka (tiež sa nazýva testovaná chemikália):  Akákoľvek látka alebo 
zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
 ▼M3 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  AKÚTNA INHALA ČNÁ TOXICITA – METÓDA AKÚTNEJ 
TOXICKEJ TRIEDY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 436 (2009). Prvé usmernenia TG 403 na vykonávanie 
testov akútnej inhalácie boli prijaté v roku 1981 a medzi časom boli revido ­
vané [pozri kapitolu B.2 tejto prílohy (1)]. Po prijatí revidovanej metódy orálnej akútnej toxickej triedy (ATC) (kapitola B.1b tejto prílohy) (5) sa považovalo za vhodné vypracova ť metódu inhala čnej ATC (2) (3) (4). 
Z retrospektívneho hodnotenia výkonnosti metódy ATC pre akútnu inha ­
lačnú toxicitu vyplynulo, že metóda je vhodná na ú čely klasifikácie 
a označovania (6). Testovacia metóda inhala čnej ATC umožní použitie po 
sebe nasledujúcich stup ňov pevne stanovených cie ľových koncentrácií na 
účely klasifikácie toxicity testovanej chemikálie. K ľúčovým parametrom je 
letalita, ale zvieratá, ktoré majú bolesti, trpia alebo sú moribundné, by sa mali humánne utrati ť, aby sa minimalizovalo ich utrpenie. Usmernenia 
k humánnym parametrom sú k dispozícii v usmer ňovacom dokumente 
OECD č. 19 (7). 
2. Usmernenia k vykonaniu a interpretácii tejto testovacej metódy sú 
k dispozícii v Usmer ňovacom dokumente č. 39 o testovaní akútnej inha ­
lačnej toxicity (GD 39) (8). 
3. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je 
uvedené v dodatku 1 a v dokumente GD 39 (8). 
4. Testovacia metóda poskytuje informácie o nebezpe čných vlastnostiach 
a umožňuje, aby bolo možné testovanú chemikáliu zatriedi ť a klasifikova ť 
podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii chemikálií, ktoré spôso ­
bujú akútnu toxicitu (9). V prípade, že sa vyžadujú bodové odhady hodnôt LC
 50 alebo analýzy vz ťahu koncentrácie a reakcie, je kapitola B.2 tejto 
prílohy (1) vhodnou testovacou metódou, ktorú možno použi ť. Ďalšie 
usmernenia o výbere testovacej metódy sú uvedené v dokumente GD 39 (8). Táto testovacia metóda nie je osobitne ur čená na testovanie špecializo ­
vaných materiálov, ako sú slabo rozpustné izometrické alebo vláknité mate ­
riály alebo priemyselne vyrábané nanomateriály.
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
5. Pred zvažovaním testovania pod ľa tejto testovacej metódy by testovacie 
laboratórium malo zoh ľadniť všetky dostupné informácie o testovanej 
chemikálii vrátane existujúcich štúdií obsahujúcich údaje, na základe 
ktorých sa ďalšie testovanie neodporú ča s cieľom minimalizova ť využívanie 
zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôc ť pri výbere najvhodnejšieho 
druhu, kme ňa, pohlavia, spôsobu expozície a primeraných testovacích 
koncentrácií, zah ŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické 
vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity  in vitro  
alebo  in vivo , predpokladané použitia a potenciál expozície človeka, 
dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách. Koncentrácie, pri ktorých sa predpokladá, že spôsobia silnú 
bolesť a utrpenie v dôsledku žieravého (
 1 ) alebo silno dráždivého pôsobenia, 
by sa nemali testova ť podľa tejto testovacej metódy [pozri dokument GD 39 
(8)]. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Hodnotenie žieravosti môže by ť založené na odbornom posudku s využitím takých 
dôkazov, ako sú: skúsenosti u ľudí a pri zvieratách, existujúce údaje (in vitro), napr. 
kapitola B.40 (10), B.40a (11) tejto prílohy alebo dokument OECD TG 435 (12), 
hodnoty pH, informácie o podobných chemikáliách alebo akéko ľvek iné súvisiace údaje.
 PRINCÍP TESTU 
6. Princíp testu spo číva v tom, že v rámci postupu nieko ľkých krokov sa 
v priebehu expozície v trvaní štyroch hodín o akútnej inhala čnej toxicite 
testovanej chemikálie získajú dostato čné informácie, ktoré umožnia jej klasi ­
fikáciu. Na špecifické regula čné účely možno použi ť iné intervaly expozície. 
V každom kroku, pre ktorý je vymedzená koncentrácia, sa testujú tri zvie ­
ratá z každého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo moribundného stavu zvierat môžu na posúdenie akútnej toxicity testovanej chemikálie 
postačovať dva kroky. Ak sú k dispozícii dôkazy o tom, že jedno pohlavie 
je vnímavejšie ako druhé, potom môže test pokra čovať s využitím iba 
vnímavejšieho pohlavia. V závislosti od výsledku predchádzajúceho kroku 
bude nasledova ť tento krok: 
a) nie je potrebné ďalšie testovanie; 
b) testovanie troch zvierat z každého pohlavia alebo 
c) testovanie šiestich zvierat vnímavejšieho pohlavia, t. j. nižšie hrani čné 
odhady toxickej triedy budú založené na šiestich zvieratách v každej skupine s koncentráciou bez oh ľadu na pohlavie. 
7. Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zjavnými boles ťami, alebo zvieratá, 
ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, by sa mali humánnym 
spôsobom usmrti ť, pričom pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú 
rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrti ť 
moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídate ľnej 
alebo nastávajúcej smrti sú predmetom Usmer ňovacieho dokumentu č. 19 
o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (7).
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
8. Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných 
laboratórnych kme ňov. Najvhodnejším zviera ťom je potkan. Použitie 
iných druhov zvierat je nutné odôvodni ť. 
Príprava zvierat  
9. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mlá ďatá a sú negravidné. V de ň 
expozície by zvieratá mali by ť mladé dospelé jedince vo veku od 8 do 12 
týždňov a ich telesná hmotnos ť by mala by ť v rozmedzí ± 20 % strednej 
hmotnosti jednotlivých pohlaví všetkých zvierat toho istého veku, ktoré boli exponované skôr. Zvieratá sa vyberajú náhodne a ozna čia sa na ú čely indi­
viduálnej identifikácie. Zvieratá sa umiestnia do klietok najmenej na pä ť dní 
pred začatím testu, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Zvieratá 
by sa na krátky čas pred testovaním mali aklimatizova ť aj na testovacie 
zariadenie, lebo sa tak zníži stres spôsobený uvedením do nového prostredia.
 
Chov zvierat  
10. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala by ť 22 ± 3 °C. 
Relatívna vlhkos ť by sa v ideálnom prípade mala udržiava ť v rozsahu od 30 
do 70 %, hoci to nemusí by ť možné, ak sa ako nosi č používa voda. Pred 
a po expozícii sú zvieratá zvy čajne umiestnené v klietkach pod ľa pohlavia 
a koncentrácie, ale po čet zvierat v jednej klietke by nemal prekáža ť bezpro­
blémovému pozorovaniu každého zviera ťa, pričom by sa mali minimali ­
zovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. 
V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže by ť potrebné, 
aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Skúmavky 
by nemali zvieratám spôsobova ť neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi 
vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže ma ť ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hyper ­
termia) a/alebo respira čný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné 
údaje, pod ľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo ve ľkej miere, 
potom skúmavky nie je potrebné vopred upravi ť. Zvieratá vystavené 
účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestni ť 
samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srs ť ostat­
ných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na k ŕmenie 
môže používa ť bežné a osved čené laboratórne krmivo s neobmedzenou 
dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by 
sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.  
Inhalačné komory  
11. Pri výbere inhala čnej komory by sa mal vzia ť do úvahy charakter testovanej 
chemikálie a cie ľ testu. Uprednost ňuje sa expozícia oblasti nosa (pri čom 
tento pojem zah ŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti 
sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu 
kondenzova ť a vytvára ť aerosóly, uprednost ňuje expozícia oblasti nosa. 
Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnu ť použitím expozície celého 
tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodni ť. Na zabezpe ­ 
čenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by 
celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnu ť 5 % objemu komory. 
Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (8).
 
PODMIENKY EXPOZÍCIE  
Podávanie koncentrácií  
12. Odporú ča sa použitie stabilného intervalu expozície v trvaní štyroch hodín, 
do ktorých nie je zapo čítaný čas na dosiahnutie rovnováhy. Na splnenie 
špecifických požiadaviek môžu by ť nutné iné intervaly, v správe o štúdii 
však treba uvies ť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (8)]. Zvieratá expo ­
nované v komorách na expozíciu celého tela by mali by ť umiestnené samo ­
statne, aby sa zabránilo požitiu testovanej chemikálie v dôsledku o čisťo­
vania tela ostatnými zvieratami v klietke. Po čas trvania expozície by sa 
zviera nemalo k ŕmiť. V priebehu expozície celého tela sa zviera ťu môže 
podať voda. 
13. Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, 
pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii 
a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne 
testované chemikálie by sa mali testova ť v podmienkach suchého vzduchu. 
Treba dba ť na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie.
 
Rozdelenie ve ľkosti častíc  
14. Častice by sa mali rozdeli ť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov 
a pár, ktoré môžu kondenzova ť a vytvára ť aerosóly. Na umožnenie expo ­
zície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporú čajú aerosóly 
so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 4 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru ( σ
 g ) 
v rozsahu od 1,5 do 3,0 (8) (13) (14). Hoci by sa malo vynaloži ť značné 
úsilie na dodržanie tejto normy, pokia ľ túto podmienku nie je možné splni ť, 
treba predloži ť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov 
môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a takisto nabité častice, 
vlákna a hygroskopické materiály (ktoré sa vo vlhkom prostredí dýchacej 
sústavy zvä čšujú) môžu túto normu prekra čovať. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Príprava testovanej chemikálie v nosi či 
15. Na prípravu vhodnej koncentrácie a ve ľkosti častíc testovanej chemikálie 
v ovzduší možno použi ť nosič. Spravidla sa uprednost ňuje voda. Tuhý 
materiál môže by ť podrobený mechanickým procesom s cie ľom dosiahnu ť 
požadovanú distribúciu ve ľkosti častíc, treba však dba ť na to, aby sa testo ­
vaná chemikália nerozložila ani nezmenila. V prípadoch, v ktorých sa usudzuje, že sa pôsobením mechanických procesov zmenilo zloženie testo ­
vanej chemikálie (napr. extrémna teplota spôsobená nadmerným mletím 
v dôsledku trenia), by sa zloženie testovanej chemikálie malo analyticky 
overiť. Treba da ť pozor, aby sa testovaná chemikália nezne čistila. Nie je 
potrebné testova ť nedrobivé granulované materiály, ktoré sa ú čelovo pripra ­
vujú tak, aby nebolo možné ich inhalova ť. Na preukázanie, že pri manipu ­
lácii s granulovaným materiálom nevznikajú dýchate ľné častice, by sa mal 
vykonať test opotrebovania. Ak pri teste opotrebovania vzniknú dýchate ľné 
častice, treba uskuto čniť test inhala čnej toxicity.
 
Kontrolné zvieratá  
16. Súbežná negatívna kontrolná skupina (ovzdušia) nie je potrebná. V prípade, 
že sa na vytvorenie testovacieho ovzdušia použije iný nosi č ako voda, sa 
kontrolná skupina nosi ča použije iba vtedy, ak nie sú k dispozícii staršie 
údaje o inhala čnej toxicite. Ak sa pri štúdii toxicity testovanej chemikálie 
pripravenej v nosi či nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosi č pri testo ­
vanej koncentrácii nie je toxický, a teda kontrola nosi ča nie je potrebná.  
MONITOROVANIE PODMIENOK EXPOZÍCIE  
Prúdenie vzduchu v komore  
17. Prúdenie vzduchu cez komoru by sa po čas každej expozície malo dôkladne 
kontrolova ť, nepretržite monitorova ť a zaznamenáva ť aspoň raz za hodinu. 
Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia (alebo stability) je inte ­
grálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy 
prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických parametrov tvorby ovzdušia. Osobitne treba dba ť na to, aby sa zabránilo opätovnému vdých ­
nutiu v komorách na expozíciu oblasti nosa v prípadoch, v ktorých prúdenie 
vzduchu cez systém expozície nesta čí na zabezpe čenie dynamického 
prúdenia vzduchu s testovanou chemikáliou. Existujú predpísané metodiky, prostredníctvom ktorých možno dokáza ť, že v zvolených prevádzkových 
podmienkach nedochádza k opätovnému vdýchnutiu (8) (15). Koncentrácia 
kyslíka by mala by ť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhli čitého by 
nemala presiahnu ť 1 %. Ak existuje dôvod domnieva ť sa, že tieto normy nie 
je možné splni ť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhli čitého by sa mali zmera ť.
 
Teplota komory a relatívna vlhkos ť 
18. Komora by sa mala udržiava ť pri teplote 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkos ť 
v dýchacej zóne zvierat, a to v prípade expozície oblasti nosa, ako aj v prípade expozície celého tela, by sa mala monitorova ť a zaznamenáva ť 
minimálne trikrát po čas expozície v trvaní až štyroch hodín a v prípade 
kratšej expozície každú hodinu. Relatívna vlhkos ť by sa ideálne mala 
udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa sta ť, že táto hodnota 
bude nedosiahnute ľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) 
alebo nemerate ľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie 
a testovacej metódy.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Testovaná chemikália: nominálna koncentrácia  
19. Vždy, ke ď je to možné, by sa mala vypo čítať a zaznamena ť nominálna 
koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnos ť 
vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, 
ktorý prešiel systémom komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na 
charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie vypovedá o ú činnosti vytvárania testovacieho systému, a teda 
sa môže použi ť na zistenie problémov s tvorbou.  
Testovaná chemikália: skuto čná koncentrácia  
20. Skuto čná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie v dýchacej 
zóne zvierat v inhala čnej komore. Skuto čné koncentrácie možno získa ť 
špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorp čnými 
alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakteri ­
záciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová 
analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jedno ­
zložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prcha ­
vosťou, pričom je potrebné túto analýzu podloži ť primeranými testovými 
charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej testovanej 
chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov takisto 
možno stanovi ť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú 
však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto infor ­
mácie nie sú dostupné, môže by ť potrebná opätovná analýza testovanej 
chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypari ť 
alebo môžu sublimova ť, by sa malo preukáza ť, že všetky fázy sa zhromaž ­
dili pomocou zvolenej metódy. V správe o štúdii by sa mali uvies ť cieľové, 
nominálne a skuto čné koncentrácie. Na výpo čet hodnôt smrte ľných koncen ­
trácií sa však v štatistických analýzach použijú iba skuto čné koncentrácie. 
21. Ak je to možné, mala by sa použi ť jedna dávka testovanej chemikálie, 
pričom testovaná vzorka by sa mala uskladni ť za podmienok, za ktorých 
sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred za čatím štúdie by mala 
byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, 
ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontami ­
nantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukáza ť napríklad týmito 
údajmi: reten čný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnos ť získaná 
pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium 
nenesie zodpovednos ť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspo
ň čias­
točne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávate ľom (napr. farbu, fyzi ­
kálne skupenstvo at ď.). 
22. Prostredie expozície by malo by ť čo najstálejšie a malo by sa nepretržite 
a/alebo ob časne monitorova ť v závislosti od metódy analýzy. Ak sa použije 
občasný odber vzoriek, vzorky ovzdušia komory by sa mali v priebehu 
štvorhodinovej štúdie odobra ť najmenej dvakrát. Ak to pre nízky prietok 
vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, môže sa v priebehu celého 
intervalu expozície odobra ť jedna vzorka. Ak sa medzi jednotlivými vzor ­
kami vyskytnú výrazné výkyvy, pri ďalších testovaných koncentráciách by 
sa mali použi ť štyri vzorky z každej expozície. Jednotlivé vzorky koncen ­
trácie v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýli ť 
o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade 
kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy 
v komore (t  95 ) by sa mal vypo čítať a zaznamena ť. Interval expozície zah ŕňa 
čas, keď sa testovaná chemikália tvorí, pri čom sa zoh ľadňujú aj časy 
potrebné na dosiahnutie t  95 . Usmernenia k odhadovaniu t  95 sú uvedené 
v dokumente GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. V prípade ve ľmi komplexných zmesí tvorených parami/plynmi a aerosólov 
(napr. spa ľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií pohá ňaných účelo­
vými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhala čnej komore 
môže každá fáza správa ť inak, takže by sa mala vybra ť aspoň jedna látka 
slúžiaca ako ukazovate ľ (analyt), naj častejšie hlavná aktívna látka v zmesi, 
každej fázy (para/plyn a aerosól). Ak je testovaná chemikália zmes, v správe 
by sa mala uvies ť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky 
alebo zložky (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa skuto čných koncentrácií 
sú uvedené v dokumente GD 39 (8).  
Testovaná chemikália: rozdelenie ve ľkosti častíc  
24. Rozdelenie ve ľkosti častíc aerosólov by sa malo stanovi ť aspoň dvakrát 
v priebehu každej expozície v trvaní štyroch hodín, a to pomocou kaskádo ­
vého impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc. Ak možno preukáza ť rovnocennos ť výsledkov získaných 
pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alterna ­
tívny prístroj môže používa ť počas celej štúdie. Druhé zariadenie, ako je 
gravimetrický filter alebo impinger/premýva čka, by sa malo použi ť súbežne 
s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej ú činnosti hlavného prístroja. 
Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou ve ľkosti častíc by mala by ť 
v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (8)]. Ak možno preukáza ť rovnocennos ť 
v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonáva ť ďalšie potvrdzujúce 
merania. V záujme zabezpe čenia dobrých životných podmienok pre zvieratá 
by sa mali prija ť opatrenia na minimalizáciu nejednozna čných údajov, ktoré 
môžu vies ť k potrebe opakova ť expozíciu. Rozdelenie ve ľkosti častíc by sa 
malo vykona ť v prípade pár, ak existuje možnos ť, že kondenzácia pary môže 
mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice 
s potenciálom zmiešaných fáz (pozri odsek 14).
 
POSTUP  
Základný test  
25. V každom kroku sa použijú tri zvieratá z každého pohlavia alebo šes ť 
zvierat vnímavejšieho pohlavia. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobi ť s cieľom minimalizova ť druhovo špecifické utrpenie. 
Úroveň koncentrácie, ktorá sa použije ako po čiatočná dávka, sa vyberie 
zo štyroch stabilných úrovní, pri čom počiatočná úrove ň koncentrácie by 
mala byť tá, pri ktorej sa pri exponovaných zvieratách s najvä čšou pravde ­
podobnos ťou vyskytne toxicita. Schémy testovania pre plyny, pary 
a aerosóly (vrátane schém uvedených v dodatkoch 2 – 4) predstavujú testo ­
vanie s hrani čnými hodnotami kategórií CLP 1 – 4 (9) v prípade plynov 
(100; 500; 2 500; 20 000 ppm/4 h) (dodatok2), v prípade pár (0,5; 2; 10; 20 mg/l/4 h) (dodatok 3) a v prípade aerosólov (0,05; 0,5; 1; 5 mg/l/4 h) 
(dodatok 4). Kategória 5, ktorá nie je za členená do nariadenia (ES) 
č. 1272/2008, (9) sa týka vyšších koncentrácií, ako sú príslušné limitné 
koncentrácie. Pre každú po čiatočnú koncentráciu platí tá istá schéma testo ­
vania. V závislosti od po čtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo 
uhynutých sa postup testovania uskuto čňuje podľa naznačených šípok, až 
kým nie je možné chemikáliu kategorizova ť. 
26. Časový interval medzi skupinami expozícií je ur čený nástupom, trvaním 
a závažnos ťou príznakov toxicity. Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni 
koncentrácie by sa mala odloži ť, kým sa nenadobudne dostato čná dôvera, 
že zvieratá, ktoré boli testované, prežijú. Medzi expozíciami pri jednotlivých úrovniach koncentrácie sa odporú ča interval tri alebo štyri dni, aby sa 
umožnilo pozorovanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže 
nastaviť podľa potreby, napr. v prípade nepresved čivej reakcie.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Limitný test  
27. Limitný test sa používa, ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná 
chemikália je v podstate netoxická, t. j. vyvoláva toxickú reakciu iba pri vyššej koncentrácii, ako je regula čná limitná koncentrácia. Informácie 
o toxicite testovanej chemikálie možno získa ť z poznatkov o podobných 
testovaných látkach alebo podobných zmesiach pri zoh ľadnení identity 
a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, ke ď existuje málo informácií alebo neexistujú žiadne 
informácie o jej toxicite, alebo ak sa o čakáva, že testovaná chemikália bude 
toxická, je potrebné vykona ť základný test [ ďalšie usmernenia sú uvedené 
v dokumente GD 39 (8)]. 
28. Podľa bežného postupu sa tri zvieratá z každého pohlavia alebo šes ť zvierat 
vnímavejšieho pohlavia vystaví koncentrácii 20 000 ppm v prípade plynov, 
20 mg/l v prípade pár a 5 mg/l v prípade prachu/hmly (ak je to možné), ktorá v rámci tejto testovacej metódy slúži ako limitný test. Pri testovaní aerosólov by hlavným cie ľom malo by ť dosiahnutie dýchate ľnej veľkosti 
častíc (t. j. MMAD 1 – 4 μm). V prípade vä čšiny testovaných chemikálií je 
túto veľkosť možné dosiahnu ť pri koncentrácii 2 mg/l. O testovanie aero ­
sólov pri vyššej koncentrácii ako 2 mg/l sa možno pokúša ť, iba ak je možné 
získať dýchate ľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (8)]. Pod ľa 
Globálneho harmonizovaného systému (GHS) (16) sa z dôvodu starostlivosti 
o zvieratá neodporú ča testovanie pri vyššej koncentrácii, ako je limitná 
koncentrácia. Testovanie v kategórii 5 systému GHS (16), ktorá nie je plne začlenená do nariadenia (ES) č. 1272/2008 (9), by sa malo zvažova ť 
iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnos ť, že výsledky takéhoto testu 
by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia, pri čom do správy 
o štúdii sa uvedie odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testova ­
ných chemikálií treba dba ť na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli 
viesť k výbuchu. S cie ľom zabráni ť zbyto
čnému využívaniu zvierat by sa 
malo pred limitným testom vykona ť testovacie kolo bez zvierat, aby sa 
zabezpečilo, že v komore je možné dosiahnu ť podmienky na ú čely limit­
ného testu.  
POZOROVANIA 
29. Zvieratá by sa mali v priebehu trvania expozície pravidelne klinicky pozo ­
rovať. Po expozícii by sa mali klinické pozorovania vykona ť najmenej 
dvakrát v de ň expozície alebo častejšie, ak to indikuje reakcia zvierat na 
testovanie, a následne najmenej raz denne po čas 14 dní. D ĺžka pozorovania 
nie je presne ur čená, ale mala by sa stanovi ť podľa charakteru a času 
nástupu klinických príznakov a d ĺžky obdobia zotavenia. Časy, keď sa 
objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia príznakov toxicity. Všetky pozorovania sa systema ­
ticky zaznamenávajú, pri čom každé zviera má individuálny záznam. Mori ­
bundné zvieratá a zvieratá, ktoré majú silné bolesti a/alebo vykazujú pretrvá ­
vajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom utrati ť. Pri vyšetrovaní klinických 
príznakov toxicity treba dáva ť pozor, aby sa po čiatočný nepatrný nález 
a krátkodobé zmeny dýchania, ktoré sú dôsledkom expozície, nezamie ňali 
za účinky súvisiace s aplikáciou chemikálie. Zoh ľadnia sa zásady a kritériá 
zhrnuté v Usmer ňujúcom dokumente o humánnych parametroch (Humane 
Endpoints Guidance Document) (7). Ke ď sa zvieratá usmrtia z humánnych 
dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zazna ­
menať čas uhynutia.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože, srsti, o čí, slizníc, 
dýchania, krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, 
ako aj somatomotoriky a správania. Ak je to možné, zaznamená sa každý rozdiel medzi lokálnymi a systémovými ú činkami. Pozornos ť sa zameriava 
na pozorovanie triašky, k ŕčov, slinenia, hna čky, letargie, spánku a kómy. 
Meraním rektálnej teploty možno získa ť dôkazy sved čiace o reflexnej 
bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu.
 
Telesné hmotnosti  
31. Individuálne hmotnosti zvierat by sa mali zaznamena ť raz počas obdobia 
aklimatizácie, v de ň expozície pred expozíciou (de ň 0), minimálne v d ňoch 
1, 3 a 7 (a následne raz za týžde ň) a v čase uhynutia alebo utratenia, pokia ľ 
k nemu dôjde po dni 1. Telesná hmotnos ť sa považuje za kritický ukazo ­
vateľ toxicity a zvieratá, pri ktorých nastane trvalý úbytok hmotnosti ≥ 20 % 
v porovnaní s hodnotami pred štúdiou, by sa mali pozorne sledova ť. Zvie­
ratá, ktoré prežijú, sa na konci obdobia po expozícii odvážia a humánne usmrtia.
 
Patológia  
32. Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú po čas testu alebo sa 
utratia a vylú čia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú 
makroskopickej pitve. Ak nie je možné vykona ť pitvu ihne ď po objavení 
uhynutého zviera ťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostato čne nízku 
teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Pitvy by sa mali vykona ť čo 
najskôr, zvy čajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati 
sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pri čom osobitná 
pozornosť sa venuje akýmko ľvek zmenám v dýchacej sústave. 
33. Na ú čely zvýšenia výpovednej hodnoty štúdie možno zváži ť ďalšie vyšet ­
renia  a priori  zahrnuté od za čiatku, ako je meranie hmotnosti p ľúc potka­
nov, ktoré prežili, a/alebo poskytnutie dôkazov o podráždení prostredníc ­
tvom mikroskopického vyšetrenia dýchacej sústavy. Medzi skúmané orgány môžu patri ť aj orgány, ktoré sved čia o makroskopickej patológii pri zviera ­
tách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, a orgány, o ktorých je známe alebo 
pri ktorých sa predpokladá, že boli zasiahnuté. Mikroskopické vyšetrenie 
celej dýchacej sústavy môže poskytnú ť užitočné informácie o testovaných 
chemikáliách, ktoré reagujú s vodou, ako sú kyseliny a hygroskopické testo ­
vané chemikálie.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
34. Treba uvies ť údaje o telesnej hmotnosti a pitevných nálezoch jednotlivých 
zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa 
uvedie pre každú pokusnú skupinu po čet použitých zvierat, po čet zvierat 
vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, po čet zvierat, ktoré sa našli 
uhynuté po čas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia 
jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických ú činkov a reverzibility 
a pitevné nálezy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Správa o teste  
35. Správa o teste by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testované zvieratá a chov:  
— opis podmienok v klietkach vrátane: po čtu (alebo zmeny po čtu) zvierat 
na klietku, výstelky, teploty prostredia a relatívnej vlhkosti, d ĺžky svetlej 
fázy a identifikácie krmiva, 
— použité druhy/kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako potkany, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— metóda randomizácie, — údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu/zdroja krmiva, zdroja 
vody), 
— opis akýchko ľvek podmienok pred testovaním vrátane krmiva, karantény 
a liečby chorôb.  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické 
vlastnosti (vrátane izomerizácie), 
— identifika čné údaje a registra čné číslo CAS (Chemical Abstract Servi ­
ces), ak je známe.  
Nosič: 
— odôvodnenie použitia nosi ča a odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako 
voda), 
— historické alebo sú časné údaje preukazujúce, že nosi č nemá vplyv na 
výsledky štúdie.  
Inhalačná komora:  
— opis inhala čnej komory vrátane rozmerov a objemu, 
— zdroj a opis zariadenia použitého na expozíciu zvierat, ako aj na vytvo ­
renie ovzdušia, 
— zariadenie na meranie teploty, vlhkosti, ve ľkosti častíc a skuto čnej 
koncentrácie, 
— zdroj vzduchu, manipulácia s dodaným/extrahovaným vzduchom 
a použitý klimatiza čný systém, 
— metódy použité na kalibráciu zariadenia s cie ľom zabezpe čiť homogénne 
testovacie ovzdušie, 
— rozdiel tlakov (pozitívny alebo negatívny), 
— expozi čné otvory na jednu komoru (v prípade expozície oblasti nosa), 
umiestnenie zvierat v systéme (v prípade expozície celého tela), 
— doč
asná homogenita/stabilita testovacieho ovzdušia, 
— umiestnenie senzorov teploty a vlhkosti a odber vzorky testovacieho 
ovzdušia v komore, 
— hodnoty prietoku vzduchu, prietok vzduchu na jeden expozi čný otvor 
(v prípade expozície oblasti nosa) alebo množstvo zvierat na komoru (v prípade expozície celého tela), 
— informácie o zariadení použitom na meranie kyslíka a oxidu uhli čitého, 
ak sa použilo,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v inhala čnej komore (t  95 ), 
— počet zmien objemu za hodinu, 
— meracie prístroje (ak sa použili).  
Údaje o expozícii:  
— odôvodnenie výberu cie ľovej koncentrácie pre základnú štúdiu, 
— nominálne koncentrácie (celková hmotnos ť testovanej chemikálie apli ­
kovanej do inhala čnej komory vydelená objemom vzduchu, ktorý prešiel 
komorou), 
— skutočné koncentrácie testovanej chemikálie zachytenej z dýchacej zóny 
zvierat, v prípade testovaných zmesí, ktoré vytvárajú heterogénne fyzi ­
kálne skupenstvá (plyny, pary, aerosóly), možno každé skupenstvo analyzova ť samostatne, 
— všetky koncentrácie ovzdušia sa zaznamenajú v hmotnostných jednot ­
kách (napr. mg/l, mg/m
 3 atď.), v zátvorke možno uvies ť aj objemové 
jednotky (napr. ppm, ppb), 
— rozdelenie ve ľkosti častíc, stredný aerodynamický hmotnostný 
priemer (MMAD) a štandardná odchýlka geometrického priemeru ( σ g ) 
vrátane metód ich výpo čtu. Jednotlivé analýzy ve ľkosti častíc sa uvedú 
v správe.  
Podmienky testovania:  
— podrobné informácie o príprave testovanej chemikálie vrátane podrob ­
ných údajov o všetkých postupoch použitých na zmenšenie ve ľkosti 
častíc tuhých látok alebo na prípravu roztokov testovanej chemikálie. 
V prípadoch, v ktorých v dôsledku mechanických procesov mohlo dôjsť k zmene zloženia testovanej chemikálie, sa uvedú výsledky 
analýzy na overenie zloženia testovanej chemikálie, 
— opis (pod ľa možnosti spolu s nákresom) zariadenia použitého na vytvo ­
renie testovacieho ovzdušia a na expozíciu zvierat testovaciemu ovzdu ­ 
šiu, 
— podrobné informácie o použitej chemickej analytickej metóde a o 
overení metódy (vrátane ú činnosti vý ťažnosti testovanej chemikálie 
z prostriedku na odber vzorky), 
— odôvodnenie výberu testovacích koncentrácií.  
Výsledky:  
— tabuľkové spracovanie teploty, vlhkosti a prúdenia vzduchu v komore, 
— tabuľkové spracovanie údajov o nominálnych a skuto čných koncentrá ­
ciách, 
— tabuľkové spracovanie údajov o ve ľkosti častíc vrátane údajov o odbere 
vzoriek na analýzu, o rozdelení ve ľkosti častíc a o výpo čtoch MMAD 
a σ
 g , 
— tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a úrovni koncentrácie 
pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane 
mortality, charakteru, závažnosti a trvania ú činkov), 
— telesné hmotnosti jednotlivých zvierat zistené po čas dní štúdie, dátum 
a čas uhynutia, ak k nemu došlo pred plánovaným utratením, časový 
priebeh nástupu príznakov toxicity a skuto čnosť, či tieto príznaky boli 
reverzibilné pre každé zviera,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú 
k dispozícii, 
— klasifikácia kategórie CLP a hrani čná hodnota LC  50 . 
Rozbor a interpretácia výsledkov:  
— osobitný dôraz sa kladie na opis metód použitých na splnenie kritérií 
tejto testovacej metódy, napr. limitnej koncentrácie alebo ve ľkosti častíc, 
— dýchate ľnosť častíc vzhľadom na celkové zistenia sa uvedie, najmä ak 
nebolo možné splni ť kritériá na ve ľkosť častíc, 
— konzistencia metód použitých na stanovenie nominálnej a skuto čnej 
koncentrácie a vz ťah skutočnej koncentrácie k nominálnej koncentrácii 
sa uvedú v celkovom hodnotení štúdie, 
— uvedie sa pravdepodobná prí čina uhynutia a prevládajúci druh pôsobenia 
(systémové či lokálne), 
— uvedie sa vysvetlenie, ak bolo potrebné humánnym spôsobom utrati ť 
zvieratá, ktoré mali bolesti alebo vykazovali príznaky silného alebo 
pretrvávajúceho utrpenia, v súlade s kritériami v usmer ňovacom doku ­
mente OECD o humánnych parametroch (Guidance Document on Humane Endpoints) (7).
 
LITERATÚRA  
1. Kapitola B.2 tejto prílohy, Akútna toxicita (inhala čná). 
2. Holzhütter, H.-G., Genschow, E., Diener, W., a Schlede, E. (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. Toxi ­
col. 77: 243 – 254. 
3. Diener, W., Kayser, D., a Schlede, E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol . 
71: 537 – 549. 
4. Diener, W., a Schlede, E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC50 Tests.  ALTEX  1: 129 – 134. 
5. Kapitola B.1b tejto prílohy, Akútna orálna toxicita — metóda triedy akútnej 
toxickej. 
6. OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asse ­
ssment No. 105, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]. 
7. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]. 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asse ­
ssment No. 39, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/te ­
stguidelines]. 
9. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 
16. decembra 2008 o klasifikácii, ozna čovaní a balení látok a zmesí, 
o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene 
a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10. Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože  in vitro : test pomocou transku ­
tánneho elektrického odporu (TER). 
11. Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože  in vitro : test pomocou modelu 
ľudskej kože. 
12. OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]. 
13. Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (druhé 
vydanie) Informa Healthcare, New York. 
14. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321 – 327. 
15. Pauluhn, J., a Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160 
– 167 
16. OSN (2007), Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a ozna čovania 
chemických látok (GHS), ST/SG/AC.10/30, OSN New York a Ženeva. 
K dispozícii na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welco ­
me_e.html].
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMU  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Dodatok 2  
Postup, ktorý treba dodrža ť pri každej po čiatočnej koncentrácii v prípade 
plynov (ppm/4 h)  
Všeobecné poznámky (  1 ) 
Pri každej po čiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené 
v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiava ť. 
Dodatok 2a: Po čiatočná koncentrácia je 100 ppm. 
Dodatok 2b: Po čiatočná koncentrácia je 500 ppm. 
Dodatok 2c: Po čiatočná koncentrácia je 2 500 ppm. 
Dodatok 2d: Po čiatočná koncentrácia je 20 000 ppm. 
V závislosti od po čtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých 
sa postup testovania uskuto čňuje podľa naznačených šípok.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) V týchto tabu ľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasi ­
fikácie a ozna čovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) 
č. 1272/2008. V prípade akútnej inhala čnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 
(9) zahrnutá kategória 5.
 Dodatok 2a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Dodatok 2b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Dodatok 2c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Dodatok 2d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Dodatok 3  
Postup, ktorý treba dodrža ť pri každej po čiatočnej koncentrácii v prípade 
pár (mg/L/4 h)  
Všeobecné poznámky (  1 ) 
Pri každej po čiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené 
v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiava ť. 
Dodatok 3a: Po čiatočná koncentrácia je 0,5 mg/l. 
Dodatok 3b: Po čiatočná koncentrácia je 2,0 mg/l. 
Dodatok 3c: Po čiatočná koncentrácia je 10 mg/l. 
Dodatok 3d: Po čiatočná koncentrácia je 20 mg/l. 
V závislosti od po čtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých 
sa postup testovania uskuto čňuje podľa naznačených šípok.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) V týchto tabu ľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasi ­
fikácie a ozna čovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) 
č. 1272/2008. V prípade akútnej inhala čnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 
(9) zahrnutá kategória 5.
 Dodatok 3a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Dodatok 3b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Dodatok 3c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Dodatok 3d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Dodatok 4  
Postup, ktorý treba dodrža ť pri každej po čiatočnej koncentrácii v prípade 
aerosólov (mg/L/4 h)  
Všeobecné poznámky (  1 ) 
Pri každej po čiatočnej koncentrácii príslušné testovacie schémy, ako je uvedené 
v tejto prílohe, uvádzajú postup, ktorý je potrebné dodržiava ť. 
Dodatok 4a: Po čiatočná koncentrácia je 0,05 mg/l. 
Dodatok 4b: Po čiatočná koncentrácia je 0,5 mg/l. 
Dodatok 4c: Po čiatočná koncentrácia je 1 mg/l. 
Dodatok 4d: Po čiatočná koncentrácia je 5 mg/l. 
V závislosti od po čtu zvierat usmrtených humánnym spôsobom alebo uhynutých 
sa postup testovania uskuto čňuje podľa naznačených šípok.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) V týchto tabu ľkách je uvedený odkaz na GHS (Globálny harmonizovaný systém klasi ­
fikácie a ozna čovania chemických látok). Ekvivalentom na úrovni EÚ je nariadenie (ES) 
č. 1272/2008. V prípade akútnej inhala čnej toxicity nie je v nariadení (ES) č. 1272/2008 
(9) zahrnutá kategória 5.
 Dodatok 4a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Dodatok 4b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Dodatok 4c  
Acute inhalation toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Dodatok 4d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  ŠTÚDIA VÝVOJOVEJ NEUROTOXICITY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 426 (2007). V júni 1995 v Kodani diskutovala pracovná 
skupina OECD pre reprodukciu a vývojovú toxicitu o potrebe aktualizova ť 
existujúce usmernenia OECD na vykonávanie testov reprodukcie a vývojovej toxicity a o vypracovaní nových usmernení k sledovaným parametrom, ktoré zatia ľ nie sú zahrnuté (1). Pracovná skupina odporu čila, 
aby sa usmernenia na vykonávanie testov vývojovej neurotoxicity vypraco ­
vali na základe usmernení US EPA, ktoré boli medzi časom revidované (2). 
V júni 1996 sa v Kodani uskuto čnilo druhé konzulta čné stretnutie s cie ľom 
poskytnúť sekretariátu preh ľad nových usmernení na vykonávanie testov 
vývojovej neurotoxicity vrátane hlavných prvkov, napr. podrobností týka ­
júcich sa výberu druhov zvierat, obdobia dávkovania, obdobia testovania, sledovaných parametrov, ktoré sa majú posudzova ť, a kritérií pre hodno ­
tenie výsledkov. Usmernenia USA k posudzovaniu rizika neurotoxicity boli 
uverejnené v roku 1998 (3). V októbri 2000 sa konalo konzulta čné stret­
nutie odborníkov OECD a v nadväznosti na ň seminár Inštitútu ILSI pre 
vedecké riziká (ILSI Risk Science Institute) a v roku 2005 konzulta čné 
stretnutie odborníkov v Tokiu. Tieto stretnutia sa uskuto čnili s cieľom pred­
iskutovať vedecké a technické otázky týkajúce sa sú časných usmernení na 
vykonávanie testov a odporú čania zo stretnutí (4)(5)(6)(7) sa zoh ľadnili pri 
vypracúvaní tejto testovacej metódy. Ďalšie informácie o realizácii, inter ­
pretácii a použitej terminológii v súvislosti s touto testovacou metódou sú 
k dispozícii v usmer ňovacom dokumente OECD č. 43 o „testovaní 
a hodnotení reproduk čnej toxicity“ (8) a v usmer ňovacom dokumente 
č. 20 o „testovaní neurotoxicity“ (9).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
2. O mnohých chemikáliách je známe, že majú vývojové neurotoxické ú činky 
na ľudí a iné živo číšne druhy (10)(11)(12)(13). Na posúdenie a hodnotenie 
toxických vlastností chemikálie môže by ť potrebné ur čiť potenciál vývo ­
jovej neurotoxicity. Štúdie vývojovej neurotoxicity sú ur čené na získanie 
údajov, medzi ktoré patrí aj charakterizácia vz ťahu medzi dávkou 
a reakciou, o potenciálnych funk čných a morfologických ú činkoch na vyví ­
jajúcu sa nervovú sústavu mlá ďat, ktoré môžu súvisie ť s expozíciou v utere 
a v ranom vývojovom štádiu. 
3. Štúdiu vývojovej neurotoxicity možno vykona ť ako samostatnú štúdiu, 
zahrnutú do štúdie reproduk čnej toxicity a/alebo štúdie neurotoxicity 
u dospelých jedincov (napr. testovacie metódy B.34 (14), B.35 (15), B.43 
(16)) alebo ju priloži ť k štúdii prenatálnej vývojovej toxicity (napr. testo ­
vacia metóda B.31 (17)). Ak je štúdia vývojovej neurotoxicity zahrnutá do inej štúdie, alebo je k nej priložená, je nevyhnutné zachova ť integritu oboch 
typov štúdií. Všetky testy by mali by ť v súlade s príslušnými právnymi 
predpismi alebo vládnymi a inštitucionálnymi usmerneniami pre používanie 
laboratórnych zvierat vo výskume (napr. 18). 
4. Testovacie laboratórium by malo posúdi ť všetky dostupné informácie 
o testovanej chemikálii pred uskuto čnením štúdie. Tieto informácie zah ŕňajú 
identitu a štruktúru chemikálie, jej fyzikálno-chemické vlastnosti, výsledky 
všetkých ostatných in vitro alebo in vivo testov toxicity s chemikáliou, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných chemikáliách a predpokladané použitie(-ia) chemikálie. Tieto informácie sú potrebné, 
aby sa zainteresované strany presved čili, že test má význam pre ochranu 
zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej po čiatočnej dávky.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCÍP TESTU 
5. Testovaná chemikália sa podá zvieratám po čas gravidity a laktácie. Ú čelom 
testovania matiek je posúdi ť účinky u gravidných samíc a samíc v laktácii, 
pričom tieto testy môžu prinies ť aj komparatívne informácie (matky 
v porovnaní s mlá ďatami). Mlá ďatá sa na ú čely hodnotenia neurotoxicity 
vyberú z vrhov náhodne. Hodnotenie pozostáva z pozorovaní s cie ľom 
odhaliť makroskopické neurologické abnormality a poruchy správania 
vrátane posúdenia fyzického vývinu, behaviorálnej ontogenézy, motorickej aktivity, motorických a zmyslových funkcií, u čenia a pamäte, ako aj posú ­
denia hmotnosti mozgu a neuropatológie po čas postnatálneho vývinu 
a dospelosti. 
6. Ak sa testovacia metóda vykonáva ako samostatná štúdia, možno ďalšie 
dostupné zvieratá v každej skupine použi ť na špecifické neurobehaviorálne, 
neuropatologické, neurochemické alebo elektrofyziologické postupy, ktoré 
môžu doplni ť údaje získané z vyšetrení odporú čaných pod ľa tejto testovacej 
metódy (16)(19)(20)(21). Dodato čné postupy môžu by ť mimoriadne 
užitočné, keď empirické pozorovania, o čakávané ú činky alebo mechaniz ­
mus/pôsobenie indikujú špecifický typ neurotoxicity. Tieto dodato čné 
postupy možno použi ť v prípade matiek, ako aj mlá ďat. Okrem toho 
možno použi ť aj postupy ex vivo alebo in vitro, pokia ľ tieto postupy 
nenarúšajú integritu postupov in vivo.
 
PRÍPRAVY NA TEST  
Výber druhov zvierat  
7. Uprednost ňovaným druhom zvierat sú potkany, ak je to vhodné, môžu sa 
použiť aj iné druhy. Majte však na pamäti, že gesta čné a postnatálne dni 
uvedené v tejto testovacej metóde sú špecifické pre bežne používané kmene potkanov a ak sa použije iný druh alebo menej bežný kme ň, mali by sa 
zvoliť porovnate ľné dni. Použitie iného druhu je potrebné odôvodni ť na 
základe toxikologických, farmakokinetických a/alebo iných údajov. 
V odôvodnení sa uvedie dostupnos ť druhovo špecifických postnatálnych 
neurobehaviorálnych a neuropatologických hodnotení. Ak sa predtým usku ­
točnil test, ktorý viedol k obavám, mal by sa zváži ť druh/kme ň, ktorý tieto 
obavy vyvolal. Vzh ľadom na rozdielne vlastnosti rôznych kme ňov 
potkanov by mali by ť k dispozícii dôkazy, že vybraný kme ň, ktorý sa 
použije, má zodpovedajúcu plodnos ť a vnímavos ť. Na účely zistenia vývo ­
jovej neurotoxicity je potrebné zdokumentova ť spoľahlivosť a citlivos ť 
ostatných druhov.
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
8. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 22 ± 3 °C. Hoci 
relatívna vlhkos ť by mala by ť najmenej 30 % a pod ľa možnosti by nemala 
presiahnu ť 70 %, okrem času čistenia miestnosti, cie ľom by mala by ť 50 – 
60 % vlhkos ť. Osvetlenie by malo by ť umelé a malo by sa strieda ť 12 
hodín svetla a 12 hodín tmy. Takisto možno obráti ť svetelný cyklus pred 
párením a po celú dobu štúdie s cie ľom posúdi ť funkčné a behaviorálne 
sledované parametre po čas obdobia tmy (pri červenom svetle), t. j. v čase, 
keď sú zvieratá zvy čajne aktívne (22). Akéko ľvek zmeny cyklu striedania 
svetla a tmy by mali zah ŕňať primeraný čas na aklimatizáciu, aby sa zvie ­
ratá mohli prispôsobi ť novému cyklu. Na k ŕmenie sa môže používa ť bežné 
laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Druh krmiva 
a vody by sa mal uvies ť do správy a krmivo aj voda sa analyzujú s cie ľom 
zistiť, či neobsahujú kontaminanty.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovna ­
kého pohlavia v klietkach. Párenie sa uskuto ční v klietkach, ktoré sú 
vhodné na tento ú čel. Po spárení alebo najneskôr do 15. d ňa gravidity sa 
spárené zvieratá umiestnia do samostatných klietok ur čených na vrh alebo 
pre matky. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné 
vplyvy vzh ľadom na ich umiestnenie. Krátko pred termínom vrhu sa 
spáreným samiciam poskytne vhodný a vymedzený hniezdiaci materiál. Je všeobecne známe, že nesprávne zaobchádzanie alebo stres po čas gravidity 
môže vies ť k nežiaducim následkom, napríklad k prenatálnej strate alebo 
k zmene fetálneho alebo postnatálneho vývinu. Aby sa zabránilo strate 
plodu v dôsledku faktorov, ktoré nesúvisia so zaobchádzaním, malo by sa so zvieratami po čas gravidity zaobchádza ť starostlivo a nemali by sa vysta ­
vovať stresu v dôsledku vonkajších faktorov, akým je napr. nadmerný hluk 
zvonka.
 
Príprava zvierat  
10. Mali by sa použi ť zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali v laboratórnych 
podmienkach a neboli predmetom predchádzajúcich experimentálnych 
postupov, pokia ľ daná štúdia nie je zahrnutá do inej štúdie (pozri odsek 
3). Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kme ňa, zdroja, 
pohlavia, hmotnosti a veku. Každému zviera ťu sa pridelí jedine čné identi­
fikačné číslo, ktorým sa zviera ozna čí. Zvieratá vo všetkých pokusných 
skupinách by pod ľa možnosti mali ma ť tú istú hmotnos ť a vek a mali by 
byť v obvyklom rozsahu druhu a kme ňa, ktorý je predmetom štúdie. Na 
každú ve ľkosť dávky sa použijú mladé dospelé, panenské samice. Súro ­
denci by sa nemali pári ť a treba dôkladne dba ť na to, aby sa zabezpe čilo, že 
sa nespária. De ň gravidity 0 je de ň, keď sa pozoruje vaginálna zátka a/alebo 
spermie. Pri kupovaní zvierat od dodávate ľa, ktoré sú pod ľa časových 
údajov gravidné, by sa im mala umožni ť primeraná doba na aklimatizáciu 
(napr. 2 – 3 dni). Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolných 
a ošetrovaných skupín a pod ľa možnosti sa do týchto skupín rozdelia 
rovnomerne (na zabezpe čenie rovnomerného rozdelenia medzi všetky 
skupiny sa odporú ča napr. stratifikovaný náhodný postup, ako je rozdelenie 
na základe na telesnej hmotnosti). Samice oplodnené rovnakým samcom sa 
rovnomerne rozdelia do skupín.  
POSTUP  
Počet a pohlavie zvierat  
11. Každá pokusná a kontrolná skupina by mala obsahova ť dostatočný počet 
gravidných samíc, ktoré budú vystavené testovanej chemikálii, aby sa 
zabezpečil dostato čne veľký počet mláďat na účely hodnotenia neurotoxi ­
city. Pre každú úrove ň dávky sa odporú ča celkom 20 vrhov. Duplicitné 
dávkovanie a dávkovanie rozložené do skupín je povolené, ak sa dosiahne 
celkový po čet vrhov na skupinu, a v prípade replikátov sa použijú prime ­
rané štatistické modely. 
12. Na 4. postnatálny de ň (4. PND) alebo skôr (de ň pôrodu je 0. PND) sa 
veľkosť každého vrhu upraví tak, že mlá ďatá navyše sa náhodne odoberú, 
aby sa zabezpe čila jednotná ve ľkosť vrhu v prípade všetkých vrhov (23). 
Veľkosť vrhu by nemala prekro čiť priemernú ve ľkosť vrhu kme ňa použi­
tých hlodavcov (8 – 12). Vo vrhu by sa mal pod ľa možnosti nachádza ť 
rovnaký po čet samčích a sami čích mláďat. Selektívne odstránenie mlá ďat, 
napr. na základe telesnej hmotnosti, nie je vhodné. Po štandardizácii vrhov (utratení) a pred ďalším testovaním funk čných sledovaných parametrov sa 
jednotlivé mlá ďatá, ktoré sa majú testova ť pred odstavením alebo po odsta ­
vení od matky, jednozna
čne identifikujú s využitím akejko ľvek vhodnej 
humánnej metódy na identifikáciu mlá ďat (napr. 24).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Zaradenie zvierat na funk čné a behaviorálne testy, váženie mozgu 
a neuropatologické hodnotenia  
13. Táto testovacia metóda umož ňuje rôzne prístupy, pokia ľ ide o zaradenie 
zvierat vystavených chemikálii v utere a prostredníctvom laktácie na funkčné a behaviorálne testy, ur čenie pohlavnej zrelosti, hmotnosti mozgu 
a neuropatologické hodnotenie (25). Ďalšie testy neurobehaviorálnych 
funkcií (napr. sociálneho správania), neurochémie alebo neuropatológie 
možno prida ť v závislosti od jednotlivých prípadov, pokia ľ sa tým nenaruší 
integrita pôvodných požadovaných testov. 
14. Z každej dávkovej skupiny sa na 4. postnatálny de ň alebo neskôr vyberú 
mláďatá a priradia sa na ú čely hodnotení sledovaných parametrov. Mlá ďatá 
by sa mali vybra ť tak, aby boli v prípade všetkých testov pod ľa možnosti 
z každého vrhu v každej dávkovej skupine rovnako zastúpené obe pohlavia. 
Na účely testovania motorickej aktivity sa testuje rovnaký pár sam čích 
a samičích mláďat všetkých vekových skupín pred odstavením od matky 
(pozri odsek 35). Pri všetkých ostatných testoch sa rovnaké alebo samo ­
statné páry samcov a samíc môžu priradi ť na rôzne behaviorálne testy. Na 
účely testovania kognitívnych funkcií odstavených mlá ďat v porovnaní 
s dospelými jedincami môže by ť potrebné priradi ť rôzne mlá ďatá, aby sa 
predišlo chybnej interpretácii v dôsledku veku zvierat a predchádzajúcich skúseností s týmito meraniami (26)(27). Pri odstavení od matky (21. postna ­
tálny deň) sa mlá ďatá, ktoré neboli vybrané na testovanie, humánnym 
spôsobom utratia. Akéko ľvek zmeny v zaradení mlá ďat sa uvedú do správy. 
Štatistická merná jednotka je vrh (alebo matka), nie mlá ďa. 
15. Existujú rôzne spôsoby, ako priradi ť mláďatá na účely vyšetrení pred odsta ­
vením a po odstavení od matky, kognitívnych testov, patologických vyšet ­
rení atď. (všeobecná schéma je uvedená na obrázku 1 a príklady priradenia 
v dodatku 1). Odporú čaný minimálny po č
et zvierat v každej dávkovej 
skupine na ú čely vyšetrení pred odstavením a po odstavení od matky je 
tento: 
Klinické vyšetrenia a telesná hmotnos ť Všetky zvieratá 
Podrobné klinické vyšetrenia 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Hmotnosť mozgu (po fixácii) 11. – 22. 
PND 10/pohlavie (1/vrh) 
Hmotnosť mozgu (bez fixácie) ~ 70. PND 10/pohlavie (1/vrh) 
Neuropatológia (fixácia ponorením alebo 
perfúziou) 11 – 22. PND 10/pohlavie (1/vrh) 
Neuropatológia (fixácia perfúziou) ~ 70. 
PND 10/pohlavie (1/vrh) 
Pohlavná zrelos ť 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) 
Iné vývojové medzníky (nepovinné) Všetky zvieratá Behaviorálna ontogenéza 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) Motorická aktivita 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) 
Motorické a zmyslové funkcie 20/pohlavie (1/pohlavie/vrh) 
Učenie a pamä ť 10/pohlavie (
 a ) (1/vrh)  
( a ) V závislosti od citlivosti testov kognitívnych funkcií by sa malo zváži ť vyšetrenie 
oveľa väčšieho počtu zvierat, napr. 1 samca a 1 samice z každého vrhu (prira ­ 
ďovanie zvierat je uvedené v dodatku 1) ( ďalšie usmernenia o ve ľkosti vzorky sa 
uvádzajú v usmer ňovacom dokumente OECD č. 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dávkovanie  
16. Použijú sa aspo ň tri veľkosti dávok a uskuto ční sa paralelná kontrola. 
Dávky sa rozložia tak, aby sa toxické ú činky zvyšovali. Ak tomu nebráni 
fyzikálno-chemický charakter alebo biologické vlastnosti chemikálie, zvolí sa najvyššia úrove ň dávky s cie ľom vyvola ť určitú toxicitu u matiek (napr. 
klinické príznaky, zníženie prírastku telesnej hmotnosti (nie viac ako 10 %) 
a/alebo známky toxicity limitnej dávky v cie ľovom orgáne). Vysoká dávka 
môže byť až na niektoré výnimky limitovaná na 1000 mg/kg/de ň telesnej 
hmotnosti. Napríklad o čakávaná expozícia ľudí môže indikova ť, že je 
potrebné použi ť vyššiu úrove ň dávkovania. Prípadne možno vykona ť 
pilotné štúdie alebo prípravné štúdie na zistenie rozsahu najvyššej dávky, 
ktorá by mala vyvola ť minimálnu úrove ň toxicity u matiek. Ak štandardná 
štúdia vývojovej toxicity alebo pilotná štúdia preukáže, že testovaná chemi ­
kália spôsobuje vývojovú toxicitu, najvyššia dávka by mala by ť maximálna 
úroveň dávky, ktorá nespôsobí nadmernú toxicitu u mlá ďat alebo v utere, 
smrť alebo malformácie plodu v takom rozsahu, ktorý znemožní zmysluplné 
hodnotenie neurotoxicity. Najnižšia úrove ň dávky by mala by ť taká, aby 
nevyvolala žiadne príznaky toxicity u matiek alebo vývojovej toxicity 
vrátane neurotoxicity. Klesajúca postupnos ť dávok sa zvolí tak, aby sa 
preukázala každá reakcia súvisiaca s dávkou a hladina bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL), alebo sa použijú dávky blízko detek čného 
limitu, ktorý by umožnil stanovi ť referenčnú dávku. Dvojnásobné až štvor ­
násobné intervaly sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania 
a pridanie štvrtej dávkovej skupiny je často vhodnejšie ako používanie 
veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami. 
17. Pri výbere úrovní dávok sa zoh ľadnia všetky existujúce údaje o toxicite, 
ako aj ďalšie informácie o metabolizme a toxikokinetike testovanej chemi
­
kálie alebo príbuzných materiálov. Tieto informácie môžu pomôc ť aj pri 
preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania. Priame dávkovanie u mlá ďat 
by sa malo zváži ť z hľadiska expozície a farmakokinetických informácií 
(28)(29). Pred vykonaním štúdií s priamym dávkovaním by sa mali dôkladne posúdi ť všetky výhody a nevýhody (30). 
18. Súbežnou kontrolnou skupinou je zdanlivo ošetrovaná kontrolná skupina 
alebo kontrolná skupina, ktorej sa podáva nosi č, ak sa pri podávaní testo ­
vanej chemikálie používa nosi č. Všetkým zvieratám sa bežne podá rovnaké 
množstvo testovanej chemikálie alebo nosi ča podľa telesnej hmotnosti. Ak 
sa použije nosi č alebo iné aditívum na u ľahčenie dávkovania, je potrebné 
zvážiť tieto vlastnosti: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo 
zadržiavanie testovanej chemikálie, ú činky na chemické vlastnosti testo ­
vanej chemikálie, ktoré môžu zmeni ť svoje toxické vlastnosti, vplyv na 
spotrebu potravy a vody alebo na stav výživy zvierat. Nosi č by nemal 
mať účinky, ktoré by mohli ma ť vplyv na interpretáciu štúdie, nemal by 
mať neurobehaviorálne toxické ú činky ani ú činky na reprodukciu alebo 
vývoj. U nových nosi čov sa okrem kontrolnej skupiny nosi ča použije zdan ­
livo ošetrovaná kontrolná skupina. So zvieratami v kontrolnej(-ých) skupi ­
ne(-ách) sa zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v pokusných 
skupinách.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Podávanie dávok  
19. Testovaná chemikália alebo nosi č sa podá spôsobom, ktorý je najrelevant ­
nejší pre potenciálnu expozíciu na ľudí, a na základe dostupných informácií 
o metabolizme a distribúcii u pokusných zvierat. Spôsob podávania bude vo všeobecnosti orálny (napr. sondou, v krmive, v pitnej vode), ale možno použiť aj iné spôsoby (napr. dermálnou aplikáciou, inhaláciou) 
v závislosti od vlastností a o čakávaných alebo známych spôsobov expozície 
na ľudí (ďalšie usmernenia sú k dispozícii v usmer ňovacom dokumente 
č. 43 (8)). Výber spôsobu podávania je potrebné odôvodni ť. Testovaná 
chemikália sa podáva každý de ň približne v rovnakom čase. 
20. Dávka podávaná každému zviera ťu sa zvy čajne zakladá na naposledy 
zistenej telesnej hmotnosti. Osobitnú pozornos ť je však potrebné venova ť 
nastavovaniu dávok po čas posledného trimestra gravidity. Ak sa zaznamená 
nadmerná toxicita u ošetrených matiek, tieto zvieratá sa humánnym spôsobom usmrtia. 
21. Testovaná chemikália alebo nosi č sa podáva minimálne raz denne spáreným 
samiciam od okamihu implantácie (6. de ň gravidity) a po čas laktácie (21. 
postnatálny de ň), aby boli mlá ďatá vystavené testovanej chemikálii po čas 
prenatálneho a postnatálneho neurologického vývoja. Vek, v ktorom sa 
začínajú podáva ť dávky, trvanie a frekvencia dávkovania možno upravi ť, 
ak sa preukáže, že takéto pokusné usporiadanie má pre expozíciu na ľudí 
väčší význam. Trvanie dávkovania sa pre ostatné druhy upraví tak, aby sa 
zabezpečila expozícia po čas počiatočných fáz vývoja mozgu (t. j. fáz 
zodpovedajúcich prenatálnemu a po čiatočnému postnatálnemu vývoju 
ľudského mozgu). S dávkovaním sa môže za čať od začiatku gravidity (0. 
deň gravidity), hoci je potrebné zváži ť
 potenciál testovanej chemikálie 
spôsobiť predimplanta čnú stratu. Podávaním od 6. d ňa gravidity sa tomuto 
riziku zabráni, nezoh ľadnia sa však vývojové štádiá medzi 0. a 6. d ňom 
gravidity. Ak laboratórium nakúpi zvieratá spárené na základe časových 
údajov, nie je praktické za čať s dávkovaním na 0. de ň gravidity a je vhodné 
začať s ním na 6. de ň gravidity. Pokusné laboratórium by malo stanovi ť 
režim dávkovania na základe relevantných informácií o ú činkoch testovanej 
chemikálie, predchádzajúcich skúseností a logistických aspektov, ktoré môžu vies ť k predĺženiu dávkovania na obdobie, ke ď sa mláďa odstaví 
od matky. Dávka by sa v de ň pôrodu nemala poda ť tým zvieratám, ktoré 
ešte nevrhli všetky svoje mlá ďatá. Vo všeobecnosti sa predpokladá, že 
k expozícii mlá ďat dôjde prostredníctvom materského mlieka, priame 
dávkovanie u mlá ďat by sa však malo zváži ť v tých prípadoch, ke ď 
nemožno preukáza ť nepretržitú expozíciu mlá ďat. Dôkazy o nepretržitej 
expozícii možno získa ť napr. z farmakokinetických informácií, na základe 
toxicity u mlá ďat alebo zmien biomarkerov (28).
 
POZOROVANIA  
Pozorovania u matiek  
22. Všetky matky sa dôkladne pozorujú najmenej raz denne, a to s oh ľadom na 
ich zdravotný stav vrátane chorobnosti a úmrtnosti. 
23. Počas ošetrovania a pozorovania by sa mali pravidelne vykonáva ť podrob­
nejšie klinické vyšetrenia (najmenej dvakrát po čas dávkovania v období 
gravidity a dvakrát po čas dávkovania v období laktácie) najmenej 
u desiatich matiek pri každej úrovni dávkovania. Zvieratá mimo domácej 
klietky pozorujú školení technici, ktorí nie sú informovaní, akým spôsobom boli zvieratá ošetrené, a to s využitím štandardizovaných postupov, aby sa minimalizoval stres u zvierat a zaujatos ť pozorovate ľa a maximalizovala sa 
spoľahlivosť pozorovate ľa. Odporú ča sa, aby vyšetrovania v danej štúdii 
podľa možnosti vykonával ten istý technik.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Pozorované príznaky sa zaznamenajú. Vždy, ke ď je to možné, zaznamená 
sa aj závažnos ť pozorovaných príznakov. Klinicky sa pozorujú okrem iného 
zmeny na koži, srsti, o čiach, slizniciach, výskyt sekrétov a autonómna akti ­
vita (napr. slzenie, zježenie, ve ľkosť zreničky, nezvy čajný priebeh dýchania 
a/alebo dýchanie ústami, všetky nezvy čajné príznaky pri mo čení alebo 
vyprázdňovaní). 
25. Všetky nezvy čajné reakcie, pokia ľ ide o polohu tela, stupe ň aktivity (napr. 
zvýšený alebo znížený záujem o preskúmanie zvy čajného priestoru) 
a koordinácia pohybu, sa tiež zaznamenajú. Zmeny chôdze (napr. tackavá chôdza, ataxia), poloha (napr. zhrbená) a reaktivita na zaobchádzanie, premiestnenie alebo iné podnety z prostredia, ako aj výskyt klonických 
alebo tonických pohybov, k ŕče, triaška, stereotypy (napr. nadmerná staro ­
stlivosť o srsť, nezvyčajné pohyby hlavou, opakovaný beh dokola), zvláštne 
správanie (napr. hryzenie alebo nadmerné olizovanie, sebamrza čenie, 
chôdza dozadu, vydávanie zvukov) alebo agresia sa zaznamenajú. 
26. Zaznamenajú sa príznaky toxicity vrátane d ňa nástupu, dennej doby, stup ňa 
a trvania. 
27. Zvieratá sa v období dávkovania v priebehu štúdie vážia najmenej raz 
týždenne alebo v de ň pôrodu či krátko pred ním a na 21. postnatálny 
deň (odstavenie od matky). V prípade štúdií, v ktorých sa chemikália 
podáva sondou, sa matky vážia najmenej dvakrát týždenne. Dávky sa pri 
každom stanovení telesnej hmotnosti pod ľa potreby upravia. Spotreba 
potravy sa meria každý týžde ň prinajmenšom v období gravidity 
a laktácie. V prípade expozície prostredníctvom vody sa aspo ň raz týždenne 
meria spotreba vody.
 
Pozorovania u mlá ďat 
28. Všetky mlá ďatá sa dôkladne pozorujú najmenej raz denne, a to s oh ľadom 
na známky toxicity, chorobnos ť a úmrtnos ť. 
29. Počas ošetrovania a pozorovania by sa u mlá ďat mali pravidelne vykonáva ť 
podrobnejšie klinické vyšetrenia. Mlá ďatá (aspo ň jedno mlá ďa z každého 
pohlavia z každého vrhu) pozorujú školení technici, ktorí nie sú informo ­
vaní, akým spôsobom boli zvieratá ošetrené, a to s využitím štandardizo ­
vaných postupov, aby sa minimalizovala zaujatos ť pozorovate ľa 
a maximalizovala sa jeho spo ľahlivosť. Odporú ča sa, aby vyšetrovania 
podľa možnosti vykonával ten istý technik. Pod ľa potreby sa monitorujú 
prinajmenšom sledované parametre opísané v odsekoch 24 a 25 s oh ľadom 
na pozorované vývojové štádium. 
30. Zaznamenajú sa všetky príznaky toxicity u mlá ďat vrátane d ňa nástupu, 
dennej doby, stup ňa a trvania.  
Fyzické a vývojové medzníky  
31. Zmeny vývojových medzníkov pred odstavením (napr. odlepovanie ušných 
boltcov, otváranie o čí, prerezávanie hryzákov) majú vysokú koreláciu 
s telesnou hmotnos ťou (30)(31). Telesná hmotnos ť môže by ť najlepším 
ukazovate ľom telesného vývoja. Meranie vývojových medzníkov sa preto 
odporúča iba vtedy, ak sa predtým preukázalo, že tieto sledované parametre 
prinesú ďalšie informácie. Časový harmonogram pre hodnotenie týchto 
parametrov je uvedený v tabu ľke 1. V závislosti od o čakávaných ú činkov 
a výsledkov po čiatočných meraní môže by ť vhodné prida ť ďalšie časy 
alebo vykona ť merania v iných vývojových štádiách.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Pri posudzovaní telesného vývoja sa namiesto postnatálneho veku odporú ča 
použiť postkoitálny vek (33). Ak sa mlá ďatá testujú v de ň odstavenia od 
matky, odporú ča sa, aby sa toto testovanie vykonalo pred samotným odsta ­
vením, aby sa predišlo chybnej interpretácii v dôsledku stresu spojeného s odstavením. Okrem toho dva dni po odstavení by sa mlá ďatá nemali 
podrobova ť žiadnemu testovaniu.
 
Tabuľka 1 
Časový harmonogram hodnotenia telesných a vývojových medzníkov 
a funkčné/behaviorálne sledované parametre  ( a ) 
Vekové 
obdobie 
Sledované parametre Pred odstavením (  b ) Dospievanie (  b ) Mladé dospelé 
jedince (  b ) 
Fyzické a vývojové medzníky  
Telesná hmotnos ť 
a klinické vyšetrenia každý týžde ň ( c ) aspo ň každé dva 
týždne aspoň každé dva 
týždne 
Hmotnosť mozgu 22. PND (  d ) pri ukon čení 
Neuropatológia 22. PND (  d ) pri ukon čení 
Pohlavná zrelos ť — pod ľa potreby — 
Iné vývojové medzní ­
ky (  e ) podľa potreby — —  
Funkčné/behaviorálne sledované parametre  
Behaviorálna ontoge ­
néza Aspoň dve merania 
Motorická aktivita 
(vrátane návykov) 1 -3 razy (  f ) — raz 
Motorické a zmyslové 
funkcie — raz raz 
Učenie a pamä ť — raz raz  
( a ) V tejto tabu ľke sa uvádza minimálny po čet meraní. V závislosti od o čakávaných ú činkov a výsledkov 
počiatočných meraní môže by ť vhodné prida ť ďalšie časy (napr. u zvierat vo vysokom veku) alebo 
vykonať merania v iných vývojových štádiách. 
( b ) Odporú ča sa, aby sa mlá ďatá netestovali po čas dvoch dní po odstavení od matky (pozri odsek 32). 
Odporúčaný vek pre testovanie dospievajúcich jedincov je: na u čenie a pamä ť = 25. PND (± 2 dni); na 
motorické a zmyslové funkcie = 25. PND (± 2 dni). Odporú čaný vek pre testovanie mladých dospelých 
jedincov je 60 -70 PND. 
( c ) Telesná hmotnos ť by sa v prípade priameho dávkovania u mlá ďat mala mera ť aspoň dvakrát týždenne 
na účely úpravy dávky v období prudkého prírastku telesnej hmotnosti. 
( d ) Hmotnos ť mozgu a neuropatológiu možno hodnoti ť skôr (napr. na 11. PND), ak je to vhodné (pozri 
odsek 39). 
( e ) Okrem telesnej hmotnosti sa pod ľa potreby zaznamenajú aj ďalšie vývojové medzníky (napr. otvorenie 
očí) (pozri odsek 31). 
( f ) Pozri odsek 35.  
33. Určí sa počet a pohlavie živých mlá ďat, napr. vizuálnou kontrolou alebo 
zmeraním anogenitálnej vzdialenosti (34)(35), a každé mlá ďa v rámci vrhu 
sa jednotlivo odváži pri narodení alebo krátko po ňom, aspoň raz týždenne 
počas laktácie a potom aspo ň raz za dva týždne. Pri hodnotení pohlavnej 
zrelosti sa ur čí vek a telesná hmotnos ť aspoň jedného samca a jednej samice 
z každého vrhu v čase, keď sa u nich pozoruje vaginálna priechodnos ť (36) 
alebo oddelenie predkožky (37).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Behaviorálna ontogenéza  
34. Ontogenéza vybraného správania sa meria aspo ň u jedného mlá ďaťa 
z každého pohlavia z každého vrhu v príslušnom vekovom období, pri čom 
na hodnotenie každého správania sa po čas všetkých dní testovania použijú 
tie isté mlá ďatá. Medzi d ňami merania by mali by ť počas tohto obdobia 
rovnomerné odstupy, aby sa ur čila buď normálna zmena v ontogenéze 
daného správania, alebo zmena v ontogenéze daného správania súvisiaca 
s ošetrením (38). Medzi príklady správania, u ktorých možno hodnoti ť ich 
ontogenézu, patrí: reflex rovnováhy, negatívna geotaxia a motorická aktivita (38)(39)(40).
 
Motorická aktivita  
35. Motorická aktivita sa monitoruje (41)(42)(43)(44)(45) v období pred odsta ­
vením od matky a po čas dospelosti. Informácie o testovaní v čase odsta ­
venia od matky sa uvádzajú v odseku 32. Testy by mali trva ť dostatočne 
dlho, aby sa po čas testovania u neošetrených kontrolných skupín prejavili 
návyky. Na hodnotenie behaviorálnej ontogenézy sa dôrazne odporú ča 
použitie motorickej aktivity. Ak sa motorická aktivita použije ako test behaviorálnej ontogenézy, potom sa v rámci testovania pri všetkých 
skúškach pred odstavením od matky použijú tie isté zvieratá. Testovania 
by mali prebieha ť dostatočne často, aby bolo možné posúdi ť ontogenézu 
návykov po čas testu (44). Na tento ú čel môže by ť potrebných tri alebo viac 
období pred d ňom odstavenia vrátane d ňa odstavenia (napr. na 13., 17., 21. 
postnatálny de ň). Tie isté zvieratá alebo zvieratá z toho istého vrhu by sa 
mali testova ť aj v dospelom veku krátko pred ukon čením štúdie (napr. na 
60. - 70. postnatálny de ň). Podľa potreby môžu testovania prebieha ť aj 
počas ďalších dní. Motorická aktivita sa monitoruje automatizovaným 
prístrojom, ktorý zaznamenáva aktivitu a ktorý by mal by ť schopný dete ­
kovať zvýšenie, ako aj zníženie aktivity (t. j. základná aktivita pod ľa 
merania prístroja by nemala by ť taká nízka, aby znemož ňovala detekciu 
zníženej aktivity, ani taká vysoká, aby znemož ňovala detekciu zvýšenej 
aktivity). Každý prístroj by sa mal otestova ť štandardnými postupmi, aby 
sa v maximálnej miere zabezpe čila spoľahlivosť fungovania všetkých 
prístrojov po čas všetkých dní. Pod ľa možnosti sa ošetrené skupiny rovno ­
merne rozdelia medzi jednotlivé prístroje. Každé zviera sa testuje jednot ­
livo. Ošetrené skupiny sa rovnomerne rozdelia medzi jednotlivé 
časy testo­
vania, aby sa predišlo mätúcemu vplyvu denného rytmu aktivity. Je potrebné zaisti ť, aby boli zmeny testovacích podmienok čo najmenšie 
a aby neboli systematicky spojené s ošetrením. Medzi premenné, ktoré 
môžu ovplyvni ť mnoho ukazovate ľov správania vrátane motorickej aktivity, 
patrí hladina hluku, ve ľkosť a tvar pokusnej klietky, teplota, relatívna 
vlhkosť, svetelné podmienky, pachy, použitie domácej klietky alebo novej 
pokusnej klietky a rozptýlenie vplyvom prostredia.
 
Motorické a zmyslové funkcie  
36. Motorické a zmyslové funkcie sa podrobne vyšetria najmenej raz v období 
dospievania a raz u mladého dospelého jedinca (napr. na 60.- 70. postna ­
tálny deň). Informácie o testovaní v čase odstavenia od matky sa uvádzajú 
v odseku 32. Testovanie by malo by ť dostatočné, aby sa zabezpe čilo prime­
rané kvantitatívne vzorkovanie zmyslových modalít (napr. somatické zmyslové, vestibulárne) a motorických funkcií (napr. sila, koordinácia). Medzi príklady testov motorických a zmyslových funkcií patrí reflex skrí ­ 
ženej extenzie (46), reflex rovnováhy (47)(48), poplašná reakcia na zvukový 
podnet (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) a evokovaný potenciál (55).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 795
Testy učenia a pamäte  
37. Test asociatívneho u čenia a pamäte sa vykoná po odstavení (napr. 25. de ň 
± 2 dni) a u mladých dospelých jedincov (na 60. postnatálny de ň a neskôr). 
Informácie o testovaní v čase odstavenia od matky sa uvádzajú v odseku 
32. V týchto dvoch vývojových štádiách možno použi ť rovnaký test alebo 
samostatné testy. U odstavených a dospelých potkanov je pri výbere testov 
učenia a pamäte povolená ur čitá miera flexibility. Testy však musia by ť 
navrhnuté tak, aby sp ĺňali dve kritériá. Po prvé, u čenie sa posudzuje bu ď 
ako zmena schopnosti v priebehu viacerých opakovaných skúšok alebo testov, alebo v testoch, ktoré pozostávajú z jednej skúšky, s oh ľadom na 
podmienku, ktorou sa zabezpe čí kontrola neasociatívnych ú činkov procesu 
učenia. Po druhé, testy by okrem prvotného u čenia (nadobúdania zru čností) 
mali zahŕňať meranie pamäte (krátkodobej alebo dlhodobej); toto meranie 
pamäte však nemožno uvies ť do správy bez merania nadobúdania zru čností 
z toho istého testu. Ak testy u čenia a pamäte odhalia ú činok testovanej 
chemikálie, možno zváži ť ďalšie testy, aby sa vylú čili alternatívne inter ­
pretácie na základe zmien zmyslových, motiva čných a/alebo motorických 
schopností. Okrem dvoch uvedených kritérií sa odporú ča, aby sa test u čenia 
a pamäte vybral na základe jeho preukázanej citlivosti na triedu skúmanej 
chemikálie, pokia ľ sú takéto informácie k dispozícii v literatúre. Ak takéto 
informácie nie sú k dispozícii, medzi príklady testov, ktoré možno vykona ť 
na splnenie týchto kritérií, patrí: pasívne vyhýbanie sa (43)(56)(57), onesko ­
rená reakcia na pozíciu u dospelých potkanov (58) a nedospelých potkanov 
(59), úprava čuchových podmienok (43)(60), Morrisovo vodné bludisko 
(61)(62)(63), Bielovo bludisko alebo Cincinnati bludisko (64)(65), 8- ramenné radiálne bludisko (66), T-bludisko (43) a nadobúdanie 
a uchovávanie správania riadeného časovým harmonogramom (26)(67)(68). 
Ďalšie testy sú opísané v literatúre týkajúcej sa odstavených (26)(27) 
a dospelých potkanov (19)(20).
 
Vyšetrenie post mortem  
38. Materské zvieratá možno po odstavení mlá ďat utratiť. 
39. Neuropatologické hodnotenie mlá ďat sa vykoná s využitím tkanív 
z humánne usmrtených zvierat na 22. postnatálny de ň alebo skôr, medzi 
11. a 22. postnatálnym d ňom, a tiež pri ukon čení štúdie. U mlá ďat usmrte ­
ných na 22. postnatálny de ň sa posudzuje mozgové tkanivo; u zvierat 
usmrtených na konci sa posudzujú tkanivá centrálnej nervovej sústavy (CNS), ako aj tkanivá periférnej nervovej sústavy (PNS). Zvieratá usmrtené na 22. postnatálny de ň alebo skôr možno fixova ť ponorením alebo 
perfúziou. Zvieratá usmrtené na konci štúdie sa fixujú perfúziou. Všetky 
aspekty prípravy vzoriek tkanív, od perfúzie zvierat, po pitvu vzoriek tkanív, spracovanie tkanív a farbenie sklí čok by sa mali vykona ť podľa 
vyváženej schémy, aby každá sada obsahovala reprezentatívne vzorky 
z každej dávkovej skupiny. Ďalšie usmernenia k neuropatológii sa uvádzajú 
v usmerňovacom dokumente OECD č. 20 (9), pozri aj (103).
 
Spracovanie vzoriek tkanív  
40. Všetky makroskopické abnormality vidite ľné v čase autopsie by sa mali 
zaznamena ť. Vzorky odobratých tkanív by mali reprezentova ť všetky 
hlavné oblasti nervovej sústavy. Vzorky tkanív sa uchovávajú vo vhodnom fixačnom prostriedku a spracujú sa v súlade so štandardizovanými uverej ­
nenými histologickými protokolmi (69)(70)(71) (103). Zaliatie do parafínu 
je v prípade tkanív CNS a PNS povolené, ak sa však požaduje vyšší stupe ň
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
rozlíšenia, môže by ť vhodné použi ť osmium po fixácii spolu so zaliatím do 
epoxidu (napr. v prípade periférnych nervov pri podozrení na periférnu 
neuropatiu a/alebo pri morfometrickej analýze periférnych nervov). Mozgové tkanivo odobraté na morfometrickú analýzu sa zaleje do vhod ­
ného prostriedku pri všetkých úrovniach dávky sú časne, aby sa predišlo 
zmenšeniu bunkových štruktúr, ktoré môže súvisie ť s predĺženým sklado ­
vaním vo fixa čnom prostriedku (6).
 
Neuropatologické vyšetrenie  
41. Účelom kvalitatívneho vyšetrenia je: 
i) identifikova ť oblasti v rámci nervovej sústavy, ktoré vykazujú známky 
neuropatologických zmien; 
ii) identifikova ť typy neuropatologických zmien, ktoré sú dôsledkom expo ­
zície účinkom testovanej chemikálie; a 
iii) stanovi ť rozsah závažnosti neuropatologických zmien. 
Reprezentatívne histologické rezy zo vzoriek tkaniva pod mikroskopom 
preskúma na tento ú čel vyškolený patológ s cie ľom zistiť neuropatologické 
zmeny. Všetkým neuropatologickým zmenám sa priradí subjektívna známka 
indikujúca závažnos ť. Na hodnotenie rezov mozgu zo zvierat humánne 
usmrtených na 22. postnatálny de ň alebo skôr môže posta čovať farbenie 
hematoxylínom a eozínom. Pre rezy tkanív CNS a PNS zo zvierat usmrte ­
ných na konci štúdie sa však odporú ča farbenie myelínom (napr. luxol fast 
blue/kresyl violet) a striebrom (napr. Bielschowskeho alebo Bodianova metóda). Na základe odborného posúdenia patológa a druhu pozorovaných zmien možno zváži ť iné farbenie vhodné na identifikáciu a charakterizáciu 
osobitných typov zmien (napr. gliový fibrilárny acidický proteín (GFAP) 
alebo lektínovú histochémiu na posúdenie gliových a mikrogliových zmien (72), farbenie farbivom Fluoro-Jade na detekciu nekrózy (73)(74) alebo farbenie striebrom špecifické pre nervovú degeneráciu (75)). 
42. Malo by sa vykona ť morfometrické (kvantitatívne) hodnotenie, ke ďže tieto 
údaje môžu pomôc ť pri detekcii ú činkov spojených s ošetrením a majú 
význam pre interpretáciu rozdielov hmotnosti alebo morfológie mozgu súvi ­
siacich s aplikáciou chemikálie (76)(77). Na ú čely morfometrického hodno ­
tenia sa odoberie a pripraví nervové tkanivo. Sú časťou morfometrických 
hodnotení môžu by ť napr. lineárne alebo plošné merania špecifických 
oblastí mozgu (78). Na lineárne alebo plošné merania je potrebné použi ť 
homologické rezy, ktoré sa uvážlivo zvolia na základe spo ľahlivých mikro ­
skopických medzníkov (6). Na zistenie ú činkov v dôsledku ošetrenia 
v prípade parametrov, ako je objem alebo po čet buniek konkrétnych neuroa ­
natomických oblastí (79)(80)(81)(82)(83)(84), možno použi ť stereológiu. 
43. Mozgy sa vyšetria, aby sa zistilo, či nevykazujú známky neuropatologic ­
kých zmien súvisiacich s ošetrením, a na zabezpe čenie dôkladného vyšet ­
renia sa vhodné vzorky odoberú zo všetkých hlavných oblastí mozgu (napr. 
čuchové bulby, mozgová kôra, hipokampus, bazálne gangliá, talamus, hypo
­
talamus, stredný mozog (tectum, tegmentum a mozgové stopky), Varolov most, pred ĺžená miecha, mozo ček). Je dôležité, aby sa rezy u všetkých 
zvierat odobrali v rovnakej rovine. U dospelých jedincov humánne usmrte ­
ných na konci štúdie sa odoberú reprezentatívne vzorky rezov miechy 
a PNS. Vyšetria sa tieto oblasti: oko s o čným nervom a sietnicou, zvä čšená 
miecha na kr čných a bedrových častiach, tkanivá chrbtové a dutiny, proxi ­
málny sedací nerv, proximálny tibiálny nerv (na kolene) a tibiálne vetvy 
nervu lýtkového svalu. Rezy tkanív miechy a periférnych nervov budú 
obsahova ť krížové, ako aj prie čne a pozd ĺžne rezy.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropatologické hodnotenie zah ŕňa vyšetrenie príznakov vývojového 
poškodenia nervovej sústavy (6)(85)(86)(87)(88)(89), okrem bunkových 
zmien (napr. neuronálna vakuolizácia, degenerácia, nekróza) a zmeny tkanív (napr. glióza, leukocytová infiltrácia, tvorba cýst). V tejto súvislosti je dôležité, aby sa ú činky v dôsledku ošetrenia odlíšili od bežných vývojových 
udalostí, o ktorých je známe, že sa vyskytujú vo vývinovom štádiu, ktoré 
zodpovedá dobe utratenia (90). Príklady významných zmien, ktoré sved čia 
o narušení vývoja, zah ŕňajú nielen: 
— zmeny makroskopickej ve ľkosti alebo tvaru čuchových bulbov, mozgu 
alebo mozo čka, 
— zmeny relatívnej ve ľkosti rôznych oblastí mozgu vrátane zmenšenia 
alebo zvä čšenia oblastí v dôsledku straty alebo pretrvávania bežne 
prechodných populácií buniek alebo axonálnych projekcií (napr. vonkajšia zárodo čná vrstva mozo čka, kalózne teleso), 
— zmeny proliferácie, migrácie a diferenciácie, ako indikujú oblasti 
nadmernej apoptózy alebo nekrózy, zhluky alebo rozptýlené populácie 
ektopických, dezorientovaných alebo poškodených neurónov alebo zmeny relatívnej ve ľkosti rôznych vrstiev kortikálnych štruktúr, 
— zmeny štruktúr myelinizácie vrátane celkového zmenšenia alebo zmeny 
zafarbenia myelinizovaných štruktúr, 
— známky hydrocefalu, najmä zvä čšenie dutín, stenóza Sylviovho kanálika 
a stenčenie mozgových hemisfér.
 
Analýza vz ťahu medzi dávkou a reakciou v prípade neuropatologic ­
kých zmien  
45. Na kvalitatívne a kvantitatívne neuropatologické analýzy sa odporú ča tento 
postup. Najprv sa porovnajú rezy zo skupiny s vysokou dávkou s rezmi 
z kontrolnej skupiny. Ak zvieratá zo skupiny s vysokou dávkou nejavia známky neuropatologických zmien, ďalšia analýza nie je potrebná. Ak sa 
v skupine s vysokou dávkou zistia neuropatologické zmeny, potom sa 
vyšetria zvieratá zo skupiny so stredne ve ľkou dávkou a s vysokou dávkou. 
Ak je skupina s vysokou dávkou ukon čená v dôsledku smrti alebo inej 
neobjasnenej toxicity, skupiny s vysokou a stredne ve ľkou dávkou sa 
podrobia analýze na neuropatologické zmeny. Ak sa v skupinách 
s nižšími dávkami prejavia známky neurotoxicity, tieto skupiny sa podrobia 
neuropatologickej analýze. Ak sa pri kvalitatívnom alebo kvantitatívnom vyšetrení zistia akéko ľvek neuropatologické zmeny v dôsledku ošetrenia, 
určí sa výskyt v závislosti od dávky, frekvencia a stupe ň závažnosti poško ­
dení alebo morfometrických zmien, a to na základe hodnotenia všetkých 
zvierat zo všetkých dávkových skupín. Do tohto hodnotenia sa zahrnú všetky oblasti mozgu, ktoré vykazujú známky neuropatologických zmien. Pri každom type poškodenia sa uvedú charakteristiky používané na vyme ­
dzenie jednotlivých stup ňov závažnosti a vlastnosti používané na rozlíšenie 
jednotlivých stup ňov. Frekvencia jednotlivých typov poškodení a ich závaž ­
nosti sa zaznamená a vykoná sa štatistická analýza, ktorá vyhodnotí povahu vzťahov medzi dávkou a reakciou. Odporú ča sa použi ť kódované sklí čka 
(91).
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
46. Údaje sa do správy uvedú jednotlivo a zhrnú sa v tabu ľke, pričom pri 
každej pokusnej skupine sa uvedú typy zmien a po čet matiek, mlá ďatá 
podľa pohlavia a vrhy pri jednotlivých typoch zmien. Ak u mlá ďat došlo 
k priamej postnatálnej expozícii, do správy sa uvedie spôsob, trvanie a čas 
expozície.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Hodnotenie a interpretácia výsledkov  
47. Štúdia vývojovej neurotoxicity prinesie informácie o ú činkoch opakovanej 
expozície ú činkom chemikálie  in utero  a v po čiatočnom postnatálnom 
vývojovom štádiu. Ke ďže dôraz sa kladie tak na všeobecnú toxicitu, ako 
aj vývojovú neurotoxicitu, výsledky štúdie umožnia rozlíšenie medzi ú čin­
kami na neurologický vývoj, ktoré sa vyskytnú pri neprítomnosti všeo ­
becnej toxicity u matky, a ú činkami, ktoré sa prejavujú iba pri dávkach, 
ktoré sú toxické aj pre materské zviera. Vzh ľadom na zložité vzájomné 
súvislosti medzi plánom štúdie, štatistickou analýzou a biologickou významnos ťou údajov je sú časťou primeranej interpretácie údajov 
o vývojovej neurotoxicite aj odborný posudok (107)(109). Interpretácia 
výsledkov testov by mala by ť založená na prístupe váhy dôkazov 
(20)(92)(93)(94). Štruktúra behaviorálnych alebo morfologických nálezov, pokiaľ sú prítomné, ako aj dôkazy o vz ťahu medzi dávkou a reakciou sa 
rozoberú. Údaje zo všetkých štúdií, ktoré majú význam pre hodnotenie 
vývojovej neurotoxicity, vrátane epidemiologických štúdií u ľudí alebo 
kazuistík a experimentálnych štúdií na zvieratách (napr. toxikokinetické údaje, informácie o vz ťahu medzi štruktúrou a aktivitou, údaje z iných 
štúdií toxicity) sa zahrnú do tejto charakterizácie. Sem patrí vz ťah medzi 
dávkami testovanej chemikálie a prítomnos ťou/neprítomnos ťou, výskytom 
a rozsahom akýchko ľvek neurotoxických ú činkov u každého pohlavia 
(20)(95). 
48. Súčasťou hodnotenia údajov by mala by ť diskusia o biologickej 
a štatistickej významnosti. Štatistickú analýzu treba vníma ť ako nástroj, 
ktorý usmer ňuje, nie ur čuje interpretáciu údajov. Chýbajúca štatistická 
významnos ť by nemala by ť jediným dôvodom pre vyvodenie záveru 
o účinku v dôsledku nepodania chemikálie, rovnako ako by štatistická 
významnos ť nemala by ť jediným odôvodnením pre vyvodenie záveru 
o účinku v dôsledku podania chemikálie. S cie ľom zabezpe č
iť sa proti 
možným falošným negatívnym zisteniam a vnútorným problémom pri 
„dokazovaní negatívneho vz ťahu“ je potrebné prediskutova ť dostupné pozi ­
tívne a historické kontrolné údaje, najmä ak podanie chemikálie nevyvolá žiadne ú činky (102)(106). Pravdepodobnos ť falošných pozitívnych 
výsledkov by sa mala prediskutova ť so zrete ľom na celkové štatistické 
hodnotenie údajov (96). Hodnotenie by sa malo týka ť aj vzťahu medzi 
pozorovanými neuropatologickými a behaviorálnymi zmenami, pokia ľ 
takýto vz ťah existuje. 
49. Všetky výsledky sa analyzujú s využitím štatistických modelov, ktoré sú 
primerané experimentálnej schéme (108). Výber parametrickej alebo nepa ­
rametrickej analýzy je potrebné odôvodni ť vzhľadom na faktory, ako je 
povaha údajov (transformovaných alebo netransformovaných) a ich distri ­
búcia, ako aj relatívna spo ľahlivosť zvolenej štatistickej analýzy. Ú čel 
a plán štúdie by mali usmer ňovať výber štatistických analýz, aby sa mini ­
malizovali chyby typu I (falošné pozitívne) a typu II (falošné negatívne) (96)(97)(104)(105). V prípade vývojových štúdií využívajúcich multiparitné druhy, pri ktorých sa testuje viacero mlá ďat z jedného vrhu, by sa do 
štatistického modelu mal zahrnú ť vrh, aby sa predišlo zvýšenej chybovosti 
typu I (98)(99)(100)(101). Štatistickou mernou jednotkou by mal by ť vrh, 
nie mláďa. Pokusy by mali by ť navrhnuté tak, aby sa mlá ďatá z toho istého 
vrhu nevyšetrovali nezávisle od seba. Každý sledovaný parameter, ktorý sa 
u toho istého objektu nameria opakovane, sa podrobí analýze s využitím 
štatistických modelov, ktoré zaru čia, že tieto merania nebudú od seba 
navzájom nezávislé.
 
Správa o teste  
50. Správa o teste obsahuje tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje vrátane zdroja,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— čistota prípravku a známe a/alebo o čakávané ne čistoty.  
Nosič (v prípade potreby):  
— odôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda alebo fyziologický 
roztok.  
Pokusné zvieratá:  
— použité druhy a kmene a odôvodnenie použitia druhov iných ako 
potkany, 
— dodávate ľ pokusných zvierat, 
— počet, vek na za čiatku testu a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo, voda at ď., 
— hmotnosti jednotlivých zvierat na za čiatku testu.  
Podmienky testovania:  
— odôvodnenie výberu úrovne dávok, 
— odôvodnenie spôsobu podávania a časového trvania, 
— špecifikácia podávaných dávok, vrátane údajov o nosi či, objeme 
a fyzikálnej forme podávaného materiálu, 
— údaje o príprave testovanej chemikálie/krmiva, dosiahnutých koncentrá ­
ciách, stabilite a homogenite prípravku, 
— metóda použitá na jednozna čnú identifikáciu matiek a mlá ďat, 
— podrobný opis postupu randomizácie použitého na priradenie matiek do 
ošetrovaných skupín, na výber mlá ďat na utratenie a na priradenie 
mláďat do testovaných skupín, 
— údaje o podávaní testovanej chemikálie, 
— konverzia z koncentrácie testovanej chemikálie v strave/vode (ppm) 
alebo pri inhalácii na samotnú dávku (mg/kg/telesná hmotnos ť/deň), 
ak je to vhodné, 
— podmienky prostredia, 
— údaje o kvalite potravy a vody (napr. voda z vodovodu, destilovaná), — dátum za čiatku a konca štúdie.
 
Pozorovania a postupy testovania:  
— podrobný opis postupov použitých na štandardizáciu pozorovaní 
a postupov, ako aj opera čné vymedzenia pre vyhodnocovanie pozoro ­
vaní, 
— zoznam všetkých použitých postupov testovania a odôvodnenie ich 
použitia, 
— údaje o použitých behaviorálnych/funk čných, patologických, neuroche ­
mických alebo elektrofyziologických postupoch vrátane informácií 
a údajov o automatizovaných prístrojoch, 
— postupy kalibrácie a na zabezpe čenie rovnocennosti prístrojov 
a vyváženosti ošetrených skupín v postupoch testovania, 
— stručné odôvodnenie všetkých rozhodnutí zah ŕňajúcich odborné posúde ­
nie. ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Výsledky (individuálne a zhrnuté vrátane strednej hodnoty a rozptylu 
v prípade potreby):  
— počet zvierat na za čiatku štúdie a ich po čet na konci štúdie, 
— počet zvierat a vrhov použitých pri jednotlivých metódach testovania, 
— identifika čné číslo každého zviera ťa a vrh, z ktorého pochádza, 
— veľkosť vrhu a stredná hmotnos ť pri narodení pod ľa pohlavia, 
— údaje o telesnej hmotnosti a o zmene telesnej hmotnosti vrátane 
konečnej telesnej hmotnosti matiek a mlá ďat, 
— údaje o spotrebe potravy a vody, ak je to vhodné (napr. ak sa testovaná 
chemikália podáva vo vode), 
— údaje o toxikologickej reakcii pod ľa pohlavia a úrovne dávky vrátane 
známok toxicity alebo úmrtnosti, času a príčiny smrti, ak je to vhodné, 
— charakter, závažnos ť, trvanie, de ň začiatku, denná doba a následný 
priebeh podrobných klinických vyšetrení, 
— hodnotenie jednotlivých vývojových medzníkov (hmotnos ť, pohlavná 
zrelosť a behaviorálna ontogenéza) v každom období vyšetrenia, 
— podrobný opis všetkých behaviorálnych, funk čných, neuropatologic ­
kých, neurochemických, elektrofyziologických nálezov pod ľa pohlavia, 
ako aj zvýšeného alebo zníženého výskytu u kontrolných skupín, 
— pitevné nálezy, 
— hmotnos ť mozgu, 
— všetky diagnózy vyvodené na základe neurologických známok 
a poškodení vrátane ochorení alebo podmienok, ktoré sa vyskytnú 
prirodzene, 
— snímky exemplárnych nálezov, 
— snímky vytvorené pri nízkej spotrebe na posúdenie homológie rezov 
použitých pri morfometrii, 
— údaje o absorpcii a metabolizme vrátane dopl ňujúcich údajov zo samo ­
statnej toxikokinetickej štúdie, ak je k dispozícii, 
— štatistické spracovanie výsledkov vrátane štatistických modelov použi ­
tých na analýzy údajov a výsledky bez oh ľadu na ich významnos ť, 
— zoznam pracovníkov, ktorí sa zú častnili štúdie, a odborná príprava.  
Rozbor výsledkov:  
— údaje o vz ťahu medzi dávkou a reakciou pod ľa pohlavia a skupiny, 
— vzťah medzi inými toxickými ú činkami pre výsledné posúdenie neuro ­
toxického potenciálu testovanej chemikálie pod ľa pohlavia a skupiny, 
— vplyv akýchko ľvek toxikokinetických informácií na výsledné posúdenie, 
— podobnosti ú činkov s ú činkami akýchko ľvek známych neurotoxických 
látok,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— údaje, ktoré preukazujú spo ľahlivosť a citlivos ť testovacej metódy (t. j. 
pozitívne a historické kontrolné údaje), 
— vzťah medzi neuropatologickými a funk čnými účinkami, ak existuje, 
— NOAEL alebo referen čná dávka pre matky a mlá ďatá podľa pohlavia 
a skupiny.  
Závery:  
— rozbor celkovej interpretácie údajov na základe výsledkov vrátane 
výsledného posúdenia, či testovaná chemikália viedla k vývojovej 
neurotoxicite a NOAEL alebo nie.  
LITERATÚRA  
1. OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Koda ň, Dánsko, 13.-14. jún 
1995. 
2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupné na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/]. 
3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Dostupné na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordi ­
splay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479]. 
4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79 - 91. 
5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111. 
6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93 - 100. 
7. OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23. 
-25. október 2000. 
8. OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on 
Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Repro ­
ductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, 
Paríž. Júl 2008 Dostupné na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/ 
displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en]. 
9. OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Paríž, September 2003. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_ 1916054_1_1_1_1,00.html]. 
10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292. 
11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188 - 197. 
13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York. 
14. Kapitola B.34 tejto prílohy, One-generation reproduction toxicity study. 
15. Kapitola B.35 tejto prílohy, Two-generation reproduction toxicity study. 16. Kapitola B.43 tejto prílohy, Neurotoxicity Study in Rodents. 17. Kapitola B.31 tejto prílohy, Prenatal developmental toxicity study. 
18. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 
2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely Ú. v. EÚ L 276, 
20.10.2010, s. 33. 
19. WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupné na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm]. 
20. WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Ženeva. Dostupné na: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm]. 
21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1
 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York. 
22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499 - 509. 
23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2 - 6. 
24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110 -112. 
25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of 
a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 
13:118 -136. 
26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey. 
27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Peri­
natal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando. 
28. Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC. 
29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87 - 94. 
30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4. 
31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use. 
32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433 - 439.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449 - 457. 
34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. 
Reprod. Toxicol., 13:383-390. 
35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. 
Toxicol. Sci., 58:350 - 365. 
36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579 - 586. 
37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. 
A Literature Review. Reprod., 17:298 -303. 
38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489 -95. 
39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896 - 920. 
40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, s. 67 -100. 
41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53 - 66. 
42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, s. 37 - 82. 
43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117 - 129. 
44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247 - 260. 
45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological asse ­
ssments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599 - 609. 
46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405 - 411. 
47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64:661 - 669. 
48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589 - 591. 
49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 287-351 
50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181- 211.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199 -211. 
53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25 - 30. 
54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437 - 445. 
55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. s. 125 - 145. 
56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321 - 332. 
57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247 -296. 
58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237 - 244. 
59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98 -105. 
60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465 - 479. 
61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47 - 60. 
62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29 - 69. 
63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60 - 90. 
64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235 - 241. 
65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387 - 399. 
66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327 - 332. 
67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342 - 352. 
68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol ., 36:338 –341. 
69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: 
A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122 - 131. 
70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, s. 84 - 107. 
71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5
 th edition, Churchill Livingstone, Londýn.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291 - 304. 
73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123 - 130. 
74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365 - 372. 
75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and 
physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545 - 561. 
76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745 - 755. 
77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain 
after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417 - 432. 
78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129 – 135. 
79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York. 
80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: 
A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 
305 - 310. 
81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262 - 268. 
82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707 - 710. 
83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51 - 61. 
84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813 – 831. 
85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113 - 121. 
86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294-298. 
87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slik­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3 - 41. 
88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70 - 74.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056 – 1060. 
90. Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin. 
91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. 
Let., 63:127 - 133. 
92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401 405. 
93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A. 
94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274 - 56322. 
95. Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. 
96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113 - 126. 
97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21 - 27. 
98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329 - 
335. 
99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165 - 172. 
100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221 - 228. 
101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. 
Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587 - 90. 
102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345 - 352. 
103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. 
(2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in 
developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296 - 313. 
104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 
14(3):205 - 210. 
105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295 - 301. 
106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266 - 287. 
107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288 - 325.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326 - 348. 
109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349 - 381.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Obrázok 1.  
Všeobecná schéma testovania pre funk čné/behaviorálne testy, neuropatologické hodnotenie 
a určenie hmotnosti mozgu. Tento diagram vychádza z opisu v odsekoch 13 - 15 (PND = 
postnatálny de ň). Príklady priradenia sú uvedené v dodatku 1
  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Dodatok 1  
1. Príklady možného priradenia sú opísané a uvedené v tabu ľkách nižšie. Tieto 
príklady sú poskytnuté s cie ľom názorne poukáza ť, že existuje viacero 
rôznych spôsobov, ako priradi ť pokusné zvieratá k rôznym testovacím 
modelom.  
Príklad 1  
2. Jeden súbor 20 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy pred odstavením. 
Z týchto zvierat sa 10 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica 
z každého vrhu) humánne usmrtí na 22. postnatálny de ň. Mozog zvierat sa 
odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodnotenie. Okrem toho sa 
získajú údaje o hmotnosti mozgov pod ľa mozgov zo zvyšných 10 samcov 
a 10 samíc pri každej úrovni dávky. 
3. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na funk čné/behaviorálne testy po odstavení (podrobné 
klinické vyšetrenia, motorická aktivita, testovanie poplašnej reakcie na zvukový podnet a kognitívnych funkcií u dospievajúcich jedincov) a hodnotenie veku pohlavnej zrelosti. Z týchto zvierat sa na konci štúdie 
(približne na 70. postnatálny de ň) podá 10 zvieratám/pohlavie/dávku (t. j. 1 
samcovi alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. Po ďalšom fixovaní in-situ sa mozog odoberie a spracuje pre 
neuropatologické hodnotenie. 
4. Na testovanie kognitívnych funkcií u mladých dospelých jedincov 
(napríklad na 60. - 70. postnatálny de ň) sa použije tretí súbor 20 mlá ďat/ 
pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého vrhu). Z týchto zvierat sa na konci štúdie 10 zvierat/pohlavie/dávku (1 samec alebo 1 samica 
z každého vrhu) usmrtí a mozog sa odoberie a odváži. 
5. Zvyšných 20 zvierat/pohlavie/skupinu je vyhradených pre možné ďalšie 
testy.
 
Tabuľka 1  
Mláďa č. ( a ) Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
1 5 20 samcov + 20 
samíc Behaviorálna ontogenéza 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu na 22. PND 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť mozgu na 22. PND 
2 6 20 samcov + 20 
samíc Podrobné klinické vyšetrenia 
20 samcov + 20 
samíc Motorická aktivita 
20 samcov + 20 
samíc Pohlavná zrelos ť 
20 samcov + 20 
samíc Motorické a zmyslové funkcie 
20 samcov + 20 
samíc Učenie a pamä ť (25. PND) 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu u mladých 
dospelých jedincov ~70. PND  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Mláďa č. ( a ) 
Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
3 7 20 samcov + 20 
samíc Učenie a pamä ť (mladí dospelí 
jedinci) 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť mozgu u mladých 
dospelých jedincov ~ 70. PND 
4 8 — Zvieratá ur čené ako náhrada 
alebo na ďalšie testy  
( a ) V tomto príklade sú vrhy zredukované na 4 samcov + 4 samice; sam čie mláďatá sú 
označené číslami 1 až 4, sami čie mláďatá číslami 5 až 8.  
Príklad 2  
6. Jeden súbor 20 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy pred odstavením. Z týchto zvierat sa 10 mlá ďat/pohlavie/dávku (1 samec alebo 1 samica 
z každého vrhu) humánne usmrtí na 11. postnatálny de ň. Mozog zvierat 
sa odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodnotenie. 
7. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (1 samec a 1 samica z každého vrhu) 
sa použije na vyšetrenie po odstavení (podrobné klinické vyšetrenia, moto ­
rická aktivita, hodnotenie veku pohlavnej zrelosti a motorických 
a zmyslových funkcií). Z týchto zvierat sa na konci štúdie (približne na 70. postnatálny de ň) podá 10 zvieratám/pohlavie/dávku (t. j. 1 samcovi 
alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. 
Po ďalšom fixovaní in situ sa mozog odoberie, odváži a spracuje pre 
neuropatologické hodnotenie. 
8. Na testovanie kognitívnych funkcií u dospievajúcich a mladých dospelých 
jedincov sa použije 10 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica 
z každého vrhu). Na testovanie kognitívnych funkcií na 23. postnatálny de ň 
a u mladých dospelých jedincov sa použijú rôzne pokusné zvieratá. Na konci sa 10 zvierat/pohlavie/skupinu, ktoré boli testované ako dospelé 
jedince, usmrtí a ich mozog sa odoberie a odváži. 
9. Zvyšných 20 zvierat/pohlavie/skupinu, ktoré neboli vybrané pre testovanie, 
sa usmrtí a vyradí pri odstavení.
 
Tabuľka 2  
Mláďa č. ( a ) Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
1 5 20 samcov + 20 
samíc Behaviorálna ontogenéza 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu na 11. PND 
2 6 20 samcov + 20 
samíc Podrobné klinické vyšetrenia 
20 samcov + 20 
samíc Motorická aktivita 
20 samcov + 20 
samíc Pohlavná zrelos ť 
20 samcov + 20 
samíc Motorické a zmyslové funkcie 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu u mladých dospelých jedincov ~70. PND
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Mláďa č. ( a ) Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
3 7 10 samcov + 10 
samíc (  b ) Učenie a pamä ť (23. PND) 
3 7 10 samcov + 10 
samíc (  b ) Učenie a pamä ť (mladí dospelí 
jedinci) 
Hmotnosť mozgu u mladých 
dospelých jedincov 
4 8 — Zvieratá usmrtené a vyradené na 
21. PND  
( a ) V tomto príklade sú vrhy zredukované na 4 samcov + 4 samice; sam čie mláďatá sú 
označené číslami 1 až 4, sami čie mláďatá číslami 5 až 8. 
( b ) Na kognitívne testy na 23. PND a u mladých dospelých jedincov sa použijú rôzne 
mláďatá (napr. párne/nepárne vrhy z celkového po čtu 20).  
Príklad 3  
10. Jeden súbor 20 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na hodnotenie hmotnosti a neuropatológie mozgu na 11. 
postnatálny de ň. Z týchto zvierat sa 10 mlá ďat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec 
alebo 1 samica z každého vrhu) humánne usmrtí na 11. postnatálny de ň 
a mozog zvierat sa odoberie, odváži a spracuje pre histopatologické hodno ­
tenie. Okrem toho sa získajú údaje o hmotnosti mozgov pod ľa mozgov zo 
zvyšných 10 samcov a 10 samíc pri každej úrovni dávky. 
11. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na testovanie behaviorálnej ontogenézy (motorickej aktivi ­
ty), vyšetrenia po odstavení (motorická aktivita a hodnotenie veku 
pohlavnej zrelosti) a testovanie kognitívnych funkcií u dospievajúcich 
jedincov. 
12. Ďalší súbor 20 zvierat/pohlavie/dávku (t. j. 1 samec a 1 samica z každého 
vrhu) sa použije na testovanie motorických a zmyslových funkcií (poplašná rekcia na zvukový podnet) a podrobné klinické vyšetrenia. Z týchto zvierat 
sa na konci štúdie (približne na 70. postnatálny de ň) podá 10 zvieratám/ 
pohlavie/dávku (t. j. 1 samcovi alebo 1 samici z každého vrhu) anestézia a zafixujú sa použitím perfúzie. Po ďalšom fixovaní in situ sa mozog 
odoberie, odváži a spracuje pre neuropatologické hodnotenie. 
13. Ďalší súbor 20 mlá ďat/pohlavie/dávku sa použije na testovanie kognitív ­
nych funkcií u mladých dospelých jedincov (t. j. 1 samec a 1 samica 
z každého vrhu). Z týchto zvierat sa na konci štúdie 10 zvierat/pohlavie/ dávku (t. j. 1 samec alebo 1 samica z každého vrhu) usmrtí a ich mozog sa odoberie a odváži.
 
Tabuľka 3  
Mláďa č. ( a ) Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
1 5 10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu na 11. PND 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť mozgu na 11. PND 
2 6 20 samcov + 20 
samíc Behaviorálna ontogenéza (moto ­
rická aktivita) 
20 samcov + 20 
samíc Motorická aktivita 
20 samcov + 20 
samíc Pohlavná zrelos ť 
20 samcov + 20 
samíc Učenie a pamä ť (27. PND)  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Mláďa č. ( a ) Počet mláďat priradených 
na test Vyšetrenie/test 
samce samice  
3 7 20 samcov + 20 
samíc Poplašná reakcia na zvukový 
podnet (dospievajúce a mladé dospelé jedince) 
20 samcov + 20 
samíc Podrobné klinické vyšetrenia 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť/neuropatológia/ 
morfometria mozgu u mladých dospelých jedincov ~70. PND 
4 8 20 samcov + 20 
samíc Učenie a pamä ť (mladí dospelí 
jedinci) 
10 samcov + 10 
samíc Hmotnosť mozgu u mladých 
dospelých jedincov
 
( a ) V tomto príklade sú vrhy zredukované na 4 samcov + 4 samice; sam čie mláďatá sú 
označené číslami 1 až 4, sami čie mláďatá číslami 5 až 8.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Dodatok 2  
Vymedzenia pojmov  
Chemikália: látka alebo zmes 
Testovaná chemikália: akáko ľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTEROTROFICKÝ BIOLOGICKÝ TEST U HLODAVCOV: 
KRÁTKODOBÝ SKRÍNINGOVÝ TEST NA ESTROGÉNNE 
VLASTNOSTI  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie TG 440 (2007). Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cie ľom zrevidova ť existujúce usmernenia 
a vypracova ť nové usmernenia na vykonávanie testov potenciálnych endo ­
krinných disruptorov (1). Sú časťou tejto činnosti bolo vypracova ť usmer­
nenie na vykonávanie uterotrofického biologického testu u hlodavcov. Uterotrofický biologický test u hlodavcov vtedy prešiel rozsiahlym 
programom validácie, ktorého sú časťou bolo vypracovanie podrobného 
podkladového dokumentu (2)(3) a vykonanie rozsiahlych intralaboratórnych a medzilaboratórnych štúdií s cie ľom preukáza ť význam 
a reprodukovate ľnosť biologického testu s použitím silného referen čného 
estrogénu, slabých agonistov estrogénnych receptorov, silných antagonistov 
estrogénnych receptorov a negatívnej referen čnej chemikálie 
(4)(5)(6)(7)(8)(9). Testovacia metóda B.54 je výsledkom skúseností nado ­
budnutých po čas programu validácie testu a výsledkov získaných pomocou 
tohto testu s estrogénnymi agonistami. 
2. Uterotrofický biologický test je krátkodobý skríningový test, ktorý vznikol 
v 30. rokoch 20. storo čia (27)(28), a odborný výbor ho prvýkrát štandar ­
dizoval na skríning v roku 1962 (32)(35). Je založený na zvýšení hmotnosti maternice alebo uterotrofickej reakcii (pre posúdenie pozri 29). Hodnotí schopnosť chemikálie vyvola ť biologické aktivity zodpovedajúce agonistom 
alebo antagonistom prirodzených estrogénov (napr. 17 β-estradiol), na 
zistenie antagonistov sa však používa ove ľa menej ako na zistenie agonis ­
tov. Maternica reaguje na estrogény dvoma spôsobmi. Prvá reakcia je nárast hmotnosti v dôsledku nasiaknutia vody. Po tejto reakcii nasleduje hmot ­
nostný prírastok v dôsledku rastu tkaniva (30). Reakcie maternice 
u potkanov a myší sú kvalitatívne porovnate ľné. 
3. Tento biologický test slúži ako skríningový test in vivo a jeho použitie je 
potrebné posudzova ť v kontexte „Koncep čného rámca OECD na testovanie 
a hodnotenie chemikálií ako endokrinných disruptorov“ (dodatok 2). V tomto koncep čnom rámci je uterotrofický biologický test zahrnutý do 
úrovne 3 ako test in vivo poskytujúcu údaje o jednom endokrinnom mecha ­
nizme, t. j. o estrogénnych ú činkoch. 
4. Uterotrofický biologický test sa má zahrnú ť do skupiny testov in vitro a in 
vivo, ktorých cie ľom je identifikova ť chemikálie s potenciálnym pôsobením 
na endokrinný systém a v kone čnom dôsledku posúdi ť riziká pre 
ľudské 
zdravie alebo životné prostredie. Vo valida čnom programe OECD sa použili 
silní aj slabí estrogénni agonisti s cie ľom zhodnoti ť účinnosť testu pri 
identifikácii estrogénnych chemikálií (4)(5)(6)(7)(8). Okrem dobrej intrala ­
boratórnej a medzilaboratórnej reprodukovate ľnosti sa tak preukázala aj 
citlivosť postupu testovania pre estrogénnych agonistov. 
5. Pokia ľ ide o negatívne chemikálie, do valida čného programu bola zahrnutá 
iba jedna „negatívna“ referen čná chemikália, ktorej negatívne ú činky 
potvrdil uterotrofický test, ako aj testy viazania receptorov in vitro a testy receptorov, na základe testov, ktoré nesúvisia s valida čným programom 
OECD, však boli vyhodnotené dopl ňujúce údaje, ktoré tiež potvrdzujú 
špecifickos ť uterotrofického biologického testu pre skríning estrogénnych 
agonistov (16).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
6. Estrogénni agonisti a antagonisti pôsobia ako ligandy pre estrogénne recep ­
tory a a b a môžu v uvedenom poradí aktivova ť alebo bráni ť transkrip č­
nému pôsobeniu receptorov. Výsledkom môžu by ť nepriaznivé zdravotné 
riziká vrátane ú činkov na rozmnožovanie a vývoj. Existuje preto potreba 
rýchleho posudzovania a hodnotenia chemikálií ako možných estrogénnych 
agonistov a antagonistov. Afinita ligandu pre estrogénny receptor alebo 
transkripčná aktivácia reportérových génov in vitro je iba jedným 
z viacerých faktorov poukazujúcich na možné riziko, hoci má iba informa ­
tívnu hodnotu. Ďalšie faktory môžu zah ŕňať metabolickú aktiváciu 
a deaktiváciu pri vstupe do tela, distribúciu do cie ľových tkanív 
a odstránenie z tela v závislosti – aspo ň sčasti – od spôsobu podávania 
a od testovanej chemikálie. Ak z vlastností chemikálie týkajúcich sa absorpcie – distribúcie – metabolizmu – eliminácie (ADME) nevyplynuli 
príslušné informácie, vzniká potreba testova ť možné ú činky chemikálie in 
vivo za relevantných podmienok. Maternicové tkanivá reagujú na stimuláciu estrogénmi rýchlym a intenzívnym rastom, najmä u laboratórnych hlodav ­
cov, u ktorých estrálny cyklus trvá približne 4 dni. Hlodavce, najmä 
potkany, sa takisto všeobecne používajú v štúdiách toxicity na charakteri ­
záciu rizika. Preto je maternica hlodavcov vhodný cie ľový orgán na testo ­
vanie estrogénnych agonistov a antagonistov in vivo. 
7. Táto testovacia metóda je založená na protokoloch použitých pri valida čnej 
štúdii OECD, ktoré sa v intralaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách 
ukázali ako spo ľahlivé a opakovate ľné (5)(7). V sú časnosti sú k dispozícii 
dve metódy, t. j. metóda, pri ktorej sa používajú dospelé samice po ovariek ­
tómii (metóda dospelých samíc po ovx), a metóda, pri ktorej sa používajú 
nedospelé samice bez ovariektómie (metóda nedospelých samíc). 
V programe validácie testov OECD sa ukázalo, že obe metódy majú porov ­
nateľnú citlivos ť a reprodukovate ľnosť. Metóda nedospelých samíc je však 
o niečo menej špecifická, ke ďže má neporušenú os hypotalamus-hypofýza- 
gonády (HPG), zah ŕňa však vä čší rozsah vyšetrovania ako metóda dospe ­
lých samíc po ovx, pretože môže reagova ť na chemikálie, ktoré pôsobia na 
os HPG a nie len na estrogénny receptor. Os HGP za čína u potkana 
fungovať približne vo veku 15 dní. Predtým nie je možné pubertu urýchli ť
 
liečbou, napr. pomocou GnRH. Ke ď samice za čnú pohlavne dospieva ť, 
samica má pred otvorením vagíny nieko ľko tichých cyklov, ktoré nemajú 
za následok otvorenie vagíny alebo ovuláciu, ale vyskytujú sa u nej ur čité 
hormonálne výkyvy. Ak chemikália priamo alebo nepriamo stimuluje os 
HPG, výsledkom je pred časná pohlavná zrelos ť, skorá ovulácia 
a urýchlené otvorenie vagíny. Takéto ú činky nemajú iba chemikálie, ktoré 
pôsobia na os HPG, ale aj niektoré krmivá, ktoré majú vyššie hladiny metabolizovate ľnej energie ako iné a stimulujú rast a urých ľujú otvorenie 
vagíny, aj ke ď nemajú estrogénny charakter. Takéto chemikálie by 
u dospelých zvierat po ovariektómii nevyvolali uterotrofickú reakciu, pretože ich os HPG nie je funk čná. 
8. V záujme dobrých životných podmienok zvierat by sa mala uprednostni ť 
metóda, pri ktorej sa používajú nedospelé potkany, čím sa predíde chirur ­
gickej predpríprave zvierat a tiež možnému nevyužitiu zvierat, ktoré vyka ­
zujú akéko ľvek znaky za čínajúceho estrálneho cyklu (pozri odsek 30).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Uterotrofická reakcia nemá výhradne estrogénny pôvod, t. j. reakciu môžu 
vyvolať aj chemikálie, ktoré nie sú estrogénnymi agonistami alebo antago ­
nistami. Napríklad relatívne vysoké dávky progesterónu, testosterónu alebo rôznych syntetických progestínov môžu vies ť k stimula čnej reakcii (30). 
Každá reakcia sa môže histologicky analyzova ť na keratinizáciu 
a kornifikáciu vagíny (30). Pozitívny výsledok uterotrofického biologického 
testu by mal bez oh ľadu na možný pôvod reakcie zvy čajne viesť k ďalším 
opatreniam s cie ľom lepšie ho objasni ť. Ďalší dôkaz o estrogénnych ú čin­
koch by mohol vyplynú ť z testov in vitro, napríklad z testu viazania estro ­
génnych receptorov a testu transkrip čnej aktivácie, alebo z iných testov in 
vivo, napríklad z testu sami čieho pohlavného dospievania. 
10. Vzh ľadom na to, že uterotrofický biologický test slúži ako skríningový test 
in vivo, zvolený valida čný prístup splnil svoj ú čel z hľadiska oh ľadu na 
životné podmienky zvierat aj z h ľadiska stratégie viacúrov ňového testova ­
nia. Na tento ú čel sa úsilie zameralo na presnú validáciu reprodukovate ľ­
nosti a citlivosti na estrogénne ú činky – čo je hlavný problém v prípade 
mnohých chemikálií – zatia ľ čo na zložku testu týkajúcu sa antiestrogén ­
nych účinkov bolo vynaložené nepatrné úsilie. Vzh ľadom na ve ľmi obme­
dzený po čet chemikálií s jednozna čnými antiestrogénnymi vlastnos ťami 
(ktoré nie sú zakryté estrogénnymi ú činkami) sa testoval iba jeden anties ­
trogén so silným ú činkom. Preto sa táto testovacia metóda venuje estrogén ­
nemu protokolu, zatia
ľ čo protokol opisujúci režim testu so zameraním sa 
na antagonistov je sú časťou usmer ňovacieho dokumentu (37). Reproduko ­
vateľnosť a citlivos ť testu na chemikálie s čisto antiestrogénnym pôsobením 
bude jasnejšie vymedzená neskôr, ke ď bude postup testovania nejakú dobu 
v rutinnej prevádzke a identifikujú sa ďalšie chemikálie s týmto druhom 
pôsobenia. 
11. Je zrejmé, že všetky postupy využívajúce zvieratá musia by ť v súlade 
s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykoná ­
vanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú ma ť 
prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parlamentu 
a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely (38). Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu so 
zvieratami uvádza organizácia OECD (25). 
12. Podobne ako pri všetkých testoch využívajúcich živé zvieratá je dôležité 
pred začiatkom testu zabezpe čiť, aby boli údaje naozaj nevyhnutné. 
Napríklad dve podmienky, pri ktorých môžu by ť údaje potrebné, sú: 
— potenciál vysokej expozície (úrove ň 1 koncep čného rámca, dodatok 2) 
alebo známky estrogénnych ú činkov (úrove ň 2) s cie ľom skúma ť, či 
takéto účinky môžu nasta ť in vivo , 
— účinky poukazujúce na estrogénne ú činky v testoch  in vivo  na úrovni 4 
alebo 5 s cie ľom preukáza ť, že účinky sa týkali estrogénneho mecha ­
nizmu, ktorý nie je možné objasni ť pomocou testu  in vitro . 
13. Vymedzenia pojmov použité v tejto testovacej metóde sú uvedené 
v dodatku 1.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCÍP TESTU 
14. Citlivos ť uterotrofického biologického testu je založená na systéme testo ­
vania na zvieratách, v ktorom os hypotalamus-hypofýza-vaje čníky nie je 
funkčná, čo má za následok nízke hladiny endogénneho estrogénu 
v obehu. Zabezpe čí sa tak nízka východisková hmotnos ť maternice 
a maximálny rozsah reakcie na podávané estrogény. U samíc hlodavcov 
túto požiadavku sp ĺňajú dva stavy citlivosti na estrogén: 
i) nedospelé samice po odstavení a pred pubertou; a 
ii) mladé dospelé samice po ovariektómii po uplynutí dostato čného času na 
regresiu maternicových tkanív. 
15. Testovaná chemikália sa podáva denne orálnou sondou alebo podkožnou 
injekciou. Postupné dávky testovanej chemikálie sa podávajú minimálne 
dvom skupinám (usmernenie sa uvádza v odseku 33) pokusných zvierat s použitím jednej úrovne dávky pri každej skupine, pri čom chemikália sa 
podáva po dobu troch po sebe nasledujúcich dní v prípade metódy nedos ­
pelých samíc a po dobu najmenej troch po sebe nasledujúcich dní v prípade 
metódy dospelých samíc po ovariektómii. Zvieratá sa pitvú približne 24 hodín po poslednej dávke. V prípade estrogénnych agonistov sa z hľadiska štatisticky významného zvýšenia posudzuje stredná hmotnos ť 
maternice v skupinách zvierat, ktorým sa podala chemikália, v porovnaní 
so skupinou, ktorej sa podal nosi č. Štatisticky významné zvýšenie strednej 
hmotnosti maternice v pokusnej skupine v tomto biologickom teste sved čí 
o pozitívnej reakcii.
 
OPIS METÓDY  
Výber druhov zvierat  
16. Môžu sa použi ť bežne používané laboratórne kmene hlodavcov. Po čas 
validácie sa ako príklad použili potkany z kme ňa Sprague-Dawley 
a Wistar. Kmene, o ktorých je známe, že majú menej citlivú maternicu, alebo sa to o nich predpokladá, sa nepoužívajú. Laboratórium musí 
preukázať citlivosť použitého kme ňa, ako sa uvádza v odsekoch 26 a 27. 
17. Potkany a myši sa v uterotrofickom biologickom teste bežne používajú od 
30. rokov 20. storo čia. Valida čné štúdie OECD sa vykonali iba u potkanov 
vzhľadom na predpoklad, že oba druhy by mali by ť rovnocenné, a preto by 
v záujme šetrenia zdrojov a zvierat mal na celosvetovú validáciu sta čiť 
jeden druh. Potkan je druh, ktorý sa vyberá vo vä čšine štúdií reproduk čnej 
a vývojovej toxicity. Vzh ľadom na rozsiahle historické údaje o myšiach a s 
cieľom rozšíri ť rozsah pôsobnosti testovacej metódy uterotrofického biolo ­
gického testu u hlodavcov o používanie myší ako pokusného druhu sa 
vykonala menšia dopl ňujúca valida čná štúdia na myšiach (16). V súlade 
s pôvodným zámerom ušetri ť zdroje a zvieratá bol zvolený preklenovací 
prístup s obmedzeným po čtom testovaných chemikálií, zú častnených labo ­
ratórií a bez testovania kódovaných vzoriek. Z preklenovacej valida čnej 
štúdie v prípade uterotrofického biologického testu u mladých dospelých myší po ovariektómii vyplýva, že údaje získané u potkanov a myší navzájom kvalitatívne a kvantitatívne súhlasia. Ak uterotrofický biologický 
test prinesie výsledok, ktorý môže vies ť k dlhodobej štúdii, v oboch 
štúdiách sa môžu použi ť zvieratá z rovnakého kme ňa a zdroja. Preklenovací 
prístup bol obmedzený na myši po ovariektómii a správa neposkytuje podrobné údaje pre validáciu modelu nedospelých samíc, preto sa model 
nedospelých samíc v rámci rozsahu pôsobnosti sú časnej testovacej metódy 
neberie do úvahy.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. V niektorých prípadoch sa preto môžu namiesto potkanov použi ť myši. 
Výber tohto druhu je potrebné odôvodni ť na základe toxikologických, 
farmakokinetických a/alebo iných kritérií. V prípade myší môžu by ť 
potrebné zmeny v protokole. U myší je napríklad spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti vyššia ako u potkanov, preto by mal by ť 
obsah fytoestrogénu v potrave u myší nižší ako u potkanov (9)(20)(22).
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
19. Všetky postupy musia by ť v súlade s miestnymi normami starostlivosti 
o pokusné zvieratá. Tieto opisy starostlivosti a zaobchádzania predstavujú 
minimálne normy a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú ma ť 
prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parlamentu 
a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na 
vedecké ú čely (38). Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala by ť 
22 °C (v rozsahu približne ± 3 °C). Relatívna vlhkos ť by mala by ť mini­
málne 30 % a pod ľa možnosti by nemala presiahnu ť maximálnu úrove ň 
70 % okrem obdobia po čas čistenia miestnosti. Cie ľom by mala by ť rela­
tívna vlhkos ť vzduchu 50 - 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé. Pokia ľ 
ide o denný svetelný rytmus, malo by sa strieda ť 12 hodín svetla a 12 hodín 
tmy. 
20. Laboratórne krmivo a pitná voda by mali by ť k dispozícii neobmedzene. 
Mladé dospelé zvieratá môžu by ť umiestnené jednotlivo alebo v klietkach 
po skupinách do troch zvierat. Vzh ľadom na nízky vek nedospelých zvierat 
sa odporú ča umiestnenie v sociálnych skupinách. 
21. Je známe, že laboratórne krmivá s vysokou hladinou fytoestrogénov zvyšujú 
u hlodavcov hmotnos ť maternice dostato čne na to, aby mali vplyv na 
uterotrofický biologický test (13)(14)(15). V prípade použitia nedospelých zvierat môžu vysoké hladiny fytoestrogénov a metabolizovate ľnej energie 
v laboratórnych krmivách tiež vies ť k predčasnej puberte. Prítomnos ť fyto­
estrogénov predovšetkým súvisí s obsahom produktov zo sóje a lucerny 
v laboratórnych krmivách a preukázalo sa, že koncentrácie fytoestrogénov sa v rôznych šaržiach štandardného laboratórneho krmiva líšia (23). Telesná hmotnosť je dôležitou premennou, pretože množstvo skonzumovanej 
potravy súvisí s telesnou hmotnos ťou. Preto sa skuto čná dávka fytoestro ­
génu skonzumovaného z rovnakého krmiva môže v závislosti od druhu zvierat a veku líši ť (9). U nedospelých samíc potkanov môže by ť spotreba 
potravy v pomere k telesnej hmotnosti približne dvakrát vyššia ako 
u mladých dospelých samíc po ovariektómii. U mladých dospelých myší 
môže byť spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti približne štvor ­
násobne vyššia ako u mladých dospelých samíc potkanov po ovariektómii. 
22. Výsledky uterotrofického biologického testu (9)(17)(18)(19) však ukazujú, 
že obmedzené množstvá fytoestrogénov v krmive sú prijate ľné a neznižujú 
citlivosť biologického testu. Ako usmernenie slúži informácia, že hladiny 
fytoestrogénov v krmive by u nedospelých samíc potkanov z kme ňa 
Sprague Dawley a Wistar nemali prekro čiť 350 μg ekvivalentov genisteínu/ 
gram laboratórneho krmiva (6)(9). Podobné krmivá by mali by ť vhodné aj 
pri testovaní na mladých dospelých potkanoch po ovariektómii, pretože 
spotreba potravy v pomere k telesnej hmotnosti je u mladých dospelých 
jedincov v porovnaní s nedospelými zvieratami nižšia. Ak sa použijú dospelé myši po ovariektómii alebo potkany citlivejšie na fytoestrogény, je potrebné zváži ť proporcionálne zníženie hladiny fytoestrogénu 
v krmive (20). Okrem toho môžu rozdiely v dostupnej metabolickej energii 
z rôznych krmív vies ť k časovým posunom za čiatku puberty (21)(22).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Pred za čiatkom štúdie je potrebné starostlivo vybra ť krmivo bez zvýšenej 
hladiny fytoestrogénov (pre usmernenie pozri (6)(9)) alebo metabolizova ­
teľnej energie, ktorá môže znehodnoti ť výsledky (15)(17)(19)(22)(36). 
Zabezpečenie primeraného fungovania testovacieho systému použitého 
v laboratóriu pod ľa odsekov 26 a 27 predstavuje dôležitú kontrolu obidvoch 
faktorov. V súlade s dobrou laboratórnou praxou (DLP) by sa mala pre 
istotu odobra ť reprezentatívna vzorka z každej šarže krmiva podávaného 
počas štúdie na ú čely prípadnej analýzy obsahu fytoestrogénu (napr. 
v prípade vysokej hmotnosti kontrolnej maternice v porovnaní 
s historickými kontrolami alebo v prípade neprimeranej reakcie na refe ­
renčný estrogén 17alfa-etinylestradiol). Alikvotné časti by sa mali analy ­
zovať v rámci štúdie alebo zmrazené pri teplote –20 °C alebo takým spôso ­
bom, aby sa zabránilo rozkladu vzorky pred analýzou. 
24. Niektoré podstielkové materiály môžu obsahova ť prirodzene sa vyskytujúce 
estrogénne alebo antiestrogénne chemikálie (napríklad je známe, že kuku ­
ričný klas ovplyv ňuje cyklus u potkanov a pod ľa všetkého má antiestro ­
génne účinky). Hladina fytoestrogénov vo vybranej podstielke by mala by ť 
minimálna.  
Príprava zvierat  
25. Pokusné zvieratá bez známok akejko ľvek choroby alebo fyzických abnor ­
malít sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sa 
usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzh ľadom na ich 
umiestnenie. Zvieratá sa jednotlivo ozna čia. Nedospelé zvieratá by mali by ť 
počas aklimatizácie umiestnené v klietke so svojimi matkami alebo náhrad ­
nými matkami až do odstavenia. Obdobie aklimatizácie pred za čatím štúdie 
by malo u mladých dospelých zvierat a u nedospelých zvierat umiestnených spolu s matkami alebo náhradnými matkami trva ť asi 5 dní. Ak sa nedos ­
pelé zvieratá získajú ako odstavené mlá ďatá bez matiek, môže posta čovať 
na aklimatizáciu kratšie obdobie, pretože dávkovanie by sa malo za čať 
okamžite po odstavení (pozri odsek 29).
 
POSTUP  
Overovanie odbornosti laboratória  
26. Na overenie odbornosti laboratória sa môžu použi ť dve rôzne metódy: 
— pravidelné overovanie vychádzajúce z po čiatočnej východiskovej pozi ­
tívnej kontrolnej štúdie (pozri odsek 27). Aspo ň raz za 6 mesiacov 
a vždy, ke ď dôjde k zmene, ktorá môže ovplyvni ť účinnosť analýzy 
(napr. nové zloženie krmiva, zmena pracovníkov vykonávajúcich pitvy, 
zmena kme ňa zvierat alebo zmena dodávate ľa atď.), je potrebné overi ť 
citlivosť testovacieho systému (zvierací model) pomocou primeranej 
dávky (na základe základnej pozitívnej kontrolnej štúdie opísanej 
v odseku 27) referen čného estrogénu: 17a- etinylestradiol (CAS č. 57- 
63-6) (EE), 
— použitie súbežných kontrol, pri čom súčasťou každého testu bude 
skupina, ktorej sa bude podáva ť primeraná dávka referen čného estro ­
génu. 
Ak systém nereaguje pod ľa očakávania, je potrebné preskúma ť a podľa 
potreby upravi ť podmienky testovania. Odporú čaná dávka referen čného 
estrogénu, ktorá sa má použi ť pri obidvoch prístupoch, je približne ED70 
až 80.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Východisková pozitívna kontrolná štúdia  – Pred prvým vykonaním štúdie 
podľa tejto testovacej metódy je potrebné preukáza ť odbornos ť laboratória 
otestovaním citlivosti zvieracieho modelu, a to stanovením reakcie na dávku referenčného estrogénu 17a- etinylestradiol (CAS č. 57-63-6) (EE) mini ­
málne v štyroch dávkach. Reakcia na hmotnos ť maternice sa porovná 
s príslušnými historickými údajmi (pozri odkaz (5)). Ak táto východisková 
pozitívna kontrolná štúdia neprinesie o čakávané výsledky, je potrebné 
preskúma ť a upravi ť podmienky testovania.
 
Počet a stav zvierat  
28. Každá pokusná a kontrolná skupina by mala zah ŕňať aspoň 6 zvierat (na 
účely protokolov metódy nedospelých samíc, ako aj metódy dospelých 
samíc po ovx).  
Vek nedospelých zvierat  
29. V uterotrofickom biologickom teste s nedospelými zvieratami sa musí 
presne ur čiť deň narodenia. Dávkovanie by sa malo za čať dostatočne 
včas s cieľom zabezpe čiť, aby na konci podávania testovanej chemikálie 
nedochádzalo k fyziologickému nárastu endogénnych estrogénov spojenému 
s pohlavným dospievaním. Na druhej strane však existujú dôkazy, že ve ľmi 
mladé zvieratá môžu by ť menej citlivé. Pri ur čovaní optimálneho veku musí 
každé laboratórium vzia ť do úvahy svoje vlastné podkladové údaje 
o dospievaní. 
Ako všeobecné usmernenie slúži informácia, že dávkovanie u potkanov sa 
môže začať ihneď po predčasnom odstavení na 18. postnatálny de ň (dátum 
narodenia je postnatálny de ň 0). Dávkovanie by sa u potkanov malo pod ľa 
možnosti skon čiť na 21. postnatálny de ň, v každom prípade však pred 25. 
postnatálnym d ňom, pretože v tomto veku za čína byť funkčná os 
hypotalamus-hypofýza-vaje čníky a endogénne hladiny estrogénu môžu 
začať stúpať spolu s nárastom stredných hodnôt východiskovej hmotnosti 
maternice a zvýšením po čtu štandardných odchýlok v skupine 
(2)(3)(10)(11)(12).  
Postup pri ovariektómii  
30. V prípade samíc potkanov a myší po ovariektómii (v pokusných 
a kontrolných skupinách) by sa ovariektómia mala vykona ť vo veku 6 až 
8 týždňov. U potkanov by medzi ovariektómiou a prvým d ňom podávania 
malo uplynú ť minimálne 14 dní, aby sa umožnila regresia maternice na 
minimálnu stabilnú východiskovú úrove ň. U myší by medzi ovariektómiou 
a prvým d ňom podávania malo uplynú ť aspoň 7 dní. Ke ďže na produkciu 
významných hladín estrogénov v obehu sta čí malé množstvo ovariálneho 
tkaniva (3), zvieratá by sa mali pred použitím testova ť aspoň päť po sebe 
nasledujúcich dní (napr. medzi 10. - 14. d ňom po ovariektómii u potkanov) 
pozorovaním epitelových buniek získaných výterom z vagíny. Ak zvieratá 
vykazujú známky za čínajúceho estrálneho cyklu, nemali by sa použi ť. 
Neskôr je potrebné pri pitve preskúma ť zvyšky po vaje čníkoch, aby sa 
odhalili známky prítomnosti ovariálneho tkaniva. Ak sa preukáže jeho 
prítomnos ť, zviera sa nezaradí do výpo čtov (3). 
31. Postup ovariektómie sa za čína po dôkladnej anestézii zviera ťa, keď zviera 
leží na bruchu. Rez otvárajúci dorzolaterálnu brušnú stenu by mal by ť 
približne 1 cm dlhý a mal by sa za čínať v strede medzi spodnou hranicou 
rebier a lopatou bedrovej kosti, nieko ľko milimetrov bo čne od laterálneho 
okraja bedrového svalu. Vaje čníky sa odoberú z brušnej dutiny na sterilný 
podklad. Vaje čník sa odpojí v mieste, kde sa vajcovod pripája k telu mater ­
nice. Po uistení, že nedochádza k silnému krvácaniu, sa brušná stena zašije a koža uzavrie pomocou šicích svoriek alebo vhodnou sutúrou. Miesta podviazania sú schematicky znázornené na obrázku 1. Použije sa vhodná 
pooperačná analgézia pod ľa odporúčania veterinárneho lekára so skúseno ­
sťami so starostlivos ťou o hlodavce.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Telesná hmotnos ť 
32. Pri metóde dospelých samíc po ovariektómii nie je medzi telesnou hmot ­
nosťou a hmotnos ťou maternice korelácia, pretože na hmotnos ť maternice 
majú vplyv hormóny ako estrogény, nie však rastové faktory, ktoré regulujú veľkosť tela. Pri metóde nedospelých samíc telesná hmotnos ť naopak súvisí 
s hmotnos ťou maternice po čas dospievania (34). Pri metóde nedospelých 
samíc by preto váhové odchýlky u zvierat mali by ť minimálne a nemali by 
presahova ť ± 20 % strednej hmotnosti. To znamená, že chovate ľ by mal 
štandardizova ť veľkosť vrhu s cie ľom zabezpe čiť, aby boli mlá ďatá rôznych 
matiek kŕmené približne rovnako. Zvieratá sa rozdelia do skupín (kontrol ­
ných a pokusných) na základe náhodného rozloženia hmotnosti tak, že 
stredná telesná hmotnos ť každej skupiny sa od akejko ľvek inej skupiny 
štatisticky nebude odlišova ť. Je potrebné dba ť na to, aby do tej istej 
pokusnej skupiny neboli priradené zvieratá z rovnakého vrhu, pod ľa 
možnosti bez navýšenia po čtu vrhov potrebných na testovanie.
 
Dávkovanie  
33. Na ur čenie možného estrogénneho pôsobenia in vivo testovanej chemikálie 
zvyčajne posta čujú dve dávkové skupiny a jedna kontrolná, preto sa tento 
model uprednost ňuje v záujme dobrých životných podmienok zvierat. Ak je 
cieľom odvodi ť krivku závislosti reakcie od dávky alebo extrapolova ť 
nižšie dávky, sú potrebné aspo ň 3 dávkové skupiny. Ak sa vyžadujú infor ­
mácie nad rámec ur čenia estrogénneho pôsobenia (napríklad odhad ú čin­
nosti), je potrebné zváži ť iný dávkový režim. So zvieratami v kontrolnej 
skupine sa musí zaobchádza ť takisto ako so zvieratami v testovaných skupi ­
nách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosi č, kontrolná skupina dostane rovnaké 
množstvo nosi ča, aké sa použilo v pokusných skupinách (alebo najvyššie 
množstvo použité v pokusných skupinách, ak sa v jednotlivých skupinách líši). 
34. V prípade uterotrofického biologického testu je cie ľom vybra ť dávky, ktoré 
zabezpečia prežitie zvierat a ktoré nespôsobujú výraznú toxicitu alebo 
utrpenie zvierat po troch po sebe nasledujúcich d ňoch podávania chemikálie 
na úrovni maximálne 1 000 mg/kg/de ň. Pri navrhovaní a výbere úrovní 
dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-) kinetike 
testovanej chemikálie a príbuzných materiálov. Pri ur čovaní najvyššej 
dávky sa musí v prvom rade vzia ť do úvahy úrove ň LD50 a/alebo infor ­
mácie o akútnej toxicite, aby sa predišlo úhynu, ťažkému utrpeniu alebo 
bolesti zvierat (24)(25)(26). Najvyššia dávka by mala predstavova ť maxi­
málnu prípustnú dávku (MTD); prípustná je aj štúdia vykonaná s dávkou, ktorá vyvolala pozitívnu uterotrofickú reakciu. Dlhé intervaly (napr. polo ­
vica log jednotiek zodpovedajúcich progresii dávok na úrovni 3,2 alebo až 
1 log jednotky) medzi dávkami sú všeobecne prípustné. Ak nie sú 
k dispozícii žiadne vhodné údaje, môže sa vykona ť vyhľadávací test 
s cieľom stanovi ť dávky, ktoré sa použijú. 
35. Ak je prípadne možné odhadnú ť estrogénnu ú činnosť agonistu z údajov in 
vitro (alebo in silico), môžu sa tieto údaje pri výbere dávky vzia ť do úvahy. 
Napríklad množstvo testovanej chemikálie, ktorá by vyvolala uterotrofické 
reakcie ekvivalentné referen čnému agonistovi (etinylestradiolu), sa odhaduje 
na základe jej relatívnej ú činnosti in vitro na etinylestradiol. Najvyššia 
testovaná dávka by sa získala vynásobením tejto ekvivalentnej dávky 
príslušným násobkom, napr. 10 alebo 100.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Úvahy k zis ťovaniu rozsahu  
36. V prípade potreby sa na nieko ľkých zvieratách môže vykona ť predbežná 
štúdia na zistenie rozsahu. V tomto oh ľade sa môže použi ť usmerňovací 
dokument OECD č. 19 (25), v ktorom sa vymedzujú klinické príznaky 
indikujúce toxicitu alebo utrpenie zvierat. Ak je to v rámci tejto štúdie na zistenie rozsahu po troch d ňoch podávania možné, maternice sa môžu 
odobrať a odváži ť približne 24 hodín po poslednej dávke. Tieto údaje 
môžu potom pomôc ť pri plánovaní hlavnej štúdie (pri výbere prijate ľnej 
maximálnej dávky a nižších dávok a odporu čení počtu dávkových skupín).
 
Podávanie dávok  
37. Testovaná chemikália sa podáva orálnou sondou alebo podkožnou injek ­
ciou. Pri výbere spôsobu podávania je potrebné zoh ľadniť dobré životné 
podmienky zvierat a toxikologické aspekty, ako je význam pre expozíciu na ľudí (napríklad orálna sonda ako simulácia požitia, podkožná injekcia ako 
simulácia vdýchnutia alebo dermálnej absorbcie), ďalej fyzikálno-chemické 
vlastnosti testovaného materiálu a najmä existujúce toxikologické infor ­
mácie a údaje o metabolizme a kinetike (napríklad potreba predís ť metabo­
lizmu prvého prechodu, vyššia ú činnosť určitého spôsobu expozície). 
38. Podľa možnosti sa odporú ča zvážiť použitie vodného roztoku/suspenzie. 
Keďže estrogénne ligandy alebo ich metabolické prekurzory sú však 
väčšinou hydrofóbne, najbežnejším prístupom je použitie roztoku/suspenzie 
v oleji (napr. kukuri čný, arašidový, sezamový alebo olivový olej). Tieto 
oleje však majú rôzny obsah kalórií a tuku, preto by nosi č mohol ovplyvni ť 
príjem metabolizovate ľnej energie (ME) a hlavne pri metóde nedospelých 
samíc by potenciálne mohol vies ť k zmene nameraných parametrov, ako je 
napríklad hmotnos ť maternice (33). Pred za čiatkom štúdie je preto potrebné 
každý nosi č, ktorý sa použije, testova ť použitím kontrol bez nosi čov. Testo ­
vanú chemikáliu možno rozpusti ť v minimálnom množstve etanolu 
s koncentráciou 95 % alebo v inom vhodnom rozpúš ťadle a zriedi ť na 
konečné pracovné koncentrácie v testovacom nosi či. Toxické vlastnosti 
rozpúšťadla musia by ť známe a musia sa testova ť v samostatnej kontrolnej 
skupine ur čenej výhradne na testovanie rozpúš ťadla. Ak je testovaná chemi ­
kália stabilná, môže sa pri jej rozpúš ťaní použi ť jemné ohrievanie 
a intenzívne mechanické pôsobenie. Ur č
í sa stabilita testovanej chemikálie 
v nosiči. Ak je testovaná chemikália stabilná po čas celého trvania štúdie, 
môže sa pripravi ť jeden po čiatočný alikvotný podiel testovanej chemikálie 
a uvedené dávkové riedenia sa môžu pripravova ť denne. 
39. Časový harmonogram dávkovania bude závisie ť od použitého modelu 
(pozri odsek 29 pre model nedospelých samíc a odsek 30 pre model dospe ­
lých samíc po ovariektómii). Nedospelým samiciam potkanov sa podáva dávka testovanej chemikálie denne tri po sebe nasledujúce dni. Trojd ňové 
podávanie sa odporú ča aj u samíc potkanov po ovariektómii, ale prípustné 
sú aj dlhšie expozície, ktoré môžu pomôc ť pri určovaní slabo aktívnych 
chemikálií. U samíc myší po ovariektómii by malo sta čiť podávanie po čas 3 
dní, pričom v prípade silných estrogénnych agonistov neprinesie pred ĺženie 
podávania na sedem dní žiadnu významnú výhodu, vo valida čnej štúdii sa 
však tento vz ťah nepreukázal v prípade slabých estrogénov (16), preto by sa 
dávkovanie malo u dospelých myší po ovariektómii pred ĺžiť na 7 po sebe 
nasledujúcich dní.Dávku je potrebné podáva ť približne v rovnakom čase 
každý de ň. Čas podávania dávky sa pod ľa potreby upraví s cie ľom 
udržiavať konštantnú úrove ň dávky vzh ľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa 
(napríklad mg testovanej chemikálie na kg telesnej hmotnosti za de ň). 
Pokiaľ ide o aplikovaný objem, jeho variabilita na základe telesnej hmot ­
nosti sa minimalizuje upravením koncentrácie dávkového roztoku s cie ľom 
zabezpečiť konštantný objem v pomere k telesnej hmotnosti pri všetkých 
úrovniach dávok a pre všetky spôsoby podávania.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Ak je testovaná chemikália podávaná cez trubicu, musí sa to realizova ť 
v jednej dennej dávke pre zviera za použitia žalúdo čnej trubice alebo 
vhodnej intuba čnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže 
jednorazovo poda ť, závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. Je potrebné 
postupova ť podľa miestnych usmernení k starostlivosti o zvieratá, objem 
by však nemal presiahnu ť 5 ml/kg telesnej hmotnosti s výnimkou vodných 
roztokov, pri ktorých sa môže použi ť 10 ml/kg telesnej hmotnosti. 
41. V prípade podávania testovanej chemikálie pomocou podkožnej injekcie sa 
chemikália podáva v jednej dennej dávke. Dávky sa vpichujú v oblasti medzi lopatkami alebo v krížovej oblasti pomocou sterilnej ihly (napríklad veľkosť 23 G alebo 25 G) a tuberkulínovej strieka čky. Oholenie miesta 
vpichu nie je povinné. Je potrebné zaznamena ť všetky straty, únik na mieste 
vpichu alebo neúplné podanie dávky. Celkový denný vpichnutý objem na potkana by nemal presiahnu ť 5 ml/kg telesnej hmotnosti rozdelených do 2 
vpichov s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa môže použi ť 10 
ml/kg telesnej hmotnosti.
 
Pozorovania  
Všeobecné a klinické pozorovania  
42. Všeobecné klinické pozorovania je potrebné vykonáva ť aspoň raz denne a v 
prípade zistenia známok toxicity častejšie. Pozorovania sa pod ľa možnosti 
vykonávajú v rovnakom čase (časoch) každý de ň a so zrete ľom na obdobie 
najvyšších o čakávaných ú činkov po dávkovaní. U všetkých zvierat sa 
sleduje úmrtnos ť, chorobnos ť a všeobecné klinické príznaky, ako napríklad 
zmeny v správaní, na koži, kožušine, o čiach, slizniciach, výskyt sekrécie, 
exkrécie a vegetatívnej aktivity (napr. slzenie, piloerekcia, ve ľkosť zreníc, 
nezvyčajné dýchanie).  
Telesná hmotnos ť a spotreba potravy  
43. Všetky zvieratá sa musia denne váži ť s presnos ťou na 0,1 g, pri čom prvé 
váženie sa vykoná tesne pred za čatím testu, t. j. pri rozde ľovaní zvierat do 
skupín. Nepovinne možno mera ť množstvo potravy spotrebovanej po čas 
testu, a to vážením k ŕmidiel v každej klietke. Výsledky spotreby potravy 
sa vyjadria v gramoch na potkana na de ň. 
Pitva a meranie hmotnosti maternice  
44. Dvadsa ťštyri hodín po poslednom podaní dávky sa potkany humánne 
usmrtia. Ak je to možné, zvolí sa náhodné poradie pitiev zvierat zo všet ­
kých skupín, aby sa predišlo priamemu postupu jedným alebo druhým smerom pod ľa dávkových skupín, čo by mohlo mierne ovplyvni ť údaje. 
Cieľom biologického testu je zmera ť hmotnos ť maternice v mokrom aj 
vysušenom stave. Mokrá hmotnos ť zahŕňa maternicu a obsah tekutín 
z lúmenu. Vysušená hmotnos ť sa meria po vytla čení a odstránení obsahu 
lúmenu z maternice. 
45. Pred pitvou sa u nedospelých zvierat vyšetrí stav otvárania vagíny. Pitva sa 
začína otvorením brušnej steny pri za čiatku lonovej spony. Následne sa od 
dorzálnej brušnej steny oddelia rohy maternice a vaje čníky, ak sú prítomné. 
Močový mechúr a mo čovody sa odstránia z ventrálnej a laterálnej strany 
maternice a vagíny. Fibrózny zrast medzi kone čníkom a vagínou sa oddelí, 
až kým nie je možné identifikova ť spojenie vaginálneho otvoru a kože 
perinea. Maternica a vagína sa od tela oddelia prerezaním vaginálnej 
steny tesne nad spojením kože perinea, ako je znázornené na obrázku 2. 
Maternica sa od steny tela oddelí jemným prerezaním maternicového
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
okružia v bode, kde je pripojená k dorzolaterálnej strane jednotlivých rohov 
maternice po celej ich d ĺžke. Po odobratí maternice z tela sa s ňou musí 
manipulova ť dostatočne rýchlo, aby sa predišlo vysychaniu tkanív. Pri 
malých tkanivách, ako je maternica, je strata hmotnosti z dôvodu vysy ­
chania ešte závažnejšia (23). Ak sú prítomné vaje čníky, odstránia sa pri 
vajcovodoch, pri čom sa zabráni strate tekutiny z lúmenu maternicového 
rohu. Ak zviera podstúpilo ovariektómiu, preskúma sa, či zvyšky po vaje č­
níkoch neobsahujú ovariálne tkanivo. Prebyto čný tuk a spojivové tkanivá sa 
odstránia. Vagína sa oddelí od maternice tesne pod kr čkom maternice tak, 
aby kŕčok maternice zostal pripojený k telu maternice, ako je znázornené na 
obrázku 2. 
46. Každá maternica sa premiestni do jednotlivo ozna čenej a odváženej nádoby 
(napr. Petriho miska alebo plastová lodi čka na váženie), pri čom sa na ďalej 
dbá na to, aby sa predišlo vysychaniu pred vážením (napríklad sa do 
nádoby môže vloži ť filtračný papier mierne navlh čený slaným roztokom). 
Maternica s tekutinou z lúmenu sa odváži s presnos ťou na 0,1 mg (mokrá 
hmotnosť maternice). 
47. Každá maternica sa následne jednotlivo spracuje s cie ľom odstráni ť tekutinu 
z lúmenu. Obidva rohy maternice sa prepichnú alebo pozd ĺžne narežú. 
Maternica sa položí na mierne navlh čený filtra čný papier (napr. Whatman 
č. 3) a jemne sa stlá ča pomocou ďalšieho mierne navlh čeného filtra čného 
papiera s cie ľom úplne odstráni ť tekutinu z lúmenu. Po odstránení obsahu 
lúmenu sa maternica odváži s presnos ťou na 0,1 mg (vysušená hmotnos ť 
maternice). 
48. Na základe hmotnosti maternice na konci štúdie možno potvrdi ť, že nebol 
prekročený primeraný vek u nedospelých neporušených potkanov, v tomto 
ohľade sú ale rozhodujúce historické údaje o kmeni potkanov, ktoré labo ­
ratórium použilo (pozri odsek 56 pre interpretáciu výsledkov).  
Nepovinné vyšetrenia  
49. Maternica sa po odvážení môže fixova ť v 10 % neutrálnom tlmivom 
roztoku formalínu, aby sa po farbení hematoxylínom a eozínom (HE) 
mohla histopatologicky vyšetri ť. Zodpovedajúcim spôsobom sa môže vyše ­
triť aj vagína (pozri odsek 9). Okrem toho sa pre kvantitatívne porovnanie 
môže vykona ť morfometrické meranie endometriálneho epitelu.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
50. Údaje zo štúdie by mali zah ŕňať: 
— počet zvierat na za čiatku testu, 
— počet a identifikáciu zvierat, ktoré sa našli uhynuté po čas testu alebo sa 
usmrtili z humánnych dôvodov, a dátum a čas každého uhynutia alebo 
humánneho usmrtenia, 
— počet a identifikáciu zvierat, ktoré vykazujú známky toxicity, a popis 
zistených známok toxicity vrátane času nástupu, trvania a závažnosti 
toxických ú činkov a 
— počet a identifikáciu zvierat, ktoré vykazujú akéko ľvek poškodenia, 
a popis typu poškodení.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. V rámci údajov o jednotlivých zvieratách sa zaznamená telesná hmotnos ť, 
mokrá hmotnos ť maternice a vysušená hmotnos ť maternice. Na zistenie, či 
podávanie testovanej chemikálie spôsobilo štatisticky významné zvýšenie (p < 0,05) hmotnosti maternice, sa použijú jednostranné štatistické analýzy agonistov. Na vyšetrenie zmien mokrej a vysušenej hmotnosti maternice 
súvisiacich s podávaním testovanej chemikálie sa vykonajú primerané štatis ­
tické analýzy. Údaje sa napríklad môžu hodnoti ť pomocou prístupu analýzy 
kovariancie (ANCOVA) s využitím telesnej hmotnosti pri pitve ako spolu ­
premennej. Pred vykonaním analýzy údajov sa údaje o maternici môžu 
podrobiť logaritmickej transformácii na stabilizáciu rozptylu. Na párové 
porovnania každej dávkovej skupiny s kontrolami nosi ča a na výpo čet 
intervalov spo ľahlivosti je vhodný Dunnettov a Hsuov test. Na zistenie 
možných od ľahlých hodnôt a posúdenie homogenity rozptylov sa môžu 
použiť grafy studentizovaných rezíduí. Tieto postupy boli použité vo vali ­
dačnom programe OECD, v rámci ktorého sa použil PROC GLM v systéme 
štatistickej analýzy (SAS Institute, Cary, NC), verzia 8 (6)(7). 
52. Závere čná správa musí obsahova ť:
 
Testovacie zariadenie:  
— zodpovední pracovníci a ich úlohy v rámci štúdie, 
— údaje z východiskového pozitívneho kontrolného testu a údaje 
z periodických pozitívnych kontrol (pozri odsek 26 a 27).  
Testovaná chemikália:  
— charakteristika testovaných chemikálií, 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti, — spôsob a periodicita prípravy roztokov, 
— všetky získané údaje o stabilite, 
— všetky analýzy dávkovacích roztokov.
 
Nosič: 
— charakteristika testovaného nosi ča (povaha, dodávate ľ a séria), 
— odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako voda).  
Pokusné zvieratá:  
— druh, kme ň a odôvodnenie ich výberu, 
— dodávate ľ a konkrétne zariadenie dodávate ľa, 
— vek v čase dodania s dátumom narodenia, 
— v prípade nedospelých zvierat údaj o tom, či boli dodané s matkou alebo 
s náhradnou matkou, a dátum odstavenia, 
— údaje o aklimatizácii zvierat, 
— počet zvierat na klietku, 
— údaje a metóda ozna čovania jednotlivých zvierat a skupín.  
Podmienky testu:  
— údaje o postupe randomizácie (t. j. použitá metóda), 
— odôvodnenie výberu dávky,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— údaje o zložení testovanej chemikálie, dosiahnutých koncentráciách, 
stabilite a homogénnosti, 
— údaje o podávaní testovanej chemikálie a odôvodnenie výberu spôsobu 
expozície, 
— krmivo (názov, typ, dodávate ľ a hladiny fytoestrogénu, ak sú známe), 
— zdroj vody (napríklad voda z vodovodu alebo filtrovaná voda) 
a dodávanie (prívodom z ve ľkej nádoby, vo f ľašiach, at ď.), 
— podstielka (názov, typ, dodávate ľ, obsah), 
— záznam podmienok umiestnenia v klietkach, interval osvetlenia, teplota 
a vlhkosť v miestnosti, čistenie miestnosti, 
— podrobný opis pitvy a postupov váženia maternice, 
— opis štatistických postupov.  
Výsledky  
Pre jednotlivé zvieratá:  
— všetky jednotlivé denné telesné hmotnosti (od rozdelenia do skupín po 
pitvu) (s presnos ťou na 0,1 g), 
— vek každého zviera ťa (uvádza sa v d ňoch, deň narodenia sa po číta ako 
deň 0) na za čiatku podávania testovanej chemikálie, 
— dátum a čas každého podania dávky, 
— výpočet podaného množstva a dávkovania a všetky pozorované straty 
v dávkach po čas ich podania alebo po ich podaní, 
— denný záznam o stave zviera ťa vrátane relevantných príznakov 
a pozorovaní, 
— predpokladaná prí čina smrti (ak sa zviera po čas štúdie našlo 
v moribundnom stave alebo uhynuté), 
— dátum a čas humánneho usmrtenia a časový interval do posledného 
podania dávky, 
— mokrá hmotnos ť maternice (s presnos ťou na 0,1 mg) a všetky pozoro ­
vané straty tekutín z lúmenu po čas pitvy a prípravy na váženie, 
— vysušená hmotnos ť maternice (s presnos ťou na 0,1 mg),  
Pre každú skupinu zvierat:  
— denné stredné telesné hmotnosti (s presnos ťou na 0,1 g) a štandardné 
odchýlky (od rozdelenia do skupín po pitvu), 
— stredné mokré hmotnosti maternice a stredné vysušené hmotnosti mater ­
nice (s presnos ťou na 0,1 mg) a štandardné odchýlky, 
— denná spotreba potravy, ak sa merala (vypo čítaná na gramy potravy 
spotrebované na jedno zviera),  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— výsledky štatistických analýz porovnávajúcich tak mokré, ako aj vysu ­ 
šené hmotnosti materníc z pokusných skupín vzh ľadom na rovnaké 
merania v kontrolných skupinách nosi ča, 
— výsledky štatistických analýz porovnávajúcich celkovú telesnú hmotnos ť 
a nárast telesnej hmotnosti u pokusných skupín vzh ľadom na rovnaké 
merania v kontrolných skupinách nosi ča. 
53. Súhrn dôležitých usmer ňujúcich faktov testovacej metódy  
Potkany Myši  
Zvieratá  
Kmeň Bežne používané laboratórne kmene hlodavcov 
Počet zvierat Minimálne 6 zvierat z každej dávkovej skupiny 
Počet skupín Minimálne 2 pokusné skupiny (pre usmernenie pozri odsek 33) 
a negatívna kontrolná skupina 
Usmernenia k pozitívnym kontrolným skupinám sú uvedené 
v odseku 26 a 27  
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
T o v miestnosti so zviera ­
tami 22 °C ± 3 °C 
Relatívna vlhkos ť 50-60 %, minimálne 30 % a maximálne 70 % 
Denný svetelný cyklus 12 hodín svetla, 12 hodín tmy 
Potrava a pitná voda Ad libitum 
Umiestnenie Jednotlivo alebo v skupinách do troch zvierat (u nedospelých 
zvierat sa odporú ča umiestnenie v sociálnych skupinách) 
Krmivo a podstielka Odporú ča sa nízka hladina fytoestrogénov v krmive a podstielke  
Protokol  
Metóda Metóda nedospelých samíc bez 
ovariektómie (uprednost ňuje 
sa). 
Metóda dospelých samíc po 
ovariektómii Metóda dospelých samíc po 
ovariektómii 
Vek vhodný pre dávko ­
vanie u nedospelých zvierat Nie skôr ako 18. PND. Dávko ­
vanie by sa malo ukon čiť pred 
25. PND Neuplatňuje sa v rozsahu 
pôsobnosti sú časnej testovacej 
metódy 
Vek vhodný na ovariek ­
tómiu Vo veku medzi 6 až 8 týžd ňom 
Vek vhodný pre dávko ­
vanie u zvierat po 
ovariektómii Medzi vykonaním ovariek ­
tómie a prvým d ňom podá ­
vania by malo uplynú ť mini­
málne 14 dní Medzi vykonaním ovariektómie 
a prvým d ňom podávania by 
malo uplynú ť minimálne 7 dní 
Telesná hmotnos ť Odchýlky telesnej hmotnosti by mali by ť minimálne a nemali by 
presiahnu ť ± 20 % strednej hmotnosti
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Potkany Myši  
Dávkovanie  
Spôsob podávania Orálnou sondou alebo podkožnou injekciou 
Frekvencia podávania Jedna denná dávka Objemové množstvo na 
sondu a injekciu ≤ 5ml/kg telesnej hmotnosti (alebo do 10 ml/kg telesnej hmot ­
nosti v prípade vodných roztokov) (v 2 miestach vpichu 
v prípade podkožnej injekcie) 
Dĺžka podávania 3 po sebe nasledujúce dni 
v prípade modelu nedospelých 
samíc 
Najmenej 3 po sebe nasledu ­
júce dni v prípade modelu 
dospelých samíc po OVX 7 po sebe nasledujúcich dní 
v prípade modelu dospelých 
samíc po OVX 
Čas pitvy Približne 24 hodín po poslednej dávke  
Výsledky  
Pozitívna reakcia Štatisticky významný nárast strednej hmotnosti maternice 
(mokrá a/alebo vysušená hmotnos ť) 
Referenčný estrogén 17 α-etinylestradiol
 
USMERNENIE PRE INTERPRETÁCIU A UZNÁVANIE VÝSLEDKOV 
54. Vo všeobecnosti sa test estrogénnych ú činkov považuje za pozitívny, ak 
dôjde k štatisticky významnému zvýšeniu hmotnosti maternice (p < 0,05) 
prinajmenšom pri vysokej úrovni dávky v porovnaní s kontrolnou skupinou, v ktorej bolo použité rozpúš ťadlo. O pozitívnom výsledku ďalej sved čí 
preukázanie biologicky vierohodného vz ťahu medzi dávkou a rozsahom 
reakcie po zoh ľadnení skuto čnosti, že prekrývajúce sa estrogénne 
a antiestrogénne ú činky testovanej chemikálie môžu ovplyvni ť tvar krivky 
závislosti reakcie od dávky. 
55. V záujme zabezpe čenia zmysluplnej interpretácie údajov je potrebné dba ť 
na to, aby sa neprekro čila maximálna prípustná dávka. Zníženie telesnej 
hmotnosti, klinické príznaky a ďalšie nálezy sa musia v tejto súvislosti 
dôkladne posúdi ť. 
56. Dôležitým faktorom pre uznanie údajov z uterotrofického biologického testu 
sú hmotnosti materníc v kontrolnej skupine, ktorej bol podaný 
nosič. Vysoké kontrolné hodnoty môžu ohrozi ť citlivosť biologického 
testu a schopnos ť odhaliť veľmi slabých estrogénnych agonistov. Odborná 
literatúra a údaje získané po čas validácie uterotrofického biologického testu 
naznačujú, že ob čas môžu spontánne nasta ť prípady vysokých kontrolných 
priemerných hodnôt, najmä u nedospelých zvierat (2)(3)(6)(9). Ke ďže 
hmotnosť maternice u nedospelých potkanov závisí od mnohých premen ­
ných, ako je napríklad kme ň alebo telesná hmotnos ť, nie je v prípade 
hmotnosti maternice možné uvies ť konečný horný limit. Pre kontrolu, ak 
sa vysušená hmotnos ť maternice u nedospelých kontrolných potkanov 
pohybuje medzi 40 a 45 mg, treba tieto výsledky považova ť za podozrivé, 
a hmotnos ť maternice nad 45 mg môže vies ť k opakovaniu testu. Je však 
potrebné posudzova ť jednotlivé prípady (3)(6)(8). Pri testovaní dospelých 
potkanov po neúplnej ovariektómii môže ovariálne tkanivo produkova ť 
endogénny estrogén a spomali ť regresiu hmotnosti maternice.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Vysušená hmotnos ť maternice u kontrolného nosi ča nižšia ako 0,09 % 
telesnej hmotnosti nedospelých samíc potkana a nižšia ako 0,04 % 
v prípade mladých dospelých samíc, ktoré podstúpili ovariektómiu, môže podľa všetkého vies ť k prijate ľným výsledkom [pozri tabu ľku 31 (2)]. Ak 
je kontrolná hmotnos ť materníc vyššia ako tieto hodnoty, je potrebné skon ­
trolovať rôzne faktory, ako je vek zvierat, riadne vykonaná ovariektómia, 
fytoestrogény v potrave at ď. a s výsledkom negatívneho testu (žiadna indi ­
kácia estrogénnej aktivity) treba narába ť opatrne. 
58. Historické údaje o kontrolných skupinách, ktorým sa podal nosi č, sa ucho ­
vávajú v laboratóriu. V laboratóriu sa uchovávajú aj historické údaje o reakciách na pozitívne referen čné estrogény, ako je 17a-etinylestradiol. 
Laboratóriá môžu tiež testova ť reakciu na známych slabých estrogénnych 
agonistoch. Všetky tieto údaje možno v záujme zabezpe čenia dostato čnej 
citlivosti metód laboratória porovna ť s dostupnými údajmi 
(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8). 
59. V priebehu valida čnej štúdie OECD sa ukázalo, že vysušená hmotnos ť 
maternice má nižšiu variabilitu ako mokrá hmotnos ť maternice (6)(7). 
Významná reakcia pri ktoromko ľvek meraní by však indikovala, že testo ­
vaná chemikália má vplyv na estrogénnu aktivitu. 
60. Uterotrofická reakcia nemá celkom estrogénny pôvod, pozitívny výsledok 
uterotrofického biologického testu by sa však vo všeobecnosti mal inter ­
pretovať ako dôkaz estrogénneho potenciálu in vivo a mal by iniciova ť 
kroky, ktoré by viedli k ďalšiemu objasneniu (pozri odsek 9 
a „Koncep čný rámec OECD k testovaniu a hodnoteniu endokrinných 
disruptorov“, príloha 2).
 
Obrázok 1  
Schematický diagram znázor ňujúci chirurgické odstránenie vaje čníkov
  
Postup sa za čína otvorením dorzolaterálnej brušnej steny v strede medzi 
spodnou hranicou rebier a lopatou bedrovej kosti a nieko ľko milimetrov 
bočne od laterálneho okraja bedrového svalu. V brušnej dutine sú umiest ­
nené vaje čníky. Na aseptickej oblasti sa následne vaje čníky fyzicky 
odstránia z brušnej dutiny, medzi vaje čník a maternicu sa uviaže obväz 
na zastavenie krvácania a vaje čník sa vyreže nad obväzom v mieste, kde 
sa vajcovod pripája k jednotlivým rohom maternice. Po uistení, že nedo ­
chádza k žiadnemu krvácaniu, sa brušná stena zašije a koža uzavrie, napr. pomocou šicích svoriek alebo stehov. Predtým, ako sa zvieratá použijú, sa 
im umožní, aby sa najmenej po dobu 14 dní zotavili a aby maternica 
nadobudla pôvodnú hmotnos ť.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Obrázok 2  
Odstránenie a príprava maternicových tkanív na váženie
  
Postup sa za čína otvorením brušnej steny pri lonovej spone. Následne sa každý 
vaječník, ak je prítomný, a roh maternice oddelí od dorzálnej brušnej steny. 
Močový mechúr a mo čovody sa odstránia z ventrálnej a laterálnej strany mater ­
nice a vagíny. Fibrózny zrast medzi kone čníkom a vagínou sa oddelí, až kým nie 
je možné identifikova ť spojenie vaginálneho otvoru a kože perinea. Maternica 
a vagína sa od tela oddelia prerezaním vaginálnej steny tesne nad spojením kože 
perinea, ako je znázornené na obrázku. Maternica sa od steny tela oddelí jemným 
prerezaním maternicového okružia v bode, kde je pripojená k dorzolaterálnej strane jednotlivých rohov maternice po celej ich d ĺžke. Po odstránení z tela sa 
odreže prebyto čný tuk a spojivové tkanivo. Ak sú prítomné vaje čníky, odstránia 
sa pri vajcovodoch, pri čom sa zabráni strate tekutiny z lúmenu maternicového 
rohu. Ak zviera podstúpilo ovariektómiu, preskúma sa, či zvyšky po vaje čníkoch 
neobsahujú ovariálne tkanivo. Vagína sa oddelí od maternice tesne pod kr čkom 
maternice tak, aby k ŕčok maternice zostal pripojený k telu maternice, ako je 
znázornené na obrázku. Maternicu možno následne odváži ť.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIA POJOMOV  
Antiestrogénny ú činok  je schopnos ť chemikálie potla čiť pôsobenie 17 ß-estra­
diolu na organizmus cicavca.  
Chemikália  je látka alebo zmes.  
Dátum narodenia  je postnatálny de ň 0. 
Dávkovanie  je všeobecný pojem, ktorý zah ŕňa dávku, jej frekvenciu a trvanie 
podávania dávok.  
Dávka  je množstvo podanej testovanej chemikálie. V prípade uterotrofického 
biologického testu sa dávka vyjadruje ako hmotnos ť testovanej chemikálie na 
jednotku telesnej hmotnosti pokusného zviera ťa na deň (napr. mg/kg telesnej 
hmotnosti/de ň). 
Maximálna prípustná dávka (MTD)  je najvä čšie množstvo chemikálie, ktorá 
po zavedení do tela pokusné zvieratá nezabije (ozna čovaná ako LD  0 ) (IUPAC, 
1993).  
Estrogénny ú činok  je schopnos ť chemikálie pôsobi ť ako 17 ß-estradiolu 
v organizme cicavcov.  
Postnatálny de ň X je X-tý de ň života po dni narodenia.  
Citlivosť je podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií, ktoré sa testom 
správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje 
kategoriza čné výsledky, a ide o dôležité h ľadisko pri hodnotení relevantnosti 
testovacej metódy.  
Špecifickos ť je podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií, ktoré sa 
testom správne klasifikovali. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá 
poskytuje kategoriza čné výsledky, a ide o dôležité h ľadisko pri hodnotení rele ­
vantnosti testovacej metódy.  
Testovaná chemikália  znamená akúko ľvek látku alebo zmes, ktorá sa testuje 
pomocou tejto testovacej metódy.  
Uterotrofický  je pojem používaný na opísanie pozitívneho vplyvu na rast mater ­
nicových tkanív.  
Validácia  je vedecký postup ur čený na charakterizovanie prevádzkových požia ­
daviek a obmedzení testovacej metódy a na preukázanie jej spo ľahlivosti 
a významu pre konkrétny ú čel. ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Dodatok 2
  
VMG mamm: Skupina pre riadenie validácie testovania a posudzovania cicavcov
 POZNÁMKY K RÁMCU:  
Poznámka 1:  Vstup na všetkých úrovniach a výstup na všetkých úrovniach je 
možný a závisí od povahy existujúcich informa čných potrieb na 
účely posúdenia nebezpe čnosti a rizík.  
Poznámka 2:  Na úrovni 5 by ekotoxikológia mala zah ŕňať sledované para ­
metre, ktoré indikujú mechanizmy nepriaznivých ú činkov 
a potenciálne poškodenie populácie.  
Poznámka 3:  Ak multimodálny model zah ŕňa viacero testov jedného sledova ­
ného parametra, daný model nahradí používanie týchto testov jedného sledovaného parametra.  
Poznámka 4:  Každá chemikália by sa mala posudzova ť jednotlivo po zoh ľad­
není všetkých dostupných informácií a so zrete ľom na funkciu 
rámcových úrovní.  
Poznámka 5:  Rámec sa v sú časnosti nepovažuje za úplný. Na úrovniach 3, 4 
a 5 zahŕňa testy, ktoré sú bu ď dostupné, alebo u ktorých 
prebieha validácia. Pokia ľ ide o testy, u ktorých prebieha vali ­
dácia, sú zahrnuté predbežne. Po vypracovaní a validácii sa 
formálne pridajú do rámca.  
Poznámka 6:  Úrove ň 5 zahŕňa aj iné ako kone čné testy. Testy zahrnuté do 
tejto úrovne majú prispie ť k všeobecnému posúdeniu nebezpe č­
nosti a rizík.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. -11. marec 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
2. OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioas ­
say. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1. 
3. Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Utero ­
trophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445 - 520. 
4. OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health 
and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33. 
5. Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785 - 94. 
6. OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34. 
7. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549 
8. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550 - 1558. 
9. Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559 - 1567. 
10. Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582 - 587. 
11. Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229 - 2237. 
12. Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleis ­
chmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J. 127:10 - 15. 
13. Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in 
a commercial animal ration. Science 118:650 - 651. 
14. Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425 - 427. 
15. Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Pers ­
pec.106:369 - 373.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16. OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67. 
17. Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157. 
18. Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517 - 1525. 
19. Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613 - 620. 
20. Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477 - 485. 
21. Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343 - 347. 
22. Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381 - 
393. 
23. Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. 
A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596 - 601. 
24. OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
25. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
26. OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
27. Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320 - 333. 
28. Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33 – 41. 
29. Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288 - 305. 
30. Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 – 291. 
31. OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paríž. 
32. Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press. 
33. Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endo ­
crine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34. Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159 - 184. 
35. Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807 - 1808. 
36. Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalua ­
tion of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro 
assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410 - 1414. 
37. OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71. 
38. SmernicaEurópskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ o ochrane zvierat 
používaných na vedecké ú čely(Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGEROV BIOLOGICKÝ TEST U POTKANOV: KRÁT ­
KODOBÝ SKRÍNINGOVÝ TEST NA (ANTI)ANDROGÉNNE 
VLASTNOSTI  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov TG 441 (2009). Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cie ľom zrevidova ť existujúce usmernenia 
a vypracova ť nové usmernenia na vykonávanie testov potenciálnych endo ­
krinných disruptorov (1). Sú časťou tejto činnosti bolo vypracova ť usmer­
nenie na vykonávanie Hershbergerovho biologického testu u potkanov. Vo farmaceutickom priemysle sa tento test používal nieko ľko desiatok rokov 
a odborný výbor ho prvýkrát normalizoval v roku 1962 ako nástroj skrí ­
ningu androgénnych chemikálií (2). V rokoch 2001 – 2007 prešiel Hershbergerov biologický test u potkanov rozsiahlym valida čným progra ­
mom, ktorý zah ŕňal vypracovanie podkladového kontrolného dokumentu 
(23), zostavenie podrobnej dokumentácie metód (3), vypracovanie príru čky 
pre pitvy (21) a vykonanie rozsiahlych intralaboratórnych a medzilaboratór ­
nych štúdií, ktoré preukazujú spo ľahlivosť a reprodukovate ľnosť biologic­
kého testu. Tieto valida čné štúdie boli vykonané na silnom referen čnom 
androgéne (testosterón propionát (TP)), dvoch silných syntetických andro ­
génoch (trenbolón-acetát a metyl-testosterón), silnom antiandrogénnom liečive (flutamid), silnom inhibítore syntézy (finasterid) prírodného andro ­
génu (dihydrotestosterón-DHT), nieko ľkých slabých antiandrogénnych 
pesticídoch (linuron, vinklozolín, procymidón, p,p' DDE), silnom inhibítore 5α-reduktázy (finasterid) a dvoch známych negatívnych chemikáliách (dini ­
trofenol a nonylfenol) (4) (5) (6) (7) (8). Táto testovacia metóda je 
výsledkom dlhodobých minulých skúseností s biologickým testom, skúse ­
ností nadobudnutých v priebehu programu validácie testu a výsledkov, ktoré tento test priniesol. 
2. Hershbergerov biologický test je krátkodobý skríningový test in vivo zalo ­ 
žený na použití akcesórnych tkanív sam čej rozmnožovacej sústavy. Test 
vznikol v 30. rokoch 20. storo čia a v 40. rokoch bol upravený s cie ľom 
rozšíriť jeho aplikáciu aj na svaly sam čej rozmnožovacej sústavy, ktoré sú 
citlivé na androgény (2) (9 - 15). V 60. rokoch sa pomocou štandardizo ­
vanej verzie protokolu vyhodnotilo viac ako 700 možných androgénov (2) 
(14) a použitie testu na androgény aj na antiandrogény sa v tomto období 
považovalo za štandardnú metódu (2) (15). Sú časný biologický test je zalo ­ 
žený na zmenách hmotnosti piatich tkanív, ktoré sú podmienené ú činkom 
androgénov, u kastrovaných peripubertálnych samcov potkana. Posudzuje 
schopnosť chemikálie vyvola ť biologickú aktivitu zodpovedajúcu andro ­
génnym agonistom, antagonistom alebo inhibítorom 5 α-reduktázy. Piatimi 
cieľovými tkanivami, ktoré sú podmienené ú činkom androgénov, zarade ­
nými do tejto testovacej metódy sú ventrálna prostata (VP), semenný 
mechúrik (SV) (vrátane tekutín a koagula čných žliaz), zdvíha č konečníka 
spolu s bulbokavernóznymi svalmi (LABC), párové Cowperove žľazy (COW) a žalu ď (GP). V týchto piatich tkanivách sa u kastrovaných 
peripubertálnych samcov potkana reakcia na pôsobenie androgénov preja ­
vuje ako zvýšenie absolútnej hmotnosti. Ke ď sa u týchto tkanív stimuluje 
zvýšenie hmotnosti podaním silného referen čného androgénu, reakcia všet ­
kých piatich tkanív na podanie antiandrogénov sa prejaví znížením abso ­
lútnej hmotnosti. Primárny model Hershbergeroveho biologického testu 
používa chirurgicky kastrovaných peripubertálnych samcov a bol valido ­
vaný vo fáze 1, 2 a 3 programu validácie Hershbergerovho testu. 
3. Hershbergerov biologický test slúži ako mechanistický skríningový test 
androgénnych agonistov, androgénnych antagonistov a inhibítorov 5a- reduktázy in vivo a jeho použitie je potrebné posudzova ť v kontexte „Kon ­
cepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie endokrinných disrupto ­
rov“ (dodatok 2). V tomto koncep čnom rámci je Hershbergerov biologický
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
test zahrnutý do úrovne 3 ako test in vivo poskytujúci údaje o jednom 
endokrinnom mechanizme, t. j. (anti)androgénnych ú činkoch. Mal by sa 
zaradiť do skupiny testov in vitro a in vivo, ktorých cie ľom je identifikova ť 
chemikálie s potenciálnym pôsobením na endokrinný systém a v kone čnom 
dôsledku posúdi ť riziká pre ľudské zdravie alebo životné prostredie. 
4. V záujme dobrých životných podmienok zvierat s cie ľom vyhnú ť sa 
kastračnému zákroku bola snaha vymyslie ť alternatívny model Hershberge ­
rovho biologického testu, ktorým bolo použitie intaktných (nekastrovaných) stimulovaných odstavených samcov. Testovacia metóda stimulovaných odstavených samcov prešla valida čným postupom (24), z valida čných štúdií 
však vyplynulo, že pri použití modelu Hershbergerovho biologického testu 
s odstavenými samcami nie je možné pri testovaných dávkach zo slabých antiandrogénov konzistentne ur čiť účinky androgénov na hmotnos ť orgá­
nov. Model preto do tejto testovacej metódy nebol zahrnutý. Uznáva sa 
však, že jeho použitie je nielen prínosom pre dobré životné podmienky 
zvierat, ale môže zárove ň priniesť informácie o iných mechanizmoch pôso ­
benia, preto sa tento model uvádza v usmer ňovacom dokumente OECD 
č. 115 (25).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
5. Androgénni agonisti a antagonisti pôsobia ako ligandy na androgénne 
receptory, pri čom agonisti môžu aktivova ť a antagonisti inhibova ť tran­
skripciu génov, ktorú riadi receptor. Okrem toho niektoré chemikálie inhi ­
bujú premenu testosterónu na silnejší prírodný androgén dihydrotestosterón 
v niektorých cie ľových androgénnych tkanivách (inhibítory 5a-reduktázy). 
Takéto chemikálie majú potenciál vies ť k nepriaznivým zdravotným rizikám 
vrátane ú činkov na rozmnožovanie a vývoj. Existuje preto regula čná 
potreba rýchleho posudzovania a hodnotenia chemikálií ako možných 
androgénnych agonistov alebo antagonistov alebo ako inhibítorov 5a-reduk ­
tázy. Afinita ligandu pre androgénny receptor meraná väzbou na receptor alebo transkrip čná aktivácia reportérových génov in vitro nie je jediným 
faktorom poukazujúcim na možné riziko, hoci má iba informatívnu 
hodnotu. Ďalšie faktory môžu zah ŕňať metabolickú aktiváciu 
a deaktiváciu pri vstupe do tela, chemickú distribúciu do cie ľových tkanív 
a odstránenie z tela. Vzniká preto potreba testova ť možné pôsobenie chemi ­
kálie in vivo za relevantných podmienok a expozície. Potreba hodnotenia in 
vivo je menej naliehavá, ak sú známe chemické vlastnosti týkajúce sa vzťahu absorpcie – distribúcie – metabolizmu – eliminácie (ADME). 
Tkanivá podmienené ú činkom androgénov reagujú, najmä u kastrovaných 
peripubertálnych samcov potkana, na stimuláciu androgénmi rýchlym 
a intenzívnym rastom. Hlodavce, najmä potkany, sa takisto všeobecne používajú v štúdiách toxicity na charakterizáciu rizika. Preto je model analýzy, v ktorom sa používajú kastrované peripubertálne potkany a pä ť 
cieľových tkanív, vhodný na in vivo testovanie androgénnych agonistov, 
antagonistov a inhibítorov 5 α-reduktázy. 
6. Táto testovacia metóda je založená na protokoloch použitých pri valida čnej 
štúdii OECD, ktoré sa v intralaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách 
ukázali ako spo ľahlivé a opakovate ľné (4)(5)(6)(7)(8). V tejto testovacej 
metóde sa uvádzajú postupy pre androgény aj antiandrogény. 
7. Hoci sa v programe OECD pre validáciu Hershbergerovho biologického 
testu vyskytli v rôznych laboratóriách ur čité rozdiely medzi dávkami testos ­
terón-propionátu (TP) použitými na detekciu antiandrogénov (0,2 verzus 0,4 
mg/kg/d, podkožnou injekciou), tieto dva rôzne protokoly sa nelíšili schop ­
nosťou detekcie slabého alebo silného antiandrogénneho pôsobenia. Je však 
zrejmé, že dávka TP nesmie by ť príliš vysoká, aby neblokovala ú činky 
slabých antagonistov androgénnych receptorov (AR), ani príliš nízka, aby 
nedošlo k nízkej rastovej reakcii androgénnych tkanív aj bez sú časného 
podávania antiandrogénov.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Rastová reakcia jednotlivých tkanív, ktoré sú podmienené androgénnym 
účinkom, nemá výhradne androgénny pôvod, t. j. zmenu hmotnosti niekto ­
rých tkanív môžu vyvola ť aj chemikálie, ktoré nie sú androgénni agonisti. 
Rastová reakcia, ktorá sa prejavuje sú časne vo viacerých tkanivách, je však 
dôkazom mechanizmu s vyššou prízna čnosťou pre androgény. Vysoké 
dávky silných estrogénov môžu napríklad vies ť k zvýšeniu hmotnosti 
semenných mechúrikov, ale ostatné tkanivá podmienené ú činkom andro ­
génov v teste podobnú reakciu nevykazujú. Antiandrogénne chemikálie môžu pôsobi ť buď ako antagonisti androgénnych receptorov, alebo ako 
inhibítory 5a-reduktázy. Ú činok inhibítorov 5a-reduktázy je variabilný, 
pretože premena na silnejší dihydrotestosterón sa líši v závislosti od tkaniva. V porovnaní so silným antagonistom androgénnych receptorov (AR), ako napr. flutamid, sa ú činky antiandrogénov, ktoré inhibujú 5 α-reduktázu, ako 
napr. finasterid, prejavujú výraznejšie na ventrálnej prostate ako na ostat ­
ných tkanivách. Pomocou tohto rozdielu v reakcii tkaniva možno rozlišova ť 
medzi mechanizmom pôsobenia vyvolaným androgénnym receptorom a 5 α- 
reduktázou. Okrem toho má androgénny receptor evolu čnú súvislos ť 
s receptorom iných steroidných hormónov a niektoré ďalšie hormóny 
môžu pri podávaní vo vysokých suprafyziologických dávkach vytvára ť 
väzby a pôsobi ť proti rastovým ú činkom TP (13). Ďalej je takisto pravde ­
podobné, že zvýšený metabolizmus steroidov a následné zníženie sérového 
testosterónu by mohlo obmedzi ť rast tkaniva podmieneného ú činkom andro ­
génov. Preto by sa akýko ľvek pozitívny výsledok Hershbergerovho biolo ­
gického testu mal oby čajne hodnoti ť na základe váhy dôkazov vrátane 
testov in vitro, ako sú napríklad testy väzieb na androgénne receptory 
a estrogénne receptory (ER) a zodpovedajúce testy transkrip čnej aktivácie, 
alebo iných testov in vivo, ktoré skúmajú podobné androgénne cie ľové 
tkanivá, ako je napríklad test na pubertálnych samcoch, 15-d ňový test na 
intaktných dospelých samcoch, 28-d ňové alebo 90-d ňové štúdie 
s opakovanými dávkami. 
9. Skúsenosti ukazujú, že xenobiotické androgény sú zriedkavejšie ako xeno ­
biotické antiandrogény. O čakáva sa preto, že Hershbergerov biologický test 
sa bude naj častejšie používa ť na skríning antiandrogénov. Postup testu na 
androgény by sa však mohol odporu čiť pre steroidné alebo steroidom 
podobné chemikálie alebo chemikálie, v prípade ktorých bola indikácia 
možných androgénnych ú činkov odvodená pomocou metód zahrnutých do 
úrovne 1 alebo 2 koncep čného rámca (dodatok 2). Nežiaduce ú činky 
spojené s (anti)androgénnymi profilmi možno pozorova ť aj v testoch úrovne 
5, čo vedie k potrebe posúdi ť, či chemikália pôsobí na endokrinný systém. 
10. Uznáva sa, že všetky postupy využívajúce zvieratá by mali by ť v súlade 
s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykoná ­
vanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú ma ť 
prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parlamentu 
a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely (26). Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu so 
zvieratami uvádza organizácia OECD (17). 
11. Rovnako ako v prípade každého biologického testu používajúceho pokusné 
zvieratá je potrebné dôkladne zváži ť, či je vykonanie tejto štúdie nevyh ­
nutné. V zásade k tomuto rozhodnutiu môžu vies ť dva dôvody: 
— potenciál vysokej expozície (úrove ň 1 koncep čného rámca) alebo 
známky (anti)androgénnych ú činkov v testoch  in vitro  (úroveň 2) 
s cieľom vyšetri ť, či takéto ú činky môžu nasta ť in vivo ; 
— účinky zodpovedajúce (anti)androgénnym ú činkom v  in vivo  testoch na 
úrovni 4 alebo 5 s cie ľom vyšetri ť konkrétny mechanizmus pôsobenia, 
napríklad zisti ť, či účinky spôsobil (anti)androgénny mechanizmus.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Vymedzenia pojmov použité v tejto testovacej metóde sú uvedené 
v dodatku 1.  
PRINCÍP TESTU 
13. Citlivos ť Hershbergerovho biologického testu je založená na použití samcov 
s minimálnou produkciou endogénnych androgénov. Preto sa používajú 
kastrované samce za predpokladu, že po kastrácii uplynie dostato čný čas 
na regresiu cie ľových tkanív na minimálnu a jednotnú východiskovú hmot ­
nosť. Pri skríningu možnej androgénnej aktivity sú teda v obehu nízke 
endogénne hladiny androgénov, os hypotalamus-hypofýza-gonády nie je 
schopná kompenzácie prostredníctvom mechanizmov spätnej väzby, schop ­
nosť reakcie tkanív sa maximalizuje a po čiatočná variabilita hmotnosti 
tkaniva sa minimalizuje. Pri testovaní možnej antiandrogénnej aktivity možno dosiahnu ť stabilnejší nárast hmotnosti tkaniva stimuláciou tkanív 
referenčným androgénom. V dôsledku toho sa pri Hershbergerovom biolo ­
gickom teste vyžaduje len 6 zvierat na dávkovú skupinu, zatia ľ čo pri iných 
testoch, ktoré používajú intaktné pubertálne alebo dospelé samce, sa odporúča 15 samcov na dávkovú skupinu. 
14. Kastrácia peripubertálnych samcov potkana sa vykoná primeraným 
spôsobom použitím schválených anestetík a sterilných postupov. V prvých d ňoch po operácii by sa mali podáva ť analgetiká s cie ľom 
zmierniť pooperačné bolesti. Kastrácia zvyšuje presnos ť testu pri detekcii 
slabých androgénov a antiandrogénov, pretože eliminuje kompenza čné 
endokrinné mechanizmy spätnej väzby, ktoré sa prejavujú u intaktného zvieraťa a ktoré môžu zmierni ť účinky podávaných androgénov 
a antiandrogénov, a vylú či vysokú variabilitu hladiny testosterónu v sére 
medzi jednotlivými zvieratami. Preto je v dôsledku kastrácie potrebný na testovanie týchto endokrinných aktivít nižší po čet zvierat. 
15. Pri testovaní možnej androgénnej aktivity sa testovaná chemikália podáva 
denne orálnou sondou alebo podkožnou injekciou po čas desiatich po sebe 
nasledujúcich dní. Testované chemikálie sa podávajú minimálne dvom ošetrovaným skupinám pokusných zvierat, pri čom v každej skupine sa 
použije jedna úrove ň dávky. Zvieratá sa pitvú približne 24 hodín po 
poslednej dávke. Štatisticky významný nárast hmotnosti dvoch alebo viace ­
rých cieľových orgánov v skupinách, ktorým sa podala testovaná chemiká ­
lia, v porovnaní s kontrolnou skupinou nosi ča indikuje pozitívny test testo ­
vanej chemikálie na možný androgénny ú činok (pozri odsek 60). Andro ­
gény, ako napr. trenbolón, na ktorý nepôsobí 5 α-reduktáza, majú 
v porovnaní s TP výraznejší ú činok na LABC a GP, všetky tkanivá by 
však mali vykazova ť zvýšený rast. 
16. Pri testovaní možnej antiandrogénnej aktivity sa testovaná chemikália 
podáva denne orálnou sondou alebo podkožnou injekciou po čas desiatich 
po sebe nasledujúcich dní v rovnakých denných dávkach ako TP (0,2 alebo 0,4 mg/kg/d) podkožnou injekciou. Vo valida čnom programe sa stanovuje, 
že sa môže použi ť dávka TP v množstve 0,2 alebo 0,4 mg/kg/d, pretože 
obidva varianty boli pri ur čovaní antiandrogénov ú činné, a preto by sa 
v teste mala vybra ť iba jedna dávka. Postupné dávky testovaných chemi ­
kálií sa podávajú minimálne trom ošetrovaným skupinám pokusných zvie ­
rat, pričom v každej skupine sa použije jedna úrove ň dávky. Zvieratá sa 
pitvú približne 24 hodín po poslednej dávke. Štatisticky významné zníženie hmotnosti dvoch alebo viacerých cie ľových orgánov v skupinách, ktorým sa 
podala testovaná chemikália a TP, v porovnaní s kontrolnou skupinou, 
ktorej sa podal iba TP, indikuje pozitívny test testovanej chemikálie na 
možný antiandrogénny ú činok (pozri odsek 61).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
OPIS METÓDY  
Výber druhu a kme ňa 
17. Potkany sa v Hershbergerovom biologickom teste bežne používajú od 30. 
rokov 20. storo čia. Hoci je z biologického h ľadiska pravdepodobné, že 
reakcie u myší by boli podobné ako u potkanov, na základe 70-ro čných 
skúseností s modelom používajúcim potkany sa pre Hershbergerov biolo ­
gický test vybral tento druh. Údaje získané z Hershbergerovho biologického 
testu môžu navyše prinies ť výsledky, ktoré môžu vies ť k dlhodobej viac ­
generačnej štúdii, preto sa v oboch štúdiách môžu použi ť zvieratá 
z rovnakého druhu, kme ňa a zdroja. 
18. Protokol umož ňuje laboratóriám vybra ť kmeň potkanov, ktorý bude použitý 
v teste, a vo všeobecnosti by to mal by ť kmeň, ktorý zú častnené laborató ­
rium používalo v minulosti. Môžu sa použi ť bežne používané 
laboratórne kmene potkanov; nemali by sa ale používa ť kmene, u ktorých 
dochádza k dospievaniu podstatne neskôr ako 42 dní po narodení, pretože 
kastrácia takýchto samcov vo veku 42 dní by mohla znemožni ť meranie 
hmotnosti žalu ďa, ktoré možno vykona ť až po oddelení predkožky od tela 
penisu. Preto sa až na výnimo čné prípady nepožívajú kmene potkanov 
vyšľachtené z kme ňa Fischer 344. Pohlavný vývoj u potkanov z kme ňa 
Fischer 344 prebieha v inom časovom rozmedzí v porovnaní s inými 
bežnejšie používanými kme ňmi, ako je Sprague Dawley alebo Wistar 
(16). V prípade použitia takého kme ňa musí laboratórium vykona ť kastráciu 
u zvierat, ktoré sú o nie čo staršie, a preukáza ť citlivosť použitého kme ňa. 
Laboratórium musí jasne uvies ť odôvodnenie výberu kme ňa potkanov. Ak 
je skríningový test predbežným testom štúdie orálnej toxicity pri opakova ­
ných dávkach, reproduk čnej a vývojovej štúdie alebo dlhodobej štúdie, vo 
všetkých štúdiách sa pod ľa možnosti použijú zvieratá z toho istého kme ňa 
a zdroja.  
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
19. Všetky postupy musia by ť v súlade s miestnymi normami starostlivosti 
o laboratórne zvieratá. Tieto opisy starostlivosti a zaobchádzania predsta ­
vujú minimálne normy a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú mať prednosť miestne predpisy, ako napríklad smernica Európskeho parla ­
mentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat použí ­
vaných na vedecké ú čely (26). Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by 
mala byť 22 °C (v rozsahu približne ± 3 °C). Relatívna vlhkos ť by mala 
byť minimálne 30 % a pod ľa možnosti by nemala presiahnu ť maximálnu 
úroveň 70 % okrem obdobia po čas čistenia miestnosti. Cie ľom by mala by ť 
relatívna vlhkos ť vzduchu 50 - 60 %. Osvetlenie by malo by ť umelé. 
Pokiaľ ide o denný svetelný rytmus, malo by sa strieda ť 12 hodín svetla 
a 12 hodín tmy. 
20. S oh ľadom na nízky vek zvierat a na skuto čnosť, že potkany sú sociálne 
zvieratá, sa uprednost ňuje umiestnenie zvierat v skupinách pred izoláciou 
zvierat. Umiestnením zvierat po dvoch alebo troch na klietku sa zabráni stiesneniu zvierat a vzniku súvisiaceho stresu, ktorý by mohol naruši ť 
hormonálnu kontrolu vývoja akcesórnych tkanív pohlavných orgánov. 
Klietky sa musia dôkladne vy čistiť, aby sa odstránili možné kontaminanty, 
a usporiada ť tak, aby sa minimalizovali možné vplyvy vzh ľadom na ich 
umiestnenie. Výberom vhodnej ve ľkosti klietok (~ 2 000 centimetrov štvor ­
cových) sa zabráni ich preplneniu. 
21. Každé zviera sa humánnym spôsobom jednotlivo ozna čí (napr. pomocou 
ušných zna čiek alebo štítkov). Metóda zna čenia sa zaznamená.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratórne krmivo a pitná voda by mali by ť k dispozícii neobmedzene. 
Laboratóriá by mali v priebehu Hershbergerovho biologického testu 
používať laboratórne krmivá, ktoré bežne používajú pri chemickom testo ­
vaní. Vo valida čných štúdiách biologického testu neboli pozorované žiadne 
účinky ani variabilita na základe použitého krmiva. Použité krmivo sa 
zaznamená a vzorka laboratórneho krmiva sa uchová pre prípad neskoršej 
analýzy.  
Kritériá pre hmotnosti orgánov podmienených ú činkom androgénov  
23. Vo valida čnej štúdii sa nepreukázalo, že zníženie telesnej hmotnosti má 
v cieľových tkanivách vplyv na zvýšenie alebo pokles rastu hmotnosti 
tkaniva (t. j. v tkanivách, ktorých hmotnos ť sa má v tejto štúdii váži ť). 
24. Na základe porovnania rôznych kme ňov potkanov, ktoré boli úspešne 
použité vo valida čnom programe, sú hmotnosti orgánov podmienených 
účinkom androgénov vyššie u ťažších kme ňov potkana ako 
u ľahších kme ňov. Preto sa v kritériách pre Hershbergerov biologický test 
neuvádzajú absolútne o čakávané hmotnosti orgánov pre pozitívne 
a negatívne kontroly. 
25. Vzh ľadom na to, že varia čný koeficient (CV) pre tkanivo má inverzný 
vzťah k štatistickej významnosti, kritériá pre Hershbergerov biologický 
test sú založené na maximálnych hodnotách CV pre každé tkanivo (tabu ľka 
1). Hodnoty varia čného koeficientu sú odvodené z valida čných štúdií 
OECD. V prípade negatívnych výsledkov by laboratóriá mali preskúma ť 
hodnoty varia čného koeficientu (CV) z kontrolnej skupiny a ošetrenej 
skupiny s vysokými dávkami s cie ľom určiť, či boli prekro čené kritériá 
maximálnych hodnôt CV. 
26. Štúdia sa musí opakova ť, ak: 1) tri alebo viac z desiatich možných jedno ­
tlivých hodnôt varia čného koeficientu v kontrolnej skupine a ošetrených 
skupinách s vysokými dávkami prekro čilo maximálne hodnoty stanovené 
pre štúdie agonistov a antagonistov v tabu ľke 1, a 2) aspo ň dve cieľové 
tkanivá vykazovali zanedbate ľné hodnoty, t. j., hodnoty r od 0,05 do 0,10.  
Tabuľka 1 
Maximálne prípustné hodnoty varia čného koeficientu (CV) stanovené 
pre cieľové akcesórne tkanivá pohlavných orgánov pre model 
kastrovaných samcov vo valida čných štúdiách OECD  ( 1 ) 
Tkanivo Antiandrogénne ú činky Androgénne ú činky 
Semenné mechúriky 40 % 40 % 
Ventrálna prostata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowperove ž ľazy 35 % 55 % 
Žaluď 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Prahová hodnota CV pre dané tkanivo bola stanovená na základe grafického zápisu 
hodnôt CV – s postupným usporiadaním od najnižšej po najvyššiu – pre všetky 
prostriedky zo všetkých pokusov vo valida čnom teste s použitím konkrétneho modelu 
(pre agonistov alebo antagonistov). Prahová hodnota CV sa pozorovala od bodu, 
v ktorom sú prírastky medzi hodnotami až po najbližšie najvyššie hodnoty CV v sérii 
výrazne vä čšie ako nieko ľko predchádzajúcich hodnôt CV – „hrani čný bod“ (breakpo ­
int). Je potrebné poznamena ť, že hoci sa touto analýzou stanovili relatívne spo ľahlivé 
„hraničné body“ pre model testu na antagonistov, v prípade kriviek CV v teste agonistov 
bol rast rovnomernejší, a preto bolo stanovenie prahovej hodnoty CV touto metódou do 
istej miery doplnkové.
 POSTUP  
Súlad s predpismi a overovanie laboratória  
27. Na rozdiel od uterotrofického testu (kapitola B.54 tejto prílohy) nie je 
v Hershbergerovom teste potrebné pred za čiatkom štúdie preukáza ť spôso­
bilosť laboratória, pretože v rámci testu prebiehajú ako jeho neoddelite ľná 
súčasť súbežné pozitívne (testosterón-propionát a flutamid) a negatívne 
kontroly.  
Počet a stav zvierat  
28. Každá ošetrená a kontrolná skupina by mala zah ŕňať minimálne 6 zvierat. 
Týka sa to protokolu v prípade androgénov, ako aj protokolu v prípade antiandrogénov.
 
Kastrácia  
29. Zvieratám sa po prijatí umožní po čiatočná nieko ľkodňová aklimatizácia 
s cieľom uistiť sa, že zvieratá sú zdravé a v dobrom stave. Zvieratá sa 
kastrujú, ke ď dosiahnu vek 42 dní, t. j. na 42. postnatálny de ň (PND) 
alebo neskôr, nie však skôr, pretože u zvierat kastrovaných pred 42. PND nemusí dôjs ť k oddeleniu predkožky. Pred kastráciou sa zvieratám podá 
anestézia, potom sa nareže miešok, odstránia sa semenníky spolu 
s nadsemenníkmi a podviažu sa cievy a semenovod. Po uistení sa, že nedochádza ku krvácaniu, sa miešok zašije alebo uzavrie pomocou šicích svoriek. V prvých d ňoch po operácii sa zvieratám podávajú analgetiká 
s cieľom zmierni ť pooperačné bolesti. Ak sa zakúpia kastrované zvieratá 
od dodávate ľa, dodávate ľ musí potvrdi ť vek a stupe ň pohlavnej zrelosti 
zvierat.
 
Aklimatizácia po kastrácii  
30. Aklimatizácia zvierat na laboratórne podmienky by mala pokra čovať mini­
málne 7 dní po kastrácii, aby sa umožnila regresia hmotnosti cie ľového 
tkaniva. Zvieratá je potrebné každý de ň pozorova ť a odstráni ť každé zviera 
s príznakmi choroby alebo fyzickými abnormalitami. S podávaním dávok (v 
rámci štúdie) sa teda môže za čať už na 49. PND, nie však neskôr ako na 
60. PND. Vek pri pitve nesmie by ť vyšší ako 70. PND. Táto flexibilita 
umožňuje laboratóriu efektívne si naplánova ť činnosti pri vykonávaní testu.  
Telesná hmotnos ť a randomizácia skupín  
31. Rozdiely v telesnej hmotnosti u jednotlivých zvierat sú zdrojom variability 
v hmotnostiach tkaniva v rámci jednotlivých skupín zvierat a medzi nimi. 
Vyššia variabilita hmotnosti tkaniva má za následok zvýšený varia čný 
koeficient (CV) a znižuje štatistickú významnos ť testu (niekedy sa ozna čuje 
ako citlivos ť testu). Preto je potrebné experimentálne a štatistické riadenie 
odchýlok telesnej hmotnosti. 
32. Experimentálne riadenie zah ŕňa zavedenie malých odchýlok telesnej hmot ­
nosti v rámci pokusných skupín a medzi nimi. Po prvé, nezvy čajne malé 
alebo veľké zvieratá sa vyradia a nebudú zahrnuté do pokusných skupín. Na 
začiatku štúdie by hmotnostné odchýlky použitých zvierat nemali 
presiahnu ť ± 20 % strednej hmotnosti (napríklad 175 g ± 35 g u kastrova ­
ných peripubertálnych potkanov). Po druhé, zvieratá sa rozdelia do skupín (kontrolných a ošetrovaných) na základe náhodného rozloženia hmotnosti tak, že stredná telesná hmotnos ť každej skupiny sa od akejko ľvek inej 
skupiny štatisticky nebude odlišova ť. Použitý postup blokovej randomizácie 
sa zaznamená.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Keďže v dôsledku toxicity sa môže telesná hmotnos ť ošetrovaných skupín 
v porovnaní s kontrolnou skupinou zníži ť, namiesto telesnej hmotnosti by 
sa pri pitve ako štatistická spolupremenná mohla použi ť telesná hmotnos ť 
zaznamenaná prvý de ň podávania testovanej chemikálie.  
Dávkovanie  
34. Na ur čenie možného androgénneho pôsobenia testovanej chemikálie in vivo 
zvyčajne posta čujú dve dávkové skupiny testovanej chemikálie, pozitívna 
kontrola a (negatívna) kontrola nosi ča (pozri odsek 43), preto sa tento 
model uprednost ňuje v záujme dobrých životných podmienok zvierat. Ak 
je cieľom odvodi ť krivku závislosti reakcie od dávky alebo extrapolova ť 
nižšie dávky, sú potrebné aspo ň 3 dávkové skupiny. Ak sa vyžadujú infor ­
mácie nad rámec ur čenia androgénneho pôsobenia (napríklad odhad ú čin­
nosti), je potrebné zváži ť iný dávkový režim. Na ú čely testovania antian ­
drogénov sa testovaná chemikália podáva spolu s referen čným andro ­
génnym agonistom. Použijú sa najmenej 3 pokusné skupiny s rôznymi 
dávkami testovanej chemikálie, pozitívna a negatívna kontrola (pozri odsek 44). So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádza ť takisto 
ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testo ­
vanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosi č, 
kontrolná skupina dostane nosi č v najvyššom používanom objeme, aký sa 
použil u pokusných skupín. 
35. Pri navrhovaní a výbere úrovní dávok sa berú do úvahy existujúce údaje 
o toxicite a (toxiko-) kinetike testovanej chemikálie a príbuzných materiá ­
lov. Pri ur čovaní najvyššej dávky sa musí v prvom rade vzia ť do úvahy 
úroveň LD
 50 a/alebo informácie o akútnej toxicite, aby sa predišlo úhynu, 
ťažkému utrpeniu alebo bolesti zvierat (17) (18) (19) (20), a v druhom rade 
dostupné informácie o dávkach použitých v štúdiách subchronickej a chronickej toxicity. Najvyššia dávka by vo všeobecnosti nemala spôsobi ť 
zníženie kone čnej telesnej hmotnosti zvierat vä čšie ako 10 % kontrolnej 
hmotnosti. Najvyššia dávka by mala by ť buď 1) najvyššia dávka, ktorá 
zabezpečí prežitie zvierat a nespôsobuje výraznú toxicitu alebo utrpenie 
zvierat po 10 po sebe nasledujúcich d ňoch podávania chemikálie do maxi ­
málnej dávky 1 000 mg/kg/de ň (pozri odsek 36), alebo 2) dávka, ktorá 
vyvolá (anti)androgénne ú činky, pod ľa toho, ktorá dávka je nižšia. Dlhé 
intervaly, napr. pol log jednotiek (zodpovedajúce priebehu dávky 3,2) alebo až 1 log jednotiek medzi dávkami sú prípustné. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, môže sa vykona ť štúdia na zistenie rozsahu dávkovania 
(pozri odsek 37) s cie ľom stanovi ť dávky, ktoré sa použijú.
 
Limitná úrove ň dávky  
36. Ak test vykonaný v súlade s opísanými postupmi, pri ktorom sa použije 
limitná dávka 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň alebo nižšia dávka, nevy ­
volá štatisticky významnú zmenu hmotnosti reproduk čných orgánov, potom 
testovanie s ďalšími úrov ňami dávok možno považova ť za zbyto čné. 
Limitná dávka sa použije s výnimkou prípadov, ke ď údaje o expozícii 
u človeka indikujú potrebu použi ť vyššiu úrove ň dávky.  
Úvahy k zis ťovaniu rozsahu  
37. V prípade potreby sa na nieko ľkých zvieratách môže vykona ť predbežná 
štúdia na zistenie rozsahu s cie ľom vybra ť vhodné dávkové skupiny [na 
základe metód testovania akútnej toxicity (kapitoly B.1 a, B.1 b tejto prílohy (27), OECD TG 425 (19))]. V prípade Hershbergerovho biologic ­
kého testu je cie ľom vybra ť dávky, ktoré zabezpe čia prežitie zvierat a ktoré 
nespôsobujú výraznú toxicitu alebo utrpenie zvierat po desiatich po sebe
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
nasledujúcich d ňoch podávania chemikálie, až do limitnej dávky 1 000 
mg/kg/de ň, ako sa uvádza v odseku 35 a 36. V tomto oh ľade možno 
vychádza ť z usmer ňovacieho dokumentu OECD (17), v ktorom sa vyme ­
dzujú klinické príznaky indikujúce toxicitu alebo utrpenie zvierat. Ak je to v rámci tejto štúdie na zistenie rozsahu po desiatich d ňoch podávania 
možné, cie ľové tkanivá sa môžu odobra ť a odváži ť približne 24 hodín po 
podaní poslednej dávky. Tieto údaje možno následne použi ť ako výcho ­
disko pri výbere dávok v hlavnej štúdii.
 
Referenčné chemikálie a nosi č 
38. Referen čným androgénnym agonistom je testosterón propionát (TP), č. CAS 
57-82-5. Úrove ň dávky referen čného TP môže by ť 0,2 mg/kg telesnej 
hmotnosti/de ň alebo 0,4 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň. Referen čným andro ­
génnym antagonistom je flutamid (FT), č. CAS 1311-84-7. Úrove ň dávky 
referenčného FT je 3 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň a mala by sa podáva ť 
spolu s dávkou referen čného TP. 
39. Podľa možnosti sa odporú ča zvážiť použitie vodného roztoku/suspenzie. 
Keďže mnohé androgénne ligandy alebo ich metabolické prekurzory sú 
však väčšinou hydrofóbne, najbežnejším prístupom je použitie roztoku/sus ­
penzie v oleji (napr. kukuri čný, arašidový, sezamový alebo olivový olej). 
Testovanú chemikáliu možno rozpusti ť v minimálnom množstve etanolu 
s koncentráciou 95 % alebo v inom vhodnom rozpúš ťadle a zriedi ť na 
konečné pracovné koncentrácie v testovacom nosi či. Toxické vlastnosti 
rozpúšťadla musia by ť známe a musia sa testova ť v samostatnej kontrolnej 
skupine ur čenej výhradne na testovanie rozpúš ťadla. Ak je testovaná chemi ­
kália stabilná, môže sa pri jej rozpúš ťaní použi ť jemné ohrievanie 
a intenzívne mechanické pôsobenie. Ur čí sa stabilita testovanej chemikálie 
v nosiči. Ak je testovaná chemikália stabilná po čas celého trvania štúdie, 
môže sa pripravi ť jeden po čiatočný alikvotný podiel testovanej chemikálie 
a uvedené dávkové riedenia sa denne môžu pripravova ť tak, aby nedošlo ku 
kontaminácii a znehodnoteniu vzoriek.  
Podávanie dávok  
40. TP sa podáva podkožnou injekciou a FT orálnou sondou. 
41. Testovaná chemikália sa podáva orálnou sondou alebo podkožnou injek ­
ciou. Pri výbere spôsobu podávania je potrebné zoh ľadniť dobré životné 
podmienky zvierat a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie. 
Okrem toho, ak injekcia vedie k pozitívnym výsledkom, pred za čiatkom 
rozsiahleho dlhodobého testovania je pri výbere spôsobu podávania potrebné zoh ľadniť toxikologické aspekty, ako je význam pre expozíciu 
u človeka (napríklad orálna sonda ako model požitia, podkožná injekcia 
ako simulácia vdýchnutia alebo dermálnej absorpcie), a existujúce toxiko ­
logické informácie a údaje o metabolizme a kinetike (napríklad potreba predísť metabolizmu prvého prechodu, vyššia ú činnosť určitého spôsobu 
expozície). 
42. Chemikália sa zvieratám podáva rovnakým spôsobom a v rovnakej časovej 
postupnosti po čas desiatich po sebe nasledujúcich dní približne v 24-hodi ­
nových intervaloch. Úrove ň dávok sa denne upravuje na základe súbežných 
denných meraní telesnej hmotnosti. Objem dávky a čas jej podania sa každý 
deň expozície zaznamená. V záujme zabezpe čenia zmysluplnej interpretácie 
údajov je potrebné dba ť na to, aby sa neprekro čila maximálna prípustná 
dávka uvedená v odseku 35. Zníženie telesnej hmotnosti, klinické príznaky 
a ďalšie nálezy sa musia v tejto súvislosti dôkladne posúdi ť. V prípade
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
orálnej sondy sa použije žalúdo čná sonda alebo vhodná intuba čná kanyla. 
Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo poda ť, závisí od 
veľkosti pokusného zviera ťa. Je potrebné postupova ť podľa miestnych 
usmernení k starostlivosti o zvieratá, objem by však nemal presiahnu ť 5 
ml/kg telesnej hmotnosti s výnimkou vodných roztokov, pri ktorých sa 
môže použi ť 10 ml/kg telesnej hmotnosti. V prípade podkožných injekcií 
sa dávky vpichujú v oblasti medzi lopatkami alebo v krížovej oblasti pomocou sterilnej ihly (napríklad ve ľkosť 23 G alebo 25 G) 
a tuberkulínovej strieka čky. Nevyžaduje sa oholenie miesta vpichu. Je 
potrebné zaznamena ť všetky straty, únik na mieste vpichu alebo neúplné 
podanie dávky. Celkový denný vpichnutý objem na potkana by nemal presiahnu ť 0,5 ml/kg telesnej hmotnosti.
 
Osobitné postupy pre androgénnych agonistov  
43. V prípade testovania androgénnych agonistov predstavuje skupina nosi ča 
negatívnu kontrolu a skupina, ktorej je podávaný TP, pozitívnu kontrolu. 
Na účely testovania biologickej aktivity zodpovedajúcej androgénnym 
agonistom sa testovaná chemikália podáva pokusným skupinám vo vybra ­
ných dávkach po čas 10 po sebe nasledujúcich dní. Na ú čely zistenia štatis ­
ticky významného zvýšenia hmotnosti piatich akcesórnych tkanív pohlav ­
ných orgánov v pokusných skupinách, v ktorých sa zvieratám podáva testo ­
vaná chemikália, sa tieto hmotnosti porovnajú so skupinou nosi ča. 
Osobitné postupy v prípade androgénnych antagonistov a inhibítory 
5α-reduktázy  
44. V prípade testovania androgénnych antagonistov a inhibítorov 5 α-reduktázy 
predstavuje skupina, v ktorej sa zvieratám podáva TP, negatívnu kontrolu 
a skupina, v ktorej sa zvieratám podávajú referen čné dávky TP spolu s FT, 
predstavuje pozitívnu kontrolu. Na ú čely testovania biologickej aktivity 
zodpovedajúcej androgénnym antagonistom a inhibítorom 5 α-reduktázy sa 
podáva referen čná dávka TP a testovaná chemikália po čas 10 po sebe 
nasledujúcich dní. Na ú čely zistenia štatisticky významného zníženia hmot ­
nosti piatich akcesórnych tkanív pohlavných orgánov v pokusných skupi ­
nách, v ktorých sa zvieratám podáva TP spolu s testovanou chemikáliou, sa 
tieto hmotnosti porovnajú so skupinou, v ktorej sa zvieratám podáva iba 
referenčný TP.  
POZOROVANIA  
Klinické pozorovania  
45. Všeobecné klinické pozorovania je potrebné vykonáva ť aspoň raz denne a v 
prípade zistenia známok toxicity častejšie. Pozorovania sa pod ľa možnosti 
vykonávajú v rovnakom čase (časoch) každý de ň a so zrete ľom na obdobie 
najvyšších o čakávaných ú činkov po dávkovaní. U všetkých zvierat sa 
sleduje úmrtnos ť, chorobnos ť a všeobecné klinické príznaky, ako napríklad 
zmeny v správaní, na koži, kožušine, o čiach, slizniciach, výskyt sekrécie, 
exkrécie a vegetatívnej aktivity (napr. slzenie, piloerekcia, ve ľkosť zreníc, 
nezvyčajné dýchanie). 
46. Každé uhynuté zviera sa odstráni a vyradí bez ďalšej analýzy údajov. 
Úmrtnosť zvierat pred pitvou sa uvedie do záznamov štúdie spolu so zjav ­
nými príčinami úmrtnosti. Všetky moribundné zvieratá sa humánne utratia. 
Všetky moribundné a následne utratené zvieratá sa uvedú do záznamu 
štúdie spolu so zjavnými prí činami chorobnosti.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Telesná hmotnos ť a spotreba potravy  
47. Všetky zvieratá sa musia denne váži ť s presnos ťou na 0,1 g, pri čom prvé 
váženie sa vykoná tesne pred za čatím testu, t. j. pri rozde ľovaní zvierat do 
skupín. Nepovinne možno mera ť množstvo potravy spotrebovanej po čas 
testu, a to vážením k ŕmidiel v každej klietke. Výsledky spotreby potravy 
sa vyjadria v gramoch na potkana na de ň. 
Pitva a váženie tkanív a orgánov  
48. Približne 24 hodín po poslednom podaní testovanej chemikálie sa potkany 
utratia a odkrvia v súlade s bežnými postupmi laboratória, ktoré test vyko ­
náva, a vykoná sa pitva. Metóda humánneho utratenia sa zaznamená do správy laboratória. 
49. Ak je to možné, zvolí sa náhodné poradie pitiev zvierat zo všetkých skupín, 
aby sa predišlo priamemu postupu jedným alebo druhým smerom pod ľa 
dávkových skupín, čo by mohlo ovplyvni ť údaje. Všetky pitevné nálezy, t. 
j. patologické zmeny/vidite ľné poškodenia sa zaznamenajú a uvedú do 
správy. 
50. Päť tkanív podmienených ú činkom androgénov (VP, SV, LABC, COW, 
GP) sa odváži. Tieto tkanivá sa vypreparujú, dôkladne zbavia prebyto čného 
priľnavého tkaniva a tuku a ur čí sa ich čerstvá (nefixovaná) hmotnos ť. 
S každým tkanivom je potrebné zaobchádza ť veľmi opatrne, aby sa predišlo 
strate tekutín a vysychaniu, ktoré by vzh ľadom na nižšie zaznamenané 
hmotnosti mohli vies ť k významným chybám a variabilite. Niektoré tkanivá 
môžu byť veľmi malé alebo sa môžu ťažko pitva ť, čo povedie k variabilite. 
Je preto dôležité, aby osoby, ktoré vykonávajú pitvu akcesórnych tkanív pohlavných orgánov poznali štandardné postupy pitvy týchto tkanív. Príručku štandardných opera čných postupov (SOP) pri pitve poskytuje orga ­
nizácia OECD (21). Dôkladnou prípravou v súlade s príru čkou SOP sa 
minimalizuje potenciálny zdroj variability v štúdii. Pod ľa možnosti by za 
pitvu daného tkaniva mal by ť zodpovedný ten istý prosektor, aby sa pred ­
išlo individuálnym rozdielom pri spracovaní tkaniva. Ak to nie je možné, 
pitva by sa mala navrhnú ť tak, aby každý prosektor pitval dané tkanivo zo 
všetkých ošetrených skupín a jeden prosektor pitval všetky tkanivá z kontrolnej skupiny, zatia ľ čo ďalšia osoba by bola zodpovedná za 
ošetrené skupiny. Všetky akcesórne tkanivá pohlavných orgánov sa odvážia 
bez vysušenia s presnos ťou na 0,1 mg a hmotnosti pre jednotlivé zvieratá sa 
zaznamenajú. 
51. Niektoré tkanivá môžu by ť veľmi malé alebo sa môžu ťažko pitva ť, č
o 
povedie k variabilite. Predchádzajúce práce poukázali na rozsah varia čného 
koeficientu (CV), ktorý sa pod ľa všetkého líši v závislosti od odbornosti 
laboratória. V niektorých prípadoch boli v rámci konkrétneho laboratória pozorované ve ľké rozdiely absolútnych hmotností tkanív, ako je VP 
a COWS. 
52. Váženie pe čene, páru obli čiek a páru nadobli čiek je nepovinné. Tkanivá sa 
opäť zbavia akýchko ľvek priľnavých tkanív a tuku. Hmotnos ť pečene sa 
odváži a zaznamená s presnos ťou na 0,1 g a hmotnos ť obličiek sa odváži 
a zaznamená s presnos ťou na 0,1 mg. Nielenže androgény vplývajú na 
pečeň, obličky a nadobli čky, tieto orgány zárove ň slúžia ako užito čné 
ukazovatele toxicity systému.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Meranie sérového luteiniza čného hormónu (LH), folikulárneho stimulujú ­
ceho hormónu (FSH) a testosterónu (T) je nepovinné. Hladiny sérového 
T majú význam pri ur čovaní, či testovaná chemikália indukuje metabo ­
lizmus testosterónu v pe čeni, čo vedie k zníženiu hladín séra. Bez údajov 
o T sa môže zda ť, že k takémuto ú činku dochádza prostredníctvom antian ­
drogénneho mechanizmu. Hladiny LH poskytujú informácie o schopnosti 
antiandrogénu nielen zníži ť hmotnos ť orgánu, ale aj ovplyvni ť funkciu 
hypotalamu-hypofýzy, čo v dlhodobých štúdiách môže vyvola ť nádory na 
semenníkoch. FSH je dôležitý hormón pre spermatogenézu. Merania séro ­
vého T4 a T3 sú takisto nepovinné merania, ktoré by priniesli užito čné 
dodatočné informácie o schopnosti narúša ť homeostázu hormónov štítnej 
žľazy. Ak sa majú vykona ť merania hormónov, potkanom sa pred pitvou 
podá anestézia a odoberie sa im krv punkciou srdca, pri čom pri výbere 
metódy anestézie sa dbá na to, aby neovplyvnila merania hormónov. 
Metóda prípravy séra, zdroj rádioimunologickej analýzy a ostatné meracie zariadenia, analytické postupy a výsledky sa zaznamenajú. Hladiny LH sa do správy uvedú v ng/ml séra, rovnako ako hladina T. 
54. Opis pitvy tkanív je uvedený ďalej spolu s podrobným pitevným postupom 
a fotografiami, ktoré boli v rámci valida čného programu zverejnené ako 
doplnkový materiál (21). Na webovej stránke kórejskej Správy pre potra ­
viny a lie čivá (Korea Food and Drug Administration) je k dispozícii aj 
video (22). 
— V polohe, ke ď je zviera oto čené bruchom nahor, zistite, či sa predkožka 
penisu oddelila od žalu ďa. Ak áno, stiahnite predkožku a odstrá ňte 
žaluď, odvážte ho (s presnos ťou na 0,1 mg) a hmotnos ť zaznamenajte. 
— Otvorte brušnú kožu a stenu tak, aby bolo vidno vnútornosti. Ak sa 
vážia nepovinné orgány, odstrá ňte a odvážte pe čeň s presnos ťou na 0,1 
g, odstráňte žalúdok a č
revá, odstrá ňte pár obli čiek a pár nadobli čiek 
a odvážte ich s presnos ťou na 0,1 mg. Týmto vypreparovaním sa odhalí 
močový mechúr a za čína sa preparovanie cie ľových sam čích akcesór ­
nych tkanív. 
— Na pitvu VP odde ľte močový mechúr od brušnej svalovej vrstvy prere ­
zaním spojivového tkaniva pozd ĺž stredovej osi. Posu ňte močový 
mechúr dopredu smerom k semenným mechúrikom, čím sa odhalí 
ľavý a pravý lalok ventrálnej prostaty (pokrytý tukovou vrstvou). 
Opatrne odstrá ňte tuk z pravého a ľavého laloku VP. Jemne odoberte 
pravý lalok VP z mo čovej trubice a vyrežte lalok z mo čovej trubice. 
Zatiaľ čo držíte pravý lalok VP, jemne odoberte ľavý lalok VP 
z močovej trubice a následne ho vyrežte, odvážte s presnos ťou na 0,1 
mg a hmotnos ť zaznamenajte. 
— Na pitvu SVCG posu ňte močový mechúr dozadu, čím odhalíte seme ­
novod a pravý a ľavý lalok semenných mechúrikov a koagula čné 
žľazy (SVCG). Úniku tekutiny zabránite upevnením svorky pri koreni 
SVCG, kde sa semenovod pripája na mo čovú trubicu. Opatrne vyrežte 
SVCG, pri zavedenej svorke odstrá ňte tuk a adnexá, zave ďte lodičku na 
váženie, odstrá ňte svorku, odvážte s presnos ťou na 0,1 mg a hmotnos ť 
zaznamenajte.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Na pitvu zdvíha ča konečníka a bulbokavernóznych svalov (LABC) je 
potrebné odhali ť svaly a kore ň penisu. Svaly zdvíha ča konečníka 
obaľujú hrubé črevo, zatia ľ čo predná časť zdvíhača konečníka 
a bulbokavernóznych svalov je pripojená k bulbu penisu. Koža a adnexá z perianálnej oblasti siahajúce od kore ňa penisu k prednému 
koncu kone čníka sa odstránia. Bulbokavernózne svaly sa postupne 
oddelia od bulbu penisu a tkanív. Hrubé črevo sa rozreže na dve časti 
a zdvíhač konečníka spolu s bulbokavernóznymi svalmi možno vyreza ť 
a odstráni ť. Zdvíhač konečníka a bulbokavernózne svaly sa zbavia tuku 
a adnex, odvážia s presnos ťou na 0,1 mg a hmotnos ť sa zaznamená. 
— Po odstránení LABC vidno oblé Cowperove alebo bulbouretrálne 
žľazy (COW) pri koreni a mierne dorzálne od bulbu penisu. Pitvu je 
potrebné vykona ť opatrne, aby sa predišlo vrúbkovaniu tenkej kapsule 
a zabránilo úniku tekutiny. Odvážte pár COW s presnos ťou na 0,1 mg 
a hmotnos ť zaznamenajte. 
— Okrem toho, ak po čas pitvy a preparovania dôjde k úniku tekutiny 
z niektorej ž ľazy, je potrebné túto skuto čnosť uviesť do správy. 
55. Ak si hodnotenie každej chemikálie vyžaduje pitvu viacerých zvierat, ako je 
primerané v jeden de ň, začiatok štúdie možno rozloži ť na dva po sebe 
nasledujúce dni, v dôsledku čoho sa pitva a súvisiaca práca rozloží na 
dva dni. Ak sa práca rozloží týmto spôsobom, v jeden de ň sa použije 
polovica zvierat z každej ošetrenej skupiny. 
56. Mŕtve telá sa po pitve vhodným spôsobom zlikvidujú.  
PODÁVANIE SPRÁV  
Údaje  
57. Údaje sa do správy uvedú jednotlivo (t. j. telesná hmotnos ť, hmotnos ť 
akcesórnych tkanív pohlavných orgánov, nepovinné merania a ostatné reakcie a pozorovania) a pre každú skupinu zvierat (stredná a štandardná 
odchýlka všetkých vykonaných meraní). Údaje sa uvádzajú v tabu ľkovej 
podobe. V údajoch sa uvedie po čet zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat, 
ktoré boli po čas testu nájdené uhynuté alebo vykazovali známky toxicity, 
opis pozorovaných známok toxicity vrátane času nástupu, trvania 
a závažnosti. 
58. Závere čná správa musí obsahova ť tieto informácie:
 
Testovacie zariadenie  
— názov zariadenia, poloha, 
— vedúci štúdie a ostatní pracovníci a ich úlohy v rámci štúdie, — dátum za čiatku a konca štúdie, t. j. prvý de ň podávania testovanej 
chemikálie a posledný de ň pitvy.
 
