Id-Direttiva tal-Kummissjoni 92/95/KEE tad-9 ta' Novembru 1992 Li temenda l-Anness tas-Seba' Direttiva 76/372/KEE li tistabbilixxi l-metodi tal-Komunità ta' l-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-materjali ta' l-għalf



Official Journal L 327 , 13/11/1992 P. 0054 - 0062

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 45 P. 0182

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 45 P. 0182

CS.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

ET.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

HU.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

LT.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

LV.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

MT.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

PL.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

SK.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11

SL.ES Chapter 3 Volume 46 P. 3 - 11



Id-Direttiva tal-Kummissjoni 92/95/KEE tad-9 ta' Novembru 1992 Li temenda l-Anness tas-Seba' Direttiva 76/372/KEE li tistabbilixxi l-metodi tal-Komunità ta' l-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-materjali ta' l-għalf IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkonsidrat it-Trattat li jistabbilixxi il-Komunità Ekonomika Ewropea, Wara li kkonsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE ta' l-20 ta' Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni tal-metodi tal-Komunità tal-kampjunar u l-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-materjali ta' l-għalf [1], kif l-aħħar emendata bl-Atti ta' l-Adeżjoni ta' Spanja u l-Portugall, u partikolarment l-Artikolu 2 tagħha, Billi s-Seba' Direttiva tal-Kummissjoni 76/372/KEE ta' l-1 ta' Marzu 1976 tistabbilixxi metodi ta' l-analiżi tal-Komunità għall-kontroll uffiċjali tal-materjali ta' l-għalf [2], kif emendata bid-Direttiva 81/680/KEE [3], tippreskrivi l-metodi li għandhom ukunu wżati għad-determinazzjoni ta' l-aflatossin B1; Billi hemm bażi għal adattazzjoni ta' dawn il-metodi fid-dawl ta' l-avvanzi fit-tgħarif xjentifiku u tekniku; billi huwa partikolarment rakkommandabbli li jkun hemm metodu disponibbli għall-kontroll ta' limiti ferm baxxi ta' l-aflatossin kif stabbiliti bid-Direttiva tal-Kunsill 74/63/KEE tas-17 ta' Diċembru 1973 dwar l-iffissar tal-livelli massimi permissibbli għal sustanzi u prodotti mhux mixtieqa fin-nutriment ta' l-annimaliu [4], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 91/132/KEE [5]; Billi huwa wkoll rakkommandabbli li jkun hemm disponibbli metodu għad-determinazzjoni ta' l-aflatossin B1 fil-preżenza ta' sustanzi li jfixklu, bħal ma hija l-polpa taċ-ċitru; Billi l-miżuri li hemm dispożizzjoni dwarhom f'din id-Direttiva huma bi qbil ma l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti tal-Materjali ta' l-Għalf; ADDOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Anness tad-Direttiva 76/372/KEE huwa emendat bi qbil ma l-Anness ta' din id-Direttiva. Artikolu 2 Istati Membri għandhom idaħħlu fid-deħħ sa mhux aktar tard mill-1 ta' Ottubru 1993, ir-regolamenti u disposizjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex dawn ikunu konformi ma' din id-Direttiva. Għandhom minnufieħ jinfurmaw lill-Kummissjoni dwar dan. Meta Stati Membri jadottaw dawn id-dispożizzjonijiet, dawn