Official Journal L 329 , 30/12/1993 P. 0054 - 0062

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 54 P. 0186

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 54 P. 0186



It-Tnax-Il Direttiva tal-Kummissjoni 93/117/KE tas-17 ta’ Diċembru 1993 li tistabbilixxi l-metodi ta’ analiżi tal-Komunità għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf tal-bhejjem IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE tal-20 ta’ Lulju 1970 dwar id-dħul ta’ metodi tal-Komunità ta’ ġbir ta’ kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf tal-bhejjem [1], kif l-aħħar emendata mir-Regolament (KEE) Nru 3768/85 [2], u b’mod partikolari l-Artikolu 2 tiegħu, Billi d-Direttiva 70/373/KEE teħtieġ li l-kontrolli uffiċjali fuq l-għalf tal-bhejjem għall-fini tal-verifika ta’ l-osservanza mal-ħtiġiet li joriġinaw mid-disposizzjonijiet dwar il-kwalità u l-komposizzjoni stabbiliti b’liġi, regolament jew azzjoni amministrattiva għandhom itwettqu bl-użu tal-metodi tal-Komunità ta’ ġbir ta’ kampjuni u ta’ analiżi; Billi l-metodi tal-Komunità ta’ analiżi għall-addittivi robenidine u methyl benzoquate għandhom ikunu stabbiliti għall-użu fil-verifikar ta’ l-osservanza mal-kondizzjonijiet għall-użu tiegħu fl-għalf għall-bhejjem; Billi l-miżuri previsti f’din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti dwar l-Għalf tal-Bhejjem, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Istati Membri għandhom jinħtieġu li l-analiżi mmexxija tul il-kontrolli uffiċjali fuq l-għalf tal-bhejjem biex jidentifikaw il-kontenut ta’ robenidine u methyl benzoquate jsir bl-użu tal-metodi deskritti fl-Anness għal din. Artikolu 2 L-Istati Membri għandhom iġibu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa għall-osservanza ta’ din id-Direttiva sat-30 ta’ Novembru 1994 l-aktar tard u għandhom minnufih jinformaw lill-Kummissjoni ta’ dan. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn id-disposizzjonijiet, dawn għandu jkollhom referenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b’dik ir-referenza mal-waqt tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-proċedura għal dik ir-referenza għandha tiġi adottata mill-Istati Membri. Artikolu 3 Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Magħmula fi Brussel, fis-17 ta’ Diċembru 1993. Għall-Kummissjoni René Steichen Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, pġ. 2. [2] ĠU L 362, tal-31.12.1985, pġ. 8. -------------------------------------------------- ANNESS 1. ID-DETERMINAZZJONI TA’ ROBENIDINE 1,3-bis[(4-chlorobenzylidene)amino] guanidine-hydrochloride 1. Fini u skop Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ robenidine fl-għalf tal-bhejjem. il-limitu ta’ determinazzjoni l-aktar baxx ikun 5 mg/kg. 2. Il-prinċipju Il-kampjun huwa estratt b’methanol aċiduż. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwot ikun soġġett għal tindifa sewwa fuq kolonna ta’ l-aluminju ossidu. Ir-Robenidine titneħħa bil-ħasil tal-methanol wara li tkun ippenetrata fil-kolonna, tiġi kkonċentrata, u mogħtija volum adatt bil-fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidine huwa ddeterminat minn kromatografija likwida ta’ kapaċità għolja (HPLC) fuq fażi kuntrarja bl-użu ta’ rilevatur UV. 3. Reaġenti 3.1. Methanol 3.2. Methanol li sar aċiduż Ittrasferixxi 4,0 ml ta’ l-aċidu idrokloriku (P20c., 1,18 g/ml) ġo’ flixkun gradwat ta’ 500 ml, tella’ sal-marka bil-methanol (3.1) u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha