(19)

Fil-Parti Ċ, jiżdiedu l-Kapitoli li ġejjin: “C.47 Test tat-Tossiċità fi Stadju Bikri tal-Ħajja tal-Ħut INTRODUZZJONI 1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 210 tal-OECD (2013). It-testijiet fl-istadji bikrija tal-ħajja tal-ħut huma maħsuba biex jiddefinixxu l-effetti letali u subletali tas-sustanzi kimiċi fuq l-istadji u l-ispeċijiet ittestjati. Huma jrendu informazzjoni ta' valur għall-istima tal-effetti letali u subletali kroniċi tas-sustanza kimika fuq speċijiet ta' ħut oħrajn. 2. Il-linja gwida tat-test 210 hija bbażata fuq proposta mir-Renju Unit li ġiet diskussa f'laqgħa ta' esperti tal-OECD li saret f'Medmenham (ir-Renju Unit) f'Novembru 1988 u li kompliet tiġi aġġornata fl-2013 sabiex tkun tirrifletti l-esperjenza fl-użu tat-test u r-rakkomandazzjonijiet minn sessjoni ta' ħidma tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità tal-ħut, li ġiet organizzata f'Settembru 2010 (1). IL-PRINĊIPJU TAT-TEST 3. L-istadji bikrija tal-ħajja tal-ħut huma esposti għal firxa ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test maħlula fl-ilma. Huma ppreferuti kundizzjonijiet bi fluss kontinwu; madankollu, jekk dawn ma jkunux possibbli, huma aċċettabbli wkoll kundizzjonijiet semistatiċi. Għad-dettalji, għandu jiġi kkonsultat id-dokument ta' gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2). It-test jinbeda billi l-bajd fertilizzat jitqiegħed f'kompartimenti tat-test u jitkompla għal perjodu ta' żmien speċifiku għall-ispeċi li huwa neċessarju sabiex il-ħut taħt kontroll jilħaq stadju bikri tal-ħajja. L-effetti letali u subletali jiġu vvalutati u mqabbla mal-valuri tal-kontroll sabiex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) jew (i) il-konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC) u/jew (ii) l-ECx (eż. EC10, EC20) permezz ta' mudell ta' rigressjoni sabiex tiġi stmata l-konċentrazzjoni li tikkawża bidla ta' x % fl-effett imkejjel. Ir-rappurtar tal-konċentrazzjonijiet tal-effett u l-parametri rilevanti jista' jiddependi fuq il-qafas regolatorju. Il-konċentrazzjonijiet tat-test għandhom jibbrakitjaw l-ECx biex b'hekk l-ECx toħroġ mill-interpolazzjoni aktar milli mill-estrapolazzjoni (ara l-Appendiċi 1 għad-definizzjonijiet). INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA KIMIKA TAT-TEST 4. Is-sustanza kimika tat-test tirreferi għal dak li qed jiġi ttestjat. Għandhom ikunu magħrufa s-solubbiltà fl-ilma (ara l-kapitolu A.6 ta' dan l-Anness) u l-pressjoni tal-fwar (ara l-kapitolu A.4 ta' dan l-Anness) tas-sustanza kimika tat-test u għandu jkun disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza kimika fis-soluzzjonijiet tat-test bi preċiżjoni u limitu ta' kwantifikazzjoni magħrufa u rrappurtati. Għalkemm mhuwiex neċessarju li jsir it-test, ir-riżultati minn test tat-tossiċità akuta (ara l-kapitoli C.1 jew C.49 ta' dan l-Anness), preferibbilment imwettaq bl-ispeċijiet magħżula għal dan it-test, jistgħu jipprovdu informazzjoni siewja. 5. Jekk il-metodu ta' ttestjar jintuża għall-ittestjar ta' taħlita, il-kompożizzjoni tagħha għandha tiġi kkaratterizzata kemm jista' jkun possibbli, pereżempju, mill-identità kimika tal-kostitwenti tagħha, l-okkorrenza kwantitattiva tagħhom u l-proprjetajiet speċifiċi għas-sustanzi tagħhom (bħal dawk imsemmija fuq). Qabel jintuża l-metodu ta' ttestjar għall-ittestjar regolatorju ta' taħlita, għandu jiġi kkunsidrat jekk dan huwiex ser jipprovdi riżultati aċċettabbli għall-iskop regolatorju maħsub. 6. L-informazzjoni siewja tinkludi l-formula strutturali, il-purità tas-sustanza, is-solubbiltà fl-ilma, l-istabilità fl-ilma u fid-dawl, il-pKa, il-Pow u r-riżultati ta' test għall-bijodegradabilità immedjata (pereżempju, il-kapitoli C.4 jew C.29 ta' dan l-Anness). IL-VALIDITÀ TAT-TEST 7. Sabiex test ikun validu japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin: — Il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt għandha tkun > 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja matul it-test; — it-temperatura tal-ilma ma għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1,5 °C bejn il-kompartimenti tat-test jew bejn il-jiem suċċessivi fi kwalunkwe ħin matul it-test u għandha tinżamm fi ħdan il-meded tat-temperaturi speċifikati għall-ispeċi tat-test (Appendiċi 2); — Il-kejl analitiku tal-konċentrazzjonijiet tat-test huwa obbligatorju. — is-sopravivenza ġenerali tal-bajd fertilizzat u s-suċċess fil-kontrolli wara t-tifqis u, fejn rilevanti, fil-kontrolli tas-solventi, għandhom ikunu akbar minn jew daqs il-limiti definiti fl-Appendiċi 2. 8. Jekk tiġi osservata devjazzjoni żgħira mill-kriterji tal-validità, għandhom jiġu kkunsidrati l-konsegwenzi b'rabta mal-affidabbiltà tad-dejta tat-test u dawn il-kunsiderazzjonijiet għandhom jiġu inklużi fir-rapport. L-effetti fuq is-sopravivenza, it-tifqis jew it-tkabbir li jseħħu fil-kontroll tas-solvent, meta mqabbel mal-kontroll negattiv, għandhom jiġu rrapportati u diskussi fil-kuntest tal-affidabbiltà tad-dejta tat-test. DESKRIZZJONI TAL-METODU Kompartimenti tat-test 9. Jistgħu jintużaw reċipjenti tal-ħġieġ, tal-azzar inossidabbli jew ta' kwalunkwe materjal kimikament inerti ieħor. Billi s-silikon huwa magħruf bħala li għandu kapaċità qawwija li jassorbi sustanzi lipofiliċi, l-użu ta' tubi tas-silikon fi studji bi fluss kontinwu u l-użu ta' siġilli tas-silikon f'kuntatt mal-ilma għandhom jitnaqqsu bl-użu ta', pereżempju, akkwarji ta' ħġieġ magħmul minn blokka waħda. Id-dimensjonijiet tar-reċipjenti għandhom ikunu kbar biżżejjed sabiex jippermettu tkabbir xieraq fil-kontroll, iż-żamma tal-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt (pereżempju, għall-ispeċijiet ta' ħut żgħir, din tista' tinkiseb b'tank b'volum ta' 7 litri) u l-konformità mal-kriterji tar-rata tat-tagħbija msemmija fil-paragrafu 19. Idealment, il-kompartimenti tat-test jitqiegħdu f'pożizzjoni għal għarrieda fiż-żona tat-test. Disinn bi blokki aleatorji b'kull trattament preżenti f'kull blokka huwa ppreferut minn disinn kompletament aleatorju. Il-kompartimenti tat-test għandhom ikunu protetti minn disturbanza mhux mixtieqa. Preferibbilment, is-sistema tat-test għandha tiġi kkondizzjonata bil-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test għal tul ta' żmien suffiċjenti sabiex ikunu jistgħu jintwerew konċentrazzjonijiet ta' esponiment stabbli qabel l-introduzzjoni tal-organiżmi tat-test. Għażla ta' speċijiet 10. L-ispeċijiet ta' ħut irrakkomandati huma mogħtija fit-Tabella 1. Dan ma jeskludix l-użu ta' speċijiet oħrajn, iżda jista' jkun li l-proċedura tat-test ikollha tiġi adatta sabiex tipprovdi kundizzjonijiet tat-test addattati. F'dan il-każ, ir-raġuni li tiġġustifika l-għażla tal-ispeċi u l-metodu sperimentali għandhom ikunu magħrufa. Iż-żamma tal-ħut riproduttiv 11. Id-dettalji dwar iż-żamma tal-istokk riproduttiv taħt kundizzjonijiet sodisfaċenti jistgħu jinstabu fl-Appendiċi 3 u fir-referenzi ċċitati (3)(4)(5). It-trattament tal-bajd iffertilizzat, tal-embrijuni u tal-larvi 12. Fil-bidu, il-bajd iffertilizzat, l-embrijuni u l-larvi jistgħu jiġu esposti f'reċipjenti iżgħar tal-ħġieġ jew tal-azzar inossidabbli fi ħdan ir-reċipjent ewlieni, mgħammrin bi xbieki fil-ġenb jew fit-truf biex ikun hemm fluss tas-soluzzjoni tat-test mir-reċipjent. Fluss kontinwu mhux turbolenti f'dawn ir-reċipjenti żgħar jista' jiġi indott billi jiġu sospiżi minn fergħa mqiegħda biex ir-reċipjent jiċċaqlaq 'il fuq u 'l isfel, iżda l-organiżmi għandhom dejjem jinżammu mgħaddsin. Il-bajd iffertilizzat ta' ħut salmonidu jista' jiġi sistemat fuq xkafef jew xbieki b'fetħiet kbar biżżejjed li jippermettu lil-larvi jgħaddu minnhom wara li jfaqqsu. 13. Meta jkunu intużaw kontenituri tal-bajd, grilji jew xbieki biex il-bajd jinżamm fir-reċipjent ewlieni tat-test, dawn ir-restrizzjonijiet għandhom jitneħħew wara li jfaqqsu l-larvi, skont il-gwida pprovduta fl-Appendiċi 3, ħlief li x-xbieki għandhom jinżammu biex jiġi evitat li l-larva taħrab. Jekk ikun hemm bżonn li jiġu ttrasferiti l-larvi, dawn ma għandhomx ikunu esposti għall-arja u ma għandhomx jintużaw xbieki biex il-larvi jinħelsu mill-kontenituri tal-bajd. It-twaqqit ta' dan it-trasferiment ivarja skont l-ispeċijiet u għandu jiġi ddokumentat fir-rapport. Madankollu, mhux dejjem ikun neċessarju li jsir trasferiment. Ilma 14. Kwalunkwe ilma li fih l-ispeċi tat-test juru sopravivenza u tkabbir adegwati fit-tul jista' jintuża bħala ilma tat-test (ara l-Appendiċi 4). Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-test. Sabiex jiġi żgurat li l-lima tad-dilwizzjoni mhuwiex ser ikollu influwenza żejda fuq ir-riżultat tat-test (pereżempju b'kumplessazzjoni tas-sustanza kimika tat-test) jew jaffettwa b'mod avvers il-prestazzjoni tal-istokk riproduttiv, għandhom jittieħdu kampjuni f'intervalli għal analiżi. Għandu jsir il-kejl tal-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), l-anjoni u l-katjoni kbar (eż. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2–), l-ammonja, il-pestiċidi klorini residwi totali, il-karbonju organiku totali u s-solidi sospiżi, pereżempju, fuq bażi biennali meta l-ilma tad-dilwizzjoni jkun magħruf li huwa relattivament kostanti fil-kwalità. Jekk l-ilma jkun magħruf li huwa ta' kwalità varjabbli, il-kejl għandu jsir aktar ta' spiss; il-frekwenza tiddependi fuq kemm il-kwalità tkun varjabbli. Fl-Appendiċi 4 jissemmew xi karatteristiċi kimiċi ta' ilma tad-dilwizzjoni aċċettabbli. Is-soluzzjonijiet tat-test 15. Għat-testijiet bi fluss kontinwu, hija meħtieġa sistema li tiddistribwixxi u tiddilwixxi b'mod kontinwu soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test (pereżempju, pompa tal-kejl, dilwitur proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) sabiex twassal serje ta' konċentrazzjonijiet fil-kompartimenti tat-test. Ir-rati tal-fluss tas-soluzzjonijiet ewlenin u l-ilma tad-dilwizzjoni għandhom jiġu kkontrollati f'ċerti intervalli matul it-test u ma għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Instab li rata tal-fluss ekwivalenti għal mill-inqas ħames volumi tal-kompartimenti tat-test kull 24 siegħa hija xierqa (3). Madankollu, jekk ir-rata tat-tagħbija speċifikata fil-paragrafu 19 tiġi rrispettata, rata ta' fluss aktar baxxa ta', pereżempju, 2-3 volumi tal-kompartimenti tat-test tkun possibbli sabiex jiġi evitat li l-ikel jitneħħa malajr. 16. Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula jiġu preparati billi tiġi dilwita soluzzjoni ewlenija. Preferibbilment, is-soluzzjoni ewlenija għandha titħejja sempliċiment billi s-sustanza kimika tat-test titħallat jew tiġi aġitata f'ilma tad-dilwizzjoni bl-użu ta' mezzi mekkaniċi (eż. tħawwid u/jew ultrasonikazzjoni). Jistgħu jintużaw kolonni ta' saturazzjoni (kolonni tas-solubilità) jew metodi ta' dożaġġ passiv (6) sabiex tinkiseb soluzzjoni ewlenija kkonċentrata kif xieraq. L-użu ta' portatur ta' solvent mhuwiex rakkomandat. Madankollu, f'każ li jkun hemm bżonn ta' solvent, fl-istess ħin għandu jsir kontroll tas-solvent, fl-istess konċentrazzjoni tas-solvent bħat-trattamenti kimiċi; i.e. preferibbilment, il-livell tas-solvent għandu jkun ugwali fil-konċentrazzjonijiet kollha, kif ukoll fil-kontroll tas-solvent. Għal xi sistemi ta' dilwituri, dan jista' jkun teknikament diffiċli; hawnhekk, il-konċentrazzjoni tas-solvent fil-kontroll tas-solvent għandha tkun daqs l-ogħla konċentrazzjoni tas-solvent fil-grupp tat-trattament. Għal sustanzi li diffiċli jiġu ttestjati, għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 23 dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2). Jekk jintuża solvent, l-għażla tas-solvent tiġi ddeterminata mill-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza. Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 23 jirrakkomanda konċentrazzjoni massima ta' 100 μl/l. Sabiex jiġi evitat l-effett potenzjali tas-solvent fuq il-punti tat-tmiem imkejla (7), huwa rakkomandat li l-konċentrazzjoni tas-solvent tinżamm kemm jista' jkun baxxa possibbli. 17. Għal test semistatiku, jistgħu jiġu segwiti żewġ proċeduri ta' tiġdid differenti. Kwalunkwe waħda mis-soluzzjonijiet ġodda tat-test jitħejjew f'kompartimenti nodfa u l-bajd u l-larvi li jibqgħu ħajjin jiġu ttrasferiti bil-galbu f'kompartimenti ġodda, jew l-organiżmi tat-test jinżammu fil-kompartimenti tat-test, filwaqt li jinbidel proporzjon (mill-inqas żewġ terzi) tas-soluzzjoni tat-test / tal-volum tal-kontroll. PROĊEDURA Kundizzjonijiet tal-Esponiment Durata 18. It-test għandu jibda mill-aktar fis possibbli wara li l-bajd ikun iffertilizza u preferibbilment wara li jkun ġie mgħaddas fis-soluzzjonijiet tat-test qabel jibda t-tifriq tal-blastodisc, jew kemm jista' jkun qrib wara dan l-istadju. Id-durata tat-test ser tiddependi fuq l-ispeċijiet użati. Xi durati rakkomandati huma mogħtija fl-Appendiċi 2. Tagħbija 19. In-numru ta' bajd fertilizzat fil-bidu tat-test għandu jkun biżżejjed sabiex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti tal-istatistika. Huma għandhom jiġu distribwiti b'mod aleatorju fost it-trattamenti u għandhom jintużaw mill-inqas 80 bajda, li jinqasmu b'mod ugwali bejn mill-inqas erba' kompartimenti tat-test irreplikati. Ir-rata tat-tagħbija (il-bijomassa skont il-volum tas-soluzzjoni tat-test) għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex tkun tista' tinżamm konċentrazzjoni maħlula ta' ossiġenu ta' mill-inqas 60 % tal-valur ta' saturazzjoni tal-arja mingħajr ossiġenazzjoni matul l-istadju tal-bajda u tal-larva. Għat-testijiet bi fluss kontinwu, ġiet rakkomandata rata ta' tagħbija b'piż imxarrab ta' mhux aktar minn 0.5 g/l kull 24 siegħa u mhux inqas minn 5 g/l ta' soluzzjoni fi kwalunkwe ħin (3). Id-dawl u t-temperatura 20. Il-fotoperjodu u t-temperatura tal-ilma għandhom ikunu adattati għall-ispeċi tat-test (ara Appendiċi 2). Tmigħ 21. L-ikel u t-tmigħ huma kritiċi u huwa essenzjali li jiġi fornut l-ikel korrett għal kull stadju tal-ħajja minn żmien xieraq u f'livell suffiċjenti sabiex jiġi sostnut it-tkabbir normali. It-tmigħ għandu jkun bejn wieħed u ieħor ugwali fost ir-repliki, sakemm ma jiġix aġġustat biex jieħu kont tal-mortalità. Għandhom jitneħħew l-ikel u r-rawt żejda, skont kif ikun hemm bżonn, sabiex tiġi evitata akkumulazzjoni ta' skart. Ir-reġimi tat-tmigħ dettaljati huma mogħtija fl-Appendiċi 3 iżda, bl-esperjenza li qiegħda tinkiseb, ir-reġimi tal-ikel u tat-tmigħ qegħdin jiġu raffinati kontinwament sabiex tittejjeb is-sopravivenza u jiġi ottimizzat it-tkabbir. L-ikel ħaj jipprovdi sors ta' arrikkiment ambjentali u, għalhekk, għandu jintuża minflok jew flimkien mal-ikel imnixxef jew iffriżat, kull meta jkun xieraq għall-ispeċijiet u għall-istadju tal-ħajja. Il-konċentrazzjonijiet tat-test 22. Normalment ikunu meħtieġa ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, b'minimu ta' erba' repliki kull konċentrazzjoni, spazjati b'fattur kostanti ta' mhux aktar minn 3.2. Jekk tkun disponibbli, għandha tiġi kkunsidrata l-informazzjoni dwar l-ittestjar akut, preferibbilment bl-istess speċi u/jew test tas-sejbien tal-medda (1) meta tintgħażel il-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test. Madankollu, għandhom jiġu kkunsidrati s-sorsi ta' informazzjoni kollha meta tintgħażel il-medda tal-konċentrazzjonijiet tat-test, inklużi sorsi bħal, pereżempju, “read-across” dejta dwar l-ittestjar tat-tossiċità akuta tal-embrijuni tal-ħut. Test tal-limitu, jew test tal-limitu estiż, b'inqas minn ħames konċentrazzjonijiet bħala t-test definittiv, jista' jkun aċċettabbli meta jkunu jridu jiġu stabbiliti biss l-NOECs empiriċi. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test ta' aktar minn 96 siegħa LC50 jew 10 mg/l, skont liema tkun l-aktar baxxa, ma hemmx bżonn li jiġu ttestjati. Kontrolli 23. Għandu jsir kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u, jekk ikun meħtieġ, kontroll tas-solvent li jkun fih it-trasportatur tas-solvent biss, minbarra s-serje tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (ara l-paragrafu 16). Il-Frekwenza tal-Kejl u d-Determinazzjonijiet Analitiċi 24. Qabel il-bidu tal-perjodu ta' esponiment, għandha tiġi żgurata l-funzjoni xierqa tas-sistema tal-kunsinna tas-sustanza kimika fost ir-repliki kollha (pereżempju, billi jitkejlu l-konċentrazzjonijiet tat-test). Għandhom jiġu stabbiliti l-metodi analitiċi meħtieġa, inkluż limitu xieraq ta' kwantifikazzjoni (LOQ) u għarfien suffiċjenti dwar l-istabilità tas-sustanza fis-sistema tal-ittestjar. Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test jiġu ddeterminati f'intervalli regolari sabiex jiġi kkaratterizzat l-esponiment. Huwa meħtieġ minimu ta' ħames determinazzjonijiet. Fis-sistemi bi fluss kontinwu, il-kejl analitiku tas-sustanza kimika tat-test f'replikat wieħed għal kull konċentrazzjoni għandu jsir mill-inqas darba fil-ġimgħa u jinbidel sistematikament fost ir-repliki. Id-determinazzjonijiet analitiċi addizzjonali ta' spiss itejbu l-kwalità tal-eżitu tat-test. Jista' jkun meħtieġ li l-kampjuni jiġu ffiltrati sabiex titneħħa kwalunkwe materja partikulata (eż. bl-użu ta' daqs ta' 0.45 μm tal-pori) jew inkella jiġu ċċentrifugati sabiex jiġi żgurat li d-determinazzjonijiet fuq is-sustanza kimika jsiru f'soluzzjoni vera. Sabiex jitnaqqas l-adsorbiment tas-sustanza kimika tat-test, il-filtri għandhom jiġu ssaturati qabel jintużaw. Meta l-konċentrazzjonijiet imkejla ma jibqgħux fil-medda ta' 80-120 % tal-konċentrazzjoni nominali, il-konċentrazzjonijiet tal-effett għandhom jiġu ddeterminati u espressi b'mod relattiv għall-konċentrazzjoni medja aritmetika għat-testijiet bi fluss kontinwu (ara l-Appendiċi 6 tal-metodu tal-ittestjar C.20 għall-kalkolazzjoni tal-medja aritmetika (8)) u jiġu espressi b'mod relattiv għall-medja ġeometrika tal-konċentrazzjonijiet imkejla għat-testijiet semistatiċi (ara l-Kapitolu 5 fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (2)). 25. Matul it-test, l-ossiġenu dissolt, il-pH u t-temperatura għandhom jitkejlu fir-reċipjenti kollha tat-test, mill-inqas kull ġimgħa, filwaqt li s-salinità u l-ebusija, jekk ikunu ġustifikati, għandhom jitkejlu fil-bidu u fi tmiem it-test. Idealment, it-temperatura għandha tiġi ssorveljata kontinwament f'mill-inqas reċipjent wieħed tat-test. Osservazzjonijiet 26. Stadju tal-iżvilupp embrijoniku : l-istadju embrijoniku fil-bidu tal-esponiment għas-sustanza kimika tat-test għandu jiġi vverifikat bl-aktar mod preċiż possibbli. Dan jista' jsir bl-użu ta' kampjun rappreżentattiv ta' bajd ippreservat u mnaddaf kif xieraq. 27. Tifqis u sopravivenza : l-osservazzjonijiet fuq it-tifqis u s-sopravivenza għandhom isiru mill-inqas darba kuljum u n-numri jridu jiġu rreġistrati. Jekk jiġi osservat fungu fuq il-bajd fi stadju bikri tal-iżvilupp tal-embrijun (eż. fl-ewwel jew fit-tieni jum tat-test), dak il-bajd għandu jingħadd u jitneħħa. Embrijuni, larva u ħut żgħir mejtin għandhom jitneħħew malli jiġu osservati minħabba li jistgħu jitmermru malajr u jistgħu jitfarrku minħabba l-azzjonijiet tal-ħut l-ieħor. Għandha tingħata attenzjoni estrema meta jitneħħew individwi mejtin sabiex ma ssirx ħsara fiżika lill-bajd/larva li jmissu magħhom. Is-sinjali ta' mewt ivarjaw skont l-ispeċi u l-istadju tal-ħajja. Pereżempju: — għall-bajd fertilizzat: partikolarment fl-istadji bikrija, nuqqas notevoli ta' trasluċidità u bidla fil-kulur, kawża ta' koagulazzjoni u/jew preċipitazzjoni ta' proteini, li twassal għal dehra bajda opaka; — għall-embrijuni, għal-larva u għall-ħut żgħir: immobilità u/jew nuqqas ta' moviment respiratorju u/jew nuqqas ta' taħbit tal-qalb u/jew nuqqas ta' reazzjoni għal stimulu mekkaniku. 28. Dehra anormali : in-numru ta' larva jew ħut żgħir li juru anormalità fil-forma tal-ġisem għandu jiġi rreġistrat f'intervalli adegwati skont id-durata tat-test u n-natura tal-anormalità deskritta. Ta' min jinnota larva u ħut żgħir anormali jseħħu b'mod naturali u jistgħu jkunu fl-ordni ta' perċentwal kbir fil-kontroll(i) f'xi speċijiet. Meta d-deformitajiet u l-imġiba anormali assoċjata jitqiesu li huma tant severi li jkun hemm tbatija konsiderevoli għall-organiżmu u dan ikun laħaq punt fejn ma jkunx jista' jirkupra, huwa jista' jitneħħa mit-test. Dawn l-annimali għandhom jiġu ewtanizzati u ttrattati bħala mortalitajiet għal analiżi tad-dejta sussegwenti. L-iżvilupp normali tal-embrijuni kien iddokumentat għall-maġġoranza tal-ispeċijiet irrakkomandati f'dan il-metodu ta' ttestjar (9) (10) (11) (12). 29. Imġiba anormali : l-anormalitajiet, pereżempju, iperventilazzjoni, għawm mhux ikkoordinat, trankwillità atipika u mġiba atipika tat-tmigħ għandhom jiġu rreġistrati f'intervalli adegwati skont id-durata tat-test (pereżempju darba kuljum għal speċijiet li jgħixu f'ilma sħun). Dawn l-effetti, għalkemm diffiċli jiġu kkwantifikati, jistgħu, meta jiġu osservati, jgħinu fl-interpretazzjoni tad-dejta dwar il-mortalità. 30. Piż : fi tmiem it-test, il-ħut kollu li jibqa' ħaj jintiżen mill-inqas fuq bażi replikata (permezz tar-rappurtar tal-għadd ta' annimali fir-replikat u tal-piż medju għal kull annimal): il-piż imxarrab — (imnixxef bit-taptip) huwa ppreferut, madankollu, tista' tiġi rrapportata wkoll dejta dwar il-piż xott (13). 31. Tul : fi tmiem it-test, jitkejlu t-tulijiet individwali. It-tul totali huwa rrakkomandat, madankollu, jekk il-ġewnaħ tad-denb jitħassar jew jitħaffer, jista' jintuża it-tul standard. L-istess metodu għandu jintuża għall-ħut kollu f'test partikolari. It-tul individwali jista' jitkejjel permezz ta', pereżempju, kalipers, kamera diġitali jew mikrometru okulari kkalibrat. It-tulijiet minimi tipiċi huma definiti fl-Appendiċi 2. DEJTA U RAPPORTAR Trattament tar-riżultati 32. Huwa rrakkomandat li d-disinn tal-esperiment u l-għażla tat-test statistiku jippermettu qawwa adegwata (80 % jew ogħla) sabiex jiġu identifikati l-bidliet ta' importanza bijoloġika fil-punti tat-tmiem fejn għandha tiġi rrapportata NOEC. Ir-rappurtar tal-konċentrazzjonijiet tal-effett u l-parametri rilevanti jista' jiddependi fuq il-qafas regolatorju. Jekk irid jiġi rrapportat ECx, id-disinn tal-esperiment u l-għażla tal-mudell ta' rigressjoni għandhom jippermettu li ssir stima tal-ECx sabiex b'hekk (i) l-intervall ta' fiduċja ta' 95 % irrapportat għal ECx ma jkunx fih żero u ma jkunx wiesa' żżejjed, (ii) l-intervall ta' fiduċja ta' 95 % għall-medja mbassra f'ECx ma jkunx fih il-medja tal-kontroll u (iii) ma jkun hemm ebda nuqqas ta' adattament sinifikanti tal-mudell ta' rigressjoni għad-dejta. Kwalunkwe wieħed mill-approċċi jirrikjedi l-identifikazzjoni tal-bidla perċentwali f'kull punt ta' tmiem li huwa importanti li jiġi identifikat jew stmat. Id-disinn sperimentali għandha jitfassal biex jippermetti dan. Meta l-kundizzjonijiet għad-determinazzjoni tal-ECx ma jiġux issodisfati, għandu jintuża l-approċċ ta' NOEC. Mhuwiex probabbli li l-istess bidla perċentwali tapplika għall-punti tat-tmiem kollha, lanqas ma huwa probabbli li jkun jista' jiġi ddisinjat esperiment fattibbli li jissodisfa dawn il-kriterji għall-punti tat-tmiem kollha, għalhekk huwa importanti li wieħed jiffoka fuq il-punti tat-tmiem, li huma importanti għall-esperiment rispettiv sabiex l-esperiment jiġi ddisinjat kif xieraq. Il-flow diagrams ta' statistika u l-gwida għal kull approċċ huma disponibbli fl-Appendiċijiet 5 u 6 sabiex iservu ta' gwida fit-trattament tad-dejta u fl-għażla tal-aktar test ta' statistika jew mudell xieraq li għandu jintuża. Jistgħu jintużaw approċċi ta' statistika oħrajn, diment li jkunu xjentifikament ġustifikati. 