għandhom ikollhom referenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b'tali referenza fil-waqt tal-publikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-proċedura għal din ir-referenza għandha tkun adottata mill-Istati Membri. Artikolu 3 Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fid-9 ta' Novembru 1992. Għall-Kummissjoni Ray Mac Sharry Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU L 102, tal-15.4.1976, p. 8. [3] ĠU L 246, tad-29.8.1981, p. 32. [4] ĠU L 38, tal-11.2.1974, p. 31. [5] ĠU L 66, tat-13.3.1991, p. 16. -------------------------------------------------- L-ANNESS I. Taħt il-Parti A "Il-metodu kromatografiku ta' saff irqieq dimensjoni-unika" it-test fil-punt 1 "Għan u Skop" huwa mibdul bit-test li ġej: "1. Għan u skop Il-metodu jagħmilha possibbli li jkun determinat il-livell ta' aflatossin B1 f'materji primi u materjali sempliċi ta' l-għalf. Dan il-metodu ma jistgħax ikun applikat fil-preżenta ta' polpa taċ-ċitru. Id-determinazzjoni tal-limitu l-baxx hija 0,10 mg/kg (10 ppb). Gil-preżenza ta' sustanzi ta' tfixkil huwa meħtieġ li tkun repetuta l-analiżi bl-użu tal-metodu B (kromatografija likwida ta' mġieba għolja)." II. Taħt il-Parti B "Il-metodu kromatografiku ta' saff irqieq dimensjoni-doppja" it-test huwa mibdul b'dan li ġej: "B. DETERMINAZZJONI TA' L-AFLATOSSIN B1. METODU KROMATOGRAFIKU LIKWIDU TA' MĠIEBA GĦOLJA 1. L-Għan u l-iskop ta' dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta' l-aflaatoxin B1 fil-materjali ta' l-għalf ta' l-annimali, inklużi dawk li jkun fihom il-polpa taċ-ċitru. Id-determinazzjoni tal-limitu l-baxx hija 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Prinċipju Il-kampjun huwa estratt bil-kloroform. L-estratt huwa iffiltrat u porzjon ta' alikwot huwa purifikat f'kapsula Florisil segwit b'kapsula C18. Is-separazzjoni u d-detrminazzjoni finali tkun akkwistata bil-kromatografija likwida ta' mġieba għola (HPLC) bl-użu ta' kolonna C18 fazi maqluba, segwita bid-derivatizzazzjoni ta' wara-l-kolonna bil-jodju fl-ilma, u s-sejbien floroxxenti. Nota: Il-mikotossini huma sustanzi estremament tossiċi. Il-manipulazzjoni għandha tkun imwettqa f'armarju speċifiku tad-dħaħen. Prekwazzjonijiet speċjali għandhom jittieħdu meta t-tossini ikunu f'għamla xotta minħabba li l-natura elettrostatika tagħhom u t-tendenza li tirriżulta li jinfirxi ma l-uċuħ tal-bank tax-xogħol. 3. Reaġenti 3.1. Kloroform, stabilizzat bi 0,5 sa 1,0 % ta' etanol, bil-massa. Ara l-osservazzjoni 10.2. 3.2. Metanol, grad HPLC għall-preatazzjoni ta' 3.6. 3.3. Aċetun. 3.4. Aċetonitril, grad HPLC. 3.5. Solventi elutenti: Ipprepara jum bil-quddiem qabel l-użu, jew neħħi l-arja mis-solventi b'mod ultrasoniku. 3.5.1. Taħlita ta' aċetun (3.3) u ilma, 98 + 2 (v + v). 3.5.2. Taħlita ta' ilma u metanol (3,2), 80 + 20 (v + v). 3.5.3. Taħlita ta' ilma u aċetun (3.3), 85 + 15 (v + v). 3.6. Fażi mobbli għal Taħlita HPLC ta' ilma, metanol (3.2) u aċetonitril (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v). NB: Il-komposizzjoni tas-solvent fil-fażi mobbli tista tkun teħtieġ li tġi aġġustata, jiddependi mill-karatteristiċi tal = kolonna HPLC kif użta. 3.7. Taħlita ta' jodju saturat: żid 2 g ta' jodju ma 400 ml ilma. Ħallat għal mill-anqas 90 min u iffiltra minn filtru tal-membrana (4.15). Ipprotieġi t-taħlita saturata mid-dawl sabiex ma tħallix li jkun hemm fotodegradazzjoni. 