(8)

Fil-Parti B, jiżdiedu l-Kapitoli li ġejjin: “B.63 TEST TA’ SKRINJAR TAT-TOSSIĊITÀ RIPRODUTTIVA/TAL-IŻVILUPP INTRODUZZJONI 1. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 421 tal-OECD (2016). Il-linji gwida tal-OECD għall-ittestjar tas-sustanzi kimiċi jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku. Il-linja gwida tat-test ta’ skrinjar oriġinali 421 ġiet adottata fl-1995, fuq il-bażi ta’ protokoll għal “Test ta’ Skrinjar għat-Tossiċità Riproduttiva Preliminari” diskuss f’żewġ laqgħat ta’ esperti, f’Londra fl-1990 (1) u f’Tokyo fl-1992 (2). 2. Dan il-metodu ta’ ttestjar ġie aġġornat b’punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali, bħala segwitu għall-attività ta’ prijorità għolja mnedija fl-OECD fl-1998 biex jiġu riveduti l-linji gwida tat-test eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida tat-test ġodda għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ interferenti endokrinali potenzjali (3). Pereżempju, it-TG 407 tal-OECD (Studju dwar it-Tossiċità Orali fuq 28 Jum b’Doża Ripetuta fir-Rodituri, Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) ġiet miżjuda fl-2008 b’parametri xierqa biex tiġi individwata l-attività endokrinali tas-sustanzi kimiċi tat-test. L-objettiv fl-aġġornar tat-TG 421 kien li jiġu inklużi xi punti ta’ tmiem rilevanti ta’ interferenti endokrinali fit-TGs tal-iskrinjar meta l-perjodi ta’ esponiment ikopru wħud mill-perjodi sensittivi matul l-iżvilupp (perjodi ta’ qabel it-twelid jew ta’ kmieni wara t-twelid). 3. Il-punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali addizzjonali magħżula, li wkoll huma parti mit-TG 443 (Studju Estiż dwar it-Tossiċità Riproduttiva f’Ġenerazzjoni Waħda, Kapitolu B.56 ta’ dan l-Anness), kienu inklużi fit-TG 421 fuq il-bażi ta’ studju tal-fattibbiltà li jindirizza mistoqsijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-inklużjoni tagħhom, kif ukoll adattamenti possibbli fid-disinn tat-test meħtieġa għall-inklużjoni tagħhom (4). 4. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jiġġenera informazzjoni limitata rigward l-effetti ta’ sustanza kimika tat-test fuq il-prestazzjoni riproduttiva fl-irġiel u fin-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u l-ħlas. Mhuwiex alternattiva għall-metodi ta’ ttestjar eżistenti B.31, B.34, B.35 jew B.56 u lanqas ma jiħdilhom posthom. KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU 5. Dan il-metodu ta’ ttestjar ta’ skrinjar jista’ jintuża biex jipprovdi informazzjoni inizjali dwar l-effetti possibbli fuq ir-riproduzzjoni u/jew l-iżvilupp, jew fi stadju bikri ta’ valutazzjoni tal-proprjetajiet tossikoloġiċi tas-sustanzi kimiċi, jew fuq is-sustanzi kimiċi ta’ tħassib. Jista’ jintuża wkoll bħala parti minn sett ta’ testijiet ta’ skrinjar inizjali għal sustanzi kimiċi tat-test eistenti li għalihom ftit li xejn ikun hemm informazzjoni tossikoloġika disponibbli jew l-ebda affattu, bħal studju ta’ individwazzjoni tad-doża għal studji aktar estensivi dwar ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp, jew meta jitqies rilevanti b’xi mod ieħor. Fit-twettiq tal-istudju, għandhom jiġu segwiti l-prinċipji ta’ gwida u l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-dokument ta’ gwida nru 19 tal-OECD dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-użu ta’ sinjali kliniċi bħala punti ta’ tmiem umanitarji għal annimali sperimentali użati fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (5). 6. Dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni kompluta fuq l-aspetti kollha tar-riproduzzjoni u tal-iżvilupp. B’mod partikolari, dan joffri biss mezz limitat kif jiġu individwati l-manifestazzjonijiet ta’ wara t-twelid ta’ esponiment ta’ qabel it-twelid, jew l-effetti li jistgħu jiġu indotti matul l-esponiment ta’ wara t-twelid. Minħabba (fost raġunijiet oħra) in-numri relattivament żgħar ta’ annimali fil-gruppi tad-doża, is-selettività tal-punti ta’ tmiem, u d-durata qasira tal-istudju, dan il-metodu mhux se jipprovdi evidenza għal dikjarazzjonijiet definiti ta’ ebda effett. Barra minn hekk, fin-nuqqas ta’ data minn testijiet oħra dwar it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali. 7. Ir-riżultati miksubin mill-parametri relatati mas-sistema endokrinali għandhom jitqiesu fil-kuntest tal-“OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (6). F’dan il-Qafas Kunċettwali, it-TG 421 imtejba tal-OECD tinsab fil-livell 4 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi data dwar l-effetti avversi fuq il-punti ta’ tmiem endokrinali rilevanti. Madankollu, sinjal endokrinali waħdu jaf ma jitqiesx evidenza suffiċjenti li s-sustanza kimika tat-test hi interferent endokrinali. 8. Dan il-metodu ta’ ttestjar jassumi amministrazzjoni orali tas-sustanza kimika tat-test. Jaf ikun hemm bżonn ta’ modifiki jekk jintużaw rotot oħra ta’ esponiment. 9. Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. 10. Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati. PRINĊIPJU TAT-TEST 11. Is-sustanza kimika tat-test tingħata f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ rġiel u nisa. L-irġiel għandhom jingħataw doża għal minimu ta’ erba’ ġimgħat u sal-jum ta’ qabel il-qatla skedata (dan jinkludi minimu ta’ ġimagħtejn qabel it-tgħammir, matul il-perjodu ta’ tgħammir u, bejn wieħed u ieħor, ġimagħtejn wara t-tgħammir). Fid-dawl tal-perjodu ta’ dożaġġ limitat ta’ qabel it-tgħammir, il-fertilità jaf ma tkunx indikatur partikolarment sensittiv ta’ tossiċità testikolari. Għaldaqstant, eżami istoloġiku dettaljat tat-testikoli hu essenzjali. Il-kombinazzjoni tal-perjodu ta’ dożaġġ ta’ qabel it-tgħammir ta’ ġimagħtejn u l-osservazzjonijiet sussegwenti dwar it-tgħammir/il-fertilità b’perjodu ta’ dożaġġ ġenerali ta’ tal-anqas erba’ ġimgħat, segwiti minn istopatoloġija dettaljata tal-gonadi tal-irġiel, hija meqjusa suffiċjenti biex tkun tista’ tiġi individwata l-maġġoranza tal-effetti fuq il-fertilità u l-ispermatoġenesi tal-irġiel. 12. In-nisa għandhom jingħataw doża matul l-istudju kollu. Dan jinkludi ġimagħtejn qabel it-tgħammir (bl-objettiv li jkunu koperti tal-anqas żewġ ċikli estrużi sħaħ), il-ħin varjabbli sal-konċepiment, id-durata tat-tqala u tal-anqas 13-il jum wara l-ħlas, sa u inkluż il-jum ta’ qabel il-qatla skedata. 13. Id-durata tal-istudju, wara l-akklimatizzazzjoni u l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż ta’ qabel id-dożaġġ, tiddependi mill-prestazzjoni tan-nisa u hi madwar 63 jum, [tal-anqas 14-il jum qabel it-tgħammir, (sa) 14-il jum tat-tgħammir, 22 jum tal-ġestazzjoni, 13-il jum tat-treddigħ]. 14. Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni l-annimali jkunu osservati mill-qrib, kull jum għal sinjali ta’ tossiċità. L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul il-perjodu tat-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqgħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom awtopsja. DESKRIZZJONI TAL-METODU Għażla tal-ispeċi tal-annimali 15. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jintuża b’firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni dettaljata jekk il-parametri speċifikati f’dan il-metodu ta’ ttestjar ikunu investigati fi speċijiet oħra ta’ rodituri. Fil-programm internazzjonali ta’ validazzjoni għad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali fit-TG 407 tal-OECD (li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness), il-far kien l-unika speċi użata. Ma għandhomx jintużaw razez b’fekundità baxxa jew li huma magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta’ difetti fl-iżvilupp. Għandhom ikunu użati annimali verġni f’saħħithom li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali preċedenti. L-annimali ittestjati għandhom ikunu karatterizzati skont l-ispeċi, ir-razza, is-sess, il-piż u/jew l-età. Malli jinbeda l-istudju l-varjazzjoni fil-piż tal-annimali użati għandha tkun minima u ma għandhiex taqbeż l-20 % tal-piż medju taż-żewġ sessi. Meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju fit-tul jew ta’ ġenerazzjoni sħiħa, idealment fiż-żewġ studji jintużaw annimali li jkunu mill-istess razza u sors. Abitazzjoni u għalf 16. Il-proċeduri kollha għandhom ikunu konformi ma’ standards lokali tal-kura tal-annmali tal-laboratorju. It-temperatura fil-kamra tal-esperimenti tal-annimali għandha tkun ta’ 22 °C (± 3 °). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun tal-anqas ta’ 30 % u preferibbilment ma taqbiżx is-70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, billi l-fotoperjodu jkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata b’dan il-metodu. 17. L-annimali għandhom jitqiegħdu f’abitazzjoni fi gruppi żgħar tal-istess sess; l-annimali jistgħu jitqiegħdu f’abitazzjoni waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat. Għal gruppi f’gaġeġ, ma għandux ikun hemm aktar minn ħames annimali jabitaw f’gaġġa waħda. Il-proċeduri ta’ tgħammir għandhom jitwettqu f’gaġeġ adattati għall-iskop. In-nisa tqal għandhom jitqiegħdu fil-gaġeġ waħedhom u jiġu pprovduti b’materjali tat-tibjit. In-nisa li jkunu qed ireddgħu jitqiegħdu f’gaġeġ waħedhom mal-wild tagħhom. 18. L-għalf għandu jkun analizzat regolarment għall-kontaminanti. Għandu jinżamm kampjun tad-dieta sakemm ikun iffinalizzat ir-rapport. Preparazzjoni tal-annimali 19. L-annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ikunu assenjati b’mod każwali lill-gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati unikament u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom tal-anqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju. Preparazzjoni tad-dożi 20. Hu rakkomandat li s-sustanza kimika tat-test tingħata b’mod orali sakemm rotot oħra ta’ amministazzjoni ma jitqisux aktar xierqa. Meta tingħażel ir-rotta orali, is-sustanza kimika tat-test normalment tingħata b’gavage; madankollu, f’każijiet oħra, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw mad-dieta jew mal-ilma tax-xorb. 21. Meta jkun hemm bżonn, is-sustanza kimika tat-test tinħall jew tiġi sospiża f’veikolu xieraq. Hu rrakkomandat li, kull meta jkun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta’ soluzzjoni fl-ilma/sospensjoni, segwit minn kunsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħa) u mbagħad possibbilment b’soluzzjoni f’veikoli oħra. Għal veikoli li mhumiex ilma, għandhom ikunu magħrufin il-karatteristiċi tossiċi tal-veikolu. Għandhom jiġu ddeterminati l-istabbiltà u l-omoġenità tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. PROĊEDURA Numru u Sess tal-annimali 22. Hu rakkomandat li kull grupp jinbeda b’tal-anqas 10 irġiel u 12-13-il mara. In-nisa jiġu evalwati qabel l-esponiment għaċ-ċikliċità estruża u l-annimali li ma jurux ċikli tipiċi ta’ bejn erba’ u ħamest ijiem ma jiddaħħlux fl-istudju; għaldaqstant, huma rakkomandati nisa żejda biex jinkisbu 10 nisa għal kull grupp. Ħlief fil-każ ta’ effetti tossiċi ċari, hu mistenni li dan jipprovdi tal-anqas tmien nisa tqal għal kull grupp li normalment ikun in-numru minimu aċċettabbli ta’ nisa tqal għal kull grupp. L-objettiv hu li jiġu prodotti biżżejjed nisa tqal u wlied biex tkun żgurata evalwazzjoni sinifikattiva tal-potenzjal tas-sustanza kimika tat-test biex taffettwa l-fertilità, it-tqala, l-imġiba materna u tat-treddigħ, u t-tkabbir u l-iżvilupp tal-ulied F 1 , mill-konċepiment sa 13-il jum wara l-ħlas. Dożaġġ 23. Ġeneralment tal-anqas għandhom jintużaw tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll. Il-livelli tad-doża jistgħu jkunu bbażati fuq informazzjoni minn testijiet tat-tossiċità akuta jew