Official Journal L 093 , 13/04/1991 P. 0001 - 0048

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 37 P. 0012

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 37 P. 0012



Id-Deċiżjoni Tal-Kummisjoni ta’ l-14 ta’ Frar 1991 li tistabbilixxi ċerti metodi ta’ analiżi u kontroll ta’ ħalib mhux ipproċessat u ħalib trattat bis-sħana (91/180/KEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ekonomika Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 85/397/KEE tal-5 ta’ Awwissu 1985 dwar is-saħħa u l-problemi tas-saħħa ta’ l-annimali li jaffettwaw il-kummerċ intra-Komunitarju f’ħalib trattat bis-sħana [1], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 89/662/KEE [2], u b’mod partikolari l-Artikolu 10(2) tagħha, Billi l-Artikolu 10(2) jipprovdi li l-Kummissjoni għandha tistabbilixxi metodi ta’ analiżi u kontroll li għandhom jiġu użati biex jagħmlu monitoraġġ ta’ konformità ma’ standards li għandhom x’jaqsmu ma ħalib mhux ipproċessat u ħalib trattat bis-sħana; Billi huwa neċessarju, għal ħalib mhux ipproċessat, li jiġu stabbiliti metodi b’mod partikolari biex jiddeterminaw il-kont tal-plates, il-kont taċ-ċelloli, il-punt tal-friża u l-preżenza ta’ antibijotiċi; Billi huwa neċessarju, għal ħalib pasturizzat, li jiġu stabbiliti metodi b’mod partikolari biex tiġi determinata l-assenza ta’ patoġeniċi, in-numru ta’ koliformi, il-kont tal-plates, l-assenza ta’ fosfati, il-preżenza ta’ perossidasju, l-assenza ta’ anitbijotiċi u l-punt tal-friża; Billi huwa neċessarju, għal ħalib sterilizzat u ħalib ta’ UHT (temperatura ultra għolja), li jiġu stabbiliti metodi inpartikolari biex jiġu determinati l-kont tal-plates u l-assenza ta’ antibijotiċi; Billi għal raġunijiet tekniċi, huwa opportun bħala l-ewwel pass li jiġu stabbiliti metodi ta’ referenza ta’ analiżi u ta’ kontrolli biex tiġi asigurata konformità ma’ ċerti standards; billi huwa neċessarju, b’mod partikolari li jibqgħu jiġu eżaminati l-kondizzjonijiet li taħthom metodi ta’ rutina, analitiċi u ta’ test għandhom jiġu applikati; billi, fl-istennija tar-riżultati ta’ dan l-eżami, hija r-responsabbiltà ta’ l-Istati Membri li jintużaw metodi rutina approprjati biex tiġi assigurata komformità ma’ l-istandards stabbiliti fid-Direttiva 85/397/KEE; Billi d-determinazzjoni ta’ metodi ta’ referenza ta’ analiżi u kontroll tinkludi d-determinazzjoni tal-proċeduri analitiċi li għandhom jiġu esegwiti u l-mod ta’ kif għandhom jiġu stabbiliti l-kriterji ta’ preċiżjoni sabiex tiġi assigurata interpretazzjoni uniformi tar-riżultati; Billi l-miżuri previsti f’din id-Deċiżjoni huma skond l-opinjoni tal-Kumitat Veterinarju Permanenti, ADDOTTAT DIN ID-DEĊIŻJONI: L-Artikolu 1 Il-proċeduri ta’ referenza għall-analiżi u l-kontroll ta’ ħalib mhux ipproċessat għandhom ikunu dawn li ġejjin: - id-determinazzjoni tal-punt friża, - l-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi — it-test tal-kont tal-plates bi 30oC - l-enumerazzjoni taċ-ċelloli somatiċi, - is-sejba ta’ antibijotiċi u sulfonamidi. L-Artikolu 2 Il-proċeduri ta’ referenza għall-analiżi u l-kontroll ta’ ħalib pasturizzat għandhom ikunu dawn li ġejjin: - id-determinazzjoni tal-punt friża, - id-determinazzjoni ta’ l-attività tal-fosfati, - id-determinazzjoni ta’ l-attività perossida, - l-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi — it-test tal-kont tal-plates bi 30 oC, - l-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi — it-test tal-kont tal-plates b’21 oC, - l-enumerazzjoni ta’ koliformi — il-kont tal-kolonji bi 30 oC, - is-sejba ta’ antibijotiċi u sulfonamidi, - is-sejba ta’ mikro-organiżmi patoġeniċi, L-Artikolu 3 Il-proċeduri ta’ referenza għall-analiżi u l-kontroll ta’ ħalib ta’ UHT u ħalib sterilizzat għandhom ikunu dawn li ġejjin: - l-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi - it-test tal-kont tal-plates bi 30 oC, - id-determinazzjoni tal-punt friża, - is-sejba ta’ antibijotiċi u sulfonamidi. L-Artikolu 4 Il-proċeduri ta’ referenza għall-analiżi u l-kontroll u l-kriterji ta’ preċiżjoni li għandhom jiġu applikati għandhom jidħlu fis-seħħ u l-ġbir ta’ kampjuni għandu jiġi mwettaq skond ir-regoli stabbiliti fl-Anness 1. L-Artikolu 5 Il-proċeduri ta’ referenza għall-analiżi u l-kontroll imsemmija fl-Artikoli 1, 2 u 3 huma stabbiliti fl-Anness 2. L-Artikolu 6 Din id-Deċiżjoni għandha tiġi rieżaminata qabel il-31 ta’ Diċembru 1992 sabiex tieħu kont ta’ żviluppi fit-tagħrif xjentifiku u tekniku. L-Artikolu 7 Din id-Deċiżjoni hija indirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fl-14 ta’ Frar 1991. Għall-Kummissjoni Ray Mac Sharry Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 226, ta’ l-24.8.1985, p. 13. [2] ĠU L 395, tat-30.12.1989, p. 13. -------------------------------------------------- L-ANNESS I WERREJ I. | Dispożizzjonijiet ġenerali … | 187 | II. | Kampjuni ta’ ħalib mhux ipproċessat u ħalib trattat bis-sħana. … | 189 | I. DISPOŻIZZJONIJIET ĠENERALI 1. Introduzzjoni Huma deskritti dispożizzjonijiet ġenerali fejn għandhom x ’jaqsmu riaġenti, tagħmir, l-espressjoni tar-riżultati, rapporti ta’ preċiżjoni u ta’ kontroll. L-awtoritajiet kompetenti ta’ l-Istati Membri u l-laboratorji ta’ applikazzjoni inkarigati biex jieħdu kampjuni u bil-kontroll tal-ħalib għandhom jirrispettaw id-dispożizzjonijiet ġenerali. 2. Riaġenti 2.1. Ilma 2.1.1. Kull meta jissemma’ l-ilma għal skopijiet ta’ soluzzjoni, diluzzjoni jew tlaħlieħ, l-ilma distillat, l-ilma dioniżżat jew l-ilma dimineraliżżat ta’ mill-inqas purità ekwivalenti għandu jintuża sakemm mhux speċifikat mod ieħor. Għal skopijiet mikrobijoloġiċi għandu jkun ħieles minn sustanzi li jistgħu jaffettwaw jew jinfluwenzaw it-tkabbir ta’ miko-organiżmi taħt kondizzjonijiet ta’ kontroll. 2.1.2. Kull meta ssir referenza għal "soluzzjoni" jew "diluzzjoni" mingħajr indikazzjoni oħra, tkun imfissra "soluzzjoni fl-ilma" jew "diluzzjoni bl-ilma". 2.2. Kimiċi Il-Kimiċi kollha użati għandhom ikunu ta’ kwalità analitika ta’ riaġenti rikonoxxuta sakemm mhux speċifikat mod ieħor. 3. Tagħmir 3.1. Lista ta’ tagħmir Il-listi ta’ tagħmir mogħtija fil-proċeduri differenti ta’ referenza jikkontjenu biss dawk l-oġġetti b ’użu speċjalizzat u oġġetti għal speċifikazzjoni partikolari. 3.2. Bilanċ analitiku Bilanċ analitiku jfisser bilanċ kapaċi biex jiżen b’ 0,1 mg. 4. Espressjoni tar-riżultati 4.1. Riżultati Sakemm mhux speċifikat mod ieħor ir-riżultati msemmija fir-rapport analitiku għandhom ikunu l-valur aritmetiku medju ottenut minn żewġ testijiet li jissodisfaw il-kriterju ta’ repetizzjoni (5.1) msemmi għal dak il-metodu. Jekk il-kriterju ta’ repetizzjoni mhuwiex issodisfat, allura t-test għandu jiġi ripetut, jew ir-riżultat dikjarat invalidu. 4.2. Kalkolu tal-perċentwali Ħlief meta speċifikat mod ieħor, ir-riżultat għandu jiġi kkalkulat bħala perċentwali skond il-massa tal-kampjun. 5. Kriterji ta’ preċiżjoni: ir-rata ta’ repetizzjoni u r-riproduċibbiltà 5.1. Il-kriterju ta’ preċiżjoni mogħti f ’kull proċedura hu definit kif ġej: 5.1.1. Ir-rata ta’ repetizzjoni (r) hija l-valur li taħtu hija stabbilita d-differenza assoluta bejn żewġ riżultati ta’ testijiet singoli ottenuti bl-istess proċedura fuq materjal identiku ta’ kontroll, taħt l-istess kondizzjionijiet (l-istess operatur, l-istess apparat, l-istess laboratorju, u intervall qasir ta’ żmien) 5.1.2. Ir-riproduċibbiltà (R) huwa l-valur li taħtu hija stabbilita d-differenza assoluta bejn żewġ riżultati ta’ testijiet singoli ottenuti bl-istess proċedura fuq materjal identiku ta’ kontroll, taħt kondizzjionijiet differenti (operaturi differenti, apparat differenti, laboratorji differenti, u/jew ħin differenti). 5.1.3. Sakemm mhux speċifikat mod ieħor il-valuri għall-kriterji ta’ repetizzjoni u riproduċibbiltà mogħtija fil-klawżoli relevanti ta’ kull proċedura jirrappreżentaw il-95 % ta’ l-intervalli tal-livell ta’ kunfidenza kif definit mill-ISO 5725: it-tieni edizzjoni 1986. Huma kkalkolati mir-riżultati ta’ provi kollaborattivi rikonoxxuti li kienu użati biex jevalwaw il-proċedura. Madanakollu, għal ftit mill-proċedura, provi kollaborattivi ma twettqux. F ’dan il-każ il-valuri ta’ rata ta’ repetizzjoni u riproduċibbiltà kienu stmati. 5.1.4. Il-provi u l-istudji kollaborattivi msemmija f’5.1.3 għandhom jiġu ppjanati u kondotti skond il-linji ta’ gwida internazzjonali. 6. Ir-rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jispeċifika l-metodu ta’ analiżi użat kif ukoll ir-riżultati ottenuti. B’żieda ma’ dan, għandu jagħti kull dettal ta’ proċedura użata mhux speċifikat fil-metodu ta’ analiżi jew li mhuwiex ta’ bilfors, kif ukoll kull ċirkostanza oħra li setgħet influwenzat ir-riżultati ottenuti. Ir-rapport tat-test għandu jagħti l-informazzjoni kollha neċessarja għall-identifikazzjoni kompleta tal-kampjun. II. KAMPJUNI TA’ ĦALIB MHUX IPPROĊESSAT U ĦALIB TRATTAT BIS-SĦANA 1. L-iskop u l-qasam ta’ l-applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza biex jittieħdu kampjuni ta’ ħalib mhux ipproċessat u ħalib trattat bis-sħana. Il-proċeduri biex jittieħdu kampjuni u għat-trasport u l-ħażna tal-kampjuni huma applikabbli għal ħalib mhux ipproċessat minn kunsinni tal-produttur u għal ħalib mhux ipproċessat u trattat bis-sħana f ’tankijiet ta’ ħażna u trasport. Il-proċeduri mogħtija f ’2,4.4, 5 u 6 huma applikabbli biex jittieħdu kampjuni ta’ ħalib trattat bis-sħana u għall-konsum dirett. 2. Ġenerali Kampjuni ta’ ħalib mhux ipproċessat u ħalib trattat bis-sħana f ’bottijiet, tankijiet, eċċ għandhom jittieħdu minn operatur kapaċi li kien kellu taħriġ adattat qabel ma ħa fuqu l-kontroll ta’ kampjuni tal-ħalib. Jekk ikkunsidrat approprjat l-awtoritajiet kompetenti jew il-laboratorju ta’ kontroll għandhom jistruwixxu lill-persunal li jieħdu l-kampjuni f ’tekniki ta’ stima sabiex jassiguraw li l-kampjun hu rappreżentattiv ta’ u b ’konformità mal-lott kollu. Jekk ikkunsidrat approprjat l-awtoritajiet kompetenti jew il-laboratorju li jieħdu l-kampjuni għandhom jistruwixxu lill-persunal ta’ l-istima dwar l-immarkar tal-kampjun sabiex jassiguraw l-identità mhux ambigwa tal-kampjun. 3. Tagħmir ta’ l-istima 3.1. Ġenerali It-tagħmir ta’ l-istima għandu jkun magħmul minn stainless steel, jew materjal xieraq ieħor ta’ saħħa adegwata u ta’ kostruzzjoni xierqa għall-iskop intiż (it-taħlit, l-istima eċċ). ċilindri u aġitaturi biex iħalltu l-likwidi f ’kontenituri għandu jkollhom arja suffiċjenti biex jipproduċu taħlit adegwat tal-prodott, imma mingħajr ma jikkawżaw l-iżvilupp ta’ togħma mranġta. Il-kuċċaruni għandu jkollhom manku solidu ta’ tul biżżejjed li jkun jista’ jittieħed kampjun minn kull fond tal-kontenitur. Il-kapaċità tal-kuċċarun m ’għandhiex tkun inqas minn 50 ml. Il-Kontenituri u l-għeluq ta’ kampjuni għandhom ikunu tal-ħġieġ, metalli adattati jew plastiċi. Il-materjali li minnhom it-tagħmir biex jittieħdu l-kampjuni (inklużi kontenituri u għeluq) huma magħmula m ’għandhomx jikkawżaw xi tibdil fil-kampjun li jista’ jaffettwa r-riżultati ta’ l-eżamijiet. Is-superfiċi kollha tat-tagħmir biex jittieħdu l-kampjuni u tal-kontenituri tal-kampjuni għandhom ikunu nodfa u niexfa, lixxi u ħielsa minn xquq, u l-kantunieri għandhom ikunu tondi 3.2. It-tagħmir biex jittieħdu kampjuni għal eżami mikrobijoloġiku It-tagħmir biex jittieħdu l-kampjuni inklużi l-kontenituri għandhom, b ’żieda għad-dispożizzjonijiet mogħtija fi 3.1, ikun sterili. Jekk l-istess tagħmir biex jittieħdu l-kampjuni hu użat għal kampjuni suċċessivi, għandu jitnaddaf u jiġi sterilizzat wara kull kampjun skond l-istruzzjonijiet jew il-ħtiġiet stabbiliti mil-laboratorju ta’ kontroll jew mill-awtorità kompetenti u biex l-integrità tal-kampjuni suċċessivi hija ppreservata. 4. It-teknika li biha jittieħdu l-kampjuni 4.1. Ġenerali Irrispettivament mit-testijiet li għandhom jitwettqu il-ħalib għandu jitħallat sew ħafna qabel l-istima, b ’mezz manwali jew mekkaniku. Il-kampjun għandu jittieħed immedjatament wara t-taħlit waqt li l-ħalib ikun għadu aġitat. Meta diversi kampjuni ta’ ħalib fit-tankijiet jittieħdu fl-istess ħin għal testijiet differenti, il-kampjun għal eżami mikrobijoloġiku għandu jittieħed l-ewwel. Il-volum tal-kampjun għandu jkun skond il-ħtiġiet tal-kontroll. Il-kapaċità tal-kontenituri tal-kampjuni użata għandha tkun tali li huma mimlija kważi kompletament mill-kampjun, u hekk jippermettu t-taħlit sewwa tal-kontenut qabel il-kontroll, imma jevitaw li jagħqad waqt it-trasport. 4.2. Kampjuni meħuda b’mod manwali 4.2.1. Kampjuni minn bramel u bottijiet tal-ħalib Sabiex tiġi ottenuta aġitazzjoni iċ-ċilindru għandu jiċċaqlaq rapidament’il fuq u’l isfel fil-barmil jew fil-bott waqt li jiġi assigurat li l-ħalib hu mħawwad tajjeb u li ebda krema ma teħel ma’ l-għonq tal-bott. Kampjun rappreżentattiv tal-kunsinna sħiħa għandu jiġi ottenut skond l-4.2.4. 