tkun ippreparata b’mod frisk qabel l-użu. 3.3. Acetonitrile, grad HPLC 3.4. Passatur molekulari Tat-tip 3A, minn 8 sa 12-il żibġa tal-malja (1,6-2,5 mm żibeġ, alumino-silicate kristallina, id-dijametru tal-pori 0,3 mm) 3.5. Ossidu ta’ l-aluminju: grad I ta’ l-attività aċiduża għal kromatografija bil-kolonni Ittrasferixxi 100 g ossidu ta’ l-aluminju ġo’ kontenitur adatt u żied 2,0 ml ilma. Agħmel it-tapp u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 20 minuta. Aħżen f’kontenitur li għandu t-tapp magħluq sew. 3.6. Soluzzjoni tal-, c = 0,025 mol/l Ħoll 3,40 g ta’ potassium dihydrogen phosphate fl-ilma (grad HPLC) ġo’ flixkun gradwat ta’ 1000 ml, tella’ sal-marka u ħawwad. 3.7. Soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Ħoll 3,55 g ta’ di-sodium hydrogen phosphate anidru (jew 4,45 g ta’diidrat jew 8,95 g ta’ dodekaidrat) fl-ilma (grad HPLC) ġo flixkun gradwat ta’ 1,000 ml, tella’ sal-marka u ħawwad. 3.8. Fażi mobbli HPLC Ħawwad flimkien ir-reaġenti li ġejjin: 650 ml ta’ acetonitrile (3.3), 250 ml ta’ ilma (grad HPLC), 50 ml tas-soluzzjoni potassium di-hydrogen phosphate (3.6), 50 ml tas-soluzzjoni di-sodium hydrogen phosphate (3.7). Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (4.6) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni, (bħala eżempju b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). 3.9. Sostanza standard Robenidine pura: 1.3-bisġ4-chlorobenzylidene)aminoħ guanidine hydrochloride, E 750. 3.9.1. Soluzzjoni standard ta’ l-istokk ta’ Robenidine: 300 μg/ml: Iżen sa l-eqreb 0,1 mg, 30 mg ta’ sostanza standard ta’ robenidine (3.9). Ħoll f’methanol li sar aċiduż (3.2) ġo flixkun gradwat ta’ 100 ml, tella’ sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Geżwer il-flixkun bil-fojl ta’ l-aluminju u aħżen f’post mudlam. 3.9.2. Soluzzjoni standard intermedjarja ta’ Robenidine: 12 μg/ml Ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ l-istokk (3.9.1) ġo’ flixkun gradwat ta’ 250 ml, tella’ sal-marka b’fażi mobili (3.8) u ħawwad. Geżwer il-flixkun bil-fojl ta’ l-aluminju u aħżen f’post mudlam. 3.9.3. Soluzzjonijiet bil-kalibrar F’serje ta’ fliexken kalibrati ta’ 50 ml, ittrasferixxi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 u 25,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedjarja (3.9.2). Tella’ sal-marka bil-fażi mobili (3.8) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 u 6,0 μg/ml ta’ robenidine rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom ikunu ppreparati b’mod frisk qabel l-użu. 4. L-apparat 4.1. Kolonna tal-ħġieġ Mibnija mill-ħġieġ ta’ l-ambra mwaħħla b’stopcock u depożitu ta’ kapaċità ta’ bejn wieħed u ieħor 150 ml, dijametru intern ta’ 10 sa 15 mm, tul ta’ 250 mm. 4.2. Shaker bl-azzjoni tal-polz fil-laboratorju 4.3. Evaporatur ta’ films li jaħdem b’sistema rotatorja 4.4. Tagħmir HPLC b’rilevatur ta’ l-ultravjola b’wavelength varjabbli jew rilevatur diode array li jaħdem fil-marġni ta’ bejn 250 u 400 mm 4.4.1. Kolonna kromatografika tal-likwidu: Ippakkjar 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm jew l-ekwivalenti 4.5. Karta filtranti tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman GF/A jew l-ekwivalenti) 4.6. Filtri tal-membrana, 0,22 μm 4.7. Filtri tal-membrana, 0,45 μm 5. Il-proċedura Nota: Ir-Robenidine hija sensittiva għad-dawl. Oġġetti tal-ħġieġ ta’ l-ambra għandhom jintużaw fl-operazzjonijiet kollha. 