“ANNESS XVIII

ID-DETERMINAZZJONI TAD-DIFFERENZA BEJN IL-KONTENUT ATTWALI U TEORETIKU TAT-TRIAĊILGLIĊEROLI MAL-ECN 42

1. AMBITU

Determinazzjoni tad-differenza assoluta bejn il-valuri sperimentali tat-TRIAĊILGLIĊEROLI (TAGs) man-numru tal-karbonju ekwivalenti 42 (ECN42HPLC) miksub mid-determinazzjoni fiż-żejt bil-kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja u l-valur teoretiku tat-TAGS b'numru tal-karbonju ekwivalenti 42 (ECN 42theoretical) ikkalkulat mill-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi.

2. SETTUR TAL-APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu applikabbli għaż-żjut taż-żebbuġa. Il-metodu applikabbli għall-għarfien tal-preżenza ta' ammonti żgħar ta' żjut taż-żrieragħ (rikki fl-aċidu linolejku) f'kull klassi ta' żjut taż-żebbuġa.

3. IL-PRINĊIPJU

Il-kontneut tat-triasilgiċeroli bl-ECN42 iddeterminat mill-analiżi u l-kontenut teoretiku tat-triasilgiċeroli bl-ECN42 (ikkalkulat abbażi tad-determinazzjoni GLC tal-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi) tikkorrispondi fi ħdan ċertu limitu għaż-żjut taż-żebbuġa ġenwini. Differenza akbar mill-valuri adottati għal kull tip ta' żejt turi jekk dak iż-żejt fihx żjut taż-żrieragħ.

4. METODU

Il-metodu għall-kalkolu tal-kontenut teoretiku tat-triaċilgiċeroli mal-ECN 42 u tad-differenza fir-rigward tad-dejta HPLC huwa essenzjalemnt magħmul mill-koordinazzjoni tad-dejta analitika miksuba b'metodi oħra. Huwa possibbli li jintgħarfu tliet fażijiet: id-determinazzjoni tal-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi bil-kromatografija kapillari bil-gass, il-kalkolu tal-kompożizzjoni teoretika tat-triaċilgiċeroli bl-ECN42, id-determinazzjoni HPLC ta' triaċilgiċeroli ECN42.

4.1. Apparat

4.1.1. Flasks bil-qiegħ tond, 250 and 500 ml.

4.1.2. Tazzi taż-żennuna, 100 ml

4.1.3. 4.1.3. Kolonna kromatografika tal-ħġieġ, dijametru intern 21 mm, tul 450 mm, b'vit u kon normalizzat (female) fuq.

4.1.4. 4.1.4. Imbiibet għas-separazzjoni, 250 ml, b'kon normalizzat (male) fin-naħ ta' isfel, tajjeb biex jitqabbad man-naħa ta' fuq tal-kolonna.

4.1.5. Virga tal-ħġieġ, tul 600 mm.

4.1.6. Lembut tal-ħġieġ, dijametru 80 mm.

4.1.7. Flasks volumetriċi, 50 ml

4.1.8. Flasks volumetriċi, 20 ml

4.1.9. Evaporatur rotatorju.

4.1.10. 4.1.10. Kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja, li tippermetti l-kontroll termostatiku tat-temperatura tal-kolonna.

4.1.11. Unitajiet tal-injezzjoni li jagħti 10 μl.

4.1.12 Rilevatur refrattometeru differenzjali. Is-sensittività fuq l-iskala kollha għandha tkun ta' mill-inqas 10–4 unità tal-indiċi refrattiv.

4.1.13 Kolonna: tubu tal-istainless steel tube ta' tul ta' 250 mm u dijamteru intern ta' 4.5 mm ippakkjat b'partiċelli tas-silika ta' dijametru ta' 5 μm bi 22 to 23 % karbonju fil-forma ta' oktaedesilsilan (nota 2).

4.1.14 Software għall-ipproċessar tad-dejta.

4.1.15 Fjali, ta' volumi ta' madwar 2mm, b'septum b'saff ta' Teflon u tapp bil-kamin.

4.2. Reaġenti

Ir-reaġenti għandhom ikunu ta' purezza analitika. Is-solventi għall-elużjoni għandhom ikunu degassifkati, u jistgħu jiġu rriċiklati bosta drabi mingħajr effett fuq is-separazzjonijiet.