3.8. Ċellulit maħsul bl-aċidu 545, jew ekwivalenti. 3.9. Kapsula florisil (ilmijiet SEP-PAK), jew ekwivalenti. 3.10. Kapsula C18 (ilmijiet SEP-PAK), jew ekwivalenti. 3.11. Gass inert, e.ġ. nitroġenu. 3.12. Taħlita normali ta' l-aflatossin B1 fil-kloroform, konċentrazzjoni 10 mg/ml. Ivverifika l-konċentrazzjoni tat-taħlita kif ġej: Iddetermina l-ispektru ta' l-assorbazzjoni tat-taħlita bejn 330 u 370 nm permezz tal-ispektrofotometru (4.23). Kejjel l-assorbenza (A) fil-massimu qrib 363 nm. Ikkalkola l-konċentrazzjoni ta' l-aflatossin B1 fi mikrogrammi kull millilitru ta' taħlita mill-formula: Konċentrazzjoni (mg/ml) = = 13,991 × A 3.12.1. Aflatossin B1 ħażna ta' taħlita normali fil-kloroform Trasferixxi b'mod kwanitattiv 2,5 ml tat-taħlita normali ta' l-aflatossin B1 (3.12) lejn garafina volumetrika 50 ml u aġġusta l-marka bil-kloroform (3.1). Aħżen din it-taħlita f'post fil-frisk (4 °C), fid-dlam, issiġillata sewwa u mgeżwra fil-liga ta' l-aluminju. 3.13. Taħlitiet tal-kalibrazzjoni aflatossin B1 HPLC. NB Uża utenti tal-ħġieġ maħsula bl-aċidu għall-preparazzjoni ta' dawn it-taħlitiet (ara 4, Apparat). 3.13.1. Taħlita tal-kalibrazzjoni 4mg/ml. Ippermetti l-garafina volumetrika bit-taħlita normali tal-ħażna (3.12.1) li tidħon sat-temperatura tal-kamra fil-liega ta' l-aluminju (għal ftit siegħat). Ittrasferixxi 400 ml mit-taħlita normali tal-ħażna (200 ng aflatossin Bi) lejn garafina volumetrika 50 ml, u evapora t-taħlita lejn tnixxif f'kunnert ta' gass inert (3.11). Dewweb ir-residu akkwistat fi madwar 20 ml ta' taħlita ilma. Aċetun (3.5.3), wassal sal-marka bit-taħlita ta' ilma/aċetun u ħawwad sewwa. 3.13.2. Taħlita tal-kalibrazzjoni 3 ng/ml. Ittrasferixxi b'mod kwantitattiv 7,5 ml tat-taħlita tal-kalibrazzjoni (3.13.1) lejn garafina volumetrika 10 ml, wassal sal-marka bit-taħlita ta' ilma/aċetun (3.5.3), u ħawwad sewwa. 3.13.3. Taħlita tal-kalibrazzjoni 2 ng/ml. Ittrasferixxi b'mod kwantitattiv 25 ml tat-taħlita tal-kalibrazzjoni (3.13.1) lejn garafina volumetrika 50 ml, wassal sal-marka bit-taħlita ta' ilma/aċetun (3.5.3), u ħawwad sewwa. Din it-taħlita hija referuta wkoll bħala in-norma ta' referenza, li għandha tkun użata għal injezzjoni repetittiva matul HPLC (5.5). 3.13.4. Taħlita tal-kalibrazzjoni 1 ng/ml. Ittrasferixxi b'mod kwantitattiv 2,5 ml tat-taħlita tal-kalibrazzjoni (3.13.1) lejn garafina volumetrika 10 ml, wassal sal-marka bit-taħlita ta' ilma/aċetun (3.5.3), u ħawwad sewwa. 3.14. Ampula li jkun fih taħlita ta' aflatossini B1, B2, G1 u G2 bi konċentrazzjonijiet ta' madwar 1, 1.5. 1 u 0,5 mg/ml rispettivament, fi 1 ml kloroform. 3.14.1. Taħlita tat-test kromatografiku. Ittrasferixxi l-kontenut ta' l-ampula (3.14) lejn tubu-tat-testijiet b'tapp tal-ħġieġ jew fjal bit-tapp tal-kamin. Ittrasferixxi 40 ml ta' din it-taħlita lejn tubu-tat-testijiet b'tapp tal-ħġieġ (imlaħlaħ bl-aċidu) (4.22). Evapora l-kloroforma f'kurrent ta' gass inert (3.11) u dewweb mill-ġdid f'taħlita ta' 10 ml ta' ilma/aċetun (3.5.3). 3.15. Reaġenti għat-test tal-konformità (6). 3.15.1. Taħlita ta' klorid tas-sodju saturat. 3.15.2. Sulfat tas-sodju, anidridu, granulari. 