ANNESS

L-Anness għar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat kif ġej:

Jiddaħħlu l-Kapitoli B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 u B.58:

“B.53. STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÀ TAL-IŻVILUPP

INTRODUZZJONI

1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-Linja Gwida dwar it-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 426 (2007). F'Ġunju 1995 f'Kopenħagen, Grupp ta' Ħidma tal-OECD dwar it-Tossiċità Riproduttiva u tal-Iżvilupp tħaddet dwar il-ħtieġa li jiġu aġġornati l-linji gwida eżistenti tal-OECD dwar it-testijiet għat-tossiċità riproduttiva u tal-iżvilupp, u l-iżvilupp ta' linji gwida ġodda għall-punti aħħarin li għadhom mhumiex koperti (1). Il-grupp ta' ħidma rrakkomanda li l-linja gwida dwar it-testijiet għan-newrotossiċità tal-iżvilupp għandhom jinkitbu fuq il-bażi ta' linja gwida tal-EPA tal-Istati Uniti, li minn dak iż-żmien 'l hawn ġiet riveduta (2). F'Ġunju 1996, saret it-tieni laqgħa ta' konsultazzjoni f'Kopenħagen biex is-Segretarjat jiġi pprovdut bi gwida fuq ir-riżultat ta' linja gwida ġdida dwar it-testijiet dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp, inklużi l-elementi ewlenin, eż., dettalji dwar l-għażla tal-ispeċi ta' annimal, il-perjodu ta' dożaġġ, il-perjodu ta' ttestjar, il-punti aħħarin li għandhom jiġu vvalutati, u l-kriterji għall-evalwazzjoni tar-riżultati. Fl-1998 ġiet ippubblikata linja gwida tal-Istati Uniti dwar valutazzjoni tar-riskju ta' newrotossiċità (3). F'Ottubru 2000 l-ewwel saret Laqgħa ta' Konsultazzjoni tal-Esperti tal-OECD u mbagħad wara sar Workshop tal-Istitut tax-Xjenza tar-Riskji tal-ILSI u fl-2005 saret laqgħa ta' konsultazzjoni tal-esperti f'Tokjo. Dawn il-laqgħat saru biex jiġu diskussi l-kwistjonijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-linja gwida kurrenti dwar it-testijiet u r-rakkomandazzjonijiet mil-laqgħat (4)(5)(6)(7) ġew ikkunsidrati fl-iżvilupp ta' dan il-metodu ta' ttestjar. Iktar informazzjoni dwar il-kondotta, l-interpretazzjoni u t-terminoloġija użata għal dan il-metodu ta' ttestjar tista' tinkiseb mid-Dokumenti ta' Gwida tal-OECD Nru 43 dwar l-‘Ittestjar u l-Valutazzjoni tat-Tossiċità Riproduttiva’ (8) u Nru 20 dwar l-‘Ittestjar tan-Newrotossiċità’(9).

KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI

2. Hemm numru ta' sustanzi kimiċi li huma magħrufin li jipproduċu effetti newrotossiċi tal-iżvilupp fil-bniedem u speċi oħrajn (10)(11)(12)(13). Id-determinazzjoni tal-potenzjal għan-newrotossiċità tal-iżvilupp jaf tkun meħtieġa biex jiġu vvalutati u evalwati l-karatteristiċi tossiċi ta' sustanza kimika. L-istudji dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp huma mfasslin sabiex jipprovdu dejta, inklużi karatterizzazzjonijiet tar-rispons għad-doża, dwar l-effetti funzjonali u morfoloġiċi potenzjali fuq is-sistema nervuża fi żvilupp tal-ulied li jistgħu jfeġġu minn esponiment fl-utru u kmieni fil-ħajja.

3. Studju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp jista' jsir bħala studju separat, inkorporat fi studju dwar it-tossiċità riproduttiva u/jew dwar in-newrotissiċità fl-adulti (eż.,, il-metodi ta' ttestjar B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)), jew jiżdied ma' studji dwar it-tossiċità tal-iżvilupp qabel it-twelid (eż., il-metodu ta' ttestjar B.31 (17)). Meta l-istudju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ikun inkorporat fi ħdan jew ikun marbut ma' studju ieħor, importanti li tinżamm l-integrità taż-żewġ tipi ta' studju. L-ittestjar kollu għandu jikkonforma mal-leġiżlazzjoni applikabbli jew il-linji gwida tal-gvern u istituzzjonali għall-użu ta' annimali tal-laboratorju fir-riċerka (eż., 18).

4. Il-laboratorju tat-testijiet għandu jqis l-informazzjoni kollha għad-dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test qabel ma jagħmel l-istudju. It-tali informazzjoni ser tinkludi l-identità u l-istruttura tas-sustanza kimika; il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' kwalunkwe test ieħor in vitro jew in vivo dwar it-tossiċità fuq is-sustanza kimika; dejta tossikoloġika dwar sustanzi kimiċi strutturalment relatati; u l-użu/i antiċipat(i) tas-sustanza kimika. Din l-informazzjoni hija neċessarja biex dawk kollha kkonċernati jkunu ssodisfati li t-test huwa rilevanti għall-protezzjoni tas-saħħa tal-bniedem, u ser tgħin fl-għażla ta' doża ta' bidu xierqa.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

5. Is-sustanza kimika tat-test tingħata lill-annimali matul it-tqala u t-treddigħ. L-ommijiet jiġu ttestjati biex jiġu vvalutati l-effetti f'nisa tqal u li qed ireddgħu u dan jista' jipprovdi wkoll informazzjoni komparattiva (ommijiet versus ulied). L-ulied jingħażlu b'mod aleatorju minn fost il-boton għal evalwazzjoni tan-newrotossiċità. L-evalwazzjoni tikkonsisti f'osservazzjonijiet biex jiġu identifikati anormalitajiet grossi fis-sistema newroloġika jew fl-imġiba, inkluża l-valutazzjoni tal-iżvilupp fiżiku, l-ontoġenija tal-imġiba, l-attività motorja, il-funzjoni motorja u sensorjali, u t-tagħlim u l-memorja; u l-evalwazzjoni tal-piżijiet tal-moħħ u n-newropatoloġija matul l-iżvilupp ta' wara t-twelid u l-fażi adulta.

6. Meta l-metodu ta' ttestjar jitwettaq bħala studju separat, jistgħu jintużaw annimali disponibbli addizzjonali f'kull grupp għal proċeduri speċifiċi relatati man-newromġiba, in-newropatoloġija, in-newrokimika jew l-elettrofiżjoloġija li jitstgħu jżidu mad-dejta miksuba mill-analiżijiet rakkomandati minn dan il-metodu ta' ttestjar (16)(19)(20)(21). Il-proċeduri supplimentari jistgħu jkunu partikolarment utli meta osservazzjoni empirika, effetti antiċipati, jew mekkaniżmu/modalità ta' azzjoni jindikaw tip speċifiku ta' newrotossiċità. Dawn il-proċeduri supplimentali jistgħu jintużaw fl-ommijiet kif ukoll fil-frieħ. Barra minn hekk, proċeduri ex vivo jew in vitro jistgħu jintużaw ukoll, diment li dawn il-proċeduri ma jibdlux l-integrità tal-proċeduri in vivo.

TĦEJJIJIET GĦAT-TEST

L-għażla tal-ispeċi tal-annimali

7. L-ispeċi ppreferuta għat-test hija l-far; jistgħu jintużaw speċijiet oħrajn meta jkunu xierqa. Madankollu, il-jiem ta' tqala u ta' wara t-twelid speċifikati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma speċifiċi għal razez użati spiss ta' firien, u għandhom jingħażlu jiem komparabbli jekk tintuża speċi differenti jew razza mhux tas-soltu. L-użu ta' speċijiet oħrajn għandu jkun iġġustifikat fuq il-bażi ta' dejta tossikoloġika, farmakokinetika, u/jew oħra. Il-ġustifikazzjoni għandha tinkludi d-disponibilità ta' valutazzjonijiet tan-newromġiba u n-newropatoloġija ta' wara t-twelid speċifiċi għall-ispeċijiet. Jekk kien hemm test preċedenti li qajjem tħassib, għandhom jiġu kkunsidrati l-ispeċi/ir-razza li qajmu tħassib. Minħabba l-attributi ta' prestazzjoni li jvarjaw ta' razez ta' firien differenti, għandu jkun hemm evidenza li r-razza magħżula sabiex tintuża għandha fekondità u risponsività adegwati. L-affidabilità u s-sensittività ta' speċijiet oħrajn biex tiġi identifikata newrotossiċità tal-iżvilupp għandhom jiġu dokumentati.

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

8. It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperimenti għandha tkun 22 ± 3 °C. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 % minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Huwa possibbli wkoll li jinqeleb iċ-ċiklu tad-dawl qabel it-tgħammir u għad-durata tal-istudju, sabiex isiru valutazzjonijiet tal-punti aħħarin funzjonali u tal-imġiba matul il-perjodu mudlam (taħt dawl aħmar), jiġifieri fil-ħin li matulu normalment l-annimali jkunu attivi (22). Kwalunkwe bidla fiċ-ċiklu tad-dawl-dlam għandha tinkludi ħin adegwat biex dan iċ-ċiklu jindera ħalli l-annimali jkunu jistgħu jadattaw għaċ-ċiklu l-ġdid. Għall-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tajjeb għax-xorb. It-tip ta' ikel u ilma għandu jiġi rrapportat u t-tnejn li huma għandhom jiġu analizzati għal kontaminanti.

9. L-annimali jistgħu jitqiegħdu f'post waħedhom jew f'gaġġa fi gruppi żgħar tal-istess sess. Il-proċeduri ta' tgħammir għandhom jitwettqu f'gaġeġ adattati għall-iskop. Wara evidenza ta' kopulazzjoni jew mhux iktar minn 15-il jum ta' tqala, l-annimali mgħammrin għandhom jitqiegħdu f'gaġeġ separati f'gaġeġ tal-ħlas jew tal-maternità. Il-gaġeġ għandhom jiġu rranġati b'tali mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli minħabba l-pożizzjoni tal-gaġġa. L-annimali nisa mgħammrin għandhom jingħataw materjal tat-tibjit xieraq u definit meta jkunu waslu biex iwelldu. Huwa magħruf b'mod ġenerali li tqandil mhux kif suppost jew stress matul it-tqala jista' jirriżulta f'riżultati avversi, inkluż korriment jew żvilupp alterat tal-fetu u wara t-twelid. Bħala protezzjoni kontra telf ta' feti minħabba fatturi li mhumiex relatati mal-kura, l-annimali għandhom jitqandlu bir-reqqa matul it-tqala, u għandu jiġi evitat stress minn fatturi esterni bħal storbju żejjed fuq barra.

Tħejjija tal-annimali

10. Għandhom jintużaw annimali b'saħħithom, li draw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju u li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali fl-imgħoddi, sakemm l-istudju ma jkunx inkorporat fi studju ieħor (ara l-paragrafu 3). L-annimali tat-test għandhom jiġu karatterizati għall-ispeċi, ir-razza, is-sors, is-sess, il-piż u l-età. Kull annimal għandu jkun assenjat u jiġi mmarkat b'numru uniku ta' identifikazzjoni. Sa fejn dan ikun prattikabbli, l-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom ikunu tal-istess piż u età u fi ħdan il-medda normali tal-ispeċi u r-razza studjata. F'kull livell ta' doża għandhom jintużaw annimali nisa żgħażagħ li qatt ma welldu. Aħwa ma għandhomx jitgħammru, u għandha tinxteħet attenzjoni biex dan jiġi żgurat. Il-Jum tat-Tqala (GD) 0 huwa l-jum li fih ikunu osservati l-plakka vaġinali u/jew l-isperma. Għandu jingħata ħin adegwat ta' akklimatizzazzjoni (eż., 2-3 ijiem) meta jinxtraw annimali tqal minn fornitur. L-annimali tqal għandhom jiġu assenjati b'mod ħieles minn preġudizzji fil-gruppi ta' kontroll u kura, u sa fejn dan ikun possibbli, għandhom jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi (eż., proċedura aleatorja stratifikata hija rakkomandata biex tkun ipprovduta distribuzzjoni ndaqs fost il-gruppi kollha, bħal dik ibbażata fuq il-piż tal-ġisem). L-annimali nisa inseminati mill-istess raġel għandhom jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi.