4.2.1. Eteru tal-pitrolju 40-60 °C grad kromatografiku jew essan

4.2.2. Etereu etililku, iddistillat frisk, ħieles mill-perossidu.

4.2.3. Solvent tal-elużjoni biex jippurifika taż-żejt bil-kolonna kromatografika: taħlita etru tal-pitrolju/eteru etiiliku 87/13 (v/v).

4.2.4. 4.2.4. Ġell tas-silika, 70-230, tip Merck 7734, b'kontenut tal-ilma standardizzat għal 5 % (w/w).

4.2.5. Fibri tal-ħġieġ (Glass wool)

4.2.6. Aċetun għal HPLC.

4.2.7. Aċetonitril jew propionitril għal HPLC.

4.2.8. Solvent tal-elużjoni HPLC: acetonitril + aċetun (il-proporzjonijiet jiġu aġġustati biex tinkiseb is-separazzjoni mixtieqa; ibda b'taħlita 50:50) jew proprionitril.

4.2.9. Solvent tas-solubilizzazzjoni: aċetun.

4.2.10. Triġliċeridi ta' referenza: trigliċeridi kummerċjali (triplamitin, triolein, eċċ.) jistgħu jintużaw u l-ħinijiet tar-retenzjoni tagħhom imbagħad jiġu pplottjati skont in-numru tal-karbonju ekwivalenti, jew alternattivament kromatogrammi ta' referenza miksuba miż-żejt tas-sojja, taħlita 30:70 żejt tas-sojja – żejt taż-żebbuġa u żejt pur taż-żebbuġa (ara n-noti 1u 2 u l-grafika 1 sa 4).

4.2.11. Kolonna tal-estrazzjoni f'fażi solida b'fażi silika 1 g, 6 ml.

4.3. It-tħejjija tal-kampjun

Billi għadd ta' sustanzi li jinterferixxu jagħtu lok għal riżultati pożittivi foloz, il-kampjun għandu dejjem jiġi ppurifkat skont il-metodu IUPAC 2.507, użat għad-determinazzjoni tal-komposti polari fiż-żjut tal-qali.

4.3.1. It-tħejjija tal-kolonna kromatografika

Fill the column (4.1.3.) Imla l-kolonna (4.1.3) b'madwar 30 ml solvent tal-elużjoni (4.2.3), imbagħad daħħal fil-kolonna ftit glass wool (4.2.5) u mbuttah sa qiegħ il-kolonna bil-virga tal-ħġieġ (4.1.5).

F'tazza ta' 100 ml, issospendi 25g ġell tas-silika (4.2.4) fi 80 ml tat-taħlita tal-eluzzjoni (4.2.3), u mbagħad ittrasferiha għall-kolonna permezz ta' lembut tal-ħġieġ (4.1.60>

Biex tiżgura t-trasferiment komplut tal-ġell tas-silika lill-kolonna, aħsel it-tazza bit-taħlita tal-eluzzjoni u ttrasferixxi l-fdalijiet tal-ħasil lill-kolonna wkoll.

Iftaħ il-vit u ħalli s-solvent jelwixxi mill-kolonna sakemm il-livell tiegħu jkun ta' madwar 1 ċm fuq il-ġell tas-silika.

4.3.2 Kromatografija bil-kolonni

Iżen bi preċiżjoni ta' 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g ta' żejt, iffiltrat minn qabel, omoġenizzat u anidrifikat, jekk meħtieġ, fi flask volumetriku ta' 50 ml (4.1.7).

Ħoll f'madwar 20 ml solvent tal-elużjoni (4.2.3). Jekk meħtieġ, saħħan kemxejn biex idub faċilment. Berred f'temperatura ambjentali u aġġusta l-volum bis-solvent tal-elużjoni.

B'pipetta volumetrika, daħħal 20 ml tas-soluzzjoni fil-kolonna mħejjija skont 4.3.1, iftaħ il-vit u ħalli s-solvent jelwixxi sal-livell tas-saff tal-ġell tas-silika..