4. Twissija dwar l-apparat: L-użu ta'apparat tal-ħġieġ mħux maħsul bl-aċidu għal taħlitiet akweji ta' l-aflatossin jistgha jaħloq telfien. Kura partikolari għandha tittieħed b'apparat tal-ħġieġ ġdid u apparat tal-ħġieġ li jintuża darba biss vħal ma huma l-fjali ta' kampjunar awtomatiku u l-pipetti Pasteur. Għalhekk l-apparat tal-ħġieġ tal-laboratorju li jkun f'kuntatt ma taħlitiet akweji ta' l-aflatossin għandu jkun mgħaddas f'aċidu mrattab (e.g. aċidu sulfuriku = 2 mol/l) għal diversi siegħat, imbaghad imlaħlaħ seww b'ila distillat sabiex jitneħħew kull traċċi ta' l-aċidu (e.g. tlett darbiet, b'verifika b'karta-pH). Fil-prattika, dan it-trattament huwa meħtieġ għal garafini bil-qiegħ tond (4.4), il-garafini volumetriċi, ċilindri tal-kejl, fjali u tubi użati għat-taħlitiet tal-kalibrazzjoni u l-estratti finali (partikolarment il-fjali ta' kampjunar awtomatiku), u l-pipetti Pasteur, jekk dawn ikunu wżati għat-trasferiment tat-taħlitiet tal-kalibrazzjoni jew estratti. 4.1. Taħlit-tħin. 4.2. Għarbiel b'toqob ta' daqs 1,0 mm, (ISO R 565). 4.3. Ċekċieka mekkanika 4.4. Evaporatur rotanti tal-vakwu, mgħammar bi 150 sa 250 ml garafina bil-qiegħ tonf. 4.5. Kromatografiku likwidu ta; mġieba għolja, injettur bid-dawra tajjeb għall-injezzjoni ta' 250 ml. Ara l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-mili parzjali jew komplut tad-dawra. 4.6. Kolonna analitika HPLC: 3 mm jew 5 mm ippakkjar C18. 4.7. Pompa mingħajr skossi għall-forniment tar-reaġent tal-jodju ta' wara l-kolonna. 4.8. Tee b'volum mejjet ta' Valco żero, azzar inossidabbli (1/16 ×0,75 mm). 4.9. Tkebbib spirali tar-reazzjoni; Teflon jew azzar inossidabbli. Qisien ta' 3000 × 0,5 mm to 5000 × 0,5 mm kienu nstabu li huma xierqa flimkien ma kolonni 5 mm jew 3 mm HPLC. 4.10. Banju ta' l-ilma ikkontrollat b'mod termostatiku aġġustat għall-60 °C, li jkista jkun bit-temperatura irregolata ta' aħjar minn 0,1 °C. 4.11. Sejjiebu floroxxenti, b'eċitament fi 365 nm u emissjoni fi 435 nm wavelengths. (Għall-istrument tal-filtraġġ: emissjoni wavelength > 400 nm). Sejbien ta' mill-anqas 0,05 ng aflatossin għandu jkun possibbli. Xi pressjoni b-lura tista tkun rakkommandabbli (e.g. restrittur, tkebbib tat-Teflon jew ta' l-azzar inossidabbli fit-tarf tas-sejjiebi), sabiex inaqqas il-bżieżaq ta' l-arja fiċ-ċellola tan-nixxija. 4.12. Reġistratur tal-grafika tat-tqaxxir. 4.13. Integratur elettroniku (voluntarju). 4.14. Karta ta' filtru skanalaturata, dijametru: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 jew ekwivalenti. 4.15. Filtru tal-membrana bil-pori tad-daqs 0,45 mm, Millipore HAWP 04700 jew ekwivalenti. 4.16. Garafina konika bit-tapp tal-ħġieg, 500 ml. 4.17. Kolonna tal-ħġieġ (diametru interna ta' madwar 1 cm, tul ta' madwar 30 cm) mgħammra bil-ponta Luer. 4.18. Stopcock (vit) Luer reżistenti għall-klorofilla (e.g. Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 jew ekwivalenti). 4.19. Siringa reżistenti għall-kimika, connettur 10 ml Leur. 4.20. Singa tajba għall-injezzjoni HPLC ta' 250 ml (ara 4.5). 4.21. Mikrisiringa 100 ml għall-preparazzjoni tat-taħlitiet tal-kalibrazzjoni (ivverifika li l-eżattezza tkun fi ħdan 2 %, permezz ta' l-użin). 4.22. Tubi ikkalibrati 10 ml bit-tapp tal-ħġieġ. 4.23. Spektrofotometru, tajjeb biex iwettaq kejl fir-reġjun UV tal-ispektru. 4.24. Apparat għat-test tal-konformità (6). 4.24.1. Lembut tas-separazzjoni, 100 ml, imlaħlaġ bl-aċidu, bil-vit tat-Teflon. 