DIRETTIVA TAL-KUMMISSJONI 2006/56/KE

tat-12 ta' Ġunju 2006

li temenda l-Annessi tad-Direttiva tal-Kunsill 93/85/KEE dwar il-kontroll ta’ taħsir ċirkulari fil-patata

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi il-Komunità Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal- Kunsill 93/85/KEE ta’ l-4 ta’Ottubru 1993 (1) dwar il-kontroll tat-taħsir ċirkulari fil-patata, u b’mod partikulari Artikolu 12 tagħha,

Billi:

Wieħed mill-organiżmi importanti li huwa ta’ periklu għall-patata huwa il- Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., l-aġent patoġeniku tat-taħsir ċirkulari fil-patata(minn hawn il-quddiem imsejjaħ “l-organiżmu”);

Dwar elementi tekniċi tal-miżuri ta’ kontroll, titjib fil-proviżjonijiet saru għal: il-mod ta’ konservazzjoni ta’ kampjuni eżaminati sabiex jkun aċċertat li wieħed jista’ jmur lura għall-organiżmu provenjenti li ġie ttestjat, l-elementi meħtieġa sabiex wieħed jasal għall-istat ta’ kontaminazzjoni probabbli, id-dettalji tan-notifijkazzjoni tal-preżenza kkonfermata ta’ l-organiżmu u taż-żona relevanti li hi kkontaminata, miżuri in kwistjoni implementati f’ postijiet ta’ produzzjoni li huma speċifikati bħala kkontaminati u li jaqgħu taħt medda ta’ territorji mmarkati;

ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA;

Artikolu 1

L-Annessi tad-Direttiva 93/85/KEE huma b’hekk sostitwiti bit-test korrispondenti f’ Anness ta’ din id-Direttiva.

Artikolu 2

1. L-Istati Membri għandhom jadottaw u jippublikaw, sal-31 ta’ Marzu 2007 l-iktar, il-ligijiet, regolamenti, u provedimenti amministrattivi neċessarji biex iħarsu din id-Direttiva. Huma għandhom jikkomunikaw mill-ewwel lill-Kummissjoni. It-test ta’ dawk id-dispożizzjonijiet u tabella ta’ korrelazzjoni bejn dawn id-dipsożizzjonijiet u d-Direttiva.

Huma għandhom japplikaw dwak id-dispożizzjonijiet mill-1 ta’ April 2007.

Meta Stati Membri jadottaw dawn id-dispożizzjonijiet, huma għandhom jinkludu referenza għal din id-Direttiva jew ikun hemm akkompanjament bit-tali referenza fl-okkażjoni tal-pubblikazjoni uffiċjali tagħhom. Stati Membri għandhom jiddeterminaw kif it-tali referenza għandha ssir.

2. Stati Membri għandhom jikkomunikaw mill-ewwel lill-Kummissjoni it-test tad-dispożizzjonijiet ewlenin tal-liġi nazzjonali li huma jaddottaw fil-qasam kopert b’ din id-Direttiva.

Artikolu 3

Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea.

Artikolu 4

Din id-Direttiva hi indirizzata lill-Istati Membri.

(1) ĠU L 259, 18.10.1993, p. 2.

ANNESS I

SKEMA TA’ TESTIJIET GĦALL-ISKOPERTA U INDENTIFIKAZZJONI TAL-BATTERJU LI JIKKAWŻA IT-TAĦSIR ĊIRKULARI, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

INTENZJONI TA’ L-ISKEMA TA’ TESTIJIET

L-iskema ppreżentata tfassal il-proċeduri varjati involuti għal:

(i) Dijanjosi ta’ taħsir ċirkulari fi tuberi ta’ patata u pjanti;

(ii) Skoperta ta’ Clavibacter michiganensis ssp. Sepedonicus fi kampjuni ta’ tuberi ta’ patata u pjanti,

(iii) Identifikazzjoni ta’ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus

PRINĊIPJI ĠENERALI

Protokolli ottimiżżati għall-metodi kollha, sustanzi rejaġġenti validati u dettalji għall- preparazzjoni tat-test u materjali li jservu ta’ kontroll jew tqabbil huma mfassla fl-Appendiċi. Lista tal-laboratorji li ġew inklużi fl-ottimizzazzjoni u validazzjoni tal-protokolli huma pprovduti f’ Appendiċi 1.