Testovaná chemikália  
— zdroj, sériové číslo/číslo šarže, identita, čistota, úplná adresa dodávate ľa 
a charakteristika testovanej chemikálie (chemikálií), 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti, — podmienky skladovania a spôsob a periodicita prípravy roztokov, 
— všetky získané údaje o stabilite, 
— všetky analýzy dávkovacích roztokov/suspenzií.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Nosič 
— charakteristika testovaného nosi ča (identita, dodávate ľ a sériové číslo), 
— odôvodnenie výberu nosi ča (ak je iný ako voda).  
Pokusné zvieratá a postupy chovu zvierat  
— použitý druh/kme ň a odôvodnenie výberu, 
— zdroj alebo dodávate ľ zvierat vrátane úplnej adresy, 
— počet a vek dodaných zvierat, 
— podmienky umiestnenia (teplota, osvetlenie at ď.), 
— krmivo (názov, typ, dodávate ľ, sériové číslo, obsah a hladiny fytoes ­
trogénov, ak sú známe), 
— podstielka (názov, typ, dodávate ľ, obsah), 
— podmienky v klietkach a po čet zvierat na klietku.  
Podmienky testu  
— vek pri kastrácii a doba aklimatizácie po kastrácii, 
— jednotlivé hmotnosti zvierat na za čiatku štúdie (s presnos ťou na 0,1 g), 
— postup randomizácie a záznam o priradení do skupín nosi ča, referen č­
ných skupín, skupín, ktorým sa podáva testovaná chemikália, a klietok, 
— stredná a štandardná odchýlka telesných hmotností v každej skupine za 
každý de ň váženia po čas štúdie, 
— odôvodnenie výberu dávky, 
— spôsob podávania testovanej chemikálie a odôvodnenie výberu spôsobu 
expozície, 
— pri teste na antiandrogénne ú činky, ošetrenie TP (dávka a objem), 
— ošetrenie testovanou chemikáliou (dávka a objem), — čas podania dávky, 
— pitevné postupy vrátane metód odkrvenia a anestézie, 
— v prípade, že sa analyzujú séra, uvedú sa údaje o metóde. Napríklad, ak 
sa použije rádioimunologická analýza (RIA), do správy sa uvedie postup 
RIA, zdroj testovacích súprav pre RIA, dátum spotreby testovacích 
súprav, postup scintila čnej spektroskopie a štandardizácie.
 
Výsledky  
— denné pozorovania jednotlivých zvierat po čas dávkovania vrátane týchto 
informácií: 
— telesné hmotnosti (s presnos ťou na 0,1 g), 
— klinické príznaky (ak sa pozorujú), 
— všetky merania alebo poznámky týkajúce sa spotreby potravy, 
— pitevné pozorovania jednotlivých zvierat vrátane týchto informácií:  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— dátum pitvy, 
— ošetrená skupina zvierat, 
— identifikácia zvierat, 
— prosektor, — denná doba pitvy a preparovania, 
— vek zvierat, 
— konečná telesná hmotnos ť v čase pitvy s uvedením prípadného štatis ­
ticky významného zvýšenia alebo zníženia telesnej hmotnosti, 
— poradie odkrvenia a preparovania zvierat v čase pitvy, 
— hmotnos ť piatich cie ľových tkanív, ktoré sú podmienené ú činkom 
androgénov: 
— ventrálna prostata (s presnos ťou na 0,1 mg), 
— semenné mechúriky a koagula čné žľazy vrátane tekutiny (spárované, 
s presnos ťou na 0,1 mg), 
— komplex zdvíha ča konečníka a bulbokavernóznych svalov (s presnos ťou 
na 0,1 mg), 
— Cowperove ž ľazy (čerstvá hmotnos ť - spárované, s presnos ťou na 0,1 
mg), 
— žaluď (čerstvá hmotnos ť s presnos ťou na 0,1 mg), 
— hmotnos ť nepovinných tkanív, ak boli vážené: 
— pečeň (s presnos ťou na 0,1 g), 
— obličky (spárované, s presnos ťou na 0,1 mg), 
— nadobli čky (spárované, s presnos ťou na 0,1 mg), 
— všeobecné poznámky a pripomienky, 
— analýza sérových hormónov, ak sa vykonala, 
— sérový LH (nepovinné – ng/ml séra) a — sérový T (nepovinné – ng/ml séra), 
— všeobecné poznámky a pripomienky.
 
Zhrnutie údajov  
Údaje sa zhrnú do tabu ľky, v ktorej sa uvedie ve ľkosť vzorky jednotlivých 
skupín, stredná hodnota a štandardná chyba strednej hodnoty alebo štan ­
dardná odchýlka. V tabu ľkách sa uvedie telesná hmotnos ť v čase pitvy, 
zmeny telesnej hmotnosti od za čiatku dávkovania po pitvu, hmotnos ť cieľo­
vých akcesórnych tkanív pohlavných orgánov a hmotnosti nepovinných orgánov.
 
Rozbor výsledkov  
Analýza výsledkov  
59. Telesná hmotnos ť a hmotnos ť orgánov v čase pitvy by sa mali štatisticky 
analyzova ť s ohľadom na také charakteristiky, ako je homogenita rozptylu 
s príslušnými transformáciami údajov pod ľa potreby. Ošetrené skupiny sa 
porovnajú s kontrolnou skupinou s využitím metód ako ANOVA a následne 
na základe párového porovnania (napr. Dunnettov jednostranný test) a kritéria pre štatistický rozdiel, napr. p ≤ 0,05. Ur čia sa štatisticky 
významné skupiny. Je však potrebné vyhnú ť sa „relatívnej hmotnosti orgá ­
nov“ vzh ľadom na neplatné štatistické predpoklady tejto manipulácie 
s údajmi.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Pokia ľ ide o androgénny agonizmus, kontrolou je testovacia skupina, ktorej 
sa podal iba nosi č. Charakteristiky mechanizmu pôsobenia testovanej 
chemikálie môžu vies ť k rôznym relatívnym reakciám u rôznych tkanív, 
napríklad trenbolón, na ktorý nepôsobí 5 α-reduktáza, má silnejšie ú činky na 
LABC a GP ako TP. Štatisticky významné zvýšenie hmotnosti (p ≤ 0,05) 
u ktorýchko ľvek dvoch alebo viacerých z piatich cie ľových tkanív podmie ­
nených ú činkom androgénov (VP, LABC, GP, CG a SVCG) je potrebné 
považova ť za pozitívny výsledok na androgénneho agonistu a všetky 
cieľové tkanivá by mali vykazova ť určitú mieru rastu. Kombinované hodno ­
tenie všetkých reakcií akcesórnych tkanív pohlavných orgánov možno 
vykonať pomocou vhodnej multivaria čnej analýzy dát. Týmto spôsobom 
možno analýzu zdokonali ť, najmä v prípadoch, ke ď sa štatisticky významná 
reakcia pozoruje iba u jedného tkaniva. 
61. Pokia ľ ide o androgénny antagonizmus, kontrolou je testovacia skupina, 
ktorej sa podal referen čný androgén (iba testosterón propionát). Charakte ­
ristiky mechanizmu pôsobenia testovanej chemikálie môžu vies ť k rôznym 
relatívnym reakciám u jednotlivých tkanív, napríklad inhibítory 5 α-reduk­
tázy, ako je finasterid, majú výraznejšie ú činky na ventrálnu prostatu ako 
iné tkanivo v porovnaní so silnými antagonistami AR, ako je flutamid. 
Štatisticky významné zníženie hmotnosti (p ≤ 0,05) u ktorýchko ľvek 
dvoch alebo viacerých z piatich cie ľových tkanív podmienených ú činkom 
androgénov (VP, LABC, GP, CG a SVCG) v porovnaní s prípadom, ke ď 
bol zvieratám podaný iba TP, je potrebné považova ť za pozitívny výsledok 
na androgénneho antagonistu a všetky cie ľové tkanivá by mali vykazova ť 
určitú mieru úbytku hmotnosti. Kombinované hodnotenie všetkých reakcií 
akcesórnych tkanív pohlavných orgánov možno vykona ť pomocou vhodnej 
multivaria čnej analýzy dát. Týmto spôsobom možno analýzu zdokonali ť, 
najmä v prípadoch, ke ď sa štatisticky významná reakcia pozoruje iba 
v prípade jedného tkaniva. 
62. Údaje sa zhrnú do tabu ľky, v ktorej sa uvedie stredná hodnota a štandardná 
chyba strednej hodnoty (štandardná odchýlka je tiež prípustná) a ve ľkosť 
vzorky jednotlivých skupín. Zahrnú sa aj tabu ľky jednotlivých údajov. 
Jednotlivé hodnoty, stredná hodnota, hodnoty SE (SD) a CV pre kontrolné 
údaje sa preskúmajú s cie ľom určiť, či spĺňajú prípustné kritériá konzistent ­
nosti s očakávanými historickými hodnotami. Hodnoty CV, ktoré presahujú 
hodnoty CV uvedené v tabu ľke 1 (pozri odseky 25 a 26) pre hmotnos ť 
jednotlivých orgánov, ur čia, či sa v dátových záznamoch alebo údajoch 
vyskytli chyby, alebo či laboratórium zatia ľ nevie presne vypreparova ť 
tkanivá podmienené ú činkom androgénov a je potrebná ďalšia odborná 
príprava/prax. Vo všeobecnosti sú hodnoty CV (štandardná odchýlka delené 
stredná hmotnos ť orgánu) opakovate ľné rôznymi laboratóriami a v rámci 
rôznych štúdií. Uvedené údaje by mali zah ŕňať prinajmenšom hmotnos ť 
ventrálnej prostaty, semenných mechúrikov, zdvíha ča konečníka 
a bulbokavernóznych svalov, Cowperových žliaz, žalu ďa, pečene, telesnú 
hmotnosť a zmenu telesnej hmotnosti od za čiatku dávkovania po pitvu. 
Možno uvies ť aj údaje po úprave kovariancie vzh ľadom na telesnú hmot ­
nosť, nemali by sa však uvádza ť namiesto neupravených údajov. Okrem 
toho, ak sa v žiadnej skupine nepozoruje oddelenie predkožky (PPS), 
výskyt PPS sa zaznamená a štatisticky porovná s kontrolnou skupinou na 
základe Fisherovho presného testu.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Pri overovaní dátových záznamov v po čítači s pôvodnými kartami údajov je 
v záujme presnosti potrebné dôkladne preskúma ť hodnoty hmotnosti orgá ­
nov, ktoré nie sú z biologického h ľadiska vierohodné, alebo sa líšia viac 
ako o tri štandardné odchýlky od stredných hodnôt danej ošetrenej skupiny, a môže by ť potrebné ich vyradi ť ako pravdepodobne chybné údaje. 
64. Porovnanie výsledkov štúdie s hodnotami CV pod ľa OECD (v tabu ľke 1) 
často predstavuje dôležitý krok v rámci interpretácie validity výsledkov 
štúdie. Historické údaje o kontrolných skupinách, ktorým sa podal nosi č, 
sa uchovávajú v laboratóriu. V laboratóriu sa uchovávajú aj historické údaje o reakciách na pozitívne referen čné chemikálie, ako je TP a FT. Laboratóriá 
môžu zárove ň pravidelne testova ť reakciu na známych slabých androgén ­
nych agonistov a antagonistov a uchováva ť tieto údaje. Tieto údaje možno 
porovnať s dostupnými údajmi OECD, aby sa zabezpe čila dostato čná štatis­
tická presnos ť a významnos ť metód laboratória.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIA POJMOV  
Androgénny  je pojem používaný na opísanie kladného ú činkuna rast tkanív 
závislých od androgénu.  
Antiandrogénný  je schopnos ť chemikálie potla čiť pôsobenie testosterón-propio ­
nátu na organizmus cicavca.  
Chemikália  znamená látku alebo zmes.  
Dátum narodenia  je postnatálny de ň 0. 
Dávka  je množstvo podanej testovanej chemikálie. V prípade Hershbergerovho 
biologického testu sa dávka vyjadruje ako hmotnos ť testovanej chemikálie na 
jednotku telesnej hmotnosti pokusného zviera ťa na deň (napr. mg/kg telesnej 
hmotnosti/de ň). 
Dávkovanie  je všeobecný pojem, ktorý zah ŕňa dávku, frekvenciu a trvanie podá ­
vania dávok.  
Moribundný  je pojem používaný na opísanie zviera ťa v stave umierania, t. j. 
blízko stavu smrti.  
Postnatálny de ň X je X-tý de ň života po dni narodenia.  
Citlivosť je schopnos ť testovacej metódy správne ur čiť chemikálie 
s vlastnos ťami, ktoré sa testujú.  
Špecifickos ť je schopnos ť testovacej metódy správne ur čiť chemikálie bez vlast ­
ností, ktoré sa testujú.  
Testovaná chemikália  znamená akúko ľvek látku alebo zmes, ktorá sa testuje 
pomocou tejto testovacej metódy.  
Validácia  je vedecký postup ur čený na charakterizovanie prevádzkových požia ­
daviek a obmedzení testovacej metódy a na preukázanie jej spo ľahlivosti 
a významu pre konkrétny ú čel. ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Dodatok 2
  
VMG mamm: Skupina pre riadenie validácie testovania a posudzovania cicavcov
 POZNÁMKY K RÁMCU  
Poznámka 1:  Vstup na všetkých úrovniach a výstup na všetkých úrovniach je 
možný a závisí od povahy existujúcich informa čných potrieb na 
účely posúdenia nebezpe čnosti a rizík.  
Poznámka 2:  Na úrovni 5 by ekotoxikológia mala zah ŕňať sledované parametre, 
ktoré indikujú mechanizmy nepriaznivých ú činkov a potenciálne 
poškodenie populácie.  
Poznámka 3:  Ak multimodálny model zah ŕňa viacero testov jedného sledova ­
ného parametra, daný model nahradí používanie týchto testov jedného sledovaného parametra.  
Poznámka 4:  Každá chemikália sa posudzuje jednotlivo po zoh ľadnení všetkých 
dostupných informácií a so zrete ľom na funkciu rámcových 
úrovní.  
Poznámka 5:  Rámec sa v sú časnosti nepovažuje za úplný. Na úrovniach 3, 4 a 5 
zahŕňa testy, ktoré sú bu ď dostupné, alebo u ktorých prebieha 
validácia. Pokia ľ ide o testy, u ktorých prebieha validácia, sú 
zahrnuté predbežne. Po vypracovaní a validácii sa formálne 
pridajú do rámca.  
Poznámka 6:  Úroveň 5 zahŕňa aj iné ako kone čné testy. Testy zahrnuté do tejto 
úrovne majú prispie ť k všeobecnému posúdeniu nebezpe čnosti 
a rizík.
 
LITERATÚRA  
1. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. - 11. marec 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
2. Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY. 
3. Gray LE Jr, Furr J a Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the 
effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandro ­
genic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols in 
Toxicology  16.9.1 - 16.9.15. J Wiley and Sons Inc. 
4. OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30. 
5. OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3. 
6. OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20. 
7. Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265 - 1269.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8. Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob 
E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671 - 8. 
9. Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413 - 422. 
10. Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306 - 
1314. 
11. Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38 - 44. 
12. Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113 - 119. 
13. Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175 - 180. 
14. Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service. 
15. Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151 - 220. 
16. Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p. 38. 
17. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
18. OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paríž. 
19. OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
20. OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4. 
21. Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. Pozri oddiel II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf. 
22. Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on 
Hershberger assay procedure, including a dissection video. http:// rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html. 
23. OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17. 
24. OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay. 
25. OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 
2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké ú čely (Ú. v. EÚ L 276, 
20.10.2010, s. 33). 
27. Nasledujúce kapitoly tejto prílohy: 
B.1a, Akútna orálna toxicita – metóda stabilnej dávky 
B.1b, Akútna orálna toxicita – metóda triedy akútnej toxicity  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  ROZŠÍRENÁ JEDNOGENERA ČNÁ ŠTÚDIA REPRODUK ČNEJ 
TOXICITY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie 
testov (TG) 443 (2012). Založená je na návrhu rozšírenej jednogenera čnej 
reprodukčnej štúdie vývojového štádia F  1 Medzinárodného inštitútu ILSI 
(International Life Science Institute – ILSI) – Inštitútu pre vedecký výskum 
zdravia a životného prostredia (Health and Environmental Sciences Institute 
– HESI), technického výboru pre hodnotenie bezpe čnosti poľnohospodár ­
skych chemických látok (Agricultural Chemical Safety Assessment – ACSA Technical Committee), ako bol publikovaný v práci Coopera a kolektívu 
v roku 2006 (1). V návrhu štúdie sa vykonali viaceré zlepšenia a vyjasnenia 
s cieľom zabezpe čiť pružnos ť a zdôrazni ť význam za čatia práce 
s existujúcimi znalos ťami, s využitím pozorovaní po čas života pri riadení 
a prispôsobovaní testovania. Táto testovacia metóda poskytuje podrobný 
opis prevádzkového vykonania rozšírenej jednogenera čnej štúdie repro ­
dukčnej toxicity. Testovacia metóda opisuje tri kohorty zvierat generácie F
 1 : 
kohorta 1: posudzujú sa sledované reproduk čné/vývojové parametre; táto 
kohorta sa môže rozšíri ť tak, aby zahrnula aj generáciu F  2 . 
kohorta 2: posudzuje sa potenciálny ú činok vystavenia chemikáliám na 
vyvíjajúci sa nervový systém. 
kohorta 3: posudzuje sa potenciálny ú činok vystavenia chemikáliám na 
vyvíjajúci sa imunitný systém. 
2. Rozhodnutia o tom, či posudzova ť druhú generáciu a či vynecha ť kohortu 
vývojovej neurotoxicity a/alebo vývojovej imunotoxicity, musia by ť zalo­ 
žené na existujúcich poznatkoch o chemikálii, ktorá sa hodnotí, ako aj na 
potrebách rôznych regula čných orgánov. Ú čelom tejto testovacej metódy je 
poskytnúť podrobné informácie o tom, ako sa dá štúdia vykona ť, a určiť, 
ako sa má každá kohorta hodnoti ť. 
3. Postup rozhodovania o vnútornom spustení vzniku 2. generácie je opísaný 
v usmerňovacom dokumente OECD 117 (39) pre regula čné orgány, ktoré 
využívajú vnútorné spúš ťače. 
ÚVODNÉ ÚVAHY A CIELE 
4. Hlavným cie ľom rozšírenej jednogenera čnej štúdie reproduk čnej toxicity je 
zhodnotiť konkrétne vývojové štádiá, ktorých sa netýkali iné druhy štúdií 
toxicity, a testova ť účinky, ktoré sa môžu vyskytnú ť v dôsledku prenatál ­
neho a postnatálneho vystavenia chemikáliám. Pre reproduk čné cieľové 
body sa predpokladá ako prvý krok a vždy, ke ď je to možné, použitie 
informácií zo štúdií s opakovanými dávkami (vrátane skríningových štúdií reprodukčnej toxicity, napríklad OECD TG 422 (32)) alebo z krátkodobých 
skríningových testov endokrinných disruptorov (napríklad uterotropický test 
– testovacia metóda B.54 (36) a Hershbergerov test – testovacia metóda 
B.55 (37)) na zis ťovanie účinkov na reproduk čné orgány samcov a samíc. 
Môže to zah ŕňať spermatogenézu (testikulárnu histopatológiu) u samcov 
a estrálny cyklus, po čty folikulov/dozrievanie oocytov a ovariálnu integritu 
(histopatológiu) u samíc. Rozšírená jednogenera čná štúdia reproduk čnej 
toxicity potom slúži ako test sledovaných reproduk čných parametrov, 
ktoré si vyžadujú interakciu samcov so samicami, samíc so zárodkom, samíc s potomstvom a generáciu F
 1 až do dosiahnutia pohlavnej zrelosti 
(pozri usmer ňovací dokument OECD 151 podporujúci túto testovaciu 
metódu (40)).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Táto testovacia metóda je navrhnutá tak, aby poskytla hodnotenie prenatál ­
nych a postnatálnych ú činkov chemikálií na vývoj, ako aj dôkladné hodno ­
tenie systémovej toxicity u gravidných samíc a samíc v laktácii a u mladého a dospelého potomstva. Predpokladá sa, že podrobným vyšetrovaním k ľúčo­
vých sledovaných vývojových parametrov, ako je životaschopnos ť potom­
stva, neonatálne zdravie, stav vývoja pri narodení a fyzický a funk čný vývoj 
do dospelosti, sa ur čia konkrétne cie ľové orgány v potomstve. Štúdia okrem 
toho poskytne a/alebo potvrdí informácie o ú činkoch testovaných chemikálií 
na integritu a činnosť reproduk čných systémov dospelých samcov a samíc. 
Posudzujú sa konkrétne, ale nie výlu čne, tieto parametre: funkcia pohlav ­
ných žliaz, estrálny cyklus, dozrievanie spermií z chvostovej časti 
nadsemenníkov, rozmnožovacie správanie, po čatie, gravidita, pôrod 
a laktácia. Informácie získané z posudzovania vývojovej neurotoxicity 
a vývojovej imunotoxicity budú navyše charakterizova ť potenciálne ú činky 
v týchto systémoch. Údaje získané z týchto testov umožnia stanovenie hladín bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL), hladín 
s najnižším pozorovate ľným nepriaznivým ú činkom (LOAEL) a/alebo refe ­
renčných dávok pre rôzne sledované parametre a/alebo sa použijú na 
charakterizovanie ú činkov zistených v predchádzajúcich štúdiách 
s opakovanými dávkami a/alebo poslúžia ako návod pre následné testovanie. 
6. Na obrázku 1 je znázornený schematický ná črt protokolu. Testovaná chemi ­
kália sa podáva sústavne v odstup ňovaných dávkach viacerým skupinám 
sexuálne zrelých samcov a samíc. Tejto generácii rodi čov (P) sa látka 
podáva po čas stanoveného obdobia pred párením (zvoleného na základe 
dostupných informácií o testovanej chemikálii, ale v d ĺžke najmenej dva 
týždne) a po čas dvojtýžd ňového obdobia párenia. Samcom generácie P sa 
látka ďalej podáva najmenej do odstavenia generácie F
 1 . Podávanie látky 
trvá najmenej 10 týžd ňov. Môže trva ť aj dlhšie, ak je potrebné objasni ť 
účinky na reprodukciu. Samiciam generácie P sa látka ďalej podáva po čas 
gravidity a laktácie až do ukon čenia po odstavení vrhu (t. j. 8 – 10 týžd ňov 
podávania). Potomstvu generácie F  1 s a testovaná chemikália ďalej podáva 
od odstavenia po dospelos ť. Ak sa posudzuje aj druhá generácia (pozri 
usmerňovací dokument OECD 117 (39)), podávanie látky potomstvu gene ­
rácie F  1 bude pokra čovať až do odstavenia generácie F  2 , alebo do ukon ­ 
čenia štúdie. 
7. Klinické pozorovania a patologické vyšetrenia sa vykonajú na všetkých 
zvieratách na príznaky toxicity s osobitným dôrazom na integritu a činnosť samčích a sami čích reproduk čných systémov a na zdravie, rast, 
vývoj a činnosť potomstva. Pri odstavení sa potomstvo rozdelí na jednotlivé 
skupiny (kohorta 1 – 3, pozri odseky 33 a 34 a obrázok 1) pre ďalšie 
vyšetrovanie vrátane sexuálneho dozrievania, integrity a činnosti reproduk č­
ných orgánov, sledovaných neurologických parametrov a parametrov sprá ­
vania a imunitných funkcií. 
8. Pri vykonávaní štúdie je potrebné sa riadi ť zásadami a h ľadiskami uvede ­
nými v usmer ňovacom dokumente OECD č. 19 Guidance Document on the 
Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation (34).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Ak bude k dispozícii dostato čný počet štúdií na to, aby sa zistil vplyv plánu 
tejto novej štúdie, testovacia metóda sa podrobí preskúmaniu a v prípade 
potreby bude revidovaná na základe získaných skúseností.  
Obrázok 1  
Schéma rozšírenej jednogenera čnej štúdie reproduk čnej toxicity
  
OPIS METÓDY/PRÍPRAVY NA TEST  
Zvieratá  
Výber druhu a kme ňa zvierat  
10. Voľbu druhov pre testy reproduk čnej toxicity je potrebné dôkladne zváži ť 
s ohľadom na všetky dostupné informácie. Vzh ľadom na rozsah základných 
údajov a porovnate ľnosť testov všeobecnej toxicity je však bežne prefero ­
vaným druhom potkan a kritériá a odporú čania uvedené v tejto testovacej 
metóde sa vz ťahujú na tento druh. Ak sa použije iný druh, je potrebné 
uviesť odôvodnenie a vykona ť príslušné úpravy protokolu. Kmene 
s nízkou plodnos ťou, alebo o ktorých je známe, že majú vysoký výskyt 
spontánnych vývojových porúch, sa nemajú používa ť. 
Vek, telesná hmotnos ť a kritériá použitia  
11. Používa ť sa musia zdravé rodi čovské zvieratá, ktoré neboli podrobené pred ­
chádzajúcim pokusom. Študova ť je potrebné samcov aj samice, pri čom 
samice by musia by ť virgínne a negravidné. Zvieratá generácie P musia 
byť sexuálne zrelé, podobnej hmotnosti (v rámci pohlavia) na za čiatku 
podávania látky, podobného veku (približne 90 dní) pri párení a mali by 
byť reprezentatívnymi predstavite ľmi skúmaného druhu a kme ňa. Zvieratá 
sa majú po príchode aklimatizova ť aspoň 5 dní. Zvieratá sa náhodne 
rozdelia do kontrolných a testovaných skupín tak, aby výsledkom boli 
porovnate ľné stredné hodnoty hmotnosti jednotlivých skupín (t. j. ± 20 % 
strednej hodnoty).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Podmienky pre umiestnenie a k ŕmenie  
12. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá má by ť 22 °C (± 3 °C). Relatívna 
vlhkosť má byť 30 – 70 %, pri čom ideálny rozsah je 50 – 60 %. Umelé 
osvetlenie má by ť zapnuté 12 hodín a 12 hodín má by ť tma. Používa ť sa 
môže bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. 
Veľkú pozornos ť je potrebné venova ť obsahu fytoestrogénov v krmive, 
keďže vysoká úrove ň fytoestrogénov v krmive môže ovplyvni ť niektoré 
sledované reproduk čné parametre. Odporú čajú sa normované krmivá 
s otvorenou receptúrou, v ktorých je obsah estrogénových chemikálií 
znížený (2) (30). Výber krmiva môže by ť ovplyvnený potrebou zaistenia 
vhodného prídavku testovanej chemikálie pri použití tejto metódy. Obsah, 
homogénnos ť a stabilitu testovanej chemikálie v krmive je potrebné overo ­
vať. Potravu a pitnú vodu je potrebné pravidelne analyzova ť na obsah 
kontaminantov. Vzorky každej dávky krmiva používaného po čas štúdie sa 
uchovávajú vo vhodných podmienkach (t. j. zmrazené na – 20 °C) až do 
vypracovania správy pre prípad, že by si výsledky vyžadovali ďalšiu 
analýzu zložiek krmiva. 
13. Zvieratá sú umiestnené v klietkach v malých skupinách rovnakého pohlavia 
a rovnakej testovanej skupiny. Môžu by ť umiestnené individuálne, aby sa 
predišlo možným poraneniam (napríklad samce po období párenia). Párenie prebieha vo vhodných klietkach. Po preukázanej kopulácii je potrebné 
samice, u ktorých sa predpokladá, že sú gravidné, umiestni ť oddelene 
v pôrodných alebo materských klietkach, kde im bude poskytnutý vhodný a stanovený materiál na hniezdenie. Vrhnuté mlá ďatá sú umiestnené so 
svojimi matkami až do odstavenia. Zvieratá generácie F
 1 sú umiestnené 
v malých skupinách rovnakého pohlavia a rovnakej testovanej skupiny od 
odstavenia do ukon čenia. Ak je to vedecky odôvodnené, zvieratá môžu by ť 
umiestnené individuálne. Úrove ň fytoestrogénov obsiahnutých vo zvolenom 
materiáli na hniezdenie musí by ť minimálna.  
Počet a identifikácia zvierat  
14. Každá testovaná a kontrolná skupina spravidla pozostáva z dostato čného 
počtu páriacich sa dvojíc tak, aby výsledkom bolo najmenej 20 gravidných 
samíc na dávkovú skupinu. Cie ľom je dosiahnu ť dostatočný počet gravidít, 
aby sa zabezpe čilo zmysluplné hodnotenie potenciálu chemikálie pôsobi ť na 
fertilitu, graviditu a materské správanie generácie P a na rast a vývoj potom ­
stva generácie F  1 od oplodnenia po dosiahnutie zrelosti. Ak sa nedosiahne 
zamýšľaný počet gravidných zvierat, neznamená to nevyhnutne neplatnos ť 
štúdie, ke ďže je potrebné každý prípad hodnoti ť individuálne a zoh ľadniť 
pritom možnú prí činnú súvislos ť s testovanou chemikáliou. 
15. Každému zviera ťu generácie P sa pred za čiatkom podávania dávok pridelí 
jeho vlastné identifika čné číslo. Ak laboratórne historické údaje nazna čujú, 
že výrazná časť samíc nemusí vykazova ť pravidelné (štvord ňové alebo 
päťdňové) estrálne cykly, odporú ča sa posúdi ť estrálne cykly pred 
začiatkom podávania látky. Alternatívne sa môže skupina zvä čšiť tak, aby 
bolo zabezpe čené, že v každej skupine bude ma ť na začiatku testovania 
pravidelné (štvord ňové alebo pä ťdňové) estrálne cykly najmenej 20 samíc. 
Každé mlá ďa z potomstva generácie F  1 sa jednozna čne identifikuje pri 
prvom vyšetrení v 0. alebo 1. postantálny de ň. Pre všetky zvieratá generácie 
F 1 a podľa potreby aj zvieratá generácie F  2 s a záznamy s uvedením vrhu, 
z ktorého pochádzajú, uchovajú po čas celého trvania štúdie.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Testovaná chemikália  
Dostupné informácie o testovanej chemikálii  
16. Preh ľad existujúcich informácií je dôležitý pre prijímanie rozhodnutí 
o spôsobe podávania, vo ľbe nosiča, výbere druhu zviera ťa, voľbe dávok 
a prípadných úpravách harmonogramu dávkovania. Preto je potrebné pri 
plánovaní rozšírenej jednogenera čnej štúdie reproduk čnej toxicity bra ť do 
úvahy všetky dôležité dostupné informácie o testovanej chemikálii, t. j. fyzikálno-chemické, toxikokinetické (vrátane metabolizmu konkrétneho 
druhu), toxikodynamické vlastnosti, vz ťahy medzi štruktúrou a aktivitou, 
metabolické procesy in vitro, výsledky predchádzajúcich štúdií toxicity a relevantné informácie o štrukturálnych analógoch. Predbežné informácie o absorpcii, distribúcii, metabolizme a eliminácii, ako aj o bioakumulácii sa 
dajú odvodi ť z chemickej štruktúry, fyzikálno-chemických vlastností, miery 
viazania proteínov plazmy alebo z toxikokinetických štúdií, zatia ľ čo 
výsledky štúdií toxicity poskytujú dopl ňujúce informácie, napríklad 
o hladine bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL), 
o metabolizme alebo indukcii metabolizmu.
 
Posúdenie toxikokinetických údajov  
17. Toxikokinetické údaje z predchádzajúcich štúdií venovaných ur čovaniu 
rozsahu dávky alebo iných štúdií sa síce nevyžadujú, sú však nesmierne 
užitočné pri navrhovaní plánu štúdie, vo ľbe hladiny dávky a interpretácii 
výsledkov. Zvláš ť prínosné sú údaje, ktoré: 1) verifikujú vystavenie vyví ­
jajúcich sa plodov a mlá ďat testovanej chemikálii (alebo príslušných meta ­
bolitov), 2) poskytujú odhad vnútornej dozimetrie a 3) hodnotia potenciálnu saturáciu kinetických procesov v závislosti od dávky. Zoh ľadniť treba aj 
ďalšie toxikokinetické údaje, ako sú profily metabolitov, priebeh závislosti 
koncentrácie od času atď., pokiaľ sú k dispozícii. Dopl ňujúce toxikokine ­
tické údaje sa dajú získa ť aj v priebehu hlavnej štúdie za predpokladu, že to 
neprekáža pri získavaní a interpretácii hlavných sledovaných parametrov štúdie. 
Ako všeobecné usmernenie platí, že pri plánovaní rozšírenej jednogene ­
račnej štúdie reproduk čnej toxicity sú užito čné tieto súbory toxikokinetic ­
kých údajov: 
— v pokro čilom období gravidity (napríklad 20. de ň gravidity) – materská 
krv a krv plodu, 
— uprostred obdobia laktácie (10. postnatálny de ň) – materská krv, krv 
mláďaťa a/alebo mlieko, 
— obdobie krátko po odstavení (napríklad 28. postnatálny de ň) – vzorky 
krvi odstaveného mlá ďaťa. 
Pri určovaní konkrétnych analytov (napríklad parentálnej, pôvodnej chemi ­
kálie a/alebo metabolitov) a plánu odberu vzoriek je potrebné uplatni ť 
pružnosť. Napríklad po čet a načasovanie odberov vzoriek v ur čený deň 
bude závisie ť od priebehu expozície a od predchádzajúcich znalostí 
o toxikokinetických vlastnostiach negravidných zvierat. V prípade dietetic ­
kých štúdií posta čuje odber vzoriek každý ur č
ený deň v jednom stabilnom 
čase, keďže dávkovanie pomocou sondy môže zaru čiť dodatočné časy 
odberu vzoriek s cie ľom získa ť lepší odhad rozsahu vnútorných dávok. 
V žiadny de ň odberu vzoriek však nie je potrebné vytvára ť plne koncen ­
trovaný časový priebeh. V prípade potreby sa krv pre plodové a neonatálne 
analýzy môže odobera ť vo vrhoch pod ľa pohlavia.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Spôsob podávania  
18. Pri výbere spôsobu podávania je potrebné zoh ľadniť spôsoby, ktoré sú 
najdôležitejšie z h ľadiska expozície ľudí. Hoci protokol je vypracovaný 
pre prípad podávania testovanej chemikálie v krmive, môže sa upravi ť na 
podávanie inými cestami (v pitnej vode, sondou, inhaláciou, dermálne), 
v závislosti od vlastností chemikálie a požadovaných informácií.  
Voľba nosiča 
19. V prípade potreby sa testovaná chemikália rozpustí alebo rozptýli vo 
vhodnom nosi či. Odporú ča sa, aby sa pod ľa možnosti najskôr zvážilo 
použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napríklad kukuri čný olej). Pre iné nosi če ako voda majú by ť známe toxické 
vlastnosti nosi ča. Vyhnú ť sa treba používaniu nosi čov s potenciálnou 
vnútornou toxicitou (napríklad acetón, dimetylsulfoxid – DMSO). Je potrebné ur čiť stabilitu testovanej chemikálie v nosi či. Ak sa na u ľahčenie 
podávania dávky používa nosi č alebo iné aditívum, je potrebné venova ť 
pozornosť týmto vlastnostiam: vplyv nosi ča na absorpciu, distribúciu, meta ­
bolizmus alebo retenciu testovanej chemikálie, vplyv na chemické vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu zmeni ť jej toxické vlastnosti, a vplyv na 
spotrebu potravy alebo vody alebo nutri čný stav zvierat.
 
Výber dávky  
20. Štúdia by spravidla mala zah ŕňať najmenej tri hladiny dávky a súbežnú 
kontrolu. Pri vo ľbe vhodných dávok výskumník zváži všetky dostupné 
informácie vrátane informácií o podávaní dávok z predchádzajúcich štúdií, toxikokinetických údajov o gravidných alebo negravidných zvieratách, rozsahu lakta čného prenosu a odhadov expozície ľudí. Ak sú k dispozícii 
toxikokinetické údaje, ktoré ukazujú, že saturácia toxikokinetických 
procesov závisí od ve ľkosti dávky, je potrebné da ť pozor, aby sa predišlo 
vysokým hladinám dávok, ktoré zjavne vykazujú saturáciu, samozrejme za predpokladu, že o čakávané expozície ľudí ležia výrazne pod 
bodom saturácie. V takých prípadoch by najvyššia hladina dávky mala 
byť na úrovni zlomového bodu prechodu k nelineárnemu toxikokinetickému 
správaniu, alebo iba tesne nad týmto bodom. 
21. Ak chýbajú príslušné toxikokinetické údaje, hladiny dávok je založená na 
toxických ú činkoch, pokia ľ nie je obmedzená fyzikálnou/chemickou 
podstatou testovanej chemikálie. Ak sú hladiny dávok založené na toxicite, 
najvyššia dávka sa vyberie tak, aby indukovala systémovú toxicitu, ale nespôsobovala uhynutie alebo vážne utrpenie zvierat. 
22. Vyberá sa klesajúca postupnos ť hladiny dávok s cie ľom preukáza ť 
akúkoľvek závislos ť účinku od dávky a stanovi ť hodnotu hladín bez pozo ­
rovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL), alebo dávky v blízkosti hranice 
zistenia, čo by umožnilo odvodenie referen čnej dávky pre najcitlivejšie 
sledované parametre. Aby sa predišlo ve ľkému rozstupu medzi hladinami 
NOAEL a hladinami s najnižším pozorovate ľným nepriaznivým 
účinkom (LOAEL), často sú najvhodnejšie dvojúrov ňové alebo štvorúrov ­ 
ňové intervaly. Pridanie štvrtej testovacej skupiny je často výhodnejšie než 
používanie ve ľmi veľkého intervalu (napríklad viac ako faktor 10) medzi 
hladinami dávok. 
23. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádza ť tak isto ako so 
zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou podania testovanej látky. 
Táto skupina je netestovaná alebo zdanlivo testovaná kontrolná skupina, prípadne kontrolná skupina s podávaním nosi ča, ak sa používa nosi č na 
podávanie testovanej látky. Ak sa pri podávaní testovanej látky používa 
nosi
č, kontrolná skupina ho dostane v najvyššom objeme, v akom je 
použitý v testovaných skupinách.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Limitný test  
24. Ak neexistuje dôkaz toxicity pri dávke najmenej 1 000 mg/kg telesnej 
hmotnosti/de ň v rámci štúdie s opakovanými dávkami, alebo ak sa toxicita 
neočakáva na základe údajov štruktúrne a/alebo metabolicky príbuzných 
chemikálií, ktoré vykazujú podobnos ť metabolických vlastností in vivo/in 
vitro, nemusí by ť nevyhnutné vykona ť štúdiu s použitím viacerých hladín 
dávky. V takých prípadoch sa rozšírená jednogenera čná štúdia reproduk čnej 
toxicity môže vykona ť s použitím kontrolnej skupiny a jednej dávky 
najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/de ň. Ak sa však pri tejto limitnej 
dávke zistí dôkaz reproduk čnej alebo vývojovej toxicity, budú potrebné 
ďalšie štúdie pri nižších hladinách dávky, aby sa stanovila hodnota 
NOAEL. Tieto úvahy o limitnom teste sa uplat ňujú iba v prípade, ke ď 
expozícia ľudí neindikuje potrebu skúmania pri vyššej hladine dávky.  
POSTUPY  
Expozícia potomstva  
25. Preferovanou metódou podávania látky je expozícia prostredníctvom 
krmiva. Ak sa vykonávajú štúdie s použitím sondy, je potrebné pozname ­
nať, že mláďatá budú testovanú chemikáliu bežne prijíma ť iba nepriamo 
prostredníctvom mlieka, až kým sa im po odstavení neza čne dávka podáva ť 
priamo. V štúdiách, pri ktorých sa látka podáva v krmive alebo pitnej vode, mláďatá dostanú dodato čne testovanú látku priamo, ke ď začnú jesť samo­
statne po čas posledného týžd ňa laktácie. Ak je vylu čovanie testovanej 
chemickej látky v mlieku slabé a neexistuje dôkaz o sústavnej expozícii potomstva, treba zváži ť úpravy plánu štúdie. V týchto prípadoch je potrebné 
uvažovať o priamom podávaní dávky mlá ďatám počas obdobia laktácie na 
základe dostupných toxikokinetických informácií, toxicity potomstva alebo 
zmien biomarkerov (3) (4). Pred za čatím realizácie štúdií s priamym podá ­
vaním dávok doj čeným mlá ďatám je potrebné dôkladne zváži ť všetky 
prínosy a nevýhody (5).
 
Dávkovací plán a podávanie dávok  
26. Niektoré informácie o estrálnom cykle, histopatológii reproduk čného traktu 
samcov a samíc a o testikulárnej/epididymálnej analýze spermií môžu by ť 
dostupné z predchádzajúcich štúdií toxicity s opakovanými dávkami v primeranom trvaní. Cie ľom testovania v období pred párením v rámci 
rozšírenej jednogenera čnej štúdie reproduk čnej toxicity je preto zistenie 
účinkov na funk čné zmeny, ktoré môžu ovplyv ňovať správanie pri párení 
a oplodnenie. Testovanie v období pred párením musí by ť dostatočne dlhé, 
aby sa dosiahli stabilné podmienky expozície samcov a samíc generácie P. Vo väčšine prípadov sa za primerané považuje dvojtýžd ňové testovanie 
v období pred párením pre obe pohlavia. U samíc to predstavuje 3 – 4 
úplné estrálne cykly a to by malo by ť dostatočné na zistenie akýchko ľvek 
nepriaznivých ú činkov na tieto cykly. U samcov to zodpovedá času potreb ­
nému na epididymálny prechod dozrievajúcich spermií a malo by to 
umožniť zistenie post-testikulárnych ú činkov na spermie (po čas závere č­
ných štádií vzniku spermií a ich epididymálneho dozrievania) pri párení. V čase ukončenia, keď je naplánovaná testikulárna a epididymálna histopa ­
tológia a analýza parametrov spermií, samce generácie P a F
 1 budú expo ­
nované najmenej po dobu jedného úplného procesu spermatogenézy ((6), 
(7), (8), (9) a usmer ňovací dokument OECD 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Scenáre expozície pred párením sa môžu upravi ť, ak v predchádzajúcich 
štúdiách bola jednozna čne zistená testikulárna toxicita (zhoršenie spermato ­
genézy) alebo ú činky na integritu a funkciu spermií. Podobne v prípade 
samíc môžu známe ú činky testovanej chemikálie na estrálny cyklus a teda 
na sexuálnu vnímavos ť byť dôvodom na odlišné scenáre expozície pred 
párením. V osobitných prípadoch môže by ť prijateľné, aby sa testovanie 
samíc generácie P za čalo až po získaní sterov pozitívnych na spermie (pozri 
usmerňovací dokument OECD 151 (40)). 
28. Po stanovení obdobia podávania dávok pred párením sa testovaná chemi ­
kália zvieratám podáva nepretržite až do pitvy. Všetkým zvieratám sa dávky podávajú rovnakou metódou. Podávanie dávok prebieha po čas dvojtýžd ňo­
vého obdobia párenia a v prípade samíc generácie P po čas gravidity 
a laktácie až do d ňa ukončenia po odstavení. Samce sa testujú rovnakým 
spôsobom až do ukon čenia v čase, keď sa zvieratá generácie F
 1 odstavia. 
Pokiaľ ide o pitvu, prioritou sú samice, ktoré sa pitvú v rovnaký/približne 
rovnaký de ň laktácie. Pitva samcov sa môže rozloži ť na viacero dní 
v závislosti od možností laboratória. Ak sa s priamym podávaním dávok vybraným samcom a samiciam generácie F
 1 nezačalo počas obdobia laktá ­
cie, začne sa s tým po odstavení a pokra čuje až do plánovanej pitvy, 
v závislosti od zaradenia do kohorty. 
29. Pre chemikálie, ktoré sú podávané ako sú časť krmiva alebo pitnej vody, je 
dôležité zaisti ť, aby množstvo obsiahnutej testovanej chemikálie neinterfe ­
rovalo s normálnou nutri čnou hodnotou alebo vodnou rovnováhou. Ak je 
testovaná chemikália podávaná v krmive, je možné použi ť buď konštantnú 
dietetickú koncentráciu (ppm), alebo konštantnú hladinu dávkovania s ohľadom na telesnú hmotnos ť zvieraťa, pričom zvolenú možnos ť je 
potrebné uvies ť. 
30. Ak je testovaná chemikália podávaná prostredníctvom sondy, objem teku ­
tiny podanej naraz by spravidla nemal presiahnu ť 1 ml/100 g telesnej hmot ­
nosti (maximum pre olej, napríklad kukuri čný olej, je 0,4 ml/100 g telesnej 
hmotnosti). S výnimkou dráždivých alebo žieravých chemikálií, ktoré zvyčajne pri vyšších koncentráciách spôsobia zhoršenie ú činkov, variabilita 
v testovanom objeme sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, 
aby sa zabezpe čil stály objem vo všetkých úrovniach dávky. Látka sa 
podáva každý de ň v približne rovnakých časoch. Dávka pre každé zviera 
je spravidla založená na najaktuálnejšom ur čení individuálnej telesnej hmot ­
nosti a upravovaná najmenej raz za týžde ň u dospelých samcov a dospelých 
negravidných samíc a každé dva dni u gravidných samíc a zvierat generácie F
 1 , ak sa podáva pred odstavením a po čas 2 týžd ňov po odstavení. Ak 
toxikokinetické údaje ukazujú nízky placentárny prenos testovanej chemi ­
kálie, môže by ť potrebné upravi ť podávanie prostredníctvom sondy po čas 
posledného týžd ňa gravidity, aby sa predišlo podávaniu nadmerne toxickej 
dávky samici. V de ň pôrodu sa samiciam nepodáva látka prostredníctvom 
sondy, ani žiadnym iným spôsobom, pri ktorom je potrebné so zviera ťom 
manipulova ť. V tento de ň sa vynechá podávanie testovanej chemikálie 
a preferuje sa nerušený priebeh pôrodu.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Párenie  
31. Každá samica generácie P sa umiestni s jedným náhodne vybraným, 
nespriazneným samcom z rovnakej dávkovej skupiny (párenie 1:1), až 
kým sa nepozoruje dôkaz kopulácie alebo kým neuplynú 2 týždne. Ak je nedostatok samcov, napríklad v dôsledku úhynu samca pred párením, môže sa samec, ktorý sa už páril, znovu pári ť (1:1) s druhou samicou tak, aby 
všetky samice absolvovali párenie. Za 0. de ň gravidity sa ur čí deň, keď sa 
potvrdí dôkaz o párení (zistí sa výskyt vaginálnej zátky alebo spermy). Zvieratá sa oddelia čo najskôr po pozorovaní dôkazu kopulácie. Ak 
k páreniu nedôjde ani po 2 týžd ňoch, zvieratá sa oddelia bez ďalšej 
možnosti párenia. Vzájomne spárené páry je potrebné v údajoch zrete ľne 
identifikova ť.
 
Veľkosť vrhu  
32. Na 4. de ň po pôrode sa môže upravi ť veľkosť každého vrhu elimináciou 
mláďat, ktoré sú navyše, náhodným výberom tak, aby sa výsledok čo 
najviac priblížil po čtu päť samcov a pä ť samíc v každom vrhu. Selektívna 
eliminácia mlá ďat, napríklad na základe telesnej hmotnosti, nie je vhodná. 
Ak počet samčích alebo sami čích mláďat bráni vytvoreniu vrhu s piatimi 
mláďatami z každého pohlavia, je prijate ľná čiastočná úprava (napríklad 
šesť samcov a štyri samice).  
Výber mlá ďat pre štúdie po odstavení (pozri obrázok 1)  
33. Po odstavení (približne 21. PND) sa zo všetkých dostupných vrhov vyberú 
mláďatá na ďalšie vyšetrenia, do 20 na každú dávkovú a kontrolnú skupinu, 
a uchovávajú sa do dosiahnutia pohlavnej zrelosti (pokia ľ sa nevyžaduje 
skoršie testovanie). Mlá ďatá sa vyberajú náhodne, s výnimkou zjavne nevy ­
vinutých jedincov (zvieratá s telesnou hmotnos ťou o viac ako dvojnásobok 
hodnoty štandardnej odchýlky nižšou, než je stredná hodnota hmotnosti 
mláďaťa v príslušnom vrhu), ktorí sa nezahrnú, ke ďže by zrejme neboli 
reprezentatívnymi príslušníkmi testovanej skupiny. 
Na 21. PND sa vybrané mlá ďatá generácie F  1 náhodne zaradia do jednej 
z týchto troch kohort zvierat: 
kohorta 1 (1A a 1B) = testovanie reproduk čnej/vývojovej toxicity 
kohorta 2 (2A a 2B) = testovanie vývojovej neurotoxicity kohorta 3 = testovanie vývojovej imunotoxicity 
Kohorta 1A: Jeden samec a jedna samica/vrh/skupinu (20/pohlavie/skupi ­
nu): prioritný výber pre primárne posúdenie ú činkov na reproduk čné 
systémy a všeobecnej toxicity. 
Kohorta 1B: Jeden samec a jedna samica/vrh/skupinu (20/pohlavie/skupi ­
nu): prioritný výber pre následné posúdenie reproduk čnej schopnosti pária ­
cich sa zvierat generácie F
 1 (pozri usmer ňovací dokument OECD 117 (39)) 
a pre získanie dodato čných histopatologických údajov v prípadoch podo ­
zrivých reproduktívnych alebo endokrinných toxických látok, alebo pre 
prípad, že sú výsledky z kohorty 1A nejednozna čné. 
Kohorta 2A: Spolu 20 mlá ďat na skupinu (10 samcov a 10 samíc na 
skupinu; jeden samec alebo jedna samica na vrh), ur čených na neurobeha ­
viorálne testovanie, po ktorom nasleduje neurohistopatologické posudzo ­
vanie v dospelosti. 
Kohorta 2B: Spolu 20 mlá ďat na skupinu (10 samcov a 10 samíc na 
skupinu; jeden samec alebo jedna samica na vrh), ur čených na neurohisto ­
patologické posudzovanie po odstavení (21. alebo 22. postnatálny de ň). Ak 
počet zvierat nie je dostato čný, uprednostni ť treba ich zaradenie do kohorty 
2A. ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohorta 3: Spolu 20 mlá ďat na skupinu (10 samcov a 10 samíc na 
skupinu; jedno na vrh, ak je to možné). Potrebné môžu by ť ďalšie mláďatá 
z kontrolnej skupiny, aby sa použili ako zvieratá na pozitívnu kontrolu v teste protilátkovej reakcie závislej od T-buniek (T-cell dependant antibody response – TDAR) v 56. (± 3) postnatálny de ň. 
34. Ak po čet mláďat vo vrhu nie je dostato čný na obsadenie všetkých kohort, 
prednosť má kohorta 1, ke ďže tá sa môže rozšíri ť vznikom generácie F
 2 . 
Dodatočné mláďatá sa môžu zaradi ť do ktorejko ľvek kohorty v prípade 
osobitného záujmu, napríklad ak existuje podozrenie, že chemikália je neurotoxická, imunotoxická alebo reproduk čne toxická. Tieto mlá ďatá sa 
môžu použi ť na vyšetrenia v rôznych časových úsekoch alebo na hodno ­
tenie doplnkových sledovaných parametrov. Mlá ďatá, ktoré neboli zaradené 
do kohort, sa podrobia klinickej biochemickej analýze (odsek 55) 
a makroskopickej pitve (odsek 68).
 
Druhé párenie zvierat generácie P  
35. Druhé párenie sa zvy čajne pre zvieratá generácie P neodporú ča, pretože ide 
na úkor straty dôležitých informácií o po čte implanta čných miest (a teda 
straty poimplanta čných a perinatálnych údajov) pre prvý vrh. Potrebu veri ­
fikovať alebo objasni ť účinok na exponované samice by lepšie naplnilo 
rozšírenie štúdie tak, aby zah ŕňala aj párenie generácie F  1 . Druhé párenie 
samcov generácie P s netestovanými samicami však stále predstavuje možnosť objasniť nejednozna čné zistenia alebo podrobnejšie charakteri ­
zovať účinky na fertilitu pozorované pri prvom párení.
 
POZOROVANIA PO ČAS ŽIVOTA  
Klinické pozorovania  
36. U zvierat generácie P a vybraných zvierat generácie F  1 sa všeobecné 
klinické pozorovanie vykonáva raz denne. V prípade podávania dávky prostredníctvom sondy sú klinické pozorovania na časované na dobu pred 
podávaním a po podávaní dávky (z dôvodu možných príznakov toxicity 
spojených s maximálnou koncentráciou plazmy). Prípadné zmeny v správaní, príznaky ťažkého alebo dlhotrvajúceho pôrodu a všetky 
príznaky toxicity sa zaznamenajú. Dvakrát denne, po čas víkendu raz denne, 
sa u všetkých zvierat sleduje silná toxicita, morbidita a mortalita. 
37. Okrem toho sa raz týždenne vykonáva podrobnejšie vyšetrenie všetkých 
zvierat generácií P a F
 1 (po odstavení), najvhodnejšie pri príležitosti váženia 
zvieraťa, čím sa minimalizuje stres z manipulácie. Pozorovania sa starost ­
livo vykonávajú a zaznamenávajú s použitím systémov hodnotenia, ktoré 
definuje testovacie laboratórium. Je potrebné minimalizova ť odlišnosti 
v podmienkach testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všíma ť, 
patria zmeny na koži, kožušine, o čiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie 
a vegetatívnej aktivity (napríklad slzenie, piloerekcia, ve ľkosť zreničiek, 
nezvyčajné dýchanie), ale uvedený výpo čet príznakov nie je vy čerpávajúci. 
Zmeny chôdze, postoja a reakcie na manipuláciu, ako aj prítomnos ť šklba­
vých pohybov alebo svalové napätie, stereotypné (napríklad nadmerné 
očisťovanie tela, opakované krúženie) alebo výstredné správanie (napríklad 
samomrza čenie, cúvanie) je nutné tiež zaznamena ť. ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Telesná hmotnos ť a spotreba potravy/vody  
38. Zvieratá generácie P sa vážia v prvý de ň podávania dávky a potom 
najmenej raz týždenne. Samice generácie P sa okrem toho po čas laktácie 
vážia v tých istých d ňoch, keď sa vážia mlá ďatá z ich vrhov (pozri odsek 
44). Všetky zvieratá generácie F  1 sa vážia individuálne po odstavení (21. 
PND) a potom najmenej raz týždenne. Telesná hmotnos ť sa zaznamenáva aj 
v deň, keď dosiahnu pohlavnú zrelos ť (ukončenie odde ľovania predkožky 
alebo otvárania vagíny). Všetky zvieratá sa vážia pri usmrtení. 
39. Počas štúdie sa zaznamenáva spotreba potravy a vody (v prípade podávania 
testovanej chemikálie v pitnej vode) najmenej raz týždenne v rovnaké dni 
ako telesná hmotnos ť zvierat (s výnimkou obdobia párenia). Spotreba 
potravy v každej klietke so zvieratami generácie F  1 sa zaznamenáva raz 
týždenne od ich zaradenia do príslušnej kohorty.  
Estrálne cykly  
40. Predbežné informácie o ú činkoch na estrálny cyklus súvisiacich 
s testovanou chemikáliou môžu by ť dostupné už z predchádzajúcich štúdií 
toxicity s opakovanými dávkami a môžu sa použi ť pri vypracovávaní proto ­
kolu pre rozšírenú jednogenera čnú štúdiu reproduk čnej toxicity konkrétnej 
testovanej chemikálie. Posudzovanie estrálneho cyklu (pomocou vaginálnej 
cytológie) sa spravidla za čne na začiatku obdobia testovania a pokra čuje až 
do potvrdenia párenia alebo do konca dvojtýžd ňového obdobia párenia. Ak 
sa u samíc vykonával skríning zameraný na normálny estrálny cyklus už 
pred testovaním, je užito čné pokračovať so stermi aj po za čiatku testovania, 
ale ak existujú obavy z nešpecifických ú činkov po za čiatku testovania (ako 
napríklad po čiatočné výrazné zníženie spotreby potravy), dá sa zvieratám 
umožniť, aby sa prispôsobili testovaniu po dobu až dvoch týžd ňov pred 
začiatkom dvojtýžd ňového obdobia odoberania sterov, ktoré ďalej vedie 
k páreniu. Ak sa takýmto spôsobom pred ĺži obdobie testovania samíc (t. 
j. na štvortýžd ňové testovanie pred párením), je potrebné zváži ť získanie 
mladších zvierat a pred ĺženie aj obdobia testovania samcov pred párením. 
Pri odbere vaginálnych/cervikálnych buniek je potrebné venova ť pozornos ť 
tomu, aby sa neporušila sliznica a následne nevyvolala pseudogravidita (10) (11). 
41. Vaginálne stery sa vyšetrujú denne u všetkých samíc generácie F
 1 v kohorte 
1A od za čiatku otvárania vagíny, až kým sa nezaznamená prvý zrohovatený 
ster, s cie ľom určiť časový interval medzi týmito dvomi udalos ťami. 
Estrálny cyklus všetkých samíc generácie F  1 v kohorte 1A sa tiež monito ­
ruje počas obdobia dvoch týžd ňov so za čiatkom okolo 75. PND. Ak je 
navyše potrebné párenie generácie F  1 , v kohorte 1B sa sleduje vaginálna 
cytológia od doby za čiatku párenia po zaznamenanie dôkazu o párení.  
Párenie a gravidita  
42. Okrem štandardných sledovaných parametrov (napríklad telesná hmotnos ť, 
spotreba potravy, klinické pozorovania vrátane kontroly mortality/morbi ­
dity) sa zaznamenávajú aj dátumy párenia, dátum inseminácie a dátum 
pôrodu a vypo čítava sa predkoitálny interval (od za čiatku párenia po inse ­
mináciu) a d ĺžka trvania gravidity (od inseminácie po pôrod). Samice gene ­
rácie P sa musia v čase očakávaného pôrodu starostlivo vyšetri ť na 
akékoľvek príznaky dystokie. Zaznamena ť treba akéko ľvek abnormality 
v správaní pri hniezdení alebo po čas laktácie.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Deň, keď dôjde k pôrodu, je 0. de ň laktácie pre samicu a 0. postnatálny de ň 
(0. PND) pre potomstvo. Alternatívne môžu by ť všetky porovnania tiež 
založené na postkoitálnom čase, aby sa eliminovali chybné údaje 
o postnatálnom vývoji v dôsledku rozdielov v d ĺžke trvania gravidity. 
Zaznamena ť však treba aj časové údaje vo vz ťahu k pôrodu. To je obzvláš ť 
dôležité, ke ď testovaná chemikália ovplyv ňuje dĺžku trvania gravidity.  
Parametre potomstva  
44. Každý vrh je potrebné vyšetri ť čo najskôr po pôrode (0. alebo 1. PND), aby 
sa zistil po čet a pohlavie mlá ďat, mŕtvo narodených a živo narodených 
jedincov a výskyt nápadných anomálií (navonok vidite ľné abnormality 
vrátane rázštepu podnebia, podkožné hemorágie, abnormálna farba alebo textúra kože, prítomnos ť pupočnej šnúry, nedostatok mlieka v žalúdku, 
prítomnos ť vyschnutých sekrétov). Prvé klinické vyšetrenie novorodencov 
zahŕňa kvalitatívne posúdenie telesnej teploty, stavu aktivity a reakcií na 
manipuláciu. Mlá ďatá, ktoré sa našli m ŕtve v 0. PND alebo neskôr, je 
potrebné vyšetri ť na možné defekty a prí činu uhynutia. Živé mlá ďatá sa 
spočítajú a každé sa jednotlivo odváži v 0. alebo 1. PND a potom pravi ­
delne, napríklad vo 4., 7., 14. a 21. PND. Klinické vyšetrenia zodpoveda ­
júce veku zvierat sa opakujú pri vážení potomstva, alebo v prípade osobit ­
ných zistení pri pôrode aj častejšie. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si 
všímať, patria vonkajšie abnormality, zmeny na koži, kožušine, o čiach, 
sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity, ale uvedený 
výpočet príznakov nie je vy čerpávajúci. Zmeny chôdze, postoja a reakcie 
na manipuláciu, ako aj prítomnos ť šklbavých pohybov alebo svalové napä ­
tie, stereotypné alebo výstredné správanie je nutné tiež zaznamena ť. 
45. Anogenitálna vzdialenos ť každého mlá ďaťa sa odmeria najmenej raz medzi 
0. a 4. PND. V de ň merania anogenitálnej vzdialenosti sa zis ťuje aj telesná 
hmotnosť mláďaťa a anogenitálna vzdialenos ť sa normalizuje na mieru 
veľkosti mlá ďaťa, najlepšie na tretiu odmocninu telesnej hmotnosti (12). 
Prítomnos ť prsných bradaviek/dvorcov prsných bradaviek u sam
čích mláďat 
sa kontroluje v 12 alebo 13. PND. 
46. U všetkých vybraných zvierat generácie F  1 , sa denne hodnotí oddelenie 
žaluďa a predkožky u samcov a otvorenie vagíny u samíc, a to so 
začiatkom pred o čakávaným d ňom dosiahnutia týchto sledovaných parame ­
trov, aby sa zistilo, či k pohlavnej zrelosti dôjde skoro. Všíma ť si treba 
akékoľvek abnormality pohlavných orgánov, ako je trvalé nedostato čné 
otvorenie vagíny, hypospádia alebo rázštep penisu. Pohlavná zrelos ť zvierat 
generácie F  1 sa porovnáva s fyzickým vývojom ur čením veku a telesnej 
hmotnosti v čase oddelenia žalu ďa a predkožky u samcov a otvorenia 
vagíny u samíc (13).  
Posúdenie potenciálnej vývojovej neurotoxicity (kohorty 2A a 2B)  
47. Na posúdenie neurotoxicity sa použije 10 samcov a 10 samíc z kohorty 2A 
a 10 samcov a 10 samíc z kohorty 2B, z každej testovanej skupiny (pre 
každú kohortu: 1 samec alebo 1 samica na vrh; každý vrh je zastúpený 
najmenej jedným mlá ďaťom; náhodný výber). Zvieratá z kohorty 2A sa 
podrobia posúdeniu sluchovej citlivosti, funk čnej pozorovacej batérii, posú ­
deniu motorickej aktivity (pozri odseky 48 – 50), a neuropatologickému 
posúdeniu (pozri odseky 74 – 75). Je potrebné vynaloži ť úsilie, aby sa 
zabezpečilo, že zmeny všetkých testovacích podmienok budú minimálne  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
a nie systematicky súvisiace s ošetrením. K premenným, ktoré môžu 
ovplyvňovať správanie, patrí hladina zvuku (napríklad krátkodobý hluk), 
teplota, vlhkos ť, osvetlenie, zápach, denná doba a narušenie životného 
prostredia. Výsledky testov na neurotoxicitu sa interpretujú vo vz ťahu 
k príslušným historickým kontrolným referen čným rozsahom. Zvieratá 
kohorty 2B sa použijú na neuropatologické posúdenie v 21. alebo 22. 
PND (pozri odseky 74 – 75). 
48. Test sluchovej citlivosti sa vykoná v 24. (± 1) PND s použitím zvierat 
z kohorty 2A. De ň testovania je potrebné stanovi ť vyvážene pre všetky 
testované a kontrolné skupiny. Každá séria pozostáva z 50 pokusov. Pri 
vykonávaní testu sluchovej citlivosti sa ur čí stredná amplitúda odozvy 
v každom bloku po 10 pokusov (5 blokov po 10 pokusov), pri čom 
podmienky testu sa optimalizujú tak, aby sa v rámci série vytvoril návyk. 
Tieto postupy musia by ť v súlade s testovacou metódou B.53 (35). 
49. Vo vhodnom čase medzi 63. a 75. PND sa zvieratá z kohorty 2A podrobia 
funkčnej pozorovacej batérii a automatickému testu motorickej aktivity. 
Tieto postupy musia by ť v súlade s testovacími metódami B.43 (33) 
a B.53 (35). Funk čná pozorovacia batéria zah ŕňa podrobný opis vzh ľadu, 
správania a funk čnej integrity subjektu. Tieto prvky sa posudzujú prostred ­
níctvom pozorovaní v domácej klietke, po presunutí do zvy čajnej vyšetro ­
vacej miestnosti na pozorovanie (otvorené pole), kde sa zviera vo ľne pohy­
buje, a prostredníctvom manipula čného testu. Testovanie pokra čuje od 
najmenej interaktívneho po najviac interaktívne. Zoznam opatrení je uvedený v dodatku 1. Starostlivé pozorovanie všetkých zvierat vykonávajú 
vyškolení pracovníci, ktorí nie sú oboznámení so stavom testovania zvierat, 
pričom používajú normované postupy s cie ľom minimalizova ť variabilitu 
pozorovate ľov. Ak je to možné, odporú ča sa, aby ten istý pozorovate ľ 
hodnotil zvieratá v danom teste. Ak to nie je možné, vyžaduje sa ur čité 
preukázanie spo ľahlivosti medzi pozorovate ľmi. Pre každý parameter 
v batérii testov na správanie sa musia použi ť presne prevádzkovo defino ­
vané stupnice a kritériá hodnotenia. Ak je to možné, vypracujú sa objek ­
tívne kvantitatívne miery pre pozorované parametre, ktoré zah ŕňajú aj 
subjektívne hodnotenie. V prípade motorickej aktivity sa každé zviera 
testuje individuálne. Séria testov má by ť dostatočne dlhá, aby sa v rámci 
série ukázal návyk na kontrolu. Motorická aktivita sa monitoruje automa ­
tickým zariadením na záznam aktivity, ktoré musí by ť schopné zisti ť nárast 
aj pokles aktivity (t. j. základná aktivita, ktorú meria zariadenie, nesmie by ť 
nastavená tak nízko, aby nebolo možné sledova ť pokles, ani tak vysoko, 
aby nebolo možné sledova ť nárast aktivity). Každé zariadenie sa testuje 
štandardnými postupmi, aby sa v najvä čšej možnej miere zabezpe čila spoľa­
hlivosť prevádzky všetkých zariadení po celý čas. Pokia ľ je to možné, 
testované skupiny majú by ť vyvážené pre všetky zariadenia. Testované 
skupiny by mali by ť vyvážené po celý čas, aby sa predišlo zmätkom 
v dôsledku denného rytmu aktivity. 
50. Ak sa existujúcimi informáciami preukáže potreba ďalšieho funk čného 
testovania (napríklad senzorického, sociálneho, kognitívneho), toto testo ­
vanie sa musí integrova ť tak, aby nebola narušená integrita ostatných 
hodnotení vykonávaných v rámci štúdie. Ak sa toto testovanie vykonáva 
na tých istých zvieratách, ktoré sa používajú na štandardný test sluchovej 
citlivosti, funk čnú pozorovaciu batériu a test motorickej aktivity, iné testy 
musia by ť naplánované tak, aby sa minimalizovalo riziko narušenia inte ­
grity pôvodných testov. Dopl ňujúce postupy môžu by ť zvlášť užitočné, keď 
empirické pozorovanie, o čakávané ú činky alebo mechanizmus/spôsob pôso ­
benia poukazuje na konkrétny druh neurotoxicity.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Posúdenie potenciálnej vývojovej imunotoxicity (kohorta 3)  
51. Na 56. (± 3) PND sa použije 10 samcov a 10 samíc z kohorty 3, z každej 
testovanej skupiny (1 samec alebo 1 samica na vrh; každý vrh je zastúpený 
najmenej jedným mlá ďaťom; náhodný výber), v teste protilátkovej reakcie 
závislej od T-buniek, t. j. primárnej reakcie protilátky IgM na antigén závislý od T-buniek, ako je napríklad ov čí erytrocyt SRBC (Sheep Red 
Blood Cell) alebo ustricový hemocyanín KLH (Keyhole Limpet Hemocya ­
nin), v súlade so sú časnými postupmi testovania immunotoxicity (14), (15). 
Reakcia sa môže hodnoti ť počítaním osobitných buniek tvoriacich plaky 
(plaque-forming cells – PFC) v slezine, alebo stanovením titra protilátky 
IgM, špecificky pre SRBC alebo KLH, v sére pomocou 
imuno-enzymatickej metódy ELISA, pri maximálnej reakcii. Reakcie dosa ­
hujú maximum spravidla štyri (reakcia PFC) alebo pä ť (metóda ELISA) dní 
po intravenóznej imunizácii. Ak sa primárna protilátková reakcia testuje 
počítaním plakotvorných buniek, je prípustné hodnoti ť podskupiny zvierat 
v rôzne dni za predpokladu, že: imunizácia a usmrtenie skupiny sa na časuje 
tak, že plakotvorné bunky sa po čítajú pri maximálnej reakcii; že podskupina 
pozostáva z rovnakého po čtu samcov a samíc potomstva zo všetkých 
dávkových skupín vrátane kontrolných, a že podskupiny sa hodnotia 
v približne rovnakom postnatálnom veku. Expozícia ú činkom testovanej 
chemikálie bude pokra čovať do dňa pred odberom slezín pre hodnotenie 
reakcie PFC alebo séra pre test ELISA.
 
Následné posúdenie potenciálnej reproduk čnej toxicity (kohorta 1B)  
52. Zvieratá z kohorty 1B sa môžu uchováva ť na testovanie dlhšie ako do 90. 
PND a chova ť, aby sa v prípade potreby získala generácia F  2 . Samce 
a samice z tej istej dávkovej skupiny sa pária (zabráni sa páreniu medzi súrodencami) po dobu až dvoch týžd ňov so začiatkom v 90. PND alebo 
neskôr, ale nie dlhšie ako do 120. PND. Postupy sú podobné ako v prípade 
zvierat generácie P. Na základe závažných dôkazov však môže posta čovať 
ukončenie vrhu vo 4. PND, namiesto jeho sledovania do odstavenia alebo 
ešte dlhšie.
 
POZOROVANIA PO USMRTENÍ  
Klinická biochémia/hematológia  
53. Systémové ú činky sa monitorujú u zvierat generácie P. Vzorky krvi zo 
stanovených miest sa rýchlo odoberú u desiatich náhodne vybraných 
samcov a samíc generácie P z každej dávkovej skupiny po usmrtení, 
uskladnia sa vo vhodných podmienkach a podrobia sa čiastočným alebo 
úplným hematologickým vyšetreniam, vyšetreniam klinickej biochémie, testom na T4 a TSH alebo iným vyšetreniam, ktoré vyplývajú zo známeho 
profilu účinkov testovanej chemikálie (pozri usmer ňovací dokument OECD 
151 (40)). Vyšetrujú sa tieto hematologické parametre: hematokrit, koncen ­
trácia hemoglobínu, po čet erytrocytov, celkový a diferen čný počet leukocy ­
tov, počet krvných došti čiek a čas/potenciál zrážanlivosti krvi. Vyšetrenia 
plazmy alebo séra zah ŕňajú: glukózu, celkový cholesterol, mo čovinu, krea ­
tinín, celkové proteíny, albumín a najmenej dva enzýmy indukujúce hepa ­
tocelulárne ú činky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, 
alkalická fosfatáza, gamaglutamyl-transpeptidáza a sorbitol-dehydrogenáza). 
Meranie ďalších enzýmov a žl čových kyselín môže za ur čitých okolností 
poskytnúť užitočné informácie. Okrem toho sa krv od všetkých zvierat
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
môže odobra ť a uložiť na možné analýzy v neskoršom období, ktoré by 
pomohli vyjasni ť nejednozna čné účinky alebo vytvorili údaje o vnútornej 
expozícii. Ak sa neuvažuje o druhom párení zvierat generácie P, vzorky krvi sa získajú pred postupom plánovaného usmrtenia, alebo ako sú časť 
tohto postupu. V prípade, že sa zvieratá zachovajú, vzorky krvi sa odoberú 
niekoľko dní pred ich druhým párením. Pokia ľ existujúce údaje zo štúdií 
s opakovanými dávkami nenazna čujú, že testovaná chemikália nemá ú činok 
na daný parameter, pred usmrtením sa vykoná vyšetrenie mo ču a hodnotia 
sa tieto parametre: vzh ľad, objem, osmolalita alebo špecifická hmotnos ť, 
pH, proteíny, glukóza, krv a krvné bunky, bunkový odpad. Mo č sa môže 
odobrať s cieľom monitorova ť exkréciu testovanej chemikálie a/alebo meta ­
bolitu (metabolitov). 
54. Systémové ú činky sa monitorujú u zvierat generácie F
 1 . Vzorky krvi zo 
stanovených miest sa rýchlo odoberú u desiatich náhodne vybraných samcov a samíc z kohorty 1A, z každej dávkovej skupiny po usmrtení, uskladnia sa vo vhodných podmienkach a podrobia sa štandardným vyšet ­
reniam klinickej biochémie vrátane posúdenia hladín séra pre tyroidné 
hormóny (T4 a TSH), hematologickým vyšetreniam (celkový a diferen čný 
počet leukocytov a erytrocytov) a vyšetreniam mo ču. 
55. Nadbyto čné mláďatá sa vo 4. PND podrobia makroskopickej pitve 
a pozornos ť sa venuje meraniu koncentrácií séra pre tyroidný hormón 
(T4). V prípade potreby sa neonatálna krv (zo 4. PND) môže združova ť 
podľa vrhu na biochemické analýzy/analýzy tyroidného hormónu. Krv sa 
odoberá aj na analýzy hormónov T4 a TSH od odstavených mlá ďat, ktoré 
sa podrobia makroskopickej pitve v 22. PND (mlá ďatá generácie F
 1 , ktoré 
neboli vybrané do kohort).  
Parametre spermií  
56. Parametre spermií sa merajú u všetkých samcov generácie P, pokia ľ existu­
júce údaje neukazujú, že po čas 90-dňovej štúdie nebol zaznamenaný ú činok 
na parametre spermií. Vyšetrenia parametrov spermií sa vykonajú u všetkých samcov kohorty 1As. 
57. Pre všetky samce generácie P a F
 1 (kohorta 1A) sa po usmrtení zaznamená 
hmotnosť semenníkov a nadsemenníkov. Najmenej jeden semenník a jeden 
nadsemenník sa odložia na histopatologické vyšetrenie. Zostávajúce 
nadsemenníky sa použijú na vy číslenie zásob spermií z chvostovej časti 
nadsemenníkov (16), (17). Spermie z chvostovej časti nadsemenníkov 
(alebo semenovodov) sa okrem toho odoberú pomocou metód, ktoré mini ­
malizujú poškodenie, na vyšetrenie pohyblivosti a morfológie spermií (18). 
58. Pohyblivos ť spermií sa môže hodnoti ť buď okamžite po usmrtení, alebo 
zaznamena ť pre neskoršiu analýzu. Podiel progresívne pohyblivých spermií 
sa dá určiť subjektívne alebo objektívne analýzou pohybu pomocou po čí­
tača (19), (20), (21), (22), (23), (24). Pri hodnotení morfológie spermií sa 
vzorka spermií z chvostovej časti nadsemenníkov (alebo semenovodu) 
vyšetrí ako fixné alebo mokré preparáty (25) a minimálne 200 spermií na vzorku sa zatriedi ako bu ď normálne (hlavi čka aj stredná časť/bičík majú 
normálny vzh ľad), alebo abnormálne. Príklady morfologických abnormalít 
spermií zah ŕňajú fúziu, oddelené hlavi čky a zdeformované hlavi čky a/alebo 
bičíky (26). Zdeformované alebo ve ľké hlavičky spermií môžu poukazova ť 
na poruchy v tvorbe spermií. 
59. Ak sú vzorky spermií zmrazené, stery odobraté a obrázky z analýzy mobi ­
lity spermií zaznamenané v čase pitvy (27), následná analýza sa môže 
obmedziť na kontrolnú skupinu a skupinu samcov s vysokou dávkou. Ak 
sa však pozorujú ú činky v súvislosti s testovaním, hodnotia sa aj skupiny 
s nižšími dávkami.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Makroskopická pitva  
60. V čase usmrtenia alebo pred časného úhynu sa u všetkých zvierat generácie 
P a F  1 vykoná pitva a vyšetrenie na akéko ľvek štrukturálne abnormality 
alebo patologické zmeny. Osobitná pozornos ť sa venuje orgánom repro ­
dukčného systému. Moribundné mlá ďatá, ktoré sa humánnym spôsobom 
usmrtia, ako aj uhynuté mlá ďatá sa zaznamenajú, a ak nie sú macerované, 
vyšetria sa na možné defekty a/alebo prí činu uhynutia a zakonzervujú sa. 
61. U dospelých samíc generácií P a F  1 sa v deň pitvy vyšetrí vaginálny ster, 
aby sa ur čilo štádium estrálneho cyklu a umožnilo ur čenie korelácie 
s histopatológiou v reproduk čných orgánoch. Maternice všetkých samíc 
generácie P (a v prípade potreby aj samíc generácie F  1 ) sa vyšetria na 
prítomnos ť a počet implanta čných miest spôsobom, ktorý neohrozí histopa ­
tologické hodnotenie.  
Hmotnos ť orgánov a uchovanie tkanív – dospelé zvieratá generácie P a 
F 1 
62. V čase usmrtenia sa ur čí telesná hmotnos ť a mokrá hmotnos ť nižšie uvede ­
ných orgánov všetkých zvierat generácie P a všetkých dospelých zvierat 
generácie F  1 z príslušných kohort (ako je uvedené ďalej), a to čo najskôr, 
aby sa predišlo vysychaniu. Tieto orgány sa potom uchovajú vo vhodných podmienkach. Pokia ľ nie je uvedené inak, párové orgány sa môžu váži ť 
jednotlivo alebo kombinovane, v súlade s bežnou praxou testovacieho labo ­
ratória. 
— Maternica (s vajcovodmi a kr čkom maternice), vaje čníky. 
— Semenníky, nadsemenníky (celé a chvostová časť na vzorky, ktoré sa 
použijú pri po čítaní spermií). 
— Prostata (kombinácia dorzolaterálnych a ventrálnych častí). Pri odrezá ­
vaní komplexu prostaty je potrebná opatrnos ť, aby sa zabránilo perfo ­
rácii semenných va čkov naplnených tekutinou. V prípade ú činku súvi ­
siaceho s testom na celkovú hmotnos ť prostaty je potrebné po fixácii 
starostlivo oddeli ť dorzolaterálne a ventrálne časti a váži ť ich osobitne. 
— Semenné va čky s koagula čnými žľazami a ich tekutinami (ako jedna 
jednotka). 
— Mozog, pe čeň, obličky, srdce, slezina, týmus, hypofýza, štítna ž ľaza (po 
fixácii), nadobli čky a známe cie ľové orgány a tkanivá. 
63. Okrem uvedených orgánov sa vo vhodných podmienkach uchovajú vzorky 
periférnych nervov, svalov, miechy, oka s o čným nervom, gastrointestinál ­
neho traktu, mo čového mechúra, p ľúc, priedušnice (s pripojenou štítnou 
žľazou a prištítnou ž ľazou), kostnej drene, semenovodov (samce), mlie č­
nych žliaz (samce a samice) a vagíny. 
64. Všetky orgány zvierat z kohorty 1A sa odvážia a uchovajú pre histopato ­
lógiu. 
65. Pri vyšetrovaní prenatálne a postnatálne vyvolaných imunotoxických 
účinkov sa 10 samcov a 10 samíc z kohorty 1A, z každej testovanej 
skupiny (1 samec alebo 1 samica na vrh; každý vrh je zastúpený najmenej 
jedným mlá ďa
ťom; náhodný výber) sa po usmrtení podrobí týmto úkonom: 
— váženie lymfatických uzlín, spojených s cestou expozície aj vzdialených 
od tejto cesty (na doplnenie hmotnosti nadobli čiek, týmusu a sleziny, 
ktorá už bola zis ťovaná u všetkých zvierat kohorty 1A)  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analýza subpopulácie slezinových lymfocytov (CD4+ a CD8+ 
T-lymfocyty, B-lymfocyty a „prirodzení zabíja či“) s použitím polovice 
sleziny, pri čom druhá polovica sleziny sa uchová na histopatologické 
hodnotenie. 
Analýzou subpopulácií slezinových lymfocytov z neimunizovaných zvierat 
(kohorta 1A) sa ur čí, či expozícia súvisí s posunom stabilnej imunologickej 
distribúcie lymfocytov vznikajúcich v týmuse – „pomocníka“ (CD4+) alebo cytotoxického lymfocytu (CD8+), prípadne „prirodzených zabíja čov“ 
(natural killer – NK) (rýchle reakcie na neoplastické bunky a patogény). 
66. U zvierat z kohorty 1B sa tieto orgány odvážia a zodpovedajúce tkanivá sa 
spracujú do blokovej fázy: 
— vagína (neváži sa) — maternica s kr čkom maternice 
— vaječníky 
— semenníky (najmenej jeden) — nadsemenníky — semenné va čky a koagula čné žľazy 
— prostata 
— hypofýza — známe cie ľové orgány 
Histopatologické vyšetrenia sa v kohorte 1B vykonajú, ak výsledky 
z kohorty 1A sú nejednozna čné, alebo v prípadoch podozrivých repro ­
dukčne alebo endokrinne toxických látok. 
67. Kohorty 2A a 2B: testovanie vývojovej neurotoxicity (21. alebo 22. PND 
a dospelé potomstvo). Zvieratá z kohorty 2A sa usmrtia po testovaní sprá ­
vania, pri čom sa zaznamená hmotnos ť ich mozgu a vykonajú sa úplné 
neurohistopatologické vyšetrenia na ú čely posúdenia neurotoxicity. Zvieratá 
z kohorty 2B sa usmrtia v 21. alebo 22. PND, pri čom sa zaznamená 
hmotnosť ich mozgu a vykoná sa mikroskopické preskúmanie mozgu na 
účely posúdenia neurotoxicity. U zvierat z kohorty 2A a volite ľne z kohorty 
2B sa vyžaduje fixovanie premývaním, ako je uvedené v testovacej metóde B.53 (35).
 
Hmotnos ť orgánov a uchovanie tkanív – odstavené mlá ďatá generácie 
F 1 
68. Mlá ďatá, ktoré neboli vybrané do kohort, vrátane nevyvinutých jedincov, sa 
usmrtia po odstavení, v 22. PND, pokia ľ výsledky nepoukazujú na potrebu 
ďalších analýz po čas života. Usmrtené mlá ďatá sa podrobia makroskopickej 
pitve vrátane posúdenia reproduk čných orgánov, ako je opísané v odsekoch 
62 a 63. U desiatich mlá ďat na skupinu, z oboch pohlaví a z čo najväčšieho 
počtu vrhov, sa odváži a vo vhodných podmienkach uchová mozog, slezina 
a týmus. Okrem toho sa môžu uchova ť prsné tkanivá týchto sam čích 
a samičích mláďat na ďalšiu mikroskopickú analýzu (  1 ) (pozri usmer ňovací 
dokument OECD 151 (40)). Výrazné abnormality a cie ľové tkanivá sa 
uchovajú na prípadné histologické vyšetrenie.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Výskum ukázal, že mlie čne žľazy, predovšetkým v raných štádiách vývoja, sú citlivými 
sledovanými parametrami pre činnosť estrogénov. Odporú ča sa, aby sledované parametre 
týkajúce sa mlie čnych žliaz mlá ďat oboch pohlaví boli po validácii zahrnuté do tejto 
testovacej metódy.
 Histopatológia – zvieratá generácie P  
69. Úplné histopatologické vyšetrenie orgánov uvedených v odsekoch 62 a 63 
sa vykoná u všetkých zvierat generácie P s vysokou dávkou a z kontrolnej 
skupiny. Orgány, ktoré vykazujú zmeny súvisiace s testovaním, sa vyšetria aj u všetkých zvierat v skupinách s nižšou dávkou, čo pomôže pri ur čovaní 
hladiny bez pozorovaného nepriaznivého ú činku (NOAEL). Ďalej sa 
podrobia histopatologickému vyšetreniu reproduk čné orgány všetkých 
zvierat s podozrením na zníženú fertilitu, napríklad tých, ktoré zlyhali pri párení, po čatí, plodení alebo vrhnutí zdravého potomstva, alebo u ktorých 
bol ovplyvnený estrálny cyklus prípadne po čet, pohyblivos ť alebo morfo ­
lógia spermií.
 
Histopatológia – zvieratá generácie F  1 
Zvieratá z kohorty 1  
70. Úplné histopatologické vyšetrenie orgánov uvedených v odsekoch 62 a 63 
sa vykoná u všetkých dospelých zvierat z kohorty 1A s vysokou dávkou a z kontrolnej skupiny. Každý vrh by mal by ť zastúpený najmenej jedným 
mláďaťom oboch pohlaví. Orgány a tkanivá, ktoré vykazujú zmeny súvi ­
siace s testovaním, a všetky výrazné lézie sa vyšetria aj u všetkých zvierat v skupinách s nižšou dávkou, čo pomôže pri ur čovaní hodnoty NOAEL. Na 
vyhodnotenie ú činkov na lymfoidné orgány vyvolaných v prenatálnom 
a postnatálnom období sa vykoná aj histopatologické vyšetrenie odobratých lymfatických uzlín a kostnej drene od 10 samcov a 10 samíc z kohorty 1A, čím sa doplnia histopatologické vyšetrenia týmusu, sleziny a nadobli čiek, 
ktoré už boli vykonané u všetkých zvierat kohorty 1A. 
71. Reproduk čné a endokrinné tkanivá od všetkých zvierat z kohorty 1B, spra ­
cované do blokovej fázy, ako je opísané v odseku 66, sa podrobia histo ­
patologickému vyšetreniu v prípadoch podozrivých reproduk čných alebo 
endokrinných toxických látok. Histologickému vyšetreniu sa podrobia aj zvieratá z kohorty 1B, ak výsledky z kohorty 1A nebudú jednozna čné. 
72. Vaje čníky dospelých samíc majú obsahova ť primordiálne a rastúce folikuly, 
ako aj ve ľké žlté teliesko. Histopatologické vyšetrenie sa preto zameria na 
kvantitatívne hodnotenie primordiálnych a malých rastúcich folikulov, ako aj veľkého žltého telieska, v telách samíc generácie F
 1 , pričom počet zvie­
rat, výber rezu vaje čníkov a výber ve ľkosti vzoriek má by ť štatisticky 
primeraný na posúdenie použitej metódy. Stanovenie po čtu folikulov sa 
môže najskôr vykona ť u zvierat z kontrolnej skupiny a s vysokou dávkou 
a v prípade negatívneho ú činku na zvieratá s vysokou dávkou sa vyšetrenie 
vykoná pri nižších dávkach. Do vyšetrenia sa zahrnie stanovenie po čtu 
primordiálnych folikulov, ktoré sa môžu kombinova ť s malými rastúcimi 
folikulmi na porovnanie vaje čníkov testovaných a kontrolných samíc (pozri 
usmerňovací dokument OECD 151 (40)). Posudzovanie ve ľkého žltého 
telieska sa vykonáva súbežne s testovaním estrálneho cyklu, preto sa pri 
posudzovaní môže zoh ľadniť fáza cyklu. Vajcovod, maternica a vagína sa 
vyšetrujú na primeranos ť vývoja zodpovedajúcu danému orgánu. 
73. U samcov generácie F  1 sa vykonajú podrobné testikulárne histopatologické 
vyšetrenia s cie ľom zistiť účinky, súvisiace s testovaním, na diferenciáciu 
a vývoj semenníkov a na spermatogenézu (38). Ak je to možné, treba vyšetriť rezy rete testis. Hlava, telo a chvostová časť nadsemenníkov 
a semenovody sa vyšetrujú na primeranos ť vývoja zodpovedajúcu danému 
orgánu a zis ťujú sa aj parametre požadované u samcov generácie P.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Zvieratá z kohorty 2  
74. Neurohistopatologické vyšetrenie sa vykoná u všetkých zvierat oboch 
pohlaví z kohorty 2A s vysokou dávkou a z kontrolnej skupiny po ukon čení 
neurobehaviorálnych testov (po 75. PND, ale nie neskôr ako v 90. PND). 
Histopatologické vyšetrenie mozgu sa vykoná u všetkých zvierat oboch 
pohlaví z kohorty 2B s vysokou dávkou a z kontrolnej skupiny v 21. alebo 22. PND. Orgány alebo tkanivá, ktoré vykazujú zmeny súvisiace s testovaním, sa vyšetria aj u všetkých zvierat v skupinách s nižšou dávkou, 
čo pomôže pri ur čovaní hodnoty NOAEL. U zvierat z kohorty 2A a 2B sa 
skúmajú viaceré rezy mozgu, čo umožní vyšetri ť čuchovú gu ľu, mozgovú 
kôru, hipokampus, bazálne gangliá, talamus, hypotalamus, stredný mozog 
(schránka, pokrývka, mozgové stopky), mozgový kme ň a mozo ček. Iba 
v prípade kohorty 2A sa vyšetrujú o či (sietnica a zrakový nerv) a vzorky 
periférnych nervov, svalov a miechy. Všetky neurohistologické postupy musia by ť v súlade s testovacou metódou B.53 (35). 
75. Reprezentatívne oblasti mozgu (homologické rezy starostlivo vybrané na 
základe spo ľahlivých mikroskopických rozhraní) podliehajú morfome ­
trickým (kvantitatívnym) hodnoteniam, ktoré môžu zah ŕňať lineárne a/alebo 
plošné merania konkrétnych oblastí mozgu. Z každého rozhrania (úrovne) je potrebné odobra ť najmenej tri po sebe idúce rezy, aby sa dal vybra ť 
najhomologickejší a najreprezentatívnejší rez z každej konkrétnej oblasti 
mozgu, ktorá sa má hodnoti ť. Neuropatológ urobí posudok, či rezy pripra ­
vené na meranie sú homologické s ostatnými v súbore vzoriek a teda vhodné na zahrnutie, ke ďže podmienky najmä lineárneho merania sa 
môžu meni ť na pomerne krátkej vzdialenosti (28). Nehomologické rezy 
sa nepoužijú. Hoci cie ľom je odobra ť vzorky zo všetkých zvierat vyhrade ­
ných na tento ú čel (10/pohlavie/úrove ň dávky), aj nižšie po čty môžu by ť 
primerané. Po čet vzoriek od menej než 6 zvierat/pohlavie/úrove ň dávky sa 
však vo všeobecnosti nepovažuje za dostato čný na účely tejto testovacej 
metódy. Na identifikáciu ú činkov súvisiacich s testovaním na parametre, 
ako je objem alebo po čet buniek pre konkrétne neuroanatomické oblasti, 
sa môže použi ť stereológia. Všetky aspekty prípravy vzoriek tkaniva, od 
fixácie tkaniva, cez vyrezanie vzoriek tkaniva, spracovanie tkaniva až po 
farbenie sklí čok musia ma
ť vyváženú štruktúru tak, aby všetky súbory 
obsahovali reprezentatívne vzorky z každej dávkovej skupiny. Ak sa majú použiť morfometrické alebo stereologické analýzy, mozgové tkanivo je 
potrebné uloži ť do vhodného média pre všetky hladiny dávky v tom 
istom čase, aby sa predišlo zmršteniu štruktúry buniek spojenému 
s predĺženým uložením vo fixa čnom prostriedku.
 
PREDKLADANIE SPRÁV  
Údaje  
76. Údaje sa zaznamenávajú jednotlivo a sumarizujú vo forme tabuliek. Pre 
každú testovanú skupinu a každú generáciu sa v správe uvedú pod ľa 
možnosti tieto údaje: po čet zvierat na za čiatku testu, po čet zvierat, ktoré 
uhynuli po čas testu, alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas 
každého úmrtia alebo humánneho usmrtenia, po čet plodných zvierat, 
počet gravidných samíc, po čet samíc, ktoré vrhli mlá ďatá a počet zvierat 
vykazujúcich príznaky toxicity. Potrebné je uvies ť aj opis toxicity vrátane 
času nástupu, trvania a závažnosti. 
77. Číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne prijate ľnou štatis ­
tickou metódou. Štatistické metódy sa zvolia ako sú časť plánu štúdie 
a musia primeranie rieši ť otázky nenormálnych dát (napríklad údaje 
o počte), cenzurovaných dát (napríklad obmedzená doba pozorovania), závi ­
slosti (napríklad vplyvy vrhu a opakované merania) a nerovnakého rozptylu.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
Zovšeobecnené lineárne zmiešané modely a modely dávka – reakcia 
zahŕňajú širokú škálu analytických nástrojov, ktoré môžu by ť vhodné pre 
údaje získané v rámci tejto metódy. Správa obsahuje dostatok informácií o analytickej metóde a použitom po čítačovom programe, aby nezávislý 
posudzovate ľ/štatistik mohol vyhodnoti ť a prehodnoti ť analýzu.
 
Vyhodnotenie výsledkov  
78. Zistenia sa môžu vyhodnoti ť z hľadiska pozorovaných ú činkov, a to vrátane 
zistení z pitvy a mikroskopických zistení. Hodnotenie zah ŕňa vzťah medzi 
dávkou a výskytom, dôsledkami a závažnos ťou abnormalít vrátane výraz ­
ných lézií, alebo neexistenciu takého vz ťahu. Posúdi ť treba aj otázky cie ľo­
vých orgánov, plodnosti, klinických abnormalít, činností reprodukcie 
a rodenia, zmien telesnej hmotnosti, mortality a ďalších toxických 
a vývojových ú činkov. Osobitnú pozornos ť je potrebné venova ť zmenám 
špecifickým pre jednotlivé pohlavia. Pri hodnotení výsledkov testu treba 
zvážiť fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie a údaje 
o timidínovej kináze vrátane placentárneho prenosu a exkrécie do mlieka, ak sú tieto údaje k dispozícii.
 
Správa o teste  
79. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie získané v danej štúdii 
o zvieratách generácií P a F  1 a o zvieratách generácie F  2 (v prípade potre ­
by): 
Testovaná chemikália:  
— všetky dôležité dostupné údaje o chemických, toxikokinetických 
a toxikodynamických vlastnostiach testovanej chemikálie, 
— identifika čné údaje, 
— čistota;  
Nosič (v prípade potreby):  
— zdôvodnenie výberu nosi ča, ak je iný ako voda;  
Pokusné zvieratá:  
— použitý druh/kme ň, 
— počet, vek a pohlavie zvierat, 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo, materiál na hniezdenie at ď., 
— individuálne hmotnosti zvierat na za čiatku testu, 
— údaje o vaginálnych steroch u samíc generácie P pre za čiatkom testo ­
vania (ak sa údaje v tom čase získavali), 
— záznamy o párení generácie P, v ktorých sú ozna čení páriaci sa partneri, 
samec a samica, a tiež úspešný výsledok párenia, 
— vrh z pôvodných záznamov o dospelých zvieratách generácie F  1 ; 
Podmienky testu:  
— zdôvodnenie výberu hladiny dávok, 
— podrobné údaje o zložení testovanej chemikálie/príprave krmiva, dosiah ­
nutých koncentráciách,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— stabilita a homogénnos ť prípravku v nosi či (napríklad v krmive, pitnej 
vode), v krvi a/alebo mlieku pri splnení podmienok použitia 
a uskladnenia v prestávke medzi obdobiami používania, 
— podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie, 
— prepo čet koncentrácie testovanej chemikálie v krmive/pitnej vode (ppm) 
na dosiahnutú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň), v prípade potreby, 
— podrobné údaje o kvalite potravy a vody (vrátane zloženia krmiva, ak sú 
údaje k dispozícii), 
— podrobný opis postupov náhodného výberu mlá ďat na vyradenie 
a náhodného zara ďovania mlá ďat do testovaných skupín, 
— podmienky prostredia, 
— zoznam pracovníkov realizujúcich štúdiu vrátane odbornej prípravy;  
Výsledky (súhrn a individuálne údaje pod ľa pohlavia a dávky):  
— spotreba potravy, spotreba vody (ak sú údaje k dispozícii), ú činnosť 
potravy (prírastok telesnej hmotnosti na gram skonzumovanej potravy, okrem obdobia párenia a laktácie) a spotreba testovanej chemikálie (pri podávaní krmiva/pitnej vody) pre zvieratá generácie P a F
 1 , 
— údaje o absorpcii (ak sú k dispozícii); — údaje o telesnej hmotnosti zvierat generácie P, 
— údaje o telesnej hmotnosti vybraných zvierat generácie F
 1 po odstavení, 
— čas uhynutia po čas štúdie alebo údaj, či zvieratá prežili do usmrtenia, 
— charakter, tvrdos ť a trvanie klinických pozorovaní ( či sú reverzibilné 
alebo nie), 
— údaje z hematologických vyšetrení, vyšetrení mo ču a klinickej 
biochémie vrátane údajov o hormónoch TSH a T4, 
— fenotypická analýza buniek sleziny (T-, B-, NK-bunky), 
— bunečnosť kostnej drene, 
— údaje o toxickej reakcii, — počet samíc generácie P a F
 1 s normálnym alebo abnormálnym 
estrálnym cyklom a trvanie cyklu, 
— čas párenia (predkoitálny interval, po čet dní medzi spárovaním 
a párením), 
— toxické alebo iné ú činky na reprodukciu vrátane po čtov 
a percentuálnych podielov zvierat, ktoré zvládli párenie, graviditu, 
pôrod a laktáciu, samcov, ktorí vyvolali graviditu, samíc s príznakmi 
dystokie/dlhého alebo ťažkého pôrodu, 
— doba trvania gravidity a pôrodu, ak je údaj k dispozícii, 
— počet implantácií, ve ľkosť vrhu a percentuálny podiel sam čích mláďat, 
— počet a percentuálny podiel poimplanta čných strát, živo narodených 
a mŕtvo narodených jedincov,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— údaje o hmotnosti vrhu a jednotlivých mlá ďat (samcov, samíc 
a kombinovane), po čet nevyvinutých jedincov, ak bol zistený, 
— počet mláďat s výrazne vidite ľnými abnormalitami, 
— toxické alebo iné ú činky na potomstvo, postnatálny rast, životaschop ­
nosť atď., 
— údaje o fyzických medzníkoch vo vývoji mlá ďat a iné postnatálne údaje 
o vývoji, 
— údaje o pohlavnej zrelosti zvierat generácie F  1 , 
— údaje o vyšetreniach funk čnosti u mlá ďat a dospelých jedincov, ak je to 
možné, 
— telesná hmotnos ť pri usmrtení a údaje o absolútnych a relatívnych hmot ­
nostiach orgánov zvierat generácie P a dospelých zvierat generácie F  1 , 
— pitevné nálezy, — podrobný opis všetkých histopatologických nálezov, — celkový po čet spermií z chvostovej časti nadsemenníkov, percentuálny 
podiel progresívne sa pohybujúcich spermií, percentuálny podiel morfo ­
logicky normálnych spermií a percentuálny podiel spermií s každou identifikovanou abnormalitou u samcov generácií P a F
 1 , 
— počet a štádium zrelosti folikulov obsiahnutých vo vaje čníkoch samíc 
generácií P a F  1 , ak je to vhodné, 
— vyčíslenie po čtu veľkých žltých teliesok (corpora lutea) vo vaje čníkoch 
samíc generácie F  1 , 
— štatisticky spracované výsledky, ak je to vhodné.  
Parametre kohorty 2:  
— podrobný opis postupov používaných na normovanie vyšetrení 
a postupov, ako aj prevádzkové vymedzenia pojmov pre hodnotiace 
vyšetrenia, 
— zoznam všetkých použitých testovacích postupov a odôvodnenie ich 
použitia, 
— podrobné údaje o použitých behaviorálnych/funk čných, neuropatologic ­
kých a morfometrických postupoch vrátane informácií a podrobných 
údajov o automatických zariadeniach, 
— postupy na kalibráciu a zabezpe čenie rovnocennosti zariadení, ako aj 
vyváženie testovacích skupín v rámci testovacích postupov, 
— krátke odôvodnenie, ktorým sa vysvet ľuje každé rozhodnutie obsahu ­
júce odborný posudok, 
— podrobný opis všetkých behaviorálnych/funk čných, neuropatologických 
a morfometrických nálezov pod ľa pohlavia a dávkovej skupiny vrátane 
nárastu a poklesu v kontrolnej skupine, 
— hmotnos ť mozgu, 
— každá diagnóza stanovená na základe neurologických príznakov a lézií 
vrátane prirodzene vznikajúcich chorôb alebo podmienok, 
— obrázky exemplárnych nálezov, 
— obrázky s nízkou energiou na posúdenie homológie častí používaných 
na morfometriu,  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— štatistické spracovanie výsledkov vrátane štatistických modelov použí ­
vaných na analyzovanie údajov a výsledkov bez oh ľadu na to, či boli 
významné alebo nie, 
— vzťah iných toxických ú činkov k záveru o neurotoxickom potenciáli 
testovanej chemikálie pod ľa pohlavia a dávkovej skupiny, 
— vplyv akejko ľvek toxikokinetickej informácie na závery, 
— údaje podporujúce spo ľahlivosť a citlivos ť testovacej metódy (t. j. pozi ­
tívne a historické kontrolné údaje), 
— vzťahy, ak nejaké sú, medzi neuropatologickými a funk čnými účinkami, 
— hodnota NOAEL alebo referen čná dávka pre samice a potomstvo, pod ľa 
pohlavia a dávkovej skupiny, 
— diskusia celkovej interpretácie údajov na základe výsledkov vrátane 
záveru o tom, či chemikália spôsobila vývojovú neurotoxicitu alebo 
nie, a na základe hodnoty NOAEL;  
Parametre kohorty 3:  
— titer séra protilátky IgM (senzibilizácia na SRBC alebo KLH) alebo 
slezinové jednotky IgM PFC (senzibilizácia na SRBC), 
— vykonávanie metódy TDAR musí v rámci procesu optimalizácie 
potvrdiť laboratórium pri prvej príprave testu a periodicky (napríklad 
raz ročne) všetky laboratóriá, 
— diskusia celkovej interpretácie údajov na základe výsledkov vrátane 
záveru o tom, či chemikália spôsobila vývojovú imunotoxicitu alebo 
nie, a na základe hodnoty NOAEL.  
Rozbor výsledkov  
Závery vrátane hodnôt NOAEL týkajúce sa ú činkov na rodi čov a potomstvo  
Predložiť by sa mali aj všetky informácie nezískané po čas štúdie, ale 
užitočné pre interpretáciu výsledkov (napríklad podobnos ť účinkov 
s akýmiko ľvek známymi neurotoxínmi).  
Interpretácia výsledkov  
80. Rozšírená jednogenera čná štúdia reproduk čnej toxicity poskytne pod ľa 
potreby informácie o ú činkoch opakovanej expozície chemikálií po čas všet­
kých fáz reproduk čného cyklu. Štúdia predovšetkým poskytne informácie 
o reproduk čnom systéme a o sledovaných faktoroch vývoja, rastu, prežitia 
a o funkčných faktoroch potomstva do 90. PND. 
81. Interpretácia výsledkov štúdie musí zoh ľadniť všetky dostupné informácie 
o chemikálii vrátane fyzikálno-chemických, toxikokinetických 
a toxikodynamických vlastností, dostupných dôležitých informácií o štrukturálnych analógiách a výsledkov predchádzajúcich štúdií toxicity testovanej chemikálie (napríklad akútnej toxicity, toxicity po opakovanej 
aplikácii, štúdie mechanizmov a štúdie posudzujúce, či existujú zásadné 
kvalitatívne a kvantitatívne rozdiely medzi druhmi, pokia ľ ide 
o metabolické vlastnosti in vivo/in vitro). Výsledky makroskopickej pitvy a hmotnosti orgánov sa posúdia v súvislosti so zisteniami z iných štúdií pri 
opakovaných dávkach, ak je to možné. Pokles vzrastu potomstva sa môže 
považova ť za prejav vplyvu testovanej chemikálie na zloženie mlieka (29).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohorta 2 (vývojová neurotoxicita)  
82. Neurobehaviorálne a neuropatologické výsledky sa interpretujú v súvislosti 
so všetkými nálezmi, pri čom sa využíva prístup váhy dôkazov a odborné 
posudky. Schémy behaviorálnych alebo morfologických nálezov, ak existujú, ako aj dôkazy o vz ťahu medzi dávkou a reakciou je potrebné 
podrobiť rozboru. Táto charakterizácia by mala zah ŕňať aj hodnotenie vývo ­
jovej neurotoxicity vrátane epidemiologických štúdií na ľuďoch alebo správ 
o prípadoch, a tiež experimentálne štúdie zvierat (napríklad toxikokinetické údaje, informácie o štrukturálnej činnosti, údaje z iných štúdií toxicity). 
Hodnotenie údajov musí zah ŕňať aj rozbor biologickej a štatistickej 
významnosti. Do hodnotenia sa musí zahrnú ť aj vzťah, ak existuje, medzi 
pozorovanými neuropatologickými zmenami a zmenami správania. Usmer ­
nenie k interpretácii výsledkov vývojovej neurotoxicity je obsiahnuté v testovacej metóde B.53 (35) a v publikácii Tyla a kol., 2008 (31).
 
Kohorta 3 (vývojová imunotoxicita)  
83. Potla čenie alebo posilnenie funkcie imunity, posudzované metódou TDAR 
(T-cell dependant antibody response – protilátková reakcia závislá od 
T-buniek), sa musí hodnoti ť v súvislosti so všetkými vykonanými pozoro ­
vaniami. Význam výsledku testu TDAR môžu podpori ť iné účinky na 
ukazovatele súvisiace s imunológiou (napríklad bune čnosť kostnej drene, 
hmotnosť a histopatologické vyšetrenie lymfatických tkanív, rozloženie 
podskupiny lymfocytov). Ú činky stanovené metódou TDAR môžu ma ť 
menší význam v prípade, že iné toxicity boli pozorované pri nižších koncentráciách expozície. 
84. Pomoc pri interpretácii výsledkov skúmania reprodukcie a neurotoxicity 
poskytne usmer ňovací dokument OECD 43 (26).
 
LITERATÚRA  
1. Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69 - 98. 
2. Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530 - 536. 
3. Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC. 
4. Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87 - 94. 
5. Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating 
Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicolo ­
gical Sciences , 49, 1 - 4. 
6. Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293 - 327. 
7. Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356 - 369.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8. Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1 -21. 
9. Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408 - 415. 
10. Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84 - 97. 
11. Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York. 
12. Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383 - 390. 
13. Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298 - 303. 
14. Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9 -19. 
15. Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23 - 35. 
16. Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92 -108. 
17. Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103 - 107. 
18. Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39 - 44. 
19. Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237 - 244. 
20. Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267 - 273. 
21. Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409 - 421. 
22. Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 449 
- 458.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23. Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. s. 
319 - 333. 
24. Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerati ­
ons’,  Journal of Andrology , 10, 401 - 415. 
25. Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491 - 505. 
26. OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paríž. 
27. Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330 - 337. 
28. Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296 - 313. 
29. Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8 - 16. 
30. Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717 - 1726. 
31. Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpo ­
ints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349 - 381. 
32. OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paríž. 
33. Kapitola B.43 tejto prílohy, Štúdia neurotoxicity u hlodavcov 34. OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paríž. 
35. Kapitola B.53 tejto prílohy, Štúdia vývojovej neurotoxicity 36. Kapitola B.54 tejto prílohy, Uterotrofický biologický test u hlodavcov: 
Krátkodobý skríningový test na estrogénne vlastnosti 
37. Kapitola B.55 tejto prílohy, Hershbergerov biologický test u potkanov: 
Krátkodobý skríningový test na (anti)androgénne vlastnosti
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38. OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paríž. 
39. OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paríž. 
40. OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Asse ­
ssment, No. 151, OECD, Paríž.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Dodatok č. 1 
Kritériá a pozorovania zahrnuté vo funk čnej pozorovacej batérii (kohorta 2a)  
Domovská klietka a otvorený priestor Manipulácia Fyziológia  
Postoj Jednoduchos ť odstránenia Teplota 
Nedobrovo ľné šklbavé pohyby 
a svalové napätie Jednoduchos ť zaobchádzania Telesná hmotnos ť 
Palpebrálne zatvorenie Svalový tonus Reakcia zreni čky 
Piloerekcia Reakcia na priblíženie Ve ľkosť zreničky 
Slinenie Reakcia na dotyk Slzenie Sluchová reakcia Vydávanie zvukov Reakcia na stisnutie chvosta Odchov Polohová reakcia Odchýlky chôdze Slabos ť dopadajúcich nôh 
Vzrušenie Sila zovretia prednými 
končatinami 
Stereotypy Sila zovretia zadnými kon ča­
tinami 
Výstredné správanie 
Škvrny 
Respiračné odchýlky
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Dodatok č. 2 
VYMEDZENIA POJMOV  
Chemikália : látka alebo zmes  
Testovaná chemikália : akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  SKÚŠKA STEROIDOGENÉZY H295R  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie 
testov (TG) 456 (2011). OECD spustila v roku 1998 prioritnú aktivitu na 
revidovanie a vypracovanie nových usmernení na vykonávanie testov na skríning a testovanie možných chemikálií narúšajúcich endokrinný systém. Koncepčný rámec OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií narúšajú ­
cich endokrinný systém z roku 2002 pozostáva z piatich úrovní, pri čom 
každá úrove ň zodpovedá inej úrovni biologickej náro čnosti (1). Skúška in 
vitro steroidogenézy H295R (H295R) opísaná v tejto testovacej metóde používa ľudskú bunkovú líniu adrenokarcinómu (bunky NCI-H295R) 
a predstavuje „skúšku in vitro, ktorá poskytuje mechanistické údaje“ na 
úrovni 2, ktoré sa používajú na ú čely skríningu a prioritizácie. Toto testo ­
vanie sa na vyšetrenie chemických ú činkov na steroidogenézu, najmä na 
produkciu 17 β-estradiolu (E2) a testosterónu (T), vypracovalo 
a štandardizovalo vo viacerých krokoch. Skúška H295R sa optimalizovala 
a validovala (2) (3) (4) (5). 
2. Cieľom skúšky steroidogenézy H295R je ur čiť chemikálie, ktoré ovplyv ­ 
ňujú produkciu E2 a T. Skúškou H295R sa majú identifikova ť xenobiotiká, 
ktorých cie ľovým miestom/cie ľovými miestami sú endogénne zložky, ktoré 
tvoria vnútrobunkovú biochemickú cestu za čínajúcu sledom reakcií od 
cholesterolu po produkciu E2 a/alebo T. Skúškou H295R sa nemajú iden ­
tifikovať chemikálie, ktoré ovplyv ňujú steroidogenézu v dôsledku ú činkov 
na os HPG (hypotalamus-hypofýza-pohlavné ž ľazy). Cieľom skúšky nie je 
poskytnúť odpoveď ÁNO/NIE, pokia ľ ide o potenciál chemikálie indukova ť 
alebo obmedzi ť produkciu T a E2; v niektorých prípadoch však možno 
získať kvantitatívne výsledky (pozri odseky 53 a 54). Výsledky skúšky sa 
vyjadrujú ako relatívne zmeny produkcie hormónov v porovnaní 
s kontrolami s aplikáciou rozpúš ťadla. Cie ľom skúšky nie je poskytnú ť 
konkrétne mechanistické informácie týkajúce sa interakcie testovanej chemi ­
kálie s endokrinným systémom. Vykonal sa výskum s použitím bunkovej 
línie na identifikáciu ú činkov na špecifické enzýmy a prostredné hormóny, 
ako je napríklad progesterón (2). 
3. Vymedzenia pojmov a skratky použité v tejto testovacej metóde sú opísané 
v dodatku. Podrobný protokol vrátane pokynov na prípravu roztokov, kulti ­
váciu buniek a vykonávanie rôznych aspektov testu sú k dispozícii ako 
dodatok I až III k dokumentu OECD s názvom Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production (4).
 
ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA 
4. V biosyntéze pohlavných steroidných hormónov pôsobí pä ť rôznych enzý ­
mov, ktoré katalyzujú šes ť rôznych reakcií. Enzymatická konverzia choles ­
terolu na pregnenolon enzýmom štiepiacim cholesterolový postranný reťazec (CYP11A) cytochrómu P450 (CYP) predstavuje prvý krok v sérii 
biochemických reakcií, ktoré kulminujú syntézou steroidných kone čných 
produktov. V závislosti od poradia ďalších dvoch reakcií sa steroidogene ­
tická dráha rozde ľuje na dve dráhy, dráhu Δ
 5 -hydroxysteroidu a dráhu Δ 4 - 
ketosteroidu, ktoré sa spájajú do produkcie androsténdiónu (obrázok č. 1). 
5. Androsténdión sa mení na testosterón (T) dehydrogenáciou 17 β-hydroxys ­
teroidu (17 β-HSD). Testosterón je tak medziprodukt, ako aj kone čný 
hormonálny produkt. T sa u samcov môže meni ť na 
dihydrotestosterón (DHT) 5 α-reduktázou, ktorá sa nachádza v bunkových 
membránach, obale bunkového jadra a v endoplazmatickom retikule cie ľo­
vých tkanív androgénnej činnosti, ako sú prostata a semenné mechúriky. 
DHT je ako androgén podstatne silnejší ako T a považuje sa tiež za 
konečný hormón. Skúškou H295R sa nemeria DHP (pozri odsek 10).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Enzým v steroidogénnej dráhe, ktorý premie ňa androgénne chemikálie na 
estrogénne chemikálie, je aromatáza (CYP19). CYP19 premie ňa T na 17 β- 
estradiol (E2) a androstendión na estrón. E2 a T sa považujú za kone čné 
hormóny steroidogenézy. 
7. Špecifickos ť činnosti lyázy CYP17 je u jednotlivých druhov pre prostredné 
substráty rozdielna. U ľudí uprednost ňuje tento enzým substráty dráhy Δ 5 - 
hydroxysteroidu (pregnenolon), zatia ľ čo u potkanov sa uprednost ňujú 
substráty v dráhe Δ 4 -ketosteroidu (progesterón) (19). Týmito rozdielmi 
činnosti lyázy CYP17 možno vysvetli ť rozdielne reakcie jednotlivých 
druhov na chemikálie, ktoré menia steroidogenézu in vivo (6). Ukázalo 
sa, že bunky H295 najlepšie odrážajú model expresie enzýmu ľudskej 
dospelej nadobli čky a produkcie steroidu (20), ale je známe, že exprimujú 
enzýmy pre dráhu Δ 5 -hydroxysteroidu a aj pre dráhu Δ 4 -ketosteroidu pre 
androgénnu syntézu (7) (11) (13) (15).  
Obrázok č. 1 
Steroidogenéza v bunkách H295R
  
Poznámka:  
Enzýmy sú ozna čené kurzívou, hormóny sú ozna čené tučným písmom 
a šípky ozna čujú smer syntézy. Šedé pozadie ozna čuje dráhy/produkty 
kortikosteroidov. Dráhy/produkty pohlavných steroidov sú zakrúžkované. CYP = cytochróm P450; HSD = hydroxysteroid-dehydrogenáza; DHEA = dehydroepiandrosterón. 
8. Ľudská bunková línia adrenokarcinómu H295R je užito čný in vitro model 
skúmania ú činkov na syntézu steroidných hormónov (2) (7) (8) (9) (10). 
Bunková línia H295R exprimuje gény, ktoré kódujú pre všetky k ľúčové 
enzýmy pre steroidogenézu uvedenú skôr v texte (11) (15) (obrázok č. 1). 
Je to jedine čná vlastnos ť, pretože expresia in vivo týchto génov je špeci ­
fická pre jednotlivé tkanivá a vývojové stupne, pri čom zvyčajne žiadne 
tkanivo ani žiadny vývojový stupe ň neexprimuje všetky gény zú častňujúce 
sa na steroidogenéze (2). Bunky H295R majú fyziologické charakteristiky 
buniek zonálne nediferencovaných ľudských fetálnych nadobli čiek (11). 
Bunky predstavujú jedine čný systém in vitro, ke ďže majú schopnos ť produ­
kovať všetky steroidné hormóny, ktoré sa nachádzajú v kôre dospelej nado ­
bličky a v pohlavných ž ľazách, čo umožňuje testovanie ú činkov na syntézu 
kortikosteroidov a aj na produkciu pohlavných steroidných hormónov, ako
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
sú androgény a estrogény, hoci skúška je validovaná len na zis ťovanie T a 
E2. Zmeny zaznamenané systémom testovania vo forme zmeny produkcie 
T a E2 môžu by ť výsledkom mnohých rôznych interakcií testovaných 
chemikálií so steroidogénnymi funkciami, ktoré exprimujú bunky H295R. Medzi ne patrí zmena expresie, syntézy alebo funkcie enzýmov zú častňu­
júcich sa na produkcii, premene alebo odstra ňovaní steroidných hormónov 
(12) (13) (14). Inhibícia produkcie hormónov môže by ť spôsobená priamou 
konkuren čnou väzbou na enzým v dráhe, vplyvom na spolufaktory, ako sú 
NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfát) a cAMP (cyklický adeno ­
zínmonofosfát), a/alebo zvýšením steroidného metabolizmu alebo potla ­ 
čením génovej expresie ur čitých enzýmov v steroidogenéze. Zatia ľ čo inhi­
bícia môže by ť funkciou priamych alebo nepriamych procesov súvisiacich 
s produkciou hormónov, indukcia je zvy čajne nepriama, napríklad tým, že 
ovplyvňuje spolufaktory, ako sú NADPH a cAMP (ako v prípade forsko ­
línu), znižuje steroidný metabolizmus (13) alebo zvyšuje steroidogénovú expresiu génov. 
9. Skúška H295R má viaceré výhody: 
— umožňuje určiť zvýšenie a zníženie produkcie T a E2; 
— umožňuje priame posúdenie možného vplyvu chemikálie na života ­
schopnosť/cytotoxicitu buniek. Je to dôležitý prvok, ke ďže umožňuje 
rozlišovať účinky spôsobené cytotoxicitou od ú činkov spôsobených 
priamou interakciou chemikálií so steroidogenézou, čo nie je možné 
v systémoch tkanivových explantátov, ktoré pozostávajú z rozmanitých typov buniek rôznej citlivosti a rôznych funk čností; 
— nevyžaduje si použitie zvierat; 
— bunková línia H295R je komer čne dostupná. 
10. Zásadné obmedzenia skúšky sú tieto: 
— jej metabolická schopnos ť je neznáma, pravdepodobne je však pomerne 
obmedzená; preto sa v tejto skúške pravdepodobne prehliadnu chemi ­
kálie, ktoré sa musia metabolicky aktivova ť; 
— keďže H295R sa získava z tkaniva nadobli čiek, obsahuje enzýmy 
schopné produkova ť glukokortikoidy a mineralokortikoidy, ako aj 
pohlavné hormóny, preto by ú činky na produkciu glukokortikoidov 
a mineralokortikoidov mohli ovplyvni ť úrovne T a E2 pozorované 
v skúške; 
— nemeria DHT, a preto zrejme nezistí chemikálie, ktoré potlá čajú 5α- 
reduktázu, v takomto prípade sa môže použi ť Hershbergerov test(16); 
— skúškou H295R sa nezistia chemikálie, ktoré narúšajú steroidogenézu 
ovplyvnením HPG osi (hypotalamus-hypofýza-pohlavné ž ľazy), keďže 
to možno skúma ť len v prípade neporušených zvierat.  
PRINCÍP TESTU 
11. Cieľom skúšky je zisti ť chemikálie, ktoré ovplyv ňujú produkciu T a E2. 
T je tiež medzistupe ň v produkcii E2. Skúškou možno zisti ť chemikálie, 
ktoré typicky potlá čajú alebo indukujú enzýmy steroidogenézy.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Skúška sa zvy čajne vykonáva v štandardných podmienkach kultivácie 
buniek na 24-jamkových platni čkách pre bunkové kultúry. Prípadne 
možno na vykonanie skúšky použi ť platničky iných ve ľkostí; nasadenie 
a podmienky skúšky by sa však mali vhodne upravi ť tak, aby boli dodržané 
kritériá vykonávania. 
13. Po aklimatiza čnom období 24 hodín na viacjamkových platni čkách sa 
bunky po dobu 48 hodín vystavia siedmim koncentráciám testovaných 
chemikálií, a to minimálne trojmo. Rozpúš ťadlo, známy inhibítor 
a spúšťač produkcie hormónov sa testujú v pevnej koncentrácii ako nega ­
tívne a pozitívne kontrolné vzorky. Na konci doby expozície sa z každej 
jamky odstráni médium. Životaschopnos ť buniek v každej bunke sa analy ­
zuje hneď po odstránení média. Koncentrácie hormónov v médiu možno 
merať pomocou rôznych metód, a to aj pomocou komer čne dostupných 
súprav na meranie hormónov a/alebo inštrumentálnych metód, ako je 
napríklad metóda kvapalinovej kromatografie – hmotnostnej spektrometrie 
(LC-MS). Údaje sa vyjadrujú ako násobná zmena v porovnaní s kontrolou rozpúšťadla a najnižšou koncentráciou s pozorovaným ú činkom (LOEC). 
Keď je skúška negatívna, najvyššia testovaná koncentrácia sa uvedie ako 
koncentrácia bez pozorovaného ú činku (NOEC). Závery týkajúce sa schop ­
nosti chemikálie ovplyvni ť steroidogenézu by mali by ť založené najmenej 
na dvoch nezávislých pokusoch. Prvý pokus môže fungova ť ako pokus na 
zistenie rozsahu, v druhom a prípadne tre ťom pokuse sa rozsahy následne 
upravujú, ak sa vyskytnú problémy s rozpustnos ťou alebo cytotoxicitou 
alebo ak sa zdá, že chemikália je na konci rozsahu testovaných koncentrácií.
 
PRÍPRAVA KULTÚR  
Bunková línia  
14. Bunky NCI-H295R sú komer čne dostupné z kolekcie kultúr amerického 
typu (ATCC) po podpísaní dohody o prenose materiálu (MTA) (  1 ). 
Úvod  
15. Z dôvodu zmien schopnosti buniek produkova ť E2 s narastajúcim vekom/ 
zvyšujúcimi sa pasážami (2) by sa bunky pred použitím mali kultivova ť na 
základe osobitného protokolu a po čtu pasáží, ke ďže bunky boli rozmrazené, 
a mal by sa poznamena ť aj počet pasáží, pri ktorom boli bunky zamrazené 
a umiestnené v tekutom dusíku na uskladnenie. Prvým číslom sa ozna čuje 
aktuálne číslo pasáže bunky a druhým číslom sa opisuje po čet pasáži, pri 
ktorom sa bunky zamrazili a uskladnili. Napríklad bunky, ktoré sa zamrazili 
po piatej pasáži a rozmrazili, a potom sa trikrát delili (4 pasáže, pri čom 
čerstvo rozmrazené bunky sa po čítajú ako pasáž 1), by sa po opätovnej 
kultivácii ozna čili ako pasáž 4.5. Príklad systému číslovania je znázornený 
v dodatku č. I k valida čnej správe (4). 
16. Zásobné médium sa používa ako základ pre obohatené a mraziace médium. 
Obohatené médium je potrebné na kultiváciu buniek. Mraziace médium je osobitne ur čené na umožnenie mrazenia buniek na dlhodobé skladovanie 
bez akýchko ľvek účinkov. Pred použitím by sa malo NuSerum (alebo 
porovnate ľné sérum s rovnakými vlastnos ťami, u ktorého sa preukázalo, 
že produkuje údaje v súlade s požiadavkami na efektívnos ť testu 
a kontrolu kvality), ktoré je zložkou obohateného média, analyzova ť na 
koncentrácie T a E2 v pozadí. Príprava týchto roztokov sa popisuje 
v dodatku č. II k valida čnej správe (4).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Po aktivácii bunkovej kultúry H295R z pôvodnej série ATCC by sa bunky 
mali namnoži ť pre päť pasáží (t. j. bunky sa delia štyri krát). Bunky z piatej 
pasáže sa potom zmrazia v tekutom dusíku na uskladnenie. Pred zmrazením buniek sa vzorka buniek z predchádzajúcej štvrtej pasáže otestuje na plat ­
ničke na kontrolu kvality (pozri odseky 36 a 37) na overenie, či základná 
produkcia hormónov a reakcia na pozitívne kontrolné chemikálie sp ĺňajú 
kritériá kontroly kvality skúšky vymedzené v tabu ľke 5. 
18. Bunky H295R sa musia kultivova ť, mraziť a usklad ňovať v tekutom 
dusíku, aby boli k dispozícii bunky vhodnej pasáže/veku na kultiváciu a použitie. Maximálny po čet pasáží po prevzatí novej (
 1 ) alebo 
zmrazenej (  2 ) série buniek na kultiváciu, ktorý je prijate ľný na použitie 
v skúške H295R, by mal by ť najviac 10. Napríklad prijate ľné pasáže pre 
kultúry buniek zo série zmrazenej v pasáži 5 by boli od 4.5 do 10.5. V prípade buniek aktivovaných z týchto zmrazených sérií sa dodržuje 
postup popísaný v odseku 19. Tieto bunky by sa pred svojím použitím 
v testovaní mali kultivova ť najmenej štyri (4) ďalšie pasáže (pasáž 4.5).
 
Štartovacie bunky zo zmrazených zásob  
19. Postup na aktiváciu buniek zo zmrazených zásob sa použije, ke ď sa na 
účely kultivácie a testovania vyberie nová séria buniek zo zásob uskladne ­
ných v tekutom dusíku. Podrobné informácie pre tento postup sa uvádzajú v dodatku č. III k valida čnej správe (4). Bunky sa vyberú z tekutého dusíka, 
rýchlo sa rozmrazia, vložia sa v obohatenom médiu do odstredivkovej 
skúmavky, odstredia sa pri izbovej teplote, resuspendujú sa v obohatenom 
médiu a prenesú sa do kultiva čnej banky. Médium by sa malo ďalší deň 
vymeniť. Bunky H295R sa kultivujú v inkubátore pri 37 °C vo vzdušnej 
atmosfére s 5 %CO
 2 a médium sa mení za nové dva- až trikrát za týžde ň. 
Keď sú bunky konfluentné na približne 85 až 90 %, mali by sa deli ť. 
Delenie buniek je potrebné na zabezpe čenie zdravia a rastu buniek a na 
zachovanie buniek na vykonávanie biologických testov. Bunky sa trikrát opláchnu s fosfátovo tlmivým fyziologickým roztokom (PBS bez Ca
 2+ 
Mg 2+ ) a uvoľnia sa z kultiva čnej banky pridaním vhodného odde ľujúceho 
enzýmu, napr. trypsínu, do fosfátovo tlmivého roztoku (bez Ca  2+ Mg 2+ ). 
Ihneď po oddelení buniek od kultiva čnej banky by sa enzymatická reakcia 
mala zastavi ť pridaním obohateného média v trojnásobnom pomere 
k objemu použitému na enzymatickú úpravu. Bunky sa vložia do odstre ­
divkovej skúmavky, odstredia sa pri izbovej teplote, odstráni sa supernatant a peleta buniek sa resuspenduje v obohatenom médiu. Vhodné množstvo bunkového roztoku sa umiestni do novej kultiva čnej banky. Množstvo 
bunkového roztoku by sa malo upravi ť tak, aby boli bunky konfluentné 
do 5 až 7 dní. Odporú čaný subkultiva čný pomer je 1:3 až 1:4. Platni čka by 
sa mala starostlivo ozna čiť. Bunky sú teraz pripravené na použitie v skúške 
a nadbyto čné bunky by sa mali zmrazi ť v tekutom dusíku, ako sa opisuje 
v odseku 20.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Nová séria“ ozna čuje čerstvú sériu buniek z ATCC. 
( 2 ) „Zmrazená séria“ ozna čuje bunky, ktoré boli predtým kultivované a zmrazené 
v laboratóriu inom než ATCC.
 Mrazenie buniek H295R (príprava buniek na uskladnenie v tekutom 
dusíku)  
20. Pri príprave buniek H295R na zmrazenie sa dodržuje postup popísaný 
vyššie v súvislosti s delením buniek až po krok resuspendácie pelety buniek na dne odstredivkovej skúmavky. Tu sa peleta buniek resuspenduje v mraziacom médiu. Roztok sa prenesie do kryogenickej nádobky, príslušne 
sa označí a mrazí sa pri – 80 °C po dobu 24 hodín, potom sa kryogenická 
nádobka prenesie do tekutého dusíku na uskladnenie. Podrobné informácie o tomto postupe sa uvádzajú v dodatku č. III k valida čnej správe (4).
 
Platničky a predinkubácia buniek na testovanie  
21. Potrebný po čet 24-jamkových platni čiek pripravených pod ľa opisu v odseku 
19 závisí od po čtu testovaných chemikálií a konfluencie buniek 
v kultiva čných miskách. Spravidla jedna kultiva čná banka (75 cm  2 ) 
s bunkami konfluentnými na 80 až 90 % poskytne dostatok buniek pre 
jednu až 1,5 (24-jamkovú) platni čku v cieľovej hustote 200 000 až 300 000 
buniek na ml média, z čoho vyplýva približne 50 až 60 % konfluencia 
v jamkách po 24 hodinách (obrázok č. 2). To je typicky optimálna hustota 
buniek na produkciu hormónov v skúške. Pri vyšších hustotách sa mení 
charakteristika produkcie T a aj E2. Pred prvým vykonaním skúšky sa 
odporúča testovanie rôznych hustôt nasadenia od 200 000 do 300 000 
buniek na ml a hustota, ktorá povedie k 50 – 60 % konfluencii v jamke po 24 hodinách, sa vyberie pre ďalšie skúšky.
 
Obrázok č. 2 
Fotomikrograf buniek H295R pri hustote nasadenia 50 % na 24-jamkovej kultiva čnej 
platničke po 24 hodinách vyhotovený na kraji (A) a v strede (B) jamky
  
22. Médium sa pipetou odoberie z kultiva čnej banky a bunky sa trikrát 
prepláchnu sterilným fosfátovo tlmivým fyziologickým roztokom (bez 
Ca 2+ Mg 2+ ). Na oddelenie buniek od kultiva čnej banky sa pridá enzymatický 
roztok (vo fosfátovo tlmivom fyziologickom roztoku). Po vhodnom čase na 
oddelenie buniek by sa enzymatická reakcia mala zastavi ť pridaním oboha ­
teného média v trojnásobnom pomere k objemu použitému na enzymatickú 
úpravu Bunky sa vložia do odstredivkovej skúmavky, odstredia sa pri  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
izbovej teplote, odstráni sa supernatant a peleta buniek sa resuspenduje 
v obohatenom médiu. Hustota buniek sa vypo číta s použitím napr. hemo ­
cytometra alebo po čítadla buniek. Bunkový roztok by sa mal rozriedi ť na 
želanú očkovaciu hustotu a poriadne premieša ť na zaistenie homogénnej 
hustoty buniek. Bunky by sa mali na platni čky vklada ť s 1 ml bunkového 
roztoku na jamku a platni čky a misky sa ozna čia. Nasadené platni čky sa 
inkubujú pri 37 °C vo vzdušnej atmosfére s obsahom menej ako 5 % CO  2 
po dobu 24 hodín, aby sa bunky mohli prichyti ť k jamkám.  
POŽIADAVKY NA KONTROLU KVALITY 
23. Je dôležité, aby sa do jamiek po čas dávkovania dali presné množstvá 
roztokov a vzoriek, pretože tieto objemy ur čujú koncentrácie použité pri 
výpočte výsledkov skúšky. 
24. Pred za čatím kultivácie buniek a následným testovaním by každé laborató ­
rium malo preukáza ť citlivosť svojho systému merania hormónov (odseky 
29 až 31). 
25. Keď sa majú použi ť skúšky na meranie hormónov založené na protilátkach, 
testované chemikálie by sa pred za čatím testovania mali analyzova ť na 
potenciál naruši ť systém merania použitý na kvantifikáciu T a E2, ako sa 
popisuje v odseku 32. 
26. DMSO je odporú čané rozpúš ťadlo pre skúšku. Ak sa použije iné rozpúš ť­
adlo, mali by sa ur čiť tieto faktory: 
— rozpustnos ť testovanej chemikálie, forskolínu a prochlorazu 
v rozpúšťadle; a 
— cytotoxicita ako funkcia koncentrácie rozpúš ťadla. 
Odporúča sa, aby maximálna prípustná koncentrácia rozpúš ťadla nepre ­
siahla 10-násobné rozriedenie najmenej cytotoxickej koncentrácie rozpúš ť­
adla. 
27. Pred prvým testovaním by laboratórium malo vykona ť kvalifika čný pokus 
na preukázanie, že laboratórium je schopné udrža ť a dosiahnu ť vhodnú 
bunkovú kultúru a podmienky skúšky potrebné na testovanie chemikálií, 
ako sa popisuje v odsekoch 33 až 35. 
28. Pri za čatí testovania novej série buniek by sa pred použitím novej série 
buniek najprv mala otestova ť kontrolná platni čka, aby sa posúdilo správanie 
buniek, ako sa popisuje v odsekoch 36 a 37.  
Systém merania hormónov  
Citlivosť metódy, správnos ť, presnos ť a krížová reaktivita so vzorovou 
matricou  
29. Každé laboratórium môže na analýzu produkcie T a E2 bunkami H295R 
používať systém merania hormónov pod ľa vlastného výberu, pokia ľ spĺňa 
kritériá vykonávania vrátane limitu kvantifikácie. Nominálne to sú 100 pg/ml pre T a 10 pg/ml pre E2 založené na základných hormonálnych 
úrovniach pozorovaných vo valida čných štúdiách. Môžu však by ť vhodné 
aj väčšie alebo nižšie úrovne v závislosti od základných hormonálnych 
úrovní dosiahnutých vo vykonávajúcom laboratóriu. Kým laboratórium začne testy na platni čkách na kontrolu kvality a skúšobné pokusy, malo 
by preukáza ť, že skúškou hormónov, ktorá sa má použi ť, sa môžu mera ť 
koncentrácie hormónov v obohatenom médiu so správnos ťou a presnos ťou
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
dostatočnými na dodržanie kritérií kvality kontroly stanovených v tabu ľkách 
1 a 5 analyzovaním obohateného média s vnútornou kontrolou hormónov. 
Do obohateného média by sa mali prida ť najmenej tri koncentrácie 
z každého hormónu (napr. 100, 500 a 2 500 pg/ml T; 10, 50 a 250 pg/ml E2; alebo sa pre najnižšie obohacovacie koncentrácie T a E2 môžu 
použiť najnižšie možné koncentrácie založené na detek čných limitoch 
zvoleného systému merania hormónov) a potom sa analyzujú. Namerané koncentrácie hormónov v neextrahovaných vzorkách by mali by ť do 30 % 
nominálnych koncentrácií a variabilita opakovaných meraní rovnakej 
vzorky by nemala presiahnu ť 25 % (pozri aj tabu ľku 8, v ktorej sa uvádzajú 
ďalšie kritériá kontroly kvality). Ak sú splnené tieto kritériá kontroly 
kvality, predpokladá sa, že zvolená skúška merania hormónov je dostato čne 
správna, presná a nemá krížovú reakciu so zložkami v médiu (vzorová 
matrica) tak, žeby sa o čakávalo významne ovplyvnenie výsledku skúšky. 
V takomto prípade sa nevyžaduje extrakcia vzoriek pred meraním hormó ­
nov. 
30. V prípade, že kritériá kontroly kvality v tabu ľkách 1 a 8 nie sú splnené, 
môže nasta ť významný matricový ú činok, a mala by sa vykona ť skúška 
s extrahovaným doplneným médiom. Príklad postupu extrakcie je popísaný 
v dodatku č. II k valida čnej správe (4). Koncentrácie hormónov 
v extrahovaných vzorkách by sa mali mera ť trojmo. (
 1 ) Ak sa dá dokáza ť, 
že zložky média po extrakcii nenarúšajú metódu zis ťovania hormónov 
v zmysle vymedzení kritérií kontroly kvality, všetky ďalšie skúšky by sa 
mali vykona ť s použitím extrahovaných vzoriek. Ak po extrakcii nie je 
možné splni ť kritériá kontroly kvality, použitý systém merania hormónov 
nie je vhodný na ú čely skúšky steroidogenézy H295R a mala by sa použi ť 
iná metóda zis ťovania hormónov.  
Štandardná krivka  
31. Koncentrácie hormónov kontrolných vzoriek s aplikáciou rozpúš ťadla by sa 
mali pohybova ť v lineárnej časti štandardnej krivky. Hodnoty kontrol 
s aplikáciou rozpúš ťadla by sa pod ľa možnosti mali nachádza ť v strede 
lineárnej časti, aby bolo možné mera ť indukciu a inhibíciu syntézy hormó ­
nov. Primerane sa zvolia riedenia média (alebo extrakty), ktoré sa majú 
merať. Lineárny vz ťah sa určí vhodným štatistickým postupom.  
Test interferencie chemikálií  
32. Ak sa majú na meranie hormónov použi ť skúšky založené na protilátkach, 
ako napríklad enzýmatická imunosorbentná analýza ELISA a rádioimunologické skúšky (RIA), každá chemikália by sa pred za čatím 
skutočného testovania chemikálií mala otestova ť na možnú interferenciu so 
systémom merania hormónov [dodatok č. III k valida čnej správe (4)], 
pretože niektoré chemikálie môžu narúša ť tieto testy (17). Ak nastane inter ­
ferencia, ktorá je ≥ 20 % základnej hormonálnej produkcie pre T a/alebo E2 
podľa stanovenia analýzou hormónov, mal by sa vykona ť test interferencie 
pri skúške pôsobenia chemikálií na hormóny [ako sa popisuje v dodatku 
č. III k valida čnej správe (4) oddiel 5.0] vo všetkých riedeniach zásobných 
roztokov testovaných chemikálií na ur čenie prahovej dávky, pri ktorej
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Poznámka:  Ak sa požaduje extrakcia, vykonajú sa tri opakované merania pre každý 
extrakt. Každá vzorka sa extrahuje len raz.
 nastane interferencia ( ≥ 20 %). Ak je interferencia menšia ako 30 %, 
výsledky možno upravi ť o interferenciu. Ak interferencia presahuje 30 %, 
údaje sú neplatné a údaje z týchto koncentrácií by sa mali vyradi ť. Ak 
nastane významná interferencia testovanej chemikálie so systémom merania hormónov pri viac ako jednej necytotoxickej koncentrácii, mal by sa použi ť 
iný systém merania hormónov. V záujme zamedzenia interferencie konta ­
minujúcich chemikálií sa odporú ča, aby sa hormóny extrahovali z média 
s použitím vhodného rozpúš ťadla, možné metódy možno nájs ť vo vali­
dačnej správe (4).
 
Tabuľka 1 
Kritériá pre systémy merania hormónov  
Parameter Kritérium  
Citlivosť metódy merania Limit kvantifikácie (LOQ – Limit of 
quantification) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Účinnosť extrakcie hormónov (len 
v prípade potreby extrakcie) Priemerné miery vý ťažnosti (na 
základe trojitých meraní) v prípade 
doplnených množstiev hormónov by sa nemali od dodaného množstva odchyľovať o viac než 30 %. 
Interferencia chemikálie (len 
v prípade systémov založených na 
protilátkach) Nemala by nasta ť žiadna významná 
(≥ 30 % základnej produkcie prísluš ­
ného hormónu) krížová reakcia so 
žiadnym hormónom produkovaným bunkami (
 b ) ( c ) 
( a ) Poznámka:  Limity metódy merania vychádzajú z hodnôt základnej produkcie 
hormónov uvedených v tabu ľke 5 a sú založené na výsledkoch. Ak je možné 
dosiahnuť vyššiu základnú produkciu hormónov, limit môže by ť väčší. 
( b ) Niektoré protilátky T a E2 môžu ma ť pri vyšších percentuálnych podieloch 
krížovú reakciu s androstendiónom a estrónom. V takýchto prípadoch nie je 
možné správne ur čiť účinky na 17 β-HSD. Údaje však môžu aj tak poskytnú ť 
užitočné informácie o ú činkoch na všeobecnú produkciu estrogénu alebo andro ­
génu. V takýchto prípadoch by sa údaje mali vyjadri ť ako reakcie androgénu/ 
estrogénu a nie E2 a T. 
( c ) Tieto zah ŕňajú: cholesterol, pregnenolón, progesterón, 11-deoxykortikosterón, 
kortikosterón, aldosterón, 17 α-pregnenolón,17 α-progesterón, deoxykortizol, korti ­
zol, DHEA, androstendión, estrón.  
Skúška spôsobilosti laboratória  
33. Laboratórium by malo pred testovaním neznámych chemikálií preukáza ť, že 
je spôsobilé dosiahnu ť a udrža ť vhodné bunkové kultúry a testovacie 
podmienky potrebné na úspešné vykonanie skúšky, a to vykonaním skúšky 
spôsobilosti laboratória. Ke ďže vykonanie skúšky je priamo spojené 
s personálom laboratória, ktorý vykonáva skúšku, tieto postupy by sa mali čiastočne opakova ť pri zmene personálu laboratória. 
34. Táto skúška spôsobilosti sa vykoná za rovnakých podmienok uvedených 
v odsekoch 38 až 40 expozíciou buniek 7 zvyšujúcim sa koncentráciám 
silných, stredných a slabých induktorov a inhibítorov a aj negatívnym chemikáliám (pozri tabu ľku 2). Medzi chemikálie, ktoré sa majú testova ť, 
patria najmä silný induktor forskolín ( č. CAS 66575-29-9); silný inhibítor 
prochloraz ( č. CAS 67747-09-5); stredný induktor atrazín ( č. CAS 1912-24- 
9); stredný inhibítor aminoglutetimid ( č. CAS 125-84-8); slabý induktor
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
(produkcia E2) a slabý inhibítor (produkcia T) bisfenol A ( č. CAS 80-05-7); 
a negatívna chemikália ľudský choriový gonadotropín (HCG) ( č. CAS 
9002-61-3), ako sa uvádza v tabu ľke 2. Pre všetky chemikálie sa použijú 
osobitné platni čky a použije sa formát uvedený v tabu ľke 6. Pri každom 
dennom testovaní chemikálií by sa mala na preukázanie spôsobilosti 
testovať aj jedna platni čka na kontrolu kvality (tabu ľka 4, odseky 36 a 37).  
Tabuľka 2 
Chemikálie na preukázanie spôsobilosti a expozi čné koncentrácie  
Chemikália na preukázanie 
spôsobilosti Testovacie koncentrácie [ μM] 
Prochloraz 0 (  a ); 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 
Forskolín 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazín 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Aminoglutetimid 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Bisfenol A 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
HCG 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100  
( a ) Kontrola (0) s aplikáciou rozpúš ťadla (DMSO), 1 μl DMSO/jamka  
Vystavenie H295R pôsobeniu chemikálií na preukázanie spôsobilosti by sa 
počas skúšky spôsobilosti laboratória malo vykonáva ť na 24-jamkových 
platničkách. Dávkovanie je v prípade všetkých dávok testovaných chemi ­
kálií v μM. Dávky by sa mali podáva ť v DMSO pri 0,1 % v/v na jamku. 
Všetky testovacie koncentrácie by sa mali testova ť v troch jamkách 
(tabuľka 6). Pre každú chemikáliu sa použijú osobitné platni čky. Pri 
každom dennom testovaní by sa mala použi ť aj jedna platni čka na kontrolu 
kvality. 
35. Životnos ť buniek a hormóny by sa mali analyzova ť podľa odsekov 42 až 
46. Prahová hodnota (najnižšia koncentrácia s pozorovaným ú činkom, 
LOEC) a rozhodnutie o klasifikácií by sa mali vykazova ť a porovnáva ť 
podľa hodnôt uvedených v tabu ľke 3. Údaje sa považujú za prijate ľné, 
keď spĺňajú LOEC a rozhodnutie o klasifikácií uvedené v tabu ľke 3.  
Tabuľka 3 
Prahové hodnoty (LOEC) a rozhodnutie o klasifikáciách pre chemikálie na preukázanie 
spôsobilosti  
č. CAS LOEC [μM] Rozhodnutie o klasifikácii 
T E2 T E2  
Prochloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (inhibícia) + (inhibícia) 
Forskolín 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0.1 + (indukcia) + (indukcia) 
Atrazín 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (indukcia) + (indukcia) 
Aminoglutetimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (inhibícia) + (inhibícia)  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
č. CAS LOEC [μM] Rozhodnutie o klasifikácii 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (inhibícia) + (indukcia) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a negatívne negatívne  
( a ) +, pozitívne 
n/a: neuplat ňuje sa, ke ďže sa nevyskytli žiadne zmeny po vystaveniu pôsobeniu necytotoxických koncen ­
trácií negatívnej kontrolnej vzorky.  
Platnička na kontrolu kvality  
36. Platni čka na kontrolu kvality sa používa na overenie správania sa buniek 
H295R v štandardných kultiva čných podmienkach a na zriadenie historickej 
databázy pre koncentrácie hormónov v kontrolách s aplikáciou rozpúš ťadla, 
v pozitívnych a negatívnych kontrolných vzorkách, ako aj v iných mera ­
niach na kontrolu kvality v priebehu času. 
— Správanie buniek H295R by sa malo posudzova ť s použitím platni čky 
na kontrolu kvality pre každú novú sériu ATCC alebo pri prvom použití 
predtým zmrazených zásob buniek, pokia ľ sa s touto sériou buniek 
nevykonala skúška spôsobilosti laboratória (odseky 32 až 34). 
— Platni čka na kontrolu kvality poskytuje úplné posúdenie podmienok 
skúšky (napr. životaschopnos ť buniek, kontrola s aplikáciou rozpúš ť­
adla, negatívne a pozitívne kontrolné vzorky, ako aj variabilita 
v rámci skúšky a medzi skúškami) pri testovaní chemikálií a mala by byť súčasťou každého testovania. 
37. Testovanie na kontrolu kvality sa vykonáva na 24-jamkovej platni čke 
s rovnakou inkubáciou, dávkovaním, životaschopnos ťou/cytotoxicitou 
buniek, postupmi extrakcie hormónov a analýzy hormónov, ako sú popísané 
v odsekoch 38 až 46 na testovanie chemikálií. Platni čka na kontrolu kvality 
obsahuje slepé vzorky, kontroly s aplikáciou rozpúš ťadla a dve koncentrácie 
známeho induktora (forskolín 1, 10 μM) a inhibítora (prochloraz, 0,1, 1 
μM) syntézy E2 a T. Okrem toho sa vo vybraných jamkách používa MeOH 
ako pozitívna kontrolná vzorka na skúšku životaschopnosti/cytotoxicity. Podrobný popis rozvrhnutia platni čky sa uvádza v tabu ľke 4. Kritériá, 
ktoré sa majú splni ť na platni čke na kontrolu kvality, sa uvádzajú 
v tabuľke 5. Minimálna základná produkcia hormónov pre T a E2 by 
mala byť dodržaná v jamkách na kontrolu s aplikáciou rozpúš ťadla a aj 
v jamkách so slepou vzorkou.
 
Tabuľka 4 
Rozvrhnutie platni čky na kontrolu kvality na vykonanie testovania nevystavených buniek 
H295R a buniek vystavených známym inhibítorom (PRO = prochloraz) a stimulátorom (FOR = forskolín) produkcie E2 a T. Po ukon čení skúšky expozície a odstránení média sa 
do všetkých jamiek MeOH pridá 70 % roztok metanolu, čo bude slúži ť ako pozitívna 
kontrolná vzorka cytotoxicity [pozri skúšku cytotoxicity v dodatku č. III k valida čnej 
správe (4)]
 
1 2 3 4 5 6  
A slepá 
vzorka (  a ) slepá 
vzorka (  a ) slepá 
vzorka (  a ) slepá 
vzorka (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) slepá 
vzorka (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) slepá vzorka (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Bunky v jamkách so slepou vzorkou dostanú len médium (t. j. žiadne rozpúš ťadlo). 
( b ) Metanol (MeOH) sa pridá  po ukončení expozície a odstránení média z týchto buniek. 
( c ) Kontrola s aplikáciou rozpúš ťadla DMSO (1 μl/jamka).  
Tabuľka 5 
Kritériá pre platni čku na kontrolu kvality  
T E2  
Základná produkcia 
hormónov pri kontrole s aplikáciou rozpúšťadla (SC) ≥ 5-krát limit 
kvantifikácie (LOQ) ≥ 2,5-krát LOQ 
Indukcia (10 μM forsko ­
lín) ≥ 1,5-krát SC ≥ 7,5-krát SC 
Inhibícia (1 μM prochlo ­
raz) ≥ 0,5-krát SC ≥ 0,5-krát SC
 
POSTUP EXPOZÍCIE CHEMIKÁLIÍ 
38. Predinkubované bunky sa vyberú z inkubátora (odsek 21) a pred dávko ­
vaním sa skontrolujú pod mikroskopom, či sú v dobrom stave (uchytenie, 
morfológia). 
39. Bunky sa umiestnia do biologicky bezpe čnej nádoby a obohatené médium 
sa odstráni a nahradí sa novým obohateným médiom (1 ml/jamka). Upred ­
nostňovaným rozpúš ťadlom pre túto testovaciu metódu je DMSO. Ak však 
existujú dôvody na použitie iných rozpúš ťadiel, malo by sa popísa ť vedecké 
zdôvodnenie. Bunky sa vystavia testovanej chemikálii pridaním 1 μl vhod­
ného zásobného roztoku do DMSO [pozri dodatok č. II k valida čnej správe 
(4)] na 1 ml obohateného média (objem jamky). To povedie ku kone čnej 
koncentrácii 0,1 % DMSO v jamkách. Na zabezpe čenie dostato čného 
pomiešania sa všeobecne odporú ča, aby sa vhodný zásobný roztok testo ­
vanej chemikálie v DMOS zmiešal na získanie želanej kone čnej koncen ­
trácie pre každú dávku s obohateným médiom a aby sa zmes pridala do každej jamky ihne ď po odstránení starého média. Ke ď sa použije táto 
možnosť, koncentrácia DMSO (0,1 %) by mala by ť vo všetkých jamkách 
konzistentná. Jamky obsahujúce dve najvä čšie koncentrácie sa vizuálne 
s použitím stereomikroskopu posúdia na tvorbu zrazenín alebo zakalenia, čo by poukazovalo na neúplnú rozpustnos ť testovanej chemikálie. Ke ď sa 
spozorujú takéto podmienky (zakalenos ť, tvorba zrazenín), preskúmajú sa 
jamky obsahujúce dve nasledujúce menšie koncentrácie (a tak ďalej), 
a koncentrácie, ktoré sa úplne nerozpustili, sa vylú čia z ďalšieho hodnotenia 
a analýzy. Platni čka sa na 48 hodín opä ť vloží do inkubátora pri teplote 
37 °C vo vzdušnej atmosfére s obsahom menej ako 5 % CO
 2 . Rozloženie 
platničky s testovanou chemikáliou sa uvádza v tabu ľke 6. Zásoby 1 až 7 
vykazujú umiestnenie zvyšujúcich sa dávok testovanej chemikálie.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabuľka 6 
Schéma dávkovania na vystavenie buniek H295R pôsobeniu testovaných chemikálií na 
24-jamkovej platni čke 
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO zásoba 4 zásoba 4 zásoba 4 
B zásoba 1 zásoba 1 zásoba 1 zásoba 5 zásoba 5 zásoba 5 C zásoba 2 zásoba 2 zásoba 2 zásoba 6 zásoba 6 zásoba 6 
D zásoba 3 zásoba 3 zásoba 3 zásoba 7 zásoba 7 zásoba 7 
40. Expozi čné platničky sa po 48 hodinách vyberú z inkubátora a každá jamka 
sa pod mikroskopom skontroluje na stav buniek (uchytenie, morfológia, 
stupeň konfluencie) a náznaky cytotoxicity. Médium sa z každej jamky 
rozdelí na dve rovnaké množstvá (každá časť približne 490 μl) a prenesie 
sa do dvoch samostatných nádobiek, ktoré sa príslušne ozna čia (t. j. jedna 
alikvotná časť na zabezpe čenie náhradnej vzorky pre každú jamku). Aby 
bunky nevyschli, médium sa odstra ňuje a nahrádza médiom na skúšku 
životaschopnosti/cytotoxicity buniek pod ľa jednotlivých radov alebo 
stĺpcov. Ke ď sa životaschopnos ť/cytotoxicita buniek nemeria ihne ď, do 
každej bunky sa pridá 200 μl fosfátovo tlmivého roztoku s Ca
 2+ a Mg  2+ . 
Média sa do ďalšieho spracovania na analýzu koncentrácií hormónov 
zmrazia pri teplote – 80 °C (pozri odseky 44 až 46). T a E2 v médiu udržiavanom v teplote – 80 °C sú všeobecne síce stabilné najmenej po 
dobu 3 mesiacov, v každom laboratóriu by sa však mala dokumentova ť 
stabilita hormónov po čas skladovania. 
41. Ihne ď po odstránení média sa ur čuje životaschopnos ť/cytotoxicita buniek 
pre každú expozi čnú platničku.
 
Určovanie životaschopnosti buniek  
42. Zvolená skúška životaschopnosti/cytotoxicity buniek sa môže použi ť na 
určenie potenciálneho vplyvu testovanej chemikálie na životaschopnos ť 
buniek. Skúška by mala by ť schopná poskytnú ť pravdivú mieru percentu ­
álneho podielu životaschopných buniek v jamke alebo by mala preukáza ť, 
že je priamo porovnate ľná (lineárna funkcia) so skúškou Live/Dead® [pozri 
dodatok č. III k valida čnej správe (4)]. Iná skúška, ktorá preukázate ľne 
funguje rovnako dobre, je test MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl 
tetrazolium bromid] (18). Posúdenie životaschopnosti buniek s použitím 
uvedených metód je relatívne meranie, ktoré nemusí preukáza ť lineárne 
vzťahy s absolútnym po čtom buniek v jamke. Preto by analytik mal vizu ­
álne subjektívne, paralelne posúdi ť každú jamku a mali by sa digitálne 
odfotografova ť kontroly s aplikáciou rozpúš ťadla a dve najvä čšie necytoto ­
xické koncentrácie, ktoré sa zaarchivujú na neskoršie posúdenie skuto čnej 
hustoty buniek, ak by to bolo potrebné. Ak by z vizuálneho preskúmania alebo zo skúšky životaschopnosti/cytotoxicity vyplynulo zdanlivé zvýšenie 
počtu buniek, musí sa toto zvýšenie overi ť. Keď sa zvýšenie buniek overí, 
malo by sa to uvies ť v protokole z testu. Životaschopnos ť buniek sa vyja ­
druje pomerne k priemernej reakcii v kontrolách s aplikáciou rozpúš ťadla, 
ktorá sa považuje za 100 % životaschopných buniek, a vypo čítava sa nále ­ 
žite pre použitú skúšku životaschopnosti/cytotoxicity buniek. V prípade 
skúšky MTT sa môže použi ť tento vzorec:
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% životaschopných buniek =  [reakcia v jamke – priemerná reakcia 
v jamkách s MeOH (= 100 % m ŕtvych)] ÷ [priemerná reakcia v jamkách 
SC – priemerná reakcia v jamkách s MeOH (= 100 % m ŕtvych)] 
43. Jamky so životaschopnos ťou nižšou ako 80 % v pomere k priemernej živo ­
taschopnosti v kontrolách s aplikáciou rozpúš ťadla (= 100 % životaschop ­
nosť) by sa nemali zahrnú ť do kone čnej analýzy údajov. Inhibícia steroi ­
dogenézy vyskytujúcej sa v prítomnosti takmer 20 % cytotoxicity by sa mala hodnoti ť opatrne, aby sa zabezpe čilo, že prí činou inhibície nie je 
cytotoxicita.
 
Analýza hormónov  
44. Každé laboratórium môže na analýzu T a E2 použi ť systém merania 
hormónov pod ľa vlastného výberu. Náhradné alikvotné časti média 
z každej pokusnej skupiny sa môžu použi ť na prípravu roztokov tak, aby 
sa koncentrácia dostala do lineárnej časti štandardnej krivky. Ako sa uvádza 
v odseku 29, každé laboratórium by malo pred vykonaním kontroly kvality alebo testovania chemikálií preukáza ť súlad svojho systému merania 
hormónov (napr. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kritériami kontroly 
kvality analýzou obohateného média s pridanou vnútornou kontrolnou vzorkou hormónov. Aby zložky testovacieho systému nenarúšali meranie hormónov, hormóny bude možno potrebné pred ich meraním extrahova ť 
z média (pozri odsek 30, v ktorom sa uvádzajú podmienky, za ktorých sa 
extrakcia vyžaduje alebo nevyžaduje). Odporú ča sa vykona ť extrakciu 
podľa postupov uvedených v dodatku č. III k valida čnej správe (4). 
45. Ak sa na meranie produkcie hormónov používa komer čná testovacia 
súprava, analýza hormónov by sa mala vykona ť podľa popisu 
v príručkách výrobcu testovacej súpravy. Vä čšina výrobcov má špecifický 
postup, akým sa vykonávajú analýzy hormónov. Riedenia vzoriek sa 
upravia tak, aby sa o čakávané koncentrácie hormónov kontrol 
s aplikáciou rozpúš ťadla pohybovali v strede lineárnej časti štandardnej 
krivky individuálnej skúšky [dodatok č. III k valida čnej správe (4)]. 
Hodnoty mimo lineárnej časti štandardnej krivky sa zavrhnú. 
46. Kone čné koncentrácie hormónov sa vypo čítavajú takto: 
Príklad: 
Extrahované: 450 μl média 
Rekonštituované v: 250 μl tlmivého roztoku 
Testovacie riedenie: 1:10 (aby bola vzorka v lineárnej časti 
štandardnej krivky) 
Testovacia koncentrácia hormó ­
nov: 150 pg/ml (už upravená na koncentráciu 
na ml testovanej vzorky) 
Výťažnosť: 89 % 
Konečná koncentrácia 
hormónov = [Koncentrácia hormónov (na ml) ÷ 
výťažnos
ť] (faktor riedenia) 
Konečná koncentrácia 
hormónov = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Výber testovacích koncentrácií  
47. Skúška by sa mala nezávisle vykona ť minimálne dvakrát. Pokia ľ 
z predchádzajúcich informácií, ako sú napríklad informácie o limitoch 
rozpustnosti alebo o cytotoxicite, nevyplýva základ na výber testovacích koncentrácií, odporú ča sa, aby testovacie koncentrácie pre prvé vykonanie 
skúšky boli v intervaloch log
 10 , pričom 10  –3 M je maximálna koncentrácia. 
Ak je chemikália rozpustná, nie je cytotoxická pri žiadnej z testovaných 
koncentrácií a prvý pokus bol negatívny pre všetky koncentrácie, potom sa to potvrdí ďalším vykonaním skúšky za tých istých podmienok, za akých sa 
vykonal prvý pokus (tabu ľka 7). Ak sú výsledky prvého pokusu nejednoz ­
načné (t. j. násobná zmena je štatisticky významná z kontroly s aplikáciou 
rozpúšťadla len v jednej koncentrácii) alebo pozitívna (t. j. násobná zmena 
v dvoch alebo viacerých hrani čiacich koncentráciách je štatisticky význam ­
ná), test by sa mal opakova ť, ako sa uvádza v tabu ľke 7, upravením zvole ­
ných testovacích koncentrácií. Testovacie koncentrácie v druhom a tre ťom 
(v náležitých prípadoch) pokuse by sa mali upravi ť na základe výsledkov 
koncentrácií z prvého pokusu, ktoré vyvolali ú činok s použitím intervalov 
koncentrácií v intervaloch 1/2-log (napr. ak výsledkom pôvodného pokusu 
s 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1 000 μM boli indukcie pri 1 a 10 μM, 
koncentrácie testované pri druhom pokuse by mali by ť 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 
30; 100 μM), pokia ľ sa nemusia použi ť nižšie koncentrácie na dosiahnutie 
LOEC. V druhom prípade by sa v druhom pokuse s použitím 1/2-log 
stupnice malo použi ť najmenej pä ť koncentrácií menších ako najnižšia 
koncentrácia testovaná v prvom pokuse. Ak sa v druhom pokuse nepotvrdí prvý pokus (t. j. nenastane štatistická významnos ť pri predtým pozitívne 
testovanej koncentrácii ± 1 zvýšenie koncentrácie), vykoná sa tretí pokus 
s použitím pôvodných testovacích podmienok. Nejednozna čné výsledky 
z prvého pokusu sa považujú za negatívne, ak v žiadnom z ďalších 
dvoch pokusov nie je možné potvrdi ť spozorovaný ú činok. Nejednozna čné 
výsledky sa považujú za pozitívne reakcie (ú činok), ke ď reakciu možno 
potvrdiť najmenej v jednom ďalšom pokuse so zvýšením koncentrácie 
± 1 (pozri oddiel 55 pre postup interpretácie údajov).
 
Tabuľka 7 
Rozhodovacia matica pre možné výsledné scenáre  
pokus 1 pokus 2 pokus 3 rozhodnutie 
scenár rozhodnutie scenár rozhodnutie scenár pozitívne negatívne  
negatívne potvrdené (  a ) negatívne ukon čenie X 
negatívne potvrdené (  a ) pozitívne upravi ť ( b ) negatívne X 
nejednozna čné (  c ) upravi ť ( b ) negatívne potvrdené (  a ) negatívne X 
nejednozna čné (  c ) upravi ť ( b ) negatívne potvrdené (  a ) pozitívne X 
nejednozna čné (  c ) upravi ť ( b ) pozitívne X 
pozitívne upravi ť ( b ) negatívne potvrdené (  a ) pozitívne X  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
pokus 1 pokus 2 pokus 3 rozhodnutie 
scenár rozhodnutie scenár rozhodnutie scenár pozitívne negatívne  
negatívne potvrdené (  a ) pozitívne upravi ť ( b ) pozitívne X 
pozitívne upravi ť ( b ) pozitívne ukon čenie X  
( a ) Potvrdenie predchádzajúceho pokusu s použitím rovnakých podmienok pokusu. 
( b ) Opätovné vykonanie skúšky v intervaloch koncentrácie 1/2-log (vymedzenie koncentrácie, ktorá v predchádzajúcom pokuse 
bola významne iná). 
( c ) Násobná zmena v jednej koncentrácii je štatisticky významne odlišná od kontroly s aplikáciou rozpúš ťadla. 
Kvalita kontroly testovacej platni čky 
48. Okrem splnenia kritérií pre platni čku na kontrolu kvality treba splni ť ďalšie 
kritériá kvality, ktoré sa týkajú prijate ľnej variability medzi replikovanými 
jamkami, opakovanými pokusmi, linearitou a citlivos ťou systémov merania 
hormónov, variabilitou medzi opakovanými meraniami hormónov rovnakej 
vzorky a percentom vý ťažnosti vrcholov hormónov po extrakcii média (v 
náležitých prípadoch; pozri odsek 30 pre požiadavky na extrakciu) a ktoré sa uvádzajú v tabu ľke 8. Údaje by sa mali pohybova ť v rámci prijate ľných 
rozsahov vymedzených pre každý parameter, ktorý sa posudzuje na ďalšie 
hodnotenie. Ak tieto kritériá nie sú splnené, v pracovnom hárku treba 
poznamena ť, že kritériá kontroly kvality neboli u predmetnej vzorky 
splnené, a vzorka by sa mala opä ť analyzova ť alebo vyradi ť zo súboru 
údajov.
 
Tabuľka 8 
Prijateľné rozsahy a/alebo variabilita (%) pre parametre testovacej platni čky skúšky 
H295R  
(LOQ: limit kvantifikácie systému merania hormónov. CV: varia čný koeficient; SC: kontrola 
s aplikáciou rozpúš ťadla; DPM: dezintegrácia za minútu)  
Porovnanie medzi T E2  
Základná produkcia 
hormónov v SC Násobne vä čšia ako LOQ ≥ 5-násobne ≥ 2,5-násobne 
Expozičné pokusy – CV 
v rámci platni čky pre SC 
(replikované jamky) Absolútne koncentrácie ≤ 30 % ≤ 30 % 
Expozičné pokusy – CV 
medzi platni čkami pre SC 
(opakované pokusy) Násobná zmena ≤ 30 % ≤ 30 % 
Systém merania hormónov 
– citlivos ť Zistiteľné násobné 
zníženie v pomere k SC ≥ 5-násobne ≥ 2,5-násobne 
Systém merania hormónov 
– CV opakovaného merania pre SC (
 a ) Absolútne koncentrácie ≤ 25 % ≤ 25 % 
Extrakcia média – 
výťažnosť vnútorného 
štandardu 3H (v náležitých 
prípadoch) DPM ≥ 65 % nominálne  
( a ) Vzťahuje sa na opakované merania rovnakej vzorky.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALÝZA ÚDAJOV A PODÁVANIE SPRÁV  
Analýza údajov  
49. Na hodnotenie relatívneho zvýšenia/zníženia chemicky zmenenej produkcie 
hormónov by sa výsledky mali normalizova ť na strednú hodnotu SC každej 
testovacej platni čky a výsledky by sa mali vyjadri ť ako zmeny v pomere 
k SC na každej testovacej platni čke. Všetky údaje sa vyjadria ako stredná 
hodnota ± 1 štandardná odchýlka (SD). 
50. Do analýzy údajov by sa mali za členiť len údaje o hormónoch z jamiek, 
v ktorých bola cytotoxicita menšia ako 20 %. Relatívne zmeny by sa mali 
vypočítavať takto:  
Relatívna zmena  = (koncentrácia hormónov v každej jamke) ÷ (stredná 
koncentrácia hormónov vo všetkých jamkách na kontrolu s aplikáciou 
rozpúšťadla). 
51. Ak by z vizuálneho preskúmania jamky alebo zo skúšky životaschopnosti/ 
cytotoxicity popísanej v odseku 42 vyplynulo zdanlivé zvýšenie po čtu 
buniek, musí sa toto zvýšenie overi ť. V prípade, že sa zvýšenie buniek 
overí, malo by sa to uvies ť v protokole z testu. 
52. Pred vykonaním štatistických analýz by sa mali posúdi ť predpoklady 
normality a homogénnosti odchýlok. Normalita by sa mala hodnoti ť 
pomocou štandardných diagramov pravdepodobnosti alebo inej vhodnej 
štatistickej metódy (napr. Shapirov-Wilkov test). Ak údaje (násobné zmeny) 
nie sú normálne distribuované, malo by sa usilova ť o transformáciu údajov 
na priblíženie sa normálnej distribúcii. Ak sú údaje normálne distribuované alebo sa blížia normálnej distribúcii, rozdiely medzi skupinami koncentrácií 
chemikálií a kontrolami s aplikáciou rozpúš ťadla by sa mali analyzova ť 
s použitím parametrického testu (napr. Dunnettov test), pri čom koncentrácia 
je nezávislá premenná a reakcia (násobná zmena) je závislá premenná. Ak 
údaje nie sú normálne distribuované, mal by sa použi ť vhodný neparame ­
trický test (napr. Kruskalov Wallisov test, test Steela Many-one rank). Rozdiely sa považujú za významné, ak je p ≤ 0,05. Štatistické vyhodnotenia 
sa vykonávajú na základe priemerných hodnôt pre každú jamku, ktoré 
predstavujú nezávislé opakované dátové body. Predpokladá sa, že pre 
veľké odstupy medzi dávkami v prvom pokuse (stupnica log
 10 ) nebude 
v mnohých prípadoch možné popísa ť jasné vz ťahy medzi koncentráciou 
a reakciou, ke ď najväčšie dve dávky budú v lineárnej časti esovitej krivky. 
Preto sa v prípade prvého pokusu alebo iných súborov údajov, kde sa 
vyskytuje tento stav (napr. ke ď nemožno odhadnú ť maximálnu ú činnosť), 
použije štatistika pevnej premennej typu I, ako sa už opísalo. 
53. Ak v lineárnej časti krivky ležia viac ako dva dátové body a ke ď možno 
vypočítať maximálne ú činnosti – ako sa predpokladá pre niektoré z druhých 
pokusov, ktoré sa vykonali s použitím polologaritmických rozostupov 
medzi expozi čnými koncentráciami –, mal by sa na výpo čet účinných 
koncentrácií (napr. EC50 a EC20) použi ť probitový, logitový alebo iný 
vhodný regresný model. 
54. Výsledky by sa mali uvies ť graficky (st ĺpcové grafy predstavujúce strednú 
hodnotu ± 1 SD) a v tabu ľkovom formáte (LOEC/NOEC, smer ú činku 
a sila maximálnej reakcie, ktorá je sú časťou časti údajov o vz ťahu medzi 
dávkou a reakciou) (pozri ako príklad obrázok č. 3) Posúdenie údajov sa 
považuje za platné, len ak bolo založené na najmenej dvoch nezávisle 
vykonaných pokusoch. Pokus sa považuje za nezávislý, ak sa vykonal v iný deň s použitím nového súboru roztokov a kontrol. Rozpätie koncen ­
trácií použitých v druhých a tretích pokusoch (ak boli potrebné) sa môže 
prispôsobi ť na základe výsledkov prvého pokusu, aby bol lepšie vymedzený 
rozsah pre vz ťah medzi dávkou a reakciou s LOEC (pozri odsek 47).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Obrázok č. 3 
Príklad prezentácie a hodnotenia údajov získaných po čas vykonania skúšky H295R v grafickom 
a tabuľkovom formáte.  
Hviezdičky označujú štatisticky významné rozdiely v porovnaní s kontrolou s aplikáciou rozpúš ťadla 
(p< 0,05 ). LOEC: najnižšia koncentrácia s pozorovaným ú činkom; maximálna zmena: maximálna sila 
reakcie pozorovanej pri akejko ľvek koncentrácii v pomere k priemernej reakcii SC (= 1)
  
Chemikália LOEC Maximálna zmena  
Forskolín 0,01 0,15-násobná 
Letrozol 0,001 29-násobná  
Postup interpretácie údajov  
55. Testovaná chemikália sa považuje za pozitívnu, ak je násobná indukcia 
štatisticky odlišná (p ≤ 0,05) od kontroly s aplikáciou rozpúš ťadla pri 
dvoch hrani čiacich koncentráciách v najmenej dvoch nezávislých pokusoch 
(tabuľka č. 7). Testovaná chemikália sa považuje za negatívnu po dvoch 
nezávislých negatívnych pokusoch alebo po troch pokusoch, z ktorých sú 
dva negatívne a jeden nejednozna čný alebo pozitívny. Ak údaje z troch 
nezávislých pokusov nesp ĺňajú rozhodovacie kritériá uvedené v tabu ľke 
7, výsledky pokusov nemožno interpretova ť. Výsledky dosiahnuté pri 
koncentráciách, ktoré presahujú limity rozpustnosti, alebo pri cytotoxických 
koncentráciách by sa nemali za členiť do interpretácie výsledkov.  
Správa z testu  
56. Správa z testu by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testovacie zariadenie  
— názov zariadenia a jeho sídlo; 
— riadite ľ štúdie a ostatní zamestnanci a ich úlohy v štúdii; 
— dátumy za čiatku a konca štúdie;  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Testovaná chemikália, reagenty a kontrolné vzorky  
— totožnos ť (názov alebo č. CAS), zdroj, číslo dávky/série, čistota, dodá ­
vateľ a charakterizácia testovanej chemikálie, reagentov a kontrolných 
vzoriek; 
— fyzická povaha a náležité fyzikálnochemické vlastnosti testovanej 
chemikálie; 
— podmienky skladovania a metóda a frekvencia prípravy testovaných 
chemikálií, reagentov a kontrolných vzoriek; 
— stabilita testovanej chemikálie;  
Bunky  
— zdroj a typ buniek; 
— počet pasáží (identifikátor bunkovej pasáže) buniek použitých v teste; 
— popis postupov na udržanie bunkových kultúr;  
Požiadavky pred testom (ak sa uplat ňuje) 
— popis a výsledky testu interferencie chemikálie so skúškou hormónov; 
— popis a výsledky meraní ú činnosti extrakcie hormónov; 
— štandardná a kalibra čná krivka pre všetky analytické skúšky, ktoré sa 
majú vykona ť; 
— detekčné limity pre zvolené analytické skúšky;  
Podmienky testu  
— zloženie médií; 
— koncentrácia testovanej chemikálie; — hustota buniek (odhadovaná alebo meraná koncentrácia buniek po 24 
a 48 hodinách); 
— rozpustnos ť testovanej chemikálie (hranica rozpustnosti, ak je stanove ­
ná); 
— inkuba čná doba a podmienky;
 
Výsledky testu  
— základné údaje pre každú jamku pre kontrolné vzorky a testované 
chemikálie – každé opakované meranie vo forme pôvodných údajov 
z nástroja použitého na meranie produkcie hormónov (napr. OD, fluo ­
rescenčné jednotky, DPM at ď.); 
— validácia normality alebo vysvetlenie transformácie údajov; — stredné hodnoty reakcií ± 1 SD pre každú meranú jamku; — údaje o cytotoxicite (testovacie koncentrácie, ktoré spôsobili cytotoxici ­
tu); 
— potvrdenie, že boli splnené požiadavky na kontrolu kvality;
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— relatívna zmena v porovnaní s kontrolou s aplikáciou rozpúš ťadla upra ­
vená o cytotoxicitu; 
— stĺpcový graf znázor ňujúci relatívnu (násobnú) zmenu v jednotlivých 
koncentráciách, SD a štatistickú významnos ť podľa odsekov 49 až 54;  
Interpretácia údajov  
— uplatnenie postupu interpretácie údajov na výsledky a diskusia 
o zisteniach;  
Diskusia  
— Vyplývajú zo štúdie nejaké náznaky týkajúce sa možnosti, že údaje 
o T/E2 by mohli by ť ovplyvnené nepriamymi ú činkami na dráhy gluko ­
kortikoidov a mineralokortikoidov?  
Záver  
LITERATÚRA  
1. OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Asse ­
ssment of Endocrine Disrupting Chemicals, v dodatku 2 ku kapitole B.54 
v tejto prílohe. 
2. Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone 
production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114 - 124. 
3. Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23 - 30. 
4. OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paríž. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/30/ 
0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html]. 
5. OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paríž. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/ 30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html]. 
6. Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Dostupné na: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf]. 
7. Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78 - 89. 
8. Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44 - 54. 
9. Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265 - 272.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
10. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137 - 1148. 
11. Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488 - 5496. 
12. He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578 - 584. 
13. Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777 - 2785. 
14. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137 - 1148. 
15. Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731 - 737. 
16. Chapter B.55 of this Annex: Hershberger Bioassay in Rats: A short-term 
Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties. 
17. Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222 - 231. 
18. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55 - 63. 
19. Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598 - 1606. 
20. Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484 - 
492.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Dodatok  
VYMEDZENIA POJMOV  
Konfluencia  označuje prekrytie alebo proliferáciu, ktoré sú bunkám umožnené 
cez kultiva čné médium alebo v kultiva čnom médiu.  
Chemikália  je látka alebo zmes.  
CV označuje variačný koeficient, ktorý sa vymedzuje ako pomer štandardnej 
odchýlky distribúcie k jej aritmetickej strednej hodnote.  
CYP  označuje cytochróm P450 monooxygenázy, čo je skupina génov a enzýmov 
z nich produkovaných, ktoré katalyzujú širokú škálu biochemických reakcií 
vrátane syntézy a metabolizmu steroidných hormónov.  
DPM  je dezintegrácia za minútu. Je to po čet atómov v danom množstve rádi ­
oaktívneho materiálu, o ktorom sa zistilo, že sa rozložil za jednu minútu.  
E2 je 17β-estradiol, čo je najdôležitejší estrogén v cicav čích systémoch. 
Bunky  H295R  sú bunky ľudského adrenokarcinómu, ktoré majú fyziologické 
charakteristiky buniek zonálne nediferencovaných ľudských fetálnych nadobli ­ 
čiek a ktoré exprimujú všetky enzýmy steroidogenézy. Dostupné sú z ATCC.  
Mraziace médium  sa používa na zmrazenie a uskladnenie zmrazených buniek. 
Tvorí ho zásobné médium plus BD NuSerum a dimetylsulfoxid.  
Lineárna časť je časť štandardnej krivky pre systém merania hormónov, kde sú 
výsledky úmerné koncentrácii analytu prítomného vo vzorke.  
LOQ  je limit kvantifikácie a ozna čuje najnižšie množstvo chemikálie, pri ktorom 
možno v rámci stanovenej hranice spo ľahlivosti rozpozna ť rozdiel od absencie 
tejto chemikálie (prázdna hodnota). Na ú čely tejto metódy LOQ zvy čajne vyme ­
dzuje výrobca testovacích systémov, ak sa neustanovuje inak.  
LOEC  je najnižšia koncentrácia s pozorovaným ú činkom, pri ktorej je reakcia 
kúšky štatisticky odlišná od reakcie skúšky pri kontrole s aplikáciou rozpúš ťadla.  
NOEC  je koncentrácia bez pozorovaného ú činku, čo je najvyššia testovaná 
koncentrácia, ke ď zo skúšky nevyplýva pozitívna reakcia.  
Pasáž  je počet delení buniek po aktivácii kultúry zo zmrazenej zásoby. Prvej 
pasáži, ktorá sa za čala zo zmrazených zásob, sa priradí číslo jedna (1). Bunky, 
ktoré sa oddelili jedenkrát, sa ozna čia pasáž 2 at ď. 
PBS je Dulbeccov fosfátovo tlmivý fyziologický roztok.  
Kontrola kvality  označuje merania potrebné na zaru čenie platných údajov.  
Platnička na kontrolu kvality  je 24-jamková platni čka, ktorá obsahuje dve 
koncentrácie pozitívnych a negatívnych kontrolných vzoriek na sledovanie sprá ­
vania novej dávky buniek alebo na zabezpe čenie pozitívnych kontrolných vzoriek 
pre skúšku pri testovaní chemikálií.  
Pokus  je nezávislý pokus charakterizovaný novým súborom roztokov 
a kontrolných vzoriek.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Zásobné médium  je základ na prípravu ostatných reagentov. Tvorí ho 1:1 zmes 
Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média a Hamovej zmesi živín F-12 
(DMEM/F12) v 15 mM HEPES tlmivom roztoku bez fenolovej červene 
a hydrogénuhli čitanu sodného. Hydrogénuhli čitan sodný sa pridáva ako tlmivý 
roztok, pozri dodatok č. II k valida čnej správe (4).  
Obohatené médium  tvorí zásobné médium plus BD NuSerum a zmes ITS+ 
premium, pozri dodatok č. II k valida čnej správe (4).  
Steroidogenéza  je syntetická dráha, ktorá vedie od cholesterolu k rôznym stero ­
idným hormónom. Niektoré prostredné hormóny v syntéze steroidov, ako napríklad progesterón a testosterón, sú samé osebe dôležité hormóny, ale slúžia aj ako prekurzory hormónov v ďalšej časti syntetickej dráhy.  
T označuje testosterón, jeden z dvoch najdôležitejších androgénov v cicav čích 
systémoch.  
Testovaná chemikália  je akáko ľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  
Testovacia platni čka je platnička, na ktorej sa bunky H295R vystavia pôsobeniu 
testovaných chemikálií. Testovacie platni čky obsahujú kontrolu s aplikáciou 
rozpúšťadla a testovanú chemikáliu trojmo v siedmich koncentráciách.  
Trypsín 1X  je zriedený roztok enzýmu trypsín, čo je pankreatická serínová 
proteáza a používa sa na uvo ľnenie buniek z platni čky na kultiváciu buniek, 
pozri dodatok č. III k valida čnej správe (4).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  TRANSGÉNNA SKÚŠKA GÉNOVEJ MUTÁCIE NA 
SOMATICKÝCH BUNKÁCH HLODAVCOV A SKÚŠKA 
GÉNOVEJ MUTÁCIE NA ZÁRODO ČNÝCH BUNKÁCH  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie 
testov (TG) 488 (2013). Testovacie metódy EÚ sú dostupné pre široký okruh skúšok mutácie in vitro, ktorými možno odhali ť chromozomálne 
a/alebo génové mutácie. Existujú testovacie metódy pre sledované para ­
metre in vivo (t. j. chromozomálne aberácie a neplánovaná syntéza DNA), pomocou nich však nie je možné mera ť génové mutácie.Transgénne 
skúšky mutácie na bunkách hlodavcov (Transgenic Rodent – TGR) uspo ­
kojujú potreby praktických a všeobecne dostupných testov génových 
mutácií in vivo. 
2. Skúšky mutácie TGR sa zna čne revidovali (24) (33). Využívajú sa pri nich 
transgénne potkany a myši, ktoré obsahujú viaceré kópie chromozálne inte ­
grovaných plazmidových alebo fágových dvojfunk čných vektorov (shuttle 
vektory). Prenesené gény obsahujú reportérové gény na detekciu rôznych typov mutácií vyvolaných testovanými chemikáliami in vivo. 
3. Mutácie vyskytujúce sa v hlodavcoch sa hodnotia získaním preneseného 
génu a analýzou fenotypu reportérového génu v bakteriálnom hostite ľovi, 
ktorému chýba reportérový gén. Skúškami génovej mutácie TGR sa merajú mutácie spôsobené v geneticky neutrálnych génoch získaných prakticky z akéhoko ľvek tkaniva hlodavca. Tieto skúšky preto obchádzajú mnohé 
z existujúcich limitácií spojených so štúdiou in vivo génovej mutácie 
v endogénnych génoch (napr. obmedzené tkanivá vhodné na analýzu, nega ­
tívna/pozitívna selekcia vo vz ťahu k mutáciám). 
4. Z váhy dôkazov vyplýva, že prenesené gény reagujú na mutagénny 
podobne ako endogénne gény, najmä pokia ľ ide o detekciu bázových 
zámen, mutácií spôsobujúcich posun čítacieho rámca a malé delécie 
a včlenenia (24). 
5. Na medzinárodných seminároch o testovaní genotoxicity (IWGT) sa 
podporilo za členenie skúšok génových mutácií TGR na zis ťovanie géno ­
vých mutácií in vivo a odporu čil sa protokol na ich vykonávanie (15) (29). 
Táto testovacia metóda je založená na týchto odporú čaniach. Ďalšie analýzy 
podporujúce používanie tohto protokolu možno nájs ť v (16). 
6. Predpokladá sa, že v budúcnosti bude možné skombinova ť skúšku génovej 
mutácie TGR so štúdiou toxicity po opakovanej dávke (kapitola B.7 tejto 
prílohy). Sú však potrebné údaje na uistenia sa, či citlivosť skúšky génovej 
mutácie TGR nebola ovplyvnená kratším jednod ňovým časovým úsekom 
od konca doby podávania do času odberu vzoriek, ktorý sa používa v štúdii 
toxicity po opakovanej dávke, v porovnaní s 3 d ňami používanými 
v skúškach génovej mutácie TGR. Tiež sú potrebné údaje na preukázanie, že výsledky skúšky po opakovanej dávke nie sú nepriaznivo ovplyvnené použitím transgénnych kme ňov hlodavcov namiesto použitia 
tradičných kme ňov hlodavcov. Ke ď budú tieto údaje dostupné, táto testo ­
vacia metóda sa upraví. 
7. Vymedzenia základných pojmov sa uvádza v dodatku.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
ÚVODNÉ ÚVAHY 
8. Skúšky génovej mutácie TGR, pre ktoré sú dostupné dostato čné údaje na 
podporu ich využitia v tejto testovacej metóde, sú: lacZ bakteriofágové myši 
(Muta™Mouse); lacZ plazmidové myši; gpt delta (gpt a Spi  – ) myši 
a potkany; lacI myši a potkany (Big Blue®), vykonávané za štandardných podmienok. Ďalej sa môže na hodnotenie mutácií v modeloch Big BlueÒ 
a MutaäMouse použi ť skúška pozitívnej selekcie cII. Mutagenéza 
v modeloch TGR sa normálne posudzuje ako frekvencia mutácií, ak sa však požaduje, môže molekulárna analýza mutácií poskytnú ť ďalšie infor ­
mácie (pozri odsek 24). 
9. Tieto testy in vivo génovej mutácie na hlodavcoch sú osobitne významné na 
posudzovanie mutagénneho rizika, ke ďže reakcie skúšok závisia od meta ­
bolizmu in vivo, farmakokinetiky, procesu obnovy DNA a translézie syntézy DNA, hoci tie sa môžu líši ť medzi jednotlivými druhmi, tkanivami 
a typmi poškodenia DNA. Skúška in vivo génových mutácií je užito čná na 
ďalšie skúmanie mutagénneho ú činku zisteného systémom in vitro a na 
sledovanie výsledkov testov s použitím iných sledovaných parametrov in vivo (24). Okrem toho, že génová mutácia je kauzálne spojená s indukciou rakoviny, je relevantným sledovaným parametrom na predikciu nerakovino ­
vých chorôb založených na mutáciách v somatických tkanivách (12) (13), 
ako aj chorôb prenášaných zárodo čnou líniou. 
10. Ak existujú dôkazy, že testovaná chemikália alebo relevantný metabolit 
nedosiahne žiadne príslušné tkanivo, nie je vhodné vykona ť skúšku génovej 
mutácie TGR.
 
PRINCÍP TESTU 
11. V skúškach popísaných v odseku 8 má cie ľový gén bakteriálny alebo 
bakteriofágový pôvod a na získanie z genómovej DNA hlodavcov sa prene ­
sený gén za člení do λ bakteriofágového alebo plazmidového dvojfunk čného 
vektora. Postup zah ŕňa extrakciu genómovej DNA z príslušného tkaniva 
hlodavca, spracovanie genómovej DNA in vitro (t. j. spájanie λ vektorov 
alebo ligácia a elektroporácia plazmidov na získanie dvojfunk čného 
vektora) a následné zis ťovanie mutácií v bakteriálnych hostite ľoch vo vhod ­
ných podmienkach. V skúške sa využívajú neutrálne prenesené gény, ktoré 
možno jednoducho získa ť z väčšiny tkanív. 
12. Základný pokus génovej mutácie TGR zah ŕňa podávanie chemikálie 
hlodavcom po čas určitého obdobia. Chemikálie možno podáva ť akýmkoľvek 
vhodným spôsobom, a to aj vrátane implantácie (napr. testovanie s lekárskym prístrojom). Celkové obdobie, po čas ktorého sa zviera ťu dávajú dávky sa 
nazýva doba podávania. Po podávaní zvy čajne nasleduje pred usmrtením 
časové obdobie, po čas ktorého sa chemikália nepodáva a po čas ktorého sa 
neobnovené lézie DNA fixujú do stabilných mutácií. V literatúre sa toto obdobie rôzne nazýva aj ako čas prejavov, čas fixácie alebo čas expresie; 
koniec tohto obdobia je čas odberu vzoriek (15) (29). Po usmrtení zviera ťa sa 
genómová DNA izoluje z príslušného tkaniva a pre čistí sa.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Údaje z jedného tkaniva z jedného zviera ťa z viacerých spojení/ligácií sa 
zvyčajne agregujú a všeobecne sa hodnotí frekvencia mutácií s použitím 
súčtu od 10  5 do 10  7 jednotiek tvoriacich plaky alebo jednotiek tvoriacich 
kolónie. Ke ď sa používajú metódy pozitívnej selekcie, celkový po čet jedno­
tiek tvoriacich plaky sa ur čí s osobitným súborom neselektívnych platni čiek. 
14. Metódy pozitívnej selekcie sa vypracovali na u ľahčenie zisťovania mutácií 
v gpt géne [gpt delta myši a potkany, gpt  – fenotyp (20) (22) (28)] a lacZ 
géne [Muta™Mouse alebo lacZ plazmidové myši (3) (10) (11) (30)]; 
pričom génové mutácie lacI vo zvieratách Big Blue® sa zis ťujú pomocou 
neselektívnej metódy, ktorou sa identifikujú mutácie prostredníctvom tvorby sfarbených (modrých) plakov. Metodológia pozitívnej selekcie funguje aj na určenie bodových mutácií vznikajúcich v cII géne λ bakteriofágového dvoj ­
funkčného vektora [Big Blue® myši alebo potkany, a Muta™Mouse (17)] 
a delečných mutácií v λ červených a gam génoch [Spi
 – selekcia v gpt delta 
myšiach a potkanoch (21) (22) (28)]. Frekvencia mutácií sa vypo čítava 
vydelením po čtu plakov/plazmidov obsahujúcich mutácie v prenesenom 
géne celkovým po čtom plakov/plazmidov získaných z tej istej vzorky 
DNA. V štúdiách génovej mutácie TGR je frekvencia mutácií vykazovaným parametrom. Frekvencia mutácií sa ďalej môže ur čiť ako podiel buniek 
s nezávislými mutáciami; tento výpo čet si vyžaduje úpravu klonovej 
expanzie sekvenciou zotavených mutantov (24). 
15. Mutácie hodnotené v skúškach lacI, lacZ, cII a bodovej mutácie gpt pozo ­
stávajú hlavne z mutácií bázovej zámeny, mutácií posúvajúcich čítací rámec 
a z malých v členení/delécií. Relatívny podiel týchto typov mutácií 
v spontánnych mutáciách je podobný ako ich relatívny podiel v endogénnom géne Hprt. Ve ľké delécie sa zis ťujú výhradne so skúškami 
selekcie Spi
 – a plazmidov lacZ (24). Zaujímavé mutácie sú mutácie in 
vivo, ktoré vznikajú v myšiach alebo potkanoch. Mutácie in vitro a ex 
vivo, ktoré môžu vzniknú ť počas získania, replikácie alebo opravy fágu/ 
plazmidu sú pomerne zriedkavé a v niektorých systémoch ich možno špeci ­
ficky identifikova ť alebo vylú čiť pomocou systému bakteriálneho hostite ľa/ 
pozitívnej selekcie.  
OPIS METÓDY  
Príprava  
Výber druhov zvierat  
16. V sú časnosti sú dostupné rôzne modely zis ťovania génovej mutácie trans ­
génnych myší a tieto systémy sa používajú viac ako modely využívajúce 
transgénne potkany. Ak je potkan jednozna čne vhodnejším modelom ako 
myš (napr. pri skúmaní mechanizmu karcinogenézy tumoru zisteného len u potkanov, na koreláciu so štúdiou toxicity na potkanoch, alebo ke ď je 
známe, že metabolizmus potkanov lepšie znázor ňuje ľudský metabolizmus), 
malo by sa zváži ť použitie modelov využívajúcich transgénne potkany.
 
Podmienky umiestnenia a k ŕmenia  
17. Teplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by ideálne mala by ť 22 °C (± 
3 °C). Aj ke ď relatívna vlhkos ť by mala by ť aspoň 30 % a pokia ľ možno 
nemala by prevyšova ť 70 % okrem času čistenia miestnosti, cie ľom je 
udržať relatívnu vlhkos ť v rozmedzí 50 – 60 %. Osvetlenie by malo by ť 
umelé, denne by sa malo strieda ť 12 hodín svetla s 12 hodinami tmy. Na  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
kŕmenie sa môže používa ť bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou 
dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže by ť ovplyvnený potrebou zabez ­
pečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, ke ď sa podáva týmto spôso ­
bom. Zvieratá by mali by ť umiestnené v malých skupinách (najviac pä ť) 
rovnakého pohlavia, pokia ľ sa nepredpokladá agresívne správanie. Ak to je 
vedecky opodstatnené, zvieratá môžu by ť umiestnené samostatne.  
Príprava zvierat  
18. Zdravé mladé, pohlavne dospelé zvieratá (staré 8 až 12 týžd ňov na začiatku 
pokusu) sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Zvieratá 
sa jedine čneoznačia. Zvieratá sa aklimatizujú na laboratórne podmienky 
najmenej pä ť dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali 
prípadné vplyvy vyplývajúce z umiestnenia klietok. Na za čiatku štúdie by 
mala byť hmotnostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnu ť 
± 20 % strednej hmotnosti každého pohlavia.  
Príprava dávok  
19. Pevné testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali 
rozpustiť alebo suspendova ť vo vhodných rozpúš ťadlách alebo nosi čoch 
alebo primieša ť do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemi ­
kálie sa podávajú priamo alebo rozriedené pred podávaním. V prípade inhalačných expozícií sa testované chemikálie môžu v závislosti od svojich 
fyzikálnochemických vlastností podáva ť ako plyn, výpary alebo tuhé/kva ­
palné aerosóly. Používajú sa čerstvé prípravky testovanej chemikálie, pokia ľ 
údaje o stabilite nepoukazujú na vhodnos ť uskladnenia.
 
Podmienky skúšky  
Rozpúšťadlo/nosič 
20. Rozpúš ťadlo/nosič by nemali vyvoláva ť toxické ú činky v používaných 
objemoch dávok a nemali by chemicky reagova ť s testovanou chemikáliou. 
Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúš ťadlá/nosiče, ich použitie by 
malo byť podporené referen čnými údajmi, ktoré poukazujú na ich kompa ­
tibilitu. Vždy, ke ď to je možné, odporú ča sa zváži ť použitie najprv vodného 
rozpúšťadla/nosiča. 
Pozitívne kontrolné vzorky  
21. Oby čajne by sa mali používa ť zvieratá na paralelnú pozitívnu kontrolu. 
V prípade laboratórií, ktoré preukázali spôsobilos ť (pozri odsek 23) 
a bežne používajú tieto skúšky, sa však na potvrdenie úspechu metódy môžu do každej štúdie za členiť DNA z pokusných zvierat 
z predchádzajúcich pozitívnych kontrol. Tieto DNA z predchádzajúcich 
pokusov by mali by ť získané z rovnakých druhov a príslušných tkanív 
a mali by by ť vhodne uskladnené (pozri odsek 36). Ke ď sa používajú 
paralelné pozitívne kontrolné vzorky, nie je potrebné podáva ť ich rovnakým 
spôsobom ako testovanú chemikáliu; o pozitívnych kontrolných vzorkách 
by však malo by ť známe, že spôsobujú mutácie v jednom tkanive alebo vo 
viacerých tkanivách, ktoré sú relevantné pre testovanú chemikáliu. Dávky pozitívnych kontrolných chemikálií by sa mali zvoli ť tak, aby spôsobovali 
slabé alebo mierne ú činky, ktoré kriticky stanovujú výsledky a citlivos ť 
skúšky. Príklad pozitívnych kontrolných chemikálií a niektorých ich cie ľo­
vých tkanív sa uvádzajú v tabu ľke 1.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabuľka 1 
Príklady pozitívnych kontrolných chemikálií a niektorých ich cie ľových tkanív  
Pozitívna kontrolná chemi ­
kália a č. CAS Názov Einecs a č. Einecs Charakteristika Cieľové tkanivo mutácie 
potkan myš  
N-etyl-N-nitrozmo čovina 
(č. CAS 759-73-9) N-etyl-N-nitrozmo čovina 
(212-072-2) priamo pôsobiaci 
mutagén pečeň, pľúca kostná dre ň, hrubé 
črevo, epitel 
hrubého čreva, 
tenké črevo, pečeň, 
pľúca, slezina, 
obličky, vaječníkové 
folikulárne bunky, 
samčie zárodo čné 
bunky 
etylkarbamát (uretán) 
(č. CAS 51-79-6) uretán 
(200-123-1) mutagén, vyžaduje 
metabolizmus alebo spôsobuje len slabé ú činky. kostná dre ň, pred­ 
žalúdok, tenké črevo, pečeň, pľúca, 
slezina 
2,4-diaminotoluén 
(č. CAS 95-80-7) 4-metyl-m-fenylén ­
diamín 
(202-453-1) mutagén, vyžaduje 
metabolizmus, 
pozitívny aj v skúške Spi
 - pečeň pe čeň 
benzo[a]pyrén 
(č. CAS 50-32-8) benzo[def]chryzén 
(200-028-5) mutagén, vyžaduje 
metabolizmus pečeň, 
omentum kostná dre ň, prsia, 
hrubé črevo, pred ­ 
žalúdok, ž ľaznatý 
žalúdok, srdce, 
pečeň, pľúca, samčie 
zárodočné bunky  
Negatívne kontrolné vzorky  
22. Pre každý čas odberu vzoriek by sa mali za členiť negatívne kontrolné 
vzorky ošetrované len s rozpúš ťadlom alebo nosi čom, s ktorými sa inak 
zaobchádza rovnako ako s pokusnými skupinami. Ak neexistujú historické 
alebo zverejnené kontrolné údaje, ktoré by preukazovali, že zvolené 
rozpúšťadlo/nosič nespôsobujú žiadne zhubné ani mutagénne ú činky, neoše ­
trované kontrolné vzorky by sa mali zaradi ť aj pre každý čas odberu 
vzoriek na stanovenie prijate ľnosti kontrolnej skupiny, ktorej bol podaný 
nosič. 
Overenie spôsobilosti laboratória  
23. Spôsobilos ť v týchto skúškach by sa mala ur čiť preukázaním schopnosti 
reprodukova ť predpokladané výsledky zo zverejnených údajov (24) pre: 1) 
frekvencie mutácií s pozitívnymi kontrolnými chemikáliami (vrátane slabých reakcií), ako sa napríklad uvádzajú v tabu ľke 1, 
s nemutagénnymi kontrolami a kontrolami s podávaním nosi ča; a 2) 
získanie preneseného génu z genómovej DNA (napr. ú činnosť spájania).
 
Sekvenovanie mutácií  
24. Pokia ľ ide o uplat ňovanie noriem, sekvenovanie DNA mutácií sa nevyža ­
duje, najmä v prípadoch, ke ď sa získa jasný pozitívny alebo negatívny 
výsledok. Údaje o sekvenovaní však môžu by ť užitočné v prípade spozo ­
rovania vysokej variácie medzi jednotlivcami. V takýchto prípadoch sa 
sekvenovanie môže použi ť na vylúčenie možnosti výnimo čných (jackpots) 
alebo klonových udalostí identifikáciou podielu jedine čných mutácií 
z konkrétneho tkaniva. Sekvenovanie približne 10 mutácií na jedno tkanivo 
na jedno zviera by malo posta čovať na jednoduché ur čenie, či klonové 
mutácie zvyšujú frekvenciu mutácií; sekvenovanie až 25 mutácií môže  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
byť potrebné na matematickú korekciu frekvencie mutácií o klonalitu. 
Sekvenovanie mutácií sa môže zváži ť aj v prípade zistenia malých zvýšení 
frekvencie mutácií (t. j. ktoré len presahujú hodnoty neošetrovanej kontrolnej skupiny). Rozdiely v spektre mutácií medzi kolóniami mutácií a pokusnými a kontrolnými zvieratami môžu potvrdi ť mutagénny ú činok 
(29). Muta čné spektrá môžu by ť užitočné aj na vývoj mechanistických 
hypotéz. Ke ď sa má sekvenovanie za členiť ako súčasť protokolu z testu, 
musí sa osobitne dba ť na plán týchto štúdií, najmä pokia ľ ide o po čet 
sekvenovaných mutácií na vzorku, aby sa dosiahla dostato čná výpovedná 
hodnota pod ľa použitého štatistického modelu (pozri odsek 43).
 
POSTUP  
Počet zvierat a ich pohlavie  
25. Počet zvierat v skupine by sa mal vopred ur čiť tak, aby bol dostato čne 
štatisticky významný na zistenie aspo ň zdvojenia vo frekvencii mutácií. 
Skupiny by mali pozostáva ť najmenej z piatich zvierat, ak je však štatis ­
tická výpovedná hodnota nedostato čná, počet zvierat by sa mal príslušne 
zvýšiť. Bežne by sa mali používa ť samce. Môžu sa vyskytnú ť prípady, ke ď 
je opodstatnené testovanie len sami čiek, napríklad pri testovaní liekov ur če­
ných pre ženy alebo pri skúmaní ženského/sami čieho metabolizmu. Ak 
existujú medzi pohlaviami významné rozdiely, pokia ľ ide o toxicitu alebo 
metabolizmus, potrebné sú samce a aj samice.  
Obdobie podávania  
26. Na základe pozorovaní, že mutácie pribúdajú s každým ošetrením, je 
potrebný režim s opakovanou dávkou s dennými ošetreniami po čas obdobia 
28 dní. Všeobecne sa to považuje za prijate ľné na produkciu dostato čnej 
akumulácie mutácií slabými mutagénmi a aj na zabezpe čenie času vysta ­
venia dosta čujúceho na zistenie mutácií v orgánoch s pomalou proliferáciou. 
Pre niektoré hodnotenia môžu by ť vhodné alternatívne režimy podávania 
a tieto iné rozvrhy podávania by mali by ť v protokole vedecky odôvodnené. 
Ošetrovania by nemali by ť kratšie ako čas potrebný na úplnú indukciu 
všetkých relevantných metabolizujúcich enzýmov a kratšie ošetrovania si môžu vyžadova ť použitie viacerých rôznych časov odberu vzoriek, ktoré sú 
vhodné pre orgány s rôznymi mierami proliferácie. V každom prípade by sa 
pri odôvod ňovaní protokolu mali použi ť všetky dostupné informácie (napr. 
o všeobecnej toxicite alebo o metabolizme a farmakokinetike), najmä v prípade odchýlenia sa od uvedených odporú čaní. Hoci to môže zvýši ť 
citlivosť, čas ošetrovania dlhší ako 8 týžd ňov by sa mal jasne vysvetli ť 
a odôvodni ť, pretože dlhý čas ošetrovania môže klonovou expanziou 
spôsobiť zrejmé zvýšenie frekvencie mutácií (29).
 
Veľkosti dávok  
27. Veľkosti dávok by mali vychádza ť z výsledkov štúdie na zistenie rozsahu 
dávok s meraním všeobecnej toxicity, ktorá sa vykonala rovnakým spôsobom expozície, alebo z výsledkov vopred existujúcich štúdii suba ­
kútnej toxicity. Na ur čenie rozsahov dávok sa môžu použi ť netransgénne 
zvieratá rovnakého kme ňa hlodavcov. V hlavnom teste by kompletná štúdia 
na získanie informácií o vz ťahu medzi dávkou a reakciou mala zah ŕňať 
negatívnu kontrolnú skupinu (pozri odsek 22) a minimálne tri ve ľkosti 
dávok s vhodnými rozostupmi okrem prípadov, ke ď bola použitá limitujúca 
dávka (pozri odsek 28). Najvyššia dávka by mala by ť maximálna tolerovaná
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
dávka (MTD). Maximálna tolerovaná dávka sa vymedzuje ako dávka 
produkujúca známky toxicity na takej úrovni, že vyššie úrovne dávok zalo ­ 
žené na rovnakom dávkovacom režime by pravdepodobne spôsobili letalitu. Chemikálie s osobitnými biologickými aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) a chemikálie, ktoré vykazujú 
saturáciu toxikokinetických vlastností, môžu by ť vyňaté z kritérií na stano ­
venie dávok a mali by sa hodnoti ť prípad od prípadu. Ve ľkosti dávok by 
mali pokrýva ť rozsah od maximálnej po malú, resp. žiadnu toxicitu.
 
Limitný test  
28. Ak z pokusov na zistenie rozsahu alebo z existujúcich údajov týkajúcich sa 
súvisiacich kme ňov hlodavcov vyplýva, že režim podávania aspo ň limitu­
júcej dávky (pozri nižšie) nespôsobuje žiadne pozorovate ľné toxické 
účinky, a ak sa genotoxicita neo čakáva ani na základe údajov zo štruktu ­
rálne príbuzných chemikálií, nepovažuje sa za nevyhnutné uskuto čniť celú 
štúdiu s použitím troch ve ľkostí dávok. V prípade obdobia podávania 
v trvaní 28 dní (t. j. 28 denných podaní) je limitujúca dávka 1 000 
mg/kg telesnej hmotnosti/de ň. V prípade obdobia podávania kratšieho ako 
14 dní je limitujúca dávka 2 000 mg/kg telesnej váhy/de ň (rozvrhy dávok 
iné než 28 denných podaní by mali by ť v protokole vedecky odôvodnené, 
pozri odsek 26).  
Podávanie dávok  
29. Testovaná chemikália sa zvy čajne podáva plnením žalúdka sondou 
s použitím žalúdo čnej rúrky alebo vhodnej intuba čnej kanyly. Pri plánovaní 
skúšky by sa všeobecne mal zváži ť predpokladaný spôsob expozície ľudí. 
Preto môžu by ť prijateľné iné spôsoby expozície (ako napríklad pitná voda, 
subkutánne, intravenózne, lokálne, inhalácia, intratracheálne, strava alebo implantácia), ke ď ich možno odôvodni ť. Intraperitoneálna injekcia sa neod ­
porúča, keďže to nie je fyziologicky relevantný spôsob expozície ľudí. 
Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podáva ť sondou alebo 
injekciou závisí od ve ľkosti pokusného zviera ťa. Objem by nemal by ť väčší 
ako 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Požitie objemov vä čších ako uvedený by 
malo byť opodstatnené. Okrem dráždivých alebo žieravých chemikálií, 
ktoré bežne odhalia zhoršené ú činky pri vyšších koncentráciách, by sa 
variabilita testovacieho objemu mala minimalizova ť upravením koncentrácie 
na zabezpe čenie stáleho objemu pri všetkých ve ľkostiach dávok.
 
Čas odberu vzoriek  
Somatické bunky  
30. Čas odberu vzoriek je kritickou premennou, ke ďže ho určuje doba potrebná 
na fixáciu mutácií. Táto doba závisí od tkaniva a zrejme súvisí s dobou zmeny bunkovej populácie, pri čom kostná dre ň a tenké črevo reagujú 
rýchlo a pe čeň reaguje omnoho pomalšie. Vhodným kompromisom na 
meranie frekvencií mutácií v tkanivách s rýchlou a aj pomalou proliferáciou sú denné režimy podávania po dobu 28 po sebe nasledujúcich dní (ako sa uvádza v odseku 26) a odber vzoriek tri dni po závere čnom podaní, hoci 
maximálna frekvencia mutácií sa v tkanivách s pomalou proliferáciou za 
týchto podmienok nemusí prejavi ť. Ak sú tkanivá s pomalou proliferáciou 
osobitne významné, môže by ť vhodnejší neskorší čas odberu vzoriek 
v trvaní 28 dní nasledujúci po období podávania v trvaní 28 dní (16) 
(29). V takýchto prípadoch by neskorší čas odberu vzoriek nahradil čas 
odberu vzoriek 3 dni a vyžadoval by si vedecké odôvodnenie.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Zárodočné bunky  
31. Skúšky TGR sú vhodné na skúmanie indukcie génovej mutácie v mužských 
zárodočných bunkách (7) (8) (27), v ktorých sú dobre vymedzené časové 
rozvrhnutie a kinetika spermatogenézy (27). Nízky po čet vajíčok dostup ­
ných na analýzu, dokonca aj po superovulácii, a skuto čnosť, že v oocyte nie 
je syntéza DNA, vylu čujú určenie mutácie v ženských zárodo čných 
bunkách s použitím transgénnych skúšok (31). 
32. Časy odberu vzoriek mužských zárodo čných buniek by mali by ť zvolené 
tak, aby sa odobrala vzorka z celého rozsahu exponovaných typov buniek v celom vývoji zárodo čných buniek a aby stupe ň, na ktorý je odber vzoriek 
zameraný, bol vystavený dostato čnej expozícii. Čas prechodu vyvíjajúcich 
sa zárodo čných buniek zo spermatogoniálnych kme ňových buniek na 
dospelé spermie, ktoré sa dostanú do semenovodu/chvosta semenníka, je ~49 dní u myší (36) a ~70 dní u potkanov (34) (35). Po 28-d ňovej expozícii 
s následnou dobou 3 dní odberu vzoriek predstavujú naakumulované 
spermie zhromaždené zo semenovodu/chvosta semenníka (7) (8) populáciu buniek exponovaných po čas približne druhej polovice spermatogenézy, čo 
zahŕňa meiotické a postmeiotické obdobie, ale nie obdobie spermatogonál ­
nych buniek alebo obdobie kme ňových buniek. Na primeraný odber vzoriek 
buniek v semenovode/chvoste semenníka, ktoré boli spermatogonálnymi kme ňovými bunkami po čas obdobia expozície, je po 
skončení podávania potrebný ďalší čas na odber vzoriek v trvaní minimálne 
7 týždňov (myši) alebo 10 týžd ňov (potkany). 
33. Bunky extrudované zo semenotvorných tubulov po režime 28 + 3 dni tvoria 
zmiešanú populáciu obohatenú o všetky stupne vyvíjajúcich sa zárodo čných 
buniek (7) (8). Odber vzoriek z týchto buniek na zistenie génovej mutácie 
neposkytuje také presné posúdenie stup ňov, v ktorých boli indukované 
mutácie zárodo čných buniek, aké možno získa ť z odberu vzoriek spermií 
zo semenovodu/chvostu semenníka (ke ďže tam sú rôzne typy zárodo
čných 
buniek, z ktorých sa odobrali vzorky z tubulov, a bude tam nieko ľko 
somatických buniek, ktoré kontaminujú túto populáciu buniek). Odber vzoriek zo semenotvorných tubulov spolo čne so spermiami zo semenovodu/ 
chvostu semenníka len v režime 28 + 3 dní by však ur čitým spôsobom 
pokryl bunky exponované vo vä čšine fáz vývoja zárodo čných buniek 
a mohol by by ť užitočný na zistenie ur čitých mutagénov zárodo čných 
buniek.
 
Pozorovania  
34. Najmenej raz denne je nutné uskuto čniť všeobecné klinické pozorovania, 
najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol o čakávaných 
účinkov po podaní. Mal by sa zaznamena ť zdravotný stav zvierat. Najmenej 
dvakrát denne je potrebné sledova ť chorobnos ť a úmrtnos ť zvierat. Všetky 
zvieratá by sa mali váži ť najmenej raz za týžde ň a pri usmrtení. Spotreba 
potravy by sa mala mera ť aspoň raz týždenne. Ak sa testovaná chemikália 
podáva vo vode na pitie, spotreba vody by sa mala mera ť pri každej 
výmene vody a aspo ň raz za týžde ň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne 
ukazovatele nadmernej toxicity, by mali by ť usmrtené pred dokon čením 
testovacieho obdobia (23).  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Zhromaž ďovanie tkaniva  
35. Treba jasne vymedzi ť odôvodnenie zhromaž ďovania tkanív. Ke ďže 
indukciu mutácie je možné skúma ť prakticky v každom tkanive, výber 
zhromažďovaných tkanív by mal by ť založený na dôvode vykonania štúdie 
a na akýchko ľvek existujúcich údajoch o mutagenite, karcinogenite alebo 
toxicite skúmanej chemikálie. Medzi dôležité posudzované faktory patrí 
spôsob podávania (založený na pravdepodobnom spôsobe expozície ľudí), 
predpokladaná tkanivová distribúcia a možný mechanizmus ú činku. Ak 
neexistujú žiadne podkladové informácie, mali by sa zhromaž ďovať viaceré 
somatické tkanivá, ktoré by mohli by ť významné. Tie by mali predstavova ť 
tkanivá s rýchlou proliferáciou, pomalou proliferáciou a plochy kontaktných 
tkanív. Okrem toho by sa mali zhromaž ďovať spermie zo semenovodu/ 
chvosta semenníka a vyvíjajúce sa zárodo čné bunky zo semenotvorných 
tubulov (ako sa opisuje v odsekoch 32 a 33), ktoré by sa mali uskladni ť 
pre prípad, žeby bola v budúcnosti potrebná analýza mutagenity zárodo č­
ných buniek. Orgány by sa mali váži ť a v prípade vä čších orgánov by sa 
mala zo všetkých zvierat zhromaž ďovať rovnaká časť. 
Uskladňovanie tkanív a DNA  
36. Tkanivá (alebo homogenáty tkanív) by sa mali usklad ňovať pri teplote 
nižšej ako - 70 °C a na izoláciu DNA by sa mali použi ť do 5 rokov. 
Izolovaná DNA, uchovávaná zmrazená pri teplote 4 °C vo vhodnom 
tlmivom roztoku, by sa mala na analýzu mutácií optimálne použi ť do 
jedného roka.  
Výber tkanív na analýzu mutácií  
37. Výber tkanív by mal by ť založený na týchto úvahách: 1) spôsob podávania 
alebo miesto prvého kontaktu (napr. ž ľaznatý žalúdok pri orálnom podá ­
vaní, pľúca pri podávaní prostredníctvom inhalácie alebo koža pri lokálnej 
aplikácii); a 2) farmakokinetické parametre pozorované v štúdiách všeo ­
becnej toxicity, z ktorých vyplýva tkanivová dispozícia, retencia alebo 
akumulácia alebo cie ľové orgány toxicity. Ak sa štúdie vykonávajú 
v nadväznosti na štúdie karcinogenity, mali by sa zváži ť cieľové tkanivá 
karcinogenity. Výberom tkanív pre analýzu by sa mala maximalizova ť 
detekcia chemikálií, ktoré sú priamo pôsobiacimi mutagénmi in vitro, 
ktoré sa rýchlo metabolizujú, sú vysoko reaktívne alebo sa zle absorbujú 
alebo u ktorých je cie ľové tkanivo ur čené spôsobom podávania (6). 
38. Ak neexistujú podkladové informácie a po zvážení miesta kontaktu vyplý ­
vajúceho zo spôsobu podávania by sa mali na mutagenitu posudzova ť pečeň 
a najmenej jedno rýchlo sa deliace tkanivo (napr. ž ľaznatý žalúdok, kostná 
dreň). Vo vä čšine prípadov možno uvedené požiadavky splni ť analýzou 
dvoch starostlivo vybraných tkanív, ale v niektorých prípadoch môžu by ť 
potrebné tri alebo viaceré tkanivá. Ak existujú dôvody na osobitné znepo ­
kojenie s oh ľadom na ú činky na zárodo čné bunky vrátane pozitívnych 
reakcií v somatických bunkách, mali by sa tkanivá zárodo čných buniek 
hodnotiť na mutácie.  
Metódy merania  
39. Na detekciu mutácií sú dostupné štandardné laboratórne alebo zverejnené 
metódy pre odporú čané transgénne modely: lacZ lambda bakteriofág 
a plazmid (30); lacI myši (2) (18); gpt delta myši (22); gpt delta potkany 
(28); cII (17). Zmeny by mali by ť opodstatnené a riadne zdokumentované. 
Údaje z viacerých spojení možno agregova ť a použiť na dosiahnutie prime ­
raného po čtu plakov alebo kolónií. Ke ď je však na dosiahnutie primeraného 
počtu plakov potrebný vä čší počet spájacích reakcií, môže to by ť znak 
nekvalitnej DNA. V týchto prípadoch by sa údaje mali posudzova ť opatrne, 
pretože môžu by ť nespoľahlivé. Optimálny celkový po čet plakov alebo  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
kolónií na vzorku DNA ur čuje štatistická pravdepodobnos ť zistenia dosta ­
točného počtu mutácií pri danej frekvencii spontánnych mutácií. Vo všeo ­
becnosti je potrebných minimálne 125 000 až 300 000 plakov, ak je frek ­
vencia spontánnych mutácií v ráde 3 × 10  –5 (15). V prípade skúšky Big 
Blue® lacI je dôležité preukáza ť, že možno zisti ť celý rad fenotypov fareb ­
ných mutácií za členením vhodných farebných kontrol súbežne s každým 
očkovaním. Tkanivá a výsledné vzorky (položky) by sa mali spracúva ť 
a analyzova ť s použitím blokového dizajnu, v rámci ktorého sa položky 
z kontrolnej skupiny používajúcej nosi č/rozpúšťadlo, z pozitívnej kontrolnej 
skupiny (ak sa používa) alebo z pozitívnej kontrolnej DNA (v náležitých 
prípadoch) a z každej pokusnej skupiny spracúvajú spolo čne. 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
40. Údaje o jednotlivých zvieratách sa uvádzajú v tabu ľkovej forme. Pokusnou 
jednotkou je jedno zviera. Správa by mala obsahova ť celkový po čet jedno­
tiek tvoriacich plaky (pfu) alebo jednotiek tvoriacich kolónie (cfu), po čet 
mutácií a frekvenciu mutácií pre každé tkanivo z každého zviera ťa. 
V prípade viacerých spájacích/záchranných reakcií treba uvies ť počet 
reakcií na vzorku DNA. Treba síce uchováva ť údaje pre každú jednotlivú 
reakciu, vykazujú sa však len celkové jednotky tvoriace plaky a jednotky 
tvoriace kolónie. Treba vykazova ť údaje o toxicite a o klinických prízna ­
koch pod ľa odseku 34. Mali by sa predklada ť všetky výsledky sekveno ­
vania pre každú analyzovanú mutáciu a mali by sa uvies ť výpočty vyplý­
vajúcej frekvencie mutácií pre každé zviera a tkanivo.  
Štatistické vyhodnocovanie a interpretácia výsledkov  
41. Je viacero kritérií na ur čenie pozitívneho výsledku, ako je zvýšenie frek ­
vencie mutácií súvisiace s dávkou alebo jasné zvýšenie frekvencie mutácií 
v skupine s jednou dávkou v porovnaní s kontrolnou skupinou používa ­
júcou rozpúš ťadlo/nosič. Na zabezpe čenie dostato čných údajov na analýzu 
vzťahu medzi dávkou a reakciou treba analyzova ť najmenej tri pokusné 
skupiny. Biologická relevantnos ť výsledkov by síce mala by ť prvoradá, 
pri vyhodnocovaní výsledkov testov sa však ako pomôcka môžu použi ť 
vhodné štatistické metódy (4) (14) (15) (25) (26). V použitých štatistických testoch by sa malo zviera posudzova ť ako pokusná jednotka. 
42. Testovaná chemikália, ktorej výsledky nesp ĺňajú uvedené kritériá v žiadnom 
tkanive, sa v tejto skúške nepovažuje za mutagénnu. Pre biologickú rele ­
vantnosť negatívneho výsledku treba potvrdi ť expozíciu tkaniva. 
43. Pre sekven čné analýzy DNA sú dostupné viaceré štatistické postupy, ktoré 
pomáhajú pri interpretácií výsledkov (1) (5) (9) (19). 
44. Zváženie toho, či sú pozorované hodnoty v rozsahu historickej kontroly 
alebo mimo nej, môže poskytnú ť usmernenie pri hodnotení biologického 
významu reakcie (32).
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Správa z testu  
45. Správa z testu by mala obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— identifika čné údaje a číslo CAS, ak je známe; 
— zdroj, číslo dávky, ak je k dispozícii; 
— fyzikálna povaha a čistota; 
— fyzikálnochemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie; 
— stabilita testovanej chemikálie, ak je známa;  
Rozpúšťadlo/nosič: 
— odôvodnenie vo ľby nosiča; 
— rozpustnos ť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúš ťadle/nosiči, ak je 
známa; 
— príprava zloženia krmiva, pitnej vodyalebo inhalácie; 
— analytické ur čenie zložení (napr. stabilita, homogénnos ť, nominálne 
koncentrácie);  
Pokusné zvieratá:  
— použité druhy/kme ň a odôvodnenie vo ľby; 
— počet, vek a pohlavie zvierat; 
— zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo at ď.; 
— hmotnos ť jednotlivých zvierat na za čiatku testu vrátane rozsahu telesnej 
hmotnosti, strednej hodnoty a štandardnej odchýlky pre každú skupinu;  
Podmienky testu:  
— údaje o pozitívnych a negatívnych (rozpúš ťadlo/nosič) kontrolných 
skupinách; 
— údaje zo štúdie na zistenie rozsahu; 
— odôvodnenie výberu ve ľkosti dávky; 
— podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie; 
— podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie; 
— odôvodnenie spôsobu podávania; — metódy merania toxicity zvierat vrátane, ke ď to je možné, histopatolo ­
gických alebo hematologických analýz, a frekvencia pozorovaní a vážení zvierat; 
— metódy overovania, či testovaná chemikália dosiahla cie ľové tkanivo 
alebo všeobecnú cirkuláciu, ak sa dosiahnu negatívne výsledky;
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/de ň) vypo čítaná 
z koncentrácie testovanej chemikálie (ppm) v krmive/pitnej vode a zo 
spotreby krmiva/pitnej vody, ak sa uplat ňuje; 
— podrobné údaje o kvalite krmiva a vody; 
— podrobný popis rozvrhov podávania a odoberania vzoriek 
a odôvodnenie volieb; 
— metóda eutanázie; — postupy izolácie a uchovávania tkanív; 
— metódy izolácie genómovej DNA hlodavcov, získavania preneseného 
génu z genómovej DNA a prenášania transgénnej DNA na bakteriál ­
neho hostite ľa; 
— zdroj a čísla dávok všetkých buniek, súprav a reagentov (v náležitých 
prípadoch); 
— metódy vy čísľovania mutácií; 
— metódy molekulárnej analýzy mutácií a použitie pri korekcii o klonalitu 
a/alebo metódy výpo čtu frekvencie mutácií, ak sa uplat ňujú;
 
Výsledky:  
— stav zviera ťa pred testovaním a po čas obdobia testovania vrátane 
príznakov toxicity; 
— váha tela a orgánov pri usmrtení; — pre každé tkanivo/zviera po čet mutácií, po čet hodnotených plakov alebo 
kolónií, frekvencia mutácií; 
— pre každé tkanivo/skupinu zvierat po čet spájacích reakcií na vzorku 
DNA, celkový po čet mutácií, stredná frekvencia mutácií, štandardná 
odchýlka; 
— vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho ur čiť; 
— pre každé tkanivo/zviera po čet nezávislých mutácií a stredná frekvencia 
mutácií, ke ď sa vykonala molekulárna analýza mutácií; 
— paralelné a historické údaje o negatívnych kontrolných skupinách 
s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami; 
— paralelné údaje o pozitívnych kontrolných skupinách (alebo 
o neparalelných DNA pozitívnych kontrolách); 
— analytické ur čenia, ak sú k dispozícii (napr. koncentrácie DNA použité 
v spájaní, údaje o sekvenovaní DNA); 
— použité štatistické analýzy a metódy;
 
Rozbor výsledkov  
Záver  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITERATÚRA  
1. Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391 - 396. 
2. Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107 - 112. 
3. Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo 
Mutations’  Nature , 377(6550): 657 - 659. 
4. Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’,  Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 246 
- 255. 
5. Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405 - 413. 
6. Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141 - 151. 
7. Douglas, G.R.,J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485 - 7489. 
8. Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197 - 212. 
9. Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411 - 1418. 
10. Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations’  
in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971–7975. 
11. Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli H ost’, Biotechniques , 14(3): 326, 330. 
12. Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125 - 136. 
13. Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96 - 106 . 
14. Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249 - 255. 
15. Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Doug ­
las, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253 - 259. 
16. Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Muta ­
gen., 41: 1 - 6.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17. Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo M uta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073 - 9078. 
18. Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212 - 218. 
19. Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772 - 778. 
20. Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465 - 470. 
21. Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi
 – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9 - 15. 
22. Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191 -215. 
23. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Paríž. 
24. OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paríž. 
25. Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231 - 245. 
26. Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249 - 289. 
27. Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164 - 193. 
28. Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71 - 78. 
29. Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141 -151. 
30. Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, s. 391 - 410.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31. Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1 - 2): 117 
-123. 
32. Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007. 
33. OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paríž. 
34. Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198 - 236. 
35. Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, s. 1071 - 1148. 
36. Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25 - 36.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Dodatok  
VYMEDZENIA POJMOV  
Obdobie podávania : celková doba, po čas ktorej sa zviera ťu podáva dávka.  
Bázová zámena : typ mutácie, ktorý spôsobuje nahradenie jedného nukleotidu 
DNA inou bázou nukleotidov DNA.  
Kapsid : bielkovinový obal, ktorý obklopuje vírusovú časticu.  
Chemikália : látka alebo zmes.  
Klonová expanzia : produkcia mnohých buniek z jednej (mutantnej) bunky.  
Jednotka tvoriaca kolónie : miera životaschopného bakteriálneho množstva.  
Konkatamer : dlhá plynulá biomolekula zložená z viacerých sériovo zapojených 
identických kópií.  
Cos-miesto : 12-nukleotidový segment jednovláknovej DNA, ktorý existuje na 
obidvoch koncoch dvojvláknového genómu bakteriofágovej lambdy.  
Delécia : mutácia, v rámci ktorej genóm stratí jeden alebo viaceré (postupné) 
nukleotidy.  
Elektroporácia : aplikácia elektrických impulzov na zvýšenie priepustnosti 
bunkových membrán.  
Endogénnygén : pôvodný gén genómu.  
Extrabinominálna variácia : väčšia variabilita v opakovaných odhadoch 
podielu populácie, ako by sa o čakávala, ak by populácia mala binominálnu 
distribúciu.  
Mutácia posúvajúca čítací rámec : genetická mutácia spôsobená v členením 
alebo deléciou viacerých nukleotidov, ktorá nie je rovnomerne delite ľná tromi 
v rámci sekvencie DNA, ktorá kóduje bielkovinu/peptid.  
Včlenenie : pridanie jedného alebo viacerých bázových párov nukleotidov do 
sekvencie DNA.  
Jackpot : veľký počet mutantov, ktorí vznikli klonovou expanziou z jednej 
mutácie.  
Veľké delécie : delécie v DNA viacerých tisíc báz (ktoré sa efektívne zistia 
skúškou selekcie Spi  – a plazmidovou skúškou  lacZ ). 
Ligácia : kovalentné spájanie dvoch koncov molekúl DNA s použitím ligázy 
DNA.  
Mitogén : chemikália, ktorá stimuluje bunku, aby sa za čala deliť, a ktorá spúš ťa 
mitózu (t. j. delenie buniek).  
Neutrálny gén : gén, ktorý nie je ovplyvnený tlakmi pozitívnej alebo negatívnej 
selekcie.  
Spájanie : syntéza infek čných fágových častíc z preparátu fágových kapsidových 
a zadných bielkovín a konkataméru fágových molekúl DNA. Bežne sa používa 
na spájanie DNA klonovaných na lambda vektore (oddelený cos-miestami) do infekčných lambda častíc.  
Účinnosť spájania : účinnosť, akou sa spájané bakteriofágy získajú 
v hostiteľskej baktérií.
 ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Jednotka tvoriaca plaky (pfu) : miera po čtu životaschopných bakteriofágov.  
Bodová mutácia : všeobecný výraz pre mutáciu, ktorá ovplyv ňuje len malú 
sekvenciu DNA vrátane malých v členení, delécií a bázových zámen.  
Pozitívna selekcia : metóda, ktorá umož ňuje prežitie len mutantov.  
Reportérový gén : gén, ktorého zmutovaný génový produkt možno ľahko zisti ť. 
Čas odberu vzoriek : koniec časového obdobia pred usmrtením, po čas ktorého 
sa nepodáva chemikália a po čas ktorého sa nespracované lézie DNA fixujú do 
stabilných mutácií.  
Dvojfunk čný vektor (shuttle vektor) : vektor zostavený tak, aby sa mohol 
množiť v dvoch rôznych hostite ľských druhoch; DNA vložená do dvojfunk čného 
vektora možno teda testova ť alebo ju manipulova ť v dvoch rôznych typoch 
buniek alebo dvoch rôznych organizmoch.  
Testovaná chemikália : akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  
Transgénny : organizmus alebo týkajúci sa organizmu, ktorého genóm bol 
zmenený prenosom génu alebo génov z iných druhov.  ▼M5 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
ČASŤ C: METÓDY NA STANOVENIE EKOTOXICITY  
OBSAH 
C.1. AKÚTNA TOXICITA NA RYBÁCH C.2. TEST AKÚTNEJ IMOBILIZÁCIE DAFNIÍ  (DAPHNIA  SP.) 
C.3. SLADKOVODNÉ RIASY A SINICE, TEST INHIBÍCIE RASTU C.4. STANOVENIE „ ĽAHKEJ“ BIODEGRADOVATE ĽNOSTI 
ČASŤ I. VŠEOBECNÉ ÚVAHY 
ČASŤ II. ÚBYTOK ROZPUSTENÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKA (DOC 
DIE-AWAY) (metóda C.4-A) 
ČASŤ III. MODIFIKOVANÝ SKRÍNINGOVÝ TEST OECD (metóda C.4-B) 
ČASŤ IV. VÝVOJ OXIDU UHLI ČITÉHO (CO
 2 ) (metóda C.4-C) 
ČASŤ V. TEST MANOMETRICKEJ RESPIROMETRIE (metóda C.4-D) 
ČASŤ VI. TEST UZAVRETEJ F ĽAŠE (metóda C.4-E) 
ČASŤ VII. TEST M.I.T.I. (metóda C.4-F) 
C.5. DEGRADÁCIA – BIOCHEMICKÁ SPOTREBA KYSLÍKA C.6. DEGRADÁCIA – CHEMICKÁ SPOTREBA KYSLÍKA C.7. DEGRADÁCIA – ABIOTICKÁ DEGRADÁCIA: HYDROLÝZA 
AKO FUNKCIA pH 
C.8. TOXICITA NA DÁŽ ĎOVKÁCH 
C.9. BIODEGRADÁCIA – ZAHN-WELLENSOV TEST C.10. SIMULA ČNÝ TEST AERÓBNEHO ČISTENIA ODPADO ­
VÝCH VÔD C.10-A: JEDNOTKY S TECHNOLÓGIOU AKTI ­
VOVANÉHO KALU – C.10-B: BIOFILMY 
C.11. BIODEGRADÁCIA – TEST RESPIRA ČNEJ INHIBÍCIE AKTI ­
VOVANÉHO KALU 
C.12. BIODEGRADÁCIA – MODIFIKOVANÝ SCAS-TEST C.13. BIOKONCENTRÁCIA: PRIETOKOVÝ RYBÍ TEST C.14. RASTOVÝ TEST MLÁ ĎAT RÝB 
C.15. RYBY, KRÁTKODOBÝ TEST TOXICITY NA EMBRYÁCH 
A VÝVOJOVOM ŠTÁDIU PLODOVÉHO VAKU 
C.16. V ČELY OBECNÉ – AKÚTNY TEST ORÁLNEJ TOXICITY 
C.17. V ČELY OBECNÉ – AKÚTNY TEST TOXICITY 
KONTAKTOM 
C.18. ADSORPCIA ALEBO DESORPCIA S POUŽITÍM ROVNO ­
VÁŽNEJ METÓDY DÁVKOVANIA
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ODHAD ADSORP ČNÉHO KOEFICIENTU (K  oc ) V PÔDE 
A V SPLAŠKOVOM KALE ZA POUŽITIA VYSOKOÚ ČINNEJ 
KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE (HPLC) 
C.20. REPRODUK ČNÝ TEST NA  DAPHNIA MAGNA  
C.21. PÔDNE MIKROORGANIZMY: TEST TRANSFORMÁCIE 
DUSÍKA 
C.22. PÔDNE MIKROORGANIZMY: TRANSFORMA ČNÝ TEST 
UHLÍKA 
C.23. AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA V PÔDE 
C.24. AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA 
V SYSTÉMOCH VODA/SEDIMENT 
C.25. AERÓBNA MINERALIZÁCIA V POVRCHOVEJ VODE – 
SIMULA ČNÝ TEST BIODEGRADÁCIE 
C.26.  LEMNA  SP. TEST INHIBÍCIE RASTU  
▼M4 
C.27. TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT 
– VODA ZA POUŽITIA OBOHATENÉHO SEDIMENTU 
C.28. TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT 
– VODA ZA POUŽITIA OBOHATENEJ VODY 
C.29. ĽAHKÁ BIODEGRADOVATE ĽNOSŤ – CO  2 V HERMETICKY 
UZAVRETÝCH NÁDOBÁCH (TEST V UZAVRETOM PRIE ­
STORE NAD KVAPALINOU) 
C.30. BIOAKUMULÁCIA PRI SUCHOZEMSKÝCH MÁLOŠTETI ­
NAVCOCH  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. AKÚTNA TOXICITA NA RYBÁCH  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Účelom tohto testu je stanovi ť akútnu letálnu toxicitu látky pre ryby 
v sladkej vode. Tak ako je to len možné, je výhodné ma ť informácie 
o rozpustnosti vo vode, tlaku pár, chemickej stabilite, disocia čných 
konštantách a biodegradabilite látky, aby tieto informácie pomohli pri výbere najvhodnejšej skúšobnej metódy (statická, semistatická 
alebo prietoková), ktorá uspokojivo zaistí konštantné koncentrácie 
testovanej látky po čas testu. 
Ďalšie informácie (napr. štruktúrny vzorec, stupe ň čistoty, druh 
a percentuálne zastúpenie ne čistôt, prítomnos ť a množstvo aditív 
a rozdeľovaci koeficient n-oktanol/voda) sa tiež berú do úvahy pri 
plánovaní testu a pri vyhodnotení výsledkov.
 
