3.

Il-Kapitoli li ġejjin huma miżjuda: “B.49. TEST TAL-MIKRONUKLEU TAĊ-ĊELLOLA MAMMIFERA IN VITRO INTRODUZZJONI 1. L-analiżi tal-mikronukleu in vitro (MNvit) hija test ta’ ġenotossiċità għall-individwazzjoni ta’ mikronuklei (MN) fiċ-ċitoplażma ta’ ċelloli fl-interfażi. Il-mikronuklei jistgħu joriġinaw minn frammenti ta’ kromożomi aċentriċi (jiġifieri li ma għandhomx ċentromer), jew kromożomi sħaħ li ma jistgħux jemigraw lejn il-poli waqt l-istadju ta’ anafażi tad-diviżjoni taċ-ċellola. L-analiżi tindividwa l-attività ta’ sustanzi kimiċi klastoġeniċi u anewġeniċi (sustanzi u taħlitiet) (1) (2) f'ċelloli li għaddew mid-diviżjoni taċ-ċelloli wara l-esponiment għas-sustanza tat-test. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar (TM) jippermetti l-użu ta’ protokolli bl-inibitur taċ-ċitokalażina B tal-polimerizzazzjoni tal-attina (actin polymerisation inhibitor cytochalasin B, cytoB) u mingħajr dan l-inibitur. Iż-żieda ta’ cytoB qabel il-mitożi mmirata tippermetti l-identifikazzjoni u l-analiżi selettiva tal-frekwenza tal-mikronuklei f'ċelloli li temmew mitożi waħda peress li dawn iċ-ċelloli għandhom żewġ nuklei (3) (4). Dan it-TM jippermetti wkoll l-użu ta’ protokolli mingħajr imblokkatur taċ-ċitokineżi, sakemm ikun hemm evidenza li l-popolazzjoni ta’ ċelloli analizzati għaddiet minn mitożi. 2. Minbarra l-użu tal-analiżi tal-MNvit sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu l-mikronuklei, l-użu ta’ imblokkatur taċ-ċitokineżi, it-tikkettar immunokimiku ta’ kinetochores, jew l-ibridizzazzjoni b'sondi ċentromeriċi/telomeriċi (ibridizzazzjoni in situ ta’ fluworexxenza (fluorescence in situ hybridisation — FISH)), ukoll jistgħu jipprovdu informazzjoni dwar il-mekkaniżmi ta’ ħsara fil-kromożomi u tal-formazzjoni ta’ mikronuklei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Il-proċeduri ta’ tikkettar u ibridizzazzjoni jistgħu jintużaw meta jkun hemm żieda fil-formazzjoni ta’ mikronuklei u l-investigatur ikun jixtieq jiddetermina jekk iż-żieda kinitx ir-riżultat ta’ avvenimenti klastoġeniċi u/jew anewġeniċi. 3. Il-mikronuklei jirrappreżentaw ħsara li ġiet trażmessa lil ċelloli ġġenerati (daughter cells), filwaqt li aberrazzjonijiet tal-kromożomi magħduda fiċ-ċelloli f'metafażi jistgħu ma jiġux trażmessi. Minħabba li l-mikronuklei fiċ-ċelloli fl-interfażi jistgħu jiġu evalwati b'mod relattivament oġġettiv, il-persunal tal-laboratorju jeħtieġ li jiddetermina biss jekk iċ-ċelloli ddividewx u kemm-il ċellola fiha mikronukleu. Għalhekk, il-preparazzjonijiet jistgħu jingħaddu relattivament malajr u l-analiżi tista' tiġi awtomatizzata. Dan jagħmilha prattika li eluf minflok mijiet ta’ ċelloli jingħaddu f'kull trattament, biex b'hekk tiżdied il-qawwa tal-analiżi. Fl-aħħar nett, minħabba li l-mikronuklei jistgħu joħorġu minn kromożomi tardivi, hemm il-potenzjal li wieħed jindividwa sustanzi li jinduċu anewplojdi li huma diffiċli li wieħed jistudjahom f'testijiet konvenzjonali tal-aberrazzjoni tal-kromożomi, eż. Linja gwida tal-Ittestjar 473 tal-OECD (Kapitolu B.10 ta’ dan l-Anness) (17). Madankollu, l-analiżi tal-MNvit ma tippermettix għad-divrenzjar ta’ sustanzi kimiċi li jinduċu poliplojdi minn dawk li jinduċu klastoġeniċità mingħajr tekniki speċjali bħall-FISH deskritta fil-paragrafu 2. 4. L-analiżi tal-MNvit hija metodu in vitro li tipikament tuża ċelloli tal-bniedem jew tal-annimali gerriema kkultivati. Hija tipprovdi bażi komprensiva għall-investigazzjoni tal-potenzjal ta’ ħsara tal-kromożomi in vitro minħabba li jistgħu jiġu individwati kemm l-anewġeni kif ukoll il-klastoġeni. 5. L-analiżi tal-MNvit hija b'saħħitha u effettiva f'varjetà ta’ tipi ta’ ċelloli, u fil-preżenza jew fin-nuqqas ta’ cytoB. Hemm dejta estensiva li tappoġġa l-validità tal-analiżi tal-MNvit permezz ta’ diversi linji ta’ ċelloli tal-annimali gerriema (CHO, V79, CHL/IU, u L5178Y) u limfoċiti tal-bniedem (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Dawn jinkludu, b'mod partikolari, l-istudji ta’ validazzjoni internazzjonali kkoordinati mis-Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) u r-rapporti tal-Grupp ta’ Ħidma Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal-Ġenotossiċità (4) (16). Id-dejta disponibbli ġiet evalwata mill-ġdid fi studju ta’ validazzjoni retrospettiv skont il-piż tal-evidenza miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta’ Metodi Alternattivi (ECVAM) tal-Kummissjoni Ewropea, u l-metodu tat-test ġie approvat bħala xjentifikament validu mill-Kumitat Xjentifiku Konsultattiv tal-ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). Ġie deskritt l-użu tal-linja ta’ ċelloli tal-bniedem limfoblastojdi TK6 (35), ċelloli HepG2 (36) (37) u ċelloli primarji tal-Embriju tal-Ħemster Sirjan (38), għalkemm ma ntużawx fi studji ta’ validazzjoni. DEFINIZZJONIJIET 6. Definizzjonijiet użati huma pprovduti f'Appendiċi 1. KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI 7. It-testijiet li jsiru in vitro ġeneralment ikunu jeħtieġu l-użu ta’ sors eżoġenu ta’ attivazzjoni metabolika diment li ċ-ċelloli ma jkunux metabolikament kompetenti fir-rigward tas-sustanzi li jkunu qegħdin jiġu ttestjati. Is-sistema eżoġena ta’ attivazzjoni metabolika ma timitax għal kollox il-kundizzjonijiet in vivo. Għandha tingħata attenzjoni wkoll sabiex jiġu evitati kundizzjonijiet li jwasslu għal riżultati pożittivi artefattwali li ma jirriflettux mutaġeniċità intrinsika, u li jistgħu joħorġu minn fatturi bħal bidliet ċari fil-pH jew osmolalità, jew permezz ta’ livelli għoljin ta’ ċitotossiċità (39) (40) (41). Jekk is-sustanza sustanza kimika tat-test toħloq bidla fil-pH tal-mezz fil-ħin taż-żieda, il-pH għandu jiġi aġġustat, preferibbilment permezz tal-ibbaffjar tas-soluzzjoni tal-istokk sabiex il-volumi kollha tal-konċentrazzjonijiet kollha tat-test, u għall-kontrolli kollha, jibqgħu l-istess. 8. Biex wieħed janalizza l-induzzjoni tal-mikronuklei, huwa essenzjali li l-mitożi tkun seħħet kemm fil-kultivazzjonijiet ittrattati kif ukoll f'dawk mhux ittrattati. L-iktar stadju informattiv għall-għadd tal-mikronuklei huwa f'ċelloli li temmew mitożi waħda waqt jew wara t-trattament bis-sustanza tat-test. PRINĊIPJU TAT-TEST 9. Il-kultivazzjonijiet taċ-ċelloli ta’ oriġini mill-bniedem jew mill-mammiferi huma esposti għas-sustanza tat-test kemm b'sors eżoġenu ta’ attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr dan is-sors diment li ma jintużawx ċelloli b'kapaċità metabolizzanti adegwata. Sustanzi kimiċi simultanji ta’ solvent/mezz (VC) u ta’ kontroll pożittiv (PC) huma inklużi fit-testijiet kollha. 10. Waqt jew wara l-esponiment għas-sustanza tat-test, iċ-ċelloli jitkabbru għal perjodu suffiċjenti sabiex il-ħsara fil-kromożomi jew fil-magħżel twassal għall-formazzjoni tal-mikronuklei f'ċelloli fl-interfażi. Għall-induzzjoni tal-anewplojdi, is-sustanza tat-test għandha normalment tkun preżenti waqt il-mitożi. Ċelloli fl-interfażi miġbura u mlewna jiġu analizzati għall-preżenza ta’ mikronuklei. Idealment, il-mikronuklei għandhom jingħaddu biss f'dawk iċ-ċelloli li jkunu temmew il-mitożi waqt l-esponiment għas-sustanza tat-test jew waqt il-perjodu ta’ wara l-esponiment, jekk jintuża wieħed. F'kultivazzjonijiet li ġew ittrattati b'imblokkatur taċ-ċitokineżi, dan jinkiseb billi jingħaddu biss iċ-ċelloli b'żewġ nuklei. Fin-nuqqas ta’ imblokkatur taċ-ċitokineżi, huwa importanti li jintwera li ċ-ċelloli analizzati aktarx li għaddew mid-diviżjoni taċ-ċelloli waqt jew wara l-esponiment għas-sustanza tat-test. Għall-protokolli kollha, huwa importanti li jintwera li l-proliferazzjoni taċ-ċelloli seħħet kemm fil-kultivazzjonijiet ta’ kontroll kif ukoll f'dawk ittrattati, u l-grad ta’ ċitotossiċità jew ċitostażi kkawżata mis-sustanza tat-test għandu jiġi vvalutat fil-kultivazzjonijiet (jew f'kultivazzjonijiet paralleli) li jingħaddu għall-mikronuklei. DESKRIZZJONI TAL-ANALIŻI Preparazzjonijiet 11. Jistgħu jintużaw limfoċiti primarji kkultivati periferiċi tad-demm tal-bniedem (5) (19) (42) (43) u għadd ta’ linji ta’ ċelloli tal-annimali gerriema bħal CHO, V79, CHL/IU, u ċelloli L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). L-użu ta’ linji u tipi oħrajn ta’ ċelloli għandu jkun iġġustifikat abbażi tal-prestazzjoni tagħhom murija fl-analiżi, kif deskritt fit-taqsima dwar il-Kriterji ta’ Aċċettazzjoni. Minħabba li l-frekwenza tal-isfond tal-mikronuklei tinfluwenza s-sensittività tal-analiżi, huwa rrakkomandat li jintużaw tipi ta’ ċelloli bi frekwenza ta’ sfond baxxa u stabbli ta’ formazzjoni ta’ mikronuklei. 12. Il-limfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem għandhom jinkisbu minn individwi żgħażagħ (ta' madwar 18-35 sena), b'saħħithom, ma jpejpux u li huma magħrufa li reċentement ma kinux esposti għal sustanzi kimiċi ġenotossiċi jew għar-radjazzjoni. Jekk jinġabru ċelloli għall-użu mingħand aktar minn donatur wieħed, l-għadd ta’ donaturi għandu jkun speċifikat. Il-frekwenza tal-mikronuklei tiżdied mal-età u din it-tendenza hija aktar ċara fin-nisa milli fl-irġiel (44) u dan għandu jiġi kkunsidrat fl-għażla ta’ ċelloli għall-ġbir minn donaturi. Il-kundizzjonijiet tal-mezzi u tal-kultivazzjoni 13. Kundizzjonijiet xierqa tal-mezz ta’ kultivazzjoni u tal-inkubazzjoni (kontenituri ta’ kultivazzjoni, konċentrazzjoni ta’ CO2, temperatura, u umdità) għandhom jintużaw għaż-żamma tal-kultivazzjonijiet. Linji u razez ta’ ċelloli stabbiliti għandhom jiġu ċċekkjati regolarment għall-istabilità tal-għadd ta’ kromożomi modali u n-nuqqas ta’ kontaminazzjoni ta’ majkoplażma, u ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kkontaminati jew jekk l-għadd ta’ kromożomi modali jkun inbidel. Il-ħin normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli għall-kundizzjonijiet ta’ kultivazzjoni użati fil-laboratorju tal-ittestjar għandu jkun magħruf. Jekk jintuża l-metodu ta’ imblukkar taċ-ċitokineżi allura l-konċentrazzjoni tal-inibitur taċ-ċitokineżi għandha tkun ottimizzata għat-tip partikolari taċ-ċellola u għandha tintwera li tipproduċi rendiment tajjeb ta’ ċelloli b'żewġ nuklei għall-għadd. Preparazzjoni tal-kultivazzjonijiet 14. Linji u razez ta’ ċelloli stabbiliti: iċ-ċelloli jitnisslu minn kultivazzjonijiet stokkjati, imqiegħda fil-mezz ta’ kultivazzjoni f'densità tali li l-kultivazzjonijiet ma jilħqux konfluwenza f'saffi uniċi, u l-kultivazzjonijiet ta’ sospensjoni ma jilħqux densità eċċessiva qabel ma jinġabru, u jiġu inkubati f'temperatura ta’ 37 °C. 15. Limfoċiti: demm sħiħ ittrattat b'antikoagulanti (eż. eparina), jew limfoċiti separati, huma kkultivati fil-preżenza ta’ mitoġenu eż. fitoemagglutinina (PHA) qabel l-esponiment għas-sustanza tat-test u cytoB. Attivazzjoni metabolika 16. Għandhom jintużaw sistemi eżoġeni ta’ metabolizzazzjoni meta jintużaw ċelloli b'kapaċità metabolika endoġena inadegwata. Is-sistema li tintuża l-aktar hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata b'kofattur (S9) imħejjija mill-fwied ta’ annimali gerriema ttrattati b'sustanzi li jinduċu l-enzimi bħall-Aroclor 1254 (45) (46) jew kombinazzjoni ta’ fenobarbiton u β-naftoflavon (46) (47) (48) (49). Din il-kombinazzjoni ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar il-Pollutanti Organiċi Persistenti (50) u r-Regolament (KE) Nru 850/2004 dwar il-Pollutanti Organiċi Persistenti (66) u ntweriet li hija daqstant effettiva daqs l-Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta’ ossidażi b'funzjoni mħallta (46) (47) (48) (49). Il-frazzjoni S9 tintuża normalment f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1-10 % (v/v) fil-mezz tat-test finali. Il-kundizzjoni ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika tista' tiddependi mill-klassi ta’ sustanza kimika li qiegħda tiġi ttestjata u f'ċerti każijiet jista' jkun xieraq li wieħed juża aktar minn konċentrazzjoni waħda ta’ S9. 