4.24.2. Blokka tas-sħana, 40 sa 50 °C. 5. Proċedura 5.1. Tħejjija tl-kampjun. Isħaq il-kampjun hekk li jkun jista jgħaddi mill-għarbiel (4.2). 5.2. Porzjon tat-test. Iżen 50 g tal-kampjun ippreparat tat-test għal ġewwa garafina konika (4.16). 5.3. Estrazzjoni; Żid 25 g ta' Ċelit (3.8), 250 ml ta' kloroform (3.1.) u 25 ml ta' ilma mal-porzjon tat-test (5.2). Għamel it-tapp fuq il-garafina, u ċekċek għal 30 minuta fuq ċekċieka mekkanika (4.3). Iffiltra mill-karta skanalaturata tal-filtru (4.14). Iġbor 50 ml tal-filtrat. Jekk meħtieġ, hu alikwott tal-filtratt u dewbu għall-50 ml bil-kloroform hekk li l-konċentrazzjoni ta' l-aflatossin B1 ma tkun akbar minn 4 ng/ml. 5.4. Naddaf (il-proċedura għandha tkun imwettqa mingħajr interruzzjonijiet sinifikanti). Attenzjoni: - ipprottieġi l-laboratorju, ta; fejn isseħħ l-analiżi, b'mod adekwat mid-dawl tal-jum. Dan jista jseħħ b'mod effettiv bl-użu ta': (i) Liega li tassorbixxi l-UV għal fuq it-twieqi flimkien ma dawl baxx (l-ebda dawl dirett tax-xemx); (ii) Purtieri jew dendili flimkien ma dawl artifiċjali (tubi florixxenti huma aċċettabbli); - Taħlitiet li jkun fihom l-aflatossin għandhom ikunu mħarsa mid-dawl kemm jista jkun possibbli (żommhom fid-dlan, uża l-liega ta' l-aluminju). 5.4.1. Purifikazzjoni Florisil SEP-PAK 5.4.1.1. Preparazzjoni ta' l-assemblea tal-kartuċċa kolonna: Waħħal it-vit (4.18) ma l0istemma l-qasirata' kartuċċa Florisil (3.9) (ara l-figura 1). Aħsel il-kartuċċa u neħħi l-ghħajnuna billi tieħu 10 ml kloroform (3.1) u għaddi malajr 8 ml mil-vit matul il-kartuċċa bl-użu ta' siringa (4.19). Waħħal l-istemma t-twila tal-kartuċċa ma kolonna tal-ħġieġ (4.17) u għaddi il-kumplament ta' 2 ml klororofm mill-kartuċċa lejn il-kolonna. Għalaq il-vit. Neħħi s-siringa. 5.4.1.2. Purifikazzjoni: Żid il-filtrat miġbur fi 5.3 ma l-assemplea tal-kartuċċa-kolonna u saffi bil-gravità. Laħlaħ bi 5 ml ta' kloroform (3.1), segwi bi 20 ml ta' metanol (3.2). Warrab it-tisfija. Matul dawn l-operazzjonijiet, assigura li l-assemblea tal-kartuċċa-kolonna ma tinxiefx. Saffi l-aflatossin B1 bi 40 ml tat-taħlita aċetun-ilma (3.5.1) u iġbor it-tisfija kollha fil-garafina tal-qiegħ tond ta' l-evaporatur rotanti (4.4). Ikkonċentra t-tisfija fuq l-evaporatur rotanti fi 40 °C sa 50 °C sa kemm l-ebda aċetun ma jkun aktar distillat. (NB. F'dan il-punt, madwar 0,5 ml tal-likwidu jibqa fil-garafina. Esperimenti wrew li aktar evaporazzjoni ma tkunx ta' ħsara u li meta jkun baqa' 0,5 ml tal-likwidu, ma jkun hemm l-ebda ammont sinifikati ta' aċetun. Residwi ta' l-aċetun jistgħu iwasslu għal-telfien ta' l-aflatossin B1 fuq il-kartuċċa C18). Żid 1 ml ta' metanol (3.2), obrom il-garafina sabiex iddewweb l-aflatossin B1 fuq il-ġemb tal-garafina, żid 4 ml ilma, u ħawwad. Neħħi u warrab il-kartuċċa. Laħlaħ il-kolonna tal-ħġieġ bl-ima u żomm għal pass tal-purifikazzjoni C18. 5.4.2. Purifikazzjoni C18 SEP-PAK 5.4.2.1. Preparazzjoni ta' l-assemblea tal-kartuċċa-kolonna. Waħħal il-vit (4.18) ma l-istemma l-qasira tal-kartuċċa C18 (3.10) (ara l-figura 1). Ikkarga l-kartuċċa u neħħi kwalunkwe arja billi tgħaddi 10 ml metanol (3.2) b'ħeffa mill-vit matul il-kartuċċa bis-siringa (4.19) (Il-bżieżaq ta' l-arja fil-kartuċċa huma viżibbli bħala tikkek tad-dawl jew inkella fuq sfond griż). Ħu 10 ml ilma, u għaddi 8 ml matul il-kartuċċa (Evita l-introduzzjoni ta' l-arja fil-kartuċċa, meta tkun qiegħed taqleb mill-metanol għall-ilma). Waħħal l-istemma t-twila tal-kartuċċa ma kolonna tal-ħġieġ (4.17) u għaddi il-kumplament ta' 2 ml mill-kartuċċa lejn il-kolonna. Għalaq il-vit. Neħħi s-siringa. 