Imbagħad elwixxi b'150 ml solvent tal-elużjoni (4.2.3), billi taġġusta r-rata tas-solvent għal madwar 2 ml/min (150 ml jieħdu madwar 60 sa 70 minuta biex jgħaddu mill-kolonna).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Elimina s-solvent bi pressjoni mnaqqsa f'evaporatur rotatorju (4.1.9) u iżen ir-residwu li se jintuża biex iħejji s-soluzzjoni għall-analiżi HPLC u għall-preparazzjoni tal-ester metiliku.

L-irkupru kampjun mill-kolonna għandu jkun ta' mill-inqas 90 % għall-kategoriji taż-żejt taż-żebbuġa ekstra verġni, verġni, ordinarju, raffinat, u minimu ta' 80 % għal żjut taż-żebbuġa lampante u residwi.

4.3.3 Purifikazzjoni tal-SPE

Il-kolonna tas-silika SPE tiġi attivita billi jiġi mgħoddija 6m ta' essan (4.2.3) f'vakwu, biex ma jkunx hemm nixfa.

Iżen sa eżatezza ta’ 0,001 g, 0,12 g fi fjala ta' 2 ml (4.1.15), u ħoll f' 0,5 ml essan (4.2.3).

Għabbi l-kolonna SPE bis-soluzzjoni u elwixxi b' 10 ml ta' eteru essan-dietil (87: 13 v/v) (4.2.3) f'vakwu.

Il-frazzjoni miġbura tiġi evaporata sa ma tinxef f'evaporatur rotatorju (4.1.9) taħt pressjoni mnaqqsa f'temperatura ambjentali. Ir-residwu jinħall fi 2 ml aċetun (4.2.6) għall-analiżi tat-triagliċerol (TAG).

4.4. Analiżi tal-HPLC

4.4.1 Tħejjija tal-kampjuni għall-analiżi kromatografika

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2 Il-Proċedura

Arma s-sistema kromatografika. Ippompja s-solvent tal-elużjoni (4.2.8) b'rata ta' 1.5 ml/min sabiex tnaddaf is-sistema kollha.. Stenna sakemm tinkiseb linja bażi stabbli.

Injetta 10 μl tal-kapmjun imħejji bħal fil-punt 4.3.

4.4.3 Kalkolu u tifsira tar-riżultati

Uża l-metodu tan-normalizzazzjoni tal-erja, i.e. assumi li s-somma tal-erja tal-qċaċet li tikkorrispondi għat-TAGs minn ECN42 sa ECN52 hija ugwali għal 100 %.

Ikkalkula l-perċentwal relattiv ta' kull trigliċerid billi tuża l-formula:

.

Ir-riżultati għandhom jingħataw sa mill-inqas żewġ postijiet deċimali.

Ara n-noti 1 sa 4.

4.5. Kalkolu tal-kompożizzjoni tat-trijaċilgliċeroli (moles%) minn dejta dwar il-kompożizzjoni ta’ aċidu xaħmi (erja%)

4.5.1 Determinazzjoni tal-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi

Il-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi hija ddeterminata bl-ISO 5508 permezz ta’ kolonna kapillari. L-esteri tal-metil huma ppreparati skont COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2. Aċidi xaħmin għall-kalkolu

Il-gliċeridi jintgħażlu skont in-Numru tal-Karbonju Ekwivalenti tagħhom (ECN), bili jitqiesu l-ekwivalenti li ġejjin bejn l-ECN u l-aċidi xaħmin. Tqiesu bissa l-aċidi xaħmin b'16 u 18-il atomu, għaliex dawn biss importanti għaż-żejt taż-żebbuġa. L-aċidi xaħmin għandhom ikunu normalizzati għal 100%.

Fatty acid (FA) Taqsira Piż molekolari (MW) ECN Aċidu palmitiku P 256,4 16 Aċidu palmitolejku Po 254,4 14 Aċidu steariku S 284,5 18 Aċidu olejku O 282,5 16 Aċidu linolejku L 280,4 14 Aċidu lineoleiku Ln 278,4 12

4.5.3 Konverżjoni ta' erja % f'moles għall-aċidi xaħmin kollha (1)

4.5.4 Normalizzazzjoni tal-moles tal-aċidu xaħmi sa 100% (2)

Ir-riżultat jagħti l-perċentwal ta' kull aċidu xaħmi f moles % fil-pożizzjoni globali (1,2,3-) tat-TAGs.