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

11. Kull grupp tat-test u ta' kontroll għandu jkun fih numru suffiċjenti ta' annimali nisa tqal li jridu jkunu esposti għas-sustanza kimika tat-test biex jiġi żgurat li jiġi prodott numru suffiċjenti ta' ulied għal evalwazzjoni tan-newrotossiċità. Huwa rakkomandat totali ta' 20 boton f'kull livell ta' doża. Disinji tad-dożaġġ tal-grupp 'staggered' u tar-replikati huma awtorizzati jekk jintlaħqu n-numri totali ta' boton f'kull grupp, u jekk jintużaw mudelli statistiċi xierqa biex jagħtu kont għar-replikati.

12. Dakinhar tal-jum wara t-twelid (PND) 4 jew qabel (il-jum tal-ħlas huwa PND 0), id-daqs ta' kull boton għandu jkun aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda permezz ta' għażla aleatorja biex jinħareġ daqs tal-boton uniformi għall-frieħ kollha (23). Id-daqs tal-boton ma għandux jaqbeż id-daqs medju tal-boton għar-razza ta' rodituri użata (8-12). Il-boton għandu jkollhom, kemm jista' jkun, numri ndaqs ta' frieħ irġiel u nisa. L-eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż.,, fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem, mhijiex xierqa. Wara l-istandardizzazzjoni tal-boton (qtil għat-tnaqqis) u qabel iktar testijiet tal-punti aħħarin funzjonali, il-frieħ individwali li huma skedati għal testijiet ta' qabel il-ftim jew wara l-ftim għandhom jiġu identifikati b'mod uniku, billi jintuża kwalunkwe metodu umanitarju xieraq għall-identifikazzjoni tal-frieħ (eż., 24).

L-assenjament ta' annimali għal testijiet funzjonali u tal-imġiba, piżijiet tal-moħħ, u evalwazzjonijiet newropatoloġiċi

13. Il-metodu ta' ttestjar jippermetti li jittieħdu diversi approċċi fir-rigward tal-assenjament tal-annimali esposti in utero u permezz ta' treddigħ għal testijiet funzjonali u tal-imġiba, maturità sesswali, determinazzjoni tal-piż tal-moħħ, u evalwazzjoni newropatoloġika (25). Jistgħu jiżdiedu wkoll testijiet oħrajn tal-funzjoni tan-newromġiba (eż., l-imġiba soċjali), in-newrokimika jew in-newropatoloġija fuq bażi ta' każ b'każ, diment li ma tkunx kompromessal-integrità tat-testijiet oriġinali meħtieġa.

14. Il-frieħ jingħażlu minn kull grupp ta' doża u jiġu assenjati għal valutazzjonijiet tal-punti aħħarin fil-PND 4 jew wara. L-għażla tal-frieħ għandha ssir b'tali mod li ż-żewġ sessi minn kull boton f'kull grupp ta' doża jkunu rappreżentati ndaqs fit-testijiet kollha kemm jista' jkun. Għall-ittestjar tal-attività motorja, l-istess par ta' frieħ irġiel u nisa għandhom jiġu ttestjati fl-etajiet kollha ta' qabel il-ftim (ara l-paragrafu 35). Għat-testijiet kollha l-oħrajn, l-istess pari ta' annimali rġiel u nisa jew oħrajn separati jistgħu jiġu assenjati f'testijiet tal-imġiba differenti. Frieħ differenti jistgħu jkunu jeħtieġu li jiġu assenjati għal testijiet ta' frieħ li għadhom kif infatmu versus adult tal-funzjoni konjittiva sabiex jiġi evitat it-tfixkil tal-effetti tal-età u t-taħriġ minn qabel f'dawk il-kejliet (26)(27). Fil-ftim (PND 21), il-frieħ li ma jingħażlux għall-ittestjar jistgħu jinqatlu b'mod dinjituż. Kwalunkwe alterazzjoni fl-assenjamenti tal-frieħ għandha tiġi rrapportata. L-unità ta' kejl statistika għandha tkun il-boton (jew l-omm) u mhux il-grupp.

15. Hemm modi differenti ta' kif frieħ jiġu assenjati għal-eżamijiet, testijiet konjittivi, eżamijiet patoloġiċi ta' qabel u wara l-ftim, eċċ., (ara l-Figura 1 għad-disinn ġenerali u l-Appendiċi 1 għal eżempji ta' assenjament). In-numri minimi rakkomandati ta' annimali f'kull grupp ta' doża għal eżamijiet ta' qabel u wara l-ftim huma kif ġejjin:

Osservazzjonijiet kliniċi u piż tal-ġisem L-annimali Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati 20/sess (1/sess/boton) Piż tal-moħħ (wara l-fissazzjoni) PND 11-22 10/sess (1/boton) Piż tal-moħħ (mhux fissat) ~ PND 70 10/sess (1/boton) Newropatoloġija (fissazzjoni b'immersjoni jew b'perfusjoni) PND 11-22 10/sess (1/boton) Newropatoloġija (fissazzjoni b'perfusjoni) PND ~70 10/sess (1/boton) Maturità sesswali 20/sess (1/sess/boton) Fażijiet oħrajn fl-iżvilupp (fakultattiva) L-annimali kollha Ontoġenija tal-imġiba 20/sess (1/sess/boton) Attività motorja 20/sess (1/sess/boton) Funzjoni motorja u sensorja 20/sess (1/sess/boton) Tagħlim u memorja 10/sess (1) (1/boton)

Dożaġġ

16. Għandhom jintużaw tal-inqas tliet livelli ta' dożi u kontroll konkurrenti. Il-livelli ta' doża għandhom ikunu distanti biżżejjed biex tinħoloq gradazzjoni tal-effetti tossiċi. Sakemm ma jkunx limitat mill-għamla fiżikokimika jew il-proprjetajiet bijoloġiċi tas-sustanza kimika, l-ogħla livell ta' doża għandu jingħażel bl-għan li jikkaġuna xi tossiċità materna (eż.,, sinjali kliniċi, tnaqqis fiż-żieda fil-piż tal-ġisem (mhux iktar minn 10 %) u/jew evidenza ta' tossiċità li tillimita d-doża f'organu fil-mira). Id-doża għolja tista' tkun limitata għal 1 000 mg/kg/jum tal-piż tal-ġisem, b'xi eċċezzjonijiet. Pereżempju, l-esponiment mistenni tal-bniedem tista' tindika l-bżonn li jintuża livell ogħla ta' doża. Inkella għandhom isiru studji pilota jew studji preliminari ta' sejbien tal-medda biex jiġi determinat l-ogħla dożaġġ li għandu jipproduċi grad minimu ta' tossiċità materna. Jekk intwera li s-sustanza kimika tat-test hija tossika għall-iżvilupp fi studju standard tat-tossiċità tal-iżvilupp jew fi studju pilota, l-ogħla livell tad-doża għandu jkun id-doża massima li ma tikkaġunax tossiċità eċċessiva fl-ulied, jew mewt jew malformazzjonijiet in utero jew neonatali, biżżejjed biex tkun prekluża evalwazzjoni sinifikanti ta' newrotossiċità. L-inqas livell ta' doża għandu jkollu l-għan li ma jipproduċi ebda evidenza ta' tossiċità materna jew tal-iżvilupp, inkluża newrotossiċità. Għandha tingħażel sekwenza dixxendenti ta' livelli ta' doża bilgħan li jintwera kwalunkwe rispons relatat mad-doża u Livell ta' Effett Avvers Mhux Osservat (NOAEL), jew dożi qrib il-limitu ta' identifikazzjoni li jippermettu li tiġi determinata doża ta' riferiment. Intervalli maqsuma fi tnejn sa erbgħa spiss ikunu ottimali sabiex jiġu stabbiliti l-livelli ta' doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp ta' doża spiss ikun ippreferut iktar mill-użu ta' intervalli kbar ħafna (eż., iktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożaġġi.

17. Il-livelli ta' doża għandhom jingħażlu filwaqt li tittieħed f'kunsiderazzjoni d-dejta eżistenti kollha dwar it-tossiċità kif ukoll l-informazzjoni addizzjonali dwar il-metaboliżmu u t-tossikokinetika tas-sustanza kimika tat-test jew materjali relatati. Din l-informazzjoni tista' tgħin ukoll biex turi l-adegwatezza tal-iskeda tad-dożaġġ. Id-dożaġġ dirett tal-frieħ għandu jitqies fuq il-bażi tal-esponiment u l-informazzjoni farmakokinetika (28)(29). Għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni bir-reqqa l-benefiċċji u l-iżvantaġġi qabel ma jsiru studji tad-dożaġġ dirett (30).

18. Il-grupp ta' kontroll konkurrenti għandu jkun grupp ta' kontroll b'kura finta jew grupp ta' kontroll b'veikolu jekk jintuża veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika. Normalment l-annimali għandhom jingħataw l-istess volum ta' sustanzi kimiċi jew veikolu tat-test fuq bażi ta' piż tal-ġisem. Jekk jintuża veikolu jew addittiv ieħor biex jiġi faċilitat id-dożaġġ, għandhom jittieħdu f'kunsiderazzjoni l-karatteristiċi li ġejjin: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu jew iż-żamma tas-susanza kimika tat-test; effetti fuq il-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza kimika tat-test li jistgħu jibdlu l-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' ikel jew ilma jew l-istatus nutrizzjonali tal-annimali. Il-veikolu ma għandux jikkaġuna effetti li jistgħu jfixklu l-interpretazzjoni tal-istudju u la għandu jkun tossiku għan-newromġiba u lanqas ma għandu jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni jew l-iżvilupp. Għal veikoli ġodda, għandu jkun inkluż grupp ta' kontroll b'kura finta minbarra grupp ta' kontroll bil-veikolu. L-annimali fil-grupp(i) ta' kontroll għandhom jiġu ttrattati bl-istess mod bħall-annimali tal-grupp tat-test.

L-għoti ta' dożi

19. Is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test għandhom jingħataw bl-iktar rotta rilevanti għall-esponiment potenzjali tal-bniedem, u fuq il-bażi ta' informazzjoni disponibbli dwar il-metaboliżmu u d-distribuzzjoni fl-annimali tat-test. Is-soltu, ir-rotta tal-amministrazzjoni tkun orali (eż.,gavage, djetetika, permezz ta' ilma tax-xorb), iżda jistgħu jintużaw rotot oħrajn (eż., dermali, teħid man-nifs) skont il-karatteristiċi u r-rotot ta' esponiment antiċipati jew magħrufin għall-bniedem (gwida ulterjuri hija pprovduta fid-Dokument ta' Gwida 43(8)). Għandha tkun ipprovduta ġustifikazzjoni għar-rotta tal-amministrazzjoni magħżula. Is-sustanza kimika tat-test għandha tingħata kuljum bejn wieħed u ieħor fl-istess ħin tal-ġurnata.

20. Normalment, id-doża mogħtija lil kull annimal għandha tkun ibbażata fuq l-iktar determinazzjoni riċenti tal-piż tal-ġisem individwali. Madankollu, meta d-dożi jiġu aġġustati matul l-aħħar terz tat-tqala, dan għandu jsir bir-reqqa. Jekk tiġi osservata tossiċità eċċessiva fl-ommijiet ikkurati, dawk l-annimali għandhom jinqatlu b'mod dinjituż.