4.2.2. Il-kampjun minn tankijiet jew vattijiet agrikoli mkessħa tal-ħalib Il-ħalib għandu jiġi aġitat mekkanikament jew manwalment sakemm tiġi ottenuta omoġenjità biżżejjed. Jekk il-volum tal-ħalib huwa tali li l-aġitatur mekkaniku ma jistax iħallat il-ħalib, għandha titwettaq aġitazzjoni manwali. 4.2.3. Kampjuni minn peżatur Huwa essenzjali lli l-ħalib, meta mxaqleb ġewwa peżatur, jitħallat b’’mod adegwat. Jista jkun neċessarju li tintuża aġitazzjoni manwali jew mekkanika sabiex tiġi assigurata d-distribuzzjoni unità tax-xaħam. Meta l-volum tal-kunsinna li għandha tiġi stmata jeċċedi l-kapaċità tal-peżatur, kampjun rappreżentattiv tal-kunsinna sħiħa għandu jittieħed skond l-4.2.4. 4.2.4. Kampjun minn lott diviż Meta l-kwantità tal-ħalib li għandu jiġi stmat hija f ’iktar minn kontenitur wieħed, għandha tittieħed kwantità rappreżentattiva minn kull kontenitur u l-kwantità tal-ħalib li għaliha jirrelata kull kampjun għandha tiġi innotata. Sakemm il-kampjuni minn kull kontenitur m ’għandhomx jiġu kkontrollati individwalment, għandhom jitħalltu porzjonijiet minn dawn il-kwantitjiet rappreżentattivi f ’ammonti li huma proporzjonali għall-kwantità fil-kontenitur li minnu kull kampjun ittieħed. Għandu(hom) jittieħed(jittieħdu) kampjun(i) minn dawn l-ammonti proprozjonali mdaqqsa wara t-taħlit. 4.2.5. Kampjuni minn reċipjenti kbar — tankijiet ta’ ħażna, tal-ferrovija u tat-triq 4.2.5.1. Il-ħalib għandu jitħallat bi proċedura approprjata, qabel ma jittieħed il-kampjun. Biex jitħallat il-kontenut ta’ reċipjenti kbar jew ta’ tankijiet ta’ ħażna, tat-triq jew tal-ferrovija, l-użu ta’ aġitazzjoni mekkanika hu suġġerit (4.2.5.2). Il-livell ta’ taħlit għandu jkun approprjat għall-perjodu ta’ żmien li tulu l-ħalib kien wieqaf. L-effiċjenza tal-proċedura tat-taħlit applikata f ’kull ċirkostanza partikolari għandha tintwera bħala adegwata għall-iskopijiet ta’ l-analiżi maħsuba; il-kriterju ta’ effiċjenza ta’ taħlit jinfluwenza b ’mod partikolari is-similitudni bejn riżultati analitiċi minn kampjuni meħuda jew minn partijiet differenti tal-kunsinni, jew mit-tank f ’intervalli tul l-iskarika. Proċedura tat-taħlit tal-ħalib għandha tiġi kkunsidrata effiċjenti jekk id-differenza fil-kontenut tax-xaħam bejn iż-żewġ kampjuni, meħuda taħt dawn il-kondizzjonijiet, hija inqas minn 0,1 %. F ’reċipjent kbir bi skarika fil-qiegħ jista’ jkun hemm, fil-punt ta’ skarika, kwantità żgħira ta’ ħalib li mhijiex rappreżentattiva tal-kontenut sħiħ anke wara t-taħlit. Għalhekk kampjuni għandhom preferibbilment jittieħdu minn toqba (mnejn jgħaddi raġel). Jekk il-kampjuni jittieħdu mill-iskarika, għandu jitħalla jiskorri ħalib biżżejjed sabiex jiġi assigurat li l-kampjuni huma rappreżentattivi ta’ l-ammont sħiħ. 4.2.5.2. It-taħlit tal-kontenut ta’ reċipjenti kbar jew ta’ tankijiet ta’ ħażna, tal-ferrovija jew tat-triq jista’ jitwettaq: - b ’aġitatur mekkaniku mibni fit-tankijiet u li jitħaddem b ’mutur elettriku, - Skrun jew aġitatur li jitmexxa b ’mutur elettriku u jitqiegħed fuq it-toqba (mnejn jgħaddi raġel) bl-aġitatur sospiż fil-ħalib, - fil-każ ta’ tankers tal-ferrovija jew tat-triq permezz ta’ riċirkulazzjoni tal-ħalib mill-manku ta’ trasferiment imqabbad mal-pompi ta’ tħottija tat-tanker u inserit ġewwa t-toqba (mnejn jgħaddi raġel). - permezz ta’ arja nadifa kkumpressata filtrata. F ’dan il-każ għandhom jintużaw il-minimu ta’ pressjoni u volum ta’ l-arja sabiex jiġi pprevenut l-iżvilupp ta’ togħma mranġta. 4.3. Kampjuni awtomatiċi jew semi-awtomatiċi Strumenti ta’ kampjuni awtomatiċi jew semi-awtomatiċi għall-istima ta’ ħalib mhux ipproċessat minn kunsinni tal-produtturi jistgħu jintużaw skond l-istruzzjonijiet mogħtija mil-laboratorju ta’ kontroll jew minn awtorità kompetenti oħra. Dan it-tagħmir għandu, qabel ma jintuża u f ’intervalli regolari meta fl-użu, jgħaddi minn testijiet approprjati kif preskritt mill-awtorità responsabbli. L-adattabilità tal-proċeduri li bihom jittieħdu l-kampjuni għandha tiġi vverifikata sabiex jiġu stabbiliti: - l-volum minimu ta’ ħalib miġbur li jista’ jiġi stmat kif suppost, - ir-rata ta’ kull carry-over (li hi relatata mal-volum minimu tal-kampjun), - l-abbiltà li jingħata kampjun rappreżentattiv tal-lott wara aġitazzjoni xierqa. Meta jintuża tagħmir ta’ kampjuni awtomatiċi jew semi-awtomatiċi, l-awtorità kompetenti nazzjonali responsabbli tista’ tippreskrivi: - l-volum minimu ta’ ħalib li minnu għandhom jinġabru l-kampjuni, - il-volum minimu tal-kampjun, - il-carry-over massimu, - liema analiżi tista’ titwettaq jew liema prekawzjonijiet għandhomjittieħdu. 4.4. L-istima ta’ ħalib trattat bis-sħana għal konsum dirett f ’imballaġġi bl-imnut Il-kampjuni ta’ ħalib trattat bis-sħana għall-konsum dirett f ’imballaġġi bl-imnut għandhom ikunu l-imballaġġ komplet issiġillat. Jekk possibbli l-kampjuni għandhom jittieħdu mill-magna ta’ l-imballaġġ jew mill-kamra kiesħa fl-istabbiliment ta’ trattament kemm jista’ jkun malajr wara l-ipproċessar. Għal ħalib ippasturizzat fl-istess jum ta’ l-ipproċessar. Il-kampjuni għandhom jittieħdu minn kull tip ta’ ħalib trattat bis-sħana (pasturizzat, trattat bil-mod UHT u sterilizzat) f ’numri li jikkorrispondu għall-kontrolli li jsiru u skond l-istruzzjonijiet stabbiliti mil-laboratorju ta’ kontroll jew minn awtorità kompetenti oħra. 5. L-identifikazzjonijiet tal-kampjun Il-kampjun għandu jiġi mmarkat b ’kodiċi ta’ identifikazzjoni sabiex jista’ jiġi identifikat malajr bl-użu ta’ struzzjonijiet mogħtija mil-laboratorju ta’ kontroll jew mill-awtorità kompetenti sabiex tiġi assigurata l-identità ta’ dan il-kampjun (ara 2). 6. It-trasport u l-ħażna tal-kampjuni L-istruzzjonijiet dwar il-kondizzjonijiet ta’ trasport, il-ħażna u ħin bejn l-istima u l-analiżi tal-ħalib għandhom jiġu ppreparati mil-laboratorju ta’ kontroll skond it-tip ta’ ħalib u skond il-proċedura ta’ analaiżi li għandha tiġi użata. L-istruzzjonijiet għandhom jiġu stabbiliti skond l-awtorità kompetenti nazzjonali. Fl-istruzzjonijiet il-punti li ġejjin għandhom jiġu inklużi: - tul it-trasport u l-ħażna għandhom jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tiġi pprevenuta l-espożizzjoni għal irwejjaħ kontaminanti u għad-dawl tax-xemx dirett. Jekk il-kontenitur użat għall-kampjuni huwa trasparenti, għandu jinħażen f ’post mudlam, - il-kampjuni ta’ ħalib mhux ipproċessat għal analiżi mikrobijoloġika għandhom jiġu ttrasportati u maħżuna bejn 0 oC u 4 oC. Il-ħin bejn meta jittieħed il-kampjun u l-analiżi għandu jkun qasir kemm jista’ jkun u, f ’ebda każ iktar minn 36 siegħa. L-awtorità kompetenti tista’ taċċetta temperatura ta’ ħażna bejn 0 oC u 6 oC jekk il-ħin bejn meta jittieħed il-kampjun u l-analiżi mhuwiex iktar minn 24 siegħa, - kampjuni ta’ ħalib ippasturizzat meħud għal analiżi mikrobijoloġika għandhom jiġu ttrasportati u maħżuna bejn 0 oC u 4 oC. Il-ħin bejn meta jittieħed il-kampjun u l-analiżi għandu jkun qasir kemm jista’ jkun u, f ’ebda każ iktar minn 24 siegħa. - il-kampjuni tal-ħalib ta’ xort’ oħra minn ħalib mhux ipproċessat u ħalib ippasturizzat għal analiżi mikrobijoloġika għandhom jiġu maħżuna fil-laboratorju taħt tkessiħ u l-ħin bejn meta jittieħed il-kampjun u l-analiżi għandu jkun qasir kemm jista’ jkun. Prekawzjonijiet speċjali għal xi analiżi huma mogħtija taħt proċeduri differenti. -------------------------------------------------- L-ANNESS II WERREJ I. | Id-determinazzjoni tal-punt friża… | 193 | II. | Id-determinazzjoni ta’ l-attività tal-fosfati… | 199 | III. | Id-determinazzjoni ta’ l-attività perossida… | 202 | IV. | L-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi – it-test tal-kont tal-plates bi 30 oC… | 203 | V. | L-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi – it-test tal-kont tal-plates b’21 oC… | 208 | VI. | L-enumerazzjoni ta’ koliformi – il-kont tal-kolonji bi 30 oC… | 212 | VII. | L-enumerazzjoni taċ-ċelloli somatiċi… | 216 | VIII. | Is-sejba ta’ antibijotiċi u sulfonamidi… | 222 | IX. | Is-sejba ta’ mikro-organiżmi patoġeniċi… | 231 | I. ID-DETERMINAZZJONI TAL-PUNT FRIŻA 1. L-iskop u l-qasam ta’ l-applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għad-determinazzjoni tal-punt friża ta’ ħalib sħiħ, mhux ipproċessat, ippasturizzat, trattat b’UHT u sterilizzat, ħalib parzjalment xkumat u ħalib xkumat bl-użu ta’ apparat (termistor krijoskopu) fejn il-banju kkontrollat termostatikament hu mkessaħ bi tkessiħ elettriku u sonda termistor jissostitwixxi t-termometru ta’ merkurju fi ħġieġ. Hemm żewġ tipi ta’ strumenti disponibbli. L-ewwel huwa strument li jfittex il-punt massimu tal-friża fuq il-"pjan" fuq il-kurva ta’ l-iffriżar, waqt li t-tieni wieħed, għal raġunijiet kummerċjali, hu stabbilit biex jaqra f’punt partikolari wara l-bidu tat-tkessiħ. Ladarba l-kurvi tal-punt tal-friża jistgħu ivarjaw minn ħalib għall-ieħor u bejn il-ħalib u soluzzjonijiet standard użati għall-kalibrazzjoni, din il-proċedura ta’ referenza teħtieġ l-użu ta’ strumenti li jfittxu l-pjan. Strumenti ta’ ħin fiss jistgħu jintużaw għal miżuri ta’ sorveljanza ta’ rutina. Il-punt tal-friża jista’ jintuża biex jagħmel stima tal-proporzjon ta’ ilma estranju fil-ħalib, sakemm l-aċidità tal-kampjun ma teċċedix 0,18 g ta’ aċidu ħalliebi għal kull 100ml (ara 7.4). 2. It-tifsira Il-punt friża tal-ħalib: Il-valur ottenut meta mkejjel skond il-proċedura deskritta u espressa fi gradi Celsius ( oC) 3. Il-prinċipju Porzjon ta’ test tal-ħalib hu mkessaħ ħafna għat-temperatura approprjata, jiddependi fuq l-istrument u l-kristallizzazzjoni tinbeda b’vibrazzjoni mekkanika li tikkawża t-temperatura togħla malajr għal pjan li jikkorrispondi għall-iffriżar tal-kampjun. L-istrument hu kkalbirat billi jiġi aġġustat biex jagħti l-qari korrett għal żewġ soluzzjonijiet standard, bl-użu ta’ l-istess proċedura bħal għall-kampjuni tal-ħalib. F’dawn il-kondizzjonijiet, il-pjan jagħti l-punt friża tal-ħalib fi gradi Celsius. 4. L-apparat u l-affarijiet tal-ħġieġ Tagħmir tas-soltu tal-laboratorju u, b’mod partikolari: 4.1. Il-krijoskopu Il-krijoskopu jikkonsisti f’banju ta’ tkessiħ ikkontrollat termostatikament, sonda termistor (termometru semikonduttur ta’ reżistenza) b’ċirkwit assoċjat u galvanometru jew "read-out", aġitatur kampjun u strument biex jinbeda l-iffriżar flimkien ma’ tubi kampjun. 4.1.1. Il-banju ta’ tkessiħ Żewġ tipi ta’ banju tat-tkessiħ jistgħu jintużaw. 4.1.1.1. It-tip ta’ l-immersjoni Banju protett sewwa li jikkontjeni likwidu xieraq għat-tkessiħ, li hu mħawwad sabiex id-differenza fit-temperatura bejn xi żewġ punti fil-likwidu ma teċċedix 0,2 oC. It-temperatura tal-likwidu m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 0,5 oC mill-valur nominali ddikjarat mill-fabbrikant. Huwa importanti li l-likwidu fil-banju ta’ tkessiħ jiġi mantnut f’livell kostanti. Is-superfiċi kollu tat-tubu kampjun taħt il-marka tal-volum għandu jkun kopert bil-likwidu ta’ tkessiħ. 4.1.1.2. It-tip ta’ ċirkolazzjoni Nixxiegħa kontinwa ta’ likwidu addattat tat-tkessiħ hi ċċirkolata madwar it-tubu kampjun. It-temperatura tal-likwidu m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 0,5 oC mill-valur nominali ddikjarat mill-fabbrikant. Likwidu addattat għat-tkessiħ huwa soluzzjoni ilma 33 % (v/v) ta’ etan 1,2 diol (ethylene glycol). 4.1.2. It-termistor u ċ-ċirkwit miegħu It-termistor għandu jkun ta’ tip ta’ sonda tal-ħġieġ, ta’ dijametru mhux akbar minn 1,80 ± 0, 2 mm u b’dijametru taċ-ċomb mhux akbar minn 0,31 mm. Il-kostant tal-ħin tat-termistor għandu jkun inqas minn żewġ sekondi u l-valur ta’ β (ara n-nota) għandu jkun għoli. Il-vultaġġ ta’ operazzjoni, il-kurrent u l-kostant tad-dissipazzjoni għandhom ikunu tali li t-temperatura tat-termistor ma titlax b’iktar minn 0,005 oC ’il fuq mill-ambjent tagħha b’ – 0,512 oC It-tolleranza massima fuq ir-reżistenza għandha tkun ± 5 %. Meta s-sonda tkun fil-pożizzjoni ta’ operazzjoni fil-krijoskopu, il-ponta taż-żibġa tal-ħġieġ għandha tkun fl-assi tat-tubu kampjun u f’punt 44,6 ± 0,1 mm taħt ’il fuq tat-tubu (ara l-figura fuq paġna 15) Għandha tiġi pprovduta template sabiex l-utent ikun jista jqiegħed is-sonda f’din il-pożizzjoni. Nota ß tiddefinixxi l-karatteristiċi tat-temperatura-reżistenza tat-termistor skond il-formola: − × = βT2 fejn: T hija t-temperatura f’Kelvin, R hija r-reżistenza f’ohms bit-temperatura T, − × 1R hija l-koeffiċjent tat-temperatura. β hija l-kostanti li tiddependi fuq il-materjal użat biex isir it-termistor. Fil-prattika kurrenti valur li jaqbeż it-3000 hu rakkomandat. 