17. Linji ta’ ċelloli mfassla ġenetikament li jesprimu enzimi attivanti speċifiċi tal-bniedem jew tal-annimali gerriema jistgħu jeliminaw il-ħtieġa ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika eżoġena, u jistgħu jintużaw bħala ċ-ċelloli tat-test. F'dawn il-każijiet l-għażla tal-linji taċ-ċelloli użati għandha tkun iġġustifikata xjentifikament, eż. skont ir-rilevanza tal-ossidażi b'funzjoni mħallta għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test (51), u r-reazzjoni tagħhom għal klastoġeni u anewġeni magħrufa (ara t-taqsima separata dwar il-Kriterji ta’ Aċċettabbiltà). Għandu jkun rikonoxxut li s-sustanza li qiegħda tiġi ttestjata tista' ma tkunx metabolizzata mill-ossidażi b'funzjoni mħallta espressa; f'dan il-każ, ir-riżultati negattivi ma jindikawx li s-sustanza tat-test ma tistax tinduċi mikronuklei. Preparazzjoni tas-sustanza tat-test 18. Sustanzi kimiċi solidi għandhom jinħallu f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli. Sustanzi kimiċi likwidi jistgħu jiżdiedu direttament fis-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Gassijiet jew sustanzi kimiċi volatili għandhom jiġu ttestjati permezz ta’ modifikazzjonijiet xierqa għall-protokolli standard, bħat-trattament f'kontenituri ssiġillati (52) (53). Għandhom jintużaw preparazzjonijiet friski tas-sustanza tat-test sakemm dejta ta’ stabilità ma turix li jistgħu jinħażnu. Kundizzjonijiet tat-test Solventi/mezzi 19. Is-solvent/mezz ma għandux jirreaġixxi mas-sustanza tat-test, jew ikun inkompatibbli mas-sopravivenza taċ-ċelloli jew maż-żamma tal-attività tal-S9 fil-konċentrazzjoni użata. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħrajn minflok dawk stabbiliti sew (eż. ilma, mezz ta’ kultivazzjoni taċ-ċelloli, sulfossidu tad-dimetil), l-użu tagħhom għandu jkun appoġġat minn dejta li tindika l-kompatibbiltà tagħhom mas-sustanza tat-test u n-nuqqas ta’ tossiċità ġenetika tagħhom. Huwa rrakkomandat li, kull fejn ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent/mezz likwidu. L-użu ta’ cytoB bħala imblokkatur taċ-ċitokineżi 20. Waħda mill-aktar konsiderazzjonijiet importanti fil-prestazzjoni tal-analiżi tal-MNvit hija l-iżgurar li ċ-ċelloli magħduda temmew il-mitożi waqt it-trattament jew il-perjodu ta’ inkubazzjoni wara t-trattament, jekk jintuża wieħed. CytoB hija s-sustanza li ntużat l-aktar sabiex timblokka ċ-ċitokineżi minħabba li tinibixxi l-ġbir tal-attina, u b'hekk tipprevjeni s-separazzjoni taċ-ċelloli ġġenerati (daughter cells) wara l-mitożi, li twassal għall-formazzjoni ta’ ċelloli b'żewġ nuklei (5) (54) (55). L-għadd tal-mikronuklei, għalhekk, jista' jkun illimitat għal ċelloli li għaddew minn mitożi waqt jew wara t-trattament. L-effett tas-sustanza tat-test fuq il-kinetika tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jista' jitkejjel fl-istess ħin. Is-cytoB għandu jintuża bħala imblokkatur taċ-ċitokineżi meta l-limfoċiti tal-bniedem jintużaw minħabba li l-ħinijiet taċ-ċikli taċ-ċelloli jkunu varjabbli f'kultivazzjonijiet u fost id-donaturi u minħabba li mhux il-limfoċiti kollha jirreaġixxu għall-PHA. Intużaw metodi oħrajn fl-ittestjar ta’ linji ta’ ċelloli sabiex jiġi stabbilit jekk iċ-ċelloli magħduda nqasmux; dawn huma indirizzati hawn taħt (ara l-paragrafu 26). 21. Il-konċentrazzjoni xierqa ta’ cytoB għandha tkun stabbilita mil-laboratorju għal kull tip ta’ ċellola sabiex tinkiseb il-frekwenza ottimali ta’ ċelloli b'żewġ nuklei fil-kultivazzjonijiet ta’ kontroll fis-solvent/mezz. Il-konċentrazzjoni xierqa ta’ cytoB normalment tkun bejn 3 u 6 μg/ml. Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-għażla tal-konċentrazzjonijiet ta’ esponiment 22. Meta wieħed jiddetermina l-ogħla konċentrazzjoni ta’ sustanza tat-test li għandha tkun ittestjata, il-konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva, il-preċipitazzjoni fil-mezz tal-kultivazzjoni, u bidliet ċari fil-pH jew osmolalità (39) (40) (41), għandhom jiġu evitati. 23. Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jsir sabiex ikun żgurat li ċ-ċelloli ttrattati jkunu għaddew minn mitożi waqt l-analiżi u li t-trattamenti jsiru fil-livelli xierqa ta’ ċitotossiċità (ara l-Paragrafu 29). Iċ-ċitotossiċità għandha tkun stabbilita b'attivazzjoni metabolika jew mingħajrha f'ċelloli li jeħtieġu attivazzjoni metabolika permezz taż-żieda relattiva fl-għadd taċ-ċelloli (RICC) jew irduppjar relattiv tal-popolazzjoni (RPD) (ara l-Appendiċi 2 għall-formoli) sakemm ma tintużax is-cytoB. Meta tintuża s-cytoB, iċ-ċitotossiċità tista' tkun stabbilita permezz tal-indiċi ta’ replikazzjoni (RI) (ara Appendiċi 2 għall-formola). 24. It-trattament tal-kultivazzjonijiet b'cytoB, u l-kejl tal-frekwenzi relattivi ta’ ċelloli b'nukleu wieħed, żewġ nuklei jew diversi nuklei fil-kultivazzjoni, jipprovdi metodu eżatt tal-kwantifikazzjoni tal-effett fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelloli u l-attività ċitotossika jew ċitostatika ta’ trattament (5), u jiżgura li ċelloli li nqasmu waqt jew wara t-trattament biss jiġu magħduda. 25. Fi studji b'cytoB, iċ-ċitostażi/ċitotossiċità tista' tiġi kkwantifikata mill-indiċi ta’ proliferazzjoni tal-imblokkatur taċ-ċitokineżi (CBPI) (5) (26) (56) jew tista' tinħareġ mill-RI minn mill-inqas 500 ċellola għal kull kultivazzjoni (ara Appendiċi 2 għall-formuli). Meta s-cytoB jintuża għall-valutazzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli, CBPI jew RI għandhom jiġu stabbiliti minn mill-inqas 500 ċellola għal kull kultivazzjoni. Dan il-kejl fost oħrajn jista' jintuża sabiex tiġi stmata ċ-ċitotossiċità billi jitqabblu l-valuri fil-kultivazzjonijiet ittrattati u ta’ kontroll. Il-valutazzjoni ta’ indikaturi oħrajn ta’ ċitotossiċità (eż. konfluwenza, għadd ta’ ċelloli, apoptożi, nekrożi, għadd ta’ metafażi) tista' tipprovdi informazzjoni utli. 26. Fi studji mingħajr cytoB, jeħtieġ li jintwera li ċ-ċelloli magħduda fil-kultivazzjoni inqasmu waqt jew wara t-trattament bis-sustanza tat-test, inkella jistgħu jiġu prodotti reazzjonijiet negattivi foloz. Metodi li ntużaw sabiex ikun żgurat li ċ-ċelloli maqsuma qegħdin jingħaddu jinkludu l-inkorporazzjoni u l-individwazzjoni sussegwenti tal-bromodeossiuridina (BrdU) għall-identifikazzjoni ta’ ċelloli li rreplikaw (57), il-formazzjoni ta’ kloni meta ċ-ċelloli minn linji ta’ ċelloli permanenti jiġu ttrattati u magħduda in situ fuq slajd tal-mikroskopju (Indiċi ta’ Proliferazzjoni (PI)) (25) (26) (27) (28), jew il-kejl ta’ Rduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) jew Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) jew metodi oħrajn ippruvati (16) (56) (58) (59) (ara Appendiċi 2 għall-formoli). Il-valutazzjoni ta’ indikaturi oħrajn għaċ-ċitotossiċità jew ċitostażi (eż. konfluwenza, għadd ta’ ċelloli, apoptożi, nekrożi, għadd ta’ metafażi) tista' tipprovdi informazzjoni utli. 27. Għallinqas għandhom jiġu evalwati tliet konċentrazzjonijiet ta’ test analizzabbli. Sabiex jinkiseb dan, jista' jkun meħtieġ li jsir l-esperiment permezz ta’ għadd akbar ta’ konċentrazzjonijiet spazjati viċin xulxin u li tiġi analizzata l-formulazzjoni ta’ mikronuklei f'dawk il-konċentrazzjonijiet li jipprovdu l-firxa xierqa ta’ ċitotossiċitajiet. Strateġija alternattiva hija li jsir test preliminari ta’ ċitotossiċità sabiex tonqos il-firxa għat-test definittiv. 28. L-ogħla konċentrazzjoni għandha timmira li tipproduċi 55 ± 5 % ċitotossiċità. Livelli ogħla jistgħu jinduċu ħsara fil-kromożomi bħala effett sekondarju ta’ ċitotossiċità (60). Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżula għandhom ikopru firxa minn dik li tipproduċi 55 ± 5 % ċitotossiċità, sa ftit li xejn jew l-ebda ċitotossiċità. 29. Jekk ma tkun osservata l-ebda ċitotossiċità jew preċipitat, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tikkorrispondi għal 0,01 M, 5 mg/mL jew 5 μl/mL, skont liema hija l-aktar baxxa. Il-konċentrazzjonijiet magħżula għall-analiżi għandhom, ġeneralment, ikunu separati minn spazju ta’ mhux aktar minn 10. Għal sustanzi tat-test li juru kurva ta’ konċentrazzjoni-reazzjoni wieqfa, jista' jkun meħtieġ li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test jiġu spazjati aktar viċin xulxin sabiex il-kultivazzjonijiet fil-firxiet moderati u baxxi tat-tossiċità jkunu magħduda wkoll. 30. Meta s-solubbiltà tkun fattur li jillimita, il-konċentrazzjoni massima, jekk ma tkunx limitata biċ-ċitotossiċità, għandha tkun il-konċentrazzjoni l-aktar baxxa li fiha l-preċipitat minimu jkun viżibbli fil-kultivazzjonijiet, sakemm ma jkunx hemm interferenza bl-għadd. L-evalwazzjoni tal-preċipitazzjoni għandha ssir permezz ta’ metodi bħal mikroskopija ħafifa, l-innutar ta’ preċipitat li jippersisti, jew li jidher waqt il-kultivazzjoni (sal-aħħar tat-trattament). Kontrolli 31. Kontrolli simultanji pożittivi u b'solvent/mezz kemm b'attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. 32. PC huma meħtieġa sabiex juru l-abbiltà taċ-ċelloli użati, u l-protokoll tat-test, li jiġu identifikati l-klastoġeni u l-anewġeni, u sabiex tkun affermata l-kapaċità metabolika tal-preparazzjoni S9. Il-PC għandu juża indutturi magħrufa ta’ formazzjoni ta’ mikronuklei f'konċentrazzjonijiet mistennija li jagħtu żidiet żgħar iżda riproduċibbli fuq l-isfond, u li juru s-sensittività tas-sistema ta’ ttestjar. Il-konċentrazzjonijiet tal-PC għandhom jintgħażlu b'mod li l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx minnufih lill-qarrej l-identità tal-islajds ikkodifikati. 33. Klastoġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika (eż. ċiklofosfammid; benżo[a]piren) għandu jintuża sabiex juri kemm il-kompetenza metabolika kif ukoll l-abbiltà tas-sistema tal-ittestjar li tindividwa l-klastoġeni. PC oħrajn jistgħu jintużaw jekk ikunu ġġustifikati. Minħabba li ċerti PC li jeħtieġu attivazzjoni metabolika jistgħu jkunu attivi mingħajr attivazzjoni metabolika eżoġena taħt ċerti kundizzjonijiet ta’ trattament jew f'ċerti linji ta’ ċelloli, il-ħtieġa għal attivazzjoni metabolika, u l-attività tal-preparazzjoni S9, għandha tkun ittestjata fil-linja ta’ ċelloli magħżula u fil-konċentrazzjonijiet magħżula. 34. Fil-preżent, l-ebda anewġen ma huwa magħruf li jeħtieġ attivazzjoni metabolika għall-attività ġenotossika tiegħu (16). PC aċċettati bħalissa għall-attività anewġenika huma, pereżempju, kolkiċina u vinblastina. Sustanzi kimiċi oħrajn jistgħu jintużaw jekk jinduċu mikronuklei biss, jew primarjament, permezz ta’ attività anewġenika. Sabiex tiġi evitata l-ħtieġa għal żewġ PC (għall-klastoġeniċità u l-anewġeniċità) mingħajr attivazzjoni metabolika, il-kontroll tal-anewġeniċità jista' jservi bħala l-PC mingħajr S9, u l-kontroll tal-klastoġeniċità jista' jintuża għall-ittestjar tal-adegwatezza tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika użata. PC kemm għall-klastoġeniċità u l-anewġeniċità għandu jintuża fiċ-ċelloli li ma jeħtiġux S9. Il-PC issuġġeriti huma inklużi fl-Appendiċi 3. 35. L-użu ta’ PC relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi jista' jiġi kkunsidrat, meta jkunu disponibbli sustanzi kimiċi adattati. Il-PC kollha użati għandhom ikunu xierqa għat-tip ta’ ċellola u l-kundizzjonijiet ta’ attivazzjoni. 