Minħabba li il-protokolli ser jinvolvu l-iskoperta ta’ organiżmu fi kwarantena u ser jinkludu użu ta’ gruppi mrobbijja vijabilment ta’ C. m. subsp. sepedonicus bħala materjal ta’ kontroll, ser ikun hemm bżonn li jsiru ċerti proċeduri taħt kundizzjonijiet ta’ kwarantena siewja bi faċilitajiet adegwati ta’ skart u taħt kundizzjonijiet ta’ licenzji approprjati kif imħarrġa mill-awtoritajiet uffiċjali tal-kwarantena tal-pjanti.

Parametri ta’ testijiet iridu jiżguraw livelli ta’ skoperta ta’ C. m. subsp. sepedonicus li jkunu riproduċibli u konsistenti sal-limiti ta’ tali metodi magħżula.

Preparazzjoni ta’ kontrolli pożittivi preċiżi hija ta’ importanza primarja.

Testjar skond il-limiti meħtieġa timplika wkoll issettjar korrett, manutenzjoni u kalibrar tat- tagħmir, użu u preżervazzjoni bil-prudenza ta’ sustanzi rejaġġenti u kull miżuri meħtieġa sabiex jiġu evitati kontaminazzjonijiet bejn kampjuni, eż. Separar ta’ kontrolli pożittivi minn kampjuni li qegħdin jiġu ttestjati. Miżuri ta’ kontroll fuq kwalità jridu jiġu implementati sabiex jiġu evitati żbalji amministrattivi u żbalji oħra speċjalment fl-immarkar u dokumentazzjoni.

Okkorrenza sospetta kif imfassla f’ artikolu 4 (2) fid-direttiva 93/85/KE tirriżulta riżulatat pożittiv fit-testijiet ta’ dijanjosi jew skrining fuq kampjun kif speċifikat fid-dijagramma hawn isfel.

Jekk l-ewwel test ta’ skrining (IF jew PCR/FISH) huwa pożittiv, kontaminazzjoni bil- Cms huwa sosopettat għalhekk test ieħor ta’ skrining irid isir. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa pożittiv, is-sospett huwa kkonfermat (preżenza kkonfermatha) u it-testijiet skond l-iskema jridu jitkomplew. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa negattiv, il- kampjun jiġi meqjus bħala mhux kontaminat bil-Cms.

Għalhekk test pożittiv ta’ l-IF kif imfassal fi artikolu 4 (2) jirriżulta definit pożittiv minn riżultat IF li jinqara’ pożittiv, ikkonfermat minn test ieħor (PCR/FISH).

Preżenza kkonfermata kif imfassala f’ artikolu 5 (1) fid- direrttiva 93/85/KE tirriżulta iżolazzjoni u identifikazzjoni ta’ kolonja safji ta’ C. m. subsp. sepedonicus bil- konferma ta’ patoġenicità.

1. PREŻENTAZZJONI B’ DIJAGRAMMA (FLOW CHART)

1.1. Skema ta’ proċeduri ta’ skoperta li jwasslu għad-dijanjosi ta’ Taħsir Ċirkulari fi tuberi tal-patata u pjanti tal-patata b’sintomi ta’ taħsir ċirkulari

Il-proċedura ta’ testjar hija mfassla għall-pjanti tal-patata u pjanti li jippreżentaw sintomi ċari jew sospetti ta’ taħsir ċirkulari. Din tinkludi skrining rapidi, iżolazzjoni tal-mikrobu patoġeniku mit-tessut vaskulari infettat fuq sostanza għat-trobbija dijanjostika u, fil- każ ta’ riżultat pożittiv, identifikazzjoni tal-grupp ta’ organiżmi in kwestjoni bħala C. m. subsp. Sepedonicus.

