DEĊIŻJONI TA' IMPLIMENTAZZJONI TAL-KUMMISSJONI (UE) 2016/1840

tal-14 ta' Ottubru 2016

li temenda l-Anness IV tad-Direttiva tal-Kunsill 2009/156/KE fir-rigward tal-metodi għad-dijanjożi tal-marda Afrikana taż-żwiemel

(notifikata bid-dokument C(2016) 6509)

(Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI EWROPEA,

Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 2009/156/KE tat-30 ta' Novembru 2009 dwar kundizzjonijiet tas-saħħa tal-annimali li jirregolaw il-moviment u l-importazzjoni minn pajjiżi terzi ta' ekwidi (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 20 tagħha,

Billi:

Għalkemm il-metodi kollha tal-RT-PCR f'ħin reali disponibbli għas-sejba tal-ġenoma tal-marda Afrikana taż-żwiemel huma sensittivi biżżejjed, il-proċedura deskritta minn Agüero et al. (2008) (4) hija l-aktar waħda użata mil-laboratorji. Il-metodu deskritt minn Guthrie et al. (2013) (5) kien maħsub speċifikament biex jiżgura li ż-żwiemel li jkunu ġejjin minn żoni fejn ikun hemm riskju tal-marda Afrikana taż-żwiemel ikunu jistgħu jiġu trasportati b'mod sikur wara l-perjodu minimu ta' kwarantita meħtieġ skont il-Kodiċi tas-Saħħa tal-Annimali Terrestri (6) tal-OIE.

Għalhekk, l-Anness IV tad-Direttiva 2009/156/KE għandu jiġi emendat billi jitneħħa t-test tal-ELISA kompetittiv u billi jiġu aġġornati l-proċeduri għat-testijiet tal-ELISA indirett u għat-testijiet tal-ELISA li jibblokka f'konformità mal-Kapitolu 2.5.1 tal-edizzjoni tal-2016 tal-Manwal ta' Testijiet Dijanjostiċi u Vaċċini għall-Annimali Terrestri tal-OIE abbażi tal-Verżjoni adottata mill-Assemblea Dinjija tad-Delegati tal-OIE f'Mejju tal-2012 (7) . Fl-istess ħin, il-proċeduri tal-RT-PCR f'ħin reali kif deskritti minn Agüero et al. (2008) kif ukoll minn Guthrie et al. (2013) għandhom jiġu inklużi f'dak l-Anness sabiex dawk it-testijiet għall-identifikazzjoni tal-aġenti jsiru disponibbli għall-għanijiet tal-ittestjar ta' qabel l-ispostament.

ADOTTAT DIN ID-DEĊIŻJONI:

Artikolu 1

L-Anness IV tad-Direttiva 2009/156/KE qed jinbidel bit-test mogħti fl-Anness ta' din id-Deċiżjoni.

Artikolu 2

Din id-Deċiżjoni hija indirizzata lill-Istati Membri.

(1) ĠU L 192, 23.7.2010, p. 1.

(2) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf

(3) Id-Direttiva tal-Kunsill 92/35/KEE tad-29 ta' April 1992 li tistabilixxi r-regoli ta' kontroll u miżuri biex tkun miġġielda l-marda Afrikana taż-żwiemel (ĠU L 157, 10.6.1992, p. 19).

(4) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. u Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(5) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-35.

(6) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf.

(7) Ara n-nota ta' qiegħ il-paġna 2.

