Ir-Regolament tal-Kummissijoni (KE) Nru 761/1999 tat-12 ta’ April 1999 li jemenda r-Regolament (KEE) Nru 2676/90 li jistabbilixxi l-metodi tal-Komunità għall-analiżi ta’ l-inbejjed



Official Journal L 099 , 14/04/1999 P. 0004 - 0014

CS.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

ET.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

HU.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

LT.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

LV.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

MT.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

PL.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

SK.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128

SL.ES Chapter 3 Volume 25 P. 118 - 128



Ir-Regolament tal-Kummissijoni (KE) Nru 761/1999 tat-12 ta’ April 1999 li jemenda r-Regolament (KEE) Nru 2676/90 li jistabbilixxi l-metodi tal-Komunità għall-analiżi ta’ l-inbejjed IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITÀ EWROPEA, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, Wara li kkunsidrat ir-Regolament tal-Kunsill (KEE) Nru 822/87 tas-16 ta’ Marzu 1987 dwar l-organizzazzjoni komuni tas-suq ta’ l-inbid [1], hekk kif emendat l-aħħar bir-Regolament (KE) Nru 1627/98 [2], u b’mod partikolari l-Artikolu 74 tiegħu, Billi l-Anness tar-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 2676/90 [3], kif emendat l-aħħar bir-Regolament (KE) Nru 822/97 [4], jiddeskrivi l-metodi ta’ analiżi; peress li l-metodu ta’ analiżi għall-aċiduD-malic deskritt fil-Kapitolu 20 ġie ippruvat bħala mhux preċiż għall-aħħar, u ġie żviluppat metodu ġdid li hu aktar korrett; peress li ġie żviluppat metodu ġdid għall-analżi tad-derivattivi tas-cyanide, li hu aktar sensittiv u aktar faċli biex jiġi applikat; peress li ġie żviluppat fuq livelli internazzjonali metodu ġdid li jiddetermina l-ethyl carbamate fl-inbid; peress li dawn it-tliet metodi ġew ippruvati b’mod konformi mal-kriterji rikonoxxuti internazzjonalment; peress li l-użu ta’ dawn il-metodi jistgħu jiżguraw aktar il-kontroll tal-kwalità u l-awtentiċità ta’ l-inbid, u jistgħu jipprevjenu nuqqas ta’ qbil minħabba l-applikazzjoni ta’ metodi ta’ analiżi skaduti u li m’humiex ta’ min jorbot wisq fuqhom; peress li d-deskrizzjonijiet tal-metodi l-ġodda ġew approvati mill-Uffiċċju Internazzjonali dwar id-Dwieli u l-Inbid; peress li dawn għandhom jidħlu f’dan ir-Regolament; Billi l-miżuri stabbiliti f’dan ir-Regolament jikkonformaw ma’ l-opinjoni tal-Kumitat ta’ Tmexxija dwar l-Inbid, ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT: Artikolu 1 L-Anness għar-REGOLAMENT (KEE) Nru 2676/90 huwa emendat kif ġej: 1. Il-Kapitolu 20 (Aċidu D-malic) huwa mibdul bl-Anness I ta’ dan ir-Regolament; 2. Il-Kapitolu 38 (derivattivi tas-cyanide) huwa mibdul bl-Anness II ta’ dan ir-Regolament; 3. L-Anness III ta’ dan ir-Regolament jiżdied mal-Kapitolu 44. Artikolu 2 Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fis-seba’ jum wara l-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunità Ewropea. Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha. Magħmul fi Brussel, fit-12 ta’ April 1999. Għall-Kummissjoni Franza Fischler Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 84, tas-27.3.1987, p. 1. [2] ĠU L 210, tat-28.7.1998, p. 10. [3] ĠU L 272, tat-3.10.1990, p. 1. [4] ĠU L 117, tas-7.5.1997, p. 10. -------------------------------------------------- ANNESS I “20. AĊIDU D-MALIC (metodu enżimatiku) 1. PRINĊIPJU 1. Fil-preżenza tad-D-Malate dehydrogenase (D-MDH), l-aċidu D-malic (D-Malate) jiġi ossidat bin-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) għal oxaloacetate. L-oxaloacetate li jifforma jinqasam f’pyruvate u carbon dioxide. Il-kwantità ta’ NADH li jifforma irid ikun proporzjonalimal-konċentrazzjoni ta’ aċidu D-malic u jitkejjel fuq wavelength ta’ 334, 340 jew 365 nm. +++++ TIFF +++++ 2. REA{ENTI 2. Kumbinazzjoni ta’ analiżi għal madwar 30 determinazzjonijiet: (a) Reċipjent 1 b’ammont ta’ madwar 30 ml ta’ soluzzjoni li tinkludi Hepes buffer gN-(2-hydroxyethyl) piperazine-N’-2-ethanesulfonic acid pH = 9,0 u stabbilizzaturi; (b) Reċipjent 2 b’madwar 210 mg ta’ NAD lyophilisate; (ċ) Tliet reċipjenti 3 b’D-MDH lyophilisate, kull wieħed ta’ madwar 8 U. (ċ) Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet 1. Uża l-kontenut tar-reċipjent 1 mingħajr ma jkun għadu miżjud bl-ilma. Qabel ma tuża ġib is-soluzzjoni għal bejn l-20 u l-25 °C. 1. 2. Ħoll il-kontenut tar-reċipjent 2 f’4 ml ilma distillat darbtejn. 2. 3. Ħoll il-kontenut ta’ wieħed mir-reċipjenti 3 f’0,6 ml ilma distillat darbtejn. Qabel ma tuża ġib is-soluzzjoni għal bejn l-20 u l-25 °C. 3. Stabbilità tas-soluzzjonijiet Il-kontenut tar-reċipjent 1 ikun stabbli għal madwar sena jekk dan jitqiegħed f’temperatura ta’ +4 °C; soluzzjoni 2 tkun stabbli għal tliet ġimgħat jekk titqiegħed f’temperatura ta’ +4 °C, u għal xahrejn f’temperatura ta’ - 20 °C; soluzzjoni 3 tkun stabbli għal ħamest ijiem jekk titqiegħed f’temperatura ta + 4 °C. 3. APPARAT 3. 3.1. Spectrophotometer li jippermetti l-kejl li għandu jsir fuq il-livell ta’ 340 nm, u li l- wavelength fuq dawn il-livelli l-assorbiment tal-NADH ikun laħaq il-massimu tiegħu. Fin-nuqqas ta’ dan jista’ jintuża spectrophotometer b’discontinuous spectrum source li jippermetti l-kejl li għandu jsir bejn il-334 u l-365 nm. Peress li huma involuti miżuri ta’ assorbiment assolut (i.e. mhux sett ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni iżda referenza għall-fattur ta’ estinzjoni tal-NADH), l-iskali tal-wavelength kif ukoll l-ispectral absorbance ta’ l-apparat irid ikun eżaminat. 3.1. 3.2. Cuvettes tal-ħġieġ b’path lengths ottiċi ta’ 1 cm (jekk tkun tippreferi, cuvettes li huma disposable jistgħu jintużaw ukoll). 3.2. 3.3. Micropipettes għal pipetting volumes ta’ bejn iż-0,01 u 2 ml. 3.3. 