33. Ser ikun neċessarju li l-varjazzjonijiet jiġu analizzati f'kull sett ta' repliki bl-użu ta' analiżi tal-varjanza jew proċeduri b'tabella ta' kontinġenza u li jintużaw il-metodi ta' analiżi statistika xierqa abbażi ta' din l-analiżi. Sabiex ikunu jistgħu jsiru paraguni multipli bejn ir-riżultati fil-konċentrazzjonijiet individwali u dawk għall-kontrolli, huwa rrakkomandat li jsir it-test ta' tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra jew ta' Williams għal risponsi kontinwi u test ta' tendenza rigressiva ta' Cochran-Armitage għal risponsi kwantali li huma konsistenti ma' rispons ta' konċentrazzjoni monotona u mingħajr ebda evidenza ta' varjanza extra-binomjali (14). Meta jkun hemm evidenza ta' varjanza extra-binomjali, hija rrakkomandata modifika ta' Rao-Scott tat-test ta' Cochran-Armitage (15) (16) jew jiġi applikat it-test ta' Williams jew Dunnett (wara trasformazzjoni arcsin-square-root) jew ta' Jonckheere-Terpstra għall-proporzjonijiet irreplikati. Meta d-dejta ma tkunx konsistenti ma' rispons ta' konċentrazzjoni monotona, il-metodu ta' Dunnett jew Dunn jew dak ta' Mann-Whitney jista' jinstab li huwa utli għal risponsi kontinwi, filwaqt li t-test Eżatt ta' Fisher jista' jinstab li huwa utli għal risponsi kwantali (14) (17) (18). Għandha tingħata attenzjoni meta jiġi applikat kwalunkwe metodu jew mudell ta' statistika sabiex ikun żgurat li r-rekwiżiti tal-metodu jew tal-mudell jiġu ssodisfati (eż. il-varjabbiltà minn kompartiment minn ieħor hija stmata u kkunsidrata fid-disinn sperimentali u fit-test jew fil-mudell użat). Id-dejta għandha tiġi evalwata għan-normalità u l-Appendiċi 5 jindika x'għandu jsir fuq ir-residwi minn ANOVA. L-Appendiċi 6 jiddiskuti kunsiderazzjonijiet addizzjonali għall-approċċ ta' rigressjoni. Għandhom jiġu kkunsidrati t-trasformazzjonijiet sabiex jiġu ssodisfati r-rekwiżiti ta' test tal-istatistika. Madankollu, it-trasformazzjonijiet li jippermettu t-tqabbil ta' mudell ta' rigressjoni jeħtieġu attenzjoni kbira, minħabba li, pereżempju, bidla ta' 25 % fir-reazzjoni mhux ittrasformata ma tikkorrespondix għal bidla ta' 25 % f'rispons ittrasformat. Fl-analiżijiet kollha, il-kompartiment tat-test, mhux il-ħut individwali, huwa l-unità tal-analiżi u l-unità sperimentali u kemm it-testijiet tal-ipoteżi kif ukoll ir-rigressjoni għandhom jirriflettu dan (3) (14) (19) (20). Rapport tat-test 34. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Sustanza kimika tat-test: Sustanza monokostitwenti — id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma u proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali; — l-identifikazzjoni tas-sustanza kimika, bħall-IUPAC jew l-isem CAS, in-numru CAS, SMILES jew il-kodiċi InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità tas-sustanza kimika tal-impuritajiet, kif xieraq u prattikament fattibbli, eċċ. (Inkluż il-kontenut tal-karbonju organiku, jekk ikun xieraq. Sustanza multi-kostitwenti, UVCBs u taħlitiet: — ikkaratterizzati kemm jista' jkun possibbli, eż., mill-identità tas-sustanza kimika (ara fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti Speċijiet tat-test: — l-isem xjentifiku, ir-razza, is-sors u l-metodu tal-ġbir tal-bajd iffertilizzat u t-trattament sussegwenti. Kundizzjonijiet tat-test: — il-proċedura tat-test użata (pereżempju, semistatika jew bi fluss kontinwu, tagħbija); — fotoperjodu/i; — id-disinn tat-test (pereżempju, l-għadd ta' kompartimenti tat-test u repliki, l-għadd ta' bajd għal kull replika, il-materjal u d-daqs tal-kompartiment tat-test (l-għoli, il-wisa', il-volum), il-volum tal-ilma għall-kompartiment tat-test); — il-metodu ta' tħejjija tas-soluzzjonijiet ewlenin u l-frekwenza tat-tiġdid (għandhom jingħataw l-aġent solubilizzanti u l-konċentrazzjoni tiegħu, meta jintużaw); — il-metodu li jintuża għad-dożaġġ tas-sustanza kimika tat-test (eż. pompi, sistemi ta' dilwizzjoni) — l-effiċjenza tal-irkupru tal-metodu u l-konċentrazzjonijiet tat-test nominali, il-limitu tal-kwantifikazzjoni, il-medji tal-valuri mkejla u d-devjazzjonijiet standard tagħhom fir-reċipjenti tat-test u l-metodu li permezz tiegħu nkisbu u evidenza li l-kejl jirreferi għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test f'soluzzjoni vera; — il-karatteristiċi tal-ilma tad-dilwizzjoni: pH, l-ebusija, it-temperatura, il-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt, il-livelli tal-klorin residwu (jekk jitkejjel), il-karbonju organiku totali (jekk jitkejjel), is-solidi sospiżi (jekk jitkejlu), is-salinità tal-medium tat-test (jekk titkejjel) u kwalunkwe kejl ieħor li jsir; — il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test, il-pH, l-ebusija, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-ossiġenu dissolt; — informazzjoni dettaljati dwar it-tmigħ (pereżempju, it-tip ta' ikel, is-sors, l-ammont mogħti u l-frekwenza). Riżultati rrapportati individwalment (jew fuq bażi rreplikata) u bħala medja u koeffiċjent tal-varjazzjoni, kif xieraq, għall-punti tat-tmiem li ġejjin: — evidenza li l-kontrolli ssodisfaw l-istandard ta' aċċettabbiltà tas-sopravivenza globali tal-ispeċi għat-test (Appendiċi 2); — dejta dwar il-mortalità f'kull stadju (embrijun, larva u żgħir) u l-mortalità kumulattiva; — jiem għat-tifqis, numru ta' larva li faqqsu kull jum u t-tmiem tat-tifqis; — in-numru ta' ħut f'saħħtu fi tmiem it-test; — dejta għat-tul (speċifika l-istandard jew l-ammont totali) u l-piż tal-annimali li jibqgħu ħajjin; — l-inċidenza, id-deskrizzjoni u n-numru ta' anormalitajiet morfoloġiċi, jekk hemm; — l-inċidenza, id-deskrizzjoni u n-numru ta' effetti ta' mġiba, jekk hemm; — l-approċċ għall-analiżi statistika (analiżi ta' rigressjoni jew analiżi tal-varjanza) u t-trattament tad-dejta (it-test statistiku jew il-mudell użat); — il-konċentrazzjoni bla effett osservat għal kull rispons ivvalutat (NOEC); — il-konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (p = 1,05) għal kull rispons ivvalutat (LOEC); — ECx għal kull rispons ivvalutat, jekk applikabbli, u l-intervalli ta' kunfidenza (eż. 90 % jew 95 %) u graff tal-mudell imqabbel għall-kalkolazzjoni tagħha, l-inklinazzjoni tal-kurva tar-rispons ta' konċentrazzjoni, il-formula tal-mudell ta' rigressjoni, il-parametri stmati tal-mudell u l-iżbalji standard tagħhom. Kwalunkwe devjazzjoni mill-metodu tal-ittestjar. Diskussjoni tar-riżultati, inkluża kwalunkwe influwenza tad-devjazzjonijiet mill-metodu ta' ttestjar fuq l-eżitu tat-test. Tabella 1 Speċi ta' ħut rakkomandat għat-test ILMA ĦELU ILMA SALMURA U BAĦAR Oncorhynchus mykiss Trota qawsalla Cyprinodon variegatus Karpjun tas-snien varjegati Pimephales promelas Karpjun buras Menidia sp. Menidja Danio rerio Żebra Oryzias latipes Medaka TAGĦRIF (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Il-Kapitolu 20 ta' dan l-Anness, Daphnia magna Reproduction Test. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Appendiċi 1 DEFINIZZJONIJIET Tul sal-furketta (fork length - FL): jirreferi għat-tul mill-ponta tal-geddum sat-tarf tax-xewk tal-pinen f'nofs id-denb u jintuża f'ħut fejn huwa diffiċli li wieħed jgħid fejn tispiċċa l-kolonna vertebrali (www.fishbase.org) Tul standard (standard length - SL): jirreferi għat-tul ta' ħuta mkejjel mill-ponta tal-geddum sat-tarf ta' wara tal-aħħar vertebra jew sat-tarf ta' wara tal-porzjon midlaterali tal-hypural plate. Fi kliem sempliċi, dan il-kejl jeskludi t-tul tad-denb. (www.fishbase.org) Tul totali (total length - TL): jirreferi għat-tul mill-ponta tal-geddum sal-ponta tal-lobu itwal tad-denb, ġeneralment imkejjel bil-lobi kkumpressati tul il-linja tan-nofs. Dan huwa kejl ta' linja dritta, li ma jitkejjilx fuq il-kurva tal-ġisem (www.fishbase.org) Figura 1 Deskrizzjoni tat-tulijiet differenti użati Sustanza kimika: sustanza jew taħlita ECx: (Konċentrazzjoni effettiva għal effett ta' x %) hija l-konċentrazzjoni li tikkawża x % ta' effett fuq l-organiżmi tat-test f'perjodu ta' esponiment partikolari meta mqabbla ma' kontroll. Pereżempju, EC50 hija konċentrazzjoni stmata li tikkawża effett fuq il-punt ta' tmiem l-ittestjar f'50 % ta' popolazzjoni esposta fuq perjodu ta' esponiment definit. Konċentrazzjoni bl-inqas effett osservat (LOEC) hija l-inqas konċentrazzjoni ttestjata ta' sustanza kimika tat-test li fiha tiġi osservata s-sustanza kimika sabiex ikollha effett statistikament sinifikanti (p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test 'il fuq mil-LOEC għandu jkollhom effett ta' ħsara daqs jew akbar minn dawk osservati fl-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu ssodisfati, għandha tingħata spjegazzjoni sħiħa għal kif intgħażlet l-LOEC (u b'hekk l-NOEC). L-appendiċijiet 5 u 6 jipprovdu gwida. Konċentrazzjoni bla effett osservat (NOEC) hija l-konċentrazzjoni tat-test immedjatament taħt l-LOEC, li meta mqabbla mal-kontroll, ma għandha ebda effett statistikament sinifikanti (p < 0,05), f'perjodu ta' esponiment ddikjarat. Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta' dan il-metodu tal-ittestjar UVCB: sustanzi ta' kompożizzjoni varjabbli jew mhux magħrufa, prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi. IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Unjoni Internazzjonali tal-Kimika Pura u Applikata). SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry Specification. Appendiċi 2 IL-KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST, ID-DURATA U L-KRITERJI TAS-SOPRAVIVENZA GĦALL-ISPEĊIJIET IRRAKKOMANDATI SPEĊIJIET IL-KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST IRRAKKOMANDATI DURATA TAT-TEST It-tul totali medju minimu tipiku tal-ħut tal-kontroll fi tmiem l-istudju (mm) (98) IS-SOPRAVIVENZA TAL-KONTROLLI (minima) It-temperatura (°C) Salinità (0/00) Fotoperjodu (sigħat) Is-suċċess tat-tifqis Is-suċċess wara t-tifqis Ilma Ħelu: Oncorhynchus mykiss Trota qawsalla 10 ± 1,5 (99) 12 - 16 (100) ġimagħtejn wara li l-kontrolli jibdew jieklu weħidhom (jew 60 jum wara t-tifqis) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Karpjun buras 25 ± 1,5 16 32 jum mill-bidu tat-test (jew 28 jum wara t-tifqis) 18 70 % 75 % Danio rerio Żebra 26 ± 1,5 12 - 16 (101) 30 jum wara t-tifqis 11 70 % 75 % Oryzias latipes Medaka 25 ± 2 12 - 16 (101) 30 jum wara t-tifqis 17 80 % 80 % Tal-Estwarju u tal-Baħar: Cyprinodon variegatus Karpjun tas-snien varjegati 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 - 16 (101) 32 jum mill-bidu tat-test (jew 28 jum wara t-tifqis) 17 75 % 80 % Menidia sp. Menidja 22 - 25 15-35 (102) 13 28 jum 20 80 % 60 % Appendiċi 3 GWIDA DWAR IT-TMIGĦ U T-TRATTAMENT GĦAR-RIPRODUZZJONI U L-ITTESTJAR TA' ANNIMALI TAL-ISPEĊIJIET IRRAKKOMANDATI SPEĊIJIET IKEL (*9) IL-ĦIN TAT-TRASFERIMENT WARA T-TIFQIS IL-ĦIN SAL-EWWEL TMIGĦ Ħut riproduttiv Larva li għadha tfaqqas Żgħar Tip Frekwenza Ilma Ħelu: Oncorhynchus mykiss Trota qawsalla ikel tat-trota Xejn (1) ikel tal-bidu tat-trota BSN 2-4 porzjonijiet ta' għalf kuljum 14-16-il jum wara t-tifqis jew fl-għawma (mhux essenzjali) 19-il jum wara t-tifqis jew fl-għawma Pimephales promelas Karpjun buras BSN, ikel imsaffaf, FBS BSN BSN48, ikel imsaffaf 2-3 darbiet kuljum ladarba t-tifqis ikun 90 % jumejn wara t-tifqis Danio rerio Żebra BSN, ikel imsaffaf, Ikel tal-larva kummerċjali, protożoa (2), proteina (3) BSN48, ikel imsaffaf BSN darba kuljum; Ikel imsaffaf darbtejn kuljum ladarba t-tifqis ikun 90 % jumejn wara t-tifqis Oryzias latipes Medaka ikel imsaffaf BSN, ikel imsaffaf (jew protożoa jew rotiferi) BSN48, ikel imsaffaf (jew rotiferi) BSN darba kuljum; ikel imsaffaf darbtejn kuljum jew ikel imsaffaf