Imbagħad tiġi kkalkulata s-somma tal-aċidi xaħmin saturati P and S (SFA) u l-aċidi xaħmin nonsaturati Po, O, L u Ln (UFA):

4.5.5 Il-kalkolu tal-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi fil-pożizzjonijiet 2- u 1, 3- tat-TAGs

L-aċidi xaħmin jitqassmu fi tliet gruppi kif ġej: wieħed għall-pożizzjoni 2- u tnejn identiċi għall-pożizzjonijiet 1- u 3-, b'koeffiċjenti differenti għall-aċidi saturati (P u S) u nonsaturati (Po, O, L u Ln).

4.5.5.1 4.5.5.1. Aċidi xaħmin saturati fil-pożizzjoni 2- [P(2) u S(2)]

4.5.5.2 Aċidi xaħmin nonsaturati fil-pożizzjoni 2- [Po(2), O(2), L(2) u Ln(2)]:

4.5.5.3 Aċidi xaħmin fil-pożizzjonijiet 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) u Ln(1,3)] (6):

4.5.6 Kalkolu ta’trijaċikliċeroli

4.5.6.1 TAGs b’aċidu grass wieħed (AAA, hawnhekk LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2 TAGs b’żewġ aċidi grassi (AAB, hawnhekk PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3 TAGs bi tliet aċidi xaħmin differenti (ABC, hawnhekk OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4 Trijaċilgliċeroli b’ECN42

It-trijaċilgliċeroli b’ECN42 huma kkalkolati skont l-ekwazzjonijiet 7, 8 u 9 u huma mbagħad mogħtija fl-ordni ta’eluzzjoni mistenni f’HPLC (normalment tliet qċaċet biss).

LLL

PoLL u l-iżomeru pożizzjonali LPoL

OLLn u l-iżomeri pożizzjonali OLnL u LnOL

PoPoL u l-iżomeru pożizzjonali PoLPo

PoOLn u l-iżomeri pożizzjonali OPoLn u OLnPo

PLLn u l-iżomeri pożizzjonali LLnP u LnPL

PoPoPo

SLnLn u l-iżomeru pożizzjonali LnSLn

PPoLn u l-iżomeri pożizzjonali PLnPo u PoPLn

It-triaċilgliċeroli b'ECN42 jingħataw mis-somma tad-disa' triaċilgliċeroli inkluż l-iżomeri pożizzjonali tagħhom. Ir-riżultati għandhom jingħataw sa mill-inqas żewġ postijiet deċimali.

5. L-EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI

The calculated theoretical content and the content determined by the HPLC analysis are compared. Jekk id-differenza fil-valur assolut tad-dejta HPLC nieqes id-dejta teoretika hija akbar mill-valuri ddikjarati fil-kategorija xierqa taż-żejt fl-istandrad tal-kummerċjalizzazzjoni, il-kampjun fih żejt taż-żrieragħ.

Ir-riżultati jingħataw sa żewġ ċifri deċimali.

6. EŻEMPJU (IN-NUMRI JIRREFERU GĦAT-TAQSIMIET FIT-TEST TAL-METODU)

— 4.5.1. Il-kalkolu tal-moles % tal-aċidi xaħmin mid-dejta GLC (erja normalizzata %)

Id-dejta li ġejja tinkiseb għall-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi mill-GLC:

FA P S Po O L Ln MW 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 Erja % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0

— 4.5.3 Konverżjoni ta' erja % f'moles għall-aċidi xaħmin kollha (ara l-formula (1))

moles P = moles S = moles Po = moles O = moles L = moles Ln = Total = 0,35821 moles TAGs

— 4.5.4 Normalizzazzjoni tal-moles tal-aċidu xaħami għal 100% (ara formula (2))

moles % P(1,2,3) = moles % S(1,2,3) = moles % Po(1,2,3) = moles % O(1,2,3) = moles % L(1,2,3) = moles % Ln(1,2,3) = Total moles % = 100 %

Total ta’ aċidi grassi saturati u nonsaturati fil-pożizzjoni1,2,3- tat-TAGs (ara formula (3)):

— 4.5.5 Kalkolu tal-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi fil-pożizzjonijiet 2- u 1,3- tat-TAGs

— 4.5.5.1 Aċidi xaħmin saturati fil-pożizzjoni 2- [P(2) u S(2)] (ara l-formula (4))