4. IL-PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUN 4. L-analiżi tad-D-Malate normalment issir direttament fuq l-inbid, mingħajr l-ebda dekolorizzazzjoni minn qabel. L-ammont ta’ D-Malate fil-cuvette għandu jkun bejn iż-2 u l-50 μg. Għalhekk, l-inbid għandu jkun mħallat bl-ilma biex iħalli l-konċentrazzjoni ta’ D-Malate bejn iż-0,02 u ż-0,5 g/l jew iż-0,02 u ż-0,3 g/l, rispettivament (jiddependi mill-apparat li jintuża). Tabella tal-proċess tat-taħlita: 5. IL-PROĊEDURA Kwantità stmata tad-D-malate/litr | Mħallta ma' l-ilma | Fattur tat-taħlit F | Mkejla fi: | 340 or 334 nm | 365 nm | < 0,3 g | < 0,5 g | – | 1 | 0,3 – 3,0 g | 0,5 – 5,0 g | 1 + 9 | 10 | 5. B’spectrophotometer aġġustat għal wavelength ta’ 340 nm, kejjel l-assorbiment billi tuża il-cuvettes ta’ 1 ċm, jew billi tuża l-arja ħalli tikseb zero absorbance (ma jkunx hemm cuvette fl-optical path) jew billi tuża l-ilma. Pipette ġol-cuvettes: Ħallat, u wara madwar sitt minuti kejjel l-assorbiment tas-soluzzjonijiet tat-test bir-referenza (A1). | Referenza | Test | Soluzzjoni 1 | 1,00 ml | 1,00 ml | Soluzzjoni 2 | 0,10 ml | 0,10 ml | Ilma distillat darbtejn | 1,80 ml | 1,70 ml | Kampjun għal-kejl | – | 0,10 ml | Żid: Ħallat; stenna sakemm ir-reazzjoni tkun kompluta (madwar 20 minuta) u kejjel l-assorbimenti tas-soluzzjonijiet tat-test u tar-referenza (A2). | Referenza | Test | Soluzzjoni 3 | 0,05 ml | 0,05 ml | Ikkalkula d-differenza ta’ l-assorbiment (A2 - A1) għas-soluzzjonijiet ta’ referenza (ΔAT) u tat-test (ΔAE). Fl-aħħar, ikkalkula d-differenza bejn dawk id-differenzi: ΔA = ΔAE – ΔAT Nota: Il-ħin meħtieġ għat-tkomplija ta’ l-attivita enżimatika tista’ tvarja minn grupp għal ieħor. Il-ħin t’hawn fuq qed jingħata biss bħala gwida, u hu rrakkomandat li dan ikun stabbilit għal kull grupp. L-aċidu D-malic jirreaġixxi malajr. L-enżima tbiddel ukoll l-aċidu L-tartaric, għalkemm ħafna aktar bil-mod. Dan jispjega għaliex ikun hemm reazzjoni kollaterali ħafifa, li tista’ tkun korretta permezz ta’ estapolazzjoni (Ara l-Appendiċi A). 6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI 6. Il-formula ġenerali biex tikkalkula il-konċentrazzjoni f’mg/l hi: C = ε × d × v fejn: V il-volum tas-soluzzjoni tat-test f’ml (2,95 ml) = ν il-volume tal-kampjun f’ml (0,1 ml) = PM il-massa molekulari tas-sustanza li għandha tiġi stabbilita = (għall-l-aċidu D-malic, PM = 134,09) d = l-optical path tal-cuvette f’ċm (1 ċm) ε sa 340 nm = 6,3 (1 mmol-1 cm-1) sa 365 nm = 3,4 (1 mmol-1 cm-1) sa 334 nm = 6,18 (1 mmol-1 cm-1). Jekk il-kampjun kien imħallat bl-ilma matul il-preparazzjoni tiegħu, mela mmultiplika r-riżultat bil-fattur tat-taħlita. Il-konċentazzjoni ta’ l-d-aċidu D-malic għandha tidher f’termini ta’ milligrammi għal kull litru (mg/l), mingħajr l-ebda ċifri deċimali. 