5.1. Ġenerali 5.1.1. Materjal vojt għandu jkun analizzat biex ikun kontrollat li la r-robenidine u lanqas s-sostanzi li jikkaġunaw interferenza ma huma preżenti. 5.1.2. Eżami ta’ rpiljar għandu jitwettaq bl-analiżi tal-materjal vojt (5.1.1) li ssaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ robenidine, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 60 mg/kg, ittrasferixxi 3,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ l-istokk (3.9.1) għal flixkun sura ta’ kon tal-250 ml. Evapora s-soluzzjoni sa c. 0,5 ml fi fluss tan-nitroġenu. Żied 15 g tal-materjal vojt, ħallat u stenna għal 10 minuti qabel ma tipproċedi bl-istadju ta’ l-estrazzjoni (5.2). Nota: għall-fini ta’ dan il-metodu, il-materjal vojt għandu jkun tat-tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi r-robenidine mgħandux jinstab. 5.2. Estrazzjoni Iżen sa l-eqreb 0,01g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal flixkun sura ta’ kon ta’ 250 ml u żied 100,0 ml ta’ methanol li sar aċiduż (3.2), għalaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa waħda fuq is-shaker (4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtranti tal-fibra tal-ħġieġ (4.5) u iġbor il-filtrat kollu ġo’ flixkun sura ta’ kon ta’ 150 ml. Żied passatur molekulari ta’ 7,5 g (3.4), għalaq bit-tapp u ħawwad għal ħamest minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtranti tal-fibra tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-istadju ta’ purifikazzjoni (5.3). 5.3. Purifikazzjoni 5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju Daħħal tapp żgħir tal-ħġieġ f’forma ta’ fibri fini ġol-qiegħ l-aktar baxx tal-kolonna tal-ħġieġ (4.1) u għafsu ’l isfer bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju ppreparat (3.5) u ttrasferixxi għall-kolonna. Għandha tingħata attenzjoni biex jitnaqqas il-kxif għall-arja matul dan l-istadju. Taptap b’mod ġentili l-kolonna mgħobbija fil-qiegħ l-aktar baxx tagħha biex l-ossidu ta’ l-aluminju joqgħod. 5.3.2. Purifikazzjoni tal-kampjun Ittrasferixxi għal fuq il-kolonna bil-pipetta 5,0 ml ta’ l-estratt tal-kampjun ippreparat f’(5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib tal-ħajt tal-kolonna u ħalli lis-soluzzjoni tkun assorbita mill-ossidu ta’ l-aluminju. Neħħi bil-ħasil ir-robenidine mill-kolonna wara li tkun ippenetrata bl-użu ta’ 100 ml methanol (3.1), b’rata ta’ ġiri ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa ġo’ flixkun bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-methanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa ta’ 40 C permezz ta’ evaporatur ta’ films li jaħdem b’sistema rotatorja (4.3). Erġa’ ħoll ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobili (3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv għal flixkun gradwat ta’ 10 ml. Rinse the flask with several 1 to 2 ml portions of mobile phase and transfer these rinsings to the graduated flask Tella’ sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn 0,45 μm (4.7). Irriżerva din is-soluzzjoni għal determinazzjoni HPLC (5.4). 5.4. Determinazzjoni ta’ HPLC 5.4.1. Parametri Il-kondizzjonijiet li ġejjin qed jiġu offerti bħala gwida, kondizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw sakemm jipproduċu riżultati ekwivalenti: Kolonna kromatografika tal-likwidu (4.4.1), Fażi mobili HPLC (3.8), Rata tal-ġiri: 1,5 sa 2 ml/minuta, Wavelength tar-rilevatur: 317 nm, Volum ta’ l-injezzjoni: 20 sa 50 μl. Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) li fiha jinsab 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm l-aqwa għoli kostanti u l-ħinijiet ta’ pussess jintlaħqu. 5.4.2. Graff ta’ kalibrar Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) diversi drabi u kejjel l-aqwa għoli (l-erji) għal kull konċentrazzjoni. Immarka l-kurva tal-kalibrar bl-użu ta’ l-aqwa għoljiet tal-medja jew erji tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala axxiżi. 5.4.3. Soluzzjoni tal-kampjun Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, bl-użu ta’ l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-aqwa għoli tal-medja (erja) ta’ l-aqwa tar-robenidine. 6. Kalkolu tar-riżultati Mill-għoli tal-medja (erja) ta’ l-aqwa tar-robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.4.2). Il-kontenut tar-robenidine w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula li ġejja: w = li fiha: c = konċentrazzjoni ta’ robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml, m = massa tal-pożizzjoni tat-test f’grammi. 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. Identità L-identità ta’ l-analyte tistà tigi kkonfermata b’ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ rilevatur diode-array li bih l-ispettri ta’ l-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.9.3) li fihom 6 μg/ml jiġu mqabbla. 7.1.1. Ko-kromatografija Estratt tal-kampjun jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3). L-ammont ta’ robenidine miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidine misjub fl-estratt tal-kampjun. L-għoli ta’ l-aqwa tar-robenidine għandha titkabbar wara li jittieħed kont kemm ta’ l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni ta’ l-estratt. L-aqwa wisa’, f’nofs it-tul massimu tagħha, għandha tkun bejn wieħed u ieħor ’il ġewwa minn 10 % tal-wisa’ oriġinali. 7.1.2. Rilevazzjoni diode-array Ir-riżultati jkunu kkalkulati skond il-kriterji li ġejjin: (a) il-wavelength tal-massimu assorbiment tal-kampjun u ta’ l-ispettri standard, irreġistrat fl-aqwa quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mill-abbiltà li tiddistingwi oġġetti żgħar ħafna jew imrassin ma’ xulxin tas-sistema ta’ rilevazzjoni. Għar-rilevazzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor ’il ġewwa minn 2 nm; (b) bejn 250 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-aqwa quċċata fuq il-kromatogramma, mgħandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet ta’ l-ispettru ’il ġewwa mill-medda ta’ bejn 10 u 100 % ta’ l-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u fl-ebda punt ta’ osservazzjoni d-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri jaqbeż il-15 % ta’ l-assorbiment ta’ l-analyte standard; (ċ) bejn 250 u 400 nm, l-ispettri ta’ ’il fuq, il-quċċata u ‘l isfel ta’ l-aqwa prodott mill-estratt tal-kampjun mgħandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet ta’ l-ispettru ‘il ġewwa mill-medda ta’ bejn 10 u 100 % ta’ l-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti kollha ta’ osservazzjoni d-devjazzjoni bejn l-ispettri ma jaqbiżx il-15 % ta’ l-assorbiment ta’ l-ispettru tal-quċċata. Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jintlaħaqx il-preżenza ta’ l-analyte ma jkunx ġie kkonfermat. 7.2. Abbiltà li jista’ jkun ripetut Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun mgħandhomx jaqbżu l-10 % tar-riżultat ogħla għall-kontenut tar-robenidine ogħla minn 15 mg/kg. 7.3. Irkupru Għall-kampjun vojt imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun ta’ mill-anqas 85 %. 