— 4.5.5.2 Aċidi xaħmin nonsaturati fil-pożizzjoni 2- [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) u Ln(1,3)] (ara l-formula (5))

— 4.5.5.3 Aċidi xaħmin fil-pożizzjonijiet 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) u Ln(1,3)] (ara l-formula (6))

— 4.5.6. Kalkolu ta’trijaċikliċeroli

Mill-kompożizzjoni kkalkulata tal-aċidu xaħmi fil-pożizzjonijiet sn-2- u sn-1,3-:

FA in 1.3-pos. 2-pos. P 16,004 % 0,653 % S 4,325 % 0,177 % Po 1,015 % 1,262 % O 68,526 % 85,296 % L 9,204 % 11,457 % Ln 0,927 % 1,153 % Sum 100,0 % 100,0 %

u t-triagliċeroli li ġejjin jiġu kkalkulati kif ġej:

LLL

PoPoPo

PoLL SLnLn b'iżomeru pożizzjonali wieħed (1) PoLL SLnLn b'iżomeru pożizzjonali wieħed (1)

SLnLn b'iżomeru pożizzjonali wieħed (1)

PoPoL b'iżomeru pożizzjonali wieħed (1)

PPoLn b’żewġ (2) isomeri pożizzjonali PPoLn b’żewġ (2) isomeri pożizzjonali

OLLn b’żewġ (2) isomeri pożizzjonali

PLLn b’żewġ (2) isomeri pożizzjonali

PoOLn b’żewġ (2) isomeri pożizzjonali

— 4.5.6.1. TAGs b'aċidu xaħmi wieħed (LLL, PoPoPo) (ara l-formula (7))

, = 0,09706 mol LLL

— 4.5.6.2 TAGs b'żewġ aċidi xaħmin (PoLL, SLnLn, PoPoL) (ara l-formula (8))

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3 TAGs bi tliet aċidi xaħmin differenti (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Ara l-formula (9)

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN42 = 0,69512 mol TAGs

Nota 1: L-ordni tal-elużjoni jista’ jiġi ddeterminat billi jiġu kkalkolati n-numri ekwivalenti tal-karbonju, ħafna drabi definiti bir-relazzjoni , fejn CN huwa numru tal-karbonju u n huwa n-numru ta' bonds doppji; jista 'jiġi kkalkolat b’mod iktar preċiż billi titqies l-oriġini tal-bond doppja. Jekk no, nl u nln homa n-numri tal-bonds doppji attribwitu lill-aċidu olejku, linolejku u linoleniku rispettivament, in-numru tal-karbonju ekwivalenti jista' jiġi kkalkulat permezz tar-relazzjoni tal-formula:

fejn il-koeffiċjent do, dl and dln jista' jiġi kkalkulat bis-saħħa tat-trigliċeridi ta' referenza. Taħt il-kundizzjonijiet speċifikati f'dan il-metodu, ir-relazzjoni miksuba tkun qrib:

Nota 2: B'bosta trigliċeridi ta' referenza, huwa wkoll possibbli tikkalkula r-riżoluzzjoni fir-rigward tat-triolein:

triolein

bl-użu tal-ħin ridott tar-retenzjoni .

Il-graff ta' log α kontra f (numru ta' bonds doppji) jippermetti li jiġu ddeterminati l-valuri ta' retenzjoni għat-triġliċeridi kollha tal-aċidi xaħmin fit-trigliċeridi ta' referenza – ara l-Grafika 1.

Nota 3: L-effiċjenza tal-kolonna għandha tippermetti separazzjoni tal-quċċata tat-trilinoein mill-qċaċet tat-trigliċeridi b'RT maġenbhom. L-eluzzjoni ssir sa quċċata ta' ECN 52.

Note 4: Kejl korrett tal-erjas għall-qċaċet kollha ta' interess għad-determinazzjoni preżenti hija żgurata jekk it-tieni quċċata li tikkorrispondi għal ECN 50 hija 50% tal-iskala sħiħa tar-rikorder.

Grafika 1

Grafika ta' log a kontra f (numru ta' bonds doppji)

Grafika 2

Żejt taż-żebbuġa b'element linoleiku baxx

(a)

(b)

Grafika 3

Żejt taż-żebbuġa b'element linoleiku għoli

(a)

(b)