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Akútna toxicita je rozpoznate ľný nepriaznivý ú činok indukovaný 
v organizme po čas krátkeho času (dni) expozície látke. V tomto 
teste je akútna toxicita vyjadrená ako stredná letálna koncentrácia (LC
 50 ), čo je taká koncentrácia vo vode, pri ktorej uhynie 50 % 
rýb z testovaného súboru po čas kontinuálnej expozície, ktorá musí 
byť predtým ur čená. 
Všetky koncentrácie testovanej látky sú uvedené v hmotnosti na 
objem (mg/liter). Môžu by ť tiež vyjadrené ako hmotnos ť na hmot ­
nosť (mg.kg  -1 ). 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky sa môžu testova ť na účely demonštrovania, že za 
laboratórnych skúšobných podmienok nedošlo k významnej zmene 
reakcie testovaných druhov. 
Pre tento test nie sú špecifikované žiadne referen čné látky.  
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Limitný test možno vykona ť pri koncentrácii 100 mg/liter na dôkaz, 
že hodnota LC  50 je väčšia ako táto koncentrácia. 
Ryby sú exponované testovanej látke pridanej do vody v rozsahu 
rôznych koncentrácií po čas 96 hodín. Úmrtnos ť sa zaznamenáva 
minimálne v 24-hodinových intervaloch, a ak je to možné, koncen ­
trácie spôsobujúce 50 % úmrtnos ť rýb (LC  50 ) sa vypo čítajú 
v každom pozorovacom čase. 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Kritériá kvality sa aplikujú pri limitnom teste, ako aj pri úplnej 
skúšobnej metóde. 
Úmrtnosť v kontrolách nesmie presiahnu ť 10 % (alebo jednu rybu, 
ak sa použilo menej ako 10 rýb) na konci testu. 
Koncentrácia rozpusteného kyslíka musí by ť vyššia ako 60 % 
z celkovej hodnoty pri saturácii vzduchom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Koncentrácie testovanej látky sa budú udržiava ť v rámci 80 % 
pôvodných koncentrácií po čas celého testu. 
Pre látky, ktoré sú ľahko rozpustné v testovacom médiu a ktoré 
tvoria stabilné roztoky, napríklad tie, ktoré nebudú vo významnej miere prchavé, nebudú sa rozklada ť, hydrolyzova ť ani adsorbova ť, 
ich počiatočná koncentrácia sa môže považova ť za ekvivalentnú 
k nominálnej koncentrácii. Musí by ť dokázané, že koncentrácie sa 
udržiavali po čas celého testu a kritériá kvality sa dodržali. 
Pre látky, ktoré sú: 
i) slabo rozpustné v testovacom médiu alebo 
ii) schopné vytvára ť stabilné emulzie alebo disperzie, alebo 
iii) nestabilné vo vodných roztokoch, 
počiatočná koncentrácia sa bude považova ť za koncentráciu meranú 
v roztoku (alebo ak to nie je technicky možné, meranú vo vodnom stĺpci) na za čiatku testu. Koncentrácia sa stanoví až po vytvorení 
rovnováhy, ale pred použitím testovaných rýb. 
Vo všetkých týchto prípadoch sa musia vykona ť ďalšie merania 
počas testu, aby sa potvrdili aktuálne expozi čné koncentrácie alebo 
aby sa dodržali kritériá kvality. 
Hodnota pH by sa nemala meni ť viac ako v rozsahu jednej jednotky.
 
1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Môžu sa použi ť tri typy postupov:  
Statický test:  
Test toxicity, v ktorom nedochádza k žiadnemu toku testovaného 
roztoku. (Roztoky zostávajú nezmenené po čas trvania testu.)  
Semistatický test:  
Test bez toku testovaného roztoku, ale s pravidelnými obnoveniami 
testovaných roztokov po ur čitom období (napr. 24 hodinách).  
Prietokový test:  
Test toxicity, v ktorom sa voda neustále obnovuje v skúšobných 
komorách a testovaná látka alebo prípravok sa transportuje vodou používanou na obnovu skúšobného média.
 
1.6.1.  Reagenty  
1.6.1.1.  Roztoky testovaných látok  
Zásobné roztoky požadovanej sily sa pripravia rozpustením látky 
v deionizovanej vode alebo vode pod ľa 1.6.1.2. 
Zvolené koncentrácie na testovanie sa pripravia zriedením zásobného 
roztoku. Ak sa testujú vysoké koncentrácie, potom sa látka môže 
rozpustiť priamo vo vode.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Látky by sa normálne mali testova ť len po limit rozpustnosti. Pri niek ­
torých látkach (napr. látky s nízkou rozpustnos ťou vo vode alebo 
vysokou hodnotou P  OW alebo tie, ktoré sú schopné tvori ť stabilné 
disperzie namiesto pravých roztokov vo vode) je prijate ľné testova ť 
koncentrácie nad limitom rozpustnosti látky, aby sa zaistilo, že bola 
dosiahnutá maximálna rozpustná/stabilná koncentrácia. Avšak je dôle ­ 
žité, aby táto koncentrácia nejakým spôsobom nenarušovala testovací systém (napr. film látky na povrchu vody, ktorý bráni oxidácii vody atď.). 
Ultrazvuková disperzia, organické rozpúš ťadlá, emulzifikátory alebo 
dispergujúce látky možno použi ť ako pomôcku pri príprave zásob ­
ných roztokov látok s nízkou rozpustnos ťou vo vode alebo ako 
pomôcku pri dispergovaní týchto látok v testovacom médiu. Ke ď 
sa použijú takéto pomocné látky, potom všetky testované koncen ­
trácie majú obsahova ť rovnaké množstvo pomocnej látky a mala by 
sa vykona ť dodatočná kontrola, pri ktorej sú ryby vystavené 
rovnakej koncentrácii pomocnej látky, aká je použitá v skúšobných 
sériách. Koncentrácia takýchto pomocných látok by mala by ť mini­
malizovaná, ale v žiadnom prípade by nemala presahova ť 100 mg/ ­
liter skúšobného média. 
Test je potrebné vykona ť bez úpravy pH. Ak dochádza k výraznej 
zmene pH, odporú ča sa, aby sa test zopakoval s úpravou pH 
a výsledky sa zaznamenali. V takomto prípade by sa nemala úprava pH hodnoty zásobného roztoku pod ľa pH hodnoty vodného roztoku, 
pokiaľ na to nie je špeciálny dôvod, urobi ť. Na tento ú čel sa odpo ­
rúča HCl a NaOH. Nadstavenie pH hodnoty je potrebné vykona ť 
takým spôsobom, aby sa koncentrácia testovanej látky v zásobnom roztoku významne nezmenila. Akúko ľvek chemickú reakciu alebo 
fyzikálnu precipitáciu testovanej látky alebo prípravku po čas úpravy 
hodnoty pH je potrebné uvies ť v záznamoch v správe z testu.
 
1.6.1.2.  Voda pre chov rýb a na riedenie  
Môže sa použi ť pitná voda (nekontaminovaná potenciálne škodlivou 
koncentráciou chlóru, ťažkými kovmi alebo inými látkami), prírodná 
voda dobrej kvality alebo rekonštituovaná voda (pozri dodatok I). 
Odporúča sa použi ť vodu s celkovou tvrdos ťou v rozsahu 10 až 
250 mg/liter (ako CaCO  3 ) a s pH hodnotou v rozmedzí 6,0 až 8,5.  
1.6.2.  Prístroje  
Všetky prístroje musia by ť vyrobené z chemicky inertného materiálu. 
— automatický zrie ďovací systém (pre prietokový test), 
— prístroj na meranie koncentrácie kyslíka, — zariadenie na stanovenie tvrdosti vody, — adekvátny prístroj na kontrolu teploty, 
— pH meter.
 
1.6.3.  Testované ryby  
Ryby by mali by ť zdravé a bez akýchko ľvek zjavných znetvorení.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Druh rýb sa vyberie len na základe praktických kritérií, ako je ich 
dobrá dostupnos ť počas celého roka, vhodné udržiavanie, vhodnos ť 
na testovanie, relatívna citlivos ť na látky alebo prípravky, ako aj 
každý ekonomický, biologický alebo ekologický faktor, ktorý má nejaký význam. Potrebu porovnate ľnosti získaných údajov 
a existujúcu medzinárodnú harmonizáciu (odkaz 1) je tiež nutné 
brať do úvahy pri výbere druhu rýb. 
Zoznam druhov rýb, ktoré sa odporú čajú pre tento test, je uvedený 
v dodatku 2; odporú čanými druhmi sú dánio pruhované a pstruh dúhový.
 
1.6.3.1.  Chov  
Testované ryby majú by ť z jednej zásoby podobnej d ĺžky a veku. 
Musia sa udržiava ť najmenej 12 dní za týchto podmienok:  
dávkovanie:  
vhodné pre systém (recirkulácia alebo prietok) a druh rýb,  
voda:  
pozri 1.6.1.2,  
svetlo:  
12 až 16 hodín osvetlenia denne,  
koncentrácia rozpusteného kyslíka:  
najmenej 80 % hodnoty nasýtenia vzdušným kyslíkom,  
kŕmenie:  
trikrát za týžde ň alebo denne, s prerušením 24 hodín pred za čiatkom 
testu.  
1.6.3.2.  Úmrtnos ť (mortalita)  
Po 48-hodinovej po čiatočnej perióde sa zaznamenáva úmrtnos ť, 
pričom sa aplikujú tieto kritériá: 
— viac ako 10 % populácie v priebehu siedmich dní: 
zrušenie celej násady, 
— medzi 5 % až 10 % populácie: 
udržiavacia perióda sa pred ĺži o ďalších sedem dní. 
Ak nedôjde k ďalším úmrtiam, násada je prijate ľná, inak sa zruší, 
— menej ako 5 % populácie: 
násada je prijate ľná. 
1.6.4.  Adaptácia  
Predtým, ako sa ryby použijú v teste, musia sa adaptova ť aspoň 
sedem dní na vodu tej istej kvality a teploty, aká sa použije pri teste.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Testovací postup  
Definitívnemu testovaniu môže predchádza ť vyhľadávací test, aby sa 
získala informácia o rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú v hlavnom teste. 
Vykonáva sa jedna kontrola bez testovanej látky, a ak je to možné, 
tiež sa vykonáva jedna kontrola obsahujúca pomocnú látku, navyše k testovaným sériám. 
V závislosti od fyzikálnych a chemických vlastností testovanej látky 
alebo prípravku sa vyberie statický, semistatický alebo prietokový 
test ako vhodný, tak aby sp ĺňal kritériá kvality. 
Ryby sú exponované látke tak, ako je uvedené nižšie: — trvanie: 96 hodín, 
— počet zvierat: aspo ň 7 na každú koncentráciu, 
— nádrže: vhodnej kapacity vo vz ťahu k odporu čenej náplni, 
— dávkovanie: maximálne dávkovanie 1 g/liter sa odporú ča pre 
statický a semistatický test, pri prietokovom systéme je prijate ľné 
aj vyššie dávkovanie, 
— testovaná koncentrácia: aspo ň päť koncentrácií líšiacich sa 
konštantným faktorom nepresahujúcim 2,2 a tak, ako je to možné, zaberajúcich rozsah od 0 % do 100 % úmrtnosti, 
— voda: pozri 1.6.1.2, 
— svetlo: 12 až 16 hodín osvetlenia denne, 
— teplota: vhodná pre príslušný druh (pozri dodatok 2), ale len 
v rozsahu ± 1
 o C pre každý jednotlivý test, 
— koncentrácia rozpusteného kyslíka: nie menej ako 60 % hodnoty 
nasýtenia vzdušným kyslíkom pri danej teplote, 
— kŕmenie: žiadne. 
Ryby sa skontrolujú po prvých 2 až 4 hodinách a v 24-hodinových 
intervaloch. Ryby sa považujú za m ŕtve, ak nevykazujú žiadnu 
reakciu po dotyku na chvostovú stopku a nie sú vidite ľné žiadne 
dýchacie pohyby. M ŕtve ryby sa odstránia a zaznamená sa úmrtnos ť. 
Zaznamenávajú sa aj vidite ľné abnormality (napr. strata rovnováhy, 
zmeny v plávaní, zmeny v dýchaní, pigmentácia at ď.). 
Denne sa musí vykona ť meranie pH, rozpusteného kyslíka a teploty.  
Limitný test  
Pri použití postupov opísaných v tejto metóde limitný test sa môže 
vykonať pri koncentrácii 100 mg/l, aby sa demonštrovalo, že LC  50 je 
väčšia ako táto koncentrácia. 
Ak sú vlastnosti látky také, že sa nemôže dosiahnu ť koncentrácia 
100 mg/liter v testovanom roztoku, limitný test sa vykoná pri koncentrácii rovnej rozpustnosti látky (alebo pri maximálnej koncen ­
trácii, pri ktorej dochádza k tvorbe stabilnej disperzie) v použitom 
médiu (pozri tiež bod 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Limitný test by sa mal vykona ť použitím 7 až 10 rýb s rovnakým 
počtom rýb v kontrole. (Z binomickej teórie vyplýva, že pri použití 
10 rýb s nulovou úmrtnos ťou je 99,9 % spo ľahlivosť, že LC  50 je 
väčšia ako koncentrácia použitá v limitnom teste. Pri 7, 8 alebo 9 
rybách za nulovej úmrtnosti je prinajmenšom 99 % spo ľahlivosť, že 
LC 50 je väčšia ako použitá koncentrácia.) 
Pri výskyte úmrtnosti sa musí vykona ť kompletná štúdia. Ak sa 
pozorujú subletálne ú činky, tieto by sa mali zaznamena ť. 
2. ÚDAJE A VYHODNOTENIE  
Pre každú periódu expozície, ke ď boli zapísané pozorovania (24, 48, 
72 a 96 hodín), sa zaznamenáva percentuálna úmrtnos ť oproti 
príslušnej koncentrácii na semilogaritmickom papieri. 
Keď je to možné, pre každý pozorovací čas by sa mali odhadnú ť 
LC 50 a limity spo ľahlivosti (p = 0,05) použitím štandardných postu ­
pov, tieto hodnoty sa zaokrúhlia na jedno alebo vä čšinou dve platné 
číslice (príklady zaokrúhlenia na dve číslice: 173,5 na 170, 0,127 na 
0,13 a 1,21 na 1,2). 
V tých prípadoch, ke ď sklon krivky koncentrácia/percentá je príliš 
strmý a neumož ňuje výpo čet LC  50 , stačí grafický odhad tejto 
hodnoty. 
Keď v dvoch po sebe nasledujúcich koncentráciách v pomere 2,2 
dochádza len k 0 % a 100 % úmrtnosti, tieto dve hodnoty sta čia na 
indikovanie rozsahu, do ktorého patrí LC  50. 
Ak sa pozoruje, že nemožno udrža ť stabilitu ani homogenitu testo ­
vanej látky, toto by sa malo zaznamena ť a výsledky by sa mali 
interpretova ť so zvýšenou pozornos ťou. 
3. SPRÁVA  
Správa z testu by mala, pokia ľ je to možné, obsahova ť tieto infor ­
mácie: 
— informácie o testovaných rybách (vedecký názov, kme ň, dodáva­
teľ, predbežné ošetrenie, ve ľkosť a počet rýb použitých pri 
každej testovanej koncentrácii), 
— zdroj vody a jej hlavné chemické charakteristiky (pH, tvrdos ť, 
teplota), 
— v prípade látky s nízkou rozpustnos ťou metódy prípravy zásob ­
ného a skúšobného roztoku, 
— koncentráciu všetkých pomocných látok, — zoznam použitých koncentrácii a všetky dostupné informácie 
týkajúce sa stability testovanej látky alebo prípravku pri daných 
koncentráciách v testovanom roztoku, 
— použité metódy a získané výsledky, ak sa vykonala analýza látky 
alebo prípravku, 
— výsledky limitného testu, ak sa vykonal, — dôvody na výber testu a detaily použitého skúšobného postupu 
(napr. statický, semi-statický, dávkovanie, informácia 
o prevzduš ňovaní, dávkovanie rýb a pod.),
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— opis skúšobného zariadenia, 
— režim osvetlenia, — koncentráciu rozpusteného kyslíka, pH hodnoty a teploty skúšob ­
ných roztokov každých 24 hodín, 
— dôkaz, že boli splnené kritériá kvality, — tabuľku uvádzajúcu kumulatívnu úmrtnos ť pri každej koncen ­
trácii a kontrolu (a tiež kontrolu s pomocnou látkou, ak je to potrebné) pri všetkých odporu čených pozorovacích časoch, 
— graf závislosti koncentrácia/percentá na konci testu, — ak je to možné, hodnoty LC
 50 pri každom z odporu čených pozo ­
rovacích časov (s 95 % limitom spo ľahlivosti), 
— štatistické postupy použité pri stanovení hodnôt LC  50 , 
— výsledky získané s referen čnou látkou, ak sa použila; 
— najvyššiu testovanú koncentráciu nespôsobujúcu úmrtnos ť počas 
celého testu, 
— najnižšiu testovanú koncentráciu spôsobujúcu 100 % úmrtnos ť 
počas celého testu.  
4. ODKAZY  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates. 
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985. 
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-305 June 1985. 
(4) ISO 7346/1, /2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Bra ­
chydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: 
Flow-through method. 
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden – Part II 1974. 
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L 1) und L(15). (7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. (8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata , 1980. 
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Commitee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979. 
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, fourteen edition, APHA-AWWAWPCF, 1975. 
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979. 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewerrung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. 
(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99. 
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978. 
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793–821. 
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3 – 32. 
(19) Stephan, C. E. Method for calculating an LC
 50 Toxicology and 
Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 
1977, 65 – 84. 
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and 
Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC
 50 US EPA.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Dodatok 1  
Rekonštituovaná voda  
Príklad vhodnej rozpúš ťacej vody  
Všetky chemické látky musia by ť analytickej čistoty. 
Voda má by ť destilovaná, dobrej kvality alebo deionizovaná s vodivos ťou menej 
ako 5 μScm  -1 . 
Prístroj na destiláciu vody nesmie obsahova ť žiadne časti vyrobené z medi.  
Zásobné roztoky  
CaCl  2 .2H2O (dihydrát chloridu vápenatého): 
Rozpustite vo vode a dopl ňte vodou na 1 liter. 11,76 g 
MgS0  4 .7H2O (heptahydrát síranu hore čnatého): 
Rozpustite vo vode a dopl ňte vodou na 1 liter. 4,93 g 
NaHCO  3 (hydrouhli čitan sodný): 
Rozpustite vo vode a dopl ňte vodou na 1 liter. 2,59 g 
KCl (chlorid draselný): 
Rozpustite vo vode a dopl ňte vodou na 1 liter. 0,23 g  
Rekonštituovaná rozpúš ťacia voda  
Zmiešajte 25 ml z každého zo štyroch zásobných roztokov a dopl ňte do 1 litra 
vodou. 
Prevzdušňujte, pokia ľ sa koncentrácia rozpusteného kyslíka nebude rovna ť 
koncentrácii nasýtenia vzdušným kyslíkom. 
Hodnota pH by mala by ť 7,8 ± 0,2. 
Ak je to potrebné, upravte pH s NaOH (hydroxidom sodným) alebo s HCl 
(kyselinou chlorovodíkovou). 
Takto pripravená rozpúš ťacia voda sa nechá stá ť asi 12 hodín a nesmie sa ďalej 
prevzdušňovať. 
Celkové množstvo Ca a Mg iónov v tomto roztoku je 2,5 mmol na liter. Pomer 
Ca: Mg iónov je 4: 1 a pomer Na: K iónov je 10: 1. Celková alkalita roztoku je 
0,8 mmol na liter. 
Žiadna odchýlka pri príprave rozpúš ťacej vody nesmie zmeni ť zloženie ani 
vlastnosti vody.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Dodatok 2  
Druhy rýb odporu čených na testovanie  
Odporučený druh Odporučený 
rozsah teplôt pri 
teste(  o C) Odporučená 
celková d ĺžka rýb 
(cm) 
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton – Buchanan), danio pruhované 20 až 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque), Fathead minnow 20 až 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758), kapor oby čajný 20 až 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck a Schlegel 
1850), halan čík japonský 20 až 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859), pávie o čko 20 až 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque, Linneanus 1758), 
slnečnica modrá 20 až 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988), pstruh dúhový 12 až 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
neanus 1758), jalec zlatý 20 až 24 6,0 ± 2,0  
Získavanie rýb  
Ryby uvedené v zozname vyššie sa dajú ve ľmi dobre chova ť a sú dostupné 
počas celého roka. Dajú sa dobre rozmnožova ť a chovať na rybárskych farmách 
alebo v laboratóriu, za kontrolovaných podmienok, čo sa týka ochorení 
a parazitov, takže testované zvieratá sú zdravé a známeho rodi čovského pôvodu. 
Tieto ryby sú dostupné v mnohých častiach sveta.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Dodatok 3  
Príklad krivky závislosti mortality, vyjadrenej v percentách, od koncentrácie  
Príklad stanovenia LC  50 na pravdepodobnostnom logaritmickom papieri
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. TEST AKÚTNEJ IMOBILIZÁCIE DAFNIÍ  (DAPHNIA  SP.)  
1. METÓDA  
Táto metóda testu akútnej imobilizácie je ekvivalentná OECD TG 
202 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda opisuje test akútnej toxicity na posúdenie ú činkov 
chemikálií na dafnie. Existujúce testovacie metódy sa použili 
v najväčšom možnom rozsahu – pozri (1, 2, 3).  
1.2. VYMEDZENIE POJMOV 
V kontexte tejto metódy sa používajú tieto definície:  
EC 50 : je koncentrácia odhadnutá na imobilizovanie 50 % dafnií 
počas stanovenej expozi čnej doby; ak sa použije iná definícia, 
musí sa to zaznamena ť spolu s príslušným odkazom.  
Imobilizácia:  Tie živočíchy, ktoré nedokážu pláva ť do 15 sekúnd po 
jemnom premiešaní testovacej nádoby, sa pokladajú za imobilizo ­
vané (a to aj ke ď ešte stále dokážu pohybova ť svojimi tykadlami).  
1.3. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Mladé dafnie, ktoré sú na za čiatku testu mladšie ako 24 hodín, sú 
počas 48 hodín exponované testovanej chemickej látke v rôznych 
koncentráciách. Imobilizácia sa zaznamenáva po 24 hodinách a 48 
hodinách sa porovnáva s kontrolnými hodnotami. Výsledky sa analy ­
zujú, aby sa vypo čítali hodnoty EC  50 po 48 h (pozri definície 
uvedené v oddiele 1.2). Stanovenie hodnoty EC  50 po 24 hodinách 
je voliteľné. 
1.4. ÚDAJE O TESTOVANEJ CHEMICKEJ LÁTKE 
Pre testovanú látku by mala by ť známa rozpustnos ť vo vode a tlak 
pary a ďalej by mala by ť dostupná spo ľahlivá analytická metóda na 
stanovenie koncentrácie danej látky v testovacom roztoku udanou 
účinnosťou výťažnosti a mala by by ť dostupná medza stanovenia. 
Medzi užito čné informácie patrí štruktúrny vzorec, čistota látky, 
stabilita vo vode alebo na svetle, P  ow a výsledky testu biodegradácie 
(pozri metódu C.4). 
Poznámka: Usmernenie na testovanie látok, ktorých testovanie je 
v dôsledku ich fyzikálno-chemických vlastností ťažko uskuto čni­
teľné, sú uvedené v odkazoch na literatúru (4).  
1.5. REFEREN ČNÉ CHEMICKÉ LÁTKY 
Ako prostriedok na zaistenie spo ľahlivých testovacích podmienok 
možno referen čnú látku testova ť so zreteľom na hodnotu EC  50 . Na 
tento účel sa odporú ča použiť toxické látky používané pri medziná ­
rodných kruhových testoch – pozri odkazy na literatúru (1, 5) (  1 ). 
Test (testy) s referen čnou chemickou látkou by sa mali vykonáva ť 
prednostne každý mesiac a najmenej dvakrát ro čne. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Vo výsledkoch týchto medzilaboratórnych testov a technických korigendách k norme 
ISO 6341 sa udáva hodnota EC  50 po 24 hodinách pre dvojchróman draselný (K  2 Cr 2 O 7 ) 
v rozsahu od 0,6 mg/l do 1,7 mg/l.
 1.6. KVALITATÍVNE KRITÉRIÁ 
Platnosť testu je podmienená splnením týchto kritérií: 
— v kontrolných vzorkách, vrátane kontrolnej vzorky obsahujúcej 
solubiliza čné činidlo, by nemalo by ť imobilizovaných viac ako 
10 % dafnií, 
— koncentrácia rozpusteného kyslíka na konci testu by mala zodpo ­
vedať hodnote > 3 mg/l v kontrolných a testovacích nádobách. 
Poznámka: Pri prvom kritériu by viac ako 10 % kontrolných dafnií 
nemalo vykazova ť imobilizáciu ani iné príznaky ochorenia alebo 
stresu, napríklad zmenu sfarbenia, nezvy čajné správanie, ako je 
napríklad uviaznutie na hladine vody.  
1.7. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.7.1.  Aparatúra  
Testovacie nádoby a iná aparatúra, ktoré prídu do styku s testovacími 
roztokmi, by mali by ť vyrobené výlu čne zo skla alebo iného 
chemicky inertného materiálu. Testovacími nádobami sú bežne 
sklené skúmavky alebo kadi čky; pred každým použitím by sa mali 
vyčistiť štandardnými laboratórnymi postupmi. Testovacie nádoby 
by sa mali vo ľne prekry ť, aby sa znížili straty vody v dôsledku 
odparovania a aby sa predišlo vnikaniu prachu do roztokov. Prchavé 
látky by sa mali testova ť v úplne zaplnených a uzavretých nádobách 
dostatočne veľkých, aby sa zabránilo limitným alebo príliš nízkym 
koncentráciám kyslíka (pozri oddiel 1.6 a prvý odsek oddielu 1.8.3). 
Okrem toho sa budú používa ť niektoré alebo všetky tieto zariadenia: 
oxymeter (s mikroelektródou alebo iným vhodným sníma čom na 
meranie rozpusteného kyslíka vo vzorkách s malým objemom); pH-meter; zodpovedajúca aparatúra na kontrolu teploty; vybavenie 
na stanovenie celkovej koncentrácie organického uhlíka (TOC); 
vybavenie na stanovenie chemickej spotreby kyslíka (COD); vyba ­
venie na stanovenie tvrdosti at ď.
 
1.7.2.  Testovacie organizmy  
Preferovaným testovacím druhom  Daphnia magna  Straus, aj ke ď pri 
tomto teste možno takisto použi ť ďalšie vhodné druhy dafnií 
(napríklad  Daphnia pulex).  Na začiatku testu by živo číchy mali 
byť mladšie ako 24 hodín a na zníženie variability sa dôrazne odpo ­
rúča, aby neboli z prvej generácie potomkov. Mali by pochádza ť zo 
zdravého rodu (t. j. bez príznakov stresu, ako napríklad vysoká 
mortalita, prítomnos ť samcov a efipií, oneskorené liahnutie prvých 
potomkov, zmena sfarbenia organizmov at ď.). Všetky organizmy 
použité v konkrétnom teste by mali pochádza ť z kultúr vypestova ­
ných z rovnakého rodu dafnií. Tento rod živo číchov sa musí ucho ­
vávať v kultiva čných podmienkach (svetlo, teplota, médium), ktoré 
sa podobajú podmienkam v použitom teste. Ak sa má v teste použi ť 
kultivačné médium odlišné od rutinného kultiva čného média dafnií, 
je správnou praxou zaradi ť predtestové aklimatiza čné obdobie. Na 
tento účel by sa generácia dafnií mala uchováva ť v riediacej vode pri 
testovacej teplote aspo ň počas 48 hodín pred za čiatkom testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Zadržiavacia a riediaca voda  
Prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná 
voda alebo odchlórovaná voda z vodovodu sú prijate ľné ako zadržia ­
vacia a riediaca voda, ak v nej dafnie prežijú po čas celej kultivácie, 
aklimatizácie a testovania bez príznakov stresu. Každá voda, ktorá 
vyhovuje chemickým charakteristikám prijate ľnej riediacej vody 
podľa zoznamu uvedeného v dodatku 1, je vhodná ako testovacia 
voda. Počas trvania testu by si voda mala ma ť stálu kvalitu. Rekon ­ 
štituovanú vodu možno vyrobi ť pridaním špecifického množstva 
reagentov uznanej analytickej čistoty do deionizovanej alebo desti ­
lovanej vody. Príklady rekonštituovanej vody sú uvedené 
v odkazoch na literatúru (1), (6) a v dodatku 2. Je dôležité pozna ­
menať, že médiá obsahujúce známe chela čné činidlá, ako sú médiá 
M4 a M7 v dodatku 2, by sa nemali používa ť na testovanie látok 
obsahujúcich kovy. Hodnota pH by mala by ť v rozsahu od 6 do 
9. Pre  Daphnia magna  sa odporú ča tvrdosť vody v rozsahu od 140 
do 250 mg/l (ako CaCO  3 ), pričom pre ostatné druhy dafnií môže by ť 
vhodná aj nižšia tvrdos ť vody. Riediaca voda sa pred použitím 
v teste môže prevzduš ňovať, aby sa dosiahla nasýtená koncentrácia 
rozpusteného kyslíka. 
Ak sa používa prírodná voda, parametre kvality by sa mali mera ť 
aspoň dvakrát ro čne, alebo vždy, ke ď vznikne podozrenie, že sa tieto 
parametre mohli výrazne zmeni ť (pozri predchádzajúci odsek 
a prílohu 1). Mal by sa stanovi ť aj obsah ťažkých kovov (napríklad 
Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Ak sa používa odchlórovaná voda 
z vodovodu, odporú ča sa každodenná analýza obsahu chlóru. Ak 
riediaca voda pochádza z povrchového alebo podzemného zdroja vody, mali by sa stanovi ť jej vodivos ť a celkový organický uhlík 
(TOC) alebo chemického kyslíka (COD).
 
1.7.4.  Testovacie roztoky  
Testovacie roztoky so zvolenými koncentráciami sa zvy čajne pripra ­
vujú riedením základného roztoku. Zásobné roztoky by sa pred ­
nostne mali pripravova ť rozpustením testovanej látky v riediacej 
vode. V najvyššej možnej miere by sa malo zabráni ť použitiu 
rozpúšťadiel, emulgátorov alebo disperga čných činidiel. Tieto činidlá 
však môžu by ť v niektorých prípadoch potrebné na vytvorenie 
vhodne koncentrovaného zásobného roztoku. Usmernenie k výberu 
vhodných rozpúš ťadiel, emulga čných a disperga čných činidiel je 
uvedené v odkaze na literatúru (4). Testovaná látka by rozhodne nemala v testovacích roztokoch presiahnu ť hranicu rozpustnosti 
v riediacej vode. 
Test by sa mal vykona ť bez úpravy pH. Ak pH nezostane 
v rozmedzí 6 – 9, potom by sa mohol vykona ť druhý test, pri ktorom 
sa upraví pH základného roztoku na hodnotu, ktorú vykazuje riediaca voda pred pridaním testovanej látky. Úprava hodnoty pH by sa mala vykona ť tak, aby sa významne nezmenila koncentrácia 
zásobného roztoku a aby nedošlo k chemickej reakcii alebo zrážaniu 
testovanej látky. Prednos ť sa dáva použitiu HCl a NaOH.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. POSTUP  
1.8.2.  Podmienky expozície  
1.8.1.1.  Testované skupiny a kontrolné vzorky  
Testovacie nádoby sa naplnia príslušným objemom riediacej vody 
a roztoku testovanej látky. Pomer objemov vzduchu a vody 
v nádobe by mal by ť rovnaký pre testovanú i kontrolnú skupinu. 
Potom sa do testovacích nádob vložia dafnie. Pre každú testovaciu koncentráciu a pre každú kontrolnú vzorku by sa malo použi ť 
najmenej 20 organizmov, rozdelených prednostne do štyroch skupín 
po piatich organizmoch. Na každý organizmus by sa malo použi ť 
aspoň 2 ml testovacieho roztoku (to znamená 10 ml pre 5 dafnií 
v každej testovacej nádobe). Ak nebude koncentrácia testovanej látky 
stála, test sa môže vykona ť s použitím polostatickej obnovy alebo 
prietokového systému. 
Okrem testovacej série sa musí vykona ť jedna séria kontrol 
s riediacou vodou, a ak je to relevantné, tak aj kontrolná séria 
obsahujúca solubiliza čné činidlo.
 
1.8.1.2.  Testovacie koncentrácie  
Ak nie sú dostupné informácie o toxicite testovanej látky, možno 
rozsah koncentrácií kone čného testu stanovi ť testom na stanovenie 
rozsahu. Na tento ú čel sa dafnie exponujú sérii široko odstup ňova­
ných koncentrácií testovanej látky. Každej testovacej koncentrácii by 
sa malo exponova ť päť dafnií po čas 48 hodín alebo po čas kratšieho 
času a opakovanie testu nie potrebné. Expozi čnú dobu možno skráti ť 
(napríklad na 24 hodín alebo menej), ak za kratší čas možné získa ť 
údaje pre test na zistenie rozsahu. 
Malo by sa použi ť najmenej pä ť testovacích koncentrácií. Tieto 
koncentrácie by mali tvori ť geometrický rad s rozde ľovacím koefi ­
cientom, ktorý by nemal presiahnu ť 2,2. Použitie menej ako 5 
koncentrácií by sa malo zdôvodni ť. Podľa možnosti by najvyššia 
testovaná koncentrácia mala vyvola ť 100 % imobilizáciu 
a najnižšia testovaná koncentrácii by nemala ma ť pozorovate ľné 
účinky.  
1.8.2.3.  Inkuba čné podmienky  
Teplota by sa mala by ť v rozsahu od 18  o C do 22  o C a pri každom 
jednotlivom teste by teplota ma by ť stála v rozpätí ± 1  o C. Odporú ča 
sa cyklus so 16 hodinami svetla a 8 hodinami tmy. Úplná tma je 
takisto prijate ľná, najmä pre testované látky nestabilné na svetle. 
Testovacie nádoby sa po čas testu nesmú prevzduš ňovať. Test sa 
vykonáva bez úpravy hodnoty pH. Dafnie by sa po čas testu nemali 
kŕmiť. 
1.8.1.4.  Dĺžka trvania testu  
Dĺžka trvania testu je 48 hodín.  
1.8.2.  Pozorovania  
V každej testovacej nádobe by sa mal skontrolova ť počet imobilizo ­
vaných dafnií po 24 a 48 hodinách od za čiatku testu (pozri definície 
v oddiele 1.2). Okrem imobility by sa malo zaznamena ť aj nezvy ­ 
čajné správanie alebo vzh ľad. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analytické merania  
Koncentrácie rozpusteného kyslíka a pH sa merajú na za čiatku a na 
konci testu v kontrolných vzorkách a pri najvyššej koncentrácii testo ­
vanej látky. Koncentrácia rozpusteného kyslíka v kontrolných testoch 
by mala zodpoveda ť kritériu validity (pozri oddiel 1.6). Za bežných 
okolností by sa hodnota pH pri žiadnom teste nemala zmeni ť o viac ako 
o 1,5 jednotky. Teplota sa zvy čajne meria v kontrolných nádobách 
alebo v okolitom vzduchu a mala by sa zaznamenáva ť prednostne 
nepretržite po čas testu alebo aspo ň na jeho za čiatku a na konci. 
Koncentrácia testovanej látky by sa mala zmera ť aspoň pri najvyššej 
a najnižšej testovacej koncentrácii a na za čiatku a na konci testu (4). 
Odporúča sa, aby výsledky boli založené na zmeraných koncentrá ­
ciách. Ak je však k dispozícii dôkaz preukazujúci, že po čas celého 
testu bola koncentrácia testovanej látky uspokojivo udržiavaná v rozmedzí ± 20 % menovitej alebo po čiatočnej nameranej koncen ­
trácie, je možné výsledky založi ť na menovitých alebo nameraných 
počiatočných hodnotách.
 
1.9. LIMITNÝ TEST 
Pomocou postupov opísaných v tejto metóde možno vykona ť limitný 
test so 100 mg/l testovanej látky alebo do výšky jej rozpustnosti 
v testovacom médiu (pod ľa toho, ktorá hodnota je nižšia) s cie ľom 
preukázať, že hodnota EC  50 je vyššia ako táto koncentrácia. Limitný 
test treba vykona ť s použitím 20 dafnií (pod ľa možnosti rozdelených 
do štyroch skupín po piatich dafniách), pri čom rovnaký po čet orga­
nizmov je aj v kontrolných testoch. Ak dôjde k imobilizácii, mala by sa vykona ť úplná štúdia. Akéko ľvek nenormálne správanie orga ­
nizmov by sa malo zaznamena ť.
 
2. ÚDAJE  
Údaje by sa mali zhrnú ť v tabuľkovej podobe, pri čom pri každej 
exponovanej skupine a kontrolnom teste je potrebné uvies ť počet 
použitých dafnií a imobilizáciu pri každom pozorovaní. Percentuálny podiel imobilizovaných organizmov za 24 hodín a 48 hodín sa 
vynesie vzh ľadom na testované koncentrácie. Údaje sa analyzujú 
pomocou vhodných štatistických metód (napríklad probitová analýza atď.) s cieľom vypočítať sklon kriviek a hodnôt EC
 50 s 95 % inter ­
valmi spo ľahlivosti (p = 0,05) (7), (8). 
Ak nemožno zo získaných údajov vypo čítať EC  50 štandardnými 
metódami, mala by by ť hodnota EC  50 aproximovaná ako geome ­
trická stredná hodnota z najvyššej koncentrácie nespôsobujúca 
imobilizáciu a najnižšej koncentrácie spôsobujúcej 100 % imobilitu.  
3. VYKAZOVANIE  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o vykonaní testu musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— fyzikálna podstata a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— identifika čné chemické údaje vrátane čistoty. 
Testovací živo číšny druh: 
— zdroj a živo číšny druh  Daphnia,  dodávate ľ zdroja (ak je známy) 
a použité kultiva čné podmienky (vrátane zdroja, druhu 
a množstva potravy, frekvencie k ŕmenia). 
Testovacie podmienky: 
— opis testovacích nádob: typ nádob, objem roztoku, po čet dafnií 
v každej testovacej nádobe, po čet testovacích nádob (replikáty) 
na jednu koncentráciu, 
— metódy prípravy zásobných a testovacích roztokov vrátane 
použitia akýchko ľvek rozpúš ťadiel alebo disperga čných činidiel, 
použité koncentrácie, 
— podrobnosti o riediacej vode: zdroj a kvalitatívne charakteristiky 
vody (pH, tvrdos ť, pomer Ca/Mg, pomer Na/K, zásaditos ť, vodi­
vosť atď.); zloženie rekonštituovanej vody, ak sa použila, 
— inkuba čné podmienky: teplota, intenzita svetla a jeho periodicita, 
rozpustený kyslík, pH at ď. 
Výsledky: 
— počet a percentuálny podiel dafnií, ktoré boli imobilizované alebo 
u ktorých sa prejavili nejaké nežiaduce ú činky (vrátane nenor ­
málneho správania) v kontrolných vzorkách a v každej expono ­
vanej skupine v jednotlivých časoch pozorovania, a opis povahy 
pozorovaných ú činkov, 
— výsledky a dátum vykonania testu s referen čnou látkou, ak sú 
dostupné, 
— menovité testovacie koncentrácie a výsledky všetkých analýz na 
stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacích nádobách; 
takisto by sa mala uvies ť výťažnosť metódy a medzu stanovenia, 
— všetky fyzikálno-chemické merania teploty, pH a rozpusteného 
kyslíka vykonávané po čas testu, 
— hodnota EC  50 po 48 hodinách pre imobilizáciu spolu s uvedením 
intervalov spo ľahlivosti a grafmi upraveného modelu použitého 
na výpočet tejto hodnoty, sklony kriviek závislosti odozvy od 
dávky a ich smerodajná chyba; štatistické postupy použité na stanovenie hodnoty EC
 50 ; (ak sa tieto parametre merali aj pre 
imobilizáciu po 24 hod., mali by sa taktiež uvies ť), 
— vysvetlenie akejko ľvek odchýlky od testovacej metódy a toho, či 
táto odchýlka ovplyvnila výsledky testu.  
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996. 
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada. 
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000. 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). 
Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the 
ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daphnia.  
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998. 
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
 50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and JL. 
Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing and Materials. Pp 65 – 84 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3
 rd ed. 
London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
DODATOK 1  
NIEKTORÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PRIJATE ĽNEJ 
RIEDIACEJ VODY  
Látka Koncentrácia  
Tuhé častice < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l 
Neionizovaný čpavok < 1 μg/l 
Reziduálny chlór < 10 μg/l 
Celkové organofosfátove pesticídy < 50 ng/l Celkové organofosfátove pesticídy a polychlórované bife ­
nyly < 50 ng/1 
Celkový organický chlór < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
DODATOK 2  
PRÍKLADY VHODNEJ REKONŠTITUOVANEJ TESTOVACEJ VODY  
Testovacia voda ISO (1)  
Zásobné roztoky (jedna látka) Na prípravu rekonštituovanej 
vody pridajte toto množstvo 
základného roztoku do 1 litra 
vody (*) Látka Množstvo pridané do 1 
litra vody (*)  
Chlorid vápenatý 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Síran hore čnatý 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Uhličitan sodný 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Chlorid draselný 
KC1 0,23 g 25 ml  
(*) Voda s primeranou čistotou, napr. deionizovaná, destilovaná, prípadne voda získaná 
reverznou osmózou s vodivos ťou, ktorá by nemala presahova ť 10 μS.cm  -1 . 
Elendtovo médium M7 a M4  
Aklimatizácia na Elendtovo médium M4 a M7  
V niektorých laboratóriách mali ťažkosti pri priamom prenose dafnií do médií 
M4 a M7. Na druhej strane sa však dosiahol ur čitý úspech s postupnou aklima ­
tizáciou, t. j. prenosom z vlastného média do 30 % Elendtovho média, potom do 60 % Elendtovho média a následne do 100 % Elendtovho média. Potrebná d ĺžka 
aklimatiza čného obdobia môže by ť až jeden mesiac.
 
Príprava  
Stopové prvky  
Vo vode vykazujúcej vhodnú čistotu, napríklad v deionizovanej, destilovanej, 
prípadne vo vode získanej reverznou osmózou, sa najprv pripravia samostatné 
zásobné roztoky (I) jednotlivých stopových prvkov. Z týchto oddelených zásob ­
ných roztokov (I) sa pripraví jeden zásobný roztok (II), ktorý obsahuje všetky stopové prvky (kombinovaný roztok), t. j.:
 
Zásobný(-é) roztok(-y) I (jedna 
látka) Množstvo pridané do 
vody (mg/l) Koncentrácia 
(vzhľadom na médium 
M4) Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku II 
pridajte do vody toto množstvo základného 
roztoku I (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-násobná 1,0 0,25 
MnCl  2 4H 2 O 7 210 20 000-násobná 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-násobná 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Zásobný(-é) roztok(-y) I (jedna 
látka) Množstvo pridané do 
vody (mg/l) Koncentrácia 
(vzhľadom na médium 
M4) Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku II 
pridajte do vody toto množstvo základného 
roztoku I (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-násobná 1,0 0,25 
SrCl  2 6H 2 O 3 040 20 000-násobná 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-násobná 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 2H 2 O 1 230 20 000-násobná 1,0 0,25 
CuCl  2 2H 2 O 335 20 000-násobná 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-násobná 1,0 1,0 
CoCl  2 6H 2 O 200 20 000-násobná 1,0 1,0 
KI 65 20 000-násobná 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000-násobná 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-násobná 1,0 1,0 
Na 2 EDTA 2H  2 O 5 000 20 000-násobná — — 
FeSO  4 7H 2 O 1 991 20 000-násobná — — 
Ako roztok Na 2 EDTA, tak roztok FeSO  4 sa pripraví samostatne, zlejú sa spolu a ihne ď sa ošetria v autokláve. 
Týmto sa získa: 
2 1 Fe-EDTA roztoku 1 000-násobná 20,0 5,0  
Médiá M4 aM7  
Médiá M4 a M7 sa pripravia pomocou zásobného roztoku II, makroživín 
a vitamínov takto:  
Množstvo pridané do 
vody (mg/l) Koncentrácia 
(vzhľadom na médium 
M4) Množstvo zásobného roztoku II pridané na 
prípravu média II (ml/l) 
M4 M7  
Zásobný roztok II (kombi ­
nované stopové prvky) 20-násobná 50 50 
Zásobné roztoky 
s obsahom makroživiny 
(jedna látka) 
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800 1 000-násobná 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000-násobná 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000-násobná 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000-násobná 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000-násobná 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-násobná 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-násobná 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000-násobná 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Množstvo pridané do 
vody (mg/l) Koncentrácia 
(vzhľadom na médium 
M4) Množstvo zásobného roztoku II pridané na 
prípravu média II (ml/l) 
M4 M7  
Zásobný roztok s obsahom 
viacerých vitamínov — 10 000-násobná 0,1 0,1 
Zásobný roztok s obsahom viacerých vitamínov sa pripraví pridaním 3 vitamínov do 1 litra vody týmto spôsobom: 
Thiamín hydrochlorid 750 10 000-násobná 
Kyanokobalamín (B  12 ) 10 10 000-násobná 
Biotín 7,5 10 000 
Kombinovaný vitamínový zásobný roztok sa skladuje zmrazený v malých alik ­
vótnych častiach. Vitamíny sa pridávajú do média tesne pred použitím. 
Poznámka: Precipitácii solí po čas prípravy kompletného média sa zabráni 
pridaním alikvotných množstiev zásobných roztokov do približne 
500 – 800 ml deionizovanej vody a potom sa objem doplní na 1 liter. 
Poznámka: Prvýkrát boli informácie o médiu M4 uverejnené v práci Elendt, 
B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Proto ­
plasma, 154, 25 – 33.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. SLADKOVODNÉ RIASY A SINICE, TEST INHIBÍCIE RASTU  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1. ÚVOD 
Testovacie metódy sa pravidelne revidujú a aktualizujú vzh ľadom na 
vedecký pokrok. Bolo potrebné revidova ť testovaciu metódu C.3 tak, 
aby zahŕňala ďalšie druhy a sp ĺňala požiadavky posudzovania rizika 
a aby bola uvedená klasifikácia chemických látok. Revízia sa usku ­
točnila na základe rozsiahlych praktických skúseností, vedeckého 
pokroku v oblasti štúdií toxicity rias a rozsiahleho regula čného 
využitia, ktoré od pôvodného prijatia metódy nastali.  
1.2. VYMEDZENIE POJMOV 
Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy a skratky:  
Biomasa : je suchá hmotnos ť živej hmoty nachádzajúcej sa 
v populácii, vyjadrená ako daný objem, napr. mg rias/liter testova ­
ného roztoku. „Biomasa“ je obvykle definovaná ako hmotnos ť, ale 
v tomto teste sa toto slovo používa na vyjadrenie hmotnosti na objem. V tomto teste biomasu vyjadruje napr. aj po čet buniek, fluo ­
rescencia at ď., ktoré sa bežne merajú, a teda používanie pojmu 
„biomasa“ sa vz ťahuje aj na tieto náhradné kritériá.  
Koeficient odchýlky : je bezrozmerná hodnota premenlivosti para ­
metra definovaná ako pomer štandardnej odchýlky k strednej 
hodnote. Môže sa vyjadri ť aj ako percentuálna hodnota. Stredný 
koeficient odchýlky priemernej špecifickej rýchlosti rastu sa v paralelných kontrolných kultúrach vypo číta takto: 
1. Vypočítajte % KO priemerného špecifického rastu na základe 
každodenných rýchlostí rastu/rýchlostí rastu po častiach pre 
príslušné paralelky. 
2. Vypočítajte strednú hodnotu zo všetkých hodnôt vypo čítaných 
v bode 1 na získanie stredného koeficientu zmeny špecifickej dennej rýchlosti rastu/špecifickej rýchlosti rastu po častiach 
v paralelných kontrolných kultúrach.  
EC
 x : je koncentrácia testovanej látky rozpustená v testovacom 
médiu, ktorej následkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu testo ­
vaného organizmu v rámci stanoveného času expozície (je potrebné 
výslovne uvies ť, ak sa odchy ľuje od celkovej alebo obvyklej d ĺžky 
testu). Na jednozna čné zaznamenanie hodnoty EC odvodenej od 
rýchlosti rastu sa používa symbol „E  r C“ alebo symbol „E  y C“ na 
zaznamenanie hodnoty z vý ťažku.  
Rastové médium : je kompletné syntetické kultiva čné médium, 
v ktorom testovaná riasa rastie v prítomnosti testovanej látky (expo ­
zícii, ktorej je vystavená). Testovaná látka sa za normálnych 
podmienok rozpustí v testovanom médiu.  
Rýchlosť rastu  (priemerná špecifická rýchlos ť rastu ): je logarit ­
mickým nárastom biomasy po čas času expozície testovanou látkou.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Najnižšia koncentrácia s pozorovate ľnými účinkami (LOEC) : je 
najnižšia testovaná koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje, že látka má 
štatisticky významný ú činok na zníženie rastu (pri p < 0,05) 
v porovnaní s kontrolou v rámci daného času expozície. Škodlivý 
účinok všetkých testovaných koncentrácií nad LOEC sa však vždy 
rovná alebo je vä čší ako účinky pozorované pri LOEC. Ak nie sú 
splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnú ť úplné vysvetle ­
nie, akým spôsobom sa zvolila LOEC (a teda aj NOEC).  
Koncentrácia bez pozorovaného ú činku (NOEC) : je testovaná 
koncentrácia bezprostredne pod LOEC.  
Hodnota reakcie : je premenná hodnota na odhad toxicity odvodená 
z akýchko ľvek stanovených parametrov opisujúcich biomasu 
rôznymi metódami výpo čtu. V prípade tejto metódy sú rýchlosti 
rastu a vý ťažok hodnotami reakcie odvodenými priamo z merania 
biomasy alebo uvedených náhradných parametrov.  
Špecifická rýchlos ť rastu : je hodnota premennej reakcie definovaná 
ako kvocient rozdielu prirodzených logaritmov parametra pozoro ­
vania (v tejto testovacej metóde biomasy) a príslušného časového 
intervalu.  
Výťažok : je hodnota meranej premennej na konci času expozície 
mínus hodnota meranej premennej na za čiatku času expozície na 
vyjadrenie nárastu biomasy po čas testu.  
1.3. POUŽITE ĽNOSŤ TESTU 
Táto testovacia metóda sa dá naj ľahšie použi ť pre látky rozpustné vo 
vode, pri ktorých sa predpokladá, že za podmienok testu zostávajú vo 
vode. V prípade testovania látok, ktoré sú prchavé, silne sa adsorbujú, 
sú sfarbené, s nízkou rozpustnos ťou vo vode, alebo látky, ktoré môžu 
ovplyvniť dostupnos ť živín alebo minerálnych látok v testovacom 
médiu, môžu by ť potrebné ur čité modifikácie uvedeného postupu 
(napr. uzatvorený systém, úprava testovacích nádob). Usmernenia 
k niektorým vhodným úpravám sú uvedené v (2) (3) a (4).  
1.4. PRINCÍP TESTU 
Cieľom tohto testu je stanovi ť účinky látky na rast sladkovodných 
mikrorias a/alebo siníc. Exponenciálne rastúce testované organizmy 
sú vystavené testovanej látke v jednorazových kultúrach obvykle počas 72 hodín. Napriek pomerne krátkej d ĺžke testu sa môžu 
hodnotiť účinky na nieko ľkých generáciách. 
Reakciou systému je zníženie rastu v sérii kultúr rias (testované 
jednotky) vystavených rôznym koncentráciám testovanej látky. Reakcia sa hodnotila ako funkcia expozi čnej koncentrácie 
v porovnaní s priemerným rastom paralelných, nevystavených 
kontrolných kultúr. Na preukázanie úplnej reakcie systému na toxické ú činky (optimálna citlivos ť) sa kultúram umožní neobme ­
dzený exponenciálny rast v podmienkach s vhodnými živinami 
a nepretržité svetlo po čas času posta čujúceho na meranie zníženia 
špecifickej rýchlosti rastu.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Rast a inhibícia rastu sa kvantifikujú stanovením biomasy rias ako 
funkcie času. Biomasa rias je definovaná ako suchá hmotnos ť na 
objem, napr. mg rias/liter testovaného roztoku. Suchá hmotnos ť sa 
však zložito stanovuje, a preto sa používajú náhradné parametre. Z týchto náhradných parametrov sa naj častejšie používa po čet 
buniek. Iné náhradné parametre zah ŕňajú objem buniek, fluorescen ­
ciu, optickú hustotu at ď. Je potrebné pozna ť prepočítavací koeficient 
medzi meraným náhradným parametrom a biomasou. 
Konečným bodom testu je inhibícia rastu vyjadrená ako logaritmický 
nárast biomasy (priemerná špecifická rýchlos ť rastu) po čas času 
expozície. Z priemerných špecifických rýchlostí rastu zaznamena ­
ných v sérii testovaných roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá 
spôsobuje špecifickú x % inhibíciu rýchlosti rastu (napr. 50 %), 
a vyjadrí sa ako E
 r C x (napr. E  r C 50 ). 
Na uplatnenie tejto metódy v regula čnom rámci EÚ by sa mal 
výpočet výsledkov opiera ť o priemernú špecifickú rýchlos ť rastu 
z dôvodov uvedených v odseku 2.2. Ďalšou hodnotou reakcie 
použitou v tejto testovacej metóde je vý ťažok, ktorý sa 
v niektorých krajinách vyžaduje na splnenie špecifických regula č­
ných požiadaviek. Definovaný je ako biomasa na konci času expo­
zície mínus biomasa na za čiatku času expozície. Z vý ťažkov zazna ­
menaných v sérii testovaných roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá 
spôsobuje špecifickú x % inhibíciu vý ťažku (napr. 50 %), a vypo číta 
sa a vyjadrí ako E  y C x (napr. E  y C 50 ). 
Okrem toho možno štatisticky stanovi ť najnižšiu koncentráciu 
s pozorovate ľnými účinkami (LOEC) a koncentráciu bez pozorova ­
ného účinku (NOEC).  
1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Informácie o testovanej látke, ktoré môžu by ť užitočné pri stanovo ­
vaní testovacích podmienok, zah ŕňajú štrukturálny vzorec, čistotu, 
svetelnú stálos ť, stabilitu pri skúšobných podmienkach, vlastnosti 
týkajúce sa absorpcie svetla, pKa a výsledky štúdií transformácie 
vrátane biologickej odbúrate ľnosti vo vode. 
Rozpustnos ť vo vode, rozde ľovací koeficient oktanol-voda (P  ow ) a tlak 
pary testovanej látky musia by ť známe a musí by ť k dispozícii valido ­
vaná metóda na kvantifikáciu látky v testovaných roztokoch so zazna ­
menanou vý ťažnosťou a detek čný limit.  
1.6. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Referenčná(-é) látka(-y), ako napr. 3,5-dichlórfenol, používané 
v medzinárodnej kruhovej skúške (4) sa môže(-u) testova ť ako 
prostriedok kontroly postupu testu. Pre zelené riasy sa môže použi ť 
ako referen čná látka aj dvojchroman draselný. Referen čnú látku je 
potrebné testova ť aspoň dvakrát do roka.  
1.7. PLATNOS Ť TESTU 
Test je platný, ak sú splnené tieto kritériá:  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomasa v kontrolných kultúrach sa musí exponenciálne zvýši ť 
aspoň o faktor 16 po čas 72-hodinového času testu. To je v súlade 
so špecifickou rýchlos ťou rastu 0,92 de ň –1 . Rýchlos ť rastu je 
obvykle podstatne vyššia pre naj častejšie používané druhy (pozri 
dodatok 1). Toto kritérium sa nemusí splni ť, ak sa používajú 
druhy, ktoré rastú pomalšie ako druhy, ktoré sú uvedené 
v dodatku 1. V tomto prípade sa čas testu pred ĺži, aby sa 
dosiahol aspo ň 16-násobný rast v kontrolných kultúrach, pri čom 
počas trvania testu musí by ť rast exponenciálny. Trvanie testu sa 
môže skráti ť najmenej na 48 hod., aby sa zachoval neobmedzený 
exponenciálny rast po čas testu, pokia ľ sa dosiahol minimálny 
multiplika čný faktor 16. 
— Priemerný koeficient odchýlky pre špecifické rýchlosti rastu po 
častiach (dni 0 – 1, 1 – 2 a 2 – 3 pre 72-hodinové testy) 
v kontrolných kultúrach (pozri oddiel 1.2 pod nápisom „koefi ­
cient odchýlky“) nesmie by ť väčší ako 35 %. Pozri druhý 
odsek v oddiele 2.2.1 na výpo čet špecifických rýchlostí rastu 
po častiach. Toto kritérium platí na strednú hodnotu koeficientov 
odchýlky vypo čítanú pre paralelné kontrolné kultúry. 
— Koeficient odchýlky priemerných špecifických rýchlostí rastu 
počas celého času testu v paralelných kontrolných kultúrach 
nesmie by ť väčší ako 7 % v testoch s  Pseudokirchneriella subca ­
pitata  a Desmodesmus subspicatus . Pre iné, menej často testo ­
vané druhy nesmie hodnota presiahnu ť 10 %.  
1.8. OPIS METÓDY  
1.8.1.  Prístroje  
Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku 
s testovanými roztokmi, musia by ť celé zo skla alebo iného 
chemicky inertného materiálu. Predmety sa musia dôkladne umy ť, 
aby sa zabezpe čilo, že žiadne organické ani anorganické kontami ­
nanty neovplyvnia rast rias ani zloženie testovaných roztokov. 
Testovacími nádobami sú zvy čajne sklené banky s rozmermi, ktoré 
umožnia dosta čujúci objem kultúry pre merania po čas testu a prenos 
dostatočného množstva CO  2 z atmosféry (pozri druhý odsek v oddiele 
1.8.9). Pamätajte, že objem kvapaliny musí by ť postačujúci pre 
analytické stanovenia (pozri piaty odsek v oddiele 1.8.11). 
Okrem toho budú potrebné niektoré z týchto zariadení: — prístroj na kultiváciu: miestnos ť alebo priestor, v ktorom sa môže 
udržiavať inkubačná teplota v rozmedzí ± 2 °C; 
— prístroje na meranie svetla: je dôležité pripomenú ť, že metóda 
merania intenzity svetla, a najmä typ receptora (kolektora) 
ovplyvní hodnotu merania. Merania by sa mali prednostne usku ­
točniť s použitím gu ľových (4 π) receptorov (ktoré reagujú na 
priame a odrazené svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou 
merania) alebo 2 π receptora (ktorý reaguje na svetlo zo všetkých 
uhlov nad rovinou merania);
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— prístroj na stanovenie biomasy rias. Po čet buniek, ktorý je naj čas­
tejšie používaným náhradným parametrom za biomasu rias, sa 
môže vypo čítať s použitím elektronického po čítadla častíc, 
mikroskopu s po čítacou komôrkou alebo prietokovým cytome ­
trom. Iné náhradné parametre za biomasu možno zmera ť 
s použitím prietokového cytometra, fluorimetra, spektrofotometra 
alebo kolorimetra. Na výpo čet je potrebný prepo čítavací faktor 
vzťahujúci sa na po čet buniek na suchú hmotnos ť. Na zabezpe ­ 
čenie potrebných meraní pri nízkych koncentráciách biomasy 
s použitím spektrofotometra môže by ť potrebné použi ť kyvety 
s dráhou svetla aspo ň 4 cm.  
1.8.2.  Testovacie organizmy  
Môžu sa použi ť viaceré druhy vo ľne rastúcich mikrorias a siníc. 
Ukázalo sa, že kmene uvedené v dodatku 1 sú vhodné pre postup 
testu uvedený v tejto testovacej metóde. 
V prípade použitia iných kme ňov je potrebné uvies ť v správe o teste 
kmeň/alebo pôvod. Musí by ť potvrdené, že sa môže zachova ť expo­
nenciálny rast zvolenej testovanej riasy po čas času testu za obvy ­
klých podmienok.  
1.8.3.  Rastové médium  
Odporúčajú sa dve alternatívne rastové médiá, OECD a AAP 
médium. Zloženie týchto médií je uvedené v dodatku 2. Pamätajte, 
že počiatočná hodnota pH a kapacita tlmenia (regulujúca nárast pH) 
oboch médií je rozdielna. Z tohto dôvodu môžu by ť výsledky testov 
odlišné v závislosti od použitého média, najmä ak sa testujú ionizu ­
júce látky. 
Na určité účely môže by ť potrebné modifikova ť rastové médium, 
napr. keď sa testujú kovy a chelata čné činidlá, alebo pri testovaní 
pri rôznych hodnotách pH. Použitie modifikovaného média sa musí 
podrobne opísa ť a odôvodni ť (3) (4).  
1.8.4.  Po čiatočná koncentrácia biomasy  
Počiatočná biomasa v testovaných kultúrach musí by ť rovnaká vo 
všetkých testovaných kultúrach a dostato čne nízka, aby umožnila 
exponenciálny rast po čas inkuba čného času bez rizika vy čerpania 
živín. Počiatočná biomasa by nemala by ť vyššia ako 0,5 mg/l, vyja ­
drená ako sušina. Odporú čajú sa tieto po čiatočné koncentrácie 
buniek:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10  3 – 10  4 bunky/ml  
Desmodesmus subspicatus  2 – 5 × 10  3 bunky/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 bunky/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 bunky/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 – 10  5 bunky/ml  
1.8.5.  Koncentrácie testovanej látky  
Rozsah koncentrácií, v ktorých sa môžu ú činky prejavi ť, sa môže 
stanoviť na základe výsledkov testov na zistenie rozsahu. Pre 
konečný definitívny test sa zvolí aspo ň päť koncentrácií usporiada ­
ných v geometrickom rade s faktorom maximálne 3,2. Pre testované látky vykazujúce plochú krivku reakcie na koncentráciu sa môže 
zvoliť vyšší faktor. Séria koncentrácií musí prednostne pokrýva ť 
rozmedzie 5 % – 75 % inhibície rýchlosti rastu rias.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Paralelky a kontroly  
Test sa uskuto ční s tromi paralelkami pri každej testovanej koncen ­
trácii. Ak sa nevyžaduje stanovenie NOEC, môže sa test pozmeni ť 
a zvýšiť počet koncentrácií a zníži ť počet paraleliek na koncentráciu. 
Musia by ť aspoň 3 kontrolné paralelky a teoreticky by sa mal použi ť 
dvojnásobný po čet paraleliek pre každú testovanú koncentráciu. 
Môže sa pripravi ť oddelený súbor testovacích roztokov na analytické 
stanovenie testovanej látky (pozri štvrtý a šiesty odsek v oddiele 1.8.11). 
Ak sa na rozpustenie testovanej látky používa rozpúš ťadlo, musia sa 
v teste použi ť ďalšie kontroly obsahujúce rozpúš ťadlo v rovnakej 
koncentrácii, ako sa používa v testovaných kultúrach.  
1.8.7.  Príprava inokula  
Na prispôsobenie testovaných rias testovacím podmienkam 
a zabezpe čenie, aby sa riasy nachádzali v exponenciálnej fáze rastu, 
keď sa používajú na inokuláciu testovacích roztokov, sa pripraví 
inokulum v testovacom médiu 2 – 4 dni pred za čiatkom testu. 
Biomasa rias sa musí upravi ť, aby sa v inokule umožnil exponen ­
ciálny rast do za čiatku testu. Inokulum sa inkubuje za rovnakých 
podmienok ako testované kultúry. V inokule sa meria nárast 
biomasy, aby sa zabezpe čilo, že rast je v obvyklom rozsahu ako 
v prípade testovaného kme ňa za podmienok kultivácie. Príklad 
postupu na kultiváciu rias je opísaný v dodatku 3. Aby sa zabránilo súčasnému rozdeleniu buniek po čas testu, môže by ť potrebné usku ­
točniť druhý krok na rozmnoženie inokula.
 
1.8.8.  Príprava testovacích roztokov  
Všetky testovacie roztoky musia obsahova ť rovnaké koncentrácie 
rastového média a po čiatočnej biomasy testovanej riasy. Testovacie 
roztoky zvolených koncentrácií sa pripravujú obvykle zmiešaním zásobného roztoku testovanej látky s rastovým médiom 
a inokulom. Zásobné roztoky sa pripravujú obvykle rozpustením 
látky v testovacom médiu. 
Rozpúšťadlá, napr. acetón, t-butyl alkohol a dimetylformamid, sa 
môžu použi ť ako nosi če na pridávanie do testovacieho média látok 
s nízkou rozpustnos ťou vo vode (2) (3). Koncentrácia rozpúš ťadla 
nesmie by ť vyššia ako 100 μl/l a rovnaká koncentrácia rozpúš ťadla 
sa musí prida ť do všetkých kultúr (vrátane kontrol) v testovanej sérii.
 
1.8.9.  Inkubácia  
Uzavrite testovacie nádoby zátkami prepúš ťajúcimi vzduch. Nádoby 
sa pretrepú a umiestnia do kultiva čného prístroja. Po čas testu je 
potrebné ponecha ť riasy v suspenzii a umožni ť prenos CO  2 . Preto 
je potrebné neustále trepanie alebo miešanie. Kultúry sa musia ucho ­
vávať pri teplote v rozmedzí 21 °C až 24 °C s presnos ťou ± 2 °C. 
Pre iné druhy, ako sú uvedené v dodatku 1, napr. pre tropické druhy, môžu byť vhodné vyššie teploty pod podmienkou, že budú splnené 
kritériá platnosti. Odporú ča sa umiestni ť banky náhodne a denne ich 
v inkubátore premiest ňovať.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Počas testu by sa pH kontrolného média nemalo zvýši ť o viac ako 
1,5. Pre kovy a zlú čeniny, ktoré sa čiastočne ionizujú pri pH okolo 
testovacieho pH, môže by ť potrebné limitova ť kolísanie pH, aby sa 
získali reprodukovate ľné a presné výsledky. Odchýlka < 0,5 pH je 
technicky možná a dá sa dosiahnu ť zabezpečením prísunu dostato č­
ného množstva CO  2 z okolitého vzduchu do testovacieho roztoku, 
napr. zvýšením rýchlosti trepania. Inou možnos ťou je zníži ť spotrebu 
CO 2 znížením po čiatočnej biomasy alebo d ĺžky testu. 
Priestor, kde sa kultúry inkubujú, musí by ť kontinuálne osvetlený 
rovnomerným fluorescen čným osvetlením, napr. studeným bielym 
svetlom alebo denným svetlom. Kmene rias a sinice sa odlišujú, pokiaľ ide o požiadavky na svetlo. Je potrebné zvoli ť takú intenzitu, 
ktorá vyhovuje použitému testovanému organizmu. Pre odporú čané 
druhy zelených rias sa zvolí intenzita svetla na úrovni testovacích 
roztokov z rozsahu 60 – 120 μE·m
 –2 ·s –1 pri meraní vo fotosynteticky 
účinnom rozsahu vlnovej d ĺžky 400 – 700 nm s použitím vhodného 
receptora. Niektoré druhy, najmä  Anabaena flos-aquae , rastú dobre 
pri nižšej intenzite svetla a pri vyššej intenzite sa môžu poškodi ť. Pre 
takéto druhy je potrebné zvoli ť priemernú intenzitu svetla v rozmedzí 
40 – 60 μE·m  –2 ·s –1 . (Pre prístroje na meranie svetla kalibrované 
v luxoch príslušné rozmedzie 4 440 – 8 880 luxov pre studené 
biele svetlo zodpovedá približne odporú čanej intenzite svetla 
60 – 120 μE·m  –2 ·s –1 .) Počas inkubácie nesmie intenzita svetla 
kolísať viac ako ± 15 % priemernej intenzity svetla.  
1.8.10.  Dĺžka testu  
Dĺžka testu je obvykle 72 hodín. D ĺžka testu sa však môže skráti ť 
alebo pred ĺžiť pod podmienkou, že budú splnené všetky kritériá 
platnosti v oddiele 1.7.  
1.8.11.  Merania a analytické stanovenia  
Počas trvania testu sa v každej banke stanovuje množstvo biomasy 
minimálne jedenkrát za de ň. Ak sa merania uskuto čňujú s malými 
objemami odobratými z testovacieho roztoku pipetou, netreba ich 
nahradiť. 
Meranie biomasy sa uskuto čňuje manuálne po čítaním buniek 
pomocou mikroskopu alebo elektronickým po čítadlom častíc (ako 
počet buniek a/alebo biologický objem). Môžu sa použi ť alternatívne 
techniky, napr. prietoková cytometria,  in vitro  alebo  in vivo  chloro­
fylová fluorescencia (6) (7), alebo optická hustota, a uspokojivú koreláciu s biomasou možno preukáza ť množstvom biomasy vysky ­
tujúcim sa v teste. 
pH roztokov sa meria na za čiatku a na konci testu. 
Ak je dostupný analytický postup na stanovenie testovanej látky 
v použitom rozsahu koncentrácie, musia sa testovacie roztoky analy ­
zovať, aby sa skontrolovali po čiatočné koncentrácie a či sa počas 
testu zachovávajú expozi čné koncentrácie.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Analýza koncentrácie testovanej látky na za čiatku a na konci testu 
nízkej a vysokej testovanej koncentrácie a koncentrácie okolo pred ­
pokladaného EC  50 môže byť dostačujúca, ak je pravdepodobnos ť, že 
expozičné koncentrácie sa budú odlišova ť o menej ako 20 % nomi ­
nálnych hodnôt po čas testu. Odporú ča sa analýza všetkých testova ­
ných koncentrácií na za čiatku a na konci testu, ak nie je pravdepo ­
dobné, že koncentrácie budú v rozmedzí 80 % – 120 % nominálnych hodnôt. Pre prchavé, nestabilné alebo silne sa adsorbujúce testované látky sa odporú ča ďalší odber vzoriek na analýzu v 24-hodinových 
intervaloch po čas expozi čného času, aby sa lepšie stanovil úbytok 
testovanej látky. Pre tieto látky budú potrebné ďalšie paralelky. Vo 
všetkých prípadoch je potrebné stanovi ť koncentrácie testovanej 
látky iba v jednej paralelnej nádobe na každú testovanú koncentráciu 
(alebo na obsahy nádob rozdelené do paraleliek). 
S testovacím médiom pripraveným osobitne na analýzu expozi čných 
koncentrácií po čas testu sa musí zaobchádza ť rovnako ako s tými, ktoré 
sa používajú na testovanie, t. j. musia sa inokulova ť riasami 
a inkubova ť za rovnakých podmienok. Ak sa vyžaduje analýza rozpus ­
tenej testovanej látky, môže by ť potrebné separova ť riasy od média. Na 
separáciu sa prednostne použije centrifugácia pri nízkom g, dostatočnom na usadenie rias. 
Ak je dokázané, že koncentrácia látky, ktorá sa má testova ť, je 
v uspokojivej miere zachovaná v rozmedzí ± 20 % nominálnej hodnoty alebo nameranej po čiatočnej koncentrácie po čas testu, 
analýza výsledkov môže by ť založená na nominálnych hodnotách 
alebo nameraných po čiatočných hodnotách. Ak je odchýlka od nomi ­
nálnej alebo nameranej po čiatočnej koncentrácie vä čšia ako ± 20 %, 
analýza výsledkov musí by ť založená na geometrickej strednej 
koncentrácii po čas expozície alebo na modeloch opisujúcich pokles 
koncentrácie testovanej látky (3) (8). 
Inhibi
čný test rias je dynamickejším testovacím systémom ako 
väčšina iných krátkodobých testov toxicity pre vodné prostredie. 
V dôsledku toho môže by ť zložité stanovi ť skutočné expozi čné 
koncentrácie, najmä pre adsorbujúce sa látky testované pri nízkych koncentráciách. V takýchto prípadoch úbytok látky z roztoku na základe adsorpcie s narastajúcim množstvom biomasy rias nezna ­
mená, že sa z testovacieho systému stratil. Pri analýze výsledku 
testu by sa malo skontrolova ť, či zníženie koncentrácie testovanej 
látky v priebehu testu sprevádza zníženie inhibície rastu. Ak áno, môže sa zváži ť vhodný model, ktorý opisuje pokles koncentrácie 
testovanej látky (8). Ak nie, môže sa vyžadova ť, aby bola analýza 
výsledkov založená na po čiatočných (nominálnych 
alebo nameraných) koncentráciách.
 
1.8.12.  Iné pozorovania  
Musí sa uskuto čniť mikroskopické pozorovanie na overenie normál ­
neho a zdravého vzh ľadu inokula a na zistenie akéhoko ľvek neob ­
vyklého vzh ľadu rias ( čo môže by ť zapríčinené expozíciou testo ­
vanej látky) na konci testu.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Limitný test  
V určitých situáciách, napr. ke ď z predbežného testu vyplýva, že 
testovaná látka nemá žiadne toxické ú činky pri koncentráciách do 
100 mg·l  –1 alebo do jej limitu rozpustnosti v testovacom médiu 
(podľa toho, ktorá hodnota je nižšia), sa môže uskuto čniť limitný 
test umož ňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a jednej 
ošetrenej skupine (100 mg·l  –1 alebo koncentrácia rovnaká ako limit 
rozpustnosti). Dôrazne sa odporú ča, aby to bolo založené na analýze 
expozičnej koncentrácie. Na limitný test platia všetky už uvedené 
testovacie podmienky a kritériá platnosti s výnimkou, že musí by ť 
aspoň šesť ošetrených paraleliek. Hodnoty reakcie v kontrolnej 
a ošetrenej skupine sa môžu analyzova ť s použitím štatistického 
testu na porovnanie stredných hodnôt, napr. Študentov t-test. Ak variancie v oboch skupinách nie sú rovnaké, je potrebné uskuto čniť 
t-test upravený na nerovnaké variancie.
 
1.8.14.  Modifikácia pre silno sfarbené látky  
Ožarovanie (intenzita svetla) by malo by ť na najvyššom konci 
rozsahu predpísanom v tejto testovacej metóde: 120 μE m-2 s-1 
alebo vyššie. 
Dráha svetla by sa mala skráti ť zmenšením obsahu testovacích 
roztokov (v rozpätí 5 – 25 ml). 
Na dosiahnutie vysokej frekvencie vystavenia rias ve ľkému ožiareniu 
na povrchu kultúry je potrebné dostato čné pretrepanie (napríklad 
miernym zatrasením).  
2. ÚDAJE  
2.1. VYTVORENIE RASTOVÝCH KRIVIEK 
Biomasa v testovacej nádobe môže by ť vyjadrená v jednotkách 
náhradného parametra použitého na meranie (napr. po čet buniek, 
svietivosť). 
Na vytvorenie rastových kriviek usporiadajte do tabu ľky stanovené 
koncentrácie biomasy v testovaných kultúrach a kontrolách spolu 
s koncentráciami testovaného materiálu a časmi merania zaznamena ­
nými s rozlíšením aspo ň na celé hodiny. V tomto prvom štádiu môžu 
byť užitočné obe stupnice, logaritmická aj lineárna, ale logaritmická 
stupnica je povinná a obvykle lepšie vyjadruje parametre charakte ­
rizujúce rast po čas trvania testu. Pamätajte, že exponenciálny rast je 
vyjadrený priamkou, ak sa vytvorí na logaritmickej stupnici, a že sklon čiary (zošikmenie) ozna čuje špecifickú rýchlos ť rastu. 
Grafické znázornenie slúži na kontrolu, či kontrolné kultúry po čas 
testu rastú exponenciálne pri predpokladanej rýchlosti rastu. Kriticky 
preskúmajte všetky experimentálne body a podobu grafov 
a skontrolujte prvotné údaje a postupy v prípade možných chýb. Skontrolujte najmä všetky experimentálne údaje, pri ktorých sa pred ­
pokladá, že sa odchy ľujú v dôsledku systematickej chyby. Ak je 
zrejmé, že sa chyby v postupe dajú zisti ť a/alebo sa pokladajú za 
vysoko pravdepodobné, konkrétny experimentálny údaj sa ozna čí 
ako extrémna hodnota a nezahrnie sa do následnej štatistickej analýzy. (Nulová koncentrácia rias v jednej z dvoch alebo troch 
paralelných nádob môže nazna čovať, že nádoba nebola správne 
inokulovaná alebo nebola riadne vy čistená.) V správe o teste sa 
musia jasne uvies ť dôvody na vyradenie experimentálneho údaju 
ako extrémnej hodnoty. Prípustnými dôvodmi sú iba (zriedkavo) 
chyby v postupe a nie nepresnos ť. Štatistické postupy v prípade 
identifikácie extrémnych hodnôt majú obmedzené použitie pre tento typ problému a nemôžu nahradi ť odborné posúdenie. Extrémne 
hodnoty (takto ozna čené) sa musia prednostne ponecha ť medzi expe ­
rimentálnymi údajmi uvedenými v každej ďalšej grafickej alebo 
tabuľkovej prezentácii údajov.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. HODNOTY REAKCIE 
Cieľom testu je stanovi ť účinky testovanej látky na rast rias. Táto testo ­
vacia metóda opisuje dve hodnoty reakcie, ke ďže členské krajiny majú 
rozdielne preferencie a regula čné požiadavky. Aby boli výsledky testu 
prijateľné vo všetkých členských krajinách, musia sa vyhodnoti ť účinky 
s použitím oboch hodnôt reakcie a) a b), ktoré sú uvedené nižšie: 
a) Priemerná špecifická rýchlos ť rastu: táto hodnota reakcie sa vypo ­ 
číta na základe logaritmického nárastu biomasy po čas času testu 
vyjadreného za de ň. 
b) Výťažok: touto hodnotou reakcie je množstvo biomasy na konci 
testu bez po čiatočného množstva biomasy. 
Na uplatnenie tejto metódy v regula čnom rámci EÚ by sa mal 
výpočet výsledkov opiera ť o priemernú špecifickú rýchlos ť rastu 
z ďalej uvedených dôvodov. Je potrebné pripomenú ť, že hodnoty 
toxicity vypo čítané s použitím týchto dvoch hodnôt reakcie nie sú 
porovnate ľné a tento rozdiel sa musí zoh ľadniť pri použití výsledkov 
testu. EC  x hodnoty založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu 
(E r C x ) budú obvykle vyššie ako výsledky založené na vý ťažku 
(E y C x ) pri dodržaní testovacích podmienok tejto testovacej metódy 
pre matematický základ príslušných metód. Neznamená to rozdiel v citlivosti medzi oboma hodnotami reakcie, ale jednoducho to 
znamená, že hodnoty sa matematicky odlišujú. Pojem priemerná 
špecifická rýchlos ť rastu je založená na všeobecnom exponenciálnom 
modele rastu rias v nelimitovaných kultúrach, kde sa toxicita stano ­
vuje na základe ú činkov na rýchlos ť rastu, bez závislosti od abso ­
lútnej úrovne špecifickej rýchlosti rastu kontroly, od klesania krivky 
reakcie na koncentráciu alebo d ĺžky testu. Naopak je to v prípade 
výsledkov založených na vý ťažku ako hodnote reakcie, ktoré sú 
závislé od všetkých týchto ďalších premenných. E
 y C x je závislé od 
špecifickej rýchlosti rastu druhov rias, ktoré sa používajú v každom 
teste a od maximálnej špecifickej rýchlosti rastu, ktorá sa môže meniť medzi druhmi a dokonca medzi rozdielnymi kme ňmi rias. 
Táto hodnota reakcie sa nesmie použi ť na porovnanie citlivosti na 
toxické látky medzi druhmi rias alebo dokonca odlišnými kme ňmi. 
Zatiaľ čo sa z vedeckého h ľadiska na stanovenie toxicity uprednost ­ 
ňuje použitie priemernej špecifickej rýchlosti rastu, aby sa vyhovelo 
súčasným regula čným požiadavkám v niektorých krajinách, do tejto 
testovacej metódy sa zahrnulo aj stanovenie toxicity založené na výťažku.
 
2.2.1.  Priemerná rýchlos ť rastu  
Priemerná špecifická rýchlos ť rastu pre konkrétny čas sa vypo číta 
ako logaritmus nárastu biomasy z rovnice pre každú jednotlivú 
kontrolnú a ošetrenú nádobu:  
μ iÄj ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (deň –1 ) 
kde: 
μ i – j je priemerná špecifická rýchlos ť rastu od času i do j 
X i je biomasa v čase i 
X j je biomasa v čase j. ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Pre každú ošetrenú a kontrolnú skupinu vypo čítajte strednú hodnotu 
pre rýchlos ť rastu spolu s odhadmi variancie. 
Vypočítajte priemernú špecifickú rýchlos ť rastu po čas celej d ĺžky 
testu (obvykle dni 0 – 3) radšej s použitím ako po čiatočnej hodnoty 
nominálne inokulovanej biomasy ako nameranej po čiatočnej 
hodnoty, pretože sa týmto spôsobom obvykle dosahuje vä čšia pres­
nosť. Ak použité zariadenie na meranie biomasy umož ňuje dosta ­
točne presné stanovenie malého množstva inokula biomasy (napr. 
prietokový cytometer), potom sa môže použi ť nameraná po čiatočná 
koncentrácia biomasy. Tiež stanovte rýchlosti rastu po častiach vypo ­ 
čítané ako špecifické rýchlosti rastu pre každý de ň počas priebehu 
testu (dni 0 – 1, 1 – 2 a 2 – 3) a skontrolujte, či je kontrolná 
rýchlosť rastu na ďalej konštantná (pozri kritériá platnosti, 
oddiel 1.7). Významne nižšia špecifická rýchlos ť rastu v de ň jeden 
ako celková priemerná špecifická rýchlos ť rastu môže indikova ť lag 
fázu. Zatia ľ čo lag fázu možno minimalizova ť a prakticky elimi ­
novať v kontrolných kultúrach vhodným namnožením prípravnej 
kultúry, lag fáza v exponovaných kultúrach môže indikova ť regene­
ráciu po pôvodnom toxickom strese alebo zníženú expozíciu pre úbytok testovanej látky (vrátane sorpcie na biomasu rias) po po čia­
točnej expozícii. Môže sa teda stanovi ť rýchlosť rastu po 
častiach na 
vyhodnotenie ú činkov testovanej látky, ktoré sa vyskytnú po čas času 
expozície. Zna čné rozdiely medzi rýchlos ťou rastu po častiach 
a priemernou rýchlos ťou rastu indikujú odchýlku od konštantného 
exponenciálneho rastu, a to, že dôkladné preskúmanie rastových 
kriviek je zabezpe čené. 
Vypočítajte inhibíciu rýchlosti rastu v percentách pre každú ošetrenú 
paralelku s pomocou rovnice:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
kde: 
%I r : percentuálna inhibícia priemernej špecifickej rýchlosti rastu 
μ C : stredná hodnota priemernej špecifickej rýchlosti rastu ( μ) 
v kontrolnej skupine 
μ T : priemerná špecifická rýchlos ť rastu pre ošetrenú paralelku. 
Ak sa použijú rozpúš ťadlá na prípravu testovacích roztokov, použijú 
sa vo výpo čte percentuálnej inhibície skôr kontroly s rozpúš ťadlom 
ako kontroly bez rozpúš ťadiel.  
2.2.2.  Vý ťažok  
Výťažok sa vypo číta ako množstvo biomasy na konci testu mínus 
počiatočné množstvo biomasy pre každú jednotlivú kontrolnú 
a ošetrenú nádobu. Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolu 
vypočítajte strednú hodnotu vý ťažku spolu s odhadmi variancie. 
Percentuálna inhibícia vý ťažku (%I  y ) sa môže vypo čítať pre každú 
ošetrenú paralelku takto:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
kde: 
% I  y : percentuálna inhibícia vý ťažku 
Y C : stredná hodnota vý ťažku v kontrolnej skupine 
Y T : hodnota vý ťažku pre ošetrenú paralelku.  
2.3. VYTVORENIE KRIVKY REAKCIE NA KONCENTRÁCIU 
Zaznamenajte do grafu percento inhibície proti logaritmu koncen ­
trácie testovanej látky a pozorne graf skontrolujte a nezoh ľadnite 
žiadny experimentálny údaj, ktorý bol vylú čený v prvej fáze ako 
extrémna hodnota. Plynulou čiarou spojte body vo ľne alebo po číta­ 
čovou interpoláciou na stanovenie prvých výsledkov o vz ťahu medzi 
koncentráciou a reakciou, potom postupujte presnejšou metódou, 
prednostne výpo čtovou štatistickou metódou. V závislosti od pláno ­
vaného využitia údajov, kvality (presnosti) a množstva údajov, ako aj dostupnosti nástrojov na analýzu sa môže rozhodnú ť (a niekedy 
odôvodni ť) zastaviť v tomto štádiu analýzu údajov a jednoducho 
odčítať kľúčové hodnoty EC
 50 a EC  10 (a/alebo EC  20 ) z krivky 
spojenej vo ľne (pozri aj nižšie uvedenú časť o stimula čných účin­
koch). Platné dôvody na nepoužitie štatistickej metódy môžu zah ŕňať 
toto: 
— Údaje nie sú vhodné pre výpo čtové metódy, aby poskytli spo ľa­
hlivejšie výsledky, ako sa dajú získa ť odborným posúdením – za 
takýchto okolností niektoré po čítačové programy môžu dokonca 
poskytnúť nesprávne riešenie (iterácie nesmú konvergova ť atď.). 
— Reakcie stimulovaného rastu nemožno náležite spracova ť 
s použitím dostupných po čítačových programov (pozri nižšie).  
2.4. ŠTATISTICKÉ POSTUPY 
Cieľom je získa ť kvantitatívny vz ťah medzi koncentráciou a reakciou 
regresnou analýzou. Možno použi ť váženú lineárnu regresiu po 
uskutočnení linearizovanej transformácie reak čných údajov – 
napríklad na probitové alebo logitové, alebo Weibullove jednotky (9), alebo sa uprednost ňujú techniky nelineárnej regresie, ktorými 
sa lepšie spracujú nepresnosti údajov, ktorým sa nedá zabráni ť, 
a odchýlky od hladkých rozdelení. Priblížením bu ď k nulovej, 
alebo k úplnej inhibícii sa takéto nepresnosti môžu transformáciou zväčšiť a ovplyvni ť analýzu (9). Je potrebné pripomenú ť, že štan­
dardné metódy analýzy s použitím probitovej, logitovej alebo 
Weibullovej transformácie sa plánujú na použitie na kvantálne (napr. 
mortalita alebo prežitie) údaje a musia sa modifikova ť, aby sa 
prispôsobili údajom o raste alebo biomase. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt EC
 x zo spojitých údajov možno nájs ť 
v (10) (11) a (12). Použitie nelineárnej regresnej analýzy je uvedené 
ďalej v dodatku 4.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Pre každú hodnotu reakcie, ktorá sa má analyzova ť, použite vz ťah 
medzi koncentráciou a reakciou na výpo čet bodových odhadov 
hodnôt EC  x . Ak je to možné, je potrebné stanovi ť 95 % hranice 
spoľahlivosti pre každý odhad. Vhodnos ť reakčných údajov na 
regresný model je potrebné vyhodnoti ť buď graficky, alebo štatis ­
ticky. Regresná analýza sa musí uskuto čniť s použitím jednotlivých 
reakcií paraleliek, nie stredných hodnôt ošetrenej skupiny. Ak je však zostrojenie nelineárnej krivky zložité alebo nemožné pre príliš veľký rozptyl údajov, problému sa dá vyhnú ť uskutočnením regresie 
na skupinovom základe ako praktický spôsob zníženia vplyvu podo ­
zrivých extrémnych hodnôt. Použitie tejto možnosti sa musí uvies ť 
v správe z testu ako odchýlka od obvyklého postupu, pretože krivky zostrojené s jednotlivými paralelkami nepriniesli dobrý výsledok. 
EC
 50 odhady a hranice spo ľahlivosti sa môžu získa ť aj s použitím 
lineárnej interpolácie bootstrappingom (13), ak dostupné regresné 
modely/metódy sú nevhodné pre údaje. 
Pre odhad LOEC aj NOEC v prípade ú činkov testovanej látky na 
rýchlosť rastu je potrebné porovna ť stredné hodnoty ošetrenej 
skupiny s použitím techník pre analýzu variancie (ANOVA). Stredná 
hodnota pre každú koncentráciu sa musí potom porovna ť 
s kontrolnou strednou hodnotou s použitím príslušného viacnásob ­
ného porovnania alebo testovacej metódy trendu. Môže sa použi ť 
Dunnettov alebo Williamsov test (14) (15) (16) (17) (18). Je 
potrebné stanovi ť, či je dodržaný ANOVA predpoklad homogenity 
variancie. Toto stanovenie sa môže uskuto čniť graficky alebo 
oficiálnym testom (18). Vhodný je Levenov alebo Bartlettov test. Nesplnenie predpokladu homogenity variancie sa môže niekedy 
upraviť logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita 
variancie extrémna a nedá sa korigova ť transformáciou, je potrebné 
posúdiť analýzu metódami, ako sú napr. „step-down Jonkheere“ testy 
trendu. Ďalšie informácie o stanovení NOEC možno nájs ť v (12). 
Najnovší vedecký vývoj vedie k odporú čaniu, aby sa upustilo od 
koncepcie NOEC a nahradila sa regresiou založenou na bodovom odhade EC
 x . Príslušná hodnota pre x pre tento test na riasach nebola 
stanovená. Rozsah 10 % až 20 % sa zdá by ť vhodný (v závislosti od 
zvolenej hodnoty reakcie) a prednostne sa musí zaznamena ť EC  10 
a EC  20 . 
2.5. STIMULÁCIA RASTU 
Niekedy sa pri nízkych koncentráciách pozoruje stimulácia rastu 
(negatívna inhibícia). Môže to by ť v dôsledku hormézy („toxickej 
stimulácie“) alebo pridania stimulujúcich rastových faktorov s testovaným materiálom do použitého minimálneho média. Pamä ­
tajte, že pridanie anorganických živín by nemalo ma ť žiadny priamy 
účinok, pretože testovacie médium by malo po čas testu zachováva ť 
nadbytok živín. Stimuláciu pri nízkych dávkach možno ignorova ť pri 
výpočtoch EC
 50 , pokiaľ nie je extrémna. Ak je však extrémna alebo 
sa má vypo čítať hodnota EC  x pre nízke x, môžu sa vyžadova ť 
osobitné postupy. Malo by sa zabráni ť vypusteniu stimula čných 
reakcií z analýzy údajov, ak je to možné, a ak dostupný softvér na vytvorenie krivky nemôže prija ť malú stimuláciu, môže sa použi ť 
lineárna interpolácia bootstrappingom. Ak je stimulácia extrémna, 
môže sa zváži ť model hormézy (19).
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. NETOXICKÁ INHIBÍCIA RASTU 
Testovacie materiály absorbujúce svetlo môžu spôsobi ť zníženie 
rýchlosti rastu, pretože tienenie znižuje množstvo dostupného svetla. Takéto fyzikálne typy ú činkov je potrebné oddeli ť od toxických 
účinkov modifikáciou podmienok testu, a to je potrebné osobitne 
uviesť v správe. Informácie možno nájs ť v (2) a (3).
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: — fyzikálny charakter a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti 
vrátane limitu rozpustnosti vo vode, 
— chemické identifika čné údaje vrátane čistoty. 
Testované druhy: 
— kmeň, dodávate ľ alebo zdroj a použité podmienky kultivácie. 
Testovacie podmienky: 
— dátum za čiatku testu a jeho d ĺžka, 
— opis testu: testovacie nádoby, objemy kultúr, hustota biomasy na 
začiatku testu, 
— zloženie média, 
— testované koncentrácie a paralelky (napr. po čet paraleliek, po čet 
testovaných koncentrácií a použitý geometrický rad), 
— opis prípravy testovaných roztokov vrátane použitia rozpúš ťadiel atď. 
— prístroj na kultiváciu, 
— intenzita svetla a kvalita (zdroj, homogenita), 
— teplota, 
— testované koncentrácie: nominálne testované koncentrácie 
a všetky výsledky analýz na stanovenie koncentrácie testovanej 
látky v testovacích nádobách. V správe sa musí uvies ť výťažnosť 
a limit kvantifikácie v testovacom matrixe, 
— všetky odchýlky od tejto testovacej metódy, 
— metódy na stanovenie biomasy a dôkaz vz ťahu medzi stano ­
veným parametrom a sušinou. 
Výsledky: 
— pH hodnoty na za čiatku a na konci testu pri všetkých ošetre ­
niach, 
— množstvo biomasy v každej banke v každom meranom bode 
a metóda merania biomasy,
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— rastové krivky (graf množstva biomasy proti času), 
— vypočítané hodnoty reakcie pre každú ošetrenú paralelku so 
strednými hodnotami a varian čným koeficientom v prípade para ­
leliek, 
— grafické znázornenie vz ťahu koncentrácie a ú činku, 
— odhady toxicity pre hodnoty reakcie, napr. EC  50 , EC  10 , EC  20 , 
a sprievodné intervaly spo ľahlivosti. Ak sa vypo čítavajú, 
LOEC a NOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie, 
— ak sa používa ANOVA, ve ľkosť účinku, ktorý sa stanovil (napr. 
najmenej významný rozdiel), 
— každá stimulácia rastu zistená v každom ošetrení, — všetky iné pozorované ú činky, napr. morfologické zmeny rias, 
— diskusia k výsledkom vrátane každého vplyvu na záver z testu 
vyplývajúceho z odchýliek od tejto testovacej metódy.
 
4. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test. 
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442. 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asse ­
ssment, no. 23. 
(4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667 – 16. 
(5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 8692. (6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in 
vitro fluorescence method for biomass measurements in algal 
growth inhibition tests. Water Research 31: 2525 – 2531. 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22,5 (1977), pp. 919 – 925. 
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073 – 2079. 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological 
Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. 
Sci. Technol. 19, 713 – 718.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157 – 167. 
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11: 1485 – 1494. 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for 
chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05 – 88. USEPA, 
Duluth, MN. 
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096 – 1121. 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482 – 491. 
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103 – 117. 
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510 – 531. 
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York. 
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93 – 96.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Dodatok 1  
Kmene, ktoré sa ukázali ako vhodné na ú čely testu  
Zelené riasy  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (predtým známa pod názvom  Selenastrum 
capricornutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG, 
— Desmodesmus subspicatus  (predtým známa ako  Scenedesmus subspicatus ), 
86.81 SAG.  
Rozsievky  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664.  
Sinice  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A, 
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1.  
Zdroje kme ňov 
Odporúčané kmene sú dostupné z kultúr s jedným druhom rias z týchto zbierok 
(v abecednom poradí): 
ATCC: American Type Culture Collection 
10801 University Boulevard 
Manassas, Virginia 20110 – 2209 
USA 
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa 
Institute of Freshwater Ecology, 
Windermere Laboratory Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria 
LA22 0LP UK 
SAG: Sammlung von Algenkulturen 
Albrecht-von-Haller-Institut 
Universität Göttingen Nikolausberger Weg 18 
37073 Göttingen 
GERMANY 
UTEX Culture Collection of Algae 
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology 
School of Biological Sciences the University of Texas at Austin 
Austin, Texas 78712 
USA
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Vzhľad a charakteristika odporú čaných druhov  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Vzhľad zakrivené, 
skrútené 
samostatné bunky oválne, 
väčšinou 
samostatné bunky tyčinky re ťazce ovál ­
nych buniek tyčinky 
Veľkosť (dl. × š.) μm 8 – 14 × 2 – 
3 7 – 15 × 3 – 
12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Objem buniek ( μm
 3 /bunku) 40 – 60 (  1 ) 60 – 80 (  1 ) 40 – 50 (  1 ) 30 – 40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Sušina buniek (mg/bunku) 2 – 3 × 10  –8 3 – 4 × 10  –8 3 – 4 × 10  –8 1 – 2 × 10  –8 2 – 3 × 10  –9 
Rýchlosť rastu (  1 ) (deň –1 ) 1,5 – 1,7 1,2 – 1,5 1,4 1,1 – 1,4 2,0 – 2,4  
( 1 ) Stanovené elektronickým po čítadlom častíc. 
( 2 ) Vypočítané z ve ľkosti. 
( 3 ) Najčastejšie pozorovaná rýchlos ť rastu v OECD médiu s intenzitou svetla približne 70 μE·m  –2 ·s –1 a 21 °C.  
Osobitné odporú čania pre kultiváciu a zaobchádzanie s odporú čanými 
testovanými druhmi  
Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus  
Tieto zelené riasy sa obvykle ľahko uchovávajú v rôznych kultiva čných médiách. 
Informácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr. Bunky sú 
obvykle samostatné, bunková hustota sa stanovuje jednoducho s použitím elek ­
tronického po čítadla častíc alebo mikroskopu.  
Anabaena flos-aquae  
Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použi ť rôzne rastové médiá. Je mimo ­
riadne dôležité, aby sa pri obnovovaní zabránilo jednorazovej kultúre prekro čiť 
log fázy rastu, v tomto bode je obnova zložitá.  
Anabaena flos-aquae  vytvára zhluky spletených re ťazcov buniek. Ve ľkosť týchto 
zhlukov sa môže meni ť podľa podmienok kultivácie. Môže by ť potrebné rozdeli ť 
tieto zhluky pri po čítaní pomocou mikroskopu alebo elektronického po čítadla 
častíc, ktoré sa použije na stanovenie množstva biomasy. 
Môže sa použi ť sonifikácia častí vzoriek na rozbitie re ťazcov, aby sa znížila 
variabilita po čtu buniek. Dlhšia sonifikácia, ako sa vyžaduje na rozbitie re ťazcov 
na kratšie úseky, môže poškodi ť bunky. Intenzita sonifikácie a jej trvanie musia 
byť rovnaké pri každom spracovaní. 
Spočítajte dostato čné množstvo polí čok na hemocytometri (minimálne 400 
buniek) na elimináciu variability. Tým sa zlepší spo ľahlivosť mikroskopického 
stanovenia hustoty. 
Elektronické po čítadlo častíc sa môže použi ť na stanovenie celkového objemu 
buniek druhu  Anabaena  po rozbití re ťazcov buniek opatrnou sonifikáciou. Je 
potrebné prispôsobi ť silu sonifikácie, aby sa zabránilo rozbitiu buniek. 
Použite vortexový mixér alebo podobnú vhodnú metódu na zabezpe čenie toho, 
že suspenzia rias, ktorá sa použije na inokuláciu testovacích nádob je dobre 
premiešaná a homogénna.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Testovacie nádoby sa musia umiestni ť na orbitálnu trepa čku s platformou 
približne pri 150 otá čkach za minútu. Alternatívne sa môže použi ť občasné 
miešanie na zníženie tvorby zhlukov druhu  Anabaena . Ak sa vyskytne zhluko ­
vanie, je potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby sa dosiahli reprezentatívne 
vzorky na stanovenie množstva biomasy. Môže by ť potrebné prudké premiešanie 
pred odberom vzoriek, aby sa rozbili zhluky rias.  
Synechococcus leopoliensis  
Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použi ť rôzne rastové médiá. Infor ­
mácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr.  
Synechococcus leopoliensis  rastie vo forme samostatných ty činkovitých buniek. 
Bunky sú ve ľmi malé, čo sťažuje použitie po čítania pomocou mikroskopu pri 
stanovovaní množstva biomasy. Užito čné sú elektronické po čítadlá častíc vyba ­
vené na po čítanie menších častíc až ve ľkosti približne 1 μm. Vhodné sú tiež 
fluorometrické merania  in vitro . 
Navicula pelliculosa  
Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použi ť rôzne rastové médiá. Infor ­
mácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr. Pamätajte, že 
do média je potrebné prida ť kremičitan. 
Navicula pelliculosa  môže za ur čitých rastových podmienok tvori ť zhluky. Kvôli 
produkcii lipidov majú bunky rias niekedy tendenciu akumulova ť vo forme 
povrchového filmu. Za týchto okolností je potrebné prija ť osobitné opatrenia 
pri odoberaní čiastočných vzoriek na stanovenie množstva biomasy, aby bolo 
možné získa ť reprezentatívne vzorky. Môže by ť potrebné prudké premiešanie, 
napr. s použitím vortexového mixéra.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Dodatok 2  
Rastové médiá  
Môže sa použi ť jedno z týchto rastových médií: 
MédiumOECD: Pôvodné médium OECD TG 201, tiež pod ľa ISO 8692. 
US EPA médium AAP, tiež pod ľa ASTM. 
Pri príprave týchto médií sa musí použi ť činidlo alebo chemické látky analytickej 
kvality a deionizovaná voda.  
Zloženie média AAP (US. EPA) a média OECD TG 201.  
Zložka EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Molárny pomer EDTA a železa je mierne vyšší ako jeden. Zabra ňuje to vyzrážaniu železa a zárove ň sa 
minimalizuje chelácia ťažkých kovov.  
V teste s rozsievkou  Navicula pelliculosa  sa musí k obidvom médiám prida ť 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0, aby sa dosiahla koncentrácia 1,4 mg Si/l. 
pH média sa dosiahne rovnováhou medzi uhli čitanovým systémom média 
a parciálnym tlakom CO  2 v okolitom vzduchu. Približný vz ťah medzi pH pri 
25 °C a molárnou koncentráciou hydrogenuhli čitanu je: 
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
15 mg/l NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (U.S. EPA médium) alebo 50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8.1 (médium OECD).  
Zloženie prvkov v testovacom médiu  
Prvok EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Príprava média OECD  
Živina Koncentrácia v zásobnom roztoku 
Zásobný roztok 1: makroživiny  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Zásobný roztok 2: železo  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Zásobný roztok 3: stopové prvky  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Zásobný roztok 4: hydrogenuhli čitan 
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Zásobné roztoky sterilizujte membránovou filtráciou (stredný priemer pórov 
0,2 μm) alebo autoklávovaním (120 °C, 15 min). Skladujte roztoky v tme pri 4 °C. 
Zásobné roztoky 2 a 4 neautoklávujte, ale sterilizujte ich membránovou filtráciou.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Pripravte rastové médium pridaním príslušného objemu zásobných roztokov 1 – 
4 do vody: 
Pridajte do 500 ml sterilizovanej vody: 
— 10 ml zásobného roztoku 1 — 1 ml zásobného roztoku 2 — 1 ml zásobného roztoku 3 — 1 ml zásobného roztoku 4. Doplňte do 1 000 ml sterilizovanou vodou. 
Poskytnite dostato čný čas na vyrovnanie média s atmosférickým CO
 2 , v prípade 
potreby prebublaním sterilným filtrovaným vzduchom nieko ľko hodín.  
Príprava média AAP  
A1.1. Pridajte 1 ml každého zásobného roztoku v A1.2.1 – A1.2.7 do 
približne 900 ml deionizovanej alebo destilovanej vody a potom 
zrieďte na 1 l. 
A1.2. Zásobné roztoky makroživín sa pripravujú rozpustením týchto látok 
v 500 ml deionizovanej alebo destilovanej vody. Činidlá A1.2.1, 
A1.2.2, A1.2.3, a A1.2.4 možno spoji ť do jedného zásobného roztoku. 
A1.2.1.  NaNO  3 – 12,750 g. 
A1.2.2.  MgCl  2 · 6H 2 O – 6,082 g. 
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g. 
A1.2.4.  Zásobný roztok mikroživín  – (pozri A1.3). 
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g. 
A1.2.6.  K  2 HPO  4 – 0,522 g. 
A1.2.7.  NaHCO  3 – 7,500 g. 
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – pozri poznámku A1.1. 
Poznámka A1.1. – Používajte iba pre testovacie druhy rozsievok. Môže 
sa pridať priamo (202,4 mg) alebo prostredníctvom zásobného roztoku, 
aby sa dosiahla kone čná koncentrácia Si v médiu 20 mg/l. 
A1.3. Zásobný roztok mikroživín sa pripravuje rozpustením týchto látok 
v 500 ml deionizovanej alebo destilovanej vody: 
A1.3.1.  H  3 BO 3 – 92,760 mg. 
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg. 
A1.3.3.  ZnCl  2 – 1,635 mg. 
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg. 
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg. 
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg. 
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg. 
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg. 
[dinátrium (etyléndinitrilo) tetraacetát].  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg. Pozri poznámku A1.2. 
Poznámka A1.2. – Používajte iba v médiu pre zásobné roztoky kultúry 
druhov rozsievok. 
A1.4. Upravte pH na 7,5 ± 0,1 pridaním 0,1  N alebo 1,0  N NaOH, alebo HCl. 
A1.5. Prefiltrujte médium do sterilnej nádoby cez 0,22- μm membránový 
filter, ak sa má používa ť počítač častíc, alebo cez 0,45- μm filter 
v prípade, že sa po čítač častíc nepoužíva. 
A1.6. Uchovávajte médium až do použitia v tme pri teplote približne 4 °C.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Dodatok 3  
Vzor postupu kultivácie rias  
Všeobecné pozorovania  
Účelom kultivácie pod ľa tohto postupu je získa ť kultúry rias na testovanie toxi ­
city. 
Musia sa použi ť vhodné metódy na zabezpe čenie, aby kultúry rias neboli infi ­
kované baktériami. Axenické kultúry môžu by ť vhodné, ale sú potrebné kultúry 
s jedným druhom rias. 
Všetky činnosti by sa mali vykonáva ť pri sterilných podmienkach, aby sa zame ­
dzilo kontaminácii baktériami a inými riasami.  
Prístroje a materiály  
Pozri v časti Testovacia metóda: Prístroje.  
Postupy na získanie kultúr rias  
Príprava živných roztokov (médií):  
Všetky živné soli média sa pripravia ako koncentrované zásobné roztoky 
a skladujú sa v tme a chlade. Tieto roztoky sa sterilizujú filtráciou alebo auto ­
klávovaním. 
Médium sa pripraví pridaním správneho množstva zásobného roztoku do sterilnej 
destilovanej vody, pozorne, aby sa zabránilo infekcii. V prípade tuhého média sa 
pridá 0,8 % agaru.  
Zásobná kultúra:  
Zásobné kultúry sú malé kultúry rias, ktoré sa pravidelne prenášajú do čerstvého 
média, aby sa použili ako po čiatočný testovací materiál. Ak sa kultúry nepouží ­
vajú pravidelne, nao čkujú sa do skúmaviek na šikmý agar. Potom sa aspo ň raz za 
dva mesiace prenesú do čerstvého média. 
Zásobné kultúry sa kultivujú v kónických bankách obsahujúcich vhodné médium 
(objem okolo 100 ml). Ak sa riasy inkubujú pri 20 °C pri kontinuálnom osvet ­
lení, je potrebný prenos raz týždenne. 
Prenesie sa také množstvo „starej“ kultúry sterilnou pipetou do banky s čerstvým 
médiom, aby po čiatočná koncentrácia rýchlo rastúceho druhu bola asi 100- 
násobne menšia ako v starej kultúre. 
Stupeň rastu druhu sa môže stanovi ť z rastovej krivky. Ak je toto známe, možno 
určiť hustotu, pri ktorej by sa mala kultúra prenies ť do nového média. To sa musí 
vykonať skôr, ako kultúra dosiahne stacionárnu fázu rastu.  
Prípravná kultúra:  
Prípravná kultúra je ur čená na to, aby poskytla potrebné množstvo rias na inoku ­
láciu testovaných kultúr. Prípravná kultúra sa inkubuje pri testovacích podmien ­
kach a použije sa, pokia ľ je ešte v exponenciálnom raste, normálne po inku ­
bačnom čase 2 až 4 dni. Kultúry rias obsahujúce deformované alebo abnormálne 
bunky sa musia odstráni ť. ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Dodatok 4  
Analýza údajov nelineárnou regresiou  
Všeobecné aspekty  
Reakcia v testoch na riasach a iných testoch mikrobiálneho rastu – rast biomasy 
je svojím charakterom kontinuálna alebo metrická premenná – rýchlos ť procesu, 
ak sa použije rýchlos ť rastu, a jeho časový integrál, ak sa zvolí biomasa. Obidva 
sa vzťahujú na zodpovedajúcu strednú hodnotu reakcie paralelných neexponova ­
ných kontrol, ktoré vykazujú maximálnu reakciu za podmienok, ktorým sú vysta ­
vené, pri čom svetlo a teplota sú v teste na riasach primárnymi ur čujúcim 
faktormi. Systém je distribuovaný alebo homogénny a na biomasu sa môže 
nahliadať ako na kontinuum, pri čom sa nezoh ľadňujú jednotlivé bunky. 
Rozdelenie variancie typu odpovede v prípade takéhoto systému sa vz ťahuje 
iba na experimentálne faktory (obvykle opísané ako logaritmickonormálne 
alebo normálne rozdelenia chyby). Čo je opakom typických reakcií pri biologic ­
kých skúškach s kvantálnymi údajmi, pre ktoré sa tolerancia (typicky binomicky rozdelená) jednotlivých organizmov často pokladá za dominantný varian čný 
komponent. Reakcie kontrol tu majú hodnotu nula alebo hodnotu pozadia. 
V podmienkach bez výskytu komplikácií normalizovaná alebo relatívna reakcia 
r monotónne klesá z 1 (nulová inhibícia) k 0 (100 % inhibícia). Pamätajte, že so všetkými reakciami sa spája chyba a že zjavné negatívne inhibície možno vypo ­ 
čítať iba ako výsledok náhodnej chyby.
 
Regresná analýza  
Modely  
Regresná analýza sa zameriava na kvantitatívny opis krivky reakcie na koncen ­
tráciu vo forme matematickej regresnej funkcie Y = f (C) alebo častejšie F (Z) 
kde Z = log C. Inverzné použitie C = f  –1 (Y) umož ňuje výpočet hodnôt EC  x 
vrátane EC  50 , EC  10 a EC  20 a ich 95 % limity spo ľahlivosti. Niektoré jednoduché 
matematické formy funkcií dokážu úspešne opísa ť vzťahy medzi koncentráciou 
a reakciou získané na základe testov inhibície rastu rias. Funkcie zah ŕňajú 
napríklad logaritmickú rovnicu, nesymetrickú Weibullovu rovnicu 
a logaritmickonormálnu rozde ľovaciu funkciu, z ktorých všetky tvoria sigmoidné 
krivky asymptoticky sa približujúce k jednej pre C → 0 a nule pre 
C → nekonečno. 
Použitie kontinuálnych modelov prahových funkcií (napr. Koymanov model „pre 
inhibíciu popula čného rastu“, Kooijman a kol., 1996) je najnovším návrhom 
alebo alternatívou asymptotických modelov. Pri tomto modeli sa nepredpokladajú účinky pri koncentráciách pod ur čitou prahovou hodnotou, EC0+, ktorá sa 
odhadne pomocou extrapolácie vz ťahu reakcie na koncentráciu, aby pre ťala os 
koncentrácie s použitím jednoduchej kontinuálnej funkcie, ktorá v po čiatočnom 
bode nie je diferenciovate ľná. 
Pamätajte, že analýza môže by ť jednoduchou minimalizáciou sú čtov reziduálnych 
štvorcov (za predpokladu konštantnej variancie) alebo vážených štvorcov, ak je 
heterogenita variancie kompenzovaná.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Postup  
Možno uvies ť nasledujúci postup: zvo ľte príslušnú rovnicu funkcie Y = f (C) 
a aproximujte ju na údaje nelineárnou regresiou. Uprednostnite využitie meraní z každej jednotlivej banky skôr ako stredné hodnoty paraleliek, aby sa z údajov získalo čo najviac informácií. Ak je variancia vysoká, na druhej strane 
z praktických skúseností vyplýva, že stredné hodnoty paraleliek môžu poskytnú ť 
lepší matematický odhad, menej ovplyvnený náhodnými chybami v údajoch, ako v prípade každého jednotlivého experimentálneho bodu. 
Zaznamenajte aproximovanú krivku a namerané údaje a skontrolujte, či je prelo ­ 
ženie krivky správne. Analýza rezíduí môže by ť obzvlášť užitočným nástrojom 
na tento ú čel. Ak zvolený funk čný vzťah použitý na reakciu na koncentráciu 
neopisuje dobre celú krivku alebo niektorú jej dôležitú časť, ako napr. reakcie pri 
nízkych koncentráciách, zvo ľte inú možnos ť aproximácie krivky – napr. nesyme ­
trickú krivku ako Weibullovu funkciu namiesto symetrickej krivky. Negatívne 
inhibície môžu by ť problémom napríklad pre log-normálnu rozde ľovaciu funkciu, 
ktorá takisto vyžaduje alternatívnu regresnú funkciu. Neodporú ča sa priradi ť nulu 
ani malú kladnú hodnotu k takýmto záporným hodnotám, pretože to skres ľuje 
rozdelenie chýb. Môže by ť vhodné vyhotovi ť samostatné aproximácie krivky na 
častiach krivky, ako napr. časť nízkej inhibície na odhad hodnôt EC
 low x . Vypo­ 
čítajte z použitej rovnice [„inverzným odhadom“, C = f  –1 (Y), charakteristické 
bodové odhady EC  x ] a zaznamenajte ako minimálne EC  50 a jeden alebo dva 
odhady EC  low x  . Zo skúseností z praktického testovania vyplýva, že presnos ť 
testu na riasach obvykle umož ňuje primerane presný odhad pri 10 % úrovni 
inhibície, ak je dostatok experimentálnych bodov – pokia ľ sa nevyskytne stimu ­
lácia pri nízkych koncentráciách ako faktor spôsobujúci zmätok. Presnos ť odhadu 
EC 20 je často podstatne lepšia ako EC  10 , pretože EC  20 je obvykle umiestnené na 
približne lineárnej časti centrálnej krivky reakcie na koncentráciu. Niekedy môže 
byť ťažké interpretova ť EC  10 pre stimuláciu rastu. Preto sa odporú ča, aj keď sa 
EC 10 dá normálne získa ť s dostato čnou presnos ťou, zaznamena ť vždy aj EC  20 . 
Váhové faktory  
Experimentálna variancia nie je spravidla konštantná a obvykle zah ŕňa propor­
cionálnu zložku, preto je výhodné bežne vykonáva ť váženú regresiu. Vážené 
faktory pre takúto analýzu sa zvy čajne pokladajú za inverzne proporcionálne 
k variancii: 
W i = 1/Var(r  i ) 
Mnohé regresné programy povo ľujú možnos ť analýzy váženou regresiou 
s váženými faktormi uvedenými v tabu ľke. Obvykle sa musia vážené faktory 
normalizova ť tak, že sa vynásobia n/ ∑ w i (n je počet experimentálnych údajov) 
tak, aby sa ich sú čet rovnal jednej.  
Normalizované reakcie  
Normalizovanie strednou hodnotou reakcie kontroly skrýva niektoré zásadné 
problémy a spôsobuje pomerne komplikovanú štruktúru variancie. Vydelením reakcií strednou hodnotou reakcie kontroly, aby sa získala percentuálna hodnota 
inhibície, sa zavádza ďalšia chyba zaprí činená chybou strednej hodnoty. Pokia ľ 
táto chyba nie je zanedbate ľne malá, musia sa opravi ť váhové faktory v regresii 
a musia sa opravi ť hranice spo ľahlivosti na kovarianciu s kontrolou (17). Pamä ­
tajte, že vysoká presnos ť odhadovanej strednej hodnoty reakcie kontroly je dôle ­ 
žitá, aby sa minimalizovala celková variancia pre relatívnu reakciu. Táto 
variancia je takáto:
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
index i sa vz ťahuje na úrove ň koncentrácie i a index 0 na kontroly: 
Y i = relatívna reakcia = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
s varianciou: 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ), 
a pretože 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 a (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
s normálne rozdelenými údajmi a paralelami m  i a m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
celková variancia relatívnej reakcie, Y  i je teda: 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Chyba strednej hodnoty kontroly je inverzne proporcionálna k druhej odmocnine 
počtu paralelných kontrol spriemerovaných a niekedy môže by ť opodstatnené 
zahrnúť predchádzajúce údaje a týmto spôsobom vo ve ľkej miere zníži ť chybu. 
Alternatívny postup je nenormalizova ť údaje a aproximova ť absolútne reakcie 
vrátane údajov o reakcii kontroly, ale zavedením hodnoty reakcie kontroly ako ďalšieho parametra na použitie nelineárnou regresiou. Regresná rovnica má 
obvykle 2 parametre, táto metóda vyžaduje 3 parametre, a preto je potrebných 
viac experimentálnych údajov ako nelineárna regresia na údaje, ktoré sú norma ­
lizované pri použití vopred nastavenej reakcie kontroly.
 
Intervaly inverznej spo ľahlivosti  
Výpočet intervalov spo ľahlivosti nelineárnej regresie inverzným odhadom je 
pomerne zložitý a nie je dostupnou štandardnou vo ľbou v bežných po čítačových 
štatistických programových balíkoch. Približné limity spo ľahlivosti sa môžu 
získať so štandardnými programami nelineárnej regresie s reparametrizáciou 
(Bruce a Versteeg, 1992), ktorá zah ŕňa prepísanie matematickej rovnice požado ­
vanými bodovými odhadmi, napr. EC  10 a EC  50 ako parametre, ktoré sa majú 
odhadnúť. [Ponechajte funkciu I = f ( α, β, koncentrácia) a použite defini čné 
vzťahy f (α, β, EC  10 ) = 0,1 a f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 na nahradenie f ( α, β 
koncentrácia) ekvivalentnou funkciou g (EC  10 , EC  50 , koncentrácia.] 
Priamejší výpo čet (Andersen a kol., 1998) sa uskuto ční ponechaním pôvodnej 
rovnice s použitím Taylorovho rozvoja okolo stredných hodnôt r  i a r 0 . 
V poslednom čase sú ob ľúbené „metódy boot strap“. Tieto metódy používajú 
stanovené údaje a generátor náhodných čísel riadeného častého opätovného 
odberu vzoriek na odhad empirického rozdelenia variancie.  
Použitá literatúra  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625 – 1632. 
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485 – 1494. 
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405 – 420.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. STANOVENIE „ ĽAHKEJ“ BIODEGRADOVATE ĽNOSTI  
ČASŤ I. VŠEOBECNÉ ÚVAHY  
1.1. ÚVOD 
Opísaných je šes ť metód, ktoré umož ňujú skríning látok 
a prípravkov na ľahkú biodegradovate ľnosť v aeróbnom vodnom 
médiu: 
a) Úbytok rozpusteného organického uhlíka (DOC) Die-Away 
(metóda C.4-A). 
b) Modifikovaný skríningový test pod ľa OECD – DOC Die-Away 
(metóda C.4-B). 
c) Vývoj oxidu uhli čitého (CO  2 ) (modifikovaný Sturmov test) 
(metóda C.4-C). 
d) Manometrická respirometria (metóda C.4-D). e) Test uzavretej f ľaše (metóda C.4-E). 
f) MITI (Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu – 
Japonsko) (metóda C.4-F). 
Všeobecné zamerania všetkých šiestich testov sú uvedené 
v časti I metódy. Položky, ktoré sú špecifické pre jednotlivé metódy, 
sú uvedené v častiach II až VII. Prílohy obsahujú pojmy, vzorce 
a návody. 
Medzilaboratórny porovnávací test OECD, vykonaný v roku 1988, 
ukázal, že metódy poskytujú zhodné výsledky. V závislosti od fyzi ­
kálneho charakteru látky, ktorá má by ť testovaná, sa však môže 
dávať prednosť určitej metóde.
 
1.2. VÝBER VHODNEJ SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Informácie o rozpustnosti látky alebo prípravku, tlaku pár 
a adsorpčných charakteristikách sú nevyhnutné pri výbere najvhod ­
nejšej metódy. Mal by by ť známy chemický vzorec alebo štruktúra, 
aby sa dali vypo čítať a/alebo skontrolova ť namerané hodnoty para ­
metrov, napr. ThOD, ThCO  2 , DOC, TOC, COD (pozri 
prílohy I a II). 
Testované chemické látky, ktoré sú rozpustné vo vode v koncentrácii 
aspoň 100 mg/l sa môžu hodnoti ť všetkými metódami, pokia ľ nie sú 
prchavé a neadsorbujú sa. Pre látky alebo prípravky, ktoré sú slabo rozpustné vo vode, prchavé alebo sa adsorbujú, sú vhodné metódy uvedené v tabu ľke č. 1. Spôsob, akým sa má zaobchádza ť so slabo 
rozpustnými a prchavými látkami alebo prchavými prípravkami je 
opísaný v dodatku 3. Stredne prchavé látky alebo prchavé prípravky sa môžu testova ť DOC Die-Away metódou, ak sa zabezpe čí dostatok 
priestoru pre plynnú fázu v skúšobných nádobách (ktoré by mali by ť 
vhodne uzavreté). V takomto prípade sa musí vykona ť abiotická 
kontrola umož ňujúca zistenie fyzikálnych strát.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabuľka 1 
Aplikovate ľnosť skúšobných metód  
Test Analytická metóda Vhodnosť pre chemické látky, ktoré sú: 
slabo rozpustné prchavé adsorbujúce  
DOC. Die Away rozpustený organický ublík — — +/- 
modifikovaný OECD Die- 
Away rozpustený organický uhlík — — +/- 
vývoj CO  2 respirometria: uvo ľňovanie 
CO 2 + — + 
manometricka respirometria manometrická respiromet ­
ria: spotreba kyslíka + +/- + 
uzavretá f ľaša Respirometria: rozpustený 
kyslík +/- + + 
MITI respirometria: spotreba 
kyslíka + +/- + 
Na interpretáciu získaných výsledkov sa požadujú informácie 
o čistote alebo relatívnom zastúpení jednotlivých zložiek testovaného 
materiálu, obzvláš ť keď sú výsledky malé alebo na okraji detekcie. 
Informácie týkajúce sa toxicity testovanej látky alebo prípravku pre 
baktérie (dodatok 4) môžu by ť veľmi užitočné pri výbere vhodných 
testovaných koncentrácii a môžu by ť nevyhnutné pre správnu inter ­
pretáciu nízkych hodnôt biodegradácie.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Na účely kontroly postupu sa testujú referen čné látky alebo 
prípravky, ktoré sp ĺňajú kritériá ľahkej biodegradovate ľnosti, ich 
zaradením vo vhodnej banke paralelne k normálnemu testu. 
Vhodnými látkami sú: anilín ( čerstvo destilovaný), octan sodný, 
benzoan sodný. Tieto referen čné látky sa degradujú v týchto metó ­
dach, a to aj v prípade, ak sa úmyselne nepridalo inokulum. 
Odporúča sa, aby za referen čnú látku bola vyh ľadaná taká, ktorá je 
ľahko biodegradovate ľná, ale vyžaduje prídavok inokula. Navrhnutý 
bol hydroftalát draselný, ale je potrebné získa ť viac informácií o tejto 
látke, skôr ako môže by ť prijatá za referen čnú látku. 
Pri respirometrických testoch môže by ť ovplyvnená spotreba kyslíka 
látkami obsahujúcimi dusík procesom nitrifikácie (pozri prílohy II a V).  
4. PRINCÍP SKÚŠOBNÝCH METÓD 
Roztok alebo suspenzia testovanej látky v minerálnom médiu sa 
inokuluje a inkubuje v aeróbnych podmienkach v tme alebo za rozptýleného svetla. Množstvo DOC v testovanom roztoku by sa vzhľadom na inokulum malo udržiava ť tak nízko, ako je to len 
možné v porovnaní s množstvom DOC vzh ľadom na testovanú látku. 
Berie sa zrete ľ na endogénnu aktivitu inokula tým, že sa vykonajú 
paralelne slepé testy s inokulom, ale bez testovanej látky, hoci endo ­
génna aktivita buniek v prítomnosti látky nebude presne súhlasi ť 
s endogénnou aktivitou v kontrole. Referen čná látka sa testuje para ­
lelne, aby sa kontrolovala činnosť postupov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Degradácia sa vo všeobecnosti sleduje stanovením parametrov, ako 
sú DOC, tvorba CO  2 a spotreba kyslíka, a merania sa vykonávajú 
v dostato čných časových intervaloch, aby to umožnilo identifikova ť 
začiatok a koniec biodegradácie. Pri použití automatických respiro ­
metrov je meranie kontinuálne. Hodnota DOC sa niekedy meria 
navyše k inému parametru, ale zvy čajne sa to robí len na za čiatku 
a na konci testu. Takisto sa môžu použi ťšpecifické chemické analýzy 
na hodnotenie primárnej degradácie testovanej látky a stanovenie koncentrácie akéhoko ľvek vzniknutého medziproduktu (povinné 
v MITI teste). 
Test trvá za normálnych okolností 28 dní. Test sa však môže ukon čiť 
pred uplynutím 28 dní, ak biodegrada čná krivka dosiahla stacionárnu 
úroveň aspoň pri troch stanoveniach. Testy sa tiež môžu pred ĺžiť, ak 
z tvaru krivky vyplýva, že biodegradácia sa síce za čala, ale ešte 
nedosiahla stacionárnu úrove ň na 28. de ň.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY  
I.5.1.  Reprodukovate ľnosť 
Stanovenia by sa mali vykona ť aspoň v dvoch paralelkách, a to kvôli 
charakteru biodegradácie a zmesových bakteriálnych kultúr použi ­
tých ako inokulum. 
Je všeobecnou skúsenos ťou, že čím väčšia koncentrácia mikroorga ­
nizmov sa na za čiatku pridá k skúšobnému médiu, tým menšie 
rozdiely sú medzi paralelkami. Kruhové testy ukázali, že môže 
dochádza ť k veľkým rozdielom medzi výsledkami získanými 
v rôznych laboratóriách, ale normálne je dobrá zhoda v prípade ľahko biodegradovate ľných látok.
 
I.5.2.  Platnos ť testu  
Test sa považuje za platný, ak rozdiely extrémnych hodnôt paraleliek 
pri odstránení testovanej látky alebo prípravku na stacionárnej úrovni na konci testu alebo na konci 10-d ňového okna sú menšie ako 20 % 
a ak percentuálna degradovate ľnosť referenčnej látky dosiahla 
úroveň ľahkej biodegradovate ľnosti do 14 dní. Ak sa jedna 
z týchto podmienok nedodrží, test by sa mal zopakova ť. Vzhľadom 
na presnos ť metód nízke hodnoty nemusia nutne znamena ť, že testo­
vaná látka nie je biodegradovate ľná v environmentálnych podmien ­
kach, ale indikova ť, že je potrebné vykona ť viac práce pri stanovení 
biodegradability. 
Ak v teste toxicity, obsahujúcom testovanú látku a referen čnú látku 
alebo prípravok, dôjde k menej ako 35 % degradácii (na základe DOC) alebo menej ako 25 % (na základe ThOD alebo ThCO
 2 ) počas 
14 dní, testovaná látka alebo prípravok sa môže považova ť za inhi­
bujúce (pozri tiež prílohu IV). Testované série by sa mali zopakova ť, 
ak možno použi ť nižšie koncentrácie testovanej látky alebo prípravku 
a/alebo vyššie koncentrácie inokula, ale nie vyššie ako 30 mg tuhých 
látok/liter.  
I.6. VŠEOBECNÉ POSTUPY A PRÍPRAVA 
Všeobecné podmienky aplikované na testy sú sumarizované 
v tabuľke 2. Prístroje a ostatné experimentálne podmienky, špeci ­
ficky prináležiace k jednotlivým testom, sú opísané neskôr pod 
hlavičkou pre daný test.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabuľka 2 
Podmienky skúšania  
Test Test Die-Away Vývoj CO  2 Manometrická 
respirometria Modifikovaný 
skrínigový test 
OECD Uzavretá f ľaša MITI (I)  
Koncentrácia 
testovanej 
látky 
v mg/liter 100 2-10 100 mg DOC/liter 10 – 40 10 – 20 10 – 40 mg TSP/liter 50 – 100 5 – 10 
Koncentrácia 
inokula (v 
bunkách/liter približne) ≤ 30 mg/liter SS 
alebo ≤ 100 ml 
eluátu na l (10
 7 – 10  8 ) 0,5 ml 
sekundár­
neho eluátu 
na liter 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
eluátu na 
liter 
(10 4 – 10  6 ) 30 mg na liter 
SS 
(10 7 – 10  8 ) 
Koncentrácia 
prvkov v minerálnom 
médiu 
(mg/liter) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 – 0,1 0,05 – 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 podl'a možno ­
sti 7,0 
Teplota 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = rozpustený organický kyslík ThoD = teoretická 
potreba kyslíka SS = suspendované 
pevné látky  
I.6.1.  Voda na prípravu roztokov  
Používa sa deionizovaná alebo destilovaná voda neobsahujúca inhi ­
bičné koncentrácie toxických látok (napr. ióny Cu  ++ ). Musí obsa ­
hovať menej ako 10 % organického uhlíka, ktorý sa nachádza 
v testovanom materiáli. Vysoká čistota skúšobnej vody je nevyh ­
nutná, aby sa eliminovali vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontami ­
nácia môže pochádza ť z vnútorných ne čistôt, iontomeni ča 
a lyzovaných baktérii a rias. Pre každú sériu testov použite len 
úplne totožnú vodu z jednej sady, ktorá je skontrolovaná analýzou DOC. Takáto kontrola nie je nutná pri teste uzavretej f ľaše, ale 
spotreba kyslíka vo vode musí by ť nízka.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Zásobné roztoky minerálnych zložiek  
Na prípravu skúšobných roztokov sa pripravia zásobné roztoky 
minerálnych zložiek vhodnej koncentrácie. Tieto zásobné roztoky sa môžu použi ť (pri rozdielnych faktoroch zriedenia) pre metódy 
DOC Die-Away, modifikovaného skríningového testu OECD, vývoja 
CO
 2 , manometrickej respirácie, testu uzavretej f ľaše. 
Zrieďovacie faktory a špecifická príprava minerálneho média pre test 
MITI sú uvedené pod hlavi čkou špecifických testov.  
Zásobné roztoky  
Pripravia sa tieto zásobné roztoky s použitím reagentov analytickej 
čistoty. 
a) Dihydrogenfosfore čňan draselný, KH  2 PO 4 8,50 g 
Hydrogénfosfore čnan didraselný, K  2 HPO  4 21,75 g 
Hydrogénfosfore čnan disodný dihydrát Na  2 HPO  4 . 
2 H  2 0 33,40 g 
Chlorid amónny, NH  4 Cl 0,50 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. Hodnota 
pH roztoku musí by ť 7,4. 
b) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl  2 27,50 g 
alebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl  2 , 2 H  2 0 36,40 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
c) Síran hore čnatý heptahydrát, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
d) Chlorid železitý hexahydrát, FeCl  3 . 6H  2 O 0,25 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
Poznámka: Aby nebolo potrebné pripravova ť tento roztok tesne pred 
jeho použitím, pridajte jednu kvapku koncentrovanej HC1 alebo 0,4 g EDTA na liter.
 
I.6.3.  Zásobné roztoky chemických látok a prípravkov  
Podľa vhodnosti napríklad rozpustite 1 až 10 g testovanej alebo 
referenčnej látky, alebo prípravku v deionizovanej vode a dopl ňte 
do 1 litra, ak rozpustnos ť presahuje 1g/l. Inak pripravte zásobný 
roztok v minerálnom médiu alebo pridajte látku alebo prípravok priamo do minerálneho média. O zaobchádzaní s menej rozpustnými 
látkami alebo prípravkami pozri prílohu III, v teste MITI (metóda 
C.4-F) sa však nepoužívajú ani rozpúš ťadlá, ani emulzifikátory.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inokulá  
Inokulum sa môže získa ť z rôznych zdrojov: napríklad 
z aktivovaného kalu, kanaliza čného výtoku (bez chlóru), povrcho ­
vých vôd, pôdy alebo ich zmesí. Ak sa používa aktivovaný kal pre 
testy DOC Die-Away, vývoj CO  2 a manometrická respirometria, 
odoberie sa z čističky alebo laboratórnej jednotky, ktoré spracúvajú 
najmä odpadové splaškové vody z domácností. Inokulá z iných zdrojov dávajú rozptýlenejšie výsledky. Zriedenejšie inokulum bez 
kalových vlo čiek je potrebné pre testy: modifikovaný skríningový 
OECD a test uzavretej f ľaše, pričom uprednost ňovaným zdrojom je 
sekundárny výtok z čističky odpadových vôd spracúvajúcej spla ­ 
škové vody z domácností alebo laboratórna jednotka. Inokulum pre 
test MITI sa získava zo zmesi zdrojov a je opísané pod hlavi čkou 
tohto špecifického testu.
 
I.6.4.1.  Inokulum z aktivovaných kalov  
Odoberie sa čerstvá vzorka aktivovaného kalu z prevzduš ňovacieho 
tanku čističky odpadových vôd alebo laboratórnej jednotky, ktoré 
spracúvajú prevažne domáce splaškové vody. Odstránia sa hrubé 
častice, a ak je to nutné, použije sa jemné sitko a potom sa udržuje 
kal v aeróbnych podmienkach. 
Alternatívne sa ponechá kal sedimentova ť alebo sa odstredí (napr. 
10 minút pri 1 100 g) po odstránení všetkých hrubých častíc. 
Odstráni sa supernatant. Kal sa môže premy ť v minerálnom médiu. 
Suspenduje sa koncentrovaný kal v minerálnom médiu, aby sa 
získala koncentrácia tuhých častíc 3 až 5 g/l, a prevzduš ňuje sa, 
pokiaľ je to potrebné. 
Kal sa odoberie zo správne pracujúcej čističky. Ak sa musí kal 
odobrať z vysokostup ňovej čističky alebo je možné, že obsahuje 
inhibitory, mal by sa premy ť. Po dôkladnom premiešaní sa sedimen ­
tuje alebo odstredí resuspendovaný kal, odstráni sa supernatant a premytý kal znovu resuspenduje v ďalšom objeme minerálneho 
média. Tento postup sa opakuje, pokia ľ sa z kalu neodstráni 
nadbytok substrátu alebo inhibitor. 
Z resuspendovaného alebo neošetreného kalu sa odoberie vzorka 
tesne pred použitím na stanovenie sušiny suspendovaných tuhých látok. 
Ďalšou alternatívou je homogenizácia aktivovaného kalu (3 – 5 g 
suspendovaných tuhých látok/l). Kal sa prevzduš ňuje v mechanickom 
mixéri 2 minúty pri strednej rýchlosti. Zmiešaný kal sa nechá sedi ­
mentovať 30 minút, alebo ak je to potrebné, aj dlhšie, a dekantuje sa 
kvapalinou na nižšie použitie ako inokulum v množstve 10 ml/ ­
l minerálneho média.
 
I.6.4.2.  Ostatné zdroje inokula  
Inokulum sa môže získa ť zo sekundárneho výtoku čističky alebo 
laboratórnej jednotky spracúvajúcej prevažne domáce splaškové 
vody. Odoberie sa čerstvá vzorka a po čas prepravy sa udržuje 
prevzdušňovaním. Nechá sa sedimentova ť asi 1 hodinu alebo sa 
prefiltruje cez hrubý filtra čný papier a udržuje sa kvapalina po 
odstránení sedimentu alebo filtrát v aeróbnom stave, pokia ľ je to 
potrebné. Tento typ inokula sa môže použi ť až do objemu 100 ml 
na 1 liter minerálneho média.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Ďalším zdrojom inokula je povrchová voda. V tomto prípade sa 
odoberie vzorka z vhodnej povrchovej vody, napr. rieky, jazera 
a udržiava sa v aeróbnom stave. Ak je to potrebné, koncentruje sa inokulum filtráciou alebo odstredením.
 
I.6.5.  Aklimatizácia inokula  
Inokulum sa môže aklimatizova ť na experimentálne podmienky, ale 
nie pred adaptované k testovanej látke alebo prípravku. Aklimati ­
zácia pozostáva z prevzduš ňovania aktivovaného kalu 
v minerálnom médiu alebo v sekundárnom výtoku po čas 5 až 7 
dní pri teplote testovania. Aklimatizácia niekedy zlepšuje presnos ť 
skúšobných metód tým, že znižuje hodnoty slepých pokusov. Za nevyhnutné sa to považuje v prípade aklimatizácie inokula v rámci testu MITI.
 
I.6.6.  Abiotické kontroly  
Skontroluje sa možnos ť abiotickej degradácie testovanej látky stano ­
vením odstránenia DOC, spotreby kyslíka alebo vývoja oxidu uhli ­ 
čitého v sterilných kontrolách neobsahujúcich inokulum. Sterilizuje 
sa filtráciou cez membránu (0,2 až 0,45 mikrometra) alebo 
prídavkom vhodnej toxickej látky vo vhodnej koncentrácii. Ak sa použije membránová filtrácia, odoberie sa vzorka asepticky, aby sa udržala sterilita. Pokia ľ adsorpcia testovanej látky alebo prípravku to 
vopred nevylu čuje, testy, ktoré merajú biodegradáciu ako odstránenie 
DOC, obzvláš ť s inokulom z aktivovaného kalu, by mali zah ŕňať 
abiotickú kontrolu, ktorá sa inokuluje a sterilizuje jedom.
 
I.6.7.  Po čet baniek  
Počet baniek v typickom teste je uvedený pod hlavi čkou každého 
testu. 
Môžu sa použi ť tieto typy baniek: 
— Testovacia suspenzia: obsahujúca testovanú látku a inokulum. — Inokulový slepý pokus: obsahujúci len inokulum. 
— Kontrola postupu: obsahujúca referen čnú látku a inokulum. 
— Abiotická sterilná kontrola: obsahujúca testovanú látku (pozri I.6.6). — Kontrola adsorpcie: obsahujúca testovanú látku, inokulum 
a sterilizujúcu látku. 
— Kontrola toxicity: obsahujúca testovanú látku, referen čnú látku 
a inokulum. 
Stanovenie v skúšobnej suspenzii a inokulovom slepom pokuse sa 
vykoná paralelne. Odporú ča sa tiež vykona ť stanovenia aj v iných 
bankách paralelne. 
Toto sa však nemôže vždy uskuto čniť. Je potrebné zaisti ť, aby sa 
odobrali dostato čné vzorky alebo vykonalo vhodné od čítanie, umož ­ 
ňujúce, aby sa zhodnotilo percentuálne odstránenie v 10-d ňovom okne.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. ÚDAJE A VYHODNOTENIE 
Pri výpočte D  t , percentuálnej degradácie, sa použijú stredné hodnoty 
paralelných meraní parametrov v testovaných nádobách a v inokulovom slepom pokuse. Vzorce sú uvedené v častiach 
o špecifických testoch. Priebeh degradácie sa zobrazí graficky 
a vyznačí sa 10-dňové okno. Vypo číta sa a uvedie percentuálne odstrá ­
nenie, ktoré sa dosiahlo na konci 10-d ňového okna, a hodnota stacio ­
nárnej úrovne alebo na konci testu, pod ľa toho, čo je vhodné. 
V respirometrických testoch látky obsahujúce dusík môžu ovplyvni ť 
spotrebu kyslíka kvôli prebiehajúcej nitrifikácii (pozri prílohy II a V).
 
I.7.1.  Degradácia meraná pomocou stanovenia DOC  
Percentuálna degradácia D  t v každom čase, keď bola odobraná vzorka, 
by sa mala vypo čítať oddelene pre banky obsahujúce testovanú látku 
použitím strednej hodnoty meraní DOC, aby sa mohla posúdi ť platnosť 
testu (pozri I.5.2). To sa vypo číta na základe tejto rovnice:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
kde: 
D t = % degradácie v čase t; 
C o = stredná po čiatočná koncentrácia DOC v inokulovanom kulti ­
vačnom médiu obsahujúcom testovanú látku (mg DOC/l); 
C t = stredná koncentrácia DOC v inokulovanom kultiva čnom 
médiu obsahujúcom testovanú látku v čase t (mg DOC/l); 
C bo = stredná po čiatočná koncentrácia DOC v slepom pokuse 
inokulovaného minerálneho média (mg DOC/l); 
C bt = stredná koncentrácia DOC v slepom pokuse inokulovaného 
minerálneho média v čase t (mg DOC/l). 
Všetky koncentrácie sú namerané experimentálne.  
I.7.2.  Degradácia meraná s použitím špeciálnych analýz  
Keď sú dostupné špecifické analytické údaje, primárna biodegradácia 
sa vypočíta z tejto z rovnice:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
kde: 
D t = percentuálna degradácia v čase t, normálne po 28 d ňoch; 
S a = zvyškové množstvo testovanej látky v inokulovanom médiu 
na konci testu (mg); 
S b = zvyškové množstvo testovanej látky v slepom pokuse s vodou/ ­
médiom, ku ktorému sa pridala len testovaná látka (mg).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Abiotická degradácia  
Ak sa použije abiotická sterilná kontrola, vypo číta sa percento 
abiotickej degradácie s použitím tejto rovnice:  
abiotická degradácia v %  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
kde: 
C S(o) = koncentrácia DOC v sterilnej kontrole, de ň 0; 
C S(t) = koncentrácia DOC v sterilnej kontrole, de ň t. 
I.8. SPRÁVA 
Správa z testu by mala ma ť, ak je to možné, tieto informácie: 
— testované a referen čné chemické látky a ich čistotu, 
— podmienky skúšania, — inokulum: povahu a miesto odobrania, koncentráciu a jeho pred ­
prípravu, 
— pomer a povahu priemyselného odpadu prítomného 
v splaškových vodách, ak známa, 
— dobu trvania testu a jeho teplotu, 
— v prípade slabo rozpustných testovaných látok alebo prípravkov 
ich úpravu, 
— aplikovanú testovaciu metódu, mali by by ť uvedené vedecké 
dôvody a vysvetlenia pri akejko ľvek zmene postupu, 
— súbor údajov, 
— pozorované javy inhibície, 
— každú pozorovanú abiotickú degradáciu, — špecifické chemické analytické údaje, ak sú dostupné, — analytické údaje o medziproduktoch, ak sú dostupné, — graf závislosti percentuálnej degradácie oproti času pre testovanú 
a referen čnú látku, lag fázu, degrada čnú fázu, 10-d ňové okno 
a sklon by mali by ť jasne uvedené (dodatok 1). Ak bol test v súlade 
s kritériami kvality, tak sa stredné hodnoty percentuálnej degradácie 
v bankách obsahujúcich testovanú látku môžu použi ť na tvorbu grafu, 
— percentuálne vyjadrenie odstránenia po 10-d ňovom okne 
a v stacionárnej fáze alebo na konci testu.
 
ČASŤ II. ÚBYTOK ROZPUSTENÉHO ORGANICKÉHO 
UHLÍKA (DOC DIE-AWAY)  (Metóda C.4-A)  
II.1. PRINCÍP METÓDY 
Známy objem inokulovaného minerálneho média so známou koncen ­
tráciou testovanej látky (10 až 40 mg DOC/1) ako nominálny jediný 
zdroj organického uhlíka sa prevzduš ňuje za tmy alebo pri difúznom 
svetle pri teplote 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Degradácia sa sleduje pomocou analýzy DOC v častých intervaloch 
počas 28 dní. Stupe ň biodegradácie sa vypo číta vyjadrením koncentrácie 
odstráneného DOC (upravené na kontrolu bez inokula) ako percento počiatočnej koncentrácie. Stupe ň primárnej biodegradácie sa môže tiež 
vypočítať z dodatočnej analýzy na za čiatku a na konci inkubácie.
 
II.2. OPIS METÓDY  
II.2.1.  Prístroje  
a) Kónické banky, napr. 250 ml až 2 litre, v závislosti od potreb ­
ného objemu pre analýzu DOC. 
b) Trepačka prispôsobená na kónické banky, a to s automatickým 
temperovaním teploty, alebo umiestnená v miestnosti so stabilnou 
teplotou a s dostato čným výkonom, aby zabezpe čila aeróbne 
podmienky vo všetkých bankách. 
c) Filtračné zariadenie s vhodnými membránami. 
d) Analyzátor DOC. 
e) Prístroj na stanovenie rozpusteného kyslíka. 
f) Odstredivka.  
II.2.2.  Príprava minerálneho média  
O príprave zásobných roztokov pozri I.6.2. 
Zmieša sa 10 ml roztoku a) s 800 ml vody, pridá po 1 ml roztokov 
b) až d) a doplní do 1 litra vodou.  
II.2.3.  Príprava a prekondiciovanie inokula  
Inokulum sa môže získa ť z rôznych zdrojov: aktivovaný kal, kana ­
lizačný výtok, povrchové vody, pôda alebo ich zmesi. 
Pozri: I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
II.2.4.  Príprava baniek  
Ako príklad sa do dvojlitrových kónických baniek s obsahom 800 ml 
minerálneho média pridajú vhodné objemy zásobných roztokov testovanej a referen čnej látky do oddelených baniek, aby sa získala 
koncentrácia ekvivalentná 10 až 40 mg DOC/l. Skontroluje sa pH 
hodnoty, a ak je to potrebné, upraví sa na hodnotu 7,4. Inokulujú sa banky s aktivovaným kalom alebo iným zdrojom inokula (pozri bod I.6.4), aby sa získala koncentrácia suspendovaných tuhých častíc 
menšia ako 30 mg/l. Pripravia sa tiež inokulové kontroly 
v minerálnom médiu, ale bez testovanej látky alebo referen čnej 
chemickej látky. 
Ak je to potrebné, použite jednu nádobu na skontrolovanie možného 
inhibičného účinku testovanej látky alebo prípravku inokulovaním 
roztoku obsahujúceho v minerálnom médiu porovnate ľné koncen ­
trácie testovanej aj referen čnej chemickej látky. 
Ak je to potrebné, použite tiež ďalšiu sterilnú banku, aby sa skon ­
trolovalo, či sa testovaná látka alebo prípravok degraduje abioticky 
s použitím neinokulovaného roztoku chemickej látky (pozri I.6.6).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Okrem toho, ak existuje podozrenie, že sa testovaná látka alebo 
prípravok zna čne adsorbuje na sklo, kal at ď., vykoná sa predbežné 
hodnotenie, aby sa stanovil pravdepodobný rozsah adsorpcie a tak aj vhodnosť testu pre látku alebo prípravok (pozri tabu ľku 1). Pripraví 
sa banka obsahujúca testovanú látku, inokulum a steriliza čné činidlo. 
Doplnia sa objemy vo všetkých bankách na 1 liter s minerálnym 
médiom a po premiešaní sa odoberie vzorka z každej banky na stanovenie po čiatočnej koncentrácie DOC (pozri prílohu II.4). 
Otvory baniek sa prikryjú napr. hliníkovou fóliou takým spôsobom, 
aby sa umožnila vo ľná výmena vzduchu medzi bankou a okolitou 
atmosférou. Potom sa vložia nádoby do trepa čky a vykoná sa test.
 
II.2.5.  Počet baniek v typickom teste  
Banky 1 a 2: Testovaná suspenzia. 
Banky 3 a 4: Inokulový slepý pokus. 
Banka 5: Kontrola postupu. Odporúča sa, a ak je to potrebné: 
Banka 6: Abiotická sterilná kontrola. 
Banka 7: Kontrola na adsorpciu. 
Banka 8: Kontrola toxicity. 
Pozri tiež I.6.7.
 
II.2.6.  Realizácia testu  
Počas celého testu sa meria koncentrácia DOC v každej banke, 
v paralelkách, v známych časových intervaloch, dostato čne často, 
aby bolo možné stanovi ť začiatok 10-d ňového okna a percento 
odstránenia na konci 10-d ňového okna. Odoberie sa len minimálny 
objem testovanej suspenzie, nevyhnutný na každé stanovenie. 
Pred odberom vzorky sa doplnia straty vyparovaním z banky 
pridaním vody (I.6.1) v potrebnom množstve, ak je to nutné. Dôkladne sa premieša kultiva čné médium pred odberom vzorky 
a zaistí sa, aby sa materiál, ktorý je prilepený k stenám nádob, 
rozpustil alebo suspendoval pred odobratím vzoriek. Po odobratí vzoriek sa ihne ď filtrujú cez membránu alebo sa odstredia (pozri 
prílohu II.4). Filtrované alebo odstredené vzorky sa analyzujú 
v ten istý de ň alebo sa skladujú pri teplote 2 – 4
 o C maximálne 
48 hodín alebo pod –18  o C dlhší čas. 
II.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
II.3.1.  Spracovanie výsledkov  
Percento degradácie v čase t sa vypo číta tak, ako je uvedené v I.7.1 
(stanovenie DOC) a prípadne pod ľa I.7.2 (špecifická analýza). 
Všetky výsledky sa zaznamenajú na poskytnutý záznamník údajov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Platnos ť výsledkov  
Pozri I.5.2.  
II.3.3.  Správa  
Pozri I.8.  
II.4. KARTA ÚDAJOV 
Príklad karty údajov je uvedený nižšie.  
TEST DOC DIE-AWAY 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  
3. TESTOVANÁ LÁTKA  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: ...mg/l chemickej látky. Počiatočná koncentrácia v médiu: ...mg/l chemickej látky.
 
4. INOKULUM  
Zdroj: 
Vykonaná úprava: 
Predkondiciovanie, ak sa vykonalo: 
Koncentrácia suspendovaných tuhých látok v reak čnej zmesi: 
mg/l.  
5. STANOVENIE UHLÍKA  
Analyzátor uhlíka:  
Banka č. DOC po n d ňoch (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testovaná látka 
a inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, stredná hodnota 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, stredná hodnota 
C b(t) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Banka č. DOC po n d ňoch (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Inokulový slepý 
pokus bez. testo ­
vanej chemickej látky 3 c
 1 
c 2 
c, stredná hodnota 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d. stredná hodnota 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VYHODNOTENIE ZÁKLADNÝCH ÚDAJOV  
Banka č. Degradáca v % po n d ňoch 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
ð1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Stredná 
hodnota (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Z hodnôt D  1 a D  2 by sa nemal robi ť priemer, ak je medzi nimi výrazný rozdiel.  
Poznámka:  Podobné tabu ľky sa môžu použi ť pre referen čnú látku 
alebo prípravok a kontroly toxicity.  
7. ABIOTICKA KONTROLA (NEPOVINNÁ)  
Čas (dni) 
0 t  
Koncentrácia DOC (mg/l) v sterilnej 
kontrole C a(l) C a(t) 
abiotický rozklad v %  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ŠPECIÁLNA CHEMICKÁ ANALÝZA (NEPOVINNÁ)  
Zvyškové množstvo testovanej 
chemichej látky na konci testu 
(mg/l) Primárna degradácia v %  
Sterilná kontrola S  b ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Zvyškové množstvo testovanej 
chemichej látky na konci testu 
(mg/l) Primárna degradácia v %  
Inokulované skúšobné médium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
ČASŤ III. MODIFIKOVANÝ SKRÍNINGOVÝ TEST OECD  
(METÓDA C.4-B)  
III.1. PRINCÍP METÓDY 
Odmeraný objem minerálneho média, obsahujúci známu koncen ­
tráciu testovanej látky (10 až 40 mg DOC/1), ako nominálny jediný 
zdroj organického uhlíka sa inokuluje s 0,5 ml odtoku z čistiarne 
odpadových vôd na liter média. Zmes sa prevzduš ňuje v tme alebo 
pri difúznom osvetlení pri teplote 22 ± 2  o C. 
Degradácia sa sleduje pomocou analýzy DOC v častých intervaloch 
počas 28 dní. Stupe ň biodegradácie sa vypo číta vyjadrením koncentrácie 
odstráneného DOC (upravené na kontrolu bez inokula) ako percento počiatočnej koncentrácie. Stupe ň primárnej biodegradácie sa môže tiež 
vypočítať z dodatočnej analýzy na za čiatku a na konci inkubácie.
 
III.2. OPIS METÓDY  
III.2.1. Prístroje 
a) Kónické banky, napr. 250 ml až 2 litre, v závislosti od potreb ­
ného objemu pre analýzu DOC. 
b) Trepačka prispôsobená na kónické banky, a to s automatickým 
temperovaním teploty alebo umiestnená v miestnosti so stabilnou teplotou a s dostato čným výkonom, aby zabezpe čila aeróbne 
podmienky vo všetkých bankách. 
c) Filtračné zariadenie s vhodnými membránami. 
d) Analyzátor DOC. 
e) Prístroj na stanovenie rozpusteného kyslíka. 
f) Odstredivka.
 
III.2.2.  Príprava minerálneho média  
O príprave zásobných roztokov pozri I.6.2. 
Zmieša sa 10 ml roztoku a) s 80 ml vody, pridá po 1 ml roztokov 
b) až d) a doplní sa do 1 litra vodou. 
Táto metóda používa len 0,5 ml inokula na liter, a preto môže 
vzniknúť potreba fortifikácie média stopovými prvkami 
a rastovými faktormi. To sa dosiahne pridaním 1 ml z týchto 
roztokov na liter kone čného média:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Roztok stopových prvkov: 
Síran mangánatý tetrahydrát, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Kyselina boritá, H  3 BO 3 57,2 mg 
Síran zino čnatý heptahydrát, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Heptamolybdenan hexaamónny, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Chelát Fe (FeCl  3 s kyselinou etyléndiamíntetraocto ­
vou) 100,0 mg 
Rozpustite vo vode a dopl ňte vodou na 1 liter. 
Vitamínový roztok: Kvasničný extrakt 15,0 mg 
Kvasničný extrakt rozpustite v 100 ml vody. Sterilizujte filtráciou 
cez 0,2-mikrónovú ( μm) membránu alebo pripravte čerstvý roztok.
 
III.2.3.  Príprava a prekondiciovanie inokula  
Inokulum sa môže získa ť zo sekundárneho výtoku čističky alebo 
laboratórnej jednotky, ktoré spracúvajú prevažne domáce splaškové vody. Pozri I.6.4.2 a I.6.5. 
Použije sa 0,5 ml na liter minerálneho média.
 
III.2.4.  Príprava baniek  
Ako príklad pridajte 800 ml minerálneho média do 2-litrových 
kónických baniek a pridajte vhodné objemy zásobných roztokov 
testovanej a referen čnej látky do oddelených baniek, aby sa získala 
koncentrácia ekvivalentná 10 až 40 mg DOC/liter. Skontrolujte pH hodnoty, a ak je to potrebné, upravte ich na 7,4. Inokulujte banky s kanaliza čným výtokom 0,5 ml/liter (pozri I.6.4.2). Tiež pripravte 
inokulové kontroly v minerálnom médiu, ale bez testovanej alebo 
referenčnej látky. 
Ak je to potrebné, použite jednu nádobu na skontrolovanie možného 
inhibičného účinku testovanej látky alebo prípravku inokulovaním 
roztoku obsahujúceho v minerálnom médiu porovnate ľné koncen ­
trácie testovanej aj referen čnej chemickej látky. 
Ak je to potrebné, použite tiež ďalšiu sterilnú banku, aby sa skon ­
trolovalo, či sa testovaná látka alebo prípravok degraduje abioticky 
s použitím neinokulovaného roztoku chemickej látky (pozri I.6.6). 
Okrem toho, ak existuje podozrenie, že sa testovaná látka alebo 
prípravok zna čne adsorbuje na sklo, kal at ď., vykoná sa predbežné 
hodnotenie, aby sa stanovil pravdepodobný rozsah adsorpcie a tak aj 
vhodnosť testu pre látku alebo prípravok (pozri tabu ľku 1). Pripraví 
sa banka obsahujúca testovanú látku, inokulum a steriliza čné činidlo. 
Doplnia sa objemy vo všetkých bankách na 1 liter s minerálnym 
médiom a po premiešaní sa odoberie vzorka z každej banky na stanovenie po čiatočnej koncentrácie DOC (pozri prílohu II.4). 
Otvory baniek sa prikryjú napr. hliníkovou fóliou takým spôsobom, 
aby sa umožnila vo ľná výmena vzduchu medzi bankou a okolitou 
atmosférou. Potom sa vložia nádoby do trepa čky a vykoná sa test.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Počet baniek v typickom teste  
Banky 1 a 2: Testovaná suspenzia. 
Banky 3 a 4: Inokulový slepý pokus. Banka 5: Kontrola postupu. A odporú ča sa, a ak je to potrebné: 
Banka 6: Abiotická sterilná kontrola. Banka 7: Kontrola na adsorpciu. 
Banka 8: Kontrola toxicity. 
Pozri tiež I.6.7.
 
III.2.6.  Realizácia testu  
Počas celého testu sa meria koncentrácia DOC v každej banke, 
v paralelkách, v známych časových intervaloch, dostato čne často, 
aby bolo možné stanovi ť začiatok 10-d ňového okna a percento 
odstránenia na konci 10-d ňového okna. Odoberie sa len minimálny 
objem testovanej suspenzie, nevyhnutný na každé stanovenie. 
Pred odberom vzorky sa doplnia straty vyparovaním z banky 
pridaním vody (I.6.1) v potrebnom množstve, ak je to nutné. Dôkladne sa premieša kultiva čné médium pred odberom vzorky 
a zaistí sa, aby sa materiál, ktorý je prilepený k stenám nádob, 
rozpustil alebo suspendoval pred odobratím vzoriek. Po odobratí vzoriek sa ihne ď filtrujú cez membránu alebo sa odstredia (pozri 
prílohu II.4). Filtrované alebo odstredené vzorky sa analyzujú 
v ten istý de ň alebo sa skladujú pri teplote 2 – 4
 o C maximálne 
48 hodín alebo pod –18  o C dlhší čas. 
III.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
III.3.1.  Spracovanie výsledkov  
Percento degradácie v čase t sa vypo číta tak, ako je uvedené v I.7.1 
(stanovenie DOC) a prípadne pod ľa I.7.2 (špecifická analýza). 
Všetky výsledky sa zaznamenajú na poskytnutý záznamník údajov.  
III.3.2. Platnos ť výsledkov 
Pozri I.5.2.  
III.3.3. Správa 
Pozri I.8.  
III.4. KARTA ÚDAJOV 
Príklad karty údajov je uvedený nižšie.  
MODIFIKOVANÝ SKRÍNINGOVÝ TEST OECD 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. TESTOVANÁ LÁTKA  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: ...mg/l chemickej látky. Počiatočná koncentrácia v médiu: ...mg/l chemickej látky
 
4. INOKULUM  
Zdroj: 
Vykonaná úprava: Predkondiciovanie, ak sa vykonalo: Koncentrácia suspendovaných tuhých látok v reak čnej zmesi: 
mg/l.
 
5. STANOVENIE UHLÍKA 
Analyzátor uhlíka:  
Banka č. DOC po n d ňoch (mg/l  1 ) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testovaná látka 
a inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, stredná hodnota 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, stredná hodnota 
C b(t) 
Inokulový slepý 
pokus bez. testo ­
vanej chemickej 
látky 3 c 1 
c 2 
c, stredná hodnota 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d. stredná hodnota 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VYHODNOTENIE ZÁKLADNÝCH ÚDAJOV  
Banka č. Degradácia v % po n d ňoch 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Banka č. Degradácia v % po n d ňoch 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Stredná 
hodnota (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Z hodnôt D  1 a D  2 by sa nemal robi ť priemer, ak je medzi nimi výrazný rozdiel.  
Poznámka:  Podobné tabu ľky sa môžu použi ť pre referen čnú látku 
alebo prípravok a kontroly toxicity.  
7. ABIOTICKÁ KONTROLA (NEPOVINNÁ)  
Čas (dni) 
0 t  
Koncentrácia DOC (mg/l) v sterilnej 
kontrole C a(i) C a(t) 
abiotický rozklad v %  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ŠPECIÁLNA CHEMICKÁ ANALÝZA (NEPOVINNÁ)  
Zvyškové množsatvo testovanej 
chemickej látky na konci testu 
(mg/l) Prímárna degradácia v %  
Sterilná kontrola S  b 
Inokulované skúšobné médium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
ČASŤ IV. VÝVOJ OXIDU UHLI ČITÉHO (CO  2 ) 
(METÓDA C.4-C)  
IV.1. PRINCÍP METÓDY 
Odmeraný objem inokulovaného minerálneho média, obsahujúceho 
známu koncentráciu testovanej látky alebo prípravku (10 až 20 mg DOC alebo TOC/l) ako nominálneho jediného zdroja organického 
uhlíka sa prevzduš ňuje prechodom vzduchu neobsahujúceho CO
 2 
v kontrolovaných podmienkach za tmy alebo pri difúznom osvetlení. 
Degradácia sa meria po čas 28 dní stanovovaním uvo ľňovaného CO  2 , 
ktorý sa zachytáva v hydroxide bárnatom alebo hydroxide sodnom 
a ktorý sa meria titráciou zvyškového hydroxidu alebo ako anorga ­
nický uhlík. Množstvo produkovaného CO  2 z testovanej látky alebo 
prípravku (upravené na hodnotu slepého inokulového pokusu) sa vyjadrí ako percento ThCO
 2 . Stupeň biodegradácie sa môže tiež 
vypočítať z dodato čnej analýzy DOC vykonanej na za čiatku a na 
konci inkubácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. OPIS METÓDY  
IV.2.1.  Prístroje  
a) 2-až 5-litrové banky, vybavené s aera čnou trubicou, dosahujúcou 
takmer na dno nádoby a výstupnou trubicou; 
b) magnetické miešadlá, ke ď sa hodnotia slabo rozpustné látky 
alebo prípravky; 
c) fľaše na absorbovanie plynu; 
d) zariadenie na kontrolu a meranie prietoku vzduchu; 
e) prístroj na odstránenie CO  2 pri príprave vzduchu, ktorý neobsa ­
huje CO  2 ; prípadne sa môže použi ť zmes kyslíka neobsahujúceho 
CO 2 a dusíka neobsahujúceho CO  2 z plynových fliaš v správnom 
pomere (20 % O  2 : 80 % N  2 ); 
f) zariadenie na stanovenie CO  2 , a to buď titráciou, alebo nejakým 
analyzátorom anorganického uhlíka; 
g) zariadenie na membránovú filtráciu (nepovinné); h) analyzátor DOC (nepovinné).
 
IV.2.2.  Príprava minerálneho média  
O príprave zásobných roztokov pozri I.6.2. 
Zmiešajte 10 ml roztoku a) s 800 ml vody, pridajte po 1 ml roztokov 
b) až d) a dopl ňte vodou do 1 litra.  
IV.2.3.  Príprava a prekondiciovanie inokula  
Inokulum sa môže získa ť z rôznych zdrojov: aktivovaný kal, kana ­
lizačný výtok, povrchové vody, pôda alebo ich zmesi. 
Pozri I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
IV.2.4.  Príprava baniek  
Ako príklad sa uvádzajú nasledujúce objemy a hmotnosti pre 5- 
litrové banky obsahujúce 3 litre suspenzie. Ak sa použijú menšie 
objemy, tieto hodnoty je potrebné pod ľa nich upravi ť, ale je potrebné 
zaistiť, aby bolo možné presne mera ť vytváraný oxid uhli čitý. 
Do každej 5-litrovej banky pridajte 2 400 ml minerálneho média. 
Pridajte vhodný objem pripraveného aktivovaného kalu (pozri I.6.4.1 a I.6.5) tak, aby získaná koncentrácia suspendovaných tuhých častíc 
nepresiahla 30 mg/l v kone čnej 3-litrovej inokulovanej zmesi. Alterna ­
tívne najskôr zrie ďte pripravený kal v minerálnom médiu na suspenziu 
s koncentráciou 500 až 1 000 mg/l pred pridaním daného objemu do 5- litrovej banky tak, aby sa získala koncentrácia 30 mg/l; to zaistí vä čšiu 
presnosť. Môžu použi ť aj iné zdroje inokula (pozri I.6.4.2). 
Cez noc prevzduš ňujte tieto inokulované zmesi so vzduchom, ktorý 
neobsahuje CO
 2 , aby sa odstránil CO  2 zo systému.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Oddelene pridajte testovaný materiál a referen čnú látku v známom 
objeme zásobných roztokov, použite paralelky v koncentráciách za 
prídavku látky alebo prípravku 10 až 20 mg DOC alebo TOC/ ­
l, nechajte niektoré banky bez prídavku látky alebo prípravku ako inokulové kontroly. Slabo rozpustné testované látky pridajte priamo 
do baniek v takom množstve alebo objeme, ako je uvedené 
v dodatku 3. 
Ak je to potrebné, použite jednu banku na kontrolu inhibi čného 
účinku testovanej látky alebo prípravku pridaním testovanej aj refe ­
renčnej látky alebo prípravku v tej istej koncentrácii, aká je 
v ostatných bankách. 
Takisto, ak je to potrebné, použite ďalšiu sterilnú banku na kontrolu, 
či sa testovaná látka alebo prípravok degraduje abioticky s použitím 
neinokulovaného roztoku látky alebo prípravku (pozri I.6.6). Sterili ­
zujte prídavkom jedovatej látky vo vhodnej koncentrácii. 
Doplňte objemy suspenzií vo všetkých bankách na 3 litre pridaním 
minerálneho média, ktoré sa predtým prevzdušnilo vzduchom neob ­
sahujúcim CO
 2 . Prípadne sa môžu odobra ť vzorky na analýzu DOC 
(pozri prílohu II.4) a/alebo na špecifickú analýzu. Pripojte absorp čné 
fľaše na výstupy z baniek. 
Ak sa použije hydroxid bárnatý, sériovo spojte tri absorp čné fľaše, 
každú obsahujúcu 100 ml 0,0125 M roztoku hydroxidu bárnatého ku každej 5-litrovej banke. Roztoky nesmú obsahova ť zrazeniny síranov 
a uhličitanov a ich sila sa musí stanovi ť tesne pred použitím. Ak sa 
použije hydroxid sodný, pripojte dve f ľaše, z ktorých druhá bude 
určená na demonštráciu, že sa všetok CO
 2 absorboval v prvej f ľaši. 
Absorpčné fľaše, na ktoré sedia uzávery sérových fliaš, sú bežne 
dostupné. Pridajte 200 ml 0,05 M NaOH do každej f ľaše, čo stačí 
na absorbovanie všetkého CO  2 , ktorý sa môže vyvinú ť pri 
úplnej degradácii testovanej látky. Roztok NaOH, aj ke ď je čerstvo 
pripravený, bude obsahova ť stopy uhli čitanov; to sa koriguje stano ­
vením uhli čitanu v slepom pokuse.  
IV.2.5.  Počet baniek v typickom teste  
Banky 1 a 2: Testovaná suspenzia,. 
Banky 3 a 4: Inokulový slepý pokus. 
Banka 5: Kontrola postupu. 
A odporú ča sa, a ak je to potrebné: 
Banka 6: Abiotická sterilná kontrola. Banka 7: Kontrola toxicity. Pozri tiež I.6.7.
 
IV.2.6.  Realizácia testu  
Začnite test prebublávaním vzduchu bez CO  2 cez suspenziu pri prie ­
toku 30 až 100 ml/min. Periodicky odoberajte vzorky absorbenta CO
 2 na analýzu obsahu CO  2 . Odporú ča sa počas prvých desiatich 
dní vykonáva ť analýzy každý druhý alebo tretí de ň a potom každý 
piaty deň až do 28. d ňa, takže sa obdobie 10-d ňového okna môže 
identifikova ť. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Na 28. de ň odoberte vzorky (volite ľné) na stanovenie DOC a/alebo 
špecifickú analýzu, merajte pH suspenzie a pridajte 1 ml koncen ­
trovanej HCl do každej banky, prevzdušnite banky cez noc, aby sa odstránil CO
 2 prítomný v testovaných suspenziách. Na 29. de ň vyko­
najte posledné analýzy uvo ľneného CO  2 . 
V dňoch merania CO  2 odpojte najbližšiu f ľašu s Ba(OH)  2 k banke 
a titrujte roztok hydroxidu s 0,05 M HCl s použitím fenolftaleínu 
ako indikátora. Posu ňte zostávajúce f ľaše bližšie k banke a pripojte 
novú fľašu s absorbentom obsahujúcu 100 ml čerstvého roztoku 
0,0125 M Ba(OH)  2 na koniec série fliaš. Vykonajte titrácie, ak sú 
potrebné, napr. ke ď sú zrazeniny vidite ľné v prvej f ľaši, ale predtým 
ako sú vidite ľné v druhej f ľaši alebo aspo ň raz za týžde ň. Ďalšou 
možnosťou je použitie NaOH ako absorbenta, v tomto prípade 
(v závislosti od charakteristiky použitého analyzátora uhlíka) 
odoberte strieka čkou malú vzorku roztoku NaOH z absorp čnej 
fľaše bližšej k banke. Injektujte vzorku do časti IC analyzátora 
uhlíka na priamu analýzu uvo ľneného CO  2 . 
Analyzujte obsah druhej záchytnej f ľaše len na konci testu, aby sa 
korigovala hodnota na prípadne prenesený CO  2 . 
IV.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
IV.3.1.  Spracovanie výsledkov  
Množstvo zachyteného CO  2 v absorbente sa pri titrácii ur čuje podľa 
rovnice: 
mgCO  2 = (100 × C  B – 0,5 × V × C  A ) × 44 
kde: V = objem HCl použitý na titráciu 100 ml absorbenta (ml); C
 B = koncentrácia roztoku Ba(OH)  2 (M); 
C A = koncentrácia roztoku HCl (M); 
ak je C  B 0,0125 M a C  A je 0,05 M, titrácia 100 ml Ba(OH)  2 je 
50 ml a hmotnos ť CO  2 je daná pod ľa rovnice:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCl titrované  ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
Preto sa v takomto prípade konvertuje objem titrovanej HCl na 
vytvorený CO  2 v mg faktorom 1,1. 
Vypočítajte hmotnosti vytvoreného CO  2 samotným inokulom 
a inokulom v prítomnosti testovanej látky alebo prípravku s použitím príslušných hodnôt titrácií, potom rozdiel je hmotnos ť 
vytvoreného CO
 2 zo samotnej testovanej látky alebo prípravku. 
Napríklad ak samotné inokulum má spotrebu na titráciu 48 ml 
a inokulum v prítomnosti testovanej látky má spotrebu 45 ml, 
CO 2 z inokula = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 z inokula v prítomnosti testovanej látky = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg, 
a preto hmotnos ť vytvoreného CO  2 z testovanej látky alebo 
prípravku je 3,3 mg. 
Percento biodegradácie sa vypo číta z rovnice:  
% degradácie ¼ mg vytvoreného CO  2 Ü 100 
ThCO  2 Ü mg pridanej testovanej látky alebo prípravku  
alebo  
% degradácie ¼ mg vytvoreného CO  2 Ü 100 
mg pridaného TOC v teste  Ü 3; 67 
kde 3,67 je konverzný faktor (44/12) pre uhlík na oxid uhli čitý. 
Získajte percentuálnu degradáciu po každom časovom intervale 
pridaním percenta z vypo čítaných hodnôt ThCO  2 pre každý de ň až 
do času, keď sa merala. 
Pre absorbent NaOH vypo čítajte množstvo uvo ľneného CO  2 , vyja­
drené ako IC (mg), vynásobením koncentrácie IC v absorbente 
objemom absorbentu. 
Percento degradácie sa vypo číta podľa rovnice:  
% ThCO  2 ¼ mg IC z testovanej banky – mg IC zo slepého pokusu 
mg TOC pridané ako testovaná látka alebo prípravok  Ü 100  
Odstránenie DOC (nepovinné) sa vypo číta podľa I.7. Zaznamenajte 
tieto a ostatné výsledky do uvedenej karty údajov.  
IV.3.2.  Platnos ť výsledkov  
Obsah IC v suspenzii testovanej látky alebo prípravku v minerálnom 
médiu na za čiatku testu musí by ť menší ako 5 % TC a celková 
tvorba CO  2 v inokulovom slepom pokuse na konci testu by nemala 
normálne presahova ť 40 mg/l média. Ak sú hodnoty vä čšie ako 
70 mg CO  2 /liter, potom by sa mali kriticky posúdi ť údaje aj expe ­
rimentálna technika. 
Pozri tiež I.5.2.  
IV.3.3.  Správa  
Pozri I.8.  
IV.4. KARTA ÚDAJOV 
Príklad záznamníka údajov je uvedený nižšie.  
TEST VÝVOJA OXIDU UHLI ČITÉHO 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  
3. TESTOVANÁ LÁTKA ALEBO PRÍPRAVOK  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: …mg/liter chemickej látky  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Počiatočná koncentrácia v médiu: …mg/liter chemickej látky 
Celkový C pridaný do banky: …mg C, 
ThCO  2 : mg CO  2 
4. INOKULUM  
Zdroj: 
Úprava: 
Prekondiciovanie, ak sa vykonalo: Koncentrácia suspendovaných tuhých látok v reak čnej zmesi: 
mg/liter. 
5. TVORBA OXIDU UHLI ČITÉHO A DEGRADOVATE ĽNOSŤ 
Metóda: Ba(OH)
 2/NaOH/iné  
Čas 
(dni) CO 2 vytvorený v  
teste (mg) CO 2 veidošan ās 
no tukša parauga (mg) Celkové množstvo 
CO 2 
(priemer v teste mínus 
priemer v teste 
naslepo) (mg) % THCO  2 
celkový  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 priemer 3 
4 priemer 1 2 1 2 priemer  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Poznámka: podobné tabu ľky sa môžu použi ť pre referen čné 
chemické látky a na kontrolu toxicity.  
6. ANALÝZA UHLÍKA (NEPOVINNÁ)  
Analyzátor uhlíka:  
Čas (dni) Test naslepo (mg/l) Testovaná látka (mg/l)  
0 C  b(l) C 0 
28 (  1 ) C  b(t) C t 
( 1 ) alebo na konci kultivácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% odstráneného DOC  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. ABIOTICKÁ DEGRADÁCIA (NEPOVINNÉ)  
% abiotickej degradácie  ¼ CO  2 Ä tvorba CO2 v sterílnej banke po 28 d ňoch ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100  
ČASŤ V. TEST MANOMETRICKEJ RESPIROMETRIE  
(METÓDA C.4-D)  
V.1. PRINCÍP METÓDY 
Známy objem inokulovaného minerálneho média, obsahujúci známu 
koncentráciu testovanej látky alebo prípravku (100 mg/liter testo ­
vanej látky, aby sa dosiahla koncentrácia aspo ň 50 až 100 mg 
ThOD/liter) ako jediného nominálneho zdroja organického uhlíka, sa mieša v uzavretej banke pri konštantnej teplote (± 1
 o C alebo 
presnejšie) po čas 28 dní. Spotreba kyslíka sa stanoví meraním množ ­
stva kyslíka (produkovaného elektrolyticky), ktoré vyžaduje udržia ­
vanie konštantného objemu plynu v respirometrickej banke, alebo zo 
zmien v objeme alebo tlaku (alebo ich kombinácia) v prístroji. Vyvi ­
nutý oxid uhli čitý sa absorbuje v roztoku KOH alebo iného vhod ­
ného absorbenta. Množstvo kyslíka odobraného testovanou látkou alebo prípravkom (upravené na spotrebu inokulového slepého 
pokusu, ktorý prebieha paralelne) sa vyjadrí ako percento z ThOD 
alebo CHSK. Primárna biodegradácia sa môže prípadne tiež vypo ­ 
čítať z dodato čnej špecifickej analýzy vykonanej na za čiatku a na 
konci inkubácie a z úplnej biodegradácie na základe analýzy DOC.
 
V.2. OPIS METÓDY  
V.2.1.  Prístroje  
a) vhodný respirometer; 
b) prístroj na udržiavanie a kontrolu teploty (± 1  o C alebo presnej ­ 
šie); 
c) zostava pre membránovú filtráciu (nepovinné); d) analyzátor uhlíka (nepovinné).
 
V.2.2.  Príprava minerálneho média  
O príprave zásobných roztokov pozri I.6.2. 
Zmiešajte 10 ml roztoku a) s 800 ml vody, pridajte po 1 ml roztokov 
b) až d) a dopl ňte vodou do 1 litra.  
V.2.3.  Príprava a prekondiciovanie inokula  
Inokulum sa môže získa ť z rôznych zdrojov: aktivovaného kalu, 
kanalizačného výtoku, povrchových vôd, pôdy alebo ich zmesí. 
Pozri I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
V.2.4.  Príprava baniek  
S použitím zásobných roztokov pripravte v oddelených sadách 
100 mg roztoky testovanej látky alebo prípravku a referen čnej látky/ ­
liter (ktoré poskytujú aspo ň 50 až 100 mg ThOD/liter).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Vypočítajte ThOD na základe tvorby amónnych solí, pokia ľ nedo­
chádza k nitrifikácii, ke ď by výpo čet mal by ť založený na tvorbe 
dusičnanov (pozri prílohu II.2). 
Stanovte hodnoty pH, a ak je to potrebné, upravte ich na 7,4 ± 0,2. 
Slabo rozpustné látky alebo prípravky by sa mali prida ť neskôr 
(pozri nižšie). 
Ak sa má stanovi ť toxicita testovanej látky alebo prípravku, pripravte 
roztok v minerálnom médiu, ktorý obsahuje sú časne testovanú látku 
alebo prípravok aj referen čnú látku v tých istých koncentráciách ako 
v jednotlivých roztokoch. 
Ak sa vyžaduje meranie fyzikálno-chemickej spotreby kyslíka, 
pripravte roztok testovanej látky alebo prípravku, normálne 100 mg ThOD/liter, ktorý bol sterilizovaný prídavkom vhodnej 
toxickej látky (pozri I.6.6). 
Umiestnite pripravené objemy roztokov testovanej a referen čnej látky 
alebo prípravku aspo ň do dvoch paralelných baniek. Do ďalších 
baniek pridajte len minerálne médium (na inokulové kontroly), a ak sa to vyžaduje, zmes roztoku testovanej a referen čnej látky 
alebo prípravku a sterilného roztoku. 
Ak je testovaná chemická látka slabo rozpustná, pridajte ju priamo 
na hmotnostnom alebo objemovom základe alebo postupujte pod ľa 
prílohy III. Pridajte KOH pelety alebo iný absorbent do častí urče­
ných na absorbciu CO
 2 . 
V.2.5.  Počet baniek v typickom teste  
Banky 1 a 2: Testovaná suspenzia 
Banky 3 a 4: Inokulový slepý pokus Banka 5: Kontrola postupu A odporú ča sa, ak je to potrebné: 
Banka 6: Sterilná kontrola 
Banka 7: Kontrola toxicity 
Pozri tiež I.6.7.
 
V.2.6.  Realizácia testu  
Zohrejte nádoby na požadovanú teplotu a inokulujte ich 
s pripraveným aktivovaným kalom alebo iným zdrojom inokula tak, aby koncentrácia suspendovaných tuhých častíc nepresiahla 
30 mg/liter. Zložte zariadenie, zapnite miešadlo, skontrolujte vzdu ­
chotesnos ť a začnite meranie spotreby kyslíka. Zvy čajne nie je 
potrebná iná starostlivos ť, ako získa ť potrebné údaje a vykona ť 
dennú kontrolu správnosti teploty a miešania. 
Vypočítajte spotrebu kyslíka z údajov, ktoré sa zistili v pravidelných 
a častých intervaloch, pod ľa metód uvedených výrobcom zariadenia. 
Na konci inkubácie, normálne po 28 d ňoch, odmerajte pH obsahu 
baniek, najmä ak spotreba kyslíka bola nízka alebo vä čšia ako 
ThODNH
 4 (pre chemické látky obsahujúce dusík).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Ak je to potrebné, odoberte vzorky z respirometrických baniek na 
začiatku a na konci na analýzu DOC alebo špecifickej látky alebo 
prípravku (pozri prílohu II.4). Pri po čiatočnom odbere zaistite, aby zostá ­
vajúci objem testovanej suspenzie v banke bol známy. Ak sa kyslík spotrebúva testovanou látkou obsahujúcou dusík, stanovte nárast 
koncentrácie dusitanov a dusi čnanov počas 28 dní a vypo čítajte korekciu 
na kyslík spotrebovaný nitrifikáciou (dodatok 5).
 
V.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
V.3.1.  Spracovanie výsledkov  
Vydeľte spotrebu kyslíka (mg) testovanou látkou alebo prípravkom 
po danom čase (upravené na spotrebu kyslíka kontrolným inoku ­
lovým slepým pokusom po rovnakom čase) hmotnos ťou použitej 
testovanej látky alebo prípravku. Tak sa získa BSK, vyjadrená ako 
mg kyslíka/mg testovanej látky alebo prípravku, t. j.:  
BOD ¼ ðmg spotreby O  2 testovanej látky – mg spotreby O  2 slepého pokusuÞ 
ðmg testovanej látky alebo prípravku v banke Þ 
= mg O  2 na mg testovanej látky alebo prípravku 
Vypočítajte percento biodegradácie bu ď z rovnice:  
% biodegradácie ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg BSKðmg O2 látky alebo prípravku ÞÞ 
ThODðmg O  2=mg ThODðmg O2 látky alebo prípravku ÞÞ Ü 100  
alebo z rovnice  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg BSKðmg O2 látky alebo prípravku ÞÞ 
ThODðmg O  2=mg ThODðmg O2 látky alebo prípravku ÞÞ Ü 100  
Je potrebné poznamena ť, že tieto dve metódy nemusia nutne posky ­
tovať rovnakú hodnotu, uprednost ňuje sa použitie prvej metódy. 
Pre testované látky alebo prípravky obsahujúce dusík použite vhodné 
ThOD (NH  4 alebo NO  3 ) podľa toho, čo je známe alebo sa o čakáva 
o výskyte nitrifikácie (pozri prílohu II.2). Ak dôjde k výskytu nitri ­
fikácie, ale nie úplnej, vypo čítajte úpravu na kyslík spotrebovaný 
nitrifikáciou zo zmien v koncentrácii dusitanov a dusi čnanov 
(dodatok 5). 
Ak sú vykonané volite ľné stanovenia organického uhlíka a/alebo 
špecifickej látky alebo prípravku, vypo čítajte percento degradácie 
podľa I.7 tejto metodiky. 
Zaznamenajte všetky výsledky na pripojený záznamník údajov.  
V.3.2.  Platnos ť výsledkov  
Spotreba kyslíka v inokulovom slepom pokuse je normálne 20 až 
30 mg O  2 na liter a nemala by presahova ť 60 mg/liter za 28 dní. 
Hodnoty vyššie ako 60 mg/liter vyžadujú kritické prehodnotenie údajov a experimentálnych techník. Ak pH hodnota je mimo rozsahu 
6 až 8,5 a spotreba kyslíka testovanou látkou alebo prípravkom je 
menšia ako 60 %, potom by sa mal test zopakova ť s nižšou koncen ­
tráciou testovanej látky. 
Pozri tiež I.5.2.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Správa  
Pozri I.8.  
V.4. KARTA ÚDAJOV  
Príklad záznamníka údajov je uvedený ďalej. 
TEST MANOMETRICKEJ RESPIROMETRIE 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  
3. TESTOVANÁ LÁTKA ALEBO PRÍPRAVOK  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: … mg/liter 
Počiatočná koncentrácia v médiu, C  o : … mg/liter 
Objem v skúšobnej banke (V): … ml 
ThOD alebo CHSK: mg O  2 /mg testovanej látky (NH  4 alebo 
NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Zdroj: 
Úprava: Prekondiciovanie, ak sa vykonalo: 
Koncentrácia suspendovaných tuhých látok v reak čnej zmesi: 
mg/liter.
 
5. SPOTREBA KYSLÍKA: BIODEGRADOVATE ĽNOSŤ 
Čas (dni) 
0 7 14 21 28  
Spotreba O  2 
(mg) testo ­
vanou látkou 1 
2 
a, priemer 
Spotreba O  2 
(mg) v teste 
naslepo 3 
4 
b, priemer 
Korigovaná 
BSK (mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BSK na mg 
testovanej látky ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Čas (dni) 
0 7 14 21 28  
Rozklad v %  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Priemer (*)  
V = objem média v skúšobnej banke. 
(*) Nemal by sa urobi ť priemer z hodnôt D  1 a D  2 , ak je medzi nimi výrazný rozdiel.  
Poznámka: Podobná tabu ľka sa môže použi ť pre referen čnú 
chemickú látku a na kontrolu toxicity.  
6. KOREKCIA NA NITRIFIKÁCIU (POZRI PRÍLOHU V).  
Deň 0 28 Rozdiel  
i) Koncentrácia dusi čnanov (mg N na liter) {N) 
ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg) — — 
iii) Koncentrácia dusitanov (mg N na liter) {N) 
iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg) — — 
ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent — —  
7. ANALÝZA UHLÍKA (NEPOVINNÉ)  
Analyzátor uhlíka:  
Čas (dni) Test naslepo (mg/l) Testovaná látka (mg/l)  
D (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) Alebo na konci inkubácie.  
% DOC % odstráneného  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100  
8. ŠPECIFICKÁ CHEMICKÁ LÁTKA (NEPOVINNÉ)  
S b = koncentrácia vo fyzikálno-chemickej (sterilnej) kontrole 
po 28 dňoch 
S a = koncentrácia v inokulovanej banke po 28 d ňoch. 
% biodegradácie ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
9. ABIOTICKÁ DEGRADÁCIA (NEPOVINNÉ)  
a = spotreba kyslíka (O  2 ) v sterilných bankách po 28 d ňoch (mg) 
spotreba kyslíka na mg testovavej látky alebo prípravku  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(pozri oddiely 1 a 3)  
% abiotickej degradácie  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
ČASŤ VI. TEST UZAVRETEJ F ĽAŠE  (METÓDA C.4-E)  
VI.1. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Roztok testovanej látky alebo prípravku v minerálnom médiu, 2 až 
5 mg/liter, sa inokuluje s relatívne malým po čtom mikroorganizmov 
zo zmesovej populácie a udržiava sa v úplne plných, uzavretých fľašiach v tme za konštantnej teploty. Degradácia sa sleduje 
analýzou rozpusteného kyslíka po čas 28-dňového obdobia. Množstvo 
spotrebovaného kyslíka testovanou látkou alebo prípravkom, upra ­
vené na spotrebu inokulového slepého pokusu, ktorý sa testuje para ­
lelne, sa vyjadrí ako percento ThOD alebo CHSK.
 
VI.2. OPIS METÓDY  
VI.2.1.  Prístroje  
a) fľaše BSK so sklenenými uzávermi, napr. 250 až 300 ml; 
b) vodný kúpe ľ alebo inkubátor na udržiavanie fliaš pri konštantnej 
teplote (± 1  o C alebo presnejšie) s vylú čením svetla; 
c) veľké sklenené f ľaše (2-až 5-litrové) na prípravu média na 
naplnenie fliaš BSK; 
d) kyslíková elektróda a prístroj alebo zariadenie a reagenty na 
Winklerovu titráciu.  
VI.2.2.  Príprava minerálneho média  
O príprave zásobných roztokov pozri I.6.2. 
Zmiešajte 1 (jeden) ml roztokov (a) až (d) a dopl ňte vodou do 1 litra.  
VI.2.3.  Príprava inokula  
Inokulum sa normálne získa zo sekundárneho výtoku čističky alebo 
laboratórnej jednotky, ktoré prevažne spracúvajú domáce splaškové 
vody. Alternatívnym zdrojom inokula je povrchová voda. Používa sa jedna kvapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na liter média, môžu by ť 
potrebné pokusy na zistenie optimálneho objemu pre daný výtok 
(pozri I.6.4.2 a I.6.5).
 
VI.2.4.  Príprava baniek  
Aspoň 20 minút intenzívne prevzduš ňujte minerálne médium. 
Pripravte každú testovaciu sériu z minerálneho média z tej istej 
zásoby. Vo všeobecnosti je médium pripravené na použitie až po 
20 hodinách státia pri teplote testovania. Stanovte koncentráciu rozpusteného kyslíka na ú čely kontroly, pri 20
 o C by mala by ť 
hodnota okolo 9 mg/liter. Vykonajte všetky prenosy a plnenia vzdu ­
chom nasýteného, bubliny neobsahujúceho média, napr. s použitím 
sifónu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Pripravte paralelné skupiny BSK fliaš na stanovenie testovanej 
a referen čnej látky na simultánne experimentálne série. Zostavte 
dostatočný počet BSK fliaš vrátane inokulového slepého pokusu, 
tak aby bolo možné meranie spotreby kyslíka aspo ň v dvoch para ­
lelkách v požadovaných skúšobných intervaloch, napr. po 0, 7, 14, 
21 a 28 d ňoch. Viac fliaš sa môže vyžadova ť na zaistenie identifi ­
kácie 10-d ňového okna. 
Pridajte kompletne prevzdušnené minerálne médium do ve ľkých fliaš 
tak, aby boli naplnené asi do jednej tretiny. Potom pridajte vhodné 
množstvo zásobných roztokov testovanej látky alebo prípravku 
a referen čnej látky do osobitných ve ľkých fliaš tak, aby kone čná 
koncentrácia látky alebo prípravku nepresahovala 10 mg/liter. Do ďalšej veľkej fľaše obsahujúcej kontrolný slepý pokus nepridávajte 
žiadne látky ani prípravky. 
Aby sa zaistilo, že aktivita inokula nie je limitovaná, koncentrácia 
rozpusteného kyslíka nesmie by ť v BSK f ľašiach nižšia ako 0,5 
mg/liter. To limituje koncentráciu testovanej látky alebo prípravku 
asi na 2 mg/liter. Avšak v prípade slabo degradovate ľných látok 
alebo prípravkov a látok alebo prípravkov s nízkou hodnotou ThOD sa môže použi ť koncentrácia 5 až 10 mg/liter. V niektorých 
prípadoch sa odporú ča testova ť paralelne pri dvoch rozdielnych 
koncentráciách, napríklad 2 mg/liter a 5 mg/liter. Normálnym 
spôsobom vypo čítajte ThOD na základe tvorby amónnych solí, ale 
ak sa vie alebo o čakáva, že bude prebieha ť nitrifikácia, je potrebné 
vypočítať túto hodnotu na základe tvorby dusi čnanov (ThOD
 NO3 : 
pozri prílohu II.2). Ak však nitrifikácia nie je úplná, ale predsa 
prebieha, je potrebné vykona ť korekciu na zmeny v koncentrácii 
dusitanov a dusi čnanov stanovených analýzou (pozri prílohu V). 
Ak je potrebné testova ť toxicitu testovanej látky alebo prípravku 
(v prípade napríklad zistenej nízkej biodegradovate ľnosti), sú 
potrebné ďalšie série fliaš. 
Pripravte ďalšiu veľkú fľašu obsahujúcu prevzdušnené minerálne 
médium (asi do jednej tretiny jej objemu) a testovanú látku alebo 
prípravok a referen čnú látku v rovnakých kone čných koncentráciách, 
aké sú v ostatných ve ľkých fľašiach. 
Inokulujte roztoky vo ve ľkých fľašiach so sekundárnym výtokom 
(jedna kvapka alebo asi 0,05 ml až 5 ml/liter) alebo iným zdrojom, 
ako je rie čna voda (pozri I.6.4.2). Nakoniec dopl ňte roztoky na 
objem s prevzdušneným minerálnym médiom s použitím hadi čky 
dosahujúcej až na dno f ľaše, aby sa dosiahlo riadne premiešanie.  
VI.2.5.  Počet baniek v typickom teste  
V typickom teste sa použijú tieto f ľaše: 
— aspoň 10 fliaš obsahujúcich testovanú látku alebo prípravok 
a inokulum (testovaná suspenzia), 
— aspoň 10 fliaš obsahujúcich len inokulum (inokulový slepý pokus), 
— aspoň 10 fliaš obsahujúcich referen čnú látku a inokulum (kon ­
trola postupu),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— a ak je to nutné, 6 fliaš obsahujúcich testovanú látku alebo 
prípravok, referen čnú látku a inokulum (kontrola toxicity). Aby 
sa však zaistila identifikácia 10-d ňového okna, bol by potrebný 
približne dvojnásobný po čet fliaš.  
VI.2.6. Realizácia testu 
Ihneď rozdeľte každý pripravený roztok do príslušnej skupiny BSK 
fliaš s použitím hadi čky zo spodnej štvrtiny (nie z dna) vhodne 
veľkej fľaše, tak aby všetky BSK f ľaše boli úplne naplnené. 
Jemne trasením odstrá ňte všetky vzduchové bubliny. Okamžite 
analyzujte v nulovom čase rozpustený kyslík Winklerovou alebo 
elektródovou metódou. Obsah fliaš sa môže zakonzervova ť pre 
neskoršiu analýzu Winklerovou metódou pridaním síranu mangana ­
tého (II) a hydroxidu sodného (prvý Winklerov reagent). Uskladnite 
starostlivo uzavreté f ľaše obsahujúce zafixovaný kyslík ako hnedý 
hydratovaný (III) oxid manganitý v tme pri teplote 10 až 20  o C nie 
dlhšie ako 24 hodín pred vykonaním zostávajúcich krokov Winkle ­
rovej metódy. Uzavrite zostávajúce paralelné f ľaše tak, aby sa zais ­
tilo, že nie sú uzavreté žiadne vzduchové bubliny, a inkubujte za tmy pri teplote 20
 o C. Každá séria musí by ť spolu s kompletnou para ­
lelnou sériou na stanovenie slepého pokusu inokulovaného média. 
Odoberte aspo ň po dve f ľaše zo všetkých sérií na analýzu rozpuste ­
ného kyslíka v časových intervaloch (aspo ň týždenne) po čas 28- 
dňovej inkubácie. 
Týždenné odbery vzoriek umožnia hodnotenie percentuálneho 
odstránenia v 14-d ňovom okne, avšak odbery každé 3 až 4 dni by 
mali umožni ť identifikova ť 10-dňové okno, čoby vyžadovalo dvoj ­
násobok fliaš. 
Pre testované látky obsahujúce dusík by sa mali vykona ť korekcie na 
spotrebu kyslíka prípadnou nitrifikáciou. Aby sa toto vykonalo, použite metódu kyslíkovej elektródy na stanovenie koncentrácie 
rozpustného kyslíka a potom odoberte vzorku z BSK f ľaše na 
analýzu dusitanov a dusi čnanov. Z nárastu koncentrácie dusitanov 
a dusičnanov vypo čítajte spotrebovaný kyslík (pozri prílohu V).
 
VI.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
VI.3.1.  Spracovanie výsledkov  
V prvom rade vypo čítajte BSK získaný po každej časovej perióde 
odpočítaním spotreby kyslíka (mg O  2 /liter) v inokulovom slepom 
pokuse od spotreby kyslíka testovanou látkou alebo prípravkom. 
Vydeľte túto upravenú spotrebu koncentráciou (mg/liter) testovanej 
látky alebo prípravku, aby sa získala špecifická hodnota BSK ako mg kyslíka na mg testovanej látky alebo prípravku. Vypo čítajte 
percento biodegradovate ľnosti vydelením špecifickej hodnoty BSK 
so špecifickou hodnotou ThOD (vypo čítanou pod ľa prílohy II.2) 
alebo CHSK (stanovené analýzou, pozri prílohu II.3), potom:
 
BOD ¼ mg spotreby O  2 testovanej Ä mg spotreby O  2 slepého pokusu 
ðBSKÞ ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 na mg testovanej látky alebu prípravku  
% degradácie ¼ BOD ðmg O  2=mg BSK ðmg O  2=mg testovanej chemickej látky ÞÞ 
ThODðmg O  2=mg ThOD ðmg O  2=mg testovanej chemickej látky ÞÞ Ü 100  
alebo  
% degradácie ¼ BOD ðmg O  2=mg BSK ðmg O  2=mg testovanej chemickej látky ÞÞ 
CODðmg O  2=mg CHSK ðmg O  2=mg testovanej chemickej látky ÞÞ Ü 100 
Je potrebné poznamena ť, že tieto dve metódy nemusia nutne posky ­
tovať rovnakú hodnotu, uprednost ňuje sa použitie prvej metódy. 
Pre testované látky obsahujúce dusík použite vhodné ThOD (NH  4 
alebo NO  3 ) podľa toho, čo je známe alebo sa o čakáva o výskyte 
nitrifikácie (pozri prílohu II.2). Ak dôjde k výskytu nitrifikácie, ale 
nie úplnej, vypo čítajte úpravu na kyslík spotrebovaný nitrifikáciou zo 
zmien v koncentrácii dusitanov a dusi čnanov (dodatok 5).  
VI.3.2.  Platnos ť výsledkov  
Spotreba kyslíka v inokulovom slepom pokuse by nemala presa ­
hovať 1,5 mg rozpusteného O  2 /liter po 28 d ňoch. Hodnoty vyššie 
ako táto vyžadujú prehodnotenie a posúdenie experimentálnych tech ­
ník. Počas celého testu by sa nemala zvyšková koncentrácia kyslíka 
znížiť pod 0,5 mg/liter. Takéto nízke hladiny kyslíka sú platné, len 
ak metódy stanovenia rozpustného kyslíka sú schopné presne mera ť 
takéto nízke koncentrácie. 
Pozri tiež I.5.2.  
VI.3.3.  Správa  
Pozri I.8.  
VI.4. KARTA ÚDAJOV 
Príklad karty údajov je uvedený ďalej. 
TEST UZAVRETEJ F ĽAŠE 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  
3. TESTOVANÁ LÁTKA ALEBO PRÍPRAVOK  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: ... mg/liter Počiatočná koncentrácia vo f ľaši: ... mg/liter 
ThOD alebo CHSK: ... mg O
 2 /mg testovanej látky  
4. INOKULUM  
Zdroj: 
Úprava:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Prekondiciovanie, ak sa vykonalo: 
Koncentrácia v reak čnej zmesi: … mg/liter  
5. STANOVENIE ROZPUSTENÉHO KYSLÍKA  
Metóda: Winklerova/elektródová  
Analýzy baniek  
Doba inkubácie (d) Rozpustený kyslik (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Test naslepo (bez 
chemickej látky) 1 C  1 
2 C  2 
Priemer 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Testovaná chemická 
látka 1 a  1 
2 a  2 
Priemer 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Poznámka: Podobná tabu ľka sa môže použi ť pre referen čnú látku 
a na kontrolu toxicity  
6. KOREKCIA NA NITRIFIKÁCIU (POZRI PRÍLOHU V)  
Doba inkubácie d) 0 n  1 n 2 n 3 
i) Koncentrácia dusi čnanov (mg N na liter) 
ii) Zmena koncentrácie dusi čnanov (mg N na liter) — 
ii) Kyslíkový ekvivalent (mg/l) — iv) Koncentrácia dusitanov (mg N na liter) v) Zmena koncentrácie dusitanov (mg N na liter) — vi) Kyslíkový ekvivalent (mg/l) — iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg/l) —
 
7. SPOTREBA ROZPUSTENÉHO KYSLÍKA: % DEGRA ­
DÁCIE  
Spotreba po n d ňoch (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
BANKA 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
BANKA 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Spotreba po n d ňoch (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
BANKA 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
koncentrácia látky Ü ThOD látky 
BANKA 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
koncentrácia látky Ü ThOD látky 
% D priemer (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Nepo čítajte priemer, ak je výrazný rozdiel medzi paralelkami.  
m to = hodnota v skúšobnej banke v čase 0 
m tx = hodnota v skúšobnej banke v čase x 
m bo = stredná hodnota slepého pokusu v čase 0 
m bx = stredná hodnota slepého pokusu v čase x 
Tiež aplikujte korekciu na nitrifikáciu z iii + vi v oddiele 6.  
8. SPOTREBA ROZPUSTENÉHO KYSLÍKA V SLEPOM 
POKUSE  
Spotreba kyslíka v slepom pokuse: (m  bo – m  b28 ) mg/liter. Táto 
spotreba je dôležitá pre platnos ť testu. Mala by by ť menšia ako 
1,5 mg/liter.  
ČASŤ VII.  TEST M.I.T.I.  (METÓDA C.4-F)  
VII.1. PRINCÍP METÓDY 
Spotreba kyslíka v miešanom roztoku alebo suspenzii testovanej 
látky alebo prípravku v minerálnom médiu, inokulovanom so špeciálne kultivovanými, neadaptovanými mikroorganizmami sa meria automaticky po čas 28 dní v tmavom, uzavretom respirometri 
pri teplote 25 ± 1
 o C. Vyvíjaný oxid uhli čitý sa absorbuje nátro ­
novým vápnom. Biodegradovate ľnosť je vyjadrená v percentách 
spotreby kyslíka (korigované na spotrebu slepého pokusu) 
z teoretickej spotreby (ThOD). Percento primárnej biodegradovate ľ­
nosti sa tiež vypo číta z dodato čnej špecifickej analýzy vykonanej na 
začiatku a na konci inkubácie a prípadne z analýzy DOC.  
VII.2. OPIS METÓDY  
VII.2.1.  Prístroje  
a) automatický elektrolytický BSK-meter alebo respirometer, 
normálne vybavený 6 f ľašami s 300 ml objemu a nádobami 
obsahujúcimi absorbent CO  2 ; ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) miestnos ť s konštantnou teplotou a/alebo vodný kúpe ľ s teplotou 
25 ± 1  o C alebo presnejšie; 
c) zariadenie na membránovú filtráciu (nepovinné); d) analyzátor uhlíka (nepovinné).
 
VII.2.2.  Príprava minerálneho média  
S použitím látok analytickej čistoty a vody pripravte tieto zásobné 
roztoky (I.6.1): 
a) Dihydrogénfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 8,50 g 
Hydrogénfosfore čnan didraselný, K  2 HPO  4 21,75 g 
Hydrogénfosfore čnan dvoj sodný dodekahydrát 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Chlorid amónny, NH  4 Cl 1,70 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. Hodnota pH roztoku musí by ť 7,2. 
b) Síran hore čnatý heptahydrát, MgSO
 4 7 H  2 O 22,50 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
c) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl  2 27,50 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
d) Chlorid železitý hexahydrát, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Rozpustí sa vo vode a doplní na 1 liter. 
Odoberte 3 ml z každého roztoku a), b), c) a d) dopl ňte do 1 litra.  
VII.2.3.  Príprava inokula  
Získajte čerstvé vzorky z najmenej desiatich miest, najmä z oblasti, kde 
sú použité a rozptýlené rozli čné látky alebo prípravky. Z miest, ako sú 
čističky odpadových vôd, čističky vôd priemyselného odpadu, rieky, 
jazerá, more zhromaždite 1 liter vzorky kalu, povrchovej pôdy, vody 
atď. a zmiešajte ich spolu. Po odstránení plávajúcich látok a odstátí 
upravte hodnotu pH supernatantu na pH 7 ± 1 s hydroxidom sodným (NaOH) alebo s kyselinou fosfore čnou (H
 3 PO 4 ). 
Použite vhodný objem filtrovaného supernatantu na naplnenie 
nádoby s aktivovaným kalom a prevzduš ňujte kvapalinu asi 23,5 
hodiny. Tridsa ť minút po zastavení prevzduš ňovania odde ľte asi 
jednu tretinu objemu supernatantu a pridajte rovnaký objem roztoku (pH 7) obsahujúceho 0,1 % glukózy, peptonu a dihydrofosfore čnanu 
draselného k usadenému materiálu a znovu za čnite prevzduš ňovanie. 
Opakujte tento postup raz denne. Kalová jednotka musí fungova ť 
podľa správnej praxe: výtok by mal by ť číry, teplota by sa mala 
udržiavať na 25 ± 2
 o C, hodnota pH má by ť 7 ± 1, kal by sa mal 
dobre sedimentova ť, dostatočné prevzduš ňovanie by malo udržiava ť 
zmes stále aeróbnu, mali by by ť prítomne prvoky a aktivita kalu by 
sa mala testova ť referenčnou látkou aspo ň každé tri mesiace. Nepou ­ 
žite kal ako inokulum skôr ako po jednom mesiaci, ale už nie po 
štyroch mesiacoch. Preto odoberte vzorku aspo ň z 10 miest 
v pravidelných intervaloch, raz za tri mesiace.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Aby sa udržala rovnaká aktivita čerstvého a starého kalu, zmiešajte 
filtrovaný supernatant aktivovaného kalu, ktorý sa používa 
s rovnakým objemom filtrovaného supernatantu z čerstvo zhromaž ­
denej zmesi z 10 miest, a kultivujte kombinovanú zmes, ako je vyššie uvedené. Použite kal ako inokulum po 18 až 24 hodinách 
po pridaní živín.
 
VII.2.4.  Príprava baniek  
Pripravte týchto 6 baniek: 
Banka č. 1: testovaná látka alebo prípravok vo vode, 100 mg/liter. 
Banka č. 2, 3 a 4: testovaná látka alebo prípravok v minerálnom 
médiu, 100 mg/liter. 
Banka č. 5: referen čná látka alebo prípravok (napr. anilín) 
v minerálnom médiu 100 mg/liter. 
Banka č. 6: samotné minerálne médium. 
Slabo rozpustné testované chemické látky pridajte priamo, a to pod ľa 
ich hmotnosti alebo objemu, alebo s nimi zaobchádzajte pod ľa toho, 
ako je to uvedené v dodatku 3, okrem toho by sa nemali prida ť 
rozpúšťadlá ani emulzifikátory. Pridajte absorbent CO  2 do všetkých 
príslušných nádob. Upravte hodnotu pH v bankách č. 2, 3 a 4 na 7,0.  
VII.2.5.  Realizácia. testu  
Inokulujte banky č. 2, 3 a 4 (testované suspenzie), č. 5 (kontrola 
aktivity) a č. 6 (inokulový slepý pokus) s malým objemom inokula 
tak, aby sa dosiahla koncentrácia suspendovaných tuhých častíc 
30 mg/l. Žiadne inokulum sa nepridáva do banky č. 1, ktorá slúži 
ako abiotická hodnota. Zložte zariadenie, skontrolujte vzduchotes ­
nosť, zapnite miešadlá a za čnite meranie spotreby kyslíka bez 
prístupu svetla. Denne kontrolujte teplotu, miešadlá 
a coulometricky záznamník spotreby kyslíka a zaregistrujte 
akékoľvek zmeny farby obsahov baniek. Od čítajte spotrebu kyslíka 
pre šesť baniek priamo pomocou vhodnej metódy, napr. zo šes ťbo­
dového zapisova ča, ktorá poskytuje krivku BSK. Na konci inkubá ­
cie, normálne po 28 d ňoch, odmerajte hodnotu pH obsahu baniek 
a stanovte koncentráciu zvyškovej testovanej látky alebo prípravku a akéhoko ľvek medziproduktu a v prípade vo vode rozpustných 
látok vo vode koncentráciu DOC (pozri prílohu II.4). Zvláštna pozor ­
nosť sa musí venova ť prchavým chemickým látkam. Ak sa pred ­
pokladá nitrifikácia, stanovte koncentráciu dusi čnanov a dusitanov, 
ak je to možné.
 
VII.3. ÚDAJE A SPRÁVA  
VII.3.1.  Spracovanie výsledkov  
Vydeľte spotrebu kyslíka (mg) testovanou látkou alebo prípravkom, 
po danom čase upravené na spotrebu kyslíka kontrolným inoku ­
lovým slepým pokusom po rovnakom čase, hmotnos ťou použitej 
testovanej látky alebo prípravku. Tak sa získa BSK vyjadrený ako mg kyslíka/mg testovanej chemickej látky, t. j.
 
BOD ¼ mg spotreby O  2 testovanou látkou – mg spotreby O  2 slepého pokusu látkou 
mg testovanej látky alebo prípravku v banke  
= mg O  2 na mg testovanej l  átky alebo prípravku.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Percentuálna biodegradácia sa potom získa z:  
% biodegradácie ¼ % ThOD ¼ 
BOD ðmg O  2 BSK ðmg O2 =mg látky alebo prípravku ÞÞ 
ThOD ðmg O  2=mg ThOD ðmg O2mg látky alebo prípravku ÞÞ Ü 100  
Pre zmesi vypo čítajte ThOD z elementárnej analýzy tak ako pre 
jednotlivé látky alebo prípravky. Použite vhodný ThOD (ThOD  NH4 , 
ThOD  NO3 ) podľa toho, či nedochádza k nitrifikácii, alebo či nitrifi­
kácia prebieha kompletne (pozri prílohu II.2). Ak však nitrifikácia 
prebieha, ale je neúplná, vykonajte korekciu na kyslík spotrebovaný 
nitrifikáciou zo zmien v koncentráciách dusitanov a dusi čnanov 
(dodatok 5). 
Vypočítajte percento primárnej biodegradácie zo straty špecifickej 
(parentálnej, pôvodnej) látky alebo prípravku (pozri I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Ak došlo k strate testovanej látky alebo prípravku v banke č. 1, 
merajúcej fyzikálno-chemické odstránenie, uve ďte to v správe 
a použite koncentráciu testovanej látky alebo prípravku (S  b ) po 28 
dňoch v tejto banke na výpo čet percenta biodegradácie. 
Ak sa vykonajú stanovenia DOC (nepovinné), vypo čítajte percento 
konečnej biodegradácie z:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100 %  
ako je opísané pod bodom I.7.1. Ak došlo k strate DOC v banke 
č. 1, merajúcej fyzikálno-chemické odstránenie, použite koncentráciu 
DOC v tejto banke na výpo čet percenta biodegradácie. 
Zaznamenajte všetky výsledky na pripojený záznamník údajov.  
VII.3.2.  Platnos ť výsledkov  
Spotreba kyslíka v inokulovom slepom pokuse je normálne 20 až 
30 mg O  2 na liter a nemala by presahova ť 60 mg/liter za 28 dní. 
Hodnoty vyššie ako 60 mg/liter vyžadujú kritické prehodnotenie 
údajov a experimentálnych techník. Ak je pH hodnota mimo rozsahu 
6 až 8,5 a spotreba kyslíka testovanou látkou alebo prípravkom je menšia ako 60 %, potom by sa mal test zopakova ť s nižšou koncen ­
tráciou testovanej látky. 
Pozri tiež I.5.2. Ak percento degradácie anilínu, vypo čítané zo spotreby kyslíka, 
nepresahuje 40 % po 7 d ňoch a 65 % po 14 d ňoch, test sa považuje 
za neplatný.
 
3.3. Správa  
Pozri I.8.  
VII.4. KARTA ÚDAJOV 
Príklad karty údajov je uvedený nižšie.  
TEST MITI (I) 
1. LABORATÓRIUM  
2. DÁTUM ZA ČIATKU TESTU  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTOVANÁ LÁTKA  
Názov: 
Koncentrácia zásobného roztoku: ... mg/liter chemickej látky. 
Počiatočná koncentrácia v médiu C  o : ... mg/liter chemickej 
látky. 
Objem reak čnej zmesi, V: ... ml. 
ThOD: ... mg O  2 /liter.  
4. INOKULUM  
Miesta odberu vzoriek kalu: 
1. … 6. … 
2. … 7. … 3. … 8. … 
4. … 9. … 
5. … 10. … 
Koncentrácia suspendovaných tuhých častíc v aktivovanom kale 
po aklimatizácii so syntetickým výtokom = … mg/liter. 
Objem aktivovaného kalu na liter kone čného média = … ml. 
Koncentrácia kalu v kone čnom médiu = … mg/liter
 
5. SPOTREBA KYSLÍKA: BIODEGRADOVATE ĽNOSŤ 
Typ použitého respirometra:  
Čas (dni) 
0 7 14 21 28  
Spotreba O  2 (mg) 
testovanou látkou a 1 
a 2 
a 3 
Spotreba O  2 (mg) 
v teste naslepo b 
Korigovaná 
spotreba O  2 (mg) (a 1 - b 1 ) 
(a 1 - b 1 ) 
(a 1 - b 1 ) 
BSK na mg testo ­
vanej 
ða Ä bÞ 
C o V Banka 1 
Banka 2 Banka 3 
Rozklad v %
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 3 
Priemer (
 1 ) 
( 1 ) Nepočítajte priemer, ak je výrazný rozdiel medzi paralelkami.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Poznámka: Podobné tabu ľky sa môžu použi ť pre referen čnú látku.  
6. ANALÝZA UHLÍKA (NEPOVINNÉ)  
Analyzátor uhlíka:  
Banka DOC % odstráneného 
DOC Priemer 
Nameraná hodnota Korigovaná hodnota  
Voda + testovaná látka a — — 
Kal + testovaná látka b  1 b 1 – c 
Kal + testovaná látka b  2 b 2 – c 
Kal + testovaná látka b  3 b 3 – c 
Kontrolný test naslepo c — — —  
% odstráneného ¼ a Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. ÚDAJE ZO ŠPECIFICKEJ CHEMICKEJ ANALÝZY  
Zvyškové množstvo testovanej 
chemickej látky na koci testu degradácia v %  
Test naslepo s vodou S  b 
Inokulované médium S a1 
S a2 
S a3 
% degradácie ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Vypočítaje % degradácie pre banky a1, a2, a a3.  
8. POZNÁMKY  
Ak je to možné, mala by sa pripoji ť krivka závislosti BSK od času. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
DODATOK 1  
SKRATKY A POJMY  
DO: Rozpustený kyslík (mg/liter) je koncentrácia rozpusteného kyslíka vo 
vodnej vzorke. 
BSK: Biochemická spotreba kyslíka (g) je množstvo spotrebovaného kyslíka 
mikroorganizmami po čas metabolizovania testovanej látky alebo 
prípravku, tiež vyjadrené ako g spotrebovaného kyslíka na 
g testovanej chemickej látky (pozri metódu C.5). 
CHSK: Chemická spotreba kyslíka (g) je množstvo spotrebovaného kyslíka 
počas oxidácie testovanej látky alebo prípravku v teplom, okyslenom 
dvojchrómane; umož ňuje meranie množstva prítomnej oxidovate ľnej 
látky; tiež vyjadruje spotrebovaný kyslík v g na g testovanej látky alebo prípravku (pozri metódu C.6). 
DOC: Rozpustený organický uhlík je organický uhlík prítomný v roztoku 
alebo ten, ktorý prechádza cez 0,45-mikrometrový filter alebo ostáva 
v supernatante po odstredení pri 40 000 m.s
 -2 (± 4 000 g) po čas 
15 minút. 
ThOD: Teoretická spotreba kyslíka (mg) je teoretické množstvo kyslíka, ktoré 
sa požaduje na kompletnú oxidáciu látky alebo prípravku; vypo číta sa 
z molekulového vzorca (pozri prílohu II.2) a je tiež vyjadrená v mg kyslíka potrebných na mg testovanej látky. 
ThCO
 2 : Teoretický oxid uhli čitý (mg) je vypo čítané množstvo oxidu uhli či­
tého, ktoré sa vytvorí zo známeho alebo odmeraného obsahu uhlíka 
v testovanej látke alebo prípravku, ke ď je kompletne mineralizovaná; 
je tiež vyjadrený v mg oxidu uhli čitého uvo ľneného z mg testovanej 
látky alebo prípravku. 
TOC: Celkový organický uhlík vzorky je súhrn organického uhlíka 
v roztoku a v suspenzii. 
IC: Anorganický uhlík. TC: Celkový uhlík je súhrn organického a anorganického uhlíka prítom ­
ného vo vzorke.
 
Primárna biodegradácia:  
je zmena v štruktúre látky, spôsobená biologickým ú činkom, ktorá má za 
následok stratu špecifickej vlastnosti tejto látky.  
Úplná biodegradácia (aeróbna):  
je taká dosiahnutá úrove ň degradácie, ke ď testovanú látku alebo prípravok úplne 
spotrebujú mikroorganizmy, čoho výsledkom je tvorba oxidu uhli čitého, vody, 
minerálnych solí a nových mikrobiálnych bunkových zložiek (biomasy).  
Ľahko biodegradovate ľné: 
je dohodnutá klasifikácia chemických látok, ktoré prešli cez ur čité špecifické 
skríningové testy na úplnú biodegradovate ľnosť; tieto testy sú také prísne, že 
sa predpokladá, že takéto látky alebo prípravky sa budú rýchlo a úplne biode ­
gradovať vo vodnom prostredí v aeróbnych podmienkach.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Inherentne (prirodzene) biodegradovate ľné: 
je klasifikácia chemických látok, pre ktoré existuje jednozna čný dôkaz ich biode ­
gradácie (primárnej alebo úplnej) v každom uznanom teste na biodegradovate ľ­
nosť. 
Odbúrate ľnosť: 
je poddajnos ť látok, aby boli odbúrané po čas biologického čistenia odpadovej 
vody bez škodlivého ovplyvnenia normálneho priebehu procesov čistenia. Všeo ­
becne možno konštatova ť, že ľahko biodegradovate ľné látky sú odbúrate ľné, ale 
to sa už nedá konštatova ť o všetkých vnútorne biodegradovate ľných látkach. Do 
odbúrania môžu by ť zapojené aj abiotické procesy.  
Fáza lag:  
je čas od inokulácie, v teste Die-Away, po dosiahnutí aspo ň 10 % degradácie. 
Fáza lag je často veľmi variabilná a slabo reprodukovate ľná. 
Doba trvania degradácie:  
je čas od konca fázy lag až po čas, kým sa nedosiahne 90 % degradácia.  
10-dňové okno:  
je 10 dní nasledujúcich po dosiahnutí 10 % degradácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
DODATOK 2  
VÝPOČET A STANOVENIE VHODNÝCH SUMÁRNYCH 
PARAMETROV  
Určité sumárne parametre sa budú vyžadova ť v závislosti od zvolenej metódy. 
Nasledujúca časť opisuje odvodenie týchto hodnôt. Použitie týchto parametrov je 
opísané pri jednotlivých metódach.  
1. Obsah uhlíka  
Obsah uhlíka sa vypo číta zo známeho elementárneho zloženia alebo sa 
stanoví elementárnou analýzou testovanej látky.  
2. Teoretická spotreba kyslíka (ThOD)  
Teoretická spotreba kyslíka (ThOD) sa môže vypo čítať, ak je známe 
elementárne zloženie alebo stanovené elementárnou analýzou. Je pre látku 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
bez nitrifikácie  
ThOD  NH4 ¼ 16½2 c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg 
alebo s nitrifikáciou,  
ThOD  NO3 ¼ 16½2 c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Chemická spotreba kyslíka (CHSK)  
Chemická spotreba kyslíka (CHSK) je stanovená pod ľa metódy C.6.  
4. Rozpustený organický uhlík (DOC)  
Rozpustený organický uhlík (DOC) je v súlade s pojmami organický uhlík 
každej látky alebo prípravku, alebo zmesi vo vode prechádzajúci cez 0,45- mikrometrový filter. 
Vzorky z testovaných nádob sa odoberajú a filtrujú okamžite vo filtra čnom 
prístroji s použitím vhodného membránového filtra. Prvých 20 ml (množ ­
stvo sa môže zredukova ť, keď sa používajú malé filtre) sa odstráni. Objemy 
10 až 20 ml alebo nižšie, ak sú injektované (objem závisí od požadovaného 
množstva pre analyzátor uhlíka), sa nechávajú na analýzu uhlíka. Koncen ­
trácia DOC sa stanoví pomocou analyzátora organického uhlíka, ktorý je schopný presne mera ť koncentráciu uhlíka ekvivalentnú alebo nižšiu ako 
10 % počiatočnej koncentrácie DOC použitej v teste. 
Filtrované vzorky, ktoré sa nemôžu analyzova ť v ten istý pracovný de ň, sa 
môžu chráni ť skladovaním v chladni čke pri teplote 2 – 4 °C po čas 48 
hodín alebo pri teplote pod –18 °C po čas dlhšieho obdobia.
 
Poznámky:  
Membránové filtre sú často impregnované povrchovo aktívnymi látkami 
kvôli hydrofilizácii. Takto filter môže obsahova ť až nieko ľko mg rozpust ­
ného organického uhlíka, ktorý by interferoval so stanovením biodegrada ­
bility. Surfaktanty a iné rozpustné organické látky alebo prípravky sa odstraňujú z filtrov varom v deionizovanej vode trikrát po jednej hodine. 
Filtre sa potom môžu skladova ť vo vode jeden týžde ň. Ak sa použijú 
jednorazové filtre, je vždy potrebné sa presved čiť, či neuvoľňujú rozpustný 
organický uhlík.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
V závislosti od typu membránového filtra sa môže testovaná látka alebo 
prípravok zachytáva ť adsorpciou. Preto môže by ť vhodné uisti ť sa, že sa 
testovaná látka alebo prípravok nezachytáva na filtri. 
Odstreďovanie pri 40 000 m.s  -2 (4 000 g) po čas 15 minút možno použi ť na 
rozlíšenie TOC od DOC namiesto filtrácie. Metóda nie je vhodná pri počiatočnej koncentrácii menšej ako 10 mg DOC/liter, pretože nie sú 
odstránené všetky baktérie alebo uhlík ako sú časť bakteriálnej plazmy je 
znovu rozpustený.
 