4.1.3. Strument ta’ kejl u read–out 4.1.3.1. Il-prinċipju tal-kejl L-istrument użat għandu jopera fuq il-prinċipju ta’ l-ewwel it-tiftix tal-"pjan" fil-kurva tal-punt friża. Il-pjan huwa parti mill-kurva fejn it-temperatura tibqa’ kostanti sa ± 0, 002 oC għal minimu ta’ 20 sekonda. 4.1.3.2. L-operazzjoni manwali Ir-reżistenza tat-termistor għandha tkun ibbilanċjata permezz ta’ pont Wheatstone jew strument simili, bl-użu ta’ resistors stabbli ta’ l-ogħla kwalità li t-tolleranza tagħhom ma' tkunx akbar minn ± 10 % u li l-koeffiċjent tat-temperatura tagħhom ma jaqbiżx 2 × 10-5 oC. Ir-resistor varjabbli (li jibbilanċja) m’għandux jitlaq mil-linearità tul ir-range kompleta b’iktar minn 0,3 % tal-valur massimu. Għandu jkun hemm mezz ta’ aġġustar tar-reġistraturi għal skopijiet ta’ kalibrazzjoni. L-arloġġ tal-kejl għandu jkun gradwat f’intervalli mhux akbar minn 0,001 oC 4.1.3.3. L-operazzjoni awtomatika L-istrument read-out għandu jipprovdi diskriminazzjoni ta’ mill-inqas 0,001 oC tul range ta’ 0 sa - 1 oC L-istabbilità ta’ l-istrument read-out u ċ-ċirkwit assoċjat tiegħu għandhom ikunu tali li indikazzjonijiet suċċessivi ta’ l-istess temperatura ma jvarjawx b’iktar minn 0,001 oC. Il-linearità taċ-ċirkwit għandha tkun tali li ebda żball ikbar minn ± 0, 001 oC ma hu introdott f’xi punt fir-range – 0,400 oC sa – 0,600 oC meta l-istrument hu operat b’mod korrett. 4.1.4. Il-wajer għat-taħlit Wajer tal-metall inert għall-ħalib u b’dijametru bejn 1 u 1,5 mm hu użat biex jitħallat il-porzjon tat-test. Il-wajer tat-taħlit għandu jkun aġġustat għall-amplitudni u għandu jiġi mmuntat wieqaf bit-tarf tan-naħa t’isfel livell mal-ponta tas-sonda termistor. Tolleranza ta’ xi 1,5 mm ’l fuq jew ’l isfel minn din il-pożizzjoni hi permessa. Il-wajer għat-taħlit għandu jivvibra lateralment b’amplitudni biżżejjed iddikjarata mill-fabbrikant (mhux inqas minn + 1,5 mm) sabiex ikun assigurta li t-temperatura fil-porzjon tat-test tibqa’ uniformi tul id-determinazzjoni. F’ebda ħin tul l-operazzjoni normali tat-taħlit ma għandu l-wajer għat-taħlit jolqot is-sonda termistor jew lill-ġenb tat-tubu. 4.1.5. Strument għall-bidu ta’ l-iffriżar Dan jista’ jkun kull strument li meta operat jibda instantanjament l-iffriżar tal-kampjun sabiex it-temperatura tal-porzjon tat-test togħla lejn il-punt ta’ l-iffriżar. Il-wajer għat-taħlit jista jiġi użat għal dan l-iskop; proċedura waħda hi li tiżdied l-amplitudni tal-vibrazzjoni għal minn sekonda sa żewġ sekondi sabiex il-wajer tat-taħlit jolqot lill-ġnub tat-tubu tal-kampjun. 4.1.6. Tubi tal-kampjuni It-tubi tal-kampjuni (ara figura 1) għandhom ikunu tal-ħġieġ u jkunu 50,8 ± 0,1 mm twal, 16,0 ± 0,1 mm fid-dijametru estern u 13,5 ± 0,1 mm fid-dijametru intern. Il-ħxuna tal-ġnub tul it-tubu m’għandhiex tvarja b’iktar minn 0,1 mm. It-tubi għandu jkollhom marka ta’ volum 29,8 mm taħt it-tarf (21 mm fuq in-naħa t’isfel tat-tubu) sabiex tindika l-volum kampjun ta’ 2,5± 0,1 ml. 4.1.7. Il-fornitura ta’ l-elettriku Il-vultaġġ ta’ fornitura għandu jiġi stabilizzat, jew fl-apparat jew esternament sabiex il-varjazzjoni ma taqbiżx ± 1 % tal-valur nominali meta l-fornitura tal-mains tvarja b’ ± 6 %. 4.2. Il-bilanċ analitiku 4.3. Kunjetti volumetriċi ta’ marka waħda, kapaċità ta’ 1000 ml, klassi A. 4.4. Forn għat-tnixxif, ventilat tajjeb, kapaċi li jmantni temperatura ta’ 130 ± 1 oC jew Forn elettriku, ventilat, kapaċi li jmantni temperatura ta’ 300 ± 25 oC 4.5. Dessikatur 5. Ir-riaġenti 5.1. Ilma borosilikat distillat mill-ħġieġ, mgħolli u mkessaħ sa 20 ± 2 oC f’kunjett b’tubu li jassorbi d-djiossidu tal-karbun. 5.2. Il-klorur tas-sodju, kwalità ta’ riaġent analitika, mitħun tajjeb, imnixxef għal ħames sigħat bi 300 ± 25 oC f’forn jew alternattivament imnixxef f’forn b’130 ± 1 oC għal mill-inqas 24 siegħa u mkessaħ għat-temperatura tal-kamra f’dessikatur effiċjenti. 5.3. Il-preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet standard Iżen l-ammont approprjat (ara Tabella 1) ta’ klorur tas-sodju niexef (5.2) fi flixkun ta’ l-użin. Ħoll f’ilma distillat (5.1), ittrasferixxi kwantitattivament għall-marka 1000 ml f’kunjett volumetriku u żid sal-marka bl-ilma f’20 ± 2oC Aħżen f’madwar 5 oC fi fliexken tal-polietilin magħluqin sewwa ta’ kapaċità mhux akbar minn 250 ml għal mhux iktar minn xahrejn. Il-punt tal-friża tas-soluzzjonijiet tal-klorur tas-sodju f’ 20 oC g NaCl/l | oC | 6,859 | –0,408 | 7,818 | –0,464 | 8,149 | –0,483 | 8,314 | –0,492 | 8,480 | –0,502 | 8,646 | –0,512 | 8,811 | –0,521 | 8,977 | –0,531 | 9,143 | –0,541 | 10,155 | –0,600 | Qabel ma tintuża s-soluzzjoni standard, il-flixkun għandu jiġi maqlub bil-mod u mdawwar diversi drabi sabiex jitħallat sew il-kontenut tiegħu. F’ebda ħin ma għandha s-soluzzjoni standard tiġi aġitata b’mod vjolenti sabiex tinkorpora l-arja. Kampjuni ta’ soluzzjoni standard għandhom jittieħdu mill-flixkun billi titferra’ s-soluzzjoni f’buqar nadif niexef, jiġifieri l-pipetti ma għandhom qatt jintużaw għal dan l-iskop. Is-soluzzjonijiet m’għandhomx jintużaw minn fliexken mimlijin inqas minn kwart, u jekk mhux ippreservati b’funġiċidi (per eżempju soluzzjoni tijomersali, 10 g/l), m’għandhomx jintużaw jekk għandhom iktar minn xahrejn. 6. Il-kalibrazzjoni tal-krijoskopu termistor Il-krijoskopu għandu jkun stabbilit sabiex it-temperatura ta’ l-arja ambjentali ma tiddevjax iktar minn 1 oC mit-temperatura li fiha l-kalibrazzjoni hi mwettqa. Il-krijoskopu m’għandux ikun espost għad-dawl tax-xemx jew għall-kurrent f’temperatura ’l fuq minn 26-27 oC Għandu jkun assigurat li l-krijoskopu hu f’kondizzjoni operattiva tajba skond l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant, u li kien mixgħul għal mill-inqas 12-il siegħa qabel il-kalibrazzjoni. Għandha tiġi kkontrollata l-pożizzjoni tas-sonda, l-amplitudini tal-wajer tat-taħlit li jivvibra u t-temperatura tal-likwidi li jkessħu. Għandhom jintgħażlu żewġ soluzzjonijiet standard (ara t-Tabella 1 fuq) li joqorbu għall-valur mistenni tal-punt ta’ l-iffriżar tal-kampjuni tal-ħalib li għandhom jiġu eżaminati. Id-differenza fil-punti ta’ l-iffriżar bejn iż-żewġ soluzzjonijiet m’għandhiex preferibbilment tkun inqas minn – 0,100 oC (F’xi disinni ta’ krijoskopu kurrentement disponibbli iċ-ċirkwit assoċjat mat-termistor hu ddisinjat biex ikun ibbilanċjat fuq valur speċifiku ta’ punt ta’ l-iffriżar fir-range tal-kejl ta’ l-istrument. F’dawn il-każijiet l-użu ta’ soluzzjoni standard li jkollha l-punt ta’ l-iffriżar bħala waħda mis-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni jiffaċilita l-proċedura tal-kalibrazzjoni, u l-fabbrikant għandu jindika dan il-valur). Pipetta 2,5 ± 0,1 ml ta’ standard wieħed f’tubu kampjun standard nadif, niexef u opera l-krijoskopu. Nota: It-tubi tal-kampjuni użati tul il-kalibrazzjoni għandhom ikunu magħmula mill-istess tip ta’ ħġieġ u maħsula u mlaħalħa b’ilma dimineralizzat fl-istess ħin bħal dawk użati tul it-test tal-kampjuni tal-ħalib. It-temperaturi tas-soluzzjonijiet standard għandhom ikunu simili għal dawk tal-kampjuni tal-ħalib. Għandhom jiġu aġġustati l-kontrolli tal-kalibrazzjoni, kif indikat mill-fabbrikant, sakemm il-qari tal-krijoskopu ikun ugwali għall-punt friża tas-soluzzjoni standard. Il-proċedura għandha tiġi ripetuta bis-soluzzjoni standard l-oħra, u tibqa’ talterna b’dan il-mod sakem qari suċċessiv fuq kull soluzzjoni, mingħajr iktar aġġustament tal-kontrolli tal-kalibrazzjoni, jagħti l-valur korrett tal-punt friża ta’ kull wieħed. Il-krijoskopu hu mbagħad lest għall-użu u jindika direttament il-punt friża tal-kampjun tal-ħalib mingħajr applikazzjoni ta’ xi korrezzjoni. 7. Il-preparazzjoni tal-kampjun tat-test 7.1. Il-kampjuni għandhom jiġu maħżuna, jekk neċessarji, f’temperatura bejn iż-0 u l − 5 oC 7.2. Għandha titneħħa kull entità barranija viżibbli jew xaħam tal-butir solidu mill-kampjun, jekk neċessarju bil-filtrazzjoni f’kontenitur nadif, niexef, u l-kampjun jitħallat bil-mod. Il-filtru, jekk użat, għandu jkun inert għall-ħalib u għandu jkun effettiv meta użat f’temperatura ta’ laboratorju. 7.3. Il-ħalib jista’ jiġi eżaminat meta jkun fit-temperatura ta’ ħażna tiegħu (bejn 0 u 5 oC) jew jista jitħalla jasal għal temperatura tal-laboratorju immedjatament qabel jinbeda t-test. Madanakollu, huwa neċessarju li s-soluzzjonijiet standard u l-kampjuni tal-ħalib huma fl-istess temperatura meta użati. 7.4. Għandha tiġi determinata l-aċidità titratabili tal-ħalib kemm jista’ jkun fl-istess ħin bħall-punt friża tat-test. Il-kampjuni b’aċidità li teċċedi 0,18 g għal kull 100ml tal-ħalib ma jistgħux jiġu eżaminati 7.5. Ħalib trattat bil-UHT u sterilizzat għandu joqgħod għal mill-inqas 20 minuta f’kontenitur miftuħ qabel l-eżami. 8. Il-proċedura 8.1. Kontrolli preliminari Għandu jiġi kkontrollat li l-livell u t-temperatura tal-likwidu li jkessaħ huma skond l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant u li, jekk approprjat, is-sonda termistor hija f’tubu vojt ta’kampjun fil-post tal-kampjuni. Għandu jinxtegħel il-krijoskopu u jiġi assigurat li l-likwidu li jkessaħ qed jiġi mħallat jew iċċirkolat sewwa, kif approprjat Meta l-krijoskopu ikun inxtegħel għal mill-inqas 12 –il siegħa, għandha tiġi kkontrollata t-temperatura tal-likwidu li jkessaħ u l-pożizzjoni u l-amplitudini tal-vibrazzjoni tal-wajer li jħallat. 8.2. L-eżami rutina ta’ kalibrazzjoni Qabel kull prova, għandu jitkejjel il-punt friża tas-soluzzjoni standard tal-klorur tas-sodju (e.ż. soluzzjoni bil-punt friża – 0,512 oC) sakemm żewġ determinazzjonijiet konsekuttivi ma jvarjawx b’iktar minn 0,001 oC Jekk il-medja ta’ dawn il-valuri tvarja mill-punt friża tas-soluzzjoni standard b’iktar minn 0,002 oC il-krijoskopu għandu jerġa jiġi kkalibrat kif deskritt f’6. Jekk il-krijoskopu huwa f’użu kontinwu, wettaq l-eżami rutina ta’ kalibrazzjoni. Jekk il-krijoskopu huwa f’użu kontinwu, wettaq l-eżami rutina ta’ kalibrazzjoni mill-inqas darba f’siegħa. L-istruzzjonijiet tal-fabbrikant għandu jittieħed kont tagħhom. 8.3. Id-determinazzjoni tal-punt friża tal-ħalib Bil-mod aqleb u dawwar il-flixkun tal-kampjun tal-ħalib ħafna drabi biex jitħallat il-kontenut. F’ebda ħin ma għandu l-kampjun ikun aġitat daqshekk bil-goff li jinkorpora l-arja. Ippipetta 2,5 ± 0, 1 ml tal-ħalib f’tubu ta’ kampjun, nadif, niexef, u neħħi xi eċċess b’pipetta. Assigura li s-sonda u l-wajer tat-taħlit huma nodfa u niexfa, jekk neċessarju, billi jintmesħu b’attenzjoni b’tessut mingħajr tnietex minn isfel għal fuq. Inserixxi t-tubu ta’ kampjun fil-krijoskopu kalibrat skond l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant. Il-ħalib jiksaħ u jibda l-iffriżar f’temperatura speċifikata mill-fabbrikant f’ 0,1 oC (F’xi strumenti awtomatiċi din it-temperatura tista’ tiġi osservata fuq ir-read-out diġitali; fuq strumenti manwali il-preċiżjoni neċessarja tintlaħaq billi jiġi assigurat li l-iffriżar jibda meta l-vleġġa jew il-linja fuq il-galvanometru jikkoinċidu mal-marka approprjata). Jekk, għal xi raġuni, l-iffriżar jibda qabel jew wara r-range ta’ temperatura speċifikata it-test għandu jitħalla u jiġi ripetut b’porzjon ta’ test ieħor tal-ħalib. Jekk il-kampjun ta’ repetizzjoni wkoll jiffriża qabel it-temperatura speċifikata, porzjon ieħor tal-kampjun għandu jissaħħan sa 45 oC u jinżamm għal ħames minuti biex jippermetti t-tidwib tax-xaħam tal-kristallini. Imbagħad għandu jerġa’ jitħalla jiksaħ għat-temperatura ta’ testing u jiġi eżaminat immedjatament. It-temperatura tal-ħalib wara l-bidu ta’ l-iffriżar togħla rapidament għal valur li jibqa’ virtwalment kostanti għal xi ħin qabel ma jerġa’ jinżel. Il-punt ta’ ffriżar jikkorrispondi għall-ogħla temperatura milħuqa tul dan il-perjodu u dan il-valur għandu jiġi rreġistrat. Nota Il-ħin li tulu t-temperatura tibqa’ kostanti u l-intervall tal-ħin bejn il-bidu ta’ l-iffriżar u meta tintlaħaq l-ogħla temperatura jvarjaw minn kampjun għal kampjun u jkunu konsiderevolment iqsar għall-ilma u soluzzjonijiet standard tal-klorur tas-sodju milli għall-ħalib. Huwa essenzjali li tkun l-ogħla temperatura li tiġi rreġistrata. Meta l-kejl ikun ġie kompletat b’mod sodisfaċenti, it-tubu għandu jitneħħa, is-sonda termistor għandha titlaħlaħ bl-ilma u mbagħad tiġi xxuttata u mħallta b’tessut mingħajr tnietex, artab, nadif minn isfel għal fuq u mbagħad issir determinazzjoni duplikata fuq porzjon ieħor tal-kampjun tal-ħalib. Jekk id-differenza bejn il-punti friża ottenuti hija ikbar mill-valur ta’ repetizzjoni (0,004 oC), għandha titwettaq determinazzjoni duplikata fuq porzjon ieħor tal-kampjun. Sakemm iż-żewġ determinazzjonijiet jaqblu sa bejn 0,004 oC, il-valuri għandhom jiġu rreġistrati u użati biex jikkalkulaw ir-riżultat finali. 