21. Bħala minimu, is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test għandhom jingħataw kuljum lil annimali nisa mgħammrin mill-ħin tal-impjant (GD 6) sat-treddigħ (PND 21), sabiex il-ħrief ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test matul l-iżvilupp newroloġiku ta' qabel u wara t-twelid. L-età li fiha jibda d-dożaġġ, u d-durata u l-frekwenza tad-dożaġġ, jistgħu jiġu aġġustati jekk l-evidenza tappoġġja disinn sperimentali iktar rilevanti għal esponimenti tal-bniedem. Id-durati tad-dożaġġ għandhom ikunu aġġustati għal speċijiet oħrajn biex jiġi żgurat esponiment matul il-perjodi bikrin kollha tal-iżvilupp tal-moħħ (jiġifieri ekwivalenti għal tkabbir tal-moħħ tal-bniedem ta' qabel it-twelid u kmiem wara t-twelid). Id-dożaġġ jista' jibda mill-bidu tat-tqala (GD 0) għad li għandu jittieħed f'kunsiderazzjoni l-potenzjal li s-sustanza kimika tat-test tikkaġuna telf ta' qabel l-impjant. Amministrazzjoni li tibda f'GD 6 tevita dan ir-riskju, iżda l-istadji ta' żvilupp bejn GD 0 u 6 ma jkunux ikkurati. Meta laboratorju jixtri annimali mgħammrin biż-żmien, ikun imprattiku li d-dożaġġ jinbeda minn GD 0, u b'hekk GD 6 ikun jum ta' bidu tajjeb. Il-laboratorju tat-test għandu jfassal l-iskeda tad-dożaġġ skont l-informazzjoni rilevanti dwar l-effetti tas-sustanza kimika tat-test, l-esperjenza fl-imgħoddi, u kunsiderazzjonijiet loġistiċi; dan jista' jinkludi estensjoni tad-dożaġġ wara l-ftim. Id-dożaġġ ma għandux iseħħ dakinhar tal-ħlas f'dawk l-annimali li ma jkunux għadhom welldu l-ulied tagħhom kompletament. B'mod ġenerali, huwa supponut li l-esponiment tal-frieħ ser isseħħ permezz tal-ħalib matern; madankollu, dożaġġ dirett tal-frieħ għandu jiġi kkunsidrat f'dawk il-każijiet fejn hemm nuqqas ta' evidenza ta' esponiment issuktat għall-ulied. L-evidenza tal-esponiment kontinwu tista' tinkiseb minn eż.,, informazzjoni farmakokinetika, tossiċità tal-ulied jew bidliet fil-bijoswieq (28).

OSSERVAZZJONIJIET

Osservazzjonijiet tal-ommijiet

22. L-ommijiet kollha għandhom jiġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum fir-rigward tal-kundizzjoni tas-saħħa tagħhom, inkluża l-morbidità u l-mortalità.

23. Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, b'mod perjodiku għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi iktar dettaljati (tal-inqas darbtejn matul il-perjodu tad-dożaġġ fit-tqala u darbtejn matul il-perjodu ta' dożaġġ fit-treddigħ) billi tal-inqas jintużaw għaxar ommijiet għal kull livell ta' doża. L-annimali għandhom ikunu osservati barra l-gaġġa oriġinali minn tekniċi mħarrġin li ma jafux bil-kura tal-annimali, billi jintużaw proċeduri standardizzati ħalli jiġi minimizzat l-istress tal-annimali u l-preġudizzju tal-osservaturi, u tiġi massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta dan ikun possibbli, huwa rakkomandat li l-osservazzjonijiet fi studju partikolari jsiru mill-istess tekniku.

24. Il-preżenza tas-sinjali osservati għandha tiġi rreġistrata. Kull meta dan ikun possibbli, anki l-kobor tas-sinjali osservati għandu jiġi rreġistrat. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu, iżda ma għandhomx ikunu limitati għal, bidliet fil-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet, u l-attività awtonomika (eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu u/jew teħid tan-nifs bil-ħalq, u kwalunkwe sinjal mhux tas-soltu ta' urina jew rawt).

25. Kwalunkwe rispons mhux tas-soltu fir-rigward ta' pożizzjoni tal-ġisem, livell ta' attività (eż., esplorazzjoni mnaqqsa jew miżjuda taż-żona standard) u koordinazzjoni tal-moviment għandhom jiġu osservati. Bidliet fil-mixja, (eż., imferċħa, atassja), qagħda (eż., ħotba) u r-reattività għat-tqandil, it-tqegħid jew stimuli ambjentali oħrajn, kif ukoll il-preżenza ta' movimenti kloniċi jew toniċi, konvulżjonijiet, rogħda, sterjotipi (eż.,mixmut wisq, ċaqliq tar-ras mhux tas-soltu, tidwir ripetittiv), imġiba mhux tas-soltu (eż., gdim jew lagħaq eċċessiv, awtomutilazzjoni, mixi lura, tleħħin), jew aggressjoni għandhom jiġu rreġistrati.

26. Sinjali ta' tossiċità għandhom jiġu rreġistrati, inkluż il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, il-grad, u d-durata.

27. L-annimali għandhom jiġu ppeżati fil-ħin tad-dożaġġ tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudju, darkinkhar jew qrib il-jum tal-ħlas, u fil-PND 21 (ftim). Għall-istudji ta' gavage, l-ommijiet għandhom jintiżnu tal-inqas darbtejn fil-ġimgħa. Id-dożi għandhom ikunu aġġustati fil-ħin ta' kull determinazzjoni tal-piż tal-ġisem, kif xieraq. Il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel kull ġimgħa tal-inqas matul it-tqala u t-treddigħ. Il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel tal-inqas darba fil-ġimgħa jekk l-esponiment ikun permezz tal-provvista tal-ilma.

L-osservazzjonijiet fuq ulied

28. L-ulied kollha għandhom jiġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum għal sinjali ta' tossiċità u għall-morbilità u l-mortalità.

29. Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi iktar dettaljati tal-ulied. L-ulied (tal-inqas ferħ/sess/boton wieħed) għandhom ikunu osservati minn tekniċi mħarrġin li ma jafux bil-kura tal-annimali, billi jużaw proċeduri standardizzati biex jiġi minimizzat il-preġudizzju u tiġi massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta dan ikun possibbli, huwa rakkomandat li l-osservazzjonijiet isiru mill-istess tekniku. Bħala minimu, il-punti aħħarin deskritti fil-paragrafi 24 u 25 għandhom jiġu ssorveljati kif xieraq għall-istadju tal-iżvilupp taħt osservazzjonijiet.

30. Is-sinjali kollha ta' tossiċità fl-ulied għandhom ikunu rreġistrati, inkluż il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, il-grad u d-durata.

Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp

31. Bidliet fil-fażijiet ta' żvilupp ta' qabel il-ftim (eż., ftuħ tal-pinna, ftuħ tal-għajnejn, spuntar tal-inċiż) huma ferm korrelatati mal-piż tal-ġisem (30)(31). Il-piż tal-ġisem jista' jkun l-aħjar indikatur ta' żvilupp fiżiku. Għaldaqstant, il-kejl tal-fażijiet ta' żvilupp huwa rakkomandat biss meta jkun hemm evidenza minn qabel ta' dawn il-punti aħħarin ser jipprovdu informazzjoni addizzjonali. Il-puntwalità għall-valutazzjoni ta' dawn il-parametri hija indikata fit-Tabella 1. Skont l-effetti antiċipati, u r-riżultati tal-kejliet inizjali, jista' jkun rakkomandabbli li jiżdiedu punti tal-ħin addizzjonali jew li l-kejliet isiru fi stadji oħrajn tal-iżvilupp.

32. Huwa rakkomandat li tintuża l-età ta' wara l-att sesswali minflok l-età ta' wara t-twelid meta jiġi vvalutat l-iżvilupp fiżiku (33). Jekk il-frieħ jiġu ttestjati dakinhar tal-ftim, huwa rakkomandat li dan l-ittestjar isir qabel il-ftim propju biex jiġi evitat effett ta' konfużjoni mill-istress marbut mal-ftim. Barra minn hekk, kwalunkwe ttestjar ta' wara l-ftim tal-frieħ ma għandux iseħħ matul il-jumejn ta' wara l-ftim.

Tabella 1

Il-puntwalità tal-valutazzjoni tal-fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp, u punti aħħarin funzjonali/tal-imġiba (2)

Perjodi tal-Età Punti Aħħarin Qabel il-ftim (3) Adolexxenza (3) Żgħażagħ (3) Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp Piż tal-Ġisem u Osservazzjonijiet Kliniċi fil-ġimgħa (4) tal-inqas kull ġimgħatejn tal-inqas kull ġimgħatejn Piż tal-moħħ PND 22 (5) fit-terminazzjoni Newropatoloġija PND 22 (5) fit-terminazzjoni Maturità sesswali — kif xieraq — Fażijiet oħrajn tal-iżvilupp (6) kif xieraq — — Punti aħħarin funzjonali/tal-imġiba Ontoġenija tal-imġiba Tal-inqas żewġ kejliet Attività motorja (inkluża d-drawwa) 1–3 darbiet (7) — darba Funzjoni motorja u sensorjali — darba darba Tagħlim u memorja — darba darba

33. Il-ħrief ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess eż., permezz ta' spezzjoni viżwali jew kejl tad-distanza anoġenitali (34)(35), u kull ferħ fi ħdan boton għandu jintiżen b'mod individwali fit-twelid jew ftit wara, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul it-treddigħ, u tal-inqas darba kull ġimgħatejn wara. Meta tiġi evalwata l-maturità sesswali, l-età u l-piż tal-ġisem tal-annimal meta sseħħ patenza vaġinali (36) jew separazzjoni preputjali (37) għandhom jiġu ddeterminati għal tal-inqas annimal raġel wieħed u annimal mara wieħed għal kull boton.

Ontoġenija tal-imġiba

34. L-ontoġenija tal-imġibiet magħżulin għandha titkejjel f'tal-inqas ferħ/sess/boton wieħed matul il-perjodu tal-età xieraq, bl-istess frieħ li jintużaw fil-jiem kollha tat-test għall-imġibiet kollha vvalutati. Il-jiem tal-kejl għandhom jitqassmu b'mod regolari tul dak il-perjodu biex tiġi definita l-bidla normali jew dik relatata mal-kura fl-ontoġenija ta' dik l-imġiba (38). Dawn li ġejjin huma xi eżempji ta' mġibiet li tista' tiġi vvalutata l-ontoġenija tagħhom: rifless sabiex l-annimal iqum fuq saqajh, ġeotassi negattiva u attività motorja (38)(39)(40).

L-attività motorja

35. L-attività motorja għandha tiġi ssorveljata (41)(42)(43)(44)(45) matul il-perjodi ta' età ta' qabel il-ftim u tal-adultezza. Għall-ittestjar fil-ħin tal-ftim, ara l-paragrafu 32. Is-sessjoni tat-test għandha tkun twila biżżejjed biex tintwera drawwa bejn is-sessjonijiet għal kontrolli mhux ikkurati. L-użu tal-attività motorja biex tiġi vvalutata l-ontoġenija tal-imġiba huwa ferm rakkomandat. Jekk jintuża bħala test tal-ontoġenija tal-imġiba, f'dak il-każ l-ittestjar għandu juża l-istess annimali għas-sessjonijiet kollha tat-test ta' qabel il-ftim. L-ittestjar għandu jkun spiss biżżejjed biex tiġi vvalutata l-ontoġenija tad-drawwa fi ħdan is-sessjoni (44). Dan jista' jkun jeħtieġ tliet perjodi ta' żmien jew iktar qabel, u inkluż, il-jum tal-ftim (eż., PND 13, 17, 21). L-ittestjar tal-istess annimali, jew sħab tal-boton, għandu jseħħ f'età adulta qrib tmiem l-istudju (eż., PND 60-70). L-ittestjar f'jiem addizzjonali jista' jsir kif ikun hemm bżonn. L-attività motorja għandha tiġi ssorveljata permezz ta' apparat awtomatizzat li jrireġistra l-attività li għandu jkun kapaċi jidentifika kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet fl-attività (jiġifieri attività bażi kif imkejla mill-istrument ma għandhiex tkun baxxa wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' tnaqqsijiet, u lanqas għolja wisq tant li tipprekludi l-qbid ta' żidiet fl-attività). Kull strument għandu jiġi ttestjat permezz ta' proċeduri standard biex tkun żgurata, kemm jista' jkun, l-affidabilità tal-operazzjoni bejn apparati u fost il-jiem. Kemm jista' jkun, il-gruppi tal-kura għandhom jiġu bbilanċjati bejn l-istrumenti. Kull annimal għandu jiġi ttestjat b'mod individwali. Il-gruppi tal-kura għandhom ikunu kontrobilanċjati bejn ħinijiet tat-test biex tiġi evitata konfużjoni permezz tar-ritmi ċirkadjani tal-attività. Għandhom isiru sforzi biex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test huma minimi u mhumiex sistematikament relatati mal-kura. Fost il-varjabbli li jistgħu jaffettwaw afna miżuri tal-imġiba, inkluża l-attività motorja, hemm il-livell tal-ħoss, id-daqs u l-forma tal-gaġġa tat-test, it-temperatura, l-umdità relattiva, il-kundizzjonijiet tad-dawl, l-irwejjaħ, l-użu tal-gaġġa oriġinali jew gaġġa tat-test ġdida u distrazzjonijiet ambjentali.