7. PREĊIŻJONI Dettalji tal-prova interlaboratorju dwar il-preċiżjoni tal-metodu jidhru fil-qosor fl-Appendiċi B. Ir-riżultati miksuba mill-esperiment interlaboratorju jistgħu ma japplikawx għal sensiela ta’ analyte concentration u matriċijiet barra minn dawk spjegati fl-Appendiċi B. 7.1. Ripetibbilità Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati individwali miksuba mill-istess materja li jkunu ġew analizzati minn operatur li qed iħaddem l-istess apparat, fl-iqsar intervall ta’ ħin, m’għandhiex teċċedi l-valur ta’ ripettibbilità r f’aktar minn 5 % tal-każijiet. r = 11 mg/l. 7.2. Riproduċibbilità Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati individwali miksuba mill-istess materja li jkunu ġew analizzati f’żewġ laboratorji differenti, m’għandhiex teċċedi l-valur tar-riproduċibbilità R f’aktar minn 5 % tal-każi. r = 20 mg/l. 8. KUMMENTI Minħabba l-grad ta’ preċiżjoni ta’ dan il-metodu, valuri ta’ aċidu D-malic taħt il-50 mg/l, jekk meħtieġ, għandhom jiġu kkonfermati permezz ta’ metodu analitiku ieħor billi jintuża prinċipju ieħor ta’ kejl, bħal dak ta’ Przyborski et al. (Mitteilungen Klosterneuburg 43, 1993; 215-218. 1993). Il-kampjun ta’ inbid fil-cuvette m’għandux ikun aktar minn 0,1 ml, biex b’jekk tkun tista’ tiġi evitata kull inibizzjoni ta’ attività enżimatika possibbli minn polyphenols. -------------------------------------------------- ANNESS II "38. DERIVATTIVI TAS-CYANIDE (Attenzjoni: ħares sew il-miżuri ta’ sigurtà dwar l-użu tal-kimiċi chloramine T, pyridine, potassium cyanide, hydrochloric acid, u phosphoric acid. Iddisponi sew minn prodotti użati, f’konformità mar-regoli ambjentali fis-seħħ. Attenzjoni partikolari mal-hydrocyanic acid li joħroġ waqt id-distillazzjoni ta’ l-inbid aċidifikat.) 1. IL-PRINĊIPJU Il-hydrocyanic acid kollu fl-inbid joħroġbil-hydrolysis ta’ l-aċidu u jiġi sseparat permezz tad-distillazzjoni. Wara li jirreaġixxi ma’ chloramine-T u pyridine, il-glutaconic dialdehyde li jifforma jiġi stabbilit b’analiżi kolorimetrika, meta ma’ 1,3-dimethyl-barbituric acid danjagħti kolorazzjoni blu. 2. APPARAT 2.1. L-apparat ta’ distillazzjoni Uża l-apparat ta’ distillazzjoni deskritt biex tistabbilixxi l-kontenut ta’ alkoħol fl-inbid 2.2. Flixkun bil-qiegħ tond ta’ 500-ml b’ground joints standardizzati 2.3. Banju ta’ l-ilma kkontrollat termostatikament għal 20 °C 2.4. Spectrophotometer li jista’ jkejjel l-assorbiment fuq wavelength ta’ 590 nm 2.5. Ċelloli tal-ħġieġ jew ċelloli li jintużaw darba biss b’optical paths ta’ 20 mm 3. REAĠENTI 3.1. Phosphoric acid (H3PO4) b’25 % (m/v) 3.2. Soluzzjoni ta’ Chloramine-T (C7H7ClNNa O2S, 3H2O) 3 % (m/v) 3.3. Soluzzjoni ta’ 1,3-dimethyl-barbituric acid: ħoll 3,658 g 1,3-dimethyl-barbituric acid(C6H8N2O3) fi 15 ml ta’ pyridine u 3 ml ta’ hydrochloric acid (ρ20=1,19 g/ml) u żid 50 ml ilma distillat 3.4. Potassium cyanide (KCN) 3.5. Soluzzjoni ta’ Potassium iodide (KI) b’10 % (m/v) 3.6. Soluzzjoni ta’ Silver nitrate (AgNO3), 0,1 M 4. IL-PROĊEDURA 4.1. Distillazzjoni Poġġi 25 ml inbid, 50 ml ilma distillat, 1 ml phosphoric acid (3.1) u ftit żibeġ tal-ħġieġ fir-reċipjent tal-500-ml (2.2). Poġġi mill-ewwel ir-reċipjent fuq l-apparat tad-distillazzjoni. Uża tapering tube biex id-distillat imur ġo reċipjent ikkalibrat ta’ 50-ml li jkun fih 10 ml ilma. Għarraq ir-reċipjent ikkalbirat f’ilma ffriżat. Iġbor bejn 30 u 35 ml ta’ distillat (jew madwar 45 ml ta’likwidu b’kollox) mir-reċipjent ikkalibrat. Naddaf it-tapering tube tal-condenser permezz ta’ ftit millilitri ta’ ilma distillat, ġib id-distillat għal 20 °C, u imla bl-ilma distillat sal-linja tal-kalibrazzjoni. 