8.4. It-tkessiħ tas-sonda Wara li jintuża l-istrument, għandu jitqiegħed tubu ta’ kampjun vojt fil-ħofra tal-kampjuni u titbaxxa r-ras operattiva sabiex is-sonda tinżamm kiesħa. (F’ċerti disinni ta’ krijoskopu dan jista’ ma jkunx possibbli; f’dawn il-każijiet, huwa essenzjali li jiġi assigurat li s-sonda titkessaħ b’mod adegwat qabel ma jittieħdu l-miżuri, per eżempju, billi jsiru diversi determinazzjonijiet finti sakemm ikun ottenut qari konsistenti). 9. L-espressjoni tar-riżultati 9.1. Il-kalkolu Jekk, wara l-kontroll ta’ kalibrazzjoni rutina, il-kalibrazzjoni tkun ikkonfermata, għandha tiġi kkalkulata l-medja tal-valuri tal-punt tal-friża duplikati aċċettabbli ottenuti arrotondati sat-tielet post deċimali. Jekk is-somma ta’ żewġ valuri aċċettabbli duplikati hi numru fard, il-medja għandha tiġi arrotondata sa l-eqreb valur biż-żewġ kif muri fl-eżempju li ġej: Il-punt tal-friża (oC) Valuri duplikati | Medja | | | 0,544 | –0,545 | –0,544 | –0,545 | –0,546 | –0,546 | 9.2. Il-preċiżjoni 9.2.1. Ir-rata ta’ Repetizzjoni (r): 0,004 oC. 9.2.2. Ir-Riproduċibbiltà (R): 0,006 oC. +++++ TIFF +++++ Figura 1Dettall tal-Krijoskopju Termistor 4.1 (pożizzjoni ta’ tubu kampjun relata maż-żibga termistor u mal-wajer tat-tahlit II. ID-DETERMINAZZJONI TA’ L-ATTIVITÀ BIL-PHOSPHATASE 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għad-determinazzjoni ta’ l-attività phosphatase f’ħalib pasturizzat. 2. Tifsira 2.1. L-attività tal-phosphatase hija miżura tal-kwantità ta’ phosphatase alkalini attivi preżenti fil-prodott, espressi bħala kwantità ta’ fenol, f’mikrogrammi, liberat taħt il-kondizzjonijiet imsemmija fil-proċedura b’1 ml tal-ħalib ippasturizzat. 2.2. Kull ħalib li l-attività phospohatase tiegħu hi taħt l-4 mg/ml hu kkunsidrat li jkun negattiv phosphatase. 3. Il-prinċipju L-attività phosphatase hi evalwata mill-ammont tal-fenol liberat mill-fenil-fosfat tad-disodju miżjud mal-kampjun. Il-fenol illiberat jirreaġixxi mad-dibromoquinonechlorimide u jipproduċi dibromoindophenol (blu fil-kulur) li hu mkejjel kulurmetrikament f’ 610 mm. Isir paragun mal-kampjun meta l-enżima tal-fosfat tkun ġiet distrutta. 4. Ir-riaġenti 4.1. Buffer ta’ l-idrossidu borat tal-Barjum 4.1.1. Ħoll 50,0 g ta’ idrossidu tal-barjum[Ba(OH)2.8H2O)]fl-ilma u żidu sa 1000 ml. 4.1.2. Ħoll 22,0 g ta’ aċidu boriku[H3BO3]fl-ilma u żidu sa 1000 ml. 4.1.3. Saħħan 500 ml ta’ kull soluzzjoni sa 50 oC, ħallat is-soluzzjonijiet, kessaħ rapidament sa madwar 20 oC, aġġusta l-pH, jekk neċessarju sa 10,6 ± 0, 1 bl-addizzjoni tas-soluzzjoni 4.1.1 jew 4.1.2. Iffiltra. Aħżen is-soluzzjoni f’kontenitur magħluq sewwa. 4.1.4. Iddilwa qabel l-użu b’volum ugwali ta’ ilma. 4.2. Buffer ta’ l-iżvilupp tal-kulur Ħoll 6,0 g ta’ metaborat tas-sodju (NaBO2)jew 12,6 g ta’ (NaBO2.4H2O), u 20,0 g ta’ klorur tas-sodju (NaCl) fl-ilma u żid sa 1000 ml. 4.3. Buffer tad-dilwizzjoni tal-kulur Iddilwa 10 ml tal-buffer ta’ żvilupp tal-kulur (4.2) ma’ 100ml bl-ilma. 4.4. Is-substrat tal-buffer Ħoll 0,1 g ta’ deidrat tal-fenilfosfat tad-disodju ħieles mill-fenol f’100ml ta’ buffer (4.1.3) jew ħoll 0,5 g ta’ fenilfosfat tad-disodju f’4,5ml tal-buffer ta’ żvilupp tal-kulur (4.2), żid żewġ qatriet tas-soluzzjoni BQC (4.6) u ħalli f’temperatura tal-kamra għal 30 minuta. Il-kulur hekk iffurmat għandu jiġi estratt b’2,5ml ta’ butan-1-ol u jitħalla sakemm il-butan-1-ol hu sseparat. Neħħi l-butan–1-ol u armi. Din l-estrazzjoni għandha tiġi ripetuta jekk neċessarju. Is-soluzzjoni tista’ tinħażen fi friġġ għal ftit jiem; żviluppa l-kulur u irrepeti l-estrazzjoni qabel l-użu. Ipprepara s-substrat tal-buffer immedjatament qabel l-użu billi tiddilwa 1ml ta’ din is-soluzzjoni ma’ 100ml bil-buffer barium borate-hydroxide. 4.5. Il-preċipitant taż-żingu-tar-ramm Ħoll 3,0 g tas-sulfat taż-żingu (ZnSO4, 7H2O) u 0,6 g tas-sulfat tar-ramm (II) (CuSO4, 5H2O) fl-ilma u żid sa 100ml. 4.6. 2,6- Is-soluzzjoni tad-Dibromoquinonechlorimide (Soluzzjoni BQC) Ħoll 40 ± 1 mg ta’ 2,6-dibromoquinonechlorimide (BQC) (C6H2Br2CINO6) f’ 10 ml ta’ 96 % (v/v) etanol. Aħżen fi flixkun bil-ħġieġ skur fi friġġ. Armi jekk huwa skulurat jew ta’ żmien iktar minn xahar. 4.7. Soluzzjoni tas-sulfat tar-ramm (II) Ħoll 0,05 g tas-sulfat tar-ramm (II) (CuSO4.5H2O) fl-ilma u żid sa 100 ml. 4.8. Is-soluzzjonijiet standard tal-fenol. 4.8.1. Iżen 200 ± 2 mg ta’ fenol anidridu pur, ittrasferixxi għal kunjetta volumetrika ta’ 100ml, żid l-ilma, ħallat u żid sal-marka. Din is-soluzzjoni stock tibqa’ stabbli għal diversi xhur fi friġġ. 4.8.2. Iddilwa 10 ml tas-soluzzjoni stock ma’ 100ml ilma u ħallat. 1ml jikkontjeni 200 mg ta’ fenol. 5. Apparat u affarijiet tal-ħġieġ Noti: (a) L-affarijiet tal-ħġieġ, l-istoppers u l-għodda kollha biex jittieħdu l-kampjuni għandhom jitnaddfu b’attenzjoni. Hu rakkomandat li jitlaħalħu b’ilma mgħolli distillat frisk jew li jitfawru. (b) Ċerti tipi ta’ stoppers tal-plastik jistgħu jikkawżaw kontaminazzjoni fenolika u l-użu tagħhom m’għandux ikun permess. It-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u, b’mod partikolari: 5.1. Il-bilanċ analitiku 5.2. Banju ta’ l-ilma, kapaċi li jinżamm f’37 ± 1 oC. 5.3. Spettrofotometru tajjeb għal qari fuq wavelength ta’ 610 mm. 5.4. Test tubes, 16 jew 18 mm × 150 mm, preferibbilment gradwati b’ 5 u 10 ml. 5.5. Pipetti 5.6. Lenbuti tal-ħġieġ ta’ daqs konvenjenti, per eżempju 5 ċm f’dijametru. 5.7. Filtri mitwija mill-inqas 9ċm f’dijametru għal veloċità medja ta’ filtrazzjoni. 5.8. Kunjetti volumetriċi għall-preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet standard. 6. Il-proċedura Noti: (a) Għandha tiġi evitata l-influwenza ta’ dawl tax-xemx dirett tul id-determinazzjoni. (b) Kontaminazzjoni bi traċċi ta’ riq jew għaraq tista’ tagħti riżultati pożittivi foloz u għandha tiġi evitata. F’dan ir-rigward, għandha tingħata attenzjoni speċjali lill-proċedura ta’ l-ippippettar. 6.1. Il-preparazzjoni tal-kampjun tat-test 6.1.1. Wettaq l-analiżi direttament wara li jittieħed il-kampjun. Inkella, żomm il-kampjun fi friġġ, imma għal mhux iktar minn jumejn. 6.2. Il-porzjon tat-test Ippipetta f’kull wieħed miż-żewġ test tubes (5.4) 1 ml tal-kampjun tat-test, bl-użu ta’ tubu wieħed bħala kontroll jew vojt. 6.3. Determinazzjoni 6.3.1. Saħħan il-vojt għal żewġ minuti f’ilma mgħolli; kopri t-test tube u l-buqar ta’ l-ilma jagħli b’foil ta’ l-aluminju sabiex ikun assigurat li t-tubu sħiħ ikun sħun. Kessaħ malajr għat-temperatura tal-kamra. 6.3.2. Ittratta l-vojt u l-kampjun tat-test b’mod simili għall-bqija tal-proċedura. Żid 10 ml tas-substrat tal-buffer (4.4) u ħallat. 6.3.3. Il-kampjuni għandhom jitqiegħdu f’inkubazzjoni immedjatament fil-banju ta’ l-ilma (5.2) għal 60 minuta, u l-kontenut għandu jitħallat okkażjonalment (mill-inqas erba’ darbiet). 6.3.4. Saħħan f’ilma jagħli għal żewġ minuti bl-istess mod kif taħt 6.3.1. Kessaħ malajr għat-temperatura tal-kamra. 6.3.5. Żid 1 ml ta’ preċipitant tar-ramm- taż-żingu (4.5) ma’ kull tubu u ħallat sew. 6.3.6. Iffiltra minn karta niexfa tal-filtru, armi l-ewwel 2 ml, erġa’ ffiltra jekk neċessarju sakemm il-filtrat hu kompletament ċar, u iġbor 5ml f’test tube. 6.3.7. Żid 5 ml tal-buffer ta’ l-iżvilupp tal-kulur (4.2). 6.3.8. Żid 0,1ml tas-soluzzjoni BQC (4.6), ħallat u ħalli l-kulur jiżviluppa għal 30 minuta fit-temperatura tal-kamra. 6.3.9. Kejjel l-assorbiment kontra l-kontroll jew il-vojt fl-ispettrofotometru (5.3) f’wavelength ta’ 610 nm. 6.3.10 Irrepeti d-determinazzjoni b’dilwizzjoni approprjata tal-kampjun jekk l-assorbiment kif imkejjel taħt 6.3.9 jeċċedi l-assorbiment ta’ l-istandard li jikkontjeni 20 mg tal-fenol għal kull tubu kif imkejjel taħt 6.4.4. Ipprepara din id-dilwizzjoni billi tħallat volum tal-kampjun tat-test ma’ volum approprjat ta’ parti ta’ l-istess kampjun tat-test b’attenzjoni sat-togħlija sabiex il-phosphatase ikun diattivat. 6.4. Il-preparazzjoni tal-kurva ta’ kalibrazzjoni 6.4.1. Ipprepara range approprjat ta’ standards dilwiti, billi tibda mill-fenol standard (4.8.2.), li jikkontjeni 0 (kontroll jew vojt), 2,5, 10 u 20 mg ta’ fenol għal kull millimetru u ppipetta rispettivament 1 ml ta’ ilma u 1 ml ta’ l-erba’ soluzzjonijiet standard tal-fenol f’kull wieħed mill-ħames test tubes. 6.4.2. Żid ma’ kull test tube 1ml tas-soluzzjoni tas-sulfat tar-ramm (II) (4.7), 5 ml tal-buffer tad-dilwizzjoni tal-kulur (4.3), 3 ml ta’ ilma u 0,1 ml tas-soluzzjoni BQC (4.6); ħallat. 6.4.3. Ħalli l-kulur jiżviluppa għal 30 minuta f’temperatura tal-kamra. 6.4.4. Kejjel l-assorbiment kontra l-kontroll jew il-vojt fl-ispettrofotometru f’wavelength ta’ 610 nm (5.3). 6.4.5. Mill-valuri ta’ l-assorbiment (6.4.4) ottenut għal kull kwantità ta’ fenol miżjud (6.4.1), ikkalkula l-linja ta’ rigress skond il-proċedura ta’ l-inqas kaxxi. 7. L-espressjoni tar-riżultati 7.1. Il-kalkolu u l-formula 7.1.1. Ikkalkula mill-qari ta’ l-assorbiment (6.3.9) il-kwantità tal-fenol bl-użu tal-linja ta’ rigress ottenuta (6.4.5) 7.1.2. Ikkalkula l-attività tal-phosphatase, espressa bħala mikrogrammi ta’ fenol għal kull millimetru tal-ħalib pasturizzat mill-formula li ġejja: L-attività tal-phosphatase = 2,4 × A × D Fejn A hija l-kwantità ta’ fenol f’mikrogrammi ottenuta taħt 7.1.1; D huwa l-fattur ta’ dilwizzjoni skond 6.3.10 (fil-każ ta’ ebda dilwizzjoni, D = 1); Il-fattur 2,4 huwa l-fattur ta’ dilwizzjoni (5/12 ta’ kampjun tat-test ta’ 1 ml) – Ara 6.2. inkonnessjoni ma’ 6.3.2, 6.3.5 u 6.3.6 7.2. Il-preċiżjoni 7.2.1. Ir-rata ta’ repetizzjoni (r) : 2 μg fenol/ml. 7.2.2. Ir-Riproduċibbiltà (R) : 3(preliminarju) μg fenol/ml. 7.2.3. Jekk id-dilwizzjoni hija applikata skond 6.3.10 il-limitu msemmi f’ 7.2.1 u 7.2.2. hu msemmi fir-riżultati ottenuti fuq il-kampjun ta’ dilwizzjoni. III. ID-DETERMINAZZJONI TA’ L-ATTIVITÀ TAL-PEROXIDASE 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tissimplifika l-proċedura ta’ referenza għad-determinazzjoni tal-preżenza jew l-assenza ta’ l-enżima ta’ peroxidase fil-ħalib bħala kontroll ta’ pasturizzazzjoni. 2. Tifsira Peroxidase - reazzjoni pożittiva: Jekk il-ħalib hu ppasturizzat kif suppost jifforma kulur blu fi żmien 30 sekonda wara t-taħlit. Peroxidase - reazzjoni negattiva: Ebda kulur ma jseħħ fi żmien 30 sekonda wara t-taħlit. 3. Il-prinċipju L-enżima tal-peroxidase tiddikomponi l-perossidu ta’ l-idroġenu. L-ossiġenu atomiku liberat jossida l-1,4 phenylenediamine mingħajr kulur fl-indofenolu vjola (it-test Storch) L-intensità tal-kulur hi proporzjonali għall-konċentrazzjoni ta’ l-enżima. 4. Ir-riaġenti 4.1. Soluzzjoni ta’ 1,4-phenylenediamine Ħoll 2 g 1,4 phenylenediamine (C6H8N2) f’ilma sħun (50 oC) u żid sa volum ta’ 100 ml. Żomm is-soluzzjoni fi flixkun kannella skur b’ tapp tal-ħġieġ u aħżen f’post kiesaħ u fid-dlam. Wara l-preparazzjoni, soluzzjoni ta’ 1,4 – phenylenediamine tifforma sediment fi żmien jum jew jumejn: għandha mbagħad tintrema. 4.2. Soluzzjoni tal-perossidu ta’ l-idroġenu Iddilwa 9 ml ta’ perossidu ta’ l-idroġenu 30 % fl-ilma u żid sa volum ta’ 100 ml. Biex tistabilizza, żid 1ml aċidu tal-kubrit ikkonċentrat għal kull litru ta’ soluzzjoni. Is-soluzzjoni tal-perossidu ta’ l-idroġenu huwa stabbli għal xahar, jekk miżmum f’post kiesaħ fid-dlam u fi flixkun b’ tapp tal-ħġieġ li jipprevieni kull kuntatt ma’ komposti organiċi. 5. Il-proċedura 5.1. Inserixxi 5ml tal-kampjun tal-ħalib f’test tube nadif b’għeluq xieraq. 5.2. Żid 5 ml tas-soluzzjoni phenylenediamine 1,4 (4.1). 5.3. Żid 2 qatriet tas-soluzzjoni tal-perossidu ta’ l-idroġenu (4.2). 5.4. Osserva l-produzzjoni tal-kulur fi żmien 30 sekonda wara t-taħlit Jekk jiġi prodott il-kulur blu iktar tard minn 30 sekonda wara ż-żieda tar-riaġenti ir-reazzjoni mhijiex speċifika. IV. L-ENUMERAZZJONI TA’ MIKRO-ORGANIŻMI — IT-TEST TAL-KONT TAL-PLATES F’ 30 oC 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għall-enumerazzjoni ta’ mikroorganiżmi permezz ta’ teknika ta’ kont tal-kolonji b’ 30 oC. Din il-proċedura hija applikabbli għal ħalib mhux ipproċessat u għal ħalib pasturizzat u għal ħalib trattat bl-UHT u ħalib sterilizzat preinkubat fi 30 oC għal 15-il ġurnata. 2. Tifsira In-nominazzjoni "mikro-organiżmi" tfisser: organiżmi li jiffurmaw kolonji li jistgħu jingħaddu meta inkubati ajrubikament taħt il-kondizzjonijiet deskritti. 3. Il-prinċipju Volum definit tal-kampjun tal-ħalib hu mħallat mal-medium ta’ kultura f’ kontenituri Petri u inkubat f’ 30 oC għal 72 siegħa. Il-kolonji huma magħduda u n-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull 1ml ta’ ħalib mhux ipproċessat jew pasturizzat jew għal kull 0,1ml ta’ ħalib preinkubat trattat b’UHT jew sterilizzat hu kkalkulat. 