36. Kontrolli ta’ solvent/mezz għandhom ikunu inklużi għal kull ħin ta’ ġbir. Barra minn hekk, NC mhux ittrattati (neqsin minn solvent/mezz) għandhom jintużaw ukoll diment li ma jkunx hemm dejta ta’ kontroll storika ppubblikata jew tal-laboratorju li turi li l-ebda effett ġenotossiku jew effett dannuż ieħor ma jiġi kkawżat mis-solvent magħżul fil-konċentrazzjonijiet użati. PROĊEDURA TAT-TEST Skeda tat-Trattament 37. Sabiex tkun massimizzata l-probabbiltà tal-identifikazzjoni ta’ anewġenu jew klastoġenu li jaġixxu fi stadju speċifiku fiċ-ċiklu taċ-ċelloli, huwa importanti li għadd suffiċjenti ta’ ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test matul l-istadji kollha taċ-ċikli taċ-ċelloli tagħhom. Għalhekk, l-iskeda tat-trattament għal-linji taċ-ċelloli u l-kulturi taċ-ċelloli primarji jistgħu jvarjaw kemmxejn minn dawk għal-limfoċiti, li jitolbu li l-istimulazzjoni mitoġenika tibda ċ-ċiklu taċ-ċelloli tagħhom, u dawn huma kkunsidrati fil-Paragrafi 41–43 (16). 38. Il-konsiderazzjonijiet teoretiċi, flimkien mal-informazzjoni ppubblikata (18) jindikaw li l-maġġoranza tal-anewġeni u l-klastoġeni ser jiġu identifikati f'perjodu ta’ trattament għal żmien qasir ta’ 3 sa 6 sigħat fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ S9, segwiti mit-tneħħija tas-sustanza tat-test u perjodu ta’ tkabbir ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli (6). Għandhom jittieħdu kampjuni taċ-ċelloli fi żmien ekwivalenti għal madwar 1,5–2,0 darba aktar mit-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli (i.e. mhux ittrattati) wara l-bidu jew wara t-tmiem tat-trattament (Ara t-Tabella 1). Il-perjodi tat-teħid tal-kampjuni jew tal-irkupru jistgħu jiġu estiżi jekk ikun magħruf jew suspettat li s-sustanza tat-test taffettwa l-perjodu ċikliku taċ-ċelloli (pereżempju meta jiġu ttestjati l-analogi nukleożidi). 39. Minħabba ċ-ċitotossiċità potenzjali tal-preparazzjonijiet tal-S9 għaċ-ċelloli mammiferi kkultivati, trattament ta’ esponiment estiż ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali jintuża biss fin-nuqqas ta’ S9. Fit-trattament estiż, jiġu offruti għażliet biex jippermettu t-trattament taċ-ċelloli bis-sustanza kimika tat-test fin-nuqqas jew fil-preżenza ta’ cytoB. Dawn l-għażliet jindirizzaw is-sitwazzjonijiet li jista' jkun hemm tħassib dwarhom fir-rigward tal-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza tat-test u s-cytoB. 40. L-iskedi ssuġġeriti għat-trattament taċ-ċelloli huma ppreżentati fit-Tabella 1. Dawn l-iskedi ta’ trattament ġenerali jistgħu jiġu mmodifikati skont l-istabilità jew ir-reattività tas-sustanza tat-test jew il-karatteristiċi ta’ tkabbir partikolari taċ-ċelloli li jkunu qegħdin jintużaw. It-trattamenti kollha għandhom jibdew u jintemmu waqt li ċ-ċelloli jkunu qegħdin jikbru b'mod esponenzjali. Dawn l-iskedi huma ppreżentati f'aktar dettall fil-paragrafi 41–47 li ġejjin. Tabella 1 It-trattament taċ-ċelloli u l-perjodi tal-ħsad għall-analiżi tal-Mnvit Limfoċiti, ċelloli primarji u linji ta’ ċelloli ttrattati b'cytoB + S9 Trattament għal 3–6 sigħat fil-preżenza ta’ S9; tneħħija tal-S9 u l-mezz tat-trattament; żieda ta’ mezz frisk u cytoB; ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar tard. – S9 Esponiment qasir Trattament għal 3–6 sigħat; tneħħija tal-mezz tat-trattament; żieda ta’ mezz frisk u cytoB; ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar tard. – S9 Esponiment estiż Għażla A: Trattament għal 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali fil-preżenza tas-cytoB; ħsad fi tmiem il-perjodu tal-esponiment. Għażla B: Trattament għal 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali; tneħħija tas-sustanza tat-test; żieda ta’ mezz frisk u cytoB; ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar tard. Linji ta’ ċelloli ttrattati mingħajr cytoB (Identiċi għall-iskedi tat-trattament deskritti hawn fuq bl-eċċezzjoni li ma tiżdied ebda cytoB) Limfoċiti, ċelloli primarji u linji ta’ ċelloli b'cytoB 41. Għal-limfoċiti, l-aktar approċċ effiċjenti huwa li l-esponiment għas-sustanza tat-test jinbeda f'44-48 siegħa wara l-istimulazzjoni tal-PHA, meta tkun telqet is-sinkronizzazzjoni taċ-ċiklu (5). Fl-analiżi inizjali, iċ-ċelloli jiġu ttrattati għal 3 sa 6 sigħat bis-sustanza tat-test fin-nuqqas jew fil-preżenza ta’ S9. Il-mezz tat-trattament jitneħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk li jkun fih is-cytoB, u ċ-ċelloli jittieħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali. 42. Jekk iż-żewġ testijiet inizjali tat-trattament qasir (3–6 sigħat) ikunu negattivi jew ekwivoċi, għandu jintuża trattament ta’ esponiment estiż sussegwenti mingħajr S9. Hemm żewġ għażliet ta’ trattament li huma disponibbli u ugwalment aċċettabbli. Madankollu, jista' jkun aktar xieraq li tiġi segwita l-Għażla A għal limfoċiti stimulati fejn it-tkabbir esponenzjali jista' jkun qiegħed jonqos f'96 siegħa wara l-istimulazzjoni. Barra minn hekk, il-kulturi taċ-ċelloli ma għandhomx ikunu laħqu konfluwenza sal-perjodu finali tat-teħid tal-kampjuni fl-Għażla B. — Għażla A: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test għal 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali, u jittieħdu fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament, — Għażla B: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test għal 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali. Il-mezz tat-trattament jitneħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk, u ċ-ċelloli jittieħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali addizzjonali. 43. Iċ-ċelloli primarji u l-linji taċ-ċelloli għandhom jiġu ttrattati b'mod simili għal-limfoċiti, ħlief li mhuwiex neċessarju li dawn jiġu stimulati b'PHA għal 44–48 siegħa. Ċelloli oħrajn minbarra l-limfoċiti għandhom ikunu esposti b'tali mod li fiż-żmien tat-terminazzjoni tal-istudju, iċ-ċelloli jkunu għadhom fil-fażi msejħa ‘log-phase growth’. Linji ta’ ċelloli mingħajr cytoB 44. Iċ-ċelloli għandhom jiġu ttrattati għal 3 sa 6 sigħat fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ S9. Il-mezz tat-trattament jitneħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk, u ċ-ċelloli jittieħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali. 45. Jekk iż-żewġ testijiet inizjali tat-trattament qasir (3–6 sigħat) ikunu negattivi jew ekwivoċi, għandu jintuża trattament ta’ esponiment estiż sussegwenti (mingħajr S9). Hemm żewġ għażliet ta’ trattament li huma disponibbli, li t-tnejn huma ugwalment aċċettabbli: — Għażla A: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test għal 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali, u jittieħdu fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament. — Għażla B: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test għal 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali. Il-mezz tat-trattament jitneħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk, u ċ-ċelloli jittieħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali addizzjonali. 46. Fil-monosaffi, iċ-ċelloli mitotiċi (identifikabbli bħala li huma tondi u maqlugħa mill-wiċċ) jistgħu jkunu preżenti fl-aħħar tat-trattament ta’ bejn 3 u 6 sigħat. Minħabba li dawn iċ-ċelloli mitotiċi jistgħu jinqalgħu faċilment, huma jistgħu jintilfu meta jitneħħa l-mezz li jkun fih is-sustanza tat-test. Għandha tingħata attenzjoni għall-ġbir ta’ dawn meta jinħaslu l-kulturi, u li dawn jiġu rritornati fil-kulturi, sabiex jiġi evitat li jintilfu ċelloli li jkunu f'mitożi, u li jkunu f'riskju għal mikronuklei, fiż-żmien tal-ħsad. L-għadd ta’ kulturi 47. Għandhom jintużaw kulturi doppji għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u għall-mezz/solvent u l-kulturi NC. Fejn tkun tista' tintwera varjazzjoni minima bejn il-kulturi doppji mill-informazzjoni storika tal-laboratorju, jista' jkun aċċettabbli li jintużaw kulturi singoli. Jekk jintużaw kulturi singoli, huwa rakkomandat li jiġi analizzat għadd akbar ta’ konċentrazzjonijiet. Il-ħsad taċ-ċelloli u l-preparazzjoni tal-lametti 48. Kull kultura tiġi maħsuda u pproċessata separatament. Il-preparazzjoni taċ-ċelloli tista' tinvolvi trattament ipotoniku, iżda dan il-pass mhuwiex neċessarju jekk jinkiseb tifrix adegwat taċ-ċelloli b'mod ieħor. Jistgħu jintużaw tekniki differenti fil-preparazzjoni tal-lametti sakemm jinkisbu preparazzjonijiet taċ-ċelloli ta’ kwalità għolja għall-għoti tal-punti. Iċ-ċitoplasma taċ-ċelloli għandha tinżamm sabiex tkun tista' ssir l-iskoperta tal-mikronuklei u l-identifikazzjoni affidabbli (fil-metodu cytokinesis-block) taċ-ċelloli binukleati. 49. Il-lametti jistgħu jingħataw il-kulur bl-użu ta’ metodi varji, bħal Giemsa jew żebgħat speċifiċi fluworexxenti tad-DNA (59). L-użu ta’ kulur speċifiku ta’ DNA (pereżempju oranġjo akridin (61) jew Hoechst 33255 plus pyronin-Y (62)) jista' jelimina xi wħud mill-prodotti assoċjati mal-użu ta’ kulur speċifiku mhux ta’ DNA. L-antikorpi antikinetokor, FISH bi probes panċentromeriċi tad-DNA, jew it-tikkettar primed in situ bi primers speċifiċi panċentromeriċi, flimkien ma’ counterstaining xieraq tad-DNA, jistgħu jintużaw biex jidentifikaw il-kontenuti (kromożomi/framment tal-kromożomi) tal-mikronuklei jekk l-informazzjoni mekkanistika dwar il-formazzjoni tagħhom tkun ta’ interess (15)(16). Jistgħu jintużaw metodi oħrajn għal divrenzjar bejn il-klastoġeni u l-anewġeni jekk dawn ikunu wrew li huma effettivi. Analiżi 50. Il-lametti kollha, inklużi dawk tas-solvent/mezz u l-kontrolli, għandhom ikunu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-analiżi mikroskopika. Inkella, il-kampjuni kkodifikati jistgħu jiġu analizzati bl-użu ta’ sistema vvalidata u awtomatizzata ta’ analiżi tal-immaġini jew ta’ analiżi tal-fluss ċitometriku. 51. Fil-kulturi ttrattati b'cytoB, il-frekwenzi mikronuklei għandhom jiġu analizzati mill-inqas f'2 000 ċellola binukleata għal kull konċentrazzjoni (mill-inqas 1 000 ċellola binukleata għal kull kultura; żewġ kulturi għal kull konċentrazzjoni). Jekk jintużaw kulturi singoli, għandhom jingħaddu mill-inqas 2 000 ċellola binukleata għal kull konċentrazzjoni minn dik il-kultura. Jekk għall-għoti tal-punti f'kull konċentrazzjoni jkunu disponibbli sostanzjalment inqas minn 1 000 ċellola binukleata għal kull kultura, jew 2 000 f'każ li tintuża kultura singola, u jekk ma tiġi osservata ebda żieda sinifikanti fil-mikronuklei, it-test għandu jiġi ripetut bl-użu ta’ aktar ċelloli, jew f'konċentrazzjonijiet inqas tossiċi, skont xi jkun l-aktar xieraq. Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma jingħaddux ċelloli binukleati b'forom irregolari jew fejn iż-żewġ nuklei jkunu jvarjaw ħafna fid-daqs; lanqas ma għandhom iċ-ċelloli binukleati jiġu mħawdin maċ-ċelloli multinukleati mifruxa ħażin. Ċelloli li jkun fihom aktar minn żewġ nuklei ewlenin ma għandhomx jiġu analizzati għall-mikronuklei, minħabba li l-frekwenza bażika tal-mikronukleu tista' tkun ogħla f'dawn iċ-ċelloli (63) (64) L-għadd taċ-ċelloli mononukleati huwa aċċettabbli jekk is-sustanza tat-test turi li tinterferixxi mal-attività tas-cytoB. 52. Fil-linji ta’ ċelloli analizzati mingħajr trattament tas-cytoB, il-mikronuklei għandhom jingħaddu mill-inqas f'2 000 ċellola għal kull konċentrazzjoni (mill-inqas 1 000 ċellola għal kull kultura; żewġ kulturi għal kull konċentrazzjoni). Fejn tintuża kultura waħda biss għal kull konċentrazzjoni, għandhom jingħaddu mill-inqas 2 000 ċellola minn dik il-kultura. 53. Meta tintuża s-cytoB, għandhom jiġu stabbiliti CBPI jew RI sabiex tiġi vvalutata l-proliferazzjoni taċ-ċelloli (ara l-Appendiċi 2) bl-użu ta’ mill-inqas 500 ċellola għal kull kultura. Meta t-trattamenti jitwettqu fin-nuqqas ta’ cytoB, huwa essenzjali li tiġi pprovduta evidenza li ċ-ċelloli li jkunu qegħdin jingħaddu għaddew minn proliferazzjoni, kif diskuss fil-Paragrafi 24-27. Kriterji ta’ aċċettabilità 54. Laboratorju li jipproponi li juża l-analiżi tal-MNvit deskritta fit-TM għandu juri l-kapaċità tiegħu li josserva b'mod affidabbli u preċiż sustanzi kimiċi ta’ attività anewġenika u klastoġenika magħrufa, b'attivazzjoni metabolika u mingħajrha, kif ukoll sustanzi kimiċi negattivi, bl-użu tas-sustanzi kimiċi ta’ referenza fl-Appendiċi 3. Bħala evidenza tal-abbiltà tiegħu li jwettaq dan it-TM b'mod korrett, il-laboratorju għandu jipprovdi evidenza li ċ-ċelloli li jkunu qegħdin jingħaddu għal formazzjoni mikronuklea jkunu temmew diviżjoni nukleari waħda jekk it-test jitwettaq mingħajr l-użu ta’ cytoB. 