ANNESS

“ANNESS IV IL-MARDA AFRIKANA TAŻ-ŻWIEMEL DIJANJOŻI PARTI A Testijiet seroloġiċi Il-metodu seroloġiku deskritt hawnhekk huwa l-assaġġ ta' immunoassorbiment enzimatiku (ELISA) ibbażat fuq il-punt 2 tat-Taqsima B tal-Kapitolu 2.5.1 tal-edizzjoni tal-2016 tal-Manwal ta' Testijiet Dijanjostiċi u Vaċċini għall-Annimali Terrestri, kif adottat mill-Assemblea Dinjija tad-Delegati tal-OIE f'Mejju tal-2012. Il-proteina virali VP7 hija antiġen immunodominanti importanti tal-virus tal-marda Afrikana taż-żwiemel (l-AHSV) u hija konservata fuq disa' serotipi tal-AHSV. Il-proteini VP7 rikombinanti tal-AHSV instabu li huma stabbli u li ma jagħmlux ħsara u huma adattati biex jintużaw bħala antiġeni fil-proċeduri tal-ELISA biex jiġu determinati l-antikorpi tal-AHSV bi grad għoli ta' sensittività u ta' speċifiċità (Laviada et al., 1992b (1); Maree u Paweska, 2005). L-ELISA indirett u l-ELISA li jibblokka huma ż-żewġ testijiet ELISA għall-AHS-VP7 adattati għad-dijanjożi seroloġika tal-marda Afrikana taż-żwiemel (l-AHS). 1. L-ELISA indirett għas-sejba ta' antikorpi kontra l-virus tal-marda Afrikana taż-żwiemel (l-AHSV) Il-konjugat użat f'dan il-metodu huwa l-gammaglobulina antiżiemel ikkonjugata mal-perossidażi tar-rafan (horseradish peroxidase anti-horse gamma-globulin) li tirreaġixxi mas-seru taż-żwiemel, tal-bgħula u tal-ħmir. Il-metodu deskritt minn Maree & Paweska (2005) (2) juża l-proteina G bħala konjugat li jirreaġixxi wkoll mas-seru taż-żebra. L-antiġen jista' jiġi pprovdut miċ-Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), li jinsab fi Spanja, fi żmien erba' sa sitt xhur minn meta ssir it-talba. 1.1. Proċedura tat-test 1.1.1. Fażi solida 1.1.1.1. Iksi l-pjanċi tal-ELISA bir-rikombinant VP7 tal-AHSV-4 dilwit f'soluzzjoni ta' karbonat/bikarbonat, b'pH ta' 9,6. Poġġi l-pjanċi f'inkubatur matul il-lejl f'temperatura ta' 4 C. 1.1.1.2. Aħsel il-pjanċi ħames darbiet b'ilma distillat li jkun fih 0,01 % (v/v) Tween 20 (soluzzjoni tal-ħasil). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 1.1.1.3. Ibblokka l-pjanċi b'soluzzjoni salina tal-fosfat (PBS) b'pH ta' 7,2 + 5 % (w/v) ta' ħalib xkumat (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/bir għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. 1.1.1.4. Neħħi s-soluzzjoni li tibblokka u taptap il-pjanċi bil-mod fuq il-materjal assorbenti. 1.1.2. Kampjuni tat-test 1.1.2.1. Il-kampjuni tas-seru li jridu jiġu ttestjati, u s-seri ta' kontroll pożittivi u negattivi, jiġu dilwiti 1 f'25 fil-PBS + 5 % (w/v) ta' ħalib xkumat + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl għal kull bir. Poġġi f'inkubatur għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. Għat-titrazzjoni, agħmel serje ta' dilwizzjonijiet doppji ta' 1 f'25 (100 μl/bir), b'seru wieħed għal kull torri bil-pjanċi, u agħmel l-istess bil-kontrolli pożittivi u negattivi. Poġġi f'inkubatur għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. 1.1.2.2. Aħsel il-pjanċi ħames darbiet b'ilma distillat li jkun fih 0,01 % (v/v) Tween 20 (soluzzjoni tal-ħasil). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 1.1.3. Konjugazzjoni 1.1.3.1. Itfa' 100μl/bir ta' gammaglobulina antiżiemel ikkonjugata mal-perossidażi tar-rafan (HRP) dilwita fil-PBS + 5 % ta' ħalib + 0,05 % Tween 20, b'pH ta' 7,2. Poġġi f'inkubatur għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. 1.1.3.2. Aħsel il-pjanċi ħames darbiet b'ilma distillat li jkun fih 0,01 % (v/v) Tween 20 (soluzzjoni tal-ħasil). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 1.1.4. Kromoġen/Substrat 1.1.4.1. Żid 200 μl/bir ta' soluzzjoni ta' kromoġen/substrat (10 ml ta' 80,6 mM DMAB (dimetil amminobenżaldeid) + 10 ml ta' 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benżo-tiażolin idrażon idroklorid) + 5 μl H2O2). L-iżvilupp tal-kulur jitwaqqaf billi jiżdiedu 50 μl ta' 3N H2SO4 wara bejn wieħed u ieħor 5 sa 10 minuti (qabel ma jibda jieħu l-kulur il-kontroll negattiv). Kromoġeni oħra bħalma huma l-ABTS (it-2,2′-Ażino-bis-[3-etilbenżotiażolin-6-aċidu sulfoniku]), it-TMB (it-tetrametil benżidina) jew l-OPD (l-orto-fenildiammina) jistgħu jintużaw ukoll. 1.1.4.2. Aqra l-pjanċi f'600 nm (jew f'620 nm). 1.2. Interpretazzjoni tar-riżultati 1.2.1. Ikkalkula l-valur ta' limitu billi żżid 0,06 mal-valur tal-kontroll negattiv (0,06 huwa d-devjazzjoni normali li tiġi minn grupp ta' 30 seru negattiv). 1.2.2. Il-kampjuni tat-test li jagħtu valuri ta' assorbiment li jkunu aktar baxxi mil-limitu huma meqjusa bħala negattivi. 1.2.3. Il-kampjuni tat-test li jagħtu valuri ta' assorbiment li jkunu ogħla mil-limitu + 0,15 huma meqjusa bħala pożittivi. 1.2.4. Il-kampjuni tat-test li jagħtu valuri ta' assorbiment li jkunu intermedji huma meqjusa bħala inkonklużivi u trid tintuża teknika oħra biex jiġi kkonfermat ir-riżultat. 2. L-ELISA li jibblokka għas-sejba ta' antikorpi għall-virus tal-marda Afrikana taż-żwiemel (l-AHSV) L-ELISA li jibblokka kompetittiv huwa maħsub sabiex jidentifika antikorpi speċifiċi tal-AHSV f'seri minn annimali ta' kwalunkwe speċi ekwina, jiġifieri żwiemel, ħmir, żebri u r-razez imħallta tagħhom, u jipprevjeni l-problema tal-ispeċifiċità li xi drabi ġrat matul l-użu tal-ELISA indirett. Il-prinċipju tat-test huwa li jibblokka r-reazzjoni tar-rikombinant tal-proteina VP7 assorbita mal-pjanċa ELISA u mal-antikorp monoklonali (Mab) speċifiku kkonjugat mal-VP7 tal-AHS. L-antikorp fis-seru tat-test se jibblokka r-reazzjoni bejn l-antiġen u l-Mab u b'hekk se jwassal għal tnaqqis fil-kulur. Minħabba li l-Mab huwa dirett kontra l-VP7, l-assaġġ se jagħti livell għoli ta' sensittività u speċifiċità. L-ELISA li jibblokka kompetittiv huwa kummerċjalment disponibbli. 2.1. Proċedura tat-test 2.1.1. Fażi solida 2.1.1.1. Iksi l-pjanċi tal-ELISA b'50 sa 100 ng ta' rikombinant VP7 tal-AHSV-4 dilwit f'soluzzjoni tal-karbonat/bikarbonat, b'pH ta' 9,6. Poġġi l-pjanċi f'inkubatur matul il-lejl f'temperatura ta' 4 °C. 2.1.1.2. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet f'soluzzjoni salina tal-fosfat (PBS) 0,1× li fiha 0,135 M NaCl u 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 2.1.2. Kampjuni tat-test u kontrolli 2.1.2.1. Il-kampjuni tas-seru li jridu jiġu ttestjati, u s-seri ta' kontroll pożittivi u negattivi, jiġu dilwiti 1 f'5 f'dilwent li fih 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 u 0,1 % Kathon, 100 μl għal kull bir. Poġġi f'inkubatur għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. Għat-titrazzjoni, agħmel serje ta' dilwizzjonijiet doppji tas-seri tal-ittestjar ta' 1 f'10 sa 1 f'280 fuq tmint ibjar (100 μl/bir), b'seru wieħed għal kull torri bil-pjanċi, u agħmel l-istess bil-kontrolli pożittivi u negattivi. Poġġi f'inkubatur għal siegħa f'temperatura ta' 37 °C. 2.1.2.2. Aħsel il-pjanċi ħames darbiet f'soluzzjoni salina tal-fosfat (PBS) 0,1× li fiha 0,135 M NaCl u 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 2.1.3. Konjugazzjoni 2.1.3.1. Itfa' 100 μl/bir ta' MAB kontra l-VP7 ikkonjugat bil-perossidażi tar-rafan. Qabel, dan l-Mab ġie dilwit 1/5 000–1/15 000 f'soluzzjoni 1/1 ta' StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Referenza: SZ03) fl-ilma distillat. Poġġi f'inkubatur għal 30 minuta f'temperatura ta' 37 °C. 2.1.3.2. Aħsel il-pjanċi ħames darbiet f'soluzzjoni salina tal-fosfat (PBS) 0,1× li fiha 0,135 M NaCl u 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Taptap il-pjanċi bil-mod fuq materjal assorbenti biex tneħħi kull fdal tal-ħasil. 2.1.4. Kromoġen/Substrat Żid 100 μl/bir ta' soluzzjoni ta' kromoġen/substrat, jiġifieri 1 ml ta' ABTS (2,2′-Ażino-bis-[3-etilbenżotiażolin-6-aċidu sulfoniku]) 5 mg/ml + 9 ml ta' soluzzjoni ta' substrat (0,1 M ta' soluzzjoni ta' Ċitrat tal-Fosfat ta' pH 4 li fiha 0,03 % ta' H2O2), u poġġi f'inkubatur għal 10 minuti f'temperatura ambjentali. L-iżvilupp tal-kulur jitwaqqaf billi jiżdiedu 100 μl/bir ta' 2 % (w/v) ta' SDS (sulfat tad-dodeċil tas-sodju). 2.1.5. Qari Aqra f'405 nm fuq tagħmir għall-qari tal-ELISA. 2.2. Interpretazzjoni tar-riżultati 2.2.1. Iddetermina l-perċentwali tal-ibblokkar (il-BP) ta' kull kampjun billi tapplika l-formula li ġejja, fejn “Abs” tfisser antikorpi: 2.2.2. Il-kampjuni li juru valur ta' BP li jkun ogħla minn 50 % għandhom jiġu meqjusa bħala pożittivi għall-antikorpi tal-AHSV. 2.2.3. Il-kampjuni li juru valur ta' BP li jkun inqas minn 45 % għandhom jiġu meqjusa bħala negattivi għall-antikorpi tal-AHSV. 2.2.4. Il-kampjuni li juru valur ta' BP ta' bejn 45 % u 50 % għandhom jiġu meqjusa bħala inkonklużivi u jridu jiġu ttestjati mill-ġdid. Jekk ir-riżultat jerġa' jkun inkonklużiv, l-annimali għandhom jiġu ttestjati mill-ġdid permezz ta' kampjuni li jittieħdu mhux aktar minn ġimagħtejn qabel wara li jkun ittieħed il-kampjun li jkun ġie meqjus bħala inkonklużiv. PARTI B Identifikazzjoni tal-aġent Traskriptażi Inversa u Reazzjoni Katina bil-Polimerażi f'Ħin Reali (rRT-PCR) It-testijiet għall-identifikazzjoni tal-aġent ibbażati fuq il-metodi bl-aċidu nuklejku jridu jidentifikaw ir-razez ta' referenza mid-disa' serotipi tal-virus tal-AHSV. Il-metodu deskritt fil-punt 2.1. huwa bbażat fuq il-punt 1.2 tat-Taqsima B tal-Kapitolu 2.5.1 tal-edizzjoni tal-2016 tal-Manwal ta' Testijiet Dijanjostiċi u Vaċċini għall-Annimali Terrestri, kif adottat mill-Assemblea Dinjija tad-Delegati tal-OIE f'Mejju tal-2012. Kull metodu ta' identifikazzjoni tal-RT-PCR użat għall-ittestjar tal-kampjuni fil-kuntest tad-Direttiva 2009/156/KE, kemm jekk il-kampjuni jkunu tad-demm kif ukoll jekk ikunu tal-milsa, irid jaħdem daqs il-metodoloġiji deskritti fil-punt 2 jew jaqbeż is-sensittività tagħhom. Ir-razez ta' referenza tas-serotipi 1 sa 9 tal-virus inattivat jistgħu jinkisbu mil-Laboratorju ta' Referenza tal-Unjoni Ewropea jew mil-Laboratorju ta' Referenza tal-OIE għall-marda Afrikana taż-żwiemel li jinsab f'Algete, fi Spanja. 