4.2. Kejl Għamel 25 ml ta’ distillat f’conical flask ta’ 50-ml bi stopper tal-ħġieġ, żid 1 ml soluzzjoni ta’chloramine-T solution (3.2), u ssiġilla bl-istopper. Wara eżattament 60 sekonda żid 3 mlsoluzzjoni ta’ 1,3-dimethyl-barbituric acid (3.3), issiġilla bl-istopper u ħalli għal 10 minuti.Imbagħad f’cells b’optical paths ta’ 20 mm kejjel l-assorbiment kontra kontroll (25 ml ilmadistillat minflok 25 ml ta’ distillat) fuq wavelength ta’ 590 nm. 5. KIF TISTABBILIXXI IL-CALIBRATION CURVE 5.1. Argentometric titration fil-potassium cyanide Ħoll daqs 0,2 g KCN (3.4), imkejla b’attenzjoni, f’100 ml ilma distillat f’reċipjent ikkalibrat ta’ 300-ml. Żid 0,2 ml soluzzjoni ta’ potassium iodide (3.5) u t-titrate mas-soluzzjoni ta’ 0,1 M silver nitrate (3.6) sakemm jinkiseb kulur safrani stabbli. Ħu 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ 0,1 M silver nitrate bħala li jikkorrispondi għal 13,2 mg KCN, u kkalkula l-konċentrazzjoni tal-kampjun KCN. 5.2. L-istandard curve 5.2.1. Preparazzjoni għal soluzzjonijiet bażiċi Wara li tkun stabbilejt il-konċentrazzjoni tal-KCN skond il-proċedura mfassla f’5.1, ippreparasoluzzjoni bażika li jkun fiha 30 ml/l hydrocyanic acid (30 ml HCN 72,3 ml KCN). Ħallatbl-ilma għal 1/10. Introduċi 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml u 5,0 ml tas-soluzzjoni tal-kampjun imħallat fir-reċipjenti kkalibrati ta’ 100-ml il-wieħed, u imla bl-ilma distillat sal-linja ta’ kalibrazzjoni. Is-soluzzjonijiet ippreparati ikollhom 30 μg, 60 μg, 90 μg, 120 μg u 150 μg ta’ hydrocyanic acid għal kull litru rispettivament. 5.2.2. It-Titration Ħu 25-ml kampjuni mis-soluzzjoniet miksuba u kompli kif indikat fuq f’4.1 u 4.2. Il-valuri ta’ l-assorbiment miksuba, fejn is-soluzzjonijiet bażiċi bħala funzjoni tal-kontentut korrispondenti tal-hydrocyanic acid huma kkonċernati, għandhom jipproduċu linja dritta li tgħaddi mis-sors ta’ oriġini. 6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI Il-hydrocyanic acid jiġi espress f’mikrogrammi għal kull litru (μg/l), mingħajr l-ebda ċifri deċimali. 6.1. Metodu tal-kalkulazzjoni Aqra l-kontenut ta’ hydrocyanic acid minn fuq il-calibration curve. Jekk il-kampjun ikuntħallat, immultipplika r-riżultat mal-fattur tat-taħlita. Inbid abjad r = 3,1 μg/l jew madwar 6 %· xi R = 12 μg/l jew madwar 25 %· xi Inbid aħmar r = 6,4 μg/l jew madwar 8 %· xi R = 23 μg/l jew madwar 29 %· xi xi = konċentrazzjoni medja ta’ HCN fl-inbid xi = 48,4 μg/l għal inbid abjad xi = 80,5 μg/l għal inbid aħmar." -------------------------------------------------- ANNESS III 44. KIF JIĠI STABBILIT L-ETHYL CARBAMATE FL-INBID: METODU TA’ INVESTIGAZZJONI SELETTIVA BILLI TUŻA GAS CHROMATOGRAPHY/MASS SPECTROMETRY (Dan hu applikabbli biex jiġi stabbilit l-ethyl carbamate għal konċentrazzjonijiet ta’ bejn l-10 u il-200 