Il-funzjoni motorja u sensorjali

36. Il-funzjoni motorja u sensorjali għandha tiġi analizzata f'dettall tal-inqas darba għall-perjodu adoloxxenti u darba matul il-perjodu taż-żgħożija (eż., PND 60-70). Għall-ittestjar fi żmien il-ftim, ara l-paragrafu 32. Għandu jsir ittestjar suffiċjenti biex jiġi żgurat kampjunar kwantitattiv adegwat tal-modalitajiet sensorjali (eż., somatosensorjali, vestibulari) u l-funzjonijiet motorji (eż.,saħħa, koordinazzjoni). Ftit eżempji ta' testijiet għall-funzjoni motorja u sensorjali huma rispons għal forza (46), rifless biex l-annimal iqum fuq saqajh (47)(48), drawwa ta' qatgħa awditorja (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54), u potenzjali evokati (55).

Testijiet tat-tagħlim u tal-memorja

37. Għandu jsir test tat-tagħlim u l-memorja assoċjattivi wara l-ftim (eż.,, 25 ± 2 jum) u għal żgħażagħ (PND 60 u iktar). Għall-ittestjar fi żmien il-ftim, ara l-paragrafu 32. L-istess test(ijiet) jew oħrajn separati jistgħu jintużaw f'dawn iż-żewġ stadji tal-iżvilupp. Jista' jkun hemm xi flessibilità fl-għażla tat-test(ijiet) għat-tagħlim u l-memorja f'firien li jkunu għadhom kif infatmu u adulti. Madankollu, it-test(ijiet) għandhom jitfasslu b'tali mod li jissodisfaw żewġ kriterji. L-ewwel nett, it-tagħlim għandu jiġi vvalutat jew bħala bidla fuq bosta provi jew sessjonijiet ripetuti ta' tagħlim, jew, f'testijiet li jinvolvu prova waħda, b'referenza għal kundizzjoni li tivverifika hemmx effetti mhux assoċjattivi tal-esperjenza ta' taħriġ. It-tieni, it-test(ijiet) għandu jinkludi xi kejl tal-memorja (tat-terminu qasir jew fit-tul) minbarra t-tagħim oriġinali (kisba), iżda dan il-kejl tal-memorja ma jistax ikun irrapportat fin-nuqqas ta' miżura ta' kisba miksuba mill-istess test. Jekk it-test(ijiet) tat-tagħlim u l-memorja juri/u effett tas-sustanza kimika tat-test, jistgħu jiġu kkunsidrati testijiet addizzjonali biex jiġu evitati interpretazzjonijiet alternattivi bbażati fuq alterazzjonijiet fil-kapaċitajiet sensorjali, motivazzjonali u/jew motorji. Minbarra dawn iż-żewġ kriterji ta' hawn fuq, huwa rakkomandat li t-test tat-tagħlim u l-memorja jingħażel fuq il-bażi tas-sensittività murija tiegħu għall-klassi tas-sustanza kimika investigata, jekk it-tali informazzjoni tkun disponibbli fit-tagħrif. Fin-nuqqas ta' din l-informazzjoni, eżempji ta' testijiet li jistgħu jsiru biex jiġu ssodisfati -kriterji ta' hawn fuq jinkludu: evitar passiv (43)(56)(57), tlaqqigħ ittardjat mal-pożizzjoni għall-far adult (58) u għall-far tarbija (59), il-kundizzjonament olfattiv (43)(60), il-labirint fl-ilma ta' Morris (61)(62)(63), il-labirint ta' Biel jew Cincinnati (64)(65), il-labirint b'fetħiet radjali (66), il-labirint T (43), u l-kisba u ż-żamma ta' mġiba kkontrollata minn skeda (26)(67)(68). Hemm testijiet addizzjonali deskritti fit-tagħrif dwar firien li jkunu għadhom kif infatmu (26)(27) u firien adulti (19)(20).

Awtopsja

38. L-annimali materni jistgħu jiġu ewtanizzati wara l-ftim tal-ulied.

39. L-evalwazzjoni newropatoloġika tal-ulied ser issir billi jintużaw tessuti minn annimali maqtulin b'mod dinjituż fil-PND 22 jew f'punt ta' żmien qabel bejn PND 11 u PND 22, kif ukoll fi tmiem l-istudju. Għal ulied maqtulin sal-PND 22, għandhom jiġu evalwati t-tessuti tal-moħħ; għal annimali maqtulin fit-tmiem, għandhom jiġu evalwati kemm it-tessuti tas-sistema nervuża ċentrali (CNS) kif ukoll it-tessuti tas-sistema nervuża periferali (PNS). L-annimali maqtulin fil-PND 22 jew qabel jistgħu jiġu fissati jew permezz ta' immersjoni jew perfużjoni. L-annimali maqtulin fi tmiem l-istudju għandhom jiġu fissati permezz ta' perfużjoni. L-aspetti kollha tat-tħejjija tal-kampjuni ta' tessut, mill-perfużjoni tal-annimali sad-dissezzjoni tal-kampjuni tat-tessuti, l-ipproċessar tat-tessuti, u t-tilwin tas-slides għadhom iħaddmu disinn kontrobilanċjat b'tali mod li kull lott ikun fih kampjuni rappreżentattivi minn kull grupp ta' doża. Tista' tinstab gwida addizzjonali dwar in-newropatoloġija fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru. 20(9), ara wkoll (103).

L-ipproċessar ta' kampjuni tat-tessuti

40. Għandha tittieħed nota tal-anormalitajiet grossi kollha li jidhru fi żmien in-nekropsija. Il-kampjuni tat-tessut meħudin għandhom jirrappreżentaw ir-reġjuni l-kbar kollha tas-sistema nervuża. Il-kampjuni tat-tessut għandhom jinżammu b'mod fissattiv xieraq u jiġu pproċessati skont protokolli standardizzati ppubblikati dwar l-istoloġija (69)(70)(71)(103). L-impjantazzjoni tal-paraffina hija aċċettabbli għal tessuti tas-CNS u l-PNS, iżda l-użu ta' ożmju wara l-fissazzjoni, flimkien ma' impjantazzjoni tal-eposside, jista' jkun xieraq meta jkun hemm bżonn ta' grad ogħla ta' riżoluzzjoni (eż.,għal nervi periferali meta tkun suspettata newropatija periferali u/jew anaiżi morfometrika tan-nervi periferali). It-tessut tal-moħħ miġbur għal analiżi morfometrika għandu jiġi impjantat fil-midjums xierqa fil-livelli tad-doża kollha fl-istess ħin sabiex jiġu evitati oġġetti li jiċkienu li jistgħu jkunu assoċjati ma' ħażna mtawla f'fissattiv (6).

Eżami newropatoloġiku

41. L-iskopijiet tal-eżami kwalitattiv huma:

(i) li jidentifika reġjuni fis-sistema nervuża li jesibixxu evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi;

(ii) li jidentifika tipi ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi li jirriżultaw minn esponiment għas-sustanza kimika tat-test; u

(iii) li jiddetermina l-medda tas-severità tal-alterazzjonijiet newropatoloġiċi.

It-taqsimiet istoloġiċi rappreżentattivi mill-kampjuni tat-tessut għandhom jiġu eżaminati bil-mikroskopju minn patoloġista mħarreġ kif xieraq għal evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi. L-alterazzjonijiet newropatoloġiċi kollha għandhom jiġu assenjati grad suġġettiv li jindika s-severità. Tilwin b'ematossilina u eosina jista' jkun biżżejjed biex jiġu evalwati taqsimiet tal-moħħ minn annimali maqtulin b'mod dinjituż fil-PND 22, jew qabel. Madankollu, tilwin tal-mjelin (eż.,, luxol fast blue/cresyl violet) u tilwin lewn il-fidda (eż., tilwin ta' Bielschowsky jew Bodians) huma rakkomandati għat-taqsimiet tat-tessuti tas-CNS u l-PNS minn annimali maqtulin fi tmiem l-istudju. Soġġetti għall-ġudizzju professjonali tal-patoloġista u t-tip ta' alterazzjonijiet osservati, tilwin ieħor jista' jitqies xieraq biex jiġu identifikati u kkaratterizzati tipi partikolari ta' alterazzjonijiet (eż., proteina aċidika fibrillari glijali (GFAP) jew istokimika tal-lektina biex jiġu vvalutati alterazzjonijiet glijali u mikroglijali (72), fluoro-jade biex tiġi identifikata nekrożi (73)(74), jew tilwin tal-fidda speċifiku għad-deġenerazzjoni newrali (75)).

42. Għandha ssir evalwazzjoni morfometrika (kwantitattiva) peress li din id-dejta tista' tgħin fl-identifikazzjoni ta' effett relatat mal-kura u hija utli fl-interpretazzjoni tad-differenzi relatati mal-kura fil-piż tal-moħħ jew il-morfoloġija (76)(77). It-tessut nervuż għandu jiġi kampjunat u jitħejja biex tkun tista' ssir evalwazzjoni morfometrika. L-evalwazzjonijiet morfometriċi jistgħu jinkludu eż., kejliet lineari jew areali ta' reġjuni speċifiċi tal-moħħ (78). Kejliet lineari jew areali jeħtieġu l-użu ta' taqsimiet omologi magħżulin bir-reqqa fuq il-bażi ta' punti referenzjarji mikroskopiċi affidabbli (6). Tista' tintuża l-istereoloġija biex jiġu identifikati effetti relatati mal-kura fuq parametri bħall-volum jew in-numru ta' ċelloli għal reġjuni newroanatomiċi speċifiċi (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. L-imħuħ għandhom jiġu eżaminati għal kwalunkwe evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi relatati mal-kura u għandhom jittieħdu kampjuni adegwati mir-reġjuni ewlenin kollha tal-moħħ (eż., il-basal olfattivi, il-kortiċi ċerebrali, l-ippokampu, il-gangliji tal-bażi, it-talamu, l-ipotalamu, il-meżenċefalu (tektum, tegmentum, u pendunkuli ċerebrali), il-pont, il-medulla tawwalija, iċ-ċervellett) biex jiġi żgurat eżami dettaljat. Importanti li t-taqsimiet għall-annimali kollha jittieħdu fl-istess pjan. F'adulti maqtulin b'mod dinjituż fi tmiem l-istudju, għandhom jittieħdu kampjuni mit-taqsimiet rappreżentattivi tas-sinsla tad-dahar u l-PNS. Iż-żoni eżaminati għandhom jinkludu l-għajn bin-nerv ottiku u r-retina, is-sinsla tad-dahar fin-nefħiet ċervikali u lombari, il-fibri tal-għeruq dorsali u ventrali, in-nerv xjatiku prossimali, in-nerv tat-tibja prossimali (fl-irkoppa), u l-għeruq tal-muskolu tal-pexxul tan-nerv tat-tibja. It-taqsimiet tas-sinsla tad-dahar u tan-nerv periferali għandhom jinkludu kemm it-taqsimiet djagonali jew trasversali kif ukoll lonġitudinali.

44. L-evalwazzjoni newropatoloġika għandha tinkludi eżami għal indikazzjonijiet ta' ħsara tal-iżvilupp fis-sistema nervaża (6)(85)(86)(87)(88)(89), minbarra l-alterazzjonijiet ċellolari (eż., vakwolazzjoni newronali, deġenrazzjoni, nekrożi) u bidliet fit-tessut (eż., glijożi, infiltrazzjoni lewkoċitika, formazzjoni ċistika). F'dan ir-rigward, importanti li l-effetti relatati mal-kura jiġu distinti minn avvenimenti normali tal-iżvilupp li jkunu magħrufin li jseħħu fi stadju tal-iżvilupp li jikkorrispondi għall-ħin tas-sagrifiċċju (90). L-eżempji ta' alterazzjonijiet sinifikanti li jindikaw ħsara tal-iżvilupp jinkludu, iżda mhumiex limitati għal:

— alterazzjonijiet fid-daqs jew il-forma gross tal-basal olfattivi, iċ-ċerebru jew iċ-ċervellett,

— alterazzjonijiet fid-daqs relattiv tal-bosta reġjuni tal-moħħ, inklużi tnaqqisijiet jew żidiet fid-daqs tar-reġjuni li jirriżultaw mit-telf jew il-persistenza ta' popolazzjonijiet normalment temporanji ta' ċelloli jew projezzjonijiet assonali (eż., saff ġerminali estern jew ċervellett, corpus callosum),

— alterazzjonijiet fil-proliferazzjoni, il-migrazzjoni, u d-differenzazzjoni, kif indikat miż-żoni ta' apoptożi jew nekrożi eċċessiva, għoqiedi jew popolazzjonijiet mifruxin ta' newroni ektopiċi, diżorjentati jew malformati jew alterazzjonijiet fid-daqs releattiv tal-bosta saffi ta' strutturi kortikali,

— alterazzjonijiet fil-mudelli ta' mjelinazzjoni, inkluż tnaqqis ġenerali fid-daqs jew tilwin alterat ta' strutturi mjelinati,

— evidenza ta' idroċefalu, b'mod partikolari tkabbir tal-ventrikli, stenożi tal-akwedott ċerebrali u tidjiq tal-emisferi ċerebrali.