fuq riżultati minn studji dwar doża ripetuta. Ħlief għat-trattament bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu għall-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat. 24. Il-livelli tad-doża għandhom jintgħażlu b’kunsiderazzjoni ta’ kwalunkwe data eżistenti disponibbli dwar it-tossiċità u l-kinetika (jew it-tossikokinetika). Ta’ min iqis ukoll li jista’ jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u annimali mhux tqal. L-ogħla livell ta’ doża għandu jintgħażel bl-għan li jġib effetti tossiċi iżda mhux il-mewt jew tbatija severa. Wara, għandha tingħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża bl-għan li jintwerew kwalunkwe reazzjoni relatata mad-dożaġġ u l-livell bla effett ħażin osservat (NOAEL) fl-anqas livell tad-doża. Intervalli ta’ darbtejn jew ta’ erba’ darbiet ta’ spiss ikunu l-aħjar biex ikunu stabbiliti l-livelli neżlin tad-dożi, u ż-żieda tar-raba’ grupp tat-test sikwit spiss tkun preferibbli milli jintużaw intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi. 25. Meta jkun hemm tossiċità ġenerali osservata (eż. piż tal-ġisem imnaqqas, effetti tal-fwied, qalb, pulmun jew kliewi, eċċ.) jew tibdiliet oħra li jistgħu ma jkunux risponsi tossiċi (eż. konsum anqas ta’ ikel, tkabbir tal-fwied), l-effetti osservati fuq punti ta’ tmiem sensittivi endokrinali għandhom ikunu interpretati b’kawtela. Test tal-limitu 26. Jekk studju orali b’livell ta’ doża waħda ta’ mill-anqas 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum jew, għall-amministrazzjoni tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, ta’ perċentwali ekwivalenti fid-dieta jew ta’ ilma tax-xorb, billi jintużaw il-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi osservabbli u jekk ma tkunx mistennija tossiċità bbażata fuq data minn sustanzi relatati strutturalment, f’dak il-każ studju sħiħ bl-użu ta’ diversi livelli ta’ doża jista’ ma jitqiesx li jkun meħtieġ. It-test tal-limitu hu applikabbli apparti minn meta l-eposizzjoni umana tindika il-ħtieġa għal doża orali għola fil-livell użat. Għal tipi oħrajn ta’ amministrazzjoni, bħal ma hi l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, bħal kemm tinħall, ta’ spiss jistgħu jiddettaw il-konċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb. Amministrazzjoni tad-dożi 27. L-annimali jingħataw doża tas-sustanza kimika tat-test darba kuljum għal sebat ijiem fil-ġimgħa. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata b’gavage, dan għandu jsir b’doża singola lill-annimali billi jintuża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni adattat. Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment juru effetti ta’ irritazzjoni b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun imminimizzata billi l-konċentrazzjoni tkun aġġustata biex ikun żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża. 28. Għas-sustanzi kimiċi tat-test mogħtija permezz tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilanċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata fid-dieta, jistgħu jintużaw konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Għal sustanza amministrata b’gavage, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili ta’ kull jum, u tiġi aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa biex jinżamm livell kostanti ta’ doża f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal. Skeda sperimentali 29. Id-dożaġġ taż-żewġ sessi għandu jibda tal-anqas ġimagħtejn (2) qabel it-tgħammir, wara li jkunu tħallew iderru għal tal-anqas ħamest ijiem u n-nisa jkunu ġew skrinjati għaċ-ċikli estrużi normali (f’perjodu ta’ pretrattament ta’ ġimagħtejn). L-istudju għandu jkun skedat b’tali mod li l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż tibda ftit wara li l-annimali jkunu kisbu maturità sesswali sħiħa. Dan jista’ jvarja ftit għal razez differenti ta’ firien f’laboratorji differenti, eż. firien Sprague Dawley ta’ 10 ġimgħat, firien Wistar li jkollhom madwar 12-il ġimgħa. L-ommijiet b’wild għandhom jinqatlu fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara. Il-jum tat-twellid (meta jitlesta l-ħlas) hu definit bħala l-jum 0 wara l-ħlas. In-nisa li ma juru ebda evidenza ta’ tgħammir jinqatlu 24-26 jum wara l-aħħar jum tal-perjodu ta’ tgħammir. Id-dożaġġ jissokta għaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta’ tgħammir. L-irġiel għandhom jibqgħu jingħataw id-doża wara l-perjodu ta’ tgħammir tal-anqas sakemm jitlesta l-perjodu minimu totali ta’ dożaġġ ta’ 28 jum. Imbagħad dawn jinqatlu jew inkella jinżammu u jibqgħu jingħataw id-doża għat-twettiq possibbli tat-tieni fażi ta’ tgħammir jekk jitqies li din tkun xierqa. 30. Id-dożaġġ ta’ kuljum tan-nisa ommijiet għandu jkompli matul it-tqala u tal-anqas sal-jum 13 wara l-ħlas, b’dan il-jum inkluż, jew sal-jum ta’ qabel is-sagrifiċċju. Għall-istudji li fihom is-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs jew bir-rotta dermali, id-dożaġġ għandu jkompli tal-anqas sal-jum 19 tal-ġestazzjoni, b’dan il-jum inkluż, u d-dożaġġ għandu jerġa’ jinbeda mill-aktar fis possibbli u mhux aktar tard mill-PND 4. 31. Dijagramma tal-iskeda sperimentali hi mogħtija fl-Appendiċi 2. Priċedura tat-tgħammir 32. Normalment, f’dan l-istudju għandu jsir tgħammir 1:1 (raġel wieħed ma’ mara waħda). Jista’ jkun hemm eċċezzjonijiet f’każ ta’ mwiet okkażjonali tal-irġiel. Il-mara għandha titqiegħed mal-istess raġel sakemm tiġi osservata evidenza ta’ tgħammir jew ikunu għaddew ġimagħtejn. Kull filgħodu in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta’ sperma jew ta’ tapp vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala hu definit bħala l-jum li fih tiġi kkonfermata evidenza ta’ tgħammir (jinstabu tapp vaġinali jew sperma). Fil-każ li l-par ma jirnexxix, jista’ jiġi kkunsidrat it-tgħammir mill-ġdid ta’ nisa ma’ rġiel diġa ipprovati tal-istess grupp. Daqs tal-boton 33. Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta’ kull boton jista’ jiġi aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda b’għażla aleatorja biex jitrendew, l-aktar viċin possibbli, erba’ jew ħamest ifrieħ għal kull sess għal kull boton skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użata. Il-kampjuni tad-demm għandhom jinġabru minn tnejn mill-frieħ eċċessi, jiġu raggruppati, u jintużaw għad-determinazzjoni tal-livelli tas-serum T4. Ma għandhiex issir eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż. fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem, jew tad-distanza anoġenitali (AGD). Mull meta n-numru ta’ frieħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun hemm erbgħa jew ħamsa minn kull sess għal kull boton, hu aċċettabbli li jsir aġġustament parzjali (pereżempju, sitt irġiel u erba’ nisa). Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas mill-mira tal-qtil (8 jew 10 ferħ/boton). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mill-mira tal-qtil, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4. 34. Jekk id-daqs tal-boton ma jkunx aġġustat, żewġt ifrieħ għal kull boton jiġu sagrifikati fil-jum 4 wara t-twelid u jittieħdu l-kampjuni tad-demm għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-ormon tat-tirojde tas-serum. Jekk possibbli, iż-żewġt ifrieħ għal kull boton għandhom ikunu frieħ nisa biex il-frieħ irġiel jinżammu għall-evalwazzjonijiet taż-żamma tal-beżżula ħlief fil-każ li jekk jitneħħew dawn il-frieħ ma jifdal ebda nisa għall-valutazzjoni fit-terminazzjoni. Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas minn 8 jew 10 ifrieħ/boton (skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użati). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mid-daqs normali tal-boton, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4. Osservazzjonijiet fil-ħajja Osservazzjonijiet kliniċi 35. Matul il-perjodu tat-test, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-anqas darba kuljum, u aktar spiss meta jiġu osservati sinjali ta’ tossiċità. Idealment dawn għandhom isiru fl-istess ħin kuljum, b’kunsiderazzjoni tal-perjodu bl-ogħla livell ta’ effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Tibdil relevanti fl-imġiba, sinjali ta’ diffikultà jew titwil tal-proċess tal-ħlas u kull sinjal ta’ tossiċità, inkluża l-mortalità, għandhom ikunu irreġistrati. Dawn ir-rekords għandhom jinkludu l-ħin tal-bidu, il-grad u d-durata tas-sinjali ta’ tossiċità. Piż tal-ġisem u konsum ta’ ikel/ilma 36. L-irġiel u n-nisa għandhom jintiżnu fl-ewwel jum tad-dożaġġ, tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, u fit-terminazzjoni. Matul it-tqala, in-nisa għandhom jintiżnu fil-jiem 0, 7, 14 u 20 u fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom ikunu rapportati individwalment għal kull annimal adult. 37. Matul il-fażi ta’ qabel it-tgħammir, it-tqala u t-treddigħ, il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel tal-anqas darba fil-ġimgħa. Il-kejl tal-konsum tal-ikel matul it-tgħammir hu fakultattiv. Il-konsum tal-ikel matul dawn il-perjodi għandu jitkejjel ukoll meta s-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb. Ċikli estrużi 38. Iċ-ċikli estrużi għandhom jiġu ssorveljati qabel ma jibda t-trattament biex għall-istudju jintgħażlu nisa b’ċikliċità regolari (ara l-paragrafu 22). It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu ssorveljati ta’ kuljum ukoll mill-bidu tal-perjodu ta’ trattament sal-evidenza ta’ tgħammir. Jekk ikun hemm tħassib dwar effetti akuti ta’ stress li jistgħu jbiddlu ċ-ċikli estrużi bit-tnedija tad-dożaġġ, il-laboratorji jistgħu jesponu l-annimali tat-test għal ġimagħtejn (2), imbagħad jiġbru tiċpisiet vaġinali ta’ kuljum biex jissorveljaw iċ-ċiklu estruż għal minimu ta’ ġimagħtejn matul il-perjodu ta’ qabel it-tgħammir b’monitoraġġ issoktat fil-perjodu ta’ tgħammir sakemm ikun hemm evidenza ta’ tgħammir. Meta jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tfixkil tal-mukoża, li jista’ jinduċi psewdotqala (7) (8). Parametri tal-ulied 39. Id-durata tal-ġestazzjoni għandha tiġi reġistrata u hi kkalkolata mill-jum 0 tat-tqala. Kull boton għandu jiġi eżaminat mill-aktar fis possibbli wara l-ħlas biex jiġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frieħ, it-twelid mejjet, it-twelid ħaj, it-twelid mhux żviluppat (frieħ li jkunu ferm iżgħar mill-frieħ tal-kontroll korrispondenti) u l-preżenza ta’ anormalitajiet serji. 40. Frieħ ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess u kull boton għandu jintiżen fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Minbarra l-osservazzjonijiet deskritti fil-paragrafu 35, kwalunkwe mġiba anormali tal-wild għandha tiġi reġistrata. 41. L-AGD ta’ kull ferħ għandha titkejjel fl-istess jum postnatali bejn il-PND 0 sal-PND 4. Il-piż tal-ġisem tal-frieħ għandu jinġabar dakinhar li titkejjel l-AGD u l-AGD għandha tiġi normalizzata għal kejl tad-daqs tal-ferħ, idealment l-għerq kwadrat tal-piż tal-ġisem (9). In-numru ta’ bżieżel/areoli fil-frieħ irġiel għandu jingħadd fil-PND 12 jew 13 kif rakkomandat fil-GD 151 tal-OECD (10). Bijokimika klinika 42. Il-kampjuni tad-demm minn sit definit jittieħdu fuq il-bażi tal-iskeda li ġejja: — minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fil-jum 4 wara t-twelid, jekk in-numru ta’ frieħ jippermetti (ara l-paragrafi 33-34) — mill-ommijiet kollha u minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fit-terminazzjoni fil-jum 13, u — mill-irġiel adulti kollha, fit-terminazzjoni, Il-kampjuni kollha tad-demm jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. Kampjuni tad-demm mill-frieħ tal-jum 13 u mill-irġiel adulti jiġu vvalutati għal-livelli tas-serum għall-ormoni tat-tirojde (T4). Issir valutazzjoni ulterjuri tat-T4 fil-kampjuni tad-demm għall-ommijiet u għall-frieħ tal-jum 4 jekk tkun rilevanti. Hemm l-għażla li jistgħu jitkejlu ormoni oħra jekk ikunu rilevanti. Id-demm tal-frieħ jista’ jiġi raggruppat skont il-boton għall-analiżijiet tal-ormon tat-tirojde. L-ormoni tat-tirojde (T4 u TSH) idealment għandhom jitkejlu bħala “total”. 