LITERATÚRA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, p. 65. 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139. — DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser-und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs-und 
Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V. 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13 (1), 169.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
DODATOK 3  
VYHODNOCOVANIE BIODEGRADOVATE ĽNOSTI SLABO 
ROZPUSTNÝCH LÁTOK  
Pri testoch biodegradovate ľnosti slabo rozpustných látok je potrebné venova ť 
pozornosť týmto požiadavkám. 
Kým homogénne kvapaliny budú len zriedkavo predstavova ť problém pri odbere 
vzoriek, odporú ča sa, aby tuhé materiály boli homogenizované vhodným spôso ­
bom, aby sa tak zabránilo chybám spôsobeným nehomogénnos ťou. Špeciálnu 
pozornosť treba venova ť v prípade požiadaviek na reprezentatívne vzorky 
niekoľkých miligramov zo zmesí látok alebo prípravkov, alebo látok s ve ľkým 
množstvom ne čistôt. 
Počas testov sa môžu použi ť rôzne spôsoby miešania. Pozornos ť by sa mala 
venovať len dostato čnému miešaniu, aby sa látka alebo prípravok udržiavali 
dispergované a aby sa zabránilo prehrievaniu, nadmernému peneniu a prílišným mechanickým silám. 
Môže sa použi ť emulzifikátor, ktorý zabezpe čuje stabilnú disperziu látky alebo 
prípravku. Nemal by by ť toxický pre baktérie a nesmie by ť biodegradovate ľný 
alebo spôsobova ť penenie v podmienkach testu. 
Pre rozpúš ťadlá platia rovnaké kritériá ako pre emulzifikátor. 
Neodporú ča sa použitie pevných nosi čov pre tuhé testované látky, ale môžu by ť 
vhodné pre olejovité látky. 
Pri použití pomocných látok, ako emulzifikátorov, rozpúš ťadiel a nosi čov, by sa 
mal vykona ť slepý pokus s pomocnou látkou. 
Každý z troch respirometrických testov CO
 2 , BSK, MITI sa môže použi ť na 
výskum biodegradability slabo rozpustných látok alebo prípravkov.  
LITERATÚRA  
(1) de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833. 
(2) Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
DODATOK 4  
VYHODNOCOVANIE BIODEGRADOVATE ĽNOSTI CHEMICKÝCH 
LÁTOK, PRI KTORÝCH EXISTUJE PODOZRENIE, ŽE SÚ TOXICKÉ 
PRE INOKULUM  
Ak sa v teste ľahkej biodegradovate ľnosti sa ukáže, že látka alebo prípravok nie 
sú biodegradovate ľné, odporú ča sa tento postup, ak je potrebné zisti ť, či ide 
o inertnú látku, alebo dochádza k inhibícii (Reynolds et al., 1987). 
Na testovanie toxicity a biodegradovate ľnosti by sa mali použi ť podobné alebo 
rovnaké inokulá. 
Na vyhodnotenie toxicity látky alebo prípravku, skúmaných v testoch ľahkej 
biodegradovate ľnosti, je vhodné použi ť jeden z týchto testov alebo ich kombi ­
náciu: test inhibície aktivovaný kalom (inhibi čný respirometrický test v aktívnom 
kale – smernica 88/302/EHS), BSK a/alebo metódy inhibície rastu. 
Ak sa chceme vyhnú ť inhibícii následkom toxicity, odporú ča sa, aby koncen ­
trácie testovanej látky použitej pri testovaní ľahkej biodegradovate ľnosti boli 
menšie ako 1/10 hodnôt EC  50 (alebo menšie ako hodnoty EC  20 ) získaných pri 
testovaní toxicity. Nie je pravdepodobné, aby látky s hodnotou EC  50 väčšou ako 
300 mg/liter mali toxické ú činky v teste ľahkej biodegradovate ľnosti. 
Hodnoty EC  50 menšie ako 20 mg/liter môžu pravdepodobne predstavova ť vážne 
problémy pri následnom testovaní. Mali by sa použi ť nízke skúšobné koncen ­
trácie, ale potom je nutné použi ť presný a citlivý test „uzavretej f ľaše“ alebo 
použiť materiál ozna čený  14 C. Prípadne aj aklimatizované inokulum umož ňuje 
použitie vyšších koncentrácií testovanej látky. Avšak v tomto prípade sa stráca špecifické kritérium testu ľahkej biodegradovate ľnosti.
 
LITERATÚRA  
1. Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
DODATOK V  
KOREKCIA NA SPOTREBU KYSLÍKA PRI INTERFERENCII 
NITRIFIKÁCIOU  
Chyby spôsobené tým, že sa nitrifikácia neberie do úvahy pri hodnotení spotreby 
kyslíka pri teste biodegradovate ľnosti látok neobsahujúcich dusík, sú okrajové 
(nie väčšie ako 5 %), a to aj v prípade, ke ď dochádza k rozdielnej oxidácii 
amóniového dusíka v teste a v slepom pokuse. V prípade testovaných látok, ktoré obsahujú dusík, však môže dôjs ť k vážnym chybám. 
Ak došlo k nekompletnej nitrifikácii, pozorovaná spotreba kyslíka reak čnou 
zmesou môže by ť upravená na množstvo kyslíka použitého na oxidáciu amónia 
na dusitany a dusi čnany, ak sú zmeny v koncentrácii dusitanov a dusi čnanov 
počas inkubácie stanovené na základe týchto rovníc: 
2 NH
 4 Cl + 3O  2 = 2 HN O  4 + 2 HCl + 2 H  4 O (1) 
2 HNO  4 + O  4 = 2 HNO  2 (2) 
Celkovo: 2 NH
 2 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  4 O (3) 
Z rovnice (1) spotreba kyslíka 28 g dusíka obsiahnutého v chloride amónnom 
(NH  4 Cl), ktorý je oxidovaný na dusitan, je 96 g, t. j. faktor 3,43 (96/28). 
Rovnakým spôsobom z rovnice (3), spotreba kyslíka, 28 g dusíka, ktorý je oxidovaný na dusi čnan, je 128 g, t. j. faktor 4,57 (128/28). 
Vzhľadom na to, že reakcie sa postupne vykonávajú rôznymi druhmi baktérií, je 
možné, aby koncentrácia dusitanov stúpala alebo klesala; v druhom prípade by 
malo dochádza ť k ekvivalentnej tvorbe dusi čnanov. Takto kyslík spotrebovaný 
pri tvorbe dusi čnanov je 4,57-násobkom vzrastu koncentrácie dusi čnanov 
a kyslík spojený s tvorbou dusitanov je 3,43-násobkom vzrastu koncentrácie 
dusitanov alebo s poklesom jeho koncentrácie strata kyslíka je - 3,43-násobkom 
poklesu koncentrácie. 
To znamená: 
O
 2 spotrebovaný na tvorbu dusi čnanov = 4,57 × nárast koncen ­
trácie dusi čnanov (4) 
a 
O 2 spotrebovaný na tvorbu dusitanov = 3,43 × nárast koncen ­
trácie dusitanov (5) 
a 
O 2 spotrebovaný pri strate dusitanov = - 3,43 × pokles koncen ­
trácie dusi čnanov (6) 
Takže: 
O 2 spotrebovaný nitrifikáciou = ± 3,43 × zmena v koncentrácii 
dusitanov + 4,57 × nárast koncentrácie dusi čnanov, (7) 
a preto 
O 2 spotrebovaný na oxidáciu C = celková pozorovaná spotreba 
– spotreba pri nitrifikácii (8) 
Ak je alternatívne stanovený len celkový oxidovaný dusík, spotreba kyslíka 
nitrifikáciou sa môže považova ť v prvom priblížení ako 4,57 × nárast oxidova ­
ného dusíka. 
Opravená hodnota spotreby kyslíka na oxidáciu C sa potom porovná s ThOD 
NH  3 vypočítanou pod ľa prílohy II.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5 DEGRADÁCIA – BIOCHEMICKÁ SPOTREBA KYSLÍKA  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Účelom metódy je meranie biochemickej spotreby kyslíka (BSK) 
tuhými alebo kvapalnými organickými látkami. 
Údaje získané týmto testom sú vhodné pre látky rozpustné vo vode; 
avšak aspo ň principiálne sa môžu testova ť aj látky prchavé a slabo 
rozpustné vo vode. 
Metóda je použite ľná len pre také testované organické materiály, 
ktoré neinhibujú baktérie pri koncentrácii použitej v teste. Ak testo ­
vaný materiál nie je rozpustný pri testovanej koncentrácii, môžu sa 
použiť špeciálne opatrenia ako ultrazvuková dispergácia, aby sa 
dosiahla dobrá dispergácia testovaného materiálu. 
Informácie o toxicite látky alebo prípravku môžu by ť užitočné na 
interpretáciu nízkych výsledkov a pri výbere vhodných skúšobných 
koncentrácií.  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Biochemická spotreba kyslíka (BSK) je definovaná ako množstvo 
rozpusteného kyslíka, ktoré si vyžaduje špecifikovaný objem roztoku 
látky na proces biochemickej oxidácie za predpísaných podmienok. 
Výsledky sú vyjadrené v gramoch biochemickej spotreby kyslíka na 
gramy testovanej látky.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Je žiaduce použi ť vhodnú referen čnú látku na skontrolovanie aktivity 
inokula.  
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Vopred stanovené množstvo látky, rozpustené alebo dispergované 
v dobre prevzdušnenom vhodnom médiu, sa inokuluje s mikroorganizmani a inkubuje pri konštantnej, definovanej okolitej 
teplote za tmy. 
Biochemická spotreba kyslíka je stanovená rozdielom v obsahu 
rozpusteného kyslíka na za čiatku a na konci testu. Test musí trva ť 
aspoň 5 dní, ale nie dlhšie ako 28 dní. 
Hodnota slepého pokusu sa musí stanovi ť paralelným meraním za 
neprítomnosti testovanej látky.
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Stanovenie biologickej spotreby kyslíka sa nemôže považova ť za 
platné stanovenie biodegradovate ľnosti látky. Tento test sa môže 
považova ť len za skríningový test.  
1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Predbežný roztok alebo disperzia látky sa pripraví s cie ľom získa ť 
takú koncentráciu biochemickej spotreby kyslíka, ktorá bude kompa ­
tibilná s použitou metódou. Biochemická spotreba kyslíka sa potom 
stanoví akouko ľvek vhodnou vnútroštátnou alebo medzinárodnou 
štandardizovanou metódou.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. ÚDAJE A VYHODNOTENIE  
Biochemická spotreba kyslíka nachádzajúca sa v predbežnom 
roztoku sa vypo číta podľa vybraných normalizovaných metód 
a prevedie sa na gramy biochemickej spotreby kyslíka (BSK) na 
gram testovanej látky.  
3. SPRÁVA  
V správe z testu sa uvedie použitá metóda. 
Biochemická spotreba kyslíka by mala by ť strednou hodnotou (prie ­
merom) aspo ň z troch platných meraní. 
Všetky informácie a poznámky, ktoré sú dôležité pre interpretáciu 
výsledkov, sa musia uvies ť obzvlášť s ohľadom na ne čistoty, fyzi ­
kálny stav, toxické ú činky a vnútorné zloženie látky, ktoré by 
ovplyvňovalo výsledky. 
Použitie prídavkov na inhibíciu biochemickej nitrifikácie sa musí 
takisto uvies ť. 
4. ODKAZY 
Zoznam štandardizovaných metód, napríklad: 
NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen demand. NBN 407: Biochemical oxygen demand. NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV). 
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the 
examination of water and associated materials, HMSO, London. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADÁCIA – CHEMICKÁ SPOTREBA KYSLÍKA  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Účelom tejto metódy je meranie chemickej spotreby kyslíka tuhých 
alebo kvapalných organických látok štandardným spôsobom 
v stanovených laboratórnych podmienkach. 
Informácie o vzorci látky budú potrebné pri vykonaní tohto testu 
a pri interpretácii získaných výsledkov (napr. halogenidy, železnaté 
soli organických zlú čenín, organochlórové zlú čeniny).  
1.2. POJMY A JEDNOTKY 
Chemická spotreba kyslíka je mierou oxidovate ľnosti látky vyjadrená 
v ekvivalentných množstvách kyslíka oxidujúceho reagentu spotre ­
búvaného látkou v stanovených laboratórnych podmienkach. 
Výsledok je vyjadrený v gramoch chemickej spotreby kyslíka na 
gram testovanej látky.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky nie je potrebné použi ť vo všetkých prípadoch, ke ď 
sa skúma nová látka. Referen čné látky slúžia na kalibráciu metódy 
z času na čas, aby sa umožnilo porovnanie výsledkov, ke ď sa 
použije ďalšia metóda.  
1.4. PRINCÍP SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Vopred stanovené množstvo látky, rozpustené alebo dispergované vo 
vode, sa oxiduje dvojchrómanom draselným v médiu obsahujúcom 
silný roztok kyseliny sírovej a síranu strieborného ako katalyzátora 
pod refluxom 2 hodiny. Zvyškový dvojchróman je stanovený titrá ­
ciou so štandardizovaným síranom železnatoamónnym. 
V prípade látok obsahujúcich chlór sa pridáva síran ortutnatý (  1 ) na 
zníženie interferencie chlóru.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Vzhľadom na dohodnuté podmienky stanovenia je chemická 
spotreba kyslíka (CHSK) „ukazovate ľom oxidovate ľnosti“ a ako 
taký sa používa ako praktická metóda na meranie organickej hmoty. 
V tomto teste môžu ruši ť chloridy; na stanovenie CHSK môžu ma ť 
takisto vplyv anorganické reduk čné a oxida čné látky. 
Niektoré cyklické látky a mnoho prchavých látok (napr. nižšie 
mastné kyseliny) nie sú úplne oxidovate ľné týmto testovacím postu ­
pom.  
1.6. OPIS SKÚŠOBNEJ METÓDY 
Pripraví sa po čiatočný roztok alebo disperzia látky tak, aby sa 
dosiahla chemická spotreba kyslíka (CHSK) od 250 do 600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) S roztokmi obsahujúcimi ortutnaté soli sa po použití zaobchádza tak, aby nedošlo 
k prieniku ortuti do životného prostredia.
 Poznámky:  
V prípade slabo rozpustných a nedispergovate ľných látok sa 
približne také množstvo práškovej látky alebo kvapaliny, ktoré 
zodpovedá 5 mg chemickej spotreby kyslíka, naváži a dá do expe ­
rimentálneho prístroja s vodou. 
Chemická spotreba kyslíka (CHSK) sa často a špeciálne v prípade 
slabo rozpustných látok stanoví výhodne rôznymi modifikáciami 
tejto metódy, napr. v uzavretom priestore s vyrovnávaním tlaku 
(K. Kelkenberg, 1975). V tejto modifikácii látok, ktoré sú len ťažko stanovite ľné konven čnou metódou – napríklad kyselina octová 
– sa môžu často úspešne kvantifikova ť. Avšak táto metóda zlyháva 
v prípade pyridínu. Ak sa koncentrácia dvojchrómanu draselného, 
ako je uvedená v odkaze (1), zvýši na 0,25 N (0,0416 M), priame naváženie 5 mg až 10 mg látky je u ľahčené, čo je nevyhnutné pre 
stanovenie chemickej spotreby kyslíka slabo rozpustných látok vo 
vode [odkaz (2)]. 
Chemická spotreba kyslíka sa stanoví akouko ľvek vnútroštátnou 
alebo medzinárodnou štandardizovanou metódou.
 
2. ÚDAJE A VYHODNOTENIE  
Chemická spotreba kyslíka obsiahnutá v experimentálnej banke sa 
vypočíta podľa vybranej normalizovanej metódy a konvertuje sa na 
gramy chemickej spotreby kyslíka na gram testovanej látky.  
3. SPRÁVA  
V správe z testu sa uvedie odkaz na použitú metódu. 
Chemická spotreba kyslíka by mala by ť strednou hodnotou aspo ň 
z troch platných meraní. Všetky informácie a poznámky, ktoré sú relevantné pre interpretáciu výsledkov, sa uvedú s oh ľadom na ne čis­
toty, fyzikálny stav, toxické ú činky a vnútorné vlastnosti látky (ak sú 
známe), ktoré by ovplyv ňovali výsledky. 
Použitie síranu ortutnatého na minimalizovanie interferencie chloridu 
sa musí tiež uvies ť.
 
4. ODKAZY  
(1) Kelkengerg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146. 
(2) Gerike P. The biodegradibility testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169. 
Zoznam štandardizovaných metód, napríklad: 
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand. 
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters. 
NF T 90-101 Determination of chemical oxygen demand. 
DS 217 = water analysis Determination of chemical oxygen 
demand. 
DIN 38409-H-41 Determination of chemical oxygen demand 
(CHSK) within the range above 15 mg per litre. 
NEN 3235 5.3: Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik. ISO 6060: Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. DEGRADÁCIA – ABIOTICKÁ DEGRADÁCIA: HYDROLÝZA 
AKO FUNKCIA pH  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda je ekvivalentná OECD TG 111 (2004).  
1.1. ÚVOD 
Chemické látky sa môžu dostáva ť do povrchových vôd napríklad 
priamou aplikáciou, rozprášením, odtokom, kanalizáciou, zneškod ňo­
vaním odpadu, odpadovými vodami z priemyslu, domácností alebo 
poľnohospodárstva, atmosférickým vylu čovaním a v týchto vodách 
sa môžu transformova ť chemickými (napr. hydrolýzou a oxidáciou), 
fotochemickými a/alebo mikrobiálnymi procesmi. V tomto usmer ­
není sa opisuje laboratórna testovacia metóda na posudzovanie abio ­
tických hydrolytických transformácií chemických látok vo vodných 
systémoch pri takých hodnotách pH, aké sú bežné v životnom prostredí (pH 4 – 9) a usmernenie je založené na sú časných usmer ­
neniach [pozri odkazy na literatúru (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7)]. 
Experimenty sa vykonávajú na stanovenie i) rýchlosti hydrolýzy 
testovanej látky ako funkcie pH a ii) identity alebo povahy a rýchlosti tvorby a degradácie produktov hydrolýzy, ktorým môžu 
byť organizmy exponované. Takéto štúdie možno požadova ť pre 
chemické látky, ktoré sa priamo aplikujú do vody alebo ktoré sa môžu dosta ť do životného prostredia inými uvedenými cestami.
 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Pozri prílohu 2.  
1.3. POUŽITE ĽNOSŤ METÓDY 
Táto metóda je vo všeobecnosti použite ľná na chemické látky (neoz ­
načené alebo ozna čené), pre ktoré je dostupná analytická metóda 
s dostato čnou presnos ťou a citlivos ťou. Je použite ľná na málo 
prchavé a neprchavé látky s dostato čnou rozpustnos ťou vo vode. 
Test by sa nemal používa ť na veľmi prchavé chemické látky, ktoré 
sa z vody ľahko uvo ľňujú (napr. vyparujúce sa látky, organické 
rozpúšťadlá) a nemožno ich udrža ť v roztoku pri experimentálnych 
podmienkach na vykonávanie tohto testu. Tento test možno ťažko 
uskutočniť s látkami, ktoré vykazujú minimálnu rozpustnos ť vo vode 
[(pozri odkaz na literatúru (8)].  
1.4. PODSTATA TESTOVACEJ METÓDY 
Do sterilných vodných tlmivých roztokov s rozli čnou hodnotou pH 
(pH 4, 7 a 9) sa pridá testovaná látka a nechajú sa inkubova ť v tme 
za kontrolovaných laboratórnych podmienok (pri konštantnej teplo ­
te). Po uplynutí príslušných časových intervalov sa tlmivé roztoky 
analyzujú z h ľadiska testovanej látky a produktov hydrolýzy. 
Použitím zna čenej testovanej látky (napr.  14 C) možno ľahšie určiť 
látkovú bilanciu. 
Táto testovacia metóda je vypracovaná ako viacstup ňový prístup, 
ktorý je znázornený a vysvetlený v dodatku 1. Každý stupe ň 
vychádza z výsledkov predchádzajúceho stup ňa. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Na meranie miery hydrolýzy možno použi ť neznačenú alebo zna čenú 
testovaciu látku. Vo všeobecnosti sa pri štúdiu mechanizmu hydro ­
lýzy a určenia látkovej bilancie dáva prednos ť značenému materiálu; 
v osobitných prípadoch však zna čenie nemusí by ť absolútne nevyh ­
nutné. Odporú ča sa značenie izotopom  14 C, užitočné však môže by ť 
aj značenie inými izotopmi, ako napríklad  13 C, 15 N alebo  
3 H. Pokiaľ je to možné, zna čka by sa mala umiestni ť do najstabil ­
nejšej časti (najstabilnejších častí) molekuly. Ak napríklad molekula 
testovanej látky obsahuje jeden kruh, požaduje sa zna čenie na tomto 
kruhu; ak testovaná látka obsahuje dva kruhy alebo viacero kruhov, 
môže vzniknú ť potreba vykona ť individuálne štúdie o vyhodnotení 
osudu každého zna čeného kruhu na získanie vhodných informácií 
o tvorbe produktov hydrolýzy. Čistota testovanej látky by mala 
byť aspoň 95 %. 
Pred vykonaním testu hydrolýzy by mali by ť k dispozícii tieto infor ­
mácie o testovanej látke: 
a) rozpustnos ť vo vode [testovacia metóda A.6]; 
b) rozpustnos ť v organických rozpúš ťadlách; 
c) tlak pár [testovacia metóda A.4] a/alebo Henryho konštanta; d) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda [testovacia metóda A.8]; 
e) disocia čná konštanta (pK
 a ) [usmernenie OECD 112] (9); 
f) v odôvodnenom prípade rýchlos ť priamej a nepriamej fototrans ­
formácie vo vode. 
Mali by by ť dostupné analytické metódy stanovenia množstva testo ­
vanej látky, a ak je to dôležité, aj identifikácie a stanovenia množstva 
produktov hydrolýzy vo vodných roztokoch (pozri aj časť 1.7.2).  
1.6. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Ak je to možné, na identifikáciu a stanovenie množstva produktov 
hydrolýzy spektroskopickými, chromatografickými alebo inými vhodnými citlivými metódami by sa mali použi ť referenčné látky.
 
1.7. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.7.1.  Vý ťažnosť 
Analýza aspo ň dvoch tlmivých roztokov alebo ich extraktov vykonaná 
ihneď po pridaní testovanej látky poskytuje prvú indikáciu opakova ­
teľnosti analytickej metódy a jednotnosti aplika čného postupu pre 
testovanú látku. Vý ťažnosti pre neskoršie štádiá experimentov vyplý ­
vajú z príslušných látkových bilancií (pri použití zna čeného materiálu). 
Výťažky by mali by ť v rozsahu od 90 % do 110 % (7) pri zna čených aj 
neznačených chemických látkach. V prípade, že je technicky náro čné 
dosiahnuť tento rozsah, pre nezna čené chemické látky je prijate ľná 
výťažnosť 70 %, treba však uvies ť zdôvodnenie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Opakovate ľnosť a citlivos ť analytickej metódy  
Opakovate ľnosť analytickej metódy (analytických metód) používanej 
(používaných) neskôr na stanovenie množstva testovanej látky a produktov hydrolýzy možno overi ť duplikátnou analýzou rovna ­
kých tlmivých roztokov (alebo ich extraktov) po vytvorení dostato č­
ného množstva produktov hydrolýzy na stanovenie množstva. 
Analytická metóda by mala by ť dostatočne citlivá na stanovenie 
množstva testovanej látky pri jej koncentrácii 10 % alebo pri nižšej východiskovej koncentrácii. Ak je to relevantné, analytické metódy by mali by ť dostatočne citlivé, aby bolo možné stanovi ť množstvo 
akéhokoľvek produktu hydrolýzy predstavujúci 10 % alebo viac 
aplikovanej (v ktoromko ľvek čase počas vykonávania štúdie) do 
25 % alebo ešte menej jeho maximálnej koncentrácie.
 
1.7.3.  Intervaly spo ľahlivosti pre kinetické údaje hydrolýzy  
Intervaly spo ľahlivosti by sa mali vypo čítať a uviesť pre všetky 
regresné koeficienty, rýchlostné konštanty, pol časy degradácie 
a akékoľvek ďalšie kinetické parametre (napr. DT50).  
1.8. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.8.1.  Zariadenie a aparatúra  
Štúdia by sa mala vykonáva ť v sklených nádobách (napr. skúmav ­
kách, malých bankách), v tme a sterilných podmienkach, ak treba, 
pokiaľ z predchádzajúcich informácií (napr. zo stanovenia rozde ľo­
vacieho koeficientu n-oktanol-voda) nevyplýva, že testovaná látka môže priľnúť ku sklu. V takýchto prípadoch môže nasta ť nutnosť 
zvážiť použitie alternatívnych materiálov (napr. teflónu). Takisto je 
možné problém pri ľnavosti ku sklu zmierni ť použitím jednej alebo 
viacerých z týchto metód: 
— stanovenie hmotnosti testovanej látky a produktov hydrolýzy 
sorbovaných na testovacej nádobe, 
— použitie ultrazvukového kúpe ľa, 
— zabezpe čenie umytia všetkých sklených nádob rozpúš ťadlom 
v každom intervale odberu vzorky, 
— použitie zložených produktov, — použitie zvýšeného množstva prídavného riedidla pri pridávaní 
testovanej látky do systému; ak sa použije prídavné riedidlo, malo by sa použi ť také riedidlo, ktoré nespôsobuje hydrolýzu 
testovanej látky. 
Bežne sa vyžaduje použitie vodných trepa čiek s reguláciou teploty 
alebo termostaticky riadených inkubátorov na inkubáciu rozli čných 
testovacích roztokov. 
Ďalej sa vyžaduje štandardné laboratórne vybavenie, najmä toto: 
— pH meter,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analytické prístroje, ako napríklad zariadenia GC, HPLC, TLC, 
vrátane príslušných detek čných systémov na analyzovanie nezna ­ 
čených a rádioizotopmi zna čených látok alebo na metódu 
riedenia inverzných izotopov, 
— prístroje na ú čely identifikácie (napr. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR atď.), 
— kvapalinový scintila čný čítač, 
— oddeľovacie lieviky na extrakciu kvapaliny kvapalinou, 
— zariadenia na koncentrovanie roztokov a extraktov (napr. rota čná 
odparka), 
— zariadenie na reguláciu teploty (napr. vodný kúpe ľ). 
Medzi používané chemické reagenty patria napríklad: — organické rozpúš ťadlá analytickej čistoty, napr. hexán, dichlór ­
metán atď., 
— scintila čná kvapalina, 
— tlmivé roztoky (podrobnosti pozri v časti 1.8.3). 
Všetko laboratórne sklo, čistá voda a tlmivé roztoky používané na 
testy hydrolýzy by sa mali sterilizova ť.
 
1.8.2.  Aplikácia testovanej látky  
Testovaná látka by sa mala aplikova ť ako vodný roztok do rôznych 
tlmivých roztokov (pozri prílohu 3). Ak je to potrebné pre správne 
rozpustenie, povo ľuje sa použi ť malé množstvá rozpúš ťadiel mieša ­
teľných s vodou (ako napr. acetonitrilu, acetónu, etanolu) na ú čely 
aplikácie a distribúcie testovanej látky, ale toto množstvo by nemalo 
presiahnu ť 1 % v/v. V prípade, že sa uvažuje o použití vyššej 
koncentrácie rozpúš ťadiel (napr. v prípade málo rozpustných testo ­
vaných látok), je to povolené len vtedy, ak možno preukáza ť, že 
riedidlo nemá vplyv na hydrolýzu testovaných látok. 
Bežne sa neodporú ča používa ť zložené produkty, pretože nemožno 
vylúčiť ovplyvnenie procesu hydrolýzy zloženými prísadami. Pri 
testovaných látkach, ktoré sú málo rozpustné vo vode, alebo pri látkach s pri ľnavosťou ku sklu (pozri časť 1.8.1) môže by ť použitie 
zloženého materiálu vhodnou alternatívou. 
Mala by sa používa ť jedna koncentrácia testovanej látky; táto 
koncentrácia by nemala by ť vyššia ako 0,01 M alebo vyššia ako 
polovica nasýtenej koncentrácie (pozri prílohu 1).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Tlmivé roztoky  
Test hydrolýzy by sa mal vykonáva ť pri hodnotách pH 4, 7 a 9. Na 
tento účel by sa mali pripravi ť tlmivé roztoky použitím čistých 
chemikálií a vody. Niektoré užito čné tlmivé roztoky sú uvedené 
v dodatku 3. Treba poznamena ť, že použitý systém tlmivého roztoku 
môže ma ť vplyv na rýchlos ť hydrolýzy, a ke ď sa takýto jav pozo ­
roval, mal by sa použi ť tlmivý roztok s inými zložkami (  1 ). 
Hodnota pH každého tlmivého roztoku by sa mala prekontrolova ť 
kalibrovaným pH-metrom, pri požadovanej teplote má by ť presnosť 
aspoň 0,1 jednotky pH.  
1.8.4.  Podmienky vykonania testu  
1.8.4.1.  Teplota pre teste  
Experiment s hydrolýzou by sa mal vykonáva ť pri konštantných 
teplotách. Na ú čely extrapolácie je dôležité udržiava ť teplotu 
s presnos ťou aspoň v rozmedzí ± 0,5  o C. 
Ak nie je známe hydrolytické správanie sa testovanej látky, pred ­
bežný test (stupe ň 1) by sa mal vykonáva ť pri teplote 50  o C. Kine­
tické testy vyššieho stup ňa by sa mali vykonáva ť aspoň pri troch 
teplotách (vrátane testu pri 50  o C), pokia ľ nebolo v teste prvého 
stupňa stanovené, že testovaná látka je hydrolyticky stabilná. 
Navrhovaný teplotný rozsah je od 10  o C do 70  o C (prednostne 
s využitím jednej teploty nižšej ako 25  o C), ktorý zah ŕňa uvádzanú 
teplotu 25  o C a väčšinu teplôt, ktoré sú v danom prostredí bežné.  
1.8.4.2.  Svetlo a kyslík  
Všetky testy hydrolýzy by sa mali vykonáva ť s použitím akejko ľvek 
vhodnej metódy, aby sa zabránilo fotolytickému efektu. Pri všetkých meraniach sa treba vyhnú ť prítomnosti kyslíka (napr. prebublávaním 
hélia, dusíka alebo argónu po dobu 5 minút pred prípravou roztoku).
 
1.8.4.3.  Doba trvania testu  
Predbežný test by mal trva ť 5 dní kým testy vyššieho stup ňa by mali 
trvať taký čas, aby zhydrolyzovalo 90 % testovanej látky alebo 30 
dní, podľa toho, čo nastane skôr.  
1.8.5.  Vykonanie testu  
1.8.5.1.  Predbežný test (stupe ň 1) 
Predbežný test sa vykonáva pri teplote 50  o C ± 0,5  o C a pri hodnote 
pH 4,0, 7,0 a 9,0. Ak po 5 d ňoch pozoruje hydrolýza nižšia ako 10 
percent, (t  0,525  o C > 1 rok), testovaná látka sa pokladá hydrolyticky za 
stabilnú a bežne sa nevyžadujú ďalšie testy. Ak je látka známa ako 
nestabilná pri teplotách bežných v životnom prostredí (  2 ), predbežný 
test sa nevyžaduje. Analytická metóda musí by ť dostatočne presná 
a citlivá na detekciu zníženia celkovej pôvodnej koncentrácie o 10 percent.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey a Mill odporú čali používa ť tlmivé roztoky bóritanu a acetátu namiesto fosfátu (11). 
( 2 ) Takéto informácie môžu pochádza ť z iných zdrojov, ako sú napríklad údaje o hydrolýze 
štruktúrne podobných zlú čenín z literatúry alebo z iných predbežných, polokvantitatív ­
nych testov hydrolýzy s testovanou látkou v skoršom štádiu vývoja.
 1.8.5.2.  Hydrolýza nestabilných látok (stupe ň 2) 
Test vyššieho stup ňa (pokročilý test) by sa mal vykona ť pri hodno ­
tách pH, pri ktorých bola zistená nestabilita testovanej látky, ako je to vymedzené v uvedenom predbežnom teste. Pufrované roztoky 
testovanej látky by sa mali uchováva ť v termostatoch pri zvolených 
teplotách. Na vykonanie testu na reakcie prvého rádu by sa mal každý rek čný roztok analyzova ť v časových intervaloch, ktorými 
sa získa minimálne šes ť oddelených časových údajov, vä čšinou 
v čase medzi 10 % až 90 % hydrolýzou testovanej látky. Jednotlivé 
vzorky opakovaných testov (minimálne dve duplikátne vzorky obsiahnuté v samostatných reak čných nádobách) by sa mali odobra ť 
a ich obsah treba analyzova ť v každom z minimálne šiestich inter ­
valoch odberu vzoriek (aspo ň pri dvanástich opakovaných údajových 
bodoch). Použitie jednej ve ľkej vzorky, z ktorej sa odoberajú jednot ­
livé malé množstvá testovaných roztokov v každom intervale odobe ­
rania vzoriek, sa pokladá za nevhodné, pretože neumož ňuje sa tým 
analyzova ť premenlivos ť údajov a môže dôjs ť k problémom súvi ­
siacim s kontamináciou testovaného roztoku. Na konci testu vyššieho stupňa by sa mali vykona ť testy potvrdenia sterilnosti (t. j. pri 90 % 
hydrolýze alebo po 30 d ňoch). Ak sa však nepozorovala 
žiadna degradácia (t. j. transformácia), vykonanie testov sterilnosti sa nepokladá za potrebné.
 
1.8.5.3.  Identifikácia produktov hydrolýzy (stupe ň 3) 
Všetky hlavné produkty hydrolýzy predstavujúce > 10 % aplikovanej 
dávky látky treba identifikova ť vhodnými analytickými metódami.  
1.8.5.4.  Volite ľné testy  
V prípade hydrolyticky nestabilnej testovanej látky môže by ť 
potrebné vykona ť ďalšie testy pri iných hodnotách pH ako 4, 7 
a 9. Napríklad sa môže vyžadova ť test v kyslejšom prostredí (napr. 
pri pH 1,2) pri jednej fyziologicky relevantnej teplote (37  o C). 
2. ÚDAJE  
Množstvo testovanej látky a produktov hydrolýzy, ak vznikajú, sa 
uvádzajú ako % z pôvodne aplikovanej koncentrácie, prípadne ako 
mg/l pre každý interval odberu vzorky pre jednotlivé hodnoty pH 
a teploty pri teste. Okrem toho by sa mala uvies ť látková bilanciu 
v percentách pôvodne aplikovanej koncentrácie, ak bola použitá značená testovaná látka. 
Malo by sa uvies ť grafické znázornenie log-transformovaných 
údajov koncentrácií testovanej látky oproti času. Mali by sa identi ­
fikovať všetky hlavné produkty hydrolýzy, aspo ň tie, ktoré predsta ­
vujú > 10 % aplikovanej dávky, a potom treba graficky zaznamena ť 
ich log-transformované koncentrácie rovnakým spôsobom ako pre 
materskú látku, aby bolo možné zobrazi ť rýchlosť ich tvorby 
a degradácie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Presnejšie stanovenie hodnôt pol časov degradácie alebo DT  50 sa 
dosiahne použitím výpo čtov podľa vhodného kinetického modelu. 
Hodnoty pol času degradácie a/alebo DT  50 (vrátane medzí spo ľahli­
vosti) by sa mali uvies ť pre každú hodnotu pH a teplotu spolu 
s opisom použitého modelu, kinetického poriadku a koeficientu stanovenia (r
 2 ). Výpočty by sa mali v prípade vhodnosti použi ť aj 
pre produkty hydrolýzy. 
V prípade, že sa štúdie rýchlosti hydrolýzy vykonávajú pri rôznych 
teplotách, mali by sa opísa ť pseudorýchlostné konštanty hydrolýzy 
prvé rádu (k  obs ) ako funkcia teploty. Výpo čet by mal by ť založený 
jednak na rozdelení kobs na rýchlostné konštanty pre hydrolýzu kyslou katalýzou, neutrálnou a bázickou katalýzou (k
 H , k  neutral  , 
respektíve k  OH ) a jednak na vz ťahoch Arrheniovej rovnice:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
kde A  i a B  i sú regresné koeficienty úseku priamky respektíve sklonu 
najvhodnejších priamok vytvorených z lineárne klesajúceho ln k  i 
oproti prevrátenej hodnote absolútnej teploty v Kelvinoch (T). 
Pomocou využitia Arrheniových vz ťahov pre hydrolýzu kyslú, 
neutrálnu a bázickú je možné vypo čítať rýchlostné konštanty pseu ­
doprvého rádu, a tým taktiež pol časy degradácie pre ostatné teploty, 
pre ktoré priame experimentálne stanovenie rýchlostnej konštanty nie je vykonate ľné (10).
 
2.2. VYHODNOTENIE A VÝKLAD VÝSLEDKOV 
Väčšina hydrolytických reakcií sa riadi zjavnými reak čnými rýchlo ­
sťami prvého rádu, a preto sú pol časy degradácie nezávislé od 
koncentrácie (pozri rovnicu 4 v dodatku 2). To zvy čajne umož ňuje 
používanie laboratórnych výsledkov stanovených pri 10  -2 až 10  -3 
M v podmienkach v životného prostredia (< 10  -6 M) (pozri odkaz 
na literatúru 10). Mabey a Mill (pozri odkaz 11) uviedli viacero príkladov zhody medzi rýchlos ťami hydrolýzy nameranej ako 
v čistej, tak aj v prírodnej vode pri mnohých chemických látkach 
s tým, že sa merala hodnota pH aj teplota.
 
3. VYPRACOVANIE SPRÁVY  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť aspoň tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— bežný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec 
(s vyznačením umiestnenia zna čky, ak sa používa zna čkovanie 
rádioaktívnym izotopom) a príslušné fyzikálno-chemické vlast ­
nosti (pozri časť 1.5), 
— čistota (ne čistoty) testovanej látky, 
— čistota zna čky chemickej látky zna čenej rádioaktívnym izotopom 
a mólová aktivita (ak j e to vhodné).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Tlmivé roztoky 
— dátumy a podrobnosti o príprave, — použité tlmivé roztoky a použité vody, 
— molarita a hodnota pH tlmivých roztokov. 
Podmienky vykonávania testu: — dátumy vykonávania štúdií, 
— množstvo aplikovanej testovanej látky, 
— metóda a rozpúš ťadlá (typ a množstvo) použité na aplikáciu 
testovanej látky, 
— objem inkubovaných tlmivých roztokov testovanej látky, 
— opis použitého inkuba čného systému, 
— hodnota pH a teplota po čas vykonávania štúdie, 
— časy odberu vzoriek, 
— metóda (metódy) extrakcie, 
— metódy stanovenia a identifikácie testovanej látky a jej produktov 
hydrolýzy v tlmivých roztokoch, 
— počet opakovaní. 
Výsledky: 
— opakovate ľnosť a citlivos ť použitých analytických metód, 
— výťažnosť ( % hodnoty sú pre platné štúdie uvedené v časti 
1.7.1), 
— opakované údaje a stredné hodnoty v tabu ľkovej forme, 
— látková bilancia po čas vykonávania štúdií a na jeho konci (pri 
použití zna čenej testovanej látky), 
— výsledky predbežného testu, 
— rozbor a výklad výsledkov, — všetky pôvodné údaje a čísla. 
Nasledujúce informácie sa vyžadujú iba pri stanovení rýchlosti 
hydrolýzy: 
— grafické znázornenie koncentrácií v prípade testovanej látky 
oproti času, a ak je to vhodné, aj v prípade produktov hydrolýzy 
pre každú hodnotu pH a teplotu, 
— tabuľky výsledkov Arrheniovej rovnice pre teplotu 20
 o C/25  o C, 
s uvedením hodnoty pH, rýchlostnej konštanty [h  -1 alebo deň 1 ], 
polčasu degradácie alebo DT  50 , teploty [C] vrátane medzí spo ľa­
hlivosti a korela čných koeficientov (r  2 ) alebo porovnate ľné infor­
mácie, 
— navrhovaný mechanizmus hydrolýzy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. ODKAZY NA LITERATÚRU  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981. 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment. 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section 
G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser 
(October 1980). 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Asse ­
ssment Nr. 23. 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993). 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental conditi ­
ons. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383 – 415.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
DODATOK 1  
Schéma stup ňovitého testu hydrolýzy
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
PRÍLOHA 2  
Vymedzenie pojmov a jednotky 
Štandardné medzinárodné (SI) jednotky  by sa mali používa ť v každom 
prípade.  
Testovaná látka:  akákoľvek látka, či už materská zlú čenina alebo relevantné 
produkty transformácie.  
Produkty transformácie:  všetky látky, ktoré sú výsledkom biotických alebo 
abiotických transforma čných reakcií testovanej látky.  
Produkty hydrolýzy:  všetky látky, ktoré sú výsledkom hydrolytických trans ­
formačných reakcií testovanej látky.  
Hydrolýza  znamená reakciu testovanej látky RX s vodou, s čistou výmenou 
skupiny X za skupinu OH v reak čnom jadre: 
RX + HOH → ROH + HX [1] 
Rýchlosť, ktorou sa znižuje koncentrácia RX v tomto zjednodušenom procese, je 
daná týmto vz ťahom: 
rýchlosť = k [H  2 O] [RX] reakcia druhého rádu 
alebo 
rýchlosť = k [RX] reakcia prvého rádu 
v závislosti od rýchlos ť určujúceho kroku. Pretože voda je v porovnaní 
s testovanou látkou prítomná vo ve ľkej prevahe, tento druh reakcie sa zvy čajne 
opisuje ako reakcia pseudoprvého rádu, v ktorej je pozorovaná rýchlostná 
konštanta daná vz ťahom 
k obs = k [H  2 O] [2] 
a možno ju stanovi ť z rovnice (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
kde 
t = čas 
a C  o , C t = koncentrácia RX v čase 0 a v čase t. 
Jednotky tejto konštanty majú rozmery ( času)  -1 a polčasu degradácie reakcie ( čas 
na reakciu 50 % RX) a sú dané vz ťahom  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Polčas degradácie:  (t 0,5 ) je čas potrebný na 50 % hydrolýzu testovanej látky, ak 
reakciu možno opísa ť kinetikou prvého rádu: nezávisí od koncentrácie.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Ak grafické znázornenie log-transformovaných údajov oproti času neindikuje lineárnu 
funkciu (zodpovedajúcu pomeru reakcie prvého rádu), potom nie je použitie rovnice [3] 
vhodné na stanovenie rýchlostnej konštanty hydrolýzy testovanej zložky.
 DT 50 (čas úbytku 50):  je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži 
o 50 %; je odlišný od pol času degradácie t  0,5 , ak sa reakcia neriadi kinetikou 
prvého rádu.  
Odhad rýchlostnej konštanty k pri rozdielnych teplotách  
Ak sú známe hodnoty rýchlostnej konštanty pri dvoch teplotách, rýchlostnú 
konštantu pri inej teplote možno vypo čítať použitím Arrheniovej rovnice:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T alebo  ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Grafické znázornenie ln k proti l/T vykazuje rovnú čiaru so sklonom –E/R, 
kde: k = rýchlostná konštanta zmeraná pri rozli čných teplotách, 
E = aktiva čná energia [kJ/mol], 
T = absolútna teplota [K], R = plynová konštanta [8,314 J/mol.K]. Aktivačná energia sa vypo čítala pomocou regresnej analýzy alebo tejto rovnice:
 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
kde: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
DODATOK 3  
Tlmivé systémy  
A. CLARK AND LUBS:  
Tlmivé zmesi CLARK a LUBS  (*) 
Zloženie pH  
0,2 N HCl A 0,2 N KCl pri 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 1,8 
5,3 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl zriedi ť na 100 ml 2,2  
0,1 M hydrogénftalán draselný + 0,1 N HCl pri 20  o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 3,4 5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 3,8  
0,1 M hydrogénftalán draselný + 0,1 N NaOH pri 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Hodnoty pH uvedené v týchto tabu ľkách sa vypo čítali na základe potenciálnych meraní pomocou Sörense ­
nových štandardných rovníc (1909). Zodpovedajúce hodnoty pH sú o 0,04 jednotiek vyššie ako hodnoty 
v tabuľkách.
 Zloženie pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogénftalánu do 100 ml 6,0
 
Tlmivé zmesi CLARK a LUBS (pokra čovanie) 
0,1 M dihydrogénfosfore čnan draselný + 0,1 N NaOH pri 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 6,0 
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 6,4 
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 6,6 
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 6,8 
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 7,0 
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 7,6 
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 7,8 
46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml 100 ml dihydrogénfosfore čnanu do 100 ml 8,0  
0,1 M H  3 BO  3 v 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH pri 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 9,6 40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 9,8 43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny trihydrogénboritej do 100 ml 10,0
 
B. KOLTHOFF A VLEESCHHOUWER:  
Citranové tlmivé roztoky KOLTHOFF a VLEESCHHOUWER  
Zloženie pH  
0,1 M citran draselný a 0,1 N HCl pri 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 2,6 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 2,8 23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 3,0 17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citranu do 100 ml 3,6  
0,10,2 M citran draselný a 0,1 N NaOH pri 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 3,8 9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 4,6 39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 4,8 46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 5,4 68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 5,6 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 5,8 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citranu do 100 ml 6,0
 
(*) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Pridajte drobný kryštál tymolu alebo podobnej látky, aby sa zabránilo rastu plesní.
 C. SÖRENSEN:  
Boritanové zmesi SÖRENSEN  
Zloženie Sörensen 
18 o C Walbum, pH pri 
ml boraxu ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M bórax + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 
8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M bórax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Fosforečnanové zmesi pod ľa SÖRENSEN  
Zloženie pH  
0,0667 M dihydrogénfosfore čnan draselný + 0,0667 M hydrogénfosfore čnan disodný pri 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICITA NA DÁŽ ĎOVKÁCH  
UMELOPÔDNY TEST  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
V tomto laboratórnom teste sa testovaná látka pridáva do umelej 
pôdy, v ktorej sú po dobu 14 dní umiestnené dáž ďovky. Po tomto 
čase (alternatívne po 7 d ňoch) sa zis ťuje letálny efekt testovanej 
látky na dáž ďovky. Test poskytuje metódu na relatívne krátkodobé 
sledovanie ú činku chemických látok na dáž ďovky cez príjem 
pokožkou a tráviacim traktom.  
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
LC 50 : Koncentrácia testovanej látky, ktorá usmrtí 50 % testovacích 
organizmov po čas doby experimentu.  
1.3. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Referenčná látka sa periodicky používa na preukázanie, že citlivos ť 
testovacieho systému sa významne nezmenila. 
Ako referen čná látka sa odporú ča chloroacetamid analytickej čistoty.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Pôda je variabilné médium, a preto sa v tomto teste používa presne 
definovaná ílovitá umelá pôda. Dospelé dáž ďovky druhu  Eiseniafoe ­
tida (pozri poznámku v dodatku) sú uchovávané v definovanej 
umelej pôde v prítomnosti rôznych koncentrácií testovanej látky. 
Obsah nádoby sa po 14 d ňoch (alternatívne po 7 d ňoch) od za čiatku 
testu vysype na tácku a pre každú testovanú koncentráciu sa po číta 
množstvo prežívajúcich dáž ďoviek  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Test je navrhnutý tak, aby bol v maximálnej miere reprodukovate ľný 
vzhľadom na použitú testovanú látku a organizmus. Mortalita 
v kontrole nesmie presiahnu ť na konci testu 10 %, v opa čnom 
prípadne je test neplatný.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Materiál  
1.6.1.1. T e s t o v a c í s u b s t r á t 
Ako základný substrát je používaná presne definovaná umelá pôda. 
a) Základný substrát (percentá sú uvedené pre sušinu) 
— 10 % rašeliny (pH čo najbližšie k 5,5 až 6,0, bez vidite ľných 
rastlinných zvyškov a jemne rozdrvená),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolínovej hliny s obsahom kaolínu prednostne vyšším 
ako 50 %, 
— približne 69 % priemyselného kremenného piesku (prevažne 
jemný piesok, kde viac ako 50 % častíc má ve ľkosť 0,05 až 
0,2 mm). Ak látka nie je dostato čne dispergovate ľná vo vode, 
10 g látky na jednu testovaciu nádobu by malo by ť pone­
chané na dodato čné zmiešanie s testovanou látkou, 
— približne 1 % uhli čitanu vápenatého (CaCO  3 ), práškový, 
chemicky čistý, pridávaný na vyrovnanie pH k 6,0 ± 0,5. 
b) Testovací substrát 
Testovací substrát obsahuje základný substrát, testovanú látku 
a deionizovanú vodu. 
Obsah vody je približne 25 až 42 % sušiny základného substrátu. 
Obsah vody v substráte sa ur čuje vysušením vzorky na 
konštantnú hmotnos ť pri teplote 105  o C. Kľúčovým kritériom 
vlhkosti umelej pôdy je neprítomnos ť stojacej vody. Pozorne 
treba dohliadnu ť na rovnomerné premiešanie testovanej látky 
a substrátu. Spôsob zapracovania testovanej látky do substrátu musí byť uvedený. 
c) Kontrolný substrát 
Kontrolný substrát obsahuje základný substrát a vodu. Ak je 
použitá nejaká aditívna látka, dodato čná kontrola by mala obsa ­
hovať rovnaké množstvo tejto aditívnej látky.
 
1.6.1.2. T e s t o v a c i e n á d o b y 
Testovacími nádobami sú sklenené nádoby s objemom približne 1 
liter (primerane zakryté plastovými vrchnákmi, miskami alebo fóliou s vetracími otvormi) naplnené testovacím alebo kontrolným substrá ­
tom, ktorý zodpovedá 500 g sušiny substrátu.
 
1.6.2.  Podmienky testu  
Nádoby by mali by ť uskladnené v klimatizovaných miestnostiach pri 
teplote 20 ± 2  o C a pri stálom osvetlení. Intenzita svetla sa odporú ča 
400 – 800 luxov. 
Doba experimentu je 14 dní, ale mortalita môže by ť alternatívne 
hodnotená po 7 d ňoch od za čatia testu.  
1.6.3.  Postup testu  
T e s t o v a c i e k o n c e n t r á c i e 
Koncentrácie testovanej látky sú vyjadrené ako hmotnos ť látky na 
hmotnosť sušiny základného substrátu (mg/kg).  
T e s t n a v y h ľ a d á v a n i e r o z s a h u 
Rozpätie koncentrácií spôsobujúcich mortalitu od 0 do 100 % môže 
byť stanovené v teste na vyh ľadávanie rozsahu, pri ktorom sa získajú 
informácie o tom, ktoré koncentrácie sa použijú v kone čnom teste.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Látka by mala by ť testovaná v nasledovných koncentráciách: 1 000; 
100; 10; 1; 0,1 mg látky/kilogram testovacieho substrátu (sušiny). 
Ak sa uskuto čňuje konečný test v plnom rozsahu, v teste na vyh ľa­
dávanie rozsahu by mala by ť dostačujúca jedna testovacia skupina na 
koncentráciu a jedna neovplyvnená kontrola, každá po 10 jedincov.  
K o n e č n ý t e s t 
Výsledky testu na vyh ľadávanie rozsahu sa použijú na výber 
najmenej 5 koncentrácií v geometrickom rade tak, aby pokrývali rozpätie mortality 0 až 100 % a odlišujúcich sa od seba konštantným 
faktorom nepresahujúcim hodnotu 1,8. 
Testy s použitím týchto koncentrácií by mali umožni ť čo najpres ­
nejšie stanovenie koncentrácie LC
 50 a jej hranice významnosti. 
V konečnom teste sú zahrnuté najmenej 4 testované skupiny na 
koncentráciu a 4 neovplyvnené kontroly, každá po 10 jedincov. 
Výsledky v paralelných skupinách sa uvádzajú ako priemer 
a smerodajná odchýlka. 
Ak dve následné koncentrácie v pomere 1,8 dávajú iba 0 a 100 % 
mortalitu, sú tieto dve hodnoty dosta čujúce na indikovanie rozpätia, 
do ktorého spadá hodnota LC  50 . 
Z m e s z á k l a d n é h o t e s t o v a c i e h o s u b s t r á t u 
a t e s t o v a n e j l á t k y 
Testovací substrát by pod ľa možnosti mal by ť pripravený bez 
akýchkoľvek prísad iných ako voda. Bezprostredne pred za čatím 
testu sa emulzia alebo disperzia testovanej látky v deionizovanej vode alebo inom rozpúš ťadle zmieša so základným testovacím 
substrátom, alebo je na substrát rovnomerne nastriekaná jemným 
chromatografickým alebo podobným sprejom. 
Ak je testovaná látka nerozpustná vo vode, môže by ť rozpustená 
v čo najmenšom objeme vhodného organického rozpúš ťadla (napr. 
hexán, acetón alebo chloroform). 
Na rozpustenie, dispergovanie alebo emulgovanie testovanej látky 
môžu by ť použité len činidlá, ktoré sú ľahko prchavé. Testovací 
substrát musí by ť pred použitím prevzdušnený. Množstvo vyparenej 
vody treba nahradi ť. Kontrola by mala obsahova ť rovnaké množstvo 
akejkoľvek aditívnej látky. 
Ak testovaná látka nie je rozpustná, dispergovate ľná alebo emulgo ­
vateľná v organickom rozpúš ťadle, je potrebné zmieša ť 10 g zmesi 
jemne rozdrveného kremenného piesku a testovanej látky v množstve 
potrebnom na ovplyvnenie 500 g sušiny umelej pôdy so 
490 g sušiny testovacieho substrátu. 
Pre každú testovaciu skupinu sa do sklenenej nádoby umiestni vlhký 
testovací substrát v množstve 500 g sušiny a na povrch substrátu sa uloží 10 dáž ďoviek, ktoré boli 24 hodín pred pokusom vystavené 
podmienkam podobným vlhkému základnému substrátu a následne 
umyté a prebyto čná voda odsatá filtra čným papierom.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Aby sa zabránilo vysychaniu substrátu, nádoby sú zakryté perforo ­
vanými plastovými vrchnákmi, miskami alebo fóliou a v týchto 
testovacích podmienkach sú uchovávané 14 dní. 
Hodnotenie by sa malo uskuto čňovať 14 dní (alternatívne 7 dní) po 
začatí experimentu. Substrát sa rozvrství na sklenenú plat ňu alebo 
platňu z nehrdzavejúcej ocele. Pozorujú sa dáž ďovky a po číta sa 
množstvo prežívajúcich jedincov. Dáž ďovka sa považuje za m ŕtvu, 
ak nereaguje na jemný mechanický podnet v prednej časti tela. 
Ak sa vyhodnotenie robí na 7. de ň, nádoby sa opätovne naplnia 
substrátom a prežívajúce dáž ďovky sa umiestnia na povrch toho 
istého testovacieho substrátu.  
1.6.4.  Testovacie organizmy  
Testovacími organizmami sú dospelé jedince druhu  Eisenia foetida  
(pozri dodatok) (najmenej 2 mesiace staré s vyvinutým klitelom) s hmotnos ťou 300 až 600 mg vo vlhkom stave. (Metóda chovu, 
pozri dodatok).
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE A VYHODNOTENIE VÝSLEDKOV 
Koncentrácie testovanej látky sa vyjadrujú vo vz ťahu k príslušným 
percentám odumretých jedincov. 
Ak sú údaje adekvátne, hodnota LC  50 a hranice významnosti (p = 
0,05) sa ur čujú štandardnými metódami (Litchfield a Wilcoxon, 
1949, pre ekvivalentnú metódu). Hodnota LC  50 sa udáva v mg testo ­
vanej látky na kilogram testovacieho substrátu (sušina). 
V prípadoch, ke ď je sklon koncentra čnej krivky príliš strmý na 
prepočet hodnoty LC  50 , postačuje grafický odhad tejto hodnoty. 
Ak dve následné koncentrácie v pomere 1,8, dávajú iba 0 a 100 % 
mortalitu, sú tieto dve hodnoty dosta čujúce na indikovanie rozpätia, 
do ktorého spadá hodnota LC  50 . 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu obsahuje pod ľa možnosti tieto informácie: 
— vyhlásenie, že test bol uskuto čnený v súlade s vyššie uvedenými 
kritériami kvality, 
— uskuto čnený test (test na vyh ľadávanie rozsahu a/alebo kone čný 
test), 
— presný opis testovacích podmienok a vyhlásenie, že test bol 
prevedený v súlade s metódou; akáko ľvek odchýlka musí by ť 
uvedená, 
— presný opis zmiešania testovacej látky so základným substrátom, — informáciu o testovacích organizmoch (druh, vek, priemer 
a rozpätie hmotnosti, podmienky udržiavania a chovu, dodáva ­
teľ),
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— metódu použitá na ur čenie hodnoty LC  50 
— výsledky, vrátane všetkých použitých údajov, 
— opis pozorovaných prejavov alebo zmien správania testovacích 
organizmov, 
— mortalita v kontrolách, — hodnotu LC
 50 alebo najvyššiu testovanú koncentráciu bez morta ­
lity a najnižšiu testovanú koncentráciu s mortalitou 100 % 14 dní (alternatívne 7 dní) po za čatí experimentu, 
— znázornenie koncentra čnej krivky/krivky odpovede, 
— výsledky získané použitím referen čnej látky, bu ď v spojení 
s prezentovaným testom, alebo z predchádzajúcej kontroly kvality.
 
4. LITERATÚRA  
(1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 207,  Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977,  Biology of Earthworms,  
Chapman and Hall, London, 331 s. 
(3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Ecology et Systé ­
matique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 671 s. 
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluation dose effect experiments.  J. Pharm. Exp. Therap.,  
vol. 96, 1949, s. 99. 
(5) Commission of the European Communities,  Development of  
a standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms,  Report EUR 8714 EN, 
1983. 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land-and 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizität ­
stest am Regenwurm  Eisenia foetida  in kunstlichem Boden“, 
in: Rudolph/Boje,  Ókotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Dodatok  
Chov a udržiavanie dáž ďoviek pred testom  
Na chov dáž ďoviek sa používa chovná nádoba s čerstvým substrátom, do ktorej 
sa na 14 dní umiestni 30 až 50 dospelých jedincov. Tieto jedince sa potom môžu použiť na ďalšie chovné sady. Dáž ďovky vyliahnuté z kokónov sa po dosiahnutí 
dospelosti používajú na testovanie (pri uvedených podmienkach je to po 2 až 
3 mesiacoch).
 
Podmienky udržiavania a chovu  
Klimatizovaná miestnos ť: teplota 20 ± 2  o C, prednostne s kontinuálnym 
osvetlením (intenzita 400 až 800 luxov), 
Chovné nádoby: primerané plytké nádoby s objemom 10 až 20 
litrov. 
Substrát:  Eisenia foetida  sa môže pestova ť v rôznych živo ­ 
číšnych exkrementoch. Ako chovné médium sa 
doporučuje zmes 50 % rašeliny a 50 % kravského 
alebo konského hnoja. Médium by malo ma ť pH 
približne 6 až 7 (regulované prídavkom uhli čitanu 
vápenatého) a nízku iónovú vodivos ť (menej ako 
6 mmhos alebo 0,5 % solí). 
Substrát by mal by ť vlhký, ale nie príliš mokrý. 
Okrem vyššie uvedenej metódy sa môžu použi ť aj 
iné úspešné postupy.  
Poznámka : Eisenia foetida  sa vyskytuje v dvoch líniách, ktoré niektorí taxono ­
misti rozdelili do druhov (Bouche, 1972). Sú morfologicky podobné, ale  Eisenia 
foetida foetida  má typické prie čne prúžkovanie na článkoch a  Eisenia foetida 
andrei  nemá uvedené prúžkovanie a má nepravidelné na červenalé zafarbenie. 
Podľa možnosti je vhodné použi ť dážďovky  Eisenia foetida andrei.  Ak je 
k dispozícii potrebná metodika, môžu by ť použité aj iné druhy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADÁCIA  
ZAHN-WELLENSOV TEST  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Účelom tejto metódy je hodnotenie potenciálnej kone čnej biodegra ­
dovateľnosti vo vode rozpustných, neprchavých organických látok 
v stacionárnom teste pri vystavení vysokým koncentráciám mikroor ­
ganizmov. 
Môže sa vyskytnú ť fyzikálno-chemická adsorbcia na suspendované 
pevné látky, a preto ju treba bra ť do úvahy pri interpretácii 
výsledkov (pozri 3.2). 
Študované látky sa používajú v koncentráciách zodpovedajúcich 
hodnotám DOC v rozmedzí 50 až 400 mg/liter alebo hodnotám COD v rozmedzí 100 až 1 000 mg/liter [DOC = dissolved organic carbon (rozpustený organický uhlík); COD = chemical oxygen demand (che ­
mická spotreba kyslíka)]. Takéto relatívne vysoké koncentrácie majú 
výhodu analytickej spo ľahlivosti. Zlú čeniny s toxickými vlastnos ťami 
môžu oddiali ť alebo inhibova ť degradačný proces. 
V tejto metóde sa na zistenie biodegradovate ľnosti testovanej látky 
využíva meranie rozpusteného organického uhlíka a chemická 
spotreba kyslíka. 
Súčasné použitie špecifickej analytickej metódy môže umožni ť zhod­
notenie primárnej biodegradácie látky (odstránenie pôvodnej 
chemickej štruktúry). 
Metóda je aplikovate ľná len na tie testované organické látky, ktoré 
pri koncentráciách použitých v teste vykazujú nasledujúce vlastnosti: 
— sú pri testovacích podmienkach rozpustné vo vode, — pri testovacích podmienkach majú zanedbate ľný tlak pár, 
— nepôsobia inhibi čne na baktérie, 
— v testovacom systéme sú adsorbované len v limitovanom množstve, 
— z testovacieho roztoku sa nestrácajú penením. Informácia o relatívnom pomere hlavných zložiek testovaného mate ­
riálu sa použije pri interpretácii získaných výsledkov, obzvláš ť 
v prípadoch, kde sú výsledky slabé alebo okrajové. 
Informácia o toxicite látky na mikroorganizmy je žiaduca pri inter ­
pretácii slabých výsledkov a pri výbere vhodných testovacích 
koncentrácií.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Stupeň biodegradácie dosiahnutý na konci testu sa udáva ako „Bio ­
degradovate ľnosť v Zahn-Wellensovom teste“:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
kde: 
DT = biodegradácia ( %) v čase T, 
CA = DOC (alebo COD) hodnota v testovanej zmesi meraná 3 
hodiny po za čatí testu (mg/l) (DOC = rozpustený orga ­
nický uhlík, COD = chemická spotreba kyslíka), 
CT = DOC alebo COD hodnota testovanej zmesi v čase odberu 
vzorky (mg/l), 
CB = DOC alebo COD hodnota slepého pokusu v čase odberu 
vzorky (mg/l), 
CBA = DOC alebo COD hodnota slepého pokusu meraná 3 
hodiny po za čatí testu (mg/l). 
Rozsah degradácie sa zaokrúh ľuje na najbližšie celé percento. 
Percentuálna degradácia sa stanovuje ako percento úbytku DOC 
(alebo COD) z testovanej látky. 
Rozdiely medzi hodnotami nameranými po 3 hodinách od za čatia 
testu a prepo čítanými alebo prednostne nameranými po čiatočnými 
hodnotami poskytujú vhodnú informáciu o eliminácii látky (pozri 3.2, Interpretácia výsledkov).
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
V prípade skúmania novej testovanej látky je vhodné použi ť refe­
renčnú látku, avšak špecifickú referen čnú látku nie je zatia ľ možné 
odporučiť. 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Aktivovaný kal, minerálne živiny a testovaný materiál ako jediný 
zdroj uhlíka vo vodnom roztoku sú spolu umiestnené do sklenenej 
nádoby s objemom 1 až 4 litre vybavenej miešadlom 
a prevzduš ňovačom. Zmes sa premiešava a prevzduš ňuje pri teplote 
20 až 25  o C pod difúznym osvetlením alebo v tme po dobu 28 dní. 
Proces degradácie sa monitoruje vo filtrovanom roztoku stanovo ­
vaním hodnoty DOC (alebo COD) denne alebo v iných pravidelných 
časových intervaloch. Pomer eliminovaných DOC (alebo COD) 
v každom časovom intervale k hodnote získanej po 3 hodinách od 
začiatku testu sa vyjadruje ako percento biodegradácie a slúži na 
meranie rozsahu degradácie v danom čase. Výsledok je znázornený 
v biodegrada čnej krivke v závislosti od času. 
Pri použití špecifickej analytickej metódy sa môže mera ť zmena 
koncentrácie pôvodnej molekuly v dôsledku biodegradácie (primárna 
biodegradovate ľnosť). ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Dostatočná reprodukovate ľnosť tohto testu bola potvrdená kruhovým 
testom. 
Citlivosť metódy je do zna čnej miery ur čená variabilitou slepej 
vzorky a v menšej miere presnos ťou stanovenia hodnoty DOC 
a hladiny testovanej zlú čeniny v médiu.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
1.6.1.1. R e a g e n č n é l á t k y 
Testovacia voda: pitná voda s obsahom organického uhlíka menej 
ako < 5 mg/liter. Koncentrácia iónov vápnika a hor číka nesmie spolu 
presiahnu ť 2,7 mmol/liter; v opa čnom prípade sa požaduje riedenie 
s deionizovanou alebo destilovanou vodou. 
Kyselina sírová, analytickej čistoty (p.a.): 50 g/l 
Roztok hydroxidu sodného (p.a.): 40 g/l 
Roztok minerálnych živín: rozpusti ť v 1 litri deionizo ­
vanej vody: 
chlorid amónny, NH  4 Cl, (p.a.): 38,5 g 
dihydrogénfosfore čnan sodný, NaH  2 PO 4 .2H  2 O, (p.a.): 33,4 g, 
dihydrogénfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 , (p.a): 8,5 g, 
hydrogénfosfore čnan draselný, K  2 HPO  4 , (p.a.): 21,75 g. 
Zmes slúži jednak ako zdroj živín aj ako tlmivý roztok.  
1.6.1.2. P r í s t r o j e 
Sklenené nádoby s objemom 1 až 4 litre (napr. cylindrické nádoby). 
Miešadlo so skleneným alebo kovovým rotorom na vhodnom pieste 
(miešadlo by malo rotova ť približne 5 až 10 cm nad dnom nádoby). 
Namiesto takéhoto miešadla môže by ť použitý aj magnetický rotor 
s miešadlom dlhým 7 až 10 cm. 
Sklená trubka s vnútorným priemerom 2 až 4 mm na vhá ňanie 
vzduchu. Koniec trubky s otvorom by mal by ť približne 1 cm nad 
dnom nádoby. 
Centrifúga (približne 3 550 g). pH meter. Prístroj na meranie rozpusteného kyslíka. Papierové filtre.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Membránová filtra čná aparatúra. 
Membránové filtre s pórmi o ve ľkosti 0,45 μm. Vhodné sú membrá ­
nové filtre, ktoré neumož ňujú únik uhlíka ani absorpciu látky po čas 
filtrácie. 
Analytické zariadenie na stanovenie obsahu organického uhlíka 
a chemickej spotreby kyslíka.  
1.6.1.3. P r í p r a v a i n o k u l a 
Aktivovaný kal z biologickej čističky sa premýva (opakovanou) 
centrifugáciou alebo sedimentovaním s testovacou vodou. 
Aktivovaný kal musí by ť vo vhodnom stave. Takýto kal je dostupný 
zo správne pracujúcej čističky odpadových vôd. Aby sa získal čo 
najväčší počet rôznych druhov bakteriálnych kme ňov, uprednost ňuje 
sa zmieša ť inokulá z rôznych zdrojov (napr. rôzne čističky, pôdne 
extrakty, rie čne vody a pod.). Zmes sa spracováva pod ľa vyššie 
uvedeného postupu. 
Na kontrolu aktivity aktivovaného kalu pozri nižšie „Funk čná 
kontrola“.  
1.6.1.4. P r í p r a v a t e s t o v a c í c h r o z t o k o v 
Do testovacej nádoby sa pridá 500 ml testovacej vody, 2,5 ml/liter 
roztoku minerálnych živín a aktivovaný kal v množstve zodpoveda ­
júcom 0,2 až 1,0 g/liter sušiny v celkovom objeme. Následne sa 
pridá také množstvo zásobného roztoku testovanej látky, aby 
výsledná koncentrácia DOC v celkovej zmesi bola 50 až 400 mg/liter. Zodpovedajúce hodnoty COD sú 100 až 1 000 mg/liter. Doplní sa testovacou vodou do celkového objemu 1 ž 4 litre. Vo ľba celkového 
objemu závisí od po čtu vzoriek, u ktorých stanovujeme DOC alebo 
COD a od objemu nevyhnutného na analytické postupy. 
Bežne môžeme považova ť objem 2 litre za dosta čujúci. Paralelne 
s každou testovanou skupinou sa spúš ťa kontrolná nádoba (slepý 
test); obsahuje iba aktivovaný kal a roztok minerálnych živín zaro ­
bený s testovacou vodou do celkového objemu rovnakého ako v testovanej skupine.
 
1.6.2.  Vykonanie testu  
Testovacie nádoby sú premiešavané magnetickými miešadlami alebo 
skrutkovitou vrtu ľou pri difúznom osvetlení alebo v tmavej miest ­
nosti pri teplote 20 až 25  o C. Prevzduš ňovanie sa vykonáva stla ­ 
čeným vzduchom, ktorý je, ak je to nevyhnutné, pre čistený cez 
bavlneno-vlnené sitko a premývaciu f ľašu. Musí by ť zaručené, že 
kal sa neusadí a koncentrácia kyslíka nepoklesne pod 2 mg/liter. 
Hodnota pH sa musí kontrolova ť v pravidelných intervaloch (napr. 
denne), a ak je to nevyhnutné, upravuje sa na pH 7 – 8.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Straty spôsobené vyparovaním sa dop ĺňajú deionizovanou alebo 
destilovanou vodou v požadovaných množstvách tesne pred každým 
odberom vzorky. Vhodným krokom je zazna čiť si hladinu kvapaliny 
v nádobe pre za čatím testu. Po každom odbere vzoriek sa robia nové 
značky (bez miešania a prevzduš ňovania). Prvé vzorky sa vždy 
odoberajú 3 hodiny po za čatí testu, aby sa ur čila adsorpcia testova ­
ného materiálu aktivovaným kalom. 
Následne po eliminácii testovaného materiálu sa denne alebo v iných 
pravidelných časových intervaloch stanovujú hodnoty DOC alebo 
COD. Vzorky z testovacích nádob a zo slepého pokusu sa prefiltrujú cez dôkladne premytý papierový filter. Prvých 5 ml testovacieho roztoku sa odstráni. Kal, ktorý sa ťažko filtruje, sa môže ešte 
predtým odstráni ť centrifugáciou 10 minút. DOC a COD hodnoty 
sa stanovujú duplicitne. Test prebieha 28 dní.  
Poznámka:  Vzorky, ktoré zostávajú zakalené, sa filtrujú cez membrá ­
nové filtre. Membránové filtre nesmú prepúš ťať alebo adsorbova ť 
žiadny organický materiál.
 
K o n t r o l a f u n k č n o s t i a k t i v o v a n é h o k a l u 
Na kontrolu funk čnej kapacity aktivovaného kalu beží paralelne 
s každou testovanou sériou nádoba obsahujúca známu látku. Na 
tento účel sa najčastejšie využíva dietylénglykol.  
A d a p t á c i a 
Ak sa analýzy uskuto čňujú v relatívne krátkych časových intervaloch 
(napr. denne), môžeme z degrada čnej krivky jasne pozorova ť adap­
táciu (pozri obrázok 2). Test by preto nemal za čínať tesne pred 
víkendom. 
Ak je adaptácia pozorovaná na konci periódy, test môže by ť 
predĺžený, až kým nie je degradácia ukon čená. 
Poznámka:  V prípade, že sú potrebné širšie poznatky o správaní sa 
adaptovaného kalu, aktivovaný kal je opätovne vystavený rovna ­
kému testovanému materiálu pod ľa nasledujúceho postupu: 
Vypne sa miešadlo a prevzduš ňovač a nechá sa usadi ť aktivovaný 
kal. Odčerpá sa supernatant a nádoba sa naplní opä ť 2 litrami testo ­
vacej vody. Mieša sa 15 minút a znovu sa nechá usadi ť. Po 
opätovnom od čerpaní supernatantu sa zvyšný kal použije na opako ­
vanie testu s tým istým testovaným materiálom pod ľa 1.6.1.4 
a 1.6.2. Aktivovaný kal možno izolova ť okrem usadzovania aj 
centrifugáciou. 
Adaptovaný kal sa môže zmieša ť s čerstvým kalom do koncentrácie 
0,2 až 1 g sušiny/liter.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l y t i c k é p r o s t r i e d k y 
Bežne sa vzorky filtrujú cez dôkladne premyté papierové filtre (na 
premývanie sa používa deionizovaná voda). 
Vzorky, ktoré zostávajú zakalené, sa filtrujú cez membránové filtre 
(0,45 um). 
Hodnoty DOC sa vo filtrátoch zo vzoriek stanovujú duplicitne 
(prvých 5 ml sa odstráni) prostredníctvom TOC zariadenia. Ak filtrát 
nie je možné analyzova ť v ten istý de ň, musí sa usklad ňovať 
v chladni čke do ďalšieho d ňa. Dlhšie skladovanie sa neodporú ča. 
Koncentrácie COD sa stanovujú vo filtrátoch zo vzoriek COD 
analýzou postupom uvedeným v literatúre pod bodom (2).  
2. ÚDAJE A HODNOTENIE  
DOC a/alebo COD koncentrácie sa stanovujú zo vzorky najmenej 
duplicitne pod ľa uvedeného odseku 1.6.2. Degradácia v čase T sa 
prepočíta podľa vzorca (s definíciami) uvedeného v odseku 1.2. 
Miera degradácie sa zaokrúh ľuje na najbližšie celé percento. 
Množstvo degradácie dosiahnuté na konci testu sa vyjadruje ako „Biodegradovate ľnosť v Zahn -Wellensovom teste“.  
Poznámka:  Ak sa dosiahne úplná degradácia ešte pred koncom testu 
a tento výsledok sa potvrdí aj druhou analýzou nasledujúci de ň, test 
môže byť uzavretý.
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu obsahuje pod ľa možnosti nasledujúce informácie: 
— počiatočnú koncentráciu testovanej látky, 
— všetky ostatné informácie a výsledky experimentov týkajúcich sa 
testovanej látky, referen čnej látky, ak bola použitá, a slepého 
pokusu, 
— koncentráciu po 3 hodinách, — biodegrada čnú krivku s opisom, 
— dátum a miesto, odkia ľ boli testovacie organizmy odobraté, stav 
adaptácie, použité koncentrácie a pod., 
— vedecké zdôvodnenie akejko ľvek zmeny testovacieho procesu.
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Úbytok DOC (COD), ktorý sa vyskytuje postupne v priebehu dní 
alebo týžd ňov, nazna čuje, že látka je biodegradovaná.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
V niektorých prípadoch však môže hra ť úlohu fyzikálno-chemická 
adsorpcia a táto je indikovaná, ak sa vyskytne úplný alebo čiastočný 
úbytok do prvých troch hodín od za čiatku testu a ak rozdiel medzi 
kontrolným a testovaným supernatantom zostáva na ne čakane nízkej 
úrovni. 
Ak rozdiely spadajú medzi biodegradáciu (alebo parciálnu biodegra ­
dáciu) a adsorpciu, sú nevyhnutné ďalšie testy. 
Toto sa môže uskuto čniť rôznymi spôsobmi, ale najpresved čivejšie 
je použitie supernatantu alebo kalu ako inokula v základnom teste (prednostne respirometrický test). 
Testovaná látka, ktorá vykazuje vysoký, neadsorp čný úbytok DOC 
(COD) v tomto teste, sa môže považova ť za potenciálne biodegra ­
dovateľnú. Čiastočný, neadsorp čný úbytok nazna čuje, že látka je 
predmetom aspo ň čiastkovej biodegradácie. Nízky alebo nulový 
úbytok DOC (COD) môže by ť zapríčinený inhibíciou mikroorga ­
nizmov testovanou látkou, čo možno tiež spozorova ť lýzou alebo 
stratou kalu za vzniku kalných supernatantov. Test treba v týchto prípadoch zopakova ť použitím nižších koncentrácií testovanej látky. 
Použitie zložkovo špecifickej analytickej metódy alebo 14C-zna čenej 
testovanej látky môže zabezpe čiť vyššiu citlivos ť. V prípade použitia 
14C-značenej testovanej zložky potvrdzuje prítomnos ť biodegradácie 
objavenie 14CO
 2 . 
Ak sa výsledky uvádzajú vo forme primárnej biodegradácie, treba 
podľa možnosti priloži ť vysvetlenie zmeny chemickej štruktúry, 
ktorá vedie k strate reakcie pôvodnej testovanej látky. 
Platnosť analytickej metódy sa musí uvies ť spolu s reakciou zistenou 
v testovacom médiu v slepom pokuse.  
4. LITERATÚRA  
(1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 302 B,  Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, 
Commission Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 19.9.1984, p. 1).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Dodatok  
PRÍKLAD VYHODNOTENIA 
Organická zložka: kyselina 4-etoxybenzoová 
Teoretická testovaná koncentrácia: 600 mg/l Teoretická hodnota DOC: 390 mg/l 
Inokulum: čistička odpadových vôd z ... 
Koncentrácia: 1 g sušiny/liter Stav adaptácie: neadaptovaný Analýza: stanovenie DOC 
Množstvo vzorky: 3ml 
Kontrolná látka: dietylénglykol Toxicita zložky: žiadny toxický efekt pod 1 000 mg/l 
Použitý test: Skúmavkový test fermentácie 
tabuľka
 
Doba testu Kontrolná látka Testovaná látka 
Slepý 
pokus 
DOC (  1 ) 
(mg/liter) DOC (  1 ) 
(mg/liter) DOC Čistý 
(mg/liter) % 
degradáde DOC (  1 ) 
(mg/liter) DOC Čistý 
(mg/liter % 
degradáde  
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 hodiny 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,2 6 1 deň 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dni 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dní 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 
6 dní 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 
7 dní 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dní 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dní 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dní 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Stredná hodnota troch stanovení DOC.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Obrázok č. 1 
Príklady biodegrada čných kriviek
  
Obrázok č. 2 
Príklady adaptácie kalu
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  SIMULA ČNÝ TEST AERÓBNEHO ČISTENIA ODPADOVÝCH 
VÔD C.10-A: JEDNOTKY S TECHNOLÓGIOU AKTIVOVANÉHO 
KALU – C.10-B: BIOFILMY  
C.10-A: Jednotky s technológiou aktivovaného kalu  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 303 (2001). V 50. rokoch 20. storo čia sa zistilo, že 
novozavedené povrchovo aktívne činidlá spôsobujú v čistiarňach odpado ­
vých vôd a v riekach nadmerné penenie. Aeróbnym čistením sa neodstránili 
úplne a v niektorých prípadoch bránili odstráneniu iných organických mate ­
riálov. Tento problém podnietil mnohé výskumy zaoberajúce sa otázkou, ako možno z odpadových vôd odstráni ť povrchovo aktívne činidlá a či 
možno nové chemikálie, ktoré priemysel produkuje, prispôsobi ť čisteniu 
odpadových vôd. Na tento ú čel sa použili modelové jednotky dvoch hlav ­
ných druhov aeróbneho biologického čistenia odpadových vôd (aktivovaný 
kal a filtrácia perkoláciou alebo prekvapkávaním). Bolo by nepraktické 
a finančne veľmi náro čné distribuova ť každú novú chemikáliu 
a monitorova ť veľké čistiarne odpadových vôd, aj keby to bolo len na 
lokálnej úrovni.
 
ÚVODNÉ ÚVAHY  
Jednotky s technológiou aktivovaného kalu  
2. Modelové jednotky s technológiou aktivovaného kalu sú opísané v rozmedzí 
veľkosti od 300 ml približne do 2 000 ml. Niektoré jednotky v mnohom 
pripomínali skuto čné čistiarne tým, že mali nádrže na usadzovanie kalu, 
z ktorých sa usadený kal pre čerpával spä ť do prevzduš ňovacej nádrže, zatia ľ 
čo iné jednotky nemali vybavenie na usadzovanie, napr. Swisher (1). 
Veľkosť zariadenia je výsledkom kompromisu. Na jednej strane musí by ť 
dostatočne veľké na zabezpe čenie funk čnej mechanickej prevádzky 
a dostato čného množstva vzoriek bez toho, aby to ovplyvnilo prevádzku, 
a na druhej strane by nemalo by ť také veľké, aby vyžadovalo nadmerný 
priestor a materiál. 
3. Dvomi druhmi zariadenia s rozsiahlym a vyhovujúcim použitím sú jednotky 
Husmann (2) a jednotky s pórovitou nádobou (3) (4), ktoré sa prvýkrát použili vo výskume povrchovo aktívnych činidiel. Tieto zariadenia sú 
opísané v tejto testovacej metóde. Uspokojivé využitie mali aj iné zariade ­
nia, napr. Eckenfelder (5). Vzh ľadom na pomerne vysokú finan čnú nároč­
nosť a úsilie pri aplikovaní tohto simula čného testu boli súbežne skúmané 
jednoduchšie a lacnejšie skríningové testy, ktoré sú teraz za členené do 
kapitoly C.4 A – F tejto prílohy (6). Zo skúseností s mnohými povrchovo 
aktívnymi činidlami a inými chemikáliami vyplynulo, že tie, ktoré prešli 
skríningovými testmi ( ľahko biodegradovate ľné), sa rozložili aj 
v simula čnom teste. Niektoré chemikálie, ktoré neprešli skríningovými 
testmi, prešli testmi inherentnej biodegradovate ľnosti [kapitoly C.12 (7) 
a C.19 (8) tejto prílohy], ale iba niektoré z nich sa rozložili v simulačnom teste, zatia ľ čo chemikálie, ktoré neprešli testmi inherentnej 
biodegradovate ľnosti, sa v simula čných testoch nerozložili (9) (10) (11). 
4. Na niektoré ú čely postačujú simula č
né testy uskuto čnené s využitím jedného 
súboru prevádzkových podmienok. Výsledky sú vyjadrené ako percentuálna eliminácia testovanej chemikálie alebo rozpusteného organického uhlíka (DOC). Opis takéhoto testu je uvedený v tejto testovacej metóde. 
Na rozdiel od predchádzajúcej verzie tejto kapitoly, v ktorej bol opísaný iba 
jeden druh zariadenia na čistenie syntetických médií cez spojenie s využitím
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
pomerne hrubej metódy odstra ňovania kalu, tento text ponúka viacero 
možností. Sú tu opísané alternatívne druhy zariadení, prevádzkové režimy 
a spôsoby odstra ňovania odpadovej vody a kalu. Tento text je v súlade 
s normou ISO 11733 (12), ktorá bola po čas prípravy predmetom dôkladnej 
kontroly, aj ke ď nebola podrobená kruhovému testu. 
5. Na iné ú čely je nevyhnutné pozna ť koncentráciu testovanej chemikálie vo 
výtoku s vä čšou presnos ťou, a je teda potrebná rozsiahlejšia metóda. 
Napríklad rýchlos ť odstraňovania kalu sa musí presnejšie kontrolova ť 
počas každého d ňa a počas trvania testu a čistiarne musia fungova ť pri 
niekoľkých rýchlostiach odstra ňovania. V rámci plne komplexnej metódy 
by testy takisto mali prebieha ť pri dvoch alebo troch rôznych teplotách: 
takúto metódu opisuje Birch (13) (14) a je zhrnutá v dodatku 6. Sú časné 
znalosti však neposta čujú na rozhodnutie o tom, ktoré kinetické modely sú 
použiteľné na biodegradáciu chemikálií pri čistení odpadových vôd a vo 
vodnom prostredí všeobecne. Použitie Monodovej kinetiky, uvedené v dodatku 6 ako príklad, je obmedzené na chemikálie prítomné v koncentrácii 1 mg/l a viac, ale pod ľa niektorých názorov aj to ešte 
treba podloži ť dôkazmi. Testy pri koncentráciách, ktoré reálnejšie odrážajú 
hodnoty namerané v odpadových vodách, sa uvádzajú v dodatku 7, ale tieto testy spolu s testami v dodatku 6 sú zahrnuté do dodatkov a nie sú publi ­
kované ako samostatné testovacie metódy.
 
Filtre  
6. Modelom perkola čných filtrov bola venovaná ove ľa menšia pozornos ť 
možno preto, lebo sú ťažšie ovládate ľné a menej kompaktné ako modely 
jednotiek s technológiou aktivovaného kalu. Gerike a kol. vyvinul jednotky s technológiou prekvapkávacích filtrov a prevádzkoval ich s využitím 
spojenia (15). Tieto filtre boli pomerne ve ľké (výška 2 m, objem 60 l) 
a každý vyžadoval 2 l/h odpadovej vody. Baumann a kol. (16) simuloval prekvapkávacie filtre tak, že vložil polyesterové vlnené pásy do trubíc dlhých 1 m (vnútorný priemer 14 mm) po tom, ako boli pásy na 30 
minút ponorené do koncentrovaného aktivovaného kalu. Testovaná chemi ­
kália ako jediný zdroj C v roztoku minerálnych solí bola napustená verti ­
kálnou trubicou a biodegradácia sa vyhodnotila na základe meraní DOC vo výtoku a CO
 2 vo vychádzajúcom plyne. 
7. Biofiltre boli simulované inak (15). Vnútorné povrchy rotujúcich trubíc, 
ktoré boli pod malým uhlom naklonené k horizontálnym, boli napustené odpadovou vodou (približne 250 ml/h) s testovanou chemikáliou a bez 
nej, pričom v odobraných výtokoch sa analyzovala prítomnos ť DOC a/alebo 
konkrétnej testovanej chemikálie.
 
PRINCÍP TESTU 
8. Táto metóda bola vypracovaná s cie ľom stanovi ť elimináciu a primárnu 
a/alebo úplnú biodegradáciu organických chemikálií rozpustných vo vode 
pomocou aeróbnych mikroorganizmov v testovacom systéme s nepretržitou 
prevádzkou, ktorý simuluje proces aktivovaného kalu. Ľahko biodegradova ­
teľné organické médium a organická testovaná chemikália sú pre mikroor ­
ganizmy zdrojom uhlíka a energie. 
9. Dve testovacie jednotky s nepretržitou prevádzkou ( čistiarne s technológiou 
aktivovaného kalu alebo pórovité nádoby) sú v prevádzke súbežne za rovna ­
kých podmienok, ktoré sa vyberú tak, aby vyhovovali ú čelu testu. Prie ­
merný hydraulický reten čný čas je zvy čajne 6 h a priemerný vek kalu 
(retenčný čas kalu) je šes ť až desať dní. Kal sa odstra ňuje jednou alebo 
dvoma metódami, testovaná chemikália sa zvy čajne pridá v koncentrácii 
medzi 10 mg/l rozpusteného organického uhlíka (DOC) a 20 mg/l DOC do prítoku (organické médium) iba jednej z jednotiek. Druhá jednotka sa 
použije ako kontrolná jednotka s cie ľom stanovi ť biodegradáciu organického 
média.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. V často odoberaných vzorkách výtokov sa špecifickou analýzou pod ľa 
možnosti ur čí DOC alebo chemická spotreba kyslíka (COD) spolu 
s koncentráciou testovanej chemikálie (ak sa požaduje) vo výtoku z jednotky, do ktorej sa pridáva testovaná chemikália. Predpokladá sa, že rozdiel medzi koncentráciami DOC alebo COD vo výtoku medzi testova ­
cími a kontrolnými jednotkami vzniká v dôsledku testovanej chemikálie 
alebo jej organických metabolitov. Tento rozdiel sa porovná s koncentráciou DOC alebo COD v prítoku v dôsledku pridanej testovanej chemikálie s cie ľom určiť elimináciu testovanej chemikálie. 
11. Biodegradáciu je možné zvy čajne odlíši ť od bioadsorpcie tak, že sa 
dôkladne preskúma krivka závislosti eliminácie chemikálie od času, 
a zvyčajne ju možno potvrdi ť pomocou testu ľahkej biodegradovate ľnosti 
s použitím aklimatizovaného inokula z jednotky, do ktorej sa pridáva testo ­
vaná chemikália.
 
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 
12. Je potrebné pozna ť čistotu, rozpustnos ť vo vode, prchavos ť a adsorp čné 
vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné správne interpretova ť 
výsledky. Prchavé a nerozpustné chemikálie sa zvy čajne nemôžu testova ť, 
pokiaľ sa neprijmú zvláštne opatrenia (pozri dodatok 5). Je nutné pozna ť aj 
chemickú štruktúru alebo aspo ň empirický vzorec, aby bolo možné vypo ­ 
čítať teoretické hodnoty a/alebo skontrolova ť namerané hodnoty parametrov, 
napr. teoretická spotreba kyslíka (ThOD), rozpustený organický uhlík (DOC) a chemická spotreba kyslíka (COD). 
13. Informácie týkajúce sa toxicity testovanej chemikálie pre mikroorganizmy 
(pozri dodatok 4) môžu by ť užitočné pri výbere vhodných testovaných 
koncentrácií a môžu by ť nevyhnutné pre správnu interpretáciu nízkych 
hodnôt biodegradácie.
 
ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI 
14. Pri pôvodnom použití tohto simula čného (potvrdzujúceho) testu primárnej 
biodegradácie povrchovo aktívnych činidiel sa požaduje odstránenie viac 
ako 80 % špecifickej chemikálie pred tým, ako sa povrchovo aktívne činidlo 
môže uvies ť na trh. Ak sa nedosiahne hodnota 80 %, môže sa použi ť tento 
simulačný (potvrdzujúci) test a povrchovo aktívne činidlo možno uvies ť na 
trh, iba ak sa odstráni viac ako 90 % špecifickej chemikálie. Pri chemiká ­
liách vo všeobecnosti nevzniká otázka úspešného/neúspešného hodnotenia v teste a získaná hodnota percentuálnej eliminácie sa môže použi ť 
v približných výpo čtoch pravdepodobnej koncentrácie v životnom prostredí, 
ktoré sa použijú v hodnotení rizika predstavovaného chemikáliami. Výsledky sa zvy čajne riadia schémou „všetko alebo ni č“. V mnohých 
štúdiách čistých chemikálií sa zistilo, že percentuálna eliminácia DOC je 
> 90 % v prípade viac ako troch štvrtín chemikálií a > 80 % pri vyše 90 % 
chemikálií, ktoré vykazovali významný stupe ň biodegradovate ľnosti. 
15. V odpadových vodách je prítomných pomerne málo chemikálií (napr. 
povrchovo aktívnych činidiel) v koncentráciách (približne 10 mg C/l) použi ­
tých v tomto teste. Niektoré chemikálie môžu ma ť pri týchto koncentráciách 
inhibičný účinok, zatia ľ čo kinetika eliminácie iných chemikálií sa pri 
nízkych koncentráciách môže líši ť. Presnejšie hodnotenie degradácie 
možno uskuto čniť prostredníctvom upravených metód s využitím realisticky 
nízkych koncentrácií testovanej chemikálie a zozbierané údaje možno použi ť 
na výpočet kinetických konštánt. Potrebné experimentálne postupy však ešte 
nie sú celkom overené a nie sú stanovené ani kinetické modely, ktoré 
opisujú biodegrada čné reakcie (pozri dodatok 7).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
16. S cie ľom zabezpe čiť správne vykonanie experimentálneho postupu je 
užitočné súbežne so skúmaním testovaných chemikálií príležitostne testova ť 
aj chemikálie, ktorých správanie je známe. Medzi také chemikálie patrí 
kyselina adipová, 2-fenylfenol, 1-naftol, kyselina 2,2-bifenyldikarboxylová, 
kyselina 1-naftoová at ď. (9) (10) (11).  
REPRODUKOVATE ĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU 
17. Existuje podstatne menej správ o štúdiách simula čných testov ako správ 
o štúdiách testov ľahkej biodegradovate ľnosti. Reprodukovate ľnosť medzi 
(súbežnými) opakovaniami testu je dobrá (v rozsahu 10 – 15 %) v prípade 
testovaných chemikálií rozložených na 80 % alebo viac, ale v prípade horšie rozložiteľných chemikálií je variabilita vä čšia. Pri niektorých hrani čných 
chemikáliách boli takisto pri rôznych príležitostiach po čas deviatich týžd ňov 
povolených v teste zaznamenané ve ľmi rôznorodé výsledky (napr. 10 %, 
90 %). 
18. Medzi výsledkami získanými pomocou dvoch druhov zariadení boli zistené 
malé rozdiely, ale niektoré chemikálie sa rozložili vo vä čšej miere 
a konzistentnejšie v prítomnosti domácich splaškových vôd ako v syntetických médiách OECD.
 
OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
Zariadenie  
Testovací systém  
19. Testovací systém pre jednu testovanú chemikáliu pozostáva z testovacej 
jednotky a z kontrolnej jednotky. Ak sa však vykonávajú iba špecifické 
analýzy (primárna biodegradácia), vyžaduje sa len testovacia jednotka. 
Jedna kontrolná jednotka sa môže použi ť pre viaceré testovacie jednotky, 
do ktorých sa pridávajú rovnaké alebo rôzne testované chemikálie. V prípade spájania (dodatok 3) musí ma ť každá testovacia jednotka svoju 
vlastnú kontrolnú jednotku. Testovacím systémom môže by ť buď model 
čistiarne s technológiou aktivovaného kalu, jednotka Husmann (dodatok 1, 
obrázok 1), alebo pórovitá nádoba (dodatok 1, obrázok 2). V oboch prípa ­
doch sú potrebné dostato čne veľké zásobné nádoby pre prítoky a výtoky, 
ako aj pumpy na dávkovanie prítoku bu ď zmiešaného s roztokom testovanej 
chemikálie, alebo dodaného samostatne. 
20. Každá jednotka čistiarne s technológiou aktivovaného kalu sa skladá 
z prevzduš ňovacej nádoby so známou kapacitou približne tri litre aktivova ­
ného kalu a separátora (sekundárny čerič), ktorý pojme približne 1,5 litra. 
Objemy možno do ur čitej miery meni ť nastavením výšky separátora. 
Nádoby rôznych ve ľkostí sú prípustné, ak sa prevádzkujú pri porovnate ľ­
ných hydraulických zá ťažiach. Ak nie je možné udrža ť teplotu v testovacej 
miestnosti v želanom rozsahu, odporú ča sa použi ť nádoby s vodným 
plášťom s kontrolou teploty vody. Na nepretržitú alebo v pravidelných 
intervaloch prerušovanú recykláciu aktivovaného kalu zo separátora do 
prevzdušňovacej nádoby sa používa vzduchové alebo dávkovacie čerpadlo. 
21. Systém pórovitej nádoby sa skladá z vnútorného pórovitého valca 
s kónickým dnom umiestneného v o nie čo väčšej nádobe rovnakého tvaru, 
ktorá je však vyrobená z nepriepustného plastového materiálu. Vhodným 
materiálom pre pórovitú nádobu je pórovitý polyetylén s maximálnou veľkosťou pórov 90 μm a s hrúbkou 2 mm. Separácia kalu z ošetreného 
organického média sa uskuto čňuje diferenciálnym prechodom cez pórovitú 
stenu. Výtok sa zhromaž ďuje v prstencovom priestore, odkia ľ preteká do 
zbernej nádoby. Nedochádza k usadzovaniu, a teda ani k obnove kalu. Celý
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
systém môže by ť upevnený vo vodnou kúpeli s termostatickou kontrolou. 
Pórovité nádoby sa môžu upcha ť a preteka ť do počiatočných fáz. V takom 
prípade je potrebné vymeni ť pórovitú vložku za čistú tak, že sa od čerpá kal 
z nádoby do čistého vedra a odstráni sa upchatá vložka. Po o čistení neprie ­
pustného vonkajšieho valca sa vloží čistá vložka a kal sa vráti spä ť do 
nádoby. Všetok kal, ktorý sa zachytil po stranách upchatej vložky, sa takisto 
dôkladne zotrie a prenesie. Upchaté nádoby sa najskôr vy čistia jemným 
prúdom vody, ktorým sa odstráni zostávajúci kal, a namo čia do zriedeného 
roztoku chlórnanu sodného, potom do vody a následne sa dôkladne 
opláchnu vodou. 
22. Na prevzduš ňovanie kalu v prevzduš ňovacích nádobách obidvoch systémov 
sú nevyhnutné vhodné metódy, napríklad sintrované frity (difúzne kamene) 
a stlačený vzduch. V prípade potreby sa musí vzduch čistiť cez vhodný filter 
a premýva ť. Do systému sa musí vhá ňať dostatok vzduchu s cie ľom 
zachovať aeróbne podmienky a udrža ť vločky kalu v suspenznom stave 
počas celého trvania testu.  
Filtračné zariadenie alebo odstredivka  
23. Prístroj na filtráciu vzoriek s membránovými filtrami vhodnej pórovitosti 
(nominálny priemer otvoru 0,45 μm), ktoré adsorbujú rozpustné organické 
chemikálie a uvo ľňujú organický uhlík v minimálnej miere. Ak sa použijú 
filtre, ktoré uvo ľňujú organický uhlík, je potrebné dôkladne umy ť filtre 
horúcou vodou, aby sa odstránil vylúhovate ľný organický uhlík. Prípadne 
sa môže použi ť odstredivka schopná dosiahnu ť 40 000 m/s  2 . 
Analytické zariadenie  
24. Prístroj schopný ur čiť: 
— DOC (rozpustený organický uhlík) a TOC (celkový organický uhlík) 
alebo COD (chemická spotreba kyslíka), 
— špecifickú chemikáliu v prípade potreby, — suspendované tuhé látky, pH, koncentráciu kyslíka vo vode, 
— teplotu, kyslos ť a zásaditos ť, 
— amónium, dusitan a dusi čnan, ak sa test vykonáva v nitrifika čných 
podmienkach.
 
Voda  
25. Voda z vodovodu s obsahom DOC nižším ako 3 mg/l. Ur čí sa zásaditos ť, 
ak ešte nie je známa. 
26. Deionizovaná voda s obsahom DOC nižším ako 2 mg/l.  
Organické médium  
27. Ako organické médium sú prípustné syntetické médiá, domáce splaškové 
vody alebo zmes obidvoch. Ukázalo sa (11) (14), že pri použití samotných domácich splaškových vôd často dochádza k zvýšenej percentuálnej elimi ­
nácii DOC a dokonca je možná eliminácia a biodegradácia niektorých 
chemikálií, ktoré nepodliehajú biodegradácii pri použití syntetických médií 
OECD. Nepretržitým alebo prerušovaným pridávaním domácich splaško ­
vých vôd sa takisto často stabilizuje aktivovaný kal vrátane rozhodujúcej 
schopnosti dobrého usadzovania sa. Preto sa odporú ča používa ť domáce 
splaškové vody. Meria sa koncentrácia DOC alebo COD v každej novej 
dávke organického média. Je potrebné pozna ť kyslosť alebo zásaditos ť 
organického média. Organické médium môže vyžadova ť pridanie vhodného 
tlmivého roztoku (hydrogénuhli čitan sodný alebo dihydrogénfosfore čnan 
draselný), ak má nízku kyslos ť alebo zásaditos ť, aby po čas testu 
v prevzduš ňovacej nádobe ostalo zachované pH s hodnotou približne 7,5 
± 0,5. O množstve a čase pridania tlmivého roztoku sa rozhoduje individu ­
álne pre každý prípad. Ak sa používajú zmesi, či už nepretržite alebo 
prerušovane, DOC (alebo COD) v zmesi sa musí udržiava ť na približne 
stálych hodnotách, napríklad riedením vodou.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Syntetické médiá  
28. V každom litri vody z vodovodu sa rozpustí: 160 mg peptónu, 110 mg 
mäsového extraktu, 30 mg mo čoviny, 28 mg bezvodého hydrogénfosfore č­
nanu draselného (K  2 HPO  4 ), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg dihydrátu 
chloridu vápenatého (CaCl  2 .2H  2 O), 2 mg heptahydrátu síranu hore čnatého 
(Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Toto syntetické médium OECD je uvedené ako príklad 
a zabezpe čuje strednú koncentráciu DOC v prítoku v hodnote približne 
100 mg/l. Môžu sa prípadne použi ť iné zloženia s približne rovnakou 
koncentráciou DOC, ktoré sa viac približujú skuto čným splaškovým vodám. 
Ak je potrebný prítok s nižšou koncentráciou, zriedia sa syntetické médiá napríklad v pomere 1: 1 s vodou z vodovodu, aby sa získala koncentrácia 
približne 50 mg/l. Takýto slabší prítok umožní lepší rast nitrifika čných 
organizmov, pri čom táto modifikácia by sa mala použi ť v prípade skúmania 
simulácie nitrifika čných čistiarní odpadových vôd. Tieto syntetické médiá sa 
môžu pripravi ť v destilovanej vode v koncentrovanej forme a do jedného 
týždňa skladova ť pri teplote približne 1 °C. V prípade potreby sa zriedia 
vodou z vodovodu. (Toto médium nie je vyhovujúce, napr. koncentrácia dusíka je ve ľmi vysoká, pomerne nízky obsah uhlíka, ale nebolo navrhnuté 
nič lepšie okrem pridania ďalšieho fosfátu ako tlmivého roztoku a ďalšieho 
peptónu).
 
Domáce splaškové vody  
29. Použijú sa čerstvo usadené splaškové vody zbierané denne z čistiarní odpa ­
dových vôd, do ktorých sa dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Mali 
by sa odobra ť pred primárnou sedimentáciou z prietokového kanála nádrže 
primárnej sedimentácie alebo z prívodu do čistiarne s technológiou aktivo ­
vaného kalu a mali by by ť zbavené hrubých častíc. Splaškové vody sa môžu 
použiť po nieko ľkodňovom uskladnení (ktoré by však vo všeobecnosti 
nemalo presiahnu ť sedem dní) pri teplote približne 4 °C, ak sa preukáže, 
že DOC (alebo COD) sa výrazne neznížil (t. j. o menej ako 20 %). Na obmedzenie porúch systému je potrebné pred použitím upravi ť DOC (alebo 
COD) každej novej dávky na vhodnú stálu hodnotu, napr. zriedením vodou 
z vodovodu.
 
Aktivovaný kal  
30. Odoberie sa aktivovaný kal na inokuláciu z prevzduš ňovacej nádrže správne 
prevádzkovanej čistiarne odpadových vôd alebo z laboratórnej jednotky 
s technológiou aktivovaného kalu spracúvajúcej prevažne domáce splaškové 
vody.  
Zásobné roztoky testovanej chemikálie  
31. V prípade chemikálií s dostato čnou rozpustnos ťou sa pripravia zásobné 
roztoky s vhodnými koncentráciami (napr. 1 – 5 g/l) v deionizovanej 
vode alebo v minerálnej časti syntetických médií (pre nerozpustné 
a prchavé chemikálie pozri dodatok 5). Ur čí sa DOC a celkový organický 
uhlík (TOC) zásobného roztoku a merania sa opakujú pri každej novej 
dávke. Ak je rozdiel medzi DOC a TOC vä čší ako 20 %, je potrebné 
skontrolova ť rozpustnos ť testovanej chemikálie vo vode. Porovná sa DOC 
alebo koncentrácia testovanej chemikálie nameraná špecifickou analýzou zásobného roztoku a nominálna hodnota, aby sa zistilo, či je výťažnosť 
dostatočná (zvyčajne možno o čakávať > 90 %). Je potrebné sa uisti ť, 
najmä pri disperziách, či sa DOC môže alebo nemôže použi ť ako analytický 
parameter alebo či sa môže použi ť iba analytická metóda špecifická pre 
testovanú chemikáliu. Pri disperziách sa vyžaduje odstredenie vzoriek. Pri 
každej novej dávke sa odmeria DOC, COD alebo testovaná chemikália 
pomocou špecifickej analýzy.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Určí sa pH zásobného roztoku. Z krajných hodnôt vyplýva, že pridanie 
chemikálie môže vplýva ť na pH aktivovaného kalu v testovacom systéme. 
V takom prípade je potrebné neutralizova ť zásobný roztok na získanie pH 7 
± 0,5 pomocou malých množstiev anorganickej kyseliny alebo zásady, ale treba zabráni ť zrážaniu testovanej chemikálie.
 
POSTUP 
33. Opísaný postup je ur čený pre čistiarne s technológiou aktivovaného kalu. 
Pre systém pórovitej nádoby je potrebné ho mierne prispôsobi ť. 
Príprava inokula  
34. Na za čiatku testu sa testovací systém inokuluje bu ď s aktivovaným kalom, 
alebo inokulom obsahujúcim nízku koncentráciu mikroorganizmov. 
Inokulum je potrebné udržiava ť prevzdušnené pri izbovej teplote až do 
jeho použitia a použi ť ho do 24 hodín. V prvom prípade sa zoberie vzorka 
aktivovaného kalu z prevzduš ňovacej nádrže ú činne prevádzkovanej biolo ­
gickej čistiarne odpadových vôd alebo z laboratórnej čistiarne, do ktorej sa 
dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Ak sa simulujú nitrifika čné 
podmienky, kal sa odoberie z nitrifika čnej čistiarne odpadových vôd. Ur čí 
sa koncentrácia suspendovaných tuhých látok a v prípade potreby sa kal 
koncentruje usadením tak, aby bol objem pridaný do testovacieho systému 
čo najmenší. Je nutné zabezpe čiť, aby bola po čiatočná koncentrácia suchej 
hmoty približne 2,5 g/l. 
35. V druhom prípade sa ako inokulum použije 2 – 10 ml/l výtoku z biologickej 
čistiarne domácich odpadových vôd. Na získanie čo najväčšieho po čtu 
rôznych druhov baktérií môže by ť užitočné pridať inokulá z viacerých 
iných zdrojov, napríklad z povrchovej vody. V takom prípade v testovacom systéme vznikne a pribudne aktivovaný kal.
 
Dávkovanie organického média  
36. Zabezpe čí sa, aby boli prítokové a výtokové nádoby a potrubia 
z prítokových nádob a do výtokových nádob dôkladne o čistené, aby sa 
eliminovalo množenie mikróbov na za čiatku a po čas trvania testu. Testo ­
vacie systémy sa sústredia v miestnosti s kontrolovanou teplotou (zvy čajne 
v rozsahu 20 – 25 °C) alebo sa použijú testovacie jednotky s vodným plášťom. Pripraví sa dostato čný objem požadovaného organického média 
(odseky 27– 29). Najskôr sa prevzduš ňovacia nádoba a separátor naplnia 
organickým médiom a pridá sa inokulum (odseky 34, 35). Za čne sa 
s prevzduš ňovaním tak, aby sa kal udržiaval v suspenzii a v aeróbnom 
stave, a následne sa za čne s dávkovaním prítoku a recykláciou usadeného 
kalu. Organické médium sa dávkuje zo skladovacích nádob do prevzduš ňo­
vacích nádob (odseky 20, 21) testovacích a kontrolných jednotiek, pri čom 
príslušné výtoky sa odoberú do podobných skladovacích nádob. S cie ľom 
dosiahnuť bežný hydraulický reten čný čas 6 h sa organické médium pre čer­
páva rýchlos ťou 0,5 l/h. Na ú čely potvrdenia tejto rýchlosti sa denné množ ­
stvo dávkovaného organického média odmeria tak, že sa zaznamená zníženie objemov média v skladovacích nádobách. Na zistenie ú činkov 
prerušovaného vypúš ťania a „šokového“ pridávania chemikálií by boli 
potrebné iné spôsoby dávkovania. 
37. Ak sa organické médium pripravuje na použitie na obdobie dlhšie ako jeden 
deň, je potrebné chladenie pri teplote približne 4 °C alebo iné vhodné 
metódy konzervácie, aby sa predišlo množeniu mikróbov a biodegradácii 
mimo testovacích jednotiek (odsek 29). Ak sa použijú syntetické médiá, 
môže sa pripravi ť a pri teplote približne 4 °C uskladni ť koncentrovaný 
zásobný roztok (napr. desa ťnásobok bežnej koncentrácie, odsek 28). Tento 
zásobný roztok možno pred použitím dôkladne zmieša ť s primeraným 
množstvom vody z vodovodu, prípadne ho možno pre čerpávať priamo, 
kým sa zvláš ť prečerpáva primerané množstvo vody z vodovodu.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dávkovanie testovanej chemikálie  
38. Primerané množstvo zásobného roztoku testovanej chemikálie (odsek 31) sa 
pridá do skladovacej nádoby prítoku alebo sa samostatnou pumpou dávkuje priamo do prevzduš ňovacej nádoby. Bežná priemerná testovacia koncen ­
trácia v prítoku by mala by ť medzi 10 mg/l a 20 mg/l DOC s hornou 
koncentráciou nie vyššou ako 50 mg/l. Ak je testovaná chemikália slabo rozpustná vo vode alebo ak sú pravdepodobné toxické ú činky, je potrebné 
znížiť koncentráciu na 5 mg/l DOC alebo aj menej, ale len v prípade, že je 
k dispozícii a vykoná sa vhodná špecifická analytická metóda (rozptýlené 
testované chemikálie, ktoré sú slabo rozpustné vo vode, sa môžu prida ť 
s využitím špeciálnych dávkovacích metód, pozri dodatok 5). 
39. Testovaná chemikália sa za čne pridáva ť po uplynutí intervalu, v ktorom sa 
systém stabilizoval a ú činne odstra ňuje DOC organického média (približne 
80 %). Pred pridaním testovanej chemikálie je dôležité skontrolova ť, či 
všetky jednotky pracujú rovnako ú činne. Ak to tak nie je, zvy čajne pomáha 
zmiešať jednotlivé kaly a do jednotlivých jednotiek znovu rozdeli ť rovnaké 
objemy. Ak sa použije inokulum (približne) 2,5 g/l (suchá hmotnos ť) akti­
vovaného kalu, testovaná chemikália sa môže pridáva ť od začiatku testu, 
lebo priame pridávanie zvyšujúcich sa množstiev od za čiatku má tú výhodu, 
že aktivovaný kal môže by ť schopný lepšie sa prispôsobi ť testovanej chemi ­
kálii. Pri ktoromko ľvek spôsobe pridávania testovanej chemikálie sa odpo ­
rúča v pravidelných intervaloch mera ť príslušnú rýchlos ť prietoku a/alebo 
objemy v skladovacej nádobe (nádobách).
 
Manipulácia s aktivovaným kalom  
40. Koncentrácia tuhých látok v aktivovanom kale sa zvy čajne v priebehu testu 
nezávisle od použitého inokula stabilizuje medzi limitmi v rozsahu 1 – 3 g/l 
(suchá hmotnos ť) v závislosti od kvality a koncentrácie organického média, 
prevádzkových podmienok, charakteru prítomných mikroorganizmov a vplyvu testovanej chemikálie. 
41. Buď sa určia suspendované tuhé látky v prevzduš ňovacej nádobe aspo ň raz 
týždenne a odoberie sa prebyto čný kal s cie ľom udrža ť koncentráciu na 
úrovni 1 – 3 g/l (suchá hmotnos ť), alebo sa pri stálej hodnote kontroluje 
stredný vek kalu, zvy čajne v rozmedzí šes ť až desať dní. Ak sa napríklad 
zvolí reten čný čas kalu v trvaní ôsmich dní, denne je potrebné odstráni ť 1/8 
objemu aktivovaného kalu v prevzduš ňovacej nádobe a zlikvidova ť ho. 
Tento postup sa vykonáva každý de ň alebo pod ľa možnosti prostredníctvom 
automatickej prerušovane prevádzkovanej pumpy. Udržiavaním konštantnej 
koncentrácie suspendovaných tuhých látok alebo jej udržiavaním v rámci úzkych limitov sa nezachováva stály reten čný čas kalu (SRT), ktorý je 
prevádzkovou premennou podmie ňujúcou hodnotu koncentrácie testovanej 
chemikálie vo výtoku. 
42. Počas trvania testu sa aspo ň raz denne odstráni všetok kal, ktorý sa zachy ­
táva na stenách prevzduš ňovacej nádoby a separátora, aby sa resuspendoval. 
Je potrebné pravidelne kontrolova ť a čistiť všetky trubice a potrubia, aby sa 
predišlo rastu biofilmu. Usadený kal zo separátora sa recykluje do prevzduš ­ 
ňovacej nádoby pod ľa možnosti prerušovaným pre čerpávaním. V systéme 
pórovitej nádoby nedochádza k recyklovaniu, ale je nutné zabezpe čiť 
vloženie čistých vnútorných nádob, skôr než objem v nádobe výrazne 
stúpne (odsek 21). 
43. V čistiar
ňach Husmann môže dochádza ť k slabému usadzovaniu a strate 
kalu. To možno napravi ť súbežným použitím jedného alebo viacerých 
krokov uvedených ďalej v testovacích aj kontrolných jednotkách: 
— v pravidelných intervaloch, napr. raz týždenne, sa môže pridáva ť čerstvý 
kal alebo flokula čné činidlo (napríklad 2 ml/na nádobu 50 g/l FeCl  3 ), ale 
je potrebné sa uisti ť, či nedochádza k žiadnej reakcii s FeCl  3 ani ku 
zrážaniu testovanej chemikálie,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— vzduchové čerpadlo sa môže nahradi ť peristaltickým čerpadlom, čím sa 
umožní približne rovnaký recirkula čný prietok kalu ako prítokový prie ­
tok, ktorý je potrebné použi ť, a umožní sa vytvorenie anaeróbnej zóny 
v usadenom kale (geometria vzduchového čerpadla obmedzuje mini ­
málny prietok navráteného kalu na približne 12-násobok prítokového 
prietoku), 
— kal sa môže pre čerpávať zo separátora do prevzduš ňovacej nádoby 
prerušovane (napr. 5 min. každú 2,5 h s cie ľom recyklova ť 1 – 1,5 
l/h, 
— môže sa použi ť netoxické protipeniace činidlo v minimálnej koncen ­
trácii, aby sa predišlo strate v dôsledku penenia (napr. silikónový 
olej), 
— do kalu v separátore sa môže v krátkych šokových dávkach púš ťať 
vzduch (napr. 10 sekúnd každú hodinu), 
— do prevzduš ňovacej nádoby sa môže v intervaloch dávkova ť orga­
nické médium (napr. 3 – 10 min. každú hodinu).  
Odber vzoriek a analýza  
44. V pravidelných intervaloch je potrebné mera ť koncentráciu rozpusteného 
kyslíka, teplotu a hodnotu pH aktivovaného kalu v prevzduš ňovacích nádo ­
bách. Treba zabezpe čiť, aby bol nepretržite k dispozícii dostatok kyslíka (> 
2 mg/l) a aby bola teplota udržiavaná v požadovanom rozmedzí (zvy čajne 
20 – 25 °C). Hodnota pH sa udržiava na úrovni 7,5 ± 0,5 pomocou dávko ­
vania malých množstiev anorganickej zásady alebo kyseliny do prevzduš ­ 
ňovacej nádoby alebo do prítoku alebo pomocou zvyšovania tlmivej kapa ­
city organického média (pozri odsek 27). Pri nitrifikácii dochádza k tvorbe kyseliny, pri čom oxidácia 1 mg N vytvára približne 7 mg CO
 3 – . Frekvencia 
meraní závisí od meraného parametra a od stability systému a môže by ť 
rôzna medzi dennými a týždennými meraniami. 
45. Odmeria sa DOC alebo COD v prítokoch do kontrolných a testovacích 
nádob. Koncentráciu testovanej chemikálie je potrebné odmera ť 
v testovacom prítoku špecifickou analýzou alebo ju odhadnú ť 
z koncentrácie v zásobnom roztoku (odsek 31), použitého objemu a množstva splaškových vôd dávkovaných do testovacej jednotky. Odporú ča 
sa vypočítať koncentráciu testovanej chemikálie, aby sa znížila variabilita 
údajov týkajúcich sa koncentrácie. 
46. Z odobratého výtoku sa zoberú vhodné vzorky (napr. 24-hodinové kompo ­
zity) a filtrujú sa cez membránu s ve ľkosťou pórov 0,45 μm alebo sa 
odstreďujú rýchlos ťou približne 40 000 m/s
 2 asi 15 min. Odstre ďovanie 
by sa malo použi ť, ak je filtrovanie zložité. Ur čí sa DOC alebo COD 
aspoň v dvoch vyhodnoteniach s cie ľom zmera ť konečnú biodegradáciu 
a v prípade potreby primárnu biodegradáciu analýzou špecifickou pre testo ­
vanú chemikáliu. 
47. Použitie COD môže pri nízkych koncentráciách vies ť k vzniku analytických 
problémov, preto sa odporú ča iba pri použití dostato čne vysokej testovacej 
koncentrácie (približne 30 mg/l). Pri silne adsorbujúcich chemikáliách sa 
takisto odporú ča merať množstvo adsorbovanej chemikálie v kale pomocou 
analytickej metódy špecifickej pre testovanú chemikáliu. 
48. Frekvencia odoberania vzoriek závisí od o čakávanej d ĺžky testu. Odporú ­ 
čaná frekvencia je trikrát týždenne. Ke ď sú jednotky v ú činnej prevádzke, 
po zavedení testovanej chemikálie sa umožní ich adaptácia po čas jedného až 
maximálne šiestich týžd ňov, aby dosiahli stabilný stav. Na vyhodnotenie 
výsledku testu je potrebné získa ť aspoň 15 platných hodnôt v rovnovážnej 
fáze (odsek 59), ktorá zvy čajne trvá tri týždne. Test sa môže ukon čiť, ak sa 
dosiahne dostato čný stupeň eliminácie (napr. > 90 %) a ak je k dispozícii 
týchto 15 hodnôt, ktoré predstavujú analýzy vykonávané každý pracovný 
deň počas troch týžd ňov. Po pridaní testovanej chemikálie by test zvy čajne 
nemal trva ť dlhšie ako 12 týžd ňov. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Ak kal nitrifikuje a ak sa skúmajú ú činky testovanej chemikálie na nitrifi ­
káciu, aspo ň raz týždenne sa analyzuje vzorka výtoku z testovacích 
a kontrolných jednotiek s cie ľom zistiť, či neobsahuje amónium a/alebo 
dusitan a dusi čnan. 
50. Všetky analýzy by sa mali vykona ť čo najskôr, najmä stanovenie dusíka. Ak 
sa analýzy musia odloži ť, vzorky sa uskladnia v tme pri teplote približne 
4 °C v plných, pevne uzavretých f ľašiach. Ak musia by ť vzorky uskladnené 
viac ako 48 hodín, zakonzervujú sa hlbokým zmrazením, acidifikáciou 
(napr. 10 ml/l z 400 g/l roztoku kyseliny sírovej) alebo pridaním vhodnej toxickej látky (napr. 20 ml/l z 10 g/l roztoku chloridu ortutnatého). Je potrebné zabezpe čiť, aby metóda konzervácie neovplyvnila výsledky 
analýzy.
 
Spájanie testovacích jednotiek  
51. Ak sa použije spájanie (dodatok 3), denne sa vymení rovnaké množstvo 
aktivovaného kalu (150 ml za 1 500 ml v prípade prevzduš ňovacích nádob 
s obsahom troch litrov tekutiny) medzi prevzduš ňovacími nádobami testo ­
vacej jednotky a jej kontrolnej jednotky. Ak testovaná látka silno adsorbuje na kale, vymení sa iba supernatant zo separátorov. V obidvoch prípadoch sa na výpočet výsledkov testu použije faktor korekcie (odsek 55).
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
52. Vypo číta sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD testovanej chemikálie 
pre každé časované hodnotenie pomocou rovnice: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
kde 
D t = % eliminácie DOC alebo COD v čase t, 
C s = DOC alebo COD v prítoku v dôsledku testovanej chemikálie, 
podľa možnosti odhadnuté zo zásobného roztoku (mg/l), 
E = nameraná hodnota DOC alebo COD v testovacom výtoku v čase 
t (mg/l), 
E o = nameraná hodnota DOC alebo COD v kontrolnom výtoku v čase 
t (mg/l). 
53. Stupe ň eliminácie DOC alebo COD organického média v kontrolnej 
jednotke je informácia užito čná pri hodnotení biodegrada čnej činnosti akti ­
vovaného kalu po čas testu. Vypo číta sa percentuálna eliminácia z rovnice: 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
kde 
D B = % eliminácia DOC alebo COD organického média v kontrolnej 
jednotke v čase t, 
C M = DOC alebo COD organického média v kontrolnom prítoku (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Môže sa zvoli ť aj vypočítanie percentuálnej eliminácie DOC alebo COD 
v dôsledku organického média a testovanej chemikálie v testovacej jednotke 
z rovnice: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
kde 
D T = % eliminácie celkového testovacieho prítoku DOC alebo COD, 
C T = DOC alebo COD celkového testovacieho prítoku alebo vypo čítané 
zo zásobných roztokov (mg/l). 
54. Vypo číta sa eliminácia testovanej chemikálie, ak je meraná špecifickou 
analytickou metódou, pri každom časovom hodnotení z rovnice: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
kde 
D ST = % primárnej eliminácie testovanej chemikálie v čase t, 
S i = nameraná alebo odhadnutá koncentrácia testovanej chemikálie 
v testovacom prítoku (mg/l), 
S e = nameraná koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom výtoku 
v čase t (mg/l). 
55. Ak sa použilo spájanie, zriedenie testovanej chemikálie v prevzduš ňovacej 
nádobe výmenou kalu sa kompenzuje pomocou faktoru korekcie (pozri 
dodatok 3). Ak sa použil stredný hydraulický reten čný čas 6 h a výmena 
polovice objemu aktivovaného kalu v prevzduš ňovacej nádobe, stanovené 
denné hodnoty eliminácie (D  t , odsek 52) sa musia opravi ť, aby sa získal 
skutočný stupeň eliminácie, D  tc , testovanej chemikálie z rovnice: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Vyjadrenie výsledkov testu  
56. Zakreslí sa percentuálna eliminácia D  t (alebo D  tc ) a D  st , ak je k dispozícii, 
v závislosti od času (pozri dodatok 2). Z tvaru krivky eliminácie testovanej 
chemikálie ( per se  alebo ako DOC) možno vyvodi ť niekoľko záverov 
o procese odstra ňovania.  
Adsorpcia  
57. Ak sa od za čiatku testu pozoruje vysoká eliminácia DOC testovanej chemi ­
kálie, testovaná chemikália je pravdepodobne eliminovaná adsorpciou na tuhých látkach aktivovaného kalu. Je možné to dokáza ť určením adsorbo ­
vanej testovanej chemikálie pomocou špecifickej analýzy. Eliminácia DOC 
adsorbovate ľných chemikálií zvy čajne neostáva vysoká po čas celého testu. 
Bežne sa na za čiatku vyskytne vysoký stupe ň eliminácie, ktorý postupne 
klesá na rovnovážnu hodnotu. Ak by však adsorbovate ľná testovaná chemi ­
kália nejakým spôsobom bola schopná spôsobi ť aklimatizáciu populácie 
mikróbov, eliminácia DOC testovanej chemikálie by následne stúpla 
a dosiahla by hornú rovnovážnu hodnotu.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Lag fáza  
58. Podobne ako pri statických skríningových testoch si mnohé testované 
chemikálie vyžadujú pred úplnou biodegradáciou lag fázu. Po čas lag fázy 
prebieha aklimatizácia alebo adaptácia degrada čných baktérií pri takmer 
nulovej eliminácii testovanej chemikálie. Potom nastane po čiatočné 
množenie týchto baktérií. Táto fáza sa kon čí a degrada čná fáza sa za čína, 
keď sa odstráni približne 10 % po čiatočného množstva testovanej chemi ­
kálie (po umožnení adsorpcie, ak k nej dochádza). Lag fáza je často veľmi 
variabilná a slabo reprodukovate ľná. 
Rovnovážna fáza  
59. Rovnovážna fáza krivky eliminácie v nepretržitom teste je vymedzená ako 
fáza, v ktorej nastáva maximálna degradácia. Rovnovážna fáza by mala 
trvať najmenej tri týždne a mala by ma ť približne 15 nameraných platných 
hodnôt.  
Stredný stupe ň eliminácie testovanej chemikálie  
60. Vypo číta sa stredná hodnota z hodnôt eliminácie (D  t ) testovanej chemikálie 
počas rovnovážnej fázy. Hodnota zaokrúhlená na celé číslo (1 %) predsta ­
vuje stupe ň eliminácie testovanej chemikálie. Odporú ča sa aj vypo čítať 
95 % interval spo ľahlivosti strednej hodnoty.  
Eliminácia organického média  
61. Zakreslí sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD organického média 
v kontrolnej jednotke (D  B ) v závislosti od času. Stredný stupe ň eliminácie 
sa označí rovnakým spôsobom ako v prípade testovanej chemikálie 
(odsek 60).  
Indikácia biodegradácie  
62. Ak testovaná chemikália výrazne neadsorbuje na aktivovanom kale a krivka 
eliminácie má typický tvar biodegrada čnej krivky s lag, degrada čnou 
a rovnovážnou fázou (odseky 58, 59), nameraná eliminácia sa môže s istotou pripísa ť biodegradácii. Ak bola po čiatočná eliminácia vysoká, 
simulačný test nemôže rozlišova ť medzi biologickými a abiotickými elimi ­
načnými procesmi. V takých prípadoch a v prípade akýchko ľvek pochyb ­
ností o biodegradácii (napr. ak dochádza k stripovaniu) sa vykoná analýza adsorbovanej testovanej chemikálie alebo ďalšie statické biodegrada čné testy 
založené na parametroch, ktoré jednozna čne indikujú biologické procesy. 
Takými testmi sú metódy absorpcie kyslíka [kapitola C.4 D, E a F tejto 
prílohy (6)] alebo test s meraním tvorby oxidu uhli čitého [kapitola C.4 
C tejto prílohy (6)] alebo ISO metóda uzavretého priestoru nad kvapalinou (18) s použitím predexponovaného inokula zo simula čného testu. Ak sa 
odmerala eliminácia DOC aj eliminácia špecifickej chemikálie, výrazné 
rozdiely (v prípade prvej hodnoty nižšej ako druhej) medzi percentuálnou elimináciou indikujú prítomnos ť organických medziproduktov vo výtokoch, 
ktoré sa môžu rozklada ť ťažšie ako materská chemikália.
 
Platnosť výsledkov testu  
63. Informácie o bežnom biodegrada čnom správaní inokula sa získajú, ak sa 
určí stupeň eliminácie organického média (odsek 53) v kontrolnej jednotke. 
Test možno považova ť za platný, ak po dvoch týžd ňoch stupe ň eliminácie 
DOC alebo COD v kontrolnej jednotke (jednotkách) je > 80 % a nie sú 
pozorované žiadne nezvy čajné javy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Ak sa použila ľahko biodegradovate ľná (referen čná) chemikália, stupe ň 
biodegradácie (D  t , odsek 52) by mal by ť > 90 %. 
65. Ak sa test vykonáva v nitrifika čných podmienkach, stredná koncentrácia vo 
výtokoch by mala by ť < 1 mg/l amoniaku-N a < 2 mg/l dusitanu-N. 
66. Ak neboli splnené tieto kritériá (odseky 63 – 65), je potrebné opakova ť test 
s použitím inokula z iného zdroja, testova ť referenčnú chemikáliu 
a skontrolova ť testovacie postupy.  
Správa o teste  
67. Správa o teste musí obsahova ť: 
Testovaná chemikália:  
— identifika čné údaje, 
— fyzikálny charakter a pokia ľ je to relevantné významné fyzikálno- 
chemické vlastnosti.  
Podmienky testovania:  
— druh testovacieho systému, všetky modifikácie pri testovaní nerozpust ­
ných a prchavých chemikálií, 
— druh organického média, 
— podiel a charakter priemyselných odpadových vôd prítomných 
v splaškových vodách, ak je známy, 
— inokulum: charakter a miesto odberu, koncentrácia a jeho predpríprava, 
— zásobný roztok testovanej chemikálie: obsah DOC a TOC, spôsob 
prípravy v prípade suspendovania, použitá testovacia koncentrácia, odôvodnenie v prípade hodnôt mimo rozsahu 10 – 20 mg/l DOC, 
metóda pridávania, dátum prvého pridania, všetky zmeny, 
— stredný vek kalu a stredný hydraulický reten čný čas, metóda odstra ňo­
vania kalu, metódy na zamedzenie zvä čšovaniu objemu, úbytok kalu 
atď., 
— použité analytické metódy, 
— teplota po čas testu, 
— kvalita zvä čšovania objemu kalu, objemový index kalu (SVI), suspen ­
dované tuhé látky v zmiešanej tekutine (MLSS), 
— všetky odchýlky od štandardných postupov a všetky okolnosti, ktoré 
mohli ovplyvni ť výsledky.  
Výsledky testu:  
— všetky namerané údaje (DOC, COD, špecifické analýzy, pH, teplota, 
koncentrácia kyslíka, suspendované tuhé látky, N chemikálie v prípade potreby, 
— všetky vypo čítané hodnoty D
 t (alebo D  tc ), D  B , D St v tabuľkovej podobe 
a krivky eliminácie, 
— informácie o lag a rovnovážnej fáze, trvanie testu, stupe ň eliminácie 
testovanej chemikálie a organického média v kontrolnej jednotke spolu so štatistickými informáciami a vyjadreniami biodegradovate ľnosti 
a platnosti testu, 
— rozbor výsledkov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITERATÚRA  
1. Swisher, R. D. (1987). Surfactant Biodegradation, druhé vydanie. Marcel 
Dekker Inc. New York, 1085 s 
2. Nemecká vláda (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt. 1 No. 49: 698 – 706. 
3. Painter, H. A., a King, E. F. (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmen ­
ham, UK. 
4. Painter, H. A. a King, E. F. (1978b). The effect of phosphate and tempera ­
ture on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909 – 915. 
5. Eckenfelder, W. W. (19) US EPA. 6. Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie „ ľahkej“ biodegradovate ľnosti. 
7. Kapitola C.12 tejto prílohy, Biodegradácia – upravený test SCAS. 8. Kapitola C.19 tejto prílohy, Odhad adsorp čného koeficientu (K
 OC ) na pôde 
a kale z odpadových vôd pomocou vysokoú činnej kvapalinovej 
chromatografie (HPLC). 
9. Gerike, P., a Fischer, W. K. (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157 – 173. 
10. Gerike, P., a Fischer, W. K. (1981), ako (9), II Additional results and 
conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45 – 55. 
11. Painter, H. A., a Bealing, D. (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113 – 138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen B. N., Muntau H., Angeletti G. 
12. ISO 11733 (1995; revidované 2004). Stanovenie eliminácie 
a biodegradability organických zlú čenín vo vodnom prostredí. Simula čná 
skúška s aktivovaným kalom. 
13. Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII 
Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33 – 48. 
14. Birch, R. R. (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340 – 343. 
15. Gerike, P., Fischer, W. K., a Holtmann, W. (1980). Biodegradability deter ­
minations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753 – 758. 
16. Baumann, U., Kuhn, G., a Benz, M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214 – 220. 
17. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of 
biodegradability. Methods for the examination of waters and associated 
materials. s. 91 – 98 ISBN 011 751661 9. 
18. ISO 14593 (1998) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradabi ­
lity organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvo ľneného 
anorganického uhlíka v uzavretých nádobách (skúška CO
 2 headspace).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Dodatok 1  
Obrázok 1  
Zariadenie používané na hodnotenie biodegradovate ľnosti  
Jednotka Husmann
  
A. Zásobná nádoba 
B. Dávkovacie čerpadlo 
C. Prevzduš ňovacia komora (kapacita 31) 
D. Usadzovacia nádrž E. Vzduchové čerpadlo 
F. Zberná nádoba G. Prevzduš ňovač 
H. Vzduchový prietokomer
 
Obrázok 2  
Zariadenie používané na hodnotenie biodegradovate ľnosti  
Pórovitá nádoba
  
A. Zásobná nádoba 
B. Dávkovacie čerpadlo 
C. Pórovitá prevzduš ňovacia nádoba 
D. Vonkajšia nepriepustná nádoba E. Zberná nádoba 
F. Difúzor G. Vzduchový prietokomer
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Obrázok 3  
Detaily trojlitrovej pórovitej prevzduš ňovacej nádoby
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Dodatok 2  
Príklad krivky eliminácie
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Dodatok 3  
[INFORMATÍVNY]  
SPÁJANIE TESTOVACÍCH JEDNOTIEK 
V úsilí o vyrovnanie populácie mikróbov v kaloch v testovacej jednotke, do 
ktorej sa pridávajú odpadové vody a testované chemikália, a v kontrolnej 
jednotke, do ktorej sa pridávajú iba odpadové vody, bola zavedená každodenná vzájomná výmena kalu (1). Postup sa nazýva spájanie a metóda je známa ako metóda spojených jednotiek. Spájanie sa prvýkrát vykonalo s použitím jednotiek 
Husmann s technológiou aktivovaného kalu, ale vykonáva sa aj s pórovitými 
nádobami (2) (3). Nezistili sa žiadne významné rozdiely vo výsledkoch medzi nespojenými a spojenými jednotkami, či už ide o jednotky Husmann alebo 
pórovité nádoby, preto z vynaloženého času a energie potrebnej na spájanie 
jednotiek nevyplýva žiadna výhoda. 
Výmeny kalu môžu vytvára ť dojem pomerne významnej eliminácie, lebo časť 
testovanej chemikálie sa prenesie a koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích a kontrolných výtokoch sa do vä čšej miery takmer vyrovnajú. 
Preto sa musia použi ť faktory korekcie, ktoré závisia od vymenenej časti 
a stredného hydraulického reten čného času. Ďalšie informácie o výpo čte boli 
uverejnené (1). 
Vypočíta sa korigovaný stupe ň eliminácie DOC alebo COD pomocou všeobec ­
ného vzorca: 
D
 tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
kde 
D tc = korigované % eliminácie DOC alebo COD, 
D t = stanovené % eliminácie DOC alebo COD, 
a = vymenená časť objemu jednotiek s technológiou aktivovaného kalu, 
r = stredný hydraulický reten čný čas (h). 
Ak sa napríklad vymení polovica objemu prevzduš ňovacej nádrže (a = 0,5) 
a stredný hydraulický reten čný čas je 6 h, korek čný vzorec je: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERATÚRA  
1. Fischer, W., Gerike, P., Holtmann, W. (1975). Biodegradability Determina ­
tions via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131 – 1135. 
2. Painter, H. A., Bealing, D. J. (1989). Experience and Data from the OECD 
Activated Sludge Simulation Test. s. 113 – 138. In: Laboratory Tests for 
Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. 
3. Painter, H. A., King, E. F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method 
for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research 
Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Dodatok 4  
HODNOTENIE INHIBÍCIE AKTIVOVANÉHO KALU  
Postup s testovanými chemikáliami  
1. Chemikália (alebo odpadová voda) sa v simula čnom teste nemusí degra ­
dovať alebo odstráni ť a môže ma ť na mikroorganizmy v kale dokonca 
inhibičný účinok. Iné chemikálie sa biodegradujú pri nízkych koncentráciách 
ale pri vyšších koncentráciách sú inhibi čné (horméza). Inhibi čné účinky sa 
môžu zisti ť v skoršej fáze alebo sa môžu ur čiť v teste toxicity s použitím 
inokula podobného alebo rovnakého ako inokulum použité v simula čnom 
teste (1). Takýmito metódami sú inhibícia absorpcie kyslíka [kapitola C.11 tejto prílohy (2) a ISO 8192(3)] alebo inhibícia množenia organizmov v kale [ISO 15522 (4)]. 
2. V simula čnom teste sa inhibícia prejaví tak, že rozdiel v rozpustenom orga ­
nickom uhlíku (DOC) alebo v chemickej spotrebe kyslíka (COD) medzi 
výtokom z testovacej nádoby a výtokom z kontrolnej nádoby bude vä čší 
ako DOC pridaný ako testovaná chemikália. Inak povedané percentuálna eliminácia DOC (a biochemickej spotreby kyslíka BOD, chemickej spotreby kyslíka COD a/alebo NH
 + 4 ) organického média pri čistení sa zníži prítom ­
nosťou testovanej chemikálie. Ak taká situácia nastane, je potrebné test 
opakovať a znižova ť koncentráciu testovanej chemikálie, až kým sa nedo ­
siahne úrove ň, pri ktorej nedochádza k inhibícii, prípadne koncentráciu ďalej 
znižovať, kým nedôjde k biodegradácii testovanej chemikálie. Ak má však 
testovaná chemikália (alebo odpadová voda) na proces nepriaznivé ú činky 
pri všetkých koncentráciách, znamená to, že chemikáliu je možné ťažko, ak 
vôbec, biologicky spracova ť, ale môže by ť vhodné zopakova ť test 
s aktivovaným kalom z iného zdroja a/alebo umožni ť postupnejšiu aklima ­
tizáciu kalu. 
3. Naopak, ak sa testovaná chemikália v simula čnom teste bioeliminuje pri 
prvom pokuse, jej koncentrácia by sa mala zvýši ť, ak je nutné zisti ť, či 
by chemikália mohla ma ť inhibičný účinok. 
4. Pri ur čovaní stup ňov inhibície je potrebné ma ť na pamäti, že populácia 
v aktivovanom kale sa môže meni ť, takže mikroorganizmy si časom 
môžu vybudova ť voči inhibičnej chemikálii toleranciu. 
5. Výpo čet stupňa inhibície: 
Celkové percentuálne eliminácie R  o pre BOD, DOC, COD at ď. pre testo ­
vacie a kontrolné jednotky možno vypo čítať podľa tohto vzorca: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
kde: 
I = koncentrácia BOD, DOC, COD at ď. v prítoku pre testovacie alebo 
kontrolné nádoby (mg/l), 
E = príslušné koncentrácie vo výtoku (mg/l). 
I a E sa musia korigova ť vzhľadom na DOC v dôsledku testovanej chemi ­
kálie v testovacích jednotkách, inak budú výpo čty percentuálnej inhibície 
nesprávne.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Stupeň inhibície spôsobený prítomnos ťou testovanej chemikálie sa môže 
vypočítať podľa vzorca: 
%inhibície ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
kde: 
R c = percentuálna eliminácia v kontrolných nádobách, 
R t = percentuálna eliminácia v testovacích nádobách.  
LITERATÚRA  
1. Reynolds, L. a kol. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2 259. 
2. Kapitola C.11 tejto prílohy, Biodegradácia – respira čno-inhibičný test aktivo ­
vaného kalu. 
3. ISO 8192 (2007) Kvalita vody. Skúška inhibície spotreby kyslíka aktivo ­
vaným kalom na oxidáciu uhlíka a amónnych iónov. 
4. ISO 15522 (1999) Water Quality – Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Dodatok 5  
Testované chemikálie so slabou rozpustnos ťou vo vode – prchavé chemikálie  
Chemikálie so slabou rozpustnos ťou vo vode  
Podľa všetkého bolo publikovaných len málo správ o testoch chemikálií so 
slabou rozpustnos ťou vo vode alebo nerozpustných chemikálií simulujúcich 
čistenie odpadových vôd (1) (2) (3). 
Neexistuje ani jedna metóda disperzie testovanej chemikálie, ktorá by sa mohla 
aplikovať na všetky nerozpustné chemikálie. Dva zo štyroch druhov metód opísa ­
ných v norme ISO 10634 (4) sa zdajú by ť vhodné na pokus o disperziu testo ­
vaných chemikálií pri simula čnom testovaní: je to použitie emulgátorov a/alebo 
ultrazvukovej energie. Je potrebné stanovi ť stabilitu po čas najmenej 24-hodino ­
vých intervalov výslednej disperzie. Vhodne stabilizované disperzie obsiahnuté v nádrži s nepretržitým miešaním (odsek 38) sa potom dávkujú do prevzduš ňo­
vacej nádrže oddelene od domácich splaškových vôd (alebo syntetických médií). 
Ak sú disperzie stabilné, je potrebné preskúma ť, ako možno testovanú chemi ­
káliu určiť v disperznej forme. Je nepravdepodobné, že by bola vhodná hodnota 
DOC, preto je potrebné pre testovanú chemikáliu stanovi ť špecifickú analytickú 
metódu, ktorá by sa mohla použi ť na výtoky, tuhé látky vo výtokoch 
a aktivovaný kal. Osud testovanej chemikálie pri simulácii procesu aktivovaného kalu sa následne ur čí v tekutej a v tuhej fáze. Stanoví sa teda „hmotnostná 
bilancia“ s cie ľom určiť, či sa testovaná chemikália biodegradovala. Tento postup 
by však indikoval iba primárnu biodegradáciu. Je potrebné pokúsi ť sa 
o preukázanie úplnej biodegradácie prostredníctvom respirometrického testu na ľahkú biodegradovate ľnosť [kapitola C.4 tejto prílohy (5) C, F alebo D] 
pomocou kalu exponovaného testovanej chemikálii v simula čnom teste ako 
inokula.
 
Prchavé chemikálie  
Použitie simulácií čistenia odpadových vôd v prípade prchavých chemikálií je 
diskutabilné a problematické. Podobne ako v prípade testovaných chemikálií so 
slabou rozpustnos ťou vo vode bolo zdá sa uverejnených len málo správ opisu ­
júcich simula čné testy s použitím prchavých látok. Bežne používaný druh zaria ­
denia na úplné miešanie sa upraví tak, že sa hermeticky uzavrú prevzduš ňovacie 
a usadzovacie nádrže, pomocou prietokometrov sa meria a kontroluje prúd 
vzduchu a vychádzajúci plyn sa vhá ňa do zachytáva čov s cie ľom zachyti ť 
prchavú organickú látku. V niektorých prípadoch sa používa vákuová pumpa na prečerpávanie vychádzajúceho plynu cez „studený“ zachytáva č alebo čistiaci 
zachytáva č obsahujúci Tenax a silikagél pre plynovochromatografickú analýzu. 
Testovaná chemikália prítomná v zachytáva či sa môže ur čiť analyticky. 
Test sa vykoná v dvoch častiach. Jednotky sa najskôr prevádzkujú bez kalu, ale 
so syntetickou odpadovou vodou a testovanou chemikáliou, ktorá sa pre čerpáva 
do prevzduš ňovacej nádrže. Nieko ľko dní sa odoberajú vzorky prítoku, výtoku 
a vychádzajúceho plynu a analyzujú sa s cie ľom zistiť, či neobsahujú testovanú 
chemikáliu. Zo zozbieraných údajov možno vypo čítať percento (R
 vs ) testovanej 
chemikálie odobratej zo systému stripovaním. 
Následne sa vykoná bežný biologický test (s kalom) za rovnakých prevádzko ­
vých podmienok ako v štúdii stripovania. Vykonajú sa aj merania DOC alebo 
COD s cie ľom preveri ť, či jednotky fungujú ú činne. V prvej časti testu sa 
vykonajú príležitostné analýzy na stanovenie testovanej chemikálie v prítoku, výtoku a vychádzajúcom plyne. Po aklimatizácii sa analýzy robia častejšie. 
Z údajov v stabilnom stave možno opä ť vypočítať percentuálnu elimináciu testo ­
vanej chemikálie z tekutej fázy všetkými postupmi (R
 T ) (fyzické a biologické), 
ako aj podiel (R  V ), ktorý bol zo systému odobratý stripovaním.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Výpočet: 
a) V nebiologickom teste možno percento (R  VP ) testovaného materiálu odobra ­
tého zo systému stripovaním vypo čítať podľa tohto vzorca: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
kde 
R VP = eliminácia testovanej chemikálie vyprchaním (%), 
S VP = testovaná chemikália zachytená v zachytáva či vyjadrená ako ekvi ­
valentná koncentrácia v tekutej fáze (mg/l), 
S IP = koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku (mg/l). 
b) V biologickom teste možno percento (R  V ) testovaného materiálu odobratého 
zo systému stripovaním vypo čítať podľa tohto vzorca: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
kde 
R V = eliminácia testovanej chemikálie vyprchaním v biologickom teste 
(%), 
S V = testovaná chemikália zachytená v zachytáva či v biologickom teste 
vyjadrená ako ekvivalentná koncentrácia v tekutom prítoku (mg/l), 
S I = koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku (mg/l). 
c) V biologickom teste sa percento (R  V ) testovanej chemikálie odstránenej všet ­
kými postupmi vypo číta takto: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
kde 
S E = koncentrácia testovanej chemikálie v (tekutom) výtoku (mg/l). 
d) Percento (R  BA ) odstránené biodegradáciou a adsorpciou teda možno vypo čítať 
podľa tohto vzorca: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Je potrebné vykona ť samostatné testy s cie ľom určiť, či testovaná chemikália 
adsorbuje, a ak áno, možno urobi ť ďalšiu korekciu. 
e) Porovnanie podielu testovanej chemikálie odobratej stripovaním 
z biologického (R  v ) a nebiologického testovacieho (R  vp ) systému indikuje 
celkový ú činok, ktorý má biologické spracovanie na emisiu testovanej chemi ­
kálie do ovzdušia.  
Príklad:  Benzén 
Retenčný čas kalu = 4 dni 
Syntetické médiá, reten čný čas = 8 h 
S IP = S  I = 150 mg/l 
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l 
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Teda 
R VP = 100 %, R  V = 15 % 
R T = 100 % a R  BA = 85 %. 
Usúdilo sa, že benzén neadsorboval na kale.  
LITERATÚRA  
1. Horn, J. A., Moyer, J. E., Hale, J. H. (1970). Biological degradation of 
tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939 
– 854. 
2. Pitter, P., Chudoba, J. (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. 
3. Stover, E. L., Kincannon, D. F. (1983). Biological treatability of specific 
organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. 
Control Fed. 55: 97. 
4. ISO 10634 (1995) Kvalita vody. Pokyny na prípravu a spracovanie organic ­
kých látok málo rozpustných vo vode na následné hodnotenie ich biodegra ­
dability vo vodnom prostredí. 
5. Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie „ ľahkej“ biodegradovate ľnosti.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Dodatok 6  
Účinky reten čného času kalu (SRT) na odbúrate ľnosť chemikálií  
ÚVOD 
1. Metóda opísaná v základnom texte bola vypracovaná s cie ľom uistiť sa, či 
sa testované chemikálie (zvy čajne tie, ktoré sú známe ako inherentné, nie 
však ľahko biodegradovate ľné) môžu biodegradova ť v rámci limitov súvi ­
siacich s čistiarňami odpadových vôd. Výsledky sú vyjadrené ako percento 
eliminácie a percento biodegradácie. Prevádzkové podmienky jednotiek 
s technológiou aktivovaného kalu a výber prítoku umož ňujú pomerne 
rozsiahle variácie koncentrácií testovanej chemikálie vo výtoku. Testy sa vykonávajú iba pri jednej nominálnej koncentrácii tuhých látok v kale alebo pri jednom nominálnom reten čnom čase kalu (SRT), pri čom opísané 
režimy odstra ňovania kalu môžu spôsobi ť, že sa hodnota SRT po čas testu 
bude výrazne meni ť, a to zo d ňa na deň, ako aj po čas dňa. 
2. V tomto variante (1) (2) sa SRT kontroluje v rámci ove ľa užších limitov 
počas každého 24-hodinového intervalu (ako v prípade ve ľkých čistiarní), čo 
má za následok stálejšiu koncentráciu vo výtokoch. Odporú ča sa použi ť 
domáce splaškové vody, lebo umož ňujú dôslednejšiu a vyššiu percentuálnu 
elimináciu. Skúmajú sa aj ú činky viacerých hodnôt SRT a v podrobnejšej 
štúdii možno ur čiť účinky škály teplôt na koncentráciu vo výtoku. 
3. Zatia ľ neexistuje všeobecná zhoda o tom, ktoré kinetické modely prebiehajú, 
keď sa chemikálie biodegradujú v podmienkach čistenia odpadových vôd. 
Pre zozbierané údaje bol vybratý Monodov model bakteriálneho rastu 
a využitia substrátu (1) (2), lebo táto metóda je ur čená iba pre chemikálie 
produkované vo ve ľkých hmotnostiach, ktorých koncentrácia v splaškových 
vodách je vyššia ako 1 mg/l. Platnos ť
 zjednodušeného modelu 
a vyvodených predpokladov sa stanovila pomocou súboru etoxylátov alko ­
holov s rôznymi stup ňami primárnej biodegradovate ľnosti (2) (3).  
Poznámka:  Tento variant metódy sa úzko prid ŕža väčšiny znenia tejto testo ­
vacej metódy C.10-A a ďalej sú uvedené iba tie údaje, ktoré sa 
líšia.  
PRINCÍP TESTU 
4. Jednotky pórovitých nádob s aktivovaným kalom navrhnuté s cie ľom zabez ­
pečiť (takmer) nepretržité odstra ňovanie miešanej tekutiny umož ňujúce 
veľmi presnú kontrolu reten čného času kalu (SRT alebo θ s ) sú prevádzko ­
vané bez spojenia pri nieko ľkých reten čných časoch kalu (SRT) a nepovinne 
pri nieko ľkých teplotách. Reten čný čas je zvy čajne dva až desa ť dní 
a teplota je v rozmedzí 5 a 20 °C. Splaškové vody, najlepšie domáce, 
a roztok testovanej chemikálie sa do jednotiek dávkujú zvláš ť rýchlosťou, 
ktorou sa zabezpe čí požadovaný reten čný čas splaškových vôd (tri až šes ť 
hodín) a požadovaná koncentrácia testovanej chemikálie v prítoku. Na ú čely 
porovnávania súbežne fungujú kontrolné jednotky, do ktorých sa nepridáva 
testovaná chemikália. 
5. Možno použi ť aj iný druh zariadenia, ale je potrebné venova ť pozornos ť 
tomu, aby sa zabezpe čila dobrá kontrola SRT. Napríklad pri použití čistiarní, 
ktoré zah ŕňajú sedimenta čnú nádrž, môže by ť nevyhnutné stanovi ť tole­
ranciu straty tuhých látok cez výtok čistiarne. Takisto je potrebné prija ť 
opatrenia, aby sa predišlo chybám v dôsledku kolísania množstva kalu 
v sedimenta čnej nádrži.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Jednotky sú prevádzkované v každom zvolenom súbore podmienok a po 
dosiahnutí rovnováhy sa získajú priemerné stabilné koncentrácie testovanej 
chemikálie vo výtokoch, prípadne aj DOC za obdobie približne troch týžd ­ 
ňov. Okrem hodnotenia percentuálnej eliminácie testovanej chemikálie, 
prípadne DOC, sa v grafickej podobe vyjadrí aj vz ťah medzi prevádzkovými 
podmienkami čistiarne a koncentráciou vo výtoku. Z tohto vyjadrenia 
možno vypo čítať predbežné kinetické konštanty a predpoveda ť podmienky, 
za ktorých sa testovaná chemikália môže odbúra ť. 
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 
7. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 12 a 13.  
ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI 
8. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 14 a 15.  
REFEREN ČNÁ TESTOVANÁ CHEMIKÁLIA 
9. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa odsek 16  
REPRODUKOVATE ĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU 
10. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 17 a 18.  
OPIS METÓDY  
Zariadenie  
11. Vhodnou jednotkou je modifikovaný systém pórovitej nádoby (dodatok 6.1). 
Pozostáva z vnútornej nádoby (alebo vložky) vyrobenej z pórovitého poly ­
propylénu s hrúbkou 3,2 mm a s ve ľkosťou pórov približne 90 μm, pričom 
spoj je bezšvový. (Ide o mohutnejšiu jednotku v porovnaní s jednotkou, 
ktorá je opísaná v odseku 21 tejto kapitoly C.10 A). Vložka je osadená do nepriepustnej polyetylénovej vonkajšej nádoby, ktorá sa skladá z dvoch častí: kruhová základ ňa s prevŕtanými dierami na umiestnenie dvoch vzdu ­
chovodov a trubice na odstránenie kalu, a vrchný valec, ktorý sa závitom 
pripevní na základ ňu a ktorý má vývod umiestnený tak, aby do pórovitej 
nádoby privádzal známy objem (3 l). Jeden zo vzduchovodov je osadený difúznym kame ňom, druhý má otvorený koniec a je umiestnený v pravom 
uhle ku kame ňu v nádobe. Tento systém vytvára potrebné vírenie zabezpe ­ 
čujúce, že obsah v nádobe sa dôkladne premiešava, a takisto zabezpe čuje 
koncentrácie rozpusteného kyslíka vyššie ako 2 mg/l. 
12. Zachováva sa primeraný po čet jednotiek pri kontrolovaných teplotách 
v rozsahu od 5 do 20 °C (± 1 °C) bu ď vo vodných kúpe ľoch, alebo 
v miestnostiach s konštantnou teplotou. Čerpadlá musia do prevzduš ňova­
cích nádob dávkova ť roztok testovanej chemikálie a usadené splaškové vody 
požadovanými rýchlos ťami (0 – 1,0 ml/min a 0 – 25 ml/min) a tretie 
čerpadlo odstra ňuje odpadový kal z prevzduš ňovacích nádob. Potrebná 
veľmi nízka prietoková rýchlos ť odpadového kalu sa dosiahne nastavením 
čerpadla na vyššiu rýchlos ť, pričom jeho činnosť sa prerušuje pomocou 
časového spína ča, napr. je činný desa ť sekúnd každú minútu pri rýchlosti 
prečerpávania 3 ml/min, čím sa dosiahne rýchlos ť odstraňovania 0,5 ml/min.
 
Filtračné zariadenie alebo odstredivka  
13. Kapitola C10 A, uplat ňuje sa odsek 23.  
Analytické zariadenie  
14. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa odsek 24.  
Voda  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 25 a 26.  
Organické médium  
16. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa odsek 27.  
Syntetické médiá  
17. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa odsek 28.  
Domáce splaškové vody  
18. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa odsek 29.  
Aktivovaný kal  
19. Kapitola C10 A, uplat ňuje sa odsek 30.  
Zásobné roztoky testovanej chemikálie  
20. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 31 a 32.  
POSTUP  
Príprava inokula  
21. Kapitola C.10 A, uplat ňuje sa iba odsek 34 – použije sa aktivovaný kal 
(približne 2,5 g/l).  
Počet testovacích jednotiek  
22. Pri jednoduchom teste, t. j. na meranie percentuálnej eliminácie, sa vyžaduje 
iba jeden SRT, ale na získanie údajov potrebných na výpo čet predbežných 
kinetických konštánt je potrebných štyri alebo pä ť hodnôt SRT. Zvy čajne sa 
vyberú hodnoty medzi dvoma a desiatimi d ňami. Z praktického h ľadiska je 
vhodné vykona ť test pri štyroch alebo piatich reten čných časoch kalu (SRT) 
súčasne pri jednej teplote. V rozšírených štúdiách sa použijú rovnaké 
hodnoty SRT alebo prípadne iný rozsah hodnôt pri iných teplotách v rozsahu 5 – 20 °C. Na primárnu biodegradáciu (základné použitie) je zvyčajne potrebná iba jedna jednotka pre daný súbor podmienok. Na 
úplnú biodegradáciu je však potrebná kontrolná jednotka pre každý súbor 
podmienok, do ktorej sa pridávajú splaškové vody, ale nie testovaná chemi ­
kália. Ak sa predpokladá prítomnos ť testovanej chemikálie v použitých spla ­ 
škových vodách, je potrebné pri hodnotení primárnej biodegradácie 
a aplikovaní potrebných korekcií vo výpo čtoch použi ť kontrolné jednotky.
 
Dávkovanie organického média a testovanej chemikálie  
23. Kapitola C.10 A, platia odseky 36 – 39, ale treba zoh ľadniť skutočnosť, že 
roztok testovanej chemikálie sa dávkuje zvláš ť a že sa použijú rôzne 
rýchlosti odstra ňovania kalu. Takisto treba monitorova ť a v prípade potreby 
upraviť, v rozsahu ± 10 %, prietokové rýchlosti prítokov, výtokov 
a odstraňovania kalu, napr. dvakrát denne. Ak sa v analytických metódach 
objavia problémy pri používaní domácich splaškových vôd, test je potrebné vykonať s použitím syntetických médií, treba sa však uisti ť, že iné médiá 
prinesú porovnate ľné kinetické údaje.
 
Manipulácia s jednotkami s technológiou aktivovaného kalu  
24. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 40 – 43, SRT však treba iba „kon ­ 
štantným“ odstra ňovaním kalu.  
Odber vzoriek a analýza  
25. Kapitola C.10 A, platia odseky 44 – 50, s výnimkou, že je potrebné ur čiť 
koncentráciu testovanej chemikálie a nepovinne DOC, COD by sa nemala 
použiť. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
26. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 52 – 54.  
Vyjadrenie výsledkov testu  
27. Kapitola C.10 A, uplat ňujú sa odseky 56 – 62.  
Výpočet kinetických konštánt  
28. Je reálnejšie uvies ť strednú stabilnú koncentráciu testovanej chemikálie vo 
výtoku a opísa ť, ako sa mení s prevádzkovými podmienkami čistiarne, ako 
uviesť percentuálnu primárnu biodegradáciu. To je možné zvážením rovnice 
(6) v dodatku 6.2, ktorá môže prinies ť hodnoty pre K  S , μ m a θ SC , kritický 
retenčný čas kalu. 
[Približné hodnoty K  S a μm možno prípadne získa ť pomocou jednoduchého 
počítačového programu s cie ľom prispôsobi ť teoretickú krivku vypo čítanú 
z rovnice 2 (dodatok 6.2) získaným experimentálnym hodnotám. Hoci 
žiadny konkrétny roztok nebude jedine čný, možno získa ť primeranú 
približnú hodnotu K  S a μ m .] 
Variabilita výsledkov  
29. Je bežnou praxou, že pre jednotlivé chemikálie sa získavajú premenlivé 
hodnoty kinetických parametrov. Predpokladá sa, že podmienky, v ktorých kal rástol, ako aj podmienky, ktoré prevažujú v použitom teste (podobne ako 
v odseku 5 a v iných testoch), majú ve ľký vplyv na výsledné hodnoty. 
Jednému aspektu tejto variability sa venoval Grady a kol. (4), ktorý navrhol používanie výrazov „existujúci“ a „vnútorný“ pre dve extrémne podmienky predstavujúce ohrani čenie fyziologického stavu, ktorý môže kultúra 
dosiahnuť počas kinetického pokusu. Ak sa stav nesmie po čas testu zmeni ť, 
hodnoty kinetických parametrov odrážajú podmienky v prostredí, z ktorého boli mikroorganizmy odobraté. Tieto hodnoty sa nazývajú „existujúce“ alebo momentálne existujúce. Pri opa čnom extréme, ak podmienky v teste 
dovoľujú úplné vytvorenie systému syntetizujúceho proteíny, ktorý umož ­ 
ňuje maximálnu možnú rýchlos ť rastu, sa získané kinetické parametre nazý ­
vajú „vnútorné“ a závisia iba od charakteru substrátu a od druhov baktérií v kultúre. Pomôckou je, že existujúce hodnoty sa získajú udržiavaním 
nízkeho pomeru koncentrácie substrátu k príslušným mikroorganizmom (S
 o / 
X o ), napr. 0,025, a vnútorné hodnoty sa získajú, ke ď je pomer vysoký, napr. 
najmenej 20. V obidvoch prípadoch by hodnota S  o mala byť rovná alebo 
vyššia ako príslušná hodnota Ks, konštanta polovi čného nasýtenia. 
30. Variabilita a iné aspekty biodegrada čnej kinetiky sa preberali na nedávnom 
seminári SETAC (5). Takéto štúdie, o ktorých sa podali správy a ktoré sú plánované, by mali poskytnú ť jasnejší poh ľad na kinetiku prebiehajúcu 
v čistiarňach odpadových vôd, aby sa umožnila lepšia interpretácia existu ­
júcich údajov a takisto aby sa v budúcnosti navrhovali vhodnejšie testovacie 
metódy.
 
LITERATÚRA:  
1. Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33 – 48. 
2. Birch, R. R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 
61(2): 340 – 343. 
3. Birch, R. R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during 
sewage treatment. J. Chem. Technická Biotechnol., 50: 411 – 422.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
4. Grady, C. P. L., Smets, B. F., a Barbeau, D. S. (1996). Variability in kinetic 
parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742 – 748. 
5. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W. 4. – 6. sept. 1996. SETAC- Európa, Brusel.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Dodatok 6.1  
Pórovitá nádoba s kontrolou SRT
  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Dodatok 6.2  
Výpočet kinetických konštánt  
1. Za predpokladu, že sa použije Monodova kinetika, a s prihliadnutím na 
hmotnostnú rovnováhu aktívnych tuhých látok a substrátu v celom systéme aktivovaného kalu (1), možno získa ť tieto vyjadrenia stabilného stavu:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
alebo  
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
kde 
S 1 = koncentrácia substrátu vo výtoku, (mg/l), 
K S = konštanta polovi čného nasýtenia, koncentrácia, pri ktorej μ = μ m /2 
(mg/l), 
μ = špecifická miera rastu (d  –1 ), 
μ m = maximálna hodnota μ m (d –1 ), 
K d = špecifická rýchlos ť rozpadu aktívnych tuhých látok (d  –1 ), 
θ S = stredný reten čný čas kalu, SRT d). 
Preskúmanie tejto rovnice vedie k týmto záverom: 
i) Koncentrácia vo výtoku je nezávislá od koncentrácie v prítoku (S  0 ), 
a preto sa percentuálna biodegradácia mení spolu s koncentráciou 
v prítoku, S  0 . 
ii) Jediný parameter kontrolovaný v čistiarni, ktorý má vplyv na S  1 , je 
retenčný čas kalu, θ S . 
iii) Pre danú koncentráciu v prítoku, S  0 , bude kritický reten čný čas kalu, 
takže:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
kde 
θ SC = kritický reten čný čas kalu, pod hranicou ktorého budú príslušné 
mikroorganizmy vymyté z čistiarne. 
iv) Keďže ostatné parametre v rovnici (2) sú spojené s kinetikou rastu, 
teplota pravdepodobne ovplyvní úrove ň substrátu vo výtoku a kritický 
vek kalu, t. j. reten čný čas kalu potrebný na dosiahnutie ur čitého stup ňa 
čistenia sa s klesajúcou teplotou zvýši. 
2. Podľa hmotnostnej bilancie tuhých látok v systéme pórovitej nádoby a za 
predpokladu, že koncentrácia tuhých látok vo výtoku čistiarne X  2 je 
v porovnaní s koncentráciou v prevzduš ňovacej nádobe X  1 nízka, reten čný 
čas kalu  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
a 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
kde 
V = objem prevzduš ňovacej nádoby (l), 
X 1 = koncentrácia tuhých látok v prevzduš ňovacej nádobe (mg/l), 
X 2 = koncentrácia tuhých látok vo výtoku (mg/l), 
Q 0 = prietoková rýchlos ť prítoku (l/d), 
Q 1 = prietoková rýchlos ť odpadového kalu (l/d). 
Retenčný čas kalu teda možno kontrolova ť pri akejko ľvek vopred zvolenej 
hodnote prostredníctvom kontroly prietokovej rýchlosti odpadového kalu, 
Q 1 . 
Závery 
3. Hlavným ú čelom testu je teda umožni ť predvídanie koncentrácie vo výtoku, 
a teda aj úrovne testovanej chemikálie vo vode, do ktorej sa chemikália 
pridáva. 
4. Zakreslením S  1 oproti θ S možno niekedy okamžite vyhodnoti ť kritický 
retenčný čas kalu, θ SC , napr. krivka 3 na obrázku 1. Ak to nie je možné, 
θ SC spolu s približnými hodnotami μ m a K  S možno vypo čítať zakreslením 
S 1 oproti S  1 •θ S . 
Podľa úpravy rovnice (1):  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Ak je K  d nízke, potom 1 + θ s • K  d ~ 1 a z rovnice [5] dostaneme:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Nákres by teda mala by ť rovná priamka (pozri obrázok 2) so sklonom 1/ μ m 
a priesečníkom K  S /μ m ; takisto θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Obrázok 1  
Tri teploty, pä ť retenčných časov kalu SRT
  
Obrázok 2  
Regresná krivka SRT · S 1 oproti S  1 , keď T = 5 °C
  
Glosár:  
Koncentrácia vo výtoku: Krivka:
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Dodatok 7  
TEST PRI NÍZKOM ( μg/l) ROZSAHU KONCENTRÁCIE 
1. Mnohé chemikálie sú vo vodnom prostredí, dokonca v odpadových vodách, 
bežne prítomné pri ve ľmi nízkych koncentráciách ( μg/l). Pri takýchto 
koncentráciách pravdepodobne neslúžia ako primárny substrát pre rast, ale oveľa pravdepodobnejšie degradujú ako nerastové, sekundárne substráty 
prítomné sú časne s množstvom prirodzene sa vyskytujúcich uhlíkových 
chemikálií. Degradácie týchto chemikálií preto nezodpovedajú modelu opísanému v dodatku 6. Existuje ve ľa modelov, ktoré by sa mohli použi ť, 
a v podmienkach prevažujúcich v čistiarňach odpadových vôd by mohli 
prebiehať viaceré sú časne. Na objasnenie tohto problému bude potrebný 
ďalší rozsiahlejší výskum. 
2. Dovtedy sa možno riadi ť postupom uvedeným v základnom texte (kapitola 
C.10 A), ale len pre primárnu biodegradovate ľnosť s použitím primerane 
nízkych koncentrácií (< 100 μg/l) a validovaného analytického postupu. 
Percentuálnu biodegradáciu možno vypo čítať (pozri odsek 54 testovacej 
metódy), ak sa zoh ľadnia abiotické procesy (adsorpcia, prchavos ť atď.). 
Príkladom je štúdia, ktorú vypracoval Nyholm a jeho spolupracovníci (1) (2), využívajúca štvorhodinový cyklus v systéme plnenia a od čerpávania. 
Do správy uviedli pseudokonštanty prvého rádu pre pä ť chemikálií prida ­
ných do syntetických médií v koncentrácii 5 – 100 μg/l. (Pre úplnú biode ­
gradovate ľnosť sa môžu použi ť testované chemikálie ozna čené
 14 C. Tento 
opis presahuje rámec tejto testovacej metódy, lebo zatia ľ neexistuje zhoda 
o postupoch, hoci navrhovaná metóda pre ISO 14592 (3) obsahuje usmer ­
nenie k použitiu chemikálií ozna čených  14 C.). 
SCAS test  
3. Neskôr bol navrhnutý jednoduchší dvojfázový test (4) (5) (6), po metóde 
polosúvislého aktivovaného kalu (SCAS) nasledujú krátkodobé kinetické testy na vzorkách odobratých z jednotiek SCAS. SCAS systém funguje so 
známymi rýchlos ťami odstra ňovania kalu (na rozdiel od pôvodnej testovacej 
metódy C.12) a napúš ťa sa modifikovanými syntetickými médiami OECD 
alebo domácimi splaškovými vodami. Syntetické médiá boli modifikované (z dôvodu meniacej sa hodnoty pH a slabej usadzovacej schopnosti kalu) 
pridaním fosfátu ako tlmivého roztoku, kvasnicového extraktu, chloridu 
železitého a stopových prvkov solí a ich COD sa zvýšila približne na 750 mg/l zvýšením koncentrácie peptónu a mäsového extraktu. Jednotky boli prevádzkované v 24-hodinovom cykle: prevzduš ňovanie po čas 23 h, odstra ­ 
ňovanie kalu, usadzovanie, odoberanie supernatantu (výtok), po ktorom 
nasledovalo pridanie syntetických médií a testovanej chemikálie až na úroveň 100 μg/l, (t. j. pri približne rovnakej koncentrácii ako 
v krátkodobom teste). Raz týždenne sa vymenilo 10 % celkového kalu za 
čerstvý kal, aby sa zachovala vyvážená populácia mikróbov. 
4. Koncentrácie testovanej chemikálie sa merajú na za čiatku a na konci 
prevdzušňovania a test pokra čuje, až kým sa nedosiahne konštantná elimi ­
nácia testovanej chemikálie, čo trvá od jedného týžd ňa až nieko ľko 
mesiacov.
 
Krátkodobý test  
5. Krátkodobý test (napr. osem hodín) sa používa na ur čenie (pseudo)konštanty 
kinetickej rýchlosti prvého rádu pre rozklad testovanej chemikálie 
v aktivovanom kale známeho ale rozdielneho pôvodu a histórie. Konkrétne, 
vzorky kalu sa odoberajú zo SCAS reaktorov – na konci prevzduš ňovacieho 
obdobia, ke ď je koncentrácia organického substrátu nízka – v priebehu testu 
aklimatizácie (odseky 3, 4). Kal sa môže na porovnanie odobra ť aj zo 
súbežnej SCAS jednotky, ktorá nebola exponovaná testovanej chemikálii. 
Zmesi kalu a testovanej chemikálie pridané v dvoch alebo viacerých  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
koncentráciách v rozsahu 1 – 50 μg/l sa prevzduš ňujú bez pridávania synte ­
tických médií alebo iného organického substrátu. Testovaná chemikália, 
ktorá ostala v roztoku, sa ur čuje v pravidelných intervaloch, napr. každú 
hodinu, v závislosti od degradovate ľnosti chemikálie v období nepresahu ­
júcom 24 h Vzorky sa pred príslušnou analýzou odstredia.  
Výpočty 
6. Údaje zo SCAS jednotiek sa použijú na výpo čet percentuálnej eliminácie 
testovanej chemikálie (odsek 54). Takisto konštantu priemernej rýchlosti K  1 , 
(štandardizovanú pre koncentráciu suspendovaných tuhých látok) možno 
vypočítať podľa vzorca: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
kde 
t = čas prevzduš ňovania (23 h), 
C e = koncentrácia na konci prevzduš ňovacieho obdobia ( μg/l), 
C i = koncentrácia na za čiatku prevzduš ňovania (μg/l), 
SS = koncentrácia tuhých látok v aktivovanom kale (g/l). 
7. V krátkodobom teste sa zakreslí log % zostávajúcej koncentrácie v závislosti 
od času, pričom sklon po čiatočnej časti (10 – 50 % degradácia) grafu je 
ekvivalentný s K  1 , (pseudo)konštantou prvého rádu. Konštanta sa štandar ­
dizuje vzh ľadom na koncentráciu tuhých látok v kale prostredníctvom 
rozdelenia sklonu koncentráciou tuhých látok v kale. Výsledok uvedený 
v správe musí zah ŕňať aj údaje o po čiatočných koncentráciách testovanej 
chemikálie a suspendovaných tuhých látok, reten čnom čase kalu, aplikácii 
a zdroji kalu, ako aj údaje o predchádzajúcej expozícii (ak k nej došlo) testovanej chemikálii.
 
Variabilita výsledkov  
8. Variabilita a iné aspekty biodegrada čnej kinetiky sa preberali na nedávnom 
seminári SETAC (7). Takéto štúdie, o ktorých sa podali správy a ktoré sú plánované, by mali poskytnú ť jasnejší poh ľad na kinetiku prebiehajúcu 
v čistiarňach odpadových vôd, aby sa umožnila lepšia interpretácia existu ­
júcich údajov a takisto aby sa v budúcnosti navrhovali vhodnejšie testovacie metódy.
 
LITERATÚRA  
1. Nyholm, N., Jacobsen, B. N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., Dambourg, A., 
a Schultz, B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339 – 353. 
2. Jacobsen, B. N., Nyholm, N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., a Ostfeldt, P. 
(1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505 – 
1510. 
3. ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Kvalita vody – hodnotenie 
aeróbnej biodegradovate ľnosti organických zlú čenín pri nízkych koncentrá ­
ciách vo vode.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
4. Nyholm, N., Ingerslev, F., Berg, U. T., Pedersen, J. P., a Frimer-Larsen, H. 
(1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in 
activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experi ­
ments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851 – 864. 
5. Berg, U. T., a Nyholm, N. (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711 – 735. 
6. Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Ministerstvo životného prostredia a energetiky, Koda ň. 
7. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, S. G. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. a Verstraete, W. 4. – 6. sept. 1996. SETAC- Európa, Brusel.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmy  
ÚVOD 
1. Simula čné testy sa zvy čajne používajú pri chemikáliách, ktoré nevyhoveli 
skríningovému testu ľahkej biodegradovate ľnosti [kapitola C.5 A – F tejto 
prílohy (9)], ale úspešne prešli testom inherentnej biodegradovate ľnosti. 
Výnimočne sa simula čné testy používajú aj v prípade akejko ľvek chemiká ­
lie, o ktorej je potrebné získa ť viac informácií, najmä v prípade ve ľkoto­
nážnych chemikálií, pri čom zvyčajne sa použije test s aktivovaným kalom 
(C.10 A). Za ur čitých okolností sú však potrebné špecifické informácie, 
ktoré vypovedajú o vz ťahu medzí správaním chemikálie a metódami čistenia 
odpadových vôd zah ŕňajúcimi biofilmy, konkrétne perkola čné alebo 
prekvapkávajúce filtre, rota čné biologické reaktory, fluidné lôžka. 
S cieľom vyhovie ť tejto potrebe boli vytvorené rôzne zariadenia. 
2. Gerike a kolektív (1) použili ve ľké pilotné prekvapkávajúce filtre, ktoré 
použili v spojení. Tieto filtre zaberali ve ľa priestoru a vyžadovali si pomerne 
veľké množstvá splaškových vôd alebo syntetických médií. Truesdale 
a kolektív (2) opísali menšie filtre (priemer 183 cm × 152 mm), do ktorých sa napúšťali prírodné splaškové vody bez povrchovo aktívnych činidiel, ale 
stále boli potrebné pomerne ve ľké množstvá. Na vytvorenie „zrelého“ 
biofilmu bolo potrebných až 14 týžd ňov, a kým došlo k aklimatizácii po 
prvom zavedení testovaného povrchovo aktívneho činidla, bolo potrebných 
ďalších štyri až osem týžd ňov. 
3. Baumann a kolektív (3) vytvorili ove ľa menší filter, ktorý ako inertné 
médium na podporu biofilmu využíval polyesterovú „vlnu“, ktorá sa predtým namo čila do aktivovaného kalu. Testovaná chemikália sa použila 
ako jediný zdroj uhlíka a biodegradovate ľnosť sa hodnotila z meraní rozpus ­
teného organického uhlíka (DOC) v prítoku a výtoku a z množstva CO
 2 vo 
vychádzajúcom plyne. 
4. Celkom odlišný prístup zaujali Gloyna a kolektív (4), ktorí vynašli rota čný 
tubulárny reaktor. Na vnútornom povrchu rota čnej trubice sa na známej 
povrchovej ploche vytvoril biofilm privádzaním prítoku na horný koniec 
trubice naklonenej k horizontálnej úrovni pod malým uhlom. Reaktor sa 
použil na pozorovanie biodegradovate ľnosti povrchovo aktívnych činidiel 
(5), ako aj na skúmanie optimálnej hrúbky biofilmu a difúzie cez film (6). Títo autori reaktor ďalej vyvíjali a upravovali, aby bol schopný ur čiť 
CO
 2 vo vychádzajúcom plyne. 
5. Rota čný tubulárny reaktor prijal Stály výbor analytikov (Spojené krá ľo­
vstvo) ako štandardnú metódu na hodnotenie biodegradovate ľnosti chemi ­
kálií (7) a odbúrate ľnosti a toxicity odpadových vôd (8). Výhodami opísanej 
metódy sú jednoduchos ť, kompaktnos ť, reprodukovate ľnosť a potreba 
pomerne malých množstiev organického média.  
PRINCÍP TESTU 
6. Na vnútorný povrch pomaly rotujúcej naklonenej trubice sa aplikujú synte ­
tické médiá alebo domáce splaškové vody a testovaná chemikália v prímesi alebo samostatne. Na vnútornom povrchu sa vytvorí vrstva mikroorga ­
nizmov podobných tým, ktoré sú prítomné na médiách s biofiltrami. 
Podmienky činnosti reaktora sa zvolia tak, aby sa zabezpe čila primeraná 
eliminácia organickej hmoty a, ak sa to požaduje, oxidácia amónia.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Výtok z trubice sa odoberie a pred analýzou na zistenie rozpusteného orga ­
nického uhlíka (DOC) a/alebo testovanej chemikálie pomocou špecifickej 
metódy sa bu ď usadí a/alebo prefiltruje. Na ú čely porovnávania súbežne 
a za tých istých podmienok fungujú kontrolné jednotky, do ktorých sa nepridáva testovaná chemikália. Predpokladá sa, že rozdiel medzi koncen ­
tráciami DOC vo výtoku z testovacích a kontrolných jednotiek vzniká 
v dôsledku testovanej chemikálie a jej organických metabolitov. Tento rozdiel sa porovná s koncentráciou pridanej testovanej chemikálie (ako DOC) s cie ľom vypočítať elimináciu testovanej chemikálie. 
8. Biodegradáciu možno od bioadsorpcie bežne odlíši ť na základe dôkladného 
preskúmania krivky eliminácie v závislosti od času. Potvrdi ť ju zvyčajne 
možno pomocou testu ľahkej biodegradovate ľnosti (absorpcia kyslíka alebo 
tvorba oxidu uhli čitého) s použitím aklimatizovaného inokula odobratého na 
konci testu z reaktorov, do ktorých sa pridáva testovaná chemikália.
 
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 
9. Je potrebné pozna ť čistotu, rozpustnos ť vo vode, prchavos ť a adsorp čné 
vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné správne interpretova ť 
výsledky. 
10. Prchavé a slabo rozpustné chemikálie sa zvy čajne nemôžu testova ť, pokiaľ 
sa neprijmú zvláštne opatrenia (pozri dodatok 5 ku kapitole C.10 A). Je nutné pozna ť aj chemickú štruktúru alebo aspo ň empirický vzorec, aby bolo 
možné vypo čítať teoretické hodnoty a/alebo skontrolova ť namerané hodnoty 
parametrov, napr. teoretickú spotrebu kyslíka (ThOD). 
11. Informácie týkajúce sa toxicity testovanej chemikálie pre mikroorganizmy 
(pozri dodatok 4 ku kapitole C.10 A) môžu by ť užitočné pri výbere vhod ­
ných testovaných koncentrácií a môžu by ť nevyhnutné na správnu interpre ­
táciu nízkych hodnôt biodegradácie.
 
ÚROVNE ÚSPEŠNOSTI 
12. Pôvodne sa požadovalo, aby primárna biodegradácia povrchovo aktívnych 
činidiel dosahovala úrove ň 80 % alebo viac, skôr než bolo možné uvies ť 
chemikáliu na trh. Ak sa nedosiahne hodnota 80 %, môže sa použi ť tento 
simulačný (potvrdzujúci) test a povrchovo aktívne činidlo možno uvies ť na 
trh, iba ak sa odstráni viac ako 90 % špecifickej chemikálie. Pri chemiká ­
liách vo všeobecnosti nevzniká otázka úspešnej/neúspešnej úrovne 
a hodnota percentuálnej eliminácie sa môže použi ť v približných výpo čtoch 
pravdepodobnej koncentrácie v životnom prostredí, ktoré sa použijú v hodnotení rizika predstavovaného chemikáliami. V mnohých štúdiách čistých chemikálií sa zistilo, že percentuálna eliminácia DOC je > 90 % 
v prípade viac ako troch štvrtín chemikálií a > 80 % pri vyše 90 % chemi ­
kálií, ktoré vykazovali významný stupe ň biodegradovate ľnosti.
 
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
13. S cie ľom zabezpe čiť správne vykonanie experimentálneho postupu je 
užitočné príležitostne testova ť aj referen čné chemikálie, ktorých správanie 
je známe. Medzi také chemikálie patrí kyselina adipová, 2-fenylfenol, 1- 
naftol, kyselina 2,2-bifenyldikarboxylová a kyselina 1-naftoová.  
REPRODUKOVATE ĽNOSŤ VÝSLEDKOV TESTU 
14. Laboratórium v Spojenom krá ľovstve zistilo, že relatívna smerodajná 
odchýlka v rámci testov je 3,5 % a medzi testmi 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
OPIS METÓDY  
Zariadenie  
Rotujúce tubulárne reaktory  
15. Zariadenie (pozri obrázky 1 a 2 v dodatku 8) pozostáva z banky 
z akrylových trubíc, z ktorých každá má d ĺžku 30,5 cm a jej vnútorný 
priemer je 5 cm, podopretej kolesami s gumovým lemovaním upevnenými v kovovom podpernom ráme. Každá trubica má vonkajší okraj, s h ĺbkou 
približne 0,5 cm, ktorým je zaistená na kolesách, vnútorný povrch je 
zdrsnený hrubou drôtenkou a na hornom (prívodnom) konci sa nachádza 
vnútorný okraj na zadržiavanie tekutiny s h ĺbkou 0,5 cm. Trubice sú naklo ­
nené v uhle približne jeden stupe ň k horizontálnej úrovni, aby sa zabezpe čil 
požadovaný kontaktný čas, keď sa testovacie médium aplikuje do čistej 
trubice. Kolesá s gumovými pneumatikami sa otá čajú pôsobením pomalého 
motora s variabilnou rýchlos ťou. Teplota trubíc sa kontroluje tak, že trubice 
sa uložia do miestnosti s konštantnou teplotou. 
16. Vďaka tomu, že každý tubulárny reaktor sa vloží do mierne vä čšej trubice 
s uzáverom a že sa zabezpe čia plynotesné prepojenia, možno na ú čely 
ďalšieho merania odobra ť vychádzajúci plyn CO
 2 v alkalickom roztoku (6). 
17. 24-hodinový prívod organického média pod ľa možnosti s pridanou testo ­
vanou chemikáliou do každej trubice sa nachádza v 20-litrovej zásobnej 
nádobe (A) (pozri obrázok 2). Ak sa to požaduje, roztok testovanej chemi ­
kálie sa môže dávkova ť samostatne. V blízkosti dna každej zásobnej nádoby 
sa nachádza vývod, ktorý je vhodnou trubicou, napr. zo silikónového 
kaučuku, prostredníctvom peristaltického čerpadla (B) pripojený ku sklenej 
alebo akrylovej prívodnej trubici, ktorá vstupuje v rozsahu 2 – 4 cm do vyššieho (prívodného) konca naklonenej trubice (C). Výtok sa nechá odkvapkáva ť z nižšieho konca naklonenej trubice, aby sa zozbieral v inej 
zásobnej nádobe (D). Pred analýzou sa výtok usadí alebo prefiltruje.
 
Filtračné zariadenie – odstredivka  
18. Prístroj na filtráciu vzoriek s membránovými filtrami vhodnej pórovitosti 
(nominálny priemer otvoru 0,45 μm), ktoré adsorbujú organické chemikálie 
a uvoľňujú organický uhlík v minimálnej miere. Ak sa použijú filtre, ktoré 
uvoľňujú organický uhlík, je potrebné dôkladne ich umy ť horúcou vodou, 
aby sa odstránil vylúhovate ľný organický uhlík. Prípadne sa môže použi ť 
odstredivka schopná dosiahnu ť 40 000 m/s  2 . 
19. Analytické vybavenie na stanovenie týchto parametrov: 
— DOC/celkový organický uhlík (TOC) alebo chemická spotreba 
kyslíka (COD), 
— špecifická chemikália (HPLC, GC at ď.), ak sa požaduje, 
— pH, teplota, kyslos ť, zásaditos ť, 
— amónium, dusitan, dusi čnan, ak sa testy vykonávajú v nitrifika čných 
podmienkach.  
Voda  
20. Voda z vodovodu s obsahom DOC nižším ako 3 mg/l. 
21. Destilovaná alebo deionizovaná voda s obsahom DOC nižším ako 2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organické médium  
22. Ako organické médium možno použi ť syntetické médiá, domáce splaškové 
vody alebo zmes obidvoch. Ukázalo sa, že pri použití samotných domácich splaškových vôd často dochádza k zvýšenej percentuálnej eliminácii DOC 
(v jednotkách s technológiou aktivovaného kalu) a dokonca je možná biode ­
gradácia niektorých chemikálií, ktoré nepodliehajú biodegradácii pri použití syntetických médií OECD. Preto sa odporú ča používa ť domáce splaškové 
vody. Meria sa koncentrácia DOC alebo COD v každej novej dávke orga ­
nického média. Je potrebné pozna ť kyslosť alebo zásaditos ť organického 
média. Médium môže vyžadova ť pridanie vhodného tlmivého roztoku 
(hydrogénuhli čitan sodný alebo hydrogénfosfore čnan draselný), ak má 
nízku kyslos ť alebo zásaditos ť, aby počas testu v reaktore ostalo zachované 
pH s hodnotou približne 7,5 ± 0,5. O množstve a čase pridania tlmivého 
roztoku sa rozhoduje individuálne pre každý prípad.
 
Syntetické médiá  
23. V každom jednom litri vody z vodovodu sa rozpustí: 160 mg peptónu, 110 
mg mäsového extraktu, 30 mg mo čoviny, 28 mg bezvodého hydrogénfos ­
forečnanu draselného (K  2 HPO  4 ), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg 
dihydrátu chloridu vápenatého (CaCl  2 .2H  2 O), 2 mg heptahydrátu síranu 
horečnatého (MgSO  4 .7H  2 O). Toto syntetické médium OECD je uvedené 
ako príklad a zabezpe čuje strednú koncentráciu DOC v prítoku v hodnote 
približne 100 mg/l. Môžu sa prípadne použi ť iné zloženia s približne 
rovnakou koncentráciou DOC, ktoré sa viac približujú skuto čným spla ­ 
škovým vodám. Tieto syntetické médiá sa môžu pripravi ť v destilovanej 
vode v koncentrovanej forme a až do jedného týžd ňa skladova ť pri teplote 
približne 1 °C. V prípade potreby sa zriedia vodou z vodovodu. (Toto médium nie je vyhovujúce, napr. koncentrácia dusíka je ve ľmi vysoká, 
pomerne nízky obsah uhlíka, ale nebolo navrhnuté ni č lepšie okrem pridania 
ďalšieho fosfátu ako tlmivého roztoku a ďalšieho peptónu).
 
Domáce splaškové vody  
24. Použijú sa čerstvo usadené splaškové vody zbierané denne z čistiarní odpa ­
dových vôd, do ktorých sa dodávajú prevažne domáce splaškové vody. Mali by sa odobra ť z prietokového kanála nádrže primárnej sedimentácie alebo 
z prívodu do čistiarne s technológiou aktivovaného kalu a mali by by ť vo 
veľkej miere zbavené hrubých častíc. Splaškové vody sa môžu použi ť po 
niekoľkodňovom uskladnení pri teplote približne 4 °C, ak sa preukáže, že 
DOC (alebo COD) sa po čas uskladnenia výrazne nezníži (t. j. o menej ako 
20 %). Na obmedzenie porúch systému je potrebné pred použitím upravi ť 
DOC (alebo COD) každej novej dávky na vhodnú stálu hodnotu, napr. zriedením vodou z vodovodu.
 
Mazivo  
25. Na mazanie valcov peristaltického čerpadla možno použi ť glycerol alebo 
olivový olej: na trubice zo silikónového kau čuku sú vhodné obe mazivá.  
Zásobné roztoky testovanej chemikálie  
26. V prípade chemikálií s dostato čnou rozpustnos ťou sa pripravia zásobné 
roztoky s vhodnými koncentráciami (napr. 1 – 5 g/l) v deionizovanej vode alebo v minerálnej časti syntetických médií. Pre nerozpustné chemi ­
kálie pozri dodatok 5 v kapitole C.10-A. Táto metóda nie je vhodná pre 
prchavé chemikálie bez úprav tubulárnych reaktorov (odsek 16). Ur čí sa 
DOC a TOC zásobného roztoku a merania sa opakujú pri každej novej dávke. Ak je rozdiel medzi DOC a TOC vä čší ako 20 %, je potrebné 
skontrolova ť rozpustnos ť testovanej chemikálie vo vode. Porovná sa DOC 
alebo koncentrácia testovanej chemikálie nameraná špecifickou analýzou
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
zásobného roztoku a nominálna hodnota, aby sa zistilo, či je výťažnosť 
dostatočná (zvyčajne možno o čakávať > 90 %). Je potrebné sa uisti ť, 
najmä pri disperziách, či sa DOC môže alebo nemôže použi ť ako analytický 
parameter alebo či sa môže použi ť iba analytická metóda špecifická pre 
testovanú chemikáliu. Pri disperziách sa vyžaduje odstredenie vzoriek. Pri 
každej novej dávke sa odmeria DOC, COD alebo testovaná chemikália 
pomocou špecifickej analýzy. 
27. Určí sa pH zásobného roztoku. Z krajných hodnôt vyplýva, že pridanie 
chemikálie môže vplýva ť na pH aktivovaného kalu v testovacom systéme. 
V takom prípade je potrebné neutralizova ť zásobný roztok na získanie pH 7 
± 0,5 pomocou malých množstiev anorganickej kyseliny alebo zásady, ale treba zabráni ť zrážaniu testovanej chemikálie.
 
POSTUP  
Príprava organického média na dávkovanie  
28. Zabezpe čí sa, aby boli všetky prítokové a výtokové nádoby a potrubia 
z prítokových nádob a do výtokových nádob dôkladne o čistené, aby sa 
eliminovalo množenie mikróbov na za čiatku a po čas trvania testu. 
29. Každý de ň sa vhodným zriedením vodou z vodovodu čerstvo pripraví synte ­
tické médium (odsek 23) bu ď z tuhých látok, alebo z koncentrovaného 
zásobného roztoku. Vo valci sa odmeria požadované množstvo, ktoré sa pridá do čistej prítokovej nádoby. V prípade potreby sa pred zriedením 
takisto pridá požadované množstvo zásobného roztoku testovanej chemikálie 
alebo referen čnej chemikálie do syntetického média. Ak je to vhodnejšie 
alebo potrebné na zabránenie straty testovanej chemikálie, pripraví sa zvláš ť 
zriedený roztok testovanej chemikálie v samostatnej nádrži a pridá sa do 
naklonených trubíc prostredníctvom iného dávkovacieho čerpadla. 
30. Prípadne (a pod ľa možnosti) sa použijú usadené domáce splaškové vody 
(odsek 24) čerstvo odobraté každý de ň.
 
Činnosť rotujúcich tubulárnych reaktorov  
31. Na hodnotenie jednej testovanej chemikálie sú potrebné dva identické tubu ­
lárne reaktory, ktoré sa umiestnia do miestnosti s konštantnou teplotou, zvyčajne 22 ± 2 °C. 
32. Peristaltické čerpadlá sa nastavia tak, aby privádzali 250 ± 25 ml/h orga ­
nického média (bez testovanej chemikálie) do naklonených trubíc, ktoré 
rotujú rýchlos ťou 18 ± 2 rpm. Na trubice čerpadla sa na za čiatku 
a pravidelne v priebehu testu aplikuje mazivo (odsek 25), aby sa zabezpe čilo 
správne fungovanie a pred ĺžila sa životnos ť trubíc. 
33. Uhol sklonu trubíc sa prispôsobí horizontálnej úrovni, aby sa dosiahol čas 
zotrvania prívodu v čistej trubici 125 ± 12,5 sekúnd. Pridaním nebiologic ­
kého markera (napr. NaCl, inertné farbivo) do prívodu sa odhadne reten čný 
čas: čas potrebný na dosiahnutie najvyššej koncentrácie vo výtoku sa 
použije ako stredný reten čný čas (keď je prítomný maximálny film, reten čný 
čas možno zvýši ť až na približne 30 min.). 
34. Tieto miery, rýchlosti a časy sa určili s cieľom zabezpe čiť primeranú elimi ­
náciu (> 80 %) DOC (alebo COD) a vytvori ť nitrifikované výtoky. Prieto ­
ková rýchlos ť by sa mala zmeni ť, ak je eliminácia nedostato čná alebo ak sa 
simuluje výkon konkrétnej čistiarne. V druhom prípade je potrebné prispô ­
sobiť mieru dávkovania organického média, kým výkon reaktora nedosiahne 
výkon čistiarne.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulácia  
35. Vzduchová inokulácia môže by ť na začatie množenia mikroorganizmov 
dostatočná, ak sa použijú syntetické médiá, v iných prípadoch je však 
potrebné do prívodu pridáva ť 1 ml/l usadeného média po čas troch dní.  
Merania  
36. V pravidelných intervaloch sa skontroluje, či sú miery dávok a rýchlosti 
rotácie v rozsahu požadovaných limitov. Takisto sa odmeria pH výtoku, 
najmä v prípade, že sa o čakáva nitrifikácia.  
Odber vzoriek a analýza  
37. Metóda, spôsob a frekvencia odberu vzoriek sa zvolia tak, aby vyhovovali 
účelu testu. Napríklad sa zachytia vzorky prítoku a výtoku alebo sa zozbie ­
rajú vzorky v priebehu dlhšieho obdobia, napr. 3 – 6 h. V prvej fáze, bez 
testovanej chemikálie, sa vzorky odoberajú dvakrát týždenne. Vzorky sa filtrujú cez membrány alebo odstredivkou pri približne 40 000 m/s
 2 počas 
približne 15 minút (odsek 18). Môže by ť potrebné, aby sa vzorky pred 
membránovou filtráciou usadili a/alebo hrubo prefiltrovali. Ur čí sa DOC 
(alebo COD) aspo ň v dvoch vyhodnoteniach a v prípade potreby BOD, 
amónium a dusitan/dusi čnan. 
38. Všetky analýzy by sa mali vykona ť čo najskôr po odbere a príprave vzoriek. 
Ak sa analýzy musia odloži ť, vzorky sa uskladnia v tme pri teplote približne 
4 °C v plných, pevne uzavretých f ľašiach. Ak musia by ť vzorky uskladnené 
viac ako 48 hodín, zakonzervujú sa hlbokým zmrazením, acidifikáciou alebo pridaním vhodnej toxickej chemikálie (napr. 20 ml/l z 10 g/l roztoku chlo ­
ridu ortutnatého). Je potrebné zabezpe čiť, aby metóda konzervácie neov ­
plyvnila výsledky analýzy.
 
Obdobie zábehu  
39. V tomto období povrchový biofilm rastie, až kým nedosiahne optimálnu 
hrúbku, čo zvyčajne trvá približne dva týždne, ale nemalo by to trva ť dlhšie 
ako šesť týždňov. Eliminácia (odsek 44) DOC (alebo COD) sa zvyšuje 
a dosiahne rovnovážnu úrove ň. Keď sa dosiahne rovnováha pri podobnej 
hodnote v oboch trubiciach, vyberie sa jedna, ktorá bude slúži ť ako 
kontrolná po čas zvyšku testu, v priebehu ktorého by ich výkon mal zosta ť 
konzistentný.  
Zavedenie testovanej chemikálie  
40. V tejto fáze sa do druhého reaktora pridá testovaná chemikália 
v požadovanej koncentrácii, zvy čajne 10 – 20 mg C/l. Kontrola pokra čuje 
s cieľom získať samostatné organické médium.  
Obdobie aklimatizácie  
41. Dvakrát týždenne sa pokra čuje v analýzach na zistenie DOC (alebo COD) a, 
ak sa hodnotí primárna biodegradovate ľnosť, odmeria sa aj koncentrácia 
testovanej chemikálie prostredníctvom špecifickej analýzy. Po prvom zave ­
dení testovanej chemikálie sa po čká jeden až šes ť týždňov (alebo 
v špeciálnych podmienkach dlhšie), aby sa umožnila aklimatizácia. Ak 
percentuálna eliminácia (odseky 43 – 45) dosiahne maximálnu hodnotu, 
získa sa 12 – 15 platných hodnôt v rovnovážnej fáze za obdobie približne troch týžd ňov na účely hodnotenia strednej percentuálnej eliminácie. Test sa 
považuje za ukon čený, ak sa dosiahne dostato čne vysoký stupe ň eliminácie. 
Po prvom pridaní testovanej chemikálie by test zvy čajne nemal trva ť dlhšie 
ako 12 týžd ňov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Odlupovanie filmu  
42. K náhlemu odstráneniu ve ľkých množstiev nadbyto čného filmu z trubíc 
alebo k odlupovaniu dochádza v pomerne pravidelných intervaloch. S cieľom zabezpe čiť, že to nebude ma ť vplyv na porovnate ľnosť výsledkov, 
musia testy zah ŕňať aspoň dva úplné cykly rastu a odlupovania.
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
43. Vypo číta sa percentuálna eliminácia DOC alebo COD testovanej chemikálie 
pre každé časované hodnotenie pomocou rovnice: 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
kde 
D t = percentuálna eliminácia DOC (alebo COD) v čase t, 
C s = koncentrácia DOC (alebo COD) v prítoku v dôsledku testovanej 
chemikálie, pod ľa možnosti odhadnutá z koncentrácie v zásobnom 
roztoku a pridaného objemu zásobného roztoku (mg/l), 
E = nameraná hodnota DOC (alebo COD) v testovacom výtoku v čase 
t (mg/l), 
E o = nameraná hodnota DOC (alebo COD) v kontrolnom výtoku v čase 
t (mg/l). 
Výpočet sa zopakuje pri referen čnej chemikálii, pokia ľ sa testuje.  
Činnosť kontrolného reaktora  
44. Stupe ň eliminácie DOC (alebo COD) (D  B ) organického média 
v kontrolných reaktoroch je informácia užito čná pri hodnotení biodegra ­
dačnej činnosti biofilmu po čas testu. Vypo číta sa percentuálna eliminácia 
z rovnice: 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
kde 
C m = DOC (alebo COD) organického média v kontrolnom prítoku (mg/l). 
45. Vypo číta sa eliminácia (D  ST ) testovanej chemikálie, ak je meraná špeci ­
fickou analytickou metódou, pri každom časovom hodnotení z rovnice: 
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
kde 
S i = nameraná alebo pod ľa možnosti odhadnutá koncentrácia testovanej 
chemikálie v testovacom prítoku (mg/l), 
S e = nameraná koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom výtoku 
v čase t (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Ak sa analytickou metódou získaná pozitívna hodnota v neupravených spla ­ 
škových vodách rovná S  c mg/l, percentuálna eliminácia (D  SC ) sa vypo číta 
podľa vzorca: 
DSC ¼ 100 ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ S c Þ % 
Vyjadrenie výsledkov testu  
46. Zakreslí sa percentuálna eliminácia D  t a D  ST (alebo D  SC ), ak je k dispozícii, 
v závislosti od času (pozri dodatok 2 v kapitole C.10-A). Zoberie sa stredná 
(vyjadrená ako najbližšie celé číslo) a smerodajná odchýlka 12 – 15 hodnôt 
pre D  T (a pre D  ST , ak je k dispozícii) získaná v rovnovážnej fáze ako 
percentuálna eliminácia testovanej chemikálie. Z tvaru krivky eliminácie možno vyvodi ť niekoľko záverov o procesoch odstra ňovania.
 
Adsorpcia  
47. Ak sa na za čiatku testu pozoruje vysoká eliminácia DOC testovanej chemi ­
kálie, testovaná chemikália je pravdepodobne eliminovaná adsorpciou na biofilme. To možno dokáza ť určením adsorbovanej testovanej chemikálie 
na tuhých látkach odlúpnutých z filmu. Eliminácia DOC adsorbovate ľných 
chemikálií zvy čajne neostáva vysoká po čas celého testu. Bežne sa na 
začiatku vyskytne vysoký stupe ň eliminácie, ktorý postupne klesá na rovno ­
vážnu hodnotu. Ak by však adsorbovaná testovaná chemikália bola schopná 
spôsobiť aklimatizáciu populácie mikróbov, eliminácia DOC testovanej 
chemikálie by následne stúpla a dosiahla by hornú rovnovážnu úrove ň.
 
Lag fáza  
48. Podobne ako pri statických skríningových testoch si mnohé testované 
chemikálie vyžadujú pred úplnou biodegradáciou lag fázu. Po čas lag fázy 
prebieha aklimatizácia alebo adaptácia príslušných baktérií pri takmer nulovej eliminácii testovanej chemikálie. Potom nastane po čiatočné 
množenie týchto baktérií. Táto fáza sa kon čí a degrada čná fáza sa svojvo ľne 
začína, keď sa odstráni približne 10 % po čiatočného množstva testovanej 
chemikálie (po umožnení adsorpcie, ak k nej dochádza). Lag fáza je často 
veľmi variabilná a slabo reprodukovate ľná.
 
Rovnovážna fáza  
49. Rovnovážna fáza krivky eliminácie v nepretržitom teste je vymedzená ako 
fáza, v ktorej nastáva maximálna degradácia. Táto fáza by mala trva ť 
najmenej tri týždne a mala by ma ť približne 12 – 15 nameraných platných 
hodnôt.  
Stredný stupe ň eliminácie testovanej chemikálie  
50. Vypo číta sa stredná hodnota z hodnôt eliminácie D  t (a D  st , ak je dostupná) 
testovanej chemikálie po čas rovnovážnej fázy. Hodnota zaokrúhlená na celé 
číslo (1 %) predstavuje stupe ň eliminácie testovanej chemikálie. Odporú ča 
sa aj vypo čítať 95 % interval spo ľahlivosti strednej hodnoty. Podobným 
spôsobom sa vypo číta stredný stupe ň (D  B ) eliminácie organického média 
v kontrolnej nádobe.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indikácia biodegradácie  
51. Ak testovaná chemikália výrazne neadsorbuje na biofilme a krivka elimi ­
nácie má typický tvar biodegrada čnej krivky s lag, degrada čnou 
a rovnovážnou fázou (odseky 48, 49), nameraná eliminácia sa môže 
s istotou pripísa ť biodegradácii. Ak bola po čiatočná eliminácia vysoká, 
simulačný test nemôže rozlišova ť medzi biologickými a abiotickými elimi ­
načnými procesmi. V takých prípadoch a v prípade akýchko ľvek pochyb ­
ností o biodegradácii (napr. ak dochádza k stripovaniu) sa vykoná analýza 
adsorbovanej testovanej chemikálie na vzorkách filmu alebo ďalšie statické 
(skríningové) testy biodegradovate ľnosti založené na parametroch, ktoré 
jednoznačne indikujú biologické procesy. Takými testmi sú metódy 
absorpcie kyslíka (kapitola C.4 tejto prílohy D, E a F) (9) alebo test, 
v ktorom sa meria tvorba CO  2 (kapitola C.4-C tejto prílohy alebo metóda 
uzavretého priestoru nad kvapalinou) (10). Ako inokulum sa použije pred ­
exponovaný biofilm z príslušného reaktora. 
52. Ak sa odmerala eliminácia DOC aj eliminácia špecifickej chemikálie, 
výrazné rozdiely (v prípade prvej hodnoty nižšej ako druhej) medzi percen ­
tuálnou elimináciou indikujú prítomnos ť organických medziproduktov, ktoré 
sa môžu rozklada ť ťažšie. Tieto medziprodukty treba preskúma ť. 
Platnosť výsledkov testu  
53. Test možno považova ť za platný, ak po dvoch týžd ňoch prevádzky stupe ň 
eliminácie DOC (alebo COD) (D  B ) v kontrolných jednotkách je > 80 % 
a nie sú pozorované žiadne nezvy čajné javy. 
54. Ak sa testovala ľahko biodegradovate ľná (referen čná) chemikália, stupe ň 
biodegradácie by mal by ť > 90 % a rozdiel medzi hodnotami duplikátov 
by nemal by ť väčší ako 5 %. Ak nie sú splnené tieto dve kritériá, je 
potrebné skontrolova ť experimentálne postupy a/alebo získa ť domáce spla ­ 
škové vody z iného zdroja. 
55. Podobne rozdiely medzi hodnotami biodegradácie z duplicitných jednotiek 
(ak sa použili), v ktorých sa spracúva testovaná chemikália, by sa nemali líšiť o viac ako 5 %. Ak toto kritérium nie je splnené, ale eliminácia je 
vysoká, v analýze sa pokra čuje ďalšie tri týždne. Ak je eliminácia nízka, 
preskúmajú sa inhibi čné účinky testovanej chemikálie, pokia ľ nie sú známe, 
a test sa pod ľa možnosti zopakuje pri nižšej koncentrácii testovanej chemi ­
kálie.
 
Správa o teste  
56. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— identifika čné údaje, 
— fyzikálny charakter a významné fyzikálno-chemické vlastnosti.  
Podmienky testovania:  
— všetky modifikácie testovacieho systému, najmä ak sa testujú neroz ­
pustné alebo prchavé látky, 
— druh organického média, 
— podiel a charakter priemyselného odpadu prítomného v splaškových 
vodách, ak sa použije a je známy, 
— metóda inokulácie,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— zásobný roztok testovanej chemikálie – obsah DOC (rozpustený orga ­
nický uhlík) a TOC (celkový organický uhlík), spôsob prípravy 
v prípade suspendovania, použitá testovacia koncentrácia, odôvodnenie v prípade hodnôt mimo rozsahu 10 – 20 mg/l DOC, metóda pridávania, dátum prvého pridania, všetky zmeny koncentrácie, 
— stredný hydraulický reten čný čas (bez rastu), rota čná rýchlos ť trubice, 
približný uhol sklonu, ak je to možné, 
— údaje o odlupovaní, čas a intenzita, 
— testovacia teplota a rozsah, 
— použité analytické metódy.  
Výsledky testu:  
— všetky namerané údaje DOC, COD, špecifické analýzy, pH, teplota, 
N chemikálie v prípade potreby, 
— všetky vypo čítané hodnoty D
 t (alebo D  tc ), D  B , D s v tabuľkovej podobe 
a krivky eliminácie, 
— informácie o lag a rovnovážnej fáze, trvanie testu, stupe ň eliminácie 
testovanej chemikálie, referen čnej chemikálie (ak sa testovala) 
a organického média (v kontrolnej jednotke) spolu so štatistickými údajmi a vyjadreniami biodegradovate ľnosti a platnos ťou testu, 
— rozbor výsledkov.
 
LITERATÚRA  
1. Gerike, P., Fischer, W., Holtmann, W. (1980). Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753 – 758. 
2. Truesdale, G. A., Jones, K., Vandyke, K. G. (1959). Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attac ­
kable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441 – 444. 
3. Baumann, U., Kuhn, G., a Benz, M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214 – 220. 
4. Gloyna, E. F., Comstock, R. F., Renn, C. E. (1952). Rotary tubes as expe ­
rimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355 – 1357. 
5. Kumke, G. W., Renn, C. E. (1966). LAS removal across an institutional 
trickling filter. JAOCS 43: 92 – 94. 
6. Tomlinson, T. G., Snaddon, D. H. M. (1966). Biological oxidation of sewage 
by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865 – 881. 
7. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, Londýn. 
8. Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, Londýn. 
9. Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie „ ľahkej“ biodegradovate ľnosti A – F. 
10. ISO 14593 (1998) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradabi ­
lity organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvo ľneného 
anorganického uhlíka v uzavretých nádobách.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Dodatok 8  
Obrázok 1  
Rotujúce trubice
  
Glosár: 
Pôdorys: 
Pohľad A/B: 
Poháňané kolesá: 
Voľnobežné kolesá: 
Hnací motor: Redukčný ozubený prevod: 
Vnútorný okolesník: Výklopný mechanizmus: Pohon šikmého ozubeného prevodu:
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Obrázok 2  
Postupový diagram
  
A: Prívodná nádrž 
B: Peristaltické čerpadlo 
C: Rotujúca trubica D: Nádoba na zber výtoku
 
VYMEDZENIE POJMOV:  
Testovaná chemikália: akáko ľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy. 
Chemikálie: „Treba poznamena ť, že pojem chemikálie má rozsiahle použitie 
v dohodách UNCED a neskorších dokumentoch na ozna čenie látok, produktov, 
zmesí, prípravkov alebo akýchko ľvek iných pojmov, ktoré sa môžu používa ť 
v existujúcich systémoch, na vymedzenie rozsahu“.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADÁCIA  
TEST RESPIRA ČNEJ INHIBÍCIE AKTIVOVANÉHO KALU  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Opísaná metodika stanovuje vplyv testovanej látky na mikroorga ­
nizmy meraním miery respirácie v definovaných podmienkach a v prítomnosti odlišných koncentrácií testovanej látky. 
Účelom metódy je poskytnú ť rýchly skríning, pomocou ktorého by 
boli identifikované látky nepriaznivo vplývajúce na aeróbnu mikro ­
biálnu čističku odpadových vôd a indikované vhodné neinhibi čné 
koncentrácie testovaných látok použite ľných v testoch biodegradova ­
teľnosti. 
Predbežné ur čenie rozsahu sledovaných koncentrácií testovanej látky 
môže predchádza ť samotný test. Týmto spôsobom sa získajú infor ­
mácie o škále koncentrácií použite ľných v hlavnom teste. 
V teste musia by ť zahrnuté aj dve kontroly bez testovanej látky, 
jedna kontrolná vzorka na za čiatku a druhá na konci testovanej 
série koncentrácií. Každá dávka aktivovaného kalu by mala by ť 
kontrolovaná aj vo či referenčnej látke. 
Test je aplikovate ľný a vysokospo ľahlivý hlavne pri látkach, ktoré sú 
rozpustné vo vode a zárove ň stabilné, takže pravdepodobne zotrvá ­
vajú v ur čitej forme vo vodách. 
Pri látkach, ktoré majú obmedzenú rozpustnos ť v testovacom médiu, 
nie je možné stanovi ť EC
 50 . 
Výsledky založené na spotrebe kyslíka môžu vies ť k chybným 
záverom v prípade, že testovaná látka vedie k odpojeniu oxidatívnej fosforylácie. 
Pred vykonaním testu sa odporú ča mať nasledujúce informácie: 
— rozpustnos ť vo vode, 
— tlak nasýtených pár, — podrobný vzorec chemickej štruktúry, 
— čistota testovanej látky.
 
Odporúčanie:  
Aktivovaný kal môže potencionálne obsahova ť patogénne orga ­
nizmy, a preto s ním treba zaobchádza ť so zvýšenou opatrnos ťou. 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Miera respirácie je spotreba kyslíka mikroorganizmami odpadových 
vôd v aeróbnom kale zne čistených vôd vyjadrená všeobecne v mg 
kyslíka (O  2 ) na mg kalu za hodinu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
S cieľom vypo čítať inhibičný efekt testovanej látky pri ur čitej 
koncentrácii je miera respirácie vyjadrená ako percento priemeru 
dvoch kontrolných mier respirácie:  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ percento inhibície  
kde: 
R S = miera spotreby kyslíka pri testovanej koncentrácii testo ­
vanej látky, 
R c1 = miera spotreby kyslíka, kontrola 1, 
R c2 = miera spotreby kyslíka, kontrola 2. 
EC 50 pri tomto teste predstavuje koncentráciu testovanej látky, pri 
ktorej je miera respirácie 50 % v porovnaní s kontrolou, za podmienok stanovených touto metódou.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Ako referen čnú látku sa odporú ča použiť 3,5-dichlórfenol, ako 
známy inhibitor respirácie a tester EC  50 , a to na každej vzorke 
aktivovaného kalu, kde je prostriedkom kontroly abnormálnej citli ­
vosti kalu.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Miera respirácie aktivovaného kalu vyživovaného štandardným 
množstvom syntetického média sa meria po kontaktnom čase 
30 minút alebo po troch hodinách, alebo v oboch časoch. Miera 
respirácie toho istého aktivovaného kalu v prítomnosti rôznych 
koncentrácií testovanej látky v inak rovnakých podmienkach sa meria tiež. Inhibi čný efekt testovanej látky v ur čitej koncentrácii sa 
vyjadruje ako percento z priemeru mier respirácie dvoch kontrol. 
Hodnota EC
 50 sa vypočíta z výsledkov získaných pri rôznych 
koncentráciách testovanej látky.  
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Platnosť výsledkov testu je splnená, ak: 
— hodnoty získané v dvoch kontrolách miery respirácie neprekra ­ 
čujú rozdiel 15 %, 
— EC  50 (po 30 minútach a/alebo 3 hodinách) pri 3,5-dichlórfenole 
nepresahuje rozmedzie hodnôt 5 mg/liter až 30 mg/liter.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Reagen čné látky  
1.6.1.1. R o z t o k y t e s t o v a n e j l á t k y 
Roztoky testovanej látky musia by ť čerstvo pripravené na za čiatku 
testu zo zásobného roztoku. Odporú ča sa koncentrácia zásobného 
roztoku 0,5 g/liter, ak sa postupuje pod ľa popísaného protokolu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. R o z t o k r e f e r e n č n e j l á t k y 
Roztok 5,5-dichlórfenolu môže by ť pripravený napríklad rozpus ­
tením 0,5 g 3,5-dichlórfenolu v 10 ml 1M NaOH, predtým rozrie ­
deným v približne 30 ml destilovanej vody, pridaním za miešania 
s 0,5M H  2 SO 4 do bodu po čiatočného zrážania – vyžaduje sa 
približne 8 ml 0,5M H  2 S0 4 – a následným zriedením zmesi na 
jeden liter s destilovanou vodou. Predpokladané pH v pripravenej zmesi sa pohybuje v rozmedzí 7 až 8.
 
1.6.1.3. S y n t e t i c k é m é d i á 
Syntetické médiá sa vytvoria rozpustením nasledovných množstiev 
látok v 1 litri vody: 
— 16 g peptónu, — 11 g mäsového extraktu, — 3 g mo čoviny, 
— 0,7 NaCl, 
— 0,4 g CaCl
 2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Poznámka 1:  Dané syntetické médium má 100-násobne vyššiu 
koncentráciu, ako je opísané v Technickej správe OECD: „Navrhnuté metódy pre stanovenie biodegradovate ľnosti surfaktantov používa ­
ných v syntetických detergentoch“ (11. jún 1976) s doplnením 
hydrogenfosfore čnanu didraselného.  
Poznámka 2:  Ak pripravené médium nie je okamžite použité, môže 
byť skladované v tme pri 0 až 4
 o C, ale nie dlhšie ako 1 týžde ň, 
v podmienkach, ktoré nevyvolávajú možné zmeny v jeho zložení. 
Médium môže by ť pred uskladnením sterilizované, prípadne sa 
peptón a mäsový extrakt pridajú krátko pred prevedením testu. Pred použitím musí by ť médium dôkladne premiešané a pH musí 
byť upravené na požadovanú hodnotu.
 
1.6.2.  Prístroje  
Meracie prístroje: presný dizajn nie je rozhodujúci. Predná časť by 
mala byť dostatočne priestorná a sonda by mala prilieha ť tesne ku 
hrdlu meracej nádoby. 
Vyžaduje sa normálne laboratórne vybavenie a špeciálne nasledovné: 
— merací prístroj, — prevzduš ňovacie zariadenie, 
— pH elektródy a meracie zariadenie, — kyslíková elektróda.
 
1.6.3.  Príprava inokula  
V teste sa ako mikrobiálne inokulum používa aktivovaný kal 
z čističky odpadových vôd, spracovávajúcej prevažne domáce spla ­ 
škové vody. 
Ak je to potrebné, v laboratórnych podmienkach môžu by ť pred 
použitím odstránené hrubé ne čistoty, a to usadzovaním po čas kratšej 
doby, približne 15 minút a následným sto čením vrchnej vrstvy 
jemnejších pevných častíc. Alternatívou k uvedenému postupu 
môže by ť miešanie kalu po čas nieko ľkých sekúnd za použitia 
miešadla.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Okrem toho, ak sa predpokladá prítomnos ť inhibičného materiálu, 
môže byť aktivovaný kal premývaný s vodou z vodovodu alebo 
s izotonickým roztokom. Po centrifugácii sa supernatant zleje a procedúra sa opakuje trikrát. 
Malé množstvo kalu sa zváži a vysuší. Z výsledkov sa vypo číta 
množstvo vlhkého kalu, ktoré musí by ť suspendované vo vode 
s cieľom získania aktivovaného kalu s obsahom pevných častíc 
v rozmedzí od 2 – 4 g/liter po zmiešaní s kvapalinou. Týmto spôsobom sa dosiahne hladina koncentrácie v rozmedzí od 0,8 – 
1,6 g/liter v testovanom médiu, ak sú predchádzajúce doporu čenia 
danej procedúry dodržané. 
Ak kal nie je možné spracova ť v deň odberu vzorky, pridá sa 50 ml 
syntetického kalu na každý liter aktivovaného kalu pripraveného 
podľa predchádzajúcich doporu čení, a takto spracovaná zmes je 
potom prevzduš ňovaná cez noc pri teplote 20 ± 2
 o C a následne aj 
počas celého d ňa pred použitím. Pred samotným testom sa skontro ­
luje pH a ak je to potrebné, tak sa upraví na 6 až 8. Pevné častice 
prítomné v kvapalnej zmesi sa môžu stanovi ť podľa predchádzajú ­
cich doporu čení. 
Ak sa vzorky z toho istého aktivovaného kalu spracujú po čas viacerých 
nasledovných dní (maximálne štyri dni), pridáva sa ďalších 50 ml 
syntetického média na liter kalu na konci každého pracovného d ňa. 
1.6.4.  Vykonanie testu  
Trvanie/kontaktný čas: 30 minút a/alebo tri hodiny, po čas 
ktorých sa prevzduš ňuje 
Voda: Pitná voda (ak je potrebné, 
s odstránením chlóru) 
Vzduch: Čistý vzduch, bez olejových stôp. Prúd 
vzduchu je 0,5 – 1 l/minútu 
Merací prístroj: F ľaša s plochým rovným dnom, ako 
BSK-nádoba 
Merač kyslíka: Vhodná kysliková elektróda, 
s rekordérom 
Živný roztok: Syntetické médium (pozri vyššie) 
Testovaná látka: Testovaná látka je čerstvo pripravená na 
začiatku testu 
Referenčná látka: 3,5-dichlórfenol (aspo ň v troch koncen ­
tráciách) 
Kontroly: Inokulované vzorky bez testovanej 
látky 
Teplota: 20 ± 2  o C 
Navrhnutá experimentálna procedúra, pod ľa ktorej sa postupuje 
v prípade testovanej aj referen čnej látky po čas trojhodinovej 
kontaktnej doby, je nasledovná: 
Používajú sa oddelené nádoby (napr. 1-litrové kadi čky). 
Testovaná látka sa pripraví aspo ň v piatich koncentráciách, pri čom 
jednotlivé koncentrácie by sa mali zvä čšovať o konštantný faktor 
nepresahujúci hodnotu 3,2. 
V čase „0“ sa pridá 16 ml syntetického média do vody do objemu 
300 ml. Následne sa pridá 200 ml mikrobiálneho inokula 
a pripravená zmes v objeme 500 ml sa preleje do prvej nádoby 
(prvá kontrola C  1 ). ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Testovacie nádoby by mali by ť kontinuálne prevzduš ňované. Malo 
by sa zabezpe čiť, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka v zmesi 
neklesla pod 2,5 mg/liter a aby tesne pred meraním miery respirácie bola koncentrácia O
 2 približne 6,5 mg/liter. 
Po „15 minútach“ (15 minút je náhodný, ale konven čné stanovený čas) 
sa predchádzajúce meranie zopakuje, ale s pridaním 100 ml testovanej 
látky zo zásobného roztoku k 16 ml syntetického média pred 
doplnením vody do 300 ml a potrebného množstva mikrobiálneho inokula, aby sa pripravila zmes s výsledným objemom 500 ml. Pripra ­
vená zmes sa preleje do druhej nádoby a prevzduš ňuje sa pod ľa pred­
chádzajúceho postupu. Tento proces sa opakuje v 15-minútových inter ­
valoch s rôznymi objemami zásobného roztoku testovanej látky, čím sa 
získa séria nádob obsahujúcich rôzne koncentrácie testovanej látky. Nakoniec sa pripraví druhá kontrola (C
 2 ). 
Po troch hodinách sa zmeria pH a dôkladne premiešaný obsah prvej 
nádoby sa preleje do meracieho prístroja, kde sa odmeria miera 
respirácie po čas doby nie dlhšej ako 10 minút. 
Meranie sa opakuje vo všetkých pripravených nádobách v 15-minú ­
tových intervaloch tak, aby kontaktný čas pri každej nádobe boli tri 
hodiny. 
Referenčná látka je testovaná pri každej vzorke mikrobiálneho 
inokula rovnakým spôsobom. 
Ak sa jednotlivé merania vykonávajú v kontaktnom čase 30 minút, 
je nevyhnutné použi ť odlišný režim (viac ako jeden kyslíkový 
merač). 
Ak sa vyžaduje meranie chemickej spotreby kyslíka, pripravia sa 
ďalšie nádoby obsahujúce testovanú látku, syntetické médium 
a vodu, ale bez aktivovaného kalu. Spotreba kyslíka sa meria 
a zaznamenáva pri prevzduš ňovaní po 30 minútach alebo 3 hodinách 
(kontaktný čas). 
2. ÚDAJE A PLATNOS Ť 
Miera respirácie sa vypo čítava zo zhotoveného záznamu medzi 
hodnotami približne 6,5 mg O  2 /liter a 2,5 mg O  2 /liter alebo po 
10 minútach, po čas ktorých bola miera respirácie nízka. Časť respi­
račnej krivky, nad ktorou sa meria miera respirácie, by mala by ť 
lineárna. 
Ak rozdiel v miere respirácie medzi dvoma kontrolami prekra čuje 
15 %, alebo ak EC  50 (v kontaktnom čase 30 minút a/alebo 3 hodiny) 
referenčnej látky prekra čuje akceptovate ľné rozmedzie hodnôt (5 až 
30 mg/liter pri 3,5-dichlórfenole), test je neplatný a musí sa zopako ­
vať. 
Percento inhibície sa vypo čítava pri každej koncentrácii testovanej 
látky (pozri 1.2). Percento inhibície je vynášané do grafu proti koncentrácii testovanej látky na logaritmickom alebo log-normálnom 
papieri a odvodí sa hodnota EC
 50 . 
95 % úrove ň spoľahlivosti pre EC  50 sa určuje podľa štandardných 
postupov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Písomná správa by mala v rámci možností obsahova ť nasledujúce 
údaje: 
— testovaná látka: údaje o chemických vlastnostiach, 
— testovací systém: zdroj, koncentrácia a prípadné predchádzajúce 
ošetrenie aktivovaného kalu, 
— testovacie podmienky: 
— pH reak čnej zmesi pred meraním respirácie, 
— teplota po čas testu, 
— trvanie testu, — referen čná látka a namerané EC
 50 , 
— abiotická spotreba kyslíka (ak je), 
— výsledky: 
— všetky údaje z meraní, — inhibi čná krivka a metódy pre výpo čet EC
 50 , 
— EC  50 ,a ak je to možné, 95 % úrove ň spoľahlivosti, EC  20 
aEC  80 , 
— všetky pozorovania a akéko ľvek odchýlky od testovacích 
metód, ktoré by mohli ovplyvni ť výsledky.  
3.2. INTERPRETÁCIA ÚDAJOV 
Hodnota EC  50 sa považuje len za pomôcku pri ur čovaní pravdepo ­
dobnej toxicity testovanej látky pre spracovanie odpadových vôd 
aktivovaným kalom alebo pre mikroorganizmy prítomné v odpadových vodách. Komplexné interakcie, ktoré sa vyskytujú v životnom prostredí, nemôžu by ť presne simulované 
v laboratórnych podmienkach. Okrem toho, testované látky, ktoré 
majú tendenciu inhibova ť oxidáciu amoniaku, môžu tiež vies ť 
k tvorbe atypických inhibi čných kriviek. Preto interpretácia týchto 
kriviek vyžaduje zvýšenú pozornos ť.
 
4. LITERATÚRA  
(1) Medzinárodný štandard ISO 8192-1986. 
(2) Broecker, B., Zahn, R.,  Water Research  11, 1977, s. 165. 
(3) Brown, D., Hitz, H. R, Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 1981, 
s. 245. 
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method No 103,  tiež 
opísané pod ľa: 
(5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser 117,  1976, s. 80. 
(6) Schefer, W.,  Textilveredlung  6, 1977, s. 247. 
(7) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 209,  Decision of the Council 
C(84) 30 final.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADÁCIA  
MODIFIKOVANÝ SCAS-TEST  
1. METÓDA  
1.1. ÚVOD 
Cieľom metódy je zhodnoti ť potencionálnu kone čnú biodegradova ­
teľnosť vo vode rozpustných, stabilných organických látok, ak sú 
vystavené ú činku relatívne vysokej koncentrácie mikroorganizmov 
počas dlhšieho časového obdobia. Životaschopnos ť mikroorga ­
nizmov je udržiavaná po čas tejto doby denným pridávaním živín 
sedimentovaných v odpadových vodách. (Po čas víkendu môžu by ť 
odpadové vody skladované pri 4  o C, alebo sa ako alternatíva môže 
použiť umelé syntetické médium pod ľa testov schválených OECD.) 
Pri interpretácii výsledkov sa musí zobra ť do úvahy možnos ť fyzi­
kálno-chemickej adsorpcie pri pevných látkach v testovacom systéme (pozri 3.2.). 
V dôsledku dlhej detek čnej doby kvapalnej fázy (36 hodín) 
a prerušovaného pridávania živín, test nesimuluje také experimen ­
tálne podmienky, aké sa docielia pri čističke odpadových vôd. 
Výsledky získané pri rôznych testovaných látkach indikujú vysoký 
biodegrada čný potenciál testu. 
Podmienky navodené testom sú vysoko priaznivé k selekcii a/alebo 
adaptácii mikroorganizmov, ktoré majú schopnos ť degradova ť testo­
vané látky. (Procedúra môže by ť využitá aj pre prípravu aklimatizo ­
vaného inokula, ktoré je prispôsobené použitiu v ďalších testoch.) 
V tejto metóde sa na stanovenie pod ľahnutia testovanej látky biodegra ­
dácii používa nameraná koncentrácia rozpusteného organického uhlíka 
(DOC). Uprednost ňuje sa stanovenie rozpusteného organického uhlíka 
(DOC) po acidifikácii a pre čistení ako rozdiel C
 celkové  – C  anorganické  . 
Simultánne využitie špecifických analytických metód umož ňuje 
stanoviť primárnu degradáciu látky (nedá sa už detekova ť parentálna 
chemická štruktúra). 
Metóda je aplikovate ľná len na tie organické látky, ktoré pri danej 
koncentrácii použitej v teste: 
— sú rozpustné vo vode (aspo ň 20 mg rozpusteného organického 
uhlíka/liter), 
— majú zanedbate ľný tlak nasýtených pár, 
— nepôsobia inhibi čne na baktérie, 
— nedochádza u nich k signifikantnej adsorpcii v testovacom 
systéme, 
— nemôže pri nich dôjs ť k úbytku v testovacom roztoku penením. 
V materiáli použitom v teste sa musí stanovi ť obsah organického 
uhlíka.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Pri interpretácii získaných výsledkov sú vhodné informácie 
o relatívnom zložení hlavných komponentov v testovacom materiáli, 
najmä v prípadoch nízkych alebo marginálnych hodnôt výsledkov. 
Pri interpretácii nízkych hodnôt výsledkov a pri selekcii vhodných 
testovacích koncentrácii sú užito čné informácie o možnej toxicite 
testovanej látky vo či mikroorganizmom.  
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
C T = koncentrácia testovanej látky vo forme organického uhlíka, 
ktorý je prítomný alebo pridaný do média na za čiatku 
prevzdušňovania (mg/liter), 
C t = koncentrácia rozpusteného organického uhlíka (DOC), zistená 
v teste pri ukon čení prevzduš ňovania (mg/liter), 
C c = koncentrácia rozpusteného organického uhlíka (DOC), zistená 
v kontrole testu po ukon čení prevzduš ňovania (mg/liter). 
V tejto metóde je biodegradácia definovaná ako vymiznutie organic ­
kého uhlíka. Biodegradácia môže by ť vyjadrená ako: 
1. Percento úbytku D  da z množstva látky pridanej denne:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100  [1] 
kde 
D da = degradácia/denný prídavok. 
2. Percento úbytku D  ssd množstva látky prítomnej na za čiatku 
každého d ňa: 
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2 (b)] 
kde 
D ssd = degradácia/látka na za čiatku dňa, 
indexy i a (i + l) sa vz ťahujú na de ň merania. 
Vzorec 2 a) sa odporú ča, ak hodnota rozpusteného organického 
uhlíka (DOC) v efluente lavíruje zo d ňa na deň, kým vzorec 2 
b) sa používa v prípade relatívne konštantnej hodnoty rozpuste ­
ného organického uhlíka (DOC) v efluente po čas dní merania.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
V určitých prípadoch, ak to výskum novej látky vyžaduje, odporú ča 
sa využiť referenčnú látku. Žiadna konkrétna referen čná látka sa pri 
tomto teste neuvádza. 
Údaje o niektorých látkach, vyhodnotené prostredníctvom kruhového 
testu, sa uvádzajú hlavne v dodatku 1, kvôli prípadnej kalibrácii 
metódy alebo pre porovnanie výsledkov získaných v ďalšej použitej 
metóde.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Aktivovaný kal z čističky odpadových vôd je umiestnený do semi ­
kontinuálnej jednotky aktivovaného kalu – SCAS jednotky. Pridá sa 
testovaná látka a sediment z domácich splaškových vôd a zmes sa prevzdušňuje 23 hodín. Po zastavení prevzduš ňovania sa kal nechá 
usadiť a supernatant nad usadeninou sa odstráni. 
Zostávajúci usadený kal v prevzduš ňovacej komore sa zmieša 
s alikvótnym množstvom testovanej látky a sedimentom splaškových 
vôd a celý cyklus sa zopakuje. 
Biodegradácia sa stanovuje ur čením obsahu rozpusteného organic ­
kého uhlíka (DOC) v supernatante. Táto hodnota sa porovná 
s hodnotou získanou v kontrolnej vzorke, ktorá je tvorená len usade ­
nými odpadovými vodami. 
Pri použití špecifických analytických metód, môžu by ť odmerané 
zmeny, ktoré nastali v koncentrácii parentálnej molekuly v dôsledku biodegradácie (primárna biodegradovate ľnosť).
 