4. Apparat u affarijiet tal-ħġieġ It-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u, b’mod partikolari: 4.1. L-apparat 4.1.1. Forn ta’ l-arja sħuna, kapaċi li jopera f’ 170 sa 175 oC 4.1.2. Awtoklavi, kapaċi li jopera f’ 121 + 1 oC. 4.1.3. Inkubatur, kapaċi li jmantni temperatura ta’ 30 ± 1 oC fil-punti kollha fih. 4.1.4. pH-meter, b’kumpens ta’ temperatura, eżatt sa ± 0, 1 unità pH. 4.1.5. Banju ta’ l-ilma, kapaċi li jopera f’ 45 ± 1 oC. 4.1.6. Lenti, ingradiment effettiv 2 – 4x 4.1.7. Lenti, ingradiment effettiv 8 – 10x 4.1.8. Il-kont tat-talja. 4.1.9. Mixer kapaċi jħallat 1 ml tal-kampjun ta’ ħalib jew dilwizzjoni deċimali ma’ 9ml dilwent u li jaħdem fuq il-prinċipju ta’ rotazzjoni eċċentrika tal-kontenut tat-test tube. 4.2. Affarijiet tal-ħġieġ 4.2.1. Test tubes b’għeluq xieraq u b’kapaċità biżżejjed biex jikkontjenu, bi spazju fuq biżżejjed għat-taħlit, 10 ml tad-dilwizzjoni primarja jew dilwizzjonijiet deċimali oħrajn. 4.2.2. Kunjetti ta’ kapaċità 150 sa 250 ml jew tubi, madwar 20ml kapaċità, biex iżommu l-medium tal-kultura. 4.2.3. Pipetti (miżduda bit-tajjar) tal-ħġieġ jew ta’ materjal sterili sintetiku b’ponta mhux miksura ta’ kapaċità nominali ta’ 1ml u li jkollhom fetħa ta’ dijametru 1,75 sa 3 mm. 4.2.4. Kontenituri Petri, ta’ ħġieġ ċar mhux ikkulurit jew materjal sterili sintetiku, bil-kontenitur fil-qiegħ li jkollu dijametru intern ta’ madwar 90 –100 mm. Il-fond intern għandu jkun ta’ minimu ta’ 10 mm. Il-qiegħ ma għandu jkollu ebda irregolarità li titħallat mal-kolonji ta’ l-għadd. 4.2.5. L-isterilizzazzjoni ta’ l-affarijiet tal-ħġieġ: L-affarijiet tal-ħġieġ għandhom ikunu sterilizzati b’waħda mill-proċeduri li ġejjin: (a) billi jinżammu f’170 sa 175 oC għal mhux inqas minn siegħa f’forn ta’ l-arja sħuna (4.1.1); (b) billi jinżammu f’121 ± 1 oC għal mhux inqas minn 20 minuta f’awtoklavi (4.1.2). Fl-awtoklavi għandu jkun hemm attenzjoni biex tiġi assigurata penetrazzjoni adegwata ta’ fwar – eż. jekk it-tagħmir hu sterilizzat f’kontenituri, dawn m’għandhomx ikunu magħluqin issikkati, il-kunjetti għandu jkollhom għotjien maħlula. Affarijiet tal-ħġieġ sterilizzati fl-awtoklavi għandhom jitnixxfu billi jiġi ventilat il-fwar. Il-pipetti għandhom jiġu sterilizzati f’forn bl-arja sħuna (4.1.1) 5. Il-Medium ta’ kultura – il-kont tal-plates tal-ħalib agar– 5.1 Il-Kompożizzjoni: Estratt tal-ħmira | 2,5 g | Trittonju | 5,0 g | Glukosju (D) jew Dextrose | 1,0 g | Trab tal-ħalib xkumat | 1,0 g | Ilma | 1000 ml | It-trab tal-ħalib xkumat għandu jkun magħmul minn sustanzi inibitorji. Dan għandu jiġi verifikat b’testijiet komparattivi li jużaw trab tal-ħalib xkumat ħieles minn sustanzi inibitorji. Il-preparazzjoni Issospendi u ħoll il-komponenti fl-ordni li ġejja: l-estratt tal-ħmira, it-trittonju, il-glukosju u fl-aħħar, it-trab tal-ħalib xkumat, fl-ilma. Meta s-sospensjoni tissaħħan il-proċedura tkun assistita. Żid l-agar u saħħan għat-togħlija, waqt li tħawwad kontinwament sakemm l-agar hu kompletament maħlul, jew fawwar għal madwar 30 minuta. Iffiltra minn karta tal-filtru, jekk neċessarju. Ikkontrolla l-pH b’pH meter (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara l-isterilizzazzjoni huwa 6,9 ± 0,1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu ta’ l-idrokloriku. 5.2. Id-distribuzzjoni, l-isterilizzazzjoni u l-ħażna tal-medium tal-kultura. Ferra l-medium (5.1) fi kwantitajiet ta’ 100 sa 150 ml f’kunjetti jew 12 sa 15-il ml f’tubi (4.2.2). Agħlaq il-kunjetti u t-tubi. Sterilizza fl-awtoklavi (4.1.2) b’121 ± 1 oC għal 15-il minuta. Ikkontrolla l-pH tal-medium. Jekk il-medium m’għandux jintuża immedjatament, aħżen fid-dlam f’temperatura bejn il-1 u l− 5 o C għal mhux iktar minn xahar wara l-preparazzjoni. 5.3. Medium ta’ kultura kummerċjali deidratat Il-medium tal-kultura (5.1) jista’ jiġi ppreparat minn medium deidratat kummerċjali. Segwi l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant imma żid it-trab tal-ħalib xkumat qabel ma tħoll jekk mhuwiex komponent. Aġġusta l-pH għal 6,9 ± 0, 1 f’ 25 oC kif deskritt f’5.1 u ferra, sterilizza u aħżen il-medium kif deskritt f’5.2. 6. Id-dilwenti 6.1. Soluzzjoni peptone/salina Il-kompożizzjoni: Peptone: | 1,0 g | Klorur tas-sodju (NaCl) | 8,5 g | Ilma | 1000 ml | Il-preparazzjoni: Ħoll il-komponenti fl-ilma, billi ssaħħan jekk neċessarju. Ikkontrolla l-pH b’pH meter (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara l-isterilizzazzjoni huwa 7.0 ± 0, 1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu idrokloriku. 6.2. Id-distribuzzjoni, l-isterilizzazzjoni u l-ħażna tad-dilwent Ferra d-dilwent (6.1) f’test tubes (4.2.1) fi kwantitajiet b’tali mod illi wara l-isterilizzazzjoni kull tubu jikkontjeni 9,0 ± 0, 2 ml tad-dilwent. Agħlaq it-tubi. Sterilizza fl-awtoklavi (4.1.2) b’121 ± 1 oC għal 15-il minuta. Ikkontrolla l-pH tad-dilwent. Jekk id-dilwent m’għandux jintuża immedjatament, aħżen fid-dlam f’temperatura bejn il-1 u l− 5 oC għal mhux iktar minn xahar wara l-preparazzjoni. 6.3. Dilwenti kummerċjali deidratati Id-dilwent (6.1) jista’ jiġi ppreparat minn tablets jew trab deidratati kummerċjali Segwi l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant Aġġusta l-pH kif deskritt f’6.1 u ferra, sterilizza u aħżen id-dilwenti kif deskritt f’6.2. 7. Il-proċedura 7.1. It-tidwib tal-medium Qabel ma jibda l-eżami mikrobijoloġiku, dewweb l-ammont meħtieġ tal-medium malajr u ttempra l-medium għal 45 ± 1 oC f’banju ta’ l-ilma (4.1.5). 7.2. Il-preparazzjoni tal-kampjun tal-ħalib Ħallat il-kampjun tal-ħalib sewwa, sabiex il-mikro-organiżmi huma ddistribwiti b’mod unit kemm jista’ jkun, billi taqleb il-kontenitur tal-kampjun tal-ħalib malajr għal 25 darba. Ir-ragħwa għandha tiġi evitata jew titħalla tixtered. L-intervall bejn it-taħlit u t-tneħħija tal-porzjon tat-test m’għandux jeċċedi t-tliet minuti. 7.3. Il-preparazzjoni tad-dilwizzjoni primarja (10–1) (ħalib mhux ipproċessat u ħalib ippasturizzat) Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun (7.2) tal-ħalib mhux ipproċessat jew tal-ħalib pasturizzat f’9ml tad-dilwent (6.1) billi tevita kuntatt bejn il-pipetta u d-dilwent. It-temperatura tad-dilwent għandha tkun bejn wieħed u ieħor l-istess bħal dik tal-kampjun tal-ħalib. Ħallat din id-dilwizzjoni primarja b’attenzjoni fil-mixer (4.1.9) għal 5-10 sekondi. B’hekk tkun ottenuta dilwizzjoni primarja ta’ 10– 1. 7.4. Il-preparazzjoni ta’ iktar dilwizzjonijiet deċimali (ħalib mhux ipproċessat u ħalib pasturizzat) Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1ml tad-dilwizzjoni primarja (7.3) f’ 9ml tad-dilwent (6.1) billi ssegwi l-istruzzjonijiet mogħtija f’7.3. Id-dilwizzjoni 10– 3 hija b’hekk ottenuta. Irrepeti dawn l-operazzjonijiet biex jiġu ottenuti iktar dilwizzjonijiet deċimali sakemm in-numru approprjat ta’ mikroorganiżmi hu mistenni li jiġi ottenut (8.1.1). 7.5. It-tilqim tal-kontenituri Petri 7.5.1. Ħalib mhux ippasturizzat: Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun u/jew id-dilwizzjoni approprjata deċimali f’kontenitur (4.2.4) Mill-inqas żewġ dilwizzjonijiet għandhom jiġu eżaminati Ipprepara kontenitur wieħed minn kull dilwizzjoni magħżula kif approprjat (8.1.1.) 7.5.2. Ħalib pasturizzat: Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun u/jew id-dilwizzjoni approprjata deċimali f’kontenitur (4.2.4) Mill-inqas żewġ dilwizzjonijiet għandhom jiġu eżaminati Ipprepara żewġ kontenituri minn kull dilwizzjoni magħżula kif approprjat (8.1.1). 7.5.3. Ħalib trattat b’UHT u ħalib sterilizzat (eżaminat wara inkubazzjoni għal 15-il ġurnata bi 30 oC – l-Anness A tad-Direttiva, il-Kapitolu VII, il-punt 5): Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 0,1 ml tal-kampjun tal-ħalib (7.2) f’kontenitur (4.2.4) Ipprepara żewġ kontenituri. 7.6. It-tferrigħ Ferra’ madwar 15 sa 18-il ml tal-medja (7.1) f’kull kontenitur imlaqqam. Ħallat immedjatament wara t-tferrigħ billi ddawwar il-kontenitur Petri biżżejjed biex tottjeni kolonji mxerrda b’mod unit wara l-inkubazzjoni. Il-ħin bejn l-aħħar tal-preparazjoni tal-kampjun tal-ħalib u t-taħlit, skond it-tip tal-ħalib, il-porzjon tat-test jew id-dilwizzjoni mal-medium m’għandux jeċċedi 15-il minuta. Ħallih jagħqad fuq superfiċi nadif, kiesaħ orizzontali. 7.7. L-inkubazzjoni tal-kontenituri Petri Ittrasferixxi l-kontenituri għall-inkubatur (4.1.3) Il-kontenituri fl-inkubatur għandhom ikunu rashom ’l isfel. Tgħabbix iktar minn sitta fuq xulxin. Il-lottijiet tal-kontenituri għandhom ikunu separati minn xulxin u mill-ħitan u mis-saqaf ta’ l-inkubatur. Inkubahom bi 30 ± 1 o C għal 72 ± 2 siegħa. 7.8. L-għadd tal-kolonji Għodd il-kolonji fil-kontenituri Petri li ma jikkontjenux iktar minn 300 kolonja. Eżamina l-kontenituri f’dawl baxx. Biex tiffaċilita l-għadd, jistgħu jintużaw lenti addattati (4.1.6) u/jew kontatur tat-talja(4.1.8). Evita li partikulati ta’ materja preċipitata fil-kontenituri jiġu interpretati bħala kolonji pinpoint. Eżamina oġġetti dubjużi b’attenzjoni, bl-użu ta’ lenti ta’ tkabbir ogħla (4.1.7) meta meħtieġ, biex tiddistingwi oġġetti minn materja barranija. Kolonji li jixterrdu huma kkunsidrati bħala konlonji singoli. Jekk inqas minn kwart tal-kontenitur hu meħud minn kolonji li jixterrdu, għodd il-kolonji fil-parti mhux affettwata tal-kontenitur u kkalkula n-numru korrispondenti għall-kontenitur sħiħ. Jekk iktar minn kwart tal-kontenitur hu meħud minn kolonji li jixterrdu, armi l-kontenitur. 8. Il-kalkolu u l-espressjoni tar-riżultati 8.1. Ħalib mhux ipproċessat u ħalib pasturizzat 8.1.1. Uża l-għadd mill-kontenituri kollha li jikkontjenu bejn 10 u 300 kolonja (ara 8.1.3 u 8.1.4). 8.1.2. In-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull 1ml ta’ ħalib mhux ipproċessat jew ħalib pasturizzat hu mogħti bil-formula: d fejn: ∑C hija t-total tal-kolonji kkuntjati f’8.1.1, (n1 + 0,1n2)d hija ekwivalenti għall-volum tal-kampjun plated fejn: n1 huwa n-numru ta’ kontenituri magħduda fl-ewwel dilwizzjoni, n2 huwa n-numru ta’ kontenituri magħduda fit-tieni dilwizzjoni, d huwa l-fattur ta’ dilwizzjoni li minnu l-ewwel għadd kien ottenut. L-għadd jingħata lil żewġ figuri sinifikanti. Meta n-numru li għandu iġi arrotondat huwa 5, arrotonda sabiex il-figura fuq ix-xellug immedjat hija biż-żewġ. Eżempju (ħalib pasturizzat): Id-dilwizzjoni 10− 2: 278 u 290 kolonja d-dilwizzjoni 10− 3: I 33 u 28 kolonja Numru/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 | | = 6290,022 | | = 28590 | | = 29000 | | = 2,9 × 104 | 8.1.3. Jekk hemm biss għadd inqas minn 10, irrapporta n-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull millilitru bħala "inqas minn 10 x d għal kull ml", u "d" jkun ir-reċiproku tal-fattur tad-dilwizzjoni l-iktar baxx. 8.1.4. Jekk hemm biss għadd li jeċċedi 300 kolonja imma l-għadd hu possibbli, kkalkula għadd stmat u mmultiplika bir-reċiproku tal-fattur tad-dilwizzjoni. Irrapporta r-riżultat bħala "Numru stmat ta’ mikro-organiżmi għal kull ml". 8.2. Ħalib ta’ UHT u ħalib sterilizzat Għadd ta’ plates ta’ iktar minn 10 kolonji b’0,1 ml għandu jiġi kkunsidrat li ma jissodIsfax iktar il-ħtiġiet fid-Direttiva 85/397/KEE. 9. Il-preċiżjoni Riżultati minn provi kollaborattivi aċċettati internazzjonalment għad mhumiex disponibbli. V. L-ENUMERAZZJONI TA’ MIKRO-ORGANIŻMI — IT-TEST TAL-KONT TAL-PLATES B’ 21 oC 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għall-enumerazzjoni ta’ mikro-organiżmi permezz ta’ teknika ta’ għadd ta’ kolonji b’ 21 oC fuq ħalib pasturizzat wara l-inkubazzjoni tal-ħalib b’ 6 oC għal ħamest ijiem biex jiġi ddeterminat il-grad ta’ kontaminazzjoni tal-ħalib pasturizzat b’mikro-organiżmi psikotropiċi kapaċi li jimmultiplikaw fil-ħalib b’ 6 oC. 2. It-tifsira In-nominazzjoni "mikro-organiżmi" tfisser: organiżmi li jiffurmaw kolonji kontabili meta inkubati ajrubikament taħt il-kondizzjonijiet deskritti. 3. Il-prinċipju Il-ħalib pasturizzat hu inkubat b’ 6 oC għal ħamest ijiem. Volum definit tal-kampjun tal-ħalib hu mħallat mal-medja ta’ kultura f’kontenituri Petri u inkubat f’ 21 oC għal 25 siegħa. Il-kolonji jitgħaddu u n-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull 1ml ta’ ħalib pasturizzat hu kkalkulat. 4. Apparat u affarijiet tal-ħġieġ It-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u, b’mod partikolari: 4.1. L-apparat 4.1.1. Forn ta’ l-arja sħuna, kapaċi li jopera f’ 170 sa 175 oC. 4.1.2. Awtoklavi, kapaċi li jopera f’ 121 ± 1 oC. 4.1.3. Inkubaturi, kapaċi li jmantnu temperatura ta’ (a) 6 ± 0,2 oC (a) 21 ± 1 oC fil-punti kollha fihom. 4.1.4. pH meter, b’kumpens ta’ temperatura, eżatt sa unità + 0,1 pH. 4.1.5. Banju ta’ l-ilma, kapaċi li jopera f’ 45 ± 1 oC. 4.1.6. Lenti, tkabbir 2 − 4x. 4.1.7. Lenti, tkabbir 8 − 10x. 4.1.8. Il-kontatur tat-talja. 