Analiżi tar-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons tal-alterazzjonijiet newropatoloġiċi

45. Hija rakkomandata l-proċedura bbażata fuq passi li ġejja għall-analiżijiet newropatoloġiċi kwalitattivi u kwantitattivi. L-ewwel nett, it-taqsimiet mill-grupp ta' doża għolja huma mqabblin ma' dawk tal-grupp ta' kontroll. Jekk ma tinstab ebda evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi fl-annimali tal-grupp ta' doża għolja, ma jkun hemm bżonn ta' ebda analiżi ulterjuri. Jekk tinsab evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġiċi fil-grupp ta' doża għolja, jiġu eżaminati l-annimali mill-gruppi ta' doża intermedja u baxxa. Jekk il-grupp ta' doża għolja jintemm minħabba mewt jew tossiċità oħra ta' konfużjoni, il-gruppi ta' doża għolja u intermedja għandhom jiġu analizzati għal alterazzjonijiet newropatoloġiċi. Jekk ikun hemm xi indikazzjoni ta' newrotossoċità fil-gruppi ta' doża baxxa, għandha ssir analiżi newropatoloġika f'dawk il-gruppi. Jekk tinstab xi alterazzjoni newropatoloġika relatata mal-kura fl-eżami kwalitattiv jew kwantitattiv, għandha tiġi ddeterminata d-dipendenza fuq id-doża tal-inċidenza, il-frekwenza u l-grad ta' severità tal-leżjonijiet jew tal-alterazzjonijiet morfometriċi, fuq il-bażi ta' evalwazzjoni tal-annimali kollha mill-gruppi ta' doża kollha. f'din l-evalwazzjoni għandhom ikunu inklużi r-reġjuni tal-moħħ li jesibixxu xi evidenza ta' alterazzjoni newropatoloġika għandhom ikunu inklużi. Ir-reġjuni kollha tal-moħħ li jesibixxu xi evidenza ta' alterazzjoni newropatoloġika għandhom Għal kull tip ta' leżjoni, għandhom jiġu deskritti l-karatteristiċi użati biex jiġi definit kull grad ta' severità, billi jiġu indikati l-karatteristiċi użati għad-differenzazzjoni ta' kull grad. Il-frekwenza ta' kull tip ta' leżjoni u l-grad ta' severità tagħha għandhom jiġu rreġistrati u għandha ssir analiżi statistika biex tiġi evalwata l-għamla ta' relazzjoni bejn id-doża u r-rispons. Huwa rakkomandat li jintużaw slides kodifikati (91).

DEJTA U RAPPORTAR

Dejta

46. Id-dejta għandha tiġi rrapportata b'mod individwali u tinġabar fil-qosor f'forma tabulari, li għal kull grupp tat-test turi t-tipi ta' bidla u n-numru ta' ommijiet, l-ulied skont is-sess, u l-boton li juru kull tip ta' bidla. Jekk ikun sar esponiment dirett tal-frieħ wara t-twelid, għandhom jiġu rrapportati r-rotta, id-durata u l-perjodu ta' esponiment.

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

47. Studju dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ser jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' esponiment ripetut għal sustanza kimika matul żvilupp in utero u kmieni wara t-twelid. Peress li jinxteħet enfasi kemm fuq punti aħħarin tat-tossiċità ġenerali kif ukoll tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, ir-riżultati tal-istudju ser jippermettu li ssir distinzjoni bejn effetti tan-newrożvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta' tossiċità materna, u dawk li jkunu espressi biss f'livelli li huma tossiċi wkoll għall-annimal matern. Minħabba l-interrelazzjonijiet kumplessi bejn id-disinn tal-istudji, l-analiżi statistika, u l-importanza bijoloġika tad-dejta, interpretazzjoni adegwata tad-dejta dwar in-newrotossiċità tal-iżvilupp ser tinvolvi ġudizzju tal-esperti (107)(109). L-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test għandha tuża approċċ ta' piż tal-evidenza (20)(92)(93)(94). Għandhom jiġu diskussi l-mudelli tas-sejbiet tal-imġiba jew morfoloġiċi, jekk ikunu preżenti, kif ukoll evidenza tar-rispons għad-doża. Dejta mill-istudji kollha rilevanti għall-evalwazzjoni tan-newrotossiċità tal-iżvilupp, inklużi studji jew rapporti ta' każijiet epidemjoloġiċi tal-bniedem, u studji sperimentali fuq annimali (eż., dejta tossikokinetika, informazzjoni struttura-attività, dejta minn studji oħrajn dwar it-tossiċità) għandha tkun inkluża f'din il-karatterizzazzjoni. Dan jinkludi r-relazzjoni bejn id-dożi tas-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew in-nuqqas, l-inċidenza, u d-daqs ta' kwalunkwe effett newrotissiku għal kull sess (20)(95).

48. L-evalwazzjoni tad-dejta għandha tinkludi taħdita kemm fuq l-importanza bijoloġika kif ukoll dik statistika. L-analiżi statistika għandha titqies bħala għodda li tiggwida minflok tiddetermina l-interpretazzjoni tad-dejta. In-nuqqas ta' importanza statistika ma għandux ikun l-unika bażi għall-konklużjoni ta' nuqqas ta' effett relatat mal-kura, u lanqas mal-importanza statistika ma għandha tkun l-unika ġustifikazzjoni għall-konklużjoni ta' effett relatat mal-kura. Bħala protezzjoni kontra sejbiet negattivi foloz u d-diffikultajiet inerenti fil-‘prova ta' negattiv’, għandha tiġi diskussa dejta kontroll storiku u pożittiv disponibbli, speċjalment meta ma jkun hemm l-ebda effett relatat mal-kura (102)(106). Il-probabilità ta' pożittivi foloz għandha tiġi diskussa fid-dawl tal-evalwazzjoni statistika sħiħa tad-dejta (96). L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm waħda, bejn alterazzjonijiet newropatoloġiċi u tal-imġiba osservati.

49. Ir-riżultati kollha għandhom jiġu analizzati billi jintużaw mudelli statistiċi xierqa għad-disinn sperimentali (108). L-għażla ta' analiżi parametrika jew nonparametrika għandha tkun iġġustifikata billi jiġu kkunsidrati fatturi bħall-għamla tad-dejta (trasformata jew le) u d-distribuzzjoni tagħha, kif ukoll ir-robustezza relattiva tal-analiżi statistika magħżula. L-iskop u d-disinn tal-istudju għandhom jiggwida l-għażla tal-analiżijiet statistċi biex jiġu minimizzati żbalji tat-Tip I (pożittiv falz) u tat-Tip II (negattiv falz)(96)(97)(104)(105). L-istudji tal-iżvilupp li jużaw speċi li jwelldu ħafna frieħ u li fihom jiġu ttestjati diversi ħrief għal kull boton għandhom jinkludu l-boton fil-mudell statistiku bħala protezzjoni kontra rati ta' żball tat-Tip I imkabbrin (98)(99)(100)(101). L-unità statistika tal-kejl għandha tkun il-boton u mhux il-ferħ. L-esperimenti għandhom jitfasslu b'tali mod li l-aħwa tal-boton ma jitqisux osservazzjonijiet indipendenti. Kwalunkwe punt aħħari mkejjel b'mod ripetut fl-istess suġġett għandu jiġi analizzat billi jintużaw mudelli statistiċi li jieħdu f'kunsiderazzjoni n-nuqqas ta' dipendenza ta' dawk il-kejliet.

Rapport tat-test

50. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sustanza kimika tat-test:

— in-natura fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fiżjokimiċi,

— dejta ta' identifikazzjoni, inkluż is-sors,

— il-purità tal-preparazzjoni, u impuritajiet magħrufin u/jew antiċipati.

Veikolu (jekk xieraq):

— ġustifikazzjoni tal-għażla tal-veikolu, jekk mhuwiex ilma jew soluzzjoni salmastra fiżjoloġika.

Annimali tat-test:

— l-ispeċi u r-razza użati, u ġustifikazzjoni jekk ma jintużax far,

— il-fornitur tal-annimali tat-test,

— in-numru, l-età fil-bidu, u s-sess tal-annimali,

— is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, l-ilma, eċċ.,

— il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.

Kundizzjonijiet tat-test:

— il-ħsieb wara l-għażla tal-livell ta' doża,

— il-ħsieb wara r-rotta tad-dożaġġ u l-perjodu ta' żmien,

— l-ispeċifikazzjonijiet tad-dożi mogħtijin, inklużi d-dettalji tal-veikolu, il-volum u l-forma fiżika tal-materjal mogħti,

— dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjoni, l-istabilità u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni,

— il-metodu użat għall-identifikazzjoni unika tal-ommijiet u l-ulied,

— deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura/i aleatorja/i użata/i biex l-ommijiet jiġu assenjati għal gruppi tal-kura, biex jingħażlu l-frieħ għall-għażla, u biex il-frieħ jiġu assenjati għal gruppi tat-test,

— dettalji tal-għoti tas-sustanza kimika tat-test,

— konverżjoni minn konċentrazzjoni tad-dieta/ilma tax-xorb jew tas-sustanza kimika tat-test li tittieħed man-nifs (ppm) għad-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli,

— il-kundizzjonijiet ambjentali,

— dettalji tal-kwalità tal-ikel u l-ilma (eż., tat-tapp, distillat);

— id-dati ta' meta beda u spiċċa l-istudju.

Osservazzjonijiet u proċeduri tat-test:

— deskrizzjoni dettaljata tal-proċeduri użati biex l-osservazzjonijiet u l-proċeduri jiġu standardizzati kif ukoll definizzjonijiet operazzjonali għall-punteġġ tal-osservazzjonijiet;

— lista tal-proċeduri kollha tat-test użati, u ġustifikazzjoni għall-użu tagħhom;

— dettalji tal-proċeduri tal-imġiba/funzjonali, patoloġiċi, newrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi użati, inklużi informazzjoni u dettalji dwar strumenti awtomatizzati;

— proċeduri għall-kalibraġġ u l-iżgurar tal-ekwivalenza tal-istrumenti u l-ibbilanċjar tal-gruppi tal-kura fil-proċeduri tal-ittestjar;

— ġustifikazzjoni qasira li tispjega kwalunkwe deċiżjoni li tinvolvi ġudizzju professjonali.

Riżultati (individwali u sommarju, inklużi l-medja u l-varjanza meta jkunu xierqa):

— in-numru ta' annimali fil-bidu tal-istudju u n-numru fi tmiem l-istudju,

— in-numru ta' annimali u boton użati għal kull metodu tat-test,

— in-numru ta' identifikazzjoni ta' kull annimal u l-boton li ġie minnu,

— id-daqs tal-boton u l-piż medju fil-bidu skont is-sess,

— dejta dwar il-piż tal-ġisem u dwar il-bidla fil-piż tal-ġisem, inkluż il-piż tal-ġisem terminali għall-ommijiet u l-ulied,

— dejta dwar il-konsum ta' ikel, u dejta dwar il-konsum ta' ilma jekk xierqa (eż., jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata permezz tal-ilma),

— dejta dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u l-livell ta' doża, inklużi sinjali tat-tossiċità jew il-mortalità, inklużi l-ħin u l-kawża tal-mewt, jekk xieraq,

— in-natura, is-severità, id-durata, il-jum tal-bidu, il-ħin tal-ġurnata, u l-kors sussegwenti tal-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati,

— il-punteġġ f'kull fażi tal-iżvilupp (il-piż, il-maturità sesswali u l-ontoġenija tal-imġiba) f'kull ħin ta' osservazzjoni,

— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha tal-imġiba, funzjonali, newropatoloġiċi, newrokimiċi, elettrofiżjoloġiċi skont is-sess, inklużi kemm żidiet kif ukoll tnaqqisiet minn kontrolli,

— sejbiet dwar in-nekropsija,

— piżijiet tal-ġisem,

— kwalunkwe dijanjosi msawra minn sinjali newroloġiċi u leżjonijiet, inklużi mard jew kundizzjonijiet li jseħħu b'mod naturali,

— stampi ta' sejbiet eżemplari,

— stampi b'enerġija baxxa biex tiġi vvalutata l-omoloġija tas-sezzjonijiet użati għall-morfometrija,

— dejta dwar l-assorbiment u l-metaboliżmu, inkluża dejta komplimentari minn studju tossikokinetiku separat, jekk disponibbli,

— it-trattament statistiku tar-riżultati, inklużi mudelli statistiċi użati biex tiġi analizzata d-dejta, u r-riżultati, irrilevanti jekk kinux sinifikanti jew le,

— lista tal-persunal tal-istudju, inkluż it-taħriġ professjonali.