5.4.2.2. Purifikazzjoni: Trasferixxi l-estratt miġbur fi 5.4.1.2 b'mod kwantitattiv lejn kolonna tal-ħġieġ (4.17), laħlaħ darbtejn il-garafina bi 5 ml taħlita ta' ilma/metanol (3.5.2) u saffi bil-gravità. Matul dawn l-operazzjonijiet, assigura li l-assemblea tal-kartuċċa-kolonna ma tinxiefx. (Meta jiżviluppaw il-bżieżaq ta' l-arja fil-kostrizzjoni qrib il-kartuċċa, waqqaf in-nixxija u taptap in-naħa ta' fuq tal-kolonna, sabiex tneħħi l-bżieżaq ta' l-arja. Imbagħad kompli). Saffi bi 25 ml taħlita ilma/metanol. Warrab it-tisfija. Saffi l-aflatossin B1 bi 50 ml taħlita ilma/aċetun (3.5.3), u iġbor it-tisfija kollha f'garafina volumetrika 50 ml. Wassal sal-marka bl-ima u ħawwad. It-taħlita riżultanti tat-test hija wżata għall-kromatografija (5.5). Attenzjoni: Il-filtrazzjoni ta' l-estratt finali qabel il-HPLC normalment ma jkunx meħtieġ. Jekk ikun meqjus bħala meħtieġ, filtri taċ-ċellulosi ma jkunux użati, minħabba li dan jista jwassal għal telf ta' l-aflatossin B1. Filtri tat-Teflon huma aċċettabbli. 5.5. Kromatografija likwida ta' mġieba għolja (Ara l-Figura 2 għall-assemblar ta' l-apparat). Ippermetti żmien biż-żejjed għall-kondizzjonar u l-istabbilizzar tal-istrumenti. Nota 1: Ir-rati tan-nixija kif mhurija għall-fażi mobbli u r-reaġent ta' wara-il-kolonna huma biss indikattivi. Dawn jistgħu ikunu jeħtieġu aġġustament, jiddependi mill-karatteristiċi tal-kolonna HPLC. Nota 2: Ir-reazzjoni tas-sejjiebi għall-aflatossin B1 tiddependi mit-temperatura, għalhekk kumpens għandu jsir għaċ-ċaqlieq (ara l-Figura 3). Bl-injezzjoni ta' ammont fiss ta' l-aflatossin B1 bġala referenza normali (3.13.3) matul intervalli regulari (i.e. kull tlett injezzjonijiet), il-valuri quċċata ta' l-aflatossin B1 bejn dawn ir-referenzi normali jistgħu ikunu ikkorreġuti bl-użu tar-reazzjoni medja, basta li d-differenza bejn ir-reazzjoni konsekuttivi tan-normi ta' referenza tkun ferm żgħira (< 10 %). Għalhekk l-injezzjonijiet għandhom iseħħu mingħajr interruzzjonijiet. Jekk interruzzjoni tkun meħtieġa, l-aħħar injezzjoni qabel l-interruzzjoni u l-ewwel injezzjoni wara l-interruzzjoni għandhom ikunu n-norma ta' referenza (3.13.3). Minħabba li l-kurva tal-kalibrazzjoni hija lineari u tgħaddi matul l-oriġini, l-ammonti ta' l-aflatossin B1 fl-estratti tal-kampjun huma determinati direttament b'referenza għan-normi tal-biswit. 5.5.1. It-tqegħid tal-pompa HPLC: Ikkalibra l-pompa HPLC (4.5) sabiex ikun hemm nixxija 0,5 jew 0,3 ml/min għal 5 mm jew 3 mm kolonna HPLC (4.6) rispettivament bl-użu tal-fażi mobbli (3.6). 5.5.2. Ikkalibrar tal-pompa ta' wara-il-kolonna: Ikkalibra l-pompa (4.7) sabiex ikun hemm nixxija ta' 0,2 sa 0,4 ml/min ta' taħlita ta' ilma saturat bil-jodju (3.7). Bħala gwida ġenerali: Nixxijiet ta' madwar 0,4 jew 0,2 ml/min huma rakkommandabbli flimkien ma nixxijiet ta' 0,5 u 0,3 ml/min tal-pażi mobbli (3.6) rispettivament. 