μg/l) (Attenzjoni: segwi sew il-miżuri ta’ sigurtà dwar kif tuża l-kimiċi, ethanol, acetone u prodotti kanċeroġeniċi (ethyl carbamate u dichloromethane). Iddisponi sew mis-solventi, f’konformità mar-regoli ambjentali fis-seħħ). A. Il-Prinċipju Propyl carbamate jiżdied ma’ kampjun biex iservi bħala bażi interna. Is-soluzzjoni titħallat bl-ilma u titpoġġa f’solid phase extraction column ta’ 50 ml. Ethyl carbamate propylcarbamate jiġu mnaddfa bid-dichloromethane. Il-likwidu tat-tindif li jifforma jiġi kkonċentrat ġo vacuum rotary evaporator. Il-konċentrat jiġi analizzat permezz ta’ gas chromatography (GC). Id-determinazzjoni ssir permezz ta’ mass spectrometry billi tuża il-frammentometrija fil-mod SIM (selected ion monitoring). B. Apparat u kondizzjonijiet kromatografiċi (eżempju) (a) Gas chromatogram/mass spectrometer (GC/MS) u jekk hemm bżonn kampjun ta’ filtru u sistema ta’ trattament tad-data jew l-ekwivalenti Capillary column magħmul minn silika mdewba b’diametru intern ta’ 30 m [1] x 0,25 mm, 0,25 μm ta’ Carbowax 20M Operazzjoni: injettur 180 °C, vettur tal-helium gas ta’ 1 ml/minuta f’25 °C, injezzjoni b’metodu li ma jinqasamx Programm tat-Temperatura: 40 °C għal 0,75 minuti, li wara titla’ b’10 °C/minuta sa 60 °C, imbagħad bi 3 °C/minuta sa 150 °C [2], li titla’ għal 220 °C, u żżomm dik it-temperatura għal 4,25 minuti. Il-ħin speċifiku ta’ retenzjoni tal-ethyl carbamate huwa ta’ bejn 23 u 27 minuta, waqt li dak tal-propyl carbamate huwa ta’ bejn 27 u 31 minuta. Gas chromatogram/spectrometer (GC/MS) interface: linja ta’ trasferiment 220 °C. Mass spectrometer b’parametri kkalibrati manwalment b’perfluorotributylamine u ottimizzati għal sensittività ta’ massa aktar baxxa, il-mod SIM ta’ kisba, solvent delay u acquisition start time ta’ 22 minuta, dwell time/ion 100 ms. (b) Vacuum rotary evaporator jew sistema simili ta’konċentrazzjoni simili għal Kuderna Danish. ( NB: ir-rata ta’ tisħiħ mill-ġdid ta’ ethyl carbamate mill-kampjun ta’ analiżi, C(g) trid tkun bejn 90 u 110 % matul il-proċess ) (c) Reċipjent - għamla ta’ lanġasa, 300 ml, b’għonq wieħed (d) Tubu għal konċentrazzjoni ta’ 4 ml, iggradat, u mgħammar b’joint miksija bit- teflon, u tapp tas-sufra C. Reaġenti (a) Acetone - ta’ kwalità LC ( NB: iċċekkja kull grupp qabel ma tuża f’GC/MS għall-assenza tar-rispons għal m/z 62, 74 u 89 ions. ) (b) Dichloromethane ( NB: analizza kull grupp qabel ma tuża f’GC/MS wara konċentrazzjoni għall-200 darba, biex tiċċekkja l-assenza tar-rispons għal m/z 62, 74 u 89 ions. ) (c) Ethanol - anhydrous (d) Soluzzjoniet bażiċi ta’ Ethyl carbamate (EC) 1. Soluzzjoni ta’ l-istokk - 1,00 mg/ml. Iżen 100 mg EC (purità ≥ 99 %) f’reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-acetone. 2. Soluzzjoni bażika li taħdem - 10,0 μg/ml. Ittrasferixxi 1 ml tas-soluzzjoni ta’ l-istock EC għal reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-acetone sas-sinjal. (e) Propyl carbamate (PC), soluzzjonijiet bażiċi 1. Soluzzjoni ta’ l-istokk - 1,00 mg/ml. Iżen 100 mg PC (grad ta’ reaġent) f’reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-acetone sas-sinjal. 