Diskussjoni tar-riżultati:

— informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, skont is-sess u l-grupp,

— relazzjoni ta' kwalunkwe effett tossiku ieħor ma' konklużjoni dwar il-potenzjal newrotissiku tas-sustanza kimika tat-test, skont is-sess u l-grupp,

— l-impatt ta' kwalunkwe informazzjoni tossikokinetika fuq il-konklużjonijiet,

— is-similaritajiet tal-effetti ta' kwalunkwe newrotossiku magħruf,

— dejta li ssostni l-affidabilità u s-sensittività tal-metodu tat-test (jiġifieri dejta ta' kontroll storiku u pożittiv),

— ir-relazzjonijiet, jekk jeżistu, bejn l-effetti newropatoloġiċi u funzjonali,

— l-NOAEL jew id-doża ta' riferiment għal ommijiet u ulied, skont is-sess u l-grupp.

Konklużjonijiet:

— diskussjoni dwar l-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta bbażata fuq ir-riżultati, inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika tat-test ikkaġunatx newrotossiċità tal-iżvilupp u l-NOAEL.

TAGĦRIF

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenħagen, id-Danimarka, 13-14 ta' Ġunju 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Disponibbli fuq: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Disponibbli fuq: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., Stati Uniti, 23-25 ta' Ottubru 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Pariġi. Lulju 2008. Disponibbli fuq: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Pariġi, Settembru 2003. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Il-Kapitolu B.34 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità riproduttiva ta' ġenerazzjoni waħda.

(15) Il-Kapitolu B.35 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità riproduttiva ta' żewġ ġenerazzjonijiet.

(16) Il-Kapitolu B.43 ta' dan l-Anness, Studju dwar in-Newrotossiċità fir-Rodituri.

(17) Il-Kapitolu B.31 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossiċità tal-iżvilupp qabel it-twelid.

(18) Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi. ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33.

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, Stati Uniti. Disponibbli fuq: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Ġinevra. Disponibbli fuq: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5 A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, Londra.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644 A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figura 1

Skema ġenerali ta' ttestjar għat-testijiet funzjonali/tal-imġiba, evalwazzjoni tan-newropatoloġija, u l-piżijiet tal-moħħ. Din id-dijagramma hija bbażata fuq id-deskrizzjoni fil-paragrafi 13-15 (PND = jum ta' wara t-twelid). L-eżempji tal-assenjament tal-annimali jingħataw fl-Appendiċi 1

Appendiċi 1 1. Eżempji ta' assenjamenti possibbli huma deskritti u mdaħħlin fit-tabelli t'hawn taħt. Dawn l-eżempji huma pprovduti biex jintwera li l-assenjament tal-annimali tal-istudju għal bosta paradigmi ta' ttestjar jista' jsir b'numru ta' modi differenti. L-Ewwel Eżempju 2. Sett wieħed ta' 20 ferħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għat-testijiet ta' qabel il-ftim tal-ontoġenija tal-imġiba. Minn dawn l-annimali, 10 ifrieħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jinqatlu b'mod dinjituż fil-PND 22. L-imħuħ jitneħħew, jintiżnu u jiġu pproċessati għal evalwazzjoni istopatoloġika. Barra minn hekk, tinġabar dejta dwar il-piż tal-moħħ billi jintużaw imħuħ mill-10 irġiel u 10 nisa li jifdal għal kull livell ta' doża. 3. Sett ieħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għat-testijiet funzjonali/tal-imġiba ta' wara l-ftim (osservazzjonijiet kliniċi dettaljati, attività motorja, qatgħa awtidotjra u ttestjar tal-funzjoni konjittiva fl-adoloxxenti) u valutazzjoni tal-età tal-maturità sesswali. Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton), jiġu anestetizzati u fissati permezz ta' perfużjoni fi tmiem l-istudju (madwar il-PND 70). Wara fissazzjoni addizzjonali in situ, il-moħħ jitneħħa u jiġi pproċessat għal evalwazzjoni newropatoloġika. 4. Għall-ittestjar tal-funzjoni konjittiva fiż-żgħażagħ (eż., PND 60-70), jintuża t-tielet sett ta' 20 ferħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton). Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/grupp (raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jinqatlu fi tmiem l-istudju u l-moħħ jitneħħa u jintiżen. 5. L-20 annimal/sess/grupp li jifdal jitħallew għal testijiet addizzjonali possibbli. Tabella 1 Nru tal-ferħ (8) Numru ta' frieħ assenjati għat-test Eżami/Test m f 1 5 20 m + 20 f Ontoġenija tal-imġiba 10 m + 10 f PND 22 piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija 10 m + 10 f PND 22 piż tal-moħħ 2 6 20 m + 20 f Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati 20 m + 20 f Attività motorja 20 m + 20 f Maturità sesswali 20 m + 20 f Funzjoni motorja u sensorjali 20 m + 20 f Tagħlim u memorja (PND 25) 10 m + 10 f Piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija ta' annimali żgħażagħ ~PND 70 3 7 20 m + 20 f Tagħlim u memorja (żgħażagħ) 10 m + 10 f Piż tal-moħħ ta' annimali żgħażagħ ~ PND 70 4 8 — Annimali ta' riżerva għal sostituti jew testijiet addizzjonali Eżempju 2 6. Sett wieħed ta' 20 ferħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għall-ittestjar ta' qabel il-ftim tal-ontoġenija tal-imġiba. Minn dawn l-annimali, 10 frieħ/sess/livell ta' doża (raġel wieħed u mara waħda għal kull boton), jinqatlu b'mod dinjituż fil-PND 11. L-imħuħ jitneħħew, jintiżnu u jiġu pproċessati għal evalwazzjoni istopatoloġika. 7. Sett ieħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' doża (raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għal eżamijiet ta' wara l-ftim (osservazzjonijiet kliniċi dettaljati, attività motorja, valutazzjoni tal-età ta' maturità sesswali u funzjoni motorja u sensorjali). Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/livell ta' doża (jiġifieriraġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jiġu anestetizzati u fissati permezz ta' perfużjoni fi tmiem l-istudju (madwar il-PND 70). Wara fissazzjoni addizzjonali in situ, il-moħħ jitneħħa, jintiżen u jiġi pproċessat għal evalwazzjoni newropatoloġika. 8. Għall-ittestjar tal-funzjoni konjittiva f'annimali adoloxxenti u żgħażagħ, 10 frieħ/sess/livell ta' doża jintużaw (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton). Jintużaw annimali differenti għall-ittestjar għal testijiet tal-funzjoni konjittiva fil-PND 23 u żgħażagħ. Fi tmiem l-istudju, l-10 annimali/sess/grupp ittestjati bħala adulti jinqatlu, il-moħħ jitneħħa u jintiżen. 9. L-20 annimal/sess/grupp li jifdal li ma jingħażlux għall-ittestjar u jiġu skartati fil-ftim. Tabella 2 Nru tal-ferħ (9) Nru ta' frieħ assenjati għat-test Eżami/Test m f 1 5 20 m + 20 f Ontoġenija tal-imġiba 10 m + 10 f PND 11 piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija 2 6 20 m + 20 f Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati 20 m + 20 f Attività motorja 20 m + 20 f Maturità sesswali 20 m + 20 f Funzjoni motorja u sensorjali 10 m + 10 f Piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija ta' annimali żgħażagħ ~PND 70 3 7 10 m + 10 f (10) Tagħlim u memorja (PND 23) 3 7 10 m + 10 f (10) Tagħlim u memorja (żgħażagħ) Piż tal-moħħ ta' annimali żgħażagħ 4 8 — Annimali maqtulin u skartati PND 21. Eżempju 3 10. Sett wieħed ta' 20 ferħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għall-valutazzjoni tal-piż tal-moħħ u n-newropatoloġija fil-PND 11. Minn dawn l-annimali, 10 frieħ/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jinqatlu dinjituż fil-PND 11 u tneħħew, intiżnu u ġew ipproċessati 11-il moħħ għal evalwazzjoni istopatoloġika. Barra minn hekk, tinġabar dejta dwar il-piż tal-moħħ billi jintużaw imħuħ mhux iffissati mill-10 annimali rġiel u nisa li jifdal għal kull livell ta' doża. 11. Sett ieħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għall-ontoġenija tal-imġiba (attività motorja), eżamijiet ta' wara l-ftim (attività motorja u valutazzjoni tal-età tal-maturità sesswali), u ttestjar tal-funzjoni konjittiva fl-annimali adoloxxenti. 12. Sett ieħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jintuża għal testijiet tal-funzjoni motorja u sensorjali (qatgħa awditorja) u osservazzjonijiet kliniċi dettaljati. Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed jew mara waħda għal kull boton) jiġu anestetizzati u ffissati permezz ta' perfużjoni fi tmiem l-istudju (madwar il-PND 70). Wara l-fissazzjoni addizzjonali in situ, il-moħħ jitneħħa, jintiżen u jiġi pproċessat għal evalwazzjoni neweropatoloġika. 13. Sett ieħor ta' 20 ferħ/sess/livell ta' doża jintuża għall-ittestjar tal-funzjoni konjittiva f'annimali żgħażagħ (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton). Minn dawn, 10 annimali/sess/grupp (jiġifieri raġel wieħed u mara waħda għal kull boton) jinqatlu fi tmiem l-istudju, il-moħħ jitneħħa u jintiżen. Tabella 3 Nru tal-ferħ (11) Nru ta' frieħ assenjati għat-test Eżami/Test m f 1 5 10 m + 10 f PND 11 piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija 10 m + 10 f PND 11 piż tal-moħħ 2 6 20 m + 20 f Ontoġenija tal-imġiba (attività motorja) 20 m + 20 f Attività motorja 20 m + 20 f Maturità sesswali 20 m + 20 f Tagħlim u memorja (PND 27) 3 7 20 m + 20 f Qatgħa awditorja (adoloxxenti u żgħażagħ) 20 m + 20 f Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati 10 m + 10 f Piż tal-moħħ/newropatoloġija/morfometrija ta' annimali żgħażagħ ~PND 70 4 8 20 m + 20 f Tagħlim u memorja (annimali żgħażagħ) 10 m + 10 f Piż tal-moħħ ta' annimali żgħażagħ

Appendiċi 2 Definizzjonijiet: Sustanza kimika: Sustanza jew taħlita Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata billi jintuża dan il-metodu ta' ttestjar

B.54. BIJOASSAĠĠ UTEROTROFIKU F'RODITURI: TEST TA' TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR GĦAL PROPRJETAJIET ESTROĠENIĊI

INTRODUZZJONI

1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għall-Linja Gwida tat-Test (TG) tal-OECD Nru 440 (2007). L-OECD nediet attività ta' profil għoli fl-1998 sabiex jiġu riveduti l-linji gwida eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida ġodda għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' sustanzi potenzjali li jfixklu s-sistema endokrinali (1). Element minnhom tal-attività kien li tiżviluppa linja gwida tat-test għal Bijoassaġġ Uterotrofiku ta' rodituri. Imbagħad, il-Bijoassaġġ Uterotrofiku tar-rodituri għaddha minn programm estensiv ta' validazzjoni inkluża l-kompilazzjoni ta' dokument ta' sfond dettaljat (2)(3) u t-twettiq ta' studji estensivi fi ħdan u bejn laboratorji biex jintwerew ir-relevanza u r-riproduċibbiltà tal-bijoassaġġ b'estroġen ta' referenza potenti, agonisti riċetturi dgħajfin tal-estroġen, antagnist riċettur qawwi tal-estroġen, u sustanza kimika ta' referenza negattiva (4)(5)(6)(7)(8)(9). Dan il-metodu ta' ttestjar B.54 huwa r-riżultat tal-esperjenza miksuba matul il-programm tat-test ta' validazzjoni u r-riżultati miksubin fih b'agonisti estroġeniċi.

2. Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku huwa test ta' tgħarbil b'terminu qasir li oriġina fis-snin tletin (27)(28) u ġie standardizzat għall-ewwel darba għat-tgħarbil minn kumitat tal-esperti fl-1962 (32)(35). Huwa msejjes fuq iż-żieda fil-piż uterin jew ir-rispons uterotrofiku (għal analiżi, ara 29). Jevalwa l-ħila ta' sustanza kimika sabiex tniedi attivitajiet bijoloġiċi konsistenti ma' agonisti jew antagonisti ta' estroġeni naturali (eż. 17ß-estradjol), madankollu, l-użu tagħha għall-identifikazzjoni ta' antagonist huwa ferm inqas komuni għall-agonisti. L-utru jirrispondi għal estroġeni b'żewġ modi. Rispons inizjali huwa żieda fil-piż minħabba imbibizzjoni ta' ilma. Dan ir-rispons huwa segwit minn żieda fil-piż minħabba tkabbir fit-tessut (30). Ir-risponsi tal-utri f'firien u ġrieden huma komparabbli b'mod kwalitattiv.

3. Dan il-bijoassaġġ iservi bħala assaġġ in vivo u l-applikazzjoni tiegħu għandha titqies fil-kuntest tal-‘Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali’ (Appendiċi 2). F'dan il-Qafas Kunċettwali, il-Bijoassaġġ Uterotrofiku jinsab fil-Livell 3 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi dejta dwar mekkaniżmu endokrinali uniku, jiġifieri l-estroġeniċità.

4. Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku huwa maħsub sabiex ikun inkluż f'sensiela ta' testijiet in vitro u in vivo biex jiġu identifikati sustanzi kimiċi b'potenzjal li jinteraġixxu mas-sistema endokrinali, li finalment iwasslu għal valutazzjonijiet tar-riskju għas-saħħa tal-bniedem jew l-ambjent. Il-programm ta' validazzjoni tal-OECD uża kemm agonisti b'saħħithom kif ukoll dgħajfin biex jevalwa l-prestazzjoni tal-assaġġ fl-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi estroġeniċi (4)(5)(6)(7)(8). B'hekk, is-sensittività tal-proċedura tat-test għal agonisti tal-estroġen intweriet sew flimkien ma' riproduċibilità tajba intra u interlaboratorja.

5. Fir-rigward tal-kimiċi negattivi, fil-programm ta' valutazzjoni kienet inkluża biss sustanza kimika ‘negattiva’ ta' referenza waħda li diġà kienet irrapportata negattiva minn assaġġ uterotrofiku kif ukoll tqabbad mar-riċettur in vitro u assaġġi ta' riċetturi, iżda ġiet evalwata dejta oħra dwar it-testijiet, mhux relatata mal-programm ta' validazzjoni tal-OECD, li kompliet issostni l-ispeċifiċità tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku għat-tgħarbil ta' agonisti tal-estroġen (16).

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

6. Agonisti u antagonisti tal-estroġen jaġixxu bħala ligandi għal riċetturi tal-estroġen α and β u jistgħu jattivaw jew jinibixxu, rispettivament, l-azzjoni transkrizzjonali tar-riċetturi. Dan jista' jkollu l-potenzjal li jwassal għal perikli tas-saħħa avversa, inklużi effetti fuq ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp. Għaldaqstant, hemm il-bżonn li sustanza kimika tiġi vvalutata u evalwata bħala agonista jew antagonista possibbli tal-estroġen. Filwaqt li informattiva, l-affinità ta' ligand għal riċettur tal-estroġen jew attivazzjoni transkrizzjonali ta' ġeni rapportaturi in vitro hija waħda mill-bosta determinanti ta' periklu possibbli. Determinanti oħrajn jistgħu jinkludu attivazzjoni u diżattivazzjoni metabolika malli jidħlu fil-ġisem, distribuzzjoni f'tessuti fil-mira, u tneħħija mill-ġisem, xi ħaġa li tal-inqas tiddependi b'mod parzjali fuq ir-rotta tal-amministrazzjoni u s-sustanza kimika li tkun qed tiġi ttestjata. Dan iwassal għall-bżonn li titgħarbel l-attività possibbli ta' sustanza kimika in vivo f'kundizzjonijiet rilevanti, sakemm il-karatteristiċi dwar is-sustanza kimika rigward l-Assorbiment — id-Distribuzzjoni — il-Metaboliżmu — l-Eliminazzjoni (ADME) ma jkunux diġà pprovdew l-informazzjoni xierqa. It-tessuti tal-utri jirrispondu bi tkabbir mgħaġġel u qawwi għall-istimolu mill-estroġeni, b'mod partikolari f'rodituri tal-laboratorju, li għandhom ċiklu estruż li jdum madwar 4 ijiem. Speċi ta' rodituri, b'mod partikolari l-firien, spiss jintużaw fi studji dwar it-tossiċità għal karatterizzazzjoni tal-periki. Għaldaqstant, l-utru tar-rodituri huwa organu mira xieraq għat-tgħarbil in vivo ta' agonisti u antagonisti tal-estroġen.

7. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq dawk il-protokolli mħaddmin fl-istudju ta' validazzjoni tal-OECD li ntwera li huwa affidabbli u ripetibbli fi studji intra u interlaboratorji (5)(7). Bħalissa, hemm żewġ metodi disponibbli, jiġifieri l-metodu tal-annimal mara adulta b'ovarettomija (metodu ovx-adult) u l-metodu tal-annimal mara immatura mingħajr ovarettomija (metodu immatur). Fil-programm tat-test ta' validazzjoni tal-OECD intwera li ż-żewġ metodi għandhom sensittività u riproduċibbiltà paragunabbli. Madankollu, l-immatur, peress li għandu assi ipotalamiku-pitwitarju-gonadali (HPG) intatt, huwa kemxejn inqas speċifiku iżda jkopri ambitu usa' ta' investigazzjoni mill-annimal ovarettomjat għaliex kapaċi jwieġeb għal sustanzi kimiċi li jinteraġixxu mal-assi HPG minflok ir-riċettur tal-estroġen biss. L-assi HGP tal-far huwa funzjonali fl-età ta' madwar 15-il jum. Qabel din, il-pubertà ma tistax titħaffef b'kuri bħal GnRH. Malli l-annimali nisa jibdew jilħqu l-pubertà, qabel il-ftuħ vaġinali, l-annimali nisa ser ikollhom ċikli silenzjużi li ma jirriżultawx fi ftuħ vaġinali jew ovulazzjoni, iżda hemm xi bidliet ormonali. Jekk sustanza kimika tistimola l-assi HPD b'mod dirett jew indirett, jirriżultaw pubertà prekoċi, ovluzzjoni bikrija u ftuħ vaġinali mħaffef. Mhux biss is-sustanzi kimiċi li jaġixxu fuq l-assi HPG jagħmlu dan iżda ċerti dieti b'livelli ogħla ta' enerġija metabolizzabbli minn oħrajn ser jistimolaw it-tkabbir u jħaffu l-ftuħ vaġinali bla ma jkunu estroġeniċi. It-tali sustanzi kimiċi ma jinduċux rispons uterotrofiku f'annimali adulti OVX peress li l-assi HPG tagħhom ma jaħdimx.

8. Għal raġunijiet ta' benessri tal-annimali, għandha tingħata preferenza lill-metodu billi jintużaw firien immaturi, billi tiġi evitata kura ta' qabel il-kirurġija tal-annimali u jiġi evitat nuqqas ta' użu possibbli ta' dawk l-annimali li jindikaw kwalunkwe evidenza ta' dħul fil-fażi estruża (ara l-paragrafu 30).

9. Ir-rispons uterotrofiku mhuwiex kompletament ta' oriġini estroġenika, jiġifieri sustanzi kimiċi li mhumiex agonisti jew antagonisti ta' estroġeni jistgħu jipprovdu rispons ukoll. Pereżempju, dożi relattivament għoljin ta' proġesteron, testosteron, jew diversi proġestini sintetiċi kollha jistgħu jwasslu għal rispons stimolattiv (30). Kwalunkwe rispons jista' jkun analizzat b'mod istoloġiku għal keratinizzazzjoni u kornifikazzjoni tal-vaġina (30). Tkun xi tkun l-oriġini possibbli tar-rispons, riżultat pożittiv ta' Bijoassaġġ Uterotrofiku normalment għandu jniedi azzjonijiet għal iktar kjarifika. Evidenza addizzjonali tal-estroġeniċità tista' tiġi minn assaġġi in vitro, bħall-assaġġi li jaqbdu mal-ER u assaġġi ta' attivazzjoni transkrizzjonali, jew minn assaġġi in vivo oħrajn bħall-assaġġ tal-pubertà tal-annimali nisa.

10. Peress li l-Bijoassaġġ Uterotrofiku jservi bħala assaġġ tat-tgħarbil in vivo, l-approċċ ta' validazzjoni meħud qeda kemm kunsiderazzjonijiet relatati mal-benessri tal-annimali kif ukoll strateġija ta' ttestjar b'saffi. Għal dan l-għan, sar sforz biex jiġu vvalidti b'mod rigoruż ir-riproduċibilità u s-sensittività għall-estroġeniċità — it-tħassib ewlieni għal ħafna susanzi kimiċi-, filwaqt li ftit li xejn sar sforz fir-rigward tal-komponent tal-antiestroġeniċità tal-assaġġ. Huwa biss antiestroġen wieħed b'attività b'saħħitha li ġie ttestjat peress li n-numru ta' sustanzi kimiċi bi profil antiestroġeniku ċar (mhux oskurat minn xi attività estroġenika) huwa ferm limitat. B'hekk, dan il-metodu ta' ttestjar huwa ddedikat għall-protokoll estroġeniku, filwaqt li l-protokoll li jiddeskrivi l-modalità antagonista tal-assaġġ huwa inkluż f'Dokument ta' Gwida (37). Ir-riproduċibilità u s-sensittività tal-assaġġ għas-sustanzi kimiċi b'attività purament antiestroġenika ser ikunu definiti b'mod iktar ċar iktar 'il quddiem, wara li l-proċedura tat-test tkun daħlet fir-rutina tal-użu għal ċertu żmien u jkunu ġew identifikati iktar sustanzi kimiċi b'din il-modalità ta' azzjoni.

11. Huwa rikonoxxut li l-proċeduri kollha bbażati fuq annimali ser jikkonformaw mal-istandards lokali tal-indukrar tal-annimali; id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura stabbiliti hawn taħt huma standards minimi tal-prestazzjoni, u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (38). Gwida ulterjuri dwar it-trattament umanitarju tal-annimali tingħata mill-OECD (25).

12. Bħal bl-assaġġ kollha li jużaw annimali ħajjin, importanti li jkun żgurat li d-dejta hija verament neċessarja qabel ma jinbeda l-assaġġ. Pereżempju, żewġ kundizzjonijiet li fihom tista' tkun meħtieġa d-dejta huma:

— potenzjal għoli ta' esponiment (Livell 1 tal-Qafas Kunċettwali, Appendiċi 2) jew indikazzjonijiet għal estroġeniċità (Livell 2) biex jiġi investigat jekk it-tali effetti jistgħux iseħħu in vivo,

— effetti li jindikaw estroġeniċità f'testijiet in vivo tal-Livell 4 jew 5 biex ikun sostanzjat li l-effetti kienu relatati ma' mekkaniżmu estroġeniku li ma jistax jintwera permezz ta' test in vitro.