43. Il-fatturi li ġejjin jistgħu jinfluwenzaw il-varjabbiltà u l-konċentrazzjonijiet assoluti tad-determinazzjonijiet tal-ormoni: — il-ħin tal-qatla minħabba varjazzjonijiet tul il-jum tal-konċentrazzjonijiet tal-ormoni — il-metodu tal-qatla biex tkun evitata tensjoni bla bżonn għall-annimali li tista’ taffettwa l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni — is-settijiet tat-testijiet għad-determinazzjonijiet tal-ormoni li jistgħu jkunu differenti mill-kurvi standard tagħhom. 44. Kampjuni ta’ plażma maħsubin speċifikatament għal determinazzjoni tal-ormoni għandhom jinkisbu f’ħin komparabbli tal-jum. Il-valuri numeriċi miksubin meta jkunu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni jkunu differenti fost diversi settijiet ta’ analiżi kummerċjali. Patoloġija Nekroskopija grossa 45. Fil-waqt tas-sagrifiċċju jew tal-mewt matul l-istudju, l-annimali adulti għandhom jiġu eżaminati makroskopikament għal kwalunkwe anormalità jew tibdil patoloġiku. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-organi tas-sistema riproduttiva. In-numru ta’ siti ta’ impjantazzjoni għandu jiġi reġistrat. It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu eżaminati filgħodu dakinhar tan-nekroskopija biex jiġi determinat l-istadju taċ-ċiklu estruż u tkun tista’ ssir korrelazzjoni mal-istopatoloġija tal-ovarji. 46. It-testikoli u l-epididimidi kif ukoll il-bżieżaq tal-prostata u seminali bil-glandoli koagolanti fis-sħuħija tagħhom, tal-annimali adulti rġiel kollha għandhom jiġu mirquma minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u l-piż niedi tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. Barra minn hekk, il-piżijiet tal-organi fakultattivi jistgħu jinkludu l-kumpless tal-levator ani u tal-muskolu bulbokavernuż, il-glandoli ta’ Cowper u r-ras tal-pene fl-irġiel u l-ovarji f’pari (piż imxarrab) u l-utru (inkluż iċ-ċerviċi) fin-nisa; jekk inklużi, dawn il-piżijiet għandhom jinġabru mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni. 47. Frieħ mejtin u frieħ maqtula fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara, tal-anqas għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa esternament għal anormalitajiet serji. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-ġenitali riproduttivi esterni li għandhom jiġu eżaminati għal sinjali ta’ żvilupp mibdul. Fil-jum 13, għandha tiġi preservata t-tirojde minn ferħ raġel wieħed u minn ferħ mara waħda għal kull boton. 48. L-ovarji, it-testikoli, l-organi sesswali aċċessorji (utru u ċerviċi, epididimidu, prostata, bużżieqa seminali u l-glandoli koagolanti), it-tirojde u l-organi kollha li juru leżjonijiet makroskopiċi tal-annimali adulti kollha għandhom jiġu preservati. Il-fissazzjoni formalina mhix rakkomandata għall-eżaminazzjoni ta’ rutina tat-testikoli u tal-epididimidu. Metodu aċċettabbli hu l-użu tal-fissattiv ta’ Bouin jew ta’ Davidsons modifikat għal dawn it-tessuti (11). It-tunika albuġinea tista’ tittaqqab bil-mod u mhux fil-fond fiż-żewġ poli tal-organu b’labra biex jitħalla jkun hemm penetrazzjoni malajr tal-fissattiv. Istopatoloġija 49. Għandu jsir eżami istoloġiku dettaljat fuq l-ovarji, it-testikoli u l-epididimide (b’enfasi speċjali fuq l-istadji tal-ispermatoġenesi u l-istopatoloġija tal-istruttura ċellolari testikolari interstizjali) tal-annimali tal-grupp tal-ogħla doża u tal-grupp tal-kontroll. L-organi preservati l-oħra inkluża t-tirojde mill-frieħ u mill-annimali adulti jistgħu jiġu eżaminati meta jkun hemm bżonn. Il-piż tat-tirojde jista’ jiġi ddeterminat wara l-fissazzjoni. It-tirqim għandu jsir ukol b’reqqa kbira u biss wara l-fissazzjoni biex tkun evitata l-ħsara lit-tessut. Il-ħsara fit-tessut tista’ tippreġudika analiżi istopatoloġika. L-eżaminazzjonijiet għandhom ikunu estiżi għall-annimali tal-gruppi l-oħra ta’ dożaġġ meta jkunu osservati tibdiliet fil-grupp tal-ogħla doża. Il-Gwida dwar l-istopatoloġija (11) tagħti aktar informazzjoni dwar id-dissezzjoni, fissazzjoni, tqassim f’taqsimiet u l-istopatoloġija ta’ tessuti endokrinali. DATA U RAPPORTAR Data 50. Għandha tkun ipprovduta d- data dwar l-annimali individwali. Barra minn hekk, id- data kollha għandha tinġabar f’forma tabulari, u għal kull grupp tat-test għandha turi n-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta’ xi mewt jew qtil uman, in-numru ta’ annimali fertili, in-numru ta’ nisa tqal, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inklużi l-ħin tal-ewwel darba, id-durata, u s-severità ta’ kwalunkwe effett tossiku, it-tip ta’ tibdiliet istopatoloġiċi u d- data rilevanti kollha dwar il-boton. Format tabulari tar-rapport ta’ sommarju li wera li hu tassew siewi għall-evalwazzjoni tal-effett riproduttiv/tal-iżvilupp hu mogħti fl-Appendiċi 3. 51. Minħabba d-dimensjonijiet limitati tal-istudju, l-analiżijiet statistiċi fil-forma ta’ testijiet għal “sinifikat” huma ta’ valur limitat għal ħafna punti ta’ tmiem, speċjalment il-punti ta’ tmiem riproduttivi. Jekk jintużaw analiżijiet statistiċi, il-metodu magħżul għandu jkun xieraq għad-distribuzzjoni tal-varjabbli eżaminat, u jintgħażel qabel il-bidu tal-istudju. Analiżi statistika tal-AGD u taż-żamma tal-beżżula għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tal-effetti fuq il-boton. Fejn xieraq, il-boton hu l-unità ta’ analiżi. Analiżi statistika tal-piż tal-ġisem tal-frieħ għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tad-daqs tal-boton. Minħabba d-daqs żgħir tal-grupp, l-użu ta’ data storika tal-kontroll (eż. għad-daqs tal-boton), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju. Evalwazzjoni tar-riżultati 52. Is-sejbiet ta’ dan l-istudju tat-tossiċità għandhom jiġu evalwati f’termini tal-effetti osservati, tan-nekroskopija u tas-sejbiet mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni bejn id-doża u s-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-severità tal-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, l-infertilità, l-anormalitajiet kliniċi, l-imġiba tar-riproduzzjoni u l-boton affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħra. 53. Minħabba l-perjodu qasir ta’ trattament tal-irġiel, l-istopatoloġija tat-testikoli u tal-epididimu għandha tiġi kkunsidrata flimkien mad- data dwar il-fertilità meta jiġu vvalutati l-effetti riproduttivi fuq l-irġiel. L-użu ta’ data storika tal-kontroll fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp (eż. għad-daqs tal-boton, l-AGD, iż-żamma tal-beżżula, il-livelli tas-serum T4), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju. 54. Għall-kontroll tal-kwalità hu propost li tinġabar data storika ta’ kontroll u li għad- data numerika jkunu kkalkolati l-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni, speċjalment għall-parametri li jkollhom rabta mad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali. Din id- data tista’ tintuża għal finijiet ta’ paragun meta jkunu evalwati studji attwali. Rapport tat-test 55. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Sustanza kimika tat-test: — is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli — l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa. Sustanza monokostitwenti: — id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali; — l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ. Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet: — ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti. Veikolu (jekk xieraq): — ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu jekk mhuwiex ilma. L-annimali tat-test: — speċi/razza użata; — l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali; — is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.; — il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test. — ġustifikazzjoni għal speċi jekk ma jkunx far Il-kundizzjonijiet tat-test: — ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża; — dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjonijiet, l-istabbiltà u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni; — dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test; — konverżjoni minn dieta/konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ta’ ilma tax-xorb (ppm) għad-doża attwali (mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli; — dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma; — deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura ta’ każwalizzazzjoni biex jintgħażlu l-frieħ għall-qtil, jekk jinqatlu. Ir-riżultati: — il-piż tal-ġisem/it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem; — il-konsum ta’ ikel, u konsum ta’ ilma, jekk disponibbli; — id-data dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u d-doża, inklużi l-fertilità, il-ġestazzjoni u kwalunkwe sinjal ieħor ta’ tossiċità; — it-tul tal-ġestazzjoni; — l-effetti tossiċi jew oħra fuq ir-riproduzzjoni, l-ulied, it-tkabbir ta’ wara t-twelid, eċċ.; — in-natura, is-severità u d-durata tal-osservazzjonijiet kliniċi (jekk reversibbli jew le); — in-numru ta’ nisa adulti b’ċiklu estruż normali jew anormali u d-durata taċ-ċiklu; — in-numru ta’ twelid ħaj u ta’ telf ta’ wara l-impjantazzjoni; — id-data dwar il-piż tal-ġisem tal-frieħ — l-AGD tal-frieħ kollha (u l-piż tal-ġisem fl-jum tal-kejl tal-AGD) — iż-żamma tal-beżżula fil-frieħ irġiel, — il-livelli tal-ormon tat-tirojde, il-frieħ tal-jum 13 u l-irġiel adulti (u l-ommijiet u l-frieħ tal-jum 4 jekk jitkejlu) — in-numru ta’ frieħ b’anormalitajiet viżibbli ċari, evalwazzjoni grossa tal-ġenitali esterni, in-numru ta’ frieħ imwielda żgħar; — il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test; — in-numru ta’ impjantazzjonijiet, id-daqs tal-boton u l-piżijiet tal-boton fil-ħin tar-reġistrazzjoni; — il-piż tal-ġisem fis-sagrifiċċju u d-data dwar il-piż tal-organi għall-annimali ġenituri; — sejbiet tan-nekroskopija; — deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatoloġiċi; — id-dettalji tal-assorbiment (jekk disponibbli); — trattament statistiku tar-riżultati, fejn xieraq. Diskussjoni tar-riżultati. Kunklużjonijiet. Interpretazzjoni tar-riżultati 56. L-istudju jipprovdi evalwazzjonijiet tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp assoċjata mal-amministrazzjoni ta’ dożi ripetuti (ara l-paragrafi 5 u 6). Jista’ jipprovdi indikazzjoni tal-ħtieġa li jsiru investigazzjonijiet ulterjuri u jipprovdi gwida fit-tfassil tal-istudji sussegwenti. Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 43 għandu jiġi kkonsultat għal għajnuna fl-interpetazzjoni tar-riżultati dwar ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp (12). Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 106 dwar l-Evalwazzjoni Istoloġika tat-Testijiet Endokrinali u Riproduttivi fir-Rodituri (11) jipprovdi informazzjoni dwar it-tħejjija u l-evalwazzjoni tal-organi (endokrinali) u tat-tiċpisiet vaġinali li jistgħu jkunu ta’ għajnuna għal din it-TG. DOKUMENTAZZJONI (1) OECD (1990). Dokument tas-seduta Nru 1 għall-14-il Laqgħa Konġunta tal-Chemicals Group and Management Committee. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (2) OECD (1992). Ir-Rapport tal-President tal-Laqgħa ta’ Esperti ad hoc dwar il-Metodi ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva, Tokyo, 27-29 ta’ Ottubru, 1992. Disponibbli Fuq Talba Mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (3) OECD (1998). Rapport tal-Ewwel Laqgħa tat-Task Force tal-OECD dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni tal-Interferenti Endokrinali (EDTA), 10-11 ta’ Marzu 1998. Disponibbli Fuq Talba Mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. u Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Parti B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, f’Auston C.R. u Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. u Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Appendiċi 1 DEFINIZZJONIJIET (ARA WKOLL IL-GD 150 TAL-OECD (6)) Androġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu. Antiandroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu. Antiestroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu. Attività tal-antitirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu. Sustanza kimika hi sustanza jew taħlita. Tossiċità tal-iżvilupp: il-manifestazzjoni tat-tossiċità riproduttiva, li tirrappreżenta disturbi strutturali jew funzjonali prenatali, perinatali u postnatali fil-wild. Dożaġġ hi terminu ġenerali li jinvolvi d-doża, il-frekwenza tagħha u d-durata tad-dożaġġ. Doża hi l-ammont ta’ sustanza kimika tat-test mogħtija. Id-doża hi espressa bħala piż tas-sustanza kimika tat-test għal kull unità ta’ piż tal-ġisem ta’ annimal tat-test għal kull jum (eż. mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jew bħala konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta. Tossiċità evidenti hi terminu ġenerali li jiddeskrivi sinjali ċari ta’ tossiċità wara li tkun ġiet amministrata kimika għall-ittestjar. Dawn għandhom ikunu suffiċjenti għal valutazzjoni tal-periklu u għandhom ikunu tali li żieda fid-doża amministrata tista’ tkun mistennija li tirriżulta fl-iżvilupp ta’ sinjali ta’ tossiċità estrema u probabbilment mortalità. Indeboliment tal-fertilità tirrappreżenta disturbi tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel jew tan-nisa. Tossiċità materna: effetti avversi fuq nisa tqal, li jseħħu b’mod speċfiku (effett dirett) jew mhux speċifiku (effett indirett). NOAEL hi l-abbrevjazzjoni għal-livell bla effett ħażin osservat. Dan hu l-ogħla livell ta’ doża fejn l-ebda sejbiet ħżiena relatati ma’ trattament ma jkunu osservati minħabba trattament. Estroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu. Tossiċità riproduttiva tirrappreżenta l-effetti dannużi fuq il-wild u/jew indeboliment tal-funzjonijiet jew tal-kapaċità riproduttivi tal-irġiel u tan-nisa. Sustanza kimika tat-test hi kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar. Attività tat-tirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu. Validazzjoni hi proċess xjentifiku mfassal biex jiġu karatterizzati r-rekwiżiti u l-limitazzjonijiet operazzjonali ta’ metodu ta’ ttestjar u biex tintwera l-affidabbiltà u r-relevanza tiegħu għal skop partikolari. Appendiċi 2 DIJAGRAMMA TAL-ISKEDA SPERIMENTALI LI TINDIKA D-DURATA MASSIMA TAL-ISTUDJU, FUQ IL-BAŻI TA’ PERJODU SĦIĦ TA’ TGĦAMMIR FUQ 14-IL JUM ﻿Appendiċi 3 RAPPORT SOMMARJU TABULARI TAL-EFFETTI FUQ IR-RIPRODUZZJONI/L-IŻVILUPP OSSERVAZZJONIJIET Valuri Dożaġġ (unitajiet) 0 (kontroll) — — — — Pari mibdija (N) Ċiklu estruż (tal-anqas it-tul medju u l-frekwenza taċ-ċikli irregolari) Nisa li juru evidenza ta’ tgħammir (N) Nisa li jilħqu t-tqala (N) Jiem tal-konċepiment 1 - 5 (N) Jiem tal-konċepiment 6 -...( (21) ) (N) Tqala ≤ 21 jum (N) Tqala = 22 jum (N) Tqala ≥ 23 jum (N) Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda (N) Ommijiet b’żgħar ħajjin imwielda fil-jum 4 pp (N) Impjanti/omm (medja) Frieħ ħajjin/omm fil-ħlas (medja) Frieħ ħajjin/omm fil-jum 4 (medja) Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-ħlas (medja) Proporzjon tas-sessi (r/n) fil-jum 4 (medja) Piż tal-boton fil-ħlas (medja) Piż tal-boton fil-jum 4 (medja) Piż tal-frieħ fil-ħlas (medja) Piż tal-frieħ fil-ħin tal-kejl tal-AGD (medja tal-irġiel, medja tan-nisa) AGD tal-frieħ fl-istess jum wara t-twelid, fil-ħlas – fil-jum 4 (medja tal-irġiel, medja tan-nisa, nota tal-PND) Piż tal-frieħ fil-jum 4 (medja) Żamma tal-beżżula tal-frieħ irġiel fil-jum 13 (medja) Piż tal-frieħ fil-jum 13 (medja) FRIEĦ ANORMALI Ommijiet b’0 Ommijiet b’1 Ommijiet bi ≥ 2 TELF TAL-ULIED Impjantazzjonijiet qabel/wara t-twelid (impjantazzjonijiet nieqes it-twelid ħaj) Nisa b’0 Nisa b’1 Nisa bi 2 Nisa bi ≥ 3 Wara t-twelid (twelid ħaj nieqes il-ħajjin fil-jum 13 wara t-twelid) Nisa b’0 Nisa b’1 Nisa b’2 Nisa bi ≥ 3 B.64 STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ B’DOŻA RIPETUTA KOMBINAT MAT- TEST TA SKRINJAR TAT-TOSSIĊITÀ RIPRODUTTIVA/TAL-IŻVILUPP INTRODUZZJONI 1. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 422 tal-OECD (2016). Il-linji gwida tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku. Il-linja gwida tat-test ta’ skrinjar oriġinali 422 ġiet adottata fl-1996, fuq il-bażi ta’ protokoll għal “Doża Ripetuta Kombinata u Test ta’ Skrinjar Riproduttiv/tal-Iżvilupp” diskuss f’żewġ laqgħat ta’ esperti, f’Londra fl-1990 (1) u f’Tokyo fl-1992 (2). 2. Dan il-metodu ta’ ttestjar jgħaqqad parti tal-iskrinjar tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp li hi bbażata fuq l-esperjenza miksuba fil-Pajjiżi membri mill-użu tal-metodu oriġinali fuq sustanzi kimiċi eżistenti b’volum ta’ produzzjoni għoli u f’testijiet esploratorji b’sustanzi tal-kontroll pożittiv (3) (4), u parti tat-tossiċità b’doża ripetuta, b’mod konkordat mal-linja gwida tat-test 407 tal-OECD (Studju dwar it-Tossiċità Orali fuq 28 Jum b’Doża Ripetuta, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness). 3. Dan il-metodu ta’ ttestjar ġie aġġornat b’punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali, bħala segwitu għall-attività ta’ prijorità għolja mnedija fl-OECD fl-1998 biex jiġu riveduti l-linji gwida tat-test eżistenti u jiġu żviluppati linji gwida tat-test ġodda għall-iskrinjar u għall-ittestjar ta’ interferenti endokrinali potenzjali (5). F’dan il-kuntest, it-TG 407 (li jikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) issaħħet fl-2008 b’paramettri xierqa għall-individwar tal-attività endokrinali tas-sustanzi kimiċi tat-test. L-objettiv fl-aġġornar tat-TG 422 kien li jiġu inklużi xi punti ta’ tmiem rilevanti ta’ interferenti endokrinali fit-TGs tal-iskrinjar meta l-perjodi ta’ esponiment ikopru wħud mill-perjodi sensittivi matul l-iżvilupp (perjodi ta’ qabel it-twelid jew ta’ kmieni wara t-twelid). 4. Il-punti ta’ tmiem rilevanti tal-interferenti endokrinali addizzjonali magħżula, li wkoll huma parti mit-TG 443 (Studju Estiż dwar it-Tossiċità Riproduttiva f’Ġenerazzjoni Waħda, li jikkorrispondi għall-Kapitolu B.56 ta’ dan l-Anness), kienu inklużi fit-TG 422 fuq il-bażi ta’ studju tal-fattibbiltà li jindirizza mistoqsijiet xjentifiċi u tekniċi relatati mal-inklużjoni tagħhom, kif ukoll adattamenti possibbli fid-disinn tat-test meħtieġa għall-inklużjoni tagħhom (6). 5. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jiġġenera informazzjoni limitata rigward l-effetti ta’ sustanza kimika tat-test fuq il-prestazzjoni riproduttiva fl-irġiel u fin-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u l-ħlas. Mhuwiex alternattiva għall-metodi ta’ ttestjar eżistenti B.31, B.34, B.35 jew B.56 u lanqas ma jiħdilhom posthom. KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU 6. Fil-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta’ sustanza kimika tat-test, id-determinazzjoni ta’ tossiċità orali bl-użu ta’ dożi ripetuti tista’ ssir wara li tkun inkisbet l-informazzjoni inizjali dwar it-tossiċità bl-ittestjar akut. Dan l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar il-perikli possibbli għas-saħħa li aktarx li jirriżultaw minn esponiment ripetut fuq perjodu relattivament limitat ta’ żmien. Il-metodu jinkludi l-istudju dwar id-doża bażika ripetuta ta’ tossiċità li jista’ jintuża għal kimiċi li dwarhom ma jkunx jista’ jsir studju ta’ 90 jum (eż. meta l-volum tal-produzzjoni ma jkunx jeċċedi ċerti limiti) jew bħala studju preliminari għal studju fit-tul. Fit-twettiq tal-istudju, għandhom jiġu segwiti l-prinċipji ta’ gwida u l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-dokument ta’ gwida nru 19 tal-OECD dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-użu ta’ sinjali kliniċi bħala punti ta’ tmiem umanitarji għal annimali sperimentali użati fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (7). 7. Jinkludi wkoll test ta’ skrinjar tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp u, għalhekk, jista’ jintuża wkoll biex jipprovdi informazzjoni inizjali dwar l-effetti possibbli fuq il-prestazzjoni riproduttiva tal-irġiel u tan-nisa bħall-funzjoni gonadali, l-imġiba tat-tgħammir, il-konċepiment, l-iżvilupp tal-konċepit u tal-ħlas, fi stadju bikri tal-valutazzjoni tal-proprjetajiet tossikoloġiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, jew inkella fuq is-sustanzi kimiċi tat-test ta’ tħassib. Dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni kompluta fuq l-aspetti kollha tar-riproduzzjoni u tal-iżvilupp. B’mod partikolari, dan joffri biss mezz limitat kif jiġu individwati l-manifestazzjonijiet ta’ wara t-twelid ta’ esponiment ta’ qabel it-twelid, jew l-effetti li jistgħu jiġu indotti matul l-esponiment ta’ wara t-twelid. Minħabba (fost raġunijiet oħra) is-selettività tal-punti ta’ tmiem, u d-durata qasira tal-istudju, dan il-metodu mhux se jipprovdi evidenza għal dikjarazzjonijiet definiti ta’ ebda effett fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp. Barra minn hekk, fin-nuqqas ta’ data minn testijiet oħra dwar it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali. 8. Ir-riżultati miksubin mill-parametri relatati mas-sistema endokrinali għandhom jitqiesu fil-kuntest tal-“Qafas Kunċettwali tal-OECD għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni ta’ Sustanzi Kimiċi Interferenti Endokrinali” (8). F’dan il-Qafas Kunċettwali, it-TG 422 imtejba tal-OECD tinsab fil-livell 4 bħala assaġġ in vivo li jipprovdi data dwar l-effetti avversi fuq il-punti ta’ tmiem endokrinali rilevanti. Madankollu, sinjal endokrinali waħdu jaf ma jitqiesx evidenza suffiċjenti li s-sustanza kimika tat-test hi interferent endokrinali. 9. Dan il-metodu ta’ ttestjar jenfasizza wkoll fuq l-effetti newroloġiċi bħala punt ta’ tmiem, u fuq il-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet kliniċi bil-galbu tal-annimali, biex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Il-metodu għandu jidentifika is-sustanzi kimiċi li għandhom potenzjal newrotossiku, u li jistgħu jiġġustifikaw investigazzjoni approfondita ulterjuri ta’ dan l-aspett. Barra minn hekk, il-metodu jista’ jagħti wkoll indikazzjoni bażika tal-effetti immunoloġiċi. 