4.1.9. Mixer kapaċi jħallat 1 ml tal-kampjun ta-ħalib jew dilwizzjoni deċimali ma’ 9ml dilwent u li jaħdem fuq il-prinċipju ta’ rotazzjoni eċċentrika tal-kontenut tat-test tube. 4.2. Affarijiet tal-ħġieġ 4.2.1. Test tubes b’għeluq xieraq u b’kapaċità biżżejjed biex jikkontjenu, bi spazju fuq biżżejjed għat-taħlit, 10 ml tad-dilwizzjoni primarja jew dilwizzjonijiet deċimali oħrajn. 4.2.2. Fliexken, ta’ kapaċità ta’ 150 sa 250 ml jew tubi, madwar 20ml kapaċità, biex iżommu l-medja tal-kultura. 4.2.3. Pipetti (miżduda bit-tajjar) tal-ħġieġ jew ta’ materjal sterili sintetiku b’ponta mhux miksura ta’ kapaċità nominali ta’ 1ml u li jkollhom fetħa ta’ dijametru 1,75 sa 3 mm. 4.2.4. Kontenituri Petri, ta’ ħġieġ ċar mhux ikkulurit jew materjal sterili sintetiku, bil-kontenitur fil-qiegħ li jkollu dijametru intern ta’ madwar 90 –100 mm. Il-fond intern għandu jkun ta’ minimu ta’ 10 mm. Il-qiegħ ma għandu jkollu ebda irregolarità li titħallat mal-kolonji ta’ l-ikkuntjar. 4.2.5. L-Isterilizzazzjoni ta’ l-affarijiet tal-ħġieġ L-affarijiet tal-ħġieġ għandhom ikunu sterilizzati b’waħda mill-proċeduri li ġejjin: (a) billi jinżammu f’170 sa 175 oC għal mhux inqas minn siegħa f’forn ta’ l-arja sħuna (4.1.1); (b) billi jinżammu f’121 + 1 oC għal mhux inqas minn 20 minuta f’awtoklavi (4.1.2). Fl-awtoklavi għandu jkun hemm attenzjoni biex tiġi assigurata penetrazzjoni adegwata ta’ fwar — eż. jekk it-tagħmir hu sterilizzat f’kontenituri, dawn m’għandhomx ikunu magħluqin issikkati, il-fliexken għandu jkollhom għotjien maħlula. Affarijiet tal-ħġieġ sterilizzati fl-awtoklavi għandhom jitnixxfu billi jiġi ventilat il-fwar. Il-pipetti għandhom jiġu sterilizzati f’forn bl-arja sħuna (4.1.1). 5. Il-medja ta’ kultura – il-kont tal-plates tal-ħalib agar 5.1. Il-kompożizzjoni: Estratt tal-ħmira | 2.5 g | Trittonju | 5.0 g | Glukosju D(+) jew id-dextrose | 1.0 g | Trab tal-ħalib xkumat | 1.0 g | Agar | 10 sa 15-il g jiddependi fuq il-karatteristiċi ta’ tagħqid ta’ l-agar użat | Ilma | 1000 ml | It-trab tal-ħalib xkumat għandu jkun ħieles minn sustanzi inibitorji. Dan għandu jiġi vverifikat b’testijiet komparattivi bl-użu ta’ trab tal-ħalib xkumat magħruf li jkun ħieles minn sustanzi inibitorji. Il-preparazzjoni: Issospendi u dewweb il-komponenti fl-ordni li ġejja: l-estratt tal-ħmira, it-trittonju, il-glukosju u fl-aħħar, it-trab tal-ħalib xkumat, fl-ilma. Meta s-sospensjoni tissaħħan il-proċedura tkun assistita. Żid l-agar u saħħan għat-togħlija, waqt li tħawwad kontinwament sakemm l-agar hu kompletament imdewweb, jew fawwar għal madwar 30 minuta. Iffiltra minn karta tal-filtru, jekk neċessarju. Ikkontrolla l-pH b’metru tal-pH (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara l-isterilizzazzjoni huwa 6.9 ± 0,1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu idrokloriku. 5.2. Id-distribuzzjoni, l-isterilizzazzjoni u l-ħażna tal-medja tal-kultura. Ferra l-medja (5.1) fi kwantitajiet ta’ 100 sa 150 ml fi fliexken jew 12 sa 15-il ml f’tubi (4.2.2). Agħlaq il-fliexken u t-tubi. Sterilizza fl-awtoklavi (4.1.2) b’ 121 ± 1 oC għal 15-il minuta. Ikkontrolla l-pH tal-medja. Jekk il-medja m’għandhiex tintuża immedjatament, aħżinha fid-dlam f’temperatura bejn il-1 u l- 5 oC għal mhux iktar minn xahar wara l-preparazzjoni. 5.3. Medja ta’ kultura deidrata kummerċjali Il-medja tal-kultura (5.1) tista’ tiġi ppreparata minn medja deidratata kummerċjali. Segwi l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant imma żid it-trab tal-ħalib xkumat qabel ma ddewweb jekk mhuwiex komponent. Aġġusta l-pH għal 6,9 ± 0,1 f’ 25 oC kif deskritt f’5.1 u ferra’ sterilizza u aħżen il-medja kif deskritt f’5.2. 6. Id-Dilwenti 6.1. Is-soluzzjoni Peptone/salina: Kompożizzjoni: Peptone | 1.0 g | Klorur tas-sodju (NaCl) | 8.5 g | Ilma | 1000 ml | Il-preparazzjoni: Dewweb il-komponenti fl-ilma, billi ssaħħan jekk neċessarju. Ikkontrolla l-pH b’metru tal-pH (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara l-isterilizzazzjoni huwa 7.0 ± 0,1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu idrokloriku. 6.2. Id-distribuzzjoni, l-isterilizzazzjoni u l-ħażna tad-dilwent Ferra d-dilwent (6.1) f’test tubes (4.2.1) fi kwantitajiet b’tali mod illi wara l-isterilizzazzjoni kull tubu jikkontjeni 9,0 ± 0,2 ml tad-dilwent. Agħlaq it-tubi. Sterilizza fl-awtoklavi (4.1.2) b’121 ± 1 oC għal 15-il minuta. Ikkontrolla l-pH tad-dilwent. Jekk il-medja m’għandhiex tintuża immedjatament, aħżinha fid-dlam f’temperatura bejn il-1 u l- 5 oC għal mhux iktar minn xahar wara l-preparazzjoni. 6.3. Dilwenti deidrati kummerċjali Id-dilwent (6.1) jista’ jiġi ppreparat minn tablets jew trab deidratati kummerċjali. Segwi l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant. Aġġusta l-pH kif deskritt f’6.1 u ferra, sterilizza u aħżen id-dilwenti kif deskritt f’6.2. 7. Il-proċedura 7.1. It-tidwib tal-medja Qabel ma jibda l-eżami mikrobijoloġiku, dewweb l-ammont meħtieġ tal-medja malajr u ttempra l-medja għal 45 ± 1 oC f’banju ta’ l-ilma (4.1.5). 7.2. Il-preparazzjoni tal-kampjun tal-ħalib 7.2.1. Inkuba pakkett mhux miftuħ ta’ ħalib pasturizzat, jew jekk dan hu impossibbli kampjun rappreżentattiv mhux inqas minn 100 ml għal 120 siegħa ± 2 sigħat f’6 ± 0,5 oC f’inkubatur (4.1.3(a)). 7.2.2. Wara l-inkubazzjoni ħallat il-kampjun tal-ħalib sewwa, sabiex il-mikro-organiżmi huma ddistribwiti b’mod unit kemm jista’ jkun, billi taqleb il-kontenitur tal-kampjun tal-ħalib malajr għal 25 darba. Ir-ragħwa għandha tġi evitata jew titħalla tixtered. L-intervall bejn it-taħlit u t-tneħħija tal-porzjon tat-test m’għandux jeċċedi t-tliet minuti. 7.3. Il-preparazzjoni tad-dilwizzjoni primarja (10− 1) Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun (7.2.2) f’9ml tad-dilwent (6.1) billi tevita kuntatt bejn il-pipetta u d-dilwent. It-temperatura tad-dilwent għandha tkun bejn wieħed u ieħor l-istess bħal dik tal-kampjun tal-ħalib. Ħallat din id-dilwizzjoni primarja b’attenzjoni bl-użu ta’ mixer (4.1.9) għal 5 sa 10 sekondi. B’hekk tkun ottenuta dilwizzjoni primarja ta’ 10− 1. 7.4. Il-preparazzjoni ta’ dilwizzjonijiet deċimali oħrajn Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1ml tad-dilwizzjoni primarja (7.3) f’9ml tad-dilwent (6.1) billi ssegwi l-istruzzjonijiet mogħtija f’7.3. Id-dilwizzjoni 10− 3 hija b’hekk ottenuta. Irrepeti dawn l-operazzjonijiet biex jiġu ottenuti iktar dilwizzjonijiet deċimali sakemm in-numru approprjat ta’ mikro-organiżmi hu mistenni li jiġi ottenut (8.1). 7.5. It-tilqim tal-kontenituri Petri Ittrasferixxi b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun u/jew id-dilwizzjoni deċimali approprjata f’kontenitur (4.2.4) Mill-inqas żewġ dilwizzjonijiet għandhom jiġu eżaminati Ipprepara żewġ kontenituri minn kull dilwizzjoni magħżula kif approprjat (8.1). 7.6. It-tferrigħ Ferra madwar 15 sa 18-il ml tal-medja (7.1) f’kull kontenitur mogħti t-tilqima. Ħallat immedjatament wara t-tferrigħ billi ddawwar il-kontenitur Petri biżżejjed biex tottjeni kolonji mxerrda b’mod unit wara l-inkubazzjoni. Il-ħin bejn l-aħħar tal-preparazzjoni tal-kampjun tal-ħalib u t-taħlit tad-dilwizzjoni mal-medja m’għandux jeċċedi 15-il minuta. Ħallih jagħqad fuq wiċċ nadif, kiesaħ orizzontali. 7.7. L-inkubazzjoni tal-kontenituri Petri Ittrasferixxi l-kontenituri għall-inkubatur (4.1.3(b)). Il-kontenituri fl-inkubatur għandhom ikunu rashom ’l isfel. Tgħabbix iktar minn sitta fuq xulxin. Il-lottijiet tal-kontenituri għandhom ikunu separati minn xulxin u mill-ħitan u mis-saqaf ta’ l-inkubatur. Inkubahom f’21 ± 1 oC għal 25 siegħa. 7.8. L-ikkuntjar tal-kolonji Għodd il-kolonji fil-kontenituri Petri li ma jikkontjenux iktar minn 300 kolonja. Eżamina l-kontenituri f’dawl baxx. Biex tiffaċilita l-ikkuntjar, jistgħu jintużaw lenti adattati (4.1.6) u/jew kuntatur tat-talja (4.1.8). Evita li partikulati ta’ materja preċipitata fil-kontenituri jiġu interpretati bħala kolonji pinpoint. Eżamina oġġetti dubjużi b’attenzjoni, bl-użu ta’ lenti ta’ ingradiment effettiv ogħla (4.1.7) meta meħtieġ, biex tiddistingwi oġġetti minn materja barranija. Kolonji li jixterrdu huma kkunsidrati bħala konlonji singoli. Jekk inqas minn kwart tal-kontenitur hu meħud minn kolonji li jixterrdu, għodd il-kolonji fil-parti mhux affettwata tal-kontenitur u kkalkula n-numru korrispondenti għall-kontenitur sħiħ. Jekk iktar minn kwart tal-kontenitur hu meħud minn kolonji li jixterrdu, armi l-kontenitur. 8. Il-kalkolu u l-espressjoni tar-riżultati 8.1. Uża l-għadd mill-kontenituri kollha li jikkontjenu bejn 10 u 300 kolonja (ara 8.3 u 8.4). 8.2. In-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull 1ml ta’ ħalib pasturizzat hu mogħti bil-formula: d fejn ∑C huwa t-total tal-kolonji magħduda bħal f’ 8.1, (n1 + 0,1n2)d huwa ekwivalenti għall-volum tal-kampjun plated fejn: n1 huwa n-numru ta’ kontenituri magħduda fl-ewwel dilwizzjoni, n2 huwa n-numru ta’ kontenituri magħduda fit-tieni dilwizzjoni, D huwa l-fattur ta’ dilwizzjoni li minnu l-ewwel għadd kien ottenut. L-għadd jingħata lil żewġ figuri sinifikanti. Meta n-numru li għandu jiġi arrotondat huwa 5, arrotonda sabiex il-figura fuq ix-xellug immedjat hija biż-żewġ. Eżempju: Id-dilwizzjoni 10− 2: 278 u 290 kolonja Id-dilwizzjoni 10− 3: 33 u 28 kolonja Numru/ml | =278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210− 2 | | = 6290,022 | | = 28590 | | = 29000 | | = 2,9 × 104 | 8.3. Jekk hemm biss għadd inqas minn 10, irrapporta n-numru ta’ mikro-organiżmi għal kull millilitru bħala "inqas minn 10 × d għal kull ml"; u "d" jkun ir-reċiproku tal-fattur tad-dilwizzjoni l-iktar baxx. 8.4. Jekk hemm biss għadd li jeċċedi 300 kolonja imma l-għadd hu possibbli, ikkalkula għadd stmat u mmultiplika bir-reċiproku tal-fattur tad-dilwizzjoni. Irrapporta r-riżultat bħala "Numru stmat ta’ mikro-organiżmi għal kull ml". 9. Il-preċiżjoni Riżultati minn provi kollaborattivi aċċettati internazzjonalment għad mhumiex disponibbli. VI. ENUMERAZZJONI TAL-KOLIFORMI — L-GĦADD TAL-KOLONJI BI 30 oC 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għall-enumerazzjoni ta’ koliformi f’ħalib pasturizzat permezz ta’ teknika ta’ għadd tal-kolonji bi 30 oC. 2. It-tifsira In-nomina "koliformi" tfisser batterjili ma’ 30 oC tifforma kolonji karatteristiċi jew kolonji mhux karatteristiċi li jiffermentaw il-lattosju bil-produzzjoni tal-gass taħt il-kondizzjonijiet deskritti. 3. Il-prinċipju Volum definit tal-kampjun tal-ħalib hu mħallat mal-medium ta’ kultura f’ kontenituri Petri u inkubat fi 30 oC għal 24 siegħa. Kolonji karatteristiċi huma magħduda u jekk neċessarju l-identità ta’ kolonji mhux karatteristiċi hija kkonfermata b’eżami għall-abbiltà li jiffermentaw il-lattosju. In-numru ta’ koliformi għal kull 1ml ta’ ħalib pasturizzat huwa mbagħad ikkalkulat. 4. Apparat u affarijiet tal-ħġieġ It-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u, b’mod partikolari: 4.1. L-apparat 4.1.1. Forn ta’ l-arja sħuna, kapaċi li jopera f’170 sa 175 oC. 4.1.2. Awtoklavi, kapaċi li jopera f’ 121 ± 1 oC. 4.1.3. Inkubatur, kapaċi li jżomm temperatura ta’ 30 ± 1 oC fil-punti kollha fih. 4.1.4. pH-meter, b’kumpens ta’ temperatura, eżatt sa unità + 0,1 pH. 4.1.5. Banju ta’ l-ilma, kapaċi li jopera f’45 ± 1 oC. 4.1.6. Labra tal-wajer magħmula mill-platinum-iridium jew minn nikel-kromju. 4.2. Affarijiet tal-ħġieġ 4.2.1. Test tubes b’għeluq xieraq u ta’ kapaċità ta’ 20 ml, biex iżommu l-medium konformatorju (5.2) u tubi Durham ta’ dimensjonijiet approprjati għall-użu mat-test tubes. 4.2.2. Kunjetti ta’ kapaċità 150 sa 250 ml biex iżommu l-medium solidu selettiv (5.1). 4.2.3. Pipetti (miżduda bit-tajjar) tal-ħġieġ jew ta’ materjal sterili sintetiku b’ponta mhux miksura ta’ kapaċità nominali ta’ 1-10 ml u li jkollhom fetħa ta’ dijametru 1,75 sa 3 mm. 4.2.4. Kontenituri Petri, ta’ ħġieġ ċar mhux ikkulurit jew materjal sterili sintetiku, bil-kontenitur fil-qiegħ li jkollu dijametru intern ta’ madwar 90-100 mm. Il-fond intern għandu jkun ta’ minimu ta’ 10 mm. Il-qiegħ ma għandu jkollu ebda irregolarità li titħallat mal-kolonji ta’ l-għadd. 4.2.5. L-Isterilizzazzjoni ta’ l-affarijiet tal-ħġieġ: L-Affarijiet tal-ħġieġ għandhom ikunu sterilizzati b’waħda mill-proċeduri li ġejjin: (a) billi jinżammu f’170 sa 175 oC għal mhux inqas minn siegħa f’forn ta’ l-arja sħuna (4.1.1); (b) billi jinżammu f’121 ± 1 oC għal mhux inqas minn 20 minuta f’awtoklavi (4.1.2). Fl-awtoklavi għandu jkun hemm attenzjoni biex tiġi assigurata penetrazzjoni adegwata ta’ fwar – eż. jekk it-tagħmir hu sterilizzat f’kontenituri, dawn m’għandhomx ikunu magħluqin issikkati, il-fliexken għandu jkollhom għotjien maħlula. Affarijiet tal-ħġieġ sterilizzati fl-awtoklavi għandhom jitnixxfu billi jiġi ventilat il-fwar. Il-pipetti għandhom jiġu sterilizzati f’forn bl-arja sħuna (4.1.1). 