8. Ir-riżultati ta’ studju kollaborattiv Studju kollaborattiv kien organizzat mill-Komunità li fih erba’ kampjuni ta’ l-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma ta’ ikla jew ta’ pilloli żgħar kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Analiżi duplikati twettqu fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella hawn taħt: Sr = standarddeviation ta' l-abbiltà li jista' jkun ripetut. CVr = ko-effiċjent tal-varjazzjoni ta' l-abbiltà li jista' jkun ripetut SR = standarddeviation tar-riproduċibilità CVR = ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità. | Tajr | Fenek | Ikla | Pillola Żgħira | Ikla | Pillola Żgħira | Medja mg/kg | 27,00 | 27,99 | 43,6 | 40,1 | Sr (mg/kg) | 1,46 | 1,26 | 1,44 | 1,66 | CVr (%) | 5,4 | 4,5 | 3,3 | 4,1 | SR (mg/kg) | 4,36 | 3,36 | 4,61 | 3,91 | CVR (%) | 16,1 | 12,0 | 10,6 | 9,7 | Irkupru (%) | 90,0 | 93,3 | 87,2 | 80,2 | 2. DETERMINAZZJONI TA’ METHYL BENZOQUATE 7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone 1. Fini u skop Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ methyl benzoquate fl-għalf tal-bhejjem. Il-limitu l-aktar baxx ta’ determinazzjoni huwa ta’ 1 mg/kg. 2. Il-prinċipju Il-Methyl benzoquate jiġi estratt mill-kampjun bis-soluzzjoni aċida methanolic methanesulfonic. L-estratt jiġi ppurifikat bil-dichloromethane, bil-kromatografija tal-bdil ta’ jone u mbagħad darb’oħra bid-dichloromethane. Il-kontenut tal-methyl benzoquate huwa ddeterminat minn kromatografija likwida ta’ kapaċità għolja (HPLC) fuq fażi kuntrarja bl-użu ta’ rilevatur UV. 3. Reaġenti 3.1. Dichloromethane 3.2. Methanol, grad HPLC 3.3. Fażi mobili HPLC: taħlita ta’ methanol (3.2) u ilma (grad HPLC) 75 + 25 (v + v). Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (4.5) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (bħala eżempju bl-ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). 3.4. Soluzzjoni ta’ l-aċidu Methanesulfonic, σ = 2 % Iddilwixxi 20,0 ml ta’ l-aċidu tal-methanesulfonic ma’1000 ml bil-methanol (3.2). 3.5. Soluzzjoni ta’ l-aċidu idrokloriku, σ = 10 % Iddilwixxi 100 ml ta’ l-aċidu idrokloriku (P20 c. 1,18 g/ml) ma’ 1000 ml bl-ilma. 3.6. Ir-raża tal-bdil ta’ cation Amberlite CG-120 (Na), bil-malja100 sa 200. Ir-raża hija pre-trattata qabel l-użu: ħallat 100 g tar-raża li hi insolubbli ma’ 500 ml tas-soluzzjoni ta’ l-aċidu idrokloriku (3.5) u saħħan fuq apparat li jsaħħan sa kemm jagħli, u ħawwad b’mod kontinwu. Ħallih jiksaħ u ferra’ l-aċidu minn flixkun għal ieħor mingħajr ma jqanqal il-fond. Iffiltra minn karta filtranti taħt vakwu. Aħsel ir-raża darbtejn b’porzjonijiet ta’ 500 ml ta’ ilma u mbagħad b’250 ml tal-methanol (3.2). Laħlaħ ir-raża b’porzjoni oħra ta’ 250 ml tal-methanol u nixxef billi tgħaddi l-arja mill-filter cake. Aħżen ir-raża mnixxfa ġo’ flixkun bit-tapp. 3.7. Sustanza standard: methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) pur. 3.7.1. Soluzzjoni standard bl-istokk tal-methyl benzoquate, 500 μg/ml Iżen sa l-eqreb 0,1 mg, 50 mg tas-sustanza standard (3.7), ħoll fis-soluzzjoni ta’ l-aċidu methanesulfonic (3.4) ġo’ flixkun gradwat tal-100 ml, tella’ sal-marka u ħallat. 3.7.2. Soluzzjoni standard intermedju tal-methyl benzoquate, 50 μg/ml Ittrasferixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ l-istokk tal-methyl benzoquate (3.7.1) ġo’ flixkun gradwat tal-50 ml, tella’ sal-marka bil-methanol (3.2) u ħallat. 