1. Estrazzjoni ta' RNA virali Biex tkun żgurata reazzjoni tajba jeħtieġ li mill-kampjun jiġi estratt RNA tal-AHSV ta' kwalità għolja. L-estrazzjoni tal-aċidi nuklejċi minn kampjuni kliniċi tista' ssir permezz ta' varjetà ta' metodi disponibbli internament u kummerċjalment. Il-kits kummerċjali jużaw approċċi differenti għall-iżolament tal-RNA. Il-biċċa l-kbira tagħhom huma bbażati fuq waħda mill-proċeduri li ġejjin: — l-estrazzjoni tal-aċidi nuklejċi permezz tal-fenol-kloroform; — l-adsorbiment tal-aċidi nuklejċi fis-sistema ta' filtrazzjoni; — l-adsorbiment tal-aċidi nuklejċi fis-sistema ta' żibeġ manjetiċi. Hawn taħt qed jingħata eżempju ta' estrazzjoni interna tal-RNA: 1.1. 1 g ta' kampjun tat-tessut jiġi omoġenizzat f'1 ml ta' soluzzjoni ta' denaturazzjoni (4 M ta' gwanidjum tioċjanat, 25 mM ta' ċitrat tas-sodju, 0,1 M ta' 2-merkaptoetanol u 0,5 % ta' sarkosil). 1.2. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, 1 μg ta' RNA ta' ħmira, 0,1 ml ta' 2 M ta' aċetat tas-sodju b'pH ta' 4, 1 ml ta' fenol u 0,2 ml ta' taħlita ta' kloroform/alkoħol tal-isoamil (49/1) jiżdiedu mas-supernatant. 1.3. Is-sospensjoni titħawwad bis-saħħa u titkessaħ fuq is-silġ għal 15-il minuta. 1.4. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, l-RNA preżenti fil-fażi milwiema jiġi estratt bil-fenol, jiġi preċipitat bl-etanol u jitħallat mill-ġdid f'ilma sterili. 2. Proċedura tal-RT-PCR f'ħin reali 2.1. L-RT-PCR f'ħin reali speċifiku għall-grupp ta' Agüero et al., 2008 (3) Dan l-RT-PCR f'ħin reali speċifiku għall-grupp għandu fil-mira l-VP7 tal-AHSV u kapaċi jidentifika s-serotipi u r-razez kollha magħrufa tal-AHSV li hawn fiċ-ċirkolazzjoni bħalissa. Dan intuża b'riżultati tajbin ħafna mil-laboratorji ta' referenza nazzjonali tal-Istati Membri tal-Unjoni Ewropea li pparteċipaw fit-testijiet ta' profiċjenza organizzati ta' kull sena mil-Laboratorju ta' Referenza tal-Unjoni Ewropea għall-perjodu mill-2009 sal-2015. Barra minn hekk, fi prova ċirkolari internazzjonali organizzata fl-2015 fil-qafas tan-netwerk tal-laboratorji ta' referenza tal-OIE dan il-protokoll ġie kklassifikat f'pożizzjoni għolja ħafna fost oħrajn. Is-sekwenzi bi primer u b'sonda għas-sejba tal-virus tal-ispeċi tal-AHSV: — Primer 'il quddiem 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′ — Primer lura 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′ — Sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′ 2.1.1. Il-konċentrazzjoni tal-istokk tal-primer tiġi dilwita ma' konċentrazzjoni ta' ħidma ta' 8 μM (“stokk ta' ħidma tal-primer 8 μM”) filwaqt li s-sonda tiġi dilwita ma' konċentrazzjoni ta' ħidma ta' 50 μM (“stokk ta' ħidma tas-sonda 50 μM”). Id-disinn tal-pjanċa tat-test għandu jiġi ddisinjat u jittella' fis-softwer tal-magni tal-PCR f'ħin reali. Bl-użu tad-disinn bħala gwida, 2,5 μl ta' kull stokk ta' ħidma tal-primer ta' 8 μM jiżdiedu f'kull bir li jkun fih il-kampjuni tal-RNA u l-kontrolli pożittivi u/jew negattivi (il-konċentrazzjoni finali tal-primer se tkun ta' 1 μM fit-taħlita tal-RT-PCR ta' 20 μl). Il-pjanċa tinżamm fuq is-silġ. 2.1.2. 