5. Il-Medium tal-Kultura 5.1. Agar lattosju ta’ bili vjola ħomor (Agar LBVĦ) Medium solidu selettiv Kompożizzjoni: Peptone | 7 g | Estratt tal-ħmira | 3 g | Lattosju (C12H22O11, H2O) | 10 g | Klorur tas-sodju (NaCl) | 5 g | Melħ tal-bili | 1,5 g | Aħmar newtrali | 0,03 g | Vjola kristall | 0,002 g | Agar | 10 sa 15 g (jiddependi fuq il-karatteristiċi ta’ tagħqid ta’ l-agar użat) | Ilma | 1000 ml | Il-preparazzjoni: Issospendi u ħoll il-komponenti fl-ilma u ħallihom joqogħdu għal diversi minuti, imbagħad ħallat vigorożament. Ikkontrolla l-pH b’pH-meter (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara t-togħlija, huwa 7.4 ± 0,1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu idrokloriku. Ġib malajr għat-togħlija, u dawwar minn żmien għal żmien u ferra’ immedjatament fi kwantitajiet ta’ 100 sa 150 ml f’ kunjetti sterili (4.2.2). Ittempra l-medium f’banju ta’ l-ilma (4.1.5) b’ 45 ± 1 oC L-isterilità tal-medium għandha tiġi kkontrollata fil-ħin ta’ l-użu (ara 6.4). Uża l-medium fi żmien tliet sigħat mill-preparazzjoni tiegħu. 5.2. Brodu ta’ bili tal-lattosju aħdar jgħajjat.Medium ta’ Konferma. Kompożizzjoni: Peptone | 10 g | Lattosju (C12H22O11, H2O) | 10 g | Bili deidrati tal-gendus | 20 g | Aħdar jgħajjat | 0,0133 g | Ilma | 1000 ml | Il-preparazzjoni: Ħoll il-komponenti fl-ilma billi tgħalli. Ikkontrolla l-pH b’metru tal-pH (4.1.4) u jekk neċessarju aġġusta l-pH sabiex, wara l-isterilizzazzjoni huwa 7.2 ± 0,1 ma’ 25 oC bl-użu ta’ soluzzjoni (mill-inqas 0,1 mol/1) ta’ l-idrossidu tas-sodju jew ta’ l-aċidu idrokloriku. Ferra’ l-medium, fi kwantitajiet ta’ 10 ml, f test tubes (4.2.1) li jikkontjenu tubi Durham. Agħlaq it-tubi. Sterilizza fl-awtoklavi (4.1.2) b’ 121 ± 1 oC għal 15-il minuta. It-tubi Durham m’għandhomx jikkontjenu bżieżaq ta’ l-arja wara l-isterilizzazzjoni. Ikkontrolla l-pH tal-medja. Jekk il-medium m’għandux jintuża immedjatament, aħżnu fid-dlam f’temperatura bejn iż-0 u l- 5 oC għal mhux iktar minn xahar wara l-preparazzjoni. 5.3. Medium ta’ kultura deidrat kummerċjali Il-medium tal-kultura (5.1) jista’ jiġi ppreparat minn medium deidratat kummerċjali. Segwi l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant. Aġġusta l-pH u ferra’, għalli jew sterilizza u aħżen il-medium kif deskritt f’ 5.1 u 5.2. 6. Il-proċedura 6.1. Il-medium Uża l-medium (agar VRBL) kif deskritt f’ 5.1. 6.2. Il-preparazzjoni tal-kampjun tal-ħalib Ħallat il-kampjun tal-ħalib sewwa, sabiex il-mikro-organiżmi huma ddistribwiti b’mod unit kemm jista’ jkun, billi taqleb il-kontenitur tal-kampjun tal-ħalib malajr għal 25 darba. Ir-ragħwa għandha tġi evitata jew titħalla tixtered. L-intervall bejn it-taħlit u t-tneħħija tal-porzjon tat-test m’għandux jeċċedi t-tliet minuti. 6.3. It-tilqim tal-kontenituri Petri 3 ml tal-kampjun tal-ħalib (6.2) huma mlaqqma billi jiġi trasferit b’pipetta sterili (4.2.3) 1 ml tal-kampjun tal-ħalib f’kull wieħed mit-tliet kontenituri (4.2.4) 6.4. It-tferrigħ Ferra agar VRBL (6.1) f’kull kontenitur imlaqqam fi kwantitajiet ta’ madwar 12-il ml. Ħallat immedjatament wara t-tferrigħ billi ddawwar il-kontenitur Petri biżżejjed biex tottjeni kolonji mxerreda b’mod unit wara l-inkubazzjoni. Il-ħin bejn l-aħħar tal-preparazzjoni tal-kampjun tal-ħalib u t-taħlit tad-dilwizzjoni mal-medja m’għandux jeċċedi 15-il minuta. Ipprepara għal skopijiet ta’ sterilità bħala kontroll kontenitur mhux imlaqqam, b’12-il ml ta’ l-agar VRBL użat għall-kontenituri mlaqqma. Ħallih jagħqad fuq superfiċi nadif kiesaħ sakemm il-medium ikun qagħad. Wara solidifikazzjoni kompleta ferra’ mill-inqas 4 ml agar VRBL (6.1) fuq is-superfiċi tal-medium imlaqqam. Ħallih jagħqad. 6.5. L-inkubazzjoni tal-kontenituri Petri Ittrasferixxi l-kontenituri għall-inkubatur (4.1.3) Il-kontenituri fl-inkubatur għandhom ikunu rashom ’l isfel. Tgħabbix iktar minn sitta fuq xulxin. Il-lottijiet tal-kontenituri għandhom ikunu separati minn xulxin u mill-ħitan u mis-saqaf ta’ l-inkubatur. Inkubahom fi 30 ± 1 oC għal 24 ± 2 siegħa. 6.6. L-għadd tal-kolonji 6.6.1. Għodd il-kolonji fil-kontenituri Petri li ma jikkontjenux iktar minn 150 kolonja. Għodd il-kolonji ħomor skuri li jkollhom dijametru ta’ mill-inqas 0,5 mm bil-materja solida madwar jew mingħajrha, karatteristika għall-koliformi. 6.6.2. Jekk il-kolonji kollha jew ftit minnhom għandhom aspett mhux karatteritsiku (eż. ivarjaw fil-kulur, fid-daqs jew fil-formazzjoni tal-materja solida madwar mill-kolonji tipiċi) wettaq test ta’ konferma (6.7). 6.7. Test ta’ konferma Skond l-indikazzjonijiet mogħtija f’6.6.2 wettaq test ta’ konferma fuq numru xieraq (eż. tlieta sa ħamsa) ta’ kolonji mhux karatteristiċi permezz ta’ tilqim f’tubi ta’ brodu ta’ bili lattosju aħdar jgħajjat (5.2) bl-użu ta’ labra tal-wajer (4.1.6). Inkuba t-tubi fi 30 ± 1 o C għal 24 ± 2 siegħa. Ikkunsidra l-kolonji li jipproduċu gass fit-tubu Durham bħala koliformi konfermati. 7. Il-Kalkolu u l-espressjoni tar-riżultati 7.1. Uża għadd (ara 7.4) minn kontenituri li ma jikkontjenux iktar minn 150 kolonja. 7.2. Jekk hu applikat test ta’ konferma, ikkalkula n-numru ta’ kolonji ta’ koliformi mill-perċentwali tal-kolonji ta’ koliformi konfermati. 7.3. In-numru ta’ koliformi għal kull 1ml ta’ ħalib pasturizzat hu mogħti bil-formula: n fejn: ∑C huwa n-numru totali ta’ kolonji ta’ koliformi (7.1 inkonnessjoni ma’ 7.2) misjuba mill-eżami tal-kampjun tal-ħalib (3 ml), N huwa n-numru ta’ millilitri tal-kampjun eżaminat (6.3) (3 ml). L-għadd hu mogħti lil żewġ figuri sinifikanti meta hemm iktar minn 100 kolonja. Meta n-numru li għandu jiġi arrotondat huwa 5, arrotonda sabiex il-figura fuq ix-xellug immedjat hija biż-żewġ. Jekk hemm biss għadd li jeċċedi 150 kolonja, irrapporta r-riżultat bħala "Numru stmat ta’ koliformi għal kull 1ml". 8. Il-preċiżjoni Riżultati minn provi kollaborattivi aċċettati internazzjonalment mhumiex disponibbli. VII. L-ENUMERAZZJONI TA’ ĊELLOLI SOMATIĊI Din il-proċedura tispeċifika żewġ proċeduri bħala proċeduri ta’ referenza għall-enumerazzjoni ta’ ċelloli somatiċi. A. Il-metodu mikroskopiku B. Il-metodu fluoro-opto-elettroniku A. Il-metodu mikroskopiku 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura ta’ referenza għall-enumerazzjoni ta’ ċelloli somatiċi f’ħalib mhux ipproċessat. Din il-proċedura tispeċifika l-proċedura għall-enumerazzjoni tan-numru ta’ ċelloli f’ kampjun tal-ħalib biex tiġi kkalibrata u eżaminata l-eżattezza tal-proċedura fluoro-opto elettronika (ara B.1). 2. It-tifsira Għal din il-proċedura ċelloli somatiċi huma dawk iċ-ċelloli, eż. ċelloli leucocytes u epithelial li n-nuklei tagħhom jistgħu jittebbgħu b’mod distint bl-użu tal-blu methylene. 3. Il-prinċipju 0,01 ml tal-ħalib hu mxerred tul 1 ċm2 ta’ mejla Il-film u mnixxef u mtebbgħa L-Għadd isir bl-użu ta’ mikroskopju. In-numru ta’ ċelloli somatiċi magħduda f’arja definita hu mmultiplikat bil-fattur operattiv sabiex ikunu ottenuti n-numru ta’ ċelloli/ml. 4. Ir-riaġenti Kimiċi analitiċi ta’ grad għandhom jintużaw. Is-soluzzjoni taż-żebgħa tal-kulur: Kompożizzjoni: Il-Blu methylene | 0,6 g | L-Etanol – 99 % | 54 ml | 1,1,1-trikloroetan jew tetrakloroetan | 40 ml | Aċidu aċetiku glaċjali | 6 ml | Twissija It-Tetrakloroetan huwa velenuż. Jekk użata l-preparazzjoni u l-applikazzjoni għandhom jitwettqu f’cupboard tad-duħħan Il-Preparazzjoni: Ħallat l-etanol u 1,1,1-trikloroetan jew tetrakloroetan fi flixkun u saħħan f’banju ta’ l-ilma sa 60 sa 70 oC Żid il-blu methylene, ħallat b’attenzjoni, kessaħ fi friġġ sa 4 oC tul 12 sa 24 siegħa u żid l-aċidu aċetiku glaċjali. Iffiltra, bl-użu ta’ filtru b’daqs ta’ pori ta’ 10 sa 12 mikroni jew inqas, u aħżen is-soluzzjoni taż-żebgħa tal-kulur fi flixkun mitbuq Jekk huma ffurmati partikolati jew sediment, iffiltra darb’oħra qabel l-użu. 5. L-Apparat u affarijiet tal-ħġieġ 5.1. Mikroskopju, b’ingradiment effettiv ta’ × 500 sa × 1000. 5.2. Mikrosiringa, 0,01 ml b’eżattezza ta’ ± 2 % jew aħjar. 5.3. Mejla, b’arja ta’ 20 mm × 5 mm immarkata għall-film, jew mejla standard u template ta’ 20 mm × 5 mm għall-film. 5.4. Hot plate illivellat, (30 sa 50 oC) biex jitnixxfu l-mejliet. 5.5. Fann(li jnixxef ix-xagħar), għat-tnixxif tal-film. 5.6. Banju ta’ l-ilma, kapaċi li jopera b’ 30 sa 40 oC biex jissaħħan il-kampjun tal-ħalib. 5.7. Mejla mikrometra ta’ stadju, irrigata f’diviżjonijiet ta’ 0,01 mm. 6. Il-proċedura 6.1. Il-kampjun tal-ħalib Il-kampjun tal-ħalib għandu jkun ittestjat fi żmien sitt sigħat minn meta jittieħdu l-kampjuni. Tul il-ħażna it-temperatura tal-kampjun m’għandhiex teċċedi 6 oC L-iffriżar għandu jiġi evitat 6.2. Il-preparazzjoni tal-kampjun fil-laboratorju Saħħan il-kampjun f’banju ta’ l-ilma (5.6) sa 30 sa 40 oC Imbagħad ħallat b’attenzjoni. Kessaħ sat-temperatura li fiha l-mikrosiringa (5.2) ġiet kalibrata, eż. 20 oC. 6.3. It-trattament minn qabel tal-mejliet Naddaf il-mejliet (5.3), per eżempju b’etanol, nixxef b’karta ħielsa mit-trab, qabbad bi fjamma u kessaħ. Aħżen f’kaxxa biex tevita t-trab. 6.4. Il-preparazzjoni tal-film Neħħi 0,01ml tal-ħalib mill-kampjun ippreparat bħal fuq bl-użu ta’ mikrosiringa (5.2). Naddaf fuq barra tas-siringa f’kuntatt mal-ħalib b’attenzjoni Qiegħed is-siringa fuq il-mejla (5.3), billi l-ewwel tpinġi l-linja ta’ barra tal-forma (20 mm x 5 mm). Imbagħad imla l-arja b’mod unit kemm jista jkun. Ixxotta l-film fuq hot plate illivellat (5.4) sakemm niexef għal kollox. Għandhom jiġu ppreparati u eżaminati mill-inqas żewġ films minn kull kampjun tal-ħalib. 6.5. It-tiżbigħ bil-kulur tal-films Bill f’soluzzjoni ta’ żebgħa bil-kulur (4) għal 10 minuti Nixxef, u kompli b’fann (5.5) jekk meħtieġ Bill il-films f’ilma tal-vit sakemm iż-żebgħa tal-kulur żejda kollha titneħħa. Imbagħad nixxef għal darb’oħra u aħżen waqt li tipproteġi kontra t-trab. 6.6. Il-kalibrazzjoni tal-qasam mikroskopiku Jiddependi fuq l-ingradiment effettiv magħżul (× 500 sa × 1000) iddetermina bil-mejla mikrometra ta’ l-istadju (5.7) id-dijametru tal-qasam mikroskopiku. 7. L-għadd u l-kalkolu 7.1. L-għadd taċ-ċelloli Uża mikroskopju (5.1) Minflok tgħodd iċ-ċelloli, biss in-nuklei taċ-ċelloli huma magħduda Dawn jintgħarfu b’mod ċar u għall-għadd mill-inqas nofs in-nukleu għandu jidher fil-qasam mikroskopiku Għodd l-istrixxi jew l-oqsma minn nofs it-terz tal-film, evita li tgħodd l-istrixxi jew l-oqsma magħżula esklussivament mill-arji periferali tal-film Il-preparazzjoni tal-film b’attenzjoni, u għalhekk kemm huma ta’ minjoqgħod fuqhom ir-riżultati, għandhom jiġu kkontrollati mill-inqas darba f’xahar billi jingħaddu l-partijiet differemti tal-film L-għadd jista’ wkoll jitwettaq billi jingħaddu l-oqsma mikroskopiċi mxerrda f’sistema sabiex il-partijiet kollha tal-film huma rappreżentati b’mod ugwali. 7.2. In-numru minimu taċ-ċelloli li għandhom jingħaddu Ladarba l-għadd mikroskopiku ta’ ċelloli somatiċi jista’ wkoll jintuża għall-istandardizzazzjoni ta’ proċeduri ta’ l-għadd awtomatiċi u mekkanizzati, il-koeffiċjent tal-varjazzjoni ta’ l-għadd fuq kampjuni identiċi m’għandux ikun ogħla minn dak ta’ strumenti elettroniċi. Il-koeffiċjent ta’ varjazzjoni fuq kampjun tal-ħalib li jikkontjeni 400000 sa 600000 ċellola/ml m’għandux jeċċedi 5 %. In-numru ta’ ċelloli somatiċi li għandu jingħadd f’kull kampjun għandu, skond il-karatteristiċi tad-distribuzzjoni Poisson, ikun mill-inqas 400 sabiex jilħaq din ir-rata ta’ repetizzjoni. Id-distribuzzjoni Poisson tippresupponi M = V = s2, fejn M huwa l-valur medju V hija l-varjazzjoni u s hija d devjazzjoni standard Il-koeffiċjent tal-varjazzjoni huwa: CV = M or CV = or CV = M (medja) li jindika n numru ta’ partikolati (ċelloli) li ngħaddew (i.e. 400 għal CV = 5 %). 7.3. Il-kalkolu tal-fattur operattiv Bl-użu ta’ 0,01ml ta’ ħalib il-fattur operattiv hu kkalkulat skond 7.3.1 jew7.3.2. 7.3.1 L-għadd ta’ l-istrixxi tul il-film It-tul ta’ l-istrixxi li għandhom jingħaddu hu ta’ 5 mm kull wieħed. Il-wisa’ ta’ strixxa tikkorrispondi għad-dijametru tal-qasam mikroskopiku kif determinat bl-mejla mikrometra ta’ l-istadju (5.7), Współczynnik roboczy = 20 × 100d × b fejn: d huwa d-dijametru tal-qasam mikroskopiku f’mm kif determinat bl-mejla mikrometra ta’ l-istadju (5.7) b huwa n-numru ta’ strixxi magħduda kompletament 7.3.2. L-għadd ta’ oqsma mikroskopiċi fit-terz tan-nofs tal-film jew bi grilja: Π × d × s = 12 732d2× s fejn: d huwa d-dijametru tal-qasam mikroskopiku f’mm kif determinat bl-mejla mikrometra ta’ l-istadju (5.7) s huwa n-numru ta’ oqsma magħduda. 7.4. Il-kalkolu tal-kontenut taċ-ċellola In-numru ta’ ċelloli somatiċi magħduda (7.1 u 7.2) hu mmultiplikat bil-Fattur Operattiv (7.3) sabiex ikunu ottenuti ċ- ċelloli għal kull ml ta’ ħalib. 