3.7.3. Soluzzjonijiet ta’ kalibrar Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 5,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedju tal-methyl benzoquate (3.7.2) f’serje ta’ fliexken gradwati tal-25 ml. Tella’ sal-marka bil-fażi mobili (3.3) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta’ 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 u 10,0 μg/ml tal-methyl benzoquate rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom ikunu preparati b’mod frisk qabel l-użu. 4. L-apparat 4.1. Shaker tal-laboratorju 4.2. Evaporatur tal-films li jaħdem b’sistema rotatorja 4.3. Kolonna tal-ħġieġ (250 mm × 15 mm) imwaħħla b’stopcock u depożitu ta’ kapaċità ta’ bejn wieħed u ieħor 200 ml. 4.4. Tagħmir ta’ l-HPLC b’rilevatur ta’ l-ultravjola ta’ wavelength varjabbli jew rilevatur diode-array. 4.4.1. Kolonna kromatografika tal-likwidu: or equivalent300 mm × 4 mm, C-18, 10 μm jew l-ekwivalenti 4.5. Filtri tal-membrana, 0,22 μm 4.5. Filtri tal-membrana, 0,45 μm 5. Il-proċedura 5.1. Ġenerali 5.1.1. Materjal vojt għandu jkun analizzat biex ikun kontrollat li la l-methyl benzoquate u lanqas sostanzi li jikkaġunaw interferenza ma jkunu preżenti. 5.1.2. Għandu jitwettaq eżami ta’ rpiljar billi jkun analizzat il-materjal vojt li ssaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità tal-methyl benzoquate, li jixbaħ lil dak preżenti fil-kampjun. Biex isaħħaħ f’livell ta’ 15 mg/kg, żied 600 μl tas-soluzzjoni standard ta’ l-istokk (3.7.1) ma’ 20 g tal-materjal vojt, ħallat u stenna sa 10 minuti qabel ma tipproċedi bl-istadju ta’ l-estrazzjoni (5.2). Nota: għall-fini ta’ dan il-metodu, il-materjal vojt għandu jkun ta’ tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi l-methyl benzoquate mgħandux jinstab. 5.2. Estrazzjoni Iżen sa l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun ippreparat u ttrasferixxi għal flixkun sura ta’ kon tal-250 ml. Żied 100,0 ml tas-soluzzjoni aċida tal-methanesulfonic (3.4) u ħawwad b’mod mekkaniku (4.1) għal 30 minuta. Għaddi s-soluzzjoni minn karta filtranti u żomm il-filtrat għall-istadju tal-qsim likwidu-likwidu (5.3). 5.3. Qsim likwidu-likwidu Ittrasferixxi ġo lenbut li jifred ta’ 500 ml li fih 100 ml tas-soluzzjoni aċida idroklorika (3.5), 25,0 ml tal-filtrat miksub f’(5.2). Żied 100 ml tal-dichloromethane (3.1) ġol-lenbut u ħawwad għal minuta waħda. Ħalli s-safef jinfirdu u skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) ġo flixkun b’qiegħ tond ta’ 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b’żewġ porzjonijiet oħra ta’ 40-ml tad-dichloromethane u ħallat dawn ma’ l-ewwel estratt ġol-flixkun b’qiegħ tond. Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b’sistema rotatorja (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa ta’ 40° C. Ħoll ir-residwu f’20 sa 25 ml tal-methanol (3.2), għalaq il-flixkun b’tapp u żomm l-estratt kollu għal kromatografija tal-bdil ta’ jone (5.4). 5.4. Il-kromatografija tal-bdil ta’ jone 5.4.1. Preparazzjoni tal-kolonna tal-bdil ta’ cation Daħħal tapp tal-ħġieġ f’forma ta’ fibri fini ġol-qiegħ l-aktar baxx tal-kolonna tal-ħġieġ (4.3). Ipprepara taħlita ta’ 5,0 g tar-raża tal-bdil ta’ cation ttrattata (3.6) b’50 ml ta’ l-aċidu idrokloriku (3.5), ferragħ fil-kolonna tal-ħġieġ u ħalliha toqgħod. Skula l-aċidu ż-żejjed eżattament għal fuq il-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna bl-ilma sakemm l-effluwent huwa newtrali għall-karta tat-tornasol. Ittrasferixxi 50 ml tal-methanol (3.2) għal fuq il-kolonna u ħallih joskula ‘l isfel sal-wiċċ tar-raża. 5.4.2. Kromatografija bil-kolonni Permezz ta’ pipetta, ittrasferixxi bl-attenzjoni l-estratt miksub f’(5.3) għal fuq il-kolonna. 