10. Fin-nuqqas ta’ data minn studji oħra dwar it-tossiċità sistemika, it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, in-newrotossiċità u/jew l-immunotossiċità, ir-riżultati pożittivi huma siewja għall-valutazzjoni inizjali tal-periklu u jikkontribwixxu għal deċiżjonijiet b’rabta man-neċessità u mat-tempestività tat-testijiet addizzjonali. It-test jista’ jkun partikolarment siewi bħala parti mill-Ġabra ta’ Data għall-Analiżi (SIDS) tal-OECD għall-valutazzjoni tas-sustanzi kimiċi eżistenti li għalihom ftit li xejn ikun hemm informazzjoni tossikoloġika disponibbli jew ebda informazzjoni affattu u jista’ jservi bħala alternattiva għat-twettiq ta’ żewġ testijiet separati għal tossiċità b’doża ripetuta (TG 407 tal-OECD, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.7 ta’ dan l-Anness) u t-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp (TG 421 tal-OECD, li tikkorrispondi għall-Kapitolu B.63 ta’ dan l-Anness), rispettivament. Jista’ jintuża wkoll bħala studju ta’ individwazzjoni tad-doża għal studji aktar estensivi dwar ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp, jew meta jitqies rilevanti għal xi raġuni oħra. 11. Ġeneralment jiġi preżunt li jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u mhux tqal. Konsegwentement, jista’ jkun aktar kumplikat li jiġu determinati livelli tad-doża f’dan it-test kombinat li jkunu adegwati biex jiġu evalwati kemm it-tossiċità sistemika ġenerali kif ukoll it-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp speċifika, minflok meta t-testijiet indiviwali jitwettqu b’mod separat. Barra minn hekk, l-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test fir-rigward tat-tossiċità sistemika ġenerali tista’ tkun aktar diffiċli milli meta jitwettaq studju separat b’doża ripetuta, speċjalment meta l-parametri tas-serum u tal-istopatoloġija ma jkunux evalwati fl-istess ħin fl-istudju. Minħabba dawn il-kumplesstajiet tekniċi, hi meħtieġa esperjenza konsiderevoli fl-ittestjar tat-tossiċità għat-twettiq ta’ dan it-test ta’ skrinjar kombinat. Min-naħa l-oħra, apparti n-numru iżgħar ta’ annimali involuti, it-test kombinat jista’ joffri mezz aħjar kif jiġu disrkiminati l-effetti diretti fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp minn dawk li huma sekondarji għal effetti (sistemiċi) oħra. 12. F’dan it-test, il-perjodu ta’ dożaġġ hu itwal milli fi studju konvenzjonali b’doża ripetuta fuq 28 jum. Madankollu, juża anqas annimali ta’ kull sess għal kull grupp meta mqabbel mas-sitwazzjoni li fiha jitwettaq studju konvenzjonali b’doża ripetuta fuq 28 jum minbarra Test ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva/tal-Iżvilupp. 13. Dan il-metodu ta’ ttestjar jassumi amministrazzjoni orali tas-sustanza kimika tat-test. Jaf ikun hemm bżonn ta’ modifiki jekk jintużaw rotot oħra ta’ esponiment. 14. Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. 15. Fl-Appendiċi 1 jingħataw id-definizzjonijiet użati. PRINĊIPJU TAT-TEST 16. Is-sustanza kimika tat-test tingħata f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ rġiel u nisa. L-irġiel għandhom jingħataw doża għal minimu ta’ erba’ ġimgħat, sal-jum ta’ qabel il-qatla skedata (dan jinkludi minimu ta’ ġimagħtejn qabel it-tgħammir, matul il-perjodu ta’ tgħammir u, bejn wieħed u ieħor, ġimagħtejn wara t-tgħammir). Fid-dawl tal-perjodu ta’ dożaġġ limitat ta’ qabel it-tgħammir, il-fertilità jaf ma tkunx indikatur partikolarment sensittiv ta’ tossiċità testikolari. Għaldaqstant, eżami istoloġiku dettaljat tat-testikoli hu essenzjali. Il-kombinazzjoni tal-perjodu ta’ dożaġġ ta’ qabel it-tgħammir ta’ ġimagħtejn u l-osservazzjonijiet sussegwenti dwar it-tgħammir/il-fertilità b’perjodu ta’ dożaġġ ġenerali ta’ tal-anqas erba’ ġimgħat, segwiti minn istopatoloġija dettaljata tal-gonadi tal-irġiel, hija meqjusa suffiċjenti biex tkun tista’ tiġi individwata l-maġġoranza tal-effetti fuq il-fertilità u l-ispermatoġenesi tal-irġiel. 17. In-nisa għandhom jingħataw doża matul l-istudju kollu. Dan jinkludi ġimagħtejn qabel it-tgħammir (bl-objettiv li jkunu koperti tal-anqas żewġ ċikli estrużi sħaħ), il-ħin varjabbli sal-konċepiment, id-durata tat-tqala u tal-anqas 13-il jum wara l-ħlas, sa u inkluż il-jum ta’ qabel il-qatla skedata. 18. Id-durata tal-istudju, wara l-akklimatizzazzjoni u l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż ta’ qabel id-dożaġġ, tiddependi mill-prestazzjoni tan-nisa u hi madwar 63 jum, [tal-anqas 14-il jum qabel it-tgħammir, (sa) 14-il jum tat-tgħammir, 22 jum tal-ġestazzjoni, 13-il jum tat-treddigħ]. 19. Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni l-annimali jkunu osservati mill-qrib, kull jum għal sinjali ta’ tossiċità. L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul it-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqgħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom awtopsja. DESKRIZZJONI TAL-METODU Għażla tal-ispeċi tal-annimali 20. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu mfassal biex jintuża b’firien. Għandha tingħata ġustifikazzjoni dettaljata jekk il-parametri speċifikati f’dan it-TG 422 ikunu investigati fi speċijiet oħra ta’ rodituri. Fil-programm internazzjonali ta’ validazzjoni għad-detezzjoni tal-interferenti endokrinali fit-TG 407, il-far kien l-unika speċi użata. Ma għandhomx jintużaw razez b’fekundità baxxa jew li huma magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta’ difetti fl-iżvilupp. Għandhom ikunu użati annimali verġni f’saħħithom li ma kinux soġġetti għal proċeduri sperimentali preċedenti. L-annimali ittestjati għandhom ikunu karatterizzati skont l-ispeċi, ir-razza, is-sess, il-piż u/jew l-età. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali użati ma għandux jaqbeż ± 20 % tal-valur medju ta’ kull sess. Meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju fit-tul jew ta’ ġenerazzjoni sħiħa, idealment fiż-żewġ studji jintużaw annimali li jkunu mill-istess razza u sors. Abitazzjoni u għalf 21. Il-proċeduri kollha għandhom ikunu konformi ma’ standards lokali tal-kura tal-annmali tal-laboratorju. It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperiment għandha tkun ta’ 22 °C (± 3 °). L-umdità relattiva għandha tkun tal-anqas ta’ 30 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, billi l-fotoperjodu jkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata b’dan il-metodu. 22. L-annimali għandhom jitqiegħdu f’abitazzjoni fi gruppi żgħar tal-istess sess; l-annimali jistgħu jitqiegħdu f’abitazzjoni waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat. Għal gruppi f’gaġeġ, ma għandux ikun hemm aktar minn ħames annimali jabitaw f’gaġġa waħda. Il-proċeduri ta’ tgħammir għandhom jitwettqu f’gaġeġ adattati għall-iskop. In-nisa tqal għandhom jitqiegħdu fil-gaġeġ waħedhom u jiġu pprovduti b’materjali tat-tibjit. In-nisa li jkunu qed ireddgħu jitqiegħdu f’gaġeġ waħedhom mal-wild tagħhom. 23. L-għalf għandu jkun analizzat regolarment għall-kontaminanti. Għandu jinżamm kampjun tad-dieta sakemm ikun iffinalizzat ir-rapport. Preparazzjoni tal-annimali 24. Annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma miġbura kif jinzerta u assenjati għall-gruppi tat-trattament u għall-gaġeġ. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati unikament u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom tal-anqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju. Preparazzjoni tad-dożi 25. Hu rakkomandat li s-sustanza kimika tat-test tingħata b’mod orali sakemm rotot oħra ta’ amministazzjoni ma jitqisux aktar xierqa. Meta tingħażel ir-rotta orali, is-sustanza kimika tat-test normalment tingħata b’gavage; madankollu, f’każijiet oħra, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll mad-dieta jew mal-ilma tax-xorb. 26. Meta jkun hemm bżonn, is-sustanza kimika tat-test tinħall jew tiġi sospiża f’veikolu xieraq. Hu rrakkomandat li, kull meta jkun possibbli, l-ewwel għandu jitqies l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni fl-ilma, segwit minn konsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/sospensjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħa) u mbagħad possibbilment b’soluzzjoni f’veikoli oħra. Għal veikoli mhux milwiema, għandhom ikunu magħrufin il-karatteristiċi tossiċi tal-veikolu. Għandhom jiġu ddeterminati l-istabbiltà u l-omoġenità tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. PROĊEDURA Numru u Sess tal-annimali 27. Hu rakkomandat li kull grupp jinbeda b’tal-anqas 10 irġiel u 12-13-il mara. In-nisa jiġu evalwati qabel l-esponiment għaċ-ċikliċità estruża u l-annimali li ma jurux ċikli tipiċi ta’ bejn erba’ u ħamest ijiem ma jiddaħħlux fl-istudju; għaldaqstant, huma rakkomandati nisa żejda biex jinkisbu 10 nisa għal kull grupp. Ħlief fil-każ ta’ effetti tossiċi ċari, hu mistenni li dan jipprovdi tal-anqas tmien nisa tqal għal kull grupp li normalment ikun in-numru minimu aċċettabbli ta’ nisa tqal għal kull grupp. L-objettiv hu li jiġu prodotti biżżejjed nisa tqal u wlied biex tkun żgurata evalwazzjoni sinifikattiva tal-potenzjal tas-sustanza kimika tat-test biex taffettwa l-fertilità, it-tqala, l-imġiba materna u tat-treddigħ, u t-tkabbir u l-iżvilupp tal-ulied F 1 , mill-konċepiment sa 13-il jum wara l-ħlas. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel tmiem l-istudju. Għandha tingħata konsiderazzjoni għal grupp satellitarju addizzjonali ta’ ħames annimali għal kull sess fil-grupp ta’ kontroll u f’dak tad-doża l-aktar għolja għall-osservazzjoni ta’ riversibbiltà, persistenza jew okkorrenza mdewma ta’ effetti tossiċi sistemiċi, għal mill-anqas 14-il jum wara it-trattament. L-annimali tal-gruppi satellitarji ma jitgħammrux u, konsegwentement, ma jintużawx għall-valutazzjoni tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp. Dożaġġ 28. Ġeneralment, tal-anqas għandhom jintużaw tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll. Jekk ma jkun hemm l-ebda data adattata disponibbli dwar it-tossiċità ġenerali, jista’ jsir studju dwar tiftix ta’ firxa (annimali tal-istess razza u sors) bħala għajnuna għad-determinazzjoni tad-dożi li jkollhom jintużaw. Ħlief għat-trattament bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jitqandlu bl-istess mod bħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintuża veikolu biex tkun amministrata s-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta’ kontroll għandu jirċievi l-veikolu fl-ogħla volum użat. 29. Il-livelli tad-doża għandhom jintgħażlu b’kunsiderazzjoni ta’ kwalunkwe data eżistenti disponibbli dwar it-tossiċità u l-kinetika (jew it-tossikokinetika). Ta’ min iqis ukoll li jista’ jkun hemm differenzi fis-sensittività bejn annimali tqal u annimali mhux tqal. L-ogħla livell ta’ doża għandu jintgħażel bl-għan li jġib effetti tossiċi iżda mhux il-mewt jew tbatija evidenti. Wara, għandha tingħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża bl-għan li jintwerew kwalunkwe reazzjoni relatata mad-dożaġġ u ebda effett avvers fl-anqas livell tad-doża. Intervalli ta’ darbtejn jew ta’ erba’ darbiet ta’ spiss ikunu ottimali u ż-żieda tar-raba’ grupp tat-test sikwit spiss tkun preferibbli milli jintużaw intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi. 30. Meta jkun hemm tossiċità ġenerali osservata (eż. piż tal-ġisem imnaqqas, effetti tal-fwied, qalb, pulmun jew kliewi, eċċ.) jew tibdiliet oħra li jistgħu ma jkunux risponsi tossiċi (eż. konsum anqas ta’ ikel, tkabbir tal-fwied), l-effetti osservati fuq punti ta’ tmiem sensittivi endokrinali għandhom ikunu interpretati b’kawtela. Test tal-limitu 31. Jekk studju orali b’livell ta’ doża waħda ta’ mill-anqas 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum jew, għall-amministrazzjoni tad-dieta, ta’ perċentwali ekwivalenti fid-dieta, jew ta’ ilma tax-xorb (fuq il-bażi tad-determinazzjonijiet tal-piż tal-ġisem), billi jintużaw il-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi osservabbli u jekk ma tkunx mistennija tossiċità bbażata fuq data minn sustanzi relatati strutturalment, f’dak il-każ studju sħiħ bl-użu ta’ diversi livelli ta’ doża jista’ ma jitqiesx li jkun meħtieġ. It-test ta’ limitu japplika ħlief meta espożizzjoni umana tindika l-ħtieġa li jkollu jintuża livell ogħla ta’ doża. Għal tipi oħrajn ta’ amministrazzjoni, bħal ma hi l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-sustanzi kimiċi tat-test, bħal kemm tinħall, ta’ spiss jistgħu jiddettaw l-esponiment massimu li jista’ jinkiseb. Amministrazzjoni tad-dożi 32. L-annimali jingħataw doża tas-sustanza kimika tat-test darba kuljum għal sebat ijiem f’ġimgħa. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata b’gavage, dan għandu jsir b’doża singola lill-annimali billi jintuża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni adattat. Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment juru effetti ta’ irritazzjoni b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun imminimizzata billi l-konċentrazzjoni tkun aġġustata biex ikun żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża. 33. Għal sustanzi kimiċi tat-test mogħtija permezz tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilanċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza kimika tat-test tkun amministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal, jista’ jkun użat; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Għal sustanza amministrata b’gavage, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili ta’ kull jum, u tiġi aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa biex jinżamm livell kostanti ta’ doża f’termini tal-piż tal-ġisem tal-annimal. Meta l-istudju kombinat jintuża bħala preliminari għal studju tat-tossiċità riproduttiva fit-tul jew sħiħ, għandha tintuża dieta simili fiż-żewġ studji. Skeda sperimentali 34. Id-dożaġġ taż-żewġ sessi għandu jibda ġimagħtejn (2) qabel it-tgħammir, wara li jkunu tħallew iderru għal tal-anqas ħamest ijiem u n-nisa jkunu ġew skrinjati għaċ-ċikli estrużi normali (f’perjodu ta’ pretrattament ta’ ġimagħtejn). L-istudju għandu jkun skedat b’tali mod li l-evalwazzjoni taċ-ċiklu estruż tibda ftit wara li l-annimali jkunu kisbu maturità sesswali sħiħa. Dan jista’ jvarja ftit għal razez differenti ta’ firien f’laboratorji differenti, eż. firien Sprague Dawley ta’ 10 ġimgħat, firien Wistar li jkollhom madwar 12-il ġimgħa. L-ommijiet b’wild għandhom jinqatlu fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara. Biex l-ommijiet jitħallew isumu qabel il-ġbir tad-demm (jekk din l-għażla tkun preferuta), l-ommijiet u uliedhom mhux bilfors ikollhom jinqatlu fl-istess jum. Il-jum tat-twellid (meta jitlesta l-ħlas) hu definit bħala l-jum 0 wara l-ħlas. In-nisa li ma juru ebda evidenza ta’ tgħammir jinqatlu 24-26 jum wara l-aħħar jum tal-perjodu ta’ tgħammir. Id-dożaġġ jissokta għaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta’ tgħammir. L-irġiel għandhom jibqgħu jingħataw id-doża wara l-perjodu ta’ tgħammir tal-anqas sakemm jitlesta l-perjodu minimu totali ta’ dożaġġ ta’ 28 jum. Imbagħad dawn jinqatlu jew inkella jinżammu u jibqgħu jingħataw id-doża għat-twettiq possibbli tat-tieni fażi ta’ tgħammir jekk jitqies li din tkun xierqa. 35. Id-dożaġġ ta’ kuljum tan-nisa ommijiet għandu jkompli matul it-tqala u tal-anqas sal-jum 13 wara l-ħlas, b’dan il-jum inkluż, jew sal-jum ta’ qabel is-sagrifiċċju. Għall-istudji li fihom is-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs jew bir-rotta dermali, id-dożaġġ għandu jkompli tal-anqas sal-jum 19 tal-ġestazzjoni, b’dan il-jum inkluż, u d-dożaġġ għandu jerġa’ jinbeda mill-aktar fis possibbli u mhux aktar tard mill-jum 4 ta’ wara t-twelid (PND). 36. L-annimali fi grupp satellitarju skedati għall-osservazzjonijiet ta’ segwitu, jekk jiġu inklużi, ma jitħallewx jitgħammru. Dawn għandhom jinżammu tal-anqas għal 14-il jum ulterjuri wara l-ewwel qtil skedat tal-ommijiet, mingħajr trattament biex jiġu individwati okkorrenza ttardjata, jew persistenza ta’ effetti tossiċi jew irkupru minn dawn. 37. Dijagramma tal-iskeda sperimentali hi mogħtija fl-Appendiċi 2. Ċikli estrużi 38. Iċ-ċikli estrużi għandhom jiġu ssorveljati qabel ma jibda t-trattament biex għall-istudju jintgħażlu nisa b’ċikliċità regolari (ara l-paragrafu 27). It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu ssorveljati ta’ kuljum ukoll mill-bidu tal-perjodu ta’ trattament sal-evidenza ta’ tgħammir. Jekk ikun hemm tħassib dwar effetti akuti ta’ stress li jistgħu jbiddlu ċ-ċikli estrużi bit-tnedija tad-dożaġġ, il-laboratorji jistgħu jesponu l-annimali tat-test għal ġimagħtejn (2), imbagħad jiġbru tiċpisiet vaġinali ta’ kuljum biex jissorveljaw iċ-ċiklu estruż għal minimu ta’ ġimagħtejn matul il-perjodu ta’ qabel it-tgħammir b’monitoraġġ issoktat fil-perjodu ta’ tgħammir sakemm ikun hemm evidenza ta’ tgħammir. Meta jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat tfixkil tal-mukoża, li jista’ jinduċi psewdotqala (8) (9). Priċedura tat-tgħammir 39. Normalment, f’dan l-istudju għandu jsir tgħammir 1:1 (raġel wieħed ma’ mara waħda). Jista’ jkun hemm eċċezzjonijiet f’każ ta’ mwiet okkażjonali tal-irġiel. Il-mara għandha titqiegħed mal-istess raġel sakemm tiġi osservata evidenza ta’ tgħammir jew ikunu għaddew ġimagħtejn. Kull filgħodu in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta’ sperma jew ta’ tapp vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala hu definit bħala l-jum li fih tiġi kkonfermata evidenza ta’ tgħammir (jinstabu tapp vaġinali jew sperma). Fil-każ li l-par ma jkunx irnexxa, jista’ jiġi kkunsidrat it-tgħammir mill-ġdid ta’ nisa ma’ rġiel diġa ipprovati tal-istess grupp. Daqs tal-boton 40. Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta’ kull boton jista’ jiġi aġġustat billi jiġu eliminati l-frieħ żejda b’għażla aleatorja biex jitrendew, l-aktar viċin possibbli, erba’ jew ħamest ifrieħ għal kull sess għal kull boton skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użata. Il-kampjuni tad-demm għandhom jinġabru minn tnejn mill-frieħ eċċessivi, jiġu raggruppati, u jintużaw għad-determinazzjoni tal-livelli tas-serum T4. Ma għandhiex issir eliminazzjoni selettiva tal-frieħ, eż. fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem jew tad-distanza anoġenitali (AGD). Mull meta n-numru ta’ frieħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun hemm erbgħa jew ħamsa minn kull sess għal kull boton, hu aċċettabbli li jsir aġġustament parzjali (pereżempju, sitt irġiel u erba’ nisa). Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas mill-mira tal-qtil (8 jew 10 ferħ/boton). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mill-mira tal-qtil, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4. 41. Jekk id-daqs tal-boton ma jkunx aġġustat, żewġt ifrieħ għal kull boton jiġu sagrifikati fil-jum 4 wara t-twelid u jittieħdu l-kampjuni tad-demm għall-kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-ormon tat-tirojde tas-serum. Jekk possibbli, iż-żewġt ifrieħ għal kull boton għandhom ikunu frieħ nisa biex il-frieħ irġiel jinżammu għall-evalwazzjonijiet taż-żamma tal-beżżula, ħlief fil-każ li jekk jitneħħew dawn il-frieħ ma jifdal ebda nisa għall-valutazzjoni fit-terminazzjoni. Ebda ferħ ma jiġi eliminat meta d-daqs tal-boton jonqos għal anqas minn 8 jew 10 ifrieħ/boton (skont id-daqs normali tal-boton fir-razza ta’ firien użati). Jekk ikun hemm ferħ wieħed biss disponibbli aktar mid-daqs normali tal-boton, ferħ wieħed biss jiġi eliminat u jintuża għall-ġbir tad-demm għall-valutazzjonijiet possibbli tas-serum T4. Osservazzjonijiet 42. Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali tal-anqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u b’kunsiderazzjoni tal-perjodu bl-ogħla livell ta’ effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjoni tas-saħħa tal-annimali għandha tiġi rreġistrata. Tal-inqas darbtejn kuljum l-annimali kollha jiġu osservati għal morbidità u għal mortalità. 43. Darba qabel l-ewwel esponiment (biex ikunu jistgħu jsiru paraguni fi ħdan l-istess suġġetti), u tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi dettaljati fl-annimali ġenituri kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa f’arena standard u preferebbilment fl-istess jum kull darba. Dawn għandhom jiġu reġistrati bir-reqqa; idealment bl-użu ta’ sistemi ta’ punteġġ, definiti b’mod espliċitu mil-laboratorju tal-ittestjar. Għandu jsir sforz biex ikun żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test ikunu minimi u li l-osservazzjonijiet preferibbilment jitmexxew minn osservaturi li ma jkunux jafu bit-trattament. Is-sinjali osservati għandhom jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, tibdliet fil-ġilda, il-pil, l-għajnejn, il-membrani mukużi, l-okkorrenza ta’ tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal-ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu). Tibdliet fil-mixja, fil-qagħda u fir-rispons għal immaniġġar, kif ukoll il-preżenza ta’ movimenti kloniċi jew toniċi, stereotipi (eż. tindif eċċessiv, dawran ripetittiv), ħlas bit-tbatija jew fit-tul jew imġiba biżarra (eż. awtomutilazzjoni, mixi b’lura) għandhom ukoll ikunu rreġistrati (10). 44. Darba matul l-istudju, ir-reattività sensorjali għal stimoli ta’ modalitajiet differenti (eż. stimoli awditorji, viżwali u proprjoċettivi) (8) (9) (11), valutazzjoni tas-saħħa tal-qabda (12) u valutazzjoni tal-attività motorja (13) għandhom isiru f’ħamest irġiel u f’ħames nisa, magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp. Aktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu jkunu segwiti jingħataw fir-referenzi rispettivi. Iżda jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi minbarra dawk fir-referenzi. Fl-irġiel, dawn l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom isiru lejn tmiem il-perjodu tad-dożaġġ, ftit qabel il-qtil skedat iżda qabel il-kampjunar tad-demm għall-ematoloġija jew għall-kimika klinika (ara l-paragrafi 53-56, inkluża n-nota 1 f’qiegħ il-paġna). In-nisa għandhom ikunu fi stat fiżjoloġikament simili matul dawn it-testijiet funzjonali u idealment għandhom jiġu ttestjati darba matul l-aħħar ġimgħa tat-treddigħ (eż. LD 6-13), ftit qabel il-qtil skedat. Sa fejn possibbli, naqqas il-ħinijiet ta’ separazzjoni tal-ommijiet u tal-frieħ. 45. Osservazzjonijiet funzjonali li jsiru darba lejn tmiem l-istudju jistgħu jitħallew barra meta l-istudju jsir bħala studju preliminari għal studju subkroniku sussegwenti (90 jum) jew fit-tul. F’dak il-każ, l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom ikunu inklużi f’dan studju ta’ segwitu. Min-naħa l-oħra, id-disponibbiltà ta’ data dwar osservazzjonijiet funzjonali minn dan l-istudju b’doża ripetuta tista’ ssaħħaħ il-kapaċità biex jintgħażlu dożi għal studju subkroniku sussegwenti jew fit-tul. 46. Bħala eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistgħu wkoll jitħallew barra għal gruppi li xort’oħra juru sinjali ta’ tossiċità tant li tfixkel b’mod sinifikanti l-prestazzjoni funzjonali tat-test. 47. Id-durata tal-ġestazzjoni għandha tiġi reġistrata u hi kkalkolata mill-jum 0 tat-tqala. Kull boton għandu jiġi eżaminat mill-aktar fis possibbli wara l-ħlas biex jiġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frieħ, it-twelid mejjet, it-twelid ħaj, it-twelid mhux żviluppat (frieħ li jkunu ferm iżgħar mill-frieħ tal-kontroll korrispondenti), u l-preżenza ta’ anormalitajiet serji. 48. Frieħ ħajjin għandhom jingħaddu u jitqassmu skont is-sess u kull boton għandu jintiżen fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Minbarra l-osservazzjonijiet fuq l-annimali ġenituri (ara l-paragrafi 43 u 44), kwalunkwe mġiba anormali tal-wild għandha tiġi reġistrata. 