u rotiferi darba kuljum mhux applikabbli 6-7 ijiem wara l-bidien Tal-Estwarju u tal-Baħar: Cyprinodon varieqatus Karpjun tas-snien varjegati BSN, ikel imsaffaf, FBS BSN BSN48 2-3 porzjonijiet ta' għalf kuljum mhux applikabbli jum wara t-tifqis/l-għawma Menidia sp. Menidja BSN48, ikel imsaffaf BSN BSN48 2-3 porzjonijiet ta' għalf kuljum mhux applikabbli jum wara t-tifqis/l-għawma Appendiċi 4 XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA TAD-DILWIZZJONI AĊĊETTABBLI Komponent Konċentrazzjoni limitu Materja partikolata 5 mg/l Karbonju organiku totali 2 mg/l Ammonja mhux jonizzata 1 μg/l Kloru residwu 10 μg/l Pestiċidi organofosforiċi totali 50 ng/l Pestiċidi organofosforiċi totali flimkien ma' bifenili poliklorinati 50 ng/l Kloru organiku totali 25 ng/l Aluminju 1 μg/l Arseniku 1 μg/l Kromju 1 μg/l Kobalt 1 μg/l Ram 1 μg/l Ħadid 1 μg/l Ċomb 1 μg/l Nikil 1 μg/l Żingu 1 μg/l Kadmju 100 ng/l Merkurju 100 ng/l Fidda 100 ng/l Appendiċi 5 GWIDA STATISTIKA GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-NOEC Ġenerali It-tank irreplikat huwa l-unità tal-analiżi. B'hekk, għall-kejl kontinwu, bħad-daqs, għandhom jiġu kkalkolati l-medji tal-irreplikati jew il-medjani tal-irreplikati u dawn il-valuri tal-irreplikati huma d-dejta għall-analiżi. Għandha tintwera l-qawwa tat-testijiet użati, preferibbilment abbażi ta' database storika adegwata għal kull laboratorju. L-effett tad-daqs li jista' jiġi identifikat b'qawwa ta' 75-80 % għandu jiġi pprovdut għal kull punt tat-tmiem bit-test statistiku li jrid jintuża. Id-databases disponibbli fiż-żmien tal-iżvilupp ta' dan il-metodu ta' ttestjar jistabbilixxu l-qawwa possibbli skont il-proċeduri statistiċi rrakkomandati. Laboratorju individwali għandu juri l-abbiltà tiegħu li jissodisfa dan ir-rekwiżit tal-qawwa billi jwettaq l-analiżi tal-qawwa tiegħu stess jew billi juri li l-Koeffiċjent tal-Varjazzjoni (CV) għal kull rispons ma jaqbiżx id-90 perċentil tas-CVs użati fl-iżvilupp tat-TG. It-Tabella 1 tipprovdi dawn is-CVs. Jekk ikunu disponibbli biss il-medji tal-irreplikati jew il-medjani tal-irreplikati, mela allura s-CV irreplikat jista' jiġi injorat. Tabella 1 Id-90 Perċentil tas-CVs għall-Ispeċijiet tal-Ilma Ħelu magħżula Speċijiet Rispons CV_Bejn ir-Repliki CV_Fi ħdan ir-Repliki Trota Qawsalla Tul 17,4 9,8 Piż 10,1 28 Karpjun Buras Tul 16,9 13,5 Piż 11,7 38,7 Żebra Tul 43,7 11,7 Piż 11,9 32,8 Kważi għat-testijiet statistiċi kollha użati għall-evalwazzjoni tal-istudji tossikoloġiċi fil-laboratorji, il-paraguni ta' interess għandhom jiġu kkontrollati mill-gruppi ta' trattament. Għal dik ir-raġuni, mhuwiex xieraq li jintalab li jsir test F sinifikanti ta' ANOVA qabel l-użu tat-test ta' Dunnett jew ta' Williams jew test sinifikanti ta' Kruskal-Wallis qabel l-użu tat-test ta' Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney jew Dunn (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). It-test ta' Dunnett għandu aġġustament ta' multipliċità inkorporat u r-rati pożittivi foloz u negattivi foloz tiegħu huma affettwati b'mod avvers bl-użu tat-test F bħala għassies. B'mod simili, it-testijiet b'tendenza rigressiva ta' Williams u Jonckheere-Terpstra li jużaw livell ta' sinifikat ta 0.05 f'kull pass jippreservaw rata pożittiva falza globali ta' 5 % u r-rata u l-qawwa tat-testijiet jiġu affettwati b'mod avvers bl-użu tat-test F- jew Kruskal-Wallis bħala kustodju. It-testijiet ta' Mann-Whitney u ta' Dunn għandhom jiġu aġġustati għall-multipliċità u huwa rrakkomandat l-aġġustament ta' Bonferroni-Holm. Diskussjoni fil-fond rigward il-maġġoranza tar-rakkomandazzjonijiet dwar l-ittestjar tal-ipoteżi u l-verifika tas-suppożizzjonijiet sottostanti għal dawn it-testijiet hija mogħtija fl-OECD (2006), li tinkludi wkoll bibljografija estensiva. It-trattament tal-Kontrolli meta Jintuża Solvent Jekk jintuża solvent, għandhom jiġu inklużi kemm kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni kif ukoll kontroll tas-solvent. Iż-żewġ kontrolli għandhom jitqabblu għal kull rispons u jiġu kkombinati għal analiżi statistika jekk ma tinstab ebda differenza sinifikanti bejn il-kontrolli. Altrimenti, għandu jintuża l-kontroll tas-solventi għad-determinazzjoni tal-NOEC jew għall-istima tal-ECx u ma jintużax il-kontroll tal-ilma. Ara r-restrizzjoni fil-kriterji tal-validità (Paragrafu 7). Għat-tul, il-piż, il-proporzjon ta' tifqis tal-bajd jew mortalità tal-larva jew larva anormali, u għall-ewwel jew l-aħħar jum tat-tifqis jew tal-għawma, għandu jintuża T-test jew it-test ta' Mann-Whitney sabiex il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni jitqabbel mal-kontroll tas-solvent f'livell ta' sinifikat ta' 0.05, billi jiġu injorati l-gruppi tat-trattamenti kollha. Ir-riżultati ta' dawn it-testijiet għandhom jiġu rrapportati. Il-kejl tad-daqs (it-tul u l-piż) Il-valuri tat-tul u tal-piż tal-ħut individwali jistgħu jiġu distribwiti b'mod normali jew log-normali. Fi kwalunkwe każ, il-valuri medji rreplikati għandhom it-tendenza li jkunu distribwiti b'mod normali permezz tas-Central Limit Theorem u kkonfermati mid-dejta minn aktar minn 100 studju tal-ELS ta' tliet speċijiet li jgħixu fl-ilma ħelu. Inkella, meta d-dejta jew id-databases storiċi jissuġġerixxu distribuzzjoni b'log-normali għall-valuri ta' daqsijiet ta' ħut individwali, jista' jiġi kkalkolat il-logaritmu medju rreplikat tal-valuri tal-ħut individwali u d-dejta għall-analiżi tista' mbagħad tkun l-anti-logs ta' dawn il-logaritmi medji rreplikati. Id-dejta għandha tiġi evalwata għall-konsistenza b'distribuzzjoni normali u omoġeneità tal-varjanza. Għal dan il-għan, għandhom jintużaw ir-residwi minn mudell ANOVA b'konċentrazzjoni bħall-varjabbli tal-klassi ta' spjegazzjoni waħda. Tista' tintuża determinazzjoni viżiva minn plotts ta' diffużjoni u istogrammi jew minn stem-and-leaf plots. B'mod alternattiv, jista' jintuża test formali bħal Shapiro-Wilk jew Anderson-Darling. Il-konsistenza mal-omoġeneità tal-varjanza tista' tiġi vvalutata minn eżaminazzjoni viżiva tal-istess plott ta' diffużjoni jew b'mod formali permezz tat-test ta' Levene. Huma biss it-testijiet parametriċi (eż. ta' Williams, Dunnett) li jeħtieġ li jiġu evalwati għan-normalità jew għall-omoġeneità tal-varjanza. Għandha tingħata attenzjoni lill-outliers possibbli u lill-effett tagħhom fuq l-analiżi. Jistgħu jintużaw it-test tal-outlier ta' Tukey u l-ispezzjoni viżiva tal-istess plottijiet ta' residwi deskritti hawn fuq. Għandu jiġi mfakkar li l-osservazzjonijiet huma repliki sħaħ, għalhekk, it-tħollija barra ta' outlier mill-analiżi għandha ssir biss wara kunsiderazzjoni bir-reqqa. It-testijiet statistiċi li jagħmlu użu mill-karatteristiċi tad-disinn sperimentali u l-aspettattiva bijoloġika huma testijiet b'tendenza rigressiva, bħal Williams u Jonckheere-Terpstra. Dawn it-testijiet jassumu rispons ta' konċentrazzjoni monotona u d-dejta għandha tiġi vvalutata għall-konsistenza ma' dik is-suppożizzjoni. Dan jista' jsir b'mod viżiv minn plott ta' diffużjoni tal-medji rreplikati fl-isfond tal-konċentrazzjoni tat-test. Ikun utli jekk dak il-plott ta' diffużjoni jiġi sovrappost bi plott lineari segmentat li jgħaqqad il-medji tal-konċentrazzjoni ponderati skont id-daqs tal-kampjun irreplikat. Devjazzjoni kbira ta' dan il-plott lineari segmentat minn monotoniċità tindika l-ħtieġa possibbli li jintużaw testijiet mingħajr tendenza. B'mod alternattiv, jistgħu jintużaw testijiet formali. Test formali sempliċi huwa għall-komputazzjoni tal-kuntrasti lineari u kwadratiċi tal-medji tal-konċentrazzjoni. Jekk il-kuntrast kwadratiku jkun sinifikanti u l-kuntrast lineari ma jkunx sinifikanti, din hija indikazzjoni ta' problema possibbli bil-monotoniċità, li għandha tiġi evalwata aktar mill-plotts. Meta n-normalità jew l-omoġeneità tal-varjanza tikkostitwixxi kwistjoni, dawn il-kuntrasti jistgħu jinbnew minn dejta ttrasformata skont l-ordni tal-klassifikazzjoni. Jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi, bħat-test ta' Bartholomew, għall-monotoniċità, iżda dawn iżidu l-kumplessità. Figura 2 Flow-Chart bil-Kejl tad-Daqs tal-NOEC (it-tul u l-piż) Sakemm id-dejta ma tkunx konsistenti mar-rekwiżiti għal dawn it-testijiet, l-NOEC tiġi ddeterminata minn applikazzjoni b'tendenza rigressiva tat-test ta' Williams jew ta' Jonckheere-Terpstra. OECD (2006) jipprovdi dettalji dwar dawn il-proċeduri. Għad-dejta li mhijiex konsistenti mar-rekwiżiti għal test b'tendenza rigressiva, jista' jintuża t-test ta' Dunnett jew ta' Tamhane-Dunnett (T3), li t-tnejn li huma għandhom aġġustamenti inkorporati għall-multipliċità. Dawn it-testijiet jassumu n-normalità u, fil-każ ta' Dunnett, l-omoġeneità tal-varjanza. Meta dawk il-kundizzjonijiet ma jiġux issodisfati, jista' jintuża t-test mhux parametriku ta' Dunn. OECD (2006) jinkludi dettalji għal dawn it-testijiet kollha. Il-figura 2 tagħti ħarsa ġenerali lejn kif tista' ssib it-test tal-għażla tiegħek. It-Tifqis tal-Bajd u s-Sopravivenza tal-Larva Id-dejta hija dwar il-proporzjonijiet ta' bajd li jfaqqas jew larva li tibqa' ħajja f'repliki individwali. Dawn il-proporzjonijiet għandhom jiġu vvalutati għall-varjanza extra-binomjali, li hija komuni iżda mhux universali għal dan il-kejl. Il-flowchart fil-figura 3 hija gwida għat-test tal-għażla; ara t-test għal deskrizzjonijiet iddettaljati. Normalment jintużaw żewġ testijiet. Dawn huma t-test ta' Tarone C(α) (Tarone, 1979) u l-chi-squared tests, kull wieħed applikat separatament għal kull konċentrazzjoni tat-test. Jekk tinstab varjanza extra-binomjali f'konċentrazzjoni waħda tat-test, mela allura għandhom jintużaw metodi li jakkomodaw. Formula 1 It-test ta' Tarone C (α) (Tarone 1979) fejn ̂ huwa l-proporzjon medju għal konċentrazzjoni partikolari, m huwa l-għadd ta' tankijiet irreplikati, nj huwa l-għadd ta' suġġetti fir-replika j u xj huwa l-għadd ta' suġġetti f'dik ir-replika li tirrispondi, eż. mhux imfaqqsin jew mejta. Dan it-test jiġi applikat għal kull konċentrazzjoni separatament. Dan it-test jista' jitqies bħala test aġġustat tal-chi-square, iżda s-simulazzjonijiet b'qawwa limitata magħmula minn Tarone wrew li huwa aktar b'saħħtu minn test tal-chi-square. Figura 3 Flow Chart tal-NOEC għat-Tifqis tal-Bajd u l-Mortalità tal-Larva Meta ma jkun hemm ebda evidenza sinifikanti ta' varjanza extra-binomjali, jista' jintuża t-test b'tendenza rigressiva ta' Cochran-Armitage. Dan it-test jinjora r-repliki, għalhekk, fejn ikun hemm tali evidenza, huwa rrakkomandat li jsir aġġustament ta' Rao-Scott għat-test ta' Cochran-Armitage (RSCA), li jieħu f'kunsiderazzjoni r-repliki, id-daqsijiet tar-repliki u l-varjanza extra-binomjali. It-testijiet alternattivi jinkludu t-testijiet b'tendenza rigressiva ta' Williams u Jonckheere-Terpstra u t-test ta' Dunnett kif deskritti għall-kejl tad-daqs. Dawn it-testijiet japplikaw irrispettivament minn jekk ikunx hemm varjanza extra-binomjali, iżda għandhom qawwa kemmxejn aktar baxxa (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). L-Ewwel jew l-Aħħar Jum tat-Tifqis jew tal-Għawma Ir-rispons huwa inteġer, li jagħti l-jum tat-test li fih tiġi osservata l-osservazzjoni indikata għal tank irreplikat partikolari. Il-medda tal-valuri ġeneralment tkun limitata ħafna u sikwit ikun hemm proporzjonijiet kbar ta' valuri marbuta, pereżempju, jiġi osservat l-istess l-ewwel jum ta' tifqis fir-replikati ta' kontroll u forsi f'konċentrazzjoni waħda jew żewġ konċentrazzjonijiet baxxi tat-test. Testijiet parametriċi bħal Williams u Dunnett mhumiex addattati għal tali dejta. Sakemm ma jkunx hemm evidenza fuq non-monotoniċità serja, it-test b'tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra huwa b'saħħtu ħafna għad-detezzjoni