1.5. KRITÉRIÁ KVALITY 
Reprodukovate ľnosť tejto metódy založenej na úbytku rozpusteného 
organického uhlíka (DOC) zatia ľ nebola preukázaná. (Ak uvažujeme 
primárnu biodegradovate ľnosť, veľmi presné údaje sa získajú pri 
látkach, ktoré sú degradované vo ve ľkom rozsahu.) 
Citlivosť metódy je do ve ľkej miery ovplyvnená variabilitou slepého 
pokusu a v menšej miere presnos ťou stanovenia rozpusteného orga ­
nického uhlíka (DOC) a hladinou testovanej látky v po čiatočnom 
objeme na za čiatku každého cyklu.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Príprava  
Použije sa čistá prevzduš ňovacia aparatúra vo vhodnej ve ľkosti 
alebo, ako alternatíva, zostavená pôvodná 1,5 1 SCAS jednotka 
s prívodovou trubicou vzduchu (obr. 1) pre každú testovanú látku 
a kontroly. Stla čený vzduch dodávaný do testovacích jednotiek po 
prečistení cez vatový filter by mal by ť bez prímesi organického 
uhlíka a vopred saturovaný vodou, aby sa zabránilo strate vyparova ­
ním. 
Vzorka zmesi, obsahujúca 1 až 4 g suspendovanej pevnej látky/liter, 
sa získa z aktivovaného kalu čističky odpadových vôd spracováva ­
júcej domáce splaškové vody. Na jednu prevzduš ňovaciu jednotku sa 
vyžaduje približne 150 ml tejto zmesi.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Zásobné roztoky testovanej látky sa pripravujú v destilovanej vode, 
pričom normálne vyžadovaná koncentrácia je 400 mg/liter vo forme 
organického uhlíka, z čoho vyplýva, že koncentrácia testovanej 
zložky na za čiatku každého cyklu prevzduš ňovania je 20 mg/liter 
vo forme uhlíka, ak nedochádza k biodegradácii. 
Ak to umož ňuje toxicita látky vo či mikroorganizmom, môže sa 
použiť aj vyššia koncentrácia. 
Meria sa obsah organického uhlíka v zásobnom roztoku.  
1.6.2.  Podmienky testu  
Teplota pri teste sa má pohybova ť v rozmedzí 20  o C až 25  o C. 
Používa sa vysoká koncentrácia aeróbnych mikroorganizmov (1 g/liter 
až 4 g/liter suspendovanej pevnej látky) a efektívna deten čná doba je 
36 hodín. Uhlíkový materiál zo živín odpadových vôd podlieha rýchlo oxidácii, v normálnych podmienkach zoxiduje po ôsmych hodinách od začiatku každého cyklu prevzduš ňovania. Potom do ukon čenia cyklu 
prevzdušňovania kal respiruje endogénne a po čas tejto doby je jediným 
dostupným zdrojom testovaná látka, ak aj táto nie je ľahko metaboli ­
zovateľná. Tieto charakteristiky v kombinácii s každodennou inokulá ­
ciou a za použitia domácich splaškových vôd ako média poskytujú 
vysokovhodné podmienky pre aklimatizáciu ako aj pre vysokú mieru 
biodegradácie.
 
1.6.3.  Vykonanie testu  
Odoberie sa vzorka zmesi z kalu aktivovaného domácimi splaško ­
vými vodami z čističky alebo laboratórnej jednotky a udržiava sa 
v aeróbnom stave až do jej spracovania v laboratóriu. Každá 
prevzdušňovacia jednotka ako aj kontrolná jednotka sa naplní 
150 ml roztoku zmesi (v prípade použitia originálneho testu SCAS sa vynásobí uvedený objem desiatimi) a následne sa za čne prevzduš ­ 
ňovať. Po 23 hodinách sa prevzduš ňovanie ukon čí a kal sa nechá 
45 minút sedimentova ť. Po otočení kohútika na každej nádobe sa 
odoberie 100 ml supernatantu. Vzorka sedimentu z domácich spla ­ 
škových vôd sa získava tesne pred použitím a pridá sa 100 ml kalu, ktorý zostal v jednotlivých prevzduš ňovači ch jednotkách. Prevzduš ­ 
ňovanie sa následne obnoví. V tomto štádiu sa nepridáva žiadny 
testovaný materiál, ale do jednotky sa dodáva denne zmes domácich splaškových vôd, až pokým sa nevytvorí po sedimentácii čistý super ­
natant. Tento proces zvy čajne prebieha dva týždne, po čas ktorých sa 
približuje obsah rozpusteného organického uhlíka (DOC) 
v supernatante konštantnej hodnote na konci každého cyklu prevzdušňovania. 
Na konci tejto periódy sa jednotlivé usadené kaly zmiešajú a 50 ml 
výsledného zloženého kalu sa pridá do každej jednotky. 
Do kontrolnej jednotky sa pridá 95 ml sedimentu z odpadových vôd 
a 5 ml vody, do testovacích jednotiek sa pridá 95 ml sedimentu 
z odpadových vôd a 5 ml z vhodného zásobného roztoku testovanej látky (400 mg/liter). Znovu sa za čne s prevzduš ňovaním po čas nasledu ­
júcich 23 hodín. Kal sa nechá sedimentova ť 45 minút, supernatant sa 
odoberie a analyzuje sa obsah rozpusteného organického uhlíka (DOC). 
Opísaný postup pridávania a odberov sa prevedie denne po čas celého 
trvania testu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Pred sedimentáciou je potrebné o čistiť steny prevzduš ňovacej 
jednotky, aby sa zabránilo akumulácii pevných častíc nad hladinou 
kvapaliny. V každej jednotke sa musí použi ť iná škrabka alebo 
kefka, aby nedošlo ku prenosu kontaminácie medzi jednotkami. 
V ideálnom prípade sa stanovuje obsah rozpusteného organického 
uhlíka (DOC) v supernatante denne, ale prípustné sú aj menej frek ­
ventované analýzy. Pred samotnou analýzou sa supernatant filtruje 
cez premyté 0,45 um membránové filtre alebo sa scentrifuguje. 
Membránové filtre sú prípustné, ak je potvrdené, že sa z nich neuvoľňuje uhlík, alebo že nevyvolávajú adsorpciu pevných častíc 
počas filtrácie. Teplota vzorky po čas centrifugácie nesmie presiahnu ť 
40
 o C. 
Dĺžka trvania testu pri látkach, ktoré vykazujú len malú alebo žiadnu 
biodegradáciu, nie je ur čená, ale skúsenosti nazna čujú, že by to malo 
byť vo všeobecnosti aspo ň 12 týždňov, ale nie dlhšie ako 26 týžd ­ 
ňov. 
2. ÚDAJE A PLATNOS Ť 
Zistené hodnoty rozpusteného organického uhlíka (DOC) 
v supernatante testovacích aj kontrolných jednotiek sa vynesú do 
grafov v závislosti od času. 
Pri dosiahnutí biodegradácie sa výsledky zistené v teste za čnú pribli­ 
žovať kontrolným výsledkom. Ak je v troch nasledujúcich meraniach 
zistený konštantný rozdiel medzi testovacími a kontrolnými jednot ­
kami, vykoná sa už len taký po čet meraní, aby bolo možné údaje 
štatisticky spracova ť a vypočítať percento biodegradácie testovanej 
látky alebo prípravku (D  da alebo D  ssd , pozri odsek 1.2).  
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí, ak je to možné, obsahova ť tieto informácie: 
— všetky informácie o type odpadových vôd, type použitých jedno ­
tiek, o experimentálnych výsledkoch zah ŕňajúcich testovanú 
látku, referen čnú látku, ak bola použitá a slepú vzorku, 
— teplotu, — úbytkovú krivku aj s opisom, spôsob výpo čtu (pozri 1.2), 
— dátum a lokalita, kde boli odobraté vzorky aktivovaného kalu 
a odpadovej vody, stav adaptácie, koncentrácie at ď., 
— vedecké odôvodnenie akýchko ľvek zmien v testovacej metóde, 
— podpis a dátum.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Keďže látka testovaná danou metódou zvy čajne nie je ľahko biode ­
gradovate ľná, normálny úbytok organického uhlíka v dôsledku 
samotnej biodegradácie bude v priebehu dní až týžd ňov postupný, 
okrem tých prípadov, ke ď dôjde k náhlej aklimatizácii sprevádzanej 
rapídnym vymiznutím uhlíka po nieko ľkých týžd ňoch. 
Významnú úlohu zohráva však v niektorých prípadoch fyzikálno- 
chemická adsorpcia, čo sa dá indikova ť na základe úplného alebo 
čiastočného úbytku rozpusteného organického uhlíka (DOC) prida ­
ného na za čiatku procedúry. Nasledujúci proces závisí od faktorov, 
ako sú stupe ň adsorpcie alebo koncentrácia suspendovaných pevných 
častíc v odstránenom efluente. Zvy čajne sa rozdiel medzi koncen ­
tráciou rozpusteného organického uhlíka v kontrolnom a testovanom 
supernatante postupne zvyšuje z pôvodnej nízkej hodnoty a tento rozdiel sa potom udržuje na ur čitej novej hodnote po zbytok expe ­
rimentu, pokia ľ nedôjde k aklimatizácii. 
Pre zistenie rozdielu medzi biodegradáciou (alebo čiastočnou biode ­
gradáciou) a adsorpciou je potrebné použi ť ďalšie testy. Existuje 
viacero možných spôsobov, ale najvýhodnejšie je využi ť supernatant 
alebo kal ako inokulum v základnej sade testov, pri čom sa preferuje 
respirometrický test. 
Testovaná látka, ktorá v teste vykazuje vysoký úbytok rozpusteného 
organického uhlíka, a to nie v dôsledku adsorpcie, sa považuje za potencionálne biodegradovate ľnú. Čiastočný úbytok (nie v dôsledku 
adsorpcie) indikuje, že testovaná látka podlieha aspo ň určitej obme ­
dzenej biodegradácii. 
Nízky alebo žiadny úbytok rozpusteného organického uhlíka môže 
byť spôsobený inhibíciou mikroorganizmov testovanou látkou. 
Dôkazom je lýza alebo strata kalu za tvorby zakaleného superna ­
tantu. V tom prípade sa test môže zopakova ť s použitím nižšej 
koncentrácie testovanej látky. 
Vyššiu citlivos ť poskytujú niektoré špecifické analytické metódy 
alebo použitie testovanej látky so zna
čeným  14 C uhlíkom. 
V prípade zna čeného  14 C uhlíka v testovanej látke, sa uskuto čnená 
biodegradácia potvrdzuje zachytením  14 CO 2 . 
V prípade interpretácie výsledkov v zmysle primárnej biodegradácie 
by sa v rámci možností malo uvies ť aj vysvetlenie zmien chemickej 
štruktúry, ktoré zabránili detekova ť pôvodnú testovanú látku. 
Spolu s výsledkami získanými v slepej vzorke (banku) musí by ť 
uvedená aj validácia analytických metód.  
4. LITERATÚRA  
(1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 302 A,  Decision of the 
Council C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Dodatok 1  
Test SCAS: príklad výsledkov  
Látka C T 
(mg/l) C t – C  c 
(mg/l) % biodegradácie 
(D ds ) Trvanie testu 
(dni) 
4-acetyl aminobenzén sulfonát 17,2 2,0 85 40 
tetrapropylénbenzén sulfonát 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 dietylénglykol 16,5 0,2 98,8 40 anilín 16,9 1,7 95,9 40 cyklopentan tetrakarboxylát 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Dodatok 2  
Príklad testovacieho prístroja  
Obrázok č. 1
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13  BIOKONCENTRÁCIA: PRIETOKOVÝ RYBÍ TEST  
1. METÓDA  
Táto metóda je prevzatá z OECD TG 305 (1996).  
1.1. ÚVOD 
Táto metóda opisuje postup, ktorý sa používa na charakterizáciu 
potenciálu látok na biokoncentrovanie v rybách pri prieto čných 
podmienkach. Prednos ť sa dáva prieto čným testovacím režimom, 
no pod podmienkou sp ĺňania kritérií platnosti možno použi ť aj polo­
prietočné režimy. 
Metóda poskytuje dostatok podrobností na uskuto čnenie testu 
a súčasne poskytuje primeranú vo ľnosť na prispôsobenie pokusného 
usporiadania podmienkam jednotlivých laboratórií a rozli čným 
charakteristikám testovaných látok. Najplatnejším spôsobom ju možno použi ť pri stálych organických chemických zlú čeninách 
s hodnotami log P
 ow medzi 1,5 a 6,0 (1), no dá sa ešte použi ť aj 
pre superlipofilné látky (s hodnotou P  ow > 6,0). Predbežne odhad ­
nutá hodnota biokoncentra čného faktora (BCF), ktorý sa niekedy 
označuje ako K  B , týchto superlipofilných látok bude pravdepodobne 
vyššia ako hodnota rovnovážneho biokoncentra čného faktora 
(BCF  SS ), ktorú možno dosiahnu ť v laboratórnych pokusoch. Pred ­
bežné odhady biokoncentra čného faktora organických látok 
s hodnotami log Pow do 9,0 možno získa ť pomocou rovnice Bintena 
a spol. (2). Medzi parametre, ktoré charakterizujú biokoncentra čný 
potenciál, patria vychytávacia konštanta/konštanta rýchlosti vychytá ­
vania (k  1 ), konštanta rýchlosti depurácie/vylu čovania (k  2 ) a BCF  SS . 
Analyzovanie vzoriek vody i rýb u ľahčuje použitie rádioaktívne 
označených látok, na základe ktorých sa dá overi ť, či treba usku ­
točniť identifikáciu a kvantifikáciu degrada čných produktov. Pri 
meraní celkových rádioaktívnych zvyškov (napríklad spa ľovaním 
alebo solubilizáciou tkanív) je BCF založené na materskej látke, 
všetkých jej metabolitoch zadržaných v organizme a tiež na asimi ­
lovanom uhlíku. Hodnoty BCF, ktoré sú založené na celkovom množstve rádioaktívnych zvyškov, preto nemožno priamo porov ­
návať s hodnotami BCF získanými pomocou špecifickej chemickej 
analýzy iba materskej látky. 
Na stanovenie BCF založeného iba na materskej látke možno 
v štúdiách s rádioaktívne ozna čenými látkami použi ť čistiace postupy 
a v prípade potreby možno stanovova ť najvýznamnejšie metabolity. 
Je tiež možná kombinácia rybej metabolickej štúdie a biokoncentra čnej štúdie, pri ktorej sa analyzujú a identifikujú meta ­
bolity v tkanivách.
 
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY 
Biokoncentrácia/bioakumulácia je zvyšovanie koncentrácie testo ­
vanej látky v alebo na organizme (jeho ur čenom tkanive) vzh ľadom 
na jej koncentráciu v okolitom prostredí. 
Biokoncentra čný faktor (BCF alebo K  SB ) v ktoromko ľvek čase počas 
vychytávacej fázy tohto akumula čného testu predstavuje koncen ­
tráciu testovanej látky v/na rybe alebo jej ur čenom tkanive [C  f ako 
μg/g (ppm)], vydelenú koncentráciou tejto látky v okolitom prostredí 
[C w ako [μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Rovnovážny biokoncentra čný faktor (BCF  SS alebo K  B ) sa počas 
dlhého časového obdobia významne nemení, koncentrácia testovanej 
látky v okolitom prostredí je po čas tohto obdobia stála. 
Plató alebo rovnovážny stav nastáva pri grafickom znázornení závi ­
slosti obsahu testovanej látky v rybe (C  f ) od času vtedy, ke ď sa 
priebeh krivky stáva paralelný s časovou osou a tri po sebe idúce 
analýzy C  f , uskuto čnené na vzorkách odobratých minimálne 
v dvojdňových intervaloch, sa od seba neodlišujú o viac ako ± 
20 % a ak po čas týchto troch odberov vzoriek nedochádza 
k žiadnym významným zmenám. Pri analyzovaní spájaných vzoriek je potrebné vykona ť najmenej štyri bezprostredne za sebou idúce 
analýzy. Pri pomaly sa vychytávajúcich látkach je primeranejší 
interval sedem dní. 
Biokoncentra čné faktory vypo čítané priamo z kinetických konštánt 
(k
 1 /k 2 ) sa nazývajú kinetický koncentra čný faktor (BCF  K ). 
Rozdeľovací koeficient oktanol-voda (P  ow ) je pomer rozpustnosti 
chemickej zlú čeniny v n-oktanole a vo vode pri rovnovážnych 
podmienkach (metóda A.8), tiež ozna čovaný ako K  ow . Dekadický 
logaritmus veli činy P  ow sa používa na vyjadrenie potenciálu 
chemickej látky na biokoncentráciu vo vodných živo číchoch. 
Expozičná alebo vychytávacia fáza je čas, počas ktorého sú ryby 
vystavené testovanej chemickej látke. 
Rýchlostná konštanta vychytávania (k  1 ) je číselná hodnota, ktorá 
definuje rýchlos ť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na 
testovaných rybách (alebo ich ur čenom tkanive), ke ď sú ryby vysta ­
vené jej prítomnosti (k  1 sa vyjadruje ako de ň -1 ). 
Poexpozičná alebo depura čná (vylučovacia) fáza je čas, ktorý nasle ­
duje po premiestnení testovaných rýb z prostredia obsahujúceho 
testovanú látku do média, v ktorom táto látka nie je prítomná 
a počas ktorého sa skúma depurácia (alebo čisté vylučovanie) látky 
z testovacích rýb (alebo z ich ur čených tkanív). 
Rýchlostná konštanta depurácie (vylu čovania) (k  2 ) je číselná hodnota 
definujúca rýchlos ť znižovania koncentrácie testovanej látky 
v testovacích rybách (alebo ich ur čených tkanivách) po premiestnení 
testovacích rýb z média obsahujúceho testovanú látku do média, 
ktoré túto látku neobsahuje (k  2 sa vyjadruje ako de ň -1 ). 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Test pozostáva z dvoch fáz, t. j. z expozi čnej (vychytávacej) 
a poexpozi čnej (depura čnej) fázy. Po čas vychytávacej fázy sa dve 
oddelené skupiny jedného druhu rýb vystavujú najmenej dvom koncentráciám testovanej látky. Potom sa premiestnia do prostredia, ktoré testovanú látku neobsahuje, a za čne prebieha ť depuračná fáza. 
Okrem prípadov, v ktorých dochádza po čas vychytávacej fázy iba 
k nevýznamnému vychytávaniu testovanej látky (t. j. hodnota BCF je nižšia ako 10), je depura čná fáza vždy potrebná. Po čas oboch fáz 
testu sa sleduje koncentrácia testovanej látky v/na rybách (alebo ich 
určených tkanivách). Okrem dvoch testovaných koncentrácií sa 
kontrolná skupina rýb vystavuje prostrediu s úplne identickými podmienkami, ktoré však neobsahuje testovanú látku. Ú čelom tejto 
skupiny je vztiahnutie možných nepriaznivých ú činkov pozorova ­
ných po čas biokoncentra čného testu na príslušné kontroly 
a získanie koncentrácie testovanej látky v pozadí.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
S výnimkou prípadov, v ktorých sa preukáže dosiahnutie rovnováž ­
neho stavu skôr, trvá vychytávacia fáza 28 dní. Predpovedanie d ĺžky 
vychytávacej fázy potrebnej na dosiahnutie rovnovážneho stavu možno uskuto čniť na základe rovnice, ktorá je uvedená v dodatku 
3. Depura čná fáza sa za čne premiestnením rýb do čistej nádrže 
s úplne rovnakým prostredím, ktoré však neobsahuje testovanú látku. 
Vždy keď je to možné, sa biokoncentra čný faktor prednostne vypo ­ 
číta ako pomer (BCF
 SS ) koncentrácie testovanej látky v rybách (C  f ) 
a vo vode (C  w ) pri zjavnom rovnovážnom stave a tiež ako kinetický 
biokoncentra čný faktor (BCF  K ), ako pomer rýchlostných konštánt 
vychytávania (k  1 ) a depurácie (k  2 ) za predpokladu, že proces sa 
riadi kinetikou prvého poriadku. V prípadoch, v ktorých sa proces zjavne neriadi kinetikou prvého poriadku, treba použi ť komplex ­
nejšie modely (dodatok 5). 
Ak sa rovnovážny stav nedosiahne do 28 dní, potom je potrebné 
pokračovať vo vychytávacej fáze až do jeho dosiahnutia alebo po čas 
60 dní pod ľa toho, čo nastane prv. Potom sa za čína depura čná fáza. 
Na základe modelu, ktorý najlepšie opisuje namerané koncentrácie 
testovanej látky v rybách a vo vode, sa vypo číta rýchlostná konštanta 
vychytávania, rýchlostná koncentrácia depurácie (vylu čovania) 
(alebo rýchlostné konštanty v prípade komplexnejších modelov), biokoncentra čný faktor a tam, kde je to možné, aj intervaly spo ľa­
hlivosti každého z týchto parametrov. 
BCF sa vyjadruje ako funkcia celkovej vlhkej hmotnosti rýb. 
Z osobitných dôvodov sa však môžu v prípadoch dostato čnej 
veľkosti rýb niekedy použi ť určené tkanivá alebo orgány (napríklad 
sval, pečeň), alebo sa môžu ryby rozdeli ť na jedlé (rezy/filety) alebo 
nejedlé časti (vnútornosti). Pretože pri mnohých organických látkach 
sa pozoruje jasná súvislos ť medzi ich biokoncentra čným potenciálom 
a lipofilitou, existuje tiež príslušná súvislos ť medzi obsahom tuku 
v testovaných rybách a pozorovanou biokoncentráciou týchto látok. V záujme znižovania takéhoto zdroja variability výsledkov testovania 
by sa pri ve ľmi lipofilných látkach (t. j. ak je ich log P
 ow > 3) mala 
biokoncentrácia vyjadrova ť okrem celkovej telesnej hmotnosti rýb aj 
na obsah tuku. 
Ak je to možné, obsah tuku by sa mal stanovova ť v rovnakom 
biologickom materiáli, ktorý sa použil na stanovenie koncentrácie testovanej látky.
 
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Pred uskuto čnením testu na zis ťovanie biokoncentrácie treba ma ť 
k dispozícii tieto informácie o testovanej látke: 
— rozpustnos ť vo vode, 
— rozdeľovací koeficient oktanol-voda P  ow (označovaný aj ako 
K ow , stanovený pomocou metódy HPLC uvedenej v A.8), 
— hydrolýzu, 
— fototransformáciu vo vode, stanovenú pri slne čnom alebo simu ­
lovanom slne čnom svetle a pri takých svetelných podmienkach, 
pri akých sa bude uskuto čňovať test na stanovenie biokoncen ­
trácie (3),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— povrchové napätie (t. j. pri látkach, pri ktorých nemožno stanovi ť 
log P  ow ), 
— tlak nasýtených pár, — okamžitú biodegradáciu (ak je to potrebné). Medzi ďalšie požadované informácie patrí toxicita pre druh rýb 
použitý v teste, pod ľa možnosti vyjadrená ako asymptotická LC
 50 
(t. j. nezávislá od času). Na kvantifikáciu testovanej látky 
v testovaných roztokoch a v biologickom materiáli musí by ť 
k dispozícii primeraná analytická metóda so známou presnos ťou 
a spoľahlivosťou. Musia by ť známe aj údaje o príprave 
a skladovaní vzorky. Treba tiež pozna ť analytický prah detekcie 
testovanej látky vo vode a v rybích tkanivách. Pri používaní testo ­
vaných látok ozna čených uhlíkom  14 C treba pozna ť aj percentuálne 
zastúpenie rádioaktivity spojenej s ne čistotami/prímesami.  
1.5. PLATNOS Ť TESTU 
Aby bol test platný, musia by ť dodržané tieto podmienky: 
— výkyvy teploty menšie ako ± 2  o C, 
— koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnú ť pod 60 % 
saturácie, 
— koncentrácia testovanej látky v komorách sa musí udržiava ť 
v rozmedzí ± 20 % priemeru hodnôt nameraných po čas vychy­
távacej fázy, 
— úhyn alebo iné nepriaznivé vplyvy/choroby sú na konci testu 
u testovaných aj kontrolných rýb nižšie ako 10 %; pri trvaní 
testu počas niekoľkých týžd ňov alebo mesiacov musí by ť úhyn 
alebo iné nepriaznivé javy nižší ako 5 % za týžde ň a celkovo 
nesmie presiahnu ť 30 %.  
1.6. REFEREN ČNÉ ZLÚČENINY 
V prípade potreby možno experimentálne postupy overi ť pomocou 
referenčných zlúčenín so známym biokoncentra čným potenciálom. 
Nemožno však zatia ľ odporúčať žiadne konkrétne látky.  
1.7. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.7.1.  Prístrojové vybavenie  
Pri všetkých sú častiach zariadení sa treba vyhýba ť používaniu mate ­
riálov, ktoré sa môžu rozpúš ťať, absorbova ť a vylúhováva ť a ktoré 
môžu ma ť na ryby nepriaznivé ú činky. Možno používa ť bežné 
nádrže pravouhlého alebo valcovitého tvaru z vhodného materiálu a takej ve ľkosti, ktorá zodpovedá ve ľkosti násady rýb. Pokia ľ 
možno, treba sa vyhýba ť používaniu hadi čiek a rúrok z mäkkých 
plastických látok. Prednostne treba používa ť hadičky, rúrky vyrobené 
z teflónu®, nehrdzavejúcej ocele alebo skla. Zo skúseností vyplýva, že pri látkach s vysokým absorp čným koeficientom (napríklad pri 
syntetických pyretroidoch) môže by ť potrebné používa ť posilanizo ­
vané sklo. V takýchto prípadoch je potrebné zariadenia po skon čení 
pokusu zlikvidova ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Voda  
Pri testoch sa vo všeobecnosti používa prírodná voda, ktorá musí by ť 
získavaná z nekontaminovaných zdrojov s jednotnou kvalitou. Riediaca voda musí ma ť takú kvalitu, aby umožnila prežívanie 
zvoleného druhu rýb po čas celého obdobia aklimatizácie 
a testovania bez toho, aby sa pri nich prejavil nezvy čajný vzhľad 
alebo správanie. V ideálnom prípade treba preukáza ť, že testovaný 
druh dokáže vo vode používanej na riedenie prežíva ť, rásť 
a rozmnožova ť sa (napríklad pomocou testu v laboratórnej kultúre 
alebo testu toxicity pre životný cyklus). Vodu treba charakterizova ť 
najmenej z h ľadiska pH, tvrdosti, celkového obsahu tuhých látok 
a organicky viazaného uhlíka a pokia ľ možno tiež obsahu amoniaku, 
dusitanov a alkalitov a pri morských druhoch aj z h ľadiska slanosti. 
Hoci sú parametre, ktoré sú potrebné na zaru čenie optimálneho 
blahobytu rýb, dobre známe, v dodatku 1 sú uvedené odporú čané 
maximálne koncentrácie celého radu parametrov charakterizujúcich 
sladkú aj morskú vodu. 
Voda musí ma ť počas celého trvania testu stálu kvalitu. Hodnota pH 
by sa mala pohybova ť v rozmedzí 6,0 až 8,5, no po čas daného testu 
by nemala kolísa ť o viac ako ± 0,5 jednotiek pH. Aby voda neov ­
plyvňovala neprimeraným spôsobom výsledky testovania (napríklad 
vznikaním komplexov testovanej látky) alebo aby nemal nepriaznivý 
vplyv na násadu testovacích rýb, je potrebné zabezpe čiť 
v pravidelných intervaloch odber vzoriek na analýzu. Ak je známe, že voda má relatívne stálu kvalitu, sta čí, ak sa v nej bude napríklad 
raz za každé tri mesiace stanovova ť obsah ťažkých kovov (napríklad 
Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavných aniónov a katiónov (napríklad Ca, 
Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), pesticídov (napríklad celkové organofosfore čné 
a organochloridové pesticídy), celkového organicky viazaného uhlíka a rozsuspendovaných tuhých častíc. Ak si voda preukázate ľne zacho­
váva stálu kvalitu po čas najmenej jedného roka, potom možno vyko ­
návať tieto stanovenia menej často (napríklad každých šes ť mesia­
cov). 
Obsah prirodzených tuhých častíc aj celkového organicky viazaného 
uhlíka by mal by ť v riediacej vode čo možno najnižší, aby sa zabrá ­
nilo absorpcii testovanej látky na organickú hmotu, v dôsledku čoho 
by sa mohla zníži ť jej biologická dostupnos ť (4). Maximálny 
prípustný obsah tuhých častíc je 5 mg/l (suchá hmotnos ť, neprechá ­
dzajúca cez 0,45 μm filter) a celkového organicky viazaného uhlíka 
2 mg/l (pozri dodatok 1). V prípade potreby treba vodu pred použitím filtrova ť. Príspevok testovacích rýb (exkrementy) 
a zvyškov krmiva k obsahu organicky viazaného uhlíka vo vode 
by mal by ť čo možno najnižší. Koncentrácia organicky viazaného 
uhlíka v testovacej nádrži by nemala po čas celého trvania testu 
prekročiť koncentráciu organicky viazaného uhlíka, pochádzajúcu 
z testovanej látky, prípadne použitého solubiliza čného činidla, 
o viac ako 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3.  Testovacie roztoky  
Pripraví sa zásobný roztok testovanej látky s vhodnou koncentráciou. 
Zásobný roztok treba pod ľa možnosti pripravi ť jednoduchým zmie ­ 
šaním alebo trepaním testovanej látky v rozpúš ťacej vode. Použitie 
rozpúšťadiel alebo disperzných činidiel (rozpúš ťajúcich činidiel) sa 
neodporú ča, hoci v niektorých prípadoch to môže by ť v záujme 
prípravy zásobného roztoku s vhodnou koncentráciou potrebné. 
Medzi rozpúš ťadlá, ktoré možno použi ť, patrí etanol, metanol, 
etylénglykol, momometyléter, etylénglykoldimetyléter, dimetylfor ­
mamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použi ť 
Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. 
Činidlá, ktoré ľahko podliehajú biodegradácii, treba používa ťs 
opatrnosťou, pretože môžu v prietokových testoch spôsobova ť 
problémy s rastom baktérií. Testovanú látku možno ozna čiť rádioak­
tívnym izotopom a musí ma ť najvyššiu možnú čistotu (napríklad 
podľa možnosti > 98 %).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Pri prieto čných testoch je potrebný systém pre nepretržitý prívod 
a zrieďovanie zásobného roztoku testovanej látky (napríklad dávko ­
vacie čerpadlo, úmerný dávkova č, saturátorový systém), ktorým sa 
zabezpečuje jej prívod do testovacích komôr. Objem každej testovacej 
komory by sa mal denne vymeni ť aspoň päťkrát. Treba uprednostni ť 
prietočný systém, hoci tam, kde to nie je možné (malo by to napríklad 
nepriaznivý vplyv na testovací organizmus) sa môžu pod podmienkou splnenia kritérií validity použi ť aj poloprieto čné usporiadania. Prieto ­
kovú rýchlos ť zásobného roztoku aj zrie ďovacej vody je potrebné 
skontrolova ť 48 hodín pred za čatím pokusu a potom najmenej raz 
denne počas celého jeho trvania. Treba pri tom kontrolova ť aj rýchlos ť 
prietoku cez každú testovaciu komoru a zabezpe čiť, aby výkyvy prie ­
toku v rámci komôr i medzi nimi nepresahovali 20 %.
 
1.7.4.  Vo ľba biologických druhov  
Pri voľbe biologických druhov sa treba riadi ť týmito kritériami: 
musia by ť ľahko dostupné, možno ich získa ť vo výhodnej ve ľkosti 
a možno ich uspokojivo udržiava ť v laboratóriu. Ako ďalšie kritériá 
pri voľbe vhodných druhov rýb treba bra ť do úvahy ich rekrea čný, 
komerčný a ekologický význam, ako aj ich pomernú citlivos ť, úspeš­
nosť použitia v minulosti a podobne. 
Odporúčané testovacie druhy sú uvedené v dodatku 2. Možno použi ť 
aj iné druhy, postup testovania však treba upravi ť tak, aby sa 
dosiahli vhodné testovacie podmienky. Použitie daného druhu a pokusnej metódy treba v takomto prípade odôvodni ť.
 
1.7.5.  Uchovávanie rýb  
Aklimatizujte zásobnú populáciu rýb najmenej dva týždne vo vode 
a pri testovacej teplote. Po čas celej aklimatizácie ich k ŕmte dosta ­
točným množstvom stravy, ktorá sa bude používa ť aj počas pokusu. 
Po 48-hodinovej privykacej-adapta čnej fáze sa zaznamená úhyn 
a uplatnia sa tieto selek čné kritériá: 
— úhyn za sedem dní prevyšuje 10 % celej populácie: celá násada 
sa vyradí, 
— úhyn za sedem dní je medzi 5 a 10 % populácie: aklimatizova ť 
ďalších sedem dní, 
— úhyn za sedem dní je nižší ako 5 % populácie: násadu možno 
použiť; ak je úhyn po čas ďalších siedmich dní vyšší ako 5 %, 
celá násada sa vyradí. 
Treba zabezpe čiť, aby boli použité testovacie ryby bez zjavných 
chorôb a abnormalít. Všetky choré ryby treba z pokusu vyradi ť. 
Dva týždne pred testom ani po čas jeho trvania nesmú by ť ryby 
ošetrované proti ochoreniam.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. PRIEBEH TESTU  
1.8.1.  Predbežná skúška  
V záujme optimalizácie podmienok hlavného testovania môže by ť 
užitočné vykona ť predbežný pokus zameraný napríklad na vo ľbu 
koncentrácie/koncentrácií testovanej látky a trvanie vychytávacej 
a depuračnej fázy.  
1.8.2.  Podmienky vystavenia testovanej látke  
1.8.2.1. T r v a n i e v y c h y t á v a c e j f á z y 
Trvanie vychytávacej fázy možno predpoveda ť na základe praktic ­
kých skúseností (napríklad na základe predchádzajúcej štúdie alebo 
znalosti o akumulácii príbuznej látky) alebo na základe istých empi ­
rických vz ťahov vychádzajúcich bu ď z rozpustnosti danej látky vo 
vode, alebo z jej rozde ľovacieho koeficientu v systéme oktanol/voda 
(pozri dodatok 3). 
Okrem prípadov, v ktorých nastane rovnovážny stav preukázate ľne 
skôr, by mala vychytávacia fáza trva ť 28 dní. Ak sa rovnovážny stav 
do 28 dní nedosiahne, potom treba vychytávaciu fázu a analyzovanie vzoriek pred ĺžiť buď do jeho dosiahnutia, alebo na 60 dní, pod ľa 
toho, čo nastane skôr.
 
1.8.2.2. T r v a n i e d e p u r a č n e j f á z y 
Na dosiahnutie dostato čného odstránenia (napríklad 95 %) testovanej 
látky z tela zvy čajne stačí polovičný čas trvania vychytávacej fázy 
(tento odhad je vysvetlený v dodatku 3). Ak je čas potrebný na 95 % 
odstránenie testovanej látky z praktického h ľadiska pridlhý a je 
napríklad dva razy dlhší ako trvanie vychytávacej fázy (t. j. viac 
ako 56 dní), potom možno použi ť kratšie obdobie (napríklad kým 
koncentrácia testovanej látky nebude nižšia ako 10 % rovnovážnej koncentrácie). V prípade látok, ktorých vychytávame a depurácia sa riadia zložitejším priebehom ako pri jednokomorovom rybom modeli 
s kinetikou prvého poriadku, treba použi ť na stanovenie rýchlostnej 
konštanty depurácie dlhšie obdobie. Podmienkou však je, aby bola koncentrácia testovanej látky po čas takéhoto pred ĺženého obdobia 
vždy vyššia, ako je prah analytickej detekcie.
 
1.8.2.3. P o č t y t e s t o v a c í c h r ý b 
Počet testovacích rýb na testovanú koncentráciu vo ľte tak, aby boli 
pri každom odbere vzoriek k dispozícii najmenej štyri kusy na jedno 
meranie. V prípade potreby vyššej štatistickej sily treba na jednu 
vzorku viac rýb. 
V prípade použitia dospelých rýb zaznamenajte, či sa pokus vyko ­
náva na sam čekoch, alebo sami čkách, alebo na oboch pohlaviach. Pri 
používaní oboch pohlaví treba ešte pred za čatím testovania zdoku ­
mentovať, že rozdiel v obsahu tuku medzi nimi nie je významný. 
Môže byť potrebné spájanie všetkých sam čekov i sami čiek. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Pri každom odbere vzoriek treba vybera ť ryby podobnej ve ľkosti, tak 
aby najmenšie z nich neboli menšie ako dve tretiny hmotnosti 
najväčších. Všetky musia by ť z rovnakého roka a musia pochádza ť 
z toho istého zdroja. Vek a hmotnos ť majú pod ľa všetkého niekedy 
na hodnoty BCF významný vplyv (1), a preto je potrebné tieto údaje 
presne zaznamenáva ť. Odporúča sa, aby sa priemerná hmotnos ť rýb 
zistila pomocou odváženia subpopulácie rýb ešte pred uskuto čnením 
testovania.  
1.8.2.4. V e ľ k o s ť n á s a d y 
Používa sa vysoký pomer vody k rybám, aby sa minimalizovalo 
znižovanie C  w spôsobené pridaním rýb na za čiatku pokusu a aby 
sa zabránilo znižovaniu koncentrácie rozpusteného kyslíka. Je dôle ­ 
žité, aby ve ľkosť násady zodpovedala použitému druhu rýb. 
V každom prípade sa však odporú ča zvyčajná veľkosť násady 
v rozmedzí 0,1 do 1,0 g rýb (vlhká hmotnos ť) na liter vody 
a deň. Možno použi ť aj vyššie násady, treba však zabezpe čiť udržia­
vanie požadovanej koncentrácie testovanej látky v rozmedzí povole ­
ných výkyvov ± 20 % a koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie. 
Pri voľbe primeraných režimov nasadzovania treba bra ť do úvahy 
bežné prirodzené prostredie daného druhu. Napríklad ryby žijúce pri dne si môžu vyžadova ť väčšiu plochu dna nádrže pri rovnakom 
objeme vody ako druhy žijúce pri hladine.
 
1.8.2.5. K ŕ m e n i e 
Počas aklimatiza čnej aj testovacej fázy sa ryby k ŕmia primeranou 
stravou so známym obsahom tukov a celkových bielkovín 
v množstve dostato čnom na udržiavanie rýb v dobrom zdravotnom 
stave a na priberanie telesnej hmotnosti. Po čas aklimatiza čnej aj 
testovacej fázy sa ryby k ŕmia denne množstvom, ktoré zodpovedá 
približne 1 až 2 % telesnej hmotnosti. Takýto režim k ŕmenia zabez ­
pečí počas celého testu relatívne stálu koncentráciu lipidov. Množ ­
stvo krmiva treba pravidelne prepo čítavať, napríklad raz týždenne, 
aby sa zabezpe čila jednotná telesná hmotnos ť aj obsah tukov. Na 
účely takéhoto výpo čtu možno hmotnos ť rýb nachádzajúcich sa 
v testovacej komore odhadnú ť na základe hmotnosti rýb odobratých 
z danej komory pri poslednom odbere vzoriek. Ryby, ktoré zostávajú 
v pokusnej komore, sa nesmú váži ť. 
Neskonzumované krmivo aj výkaly sa z testovacej komory denne 
odsávajú, a to krátko po skon čení kŕmenia (do pol až jednej hodiny). 
Testovacie komory treba po čas celého testovacieho obdobia 
udržiavať v čo možno naj čistejšom stave, aby sa na čo možno 
najnižšiu úrove ň znižovala aj koncentrácia organickej hmoty. Prítom ­
nosť organicky viazaného uhlíka totiž môže obmedzova ť biologickú 
dostupnos ť testovanej látky (1). 
Mnohé krmivá obsahujú rybaciu mú čku, krmivo je preto potrebné 
analyzova ť na prítomnos ť testovanej látky. Je žiaduce, aby sa 
v krmive stanovoval aj obsah pesticídov a ťažkých kovov.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. S v e t l o a t e p l o t a 
Dĺžka fotoperiódy je zvy čajne 12 až 16 hodín a teplota (± 2  o C) by 
mala byť primeraná druhu testovacích rýb (dodatok 2). Musí by ť 
známy typ osvetlenia a jeho charakteristiky. Treba zachováva ť 
opatrnosť z hľadiska možnosti fototransformácie testovanej látky 
pod vplyvom svetelných podmienok štúdie. Treba udržiava ť prime­
rané osvetlenie, aby sa ryby nevystavovali ú činkom neprirodzených 
fotoproduktov. V niektorých prípadoch môže by ť potrebné používa ť 
filtre na elimináciu ultrafialového žiarenia s vlnovou d ĺžkou nižšou 
ako 290 nm.  
1.8.2.7. T e s t o v a n é k o n c e n t r á c i e 
Ryby sa v prieto čných podmienkach vystavujú najmenej dvom 
koncentráciám testovanej látky vo vode. Vyššia (alebo najvyššia) koncentrácia testovanej látky sa zvy čajne volí tak, aby predstavovala 
približne 1 % jej akútnej asymptotickej LC
 50 a aby bola najmenej 
desať ráz vyššia ako jej prah detegovate ľnosti pomocou používanej 
analytickej metódy. 
Najvyššiu testovanú koncentráciu tiež možno stanovi ť vydelením 
hodnoty akútnej 96-hodinovej LC  50 príslušným pomerom akútnej/ ­
chronickej koncentrácie (príslušné pomery sa môžu pri niektorých chemikáliách pohybova ť od 3 to 100). Ak je to možné, druhú (prí ­
padne ďalšie) z testovaných koncentrácií treba voli ť tak, aby sa od 
prvej odlišovala/odlišovali o faktor 10. Ak to z dôvodu kritéria 1 % 
hodnoty LC
 50 alebo analytického prahu nie je možné, potom možno 
použiť faktor nižší ako 10 alebo treba uvažova ť o označení testo­
vanej látky izotopom  14 C. Nesmú sa používa ť koncentrácie, ktoré sú 
vyššie ako rozpustnos ť testovanej látky. 
V prípade použitia solubiliza čného činidla nesmie by ť jeho koncen ­
trácia vyššia ako 0,1 ml/l a malo by by ť rovnaké pre všetky pokusné 
nádrže. Musí by ť známe, akým spôsobom prispievajú spolo čne 
s testovanou látkou k celkovému obsahu organicky viazaného uhlíka v testovanej vode. V každom prípade treba urobi ť všetko pre to, aby 
sa tieto látky nemuseli vôbec používa ť.
 
1.8.2.8. K o n t r o l y 
Okrem pokusných skupín je potrebné ma ť aj kontrolnú skupinu 
udržiavanú iba v riediacej vode a v príslušných prípadoch aj 
kontrolnú skupinu udržiavanú v riediacej vode s prídavkom iba solu ­
bilizačného činidla. Podmienkou je, aby solubiliza čné činidlo nemalo 
na ryby žiadny ú činok. Ak takýto ú činok má, potom je potrebné 
zaradiť do pokusu obidve kontrolné skupiny.  
1.8.3.  Frekvencia merania kvality vody  
Počas testu treba vo všetkých nádržiach sledova ť obsah rozpusteného 
kyslíka, TOC, pH a teplotu. Pri kontrolnej skupine a v jednej nádrži s vyššou (najvyššou) koncentráciou treba mera ť celkovú tvrdos ť, 
a ak to prichádza do úvahy, aj slanos ť vody. Množstvo rozpusteného 
kyslíka, a ak to prichádza do úvahy, aj slanos ť je počas vychytávacej 
fázy potrebné mera ť minimálne tri razy, t. j. na jej za čiatku, približne 
v strede a na konci. Po čas depura čnej fázy treba tieto hodnoty mera ť 
raz týždenne. TOC sa musí mera ť na začiatku testu (24 a 48 hodín 
pred začatím vychytávacej fázy) pred pridaním rýb a potom 
najmenej raz týždenne po čas vychytávacej aj depura čnej fázy. 
Teplotu treba mera ť denne, pH na za čiatku a konci každého obdobia 
a tvrdosť raz počas každého testu. Aspo ň v jednej nádrži by sa malo 
zabezpečiť kontinuálne meranie teploty.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Odber a analyzovanie vzoriek rýb a vody  
1.8.4.1. H a r m o n o g r a m o d o b e r a n i a v z o r i e k r ý b a v o d y 
Voda na stanovenie koncentrácie testovanej látky sa z testovacích 
nádrží odoberá pred pridaním rýb a po čas vychytávacej i depura čnej 
fázy. Vzorky vody sa ako minimum odoberajú v rovnakom čase ako 
ryby a tiež pred k ŕmením. Po čas vychytávacej fázy sa merajú 
koncentrácie testovanej látky, aby sa overovalo sp ĺňanie kritéria plat ­
nosti. 
Vzorky rýb sa odoberajú najmenej pä ť ráz počas vychytávacej 
a najmenej štyri razy po čas depura čnej fázy. Dostato čne presné 
hodnoty BCF sa niekedy pri takomto po čte vzoriek vypo čítavajú 
veľmi ťažko, najmä ak sa depurácia zjavne riadi inou ako jednodu ­
chou kinetikou prvého poriadku. V takýchto prípadoch je žiaduce robiť odber po čas oboch fáz častejšie (pozri dodatok 4). Navyše 
odobraté vzorky sa usklad ňujú a analyzujú iba vtedy, ak sa výsledky 
prvého kola analýz ukážu by ť pre výpo čet BCF s požadovanou 
presnosťou nedostato čné. 
Príklad prijate ľného harmonogramu odberu vzoriek je uvedený 
v dodatku 4. Jednoducho možno vypo čítať aj iné harmonogramy, 
použijúc pri tom iné predpokladané hodnoty P
 ow potrebné na 
výpočet dĺžky vystavenia, ktorá je potrebná na dosiahnutie 95 % 
vychytávania. 
Počas vychytávacej fázy pokra čujú odbery až po dosiahnutie rovno ­
vážneho stavu alebo po čas 28 dní, pod ľa toho, čo nastane skôr. Ak 
sa rovnovážny stav do 28 dní nedosiahne, odbery pokra čujú až do 
jeho dosiahnutia alebo po čas 60 dní, pod ľa toho, čo nastane skôr. 
Pred začatím depura čnej fázy sa ryby premiestnia do čistej nádrže.  
1.8.4.2. O d b e r a p r í p r a v a v z o r i e k 
Vzorky vody sa na analyzovanie odoberajú napríklad odsávaním 
pomocou inertnej hadi čky zo stredu testovacej nádrže. Oddelenie 
frakcií testovanej látky dostupných pre biodegradáciu od frakcií pre biodegradáciu nedostupných často nemožno uskuto čniť ani filtrá ­
ciou, ani centrifugáciou (najmä v prípade superlipofilných chemikálií 
s hodnotou log P
 ow > 5 (1) (5), takže podrobova ť vzorky týmto 
postupom nemusí by ť potrebné. 
Namiesto toho treba vykonáva ť také opatrenia, ktoré zabezpe čia čo 
možno najlepšiu čistotu nádrží, a po čas vychytávacej aj depura čnej 
fázy treba sledova ť obsah celkového organicky viazaného uhlíka. 
Pri každom odbere vzoriek sa z testovacích nádrží odoberie prime ­
raný počet rýb (zvy čajne minimálne štyri). Odobraté ryby sa rýchle 
opláchnu, osušia pomocou absorp čného materiálu a pomocou najpri ­
meranejšej a najhumánnejšej metódy ihne ď usmrtia a odvážia. 
Voda aj ryby by sa mali analyzova ť podľa možnosti ihne ď po 
odbere, čím sa predíde degradácii alebo iným stratám. Priebežne 
počas vykonávania testu treba vypo čítavať približné rýchlosti vychy ­
távania a depurácie. Okamžitým vykonávaním analýz predídeme aj 
oddialeniu identifikácie dosiahnutia rovnovážneho stavu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Pri oddialení analýz treba vzorky primeraným spôsobom uskladni ť. 
Pred začatím štúdie sa treba oboznámi ť so správnym spôsobom 
skladovania danej testovanej látky – napríklad zamrazením, sklado ­
vaním pri 4  o C, extrahovaním at ď. 
1.8.4.3. K v a l i t a a n a l y t i c k ý c h m e t ó d 
Celý postup v zásade závisí od presnosti a citlivosti analytických 
metód používaných pri testovanej látke. Treba preto experimentálne 
overiť, či sú presnos ť a reprodukovate ľnosť chemických analýz, ako 
aj úroveň opätovného získania testovanej látky z vody aj z rýb pre 
danú metódu uspokojivé. Treba tiež overi ť, či nie je testovaná látka 
v detegovate ľných množstvách prítomná v riediacej vode. 
V prípade potreby sa hodnoty C  w a C  f získané z testu upravia pod ľa 
úrovne opätovného získania testovanej látky a hodnôt pozadia ziste ­
ných pri kontrolách. So vzorkami rýb aj vody je potrebné po čas 
celého testovania zaobchádza ť tak, aby sa minimalizovala koncen ­
trácia a straty (vznikajúce napríklad v dôsledku absorpcie na odobe ­
racie zariadenie).  
1.8.4.4. A n a l y z o v a n i e r y b í c h v z o r i e k 
V prípade použitia rádioaktívne ozna čeného materiálu možno stano ­
vovať celé množstvo ozna čenej látky (t. j. materskú zlú čeninu aj jej 
metabolity) alebo možno vzorky pre čistiť a stanovova ť materskú 
látku osobitne. V rovnovážnom stave alebo na konci vychytávacej 
fázy, pod ľa toho, čo nastane skôr, možno charakterizova ť aj hlavné 
metabolity. V prípadoch, v ktorých je hodnota BCF vyjadreného celkovým množstvom rádioaktívnych zvyškov ≥ 1 000 %, môže 
byť žiaduce a pre niektoré kategórie chemických látok, ako sú pesti ­
cídy, sa to dôrazne odporú ča, aby sa identifikovali a kvantifikovali 
tie degrada čné produkty testovanej látky, ktoré v rybích tkanivách 
predstavujú v rovnovážnom stave ≥ 10 % celkového množstva 
zvyškov. Po identifikácii a kvantifikácii degrada čných produktov, 
ktoré predstavujú v rybích tkanivách ≥ 10 % celkového množstva 
rádioaktívnych zvyškov, sa tiež odporú ča identifikácia 
a kvantifikácia takýchto degrada čných produktov aj v testovanej 
vode. 
Koncentráciu testovanej látky je zvy čajne potrebné stanovi ť v každej 
jednej odváženej rybe. Ak to nie je možné, potom možno vzorky 
odobraté pri rovnakom odbere spája ť, hoci spájaním sa obmedzujú 
štatistické metódy, ktoré možno použi ť pri spracúvaní výsledkov. Ak 
má niektorá štatistická metóda a stupe ň štatistickej významnosti 
osobitnú dôležitos ť, potom je potrebné použi ť v teste taký po čet rýb, 
ktorý umožní uskuto čniť požadovaný spôsob spájania vzoriek (6) (7). 
BCF je potrebné vyjadri ť ako funkciu celkovej vlhkej hmotnosti 
a v prípade vysoko lipofilných látok aj ako funkciu obsahu tuku. 
Ak je to možné, obsah tuku treba stanovi ť pri každom odbere 
vzoriek. Obsah tuku treba stanovi ť pomocou vhodnej metódy (lite ­
rárne odkazy 8 a 2 v dodatku 3). Ako štandardnú metódu možno 
odporúčať extrakciu zmesou chloroformu a metanolu (9). Jednotlivé 
metódy neposkytujú rovnaké výsledky (10), pri každej z nich je 
preto dôležité uvies ť podrobné údaje. Ak je to možné, obsah tuku 
treba stanovova ť v rovnakom extrakte, ktorý sa pripravil na analy ­
zovanie testovanej látky, pretože tuky býva často potrebné pred 
chromatografickým krokom zo vzorky odstráni ť. Obsah tukov 
v rybách (ako mg/kg vlhkej hmotnosti) na konci pokusu by sa nemal líši ť od obsahu tukov na jeho za čiatku o viac ako ± 25 %. 
Treba zaznamena ť aj percentuálny obsah sušiny v tkanivách, aby 
bolo možné vyjadri ť obsah tuku aj na suchú hmotnos ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Vychytávacia krivka testovanej látky sa získa grafickým vynášaním 
koncentrácie v/na rybách (alebo ur čenom tkanive) po čas vychytá ­
vacej fázy proti času na aritmetických osiach. Ak krivka dosiahne 
plató, t. j. ak sa stane približne asymptotická k časovej osi, potom 
možno rovnovážnu hodnotu BCF  SS vypočítať zo vzťahu: 
C f rovnovážne ðpriemerÞ 
C w rovnovážne ðpriemerÞ 
Ak sa rovnovážny stav nedosiahne, potom sa môže da ť BCF  SS 
vypočítať s presnos ťou dostato čnou na vyhodnotenie rizika na 
základe „rovnovážneho stavu“ pri 80 % (1,6/k  2 ) alebo 95 % (3,0/k  2 ) 
rovnováhe. 
Stanovuje sa aj koncentra čný faktor (BCF  K ), ktorý je vyjadrený ako 
pomer dvoch kinetických konštánt prvého poriadku, t. j. k  1 /k 2 . 
Rýchlostná konštanta depurácie (k  2 ) sa zvy čajne stanovuje 
z depura čnej krivky (t. j. z grafického znázornenia znižovania 
koncentrácie testovanej látky v rybách v závislosti od času). 
Z hodnoty k  2 a na základe Cf, ktorá je odvodená z vychytávacej 
krivky, sa potom vypo číta rýchlostná konštanta vychytávania (k  1 ) 
(pozri tiež dodatok 5). Prednostným spôsobom stanovovania BCFK a oboch rýchlostných konštánt k
 1 a k 2 sú nelineárne metódy odha ­
dovania parametrov pomocou po čítača (11). Na výpo čet k  1 a k  2 
možno okrem toho použi ť grafické metódy. V prípade zjavnej neli ­
neárnosti depura čnej krivky (t. j. ak sa depurácia neriadi kinetikou 
prvého poriadku) treba použi ť komplexnejšie modely (pozri literárne 
odkazy v dodatku 3) a poradi ť sa s bioštatistikom.  
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
V prípadoch, v ktorých sa koncentrácie testovaných roztokov pohy ­
bujú na úrovni blízkej prahu detegovate ľnosti analytickej metódy, 
treba interpretova ť výsledky s ve ľkou opatrnos ťou. 
Jasne vymedzené krivky vychytávania a odbúravania sú príznakom 
dobrej kvality údajov o biokoncentrácii. Rozdiely vychytávacích/ ­
depuračných konštánt medzi dvoma testovanými koncentráciami 
musia by ť menšie ako 20 %. Významné rozdiely v rýchlosti vychy ­
távania a depurácie medzi dvoma testovacími koncentráciami treba 
zaznamena ť a treba sa pokúsi ť sa o ich možné vysvetlenie. Medza 
spoľahlivosti hodnôt BCF sa pri dobre zostavených štúdiách 
zvyčajne približuje k hodnote ± 20 %.  
3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY  
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie:  
3.1. TESTOVANÁ LÁTKA 
— fyzikálna povaha a v primeraných prípadoch fyzikálno-chemické 
vlastnosti, 
— identifika čné chemické údaje (vrátane obsahu organicky viaza ­
ného uhlíka, ak to prichádza do úvahy) 
— v prípade rádioaktívneho ozna čenia presná poloha ozna čeného 
atómu/ozna čených atómov a percento rádioaktivity viazanej na 
nečistoty/prímesi.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. TESTOVACÍ BIOLOGICKÝ DRUH 
— vedecký názov, kme ň, pôvod, všetky zásahy uskuto čnené pred 
pokusom, aklimatizácia, vek, rozsah hmotností at ď. 
3.3. TESTOVACIE PODMIENKY 
— typ pokusu (napríklad prieto čný alebo poloprieto čný systém), 
— typ a charakteristiky osvetlenia a d ĺžka svetlej fázy/svetlých fáz, 
— zostava pokusu (napríklad po čet a veľkosť testovacích komôr, 
rýchlosť výmeny celého objemu vody, po čet replikátov, po čet 
rýb v replikáte, po čet testovaných koncentrácií, d ĺžka vychytá ­
vacej a depura čnej fázy, frekvencia odoberania vzoriek rýb 
a vody), 
— metóda prípravy zásobného roztoku a frekvencia jeho obnovo ­
vania (solubiliza čné činidlo, v prípade použitia musí by ť uvedená 
jeho koncentrácia a príspevok k obsahu organicky viazaného uhlíka), 
— nominálne testované koncentrácie, priemery hodnôt nameraných 
v testovacích nádržiach a ich štandardné odchýlky a spôsob, 
akým sa vypo čítali, 
— zdroj zrie ďovacej vody, opis jej každého ošetrenia pred poku ­
som, výsledky každého preukazovania, že ryby sú schopné 
v pokusnej vode ži ť, charakteristiky vody: pH, tvrdos ť, teplota, 
koncentrácia rozpusteného kyslíka, zvyškové hladiny chlóru (ak boli merané), celkový organicky viazaný uhlík, rozsuspendované tuhé častice, slanos ť testovacieho média (ak prichádza do úvahy) 
a všetky ďalšie merania, 
— kvalita vody v testovacej nádrži, pH, tvrdos ť, TOC, teplota 
a koncentrácia rozpusteného kyslíka, 
— podrobné informácie o režime k ŕmenia (napríklad typ krmiva, 
zdroj, zloženie – prinajmenšom obsah tukov a bielkovín, a ak 
to je možné, aj dávané množstvo a frekvencia k ŕmenia), 
— informácie o spracúvaní vzoriek rýb a vody vrátane údajov o ich 
príprave, skladovaní, extrakcii a analytických metódach použi ­
tých pri stanovovaní testovanej látky a obsahu tukov (ak sa 
meral).
 
3.4. VÝSLEDKY 
— výsledky všetkých predbežných štúdií, 
— úhyn rýb v kontrolnej skupine a v skupine nachádzajúcej sa 
v expozi čnej komore a všetky pozorované abnormality 
v správaní, 
— obsah tukov v rybách (ak sa pri testovaní stanovoval), — krivky (vrátane všetkých nameraných údajov) opisujúce vychy ­
távanie a depuráciu testovanej látky v rybách, čas potrebný na 
dosiahnutie rovnovážneho stavu,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— Cf a Cw (spolu so štandardnou odchýlkou a rozsahom, ak je to 
potrebné) v každom čase odberu vzoriek [Cf je vyjadrené v μg/­
g vlhkej hmotnosti (ppm) celého tela alebo jeho ur čeného 
tkaniva, napríklad tuku, a Cw vyjadrené v μg/ml (ppm)]. 
Hodnoty Cw pre kontrolné skupiny (treba uvies ť aj hodnoty 
pozadia), 
— rovnovážny biokoncentra čný faktor (BCFSS), resp. kinetický 
biokoncentra čný faktor (BCFk), a ak to prichádza do úvahy, 
tak aj 95 % medzu spo ľahlivosti pre konštanty vychytávania 
a depurácie (všetky vyjadrené vzh ľadom na celé telo zviera ťa 
alebo jeho ur čené tkanivo a celkový obsah tukov, ak bol mera ­
ný), medzu spo ľahlivosti a štandardné odchýlky (ak sú 
k dispozícii) a metódy výpo čtu pre každú použitú koncentráciu 
testovanej látky, 
— v prípade použitia rádioaktívne ozna čených látok, a ak sa to 
vyžaduje, možno uvies ť aj hromadenie všetkých zachytených 
metabolitov, 
— čokoľvek nezvy čajné, čo sa počas testu pozorovalo, všetky 
odchýlky od týchto postupov a všetky iné významné informácie. 
Počas predbežných pokusov a pri vypracúvaní experimentálnej 
zostavy minimalizujte výskyt výsledkov typu „nezachytené pri 
danom prahu detegovate ľnosti“, pretože takéto výsledky sa nedajú 
použiť na výpo čet konštánt.  
4. ODKAZY  
(1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persis ­
tent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, pp. 117 – 156. 
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29 – 390. 
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. 
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 
(5) US EPA 822-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Initia ­
tive Technical Support Document for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumulation Factors. July 1994. 
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
Analytical Manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or 
Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) 
Research Triangle Park, N. C. 27711. 
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects 
of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, 
toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3. Part II. Government Publis ­
hing Office, the Hague, Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099 – 1105. 
(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell 
R. J. (1991). Evaluation of selected methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp, 1431 – 1436. 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow- 
through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final 
report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. 
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
Conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
DODATOK 1  
Chemické charakteristiky prijate ľnej zrieďovacej vody  
Látka Hrani čná koncentrácia  
1 Tuhé častice 5 mg/l 
2 Celkový organicky viazaný uhlík 2 mg/l 3 Neionizovaný amoniak 1 μg/l 
4 Zvyškový chlór 10 μg/l 
5 Celkové pesticídy na báze organofosfátov 50 ng/l 6 Celkové pesticídy na báze organicky viazaného chlóru 
plus polychlórované bifenyly 50 ng/l 
7 Celkový organicky viazaný chlór 25 ng/l 
8 Hliník 1 μg/l 
9 Arzén 1 μg/l 
10 Chróm 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Me ď 1 μg/l 
13 Železo 1 μg/l 
14 Olovo 1 μg/l 
15 Nikel 1 μg/l 
16 Zinok 1 μg/l 
17 Kadmium 100 ng/l 18 Ortu ť 100 ng/l 
19 Striebro 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
DODATOK 2  
Druhy rýb odporú čané na testovanie  
Odporúčaný druh Odporúčaný roz- 
sah testovacích 
teplôt Odporúčaná 
celková d ĺžka 
testovacíchi 
zvierat (cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cvprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) danio pásikavé 20 – 25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) 20 – 25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
kapor oby čajný 20 – 25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
a Schlegel) kaprozúbka 20 – 25 4,0 ± 1,0 
5 Poccílía reticulata (Teleostei, Poecilüdae) (Peters) 
gupka dúhová 20 – 25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) slne čnica modrohrdlá 20 – 25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykíss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) pstruh dúhový 13 – 17 8,0 ± 4,0 
S Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linneaus) pich ľavka siná 18 – 20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London. Series B.. Vol. 252, p. 231.  
V jednotlivých krajinách sa používajú rozli čné brakické a morské druhy rýb, napríklad:  
Lelostormus xanthous  
kaprozúbka  Cyprinodon variegntus 
Menidia bery llina 
Cymatogaster aggregata 
Parophrys vertulus Leptocottus armatus  
pichľavka siná  Gasterosteus aculeatus  
pyskatec  Dicentracus labrax  
belička európska  Albumus albumus
 
Odchyt  
Sladkovodné ryby, ktoré sú uvedené v tabu ľke, sa jednoducho chovajú, resp. sú dostupné po čas 
celého roka, zatia ľ čo dostupnos ť morských a brakických druhov je čiastočne obmedzená na 
jednotlivé krajiny. V kontrolovaných podmienkach bez výskytu ochorení a parazitov ich možno 
rozmnožova ť a chovať buď na rybích farmách, alebo v laboratóriách, takže pokusné zvieratá sú 
zdravé a je známy ich pôvod. Tieto ryby sú dostupné v mnohých častiach sveta.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
DODATOK 3  
Predpove ď trvania vychytávacej a depura čnej fázy  
1. Predpove ď trvania vychytávacej fázy  
Pred vykonaním testu možno na základe empirického vz ťahu medzí k  2 
a rozdeľovacím koeficientom pre zmes n-oktanol/voda (P  ow ) alebo medzi 
k 2 a rozpu st nos ťou vo vode (s) odhadnú ť hodnotu konštanty k  2 , a tým aj 
istý zlomok času potrebný na dosiabnutie rovnovážnebo stavu. 
Odhad hodnoty k  2 (vyjadrený ako de ň -1 ) možno získa ť napríklad na 
základe tohto vz ťahu (1)]: 
log 10 k 2 = - 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (rovnica 1) 
Ďalšie vzťahy sú uvedené v odkaze (2). 
Ak hodnota P  ow nie je známa, potom sa dá odhad (3) urobi ť na základe 
znalosti rozpustnosti látky (s) pomocou vz ťahu: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (rovnica 2) 
kde 
s = rozpustnos ť (mol/l): (n = 36). 
Tieto vzťahy platia iba pre chemické látky s hodnotou log P  ow v rozmedzí 
2 a 6,5 (4). 
Čas potrebný na dosiahnutie istej časti rov novážn eh o stavu sa dá získa ť 
pomocou dosadenia hodnoty k  2 do všeobecnej kinetickej rovnice, ktorá 
opisuje vychytávanje a depuráciu (kinetika prvého poriadku):  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
alebo ak je C  w konštantné  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (rovnica 3) 
V oblastiach blízkych rovnovážnemu stavu (t—> ∞) možno rovnicu 3 
zjednoduši ť (5) (6) na vz ťah: 
C f ¼ k 1 
k 2: C w alebo  C f /C w = k  1 /k 2 = BCF 
Hodnota sú činu k  1 /k 2 · C w sa približuje ku koncentrácii v rybách pri 
„rovnovážnom stave“ (C  f, s ). 
Rovnica 3 sa dá prepisa ť takto]  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ alebo  C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (rovnica 4) 
Po predbežnom odhade hodnoty k  2 na základe rovnice 1 alebo 2 možno 
pomocou rovnice 4 vypo čítať určité percento rovnovážneho stavu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Ako orientácia platí, že štatisticky významná d ĺžka trvania vy c hytávace 
j fázy pre získanie statistic ky významných údajov (BCF  K ) je čas. za ktorý 
dosiahne krivka závislosti logaritmu koncentrácie testovanej látky v rybách od lineárneho času svoju polovicu, čiže 1,6/k
 2 alebo 80 % rovnovážneho 
stavu, avšak nie viac ako 3,0/k  2 alebo 95 % rovnovážneho stavu (7). 
Čas potrebný na dosiahnutie 80 % rovnovážneho stavu je (rovnica 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 jeb t  80 ¼ 1; 6 
k 2 (rovnica 5) 
Podobne pre 95 % rovnovážneho stavu platí:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (rovnica 6) 
Napríklad trvanie vychytávacej fázy (zvyšovanie koncentrácie) pre látky 
s hodnotou log P  ow = 4 je (s použitím rovníc 1, 5 a 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dní  -1 
do (80 %) = 1,6/0,652, t. j. 2,45 dní (59 hodín) 
alebo do (95 %) = 3,0/0,652, t. j. 4,60 dní (110 hodín) 
Podobne pre testovanú látku s hodnotou s = 10  -5 mol/l (log(s) = 5,0) je 
trvanie zvyšovania koncentrácie (rovnice 1, 2, 5 a 6): 
log 10 (p ow ) = - 0,862 (- 5,0)+ 0,710= 5,02 
log 10 k 2 = - 0,414 (5,02) + 1,47 
k 2 = 0,246 dní  -1 
do (80 %) = 1,6/0,246, t. j. 6,5 dní (156 hodín) 
alebo do (95 %) = 3,0/0,246, t. j. 12,2 dní (293 hodín) Alternatívne výraz: t
 eq = 6,54 × 10  -3 P ow + 55,31 (hodiny). 
možno použi ť na vypo čítanie času potrebného na dosiahnutie efektívneho 
rovnovážneho stavu (4).  
2. Predpovedanie trvama depura čnej fázy 
Na základe všeobecnej rovnice opisujúcej vychyrávanie a deputáciu (kine ­
tika prvého poriadku) sa dá odhadnú ť aj čas, ktorý je potrebný na zníženie 
telesnej koncentrácie látky na ur čité percento jej pôvodnej koncentrácie 
v tele (1) (8). 
Predpokladá sa, že hodnota C  w je počas depura čnej fázy nulová. Rovnicu 
možno preto zjednoduši ť na vzťah: 
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f alebo C  f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
kde C  f, o je koncentrácia na za čiatku depura čnej fázy. 50 % depurácia sa 
potom dosiahne za čas (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 alebo t  50 ¼ 0; 693 
k 2 
Podobne sa dá vypo čítať, že 95 % depurácia sa dosiahne za:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Ak sa v prvom období dosiahne 80 % vychytávania (1,6/k  2 ) a celkové 
odbúranie po čas depura čnej fázy bude 95 % (3,0/k  2 ), potom trvá depura čná 
fáza približne dva razy tak dlho ako fáza vychytávacia. 
Je však potrebné ma ť na pamäti, že tieto odhady sú založené na pred ­
poklade, že vychytávame aj depurácia sa riadia kinetikou prvého poriadku. Ak pri nich kinetika prvého poriadku zjavne neplatí, potom je potrebné použiť komplexnejšie modely [uvedené napríklad v odkaze (1)].
 
Odkazy  (citované v dodatku 5) 
(1) Spacie A. a Hamelink J. L. (1982), Alternative  models for describing 
the bloconcentration of organics in fish . Environ, Toxicol, and Chem. 
1. pp. 309 – 320. 
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration  in fish: comparison of biocon ­
centration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemi ­
cals. Water Quality Institute, Denmark. 
(3) J. Chiou C T, a Schmedding D. W, (1982),  Partitioning of organic 
Compounds in octanol-water systems . Environ, Sci. Technol 16 (1), 
pp, 4 – 10. 
(4) Hawker D. W. and Connell D, W, (1988).  influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish . 
Wat. Res. 22 (6), pp. 701 – 707. 
(5) Branson D. R., Blau G. E,, Alexander H. C and Neely W, B. (1975),  
Transactions of the American Fisheries Society , 104 (4), pp, 785 – 
792. 
(6) Ernst W. (1985),  Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals . Ed, By 
Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P, H, Part 4,4. pp 
24 3-255. SCOPE. 1 98 5. John Wiley and Sons Ltd, N. Y. 
(7) Reilly P, M„ Bajramovic R., Blau G, E.., Branson D, R. and Sauerhoff 
M. W. (1977).  Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kinetic models , Can, J. Chem. Eng. 
55, pp, 514 – 622. 
(8) Könemann H, and Van Leeuwen K. (1980),  Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of Six Chlorobenzenes by Guppies . 
Chemosphere, 9, pp. 3 – 19.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
DODATOK 4  
Teoretický príklad odberu vzoriek pre stanovovanie biokoncentrácie látok s hodnotou log P  ow = 4 
Odbery rýb Harmonogram odberov 
Počet vzoriek vody Po čet rýb na vzorku Minimálna požadovaná 
častosť odberov (dni) Prídavné odbery  
Vychytávacia faza -1 
0 20 (*) 
2 Pridať 45 až 30 rýb 
Prvý 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
Druhý 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
Tretí 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
Štvrttý 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
Piaty 4,7 2 6 
Depuračná fáza Preniest' ryby do vody 
bez testovanej látky 
Šiesty 5,0 5,3 4 
(4) 
Siedmy 5,9 7,0 4 
(4) 
Ôsmv 9,3 11,2 4 
(4) 
Deviaty 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Vodu odoberajte až po pridaní najmenej „troch objemov testovacej komory“. 
Čísla v zátvorkách udávajú po čet vzoriek (vody, rýb), ktoré sa majú odobra ť v prípade dodato čného odoberania vzoriek.  
Pozn. : Vopred odhadnutá hodnota k  2 pre látky s log P  ow = 4 je 0,652 d ňa -1 . Celkové trvanie pokusu je 3  × fázy vychytávania: 3 × 4,6 
dňa, t. j. 14 dní. Spôsob odhadu „fázy vychytávania“ je uvedený v dodatku 3.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
DODATOK 5  
Rozlišovacia schopnos ť modelu  
Pri väčšine biokoncentra črých údajov sa predpokladá, že sú „dostato čne uspoko ­
jivo“ opísané pomocou dvojdielneho/dvojparametrového modelu, ktorý vyplýva z priamky udávajúcej koncentrácie testovanej látky v rybách po čas depura čnej 
fázy, keď sa graficky znázornia na semilogaritmickom papieri. (Ak nemožno 
tieto body opísa ť priamkou, potom treba použi ť komplexnejšie modely; pozri 
napríklad v Spacie a Hamelink. odkaz 1 v dodatku 3.)
 
Grafická metóda na stanovenie rýchlostnej konštanty depurácie (eliminácie) k  2 
Vyneste koncentráciu testovanej látky zistenú v každej rybej vzorke proti času na 
semilogaritmickom papieri. Sklon krivky je:  
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Treba si uvedomi ť, že odchýlky od priamkového priebehu môžu poukazova ť na 
komplexnejší priebeh depurácie ako ten, ktorý podlieha kinetike prvého poriadku. 
Na riešenie priebehu depurácie podliehajúcej kinetike nie prvého poriadku môže byť potrebné použitie grafickej metódy.
 
Grafická metóda na stanovenie konštanty vychytávania k  1 
Hodnota k  1 sa na základe známej hodnoty k  2 vypočíta takto:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (rovnica 1) 
Hod nota C  f sa odčíta v strede hladkej vychytávacej priamky získanej z údajov 
vynesením dekadického logaritmu koncentrácie proti času (v aritmetickej mier ­
ke). ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Počítačová metóda na výpo čet rýchlostných konštánt vychytávania 
a depurácie  
Prednostnou metódou na stanovovanie biokoncentra čného faktora a oboch 
rýchlostných konštánt k  1 a k  2 sú nelineárne metódy odhadovania parametrov 
pomocou po čítača. Tieto programy vypo čítavajú hodnoty pre k  1 a k 2 na základe 
známych po sebe idúcich koncentrácií v čase a pod ľa tohto modelu:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (rovnica 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t < t  c (rovnica 3) 
kde t  c = čas na konci vychytávacej fázy. 
Takýmto prístupom možno získa ť odhady štandardných odchýlok k  1 a k 2 . 
Hodnotu k  2 možno vo vä čšine prípadov stanovi ť na základe depura čnej krivky 
s veľkou presnos ťou a medzi k  1 a k 2 existuje silná korelácia, ak sa stanovujú sú časne. 
Odporúčame preto, aby sa najprv vypo čítala na základe iba depura čných údajov 
hodnota k  2 a potom možno pomocou nelineárnej regresnej analýzy vypo čítať k 1 . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  RASTOVÝ TEST MLÁ ĎAT RÝB  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda vplyvu toxicity na rast rýb je totožná 
s metódou OECD TG 215 (2000).  
1.1. ÚVOD 
Tento test je ur čený na odhadnutie ú činkov pred ĺženého pôsobenia 
chemických látok na rast mlá ďat rýb. Vychádza z metódy, ktorá bola 
vyvinutá a podrobená skupinovým testom (1) (2) v rámci Európskej únie, používa sa na odhadnutie ú činkov chemických látok na rast mlá ďat 
pstruha dúhového  (Oncorynchus mykiss)  za prieto čných podmienok. 
Môžu sa použi ť aj iné dobre zdokumentované druhy. K dispozícii sú 
napríklad skúsenosti z rastových testov pre zebri čky (Danio rerio)  (
 1 ) 
(3), (4) a ryžové rybky ((medaka,  Oryzias latipes)  (6) (7) (8). 
Pozri všeobecný úvod časť C. 
1.2. DEFINÍCIE  
Najnižšia zistená ú činná koncentrácia (LOEC):  je najnižšia testo ­
vaná koncentrácia látky, pri ktorej je pozorované, že má významný 
účinok (p < 0,05) v porovnaní s kontrolou. Všetky skúšobné koncen ­
trácie vyššie ako LOEC musia ma ť škodlivé ú činky rovnaké alebo 
vyššie než ú činky pozorované pri LOEC.  
Nezistená ú činná koncentrácia (NOEC):  je testovaná koncentrácia 
hneď pod LOEC.  
EC x : v tejto skúšobnej metóde je to koncentrácia testovanej látky, 
ktorá spôsobila x % zmenu v raste rýb, ak sa porovnajú s kontrolnou 
skupinou.  
Nasadené množstvo:  je mokrá hmotnos ť rýb na objem vody.  
Chovná hustota:  je počet rýb na objem vody.  
Špecifická rastová miera individuálnej ryby:  vyjadruje mieru rastu 
jedného indivídua, založenú na jeho po čiatočnej hmotnosti.  
Priemerná špecifická rastová miera v nádrži:  vyjadruje význam 
miery rastu pre populáciu v nádrži pri jednej koncentrácií.  
Pseudošpecifická miera rastu:  vyjadruje individuálnu mieru rastu 
porovnaním s po čiatočnou hmotnos ťou populácie v nádrži.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish  
(Danio rerio),  a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252. 231 – 236.
 1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Mláďatá rýb v exponenciálnej fáze rastu sa po ich zvážení umiestnia 
do testovacích komôr a sú vystavené ú činkom testovanej látky, 
rozpustenej vo vode v rôznych subletálnych koncentráciách, 
najlepšie pri prieto čných podmienkach, alebo ak to nie je možné, 
pri vhodných semistatických podmienkach. Doba testu je 28 dní. Ryby sa k ŕmia denne. Dávka potravy závisí od po čiatočnej hmot ­
nosti ryby a prepo čítava sa po 14-tich d ňoch. Na konci testu sa ryby 
odvážia znovu. Vplyvy na mieru rastu sa analyzujú použitím regres ­
ného modelu, aby sa odhadla koncentrácia, ktorá môže spôsobi ť x- 
percentnú odchýlku v miere rastu, t. j. EC
 x (napr. EC  10 , EC  20 alebo 
EC 30 ). Údaje sa môžu porovna ť s kontrolnými hodnotami, a tým sa 
stanoví najnižšia zistená efektívna koncentrácia (LOEC) a odtia ľ 
nezistená efektívna (ú činná) koncentrácia (NOEC).  
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LATKE 
Výsledky testov akútnej toxicity (pozri testovaciu metódu C.1.) 
prevedených najlepšie s druhmi vybratými na tento test by mali byť dostupné. Z toho vyplýva, že rozpustnos ť vo vode a tlak pár 
testovanej látky je známy a že je dostupná spo ľahlivá analytická 
metóda na kvantitatívne stanovenie testovanej látky v testovanom 
roztoku a tiež sa dá stanovi ť rozpätie údajov o presnosti. 
Užitočné sú informácie ako štruktúrny vzorec, čistota látky, stabilita 
vo vode a na svetle pK
 a (disociačná konštanta), P  ow (rozdeľovaci 
koeficient v systéme oktanol-voda), výsledky z testov biodegradabi ­
lity (pozri testovacia metóda C.4.).  
1.5. PLATNOS Ť TESTOVACEJ METÓDY 
Pre platnos ť testu je potrebné uplat ňovať nasledujúce podmienky: 
— mortalita v kontrolných skupinách nesmie presiahnu ť 10 % na 
konci testu, 
— hmotnos ť rýb v kontrolnej skupine musí dostato čne narásť, aby 
umožnila detekcie minimálnej odchýlky v miere rastu, ktorá je považovaná za významnú. Kruhový test (2) ukázal, že pre dúho ­
vého pstruha musí hmotnos ť v kontrolnej vzorke vzrás ť najmenej 
o polovicu (t. j. 50 %) z ich po čiatočnej hmotnosti za 28 dní 
napr. počiatočná hmotnos ť 1g/ryba (= 100 %), kone čná hmot­
nosť po 28 dňoch: > 1,5 g/ryba (> 150 %), 
— koncentrácia rozpusteného kyslíka musí by ť najmenej 60 % satu ­
račnej hodnoty vzduchom (ASV) po čas testu, 
— teplota vody sa môže líši ť nie viac ako ± 1
 o C medzi testovacími 
komorami v danom čase testu a mala by by ť udržiavaná 
v rozsahu 2  o C v teplotných rozsahoch špecifikovaných pre testo ­
vaný druh (dodatok 1).  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Zariadenie  
Obvyklé laboratórne vybavenie a nasledujúce špeciálne zariadenie: 
— zariadenie na meranie kyslíka a pH meter,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— zariadenie na stanovenie tvrdosti vody a alkality, 
— vhodné prístroje na kontrolu teploty a kontinuálne monitorovanie, — nádrže z chemicky inertných materiálov a vhodnej kapacity 
v súvislosti na odporu čenú násadu a sie ťovú hustotu (pozri 
odsek 1.8.5. a dodatok 1), 
— vhodné presné váhy (t. j. presnos ť do ± 0,5 %).
 
1.6.2.  Voda  
Použiteľná voda na test je každá voda, v ktorej testovaný druh 
vykazuje vhodné dlhotrvajúce prežívanie a rast. Musí ma ť 
konštantnú kvalitu po čas celého testu. pH vody má by ť v rozsahu 
od 6,5 do 8,5, ale po čas daného testu môže by ť v rozsahu ± 0,5 pH 
jednotky. Odporu čená tvrdos ť vody je 140 mg/l (ako CaCO  3 ). Aby 
sa zaistilo, že voda používaná ako rozpúš ťadlo nebude ma ť prílišný 
vplyv na výsledky testu (napr. tvorbu komplexu testovanej látky), vzorky sa odoberajú v intervaloch po čas analýzy. Ak je známe, že 
voda má relatívne konštantnú kvalitu, zistenie ťažkých kovov (napr. 
Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO
 4 ), pesticídov (napr. celkové organofosfore čné 
a organochlórové pesticídy) celkového organického uhlíka, suspen ­
dovaných látok sa vykonáva napr. každé tri mesiace. Ak sa 
potvrdilo, že kvalita vody je stabilná najmenej po čas jedného roka, 
zistenia sa nemusia vykonáva ť tak často a intervaly medzi nimi sa 
môžu pred ĺžiť (napr. každý šiesty mesiac). Niektoré chemické vlast ­
nosti pre vodu ur čenú na rozpúš ťanie sú v zozname v dodatku 2.  
1.6.3.  Testované roztoky  
Testovacie roztoky vybraných koncentrácií sa pripravia riedením 
zásobného roztoku. 
Zásobný roztok má by ť pripravený jednoduchým miešaním alebo 
trepaním testovanej látky v riediacej vode mechanickým 
prostriedkom (napr. miešaním alebo ultrazvukom). Nasycovanie 
kolón sa môže využi ť na docielenie vhodne koncentrovaných zásob ­
ných roztokov. 
Použitie rozpúš ťadiel alebo látok zlepšujúcich rozpustnos ť sa môže 
vyžadova ť v niektorých prípadoch, aby sa zabezpe čila príprava 
vhodne koncentrovaných zásobných roztokov. Vhodnými rozpúš ťad­
lami sú napr. acetón, etanol, metanol, dimetyl sulfoxid, dimetylfor ­
mamid a tritylénglykol. Príklady vhodných dispergentov sú Cremophor RH 40, Tween 80, Methylcellulose 0,01 % a HCO- 40. Ak sa používajú ľahko biodegradovate ľné reagenty (napr. 
acetón) a/alebo vysoko prchavé zlú čeniny, tieto môžu spôsobi ť 
problémy v stavbe baktérií v prieto čných testoch. Ak sa použijú 
látky zvyšujúce rozpustnos ť, nesmú ma ť žiadny signifikantný ú činok 
na rast rýb alebo vidite ľné škodlivé ú činky na mlá ďatá, ako by sa 
preukázali iba pri kontrole rozpúš ťadla (napr. meracia pumpa, 
proporcionálny zmiešava č, saturačný systém).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Na prieto čné testy sa vyžaduje systém, ktorý kontinuálne rozde ľuje 
zásobný roztok testovanej látky a dodáva ho do testovacích komôr. 
Prietoky zásobných roztokov a vody na riedenie sa kontrolujú v časových intervaloch, najlepšie denne po čas trvania testu 
a nesmú sa meni ť viac ako 10 %. Kruhový test (2) preukázal, že 
pre pstruha dúhového je posta čujúca frekvencia výmeny vody po čas 
testu 6 litrov/g hmotnosti ryby/de ň (pozri odsek 1.8.2.2.). 
Pre semi-statické testy bude frekvencia výmeny prostredia závisie ť 
od stability testovanej látky, ale odporú ča sa denne vymie ňať vodu. 
Ak predbežný test stability preukázal, že koncentrácia testovanej 
látky nie je stabilná po čas periódy obnovy (t. j. je mimo rozsahu 
80 – 120 % nominálnej koncentrácie alebo pod 80 % nameranej počiatočnej koncentrácie), je treba vzia ť do úvahy použitie prieto č­
ného testu.
 
1.6.4.  Výber druhov  
Pstruh dúhový  (Oncorhynchus mykiss)  je odporú čaným druhom na 
tento test odvtedy, čo sa v skupinových testoch získalo dostato čné 
množstvo skúseností s týmto druhom (1), (2). Môžu sa však použi ť 
aj iné zdokumentované druhy, ale postupy pri testovaní sa musia 
prispôsobi ť tak, aby sa dosiahli vyhovujúce podmienky testu napr. 
aj pre zebri čku (Danio rerio)  (3), (4) a ryžovú rybku  (Oryzias lati ­
pes) (5), (6), (7) sú tieto skúsenosti dostato čné. Je potrebné uvies ť 
odôvodnenie na výber druhov rýb a na výber experimentálnej 
metódy.  
1.6.5.  Chov rýb  
Testované ryby sa budú vybera ť z populácie jednej zásoby, najlepšie 
z rovnakého poteru (ikier), ktorý bol držaný najmenej dva týždne pred testom v podobných podmienkach vody a osvetlenia. Musia by ť 
kŕmené dávkou potravy, ktorá sa rovná minimálne 2 % z telesnej 
hmotnosti ryby na de ň a optimálna dávka vo výške 4 % z telesnej 
hmotnosti ryby na de ň v období skladovania a po čas testu. 
V nasledujúcom 48-hodinovom nastavovacom období je zaznamená ­
vaná mortalita a uplat ňujú sa nasledujúce kritériá: 
— mortalita vyššia ako 10 % populácie po siedmich d ňoch, 
zamietne sa celá vsádka, 
— mortalita medzi 5 % a 10 % z populácie, aklimatizácia ďalších 
sedem dní, ak je mortalita viac ako 5 % po čas druhých siedmich 
dní, zamietne sa celá vsádka, 
— mortalita je menej ako 5 % z populácie po siedmich d ňoch, 
vsádka sa akceptuje. 
Ryby nemajú by ť vystavené chorobám po čas dvoch týžd ňov pred­
chádzajúcich testu alebo po čas testu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. KONCEPCIA TESTU 
Koncepcia testu sa vz ťahuje na výber po čtu a odstup testovaných 
koncentrácií, po čet nádrží v každej koncentra čnej hladine a po čet rýb 
v každej nádrži. Ideálne je vybera ť koncepciu s oh ľadom na: 
— objekt štúdie, 
— metódu štatistickej analýzy, ktorá bude použitá, 
— dostupnos ť a cenu experimantálnych zdrojov. 
Ak je to možné, stav objektu by mal špecifikova ť štatistickú váhu, 
kde daná ve ľkosť diferencie (napr. miera rastu) a detekcia sa vyža ­
duje alebo alternatívne sa vyžaduje odhad EC  x (napr. s x = 10, 20 
alebo 30, najlepšie na menej ako 10). Bez toho nemôže by ť daný 
nemenný predpis o ve ľkosti štúdie. 
Je dôležité vzia ť na vedomie, že usporiadanie, ktoré je optimálne 
(najlepšie využíva prostriedky) pri použití jednej metódy štatistickej analýzy, nie je nutne optimálne pre inú metódu. Doporu čené uspo­
riadanie pre odhad LOEC/NOEC teda nebýva rovnaké ako usporia ­
danie pre analýzu regresií. 
V mnohých prípadoch sa regresnej analýze dáva prednos ť pred 
analýzou rozptylu, a to z dôvodov diskutovaných Stephanom 
a Rogersom (8). Ak sa však nenájde vhodný regresný model (r
 2 
< 0,9), malo by sa použi ť stanovenie NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Koncepcia regresnej analýzy  
Dôležité predpoklady na koncepciu regresnej analýzy sú: 
— Učinná koncentrácia (napr. EC  10, 20, 30  ) a koncentra čný rozsah 
testovanej látky, v ktorom nás zaujímajú jej ú činky, a ktoré sa 
merajú koncentráciami zahrnutými do testu. Ak je efektívna koncentrácia v strede rozsahu testovaných koncentrácií, potom 
bude presnos ť, s ktorou budú vykonané odhady ú činných 
koncentrácií, najvyššia. Pri výbere vhodných testovacích koncen ­
trácií môže by ť nápomocný predbežný test na zistenie rozsahu. 
— Aby sa umožnilo uspokojivé štatistické vytvorenie modelu, test 
by mal zah ŕňať najmenej jednu kontrolnú nádrž a pä ť ďalších 
nádrží pri rôznych koncentráciách. Ak sa použila látka, ktorá zvyšuje rozpustnos ť, okrem testovaných sérií je potrebné otes ­
tovať jednu kontrolnú nádrž, obsahujúcu látku zvyšujúcu 
rozpustnos ť v najvyššej testovanej koncentrácii, ak je to možné 
(pozri odsek 1.8.3 a 1.8.4). 
— Je potrebné použi ť vhodné geometrické alebo logaritmické rady (9) 
(pozri dodatok 3). Preferuje sa logaritmický odstup medzi testova ­
nými koncentráciami.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— Ak je k dispozícii viac ako 6 nádrží, každá z nich by mala by ť 
použitá, aby sa získali opakovania alebo distribúcia cez koncen ­
tračný rozsah, aby sa umožnilo uzatvorenie hladín. Požaduje sa 
jedno aj druhé z týchto meraní.  
1.7.2.  Koncepcia odhadu NOEC/LOEC za použitia analýzy odchýlok  
Na každú koncentráciu je najvhodnejšie ma ť niekoľkonásobné 
nádrže a štatistická analýza sa vykonáva na úrovni nádrže (10). Bez paralelných nádrží nemôže by ť uvoľnený žiaden rozptyl na 
odchýlku medzi nádržami pre jednotlivé ryby. Avšak skúsenosti 
ukázali (11), že odchýlka medzi nádržami bola ve ľmi malá 
v porovnaní s vnútronádržovou (t. j. medzi rybami) v prípade skúša ­
nia. Z toho dôvodu je akceptovate ľná alternatívna štatistická analýza 
vykonaná na úrovni jednotlivých rýb. 
Obvykle sa používa najmenej pä ť testovaných koncentrácií 
v geometrickom rade s faktorom nepresahujúcim hodnotu 3,2. 
Vo všeobecnosti, ak sa vykonáva test s nieko ľkonásobnými 
nádržami, po čet kontrolných paralelných nádrží a teda aj po čet rýb 
by mal by ť dvojnásobok po čtu v každej testovanej koncentrácií, 
ktorý by mal by ť rovnaký (12), (13), (14). Na druhej strane, ak sa 
nepoužili paralelné nádrže, po čet rýb v kontrolnej skupine má by ť 
rovnaký ako po čet v každej testovanej koncentrácii. 
Ak ANOVA vychádza z nádrží uprednostnených pred jednotlivými 
rybami, [ktoré môžu ma ť za následok bu ď individuálnu klasifikáciu, 
alebo použitie „pseudo“ špecifickej miery rastu (pozri odsek 21.2.)], je potrebné ma ť dostatočný počet niekoľkonásobných nádrží, aby 
bolo možné stanovi ť štandardnú odchýlku nádrží v rámci koncen ­
trácie. To znamená, že stupne vôle na chyby v analýze odchýlok by mali byť rovné najmenej 5 (10). Ak sú opakované iba kontrolné 
skupiny, hrozí nebezpe čenstvo, že chyba premenlivosti (variability) 
bude ovplyvnená, pretože sa môže zvýši ť s veľkosťou hodnoty 
miery rastu. Ke ďže miera rastu pravdepodobne poklesne so vzrasta ­
júcou koncentráciou, bude to ma ť za následok tendenciu nadhodno ­
covať spomínanú variabilitu.
 
1.8. POSTUP  
1.8.1.  Výber a váženie testovaných rýb  
Je dôležité minimalizova ť odchýlku v hmotnosti rýb hne ď na 
začiatku testu. Vhodné rozmedzie ve ľkostí na rôzne odporu čené 
druhy rýb na tento test sú dané v dodatku 1. Pre celú skupinu rýb 
použitých v teste by sa mal rozsah individuálnych hmotností na začiatku štartu udržiava ť v optimálnom stave ± 10 % aritmetického 
priemeru hmotnosti a v žiadnom prípade nemôže prekro čiť 25 %. 
Odporúča sa odváži ť aj vedľajšiu vzorku rýb pred testom, aby sa 
mohla odhadnú ť priemerná hmotnos ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Zásobná populácia nedostane potravu 24 hodín pred za čiatkom testu. 
Ryby sa potom vyberajú náhodne. Po použití obvyklého anestetika 
[napr. vodný roztok 100 mg/l tricaine metán sulfonátu (MS 222) neutralizovaného pridaním dvoch dielov bikarbonátu sodného na jeden diel MS 222], ryby budú vážené jednotlivo ako mokrá hmot ­
nosť (vytreté do sucha) s presnos ťou danou v dodatku 1. Ryby 
s hmotnos ťou v naplánovanom rozsahu sa ponechajú a potom 
náhodne rozdelia do testovacích nádob. Je potrebné zaznamena ť 
celkovú mokrú hmotnos ť rýb v testovacej nádobe. Použité aneste ­
tiká, ako aj manipulácia s rybami (vrátane otierania a váženia) môžu 
spôsobiť stres a poškodenie mlá ďat rýb, predovšetkým tých druhov, 
ktoré sú malých rozmerov. Z tohto dôvodu sa musí manipulácia s mláďatami rýb vykonáva ť s najväčšou možnou opatrnos ťou, aby 
sa neprivodil stres a poškodenie testovaných zvierat. 
Ryby sa opätovne odvážia po 28 d ňoch testu (pozri odsek 1.8.6). Ak 
sa však nazdávame, že je potrebné znova vypo čítať dávky krmiva, 
ryby sa odvážia znovu na 14. de ň testu (pozri odsek 1.8.2.3). Na 
stanovenie zmien vo ve ľkosti rýb sa môže sa použi ť aj iná metóda, 
napríklad fotografická, na základe ktorej sa môže regulova ť dávka 
potravy.
 
1.8.2.  Podmienky expozície  
1.8.2.1.  Trvanie  
Test trvá ≥ 28 dní.  
1.8.2.2.  Nasadené množstvá a chovná hustota  
Je dôležité, aby nasadené množstvo a chovná hustota boli vhodné na 
použitý testovaný druh (pozri dodatok 1). Ak je chovná hustota príliš vysoká, stres z nahustenia môže privodi ť zníženie miery rastu 
a chorobnos ť násady. Ak je príliš nízka, teritoriálne správanie dokáže 
ovplyvňovať rast. V každom prípade by nasadené množstvo malo 
byť dostatočne nízke, aby sa dosiahla koncentrácia rozpustného 
kyslíka najmenej 60 % AS V bez použitia prevzduš ňovača. Skupi­
nové testy (2) ukázali, že u pstruha dúhového je prípustné nasadenie 
množstva 16 pstruhov o hmotnosti 3 – 5 g v objeme 40 
l. Odporú čaná frekvencia výmeny vody po čas testu je 6 l/g na 
telesnú hmotnos ť ryby/deň.
 
1.8.2.3.  Kŕmenie  
Ryby sa budú k ŕmiť vhodnou potravou (dodatok 1), a to v dostato čnom 
množstve, aby sa vyvolala akceptovate ľná miera rastu. Treba dba ť na 
to, aby sa neprivodil rast mikroorganizmov alebo zákal vody. U pstruha dúhového je množstvo 4 % z ich telesnej hmotnosti na de ň vhodná 
dávka spĺňajúca tieto podmienky (2), (15), (16), (17). Denná dávka 
môže byť rozdelená do dvoch porcií a dáva sa rybám v dvoch k ŕme­
niach za de ň, oddelene, najmenej po piatich hodinách. Dávka závisí od 
počiatočnej celkovej hmotnosti rýb v každej testovacej nádobe. Ak sú 
ryby znovu vážené v 14-ty de ň, dávka sa potom prepo číta. 24 hodín 
pred vážením sa ryby nek ŕmia.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Nezjedená potrava a fekálny materiál sa odstra ňujú z testovacích 
nádob každý de ň, dôkladne sa vy čistí dno každej nádoby pomocou 
odsávania.  
1.8.2.4.  Svetlo a teplota  
Fotoperióda a teplota vody by mali by ť vhodné pre testovacie druhy 
(dodatok 1).  
1.8.3.  Testované koncentrácie  
Bežne sa vyžaduje 5 rôznych koncentrácií testovanej látky, pod ľa 
variácie koncepcie testu (pozri odsek 1.7.2). Prvotné znalosti o toxicite testovanej látky (napr. z testu akútnej toxicity a/alebo zo štúdií ohľadom rozsahu nálezov) môžu napomôc ť pri výbere vhod ­
ných testovacích koncentrácií. Ak sa použije menej ako pä ť koncen­
trácií, je to potrebné odôvodni ť. Najvyššia testovaná koncentrácia by 
nemala presiahnu ť hranicu rozpustnosti testovanej látky vo vode. 
Ak sa pri príprave zásaditého roztoku použije činidlo zvyšujúce 
rozpustnos ť testovanej látky, jeho kone čná koncentrácia nebude 
vyššia ako 0,1 ml/l a najvhodnejšie je, ak je rovnaká vo všetkých testovacích nádobách (pozri odsek 1.6.3). Je potrebné však urobi ť 
všetko pre to, aby sme sa vyhli použitiu týchto materiálov.
 
1.8.4.  Kontroly  
Počet kontrol vodných roztokov závisí od koncepcie testu (pozri 
odsek 1.7. – 1.7.2.). Ak použijeme rozpustnú chemickú látku, potom je potrebné vykona ť aj rovnaký po čet jej kontrol, tak ako 
aj počet kontrol vodných roztokov.
 
1.8.5.  Frekvencia analytických stanovení a meraní  
Koncentrácia testovanej látky sa po čas testu stanovuje 
v pravidelných intervaloch (pozri dole). 
V prietočných testoch by sa mali kontrolova ť prietoky zrie ďovadla 
a zásadného roztoku toxickej látky v intervaloch, najlepšie denne 
a nemali by sa po čas testu meni ť viac ako o 10 %. Kde sú pred ­
pokladané koncentrácie testovanej látky v rozsahu do ± 20 % nomi ­
nálnych hodnôt (t. j. v rozmedzí od 80 – 120 %, pozri odsek 1.6.2 
a 1.6.3), odporú ča sa minimálne analyzova ť najvyššie a najnižšie 
testované koncentrácie na za čiatku testu a potom následne 
v týždenných intervaloch. Pri teste, kde sa neo čakáva, že koncen ­
trácia testovanej látky zostane do ± 20 % nominálu (na základe 
údajov o stabilite testovanej látky), je potrebné analyzova ť všetky 
testované koncentrácie, ale pod ľa rovnakého režimu. 
V semistatických testoch, kde sa o čakáva, že koncentrácia testovanej 
látky zostane na ± 20 % nominálnej hodnoty, čo je odporu čené ako 
minimálna koncentrácia, najvyššie a najnižšie testované koncentrácie 
sa analyzujú ak sú čerstvo pripravené a ihne ď pred výmenou na 
začiatku štúdie a potom v týždenných intervaloch. V testoch, kde 
sa neočakáva, že koncentrácia testovanej látky zostane na ± 20 % 
nominálnej koncentrácie, všetky testované koncentrácie musia by ť 
analyzované pod ľa rovnakého režimu ako stabilizujúce látky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Odporúča sa, aby výsledky boli založené na meraných koncentrá ­
ciách. Ak je však z evidencie preukázate ľné, že koncentrácia testo ­
vanej látky v roztoku bola uspokojivo udržiavaná v ± 20 % nomi ­
nálu alebo nameranej po čiatočnej koncentrácie po čas testu, potom 
môžu výsledky vychádza ť z nominálnej koncentrácie alebo name ­
ranej hodnoty. 
Vzorky je potrebné filtrova ť (napr. použitý filter s ve ľkosťou pórov 
0,45 μm) alebo odstre ďovať. Odstreďovanie je odporu čený postup. 
Ak sa však testovaný materiál neabsorbuje na filtri, filtrácia je tiež 
akceptovate ľná. 
Vo všetkých testovacích nádobách sa musí po čas testu mera ť rozpus­
tený kyslík, pH a teplota. Celkovú tvrdos ť vody, alkalitu a salinitu 
(ak je podstatná) je potrebné mera ť v kontrolných nádobách 
a v jednej nádobe s najvyššou koncentráciou testovanej látky. Mini ­
málne sa však musí mera ť 3-krát: rozpustný kyslík a solicita (ak je 
dôležitá), a to na za čiatku, v strede a nakonci testu. V semistatických 
testoch sa odporú ča, aby sa rozpustný kyslík meral častejšie, 
najlepšie pred a po každej výmene vody alebo najmenej raz za 
týždeň. Hodnota pH sa meria na za čiatku a po každej výmene 
vody v statickom obnovovacom teste, a to týždenne v prieto čnom 
teste. Tvrdos ť vody a alkalita sa meria raz po čas testu. Teplota sa 
monitoruje kontinuálne aspo ň v jednej testovacej nádobe.  
1.8.6.  Pozorovania  
Hmotnosť: na konci testu všetky prežívajúce ryby musia by ť odvá­ 
žené ako mokrá hmotnos ť (trené do sucha) jednak v skupinách 
v testovacej nádobe alebo individuálne. Váženie zvierat v testovacej nádobe sa preferuje pred individuálnym vážením rýb, 
ktoré si vyžaduje, aby ryby boli jednotlivo ozna čené. V prípade 
váženia jednotlivcov, stanovenie špecifickej miery rastu pre jednot ­
livé ryby, vybratá technika ozna čovania, môžu spôsobi ť stres zvie ­
raťu (alternatívne ozna čovanie mrazením je vhodné, napr. použitie 
farebnej jemnej rybárskej linky). 
Ryby sa kontrolujú denne po čas testovacieho obdobia a všetky 
vonkajšie abnormality (ako napr. krvácanie, odfarbenie) a abnormálne správanie, sa zaznamenávajú. Každý úhyn musí by ť 
zapísaný a uhynutá ryba musí by ť odstránená tak rýchlo, ako je to 
možné. M ŕtve ryby sa nenahrádzajú, nasadené množstvo (sádka), 
hustota chovu sú dostato čné, aby spôsobili vplyv na rast cez 
zmeny v po čte rýb na nádrž. Musí sa však upravi ť dávka potravy.
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Odporúča sa, aby sa štatistika zahrnula aj do návrhu aj do analýzy 
testu, keďže táto testovacia metóda pripúš ťa opodstatnené variácie 
v návrhu experimentu (ako napr. v po čte testovacích komôr, v po čte 
testovaných koncentrácií, v po čte rýb at ď.). Z poh ľadu možností 
prípustných v návrhu testu nie je daný presný postup na štatistickú 
procedúru.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Miera rastu sa nedá vypo čítať pre nádobu, v ktorej úmrtnos ť 
dosiahla 10 %. Mieru úmrtnosti je však možné indikova ť na všetky 
stupne koncentrácie. 
Bez ohľadu na to, ktorá metóda na analýzu údajov sa použije, 
najdôležitejším pojmom je špecifická miera rastu medzi časom t  1 
a časom t  2 . Môže sa definova ť viacerými spôsobmi v závislosti na 
tom, či venujeme pozornos ť jednotlivým rybám alebo nie, alebo či 
sa požaduje priemer z nádrže.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
kde: r
 1 = individuálna špecifická miera rastu ryby 
r 2 = priemerná špecifická miera rastu pre nádrž 
r 3 = „pseudo“ špecifická miera rastu 
w 1 , w 2 = hmotnosti jednej ryby v čase t  1 a t 2 , jednotlivo 
log e w 1 = dekadický logaritmus individuálnej hmotnosti ryby na 
začiatku štúdie 
log e W 2 = dekadický logaritmus individuálnej hmotnosti ryby na 
konci štúdie 
log e W 1 = priemerná hodnota dekadického logaritmu z hodnoty 
w 1 pre rybu v nádrži na za čiatku štúdie 
log e W 2 = priemerná hodnota dekadického logaritmu z hodnoty 
w 2 pre rybu v nádrži na konci štúdie 
t 1 , t 2 = čas (dni) štart a koniec štúdie 
r 1 r 2 r 3 môžu byť vypočítané pre 0 – 28-d ňové obdobie a kde je 
to vhodné (t. j. ak bolo meranie vykonané v 14. dni) na 0 – 14 
a 14 – 28 dní periód.  
2.1.1.  Regresná analýza výsledkov (modelovanie závislosti koncentrá ­
cie) 
Táto analytická metóda zavádza vhodné matematické vz ťahy medzi 
špecifickou mierou rastu a koncentráciou, a teda umož ňuje odhad 
„EC  x “ t. j. akejko ľvek požadovanej EC hodnoty. Použitie tejto 
metódy na výpo čet r pre jednotlivú rybu (r  1 ) nie je potrebné 
a namiesto toho analýza môže vychádza ť z priemernej hodnoty pre 
nádrž r (r  2 ). Uprednost ňuje sa použitie poslednej metódy. Je taktiež 
vhodnejšia v prípade menších druhov rýb. 
Špecifická priemerná miera rastu pre nádrž (r  2 ) môže by ť graficky 
znázornená oproti koncentrácií, aby sa zistil vz ťah koncentra čnej 
odozvy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Pre vyjadrenie vz ťahu medzi r  2 a koncentráciou je potrebné vybra ť 
model a výber musí by ť podložený patri čným zdôvodnením. 
Ak počet rýb, ktoré prežili do konca testu, nie je rovnaký v každej 
nádrži, potom proces zavádzania modelu, či jednoduchého alebo 
nelineárneho, musí by ť vážený, aby pripúš ťal nerovnakú ve ľkosť 
skupín. 
Metóda zavádzania modelu musí umož ňovať odhad, napríklad EC  20 
alebo jej rozptyl/štandardná odchýlka alebo interval spo ľahlivosti/, 
aby sa dali tieto odvodi ť. Graf vybratého modelu by mal ukazova ť, 
či je model primeraný (8), (18), (19), (20).  
2.1.2.  Analýza výsledkov pre odhad LOEC  
Ak test zah ŕňa kópie/repliky/nádrže, odhad LOEC môže vychádza ť 
z analýzy odchýlok (ANOVA) špecifickej miery rastu pre nádrž (pozri odsek 2.1), pod ľa vhodnej metódy [napr. Dunnettov alebo 
Williamsov test (12), (13), (14), (21)] porovnávajúci priemernú 
hodnotu na každú koncentráciu s priemernou hodnotou na kontrolu nádrže, aby sa zistila najnižšia koncentrácia, pre ktorú je odchýlka významná pri hodnote 0,05 stup ňa pravdepodobnosti. Ak sa poža ­
dované predpoklady parametrických metód nezhodujú, použije sa 
netypická distribúcia (napr. Shapiro-Wilkov test) alebo heterogénna odchýlka (Barlettov test) na transformovanie údajov na homogénnu odchýlku, a to prednostne pred vykonaním ANOVA alebo váženým 
ANOVA testom. 
Ak test neobsahuje paralelné nádrže pre každú koncentráciu, 
ANOVA vychádzajúca z nádrží bude necitlivá alebo nemožná. V tejto situácii je akceptovate ľným kompromisom ANOVA, vychá ­
dzajúca z „pseudo“ špecifickej miery rastu r
 3 pre jednotlivé ryby. 
Priemerná hodnota r  3 na každú testovanú koncentráciu sa môže 
potom porovnáva ť s priemernou hodnotou r  3 na kontrolné nádrže 
a LOEC sa môže identifikova ť rovnako ako v predchádzajúcom 
prípade. Musí by ť jasné, že táto metóda neposkytuje žiadnu dovo ­
lenú odchýlku alebo ochranu vo či premenlivosti medzi nádržami, 
okrem tej, ktorá bola vypo čítaná na premenlivos ť medzi jednotlivými 
rybami. Skúsenosti (8) však ukázali, že premenlivos ť medzi 
nádržami je ve ľmi malá v porovnaní s variabilitou v rámci nádrže 
(t. j. medzi jednotlivými rybami). Ak nie sú do analýzy zahrnuté jednotlivé ryby, je potrebné zdôvodni ť použitie metódy vonkaj šej 
identifikácie.
 
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Výsledky sa musia interpretova ť opatrne, ak namerané koncentrácie 
jedovatých látok v testovaných rozsahoch dosahujú úrovne blízke detekčným limitom analytickej metódy alebo v semistatických 
testoch, kde koncentrácia testovanej látky klesá medzi koncentráciu 
v čerstvo pripravenom roztoku a koncentráciou pred výmenou 
roztoku.
 
2.3. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Testovaná látka  
— fyzikálne vlastnosti a závažné fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné údaje chemickej látky zahr ňujúce čistotu 
a analytickú metódu na kvantitatívne stanovenie testovanej látky, ak je to vhodné.
 
2.3.2.  Testované druhy  
— podľa možnosti vedecký názov, 
— rod, ve ľkosť, dodávate ľ, možná predpríprava at ď., 
2.3.3.  Podmienky testu  
— používaná testovacia metóda (napr. semistatická/obnovovacia, 
prietočná, nakladanie, chovná hustota at ď.), 
— koncepcia testu (napr. po čet testovacích nádob, testované 
koncentrácie a paralelné stanovenie, po čet rýb v nádrži), 
— metóda prípravy zásobného roztoku a frekvencia obnovy (ak 
bolo použité činidlo rozpustnosti, jeho koncentrácia musí by ť 
daná), 
— nominálna testovaná koncentrácia, priemery nameraných hodnôt 
a ich štandardné odchýlky v testovacích nádobách a metóda, ktorou boli tieto hodnoty získané a dôkaz o tom, že merania zodpovedajú koncentráciám testovanej látky v skuto čnom 
roztoku, 
— charakteristiky vody použitej na riedenie: pH, tvrdos ť, alkalita, 
teplota, rozpustný kyslík, reziduálny chlór, ak bol stanovený 
celkový organicky viazaný uhlík, suspendované látky, salinita 
(obsah solí) z testu prostredia (ak bola stanovená) a iné vykonané merania, 
— kvalita vody v testovacích nádržiach: pH, tvrdos ť, teplota 
a koncentrácia rozpustného kyslíka, 
— podrobné informácie o k ŕmení (napr. druh potravy/zdroj, dávko ­
vané množstvo a frekvencia)
 
2.3.4.  Výsledky  
— dôkaz, že kontrolné nádrže splnili kritériá validity prežívania 
a údaje o úmrtnosti vyskytujúcej sa pri niektorej z testovaných 
koncentrácií; 
— používané štatistické analytické techniky, štatistiky vychádzajúce 
z počtu paralelných stanovení alebo na jednotlivých rybách, spra ­
covanie dát a odôvodnenie použitia danej techniky; 
— údaje v tabu ľkovej forme na jednotlivú a priemernú hmotnos ť 
rýb v dňoch 0, 14 (ak merané) a 28 hodnôt v priemere na nádrž 
alebo hodnoty „pseudo“ špecifickej miery rastu (ak je to vhodné) počas obdobia 0. – 28. d ňa alebo ak je to možné na 0. – 14. 
a 14.– 28. de ň; 
— výsledky štatistickej analýzy (t. j. regresnej analýzy alebo 
ANOVA), najlepšie v tabu ľkovej alebo grafickej forme 
a LOEC (p = 0,05) a NOEC alebo ECx so štandardnými 
chybami;
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— rozsah neobvyklých reakcií rýb a akéko ľvek vidite ľné účinky 
vyvolané testovanou látkou.  
3. POUŽITÁ LITERATÚRA 
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2. 
[Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylo ­
genetic position of the zebrafish ( Danio rerio ), a model system 
in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, s. 231 – 236.] 
(2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of 
the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. 
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, s. 1855 – 1870. 
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Hôfte B. B. (1991). Effect of 3,4- 
dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish ( Bra­
chydanio rerio ): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, s. 157 – 164. 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan. 
(6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Ory­
zias latipes ). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, s. 287 – 297. 
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota. 
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, s. 328 – 338. 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 pp. 
(10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt. 
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12. December 1991. 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096 – 1121. 
(13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, s. 482 – 491.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, s. 103 – 117. 
(15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). 
A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  
Oncorhynchus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 
120, s. 123 – 133. 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, pp. 33 – 41. 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp. 
(18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data Environ. Toxicol. 
Chem. 11, s. 1485 – 1494. 
(19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and Mclntyre, D. O. (1989). Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA. 
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for 
chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protec ­
tion Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minne ­
sota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Asses ­
ment Center. Sept. 1988. 12 s. 
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, s. 510 – 531.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
DODATOK 1  
DRUHY RÝB ODPORU ČENÝCH NA TESTOVANIE A VHODNÉ PODMIENKY NA VYKONANIE TESTOV  
Druh Odporučený rozsah 
teplôt pri testoch 
( o C) Fotoperióda 
(hod.) Odporúčany rozsah 
pre počiatočnú 
hmotnosť 
(g) Požadovaná presnos ť 
merania Nasadené 
množstvo 
(g/l) Chovná hustota 
(l) Potrava Trvanie testu 
(dni) 
Odporučené druhy:  
Oncorhynchu s mykiss  
Pstruh dúhový 12,5 – 16,0 12 – 16 1 – 5 na 100 mg 1,2 – 2,0 4 sušená lososovitá potrava ≥ 28 
Ostatné dobre zdokumentov 
ané druhy:  
Danio rerio  
Zebrička 21 – 25 12 – 16 0,050 – 0,100 na 1 mg 0,2 – 1,0 5 – 10 živá potrava ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Ryžová rybka (Medaka) 21 – 25 12 – 16 0,050 – 0,100 na 1 mg 0,2 – 1,0 5 – 20 živá potrava  (Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28
DODATOK 2  
NIEKTORÉ CHARAKTERISTIKY VHODNEJ VODY NA RIEDENIE  
Látka Koncentrácie  
Látka v časticiach < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l Zlúčený uhlík < 1 μg/l 
Zostatkový chlór < 10 μg/l 
Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované 
bifenyly < 50 ng/1 
Celkový organický chlór < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
DODATOK 3  
Logaritmické série koncentrácií vhodných na test na toxicitu (9)  
Stĺpec (čislo koncentrácie medzi 100 a 10 alebo medzi 10 a 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Zo st ĺpcov sa dá vybra ť päť alebo viac sérií za sebou idúcich koncentrácií. Stredné body medzi koncentráciami v st ĺpci x) sa 
nachádzajú v st ĺpci (2x + 1). Uvedené hodnoty predstavujú koncentrácie vyjadrené ako percento na objem alebo hmotnos ť 
(mg/l alebo μg/l). Hodnoty je možné násobi ť alebo deli ť akoukoľvek mocninou 10 pod ľa potreby. Hodnoty v st ĺpci 1 sa môžu 
použiť, ak nastala zna čná neistota oh ľadom úrovne toxicity.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  RYBY, KRÁTKODOBÝ TEST TOXICITY NA EMBRYÁCH 
A VÝVOJOVOM ŠTÁDIU PLODOVÉHO VAKU  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda krátkodobého testu toxicity je totožná 
s metódou OECD TG 212 (1998).  
1.1. ÚVOD 
Tento test toxicity na rybích embryách a rybách vo vývojovom 
štádiu plodového va čku – poteru je krátkodobým testom, v ktorom 
sú vývojové štádiá od čerstvo oplodnených vají čok po koniec štádia 
plodového vaku – poteru vystavené ú činkom testovanej látky. Rybie 
embryá a štádiá plodového vaku – poteru sa nek ŕmia a test má by ť 
ukončený dovtedy, kým sú rybám v štádiu plodového vá čku dodá­
vané živiny zo ž ĺtkového vaku. 
Test je ur čený na definovanie letálnych ú činkov a hraníc subletál ­
nych účinkov chemikálií na vybraté testované vývojové štádiá 
a druhy rýb. Mal by preto poskytnú ť užitočné informácie o tom, 
či je možné a) nájs ť spojitos ť medzi letálnymi a subletálnymi 
testami, b) použi ť ho ako screeningový test jednak ako test pre 
najrannejšie vývojové štádiá alebo ako test chronickej toxicity 
a c) či je použite ľný pri testovaní druhov tam, kde techniky chovu 
hospodárenia nie sú dostato čne vyspelé, aby pokryli obdobie zmien 
od endogénneho k exogénnemu k ŕmeniu. 
Je potrebné uvedomi ť si, že iba testy spájajúce všetky štádiá život ­
ného cyklu rýb sú vo všeobecnosti schopné poda ť presný odhad 
chronickej toxicity chemikálií u rýb a že pôsobenie obmedzené 
akýmkoľvek spôsobom s oh ľadom na štádium života môže znižova ť 
citlivosť a zárove ň podhodnoti ť chronickú toxicitu. Preto možno 
očakávať, že embryonálny test a test v štádiu plodového vaku – 
poteru môže by ť menej citlivý ako najrannejší test úplne vývojového 
štádia, predovšetkým s oh ľadom na vysoko lipofilné chemikálie (log 
P ow > 4) a chemikálie so špeciálnymi spôsobmi toxickej aktivity. Pri 
chemikáliách s nešpecifickými, narkotickými ú činkami sa však môžu 
očakávané menšie rozdiely v senzitivite medzi dvoma testami (1). 
Pred uverejnením testu sa najviac skúseností získalo v testoch na 
embryonálne štúdium a na štádium plodového vaku – poteru 
u sladkovodných rýb  Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, 
Cyprinidae – bežný názov zebrafish). Podrobnejší návod na vyko ­
nanie testu pre tento druh je uvedený v dodatku 1. Toto však nevy ­
lučuje použitie iných druhov rýb, s ktorými sú tiež skúsenosti 
(tabuľka 1).  
1.2. DEFINÍCIE  
Najnižšia zistená ú činná koncentrácia (LOEC):  je najnižšia 
skúmaná koncentrácia testovanej látky, pri ktorej sa pozoruje signi ­
fikantný ú činok (p < 0,05) pri porovnaní s kontrolnou vzorkou. 
Všetky testované koncentrácie nad LOEC musia ma ť však škodlivý 
vplyv rovnajúci sa alebo vä čší ako ten, ktorý bol zistený pri LOEC.  
Nezistená ú činná koncentrácia (NOEC):  je testovaná koncentrácia 
hneď pod LOEC.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Embryá a vývojové štádium plodového vaku – poteru rýb sú vysta ­
vené účinkom rôznych koncentrácií testovanej látky rozpustenej vo 
vode. V protokole o teste je možný výber medzi semistatickým 
a prietočným typom postupu. Výber závisí od charakteru testovanej 
látky. Test za čína umiestnením oplodnených vají čok do testovacej 
komory a kon čí práve predtým, ako ktoráko ľvek z lariev 
v ktorejko ľvek testovanej komore komplexne absorbuje ž ĺtkový 
vak alebo pred uhynutím v dôsledku za čínajúceho hladovania 
v kontrolnej komore. Letálne a subletálne ú činky sa vyhodnotia 
a porovnávajú s kontrolnými hodnotami, ak bola stanovená najnižšia 
zistená ú činná koncentrácia alebo sa podrobia analýze použitím 
regresného modelu, aby sa odhadla koncentrácia, ktorá môže zaprí ­ 
činiť daný percentuálny ú činok (t. j. LC/ECx, kde x je definované 
ako % účinnosti).  
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Výsledky aktuálneho testu toxicity, (pozri metóda C.1) najlepšie 
toho, ktorý bol vykonaný na druhu rýb vybratom na tento test, 
musia by ť k dispozícii. Môžu by ť užitočné pri výbere vhodného 
rozsahu testovaných koncentrácií na test v ranných vývojových štádiách života rýb. Rozpustnos ť vo vode (vrátane rozpustnosti 
v testovanej vode) a tlak pár testovanej látky musia by ť známe. Je 
potrebné ma ť spoľahlivú analytickú metódu na kvantitatívne stano ­
venie látky v testovaných roztokoch so známou a uvedenou pres ­
nosťou a detek čným limitom. 
Informácie o testovanej látke, ktoré sú použité pri stanovení 
podmienok testu, zah ŕňajú štruktúrny vzorec, čistotu látky, svetelnú 
stabilitu, stabilitu za podmienok testu, pK
 a , P ow a výsledky testov na 
stupeň biodegradability stupe ň biologickej odbúrate ľnosti (pozri 
metóda C.4).  
1.5. PLATNOS Ť TESTU 
Na platnos ť testu je potrebné uplat ňovať nasledujúce podmienky: 
— počet všetkých oplodnených vají čok, ktoré prežili v kontrolnej 
nádrži a ak je to dôležité, iba v nádobách s rozpúš ťadlom, musí 
byť väčší alebo rovný limitom definovaným v doplnkoch (2) a (3), 
— koncentrácia rozpusteného kyslíka musí by ť počas testu 
v rozmedzí 60 až 100 % z hodnoty saturácie vzduchu (ASV), 
— teplota vody sa nesmie meni ť viac ako ± 1,5  o C medzi testova ­
nými komorami alebo medzi nasledujúcimi d ňami v ur čitom 
časovom intervale testu a bude v rozsahu teplôt ur čených na 
testované druhy (dodatky 2 a 3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Testovacie komory  
Môžu sa používa ť nádoby sklenené alebo z iných chemicky inert ­
ných látok. Rozmery nádob musia by ť dostatočne veľké, aby boli 
v súlade s nasadeným množstvom rýb (pozri odsek 1.7.1.2). Odpo ­
rúča sa umiestni ť testovacie nádoby náhodne na testovacej ploche. 
Náhodný blokový dizajn, v ktorom je každý postup prítomný v každom bloku, je najlepší, aby sa zabezpe čil úplne náhodný dizajn, 
v ktorom sú zahrnuté vplyvy laboratória, takže na kontrole sa môže 
využiť testovanie po blokoch. Ak použijeme testovanie po blokoch, 
budú sa bra ť do úvahy aj následné údaje analýzy. Testované komory 
sa takto ochránia pred nechcenými vplyvmi.
 
1.6.2.  Výber druhov rýb  
Odporúčané druhy rýb sú dané v tabu ľke 1A. To ale neobmedzuje 
použitie aj iných druhov (príklady uvedené v tabu ľke 1B), ale testo ­
vací postup musí by ť prispôsobovaný tak, aby poskytoval uspokojivé 
podmienky testu. V tomto prípade je potrebné zaznamena ť dôvody, 
ktoré viedli k výberu iných druhov a experimentálnych metód.  
1.6.3.  Chov húfu rýb  
Podrobnosti o chovaní rýb po čas množenia za vhodných podmienok 
nájdete v OECD TG 210 (  1 ) metóde a v použitej literatúre (2), (3), 
(4), (5), (6).  
1.6.4.  Manipulácia s embryami a larvami  
Embryá a larvy môžu by ť vystavené expozícii v malých vyhovujú ­
cich nádobách so sie ťovanými stenami, aby sa umožnilo pretekanie 
testovaného roztoku cez nádobu. Neturbulentný tok cez tieto malé nádoby je zabezpe čený ich zavesením na ramene usporiadanom na 
pohyb nadol a nahor, ktoré však udržuje organizmy ponorené. Je 
možné použi ť systém prieto čný – sifónový. Oplodnené vají čka loso­
sovitých rýb môžu by ť udržované na krmidlách alebo na sie ťovine 
s dostatočne veľkými okami, aby mohli cez ne po vyliahnutí prepad ­
núť. Na premiest ňovanie embryí a lariev pri semistatických testoch 
s kompletnou dennou výmenou (pozri odsek 1.6.6.) vody je vhodné 
použiť pasteurove pipety. 
Ak sa v hlavnej testovacej nádobe na zadržiavanie vají čok použili 
kontajnery, mriežky alebo sie ťky, potom po vyliahnutí lariev môžu 
byť tieto zábrany odstránené [2] s výnimkou, ak mriežky preventívne 
zabraňujú úniku rýb. Ak je potrebné premiestni ť larvy, tieto by 
nemali by ť vystavené vzduchu a nemali by sa používa ť sieťky na 
vylovenie rýb z kontajnerov na vají čka (upozornenie sa netýka menej 
krehkých druhov rýb, napr. kapra). Na časovanie takéhoto prenosu sa 
mení v závislosti od druhu rýb a prenos nie je vždy potrebný. Pri semistatickej technike môžeme používa ť hadičky alebo plytké zásob ­
níky a ak je to nutné, môžu by ť vybavené prepážkou zo sie ťoviny, 
nepatrne naddvihnutou nad dnom hadi čky. Ak je objem týchto 
kontajnerov dostato čný, aby vyhovoval požiadavkám pre nasadené 
množstvo vsádky (poyri 1.7.1.2), žiaden prenos embryí alebo lariev 
nebude nutný.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test“.
 1.6.5.  Voda  
Každá voda, sp ĺňajúca chemické charakteristiky na vodu na riedenie 
tak, ako sú uvedené v zozname v dodatku 4 a v ktorej testované druhy vykazujú kontrolu prežívania najmenej takú dobrú, ako bolo 
popísané v dodatkoch 2 a 3, je vhodná ako testovacia voda. Voda 
má mať konštantnú kvalitu po čas celého trvania testu. Jej pH 
hodnota by sa mala pohybova ť v rozmedzí ± 0,5 jednotiek pH, 
aby sa zabezpe čilo, že riedenie nebude ma ť neželaný vplyv na 
výsledky testu/napr. vytváranie komplexov s testovanou látkou/alebo 
nepriaznivý ú činok na vyliahnuté zásobné ryby. Vzorky vody na 
analýzu je potrebné odobera ť v určitých intervaloch. Meranie hodnôt 
ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavných aniónov 
a katiónov (napr. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO
 4 , pesticídov (napr. 
celkový obsah organofosfore čňanových alebo celkový obsah organo ­
chlórovaných pesticídov), celkového organicky viazaného uhlíka 
v suspendovaných látkach by sa malo vykonáva ť napr. každé tri 
mesiace, ak je známe, že zrie ďovacia voda má relatívne konštantnú 
kvalitu. Ak sa preukázalo, že kvalita vody sa upravila najmenej počas jedného roka, merania sa môžu vykonáva ť menej často 
a časové intervaly medzi nimi sa môžu pred ĺžiť (napr. každých 
šesť mesiacov).
 
1.6.6.  Testovacie roztoky  
Testovacie roztoky vybratých koncentrácií sa pripravujú riedením 
zásobných roztokov. 
Zásobný roztok môže by ť pripravený naj častejšie jednoduchým 
zmiešaním alebo pretrepávaním testovanej látky v zrie ďovacej 
vode mechanickým spôsobom (napr. trepaním alebo ultrazvukom). 
Saturácia kolón môže by ť využitá na dosiahnutie vhodne koncen ­
trovaných zásobných roztokov. Pokia ľ je to možné, vyhneme sa 
používaniu rozpúš ťadiel a dispergentov ( činidlá zvyšujúce rozpust ­
nosť látok), hoci u niektorých zlú čenín v ur čitých prípadoch sa to 
vyžaduje, aby sa pripravil vhodne koncentrovaný zásobný roztok. Príklady vhodných rozpúš ťadiel sú acetón, metanol, etanol, dimetyl ­
formamid a trichylénglykol. Príkladmi používaných dispergentov sú 
Cremophor RH40, Tween 80, me ťnylcellulose 0,01 % a HCO- 
40. Treba dba ť na to, ak sa používajú ľahké činidlá (napr. acetón) 
a/alebo ve ľmi prchavé biologicky odbúrate ľné látky, môžu tieto 
spôsobiť problémy s množením baktérií v prieto čných testoch. Ak 
používané činidlo zvyšuje rozpustnos ť, nesmie ma ť žiaden signifi ­
kantný ú činok na prežívanie alebo žiaden vidite ľný nepriaznivý 
účinok na ranné vývojové štádiá, ako sa to prejavilo v kontrolných 
nádržiach s rozpúš ťadlom. Je však potrebné vynaloži ť maximálne 
úsilie, aby sme sa vyhli použitiu týchto látok. 
Pri semistatických technikách môžu nasledova ť dva rôzne postupy 
obnovy: i) do čistých nádob sa pripravia nové testovacie roztoky 
a prežívajúce vají čka a larvy sa do nich opatrne prenesú v malých 
objemoch starého roztoku tak, aby sme sa vyhli ich vystaveniu na 
vzduchu alebo ii) testované organizmy zostanú umiestnené 
v nádobách, pokia ľ sa časť (najmenej tri štvrtiny) testovanej vody 
vymení. Frekvencia obnovy prostredia bude závisie
ť na stabilite 
testovanej látky, ale odporú ča sa denná výmena. Ak z predbežných 
testov stability (pozri odsek 14) testovanej látky vyplýva, že koncen ­
trácia testovanej látky nie je stála (t. j. mimo rozsahu 80 – 120 % nominálnej koncentrácie alebo poklesne pod 80 % nameranej po čia­
točnej koncentrácie) po čas obnovovacej periódy, je dôležité použi ť 
prietočný test. V tomto prípade je treba dba ť na to, aby sme sa vyhli 
stresovaniu lariev po čas výmeny vody.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Pri prieto čných testoch, v ktorých je systém kontinuálne vypúš ťaný 
a riedený (napr. dávkovacie meracie pumpy, proporcionálny zrie ďo­
vač, saturačný systém), zásobný roztok testovanej látky sa vyžaduje 
dodávať do testovacích nádrží v sériách koncentrácií. Prietoky zásob ­
ných roztokov a zrie ďovacej vody treba kontrolova ť v určitých časo­
vých intervaloch, najlepšie denne a nemal by sa meni ť viac ako 
o 10 % po čas testu. Prekro čené množstvo ekvivalentné objemu 
najmenej piatich testovacích komôr za 24 hodín sa pokladá za vyho ­
vujúce (2).  
1.7. POSTUP 
Užitočné informácie o vykonaní testov toxicity na rybích embryách 
a v štádiu plodového vaku – poteru sú dostupné v literatúre, niektoré príklady sú zahrnuté do zoznamu použitej literatúry v texte (7), (8), (9).
 
1.7.1.  Podmienky expozície  
1.7.1.1.  Dĺžka testu  
Test je najlepšie za čať 30 minút po oplodnení vají čok. Embryá sa 
ponoria do testovaného roztoku pred alebo čo najskôr po za čatí 
štádia štiepenia blastodiskov a v žiadnom prípade nie pred zapo čatím 
štádia gastrulí. Pri vají čkach od komer čných dodávate ľov nie je 
vhodné za čať test ihne ď po oplodnení. Ak pozdržanie za čiatku 
testu závažne ovplyv ňuje senzibilitu testu, je ho potrebné za čať do 
ôsmich hodín po oplodnení. Ak nie sú larvy k ŕmené počas expo­
zičnej periódy, test treba ukon čiť práve predtým, ako ž ĺtkové vačky 
lariev v testovaných komorách boli kompletne absorbované alebo predtým ako za čnú hynú ť od hladu v kontrolných komorách. 
Dĺžka testu bude závisie ť od použitých druhov. Niektoré odporú čané 
dĺžky trvania testov sú uvedené v dodatkoch 2 a 3.
 
1.7.1.2.  Nasádzanie  
Počet oplodnených vají čok na začiatku testu musí by ť dostatočný na to, 
aby sa splnili štatistické požiadavky. Rozdelia sa náhodne, najmenej 
však po 30 oplodnených vají čok, rozdelených rovnako, alebo tak 
rovnako ako je to možné. Môže by ť dosť zložité získa ť rovnaké 
vsádky, ak použijeme niektoré druhy medzi najmenej tri paralelné 
testovacie komory na jednu koncentráciu. Nasadené množstvo (bio ­
masa) na objem testovaného roztoku má by ť dostatočne nízke, aby 
sa koncentrácia rozpusteného kyslíka udržiavala na hodnote najmenej 60 % ASV bez prevzduš ňovania. Pri prieto čných testoch sa odporú ča, 
aby nasadené množstvo neprekro čilo 0,5 g/l po čas 24 hodín a nesmie 
nikdy prekro čiť množstvo 5 g/l roztoku (2).
 
1.7.1.3.  Svetlo a teplota  
Fotoperióda a teplota majú by ť vhodné na testované druhy (dodatky 
2 a 3). Ak chceme monitorova ť teplotu, je vhodné použi ť ďalšiu 
testovaciu nádobu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Testované koncentrácie  
Obvykle sa vyžaduje pä ť koncentrácií testovanej látky s odstupom 
s konštantným faktorom nepresahujúcim 3,2. Pri výbere rozsahu testovaných koncentrácií, je potrebné bra ť do úvahy krivku vz ťahu­
júcu LC
 50 na dobu expozície v štúdii akútnej toxicity. Za ur čitých 
okolností je vhodné použi ť menej ako pä ť koncentrácií, napr. 
v limitných testoch a v užších koncentra čných intervaloch. Koncen ­
trácia látky vyššia ako 96 hodín LC  50 alebo 100 mg/l a tá, ktorá 
z nich je nižšia, nemusí by ť testovaná. Látky sa nemali testova ť pod 
ich hranicou rozpustnosti v testovacej vode. 
Ak sa použije činidlo zvyšujúce rozpustnos ť, aby napomohlo pri 
príprave testovaných roztokov (pozri odsek 16.6.), jeho kone čná koncen ­
trácia v testovaných nádobách nemá by ť vyššia ako 0,1 ml/l a nemala by 
byť rovnaká vo všetkých testovaných nádobách.  
1.7.3.  Kontrola  
Jedna kontrolná nádrž zrie ďovacej vody (replikát, paralela ak je to 
možné) a tiež, ak je to dôležité, jedna kontrolná nádrž obsahujúca činidlo zvyšujúce rozpustnos ť (replikát, paralela, ak je to možné) sa 
musí zanalyzova ť v dodato čnej testovacej sérii.
 
1.7.4.  Frekvencia analytických stanovení a meraní  
Koncentrácie testovanej látky sú stanovené v pravidelných časových 
intervaloch po čas doby testu. 
V semistatických testoch, kde sa o čakáva, že koncentrácia zostane na 
± 20 % nominálu (t. j. v rozsahu 80 – 120 %, pozri odseky 1.4 
a 1.6.6), čo je odporú čané ako minimálna koncentrácia, najvyššie 
a najnižšie testované koncentrácie sa analyzujú, ak sú čerstvo pripra ­
vené a ihne ď po výmene, najmenej trikrát v pravidelných časových 
odstupoch v priebehu testu (t. j. analýzy by sa mali vykona ť na 
vzorkách z rovnakého roztoku, ak je tento čerstvo pripravený, a to 
pri výmene). 
Pri testoch, kde sa neo čakáva, že koncentrácia testovanej látky 
zostane na ± 20 % z nominálu (na základe údajov o stabilite látky), 
je potrebné analyzova ť všetky testované koncentrácie pre čerstvo 
pripravené a vymenené roztoky, ale pod ľa rovnakého režimu 
(t. j. najmenej trikrát v pravidelných časových odstupoch 
v priebehu testu). Stanovenie koncentrácií testovanej látky pred 
výmenou je potrebné vykona ť iba v jednej paralelnej (replika čnej) 
nádobe pre každú testovanú koncentráciu. Stanovenia je potrebné vykonať do siedmich dní po odbere vzoriek. Odporú ča sa to pre 
prípad, že výsledky budú vychádza ť z nameraných koncentrácií. 
Ak však záznamy dokazujú, že koncentrácia testovanej látky 
v roztoku bola uspokojivo udržiavaná v ± 20 % z nominálu alebo nameranej po čiatočnej koncentrácie po čas testu, potom výsledky 
môžu vychádza ť z nominálu alebo nameranej po čiatočnej hodnoty 
koncentrácie. 
Na prieto čné testy je vhodný podobný režim so vzorkami ako je 
uvedený na semistatické testy (ale meranie „starého“ roztoku nie je v tomto prípade možné). Ak však test trvá viac ako sedem dní, je možno vhodné zvýši ť počet vzorkovaní po čas prvého týžd ňa, napr. 
tri série meraní, aby sa zistilo, že testované koncentrácie zostávajú 
nezmenené.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Vzorky si môžu vyžadova ť odstreďovanie alebo filtrovanie za 
použitia filtra s pórmi ve ľkosti 0,45 μm. Pretože ani odstre ďovanie 
ani filtrácia však vždy nedokážu odseparova ť biologicky nedostupnú 
frakciu testovanej látky od tej, ktorá je biologicky dostupná, vzorky by mali by ť podrobené spomínaným postupom. 
Počas testu je potrebné mera ť rozpustený kyslík, pH a teplotu vo 
všetkých testovaných nádobách. Po čas kontrol je vhodné mera ť 
celkovú tvrdos ť vody a obsah solí v nádobe, a to v jednej nádobe 
s najvyššou koncentráciou. Rozpustený kyslík a obsah solí sa musí 
merať minimálne trikrát (na za čiatku, v strede a na konci testu). Pri 
semistatických testoch sa odporú ča meranie rozpusteného kyslíka 
s väčšou frekvenciou, najlepšie pred a po každej výmene vody 
alebo najmenej raz za týžde ň. pH je potrebné mera ť na začiatku 
a konci každej výmeny vody pri semistatických testoch a najmenej 
raz týždenne pri prieto čných testoch. Tvrdos ť vody je vhodné mera ť 
raz počas trvania testu. Teplota sa meria denne a najlepšie je konti ­
nuálne monitorovanie najmenej v jednej testovanej nádobe.
 
1.7.5.  Pozorovania  
1.7.5.1.  Štádium embryonálneho vývoja  
Embryonálne štádium (t. j. štádium gastrulí) na za čiatku vystavenia 
testovanej látke musí by ť čo najpresnejšie. Toto overenie sa môže 
urobiť použitím reprezentatívnej vzorky vají čok vhodne chránených 
a vyčíslených. Pri opisovaní a ilustrácii embryonálnych štádií sa 
odporúča čerpať z odbornej literatúry (2), (5), (10), (11).  
1.7.5.2.  Liahnutie a prežívanie  
Pozorovania liahnutia a prežívania by sa mali vykonáva ť najmenej 
raz za de ň a je potrebné si zaznamena ť počet vyliahnutých jedno ­
tlivcov. Na za čiatku testu sa odporú ča vykonáva ť pozorovania 
častejšie (napr. každých 30 minút po čas prvých troch hodín), 
keďže v niektorých prípadoch časy prežitia môžu by ť dôležitejšie 
ako iba po čet uhynutých kusov (napr. ak sa vyskytujú akútne ú činky 
toxicity). M ŕtve embryá a larvy treba odstráni ť ihneď po objavení, 
pretože sa ve ľmi rýchlo rozkladajú. Mimoriadnu pozornos ť treba 
venovať tomu, aby sme pri odstra ňovaní mŕtvych jedincov neudreli 
alebo fyzicky nepoškodili susedné vají čka/larvy, ktoré sú extrémne 
krehké a citlivé. Kritériá úhynu sa menia pod ľa vývojového štádia: 
— u vajíčok: predovšetkým v ranných štádiách, výrazná strata prie ­
hľadnosti a zmeny v zafarbení, spôsobené koaguláciou a/alebo 
znížením proteínov, vedúcim k bielemu neprieh ľadnému 
vzhľadu, 
— u embrií : absencia telesného pohybu a/alebo absencia tepu srdca 
a/alebo neprieh ľadné odfarbenie pri druhoch, ktorých embryá sú 
normálne prieh ľadné, 
— u lariev : nepohyblivos ť a/alebo neprítomnos ť respiračných 
pohybov a/alebo neprítomnos ť tepu srdca a/alebo biele neprieh ­ 
ľadné zafarbenie centrálneho nervového systému a/alebo strata 
reakcií na mechanické stimuly.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Abnormálny vzh ľad 
Počet lariev vykazujúcich abnormality vo forme tela a/alebo pigmen ­
tácie v štádiu absorpcie ž ĺtkového vaku sa zaznamenávajú 
v príslušných časových úsekoch v závislosti od d ĺžky trvania testu 
a charaktere popísaných abnormalít. Treba poznamena ť, že abnor ­
málne embryá a larvy sa vyskytujú prirodzene a môžu by ť 
v rozmedzí nieko ľkých percent v kontrolných vsádkach pre niektoré 
druhy. Je nevyhnutné odstráni ť abnormálne uhynuté druhy 
z testovaných nádob.  
1.7.5.4.  Abnormálne správanie  
Abnormality ako napr. hyperventilácia, nekoordinované plávanie 
a netypická nehybnos ť sa musia zaznamenáva ť v príslušných časo­
vých intervaloch, ktoré závisia od doby trvania testu. Tieto vplyvy, hoci ich je ťažké kvantifikova ť, môžu (ak sú spozorované) pomôc ť 
pri interpretácii údajov o mortalite t. j. poskytnú ť údaje o spôsobe 
toxických ú činkov látky.
 
1.7.5.5.  Dĺžka 
Na konci testu sa odporú ča zmerať dĺžku jednotlivcov: štandardná, 
dĺžka rozdvojenia alebo celková d ĺžka. Možno použi ť všetky typy. 
Ak sa však vyskytne hnitie chvostovej plutvy alebo erózia plutvy, je 
možné použi ť štandardné d ĺžky. Všeobecne v dobre prebiehajúcom 
teste varia čný koeficient pre d ĺžku medzi replikami kontrolných 
meraní by mal by ť ≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Hmotnos ť 
Na konci testu je vhodné jednotlivé ryby odváži ť. Uprednost ňovaná 
je suchá hmotnos ť (24 hodín pri 60  o C) pred mokrou hmotnos ťou 
(vysušené do sucha). Všeobecne v dobre prebiehajúcom teste 
variačný koeficient pre hmotnos ť medzi replikami kontrolných 
meraní by mal by ť ≤ 20 %. 
Tieto pozorovania budú ma ť za následok niektoré alebo všetky 
z nasledujúcich údajov, využite ľné na štatistické analýzy: 
— kumulovaná mortalita, — počet zdravých lariev na konci testu, 
— čas začiatku liahnutia a koniec liahnutia (t. j. 90 % vyliahnutých 
v každej replike), 
— počet lariev vyliahnutých za de ň, 
— dĺžka (a hmotnos ť) prežívajúcich zvierat na konci testu, 
— počet lariev, ktoré sú zdeformované alebo abnormálneho 
vzhľadu, 
— počet lariev vykazujúce abnormálne správanie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Odporúča sa, aby sa štatistika za členila aj do koncepcie a aj analýzy 
testu, keďže metóda pripúš ťa mnohé variácie v koncepcii experi ­
mentu, ako napríklad v po čte testovaných komôr, po čte testovaných 
koncentrácií, v po čiatočnom po čte oplodnených vají čok 
a v meraných parametroch. Špecifický návod na štatistické postupy nie je daný, vzh ľadom na možnosti v koncepcii testov. 
Ak sa odhadnú LOEC/NOEC, bude potrebné analyzova ť variácie 
v každej sérií (skupine) použitím analýzy odchýlok (ANOVA) alebo 
použiť tabuľky neistôt. Aby bolo možné urobi ť niekoľkonásobné 
pozorovanie medzi výsledkami pre jednotlivé koncentrácie a pre kontrolné nádrže, je vhodné použi ť Dunnettovu metódu (12), (13). 
Vhodné príklady sú uvedené v (14), (15). Ve ľkosť účinku, detegova ­
teľná použitím ANOVA alebo iných postupov (t. j. význam testu), sa 
vypočíta a zaznamená. Je potrebné poznamena ť, že nie všetky 
pozorovania uvedené v odseku 1.7.5.6. sú vhodné na štatistickú analýzu metódou ANOVA. Napríklad kumulovaná mortalita a po čet 
zdravých lariev na konci testu sa môžu analyzova ť metódou 
pravdepodobnosti. 
Ak sú odhadované LC/EC
 x a) údajmi, ktoré nás zaujímajú, je vhodné 
ich znázorni ť krivkou napr. logaritmickou, ktorej tvar zistíme 
použitím štatistických metód napr. metódy najmenších štvorcov alebo nelineárnej metódy najmenších štvorcov. Krivka by mala 
mať také parametre, aby LC/EC
 x pri údajoch, ktoré sledujeme 
a ich štandardných odchýlkach mohli by ť odhadnuté priamo. Toto 
významne potom u ľahčí výpočet intervalov spo ľahlivosti pre LC/ ­
EC x . Ak neexistuje dobrý dôvod na výber iných konfiden čných 
intervalov, stanoví sa obojstranný 95 % konfiden čný interval. Krivka 
má byť položená tak, aby odchýlka od hodnôt bola priemerne odhad ­
nutá. Môžu sa použi ť aj grafické metódy prekladania kriviek. 
Regresná analýza je vhodná na všetky pozorovania uvedené 
v odseku 1.7.5.6.  
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Výsledky by sa mali interpretova ť pozorne, najmä ak namerané 
koncentrácie toxických látok v testovaných roztokoch dosahujú 
úrovne blízke detek čným limitom analytickej metódy. Interpretácia 
výsledkov pri koncentráciách nad hodnoty rozpustnosti daných látok vo vode si taktiež vyžaduje obozretnos ť.
 
2.3. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  
2.3.1.  Testovaná látka  
— fyzikálny charakter a dôležité fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— identifika čné chemické údaje, zah ŕňajúce čistotu a analytickú 
metódu na kvantifikáciu testovanej látky, ak je to vhodné.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Testované druhy  
— vedecký názov, rod, po čet rodičovských rýb (t. j. ko ľko samíc 
bolo použitých, aby sa získal pre test vyžadovaný po čet), zdroj 
a metóda zberu oplodnených vají čok a nasledujúca manipulácia.  
2.3.3.  Podmienky testu:  
— použitá testovacia procedúra (t. j. semistatická alebo prieto čná 
metóda, časový úsek od oplodnenia po štart testu, vsadené množ ­
stvo atď.), 
— fotoperiódy, 
— koncepcia testu (t. j. po čet testovaných komôr a replík, po čet 
embryí v replike), 
— metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia obnovy 
(činidlo zvyšujúce rozpustnos ť a jeho koncentrácia, ak bolo 
použité, musí by ť udané), 
— nominálne testovacie koncentrácie, namerané hodnoty, ich prie ­
mery a ich štandardné odchýlky v testovaných nádobách 
a metóda, ktorou boli získané a ak je testovaná látka rozpustná 
vo vode v koncentráciách pod tými, ktoré boli testované, mali by byť uvedené poznámky o tom, že merania referujú 
o koncentráciách testovanej látky v roztoku, 
— charakteristiky zrie ďovacej vody: pH, tvrdos ť vody, teplota, 
koncentrácia rozpusteného kyslíka, úrove ň zostatkového chlóru 
(ak bola zmeraná), celkový organický uhlík, suspendované látky, 
salinita v testovanom prostredí (ak bol meraný) a iné vykonané merania, 
— kvalita vody v testovaných nádobách: pH, tvrdos ť vody, teplota 
a koncentrácia rozpusteného kyslíka.
 
2.3.4.  Výsledky:  
— výsledky z predbežných štúdií stability testovanej látky, 
— záznamy, že v kontrolných nádobách boli splnené požiadavky na 
akceptovanie úhrnného prežívania testovaných druhov po čas 
testu (dodatok 2 a 3), 
— dátum úmrtia alebo prežitia v embryonálnom a larválnom štádiu 
a úhrnná úmrtnos ť alebo prežitie, 
— deň vyliahnutia a po čet vyliahnutých jedincov, 
— údaje o d ĺžke (a hmotnosti), 
— rozsah a opis morfologických abnormalít, ak sa nejaké vyskytli, — rozsah a opis ú činkov na správanie, ak sa nejaké vyskytli, 
— štatistická analýza a spracovanie údajov 
— pri testoch analyzovaných za použitia ANOVA metódy – 
najnižšie zistená ú činná koncentrácia (LOEC) pri p = 0,05/ ­
a nezistená ú činná koncentrácia (NOEC) pri predpokladanom 
účinku, zah ŕňajúca popis štatistických postupov a predpoklad, 
aký veľký účinok je možné detegova ť,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— pri testoch analyzovaných regresnými technikami LC/ECx 
a intervaly spo ľahlivosti, grafy preložených modelov, ktoré boli 
použité na ich výpo čty, 
— vysvetlenie pri všetkých odchýlkach od tejto testovacej metódy.  
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, 60 pp. June 1990. 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 s. 
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, s. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio ) in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, s. 121 – 173. 
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, s. 328 – 330. 
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish ( Brachydanio rerio ) Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and 
Chemistry, 6, s. 61 – 71. 
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining 
the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and 
Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, s. 807 – 821. 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri ). J. Aquatic Toxicology, 9, s. 129 – 145. 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company. 
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 s. 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096 – 1121. 
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, s. 482 – 491. 
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G (1980). Statis ­
tical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings 
of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321 – 334. 
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
1/RM/28, December 1992, 81 s. 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio . Arch, of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, s. 126 – 134. 
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phyloge ­
netic position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system 
in developmental biology S an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: s. 231 – 236. 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud 
P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Refe ­
rence Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, s. 19 – 28. 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes . EPA report EPA/600/3-91/064, 
Dec. 1991, EPA, Duluth. 
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth. 
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic 
T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus 
M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow ( Pimephales promelas ) larval survival and 
growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. 
Tox. Chem. 10, s. 1189 – 1203. 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish. 
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 s. 
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1 – 58.
 
Tabuľka 1A  
Odporučené druhy rýb na testovanie  
Sladkovodné ryby  
Oncorhynchus mykiss  
Pstruh dúhový (9)(16)  
Danio rerio  
Zebrička(7)(17)(18)  
Cyprinus caprio  
Kapor oby čajný (8)(19)  
Oryzias latipes  
Ryžová rybka/Medaka (20)(21)  
Pimephales promelas  
Fathead minnow (8)(22) – malá kaprovitá ryba  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabuľka 1B  
Príklady iných dobre zdokumentovaných druhov rýb, ktoré sa tiež používajú na testovanie  
SLADKOVODNÉ RYBY MORSKÉ RYBY  
Carassius auratus  
Karas zlatý (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside – malá morská ryba druhu 
Menidia peninsulae (23)(24)(25)  
Lepomis macrochirus  
Pleskáč silný (8)  Clupea harensus  
Sleď druhu Clupea harengus (24)(25)  
Gadus morhua  
Treska druhu  Gadus morhua  (24)(25)  
Cyprinodon variesatus  
Sheepshead minnow – malá morská ryba druhu 
Cyprinodon variegatus (23)(24)(25)  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
DODATOK 1  
NÁVOD NA VYKONANIE TESTU TOXICITY NA EMBRYÁCH 
A PLODOVOM VAKU – POTERI U ZEBRI ČIEK (Brachydanio rerio)  
ÚVOD 
Zebrička pochádza z Koromandelského pobrežia v Indii, kde osíd ľuje rýchlo 
prúdiace toky. Je to bežná akvarijná rybka z rodu kaprovitých a informácie ojej 
ošetrovaní a chovaní možno nájs ť v študijných príru čkách o tropických rybách. 
Ich biológiu a použitie vo výskume rýb vo svoje práci popísal Laaleom (1). 
Ryba výnimo čne dosahuje d ĺžku 45 mm. Telo má valcovité so 7 – 9 tmavomo ­
drými striebristými pásikmi. Tieto pásiky sa tiahnu od chrbtovej po análnu plutvu. Chrbát je olivovo-zelený. Sam čekovia sú štíhlejší ako sami čky. Samičky 
sú striebristej ši e a ich bruško je vyduté, predovšetkým pred trením. 
Dospelé ryby sú schopné znáša ť veľké rozdiely v teplote, pH a tvrdosti vody. 
Aby sme však získali zdravé ryby, ktoré produkujú vají čka dobrej kvality, je 
potrebné dodržiava ť optimálne podmienky. 
Počas trenia sam ček zachytí sami čku a spojí sa s ňou, táto potom vypudí oplod ­
nené vají čka. Vajíčka, ktoré sú prieh ľadné a nepri ľnavé, padajú na dno, kde ich 
môžu ich rodi čia zožrať. Na ich trenie má vplyv svetlo. Ak je ranné svetlo 
dostatočné, ryby sa trú v skorých ranných hodinách, hne ď po úsvite. 
Samičky môžu v týždenných intervaloch vyprodukova ť sériu nieko ľkých stoviek 
vajíčok.
 
PODMIENKY PRE RODI ČOVSKÉ RYBY, REPRODUK ČNÉ RYBY 
A VÝVOJOVÉ ŠTÁDIÁ ŽIVOTA RÝB 
Vyberte vhodný po čet zdravých rýb a držte ich v príslušnej kvalite (napr. 
dodatok 4) najmenej dva týždne pred o čakávaným trením. Skupine rýb by sa 
malo umožni ť vytrieť najmenej raz pred vyprodukovaním série vají čok prežitých 
v teste. Hustota rýb po čas tohto obdobia by nemala presiahnu ť 1 gram ryby na 
liter vody. Ak sa pravidelne vymie ňa voda alebo sa používajú systémy na 
čistenie vody, potom môže by ť hustota rýb vyššia. Je potrebné udržiava ť stálu 
teplotu v chovných nádržiach a to hodnoty 25  o C ± 2  o C. Ryby sa k ŕmia rôznou 
potravou, ktorá môže pozostáva ť napríklad z komer čnej suchej potravy, živých, 
čerstvo vyliahnutých Arthémií, chironomných dafnií, bielych červov (Enchy ­
traeid). 
Dva postupy, ktoré sú uvedené nižšie, v praxi vedú k získaniu dostato čného 
množstva zdravých oplodnených vají čok použite ľných na test: 
i) Osem sami čiek a 16 sam čekov sa umiestni do nádrže obsahujúcej 50 
l zrieďovacej vody, zabezpe čia sa pred priamym svetlom a nechajú sa neru ­ 
čene najmenej 48 hodín. Trecia podložka je umiestnená na dno akvária 
poobede, de ň pred štartom testu. Trecí tanier pozostáva z rámu (z plexiskla 
alebo iného vhodného materiálu), výšky 5 – 7 cm s hrubou sie ťovinou 2 – 
5 mm ve ľkosť oka, zachytenou na vrchu s jemnou sie ťovinou s 10 – 30 μm 
veľkosť oka na dne. Po čet „trecích stromov“, pozostávajúcich z neto čiacich sa 
nylonových laniek, je uchytených na hrubej sie ťovine v ráme. Potom, čo ryby 
boli držané 12 hodín v tme, zažneme slabé svetlo, ktoré iniciuje trenie. Trecí tanier je po dvoch až štyroch hodinách po trení odstránený spolu so zozbie ­
ranými vají čkami. Trecí tanier zabra ňuje rybám požiera ť vajíčka a súčasne 
dovoľuje ľahký zber vají čok. Skupine rýb by sa mala vytrie ť najmenej raz 
pred trením, z ktorého vají čka budú použité v teste.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Od 5 do 10 samcov a sami čiek rýb je individuálne držaných najmenej dva 
týždne pred zamýš ľaným trením. Po 5 – 10 d ňoch budú brušká sami čiek 
vypuklé a ich genitálne papily budú vidite ľné. Samčeky sú bez papíl. Trenie 
sa uskuto ční v trecích nádržiach vybavených falošným sie ťovaným dnom 
(ako bolo popísané vyššie). Nádrž je naplnená zried'ovacou vodou tak, že 
hĺbka vody nad sie ťou je 5 – 10 cm. Jedna sami čka a dvaja sam čekovia sú 
umiestnení do nádrže jeden de ň pred zamýš ľaným trením. Teplotu vody 
postupne zvyšujeme na teplotu o 1 stupe ň vyššiu ako bola aklimatiza čná 
teplota. Svetlo je vypnuté a nádrž zostáva ni čím nerušená. Ráno je zapnuté 
slabé svetlo, ktoré vyvolá trenie. Po 2 – 4 hodinách sú ryby odstránené 
a vajíčka sa zozbierajú. Ak je potrebné získa ť od jednej sami čky veľký 
počet sérií vají čok, potom sa pripraví dostato čný počet paralelných trecích 
nádrží. Pod ľa záznamov o reproduk čných výsledkoch jednotlivých sami čiek 
pred testom (ve ľkosť série a kvalita), môžu by ť tieto sami čky s najvyššou 
reprodukciou vybrané ako chovné. 
Vajíčka by mali by ť prenesené do testovacích nádob sklenenými trubicami/ ­
vnútorný priemer nie menší ako 4 mm/vybavené sacou bankou – balónikom. Množstvo vody obklopujúce prenášané vají čka má by ť čo najmenšie. Vají čka 
sú ťažšie ako voda a vypadávajú z trubky. Vají čka (larvy) je potrebné chráni ť
 
pred stykom so vzduchom. Mikroskopické skúmanie vzoriek zo sérií má dba ť na 
to, aby sa nevyskytli žiadne neregulárnosti v prvom vývojovom štádiu. Dezin ­
fekcia vají čok nieje povolená. 
Miera úmrtnosti vají čok je najvyššia v prvých 24 hodinách po oplodnení. Po čas 
tohto obdobia je vždy vykazovaná mortalita 5 – 40 %. Degenerujúce vají čka sú 
výsledkom neúspešného oplodnenia alebo vývojových porúch. Zdá sa, že série 
vajíčok závisia od sami čky ryby, tak ako niektoré sami čky sústavne produkujú 
vajíčka dolnej kvality, iné nikdy. Tiež vývojový pomer a miera liahnutia sa mení 
od jednej série ku druhej. Úspešne oplodnené vají čko a žĺtkový vačok lariev 
prežívajú dobre, normálne okolo 90 %. Pri 25  o C vajíčka sa vyliahnu 3 – 5 
dní po oplodnení a ž ĺtkový vačok sa absorbuje priebežne do 13 dní po oplodnení. 
Embryonálny vývoj bol ve ľmi dobre definovaný Hisaokom a Bat ťlom (2). 
Cestou prieh ľadnosti vají čok a počtom vyliahnutých lariev môžeme sledova ť 
vývoj rýb a zisti ť prítomnos ť malformácií. Približne po štyroch hodinách od 
oplodnenia je možné odlíši ť neoplodnené vají čka od oplodnených (3). Pri 
tomto testovaní sú vají čka a larvy umiestnené do testovacích nádob s malým 
objemom a sú skúmané pod mikroskopom. 
Testované podmienky, ktoré uplat ňujeme na ranné štádiá života, sú v zozname 
v dodatku 2. Optimálne hodnoty pH a tvrdos ť zrieďovacej vody sú pH 7,8 
a 250 mg CaCO  3 /l. 
VÝPOČTY A ŠTATISTIKA 
Navrhuje sa dvojfázový prístup. Po prvé, údaje o úmrtnosti, abnormálnom vývoji 
a čase liahnutia sa štatisticky analyzujú. Ak pri koncentráciách nebol detegovaný 
žiadny účinok, štatisticky sa vyhodnotí d ĺžka tela. Tento prístup je vhodný, ak 
toxická látka môže selektívne zabíja ť malé ryby, zadrža ť čas liahnutia 
a vyvoláva ť všeobecné malformácie, takže vedú k meraniam d ĺžky 
s odchýlkami. Okrem toho, zmeria sa približne rovnaký po čet rýb pre každý 
spôsob spracovania, aby sa zabezpe čila validita štatistiky daného testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
STANOVENIE LC  50 A EC  50 
Percento prežívajúcich vají čok a lariev sa vypo číta a koriguje vzh ľadom na 
mortalitu v kontrolnom stanovení pod ľa Abbottovho vzorca (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 
C Ü 100 Í Î  
kde: 
P = korigované % prežívajúcich P' = % prežívajúcich zistené pri testovanej koncentrácií C = prežívajúce pri kontrolnom stanovení Ak je to možné, LC
 50 sa stanoví vhodnou metódou na konci testu. 
Ak sa vyžaduje zahrnutie morfologických abnormalít do štatistiky pre EC  50 , 
potom návod môžeme nájs ť v Stephanovi (5).  
ODHAD LOEC A NOEC 
Objektívny test vají čok a plodový vak – poter porovnávaný s nenulovou koncen ­
tráciou pri kontrolnom stanovení – stanoví sa LOEC. Z toho dôvodu môžu by ť 
užitočné násobné porovnávacie postupy (6), (7), (8), (9), (10).  
POUŽITÁ LITERATÚRA 
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio 
rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, s. 121 – 
173. 
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 s. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, s. 173 – 181. 
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1 – 333. 
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, s. 69 – 81. 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096 – 
1121. 
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with 
a Control. Biometrics, 20, pp. 482 – 491. 
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, s. 103 – 117. 
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with 
a Zero Dose Control. Biometrics 28, s. 519 – 531. 
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H.Freeman and Co., San Francisco.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
DODATOK 2  
PODMIENKY A TRVANIE TESTU A KRITÉRIÁ NA PREŽITIE U ODPORU ČENÝCH DRUHOV RÝB  
Druh rýb Teplota 
( o C) Obsah solí 
(0/00) Fotoperióda 
(hod.) Trvanie štádia 
(DNI) 
Typická d ĺžka testu Zostatok po kontrole 
(minimum prežitých %) 
Embryo Plodový 
vačok – poter Úspešne 
vyliahnuté Po vyliahnutí  
SLADKOVODNÉ  
Bracydanio rerio  
Zebrička 25 ± 1 — 12 – 16 3 – 5 8 – 10 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 5 dní po vyliahnutí (8 – 10 dní) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Pstruh dúhový 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30 – 35 25 – 30 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 20 dní po vyliahnutí (50 – 55 
dní) 66 70  
Cyprinus carpio  
Kapor oby čajný 21 – 25 — 12 – 16 5 > 4 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 4 dní po vyliahnutí (8 – 9 dní) 80 75  
Oryzias latipes  
Ružová rybka/Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12 – 16 8 – 11 4 – 8 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 5 dní po vyliahnutí (13 – 16 
dní) 80 80  
Pimephales promelas  
Fathead minnow – malá kaprovitá 
ryba 25 ± 2 — 16 4 – 5 5 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 4 dní po vyliahnutí (8 – 9 dní) 60 70  
( 1 ) U embrií. 
( 2 ) U lariev. 
( a ) Embryá a larvy sa musia až do obdobia jedného týžd ňa po vyliahnutí drža ť v tme (mimo kontrolných časov). Po čas trvania testu sa držia pri tlmenom osvetlení.
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
DODATOK 3  
Podmienky a trvanie testu a kritériá na prfežitie u ostatných dobre zdokumentovaných druhov rýb  
Druh rýb Tepl ota (  o C) Obsah soli 
(0/00) Foto perióda 
(hod.) Trvanie štádia (dni) 
Typická d ĺžka testu Zostatok po kontrole (minimum 
prežitých %) 
Embryo Plodový 
vačok – poter Úspešne 
vyliahnuté Po vyliahnutí  
SLADKOVODNÉ RYBY  
Carassius auratus  
Karas zlatý 24 ± 1 — — 3 – 4 > 4 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 4 dní po vyliahnutí (7 dní) — 80  
Leopomis macrochirus  
Pleskáč silný 21 ± 1 — 16 3 > 4 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 4 dní po vyliahnutí (7 dní) — 75 
MORSKÉ RYBY  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside – malá morská 
ryba 22 – 25 15 – 22 12 1,5 10 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 5 dní po vyliahnutí (6 – 7 dní) 80 60  
Clupea harengus  
Sleď druhu 10 ± 1 8 – 15 12 20 – 25 3 – 5 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 3 dní po vyliahnutí (23 – 27 
dní) 60 80  
Gadus morhua  
Treska druhu 5 ± 1 5 – 30 12 14 – 16 3 – 5 Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 3 dní po vyliahnutí (18 dní) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow – malá morská 
ryba druhu 25 ± 1 15 – 30 12 — — Čo najskôr po oplodnení (rané štádium 
gastrulí) do 4/7 dní po vyliahnutí (28 dní) > 75 80
DODATOK 4  
NIEKTORÉ CHARAKTERISTIKY VODY VHODNEJ NA RIEDENIE  
LÁTKA KONCENTRÁCIE  
Látka v časticiach < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l Zlúčený amoniak < 1 μg/l 
Zostatkový chlór < 10 μg/l 
Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l 
Celkové organochlórované pesticídy plus polychlórované 
bifenyly < 50 ng/1 
Celkový organický chlór < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  VČELY OBECNÉ – AKÚTNY TEST ORÁLNEJ TOXICITY  
1. METÓDA  
Táto metóda akútneho toxikologického testu je totožná s metódou 
OECD TG 213 (1998)  
1.1. ÚVOD 
Tento toxikologický test je laboratórna metóda navrhnutá na stano ­
venie orálnej akútnej toxicity aplikovaných chemických látok pri 
ochrane dospelých v čiel robotníc. 
Pri stanovení a vyhodnocovaní toxických charakteristík látok sa 
určenie akútnej a orálnej toxicity u v čiel môže požadova ť všade 
tam, kde je napr. možná expozícia v čiel danou chemikáliou. Akútny 
orálny test toxicity sa vykonáva s cie ľom zistenia vrodenej toxicity 
pesticídov a iných chemikálii vo či včelám. Výsledky testu je možné 
použiť na definovanie potreby na následné vyhodnotenie. Túto 
metódu je možné použi ť najmä v postupných krokových – odbor ­
ných programoch, zameraných na zistenie nebezpe čenstva vplyvu 
pesticídov na v čely, založených na postupnom progrese od labora ­
tórnych testov toxicity cez semipo ľné až ku po ľným – terénnym 
pokusom (1). Pesticídy môžu by ť testované ako aktívne látky 
(a. s.) alebo ako viazané produkty. 
Toxický štandard sa dá použi ť na overenie citlivosti v čiel a presnos ť 
testovacieho postupu.  
1.2. DEFINÍCIE  
Akútna orálna toxicita:  sú nepriaznivé ú činky, ktoré sa dostavia 
maximálne do 96 hodín po orálnom podaní jednej dávky testovanej 
látky.  
Dávka:  je množstvo skonzumovanej testovanej látky a je vyjadrená 
ako hmotnos ť (ug) testovanej látky na testovaného živo čícha (μg/­
včelu). Skuto čná dávka sa nedá vypo čítať pre každú v čelu individu ­
álne vzhľadom na spolo čné kŕmenie, ale je možné vyjadri ť prie­
mernú dávku (celkovo skonzumovaná testovaná látka/po čet testova ­
ných včiel v jednom úli).  
LD 50 (stredná letálna dávka) orálna : je štatisticky odvodená 
hodnota jednej dávky látky, po ktorej dochádza k úhynu 50 % testo ­
vaných živo číchov po podaní orálnou cestou. Hodnota LD  50 je vyja­
drená v ( μg) testovanej látky na v čelu. Pre pesticídy môže by ť 
testovaná látka aj v aktívnej forme (a. s.), ale aj vo forme viazanej, 
a to ako produkt obsahujúci viac ako jednu ú činnú látku.  
Mortalita:  úhyn živo čícha sa konštatuje v prípade jeho kompletnej 
imobility.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Dospelé robotnice v čiel obecných ( Apis mellifera)  sú vystavené 
celému radu dávok testovanej látky, ktorá je rozptýlená v roztoku sacharózy. Potom sa v čely kŕmia rovnakou stravou, ktorá neobsahuje 
testovanú látku. Úmrtnos ť sa zaznamenáva denne najmenej 48 hodín 
a porovnáva sa s kontrolnými hodnotami. Ak sa úmrtnos ť zvýši 
medzi 24 až 48 hodinami, kým kontrolná úrove ň úmrtnosti zostáva 
na akceptovate ľnej hladine, t. j. menej alebo rovných 10 %, je 
vhodné pred ĺžiť trvanie testu maximálne na 96 hodín. Výsledky sa 
analyzujú, aby sa mohla vypo čítať hodnota LD
 50 za 24 hodín a 48 
hodín a v prípade pred ĺženia štúdie aj za 72 hodín a 96 hodín.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDITA TESTU 
Ak má by ť test platný, musia plati ť nasledovné podmienky: 
— priemerná úmrtnos ť na celkový po čet kontrol nesmie prekro čiť 
10 % na konci testu, 
— hodnota LD  50 toxického štandardu musí sp ĺňať špecifikovaný 
rozsah.  
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Výber v čiel 
Mali by sa použi ť mladé robotnice rovnakého druhu (t. j. v čely 
rovnakého veku, v čely rovnako stravované, at ď. Včely by sa mali 
odobrať z primeraného k ŕmeného, zdravého chovu a ak je to možné, 
z chovu nezasiahnutého chorobami a z kolónie s krá ľovnou 
s overeným pôvodom a fyziologickým stavom. V čely by sa mali 
vyberať ráno pred použitím alebo ve čer pred testovacím d ňom 
a potom by sa mali udržiava ť v týchto podmienkach až do nasledu ­
júceho dňa. Vhodné sú v čely odobrané z rámov, bez mlá ďat. Malo 
by sa vyvarova ť odoberaniu v čiel skoro na jar alebo neskoro na 
jeseň, keďže v tomto období sa v čelám mení ich fyziológia. 
V prípade, že sa predsa test musí vykona ť počas skorej jari alebo 
neskorej jesene, v čely môžu by ť v prípade núdze premiestnené do 
inkubátora a po čas jedného týžd ňa sa budú k ŕmiť včelím chlebom 
(peľ zozbieraný z plástov) a roztokom sacharózy. V čely liečené 
chemickými látkami ako sú antibiotiká, antivarroa produktmi, at ď. 
by sa nemali použi ť na toxikologický test po dobu štyroch týžd ňov 
od poslednej lie čby. 
1.5.2.  Podmienky k ŕmenia a chovu v čiel 
Vhodné sú úle s ľahkým čistením a dobrým vetraním. Je možné 
použiť ľubovoľný vhodný materiál ako je napr.: nehrdzavejúca 
oceľ, pletivo, plastické alebo drevené úle. Je vhodné umiestni ť 
skupinu 10 v čiel do jedného ú ľa. Veľkosť testovacích ú ľov by 
mala byť úmerná po čtu včiel, t. j. aby bol zabezpe čený dostato čný 
priestor. 
Včely sa majú drža ť v tme, v miestnosti ur čenej na pokusy pri 
teplote 25 ± 2  o C. Relatívna vlhkos ť, normálne okolo 50 – 70 %, 
by mala by ť zaznamenávaná po čas doby trvania testu. Manipulo ­
vanie vrátane lie čby a pozorovania sa môžu uskuto čňovať za 
denného svetla. Ako potrava sa použije roztok sacharózy vo vode s konečnou koncentráciou 500 g/l (50 % objemových). Po podaní 
testovacích dávok by sa mala strava podáva ť ad libitum.  Spôsob 
kŕmenia by mal umož ňovať zaznamenanie podávanej stravy pre 
každý testovací ú ľ (pozri časť 1.6.3.1). Je možné použi ť sklenenú 
trubicu (približne 50 mm dlhú a 10 mm širokú s otvoreným zúženým koncom okolo 2 mm v priemere)
 
1.5.3.  Príprava v čiel 
Zozbierané v čely sú náhodne rozmiestnené do testovacích ú ľov, 
ktoré sú náhodne rozmiestnené v experimentálnej miestnosti.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Pred začatím testu by sa mali v čely necha ť vyhladova ť aspoň dve 
hodiny pred za čiatkom testu. Odporú ča sa, aby v čely neprijímali 
potravu, t. j. aby ich obsah čriev pred za čatím testu bol rovnaký. 
Umierajúce v čely je pred za čiatkom testu potrebné nahradi ť zdra­
vými.  
1.5.4.  Príprava dávok  
Ak je testovaná látka miešate ľná s vodou, môže sa rozptýli ť priamo 
v 50 % roztoku sacharózy. V prípade technických produktov a látok s nízkou rozpustnos ťou vo vode, akými sú napríklad organické 
rozpúšťadlá, emulsifikátory alebo disperzné činidlá s nízkou toxi ­
citou na v čely môže by ť použitý napr. acetón, dimethylformamid, 
dimetylsulfoxid. Koncentrácia rozpúš ťadla závisí od rozpustnosti 
testovanej látky a mala by by ť rovnaká pre všetky testované koncen ­
trácie. Aj ke ď koncentrácia rozpúš ťadla o hodnote 1 % je v zásade 
prijateľná, nemala by sa prekro čiť. 
Mali by sa pripravi ť vhodné kontrolné roztoky, t. j. roztoky, 
v ktorých rozpúš ťadlo alebo disperzné činidlo rozpustí testovanú 
látku. Použijú sa dve oddelené kontrolné skupiny: vodný roztok 
a sacharózový roztok rozpúš ťadlom/nosi čom v koncentrácii použitej 
v dávkovacích roztokoch.
 
1.6. POSTUP  
1.6.1.  Test a kontrolné skupiny  
Počet dávok a ich opakovaní by mal sp ĺňať štatistické požiadavky na 
stanovenie LD  50 s 95 % pravdepodobnos ťou. Bežne sa pre tento test 
požaduje pä ť dávok v geometrickom rade s faktorom nepresahujúcim 
2,2 pre daný rozsah LD  50 . Zrieďovací faktor a po čet dávkovaní 
rôznych koncentrácií sa musí stanovi ť vo vzťahu ku strmosti krivky 
toxicity (dávka versus úmrtnos ť), je potrebné vzia ť do úvahy štatis ­
tickú metódu, ktorá bola zvolená na analýzu výsledkov. Výber rozsahu pre test umožní vybra ť vhodné koncentrácie dávkovanej 
látky. 
Minimálne tri testovacie skupiny, každá po desiatich v čelách, by 
mali byť kŕmené testovanou látkou na každú skúmanú koncentráciu. 
Minimálne tri kontrolné skupiny, každá po desiatich v čelách, by mali 
prebiehať súbežne s testovanými sériami. Kontrolné skupiny by mali 
byť tiež zaradené pre použité rozpúš ťadlo/nosič (pozri časť 1.5.4).
 
1.6.2.  Toxický štandard  
Do testovacích sérií je potrebné zahrnú ť toxický štandard. Následne 
sa vyselektujú aspo ň tri dávky, aby sa dosiahla o čakávaná hodnota 
LD 50 . Pri každej testovanej dávke by sa mali použi ť minimálne tri 
úle, každý po desiatich v čelách. Preferovaný štandard toxicity je 
dimetoát, pre ktorý je zaznamenaná hodnota LD  50 za 24 hodín 
v rozmedzí 0,10 – 0,35 μg a. s. /včelu (2). Aj iné štandardy toxicity 
budú akceptovate ľné tam, kde sa dá získa ť dostatočné množstvo 
údajov na overenie o čakávanej odozvy dávky (napr. parathion).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Expozícia  
1.6.3.1  Podávanie dávok  
Každej testovanej skupine v čiel sa bude podáva ť 100 – 200 μl 
vodného roztoku 50 % sacharózy, ktorý obsahuje testovanú látku 
primeranej koncentrácie. V prípade látok s nízkou rozpustnos ťou, 
nízkou toxicitou alebo nízkou koncentráciou vo viazanej forme sa vyžaduje vä čšie množstvo testovanej látky v sacharózovom roztoku. 
Skonzumované množstvo potravy je potrebné monitorova ť u každej 
skupiny v čiel. Ak je krmivo s testovanou látkou sk ŕmené (oby čajne 
v intervale 3 – 4 hodín), zvyšok krmiva sa z testovacieho ú ľa 
odoberie a nahradí sa krmivom obsahujúcim iba sacharózový roztok. 
Sacharózový roztok sa potom podáva  ad libitum . Pri niektorých 
zlúčeninách podávaných vo vyšších koncentráciách sa môže prejavi ť 
znížené alebo žiadne prijímanie potravy ako dôsledok zvýšenej koncentrácie. Po maximálne 6 hodinách sa neskonzumované krmivo 
odoberie a nahradí roztokom sacharózy. Množstvo skonzumovanej 
potravy sa zaznamená (meranie objemu/hmotnos ť zostatkovej potra ­
vy).
 
1.6.3.2.  Trvanie testu  
Na trvanie testu sa uprednost ňuje doba 48 hodín, po ktorej sa testo ­
vaný roztok nahradí samotným roztokom sacharózy. Ak vzostup 
úmrtnosti v čiel pokra čuje a prekro čí hodnotu 10 % po čas prvých 
24 hodín, trvanie testu by malo by ť predĺžené na maximálne 96 
hodín, za predpokladu, že kontrola úmrtnosti v čiel neprekro čí 10 %.  
1.6.4.  Pozorovania  
Úmrtnosť sa zaznamenáva po 4 hodinách od za čiatku testu a potom 
po 24 hodinách a po 48 hodinách (po podaní testovacej dávky). Ak je potrebný pred ĺžený čas pozorovania, ďalšie hodnotenie by malo 
prebehnúť v 24 hodinových intervaloch, avšak maximálne do celko ­
vých 96 hodín na dôkaz toho, že úmrtnos ť včiel neprekro čí stano­
vených 10 %. 
Je potrebné zaznamena ť aj množstvo skonzumovanej testovacej látky 
na skupinu v čiel. Porovnaním hodnôt skonzumovanej 
a neskonzumovanej potravy po čas 6 hodín sa získajú informácie 
o strávite ľnosti poskytnutej potravy. 
Všetky abnormálne prejavy správania sa v čiel počas testovaného 
obdobia by mali by ť zaznamenané.
 
1.6.5.  Limitný test  
V niektorých prípadoch (napr. za predpokladu, že testovaná látka má 
nízku toxicitu) je možné vykona ť limitný test 100 μg a. s. /v čelu 
s cieľom dokáza ť, že hodnota LD  50 je väčšia ako uvedená hodnota. 
Rovnaký postup by sa mal použi ť vrátane troch opakovaní testu na 
danú testovanú látku, aj na relevantnú kontrolu, na zistenie množstva skonzumovanej potravy a pri použití toxických štandardov. 
V prípade mortality sa celá štúdia prepracuje. Ak sa spozorujú suble ­
tálne účinky (pozri časť 1.6.4.), aj tieto je potrebné zaznamena ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
2.1. ÚDAJE 
Údaje sa zosumarizujú do tabu ľkovej formy, pre každú pokusnú 
skupinu zvláš ť, tak isto aj pre kontrolnú skupinu v čiel a skupinu 
použitú na zistenie toxického štandardu, pre po čet použitých v čiel, 
úmrtnosť v každom období pozorovania a pre po čet včiel so 
zmeneným správaním. Údaje mortality je potrebné analyzova ť vhod­
nými štatistickými metódami (napr. probitová analýza, pohyblivý 
priemer, binominálna pravdepodobnos ť) (3), (4). Grafické záznamy 
dávok a ich odoziev by mali by ť zaznamenané formou kriviek, a to 
v každý odporú čaný čas pozorovania na výpo čet sklonu strmosti 
kriviek a stredných smrte ľných dávok (LD  50 ) s 95 % pravdepodob ­
nostnými limitami. Opravy týkajúce sa kontroly úmrtnosti sa vyko ­
najú za pomoci Abbottových korekcií (4), (5). Tam, kde nebola úplne skonzumovaná použitá potrava, zaznamenajú sa skonzumo ­
vané testovacie dávky na skupinu v čiel. Hodnota LD
 50 by mala 
byť vyjadrená v μg testovanej látky na v čelu. 
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  
2.2.1.  Testované látky:  
— fyzikálna podstata a relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti 
(ako napr.: stabilita – odolnos ť vo vode, tlak pár), 
— identifika čné chemické údaje, vrátane štruktúrneho vzorca, čistota 
(napr. pesticídov, identitu a koncentráciu ú činnej látky alebo 
látok).  
2.2.2.  Testované druhy:  
— odborný názov, druh, približný vek (v týžd ňoch), metóda zberu, 
dátum zberu, 
— informácie o kolónach použitých na zber testovaných v čiel, 
vrátane zdravotného stavu, všetkých chorôb týkajúcich sa dospe ­
lého včelstva, všetky prelie čenia, atď. 
2.2.3.  Podmienky testu  
— teplota a relatívna vlhkos ť experimentálnej miestnosti, 
— podmienky chovu v čiel, vrátane typu, ve ľkosti a materiálu testo ­
vacích úľov, 
— metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia prípravy 
nových roztokov (rozpúš ťaná látka a jej koncentrácia sa musí 
v prípade použitia uvies ť), 
— koncepcia testu, napr. použitý po čet a testovacie koncentrácie, 
počet kontrol pre každú testovanú koncentráciu a kontrolu, 
počet kópií testovacích ú ľov a počet včiel na testovaný ú ľ, 
— dátum testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky predbežného výberu rozsahu štúdie, ak bol výber usku ­
točnený, 
— nespracované údaje: úmrtnos ť pri každej testovanej dávke, pri 
každom pozorovanom čase, 
— graf udávajúci závislos ť, dávka a odozva na konci každého testu, 
— hodnoty LD  50 s 95 % pravdepodobnos ťou limitu pre každý 
odporúčaný čas pozorovania, pre testovanú látku a toxický štan ­
dard, 
— štatistické postupy použité na ur čenie LD  50 , 
— úmrtnos ť pri kontrolách, 
— iné biologické dopady pozorované alebo merané, ako napr.: 
abnormálne správanie sa v čiel (vrátane odmietnutia testovacej 
dávky potravy), pomer skonzumovanej potravy v skupinách včiel testovaných a netestovaných, 
— akéko ľvek odchýlky od testovacích postupov tu uvedených 
a všetky dostupné, relevantné informácie.
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA:  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision – Making Scheme 
for the Enviromental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol.23, N.1, s. 151 – 165. March 1993. 
(2) Gough, H.J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B.(1994). The use of 
dimethoat as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981 – 1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, s. 119 – 125 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method ef 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. 
Ther., pp. 99 – 113 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York 
(5) Abbott, W.S.(1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, s. 265 – 267.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  VČELY OBECNÉ – AKÚTNY TEST TOXICITY KONTAKTOM  
1. METÓDA  
Táto metóda akútneho toxikologického testu je totožná s metódou 
OECD TG 214 (1998).  
1.1. ÚVOD 
Tento toxikologický test je laboratórna metóda navrhnutá na stano ­
venie orálnej akútnej toxicity aplikovaných chemických látok pri ochrane dospelých v čiel robotníc. 
Pri stanovení a vyhodnocovaní toxických charakteristík látok sa 
určenie akútnej a orálnej toxicity u v čiel môže požadova ť všade 
tam, kde je napr. možná expozícia v čiel danou chemikáliou. Akútny 
orálny test toxicity sa vykonáva s cie ľom zistenia vrodenej toxicity 
pesticídov a iných chemikálii vo či včelám. Výsledky testu je možné 
použiť na definovanie potreby na následné vyhodnotenie. Túto 
metódu je možné použi ť najmä v postupných krokových – odbor ­
ných programoch, zameraných na zistenie nebezpe čenstva vplyvu 
pesticídov na v čely, založených na postupnom progrese od labora ­
tórnych testov toxicity cez semipo ľné až ku po ľným – terénnym 
pokusom (1). Pesticídy môžu by ť testované ako aktívne látky 
(a. s.) alebo ako viazané produkty. 
Toxický štandard sa dá použi ť na overenie citlivosti v čiel a presnos ť 
testovacieho postupu.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Akútna orálna toxicita:  sú nepriaznivé ú činky, ktoré sa dostavia 
maximálne do 96 hodín po lokálnej aplikácií jednej dávky testovanej 
látky.  
Dávka:  je množstvo skonzumovanej testovanej látky a je vyjadrená 
ako hmotnos ť (μg) testovanej látky na testovaného živo čícha (μg/­
včelu). 
LD 50 (stredná letálna dávka):  je štatisticky odvodená hodnota 
jednej dávky látky, po ktorej dochádza k úhynu 50 % testovaných živočíchov pri kontakte s látkou. Hodnota LD
 50 je vyjadrená v ( μg) 
testovanej látky na v čelu. U pesticídov môže by ť testovaná látka aj 
v aktívnej forme (a. s.), ale aj vo forme viazanej, a to ako produkt 
obsahujúci viac ako jednu ú činnú látku.  
Mortalita:  úhyn živo čícha sa konštatuje v prípade jeho kompletnej 
imobility.  
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Dospelé robotnice v čiel obecných  (Apis mellifera)  sú vystavené 
celému radu dávok testovanej látky, ktorá je rozpustená vo vhodnom nosiči, priamou aplikáciou do thoraxu (kvapô čky). Dĺžka trvania 
testu je 24 hodín. Potom sa v čely kŕmia rovnakou stravou, ktorá 
neobsahuje testovanú látku. Ak sa úmrtnos ť zvýši medzi 24 až 48 
hodinami, kým kontrolná úrove ň úmrtnosti zostáva na akceptova ­
teľnej hladine, t. j. menej alebo rovných 10 %, je vhodné pred ĺžiť 
trvanie testu maximálne na 96 hodín. Výsledky sa analyzujú, aby sa 
mohla vypo čítať hodnota LD
 50 za 24 hodín a 48 hodín a v prípade 
predĺženia štúdie aj za 72 hodín a 96 hodín.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDITA TESTU 
Ak má by ť test platný, musia plati ť nasledovné podmienky: 
— priemerná úmrtnos ť na celkový po čet kontrol nesmie prekro čiť 
10 % na konci testu, 
— hodnota LD  50 toxického štandardu musí sp ĺňať špecifikovaný 
rozsah.  
1.5. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.5.1.  Výber v čiel 
Mali by sa použi ť mladé robotnice rovnakého druhu (t. j. v čely 
rovnakého veku, v čely rovnako stravované, at ď. Včely by sa mali 
odobrať z primeraného k ŕmeného, zdravého chovu a ak je to možné, 
z chovu nezasiahnutého chorobami a z kolónie s krá ľovnou 
s overeným pôvodom a fyziologickým stavom. V čely by sa mali 
vyberať ráno pred použitím alebo ve čer pred testovacím d ňom 
a potom by sa mali udržiava ť v týchto podmienkach až do nasledu ­
júceho dňa. Vhodné sú v čely odobrané z rámov, bez mlá ďat. Malo 
by sa vyvarova ť odoberaniu v čiel skoro na jar alebo neskoro na 
jeseň, keďže v tomto období sa v čelám mení ich fyziológia. 
V prípade, že sa predsa test musí vykona ť počas skorej jari alebo 
neskorej jesene, v čely môžu by ť v prípade núdze premiestnené do 
inkubátora a po čas jedného týžd ňa sa budú k ŕmiť včelím chlebom 
(peľ zozbieraný z plástov) a roztokom sacharózy. V čely liečené 
chemickými látkami ako sú antibiotiká, antivarroa produktmi, at ď. 
by sa nemali použi ť na toxikologický test po dobu štyroch týžd ňov 
od poslednej lie čby. 
1.5.2.  Podmienky k ŕmenia a chovu v čiel 
Vhodné sú úle s ľahkým čistením a dobrým vetraním. Je možné 
použiť ľubovoľný vhodný materiál, ako je napr.: nehrdzavejúca 
oceľ, pletivo, plastické alebo drevené úle. Je vhodné umiestni ť 
skupinu 10 v čiel do jedného ú ľa. Veľkosť testovacích ú ľov by 
mala byť úmerná po čtu včiel, t. j. aby bol zabezpe čený dostato čný 
priestor. 
Včely sa majú drža ť v tme, v miestnosti ur čenej na pokusy pri 
teplote 25 ± 2  o C. Relatívna vlhkos ť, normálne okolo 50 – 70 %, 
by mala by ť zaznamenávaná po čas doby trvania testu. Manipulo ­
vanie vrátane lie čby a pozorovania sa môžu uskuto čňovať za 
denného svetla. Ako potrava sa použije roztok sacharózy vo vode s konečnou koncentráciou 500 g/l (50 % objemových). Po podaní 
testovacích dávok by sa mala strava podáva ť ad libitum  s použitím 
včelieho kŕmidla. Je možné použi ť sklenenú trubicu (približne 
50 mm dlhú a 10 mm širokú s otvoreným zúženým koncom okolo 2 mm v priemere)
 
1.5.3.  Príprava v čiel 
Zozbierané v čely sa znecitlivejú použitím oxidu uhli čitého alebo 
dusíka pri každej aplikácií testovanej látky. Je potrebné minimali ­
zovať nielen množstvo použitého anestetika, ale aj časť expozície. 
Umierajúce v čely je pred za čiatkom testu potrebné nahradi ť zdra­
vými.  
1.5.4.  Príprava dávok  
Testovanú látku je možné aplikova ť ako roztok na nosi či, 
t. j. organické rozpúš ťadlo alebo vodný roztok so zvlh čujúcim činid­
lom. Ako organické rozpúš ťadlo sa používa acetón, ale je možné 
použiť aj iné organické rozpúš ťadlá s nízkou toxicitou vo či včelám 
(napr. dime ťnylformamid, dimetylsulfoxid). Pri vo vode rozpustných 
viazaných produktoch a vysoko polárnych organických zlú čeninách 
nerozpustných v organických nosi čových rozpúš ťadlách je lepšie 
použiť slabé roztoky komer čne dostupných zvlh čujúcich činidiel na 
ľahšiu aplikáciu (napr. Agral, Cittowet, Lubrol, Triton, Tween).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Mali by sa pripravi ť vhodné kontrolné roztoky, t. j. roztoky, 
v ktorých rozpúš ťadlo alebo disperzné činidlo rozpustí testovanú 
látku. Použijú sa dve oddelené kontrolné skupiny: jedna s použitím vody a jedna s použitím rozpúš ťadla alebo disperzanta.
 
1.6. POSTUP  
1.6.1.  Test a kontrolné skupiny  
Počet dávok a ich opakovaní by mal sp ĺňať štatistické požiadavky na 
stanovenie LD  50 s 95 % pravdepodobnos ťou. Bežne sa na tento test 
požaduje pä ť dávok v geometrickom rade s faktorom nepresahujúcim 
2,2 na daný rozsah LD  50 . Počet dávok sa musí stanovi ť vo vzťahu 
ku strmosti krivky toxicity (dávka versus úmrtnos ť). Je potrebné 
vziať do úvahy štatistickú metódu, ktorá bola zvolená na analýzu 
výsledkov. Výber rozsahu pre test umožní vybra ť vhodné koncen ­
trácie dávkovanej látky. 
Každá testovaná koncentrácia sa podá minimálne trom skupinám, 
každá po desiatich v čelách. 
Súčasne by sa mali vykona ť testovacie série na aspo ň troch kontrol ­
ných skupinách, každá po desiatich v čelách. V prípade použitia 
organického rozpúš ťadla alebo zvlh čovacieho činidla sa použijú tri 
dodatočné kontrolné skupiny po desiatich v čelách.  
1.6.2.  Toxický štandard  
Do testovacích sérií je potrebné zahrnú ť toxický štandard. Následne 
sa vyselektujú aspo ň tri dávky, aby sa dosiahla o čakávaná hodnota 
LD 50 . Pri každej testovanej dávke by sa mali použi ť minimálne tri 
úle, každý po desiatich v čelách. Preferovaný štandard toxicity je 
dimetoát, pre ktorý je zaznamenaná hodnota LD  50 za 24 hodín 
v rozmedzí 0,10 – 0,30 μg a. s. /včelu (2). Aj iné štandardy toxicity 
budú akceptovate ľné tam, kde sa dá získa ť dostatočné množstvo 
údajov na overenie o čakávanej odozvy dávky (napr. parathion).  
1.6.3.  Expozícia  
1.6.3.1.  Podávanie dávok  
Je potrebné individuálne zaobchádza ť s anestezovanými v čelami pri 
lokálnej aplikácií. V čelám sa náhodne pride ľujú testovacie látky 
a náhodným výberom sa podrobia kontrole. Objem 1 μl roztoku 
obsahujúceho testovanú látku vo vhodnej koncentrácií sa bude apli ­
kovať mikroaplikátorom na dorzálnu stranu thoraxu každej v čely. 
V prípade opodstatnenosti je možné použi ť aj iné objemy roztoku. 
Po aplikácií testovanej látky sa v čely umiestnia do testovacích ú ľov 
a vyživujú sa roztokom sacharózy.  
1.6.3.2.  Trvanie testu  
Na trvanie testu sa uprednost ňuje doba 48 hodín. Ak úmrtnos ť včiel 
prekročí hodnotu 10 % po čas prvých 24 hodín až 48 hodín, trvanie 
testu by malo by ť predĺžené na maximálne 96 hodín za predpokladu, 
že kontrola úmrtnosti neprekro čí 10 %.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Pozorovania  
Úmrtnosť sa zaznamenáva po 4 hodinách od za čiatku testu a potom 
po 24 hodinách a po 48 hodinách. Ak je potrebný pred ĺžený čas 
pozorovania, ďalšie hodnotenie by malo prebehnú ť v 24 hodinových 
intervaloch, avšak maximálne do celkových 96 hodín na dôkaz toho, 
že úmrtnos ť včiel neprekro čí stanovených 10 %. 
Všetky abnormálne prejavy správania sa v čiel počas testovaného 
obdobia by mali by ť zaznamenané.  
1.6.5.  Limitný test  
V niektorých prípadoch (napr. za predpokladu, že testovaná látka má 
nízku toxicitu) je možné vykona ť limitný test 100 μg a. s. /v čelu 
s cieľom dokáza ť, že hodnota LD  50 je väčšia ako uvedená hodnota. 
Rovnaký postup by sa mal použi ť vrátane troch opakovaní testu na 
danú testovanú látku aj na relevantnú kontrolu a použitie toxického 
štandardu. V prípade mortality sa celá štúdia prepracuje. Ak sa spozorujú subletálne ú činky (pozri časť 1.6.4.), aj tieto je potrebné 
zaznamena ť.
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
2.1. ÚDAJE 
Údaje sa zosumarizujú do tabu ľkovej formy, na každú pokusnú 
skupinu zvláš ť, tak isto aj na kontrolnú skupinu v čiel a skupinu 
použitú na zistenie toxického štandardu, na po čet použitých v čiel, 
úmrtnosť v každom období pozorovania a na po čet včiel so 
zmeneným správaním. Údaje mortality je potrebné analyzova ť vhod­
nými štatistickými metódami (napr. probitová analýza, pohyblivý priemer, binominálna pravdepodobnos ť) (3), (4). Grafické záznamy 
dávok a ich odoziev by mali by ť zaznamenané formou kriviek, a to 
v každý odporú čaný čas pozorovania (napr. 24 h, 48 h, a ak je to 
potrebné 72 h, 96 h) na výpo čet sklonu – strmosti kriviek 
a stredných smrte ľných dávok (LD
 50 ) s 95 % pravdepodobnostnými 
limitami. Opravy týkajúce sa kontroly úmrtnosti sa vykonajú za 
pomoci Abbottových korekcií (4), (5). Tam, kde nebola úplne skon ­
zumovaná použitá potrava, zaznamenajú sa skonzumované testovacie dávky na skupinu v čiel. Hodnota LD
 50 by mala by ť vyjadrená v μg 
testovanej látky na v čelu. 
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť nasledujúce informácie:  
2.2.1.  Testované látky:  
— fyzikálna podstata a relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti 
(ako napr.: stabilita – odolnos ť vo vode, tlak pár), 
— identifika čné chemické údaje vrátane štruktúrneho vzorca, čistota 
(napr. pesticídov, identita a koncentrácia ú činnej látky alebo 
látok).  
2.2.2.  Testované druhy:  
— odborný – vedecký názov, druh, približný vek (v týžd ňoch), 
metóda zberu, dátum zberu, 
— informácie o kolónach použitých na zber testovaných v čiel 
vrátane zdravotného stavu, všetkých chorôb týkajúcich sa dospe ­
lého včelstva, všetky prelie čenia atď. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Podmienky testu  
— teplota a relatívna vlhkos ť experimentálnej miestnosti, 
— podmienky chovu v čiel, vrátane typu, ve ľkosti a materiálu testo ­
vacích úľov, 
— metódy podávania testovanej látky, napr. použité rozpúš ťadlo – 
nosič, objem testovaného roztoku, použitý roztok anestetika, 
— koncepcia testu, napr.: použitý po čet a testovacie koncentrácie, 
počet kontrol na každú testovanú koncentráciu a kontrolu, po čet 
kópií testovacích ú ľov a počet včiel na testovaný ú ľ, 
— dátum testu.  
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky predbežného výberu rozsahu štúdie, ak bol výber usku ­
točnený, 
— nespracované údaje: úmrtnos ť pri každej testovanej dávke pri 
každom pozorovanom čase, 
— graf udávajúci závislos ť dávky – odozvy na konci každého testu, 
— hodnoty LD  50 s 95 % pravdepodobnos ťou limitu na každý odpo ­
rúčaný čas pozorovania, na testovanú látku a toxický štandard, 
— štatistické postupy použité na ur čenie LD  50 , 
— úmrtnos ť pri kontrolách, 
— iné biologické dopady pozorované alebo merané, ako napr.: 
abnormálne správanie sa v čiel (vrátane odmietnutia testovacej 
dávky potravy), pomer skonzumovanej potravy v skupinách včiel testovaných a netestovaných, 
— akéko ľvek odchýlky od testovacích postupov tu uvedených 
a všetky dostupné, relevantné informácie.
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision – Making Scheme 
for the Enviromental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol.23, N.1, s. 151 – 165. March 1993. 
(2) Gough, H.J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B.(1994). The use of 
dimethoat as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981 – 1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, s. 119 – 125. 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method ef 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. 
Ther., s. 99 – 113. 
(4) Finney, D.J. (1971. Probit analysis. 3rd ed., Cambridge, London 
and New York. 
(5) Abbott, W.S.(1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol, 18, s. 265 – 267.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C. 18.  ADSORPCIA ALEBO DESORPCIA S POUŽITÍM 
ROVNOVÁŽNEJ METÓDY DÁVKOVANIA  
1. METÓDA  
Táto metóda je totožná s metódou OECD TG 106, na stanovenie 
adsorbcie alebo desorbcie v zemine, použitím dávkovacej rovno ­
vážnej metódy (2000).  
1.1. ÚVOD 
Metóda sa zaoberá kruhovým testom a praktickým postupom ur čeným 
na selekciu pôdy na vývoj adsorb čného testu (1), (2), (3), (4) a tiež jeho 
zavedením na vnútroštátnej úrovni (5), (6) (7), (8), (9), (10), (11). 
Adsorbčné alebo desorb čné štúdie sú užito čné na získavanie základ ­
ných informácií o pohybe chemikálií a ich distribúcii v pôde, vode a v plynnom stave biosféry (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), 
(19), (20), (21). Tieto informácie môžu by ť použité pri predvídaní 
alebo odhade, napríklad možnej dosažite ľnej miery degradácie chemi ­
kálie (22), (23), transformácii a po príjme organizmom (24), lúhovaním cez pôdny profil (16), (18), (19), (21), (25), (26), (27), (28), prchavo ­
sťou pôdy (21), (29), (30), prenosom z povrchu terénu do prírodných 
vodných zdrojov (18) (31), (32). Údaje o adsorbcii môžu by ť použité 
na porovnávacie a modelové ú čely (19), (33), (34), (35). 
Distribúcia chemikálii medzi pôdou a vodnými fázami je komplexný 
proces, ktorý závisí od po čtu rozdielnych faktorov: chemickej povahy 
látky (12), (36), (37), (38), (39), (40), charakteristík pôdy (4), (12), 
(13), (14), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49) 
a klimatických faktorov ako sú napríklad zrážky, teplota, slne čný svit 
a vietor. Preto predkladaným zjednodušeným laboratórnym modelom ako je táto metóda, nemôžu by ť kompletne postihnuté všetky 
rôznorodé fenomény a mechanizmy zahrnuté v procese adsorbcie 
chemikálie pôdou. Akoko ľvek, aj ke ď sa týmto modelom nedajú 
pokryť všetky enviromentálne možné prípady, môže poskytnú ť 
hodnotné informácie o význame adsorbcie chemikálií na životné 
prostredie. 
Pozri Všeobecný úvod.
 
1.2. Ú ČEL 
Cieľom tejto metódy je stanovenie adsorb čného alebo desorb čného 
správania sa látok v pôde. Cie ľom je získa ť údaje o sorp čných 
hodnotách, ktoré môžu by ť použité na predpoklad segmentácie 
spomedzi množstva enviromentálnych podmienok: rovnovážnych 
adsorbčných koeficientov pre chemikálie na rôznych pôdach, ktoré 
sú vymedzené funkciou pôdnych charakteristík (ako napr.: obsah organického uhlíka, obsah ílov, pôdnou štruktúrou a pH). Použijú 
sa rôzne pôdne typy, aby sa čo najširšie pokryl rozsah interakcií 
danej látky s prírodnými typmi pôd. 
V tejto metóde adsorbcia reprezentuje proces väzby chemikálie na 
pôdny povrch: nerozlišuje medzi rozdielnymi adsorb čnými procesmi 
(fyzikálnou alebo chemickou adsorbciou) a procesmi ako povrchovo katalyzovaná degradácia, rozsahom adsorbcie alebo chemickou reak ­
ciou. Adsorbcia, ktorá bude prebieha ť na koloidných časticiach 
(o priemere 0,2 um) vytvorených pôdou, nie je bratá do úvahy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Pôdne parametre, ktoré sú braté do úvahy z poh ľadu adsorpcie 
a najväčšej miery dôležitosti, sú: obsah organického uhlíka (3), 
(4), (12), (13), (14), (41), (43), (44), (45), (46), (47), (48); obsah ílu a pôdna štruktúra (3), (4), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48) a pH pre ionizovate ľné zlúčeniny (3), (4), (42). Ďalšie pôdne 
parametre, ktoré môžu ma ť dopad na adsorpciu alebo desorpciu 
danej látky, sú efektívne katióny s výmennou kapacitou (ECEC), obsah amorfného železa a oxidov hliníka, hlavne na vulkanické a tropické pôdy (4), tak ako aj na špecifický povrch (49). 
Test je navrhnutý na vyhodnocovanie adsorpcie chemikálií na 
rozdielnych pôdnych typoch s rôznymi rozsahmi obsahu organického uhlíka, obsahu ílu, pôdnej matrice a hodnoty pH pôdy. Tento test zahrňuje tri rady:  
Rad 1:  — pomer pôda/roztok, 
— čas potrebný na dosiahnutie adsorp čnej rovnováhy 
a množstvo testovanej látky adsorbovanej 
v rovnovážnom stave, 
— adsorpcia testovanej látky na povrchoch testovaných 
nádob a stabilita testovanej látky po čas trvania testu.  
Rad 2 : Skríningový test: Adsorpcia je študovaná na piatich rozdiel ­
nych pôdnych typoch v zmysle adsop čnej kinetiky pri 
jednotnej koncentrácii a stanovenie distribu čných koefi ­
cientov K
 d a K  oc . 
Rad 3 : Stanovenie Freundlichových adsorp čnych izoterm na vyme ­
dzenie vplyvu koncentrácie na rozšírenie pôdnej adsorpcie. 
Štúdia desorpcie vo význame desorp čnej kinetiky/ ­
Freundlichových desorp čných izoterm (dodatok 1).  
1.3. DEFINÍCIE A JEDNOTKY  
Symbol Definície Jednotky  
A t i adsorpčné percento v čase t  i % 
A eq adsorpčné percento v adsorp čnej rovnováhe %  
m s ads ðt i Þ hmotnosť testovanej latky adsorbovanej na pôdu v čase t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ hmotnosť testovanej látky adsorbovanej na pôdu po čas 
časového intervalu Δt i μg 
m s ads ðeqÞ hmotnosť testovanej látky adsorbovanej na pôdu 
v adsorpčnej rovnováhe μg 
m 0 hmotnosť testovanej látky v testovacej trubici na za čiatku 
adsorpčného testu μg 
m m ads ðt i Þ hmotnosť podielu testovanej látky meranej pomere ( v a A ) 
v časovom bode t  i μg 
m aq ads ðeqÞ hmotnosť látky v roztoku v adsorb čnej rovnováhe μg 
m pôda množstvo pôdnej fázy vyjadrenej ako vysušená hmota 
pôdy g ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symbol Definície Jednotky  
C st hmotnostná koncentrácia zásobného roztoku látky ug cm  -3 
C 0 počiatočná hmotnostná koncentrácia testovaného roztoku 
v kontakte s pôdou μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ hmotnostná koncentrácia látky vo vodnej fáze v čase t  i , 
v ktorom je analýza uskuto čnená μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ obsah adsorbovanej látky na pôde v adsorp čnej rovnováhe μg g  -1 
C aq ads ðeqÞ hmotnostná koncentrácia látky vo vodnej fáze v adsorp čnej 
rovnováhe μg cm  -3 
V 0 počiatočný objem vodnej fázy v kontakte s pôdou po čas 
adsorpčného testu cm 3 
v a A objem podielu, v ktorom je meraná testovaná látka cm  3 
K d distribučný adsorb čný koeficient cm  3 g -1 
K oc organický uhlík normalizujúci adsorp čný koeficient cm  3 g -1 
K om organická hmota normalizujúca distribu čný koeficient cm  3 g -1 
K F ads Freundlichov adsorp čný koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlichov exponent  
D t i desorpčné percento v časovom bode t  i % 
D Δt i desorpčné percento korešpondujúce s časovým intervalom Δt i % 
K des aparentný desorp čný koeficient cm  3 g -1 
K F des Freundlichov desorp čný koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ hmotnosť testovanej látky desorbovanej z pôdy v čase t  i μg 
m m des ðΔt i Þ hmotnosť testovanej látky desorbovanej z pôdy po čas času 
Δt i μg 
m m des ðeqÞ hmotnosť látky určenej analyticky vo vodnej fáze 
v desorpčnej rovnováhe μg 
m aq des ðeqÞ celková hmotnos ť testovanej látky desorbovanej 
v desorpčnej rovnováhe μg 
m s des ðΔt i Þ hmotnosť zostávajúcej látky adsorbovanej na pôdu po 
časovom intervale Δt i μg 
m aq A hmotnosť látky po adsorp čnej rovnováhe pri nekompletnej 
objemovej zámene μg 
C s des ðeqÞ obsah zostatkovej testovanej látky adsorbovanej na pôdu 
v desorpčnom eguilibriu μg g  -1 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symbol Definície Jednotky  
C aq des ðeqÞ hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnej fáze 
v desorpčnej rovnováhe μg cm  -3 
V T celkový objem vodnej fázy v kontakte s pôdou po čas 
desorpčného kinetického experimentu po čas sériovej 
metódy cm 3 
V R objem supernatantu odstráneného z trubice po dosiahnutí 
adsorpčnej rovnováhy a nahradenej rovnakým objemom 
roztoku 0,01 M CaCl  2 cm 3 
v a D objem alikvotného podielu dávkovanej látky na analytické 
účely v čase (i), po čas experimentu desorp čnej kinetiky 
uskutočneného sériovou metódou cm 3 
V ra i D objem roztoku odobratého z trubice (i) na meranie testo ­
vanej látky v experimente desorp čnej kinetiky (paralelná 
metóda) cm 3 
V r F objem roztoku odobratého z trubice na meranie testovanej 
látky v desorp čnej rovnováhe cm 3 
MB hmotnostná rovnováha % 
m E celkové množstvo testovanej látky extrahovanej z pôdy 
a stien testovacích nádob v dvoch krokoch μg 
V rec objem supernatantu získaného po adsorp čnej rovnováhe cm  3 
P ow oktanol/parciálny vodný koeficient 
pKa disocia čná konštanta 
S w rozpustnos ť vo vode g l  -1 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Známe objemy roztokov testovanej látky, neozna čenej alebo radioak ­
tívne ozna čenej so známymi koncentráciami v 0,01 M roztoku CaCl  2 
sú pridané do vzoriek pôdy o známej hmotnosti v suchom stave, 
ktoré sú preekvilibrované s 0,01 M roztokom CaCl  2 . Zmes sa 
premiešava dostato čne dlhý čas. Pôdne suspenzie sú potom oddelené 
odstredením a ak je potrebné filtráciou a analyzuje sa vodná fáza. Množstvo testovanej látky adsorbovanej na pôdnej vzorke je vypo ­ 
čítané ako rozdiel medzi množstvom testovanej látky obsiahnutej 
v roztoku na za čiatku a zostatkového množstva látky na konci expe ­
rimentu (nepriama metóda). 
Variabilne je možné stanovova ť množstvo adsorbovanej testovanej 
látky priamo analýzou pôdy (priama metóda). Tento postup, ktorý 
zahŕňa postupný program pôdnej extrakcie s vhodným rozpúš ťadlom, 
sa odporú ča v prípadoch, kde rozdiel koncentrácií roztoku látky 
nemôže by ť presne ur čený. Príklady takýchto prípadov sú: adsorpcia 
testovanej látky na povrchu testovaných nádob, nestabilita testovanej 
látky v dobe trvania experimentu, nízka adsorpcia spôsobujúca iba malú zmenu koncentrácie v roztoku a silná adsorpcia poskytujúca nízku koncentráciu, ktorá nemôže by ť presne stanovená. Ak sa 
používa radioaktívne ozna čená látka, pôdna extrakcia môže by ť 
nahradená analýzou pôdnej fázy po zhorení a tekutým scintila čným 
načítavaním. Nako ľko tekuté scintila čné načítavanie je nešpecifická 
technika, ktorá nemôže rozlišova ť medzi pôvodnými 
a transformovanými produktmi, mala by by ť použitá iba v prípade, 
ak je testovaná chemikália stabilná po čas trvania štúdií.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Chemické reagenty by mali ma ť stupeň čistoty – analyticky čistá. 
Odporúča sa použitie neozna čkovaných testovacích látok so známym 
zložením aspo ň 95 % čistoty alebo u rádioozna čených látok 
o známom zložení a rádio- čistoty v prípade krátkej polovi čnej 
doby rozpadu by sa mali aplikova ť korekcie na rozpad. 
Pred začatím adsorp čne desorp čného testu by mali by ť dostupné 
nasledovné informácie o testovanej látke: 
a) rozpustnos ť vo vode (A.6); 
b) tlak pár (A.4) a/alebo Henryho konštanta; c) abiotická degradácia: hydrolýza ako funkcia pH (C.7); 
d) rozdeľovací koeficient (A.8); 
e) stav biodegradability (C.4) alebo aeróbna a anaeróbna transfor ­
mácia v pôde; 
f) pKa ionizovate ľných látok; 
g) priama fotolýza vo vode (napr.: UV-Vis absorp čné spektrum vo 
vode, množstvo vý ťažku) a fotodegradácia na pôde.
 
1.6. APLIKOVATE ĽNOSŤ TESTU 
Tento test sa dá aplikova ť na chemické látky, pre ktoré je možné 
aplikovať analytickú metódu s dostato čnou presnos ťou. Dôležitým 
parametrom, ktorý môže ovplyvni ť dôveryhodnos ť výsledkov, 
špeciálne v prípadoch, kedy sa používa nepriama metóda, je stabilita testovanej látky v závislosti na čase počas trvania testu. 
T. j. predpokladá sa skontrolova ť stabilitu a úvodnú štúdiu; ak sa 
spozoruje transformácia v závislosti na čase, odporú ča sa, aby hlavná 
časť testu bola uskuto čnená v oboch fázach, kvapalnej aj pevnej. 
Pri realizovaní tohto testu sa môžu objavi ť ťažkosti u testovaných látok 
s nízkou rozpustnos ťou vo vode (S
 w < 10  -4 g l -1 ), ako aj u ve ľmi 
nabitých látok, vzh ľadom na skuto čnosť, že koncentrácia v kvapalnej 
fáze sa nemôže mera ť analyticky s dostato čnou presnos ťou. V takýchto 
prípadoch musia by ť urobené dodato čné opatrenia. Návod, ako postu ­
povať v týchto prípadoch (ako zvládnu ť tieto problémy), je uvedený 
v zodpovedajúcej časti tejto analytickej metódy. 
Pri použití prchavých látok by sa malo vyvarova ť stratám po čas 
štúdie.  
1.7. OPIS METÓDY  
1.7.1.  Prístroje a chemikálie  
Štandardné laboratórne vybavenie: 
a) Trubice a nádobky na vykonanie experimentu. Je dôležité, aby 
tieto trubice a nádobky: 
— zapadali do aparatúry odstredivky, aby minimalizovali mani ­
puláciu a prenos chýb, 
— boli vyrobené z nerezového materiálu, ktorý minimalizuje 
adsorpciu testovanej látky na ich povrchu  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Miešacie zariadenie: trepa čka alebo ekvivalentné zariadenie na 
trepanie, ktoré je schopné zachova ť pôdu po čas doby pretrepá ­
vania v stave suspenzie. 
c) Odstredivka: uprednost ňuje sa vysokorýchlostná, napr.: so silou 
odstredenia vä čšou ako 3 000 g, tepelne regulovate ľnou, so schop ­
nosťou odstráni ť častice s priemerom vä čším ako 0,2 μm z vodného 
roztoku. Kontajnery by mali by ť počas pretrepávania 
a odstreďovania uzavreté kvôli strate vody a prchavosti látok, 
kvôli minimalizácii adsorpcií na látky by sa mali používa ť deakti­
vované uzávery ako napr. teflónom pokryté skrutkové vrchná čiky. 
d) Volite ľné: je možné použi ť aj filtračné zariadenie, filtre s porozitou 
0,2 μm, sterilné, na jednorázové použitie. Špeciálna starostlivo ť sa 
musí venova ť výberu materiálu filtra kvôli zamedzeniu strát testo ­
vanej látky na jeho povrchu; pri málo rozpustných testovaných 
látok sa neodporú ča filter z organického materiálu. 
e) Analytické prístroje, vhodné na meranie koncentrácie testovaných 
chemikálií. 
f) Laboratórna pec, schopná udrža ť teplotu v rozsahu 103  o C až 110  o C. 
1.7.2.  Charakteristika a výber pôdy  
Pôda by mala by ť charakterizovaná tromi parametrami, ktoré sú 
zodpovedné za ich adsorp čnú kapacitu: organický uhlík, obsah 
hliny a štruktúra pôdy a pH. Ako už bolo spomenuté (pozri Preh ľad), 
ostatné fyzikálno-chemické vlastnosti pôdy môžu ovplyv ňovať 
adsorpciu alebo desorpciu špeciálnych látok a mohli by zaváži ť 
v takýchto prípadoch. 
Metódy, ktoré charakterizujú pôdu, sú ve ľmi dôležité a môžu ma ť 
signifikantný vplyv na výsledky. Preto sa odporú ča, aby pH pôdy 
bolo merané v roztoku 0,01 M CaCL  2 (to je roztok, ktorý sa používa 
pri testoch (desorpcia alebo adsorpcia) pod ľa odpovedajúcej ISO- 
10390-1. Tiež sa odporú ča, aby sa ostatné relevantné vlastnosti 
pôdy stanovovali v súlade so štandardným postupom (napr. ISO 
„Príručka pre analýzu pôdy“). Toto zabezpe čí analýzy sorp čných 
údajov na báze všeobecne štandardizovaných parametrov na pôdu. Niektoré návody, opisy existujúcich štandardných metód na analýzu 
a charakterizáciu pôdy je možné získa ť v odkazoch (50 – 52). Na 
kalibráciu testovacích metód na pôdu sa odporú ča použiť referenčné 
pôdy. 
Návod (sprievodca) na výber pôd na adsorp čno alebo desorp čné 
experimenty je uvedený v tabu ľke 1. Sedem vybratých typov pôd 
nachádzajúcich sa v miernom geografickom pásme. Pre ionizujúce sa testovacie látky by vybraté pôdy mohli zah ŕňať široké rozpätie pH, 
v prípade, že by mohli zhodnoti ť adsorpciu látky v jej ionizujúcej 
a neionizujúcej forme. Návod, preh ľad, na ko ľkých mnohých 
rozdielnych typoch pôd sa používa v rozli čných stup ňoch testuje 
uvedený v odseku 1.9. – Vykonanie testu. 
Ak sa uprednost ňujú iné typy pôdy, tieto môžu by ť charakterizované 
tými istými parametrami a môžu ma ť podobné odchýlky alebo 
variácie vo vlastnostiach tak, ako je to uvedené v tabu ľke 1, hoci 
nedosahujú presne uvedené kritériá.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabuľka 1 
Návod na výber vzoriek pôdy pre adsorpciu/desorpciu  
Druh pôdy Rozsah pH (v 0,01 
M CaCl  2 ) Obsah organického 
uhlíka ( %) Obsah ílu ( %) Matrica pôdy (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65 – 80 íl 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20 – 40 ílovitá hlina 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15 – 25 prachovitá hlina 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15 – 30 hlina 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) <0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10 – 15 (  2 ) hlinitý piesok 
6 > 7,0 <0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40 – 65 ílovitá hlina/íl 
7 < 4,5 > 10 < 10 piesok/hlinitý 
piesok  
( 1 ) Podľa FAO a US systému (85). 
( 2 ) Príslušné premenné by mali ma ť hodnoty v uvedenom rozsahu. Ak sa pri h ľadaní vhodnej matrice pôdy vyskytnú 
ťažkosti, v takomto prípade sa môžu akceptova ť aj hodnoty nižšie ako uvedené minimum. 
( 3 ) Pôdy s obsahom organického uhlíka nižším ako 0,3 % môžu pôsobi ť rušivo na korela čný vzťah medzi obsahom 
organického uhlíka a adsorpciou. Takže sa odporú ča používa ť pôdy s minimálnym obsahom organického uhlíka 
0,3 %.  
1.7.3.  Výber a skladovanie pôdnych vzoriek  
1.7.3.1  Výber  
Neodporú čajú sa žiadne špecifické vzorkovacie techniky: vzorkovacie 
techniky závisia od ú čelu štúdie (53), (54), (55), (56), (57), (58). 
Je možné uvažova ť o nasledujúcich možnostiach: 
a) podrobné informácie o histórii miesta po ľa sú nevyhnutné; táto 
zahrňuje umiestnenie, vegeta čný povrch, aplikáciu prípravkov na 
ochranu rastlín, priemyselných hnojív, biologických prípravkov 
alebo náhodnú kontamináciu. Odporú čania štandardu ISO 
o vzorkovaní pôd (ISO 10381-6) by sa mali dodržiava ť 
s ohľadom na opis vzorkovacieho miesta. 
b) vzorkovacie miesto musí by ť definované pod ľa UTM (Universal 
Transversal Mercator – Projection/European Horizontal Datum) 
alebo geografickými súradnicami, čo môže povoli ť 
v budúcnosti opätovné zhromaž ďovanie špeciálnych pôd alebo 
by mohlo pomôc ť definova ť pôdu z rôzne/rozdielne klasifikova ­
ných systémov používaných v rozli čných krajinách. Tiež iba 
A horizont by mohol by ť zhromaždený do h ĺbky 20 cm. 
Špeciálne pre druh pôdy č. 7, ak je prítomný O  h horizont ako 
časť pôdy, môže by ť zaradený do vzorkovania. 
Vzorky pôdy by mohli by ť transportované pri použití kontajnerov za 
teplotných podmienok, ktoré garantujú, že po čiatočné vlastnosti pôdy 
nie sú podstatne zmenené.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Skladovanie  
Uprednost ňuje sa používa ť čerstvo odobratú pôdu. Iba v prípade, 
keď to nie je možné, pôda sa môže uskladni ť pri teplote miestnosti 
a mala by by ť sušená na vzduchu. Nie je ur čený limit na usklad ňo­
vanie, ale pôda, ktorá bola uskladnená dlhšie než tri roky, by mala 
byť reanalyzovaná pred použitím na obsah organického uhlíka, pH 
a CEC.  
1.7.3.3.  Manipulácia a príprava pôdnych vzoriek na test.  
Pôda sa suší vzduchom pri izbovej teplote (preferuje sa teplota medzi 
20 o C – 25  o C). Desagregácia by sa mala da ť vykonať s minimálnou 
silou tak, aby sa originálna štruktúra pôdy zmenila na najmenšiu 
možnú. Pôda sa preosieva na čiastočky s veľkosťou rovnou alebo 
menšou ako 2 mm. Mali by sa dodržiava ť odporúčania štandardu 
ISO na vzorkovanie pôdy (ISO 10381-6) s oh ľadom na sitovací 
proces. Odporú ča sa vykona ť opatrne homogenizáciu vzorky, toto 
prispeje k vylepšeniu reprodukovate ľnosti výsledkov. Obsah vlhkosti 
každej pôdy sa stanoví na trikrát pri zahriatí na 105  o C až do 
dosiahnutia konštantnej hmotnosti (približne 12 hodín). Vo všetkých 
výpočtoch hmotnos ť pôdy sa vz ťahuje na vysušenú hmotnos ť v peci, 
hmotnosť pôdy upravená o obsah vlhkosti.  
1.7.4.  Príprava testovacej látky na aplikáciu na pôdu  
Testovaná látka sa rozpustí v roztoku 0,01 M CaCL  2 v destilovanej 
alebo deionizovanej vode; roztok CaCL  2 sa používa ako vodná 
rozpustná fáza na zlepšenie odstre ďovania a minimalizácie výmeny 
katiónov. Koncentrácia zásobného roztoku by mala by ť tri rady 
vyššia než detek čný limit používanej analytickej metódy. Táto 
prahová hodnota ochra ňuje presnos ť stanovenia s oh ľadom na meto ­
dológiu uvedenú v tejto metóde. Naviac koncentrácia zásobného 
roztoku by mala by ť pod rozpustnos ťou testovanej látky vo vode. 
Zásobný roztok by mal by ť pripravený tesne pred aplikáciou na 
pôdne vzorky a mal by sa udržiava ť v tme pri 4  o C. Čas usklado ­
vania je závislý od stability testovanej látky a jej koncentrácie v roztoku. 
Iba pre zle rozpustné látky (S
 w < 10  -4 gl -1 ), bude potrebné vhodné 
rozpustné činidlo, ak je ťažko rozpustná v testovanej látke. Takéto 
rozpúšťajúce činidlo a) by malo by ť miešateľné s vodou tak ako je 
metanol alebo acetonitril; b) jeho koncentrácia by nemala presiahnu ť 
1 % z celkového objemu zásobného roztoku a mal by predstavova ť 
menej objemu ako je v roztoku testovanej látky, ktorá prichádza do 
kontaktu s pôdou (pokia ľ možno menej než 0,1 %); a c) nemalo by 
to byť povrchovo aktívne činidlo alebo by sa nemalo podrobi ť solvo­
lytickej reakcii s testovanou chemikáliou. Použitie rozpúš ťajúceho 
činidla sa stanoví a potvrdí výpisom údajov. 
Iná alternatíva pri zle rozpustných látkach je prida ť označkovanú 
testovanú látku do testovacieho systému. Testovacia látka je rozpustná v organických rozpúš ťadlách; jej alikvotná časť sa pridá 
do pôdneho systému a 0,01 M CaCl
 2 v destilovanej alebo deionizo ­
vanej vode. Obsah organického rozpúš ťadla vo vodnej fáze by sa 
mal udržiava ť tak nízko, ako je to len možné, normálne by nemal 
presiahnu ť 0,1 %. Zna čkovanie organickým roztokom môže pred ­
chádzať nereprodukovate ľnosti objemu. Takto môžeme zavies ť 
ďalšiu následnú chybu v prípade, ak koncentrácie testovanej látky 
ako rozpúš ťadla by neboli rovnaké po čas trvania celého testu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. ZÁKLADNÉ POŽIADAVKY NA VYKONANIE ADSORPCNEHO 
ALEBO DESORP ČNÉHO TESTU  
1.8.1.  Analytická metóda  
Kľúčové parametre, ktoré môžu ovplyvni ť presnos ť sorbčných 
meraní, zah ŕňajú presnos ť analytickej metódy použitej pri rozbore 
roztoku a adsorbovanej fázy, stabilitu a čistotu testovanej látky, 
dosiahnutie sorb čnej rovnováhy, ve ľkosť koncentra čnej zmeny 
roztoku, pomer pôda a roztok a zmeny v pôdnej štruktúre po čas 
ekvilibračného procesu (35), (59 – 62). Niektoré spôsoby chovania 
sa pri presných východoch sú uvedené v dodatku 2. 
Spoľahlivosť použitých analytických metód sa musí skontrolova ť 
v koncentra čnom rozsahu, ktorý sa môže vyskytnú ť počas testu. 
Experimentátor by mal ma ť voľnú ruku pri vyvíjaní vhodnej metódy 
s náležitou presnos ťou, precíznos ťou, reprodukovate ľnosťou, detek ­
ciou limitov a vý ťažnosťou. Návod, ako vykona ť takýto test, je 
uvedený v nižšie opísanom experimente. 
Pôda s vysokou adsorbilitou o hmotnosti cca 20 g s vysokým 
obsahom organického uhlíka a obsahom ílu sa pretrepáva vo 
vhodnom objeme 0,01 M CaCl  2 , napr. 100 cm  3 počas 4 hodín. 
Tieto udané objemy a váhy môžu kolísa ť v závislosti na analytic ­
kých potrebách, ale pomer pôda k roztoku 1:5 je vhodné použi ť ako 
východiskový bod. Zmes sa odstredí a vodná fáza prefiltruje. Ur čitý 
objem testovanej látky zásobného roztoku je pridaný do novšieho na 
dosiahnutie nominálnej koncentrácie vrátane koncentra čného 
rozsahu, ktoré sa môžu vyskytnú ť počas testu. Tento objem by 
nemal prekro čiť 10 % kone čného objemu vodnej fázy, v záujme 
zmeniť charakter pred dosiahnutím rovnováhy roztoku tak málo 
ako sa len dá. Roztok sa následne analyzuje. 
Jeden slepý pokus pozostávajúci zo systému pôda + roztok CaCl  2 , 
(bez testovanej látky) musí by ť zahrnutý do testu z dôvodu na 
odhalenie artefaktov v analytickej metóde a na efekty matrice zaprí ­ 
činené pôdou. 
Medzi analytické metódy, ktoré môžme použi ť na sorpčné merania, 
patria chromatografia plyn – kvapalina (GLC), vysoko ú činná kvapa ­
linová chromaografia (HPLC), spektrometria (GC/hmotnostná spek ­
trometria – plynová chromatografia v kombinácii s hmotnostnou 
spektrometriou), HPLC/hmotnostná spektrometria – kvapalinová 
chromatografia v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou) a kvapalné scintila čné počítadlo (na látky ozna čené rádioaktívnou 
látkou). Nezávislos ť použitých analytických metód je viazaná na 
výťažnosť, ktorá by mala by ť medzi 90 % – 110 % nominálnej 
hodnoty. 
Charakteristiky a detekcia limitov analytickej metódy vhodnej na 
vykonanie adsorb čnej štúdie zohrávajú dôležitú úlohu 
v zadefinovaní testovacích podmienok a celého experimentálneho uskutočnenia testu. Táto metóda kopíruje všeobecnú experimentálnu 
cestu a poskytuje odporú čania a návod na alternatívne riešenia, kde 
môžu analytické metódy a laboratórne vybavenie obmedzova ť vyko­
návanie testov.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Výber optimálnych pomerov pôda k roztoku  
Selekcia vhodného pomeru pôdy k roztoku na sorp čné štúdie záleží 
na distribu čnom koeficiente K  d a relatívnom stupni požadovanej 
adsorpcie. Zmena koncentrácie látky v roztoku ur čuje štatistická 
presnosť meraní založených na tvare adsorp čnej rovnice a limity 
analytickej metodológie, pri detekcii koncentrácie chemikálie v roztoku. Vo všeobecnosti je užito čné zadať niekoľko pevných 
pomerov, pre ktoré je adsorp čné percento nad 20 % a vhodnejšie 
je viac ako 50 % (62), po čas ktorej by sa mala zameriava ť pozornos ť 
na koncentráciu testovanej látky vo vodnej fáze dostato čne vysokej 
na to, aby bolo možné vykona ť presné meranie. Toto je obzvláš ť 
dôležité v prípade vysokých adsorp čných percent. 
Vhodný prístup pri výbere primeraného pomeru pôda/voda je zalo ­ 
žený na odhade hodnoty K
 d , buď z predbežných štúdií alebo sú 
stanovené bežnými technikami (dodatok 3). Výber vhodného pomeru 
sa uskuto ční na základe záznamu vhodného pomeru pôdy a roztoku 
verzus hodnota K  d pre fixne stanovené adsorp čné percentá (obr. 1). 
V tomto zámere je predpoklad, že adsorp čná rovnováha je 
v lineárnom vz ťahu (  1 ). Aplikačný vzťah sa dosiahne zmenou uspo ­
riadania rovnice (4) pre hodnoty Kd vo forme vz ťahu (1):  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
alebo v logaritmickej forme, ktorá predpokladá, že: R = m  pôda /V 0 
a A  eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ Ä logK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # 
(2)
 
Obr. 1.  Vzťah medzi pomerom pôdy a roztoku a hodnoty K  d v rôznych adsorp čných 
percentách testovanej látky  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 Obr. 1 ukazuje pomery pôdy a roztoku požadované ako funkcia K  d 
na rôzne hladiny adsorpcie. Napríklad v pomere pôda k roztoku 
v hodnote 1:5 a hodnoty K  d rovných 20, by mala nasta ť približne 
80 % adsorpcia. Na získanie 50 % adsorpcie na tú istú hodnotu K  d 
musí byť použitý pomer 1:25. Tento je možné dosiahnu ť vhodným 
pomerom pôdy a roztoku, ktorý umož ňuje výskumníkovi pružnos ť 
vo výbere experimentálnych potrieb. 
Oblasti, ktoré sú problematickejšie, súvisia s tým, že niektoré chemi ­
kálie sú výrazne alebo len ve ľmi mierne adsorbované. Pri nízkej 
adsorpcii sa odporú ča pomer 1:1, hoci na niektoré silne organické 
pôdne typy sú potrebné nižšie pomery na dosiahnutie ílovitej kaše. Dôraz sa kladie na analytickú metodológiu merania malých zmien koncentrácií roztoku, v opa čnom prípade budú adsorp čné merania 
nepresné. Na druhej strane pri ve ľmi vysokých distribu čných koefi ­
cientoch, K
 d koeficient môže ís ť až do pomeru pôdy a roztoku 
1:100, kedy zanecháva signifikantné množstva chemikálie v roztoku. Pozornos ť treba venova ť dokonalému zmiešaniu 
a systému treba ponecha ť dostatočný čas na ekvilibráciu. V týchto 
extrémnych prípadoch, kde chýba primeraná analytická metodológia, je predpoklad hodnoty K
 d založený na technike odhadu, napríklad na 
hodnotách P  ow (dodatok 3). Táto metóda môže by ť užitočná najmä 
v prípadoch nízkej adsorbovate ľnosti polárnych zlú čenín s hodnotou 
P ow nižšou ako 20 a pre lipofilné – vysoko sorp čné chemikálie 
s hodnotou P  ow väčšou ako 10  4 . 
1.9. USKUTO ČNENIE TESTU  
1.9.1.  Podmienky testu  
Všetky experimenty sa realizujú pri izbovej teplote, ak je to možné, 
pri konštantnej teplote medzi 20  o C až 25  o C. 
Podmienky odstre ďovania musia umož ňovať odstránenie čiastočiek 
väčších ako 0,2 μm z roztoku. Táto hodnota uvo ľňuje najmenšie 
častice, ktoré sa považujú za pevné a je hranicou medzi pevnými 
a koloidnými časticami. Opis priebehu podmienok odstre ďovania je 
uvedený v dodatku 4. 
Ak odstre ďovacie zariadenia nemôžu garantova ť odstránenie častíc 
väčších ako 0,2 μm, musí sa použi ť kombinácia odstredenia 
a filtrácie s pórovitos ťou filtrov 0,2 μm. Tieto filtre by mali by ť 
vyrobené z vhodného inertného materiálu, ktorý zabráni stratám testovanej látky na ich povrchu. V každom prípade je nutné dokáza ť, 
že počas filtrovania nedochádza k žiadnym stratám testovanej látky.
 