49. L-AGD ta’ kull ferħ għandha titkejjel fl-istess jum postnatali bejn il-PND 0 sal-PND 4. Il-piż tal-ġisem tal-frieħ għandu jinġabar dakinhar li titkejjel l-AGD u l-AGD għandha tiġi normalizzata għal kejl tad-daqs tal-ferħ, idealment l-għerq kwadrat tal-piż tal-ġisem (14). In-numru ta’ bżieżel/areoli fil-frieħ irġiel għandu jingħadd fil-PND 12 jew 13 kif rakkomandat fil-GD 151 tal-OECD (15). Piż tal-ġisem u konsum ta’ ikel/ilma 50. L-irġiel u n-nisa għandhom jintiżnu fl-ewwel jum tad-dożaġġ, tal-anqas darba fil-ġimgħa wara dan, u fit-terminazzjoni. Matul it-tqala, in-nisa għandhom jintiżnu fil-jiem 0, 7, 14 u 20 u fi żmien 24 siegħa mill-ħlas (jum 0 jew 1 wara l-ħlas) u tal-anqas fil-jiem 4 u 13 wara l-ħlas. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom ikunu rapportati individwalment għal kull annimal adult. 51. Matul il-fażi ta’ qabel it-tgħammir, it-tqala u t-treddigħ, il-konsum tal-ikel għandu jitkejjel tal-anqas darba fil-ġimgħa. Il-kejl tal-konsum tal-ikel matul it-tgħammir hu fakultattiv. Il-konsum tal-ikel matul dawn il-perjodi għandu jitkejjel ukoll meta s-sustanza kimika tat-test tingħata b’dak il-medium. Ematoloġija 52. Darba matul l-istudju, għandhom isiru l-eżaminazzjonijiet ematoloġiċi li ġejjin f’ħamest irġiel u ħames nisa magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp: ematokrit, konċentrazzjoni ta’ emoglobina, l-għadd ta’ eritroċiti, retikuloċiti, l-għadd totali u differenzjali tal-lewkoċiti, l-għadd tal-pjastrini u kejl tal-ħin/potenzjali ta’ koagulazzjoni. Determinazzjonijiet oħra li għandhom isiru, jekk is-sustanza kimika tat-test jew il-metaboliti putattivi tagħha jkollhom jew ikunu ssuspettati li jkollhom proprjetajiet ossidanti, jinkludu konċentrazzjoni ta’ metemoglobina u l-korpi ta’ Heinz. 53. Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn sit imsemmi. In-nisa għandhom ikunu fi stat fiżjoloġikament simili matul il-kampjunar. Biex jiġu evitati diffikultajiet prattiċi relatati mal-varjabbiltà fil-bidu tal-ġestazzjoni, il-ġbir tad-demm fin-nisa jista’ jsir fi tmiem il-perjodu ta’ tgħammir bħala alternattiva għall-kampjunar eżatt qabel il-proċedura għall-ewtanażja tal-annimali jew bħala parti minn din. Il-kampjuni tad-demm tal-irġiel idealment għandhom jittieħdu eżatt qabel l-ewtanażja tal-annimali jew bħala parti minn din. Inkella, il-ġbir tad-demm fl-irġiel jista’ jsir ukoll fi tmiem il-perjodu ta’ tgħammir meta dan il-punt ta’ żmien ikun ingħata preferenza għan-nisa. 54. Il-kampjuni tad-demm għandhom jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. Bijokimika klinika 55. Id-determinazzjonijiet tal-bijokimika klinika biex jiġu investigati effetti tossiċi kbar f’tessuti u, b’mod speċifiku, l-effetti fuq il-kliewi u l-fwied, għandhom isiru fuq kampjuni tad-demm miksuba mill-ħamest irġiel u mill-ħames nisa magħżula ta’ kull grupp. Hu rakkomandat is-sawm mal-lejl tal-annimali qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm ( 22 ) . L-investigazzjonijiet tal-plażma jew serum għandhom jinkludu is-sodju, il-potassju, il-glokożju, il-kolesterol totali, l-urea, il-kreatinina, il-proteini u l-albumina totali, tal-anqas żewġ enzimi indikattivi ta’ effetti epatoċellulari (bħalma huma l-alanina aminotransferażi, aspartataminotransferażi u sorbitol deidroġenażi) u aċidi biljari. Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ oriġini epatika jew oriġinijiet oħra) u ta’ bilirubina jistgħu jipprovdu informazzjoni utli f’ċerti ċirkostanzi. 56. Il-kampjuni tad-demm minn sit definit jittieħdu fuq il-bażi tal-iskeda li ġejja: — minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fil-jum 4 wara t-twelid, jekk in-numru ta’ frieħ jippermetti (ara l-paragrafi 40-41) — mill-ommijiet kollha u minn tal-anqas żewġt ifrieħ għal kull boton fit-terminazzjoni fil-jum 13, u — mill-irġiel adulti kollha, fit-terminazzjoni Il-kampjuni kollha tad-demm jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. Kampjuni tad-demm mill-frieħ tal-jum 13 u mill-irġiel adulti jiġu vvalutati għal-livelli tas-serum għall-ormoni tat-tirojde (T4). Issir valutazzjoni ulterjuri tat-T4 fil-kampjuni tad-demm għall-ommijiet u għall-frieħ tal-jum 4 jekk tkun rilevanti. Hemm l-għażla li jistgħu jitkejlu ormoni oħra jekk ikunu rilevanti. Id-demm tal-frieħ jista’ jiġi raggruppat skont il-boton għall-analiżijiet tal-ormon tat-tirojde. L-ormoni tat-tirojde (T4 u TSH) idealment għandhom jitkejlu bħala “total”. 57. Hemm l-għażla li jsiru d-determinazzjonijiet tal-urinaliżi li ġejjin f’ħamest irġiel magħżula b’mod aleatorju ta’ kull grupp matul l-aħħar ġimgħa tal-istudju bl-użu ta’ ġbir ta’ volum ta’ urina bil-ħin miżmum; l-apparenza, il-volum, l-ożmolalità jew gravità speċifika, il-pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm. 58. Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza kimika tat-test jistgħu, jew huma suspettati li jaffettwaw il-profili metaboliċi relatati jinkludu il-kalċju, it-trigliċeridi waqt sawm u l-glukożju waqt sawm, l-ormoni speċifiċi, il-metaemoglobina u l-kolinesterasi. Dawn jeħtieġ li jiġu eżaminati fuq bażi ta’ każ b’każ. 59. Il-fatturi li ġejjin jistgħu jinfluwenzaw il-varjabbiltà u l-konċentrazzjonijiet assoluti tad-determinazzjonijiet tal-ormoni: — il-ħin tal-qatla minħabba varjazzjonijiet tul il-jum tal-konċentrazzjonijiet tal-ormoni — il-metodu tal-qatla biex tkun evitata tensjoni bla bżonn għall-annimali li tista’ taffettwa l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni — is-settijiet tat-testijiet għad-determinazzjonijiet tal-ormoni li jistgħu jkunu differenti mill-kurvi standard tagħhom. 60. Kampjuni ta’ plażma maħsubin speċifikatament għal determinazzjoni tal-ormoni għandhom jinkisbu f’ħin komparabbli tal-jum. Il-valuri numeriċi miksubin meta jkunu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-ormoni jkunu differenti fost diversi settijiet ta’ analiżi kummerċjali. 61. Jekk bażi ta’ data storika ma tkunx adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni ta’ varjabbli ematoloġiċi u ta’ bijokimika klinika qabel ma jibda d-dożaġġ jew preferibbilment f’sett ta’ annimali mhux inklużi fil-gruppi ta’ esperimenti. Għan-nisa, id- data trid tiġi minn annimali li jreddgħu. PATOLOĠIJA Nekroskopija grossa 62. L-annimali adulti kollha fl-istudju għandhom ikunu ssoġġettati għal nekroskopija profonda sħiħa u dettaljata li tkun tinkludi eżami bir-reqqa tal-wiċċ estern tal-ġisem, tal-fetħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, toraċiċi u abdominali u tal-kontenuti tagħhom. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għal-organi tas-sistema riproduttiva. In-numru ta’ siti ta’ impjantazzjoni għandu jiġi reġistrat. It-tiċpisiet vaġinali għandhom jiġu eżaminati dakinhar tan-nekroskopija biex jiġi determinat l-istadju taċ-ċiklu estruż u tkun tista’ ssir korrelazzjoni mal-istopatoloġija tal-organi riproduttivi tan-nisa. 63. It-testikoli u l-epididimidi kif ukoll il-bżieżaq tal-prostata u seminali bil-glandoli koagolanti fis-sħuħija tagħhom, tal-annimali adulti rġiel kollha għandhom jiġu mirquma minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u l-piż niedi tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. Barra minn hekk, il-piżijiet tal-organi fakultattivi jistgħu jinkludu l-kumpless tal-levator ani u tal-muskolu bulbokavernuż, il-glandoli ta’ Cowper u r-ras tal-pene fl-irġiel u l-ovarji f’pari (piż imxarrab) u l-utru (inkluż iċ-ċerviċi) fin-nisa; jekk inklużi, dawn il-piżijiet għandhom jinġabru mill-aktar fis possibbli wara d-dissezzjoni. L-ovarji, it-testikoli, l-epididimu, l-organi sesswali aċċessorji, u l-organi kollha li juru leżjonijiet makroskopiċi tal-annimali adulti kollha għandhom jiġu preservati. 64. Għall-irġiel u għan-nisa adulti kollha u għal raġel wieħed u għal mara waħda li jkunu frieħ tal-jum 13 minn kull boton, il-glandoli tat-tirojde għandhom jiġu preservati fl-aktar medium ta’ fissazzjoni xierqa għall-eżami istopatoloġiku sussegwenti maħsub. Il-piż tat-tirojde jista’ jiġi ddeterminat wara l-fissazzjoni. It-tirqim għandu jsir ukol b’reqqa kbira u biss wara l-fissazzjoni biex tkun evitata l-ħsara lit-tessut. Il-ħsara fit-tessut tista’ tippreġudika analiżi istopatoloġika. Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn sit imsemmi eżatt qabel jew bħala parti mill-proċedura għall-ewtanażja tal-annimali, u għandhom jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa (ara l-paragrafu 56). 65. Barra minn hekk, għal tal-anqas ħamest irġiel u nisa adulti, magħżula b’mod aleatorju minn kull grupp (minbarra dawk misjuba fi stat ta’ agunija u/jew ewtanizzati qabel it-terminazzjoni tal-istudju), il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-timus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb għandhom jitraqqmu minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq u l-piż tagħhom għandu jittieħed mill-aktar fis wara d-dissezzjoni biex jiġi evitat milli jinxfu. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq kemm għat-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-leżjonijiet kbar kollha, il-moħħ (reġjuni rappreżentattivi li jinkludu ċ-ċerebru, iċ-ċerebellum u l-pons), is-sinsla tad-dahar, l-għajn, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l-irqajja’ ta’ Peyer), il-fwied, il-kliewi, l-adernali, il-milsa, il-qalb, it-timus, it-trakea u l-pulmun (preservat bl-infiħ b’fissattiv u mbagħad mgħaddas), il-gonadi (testikoli u ovarji), l-organi sesswali aċċessorji (utru u ċerviċi, epididimu, prostata, bżieżaq seminali u l-glandoli koagolanti), il-vaġina, il-borża tal-awrina, il-limfonodi (minbarra l-aktar limfonodu drenanti prossimali, għandu jittieħed limfonodu ieħor skont l-esperjenza tal-laboratorju (16)), in-nerv periferali (xjatiku jew tibjali) idealment qrib il-muskolu, il-muskolu skeletali u l-għadma, bil-mudullun (sezzjoni jew inkella aspirat tal-mudullun immuntat ġdid). Hu rrakkomandat li t-testikoli jkunu ffissati b’immersjoni fil-fissattiv ta’ Bouin jew f’dak modifikat ta’ Davidson (16) (17) (18); fissazzjoni tal-formalina mhix rakkomandata għal dawn it-tessuti. It-tunika albuġinea tista’ tittaqqab bil-mod u mhux fil-fond fiż-żewġ poli tal-organu b’labra biex jitħalla jkun hemm penetrazzjoni malajr tal-fissattiv. Is-sejbiet kliniċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. Għandu wkoll ikun ippreservat kull organu li x’aktarx ikun meqjus bħala organu mmirat abbażi tal-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza kimika tat-test. 66. It-tessuti li ġejjin jistgħu jagħtu indikazzjoni siewja għall-effetti relatati mal-endokrina: Il-gonadi (ovarji u testikoli), l-organi sesswali aċċessorji (utru li jinkludi ċerviċi, epididimu, bżieżaq seminali bi glandoli tal-koagulazzjoni, prostata dorsolaterali u ventrali), il-vaġina, il-glandola pitwitarja tal-mammiferi rġiel u l-glandola adrenali. It-tibdiliet fil-glandoli tal-mammiferi rġiel ma kinux iddokumentati b’mod suffiċjenti iżda dan il-parametru jista’ jkun sensittiv ħafna għal sustanzi b’azzjoni estroġenika. L-osservazzjoni tal-organi/tat-tessuti li mhumiex elenkati fil-paragrafu 65 hi fakultattiva. 67. Frieħ mejtin u frieħ maqtula fil-jum 13 wara l-ħlas, jew ftit wara, tal-anqas għandhom jiġu eżaminati bir-reqqa esternament għal anormalitajiet serji. Għandha tingħata attenzjoni partikolari għall-ġenitali riproduttivi esterni li għandhom jiġu eżaminati għal sinjali ta’ żvilupp mibdul. Istopatoloġija 68. Għandha ssir istopatoloġija sħiħa fuq l-organi u t-tessuti preservati tal-annimali magħżula fil-gruppi tal-kontroll u ta’ doża għolja (b’enfasi speċjali fuq l-istadji tal-ispermatoġenesi fil-gonadi tal-irġiel u l-istopatoloġija tal-istruttura taċ-ċelloli testikolari interstizjali). Il-glandola tat-tirojde mill-frieħ u mill-annimali adulti li jifdal tista’ tiġi eżaminata meta jkun hemm bżonn. Dawn l-eżaminazzjonijiet għandhom ikunu estiżi għall-annimali tal-gruppi l-oħra ta’ dożaġġ, jekk jiġu osservati tibdiliet relatati mat-trattament fil-grupp ta’ doża għolja. Il-Gwida dwar l-istopatoloġija (10) tagħti aktar informazzjoni dwar id-dissezzjoni, il-fissazzjoni, is-sezzjonar u l-istopatoloġija ta’ tessuti endokrinali. 