tal-effetti tas-sustanza kimika tat-test. Altrimenti, jista' jintuża t-test ta' Dunn. Anormalitajiet tal-Larva Ir-rispons huwa l-għadd ta' larva li b'xi mod tinstab li hija anormali. Dan ir-rispons ta' spiss ikun ta' inċidenza baxxa u jesperjenza wħud mill-istess problemi bħall-ewwel jum tat-tifqis, kif ukoll xi drabi juri rispons erratiku għall-konċentrazzjoni. Jekk id-dejta mill-inqas bejn wieħed u ieħor issegwi forma ta' konċentrazzjoni monotona, it-test b'tendenza rigressiva ta' Jonckheere-Terpstra huwa b'saħħtu għall-identifikazzjoni tal-effetti. Altrimenti, jista' jintuża t-test ta' Dunn. REFERENZI Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Appendiċi 6 GWIDA STATISTIKA GĦALL-ESTIMI TA' RIGRESSJONI Ġenerali L-osservazzjonijiet użati biex jiddaħħal mudell huma medji rreplikati (tul u piż) jew proporzjonijiet irreplikati (tifqis tal-bajd u mortalità tal-larva) (OECD 2006). Ġeneralment, hija rrakkomandata rigressjoni ponderata li tuża d-daqs tal-kampjun irreplikat bħala l-piż. Huma possibbli skemi ta' ponderazzjoni oħrajn, bħall-ponderazzjoni b'rispons medju mbassar jew kombinazzjoni ta' dan u d-daqs tal-kampjun irreplikat. Mhix irrakkomandata l-ponderazzjoni b'varjanza reċiproka fi ħdan il-kampjun ta' konċentrazzjoni (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Kwalunkwe trasformazzjoni tar-risponsi qabel analiżi għandha tippreserva l-indipendenza tal-osservazzjonijiet u l-ECx u l-limiti ta' kunfidenza tagħha għandhom jiġu espressi fl-unitajiet oriġinali tal-kejl, aktar milli f'unitajiet ittrasformati. Pereżempju, bidla ta' 20 % fil-logaritmu tat-tul mhijiex ekwivalenti għal bidla ta' 20 % fit-tul (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999). Il-flowchart fil-figura 4 tagħti ħarsa ġenerali lejn l-estimi tal-ECx. Id-dettalji huma deskritti fit-test ta' hawn taħt. Figura 4 Flow chart għal ECx Stima tat-Tul, tal-Piż jew tal-Proporzjon Medju Replikat tat-Tifqis tal-Bajd jew tal-Mortalità tal-Larva, ara t-test għal aktar dettalji Kunsiderazzjonijiet għat-Tifqis tal-Bajd u għall-Mortalità tal-Larva Għat-tifqis tal-bajd u l-mortalità tal-larva, huwa ġeneralment aħjar li jiddaħħal mudell ta' tnaqqis, sakemm ma jiddaħħalx mudell probit kif deskritt hawn taħt. Jiġifieri, wieħed għandu jimmudella l-proporzjon ta' bajd li ma jfaqqasx jew ta' larvi li jmutu. Ir-raġuni għal dan hija li ECx tirreferi għal konċentrazzjoni li fiha jkun hemm bidla ugwali għal x % tar-rispons medju tal-kontroll. Jekk ikun hemm 5 % tal-bajd fil-kontroll li ma jfaqqsux u wieħed jimmudella n-nuqqas ta' tifqis, mela allura l-EC20 tirreferi għal konċentrazzjoni li fiha jkun hemm bidla ugwali għal 20 % tal-5 % tal-bajd fil-kontroll li ma jfaqqsux, jiġifieri bidla ta' 0,2 × 0,05 = 0,01 jew punt perċentwal wieħed għal 6 % tal-bajd li ma jfaqqsux. Din il-bidla żgħira ma tistax tiġi stmata bi kwalunkwe mod sinifikanti mid-dejta disponibbli u mhijiex bijoloġikament importanti. Filwaqt li, jekk wieħed jimmudella l-proporzjon tal-bajd li jfaqqsu, il-proporzjon tal-kontroll ikun 95 % f'dan l-eżempju u tnaqqis ta' 20 % mill-medja tal-kontroll ikun ifisser bidla ta' 0,95 × 0,2 = 0,18, għalhekk, minn rata ta' suċċess tat-tifqis ta' 95 % għal suċċess ta' tifqis ta' 77 % (= 95-18) u l-konċentrazzjoni tal-effetti tista' tiġi stmata u preżumibbilment hija ta' interess akbar. Din ma tikkostitwixxi ebda kwistjoni bil-kejl tad-daqs, għalkemm l-effetti avversi fuq id-daqs ġeneralment ifissru tnaqqis fid-daqs. Mudelli għad-Daqs (tul jew piż) u s-Suċċess tat-Tifqis tal-Bajd jew is-Sopravivenza tal-Larva. Għajr għall-mudell ormetiku ta' Brain-Cousens, dawn il-mudelli kollha huma deskritti u rrakkomandati fl-OECD (2006). Dawn il-mudelli, imsejħa OECD 2-5, huma diskussi wkoll għall-esperimenti tal-ekotossiċità fi Slob (2002). Ovvjament, hemm ħafna mudelli oħrajn li jistgħu jkunu utli. Bunke, et al. (1999) isemmi bosta mudelli li mhumiex inklużi hawnhekk u hemm għadd kbir ta' referenzi għal mudelli oħrajn. Dawk imsemmija hawn taħt huma ssuġġeriti bħala partikolarment xierqa fl-esperimenti tal-ekotossiċità u jintużaw ħafna. B'5 konċentrazzjonijiet tat-test flimkien mal-kontroll — Bruce-Versteeg — Esponenzjali Sempliċi (OECD 2) — Esponenzjali bil-parametru tal-forma (OECD 3) — Esponenzjali Sempliċi b'Livell Inferjuri (OECD 4) B'6 konċentrazzjonijiet tat-test jew aktar flimkien mal-kontroll — Esponenzjali b'parametru tal-forma u livell inferjuri (OECD 5) — Michaelis-Menten — Hill Fejn ikun hemm evidenza viżiva ta' ormeżi (mhux probabbli b'suċċess ta' tifqis tal-bajd jew sopravivenza tal-larva, iżda xi drabi osservata fl-osservazzjonijiet tad-daqs) — Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989) Mudelli alternattivi għall-falliment fit-tifqis tal-bajd u l-mortalità tal-larva — Il-mudelli dejjem jiżdiedu għal dawn ir-risponsi jistgħu jiddaħħlu b'mudelli probit (jew loġistiċi) jekk ma jkun hemm ebda evidenza ta' varjanza extra-binomjali u l-inċidenza tal-kontroll tkun stmata fil-mudell addattat. Dan mhuwiex il-metodu ppreferut, minħabba li jittratta l-individwu, mhux ir-replika, bħala l-unità tal-analiżi (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). L-idoneità tal-adattament ta' mudell waħdieni — Qabbel b'mod viżiv it-tnaqqis perċentwali osservat u mbassar f'kull konċentrazzjoni tat-test (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999). — Qabbel il-medja kwadratika tal-iżball ta' rigressjoni mal-medja kwadratika tal-iżball pur bl-użu ta' F-test (Draper and Smith 1999). — Ivverifika li kull terminu fil-mudell huwa differenti b'mod sinifikanti minn żero (jiġifieri ddetermina jekk it-termini kollha użati fil-mudell humiex importanti), (Motulsky and Christopoulos 2004). — Il-plotts ta' residwi minn rigressjoni kontra l-konċentrazzjoni tat-test, possibbilment fuq skala log(conc). Ma għandu jkun hemm ebda mudell għal dan il-plott; il-punti għandhom ikunu mifruxa b'mod aleatorju madwar linja orizzontali f'għoli ta' żero. — Id-dejta għandha tiġi evalwata għan-normalità u għall-omoġeneità tal-varjanza bl-istess mod kif indikat fl-Appendiċi 5. — Barra minn hekk, in-normalità tar-residwi dwar il-mudell ta' rigressjoni għandha tiġi vvalutata bl-użu tal-istess metodi indikati fl-Appendiċi 5 għar-residwi minn ANOVA Qabbel il-mudelli — Uża l-kriterji AICc ta' Akiake Valuri ta' AICc iżgħar juru adattamenti aħjar u jekk AICc(B)-AICc(A)≥10, il-mudell A huwa kważi ċertament aħjar mill-mudell B (Motulsky and Christopoulos (2004). — Qabbel iż-żewġ mudelli viżwalment skont kemm jissodisfaw tajjeb il-kriterji tal-mudell waħdieni msemmija fuq. — Huwa rrakkomandat il-prinċipju ta' parsimonja, fejn jintuża l-aktar mudell sempliċi li jkun adattat b'mod raġonevoli għad-dejta (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). Stima tal-kwalità tal-ECx L-intervall ta' kunfidenza (confidence interval — CI) għall-ECx ma għandux ikun wiesa' żżejjed. Huwa meħtieġ ġudizzju statistiku sabiex jiġi deċiż kemm jista' jkun wiesa' l-intervall ta' kunfidenza u l-ECx jibqgħu utli. Is-simulazzjonijiet għall-mudelli ta' rigressjoni adattati għat-tifqis tal-bajd u d-dejta dwar id-daqs juru li madwar 75 % tal-intervalli ta' kunfidenza għal ECx (x=10, 20 jew 30) huma mifruxa fuq mhux aktar minn żewġ konċentrazzjonijiet tat-test. Dan jipprovdi gwida ġenerali għal x'inhu aċċettabbli u gwida prattika għal dak li jista' jinkiseb. Bosta awturi jasserixxu l-ħtieġa li jiġu rrapportati l-intervalli ta' kunfidenza għall-parametri tal-mudelli kollha u li l-intervalli ta' kunfidenza wiesgħa għall-parametri tal-mudelli jindikaw mudelli inaċċettabbli (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). Is-CI għall-ECx (jew kwalunkwe parametru ta' mudell ieħor) ma għandux jinkludi żero (Motulsky and Christopoulos 2004). Din hija r-rigressjoni ekwivalenti għad-differenza sinifikanti minima li sikwit tiġi ċċitata fl-approċċi tal-ittestjar ipotetiku (eż. Wang et al 2000). Hija tikkorrespondi għall-intervall ta' kunfidenza sabiex ir-risponsi medji fl-LOEC ma jkunux jinkludu l-medja tal-kontroll. Wieħed għandu jistaqsi jekk l-estimi tal-parametru humiex xjentifikament plawżibbli. Pereżempju, jekk l-intervall ta' kunfidenza għal y0 ikun ±20 %, ma hija plawżibbli ebda stima ta' EC10. Jekk il-mudell jipprevedi effett ta' 20 % f'konċentrazzjoni C u l-effett massimu osservat f'C u konċentrazzjonijiet aktar baxxi jkun 10 %, mela allura l-EC20 ma tkunx plawżibbli (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). ECx ma għandhiex tirrikjedi estrapolazzjoni barra l-medda ta' konċentrazzjonijiet pożittivi (Draper and Smith 1999, OECD 2006). Pereżempju, gwida ġenerali tista' tkun li l-ECx ma tkunx aktar minn madwar 25 % taħt l-inqas konċentrazzjoni ttestjata jew aktar mill-ogħla konċentrazzjoni ttestjata. REFERENZI Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Assaġġ tar-Riproduzzjoni tal-Ħut Fuq Żmien Qasir INTRODUZZJONI 1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 229 tal-OECD (2012). Il-ħtieġa li jiġi żviluppat u vvalidat assaġġ tal-ħut li jkun jista' jidentifika ċerti sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali ġejja mit-tħassib li l-livelli ambjentali tas-sustanzi kimiċi jistgħu jikkawżaw effetti avversi kemm fil-bnedmin kif ukoll fl-organiżmi selvaġġi minħabba l-interazzjoni ta' dawn is-sustanzi kimiċi mas-sistema endokrinali. Fl-1998, l-OECD bdiet attività ta' prijorità għolja biex tirrevedi l-linji gwida eżistenti u tiżviluppa linji gwida ġodda għall-iskrinjar u l-ittestjar ta' sustanzi li potenzjalment ifixklu s-sistema endokrinali. Element minnhom tal-attività kien li tiġi żviluppata linja gwida tat-test għall-iskrinjar ta' sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali tal-ispeċi tal-ħut. L-Assaġġ tar-Riproduzzjoni tal-Ħut Fuq Żmien Qasir għadda minn programm estensiv ta' validazzjoni li jikkonsisti fi studji interlaboratorji b'sustanzi kimiċi magħżula biex jintwerew ir-rilevanza u l-affidabbiltà tal-assaġġ għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li jħallu impatt fuq ir-riproduzzjoni tal-ħut b'diversi mekkaniżmi, inklużi modalitajiet endokrinali (1, 2, 3, 4, 5 ). Il-punti tat-tmiem kollha tal-linja gwida tat-test tal-OECD ġew ivvalidati fuq il-karpjun buras u subsett ta' punti tat-tmiem ġie vvalidat fuq il-medaka Ġappuniża (jiġifieri l-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji) u fuq iż-żebra (jiġifieri vitelloġenina). Il-ħidma ta' validazzjoni ġiet riveduta permezz ta' evalwazzjoni bejn il-pari minn bord ta' esperti nnominati mill-Koordinaturi Nazzjonali tal-Programm tal-Linji Gwida tat-Test tal-OECD (6) u minn bord ta' esperti indipendenti kkummissjonati mill-Aġenzija għall-Ħarsien Ambjentali tal-Istati Uniti (29). L-assaġġ mhuwiex imfassal biex jidentifika mekkaniżmi speċifiċi ta' tfixkil ormonali minħabba li l-annimali tat-test għandhom assi ipotalamika-pitwitarja-gonadali (HPG) intatta, li jista' jkollha rispons għal sustanzi kimiċi li għandhom impatt fuq l-assi HPG f'livelli differenti. 2. Dan il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi assaġġ ta' skrinjar in vivo li fih ħut maskili sesswalment matur u ħut femminili li jkun qed ibid jinżammu flimkien u jiġu esposti għal sustanza kimika matul parti limitata miċ-ċiklu tal-ħajja tagħhom (21 jum). Fi tmiem il-perjodu ta' esponiment ta' 21 jum, jitkejlu żewġ punti ta' tmiem bijomarkaturi fl-irġiel u n-nisa bħala indikaturi tal-attività endokrinali tas-sustanza kimika tat-test; dawn il-punti ta' tmiem huma l-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji. Il-vitelloġenina titkejjel fil-karpjun buras, fil-medaka Ġappuniża u fiż-żebra, filwaqt li l-karatteristiċi sesswali sekondarji jitkejlu fil-karpjun buras u fil-medaka Ġappuniża. Barra minn hekk, il-fekondità kwantitattiva tiġi mmonitorjata kuljum matul it-test. Il-gonadi jiġu ppreservati wkoll u l-istopatoloġija tista' tiġi evalwata sabiex tkun ivvalutata l-idoneità riproduttiva tal-annimali tat-test u tiżdied mal-piż tal-evidenza ta' punti tat-tmiem oħrajn. 