2 μl ta' RNA iżolat (il-kampjuni tat-test u l-kontroll pożittiv), jew 2 μl ta' ilma mingħajr RNAse fil-kontrolli ta' reazzjoni negattivi, jitħalltu ma' primers 'il quddiem u ma' primers lura. Din it-taħlita tiġi denaturata billi tissaħħan f'temperatura ta' 95 °C għal 5 minuti, u wara titkessaħ malajr fuq is-silġ għal mill-anqas 5 minuti. 2.1.3. Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur jiġi ppreparat volum xieraq ta' taħlita master ta' RT-PCR f'ħin reali b'fażi waħda għall-għadd ta' kampjuni li jridu jiġu ttestjati. F'kull bir li fih il-kampjuni tal-RNA jiġi miżjud 0,1μl ta' stokk ta' ħidma tas-sonda ta' 50 μΜ (f'kull bir li fih il-kampjuni tal-RNA l-konċentrazzjoni finali tas-sonda se tkun ta' 0,25 μM). F'kull bir fuq il-pjanċa tal-PCR li jkun fih il-primer u l-RNA denaturati jiġu distribwiti 13 μl tat-taħlita master ta' RT-PCR f'ħin reali b'fażi waħda. 2.1.4. Il-pjanċa titpoġġa f'ċiklatur termali f'ħin reali pprogrammat għat-traskriptażi inversa u għall-amplifikazzjoni tas-cDNA u s-sejba tal-fluworexxenza. Il-kundizzjonijiet tal-amplifikazzjoni jikkonsistu fl-ewwel fażi tat-traskriptażi inversa f'temperatura ta' 48 C għal 25 minuta, segwit minn 10 minuti f'temperatura ta' 95 °C (“startjar sħun”) u 40 ċiklu ta' 15-il sekonda f'temperatura ta' 95 °C, 35 sekonda f'temperatura ta' 55 °C u 30 sekonda f'temperatura ta' 72 °C (jew 40 ċiklu f'temperatura ta' 97 °C għal 2 sekondi u 55 °C għal 30 sekonda jekk jintużaw reaġenti u ċiklatur termali li jippermettu reazzjonijiet rapidi). Id-dejta dwar il-fluworexxenza tinkiseb fl-aħħar tal-istadju f' temperatura ta' 55 °C. 2.1.5. L-assaġġ ma jiġix meqjus bħala validu jekk jinkisbu kurvi ta' amplifikazzjoni atipiċi, u jrid jerġa' jsir. Il-kampjuni jitqiesu bħala pożittivi jekk il-valur tas-Ct (in-numru taċ-ċiklu li fih il-fluworexxenza ġġenerata f'reazzjoni taqbeż il-limitu tal-fluworexxenza) ikun anqas jew ugwali għal-limitu stabbilit għas-Ct (35) f'40 ċiklu tal-PCR (Ct ≤ 35). Il-kampjuni jitqiesu bħala inkonklużivi jekk il-valur tas-Ct jkun ogħla mil-limitu definit għas-Ct (35) f'40 ċiklu tal-PCR (CT ≥ 35). Il-kampjuni jitqiesu bħala negattivi jekk tinkiseb kurva ta' amplifikazzjoni orizzontali li ma taqbiżx il-linja tal-limitu f'40 ċiklu tal-PCR. 2.2. L-RT-PCR f'ħin reali speċifiku għall-grupp ta' Guthrie et al., 2013 (4) RT-PCR f'ħin reali li fih jintużaw sondi ta' trasferiment tal-enerġija b'reżonanza fluworexxenti (FRET) għas-sejba tal-aċidu nuklejku tal-AHSV. L-assaġġ tal-RT-PCR tal-AHSV deskritt ġie mfassal bl-użu ta' sekwenzi minn varjetà wiesgħa ta' razez tal-mikrobu tal-AHSV li hawn fiċ-ċirkolazzjoni bħalissa (Quan et al., 2010 (5)). Dan jinkorpora wkoll assaġġ tal-kontroll estern sintetiku proprjetarju għall-verifikazzjoni tal-funzjonament xieraq tal-komponenti tal-assaġġ. Il-kits għall-PCR f'ħin reali b'fażi waħda huma disponibbli kummerċjalment. Hawn taħt qed jingħataw ftit passi bażiċi kif deskritti minn Guthrie et al. (2013), li jistgħu jiġu modifikati skont il-ħtiġijiet lokali u l-każ speċifiku, il-kits użati u t-tagħmir disponibbli. Is-sekwenzi