13. Id-definizzjonijiet użati f'dan il-metodu ta' ttestjar jingħataw fl-Appendiċi 1.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

14. Il-Bijoassaġġ Uterotrofiku jiddependi għas-sensittività tiegħu fuq sistema ta' ttestjar tal-annimali li fiha l-assi ipotalamiku-pitwitarju-ovarju mhuwiex funzjonali, xi ħaġa li twassal għal livelli endoġeni baxxi ta' estroġen li jiċċirkola. Dan ser jiżgura piż uterin bażi baxx u medda massima ta' rispons għal estroġeni amministrati. Żewġ stati sensittivi tal-estroġen fir-roditur mara jissodisfaw dan ir-rekwiżit:

(i) annimali nisa immaturi wara l-ftim u qabel il-pubertà, u

(ii) annimali nisa żgħażagħ wara ovarettomija b'ħin adegwat sabiex it-tessuti tal-utri jagħmlu rigress.

15. Is-sustanza kimika tat-test tingħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima taħt il-ġilda. Dożi tas-sustanza kimika tat-test gradwati jingħataw lil minimu ta' żewġ gruppi tal-kura (ara l-paragrafu 33 għal gwida) ta' annimali sperimentali billi jintuża livell wieħed ta' doża għal kull grupp u perjodu ta' għoti ta' tliet ijiem konsekuttivi għal metodu immatur u perjodu ta' għoti minimu ta' tliet ijiem konsekuttivi għall-metodu adulti ovx. L-annimali huma nekropsjati madwar 24 siegħa wara l-aħħar doża. Għal agonisti tal-estroġen, il-piż uterin medju tal-gruppi ta' annimali kkurati fir-rigward tal-grupp veikolu huwa vvalutat għal żieda statistikament importanti. Żieda statistikament importanti fil-piż uterin medju ta' grupp tat-test tindika rispons pożittiv f'dan il-bijoassaġġ.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Għażla tal-ispeċi ta' annimali

16. Jistgħu jintużaw razez ta' rodituri tal-laboratorju użati spiss. Bħala eżempju, matul il-validazzjoni intużaw ir-razez Sprague-Dawley u Wistar ta' firien. Razez b'utri magħrufin jew suspettati li huma inqas risponsivi ma għandhomx jintużaw. Il-laboratorju għandu juri s-sensittività tar-razza użata kif deskritta fil-paragrafi 26 u 27.

17. Il-far u l-ġurdien intużaw spiss fil-Bijoassaġġ Uterotrofiku sa mis-snin tletin. L-istudji ta' validazzjoni tal-OECD saru biss b'firien fuq il-bażi ta' fehim li ż-żewġ speċi huma mistennija jkunu ekwivalenti u għalhekk, speċi waħda tkun biżżejjed għall-validazzjoni madwar id-dinja sabiex jiġu ffrankati riżorsi u annimali. Il-far huwa l-ispeċi tal-għażla f'ħafna mill-istudji dwar it-tossiċità riproduttiva u tal-iżvilupp. Peress li teżisti database storika vasta għal firien u, għalhekk, sabiex jitwessa' l-ambitu tal-metodu ta' ttestjar tal-Bijoassaġġ Utertrofiku f'rodituri għall-użu ta' ġrieden bħala speċi tat-test, sar studju limitat ta' validazzjoni ta' segwitu fil-ġrieden (16). Ingħażel approċċ komparattiv b'numru limitat ta' sustanzi kimiċi tat-test, laboratorji li jieħdu sehem u mingħajr ittestjar ta' kampjun kodifikat sabiex jinżamm l-iskop oriġinali biex jiġu ffrankati riżorsi u annimali. Dan l-istudju komparattiv ta' validazzjoni juri għall-Bijoassaġġ Uterotrofiku fi ġrieden ovarjettomizzati żgħażagħ li, b'mod kwalitattiv u kwantitattiv, id-dejta miksuba f'firien u ġrieden jikkorrispondi sew għal xulxin. Meta r-riżultat tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku jista' jkun preliminari għal studju fit-tul, dan jippermetti sabiex fiż-żewġ studji jintużaw annimali mill-istess razza u sors. L-approċċ komparattiv kien limitat għall-ġrieden OVX u r-rapport ma jipprovdix dejta robusta stabbilita biex jiġi vvalidat il-mudell immatur, u b'hekk il-mudell immatur għall-ġrieden mhuwiex ikkunsidrat taħt il-kamp ta' applikazzjoni tal-metodu ta' ttestjar kurrenti.

18. B'hekk, f'xi każijiet, jistgħu jintużaw ġrieden minflok firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni għal din l-ispeċi, fuq il-bażi ta' kriterji tossikoloġiċi, farmakokinetiċi u/jew oħrajn. Jista' jkun hemm bżonn ta' modifiki tal-protokoll għall-ġrieden. Pereżempju, il-konsum ta' ikel tal-ġrieden fuq bażi tal-piż tal-ġisem huwa ogħla minn dak tal-firien u, għaldaqstant, il-kontenut ta' fitoestroġen fl-ikel għandu jkun inqas għall-ġrieden milli għall-firien (9)(20)(22).

Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-għalf

19. Il-proċeduri kollha għandhom jikkonformaw ma' standards lokali ta' indukrar tal-annimali tal-laboratorju. Dawn id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura huma standards minimi u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (38). It-temperatura fil-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta' 22 °C (b'medda ta' madwar ± 3 °C). L-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma għandhiex taqbeż massimu ta' 70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra. Il-mira għandha tkun umdità relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali. Is-sekwenza tad-dawl ta' kuljum għandha tkun ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam.

20. Id-dieta tal-laboratorju u l-ilma tax-xorb għandhom ikunu pprovduti ad libitum. L-annimali żgħażagħ jistgħu jitrabbew f'post b'mod individwali jew jitqiegħdu f'gaġġa fi gruppi li jaslu sa tliet annimali. Minħabba l-età żgħira tal-annimali immaturi, huwa rakkomandat li jitrabbew fi grupp soċjali.

21. Il-livelli għoljin ta' fitoestroġeni f'dieti tal-laboratorju huma magħrufin li jżidu l-piżijiet uterini fir-rodituri sa grad għolji biżżejjed li jxekkel il-Bijoassaġġ Uterotrofiku (13)(14)(15). Livelli għoljin ta' fitoestroġeni u ta' enerġija metabolizzabbli f'dieti tal-laboratorju jistgħu jirriżultaw f'pubertà bikrija wkoll, jekk jintużaw annimali immaturi. Il-preżenza ta' fitoestroġeni tirriżulta primarjament mill-inklużjoni ta' prodotti tas-sojja u tal-alfalfa fid-dieti tal-laboratorju u ntwera li konċentrazzjonijiet ta' fitoestroġeni jvarjaw minn lott għal ieħor ta' dieti standard tal-laboratorju (23). Il-piż tal-ġisem huwa varjabbli importanti, peress li l-kwantità ta' ikel ikkonsmat huwa relatat mal-piż tal-ġisem. Għalhekk, id-doża propja ta' fitoestroġen ikkonsmata mill-istess dieta tista' tvarja bejn speċi u skont l-età (9). Għal firien nisa immaturi, il-konsum tal-ikel fuq bażi ta' piż tal-ġisem jista' jkun bejn wieħed u ieħor id-doppju dak ta' firien adulti żgħażagħ b'ovarettomija. Għal ġrieden żgħażagħ, il-konsum tal-ikel fuq bażi tal-piż tal-ġisem jista' jkun bejn wieħed u ieħor erba' darbiet dak ta' firien żgħażagħ nisa b'ovarettomija.

22. Madankollu, ir-riżultati tal-Bijoassaġġ Uterotrofiku (9)(17)(18)(19) juru li kwantitajiet limitati ta' fitoestroġeni djetetiċi huma aċċettabbli u ma jnaqqsux is-sensittività tal-bijoassaġġ. Bħala gwida, livelli djetetiċi ta' fitoestroġeni ma għandhomx jaqbżu it-350 μg tal-ekwivalenti ta' genistein/gramma tad-dieta tal-laboratorju għal firien nisa immaturi Sprague Dawley u Wistar (6)(9). Dawn id-dieti għandhom ikunu xierqa wkoll meta jiġu ttestjati f'firien żgħażagħ b'ovarettomija għaliex il-konsum tal-ikel fuq bażi ta' piż tal-ġisem huwa inqas f'żgħażagħ meta mqabbel ma' annimali immaturi. Jekk ser jintużaw ġrieden adulti b'ovarettomija jew firien iktar sensittivi għal fitoestroġeni, għandu jiġi kkunsidrat tnaqqis proporzjonat fil-livelli tal-fitoestroġen fid-dieta (20). Barra minn hekk, id-differenzi f'enerġija metabolika disponibbli minn dieti differenti jistgħu jwasslu għal qabżiet fiż-żmien għall-bidu tal-pubertà (21)(22).

23. Qabel l-istudju, hemm bżonn li ssir għażla bir-reqqa ta' dieta mingħajr livell għoli ta' fitoestroġeni (għal gwida ara (6)(9)) jew enerġija metabolizzabbli, li tista' tfixkel ir-riżultati (15)(17)(19)(22)(36). L-iżgurar tal-prestazzjoni xierqa tas-sistema tat-test użata mil-laboratorju kif speċifikat fil-paragrafi 26 u 27 huwa kontroll importanti fuq dawn iż-żewġ fatturi. Bħala salvagwardja konsistenti ma' prattika tajba tal-laboratorju (GLP) għandu jsir kampjunar rappreżentattiv ta' kull lott ta' dieta mogħtija matul l-istudju għal analiżi possibbli ta' kontenut fitoestroġenu (eż. fil-każ ta' piż ta' kontroll uterin għoli relatat ma' kontrolli storiċi jew rispons inadegwat għall-estroġen ta' referenza, 17 alfa etinil estradjol). L-alikwoti għandhom jiġu analizzati bħala parti mill-istudju jew jiġu ffriżati f'– 20 oC jew b'tali mod li jipprevjenu milli l-kampjun jiddekomponi qabel l-analiżi.

24. Ċerti materjali tas-sodod jista' jkun fihom sustanzi kimiċi estroġeniċi jew antiestroġeniċi li jseħħu b'mod naturali (eż. iċ-ċifċiegħa tal-qamħirrun hija magħrufa li taffettwa ċ-ċikliċità tal-firien u tidher li hija antiestroġenika). Il-materjal tas-sodda magħżul għandu jkun fih livell minimu ta' fitoestroġeni.

Preparazzjoni tal-annimali

25. Annimali sperimentali mingħajr evidenza ta' xi marda jew anormalità fiżika jingħażlu b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u tal-kura. Il-gaġeġ għandhom jiġu rranġati b'tali mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli dovuti għat-tqegħid tal-gaġġa. L-annimali għandhom jiġu identifikati b'mod uniku. Idealment, annimali immaturi għandhom jitqiegħdu f'gaġġa ma' ommijiet jew ommijiet adottivi sal-ftim matul l-akklimatizzazzjoni. Il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni qabel il-bidu tal-istudju għandu jkun ta' madwar 5 ijiem għal annimali żgħażagħ u għall-annimali immaturi ma' ommijiet jew ommijiet adottivi. Jekk l-annimali immaturi jinkisbu bħala annimali li għadhom kif infatmu mingħajr ommijiet, jista' jkun hemm bżonn ta' durata iqsar tal-perjodu ta' akklimatizzazzjoni peress li d-dożaġġ għandu jibda eżatt wara l-ftim (ara l-paragrafu 29).

PROĊEDURA

Verifika tal-Profiċjenza tal-Laboratorju

26. Jistgħu jintużaw żewġ għażliet differenti biex tiġi verifikata l-profiċjenza tal-laboratorju:

— Verifika perjodika, li tiddependi fuq studju bażi inizjali ta' kontroll pożittiv (ara l-paragrafu 27). Tal-inqas kull 6 xhur u kull darba li jkun hemm bidla li tista' tinfluwenza l-prestazzjoni tal-assaġġ (eż. formulazzjoni ġdida tad-dieta, bidla fil-persunal li jagħmel dissezzjonijiet, bidla fir-razza jew il-fornituri tal-annimali, eċċ), ir-risponsitività tas-sistema tat-test (mudell tal-annimal) għandha tiġi verifikata billi tintuża doża xierqa (fuq il-bażi tal-istudju bażi ta' kontroll pożittiv deskritt fil-paragrafu 27) ta' estroġen ta' referenza: 17α-etinil estradjol (Nru tas-CAS 57-63-6) (EE),

— L-użu ta' kontrolli konkurrenti, billi jiġi inklu