3. Dan il-bijoassaġġ iservi bħala assaġġ ta' skrinjar riproduttiv in vivo u l-applikazzjoni tiegħu għandha titqies fil-kuntest tal-“Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni ta' Sustanzi Kimiċi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali” (30). F'dan il-Qafas Kunċettwali, l-Assaġġ tar-Riproduzzjoni Fuq Żmien Qasir huwa propost fil-Livell 3 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi dejta dwar il-mekkaniżmu/i jew il-passaġġ(i) endokrinali magħżula. KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET 4. Normalment il-vitelloġenina (VTG) tiġi prodotta mill-fwied ta' vertebrati ovipari femminili bħala rispons għall-estroġenu endoġenu li jkun qed jiċċirkola. Hija prekursur tal-proteini tal-isfar tal-bajd u, ladarba tiġi prodotta fil-fwied, tgħaddi mad-demm u tidħol fl-ovarji, fejn tiġi assorbita u modifikata mill-bajd li jkun qed jiżviluppa. Il-vitelloġenina hija kważi intraċċabbli fil-plażma ta' ħut femminili u maskili immaturi għaliex ma għandhomx biżżejjed estroġenu jiċċirkola; madankollu, il-fwied kapaċi jissintetizza u jnixxi l-vitelloġenina bħala rispons għal stimulazzjoni tal-estroġenu eżoġenu. 5. Il-kejl tal vitelloġenina jservi għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li għandhom diversi modi ta' azzjoni estroġenika. Id-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi estroġeniċi tista' ssir bil-kejl tal-induzzjoni tal-vitelloġenina fil-ħut maskili, u ġiet dokumentata sew fil-letteratura xjentifika evalwata bejn il-pari (eż. (7)). L-induzzjoni tal-vitelloġenina ntweriet ukoll wara espożizzjoni għal androġeni aromatizzabbli (8, 9). Tnaqqis fil-livell ta' estroġenu li jiċċirkola fin-nisa, pereżempju, permezz tal-inibizzjoni tal-aromatażi li tikkonverti l-androġenu endoġenu f'estroġenu naturali 17β-estradjol, jikkawża tnaqqis fil-livell ta' vitelloġenina, li jintuża għad-detezzjoni ta' sustanzi kimiċi li għandhom karatteristiċi inibitorji tal-aromatażi (10, 11). Ir-rilevanza bijoloġika tar-rispons tal-vitelloġenina wara inibizzjoni estroġenika/tal-aromatażi hija stabbilita u ġiet iddokumentata b'mod estensiv. Madankollu, huwa possibbli wkoll li l-produzzjoni tal-VTG fin-nisa tiġi affettwata mit-tossiċità ġenerali u modi ta' azzjoni tossiċi mhux endokrinali, eż. epatotossiċità. 6. Ġew żviluppati b'suċċess diversi metodi ta' kejl u dawn ġew standardizzati għall-użu ta' rutina. Dan huwa l-każ fil-metodi ta' Assaġġ ta' Immunoassorbiment Enzimatiku (ELISA) speċifiċi għall-ispeċi li jużaw l-immunokimika għall-kwantifikazzjoni tal-VTG prodotta f'kampjuni żgħar tad-demm jew tal-fwied miġbura minn ħut individwali (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Għall-kejl tal-VTG jittieħed kampjun tad-demm tal-karpjun buras, id-demm taż-żebra jew l-omoġenat tar-ras/denb, u l-fwied tal-medaka. Fil-medaka, hemm korrelazzjoni tajba bejn il-VTG imkejla mid-demm u mill-fwied (19). L-Appendiċi 6 jipprovdi l-proċeduri rrakkomandati għall-ġbir tal-kampjuni għal analiżi tal-VTG. Kits għall-kejl tal-vitelloġenina jistgħu jinkisbu faċilment; dawn il-kits għandhom ikunu bbażati fuq metodu ELISA vvalidat li jkun speċifiku għall-ispeċi. 7. Il-karatteristiċi sesswali sekondarji f'ħut maskili ta' ċerti speċijiet jidhru fuq barra, huma kwantifikabbli u jirrispondu għal-livelli ta' androġeni endoġeni li jiċċirkolaw; dan huwa l-każ għall-karpjun buras u l-medaka — iżda mhux għaż-żebra, li ma għandhiex karatteristiċi sesswali sekondarji kwantifikabbli. In-nisa jżommu l-kapaċità li jiżviluppaw karatteristiċi sesswali sekondarji maskili, meta jiġu esposti għal sustanzi kimiċi androġeniċi fl-ilma. Hemm bosta studji disponibbli fil-letteratura xjentifika li jiddokumentaw dan it-tip ta' rispons fil-karpjun buras (20) u fil-medaka (21). Tnaqqis fil-karatteristiċi sesswali sekondarji fl-irġiel għandu jiġi interpretat b'kawtela minħabba saħħa statistika dgħajfa, u għandu jkun ibbażat fuq ġudizzju espert u l-piż tal-evidenza. Hemm limitazzjonijiet dwar l-użu taż-żebra f'dan assaġġ, minħabba n-nuqqas ta' karatteristiċi sesswali sekondarji kwantifikabbli li jirrispondu għal sustanzi kimiċi b'effetti androġeniċi. 8. Fil-karpjun buras, l-indikatur ewlieni ta' esponiment androġeniku eżoġenu huwa l-għadd ta' tuberkuli tan-namra (nuptial tubercles) li jinsabu fuq imnieħer il-ħuta femminili. Fil-medaka, l-għadd ta' proċessi papillari jikkostitwixxi l-markatur ewlieni ta' esponiment eżoġenu għal sustanzi kimiċi androġeniċi f'ħut femminili. L-Appendiċi 5A u l-Appendiċi 5B jindikaw il-proċeduri rrakkomandati li għandhom jiġu segwiti għall-evalwazzjoni tal-karatteristiċi sesswali fil-karpjun buras u fil-medaka, rispettivament. 9. L-assaġġ ta' 21 jum jinkludi l-evalwazzjoni tal-produzzjoni kwantitattiva tal-bajd u l-preservazzjoni tal-gonadi għal eżaminazzjoni fakultattiva tal-istopatoloġija. Xi awtoritajiet regolatorji jistgħu jirrikjedu dan il-punt ta' tmiem addizzjonali għal evalwazzjoni aktar sħiħa tal-idoneità riproduttiva tal-annimali tat-test, jew f'dawk il-każijiet fejn il-vitelloġenina u l-karatteristiċi sesswali sekondarji ma rrispondewx għall-esponiment kimiku. Għalkemm xi punti ta' tmiem jistgħu jkunu dijanjostiċi ħafna (eż. induzzjoni tal-VTG fl-irġiel u formazzjoni tat-tuberkuli fin-nisa), mhux il-punti tat-tmiem kollha (eż. fekondità u istopatoloġija gonadali) fl-assaġġ huma maħsuba biex jidentifikaw b'mod inekwivoku l-mekkaniżmi ċellulari speċifiċi ta' azzjoni. Minflok, il-firxa ta' punti ta' tmiem, b'mod kollettiv, tippermetti li jsiru inferenzi fir-rigward tad-disturbanzi endokrinali possibbli u, b'hekk, tipprovdi gwida għal aktar ittestjar. Għalkemm mhijiex speċifika għall-endokrini, il-fekondità, minħabba s-sensittività murija minnha fost is-sustanzi kimiċi attivi endokrinali magħrufa (5), hija punt ta' tmiem importanti li jrid jiġi inkluż, minħabba li meta dan u punti ta' tmiem oħrajn ma jkunux affettwati, wieħed huwa aktar kunfidenti li kompost mhux probabbli jkun attiv fis-sistema endokrinali. Madankollu, meta l-fekondità tkun affettwata, hija tikkontribwixxi ħafna għall-inferenzi fil-piż tal-evidenza. F'dan il-metodu ta' ttestjar hija pprovduta gwida dwar l-interpretazzjoni tad-dejta u l-aċċettazzjoni tar-riżultati tat-test. 10. Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma mogħtija fl-Appendiċi 1. IL-PRINĊIPJU TAT-TEST 11. Fl-assaġġ, il-ħut maskili u dawk femminili li jkunu fi stat riproduttiv jiġu esposti f'reċipjenti tat-test flimkien. L-istat adult u riproduttiv tagħhom jippermetti sabiex issir differenzjazzjoni ċara bejn is-sessi, u b'hekk tkun tista' ssir analiżi relatata mas-sess ta' kull punt ta' tmiem, u jiżgura s-sensittività tagħhom lejn sustanzi kimiċi esoġeni. Fi tmiem it-test, is-sess jiġi kkonfermat permezz ta' eżami makroskopiku tal-gonadi wara ftuħ ventrali tal-addome b'imqass. Fl-Appendiċi 2 tingħata ħarsa ġenerali lejn il-kundizzjonijiet rilevanti tal-bijoassaġġ. Normalment, l-assaġġ jinbeda b'kampjun ta' ħut minn popolazzjoni li tkun f'kundizzjoni riproduttiva; ma għandhomx jintużaw annimali li qed jixjieħu. Fis-sezzjoni dwar l-Għażla tal-ħut hija pprovduta gwida dwar l-età tal-ħut u dwar l-istatus riproduttiv. L-assaġġ isir permezz ta' tliet konċentrazzjonijiet ta' sustanzi kimiċi li jintużaw għall-espożizzjoni kif ukoll kontroll tal-ilma, u kontroll tas-solvent jekk ikun hemm bżonn. Għaż-żebra jintużaw żewġ reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 5 irġiel u 5 nisa). Għall-karpjun buras jintużaw erba' reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 2 irġiel u 4 nisa). Dan isir biex tiġi akkomodata l-imġiba territorjali tal-karpjun buras maskili filwaqt li jinżamm assaġġ b'saħħtu biżżejjed. Għall-medaka jintużaw erba' reċipjenti jew repliki għal kull trattament (kull reċipjent ikun fih 3 irġiel u 3 nisa). L-espożizzjoni ssir għal 21 jum u l-kampjunar tal-ħut isir fil-21 jum tal-esponiment. Il-fekondità kwantitattiva tiġi mmonitorjata kuljum. 12. Mal-kampjunar fil-jum 21, l-annimali kollha jinqatlu bla tbatija. Il-karatteristiċi sesswali sekondarji jitkejlu fil-karpjun buras u fil-medaka (ara l-Appendiċi 5A u l-Appendiċi 5B); fiż-żebra u l-karpjun buras jinġabru kampjuni tad-demm għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina, inkella jistgħu jinġabru r-ras/id-denb għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina fiż-żebra (Appendiċi 6); fil-medaka, il-fwied jinġabar għall-analiżi tal-VTG (Appendiċi 6); il-gonadi jinżammu jew magħqudin flimkien bħala ħaġa sħiħa jew inkella mifrudin għal evalwazzjoni istopatoloġika potenzjali (22). IL-KRITERJI TA' AĊĊETTAZZJONI TAT-TEST 13. Biex ir-riżultati tat-test ikunu aċċettabbli, japplikaw il-kundizzjonijiet li ġejjin: — il-mortalità fil-kontrolli tal-ilma (jew tas-solvent) ma għandhiex taqbeż l-10 fil-mija fi tmiem il-perjodu ta' esponiment; — matul il-perjodu ta' esponiment, il-konċentrazzjoni ta' ossiġenu dissolt għandha tilħaq minimu ta' 60 fil-mija tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV); — it-temperatura tal-ilma ma għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1,5 °C bejn ir-reċipjenti tat-test fi kwalunkwe ħin matul il-perjodu ta' esponiment u għandha tinżamm fi ħdan 2 °C tal-meded tat-temperaturi speċifikati għall-ispeċi tat-test (Appendiċi 2); — għandha tkun disponibbli evidenza li turi li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test fis-soluzzjoni jkunu nżammu b'mod sodisfaċenti fi ħdan ± 20 % tal-valuri medji mkejla; — evidenza li l-ħut qed jirriproduċi b'mod attiv fir-repliki kollha qabel Jinbeda esponiment kimiku u fir-repliki ta' kontroll matul it-test. DESKRIZZJONI TAL-METODU Apparat 14. Tagħmir normali tal-laboratorju u speċjalment dan li ġej: a. ossiġenometri u apparati li jkejlu l-pH; b. tagħmir għad-determinazzjoni tal-ebusija u l-alkalinità tal-ilma; c. apparat adegwat għall-kontroll tat-temperatura u preferibbilment monitoraġġ kontinwu; d. tankijiet magħmulin minn materjal kimiku inerti u ta' kapaċità adattata b'rabta mad-densità rrakkomandata tat-tagħbija u tal-istokkjar (ara l-Appendiċi 2); e. sottostrat tal-bidien għall-karpjun buras u ż-żebra, l-Appendiċi 4 jagħti d-dettalji neċessarji. f. bilanċ preċiż biżżejjed (jiġifieri preċiż sa ± 0.5mg). Ilma 15. Kwalunkwe ilma li fih l-ispeċi tat-test juru sopravivenza u tkabbir adegwat fit-tul jista' jintuża bħala ilma tat-test. Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-test. Il-pH tal-ilma għandha tkun fil-medda ta' 6.5 sa 8.5, iżda matul test speċifiku għandha tkun f'medda ta' ± 0.5 unitajiet tal-pH. Sabiex jiġi żgurat li l-ilma tad-dilwizzjoni ma jinfluwenzax bla bżonn ir-riżultat tat-test (pereżempju billi jbiddel is-sustanza kimika tat-test); għandhom jittieħdu kampjuni f'intervalli sabiex jiġu analizzati. Għandu jsir il-kejl tal-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), l-anjoni u l-katjoni kbar (eż. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– u SO4 2–), il-pestiċidi (eż. pestiċidi organofosforiċi totali u pestiċidi organokloriniċi totali), il-karbonju organiku totali u s-solidi sospiżi, pereżempju, kull tliet xhur meta l-ilma tad-dilwizzjoni jkun magħruf li huwa relattivament kostanti fil-kwalità. Jekk ikun intwera li l-kwalità tal-ilma hija kostanti matul tal-anqas sena, id-determinazzjonijiet jistgħu jkunu inqas spissi u l-intervalli jistgħu jittawlu (eż. kull sitt xhur). Xi karatteristiċi kimiċi ta' ilma b'dilwizzjoni aċċettabbli huma elenkati fl-Appendiċi 3. Is-soluzzjonijiet tat-test 16. Is-soluzzjonijiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula jiġu preparati billi tiġi dilwita soluzzjoni ewlenija. Idealment, is-soluzzjoni ewlenija għandha tiġi ppreparata permezz ta' sempliċi tħallit jew theżżiż tas-sustanza kimika tat-test f'ilma tad-dilwizzjoni bl-użu ta' mezzi mekkaniċi (eż. tħawwid jew ultrasonikazzjoni). Biex tinkiseb soluzzjoni ewlenija konċentrata adegwata jistgħu jintużaw kolonni ta' saturazzjoni (kolonni ta' solubilità). L-użu ta' portatur ta' solvent mhuwiex rakkomandat. Madankollu, f'każ li jkun hemm bżonn ta' solvent, fl-istess ħin għandu jsir kontroll tas-solvent, fl-istess konċentrazzjoni tas-solvent bħat-trattamenti kimiċi; Għal sustanzi kimiċi li diffiċli jiġu ttestjati, solvent jista' teknikament ikun l-aħjar soluzzjoni; għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta' Gwida tal-OECD dwar l-ittestjar tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u taħlitiet diffiċli (23). L-għażla tas-solvent tiġi ddeterminata mill-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza jew tat-taħlita. Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD jirrakkomanda massimu ta' 100μl/l, li għandu jiġi osservat. Madankollu, reviżjoni riċenti (24) enfasizzat fuq tħassib addizzjonali meta jintużaw solventi għall-ittestjar tal-attività fis-sistema endokrinali. Għalhekk, huwa rrakkomandat li l-konċentrazzjoni tas-solvent, jekk ikun meħtieġ, tiġi minimizzata meta dan ikun teknikament fattibbli (skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanza kimika tat-test). 17. Għandha tintuża sistema ta' test bi fluss kontinwu. Sistema bħal din tiddistribwixxi u tiddilwixxi b'mod kontinwu soluzzjoni ewlenija tas-sustanza kimika tat-test (eż. pompa tal-kejl, dilwitur proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) sabiex twassal serje ta' konċentrazzjonijiet fil-kompartimenti tat-test. Ir-rati tal-fluss tas-soluzzjonijiet ewlenin u tal-ilma tad-dilwizzjoni għandhom jiġu ċċekkjati kull ċertu żmien, idealment kuljum, matul it-test u m'għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat l-użu ta' tubi tal-plastik ta' grad baxx jew materjal ieħor li jista' jkun fih sustanzi kimiċi bijoloġikament attivi. Meta jkun qed jintgħażel il-materjal għas-sistema bi fluss kontinwu, għandha titqies il-possibilità li s-sustanza kimika tat-test tiġi adsorbita f'dan il-materjal. Iż-żamma tal-ħut 18. Il-ħut tat-test għandu jintgħażel minn popolazzjoni tal-laboratorju, idealment minn stokk wieħed, li jkun idderra għal mill-inqas ġimgħatejn qabel it-test fil-kondizzjonijiet ta' kwalità tal-ilma u ta' illuminazzjoni li jkunu simili għal dawk użati fit-test. Importanti li r-rata tat-tagħbija u d-densità tal-istokkjar (għad-definizzjonijiet, ara l-Appendiċi 1) jkunu xierqa għall-ispeċi tat-test użata (ara l-Appendiċi 2). 19. Wara perjodu ta' 48 siegħa li fih il-ħut jitħallew joqogħdu, jiġu rreġistrati l-mortalitajiet u jiġu applikati l-kriterji li ġejjin: — mortalitajiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: jintrema l-lott kollu; — mortalitajiet ta' bejn 5 % u 10 % tal-popolazzjoni: akklimatizzazzjoni għal sebat ijiem oħra; jekk ikun hemm mortalità ogħla minn 5 % matul it-tieni sebat ijiem, il-lott kollu jitwarrab; — mortalitajiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: il-lott jiġi aċċettat. 20. Matul il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni, fil-perjodu ta' qabel l-esponiment, jew matul il-perjodu ta' esponiment l-ħut m'għandux jingħata kura għal mard. Perjodu ta' qabel l-esponiment u l-għażla tal-ħut 21. Il-perjodu ta' qabel l-esponiment ta' bejn ġimgħa u ġimgħatejn huwa rrakkomandat għall-annimali mqiegħda f'reċipjenti simili għat-test proprju. Matul il-perjodu ta' żamma u matul il-fażi ta' esponiment, il-ħut għandu jiġi mitmugħ ad libitum. Il-fażi ta' esponiment tinbeda b'ħut adult sesswalment dimorfiku minn provvista tal-laboratorju ta' annimali maturi biżżejjed għar-riproduzzjoni (eż. b'karatteristiċi sesswali sekondarji li jidhru fir-rigward tal-karpjun buras u l-medaka), u li jkunu qed ibidu b'mod attiv. Għal gwida ġenerali biss (u dan ma għandux jitqies mingħajr l-osservazzjoni tal-istatus riproduttiv propju ta' lott partikolari ta' ħut), il-karpjuni buras għandu jkollhom madwar 20 (± 2) ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 25 ± 2 °C matul ħajjithom. Il-medaka Ġappuniża għandu jkollha madwar 16 (± 2)il-ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 25 ± 2 °C matul ħajjithom. Iż-żebra għandu jkollha madwar 16 (± 2)il-ġimgħa, jekk wieħed jassumi li jkunu ġew ikkulturati f'temperatura ta' 26 ± 2 °C matul ħajjithom. Il-produzzjoni tal-bajd għandha tiġi vvalutata kuljum matul il-fażi ta' qabel l-esponiment. Huwa rrakkomandat li r-riproduzzjoni tiġi osservata fit-tankijiet irreplikati kollha qabel l-inklużjoni fil-fażi tal-esponiment tal-assaġġ. F'dan l-istadju, ma tistax tiġi pprovduta gwida kwantitattiva dwar il-produzzjoni tal-bajd mixtieqa ta' kuljum, iżda huwa relattivament komuni li jiġu osservati bidien medji ta' > 10 bajdiet/femminili/jum għal kull speċi. Għandu jintuża disinn bi blokki aleatorji skont l-output tal-produzzjoni tal-bajd sabiex jiġu allokati repliki għad-diversi livelli sperimentali bil-għan li tiġi żgurata distribuzzjoni bilanċjata tar-repliki. ID-DISINN TAT-TEST 22. Jintużaw tliet konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test, kontroll wieħed (tal-ilma) u, jekk ikun hemm bżonn, kontroll tas-solvent. Id-dejta tista' tiġi analizzata sabiex jiġu determinati differenzi statistikament sinifikanti bejn ir-risponsi għat-trattament u għall-kontroll. Dawn l-analiżijiet ser jindikaw jekk hemmx il-ħtieġa ta' ittestjar ulterjuri aktar fit-tul għal effetti avversi (jiġifieri, is-sopravivenza, l-iżvilupp, it-tkabbir u r-riproduzzjoni) għas-sustanza kimika, aktar milli għall-użu fil-valutazzjoni tar-riskju (25). 23. Għaż-żebra, fil-jum 21 tal-esperiment, jittieħdu kampjuni ta' rġiel u nisa minn kull livell ta' trattament (5 irġiel u 5 nisa f'kull wieħed miż-żewġ repliki) u mill-kontroll(i) għall-kejl tal-vitelloġenina. Għall-medaka, fil-jum 21 tal-esperiment, jittieħdu kampjuni ta' rġiel u nisa minn kull livell ta' trattament (3 irġiel u 3 nisa f'kull wieħed mill-erba' repliki) u mill-kontroll(i) għall-kejl tal-vitelloġenina u tal-karatteristiċi sesswali sekondarji. Għall-karpjun buras, fil-jum 21 ta' esponiment, l-irġiel u n-nisa (2 irġiel u 4 nisa f'kull wieħed mill-erba' repliki) u mill-kontroll(i) jiġu kampjunati għall-kejl tal-vitelloġenina u tal-karatteristiċi sesswali sekondarji. Hija meħtieġa valutazzjoni kwantitattiva tal-fekondità u t-tessuti gonadali għandhom jitqiegħdu sħaħ jew mifrudin tkun tista' ssir evalwazzjoni istopatoloġika, jekk tkun meħtieġa. L-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test 24. Għall-finijiet ta' dan it-test, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tiġi stabbiliti mill-konċentrazzjoni massima tollerata (MTC) li tiġi ddeterminata minn range finder jew minn dejta oħra dwar it-tossiċità, jew 10 mg/l, jew is-solubilità massima fl-ilma, skont liema tkun l-aktar baxxa. L-MTC hija definita bħala l-ogħla konċentrazzjoni tat-test tas-sustanza kimika li twassal għal mortalità ta' inqas minn 10 %. L-użu ta' dan l-approċċ jassumi li teżisti dejta empirika dwar tossiċità akuta jew dejta oħra dwar it-tossiċità li minnha tista' tiġi stmata l-MTC. L-istima tal-MTC tista' ma tkunx eżatta u normalment teħtieġ ċertu ġudizzju professjonali. 25. Huma meħtieġa tliet konċentrazzjonijiet tat-test, spazjati b'fattur kostanti li ma jaqbiżx l-10, u kontroll ta' ilma tad-dilwizzjoni (u kontroll tas-solvent jekk ikun meħtieġ). Huwa rrakkomandat li l-fatturi ta' spazjar jkunu f'firxa ta' bejn 3.2 u 10. PROĊEDURA L-għażla u l-użin tal-ħut tat-test 26. Huwa importanti li fil-bidu tal-assaġġ tiġi minimizzata l-varjazzjoni fil-piż tal-ħut. Il-meded ta' daqsijiet adattati għall-ispeċi differenti rrakkomandati għall-użu f'dan it-test huma mogħtija fl-Appendiċi 2. Għal-lott kollu ta' ħut użat fit-test, il-medda tal-piżijiet individwali għall-ħut maskili u femminili fil-bidu tat-test għandha, jekk possibbli, tinżamm bejn ± 20 % tal-piż medju aritmetiku tal-istess sess. Huwa rrakkomandat li qabel it-test jintiżen sottokampjun tal-istokk tal-ħut sabiex jiġi stmat il-piż medju. Kundizzjonijiet tal-Esponiment Durata 27. It-test idum għaddej 21 jum, wara perjodu ta' qabel l-esponiment. Il-perjodu ta' qabel l-esponiment rrakkomandat huwa ta' bejn ġimgħa u ġimgħatejn. Tmigħ 28. Il-ħut għandu jiġi mitmugħ ad libitum b'ikel addattat (Appendiċi 2) b'rata suffiċjenti biex tinżamm il-kundizzjoni tal-ġisem. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tkabbir mikrobiku u turbidità fl-ilma. Bħala gwida ġenerali, ir-razzjon ta' kuljum jista' jinqasam f'żewġ jew tliet porzjonijiet ugwali għal tmigħ multiplu kuljum, separat b'mill-inqas tliet sigħat bejn kull tmigħ. Huwa aċċettabbli li jingħata razzjon akbar uniku b'mod partikolari għal tmiem il-ġimgħa. Il-ħut m'għandux jingħata x'jiekol għal 12-il siegħa qabel il-kampjunar/nekroskopija. 29. L-ikel tal-ħut għandu jiġi evalwat għall-preżenza ta' kontaminanti bħal pestiċidi organokloriniċi, idrokarboni aromatiċi poliċikliċi (PAHs), bifenili poliklorinati (PCBs). Għandu jiġi evitat ikel b'livell għoli ta' fitoestroġeni li jista' jikkomprometti r-rispons tal-assaġġ għal agonisti magħrufa tal-estroġenu (eż. 17b- estradiol). 30. Ikel mhux mikul u materjal tar-rawt għandu jitneħħa mir-reċipjent tat-test tal-inqas darbtejn fil-ġimgħa, eż. billi l-qiegħ ta' kull tank jitnaddaf sew permezz ta' sifun. Id-dawl u t-temperatura 31. Il-fotoperjodu u t-temperatura tal-ilma għandhom ikunu adattati għall-ispeċi tat-test (ara Appendiċi 2). Il-Frekwenza tal-Kejl u d-Determinazzjonijiet Analitiċi 32. Qabel jibda l-perjodu ta' qabel l-esponiment, għandu jiġi żgurat li s-sistema tat-twassil tas-sustanza kimika taħdem kif suppost. Għandhom jiġu stabbiliti l-metodi analitiċi kollha meħtieġa, inkluż għarfien suffiċjenti dwar l-istabilità kimika fis-sistema tat-test. Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza kimika tat-test jiġu determinati f'intervalli regolari, kif ġej: preferibbilment, ir-rati tal-fluss tas-soluzzjoni ewlenija dilwenti u tossikanti għandhom jiġu vverifikati kuljum, iżda mill-inqas darbtejn fil-ġimgħa, u ma għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul it-test. Huwa rrakkomandat li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi tat-test innifsu jitkejlu fir-reċipjenti kollha fil-bidu tat-test u f'intervalli ta' ġimgħa wara dan. 33. Huwa rrakkomandat li r-riżultati jkunu bbażati fuq il-konċentrazzjonijiet imkejla. Madankollu, jekk matul it-test il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test fis-soluzzjoni tkun inżammet b'mod sodisfaċenti bejn ±20 % tal-konċentrazzjoni nominali, ir-riżultati jkunu jistgħu jiġu bbażati fuq valuri nominali jew valuri mkejla. 34. Il-kampjuni jistgħu jeħtieġu jiġu ffiltrati (eż. bl-użu ta' pori ta' μ0.45 μm) jew jiġu ċentrifugati. Jekk ikun hemm bżonn, imbagħad iċ-ċentrifugazzjoni hija l-proċedura rrakkomandata. Madankollu, jekk il-materjal tat-test ma jiġix adsorbit mill-filtri, il-filtrazzjoni tista' tkun aċċettabbli wkoll. 