69. Il-feriti kbar kollha għandhom jiġu eżaminati. Bħala għajnuna fl-iċċarar tal-NAOELs, l-organi fil-mira fi gruppi ta’ doża oħra għandhom jiġu eżaminati, b’mod partikolari fi gruppi li jiġi ddikjarat li juru NAOEL. 70. Meta jintuża grupp satellitarju, l-istopatoloġija għandha ssir fuq tessuti u organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi ttrattati. DATA U RAPPORTAR Data 71. Għandha tkun ipprovduta d- data dwar l-annimali individwali. Barra minn hekk, id- data kollha għandha tinġabar f’forma tabulari, u għal kull grupp tat-test għandha turi n-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ annimali misjuba mejta matul it-test jew ewtanizzati għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta’ xi mewt jew ewtanażja, in-numru ta’ annimali fertili, in-numru ta’ nisa tqal, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inklużi l-ħin tal-ewwel darba, id-durata, u s-severità ta’ kwalunkwe effett tossiku, it-tip ta’ tibdiliet istopatoloġiċi u d- data rilevanti kollha dwar il-boton. Format tabulari tar-rapport ta’ sommarju li wera li hu tassew siewi għall-evalwazzjoni tal-effetti riproduttivu/tal-iżvilupp hu mogħti fl-Appendiċi 3. 72. Meta jkun possibbli, ir-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati b’metodu ta’ statistika ġeneralment aċċettabbli u adattat. Il-paraguni tal-effett tul firxa tad-doża għandhom jevitaw l-użu ta’ testijiet-t multipli. Il-metodi ta’ statistika għandhom jintgħażlu matul it-tfassil tal-istudju. Analiżi statistika tal-AGD u taż-żamma tal-beżżula għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tal-effetti fuq il-boton. Fejn xieraq, il-boton hu l-unità ta’ analiżi. Analiżi statistika tal-piż tal-ġisem tal-frieħ għandha tkun ibbażata fuq data tal-frieħ individwali, b’kunsiderazzjoni tad-daqs tal-boton. Minħabba d-dimensjonijiet limitati tal-istudju, l-analiżijiet statistiċi fil-forma ta’ testijiet għal “sinifikat” huma ta’ valur limitat għal ħafna punti ta’ tmiem, speċjalment il-punti ta’ tmiem riproduttivi. Uħud mill-aktar metodi użati ta’ spiss, speċjalment testijiet parametriċi għall-kejl tat-tendenza ċentrali, mhumiex adattati. Jekk jintużaw analiżijiet statistiċi, il-metodu magħżul għandu jkun xieraq għad-distribuzzjoni tal-varjabbli eżaminat, u jintgħażel qabel il-bidu tal-istudju. Evalwazzjoni tar-riżultati 73. Is-sejbiet ta’ dan l-istudju tat-tossiċità għandhom jiġu evalwati f’termini tal-effetti osservati, tan-nekroskopija u tas-sejbiet mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni bejn id-doża u s-sustanza kimika tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-severità tal-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, l-infertilità, l-anormalitajiet kliniċi, l-imġiba tar-riproduzzjoni u l-boton affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħra. 74. Minħabba l-perjodu qasir ta’ trattament tal-irġiel, l-istopatoloġija tat-testikoli u tal-epididimu għandha tiġi kkunsidrata flimkien mad- data dwar il-fertilità meta jiġu vvalutati l-effetti riproduttivi fuq l-irġiel. L-użu ta’ data storika tal-kontroll fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp (eż. għad-daqs tal-boton, l-AGD, iż-żamma tal-beżżula, il-livelli tas-serum T4), fejn disponibbli, jista’ jkun siewi wkoll bħala għajnuna għall-interpretazzjoni tal-istudju. 75. Għall-kontroll tal-kwalità huwa propost li tinġabar data storika ta’ kontroll u li għad- data numerika jkunu kkalkolati l-koeffiċjenti ta’ varjazzjoni, speċjalment għall-parametri li jkollhom rabta mad-detezzjoni tal-interferent endokrinali. Din id- data tista’ tintuża għal finijiet ta’ paragun meta jkunu evalwati studji attwali. Rapport tat-test 76. Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Sustanza kimika tat-test: — is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli — l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa. Sustanza monokostitwenti: — id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali; — l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ. Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet: — ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti. Veikolu (jekk xieraq): — ġustifikazzjoni għal għażla ta’ veikolu, jekk ma jkunx ilma. L-annimali tat-test: — speċi/razza użata; — l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali; — is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.; — il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test. — ġustifikazzjoni għal speċi jekk ma jkunx far Il-kundizzjonijiet tat-test: — ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża; — dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni tad-dieta, il-konċentrazzjoni, l-istabbiltà u l-omoġenità miksubin tal-preparazzjoni, — dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test; — konverżjoni minn dieta/konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test ta’ ilma tax-xorb (ppm) għad-doża attwali (mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli; — dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma; — deskrizzjoni dettaljata tal-proċedura ta’ każwalizzazzjoni biex jintgħażlu l-frieħ għall-qtil, jekk jinqatlu. Riżultati: — piż tal-ġisem/bidliet fil-piż tal-ġisem; — konsum ta’ ikel, u konsum ta’ ilma, jekk applikabbli; — id-data dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u d-doża, inklużi l-fertilità, il-ġestazzjoni u kwalunkwe sinjal ieħor ta’ — tossiċità; — it-tul tal-ġestazzjoni; l-effetti tossiċi jew oħra fuq ir-riproduzzjoni, l-ulied, it-tkabbir ta’ wara t-twelid, eċċ.; — natura, severità u durata ta’ osservazzjonijiet kliniċi (jekk reversibbli jew le); — attività sensorja, qawwa tal-qabda u valutazzjonijiet tal-attività motorja; — testijiet ematoloġiċi b’valuri bażi rilevanti; — testijiet ta’ bijokimika klinika b’valuri linja bażi rilevanti; — in-numru ta’ nisa adulti b’ċiklu estruż normali jew anormali u d-durata taċ-ċiklu; — in-numru ta’ twelid ħaj u ta’ telf ta’ wara l-impjantazzjoni; — in-numru ta’ frieħ b’anormalitajiet ferm viżibbli; evalwazzjoni profonda tal-ġenitali esterni, in-numru ta’ frieħ li jitwieldu żgħar ħafna; — il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test; — in-numru ta’ impjantazzjonijiet, id-daqs tal-boton u l-piżijiet tal-boton fil-ħin tar-reġistrazzjoni; — id-data dwar il-piż tal-ġisem tal-frieħ — l-AGD tal-frieħ kollha (u l-piż tal-ġisem fl-jum tal-kejl tal-AGD) — iż-żamma tal-beżżula fil-frieħ irġiel, — il-livelli tal-ormon tat-tirojde, il-frieħ tal-jum 13 u l-irġiel adulti (u l-ommijiet u l-frieħ tal-jum 4 jekk jitkejlu) — il-piż tal-ġisem fis-sagrifiċċju u d-data dwar il-piż tal-organi għall-annimali ġenituri; — sejbiet dwar in-nekroskopija, — deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatoloġiċi; — id-dettalji tal-assorbiment (jekk disponibbli); — trattament ta’ statistika ta’ riżultati, fejn jixraq. Diskussjoni tar-riżultati. Kunklużjonijiet. Interpretazzjoni tar-Riżultati 77. L-istudju jipprovdi evalwazzjonijiet tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp assoċjata mal-amministrazzjoni ta’ dożi ripetuti. B’mod partikolari, peress li l-enfasi hi mixħuta kemm fuq il-punti ta’ tmiem tat-tossiċità ġenerali kif ukoll tat-tossiċità riproduttiva/tal-iżvilupp, ir-riżutlati tal-istudju jippermettu li ssir distinzjoni bejn l-effetti fuq ir-riproduzzjoni/l-iżvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta’ tossiċità ġenerali u dawk li jkunu espressi biss f’livelli li jkunu tossiċi għall-annimali ġenituri wkoll (ara l-paragrafi 7-11). Jista’ jipprovdi indikazzjoni tal-ħtieġa li jsiru investigazzjonijiet ulterjuri u jista’ jipprovdi gwida fit-tfassil tal-istudji sussegwenti. Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 43 għandu jiġi kkonsultat għal għajnuna fl-interpetazzjoni tar-riżultati dwar ir-riproduzzjoni u l-iżvilupp (19). Id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD Nru 106 dwar l-Evalwazzjoni Istoloġika tat-Testijiet Endokrinali u Riproduttivi fir-Rodituri (16) jipprovdi informazzjoni dwar it-tħejjija u l-evalwazzjoni tal-organi (endokrinali) u tat-tiċpisiet vaġinali li jistgħu jkunu ta’ għajnuna għal dan il-metodu ta’ ttestjar. DOKUMENTAZZJONI (1) OECD (1990). Dokument tas-seduta Nru 1 għall-14-il Laqgħa Konġunta tal-Chemicals Group and Management Committee. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi (2) OECD (1992). Ir-Rapport tal-President tal-Laqgħa ta’ Esperti ad hoc dwar il-Metodi ta’ Skrinjar tat-Tossiċità Riproduttiva, Tokyo, 27-29 ta’ Ottubru, 1992. Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. u Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. u Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Rapport tal-Ewwel Laqgħa tat-Task Force tal-OECD dwar l-Ittestjar u l-Valutazzjoni tal-Interferenti Endokrinali (EDTA), 10-11 ta’ Marzu 1998, Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.u Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Parti B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, f’Auston C.R. u Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. u Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. u Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp u V.L. Reynolds. (1999). “Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (16) OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (17) Hess RA u Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. Fi: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi. Appendiċi 1 DEFINIZZJONIJIET (ARA WKOLL (20) GD 150 TAL-OECD) Androġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li taġixxi bħal ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu. Antiandroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon androġeniku naturali (eż. testosteron) f’organiżmu mammiferu. Antiestroġeniċità hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon estroġeniku naturali (eż. estradijol 17ß) f’organiżmu mammiferu. Attività tal-antitirojde hi l-kapaċità ta’ sustanza kimika li trażżan l-azzjoni ta’ ormon naturali tat-tirojde (eż. T3) f’organiżmu mammiferu. Sustanza kimika hija sustanza jew taħlita. Tossiċità tal-iżvilupp il-manifestazzjoni tat-tossiċità riproduttiva, li tirrappreżenta disturbi strutturali jew funzjonali prenatali, perinatali u post natali fil-wild. Doża hi l-ammont ta’ sustanza kimika tat-test mogħtija. Id-doża hi espressa bħala piż tas-sustanza kimika tat-test għal kull unità ta’ piż tal-ġisem ta’ annimal tat-test għal kull jum (eż. mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum), jew bħala konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta. Dożaġġ hi terminu ġenerali li jinvolvi d-doża, il-frekwenza tagħha u d-durata tad-dożaġġ. Tossiċità evidenti hi terminu ġenerali li jiddeskrivi sinjali ċari ta’ tossiċità wara li tkun ġiet amministrata kimika għall-ittestjar. Dawn għandhom ikunu suffiċjenti għal valutazzjoni tal-periklu u għandhom ikunu tali li żieda fid-doża amministrata tista’ tkun mistennija li tirriżulta fl-iżvilupp ta’ sinjali ta’ tossiċità estrema u probabbilment mortalità. Indeboliment tal-fertilità tirrappreżenta disturbi tal-funz