5 sa 10 ml tal-methanol (3.2) u ttrasferixxi dawn il-ħasliet għall-kolonna. Skula l-estratt sal-wiċċ tar-raża u aħsel il-kolonna b’50 ml tal-methanol, waqt li tiżgura li r-rata ta’ ġiri ma jaqbiżx il-5ml kull minuta. Armi l-effluwent. Neħħi bil-ħasil il-methyl benzoquate mill-kolonna bl-użu ta’ 150 ml tas-soluzzjoni aċidu methanesulfonic (3,4) u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni mill-kolonna ġo flixkun sura ta’ kon tal-250 ml. 5.5. Qsim likwidu-likwidu Ittrasferixxi s-soluzzjoni li titneħħa bl-elużjoni miksuba f’(5.4.2) ġo’ lenbut li jifred ta’ litru. Laħlaħ il-flixkun sura ta’ kon b’5 sa 10 ml tal-methanol (3.2) u ħallat il-ħasliet mal-kontenuti tal-lenbut li jifred. Żid 300 ml tas-soluzzjoni aċida idroklorika (3.5) u 130 ml tad-dichloromethane (3.1). Ħawwad għal minuta waħda u ħalli l-fażijiet jinfirdu. Skula s-saff l-aktar baxx (dichloromethane) fil-flixkun b’qiegħ tond ta’ 500 ml. Irripeti l-estrazzjoni tal-fażi milwiema b’żewġ porzjonijiet oħra ta’ 70-ml tad-dichloromethane u ħallat dawn l-estratti ma’ l-ewwel estratt ġol-flixkun b’qiegħ tond. Evapora l-estratt tad-dichloromethane sakemm jinxef fuq l-evaporatur b’sistema rotatorja (4.2) li jaħdem taħt pressjoni mnaqqsa ta’ 40° C. Ħoll ir-residwu fil-flixkun b’ 5 ml bejn wieħed u ieħor tal-methanol (3.2) u ttrasferixxi din is-soluzzjoni b’mod kwantitattiv għal flixkun gradwat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-flixkun b’qiegħ tond b’żewġ porzjonijiet oħra ta’ 1 sa 2 ml tal-methanol u ttrasferixxi dawn għall-flixkun gradwat. Tella’ sal-marka bil-methanol u ħallat. Porzjon alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.6). Irriserva din is-soluzzjoni għal determinazzjoni HPLC (5.6). 5.6. Determinazzjoni HPLC 5.6.1. Parametri Il-kondizzjonijiet li ġejjin qed jiġu offruti bħala gwida, kondizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti: - kolonna kromatografika tal-likwidu (4.4.1), - fażi mobili HPLC: taħlita methanol-ilma (3.3), - rata ta’ ġiri: 1 sa 1,5 ml/l-minuta, - wavelength tar-rilevazzjoni: 265 nm, - Volum ta’ l-injezzjoni: 20 sa 50 μl. Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, b’injezzjoni tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.7.3) li fiha 4 μg/ml għal diversi drabi, sakemm l-aqwa għoli jew erji kostanti u l-ħinijiet ta’ pussess jintlaħqu. 5.6.2. Graff ta’ kalibrar Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.7.3) għal diversi drabi u kejjel l-aqwa għoli (l-erji) għal kull konċentrazzjoni. Immarka bl-użu ta’ l-aqwa għoljiet jew erji tal-medja tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxiżi. 5.6.3. Soluzzjoni tal-kampjun Injetta l-estratt tal-kampjun (5.5) għal diversi drabi, bl-użu ta’ l-istess volum bħal dak li ttieħed għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-aqwa għoli (l-erja) medja ta’ l-aqwa tal-methyl benzoquate. 6. Kalkolu tar-riżultati Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’mg/ml mill-għoli (l-erja) medja tal-aqwa tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.6.2). Il-kontenut tal-methyl benzoquate w (mg/kg) tal-kampjun huwa mogħti bil-formula li ġejja: w = li fiha: c = konċentrazzjoni tal-methyl benzoquate tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml, m = massa tal-porzjoni tat-test f’grammi. 