2. Soluzzjoni bażika li taħdem - 10,0 μg/ml. Ittrasferixxi 1 ml tas-soluzzjoni ta’ l-istokk’ PC f’reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-acetone sas-sinjal. 3. Soluzzjoni bażika interna PC - 400 ng/ml. Ittrasferixxi 4 ml ta’ soluzzjoni bażika li taħdem ta’ PC għal ġo reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-ilma sas-sinjal. (f) Soluzzjonijiet bażiċi kkalibrati EC-PC Ħallat soluzzjoni bażika li taħdem ta’ EC (d)(2) u soluzzjoni bażika li taħdem ta’ PC (e)(2) ma’ dichloromethane biex tikseb: 1. (100 ng EC u 400 ng PC)/ml; 2. (200 ng EC u 400 ng PC)/ml; 3. (400 ng EC u 400 ng PC)/ml; 4. (800 ng EC u 400 ng PC)/ml; 5. (1600 ng EC u 400 ng PC)/ml. (g) Kampjun ta’ analiżi - 100 ng EC/ml f’40 % ta’ ethanol Ittrasferixxi 4 ml ta’ soluzzjoni bażika li taħdem ta’ PC għal ġo reċipjent volumetriku ta’ 100 ml u ħallat bl-ilma sal-marka. (h) Solid phase extraction column - ta’ materjal li jintuża darba, ippakkjat minn qabel b’diatomaceous earth, jesa 50 ml NB: Qabel l-analiżi, iċċekkja kull grupp ta’ extraction columns għall-akkwist mill-ġdid ta’ EC u PC u n-nuqqas ta’ rispons ta’ ions ta’ 62,74 u 89 m/z. Ipprepara 100 ng EC/ml ta’ kampjun ta’ analiżi (g). Analizza 5,00 ml ta’ kampjun ta’ anliżi kif deskritt fid-D(a), E u F. It-tisħiħ mill-ġdid ta’ bejn 90 u 110 ng ta’ EC/ml ikun sodisfaċenti. Assorbenti li l-iżgħar diametru tagħhom ikun irregolari jistgħu jwasslu biex ikun hemm ċirkulazzjoni bil-mod li taffettwa it-tisħiħ mill-ġdid ta’ EC u PC. Jekk bejn 90 u 110 % tal-valur tal-kampjun ta’ analiżi ma jinkisbx wara diversi attentati, ibdel il-kolonna jew uża calibration recovery curve korretta biex tikkwantifika l-EC. Biex tikseb il-calibration curve korretta, ipprepara soluzzjonijiet bażiċi kif deskritt f’(f) billi tuża 40 % ta’ ethanol minflok dichloromethane. Analizza 1 ml tas-soluzzjoni bażika ta’ kalibrazzjoni kif deskritt fid-D, E u F. Stabbilixi calibration curve ġdida billi tuża r-rata ta’ proporzjon ta’ EC/PC tal-mudelli estratti. D. Preparazzjoni tal-kampjun ta’ analiżi Poġġi dawn il-volumi tal-materjal ta’ analiżi li ġejjin f’żewġ beakers separati ta’ 100 ml: (a) inbejjed li jkollhom aktar minn 14 % volum ta’ alkoħol: 5,00 ± 0,01 ml; (b) inbejjed li jkollhom massimu ta’ 14 % volum ta’ alkoħol: 20,00 ± 0,01 ml. Għal kull beaker, żid l ml ta’ soluzzjoni bażika interna PC C(e)(3) u ilma, biex tikseb volum totali ta’ 40 ml (jew 40 g). E. Estrazzjoni L-estrazzjoni għandha ssir taħt extractor hood apposta, b’ventilazzjoni adegwata. Ittrasferixxi l-kampjun ippreparat taħt l-intestatura D għal extraction column. Laħlaħ il-beaker b’10 ml ilma u ttrasferixxi l-ilma tat-tlaħliħ għal extraction column. Ħalli l-likwidu għal erba’ minuti ħa jassorbi. Naddaf permezz ta’ 2 x 80 ml ta’ dichloromethane. Iġbor il-likwidu tat-tlaħliħ li tkun għadek kif użajt f’conical flask ta’ 300 ml. Evapora minn 2 sa 3 ml ta’ dan il-likwidu f’bath