1.9.2.  Rad 1 – Úvodná štúdia  
Účel vypracovania úvodnej štúdie bol už uvedený v časti Scope 
(Prehľad). Návod na vymedzenie takéhoto testu je opísaný 
s odporučeniami na experiment, uvedenými nižšie.  
1.9.2.1.  Výber optimálnych pomerov pôdy k roztoku  
Použijú sa dva pôdne typy a tri pomery pôdy k roztoku (6 experi ­
mentov). Jeden z pôdnych typov má vysoký obsah uhlíka a nízky 
obsah ílu, druhý má nízky obsah organického uhlíka a vysoký obsah 
ílu. Navrhujú sa nasledovné pomery pôdy k roztoku: 
— 50 g pôdy a 50 cm  3 testovanej látky vo vodnom roztoku (pomer 1:1),  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g pôdy a 50 cm  3 testovanej látky vo vodnom roztoku (pomer 1:5), 
— 2 g pôdy a 50 cm  3 testovanej látky vo vodnom roztoku (pomer 1:25). 
Minimálne množstvo pôdy, na ktorom sa môže uskuto čniť experi­
ment, závisí na laboratórnom vybavení a od ú činnosti použitých 
analytických metód. Odporú ča sa použi ť aspoň 1 g, prípadne 
2 g, ak sa chcú dosiahnu ť presné výsledky testu. 
Jedna kontrolná vzorka iba s testovanou látkou v roztoku 0,01 
M CaCl  2 (bez pôdy) sa podrobí presne tomu istému postupu, aký 
bol použitý na test, s cie ľom preskúmania stability testovanej látky 
v roztoku CaCl  2 a jej možnej adsorpcie na povrchoch testovacích 
nádob. 
Čistá vzorka alebo slepý pokus s rovnakým množstvom pôdy 
o celkovom objeme 50 cm  3 0,01 M roztoku CaCl  2 (bez testovanej 
látky) sa podrobí tomu istému postupu, ako je predpísaný na test. Slúži ako spätná kontrola na pozadie po čas analýzy na detekciu 
interferujúcich látok alebo kontaminovaných pôd. 
Všetky experimenty, vrátane kontrol a slepých pokusov, by sa mali 
uskutočniť minimálne duplicitne. Celkový po čet vzoriek, ktoré by 
mali byť pripravené na štúdiu, je možné vypo čítať s ohľadom na 
metodológiu, ktorá sa bude dodržiava ť. 
Metódy na úvodnú štúdiu a hlavnú štúdiu sú v podstate rovnaké, 
výnimky sa uvádzajú iba ak je to potrebné. 
Vzduchom vysušené pôdne vzorky sa ustália do rovnovážneho stavu 
počas noci (12 h) pred d ňom experimentu, trasením, s minimálnym 
objemom 45 cm
 3 0,01 M CaCl  2 . Následne sa pridá ur čitý objem 
zásobného roztoku testovanej látky, aby sa dosiahol kone čný 
objem 50 cm  3 . Tento pridaný objem pôvodného roztoku: a) by 
nemal prekro čiť 10 % kone čného 50 cm  3 objemu vodnej fázy 
v snahe čo najmenej zmeni ť podstatu preekvilibrovaného roztoku 
a b) mal by pokia ľ možno vyústi ť do počiatočnej koncentrácie testo ­
vanej látky, ktorá je v kontakte s pôdou (C  o ) aspoň o dva rády vyššie 
ako je hodnota veli činy na limit detekcie analytickej metódy; táto 
prahová hodnota zabezpe čí schopnos ť vykonať presné merania, aj 
keď sú hodnoty adsorpcie vä čšie ako 90 % a následne stanovi ť 
adsorpčné izotermy. Odporú ča sa, ak je to možné, aby po čiatočná 
koncentrácia látky (C  o ) neprekro čila polovicu limitu jej rozpustnosti. 
Príklad, ako sa po číta koncentrácia zásobného roztoku (C  st ), je 
uvedený v nasledujúcom texte nižšie. Predpokladaný detek čný 
limit je 0,01 μg cm  -3 a 90 % adsorpcia: tak by po čiatočná koncen ­
trácia testovanej látky v pôde mala by ť 1 μg cm  -3 (dva rády hodnoty 
vyššia ako detek čný limit). Predpokladajme, že sa pridá maximálny 
odporúčaný objem zásobného roztoku, t. j. od 5 do 45 cm  3 0,01 
M CaCl  2 rovnovážneho roztoku (= 10 % zásobného roztoku ku 
50 cm  3 celkového objemu vodnej fázy), koncentrácia zásobného 
roztoku by mala by ť 10 μg cm  -3 , toto sú o tri rády vyššie hodnoty 
ako je detek čný limit analytickej metódy. 
Meranie pH vodnej fázy je potrebné vykona ť pred a po kontakte 
s pôdou, pretože práve toto zohráva dôležitú úlohu v celom 
adsorpčnom procese, špeciálne na ionizovate ľné látky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Zlúčenina je až do bodu dosiahnutia adsorp čnej rovnováhy premieša ­
vaná. Čas rovnováhy v pôdach je ve ľmi nestály a záleží od typu chemi ­
kálie a pôdy. Za dostato čne dlhé obdobie sa považuje 24 hodín (77). 
V predbežnej štúdii môžu by ť vzorky zozbierané postupne po čas 48 
hodín miešania (napríklad pri 4, 8, 24, 48 hodinách). Aj napriek tomu 
by sa mal čas analýzy flexibilne zváži ť vzhľadom na pracovný program 
laboratória. 
Sú dve možnosti, ako analyzova ť testovanú látku vo vodnom 
roztoku: a) paralelná metóda, b) sériová metóda. Je potrebné zdôraz ­
niť, že paralelná metóda je experimentálne viac zd ĺhavá, matema ­
tické spracovanie výsledkov je jednoduchšie (dodatok 5). Výber 
metodológie je ponechaný na rozhodnutí experimentátora, ktorý 
musí zváži ť dostupné možnosti laboratórneho vybavenia a zdrojov/ ­
prostriedkov. 
a) Paralelná metóda: pripravia sa vzorky s rovnakým pomerom pôdy 
a roztoku, v daných časových intervaloch, tak ako to požaduje 
štúdia adsorp čnej kinetiky. Po ukon čení odstre ďovania a ak je to 
potrebné, aj filtrácie, vodná fáza z prvej trubice sa znova čo naj 
dôkladnejšie použije a následne sa zmeria, napríklad po 4 hodi ­
nách, z druhej trubice po 8 hodinách a z tretej po 24 hodinách atď. 
b) Sériová metóda: pripraví sa iba duplikovaná vzorka na každý 
pomer pôdy a roztoku. V definovaných časových intervaloch, 
s cieľom oddelenia fáz, je zmes odstre ďovaná. Malý alikvótny 
podiel vodnej fázy sa ihne ď analyzuje na testovanú látku, 
následne potom pokra čuje experiment s pôvodnou látkou. Ak 
sa aplikuje filtrácia po odstre ďovaní, laboratórium by malo ma ť 
zariadenia potrebné na zaobchádzanie s malými vodnými 
podielmi. Odporú ča sa, aby celkový objem odobratých podielov 
nepresiahol 1 % celkového objemu roztoku, aby sa významne nezmenil pomer pôdy a roztoku a aby sa znížilo množstvo 
rozpustenej látky využite ľnej na adsorpciu po čas testu. 
Percentuálna adsorpcia
 A t i sa vypočítava v každom časovom bode 
(t i ) na základe nominálnej po čiatočnej koncentrácie a odmeranej 
koncentrácie v čase dávkovania (t  i ) a opravenej o hodnotu slepého 
pokusu. Záznamy percentuálnej adsorpcie  A t i oproti času (obr. 1 
dodatok 5) sú vytvorené v záujme odhadu o čakávaného výsledku 
rovnovážneho plató (  1 ). Hodnota K  d je vypočítaná v ekvilibriu. Na 
základe hodnoty K  d , sú vybrané vhodné pomery pôdy a roztoku 
z obr. 1 tak, že adsorp čné percento presiahne 20 % a prednostne 
viac ako 50 % (61). Všetky aplikovate ľné rovnice a princípy zobra ­
zenia sú udané v časti o Údajoch a záznamoch v dodatku 5.  
1.9.2.2.  Stanovenie rovnovážneho adsorp čného času a množstva adsorbo ­
vanéj látky v stave rovnováhy  
Ako už bolo spomenuté, zobrazenia  A  t i alebo  C aq ads oproti času 
umožňuje odhad adsorp čného ekvilibria a množstvo testovanej 
látky adsorbovanej v ekvilibriu. Obrázky 1 a 2 nachádzajúce sa v dodatku 5 ukazujú príklady takých záznamov. Čas rovnováhy je 
potrebný, aby systém dosiahol plató.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Záznamy koncentrácie testovanej látky vo vodnej fáze  C aq ads oproti času by sa mohli 
takisto použi ť na odhad o čakávaného výsledku rovnovážneho plató (pozri obr. 2 
v dodatku 5).
 Ak s určitou pôdou nie je nájdené plató, ale iba stály vzostup, môže 
to byť spôsobené komplikujúcimi činiteľmi, ako sú biodegradácia 
alebo nízka difúzia. Biodegradácia sa dá zisti ť opakovaným experi ­
mentom so sterilizovanou vzorkou pôdy. Ak ani v tomto prípade nie je dosiahnuté plató, experimentátor by mal h ľadať iné fenomény, 
ktoré by mohli by ť zahrnuté v jeho špecifickej štúdii; toto by sa 
mohlo zabezpe čiť vhodnou zmenou experimentálnych podmienok 
(teplota, čas premiešavania, pomery pôdy a roztoku). Je na rozhod ­
nutí výskumného pracovníka, či je vhodné pokra čovať v postupe 
testu aj napriek možnému zlyhaniu dosiahnutia rovnováhy.
 
1.9.2.3.  Adsorbcia na povrchu testovacích nádobiek a stabilita testovanej 
látky  
Niektoré informácie, týkajúce sa adorpcie testovanej látky na 
povrchu testovacích nádobiek, rovnako ako aj ich stability, sa dajú 
odvodiť z analýzy kontrolných vzoriek. Ak sú vy čerpané všetky 
bežné chyby analytickej metódy, mohla by by ť na prí čine 
abiotická degradácia a/alebo adsorbcia na povrchu testovacej nádoby. 
Rozdiel medzi týmito dvomi faktami sa dá dosiahnu ť prostredníc ­
tvom očistenia stien testovacej nádoby so známym objemom vhod ­
ného rozpúš ťadla a následného vyhodnotenia roztoku použitého na 
vymytie nádob na obsah testovanej látky. Ak sa na povrchu testo ­
vacích látok zistí adsorpcia, rozdiel demonštruje abiotickú nestabilitu 
testovanej látky. Ak bola zistená takáto adsorpcia, je nevyhnutné vymeniť materiál testovacích nádob. Údaje o adsorpcii na povrchu 
testovacích nádob získaných z tohto pokusu nemôžu by ť priamo 
extrapolované na pokus pôdy a roztoku. 
Ďalšie údaje o stabilite testovanej látky je možné odvodi ť pomocou 
určenia parentálnej hmotnej bilancie. To znamená, že vodná fáza, 
extrahovaná z pôdy a stien testovacej nádoby, sa analyzuje na obsah testovanej látky. Rozdiel medzi pridanou hmotou testovanej chemikálie a sumou hmoty testovaných chemikálii vo vodnej fáze, 
extraktami pôdy a stenami testovacích nádob je rovný hmote odbú ­
ranej a/alebo nestálej a/alebo neextrahovanej. V záujme uskuto čnenia 
hmotnostnej rovnováhy, adsorp čné ekvilibrium by malo by ť dosiah­
nuté počas obdobia trvania experimentu. 
Je potrebné dosiahnu ť hmotnostnú rovnováhu na obidvoch pôdach 
a na pomer pôdy a roztoku na každú z pôd, čím sa dosiahne zníženie 
presahujúce 20 % a vä čšie ako 50 % ekvilibria. Akonáhle je postup 
na zistenie pomeru ukon čený spolu s analýzou poslednej vzorky 
vodnej fázy po 48 hodinách, fázy sa rozdelia odstre ďovaním a ak 
je potrebné aj filtráciou. Vodná fáza sa znovu použije v takom množ ­
stve, aké je len možné a pridá sa primeraná extrakcia rozpúš ťadla 
(extrakčný koeficient minimálne o hodnote 95 %) do pôdy na 
extrakciu testovanej látky. Sú odporú čané minimálne dve postupné 
extrakcie. Z množstva zistenej testovanej látky v pôde a v extrakte 
testovacích nádob sa vypo číta hmotnostná rovnováha (rovnica 10, 
Údaje a záznamy). Ak je táto hodnota menšia ako 90 %, testovaná látka sa považuje za nestabilnú v časovom rozpätí testu. Aj napriek 
tomu je možné v štúdii pokra čovať, ak sa po číta s nestabilitou testo
­
vanej látky. V prípadoch, ako bol tento, sa však odporú ča analy­
zovať obidve fázy v hlavnej štúdii.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Rad 2 – Adsorp čná kinetika pri jednej koncentrácii testovanej látky  
Použije sa pä ť pôdnych typov, vybratých z tabu ľky 1. Je vhodné do 
týchto piatich pôdnych typov zahrnú ť niektoré alebo všetky pôdne 
typy použité v predbežnej štúdii. V takomto prípade sa rad 2 nemusí 
opakovať pri pôdach, ktoré boli zahrnuté v predbežnej štúdii. 
Čas rovnováhy, pomer pôdy a roztoku, váha pôdnej vzorky, objem 
vodnej fázy v kontakte s pôdou a koncentrácia testovanej látky 
v roztoku sa zvolia na základe výsledkov predbežnej štúdie. Analýza 
by mala by ť vykonaná po 2, 4, 6, 8, (možno aj po 10) a 24 hodinách 
kontaktného času, čas potrebný na trepanie môže by ť predĺžený 
maximálne na 48 hodín, a to v prípade, ak chemikália vyžaduje 
dlhší ekvilibra čný čas, rešpektujúc tak výsledok nájdeného pomeru. 
Aj napriek tomu by sa mal čas určený na analýzu flexibilne zváži ť. 
Každý experiment (raz pôda a raz roztok) sa realizuje aspo ň dvakrát, 
čo umožní stanovi ť odchýlky výsledkov. Do každého pokusu sa 
zahrnie aj jeden blank – slepý pokus. Tento pozostáva z pôdy a roztoku 0,01 M CaCl
 2 , bez testovanej látky a váhy a objemu, 
respektívne je identický s tými, ktoré boli použité v experimente. 
Na kontrolnú vzorku s obsahom iba testovanej látky v roztoku 0,01 
M CaCl  2 (bez pôdy) sa odporú ča použiť ten istý testovací postup ako 
poistku pred nie čím neočakávaným. 
Adsorpčné percento sa vypo číta v každom časovom bode  A t i a/alebo 
časovom intervale  A Δt i (podľa potreby) a je zaznamenávané oproti 
času. Distribu čný koeficient K  d v ekvilibriu, tak ako aj organický 
uhlík normalizovaný adsorp čný K  oc (pre nepolárne organické chemi ­
kálie) sa taktiež vypo čítajú. 
Výsledky testu adsorb čnej kinetiky 
Lineárna hodnota K  d je obyčajne vhodná na opísanie sorp čného 
správania v pôdach (35), (78) a reprezentuje vyjadrenie vlastnej 
pohyblivosti chemikálii v pôde. Napríklad vo všeobecnosti chemi ­
kálie s K  d ≤ 1 cm  3 g -1 sú hodnotené ako kvalitatívne mobilné. 
Podobne aj mobilná klasifika čná schéma založená na hodnotách K  d 
bola získaná MacCall  et al.  (16). Dodato čne existujúce lúhovacie 
klasifikačné schémy sú založené na vz ťahu medzi hodnotou K  oc 
a DT-50 (  1 ) (32), (79). 
Podľa štúdie chybných analýz (61) sa nedajú K  d hodnoty pod 
0,3 cm  3 g -1 správne odhadnú ť z poklesu koncentrácie vo vodnej 
fáze, aj ke ď je použitý najvhodnejší pomer pôdy a roztoku 
(z pohľadu presnosti), t. j. 1:1. V takomto prípade sa odporú ča 
analýza obidvoch fáz, pôdy aj roztoku.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: čas rozkladu (degradation time) 50 % testovanej látky.
 S ohľadom na uvedené sa odporú ča, aby sa štúdia adsorp čného 
správania chemikálie v pôde a jej možná pohyblivos ť doplnila 
o presné stanovenie Freundlichovej adsorb čnej izotermy u tých 
systémov, u ktorých je možné presné stanovenie hodnoty K  d za 
použitia postupu experimentálneho protokolu popísaného v tejto 
metóde. Presné stanovenie je možné v prípade, ak je hodnota 
výsledkov získaných násobením hodnôt K  d a pomeru pôdy 
a roztoku vä čšia ako 0,3 v prípade, ak sú merania založené na 
koncentra čnom poklese vo vodnej fáze (nepriama metóda), alebo 
ak je táto hodnota vä čšia ako 0,1, v prípade analýzy obidvoch fáz 
(priama metóda) (61).  
1.9.2.5.  Rad 3 – Adsorp čné izotermy a desorp čná kinetika/desorp čné 
izotermy  
1.9.2.5.1. A d s o r p č n é i z o t e r m y 
Používa sa pä ť testovaných koncentrácií látok, obsahujúcich dva 
rády veli čín, pri vo ľbe týchto koncentrácii by sa mala vzia ť do 
úvahy rozpustnos ť vo vode a výsledná koncentra čná rovnováha. Je 
potrebné zachova ť rovnaký pomer pôdy a roztoku pre danú pôdu 
počas celej štúdie. Adsorp čný test sa vykoná tak, ako bolo spome ­
nuté, s jediným rozdielom, a to, že vodná fáza sa analyzuje iba raz 
v čase nevyhnutnom na dosiahnutie rovnováhy, ako bolo uvedené 
v Rade 2. Rovnovážne koncentrácie v roztoku sú ur čené a množstvo 
adsorbovanej látky sa vypo číta zo straty testovanej látky v roztoku 
alebo priamou metódou. Adsorbovaná hmotnos ť na jednotku hmot ­
nosti pôdy je znázornená ako funkcia rovnovážnej koncentrácie testovanej látky (pozri Údaje a správa). 
Výsledky experimentu adsorp čnej izotermy 
Medzi matematickými adsorb čnými modelmi doteraz navrhnutými, 
Freundlichova izoterma je jedna z naj častejšie používaných na 
opísanie adsorb čných procesov. Detailnejšie informácie na interpre ­
táciu a dôležitos ť adsorbčných modelov sú uvedené v použitej lite ­
ratúre (41), (45), (80), (81), (82).  
Poznámka:  Je potrebné uvies ť, že porovnanie hodnôt K
 F (Freundli­
chovho adsorp čného koeficientu) pre rôzne látky je možné iba 
v prípade, ak sú tieto hodnoty K  F vyjadrené v rovnakých jednotkách (83).  
1.9.2.5.2. D e s o r p č n á k i n e t i k a 
Účelom tohto postupu je pozorovanie, či sú chemikálie reverzibilne 
alebo ireverzibilne adsorbované v pôde (na pôdnych vzorkách). Táto 
informácia je dôležitá, ke ďže desorp čný proces zohráva dôležitú 
úlohu pri správaní sa chemikálií na pôdu v teréne. A naviac, desorpčné údaje sú užito čné vstupy do po čítačových modelov na 
simuláciu procesu lúhovania a rozpúš ťacieho procesu. Ak sa poža ­
duje desorp čná štúdia, odporú ča sa, aby bola štúdia opísaná vopred 
pred vykonaním testu na každý systém, na ktorý sa stanovuje presná hodnota K
 d pri vykonaní testu adsorp čnej kinetiky. 
Podobne pri adsorp čnej kinetickej štúdii sú dve varianty na vyko ­
nanie kinetického experimentu: a) paralelná metóda a b) sériová 
metóda. Výber metodológie bude ponechaný na experimentátora, 
ktorý posúdi možné laboratórne vybavenie a zdroje.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Paralelná metóda: pre každú vzorku, ktorá bola vybraná na vyko ­
nanie desorp čnej štúdie, sa pripravia vzorky s tým istým 
pomerom pôda a roztok, a to to ľkokrát, v ko ľkých časových 
intervaloch sa požaduje študova ť desorpčnú kinetiku. Preferujú 
sa tie isté časové intervaly, ako by boli použité pri experimente 
adsorpčnej kinetiky; hoci celkový čas môže by ť predĺžený pri 
meraní v závislosti od dosiahnutia rovnováhy systému. Pri každom pokuse (jedna pôda, jeden roztok) prebehne jeden slepý pokus. Každý pokus sa skladá z pôdy a 0,01 M roztoku CaCL
 2 
bez testovanej látky, hmotnosti a objemu, respektívne je identický 
s experimentom. Kontrolná vzorka ako testovacia látka v 0,01 M CaCL
 2 v roztoku (bez soli) sa podrobí tomu istému testova ­
ciemu postupu. Všetky zmesi pôdy s roztokom sa budú vytre ­
pávať až do dosiahnutia adsorp čnej rovnováhy (ako je to uvedené 
v časti rad 2). Potom sa fázy oddelia odstre ďovaním a vodná fáza 
sa oddelí tak, ako je to najlepšie možné. Oddelený roztok sa nahradí rovnakým objemom 0,01 M CaCL
 2 v destilovanej vode 
bez testovacej látky a nová zmes sa znovu vytrepe. Vodná fáza 
z prvej trubice sa získa tak dôkladne, ako je to možné a odmeria sa po napr. 2 hodinách, z druhej trubice po 4 hodinách a z tretej po 6 hodinách at ď., až kým sa nedosiahne desorp čná rovnováha. 
b) Sériová metóda: po experimente adsorp čnej kinetiky sa zmes 
odstredí a vodná fáza sa oddelí tak, ako je to najlepšie možné. Oddelený objem roztoku sa nahradí rovnakým objemom 0,01 M CaCL
 2 bez testovacej látky. Nová zmes sa znovu vytrepe, 
až kým sa nedosiahne desorp čná rovnováha. Po čas tohto časo­
vého intervalu sa bude zmes odstre ďovať, aby sa oddelili fázy. 
Malé alikvotné množstvo sa ihne ď analyzuje na testovaciu látku; 
potom experiment pokra čuje s pôvodnou zmesou. Objem každej 
alikvotnej časti by mal by ť menší než 1 % z celkového objemu. 
Také isté množstvo čerstvého roztoku 0,01 M CaCl  2 sa pridá do 
zmesi, aby sa dodržal pomer na pôdu a roztok a vytrepávanie pokračuje až do ďalšieho časového intervalu. 
Percento desorpcie sa vypo číta na každý meraný čas (bodovite)
D t i a/alebo aj časový interval  D Δt i (podľa potrieb štúdie) a zaznamenáva 
sa proti času. Rovnovážny desorp čný koeficient K  des sa taktiež vypo ­ 
číta. Všetky aplikovate ľné rovnice sú uvedené v časti „Údaje 
a správa“ a v dodatku 5. 
Výsledky z experimentu desorp čnej kinetiky 
Bežné záznamy percenta desorpcie  D t i a adsorpcie  A t i voči času 
umožňujú stanovi ť reverzibilitu adsorp čného procesu. Ak desorp čná 
rovnováha dosiahne dvakrát čas adsorp čnej rovnováhy a celková 
desorpcia je vä čšia než 75 % adsorbovaného množstva, adsorpcia 
sa považuje za reverzibilnú.  
1.9.2.5.3. D e s o r p č n á i z o t e r m a 
Na pôdach, ktoré sa používajú na adsorp čno izotermický experiment, 
sa stanovujú Freundlichove desorp čné izotermy. Desorp čný test sa 
uskutoční podľa postupu uvedeného v časti „Desorp čná kinetika“ 
s jedným rozdielom, že vodná fáza sa analyzuje iba raz pri 
desorpčnej rovnováhe. Desorbované množstvo testovanej látky sa 
určí výpočtom. Množstvo adsorbovanej látky, ktorá sa zadrží na 
pôde pri desorp čnej rovnováhe, sa zaznamená ako funkcia rovno ­
vážnej koncentrácie testovanej látky v roztoku (pozri časť „Výsledky 
a správa“ a v dodatku 5).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
Analytické výsledky sa udávajú v tabu ľkovej forme (pozri dodatok 
6). Zadávajú sa jednotlivé merania a vypo čítané priemery. Adsorp čné 
izotermy sa znázor ňujú graficky. Výpo čty sa robia pod ľa postupu, 
ktorý je uvedený nižšie. 
Na účel tohto testu je ur čené, že hmotnos ť 1 cm  3 vodného roztoku je 
1 g. Pomer pôdy a roztoku by sa mohol vyjadri ť v hmotnostných 
alebo objemových jednotkách s tými istými číslami.  
2.1. ADSORPCIA 
Adsorpcia  A t i je definovaná ako percento adsorbovanej látky na 
pôdu, ktoré sa vz ťahuje na množstvo prítomné na po čiatku testu 
podľa podmienok testu. Ak je testovacia látka stála a neadsorbuje 
sa viditeľne na stenách nádoby,  A t i sa vypočíta na každý časový bod 
t i podľa rovnice:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
kde: 
A t i = adsorp čné percento na časový bod t  i ( %);  
m s ads ðt i Þ = hmotnos ť adsorbovanej testovanej látky na pôdu v čase 
t i (μg); 
m o = hmotnos ť testovanej látky v testovacej trubke na 
začiatku testu ( μg). 
Podrobné informácie, ako sa dá vypo čítať percento adsorpcie  A t i pre 
paralelné a sériové metódy, je uvedený v dodatku 5. 
Distribučný koeficient K  d je pomer medzi obsahom látky v pôdnej 
fáze a hmotnostnou koncentráciou látky vo vodnom roztoku za 
podmienok testu v stave dosiahnutia adsorp čnej rovnováhy.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
kde: 
C s ads ðeqÞ = obsah látky adsorbovanej na pôde pri adsorp čnej 
rovnováhe ( μg g  -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = hmotnostná koncentrácia látky vo vodnej fáze pri 
adsorpčnej rovnováhe ( μg cm-  3 ). Táto koncentrácia 
sa stanoví pomocou hodnôt získaných zo slepého pokusu
 
m s ads ðeqÞ = obsah látky adsorbovanej na pôde pri adsorp čnej 
rovnováhe ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = obsah látky adsorbovanej v roztoku pri adsorp čnej 
rovnováhe ( μg); 
m soil = množstvo pevnej fázy, vyjadrenej ako sušina (suchá 
pôda) (g); 
V o = počiatočný objem vodnej fázy v styku s pôdou (cm  3 ). 
Vsťah medzi A  eq a K d je daný  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
kde: 
A eq = percento adsorpcie pri adsorp čnej rovnováhe, %. 
Organický uhlík normalizovaný adsorp čný koeficient K  oc súvisí 
s distribu čným koeficientom K  d k obsahu organického uhlíka vo 
vzorke pôdy:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
kde: 
%OC = percento organického uhlíka vo vzorke pôdy (g g  -1 ). 
K oc koeficient predstavuje jednoduchú hodnotu, ktorá charakterizuje 
účasť vo väčšine nepolárnych organických zlú čenín medzi orga ­
nickým uhlíkom v pôde alebo sedimentom a vodou. Adsorpcia týchto chemikálií sa koreluje na obsah organicky sorbujúcej tuhej 
látky (7), kde hodnoty K
 oc závisia od špecifických charakteristík 
glejovitých frakcií, ktoré sa významne odlišujú v sorp čnej kapacite 
vzhľadom na odlišnosti v pôvode, vývoji at ď. 
2.1.1.  Adsorp čné izotermy  
Rovnica pre Freundlichove adsorp čné izotermy súvisí s množstvom 
adsorbovanej testovanej látky ku koncentrácii testovanej látky 
v roztoku pri rovnováhe (rovnica 8). 
Výsledky sa triedia ako „adsopcia“ a na každú testovaciu trubicu, 
obsah adsorbovanejtestovacej látky na pôdu po adsorb čnom teste 
[C s ads ðeqÞ, je niekde inde ozna čená ako x/m] sa vypo číta. Pred­
pokladá sa, že rovnováha bola dosiahnutá a  C s ads ðeqÞ reprezentuje 
hodnotu rovnováhy:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i
: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Freundlichova adsorp čná rovnica je zobrazená v (8).  
C s ads ðeqÞ ¼ K  F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
alebo v lineárnom tvare:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
kde: 
K F ads = Freundlichov adsorb čný koeficient; jeho rozmer je cm  3 g -1 . 
Len ak l/n = 1; vo všetkých ostatných prípadoch strmos ť 
l/n je daná rozmerom  K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = regresná konštanta; l/n bežný rozsah je v rozpätí 0,7 – 1,0, 
indikuje, že sorp čné údaje sú často mierne nelineárne. 
Rovnice (8) a (9) sú zaznamenané a hodnoty  K F ads a l/n sú vypo ­ 
čítané regresnou analýzou s využitím rovnice (9). Korela čný koefi­
cient r  2 z logaritmickej rovnice je tiež vypo čítaný. Príklad takéhoto 
zobrazenia je na obr.2.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Obr.  2. Freundlichova adsorp čná krivka normálna a linearizovaná  
2.1.2.  Hmotnostná bilancia  
Hmotnostná bilancia (MB) je definovaná ako percento látky, ktorá 
môže byť analyticky obnovená po adsorpcii testu oproti po čiatoč­
nému množstvu látky na za čiatku testu. 
Spracovanie výsledkov sa bude líši ť, ak je rozpúš ťadlo kompletne 
miešateľné s vodou. V prípade vodou miešate ľného rozpúš ťadla je 
spracovanie výsledkov opísané v časti „Opis“, môže by ť aplikované 
na stanovenie množstva látky obnovenej po extrakcii rozpúš ťadla. 
Ak je rozpúš ťadlo menej miešate ľné s vodou, stanovenie/ur čenie 
obnoveného množstva sa musí stanovi ť. 
Hmotnostná bilancia MB na adsorpciu sa vypo číta nasledovne: 
vychádza sa z toho, že údaj (m  E ) korešponduje so sumou hmotností 
testovaných chemikálií extrahovaných z pôdy a povrchu testovaných 
pojív s rozpúš ťadlom.  
MB ¼ V rec · C aq ads ðeqÞ þ m  E Ê Ì  
· 100 
V 0 · C 0 ð%Þ (10) 
kde: 
MB = hmotnostná bilancia ( %); m
 E = celková hmotnos ť testovanej látky vyextrahovanej z pôdy 
a stien testovacej nádoby v dvoch krokoch ( μg); 
C o = počiatočná hmotnostná koncentrácia testovaného roztoku 
v styku s pôdou ( μg cm  -3 ); 
V rec = objem kalu obnoveného po adsorp čnej rovnováhe (cm  -3 ). 
2.2. DESORPCIA 
Desorpcia (D) je definovaná ako percento testovanej látky, ktoré je 
desorbované, vztiahnuté ku kvantite látky, ktorá bola adsorbovaná 
predtým za testovacích podmienok.  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
kde: 
D t i = desorp čné percento v jednotkovom bode/ čase t  i ( %);  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = hmotnos ť testovanej látky desorbovanej z pôdy 
v časovom bode t  i (μg); 
m s ads ðeqÞ = hmotnos ť testovanej látky adsorbovanej do pôdy pri 
adsorpčnej rovnováhe ( μg). 
Podrobné informácie o tom, ako sa má postupova ť pri výpo čte 
percenta desorpcie  D  t i paralelnej a sériovej metóde, sú uvedené 
v dodatku 5. 
Zjavný desorp čný koeficient (K  des ) je, za podmienok testu, pomer 
medzi obsahom lát zadržanej v pôde a hmotnostnou koncentráciou desorbovanej látky vo vodnom roztoku dosiahnutí desorp čnej rovno ­
váhy.
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
kde: 
K des = dessorp čný koeficient (cm  3 g -1 ); 
m aq des ðeqÞ = celková hmotnos ť testovanej látky desorbovanej 
z pôdy pri desorp čnej rovnováhe ( μg); 
V T = celkový objem vodnej fázy v kontakte s pôdou po čas 
desorpčných kinetických testov (cm  3 ). 
Návod na výpo čet m aq des ðeqÞ je uvedený v dodatku 5, v časti pod 
názvom „Desorpcia“. 
Poznámka Ak bol urobený adsorp čný test, ktorý sa vykonal paralelnou metó ­
dou, objem V
 T v rovnici 12 by mal by ť rovnaký s objemom V  o . 
2.2.1.  Desorp čné izotermy  
Rovnica pre Freundlichove desorp čné izotermy udáva vz ťah obsahu 
testovanej látky, zadržanej adsorpciou na vzorke pôdy, ku koncen ­
trácii testovanej látky v roztoku pri adsorp čnej rovnováhe (rovnica 
16). 
Pre každú testovaciu trubicu sa obsah látky zadržanej adsorbciou na 
pôdnej vzorke pri desorp čnej rovnováhe vypo číta nasledovne:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ je definovaná ako:  
m aq des ðeqÞ ¼ m  m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m  aq A (μg) (14) 
kde: 
C s des ðeqÞ = obsah testovanej látky zadržanej na pôdnej vzorke pri 
desorpčnej rovnováhe ( μg g -1 ); 
m m des ðeqÞ = hmotnos ť látky stanovenej analyticky vo vodnej fáze 
pri desorp čnej rovnováhe ( μg); ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = hmotnos ť zostatkovej testovanej látky po adsorp čnej 
rovnováhe ku nekompletnému náhradnému objemu 
(μg); 
m aq des ðeqÞ = hmotnos ť látky v roztoku pri adsorp čnej rovnováhe 
(μg); 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(15) 
V r F = objem odobratého roztoku z trubice na stanovenie testovanej 
látky pri adsorp čnej rovnováhe (cm  3 ); 
V R = objem glejovitého roztoku odobratého z trubice po dosiah ­
nutí adsorp čnej rovnováhy a nahradení toho istého objemu 
0,01M roztokom CaCl  2 (cm  3 ); 
Freundlichova desorp čná rovnica je v (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
alebo v lineárnom tvare:  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n · logC  aq des ðeqÞ (17) 
kde: 
K F des = Freundlichov desorp čný koeficient; 
n = regresná konštanta;  
C aq des ðeqÞ = hmotnostná koncentrácia látky vo vodnej fáze pri 
desorpčnej rovnováhe ( μg cm  -3 ). 
Rovnice 16 a 17 sa môžu znázorni ť a hodnoty  K F des a vypočítajú sa 
z regresnej analýzy použitím rovnice 17. 
Poznámka Ak Freundlichov adsorp čný alebo desorp čný exponent l/n je rovný 1, 
Freundlichova adsorp čná alebo desorp čná väzobná konštanta (
K F ads 
a K F des ) bude rovná adsorb čnej a desorp čnej rovnovážnej konštante 
(K d a K  des ) respektívne, a záznamy C  s a C  aq budú lineárne. Ak 
exponent nie je rovný 1, záznamy C  s a C  aq nebudú lineárne 
a adsorpčná a desorp čná konštanta sa budú meni ť pozdĺž izotermy.  
2.2.2.  Správa z testu  
Správa z testu má obsahova ť nasledovné informácie: 
— kompletnú identifikáciu použitých pôdnych vzoriek vrátane: — geografické odkazy o mieste (zemepisná šírka, zemepisná d ĺžka), 
— dátum vzorkovania,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— použitý vzor (po ľnohospodárska pôda, les at ď.), 
— hĺbka vzorkovania, 
— obsah piesku (bahna alebo ílu), — pH hodnoty (v 0,01 M CaCl
 2 ), 
— obsah organického uhlíka, — obsah organickej hmoty, 
— obsah dusíka, 
— pomer C/N, — kapacita výmeny katiónov (mmol/kg), — všetky informácie súvisiace s kumuláciou, skladovaním pôdnych 
vzoriek, 
— kde je to vhodné, všetky relevantné informácie na interpretáciu 
adsorpcie/desorpcie testovanej látky, 
— odkazy na metódy použité pre stanovenie každého parametra, — informácie o testovanej látke, ak je to potrebné, — teplota pri experimente, — podmienky na odstre ďovanie, 
— analytický postup použitý na analýzu testovanej látky, 
— rozhodnutie o výbere rozpúš ťacieho činidla na prípravu zásob ­
ného roztoku testovanej látky, 
— ak je to relevantné, uvies ť korelácie robené výpo čtom, 
— údaje v súlade s prepisom ako je to v dodatku 6 a grafické 
znázornenie, 
— všetky informácie a pozorovania, ktoré môžu by ť nápomocné pri 
interpretácii výsledkov testu.
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II. 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of 
Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I. 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, 
ISPRA, December 1994. 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18 – 20 January 1995 (June 1995). 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorp ­
tion Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996. 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K
 oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments. 
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment. 
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agricul ­
ture and Forestry, Braunschweig, Germany. 
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour 
in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review). 
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in 
Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance 
ed.), Academic Press, London, pp. 83 – 122. 
(14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31 – 44. 
(15) Van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for 
the prediction of pesticide movement through porous media“. 
Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29 – 35. 
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger 
H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic 
chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC. 
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. 
Weeds, 13, pp. 185 – 190. 
(18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Deter ­
mination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524 – 528. 
(19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd. 
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk 
J. W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901 – 932.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137 – 157, BCPC, Surrey, UK. 
(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269 – 273. 
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45 – 52. 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961 – 971. 
(25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil“. Pestic. Sci., 4, pp. 247 – 258. 
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Bôden“. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143 – 154. 
(27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135 – 172, Plenum Press, NY. 
(27) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732 – 210. 
(29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring 
and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49 – 143. 
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, pp. 37 – 44. 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297 – 325, Acs Symp. Ser. 259, American 
Chemical Society, Washington, DC. 
(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide teachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339 – 357. 
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340 – 350. 
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, pp. 389 – 395. 
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80 – 101, 
(36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572 – 576.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils“. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667 – 668. 
(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils“. Nature, 223, 1288. 
(39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050 – 1059. 
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology“. 
J. Agric. Food Chem., 32, pp. 243 – 246. 
(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, pp. 29 – 92. 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. 
Proc. 32: pp. 222 – 234. 
(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, pp. 833 – 846. 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1 – 17. 
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in 
organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49 – 143. 
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: pp. 67 – 69. 
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, pp. 454 – 457. 
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparati ­
ons“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna. 
(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documenta ­
tion, USDA Conservation Research report. 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality 
S General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994). 
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, 
F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition. 
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark 
F. E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality Š Sampling Š Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes. 
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality Š Sampling Š Part 2: Guidance 
on sampling techniques. 
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality S Sampling S Part 3: Guidance 
on safety of sampling. 
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality Š Sampling Š Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils. 
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality S Sampling S Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indu ­
strial sites.3 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality Š Sampling Š Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesti ­
cide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, pp. 
353 – 354. 
(60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., pp. 109 – 138. 
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31 – 41. 
(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106“. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29. April 1994. 
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement 
de substances herbicides dans le sol enfonction de leur struc ­
ture chimique“. Weed Res. 21, pp. 227 – 231. 
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction 
of organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), pp. 382 – 386. 
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
„Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227 – 231. 
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297 – 312. 
(67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), pp. 109 – 116. 
(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC. 
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic 
Toxicology (eds J.G Eaton, et al.), pp. 78 – 115, ASTM STP 
707, Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds“. Science, Vol. 206, pp. 831 – 832.3 
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G, and Means J. C, (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 38 – 42. 
(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. 
Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833 – 846. 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité“. 
Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319 – 322. 
(74) M., Kôrdel W. (1996), „Comparison of screening methods for 
the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), pp. 2493 – 2504. 
(75) Kôrdel W., Kotthoff G, Muller M. (1995), „HPLC Š screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil 
S results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), pp. 1373 – 1384. 
(76) Kôrdel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC Š screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil S comparison of different stationary phases“. Chemosphere 
27 (12), str. 2341 – 2352. 
(77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, Vol. 7, str. 29 – 36. 
(78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: 
Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield 
C. G (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297 – 325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. 
(80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. 
S.C.I. Monograph No. 37, str. 14 – 32. 
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, 
D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classifica ­
tion of solution adsorption isotherms and its use in the diag ­
nosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesti ­
cides surface areas of soils“. J. Chem. Soc, str. 3973 – 93. 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques generales de l'adsorption“. Ann. Agron. 31: str 239 – 251. 
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation“, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13 – 15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK. 
(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1 – 3, Canterbury, UK. 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
DODATOK 1  
Schéma testu
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
DODATOK 2  
VPLYV PRESNOSTI ANALYTICKEJ METÓDY A KONCENTRA Č­
NÝCH ZMIEN NA PRESNOS Ť VÝSLEDKOV ADSORPCIE  
Z nasledujúcej tabu ľky (8.4) vyplýva, že rozdiel medzi po čiatočnou hmotnos ťou 
(m 0 = 110 μg) a rovnovážnou hmotnos ťou (m aq ads ðeqÞ= 100 μg) testovanej látky 
v roztoku je ve ľmi malý, 5 % odchýlka pri meraní výsledkov rovnovážnej 
hmotnosti sa prejaví 50 % odchýlkou vo výpo čte hmotnosti látky absorbovanej 
v pôde ( m s ads ðeqÞ)a 52,4 % vo výpo čte K  d . 
Množstvo pôdy m  pôda = 10 g 
Objem roztoku V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm-  3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g-  1 ) R‡ K  d * R‡  
PRE A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg alebo 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 skuto čná 
hodnota 10 1,00 skuto čná 
hodnota 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
PRE A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg alebo 
C 0 ¼ 1; 100μg=cm3 
50,0 0,500 skuto čná 
hodnota 60,0 6,00 skuto čná 
hodnota 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
PRE A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg alebo 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 skuto čná 
hodnota 108,9 10,89 skuto čná 
hodnota 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 % 
kde: 
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = hmotnos ť testovanej látky v pôde v rovnovážnom stave, μg; 
m aq ads ðeqÞ = hmotnos ť látky v roztoku v čase adsorp čnej rovnováhy, μg; 
C s ads ðeqÞ = obsah testovanej látky v pôdnej faze v rovnovážnom stave, μg g  -1 : 
C aq ads ðeqÞ = hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnej fáze v rovnovážnom stave, μg cm  -3 
R = analytlická odchýlka pri stanovení  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = vypo čítaná odchýlka spôsobená analytickou chybou R.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
DODATOK 3  
TECHNIKA ODHADU K  d 
1. Technika odhadu umož ňuje predpoklad K  d na základe korelácie, napr. 
s hodnotami P  ow (12), (39), (63 – 68), s údajmi o rozpustnosti vo vode 
(12), (19), (21), (39), (68 – 73) alebo s údajmi o polarite získanými uplat ­
nením HPLC na obrátených fázach (74 – 76). Ako je vidie ť z tabuliek 1 
a 2, hodnoty K  oc a K  om sa vypočítavajú pod ľa týchto rovníc a potom 
nepriamo, K  d podľa týchto rovníc:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Podstata týchto korelácií je založená na dvoch predpokladoch: (1) na orga ­
nickej podstate pôdy, hlavne jej vplyvoch na adsorpciu látky a (2) na 
interakciách, hlavne medzi nepolárnymi látkami. Výsledkom týchto kore ­
lácií je: (1) nie sú alebo sú iba do istej miery aplikovate ľné na polárne látky 
a (2) sú neaplikovate ľné v prípadoch, kde obsah organickej látky v pôde je 
veľmi malý (12). Okrem toho, hoci medzi P  ow a adsorpciou (19) bola 
zistená uspokojivá súvz ťažnosť, to isté sa nedá tvrdi ť o vzťahu medzi 
rozpustnos ťou vo vode a rozpätím adsorpcie (19), (21); ke ďže sú štúdie 
ohľadom tejto témy ve ľmi protichodné. 
3. V tabu ľkách 1 a 2 sú uvedené niektoré príklady korelácií medzi 
adsorpčným koeficientom a rozde ľovacím koeficientom pre oktanol-voda, 
ako aj rozpustnos ť vo vode.  
Tabuľka 1 
Príklady korelácií medzi adsorp čným koeficientom a rozde ľovacím koeficientom pre oktanol-voda, ďalšie 
príklady pozri (12) (68).  
Látky Korelácie Autori  
Substituované mo čoviny log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Chlórované aromáty log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al.  (1983) (65) 
Rôzne prípravky na ochranu 
rastlín log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl and Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatické uh ľovodíky log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles and Mantoura (1987) (67)  
Tabuľka 2 
Príklady korelácií medzi adsorp čným rozde ľovacím koeficientom a rozpustnos ťou vo vode; ďalšie príklady 
pozri (68) (69).  
Látky Korelácie Autori  
Rôzne prípravky na ochranu 
rastlín log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl and Mingelgrin (1984)(66) 
Alifatické, aromatické chló ­
rované látky log K  om = (4,040 +/– 0,038) – (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou  et al.  (1979) (70) 
α-naftol log K  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset  et al . (1981) (71) 
Cyklické, alifatické aroma ­
tické látky log K  oc = - 1,405 – 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff(1981)(72) 
Rôzne zlú čeniny log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
DODATOK 4  
VÝPOČTY NA DEFINOVANIE PODMIENOK ODSTRE ĎOVANIA  
1. Čas odstreďovania je stanovený nasledujúcim vzorcom za predpokladu, že 
častice majú sférický tvar:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Na zjednodušenie sú všetky parametre popísané v jednotkách SI (g, cm). 
Kde: ω = rýchlos ť rotácie (=2 π rpm/60), rad s
 1 ; 
rpm = po čet otáčok za minútu; 
η = viskozita roztoku, g s-  1 cm-  1 ; 
r p = polomer častice, cm; 
ρ s = hustota pôdy (merná hmotnos ť), g cm-  3 ; 
ρ aq = hustota roztoku (merná hmotnos ť), g cm-  3 ; 
R t = vzdialenos ť od stredu rotora odstredivky po vrchol roztoku 
v odstred'ovacej skúmavke, cm; 
R b = vzdialenos ť od stredu rotora odstredivky po spodok roztoku 
v odstred'ovacej skúmavke, cm; 
R b – R  t = výška st ĺpca zmesi pôdy a roztoku v odstred'ovacej 
skúmavke, cm. 
V bežnej praxi sa používa dvojnásobok vypo čítaného času odstre ďovania, 
aby sa zaistila úplná separácia. 
2. Rovnica (1) sa dá ďalej zjednoduši ť, ak budeme považova ť dynamickú 
viskozitu ( η) a hustotu [mernú hmotnos ť] (ρ aq ) roztoku za rovnú dyna ­
mickej viskozite a hustote vody pri 25  o C, teda η = 8,95 × 10-  3 g.s-  
1 cm-  1 a ρ aq = 1,0 g. cm-  3 . 
Potom je čas odstreďovania daný rovnicou (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Z rovnice (2) je zrejmé, že nasledujúce dva parametre sú dôležité na defi ­
novanie podmienok odstre ďovania, t. j. čas t) a rýchlos ť (rpm), aby sa 
dosiahla separácia častíc so špecifickou ve ľkosťou (v našom prípade 
priemer častíc 0,1 μm): merná hmotnos ť pôdy a (2) výška st ĺpca zmesi 
v odstreďovacej skúmavke (R  b – R  t ), t. j. vzdialenos ť, ktorú častica pôdy 
pokrýva od vrcholu roztoku po spodok skúmavky; je zrejmé, že pre stály 
objem bude výška st ĺpca v skúmavke závisie ť od štvorca polomeru 
skúmavky. 
4. Obr. 1 predstavuje variácie v čase odstre ďovania t) verzus rýchlos ť (rpm) 
pri rôznych hodnotách mernej hmotnosti pôdy (p  s ) (obr. la) a rôzne výšky 
stĺpcov zmesí v odstre ďovacej skúmavke (obr. 2a). Z obr. la je vidie ť, že 
vplyv mernej hmotnosti pôdy sa stáva o čividným; napr. pri klasickom 
odstreďovaní pri 3000 otá čkach/min. je čas odstre ďovania približne 
240 min. pri mernej hmotnosti pôdy 1,2 g cm  3 , zatiaľ čo pri mernej 
hmotnosti pôdy rovnajúcej sa 2,0 g cm  3 je to iba 50 min. Podobne (obr. 
lb) pri klasickom odstre ďovaní pri 3000 otá čkach/min. je čas odstreďovania 
približne 50 min. pri výške st ĺpca zmesi 10 cm a iba 7 min. pri výške st ĺpca 
1 cm. Je však dôležité nájs ť optimálny vz ťah medzi odstre ďovaním, ktoré 
vyžaduje najmenšiu možnú výšku st ĺpca a ľahkou manipuláciou pre expe ­
rimentátora pri odde ľovaní fáz po odstre ďovaní.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Okrem toho, pri definovaní experimentálnych podmienok na separáciu fáz 
pôdy a roztoku je dôležité vzia ť do úvahy možnú existenciu tretej „pseu ­
dofázy“ koloidov. Tieto častice, s ve ľkosťou menšou ako 0,2 μm môžu 
mať významný vplyv na celý mechanizmus adsorpcie látky v pôdnej 
suspenzii. Po ukon čení odstre ďovania, ako je popísané vyššie, koloidy 
zostávajú vo vodnej fáze a sú podrobené analýze spolu s vodnom fázou. 
Takto sa stratí informácia o ich vplyve. 
Ak má riadiace laboratórium ve ľkú odstredivku alebo možnos ť ultrafiltrá ­
cie, adsorpcia/desorpcia látky vo vode sa dá preskúma ť do väčšej hĺbky 
vrátane informácií o adsorpcii látky na koloidoch. V tomto prípade sa 
ultraodstredivka nastaví na 60 000 otá čok/min alebo sa použije ultrafiltrácia 
s filtrom o porozite/ve ľkosť pórov/100 000 daltonov, aby sa oddelili tri 
fázy – pôda, koloidy, roztok. Pod ľa toho sa upraví aj protokol 
o výsledkoch testu, aby sa všetky tri fázy stali sú časťou analýzy.  
Obr. 1a
  
Variácie času odstre ďovania (t) verzus rýchlos ť odstreďovania (rpm) na 
rôzne merné hmotnosti pôdy ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b – R  t = 10 cm, η = 
8,95 × 10-  3 g s-  1 cm-  1 a ρ aq = 1,0 g.cm-  3 pri 25  o C. 
Obr. 1b
  
Variácie času odstre ďovania (t) verzus rýchlos ť odstreďovania (rpm) na 
rôzne výšky st ĺpca zmesi v odstre ďovacej skúmavke (R  b – R  t )= L; R  t = 
10 cm; η = 0,89 × 10-  3 g s-  1 cm-  1 , ρ aq = 1,0 g.cm-  3 pri 25  o C a ρ s = 
2,0 g cm-  3 . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
DODATOK 5  
VÝPOČET ADSORPCIE A (%) A DESORPCIE D (%)  
Časová schéma postupu je:
  
Pri všetkých výpo čtoch sa predpokladá, že testovaná látka je stabilná a vo vä čšej 
miere sa neadsorbuje na stenách nádoby.  
ADSORPCIA A (A %)  
a) Paralelná metóda  
Percento adsorpcie sa vypo číta na každú testovanú skúmavku (i) v každom 
časovom bode (t  i ) podľa rovnice:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Členy tejto rovnice sa dajú vypo čítať takto: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
kde: 
A t i = percento adsorpcie [ %] v časovom bode t  i ; 
m s ads ðt i Þ = hmotnos ť testovanej látky v pôde v čase t  i , analýza je ( μg); 
m o = hmotnos ť testovanej látky v testovanej skúmavke na za čiatku 
testu (μg); 
C o = počiatočná hmotnostná koncentrácia testovaného roztoku, 
ktorý je v kontakte s pôdou (ug cm  -3 ); ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = hmotnostná koncentrácia látky vo vodnej fáze v čase t  i , 
analýza je ukon čená (μg cm  -3 ); táto koncentrácia sa stanovuje 
analyticky tak, že sa vezmú do úvahy hodnoty uvedené zo slepých pokusov 
V
 o = počiatočný objem testovaného roztoku, ktorý je v kontakte 
s pôdou (cm  3 ). 
Hodnoty percenta adsopcie  A t i alebo  C aq ads ðt i Þsú zobrazené verzus čas a čas, 
po ktorom sa dosiahne sorp čná rovnováha, je stanovený. Príklady takýchto 
grafov sú uvedené v obr. 1 a 2.
  
Obr. 1  
Graf adsorp čnej rovnováhy
  
Obr. 2  
Závislosť hmotnostnej koncentrácie testovanej látky vo vodnej fáze (C  aq ) od času ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Sériová metóda  
Pri nasledujúcich rovniciach platí, že adsorp čná metóda sa vykonáva 
meraním testovanej látky v malých alikvotných častiach vodnej fázy za 
určitých časových intervalov. 
— množstvo látky adsorbovanej na pôde po čas každého časového inter ­
valu sa vypo číta nasledovne: 
— pre prvý časový interval Δt 1 = t 1 – t o 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
(4) 
— pre druhý časový interval Δt 2 = t 2 - t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— pre tretí časový interval Δt 3 = t 3 – t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2·v a A 
v a A Î 
(6) 
— pre tretí časový interval Δt n = t n – t n-1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— percento adsorpcie v každom časovom intervale  A Δt i sa vypočíta podľa 
nasledujúcej  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
pričom percento adsorpcie  A  t i v časovom bode t  i je dané vyššie 
uvedenou rovnicou:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Hodnoty percenta adsorpcie  A t i alebo  A Δt i (s ohľadom na potreby štúdie) 
sú zaznamenané oproti času a čas, po ktorom sa dosiahla sorp čná 
rovnováha, je stanovený. 
— V rovnovážnom čase t  eq : 
— hmotnos ť testovanej látky adsorbovanej na pôde je:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— hmotnos ť testovanej látky v roztoku je:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— percento adsorpcie v rovnováhe je:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) 
Vyššie uvedené parametre sa definujú ako:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = hmotnos ť látky adsorbovanej na 
pôde v časových intervaloch Δ t1 , 
Δ t2 ,..., Δ tn jednotlivo ( μg); 
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = hmotnos ť látky meraná v alikvót ­
nych častiach  v  a A v časových 
bodoch t  1 , t 2 , t n jednotlivo ( μg); 
m s ads ðeqÞ = hmotnos ť látky adsorbovanej na 
pôde v čase adsorp čnej rovnováhy 
(μg); 
m aq ads ðeqÞ = hmotnos ť látky v roztoku v čase 
adsorpčnej rovnováhy ( μg); 
v a A = objem alikvotnej časti, v ktorej je 
testovaná látka meraná (cm  3 ); 
A Δt i = precento adsorpcie zodpovedajúce 
časovému intervalu Δt i (%); 
A eq = precento adsorpcie v čase 
adsorpčnej rovnováhy (%).  
DESORPCIA D (%)  
Čas t  o , v ktorom za čína experiment na ur čenie desorp čnej kinetiky, sa považuje 
ten moment, v ktorom je nahradený maximálny objem roztoku testovanej látky rovnakým objemom roztoku 0,01 M CaCl
 2 . 
a) Paralelná metóda  
V časovom bode t  i sa hmotnos ť testovanej látky meria vo vodnej fáze 
vybratej zo skúmavky i ( V i 
r ) a desorbovaná hmotnos ť sa vypočíta podľa 
vzorca:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Pri desorp čnej rovnováhe platí, že t  i = t eq , a teda  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
Hmotnosť testovanej látky desorbovanej po čas intervalu ( Δt i ) je daná rovni ­
cou: 
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Percento desorpcie sa vypo číta: 
v časovom bode t  i podľa rovnice:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
v časovom intervale ( Δt i ) podľa rovnice:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
kde: 
D t i = percento desorpcie v časovom bode t  i (%); 
D Δt i = percento desorpcie zodpovedajúce časovému intervalu Δt i 
(%); 
m aq des ðt 1 Þ = hmotnos ť testovanej látky desorbovanej v časovom bode t  i 
(μg); 
m aq des ðΔt 1 Þ = hmotnos ť látky desorbovanej na pôde v časovom intervale 
Δt i (μg); 
m m des ðt i Þ = analyticky stanovená hmotnos ť testovanej látky nameraná 
v časovom bode t  i a v roztoku  V r i , ktorý bol analyzovaný 
(μg); 
m aq A = hmotnos ť testovanej látky, ktorá zostala z adsorp čnej 
rovnováhy kvôli nedokon čenej substitúcii objemu ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m aq ads ðeqÞ = hmotnos ť testovanej látky v roztoku v čase adsorp čnej 
rovnováhy ( μg); 
V R = objem kalu odstráneného zo skúmavky po dosiahnutí 
adsorpčnej rovnováhy a nahradeného rovnakým objemom 
0,01 M CaCl  2 (cm  3 ); 
V r i = objem roztoku odohraného zo skúmavky i) na meranie testo ­
vanej látky v experimente desorp čnej kinetiky (cm  3 ). 
Hodnoty desorpcie  D t i alebo  D Δt i (podľa potrieb štúdie) sú zobrazené verzus 
čas a čas, po ktorom je dosiahnutá desorp čná rovnováha, je stanovený.  
b) Sériová metóda  
Nasledujúce rovnice zoh ľadňujú to, že adsorp čné postupy, ktoré predchá ­
dzali, boli uskuto čnené meraním testovanej látky v malom alikvotnom 
objeme ( v A 
a ) vodnej fázy (sériová metóda v 1.9 Vykonanie testu). Pred ­
pokladá sa, že a) objem kalu odstráneného zo skúmavky po pokuse na získanie adsorp čnej kinetiky bol nahradený rovnakým objemom 0,01 
M CaCl
 2 roztoku (V  R ) a b) celkový objem vodnej fázy, ktorá je 
v kontakte s pôdou (V  T ), zostáva konštantná po čas pokusu na získanie 
adsorpčnej kinetiky a je vyjadrená rovnicou:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
časovom bode t  i : 
— hmotnos ť testovanej látky meraná v malom alikvotnom objeme ( v a D ) 
a desorbovaná hmotnos ť sa vypočítajú podľa rovnice:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— v desorp čvnej rovnováhy t  i = t eq a preto  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— percento desorpcie  D t i sa vypočíta podľa nasledujúcej rovnice:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
V časovom intervale pre tretí časový interval ( Δt i ): 
— pre prvý časový interval Δt i = t i – t o 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— pre druhý časový interval Δt 2 = t 2 – t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— pre n-tý časový interval Δt n = t n – t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
and 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Nakoniec, percento desorpcie v každom časovom intervale  D Δt i sa vypočíta 
pomocou nasledujúcej rovnice:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
zatiaľ čo percento desorpcie  D t i v každom časovom bode t  i je dané rovni ­
cou: 
D t i ¼ X  
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
kde sú vyššie uvedené parametre definované nasledovne:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = hmotnos ť látky, ktorá 
zostáva absorbovaná na 
pôde po časových interva ­
loch Δt 1 , Δt 2 ..., Δt n jednot­
livo (μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = hmotnos ť testovanej desor ­
bovanej látky po čas časo­
vých intervalov Δt 1 , Δt 2 ..., 
Δt n jednotlivo ( μg); 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = hmotnos ť látky meranej 
v alikvótnej časti ( v D 
a ) 
v časovom bode Δt 1 , Δt 2 
..., Δt n jednotlivo ( μg); 
V T = celkový objem vodnej fázy 
v kontakte s pôdou po čas 
pokusu na získanie desorp ­ 
čnej kinetiky vykonaného 
sériovou metódou (cm  3 ); 
m A 
aq = hmotnos ť látky, ktorá 
zostala z adsorp čnej rovno ­
váhy kvôli neukon čenej 
substitúcii objemu ( μg); 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = objem kalu odstráneného zo 
skúmavky po dosiahnutí adsorpčnej rovnováhy 
a nahradeného rovnakým 
objemom 0,01 M CaCl
 2 
solution (cm  3 ); 
v D 
a = objem alikvotnej časti 
odobratej na analytické 
použitie zo skúmavky 
(i) počas pokusu na zistenie 
desorpčnej kinetiky 
vykonaného sériovou 
metódou (cm  3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
DODATOK 6  
ADSORPCIA – DESORPCIA V PÔDE: PREH ĽAD ÚDAJOV  
Testovaná látka: 
Testovaná pôda: 
Hmotnostný obsah suchej pôdy (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Vhodnos ť analytickej metódy  
Odvážená pôda g 
Hmotnosť suchej pôdy g 
Objem roztoku CaCl  2 cm 3 
Menovitá koncentrácia finálneho roztoku μg cm  -3 
Analytická koncentrácia finálneho roztoku μg cm  -3 
Princíp použitej analytickej metódy: 
Kalibrácia použitej analytickej metódy: 
Testovaná látka: 
Testovaná pôda: Hmotnostný obsah suchej pôdy (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Druh analytickej metodológie: nepriam  □ paralelná  □ sériová  □ 
priama  □ 
Adsorpčný test: testované vzorky  
Symbol Jednotky Rovnovážny 
cas Rovnovážny 
čas Rovnovážny 
čas Rovnovážny 
čas 
Skúmavka č. 
Odvážená pôda — g Pôda: suchá hmotnos ť m
 pôda g 
Objem vody v odváženej vode 
(vypočítany) V ws cm 3 
Objem 0,01 M CaCl  2 roztoku 
v rovnovážnej pôde cm 3 
Objem zásobného roztoku cm  3 
Celkový objem vodnej fázy 
v kontakte s pôdou V 0 cm 3 
Počiatočná koncentrácia testo ­
vaného roztoku C 0 μg cm  3 
Hmotnosť testovanej látky na 
začiatku testu m 0 μg ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symbol Jednotky Rovnovážny 
cas Rovnovážny 
čas Rovnovážny 
čas Rovnovážny 
čas 
Po vytrepávaní a odstred'ovaní  
NEPRIAMA METÓDA 
Paralelná metóda 
Koncentrácia testovanej látky, 
vodná fáza, korekcia slepých 
pokusov  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Sériová metóda 
Nameraná hmotnos ť testovanej 
látky v alikvotnom objeme V  a A m m ads ðt i Þ μg 
PRIAMA METÓDA 
Hmotnosť testovanej látky 
adsorbovanej na pôde  m s ads ðt i Þ μg 
Vypočet adsorpcie 
Adsorpcia  A  t i % 
A Δt i % 
Hodnoty 
Koeficient adsorpcie K  d cm 3 g- 1 
Hodnoty 
Koeficient adsorpcie K  oc cm 3 g -1 
Hodnoty 
Testovaná látka: 
Testovaná pôda: 
Hmotnostný obsah suchej pôdy (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Test adsorpcie: slepé pokusy a kontrola  
Symbol Jednotky Slepý pokus Slepý pokus Kontrola  
Skúmavka č. 
Hmotnosť pôdy g 0 0 
Množstvo vody v odváženej pôde 
(vypočítané) cm 3 — — 
Objem 0,01 M CaCl  2 pridaného 
roztoku cm 3 
Objem zásobného roztoku pridanej 
testovanej látky cm 3 0 0 
Celkový objem vodnej fázy (vypo čí­
taný) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symbol Jednotky Slepý pokus Slepý pokus Kontrola  
Počiatočná koncentrácia testovanej 
látky vo vodnej faze μg cm  -3 
Po vytrepávaní a odstre ďovaní  
Koncentrácia vo vodnej faze μg cm  -3 
Pozn. Pridajte kolónky, ak je to potrebné. 
Testovaná látka: Testovaná pôda: Hmotnostný obsah suchej pôdy (105
 o C 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Hmotnostná bilancia  
Symbol Jednotky  
Skúmavka č.. 
Odvážená pôda — g 
Pôda: suchá hmotnos ť m  pôda g 
Objem vody v odváženej pôde (vypo čí­
tané) V WS ml 
Objem 0,01 M CaCl  2 roztoku 
v rovnovážnej pôde ml 
Objem zásobného roztoku cm  3 
Celkový objem vodnej fázy v kontakte 
s pôdou V 0 cm 3 
Počiatočná koncentrácia testovaného 
roztoku C 0 μg cm  -3 
Rovnovážny čas — h  
Po vytrebabaní a odstred'ovaní  
Koncentrácia testovanej látky vodná 
fáza, vrátane korekcie rovnováhy slepého pokusu
 C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Rovnovážny čas t  eq h 
Prvé riedenie s rozpúš ťadlom 
Nahradený objem vodnej fázy V  rec cm 3 
Pridaný objem rozpúš ťadla ΔV cm  3 
Prvá extrakcia s rozpúš ťadlom 
Signál analyzovaný v rozpúš ťadle S  E1 rôzne 
Koncentrácia testovanej látky 
v rozpúšťadle C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symbol Jednotky  
Hmotnosť látky extrahovanej z pôdy 
a zo stein nádoby m E1 μg 
Druhé riedenie s rozpúš ťadlom 
Nahradený objem vodnej fázy ΔV s cm 3 
Pridaný objem vodnej fázy ΔV' cm  3 
Druhá extrakcia s rozpúš ťadlom 
Signál analyzovaný v rozpúš ťadle S  E2 var. 
Koncentrácia testovanej látky 
v rozpúšťadle C E2 μg cm  -3 
Hmotnosť látky extrahovanej z pôdy 
a zo stein nádoby m E2 μg 
Celková hmotnos ť testovanej látky 
extrahovanej v dvoch krokoch m E μg 
Hmotnostná bilancia MB % 
Testovaná látka: 
Testovaná pôda: Hmotnostný obsah suchej pôdy (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorpčná izotermia  
Symbol Jednotky  
Skúmavka č. 
Odvážená pôda — g 
Pôda: suchá hmotnos ť E g 
Objem vody v odváženej pôde 
(vypočítané) V WS cm 3 
Objem 0,01 M CaCl  2 roztoku 
v rovnovážnej pôde cm 3 
Pridaný objem zásobného 
roztoku cm 3 
Celkový objem vodnej fázy 
v kontakte s pôdou (vypo čítaný) V 0 cm 3 
Počiatočná koncentrácia testo ­
vaného roztoku C 0 μg cm  -3 
Rovnovážny čas — h  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symbol Jednotky  
Po vytrepaní a odstre ďovaní  
Koncentrácia látky vodná fáza, 
vrátane korekcie slepého pokusu  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Teplota  o C 
Adsorpčná hmotnos ť na 
jednotke pôdy  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regresná analýza: 
Hodnota K  F ads : 
Hodnota l/n: Regresný koeficient r
 2 : 
Testovaná látka: Testovaná pôda: Hmotnostný obsah suchej pôdy (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . % 
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Druh analytickej metodológie: nepriama  □ paralelná  □ sériová  □ 
Desorpčný test  
Symbol Jednotka Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval  
Skúmavka č. vystupujúca z adsorp čného 
testu 
Hmotnosť látky adsorbovanej na pôde 
v čase adsorp čnej rovnováhy  m s ads ðeqÞ μg 
Nahradený objem vodnej fázy, nahradený 
objem 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Celkový objem vodnej 
fázy v kontakte s pôdou PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Hmotnosť testovanej látky odloženej 
počas adsorp čnej rovnováhy kvôli nedo ­
končenej substitúcii objemu  m aq A μg 
Desorpčná kinetika  
Nameraná hmotnos ť látky desorbovaná 
z pôdy v čase t  i m m des ðt i Þ μg 
Objem roztoku odobraný 
zo skúmavky i) s cie ľom 
merania testovanej látky PM V  r i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Hmotnosť látky desorbovanej z pôdy 
v čase t  i (nameraná)  m aq des ðt i Þ μg 
Hmotnosť látky desorbovanej z pôdy 
v časovom intervale Δ ti (nameraná)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symbol Jednotka Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval  
Percento desorpcie  
Desorpcia v čase t  i Dt i % 
Desorpcia v časovom intervale Δt i D Δt i % 
Zdanlivý desorp čný koeficient K  des 
PM: paralelná metóda 
SM: sériová metóda  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ODHAD ADSORP ČNÉHO KOEFICIENTU (K  oc ) V PÔDE 
A V SPLAŠKOVOM KALE ZA POUŽITIA VYSOKOÚ ČINNEJ 
KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE/HPLC/  
1. METÓDA  
Táto metóda je totožná s metódou OECD TG121 (2001).  
1.1. ÚVOD 
Sorpčné správanie sa látok v pôde a splaškových kaloch môže by ť 
opísané cez experimentálne stanovené parametre v zmysle testovacej metódy C.18. Dôležitým parametrom je adsorp čný koeficient, ktorý 
je definovaný ako pomer medzi koncentráciou látky v pôde/splaškoch 
a koncentrácie látky vo vodnej fáze pri adsorp čnej rovnováhe. 
Adsorpčný koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíka 
v pôde K
 oc je vhodný indikátor väzbovej kapacity chemikálií na 
organické látky z pôdy/splaškov a dovo ľuje urobi ť porovnania 
rôznymi chemikáliami. Tento parameter môže by ť odhadnutý cez 
korelácie s rozpustnos ťou vo vode a n-oktanol/voda rozde ľovacím 
koeficientom (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7). 
Experimentálna metóda opísaná v tomto teste používa vysokoú činnú 
kvapalinovú chromatografiu/HPLC/na odhadnutie adsorp čného koefi ­
cientu K  oc v pôde a splaškových kaloch (8). Odhady sú vyššej 
spoľahlivosti ako tie z QSAR výpo čtov (9). Metóda odhadov 
nemôže úplne nahradi ť série rovnovážnych experimentov používa ­
ných v testovacej metóde C.18. Avšak odhadnutý K  oc môže byť 
osožný pri vyberaní vhodných parametrov testu na štúdie adsorpcie/ ­
desorpcie pod ľa testovacej metódy C.18 vypo čítaním K  d (distribučný 
koeficient) alebo K  f (Freundlichov adsorp čný koeficient) pod ľa 
rovnice 3 (pozri sekciu 1.2).  
1.2. DEFINÍCIE  
K d : Distribu čný koeficient je definovaný ako pomer rovnovážnej 
koncentrácie C rozpustenej testovacej látky v dvojfázovom systéme 
pozostávajúcom zo sorbentu/pôda alebo splaškové kaly/a pôdnej fázy; je to bezrozmerná veli čina, keď koncentrácie v obidvoch 
fázach sú vyjadrené na základe hmotnos ť/hmotnosť. V prípade 
koncentrácie vo vodnej fáze je daná na základe hmotnos ť/objem, 
potom jednotky sú ml.g
 -1 .K d sa môže meni ť s vlastnos ťou sorbentu 
a môže by ť závislé od koncentrácie.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
kde: 
C pôda = koncentrácia testovacej látky v pôde pri rovnováhe ( μg .g  -1 ) 
C kal = koncentrácia testovacej látky v kale pri rovnováhe ( μg .g  -1 ) 
C aq = koncentrácia testovacej látky vo vodnej fáze pri rovnováhe 
(μg.g -1 , μg .ml  -1 ) ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlichov adsorp čný koeficient je definovaný ako koncen ­
trácia testovacej látky v pôde alebo splaškovom kale (x/m), ke ď 
rovnovážna koncentrácia C  aq vo vodnej fáze je rovná 1; jednotky 
sú μg.g -1 sorbent. Hodnota sa môže meni ť s vlastnos ťami sorbentu.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (1) 
kde: 
x/m = množstvo testovacej látky x ( μg) adsorbovanie na množstve 
sorbentu m (g) pri rovnováhe 
l/n = nábeh Freundlichovej adsorp čnej izotermy 
C aq = koncentrácia testovacej látky vo vodnej fáze pri rovnováhe 
(μg.ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Distribu čný koeficient (K  d ) alebo Freundlichov adsorp čný 
koeficient (K  f ) normalizovaný na obsah organického uhlíka (f  oc ) 
v sorbente, predovšetkým na neionizované chemikálie, je to vhodný 
indikátor na stupe ň adsorpcie medzi látkou a sorbentom a umož ňuje 
urobiť porovnania medzi rôznymi chemikáliami. V závislosti od 
rozmeru/jednotiek, v ktorých sú udávané (K  d a K  f , K  oc ) môže by ť 
bezrozmerný alebo ma ť jednotku (ml.g  -1 ) alebo (μg .g  -1 ) organickej 
látky.  
K oc ¼ K d 
f oc Ê 
bezrozmzrný alebo ml ·g Ä1 Ì 
alebo  K f 
f oc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
Vzťah medzi K  oc a K  d nie je vždy lineárny a preto K  oc hodnota sa 
môže meni ť z pôdy na pôdu, ale ich variabilita je zna čne redukovaná 
porovnaním K  d alebo K  f hodnôt. 
Adsorpčný koeficient (K  oc ) je odvodený z kapacitného faktora (k”) 
využívajúceho kalibra čnú závislos ť log k' versus log K  oc na vybraté 
referenčné zlúčeniny.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
kde: 
t R = HPLC reten čný čas testovacej a referen čnej látky (minúty) 
t o = HPLC m ŕtvy čas (minúty) (pozri odsek 1.8.2)  
P ow : Rozdeľovaci koeficient na systém oktanol – voda je definovaný 
ako pomer koncentrácií rozpustených látok v n-oktanole a vo vode – 
je to bezrozmerná hodnota.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. REFEREN ČNÉ LATKY 
Štruktúrny vzorec, čistota a disocia čná konštanta látok (ak je to 
vhodné) by mali by ť známe pred použitím metódy. Informácia 
o rozpustnosti vo vode a v organických rozpúš ťadlách, 
o rozde ľovacom koeficiente na systém oktanol – voda 
a hydrolyza čné charakteristiky sú vhodné.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Aby sme priviedli do vzájomného vz ťahu FTPLC – reten čné údaje 
testovacej látky s jeho adsorp čným koeficientom, K  oc , bol stanovený 
kalibračný graf ako log K  oc = f (log k'). Mal by by ť zostrojený 
minimálne so šiestich referen čných bodov, najmenej jeden bod nad 
a jeden pod o čakávanou hodnotou na testovaciu látku. Presnos ť 
metódy sa zna čne zlepší, ak sa použijú referen čné látky, ktorých 
štruktúra je príbuzná testovacej látke, štruktúre. Ak nie sú tieto údaje dostupné, potom je na užívate ľovi, ktorý musí vybra ť vhodné 
kalibračné látky. V tomto prípade bol vybraný obvyklejší set štruk ­
túrovo heterogénnych látok. Látky a hodnoty K
 oc , ktoré môžu by ť 
použité, sú vypísané v dodatku v tabu ľke 1 pre splaškové kaly 
a v tabuľke 3 pre pôdu. Výber iných kalibra čných látok by mal 
byť opodstatnený.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
FTPLC je vykonávaná na analytických kolónach naplnených 
s komerčne dostupnou tuhou fázou kyanopropylom obsahujúcou 
lipofilické a pólové podiely. Je používaná mierne pólová stacionárna fáza zakotvená na kremi čitanovej matrici. 
– O – Si – CH
 2 – CH  2 – CH  2 – CN 
silica nepólová zložka pólová 
skupina 
Princíp testovacej metódy je podobný testovacej metóde A.8 (roz ­
deľovaci koeficient, FTPLC metóda). Zatia ľ čo v tom čase prechádza 
cez kolónu spolu s mobilnou fázou, testovacia látka je interaktívna 
so stacionárnou fázou. Dvojité zloženie stacionárnej fázy, ktorá má polárny aj nepolárny charakter, umož ňuje interakcie pólových aj 
nepólových skupín v molekule podobnou cestou ako v prípade orga ­
nickej látky v pôdach alebo v splaškovo kalových matriciach. Toto 
umožňuje utvori ť vzťah medzi reten čným časom na kolóne 
a adsorpčným koeficientom z organickej látky. 
pH má zna čný vplyv na sorp čné správanie sa predovšetkým na 
pólové látky. Pre po ľnohospodársku pôdu alebo nádrže čistiarní 
odpadových vôd pH sa normálne mení pH v rozmedzí pH = 5,5 – 7,5. Pre ionizovate ľné látky by mali by ť vykonané dva testy 
s obidvoma, ionizovanou a neionizovanou formou, vo vhodnom 
tlmiacom roztoku, ale iba v prípade, ke ď najmenej 10 % testovacej 
zlúčeniny bude disociované v rozmedzí pH od 5,5 do 7,5. 
Odkedy sa využíva na vyhodnotenie len vz ťah medzi retenciou na 
HPLC kolóne a adsorp čným koeficientom, nevyžaduje sa žiadna 
kvalitatívna analytická metóda a je potrebné iba stanovenie reten č­
ného času. Ak je dostupný vhodný set referen čných látok a môžu 
byť použité štandardné experimentálne podmienky, metóda posky ­
tuje rýchlu a ú činnú cestu na odhad adsorp čného koeficientu K
 oc . 
1.5. APLIKOVATE ĽNOST TESTU 
HPLC metóda je aplikovate ľná na chemické látky (neozna čené alebo 
označené), pre ktoré je dostupný vhodný detek čný systém (napr. 
spektrofotometer, radia čný detektor (a ktoré sú dostato čne stabilné 
počas trvania experimentu. Môže by ť hlavne použitá na chemikálie, 
ktoré môžeme ťažko študova ť pomocou iných experimentálnych 
systémov (napr. prchavé látky, ktoré nie sú rozpustné vo vode 
v koncentráciách, ktoré môžu by ť merané analyticky. Látky 
s vysokou afinitou vo či povrchu inkuba čných systémov). Metóda 
môže by ť použitá pri zmesiach, ktoré dávajú nerozlíšené elu čné 
skupiny. V takomto prípade najvyšší a najnižší limit na hodnotu 
log K  oc pre zlúčeniny v zmesi by mal by ť daný.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Nečistoty môžu niekedy spôsobi ť problémy pri interpretácií 
výsledkov z HPLC, ale majú iba malý význam, ak testovacia látka 
je jednozna čne analyticky identifikovaná a oddelená od ne čistôt. 
Metóda je platná na látky v tabu ľke 1 v dodatku a bola tiež apliko ­
vaná na rôzne iné chemické látky prislúchajúce do nasledujúcich chemických skupín: 
— aromatické amíny (napr. trifluralín, 4-chlóranilín, 3,5-dinitroani ­
lín, 4-metylanilín, N-metylanilín, 1-naftylamín), 
— estery aromatických karboxylových kyselín (napr. metylester 
kyseliny benzoovej, etylester kyseliny 3,5-dinitrobenzovej), 
— aromatické uh ľovodíky/napr. toluén, xylén, etylbenzén, nitroben ­
zén, 
— estery aryloxyfenoxy propionóvej kyseliny (napr. diclofop-metyl, 
fenoxaprop-etyl, fenoxaprop-P-etyl), 
— benzimidazol a imidazolové fungicídy (napr. carbendozim, fube ­
ridazol, trianoxid), 
— amidy karboxylových kyselín (napr. 2-chlórbenzamid, N,N-dime ­
tylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metylbenzamid, 2-nitroben ­
zamid, 3-nitrobenzamid), 
— chlórované uh ľovodíky (napr. endosulfan, DDT, hexachlórben ­
zén, chintozén, 1,2,3-trichlórbenzén), 
— organofosfore čné insekticídy (napr. azinofos-metyl, disulfoton, 
fenamiphos, izofenfs, pyra-zofos, sulprofos, triazofos), 
— fenoly (napr. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlórofenol, 
2,4,6-trichlórfenol, 1-naftol), 
— deriváty fenylmo čoviny (napr. izoproturon, monolinuron, pency ­
curon), 
— pigmenty farbív (napr. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81) 
— polyaromatické uh ľovodíky (napr. acenaftén, naftalén), 
— 1,3,5-trianzínové herbicídy (napr. prometrín, propazin, simazín, 
terbutrín), 
— triazolové deriváty (napr. tebucanozol, triadimefon, tradimenol, 
triapentenol). 
Táto metóda nie je použite ľná na látky, ktoré reagujú s hociktorým 
z eluentov alebo so stacionárnou fázou. Tiež nie je aplikovate ľná na 
látky, ktoré reagujú špecifickým spôsobom s anorganickými zlož ­
kami (napr. formácia klastrových komplexov s ílovými minerálmi). 
Metóda nemusí fungova ť na povrchovo aktívne látky, anorganické 
zlúčeniny a slabé alebo silné organické kyseliny a zásady. Hodnota 
log K
 oc môže byť stanovená v rozmedzí od 1,5 do 5,0. Ionizovate ľné 
látky musia by ť merané za použitia tlmiacej mobilnej fázy, ale treba 
dbať, aby sa zabránilo zvážaniu tlmiacich zložiek roztoku alebo 
testovanej látky.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.6.1.  Presnos ť 
Obvykle môže by ť adsorpčný koeficient testovacej látky odhadnutý 
v medziach ± 0,5 log jednotky hodnoty, stanovenej sériou rovno ­
vážnej metódy (pozri tabu ľka 1 v dodatku). Vyššia presnos ť môže 
byť dosiahnutá, ak sú použité referen čné látky s podobnou štruktúrou 
ako testovacia látka.  
1.6.2.  Opakovate ľnosť 
Stanovenie by sa malo vykona ť najmenej dvakrát. Hodnoty log K  oc 
odvodené z jednotlivých meraní by mali by ť v rozmedzí 0,25 log 
jednotky.  
1.6.3.  Reprodukovate ľnosť 
Doteraz nadobudnutá skúsenos ť v používaní metódy potvrdzuje jej 
platnosť. Overovanie HPLC metódy, pri ktorej bolo použitých 48 
látok (vä čšinou pesticídov), na ktoré boli spo ľahlivé dáta K  oc 
v pôdach dostupné, získal sa korela čný koeficient R = 0,95 (10), (11). 
Vykonal sa vnútrolaboratórny porovnávací test s 11 ú častníckymi 
laboratóriami, aby sa zdokonalila validová metóda. Výsledky sú 
uvedené v tabu ľke 2 v dodatku.  
1.7. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.7.1.  Predbežný odhad adsorp čného koeficientu  
Rozdeľovači koeficient na systém oktanol/voda P  ow (= K  ow ) 
a v určitej miere rozpustnos ť vo vode môže by ť použitý ako indi ­
kátor stup ňa adsorpcie, predovšetkým pre neionizovate ľné látky, 
a preto môže by ť použitý na predbežné h ľadanie rozsahu vhodných 
korelácií. Množstvo vhodných korelácií bolo publikovaných na 
niekoľko rôznych skupín chemikálií (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7).  
1.7.2.  Zariadenie  
Vyžaduje sa kvapalinový chromatograf vybavený bezpulzovou pumpou 
a vhodným detek čným zariadením. Odporú ča sa použitie dávkovacieho 
ventilu s dávkovacou slu čkou. Môže by ť použitá komer čná kyano- 
propylová chemicky viazaná silica na kremi čitanovom základe (napr. 
Hypersil a Zorbax KN). Medzi injek čný/dávkovací/systém 
a analytickú kolónu môže by ť umiestnená ochranná kolóna (predkolóna) 
z rovnakého materiálu ako analytická kolóna. Kolóny od rôznych dodá ­
vateľov sa môžu významne líši ť v ich separa čnej účinnosti. Ako príklad 
– nasledujúci kapacitný faktor k'sa dosiahne: log k' > 0,0 pre log K  oc = 
3,0 a log k' > - 0,4 pre log K  oc = 2,0. Ak použijeme ako mobilnú fázu 
metanol/voda v pomere 55 ku 45 %.  
1.7.3.  Mobilné fázy  
Bolo testovaných nieko ľko mobilných fáz a nasledujúce dve sú 
odporúčané: 
— metanol/voda (55/45 % objemových), — metanol/0,01 M citrátový tlmivý roztok pH = 6,0 (55/45 % obje ­
mových).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Metanol, destilovaná voda alebo citrátový tlmivý roztok – stupne pre 
HPLC sa používajú na prípravu elu čného rozpúš ťadla. Zmes je pred 
použitím odplynená. Použije sa izokratické eluovanie. Ak zmesi etanol/voda nie sú vhodné, môžeme odskúša ť iné zmesi organická 
látka/voda, napr. etanol/voda alebo acetonitril/voda. Pre iónové 
zlúčeniny sa odporú ča používa ť tlmiace roztoky, aby sa stabilizovalo 
pH roztoku. Pozor treba dáva ť, aby sme sa vyhli vyzrážaniu soli 
alebo zne čisteniu kolóny, čo sa môže vyskytnú ť pri niektorých 
zmesiach organická fáza/tlmivý roztok. 
Nemôžu by ť používané žiadne aditíva, pretože môžu ovplyvni ť sorpčné 
vlastnosti stacionárnej fázy, takže zmeny stacionárnej fázy môžu by ť 
ireverzibilné. Z tohto dôvodu je dané, že experimenty, v ktorých sa používajú aditíva, sa vykonávajú na separátnych kolónach.
 
1.7.4.  Rozpúš ťadlá 
Testovacie a referen čné látky by mali by ť nerozpustné v mobilnej fáze.  
1.8. VYKONANIE TESTU  
1.8.1  Podmienky testu  
Teplota po čas merania by mala by ť zapisovaná. Ve ľmi odporú čame 
používať oddelene kolónu s kontrolovanou teplotou, aby sa zistili 
konštantné podmienky po čas kalibrácie, chodu na odhad a merania 
testovacej látky.  
1.8.2.  Stanovenie m ŕtveho času to  
Na stanovenie m ŕtveho času t  o môžu byť použité dve rôzne metódy 
(pozri odsek 1.2).  
1.8.2.1.  Stanovenie m ŕtveho času to v zmysle homologického radu.  
Tento postup bol preverený, aby poskytoval spo ľahlivú 
a štandardizovanú hodnotu t  o – mŕtveho času. Podrobne pozri testo ­
vaciu metódu A.8: rozde ľovací koeficient (n-oktanol/voda), HPLC 
metóda.  
1.8.2.2.  Stanovenie m ŕtveho času pomocou inertnej látky, ktorá nie je 
zadržiavaná na kolóne.  
Táto technika je založená na nastreknutí roztoku formamidu, mo čo­
viny alebo dusi čňanu sodného. Meranie je potrebné vykona ť 
najmenej dvakrát.  
1.8.3.  Stanovenie reten čného času tR  
Retenčné látky by mali by ť vybraté ako bolo popísané 
v odseku 1.3. Môžu by ť nadávkované ako zmiešané štandardy na 
stanovenie ich reten čných časov. Bolo potvrdené, že reten čný čas 
každého referen čného štandardu je neovplyvnený prítomnos ťou 
iných referen čných štandardov. Kalibrácia by sa mala vykonáva ť 
v pravidelných intervaloch najmenej dvakrát denne, aby sme vysve ­
tlili neočakávané zmeny v ú činnosti kolóny. Kalibrácia – nadávko ­
vanie kalibra čnej zmesi. Kalibra čnú zmes by sme mali nadávkova ť 
pred a po dávkovaní testovacej látky, aby sme si potvrdili, že retenčné časy sa neposúvajú. Testovacie látky sa dávkujú osobitne 
v množstve tak malom ako je to možné, aby sme sa vyhli pre ťaženiu 
kolóny a stanovia sa reten čné časy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Aby sme zvýšili spo ľahlivosť merania, stanovenie by malo by ť 
vykonané najmenej dvakrát. Hodnota log K  oc získaná 
z jednotlivých meraní by mala spada ť do rozmedzia 0,25 log 
jednotky.  
1.8.4.  Vyhodnotenie  
Kapacitné faktory k' sú vypo čítané z m ŕtveho času to a reten čných 
časov t  R vybraných referen čných látok pod ľa rovnice 4/pozri odsek 
12/. log k' údaje referen čných látok sú uvedené oproti ich log K  oc 
hodnotám na sériu rovnovážnych pokusov/experimentov/daných 
v tabuľke 1 a 3 v dodatku. Využívajúc tento graf je hodnota log 
k' testovacej látky potom použitá na stanovenie jeho hodnoty log K
 oc . Ak aktuálne výsledky ukazujú, že log K  oc testovacej látky je 
mimo kalibra čný rozsah, test by sa mal zopakova ť s použitím inej 
vhodnej testovacej látky.  
2. ÚDAJE A SPRÁVA  
Správa musí zah ŕňať nasledujúce informácie: 
— identitu testovacích alebo referen čných látok a ich čistotu, 
hodnotu pKa, ak je relevantná, 
— opis zariadenia a pracovné podmienky, napr. typ a rozmery 
analytickej predkolóny, spôsob detekcie, mobilnú fázu (pomer 
zložiek a pH), rozsah teplôt po čas merania, 
— mŕtvy čas a metódu použitú na jeho stanovenie, 
— množstvá testovacích a referen čných látok vstupujúcich do 
kolóny, 
— retenčné časy referen čných zlúčenín použitých na kalibráciu, 
— detaily získanej regresnej krivky (log k' vs log K  oc ) a graf 
regresnej krivky, 
— priemer reten čných údajov a odhad d log K  oc hodnoty na testo ­
vaciu zlú čeninu, 
— chromatogramy.  
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York. 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorp ­
tion coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67. 
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the 
parachor. J. Agric. Food Chem., 29, s. 1050 – 1059. 
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, s. 227 – 231. 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, s. 297 – 312.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, pp. 831 – 832. 
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, s. 833 – 846. 
(8) W. Kôrdel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), s. 121 – 128. 
(9) M. Mueller, W. Kôrdel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), s. 2493 – 2504. 
(10) W. Kôrdel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemo ­
sphere, 27(12), s. 2341 – 2352. 
(11) B. von Oepen, W. Kôrdel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, s. 285 – 304. 
(12) W. Kôrdel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), s. 1373 – 1384.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
DODATOK  
Tabuľka 1 
Porovnanie Koc hodnôt na pôdne a splaškové kaly a vypo čítané hodnoty pod ľa skríningovej HPLC metódy  ( 1 ) ( 2 ) 
Látka Číslo CAS log K  oc 
splaškové 
kaly log K  oc 
HPL C Δ log K  oc 
pôdy log K  oc 
HPL C Δ 
atrazín 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 
fenantrén 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 
fenyl ester kyseliny 
benzoovej 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 acetanilíd 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 anilín 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-dichlóranilín 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kôrdel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), s. 121 – 128. 
( 2 ) W. Kôrdel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), s. 107 – 119.  
Tabuľka 2 
Výsledky laboratórnych porovnávacích testov (11 zú častnených laboratórií) vykonaných s cie ľom vylepši ť 
a potvrdi ť platnosť HPLC-metódu  ( 1 ) 
Látka Číslo CAS log K  oc K oc log K  oc 
[OECD 106] [HPLC-metóda]  
atrazín 1912-24-9 1,81 78 + 16 1,89 
monuron 150-68-5 1,99 100 + 8 2,00 triapentenol 77608-88-3 2,37 292 + 58 2,47 linuron 330-55-2 2,59 465 + 62 2,67 fention 55-38-9 3,31 2062 + 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Miiller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-  
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), s. 1373 – 1384.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabuľka 3 
Odporúčané referen čné látky na skríningovú HPLC metódu vychádzajúcu z adsorp čných údajov na pôdu  
Referenčná látka Číslo CAS log Koc hodnoty 
dávok číslo Koc 
údajov log S.D. Zdroj  
acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-nitrob enzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetylmenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metylbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
metylbenzoan 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
atrazín 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
anilín 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
triazooxid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
naftalén 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
metfiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3 -trichlorbenzén 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
priama červeň 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
pyrazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-endosulfán 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
diclofop-metyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
fenantrén 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
basic blue 41 zmes 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & 
D Report No. 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304. 
( c ) Údaje poskytnuté priemyslom.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  REPRODUK ČNÝ TEST NA DAPHNIA MAGNA  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda reproduk čnej toxicity je totožná s metódou 
OECD TG 211 (1998).  
1.1. ÚVOD 
Prvotným cie ľom testu je odhadnú ť vplyv chemických látok 
a prípravkov na reproduk čný výstup  Daphnia magna.  
1.2. DEFINÍCIE A JEDNOTKY  
Rodičovské živo číchy:  sú sami čky Daphnia magna  prítomné od 
začiatku testu a ktorých reproduk čný výstup je objektom štúdie.  
Potomstvo:  sú mladé  Daphnie  vyprodukované rodi čovskými živo čí­
chmi v priebehu testu.  
Najnižšia zistená ú činná koncentrácia (LOEC):  je najnižšia testo ­
vaná koncentrácia, pri ktorej je badate ľný štatisticky významný efekt 
tejto látky na reprodukciu a rodi čovskú mortalitu (v p < 0,05), ke ď 
porovnávame s kontrolou v medziach stanoveného času pôsobenia.  
Koncentrácia s nezisteným vplyvom (neú činná koncentrácia 
NOEC):  je testovaná koncentrácia ihne ď pod LOEC, ktorá je porov ­
návaná s kontrolnou, nemá štatisticky významný vplyv (p < 0,05) v rámci danej expozi čnej doby.  
EC
 x : je koncentrácia testovanej látky rozpustenej vo vode, ktorá 
spôsobí x % redukciu reprodukcie  Daphnie magna  v medziach 
určenej expozi čnej doby.  
Vlastný pomer rastu:  je meranie rastu populácie, ktoré zah ŕňa 
reprodukčný výstup a mortalitu špecifickú pre istú dobu života 
(20), (21), (22). Pri ustálenom stave populácie je nula. Pre rastúcu populáciu to bude pozitívna hodnota a pre zmenšujúcu populáciu 
bude negatívna. Bezpochyby neskoršie nie je udržate ľná a vedie 
napokon k vymretiu.  
Detekčný limit:  je najnižšia koncentrácia, ktorá môže by ť zistená, 
ale nie kvantifikovaná.  
Medze stanovenia:  je najnižšia koncentrácia, ktorá môže by ť kvan­
titatívne zmeraná.  
Mortalita:  živočích sa považuje za m ŕtvy, keď sa nepohybuje, napr. 
keď nie je schopný pláva ť alebo ak nie je pozorovaný pohyb príve ­
skov alebo podbruška do 15 sekúnd po jemnom potrasení testovacej 
nádobky. (Ak sa použije iná definícia, musí by ť uvedená spolu s jej 
odkazmi.)
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Mladá sami čka Daphnií,  mladšia ako 24 hodín na za čiatku testu je 
vystavená testovacej látke pridanej do vody rôznych koncentrácií. Test trvá 21 dní. Na konci testu sa odhaduje celkový po čet živého 
potomstva vyprodukovaného rodi čovským živo číchom, ktorý prežil 
do konca testu, to znamená, že mlá ďatá vyprodukované dospelými 
jedincami, ktorí uhynuli po čas testu, sú vylú čené z výpo čtov. Repro ­
dukčný výstup rodi čovských živo číchov môže by ť vyjadrený 
rôznymi spôsobmi (napr. po čet žijúceho potomstva vyprodukova ­
ného na živo čícha za de ň od prvého d ňa, keď bolo spozorované 
potomstvo), ale okrem toho je opísaný ako celkový po čet mláďat 
vyprodukovaný rodi čovskými živo číchmi prežívajúcimi do konca 
testu. Reproduk čný výstup živo číchov vystavený testovacej látke je 
porovnávaný s kontrolnou vzorkou, aby sa stanovila najnižšia zistená účinná koncentrácia (LOEC) a teda aj nezistite ľná účinná koncen ­
trácia (NOEC). A okrem toho, tak ako je to len možné, sú dáta 
analyzované za použitia regresného modelu, aby sa odhadla koncen ­
trácia, ktorá zaprí činí x % redukciu reproduk čného výstupu (napr. 
EC
 50 , EC  20 alebo. EC  10 ). 
Počet prežívajúcich rodi čovských živo číchov a čas prvého potomstva 
musí byť taktiež zaznamenaný. Taktiež iné látky s príbuzným 
efektom na parametre ako napr. rast (d ĺžka) a možný vnútorný 
pomer rastu je taktiež možné otestova ť. 
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LATKE 
Výsledky testu akútnej toxicity (pozri metódu C.2, časť I), vykona ­
ného na  Daphnii magne,  sú dostupné. Výsledky môžu by ť užitočné 
pri výbere vhodných testovacích koncentrácií v reproduk čných 
testoch. Je potrebné pozna ť rozpustnos ť vo vode aj tlak pár testo ­
vanej látky a ma ť spoľahlivú analytickú metódu na kvantifikáciu 
látky v testovanom roztoku so známou ú činnosťou a známym 
detekčným limitom. 
Informácie o testovanej látke, ktoré sú použité pri stanovení 
podmienok testu, zah ŕňajú štruktúrny vzorec, svetelnú stabilitu, stabi ­
litu pri podmienkach testu, pKa (disocia čná konštanta), P  ow 
a výsledky testu na rýchlu biodegradáciu (pozri metódu C.4).  
1.5. VALIDITA TESTU 
Aby bol test platný, je potrebné kontrolova ť nasledujúce kritériá na 
vykonanie testu: 
— mortalita rodi čovských živo číchov nemá na konci testu 
presiahnu ť 20 % na jedného, 
— významný po čet živých potomkov vyprodukovaných rodi čov­
ským živo číchom prežívajúcich do konca testu je > 60.  
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Zariadenie  
Testovacia nádoba a ostatné zariadenia, ktoré prichádzajú do 
kontaktu s testovaným roztokom, musia by ť celé vyrobené zo skla 
alebo z iného chemicky inertného materiálu. Testovacie nádoby sú obvykle sklenené kadi čky. 
Okrem toho sa vyžadujú niektoré alebo všetky nasledujúce zariade ­
nia: 
— oxygén meter (zariadenie na meranie kyslíka) mikroelektródou 
alebo iným vhodným zariadením merajúcim rozpustný kyslík 
v malých objemoch vzoriek,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— príslušné zariadenie na kontrolu teploty, 
— pH-meter, 
— zariadenie na meranie tvrdosti vody, — zariadenie na stanovenie celkovej koncentrácie organického 
kyslíka (TOC) vo vode alebo zariadenie chemickej spotreby 
kyslíka (COD), 
— vhodné zariadenie na kontrolovanie svetelného režimu a meranie 
intenzity svetla.
 
1.6.2.  Testované organizmy  
Druh používaný v testoch je  Daphnia magna  Straus. Môžu by ť 
použité aj iné druhy dafnií pod podmienkou, že sp ĺňajú kritériá 
validity (kritériá validity podobné reproduk čným výstupom 
v kontrolnej vzorke sú významné pre druhy Dafnia.) Ak sa použijú iné druhy dafnií, musia by ť jasne definované a ich použitie musí by ť 
opodstatnené. 
Výhodnejšie je identifikovanie klonov genotypmi. Výskum (1) 
ukázal, že reproduk čná účinnosť klonu A, ktorý pochádza 
z IRCHA vo Francúzsku, (3) dôsledne vyhovuje kritériám validity 
v zmysle ≥ 60 potomkov na rodi čovského živo čícha prežívajúceho, 
keď sú kultivované za podmienok opísaných v tejto metóde. Sú však 
akceptovate ľné aj iné klony, zabezpe čujúce, že kultúra dafnií uspo ­
kojuje kritériá validity testu. 
Na začiatku testu majú živo číchy menej ako 24 hod. a nesmú by ť 
prvým vrhom potomstva. Mali by by ť získané zo zdravého materiálu 
(t. j. nevykazujúc žiadne známky stresu ako vysoká mortalita, 
prítomnos ť samčekov a ephippia oneskorenie v produkcii prvého 
potomstva, bezfarebné živo číchy atď.). Zásobné živo číchy musia 
byť udržiavané v kultivovaných podmienkach (svetlo, teplota, 
médium k ŕmenie a po čet organizmov na jednotku objemu) podob ­
ných tým, ktoré sa používajú pri teste. Ak médium dafniovej kultúry 
použité v teste je odlišné od bežnej kultúry dafnií, je dobré zaradi ť 
pred testom aklimatiza čnú periódu trvajúcu obvykle okolo troch 
týždňov (t. j. jedna generácia), aby sme sa vyhli skres ľovaniu rodi ­ 
čovských živo číchov.
 
1.6.3  Testovacie médium  
V tomto teste odporú čame použi ť úplne definované médium. Tým sa 
môžeme vyhnú ť použitiu aditív (napr. chalúh, pôdnych extraktov 
atď.), ktoré sú ťažko charakterizovate ľné a zárove ň sa zlepšujú 
možnosti štandardizácie medzi laboratóriami. Elendt M4 (4) 
a M7 médiá (pozri dodatok 1) sú vhodné na tento ú čel. Aj iné 
médiá napr. (5), (6) sú však akceptovate ľné na zis ťované účinnosti 
kultúry  Daphnia magna,  ak sa ukáže, že uspokojujú kritériá validity 
testu. 
Ak sú použité médiá, ktoré obsahujú nedefinované aditíva, tieto 
aditíva musia by ť špecifikované jasne a informácie musia by ť 
poskytnuté vo výpise testu na zloženie, obzvláš ť s dôrazom na 
obsah uhlíka, ke ďže toto môže napomôc ť pri poskytovaných 
dávkach potravy. Odporú ča sa, aby celkový organický uhlík (TOC) 
a/alebo chemicky požadovaný kyslík (COD) bol pri príprave zásoby organických aditív definovaný a bol vykonaný odhad výsledku 
k TOC/COD v testovanom médiu. Ďalej sa odporú ča, aby úrove ň 
TOC v médiu (t. j. pred prídavkom rias) bol pod 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Keď testované látky obsahujú kovy, je dôležité rozpozna ť, že vlast ­
nosti testovaného média (t. j. tvrdos ť, chelatačná kapacita – schop ­
nosť vykonáva ť chelačné komplexy) môžu ma ť súvislosť s toxicitou 
testovanej látky. Z tohto dôvodu sa vyžaduje úplne definované médium, v sú časnosti sú však iba Elendt M4 a M7 plne definované 
médiá, ktoré sú vhodné na dlhožijúce kultúry  Daphnia magna.  
Obidve médiá obsahujú chelátotvornú zložku EDTA (etyléndiamín ­
tetraoktamín kyselina). Pri práci (2) sa ukázalo, že evidentná-zjavná toxicita kadmia je vo všeobecnosti nižšia, ke ď sa reproduk čný test 
vykonal v M4 a M7 médiách, ako v médiách neobsahujúcich EDTA. 
M4 a M7 nie sú doporu čené na testovanie látok obsahujúcich kovy 
a iné médiá obsahujúce známe chelatotvorné zložky by sa nemali taktiež používa ť. Pre kov obsahujúce látky sa odporú ča použiť alter­
natívne médium tak ako napr. ASTM znovu stanovená tvrdá čerstvá 
voda (7), ktorá neobsahuje žiadne EDTA, s pridaným extraktom z chalúh (8). Táto kontribúcia ASTM rekonštruovanej tvrdej čerstvej 
vody a chaluhového extraktu je tiež vhodná na dlhožijúce kultúry 
a testovanie  Daphnie magna  (2), hoci sa stále uplat ňuje proces, pri 
ktorom sa tvoria mierne chelátové komplexy, spôsobené organickými zložkami v pridanom extrakte z chalúh. 
Na začiatku a po čas testu má by ť koncentrácia rozpusteného kyslíka 
okolo 3 mg/l. pH v rozmedzí 6 – 9 a obvykle sa nemení viac ako 1,5 jednotky v žiadnom teste. Doporu čená tvrdos ť vody je približne 
140 mg/l (ako CaCO
 3 ). Testy na tejto úrovni a vyššej demonštrujú 
účinnosť reprodukcie v súlade s kritériami validity (9), (10).  
1.6.4.  Testované roztoky  
Testovacie roztoky ur čitých koncentrácií sa obvykle pripravujú zrie ­
dením zásobného roztoku. Zásobné roztoky sa naj častejšie pripravujú 
rozpustením látky v testovacom médiu. 
V niektorých prípadoch sa odporú ča použitie organických rozpúš ťa­
diel alebo látok tvoriacich disperziu, aby sa pripravil zásobný roztok v požadovanej koncentrácii, ale malo by by ť vyvinuté všetko úsilie, 
aby sa vyhlo použitiu takýchto materiálov. Príklady vhodných 
rozpúšťadiel sú acetón, etanol, metanol, dimetyl-formanid 
a trietylénglykol. Príklady vhodných látok tvoriacich disperzie sú Cremophor RH 40, metylcelulóza 0,01 % a HCO-40. V niektorých prípadoch testovaná látka v testovacom roztoku by nemala dosiahnu ť 
limit rozpustnosti v testovacom médiu. 
Rozpúšťadlá sa používajú na prípravu zásobných roztokov, ktoré môžu 
byť presne dávkované priamo do vody. V odporú čaných koncentrá ­
ciách rozpúš ťadiel vo finálnom testovacom médiu (napr. < 0,1 ml/l), 
rozpúšťadlá uvedené vyššie nebudú toxické a nezvyšujú rozpustnos ť 
danej látky vo vode. 
Disperzanty (látky tvoriace disperzie) napomáhajú v presnom dávko ­
vaní a pri tvorbe disperzií. V odporú čaných koncentráciách vo 
finálnom testovanom médiu (< 0,1 ml/l) látky tvoriace disperzie 
nie sú toxické a nezvyšujú rozpustnos ť danej látky vo vode.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. KONCEPCIA TESTU 
Postupy by mali by ť umiestnené v testovacích nádobách a všetky 
nasledujúce činnosti sú vykonávané náhodným spôsobom. Neúspech 
vykonaného môže by ť výsledkom odchýlky vysvet ľovanej koncen ­
tračným efektom. Najmä ak sú experimentálne jednotky zamenené 
v postupe alebo koncentra čnom rade, potom niektoré časovo 
príbuzné efekty, ako napr. únava operátora alebo iné chyby môžu vniesť zvýšenie vplyvov pri vysokých koncentráciách. Okrem toho, 
ak výsledky testu majú tendenciu by ť ovplyvnené po čiatočnými 
alebo enviromentálnymi podmienkami testu, ako napr. umiestnením v laboratóriu, potom by sa malo zváži ť pozastavenie testu.
 
1.8. POSTUP  
1.8.1.  Podmienky expozície  
1.8.1.1  Trvanie  
Test trvá 21 dní.  
1.8.1.2.  Loading  
Rodičovské živo číchy sú udržiavané individuálne, jeden na testo ­
vaciu nádobu s objemom 50 – 100 ml média v každej nádobe. 
Väčšie objemy sú niekedy potrebné na uspokojenie požiadaviek 
analytického postupu použitého na stanovenie koncentrácie testo ­
vanej látky, hoci združovanie kópii na chemickú analýzu je tiež prípustné. Ak sa použijú objemy vä čšie ako 100 ml, dávkovanie 
dané pre dafnie je potrebné zvýši ť na zabezpe čenie primeranej 
dostupnosti potravy a v súlade s kritériami validity. Na prieto čný 
test z technických prí čin môže by ť vybratá alternatívna koncepcia 
testu (napr. štyri skupiny po 10 živo číchoch vo ve ľkoobjemovom 
teste), ale všetky zmeny koncepcie testu musia by ť zaznamenané.
 
1.8.1.3.  Počet živočíchov  
Na semistatický test je najmenej 10 živo číchov držaných samostatne, 
na každú testovanú koncentráciu najmenej 10 živo číchov je držaných 
v kontrolnej sérii. 
Na prieto čné testy je 40 živo číchov rozdelených do štyroch skupín 
po 10 na každú testovanú koncentráciu (1). Môže sa používa ť aj 
menší po čet živočíchov a odporú ča sa minimálne 20 živo číchov na 
koncentráciu rozdelených do dvoch alebo viacerých skupín s rovnakým po čtom živo číchov (napr. štyri opakovania, každé 
s piatimi dafniami). Zapamätajte si, že pri testoch, pri ktorých sú 
zvieratá umiestnené v skupinách, nebude možné vyjadri ť repro­
dukčný výstup ako celkový po čet žijúcich potomkov vyprodukova ­
ných na rodi ča prežívajúceho do konca testu, ak rodi čovský živo čích 
uhynie. V tomto prípade reproduk čný výstup bude vyjadrený ako 
celkový po čet žijúcich potomkov vyprodukovaných na rodi ča 
prítomného na za čiatku testu.
 
1.8.1.4.  Kŕmenie  
Pri semistatickom teste sa k ŕmenie vykonáva denne, najmenej trikrát 
za týždeň (napr. zodpovedajúc zmenám média). Odchýlky od tohto 
musia by ť zaznamenané (napr. pri prieto čnom teste).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Počas testu sú rodi čovské živo číchy kŕmené prednostne živými 
bunkami rias jednou alebo viacerými z nasledujúcich: Chlorella 
sp., Selenastrum capricornutum (teraz Pseudokirchneriella subcapi ­
tata) (11) a Scenedesmus subspicatus. Zásobovanie potravou je zalo ­ 
žené na množstve organického uhlíka (C) poskytovaného každému 
rodičovskému živo číchovi. Výskum (12) ukázal, že pre  Daphnia 
magna  je dávka na úrovni 0,1 – 0,2 mg C/dafnia/de ň postačujúca 
na dosiahnutie požadovaného množstva mlá ďat, aby boli v súlade 
s kritériami validity testu. Prídel môže by ť počas periódy testu dodá ­
vaný buď v stálej miere, alebo ak je žiaduce, v menšej miere môže 
byť použitý na za čiatku a potom zvýšený po čas testu, aby sa bral 
ohľad na rast rodi čovského živo čícha. V tomto prípade by mal prídel 
zostať v medziach odporú čaného rozpätia 0,1 – 0,2 mg C/dafnia/de ň 
po celý čas. 
Ak budú použité náhradné merania, ako napr. po čet buniek rias 
alebo absorbcia svetla, aby sa naplnila úrove ň dávky (napr. pretože 
meranie obsahu uhlíka je časovo náro čné), každé laboratórium musí 
vytvoriť svoj vlastný nomogram, spojený s náhradným meraním 
obsahu uhlíka kultúry rias (pozri dodatok 2 – odporú čanie na: ako 
zostrojiť nomogram). Nomogram kontrolujeme najmenej raz do roka 
a častejšie, ak sa zmenili podmienky v kultúre rias. Zistilo sa, že 
svetelná absorbcia je lepšia náhrada za údaje o obsahu uhlíka ako počet buniek (13). 
Koncentrovaná suspenzia rias sa pridáva k dafniám, aby sa minima ­
lizoval objem kultúry rias prenášaný do testovacích návodov. 
Koncentrácia rias sa dosiahne odstre ďovaním, po ktorom nasleduje 
znovuprevedenie na suspenziu v destilovanej vode, v deionizovanej vode alebo médiom kultúry dafnia.
 
1.8.1.5.  Svetlo  
16 hodín svetla o intenzite nepresahujúcej 15 – 20 μE. m  -2 . s -1 
1.8.1.6.  Teplota  
Teplota testovaného média je v rozmedzí 18 – 22  o C, na žiaden test, 
ak je to možné, by sa však teplota nemala meni ť viac ako o 2  o C 
v rámci týchto limitov (napr. 18 – 20  o C, 19 – 21  o C, 20 – 22  o C). Je 
vhodné použi ť prídavnú testovaciu nádobu s cie ľom monitoringu 
teploty.  
1.8.1.7.  Vetranie  
Testovacia nádoba musí by ť vetraná po čas testu.  
1.8.2.  Testovacie koncentrácie  
Obvykle sa požíva najmenej 5 testovacích koncentrácií zaradených 
do geometrických sérií so separa čným faktorom nepresahujúcim 
hodnotu 3,2 a vhodným po čtom opakovaní na každú testovanú 
koncentráciu (pozri odsek 1.8.1.3.). Musí by ť poskytnuté potvrdenie, 
ak bolo použitých menej ako 5 koncentrácií. Látky sa netestujú 
v testovacích médiách nad hranicou rozpustnosti.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Pri stanovení koncentra čného rozsahu je treba ma ť na pamäti: 
i) ak je cie ľom získa ť LOEC/NOEC, najnižšia testovaná koncen ­
trácia musí by ť dosť nízka, takže plodnos ť pri tejto koncentrácii 
nie je zna čne nižšia ako v kontrolnej vzorke. Ak to tak nie je, 
test sa musí zopakova ť s redukovanou najnižšou koncentráciou; 
ii) ak je cie ľom získa ť LOEC/NOEC, najvyššia testovaná koncen ­
trácia musí by ť dosť vysoká, takže plodnos ť pri tejto koncen ­
trácií je zna čne nižšia ako v kontrolnej vzorke. Ak to tak nie je, 
test sa musí opakova ť, pričom sa zvýši najvyššia koncentrácia; 
iii) ak je EC  X odhadovaný ú činok na reprodukciu EC  X , je vhodné 
použiť postačujúcu koncentráciu na definovanie EC  X s vhodným 
stupňom spoľahlivosti. Ak je odhadnutý ú činok EC  50 na repro­
dukciu, je vhodné, aby najvyššia testovaná koncentrácia bola 
vyššia ako táto koncentrácia EC  50 . Inak i ke ď bude ešte 
možné odhadnú ť EC  50 , interval spo ľahlivosti na EC  50 bude 
veľmi široký a nebude možné dosta čujúco odhadnú ť primeranos ť 
vhodného modelu; 
iv) rozsah testovaných koncentrácií by nemal zah ŕňať žiadnu 
koncentráciu, ktorá má štatisticky významný efekt na prežívajú ­
cich dospelých, ke ďže toto môže zmeni ť charakter testu 
z jednoduchého reproduk čného na kombinovaný reproduk čný 
a test mortality vyžadujúci omnoho viac komplexnú štatistickú 
analýzu. 
Prvotné znalosti o toxicite testovanej látky (napr. z akútneho testu 
a/alebo zo štúdie ur čenia rozsahu) pomôžu pri výbere vhodných 
testovaných koncentrácií. 
Kde sa použije rozpúš ťadlo alebo látka, aby sa napomohlo príprave 
testovacieho roztoku (pozri odsek 14.), finálna koncentrácia v testovacej nádobe nesmie by ť väčšia ako 1ml/l a musí by ť rovnaká 
vo všetkých testovacích nádobách.
 
1.8.3.  Kontrola  
Jedna kontrolná séria testovacieho média a ak je to podstatné, tak aj 
jedna kontrolná séria obsahujúca rozpúš ťadlo a látky tvoriace disper ­
zie, sa musí analyzova ť v testovanej sérii. Ke ď sa použijú, koncen ­
trácia rozpúš ťadla a látky tvoriacej disperziu musí by ť rovnaká ako 
v nádobe obsahujúcej testovanú látku. Použije sa vhodný po čet 
opakovaní, paralelných stanovení (pozri odsek 1.8.1.3.). 
Všeobecne v dobre prebiehajúcom teste varia čný koeficient okolo 
významného po čtu žijúcich potomkov vyprodukovaných na jedného 
rodičovského živo čícha v kontrolnej vzorke je ≤ 25 % a toto je 
popísané na testovaciu koncepciu používajúcu individuálne chované 
živočíchy.  
1.8.4.  Obnova testovaného média  
Frekvencia obnovy testovacieho média závisí od stability testovacej 
látky, ale musí sa obnovi ť najmenej trikrát za týžde ň. Ak z úvodných 
testov stability (pozri odsek 14) je zrejmé, že koncentrácia testovanej látky je nestabilná (t. j. mimo rozsahu 80 – 120 % nominálu alebo poklesne pod 80 % nameranej po čiatočnej koncentrácie) cez maxi ­
málnu periódu obnovy (t. j. tri dni), mala by sa venova ť pozornos ť 
častejšej obnove média alebo používa ť priebežný prieto čný test.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Keď je médium vymie ňané v semistatickom teste, pripraví sa druhá 
séria testovacích nádob a rodi čovské živo číchy sú prenesené do nich, 
napríklad sklenenou pipetou vhodného priemeru. Objem média preneseného s dafniami musí by ť minimálny.
 
1.8.5.  Pozorovania  
Výsledky pozorovaní urobených po čas testu sa zaznamenajú do 
hárku údajov (pozri príklady v dodatkoch 3 a 4). Ak sa vyžadujú iné merania, môžu by ť požadované dodato čné pozorovania.
 
1.8.6.  Potomok  
Potomok vyprodukovaný každým rodi čovským živo číchom je radšej 
premiestnený a po číta sa denne od objavenia sa prvého potomstva, 
aby sa im zabránilo konzumova ť potravu ur čenú pre dospelých 
jedincov. Na ú čel tejto metódy je potrebné po čítať iba počet žijúcich 
potomkov, ale prítomnos ť nedozretých vají čok alebo nežijúci potom ­
kovia musia by ť zaznamenané.  
1.8.7.  Mortalita  
Mortalitu medzi rodi čovskými živo číchmi zaznamenávajte denne 
aspoň v rovnakom čase, ako je po čítané potomstvo.  
1.8.8.  Iné parametre  
Hoci táto metóda je principiálne stanovená, vytvorená na odhado ­
vanie vplyvov na reprodukciu, je možné, že iné vplyvy môžu by ť 
tiež dostato čne kvantifikované, aby umožnili štatistickú analýzu. 
Merania rastu sú vysoko žiaduce, ke ďže zadovažujú informácie 
o možných subletálnych vplyvoch, ktoré sú užito čnejšie ako meranie 
reprodukcie samotné, meranie d ĺžky rodi čovských živo číchov 
(t. j. dĺžka tela bez análnej kosti) sa odporú ča na konci testu. Iné 
parametre môžeme mera ť alebo po čítať zahŕňajúc čas prvého potom ­
stva (a nasledujúcich vrhov), po čet a veľkosť vrhov na jedného 
živočícha, počet premrhaných vrhov, prítomnos ť samčekov a efipia 
a vnútorný pomer rastu populácie.  
1.8.9.  Frekvencia analytických stanovení a meraní  
Koncentrácia kyslíka, teplota, tvrdos ť vody a pH hodnoty sa merajú 
aspoň raz za týžde ň v čerstvom a starom médiu, v kontrolnom a pri 
vyšších koncentráciách testovanej látky. 
Koncentrácia testovanej látky po čas testu je stanovená 
v pravidelných intervaloch. 
V semistatických testoch, kde je o čakávaná zostávajúca koncentrácia 
testovanej látky v rozmedzí ± 20 % z nominálu (t. j. v rozsahu 80 – 
120 %, pozri 1.4. a 1.8.4.) sa odporú ča ako minimum, najvyššia 
a najnižšia testovaná koncentrácia je analyzovaná, ke ď je čerstvo 
pripravená a v čase obnovy po čas prvého týžd ňa testu 
(t. j. analýza sa vykoná na vzorke z rovnakého roztoku – ke ď je 
čerstvo pripravený a obnovený.) Tieto stanovenia sú potom opako ­
vané aspo ň raz za týžde ň. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
V testoch, kde sa neo čakáva zostatková koncentrácia testovanej látky 
v rozmedzí ± 20 % nominálu, je potrebné analyzova ť všetky testo ­
vané koncentrácie testovanej látky, ke ď sú čerstvo pripravené a po 
obnove. Hoci na tieto testy, kde má meraná po čiatočná koncentrácia 
testovanej látky nie je v rozmedzí ± 20 % nominálu, ale kde dosta ­
točná evidencia môže preukáza ť, že počiatočná koncentrácia je 
opakovate ľná a stabilná (t. j. v rozsahu 80 – 120 % z po čiatočnej 
koncentrácie), chemické stanovenia sa zredukujú v týžd ňoch 2 a 3 na 
test najvyššej a najnižšej testovanej koncentrácie. Vo všetkých prípa ­
doch stanovenie koncentrácií testovanej látky na obnovu sa vyžaduje 
vykázať iba v jednej nádobe na každú testovanú koncentráciu. 
Ak sa použije priebežný (prieto čný test), je vhodný podobný vzor ­
kovací režim ako bol popísaný pri semistatickom teste (ale meranie „starého“ roztoku nie je v tomto prípade aplikovate ľné). Hoci môže 
byť vhodné zvýši ť počet vzorkovacích príležitostí po čas prvého 
týždňa (t. j. tri skupiny meraní), aby sa zistilo, že testované koncen ­
trácie zostávajú stabilné. V týchto typoch testov pomer prietoku riedidla a testovanej látky musí by ť kontrolovaný denne. 
Ak je evidencia koncentrácie látky, ktorá je testovaná, uspokojivo 
zachovaná v rozmedzí ± 20 % nominálnej alebo po čiatočnej koncen ­
trácie počas testu, potom výsledky môžu by ť založené na nominál ­
nych alebo po čiatočných nameraných hodnotách. Ak odchýlka od 
nominálnej alebo po čiatočnej nameranej koncentrácie je vä čšia ako 
± 20 %, výsledky budú vyjadrené v pojmoch čas – hmotnos ť (pozri 
dodatok 5).
 
2. ÚDAJE A VÝSLEDKY  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Účelom tohto testu je stanovi ť efekt testovanej látky na celkový 
počet živých potomkov vyprodukovaných jedným rodi čovským 
živočíchom prežívajúcim do konca testu. Celkový po čet potomkov 
na rodičovského živo čícha sa vypo číta na každú testovaciu nádobu 
(t. j. replikát – opakovanie). Ak v niektorom opakovaní rodi čovský 
živočích uhynie po čas testu alebo sa zmení na sam čeka, potom sa 
replikát vylú či z analýzy. Analýza sa bude následne zaklada ť na 
redukovanom po čte replikátov. 
Na odhad LOEC ako aj na NOEC na vplyvy chemikálií na reproduk čný 
výstup je potrebné vypo čítať významný reproduk čný výstup cez repli ­
káty cez každú koncentráciu a združené reziduálne štandardné odchýlky, môže sa to vykona ť za použitia analýzy rozptylu (ANOVA). Priemer na 
každú koncentráciu musí by ť potom porovnaný s priemerom kontrolnej 
vzorky za použitia vhodnej nieko ľkonásobnej porovnávacej metódy 
Dunnettov alebo Williamsov test je užito čný (14), (15), (16), (17). Je 
potrebné kontrolova ť, či ANOVA dodržiava predpoklad homogenity 
rozptylu. Odporú ča sa vykona ť test graficky skôr ako cestou testu 
formálneho významu (18); vhodná alternatíva je urobi ť Barlettov test. 
Ak sa nedodrží tento predpoklad, potom je pozornos ť zameraná na trans ­
formáciu údajov do homogeniza čného rozptylu pred použitím ANOVA 
alebo vykona ť vážený ANOVA. Ve ľkosť vplyvu detegovaná použitím 
ANOVA (t. j. najmenšia významná odchýlka) musí by ť vypočítaná 
a zaznamenaná.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Na odhad koncentrácie, ktorá môže spôsobi ť 50 % pokles 
v reproduk čnom výstupe (t. j. EC  50 ), by mala by ť vhodná krivka 
z dát, ako napr. logaritmická krivka vyhotovená za použitia štatis ­
tickej metódy, ako napr. metódy najmenších štvorcov. Krivka má mať také parametre, aby sa EC
 50 a jej štandardná odchýlka mohli 
priamo odhadnú ť. Toto ve ľmi uľahčí výpočet intervalov spo ľahli­
vosti okolo EC  50 . Pokiaľ nie sú dostato čné dôvody na uprednost ­
nenie odlišných hladín spo ľahlivosti, mali by sa uvies ť dvojstranné 
95 % intervaly hladín spo ľahlivosti. Vhodný postup bude predo ­
všetkým poskytova ť prostriedky na odhadnutie významu straty 
primeranosti. Môžeme to spravi ť graficky alebo podielom zostat ­
kovej sumy štvorcov v „strate prítomnosti“ a „ čistej chyby zložiek“ 
a vykonaním testu významnosti na stratu primeranosti. Pretože 
postupy dávajúce vysokú plodnos ť majú tendenciu viac variova ť 
v počte vyprodukovaných potomkov ako procesy vykazujúce nízku 
plodnosť, pozornos ť by sa mala upriami ť na váženie spozorovaných 
hodnôt s cie ľom zobrazenia rôzneho rozptylu v odlišných proceso ­
vých skupinách [pozri základné informácie (18)]. 
V analýze údajov z finálneho kruhového testu (2) logistická krivka 
bola prispôsobená použitím nasledujúceho modelu, hoci aj iné 
vhodné modely môžu by ť použité:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  
b 
kde: 
Y: = celkový po čet mláďat na rodi čovského živo čícha prežívajú ­
ceho do konca testu (vypo čítané na každú nádobu) 
x: = koncentrácia látky 
c: = očakávaný po čet mláďat, keď x = 0 
x 0 : = EC  50 v populácii 
b: = tangenta (nábehový parameter) 
Tento model je prijate ľný vo ve ľkom počte situácií, ale sú tu testy, 
na ktoré nie je vhodný. Je potrebné vykona ť kontrolu validity 
modelu, ako bolo odporú čané vyššie. V niektorých prípadoch 
môže byť vhodný hormesis model, ktorý pri nízkych koncentráciách 
dáva zvýšený efekt (19). 
Ostatné vplyvy koncentrácií, ako napr. EC  10 a EC  20 môžu byť tiež 
odhadnuté, hoci môže by ť výhodnejšie použi ť iné určenie parame ­
trov modelu z toho použitého na odhad EC  50 . 
2.2. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí zah ŕňať nasledujúce:  
2.2.1.  Testovaná látka:  
— fyzikálny charakter a podstatné fyzikálno-chemické vlastnosti,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— chemické identifika čné údaje vrátane čistoty.  
2.2.2.  Testované druhy:  
— klony ( či sú geneticky otypované), dodávate ľ a zdroj (ak je 
známy) a použité podmienky kultúr. Ak sú použité iné druhy 
ako Daphnia magna , musí to by ť uvedené a odôvodnené.  
2.2.3.  Podmienky testu:  
— použitý testovací postup (procedúra, metóda), (napr. semistatická, 
objem, dávkovanie v po čte dafnií na liter), 
— fotoperióda a intenzita svetla, — koncepcia testu (napr. po čet paraleliek, replík, opakovaní, po čet 
rodičov na paralelu, repliku), 
— detaily o použitom médiu kultúry, — ak bol použitý, prídavky organických látok zahr ňujúce zloženie, 
zdroj, metódu prípravy, TOC/COD zásobné roztoky, odhad výsledného TOC/COD v testovanom médiu, 
— podrobné informácie o k ŕmení zahr ňujúce množstvo v (mg 
C/Daphnia /deň) a tabuľku (napr. typ potravy, zahr ňujúc špeci ­
fický druh rias a ak je známy, tak aj rod, podmienky kultúry), 
— metódu prípravy zásobného roztoku a frekvenciu obnovy (roztok 
alebo dispergovadlo a ak boli použité, musia by ť udané ich 
koncentrácie).
 
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky nejakých predbežných štúdií stability testovacej látky, 
— nominálne testované koncentrácie a výsledky všetkých analýz na 
stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacích nádobách, 
(pozri príklad na hárky údajov – výpisy dodatok 4), ú činnosť 
pokrytia metódy a medza stanovite ľnosti musia by ť uvedené, 
— kvalita vody v rámci testovacích nádob (t. j. pH, teplota, koncen ­
trácia rozpusteného kyslíka, TOC a/alebo COD a tvrdos ť vody, 
kde je to možné) (pozri príklad na hárky údajov – dodatok 3), 
— úplný záznam žijúcich potomkov na každého rodi čovského živo ­ 
čícha (pozri príklad na karty bezpe čnostných údajov – dodatok 3), 
— počet uhynutých medzi rodi čovskými živo číchmi a dni, v ktorých 
sa vyskytli (pozri príklad na karty bezpe čnostných údajov – 
dodatok 3), 
— koeficient kontroly plodnosti (založený na celkovom po čte žijú­
cich potomkov na rodi čovského živo čícha prežívajúceho do 
konca testu), 
— graf celkového po čtu žijúceho potomstva na jedného rodi čov­
ského živo čícha (na každú repliku, paralelu), prežívajúceho do 
konca testu versus koncentrácia testovanej látky), 
— najnižšia zistená efektívna koncentrácia (LOEC) na reprodukciu 
obsahujúca popis štatisticky používaných metód a indikácia, akej veľkosti je detegovaný a nezistite ľné účinná koncentrácia 
(NOEC) na reprodukciu, ke ď je to vhodné, LOEC/NOEC na 
mortalitu rodi čovských živo číchov musí by ť tiež uvedené,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— keď je to vhodné, EC  x na reprodukciu a intervaly spo ľahlivosti, 
graf zodpovedajúceho modelu používaného na ich výpo čet, 
tangenta krivky dávkovej odozvy a j ej štandardnej chyby, 
— ostatné zistené biologické efekty alebo meranie: výpis ostatných 
biologických efektov, ktoré boli získané alebo namerané (napr. rast rodi čovských živo číchov) vrátane všetkých vhodných 
odôvodnení, 
— vysvetlenie na každú odchýlku od testovacej metódy.
 
3. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20 – 21 March 1993. 
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997. 
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, s. 257 – 265. 
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage  in Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, s. 25 – 33. 
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio. 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol, 47, s. 775 – 782. 
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P. A. 20 pp. 
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In:Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, 
H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), s. 144 – 148. 
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, s. 1 – 8. 
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol, 120(2), s. 185 – 196. 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209. 
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward 
a standard  Daphnia  juvenile production test. Environmental 
Toxicology and Chemistry, 12, s. 2053 – 2058.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the rela ­
tionship between total organic carbon with three commonly used 
parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol, 128, s. 459 – 466. 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096 – 1121. 
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, s. 482-491. 
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, s. 103 – 117. 
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, s. 510 – 531. 
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y. 
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, s. 93 – 96. 
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc.Publishers. 
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, s. 532. 
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G, McDonald L. L. and Boyce 
M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: 
Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, s. 1156 – 1166.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
DODATOK 1  
PRÍPRAVA PLNE DEFINOVANÉHO MÉDIA ELENDT M7 A M4  
Aklimatizácia do Elendt M7 a M4 média  
Niektoré laboratóriá podstúpili ťažkosti pri priamom prenose  Daphnia  do média 
M4 (1) a M7. Ur čité úspechy sa dosiahli postupnou aklimatizáciou, 
t. j. premiestnením z vlastného prostredia do 30 percentného Elendtu, potom 
do 60 percentného Elendtu a potom do 100 percentného Elendtu. Aklimatiza čné 
periódy môžu by ť dlhé až jeden mesiac.  
PRÍPRAVA  
Stopové prvky  
Separované zásobné roztoky (I) jednotlivých stopových prvkov sú najprv pripra ­
vované vo vode vhodnej čistoty, napr. deionizovaná, destilovaná alebo voda 
získaná reverznou osmózou. Z týchto rôznych zásobných roztokov (I) je pripra ­
vený druhý samostatný (jednoduchý) zásobný roztok (II), ktorý obsahuje všetky 
stopové prvky (kombinovaný roztok), t. j.:  
Zásobný roztok I 
(samostatná látka) Množstvo pridá ­
vané k vode 
(mg/l) Koncentrácia 
(vo vzťahu 
k médiu M4) Na prípravu kombinovaného zásobného 
roztoku II pridajte nasledujúce množstvo 
zásobného roztoku I do vody 
(ml/1) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 0 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Posledné dva roztoky Na  2 EDTA a FeSO  4 sa pripravujú jednotlivo, nalievajú sa spolu a hne ď sa autoklávujú: 
21 Fe-EDTA roztok 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Médiá M4 a M7  
Médiá M4 a M 7 sa pripravujú použitím zásobného roztoku II, makroživín 
a vitamínov nasledujúcim spôsobom:  
Množstvo pridá ­
vané k vode 
(mg/l) Koncentr ácia 
(vo vzťahu 
k médiu M4) Množstvo zásobného roztoku pridáva ­
ného na prípravu média 
(ml/l) 
M4 M7  
Zásobný roztok II kombinované stopové 
prvky 20 50 50 
Zasobný roztok makroživín (jedna látka) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Zásobný roztok kombinovaných vitamínov — 10 000 0,1 0,1 Zásobný roztok kombinovaných vitamínov sa pripravuje pridaním 3 vitamínov do 1 l vody, ako je uvedené nižšie: 
Tiamín hydrochlorid 750 10 000 — — 
Kyanokobalamin (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotin 7,5 10 000 — —  
Zásobný roztok kombinovaných vitamínov sa usklad ňuje zamrazený v malých alikvótnych dieloch. Vitamíny sa do média pridávajú 
krátko pred použitím.  
Poznámka 1  Aby sa zabránilo vyzrážaniu solí pri príprave kompletného média, pridáme alikvótne diely zásobného roztoku do približne 
500 – 800 ml deionizovanej vody a potom doplníme do 1 litra.  
Poznámka 2  Prvá zmienka o médiu M4 sa nachádza v publikácii od autora: Elendt, B.P. z r. 1990 s názvom Selenium deficiency in 
crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, s. 25 – 33.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
DODATOK 2  
ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKA (TOC) A TVORBA 
MONOGRAMU NA OBSAH TOC RIASOVÉHO KRMIVA  
Je známe, že obsah uhlíka v riasách nie je obvykle meraný priamo, ale pomocou 
korelácií (t. j. nomogramov), náhradných meraní ako napr. po čtu buniek rias 
alebo absorbancie svetla. 
TOC by malo by ť merané metódou vysokoteplotnej oxidácie radšej ako UV 
alebo persulfátovou metódou (pozri The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WCIV 6HB). 
Na prípravu nomogramu riasy sa separujú z rastového prostredia (média) odstre ­ 
ďovaním, po ktorom nasleduje znovu prevedenie rozpustené na suspenziu 
v destilovanej vode. Meranie náhradných parametrov a TOC koncentrácie v každej vzorke sa opakuje trikrát. Urobíme slepý pokus v destilovanej vode 
a koncentrácia TOC sa odhadne z TOC koncentrácie vzorky rias. 
Nomogram by mal by ť lineárny v celom rozsahu požadovaných koncentrácií 
uhlíka. Príklady sú uvedené nižšie. 
Poynámka: Tieto nemôžu by ť použité na konverziu, je potrebné, aby si labora ­
tóriá pripravili ich vlastné nomogramy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
DODATOK 3  
PREHĽAD ÚDAJOV ZAZNAMENÁVAJÚCICH OBNOVU MÉDIA, FYZIKÁLNYCH A CHEMICKÝCH ÚDAJOV, K ŔMENIE, REPRODUKCIU DAFNIÍ A MORTALITU 
DOSPELÝCH JEDINCOV  
Číslo pokusu: Údaje datované k: Klon: Médium: Druh potravy: Testovaná látka: Nominálna koncentrácia: 
Deň 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Obnova média 
(háčik) 
PH (  1 ) nová 
stará 
O 2 mg/l (  1 ) nová 
stará 
Teplota (  o C) (  1 ) nová 
stará 
Podané krmivo 
(háčik) 
Žiadny živý 
potomok (  2 ) Celková 
Nádoba 1 
2 3 4 5
 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Číslo pokusu: Údaje datované k: Klon: Médium: Druh potravy: Testovaná látka: Nominálna koncentrácia: 
Deň 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Celková 
Kumulovaná úmrtnos ť 
dospelých jedincov (
 3 ) 
( 1 ) Určuje, ktorá nádoba bola použitá pri pokuse. 
( 2 ) Záznam prerušených vrhov ako „AB“ v príslušnej kolónke. 
( 3 ) Záznam úmrtnosti dospelých živo číchov ozna čených ako „M“ v príslušnej kolónke.
 DODATOK 4  
PREHĽAD ÚDAJOV TÝKAJÚCICH SA ZAZNAMENÁVANIA VÝSLEDKOV CHEMICKÝCH ANALÝZ  
a) Merané koncentrácie  
Nominálna 
koncentrácia Týždeň/vzorka č. 1 Týžde ň/vzorka č. 2 Týžde ň/vzorka č. 3 
Čerstvá Stará Čerstvá Stará Čerstvá Stará  
b) Merané koncentrácie ako percento z nominálu  
Nominálna 
koncentrácia Týždeň/vzorka č. 1 Týžde ň/vzorka č. 2 Týžde ň/vzorka č. 3 
Čerstvá Stará Čerstvá Stará Cerstva Stará  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
DODATOK 5  
VÝPOČET ČASOVO-VÁŽENÉHO PRIEMERU  
Je známe, že koncentrácia testovanej látky môže poklesnú ť v perióde medzi 
obnovou (výmenou) média, preto je to potrebné bra ť do úvahy, aká koncentrácia 
sa vybrala ako reprezentatívna z rozsahu koncentrácií skúšaných rodi čovskou 
dafniou. Výber musí by ť založený tak na biologickom význame ako aj na štatis ­
tickom. Napríklad ak je reprodukcia myslená predovšetkým vrcholom odskúšanej koncentrácie, potom sa musí použi ť maximálna koncentrácia. Hoci ak je dlho ­
trvajúci alebo akumulovaný vplyv jedovatej látky považovaný za dôležitejší, 
priemerná koncentrácia je významnejšia. V tomto prípade použite ľný vhodný 
priemer je časovo vážená priemerná koncentrácia – vysvetlenie variácií (odchý ­
lok) v okamžitej koncentrácií v čase.
 
Obrázok 1:  
Príklad časovo-váženého priemeru
  
Obrázok 1 znázor ňuje príklad zjednodušeného testu trvajúceho sedem dní 
s médiom obnoveným v d ňoch 0, 2 a 4. 
Tenká cik-caková krivka predstavuje koncentráciu v akomko ľvek časovom 
bode. Predpokladá sa, že pokles koncentrácie bude sprevádza ť exponen ­
ciálny rozkladný proces. 
Šesť zobrazených bodov predstavuje zistené koncentrácie namerané na 
začiatku a konci každej periódy obnovy. 
Hrubá čiara indikuje (ur čuje) pozíciu časovo-váženého priemeru. 
Časovo-vážený priemer je vypo čítaný tak, že plocha pod časovo-váženým prie ­
merom je rovná plocha pod koncentra čnou krivkou. Na vyššie uvedený príklad je 
ilustrovaný výpo čet v tabu ľke 1. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabuľka 1 
Výpočet časovo-váženého priemeru  
Číslo výmeny Dni Koncentrácia 0 Koncentrácia 1 Ln(konc.0) Ln(konc.1) Plocha  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Celkový po čet dní: 7 Celková 
plocha 50,091 
Časovo- 
vážený 
priemer 7,156
 
Dni =  počet dní v období výmeny  
Koncentrácia 0  je nameraná koncentrácia na za čiatku každého obdobia výmeny  
Koncentrácia 1  je nameraná koncentrácia na konci každého obdobia výmeny  
Ln(konc.0) =  prirodzený logaritmus koncentrácie 0  
Ln(konc1) =  prirodzený logaritmus koncentrácie 1  
Plocha  je plocha pod exponenciálnou krivkou na každé obdobie výmeny. Vypo čítava sa 
podľa: 
plocha ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü počet dní  
Časovo-vážený priemer je  celková plocha  vydelená celkovým  počtom dní.  
Je samozrejmé, že pri reproduk čnom teste sa u dafnií rozšíri, aby pokryla 21 dní. 
Je zrejmé, že pokia ľ sa pozorovania uskuto čňujú iba na za čiatku a konci každého 
obdobia výmeny, nie je možné potvrdi ť, že rozkladný proces je skuto čne expo­
nenciálny. Rôzne výpo čty plochy sa prejavia rôznymi krivkami. Exponenciálny 
rozkladný proces je však nepravdepodobný a v prípade chýbajúcich informácií je vhodné použi ť najlepšiu krivku. 
Ak chemická analýza nenájde žiadnu látku na konci obdobia výmeny, je 
potrebné na to upozorni ť. Ak nie je možné odhadnú ť, ako rýchlo sa látka stráca 
z roztoku, je taktiež nemožné získa ť skutočnú plochu pod krivkou, a preto 
nemožno získa ť príslušný časovo-vážený priemer.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  PÔDNE MIKROORGANIZMY: TEST TRANSFORMÁCIE 
DUSÍKA  
1. METÓDA  
Táto metóda zodpovedá OECD TG 216 (2000).  
1.1. ÚVOD 
Táto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu, ur čenú na stano ­
venie dlhodobých ú činkov chemikálií po jednorazovej expozícii na 
aktivitu pôdnych mikroorganizmov transformova ť dusík. Test sa 
v podstate zakladá odporú čaniach Organizácie na ochranu rastlín 
v Európe a stredomorskej oblasti (1). Zoh ľadnili sa však aj ďalšie 
usmernenia vrátane German Biologische Bundesanstalt (2), US Envi ­
ronmental Protection Agency (3), SETAC (4) a Medzinárodnej orga ­
nizácie pre normalizáciu (5). Na OECD workshope o výbere pôd/ ­
sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, Taliansko, v roku 1995 (6) 
sa dohodlo množstvo a typy pôd používaných v tomto teste. Odpo ­
rúčania pre odoberanie, manipuláciu a skladovanie vzoriek pôdy sa 
zakladajú na Usmer ňovačom dokumente ISO (7) a odporú čaniach 
z workshopu v Belgirate. Pri posudzovaní a hodnotení toxických 
vlastností testovaných látok sa môže vyžadova ť stanovenie ú činkov 
na mikrobiálnu aktivitu pôdy, napr. ke ď sa vyžadujú údaje 
o potenciálnych ved ľajších účinkoch výrobkov na ochranu rastlín 
na pôdnu mikroflóru, alebo ke ď sa predpokladá expozícia pôdnych 
mikroorganizmov inými chemikáliami, ako sú výrobky na ochranu rastlín. Test transformácie dusíka sa vykonáva na stanovenie ú činkov 
takýchto chemikálií na pôdnu mikroflóru. Ak sa testujú agrochemi ­
kálie (napr. výrobky na ochranu rastlín, hnojivá, chemikálie použí ­
vané v lesníctve) vykonáva sa test transformácie dusíka a aj test transformácie uhlíka. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, test transformácie dusíka je posta čujúci. Ak však hodnoty EC
 50 
testu transformácie dusíka pre takéto chemikálie ležia v rozsahu 
zistenom pre komer čne dostupné inhibitory nitrifikácie (napr. nitra ­
pyrín), môže sa vykona ť test transformácie uhlíka, aby sa získali 
ďalšie informácie. 
Pôdy pozostávajú zo živých a neživých zložiek, ktoré existujú 
v komplexných a heterogénnych zmesiach. Mikroorganizmy zohrá ­
vajú významnú úlohu pri rozkladaní a transformácii organických látok v úrodných pôdach, pri čom mnohé druhy prispievajú 
k rôznym aspektom úrodnosti pôdy. Každý dlhodobý vplyv na 
tieto biochemické procesy by mohol potenciálne naruši ť obeh živín 
a toto by mohlo ovplyvni ť úrodnos ť pôdy. Transformácia uhlíka 
a dusíka sa vyskytuje vo všetkých úrodných pôdach. Aj ke ď sa 
mikrobiálne populácie, ktoré sú zodpovedné za tieto procesy, odli ­ 
šujú v prípade jednotlivých pôd, cesty transformácie sú v podstate rovnaké. 
Táto opísaná testovacia metóda je ur čená na stanovenie dlhodobých 
nepriaznivých ú činkov látky na proces transformácie dusíka 
v aeróbnych povrchových pôdach. Testovacia metóda umož ňuje aj 
stanovenie ú činkov látky na transformáciu uhlíka v pôdnej mikrof ­
lóre. Tvorba dusíka sa uskuto čňuje následne po degradácii väzieb 
medzi uhlíkom a dusíkom. Preto, ak sa rovnaké miery produkcie 
dusíka zistia v ošetrenej a kontrolnej pôde, je ve ľmi pravdepodobné, 
že hlavné cesty degradácie sú neporušené a funk čné. Substrát 
vybratý na test (prášková múka z lucerny) má vhodný pomer uhlíka a dusíka (zvy čajne medzi 12/1 a 16/1). Na základe tohto sa deficit 
uhlíka po čas testu zníži a ak sú mikrobiálne populácie poškodené 
chemikáliou, môžu sa v priebehu 100 dní zotavi ť.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Testy, z ktorých sa táto testovacia metóda vyvinula, boli prednostne 
určené pre látky, pri ktorých sa dá predpoklada ť množstvo, ktoré sa 
dostane do pôdy. Toto je prípad, napríklad výrobkov na ochranu rastlín, pri ktorých je známa aplika čná dávka v teréne. V prípade 
agrochemikálií posta čuje testovanie dvoch dávok, ktoré zodpovedajú 
predpokladanej alebo predpovedanej aplika čnej dávke. Agrochemi ­
kálie sa môžu testova ť ako aktívne zložky (a.z.) alebo ako zložené 
výrobky. Test sa však neobmedzuje na agrochemikálie. Zmenením množstva testovanej látky aplikovanej na pôdu a aj spôsobu, akým 
sa údaje vyhodnocujú, sa môže test použi ť aj na chemikálie, 
v prípade ktorých nie je známe predpokladané množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. A takto sa pre iné chemikálie ako agrochemikálie stanovia ú činky série koncentrácií na transformáciu dusíka. Údaje 
z týchto testov sa použijú na prípravu krivky reakcie na dávku 
a vypočítajú sa hodnoty EC
 x , kde x je definovaný ú činok 
v percentuálnom vyjadrení.  
1.2. DEFINÍCIE  
Transformácia dusíka:  konečná degradácia organickej látky, ktorá 
obsahuje dusík, mikroorganizmami prostredníctvom procesu amoni ­
fikácie a nitrifikácie na príslušný anorganický kone čný produkt 
nitrát.  
EC x (Efektívna koncentrácia):  je koncentrácia testovanej látky 
v pôde, ktorá spôsobí x percentnú inhibíciu transformácie dusíka 
na nitrát.  
EC 50 (Stredná efektívna koncentrácia):  je koncentrácia testovanej 
látky v pôde, ktorá spôsobí 50 percentnú (50 %) inhibíciu trans ­
formácie dusíka na nitrát.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Žiadne.  
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Preosiata pôda sa doplní s práškovou rastlinnou múkou a bu ď sa 
ošetrí testovanou látkou, alebo sa ponechá bez ošetrenia (kontrola). 
Ak sa testujú agrochemikálie, odporú čajú sa minimálne dve testo ­
vané koncentrácie a tieto koncentrácie sa vyberú vzh ľadom na 
najvyššiu koncentráciu predpokladanú v teréne. Po 0, 7, 14 d ňoch 
a 28 dňoch inkubácie sa vzorky ošetrených a kontrolných pôd extra ­
hujú vo vhodnom rozpúš ťadle a stanovia sa množstvá nitrátu 
v extraktoch. Miera tvorby nitrátu v ošetrených vzorkách sa porovná s mierou v kontrolách a vypo číta sa percentuálna odchýlka ošetrenej 
vzorky od kontroly. Všetky testy prebiehajú aspo ň 28 dní. Ak sú na 
28. deň rozdiely medzi ošetrenými a neošetrenými pôdami rovnaké 
alebo väčšie ako 25 %, merania pokra čujú do maximálne 100 dní. 
Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, testovaná látka sa pridá v sérii koncentrácií do vzoriek pôdy a zmerajú sa množstvá nitrátu, 
ktorý sa vytvorí v ošetrených a kontrolných vzorkách po 28 d ňoch 
inkubácie. Výsledky z testov s viacerými rozdielnymi koncentráciami sa analyzujú s použitím regresného modelu a vypo čítajú sa hodnoty 
EC
 X (t. j. EC  50 , EC  25 a/alebo EC  10 ). Pozri definície.  
1.5. VALIDITA TESTU 
Hodnotenia výsledkov testu s agrochemikáliami sa zakladajú na rela ­
tívne malých rozdieloch (t. j. priemerná hodnota ± 25 %) medzi koncentráciami nitrátu v kontrolných a ošetrených vzorkách pôdy, takže veľké odchýlky v kontrolách môžu vies ť k nesprávnym výsled ­
kom. Z tohto dôvodu odchýlka medzi paralelnými kontrolnými vzor ­
kami má by ť menšia ako ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Aparatúra  
Používajú sa testovacie nádoby, vyrobené z chemicky inertného 
materiálu. Mali by ma ť vhodný objem v súlade s postupom, 
použitým na inkubáciu pôd, t. j. hromadná inkubácia alebo séria 
jednotlivých vzoriek pôdy (pozri oddiel 1.7.1.2). Je potrebné venovať pozornos ť minimalizovaniu strát vody, a aj tomu, aby sa 
počas testu umožnila výmena plynov (napr. testovacie nádoby sa 
môžu zakry ť perforovanou polyetylénovou fóliou). Ke ď sa testujú 
prchavé látky, použijú sa nádoby, ktoré sa dajú utesni ť a plynotesné 
nádoby. Tieto majú ma ť takú veľkosť, aby mohli by ť asi do jednej 
štvrtiny svojho objemu vyplnené vzorkou pôdy. 
Používa sa bežné laboratórne zariadenie vrátane: 
— miešacieho zariadenia: mechanická mieša čka alebo rovnocenné 
zariadenie, 
— odstredivky (3 000 g) alebo filtra čného zariadenia 
(s beznitrátovým filtra čným papierom), 
— prístroj s vhodnou citlivos ťou reprodukovate ľnosťou na analýzu 
nitrátu.
 
1.6.2.  Výber a po čet pôd  
Použije sa jediná pôda. Odporú čané charakteristiky pôdy sú tieto: 
— obsah piesku: nie menej ako 50 % a nie viac ako 75 %, — pH: 5,5 – 7,5, — obsah organického uhlíka: 0,5 – 1,5 %, — stanoví sa mikrobiálna biomasa (8), (9) a obsah uhlíka v nej má 
byť aspoň 1 % celkového organického uhlíka v pôde. 
Vo väčšine prípadov pôda s týmito charakteristikami predstavuje 
najhorší prípad, ktorý môže nasta ť, pretože adsorpcia testovanej 
chemikálie je minimálna a jej dostupnos ť pre mikroflóru je maxi ­
málna. Následne nie sú vo všeobecnosti potrebné testy s inými pôdami. Za ur čitých okolností však, t. j. ak sa predpokladá hlavné 
použitie testovanej látky v konkrétnych pôdach, ako sú kyslé lesné 
pôdy, alebo v prípade elektrostaticky nabitých chemikálií, môže by ť 
potrebné použi ť ďalšiu pôdu.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Odber a skladovanie vzoriek pôdy  
1.6.3.1.  Odber  
Potrebné sú podrobné informácie o histórii miesta v teréne, odkia ľ sa 
testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná poloha, porast, dátumy 
ošetrení výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia organickými 
a anorganickými hnojivami, prídavky biologických materiálov alebo náhodné kontaminácie. Miesto, vybraté na odber pôdy, má byť také, aby umož ňovalo dlhodobé použitie. Stále pasienky, polia 
s ročnými plodinami (okrem kukurice) alebo husto zasiate rastliny na 
zelené hnojivo sú vhodné. Vybraté miesto na odber sa nesmie ošetrovať výrobkami na ochranu rastlín minimálne jeden rok pred 
odberom. Aspo ň šesť mesiacov sa nesmie použi ť ani žiadne orga ­
nické hnojivo. Použitie minerálneho hnojiva je prijate ľné iba 
v prípade, ak sa v súlade s požiadavkami na vzorky plodín a vzoriek pôdy neodoberú skôr ako minimálne tri mesiace po apli ­
kácii hnojiva. Je potrebné vyhnú ť sa použitiu pôdy ošetrenej hnoji ­
vami so známymi biocídnymi ú činkami (napr. kyanamid vápenatý). 
Vzorky by sa nemali odobera ť počas alebo bezprostredne po dlhých 
obdobiach (viac ako 30 dní) sucha alebo nadmernej vlahy. Vzorky ornej pôdy odoberajú z h ĺbky 0 až 20 cm. Pre vzorky pôdy z pastvín 
(lúk) alebo iných pôd, ktoré sa dlhšiu dobu neorú (aspo ň jedno 
vegetačné obdobie), môže by ť maximálna h ĺbka odberu vzoriek 
o niečo väčšia ako 20 cm (napr. 25 cm). 
Vzorky pôdy sa prepravujú v nádobách a za teplotných podmienok, 
ktoré zaru čujú, že sa pôvodné vlastnosti pôdy významne nezmenia.
 
1.6.3.2.  Uchovávanie  
Uprednost ňuje sa použitie čerstvo odobratých pôd z terénu. Ak nie je 
možné vyhnú ť sa skladovaniu v laboratóriu, pôdy sa môžu skladova ť 
v tme pri 4 ± 2  o C najviac tri mesiace. Po čas uchovávania vzoriek sa 
musia zabezpe čiť aeróbne podmienky. Ak sa pôdy odoberajú 
z oblastí, kde sú zamrznuté aspo ň tri mesiace do roka, môže sa 
uvažovať o skladovaní šes ť mesiacov pri mínus 18  o C až mínus 
22 o C. Pred každým pokusom sa stanoví mikrobiálna biomasa skla ­
dovaných pôd a uhlík v biomase by mal tvori ť aspoň 1 % 
z celkového obsahu organického uhlíka v pôde (pozri oddiel 1.6.2).  
1.6.4.  Manipulácia a príprava pôdy na test  
1.6.4.1.  Preinkubácia  
Ak sa pôda skladuje (pozri oddiel 1.6.3.2), odporú ča sa preinkubácia 
v trvaní medzi 2 a 28 d ňami. Teplota a obsah vlhkosti pôdy po čas 
preinkubácie by mali by ť rovnaké, ako sú tie, ktoré sa použijú v teste 
(pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fyzikálno-chemické charakteristiky  
Pôda sa ru čne zbaví ve ľkých predmetov (napr. kame ňov, častí rastlín 
atď.) a potom sa vlhká preoseje tak, aby sa príliš nevysušila, na 
veľkosť častíc menšiu alebo rovnajúcu sa 2 mm. Obsah vlhkosti 
vzorky pôdy sa nastaví destilovanou alebo deionizovanou vodou 
na hodnotu medzi 40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody.
 
1.6.4.3.  Obohatenie organickým substrátom  
Pôda sa obohatí vhodným organickým substrátom, napr. práškovou 
múkou z lucerny-trávy-zeleného krmiva (hlavná zložka:  Medicago 
sativa ) s pomerom C/N medzi 12/1 a 16/1. Odporú čaný pomer 
lucerna – pôda je 5 g lucerny na kilogram pôdy (suchá hmotnos ť). 
1.6.5.  Príprava testovanej látky na aplikáciu do pôdy  
Testovaná látka sa zvy čajne aplikuje s použitím nosi ča. Nosičom 
môže byť voda (pre látky rozpustné vo vode) alebo inertná tuhá 
látka ako napr. jemný kremenný piesok (ve ľkosť častíc: 0,1 – 
0,5 mm). Kvapalné nosi če, ktoré sú iné ako voda (napr. organické 
rozpúšťadlá ako acetón, chloroform), by sa nemali používa ť, lebo 
môžu poškodzova ť mikroflóru. Ak sa ako nosi č použije piesok, 
môže by ť pokrytý testovanou látkou, ktorá je rozpustená alebo 
suspendovaná vo vhodnom rozpúš ťadle. V takýchto prípadoch sa 
rozpúšťadlo pred zmiešaním s pôdou odparí. Pre optimálnu distri ­
búciu testovanej látky v pôde sa odporú ča pomer 10 g piesku na 
kilogram pôdy (suchá hmotnos ť). Kontrolné vzorky sa ošetria iba 
rovnakým množstvom vody a/alebo kremenného piesku. 
Pri testovaní prchavých chemikálií je potrebné pokia ľ možno 
zabrániť stratám po čas ošetrenia a pokúsi ť sa o zabezpe čenie homo ­
génnej distribúcie v pôde (napr. testovaná látka sa na nieko ľkých 
miestach vstrekne do pôdy).  
1.6.6.  Testované koncentrácie  
Pri testovaní agrochemikálií by sa mali použi ť aspoň dve koncen ­
trácie. Nižšia koncentrácia by mala zoh ľadňovať prinajmenšom 
očakávané maximálne množstvo, ktoré sa dostane do pôdy za 
zvyčajných okolností v praxi, pri čom vyššia koncentrácia by mala 
byť násobkom nižšej koncentrácie. Koncentrácie testovanej látky, 
pridanej do pôdy, sa vypo čítajú za predpokladu jednotného zabudo ­
vania do h ĺbky 5 cm a objemovej hmotnosti pôdy 1,5. V prípade 
agrochemikálií, ktoré sa aplikujú priamo do pôdy, alebo v prípade chemikálií, pre ktoré sa dá predpoveda ť množstvo, ktoré sa dostatne 
do pôdy, odporú čané testované koncentrácie sú maximálne pred ­
povedané environmentálne koncentrácie [Predicted Environmental 
Concentration (PEC)] a pä ťnásobok týchto koncentrácií. Látky, pri 
ktorých sa o čakáva, že sa budú aplikova ť do pôd nieko ľkokrát za 
sezónu, sa testujú s koncentráciami, ktoré sa stanovia vynásobením 
PEC maximálnym predpokladaným po čtom aplikácií. Horná testo ­
vaná koncentrácia by však nemala prekro čiť desaťnásobok maxi ­
málnej jednorazovej aplika čnej dávky. Ak sa testujú iné látky ako 
agrochemikálie, použije sa geometrický rad s aspo ň piatimi koncen ­
tráciami. Testované koncentrácie by mali by ť v rozsahu potrebnom 
na stanovenie hodnôt EC
 x . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. VYKONANIE TESTU  
1.7.1.  Podmienky expozície  
1.7.1.1.  Ošetrenie a kontrola  
Pri testovaní agrochemikálií sa pôda rozdelí do troch dávok 
s rovnakou hmotnos ťou. Dve dávky sa zmiešajú s nosi čom, ktorý 
obsahuje produkt, a ďalšia sa zmieša s nosi čom bez produktu (kon ­
trola). Odporú čajú sa minimálne tri paralelné vzorky pre ošetrené 
a aj neošetrené pôdy. Pri testovaní iných látok ako agrochemikálií 
sa pôda rozdelí do šiestich dávok s rovnakou hmotnos ťou. Päť 
vzoriek sa zmieša s nosi čom, ktorý obsahuje testovanú látku, 
a šiesta vzorka sa zmieša s nosi čom bez chemikálie. Odporú čajú 
sa tri paralelné vzorky pre ošetrené a aj kontrolné vzorky. Je 
potrebné venova ť pozornos ť zabezpe čeniu homogénnej distribúcie 
testovanej látky v ošetrených vzorkách pôdy. Po čas zmiešavania je 
potrebné zabráni ť, aby sa pôda ubila, alebo sa vytvorili hrudky.  
1.7.1.2.  Inkubácia vzoriek pôdy  
Inkubácia vzoriek pôdy sa môže vykona ť dvomi spôsobmi: ako 
hromadné vzorky každej ošetrenej a neošetrenej pôdy alebo série 
jednotlivých a rovnako ve ľkých čiastočných vzoriek každej ošetrenej 
a neošetrenej pôdy. Ak sa však testujú prchavé látky, test sa usku ­
toční len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek. Ak sa pôdy 
inkubujú hromadne, pripravujú sa ve ľké množstvá ošetrenej 
a neošetrenej pôdy a čiastočné vzorky, ktoré sa majú analyzova ť, 
sa odoberú pod ľa potreby po čas testu. Množstvo pripravené na 
začiatku pre každé ošetrenie a kontrolu závisí od ve ľkosti čiastoč­
ných vzoriek, po čtu paralelných vzoriek použitých na analýzu 
a predpokladaného maximálneho po čtu odberov vzoriek. Pôdy inku ­
bované hromadne sa dôkladne premiešajú pred odberom čiastočných 
vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú ako séria jednotlivých vzoriek pôdy, 
každá ošetrená a neošetrená hromadne inkubovaná pôda sa rozdelí 
do požadovaného po čtu čiastočných vzoriek a tieto vzorky sa 
použijú pod ľa potreby. V pokusoch, pri ktorých sa predpokladajú 
viac ako dva odbery, sa pripraví dostato čný počet čiastočných 
vzoriek, aby sa zoh ľadnili všetky paralelné vzorky a odbery. 
Aspoň tri paralelné vzorky testovanej pôdy by sa mali inkubova ť 
za aeróbnych podmienok. Po čas všetkých testov by sa mali použi ť 
vhodné nádoby s dostato čnou plynnou fázou, aby sa zabránilo vytvo ­
reniu anaeróbnych podmienok. Ak sa testujú prchavé látky, test sa 
uskutoční len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek.  
1.7.1.3.  Podmienky testu a trvanie  
Test sa uskuto čňuje v tme pri teplote miestnosti 20 ± 2  o C. Obsah 
vlhkosti vzoriek pôdy by sa mal po čas testu zachova ť medzi 40 % 
a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde (pozri 
oddiel 1.6.4.2) s rozpätím ± 5 %. Pod ľa potreby sa môže prida ť 
destilovaná, deionizovaná voda. 
Minimálne trvanie testu je 28 dní. Pri testovaní agrochemikálií sa 
porovnáva miera tvorby nitrátu v ošetrených a kontrolných vzorkách. 
Ak sa odlišujú o viac ako 25 % na 28. de ň, test pokra čuje, pokia ľ sa 
nedosiahne rozdiel rovný alebo menší ako 25 %, alebo maximálne 100 dní, pod ľa toho, čo je kratšie. V prípade iných látok ako agro ­
chemikálie sa test ukon čí po 28 d ňoch. Na 28. de ň sa množstvá 
nitrátu v ošetrených a kontrolných vzorkách pôdy stanovia 
a vypočítajú sa hodnoty EC
 x . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Odber vzoriek a analýza pôd  
1.7.2.1.  Harmonogram odberu vzoriek  
Pri testovaní agrochemikálií sa vzorky pôdy analyzujú na nitrát v dni 
0, 7, 14 a 28. Ak je potrebný pred ĺžený test, uskuto čnia sa po 28. dni 
ďalšie merania v 14-denných intervaloch. 
Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie použije sa aspo ň päť 
testovaných koncentrácií a vzorky pôdy sa analyzujú na nitrát na začiatku (deň 0) a na konci expozície (28 dní). Ak sa to pokladá 
za potrebné, môže sa prida ť napr. na siedmy de ň prechodné meranie. 
Údaje získané na 28. de ň sa použijú na stanovenie hodnoty EC
 x pre 
chemikáliu. V prípade potreby sa môžu použi ť v správe 
o počiatočnom množstve nitrátu v pôde údaje kontrolných vzoriek 
z dňa 0. 
1.7.2.2.  Analýza vzoriek pôdy  
Množstvo nitrátu, ktoré sa vytvorí v každej ošetrenej a kontrolnej 
paralelnej vzorke, sa stanoví pri každom odbere. Nitrát sa extrahuje 
z pôdy pretrepávaním vzoriek s vhodným extrak čným činidlom, 
napr. 0,1 M roztokom chloridu draselného. Odporú ča sa pomer 
5 ml KCl na gram suchého hmotnostného ekvivalentu pôdy. Na 
optimalizáciu extrakcie by mali by ť nádoby, v ktorých sa nachádza 
pôda a extrak čné činidlo, naplnené najviac do polovice. Zmesi sa 
pretrepávajú 60 minút pri 150 otá čkach za minútu (rpm). Zmesi sa 
odstreďujú alebo prefiltrujú a kvapalné fázy sa analyzujú na nitrát. 
Kvapalné extrakty, ktoré neobsahujú častice, sa môžu skladova ť pred 
analýzou pri mínus 20 ± 5  o C do šiestich mesiacov.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Ak sa test uskuto čňuje s agrochemikáliami, množstvo nitrátu, ktoré 
sa vytvorí v každej paralelnej vzorke pôdy, sa zaznamená 
a priemerné hodnoty všetkých paralelných vzoriek sa uvedú 
v podobe tabuliek. Miera transformácie dusíka sa vyhodnotí vhod ­
nými a všeobecne uznávanými štatistickými metódami (napr. F-test, 5 % úrove ň významnosti). Množstvá vytvoreného nitrátu v mg 
nitrátu/kg suchej hmotnosti pôdy/de ň. Miera tvorby nitrátu 
v každej ošetrenej vzorke sa porovná s kontrolnou vzorkou a vypočíta sa percentuálna odchýlka od kontrolnej vzorky. 
Ak sa test uskuto čňuje s inými látkami ako agrochemikáliami, 
stanoví sa množstvo vytvoreného nitrátu v každej paralelnej vzorke 
a krivka reakcie na dávku na stanovenie hodnôt EC
 x . Množstvá 
nitrátu (t. j. mg nitrátu/kg suchej hmotnosti pôdy) zistené v ošetrených vzorkách po 28 d ňoch sa porovná s množstvami ziste ­
nými v kontrole. Z týchto údajov sa vypo čítajú hodnoty inhibície 
v percentuálnom vyjadrení pre každú testovanú koncentráciu. Tieto 
percentuálne hodnoty sa vynesú proti koncentrácii a potom sa použijú štatistické postupy na výpo čet hodnôt ECX. Hranice spo ľa­
hlivosti (p = 0,95) pre vypo čítané EC
 x sa tiež stanovia s použitím 
štandardných postupov (10), (11), (12). 
Testované látky, ktoré obsahujú ve ľké množstvá dusíka, môžu prispie ť 
k množstvám nitrátu vytvoreného po čas testu. Ak sa tieto látky testujú 
pri vysokej koncentrácii (napr. chemikálie, pri ktorých sa predpokladá opakované používanie), musia sa zahrnú ť do testu príslušné kontroly 
(t. j. pôda plus testovaná látka, ale bez rastlinnej múky). Údaje z týchto 
kontrol sa musia zoh ľadniť vo výpočtoch EC
 x . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Ak je pri hodnotení výsledkov z testov s agrochemikáliami rozdiel 
v miere tvorby nitrátu medzi nižším ošetrením (t. j. maximálna očakávaná koncentrácia) a kontrolou rovný alebo menší ako 25 % 
pri každom odbere vzoriek po dni 28, môže sa vyhodnoti ť, že 
produkt nemá dlhodobý vplyv na transformáciu dusíka v pôdach. Pri hodnotení výsledkov testov s inými chemikáliami ako agroche ­
mikáliami sa používajú hodnoty EC
 50 , EC  25 a/alebo EC  10 . 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Úplnú identifikáciu použitej pôdy, vrátane: — geografických údajov o mieste (zemepisná šírka, d ĺžka), 
— informácie o histórii miesta (t. j. rastlinný porast, ošetrenia 
s výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia s hnojivami, náhodná 
kontaminácia at ď.), 
— štruktúra využitia (napr. po ľnohospodárska pôda, les at ď.), 
— hĺbka odberu vzoriek (cm), 
— obsah piesku/bahna/ílu ( % suchej hmotnosti), — pH (vo vode), — obsah organického uhlíka ( % suchej hmotnosti), 
— obsah dusíka ( % suchej hmotnosti), 
— počiatočná koncentrácia nitrátu (mg nitrátu/kg suchej hmotnosti), 
— kapacita výmeny katiónov (mmol/kg), 
— mikrobiálna biomasa v percentách celkového organického uhlíka, 
— údaje o metódach použitých na stanovenie každého parametra, — všetky informácie týkajúce sa odberu a skladovania vzoriek 
pôdy, 
— údaje o prípadnej preinkubácii pôdy. Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlast ­
nosti, 
— chemické identifika čné údaje, v prípade potreby vrátane štruktúr ­
neho vzorca, čistoty (t. j. v prípade výrobkov na ochranu rastlín 
percento ú činnej látky), obsah dusíka. 
Substrát: 
— zdroj substrátu, 
— zloženie (t. j. múka z lucerny, múka z lucerny – trávy – zeleného 
krmiva), 
— obsah uhlíka, dusíka ( % suchej hmotnosti), — veľkosť otvorov sita (mm).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Testovacie podmienky: 
— údaje o obohatení pôdy organickým substrátom, 
— počet použitých koncentrácií testovanej chemikálie a v prípade 
potreby zdôvodnenie vybratých koncentrácií, 
— údaje o aplikácii testovanej látky do pôdy, — inkuba čná teplota, 
— obsah vlhkosti v pôde na za čiatku a po čas testu, 
— použitá metóda inkubácie pôdy (t. j. hromadná alebo ako séria 
jednotlivých čiastkových vzoriek), 
— počet paralelných vzoriek, 
— počet odberov, 
— metóda použitá na extrakciu nitrátu z pôdy. Výsledky: — analytický postup a zariadenie použité na analýzu nitrátu, 
— údaje vo forme tabuliek, vrátane jednotlivých a priemerných 
hodnôt pri stanovení nitrátu, 
— odchýlka medzi paralelnými a kontrolnými vzorkami, — vysvetlenie prípadných korekcií pri výpo čtoch, 
— percentuálna odchýlka v mierach tvorby nitrátu pri každom 
odbere alebo v prípade potreby hodnota EC
 50 s 95 % hranicou 
spoľahlivosti, iné EC  x (t. j. EC  25 alebo EC  10 ) s intervalmi spo ľa­
hlivosti a graf krivky reakcie na dávku, 
— štatistické spracovanie výsledkov, 
— všetky informácie a pozorovania umož ňujúce interpretáciu 
výsledkov.  
4. ODKAZY  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987. 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Bruxelles. 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18 – 20 janvier 1995. 
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99 – 113. 
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  PÔDNE MIKROORGANIZMY: TRANSFORMA ČNÝ TEST 
UHLÍKA  
1. METÓDA  
Táto metóda zodpovedá OECD TG 217 (2000).  
1.1. ÚVOD 
Táto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu, ur čenú na 
skúmanie dlhodobých potenciálnych ú činkov chemikálií jednora ­
zovej expozície výrobkami na ochranu rastlín, a prípadne iných chemikálií, na aktivitu pôdnych mikroorganizmov transformova ť 
uhlík. Test sa v podstate zakladá odporú čaniach Organizácie na 
ochranu rastlín v Európe a stredomorskej oblasti (1). Zoh ľadnili sa 
aj ďalšie usmernenia ako German Biologische Bundesanstalt (2), US 
Environmental Protection Agency (3) a SETAC (4). OECD 
workshop o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, 
Taliansko, v roku 1995 (5) sa dohodol na množstve a type pôd používaných v tomto teste. Odporú čania pre odoberanie, manipuláciu 
a skladovanie vzoriek pôdy sa zakladajú na Usmer ňovacom doku ­
mente ISO (6) a odporú čaniach z workshopu v Belgirate. 
Pri posudzovaní a hodnotení toxických vlastností testovaných látok 
sa môže vyžadova ť stanovenie ú činkov na mikrobiálnu aktivitu 
pôdy, napr. ke ď sa vyžadujú údaje o potenciálnych ved ľajších účin­
koch výrobkov na ochranu rastlín na pôdnu mikroflóru, alebo ak sa 
predpokladá expozícia pôdnych mikroorganizmov iným chemiká ­
liám, ako sú výrobky na ochranu rastlín. Test transformácie uhlíka sa vykonáva na stanovenie ú činkov takýchto chemikálií na pôdnu 
mikroflóru. Ak sa testujú agrochemikálie (napr. výrobky na ochranu 
rastlín, hnojivá, chemikálie používané v lesnom hospodárstve) vyko ­
náva sa test transformácie uhlíka a aj test transformácie dusíka. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, test transformácie dusíka je 
postačujúci. Ak však hodnoty EC
 50 testu transformácie dusíka pre 
takéto chemikálie sú v rozsahu zistenom pre komer čne dostupné 
inhibitory nitrifikácie (napr. nitrapyrín), na získanie ďalších infor ­
mácií sa môže vykona ť test transformácie uhlíka. 
Pôdy pozostávajú zo živých a neživých zložiek, ktoré existujú 
v komplexných a heterogénnych zmesiach. Mikroorganizmy zohrá ­
vajú významnú úlohu pri rozkladaní a transformácii organických látok v úrodných pôdach, pri čom mnohé druhy prispievajú 
k rôznym aspektom úrodnosti pôdy. Každý dlhodobý vplyv na 
tieto biochemické procesy by mohol potenciálne naruši ť obeh živín 
a to by mohlo ovplyvni ť úrodnos ť pôdy. Transformácia uhlíka 
a dusíka sa vyskytuje vo všetkých úrodných pôdach. Aj ke ď sa 
mikrobiálne populácie, zodpovedné za tieto procesy, odlišujú 
v prípade jednotlivých pôd, cesty transformácie sú v podstate 
rovnaké.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Táto testovacia metóda je ur čená na stanovenie dlhodobých nepriazni ­
vých účinkov látky na proces transformácie uhlíka v aeróbnych 
povrchových pôdach. Tento test je citlivý na zmeny ve ľkosti 
a aktivity mikrobiálnych populácií, zodpovedných za transformáciu uhlíka, ke ďže vystavuje tieto populácie pôsobeniu chemikálií 
a nedostatku uhlíka. Používa sa piesková pôda, chudobná na organické 
látky. Táto pôda sa ošetrí testovanou látkou a inkubuje za podmienok, ktoré umož ňujú rýchly mikrobiálny metabolizmus. Za týchto 
podmienok sa zdroje ľahko dostupného uhlíka v pôde rýchlo spotre ­
bujú. Toto spôsobí nedostatok uhlíka, ktoré zabíja mikrobiálne bunky 
a vyvoláva latentný stav a/alebo sporuláciu. Ak test prebieha viac ako 28 dní, súhrn týchto reakcií sa môže stanovi ť v kontrolách (neošetrenej 
pôdy) ako progresívna strata metabolicky aktívnej biomasy (7). Ak na 
biomasu v pôde vystavenú nedostatku uhlíka, v podmienkach testu 
pôsobí prítomnos ť chemikálie, nemusí sa vráti ť na rovnakú úrove ň 
ako kontrola. A preto narušenie spôsobené testovanou látkou kedy ­
koľvek počas testu bude často pretrváva ť do konca testu. 
Testy, z ktorých sa táto testovacia metóda vyvinula, boli prednostne 
určené pre látky, pri ktorých sa dá predpoklada ť množstvo, ktoré sa 
dostane do pôdy. Napríklad v prípade výrobkov na ochranu rastlín, pri ktorých je známa aplika čná dávka v teréne. V prípade agroche ­
mikálií je testovanie dvoch dávok, ktoré zodpovedajú predpokladanej 
alebo predpovedanej aplika čnej dávke, dosta čujúce. Agrochemikálie 
sa môžu testova ť ako aktívne zložky (a.z.) ako zložené výrobky. Test 
však sa však obmedzuje na chemikálie s predvídate ľnými environ ­
mentálnymi koncentráciami. Zmenením množstva testovanej látky 
aplikovanej na pôdu a spôsobu, akým sa údaje vyhodnocujú, sa 
test môže použi ť aj na chemikálie, v prípade ktorých nie je známe 
predpokladané množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. A tým sa pri iných chemikáliách ako agrochemikálie stanovia ú činky série 
koncentrácií na transformáciu uhlíka. Údaje z týchto testov sa 
použijú na prípravu krivky vz ťahu medzi dávkou a reakciou 
a vypočítajú sa hodnoty EC
 x , kde x je definované ako ú činok 
v percentuálnom vyjadrení.  
1.2. DEFINÍCIE  
Transformácia uhlíka:  je degradácia organickej látky mikroorganiz ­
mami na anorganický kone čný produkt oxid uhli čitý. 
EC x (Efektívna koncentrácia):  je koncentrácia testovanej látky 
v pôde, ktorá spôsobí x percentnú inhibíciu transformácie uhlíka 
na oxid uhli čitý. 
EC 50 (Stredná efektívna koncentrácia):  je koncentrácia testovanej 
látky v pôde, ktorá spôsobí 50 percentnú inhibíciu transformácie uhlíka na oxid uhli čitý.
 
1.3. REFEREN ČNÉ LATKY 
Žiadne.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Preosiata pôda sa ošetrí testovanou látkou, alebo sa ponechá bez 
ošetrenia (kontrola). Ak sa testujú agrochemikálie, odporú čajú sa 
minimálne dve testované koncentrácie a tieto koncentrácie sa vyberú 
vo vzťahu k najvyššej koncentrácii predpokladanej v teréne. Po 0., 
7., 14. a 28. dni inkubácie sa vzorky ošetrených a kontrolných pôd zmiešajú s glukózou a merajú sa glukózou indukované rýchlosti respirácie po sebe nasledujúcich 12 hodín. Rýchlosti respirácie sa 
vyjadrujú ako uvo ľnený oxid uhli čitý (mg oxidu uhli čitého/kg suchej 
pôdy/h) alebo spotrebovaný kyslík (mg kyslíka/kg pôdy/h). Prie ­
merná rýchlos ť respirácie vo vzorkách s ošetrenou pôdou sa porovná 
s pôdou v kontrole a vypo číta sa percentuálna odchýlka ošetrenej 
pôdy od kontroly. Všetky testy prebiehajú aspo ň 28 dní. Ak na 28. 
deň sa rozdiely medzi ošetrenými a neošetrenými pôdami rovnajú 
alebo sú vä čšie ako 25 %, merania pokra čujú v 14 d ňových inter ­
valoch do maximálne 100 dní. Ak sa testujú iné chemikálie ako 
agrochemikálie, pridáva sa séria koncentrácií testovanej látky ku vzorkám pôdy a glukózou indukované rýchlosti respirácie (t. j. priemer množstiev vzniknutého oxidu uhli čitého alebo spotre ­
bovaného kyslíka) sa stanovia po 28 hodinách. Výsledky z testov zo 
série koncentrácií sa analyzujú s použitím regresného modelu a vypočítajú sa hodnoty EC
 x (t. j. EC  50 , EC  25 a/alebo EC  10 ). Pozri 
definície.  
1.5. VALIDITA TESTU 
Hodnotenia výsledkov testu s agrochemikáliami sa zakladajú na rela ­
tívne malých rozdieloch (t. j. priemerná hodnota ± 25 %) medzi 
uvoľneným oxidom uhli čitým alebo spotrebovaným kyslíkom 
v (alebo prostredníctvom) kontrolných a ošetrených vzorkách pôdy, takže veľké odchýlky v kontrolách môžu vies ť k nesprávnym výsled ­
kom. Z tohto dôvodu odchýlka medzi paralelnými kontrolnými vzor ­
kami má by ť menšia ako ± 15 %.
 
1.6. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.6.1.  Aparatúra  
Použijú sa testovacie nádoby, vyrobené z chemicky inertného mate ­
riálu. Mali by ma ť vhodný objem v súlade s postupom použitým na 
inkubáciu pôd, t. j. hromadná inkubácia alebo séria jednotlivých 
vzoriek pôdy (pozri oddiel 1.7.1.2). Je potrebné venova ť pozornos ť 
tomu, aby sa minimalizovali straty vody, a aj tomu, aby sa po čas 
testu umožnila výmena plynov (napr. testovacie nádoby sa môžu zakryť perforovanou polyetylénovou fóliou). Ke ď sa testujú prchavé 
látky, použijú sa nádoby, ktoré je možné utesni ť a plynotesné 
nádoby. Tieto nádoby by mali ma ť takú veľkosť, aby mohli by ť 
asi do jednej štvrtiny svojho objemu vyplnené vzorkou pôdy. 
Na stanovenie glukózou indukovanej respirácie sa vyžadujú inku ­
bačné systémy a prístroje na meranie tvorby oxidu uhli čitého alebo 
spotreby kyslíka. Príklady takýchto systémov a nástrojov sa nachá ­
dzajú v literatúre (8), (9), (10), (11).
 
1.6.2.  Výber a po čet pôd  
Použije sa jediná pôda. Odporú čané charakteristiky pôdy sú tieto: 
— obsah piesku: nie menej ako 50 % a nie viac ako 75 %;  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5 – 7,5; 
— obsah organického uhlíka: 0,5 – 1,5 %; 
— mikrobiálna biomasa sa zmeria (12), (13) a jej obsah uhlíka by 
mal byť aspoň 1 % celkového organického uhlíka v pôde. 
Vo väčšine prípadov pôda s týmito charakteristikami predstavuje 
najhorší prípad, ktorý môže nasta ť, pretože adsorpcia testovanej 
chemikálie je minimálna a jej dostupnos ť pre mikroflóru je maxi ­
málna. Následne nie sú vo všeobecnosti potrebné testy s inými pôdami. Za ur čitých okolností však, t. j. ak sa predpokladá hlavné 
použitie testovanej látky v konkrétnych pôdach, ako sú kyslé lesné 
pôdy, alebo v prípade elektrostaticky nabitých chemikálií, sa môže 
vyžadova ť použitie ďalšej pôdy.
 
1.6.3.  Odber a skladovanie vzoriek pôdy  
1.6.3.1.  Odber  
K dispozícii by mali by ť podrobné informácie o histórii miesta 
v teréne, odkia ľ sa testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná 
poloha, porast, dátumy ošetrení výrobkami na ochranu rastlín, ošet ­
renia organickými a anorganickými hnojivami, prídavky biologic ­
kých materiálov alebo náhodné kontaminácie. Miesto, vybraté na 
odber pôdy, má by ť také, aby umož ňovalo dlhodobé použitie. 
Vhodné sú stále pasienky, polia s ro čnými plodinami (okrem kuku ­
rice) alebo husto zasiate rastliny na zelené hnojivo. Vybraté miesto na odber sa nesmie ošetrova ť výrobkami na ochranu rastlín mini ­
málne jeden rok pred odberom. Aspo ň šesť mesiacov sa nesmie 
použiť ani žiadne organické hnojivo. Použitie minerálneho hnojiva 
je prijateľné iba v prípade, ak je potrebné pre plodiny a vzorky pôdy 
sa neodoberú skôr ako aspo ň tri mesiace po aplikácii hnojiva. Je 
potrebné vyhnú ť sa použitiu pôdy ošetrenej hnojivami so známymi 
biocídnymi ú činkami (napr. kyanamid vápenatý). 
Vzorky sa neodoberajú po čas dlhých období (viac ako 30 dní) sucha 
alebo nadmernej vlahy alebo bezprostredne po nich. Vzorky ornej 
pôdy odoberajú z h ĺbky 0 až 20 cm. Pre vzorky pôdy z pastvín (lúk) 
alebo iných pôd, ktoré sa dlhšiu dobu neorú (aspo ň jedno vegeta čné 
obdobie), môže by ť maximálna h ĺbka odberu vzoriek o nie čo väčšia 
ako 20 cm (napr. 25 cm). Vzorky pôdy sa prepravujú v nádobách 
a za teplotných podmienok, ktoré zaru čujú, že sa pôvodné vlastnosti 
pôdy významne nezmenia.
 
1.6.3.2.  Uchovávanie  
Uprednost ňuje sa použitie čerstvo odobratých pôd z terénu. Ak sa 
nedá zabráni ť skladovaniu v laboratóriu, pôdy sa môžu skladova ť 
v tme pri 4 ± 2  o C najviac tri mesiace. Po čas uchovávania vzoriek sa 
musia zabezpe čiť aeróbne podmienky. Ak sa pôdy odoberajú 
z oblastí, kde sú zamrznuté aspo ň tri mesiace do roka, môže sa 
uvažovať o skladovaní šes ť mesiacov pri mínus 18  o C. Pred každým 
pokusom sa stanoví mikrobiálna biomasa skladovaných pôd a uhlík 
v biomase má tvori ť aspoň 1 % celkového obsahu organického 
uhlíka v pôde (pozri oddiel 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Manipulácia a príprava pôdy na test  
1.6.4.1.  Preinkubácia  
Ak sa pôda skladuje (pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3), odporú ča sa 
preinkubácia v trvaní medzi 2 a 28 d ňami. Teplota a obsah vlhkosti 
pôdy počas preinkubácie by mali by ť rovnaké, ako sa použije v teste 
(pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Fyzikálno-chemické charakteristiky  
Pôda sa ru čne zbaví ve ľkých predmetov (napr. kame ňov, častí rastlín 
atď.) a potom sa vlhká preoseje tak, aby sa príliš vysušila, na ve ľkosť 
častíc menšiu alebo rovnajúcu sa 2 mm. Obsah vlhkosti vzorky pôdy sa 
nastaví destilovanou alebo deionizovanou vodou na hodnotu medzi 
40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody.  
1.6.5.  Príprava testovanej látky na aplikáciu do pôdy  
Testovaná látka sa zvy čajne aplikuje s použitím nosi ča. Nosičom 
môže byť voda (pre látky rozpustné vo vode) alebo inertná tuhá 
látka ako napr. jemný kremenný piesok (ve ľkosť častíc: 0,1 – 
0,5 mm). Kvapalné nosi če, ktoré sú iné ako voda (napr. organické 
rozpúšťadlá ako acetón, chloroform), by sa nemali používa ť, lebo 
môžu poškodzova ť mikroflóru. Ak sa použije piesok ako nosi č, 
môže byť pokrytý testovanou látkou rozpustenou alebo suspendo ­
vanou vo vhodnom rozpúš ťadle. V takýchto prípadoch sa rozpúš ť­
adlo pred zmiešaním s pôdou odparí. Pre optimálnu distribúciu testo ­
vanej látky v pôde sa odporú ča pomer 10 g piesku na kilogram pôdy 
(suchá hmotnos ť). Kontrolné vzorky sa ošetria iba rovnakým množ ­
stvom vody a/alebo kremenného piesku. 
Pri testovaní prchavých chemikálií je potrebné zabráni ť stratám po čas 
ošetrenia a pokúsi ť sa o zabezpe čenie homogénnej distribúcie v pôde 
(napr. testovaná látka sa na nieko ľkých miestach vstriekne do pôdy).  
1.6.6.  Testované koncentrácie  
Ak sa testujú výrobky na ochranu rastlín alebo iné chemikálie 
s predvídate ľnými environmentálnymi koncentráciami, použijú sa 
aspoň dve koncentrácie. Nižšia koncentrácia by mala zoh ľadňovať 
prinajmenšom o čakávané maximálne množstvo, ktoré sa dostane do 
pôdy za zvy čajných okolností v praxi, pri čom vyššia koncentrácia by 
mala byť násobkom nižšej koncentrácie. Koncentrácie testovanej 
látky pridanej do pôdy sa vypo čítajú za predpokladu jednotného 
zabudovania do h ĺbky 5 cm a objemovej hmotnosti pôdy 1,5. 
V prípade agrochemikálií, ktoré sa aplikujú priamo do pôdy, alebo v prípade chemikálií, pre ktoré sa dá predpoveda ť množstvo, ktoré sa 
dostane do pôdy, odporú čané testovacie koncentrácie sú maximálne 
predvídate ľné environmentálne koncentrácie [Predictable Environ ­
mental Concentration (PEC)] a pä ťnásobok týchto koncentrácií. 
Látky, pri ktorých sa o čakáva, že sa budú aplikova ť do pôd nieko ľ­
kokrát za sezónu, sa testujú s koncentráciami, ktoré sa stanovia 
vynásobením PEC maximálnym predpokladaným po čtom aplikácií. 
Horná testovaná koncentrácia by však nemala prekro čiť desaťná­
sobok maximálnej jednorazovej aplika čnej dávky. 
Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, použije sa geometrický 
rad s aspo ň piatimi koncentráciami. Odporú ča sa, aby testované 
koncentrácie boli v rozsahu potrebnom na stanovenie hodnôt EC
 x . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. VYKONANIE TESTU  
1.7.1.  Podmienky expozície  
1.7.1.1.  Ošetrenie a kontrola  
Pri testovaní agrochemikálií, sa pôda rozdelí do troch dávok 
s rovnakou hmotnos ťou. Dve dávky sa zmiešajú s nosi čom, ktorý 
obsahuje produkt a ďalšia sa zmieša s nosi čom bez produktu (kon ­
trola). Odporú čajú sa minimálne tri paralelné vzorky pre ošetrené 
a aj neošetrené pôdy. Pri testovaní iných látok ako agrochemikálií 
sa pôda rozdelí do šiestich dávok s rovnakou hmotnos ťou. Päť 
vzoriek sa zmieša s nosi čom obsahujúcim testovanú látku a šiesta 
vzorka sa zmieša s nosi čom bez chemikálie. Odporú čajú sa tri para ­
lelné vzorky pre ošetrené a aj kontrolné vzorky. Je potrebné venova ť 
pozornosť zabezpe čeniu homogénnej distribúcie testovanej látky 
v ošetrených vzorkách pôdy. Po čas miešania je potrebné zabráni ť, 
aby sa pôda ubila, alebo sa vytvorili hrudky.  
1.7.1.2.  Inkubácia vzoriek pôdy  
Inkubácia vzoriek pôdy sa môže vykona ť dvomi spôsobmi: ako 
hromadné vzorky každej ošetrenej a neošetrenej pôdy alebo série 
jednotlivých a rovnako ve ľkých čiastočných vzoriek každej ošetrenej 
a neošetrenej pôdy. Ak sa však testujú prchavé látky, test by sa mal uskutočniť len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek. Ak sa 
pôdy inkubujú hromadne, pripravujú sa ve ľké množstvá ošetrenej 
a neošetrenej pôdy a čiastočné vzorky, ktoré sa majú analyzova ť, 
sa odoberú pod ľa potreby po čas testu. Množstvo pripravené na 
začiatku pre každé ošetrenie a kontrolu závisí od ve ľkosti čiastoč­
ných vzoriek, po čtu paralelných vzoriek použitých na analýzu 
a predpokladaného maximálneho po čtu odberov vzoriek. Pôdy, inku ­
bované hromadne, sa dôkladne premiešajú pred odberom čiastočných 
vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú ako séria jednotlivých vzoriek pôdy, každá ošetrená a neošetrená hromadne inkubovaná pôda sa rozdelí 
do požadovaného po čtu čiastočných vzoriek a tieto vzorky sa 
použijú pod ľa potreby. V experimentoch, pri ktorých sa predpokladá 
viac ako dva odbery, sa pripraví dostato čný počet čiastočných 
vzoriek, aby sa zoh ľadnili všetky paralelné vzorky a odbery. Odpo ­
rúča sa, aby sa aspo ň tri paralelné vzorky testovanej pôdy inkubovali 
za aeróbnych podmienok (pozri oddiel 1.7.1.1). Po čas všetkých 
testov sa by sa mali použi ť vhodné nádoby s dostato čnou plynnou 
fázou, aby sa zabránilo vytvoreniu anaeróbnych podmienok. Ak sa 
testujú prchavé látky, test sa by sa mal vykona ť len so sériou jedno ­
tlivých čiastočných vzoriek.  
1.7.1.3.  Podmienky testu a trvanie  
Test sa uskuto čňuje v tme pri teplote miestnosti 20 ± 2  o C. Obsah 
vlhkosti vzoriek pôdy sa po čas testu zachová medzi 40 % a 60 % 
maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde (pozri oddiel 1.6.4.2) 
s rozpätím ± 5 %. Pod ľa potreby sa môže prida ť destilovaná, deio ­
nizovaná voda. 
Minimálne trvanie testu je 28 dní. Pri testovaní agrochemikálií sa 
porovnajú množstvá uvo ľneného oxidu uhli čitého alebo spotrebova ­
ného kyslíka v ošetrených a kontrolných vzorkách. Ak sa odlišujú o viac ako 25 % na 28. de ň, test pokra čuje, pokia ľ sa nedosiahne 
rozdiel, ktorý sa rovná alebo je menší ako 25 %, alebo maximálne 
100 dní, pod ľa toho, čo je kratšie. Pri testovaní iných látok ako 
agrochemikálie sa test ukon čí po 28 d ňoch. Na 28. de ň sa množstvá 
uvoľneného oxidu uhli čitého alebo spotrebovaného kyslíka 
v ošetrených a kontrolných vzorkách pôdy stanovia a vypo čítajú sa 
hodnoty EC
 x . ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Odber vzoriek a analýza pôd  
1.7.2.1.  Harmonogram odberu vzoriek  
Pri testovaní agrochemikálií sa vzorky pôdy analyzujú na glukózou 
indukované rýchlosti respirácie v dni 0, 7, 14 a 28. Ak je potrebný 
predĺžený test, uskuto čnia sa po 28. dni ďalšie merania v 14-denných 
intervaloch. 
Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, použije sa aspo ň päť 
testovaných koncentrácií a vzorky pôdy sa analyzujú na glukózou 
indukovanú respiráciu na za čiatku (deň 0) a na konci vymedzeného 
času expozície (28 dní). Ak sa to pokladá za potrebné, môže sa 
pridať napr. na 7. de ň prechodné meranie. Údaje, získané na 28. 
deň, sa použijú na stanovenie hodnoty EC  x pre chemikáliu. Pod ľa 
potreby sa môžu použi ť údaje kontrolných vzoriek z d ňa 0 na odhad 
počiatočných množstiev metabolicky aktívnej biomasy v pôde (12).  
1.7.2.2.  Meranie glukózou indukovaných rýchlostí respirácie  
Rýchlosť respirácie, indukovaná glukózou v každej ošetrenej 
a kontrolnej paralelnej vzorke, sa stanoví pri každom odbere. Vzorky pôdy sa zmiešajú s dostato čným množstvom glukózy, aby sa zistila 
okamžitá maximálna respira čná reakcia. Množstvo glukózy, 
potrebnej na zistenie maximálnej respira čnej reakcie z danej pôdy, 
sa môže stanovi ť v predbežnom teste s použitím série koncentrácií 
glukózy (14). Pre pieskové pôdy s 0,5 – 1,5 % organického uhlíka, 
2 000 mg až 4 000 mg glukózy na kg suchej hmotnosti pôdy je 
zvyčajne dosta čujúce. Glukóza sa môže pomlie ť na prášok 
s čistým kremenným pieskom (10 g piesku/kg suchej hmotnosti 
pôdy) a homogénne sa zmieša s pôdou. 
Vzorky s pridanou glukózou sa inkubujú vo vhodnej aparatúre na 
stanovenie rýchlosti respirácie bu ď kontinuálne, každú hodinu, alebo 
každé dve hodiny (pozri oddiel 1.6.1) pri 20 ± 2
 o C. Uvoľnený oxid 
uhličitý alebo spotrebovaný kyslík sa stanoví 12 po sebe nasledujú ­
cich 12 hodín a merania sa za čnú čo najskôr, t. j. do 1 až 2 hodín po 
pridaní glukózy. Celkové množstvá uvo ľneného oxidu uhli čitého 
alebo spotrebovaného kyslíka po čas 12 hodín sa zmerajú 
a stanovia sa priemerné rýchlosti respirácie.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Ak sa testujú agrochemikálie, množstvo uvo ľneného oxidu uhli čitého 
alebo spotrebovaného kyslíka v každej paralelnej vzorke pôdy sa 
zaznamená a priemerné hodnoty všetkých paralelných vzoriek sa uvedú v podobe tabuliek. Výsledky sa vyhodnotia vhodnými a všeobecne uznávanými štatistickými metódami (napr. F-test, 5 % 
úroveň významnosti). Rýchlosti respirácie indukovanej glukózou sa 
vyjadrujú v mg oxidu uhli čitého/kg suchej hmotnosti pôdy/h alebo 
mg kyslíka/suchú hmotnos ť pôdy/h. Priemerná hodnota miery tvorby 
oxidu uhli čitého alebo priemerná hodnota miery spotrebovaného 
kyslíka sa porovná s hodnotami v kontrole a vypo číta sa percentu ­
álna odchýlka od kontroly.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Ak sa test uskuto čňuje s inými látkami ako agrochemikáliami, 
stanovia sa množstvá uvo ľneného oxidu uhli čitého 
a spotrebovaného kyslíka v každej paralelnej vzorke a vyhotoví sa krivka reakcie na dávku na stanovenie hodnôt EC
 x . Rýchlosti respi ­
rácie indukovanej glukózou (t. j. mg oxidu uhli čitého/kg suchej 
hmotnosti pôdy/h alebo mg kyslíka/suchú hmotnos ť pôdy/h) zistené 
v ošetrených vzorkách po 28 d ňoch sa porovnajú s hodnotami ziste ­
nými v kontrole. Z týchto údajov sa vypo čítajú hodnoty inhibície 
v percentuálnom vyjadrení pre každú testovanú koncentráciu. Tieto 
percentuálne hodnoty sa vynesú proti koncentrácii a použijú sa štatis ­
tické postupy na výpo čet hodnôt EC  x . Hranice spo ľahlivosti (p = 
0,95) pre vypo čítané EC  x sa stanovia tiež s použitím štandardných 
postupov (15) (16) (17).  
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Ak sa pri hodnotení výsledkov z testov s agrochemikáliami rozdiel 
v rýchlostiach respirácie medzi ošetrením s nižšími dávkami (t. j. maximálna o čakávaná koncentrácia) a kontrolou rovná alebo 
je menší ako 25 % pri každom odbere vzoriek po dni 28, môže sa 
vyhodnoti ť, že produkt nemá dlhodobý vplyv na transformáciu 
uhlíka v pôde. Pri hodnotení výsledkov testov s chemikáliami inými ako agrochemikáliami sa používajú hodnoty EC
 50 , EC  25 
a/alebo EC  10 . 
3. PODÁVANIE SPRAV  
SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie: 
Úplnú identifikáciu použitej pôdy vrátane: 
— geografických údajov o mieste (zemepisná šírka, zemepisná d ĺžka), 
— informácie o histórii miesta (t. j. rastlinný porast, ošetrenia 
s výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia s hnojivami, náhodná 
kontaminácia at ď.), 
— štruktúra využitia (napr. po ľnohospodárska pôda, les at ď.), 
— hĺbka odberu vzoriek (cm), 
— obsah piesku/bahna/ílu (% suchej hmotnosti), 
— pH (vo vode), 
— obsah organického uhlíka ( % suchej hmotnosti), 
— obsah dusíka ( % suchej hmotnosti), 
— kapacita výmeny katiónov (mmol/kg), 
— počiatočná mikrobiálna biomasa v percentách celkového organic ­
kého uhlíka, 
— údaje o metódach použitých na stanovenie každého parametra, 
— všetky informácie týkajúce sa odberu a skladovania vzoriek 
pôdy, 
— údaje o prípadnej preinkubácii pôdy.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlast ­
nosti, 
— chemické identifika čné údaje, v prípade potreby vrátane štruktúr ­
neho vzorca, čistoty (t. j. v prípade výrobkov na ochranu rastlín 
percento ú činnej látky), obsahu dusíka. 
Testovacie podmienky: — údaje o obohatení pôdy organickým substrátom, 
— počet použitých koncentrácií testovanej chemikálie a v prípade 
potreby zdôvodnenie vybratých koncentrácií, 
— údaje o aplikácii testovanej látky do pôdy, — inkuba čná teplota, 
— obsah vlhkosti pôdy na za čiatku a po čas testu, 
— použitá metóda inkubácie pôdy (t. j. hromadná alebo ako séria 
jednotlivých čiastkových vzoriek), 
— počet paralelných vzoriek, 
— časy odberov. 
Výsledky: — metóda a zariadenie použité na meranie rýchlostí respirácie, 
— údaje v podobe tabuliek, vrátane jednotlivých a priemerných 
hodnôt množstiev oxidu uhli čitého alebo kyslíka, 
— odchýlka medzi paralelnými a kontrolnými vzorkami, 
— vysvetlenie prípadných korekcií pri výpo čtoch, 
— percentuálna odchýlka v glukózou indukovaných rýchlostiach 
respirácie pri každom odbere alebo v prípade potreby hodnota 
EC
 50 s 95 % hranicou spo ľahlivosti, iné EC  x (t. j. EC  25 alebo 
EC 10 ) s intervalmi spo ľahlivosti a graf krivky reakcií na dávku, 
— štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby, 
— všetky informácie a pozorovania umož ňujúce interpretáciu 
výsledkov.  
4. ODKAZY  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18 – 20 January 1995. 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory. 
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils 
for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 
45 – 60. 
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831 – 871. 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, 
G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measure ­
ments; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77 – 81. 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate induced respiration 
method. 
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenuber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influ ­
ence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as 
an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Brauns ­
chweig, 38: 113 – 120. 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99 – 113. 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York. 
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA V PÔDE  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda zodpovedá OECD TG 307 (2002).  
1.1. ÚVOD 
Táto testovacia metóda je založená na existujúcich usmerneniach (1) 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Metóda opísaná v tejto testovacej 
metóde je navrhnutá na hodnotenie aeróbnej a anaeróbnej transfor ­
mácie chemikálií v pôde. Experimenty sa vykonávajú na stanovenie i) miery transformácie testovanej látky a ii) charakteru a miery 
tvorby a rozkladu produktov transformácie, ktorým rastliny 
a pôdne organizmy môžu by ť vystavené. Takéto štúdie sa vyžadujú 
pre chemikálie, ktoré sa priamo aplikujú to pôdy alebo ktoré sa môžu dosta ť do pôdneho prostredia. Výsledky takýchto laboratór ­
nych štúdií sa môžu použi ť aj na vypracovanie protokolov pre 
odbery a analýzy pre príslušné štúdie v teréne. 
Aeróbne a anaeróbne štúdie s jedným typom pôdy sú zvy čajne 
dostačujúce na hodnotenie ciest transformácie (8) (10) (11). Miery 
transformácie sa stanovia aspo ň v troch ďalších pôdach (8) (10). 
Na workshope OECD o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal 
v talianskom Belgirate v roku 1995 (10), sa dohodlo konkrétne množstvo a typ pôd používaných v tomto teste. Typy testovaných pôd by mali by ť reprezentatívne pre environmentálne podmienky 
v mieste, kde dôjde k použitiu chemikálie alebo uvo ľneniu. 
Napríklad chemikálie, ktoré sa môžu uvo ľniť v subtropickom až 
tropickom podnebí, sa testujú s ferrasolmi alebo nitosolmi (FAO systém). Workshop vydal tiež odporú čania, založené na pokynoch 
ISO (15), týkajúce sa odberu, manipulácie a skladovania vzoriek 
pôdy. Používanie ryžových pôd sa v tejto metóde tiež posudzuje.
 
1.2. DEFINÍCIE  
Testovaná látka:  každá látka, či ide o východiskovú zlú čeninu alebo 
príslušné produkty transformácie.  
Produkty transformácie:  všetky látky, ktoré vzniknú z biotických 
alebo abiotických transforma čných reakcií testovanej látky, vrátane 
CO 2 a produktov, ktoré sú vo viazaných rezíduách.  
Viazané rezíduá: „Viazané rezíduá“ sú zlú čeniny v pôde, rastlinách 
alebo zvieratách, ktoré pretrvávajú po extrakcii v matrici vo forme 
východiskovej zlú čeniny alebo jej metabolitu(-ov)/produktov trans ­
formácie. Extrak čné metódy nemusia podstatne meni ť samotné 
zlúčeniny alebo štruktúru matrice. Charakter väzby sa čiastočne dá 
objasniť extrakčnými metódami, ktorými sa mení matrica, 
a zložitými analytickými technikami. Doposia ľ sa týmto spôsobom 
identifikovali napríklad kovalentné iónové a sorp čné väzby, ako aj 
zadržiavanie. Vo všeobecnosti vznik viazaných rezíduí významne znižuje biologickú prístupnos ť a dostupnos ť (12) [upravené 
z IUPAC 1984 (13)].  
Aeróbna transformácia:  reakcie, ktoré sa vyskytujú v prítomnosti 
molekulárneho kyslíka (14).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaeróbna transformácia:  reakcie, ktoré sa vyskytujú 
v neprítomnosti molekulárneho kyslíka (14).  
Pôda:  je zmes minerálnych a organických chemických zložiek, 
pričom organické chemické zložky obsahujú zlú čeniny s vysokým 
obsahom uhlíka a dusíka a s vysokými molekulovými hmotnos ťami 
a s malými (prevažne mikro-) organizmami. Pôda sa môže spraco ­
vávať v dvoch stavoch: 
a) nenarušená, ako sa vytvorila v priebehu času, v charakteristických 
vrstvách s rozli čnými typmi pôdy; 
b) narušená, ako sa zvy čajne nachádza v po ľnohospodársky využí ­
vaných oblastiach alebo ako sa vyskytuje pri odbere vzoriek kopaním a použije v tejto testovacej metóde (14).  
Mineralizácia:  je úplná degradácia organickej zlú čeniny na CO
 2 
a H  2 O v aeróbnych podmienkach a na CH  4 , CO  2 
a H  2 O v anaeróbnych podmienkach. V súvislosti s touto testovacou 
metódou, ak sa používa zlú čenina ozna čená 14 C, mineralizácia 
znamená rozsiahlu degradáciu, po čas ktorej sa ozna čený atóm uhlíka 
oxiduje za uvo ľnenia príslušného množstva  14 CO 2 (14).  
Polčas: t 0,5 je čas, za ktorý sa transformuje 50 % testovanej látky, ak 
sa transformácia dá opísa ť kinetikou prvého rádu; je nezávislý od 
koncentrácie.  
DT 50 (Doba odbúrania 50) : je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 50 %; odlišuje sa od pol času t  0,5 , ak transfor ­
mácia nepostupuje pod ľa kinetiky prvého rádu.  
DT 75 (Doba odbúrania 75) : je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 75 %.  
DT 90 (Doba odbúrania 90) : je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 90 %.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky sa použijú na charakterizáciu a/alebo identifikáciu 
produktov transformácie spektroskopickými a chromatografickými 
metódami.  
1.4. POUŽITE ĽNOSŤ TESTU 
Metóda je použite ľná na všetky chemické látky (neozna čené alebo 
rádioaktívne ozna čené), pre ktoré je k dispozícii analytická metóda 
s dostato čnou presnos ťou a citlivos ťou. Je použite ľná na mierne 
prchavé, neprchavé, vo vode rozpustné alebo vo vode nerozpustné zlúčeniny. Test sa nepoužíva na chemikálie, ktoré sú ve ľmi prchavé 
z pôdy (napr. fumiganty, organické rozpúš ťadlá), a teda sa pri expe ­
rimentálnych podmienkach testu nemôžu uchova ť v pôde.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Na meranie miery transformácie sa môže použi ť neoznačená alebo 
označená testovaná látka. Ozna čený materiál sa vyžaduje pri 
skúmaní ciest transformácie a pri stanovení hmotnostnej bilancie. 
Odporúča sa ozna čenie pomocou  14 C, ale môže použi ť aj označenie 
inými izotopmi, ako napr.  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Značka sa umiestni 
pokiaľ možno v najstabilnejšej(-ích) časti(-iach) molekuly (  1 ). Čistota 
testovanej látky by mala by ť aspoň 95 %. 
Pred uskuto čnením testu aeróbnej a anaeróbnej transformácie v pôde 
sú potrebné tieto informácie o testovanej látke: 
a) rozpustnos ť vo vode (metóda A.6); 
b) rozpustnos ť v organických rozpúš ťadlách; 
c) tlak pár (metóda A.4) a Henryho konštanta; d) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda (metóda A.8); 
e) chemická stabilita v tme (hydrolýza) (metóda C.7); f) pK
 a , ak molekula podlieha protonácii alebo deprotonácii [usmer ­
nenie OECD 112] (16). 
Ďalšie užito čné informácie môžu zahrnova ť údaje o toxicite testo ­
vanej látky pre pôdne mikroorganizmy [testovacie metódy C.21 a C.22] (16). 
Je potrebné ma ť k dispozícii analytické metódy (vrátane extrak čných 
a purifika čných metód) na kvantifikáciu a identifikáciu testovanej 
látky a jej produktov transformácie.
 
1.6. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Vzorky pôdy sa ošetria testovanou látkou a inkubujú v tme 
v bankách biometrického typu alebo v prietokových systémoch za 
kontrolovaných laboratórnych podmienok (pri konštantnej teplote a vlhkosti pôdy). Po príslušných časových intervaloch sa vzorky 
pôdy extrahujú a analyzujú na východziu látku a na produkty trans ­
formácie. Prchavé produkty sa tiež zhromaždia na analýzu s použitím 
príslušných absorp čných zariadení. S použitím materiálu ozna čeného
 
14 C sa môžu mera ť rôzne miery mineralizácie testovanej látky zachy ­
tením uvo ľneného  14 CO 2 a môže sa stanovi ť hmotnostná bilancia, 
vrátane tvorby viazaných rezíduí v pôde.  
1.7. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.7.1.  Regenerácia  
Extrakcia a analýza minimálne dvoch paralelných vzoriek pôdy 
ihneď po pridaní testovanej látky poskytne prvý dôkaz reprodukova ­
teľnosti analytickej metódy a rovnomerného rozdelenia testovanej 
látky pri aplikácii. Regenerácie v neskorších štádiách experimentov 
sú dané príslušnými hmotnostnými bilanciami. Regenerácie by mali 
byť v rozsahu od 90 % do 110 % pre ozna čené chemikálie (8) a od 
70 % do 110 % pre neozna čené chemikálie (3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Napríklad, ak testovaná látka obsahuje jeden kruh, ozna čenie tohto kruhu je potrebné; ak 
testovaná látka obsahuje dva alebo viac kruhov, môžu by ť potrebné samostatné štúdie na 
hodnotenie osudu každého ozna čeného kruhu a na získanie príslušných informácií 
o tvorbe produktov transformácie.
 1.7.2.  Reprodukovate ľnosť a citlivos ť analytickej metódy  
Reprodukovate ľnosť analytickej metódy (okrem ú činnosti extrakcie 
v počiatočnom štádiu) na kvantifikovanie testovanej látky 
a produktov transformácie sa môže overi ť paralelnou analýzou 
rovnakého extraktu pôdy inkubovaného dostato čne dlho, aby vznikli 
produkty transformácie. 
Detekčný limit (LOD) analytickej metódy pre testovanú látku a pre 
produkty transformácie má by ť aspoň 0,01 mg/kg pôdy (ako testo ­
vaná látka) alebo 1 % aplikovanej dávky, pod ľa toho ktorá hodnota 
je nižšia. Je potrebné stanovi ť aj kvantifika čný limit (LOQ).  
1.7.3.  Presnos ť údajov o transformácii  
Regresná analýza koncentrácií testovanej látky v závislosti od času 
poskytuje príslušné informácie o spo ľahlivosti transforma čnej krivky 
a umožňuje výpočet hraníc spo ľahlivosti pre pol časy (v prípade kine ­
tiky pseudo prvého rádu) alebo hodnôt DT  50 a v prípade potreby 
DT 75 a DT  90 . 
1.8. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.8.1.  Prístroje a chemické reagencie  
Inkubačné systémy pozostávajú zo statických uzatvorených systémov 
alebo vhodných prietokových systémov (7) (17). Príklady vhodného prietokového prístroja na inkubáciu pôdy biometrického typu sú 
znázornené na obrázkoch 1 a 2. Obidva typy inkuba čných systémov 
majú výhody a obmedzenia (7) (17). 
Sú potrebné štandardné laboratórne prístroje, a osobitne tieto: — analytické prístroje, ako napr. GLC-, HPLC-, TLC-zariadenie, 
vrátane vhodných detek čných systémov na analýzu rádioaktívne 
označených alebo neozna čených látok alebo inverzná izotopová 
zrieďovacia metóda, 
— identifika čné prístroje (napr. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR at ď.), 
— kvapalný scintila čný počítač, 
— oxidačné činidlo na spa ľovanie rádioaktívneho materiálu, 
— odstredivka, 
— extrak čný prístroj (napríklad centrifuga čné kyvety na extrakciu za 
studena a Soxhletov extraktor na kontinuálnu refluxnú extrakciu), 
— prístroje na zvýšenie koncentrácie roztokov a extraktov (napr. 
rotačná odparka); 
— vodný kúpe ľ, 
— mechanická mieša čka (napr. stroj na miesenie, rota čný mixér).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Použité chemické reagencie zahrnujú napríklad: 
— NaOH, analytická kvalita, 2 mol/dm  3 alebo iná vhodná zásada 
(napr. KOH, etanolamín), 
— H  2 SO 4 , analytická kvalita, 0,05 mol/dm  3 , 
— etylénglykol, analytická kvalita, 
— tuhé absorp čné materiály, napr. nátronové vápno a polyuretánové 
zátky, 
— organické rozpúš ťadlá, analytická kvalita, napr. acetón, metanol at ď., 
— scintila čná kvapalina.  
1.8.2.  Aplikácia testovanej látky  
Aby sa testovaná mohla prida ť do pôdy a distribuova ť v nej, môže 
sa rozpusti ť vo vode (deionizovanej alebo destilovanej) alebo 
v prípade potreby v minimálnych množstvách acetónu alebo iných 
organických rozpúš ťadlách (6), v ktorých je testovaná látka dosta ­
točne rozpustná a stabilná. Množstvo zvoleného rozpúš ťadla by 
nemalo ma ť významný vplyv na mikrobiálnu aktivitu pôdy (pozri 
oddiely 1.5 a 1.9.2 – 1.9.3). Je potrebné zabráni ť, aby sa používali 
rozpúšťadlá inhibujúce mikrobiálnu aktivitu, ako je chloroform, 
dichlórmetán a iné halogenované rozpúš ťadlá. 
Testovaná látka sa môže tiež prida ť ako tuhá látka, napr. zmiešaná 
v kremennom piesku (6) alebo v malých čiastočných vzorkách pôdy, 
ktoré sa vysušia na vzduchu a sterilizujú. Ak sa testovaná látka pridá 
s použitím rozpúš ťadla, rozpúš ťadlo by sa malo odpari ť predtým, 
ako sa čiastočná vzorka s pridanou látkou pridá k pôvodnej neste ­
rilnej vzorke pôdy. 
V prípade bežných chemikálií, ktoré sa dostávajú do pôdy najmä 
prostredníctvom splaškového kalu/aplikácie v po ľnohospodárstve, 
sa testovaná látka najskôr pridá do kalu, ktoré sa potom aplikuje 
do vzorky pôdy. (pozri oddiely 1.9.2 a 1.9.3) 
Použitie zložených produktov sa zvy čajne neodporú ča. Použitie 
zloženého materiálu však môže by ť vhodnou alternatívou, napríklad 
v prípade ťažko rozpustných testovaných látok.  
1.8.3.  Pôdy  
1.8.3.1.  Výber pôdy  
Na stanovenie transforma čnej cesty sa môže použi ť reprezentatívna 
pôda; pieso čnatá hlina alebo prachovitá (bahenná) hlina, alebo 
hlina alebo hlinitý piesok [pod ľa FAO a USDA klasifikácie (18)] 
s pH 5,5 – 8,0, s obsahom organického uhlíka 0,5 % – 2,5 % 
a mikrobiálnou biomasou s obsahom aspo ň 1 % celkového organic ­
kého uhlíka (10). 
Pre štúdie miery transformácie sa použijú aspo ň tri ďalšie pôdy 
predstavujúce rozsah relevantných pôd. Pôdy sa odlišujú v obsahu 
organického uhlíka, pH, obsahu ílu a mikrobiálnej biomasy (10).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Všetky pôdy by mali by ť charakterizované aspo ň týmito vlastno ­
sťami textúry ( % piesok, % bahno, % íl) [klasifikácia pod ľa FAO 
a USDA (18)], pH, katiónová výmenná kapacita, organický uhlík, objemová hmotnos ť, charakteristika retencie vody (
 1 ) a mikrobiálna 
biomasa (iba pre aeróbne štúdie). Ďalšie informácie o vlastnostiach 
pôdy môžu by ť užitočné pri interpretácii výsledkov. Na stanovenie 
charakteristík pôdy sa môžu použi ť odporúčané metódy v odkazoch 
(19) (20) (21) (22) (23). Mikrobiálna biomasa sa stanoví s použitím metódy substrátom indukovanej respirácie (SIR) (25) (26) alebo 
alternatívnymi metódami (20).
 
1.8.3.2.  Odber, manipulácia a skladovanie pôd  
Potrebné sú podrobné informácie o histórii miesta v teréne, odkia ľ sa 
testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná poloha, porast, ošetrenia chemikáliami, ošetrenia organickými a anorganickými hnojivami, prídavky biologických materiálov alebo iné kontaminácie. Na štúdie 
transformácie sa nepoužijú pôdy, ktoré boli ošetrené testovanou 
látkou alebo jej štrukturálnymi analógmi v priebehu ostatných štyroch rokov (10) (15). 
Pôda má by ť čerstvo odobratá z terénu (z horizontu A alebo vrchnej 
20 cm vrstvy) s obsahom vody v pôde, ktorý umožní preosiatie. 
V prípade iných pôd ako ryžové polia sa vzorky neodoberajú 
počas alebo bezprostredne po dlhých obdobiach (> 30 dní) sucha, 
mrazu alebo záplav (14). Vzorky sa dopravia tak, aby sa minimali ­
zovali zmeny v obsahu vody v pôde a uchovávajú sa v tme za čo 
najväčšieho prístupu vzduchu. Na tento ú čel zvyčajne posta čí voľne 
zaviazané polyetylénové vrecúško. 
Pôda by sa mala spracova ť čo najskôr po odbere vzoriek. Porast, 
väčšie kusy pôdnych živo číchov a kamene sa odstránia pred 
preosiatím cez 2 mm sito, ktorým sa odstránia malé kamienky, živo ­ 
číchy a zvyšky rastlín. Je potrebné zabráni ť nadmernému vysušeniu 
a rozdrveniu pôdy pred preosiatím (15). 
Ak je ťažké odobera ť vzorky v zime v teréne (zamrznutá pôda alebo 
pokrytá vrstvami snehu), môže sa odobra ť zo šarže pôdy, uchovávanej 
v skleníku pod porastom (napr. tráva alebo zmes trávy a ďateliny). 
V každom prípade sa uprednost ňujú štúdie s čerstvo odobratou 
pôdou z terénu, ale ak sa odobratá a spracovaná pôda musela skladova ť 
pred začiatkom štúdie, musia sa dodrža ť vhodné skladovacie 
podmienky a iba na obmedzený čas (4
 o C ± 2  o C maximálne tri mesia ­
ce), aby sa zachovala mikrobiálna aktivita (  2 ). Podrobné pokyny na 
odber, manipuláciu a skladovanie pôd, ktoré sa použijú na biotrans ­
formačné pokusy sa nachádzajú v odkazoch (8) (10) (15) (26) (27).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Charakteristiku retencie vody v pôde je možné mera ť ako kapacitu po ľa, ako kapacitu 
zadržiavania vody alebo ako sací tlak vody (pF). Na vysvetlenie pozri dodatok 1. 
V správe z testu je potrebné uvies ť, či charakteristiky retencie vody a objemová hmot ­
nosť pôd boli stanovené v nenarušených vzorkách z terénu alebo narušených (spracova ­
ných) vzorkách. 
( 2 ) Z výsledkov posledného výskumu vyplýva, že vzorky z miernych oblastí sa tiež môžu 
skladovať pri – 20  o C viac ako tri mesiace (28) (29) bez významných strát mikrobiálnej 
aktivity.
 Predtým, ako sa spracovaná pôda použije v tomto teste, mala by sa 
podrobiť preinkubácii na umožnenie klí čenia a odstránenia semien 
a na opätovné nastolenie rovnováhy mikrobiálneho metabolizmu po následnej zmene podmienok odberu alebo skladovania na podmienky inkubácie. Vo všeobecnosti je vhodná doba preinkubácie medzi 2 
a 28 dňami za teplotných podmienok a vlhkosti približujúcej sa 
skutočnému testu (15). Čas skladovania a preinkubácie spolu nesmie 
trvať dlhšie ako tri mesiace.
 
1.9. VYKONANIE TESTU  
1.9.1.  Testovacie podmienky  
1.9.1.1.  Teplota pri teste  
Počas celého obdobia testovania by sa pôdy mali inkubova ť v tme 
pri konštantnej teplote, predstavujúcej klimatické podmienky, kde sa 
vyskytne použitie alebo uvo ľnenie. Pre všetky testované látky, ktoré 
sa môžu dosta ť do pôdy v miernom podnebí, sa odporú ča teplota 
20 o C ± 2  o C. Teplota by sa mala sledova ť. 
V prípade chemikálií, aplikovaných alebo uvo ľnených v chladnejšom 
podnebí (napr. v severných krajinách po čas obdobia jesene/zimy), sa 
inkubujú ďalšie vzorky pôdy, ale pri nižšej teplote (napr. 10  o C ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Obsah vlhkosti  
V prípade testov transformácie v aeróbnych podmienkach sa obsah 
pôdnej vlhkosti (  1 ) nastaví a zachová na pF medzi 2,0 a 2,5 (3). 
Obsah pôdnej vlhkosti sa vyjadruje ako hmotnos ť vody na hmotnos ť 
suchej pôdy a pravidelne sa kontroluje (napr. v 2-týžd ňových inter ­
valoch) vážením v inkuba čných bankách a straty vody sa doplnia 
pridaním vody (pokia ľ možno sterilnej filtrovanej vody z vodovodu). 
Je potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby sa predchádzalo 
a minimalizovali straty testovanej látky a/alebo produktov transfor ­
mácie vyparovaním a/alebo fotodegradáciou (ak sa vyskytuje) po čas 
pridávania vlhkosti. 
Pri testoch transformácie v anaeróbnych podmienkach 
a podmienkach ryžových polí sa pôda saturuje zaplavením.  
1.9.1.3.  Aeróbne inkuba čné podmienky  
V prietokových systémoch sa aeróbne podmienky zabezpe čujú 
nekontinuálnym premývaním alebo kontinuálnou ventiláciou zvlhčeným vzduchom. V bankách biometrického typu sa vzduch 
zabezpečuje difúziou.
 