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. Identità L-identità ta’ l-analyte tista’ tiġi konfermata bil-ko-kromatografija, jew bl-użu tar-rilevatur diode-array li bih l-ispettri ta’ l-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.7.3) li fihom 10 μg/ml ikunu mqabbla. 7.1.1. Ko-kromatografija Estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni standard intermedju (3.7.2). L-ammont tal-methyl benzoquate miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat tal-methyl benzoquate fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-aqwa tal-methyl-benzoquate biss għandha titkabbar wara li jittieħed kont kemm ta’ l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni ta’ l-estratt L-aqwa wiesgħa, f’nofs it-tul massimu tagħha, għandha tkun bejn wieħed u ieħor ’il ġewwa minn 10 % tal-wiesgħa oriġinali. 7.1.2. Rilevazzjoni diode-array Ir-riżultati jkunu kkalkulati skond il-kriterji li ġejjin: (a) il-wavelength tal-massimu assorbiment tal-kampjun u ta’ l-ispettri standard, reġistrat fl-aqwa quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mill-abbiltà li tiddistingwi oġġetti żgħar ħafna jew imrassin ma’ xulxin tas-sistema ta’ rilevazzjoni. Għar-rilevazzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor ’il ġewwa minn 2 nm; (b) bejn 220 u 350 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-aqwa quċċata fuq il-kromatogramma, mgħandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet ta’ l-ispettru ’il ġewwa mill-medda ta’ bejn 10 u 100 % ta’ l-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u fl-ebda punt ta’ osservazzjoni d-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri jaqbeż il-15 % ta’ l-assorbiment ta’ l-analyte standard; (ċ) bejn 220 u 350 nm, l-ispettri ta’ ‘il fuq, il-quċċata u ‘l isfel ta’ l-aqwa prodott mill-estratt tal-kampjun mgħandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet ta’ l-ispettru ‘il ġewwa mill-medda ta’ bejn 10 u 100 % ta’ l-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti kollha ta’ osservazzjoni d-devjazzjoni bejn l-ispettri ma jaqbiżx il-15 % ta’ l-assorbiment ta’ l-ispettru tal-quċċata. Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jintlaħaqx il-preżenza ta’ l-analyte ma jkunx ġie kkonfermat. 7.2. Abbiltà li jista’ jkun ripetut Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun mgħandhomx jaqbżu: l-10 % relattiv għar-riżultat ogħla għall-kontenuti tal-methyl benzoquate bejn 4 u 20 mg/kg. 7.3. Irkupru Għall-kampjun vojt imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun ta’ mill-anqas 90 %. 8. Ir-riżultati ta’ studju kollaborattiv Ħames kampjuni kienu analizzati minn 10 laboratorji. Analiżi duplikati twettqu fuq kull kampjun. Ir-riżultati n.d. = mhux rilevat. Sr = standarddeviation ta' l-abbiltà li jista' jkun ripetut. CVr = ko-effiċjent tal-varjazzjoni ta' l-abbiltà li jista' jkun ripetut SR = standarddeviation tar-riproduċibilità. CVR = ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità. | Vojt | Ikla 1 | Pillola Żgħira 1 | Ikla 2 | Pillola Żgħira 2 | Medja (mg/kg) | n.d. | 4,50 | 4,50 | 8,90 | 8,70 | Sr (mg/kg) | - | 0,30 | 0,20 | 0,60 | 0,50 | CVr (%) | - | 6,70 | 4,40 | 6,70 | 5,70 | SR (mg/kg) | - | 0,40 | 0,50 | 0,90 | 1,00 | CVR (%) | - | 8,90 | 11,10 | 10,10 | 11,50 | Irkupru (%) | - | 92,00 | 93,00 | 92,00 | 89,00 | --------------------------------------------------