rotary evaporator tal-ilma f’temperatura ta’ 30 °C. (NB: tħallihx jagħli ħafna.) Ittrasferixxi l-fdal konċentrat għal ġo graduated tube ta’ 4 ml permezz ta’ Pasteur pipette. Laħlaħ ir-reċipjent b’1 ml ta’ dichloromethane u ttrasferixxi l-likwidu li tkun laħlaħt bih għal ġot-tubu. Ikkonċentra l-kampjun għal 1 ml taħt emissjoni dgħajfa ta’ nitroġenu. Jekk ikun hemm bżonn, ittrasferixxi l-konċentrat għal ġo auto sampler flask għall-analiżi GC/MS. F. L-analiżi GC/MS (a) Calibration curve Injetta 1 μ1 ta’ kull soluzzjoni bażika ta’ kalibrazzjoni C(f) ġol-GC/MS. Ipplottja l-graph li turi EC-PC area ratio għar-rispons ta’ m/z 62 ion fuq l-assi vertikali u l-kwantità ta’ EC f’ng/ml fuq l-assi orizzontali (100, 200, 400, 800, 1600 ng/ml). (b) Kwantifikazzjoni ta’ EC Injetta 1 μl ta’ estratt konċentrat ippreparat taħt E ġos-sistema GC/MS u kklakula l-area ratio ta’ EC-PC għal m/z 62 ion. Stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ EC (ng/ml) fl-estratt billi tuża l-internal standard calibration curve. Ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ EC fil-kampjun ta’ analiżi (ng/ml) billi tiddividi l-kwantità ta’ EC (ng) fl-estratt bil-volum (ml) tal-kampjun ta’ analiżi. (c) Il-Konferma ta’ l-identita ta’ EC Iddetermina jekk ir-rispons ta’ m/z 62, 74 u 89 ions jidhirx matul il-perjodu tar-detenzjoni ta’ EC. Dan ir-rispons jikkostitwixxi għamliet tal-frak prinċipali (M - C2H2)+ u (M - CH3)+ u ion molekulari (M)+ rispettivament. Il-preżenza ta’ EC hija kkonfermata jekk ir-rati ta’ proporzjon relattivi ta’ dawn l-ions ikunu f’mhux aktar minn 20 % tar-rati ta’ proporzjon tal-bażi EC. L-estratt jista’ jkollu jiġi kkonċentrat aktar biex jikseb rispons suffiċjenti għal m/z 89 ion. G. Analiżi kollaborattiva It-tabella turi riżultati individwali għall-mod prattiku kif ġie mnissel il-kampjun u għaż-żewġ tipi ta’ inbid. Il-Cochran test wassal għall-eliminazzjoni ta’ par wieħed biss ta’ riżultati, għal inbid ta’ qawwa ta’ volum alkoħoliku ta’ aktar minn 14 %, u għal inbid ta’ qawwa ta’ volum alkoħoliku ta’ 14 % jew anqas, minn żewġ laboratorji differenti. Ir-riproduċibbilità relattiva (RSDR) għandha t-tendenza li titnaqqas hekk kif tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ ethyl carbamate. Preżentazzjoni tal-metodu dwar kif jiġi stabbilit l-ethyl carbamate EC f’xarbiet alkoħoliċi permezz tal-GC/MS Kampjun | EC medju misjub (ng/ml) | Irkupru ta' EC miżjud (%) | Sr | SR | RSDr (%) | RSDR (%) | Inbejjed > 14 % vol | 40 | | 1,59 | 4,77 | 4,01 | 12,02 | | 80 | 89 | 3,32 | 7,00 | 4,14 | 8,74 | | 162 | 90 | 8,20 | 11,11 | 5,05 | 6,84 | Inbejjed ≤ 14 % vol | 11 | | 0,43 | 2,03 | 3,94 | 18,47 | | 25 | 93 | 1,67 | 2,67 | 6,73 | 10,73 | | 48 | 93 | 1,97 | 4,25 | 4,10 | 8,86 | [1] Għal ċerti inbejjed ta’ kwalità għonja ħafna, tista’ tkun meħtieġa capillary column ta’ 50 m. [2] Għal ċerti inbejjed partikolari ta’ kwalità għolja ħafna, jista’ jkun meħtieġ programm ta’ temperatura ta’ 2 °C/minuta. --------------------------------------------------