5.5.3. Sejjiebi florixxenti: Ikkalibra s-sejjiebi florixxenti (4.11) sabiex iwettaq = 365 nm u em = 435 nm (strument tal-filtraġġ; > 400 nm). Aġġusta l-attwnnatur tas-sejjiebi sabiex takkwista madwar 80 % diflezzjoni ta' skala sħiħa tal-pinna tar-reġistratur għal kull 1 ng ta' aflatossin B1. 5.5.4. Injettur: Għas-soluzzjonijiet kollha, injetta 250 ml ammonti skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur ta' l-injettur. 5.5.5. Verifika tas-separazzjoni kromatografika Injetta t-taħlita tat-test kromatografiku (3.14.1). In-niżliet għandhom ikunu anqas minn 5 % tas-somma ta' l-għoljiet tal-quċċata ta' quċċata taal-biswit. 5.5.6. Ivverifika l-istabbilita tas-sistema: Qabel kull serje ta' l-analiżi, rispettivament injetta t-taħlita normali ta' referenza (3.13.3), sakemm żoni ta' quċċata stabbli jkunu akkwistati (NB. Reazzjonijiet quċċata għall-aflatossin B1 bnejn injezzjonijiet konsekuttivi m'għandhomx ikollom differenza ta' aktar minn 6 %). Ipproċedi mingħajr dewmien bill-verifika lineari (5.5.7). 5.5.7. Verifika tal-linearità: Injetta t-taħlitiet tal-kalibrazzjoni aflatossin B1 (3.13.1 sa 3.13.4). Kull tielet injezzjoni uża t-taħlita normali ta' referenza (3.13.3), għaċ-ċaqlieq tal-korrezzjoni b'reazzjoni (NB. Ir-reazzjonijiet tal-quċċata għal din it-taħlita normali ta' referenza m'għandhiex tkun tiddifferixxi b'aktar minn 10 % fi 90 minuta). Ikkorreġi ċ-ċaqlieq skond il-formula fi 7. Il-grafika tal-kalibrazzjoni għandha tkun lineari u tgħaddi matul l-oriġini, fi ħdan darbtejn l-iżball normali ta' Y-stima. Il-valuri misjuba m'għandomx jiddifferixxu b'aktar minn 3 % mill-valuri nominali. Jekk dawn il-ħtiġiet ikunu mwettqa, kompli mingħajr dewmien. Jekk le, identifika u ikkorreġi s-sorsi tal-problema qabel ma tkompli. 5.5.8. Injezzjoni ta' l-estratti tal-kampjun: Injetta l-estratti tal-kampjun purifikat (5.4.2.2). Wara kull żewġ estratti tal-kampjun, irrepeti l-injezzjoni tat-taħlita normali ta' referenza (3.13.3) skond is-sekwenza li ġejja: Taħlita normali ta' referenza, estratt, estratt, taħlita normali ta' referenza, estratt, estratt, taħlita normali ta' referenza, eċċ. 6. Test tal-konferma 6.1. Aktar trattament ta' l-estratt (5.4.2.2). Żid 5 ml taħlita tal-klorat tas-sodju (3.15.1) sa l-estratt finali akkwistat fi 5.4.2.2. Ħu estratt tlett darbiet kull waħda bi 2 ml kloroform (3.1) għal minuta waħda, fil-lembut tas-separazzjoni (4.24.1). Ferra l-estratti magħquda tal-kloroform matul madwar 1 g sulfat tas-sodju (3.15.2) għal ġewwa 10 ml tubu tat-testijiet. Lembut żgħir (diametru: 4 cm) jista jkun wżat ma biċċa tajjar fil-kostrizzjoni, mgħotti b'madwar 1 g sulfat tas-sodju. Aħsel is-saff tas-sulfat tas-sodju fi ftit ml ta' kloroform u iġbor il-ħasil fl-istess tubu tat-testijiet. Evapora l-estratt tal-kloroform għal tnixxif fl-istess tubu tat-testijiet bl-użu ta' blokka tas-sħana (2.24.2) u dewweb mill-ġdid fi 1 ml ta' kloroform. 6.2. Preparazzjoni tad-derivattiva u kromatografija tas-saff irqieq: Ara l-Anness tad-Direttiva tal-Kunsill 76/372/KEE, il-metodu A, il-punt 5.6.2. 