1.9.1.4.  Sterilné aeróbne podmienky  
Aby sa získali informácie o dôležitosti abiotickej transformácie testo ­
vanej látky vzorky, vzorky pôdy sa môžu sterilizova ť [steriliza čné 
metódy pozri v odkazoch (16) a (29)], ošetri ť sterilnou testovanou 
látkou (napr. pridaním roztoku cez sterilný filter) a prevzdušni ť 
zvlhčeným sterilným vzduchom, ako je uvedené v oddiele 1.9.1.3. 
V prípade ryžových pôd sa pôda a voda sterilizujú a inkubácia sa 
uskutoční, ako je uvedené v oddiele 1.9.1.6.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Pôda nemá by ť ani príliš mokrá, ani príliš suchá, aby sa zachovalo primerané prevzduš ­
nenie a výživa pôdnej mikroflóry. Odporú čané vlhkosti pôdy pre optimálny mikrobiálny 
rast sú v rozsahu 40 % – 60 % kapacity zadržiavania vody (WHC) a od 0,1 bar – 0,33 
bar (6). Posledný uvedený rozsah zodpovedá rozsahu pF 2,0 – 2,5. Typické obsahy 
vlhkostí rôznych typov pôdy sú uvedené v dodatku 2.
 1.9.1.5.  Anaeróbne inkuba čné podmienky  
Na zistenie a zachovanie anaeróbnych podmienok sa pôda, ošetrená 
testovanou látkou a inkubovaná za aeróbnych podmienok 30 dní alebo jeden pol čas, alebo DT
 50 (podľa toho, ktoré je kratšie), 
potom zaleje vodou (1 cm – 3 cm vrstva vody) a do inkuba čného 
systému sa vženie inertný plyn (napr. dusík alebo argón) (  1 ). Testo­
vací systém musí umož ňovať merania, ako napr. pH, koncentrácia 
kyslíka a redox potenciál, a zapojenie zariadenia na zachytávanie 
prchavých produktov. Systém biomerického typu musí by ť uzatvo­
rený, aby nevnikol vzduch difúziou.  
1.9.1.6.  Inkuba čné podmienky ryžových polí  
Na štúdiu transformácie v ryžových pôdach sa pôda zaplaví 1 cm – 
5 cm vrstvou vody a testovaná látka sa aplikuje do vodnej fázy (9). Odporúča sa hĺbka pôdy aspo ň 5 cm. Systém sa prevzduš ňuje vzdu­
chom ako za aeróbnych podmienok. Sleduje sa a zaznamená pH, 
koncentrácia kyslíka a redox potenciál vodnej vrstvy. Pred za čatím 
tranforma čných štúdií je potrebná doba preinkubácie aspo ň dva 
týždne (pozri oddiel 1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Trvanie testu  
Štúdie miery a cesty by nemali by ť zvyčajne dlhšie ako 120 dní (  2 ) 
[(3) (6) (8)], pretože potom sa dá o čakávať pokles pôdnej mikro ­
biálnej aktivity s časom v neprirodzenom laboratórnom systéme 
izolovanom od prírodných revitaliza čných procesov. Ak je potrebné 
charakterizova ť rozklad testovanej látky a tvorbu a rozklad hlavných 
produktov transformácie, štúdie môžu pokra čovať dlhšie obdobia 
(napr. 6 alebo 12 mesiacov) (8). Dlhšie inkuba čné doby sa 
zdôvodnia v správach z testov a doložia sa k nim údaje z meraní biomasy po čas týchto dôb a na ich konci.
 
1.9.2.  Vykonanie testu  
Približne 50 g až 200 g pôdy (vz ťahuje sa na suchú hmotnos ť) 
sa umiestni do každej inkuba čnej banky (pozri obrázky 1 a 2 
v dodatku 3) a pôda sa ošetrí testovanou látkou pod ľa jednej z metód 
uvedených v oddiele 1.8.2. Ak sa na aplikáciu testovanej látky použí ­
vajú organické rozpúš ťadlá, odstránia sa z pôdy odparením. Potom sa 
pôda dôkladne premieša ty činkou a/alebo pretrepaním banky. Ak sa 
štúdia uskuto čňuje v podmienkach ryžových polí, po aplikácii testo ­
vanej látky sa pôda a voda dôkladne premiešajú. Malé alikvótne časti 
(napr. 1 g) ošetrených pôd sa analyzujú na testovanú látku, aby sa overilo rovnomerné rozdelenie. Alternatívna metóda je uvedená ďalej.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aeróbne podmienky prevládajú v povrchových pôdach a dokonca v podpovrchových 
pôdach, ako je uvedené vo výskumnom projekte, ktorý sponzoruje EÚ [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal 
variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. 
Aspects Pesticides Microbiol., 270 – 277, 17 – 21. August 1992, Sigtuna, Sweden]. 
Anaeróbne podmienky sa môžu vyskytnú ť iba príležitostne po čas zaplavenia pôd po 
dlhotrvajúcich daž ďoch alebo v podmienkach ryžových polí na poliach s ryžou. 
(
 2 ) Aeróbne štúdie by sa mohli ukon čiť pred uplynutím 120 dní za predpokladu, že sa 
zreteľne dosiahne kone čná cesta transformácie a kone čná mineralizácia v tom čase. 
Ukončenie testu je možné po 120 d ňoch, alebo ke ď sa aspoň 90 % testovanej látky 
transformuje, ale iba ak sa vytvorí aspo ň 5 % CO  2 .
 Miera ošetrenia by mala zodpoveda ť najvyššej aplika čnej dávke 
výrobku na ochranu rastlín, odporú čanej v návode na použite, 
a rovnomernému zabudovaniu v zodpovedajúcej h ĺbke v teréne 
[napr. vrchná 10 cm vrstva (  1 ) pôdy]. Napríklad pre chemikálie, 
ktoré sa aplikujú na listy alebo na pôdu bez zabudovania, zodpove ­
dajúca hĺbka pre výpo čet, koľko chemikálie sa má prida ť do každej 
banky, je 2,5 cm. Pre chemikálie, ktoré sa zabudujú do pôdy, je zodpovedajúca h ĺbka presne uvedená v návode na použitie. Pre 
bežné chemikálie by sa aplika čná dávka mala odhadnú ť na základe 
najvýznamnejšej cesty prieniku; napríklad, ak je hlavná cesta prie ­
niku do pôdy cez splaškový kal, chemikália sa dávkuje do kalu pri koncentrácii, ktorá zodpovedá o čakávanej koncentrácii kalu, 
a množstvo kalu pridaného do pôdy by malo zodpoveda ť bežnej 
aplikácii kalu, používanej na po ľnohospodárske pôdy. Ak táto 
koncentrácia nie je na identifikáciu hlavných produktov transfor ­
mácie dostato čne vysoká, môže by ť užitočná inkubácia samostatných 
vzoriek pôdy s vyššou mierou ošetrenia, ale je potrebné zamedzi ť 
priveľkej miere ošetrenia ovplyv ňujúcej mikrobiálne funkcie pôdy 
(pozri oddiely 1.5 a 1.8.2). 
Alternatívne sa môže vä čšia dávka (t. j. 1 kg až 2 kg) pôdy ošetri ť 
testovanou látkou, dôkladne premieša ť vo vhodnom miešacom zaria ­
dení a potom prenies ť v malých dávkach 50 g až 200 g do inku ­
bačných baniek (napríklad s použitím dávkova čov vzoriek). Malé 
alikvótne časti (napr. 1 g) ošetrenej pôdy sa analyzujú na testovanú 
látku, aby sa overilo rovnomerné rozdelenie. Uprednost ňuje sa takýto 
postup, pretože umož ňuje rovnomernejšie rozdelenie testovanej látky 
do pôdy. 
Aj neošetrené vzorky pôdy sa inkubujú za rovnakých podmienok 
(aeróbne) ako vzorky ošetrené testovanou látkou. Tieto vzorky sa 
používajú na merania biomasy v priebehu štúdií a na ich konci. 
Ak sa testovaná látka aplikuje do pôdy rozpustená v organickom(- 
ých) rozpúš ťadle(-ách), vzorky pôdy ošetrené rovnakým množstvom 
rozpúšťadla(-iel) sa inkubujú za rovnakých podmienok (aeróbne) ako 
vzorky ošetrené testovanou látkou. Tieto vzorky sa používajú na 
stanovenia biomasy na za čiatku štúdií, po čas nich a na ich konci, 
na overenie ú činkov rozpúš ťadla(-iel) na mikrobiálnu biomasu. 
Banky obsahujúce ošetrenú pôdu sa bu ď
 pripoja na prietokový 
systém opísaný na obrázku 1, alebo uzavrú absorp čnou kolónou 
znázornenou na obrázku 2 (pozri dodatok 3).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Výpočet počiatočnej koncentrácie v mieste s použitím tejto rovnice: 
C soil [mg/kg  soil ] = A½kg=haâ · 10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ · 10 4 ½m 2=haâ · d kg  soil=m 3 h i  
C soil = počiatočná koncentrácia v pôde [mg/kg] 
A = aplika čná dávka [kg/ha]; 1 = hrúbka pôdnej vrstvy po ľa [m]; d = suchá obje ­
mová hmotnos ť [kg/m  3 ]. 
Spravidla aplika čná dávka 1 kg/ha vytvára koncentráciu 1 mg/kg v 10 cm vrstve 
(pri objemovej hmotnosti 1 g/cm  3 ).
 1.9.3.  Odber vzoriek a meranie  
V príslušných časových intervaloch sa odoberú paralelné inkuba čné 
banky a vzorky pôdy sa extrahujú s príslušnými rozpúš ťadlami 
rôznej polarity a analyzujú na testovanú látku a/alebo produkty trans ­
formácie. Vhodne zostavená štúdia zahrnuje dostato čný počet baniek 
tak, aby sa mohli odobra ť dve banky pri každom odbere. Odoberajú 
sa aj absorp čné roztoky alebo tuhé absorp čné materiály v rôznych 
časových intervaloch (7-d ňové intervaly v priebehu prvého mesiaca 
a po jednom mesiaci 17-d ňové intervaly) po čas inkubácie každej 
vzorky pôdy a na jej konci a analyzujú sa na prchavé produkty. Okrem vzorky pôdy odobratej priamo po aplikácii (vzorka 
z nultého d ňa) je potrebné naplánova ť aspoň 5 ďalších termínov 
odberu. Časové intervaly sa zvolia tak, aby sa dala stanovi ť schéma 
rozkladu testovanej látky a schémy tvorby a rozkladu produktov transformácie (napr. 0, 1, 3, 7 dní; 2, 3 týždne; 1, 2, 3 mesiacov 
atď.). 
Ak sa použije testovaná látka, ozna čená
 14 C, neextrahovate ľná rádi­
oaktivita sa kvantifikuje spa ľovaním a vypo číta sa hmotnostná 
bilancia pre každý interval odberu. 
V prípade anaeróbnej inkubácie a inkubácie v podmienkach ryžo ­
vých polí sa pôdne a vodné fázy analyzujú spolu pre testovanú látku 
a produkty transformácie alebo sa pred extrakciou a analýzou oddelia pomocou filtrácie alebo centrifugácie.
 
1.9.4.  Nepovinné testy  
Aeróbne, nesterilné štúdie pri ďalších teplotách a vlhkostiach pôdy 
môžu byť užitočné na posúdenie vplyvu teploty a vlhkosti pôdy na 
mieru transformácie testovanej látky a/alebo jej produktov transfor ­
mácie v pôde. 
Ďalšiu charakterizáciu neextrahovate ľnej rádioaktivity možno skúsi ť 
napríklad superkritickou fluidnou extrakciou.  
2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Množstvá testovanej látky, produktov transformácie, prchavých látok 
(iba v percentách) a neextrahovate ľných látok sa vyjadria 
v percentách aplikovanej po čiatočnej koncentrácie a v prípade 
potreby ako mg/kg pôdy (vo vz ťahu k suchej hmotnosti pôdy) pre 
každý interval odberu. Hmotnostná bilancia sa uvedie v percentách 
aplikovanej po čiatočnej koncentrácie pre každý interval odberu. 
Grafické znázornenie koncentrácií testovanej látky v závislosti od času umožní stanovenie jej pol času transformácie alebo DT
 50 . Mali 
by sa identifikova ť hlavné produkty transformácie a ich koncentrácie 
by sa tiež mali vynies ť v závislosti od času na znázornenie ich miery 
tvorby a rozkladu. Hlavný produkt transformácie je každý produkt, ktorý predstavuje ≥ 10 % aplikovanej dávky kedyko ľvek počas 
štúdie. 
Zachytené prchavé látky poskytujú dôkazy o možnej prchavosti 
testovanej látky a jej produktov transformácie z pôdy.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Presnejšie stanovenia pol časov alebo hodnôt DT  50 , prípadne hodnôt 
DT 75 a DT  90 , by sa mali získa ť s použitím výpo čtov príslušného 
kinetického modelu. Pol čas a hodnoty DT  50 by sa mali zaznamena ť 
spolu s opisom použitého modelu, kinetického rádu a determina čného koeficientu (r
 2 ). Kinetika prvého rádu sa upred ­
nostňuje, pokia ľ r 2 < 0,7. V prípade potreby by sa výpo čty mali 
použiť aj na hlavné produkty transformácie. Príklady príslušných 
modelov sú uvedené v odkazoch (31) až (35). 
Ak sa štúdie miery transformácie vykonávajú pri rôznych teplotách, 
miera transformácie sa uvedie ako funkcia teploty v rámci experi ­
mentálneho rozsahu teploty s použitím Arrheniovho vz ťahu vo 
forme:  
k ¼ A · e ÄB=T alebo  lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
kde ln A je regresná konštanta zo zadržania a ln B je regresná 
konštanta nábehu, prípadne najlepšieho smeru uvo ľneného 
z lineárnej regresie ln k proti l/T, k je množstvová konštanta pri 
teplote T a T je teplota v kelvinoch. Je potrebné venova ť pozornos ť 
obmedzenému rozsahu teplôt, v ktorom platí Arrheniov vz ťah 
v prípade, ak sa transformácia riadi mikrobiálnou aktivitou.  
2.2. HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Aj keď sa štúdie uskuto čňujú v neprirodzenom laboratórnom 
systéme, výsledky umožnia posúdi ť mieru transformácie testovanej 
látky a tiež mieru tvorby a rozkladu produktov transformácie 
v podmienkach v teréne (36) (37). 
Štúdia cesty transformácie testovanej látky poskytuje informácie 
o spôsobe, akým sa aplikovaná látka v pôde štrukturálne mení 
chemickými a mikrobiálnymi reakciami.  
3. PODÁVANIE SPRÁV  
SPRÁVA O TESTE 
Správa o teste musí obsahova ť: 
Testovaná látka: 
— všeobecný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec 
[uvádzajúci pozíciu ozna čenia(-í), ak sa použije rádioaktívne 
označený materiál] a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti 
(pozri oddiel 1.5), 
— čistota (ne čistoty) testovanej látky, 
— rádiochemická čistota ozna čenej chemikálie a špecifická aktivita 
(v prípade potreby). 
Referenčné látky: 
— chemický názov a štruktúra referen čných látok použitých na 
charakterizáciu a/alebo identifikáciu produktu transformácie. 
Testované pôdy: 
— údaje o mieste odberu, 
— dátum a postup odberu vzoriek pôdy,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— vlastnosti pôd, ako napr. pH, obsah organického uhlíka, textúra 
(koľko percent piesku, ko ľko percent bahna, ko ľko percent ílu), 
katiónová výmenná kapacita, objemová hmotnos ť, charakteristika 
retencie vody a mikrobiálna biomasa, 
— dĺžka skladovania pôdy a podmienky skladovania (ak sa skladu ­
je). 
Testovacie podmienky: 
— dátumy uskuto čnenia štúdií, 
— množstvo použitej testovanej látky, — použité rozpúš ťadlá a metóda aplikácie pre testovanú látku, 
— hmotnos ť ošetrenej pôdy na za čiatku testu a v každom intervale 
odberu na analýzu, 
— opis použitého inkuba čného systému, 
— miera prietoku vzduchu (iba pre prietokové systémy), 
— teplota experimentálnej zostavy, — obsah pôdnej vlhkosti po čas inkubácie, 
— mikrobiálna biomasa na za čiatku, v priebehu a na konci aeró ­
bnych štúdií, 
— pH, koncentrácia kyslíka a redox potenciál na za čiatku, 
v priebehu a na konci anaeróbnych a štúdií v podmienkach ryžo ­
vých polí, 
— extrak čná(-é) metóda(-y), 
— metódy kvantifikácie a identifikácie testovanej látky a hlavné 
produkty transformácie v pôde a absorp čné materiály, 
— počet paralelných vzoriek a po čet kontrol. 
Výsledky: — výsledok stanovenia mikrobiálnej aktivity, — opakovate ľnosť a citlivos ť použitých analytických metód, 
— miera regenerácie percentuálne hodnoty pre platnú štúdiu sú 
uvedené v oddiele 1.7.1), 
— tabuľky s výsledkami vyjadrenými v percentách aplikovanej 
počiatočnej dávky a v prípade potreby ako mg/kg pôdy (vz ťahuje 
sa na suchú hmotnos ť), 
— hmotnostná bilancia v priebehu štúdií a na ich konci, — charakterizácia neextrahovate ľnej (viazanej) rádioaktivity alebo 
rezíduí v pôde, 
— kvantifikácia uvo ľneného CO
 2 a iných prchavých látok, 
— grafické znázornenie pôdnych koncentrácií proti času pre testo ­
vanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty transformá ­
cie, 
— polčas alebo DT  50 , DT  75 a DT  90 pre testovanú látku a v prípade 
potreby pre hlavné produkty transformácie, vrátane hraníc spo ľa­
hlivosti,  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— posúdenie miery abiotickej degradácie v sterilných podmienkach, 
— vyhodnotenie kinetiky transformácie pre testovanú látku 
a v prípade potreby pre hlavné produkty transformácie, 
— v prípade potreby údaje o cestách transformácie, — diskusia a interpretácia výsledkov, — nespracované údaje (t. j. chromatogramy vzoriek, vzorové 
výpočty miery transformácie a prostriedky použité na identifi ­
káciu produktov transformácie).
 
4. ODKAZY  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Asse ­
ssment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate. 
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(3) Európska únia (EÚ) (1995). Smernica Komisie 95/36/ES zo 
14. júla 1995, ktorou sa mení a dop ĺňa smernica Rady 91/414/ ­
EHS o umiestnení prípravkov na ochranu rastlín na trh. 
Príloha II časť A a príloha III časť A: Osud a správanie sa 
účinnej látky v životnom prostredí. 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, 
water and air. 
(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prüfung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus. 
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on labora ­
tory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions. 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil–Aerobic metabolism study in soil 
under paddy field conditions (flooded). 
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18 – 20 January 1995. 
(11) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interac ­
tions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123 – 157. 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998). (13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984). 
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(16) Príloha V k smernici 67/548/EHS. 
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 – 114. 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
– General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition. 
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. 
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. 
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial biomass 
in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215 – 221. 
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of 
soil microbial biomass –Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method. 
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45 – 60. 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and biotransformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Sympo ­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105 – 120. 
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59 – 63 (SETAC-Europe). 
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In 
Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68 – 69 (SETAC-Europe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197 – 200. 
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141 – 146.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181 – 199. 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
„Environmental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and 
V.H. Freed, Eds., 135 – 172. 
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten 
Bayer 39, 188 – 204. 
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47 – 60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032 – 1041. 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83 – 122.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
DODATOK 1  
TLAK VODY, KAPACITA PO ĽA (KP) A KAPACITA ZADRŽIAVANIA VODY (KZV)  ( 1 ) 
Výška vodného st ĺpca 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Poznámky  
10 7 7 10  4 suchá pôda 
1,6 × 10  4 4,2 16 bod vädnutia 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6 × 10  2 2,8 0,6 
3,3 × 10  2 2,5 0,33 (  c ) 
rozsah 
kapacity po ľa ( d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 KVZ (aproximácia) 1 0 0,001 vodou nasýtená pôda
 
( a ) pF = logaritmus cm vodného st ĺpca. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Zodpovedá približnému obsahu vody 10 % v piesku, 35 % v hline a 45 % v íle. 
( d ) Kapacita po ľa nie je konštantná, ale mení sa s typom pôdy medzi pF 1,5 a 2,5.  
Tlak vody  sa meria v cm vodného st ĺpca alebo v baroch. Kvôli ve ľkému rozsahu sacieho tlaku sa 
vyjadruje jednoducho ako hodnota pF, ktorá je zodpovedá logaritmu cm vodného st ĺpca. 
Kapacita po ľa sa definuje ako množstvo vody, ktoré sa môže v prírodnej pôde zachova ť proti 
gravitácii 2 dni po dlhšom období daž ďov alebo po dostato čnom zavlažovaní. Stanovuje sa 
v nenarušenej pôde  in situ  v teréne. Meranie sa teda nepoužíva na narušené laboratórne vzorky 
pôdy. Stanovené hodnoty KP v narušených pôdach môžu vykazova ť veľké systematické odchýlky.  
Kapacita zadržiavania vody (KZV)  sa stanovuje v laboratóriu s nenarušenou a narušenou pôdou 
nasýtením st ĺpca pôdy vodou prostredníctvom kapilárnej vzlínavosti. Je to osobitne dôležité pre 
narušené pôdy a môže by ť až o 30 % vä čšia ako kapacita po ľa (1). Je tiež jednoduchšie experi ­
mentálne stanovi ť spoľahlivé hodnoty KP. 
Poznámky  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
DODATOK 2  
OBSAH PÔDNEJ VLHKOSTI (g vody na 100 g suchej pôdy) RÔZNYCH TYPOV PÔDY 
Z RÔZNYCH KRAJÍN  
Pôdna vlhkos ť pri 
Typ pôdy Krajina 
KZV (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Piesok Nemecko 28,7 8,8 3,9 
Hlinitý piesok Nemecko 50,4 17,9 12,1 
Hlinitý piesok Švaj čiarsko 44,0 35,3 9,2 
Prachovitá hlina Švaj čiarsko 72,8 56,6 28,4 
Ílovitá hlina Brazília 69,7 38,4 27,3 Ílovitá hlina Japonsko 74,4 57,8 31,4 Piesčitá hlina Japonsko 82,4 59,2 36,0 
Prachovitá hlina USA 47,2 33,2 18,8 Piesčitá hlina USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Kapacita zadržiavania vody.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
DODATOK 3  
Obrázok 1  
Príklad prietokového prístroja na štúdium transformácie chemikálií 
v pôde  ( 1 ) ( 2 )
 
Obrázok 2  
Príklad banky biometrického typu na štúdium transformácie chemikálií 
v pôde  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and 
the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123 – 157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In 
Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. 
Vol 1, 85 – 114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau 
und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141 – 146.
 C.24.  AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA V 
SYSTÉMOCH VODA/SEDIMENT  
1. METÓDA  
Táto testovacia metóda zodpovedá OECD TG 308 (2002).  
1.1. ÚVOD 
Chemikálie sa môžu dosta ť do plytkých alebo hlbokých povrcho ­
vých vôd takými cestami, ako je priama aplikácia, postrek, odtok, 
odvodnenie, zneškod ňovanie odpadov, priemyselné, domáce alebo 
poľnohospodárske odpadové vody a atmosférické usadzovanie. 
Táto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu na hodnotenie aeróbnej a anaeróbnej transformácie organických chemikálií 
v systémoch voda/sediment. Táto testovacia metóda je založená na 
existujúcich usmerneniach (1) (2) (3) (4) (5) (6). Na OECD works ­
hope o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v talianskom Belgirate v roku 1995 (7) sa konkrétne dohodlo množstvo a typ sedimentov 
používaných v tomto teste. Tiež sa vydali odporú čania týkajúce sa 
odberu, manipulácie a skladovania vzoriek sedimentov, ktoré sa zakladajú na pokynoch ISO (8). Takéto štúdie sa vyžadujú pre chemikálie, ktoré sa priamo aplikujú to vody alebo ktoré sa môžu 
dostať do vodného prostredia vyššie uvedenými cestami. 
Podmienky v prírodných systémoch voda/sediment sú často aeróbne 
vo vrchnej vodnej fáze. Povrchová vrstva sedimentu môže by ť buď 
aeróbna, alebo anaeróbna, zatia ľ čo hlbšie vrstvy sedimentu sú 
zvyčajne anaeróbne. Aby sa zahrnuli obe tieto možnosti, v tomto 
dokumente sa opisujú aeróbne aj aneróbne testy. Aeróbny test simu ­
luje aeróbny vodný st ĺpec nad aeróbnou vrstvou sedimentu, ktorá je 
podvrstvená anaeróbnym gradientom. Anaeróbny test simuluje úplný anaeróbny systém voda-sediment. Ak z okolností vyplýva, že je potrebné zna čne sa odkloni ť od týchto odporú čaní, napríklad použi ť 
intaktné jadrá sedimentov alebo sedimenty, ktoré môžu by ť vysta­
vené pôsobeniu testovanej látky, sú na tento ú čel dostupné iné 
metódy (9).
 
1.2. DEFINÍCIE 
V každom prípade sa použijú medzinárodné jednotky (SI).  
Testovaná látka:  každá látka, či východisková, alebo príslušné 
produkty transformácie.  
Produkty transformácie:  všetky látky, ktoré vzniknú z biotických 
a abiotických transforma čných reakcií testovanej látky, vrátane CO  2 
a viazaných rezíduí.  
Viazané rezíduá: „Viazané rezíduá“ sú zlú čeniny v pôde, rastlinách 
alebo zvieratách, ktoré pretrvávajú po extrakcii v matrici vo forme východzej zlú čeniny alebo jej metabolitu(-ov). Extrak čná metóda 
nemusí podstatne meni ť samotné zlú čeniny alebo štruktúru matrice. 
Charakter väzby sa čiastočne dá objasni ť extrakčnými metódami, 
ktorými sa mení matrica, a zložitými analytickými technikami. Doposiaľ sa identifikovali týmto spôsobom napríklad kovalentné 
iónové a sorp čné väzby, ako aj zadržiavanie. Vo všeobecnosti 
vznik viazaných rezíduí významne znižuje biologickú prístupnos ť 
a biologickú dostupnos ť (10) [upravené z IUPAC 1984 (11)].
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aeróbna transformácia:  (oxidačná): reakcie, ktoré sa vyskytujú 
v prítomnosti molekulárneho kyslíka (12).  
Anaeróbna transformácia:  (redukčná): reakcie, ktoré sa vyskytujú 
za neprítomnosti molekulárneho kyslíka (12).  
Prírodné vody:  sú povrchové vody získané z nádrží, riek, potokov at ď. 
Sediment:  je zmes minerálnych a organických chemických zložiek, 
pričom organické chemické zložky obsahujú zlú čeniny s vysokým 
obsahom uhlíka a dusíka a s vysokými molekulovými hmotnos ťami. 
Ukladá sa prírodnou vodou a tvorí rozhranie s vodou.  
Mineralizácia:  je kompletná degradácia organickej zlú čeniny na 
CO 2 , H  2 O v aeróbnych podmienkach a na CH  4 , CO  2 
a H  2 O v anaeróbnych podmienkach. V súvislosti s touto testovacou 
metódou, ak sa používa rádioaktívne ozna čená zlúčenina, minerali ­
zácia znamená rozsiahlu degradáciu molekuly, po čas ktorej sa ozna ­ 
čený atóm uhlíka kvantitatívne oxiduje alebo redukuje za uvo ľnenia 
príslušného množstva  14 CO 2 alebo  14 CH 4 . 
Polčas, t 0,5 , je čas, za ktorý sa transformuje 50 % testovanej látky, 
ak sa transformácia dá opísa ť kinetikou prvého rádu; je nezávislý od 
koncentrácie.  
DT 50 (Doba odbúrania 50):  je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 50 %.  
DT 75 (Doba odbúrania 75):  je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 75 %.  
DT 90 (Doba odbúrania 90):  je čas, za ktorý sa koncentrácia testo ­
vanej látky zníži o 90 %.  
1.3. REFEREN ČNÉ LÁTKY 
Referenčné látky by sa mali používa ť na identifikáciu a kvantifikáciu 
produktov transformácie spektroskopickými a chromatografickými 
metódami.  
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Na meranie miery transformácie sa môže použi ť neoznačená alebo 
izotopom ozna čená testovaná látka, aj ke ď sa uprednost ňuje ozna­ 
čený materiál. Ozna čený materiál sa vyžaduje pri skúmaní ciest 
transformácie a pri stanovení hmotnostnej bilancie. Odporú ča sa 
označenie pomocou  14 C, ale môže použi ť aj ozna čenie inými 
izotopmi, ako napr.  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Značka sa umiestni pokia ľ 
možno v najstabilnejšej(-ích) časti(-iach) molekuly (  1 ). Chemická a/ ­
alebo rádiochemická čistota testovanej látky by mala by ť aspoň 
95 %. 
Pred uskuto čnením testuje potrebné, aby boli k dispozícii tieto infor ­
mácie: 
a) rozpustnos ť vo vode (metóda A. 6); 
b) rozpustnos ť v organických rozpúš ťadlách; 
c) tlak pár (metóda A.4) a Henryho konštanta;  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Napríklad, ak látka obsahuje jeden kruh, ozna čenie tohto kruhu je potrebné; ak testovaná 
látka obsahuje dva alebo viac kruhov, samostatné štúdie môžu by ť potrebné na hodno ­
tenie osudu každého ozna čeného kruhu a na získanie príslušných informácií o tvorbe 
produktov transformácie.
 d) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda (metóda A. 8); 
e) adsorp čný koeficient (K  d , K  f alebo K  oc , podľa potreby) 
(metóda C. 18); 
f) hydrolýza (metóda C.7); g) disocia čná konštanta (pK
 a ) [usmernenie OECD 112] (13); 
h) chemická štruktúra testovanej látky a pozícia izotopového ozna ­ 
čenia, v prípade potreby.  
Poznámka:  Zaznamená sa teplota, pri ktorej sa robili tieto merania. 
Iné užitočné informácie môžu obsahova ť údaje o toxicite testovanej 
látky pre mikroorganizmy, údaje o rýchlej a/alebo potenciálnej biolo ­
gickej rozložite ľnosti a údaje o aeróbnej a anaeróbnej transformácii 
v pôde. 
Je potrebné ma ť k dispozícii analytické metódy (vrátane extrak čných 
a purifika čných metód) na identifikáciu a kvantifikáciu testovanej 
látky a jej produktov transformácie vo vode a v sedimente (pozri 
oddiel 1.7.2).  
1.5. PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY 
Metóda uvedená v tomto teste využíva systém aeróbnych 
a anaeróbnych vodných sedimentov (pozri dodatok 1), ktorý umož ­ 
ňuje: 
— meranie miery transformácie testovanej látky v systéme voda- 
sediment, 
— meranie miery transformácie testovanej látky v sedimente, — meranie miery mineralizácie testovanej látky a/alebo jej produktov 
transformácie (ak sa použije testovaná látka ozna čená
 14 C), 
— identifikáciu a kvantifikáciu produktov transformácie vo vodnej 
fáze a fáze sedimentu vrátane hmotnostnej bilancie (ak sa použije 
označená testovaná látka), 
— meranie distribúcie testovanej látky a jej produktov transformácie 
medzi dvoma fázami po čas inkuba čnej doby v tme (aby sa zabrá ­
nilo, napríklad, rozmnoženiu rias) pri stálej teplote. Pol časy, 
hodnoty DT  50 , DT  75 a DT  90 sa stanovia, ak to umož ňujú údaje, 
ale nesmú sa extrapolova ť veľmi dlho od doby experimentu 
(pozri oddiel 1.2). 
Aspoň dva sedimenty a ich pridružené vody sú potrebné pre aeróbne 
a anaeróbne štúdie (7). Môžu sa však vyskytnú ť prípady, ke ď je 
potrebné použi ť viac ako dva vodné sedimenty, napríklad 
v prípade chemikálie, ktorá sa môže nachádza ť v sladkých a/alebo 
morských vodách.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. POUŽITE ĽNOSŤ TESTU 
Metóda je všeobecne použite ľná na všetky chemické látky (neozna ­ 
čené alebo ozna čené), pre ktoré je k dispozícii analytická metóda 
s dostato čnou presnos ťou a citlivos ťou. Je použite ľná na mierne 
prchavé, neprchavé, vo vode rozpustné alebo vo vode zle rozpustné 
zlúčeniny. Test sa nepoužíva na chemikálie, ktoré sú ve ľmi prchavé 
z vody (napr. fumiganty, organické rozpúš ťadlá), a teda sa pri expe ­
rimentálnych podmienkach testu nemôžu uchova ť vo vode. 
Metóda sa doteraz používala na skúmanie transformácie chemikálií 
v sladkých vodách a sedimentoch, ale v zásade sa dá použi ť aj na 
systémy ústí riek a morské systémy. Nie je vhodná na simulovanie podmienok v te čúcich vodách (napr. rieky) alebo podmienok otvo ­
reného mora.
 
1.7. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.7.1.  Regenerácia  
Extrakcia a analýza minimálne dvoch paralelných vzoriek vody 
a sedimentu ihne ď po pridaní testovanej látky poskytuje prvý 
dôkaz reprodukovate ľnosti analytickej metódy a rovnomerného 
rozdelenia testovanej látky pri aplikácii. Regenerácie v neskorších stupňoch experimentov sú dané príslušnými hmotnostnými bilan ­
ciami (ak sa použije ozna čený materiál). Regenerácie by mali by ť 
v rozsahu od 90 % do 110 % pre ozna čené chemikálie (6) a od 70 % 
do 110 % pre neozna čené chemikálie.
 
1.7.2.  Reprodukovate ľnosť a citlivos ť analytickej metódy  
Repredukovate ľnosť analytickej metódy (okrem po čiatočnej účin­
nosti extrakcie) na kvantifikovanie testovanej látky a produktov transformácie sa môže overi ť paralelnou analýzou rovnakého 
extraktu vzoriek vody alebo sedimentu, ktorý sa inkuboval dosta ­
točne dlho, aby vznikli produkty transformácie. 
Detekčný limit (LOD) analytickej metódy pre testovanú látku a pre 
produkty transformácie má by ť aspoň 0,01 mg/kg vo vode alebo 
sedimente (ako testovaná látka) alebo 1 % po čiatočnej dávky, apli ­
kovanej do testovaného systému, pod ľa toho ktorá hodnota je nižšia. 
Je potrebné stanovi ť aj kvantifika čný limit (LOQ).
 
1.7.3.  Presnos ť údajov o transformácii  
Regresná analýza koncentrácií testovanej látky v závislosti od 
času poskytuje príslušné informácie o presnosti transforma čnej 
krivky a umožní výpo čet hraníc spo ľahlivosti pre pol časy (ak platí 
kinetika pseudo prvého rádu) alebo hodnôt DT  50 a v prípade potreby 
DT 75 a DT  90 . 
1.8. OPIS METÓDY  
1.8.1.  Testovaný systém a aparatúra  
Štúdia by sa mala vykona ť v sklenených nádobách (t. j. f ľaše, centri ­
fugačné kyvety), pokia ľ z predbežných informácií (napr. rozde ľovací 
koeficient n-oktanol-voda, sorp čné údaje at ď.) nevyplýva, že testo ­
vaná látka môže pri ľnúť na sklo, v takomto prípade sa môže 
uvažovať o použití alternatívneho materiálu, napr. teflónu). Ak je 
známe, že testovaná látka pri ľne na sklo, môže sa tento problém 
vyriešiť pomocou jednej alebo viacerých z týchto metód:  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— stanovi ť hmotnos ť testovanej látky a produktov transformácie 
zachytenej na sklo, 
— zabezpe čiť, aby sa umyli rozpúš ťadlom všetky sklenené 
pomôcky na konci testu, 
— použiť zložené výrobky (pozri tiež oddiel 1.9.2), 
— použiť väčšie množstvo pomocných rozpúš ťadiel na pridávanie 
testovanej látky do systému; ak sa pomocné rozpúš ťadlá použí ­
vajú, musí to by ť pomocné rozpúš ťadlo, ktoré nespôsobí solvo ­
lýzu testovanej látky. 
Príklady typickej pokusnej aparatúry, t. j. plynový prietokový systém 
a systém biometrického typu, sú znázornené v dodatku 2 a 3 (14). 
Ďalšie užito čné inkuba čné systémy sú uvedené v odkaze (15). 
Konštrukcia pokusnej aparatúry by mala umožni ť výmenu vzduchu 
alebo dusíka a zachytenie prchavých produktov. Rozmery aparatúry 
musia by ť také, aby boli v súlade s požiadavkami testu (pozri 
oddiel 1.9.1). Prevzdušnenie sa zabezpe čí buď jemným prebubláva ­
ním, alebo prepúš ťaním vzduchu alebo dusíka nad povrchom vody. 
V druhom prípade pre lepšiu distribúciu kyslíka alebo dusíka vo 
vode sa môže odporú čať jemné miešanie vody zvrchu. Vzduch 
zbavený CO  2 by sa nemal používa ť, lebo môže spôsobi ť zvýšenie 
pH vody. V každom prípade narušenie sedimentu nie je želate ľné 
a, pokiaľ možno, treba mu zabráni ť. Mierne prchavé látky by sa mali 
testovať v systéme biometrického typu jemným premiešaním 
povrchu vody. Môžu sa použi ť aj uzavreté nádoby s plynnou 
fázou tvorenou atmosférickým vzduchom alebo dusíkom a internými nádobkami na zachytávanie prchavých produktov (16). 
Je potrebná pravidelná výmena plynnej fázy v aeróbnom teste, aby 
sa kompenzovala spotreba kyslíka biomasou. 
Vhodné zachytáva če na zachytávanie prchavých produktov transfor ­
mácie obsahujú okrem iného roztoky hydroxidu draselného alebo hydroxidu sodného v koncentrácii 1 mol/dm
 3 pre oxid uhli čitý (  1 ) 
a etylénglykol, etanolamín alebo 2 % parafín v xyléne pre organické 
zlúčeniny. Prchavé látky, ktoré sa tvoria za anaeróbnych podmienok, 
ako napr. metán, sa môžu zachytáva ť, napríklad molekulovými 
sitami. Takéto prchavé látky sa môžu spa ľovať, napríklad na CO  2 
prepúšťaním plynu cez kremennú trubicu naplnenú CuO pri teplote 
900  o C a zachytávaním vzniknutého CO  2 v absorbéri s alkalickou 
látkou (17). 
Je potrebné laboratórne zariadenie na chemickú analýzu testovanej látky 
a produktov transformácie [(t. j. plynová kvapalinová chromatografia 
(GLC), vysokoú činná kvapalinová chromatografia (HPLC), chromato ­
grafia na tenkej vrstve (TLC), hmotnostná spektroskopia (MS), plynová chromatografia – hmotnostná spektroskopia (GC-MS), kvapalinová chromatografia – hmotnostná spektrometria (LC-MS), jadrová magne ­
tická rezonancia (NMR) at ď.], vrátane detek čných systémov pre 
rádioaktívne ozna čené a neozna čené chemikálie, pod ľa potreby. Ak sa 
používa rádioaktívne ozna čený materiál, bude potrebný aj kvapalný 
scintilačný počítač a oxidačné činidlo na spa ľovanie (na spa ľovanie 
vzoriek sedimentu na analýzu rádioaktivity). 
V prípade potreby je potrebné ďalšie bežné laboratórne zariadenie na 
fyzikálno-chemické a biologické stanovenia (pozri tabu ľku 
v oddiele 1.8.2.2), sklenené nádoby, chemikálie a reagencie.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Keďže tieto alkalické absorp čné roztoky tiež absorbujú oxid uhli čitý zo vzduchu pri 
prevzdušňovaní, ktorý sa tvorí respiráciou pri aeróbnych pokusoch, musia sa 
v pravidelných intervaloch vymie ňať, aby sa zabránilo ich saturácii, a tým strate ich 
absorpčnej kapacity.
 1.8.2.  Výber a po čet vodných sedimentov  
Miesta odberu sa zvolia v súlade s cie ľom testu v danej situácii. Pri 
výbere miest odberu sa musia posúdi ť predchádzajúce možné vstupy 
z poľnohospodárstva, priemyslu alebo domácností do spádovej 
oblasti a horných tokov. Sedimenty sa nepoužijú, ak boli kontami ­
nované testovanou látkou alebo jej štrukturálnymi analógmi po čas 
predchádzajúcich 4 rokov.  
1.8.2.1.  Výber sedimentu  
Na aeróbne štúdie sa zvy čajne používajú dva sedimenty (7). Vybraté 
dva sedimenty by sa mali odlišova ť v obsahu organického uhlíka 
a textúrou. Jeden sediment by mal ma ť vysoký obsah organického 
uhlíka (2,5 % – 7,5 %) a jemnú textúru, druhý sediment by mal ma ť 
nízky obsah organického uhlíka (0,5 % – 2,5 %) a hrubú textúru. 
Rozdiel medzi obsahom organického uhlíka by mal by ť zvyčajne 
aspoň 2 %. „Jemná textúra“ je definovaná ako obsah [íl + bahno] (  1 ) 
> 50 % a „hrubá textúra“ je definovaná ako obsah [íl + bahno] 
< 50 %. Rozdiel v obsahu [íl + bahno] pre dva sedimenty by mal 
byť zvyčajne aspo ň 20 %. V prípadoch ke ď sa chemikália môže 
dostať aj do morských vôd, aspo ň jeden z týchto systémov voda- 
sediment by mal pochádza ť z mora. 
Pre striktne anaeróbnu štúdiu sa dva sedimenty (vrátane ich pridru ­ 
žených vôd) odoberú z anaeróbnych zón povrchových vodných telies 
(7). S obidvoma fázami sediment aj voda sa manipuluje opatrne 
a prepravujú sa takisto opatrne bez prítomnosti kyslíka. 
Ďalšie parametre môžu by ť dôležité pri výbere sedimentov a je ich 
potrebné posudzova ť podľa jednotlivých prípadov. Napríklad rozsah 
pH sedimentov by mohol by ť dôležitý pri testovaní chemikálií, 
v prípade ktorých transformácia a/alebo sorpcia môže závisie ť od 
pH. Závislos ť sorpcie od pH môže vyjadrova ť pK  a testovanej látky.  
1.8.2.2.  Charakterizácia vzoriek voda-sediment  
Kľúčové parametre, ktoré sa musia mera ť a uvies ť v správe 
(s odkazom na použitú metódu) pre vodu aj sediment, a štádium testu, v ktorom sa tieto parametre majú stanovi ť, sú zosumarizované 
v ďalej uvedenej tabu ľke. Informácie o metódach na stanovenie 
týchto parametrov sú uvedené odkazoch (18) (19) (20) (21). 
Podľa okolností je potrebné stanovi ť a uviesť v správe aj ďalšie 
parametre [napr. pre sladkú vodu: častice, zásaditos ť, tvrdosť, 
konduktivitu, NO
 3 /PO  4 (pomer a jednotlivé hodnoty); pre sedimenty: 
katiónovú výmennú kapacitu, kapacitu zadržiavania vody, uhli čitany, 
celkový dusík a fosfor; a pre morské systémy: so ľnatosť]. Analýza 
sedimentov a vody na nitrát, sulfát, biologicky dostupné železo a prípadne iné akceptory elektrónov môže by ť tiež užito čná pri 
posudzovaní redoxných podmienok najmä vo vz ťahu k anaeróbnej 
transformácii.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [íl + bahno] je minerálna frakcia sedimentu s ve ľkosťou častíc < 50 μm.
 Stanovenie parametrov na charakterizáciu vzoriek voda-sediment (7) (22) (23)  
Parameter Štádium postupu testu 
odber 
vzoriek 
v teréne manipulácia začiatok 
aklimati­
zácie začiatok 
testu priebeh 
testu koniec testu  
Voda  
Pôvod/zdroj x 
Teplota x 
pH x x x x x 
TOC (celková koncentrácia 
organického kyslíka) x x x 
koncentrácia O  2 (*) x x x x x 
Redox potenciál (**) x x x x  
Sediment  
Pôvod/zdroj x 
Hĺbka vrstvy x 
pH x x x x x 
Distribúcia ve ľkosti častíc x 
TOC (celková koncentrácia 
organického kyslíka) x x x x 
Mikrobiálna biomasa (*) x x x 
Redox potenciál (**) pozoro ­
vanie (farba/ vôňa) x x x x
 
(*) Z posledných výsledkov výskumu vyplýva, že merania koncentrácií kyslíka vo vode a redox potenciálov nemá 
mechanistickú ani prognostickú hodnotu, pokia ľ ide o rast a vývoj mikrobiálnych populácií v povrchových vodách 
(24) (25). Stanovenie biochemickej spotreby kyslíka (BSK, pri odbere vzoriek v teréne, na za čiatku a konci testu) 
a koncentrácií mikro/makro živín Ca, Mg a Mn (na za čiatku a konci testu) vo vode a meranie celkového 
N a celkového P v sedimentoch (pri odbere vzoriek v teréne a na konci testu) môžu by ť lepšími nástrojmi na 
vyjadrenie a posúdenie miery a ciest aeróbnej biotransformácie. 
(**) Metóda rýchlosti mikrobiálnej respirácie (26), fumiga čná metóda (27) alebo stanovenie po čtu mikroorganizmov 
(napr. baktérie, aktinomycéty, plesne a celkové kolónie) pre aeróbne štúdie; miera metanogenézy pre anaeróbne 
štúdie.  
1.8.3.  Odber, manipulácia a skladovanie  
1.8.3.1.  Odber  
Odber vzoriek sedimentu by sa mal robi ť podľa návrhu pokynov 
ISO pre odber vzoriek spodného sedimentu (8). Vzorky sedimentu by sa mali odobra ť z celkovej vrchnej vrstvy 5 cm až 10 cm sedi ­
mentu. Pridružené vody by sa mali odobra ť z rovnakého miesta 
alebo lokality a v rovnaký čas ako sediment. Pre anaeróbnu štúdiu 
by sa mali odobra ť vzorky sedimentu a pridruženej vody a dopravi ť 
za neprítomnosti kyslíka (28) (pozri oddiel 1.8.2.1). Niektoré zaria ­
denia na odber vzoriek sú uvedené v odkazoch (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Manipulácia  
Sediment sa oddelí od vody filtráciou a tento sediment sa za mokra 
preoseje na site s otvormi 2 mm s použitím nadbytku vody z lokality a voda z lokality sa potom odstráni. Potom sa známe množstvá sedi ­
mentov a vody zmiešajú v požadovanom pomere (pozri oddiel 1.9.1) 
v inkubačných bankách a pripravia na aklimatiza čné obdobie (pozri 
oddiel 1.8.4). V prípade anaeróbnej štúdie sa všetky kroky pri manipulácii musia uskuto čňovať za neprítomnosti kyslíka (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Uchovávanie  
Dôrazne sa odporú ča použiť čerstvo odobraté vzorky sedimentu 
a vody, ale ak je potrebné skladovanie, sediment a voda sa preoseje, ako je uvedené vyššie, a skladujú sa spolu zaliate vodou (6 cm – 10 cm vodná vrstva), v tme, pri 4
 o C ± 2  o C( 4 ) maximálne 4 týždne 
(7) (8) (23). Vzorky na použitie v aeróbnych štúdiách sa skladujú za 
voľného prístupu vzduchu (napr. v otvorených nádobách), zatia ľ čo 
vzorky na použitie v anaeróbnych štúdiách za neprítomnosti kyslíka. Počas prepravy a skladovania nesmie sediment ani voda zamrznú ť 
a sediment tiež nesmie vyschnú ť.
 
1.8.4.  Príprava vzoriek sedimentu/vody na test  
Pred pridaním testovanej látky by sa mala uskuto čniť aklimatizácia 
každej vzorky sedimentu/vody, ktorá sa umiestni do inkuba čnej 
nádoby, ktorá sa má použi ť v základnom teste, a aklimatizácia sa 
uskutoční za presne rovnakých podmienok ako inkubácia v teste 
(pozri oddiel 1.9.1). Doba aklimatizácie je čas potrebný na dosiah ­
nutie primeranej stability systému vyjadrenej hodnotou pH, koncen ­
tráciou kyslíka vo vode, redox potenciálom sedimentu a vody 
a makroskopickou separáciou fáz. Doba aklimatizácie by mala 
zvyčajne trva ť medzi jedným a dvoma týžd ňami a nemala by 
presiahnu ť štyri týždne. Výsledky stanovení uskuto čnených po čas 
tohto obdobia by sa mali zaznamena ť. 
1.9. VYKONANIE TESTU  
1.9.1.  Testovacie podmienky  
Test by sa mal uskuto čniť v inkuba čnom zariadení (pozri 
oddiel 1.8.1) s pomerom objemu voda/sediment medzi 3:1 a 4:1 a vrstvou sedimentu 2,5 cm (± 0,5 cm) (
 1 ). Odporú ča sa minimálne 
množstvo 50 g sedimentu (suchá hmotnos ť) na inkuba čnú nádobu. 
Test by sa mal uskuto čniť v tme pri stálej teplote v rozmedzí 10  o C 
až 30  o C. Teplota (20  o C ± 2  o C) je primeraná. V prípade potreby sa 
môže v jednotlivých prípadoch dodato čne uvažova ť o nižšej teplote 
(napr. 10  o C) v závislosti od informácií, ktoré sa na základe testu 
požadujú. Inkuba čnú teplotu je potrebné sledova ť a zaznamenáva ť. ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Posledné štúdie ukázali, že skladovanie pri 4  o C môže vies ť k poklesu obsahu organic ­
kého uhlíka sedimentu, ktorý môže ma ť prípadne za následok zníženie mikrobiálnej 
aktivity (34).
 1.9.2.  Spracovanie a aplikácia testovanej látky  
Používa sa jedna testovacia koncentrácia chemikálie (  1 ). Pre chemi ­
kálie na ochranu rastlín, ktoré sa priamo aplikujú do vodných telies, maximálna dávka uvedená na ozna čení je maximálna aplika čná 
dávka, ktorá sa vypo číta vo vz ťahu na povrch vody v testovacej 
nádobe. Vo všetkých ostatných prípadoch by koncentrácia, ktorá sa má použi ť, mala vychádza ť z výpočtov environmentálnych emisií. Je 
potrebné venova ť pozornos ť na zabezpe čenie toho, aby sa na charak ­
terizáciu cesty transformácie a tvorby a rozkladu produktov trans ­
formácie použila primeraná koncentrácia testovanej látky. Môže by ť 
potrebné použi ť vyššie dávky (napr. 10-násobné) v situáciách, ke ď 
sa koncentrácie testovanej látky približujú k detek čným limitom na 
začiatku štúdie a/alebo sa hlavné produkty transformácie nedajú 
jasne stanovi ť, keď ich podiel tvorí 10 % aplika čnej dávky testo ­
vanej látky. Ak sa však použijú vyššie testovacie koncentrácie, 
nemali by ma ť významný nepriaznivý ú činok na mikrobiálnu akti ­
vitu systému voda-sediment. Aby sa dosiahla konštantná koncen ­
trácia testovanej látky v nádobách rôznych rozmerov, môže by ť 
potrebné zváži ť prispôsobenie na množstvo použitého materiálu na 
základe h ĺbky vodného st ĺpca v nádobe vo vz ťahu k hĺbke vody 
v teréne (predpokladá sa, že bude 100 cm, ale môžu sa použi ť iné 
hĺbky). Príklady výpo čtu pozri v dodatku 4. 
V ideálnom prípade by sa mala testovaná látka aplikova ť ako vodný 
roztok do vodnej fázy testovaného systému. Ak je to nevyhnuté, 
povoľuje sa použi ť nízke množstvá vodou zmiešate ľných rozpúš ťa­
diel (ako napr. acetón, etanol) na aplikáciu a distribúciu testovanej látky, ale nemali by presiahnu ť 1 obj. % a nemali by ma
ť nepriaz­
nivé účinky na mikrobiálnu aktivitu testovaného systému. Pri 
príprave vodného roztoku testovanej látky je potrebné dáva ť pozor 
– na zabezpe čenie úplnej homogenity môže by ť potrebné použi ť 
stĺpcové usporiadanie generátora a premiešanie. Po pridaní vodného 
roztoku do testovaného systému sa odporú ča jemné premiešanie 
vodnej fázy tak, aby sa čo najmenej narušil sediment. 
Použitie zložených prípravkov sa bežne neodporú ča, pretože zložky 
prípravku môžu ovplyvni ť distribúciu testovanej látky a/alebo 
produktov transformácie medzi vodnou fázou a fázou sedimentu. 
Použitie zloženého materiálu však môže by ť vhodnou alternatívou, 
napríklad v prípade vo vode ťažko rozpustných testovaných látok. 
Počet inkuba čných nádob závisí od po čtu odberov (pozri 
oddiel 1.9.3). Je potrebné použi ť dostatočný počet testovaných 
systémov tak, aby sa na každý odber mohli použi ť dva systémy. 
Ak sa používajú kontrolné jednotky každého systému voda/sediment, nemali by sa ošetrova ť testovanou látkou. Kontrolné jednotky sa 
môžu použi ť na stanovenie mikrobiálnej biomasy sedimentu 
a celkového organického uhlíka vody a sedimentu na konci štúdie. Dve kontrolné jednotky (t. j. jedna kontrolná jednotka každého vodného sedimentu) sa môže použi ť na sledovanie požadovaných 
parametrov v sedimente a vode po čas doby aklimatizácie (pozri 
tabuľku v oddiele 1.8.2.2). Dve ďalšie kontrolné jednotky sa musia 
použiť v prípade, ke ď sa testovaná látka aplikuje s použitím rozpúš ť­
adla na stanovenie nepriaznivých ú činkov na mikrobiálnu aktivitu 
testovaného systému.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Test s druhou koncentráciou môže by ť užitočný pre chemikálie, ktoré sa dostanú do 
povrchových vôd rôznymi cestami vstupu, výsledkom čoho sú zna čne rozdielne koncen ­
trácie, pokia ľ sa nižšia koncentrácia dá analyzova ť s dostato čnou presnos ťou.
 1.9.3.  Trvanie testu a odber vzoriek  
Trvanie experimentu by zvy čajne nemalo by ť dlhšie ako 100 dní (6) 
a malo by pokra čovať až do stanovenia cesty degradácie a modelu 
distribúcie voda/sediment, alebo kým sa transformáciou rozloží a/ ­
alebo vyprchá 90 % testovanej látky. Malo by sa vykona ť aspoň šesť 
odberov (vrátane času nula) s nepovinnou predbežnou štúdiou (pozri 
oddiel 1.9.4), ktorá sa použije na stanovenie vhodného režimu odberov vzoriek a trvania testu, pokia ľ nebudú k dispozícii dosta ču­
júce údaje o testovanej látke z predchádzajúcich štúdií. Pre hydro ­
fóbne testované látky môžu by ť potrebné ďalšie odbery v priebehu 
počiatočného štádia štúdie, aby sa stanovila miera distribúcie medzi 
vodnou fázou a fázou sedimentu. 
V dobe príslušných odberov sa všetky inkuba čné nádoby (paralelne) 
odoberú na analýzu. Sediment a voda nad ním sa analyzujú samostatne (
 1 ). Povrchová voda by sa mala opatrne odstráni ť tak, 
aby sa čo najmenej narušil sediment. Extrakcia a charakterizácia 
testovanej látky a produkty transformácie by sa mali uskuto čniť 
podľa príslušných analytických postupov. Je potrebné venova ť 
pozornosť, aby sa odstránil materiál, ktorý sa môže naadsorbova ť 
na inkuba čnú nádobu alebo na rúrky, ktoré slúžia na prepojenie 
pri zachytávaní prchavých látok.  
1.9.4.  Nepovinný predbežný test  
Ak sa trvanie a režim odberov vzoriek nedá ur čiť z iných prísluš ­
ných štúdií o testovanej látke, môže sa usúdi ť, že je vhodné vykona ť 
nepovinný predbežný test, ktorý by sa uskuto čnil za rovnakých testo ­
vacích podmienok, aké sú navrhnuté pre kone čnú štúdiu. Príslušné 
experimentálne podmienky a výsledky z predbežného testu, ak sa 
uskutoční, by sa mali stru čne zaznamenáva ť. 
1.9.5.  Merania a analýza  
Koncentrácia testovanej látky a produktov transformácie pri každom 
odbere vo vode a sedimente by sa mala stanovi ť a zaznamena ť (ako 
koncentrácia a ako percentuálny podiel použitého množstva). Vo všeobecnosti by sa mali identifikova ť produkty transformácie stano ­
vené pri ≥ 10 % použitej rádioaktivity v celom systéme voda-sedi ­
ment pri ktoromko ľvek odbere, pokia ľ neexistuje iný riadne odôvod ­
nený postup. Produkty transformácie, pre ktoré sa koncentrácie trvale zvyšujú po čas štúdie, by sa taktiež mali posúdi ť na identifikáciu, aj 
keď ich koncentrácie nepresahujú limity uvedené vyššie, lebo to 
môže byť dôkazom perzistencie. Toto je potrebné posúdi ť na základe 
jednotlivých prípadov s odôvodneniami, ktoré sa uvedú v správe. 
Výsledky zo systémov na zachytávanie plynov/prchavých látok (CO
 2 
a iné, t. j. prchavé organické látky) by sa mali zaznamena ť pri 
každom odbere. Mala by sa zaznamena ť miera mineralizácie. Neex ­
trahovateľné (viazané) rezíduá v sedimente sa zaznamenajú pri 
každom odbere.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) V prípadoch, ke ď môže ľahko dôjs ť k rýchlej reoxidácii anaeróbnych produktov trans ­
formácie, treba zachova ť anaeróbne podmienky po čas odberu vzoriek a analýzy.
 2. ÚDAJE  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV 
Celková hmotnostná bilancia alebo regenerácia (pozri oddiel 1.7.1) 
pridanej rádioaktivity sa vypo číta pri každom odbere. Výsledky sa 
zaznamenajú ako percentuálna hodnota pridanej rádioaktivity. Distri ­
búcia rádioaktivity medzi vodou a sedimentom sa zaznamenáva ako koncentrácie a percentuálne hodnoty pri každom odbere. 
Polčas, DT
 50 a v prípade potreby DT  75 a DT  90 testovanej látky sa 
vypočítajú spolu s ich hranicami spo ľahlivosti (pozri oddiel 1.7.3). 
Informácie o miere rozptylu testovanej látky vo vode a sedimente sa získajú na základe použitia príslušných vyhodnocovacích nástrojov. 
K nim môže patri ť použitie kinetiky pseudo prvého rádu, empirické 
techniky (konštrukcia krivky bod po bode), ktoré používajú grafické alebo numerické riešenia a komplexnejšie vyhodnotenia s použitím napríklad jednoduchých alebo nieko ľkonásobných kazetových mode ­
lov. Ďalšie informácie je možné získa ť z odkazov (35) (36) (37). 
Všetky prístupy majú svoje silné a slabé stránky a odlišujú sa 
v komplexnosti. Predpoklad kinetiky prvého rádu môže by ť 
prílišným zjednodušením procesov degradácie a distribúcie, ale ak 
je možné, poskytuje hodnotu (rýchlostnú konštantu alebo pol čas), 
ktorá je ľahko zrozumite ľná a má zmysel pre simula čné modelovanie 
a výpočty očakávaných environmentálnych koncentrácií. Výsledkom 
empirických prístupov alebo lineárnych transformácií môže by ť 
lepšie prispôsobenie kriviek údajom, a preto umož ňujú lepšie stano ­
venie pol časov, hodnôt DT
 50 a v prípade potreby DT  75 a DT  90 . 
Použitie odvodených konštánt je však obmedzené. Kazetové modely môžu vytvori ť množstvo užito čných konštánt, ktoré majú význam pri 
hodnotení rizika, ktoré opisuje mieru degradácie v rôznych kazetách 
a distribúciu chemikálie. Používajú sa na stanovenie rýchlostných konštánt na tvorbu a degradáciu hlavných produktov transformácie. V každom prípade sa zvolená metóda musí zdôvodni ť 
a experimentátor demonštrova ť graficky a/alebo štatisticky správnos ť 
prispôsobenia.
 
3. PODÁVANIE SPRÁV  
3.1. SPRÁVA O TESTE 
Správa musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— všeobecný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec 
[uvádzajúci pozíciu ozna čenia(-í), ak sa použije rádioaktívne 
označený materiál] a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— čistota (ne čistoty) testovanej látky, 
— rádiochemická čistota ozna čenej chemikálie a molárna aktivita 
(v prípade potreby).  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referenčné látky: 
— chemický názov a štruktúra referen čných látok použitých na 
charakterizáciu a/alebo identifikáciu produktov transformácie. 
Testované sedimenty a vody: — umiestnenie a opis miesta (miest) odberu vzoriek vodného sedi ­
mentu vrátane, ak je to možné, predchádzajúcej kontaminácie, 
— všetky informácie týkajúce sa odberu, skladovania (ak sa usku ­
točnilo) a aklimatizácie systémov voda-sediment, 
— charakteristiky vzoriek voda-sediment, ako sú uvedené v tabu ľke 
v oddiele 1.8.2.2. 
Testovacie podmienky: — použitý systém testovania (napr. prietokový, biometrický, spôsob 
ventilácie, metóda miešania, objem vody, hmotnos ť sedimentu, 
výška vodnej vrstvy a vrstvy sedimentu, rozmer testovacích 
nádob atď.), 
— aplikácia testovanej látky na testovaný systém: použitá testovaná 
koncentrácia, po čet paralelných a kontrolných vzoriek, spôsob apli ­
kácie testovanej látky (napr. prípadného použitia rozpúš ťadla) atď., 
— inkuba čná teplota, 
— počet odberov, 
— extrak čné metódy a ú činnosti, ako aj analytické metódy 
a detekčné limity, 
— metódy na charakterizáciu/identifikáciu produktov transformácie, — odchýlky od protokolu testu alebo testovacích podmienok po čas 
štúdie. 
Výsledky: 
— číselné hodnoty nespracovaných údajov reprezentatívnych analýz 
(všetky nespracované údaje sa musia uchováva ť v SLP archíve), 
— opakovate ľnosť a citlivos ť použitých analytických metód, 
— miera regenerácie (percentuálne hodnoty pre platnú štúdiu sú 
uvedené v oddiele 1.7.1), 
— tabuľky s výsledkami vyjadrené ako % aplikovanej dávky a v mg/ ­
kg vo vode, sedimente a celkovom systéme (iba %) pre testovanú 
látku a v prípade potreby pre produkty transformácie a neextrahovate ľnú rádioaktivitu, 
— hmotnostná bilancia v priebehu a na konci štúdií, — grafické znázornenie transformácie vo vodných frakciách 
a frakciách sedimentu a v celkovom systéme (vrátane minerali ­
zácie), 
— miera mineralizácie,
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— polčas, hodnoty DT  50 a v prípade potreby DT  75 a DT  90 pre 
testovanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty trans ­
formácie vrátane hraníc spo ľahlivosti vo vode, sedimente 
a celkovom systéme, 
— vyhodnotenie kinetiky transformácie testovanej látky a v prípade 
potreby hlavných produktov transformácie, 
— údaje o cestách transformácie, v prípade potreby, — diskusia k výsledkom.
 
4. ODKAZY  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany. 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for regi ­
stration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). 
The Netherlands. 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides 
in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom. 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35 – 37. 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision 
N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, 
Anaerobic aquatic metabolism. 
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels. 
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18 – 20 January 1995. 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments. 
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080. 
(10) DFG Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). 
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945 – 956 (IUPAC 1984). 
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981). 
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals. 
(14) Scholz, K, Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149 – 158.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85 – 114. J. Wiley & Sons. 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631 – 637. 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661 – 667. 
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C. 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman. 
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038 – 1039. 
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3 – 4 July 1991. 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8 – 10. November 1993. Eds.: 
I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach. 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of 
environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858 
– 2868. 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329 – 338. 
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively- metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197 – 203. 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation extraction method. 
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13 – 21. 
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850 – 857. 
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527 – 1550. 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation 
tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499 – 1509.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing 
the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic 
anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597 – 3603. 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090. 
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961 – 968. 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187 – 203. 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47 – 60. 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and 
Diseases, 1349 – 1354.
 ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
DODATOK 1  
USMERNENIE K AERÓBNYM A ANAERÓBNYM TESTOVANÝM 
SYSTÉMOM  
Aeróbny testovaný systém  
Aeróbny testovaný systém opísaný v tejto testovacej metóde pozostáva 
z aeróbnej vodnej vrstvy (zvy čajné koncentrácie kyslíka v rozsahu od 7 mg/l do 
10 mg/l) a vrstvy sedimentu, aeróbnej na povrchu a anaeróbnej pod povrchom [zvyčajné priemerné redox potenciály (E
 h ) v anaeróbnej zóne sedimentu 
v rozsahu od – 80 do – 190 mV]. Nad povrchom vody v každej inkuba čnej 
jednotke sa preženie zvlh čený vzduch, aby sa vo vrchnej časti zabezpe čil 
dostatok kyslíka.  
Anaeróbny testovaný systém  
Pre anaeróbny testovaný systém je postup testu v podstate rovnaký, ako je 
uvedené pre aeróbny systém, s tou výnimkou, že zvlh čený dusík sa preženie 
nad povrchom vody v každej inkuba čnej jednotke, aby sa vo vrchnej časti 
zachoval dostatok dusíka. Sediment a voda sa pokladajú za anaeróbne, ke ď je 
redox potenciál (E  h ) nižší ako – 100 mV. 
V anaeróbnom teste vyhodnotenie mineralizácie zahrnuje meranie uvo ľneného 
oxidu uhli čitého a metánu.  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
DODATOK 2  
PRÍKLAD PLYNOVÉHO PRIETOKOVÉHO PRÍSTROJA
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
DODATOK 3  
PRÍKLAD BIOMETRICKÉHO PRÍSTROJA
  ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
DODATOK 4  
PRÍKLAD VÝPO ČTU PRE APLIKA ČNÚ DÁVKU V TESTOVACÍCH 
NÁDOBÁCH  
Vnútorný priemer valca: = 8 cm 
Výška vodného st ĺpca bez sedimentu: = 12 cm 
Povrch: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Aplikačná dávka: 500 g testovanej látky/ha 
zodpovedá 5 μg/cm  2 
Celkove μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Vzťah množstva k výške vodného st ĺpca 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Objem vodného st ĺpca: 50,3 × 12 = 603 ml 
Koncentrácia vo vode: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml alebo 50 μg/l ▼B 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AERÓBNA MINERALIZÁCIA V POVRCHOVEJ VODE – 
SIMULA ČNÝ TEST BIODEGRADÁCIE  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1. ÚVOD 
Cieľom tohto testu je stanovi ť časový priebeh biodegradácie testo ­
vanej látky pri nízkej koncentrácii v aeróbnej prírodnej vode a kvantifikova ť zistenia formou vyjadrenia kinetických rýchlostí. 
Tento simula čný test je laboratórny dávkový test trepa čkovej 
banky na stanovenie rýchlostí aeróbnej biodegradácie organických 
látok vo vzorkách prírodnej povrchovej vody (sladkej, poloslanej alebo morskej). Je založený na ISO/DIS 14592 – 1 (2) a obsahuje aj prvky z testovacích metód C.23 a C.24 (3) (4). Volite ľne sa môže 
v prípade dlhodobých testov nahradi ť dávkový postup semikontinu ­
álnym postupom, aby sa zabránilo degenerácii testovaného mikro ­
kozmu. Základným cie ľom simula čného testu je stanovi ť minerali ­
záciu testovanej látky v povrchovej vode a mineralizácia tvorí základ 
vyjadrenia kinetiky degradácie. Volite ľný druhý cie ľ testu však slúži 
na získanie informácií o primárnej degradácii a vzniku hlavných transforma čných produktov. Identifikácia transforma čných produktov 
a prípadne kvantifikácia ich koncentrácií sú osobitne dôležité 
v prípade ve ľmi pomaly mineralizujúcich látok (napr. s pol časmi 
pre celkový zvyškový
 14 C presahujúcimi 60 dní). Na identifikáciu 
a kvantifikáciu hlavných produktov transformácie sa musia kvôli analytickým obmedzeniam obvykle používa ť vyššie koncentrácie 
testovanej látky (napr. > 100 μg/l). 
Nízka koncentrácia v tomto teste znamená koncentráciu (napr. menej 
ako 1 μg/l až 100 μg/l), ktorá je dostato čne nízka na zabezpe čenie 
toho, aby kinetika biodegradácie získaná z testu odrážala koncen ­
trácie predpokladané v prostredí. V porovnaní s celkovým množ ­
stvom biologicky odbúrate ľných uhlíkových substrátov dostupných 
v prírodnej vode použitej v teste bude testovaná látka prítomná 
v nízkej koncentrácii slúži ť ako sekundárny substrát. Z toho vyplýva, 
že predpokladaná kinetika biodegradácie je prvého poriadku („neras ­
tová“ kinetika) a že testovaná látka sa môže da ť odbúrať „kometa ­
bolizmom“. Z kinetiky prvého poriadku vyplýva, že 
rýchlosť degradácie (mg/L/day) je úmerná koncentrácii látky, ktorá 
sa časom znižuje. V prípade pravej kinetiky prvého poriadku 
špecifická degrada čná rýchlostná konštanta k nie je závislá od času 
a koncentrácie. Znamená to, že k významne nemení svoju hodnotu 
počas pokusu a pridávanou koncentráciou medzi pokusmi sa nemení. 
Podľa definície sa špecifická degrada čná rýchlostná konštanta rovná 
relatívnej zmene koncentrácie za čas: k = (1/C) · (dC/dt). Aj ke ď sa 
obvykle predpokladá kinetika prvého poriadku za predpísaných 
podmienok, za ur čitých okolností môžu by ť vhodnejšie iné kinetiky. 
Odchýlky od kinetiky prvého poriadku sa môžu pozorova ť napríklad 
vtedy, ak jav prenosu hmoty, ako napr. rýchlos ť difúzie, obmedzuje 
skôr rýchlos ť biotransformácie ako rýchlos ť biologickej reakcie. 
Údaje sa dajú takmer vždy opísa ť kinetikou pseudoprvého poriadku 
pri akceptácii závislosti rýchlostnej konštanty od koncentrácie.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Informácie o biologickej odbúrate ľnosti testovanej látky pri vyšších 
koncentráciách (napr. zo štandardných skríningových testov), ako aj 
informácie o abiotickej odbúrate ľnosti, produktoch transformácie 
a príslušných fyzikálnochemických vlastnostiach musia by ť pred 
testom k dispozícii ako pomôcka pri plánovaní pokusu 
a interpretácii výsledkov. Použitie testovaných látok ozna čených  
14 C a stanovenie fázového rozdelenia  14 C na konci testu umožní 
stanoviť konečnú biologickú odbúrate ľnosť. Ak sa použije neozna ­ 
čená testovaná látka, možno odhadnú ť iba kone čnú biodegradáciu, 
ak sa testuje vyššia koncentrácia a všetky známe produkty transfor ­
mácie sú známe.  
1.2. VYMEDZENIE POJMOV  
Primárna biodegradácia : Štrukturálna zmena (transformácia) 
chemickej látky mikroorganizmami, ktorá má za následok stratu chemickej identity.  
Funkčná biodegradácia : Štrukturálna zmena (transformácia) 
chemickej látky mikroorganizmami, ktorá má za následok stratu 
špecifickej vlastnosti.  
Konečná aeróbna biodegradácia : Rozloženie chemickej látky 
mikroorganizmami v prítomnosti kyslíka na oxid uhli čitý, vodu 
a minerálne soli všetkých ostatných prítomných prvkov (mineralizá ­
cia) a vznik novej biomasy a organických mikrobiálnych produktov biosyntézy.  
Mineralizácia : Rozloženie chemickej látky alebo organického mate ­
riálu mikroorganizmami v prítomnosti kyslíka na oxid uhli čitý, vodu 
a minerálne soli všetkých ostatných prítomných prvkov.  
Lag fáza : Dosiahnutý čas od za čiatku testu do 
prispôsobenia degradujúcich mikroorganizmov a do zvýšenia stup ňa 
biodegradácie chemickej látky alebo organického materiálu na 
úroveň stanovite ľnosti (napr. 10 % maximálnej teoretickej biodegra ­
dácie alebo menej v závislosti od presnosti meracej techniky).  
Maximálna úrove ň biodegradácie : Stupeň biodegradácie chemickej 
látky alebo organickej hmoty v teste zaznamenaný v percentách, po ktorom sa už žiadna ďalšia biodegradácia neuskuto ční. 
Primárny substrát : Súbor prírodných zdrojov uhlíka a energie, 
ktoré zabezpe čujú rast a udržiavanie mikrobiálnej biomasy.  
Sekundárny substrát : Zložka substrátu prítomná v takej nízkej 
koncentrácii, že jej degradáciou by sa príslušným mikroorganizmom 
dodali iba nepatrné množstvá uhlíka a energie v porovnaní s uhlíkom a energiou dodanými degradáciou hlavných zložiek substrátu (pri ­
márne substráty).  
Degradačná rýchlostná konštanta : Rýchlostná konštanta prvého 
poriadku alebo pseudoprvého poriadku k (d
 –1 ), ktorá vyjadruje 
rýchlosť procesov degradácie. Pre dávkový pokus sa k odhadne zo 
začiatočnej časti degrada čnej krivky získanej po ukon čení lag fázy.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Polčas, t  1/2 (d): Termín používaný na charakterizáciu rýchlosti 
reakcie prvého poriadku. Je to časový interval, ktorý zodpovedá 
poklesu koncentrácie o faktor 2. Pol čas a degrada čná rýchlostná 
konštanta sú vo vz ťahu vyjadrenom rovnicou t  1/2 = ln2/k.  
Polčas degradácie, DT  50 (d): Termín používaný na kvantifikáciu 
výsledku biodegrada čných testov. Je to časový interval vrátane lag 
fázy, potrebný na dosiahnutie hodnoty 50 % biodegradácie.  
Detekčný limit (LOD) a kvantifika čný limit (LOQ) : Detekčný 
limit (LOD) je koncentrácia látky, pod ktorou nemožno odlíši ť iden­
titu látky od analytických údajov. Kvantifika čný limit (LOQ) je 
koncentrácia látky, pod ktorou nemožno stanovi ť koncentráciu 
s prípustnou presnos ťou. 
Rozpustený organický uhlík (DOC) : Tá časť organického uhlíka 
vo vzorke vody, ktorá sa nedá odstráni ť špecifickým oddelením fáz, 
napríklad centrifugáciou 15 minút pri 40 000 ms  –2 alebo membrá ­
novou filtráciou s použitím membrán s pórmi s priemerom 0,2 μm 
–0,45 μm. 
Celková aktivita organického  14 C (TOA) : Celková aktivita  14 C 
spojená s organickým uhlíkom.  
Aktivita rozpusteného organického  14 C (DOA) : Celková aktivita  14 C 
spojená s rozpustených organickým uhlíkom.  
Aktivita časticového organického  14 C (POA) : Celková aktivita  14 C 
spojená s organickým uhlíkom v časticiach.  
1.3. POUŽITE ĽNOSŤ TESTU 
Tento simula čný test sa dá použi ť na neprchavé alebo mierne prchavé 
organické látky testované pri nízkych koncentráciách. Pri použití baniek, 
ktoré umož ňujú prístup vzduchu (napr. s vatovými zátkami), sa môžu 
látky s Henryho konštantami menšími ako približne 1 Pa·m  3 /mol (pribl. 
10 –5 atm·m  3 /mol) v podstate poklada ť za neprchavé. Pri použití uzavre ­
tých baniek s plynnou fázou možno testova ť mierne prchavé látky (s 
Henryho konštantami < 100 Pa·m  3 /mol alebo < 10  –3 atm·m  3 /mol) bez 
strát z testovacieho systému. Ak sa pri odstra ňovaní CO  2 nevykonajú 
príslušné opatrenia, môže sa vyskytnú ť strata látok ozna čených  14 C. Za 
takýchto okolností môže by ť potrebné, aby sa CO  2 zachytil v internom 
absorbéri s alkalickým hydroxidom alebo aby sa použil externý absorpčný systém na CO
 2 (priame stanovenie  14 CO 2 , pozri 
dodatok 3). Na stanovenie kinetiky biodegradácie musia by ť koncen­
trácie testovanej látky nižšie ako jej rozpustnos ť vo vode. Je však 
potrebné pripomenú ť, že hodnoty rozpustnosti vo vode z literatúry 
môžu byť značne vyššie ako rozpustnos ť testovanej látky v prírodných 
vodách. Prípadne sa môže rozpustnos ť testovacích látok, ktoré sú 
mimoriadne zle rozpustné vo vode, stanovi ť tak, že sa použijú testované 
prírodné vody. 
Môže sa použi ť metóda na simuláciu biodegradácie v povrchovej 
vode bez hrubých častíc („pelagický test“) alebo v kalnej povrchovej 
vode, ktorá sa môže vyskytova ť napr. v blízkosti rozhrania voda/ ­
sediment („test suspendovaného sedimentu“).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. PRINCÍP TESTU 
Test sa uskuto čňuje v dávkach tak, že sa inkubuje testovaná látka 
buď iba s povrchovou vodou („pelagický test“), alebo s povrchovou 
vodou doplnenou o suspendované tuhé látky/sediment 0,01 až 1 g/L 
sušiny („test suspendovaného sedimentu“) na simuláciu vodného 
toku so suspendovanými tuhými látkami alebo resuspendovaným sedimentom. Koncentrácia suspendovaných tuhých látok/sedimentu v spodnom rozsahu tohto intervalu je typická pre vä čšinu povrcho ­
vých vôd. Testovacie banky sa inkubujú v tme pri teplote prostredia 
za aeróbnych podmienok a miešania. Na ú čely stanovenia 
kinetiky degradácie sa musia použi ť minimálne dve rozdielne 
koncentrácie testovanej látky. Koncentrácie sa musia navzájom odli ­ 
šovať o faktor 5 až 10 a mali by predstavova ť predpokladaný rozsah 
koncentrácií v prostredí. Maximálna koncentrácia testovanej látky nesmie by ť vyššia ako 100 μg/L, ale uprednost ňujú sa maximálne 
testované koncentrácie nižšie ako 10 μg/L alebo menej, aby sa 
zabezpečilo, že biodegradácia prebieha pod ľa kinetiky prvého 
poriadku. Najnižšia koncentrácia nesmie by ť vyššia ako 10 μg/L, 
ale uprednost ňujú sa najnižšie testované koncentrácie 1 – 2 μg/L 
alebo menej ako 1 μg/L. S použitím obchodne dostupných látok 
označených
 14 C možno uskuto čniť náležitú analýzu takejto nízkej 
koncentrácie. Pre analytické obmedzenia často nemožno stanovi ť 
koncentráciu testovanej látky s potrebnou presnos ťou, ak sa použije 
testovaná látka pri koncentrácii ≤ 100 μg/L (pozri druhý 
odsek v oddiele 1.7.2). Môžu sa použi ť vyššie koncentrácie testo ­
vanej látky (> 100 μg/L a niekedy > 1 mg/L) na identifikáciu 
a kvantifikáciu hlavných produktov transformácie alebo vtedy, ak 
nie je dostupná špecifická analytická metóda s nízkym detek čným 
limitom. Ak sa testujú vysoké koncentrácie testovanej látky, môže sa stať, že sa nebudú da ť použiť výsledky na stanovenie degrada čnej 
konštanty prvého poriadku a pol čas, keďže degradácia pravdepo ­
dobne nebude prebieha ť podľa kinetiky prvého poriadku. 
Ak sa použije špecifická chemická analýza, sleduje sa degradácia 
v príslušných časových intervaloch a meria sa bu ď zvyškový
 14 C, 
alebo zvyšková koncentrácia testovanej látky. Ozna čenie najstabil ­
nejšej časti molekuly  14 C zabezpe čuje stanovenie celkovej minerali ­
zácie, zatia ľ čo označenie  14 C najmenej stabilnej časti molekuly, ako 
aj použitie špecifickej analýzy umož ňuje iba vyhodnotenie primárnej 
biodegradácie. Najstabilnejšia časť však nemusí zah ŕňať relevantnú 
funkčnú časť molekuly (ktorá môže súvisie ť so špecifickou vlastno ­
sťou, ako napr. toxicita, bioakumulácia at ď.). V tomto prípade môže 
byť potrebné otestova ť látku ozna čenú  14 C vo funk čnej časti na 
sledovanie eliminácie špecifickej vlastnosti.  
1.5. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
V tomto teste sa môžu použi ť radioaktívne ozna čené aj neozna čené 
testované látky. Odporú ča sa technika ozna čenia  14 C a ozna čenie 
musí byť spravidla na najstabilnejšej časti(-iach) molekuly (pozri aj 
oddiel 1.4). Pre látky obsahujúce viac ako jeden aromatický kruh sa prednostne ozna čí
 14 C jeden alebo viac uhlíkov v každom kruhu. 
Okrem toho sa ozna čí 14 C jeden alebo viac uhlíkov na oboch stra ­
nách ľahko degradovate ľných väzieb. Chemická a/alebo rádioche ­
mická čistota testovanej látky musí by ť > 95 %. V prípade rádioak ­
tívne ozna čených látok sa uprednost ňuje špecifická aktivita 
v hodnote približne 50 μCi/mg (1,85 MBq) alebo viac, aby sa umož ­
nili merania  14 C v testoch s nízkymi za čiatočnými koncentráciami. 
Musia by ť dostupné tieto informácie o testovanej látke:  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— rozpustnos ť vo vode [metóda A.6], 
— rozpustnos ť v organickom(-ých) rozpúš ťadle(-ách) (látky použité 
s rozpúšťadlom alebo s nízkou rozpustnos ťou vo vode), 
— disocia čná konštanta (pKa), ak je látka náchylná na protonizáciu 
alebo deprotonizáciu [OECD TG 112] (5), 
— tlak pár [metóda A.4] a Henryho konštanta, — chemická stabilita vo vode a v tme (hydrolýza) [metóda C.7]. Ak sa testujú vo vode málo rozpustné látky v morskej vode, môže by ť 
takisto osožné pozna ť vysoľovací koeficient (alebo „Se čenovovov 
koeficient“) K
 s , ktorý je definovaný výrazom: log (S/S’) = K  s C m , 
kde S je rozpustnos ť látky v čerstvej vode a S’ je rozpustnos ť látky 
v morskej vode a C  m je molárna koncentrácia soli. 
Ak sa test vykonáva ako „test suspendovaného sedimentu“, musia 
byť k dispozícii aj tieto informácie: 
— rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda [metóda A.8], 
— adsorp čný koeficient [metóda C.18]. 
Ostatné osožné informácie môžu zah ŕňať: 
— environmentálnu koncentráciu, ak je známa alebo odhadnutá, — toxicitu testovanej látky pre mikroorganizmy [metóda C.11], 
— ľahkú a/alebo prirodzenú biodegradovate ľnosť [metódy C.4 A – F, 
C.12, C.9, OECD TG 302 (5)], 
— aeróbnu alebo anaeróbnu biodegradovate ľnosť v štúdiách transfor ­
mácie v pôde a systémoch sediment/voda [metódy C.23, C.24].
 
1.6. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Ako referen čnú látku je potrebné použi ť látku, ktorá sa za aeróbnych 
podmienok bežne ľahko odbúrava (napr. anilín alebo benzoát sodný). 
Predpokladaný časový interval pre degradáciu anilínu a benzoátu 
sodného je obvykle menej ako 2 týždne. Ú čelom referen čných 
látok je zabezpe čiť, aby mikrobiálna aktivita testovanej vody bola 
v určitých hraniciach, t. j. aby voda obsahovala aktívnu mikrobiálnu 
populáciu.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KRITÉRIÁ KVALITY  
1.7.1.  Vý ťažnosť 
Hneď po pridaní testovanej látky sa musí každá po čiatočná koncen ­
trácia preveri ť stanovením aktivity  14 C alebo chemickou analýzou 
v prípade neozna čených látok minimálne s jednou paralelnou vzor ­
kou. Poskytnú sa tým informácie o použite ľnosti a opakovate ľnosti 
analytickej metódy a o homogenite rozdelenia testovanej látky. Obvykle sa v následnej analýze údajov skôr používa nameraná 
počiatočná aktivita
 14 C alebo koncentrácia testovanej látky ako 
nominálna koncentrácia, ke ďže sa tým kompenzujú straty kvôli 
adsorpcii a chybám pri dávkovaní. Pre testovanú látku  14 C je úrove ň 
výťažnosti na konci pokusu daná hmotnostnou bilanciou (pozri 
posledný odsek v oddiele 1.8.9.4). V ideálnom prípade by mala byť radioaktívne ozna čená hmotnostná bilancia v rozsahu od 90 % 
do 110 %, zatia ľ čo analytická presnos ť v prípade neozna čených 
testovaných látok by mala vies ť k počiatočnej výťažnosti medzi 
70 % a 110 %. Tieto rozsahy je potrebné interpretova ť ako ciele 
a nemali by sa používa ť ako kritériá pre prípustnos ť testu. Volite ľne 
sa pre testovanú látku a pre hlavné produkty transformácie môže 
analytická presnos ť stanoviť pri nižšej koncentrácii ako po čiatočná 
koncentrácia.
 
1.7.2.  Opakovate ľnosť a citlivos ť analytickej metódy  
Opakovate ľnosť analytickej metódy (vrátane ú činnosti po čiatočnej 
extrakcie) na kvantifikáciu testovanej látky a produktov transfor ­
mácie sa v prípade potreby musí preveri ť piatimi paralelnými analý ­
zami jednotlivých extraktov povrchovej vody. 
Detekčný limit (LOD) analytickej metódy pre testovanú látku a pre 
produkty transformácie musí by ť aspoň 1 % z po čiatočného množ ­
stva aplikovaného na testovací systém, ak je to možné. Limit kvan ­
tifikácie (LOQ) musí by ť rovný alebo menší ako 10 % použitej 
koncentrácie. Chemická analýza mnohých organických látok a ich 
produktov transformácie často vyžaduje, aby sa testovaná látka 
použila v pomerne vysokej koncentrácii, t. j. > 100 μg/L. 
1.8. OPIS TESTOVACEJ METÓDY  
1.8.1.  Zariadenie  
Test sa môže vykonáva ť v Erlenmeyerových alebo valcovitých 
bankách vhodnej kapacity (napr. 0,5 alebo 1,0 litra) uzatvorených silikónovými alebo gumovými zátkami, alebo v sérových bankách s uzávermi neprepúš ťajúcimi CO
 2 (napr. s butylkau čukovou zátkou). 
Ďalšia možnos ť je vykona ť test s použitím viacerých baniek 
a zužitkova ť celé banky aspo ň v dvoch paralelkách v každom 
časovom intervale (pozri posledný odsek v oddiele 1.8.9.1). Pre 
neprchavé testované látky, ktoré nie sú rádioaktívne ozna čené, nie 
sú potrebné plynotesné zátky ani uzávery, vhodné sú vo ľné vatové 
zátky, ktoré zabra ňujú kontaminácii z ovzdušia (pozri druhý 
odsek v oddiele 1.8.9.1). Mierne prchavé látky sa musia testova ť 
v systéme biometrického typu jemným premiešavaním vodného 
povrchu. Na zabránenie bakteriálnej kontaminácii sa nádoby môžu 
prípadne pred použitím sterilizova ť zahriatím alebo autoklávovaním. 
Okrem toho sa môže použi ť toto štandardné laboratórne zariadenie: 
— trepačka alebo magnetické miešadlá na nepretržité miešanie testo ­
vacích baniek,  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifúga, 
— pH meter, 
— turbidimeter na nefelometrické merania zákalu, 
— pec alebo mikrovlnná pec na stanovenia sušiny, 
— prístroj na membránovú filtráciu, 
— autokláv alebo pec na tepelnú sterilizáciu sklených nádob, 
— zariadenia na manipuláciu s látkami ozna čenými  14 C, 
— zariadenie na kvantifikáciu aktivity  14 C vo vzorkách z roztokov 
na zachytávanie CO  2 a v prípade potreby zo vzoriek sedimentu, 
— analytické zariadenie na stanovenie testovanej (a referen čnej) 
látky, ak sa používa špecifická chemická analýza (napr. plynová 
chromatografia, vysokotlaková kvapalinová chromatografia).  
1.8.2.  Zásobné roztoky testovanej látky  
Na prípravu zásobných roztokov testovaných a referen čných látok sa 
používa deionizovaná voda (pozri prvý odsek v oddiele 1.8.7). Deio ­
nizovaná voda musí by ť zbavená látok, ktoré môžu by ť toxické pre 
mikroorganizmy, a rozpustený organický uhlík (DOC) nesmie tvori ť 
viac ako 1 mg/L (6).  
1.8.3.  Odber a preprava povrchovej vody  
Miesto odberu povrchovej vody sa zvolí v súlade s cie ľom testu 
v danej situácii. Pri výbere miest odberu sa musia posúdi ť predchá­
dzajúce možné vstupy z po ľnohospodárstva, priemyslu alebo domác ­
ností. Ak je známe, že vodné prostredie bolo kontaminované testo ­
vanou látkou alebo jej štrukturálnymi analógmi v priebehu predchá ­
dzajúcich štyroch rokov, nesmie sa použi ť na odber testovanej vody, 
pokiaľ preskúmanie rýchlostí degradácie v miestach, ktoré už boli 
vystavené pôsobeniu, nie je výslovným cie ľom výskumného pracov ­
níka. V mieste odberu sa zmeria pH a teplota vody. Ďalej je potrebné 
zaznamena ť hĺbku odberu vzorky a vzh ľad vzorky vody (napr. farbu 
a zakalenie) (pozri oddiel 3). Stanoví sa koncentrácia kyslíka a/alebo redoxný potenciál vo vode a v povrchovej vrstve sedimentu na 
dôkaz aeróbnych podmienok, pokia ľ to nie je zrejmé z posúdenia 
vzhľadu a predchádzajúcich skúseností s týmto miestom. Povrchová 
voda sa prepravuje v dôkladne vy čistenej nádobe. Po čas prepravy 
nesmie teplota vzorky výrazne prekro čiť teplotu používanú v teste. 
Odporúča sa chladenie pri 4 °C, ak preprava trvá viac ako 2 až 
3 hodiny. Vzorka vody nesmie by ť zamrznutá.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Skladovanie a príprava povrchovej vody  
Test je potrebné prednostne za čať do nasledujúceho d ňa po odbere 
vzorky. Skladovanie vody je v prípade potreby nevyhnutné minima ­
lizovať a nesmie v žiadnom prípade prekro čiť maximálne 4 týždne. 
Vzorka vody sa do použitia udržiava pri 4 °C za prístupu vzduchu. 
Pred použitím sa odstránia hrubé častice, napr. filtráciou cez nylo ­
nový filter približne s 100 μm veľkosťou ôk alebo cez hrubý papie ­
rový filter, alebo sedimentáciou.  
1.8.5.  Príprava vody doplnenej o sediment (volite ľné) 
Pre test suspendovaného sedimentu sa pridá povrchový sediment do 
baniek obsahujúcich prírodnú vodu (filtrovanú na ú čely odstránenia 
hrubých častíc, ako je uvedené v oddiele 1.8.4), aby sa získala suspenzia; 
koncentrácia suspendovaných tuhých látok musí by ť medzi 0,01 a 1 g/L. 
Povrchový sediment musí pochádza ť z rovnakého miesta, z ktorého bola 
odobratá vzorka vody. V závislosti od konkrétneho vodného prostredia 
môže byť povrchový sediment charakterizovaný bu ď vysokým obsahom 
organického uhlíka (2,5 % –7,5 %) a jemnou textúrou, alebo nízkym obsahom organického uhlíka (0,5 % –2,5 %) a hrubou textúrou (2). Povrchový sediment sa môže pripravi ť takto: extrahujte nieko ľko jadier 
sedimentov s použitím skúmavky z priesvitného plastu, odrežte vrchné 
aeróbne vrstvy (z povrchu do h ĺbky max. 5 mm) hne ď po odbere vzorky 
a spojte ich dohromady. Výsledná vzorka sedimentu sa musí prepra ­
vovať v nádobe s ve ľkou plynnou fázou, aby sa sediment udržiaval 
v aeróbnych podmienkach (ochla ďte na 4 °C, ak preprava trvá viac 
ako 2 až 3 hodiny). Vzorka sedimentu sa suspenduje v testovanej vode v pomere 1: 10 a do použitia sa udržiava pri 4 °C za prístupu vzduchu. Skladovanie sedimentu je v prípade potreby nevyhnutné mini ­
malizovať a nesmie v žiadnom prípade prekro čiť maximálne 4 týždne.
 
1.8.6.  Semikontinuálny postup (volite ľné) 
Môže by ť potrebné pred ĺžiť inkubáciu (nieko ľko mesiacov), ak sa 
vyskytuje dlhá lag fáza predtým, ako možno stanovi ť 
významnú degradáciu testovanej látky. Ak je toto známe 
z predchádzajúceho testovania látky, test možno za čať s použitím 
semikontinuálneho postupu, ktorý umož ňuje pravidelné obnovovanie 
časti testovanej vody alebo suspenzie (pozri dodatok 2). Alternatívne 
sa môže bežný dávkový test zmeni ť na semikontinuálny test, ak sa 
nedosiahne žiadna degradácia testovanej látky po čas približne 60 dní 
testovania s použitím dávkového postupu (pozri druhý odsek v oddiele 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Pridávanie testovanej (alebo referen čnej) látky  
Pre látky s vysokou rozpustnos ťou vo vode (> 1 mg/L) a nízkou prcha ­
vosťou (Henryho konštanty < 1 Pa·m  3 /mol alebo < 10  –5 atm·m  3 /mol) 
sa môže pripravi ť zásobný roztok v deionizovanej vode (pozri 
oddiel 1.8.2); do testovacích nádob sa pridá príslušný objem zásobného 
roztoku, aby sa dosiahla požadovaná koncentrácia. Je potrebné, aby bol objem každého pridaného zásobného roztoku čo možno najmenší 
(< 10 % kone čného objemu kvapaliny, ak je to možné). Ďalší postup 
je rozpusti ť testovanú látku vo vä čšom objeme testovanej vody, ktorá 
môže byť alternatívou použitia organických rozpúš ťadiel.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Ak je to nevyhnutné, pripravia sa zásobné roztoky neprchavých látok 
s nízkou rozpustnos ťou vo vode s použitím prchavého organického 
rozpúšťadla, ale množstvo pridaného rozpúš ťadla do testovacieho 
systému nesmie by ť vyššie ako 1 objemové % a nesmie ma ť škod­
livé účinky na mikrobiálnu aktivitu. Rozpúš ťadlo nesmie ovplyvni ť 
stabilitu testovanej látky vo vode. Rozpúš ťadlo sa musí odstráni ť až 
do extrémne malého množstva tak, aby významne nezvýšilo koncen ­
tráciu DOC testovanej vody alebo suspenzie. Je to potrebné skon ­
trolovať špecifickou analýzou pre látku alebo ak je možné, analýzou 
DOC (6). Je potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby sa množstvo 
preneseného rozpúš ťadla obmedzilo na čo najnižšiu potrebnú mieru, 
a zabezpe čiť, aby sa množstvo testovanej látky dalo rozpusti ť 
v konečnom objeme testovanej vody. Môžu sa použi ť iné techniky 
na pridávanie testovanej látky do testovacích nádob, ako je uvedené 
v (7) a (8). Ak sa používa organické rozpúš ťadlo na aplikáciu testo ­
vanej látky, s kontrolami s rozpúš ťadlom obsahujúcimi testovanú 
vodu (bez žiadnych prídavných látok) a testovanú vodu s pridanou 
referenčnou látkou sa musí zaobchádza ť rovnako ako s aktívnymi 
testovacími nádobami doplnenými o testovanú látku v nosi či, ktorým 
je rozpúš ťadlo. Účelom kontrol s rozpúš ťadlom je preskúma ť 
prípadné škodlivé ú činky na mikrobiálnu populáciu spôsobené 
rozpúšťadlom, ako nazna čuje degradácia referen čnej látky.  
1.8.8.  Testovacie podmienky  
1.8.8.1.  Teplota pri teste  
Inkubácia sa musí vykonáva ť v tme (prednostne) alebo v difúznom 
svetle pri regulovanej teplote (± 2 °C), čo môže by ť teplota terénu 
alebo štandardná teplota 20 °C – 25 °C. Teplota terénu môže by ť 
buď aktuálna teplota vzorky v čase odberu vzorky, alebo priemerná 
teplota terénu v mieste odberu.  
1.8.8.2.  Miešanie  
Musí sa zabezpe čiť miešanie nepretržitým trepaním alebo miešaním, 
aby sa zachovala suspenzia častíc a mikroorganizmov. Miešanie tiež 
uľahčuje prenos kyslíka z plynnej fázy do kvapaliny tak, že možno 
náležite zachova ť aeróbne podmienky. Umiestnite banky na trepa čku 
(trepanie približne pri 100 rpm) alebo použite magnetické miešanie. Miešanie musí by ť nepretržité. Trepanie alebo miešanie musí by ť čo 
najmiernejšie, avšak také, aby sa neustále zachovala homogénna 
suspenzia.
 
1.8.8.3.  Dĺžka testu  
Dĺžka testu obvykle nemá presiahnu ť 60 dní, pokia ľ sa nepoužíva 
semikontinuálny postup s pravidelným obnovovaním testovanej suspenzie (pozri oddiel 1.8.6 a dodatok 2). Čas testu v prípade 
dávkového testu sa môže pred ĺžiť maximálne na 90 dní, ak 
sa degradácia testovanej látky za čala počas prvých 60 dní. Degra ­
dácia sa monitoruje v príslušných časových intervaloch stanovením 
zvyškovej aktivity
 14 C alebo uvo ľneného  14 CO 2 (pozri 
oddiel 1.8.9.4) a/alebo chemickou analýzou (oddiel 1.8.9.5). Inku ­
bačný čas musí by ť dostatočne dlhý na vyhodnotenie degrada čného 
procesu. Prednostne by miera degradácie mala by ť vyššia ako 50 %; 
pre pomaly degradovate ľné látky miera degradácie musí by ť dosta­
točná (obvykle vyššia ako 20 % degradácia) na zabezpe čenie stano ­
venia kinetickej degrada čnej rýchlostnej konštanty.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
V testovacom systéme sa musia vykonáva ť pravidelné merania 
koncentrácie pH a kyslíka, pokia ľ z predchádzajúcich skúseností 
z podobných testov so vzorkami vôd a sedimentu odobratých z rovnakého miesta nevyplýva zbyto čnosť takýchto meraní. Za ur či­
tých podmienok by metabolizmus primárnych substrátov pri ove ľa 
vyšších koncentráciách vo vode alebo sedimente mohol ma ť za 
následok dostato čné uvoľnenie CO
 2 a vyčerpanie kyslíka, ktoré 
významne zmenia experimentálne podmienky po čas testu.  
1.8.9.  Postup  
1.8.9.1.  Príprava baniek na pelagický test  
Preneste príslušný objem testovanej vody do testovacích baniek, do 
približne jednej tretiny objemu banky a najmenej okolo 100 ml. Ak 
sa používajú viaceré banky (aby sa umožnilo zužitkovanie celých 
baniek v každom čase odberu vzoriek), je vhodný objem testovanej 
vody tiež približne 100 ml, ke ďže malé objemy vzoriek môžu 
ovplyvňovať dĺžku lag fázy. Testovaná látka sa pridáva zo zásob ­
ného roztoku, ako je uvedené v oddieloch 1.8.2 a 1.8.7. Je potrebné 
použiť minimálne dve rozdielne koncentrácie testovanej látky odli ­ 
šujúce sa o faktor 5 až 10 na stanovenie kinetiky degradácie a výpočet kinetickej degrada čnej rýchlostnej konštanty. Obe zvolené 
koncentrácie musia by ť menšie ako 100 μg/L a prednostne 
v rozmedzí < 1 – 10 μg/L. 
Uzavrite banky zátkami alebo uzávermi neprepúš ťajúcimi vzduch 
a CO
 2 . Pre neprchavé testované chemické látky, neozna čené 14 C, 
sú vhodné vo ľné vatové zátky, ktoré zabra ňujú kontaminácii 
z ovzdušia (pozri oddiel 1.8.1), za predpokladu, že všetky hlavné 
produkty degradácie sú známe ako neprchavé a ak sa používa 
nepriame stanovenie CO  2 (pozri dodatok 3). 
Inkubujte banky pri zvolenej teplote (pozri oddiel 1.8.8.1). Na 
začiatku testu odoberte vzorky na chemickú analýzu alebo stano ­
venia  14 C (t. j. predtým ako sa za čne biodegradácia; pozri 
oddiel 1.7.1) a potom v príslušných časových intervaloch 
v priebehu testu. Odber vzoriek sa môže vykona ť odoberaním čias­
točných vzoriek (napr. 5 ml alikvóty) z každej paralelky alebo zužit ­
kovať celé banky v každom čase odberu vzoriek. Mineralizácia testo ­
vanej látky sa môže stanovi ť buď nepriamo, alebo priamo (pozri 
dodatok 3). Obvykle je potrebných minimálne pä ť odberov 
počas degrada čnej fázy (t. j. po ukon čení lag fázy) na stanovenie 
spoľahlivej rýchlostnej konštanty, pokia ľ sa nedá odôvodni ť, že pre 
rýchlo degradujúce látky sú posta čujúce tri odbery. Pre látky, ktoré 
sa počas degrada čnej fázy nedegradujú rýchlo, možno ľahko usku ­
točniť viac meraní, a preto sa na stanovenie k musí použi ť viac 
experimentálnych bodov. Nedá sa stanovi ť pevný harmonogram 
pre odber vzoriek, lebo rýchlos ť biodegradácie je premenlivá, ale 
odporúča sa, ak je degradácia pomalá, odobera ť vzorky raz do 
týždňa. Ak je testovaná látka rýchlo degradovate ľná, odber vzoriek 
sa musí uskuto čniť jedenkrát za de ň počas prvých troch dní a potom 
každý druhý alebo tretí de ň. Za určitých okolností, ako napr. 
v prípade ve ľmi rýchlo hydrolyzujúcich látok, môže by ť potrebné 
odoberať vzorky v hodinových intervaloch. Odporú ča sa, aby sa 
uskutočnila predbežná štúdia pred testom na stanovenie vhodných 
intervalov odberov vzoriek. Ak musia by ť vzorky k dispozícii pre 
ďalšie špecifické analýzy, odporú ča sa odobra ť viac vzoriek a potom 
vybrať tie, ktoré sa budú analyzova ť na konci pokusu na základe 
obrátenej stratégie, t. j. posledné vzorky sa analyzujú prvé (pozri 
druhý odsek v oddiele 1.8.9.5 pre pokyny o stabilite vzoriek po čas 
skladovania).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Počet baniek a vzoriek  
Pripravte dostato čný počet testovacích baniek, aby ste mali 
k dispozícii: 
— testovacie banky; minimálne dve banky pre každú koncentráciu 
testovanej látky (prednostne minimálne 3) alebo viac testovaných 
baniek pre každú koncentráciu, ak sa zužitkujú celé banky 
v každom čase odberu (ozna čené ako F  T ), 
— testovacie banky pre výpo čet hmotnostnej bilancie; minimálne 
dve banky pre každú koncentráciu testovanej látky (ozna čené 
ako F  M ), 
— slepú kontrolu, bez testovanej látky; minimálne jedna čistá testo­
vacia banka obsahujúca iba testovanú vodu (ozna čené ako F  B ), 
— referen čnú kontrolu; dve paralelné banky s referen čnou látkou 
(napr. anilín alebo benzoát sodný s koncentráciou 10 μg/l) (ozna ­ 
čené ako F  C ). Účelom referen čnej kontroly je potvrdi ť minimálnu 
mikrobiálnu aktivitu. Ak je to vhodné, môže sa použi ť radioak­
tívne ozna čená referen čná látka aj vtedy, ke ď sa degradácia testo ­
vanej látky sleduje chemickou analýzou, 
— sterilnú kontrolu; jedna alebo dve banky obsahujúce sterilizovanú 
testovanú vodu na preskúmanie prípadnej abiotickej degradácie alebo inej nebiologickej eliminácie testovanej látky (ozna čené 
ako F
 S ). Biologickú aktivitu možno zastavi ť autoklávovaním 
(121 °C; 20 min) testovanej vody alebo pridaním toxickej látky (napr. azid sodný (NaN
 3 ) v množstve 10 – 20 g/l, chlorid ortu ť­
natý (HgCl  2 ) v množstve 100 mg/l alebo formalín v množstve 
100 mg/l) alebo gamma žiarením. Ak sa použije HgCl  2 , musí sa 
zneškodňovať ako toxický odpad. V prípade vody s ve ľkým 
množstvom pridaného sedimentu nie je jednoduché dosiahnu ť 
sterilné podmienky; v takomto prípade sa odporú ča opakované 
autoklávovanie (napr. trikrát). Je potrebné zoh ľadniť, že sa môžu 
počas autoklávovania zmeni ť sorpčné vlastnosti sedimentu, 
— kontroly rozpúš ťadla obsahujúce testovanú vodu a testovanú 
vodu s referen čnou látkou; dve paralelné banky s rovnakým 
množstvom rozpúš ťadla a s použitím rovnakého postupu, ako 
sa používa pri aplikácii testovanej látky. Ú čelom je preskúma ť 
možné škodlivé ú činky rozpúš ťadla stanovením degradácie refe ­
renčnej látky. 
Pri zostavovaní testu by výskumný pracovník mal zoh ľadniť rela­
tívnu dôležitos ť väčšieho počtu paraleliek v pokuse v porovnaní so 
zvýšeným po čtom časov odberu. Presné číslo baniek bude závisie ť 
od použitej metódy na stanovenie degradácie (pozri tretí 
odsek v oddiele 1.8.9.1, odsek 1.8.9.4 a dodatok 3).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
V každom čase odberu sa musia odobra ť z každej testovanej banky 
dve čiastočné vzorky (napr. 5 ml alikvóty). Ak sa použije viac 
baniek, aby sa umožnilo zbieranie celých baniek, musia sa obetova ť 
minimálne dve banky v každom čase odberu (pozri prvý 
odsek v oddiele 1.8.9.1).  
1.8.9.3.  Príprava baniek na test suspendovaného sedimentu [volite ľné] 
Pridajte potrebné objemy testovanej vody a sedimentu, ak je 
potrebné, do testovacích nádob (pozri oddiel 1.8.5). Príprava baniek pre test suspendovaného sedimentu je rovnaká ako pre pelagický test 
(pozri oddiely 1.8.9.1 a 1.8.9.2). Použite prednostne sérové f ľašky 
alebo banky podobného tvaru. Umiestnite uzatvorené banky na trepačku horizontálne. Otvorené banky pre neprchavé látky 
a neoznačené
 14 C je potrebné umiestni ť vo zvislej polohe; v tomto 
prípade sa odporú ča magnetické miešanie s použitím magnetických 
miešadielok pokrytých sklom. V prípade potreby f ľašky prevzduš ­
nite, aby boli zachované správne aeróbne podmienky.  
1.8.9.4.  Rádiochemické stanovenia  
Uvoľnený  14 CO 2 sa stanovuje nepriamo a priamo (pozri dodatok 3).  
14 CO 2 sa stanovuje nepriamo na základe rozdielu medzi po čiatočnou 
aktivitou  14 C v testovanej vode alebo suspenzii a celkovou 
zvyškovou aktivitou v čase odberu vzorky meranej po okyslení 
vzorky na pH 2 – 3 a odstránení CO  2 . Anorganický uhlík sa tým 
odstráni a meraná zvyšková aktivita pochádza z organického mate ­
riálu. Nepriame stanovenie  14 CO 2 sa nesmie použi ť, ak počas trans­
formácie testovanej látky vznikajú prchavé hlavné produkty trans ­
formácie (pozri dodatok 3). Ak je to možné, je potrebné mera ť 
uvoľnenie  14 CO 2 priamo (pozri dodatok 3) v každom čase odberu 
vzoriek aspo ň v jednej testovacej banke; tento postup umož ňuje 
kontrolu hmotnostnej bilancie aj procesu biodegradácie, ale je obme ­
dzený na testy uskuto čnené s uzatvorenými bankami. 
Ak sa stanovuje uvo ľnený  14 CO 2 priamo po čas testu, musí sa na 
tento účel na za čiatku testu pripravi ť viac baniek. Odporú ča sa 
priame stanovenie  14 CO 2 , ak počas transformácie testovanej látky 
vznikajú prchavé hlavné produkty transformácie. V každom bode merania sa okyslia ďalšie testovacie banky na pH 2 – 3 a
 14 CO 2 
sa zhromaždí v internom alebo externom absorbéri (pozri dodatok 3). 
Prípadne sa koncentrácie testovanej látky ozna čenej  14 C a hlavné 
produkty transformácie môžu stanovi ť s použitím rádiochromato ­
grafie (napr. chromatografia na tenkej vrstve, RAD-TLC) alebo 
HPLC s rádiochemickou detekciou. 
Prípadne sa môže stanovi ť fázové rozdelenie zvyškovej rádioaktivity 
(pozri dodatok 1) a zvyšnej testovanej látky a môžu sa stanovi ť 
produkty transformácie.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Na konci testu sa musí stanovi ť hmotnostná bilancia priamym 
meraním  14 CO 2 s použitím oddelených testovacích baniek, 
z ktorých sa po čas testu neodoberú žiadne vzorky (pozri dodatok 3).  
1.8.9.5.  Špecifická chemická analýza  
Ak je k dispozícii citlivá špecifická analytická metóda, primárna 
biodegradácia sa môže namiesto použitia techník rádioaktívneho označovania vyhodnoti ť meraním celkovej zvyškovej koncentrácie 
testovanej látky. Ak sa používa rádioaktívne ozna čená testovaná 
látka (na meranie celkovej mineralizácie), môže sa paralelne usku ­
točniť špecifická chemická analýza, aby poskytla ďalšie užito čné 
informácie, a na kontrolu postupu. Špecifická chemická analýza sa 
môže tiež použi ť na meranie transformácie produktov, ktoré sa tvoria 
počas degradácie testovanej látky, a to sa odporú ča pre látky, ktoré 
sa mineralizujú, s pol časmi viac ako 60 dní. Koncentrácia testovanej 
látky a produktov transformácie pri každom odbere sa stanoví 
a zaznamená (ako koncentrácia a ako percentuálny podiel použitého 
množstva). Vo všeobecnosti sa produkty transformácie stanovené pri ≥ 10 % použitej koncentrácie v ktoromko ľvek čase odberu vzoriek 
musia identifikova ť, pokiaľ neexistuje iný riadne odôvodnený 
postup. Produkty transformácie, pre ktoré sa koncentrácie trvale 
zvyšujú po čas štúdie, sa tiež posúdia na ú čely identifikácie, aj ke ď 
ich koncentrácie nepresahujú vyššie uvedené limity, lebo to môže byť dôkazom perzistencie. Je potrebné zváži ť analýzu produktov 
transformácie v sterilných kontrolkách, ak sa usudzuje, že by bola 
možná rýchla abiotická transformácia testovanej látky (napr. hydro ­
lýza). Pod ľa jednotlivých prípadov je potrebné uváži ť potrebu kvan ­
tifikácie a identifikácie a v správe sa uvedú odôvodnenia. Extrak čné 
techniky s organickým rozpúš ťadlom sa musia použi ť podľa 
pokynov v príslušnom analytickom postupe. 
Všetky vzorky sa musia skladova ť pri 2 °C až 4 °C a bez prístupu 
vzduchu, ak sa analýza uskuto ční do 24 hodín (prednostne). 
V prípade dlhšieho skladovania sa vzorky zmrazia pod – 18 °C 
alebo sa chemicky zakonzervujú. Acidifikácia ako metóda na konzer ­
váciu vzoriek sa neodporú ča, pretože acidifikované vzorky môžu by ť 
nestabilné. Ak sa vzorky neanalyzujú do 24 hodín a skladujú sa 
dlhšie, je potrebné uskuto čniť
 štúdiu stability po čas skladovania, 
aby sa dokázala stabilita chemických látok, pri skladovaní pod – 18 °C alebo v podmienkach konzervácie. Ak analytická metóda 
obsahuje bu ď extrakciu rozpúš ťadla, alebo extrakciu tuhej fázy 
(ETF), extrakcia sa musí uskuto čniť hneď po odbere vzoriek alebo 
po uskladnení vzoriek v chladni čke maximálne 24 hodín. 
V závislosti od citlivosti analytickej metódy môžu by ť potrebné 
väčšie objemy vzoriek, ako sú uvedené v odseku 16. Test sa môže 
jednoducho vykona ť s jednolitrovými testovanými objemami v 2 – 
3-litrových bankách, ktoré umož ňujú odber približne 100 ml vzoriek.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. ÚDAJE A SPRÁVY  
2.1. SPRACOVANIE VÝSLEDKOV  
2.1.1.  Grafické zaznamenanie údajov  
Zaokrúhlite časy odberu na celé hodiny (pokia ľ sa látka podstatne 
nedegraduje za nieko ľko minút až hodín), ale nie na celé dni. 
Graficky zaznamenajte odhady zvyškovej aktivity testovanej látky 
(pre látky ozna čené 14 C) alebo zvyškovú koncentráciu (pre neozna ­ 
čené látky) proti času v lineárnom aj v semilogaritmickom grafe 
(pozri obrázky 1a, 1b). Ak prebieha degradácia, porovnajte výsledky 
z baniek F  T s výsledkami z baniek F  S . Ak sa stredné hodnoty 
výsledkov z baniek s testovanou látkou (F  T ) a sterilných baniek 
(F S ) odchyľujú o menej ako 10 %, dá sa predpoklada ť, že 
pozorovaná degradácia je hlavne abiotická. Ak je degradácia 
v bankách F  S nižšia, môžu sa použi ť čísla na korekciu čísel získa ­
ných z baniek F  T (odpočítaním) na odhad miery biodegradácie. Ak 
sa uskuto čnia volite ľné analýzy pre hlavné produkty transformácie, 
je potrebné okrem grafu rozkladu testovanej látky poskytnú ť grafy 
znázorňujúce ich tvorbu a rozklad. 
Stanovte d ĺžku lag fázy t  L z degrada čnej krivky (semilogaritmický 
graf) extrapoláciou jej lineárnej časti na nulovú degradáciu alebo 
alternatívne stanovením času pre približne 10 % degradáciu (pozri 
obrázky 1a a 1b). Zo semilogaritmického grafu stanovte rýchlostnú 
konštantu prvého poriadku k a jej štandardnú chybu lineárnou 
regresiou ln (zvyškovej aktivity  14 C alebo koncentrácie testovanej 
látky) proti času. Pomocou predovšetkým meraní  14 C použite iba 
údaje prislúchajúce po čiatočnej lineárnej časti krivky po ukon čenej 
lag fáze a uprednostnite skôr výber menšieho množstva údajov, ktoré 
sú reprezentatívne, pred výberom vä čšieho množstva nespo ľahlivej­ 
ších údajov. Nespo ľahlivosť sa v tomto prípade týka chýb súvisia ­
cich s odporú čaným priamym použitím nameraných zvyškových 
aktivít  14 C (pozri nižšie). Niekedy môže by ť potrebné vypo čítať 
dve odlišné rýchlostné konštanty, ak degradácia prebieha pod ľa bifá­
zického modelu. Na tento ú čel sa definujú dve odlišné 
fázy degrada čnej krivky. Pre každú jednu paralelnú banku sa 
musia urobi ť výpočty rýchlostnej konštanty k a pol času t  ½ = ln2/k, 
ak sa odoberajú čiastočné vzorky z rovnakej banky, alebo s použitím 
priemerných hodnôt, ak sa zužitkujú celé banky v každom čase 
odberu (pozri posledný odsek v oddiele 1.8.9.2). Ak sa použije 
prvý uvedený postup, je potrebné uvies ť v správe rýchlostnú 
konštantu a pol čas pre každú jednu paralelnú banku ako priemernú 
hodnotu so štandardnou chybou. Ak sa použili vysoké koncentrácie testovanej látky, degrada čná krivka sa môže zna čne odchýli ť od 
rovnej čiary (semilogaritmický graf) a kinetika prvého poriadku 
nemusí plati ť. Preto nemá zmysel definova ť polčas. V prípade obme ­
dzeného rozsahu údajov sa však môže použi ť kinetika pseudoprvého 
poriadku a stanovi ť polčas degradácie DT
 50 (čas dosiahnutia 
50 % degradácie). Je potrebné však pamäta ť na to, že časový 
priebeh degradácie mimo zvoleného rozsahu údajov sa nedá pred ­
povedať s použitím DT  50 , ktorý je iba deskriptorom daného súboru 
údajov. Analytické nástroje na u ľahčenie štatistických výpo čtov a na 
zostrojenie krivky sú ľahko dostupné a odporú ča sa používa ť tento 
druh softvéru.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Ak sa vykonáva špecifická chemická analýza, stanovte rýchlostné 
konštanty a pol časy pre primárnu degradáciu, ako je uvedené vyššie 
pre celkovú mineralizáciu. Ak primárna degradácia je ohrani čeným 
procesom, môžu sa použi ť experimentálne údaje z celého 
priebehu degradácie. Je to preto, že merania sú na rozdiel od meraní 
aktivity  14 C priame. 
Ak sa použijú látky ozna čené 14 C, aspoň na konci testu sa musí 
vyjadriť hmotnostná bilancia ako percento použitej za čiatočnej 
koncentrácie.  
2.1.2.  Zvyšková aktivita  
Ak sa biologicky degraduje časť organickej látky ozna čená 14 C, 
hlavná časť 14 C sa premení na  14 CO 2 , zatiaľ čo ďalšia časť sa 
využije na rast biomasy a/alebo syntézu mimobunkových metaboli ­
tov. Z tohto dôvodu úplná „kone čná“ biodegradácia látky nemá za 
následok 100 % konverziu uhlíka na  14 CO 2 . 14 C zabudovaný do 
produktov vytvorených biosyntézou sa následne pomaly uvo ľňuje 
ako  14 CO 2 pre „sekundárnu mineralizáciu“. Z týchto dôvodov sa 
v grafických znázorneniach zvyškovej organickej aktivity  14 C 
(meranej po uvo ľnení CO  2 ) alebo  14 CO 2 proti času po 
ukončení degradácie ukazuje „chvostovanie“. To s ťažuje kinetickú 
interpretáciu údajov a z tohto dôvodu by sa na stanovenie degrada čnej rýchlostnej konštanty mala obvykle použi ť 
iba začiatočná časť krivky (po ukon čení lag fázy a predtým, ako sa 
dosiahne približne 50 % degradácie). Ak sa degraduje testovaná látka, celková zvyšková aktivita organického
 14 C je vždy vyššia 
ako aktivita  14 C spojená so zvyšnou intaktnou testovanou látkou. 
Ak sa testovaná látka degraduje reakciou prvého poriadku 
a konštantná časť α sa mineralizuje na CO  2 , počiatočný sklon krivky 
úbytku  14 C (celkový organický  14 C proti času) bude α časy sklonu 
príslušnej krivky pre koncentráciu testovanej látky (alebo aby sme 
boli presní, časť testovanej látky ozna čenej  14 C). Na základe meraní 
celkovej nekorigovanej aktivity organického  14 C bude preto 
vypočítaná degrada čná rýchlostná konštanta konzervatívna. Postupy 
na stanovenie koncentrácií testovanej látky z nameraných rádioche ­
mických aktivít, založené na rôznych zjednodušujúcich predpokla ­
doch, sú uvedené v odkazoch (2) (9) (10) (11). Takéto postupy sa najjednoduchšie používajú pre rýchlo degradovate ľné látky.
 
2.2. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV 
Ak sa zistí, že k je nezávislá od pridanej koncentrácie (t. j. ak 
vypočítané k je približne rovnaké ako pri rôznych koncentráciách 
testovanej látky), dá sa predpoklada ť, že rýchlostná konštanta prvého 
poriadku je reprezentatívna pre použité testovacie podmienky, t. j. 
testovanú látku, vzorku vody a teplotu pri teste. To, do akej miery sa dajú výsledky zovšeobecni ť alebo extrapolova ť na iné systémy, sa 
musí odborne posúdi ť. Ak sa použije vysoká koncentrácia testovanej 
látky a degradácia preto neprebieha pod ľa kinetiky prvého poriadku, 
údaje sa nedajú použi ť na priame stanovenie rýchlostnej konštanty 
prvého poriadku alebo príslušný pol čas. Údaje odvodené z testu 
s použitím vysokej koncentrácie testovanej látky sa môžu ešte stále 
použiť na stanovenie stup ňa celkovej mineralizácie a/alebo na 
detekciu a kvantifikáciu produktov transformácie.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Ak sú známe rýchlosti iných procesov úbytku ako biodegradácia 
(napr. hydrolýza alebo prchavos ť), môžu sa odpo čítať od čistej 
rýchlosti úbytku zistenej po čas testu na stanovenie približného 
odhadu rýchlosti biodegradácie. Údaje pre hydrolýzu sa môžu získa ť 
napr. zo sterilnej kontroly alebo z paralelného testovania s použitím 
vyššej koncentrácie testovanej látky. 
Nepriame a priame stanovenie  14 CO 2 (oddiel 1.8.9.4 a dodatok 3) 
možno použi ť iba na meranie miery mineralizácie testovanej látky na 
CO 2 . Rádiochromatografia (RAD-TLC) alebo HPLC sa môžu použi ť 
na analyzovanie koncentrácií testovanej látky ozna čenej  14 C a vzniku 
hlavných produktov transformácie (tretí odsek v oddiele 1.8.9.4). Na 
umožnenie priameho stanovenia pol času je potrebné, aby neboli 
prítomné žiadne hlavné produkty transformácie (definované ako ≥ 10 % použitého množstva testovanej látky). Ak sú prítomné hlavné 
produkty transformácie, ako sa tu definuje, je potrebné podrobné 
vyhodnotenie údajov. Toto môže zah ŕňať opakované testovanie a/ ­
alebo identifikáciu produktov transformácie (pozri prvý odsek v oddiele 1.8.9.5), pokia ľ osud produktov transformácie 
nemožno logicky vyhodnoti ť na základe skúseností (napr. informácie 
o ceste degradácie). Ke ďže sa pomer uhlíka testovanej látky preme ­
nenej na CO
 2 mení (v závislosti zvä čša od koncentrácie testovanej 
látky a iných dostupných substrátov, testovacích podmienok a mikrobiálneho spolo čenstva), tento test neumož ňuje priame stano ­
venie kone čnej biodegradácie ako v DOC die-away teste, ale 
výsledok je podobný výsledku získanému respirometrickým testom. Stupeň mineralizácie bude teda nižší alebo rovnajúci sa minimálnej 
úrovni kone čnej biodegradácie. Na získanie úplnejšieho obrazu 
konečnej biodegradácie (mineralizácie a zabudovania do biomasy) 
sa na konci testu musí vykona ť analýza fázového rozdelenia
 14 C 
(pozri dodatok 1).  14 C v podiele častíc bude pozostáva ť z 14 C zabu­
dovaného do bakteriálnej biomasy a  14 C adsorbovaného na organické 
častice.  
2.3. PLATNOS Ť TESTU 
Ak sa referen čná látka nedegraduje v predpokladom časovom inter ­
vale (pre anilín a benzoát sodný obvykle menej ako dva týždne), platnosť testu je spochybnená a musí sa ďalej preveri ť alebo sa 
alternatívne test musí zopakova ť s novou vzorkou vody. 
V kruhovom teste ISO metódy, na ktorom sa zú častnilo sedem 
laboratórií z Európy, prevzali degrada čné rýchlostné konštanty pre 
anilín v rozmedzí 0,3 až 1,7 de ň
 –1 s priemerom 0,8 d  –1 pri 20  o C 
a štandardnou chybou ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 dňa). Typické lag fázy boli 
1 až 7 dní. Uviedlo sa, že skúmané vody mali bakteriálnu biomasu 
zodpovedajúcu 10  3 -10 4 jednotkám tvoriacim kolónie (CFU) na ml. 
Degradačné rýchlosti v stredoeurópskych vodách bohatých na živiny 
boli vyššie ako v severských oligotrofických vodách, čo môže by ť 
kvôli odlišnému trofickému stavu alebo prechádzajúcemu vystaveniu 
chemickým látkam. 
Celková vý ťažnosť (hmotnostná bilancia) na konci pokusu musí by ť 
medzi 90 % a 110 % pre radioaktívne ozna čené látky, pri čom počia­
točná výťažnosť na začiatku pokusu musí by ť medzi 70 % a 110 % 
pre neozna čené látky. Uvedené rozsahy je však potrebné interpre ­
tovať len ako ciele a nemali by sa používa ť ako kritériá pre akcep ­
táciu testu.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. SPRÁVA O TESTE  
Typ štúdie, t. j. pelagický alebo test suspendovaného sedimentu, sa 
musia jasne stanovi ť v správe z testu, ktorá musí obsahova ť mini­
málne tieto informácie: 
Testovaná látka a referen čná látka(y): 
— všeobecné názvy, chemické názvy (odporú čané názvy IUPAC 
a/alebo názvy CAS), čísla CAS, štrukturálne vzorce (uvádzajúce 
pozíciu ozna čenia  14 C, ak sa používa rádioaktívne ozna čená 
látka) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti testu a referenčnej látky (pozri oddiely 1.5 a 1.6), 
— všeobecné názvy, čísla CAS, štrukturálne vzorce (uvádzajúce 
pozíciu ozna čenia
 14 C, ak sa používa rádioaktívne ozna čená 
látka) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti látok použitých 
ako štandardy na identifikáciu produktov transformácie, 
— čistota (ne čistoty) testovaných a referen čných látok, 
— rádiochemická čistota ozna čenej chemickej látky a špecifická 
aktivita (v prípade potreby). 
Povrchová voda: 
Musia sa poskytnú ť minimálne tieto informácie pre odobratú vzorku 
vody: 
— umiestnenie a opis miesta odberu vzoriek vrátane predchádza ­
júcej kontaminácie, ak je to možné, 
— dátum a miesto odberu vzoriek, 
— živiny (celkový N, amónne ióny, dusitany, dusi čnany, celkový P, 
rozpustené ortofosfáty), 
— hĺbka odberu, 
— vzhľad vzorky (napr. farba a zákal), 
— DOC a TOC, — BSK, — teplota a pH v mieste a čase odberu, 
— kyslík alebo redoxný potenciál (povinné iba vtedy, ak nie sú 
zrejmé aeróbne podmienky), 
— slanos ť alebo vodivos ť (v prípade morskej vody a poloslanej 
vody), 
— suspendované tuhé látky (v prípade zakalenej vzorky), 
— prípadne ďalšie informácie o mieste odberu v čase odberu (napr. 
aktuálne alebo predchádzajúce údaje o rýchlosti toku riek alebo 
morských prúdov, hlavné vypúš ťania v blízkosti a typ vypúš ťaní, 
poveternostné podmienky pred časom odberu) 
a prípadne: — mikrobiálna biomasa (napr. priame stanovenie metódou farbenia 
akridínovou oranžovou alebo jednotky tvoriace kolónie),
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— anorganický uhlík, 
— koncentrácia chlorofylu-a ako špecifické stanovenie biomasy rias. Okrem toho sa poskytnú tieto informácie o sedimente, ak sa usku ­
točňuje test suspendovaného sedimentu: 
— hĺbka odberu sedimentu, 
— vzhľad sedimentu (napr. sfarbený, bahnitý, prachový 
alebo pieskový), 
— textúra (napr. % hrubého piesku, jemného piesku, siltu a ílu), — sušina v g/l suspendovaných tuhých látok, koncentrácia TOC 
alebo úbytok hmotnosti žíhaním ako kritérium obsahu organickej 
látky, 
— pH, — kyslík alebo redoxný potenciál (povinné iba, ak nie sú zrejmé 
aeróbne podmienky). 
Testovacie podmienky: — čas medzi odberom a s použitím v laboratórnom teste, sklado ­
vanie vzoriek a predpríprava vzorky, dátumy uskuto čnenia štúdií, 
— množstvo použitej testovanej látky, testovaná koncentrácia 
a referenčná látka, 
— metóda aplikácie testovanej látky vrátane každého použitia 
rozpúšťadiel, 
— objem použitej povrchovej vody a sedimentu (ak sa používa) 
a odobratý objem v každom intervale na analýzu, 
— opis použitého testovacieho systému, ak sa nemôžu dodrža ť podmienky uchovávania v tme, informácie 
o podmienkach „difúzneho svetla“, 
— informácie o metóde(-ach) použitých na zabezpe čenie sterilných 
podmienok (napr. teplota, čas a počet autoklávovaní), 
— inkuba čná teplota, 
— informácie o analytických technikách a metóde(-ach) použitých 
na rádiochemické merania a na kontrolu hmotnostnej bilancie a stanovenia fázového rozdelenia (ak sa vykonáva), 
— počet paraleliek. 
Výsledky: — výťažnosť v percentách (pozri oddiel 1.7.1), 
— opakovate ľnosť a citlivos ť použitých analytických metód vrátane 
detekčného limitu (LOD) a limitu kvantifikácie (LOQ) (pozri 
oddiel 1.7.2),
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— všetky namerané údaje (vrátane časov odberu) a vypo čítané 
hodnoty v tabu ľkovej forme a degrada čné krivky pre každú testo ­
vanú koncentráciu a pre každú paralelnú banku; zaznamenajte lineárny korela čný koeficient pre sklon logaritmického grafu, 
stanovenú lag fázu a rýchlostnú konštantu prvého poriadku 
alebo pseudoprvého poriadku (ak je to možné) a príslušný 
polčas degradácie (alebo pol čas, t
 50 ), 
— zaznamenajte príslušné hodnoty ako priemery výsledkov ziste ­
ných v jednotlivých paralelkách, napr. d ĺžku lag fázy, degra ­
dačnú rýchlostnú konštantu a pol čas degradácie (alebo t  50 ), 
— kategorizujte systém ako neadaptovaný alebo adaptovaný na 
základe vzh ľadu degrada čnej krivky a prípadného vplyvu testo ­
vanej koncentrácie, 
— výsledky kone čnej kontroly hmotnostnej bilancie a výsledky 
stanovení fázového rozdelenia (ak sa uskuto čnili), 
— frakcia mineralizovaného  14 C a v prípade použitia špecifickej 
analýzy kone čná úroveň primárnej degradácie, 
— identifikácia, molárna koncentrácia a percento použitých 
a hlavných produktov transformácie (pozri prvý odsek v oddiele 1.8.9.5) v prípade potreby, 
— navrhovaná cesta transformácie v prípade potreby, — diskusia o výsledkoch.
 
4. POUŽITÁ LITERATÚRA  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test. 
2. ISO/DIS 14592 – 1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concent ­
rations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions. 
3. Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in soil. 4. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments. 
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris. 
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determination 
of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). 
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. 
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asse ­
ssment. No 22 (to be published summer 2000).
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394 – 401. 
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274 – 283. 
11. ISO/CD 14592 – 1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Dodatok 1  
Fázové rozdelenie  14 C 
Na kontrolu postupu sa musí bežné stanovenie celkovej zvyškovej organickej 
aktivity  14 C (TOA) doplni ť meraniami hmotnostnej bilancie zah ŕňajúcej priame 
stanovenie uvo ľneného  14 CO 2 po zachytení na absorbéri (pozri dodatok 3). Pozi ­
tívny vznik  14 CO 2 je sám osebe priamym dôkazom biodegradácie na rozdiel od 
abiotickej degradácie alebo iných mechanizmov úbytku, ako napr. prchavos ť 
a sorpcia. Ďalšie užito čné informácie charakterizujúce priebeh biodegradovate ľ­
nosti možno získa ť z meraní distribúcie TOA medzi rozpusteným stavom (akti ­
vita rozpusteného organického  14 C, DOA) a časticovým stavom ( časticová akti ­
vita organického  14 C, POA) po oddelení častíc membránovou filtráciou alebo 
odstredením. POA pozostáva z testovanej látky naadsorbovanej na mikrobiálnu biomasu a na iné častice testovanej látky okrem uhlíka, ktorý sa použil na 
syntézu nového bunkového materiálu a tak zabudoval do časticovej frakcie 
biomasy. Vznik rozpusteného
 14 C organického materiálu sa dá stanovi ť ako 
DOA na konci biodegradácie (plató na krivke degradácie proti času). 
Stanovenie fázového rozdelenia zvyškového  14 C vo vybratých vzorkách filtro ­
vaním vzoriek na 0,22 μm alebo 0,45 μm membránovom filtri z materiálu, ktorý 
neadsorbuje významné množstvá testovanej látky (môžu by ť vhodné polykarbo ­
nátové filtre). Ak je adsorpcia testovanej látky na filter príliš ve ľká na to, aby sa 
nemusela zoh ľadniť (je to potrebné skontrolova ť pred pokusom), môže sa použi ť 
namiesto filtrácie centrifugácia pri vysokej rýchlosti (2 000 g; 10 min.). 
Pokračujte s filtrátom alebo s odstredenou zložkou, ako je uvedené v dodatku 3 
pre nefiltrované vzorky. Rozpustite membránové filtre vo vhodnej scintila čnej 
kvapaline a merajte ako obvykle, bežne len pomerovou metódou s externým štandardom na korekciu zhášania, alebo použite okysli čovadlo vzoriek. Ak sa 
použila centrifugácia, resuspendujte pelet vzniknutý z frakcie častíc v 1 – 2 ml 
destilovanej vody a preneste do scintila čnej fľaštičky. Potom s použitím 1 ml 
destilovanej vody dvakrát premyte a preneste premývaciu vodu do f ľaštičky. 
V prípade potreby sa suspenzia môže zalia ť do gélu na meranie kvapalinovým 
scintilačným počítačom.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Dodatok 2  
PoloKontinuálny postup  
Môže by ť potrebné pred ĺžiť inkubáciu na nieko ľko mesiacov na dosiahnutie 
dostatočnej degradácie látok, ktoré sa ťažko odbúravajú. D ĺžka testu nesmie 
byť obvykle dlhšia ako 60 dní, pokia ľ nie sú zachované vlastnosti pôvodnej 
vzorky vody obnovením testovanej suspenzie. Čas testu sa však môže pred ĺžiť 
maximálne na 90 dní bez obnovenia testovanej suspenzie, ak sa degradácia testovanej látky za čala počas prvých 60 dní. 
Počas dlhodobej inkubácie sa diverzita mikrobiálneho spolo čenstva môže obme ­
dziť kvôli mechanizmom úbytku a kvôli prípadnému úbytku základných živín 
a primárnych uhlíkových substrátov vo vzorke vody. Preto sa odporú ča, aby sa 
použil semikontinuálny test na príslušné stanovenie rýchlosti degradácie látok, ktoré sa pomaly degradujú. Test je potrebné za čať s použitím semikontinuálneho 
postupu, ak sa na základe predchádzajúcich skúseností predpokladá, že na 
dosiahnutie 20 % degradácie látky bude potrebný inkuba čný čas tri mesiace. 
Alternatívne sa môže bežný dávkový test zmeni ť na semikontinuálny test, ak 
sa nedosiahne žiadna degradácia testovanej látky po čas približne 60 dní testo ­
vania s použitím dávkového postupu. Semikontinuálny postup sa môže zastavi ť 
a test pokra čuje ako dávkový pokus, ke ď sa zaznamená významná degradácia 
(napr. > 20 %). 
V polokontinuálnom teste sa každé dva týždne nahradí približne jedna tretina 
objemu testovanej suspenzie čerstvo odobratou vodou s testovanou látkou, ktorá 
sa pridá do po čiatočnej koncentrácie. Ak sa vykonáva test suspendovaného sedi ­
mentu, podobne sa do vody pridá sediment na nahradenie do po čiatočnej koncen ­
trácie (medzi 0,01 a 1 g/l). Pri uskuto čňovaní testu so suspendovanými tuhými 
látkami je dôležité, aby sa zachoval plne suspendovaný systém aj po čas obno­
venia vody a aby bol reziden čný 
čas rovnaký pre tuhé látky a vodu, lebo 
v opačnom prípade sa môže strati ť plánovaná podobnos ť s homogénnym vodným 
systémom bez ustálených fáz. Z týchto dôvodov sa uprednost ňuje počiatočná 
koncentrácia suspendovaných sedimentov v spodnom rozsahu špecifikovaného 
intervalu, ak sa používa semikontinuálny postup. 
Predpísané pridanie testovanej látky znamená, že sa po čiatočná koncentrácia 
testovanej látky čiastočným obnovením testovanej suspenzie neprekro čí, a teda 
sa zabráni adaptácii, ktorá sa často pozoruje pri vysokých koncentráciách testo ­
vanej látky. Ke ďže postup zah ŕňa reinokuláciu aj nahradenie vy čerpaných živín 
a primárnych substrátov, pôvodná mikrobiálna diverzita sa obnoví a trvanie testu 
sa môže v podstate predlžova ť až do nekone čna. Ak sa používa semikontinuálny 
postup, je dôležité pripomenú ť, že sa zvyšková koncentrácia testovanej látky 
musí korigova ť o množstvá pridanej a odstránenej testovanej látky pri každom 
obnovení. Pre látky, ktoré sa zle adsorbujú, sa môže používa ť celková koncen ­
trácia alebo koncentrácia rozpustenej testovanej látky. Adsorpcia je minimálna (< 5 %) za špecifických podmienok (0,1 – 1 g tuhých látok/l) pre látky s log Kow < 3 (platí pre neutrálne, lipofilné zlú čeniny). Toto je vyjadrené 
v nasledujúcom príklade výpo čtu: 0,1 g/l tuhých látok približne zodpovedá 
10 mg uhlíka na liter (frakcia uhlíka, f
 C = 0,01). Za predpokladu, že 
Log K  ow (testovanej látky) = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
rozdeľovací koeficient, K  d = f C × K  oc , 
potom rozpustená frakcia celkovej koncentrácie (C-voda (C  w )/C-celková (C  t ) je: 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Dodatok 3  
Stanovenie  14 CO  2 
Nepriame stanovenie  14 CO  2 
Pre bežné merania je nepriama metóda obvykle najmenej časovo náro čnou 
a najpresnejšou metódou, ak je testovaná látka neprchavá a netransformuje sa 
na prchavé produkty transformácie. Preneste jednoducho nefiltrované vzorky, 
napr. veľkosti 5 ml, do scintila čných fľaštičiek. Na za čiatku je vhodná aktivita 
vo vzorkách 5 000 dpm – 10 000 dpm (80 – 170 Bq) a minimálna po čiatočná 
aktivita je okolo 1 000 dpm. CO  2 sa musí odstráni ť po okyslení na pH 2 – 3 1 – 
2 kvapkami koncentrovanej H  3 PO 4 alebo HCl. Odstránenie CO  2 možno usku ­
točniť prebublávaním vzduchom po čas približne ½ – 1 hodiny. Alternatívne sa 
môžu fľaštičky prudko trepa ť 1 – 2 hodiny (napríklad na mikrotrepa čke) alebo za 
miernejšieho trepania cez noc. Ú činnosť postupu odstra ňovania CO  2 sa musí 
skontrolova ť (predĺžením času prevzduš ňovania alebo trepania). Potom sa musí 
pridať scintilačná kvapalina vhodná na meranie vodných vzoriek, vzorka sa 
homogenizuje vo vírivom mixéri a rádioaktivita sa stanoví meraním kvapali ­
novým scintila čným počítačom a odpo čítaním aktivity pozadia zistenej 
v slepých vzorkách (F  B ). Pokiaľ nie je testovaná voda príliš sfarbená alebo 
neobsahuje vysokú koncentráciu častíc, vykazujú vzorky obvykle rovnaké 
zhášanie a bude posta čujúce uskuto čniť korekcie zhášania s použitím externého 
štandardu. Ak je testovaná voda ve ľmi sfarbená, môže by ť potrebná korekcia 
zhášania pridaním vnútorného štandardu. Ak je vysoká koncentrácia častíc, 
nemusí sa da ť dosiahnu ť homogénny roztok alebo gél alebo môžu sa vyskytnú ť 
veľké odchýlky medzi vzorkami v zhášaní. V tomto prípade sa môže použi ť 
metóda merania opísaná nižšie pre testované suspenzie. Ak sa test vykonáva 
ako test suspendovaného sedimentu, meranie  14 CO 2 by sa mohlo uskuto čniť 
nepriamo odobratím homogénnej 10 ml vzorky testovanej vody/suspenzie a oddelením fáz centrifugáciou pri vhodnej rýchlosti (napr. 15 min. pri 40 000 m/ ­
s
 2 ). Vodná fáza sa potom spracuje, ako je uvedené vyššie. Aktivita  14 C vo fáze 
častíc (POA) sa stanoví resuspendovaním sedimentu do malého objemu destilo ­
vanej vody, prenosom do scintila čných fľaštičiek a pridaním scintila čnej kvapa ­
liny na vytvorenie gélu (na tento ú čel sú dostupné špeciálne scintila čné kvapa ­
liny). V závislosti od charakteru častíc (napr. aký majú obsah organického mate ­
riálu), môže by ť vhodné natrávi ť vzorku cez noc solubilizérom tkanív a potom 
pred pridaním scintila čnej kvapaliny homogenizova ť vo vírivom mixéri. Alterna ­
tívne sa môže stanovi ť POA spa ľovaním v nadbytku kyslíka s použitím okysli ­ 
čovadla vzoriek. Pri meraní sa musia vždy prida ť vnútorné štandardy a môže by ť 
potrebné uskuto čniť korekcie zhášania pridaním vnútorného štandardu pre každú 
jednu vzorku.  
Priame stanovenie  14 CO  2 
Na priame stanovenie uvo ľneného  14 CO 2 sa na za čiatku testu pripraví viac 
baniek, zužitkovanie testovacích baniek sa v každom bode stanovenia vykoná 
tak, že sa testovacie banky okyslia na pH 2 – 3 a  14 CO 2 sa zhromaždí vo 
vnútornom (umiestnenom v každej testovacej banke na za čiatku testu) alebo 
externom absorbéri. Ako absorb čné médium sa môže použi ť buď alkalická 
zásada (napr. 1 N roztok NaOH alebo granule NaOH), etanolamín alebo 
komerčne dostupné absorbéry založené na etanolamíne. Na priame stanovenie  
14 CO 2 musia by ť banky uzatvorené, napr. butylkau čukovou zátkou.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Obrázok 1a  
Príklad aritmetického grafického zaznamenania údajov (zvyšková aktivita proti času)
 
Obrázok 1b  
Vzor semilogaritmického grafického zaznamenania údajov (ln zvyškovej aktivity proti času)
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SP. TEST INHIBÍCIE RASTU  
1. METÓDA  
Táto metóda je rovnocenná s OECD TG 221 (2006) (1). Orgány EÚ 
dospeli k širokému konsenzu, že pri silne zafarbených látkach sú testy s rodom  Lemna  vhodnou alternatívou k testu s riasami (2) (3).
 
1.1. ÚVOD 
Táto testovacia metóda je ur čená na hodnotenie toxicity látok pre 
sladkovodné rastliny rodu  Lemna  (žaburinka). Je založená na existu ­
júcich usmerneniach (4) (5) (6) (7) (8) (9), ale obsahuje modifikácie 
týchto metód zoh ľadňujúce najnovší výskum a konzultácie týkajúce 
sa množstva k ľúčových aspektov. Navrhovaná metóda bola valido ­
vaná medzinárodným kruhovým testom (10). 
Táto testovacia metóda opisuje testovanie toxicity pri použití  Lemna 
gibba  a Lemna minor , obidvoch druhov, ktoré sa študujú vo ve ľkej 
miere a podliehajú uvedeným normám. Taxonómia  Lemna  spp. je 
zložitá, komplikuje ju výskyt ve ľkého množstva fenotypov. Aj ke ď 
sa môže vyskytnú ť genetická variabilita pri reakcii na toxické látky 
v prípade rodu  Lemna , v súčasnosti neexistujú dostato čné údaje 
o tomto zdroji variability, aby sa mohol odporu čiť konkrétny klon 
na použitie v tejto testovacej metóde. Je potrebné pripomenú ť, že test 
sa nevykonáva axenicky, ale jednotlivé kroky po čas postupu testu sa 
uskutočňujú v etapách, aby sa minimalizovala kontaminácia inými 
organizmami. 
Uvádzajú sa informácie o testovaní pri obnove (semistatické 
a prietokové) a bez obnovy (statické) testovacieho roztoku. 
V závislosti od cie ľov testu a od regula čných požiadaviek sa odporú ča 
posúdiť semistatické a prietokové metódy, napr. pre látky, ktoré 
z roztoku rýchlo unikajú v dôsledku odparovania, fotodegradácie, 
precipitácie alebo biodegradácie. Ďalšie informácie sú uvedené v (11).  
1.2. VYMEDZENIE POJMOV 
Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy a skratky:  
Biomasa : je sušina živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii. 
V tomto teste biomasu nahrádza napr. po čet lístkov alebo plocha 
lístkov, ktoré sa bežne merajú, a používanie pojmu „biomasa“ sa 
teda vzťahuje aj na tieto náhradné kritériá.  
Chloróza : je žltnutie tkaniva lístkov.  
Klon : je organizmus alebo bunka, ktorá vznikla z jedného jedinca 
nepohlavným rozmnožovaním. Jedince z rovnakého klonu sú preto 
geneticky identické.  
Kolónia : znamená zhluk navzájom spojených materských 
a dcérskych lístkov (obvykle 2 až 4). Niekedy sa uvádza ako rastlina.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : je koncentrácia testovanej látky rozpustená v testovacom 
médiu, ktorá má za následok x % (napr. 50 %) zníženie rastu rodu  
Lemna  v rámci stanoveného času expozície (je potrebné výslovne 
uviesť v prípade odchýlky od celkovej alebo obvyklej d ĺžky testu). 
Na jednozna čné zaznamenanie hodnoty EC odvodenej z rýchlosti 
rastu alebo vý ťažku sa používa symbol „E  r C“ pre rýchlos ť rastu 
a symbol „E  y C“ sa používa pre vý ťažok, po ktorom nasleduje 
použitá meraná premenná, napr. E  r C (počet lístkov).  
Prietoková metóda : je test, v ktorom sa testovacie roztoky kontinu ­
álne nahrádzajú.  
Lístok : je individuálna/samostatná „lístkovitá“ štruktúra žaburinky. 
Je to najmenšia jednotka, t. j. jednotlivec schopný rozmnožovania.  
Gibozita : znamená lístky, ktoré majú vypuklý alebo napuchnutý 
vzhľad. 
Rast : je nárast meranej premennej, napr. po čtu lístkov, sušiny, hmot ­
nosti vo vlhkom stave alebo plochy lístkov, po čas testu.  
Rýchlosť rastu  (priemerná špecifická rýchlos ť rastu ): je logarit ­
mickým nárastom biomasy po čas expozície testovanou látkou.  
Najnižšia koncentrácia s pozorovate ľnými účinkami (LOEC) : je 
najnižšia testovaná koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje, že látka má štatisticky významný ú činok na zníženie rastu (pri p < 0,05) pri 
porovnaní s kontrolou v rámci daného času expozície. Škodlivý 
účinok všetkých testovaných koncentrácií nad LOEC však musí 
byť vždy rovnaký alebo vä čší ako účinky pozorované pri LOEC. 
Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnú ť 
úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila LOEC (a teda aj 
NOEC).  
Merané premenné : sú všetky typy premenných, ktoré sa merajú na 
vyjadrenie kone čného bodu testu s použitím jedného alebo viacerých 
hodnôt reakcie. V tejto metóde po čet lístkov, plocha lístkov, hmot ­
nosť v čerstvom stave a sušina sú meranými premennými.  
Monokultúra : je kultúra s jedným druhom rastliny.  
Nekróza : je odumreté (t. j. biele alebo rozmo čené) tkanivo lístkov.  
Koncentrácia bez pozorovaného ú činku (NOEC) : je testovaná 
koncentrácia bezprostredne pod LOEC.  
Fenotyp : je vidite
ľná charakteristika organizmu ur čená interakciou 
jeho génov s jeho prostredím.  
Premenná hodnota reakcie : je premenná na odhad toxicity odvo ­
dená z akýchko ľvek stanovených premenných opisujúcich biomasu 
rôznymi metódami výpo čtu. Pre túto metódu sú rýchlosti rastu 
a výťažok hodnoty reakcie odvodené z meraných premenných, ako 
počet lístkov, plocha lístkov, hmotnos ť v čerstvom stave alebo 
sušina.  
Semistatický (obnovovací) test : je test, v ktorom sa testovací roztok 
počas testu pravidelne nahrádza v konkrétnych intervaloch.  
Statický test : je testovacia metóda bez obnovy testovacieho roztoku 
počas testu.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Konečný bod testu : opisuje všeobecný faktor, ktorý sa zmení testo ­
vanou chemickou látkou v porovnaní s kontrolou ako cie ľ testu. 
V tejto metóde je kone čným bodom inhibícia rastu, ktorá môže 
byť vyjadrená rôznymi hodnotami reakcie, založenými na jednej 
alebo viacerých meraných premenných.  
Testovacie médium : je kompletné syntetické kultiva čné médium, 
v ktorom testované rastliny rastú v podmienkach expozície testo ­
vanou látkou. Testovaná látka sa pri normálnych podmienkach 
rozpustí v testovanom médiu.  
Výťažok : je hodnota meranej premennej na vyjadrenie množstva 
biomasy na konci času expozície mínus meraná premenná na 
začiatku času expozície.  
1.3. PRINCÍP TESTU 
Umožní sa exponenciálny rast rastlinných kultúr rodu  Lemna  vo 
forme monokultúr v odlišných koncentráciách testovanej látky počas siedmich dní. Ú čelom testu je kvantifikova ť účinky vo vz ťahu 
k testovanej látke na vegetatívny rast po čas tohto času založené na 
hodnotení zvolených meraných premenných. Po čet lístkov je 
najdôležitejšou meranou premennou. Meria sa ešte aspo ň jedna 
ďalšia meraná premenná (celková plocha lístkov, sušina alebo hmot ­
nosť v čerstvom stave), lebo niektoré látky môžu ove ľa viac 
ovplyvniť iné merané premenné ako po čet lístkov. Na kvantifiko ­
vanie účinkov vz ťahujúcich sa na testovanú látku sa rast 
v testovacích roztokoch porovnáva rastom v kontrolách a koncentrácia spôsobujúca špecifickú x % inhibíciu rastu (napr. 
50 %) sa ur čí a vyjadrí ako EC
 x (napr. EC  50 ). 
Konečným bodom testu je inhibícia rastu vyjadrená ako logaritmický 
nárast meranej premennej (priemerná špecifická rýchlos ť rastu) po čas 
expozície. Z priemerných špecifických rýchlostí rastu zaznamena ­
ných v sérii testovaných roztokov sa koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu rýchlosti rastu (napr. 50 %), stanoví 
a vyjadrí ako E
 r C x (napr. E  r C 50 ). 
Ďalšou hodnotou reakcie použitou v tejto testovacej metóde je vý ťa­ 
žok, ktorý sa v niektorých krajinách vyžaduje na splnenie špecific ­
kých regula čných požiadaviek. Je definovaný ako merané premenné 
na konci času expozície mínus merané premenné na za čiatku času 
expozície. Z vý ťažku zaznamenaného v sérii testovaných roztokov sa 
koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu vý ťažku 
(napr. 50 %), vypo číta a vyjadrí ako E  y C x (napr. E  y C 50 ). 
Okrem toho možno štatisticky stanovi ť najnižšiu koncentráciu 
s pozorovate ľnými účinkami (LOEC) a koncentráciu bez pozorova ­
ného účinku (NOEC).  
1.4. INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
Musí byť k dispozícii analytická metóda s vhodnou citlivos ťou na 
kvantifikáciu látky v testovacom médiu.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Informácie o testovanej látke, ktoré môžu by ť osožné pri stanovovaní 
testovacích podmienok, obsahujú štrukturálny vzorec, čistotu, 
rozpustnos ť vo vode, stabilitu vo vode a svetle, pKa, K  ow , tlak 
pary a biologickú odbúrate ľnosť. Rozpustnos ť vo vode a tlak pary 
sa dajú použi ť na výpočet Henryho konštanty, ktorá bude indikova ť, 
či sú pravdepodobné zna čné úbytky testovanej látky. To pomôže pri 
indikácii, či je potrebné prija ť konkrétne kroky na kontrolu takýchto 
úbytkov. Ak sú informácie o rozpustnosti a stabilite testovanej látky neurčité, odporú ča sa, aby sa tieto informácie hodnotili za 
podmienok testu, t. j. rastové médium, teplota, režim osvet ľovania 
používané v teste. 
Ak je kontrola pH testovacieho média obzvláš ť dôležitá, napr. pri 
testovaní kovov alebo látok, ktoré sú hydrolyticky nestabilné, odpo ­
rúča sa prida ť do rastového média tlmivý roztok (pozri prvý 
odsek v oddiele 1.7.4). Ďalšie informácie pre testované látky 
s fyzikálno-chemickými vlastnos ťami, ktoré s ťažujú ich testovanie, 
sú uvedené v (11).
 
1.5. REFEREN ČNÁ LÁTKA 
Referenčná(-é) látka(-y), ako napr. 3,5-dichlórfenol, používaná(-é) 
v medzinárodnom kruhovom teste (10), sa môže(-u) testova ť ako 
prostriedok kontroly postupu testu. Odporú ča sa testova ť referenčnú 
látku aspo ň dvakrát do roka, alebo ak sa testovanie vykonáva menej 
často, súbežne so stanovením toxicity testovanej látky.  
1.6. PLATNOS Ť TESTU 
Tento test je platný, iba ak čas zdvojenia po čtu lístkov v kontrole je 
menej ako 2,5 dní (60 h), čo zodpovedá približne sedemnásobnému 
zvýšeniu za sedem dní a priemernej špecifickej rýchlosti rastu 
0,275 d  –1 . Pri použití média a za podmienok testu uvedených 
v tejto testovacej metóde môže sa toto kritérium splni ť, ak sa použije 
statický test (8). Rovnako sa predpokladá, že toto kritérium sa bude dať dosiahnu ť aj za podmienok semistatického a prietokového testu. 
Výpočet času zdvojenia je uvedený v oddiele 2.1.
 
1.7. OPIS METÓDY  
1.7.1.  Prístroje  
Všetky zariadenia, ktoré prichádzajú do styku s testovacím médiom, 
musia by ť vyrobené zo skla alebo iného chemicky inertného mate ­
riálu. Sklené nádoby, ktoré sa používajú na kultiváciu a na testova ­
nie, sa musia vy čistiť od chemických kontaminantov, ktoré by sa 
mohli rozpúš ťať v testovacom médiu, a musia by ť sterilné. Testo ­
vacie nádoby musia by ť dostatočne široké, aby lístky rôznych 
kolónií v kontrolných nádobách mohli rás ť bez prekrývania na 
konci testu. Neprekáža, ak sa korienky dotýkajú dna testovacích 
nádob, ale odporú ča sa minimálna h ĺbka 20 mm a minimálny 
objem 100 ml v každej testovacej nádobe. Výber testovacích nádob nie je rozhodujúci, pokia ľ sa tieto požiadavky dodržia. 
Vhodné sú všetky druhy sklených kadi čiek, kryštaliza čných misiek 
alebo sklených Petriho misiek vhodných rozmerov. Testovacie nádoby musia by ť zakryté, aby sa minimalizovalo vyparovanie 
a náhodná kontaminácia, pri čom sa musí umožni ť potrebná výmena 
vzduchu. Vhodné testovacie nádoby, a predovšetkým veká nesmú 
spôsobova ť tienenie alebo zmeny spektrálnych charakteristík svetla.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kultúry a testovacie nádoby sa nesmú uchováva ť spoločne. To sa dá 
najlepšie dosiahnu ť s použitím oddelených environmentálnych rasto ­
vých komôr, inkubátorov alebo miestností. Osvetlenie a teplota sa musia by ť nastavovate ľné a udržiavané na konštantnej úrovni (pozri 
oddiel 1.7.8).
 
1.7.2.  Testované organizmy  
Organizmus používaný pre tento test je bu ď Lemna gibba , alebo  
Lemna minor . Krátka charakteristika druhov žaburinky, ktoré sa 
používajú na testovanie toxicity, je uvedená v dodatku 1. Rastlinný materiál možno získa ť zo zbierky kultúr, iného laboratória alebo 
z terénu. Ak je získaný z terénu, je potrebné minimálne osem 
týždňov pred použitím uchováva ť rastliny v kultúre v rovnakom 
médiu, ako sa používa na testovanie. Miesta v teréne použité na zbieranie po čiatočných kultúr musia by ť bez zrejmých zdrojov 
kontaminácie. Ak sa získa z iného laboratória alebo zbierky kultúr, 
mali by sa podobne uchováva ť minimálne tri týždne. Vždy je 
potrebné uvies ť v správe zdroj rastlinného materiálu a druh a klon 
(ak je známy) použitý na testovanie. 
Musia sa používa ť monokultúry, ktoré sú vidite ľne bez kontaminácie 
inými organizmami, ako napr. riasy a prvoky. Zdravé rastliny  L. 
minor  sa skladajú z kolónií obsahujúcich dva až pä ť lístkov, pri čom 
zdravé kolónie  L. gibba  môžu obsahova ť až sedem lístkov. 
Kvalita a uniformita rastlín, ktoré sa používajú na test, budú ma ť 
značný vplyv na výsledok testu, a preto by sa mali starostlivo vybe ­
rať. Musia sa použi ť mladé, rýchlo rastúce rastliny bez vidite ľných 
lézií alebo straty farby (chloróza). Kvalitné kultúry sa prejavujú vysokým výskytom kolónií, ktoré pozostávajú aspo ň z dvoch lístkov. 
Veľký počet jediných lístkov zna čí environmentálny stres, napr. 
obmedzený prísun živín, a rastlinný materiál z takýchto kultúr sa 
nesmie použi ť na testovanie.
 
1.7.3.  Kultivácia  
Na zníženie frekvencie uchovávania kultúr (napr. v čase, keď sa 
neplánujú žiadne testy s rodom  Lemna ) sa kultúry môžu uchováva ť 
pri obmedzenom osvetlení a teplote (4 °C – 10 °C). Informácie 
o kultivovaní sú uvedené v dodatku 2. Zrejmé znaky kontaminácie 
riasami alebo inými organizmami budú vyžadova ť povrchovú steri ­
lizáciu čiastočnej vzorky lístkov rodu  Lemna , ktorá sa potom 
prenesie do čerstvého média (pozri dodatok 2). V tomto prípade sa 
zvyšná kontaminovaná kultúra vyradí. 
Aspoň sedem dní pred uskuto čnením testu sa dostato čný počet 
kolónií prenesie sterilne do čerstvého sterilného média a kultivuje 
7 – 10 dní za podmienok testu.  
1.7.4.  Testovacie médium  
Odporúčajú sa rôzne médiá pre  Lemna minor  a Lemna gibba , ako sa 
uvádza nižšie. Je potrebné starostlivo posúdi ť pridanie pH tlmivého 
roztoku do testovacieho roztoku [MOPS (kyselina 3-morfolinopro ­
pánsulfónová, č. CAS: 1132 – 61 – 2; č. EINECS: 214 – 478 – 5) 
v médiu pre  L. minor  a NaHCO  3 v médiu pre  L. gibba ], ak sa 
očakáva, že by mohli reagova ť s testovanou látkou a ovplyvni ť 
vyjadrenie jej toxicity. Steinbergovo médium (12) je tiež prijate ľné, 
pokiaľ sú splnené kritériá platnosti.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Odporúča sa modifikácia švédskej normy (SIS) rastového média pre  
Lemna  na kultiváciu a testovanie  L. minor . Zloženie tohto média je 
uvedené v dodatku 3. 
Na kultiváciu a testovanie  L. gibba  sa odporú ča rastové médium 20X 
– AAP, ako je uvedené v dodatku 3. 
Steinbergovo médium, ako je uvedené v dodatku 3, je vhodné aj pre  
L. minor , ale sa môže použi ť aj pre  L. gibba , pokiaľ sú splnené 
kritériá platnosti.  
1.7.5.  Testovacie roztoky  
Testovacie roztoky sa pripravujú obvykle zriedením zásobného 
roztoku. Zásobné roztoky testovacieho roztoku sa pripravujú obvykle rozpustením látky v rastovom médiu. 
Najvyššia testovacia koncentrácia testovanej látky nesmie by ť spra­
vidla vyššia ako rozpustnos ť látky vo vody za podmienok testu. Je 
potrebné však pripomenú ť, že Lemna  spp. plávajú na povrchu 
a môžu by ť vystavené látkam, ktoré sa zhromaž ďujú na rozhraní 
voda-vzduch (napr. látky, ktoré sú vo vode zle rozpustné alebo hydrofóbne látky, alebo povrchovoaktívne látky). Za takýchto podmienok bude expozícia pochádza ť z iného materiálu, ako sa 
nachádza v roztoku, a testovacie koncentrácie môžu v závislosti od 
vlastností testovanej látky by ť vyššie ako rozpustnos ť vo vode. Pre 
testované látky s nízkou rozpustnos ťou vo vode môže by ť potrebné 
pripraviť koncentrovaný zásobný roztok alebo disperziu látky 
s použitím organického rozpúš ťadla alebo disperzantu, aby sa umož ­
nilo pridanie príslušných množstiev testovanej látky do testovacieho média a napomohlo jej rozptýlenie a rozpustenie. Treba vyvinú ť 
všetko úsilie na to, aby sa zabránilo použitiu takýchto materiálov. 
Nesmie sa vyskytova ť žiadna fytotoxicita v dôsledku použitia 
pomocných rozpúš ťadiel alebo disperzantov. Napríklad k bežne 
používaným rozpúš ťadlám, ktoré nespôsobujú fytotoxicitu pri 
koncentráciách do 100 μl·l
 –1 , patrí acetón a dimetylformamid. Ak 
sa používa rozpúš ťadlo alebo disperzant, jeho kone čná koncentrácia 
sa musí zaznamena ť a udržiava ť na minime ( ≤ 100 μ·l –1 ) a všetky 
ošetrené vzorky a kontroly musia obsahova ť rovnakú koncentráciu 
rozpúšťadla alebo disperzantu. Ďalšie informácie o použití disper ­
zantov sú uvedené v (11).  
1.7.6.  Testované a kontrolné skupiny  
Predchádzajúce poznatky o toxicite testovanej látky pre rod  Lemna , 
napr. z testov na zistenie rozmedzia, napomôžu pri vo ľbe vhodných 
testovaných koncentrácií. V kone čnom teste toxicity musí by ť aspoň 
päť testovaných koncentrácií zoradených v geometrických radoch. 
Prednostne nesmie by ť rozdeľovací koeficient medzi testovanými 
koncentráciami vyšší ako 3,2, ale môže sa použi ť vyššia hodnota, 
ak je krivka reakcie na koncentráciu plochá. Je potrebné uvies ť 
zdôvodnenie, ak sa použije menej ako pä ť koncentrácií. Na každú 
testovanú koncentráciu sa musia použi ť aspoň tri paralelky. 
Pri stanovení rozsahu testovaných koncentrácií (v prípade testov na 
zistenie rozsahu a/alebo kone čnom teste toxicity) je potrebné zváži ť 
toto: ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Na stanovenie EC  x musia testované koncentrácie obklopova ť 
hodnotu EC  x , aby sa zabezpe čila primeraná úrove ň spoľahlivosti. 
Napríklad ak sa odhaduje EC  50 , najvyššia testovaná koncentrácia 
musí byť vyššia ako hodnota EC  50 . Ak hodnota EC  50 leží mimo 
rozsahu testovaných koncentrácií, asociované intervaly spo ľahli­
vosti budú vä čšie a môže sa sta ť, že sa vhodnos ť modelu pre 
štatistické spracovanie nebude da ť správne posúdi ť. 
— Ak je cie ľom odhad LOEC/NOEC, najnižšia testovaná koncen ­
trácia musí by ť dostatočne nízka na to, aby rast nebol významne 
nižší ako v kontrole. A ďalej najvyššia testovaná koncentrácia 
musí byť dostatočne vysoká na to, aby bol rast významne nižší 
ako v kontrole. Ak to tak nie je, test sa bude musie ť opakova ť 
s použitím rôznych rozsahov koncentrácií (pokia ľ najvyššia 
koncentrácia nie je limitnou hodnotou rozpustnosti alebo maxi ­
málnou povolenou limitnou hodnotou koncentrácie, napr. 100 mg·l
 –1 ). 
Každý test musí zah ŕňať kontroly pozostávajúce z rovnakého 
živného média, po čtu lístkov a kolónií, environmentálnych 
podmienok a postupov ako v prípade testovacích nádob, ale bez testovanej látky. Ak sa používa pomocné rozpúš ťadlo alebo disper ­
zant, musí sa zahrnú ť ďalšia kontrola s rozpúš ťadlom/disperzantom 
v rovnakej koncentrácii, ako sa nachádza v nádobách s testovanou látkou. Po čet paralelných kontrolných nádob (a v prípade potreby 
nádob s rozpúš ťadlom) musí by ť minimálne rovnaký 
alebo v ideálnom prípade dvojnásobný ako po čet nádob použitý 
pre každú testovanú koncentráciu. 
Ak sa nevyžaduje stanovenie NOEC, môže sa test pozmeni ť a zvýšiť 
počet koncentrácií a zníži ť počet paraleliek na koncentráciu. Musia 
byť však aspo ň tri paralelky kontroly.
 
1.7.7.  Expozícia  
Kolónie pozostávajúce z 2 až 4 vidite ľných lístkov sa prenesú do 
kultúry inokula a náhodne sa rozdelia do testovacích nádob za steril ­
ných podmienok. Každá testovacia nádoba musí obsahova ť celkove 
9 až 12 lístkov. Po čet lístkov a kolónií musí by ť rovnaký v každej 
testovacej nádobe. Zo skúseností pri použití tejto metódy a údajov 
kruhového testu vyplýva, že tri paralelky na jedno ošetrenie, pri čom 
každá paralelka obsahuje na za čiatku 9 až 12 lístkov, sú dostato čné 
na detekciu rozdielov v raste približne v rozmedzí 4 % až 7 % inhibície vypo čítanej na základe rýchlosti rastu (10 % až 15 % 
vypočítanej pod ľa výťažku) medzi ošetreniami (10). 
Je potrebné, aby sa testovacie nádoby v inkubátore umiest ňovali 
náhodne, aby sa minimalizoval vplyv priestorových rozdielov v intenzite svetla alebo teplote. Takisto je potrebné blokové usporia ­
danie alebo náhodné premiest ňovanie nádob pri uskuto čňovaní pozo ­
rovaní (alebo častejšie premiest ňovanie).
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Ak z predbežného testu stability vyplýva, že sa nedá zachova ť 
koncentrácia testovanej látky (t. j. meraná koncentrácia poklesne 
pod 80 % meranej po čiatočnej koncentrácie) po čas trvania testu 
(7 dní), odporú ča sa uskuto čniť semistatický test. V tomto prípade 
sa kolónie musia exponova ť čerstvo pripraveným testovacím 
a kontrolným roztokom aspo ň dvakrát po čas testu (napr. dni 3 
a 5). Frekvencia expozície čerstvého média bude závisie ť od stability 
testovanej látky; môže by ť potrebná vyššia frekvencia na zachovanie 
približne konštantných koncentrácií ve ľmi nestabilných alebo prcha ­
vých látok. V niektorých prípadoch môže by ť potrebné použi ť prie­
tokový postup (11) (13). 
Spôsob expozície aplikáciou na listy (sprej) sa nenachádza v tejto 
testovacej metóde, namiesto toho pozri (14).  
1.7.8.  Podmienky inkubácie  
Použije sa kontinuálne teplé alebo studené biele fluorescen čné osvet­
lenie na zabezpe čenie zvolenej intenzity svetla medzi 85 – 
135 μE·m  –2 ·s –1 pri meraní vo fotosynteticky aktívnom žiarení (400 
– 700 nm) v bodoch v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako 
lístky rastliny rodu  Lemna  (rovnocenné 6 500 – 10 000 lux). Žiadna 
odlišnosť od zvolenej intenzity svetla nad plochou, kde sa uskuto č­ 
ňuje test, nesmú presiahnu ť ± 15 %. Metóda detekcie svetla 
a merania, najmä typ senzora, ovplyvní meranú hodnotu. Gu ľové 
senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) a „kosínusové“ senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania) sa uprednost ňujú pred 
jednosmernými senzormi a poskytnú presnejšie snímanie v prípade 
viacbodového svetelného zdroja takého typu, aký sa uvádza v tejto metóde. 
Teplota v testovaných nádobách musí by ť 24 °C ± 2 °C. pH kontrol ­
ného média sa nesmie zvýši ť počas testu o viac ako 1,5 jednotiek. 
Odchýlka o viac ako 1,5 jednotiek by však nemala spôsobi ť neplat­
nosť testu, ak sa dokáže, že sú splnené kritériá platnosti. V ur čitých 
prípadoch je potrebné venova ť dodatočnú pozornos ť kolísaniu pH, 
ako napr. pri testovaní nestabilných látok alebo kovov. Ďalšie infor ­
mácie sú uvedené v (11).
 
1.7.9.  Trvanie  
Test sa ukon čí 7 dní po premiestnení rastlín do testovacích nádob.  
1.7.10.  Merania a analytické stanovenia  
Na začiatku testu sa spo číta a zaznamená po čet lístkov v testovacích 
nádobách, pri čom je potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby sa 
spočítali vystupujúce, zrete ľne viditeľné lístky. Po čet lístkov, ktoré 
majú normálny alebo abnormálny vzh ľad, je potrebné stanovi ť na 
začiatku testu, minimálne každé 3 dni po čas expozície (t. j. aspo ň 2- 
krát počas 7 dní) a po ukon čení testu. Je potrebné si všimnú ť zmeny 
vo vývoji rastliny, napr. vo ve ľkosti lístkov, vzh ľade, známky 
nekrózy, chlorózy a gibozity, rozpad kolónií alebo stratu schopnosti plávať na hladine a v d ĺžke korienkov a vzh ľade. Je potrebné si 
všimnúť aj významné znaky testovacieho média (napr. prítomnos ť 
nerozpusteného materiálu, rast rias v testovacej nádobe).
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Okrem stanovení po čtu lístkov po čas testu sa posudzujú aj ú činky 
testovanej látky na jednu (alebo viac) z týchto meraných premen ­
ných: 
i) celková plocha lístkov; 
ii) sušina; 
iii) hmotnos ť v čerstvom stave. 
Celková plocha lístkov je výhodná, lebo sa dá stanovi ť pre každý 
test a kontrolnú nádobu na za čiatku, počas a na konci testu. Sušinu 
alebo hmotnos ť v čerstvom stave je potrebné stanovi ť na začiatku 
testu zo vzorky kultúry inokula, ktorá predstavuje kultúru použitú na začiatku testu a na konci testu, s rastlinným materiálom z každého 
testu a kontrolnej nádoby. Ak sa plocha lístkov nemeria, uprednost ­ 
ňuje sa sušina pred hmotnos ťou v čerstvom stave. 
Celková plocha lístkov, sušina a hmotnos ť v čerstvom stave sa môže 
stanoviť takto: 
i) Celková plocha lístkov: Celková plocha lístkov všetkých kolónií 
sa môže stanovi ť analýzou obrazu. Siluetu testovacej nádoby 
a rastlín možno zachyti ť prostredníctvom videokamery (t. j. 
umiestnením nádoby na svetelný box) a výsledný obraz sa digi ­
talizuje. Kalibráciou plochých tvarov známej plochy sa potom môže stanovi ť celková plocha lístkov v testovacej nádobe. Je 
potrebné venova ť pozornos ť tomu, aby sa vylú čila interferencia 
spôsobená okrajom testovacej nádoby. Alternatívnym, ale prác ­
nejším prístupom je urobi ť fotokópiu testovacej nádoby a rastlín, 
vystrihnú ť výslednú siluetu kolónií a stanovi ť ich plochu 
s použitím analyzátora plochy lístkov alebo milimetrového 
papiera. Môžu by ť vhodné aj iné techniky (napr. pomer hmot ­
nosti papiera medzi plochou siluety kolónii a jednotkou plochy). 
ii) Sušina: Všetky kolónie sa zozbierajú z každej testovacej nádoby 
a opláchnu destilovanou alebo deionizovanou vodou. Osušia sa, 
aby sa odstránila nadbyto čná voda a potom sa sušia pri 60 °C do 
konštantnej hmotnosti. Musia obsahova ť všetky úlomky korienkov. 
Sušina sa musí vyjadri ť s presnos
ťou minimálne 0,1 mg. 
iii) Hmotnos ť v čerstvom stave: Všetky kolónie sa prenesú do pred ­
vážených polystyrénových (alebo iný inertný materiál) skúma ­
viek s malými (1 mm) otvormi v zaoblených dnách. Skúmavky sa potom 10 minút centrifugujú pri 3 000 rpm pri teplote miest ­
nosti. Skúmavky obsahujúce už vysušené kolónie sa opätovne 
prevážia a hmotnos ť v čerstvom stave sa vypo číta odpočítaním 
hmotnosti prázdnej skúmavky.
 
1.7.10.1.  Frekvencia meraní a analytické stanovenia  
Ak sa použije statický test, na za čiatku a na konci testu sa musí 
zmerať pH každej ošetrenej vzorky. Ak sa použije semistatický test, 
pH sa musí zmera ť v každej dávke „ čerstvého“ testovacieho roztoku 
pred každým obnovením a aj v zodpovedajúcich „spotrebovaných“ 
roztokoch.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Intenzita svetla sa musí mera ť v rastovej komore, inkubátore alebo 
miestnosti v bodoch v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako 
lístky  Lemna . Merania sa musia uskuto čniť minimálne jedenkrát 
počas testu. Teplota média v náhradnej nádobe udržiavanej 
v rovnakých podmienkach v rastovej komore, inkubátore alebo 
miestnosti sa musí zaznamena ť minimálne jedenkrát za de ň. 
Počas testu sa v príslušných intervaloch stanovia koncentrácie testo ­
vanej látky. V statických testoch je minimálne potrebné stanovi ť 
koncentrácie na za čiatku a na konci testu. 
V semistatických testoch, kde sa o čakáva, že koncentrácie testovanej 
látky nebudú v rozmedzí ± 20 % nominálnej koncentrácie, je potrebné analyzova ť všetky čerstvo pripravené testovacie roztoky 
a rovnaké roztoky pri každom obnovení (pozri tretí 
odsek v oddiele 1.7.7). V prípade tých testov, kde však nameraná 
počiatočná koncentrácia testovanej látky nie je v rozmedzí ± 20 % 
nominálnej hodnoty, ale kde sa dajú poskytnú ť dostačujúce dôkazy 
na preukázanie, že po čiatočné koncentrácie sú reprodukovate ľné 
a stabilné (t. j. v rozmedzí 80 % – 20 % po čiatočnej koncentrácie), 
sa môžu chemické stanovenia vykona ť iba s najvyššími a najnižšími 
testovanými koncentráciami. Vo všetkých prípadoch je potrebné 
stanoviť koncentrácie testovanej látky pred obnovením iba v jednej 
paralelnej nádobe na každú testovanú koncentráciu (alebo obsahy nádob rozdelených do paraleliek). 
Ak sa použije prietokový test, je vhodný podobný systém odberu 
vzoriek, ako je uvedený pre semistatické testy, vrátane analýzy na 
začiatku, v polovici a na konci testu, ale meranie „spotrebovaných“ 
roztokov v tomto prípade nie je vhodné. Pri tomto type sa musí prietoková rýchlos ť riedidla a testovaná látka alebo zásobný roztok 
testovanej látky denne kontrolova ť. 
Ak je dokázané, že koncentrácia látky, ktorá sa testuje, je po čas testu 
dostatočnej miere udržiavaná v rozmedzí ± 20 % nominálnej 
hodnoty alebo nameranej po čiatočnej koncentrácie, analýza 
výsledkov sa môže zaklada ť na nominálnych hodnotách alebo name ­
raných po čiatoč
ných hodnotách. Ak je odchýlka od nominálnej alebo 
nameranej po čiatočnej koncentrácie vä čšia ako ± 20 %, analýza 
výsledkov sa musí zaklada ť na geometrickej strednej koncentrácii 
počas expozície alebo modeloch opisujúcich pokles koncentrácie 
testovanej látky (11).  
1.7.11.  Limitný test  
Za niektorých okolností, napr. ak z predbežného testu vyplýva, že 
testovaná látka nemá žiadne toxické ú činky pri koncentráciách do 
100 mg·l  –1 alebo do jej limitu rozpustnosti v testovacom médiu 
(podľa toho, ktorá hodnota je nižšia), môže sa uskuto čniť limitný 
test umož ňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a jednej 
ošetrenej skupine (100 mg·l  –1 alebo koncentrácia rovnaká ako limit 
rozpustnosti). Dôrazne sa odporú ča, aby sa toto zakladalo na analýze 
expozičnej koncentrácie. Na limitný test platia všetky už uvedené 
testovacie podmienky a kritériá validity s výnimkou, že musí by ť 
aspoň šesť ošetrených paraleliek. Rast v kontrolnej a ošetrenej 
skupine sa môže analyzova ť s použitím štatistického testu na porov ­
nanie prostriedkov, napr. Študentov t-test.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. ÚDAJE A SPRÁVY  
2.1. ČAS ZDVOJENIA 
Na stanovenie času zdvojenia (T  d ) počtu lístkov a pri dodržaní tohto 
kritéria platnosti pod ľa štúdie (oddiel 1.6) sa použije tento vzorec 
s údajmi, ktoré sa získali z kontrolných nádob: 
T d = ln 2/μ 
kde μ je priemerná špecifická rýchlos ť rastu stanovená a opísaná 
v prvom a druhom odseku oddielu 2.2.1.  
2.2. HODNOTY REAKCIE 
Cieľom testu je stanovi ť účinky testovanej látky na vegetatívny rast 
rastlín rodu  Lemna . Táto testovacia metóda opisuje dve premenné 
hodnoty reakcie, ke ďže členské krajiny majú rozdielne preferencie 
a regulačné požiadavky. Aby boli výsledky testu prijate ľné vo všet ­
kých členských krajinách, ú činky sa musia vyhodnoti ť s použitím 
oboch premenných hodnôt reakcie a) a b), ktoré sú uvedené nižšie. 
a) Priemerná špecifická rýchlos ť rastu: táto premenná hodnota 
reakcie sa vypo číta na základe zmien logaritmu po čtu lístkov 
a okrem toho na základe zmien logaritmu iného parametra merania (celková plocha lístkov, sušina alebo hmotnos ť 
v čerstvom stave) v kontrolách a v každej ošetrenej skupine až 
do ukončenia testu. Niekedy sa uvádza ako relatívna rýchlos ť 
rastu (15). 
b) Výťažok: táto premenná hodnota reakcie sa vypo číta na základe 
zmien po čtu lístkov a okrem toho na základe zmien iného para ­
metra merania (celková plocha lístkov, sušina alebo hmotnos ť 
v čerstvom stave) v kontrolách a v každej ošetrenej skupine až 
do ukončenia testu. 
Je potrebné pripomenú ť, že hodnoty toxicity vypo čítané s použitím 
týchto dvoch premenných hodnôt reakcie nie sú porovnate ľné a tento 
rozdiel sa musí zoh ľadniť pri použití výsledkov testu. EC
 x hodnoty 
založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (E  r C x ) budú 
obvykle vyššie ako výsledky založené na vý ťažku (E  y C x ) pri 
dodržaní testovacích podmienok tejto testovacej metódy kvôli mate ­
matickému základu príslušných metód. Neznamená to rozdiel v citlivosti medzi oboma premennými hodnotami reakcie, ale jedno ­
ducho to znamená, že hodnoty sa odlišujú matematicky. Pojem prie ­
merná špecifická rýchlos ť rastu sa zakladá na všeobecnom exponen ­
ciálnom modele rastu rias v nelimitovaných kultúrach, kde sa toxicita stanovuje na základe ú činkov na rýchlos ť rastu, bez závislosti od 
absolútnej úrovne špecifickej rýchlosti rastu kontroly, od klesania 
krivky reakcie na koncentráciu alebo od d ĺžky testu. Naopak je to 
v prípade výsledkov založených na vý ťažku ako premennej hodnote 
reakcie, ktoré sú závislé od všetkých týchto ďalších premenných. 
E
 y C x je závislé od špecifickej rýchlosti rastu druhov žaburiniek, 
ktoré sa používajú v každom teste, a od maximálnej špecifickej rýchlosti rastu, ktorá sa môže meni ť medzi druhmi a dokonca 
medzi rozdielnymi klonmi. Táto premenná hodnota reakcie sa 
nesmie použi ť na porovnanie citlivosti na toxické látky medzi 
druhmi žaburinky alebo dokonca odlišnými klonmi. Zatia ľ čo sa 
z vedeckého h ľadiska uprednost ňuje použitie priemernej špecifickej 
rýchlosti rastu, na odhady toxicity, aby sa vyhovelo sú časným regu ­
lačným požiadavkám v niektorých krajinách, do tejto testovacej 
metódy sa zahrnulo aj stanovenie toxicity založené na vý ťažku.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Odhady toxicity sa musia zaklada ť na počte lístkov a na jednej 
ďalšej meranej premennej (celková plocha lístkov, suchá hmotnos ť 
alebo čerstvá hmotnos ť), pretože niektoré látky môžu ovplyvni ť iné 
merané premenné ove ľa viac ako po čet lístkov. Tento ú činok by sa 
nemal stanovova ť iba na základe po čítania počtu lístkov. 
Počet lístkov, ako aj každá iná zaznamenaná meraná premenná, t. 
j celková plocha lístkov, sušina alebo hmotnos ť v čerstvom stave, sa 
zapíše do tabu ľky spolu s koncentráciami testovanej látky pri 
každom meraní. Následná analýza údajov, napr. na odhad LOEC, 
NOEC alebo EC  x , sa musí zaklada ť na hodnotách pre jednotlivé 
paralelné vzorky a nie na vypo čítaných stredných hodnotách pre 
každú ošetrenú skupinu.  
2.2.1.  Priemerná špecifická rýchlos ť rastu  
Priemerná špecifická rýchlos ť rastu za konkrétny čas sa vypo číta ako 
logaritmus nárastu premenných rastu – po čtu lístkov a jednej ďalšej 
meranej premennej (celková plocha lístkov, sušina alebo hmotnos ť 
v čerstvom stave) – s použitím uvedeného vzorca pre každú para ­
lelnú vzorku kontroly a ošetrených vzoriek:  
μ iÄj ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
kde: 
— μ i – j : priemerná špecifická rýchlos ť rastu od času i do j 
— N  i : meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe 
v čase i 
— N  j : meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe 
v čase j 
— t: čas od i do j. 
Pre každú ošetrenú a kontrolnú skupinu vypo čítajte strednú hodnotu 
pre rýchlos ť rastu spolu s odhadmi variancie. 
Priemerná špecifická rýchlos ť rastu sa vypo číta pre celý čas testu 
(čas „i“ v uvedenom vzorci je za čiatok testu a čas „j“ je koniec 
testu). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolu vypo čítajte 
strednú hodnotu špecifickej rýchlosti rastu spolu s odhadmi varian ­
cie. Okrem toho sa môže stanovi ť rýchlosť rastu po častiach, aby sa 
vyhodnotili ú činky testovanej látky, ktoré sa vyskytnú po čas expo­
zície (napr. skontrolovaním logaritmicky transformovaných rasto ­
vých kriviek). Zna čné rozdiely medzi rýchlos ťou rastu po častiach 
a priemernou rýchlos ťou rastu indikujú odchýlku od konštantného 
exponenciálneho rastu, a to, že je zaru čené dôkladné preskúmanie 
rastových kriviek. V tomto prípade by bolo konzervatívnym prístupom porovnávanie špecifických rýchlostí rastu ošetrených 
kultúr po čas času maximálnej inhibície so špecifickými rýchlos ťami 
rastu kontrol po čas rovnakého času.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Percento inhibície rýchlosti rastu (I  r ) sa môže potom vypo čítať pre 
každú testovanú koncentráciu (ošetrenú skupinu) pod ľa tohto vzorca:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
kde: 
— % I  r : percento inhibície priemernej špecifickej rýchlosti rastu 
— μ C : stredná hodnota pre μ v kontrole 
— μ T : stredná hodnota pre μ v ošetrenej skupine.  
2.2.2.  Vý ťažok  
Účinky na vý ťažok sa stanovia na základe dvoch meraných premen ­
ných, počtu lístkov a jednej ďalšej meranej premennej (celkového 
počtu lístkov, suchej hmotnosti alebo čerstvej hmotnosti) nachádza ­
júcej sa v každej testovacej nádobe na za čiatku a na konci testu. Pre 
sušinu alebo hmotnos ť v čerstvom stave sa po čiatočné množstvo 
biomasy stanoví na základe vzorky lístkov odobratých z rovnakej 
dávky použitej na inokuláciu testovacích nádob (pozri druhý 
odsek v oddiele 1.7.3). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolu vypo čítajte strednú hodnotu vý ťažku spolu s odhadmi 
variancie. Stredné percento inhibície vý ťažku (%I
 y ) sa môže vypo ­ 
čítať pre každú ošetrenú paralelnú vzorku takto:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
kde: 
— % I  y : percento zníženia vý ťažku 
— b  C : kone čné množstvo biomasy mínus po čiatočné množstvo 
biomasy pre kontrolnú skupinu 
— b  T : kone čné množstvo biomasy mínus po čiatočné množstvo 
biomasy v ošetrenej skupine.  
2.2.3.  Zostrojenie kriviek reakcie na koncentráciu  
Krivky reakcie na koncentráciu vz ťahujúce sa na stredné percento 
inhibície hodnoty reakcie (I  r , alebo I  y vypočítané, ako je uvedené 
v poslednom odseku oddielu 2.2.1 alebo v oddiele 2.2.2), a logaritmus koncentrácie testovanej látky sa graficky zaznamenajú.
 
2.2.4.  Odhad EC  x 
Odhady EC  x (napr. EC  50 ) sa musia zaklada ť na priemernej rýchlosti 
rastu (E  r C x ) a aj na vý ťažku (E  y C x ), z ktorých sa každý musí zasa 
zakladať na počte lístkov a jednej ďalšej meranej premennej (cel ­
kový počet lístkov, sušina alebo hmotnos ť v čerstvom stave). Je to 
preto, že existujú testované látky, ktoré rozdielne vplývajú na po čet 
lístkov, a iné merané premenné. Požadovanými parametrami toxicity sú preto štyri hodnoty EC
 x pre každú vypo čítanú úrove ň inhibície x: 
E r C x (počet lístkov), E  r C x (celková plocha lístkov, sušina alebo 
hmotnosť v čerstvom stave), E  y C x (počet lístkov) a E  y C x (celková 
plocha lístkov, sušina alebo hmotnos ť v čerstvom stave).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. ŠTATISTICKÉ POSTUPY 
Cieľom je získa ť kvantitatívny vz ťah medzi koncentráciou a reakciou 
regresnou analýzou. Možno použi ť váženú lineárnu regresiu po 
uskutočnení linearizovanej transformácie reak čných údajov – 
napríklad na probitové alebo logitové alebo Weibullove jednotky 
(16), alebo sa uprednost ňujú techniky nelineárnej regresie, ktorými 
sa lepšie spracujú nepresnosti údajov, ktorým sa nedá zabráni ť, 
a odchýlky od hladkých rozdelení. Priblížením bu ď k nulovej, 
alebo úplnej inhibícii sa takéto nepresnosti môžu transformáciou 
zväčšiť a ovplyvni ť analýzu (16). Je potrebné pripomenú ť, že štan­
dardné metódy analýzy s použitím probitových, logitových alebo 
Weibullových transformácií sa plánujú na použitie na kvantálne 
(napr. mortalita alebo prežitie) údaje a musia sa modifikova ť, aby 
sa prispôsobili údajom o rýchlosti rastu alebo biomasy. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt EC
 x zo spojitých údajov možno 
nájsť v (17) (18) a (19). 
Pre každú hodnotu reakcie, ktorá sa má analyzova ť, použite vz ťah 
medzi koncentráciou a reakciou na výpo čet bodových odhadov 
hodnôt EC  x . Ak je to možné, je potrebné stanovi ť 95 % hranice 
spoľahlivosti pre každý odhad. Vhodnos ť reakčných údajov pre 
regresný model je potrebné vyhodnoti ť buď graficky, alebo štatis ­
ticky. Regresná analýza sa musí uskuto čniť s použitím jednotlivých 
reakcií paralelných vzoriek, nie stredných hodnôt ošetrenej skupiny. 
Odhady EC  50 a hranice spo ľahlivosti sa môžu získa ť aj s použitím 
lineárnej interpolácie bootstrappingom (20), ak dostupné regresné modely/metódy sú pre údaje nevhodné. 
Na odhad LOEC aj NOEC je potrebné porovna ť stredné hodnoty 
ošetrenej skupiny s použitím techník pre analýzu variancie (ANO ­
VA). Stredná hodnota pre každú koncentráciu sa musí potom porovnať s kontrolnou strednou hodnotou s použitím príslušného 
viacnásobného porovnania alebo testovacej metódy trendu. Môže 
sa použiť Dunnettov alebo Williamsov test (21) (22) (23) (24). Je 
potrebné stanovi ť, či je dodržaný ANOVA predpoklad homogenity 
variancie. Toto stanovenie sa môže uskuto čniť graficky alebo 
oficiálnym testom (25). Vhodný je Levenov alebo Bartlettov test. 
Nesplnenie predpokladu homogenity variancie sa môže niekedy kori ­
govať logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita 
variancie extrémna a nedá sa korigova ť transformáciou, je potrebné 
posúdiť analýzu metódami, ako sú napr. „step-down Jonkheere“ testy 
trendu. Ďalšie informácie o stanovení NOEC možno nájs ť v (19). 
Najnovší vývoj vo vede vedie k odporú čaniu, aby sa upustilo od 
koncepcie NOEC a aby sa nahradila regresiou založenou na 
bodovom odhade EC
 x . Príslušná hodnota pre x nebola stanovená 
pre tento test na rastlinách rodu  Lemna . Rozsah 10 % až 20 % sa 
však zdá by ť vhodný (v závislosti od zvolenej hodnoty reakcie) 
a prednostne sa musí zaznamena ť EC  10 a EC  20 . 
3. SPRÁVA  
3.1. SPRÁVA Z TESTU 
Správa z testu musí obsahova ť tieto informácie: 
Testovaná látka: 
— fyzikálny charakter a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti 
vrátane limitu rozpustnosti vo vode,  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— chemické identifika čné údaje (napr. číslo CAS) vrátane čistoty. 
Testované druhy: — vedecký názov, klon (ak je známy) a zdroj. 
Testovacie podmienky: 
— použitý postup testovania (statický, semistatický 
alebo prietokový), 
— dátum za čiatku testu a jeho d ĺžka, 
— testovacie médium, 
— opis priebehu experimentu: testovacie nádoby a veká, objemy 
roztokov, po čet kolónií a lístkov na testovaciu nádobu na 
začiatku testu, 
— testované koncentrácie (nominálne a merané pod ľa potreby) 
a počet paralelných vzoriek na koncentráciu, 
— metódy prípravy zásobných roztokov vrátane všetkých použitých 
rozpúšťadiel alebo disperzantov, 
— teplota po čas testu, 
— zdroj svetla, intenzita a homogenita, 
— hodnoty pH testovacieho a kontrolného média, 
— koncentrácie testovaných látok a metóda analýzy s príslušným 
posúdením kvality údajov (valida čné štúdie, štandardné odchýlky 
alebo hranice spo ľahlivosti analýzy), 
— metódy stanovenia po čtu lístkov a iné merané premenné, napr. 
sušina, hmotnos ť v čerstvom stave alebo po čet lístkov, 
— všetky odchýlky od tejto testovacej metódy. Výsledky: 
— nespracované údaje: po čet lístkov a iné merané premenné 
v každej testovacej a kontrolnej nádobe pri každom pozorovaní 
a analýze, 
— stredné hodnoty a štandardné odchýlky pre každú meranú 
premennú, 
— rastové krivky pre každú koncentráciu (odporú čané 
s logaritmicky transformovanou meranou premennou, pozri druhý odsek v oddiele 2.2.1), 
— čas zdvojenia/rýchlos ť rastu v kontrole založené na po čte lístkov, 
— vypočítané hodnoty reakcie pre každú ošetrenú paralelnú vzorku 
so strednými hodnotami a varian čným koeficientom pre para ­
lelky, 
— grafické znázornenie vz ťahu koncentrácie/ú činku, 
— odhady toxických kone čných bodov pre hodnoty reakcie, napr. 
EC
 50 , EC  10 , EC  20 , a príslušné intervaly spo ľahlivosti. Ak sa 
vypočítava, LOEC a NOEC a štatistické metódy použité na ich 
stanovenie,  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— ak sa používa ANOVA, ve ľkosť účinku, ktorý sa stanovil (napr. 
najmenej významný rozdiel), 
— každá stimulácia rastu zistená v každom ošetrení, — všetky vidite ľné znaky fytotoxicity, ako aj pozorovania testova ­
cích roztokov, 
— diskusia k výsledkom vrátane každého vplyvu na záver z testu 
vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.
 
4. POUŽITÁ LITERATÚRA  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test. 
(2) The use of Lemna studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, 
at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals. 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, dostupné na adrese: 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685# 
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415 – 91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733 – 742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental 
Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, 
PA. 
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96 – 156. 8 pp. 
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90 – 337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 pp. 
(7) SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15pp. (v švéd čine). 
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37 – 120 pp. 
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145. 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc – Environment Agency. 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3 – 77 108. September 1977. 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioas ­
says with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359. 
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481 – 483. 
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713 – 718. 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157 – 167. 
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485 – 1494. 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asse ­
ssment Center Technical Report 05 – 88. USEPA, Duluth, MN. 
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096 – 1121. 
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482 – 491. 
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103 – 117. 
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510 – 531. 
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93 – 96.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Dodatok 1  
Opis  Lemna  spp.  
Vodná rastlina bežne nazývaná žaburinka,  Lemna  spp., patrí do čeľade Lemna­
ceae, ktorá má množstvo druhov rozšírených po celom svete v štyroch rodoch. 
Ich odlišný vzh ľad a taxonómia sú dôkladne opísané (1) (2).  Lemna gibba  a L. 
minor  sú druhy zastúpené v miernych pásmach a bežne sa používajú na testy 
toxicity. Obidva druhy majú plávajúcu alebo ponorenú by ľ v tvare disku (lístok) 
a veľmi tenký kore ň vychádzajúci z centra spodnej plochy každého lístka.  Lemna  
spp. zriedkavo vytvárajú kvety a rastliny sa rozmnožujú vegetatívne vytváraním 
nových lístkov (3). V porovnaní so staršími rastlinami bývajú bledšie, majú 
kratšie korene a skladajú sa z dvoch až troch lístkov rôznych ve ľkostí. Malá 
veľkosť rastliny  Lemna , jej jednoduchá štruktúra, nepohlavné rozmnožovanie 
a krátky čas vývoja umož ňujú, že rastliny tohto rodu sú ve ľmi vhodné na labo ­
ratórne testovanie (4) (5). 
Vzhľadom na pravdepodobné odchýlky medzi druhmi sú platné iba porovnania 
citlivosti v rámci jedného druhu.  
Príklady druhov  Lemna , ktoré sa používajú na testovanie: Odkazy týkajúce 
sa druhov  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as 
a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935 – 941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. 
EPA 712-C-96 – 156. 8 pp. 
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90 – 337: 
Détermination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 pp. 
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth 
inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (v švéd čine). 
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415 – 91 (Reapproved 1998). pp. 733 – 742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. EPA 
712-C-96 – 156. 8 pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959 – 1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87 – 96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the asse ­
ssment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481 – 483.
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and 
synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102 – 2111.  
Zdroje druhov  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria 
Department of Botany, University of Toronto Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 Tel. +1 4169783641 
Fax +1 4169785878 
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc 
North Carolina State University 
Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695 – 8002 
United States 
Tel. 1 9195157572 astomp@unity.ncsu.edu 
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University 
SE-106 91 STOCKHOLM SWEDEN Tel. +46 86747240 Fax +46 86747636 
Federal Environmental Agency (UBA) 
FG III 3.4 Schichauweg 58 
12307 Berlin 
GERMANY e-mail: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm
 
Použitá literatúra  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221 – 287. 
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland. 
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82 – 991150 – 0 – 0. The 
Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo. 
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1 – 14. 
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7 – 22.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Dodatok 2  
Uchovávanie zásobnej kultúry  
Zásobné kultúry sa môžu dlhší čas uchováva ť pri nízkych teplotách (4 °C – 
10 °C) bez toho, aby ich bolo potrebné opätovne pripravi ť. Rastové médium 
pre rastliny rodu  Lemna  môže by ť rovnaké, ako sa používa na testovanie, ale pre 
zásobné kultúry sa môžu použi ť iné médiá bohaté na živiny. 
Pravidelne sa pomocou sterilných nástrojov premiestni množstvo mladých svetlo ­
zelených rastlín do nových kultiva čných nádob obsahujúcich čerstvé médium. Pri 
chladnejšej teplote navrhnutej v tomto materiáli sa môže čiastočná kultivácia 
vykonáva ť v intervaloch až tri mesiace. 
Musia sa používa ť chemicky čisté (umyté v kyseline) a sterilné sklenené kulti ­
vačné nádoby a sterilné postupy. V prípade kontaminácie zásobnej kultúry, napr. 
riasami alebo ples ňami, je potrebné prija ť opatrenia na odstránenie kontaminu ­
júcich organizmov. V prípade rias a vä čšiny iných kontaminujúcich organizmov 
sa to dá docieli ť povrchovou sterilizáciou. Vzorka kontaminovaného rastlinného 
materiálu sa odoberie a korienky sa odstrihnú. Potom sa materiál prudko pretrepe 
v čistej vode, následne sa ponorí do 0,5 % (v/v) roztoku chlórnanu sodného na 
30 sekúnd až 5 minút. Rastlinný materiál sa potom opláchne sterilnou vodou 
a prenesie v nieko ľkých dávkach do kultiva čných nádob obsahujúcich čerstvé 
rastové médium. V dôsledku tohto postupu ve ľa lístkov uhynie, najmä ak sa 
použijú dlhšie expozi čné časy, ale tie, ktoré prežijú, sú obvykle nekontamino ­
vané. Tieto sa môžu potom použi ť na opätovné nao čkovanie nových kultúr.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Dodatok 3  
Médiá  
Odporúčajú sa rôzne rastové médiá pre  L. minor  a L. gibba . Pre  L. minor  sa 
odporúča modifikované médium pod ľa švédskej normy (SIS), zatia ľ čo pre  L. 
gibba  sa odporú ča médium 20X AAP. Zloženia oboch médií sú uvedené nižšie. 
Pri príprave týchto médií sa musia použi ť reagencie alebo chemikálie analytickej 
kvality a deionizovaná voda.  
Rastové médium pod ľa švédskej normy (SIS) pre rastliny rodu  Lemna  
— Zásobné roztoky I – V sa sterilizujú v autokláve (120 °C, 15 minút) alebo 
membránovou filtráciou (ve ľkosť pórov približne 0,2 μm). 
— Zásobný roztok VI (a volite ľne VII) sa sterilizuje iba membránovou filtrá ­
ciou, nie je potrebné ho autoklávova ť. 
— Sterilné zásobné roztoky sa skladujú v chlade a tme. Zásobné roztoky 
I – V sa musia vyradi ť po šiestich mesiacoch, zatia ľ čo zásobný roztok VI 
(a voliteľne VII) má čas použite ľnosti jeden mesiac.  
Zásobný 
roztok č. Látka Koncentrácia 
v zásobnom 
roztoku (g·l  –1 ) Koncentrácia 
v pripravenom 
médiu (mg·l  –1 ) Pripravené médium 
Prvok Koncentrácia 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 1,00 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 B 
Mn Mo Zn 
Cu 
Co 0,17 
0,056 0,0040 0,011 
0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (tlmiaci roztok) 490 490 — — 
— Na prípravu jedného litra média SIS sa pridá do 900 ml deionizovanej vody: 
— 10 ml zásobného roztoku I — 5 ml zásobného roztoku II — 5 ml zásobného roztoku III — 5 ml zásobného roztoku IV
 ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml zásobného roztoku V 
— 5 ml zásobného roztoku VI — 1 ml zásobného roztoku VII (volite ľné).
 
Poznámka:  Ďalší zásobný roztok VII (tlmivý roztok MOPS) môže by ť potrebný pre 
určité testované látky (pozri posledný odsek v oddiele 1.4).  
— pH sa nastaví na 6,5 ± 0,2 bu ď 0,1, alebo 1 mol HCl, alebo NaOH a objem 
sa doplní do jedného litra deionizovanou vodou.  
Rastové médium 20X AAP  
Zásobné roztoky sa pripravia v sterilnej destilovanej alebo deionizovanej vode. 
Sterilné zásobné roztoky sa skladujú v chlade a tme. V týchto podmienkach budú 
mať zásobné roztoky čas trvanlivosti minimálne 6 – 8 týžd ňov. 
Pre médium 20X – AAP sa pripraví pä ť živných zásobných roztokov (A1, A2, 
A3, B a C) a použijú sa chemikálie reagen čnej kvality. Na prípravu rastového 
média sa pridá 20 ml každého živného zásobného roztoku do približne 850 ml 
deionizovanej vody. pH sa nastaví na 7,5 ± 0,1 bu ď 0,1, alebo 1 mol HCl, alebo 
NaOH a objem sa doplní do jedného litra deionizovanou vodou. Médium sa potom prefiltruje do sterilnej nádoby cez 0,2 μm (približne) membránový filter. 
Rastové médium ur čené na testovanie sa musí pripravi ť 1 – 2 dni pred použitím, 
aby sa stabilizovalo pH. Pred použitím sa skontroluje pH rastového média 
a v prípade potreby sa znovu upraví pridaním 0,1 alebo 1 M NaOH, alebo 
HCl, ako sa uvádza vyššie.
 
Zásobný 
roztok č. Látka Koncentrácia 
v zásobnom 
roztoku (g·l  –1 ) (*) Koncentrácia 
v pripravenom 
médiu(mg·l  –1 ) (*) Pripravené médium 
Prvok Koncentrácia 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Pokia ľ nie je známa.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Poznámka: Teoreticky vhodná kone čná koncentrácia hydrogenuhli čitanu (ktorým by sa 
zabránilo zna čnému upravovaniu pH) je 15 mg/l, a nie 300 mg/l. Používanie 
20X AAP média v minulosti vrátane kruhového testu pre túto metódu je zalo ­ 
žené na 300 mg/l [I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD 
Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment 
Agency].  
STEINBERGOVO médium (pod ľa ISO 20079)  
Koncentrácie a zásobné roztoky  
— Modifikované Steinbergovo médium sa používa v ISO 20079 pre samotné  
Lemna minor  (lebo iba  Lemna minor  je v tomto prípade povolená), ale 
z testov vyplýva, že dobré výsledky sa dajú dosiahnu ť aj s  Lemna gibba . 
— Pri príprave média sa musia použi ť reagencie alebo chemické látky 
reagenčnej alebo analytickej kvality a deionizovaná voda. 
— Príprava živného média zo zásobných roztokov alebo 10-krát koncentrova ­
ného média, ktoré umož ňuje maximálnu koncentráciu média bez vyzrážania.  
Tabuľka 1 
pH-stabilizované STEINBERGOVO médium (modifikované pod ľa Altenburgera)  
Látka Živné médium  
Makroprvky  mol. hmotnos ť mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroprvky  mol. hmotnos ť μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA dinátrium-dihydrát 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabuľka 2 
Zásobné roztoky (Makroprvky)  
1. Makroprvky (50-krát koncentrovaný)  g/l  
Zásobný roztok 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Zásobný roztok 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Zásobný roztok 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabuľka 3 
Zásobné roztoky (Mikroprvky)  
2. Mikroprvky (1 000-krát koncentrovaný)  mg/l  
Zásobný roztok 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Zásobný roztok 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Zásobný roztok 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Zásobný roztok 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Zásobný roztok 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA dinátrium-dihydrát 1 500,00 
— Môžu sa použi ť zásobné roztoky 2 a 3 a samostatne 4 až 7 (pri zoh ľadnení 
požadovaných koncentrácií). 
— Na dlhší čas trvanlivosti sterilizujte zásobné roztoky v autokláve pri 121 °C 
20 min. alebo alternatívne sterilne prefiltrujte (0,2 μm). Pre zásobný roztok 8 
sa dôrazne odporú ča sterilná filtrácia (0,2 μm). 
Príprava kone čnej koncentrácie STEINBERGOVHO média (modifikované)  
— Pridajte 20 ml zásobných roztokov 1, 2 a 3 (pozri tabu ľku 2) do približne 
900 ml deionizovanej vody, aby ste zabránili vyzrážaniu. 
— Pridajte 1,0 ml zásobných roztokov 4, 5, 6, 7 a 8 (pozri tabu ľku 3). 
— pH musí by ť 5,5 ± 0,2 (upravte pridaním minimálneho objemu roztoku 
NaOH alebo HCl).  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Doplňte vodou do 1 000 ml. 
— Ak sú roztoky sterilné a používa sa vhodná voda, ďalšia sterilizácia nie je 
potrebná. Ak sa sterilizuje kone čné médium, zásobný roztok 8 sa musí prida ť 
po autoklávovaní (20 min. pri 121 °C).  
Príprava 10-krát koncentrovaného STEINBERGOVHO média (modifikova ­
ného) na do časné skladovanie  
— Pridajte 20 ml zo zásobných roztokov 1, 2 a 3 (pozri tabu ľku 2) približne do 
30 ml vody, aby ste zabránili vyzrážaniu. 
— Pridajte 1,0 ml zo zásobných roztokov 4, 5, 6, 7 a 8 (pozri tabu ľku 3). 
Doplňte vodou do 100 ml. 
— Ak sú roztoky sterilné a používa sa vhodná voda, ďalšia sterilizácia nie je 
potrebná. Ak sa sterilizuje kone čné médium, zásobný roztok 8 sa musí prida ť 
po autoklávovaní (20 min. pri 121 °C). 
— pH média (kone čná koncentrácia) musí by ť 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – 
VODA ZA POUŽITIA OBOHATENÉHO SEDIMENTU  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 218 (2004). Táto testovacia metóda bola vypracovaná 
s cieľom hodnoti ť účinky pred ĺženého pôsobenia chemikálií na vodné 
larvy dvojkrídlovcov rodu  Chironomus  žijúce v sedimente. Vychádza 
z existujúcich protokolov o testoch toxicity pri druhoch  Chironomus ripa ­
rius a Chironomus tentans , ktoré boli vypracované v Európe (1) (2) (3) 
a Severnej Amerike (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom 
(1) (6) (9). Môžu sa použi ť aj iné dobre zdokumentované druhy pakomárov, 
napr.  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Expozi čný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie sedi ­
mentu testovanou látkou. Výber vhodného expozi čného scenára závisí od 
plánovaného použitia testu. Scenár obohacovania sedimentu je ur čený na 
simuláciu akumulovaných úrovní chemikálií pretrvávajúcich v sedimente. Tento expozi čný systém zah ŕňa obohacovanie sedimentu v testovacom 
systéme sediment – voda. 
3. Látky, ktoré je potrebné testova ť na organizmoch žijúcich v sedimente, 
zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce 
v sedimente môžu by ť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam 
každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich 
podieľa na celkových toxických ú činkoch, závisí od fyzikálno-chemických 
vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log K
 ow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže by ť 
významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. 
S cieľom zabráni ť podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok možno 
zvážiť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testovanej 
látky. S cie ľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa táto 
testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je 
v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov  C. riparius  a C. yoshimatsui  
a 28 – 65 dní pri  C. tentans . Ak sú na špecifické ú čely potrebné krátkodobé 
údaje, napríklad s cie ľom skúma ť účinky nestabilnej chemikálie, môžu sa po 
desiatich d ňoch odstráni ť ďalšie replikáty. 
4. Meranými parametrami sú celkový po čet vykuklených dospelých jedincov 
a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporú ča sa 
vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich d ňoch s použitím 
ďalších replikátov pod ľa potreby. 
5. Odporú ča sa použi ť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment 
má oproti prírodným sedimentom nieko ľko výhod: 
— zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára repro ­
dukovateľnú „štandardizovanú matricu“, a odstráni sa potreba nájs ť 
nekontaminované a čisté zdroje sedimentu, 
— testy je možné za čať kedykoľvek bez problému sezónnej variability 
v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripravi ť, aby 
sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu 
takisto znižuje náklady spojené s odberom dostato čných množstiev sedi ­
mentu v teréne na rutinné testovanie, 
— použitie umelo pripraveného sedimentu umož ňuje porovnanie toxicity 
a následné zatriedenie látok. 
6. Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCÍP TESTU 
7. Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií 
testovanej chemikálie v systémoch sediment – voda. Sediment sa obohatí testovanou látkou a následne sa larvy prvého instaru zavedú do testovacích 
kadičiek, v ktorých sa stabilizovali koncentrácie sedimentu a vody. Na konci 
testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Pod ľa potreby sa 
môže po desiatich d ňoch mera ť aj prežitie a hmotnos ť lariev (pomocou 
ďalších replikátov pod ľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú bu ď prostredníc ­
tvom regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila 
× % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC
 15 , EC  50 
atď.), alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie 
koncentrácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatis ­
tických testov porovna ť hodnoty ú činkov s kontrolnými hodnotami.  
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
8. Je potrebné pozna ť rozpustnos ť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, 
namerané alebo vypo čítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v 
sedimente. Mala by by ť k dispozícii spo ľahlivá analytická metóda so 
známou a zdokumentovanou presnos ťou a detek čným limitom na kvantifi ­
káciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi 
užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. 
Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. 
rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia at ď.). Ďalšie informácie pre 
testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnos ťami, ktoré s ťažujú ich 
testovanie, sú uvedené v odkaze (12).  
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
9. Referen čné chemikálie sa môžu testova ť pravidelne ako prostriedok na 
zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. 
Príkladmi referen čných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú 
v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, penta ­
chlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13).  
PLATNOS Ť TESTU 
10. Pre platnos ť testu je potrebné uplat ňovať tieto podmienky: 
— vykuklenie v kontrolných skupinách musí by ť na konci testu na úrovni 
minimálne 70 % (1) (6), 
— vykuklenie druhov  C. riparius  a C. yoshimatsui  na dospelé jedince 
z kontrolných nádob by malo nasta ť 12 – 23 dní po ich vložení do 
nádob. V prípade druhu C. tentans je potrebné obdobie 20 – 65 dní, 
— na konci testu je potrebné zmera ť v každej nádobe pH a koncentráciu 
rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavova ť najmenej 60 % satura čnej hodnoty vzduchom (ASV) 
a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách 
mala byť v rozmedzí 6 – 9, 
— teplota vody by sa nemala líši ť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je 
možné kontrolova ť pomocou izotermickej komory a v tom prípade je 
potrebné v primeranom časovom intervale potvrdi ť teplotu v komore.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
OPIS METÓDY  
Testovacie nádoby  
11. Štúdia sa vykonáva v sklenených kadi čkách s objemom 600 ml a s prie ­
merom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaru čiť vhodnú h ĺbku 
nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal by ť dostatočne 
veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm  2 priestoru na larvu. Pomer h ĺbky vrstvy 
sedimentu k h ĺbke nadložnej vody by mal by ť 1: 4. Testovacie nádoby a iné 
prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali by ť 
vyrobené výlu čne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. 
teflónu).  
Výber druhov  
12. Uprednost ňovaným druhom na použitie v teste je  Chironomus riparius . 
Chironomus tentans  je takisto vhodný, ale je náro čnejší na starostlivos ť 
a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použi ť aj Chironomus yoshimatsui . 
Podrobné informácie o kultiva čných metódach v prípade druhu  Chironomus 
riparius  sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultiva čných podmienkach 
sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j.  Chironomus tentans  (4) a  Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identifikácia druhov musí by ť pred testovaním potvrdená, 
ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry.
 
Sediment  
13. Uprednost ňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod 
názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však 
použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizova ť (aspoň pH, 
obsah organického uhlíka, odporú ča sa takisto stanovenie ostatných parame ­
trov ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahova ť žiadne konta ­
minanty ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperi ť alebo ich 
požierať. Takisto sa odporú ča, aby bol prírodný sediment pred použitím 
v teste toxicity pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú prevláda ť v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa 
odporúča použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej 
pôde použitej v testovacej metóde C.8 (14): 
a) 4 – 5 % (suchá hmotnos ť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je 
dôležité použi ť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (ve ľkosť 
častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom; 
b) 20 % (suchá hmotnos ť) kaolínu (obsah kaolinitu pod ľa možnosti nad 
30 %); 
c) 75 – 76 % (suchá hmotnos ť) kremenného piesku (mal by prevláda ť 
jemný piesok s viac ako 50 % častíc s ve ľkosťou od 50 do 200 μm); 
d) deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkos ť konečnej zmesi 
v rozsahu 30 - 50 %; 
e) uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO
 3 ) sa pridá, aby sa pH 
konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5; obsah organického 
uhlíka v kone čnej zmesi by mal by ť 2 % (± 0,5 %) a je potrebné ho 
upraviť pomocou primeraného množstva rašeliny a piesku pod ľa písmen 
a) a c). 
14. Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal by ť známy. Je potrebné skontrolo ­
vať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké 
kovy, organochlórové zlú čeniny, organofosforové zlú čeniny atď.). Príklad 
prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc 
rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostato čnej miere uvedené do 
podmienok.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Voda  
15. Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijate ľnej 
riediacej vody pod ľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná 
ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo 
podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlóro ­
vaná voda z vodovodu sú prijate ľné ako voda na kultiváciu a testovacia 
voda, ak v nej pakomáre prežijú po čas celej kultivácie a testovania bez 
príznakov stresu. Na za čiatku testu by pH testovacej vody mala ma ť 
hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdos ť by nemala by ť vyššia ako 400 
mg/l pre CaCO  3 . Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi 
tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použi ť voda s nižšou tvrdos ťou (a 
v takom prípade sa teda nesmie použi ť Elendtovo médium M4). Po čas celej 
štúdie by sa mal používa ť rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody 
uvedené v dodatku 4 by sa mali mera ť najmenej dvakrát za rok alebo ak 
existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeni ť. 
Zásobné roztoky – obohatené sedimenty  
16. Obohatené sedimenty vybratej koncentrácie sa zvy čajne pripravujú pridaním 
roztoku testovanej látky priamo do sedimentu. Zásobný roztok testovanej 
látky rozpustenej v deionizovanej vode sa zmieša s umelo pripraveným 
sedimentom pomocou valcovne, stroja na miešanie krmív alebo ru čným 
miešaním. Ak je testovaná látka slabo rozpustná vo vode, možno ju rozpustiť v čo najmenšom objeme vhodného organického rozpúš ťadla (napr. 
hexán, acetón alebo chloroform). Tento roztok sa následne zmieša s 10 
g jemného kremenného piesku na jednu testovaciu nádobu. Po čká sa, 
kým sa rozpúš ťadlo odparí, pri čom sa musí z piesku celkom odstráni ť. 
Piesok sa potom zmieša s vhodným množstvom sedimentu na testovaciu 
kadičku. Na zvýšenie rozpustnosti, na disperziu alebo na emulziu testovanej 
látky možno použi ť iba látky, ktoré sú ľahko prchavé. Treba ma ť na pamäti, 
že pri príprave sedimentu je nutné zoh ľadniť piesok, ktorý pochádza 
z testovanej látky a pieskovej zmesi (t. j. sediment by sa teda mal pripravi ť 
s menším množstvom piesku). Je nutné zabezpe čiť, aby sa testovaná látka 
pridávaná do sedimentu v sedimente dôkladne a rovnomerne distribuovala. V prípade potreby možno na ú čely stanovenia stup ňa homogenity analy ­
zovať podvzorky.
 
KONCEPCIA TESTU 
17. Koncepcia testu sa vz ťahuje na výber po čtu a odstup testovaných koncen ­
trácií, počet nádob pri každej koncentrácii a po čet lariev v každej nádobe. 
Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncen ­
trácie NOEC a na vykonanie limitného testu.  
Koncepcia regresnej analýzy  
18. Účinná koncentrácia (napr. EC  15 , EC  50 ) a koncentra čný rozsah, v ktorom sa 
skúmajú ú činky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do 
testu. Vo všeobecnosti sú presnos ť a najmä platnos ť, s ktorou možno odha ­
dovať účinné koncentrácie (EC  x ), lepšie, ak je ú činná koncentrácia 
v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýba ť sa extrapolácii 
hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou 
koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užito čný 
predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Ak je potrebné odhadnú ť EC  x , malo by sa testova ť najmenej pä ť koncen­
trácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade sa odporú ča 
použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový 
odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal by ť väčší ako dva (v prípa ­
doch, keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobi ť 
výnimku). Po čet replikátov pri každej aplikácii sa môže zníži ť, ak sa zvýši 
počet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie po čtu 
replikátov alebo skrátenie d ĺžky intervalov testovacích koncentrácií zvy čajne 
vedie k nižším intervalom spo ľahlivosti testu. Ak sa odhaduje desa ťdňové 
prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty.  
Koncepcia odhadu NOEC/LOEC  
20. Ak sa odhadujú koncentrácie LOEC alebo NOEC, použije sa pä ť testova­
cích koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentrá ­
ciami by nemal by ť vyšší ako 2. Po čet replikátov by mal by ť dostatočný, 
aby sa zabezpe čila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie 
rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). 
V prípade vývojového pomeru je zvy čajne vhodná analýza 
rozptylu (ANOVA), ako napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere vykuklenia možno použi ť Cochranov-Armitageho 
test, Fisherov exaktný test (s Bonferroniho korekciou) alebo 
Mantelov-Haenszelov test.
 
Limitný test  
21. Môže sa vykona ť limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak 
v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne ú činky. 
Účelom limitného testu je vykona ť test pri dostato čne vysokej koncentrácii, 
ktorá umožní subjektom zodpovedným za rozhodovanie vylú čiť možné 
toxické ú činky testovanej látky a stanovi ť limit pri koncentrácii, ktorá sa 
neočakáva v žiadnej situácii. Odporú ča sa úrove ň 1 000 mg/kg (suchá hmot ­
nosť). Zvyčajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných najmenej šes ť repli­
kátov. Je nutné preukáza ť primeranú štatistickú výpovednú hodnotu na 
zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer a hmotnos ť) je vhodnou 
štatistickou metódou t-test, pokia ľ údaje sp ĺňajú požiadavky tohto testu 
(normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požiadavky nie sú splnené, 
môže sa použi ť t-test nerovnomerných rozptylov alebo neparametrický test 
ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test.
 
POSTUP  
Podmienky expozície  
Príprava systému obohatený sediment – voda  
22. Postup obohacovania opísaný v testovacej metóde C.8: Toxicita pre 
dážďovky je odporú čaným postupom na aplikáciu testovanej látky (14). 
Obohatené sedimenty sa umiestnia do nádob, do ktorých sa pridá nadložná voda, aby sa vytvoril objemový pomer sediment – voda 1: 4 (pozri odseky 
11 a 15). Výška vrstvy sedimentu by mala by ť v rozsahu 1,5 - 3 cm. 
S cieľom zabráni ť separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného 
materiálu po čas pridávania testovacej vody do vodného st ĺpca môže by ť 
sediment v čase, keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotú ­ 
čom, ktorý sa hne ď potom odstráni. Môže by ť vhodné aj použitie iných 
prístrojov. 
23. Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými plat ňami). V prípade 
potreby sa po čas štúdie dop ĺňajú hladiny vody na pôvodný objem 
s cieľom kompenzova ť vyparovanie vody. Na tento ú čel sa použije destilo ­
vaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizácia  
24. Keď je obohatený sediment s nadložnou vodou pripravený, je vhodné 
umožniť delenie testovanej látky z vodnej fázy do sedimentu (3) (4) (6) 
(13). To by sa pod ľa možnosti malo vykona ť za rovnakých teplotných 
a prevzduš ňovacích podmienok, aké sa použijú v teste. Primeraný čas vyva­ 
žovania závisí od konkrétneho sedimentu a chemikálie a môže trva ť 
niekoľko hodín až dní a v zriedkavých prípadoch až nieko ľko týždňov (štyri 
až päť týždňov). Keďže tým by sa poskytol čas na degradáciu mnohých 
chemikálií, na rovnovážny stav sa ne čaká, ale odporú ča sa vyvažovacie 
obdobie v trvaní 48 hodín. Na konci tohto ďalšieho vyvažovacieho obdobia 
sa odmeria koncentrácia testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode 
a sedimente aspo ň pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii 
(pozri odsek 38). Tieto analytické skúmania testovanej látky umož ňujú 
výpočet hmotnostnej bilancie a vyjadrenie výsledkov na základe meraných 
koncentrácií.  
Pridanie testovacích organizmov  
25. Štyri až pä ť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob 
sa z kultúr odoberú vají čkové masy a umiestnia sa do malých nádob 
s kultivačných médiom. Môže sa použi ť staršie médium zo zásobnej kultúry 
alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kulti ­
vačné médium, je potrebné do ň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené 
riasy a/alebo nieko ľko kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vlo č­
kového krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené 
vajíčkové masy. Larvy sa zvy čajne začnú liahnu ť niekoľko dní po nakladení 
vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu  Chironomus riparius  pri teplote 
20 °C a jeden až štyri dni v prípade  Chironomus tentans  pri teplote 
23 °C a  Chironomus yoshimatsui  pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha 
v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliah ­
nutí). Instar pakomárov je možné skontrolova ť podľa šírky hlavového 
segmentu (6). 
26. Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých 
testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzduš ňo­
vanie vody je nutné po čas pridávania lariev do testovacích nádob preruši ť 
a musí by ť pozastavené po čas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri 
odseky 25 a 32). Pod ľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) 
je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu 
EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC.
 
Testovacie koncentrácie  
27. Pri ur čovaní rozsahu koncentrácií pre kone čný test môže by ť užitočný test 
na zistenie rozsahu. Na tento ú čel sa použije súbor koncentrácií testovanej 
látky s ve ľkými odstupmi. S cie ľom zabezpe čiť rovnakú hustotu povrchu na 
pakomára, ktorá sa použije pri kone čnom teste, sú pakomáre vystavené 
každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umož ňuje odhad 
vhodných testovacích koncentrácií, pri čom nie sú potrebné žiadne replikáty. 
28. Testovacie koncentrácie pre kone čný test sa vyberú na základe výsledkov 
testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použi ť a vybrať najmenej pä ť koncen­
trácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontroly  
29. Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré 
však obsahujú sediment, a primeraný po čet replikátov (pozri odseky 19 – 
20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúš ťadlo (pozri odsek 
16), je potrebné prida ť kontrolu rozpúš ťadla v sedimente.  
Testovací systém  
30. Použijú sa statické systémy. Vo výnimo čných prípadoch sa môžu použi ť 
semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým 
obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody 
nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyv ňujú chemickú rovno ­
váhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylu čo­
vaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo 
má vplyv na pH a/alebo tvrdos ť vody). Zvy čajne však posta čujú 
a uprednost ňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako 
napríklad prevzduš ňovanie.  
Potrava  
31. Je nevyhnutné larvy k ŕmiť podľa možnosti každý de ň alebo najmenej trikrát 
do týždňa. V prvých desiatich d ňoch je pre mladé larvy pod ľa všetkého 
vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) 
v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh  C. yoshimatsui ) 
na jednu larvu. Pre staršie larvy môže by ť potrebné o nie čo väčšie množstvo 
potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu posta čovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa 
v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo 
všetkých testovacích nádobách zníži ť a mal by sa kontrolova ť. Ak nie je 
možné vznik hubovitých organizmov zastavi ť, test je nutné opakova ť. Pri 
testovaní silno adsorbujúcich látok (napr. s log K
 ow > 5) alebo látok, ktoré 
sa kovalentne viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu 
pred stabiliza čným obdobím prida ť množstvo potravy potrebné na zabezpe ­ 
čenie prežitia a prirodzeného rastu organizmov. Na tento ú čel sa namiesto 
krmiva pre ryby musí použi ť rastlinný materiál, napr. sa môže prida ť 0,5 % 
(suchá hmotnos ť) jemne rozomletých listov napr. p ŕhľavy dvojdomej 
(Urtica dioica ), moruše ( Morus alba ), ďateliny plazivej ( Trifolium repens ), 
špenátu ( Spinacia oleracea ) alebo iného rastlinného materiálu ( Cerophyl  
alebo alfa celulóza).  
Podmienky inkubácie  
32. Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpe čí jemné prevzduš ­ 
ňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokra čuje v ňom počas 
celého testu (treba dba ť na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka 
neklesla pod 60 % ASV). Prevzduš ňovanie sa zabezpe čí pomocou sklenenej 
Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna alebo nieko ľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, 
možno zváži ť, že systém sediment – voda sa nebude prevzduš ňovať. 
33. Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu  C. 
tentans  sa odporú ča teplota 23 °C a v prípade  C. yoshimatsui  25 °C (± 
2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pri čom intenzita svetla by mala 
byť 500 – 1 000 luxov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Trvanie expozície  
34. Expozícia sa za čne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. 
Maximálna d ĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov  C. riparius  a C. 
yoshimatsui  a 65 dní v prípade  C. tentans . Ak sa pakomáre vykuklia skôr, 
test sa môže ukon čiť najskôr po piatich d ňoch po vykuklení posledného 
dospelého jedinca v kontrolnej skupine.  
Pozorovania  
Vykuklenie  
35. Určí sa čas vývoja a celkový po čet úplne vykuklených sam čích a sami čích 
pakomárov. Sam čeky sa ľahko identifikujú pod ľa obrvených tykadiel. 
36. Testovacie nádoby je potrebné pozorova ť najmenej trikrát do týžd ňa 
s cieľom vizuálne zhodnoti ť každé abnormálne správanie (napr. opúš ťanie 
sedimentu, nezvy čajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Po čas 
obdobia o čakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý de ň spočítať vyku­
klené pakomáre. Pohlavie a po čet úplne vykuklených pakomárov sa zazna ­
menáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vají č­
kové masy nakladené pred ukon čením testu sa zaznamenajú a následne 
odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená po čet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmer ­
nenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5.
 