55. Is-sustanzi kimiċi fl-Appendiċi 3 huma rrakkomandati biex jintużaw bħala sustanzi kimiċi ta’ referenza. Jistgħu jiġu inklużi sustanzi kimiċi sostituti jew addizzjonali jekk l-attività tagħhom tkun magħrufa u jekk jinduċu mikronuklei permezz tal-istess mekkaniżmi ta’ azzjoni, u jekk dawn juru li huma rilevanti għas-sustanzi kimiċi li għandhom jiġu ttestjati bl-użu tal-proċedura MNvit. Ġustifikazzjoni tista' tinkludi studju ta’ validazzjoni li japplika varjetà wiesgħa ta’ sustanzi jew iffokat fuq spettru idjaq ibbażat fuq il-klassi kimika tas-sustanza tat-test jew il-mekkaniżmu ta’ dannu li jkun qiegħed jiġi studjat. 56. Il-kontroll tas-solvent/mezz u l-kulturi mhux ittrattati għandhom jagħtu frekwenzi ta’ mikronuklei konsistenti u riproduċibbilment baxxi (tipikament 5-25 mikronukleu/1 000 ċellola għat-tipi taċ-ċelloli identifikati fil-paragrafu 11). Tipi oħrajn ta’ ċelloli jista' jkollhom firxiet differenti ta’ reazzjonijiet li għandhom jiġu stabbiliti meta jiġu vvalidati biex jintużaw fl-analiżi tal-MNvit. L-informazzjoni minn kontroll negattiv, solvent u PC għandha tintuża biex tistabbilixxi l-firxiet tal-kontroll storiku. Dawn il-valuri għandhom jintużaw sabiex tiġi deċiża l-adegwatezza tal-NC/PC simultanju għal esperiment. 57. Jekk għall-analiżi jiġu proposti bidliet żgħar fil-protokoll (eż. l-użu ta’ tekniki ta’ għoti ta’ punti awtomatizzati minflok manwali; l-użu ta’ tip ta’ ċellola ġdida) l-effikaċja tal-bidla għandha tintwera qabel ma l-protokoll immodifikat ikun jista' jitqies bħala aċċettabbli biex jintuża. It-turija tal-effikaċja tinkludi dimostrazzjoni li jistgħu jiġu osservati l-mekkaniżmi ewlenin tal-ksur tal-kromożomi u l-ksib jew it-telf tagħhom, u li jistgħu jinkisbu riżultati pożittivi u negattivi xierqa għall-klassi tas-sustanza individwali, jew il-firxa wiesgħa ta’ sustanzi, li għandhom jiġu ttestjati. INFORMAZZJONI U RAPPURTAR It-trattament tar-riżultati 58. Jekk tintuża t-teknika cytokinesis-block, huma biss il-frekwenzi taċ-ċelloli binukleati b'mikronuklei (indipendenti mill-għadd ta’ mikronuklei għal kull ċellola) li għandhom jintużaw fl-evalwazzjoni tal-induzzjoni tal-mikronuklei. L-għadd tan-numri ta’ ċelloli b'mikronuklea waħda, b'żewġ mikronuklei jew b'aktar mikronuklei jista' jipprovdi informazzjoni utli, iżda mhuwiex obbligatorju. 59. Għandhom jiġu stabbiliti miżuri simultanji ta’ ċitotossiċità u/jew ċitostażi għall-kulturi kollha ttrattati jew ta’ kontroll tas-solvent/mezz (58). Is-CBPI jew l-RI għandhom jiġu kkalkolati għall-kulturi kollha ttrattati u ta’ kontroll bħala kejl tad-dewmien taċ-ċiklu taċ-ċelloli meta jintuża l-metodu cytokinesis-block. Fin-nuqqas ta’ cytoB, għandhom jintużaw l-RPD, l-RICC jew il-PI (ara l-Appendiċi 2). 60. Għandha tiġi pprovduta informazzjoni dwar il-kultura individwali. Barra minn hekk, l-informazzjoni kollha għandha tinġabar fil-qosor f'forma ta’ tabella. 61. Sustanzi kimiċi li jinduċu mikronuklei fl-analiżi tal-MNvit jistgħu jagħmlu dan minħabba li jinduċu ksur tal-kromożomi, telf tal-kromożomi jew kombinazzjoni tat-tnejn. Tista' tintuża analiżi ulterjuri li tuża antikorpi antikinetokor, ċentromeri speċifiċi fi probes in situ jew metodi oħrajn sabiex jiġi stabbilit jekk il-mekkaniżmu tal-induzzjoni tal-mikronuklei huwiex dovut għal attività klastoġenika u/jew anewġenika. Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati 62. Ma hemm ebda ħtieġa għal verifika permezz ta’ ttestjar addizzjonali ta’ reazzjoni pożittiva jew negattiva ċara. Ir-riżultati ekwivoċi jistgħu jiġu kkjarifikati permezz ta’ analiżi ta’ 1 000 ċellola oħra mill-kulturi kollha sabiex jiġi evitat it-telf tal-blinding. Jekk dan l-approċċ ma jsolvix ir-riżultat, ikunu jridu jsiru aktar testijiet. Il-modifika tal-parametri ta’ studju fuq firxa wiesgħa jew dejqa ta’ kondizzjonijiet, kif xieraq, għandha tiġi kkunsidrata fl-esperimenti ta’ segwitu. Il-parametri ta’ studju li jistgħu jiġu mmodifikati jinkludu l-ispazjar tal-konċentrazzjoni tat-test, l-għażla taż-żmien tat-trattament u l-ħsad taċ-ċelloli, u/jew il-kondizzjonijiet tal-attivazzjoni metabolika. 63. Hemm bosta kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hija żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda statistikament sinifikanti fl-għadd ta’ ċelloli li fihom mikronuklei. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Il-konsiderazzjoni ta’ jekk il-valuri osservati humiex fi ħdan jew barra l-firxa ta’ kontroll storiku tista' tipprovdi gwida fl-evalwazzjoni tas-sinifikat bijoloġiku tar-reazzjoni. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (65) jistgħu jintużaw metodi ta’ statistika. Madankollu, ir-riżultati tat-testijiet statistiċi għandhom jiġu vvalutati fir-rigward tar-relazzjoni bejn id-doża u r-reazzjoni. Fatturi oħrajn li għandhom jiġu kkunsidrati huma r-riproduċibbiltà u l-informazzjoni storika. 64. Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-reazzjonijiet jistgħu jibqgħu ekwivoċi jew inċerti irrispettivament mill-għadd ta’ drabi li jkun ripetut l-esperiment. 65. Ir-riżultati pożittivi mill-analiżi tal-MNvit jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq ksur tal-kromożomi jew telf tal-kromożomi fiċ-ċelloli mammiferi kkulturati. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kondizzjonijiet tat-test użati, is-sustanza tat-test ma toħloq ebda ksur tal-kromożomi u/jew ksib jew telf ta’ ċelloli mammiferi kkulturati. Rapport tat-Test 66. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi mill-inqas l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun rilevanti għat-twettiq tal-istudju: Sustanza kimika tat-test — informazzjoni dwar l-identifikazzjoni u n-Numru tar-Reġistru tal-Chemical Abstract Services (CAS) u n-Numru tal-KE, — in-natura u l-purità fiżika, — il-karatteristiċi fiżikokimiċi rilevanti għat-twettiq tal-istudju, — ir-reattività tas-sustanza kimika tat-test mas-solvent/mezz jew il-mezzi tal-kultura taċ-ċelloli, Solvent/Mezz — ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/tal-mezz, — is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/fil-mezz, Ċelloli — it-tip u s-sors taċ-ċelloli użati, — l-adattabilità tat-tip ta’ ċelloli użati, — in-nuqqas ta’ majkoplasma, jekk applikabbli, — informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli, l-irduppjar taż-żmien jew l-indiċi tal-proliferazzjoni, — fejn jintużaw limfoċiti, is-sess, l-età u l-għadd ta’ donaturi tad-demm, jekk applikabbli, — fejn jintużaw limfoċiti, jekk id-demm sħiħ jew il-limfoċiti separati humiex esposti, — l-għadd ta’ passaġġi, jekk applikabbli, — il-metodi użati għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli, jekk applikabbli; — in-numru modali tal-kromożomi, — iż-żmien normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli (kontroll negattiv), Kondizzjonijiet tat-Test — l-identità taċ-ċitokineżi li timblokka s-sustanza (eż. cytoB), jekk tintuża, u l-konċentrazzjoni tagħha, flimkien mat-tul tal-esponiment taċ-ċelloli, — ir-raġuni għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u l-għadd ta’ kulturi, inklużi informazzjoni dwar iċ-ċitotossiċità u l-limitazzjonijiet tas-solubilità, jekk ikunu disponibbli, — il-kompożizzjoni tal-mezzi, il-konċentrazzjoni tas-CO2, jekk applikabbli, — il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, — il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) tal-mezz u s-sustanza tat-test miżjuda, — it-temperatura u l-ħin tal-inkubazzjoni, — it-tul tat-trattament, — il-ħin tal-ħsad wara t-trattament, — id-densità taċ-ċelloli waqt l-injettar, jekk applikabbli, — it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema tal-attivazzjoni metabolika, inklużi l-kriterji tal-aċċettabilità, — is-sustanzi kimiċi ta’ kontroll pożittiv u l-kontrolli negattivi, — il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti u t-teknika użata għall-għoti tal-kulur, — il-kriterji għall-identifikazzjoni tal-mikronuklei, — l-għadd ta’ ċelloli analizzati, — il-metodi għall-kejl taċ-ċitotossiċità, — kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità, — il-kriterji sabiex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi, — il-metodu/i tal-analiżi statistika użata, — il-metodi, bħall-użu ta’ antikorp kinetochore, sabiex jikkaratterizzaw jekk il-mikronuklei fihomx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli, Ir-riżultati — il-kejl taċ-ċitotossiċità użata, eż. CBPI jew RI fil-każ tal-metodu cytokinesis-block; RICC, RPD jew PI meta ma jintużawx il-metodi ta’ cytokinesis-block; osservazzjonijiet oħrajn meta applikabbli, eż. konfluwenza taċ-ċelloli, apoptożi, nekrożi, l-għadd tal-metafażi, il-frekwenza taċ-ċelloli binukleati, — sinjali ta’ preċipitazzjoni, — informazzjoni dwar il-pH u l-osmolalità tal-mezz tat-trattament, jekk ikun stabbilit, — definizzjoni taċ-ċelloli aċċettabbli għall-analiżi, — id-distribuzzjoni taċ-ċelloli mononukleati, binukleati u multinukleati jekk jintuża l-metodu cytokinesis-block, — l-għadd ta’ ċelloli b'mikronuklei mogħtija separatament għal kull kultura ttrattata u kkontrollata, u jekk hux minn ċelloli binukleati jew mononukleati, fejn xieraq, — ir-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-reazzjoni, fejn possibbli, — informazzjoni kimika simultanja (konċentrazzjonijiet u solventi) dwar il-kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, — informazzjoni kimika storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, il-mezzi u l-intervall standard ta’ devjazzjoni u kunfidenza (eż. 95 %), — analiżi statistika; il-valuri p, jekk ikun hemm. Diskussjoni tar-riżultati Konklużjonijiet LETTERATURA (1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1–4. (2) Parry, J.M. u Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3–15. (3) Fenech, M. u Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233–246. (4) Kirsch–Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. u Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167–172. (5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084–1104. (6) Fenech, M. u Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193–198. (7) Eastmond, D.A. u Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34–43. (8) Eastmond, D.A. u Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9–20. (9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. u Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297–302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F. u Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329–334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. u Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205–213. (12) Norppa, H., Renzi, L. u Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519–525. (13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. u Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9–20. (14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. u Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233–245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. u Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211–219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. u Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153–163. (17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Linja Gwida tat-Test Nru 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariġi. Disponibbli fuq: [www.oecd.org/env/testguidelines] (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. u Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13–36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37–60. (20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61–87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88–124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125–152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. u Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187–208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. u Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45–59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. u Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81–116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. u Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183–190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. u Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55–71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. u Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137–163. (29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. u Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123–134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. u Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569–580. (31) Elhajouji, A., u Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1–152. (32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16–17 ta’ Novembru 2006, Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271–283. (35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. u Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105–115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. u Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257–260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. u Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315–328. (38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. u Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61–70. (39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. u Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147–205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. u Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297–305. (41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886. (42) Fenech, M. u Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29–36. (43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11–18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. u Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international bażi tad-dejta comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31–45. (45) Maron, D.M. u Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173–215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. u Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65. (47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. u Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175–177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. u Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. u Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. (49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. u Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59. (50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Disponibbli fuq: [http://www.pops.int/] (51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. u Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247–274. (52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. u McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. u Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103. (53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. u Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795–801. (54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35–44. (55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., u Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103–112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. u Wakata, A. (2004), Corrigendum to ‘Report from the in vitro micronucleus assay working group’, Mutation Res., 564, 97–100. (57) Pincu, M., Bass, D. u Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61–65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. u Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1–3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. u Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169–184. (60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191–201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., u Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241–247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., u Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 u Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269–275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. u Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241–247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. u Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65–75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. u Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467. (66) Ir-Regolament (KE) Nru 850/2004 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tad-29 ta’ April 2004 dwar pollutanti organiċi persistenti u li jemenda d-Direttiva 79/117/KEE, ĠU L 229, 30.4.2004, p. 5. Appendiċi 1 Definizzjonijiet Anewġenu: kwalunkwe sustanza jew proċess li, meta jinteraġġixxu mal-komponenti taċ-ċiklu tad-diviżjoni taċ-ċellola mitotika u mejotika, iwasslu għal anewplojdija f’ċelloli jew organiżmi. Anewplojdija: kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta’ diplojdi (jew aplojdi) normali ta’ kromożomi minn kromożomu wieħed jew minn aktar minn kromożomu wieħed, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta’ kromożomi (poliplojdija). Apoptożi: mewta taċ-ċelloli kkaratterizzati minn serje ta’ passi li jwasslu għal diżintegrazzjoni taċ-ċelloli fil-partikoli mwaħħlin mal-membrana li jiġu mbagħad eliminati permezz ta’ fagoċitożi jew permezz ta’ tixrid. Proliferazzjoni taċ-ċelloli: żieda fl-għadd ta’ ċelloli bħala riżultat ta’ diviżjoni mitotika taċ-ċelloli. Ċentromer: reġjun tad-DNA ta’ kromożomu wieħed fejn iż-żewġ kromatidi jinżammu flimkien u li fuqu hemm imwaħħlin ġenb ma’ ġenb iż-żewġ kinetokori. Klastoġen: kull sustanza jew proċess li tikkawża aberrazzjonijiet kromosomali strutturali fil-popolazzjoni ta’ ċelloli jew organiżmi. Ċitokineżi: il-proċess ta’ diviżjoni taċ-ċelloli minnufih wara mitożi sabiex jifforma żewġ ċelloli żgħar, fejn kull waħda jkun fiha nukleu wieħed. Indiċi ta’ Proliferazzjoni Blokk taċ-Ċitokineżi (Cytokinesis-Block Proliferation index (CBPI)): il-proporzjon ta’ ċelloli tat-tieni diviżjoni fil-popolazzjoni ttrattata fir-rigward tal-kontroll mhux ittrattat (ara Appendiċi 2 għall-formula). Ċitostażi: inibizzjoni tat-tkabbir taċ-ċelloli (ara Appendiċi 2 għall-formula). Ċitotossiċità: effetti ta’ ħsara għall-istruttura jew għall-funzjoni taċ-ċelloli, li fl-aħħar mill-aħħar jikkawżaw il-mewta taċ-ċelloli. Ġenotossiċità: terminu ġenerali li jinkludi kull tip ta’ ħsara fid-DNA jew kromożoma, inkluż ksur, riarranġamenti tal-adduttorji, mutazzjonijiet, aberrazzjonijiet tal-kromożomi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta’ effetti ġenotossiċi jirriżultaw f’mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromożomi stabbli. Ċelloli interfażi: ċelloli li mhumiex fil-fażi mitotika. Kinetochore: struttura li fiha l-proteini li tingħaqad fiċ-ċentromer ta’ kromożoma fejn il-fibri ‘spindle’ jassoċjaw waqt id-diviżjoni taċ-ċelloli, u dan jippermetti moviment ordnat tal-kromożomi li jfaqqsu (daughter chromosomes) għall-poli taċ-ċelloli li jfaqqsu (daughter cells). Mikronuklei: nuklei żgħar, separati minn u addizzjonali għan-nuklei prinċipali ta’ ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta’ mitożi jew mejożi permezz frammenti ta’ kromożomi li jibqa’ jew kromożomi sħaħ. Mitożi: diviżjoni tan-nukleu taċ-ċelloli li normalment jinqasam f’profażi, prometafażi, metafażi, anafażi u telofażi. Indiċi mitotiku: il-proporzjon ta’ ċelloli fil-metafażi diviżi bl-għadd totali ta’ ċelloli osservati f’popolazzjoni ta’ ċelloli; indikazzjoni tal-ammont ta’ proliferazzjoni ta’ ċelloli ta’ dik il-popolazzjoni. Mutaġeniku: jipproduċi bidla ereditarja ta’ sekwenza(i) tal-pari tal-bażi tad-DNA f’ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet tal-kromożomi). Nondisġunzjoni: nuqqas min-naħa tal-kromatidi f’pari milli jinfirdu u jissegregaw ruħhom sew sabiex jiżviluppaw ċelloli żgħar, u dan jirriżulta f’ċelloli żgħar b’għadd anormali ta’ kromożomi. Poliplojdija: aberrazzjonijiet numeriċi tal-kromożomi f’ċelloli jew organiżmi li jinvolvu sett(ijiet) sħiħ(sħaħ) ta’ kromożomi, meta mqabbla mal-kromożomu jew kromożomi individwali (anewplojdija). Indiċi ta’ Proliferazzjoni (PI): metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax cytoB (ara Appendiċi 2 għall-formula). Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (Relative Increase in Cell Count — RICC): metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax cytoB (ara Appendiċi 2 għall-formula). Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (Relative Population Doubling — RPD): metodu għall-kejl taċ-ċitotossiċità meta ma tintużax cytoB (ara Appendiċi 2 għall-formula). Indiċi tar-Replikazzjoni (RI): il-proporzjon taċ-ċikli tad-diviżjoni taċ-ċelloli mwettqa f’kultura ttrattata, fir-rigward tal-kontroll mhux trattat, matul il-perjodu ta’ esponiment u l-irkupru (ara Appendiċi 2 għall-formula). Sustanza kimika tat-test (li ssir referenza għaliha wkoll bħala s-sustanza tat-test): Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata billi jintuża dan it-TM. Appendiċi 2 Formoli għal valutazzjoni taċ-ċitotossiċità 1. Meta tintuża cytoB, l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità għandha tkun ibbażata fuq l-Indiċi ta’ Profilerazzjoni Blokk taċ-Ċitokineżi (Cytokinesis-Block Proliferation Index — CBPI) jew l-Indiċi Replikattiv (Replicative Index — RI) (16) (58). Is-CBPI jindika l-għadd medju ta’ ċikli taċ-ċelloli għal kull ċellola matul il-perjodu ta’ esponiment għal cytoB, u jista’ jintuża biex jikkalkula l-proliferazzjoni taċ-ċelloli. L-RI jindika l-għadd relattiv ta’ nuklei fil-kulturi ttrattati meta mqabbel mal-kulturi ta’ kontroll u jista’ jintuża biex jikkalkula l-% taċ-ċitostażi: % ta’ Ċitostażi = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} U: T = kultura tat-trattament kimiku bi prova C = kultura ta’ kontroll tal-mezz Meta: Għaldaqstant, CBPI ta’ 1 (iċ-ċelloli kollha huma mononukleati) huwa ekwivalenti għal ċitostażi ta’ 100 %. Ċitostażi = 100 – RI T = kulturi ttrattati C = kulturi ta’ kontroll 2. B’hekk, RI ta’ 53 % ifisser li, meta mqabbel mal-għadd ta’ ċelloli li jkunu nqasmu biex jiffurmaw ċelloli binukleati u multinukleati fil-kultura ta’ kontroll, 53 % biss ta’ dan l-għadd ġew diviżi fil-kultura trattata, jiġifieri ċitostażi ta’ 47 %. 3. Meta ma tintużax cytoB, hija rrakkomandata evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità fuq il-bażi taż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (Relative Increase in Cell Counts — RICC) jew fuq l-Irduppjar tal-Popolazzjoni Relattiva (Relative Population Doubling — RPD) (58), minħabba li t-tnejn iqisu l-proporzjon tal-popolazzjoni taċ-ċelloli li tkun iddividiet ruħha. fejn: Irduppjar tal-popolazzjoni = [log (Numru ta’ ċelloli wara t-trattament ÷ Numru ta’ ċelloli inizjali)] ÷ log 2 4. B’hekk, RICC, jew RPD ta’ 53 % jindika 47 % ċitotossiċità/ċitostażi. 