7. Kalkolazzjoni tar-riżultati tal-kontenut aflatossin B1 (mm/kg) preżenti fil-kampjun, bl-użu tal-formula: Kontenut aflatossin B1 fi mg/kg = m × V V × M × VfVc meta: M m = P + P × 2 r st P (kampjun) = żona tal-quċċata ta' aflatossin B1 tal-kampjun P (st1) = żona tal-quċċata ta' aflatossin B1 li tiorriżulta mill-injezzjoni preċedenti tat-taħlita normali ta' referenza (3.13.3) P (st2) = żona tal-quċċata ta' aflatossin B1 li tirriżulta mill-injezzjoni segwentu tat-taħlita normali ta' referenza (3.13.3) r (st) = ammont in jettat ta' aflatossin B1 fit-taħlita normali ta' referenza (3.13.3) fib g Vm = volum ta' l-estratt tal-kampjun injettat fi ml V ext = volum final ital-kampjun estratt fi ml, billi tippermetti għal xi trattib li kien sar (5.3) M = massa tal-kampjun fi g Vf = volum tal-filtrat trasferit lejn il-kartuċċa Florisil (5.4.1.2) fi ml Vc = volum tal-kloroform, użat għall-estrazzjoni tal-kampjun fi ml. Jekk il-proċedura tkun segwita bħal f'dan il-protokoll, il-formula tkun imqassra għal: Kontenut aflatossin B1 fi mg/kg = 20 × m. 7.1. Kalkozzajonijiet tar-riżultati tista wkoll titwettaq bil-kejl ta' l-għoli tal-quċċata. 8. Repetabbilità: Ara taħt 10.1 9. Reproduċibbiltà: Ara taħt 10.1 10. Osservazzjonijiet: 10.1. Preċiżjoni: Studju kollaborattiv [1] imwettaq f'livell internazzjonali fuq materjali mħallta ta' l-għalf taw riżultati għar-repetabbilità u reproduċibbiltà indikati fit-Tabella 1. It-terminu repetabbiltà (r) użat hawnhekk huwa definit bħala l-akbar relattivita li ma tkunx sinifikanti b'livell ta' probabbiltà ta' 95 % għat-tqabbil maż-żewġ qari ta' l-istess kampjun fl-istess laboratorju bl-istess kondizzjonijiet. It-terminu reproduċċibbiltà (R) huwa l-istess definit għal tqabbil bejn żewġ laboratorji differenti. Bi qbil ma ISO 3534 - 1977, 2.35 [2] u d-Deċiżjoni tal-Kummissjoni 89/610/KEE [3] r u R huma wkoll mogħtija fit-Tabella 1 f'termini ta' ko-effiċjenti ta' varjazzjoni. Tabella 1: Repetabbiltà (r) u reproduċċibbiltà (R) espressi bħala relattivitajiet u ko-effiċjenti korrespondenti tal-varjazzjoni (15 il-laboratorju) Livell | r | R | CVr [4] | CVR | (mg/kg) | | | (%) | (%) | 8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 | "CV 10.2. Stabbilizzazzjoni tal-kloroform (3.1): Il-karatteristiċi ta' assorbazzjoni tal-kartiċċa Florisil jistgħi jinbidlu jekk stabilizzaturi oħrajn, apparti milli etanol, ikunu wżati. Dan għandu jkun verifikat bi qbil ma 10.3 meta l-kloroform deskritt ma jkunx disponibbli. 10.3. Eżatezza: L-applikazzjonijiet korretti tal-metodu għandhom ikunu verifikati billi jkun hemm kejn repetut fuq materjali ċertifikati ta' referenza. Jekk dawn ma jkunux disponibbli; l-imġieba tal-metodu għandha tkun verifikata bl-irkupru ta' l-esperimenti imwettqa fuq kampjuni fl-imbjank. Id-devjazzjoni tal-medja mill-valur aattwali, espressa bħala persentaġġ tal-valur attwali, m'għandhiex tkun il-barra mill-limiti 20 sa + 10 %. +++++ TIFF +++++ Figura 1: Assemblea tal-kartuċċa-kolonna +++++ TIFF +++++ Figura 2: Diagramma tan-nixxija tas-sistema LC bil-wara-kolonna tal-jodju, reazzjoni tad-devjazzjoni tal-medja ta' normi ta' referenza tal-biswit, referenza taż-żmien ta' l-estratt normali (jew kalibrant) estratt (jew kalibrant) estratt normali ta' referenza (jew kalibrant). +++++ TIFF +++++ Figura 3:Kummpens għaċ-ċaqlieq fir-reazzjoni ta' l-aflatossin B1 bl-injezzjoni tan-norma ta' referenza (3.13.3) matul intervalli regolari'" [1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Addittivi u Kontaminati ta' l-Ikel 8, 17-29. [2] ISO 3534-1977. [3] ĠU L 351, tat-2.12.1989, p. 39. [4] "varjazzjoni tal-ko-effiċjent. --------------------------------------------------