Rast a prežívanie  
37. Ak je potrebné získa ť údaje o desa ťdňovom prežívaní a raste lariev, na 
začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne 
použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla 
s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritérium na stanovenie smrti 
je nehybnos ť alebo absencia reakcie na mechanický podnet. Stratené larvy 
sa takisto po čítajú medzi m ŕtve (larvy, ktoré uhynuli na za čiatku testu, sa 
mohli rozloži ť pôsobením mikróbov). Ur čí sa suchá hmotnos ť (bez popola) 
lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypo číta sa stredná suchá 
hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užito čné určiť, do ktorého instaru 
patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použi ť šírka hlavového 
segmentu každého jedinca.  
Analytické merania  
Koncentrácia testovanej látky  
38. Pred za čiatkom testu (t. j. pred pridaním lariev) sa pri každom ošetrení 
z najmenej jednej nádoby odstránia súhrnné vzorky sedimentu na ú čely 
analytického stanovenia koncentrácie testovanej látky v sedimente. Odpo ­
rúča sa, aby sa vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu analyzo ­
vali minimálne na za čiatku (pozri odsek 24) a na konci testu pri najvyššej 
koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania testovanej látky 
poskytujú informácie o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – 
sediment. 
39. Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v de ň 7) a ak sú na analýzu 
potrebné ve ľké vzorky, ktoré nemožno odobra ť z testovacích nádob bez 
ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchá ­
dzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale 
ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Na izolovanie intersticiálnej vody je odporú čaným postupom odstredenie 
napr. pri 10 000 g a 4 °C po čas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná 
látka sa na filtroch neadsorbuje, môže by ť prijateľná aj filtrácia. 
V niektorých prípadoch nemusí by ť možné analyzova ť koncentrácie 
v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá.  
Fyzikálno-chemické parametre  
41. Je potrebné vhodným spôsobom odmera ť pH a teplotu v testovacích nádo ­
bách (pozri odsek 10). Tvrdos ť a amoniak sa merajú v kontrolných nádo ­
bách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej koncentrácii na za čiatku a na 
konci testu.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
42. Účelom tohto testu je ur čiť vplyv testovanej látky na vývojový pomer 
a celkový po čet úplne vykuklených sam čích a sami čích pakomárov, alebo 
v prípade desa ťdňového testu ú činky na prežívanie a hmotnos ť lariev. Ak 
nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavos ť medzi pohlaviami, 
výsledky pre sam čeky a sami čky možno na ú čely štatistických analýz 
zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky 
posúdiť napr. tabu ľkovým testom χ 2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná 
suchá hmotnos ť jedincov na jednu nádobu sa pod ľa potreby musí ur čiť po 
desiatich d ňoch. 
43. Účinné koncentrácie vyjadrené a vychádzajúce zo suchej hmotnosti sa pod ľa 
možnosti vypo čítajú na základe koncentrácií nameraných v sedimente na 
začiatku testu (pozri odsek 38). 
44. Na vy číslenie odhadu bodu EC  50 alebo akejko ľvek inej hodnoty EC  x sa ako 
pravé replikáty môže použi ť štatistika na jednu nádobu. Pri výpo čte inter­
valu spoľahlivosti pre každú hodnotu EC  x je potrebné zoh ľadniť variabilitu 
medzi nádobami alebo je nutné preukáza ť, že táto variabilita je taká malá, že 
je možné ju ignorova ť. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, 
v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikova ť transformáciu, aby sa 
zlepšila homogénnos ť rozptylu. Hodnoty EC  x by sa však mali vypo čítať po 
tom, ako sa reakcia transformuje naspä ť na pôvodnú hodnotu. 
45. Ak je cie ľom štatistickej analýzy ur čenie koncentrácie NOEC/LOEC 
prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zoh ľadniť variabilitu 
medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alterna ­
tívne môžu by ť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, ke ď dochádza 
k nedodržaniu zvy čajných predpokladov analýzy ANOVA.  
Pomer vykuklenia  
46. Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzova ť pomocou 
Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, ke ď 
sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto 
očakávaniu. Ak to tak nie je, možno použi ť Fisherov exaktný test alebo 
Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak 
sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže vä čšia variabilita, 
než akú by indikovala binomická distribúcia ( často sa uvádza ako „extra- 
binomická“ variácia), potom by sa mal použi ť podrobný 
Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje 
v bode (21).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa 
počtom zavedených lariev, na:  
ER ¼ n e 
n a 
kde: 
ER = pomer vykuklenia, n
 e = počet pakomárov vykuklených na nádobu, 
n a = počet zavedených lariev na nádobu. 
47. Najvhodnejšou alternatívou pri ve ľkých vzorkách v prípadoch extra bino ­
mickej variácie je bra ť pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu 
a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa o čakáva mono ­
tónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak 
reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za ve ľkú vzorku sa 
pokladá vzorka, v ktorej je po čet vykuklených aj po čet nevykuklených 
jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako pä ť. 
48. Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformova ť hodnoty 
ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo 
Freemanovej-Tukeyho transformácie s cie ľom získa ť približnú normálnu 
distribúciu a vyrovna ť rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov 
exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno apliko ­
vať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej 
odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin  –1 ) druhej 
odmocniny ER. 
49. Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty EC  x vypočítajú pomocou regresnej 
analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhod ­
ného komer čného softvéru at ď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak 
sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparame ­
trické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá inter ­
polácia.  
Vývojový pomer  
50. Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením 
lariev (de ň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpo čte 
reálneho vývojového času sa zoh ľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývo ­
jový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/de ň) 
a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za de ň. Pri hodnotení týchto 
štúdií toxicity v sedimente sa uprednost ňuje vývojový pomer, lebo jeho 
rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší 
a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy teda možno lepšie použi ť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. 
Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty EC
 x odhadnúť 
pomocou regresnej analýzy [napr. (23), (24)]. 
51. Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že po čet pakomárov 
pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale 
medzi dňom × a d ňom x - l (l = d ĺžka kontrolného intervalu, zvy čajne jeden 
deň). Stredný vývojový pomer na nádobu sa vypo číta podľa tejto rovnice:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
kde: 
x: stredný vývojový pomer na nádobu, 
i: index kontrolného intervalu, 
m: maximálny po čet kontrolných intervalov,  
ƒ i : počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i, 
n e : celkový po čet pakomárov vykuklených na konci pokusu, (=  P ƒ i ), 
x i : vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i; 
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
kde: 
deň i : kontrolný de ň (dni od aplikácie), 
l i : dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvy čajne jeden de ň). 
Správa o teste  
52. Správa o teste musí obsahova ť aspoň tieto informácie:  
Testovaná látka:  
— fyzikálny charakter a významné fyzikálno-chemické vlastnosti (rozpust ­
nosť vo vode, tlak pary, rozde ľovací koeficient v pôde (alebo 
v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode at ď.), 
— chemické identifika čné údaje (bežný názov, chemický názov, štruktu ­
rálny vzorec, číslo CAS at ď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvan ­
tifikácie testovanej látky.  
Testovacie druhy:  
— použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov 
a podmienky chovu, 
— informácie o manipulácii s vají čkovými masami a larvami, 
— vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob.  
Podmienky testovania:  
— použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment, 
— v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek 
vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (pod ľa potreby), 
— príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah 
organického uhlíka, pH, vlhkos ť atď. na začiatku testu), 
— príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) 
a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivos ť, tvrdosť atď. na 
začiatku testu), 
— výška sedimentu a nadložnej vody, 
— objem nadložnej a pórovej vody, hmotnos ť mokrého sedimentu 
s pórovou vodou a bez nej,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— testovacie nádoby (materiál a ve ľkosť), 
— metóda obohatenia sedimentu: použité testovacie koncentrácie, po čet 
replikátov a prípadné použitie rozpúš ťadiel, 
— rovnovážna fáza stabilizácie systému obohatený sediment – voda: trvanie 
a podmienky, 
— inkuba čné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzuš ňo­
vanie (frekvencia a intenzita), 
— podrobné informácie o k ŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množ ­
stva a kŕmneho režimu.  
Výsledky:  
— nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie 
a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej 
látky v testovacej nádobe, 
— kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, 
tvrdosť a amoniak, 
— kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody, — počet vykuklených sam čích a sami čích pakomárov na nádobu na de ň, 
— počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili, 
— stredná suchá hmotnos ť jednotlivých lariev na nádobu a na instar pod ľa 
potreby, 
— percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (sam čie 
a samičie pakomáre spolu), 
— stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát 
a miera ošetrenia (sam čie a sami čie pakomáre spolu), 
— odhady toxických parametrov, napr. ECx (a súvisiace intervaly spo ľa­
hlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie, 
— rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajú ­
ceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.
 
LITERATÚRA  
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development 
and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995. 
2. Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Závere čná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. 
August 1994. WRc, UK. 
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý sa uskuto čnil v Holandsku. 
4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. s. 
1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé 
vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 1994. 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inverte ­
brates. 
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 
9. Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., a Kirby, R. S. (1996). Recent intra- 
and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. 
10. Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350. 
11. Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57. 
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publicati ­
ons, Series on Testing and Assessment No. 23. 
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
14. Testovacia metóda C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dáž ďovky. 
15. Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163 – 1175. 
16. Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303. 
17. Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096 – 1121. 
18. Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482 – 491. 
19. Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 
27: 103 – 117. 
20. Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510 – 531. 
21. Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585. 
22. Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221. 
23. Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494. 
24. Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV 
Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov:  
Umelo pripravený sediment  alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický 
sediment, je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu.  
Nadložná voda  je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom.  
Intersticiálna voda  alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi 
časticami sedimentu a pôdy.  
Obohatený sediment  je sediment, do ktorého bola pridaná testovaná látka.  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Dodatok 2  
Odporúčania ku kultúre  Chironomus riparius  
1. Larvy rodu  Chironomus  sa môžu chova ť v kryštaliza čných miskách alebo 
vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného 
kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (posta čuje tenšia vrstva 
do výšky len nieko ľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do 
výšky nieko ľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali pod ľa potreby 
dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysycha ­
niu. Vodu je možné v prípade potreby vymeni ť. Je potrebné zabezpe čiť 
jemné prevzduš ňovanie. Misky na chov lariev by mali by ť umiestnené vo 
vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala by ť dostatočne veľká, aby umož ňovala rojenie vykuklených 
dospelých jedincov, v opa čnom prípade by nemuselo dôjs ť ku kopulácii 
(minimálna ve ľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm). 
2. Klietky je potrebné udržiava ť pri izbovej teplote alebo v miestnosti so 
stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 
hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní 8 hodín. Je preuká ­
zané, že vlhkos ť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže bráni ť reprodukcii.
 
Riediaca voda  
3. Možno použi ť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa 
používa stud ňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá 
(napr. Elendtovo médium „M4“ alebo „M7“, pozri ďalej). Pred použitím 
je potrebné vodu prevzdušni ť. V prípade potreby možno kultiva čnú vodu 
obnoviť opatrným odliatím alebo od čerpaním použitej vody z kultiva čných 
nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev.  
Kŕmenie lariev  
4. Larvy rodu  Chironomus  sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra 
Min®, Tetra Phyll® alebo iná podobná zna čka patentovaného krmiva pre 
ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na de ň. Krmivo sa môže 
podávať ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 1,0 
g vločkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, aby 
sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podáva ť v množstve 
približne 5 ml na nádobu na de ň (pred použitím pretrepa ť). Staršie larvy 
môžu dostáva ť viac. 
5. Kŕmenie sa upraví pod ľa kvality vody. Ak sa kultiva čné médium zakalí, 
kŕmenie je potrebné obmedzi ť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo 
monitorova ť. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúva ť 
k vodnému st ĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov 
a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjs ť 
k zníženiu rastových pomerov. 
6. Pri založení nových kultiva čných nádob sa môžu prida ť aj bunky niektorých 
zelených rias (napr.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov  
7. Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé 
jedince môže slúži ť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým 
roztokom.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Vykuklenie  
8. Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince za čnú kukliť z nádoby na chov 
lariev po približne 13 – 15 d ňoch. Sam čeky sa ľahko rozlíšia pod ľa obrve­
ných tykadiel.  
Vajíčkové masy  
9. Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách 
na chov lariev je potrebné trikrát do týžd ňa kontrolova ť kladenie želatíno ­
vých vají čkových más. Ak sú vají čkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. 
Mali by sa prenies ť na malú misku so vzorkou kultiva čnej vody. Vají čkové 
masy sa použijú na založenie nových kultiva čných nádob (napr. dve až štyri 
vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity. 
10. Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnu ť po dvoch až troch d ňoch. 
Založenie nových kultiva čných nádob  
11. Po vytvorení kultúr by malo by ť možné založi ť novú nádobu na kultiváciu 
lariev každý týžde ň alebo menej často v závislosti od testovacích požiada ­
viek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstrá ­
nia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpe čí pravidelné 
dopĺňanie dospelých jedincov.  
Príprava testovacích roztokov „M4“ a „M7“  
12. Elendt (1990) opísal médium „M4“. Médium „M7“ sa pripravuje ako 
médium „M4“ s výnimkou látok ozna čených v tabu ľke 1, pre ktoré sú 
koncentrácie v médiu „M7“ štyrikrát nižšie ako v médiu „M4“. Publikácia 
o médiu „M7“ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací 
roztok by sa nemal pripravi ť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncen ­
trácie NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 a K  2 HPO  4 uvedené pre prípravu 
zásobných roztokov nie sú vhodné.  
Príprava média „M7“  
13. Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný 
roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabu ľku 1). 
Na prípravu média „M7“ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) 
a množstvá každého makronutri čného zásobného roztoku uvedené v tabu ľke 
2 doplnia do jedného litra deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabuľke 3, a krátko pred použitím sa do kone čného média „M7“ pridá 0,1 
ml kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný 
roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach.) Médium sa 
prevzdušňuje a stabilizuje.
 
LITERATÚRA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabuľka 1 
Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7  
Zásobné roztoky (I) Množstvo (mg) 
doplnené do 
jedného litra 
deionizovanej 
vody Na prípravu kombinovaného zásob ­
ného roztoku (II) sa zmiešajú tieto 
množstvá (ml) zásobných 
roztokov (I) a doplnia sa do jedného 
litra deionizovanej vody Konečné koncentrácie v testovacích 
roztokoch (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Tieto látky sa líšia v M4 a M7, ako je uvedené vyššie. 
( 2 ) Tieto roztoky sa pripravia jednotlivo, potom sa zlejú dokopy a okamžite sa autoklávujú.  
Tabuľka 2 
Makronutri čné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7  
Množstvo doplnené do 
jedného litra deionizo ­
vanej vody 
(mg) Množstvo pridaných 
makronutri čných zásobných 
roztokov pri príprave médií 
M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrácie 
v testovacích 
roztokoch M4 a M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabuľka 3 
Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7. Všetky tri vitamínové roztoky sa 
skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok.  
Množstvo doplnené do 
jedného litra deionizo ­
vanej vody 
(mg) Množstvo pridaného vitamí ­
nového zásobného roztoku pri 
príprave médií M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrácie 
v testovacích roztokoch 
M4 a M7 
(mg/l)  
Tiamín hydrochlorid 750 0,1 0,075 
Kyanokobalamín (B12) 10 0,1 0,0010 Biotín 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATÚRA  
Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25 – 33. 
Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water 
Research  24 (9): 1157 – 1167.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Dodatok 3  
PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU  
Zloženie sedimentu  
Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo by ť takéto:  
Zložka Charakteristika % suchej hmotnosti 
sedimentu  
Rašelina Rašelinníková rašelina, pH čo 
najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, 
jemne rozomletá (ve ľkosť 
častíc ≤ 1 mm) a usušená 
vzduchom 4 – 5 
Kremenný piesok Ve ľkosť zrniek: > 50 % 
častíc by malo ma ť veľkosť 
v rozsahu 50 – 200 μm 75 – 76 
Kaolín Obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 
Organický uhlík Upravený pridaním rašeliny 
a piesku 2 (± 0,5) 
Uhličitan vápenatý CaCO
 3 , rozomletý na prach, 
chemicky čistý 0,05 - 0,1 
Voda Vodivos ť ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Príprava  
Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode 
sa pomocou vysokovýkonného homogeniza čného prístroja pripraví suspenzia 
požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa 
upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO  3 . Suspenzia sa aspo ň na dva dni uvedie 
do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opä ť sa zmeria pH, ktoré by 
malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša 
s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 - 50 percent suchej hmot ­
nosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH kone čnej zmesi a pod ľa potreby sa 
pomocou CaCO
 3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa 
určila suchá hmotnos ť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporú ča, aby 
sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevláda ť 
v nasledujúcom teste.
 
Skladovanie  
Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladova ť na suchom 
a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by 
sa pred použitím v teste nemal skladova ť. Mal by sa použi ť hneď po sedemd ­ 
ňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa kon čí jeho príprava.  
LITERATÚRA  
Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dáž ďovky. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10 – 20.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Dodatok 4  
Chemické charakteristiky prijate ľnej riediacej vody  
Látka Koncentrácie  
Pevné častice < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l 
Tvrdosť ako CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Zostatkový chlór < 10 μg/l 
Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l Celkové organochlórované pesticídy plus polychlóro ­
vané bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organický chlór < 25 ng/l
 
(*) Treba však poznamena ť, že ak existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti 
a testovanou látkou, mala by sa použi ť voda s nižšou tvrdos ťou (a v takom prípade sa 
teda nesmie použi ť Elendtovo médium M4).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Dodatok 5  
Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov  
Na testovacie kadi čky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú 
potrebné odo d ňa 20 do skon čenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej 
pasce.
  
A: nylonová sie ťka 
B: prevrátené umelohmotné misky 
C: expozi čná kadička bez okraja D: sieťované otvory na výmenu vody 
E: voda 
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C. 28.  TEST TOXICITY CHIRONOMIDAE V SYSTÉME SEDIMENT – 
VODA ZA POUŽITIA OBOHATENEJ VODY  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 219 (2004). Táto testo ­
vacia metóda bola vypracovaná s cie ľom hodnoti ť účinky pred ĺženého pôso ­
benia chemikálií na vodné larvy dvojkrídlovcov rodu  Chironomus  žijúce 
v sedimente. Vychádza najmä z usmernenia BBA, ktoré používa testovací systém sediment – voda s umelou pôdou a expozi čným scenárom vo 
vodnom st ĺpci (1). Zoh ľadňuje aj existujúce protokoly o testoch toxicity 
na Chironomus riparius  a Chironomus tentans , ktoré boli vypracované 
v Európe a Severnej Amerike (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) a boli podrobené kruhovým testom (1) (6) (9). Môžu sa použi ť aj iné dobre zdokumentované 
druhy pakomárov, napr.  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Expozi čný scenár použitý v tejto testovacej metóde je obohacovanie vody. 
Výber vhodného expozi čného scenára závisí od plánovaného použitia testu. 
Vodný expozi čný scenár zah ŕňajúci obohatenie vodného st ĺpca je určený na 
simuláciu prípadu pesticídneho postreku a zah ŕňa počiatočné maximálne 
koncentrácie v pórovej vode. Je užito čný aj pri iných druhoch expozície 
(vrátane chemických únikov) s výnimkou akumula čných procesov, ktoré 
trvajú dlhšie ako testovacie obdobie. 
3. Látky, ktoré je potrebné testova ť na organizmoch žijúcich v sedimente, 
zvyčajne pretrvajú v tomto kompartmente dlhý čas. Organizmy žijúce 
v sedimente môžu by ť exponované viacerými spôsobmi. Relatívny význam 
každého spôsobu expozície a časové obdobie, v ktorom sa každý z nich 
podieľa na celkových toxických ú činkoch, závisí od fyzikálno-chemických 
vlastností danej chemikálie. V prípade silno adsorbujúcich látok (napr. s log K
 ow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne viažu na sediment, môže by ť 
významným spôsobom expozície prijímanie kontaminovanej potravy. 
S cieľom vyhnú ť sa podhodnoteniu toxicity vysokolipofilných látok 
možno zváži ť použitie potravy pridanej do sedimentu pred aplikáciou testo ­
vanej látky. S cie ľom zohľadniť všetky potenciálne spôsoby expozície sa 
táto testovacia metóda zameriava na dlhodobú expozíciu. Trvanie testu je 
v rozsahu 20 – 28 dní v prípade druhov  C. riparius  a C. yoshimatsui  a 28 – 
65 dní pri  C. tentans . Ak sú na špecifické ú čely potrebné krátkodobé údaje, 
napríklad s cie ľom skúma ť účinky nestabilných chemikálií, môžu sa po 
desiatich d ňoch odstráni ť ďalšie replikáty. 
4. Meranými parametrami sú celkový po čet vykuklených dospelých jedincov 
a čas do vykuklenia. Ak sú potrebné ďalšie krátkodobé údaje, odporú ča sa 
vykonať merania prežitia a rastu lariev až po desiatich d ňoch s použitím 
ďalších replikátov pod ľa potreby. 
5. Odporú ča sa použi ť umelo pripravený sediment. Umelo pripravený sediment 
má oproti prírodným sedimentom nieko ľko výhod: 
— zníži sa variabilita testu, lebo umelo pripravený sediment vytvára repro ­
dukovateľnú „štandardizovanú matricu“, a odstráni sa potreba nájs ť 
nekontaminované a čisté zdroje sedimentu, 
— testy je možné za čať kedykoľvek bez problému sezónnej variability 
v testovanom sedimente a nie je potrebné sediment predpripravi ť, aby 
sa odstránila pôvodná fauna. Použitie umelo pripraveného sedimentu 
takisto znižuje náklady spojené s odberom dostato čných množstiev sedi ­
mentu v teréne na rutinné testovanie,  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— použitie umelo pripraveného sedimentu umož ňuje porovnanie toxicity 
a následné zatriedenie látok: údaje o toxicite z testov s prírodnými 
a umelými sedimentmi boli v prípade viacerých chemikálií porovnate ľné 
(2). 
6. Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.  
PRINCÍP TESTU 
7. Larvy pakomárov v prvom instare sú exponované rozsahu koncentrácií 
testovanej látky v systémoch sediment – voda. Test sa za čne umiestnením 
lariev v prvom instare do testovacích kadi čiek obsahujúcich systém sedi ­
ment – voda a následne obohatením vody testovanou látkou. Na konci testu sa meria vykuklenie pakomárov a vývojový pomer. Pod ľa potreby sa môže 
po desiatich d ňoch mera ť aj prežitie a hmotnos ť lariev (pomocou ďalších 
replikátov pod ľa potreby). Tieto údaje sa analyzujú bu ď prostredníctvom 
regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila x % pokles vo vykuklení, prežívaní lariev alebo raste (napr. EC
 15 , EC  50 atď.), 
alebo prostredníctvom testovania štatistickej hypotézy na stanovenie koncen ­
trácie NOEC/LOEC. Pri druhom spôsobe je potrebné pomocou štatistických 
testov porovna ť hodnoty ú činkov s kontrolnými hodnotami.  
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE 
8. Je potrebné pozna ť rozpustnos ť testovanej látky vo vode, jej tlak pary, 
namerané alebo vypo čítané delenie na sediment a stabilitu vo vode a v 
sedimente. Mala by by ť k dispozícii spo ľahlivá analytická metóda so 
známou a zdokumentovanou presnos ťou a detek čným limitom na kvantifi ­
káciu testovanej látky v nadložnej vode, pórovej vode a sedimente. Medzi 
užitočné informácie patrí štrukturálny vzorec a čistota testovanej látky. 
Užitočnou informáciou je aj chemický osud testovanej chemikálie (napr. 
rozptýlenie, abiotická a biotická degradácia at ď.). Ďalšie informácie pre 
testované látky s fyzikálno-chemickými vlastnos ťami, ktoré s ťažujú ich 
testovanie, sú uvedené v odkaze (12).  
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
9. Referen čné chemikálie sa môžu testova ť pravidelne ako prostriedok na 
zabezpečenie spoľahlivosti testovacieho protokolu a testovacích podmienok. 
Príkladmi referen čných toxických látok, ktoré sa úspešne používajú 
v kruhových testoch a overovacích štúdiách, sú: lindán, trifluralín, penta ­
chlórfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (1) (2) (5) (6) (13).  
PLATNOS Ť TESTU 
10. Aby bol test platný, musí sp ĺňať tieto podmienky: 
— vykuklenie v kontrolných skupinách musí by ť na konci testu na úrovni 
minimálne 70 % (1) (6), 
— vykuklenie druhov  C. riparius  a C. yoshimatsui  na dospelé jedince 
z kontrolných nádob by malo nasta ť 12 – 23 dní po ich vložení do 
nádob. V prípade druhu  C. tentans  je potrebné obdobie 20 – 65 dní, 
— na konci testu je potrebné zmera ť v každej nádobe pH a koncentráciu 
rozpusteného kyslíka. Koncentrácia kyslíka by pri použitej teplote mala predstavova ť najmenej 60 % satura čnej hodnoty vzduchom (ASV) 
a hodnota pH nadložnej vody by vo všetkých testovacích nádobách 
mala byť v rozmedzí 6 – 9,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— teplota vody by sa nemala líši ť o viac ako ± 1,0 °C. Teplotu vody je 
možné kontrolova ť pomocou izotermickej komory a v tom prípade je 
potrebné v primeraných časových intervaloch potvrdi ť teplotu v komore.  
OPIS METÓDY  
Testovacie nádoby  
11. Štúdia sa vykonáva v sklenených kadi čkách s objemom 600 ml a s prie ­
merom 8 cm. Sú vhodné aj iné nádoby, ale musia zaru čiť vhodnú h ĺbku 
nadložnej vody a sedimentu. Povrch sedimentu by mal by ť dostatočne 
veľký, aby poskytoval 2 – 3 cm  2 priestoru na larvu. Pomer h ĺbky vrstvy 
sedimentu k h ĺbke nadložnej vody by mal by ť 1: 4. Testovacie nádoby a iné 
prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacím systémom, by mali by ť 
vyrobené výlu čne zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu (napr. 
teflónu).  
Výber druhov  
12. Uprednost ňovaným druhom na použitie v teste je  Chironomus riparius . 
Chironomus tentans  je takisto vhodný, ale je náro čnejší na starostlivos ť 
a vyžaduje si dlhšie trvanie testu. Možno použi ť aj Chironomus yoshimatsui . 
Podrobné informácie o kultiva čných metódach v prípade druhu  Chironomus 
riparius  sú uvedené v dodatku 2. Informácie o kultiva čných podmienkach 
sú k dispozícii aj pre iné druhy, t. j.  Chironomus tentans  (4) a  Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identifikácia druhov musí by ť pred testovaním potvrdená, 
ale nevyžaduje sa pred každým testom, ak organizmy pochádzajú z internej kultúry.
 
Sediment  
13. Uprednost ňuje sa použitie umelo pripraveného sedimentu (známeho aj pod 
názvom rekonštituovaný, umelý alebo syntetický sediment). Ak sa však použije prírodný sediment, je potrebné ho charakterizova ť (aspoň pH, 
obsah organického uhlíka, odporú ča sa aj stanovenie ostatných parametrov 
ako pomer C/N a granulometria) a nemal by obsahova ť žiadne kontaminanty 
ani iné organizmy, ktoré by mohli s pakomármi súperi ť alebo ich požiera ť. 
Takisto sa odporú ča, aby bol prírodný sediment pred použitím v teste toxi ­
city pri pakomároch na sedem dní uvedený do podmienok, ktoré budú 
prevládať v nasledujúcom teste. V tomto teste (1) (15) (16) sa odporú ča 
použiť nasledujúci umelo pripravený sediment založený na umelej pôde 
použitej v testovacej metóde C.8 (14): 
a) 4 – 5 % (suchá hmotnos ť) rašeliny: čo najbližšie k pH 5,5 – 6,0. Je 
dôležité použi ť rašelinu v práškovej forme, jemne rozomletú (ve ľkosť 
častíc ≤ 1 mm) a sušenú iba vzduchom; 
b) 20 % (suchá hmotnos ť) kaolínu (obsah kaolinitu pod ľa možnosti nad 
30 %); 
c) 75 – 76 % (suchá hmotnos ť) kremenného piesku (mal by prevláda ť 
jemný piesok s viac ako 50 % častíc s ve ľkosťou od 50 do 200 μm); 
d) deionizovaná voda sa pridá, aby sa dosiahla vlhkos ť konečnej zmesi 
v rozsahu 30 – 50 %; 
e) uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO
 3 ) sa pridá, aby sa pH 
konečnej zmesi sedimentu upravila na 7,0 ± 0,5; 
f) obsah organického uhlíka v kone čnej zmesi by mal by ť 2 % (± 0,5 %) 
a je potrebné ho upravi ť pomocou primeraného množstva rašeliny 
a piesku pod ľa písmen a) a c).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal by ť známy. Je potrebné skontrolo ­
vať, či zložky sedimentu neobsahujú chemické kontaminanty (napr. ťažké 
kovy, organochlórové zlú čeniny, organofosforové zlú čeniny atď.). Príklad 
prípravy umelo pripraveného sedimentu je uvedený v dodatku 3. Miešanie suchých zložiek je takisto prípustné, ak sa preukáže, že po pridaní nadložnej 
vody nedochádza k separácii zložiek sedimentu (napr. k vyplaveniu častíc 
rašeliny) a že rašelina alebo sediment sú v dostato čnej miere uvedené do 
podmienok.
 
Voda  
15. Každá voda, ktorá vyhovuje chemickým charakteristikám prijate ľnej 
riediacej vody pod ľa zoznamu uvedeného v dodatkoch 2 a 4, je vhodná 
ako testovacia voda. Každá vhodná voda, prírodná voda (povrchová alebo podzemná voda), rekonštituovaná voda (pozri dodatok 2) alebo odchlóro ­
vaná voda z vodovodu sú prijate ľné ako voda na kultiváciu a testovacia 
voda, ak v nej pakomáre prežijú po čas celej kultivácie a testovania bez 
príznakov stresu. Na za čiatku testu by pH testovacej vody mala ma ť 
hodnotu medzi 6 a 9 a celková tvrdos ť by nemala by ť vyššia ako 400 
mg/l pre CaCO
 3 . Ak však existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi 
tvrdosti a testovanou látkou, mala by sa použi ť voda s nižšou tvrdos ťou (a 
v takom prípade sa teda nesmie použi ť Elendtovo médium M4). Po čas celej 
štúdie by sa mal používa ť rovnaký druh vody. Charakteristiky kvality vody 
uvedené v dodatku 4 by sa mali mera ť najmenej dvakrát za rok, alebo ak 
existuje podozrenie, že sa tieto charakteristiky mohli významne zmeni ť. 
Zásobné roztoky – obohatená voda  
16. Testovacie koncentrácie sa vypo čítajú na základe koncentrácií vo vodnom 
stĺpci, t. j. vody nad sedimentom. Testovacie roztoky vybratých koncentrácií 
sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky sa 
podľa možnosti pripravujú rozpustením testovanej látky v testovacom 
médiu. V niektorých prípadoch môže by ť na vytvorenie vhodne koncentro ­
vaného zásobného roztoku potrebné použi ť rozpúšťadlá alebo disperzné 
činidlá. Príkladmi vhodných rozpúš ťadiel sú acetón, etanol, metanol, 
etylénglykolmonoetyléter, etylénglykoldimetyléter, dimetylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použi ť Cremophor RH40, 
Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. Koncentrácia látky zvyšujúcej 
rozpustnos ť v konečnom testovacom médiu by mala by ť minimálna (t. j. ≤ 
0,1 ml/l) a mala by by ť vo všetkých pokusoch rovnaká. Ak sa použije látka 
zvyšujúca rozpustnos ť, nesmie ma ť žiadne signifikantné ú činky na preží ­
vanie ani žiaden vidite ľný škodlivý ú činok na larvy pakomárov, aké sa 
preukázali pri kontrole s rozpúš ťadlom. Je však potrebné vynaloži ť maxi­
málne úsilie, aby sa predišlo použitiu týchto materiálov.
 
KONCEPCIA TESTU 
17. Koncepcia testu sa vz ťahuje na výber po čtu a odstup testovaných koncen ­
trácií, počet nádob pri každej koncentrácii a po čet lariev v každej nádobe. 
Sú tu opísané koncepcie na odhadnutie bodu EC, na odhadnutie koncen ­
trácie NOEC a na vykonanie limitného testu. Uprednost ňuje sa regresná 
analýza pred testovaním hypotéz.  
Koncepcia regresnej analýzy  
18. Účinná koncentrácia (napr. EC  15 , EC  50 ) a koncentra čný rozsah, v ktorom sa 
skúmajú ú činky testovanej látky, sa merajú koncentráciami zahrnutými do 
testu. Vo všeobecnosti sú presnos ť a najmä platnos ť, s ktorou možno odha ­
dovať účinné koncentrácie (EC  x ), lepšie, ak je ú činná koncentrácia  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
v rozsahu testovaných koncentrácií. Je potrebné vyhýba ť sa extrapolácii 
hlboko pod najnižšou pozitívnou koncentráciou alebo nad najvyššou 
koncentráciou. Pri výbere rozsahu koncentrácií, ktoré sa použijú, je užito čný 
predbežný test na zistenie rozsahu (pozri odsek 27). 
19. Ak je potrebné odhadnú ť EC  x , malo by sa testova ť najmenej pä ť koncen­
trácií a tri replikáty pre každú koncentráciu. V každom prípade je vhodné použiť dostatočné testovacie koncentrácie, ktoré umožnia dobrý modelový 
odhad. Faktor medzi koncentráciami by nemal by ť väčší ako 2 (v prípadoch, 
keď má krivka závislosti reakcie od dávky plytký sklon, možno urobi ť 
výnimku). Po čet replikátov pri každej aplikácii sa môže zníži ť, ak sa 
zvýši po čet testovacích koncentrácií s rozdielnymi reakciami. Zvýšenie 
počtu replikátov alebo skrátenie d ĺžky intervalov testovacích koncentrácií 
zvyčajne vedie k nižším intervalom spo ľahlivosti testu. Ak sa odhaduje 
desaťdňové prežívanie a rast lariev, sú potrebné ďalšie replikáty.
 
Koncepcia odhadu NOEC/LOEC  
20. Ak sa odhadujú koncentrácie NOEC/LOEC, použije sa pä ť testovacích 
koncentrácií s najmenej štyrmi replikátmi a faktor medzi koncentráciami 
by nemal by ť vyšší ako dva. Po čet replikátov by mal by ť dostatočný, aby 
sa zabezpe čila primeraná štatistická výpovedná hodnota na zistenie rozdielu 
20 % pri kontrole pri úrovni významnosti 5 % (p = 0,05). V prípade vývo ­
jového pomeru je zvy čajne vhodná analýza rozptylu (ANOVA), ako 
napríklad Dunnettov test a Williamsov test (17) (18) (19) (20). Pri pomere 
vykuklenia možno použi ť Cochranov-Armitageho, Fisherov exaktný (s 
Bonferroniho korekciou) alebo Mantelov-Haenszelov test.  
Limitný test  
21. Môže sa vykona ť limitný test (jedna testovaná koncentrácia a kontrola), ak 
v predbežnom teste na zistenie rozsahu neboli pozorované žiadne ú činky. 
Účelom limitného testu je ukáza ť, že toxická hodnota testovanej látky je 
väčšia ako testovaná limitná koncentrácia. V tejto testovacej metóde 
nemožno navrhnú ť odporúčanú koncentráciu. Toto rozhodnutie je na posú ­
dení regula čného orgánu. Zvy čajne je na aplikáciu aj kontrolu potrebných 
najmenej šes ť replikátov. Je nutné preukáza ť primeranú štatistickú výpo ­
vednú hodnotu na zistenie rozdielu 20 % pri kontrole pri úrovni význam ­
nosti 5 % (p = 0,05). V prípade metrickej reakcie (vývojový pomer 
a hmotnos ť) je vhodnou štatistickou metódou t-test, pokia ľ údaje sp ĺňajú 
požiadavky tohto testu (normalita, homogénne rozptyly). Ak tieto požia ­
davky nie sú splnené, môže sa použi ť t-test nerovnomerných rozptylov 
alebo neparametrický test, ako napríklad Wilcoxonov-Mannov-Whitheyho 
test. Pri pomere vykuklenia je vhodný Fisherov exaktný test.  
POSTUP  
Podmienky expozície  
Príprava systému obohatená voda – sediment  
22. Do testovacích nádob sa pridajú primerané množstvá umelo pripraveného 
sedimentu (pozri odseky 13 – 14 a dodatok 3), aby sa vytvorila vrstva hrubá 
najmenej 1,5 cm. Voda sa pridá do výšky 6 cm (pozri odsek 15). Pomer výšky vrstvy sedimentu a výšky vody by nemal presiahnu ť 1: 4, pri čom 
vrstva sedimentu by nemala by ť hrubšia ako 3 cm. Systém sediment – voda 
by sa mal pred pridaním testovacích organizmov necha ť jemne prevzduš ­ 
ňovať počas siedmich dní (pozri odsek 14 a dodatok 3). S cie ľom zabráni ť 
separácii zložiek sedimentu a resuspendovaniu jemného materiálu po čas 
pridávania testovacej vody do vodného st ĺpca môže by ť sediment v čase, 
keď sa naň nalieva voda, prikrytý umelohmotným kotú čom, ktorý sa hne ď 
potom odstráni. Môže by ť vhodné aj použitie iných prístrojov.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Testovacie nádoby sa zakryjú (napr. sklenenými plat ňami). V prípade 
potreby sa po čas štúdie dop ĺňajú hladiny vody na pôvodný objem 
s cieľom kompenzova ť vyparovanie vody. Na tento ú čel sa použije destilo ­
vaná alebo deionizovaná voda, aby sa predišlo hromadeniu solí.  
Pridanie testovacích organizmov  
24. Štyri až pä ť dní pred pridaním testovacích organizmov do testovacích nádob 
sa z kultúr odoberú vají čkové masy a umiestnia sa do malých nádob 
s kultivačných médiom. Môže sa použi ť staršie médium zo zásobnej kultúry 
alebo čerstvo pripravené médium. Ak sa použije čerstvo pripravené kulti ­
vačné médium, je potrebné do ň pridať malé množstvo potravy, napr. zelené 
riasy a/alebo pár kvapiek filtrátu z jemne rozomletej suspenzie vlo čkového 
krmiva pre ryby (pozri dodatok 2). Použijú sa iba čerstvo nakladené vají č­
kové masy. Larvy sa zvy čajne začnú liahnu ť niekoľko dní po nakladení 
vajíčok (dva až tri dni v prípade druhu  Chironomus riparius  pri teplote 
20 °C a jeden až štyri dni v prípade  Chironomus tentans  pri teplote 
23 °C a  Chironomus yoshimatsui  pri teplote 25 °C) a rast lariev prebieha 
v štyroch instaroch, z ktorých každý trvá štyri až osem dní. V teste sa 
použijú larvy prvého instaru (dva až tri alebo jeden až štyri dni po vyliah ­
nutí). Instar pakomárov je možné skontrolova ť podľa šírky hlavového 
segmentu (6). 
25. Larvy 21. instaru sa pomocou tupej pipety náhodne rozdelia do jednotlivých 
testovacích nádob obsahujúcich obohatený sediment a vodu. Prevzduš ňo­
vanie vody je nutné po čas pridávania lariev do testovacích nádob preruši ť 
a musí by ť pozastavené po čas ďalších 24 hodín po pridaní lariev (pozri 
odseky 24 a 32). Pod ľa použitej koncepcie testu (pozri odseky 19 a 20) 
je počet lariev použitých pri každej koncentrácii najmenej 60 na odhad bodu 
EC a 80 na stanovenie koncentrácie NOEC. 
26. Dvadsa ťštyri hodín po pridaní lariev sa do nadložného vodného st ĺpca pridá 
testovaná látka a opä ť sa začne s jemným prevzduš ňovaním. Pod povrch 
vody sa pomocou pipety aplikujú malé množstvá roztokov testovanej látky. 
Nadložná voda sa potom opatrne premieša, aby sa nenarušil sediment.  
Testovacie koncentrácie  
27. Pri ur čovaní rozsahu koncentrácií pre kone čný test môže by ť užitočný test 
na zistenie rozsahu. Na tento ú čel sa použije súbor koncentrácií testovanej 
látky s ve ľkými odstupmi. S cie ľom zabezpe čiť rovnakú hustotu povrchu na 
pakomára, ktorá sa použije pri kone čnom teste, sú pakomáre vystavené 
každej koncentrácii testovanej látky na obdobie, ktoré umož ňuje odhad 
vhodných testovacích koncentrácií, pri čom nie sú potrebné žiadne replikáty. 
28. Testovacie koncentrácie pre kone čný test sa vyberú na základe výsledkov 
testu na zistenie rozsahu. Je potrebné použi ť a vybrať najmenej pä ť koncen­
trácií, ako sa uvádza v odsekoch 18 – 20.  
Kontroly  
29. Súčasťou testu sú kontrolné nádoby bez prítomnosti testovanej látky, ktoré 
však obsahujú sediment, a primeraný po čet replikátov (pozri odseky 19 – 
20). Ak sa pri aplikácii testovanej látky použije rozpúš ťadlo (pozri odsek 
16), je potrebné prida ť kontrolu rozpúš ťadla v sedimente.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Testovací systém  
30. Použijú sa statické systémy. Vo výnimo čných prípadoch sa môžu použi ť 
semistatické alebo prietokové systémy s prerušovaným alebo nepretržitým obmieňaním nadložnej vody, napríklad ak sú špecifikácie kvality vody 
nevhodné pre testovacie organizmy alebo ak ovplyv ňujú chemickú rovno ­
váhu (napr. úrovne rozpusteného kyslíka príliš klesnú, koncentrácia vylu čo­
vaných produktov príliš stúpne alebo sa zo sedimentu lúhujú minerály, čo 
má vplyv na pH a/alebo tvrdos ť vody). Zvy čajne však posta čujú 
a uprednost ňujú sa iné metódy zlepšenia kvality nadložnej vody, ako 
napríklad prevzduš ňovanie.
 
Potrava  
31. Je nevyhnutné larvy k ŕmiť podľa možnosti každý de ň alebo najmenej trikrát 
do týždňa. V prvých desiatich d ňoch je pre mladé larvy pod ľa všetkého 
vhodné krmivo pre ryby (suspenzia vo vode alebo jemne rozomletá potrava, napr. Tetra-Min alebo Tetra-Phyll, bližšie informácie pozri v dodatku 2) v dennom množstve 0,25 – 0,5 mg (0,35 – 0,5 mg pre druh  C. yoshimatsui ) 
na jednu larvu. Pre staršie larvy môže by ť potrebné o nie čo väčšie množstvo 
potravy: denné množstvo 0,5 – 1 mg na jednu larvu by malo po zvyšok testu posta čovať. Ak sa pozoruje rast hubovitých organizmov alebo ak sa 
v kontrolných nádobách pozoruje mortalita, prídel potravy by sa mal vo 
všetkých testovacích a kontrolných nádobách zníži ť. Ak nie je možné vznik 
hubovitých organizmov zastavi ť, test je nutné opakova ť. Pri testovaní silno 
adsorbujúcich látok (napr. s log K
 ow > 5) alebo látok, ktoré sa kovalentne 
viažu na sediment, sa môže do umelo pripraveného sedimentu pred stabili ­
začným obdobím prida ť množstvo potravy potrebné na zabezpe čenie prežitia 
a prirodzeného rastu organizmov. Na tento ú čel sa namiesto krmiva pre ryby 
musí použi ť rastlinný materiál, napr. sa môže prida ť 0,5 % (suchá hmot ­
nosť) jemne rozomletých listov napr. p ŕhľavy dvojdomej ( Urtica dioica ), 
moruše ( Morus alba ), ďateliny plazivej ( Trifolium repens ), špenátu ( Spi­
nacia oleracea ) alebo iného rastlinného materiálu ( Cerophyl  alebo alfa celu ­
lóza).  
Podmienky inkubácie  
32. Najlepšie po 24 hodinách od pridania lariev sa zabezpe čí jemné prevzduš ­ 
ňovanie nadložnej vody v testovacích nádobách a pokra čuje v ňom počas 
celého testu (treba dba ť na to, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka 
neklesla pod 60 % ASV). Prevzduš ňovanie sa zabezpe čí pomocou sklenenej 
Pasteurovej pipety upevnenej 2 – 3 cm nad vrstvou sedimentu (t. j. jedna 
alebo nieko ľko bublín za sekundu). Ak sa testujú prchavé chemikálie, 
možno zváži ť, že systém sediment – voda sa nebude prevzduš ňovať. 
33. Test sa vykonáva pri konštantnej teplote 20 °C (± 2 °C). V prípade druhu  C. 
tentans  sa odporú ča teplota 23 °C a v prípade  C. yoshimatsui  25 °C (± 
2 °C). Použije sa 16-hodinová svetlá fáza, pri čom intenzita svetla by mala 
byť 500 – 1 000 luxov.  
Trvanie expozície  
34. Expozícia sa za čne pridaním lariev do obohatených a kontrolných nádob. 
Maximálna d ĺžka expozície je 28 dní v prípade druhov  C. riparius  a C. 
yoshimatsui  a 65 dní v prípade  C. tentans . Ak sa pakomáre vykuklia skôr, 
test sa môže ukon čiť najskôr pä ť dní po vykuklení posledného dospelého 
jedinca v kontrolnej skupine.  
POZOROVANIA  
Vykuklenie  
35. Určí sa čas vývoja a celkový po čet úplne vykuklených sam čích a sami čích 
pakomárov. Sam čeky sa ľahko identifikujú pod ľa obrvených tykadiel.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Testovacie nádoby je potrebné pozorova ť najmenej trikrát do týžd ňa 
s cieľom vizuálne zhodnoti ť každé abnormálne správanie (napr. opúš ťanie 
sedimentu, nezvy čajné plávanie) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Po čas 
obdobia o čakávaného vykuklenia je nevyhnutné každý de ň spočítať vyku­
klené pakomáre. Pohlavie a po čet úplne vykuklených pakomárov sa zazna ­
menáva denne. Po identifikácii sa pakomáre vyberú z nádob. Všetky vají č­
kové masy nakladené pred ukon čením testu sa zaznamenajú a následne 
odstránia, aby sa predišlo opätovnému zavedeniu lariev do sedimentu. Takisto sa zaznamená po čet viditeľných kukiel, ktoré sa nevykuklili. Usmer ­
nenie k meraniu vykuklenia je uvedené v dodatku 5.
 
Rast a prežívanie  
37. Ak je potrebné získa ť údaje o desa ťdňovom prežívaní a raste lariev, na 
začiatku sa pripravia ďalšie testovacie nádoby tak, aby sa mohli následne 
použiť. Sediment z týchto ďalších nádob sa precedí pomocou cedidla 
s hrúbkou 250 μm, aby sa zachytili larvy. Kritériami na stanovenie smrti 
sú nehybnos ť alebo chýbajúca reakcia na mechanický podnet. Stratené larvy 
sa takisto po čítajú medzi m ŕtve (larvy, ktoré uhynuli na za čiatku testu, sa 
mohli rozloži ť pôsobením mikróbov). Ur čí sa suchá hmotnos ť (bez popola) 
lariev, ktoré prežili v každej testovacej nádobe, a vypo číta sa stredná suchá 
hmotnosť jedincov na jednu nádobu. Je užito čné určiť, do ktorého instaru 
patria larvy, ktoré prežili. Na toto meranie sa môže použi ť šírka hlavového 
segmentu každého jedinca.  
Analytické merania  
Koncentrácia testovanej látky  
38. Vzorky nadložnej vody, pórovej vody a sedimentu sa musia analyzova ť 
minimálne na za čiatku (najlepšie jednu hodinu po aplikácii testovanej látky) 
a na konci testu pri najvyššej koncentrácii a pri jednej nižšej koncentrácii. Tieto skúmania koncentrácie testovanej látky poskytujú informácie 
o správaní/delení testovanej látky v systéme voda – sediment. Odoberanie 
vzoriek na za čiatku testu môže ovplyvni ť testovací systém (napr. odstrá ­
nenie testovaných lariev), preto je potrebné použi ť ďalšie testovacie nádoby, 
aby bolo pod ľa potreby možné vykona ť analytické vyšetrenia na za čiatku 
a počas testu (pozri odsek 39). Merania v sedimente nemusia by ť potrebné, 
ak sa delenie testovanej látky medzi vodu a sediment jednozna čne určilo 
v štúdii voda/sediment pri porovnate ľných podmienkach (napr. pomer sedi ­
mentu k vode, druh aplikácie, obsah organického uhlíka v sedimente). 
39. Ak sa vykonajú prostredné merania (napr. v de ň 7) a ak sú na analýzu 
potrebné ve ľké vzorky, ktoré nemožno odobra ť z testovacích nádob bez 
ovplyvnenia testovacieho systému, analytické vyšetrenia je potrebné 
vykonať na vzorkách z ďalších testovacích nádob, s ktorými sa zaobchá ­
dzalo rovnakým spôsobom (vrátane prítomnosti testovacích organizmov), ale ktoré sa nepoužijú na biologické pozorovania. 
40. Na izolovanie intersticiálnej vody je odporú čaným postupom odstredenie 
napr. pri 10 000 g a 4 °C po čas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná 
látka sa na filtroch neadsorbuje, môže by ť prijateľná aj filtrácia. 
V niektorých prípadoch nemusí by ť možné analyzova ť koncentrácie 
v pórovej vode, lebo vzorka je príliš malá.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fyzikálno-chemické parametre  
41. Je potrebné vhodným spôsobom odmera ť pH, rozpustený kyslík v testovacej 
vode a teplotu v testovacích nádobách (pozri odsek 10). Tvrdos ť a amoniak 
sa merajú v kontrolných nádobách a v jednej testovacej nádobe pri najvyššej 
koncentrácii na za čiatku a na konci testu.  
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
42. Účelom tohto testu je ur čiť účinok testovanej látky na vývojový pomer 
a celkový po čet úplne vykuklených sam čích a sami čích pakomárov, alebo 
v prípade desa ťdňového testu ú činky na prežívanie a hmotnos ť lariev. Ak 
nič nepoukazuje na štatisticky rozdielnu vnímavos ť medzi pohlaviami, 
výsledky pre sam čeky a sami čky možno na ú čely štatistických analýz 
zhrnúť spoločne. Rozdiely vnímavosti medzi pohlaviami sa môžu štatisticky 
posúdiť, napr. tabu ľkovým testom χ 2 – r × 2. Prežívanie lariev a stredná 
suchá hmotnos ť jedincov na jednu nádobu sa pod ľa potreby musí ur čiť po 
desiatich d ňoch. 
43. Účinné koncentrácie vyjadrené ako koncentrácie v nadložnej vode sa pod ľa 
možnosti vypo čítajú na základe nameraných koncentrácií na za čiatku testu 
(pozri odsek 38). 
44. Na vy číslenie odhadu bodu EC  50 alebo akejko ľvek inej hodnoty EC  x sa ako 
pravé replikáty môže použi ť štatistika na jednu nádobu. Pri výpo čte inter­
valu spoľahlivosti pre každú hodnotu EC  x je potrebné zoh ľadniť variabilitu 
medzi nádobami alebo je nutné preukáza ť, že táto variabilita je taká malá, že 
je možné ju ignorova ť. Ak sa model upraví metódou najmenších štvorcov, 
v štatistike na jednu nádobu je potrebné aplikova ť transformáciu, aby sa 
zlepšila homogénnos ť rozptylu. Hodnoty EC  x by sa však mali vypo čítať po 
tom, ako sa reakcia transformuje naspä ť na pôvodnú hodnotu. 
45. Ak je cie ľom štatistickej analýzy ur čenie koncentrácie NOEC/LOEC 
prostredníctvom testovania hypotézy, je potrebné zoh ľadniť variabilitu 
medzi nádobami, napr. pomocou hierarchickej analýzy ANOVA. Alterna ­
tívne môžu by ť vhodné podrobnejšie testy (21) v prípadoch, ke ď dochádza 
k nedodržaniu zvy čajných predpokladov analýzy ANOVA.  
Pomer vykuklenia  
46. Pomery vykuklenia sú kvantové údaje a môžu sa analyzova ť pomocou 
Cochranovho-Armitageho testu aplikovaného zostupne v prípadoch, ke ď 
sa očakáva monotónna reakcia na dávku a tieto údaje zodpovedajú tomuto 
očakávaniu. Ak tomu tak nie je, možno použi ť Fisherov exaktný test alebo 
Mantzelov-Haentzalov test s Bonferroniho-Holmovou úpravou hodnôt p. Ak sa medzi replikátmi pri rovnakej koncentrácii preukáže vä čšia variabilita, 
než akú by indikovala binomická distribúcia ( často sa uvádza ako „extra- 
binomická“ variácia), potom by sa mal použi ť podrobný 
Cochranov-Armitageho test alebo Fisherov exaktný test, ako sa navrhuje v bode (21). 
47. Určí sa súčet pakomárov vykuklených na jednu nádobu, ne, a vydelí sa 
počtom zavedených lariev, na:  
ER ¼
 n e 
n a ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
kde: 
ER = pomer vykuklenia, n
 e = počet pakomárov vykuklených na nádobu, 
n a = počet zavedených lariev na nádobu. 
48. Najvhodnejšou alternatívou pri ve ľkých vzorkách v prípadoch extra bino ­
mickej variácie je bra ť pomer vykuklenia (ER) ako nepretržitú reakciu 
a použiť postupy, ako je napríklad Williamsov test, ak sa o čakáva mono ­
tónna reakcia na dávku, ktorá je konzistentná s týmito údajmi o ER. Ak reakcia nie je monotónna, je vhodný Dunnettov test. Za ve ľkú vzorku sa 
pokladá vzorka, v ktorej je po čet vykuklených aj po čet nevykuklených 
jedincov v každom replikáte (nádobe) vyšší ako pä ť. 
49. Pri aplikovaní metód ANOVA je potrebné najskôr transformova ť hodnoty 
ER pomocou arkussínusovej transformácie druhej odmocniny alebo 
Freemanovej-Tukeyho transformácie s cie ľom získa ť približnú normálnu 
distribúciu a vyrovna ť rozptyly. Cochranov-Armitageho test, Fisherov 
exaktný (Bonferroniho) test alebo Mantelov-Haenszelov test možno apliko ­
vať, ak sa použijú absolútne frekvencie. Arkussínusová transformácia druhej 
odmocniny sa aplikuje pomocou prevrátenej hodnoty sínusu (sin
 –1 ) druhej 
odmocniny ER. 
50. Pri pomeroch vykuklenia sa hodnoty EC  x vypočítajú pomocou regresnej 
analýzy (alebo napr. pomocou modelov probit (22), logit, Weibull, vhod ­
ného komer čného softvéru at ď.). Ak je regresná analýza neúspešná (napr. ak 
sú k dispozícii menej ako dve čiastkové reakcie), použijú sa iné neparame ­
trické metódy, ako je metóda pohyblivého priemeru alebo jednoduchá inter ­
polácia.  
Vývojový pomer  
51. Stredný vývojový čas predstavuje stredné časové rozpätie medzi zavedením 
lariev (de ň 0 testu) a vykuklením pokusnej kohorty pakomárov. (Pri výpo čte 
reálneho vývojového času sa zoh ľadní vek lariev v čase zavedenia). Vývo ­
jový pomer je prevrátená hodnota vývojového času (jednotka: 1/de ň) 
a predstavuje časť vývinu lariev, ktorá prebieha za de ň. Pri hodnotení týchto 
štúdií toxicity v sedimente sa uprednost ňuje vývojový pomer, lebo jeho 
rozptyl je nižší a v porovnaní s vývojovým časom je homogénnejší 
a bližší normálnej distribúcii. Výkonné parametrické testovacie postupy 
teda možno lepšie použi ť s vývojovým pomerom ako s vývojovým časom. 
Pre vývojový pomer ako nepretržitú reakciu možno hodnoty EC  x odhadnúť 
pomocou regresnej analýzy [napr. (23) (24)]. 
52. Pri nasledujúcich štatistických testoch sa predpokladá, že po čet pakomárov 
pozorovaných v kontrolnom dni × sa vykuklil v strednom časovom intervale 
medzi dňom × a d ňom x - l (l = d ĺžka kontrolného intervalu, zvy čajne jeden 
deň). Stredný vývojový pomer na nádobu  x) sa vypo číta podľa tejto rovnice:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
kde: 
x: stredný vývojový pomer na nádobu, 
i: index kontrolného intervalu, m: maximálny po čet kontrolných intervalov,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : počet pakomárov vykuklených v kontrolnom intervale i, 
n e : celkový po čet pakomárov vykuklených na konci pokusu (=  P ƒ i ), 
x i : vývojový pomer pakomárov vykuklených v intervale i; 
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
kde: 
deň i : kontrolný de ň (dni od aplikácie), 
l i : dĺžka kontrolného intervalu i (dni, zvy čajne jeden de ň). 
Správa o teste  
53. Správa o teste musí obsahova ť aspoň tieto informácie:  
Testovaná látka:  
— fyzikálny charakter a, ak je to relevantné, fyzikálno-chemické vlastnosti 
(rozpustnos ť vo vode, tlak pary, rozde ľovací koeficient v pôde (alebo 
v sedimente, ak je k dispozícii), stabilita vo vode at ď.), 
— chemické identifika čné údaje (bežný názov, chemický názov, štruktu ­
rálny vzorec, číslo CAS at ď.) vrátane čistoty a analytickej metódy kvan ­
tifikácie testovanej látky.  
Testovacie druhy:  
— použité testovacie zvieratá: druh, vedecký názov, zdroj organizmov 
a podmienky chovu, 
— informácie o manipulácii s vají čkovými masami a larvami, 
— vek testovacích zvierat pri umiestnení do testovacích nádob.  
Podmienky testovania:  
— použitý sediment, t. j. prírodný alebo umelo pripravený sediment, — v prípade prírodného sedimentu poloha a opis miesta odobratia vzoriek 
sedimentu vrátane histórie kontaminácie, ak je to možné, charakteristiky: pH, obsah organického uhlíka, pomer C/N a granulometria (pod ľa potre­
by), 
— príprava umelo pripraveného sedimentu: zložky a charakteristiky (obsah 
organického uhlíka, pH, vlhkos ť atď. na začiatku testu), 
— príprava testovacej vody (ak sa použije rekonštituovaná voda) 
a charakteristiky (koncentrácia kyslíka, pH, vodivos ť, tvrdosť atď. na 
začiatku testu), 
— výška sedimentu a nadložnej vody, — objem nadložnej a pórovej vody, hmotnos ť mokrého sedimentu 
s pórovou vodou a bez nej, 
— testovacie nádoby (materiál a ve ľkosť), 
— metóda prípravy zásobných roztokov a testovacích koncentrácií,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— aplikácia testovanej látky: použité testovacie koncentrácie, po čet repli­
kátov a prípadné použitie rozpúš ťadiel, 
— inkuba čné podmienky: teplota, svetelný cyklus a intenzita, prevdzuš ňo­
vanie (frekvencia a intenzita), 
— podrobné informácie o k ŕmení vrátane druhu potravy, prípravy, množ ­
stva a kŕmneho režimu.  
Výsledky:  
— nominálne testovacie koncentrácie, namerané testovacie koncentrácie 
a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej látky v testovacej nádobe, 
— kvalita vody v testovacích nádobách, t. j. pH, teplota, rozpustený kyslík, 
tvrdosť a amoniak, 
— kompenzácia prípadnej vyparenej testovacej vody, 
— počet vykuklených sam čích a sami čích pakomárov na nádobu na de ň, 
— počet lariev na nádobu, ktoré sa nevykuklili, 
— stredná suchá hmotnos ť jednotlivých lariev na nádobu a na instar pod ľa 
potreby, 
— percentuálne vykuklenie na replikát a testovaciu koncentráciu (sam čie 
a samičie pakomáre spolu), 
— stredný vývojový pomer úplne vykuklených pakomárov na replikát 
a miera ošetrenia (sam čie a sami čie pakomáre spolu), 
— odhady toxických parametrov, napr. EC
 x (a súvisiace intervaly spo ľa­
hlivosti), NOEC a/alebo LOEC a štatistické metódy použité na ich 
stanovenie, 
— rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajú ­
ceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.  
LITERATÚRA  
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H. Köpp. Berlín 1995. 
2. Fleming, R. a kol. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Závere čná správa pre Európsku komisiu. Správa č.: EK, 3738. 
August 1994. WRc, UK. 
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. Zo seminára WOSTA, ktorý 
sa uskuto čnil v Holandsku. 
4. ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, s. 
1125 – 1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druhé 
vydanie. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Revízia prvého vydania z júna 
1994.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inverte ­
brates. 
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. 
10. Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345 – 350. 
11. Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47 – 57. 
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publicati ­
ons, Series on Testing and Assessment No. 23. 
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
14. Kapitola C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dáž ďovky. 
15. Suedel, B. C., a Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163 – 1175. 
16. Naylor, C., a Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291 – 3303. 
17. Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096 – 1121. 
18. Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482 – 491. 
19. Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 
27: 103 – 117. 
20. Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510 – 531. 
21. Rao, J. N. K., a Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577 – 585. 
22. Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213 – 221. 
23. Bruce a Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485 – 1494. 
24. Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298 – 312.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV 
Na účely tejto metódy sa používajú tieto vymedzenia pojmov:  
Umelo pripravený sediment  alebo rekonštituovaný, umelý alebo syntetický 
sediment je zmes materiálov použitých na napodobnenie fyzických zložiek prírodného sedimentu.  
Nadložná voda  je voda umiestnená v testovacej nádobe nad sedimentom.  
Intersticiálna voda  alebo pórová voda je voda nachádzajúca sa v priestore medzi 
časticami sedimentu a pôdy.  
Obohatená voda  je voda, do ktorej bola pridaná testovaná látka.  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Dodatok 2  
Odporúčania ku kultúre  Chironomus riparius  
1. Larvy rodu  Chironomus  sa môžu chova ť v kryštaliza čných miskách alebo 
vo väčších nádobách. Na dno nádoby sa nanesie tenká vrstva jemného 
kremenného piesku vo výške 5 – 10 mm. Je preukázané, že vhodným substrátom je aj diatomit (napr. Merck, článok 8117) (posta čuje tenšia vrstva 
do výšky len nieko ľkých milimetrov). Potom sa pridá vhodná voda do 
výšky nieko ľkých centimetrov. Hladiny vody by sa mali pod ľa potreby 
dopĺňať, aby sa kompenzovala strata vyparením a aby sa predišlo vysycha ­
niu. Vodu je možné v prípade potreby vymeni ť. Je potrebné zabezpe čiť 
jemné prevzduš ňovanie. Misky na chov lariev by mali by ť umiestnené vo 
vhodnej klietke, ktorá zabráni úniku vykuklených dospelých jedincov. Klietka by mala by ť dostatočne veľká, aby umož ňovala rojenie vykuklených 
dospelých jedincov, v opa čnom prípade by nemuselo dôjs ť ku kopulácii 
(minimálna ve ľkosť je asi 30 × 30 × 30 cm). 
2. Klietky je potrebné udržiava ť pri izbovej teplote alebo v miestnosti so 
stálym prostredím pri teplote 20 ± 2 °C so svetlou fázou v trvaní 16 hodín (intenzita asi 1 000 luxov) a fázou tmy v trvaní osem hodín. Je 
preukázané, že vlhkos ť vzduchu nižšia ako 60 % RH môže bráni ť repro­
dukcii.
 
Riediaca voda  
3. Možno použi ť akúkoľvek vhodnú prírodnú alebo syntetickú vodu. Bežne sa 
používa stud ňová voda, odchlórovaná voda z vodovodu a umelé médiá 
(napr. Elendtovo médium „M4“ alebo „M7“, pozri ďalej). Pred použitím 
je potrebné vodu prevzdušni ť. V prípade potreby možno kultiva čnú vodu 
obnoviť opatrným odliatím alebo od čerpaním použitej vody z kultiva čných 
nádob bez toho, aby sa poškodili trubice lariev.  
Kŕmenie lariev  
4. Larvy rodu  Chironomus  sa kŕmia vločkovým krmivom pre ryby [Tetra 
Min®, Tetra Phyll® alebo inou podobnou zna čkou patentovaného krmiva 
pre ryby] približným množstvom 250 mg na nádobu na de ň. Krmivo sa 
môže podáva ť ako suchý rozomletý prášok alebo ako suspenzia vo vode: 
1,0 g vlo čkového krmiva sa pridá do 20 ml riediacej vody a premieša sa, 
aby sa získala homogénna zmes. Tento prípravok sa môže podáva ť 
v množstve približne 5ml na nádobu na de ň (pred použitím pretrepa ť). 
Staršie larvy môžu dostáva ť viac. 
5. Kŕmenie sa upraví pod ľa kvality vody. Ak sa kultiva čné médium zakalí, 
kŕmenie je potrebné obmedzi ť. Prídavky do krmiva sa musia starostlivo 
monitorova ť. Nedostatok potravy spôsobí, že larvy sa budú presúva ť 
k vodnému st ĺpcu, a prebytok potravy spôsobí zvýšenie činnosti mikróbov 
a zníženie koncentrácií kyslíka. V obidvoch prípadoch môže dôjs ť 
k zníženiu rastových pomerov. 
6. Pri založení nových kultiva čných nádob sa môžu prida ť aj bunky niektorých 
zelených rias (napr.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Kŕmenie vykuklených dospelých jedincov  
7. Z niektorých pokusov vyplýva, že ako potrava pre vykuklené dospelé 
jedince môže slúži ť vatový tampón napustený nasýteným sacharózovým 
roztokom.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Vykuklenie  
8. Pri teplote 20 ± 2 °C sa dospelé jedince za čnú kukliť z nádoby na chov 
lariev po približne 13 – 15 d ňoch. Sam čeky sa ľahko rozlíšia pod ľa obrve­
ných tykadiel.  
Vajíčkové masy  
9. Keď sú v chovnej klietke prítomné dospelé jedince, vo všetkých nádobách 
na chov lariev je potrebné trikrát do týžd ňa kontrolova ť kladenie želatíno ­
vých vají čkových más. Ak sú vají čkové masy prítomné, opatrne sa odoberú. 
Mali by sa prenies ť na malú misku so vzorkou kultiva čnej vody. Vají čkové 
masy sa použijú na založenie nových kultiva čných nádob (napr. dve až štyri 
vajíčkové masy na nádobu) alebo sa použijú v testoch toxicity. 
10. Larvy prvého instaru by sa mali vyliahnu ť po dvoch až troch d ňoch. 
Založenie nových kultiva čných nádob  
11. Po vytvorení kultúr by malo by ť možné založi ť novú nádobu na kultiváciu 
lariev každý týžde ň alebo menej často v závislosti od testovacích požiada ­
viek, pričom staršie nádoby sa po vykuklení dospelých pakomárov odstrá ­
nia. Týmto spôsobom sa pri minimálnom riadení zabezpe čí pravidelné 
dopĺňanie dospelých jedincov.  
Príprava testovacích roztokov „M4“ a „M7“  
12. Elendt (1990) opísal médium „M4“. Médium „M7“ sa pripravuje ako 
médium „M4“ s výnimkou látok ozna čených v tabu ľke 1, pre ktoré sú 
koncentrácie v médiu „M7“ štyrikrát nižšie ako v médiu „M4“. Publikácia o médiu „M7“ je v štádiu prípravy (Elendt, osobná komunikácia). Testovací 
roztok by sa nemal pripravi ť podľa Elendta a Biasa (1990), lebo koncen ­
trácie NaSiO
 3 .5H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 a K  2 HPO  4 uvedené pre prípravu 
zásobných roztokov nie sú vhodné.  
Príprava média „M7“  
13. Každý zásobný roztok (I) sa pripraví jednotlivo a kombinovaný zásobný 
roztok (II) sa pripraví z týchto zásobných roztokov (I) (pozri tabu ľku 1). 
Na prípravu média „M7“ sa 50 ml z kombinovaného zásobného roztoku (II) a množstvá každého makronutri čného zásobného roztoku uvedené v tabu ľke 
2 doplnia do 1 l deionizovanej vody. Vitamínový zásobný roztok sa pripraví 
pridaním troch vitamínov do deionizovanej vody, ako je uvedené v tabu ľke 
3, a krátko pred použitím sa do kone čného média „M7“ pridá 0,1 ml 
kombinovaného vitamínového zásobného roztoku. (Vitamínový zásobný 
roztok sa skladuje zmrazený v malých alikvotných častiach). Médium sa 
prevzdušňuje a stabilizuje.
 
Tabuľka 1 
Zásobné roztoky stopových prvkov pre médiá M4 a M7  
Zásobné roztoky (I) Množstvo (mg) 
doplnené do 
jedného litra 
deionizovanej 
vody Na prípravu kombinovaného zásob ­
ného roztoku (II) sa zmiešajú tieto 
množstvá (ml) zásobných 
roztokov (I) a doplnia sa do jedného 
litra deionizovanej vody Konečné koncentrácie v testovacích 
roztokoch (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 • 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Zásobné roztoky (I) Množstvo (mg) 
doplnené do 
jedného litra 
deionizovanej 
vody Na prípravu kombinovaného zásob ­
ného roztoku (II) sa zmiešajú tieto 
množstvá (ml) zásobných 
roztokov (I) a doplnia sa do jedného 
litra deionizovanej vody Konečné koncentrácie v testovacích 
roztokoch (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 • 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 • 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 • 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 • 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA • 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 • 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Tieto látky sa líšia v M4 a M7, ako je uvedené vyššie. 
( 2 ) Tieto roztoky sa pripravia jednotlivo, potom sa zlejú dokopy a okamžite sa autoklávujú.  
Tabuľka 2 
Makronutri čné zásobné roztoky pre médiá M4 a M7  
Množstvo doplnené do 
jedného litra deionizo ­
vanej vody 
(mg) Množstvo pridaných 
makronutri čných zásobných 
roztokov pri príprave médií 
M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrácie 
v testovacích 
roztokoch M4 a M7 
(mg/l)  
CaCl  2 • 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 • 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 • 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabuľka 3 
Vitamínový zásobný roztok pre médiá M4 a M7  
Všetky tri vitamínové roztoky sa skombinujú, aby sa vytvoril jeden vitamínový zásobný roztok.  
Množstvo doplnené do 
jedného litra 
deionizovanej vody 
(mg) Množstvo pridaného 
vitamínového zásobného 
roztoku pri príprave médií 
M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrácie 
v testovacích roztokoch 
M4 a M7 
(mg/l)  
Tiamín hydrochlorid 750 0,1 0,075 
Kyanokobalamín (B12) 10 0,1 0,0010 Biotín 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATÚRA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Upravili M. Streloke a H.Köpp. Berlín 1995. 
Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25 – 33. 
Elendt, B. P., a Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water 
Research  24 (9): 1157 – 1167.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Dodatok 3  
PRÍPRAVA UMELO PRIPRAVENÉHO SEDIMENTU  
Zloženie sedimentu  
Zloženie umelo pripraveného sedimentu by malo by ť takéto:  
Zložka Charakteristika % suchej hmotnosti 
sedimentu  
Rašelina Rašelinníková rašelina, pH čo 
najbližšie k 5,5 – 6,0, bez viditeľných zvyškov rastlín, 
jemne rozomletá (ve ľkosť 
častíc ≤ 1 mm) a usušená 
vzduchom 4 – 5 
Kremenný piesok Ve ľkosť zrniek: > 50 % 
častíc by malo ma ť veľkosť 
v rozsahu 50 – 200 μm 75 – 76 
Kaolín Obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 
Organický uhlík Upravený pridaním rašeliny 
a piesku 2 (± 0,5) 
Uhličitan vápenatý CaCO
 3 , rozomletý na prach, 
chemicky čistý 0,05 – 0,1 
Voda Vodivos ť ≤ 10 μS/cm 30 – 50  
Príprava  
Rašelina sa usuší vzduchom a rozomelie na jemný prášok. V deionizovanej vode 
sa pomocou vysokovýkonného homogeniza čného prístroja pripraví suspenzia 
požadovaného množstva rašelinového prášku. Hodnota pH tejto suspenzie sa 
upraví na 5,5 ± 0,5 pomocou CaCO  3 . Suspenzia sa aspo ň na dva dni uvedie 
do podmienok jemným premiešavaním pri teplote 20 ± 2 °C, aby sa stabilizovala hodnota pH a vytvorila stabilná mikrobiálna zložka. Opä ť sa zmeria pH, ktoré by 
malo byť na úrovni 6,0 ± 0,5. Rašelinová suspenzia sa následne zmieša 
s ostatnými zložkami (piesok a kaolín) a s deionizovanou vodou, aby sa získal homogénny sediment s obsahom vody v rozsahu 30 – 50 percent suchej hmot ­
nosti sedimentu. Znova sa zmeria hodnota pH kone čnej zmesi a pod ľa potreby sa 
pomocou CaCO
 3 upraví na 6,5 – 7,5. Odoberú sa vzorky sedimentu, aby sa 
určila suchá hmotnos ť a obsah organického uhlíka. Následne sa odporú ča, aby 
sa pred použitím v teste toxicity pri pakomároch umelo pripravený sediment uviedol na sedem dní do rovnakých podmienok, aké budú prevláda ť 
v nasledujúcom teste.
 
Skladovanie  
Suché zložky na prípravu umelého sedimentu sa môžu skladova ť na suchom 
a chladnom mieste pri izbovej teplote. Umelo pripravený (mokrý) sediment by 
sa pred použitím v teste nemal skladova ť. Mal by sa použi ť hneď po sedemd ­ 
ňovom období uvádzania do podmienok, ktorým sa kon čí jeho príprava.  
LITERATÚRA:  
Kapitola C.8 tejto prílohy. Toxicita pre dáž ďovky. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10 – 20.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Dodatok 4  
Chemické charakteristiky prijate ľnej riediacej vody  
Látka Koncentrácie  
Pevné častice < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l 
Tvrdosť ako CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Zostatkový chlór < 10 μg/l 
Celkové organofosfátové pesticídy < 50 ng/l Celkové organochlórované pesticídy plus polychlóro ­
vané bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organický chlór < 25 ng/l
 
(*) Treba však poznamena ť, že ak existuje podozrenie na interakciu medzi iónmi tvrdosti 
a testovanou látkou, mala by sa použi ť voda s nižšou tvrdos ťou (a v takom prípade sa 
teda nesmie použi ť Elendtovo médium M4).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Dodatok 5  
Usmernenie k monitorovaniu vykuklenia lariev pakomárov  
Na testovacie kadi čky sa umiestnia pasce na vykuklené jedince. Tieto pasce sú 
potrebné odo d ňa 20 do skon čenia testu. Ďalej je znázornený príklad použitej 
pasce.
  
A: nylonová sie ťka 
B: prevrátené umelohmotné misky 
C: expozi čná kadička bez okraja D: sieťované otvory na výmenu vody 
E: voda 
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  ĽAHKÁ BIODEGRADOVATE ĽNOSŤ – CO  2 V HERMETICKY 
UZAVRETÝCH NÁDOBÁCH (TEST V UZAVRETOM PRIESTORE 
NAD KVAPALINOU)  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 310 (2003). Táto testovacia metóda je skríningovou metódou na hodnotenie ľahkej biodegradovate ľnosti chemikálií 
a poskytuje podobné informácie ako šes ť testovacích metód opísaných 
v kapitole C.4 tejto prílohy A až F. Chemikáliu, pri ktorej sa v tejto testo ­
vacej metóde preukážu pozitívne výsledky, možno preto považova ť za 
ľahko biodegradovate ľnú, a teda za rýchlo degradovate ľnú v životnom 
prostredí. 
2. Zvyčajne bola prvou vo ľbou na testovanie slabo rozpustných chemikálií 
a chemikálií, ktoré silne adsorbujú, osved čená metóda (1) oxidu uhli čitého 
(CO
 2 ) založená na Sturmovom pôvodnom teste (2) na hodnotenie biodegra ­
dovateľnosti organických chemikálií meraním oxidu uhli čitého vytváraného 
mikrobiálnym pôsobením. Vyberá sa aj v prípade rozpustných (ale nie prchavých) chemikálií, lebo uvo ľňovanie oxidu uhli čitého mnohí považujú 
za jediný jednozna čný dôkaz mikrobiálnej činnosti. Rozpustený organický 
uhlík možno odstráni ť fyzikálno-chemickými procesmi (adsorpciou, vypare ­
ním, zrážaním, hydrolýzou), ako aj mikrobiálnym pôsobením, pri čom 
mnohé nebiologické reakcie spotrebúvajú kyslík. V zriedkavých prípadoch sa CO
 2 z organických chemikálií tvorí abioticky. V pôvodnom 
a modifikovanom Sturmovom teste (1) (2) sa CO  2 odstráni z tekutej fázy 
do absorbujúcich nádob čerením (t. j. bublajúcim vzduchom aplikovaným 
s cieľom odstráni ť CO  2 cez tekuté médium), zatia ľ čo v Larsonovej verzii 
(3) (4) sa CO  2 prevedie z reak čnej nádoby do absorbérov púš ťaním vzduchu 
bez obsahu CO  2 cez uzavretý priestor nad kvapalinou a ďalej nepretržitým 
pretrepávaním testovacej nádoby. Reak čná nádoba sa pretrepáva iba 
v Larsonovej modifikácii. Premiešavanie je v ISO 9439 (5) a v pôvodnej americkej verzii (6) špecifikované iba pre nerozpustné látky, pri čom obe 
normy špecifikujú skôr čerenie namiesto výmeny uzavretého priestoru nad 
kvapalinou. V ďalšej oficiálnej metóde USA EPA (7) založenej na Gledhil ­
lovej metóde (8) sa pretrepávaná reak čná nádoba uzavrie pred ovzduším 
a vyprodukované CO
 2 sa hromadí vo vnútornom alkalickom zachytáva či 
priamo z plynnej fázy podobne ako v prípade klasických Warburgových/ 
Barcroftových respirometrických baniek. 
3. Ukázalo sa však, že po čas aplikácie štandardného modifikovaného Stur ­
movho testu na viaceré chemikálie sa v médiu hromadí anorganický 
uhlík (IC) (9). Po čas degradácie 20 mg C/l anilínu bola zistená koncentrácia 
IC až 8 mg/l. Hromadenie CO  2 v alkalických zachytáva čoch preto nezod ­
povedalo reálnemu množstvu mikrobiologicky vyprodukovaného CO  2 
v medzičasoch po čas degradácie. Špecifikácia, pod ľa ktorej na to, aby sa 
testovaná chemikália klasifikovala ako ľahko biodegradovaná, sa musí po čas 
„desaťdňového okna“ (desa ť dní nasledujúcich ihne ď po dosiahnutí 10 % 
biodegradácie) nahromadi ť > 60 % teoretickej maximálnej produkcie CO  2 
(ThCO  2 ), nebude splnená v prípade niektorých chemikálií, ktoré by takto 
boli klasifikované po použití eliminácie rozpusteného organického uhlíka (DOC). 
4. Ak je percentuálna degradácia nižšia, ako sa o čakáva, je možné, že IC sa 
akumuloval v testovacom roztoku. Degradovate ľnosť sa potom môže 
hodnotiť pomocou iných testov ľahkej biodegradovate ľnosti.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Ďalšie nedostatky Sturmovej metodiky (náro čnosť vykonania, náro čnosť na 
čas, náchylnos ť k chybám pri pokusoch a nemožnos ť použitia v prípade 
prchavých chemikálií) dali podnet k skúmaniu metódy uzavretej nádoby, ktorá by bola iná ako Gledhillova a ktorá by nahradila prúdenie plynu (10) (11). Boatman a kolektív (12) vyhodnotili predchádzajúce metódy 
a zaviedli systém uzavretého priestoru nad kvapalinou, v ktorom sa CO
 2 
na konci inkubácie uvo ľňoval do priestoru nad kvapalinou prostredníctvom 
okysľovania média. CO  2 sa meral plynovou chromatografiou (GC)/analýzou 
IC vo vzorkách automaticky odoberaných z priestoru nad kvapalinou, ale 
nezohľadňoval sa rozpustený anorganický uhlík (DIC) v tekutej fáze. 
Takisto použité nádoby boli ve ľmi malé (20 ml) a obsahovali iba 10 ml 
média, čo spôsobovalo problémy napr. pri pridávaní nevyhnutne ve ľmi 
malých množstiev nerozpustných testovaných chemikálií a/alebo problém 
s mikroorganizmami schopnými degradova ť testovanú chemikáliu, ktoré 
mohli by ť v inokulovanom médiu prítomné v nedostato čnom množstve 
alebo vôbec. 
6. Tieto problémy prekonali nezávislé štúdie Struijsa a Stoltenkampa (13) 
a Bircha a Fletchera (14), pri čom druhých menovaných inšpirovali ich 
skúsenosti so zariadením používaným v teste anaeróbnej biodegradácie (15). V prvej metóde (13) sa CO
 2 meria v priestore nad kvapalinou po 
acidifikácii a vyrovnaní, zatia ľ čo v druhej metóde (14) sa meria DIC 
v plynnej aj tekutej fáze bez ošetrenia. Vyše 90 % vytvoreného IC sa vyskytovalo v tekutej fáze. Obidve metódy majú oproti Sturmovmu testu výhody v tom, že testovací systém je kompaktnejší a ovládate ľnejší, môžu 
sa testova ť prchavé chemikálie a predišlo sa možnosti oneskorenia v meraní 
vyprodukovaného CO
 2 . 
7. Tieto dva prístupy boli skombinované do normy ISO o CO  2 v uzavretom 
priestore nad kvapalinou (16), ktorá bola podrobená kruhovým testom (17), 
a práve táto norma predstavuje základ uvedenej testovacej metódy. Tieto dva prístupy sa podobne využili v metóde USA EPA (18). Odporú čajú sa 
dve metódy merania CO
 2 , konkrétne CO  2 v uzavretom priestore nad kvapa ­
linou po acidifikácii (13) a IC v tekutej fáze po pridaní prebyto čných alkálií. 
Druhú uvedenú metódu predstavil Peterson po čas kruhového testu 
CONCAWE (19) tejto metódy uzavretého priestoru nad kvapalinou, ktorá bola modifikovaná na meranie inherentnej biodegradovate ľnosti. Zmeny 
vykonané pri revízii metód z roku 1992 (20) v kapitole C.4 tejto 
prílohy týkajúce sa ľahkej biodegradovate ľnosti boli za členené do tejto 
testovacej metódy tak, aby podmienky (médium, trvanie at ď.) boli inak 
rovnaké ako podmienky v revidovanom Sturmovom teste (20). Birch 
a Fletcher (14) preukázali, že pri tomto teste uzavretého priestoru nad 
kvapalinou sa dosiahli ve ľmi podobné výsledky, aké sa s rovnakými chemi ­
káliami dosiahli v kruhovom teste OECD (21) revidovaných testovacích metód.
 
PRINCÍP TESTU 
8. Testovaná chemikália, zvy čajne v koncentrácii 20 mg C/l, sa ako jediný 
zdroj uhlíka a energie inkubuje v tlmivom médiu s obsahom minerálnych 
solí, ktoré bolo inokulované zmiešanou populáciou mikroorganizmov. Test prebieha v hermeticky uzavretých f ľašiach s priestorom nad kvapalinou 
obsahujúcim vzduch, ktorý predstavuje rezervoár kyslíka pre aeróbnu biode ­
gradáciu. Uvo ľňovanie CO
 2 , ktoré je dôsledkom úplnej aeróbnej biodegra ­
dácie testovanej chemikálie, sa stanoví meraním množstva IC vyprodukova ­
ného v testovacích f ľašiach, ktoré presahuje množstvo IC vyprodukované 
v slepých kontrolných nádobách obsahujúcich iba inokulované médium. 
Rozsah biodegradácie je vyjadrený ako percento teoretickej maximálnej produkcie IC (ThIC) založené na množstve testovanej chemikálie (ako orga ­
nického uhlíka) pridanej na za čiatku testu. 
9. Takisto možno odmera ť aj elimináciu DOC a/alebo rozsah primárnej biode ­
gradácie testovanej chemikálie (20).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII 
10. Je potrebné pozna ť obsah organického uhlíka (hmotnostné percento) 
v testovanej chemikálii bu ď z jej chemickej štruktúry, alebo na základe 
merania, aby bolo možné vypo čítať percentuálnu degradáciu. V prípade 
prchavých testovaných chemikálií je na stanovenie vhodného pomeru prie ­
storu nad kvapalinou k objemu kvapaliny užito čná nameraná alebo vypo čí­
taná Henryho konštanta. Pri výbere vhodnej testovacej koncentrácie a pri interpretácii výsledkov poukazujúcich na slabú biodegradovate ľnosť sú 
užitočné informácie o toxicite testovanej chemikálie na mikroorganizmy: 
pokiaľ nie je známe, že testovaná chemikália nemá na mikrobiálnu činnosť 
inhibičné účinky, odporú ča sa zahrnú ť kontrolu inhibície (pozri odsek 24).
 
POUŽITE ĽNOSŤ METÓDY 
11. Test možno použi ť na testované chemikálie rozpustné vo vode a na neroz ­
pustné testované chemikálie, je však potrebné zabezpe čiť dobrú disperziu 
testovanej chemikálie. Pri použití odporú čaného pomeru priestoru nad 
kvapalinou k objemu kvapaliny 1: 2 možno testova ť prchavé chemikálie 
s Henryho konštantou do 50 Pa.m  3 .mol  –1 , lebo podiel testovanej chemikálie 
v uzavretom priestore nad kvapalinou nepresiahne 1 % (13). Pri testovaní prchavejších chemikálií možno použi ť menší objem priestoru nad kvapali ­
nou, ale ich biodostupnos ť môže by ť obmedzujúca, najmä ak sú slabo 
rozpustné vo vode. Používatelia však musia zabezpe čiť, aby pomer priestoru 
nad kvapalinou k objemu kvapaliny a koncentrácia testovanej chemikálie boli také, aby bol k dispozícii dostatok kyslíka, ktorý umož ňuje úplnú 
aeróbnu biodegradáciu (napr. sa treba vyhnú ť používaniu vysokej koncen ­
trácie substrátu a malého objemu priestoru nad kvapalinou). Usmernenia k tejto téme sú uvedené v bodoch (13) (23).
 
REFEREN ČNÉ CHEMIKÁLIE 
12. Na kontrolu postupu testovania sa súbežne testuje referen čná chemikália so 
známou biodegradovate ľnosťou. Na tento ú čel možno pri testovaní chemi ­
kálií rozpustných vo vode použi ť anilín, benzoan sodný alebo etylénglykol 
a pri testovaní slabo rozpustných chemikálií 1-oktanol (13). Biodegradácia 
týchto chemikálií musí v priebehu 14 dní dosiahnu ť úroveň > 60 % ThIC.  
REPRODUKOVATE ĽNOSŤ 
13. V ISO kruhovom teste metódy (17) sa pri použití odporú čaných podmienok 
vrátane 20 mg C testovanej chemikálie/l získali tieto výsledky.  
Testovaná chemi ­
kália Stredná percentuálna 
biodegradácia 
(28 d) Variačný koeficient 
(%) Počet laboratórií  
Anilín 90 16 17 
1-oktanol 85 12 14 
Variabilita v rámci testu (replikovate ľnosť) pri použití anilínu bola takmer 
vo všetkých uskuto čnených testoch v prípade varia čných koeficientov nepre ­
sahujúcich 5 % nízka. V dvoch prípadoch, v ktorých bola replikovate ľnosť 
horšia, bola vä čšia variabilita pravdepodobne spôsobená vysokou produk ­
ciou IC v slepých kontrolných nádobách. Replikovate ľnosť bola horšia 
v prípade 1-oktanolu, ale stále bola v 79 % uskuto čnených testov pod 
úrovňou 10 %. Táto vä čšia variabilita v rámci testu mohla by ť spôsobená 
chybami v dávkovaní, lebo do hermeticky uzavretých testovacích fliaš sa 
musel vstreknú ť malý objem (3 – 4 μl) 1-oktanolu. Pri použití nižších 
koncentrácií testovanej chemikálie by výsledné varia čné koeficienty boli 
vyššie, a to najmä pri koncentráciách nižších ako 10 mg C/l. Čiastočne 
možno tento problém vyrieši ť znížením koncentrácie celkového anorganic ­
kého uhlíka (TIC) v inokule.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Kruhový test EÚ (24) piatich povrchovo aktívnych činidiel pridávaných 
v koncentrácii 10 mg C/l priniesol tieto výsledky:  
Testovaná chemikália Stredná percentuálna 
biodegradácia 
(28 d) Variačný 
koeficient 
(%) Počet 
laboratórií  
Tetrapropylén 
Benzénsulfonát 17 45 10 
Di-izo-oktylsulfo- 
sukcinát 
(aniónový) 72 22 9 
Hexadecyltrimetyl- (*) 
amónium chlorid 
(katiónový) 75 13 10 
Izo-nonylfenol-(etoxy ­
lát) 9 
(neiónový) 41 32 10 
Koko-amid-propyl 
dimetylhydroxy sulfobetaín 
(amfotérny) 60 23 11
 
(*) SiO  2 bol pridaný s cie ľom neutralizova ť toxicitu.  
Z výsledkov vyplýva, že vo všeobecnosti bola variabilita vyššia v prípade 
horšie degradovaných povrchovo aktívnych činidiel. Variabilita v rámci 
testu bola nižšia ako 15 % vo vyše 90 % prípadov, pri čom najvyššia úrove ň 
dosiahla 30 – 40 %.  
Poznámka:  Väčšina povrchovo aktívnych činidiel nie sú jednomolekulové 
substancie, ale zmesi izomérov, homológov at ď., ktoré degra ­
dujú po rôznych charakteristických lag obdobiach a pri rôznych kinetických rýchlostiach, čo vedie k „nejasným“ podhodno ­
teným krivkám, takže hodnota úspešnosti 60 % sa v rámci 
„desaťdňového okna“ nemusí dosiahnu ť, ani v prípade, že by 
každá individuálna molekulárna substancia pri samostatnom testovaní za desa ť dní dosiahla úrove ň > 60 %. Tento jav 
možno pozorova ť aj pri iných komplexných zmesiach.
 
OPIS METÓDY  
Zariadenie  
15. Bežné laboratórne zariadenie a: 
a) sklenené sérové f ľaše hermeticky uzavreté butylovými gumenými 
zátkami a tesniacimi hliníkovými uzávermi. Odporú čaná veľkosť je 
125 ml, pri čom celkový objem je približne 160 ml (v tomto prípade 
by mal známy objem každej f ľaše byť 160 ± 1 ml). Menšie nádoby 
možno použi ť, ak výsledky sp ĺňajú podmienky uvedené v odsekoch 66 
a 67; 
b) uhlíkový analyzátor alebo iný prístroj (napr. plynový chromatograf) na 
meranie anorganického uhlíka;  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) strieka čky s vysokou presnos ťou na plynné a kvapalné vzorky; 
d) orbitálna trepa čka v prostredí s kontrolovanou teplotou; 
e) prívod vzduchu bez obsahu CO  2 – môže sa pripravi ť púšťaním vzduchu 
cez granule nátronového vápna alebo použitím plynnej zmesi 80 % N
 2 /20 % 0  2 (nepovinné) (pozri odsek 28); 
f) membránové filtra čné zariadenie s pórovitos ťou 0,20 – 0,45 μm (nepo­
vinné); 
g) analyzátor organického uhlíka (nepovinné).  
Činidlá  
16. Vždy sa používajú analyticky čisté činidlá.  
Voda  
17. Používa sa destilovaná alebo deionizovaná voda s obsahom celkového orga ­
nického uhlíka ≤ 1 mg/l. Táto hodnota predstavuje ≤ 5 % počiatočného 
obsahu organického uhlíka pridaného v odporú čanej dávke testovanej 
chemikálie.  
Zásobné roztoky pre médium s obsahom minerálnych solí  
18. Zásobné roztoky a médium s obsahom minerálnych solí sú podobné tým, 
ktoré sú špecifikované v norme ISO 14593 (16) a v testoch „ ľahkej biode ­
gradovate ľnosti“ v kapitole C.4 (20). Použitie vyššej koncentrácie chloridu 
amónneho (2,0 g/l namiesto 0,5 g/l) je nutné iba vo výnimo čných prípadoch, 
napr. ak je koncentrácia testovanej chemikálie > 40 mg C/l. Zásobné roztoky sú uskladnené v chlade a mali by sa zlikvidova ť po šiestich mesia ­
coch alebo skôr, ak vykazujú známky zrážania alebo mikrobiálneho rastu. 
Pripravia sa tieto zásobné roztoky: 
a) dihydrogénfosfore čnan draselný (KH
 2 PO 4 ) 8,50 g, 
hydrogénfosfore čnan draselný (K  2 HPO  4 ) 21,75 g, 
dihydrát hydrogénfosfore čnanu disodného (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g, 
chlorid amónny (NH  4 Cl) 0,50 g. 
Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter. Hodnota pH tohto roztoku 
by mala by ť 7,4 (± 0,2). Ak tomu tak nie je, pripraví sa nový roztok; 
b) dihydrát chloridu vápenátého (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g. 
Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter; 
c) heptahydrát síranu hore čnatého (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g. 
Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter; 
d) chlorid železitý hexahydrát (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g. 
Rozpustí sa vo vode a doplní na jeden liter, pri čom sa pridá jedna 
kvapka koncentrovaného roztoku.  
Príprava minerálneho média  
19. Zmieša sa 10 ml roztoku v písmene a) s približne 800 ml vody (odsek 17), 
potom sa pridá 1 ml roztokov v písmenách b), c) a d) a doplní vodou (odsek 
17) na jeden liter.  
Iné činidlá  
20. Koncentrovaná kyselina trihydrogénfosfore čná (H  3 PO 4 ) (> 85 % hmotnosti 
na objem).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Roztok hydroxidu sodného 7 M  
21. V jednom litri vody sa rozpustí 280 g hydroxidu sodného (NaOH) (odsek 
17). Určí sa koncentrácia DIC tohto roztoku a táto hodnota sa zoh ľadní pri 
výpočte výsledkov testu (pozri odseky 55 a 61), najmä v súvislosti 
s kritériom platnosti pod ľa odseku 66 písm. b). Ak je koncentrácia DIC 
príliš vysoká, pripraví sa nový roztok.  
Testovaná chemikália  
22. Vo vode (odsek 17) alebo v testovacom médiu (odsek 19) sa pripraví 
zásobný roztok testovanej chemikálie, ktorá je dostato čne rozpustná vo 
vode, s koncentráciou pokia ľ možno stokrát vyššou, ako je kone čná koncen ­
trácia, ktorá sa použije v teste. Môže by ť potrebné upravi ť pH zásobného 
roztoku. Zásobný roztok sa pridá do minerálneho média, aby sa dosiahla 
konečná koncentrácia organického uhlíka medzi 2 a 40 mg C/l, ideálne 20 
mg C/l. Použitie nižších ako uvedených koncentrácií môže ma ť za následok 
nižšiu presnos ť. Rozpustné a nerozpustné kvapalné chemikálie možno do 
nádob pridáva ť priamo pomocou strieka čiek s vysokou presnos ťou. Slabo 
rozpustné a nerozpustné testované chemikálie môžu vyžadova ť osobitné 
postupy (25). Možnosti sú tieto: 
a) priame pridanie známych odvážených množstiev; 
b) ultrazvuková disperzia pred pridaním; 
c) disperzia pomocou emulgujúcich činidiel potrebná na zistenie inhibi č­
ných alebo stimula čných účinkov na mikrobiálnu činnosť pred pridaním; 
d) adsorpcia kvapalnej testovanej chemikálie alebo roztoku vo vhodnom 
prchavom rozpúš ťadle, na inertnom médiu alebo nosnom materiáli (napr. 
filter zo sklenených vlákien), po ktorej nasleduje odparenie rozpúš ťadla, 
ak sa použilo, a priame pridanie známych množstiev; 
e) pridanie známeho objemu roztoku testovanej chemikálie vo vysoko ­
prchavom rozpúš ťadle do prázdnej testovacej nádoby a následné odpa ­
renie rozpúš ťadla. 
Činidlá alebo rozpúš ťadlá použité v písmenách c), d) a e) je potrebné 
testovať na zistenie akýchko ľvek stimula čných alebo inhibi čných účinkov 
na mikrobiálnu činnosť [pozri odsek 42 písm. b)].  
Referenčná chemikália  
23. Vo vode sa pripraví zásobný roztok (rozpustnej) referen čnej chemikálie 
(odsek 17), s koncentráciou, pokia ľ možno stokrát vyššou, ako je kone čná 
koncentrácia, ktorá sa použije (20 mg C/l) v teste.  
Kontrola inhibície  
24. Testované chemikálie v podmienkach použitých pri hodnotení ľahkej biode ­
gradácie často nevykazujú významnú degradáciu. Jednou z možných prí čin 
je skutočnosť, že testovaná chemikália v koncentrácii, v ktorej sa aplikuje 
v teste, má na inokulum inhibi čné účinky. Do koncepcie testu sa môže 
zahrnúť kontrola inhibície s cie ľom umožni ť identifikáciu (pri spätnom 
pohľade) inhibície ako možnej prí činy alebo prispievajúceho faktora. 
Kontrolou inhibície možno prípadne takéto interferencie vylú čiť 
a preukáza ť, že nulovú alebo nepatrnú degradáciu možno pripísa ť výhradne 
rezistencii vo či mikrobiálnemu napadnutiu v podmienkach testu. Na ú čely 
získania informácií o toxických ú činkoch testovanej chemikálie na (aeróbne) 
mikroorganizmy sa pripraví roztok v testovacom médiu obsahujúci testo ­
vanú chemikáliu a referen čnú chemikáliu (odsek 19), každý v rovnakej 
koncentrácii, v akej sa pridáva (pozri odsek 22 a 23).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum možno získa ť z rôznych zdrojov: aktivovaný kal, výtok splaško ­
vých vôd (nechlórovaný), povrchové vody a pôdy alebo zmes uvedeného (20). Biodegrada čnú činnosť zdroja treba skontrolova ť pomocou referen čnej 
chemikálie. Ak sa daný postup použije ako test ľahkej biodegradovate ľnosti, 
bez ohľadu na zdroj by sa nemali použi ť mikroorganizmy, ktoré boli 
predtým exponované testovanej chemikálii.
 
Upozornenie: Aktivovaný kal, splaškové vody a výtok splaškových vôd 
obsahujú choroboplodné organizmy a je nutné s nimi zaob ­
chádzať opatrne. 
26. Na základe skúseností je optimálny objem inokula taký, ktorý: 
— je dostato čný na zabezpe čenie primeranej biodegrada čnej činnosti, 
— degraduje referen čnú chemikáliu o stanovené percento (pozri odsek 66), 
— poskytuje 10  2 – 10  5 jednotiek tvoriacich kolónie na mililiter v kone čnej 
zmesi, 
— zvyčajne poskytuje koncentráciu 4 mg/l suspendovaných tuhých látok 
v konečnej zmesi pri použití aktivovaného kalu; môžu sa použi ť koncen­
trácie do 30 mg/l, ale tie môžu významne zvýši ť produkciu CO  2 
v slepých kontrolných nádobách (26), 
— predstavuje menej ako 10 % po čiatočnej koncentrácie organického 
uhlíka zavedeného testovanou chemikáliou, 
— predstavuje vo všeobecnosti 1 – 10 ml inokula na jeden liter testova ­
cieho roztoku.  
Aktivovaný kal  
27. Odoberie sa čerstvá vzorka aktivovaného kalu z prevzduš ňovacej nádrže 
čističky odpadových vôd alebo z laboratórnej jednotky, ktoré spracúvajú 
prevažne domáce splaškové vody. V prípade potreby sa cedením odstránia 
hrubé častice (napr. pomocou cedidla, ktorého oká majú ve ľkosť 1 mm  2 ) 
a kal sa až do použitia usklad ňuje v aeróbnych podmienkach. 
28. Po odstránení hrubých častíc sa prípadne nechá sedimentova ť alebo sa 
odstredí (napr. 1 100 × g na 10 minút). Supernatantová kvapalina sa zleje. 
Kal sa môže premy ť v minerálnom roztoku. Koncentrovaný kal sa suspen ­
duje v minerálnom médiu s cie ľom získa ť koncentráciu 3 – 5 
g suspendovaných tuhých látok/l. Následne sa prevzduš ňuje podľa potreby. 
29. Kal sa odoberie zo správne pracujúcej čističky. Ak sa musí kal odobra ť 
z vysokostup ňovej čističky alebo je možné, že obsahuje inhibítory, mal by 
sa premy ť. Po dôkladnom premiešaní sa sedimentuje alebo odstredí resus ­
pendovaný kal, odstráni sa supernatantová kvapalina a premytý kal znovu 
suspenduje v ďalšom objeme minerálneho média. Tento postup sa opakuje, 
kým sa z kalu neodstráni nadbyto čný substrát alebo inhibítor. 
30. Z úplne resuspendovaného alebo neošetreného kalu sa odoberie vzorka tesne 
pred použitím na stanovenie suchej hmotnosti suspendovaných tuhých látok. 
31. Ďalšou alternatívou je homogenizácia aktivovaného kalu (3 – 5 
g suspendovaných tuhých látok/l). Kal sa prevzduš ňuje v mixéri Waring 
dve minúty pri strednej rýchlosti. Zmiešaný kal sa nechá sedimentova ť 30 
minút, alebo ak je to potrebné, aj dlhšie, a dekantuje sa kvapalinou na nižšie 
použitie ako inokulum v množstve 10 mg/l minerálneho média.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Ďalšie zníženie uvo ľňovania čistého CO  2 možno dosiahnu ť prevzduš ňo­
vaním kalu po čas noci vzduchom bez obsahu CO  2 . Ako inokulum sa 
v tomto teste použije koncentrácia 4 mg/l tuhých látok aktivovaného kalu (13).
 
Sekundárny výtok splaškových vôd  
33. Inokulum možno prípadne získa ť zo sekundárneho výtoku čističky alebo 
z laboratórnej jednotky, ktoré prevažne spracúvajú domáce splaškové 
vody. Vzorka sa udržiava v aeróbnych podmienkach a použije sa v de ň 
odberu alebo sa pod ľa potreby aklimatizujte. Výtok sa prefiltruje cez 
hrubý filter, aby sa odstránili hrubé pevné častice, a odmeria sa hodnota pH. 
34. Filtrát sa s cie ľom zníženia obsahu IC po čas jednej hodiny čerí vzduchom 
bez obsahu CO  2 [odsek 15 písm. e)], pri čom hodnota pH sa udržiava na 
úrovni 6,5 pomocou kyseliny trihydrogénfosfore čnej (odsek 20). Hodnota 
pH sa zmení na pôvodnú úrove ň pomocou hydroxidu sodného (odsek 21) 
a po približne hodinovej sedimentácii sa odoberie vhodné množstvo super ­
natantu na inokuláciu. Týmto postupom čerenia sa znižuje obsah IC 
v inokule. Napríklad ak sa ako inokulum použil maximálny odporú čaný 
objem filtrovaného čereného výtoku (100 ml) na liter, množstvo IC 
prítomné v slepých kontrolných nádobách bolo v rozsahu 0,4 – 1,3 mg/l (14), čo predstavuje 2 – 6,5 % C testovanej chemikálie pri 20 mg C/l a 4 – 
13 % pri 10 mg C/l.
 
Povrchové vody  
35. Z vhodnej povrchovej vody sa odoberie vzorka. Mala by sa udržiava ť 
v aeróbnych podmienkach a použi ť v deň odberu. Vzorka sa pod ľa potreby 
koncentruje filtráciou alebo odstredením. Objem inokula, ktoré sa použije 
v každej testovacej nádobe, by mal sp ĺňať kritériá uvedené v odseku 26.  
Pôda  
36. Z maximálnej h ĺbky 20 cm pod pôdnym povrchom sa odoberie vzorka 
vhodnej pôdy. Skôr než sa vzorka pôdy preoseje cez sito s ve ľkosťou ôk 
2 mm, odstránia sa z nej kamene, zvyšky rastlín a bezstavovcov (ak je 
vzorka príliš mokrá a nie je možné ju ihne ď preosiať, čiastočne sa usuší 
vzduchom, aby sa u ľahčilo preosievanie). Vzorka sa udržiava v aeróbnych 
podmienkach a použije sa v de ň odberu. (Ak sa vzorka prenáša vo vo ľne 
uviazanom čiernom polyetylénovom vreci, možno ju v tomto vreci skla ­
dovať pri teplote 2 – 4 °C až jeden mesiac).  
Aklimatizácia inokula  
37. Inokulum sa môže aklimatizova ť na experimentálne podmienky, ale nie 
predadaptova ť na testovanú chemikáliu. Aklimatizáciou možno zníži ť uvoľ­ 
ňovanie čistého CO  2 . Aklimatizácia pozostáva z prevzduš ňovania aktivova ­
ného kalu po zriedení v testovacom médiu na úrove ň 30 mg/l pomocou 
vlhkého vzduchu bez obsahu CO  2 v trvaní pä ť až sedem dní pri testovacej 
teplote.  
POSTUP TESTOVANIA  
Počet fliaš  
38. Počet fliaš [odsek 15 písm. a)] potrebný na test bude závisie ť od frekvencie 
analýz a trvania testu. 
39. Odporú ča sa analyzova ť trojice fliaš po dostato čnom počte časových inter ­
valov, aby sa mohlo ur čiť desaťdňové okno. Na konci testu sa takisto 
analyzuje najmenej pä ť testovacích fliaš [odsek 15 písm. a)] zo súborov 
fliaš v písmenách a), b) a c) (pozri odsek 42) s cie ľom umožni ť výpočet 
95 % intervalov spo ľahlivosti pre strednú hodnotu percentuálnej biodegra ­
dácie.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Inokulované médium  
40. Inokulum sa použije pri koncentrácii 4 mg/l suchých tuhých látok 
v aktivovanom kale. Tesne pred použitím sa pripraví dostato čne inokulo ­
vané médium pridaním napríklad 2 ml vhodne upraveného aktivovaného 
kalu (odseky 27 – 32) s koncentráciou 2 000 mg/l do jedného litra média 
s obsahom minerálnych solí (odsek 19). Ak sa použije sekundárny výtok splaškových vôd, maximálne 100 ml výtoku (odsek 33) sa pridá do 900 ml média s obsahom minerálnych solí (odsek 19) a zriedi sa médiom na jeden 
liter.
 
Príprava fliaš  
41. Alikvotné časti inokulovaného média sa rozdelia do paralelných fliaš tak, 
aby bol pomer priestoru nad kvapalinou ku kvapaline 1: 2 (napr. sa pridá 107 ml do fliaš s kapacitou 160 ml). Možno použi ť aj iné pomery, ale treba 
venovať pozornos ť varovaniu uvedenému v odseku 11. Bez oh ľadu na 
použité inokulum je nutné sa uisti ť, že inokulované médium je dostato čne 
premiešané, aby sa zabezpe čila jeho rovnomerná distribúcia do fliaš. 
42. Pripravia sa súbory fliaš [odsek 15 písm. a)], ktoré obsahujú: 
a) testovacie nádoby (ozna čené F
 T ) obsahujúce testovanú chemikáliu; 
b) slepé kontrolné nádoby (ozna čené F  B ) obsahujúce iba testovacie médium 
a inokulum; takisto sa musia prida ť všetky chemikálie, rozpúš ťadlá, 
činidlá alebo filtre zo sklenených vlákien, ktoré sa použili na zavedenie 
testovanej chemikálie do testovacích nádob; 
c) nádoby (ozna čené F  C ) na kontrolu postupu obsahujúce referen čnú chemi ­
káliu; 
d) v prípade potreby nádoby (ozna čené F  I ) na kontrolu možných inhibi č­
ných účinkov testovanej chemikálie obsahujúce testovanú chemikáliu aj 
referenčnú chemikáliu v rovnakých koncentráciách (odsek 24) ako vo 
fľašiach F  T a F C ; 
e) nádoby (ozna čené F  S ) na kontrolu možnej abiotickej degradácie ako 
v písmene a) plus 50 mg/l HgCl  2 alebo sterilizované inými prostriedkami 
(napr. v autokláve). 
43. Vo vode rozpustné testované chemikálie a referen čné chemikálie sa pridajú 
ako vodné zásobné roztoky (odseky 22, 23 a 24), aby sa dosiahla koncen ­
trácia 10 – 20 mg C/l. 
44. Nerozpustné testované chemikálie a nerozpustné referen čné chemikálie sa 
pridajú do fliaš rôznymi spôsobmi [pozri odsek 22 písm. a) – e)] pod ľa 
charakteru testovanej chemikálie pred alebo po pridaní inokulovaného média v závislosti od metódy aplikácie testovanej chemikálie. Ak sa použije jeden z postupov uvedených v odseku 22 písm. a) – e), potom by sa so slepými 
fľašami F
 B [odsek 42 písm. b)] malo naloži ť podobným spôsobom, ale 
s vylúčením testovanej chemikálie alebo referen čnej chemikálie. 
45. Prchavé testované chemikálie sa pomocou mikrostrieka čky vstreknú do 
hermeticky uzavretých fliaš (odsek 47). Dávka sa vypo číta zo vstreknutého 
objemu a hustoty testovanej chemikálie. 
46. Podľa potreby sa do nádob pridá voda, aby bol v každej nádobe rovnaký 
objem kvapaliny. Treba zabezpe čiť, aby pomer priestoru nad kvapalinou ku 
kvapaline (zvy čajne 1: 2) a koncentrácia testovanej chemikálie boli nasta ­
vené tak, aby bol k dispozícii dostatok kyslíka, ktorý umožní úplnú biode ­
gradáciu.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Všetky f ľaše sa potom hermeticky uzatvoria napríklad butylovými gume ­
nými priehradkami a hliníkovými uzávermi. Prchavé testované chemikálie je 
potrebné prida ť v tejto fáze (odsek 45). Na ú čely monitorovania poklesu 
koncentrácie DOC testovanej chemikálie a analýz, ktoré sa vykonávajú v nulovom čase pri po čiatočnej koncentrácii IC [sterilné kontroly, odsek 
42 písm. e)], alebo iných determinantov sa z testovacej nádoby odoberie 
primeraná vzorka. Testovacia nádoba a jej obsah sa následne zlikviduje. 
48. Hermeticky uzavreté f ľaše sa umiestnia na rota čnú trepačku [odsek 15 
písm. d)] s rýchlos ťou pretrepávania, ktorá je dostato čná na to, aby obsahy 
fliaš ostali dobre premiešané a v suspenzii (napr. 150 – 200 rpm), a následne sa inkubujú v tme pri teplote 20 °C a skladujú pri tejto teplote v rozmedzí 
± 1 °C.
 
Odber vzoriek  
49. Systém odberu vzoriek bude závisie ť od lag fázy a kinetickej rýchlosti 
biodegradácie testovanej chemikálie. V de ň odberu vzoriek sa f ľaše zlikvi ­
dujú na ú čely analýzy, čo by sa malo vykonáva ť najmenej raz do týžd ňa 
alebo častejšie (napr. dvakrát do týžd ňa), ak sa požaduje úplná krivka degra ­
dácie. Z trepa čky sa odoberie požadovaný po čet paralelných fliaš predsta ­
vujúcich F  T , F B a F  C a, ak sa použili, F  I a F  S (pozri odsek 42). Test 
zvyčajne trvá 28 dní. Ak z biodegrada čnej krivky vyplýva, že sa dosiahol 
rovnovážny stav pred uplynutím 28 dní, test môže by ť ukončený skôr. 
Z piatich fliaš vyhradených na 28. de ň testu sa odoberú vzorky na analýzu 
a výsledky sa použijú na výpo čet limitov spo ľahlivosti alebo varia čného 
koeficientu percentuálnej biodegradácie. Z fliaš, ktoré slúžia ako kontroly inhibície a abiotickej degradácie, nie je potrebné odobera ť vzorky tak často 
ako z ostatných fliaš; posta čuje deň 1 a deň 28.
 
Analýza anorganického uhlíka (IC)  
50. Produkcia CO  2 vo fľašiach sa zistí tak, že sa odmeria zvýšenie koncentrácie 
anorganického uhlíka (IC) po čas inkubácie. Na meranie množstva IC vypro ­
dukovaného v teste sú k dispozícii dve odporú čané metódy, ktoré sú opísané 
ďalej. Keďže výsledky týchto metód sa môžu mierne líši ť, v priebehu testu 
by sa mala použi ť iba jedna. 
51. Metóda a) sa odporú ča, ak médium pravdepodobne obsahuje napríklad 
zvyšky papiera zo skleneného filtra a/alebo nerozpustnej testovanej chemi ­
kálie. Ak nie je k dispozícii uhlíkový analyzátor, možno túto analýzu možno 
vykonať pomocou plynového chromatografu. Je dôležité, aby mali f ľaše 
počas analýzy plynu v uzavretom priestore nad kvapalinou teplotu, ktorá 
je rovnaká alebo sa blíži k testovacej teplote. Metóda b) môže by ť jednodu­
chšia pre laboratóriá, ktoré na meranie IC používajú uhlíkový analyzátor. Je 
dôležité, aby bol roztok hydroxidu sodného (odsek 21), ktorý sa použije na 
premenu CO  2 na uhličitan, čerstvo pripravený alebo aby bol známy jeho 
obsah IC, takže bude možné ho zoh ľadniť pri výpo čte výsledkov testu 
[pozri odsek 66 písm. b)].  
Metóda a): acidifikácia na pH < 3  
52. Pred každou várkou analýz sa IC analyzátor nakalibruje pomocou vhodného 
štandardu IC (napr. 1 % hmotnostného CO  2 v N  2 ). Koncentrovaná kyselina 
trihydrogénfosfore čná (odsek 20) sa vstrekne cez priehradku každej f ľaše, 
z ktorej sa odoberá vzorka, s cie ľom znížiť pH média na úrove ň < 3 (napr. 
sa pridá 1 ml do 107 ml testovacieho média). F ľaše sa umiestnia spä ť do 
trepačky. Po jednohodinovom pretrepávaní pri testovacej teplote sa f ľaše 
vyberú z trepa čky, odoberú sa alikvotné časti (napr. 1 ml) plynu 
z uzavretého priestoru nad kvapalinou každej f ľaše a vstreknú sa do IC 
analyzátora. Namerané koncentrácie IC sa zaznamenajú v jednotkách mg C/l.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Princípom tejto metódy je, že po acidifikácii na pH < 3 a vyvážení pri 
teplote 20 °C je rovnovážna konštanta pre distribúciu CO  2 medzi kvapalnou 
a plynnou fázou v testovacích f ľašiach 1,0 v prípade, že sa meria ako 
koncentrácia (13). Tento fakt je potrebné pre testovací systém aspo ň raz 
preukázať týmto spôsobom: 
Založia sa f ľaše obsahujúce 5 a 10 mg/l IC s využitím roztoku bezvodého 
uhličitanu sodného (Na  2 CO 3 ) vo vode bez obsahu CO  2 , ktorý sa pripraví 
tak, že voda sa pomocou koncentrovanej kyseliny trihydrogénfosfore čnej 
okyslí na pH 6,5 (odsek 20), po čas noci sa čerí pomocou vzduchu bez 
obsahu CO  2 a pomocou alkálie sa jeho pH zvýši na neutrálnu úrove ň. Je 
potrebné zabezpe čiť, aby bol pomer objemu uzavretého priestoru nad kvapa ­
linou k objemu kvapaliny rovnaký ako v testoch (napr. 1 : 2). Obsah fliaš sa 
okyslí a vyváži pod ľa opisu v odseku 52 a odmeria sa koncentrácia IC 
v uzavretom priestore nad kvapalinou, ako aj v kvapalnej fáze. Skontroluje sa, či sú tieto dve koncentrácie v rozsahu pokusnej chyby rovnaké. Ak nie 
sú, pracovník by mal skontrolova ť postupy. Túto kontrolu distribúcie IC 
medzi kvapalnou a plynnou fázou nie je potrebné vykona ť počas každého 
testu. Pravdepodobne ju bude možné vykona ť počas kalibrácie. 
54. Ak sa meria eliminácia DOC (iba testované chemikálie rozpustné vo vode), 
vzorky z kvapalnej fázy sa odoberú zo samostatných (neokyslených) fliaš, 
prefiltrujú sa cez membránu a vstreknú sa do analyzátora DOC. Tieto f ľaše 
možno v prípade potreby použi ť pri iných analýzach na meranie primárnej 
biodegradácie.
 
Metóda b): premena CO  2 na uhličitan 
55. Pred každou várkou analýz sa IC analyzátor nakalibruje pomocou vhodného 
štandardu, ako je napríklad roztok hydrogénuhli čitanu sodného (NaHCO  3 ) 
vo vode bez obsahu CO  2 (pozri odsek 53) v rozsahu 0 – 20 mg/l ako IC. 
Roztok hydroxidu sodného (7M, odsek 21) (napr. 1 ml do 107 ml média) sa 
vstrekne cez priehradku každej f ľaše, z ktorej sa odoberajú vzorky, a f ľaše 
sa nechajú pretrepáva ť pri testovacej teplote jednu hodinu. V prípade všet ­
kých fliaš zlikvidovaných v daný de ň sa použije rovnaký roztok NaOH, ale 
nemusí sa nevyhnutne použi ť pri každom odbere vzoriek po čas testu. Ak sa 
v čase každého odberu vzoriek požadujú absolútne hodnoty IC v slepých 
pokusoch, bude potrebné stanovi ť IC roztoku NaOH pri každom použití. 
Fľaše sa vyberú z trepa čky a nechajú sa sedimentova ť. Striekačkou sa 
z každej nádoby odoberú vhodné objemy (napr. 50 – 1 000 μl) kvapalnej 
fázy. Vzorky sa vstreknú do IC analyzátora a zaznamenajú sa koncentrácie IC. Je potrebné zabezpe čiť, aby bol použitý analyzátor správne vybavený na 
spracovanie zásaditých vzoriek produkovaných pri tejto metóde. 
56. Princípom tejto metódy je, že po pridaní alkálie a pretrepaní je koncentrácia 
IC v uzavretom priestore nad kvapalinou zanedbate ľná. Tento fakt je pre 
testovací systém nutné aspo ň raz skontrolova ť pomocou štandardov IC, 
pridaním alkálie, vyvážením a odmeraním koncentrácie IC v uzavretom priestore nad kvapalinou, ako aj v kvapalnej fáze (pozri odsek 53). Koncen ­
trácia v uzavretom priestore nad kvapalinou by sa mala blíži ť nule. Túto 
kontrolu prakticky úplnej absorpcie CO
 2 nie je potrebné vykonáva ť pri 
každom teste. 
57. Ak sa meria eliminácia DOC (iba testované chemikálie rozpustné vo vode), 
vzorky z kvapalnej fázy sa odoberú zo samostatných fliaš (neobsahujúcich žiadne pridané alkálie), prefiltrujú sa cez membránu a vstreknú sa do analy ­
zátora DOC. Tieto f ľaše možno v prípade potreby použi ť pri iných analý ­
zach na meranie primárnej biodegradovate ľnosti.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Výpočet výsledkov  
58. Pri predpoklade stopercentnej mineralizácie testovanej chemikálie na CO  2 sa 
nadbytočný ThIC vyprodukovaný v slepých kontrolných testoch rovná TOC 
pridanému do každej testovacej f ľaše na za čiatku testu, teda: 
ThIC ¼ TOC 
Celková hmotnos ť (mg) anorganického uhlíka (TIC) v každej f ľaši je: 
TIC ¼ ðmg Cv kvapaline þ mg Cv uzavretom priestore 
nad kvapalinouÞ ¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ rovnica [1] 
kde: 
V L = objem kvapaliny vo f ľaši (litre), 
CL = koncentrácia IC v kvapaline (mg/l ako uhlík), 
VH = objem uzavretého priestoru nad kvapalinou (litre), CH = koncentrácia IC v uzavretom priestore nad kvapalinou (mg/l ako 
uhlík). 
Výpočty TIC pre dve analytické metódy použité na meranie IC v tomto teste 
sú opísané ďalej v odsekoch 60 a 61. Percentuálna biodegradácia ( % D ) sa 
v jednotlivých prípadoch vypo číta podľa vzorca: 
%D ¼
 ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 rovnica [2] 
kde: 
TIC  t = mg TIC v testovacej f ľaši v čase t, 
TIC  b = stredná mg TIC v slepých kontrolných f ľašiach v čase t, 
TOC = mg TOC pridaná do testovacej nádoby na za čiatku. 
Z príslušných množstiev TIC vyprodukovaných do časov odberu sa vypo číta 
percentuálna biodegradácia, % D, pre testovacie (F  T ), referen čné (F  C ) a, ak 
sú zahrnuté, kontrolné (F  I ) fľaše na monitorovanie inhibície. 
59. Ak v priebehu testovacieho obdobia došlo k výraznému zvýšeniu obsahu 
TIC sterilných kontrolných fliaš (F  S ), potom možno vyvodi ť záver, že došlo 
k abiotickej degradácii testovanej chemikálie, ktorú treba zoh ľadniť pri 
výpočte D v rovnici [2].  
Acidifikácia na pH < 3  
60. Keďže acidifikácia na pH < 3 a vyvažovanie vedie k vyrovnaniu koncen ­
trácie TIC v kvapalnej a plynnej fáze, sta čí odmerať iba koncentráciu IC 
v plynnej fáze. Teda z rovnice [1]  TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , kde 
V B = objem sérovej f ľaše. 
Premena CO  2 na uhličitan 
61. Pri tejto metóde sú výpo čty rovnaké ako v rovnici [1], ale zanedbate ľné 
množstvo IC v plynnej fáze sa ignoruje, čiže V  H Ü C H ¼ 0 
a TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Vyjadrenie výsledkov  
62. Krivka biodegradácie sa získa tak, že sa zakreslí percentuálna biodegradácia, 
D, v závislosti od času inkubácie a pod ľa možnosti sa nazna čí lag fáza, 
biodegrada čná fáza, desa ťdňové okno a rovnovážna fáza, teda fáza, v ktorej 
sa dosiahla maximálna degradácia a krivka biodegradácie sa vyrovnala. Ak 
sa pre súbežné testovacie nádoby získajú porovnate ľné výsledky F  T (< 20 % 
rozdiel), zakreslí sa stredná krivka (pozri dodatok 2, obrázok 1), ak nie, krivky sa zakreslia pre každú nádobu. Stanoví sa stredná hodnota percentu ­
álnej biodegradácie v rovnovážnej fáze alebo sa posúdi najvyššia hodnota 
(napr. ke ď krivka v rovnovážnej fáze klesá), ale je dôležité zváži ť, či 
v druhom prípade nejde o od ľahlú hodnotu. Táto maximálna úrove ň biode­
gradácie sa v správe o teste uvedie ako „stupe ň biodegradácie testovanej 
chemikálie“. Ak po čet testovacích nádob nebol na nazna čenie rovnovážnej 
fázy dostato čný, na výpo čet strednej hodnoty sa použijú údaje namerané 
v posledný de ň testu. Táto posledná hodnota, priemer piatich replikátov, 
slúži na ur čenie presnosti, s ktorou bola stanovená percentuálna biodegra ­
dácia. Do správy sa uvedie aj hodnota získaná na konci desa ťdňového okna. 
63. Rovnakým spôsobom sa zakreslí krivka pre referen čnú chemikáliu, F
 C , a, ak 
je zahrnutá, pre abiotickú kontrolu eliminácie, F  S , a kontrolu inhibície, F  I . 
64. Zaznamenajú sa množstvá TIC prítomné v slepých kontrolných nádobách 
(F B ), rovnako ako množstvá v bankách F  S (abiotická kontrola), ak takéto 
nádoby boli zahrnuté do testu. 
65. Vypo číta sa D pre nádoby F  I podľa teoretického nárastu IC o čakávaného iba 
v dôsledku referen čnej zložky zmesi. Ak v de ň 28 [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] 
× 100 > 25 %, možno predpoklada ť, že testovaná chemikália potla čila 
činnosť inokula, čo mohlo vies ť k nízkym hodnotám D  FT získaným 
v podmienkach testu. V takom prípade možno test opakova ť s využitím 
nižšej testovacej koncentrácie a pod ľa možnosti znížením DIC v inokule 
a TIC vytvorenej v slepých kontrolných nádobách, lebo nižšia koncentrácia bude ma ť inak za následok menšiu presnos ť metódy. Prípadne možno 
použiť iné inokulum. Ak je vo f ľaši F
 S (abiotická) pozorované výrazné 
zvýšenie (> 10 %) množstva TIC, mohlo dôjs ť k abiotickým degrada čným 
procesom.  
Platnosť výsledkov  
66. Test sa považuje za platný, ak: 
a) stredná percentuálna degradácia v nádobách F  C obsahujúcich referen čnú 
chemikáliu je > 60 % do 14. d ňa inkubácie a 
b) stredné množstvo TIC prítomnej v slepých kontrolných nádobách F  B na 
konci testu je > 3 mg C/l. 
Ak tieto limity nie sú splnené, test by sa mal zopakova ť s využitím inokula 
z iného zdroja a/alebo je potrebné preveri ť použité postupy. Napríklad ak je 
problémom vysoká produkcia IC v slepých kontrolných nádobách, treba sa riadiť postupom uvedeným v odsekoch 27 – 32.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Percentuálna degradácia v nádobách F  C obsahujúcich referen čnú látku. 
( 2 ) Percentuálna degradácia v nádobách F  I .
 67. Ak testovaná chemikália nedosiahne 60 % ThIC a preukáže sa, že nemá 
inhibičné účinky (odsek 65), test možno zopakova ť pri vyššej koncentrácii 
inokula (až do 30 mg/l aktivovaného kalu a 100 ml výtoku/l) alebo s využitím inokúl z iných zdrojov, najmä ak bola degradácia v rozsahu 20 – 60 %.
 
Interpretácia výsledkov  
68. Biodegradácia > 60 % ThIC po čas desaťdňového okna v tomto teste preuka ­
zuje, že testovaná chemikália ja ľahko biodegradovate ľná v aeróbnych 
podmienkach. 
69. Ak sa nedosiahne hrani čná hodnota 60 % ThIC, stanoví sa hodnota pH 
v médiách vo f ľašiach, ktoré sa neacidifikovali ani nealkalizovali. Hodnota 
pod 6,5 môže znamena ť, že došlo nitrifikácii. V takom prípade je potrebné 
test zopakova ť s tlmivým roztokom vyššej koncentrácie.  
Správa o teste  
70. Pre každý de ň, v ktorom sa odoberali vzorky, sa zostaví tabu ľka % D pre 
každú testovaciu (F  T ), referen čnú (F  C ) a, ak bola zahrnutá, inhibi čnú 
kontrolnú f ľašu (F  I ). Ak sa v prípade paralelných fliaš získajú porovnate ľné 
výsledky, zakreslí sa krivka strednej hodnoty % D v závislosti od času. 
Zaznamená sa množstvo TIC v slepých kontrolných (F  B ) a v sterilných 
kontrolných nádobách (F  S ), DOC a/alebo ostatných determinantov a ich 
percentuálna eliminácia. 
71. Stanoví sa stredná hodnota % D v rovnovážnej fáze alebo v prípade, že 
biodegrada čná krivka v rovnovážnej fáze klesá, sa použije najvyššia hodnota 
a táto hodnota sa v správe uvedie ako „stupe ň biodegradácie testovanej 
chemikálie“. Je dôležité zabezpe čiť, aby v druhom prípade najvyššia 
hodnota nebola od ľahlá. 
72. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— bežný názov, chemický názov, číslo CAS, štrukturálny vzorec 
a významné fyzikálno-chemické vlastnosti, 
— čistota (ne čistoty) testovanej chemikálie.  
Podmienky testovania:  
— odkaz na túto testovaciu metódu, 
— opis použitého testovacieho systému (napr. objem nádoby, pomer 
uzavretého priestoru nad kvapalinou a kvapaliny, metóda miešania at ď.), 
— aplikácia testovanej chemikálie a referen čnej chemikálie v testovacom 
systéme: použitá testovacia koncentrácia a množstvo uhlíka dávkované do každej testovacej f ľaše, použitie akýchko ľvek rozpúš ťadiel, 
— údaje o použitom inokule, akomko ľvek predchádzajúcom ošetrení 
a aklimatizácii, 
— inkuba čná teplota, 
— overenie princípu analýzy IC, 
— hlavné charakteristiky použitého IC analyzátora (a všetkých ostatných 
použitých analytických metód), 
— počet replikátov.  
Výsledky:  
— nespracované údaje a vypo čítané hodnoty biodegradovate ľnosti 
v tabuľkovej forme,
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— graf percentuálnej degradácie v závislosti od času pre testovanú 
a referen čnú chemikáliu, lag fáza, fáza degradácie, desa ťdňové okno 
a sklon, 
— percentuálna eliminácia v rovnováhe, na konci testu a po desa ťdňovom 
okne, 
— dôvody pre akéko ľvek odmietnutie testovacích výsledkov, 
— akéko ľvek ďalšie skuto čnosti, ktoré majú význam pre použitý postup, 
— rozbor výsledkov.  
LITERATÚRA  
1. Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie „ ľahkej“ biodegradovate ľnosti – test 
uvoľňovania CO  2 (metóda C.4-C). 
2. Sturm, R. N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159 
– 167. 
3. Larson, R. J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153 – 1161. 
4. Larson, R. J., Hansmann, M. A., a Bookland, E. A. (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195 – 1210. 
5. ISO 9439 (1990; revidované 1999). Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeró ­
bnej biodegradability organických látok vo vodnom prostredí. Skúška tvorby oxidu uhli čitého (Sturm) 
6. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC. 
7. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC. 
8. Gledhill, W. E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922 – 929. 
9. Weytjens, D., Van Ginneken, I., a Painter, H. A. (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801 – 812. 
10. Ennis, D. M., a Kramer, A. (1975). A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181 – 185. 
11. Ennis, D. M., Kramer, A., Jameson, C. W., Mazzoccki, P. H., a Bailey, P. H. 
(1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51 – 53. 
12. Boatman, R. J., Cunningham, S. L., a Ziegler, D. A. (1986). A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233 – 243. 
13. Struijs, J., a Stoltenkamp, J. (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204 – 211. 
14. Birch, R. R., a Fletcher, R. J. (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507 – 524. 
15. Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., 
Reust, H., a Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic 
biodegradation. Chemosphere 19: 1527 – 1550.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
16. ISO 14593, (1999) Kvalita vody. Hodnotenie úplnej aeróbnej biodegradabi ­
lity organických látok vo vodnom prostredí. Metóda analýzy uvo ľneného 
anorganického uhlíka v uzavretých nádobách (skúška CO  2 headspace) 
17. Battersby, N. S. (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemo ­
sphere 34: 1813 – 1822. 
18. US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel 
carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substance, Washington, DC. 
19. Battersby, N. S., Ciccognani, D., Evans, M. R., King, D., Painter, H. A., 
Peterson, D. R., a Starkey, M. (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemo ­
sphere 38: 3219 – 3235. 
20. Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie „ ľahkej“ biodegradovate ľnosti. 
21. OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Správa predsedu (M. Hashimoto; MITI) a závere čná správa (M. 
Kitano a M. Takatsuki; CITI). Paríž. 
22. Kapitola C.11 tejto prílohy, Respira čno-inhibičný test aktivovaného kalu. 
23. Struijs, J., Stoltenkamp-Wouterse, M. J., a Dekkers, A. L. M. (1995). 
A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability 
tests. Biodegradation 6: 319 – 327. 
24. EÚ (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO
 2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, 
máj 1999, Medmenham, SL7 2HD, Spojené krá ľovstvo. 
25. ISO 10634 (1996) Kvalita vody. Pokyny na prípravu a spracovanie organic ­
kých látok málo rozpustných vo vode na následné hodnotenie ich biodegra ­
dability vo vodnom prostredí.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Dodatok 1  
SKRATKY A VYMEDZENIE POJMOV  
IC: anorganický uhlík.  
ThCO  2 : teoretický oxid uhli čitý (mg) je vypo čítané množstvo oxidu uhli čitého, 
ktoré sa vytvorí zo známeho alebo odmeraného obsahu uhlíka v testovanej chemikálii, ke ď je kompletne mineralizovaná. Je vyjadrený aj ako mg oxidu 
uhličitého uvo ľneného z mg testovanej chemikálie.  
DOC:  rozpustený organický uhlík je organický uhlík prítomný v roztoku alebo 
ten, ktorý prechádza cez 0,45-mikrometrový filter alebo ostáva v supernatante po odstredení pri cca. 4 000 g (približne 40 000 m s
 -2 ) počas 15 minút.  
DIC:  rozpustený anorganický uhlík.  
ThIC:  teoretický anorganický uhlík.  
TIC:  celkový anorganický uhlík.  
Ľahko biodegradovate ľné: dohodnutá klasifikácia chemikálií, ktoré prešli cez 
určité špecifické skríningové testy na úplnú biodegradovate ľnosť. Tieto testy sú 
také prísne, že sa predpokladá, že takéto chemikálie sa budú rýchlo a úplne biodegradova ť vo vodnom prostredí v aeróbnych podmienkach.  
Desaťdňové okno:  desať dní nasledujúcich ihne ď po dosiahnutí 10 % degradá ­
cie. 
Inherentná biodegradovate ľnosť: klasifikácia chemikálií, pre ktoré existuje 
jednoznačný dôkaz ich biodegradácie (primárnej alebo úplnej) v každom teste 
na biodegradovate ľnosť. 
Úplná aeróbna biodegradácia:  úroveň degradácie, ktorá sa dosiahne, ke ď testo­
vanú chemikáliu úplne spotrebujú mikroorganizmy, čoho výsledkom je tvorba 
oxidu uhli čitého, vody, minerálnych solí a nových mikrobiálnych bunkových 
zložiek (biomasy).  
Mineralizácia:  mineralizácia je úplná degradácia organickej chemikálie na CO
 2 
a H  2 O v aeróbnych podmienkach a na CH  4 , CO  2 a H  2 O v anaeróbnych podmien ­
kach.  
Lag fáza:  dosiahnutý čas od začiatku testu do aklimatizácie a/alebo prispôso ­
benia degradujúcich mikroorganizmov a do zvýšenia stup ňa biodegradácie testo ­
vanej chemikálie alebo organického materiálu na úrove ň stanovite ľnosti (napr. 
10 % maximálnej teoretickej biodegradácie alebo menej v závislosti od presnosti 
meracej techniky).  
Fáza degradácie:  čas od konca lag fázy až po čas, keď sa dosiahne 90 % 
maximálnej úrovne degradácie.  
Rovnovážna fáza:  rovnovážna fáza je fáza, v ktorej sa dosiahla maximálna 
degradácia a v ktorej je krivka biodegradácie vyrovnaná.  
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Dodatok 2  
Príklad krivky biodegradácie  
Obrázok 1  
Biodegradácia 1-oktanolu v teste CO  2 v uzavretom priestore nad kvapalinou
  
Glosár 
Biodegradácia: Fáza degradácie: Maximálna úrove ň biodegradácie: 
Rovnovážna fáza: 
Desaťdňové okno: 
Čas testovania (dni):
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C. 30.  BIOAKUMULÁCIA PRI SUCHOZEMSKÝCH MÁLOŠTETINAV ­
COCH  
ÚVOD 
1. Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykoná ­
vanie testov (TG) 317 (2010). Pokia ľ ide o testovacie metódy týkajúce sa 
environmentálneho osudu, Biokoncentrácia: prietokový rybí test [kapitola C.13 tejto prílohy (49)] bola uverejnená v roku 1996 a Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente [kapitola C.51 tejto 
prílohy (53)] bola uverejnená v roku 2008. Extrapolácia údajov o vodnej 
bioakumulácii na suchozemské organizmy, ako sú dáž ďovky, je zložitá, 
resp. nemožná. Modelové výpo čty založené na lipofilite testovanej chemi ­
kálie, napr. (14) (37), sa v sú časnosti využívajú na hodnotenie bioakumu ­
lácie chemikálií v pôde, ako napríklad v technickom usmer ňovacom doku ­
mente EÚ (19). Potrebe testovacej metódy špecifickej pre kompartmenty už bola venovaná pozornos ť, napr. (55). Takáto metóda je dôležitá najmä pre 
hodnotenie sekundárnej otravy v suchozemských potravinových re ťazcoch 
(4). Problému bioakumulácie v organizmoch iných ako ryby sa venuje 
niekoľko testovacích metód na vnútroštátnej úrovni, napr. (2) a (72). 
Metódu merania bioakumulácie pri dáž ďovkách a červoch čeľade Enchy­
traeidae  (Eisenia fetida, Savigny) z kontaminovanej pôdy vypracovala 
Americká spolo čnosť pre testovanie a materiály (American Society for 
Testing and Materials) (3). Medzinárodne uznávaná metóda na stanovenie bioakumulácie v obohatenej pôde prispeje k lepšiemu hodnoteniu rizík chemikálií v suchozemských ekosystémoch, napr. (25) (29). 
2. Bezstavovce požívajúce pôdu sú vystavené ú činkom chemikálií naviazaných 
na pôdu. Medzi týmito zvieratami zohrávajú suchozemské máloštetinavce významnú úlohu v štruktúre a funkcii pôdy (15) (20). Suchozemské máloš ­
tetinavce žijú v pôde a čiastočne na pôdnom povrchu (najmä v nadložnom 
horizonte). Často predstavujú najhojnejšie zastúpený živo číšny druh 
v biomase (54). Tieto zvieratá vzh ľadom na bioturbáciu pôdy 
a skutočnosť, že bývajú častou koris ťou, významne ovplyv ňujú biodostup ­
nosť chemikálií pre iné organizmy, ako sú dravce patriace do skupiny 
bezstavovcov [napr. dravé rozto če a chrobáky, napr. (64)] alebo stavovcov 
(napr. líšky a čajky) (18) (62). Niektoré druhy suchozemských málošteti ­
navcov, ktoré sa v sú časnosti využívajú v ekotoxikologickom testovaní, sú 
opísané v dodatku 5. 
3. V štandardnej príru čke ASTM na vykonávanie laboratórnych testov pôdnej 
toxicity alebo bioakumulácie pri dáž
ďovkách druhu  Eisenia fetida  a červov 
čeľade Enchytraeidae  druhu  Enchytraeus albidus  (3) sa uvádza mnoho 
základných a užito čných informácií týkajúcich sa postupu tejto testovacej 
metódy bioakumulácie v pôde. Medzi ďalšie dokumenty, ktoré sú uvedené 
v tejto testovacej metóde, patrí kapitola C.13 tejto prílohy, Biokoncentrácia: prietokový rybí test (49) a kapitola C.51 tejto prílohy: Bioakumulácia pri 
bentických máloštetinavcoch žijúcich v sedimente (53). Ďalší významný 
zdroj informácií o tejto testovacej metóde predstavujú aj praktické skúse ­
nosti so štúdiami bioakumulácie v pôde a publikácie uvedené v literatúre, napr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). 
4. Túto testovaciu metódu možno použi ť najmä v prípade stabilných, neutrál ­
nych organických chemikálií, ktoré sa zvy čajne adsorbujú na pôde. 
Pomocou tejto testovacej metódy možno testova ť bioakumuláciu stabilných 
organokovových zlú čenín, ktoré sa viažu na pôdu. Možno ju použi ť aj na 
kovy a iné stopové prvky.
 
PREDPOKLADANÉ PODMIENKY 
5. Testy na meranie bioakumulácie chemikálie pri suchozemských málošteti ­
navcoch boli vykonané s ťažkými kovmi [pozri napr. (63)] a perzistentnými, 
organickými chemikáliami s hodnotami log Kow od 3,0 do 6,0, napr. (40). Takéto testy sa vz ťahujú aj na: 
— chemikálie, ktoré vykazujú nízky log K
 ow vyšší ako 6,0 (superhydro ­
fóbne chemikálie),  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— chemikálie patriace do triedy organických chemikálií, o ktorých je 
známe, že majú potenciál sa bioakumulova ť v živých organizmoch, 
napr. povrchovo aktívne alebo vysokoadsorp čné chemikálie, 
— chemikálie, ktoré vykazujú potenciál bioakumulácie vzh ľadom na štruk ­
túrne charakteristiky, napr. analógy chemikálií, pri ktorých je známy potenciál bioakumulácie, a 
— kovy. 
6. Informácie o testovanej chemikálii, ako je bežný názov, chemický názov 
(podľa možnosti názov IUPAC), štrukturálny vzorec, registra čné číslo CAS, 
čistota, bezpe čnostné opatrenia, vhodné podmienky skladovania a analytické 
metódy, je potrebné získa ť pred začiatkom štúdie. Okrem toho je nutné 
poznať tieto informácie: 
a) rozpustnos ť vo vode; 
b) rozdeľovací koeficient oktanol – voda, K
 ow ; 
c) rozdeľovací koeficient pôda – voda, vyjadrený ako K  oc ; 
d) tlak pary; 
e) degradovate ľnosť (napr. v pôde, vo vode); 
f) známe metabolity. 
7. Možno použi ť rádioozna čené testované chemikálie alebo chemikálie bez 
rádioozna čenia. Na u ľahčenie analýzy sa však odporú ča použiť rádioozna ­ 
čenú testovanú chemikáliu. Rozhodnutie bude závisie ť od detek čných 
limitov alebo od požiadavky na meranie materskej testovanej chemikálie a metabolitov. Ak sa použije rádioozna čená testovaná chemikália a merajú 
sa celkové rádioaktívne rezíduá, je dôležité, aby sa rádioozna čené rezíduá 
v pôde aj v testovacích organizmoch charakterizovali prostredníctvom 
určenia percenta materskej testovanej chemikálie a percenta ozna čenej 
nematerskej chemikálie, napr. vo vzorkách odobratých v rovnovážnom stave alebo na konci fázy absorpcie, aby bolo možné vypo čítať bioakumu ­
lačný faktor (BAF) pre danú materskú testovanú chemikáliu a pre metabo ­
lity v pôde (pozri odsek 50). Metódu, ktorá je tu opísaná, možno modifi ­
kovať, napr. na ú čely zabezpe čenia dostato čnej biomasy, na meranie orga ­
nickej testovanej chemikálie bez rádioozna čenia alebo v prípade kovov. Ak 
sa merajú celkové rádioaktívne rezíduá (prostredníctvom kvapalinovej scin ­
tilačnej spektroskopie nasledujúcej po extrakcii, horení alebo stabilizácii 
tkaniva), bioakumula čný faktor je založený na materskej testovanej chemi ­
kálii a metabolitoch. Výpo čet BAF by pod ľa možnosti mal vychádza ť 
z koncentrácie materskej testovanej chemikálie v organizmoch a celkových rádioaktívnych rezíduí. Následne sa na ú čely porovnate ľnosti 
medzi výsledkami rôznych testov bioakumulácie na základe BAF vypo číta 
akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) normalizovaný na obsah lipidov 
v červoch a obsah organického uhlíka (OC) v pôde. 
8. Toxicita testovanej chemikálie pre živo
číšny druh použitý v teste by mala 
byť známa, napr. ú činná koncentrácia (ECx) alebo letálna koncentrácia 
(LCx) po čas fázy absorpcie [napr. (19)]. Vybratá koncentrácia testovanej 
chemikálie by pod ľa možnosti mala predstavova ť približne 1 % jej akútnej 
asymptotickej LC  50 a mala by by ť najmenej desa ťkrát vyššia ako jej 
detekčný limit v pôde pri použitej analytickej metóde. Prednostne by sa 
mali použi ť hodnoty toxicity získané z dlhodobých štúdií o subletálnych 
parametroch, pokia ľ sú k dispozícii (51) (52). Ak takéto údaje nie sú 
dostupné, užito čné informácie prinesie test akútnej toxicity [pozri napr. 
(23)].  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Mala by by ť k dispozícii vhodná analytická metóda známej správnosti, 
presnosti a citlivosti na kvantifikáciu chemikálie v testovacích roztokoch, 
v pôde a v biologickom materiáli, ako aj údaje o príprave a skladovaní vzoriek a karty bezpe čnostných údajov o materiáli. Treba pozna ť aj analy­
tické detek čné limity testovanej látky v pôde a v tkanivách červov. Ak sa 
použije testovaná chemikália ozna čená 14C, je nutné pozna ť špecifickú 
rádioaktivitu (t. j. Bq mol
 –1 ) a percento rádioaktivity spojenej 
s nečistotami. Špecifická rádioaktivita testovanej chemikálie by mala by ť 
dostatočne vysoká, aby umožnila analýzu, a použité testovacie koncentrácie 
by nemali vyvoláva ť toxické ú činky. 
10. Test možno vykona ť s využitím umelej alebo prírodnej pôdy. Informácie 
o charakteristikách použitej prírodnej pôdy, napr. pôvod pôdy alebo jej 
zložiek, pH, obsah organického uhlíka, rozdelenie ve ľkosti častíc (percento 
piesku, siltu a hliny), a reten čná kapacita vody (WHC) by mali by ť známe 
pred začiatkom testu (3) (48).  
PRINCÍP TESTU 
11. Medzi parametre, ktoré charakterizujú bioakumuláciu testovanej chemikálie, 
patrí bioakumula čný faktor (BAF), konštanta rýchlosti absorpcie (k  s ) 
a konštanta rýchlosti eliminácie (k  e ). Vymedzenie pojmov je uvedené 
v dodatku 1. 
12. Test pozostáva z dvoch fáz: fázy absorpcie (expozícia) a fázy eliminácie (po 
expozícii). Po čas fázy absorpcie sa paralelné skupiny červov vystavia pôso ­
beniu pôdy, ktorá bola obohatená testovanou chemikáliou. Okrem testova ­
cích zvierat sa za tých istých podmienok bez testovanej chemikálie chovajú skupiny kontrolných červov. Odmeria sa suchá hmotnos ť a obsah lipidov 
v testovacích organizmoch. Na toto meranie možno použi ť červy 
z kontrolnej skupiny. Analytické hodnoty pozadia (slepý test) možno získa ť 
analýzou vzoriek kontrolných červov a pôdy. Vo fáze eliminácie sa červy 
prenesú do pôdy, ktorá neobsahuje testovanú chemikáliu. Fáza eliminácie je 
nutná vždy okrem prípadu, ke ď je absorpcia testovanej chemikálie po čas 
fázy expozície bezvýznamná. Fáza eliminácie poskytuje informácie o rýchlosti, ktorou testovacie organizmy vylu čujú testovanú chemikáliu 
[napr. (27)]. Ak sa v priebehu fázy absorpcie nedosiahol rovnovážny stav, 
stanovenie kinetických parametrov – kinetického bioakumula čného faktora 
BAFk, konštánt rýchlosti absorpcie a eliminácie – by pod ľa možnosti malo 
byť založené na súbežnej úprave výsledkov z fáz absorpcie a eliminácie. 
Koncentrácia testovanej chemikálie v/na červoch sa monitoruje v priebehu 
oboch fáz testu. 
13. Počas fázy absorpcie sa vykonávajú merania v časoch odberov vzoriek 
počas až 14 dní ( čeľaď Enchytraeidae ) alebo 21 dní (dáž ďovky), až kým 
sa nedosiahne rovnovážny stav (11) (12) (67). Rovnovážny stav nastáva vtedy, ke ď je krivka závislosti koncentrácie pri červoch od času paralelná 
s časovou osou a ak sa tri po sebe nasledujúce analýzy vzoriek odobratých 
v intervaloch najmenej dvoch dní navzájom nelíšia o viac ako ± 20 % na 
základe štatistických porovnaní (napr. analýza rozptylu, regresná analýza). 
14. Fáza eliminácie pozostáva z prenosu testovacích organizmov do nádob 
obsahujúcich rovnaký substrát bez testovanej chemikálie. Po čas fázy elimi ­
nácie sa merania vykonávajú v časoch odberov vzoriek po čas 14 dní ( čeľaď 
Enchytraeidae ) alebo 21 dní (dáž ď
ovky), pokia ľ skoršie analytické 
skúmanie nepreukázalo 90-percentné zníženie rezíduí testovanej chemikálie 
pri červoch. Koncentrácia testovanej chemikálie pri červoch na konci fázy  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
eliminácie sa do správy uvedie ako neeliminované rezíduá. Rovnovážny 
bioakumula čný faktor (BAFss) sa pod ľa možnosti vypo číta ako pomer 
koncentrácie pri červoch (Ca) a v pôde (Cs) pri zrejmom rovnovážnom 
stave, a ako kinetický bioakumula čný faktor, BAFK, ako pomer konštanty 
rýchlosti absorpcie z pôdy (ks) a konštanty rýchlosti eliminácie (ke) (pre 
vymedzenie pojmov pozri dodatok 1) pri predpoklade kinetiky prvého rádu 
(pre výpo čty pozri dodatok 2). Ak je zrejmé, že nie je možné použi ť 
kinetiku prvého rádu, mali by sa použi ť iné modely. 
15. Konštanta rýchlosti absorpcie, konštanta rýchlosti eliminácie (alebo 
konštanty, ak boli použité ďalšie modely), kinetický bioakumula čný 
faktor (BAFK) a pod ľa možnosti limity spo ľahlivosti každého z týchto 
parametrov sa vypo čítajú pomocou po čítačových modelových rovníc (pre 
ďalšie usmernenia pozri dodatok 2). Správnos ť odhadu každého modelu 
možno stanovi ť napr. na základe korela čného koeficientu alebo koeficientu 
určenia (koeficienty blízke hodnote jeden indikujú vysokú mieru zhody) 
alebo na základe chí-kvadrátu. Takisto ve ľkosť štandardnej chyby alebo 
limit spoľahlivosti blízko odhadovaných parametrov môžu indikova ť správ­
nosť odhadu modelu. 
16. Na zníženie variability výsledkov testu v prípade testovaných chemikálií 
s vysokou lipofilitou by bioakumula čné faktory mali by ť vyjadrené vo 
vzťahu k obsahu lipidov a k obsahu organického uhlíka (kg organického 
uhlíka (OC) kg  –1 obsahu lipidov pri červoch). Tento prístup je založený na 
skutočnosti, že v prípade iektorých chemických tried existuje zrejmá závi ­
slosť medzi potenciálom bioakumulácie a lipofilitou, ktorá bola zistená pri 
rybách (47). Medzi obsahom lipidov pri rybách a bioakumuláciou takýchto chemikálií existuje vz ťah. V prípade bentických organizmov boli zistené 
podobné korelácie, napr. (30) (44). Podobne sa táto korelácia preukázala 
v prípade suchozemských máloštetinavcov, napr. (5) (6) (7) (14). Ak je k dispozícii dostatok ntkaniva z červov, obsah lipidov v testovacích zviera ­
tách možno ur čiť na rovnakom biologickom materiáli, aký bol použitý na 
určenie koncentrácie testovanej chemikálie. Na meranie obsahu lipidov 
možno prípadne použi ť kontrolné zvieratá.
 
PLATNOS Ť TESTU 
17. Ak má by ť test platný, musia by ť splnené tieto kritériá v prípade kontrol ­
ných zvierat, ako aj v prípade ošetrených zvierat: 
— na konci testu by celková mortalita po čas fázy absorpcie a eliminácie 
nemala presahova ť 10 % (dáž ďovky) alebo 20 % ( červy čeľade Enchy­
traeidae ) celkového po čtu zavedených červov, 
— pri druhoch  Eisenia fetida  a Eisenia andrei  by strata strednej hmotnosti 
nameraná na konci fázy absorpcie a na konci fázy eliminácie nemala presahova ť 20 % v porovnaní s po čiatočnou čerstvou hmotnos ťou (f.w.) 
na začiatku jednotlivých fáz.
 
OPIS METÓDY  
Testovacie druhy  
18. Na testovanie bioakumulácie sa odporú ča niekoľko druhov suchozemských 
máloštetinavcov. Najbežnejšie používané druhy  Eisenia fetida  alebo  Eisenia 
andrei  (čeľaď Lumbricidae ), alebo  Enchytraeus albidus , Enchytraeus cryp ­
ticus  alebo  Enchytraeus luxuriosus  (čeľaď Enchytraeidae ) sú opísané 
v dodatku 5.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Zariadenie  
19. V prípade všetkých častí zariadenia treba dba ť na to, aby sa predišlo použí ­
vaniu materiálov, ktoré môžu rozpusti ť, adsorbova ť testovanú chemikáliu 
alebo vylúhova ť iné chemikálie a ma ť škodlivé ú činky na testovacie zvie ­
ratá. Možno použi ť štandardné nádoby pravouhlého alebo valcovitého tvaru 
vyrobené z chemicky inertného materiálu a s primeranou kapacitou, ktorá zodpovedá ve ľkosti násady, t. j. po čtu testovacích červov. Na každé zaria ­
denie, ktoré prichádza do kontaktu s testovacími médiami, možno použi ť 
nerezovú oce ľ, umelú hmotu alebo sklo. Testovacie nádoby by mali by ť 
vhodne prikryté, aby sa zabránilo úniku červov, ale zárove ň bol zabezpe ­ 
čený dostato čný prívod vzduchu. V prípade chemikálií s vysokým 
adsorpčným koeficientom, ako sú syntetické pyretroidy, môže by ť potrebné 
posilanizované sklo. V takýchto prípadoch je potrebné zariadenia po skon ­ 
čení pokusu zlikvidova ť (49). Je nutné zabráni ť úniku rádioozna čených 
testovaných látok a prchavých chemikálií. Na zachytenie všetkých rezíduí 
odparených z testovacích nádob by sa mali použi ť zachytáva če (napr. skle ­
nené fľaše na premývanie plynu) obsahujúce vhodné absorbenty.
 
Pôda  
20. Testovacia pôda by mala ma ť takú kvalitu, aby umožnila prežívanie a pod ľa 
možnosti reprodukciu testovacích organizmov po čas celého obdobia aklima ­
tizácie a testovania bez toho, aby sa pri týchto organizmoch prejavil nezvy ­ 
čajný vzhľad alebo správanie. Červy by sa mali zahraba ť do pôdy. 
21. Ako substrát v týchto testoch sa odporú ča použiť umelú pôdu opísanú 
v kapitole C.8 tejto prílohy (48). Príprava umelej pôdy pre testy bioakumu ­
lácie a odporú čania týkajúce sa skladovania umelej pôdy sú uvedené 
v dodatku 4. Umelú pôdu vysušenú vzduchom možno až do použitia skla ­
dovať pri izbovej teplote. 
22. Ako testovacia a/alebo kultiva čná pôda však môže slúži ť prírodná pôda 
z neznečistených miest. V prípade prírodnej pôdy je nutné uvies ť aspoň 
pôvod (miesto odberu), pH, obsah organického uhlíka, rozdelenie ve ľkosti 
častíc (percento piesku, siltu a hliny), maximálnu reten čnú kapacitu vody 
(WHCmax) a percentuálny obsah vody (3). Analýzou pôdy alebo jej zložiek 
pred použitím možno získa ť užitočné informácie o zne čisťujúcich mikrolát ­
kach. Ak sa použije pôda z po ľnohospodárskeho po ľa, nemala by by ť 
ošetrovaná výrobkami na ochranu plodín ani hnojivom z ošetrovaných zvie ­
rat, ako sú umelé hnojivá, najmenej jeden rok a v prípade organických 
hnojív najmenej šes ť mesiacov pred odberom vzoriek (50). Postupy mani ­
pulácie s prírodnou pôdou pred jej použitím v ekotoxikologických testoch s máloštetinavcami v laboratóriu sú opísané v odseku (3). Čas skladovania 
prírodnej pôdy v laboratóriu by mal by ť čo najkratší.
 
Aplikácia testovanej chemikálie  
23. Testovaná chemikália sa pridá do pôdy. Je potrebné zoh ľadniť fyzikálno- 
chemické vlastnosti testovanej chemikálie. Testovaná chemikália rozpustná vo vode by sa mala pred tým, ako sa zmieša s pôdou, vo vode úplne rozpustiť. Odporúčaný postup obohacovania v prípade testovanej chemiká ­
lie, ktorá je slabo rozpustná vo vode, zah ŕňa nanesenie testovanej chemikálie 
na jednu alebo viacero (umelých zložiek) pôdy. Napríklad kremenný piesok alebo jeho časť možno napusti ť roztokom testovanej chemikálie vo 
vhodnom organickom rozpúš ťadle, ktorý sa následne odparí do sucha. 
a Časť s nánosom možno potom zamieša ť do mokrej pôdy. Hlavnou 
výhodou tohto postupu je fakt, že do pôdy sa nedostane žiadne rozpúš ťadlo.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
Ak sa použije prírodná pôda, testovanú chemikáliu možno prida ť oboha­
tením časti pôdy vysušenej vzduchom, ako je opísané v prípade umelej 
pôdy, alebo zamiešaním testovanej chemikálie do mokrej pôdy, pri čom 
ďalším krokom bude odparenie v prípade, že sa použilo činidlo zvyšujúce 
rozpustnos ť. Vo všeobecnosti treba v čo najväčšej možnej miere zabráni ť 
kontaktu mokrej pôdy s rozpúš ťadlami. Je možné uvažova ť o nasledujúcich 
možnostiach (3): 
— ak sa použije iné rozpúš ťadlo ako voda, malo by by ť miešateľné 
s vodou a/alebo by malo by ť možné ho odstráni ť (napríklad odparením), 
v dôsledku čoho by v pôde zostala iba testovaná chemikália, 
— ak sa použije kontrola rozpúš ťadla, negatívna kontrola nie je nutná. 
Kontrola rozpúš ťadla by mala obsahova ť najvyššiu koncentráciu 
rozpúšťadla pridaného do pôdy a malo by sa pri nej použi ť rozpúšťadlo 
z tej istej dávky, aká bola použitá na prípravu zásobného roztoku. Toxi ­
cita a prchavos ť rozpúšťadla a rozpustnos ť testovanej chemikálie vo 
vybratom rozpúš ťadle by mali by ť hlavnými kritériami pri výbere vhod ­
ného činidla zvyšujúceho rozpustnos ť. 
24. V prípade chemikálií, ktoré sú slabo rozpustné vo vode a v organických 
rozpúšťadlách, možno na dosiahnutie želanej testovacej koncentrácie 
zmiešať 2,0 – 2,5 g jemného kremenného piesku na testovaciu nádobu 
s určitým množstvom testovanej chemikálie, napr. pomocou trecej misky 
a paličky. Táto zmes kremenného piesku a testovanej chemikálie sa pridá 
do predvlh čenej pôdy a dôkladne sa zmieša s primeraným množstvom 
deionizovanej vody, aby sa získal požadovaný obsah vlhkosti. Kone čná 
zmes sa rozdelí do testovacích nádob. Postup sa opakuje pri každej testo ­
vacej koncentrácii a pripraví sa aj vhodná kontrola s 2,0 – 2,5 g jemne 
zomletého kremenného piesku na testovaciu nádobu. 
25. Koncentrácia testovanej chemikálie v pôde sa stanoví po obohatení. Pred 
zavedením testovacích organizmov je potrebné overi ť homogénnu distri ­
búciu testovanej chemikálie do pôdy. Metóda použitá na obohatenie 
a dôvody pre výber konkrétneho postupu obohacovania sa uvedú do správy (24). 
26. Rovnováha medzi pôdnou fázou a fázou pórovej vody by sa pod ľa možnosti 
mala stanovi ť ešte pred pridaním organizmov. Odporú ča sa použi ť obdobie 
štyroch dní pri teplote 20 °C. V prípade mnohých organických chemikálií 
slabo rozpustných vo vode sa čas potrebný na dosiahnutie skuto čnej rovno ­
váhy medzi adsorbovanými a rozpustenými časťami môže po čítať na dni 
alebo mesiace. V závislosti od ú čelu štúdie, napríklad ak sa napodob ňujú 
podmienky životného prostredia, sa obohatená pôda môže necha ť „zrieť“ 
dlhšie, napr. v prípade kovov po čas troch týžd ňov pri teplote 20 °C (22).
 
Kultivácia testovacích organizmov  
27. Červy sa pod ľa možnosti chovajú v stálej laboratórnej kultúre. Usmernenia 
o metódach laboratórnej kultivácie v prípade druhov  Eisenia fetida  a Eisenia 
andrei  a druhov čeľade Enchytraeidae  sú uvedené v dodatku 5 [pozri aj (48) 
(51) (52)]. 
28. Červy použité v testoch by nemali ma ť žiadne badate ľné choroby, abnor ­
mality a parazity.  
VYKONANIE TESTU 
29. Testovacie organizmy sú po čas fázy absorpcie vystavené pôsobeniu testo ­
vanej chemikálie. Fáza absorpcie by mala trva ť 14 dní ( Enchytraeidae ) 
alebo 21 dní (dáž ďovky), pokia ľ sa nepreukáže, že bol dosiahnutý rovno ­
vážny stav.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Vo fáze eliminácie sa červy prenesú do pôdy, ktorá neobsahuje testovanú 
chemikáliu. Prvá vzorka sa odoberie po 4 – 24 hodinách od za čiatku fázy 
eliminácie. Príklady harmonogramu odberov vzoriek v prípade 21-d ňovej 
fázy absorpcie a 21-d ňovej fázy eliminácie sú uvedené v dodatku 3.  
Testovacie organizmy  
31. V prípade mnohých druhov suchozemských červov čeľade Enchytraeidae  je 
individuálna hmotnos ť veľmi nízka (napr. 5 – 10 mg čerstvej hmotnosti na 
jedinca v prípade druhu  Enchytraeus albidus  a ešte menej v prípade druhu  
Enchytraeus crypticus  alebo  Enchytraeus luxuriosus ). Na vykonanie meraní 
hmotnosti a chemickú analýzu môže by ť potrebné zozbiera ť červy 
z paralelných testovacích nádob (t. j. na získanie jedného analytického výsledku z tkaniva sa použijú všetky červy z paralelnej nádoby). Do 
každého replikátu sa pridá 20 jedincov  Enchytraeidae , pričom sa použijú 
najmenej tri replikáty. Ak je analytický detek čný limit testovanej chemikálie 
vysoký, môže by ť potrebných viac červov. V prípade testovacích druhov 
s vyššou individuálnou hmotnos ťou (Eisenia fetida  a Eisenia andrei ) možno 
použiť paralelné nádoby obsahujúce jedného jedinca. 
32. Dážďovky použité v teste by mali ma ť podobnú hmotnos ť (napr. individu ­
álna hmotnos ť Eisenia fetida  a Eisenia andrei  by mala by ť v rozmedzí 250 
– 600 mg). Červy čeľade Enchytraeidae  (napr.  Enchytraeus albidus ) by mali 
mať dĺžku približne 1 cm. Všetky červy použité v konkrétnom teste by mali 
pochádza ť z rovnakého zdroja a malo by ís ť o dospelé zvieratá s klitelom 
(pozri dodatok 5). Ke ď
že hmotnos ť a vek zviera ťa môže ma ť vplyv na 
hodnoty BAF (napr. v dôsledku meniaceho sa obsahu lipidov a/alebo prítomnosti vají čok), tieto parametre je nutné presne zaznamena ť 
a zohľadniť pri interpretácii výsledkov. Okrem toho po čas obdobia expo ­
zície môže dôjs ť k nakladeniu kokónov, čo bude ma ť takisto vplyv na 
hodnoty BAF. Pred testom sa odporú ča odvážiť podvzorku testovacích 
červov na odhadnutie strednej čerstvej a suchej hmotnosti. 
33. Používa sa vysoký pomer pôdy k červom, aby sa minimalizovalo znižovanie 
koncentrácie testovanej chemikálie v pôde po čas fázy absorpcie. V prípade 
druhov  Eisenia fetida  a Eisenia andrei  je minimálne odporú čané množstvo 
50 g suchej hmotnosti (d.w.) pôdy na červa a v prípade červov čeľade 
Enchytraeidae  minimálne 10 – 20 g d.w. pôdy na testovaciu nádobu. 
Nádoby by mali obsahova ť vrstvu pôdy hrubú 2 – 3 cm ( Enchytraeidae ) 
alebo 4 – 5 cm (dáž ďovky). 
34. Červy použité v teste sa odoberú z kultúry (napr. červy Enchytraeidae  
pomocou pinzety). Dospelé zvieratá sa prenesú do neošetrenej testovacej pôdy, aby sa aklimatizovali, a k ŕmia sa (pozri odsek 36). Ak sa podmienky 
testovania líšia od podmienok kultivácie, fáza aklimatizácie v trvaní 24 – 72 
hodín by mala posta čovať, aby sa červy adaptovali na podmienky testova ­
nia. Po aklimatizácii sa dáž ďovky prepláchnu tak, že sa prenesú do sklene ­
ných misiek (napr. Petriho misiek) obsahujúcich čistú vodu a následne sa 
odvážia pred tým, ako sa vložia do testovacej pôdy. Pred vážením treba 
z červov odstráni ť nadbyto
čnú vodu jemným dotykom o hranu misky alebo 
opatrným osušením mierne navlh čenou papierovou vreckovkou. 
35. Zahrabávanie testovacích organizmov sa pozoruje a zaznamená. V testoch 
s dážďovkami sa zvieratá (kontrolné a ošetrené) zvy čajne zahrabú do pôdy 
za niekoľko hodín, čo treba najneskôr do 24 hodín po pridaní červov do 
testovacích nádob skontrolova ť. Ak sa dáž ďovky nezahrabú do pôdy (napr. 
viac ako 10 % v priebehu vyše polovice fázy absorpcie), znamená to bu ď, 
že podmienky testovania nie sú vhodné, alebo že testovacie organizmy nie  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
sú zdravé. V takom prípade je potrebné test pozastavi ť a zopakova ť. Červy 
Enchytraeidae  žijú najmä v intersticiálnych póroch pôdy a ich integument 
môže byť často v kontakte s okolitým substrátom iba čiastočne. Predpokladá 
sa, že expozícia zahrabávajúcich sa a nezahrabávajúcich sa červov  Enchy­
traeidae  je rovnaká a v prípade, že sa červy nezahrabú, nie je nevyhnutne 
potrebné test opakova ť. 
Kŕmenie  
36. Ak sa použije pôda s nízkym celkovým obsahom organického uhlíka, je 
potrebné naplánova ť kŕmenie. Ak sa použije umelá pôda, odporú čaná 
týždenná dávka krmiva (t. j. červy sa k ŕmia raz týždenne) je 7 mg sušeného 
hnoja na g suchej hmotnosti pôdy v prípade dáž ďoviek a 2 – 2,5 mg 
zomletých ovsených vlo čiek na g suchej hmotnosti pôdy v prípade červov  
Enchytraeidae  (11). Prvá dávka potravy sa zmieša s pôdou tesne pred 
pridaním testovacích organizmov. Pod ľa možnosti sa použije rovnaký 
druh potravy, aký sa použil v kultúrach (pozri dodatok 5).  
Svetlo a teplota  
37. Testy sa vykonávajú v kontrolovaných 16/8-hodinových cykloch svetla/tmy, 
podľa možnosti s intenzitou 400 – 800 lx v priestore testovacích nádob (3). 
Testovacia teplota by po čas celého testu mala by ť 20 ± 2 °C.  
Testovacie koncentrácie  
38. Použije sa jedna koncentrácia. Prípady, ke ď je potrebná ďalšia koncentrácia 
(koncentrácie), treba odôvodni ť. Ak sa toxicita (ECx) testovanej chemikálie 
blíži k analytickému detek čnému limitu, na testovanie sa odporú ča sa použi ť 
rádioozna čenú chemikáliu s vysokou špecifickou rádioaktivitou. V prípade 
kovov by koncentrácia mala by ť vyššia ako úrove ň pozadia v tkanive 
a pôde.  
Replikáty  
39. Na kinetické merania (fáza absorpcie a eliminácie) sa pri každom odbere 
vzorky použijú minimálne tri ošetrené paralelné nádoby. Celkový po čet 
pripravených replikátov by mal by ť dostatočný na pokrytie všetkých 
časov odberu vzoriek vo fáze absorpcie a eliminácie. 
40. Na ú čely biologických pozorovaní a meraní (napr. pomer suchej a čerstvej 
hmotnosti, obsahu lipidov) a na analýzu koncentrácií v pozadí pri červoch 
a v pôde musí by ť v prípade, že sa nepoužilo iné rozpúš ťadlo ako voda, 
k dispozícii najmenej 12 paralelných nádob negatívnej kontroly (zo štyroch sa vzorka odoberie na za čiatku, zo štyroch na konci fázy absorpcie a zo 
štyroch na konci fázy eliminácie). Ak sa pri aplikácii testovanej chemikálie 
použije činidlo zvyšujúce rozpustnos ť, okrem ošetrených replikátov treba 
vykonať kontrolu rozpúš ťadla (zo štyroch paralelných nádob sa vzorka 
odoberie na za čiatku, zo štyroch na konci fázy absorpcie a zo štyroch na 
konci fázy eliminácie) obsahujúcu všetky zložky okrem testovanej látky. 
V tomto prípade možno na nepovinný odber vzorky na konci fázy absorpcie 
použiť ďalšie štyri paralelné nádoby na negatívnu kontrolu (bez rozpúš ťad­
la). Tieto replikáty možno biologicky porovna ť s kontrolou rozpúš ťadla 
s cieľom získa ť informácie o možnom vplyve rozpúš ťadla na testovacie 
organizmy. Odporú ča sa založenie dostato čného počtu ďalších rezervných 
paralelných nádob (napr. osem) na aplikáciu látky a kontrolu.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frekvencia merania kvality pôdy  
41. Hodnota pH pôdy, obsah vlhkosti pôdy a teplota (nepretržitá) v testovacej 
miestnosti sa odmerajú na za čiatku a na konci fázy absorpcie a eliminácie. 
Raz týždenne sa obsah vlhkosti pôdy skontroluje odvážením testovacích 
nádob a porovnaním skuto čných hmotností s po čiatočnými hmotnos ťami 
na začiatku testu. Straty vody treba kompenzova ť pridávaním deionizovanej 
vody.  
Odber vzoriek a analýza červov a pôdy  
42. Príklad harmonogramu fázy absorpcie a fázy eliminácie v testoch bioaku ­
mulácie pri dáž ďovkách a  Enchytraeidae  je uvedený v dodatku 3. 
43. Vzorky pôdy sa z testovacích nádob na ú čely stanovenia koncentrácie testo ­
vanej chemikálie odoberú pred pridaním červov a po čas fázy absorpcie 
a fázy eliminácie. V priebehu testu sa stanovia koncentrácie testovanej 
chemikálie v červoch a v pôde. Vo všeobecnosti sa merajú celkové koncen ­
trácie pôdy. Nepovinne možno odmera ť koncentrácie v pórovej vode. 
V takom prípade je nutné pred za čiatkom štúdie uvies ť odôvodnenie 
a príslušné metódy a zahrnú ť ich do správy. 
44. Vzorky červov a pôdy sa po čas fázy absorpcie a fázy eliminácie odoberú 
najmenej šes ťkrát. Ak sa preukáže stabilita testovanej chemikálie, po čet 
analýz pôdy možno zníži ť. Odporú ča sa analyzova ť najmenej tri replikáty 
na začiatku a na konci fázy absorpcie. Ak sa koncentrácia v pôde nameraná 
na konci fázy absorpcie líši od po čiatočnej koncentrácie o viac ako 30 %, 
treba analyzova ť aj vzorky pôdy odobraté v iné dni. 
45. Červy z daného replikátu sa z pôdy pri každom čase odberu vzorky vyberú 
(napr. sa na plytkú misku rozotrie pôda z replikátu a červy sa povyberajú 
pomocou jemnej pinzety) a rýchlo sa prepláchnu vodou v plytkom pohári alebo oce ľovej miske. Nadbyto čná voda sa odstráni (pozri odsek 34). Červy 
sa opatrne prenesú do predváženej nádoby a okamžite sa odvážia vrátane 
obsahu tráviaceho traktu. 
46. V prípade dáž ďoviek (druh  Eisenia ) sa počká jednu noc na vyprázdnenie 
tráviaceho traktu červov, napr. sa umiestnia na vlhký filtra čný papier do 
prikrytej Petriho misky (pozri odsek 34). Po vyprázdnení sa stanoví hmot ­
nosť červov, aby sa posúdilo možné zníženie biomasy po
čas testu (pozri 
kritériá platnosti v odseku 17). Váženie a analýza tkaniva sa v prípade  
Enchytraeidae  vykonáva bez vyprázd ňovania, lebo je to vzh ľadom na 
malú veľkosť týchto červov technicky náro čné. Po stanovení kone čnej 
hmotnosti sa červy okamžite najvhodnejšou metódou usmrtia (napr. 
pomocou tekutého dusíka alebo zmrazením pri teplotách pod – 18 °C). 
47. Vo fáze eliminácie červy nahradia kontaminovaný obsah tráviaceho traktu 
čistou pôdou. To znamená, že merania pri nevyprázdnených červoch (v 
tomto kontexte  Enchytraeidae ), z ktorých sa vzorky odoberali tesne pred 
fázou eliminácie, obsahujú kontaminovanú pôdu v tráviacom trakte. Pri vodných máloštetinavcoch sa predpokladá, že po prvých 4 – 24 hodinách 
fázy eliminácie sa vä čšina kontaminovaného obsahu tráviaceho traktu 
nahradí čistým sedimentom, napr. (46). Podobné zistenia boli zaznamenané 
aj pri dáž ďovkách v štúdiách akumulácie rádioozna čeného kadmia a zinku 
(78). Pri nevyprázdnených  Enchytraeidae  možno koncentráciu tejto prvej 
vzorky fázy eliminácie považova ť za koncentráciu v tkanive po vyprázdnení 
tráviaceho traktu. Na zoh ľadnenie zriedenia koncentrácie testovanej látky 
nekontaminovanou pôdou po čas fázy eliminácie možno hmotnos ť obsahu 
tráviaceho traktu odhadnú ť na základe pomeru čerstvej hmotnosti 
a hmotnosti popola alebo pomeru suchej hmotnosti a hmotnosti popola pri 
červoch.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Vzorky pôdy a červov by sa pod ľa možnosti mali analyzova ť ihneď po 
odobratí (t. j. do jedného až dvoch dní), aby sa predišlo degradácii alebo 
iným stratám, pri čom sa odporú ča vypočítať približnú rýchlos ť absorpcie 
a rýchlos ť eliminácie v priebehu testu. Ak sa analýza odloží, vzorky by sa 
mali vhodnou metódou uskladni ť, napr. hlbokým zmrazením ( ≤ – 18 °C). 
49. Treba skontrolova ť, či presnos ť a reprodukovate ľnosť chemickej analýzy, 
ako aj vý ťažnosť testovanej chemikálie zo vzoriek pôdy a červov vyhovujú 
danej metóde. V správe sa uvedie extrak čná účinnosť, detekčný limit (LOD) 
a kvantifika čný limit (LOQ). Podobne treba skontrolova ť, či testovaná 
chemikália nie je prítomná v kontrolných nádobách vo vyšších koncentrá ­
ciách, ako je koncentrácia v pozadí. Ak je koncentrácia testovanej chemi ­
kálie v testovacom organizme Ca pri kontrolných červoch > 0, treba túto 
skutočnosť pri výpo čte kinetických parametrov zoh ľadniť (pozri dodatok 2). 
So všetkými vzorkami by sa po čas celého testu malo zaobchádza ť tak, aby 
sa minimalizovala kontaminácia a strata (napr. v dôsledku adsorpcie testo ­
vanej chemikálie na zariadenie na odber vzoriek). 
50. Pri práci s rádioozna čenými testovanými chemikáliami sa môže analyzova ť 
materská chemikália a metabolity. Kvantifikáciou materskej testovanej 
chemikálie a metabolitov v rovnovážnom stave alebo na konci fázy 
absorpcie sa získajú dôležité informácie. Vzorky by sa následne mali vy čis­
tiť, aby bolo možné kvantifikova ť materskú testovanú chemikáliu samo ­
statne. Ak v analyzovanej vzorke (vzorkách) samotné metabolity presahujú 
10 % celkovej rádioaktivity, odporú ča sa identifikova ť tieto metabolity. 
51. Celková vý ťažnosť a výťažnosť testovanej chemikálie v červoch, v pôde a, 
ak sa použijú, v zachytáva čoch obsahujúcich absorbenty na zadržanie odpa ­
renej testovanej chemikálie sa zaznamená a uvedie do správy. 
52. Spájanie vzoriek jedincov odobratých z danej testovacej nádoby je prípustné 
v prípade červov  Enchytraeidae , ktoré sú menšie ako dáž ďovky. Ak 
spájanie vzoriek vedie k zníženiu po čtu replikátov, štatistické postupy, 
ktoré možno použi ť pri spracúvaní údajov, budú obmedzenejšie. Ak sa 
vyžaduje špecifický štatistický postup a významnos ť, potom je potrebné 
do testu zahrnú ť primeraný po čet paralelných testovacích nádob, aby sa 
zabezpečilo želané spájanie vzoriek, postup a významnos ť. 
53. Odporú ča sa vyjadri ť BAF ako funkciu celkovej suchej hmotnosti a v 
prípade potreby (t. j. v prípade vysokohydrofóbnych chemikálií) aj ako funkciu obsahu lipidov. Na stanovenie obsahu lipidov sa použijú vhodné 
metódy (niektoré existujúce metódy – napr. (31) (58) – je potrebné na tento 
účel upravi ť). Tieto metódy využívajú extrakciu zmesou chloroformu 
a metanolu. S cie ľom predís ť použitiu chlórovaných rozpúš ťadiel by sa 
mala použi ť upravená metóda pod ľa Bligha a Dyera (9) uvedená 
v odkaze (17). Ke ďže rôznymi metódami sa nemusí dospie ť k identickým 
hodnotám, je dôležité uvies ť podrobné informácie o použitej metóde. Ak je 
to možné, t. j. ak je k dispozícii dostato čné množstvo tkaniva z červov, 
analýza lipidov by sa pod ľa možnosti mala vykona ť na rovnakej vzorke 
alebo extrakte, aké boli použité na analýzu testovanej chemikálie, lebo 
lipidy je často nutné z extraktu odstráni
ť, skôr než ich možno chromato ­
graficky analyzova ť (49). Prípadne možno použi ť kontrolné zvieratá na 
meranie obsahu lipidov, ktorý sa následne môže použi ť na normalizáciu 
hodnôt BAF. Pri druhom prístupe je kontaminácia zariadenia testovanou 
chemikáliou nižšia.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV  
Spracovanie výsledkov  
54. Krivka absorpcie testovanej chemikálie sa získa tak, že sa na aritmetické osi 
zakreslí jej koncentrácia v/na červoch po čas fázy absorpcie v závislosti od 
času. Ak krivka dosiahne rovnováhu alebo rovnovážny stav (pozri vyme ­
dzenie pojmov v dodatku 1), rovnovážny bioakumula čný faktor BAFss sa 
vypočíta podľa tohto vzorca:  
C a vrovnovážnom stave alebo na konci fázy absorpcie  ðstrednáÞ 
C s v rovnovážnom stave alebo na konci fázy absorpcie  ðstrednáÞ 
C a je koncentrácia testovanej chemikálie v testovacom organizme, 
C s je koncentrácia testovanej chemikálie v pôde. 
55. Ak sa nedosiahne rovnovážny stav, namiesto BAFss sa na základe konštánt 
rýchlosti ur čí BAFK týmto spôsobom: 
— určí sa akumula čný faktor (BAF  K ) ako pomer k  s /k e , 
— rýchlosti absorpcie a eliminácie sa pod ľa možnosti vypo čítajú súbežne 
(pozri rovnicu 11 v dodatku 2), 
— konštanta rýchlosti eliminácie (k  e ) sa zvy čajne stanoví pod ľa krivky 
eliminácie (t. j. znázornenia koncentrácie testovanej látky v červoch 
počas fázy eliminácie). Konštanta rýchlosti absorpcie k  s sa potom vypo ­ 
číta podľa k e a hodnoty C  a , ktorá je odvodená z krivky absorpcie (opis 
týchto metód je uvedený v dodatku 2). Prednostným spôsobom stano ­
vovania BAF  K a oboch rýchlostných konštánt k  s a k  e sú nelineárne 
metódy odhadovania parametrov pomocou po čítača. Ak je zrejmé, že 
eliminácia nie je prvého rádu, potom je potrebné použi ť komplexnejšie 
modely.  
Správa o teste  
56. Správa o teste musí obsahova ť tieto informácie:  
Testovaná chemikália:  
— všetky dostupné informácie o akútnej alebo dlhodobej toxicite (napr. 
EC x , LC  x , NOEC) testovanej chemikálie pre máloštetinavce žijúce 
v pôde, 
— čistota, fyzický charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti, napr. log K  ow , 
rozpustnos ť vo vode, 
— chemické identifika čné údaje; zdroj testovanej látky, identita 
a koncentrácia akéhoko ľvek použitého rozpúš ťadla, 
— ak sa použije rádioozna čená testovaná chemikália, presná poloha ozna ­ 
čených atómov, špecifická rádioaktivita a rádiochemická čistota.  
Testovacie druhy:  
— vedecký názov, kme ň, pôvod, všetky zásahy uskuto čnené pred pokusom, 
aklimatizácia, vek, rozsah hmotností at ď. ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Podmienky testovania:  
— použitý postup testovania, — typ a charakteristiky osvetlenia a d ĺžka svetlej fázy (svetlých fáz), 
— koncepcia testu (napr. po čet a veľkosť testovacích nádob, hmotnos ť 
pôdy a výška vrstvy pôdy, po čet replikátov, po čet červov v jednom 
replikáte, po čet testovacích koncentrácií, trvanie fázy absorpcie a fázy 
eliminácie, frekvencia odberov vzoriek), 
— odôvodnenie výberu materiálu testovacej nádoby, — metóda prípravy a aplikácie testovanej látky, ako aj dôvody pre výber 
špecifickej metódy, 
— nominálne testovacie koncentrácie, priemery hodnôt nameraných 
v testovacích nádobách a ich smerodajné odchýlky a spôsob, akým sa vypočítali, 
— zdroj zložiek umelej pôdy alebo – ak boli použité prírodné médiá – 
pôvod pôdy, opis všetkých zásahov uskuto čnených pred pokusom, 
výsledky kontrol (prežívanie, tvorba biomasy, reprodukcia), charakteris ­
tiky pôdy (pH, celkový obsah organického uhlíka, rozdelenie ve ľkosti 
častíc (percento piesku, siltu a hliny), WHC
 max , percentuálny obsah 
vody na za čiatku a na konci testu a akéko ľvek iné uskuto čnené mera ­
nia), 
— podrobné informácie o manipulácii so vzorkami pôdy a červov vrátane 
údajov o príprave, skladovaní, postupoch obohacovania, extrakcii 
a analytických postupoch (a presnosti) testovanej látky v červoch a v 
pôde, obsahu lipidov (ak sa meral) a vý ťažnosti testovanej látky.  
Výsledky:  
— mortalita kontrolných červov a červov v jednotlivých testovacích nádo ­
bách a akéko ľvek pozorované nezvy čajné správanie (napr. vyhýbanie sa 
pôde, chýbajúca reprodukcia v teste bioakumulácie pri  Enchytraeidae ), 
— pomer suchej hmotnosti k čerstvej hmotnosti pôdy a testovacích orga ­
nizmov (užito čné na účely normalizácie), 
— čerstvé hmotnosti červov v každom čase odberu vzorky; v prípade 
dážďoviek, čerstvé hmotnosti na za čiatku testu a v každom čase odberu 
vzorky pred a po vyprázdnení tráviaceho traktu, 
— obsah lipidov v testovacích organizmoch (ak bol stanovený), — krivky znázor ňujúce absorp čnú a elimina čnú kinetiku testovanej chemi ­
kálie pri červoch a v čase rovnovážneho stavu, 
— C
 a a C  s (so smerodajnou odchýlkou a rozsahom, ak je to vhodné) pre 
všetky časy odberov vzoriek (C  a vyjadrené v g kg  –1 čerstvej a suchej 
hmotnosti celého tela, C  s vyjadrená v g kg  –1 čerstvej a suchej hmotnosti 
pôdy). Ak sa požaduje akumula čný faktor bioty k pôde (BSAF) (napr. 
na porovnanie výsledkov z dvoch alebo viacerých testov vykonaných so 
zvieratami s odlišným obsahom lipidov), C  a možno dodato čne vyjadri ť 
ako g kg  –1 obsahu lipidov v organizme a C  s možno vyjadri ť ako g kg  –1 
organického uhlíka (OC) v pôde, 
— BAF (vyjadrený v kg pôdy ·kg –1 červov), konštanta rýchlosti absorpcie 
pôdy k  s (vyjadrená v g pôdy kg  –1 červov deň –1 ) a konštanta rýchlosti 
eliminácie k  e (vyjadrená v de ň –1 ), BSAF (vyjadrený v kg pôdy OC kg  –1 
obsahu lipidov pri červoch) možno do správy uvies ť dodatočne, ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— ak sa merajú: percentá materskej chemikálie, metabolitov a viazaných 
rezíduí (t. j. percento testovanej chemikálie, ktoré nemožno extrahova ť 
pomocou bežných metód extrakcie) zistené v pôde a testovacích zviera ­
tách, 
— metódy použité na štatistické analýzy údajov.  
Hodnotenie výsledkov:  
— súlad výsledkov s kritériami platnosti uvedenými v odseku 17, — neočakávané alebo nezvy čajné výsledky, napr. neúplná eliminácia testo ­
vanej chemikálie z testovacích zvierat.
 
LITERATÚRA  
1. Amorim, M. (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Diplomová práca, Univerzita Coimbra. 
2. ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688-00a. 
3. ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Internatio ­
nal, E1676-04: 26 s. 
4. Beek, B., Boehling, S., Bruckmann, U., Franke, C., Joehncke, U., Studinger, 
G. (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin 
Heidelberg: 235 – 276. 
5. Belfroid, A., Sikkenk, M., Seinen, W., Van Gestel, C., Hermens, J. (1994). 
The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia 
andrei ): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93 – 99. 
6. Belfroid, A., Van Wezel, A., Sikkenk, M., Van Gestel, C., Seinen, W., 
a Hermens, J. (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154 – 165. 
7. Belfroid, A., Meiling, J., Drenth, H., Hermens, J., Seinen, W., Van Gestel, 
C. (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185 – 191. 
8. Bell, A. W. (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1 – 13. 
9. Bligh, E. G., a Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction 
and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911 – 917. 
10. Bouche, M. (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paríž, 671 s 
11. Bruns, E., Egeler, Ph., Moser, T., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental 
Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416. 
12. Bruns, E., Egeler, Ph., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001b). 
Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  
Enchytraeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligo ­
chaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185 – 196. 
13. Conder, J. M., a Lanno, R. P. (2003). Lethal critical body residues as 
measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  
Eisenia fetida.  J. Soils Sediments 3: 13 – 20.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
14. Connell, D. W., a Markwell, R. D. (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91 – 100. 
15. Didden, W. A. M. (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobio ­
logia 37: 2 – 29. 
16. Didden, W. (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., Holandsko, s. 555 – 576. 
17. De Boer, J., Smedes, F., Wells, D., Allan, A. (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme. 
18. Dietrich, D. R., Schmid, P., Zweifel, U., Schlatter, C., Jenni-Eiermann, S., 
Bachmann, H., Bühler, U., Zbinden, N. (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 29: 140 – 145. 
19. Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 
z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní 
chemických látok (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, 
o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice 
Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES 
a 2000/21/ES (Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1). 
20. Edwards, C. A., a Bohlen, P. J. (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Tretie vydanie, Chapman & Hall, Londýn, 426 s 
21. Kapitola C.51 tejto prílohy, Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch 
žijúcich v sedimente. 
22. Egeler, Ph., Gilberg, D., Scheffczyk, A., Moser, Th., a Römbke, J. (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by 
an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), 
R&D No.: 204 67 458: 149 s Dostupné na prevzatie na: http:// 
www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf. 
23. Elmegaard, N., a Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 s. 
24. Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. 
25. EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195 – 208. 
26. Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905. 
27. Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., 
Cohors-Fresenborg, D., Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumu ­
lation. Chemosphere 29: 1501 – 1514. 
28. Füll, C. (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbrici ­
dae). Dizerta čná práca, Univerzita Mainz, 156 s.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
29. Füll, C., Schulte, C., Kula, C. (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 
15: 78 – 84. 
30. Gabric, A. J., Connell, D. W., Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for 
bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225 – 1231. 
31. Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., Parrish, C. C. (1985). Micro ­
methods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 
30: 1099 – 1105. 
32. Hawker, D. W., a Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701 – 707. 
33. Hund-Rinke, K., a Wiechering, H. (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15 – 20. 
34. Hund-Rinke, K., Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. V: Toxiko ­
logische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59 – 81. 
35. ISO 11268-2 (1998) Kvalita pôdy – ú činky zne čisťujúcich látok na 
dážďovky ( Eisenia fetida ). Časť 2: Stanovenie ú činkov na reprodukciu. 
36. Jaenike, J. (1982). „ Eisenia foetida “ is two biological species. Megadrilogica 
4: 6 – 8. 
37. Jager, T. (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080 – 2090. 
38. Jager, T., Sanchez, P. A., Muijs, B., van der Welde, E., Posthuma, L. (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953 – 961. 
39. Jager, T., Baerselman, R., Dijkman, E., De Groot, A. C., Hogendoorn, E. A., 
DeJong, A., Kruitbosch, J. A. W., Peijnenburg, W. J. G. M. (2003a). Avai ­
lability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , 
Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. 
Toxicol. Chem. 22: 767 – 775. 
40. Jager, T., Fleuren, R. L. J., Hoogendoorn, E., de Korte, G. (2003b). Eluci ­
dating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  
Eisenia andrei  (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399 – 3404. 
41. Janssen, M. P. M., Bruins, A., De Vries, T. H., Van Straalen, N. M. (1991). 
Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Envi ­
ron. Contam. Toxicol. 20: 305 – 312. 
42. Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217 – 232. 
43. Khalil, A. M. (1990). Aufnahme und Metabolismus von
 14 C-Hexachlor ­
benzol und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dizerta čná práca, 
Univerzita Mníchov, 137 s. 
44. Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588 – 595. 
45. Marinussen, M. P. J. C., Van der Zee, S. E. A. T. M., De Haan, F. A. M. 
(1997). Cu accumulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions 
compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17 – 26. 
46. Mount, D. R., Dawson, T. D., Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut 
purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment 
with Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244 – 1249.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
47. Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumula ­
tion in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlín 1990, VCH, Weinheim. 
48. Kapitola C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dáž ďovky. 
49. Kapitola C.13 tejto prílohy, Biokoncentrácia: prietokový rybí test. 50. Kapitola C.21 tejto prílohy, Pôdne mikroorganizmy: test dusíkovej premeny. 
51. Kapitola C.35 tejto prílohy, Test reprodukcie pri  Enchytraeidae . 
52. Kapitola C.36 tejto prílohy, Test reprodukcie pri dáž ďovkách 
53. Kapitola C.51 tejto prílohy: Bioakumulácia pri bentických máloštetinavcoch 
žijúcich v sedimente. 
54. Petersen, H., a Luxton, M. (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287 – 388. 
55. Phillips, D. J. H. (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378 – 396. 
56. Pflugmacher, J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- 
Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77 – 81. 
57. Posthuma, L., Weltje, L., Anton-Sanchez, F. A. (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven. 
58. Randall, R. C., Lee, II H., Ozretich, R. J., Lake, J. L., Pruell, R. J. (1991). 
Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumula ­
tion. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431 – 1436. 
59. Römbke, J., Egele, P., Füll, C. (1998). Literaturstudie über Bioakkumulati ­
onstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 s 
60. Römbke, J., a Moser, Th. (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 s 
61. Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen, 
In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105 – 129. 
62. Romijn, C. A. F. M., Luttik, R., Van De Meent, D., Slooff, W.,Canton, J. H. 
(1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107 – 127. 
63. Sample, B. E., Suter, D. W., Beauchamp, J. J., Efroymson, R. A. (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110 – 2120. 
64. Schlosser, H.-J., a Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413 – 433. 
65. Schmelz, R., a Collado, R. (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93 – 100.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
66. Sims, R. W., a Gerard, B. M. (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 
171 S. Londýn: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. 
67. Sousa, J. P., Loureiro, S., Pieper, S., Frost, M., Kratz, W., Nogueira, A. J. 
A., Soares, A. M. V. M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 
2557 – 2563. 
68. Spacie, A., a Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309 – 320. 
69. Stephenson, G. L., Kaushik, A., Kaushik, N. K., Solomon, K. R., Steele, T., 
Scroggins, R. P. (1998). Use of an avoidance-response test to assess the 
toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm 
ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67 – 81. 
70. Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M., Van 
Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein 
binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  
Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167 – 1171. 
71. UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlín. 
72. US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Druhé vyda ­
nie, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. 
73. Van Brummelen, T. C., a Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimina ­
tion of benzoa)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Envi ­
ron. Contam. Toxicol. 31: 277 – 285. 
74. Van Gestel, C. A. M. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H., Edwards, P. J., Greig-Smith, P. W., a Heimbach, F.). 
Intercept Press, Andover (GB). 
75. Van Gestel, C. A., a Ma, W.-C. (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023 – 1033. 
76. Van Straalen, N. M., Donker, M. H., Vijver, M. G., van Gestel, C. A. M. 
(2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil 
invertebrates. Environmental Pollution 136: 409 – 417. 
77. Venter, J. M., a Reinecke, A. J. (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161 – 165. 
78. Vijver, M. G., Vink, J. P. M., Jager, T., Wolterbeek, H. T., van Straalen, N. 
M., van Gestel, C. A. M. (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of 
Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated 
floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843 – 1851. 
79. Widianarko, B., a Van Straalen, N. M. (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 
15: 402 – 406.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Dodatok 1  
VYMEDZENIE POJMOV  
Bioakumulácia  je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na 
organizme vzh ľadom na koncentráciu testovanej chemikálie v okolitom médiu. 
Bioakumulácia je dôsledkom procesov biokoncentrácie a biomagnifikácie (pozri ďalej).  
Biokoncentrácia  je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na 
organizme, ktoré je dôsledkom absorpcie chemikálie výlu čne z okolitého média 
(t. j. prostredníctvom povrchu tela a požitej pôdy), vzh ľadom na koncentráciu 
testovanej chemikálie v okolitom médiu.  
Biomagnifikácia  je zvyšovanie koncentrácie testovanej chemikálie v alebo na 
organizme, ktoré je dôsledkom hlavne absorpcie z kontaminovanej potravy alebo 
koristi, vzh ľadom na koncentráciu testovanej chemikálie v potrave alebo koristi. 
Biomagnifikácia môže vies ť k prenosu alebo akumulácii testovanej látky v rámci 
potravinového re ťazca.  
Eliminácia  testovanej chemikálie je strata tejto chemikálie z tkaniva testovacieho 
organizmu aktívnymi alebo pasívnymi procesmi, ku ktorým dochádza bez oh ľadu 
na prítomnos ť alebo neprítomnos ť testovanej látky v okolitom médiu.  
Bioakumula čný faktor  (BAF) v akomko ľvek čase počas fázy absorpcie tohto 
testu bioakumulácie je koncentrácia testovanej chemikálie v/na testovacom orga ­
nizme (C
 a v g·kg –1 suchej hmotnosti červov) vydelená koncentráciou chemikálie 
v okolitom médiu (C  s ako g·kg –1 suchej hmotnosti pôdy); jednotkou BAF je kg 
pôdy·kg –1 červov.  
Rovnovážny bioakumula čný faktor  (BAF  ss ) je BAF v rovnovážnom stave a v 
priebehu dlhšieho obdobia sa výrazne nemení, pri čom koncentrácia testovanej 
chemikálie v okolitom médiu (C  s ako g kg  –1 suchej hmotnosti pôdy) je po čas 
tohto obdobia konštantná.  
Bioakumula čné faktory  vypočítané priamo na základe pomeru konštanty 
rýchlosti absorpcie pôdy a konštanty rýchlosti eliminácie (k  s a k e , pozri ďalej) 
sa označujú ako kinetický bioakumula čný faktor (BAF  K ). 
Akumula čný faktor bioty k pôde  (BSAF) je koncentrácia testovanej chemikálie 
v/na testovacom organizme normalizovaná na lipidy vydelená koncentráciou testovanej chemikálie v pôde v rovnovážnom stave normalizovanou na organický 
uhlík. C
 a je potom vyjadrená ako g ·kg –1 obsahu lipidov v organizme a C  s ako 
g·kg –1 organického obsahu pôdy; jednotkou BSAF je kg OC ·kg –1 lipidov.  
Rovnováha  alebo  rovnovážny stav  sa vymedzuje ako rovnováha medzi 
procesmi absorpcie a eliminácie, ku ktorým dochádza sú časne počas fázy expo ­
zície. Rovnovážny stav nastáva pri grafickom znázornení závislosti BAF od času 
vtedy, ke ď sa priebeh krivky stáva paralelný s časovou osou a tri po sebe idúce 
analýzy BAF uskuto čnené na vzorkách odobratých minimálne v dvojd ňových 
intervaloch sa od seba neodlišujú o viac ako 20 % a ak medzi týmito tromi obdobiami odberu vzoriek neexistujú štatisticky významné rozdiely. V prípade 
testovaných chemikálie, ktoré sa vstrebávajú pomalšie, sú vhodnejšie intervaly 
v trvaní sedem dní (49).  
Rozdeľovací koeficient organický uhlík – voda  (K
 oc ) je pomer koncentrácie 
chemikálie v/na zlomku pôdy tvorenom organickým uhlíkom a koncentrácie chemikálie vo vode v rovnováhe.  
Rozdeľovací koeficient oktanol – voda  (K
 ow ) je pomer rozpustnosti chemikálie 
v n-oktanole a vo vode v rovnováhe, niekedy vyjadrený aj ako P  ow . Dekadický 
logaritmus K  ow (log K  ow ) sa používa na vyjadrenie potenciálu chemikálie na 
bioakumuláciu vo vodných živo číchoch.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Fáza absorpcie alebo expozície  je čas, počas ktorého sú testovacie organizmy 
vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie.  
Konštanta rýchlosti absorpcie pôdy  (k  s ) je číselná hodnota vyjadrujúca 
rýchlosť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na testovacom organizme 
v dôsledku absorpcie z pôdnej fázy; k  s je vyjadrená v g pôdy kg  –1 červov d  –1 . 
Fáza eliminácie  je čas nasledujúci po prenose testovacích organizmov 
z kontaminovaného média do média bez obsahu testovanej látky, po čas ktorého 
sa skúma eliminácia (alebo čistá strata) chemikálie z testovacích organizmov.  
Konštanta rýchlosti eliminácie  (k e ) je číselná hodnota vyjadrujúca rýchlos ť 
znižovania koncentrácie testovanej látky v/na testovacom organizme po prenose testovacích organizmov z média obsahujúceho testovanú látku do média bez 
obsahu testovanej látky; k
 e je vyjadrená v d  –1 . 
Testovaná chemikália:  akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto 
testovacej metódy.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Dodatok 2  
Výpočet parametrov absorpcie a eliminácie  
Hlavným parametrom testu bioakumulácie je bioakumula čný faktor, BAF. 
Meraný BAF možno vypo čítať tak, že koncentrácia v testovacom organizme, 
C a , sa vydelí koncentráciou v pôde, C  s , v rovnovážnom stave. Ak sa po čas 
fázy absorpcie nedosiahne rovnovážny stav, BAF  K sa vypočíta z konštánt 
rýchlosti, nie z BAFss. Treba však uvies ť, či je BAF založený na koncentráciách 
v rovnovážnom stave alebo nie. 
Zvyčajným prostriedkom stanovovania kinetického bioakumula čného faktora 
(BAF  K ), konštanty rýchlosti absorpcie pôdy (k  s ) a konštanty rýchlosti eliminácie 
(k e ) je použitie nelineárnych metód odhadovania parametrov na po čítači, napr. na 
základe modelov opísaných v odkaze (68). Vzh ľadom na súbor sekven čných 
údajov o koncentrácii v závislosti od času a modelové rovnice: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnica 1] 
alebo 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [rovnica 2] 
kde 
C a = koncentrácia chemikálie v červoch [g kg  –1 čerstvej alebo suchej hmotnos ­
ti], 
k s = konštanta rýchlosti absorpcie v tkanivách [g pôdy kg  –1 červov d  –1 ], 
C s = koncentrácia chemikálie v pôde [g kg  –1 čerstvej alebo suchej hmotnosti], 
k e = konštanta rýchlosti eliminácie [d  –1 ], 
t c = čas na konci fázy absorpcie, 
tieto počítačové programy po čítajú hodnoty BAF  K , k s a k e . 
Ak sa koncentrácia v pozadí pri neexponovaných červoch, napr. v de ň 0, výrazne 
líši od nuly (to môže nasta ť napr. v prípade kovov), daná koncentrácia v pozadí 
(C a,0 ) by sa mala zahrnú ť do týchto rovníc, ktoré budú ma ť takúto podobu: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnica 3] 
a 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [rovnica 4] 
V prípadoch, ke ď je pozorovaný výrazný priebežný pokles koncentrácie testo ­
vacej chemikálie v pôde po čas fázy absorpcie, možno použi ť tieto modely, napr. 
(67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [rovnica 5]  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
kde 
C s = koncentrácia chemikálie v pôde [g kg  –1 čerstvej alebo suchej hmotnosti], 
k 0 = konštanta rýchlosti degradácie v pôde [d  –1 ], 
C 0 = počiatočná koncentrácia chemikálie v pôde [g kg  –1 čerstvej alebo suchej 
hmotnosti], 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnica 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [rovnica 7] 
kde 
C a = koncentrácia chemikálie v červoch [g kg  –1 čerstvej alebo suchej hmotnos ­
ti], 
k s = konštanta rýchlosti absorpcie v tkanivách [g pôdy kg  –1 červov d  –1 ], 
k 0 = konštanta rýchlosti degradácie v pôde [d  –1 ], 
k e = konštanta rýchlosti eliminácie [d  –1 ], 
t c = čas na konci fázy absorpcie. 
Ak sa po čas fázy absorpcie dosiahne rovnovážny stav (t. j. t = ∞), rovnicu 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnica 1] 
možno zredukova ť na: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
alebo 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [rovnica 8] 
Potom k  s /k e x C  s je prístup ku koncentrácii testovanej látky v tkanivách červov 
v rovnovážnom stave (C  a,ss ). 
Akumulačný faktor bioty k pôde (BSAF) možno vypo čítať takto: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [rovnica 9] 
kde f  oc je frakcia pôdneho organického uhlíka a f  lip je frakcia lipidov z červov, 
podľa možnosti obe stanovené zo vzoriek odobratých po čas testu a na základe 
suchej hmotnosti alebo čerstvej hmotnosti. 
Kinetiku eliminácie možno modelova ť na základe údajov z fázy eliminácie a s 
využitím tejto modelovej rovnice a po čítačovej metódy odhadovania nelineárnych 
parametrov. Ak dátové body zakreslené v závislosti od času poukazujú na 
konštantný exponenciálny pokles koncentrácie testovanej látky pri zvieratách, na opísanie časového priebehu eliminácie možno použi ť jednokompartmentový 
model (rovnica 9). 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [rovnica 10]  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Procesy eliminácie sa niekedy javia ako dvojfázové, pri čom počas počiatočných 
fáz vykazujú rýchly pokles C  a , ktorý prechádza v pomalšiu stratu testovaných 
látok v neskorších fázach eliminácie, napr. (27) (68). Dve fázy možno interpre ­
tovať s využitím predpokladu, že v organizme, z ktorého sa testovaná látka stráca 
rôznymi rýchlos ťami, existujú dva rôzne kompartmenty. V týchto prípadoch je 
potrebné si preštudova ť konkrétnu literatúru, napr. (38) (39) (40) (78). 
Pomocou uvedených modelových rovníc možno kinetické parametre (k  s a k  e ) 
vypočítať aj v jednom kole použitím modelu kinetiky prvého rádu na všetky 
údaje z fázy absorpcie aj eliminácie sú časne. Opis metódy, ktorá umož ňuje 
takýto kombinovaný výpo čet konštánt rýchlostí absorpcie a eliminácie, možno 
nájsť v odkazoch 41, 73 a 70. 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[rovnica 11]  
Poznámka:  Ak sa parametre absorpcie a eliminácie odhadujú sú časne 
z kombinovaných údajov o absorpcii a eliminácii, premenná „m“ uvedená v rovnici 11 je deskriptor, ktorý umož ňuje počítačovému 
programu priradi ť podpojmy rovnice k súborom údajov z príslušnej 
fázy a vykona ť správne hodnotenie (m = 1 pre fázu absorpcie; m = 2 
pre fázu eliminácie). 
Tieto modelové rovnice by sa však mali používa ť opatrne, najmä ak po čas testu 
dôjde k zmenám v biodostupnosti alebo (bio)degradácie testovanej chemikálie [pozri napr. (79)].
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Dodatok 3  
PRÍKLADY HARMONOGRAMOV TESTOV BIOAKUMULÁCIE V PÔDE  
Test s dáž ďovkami  
a) Fáza absorpcie s použitím ôsmich dní odberu vzoriek na výpo čet kinetiky  
Deň Činnosť 
– 6 aklimatizácia pripravenej pôdy po čas 48 h; 
– 4 obohatenie pôdnej frakcie s roztokom testovanej chemikálie; 
odparenie akéhoko ľvek rozpúš ťadla; miešanie pôdnych zložiek; 
rozdelenie pôdy do testovacích nádob; vyvažovanie v testovacích podmienkach po čas štyroch dní (troch týžd ňov v prípade pôdy 
obohatenej kovmi); 
– 3 až – 1 separácia testovacích organizmov z kultúry na aklimatizáciu; 
príprava a zvlh čovanie pôdnych zložiek; 
0 meranie teploty a pH pôdy; odstránenie pôdnych vzoriek 
z ošetrených nádob a kontrol rozpúš ťadla na stanovenie koncen ­
trácie testovanej chemikálie; pridanie prídelu potravy; váženie 
a náhodné rozdelenie červov do testovacích nádob; zachovanie 
dostatočných podvzoriek červov na stanovenie analytických 
hodnôt pozadia, čerstvej a suchej hmotnosti a obsahu lipidov; 
váženie všetkých testovacích nádob na kontrolu vlhkosti pôdy; 
kontrola prívodu vzduchu, ak sa používa uzavretý testovací systém; 
1 kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov 
a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncen ­
trácie testovanej látky; 
2 rovnako ako de ň 1; 
3 kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty; 
4 rovnako ako de ň 1; 
5 – 6 rovnako ako de ň 3; 
7 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou 
odparenej vody; 
8 – 9 rovnako ako de ň 3; 
10 rovnako ako de ň 1; 
11 – 13 rovnako ako de ň 3; 
14 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody; 
15 – 16 rovnako ako de ň 3; 
17 rovnako ako de ň 1; 
18 – 20 rovnako ako de ň 3;
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Deň Činnosť 
21 rovnako ako de ň 1; meranie teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; koniec fázy 
absorpcie; prenos červov zo zvyšných exponovaných replikátov 
do nádob obsahujúcich čistú pôdu pre fázu eliminácie (bez 
vyprázdnenia tráviaceho traktu); odber vzoriek pôdy a červov 
z kontrol rozpúš ťadla. 
Činnosti pred expozíciou (fáza vyvažovania) by sa mali naplá ­
novať tak, aby boli zoh ľadnené vlastnosti testovanej chemikálie. 
Činnosti opísané pre de ň 3 by sa mali vykonáva ť denne (aspo ň 
cez pracovné dni). 
b) Fáza eliminácie  
Deň Činnosť 
– 6 príprava a zvlh čovanie pôdnych zložiek; aklimatizácia pripra ­
venej pôdy po čas 48 h; 
– 4 miešanie pôdnych zložiek; rozdelenie pôdy do testovacích nádob; 
inkubácia v testovacích podmienkach po čas štyroch dní; 
0 (koniec fázy 
absorpcie) meranie teploty a pH pôdy; váženie a náhodné rozdelenie červov 
do testovacích nádob; pridanie prídelu potravy; prenos červov zo 
zvyšných exponovaných replikátov do nádob obsahujúcich čistú 
pôdu; odber vzoriek pôdy a červov po 4 – 6 h na stanovenie 
koncentrácie testovanej chemikálie; 
1 kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov 
a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncen ­
trácie testovanej chemikálie; 
2 rovnako ako de ň 1; 
3 kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty; 
4 rovnako ako de ň 1; 
5 – 6 rovnako ako de ň 3; 
7 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou odparenej vody; 
8 – 9 rovnako ako de ň 3; 
10 rovnako ako de ň 1; 
11 – 13 rovnako ako de ň 3; 
14 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob a kompenzáciou 
odparenej vody; 
15 – 16 rovnako ako de ň 3; 
17 rovnako ako de ň 1;
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Deň Činnosť 
18 – 20 rovnako ako de ň 3; 
21 rovnako ako de ň 1; meranie teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti 
pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; odber vzoriek 
pôdy a červov z kontrol rozpúš ťadla. 
Príprava pôdy pred za čiatkom fázy eliminácie by mala by ť 
rovnaká ako pred fázou absorpcie. 
Činnosti opísané pre de ň 3 by sa mali vykonáva ť denne (aspo ň 
cez pracovné dni).  
Test s  Enchytraeidae  
a) Fáza absorpcie s použitím ôsmich dní odberu vzoriek na výpo čet kinetiky  
Deň Činnosť 
– 6 aklimatizácia pripravenej pôdy po čas 48 h; 
– 4 obohatenie pôdnej frakcie s roztokom testovanej chemikálie; 
odparenie akéhoko ľvek rozpúš ťadla; miešanie pôdnych zložiek; 
rozdelenie pôdy do testovacích nádob; vyvažovanie v testovacích podmienkach po čas štyroch dní (troch týžd ňov v prípade pôdy 
obohatenej kovmi); 
– 3 až – 1 separácia testovacích organizmov z kultúry na aklimatizáciu; 
príprava a zvlh čovanie pôdnych zložiek; 
0 meranie teploty a pH pôdy; odstránenie pôdnych vzoriek 
z ošetrených nádob a kontrol rozpúš ťadla na stanovenie koncen ­
trácie testovanej chemikálie; pridanie prídelu potravy do pôdy; váženie a náhodné rozdelenie červov do testovacích nádob; 
zachovanie dostato čných podvzoriek červov na stanovenie analy ­
tických hodnôt pozadia, čerstvej a suchej hmotnosti a obsahu 
lipidov; váženie všetkých testovacích nádob na kontrolu vlhkosti pôdy; kontrola prívodu vzduchu, ak sa používa uzavretý testovací 
systém; 
1 kontrola prívodu vzduchu, zaznamenanie správania červov 
a teploty; odber vzoriek pôdy a červov na stanovenie koncen ­
trácie testovanej látky; 
2 rovnako ako de ň 1; 
3 kontrola prívodu vzduchu, správania červov a teploty; 
4 rovnako ako de ň 1; 
5 – 6 rovnako ako de ň 3; 
7 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy do pôdy; kontrola 
vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob 
a kompenzáciou odparenej vody; 
9 rovnako ako de ň 1; 
10 rovnako ako de ň 3;
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Deň Činnosť 
11 rovnako ako de ň 1; 
12 – 13 rovnako ako de ň 3; 
14 rovnako ako de ň 1; pridanie prídelu potravy do pôdy; meranie 
teploty a pH pôdy; kontrola vlhkosti pôdy opätovným odvážením testovacích nádob; koniec fázy absorpcie; prenos červov zo zvyš ­
ných exponovaných replikátov do nádob obsahujúcich čistú pôdu 
pre fázu eliminácie (bez vyprázdnenia tráviaceho traktu); odber vzoriek pôdy a červov z kontrol rozpúš ťadla. 
Činnosti pred expozíciou (fáza vyvažovania) by sa mali naplá ­
novať tak, aby boli zoh ľadnené vlastnosti testovanej chemikálie. 
Činnosti opísané pre de ň 3 by sa mali vykonáva ť denne (aspo ň 
cez pracovné dni).
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Dodatok 4  
Umelá pôda – odporú čania týkajúce sa prípravy a skladovania  
Keďže prírodné pôdy z konkrétneho zdroja nemusia by ť k dispozícii po celý rok 
a autochtónne organizmy, ako aj prítomnos ť znečisťujúcich mikrolátok môže 
ovplyvniť test, v tomto teste sa odporú ča použiť umelý substrát, umelú pôdu 
podľa kapitoly C.8 tejto prílohy, Toxicita pre dáž ďovky (48). V takejto pôde 
môžu preži ť, rásť a rozmnožova ť sa viaceré testovacie druhy a je zabezpe čená 
maximálna štandardizácia, ako aj intra- a interlaboratórna porovnate ľnosť testo­
vacích a kultiva čných podmienok. 
Pôdne zložky 
Rašelina: 10 % Rašelinníková rašelina, pod ľa usmernenia 
OECD 207 (48) 
Kremenný piesok: 70 % Priemyselný kremenný piesok (vysušený 
vzduchom); ve ľkosť častíc: viac ako 50 % 
častíc by malo ma ť veľkosť v rozsahu 50 
– 200 μm, ale všetky častice by mali by ť 
≤ 2 mm 
Kaolín: 20 % Obsah kaolinitu ≥ 30 % 
Uhličitan vápenatý: ≤ 1 % CaCO  3 , rozomletý na prach, chemicky čistý 
Obsah organického uhlíka v umelej pôde možno prípadne zníži ť, napr. znížením 
obsahu rašeliny na 4 – 5 % suchej pôdy a zodpovedajúcim zvýšením obsahu 
piesku. V dôsledku takéhoto zníženia obsahu organického uhlíka sa môžu zníži ť 
možnosti adsorpcie testovanej chemikálie na pôde (organický uhlík) a dostupnos ť 
testovanej chemikálie pre červy sa môže zvýši ť (74). Preukázalo sa, že druhy  
Enchytraeus albidus  a Eisenia fetida  môžu splni ť kritéria platnosti týkajúce sa 
reprodukcie, ak sa testujú v po ľných pôdach s nižším obsahom organického 
uhlíka, napr. 2,7 % (33), 61, a na základe skúseností možno tento výsledok dosiahnuť aj v umelej pôde, ktorá obsahuje 5 % rašeliny.
 
Príprava  
Suché zložky pôdy sa dôkladne zmiešajú (napr. vo ve ľkokapacitnom labora ­
tórnom mieša či). Zložky sa zmiešajú približne týžde ň pred za čiatkom testu. 
Zmiešané suché pôdne zložky sa zvlh čia deionizovanou vodou najmenej 48 
hodín pred aplikáciou testovanej látky, aby sa vyvážila/stabilizovala kyslos ť. 
Na stanovenie pH zmesi pôdy sa používa roztok 1 M KCl v pomere 1: 5. Ak 
hodnota pH nie je v požadovanom rozmedzí (6,0 ± 0,5), do pôdy sa pridá 
dostatočné množstvo CaCO  3 alebo sa pripraví nová várka pôdy. 
Maximálna reten čná kapacita vody (WHC) umelej pôdy sa ur čí podľa ISO 
11268-2 (35). Najmenej dva dni pred za čiatkom testu sa suchá umelá pôda zvlh čí 
pridaním dostato čného množstva deionizovanej alebo rekonštituovanej vody, aby 
sa získala približne polovica kone čného obsahu vody. Kone čný obsah vody by 
mal predstavova ť 40 – 60 % maximálnej WHC. Na za čiatku testu sa predvlh čená 
pôda rozdelí na to ľko várok, ko ľko je testovacích koncentrácií a kontrol použi ­
tých v teste, a obsah vlhkosti sa pomocou roztoku testovanej látky a/alebo 
pridaním deionizovanej alebo rekonštituovanej vody upraví na 40 – 60 % WHC
 max . Obsah vlhkosti sa stanoví na za čiatku a na konci testu (pri teplote 
105 °C). Mal by optimálne zodpoveda ť požiadavkám jednotlivých druhov (obsah 
vlhkosti možno skontrolova ť aj takto: ke ď sa pôda jemne stla čí v ruke, medzi 
prstami by sa mali objavi ť malé kvapky vody).  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Skladovanie  
Suché zložky umelej pôdy možno až do použitia skladova ť pri izbovej teplote. 
Pripravená predvlh čená pôda sa pred obohatením môže skladova ť na chladnom 
mieste po čas až troch dní. Je potrebné dba ť na to, aby sa minimalizovalo odpa ­
rovanie vody. Pôda obohatená o testovanú látku by sa mala ihne ď použiť, pokiaľ 
nie sú k dispozícii informácie, pod ľa ktorých možno konkrétnu pôdu skladova ť 
bez toho, aby to malo vplyv na toxicitu a biodostupnos ť testovanej látky. Vzorky 
obohatenej pôdy sa môžu do analýzy uskladni ť v podmienkach odporú čaných pre 
konkrétnu testovanú látku.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Dodatok 5  
Odporúčané druhy suchozemských máloštetinavcov na testovanie 
bioakumulácie z pôdy  
Dážďovky  
Odporúčaný testovací druh je  Eisenia fetida  (Savigny 1826) patriaci do čeľade 
Lumbricidae . Od roku 1972 sa delí na dva poddruhy [ Eisenia fetida  a Eisenia 
andrei  (10)]. Pod ľa Jaenikeho (36) ide v skuto čnosti o dva samostatné druhy.  
Eisenia fetida  sa ľahko rozpozná pod ľa svetlých intersegmentálnych žltých pási ­
kov, zatia ľ čo Eisenia andrei  má jednotné tmavo červené zafarbenie. Tieto druhy 
pravdepodobne pochádzajú z oblasti Čierneho mora a v sú časnosti sú rozšírené 
na celom svete, najmä v antropogénne modifikovaných biotopoch, ako sú haldy 
kompostu. Oba druhy možno použi ť na ekotoxikologické aj bioakumula čné testy.  
Eisenia fetida  a Eisenia andrei  sú komer čne dostupné, napr. ako návnady na 
ryby. V porovnaní s inými dáž ďovkovitými červami majú krátky životný cyklus, 
pričom dospelos ť dosahujú približne v dvoch až troch mesiacoch (pri izbovej 
teplote). Ich optimálna teplota je približne 20 – 24 °C. Majú radšej pomerne 
vlhké substráty s takmer neutrálnym pH a vysokým obsahom organického mate ­
riálu. Ke ďže tieto druhy sa vo ve ľkej miere využívajú v štandardizovaných 
ekotoxikologických testoch približne 25 rokov, ich kultivácia je zaužívaná (48) 
(77). 
Oba druhy možno chova ť v širokej škále živo číšnych odpadov. Chovné médium, 
ktoré sa odporú ča podľa ISO (35), je zmes konského alebo dobyt čieho hnoja 
a rašeliny v pomere 50: 50. Médium by malo ma ť hodnotu pH 6 – 7 (regulovaná 
pomocou uhli čitanu vápenatého), nízku iónovú vodivos ť (menej ako 6 mS/cm 
alebo menej ako 0,5 % koncentrácie soli) a nemalo by by ť nadmerne kontami ­
nované amoniakom alebo zvieracím mo čom. Možno použi ť aj komer čnú 
záhradnú pôdu bez prísad alebo umelú pôdu pod ľa OECD (48) alebo zmes 
oboch pôd v pomere 50: 50. Substrát by mal by ť vlhký, ale nie príliš mokrý. 
Vhodné sú chovné boxy s objemom 10 – 50 litrov. 
Na získanie červov štandardného veku a hmotnosti je najlepšie za čať kultiváciou 
kokónov. Dospelé červy sa preto pridajú do chovného boxu obsahujúceho 
čerstvý substrát na tvorbu kokónov. Praktické skúsenosti preukázali, že hustota 
populácie približne 100 dospelých červov na kg substrátu ( čerstvá hmotnos ť) 
zabezpečuje dobrú mieru reprodukcie. Po 28 d ňoch sa dospelé červy odoberú. 
Dážďovky vyliahnuté z kokónov sa použijú na testovanie, ke ď dosiahnu dospe ­
losť, aspoň po dvoch mesiacoch, ale pred uplynutím 12 mesiacov. 
Červy opísaných druhov možno považova ť za zdravé, ke ď sa pohybujú 
v substráte, nesnažia sa opusti ť substrát a priebežne sa rozmnožujú. Ve ľmi 
pomalý pohyb alebo žltá zadná časť (v prípade  Eisenia fetida ) znamená vy čer­
panie substrátu. V takom prípade sa odporú ča čerstvý substrát a/alebo nižší po čet 
zvierat v boxe.  
Ďalšie vybraté odkazy  
Gerard, B. M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. Londýn, 6: 1 – 58. 
Graff, O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1 – 81. 
Römbke, J., Egeler, P., Füll, C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + 
E 206 03 909, 86 s 
Rundgren, S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern 
Sweden. Oikos 28: 49 – 55. 
Satchell, J. E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology 
(Kevan): 180 – 201.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims, R. W., a Gerard, B. M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean 
Soc. Londýn 31: 1 – 171. 
Tomlin, A. D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earth ­
worm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & 
Hall, Londýn. 331 – 338 s.  
Enchytraeidae  
Odporúčaný testovací druh je  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (mrlica biela).  
Enchytraeus albidus  je jeden z najvä čších (až 15mm) druhov obrú čkavých 
máloštetinavcov čeľade Enchytraeidae  a vyskytuje sa na celom svete, napr. 
(8). Enchytraeus albidus  sa vyskytuje v morských, sladkovodných 
a suchozemských biotopoch, najmä v rozkladajúcej sa organickej hmote (morské 
riasy, kompost) a vzácne na lúkach (42). Táto široká ekologická tolerancia 
a niektoré morfologické variácie poukazujú na skuto čnosť, že môže existova ť 
niekoľko rás tohto druhu.  
Enchytraeus albidus  je komer čne dostupný, predáva sa ako potrava pre ryby. 
Treba skontrolova ť, či kultúra nie je kontaminovaná inými, zvy čajne menšími 
druhmi (60). Ak dôjde ku kontaminácii, všetky červy by sa mali premy ť vodou 
v Petriho miske. Ve ľké dospelé jedince druhu  Enchytraeus albidus  sa následne 
vyberú (pomocou stereomikroskopu) na založenie novej kultúry. Všetky ostatné červy sa zlikvidujú. Životný cyklus tohto druhu je krátky, ke ďže dospieva od 33 
dní (pri teplote 18 °C) do 74 dní (pri teplote 12 °C). V teste možno použi ť iba 
kultúry, ktoré sa udržiavali v laboratóriu bez problémov po čas najmenej piatich 
týždňov (jedna generácia). 
Iné druhy rodu  Enchytraeus  sú takisto vhodné, najmä  Enchytraeus luxuriosus.  
Tento druh sa fyziologicky vyskytuje v pôde a najnovšie bol opísaný v odkaze (65). Ak sa použijú iné druhy rodu  Enchytraeus , musia by ť jednozna čne identi­
fikované a do správy sa musí uvies ť odôvodnenie výberu daného druhu.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide a Graefe 1992) je druh, ktorý patrí do tej istej 
skupiny ako  Enchytraeus luxuriosus . Nebolo s istotou zistené, či sa tento druh 
vyskytuje v poli, a opísaný bol iba z kultúr dáž ďoviek a háld kompostu (Römbke 
2003). Jeho pôvodné ekologické potreby preto nie sú známe. Najnovšie labora ­
tórne štúdie v rôznych po ľných pôdach však potvrdili, že tento druh má vysokú 
toleranciu vo či vlastnostiam pôdy, ako je pH a štruktúra (Jänsch a kol. 2005). 
V posledných rokoch sa tento druh často používa v ekotoxikologických štúdiách 
pre jednoduchos ť chovu a testovania, napr. Kuperman a kol. 2003). Je však malý 
(3 – 12 mm; 7 mm v priemere (Westheide a Müller 1996), v dôsledku čoho je 
manipulácia problematickejšia ako v prípade druhu  Enchytraeus albidus . Ak sa 
tento druh použije namiesto  Enchytraeus albidus , veľkosť testovacej nádoby 
môže, ale nemusí by ť menšia. Okrem toho je potrebné zoh ľadniť, že tento 
druh sa ve ľmi rýchlo rozmnožuje, a genera čný čas pri teplote 20 ± 2 °C je 
menej ako 20 dní (Achazi a kol. 1999) alebo pri vyšších teplotách ešte menej.  
Enchytraeidae  druhu  Enchytraeus albidus  (ako aj iné druhy rodu  Enchytraeus ) 
možno chova ť vo veľkých umelohmotných boxoch (napr. 30 × 60 × 10 cm alebo 
20 × 12 × 8 cm, ktorý je vhodný pre kultúry malých červov) naplnených zmesou 
umelej pôdy a komer čne dostupnej nekontaminovanej záhradnej pôdy bez prísad. 
Kompostový materiál by sa nemal používa ť, lebo môže obsahova ť toxické 
chemikálie, ako sú ťažké kovy. Faunu je potrebné z chovnej pôdy pred použitím 
odstrániť prostredníctvom hlbokého zmrazenia, ktoré sa vykoná trikrát. Možno 
použiť aj čistú umelú pôdu, ale miera reprodukcie môže by ť pomalšia 
v porovnaní s mierou, ktorá sa dosiahne pomocou zmiešaných substrátov. Hodnota pH substrátu by mala by ť 6,0 ± 0,5. Kultúra je uložená v inkubátore 
pri teplote 15 ± 2 °C bez svetla. V každom prípade treba zabráni ť tomu, aby bola 
teplota vyššia ako 23 °C. Umelá/prírodná pôda by mala by ť vlhká, ale nie mokrá. 
Keď sa pôda jemne stla čí v ruke, mali by sa objavi ť iba malé kvapky vody. 
V každom prípade treba predchádza ť anoxickým podmienkam (napr. ak sa 
použije veko, po čet dier vo veku by mal by ť dostatoč
ne vysoký, aby zabezpe ­ 
čoval dostato čnú výmenu vzduchu). Chovná pôda by sa mala raz týždenne 
prevzdušni ť dôkladným miešaním.  ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Červy by sa mali k ŕmiť najmenej raz týždenne ad libitum ovsenými otrubami, 
ktoré sa vložia do dutiny na povrchu pôdy a prikryjú pôdou. Ak v nádobe ostala 
potrava z posledného d ňa kŕmenia, množstvo podávanej potravy by sa malo 
zodpovedajúco upravi ť. Ak na zvyšnej potrave rastú huby, mala by sa nahradi ť 
novým množstvom ovsených vlo čiek. Na stimuláciu reprodukcie možno ovsené 
vločky každé dva týždne doplni ť komerčne dostupným bielkovinovým práškom 
s vitamínmi. Po troch mesiacoch sa zvieratá prenesú do čerstvo pripravenej 
kultúry alebo chovného substrátu. Ovsené otruby, ktoré musia by ť uskladnené 
v hermeticky uzavretých nádobách, sa pred použitím autoklávujú alebo zohrejú, 
aby sa zabránilo infekciám v dôsledku mú čnych rozto čov (napr. druh  Glyzypha ­
gus, Astigmata , Acarina ) alebo dravých rozto čov (napr.  Hypoaspis (Cosmolae ­
laps) miles , Gamasida , Acarina ). Po dezinfekcii sa potrava zomelie, aby ju bolo 
možné ľahko rozsypa ť po povrchu pôdy. Ďalším možným zdrojom potravy sú 
pekárske kvasnice alebo potrava pre ryby TetraMin  ® . 
Vo všeobecnosti sú kultiva čné podmienky dostato čné, ak sa červy nesnažia 
opustiť substrát, v pôde sa pohybujú rýchlo, majú lesklý vonkajší povrch bez 
prilepených častíc pôdy a sú viac-menej do biela zafarbené a ak možno pozo ­
rovať červy rôzneho veku. Červy možno v skuto čnosti považova ť za zdravé, ak 
sa priebežne rozmnožujú.  
Ďalšie vybraté odkazy  
Achazi, R. K., Fröhlich, E., Henneken, M., Pilz, C. (1999). The effect of soil 
from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligo ­
chaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117 – 126. 
Jänsch, S., Amorim, M. J. B., Römbke, J. (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51 – 83. 
Kuperman, R. G., Checkai, R. T., Simini, M., Phillips, C. T., Kolakowski, J. E., 
Kurnas, C. W., Sunahara, G. I. (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus 
crypticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with 
the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651 – 656. 
Römbke, J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: 
A review. Pedobiologia 47: 607 – 616. 
Westheide, W., a Graefe, U. (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488. 
Westheide, W., a Müller, M. C. (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263 – 267.
 ▼M4 2008R0440 — SK — 24.08.2014 — 005.001 — 1467