35. Matul it-test, l-ossiġenu dissolt, it-temperatura, u l-pH għandhom jitkejlu fir-reċipjenti kollha tat-test tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-ebusija u l-alkalinità totali għandhom jitkejlu fil-kontrolli u f'reċipjent wieħed fl-ogħla konċentrazzjoni tal-anqas darba fil-ġimgħa. Idealment, it-temperatura għandha tiġi ssorveljata kontinwament f'mill-inqas reċipjent wieħed tat-test. Osservazzjonijiet 36. Għadd ta' risponsi ġenerali (eż. sopravivenza) u risponsi bijoloġiċi ewlenin (eż. il-livelli tal-vitelloġenina) jiġu vvalutati matul l-assaġġ jew fi tmiem l-assaġġ. Jeħtieġ li kuljum isir il-monitoraġġ kwantitattiv tal-fekondità. Il-kejl u l-valutazzjoni ta' dawn il-punti ta' tmiem u l-utilità tagħhom huma deskritti hawn taħt. Sopravivenza 37. Matul il-perjodu tat-test, il-ħut għandu jiġi eżaminat kuljum u kwalunkwe mortalità għandha tiġi rreġistrata u l-ħut mejjet għandu jitneħħa malajr kemm jista' jkun. Il-ħut mejjet m'għandux jiġi sostitwit la fir-reċipjent tal-kontroll u lanqas fir-reċipjent tat-trattament. Is-sess tal-ħut li jmut matul it-test għandu jiġi determinat permezz ta' evalwazzjoni makroskopika tal-gonadi. Imġiba u dehra 38. Għandha tittieħed nota ta' kwalunkwe mġiba abnormali (relatata mal-kontrolli); din tista' tinkludi sinjali ta' tossiċità ġenerali inklużi iperventilazzjoni, għawm mhux ikkoordinat, telf tal-bilanċ u inattivitá jew tmigħ mhux tas-soltu. Barra minn hekk għandha tittieħed nota ta' anormalitajiet esterni (bħal emorraġija, skolorazzjoni). Dawn is-sinjali ta' tossiċità għandhom jiġu kkunsidrati bir-reqqa waqt l-interpretazzjoni tad-dejta peress li jistgħu jindikaw konċentrazzjonijiet li fihom il-bijomarkaturi ta' attività endokrinali ma jkunux affidabbli. Dawn l-osservazzjonijiet tal-imġiba jistgħu anke jipprovdu informazzjoni kwalitattiva biex jinkiseb tagħrif dwar rekwiżiti futuri potenzjali għall-ittestjar tal-ħut. Pereżempju, fil-karpjuni buras, f'irġiel normali jew f'nisa b'karatteristiċi maskili ġiet osservata aggressività territorjali matul esponiment androġeniku; fiż-żebra, l-imġiba karatteristika ta' tgħammir u riproduzzjoni wara li jinxtegħel id-dawl tiddgħajjef jew tiġi mfixkla minn esponiment estroġeniku jew antiandroġeniku. 39. Billi xi aspetti tad-dehra (primarjament il-kulur) jistgħu jinbidlu malajr bit-tqandil, importanti li l-osservazzjonijiet kwalitattivi jsiru qabel ma l-annimali jitneħħew mis-sistema tat-test. L-esperjenza miksuba sa issa bil-karpjuni buras tissuġġerixxi li, għall-ewwel, xi sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali jistgħu jikkawżaw tibdil fil-karatteristiċi esterni li ġejjin: il-kulur tal-ġisem (ċar jew skur), mudelli ta' kolorazzjoni (il-preżenza ta' strixxi vertikali) u l-forma tal-ġisem (ir-ras u r-reġjun pettorali). Għalhekk, l-osservazzjonijiet dwar id-dehra fiżika tal-ħut għandhom isiru matul it-test, u fi tmiem l-istudju Fekondità 40. L-osservazzjonijiet kwantitattivi ta' kuljum tar-riproduzzjoni għandhom jiġu rreġistrati fuq bażi rreplikata. Il-produzzjoni tal-bajd għandha tiġi rreġistrata bħala l-għadd ta' bajd/nisa li jibqgħu ħajjin/jum fuq bażi rreplikata. Il-bajd jitneħħa kuljum mill-kompartimenti tat-test. Is-sottostrati riproduttivi għandhom jitqiegħdu fil-kompartimenti tat-test għall-karpjun buras u għaż-żebra sabiex il-ħut ikun jista' jbid f'kundizzjonijiet normali. L-Appendiċi 4 jagħti aktar dettalji tas-sottostrati riproduttivi għaż-żebra (Appendiċi 4A) u għall-karpjun buras (Appendiċi 4B). Mhuwiex meqjus bħala neċessarju li jiġi pprovdut sottostrat riproduttiv għall-medaka. Il-qtil bla tbatija tal-ħut 41. Fil-jum 21, jiġifieri fi tmiem l-esponiment, il-ħut għandu jiġi ewtanizzat b'ammonti xierqa ta' Trikaina (Trikaina metan sulfonat, Metakaina, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l ibbaferjat bi 300 mg/l NaHCO3 (bikarbonat tas-sodju, CAS.144-55-8) biex titnaqqas l-irritazzjoni fil-membrana mukuża; imbagħad jittieħed kampjun tad-demm jew tat-tessut għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina, kif spjegat fis-sezzjoni tal-vitelloġenina. Osservazzjoni tal-karatteristiċi sesswali sekondarji 42. Ċerti sustanzi kimiċi attivi fis-sistema endokrinali jistgħu jikkawżaw tibdil fil-karatteristiċi sesswali sekondarji speċjalizzati (l-għadd ta' tuberkuli tan-namra fil-karpjun buras maskili, il-proċessi papillari fil-medaka maskili). B'mod partikolari, sustanzi kimiċi li jkollhom ċerti modi ta' azzjoni jistgħu jikkawżaw l-okkorrenza anormali ta' karatteristiċi sesswali sekondarji fl-annimali tas-sess oppost; pereżempju, agonisti tar-riċettur tal-androġenu, bħal trenbolon, metiltestosteron u diidrotestosteron, jistgħu jwasslu sabiex il-karpjuni buras femminili jiżviluppaw tuberkuli tan-namra prominenti jew sabiex il-medaka femminili tiżviluppa proċessi papillari (11, 20, 21). Ġie rrapportat ukoll li l-agonisti tar-riċettur tal-estroġenu jistgħu jnaqqsu l-għadd tat-tuberkuli tan-namra u d-daqs tal-kuxxinett tal-kozz dorsali f'irġiel adulti ta' karpjun buras (26, 27). Dawn l-osservazzjonijiet morfoloġiċi grossi jistgħu jipprovdu tagħrif kwalitattiv u kwantitattiv siewi biex jingħata tagħrif dwar rekwiżiti futuri potenzjali għall-ittestjar tal-ħut. L-għadd u d-daqs tat-tuberkuli tan-namra fil-karpjun buras u l-proċessi papillari fil-medaka jistgħu jiġu kkwantifikati b'mod dirett jew b'mod aktar prattiku f'kampjuni ppreservati. Il-proċeduri rrakkomandati għall-evalwazzjoni tal-karatteristiċi sesswali sekondarji fil-karpjun buras u fil-medaka huma disponibbli mill-Appendiċi 5A u mill-Appendiċi 5B, rispettivament. Vitelloġenina (VTG) 43. Id-demm jinġabar mill-arterja/vina kawdali permezz ta' tubulu kapillari mikroematokritiku eparinizzat, jew inkella permezz ta' titqiba fil-qalb b'siringa. Skont kemm hi kbira l-ħuta, il-volumi tad-demm li jistgħu jinġabru ġeneralment ivarjaw bejn 5 u 60 μl għal kull ħuta individwali għall-karpjuni buras u minn 5-15 μl għal kull ħuta individwali għaż-żebra. Il-plażma tiġi separata mid-demm permezz ta' ċentrifugazzjoni, u tinħażen ma' inibituri tal-proteażi f'temperatura ta' – 80 °C, sakemm tiġi analizzata għall-vitelloġenina. Inkella, fil-medaka jintuża l-fwied, u fiż-żebra jista' jintuża l-omoġenat tar-ras/denb bħala sors ta' tessut għad-determinazzjoni tal-vitelloġenina (Appendiċi 6). Il-kejl tal-VTG għandu jkun imsejjes fuq metodu ELISA omologu vvalidat, bl-użu ta' standard omologu tal-VTG u antikorpi omologi. Huwa rrakkomandat li jintuża metodu li jkun kapaċi jiskopri livelli ta' VTG baxxi daqs ftit ng/ml fil-plażma (jew ng/mg fit-tessut), li huwa l-livell ta' sfond f'ħut maskili li ma jkunx ġie espost. 44. Il-kontroll tal-kwalità tal-analiżi tal-vitelloġenina jintlaħaq permezz tal-użu ta' standards, bjanki u mill-inqas analiżijiet duplikati. Għal kull metodu ELISA, għandu jsir test għall-effett matriċi (effett ta' dilwizzjoni ta' kampjun) biex jiġi determinat il-fattur minimu tad-dilwizzjoni tal-kampjun. Kull platt ELISA li jintuża għall-assaġġi tal-VTG għandu jinkludi l-kampjuni tal-kontroll tal-kwalità li ġejjin: mill-inqas 6 standards ta' kalibrazzjoni li jkopru l-firxa ta' konċentrazzjonijiet mistennija tal-vitelloġenina u mill-inqas bjank tal-assaġġ vinkolanti mhux speċifiku wieħed (analiżi duplikata). L-assorbiment ta' dawn il-bjanki għandu jkun ta' anqas minn 5 % tal-assorbiment standard massimu ta' kalibrazzjoni. Minn kull kampjun ta' dilwizzjoni jiġu analizzati tal-anqas żewġ alikwoti (well-duplicates). Well-duplicates li jvarjaw b'aktar minn 20 % għandhom jerġgħu jiġu analizzati. 45. Il-koeffiċjent tal-korrelazzjoni (R2) għall-kurvi ta' kalibrazzjoni għandu jkun ta' aktar minn 0.99. Madankollu, korrelazzjoni għolja mhijiex biżżejjed biex tiggarantixxi tbassir adegwat tal-konċentrazzjoni fil-meded kollha. Minbarra li jkun hemm korrelazzjoni għolja biżżejjed għall-kurva ta' kalibrazzjoni, il-konċentrazzjoni ta' kull standard, kif ikkalkolata mill-kurva ta' kalibrazzjoni, dejjem għandha taqa' bejn 70 u 120 % tal-konċentrazzjoni nominali tiegħu. Jekk il-konċentrazzjonijiet nominali jxaqilbu lil hinn mil-linja ta' rigressjoni tal-kalibrazzjoni (eż. f'konċentrazzjonijiet inqas), jista' jkun hemm bżonn li l-kurva ta' kalibrazzjoni tinqasam f'meded baxxi u għoljin jew li jintuża mudell nonlineari li jaqbel b'mod adegwat mad-dejta dwar l-assorbiment. Jekk il-kurva tinqasam, iż-żewġ segmenti tal-linja għandu jkollhom R2 > 0.99. 46. Il-limitu ta' detezzjoni (LOD) huwa definit bħala l-konċentrazzjoni tal-inqas standard analitiku, u l-limitu ta' kwantitazzjoni (LOQ) huwa definit bħala l-konċentrazzjoni tal-inqas standard analitiku mmoltiplikata bl-inqas fattur ta' dilwizzjoni. 47. F'kull jum li fih isiru l-assaġġi tal-vitelloġenina għandu jiġi analizzat kampjun ta' fortifikazzjoni permezz ta' standard ta' referenza interassaġġi (Appendiċi 7). Il-proporzjon tal-konċentrazzjoni mistennija għall-konċentrazzjoni mkejla jiġi rrapportat flimkien mar-riżultati minn kull sett ta' assaġġi li jkunu saru dakinhar. Evalwazzjoni tal-istopatoloġija gonadali 48. Jista' jkun meħtieġ li ssir istopatoloġija gonadali mill-awtoritajiet regolatorji sabiex ikunu jistgħu jistudjaw l-organu fil-mira fuq l-assi tal-HPG wara l-esponiment kimiku. F'dan ir-rigward, il-gonadi jitqiegħdu sħaħ jew dissezzjonati. Meta tkun meħtieġa istopatoloġija, għandhom jiġu mfittxija risponsi endokrinali speċifiċi fuq il-gonadi fil-valutazzjoni tal-attività endokrinali tas-sustanza kimika tat-test. Dawn ir-risponsi dijanjostiċi essenzjalment jinkludu l-preżenza ta' ooċiti testikulari, iperplażja taċ-ċellula Leydig, tnaqqis fil-formazzjoni tal-isfar tal-bajd, żieda fl-ispermatogonija u iperplażja perifollikulari. Leżjonijiet gonadali oħrajn, bħal atreżja tal-ooċiti, diġenerazzjoni testikulari u bidliet fl-istadji, jista' jkollhom diversi kawżi. Id-dokument ta' Gwida dwar l-istopatoloġija gonadali tal-ħut jispeċifika l-proċeduri li jintużaw fid-dissezzjoni, il-fissazzjoni, is-sezzjonar u l-evalwazzjoni istopatoloġika tal-gonadi (22). DEJTA U RAPPORTAR Valutazzjoni tar-Risponsi tal-Bijomarkatur permezz ta' Analiżi tal-Varjanza (ANOVA) 49. Biex tiġi identifikata l-attività endokrinali potenzjali ta' sustanza kimika, ir-risponsi jitqabblu bejn il-gruppi ta' trattament u ta' kontroll permezz ta' analiżi tal-varjanza (ANOVA). Meta jintuża kontroll tas-solvent, għandu jsir test statistiku xieraq bejn il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u l-kontroll tas-solvent għal kull punt ta' tmiem. Gwida dwar kif tittratta d-dejta dwar il-kontroll tal-ilma tad-dilwizzjoni u tas-solvent fl-analiżi statistika sussegwenti tista' tinstab fl-OECD, 2006c (28). Id-dejta kollha dwar ir-rispons bijoloġiku għandha tiġi analizzata u rrapportata separatament skont is-sess. Jekk ma jintlaħqux is-suppożizzjonijiet meħtieġa għall-metodi parametriċi — distribuzzjoni mhux normali (eż. it-test ta' Shapiro-Wilk) jew varjanza eteroġena (it-test ta' Bartlett jew it-test ta' Levene), għandha tiġi kkunsidrata l-possibilità li d-dejta tiġi konvertita f'varjanzi omoġenizzati qabel ma ssir l-ANOVA, jew qabel ma ssir ANOVA ponderata. It-test ta' Dunnett (parametriku) fuq tqabbiliet multipli bejn pari jew it-test ta' Mann-Whitney b'aġġustament Bonferroni (mhux parametriku) jista' jintuża għal rispons mhux monotonu għad-doża. Jekk ir-rispons għad-doża ikun kważi monotonu jistgħu jintużaw testijiet statistiċi oħra (eż. it-test ta' Jonckheere-Terpstra jew it-test ta' Williams). Fl-Appendiċi 8 ġiet ipprovduta flowchart statistika biex tgħin fid-deċiżjoni dwar l-aktar test statistiku xieraq li għandu jintuża. Tagħrif addizzjonali jista' jinkiseb ukoll mid-Dokument tal-OECD dwar Approċċi Attwali lejn l-Analiżi Statistika ta' Dejta dwar l-Ekotossiċità (28). Rappurtar tar-riżultati tat-test 50. Id-dejta tal-istudju għandha tinkludi: Il-faċilità tal-ittestjar: — Il-persunal responsabbli u r-responsabilitajiet