5. Billi jintuża Indiċi ta’ Proliferazzjoni (Proliferation Index — PI), iċ-ċitotossiċità tista’ tiġi vvalutata pemrezz tal-għadd (scoring) tan-numru ta’ kloni li jikkonsistu f’ċellola 1 (cl1), 2 ċelloli (cl2), 3 sa 4 ċelloli (cl4) u 5 sa 8 ċelloli (cl8) 6. Il-PI ntuża bħala parametru siewi u affidabbli taċ-ċitotossiċità wkoll għal linji ta’ ċelloli kkulturati in situ fin-nuqqas ta’ cytoB (25) (26) (27) (28). Appendiċi 3 Sustanzi kimiċi ta’ referenza rrakkomandati għall-valutazzjoni tal-prestazzjoni (14) Kategorija Sustanza Kimika Nru tal-CAS Nru tal-KE 1. Klastoġeni attivi mingħajr attivazzjoni metabolika Ċitosina arabinosida 147-94-4 205-705-9 Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 2. Klastoġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika Benżo(a)piren 50-32-8 200-028-5 Ċiklofosfammid 50-18-0 200-015-4 3. Anewġeni Kolkiċina 64-86-8 200-598-5 Vinblastina 143–67-9 205-606-0 4. Sustanzi negattivi Di-(2-etileżil)ftalat 117-81-7 204-211-0 Aċidu nalidissiku 389-08-2 206-864-7 Piren 129-00-0 204-927-3 Klorur tas-sodju 7647-14-5 231-598-3 B.50. SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA: ANALIŻI TAN-NODI TAL-LIMFA LOKALI: DA INTRODUZZJONI 1. Il-Linji gwida tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi u l-Metodi ta’ Ttestjar tal-UE bbażati fuqhom jiġu analizzati minn żmien għal żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu, u konsiderazzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali. L-ewwel Metodu tat-Test (TM) (B.42) għad-determinazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda fil-ġurdien, l-Analiżi tan-Nodi tal-Limfa Lokali (Local Lymph Node Assay — LLNA; Linja gwida 429 tat-Test tal-OECD) ġie rivedut (1). Id-dettalji tal-validazzjoni tal-LLNA u analiżi tax-xogħol assoċjat ġew ippubblikati (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Fl-LLNA, tintuża t-timidina jew jojdu radjoisotopiku biex titkejjel il-proliferazzjoni tal-limfoċiti u għaldaqstant, l-analiżi għandha użu limitat fejn l-akkwiżizzjoni, l-użu jew l-eliminazzjoni tar-radjuattività huma problematiċi. L-LLNA: DA (żviluppat minn Daicel Chemical Industries, Ltd.) huwa modifikazzjoni mhux radjuattiva għal-LLNA, li tikkwantifika l-kontenut tat-trifosfat tal-adenożina (adenosine triphosphate, ATP) permezz ta’ bijoluminexxenza bħala indikatur tal-proliferazzjoni tal-limfoċiti. Il-metodu ta’ ttestjar LLNA: DA ġie vvalidat u analizzat u rakkomandat minn panil internazzjonali ta’ analiżi minn pari bħala utli għall-identifikazzjoni ta’ sustanzi kimiċi sensitizzanti u mhux sensitizzanti, b'ċerti limitazzjonijiet (10) (11) (12) (13). Dan it-TM huwa mfassal għall-valutazzjoni tal-potenzjal tas-sustanzi kimiċi li jikkawżaw sensitizzazzjoni tal-ġilda (sustanzi u taħlitiet) fl-annimali. Kapitolu B.6 ta’ dan l-Anness u Linja Gwida 406 tat-Test OECD jużaw fniek tal-Indi, b'mod partikolari t-test ta’ massimizzazzjoni tal-fniek tal-Indi u t-test Buehler (14). L-LLNA (Kapitolu B.42 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 429 tat-Test OECD) u ż-żewġ modifikazzjonijiet mhux radjuattivi, LLNA: DA (Kapitolu B.50 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 442 A tat-Test OECD) u LLNA: BrdU-ELISA (Kapitolu B.51 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 442 B tat-Test OECD), kollha jipprovdu vantaġġ fuq it-testijiet tal-fniek tal-Indi f'B.6 u fil-Linja Gwida 406 tat-Test OECD (14) f'termini ta’ tnaqqis u rfinar tal-użu tal-annimali. 2. B'mod simili għal-LLNA, l-LLNA: DA tistudja l-fażi ta’ induzzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda u tipprovdi dejta kwantitattiva adattata għall-valutazzjoni tad-doża u r-reazzjoni. Barra minn hekk, abilità li jinkixfu sensitizzaturi tal-ġilda mingħajr il-ħtieġa li tintuża radjutikketta għad-DNA telimina l-potenzjal għal esponiment fuq il-post tax-xogħol għal kwistjonijiet ta’ radjuattività u ta’ rimi ta’ skart. Min-naħa tiegħu, dan jista' jippermetti għall-użu miżjud ta’ ġrieden għall-individwazzjoni ta’ sensitizzaturi tal-ġilda, li jnaqqas ulterjorment l-użu tal-fniek tal-Indi għal testijiet għal potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda (jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-Test OECD) (14). DEFINIZZJONIJIET 3. Definizzjonijiet użati huma pprovduti f'Appendiċi 1. KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET 4. L-LLNA: DA huwa metodu tal-LLNA modifikat għall-identifikazzjoni tal-potenzjal ta’ sustanzi kimiċi li jikkawżaw sensitizzazzjoni fil-ġilda, b'limitazzjonijiet speċifiċi. Dan mhux neċessarjament jimplika li fil-każijiet kollha, l-LLNA: DA għandha tintuża minflok it-testijiet fuq il-fniek tal-Indi (jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-test OECD) (14), iżda pjuttost li l-analiżi għandha l-istess mertu u tista' tintuża bħala alternattiva li fiha r-riżultati pożittivi u negattivi ġeneralment ma jkunux jeħtieġu aktar konferma (10) (11). Il-laboratorju tal-ittestjar għandu jikkunsidra l-informazzjoni disponibbli kollha fuq is-sustanza tat-test qabel iwettaq l-istudju. Din l-informazzjoni għandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza tat-test; il-karatteristiċi fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta’ kwalunkwe test ta’ tossiċità in vitro jew in vivo fuq is-sustanza tat-test; u dejta tossikoloġika dwar sustanzi kimiċi strutturalment relatati. Din l-informazzjoni għandha titqies sabiex wieħed jiddetermina jekk l-LLNA: DA huwiex adattat għas-sustanza (minħabba n-nuqqas ta’ kompatibbiltà ta’ tipi limitati ta’ sustanzi kimiċi mal-LLNA: DA [ara paragrafu 5]) u sabiex tgħin fl-għażla tad-doża. 5. L-LLNA: DA huwa metodu in vivo u, b'konsegwenza ta’ dan, ma jeliminax l-użu tal-annimali fil-valutazzjoni ta’ attività ta’ sensitizzazzjoni ta’ kuntatt allerġiku. Huwa għandu, madankollu, il-potenzjal li jnaqqas l-għadd ta’ annimali meħtieġa għal dan il-għan meta mqabbel mat-testijiet fuq il-fniek tal-Indi (B.6; Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD) (14). Barra minn hekk, l-LLNA: DA toffri rfinar sostanzjali (inqas uġigħ u dwejjaq) fil-mod kif l-annimali jintużaw għal provi ta’ sensitizzazzjoni ta’ kuntatt allerġiku, minħabba li b'differenza mill-B.6 u mil-Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD, l-LLNA: DA ma jeħtieġx li reazzjonijiet ta’ sensittività eċċessiva dermali indotti mill-isfida jiġu indikati. Minkejja l-vantaġġi tal-LLNA: DA fuq B.6 u l-Linja Gwida 406 tat-Test OECD (14), hemm xi limitazzjonijiet li jistgħu jeħtieġu l-użu ta’ B.6 u l-Linja Gwida 406 tat-Test OECD (eż. l-ittestjar ta’ ċerti metalli, sejbiet pożittivi foloz b'ċerti irritanti tal-ġilda [bħal xi sustanzi tat-tip tensjoattivi] (6) (1 u l-Kapitolu B.42 f'dan l-Anness), solubilità tas-sustanza tat-test). Barra minn hekk, il-klassijiet ta’ sustanzi kimiċi jew sustanzi li fihom gruppi funzjonali li ntwerew li jaġixxu bħala konfondituri potenzjali (16) jistgħu jeħtieġu l-użu ta’ testijiet fuq il-fniek tal-Indi (jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-Test OECD (14)). Limitazzjonijiet li ġew identifikati għal-LLNA (1, u Kapitolu B.42 f'dan l-Anness) ġew rakkomandati sabiex japplikaw ukoll għal-LLNA: DA (10). Barra minn hekk, l-użu tal-LLNA: DA ma jkunx xieraq għal sustanzi ta’ ttestjar li jaffettwaw il-livelli tal-ATP (eż. sustanzi li jiffunzjonaw bħala inibituri tal-ATP) jew dawk li jaffettwaw il-kejl preċiż ta’ ATP intraċellolari (eż. il-preżenza ta’ enzimi ta’ degradazzjoni tal-ATP, il-preżenza ta’ ATP ekstraċellolari fin-nodi tal-limfa). Minbarra dawn il-limitazzjonijiet identifikati, l-LLNA: DA għandu jkun applikabbli għall-ittestjar ta’ kwalunkwe sustanza diment li ma jkunx hemm karatteristiċi assoċjati ma’ dawn is-sustanzi li jistgħu jinterferixxu mal-eżattezza tal-LLNA: DA. Barra minn hekk, għandha tingħata konsiderazzjoni għall-possibilità ta’ riżulatati pożittivi tal-limitu meta jinkisbu valuri ta’ Indiċi ta’ Stimulazzjoni (SI) ta’ bejn 1,8 u 2,5 (ara l-paragrafi 31-32). Dan huwa bbażat fuq il-bażi ta’ dejta ta’ validazzjoni ta’ 44 sustanza li jużaw SI ≥ 1,8 (ara paragrafu 6) li għalihom, l-LLNA: DA identifika b'mod korrett it-32 sensitizzatur tal-LLNA, iżda b'mod inkorrett identifika tlieta minn 12-il nonsensitizzaturi tal-LLNA b'valuri tal-SI ta’ bejn 1,8 u 2,5 (jiġifieri linja tal-limitu pożittiva) (10). Madankollu, minħabba li l-istess sett ta’ dejta ntuża għall-issettjar tal-valuri SI u għall-kalkolu tal-karatteristiċi ta’ tbassir tat-test, ir-riżultati ddikjarati jistgħu jkunu stima eċċessiva tal-karatteristiċi ta’ tbassir reali. PRINĊIPJU TA' DAN IL-METODU TA' TTESTJAR 6. Il-prinċipju bażiku wara l-LLNA: DA huwa li s-sensitizzaturi jikkawżaw il-proliferazzjoni ta’ limfoċiti fin-noduli tal-limfa li jsaffu s-sit tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Din il-proliferazzjoni hija proporzjonata mad-doża u mal-qawwa tal-allerġen applikat u tipprovdi mezz sempliċi ta’ kif wieħed jikseb kejl kwantitattiv ta’ sensitizzazzjoni. Il-proliferazzjoni titkejjel billi wieħed iqabbel il-proliferazzjoni medja f'kull grupp tat-test mal-proliferazzjoni medja fil-grupp ta’ kontroll ittrattati bil-mezzi (VC). Il-proporzjon tal-proliferazzjoni medja f'kull grupp ittrattat ma’ dak fil-grupp VC simultanju, imsejjaħ l-SI, jiġi stabbilit, u għandu jkun ≥ 1,8 qabel ma tkun meħtieġa evalwazzjoni ulterjuri tas-sustanza tat-test bħala sensitizzatur potenzjali tal-ġilda. Il-proċeduri deskritti hawnhekk huma bbażati fuq l-użu tal-kejl tal-kontenut ta’ ATP b'bijoluminexxenza (magħrufa li tikkorrelata mal-għadd ta’ ċelloli ħajjin) (17) sabiex jiġi indikat għadd miżjud ta’ ċelloli ta’ proliferazzjoni fin-nodi tal-limfa awrikulari li jnixxu (18) (19). Il-metodu bijoluminexxenti juża l-enzima luċiferażi biex jikkatalizza l-formazzjoni tad-dawl minn ATP u luċiferin skont ir-reazzjoni li ġejja: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Dawl L-intensità tad-dawl emess hija relatata b'mod lineari mal-konċentrazzjoni tal-ATP u hija mkejla permezz ta’ luminometru. L-analiżi ta’ luċiferin-luċiferażi hija metodu sensittiv għall-kwantifikazzjoni tal-ATP użata f'firxa wiesgħa ta’ applikazzjonijiet (20). DESKRIZZJONI TAL-ANALIŻI Għażla tal-ispeċi tal-annimali 7. Il-ġurdien huwa l-ispeċi tal-għażla għal dan it-test. Studji ta’ validazzjoni għal-LLNA: DA twettqu esklussivament bir-razza CBA/J li għaldaqstant hija kkunsidrata r-razza ppreferuta (12) (13). Jintużaw ġrieden nisa adulti żgħar, li huma nulliparużi u mhumiex tqal. Fil-bidu tal-istudju, l-annimali għandu jkollhom bejn 8 ġimgaħt u 12-il ġimgħa, u l-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx l-20 % tal-piż medju. Inkella, jistgħu jintużaw razez oħrajn u ġrieden irġiel meta tkun iġġenerata biżżejjed dejta li turi li ma jeżistux differenzi sinifikanti speċifiċi għar-razez u/jew għas-sess fir-reazzjoni għal-LLNA: DA. Kundizzjoinijiet ta’ fejn jinżammu u x'jieklu 8. Il-ġrieden għandhom jinżammu fi gruppi (21), sakemm ma tingħatax loġika xjentifika adegwata għat-tqegħid tal-ġrieden f'gaġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta’ 22 ± 3 °C. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-inqas 30 % u preferibbilment ma taqbiżx is-70 %, għajr waqt it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, u s-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista mingħajr limitu ta’ ilma tax-xorb. It-tħejjija tal-annimali 9. L-annimali għandhom jintgħażlu b'mod aleatorju, immarkati sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati individwalment (iżda mingħajr l-ebda forma ta’ mmarkar fil-widnejn), u miżmuma fil-gaġeġ tagħhom għal mill-inqas ħamest ijiem qabel ma jibda d-dożar sabiex ikunu jistgħu jidraw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel il-bidu tat-trattament, l-annimali kollha jiġu eżaminati sabiex ikun żgurat li huma ma jkollhom l-ebda feriti osservabbli fuq il-ġilda. It-tħejjija tas-soluzzjonijiet għad-dożar 10. Is-sustanzi kimiċi solidi għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi/mezzi u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel l-applikazzjoni fuq il-widna tal-ġrieden. Is-sustanzi kimiċi likwidi jistgħu jiġu applikati waħedhom jew dilwiti qabel id-dożar. Is-sustanzi kimiċi li ma jinħallux, bħal dawk li naraw ġeneralment fl-apparat mediku, għandhom ikunu soġġetti għal estrazzjoni eżaġerata f'solvent adattat sabiex jiżvelaw il-kostitwenti kollha li jistgħu jiġu estratti għall-ittestjar qabel jiġu applikati fuq il-widna tal-ġrieden. Is-sustanzi tat-test għandhom jitħejjew kuljum sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix li jistgħu jinħażnu. Il-verifika tal-affidabbiltà 11. Sustanzi kimiċi ta’ kontroll pożittiv (PC) jintużaw sabiex tintwera prestazzjoni xierqa tal-analiżi billi jirreaġixxu b'sensittività adegwata u riproduċibbli għal sustanza tat-test sensitizzanti li għaliha l-kobor tar-reazzjoni huwa kkaratterizzat sew. L-inklużjoni ta’ PC simultanju hija rrakkomandata għaliex din turi l-kompetenza tal-laboratorju biex iwettaq b'suċċess kull analiżi u tippermetti l-valutazzjoni u t-tqabbil tar-riproduċibbiltà fil-laboratorju u bejn il-laboratorji. Xi awtoritajiet regolatorji jeħtieġu wkoll PC għal kull studju u għaldaqstant, l-utenti huma mħeġġa jikkonsultaw mal-awtoritajiet rilevanti qabel iwettqu l-LLNA: DA. Għalhekk, l-użu ta’ rutina ta’ PC simultanju huwa rrakkomandat sabiex tiġi evitata l-ħtieġa ta’ aktar ittestjar fuq l-annimali sabiex jintlaħqu tali rekwiżiti li jistgħu jinħolqu mill-użu ta’ PC perjodiku (ara l-paragrafu 12). Il-PC għandha tipproduċi reazzjoni tal-LLNA: DA pożittiva f'livell ta’ esponiment li mistenni jagħti żieda fl-SI > 1,8 fuq il-grupp ta’ kontroll negattiv (NC). Id-doża tal-PC għandha tintgħażel b'mod li ma tikkawżax irritazzjoni eċċessiva fil-ġilda jew tossiċità sistemika u l-induzzjoni hija riproduċibbli iżda mhux eċċessiva (jiġifieri SI > 10 ikun jitqies eċċessiv). PC ippreferuti huma 25 % eżil ċinnamaldeid (Numru tal-Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) u 25 % ewġenol (numru tal-CAS 97-53-0,) fl-aċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v). Jista' jkun hemm ċirkostanzi fejn, minħabba ġustifikazzjoni adegwata, jistgħu jintużaw PCs oħrajn, li jissodisfaw il-kriterji ta’ hawn fuq. 12. Filwaqt li l-inklużjoni ta’ grupp ta’ PC simultanju hija rrakkomandata, jista' jkun hemm sitwazzjonijiet fejn l-ittestjar perjodiku (jiġifieri f'intervalli ≤ 6 xhur) tal-PC jista' jkun adegwat għal-laboratorji li jagħmlu l-LLNA: DA b'mod regolari (jiġifieri jagħmlu l-LLNA: DA fi frekwenza ta’ mhux inqas minn darba fix-xahar) u għandhom bażi tad-dejta ta’ PC storika stabbilita li turi l-kapaċità tal-laboratorju biex jikseb riżultati riproduċibbli u eżatti b'PCs. Profiċjenza adegwata bl-LLNA: DA tista' tintwera b'suċċess billi jiġu ġġenerati riżultati pożittivi konsistenti bil-PC f'mill-inqas 10 testijiet indipendenti li jsiru f'perjodu ta’ żmien raġonevoli (jiġifieri inqas minn sena waħda). 13. Grupp ta’ PC simultanju għandu dejjem ikun inkluż meta jkun hemm bidla fil-proċedura tal-LLNA: DA (eż. bidla fil-persunal imħarreġ, bidla fil-materjali tal-metodu tat-test u/jew fir-reaġenti, bidla fit-tagħmir tal-metodu tat-test, bidla fis-sors tal-annimali tat-test), u dawn il-bidliet għandhom jiġu ddokumentati fir-rapporti tal-laboratorju. Għandu jiġi kkunsidrat l-impatt ta’ dawn il-bidliet fuq l-adegwatezza tal-bażi tad-dejta storika stabbilita qabel ma tiġi deċiża l-ħtieġa li tkun stabbilita bażi tad-dejta storika ġdida sabiex tiddokumenta l-konsistenza fir-riżultati tal-PC. 14. Ir-riċerkaturi għandhom ikunu konxji li d-deċiżjoni li jsir studju tal-PC fuq bażi perjodika minflok fl-istess ħin għandha konsegwenzi fuq l-adegwatezza u l-aċċettabbiltà tar-riżultati negattivi ta’ studju ġġenerati mingħajr PC simultanju waqt l-intervall bejn kull studju tal-PC perjodiku. Pereżempju, jekk jinkiseb riżultat negattiv falz fl-istudju tal-PC perjodiku, ir-riżultati negattivi tas-sustanza tat-test miksuba fl-intervall bejn l-aħħar studju tal-PC perjodika aċċettabbli u l-istudju tal-PC perjodika mhux aċċettabbli jistgħu jkunu dubjużi. L-implikazzjonijiet ta’ dawn l-eżiti għandhom ikunu kkunsidrati b'attenzjoni meta jkun deċiż jekk għandhomx ikunu inklużi PCs simultanji jew li jsiru biss PCs perjodiċi. Għandu jiġi kkunsidrat ukoll l-użu ta’ inqas annimali fil-grupp ta’ PC simultanju meta dan ikun iġġustifikat xjentifikament u jekk il-laboratorju juri, fuq dejta storika speċifika għal-laboratorju, li jistgħu jintużaw inqas ġrieden (22). 15. Għalkemm il-PC għandu jiġi ttestjat f'mezz li huwa magħruf li jeliċita reazzjoni konsistenti (eż. l-aċetun: żejt taż-żebbuġa; 4:1, v/v), jista' jkun hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom it-testijiet b'mezz mhux regolari (formulazzjoni klinika/kimikament rilevanti) ikunu meħtieġa wkoll (23). Jekk il-PC simultanju jiġi ttestjat f'mezz differenti mis-sustanza tat-test, allura għandu jiġi inkluż VC separat għall-PC simultanju. 16. F'każijiet fejn ikunu qegħdin jiġu vvalutati sustanzi tat-test ta’ klassi speċifika ta’ sustanzi kimiċi jew firxa ta’ reazzjonijiet, is-sustanzi ta’ referenza jistgħu jkunu utli wkoll sabiex juru li l-metodu ta’ ttestjar qed jaħdem sew sabiex jinstab il-potenzjal tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda ta’ dawn it-tipi ta’ sustanzi. Is-sustanzi ta’ referenza adattati għandu jkollhom il-karatteristiċi li ġejjin: — xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta’ sustanzi tat-test li qegħdin jiġu ttestjati, — karatteristiċi fiżiċi/kimiċi magħrufa, — dejta ta’ appoġġ mil-LLNA: DA, — dejta ta’ appoġġ minn mudelli oħrajn ta’ annimali u/jew mill-bnedmin. IL-PROĊEDURA TAT-TEST Għadd ta’ annimali u livelli tad-doża 17. Għal kull grupp ta’ dożi għandhom jintużaw tal-inqas erba' annimali, b'minimu ta’ tliet konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma’ grupp ta’ NC simultanju ttrattat biss bil-mezz għas-sustanza tat-test, u PC (simultanja jew reċenti, ibbażata fuq il-politika tal-laboratorju fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11-15). Għandu jiġi kkunsidrat l-ittestjar ta’ dożi multipli tal-PC, b'mod speċjali meta wieħed jittestja l-PC fuq bażi intermittenti. Apparti n-nuqqas ta’ trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi ta’ kontroll għandhom jiġu mmaniġġjati u trattati b'mod identiku bħall-annimali fil-gruppi tat-trattament. 18. L-għażla tad-doża u tal-mezz għandha tkun ibbażata fuq ir-rakkomandazzjonijiet mogħtija fir-referenzi (2) u (24). Dożi konsekuttivi normalment jintgħażlu minn sensiela xierqa ta’ konċentrazzjonijiet bħal 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, eċċ. Loġika xjentifika adegwata għandha takkumpanja l-għażla tas-sensiela ta’ konċentrazzjonijiet użati. L-informazzjoni tossikoloġika kollha eżistenti (eż. tossiċità akuta u irritazzjoni fil-ġilda) u l-informazzjoni strutturali u fiżikokimika dwar is-sustanza tat-test ta’ interess (u/jew sustanzi relatati strutturalment) għandhom jiġu kkunsidrati meta jkunu disponibbli, fl-għażla tat-tliet konċentrazzjonijiet konsekuttivi biex b'hekk l-ogħla konċentrazzjoni timmassimizza l-esponiment filwaqt li tevita t-tossiċità sistemika u/jew l-irritazzjoni lokali eċċessiva fil-ġilda (24) (25). Fin-nuqqas ta’ informazzjoni bħal din, jista' jkun meħtieġ test inizjali qabel l-iskrinjar (ara l-paragrafi 21-24). 19. Il-mezz ma għandux jinterferixxi ma’ jew jinfluwenza r-riżultat tat-test u għandu jintgħażel fuq il-bażi tal-massimmizzazzjoni tas-solubbiltà sabiex tinkiseb l-ogħla konċentrazzjoni li tista' tinkiseb filwaqt li tiġi prodotta soluzzjoni/sospensjoni adattata għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-mezzi rakkomandati huma aċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v), N,N-dimetilformammid, metiletilketon, propilen glikol, u dimetilsulfossidu (6) iżda jistgħu jintużaw oħrajn jekk tingħata loġika xjentifika suffiċjenti. F'ċerti sitwazzjonijiet, jista' jkun meħtieġ li jsir użu minn solvent kimikament rilevanti jew mill-formulazzjoni kummerċjali li fiha s-sustanza tat-test hija kkummerċjalizzata bħala kontroll addizzjonali. Għandha tingħata attenzjoni partikolari sabiex ikun żgurat li s-sustanzi idrofiliċi jkunu inkorporati f'sistema ta’ mezzi, li xxarrab il-ġilda u ma ċċarċarx mal-ewwel, permezz tal-inkorporazzjoni ta’ sustanzi li jħollu xierqa (eż. 1 % Pluronic® L92). Għalhekk, mezzi likwidi għalkollox għandhom jiġu evitati. 20. L-ipproċessar ta’ noduli tal-limfa minn ġrieden individwali jippermetti l-valutazzjoni tal-varjabbiltà bejn l-annimali u tqabbil statistiku tad-differenza bejn is-sustanza tat-test u l-kejl tal-grupp VC (ara paragrafu 33). Barra minn hekk, il-valutazzjoni tal-possibbiltà li jitnaqqas l-għadd ta’ ġrieden fil-grupp PC hija fattibbli meta tinġabar dejta dwar annimali individwali (22). Barra minn hekk, ċerti awtoritajiet regolatorji jitolbu l-ġbir ta’ dejta dwar annimali individwali. Ġbir regolari ta’ dejta dwar annimali individwali jipprovdi vantaġġ mil-lat tal-benesseri tal-annimal billi jevita ttestjar doppju li jkun meħtieġ li kieku r-riżultati tas-sustanza tat-test li tkun inġabret oriġinarjament b'xi mod (eż. permezz ta’ dejta miġbura dwar l-annimali) kellhom jiġu kkunsidrati aktar tard mill-awtoritajiet regolatorji ma’ rekwiżiti oħrajn (eż. dejta individwali dwar l-annimali). Test ta’ qabel l-iskrinjar 21. Fin-nuqqas ta’ informazzjoni sabiex tkun stabbilita l-ogħla doża li għandha tiġi ttestjata (ara paragrafu 18), għandu jsir test ta’ qabel l-iskrinjar sabiex jiġi definit il-livell ta’ doża xierqa li għandha tiġi ttestjata fl-LLNA: DA. L-iskop tat-test ta’ qabel l-iskrinjar huwa li jipprovdi gwida għall-għażla tal-livell tad-doża massima li għandha tintuża fl-istudju ewlieni tal-LLNA: DA, meta l-informazzjoni dwar il-konċentrazzjoni li tikkawża tossiċità sistemika (ara paragrafu 24) u/jew irritazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda (ara paragrafu 23) ma tkunx disponibbli. Il-livell massimu tad-doża ttestjata għandu jkun 100 % tas-sustanza tat-test għal-likwidi jew il-konċentrazzjoni massima possibbli għas-solidi jew għas-sospensjonijiet. 22. It-test ta’ qabel l-iskrinjar isir taħt l-istess kundizzjonijiet tal-istudju ewlieni tal-LLNA: DA, ħlief għall-fatt li ma hemmx valutazzjoni tal-proliferazzjoni tan-noduli tal-limfa u li jistgħu jintużaw inqas annimali għal kull grupp ta’ doża. Huwa ssuġġerit li jintuża annimal wieħed jew tnejn għal kull grupp ta’ doża. Il-ġrieden kollha jiġu osservati kuljum għal kwalunkwe sinjal kliniku ta’ tossiċità sistemika jew irritazzjoni lokali fis-sit tal-applikazzjoni. Il-piżijiet tal-ġisem jiġu ddokumentati qabel it-test u wara li jintemm (Jum 8). Iż-żewġ widniet ta’ kull ġurdien jiġu osservati għall-eritema u jingħataw punteġġ skont it-Tabella 1 (25). Jittieħed il-kejl tal-ħxuna tal-widna permezz ta’ gejġ ta’ ħxuna (eż. mikrometru diġitali jew gejġ tal-ħxuna Peacock Dial) f'Jum 1 (qabel id-doża), f'Jum 3 (madwar 48 siegħa wara l-ewwel doża), f'Jum 7 (24 siegħa qabel it-tmiem) u f'Jum 8. Barra minn hekk, f'Jum 8, il-ħxuna tal-widna tista' tiġi stabbilita permezz ta’ determinazzjonijiet tal-piż bl-immarkar tal-widnejn, li għandu jsir wara li l-annimali jinqatlu b'mod uman. L-irritazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda hija indikata b'punteġġ ta’ eritema ≥ 3 u/jew ħxuna tal-widna ta’ ≥ 25 % fi kwalunkwe jum tal-kejl (26) (27). L-ogħla doża magħżula għall-istudju ewlieni tal-LLNA: DA tkun id-doża l-aktar baxxa li jmiss fis-sensiela ta’ konċentrazzjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar (ara paragrafu 18) li ma tikkawżax tossiċità sistemika u/jew irritazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda. Tabella 1 Punteġġi għall-Eritema Osservazzjoni Punteġġ L-ebda eritema 0 Ftit li xejn eritema (bil-kemm tidher) 1 Eritema definita sew 2 Eritema moderata sa severa 3 Eritema severa (ħmura qawwija) sa formazzjoni ta’ tessut oħxon u danneġġjat li jipprevjeni l-klassifikazzjoni tal-eritema 4 23. Minbarra żieda ta’ 25 % fil-ħxuna tal-widna (26) (27), intużat ukoll żieda statistikament sinifikanti fil-ħxuna tal-widna fil-ġrieden ittrattati meta mqabbla mal-ġrieden tal-kontroll sabiex jiġu identifikati sustanzi irritanti fl-LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Madankollu, għalkemm jistgħu jseħħu żidiet statistikament sinifikanti meta l-ħxuna tal-widna tkun inqas minn 25 % dawn ma ġewx assoċjati b'mod speċifiku ma’ irritazzjoni eċċessiva (67) (31) (69) (70) (71). 