bi primer u b'sonda għas-sejba tal-virus tal-ispeċi tal-AHSV: — Primer 'il quddiem 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′ — Primer lura 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′ — Sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′ 2.2.1. Is-soluzzjonijiet tal-istokk tat-taħlita tal-primer u tas-sonda huma magħmulin minn konċentrazzjoni ta' 25 × f'5 μΜ għall-primers 'il quddiem u għall-primers lura u fi 3 μm għas-sonda. Id-disinn tal-pjanċa tat-test għandu jiġi ddisinjat u jittella' fis-softwer tal-magni tal-PCR f'ħin reali. Bl-użu tad-disinn bħala gwida, 5 μl ta' kampjuni tal-RNA, inklużi l-kampjuni tat-test u l-kontrolli pożittivi u negattivi, jiżdiedu fil-bjar ix-xierqa tal-pjanċa skont id-disinn. 2.2.2. L-RNA jiġi denaturat billi jissaħħan f'temperatura ta' 95 °C għal 5 minuti, u wara jitkessaħ malajr fuq is-silġ għal mill-anqas 3 minuti. 2.2.3. Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur jiġi ppreparat volum xieraq ta' taħlita master ta' RT-PCR f'ħin reali b'fażi waħda għall-għadd ta' kampjuni li jridu jiġu ttestjati. 1 μl ta' soluzzjoni tal-istokk tat-taħlita tal-primer u tas-sonda ta' 25 × (mill-punt 2.2.1 t'hawn fuq) jiġi inkluż fit-taħlita master sabiex f'kull bir ikun hemm konċentrazzjoni finali ta' 200 nM għal kull primer u ta' 120 nM tas-sonda. 20 μl tat-taħlita master titqassam f'kull bir fuq il-pjanċa tal-PCR li jkun fih l-RNA denaturat. 2.2.4. Il-pjanċa titpoġġa f'ċiklatur termali f'ħin reali pprogrammat għat-traskriptażi inversa u għall-amplifikazzjoni tas-cDNA u s-sejba tal-fluworexxenza kif issuġġerit mill-manifatturi. Il-kundizzjonijiet tal-amplifikazzjoni jikkonsistu, pereżempju, fl-ewwel fażi tat-traskriptażi inversa f'temperatura ta' 48 °C għal 10 minuti, segwit minn 10 minuti f'temperatura ta' 95 °C u 40 ċiklu ta' 15-il sekonda f'temperatura ta' 95 °C u 45 sekonda f'temperatura ta' 60 °C. 2.2.5. Il-kampjuni jitqiesu bħala pożittivi jekk il-fluworexxenza normalizzata għall-assaġġ tal-RT-PCR tal-AHSV taqbeż il-limitu ta' 0,1 f'36 ċiklu tal-PCR fir-repliki kollha ta' kampjun. Il-kampjuni jitqiesu bħala inkonklużivi jekk il-fluworexxenza normalizzata għall-assaġġ tal-RT-PCR tal-AHSV taqbeż il-limitu ta' 0,1 f'bejn 36 u 40 ċiklu tal-PCR f'kull replika ta' kampjun. Il-kampjuni jitqiesu bħala negattivi jekk il-fluworexxenza normalizzata għall-assaġġ tal-RT-PCR tal-AHSV ma taqbiżx il-limitu ta' 0,1 f'40 ċiklu tal-PCR fir-repliki kollha ta' kampjun u jekk il-fluworexxenza normalizzata għall-assaġġ tal-kontroll estern sintetiku proprjetarju pożittiv intern taqbeż il-limitu ta' 0,1 fi 33 ċiklu tal-PCR.”

(1) Laviada M.D., Roy P. u Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. Ippubblikat fi: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.

(2) Maree S. u Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.

(3) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. u Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(4) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS u Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-35.

(5) Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A. u Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.