7.5. Il-preċiżjoni Il-koeffiċjent tal-varjazzjoni (ara 7.2) m’għandux jeċċedi 5 %. Riżultati minn provi kollaborattivi aċċettati internazzjonalment mhumiex disponibbli. B. Il-metodu fluoro-opto-elettroniku 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tissimplifika l-proċedura ta’ referenza, li wara kalibrazzjoni kif suppost (ara A.1), tista’ tintuża għall-għadd ta’ ċelloli somatiċi f’ħalib mhux ipproċessat – bil-preservazzjoni kimika jew mingħajrha. 2. It-tifsira Għal din il-proċedura ċelloli somatiċi huma partikulati li għandhom intensità minima ta’ florexxenza minħabba t-tebgħa tad-DNA fin-nukleu taċ-ċelloli somatiċi. 3. Il-prinċipju Parti tal-kampjun (eż. 0,2ml) hija mħallta sewwa mas-soluzzjoni buffer u mas-soluzzjoni florexxenti. Parti minn din it-taħlita hija mbagħad trasferita fil-forma ta’ film irqiq għal diska li ddur li sservi bħala pjan ta’ oġġett għall-mikroskopju. Kull ċellola tipproduċi polz elettriku li hu amplifikat u rreġistrat. In-numru ta’ ċelloli somatiċi hu stampat f’eluf għal kull ml. 4. Ir-riaġenti Kimiċi analitiċi ta’ grad għandhom jintużaw sakemm mhux iddikjarat mod ieħor. L-ilma għandu jew jiġi distillat jew deonizzat jew ta’ purità ekwivalenti. 4.1. Is-soluzzjoni buffer Kompożizzjoni: Ftalat ta’ l-idroġenu tal-potassju | 51,0 g | Idrossidu tal-Potassju | 13,75 g | Polyethyleneglycol-mono-p(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl-ether (eż. Triton X-100), 1 % skond il-volum | 10 ml | pH 5,7 sa 5,9. Żid bl-ilma sa 10000 ml. | | Preparazzjoni: Il-komponenti individwali huma mħallta Il-ħażna mitbuqa m’għandhiex teċċedi sebat ijiem. 4.2. Is-soluzzjoni florexxenti (soluzzjoni stock) Kompożizzjoni: Ethidium bromide | 1.0 g | Żid bl-ilma sa 1000 ml. Preparazzjoni: L-Ethidium bromide hu maħlul fl-ilma. Il-ħażna fi flixkun protett kontra d-dawl u mitbuq u m’għandhiexx teċċedi xahrejn. 4.3. Is-soluzzjoni florexxenti (soluzzjoni operattiva) 20 ml tas-soluzzjoni stock (4.2) huma mħallta mas-soluzzjoni buffer (4.1) biex jagħtu 1000 ml. Is-soluzzjoni operattiva m’għandhiex tintuża għal iktar minn sebat ijiem. 4.4. Is-soluzzjoni tat-tindif Kompożizzjoni: Soluzzjoni buffer (4.1) | 10 ml | Polyethy;eneglycol-mono-p-1(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl-ether (eż. Triton x-100), 1 % skond il-volum | 10 ml | L-Ammonja, 25 % skond il-volum | 25 ml | Żid bl-ilma sa 10000 ml Il- Preparazzjoni: Il-komponenti individwali huma mħallta Il-ħażna m’għandhiex teċċedi 30 ġurnata. 5. L-apparat u affarijiet tal-ħġieġ 5.1. L-istrument ta’ l-għadd, f’operazzjoni skond il-prinċipju ottiku florexxenti Nota: Qabel l-użu l-istrument għandu jiġi kalibrat Ir-relazzjoni bejn il-volum tal-partikoli li għandhom jingħaddu u l-livell għatba li fuqu l-għadd isir huma hekk determinati. Il-kalibrazzjoni ta’ l-apparat issir skond l-istruzzjonijiet tal-fabbrikant bl-użu ta’ kampjuni li l-kontenut taċ-ċelloli tagħhom ġie determinat bil-proċedura mikroskopika (A). 5.2. Banju ta’ l-ilma, b’ċirkolazzjoni, kapaċi li jopera f’ 40 ± 1 oC. 5.3. Test tube, b’siġill approprjat, bejn wieħed u ieħor 15-il ml. 6. Il-kampjun tal-ħalib 6.1. Il-kampjun għandu jinħażen f’temperatura baxxa f’test tube (5.3) Jekk il-kampjun mhuwiex ippreservat kimikament, m’għandux jingħadd fl-24 siegħa wara l-ħlib minħabba li l-għadd ikunu baxxi wisq. It-temperatura tal-ħażna m’għandhiex taqbeż 6 oC. 6.2. Il-preservazzjoni Il-preservazzjoni kimika għandha ssir fi żmien 24 siegħa. Il-preservazzjoni għandha titwettaq kemm jista’ jkun malajr wara li jittieħdu l-kampjuni. 6.2.1. Il-preservazzjoni kimika tal-kampjun tista’ tiġi akkwistata bl-addizzjoni ta’ wieħed mill-preservanti li ġejjin: - l-aċidu ortoboriku: il-konċentrazzjoni finali ta’ l-aċidu ortoboriku fil-kampjun m’għandhiex teċċedi 0,6 g/100 ml. Dan il-kampjun ippreservat jista’ jinħażen għal 24 siegħa oħra f’6 sa 12 oC. - id-dikromat tal-potassju: il-konċentrazzjoni finali tad-dikromat tal-potassju m’għandhiex teċċedi 0,2 g/100 ml Dawn il-kampjuni ppreservati jistgħu jinħażnu għal 72 siegħa oħra f’ 6 sa 12 oC - l-ażide tas-sodju: il-kampjuni jistgħu jiġu ppreservati b’ażide tas-sodju sal-konċentrazzjoni finali ta’ 0,024g/100ml, sakemm il-kampjun hu mkessaħ sa 6 sa 12 oC immedjatament wara li jittieħed il-kampjun, u magħdud fi żmien 48 siegħa wara li jittieħed il-kampjun. - il-bronopol: il-kampjun jista’ jiġi ppreservat bil-bronopol sa konċentrazzjoni finali ta’ 0.05 g/100ml, sakemm il-kampjun hu mkessaħ sa 6 sa 12 oC immedjatament wara li jittieħed il-kampjun, u magħdud fi żmien 72 siegħa wara li jittieħed il-kampjun. 6.2.2. Kampjun diġà ppreservat bl-aċidu ortoboriku jista’ jiġi iktar ippreservat għal sa 48 siegħa bl-użu tad-dikromat tal-potassju. Nota: Kondizzjonijiet lokali li jirrigwardaw l-iskarika ta’ effluwenti għandhom jiġu osservati għal kampjuni ppreservati bid-dikromat tal-potassju. 7. Il-proċedura 7.1. It-trattament minn qabel tal-kampjun Il-ħalib li għandu jiġi eżaminat għandu jinħażen wara l-ħlib għal mill-inqas 24 siegħa f’bejn wieħed u ieħor 2 sa 6 oC. L-għadd tal-kampjuni fil-jum tal-ħlib mhux ta’ min isir mingħajr trattament minn qabel minħabba li r-riżultati jistgħu ikunu baxxi wisq. Jekk l-għadd ta’ dan il-kampjun huwa neċessarju, dan għandu jiġi trattat minn qabel għal mill-inqas tliet sigħat bid-dikromat tal-potassju (ara 6.2.1). 7.2. Preparazzjoni Il-kampjun trattat minn qabel (ara 7.1), jew il-kampjun mhux trattat li jkun ilu mill-inqas ġurnata, hu msaħħan f’banju ta’ l-ilma (5.2) sa bejn wieħed u ieħor 40 oC Il-kampjun hu mbagħad maħżun f’temperatura tal-kamra sakemm isir l-għadd. 7.3. L-għadd taċ-ċelloli L-għadd għandu jitwettaq bl-użu ta’ strument ta’ l-għadd (5.1) fi żmien 15-il minuta mill-aħħar tat-tisħin (ara 7.2) Immedjatament qabel l-għadd, il-kampjun għandu jitħallat sewwa sabiex tiġi ottenuta distribuzzjoni kemm jista’ jkun omoġenja taċ-ċelloli somatiċi. Aktar dilwizzjoni u preparazzjoni tal-kampjun għandha sseħħ awtomatikament fl-istrument. 8. Il-preċiżjoni Figuri għar-rata ta’ repetizzjoni (r) u r-riproduċibbiltà (R) minn provi internazzjonali kollaborattivi mhumiex disponibbli. Fil-ġejjieni, informazzjoni ta’ preċiżjoni tiġi ddikjarata. L-informazzjoni disponibbli fuq livell nazzjonali tippermeti l-istimi li ġejjin: (1) Livell tal-kont taċ-ċelloli bejn 400000 u 500000 /ml - devjazzjoni standard għar-repetizzjoni: sr = 20000 ċelloli/ml (ekwivalenti għal koeffiċjent ta’ varjazzjoni jew 5 − 4 % - devjazzjoni standard għar-riproduċibbiltà: sR = 40000 ċelloli/ml (ekwivalenti għal koeffiċjent ta’ varjazzjoni ta’ 10-8 %) 9. Il-kontroll ta’ l-eżattezza Il-kontroll ta’ l-eżattezza jitwettaq bl-użu ta’ kampjuni b’kontenuti taċ-ċelloli magħrufa determinati b’għadd ta’ ċelloli mikroskopiċi f’laboratorju nazzjonali ta’ referenza. VIII. IS-SEJBIEN TA’ ANTIBIJOTIĊI U SULFONAMIDI L-ISKOP U L-QASAM TA’ APPLIKAZZJONI Din il-proċedura tispeċifika il-proċedura ta’ referenza għas-sejbien ta’ antibijotiċi u sulfonamidi f’ħalib mhux ipproċessat u fħalib trattat bis-sħana. Il-proċeduira ta’ referenza tinkludi: A. Il-metodu kwalitattiv Din il-proċedura hija l-proċedura inizjali li permezz tagħha kampjuni tal-ħalib li jikkontjenu antibijotiċi inklużi sulfonamidi huma magħżula. Il-proċedura deskritta hija waħda minn numru ta’ proċeduri simili, li fil-prinċipju kollha jużaw Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis, ATTC 10149 bħala l-organiżmu tat-test. Il-proċedura ġiet magħżula bħala rappreżentattiva għal dawk it-testijiet. B. Proċedura għall-konferma u l-identifikazzjoni tal-peniċillina Din il-proċedura għandha tintuża biex tikkonferma r-riżultati tal-proċedura kwalitattiva, għall-identifikazzjoni tal-peniċillina u biex tiġi determinata l-konċentrazzjoni tal-peniċillina. A. Proċedura kwalitattiva 1. L-iskop u l-qasam ta’ applikazzjoni Din il-proċedura tispeċifika s-sejbien kwalitattiv ta’ antibijotiċi u sulfonamidi f’ħalib mhux ipproċessat u trattat bis-sħana ineċċess tal-limiti stabbiliti fit-tabella: Konċentrazzjonijiet li jinstabu ta’ varji antibijotiċi u sulfonamidi [1] | Is-sensittività tat-test | Kollha negattivi | Kollha pożittivi | Benzylpenicillin | 0,002 | 0,006 | Ampicillin | 0,002 | 0,005 | Cloxacillin | 0,015 | 0,035 | Nafcillin | 0,006 | 0,011 | Tetracycline | 0,10 | 0,40 | Oxytetracycline | 0,20 | 0,45 | Chlortetracycline | 0,15 | 0,50 | Chloramphenicol | 7 | 15 | Dihydrostreptomycin | 4 | 13 | Neomycine | 1 | 22 | Kanamycin | 9 | 28 | Bacitracin | 0,06 | 0,14 | Erythromycin | 1 | 2,25 | Rifamycin | 0,01 | 0,14 | Diaphenylsulfone | 0,01 | 0,1 | Sulphamethazine (Sulphadimidine) | 0,5 | 1 | Estratt tal-ħmira | 2 g | Peptone | 5 g | Estratt tal-laħam | 1 g | Klorur tas-sodju | 5 g | Agar | 10 - 15 g | L-Ilma | 1000 ml | Il-preparazzjoni Ħoll il-komponenti fl-ilma. Għalli, billi ddawwar minn żmien għal żmien. Aġġusta l-pH sabiex wara l-isterilizzazzjoni hu 7,4 ± 0,1 b’ 25 oC. Ferra’ kwantitiajiet ta’ 10 ml f’ test tubes biex tagħmel mejliet ta’ agar jew kwantitajiet ta’ 100 ml fi fliexken. Sterilizza f’ 121 ± 1 oC għal 15-il minuta. 5.1.2. Il-medium ta’ l-agar Kompożizzjoni Klorur tas-sodju | 2 g | Agar | 15 g | Ilma | 1000 ml | Soluzzjoni tat-Trimethoprim jew Tetroxoprim (ara 5.1.3) | 10 ml | Il-preparazzjoni Ħoll il-komponenti ħlief it-trimethoprim jew it-textroprim fl-ilma. Għalli, billi ddawwar minn żmien għal żmien. Żid it-trimethoprim jew it-tetroxoprim u sterilizza f’121 ± 1 oC għal 15-il minuta; aġġusta l-pH sabiex wara l-isterilizzazzjoni hija 7,0 ± 0,1 b 25 oC. 5.1.3. Is-soluzzjoni tat-trimethoprim jew tat-tetroxoprim Kompożizzjoni Trimethoprim | 5 mg | Jew Tetroxoprim | 30 mg | Etanol 96 % | 5 ml/30 ml | Ilma sa | 1000 ml | Il-Preparazzjoni Ħoll it-trimethoprim jew it-tetroxoprim fl-etanol (5 jew 30 ml) u d-diluwixxi bl-ilma. 5.1.4. Nutrijent Kompożizzjoni Estratt tal-ħmira | 0,75 mg | Glukosju | 5,0 mg | Lamtu solubili | 8,0 mg | Bromokresol vjola | 0,025 g | Ilma sa | 50 ml | Il-preparazzjoni Ħoll in-nutrijenti u l-indikatur fl-ilma, jekk neċessarju billi ssaħħan, sterilizza b’filtrazzjoni. In-nutrijent hu kummerċjalment disponibbli bħala tablets. 5.2. Soluzzjonijiet standard tal-peniċillina 5.2.1. Ipprepara soluzzjoni tal-peniċillina ta’ 60 μg/ml = (100 IU/ml) billi tħoll sodju tal-kristallina jew peniċillina tal-potassium benzyl f’ilma distillat sterili fi flixkun approprjat sterili magħluq. 5.2.2. Ipprepara soluzzjoni operattiva ta’ peniċillina billi żżid 1,25 ml tas-soluzzjoni tal-peniċillina (5.2.1) sa 1000 ml b’ilma sterili distillat. Din is-soluzzjoni operattiva tikkontjeni 0,075 μg (= 0,125 IU/ml). 5.2.3. Ipprepara 75 ml ta’ soluzzjoni standard tal-peniċillina li tikkontjeni 0,004 mg/ml (= 0,0067 IU/ml) billi żżid 71 ml ħalib ħieles minn inibitorji (5.3) ma’ 4 ml ta’ soluzzjoni operattiva ta’ peniċillina (5.2.2) u tħallat. 5.2.4. Is-soluzzjonijiet tal-peniċillina msemmija f’5.2.1 sa 5.2.3 għandhom jiġu ppreparati fil-ġurnata li fiha jsir it-test. 5.3. Ħalib ħieles minn inibitorji Ipprepara bħala kontroll ħalib ħieles minn inibitorji billi tirrikostitwixxi trab ta’ ħalib xkumat (10 5 m/v) eżaminat minn qabel u miżjud ħieles minn sustanzi inibitorji, f’ilma sterili distillat. Alternattivament, kwantità suffiċjenti ta’ ħalib frisk bl-ingrossa kkontrollat u misjub ħieles minn sustanzi inibitorji jista’ jitferra’ fi fliexken, imsaħħna għal siegħa f’ 100 oC u mbagħad jinħażen fi friġġ bejn 0 u 6 oC għal perjodu massimu ta’ ġimgħa. 5.4. L-organiżmu tat-test 5.4.1. It-tendenza Bacillus stearothermophilus var. calidolactus ATCC 10149 hi użata bħala l-organiżmu tat-test. It-tendenza hi identika għal C 953. 5.4.2. Ipprepara kultura stock biex tinżamm il-kultura tat-test. Il-kultura tat-test tinżamm fuq mejla ta’ agar nutrijent (5.1.1) Il-mejla ta’ l-agar hi mlaqqma b’leħħa mis-superfiċi, bl-użu ta’ ħolqatal-kultura tat-test, u tinżamm inkubata ajrubikament għal 48 siegħa f’63 ± 1 oC Wara l-inkubazzjoni, it-tubu hu ssiġillat, bl-użu ta’ għeluq sterili tal-gomma. Il-kultura stock hekk ottenuta tista tinżamm għal diversi xhur fi friġġ bejn 0 u 5 oC. 5.5. Il-kultura tat-test (is-sospensjoni ta’ l-ispori) 5.5.1. 20 ml tan-nutrijent ta’ l-agar (5.1.1) hu ttrasferit aseptikament għal kontenitur sterili Petri (4.2.2) u mkessaħ għat-temperatura tal-kamra. 5.5.2. B’pipetta sterili (4.2.4) ittrasferixxi 5 ml ilma sterili distillat għal tubu b’kultura stock (5.4.2) u aħsel l-ispori mill-mejla ta’ l-agar bl-użu ta’ ħolqa sterili. Din is-sospensjoni ta’ l-ispora għandha tinżamm bejn 0 sa 5 oC u għandha tintuża fi żmien 36 siegħa. 5.5.3. B’pipetta sterili (4.2.4) ittrasferixxi 0,5ml tas-sospensjoni