24. L-osservazzjonijiet kliniċi li ġejjin jistgħu jindikaw tossiċità sistemika (35) meta jintużaw bħala parti minn valutazzjoni integrata u għalhekk jistgħu jindikaw il-livell massimu tad-doża li għandha tintuża fl-LLNA: DA ewlenija: bidliet fil-funzjoni tas-sistema nervuża (eż. pil wieqaf, atassja, rogħda, u konvulżjonijiet); bidliet fl-imġiba (eż. aggressività, bidla fl-attività tal-indafa, bidla sinifikanti fil-livell ta’ attività); bidliet fit-tendenzi respiratorji (jiġifieri bidliet fil-frekwenza u fl-intensità tan-nifs bħal dispneja, nifs maqtugħ, u ħsejjes mill-pulmun (rales)), u bidliet fil-konsum tal-ikel u tal-ilma. Barra minn hekk, sinjali ta’ letarġija u/jew nuqqas ta’ reazzjoni u kull sinjal kliniku ieħor ta’ aktar minn uġigħ jew tbatija żgħira jew momentanja, jew tnaqqis ta’ > 5 % fil-piż tal-ġisem minn Jum 1 sa Jum 8 u mortalità, għandhom jiġu kkunsidrati fl-evalwazzjoni. Annimali moribondi jew annimali li juru sinjali ta’ uġigħ jew dieqa severa għandhom jinqatlu b'mod uman (36). Skeda sperimentali tal-istudju ewlieni 25. L-iskeda sperimentali tal-analiżi hija kif ġej: — Jum 1: Identifika individwalment u ħu nota tal-piż ta’ kull annimal u ta’ kwalunkwe osservazzjoni klinika. Applika soluzzjoni milwiema ta’ 1 % sodju lauril sulfat (SLS) fuq il-parti ta’ wara ta’ kull widna billi tuża pinzell imbill fis-soluzzjoni ta’ SLS sabiex tkopri d-dorsum ta’ kull widna b'erba' jew ħames pinzellati. Siegħa wara t-trattament bl-SLS, applika 25 μL tad-dilwizzjoni xierqa tas-sustanza tat-test, il-mezz waħdu, jew il-PC (simultanja jew reċenti, skont il-politika tal-laboratorju fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11–15), fuq in-naħa ta’ wara ta’ kull widna. — Jiem 2, 3 u 7: Irrepeti l-proċedura ta’ applikazzjoni ta’ qabel it-trattament bis-sustanza milwiema ta’ 1 % SLS u tas-sustanza tat-test imwettqa f'Jum 1. — Jiem 4, 5 u 6: L-ebda trattament. — Jum 8: Ħu nota tal-piż ta’ kull annimal u ta’ kwalunkwe osservazzjoni klinika. Bejn wieħed u ieħor 24 sa 30 siegħa wara l-bidu tal-applikazzjoni f'Jum 7, oqtol l-annimali b'mod uman. Aqta' barra n-nodi limfatiċi awrikulari li jkunu qed inixxu minn kull widna tal-ġurdien u pproċessa separatament f'soluzzjoni ta’ ilma bil-melħ ibbaferjata bil-fosfat (PBS) għal kull annimal. Id-dettalji u d-dijagrammi tal-identifikazzjoni u d-dissezzjoni tan-noduli limfatiċi tinsab fir-referenza (22). Sabiex tkompli tissorvelja r-reazzjoni lokali tal-ġilda fl-istudju ewlieni, jistgħu jiġu inklużi parametri oħrajn bħall-għoti ta’ punti għall-eritema fil-widna jew il-kejl tal-ħxuna tal-widna (miksuba kemm permezz ta’ gejġ tal-ħxuna, kif ukoll permezz tad-determinazzjonijiet tal-piżijiet bl-immarkar tal-widna fl-awtopsja) fil-protokoll tal-istudju. It-tħejjija tas-sospensjonijiet taċ-ċelloli 26. Minn kull ġurdien, titħejja sospensjoni ta’ ċellola singola ta’ ċelloli tan-nodi limfatiċi (LNC — lymph node cells) maqtugħin bilateralment billi n-nodi limfatiċi jitpoġġew mgħaffġin bejn żewġ slajds tal-ħġieġ u tiġi applikata pressjoni ħafifa sabiex in-nodi jitgħaffġu. Wara li jiġi kkonfermat li t-tessut infirex irqiq, irqiq, issepara ż-żewġ slajds minn ma’ xulxin. Issospendi t-tessut fuq iż-żewġ slajds fil-PBS billi żżomm kull slajd f'angolu fuq id-dixx Petri u filwaqt li tlaħlaħ b'PBS waqt li fl-istess ħin tqaxxar it-tessut mill-islajd bi scraper taċ-ċelloli. Barra minn hekk, in-nodi limfatiċi f'annimali NC huma żgħar, għalhekk operazzjoni attenta hija importanti sabiex ikun evitat kwalunkwe effett artifiċjali fuq il-valuri SI. Għandu jintuża volum total ta’ 1 mL PBS għat-tlaħliħ taż-żewġ slajds. Is-sospensjoni tal-LNC fid-dixx Petri għandha tiġi omoġenizzata kemmxejn bl-iscraper taċ-ċelloli. Imbagħad jinġabar alikwott ta’ 20 μL tas-sospensjoni tal-LNC b'mikropipetta, filwaqt li wieħed joqgħod attent li ma jiħux il-membrana li hija viżibbli għall-għajn, u sussegwentament jitħallat ma’ 1,98 mL tal-PBS biex jagħti kampjun ta’ 2 mL. Imbagħad jitħejja t-tieni kampjun ta’ 2 mL, billi tintuża l-istess proċedura sabiex jitħejjew żewġ kampjuni għal kull annimal. Determinazzjoni tal-proliferazzjoni ċellolari (kejl tal-kontenut tal-ATP tal-limfoċiti) 27. Żidiet fil-kontenut ta’ ATP fin-nodi limfatiċi jitkejlu bil-metodu luċiferin/luċiferażi li juża kit tal-kejl tal-ATP, li jkejjel il-bijoluminexxenza f'Unitajiet ta’ Luminexxenza Relattiva (Relative Luminescence Units — RLU). Il-ħin tal-analiżi mill-ħin tal-qatla tal-annimal sal-kejl tal-kontenut ta’ ATP għal kull annimal individwali għandu jinżamm uniformi, fi żmien bejn wieħed u ieħor 30 minuta minħabba li l-kontenut ta’ ATP huwa meqjus li gradwalment jonqos mal-ħin wara l-qatla tal-annimal (12). B'hekk, is-serje ta’ proċeduri mill-qtugħ tan-nodi limfatiċi awrikulari sal-kejl tal-ATP għandha titlesta fi żmien 20 minuta permezz tal-iskeda ta’ żmien predeterminata li hija l-istess għal kull annimal. Il-luminexxenza tal-ATP għandha titkejjel f'kull kampjun ta’ 2 mL sabiex jinġabar total ta’ żewġ kejlijiet ta’ ATP għal kull annimal. Il-luminexxenza tal-ATP medja tiġi mbagħad stabbilita u użata f'kalkoli sussegwenti (ara paragrafu 30). OSSERVAZZJONIJIET Osservazzjonijiet kliniċi 28. Kull ġurdien għandu jiġi osservat b'attenzjoni mill-inqas darba kuljum għal kwalunkwe sinjal kliniku, kemm ta’ irritazzjoni lokali fil-post tal-applikazzjoni jew ta’ tossiċità sistemika. L-osservazzjonijiet kollha jiġu rreġistrati b'mod sistematiku u jinżammu rekords għal kull ġurdien. Il-pjanijiet ta’ sorveljanza għandhom jinkludu kriterji sabiex jiġu identifikati mill-ewwel dawk il-ġrieden li juru tossiċità sistemika, irritazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda, jew tmermir tal-ġilda għall-ewtanażja (36). Piżijiet tal-ġisem 29. Kif iddikjarat fil-paragrafu 25, il-piżijiet tal-ġisem tal-annimali individwali għandhom jitkejlu fil-bidu tat-test u fil-qatla b'mod uman skedata. KALKOLU TAR-RIŻULTATI 30. Ir-riżultati għal kull grupp ta’ trattament huma espressi bħala l-SI medja. L-SI jinkiseb billi wieħed jiddividi l-RLU/ġurdien medju f'kull grupp tas-sustanza tat-test, u l-grupp tal-PC, bl-RLU/ġurdien medju għall-grupp tas-solvent/VC. L-SI medju għall-VCs imbagħad ikun wieħed. 31. Il-proċess tad-deċiżjoni jqis riżultat bħala pożittiv meta SI ≥ 1,8 (10). Madankollu, il-qawwa tar-relazzjoni tad-doża-reazzjoni, is-sinifikat statistiku u l-konsistenza tas-solvent/mezz u r-reazzjonijiet tal-PC jistgħu jintużaw ukoll sabiex wieħed jiddetermina jekk riżultat marġinali (jiġifieri valur SI bejn 1,8 u 2,5) jiġix iddikjarat pożittiv (2) (3) (37). 32. Għal rispons pożittiv marġinali bejn SI ta’ 1,8 u 2,5, l-utenti jistgħu jkunu jridu jikkunsidraw informazzjoni addizzjonali bħar-relazzjoni doża-reazzjoni, evidenza ta’ tossiċità sistemika jew irritazzjoni eċċessiva, u fejn xieraq, sinifikat statistiku flimkien ma’ valuri SI sabiex jiġi kkonfermat li tali riżultati huma pożittivi (10). Għandhom jiġu kkunsidrati d-diversi karatteristiċi tas-sustanza tat-test, inkluż jekk għandhiex relazzjoni strutturali ma’ sustanzi magħrufa li joħolqu sensititizzazzjoni fil-ġilda, jekk tikkawżax irritazzjoni eċċessiva fil-ġilda tal-ġurdien, u n-natura tar-relazzjoni bejn id-doża u r-reazzjoni osservata. Dawn u konsiderazzjonijiet oħrajn huma diskussi fid-dettall f'parti oħra (4). 33. Il-ġbir ta’ dejta fil-livell tal-ġurdien individwali jippermetti li ssir analiżi statistika għall-preżenza u l-grad ta’ relazzjoni bejn id-doża u r-reazzjoni fid-dejta. Kull valutazzjoni statistika tista' tinkludi valutazzjoni tar-relazzjoni bejn id-doża u r-reazzjoni kif ukoll tqabbil aġġustat kif xieraq tal-gruppi tat-test (eż. grupp iddożat f'pari kontra tqabbil ta’ kontroll ta’ solvent simultanju/VC simultanji). L-analiżijiet statistiċi jistgħu jinkludu, eż. regressjoni lineari jew it-test ta’ William għall-valutazzjoni tat-tendenzi tad-doża u tar-reazzjoni, u t-test ta’ Dunnett għal tqabbil tal-pari. Meta jagħżel metodu xieraq għall-analiżi statistika, ir-riċerkatur għandu jkun konxju mill-inugwaljanzi possibbli tad-differenzi u problemi oħrajn relatati li jistgħu jeħtieġu trasformazzjoni tad-dejta jew analiżi statistika mhux parametrika. Fi kwalunkwe każ, ir-riċerkatur jista' jeħtieġ li jagħmel kalkoli tal-SI u analiżijiet statistiċi bi jew mingħajr ċerti punti ta’ dejta (li xi drabi jissejħu ‘anomaliji’ (outliers)). DEJTA U RAPPURTAR Dejta 34. Id-dejta għandha tingħata fil-qosor f'għamla ta’ tabella li turi l-valuri tal-RLU tal-annimal individwali, l-RLU medju tal-grupp/annimal, it-terminu ta’ żball assoċjat tiegħu (eż. SD, SEM), u l-SI medju għal kull grupp ta’ dożi meta mqabbel mas-solvent/grupp ta’ kontroll tal-mezz simultanju. Rapport tat-test 35. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Sustanzi kimiċi tat-test u ta’ kontroll — dejta tal-identifikazzjoni (eż. in-numru tal-CAS u tal-KE, jekk disponibbli; is-sors; il-purità; l-impuritajiet magħrufa; in-numru tal-lott), — in-natura fiżika u l-karatteristiċi fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, stabbilità, solubilità), — jekk taħlita, il-kompożizzjoni u l-perċentwali relattivi tal-komponenti, Solvent/mezz — dejta tal-identifikazzjoni (purità; konċentrazzjoni, fejn xieraq; il-volum użat), — raġuni għall-għażla tal-mezz, Annimali tat-test — is-sors tal-ġrieden tas-CBA, — l-istatus mikrobijoloġiku tal-annimali, meta jkun magħruf, — l-għadd u l-età tal-annimali, — is-sors tal-annimali, il-kundizzjonijiet tal-gaġeġ, id-dieta, eċċ., Kondizzjonijiet tat-test, — is-sors, in-numru tal-lott u assigurazzjoni tal-kwalità tal-manifattur/dejta ta’ kontroll tal-kwalità għall-kit tal-ATP, — dettalji dwar it-tħejjija u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test, — raġuni għall-għażla tad-doża (inklużi riżultati mit-test ta’ qabel l-iskrinjar, jekk ikun sar), — il-konċentrazzjonijiet tal-mezz u tas-sustanza tat-test użati, u l-ammont totali tas-sustanza tat-test applikat, — dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inkluż it-tip/is-sors tad-dieta, is-sors tal-ilma), — dettalji dwar l-iskedi tat-trattament u tat-teħid ta’ kampjuni, — metodi ta’ kejl tat-tossiċità, — kriterji li ntużaw sabiex l-istudji jiġu kkunsidrati pożittivi jew negattivi, — dettalji dwar kwalunkwe devjazzjoni mill-protokoll u spjegazzjoni dwar kif id-devjazzjoni taffettwa d-disinn u r-riżultati tal-istudju, Verifika tal-affidabilità: — sommarju tar-riżultati tal-aħħar kontroll tal-affidabbiltà, inkluża informazzjoni dwar is-sustanza tat-test, il-konċentrazzjoni u l-mezz użati, — PC simultanju u/jew storiku u dwar dejta negattiva simultanja (solvent/mezz) għal-laboratorju li qed jagħmel it-test, — jekk ma kinitx inkluża PC simultanja, id-data u r-rapport tal-laboratorju għall-aktar PC perjodika reċenti u rapport li jagħti dettalji dwar id-dejta tal-PC storika għal-laboratorju li tiġġustifika l-bażi għaliex ma saritx PC simultanja, Ir-riżultati, — piżijiet individwali tal-ġrieden fil-bidu tad-dożar