1.2. Skema għall-iskoperta u identifikazzjoni ta’ michiganensis ssp. sepedonicus f’ kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi

Prinċipju:

Il- proċedura tat-testjar hija intiża sabiex isir l-iskoperta ta’ infezzjoni moħbija fit-tuberi tal-patata. Riżultat pożittiv minn mill-inqas żewġ testijiet ta’ skrining, li huma bbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti, jridu jkunu kkomplimentati bl-iżolazzjoni tal-mikrobu patoġeniku; segwentament, fil-każ ta’ iżolazzjoni ta’ kolonji tipiċi, konferma ta’ grupp safi ta’ C. m. subsp. Sepedonicus. Riżultat pożittiv minn test ta’ skrining wieħed biss mhux biżżejjed sabiex il-kampjun jiġi kkonsidrat suspett.

Testijiet ta’ skrining u iżolazzjoni jridu jippermettu l-iskoperta ta’ limiti minimi ta’ 103 sa 104 ċellula/ml ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid, inkluża bħala kontroll pożittiv f’ kull serje ta’ testijiet.

(1) Il-kwantità stàndard huwa ta’ 200 tuberu, għalkemm il-proceduri jistgħu jintużaw bi kampjuni iżgħar jekk 200 tuberu mhumiex disponibbli. (2) Metodi ta’ estrazzjoni tal-mikrobu patoġeniku u metodi ta’ konċentrazzjoni huma mfassla f’ taqsima 3.1. (3) Jekk mill-inqas żewġ testijiet ibbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti joħorġu pożittivi, iżolazzjoni u test ta’ konferma jridu jsiru. Jrid isir mill-inqas test ta’ skrining wieħed. Ġib fis-seħħ mill-inqas test ta’ tifli wieħed. Meta tali test joħroġ negattiv il- kampjun jiġi meqjus negattiv. Jekk dan it-test joħroġ pożittiv it-tieni jew iktar testijiet ta’ skrining ibbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti oħra jridu jsiru sabiex ir-riżultat pożittiv jiġi vverifikat. Jekk it-tieni test jew testijiet oħra jirriżultaw negattivi, il- kampjun huwa meqjus bħala negattiv. Testijiet oħra mhumhiex meħtieġa. (4) Test ta’ l-immunofluworexxenza (IF) Dejjem agħmel użu minn antikorpi poliklonali għall-iskrining bit-test IF, antikorpi monoklonali oħra jistgħu jagħtu aktar speċifiċità (ara taqsima 4). (5) Testijiet PCR. Agħmel użu minn rejaġġenti PCR u protokolli validati (ara taqsima 6). (6) test FISH. Agħmel użu ta’ rejaġġenti u protokolli validati (ara taqsima 5). (7) Iżolazzjoni selettiva. Permezz tal-materjal MTNA jew NCP-88 u b’dilwizzjoni ta’ 1/100 tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid, din isservi ta’ meetodu adegwat għall-iżolażżjoni diretta ta’ C. m. subsp. Sepedonicus. Kolonji tipiċi jikbru wara 3-10 ijiem wara li ssir il-kisja. L-aġent patoġeniku jista’ segwentament jiġi ppurifikat u identifikat. Għall-użu komplet tal-potenzjal tiegħu, it-test jeħtieġ preparazzjoni bil-galbu ta’ qlub meħudin minn naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu sabiex batterji sekondarji assoċjati mat-tuberu tal-patata li huma kompetituri ma’ C. m. subsp. Sepedonicus fuq il- materjal li fuqu qed jikbru u għalhekk jistgħu jikbru iktar mill-aġent patoġeniku. Jekk it-test tal-kisi ma jgħaddix, iżolazzjoni trid terġa’ ssir minn pjanti użati għall-bioassay (ara taqsima 8). (8) It-test tal-bioassay huwa użat għat-testjar ta’ C. m. subsp. Sepedonicus minn pellets meħudin minn patata bil-proviżjoni ta’ susutanzi nutrijenti li jgħinu it-trobbija selettivament fuq brunġiel (Solanum melongena). It-test jeħtieġ kundizzjonijiet ta’ inkubazzjoni ottimali kif speċifikat f’dan il-metodu. Batterji li huma ta’ tfixkil u inħibizzjoni għal C. m. subsp. Sepedonicus fuq MTNA jew NCP-88 probabbilment ma għandhom ebda effet fuq ir-riżultat ta’ dan it-test (ara taqsima 7). (9) Morfolġija tipika tal-kolonja hija mfassla f’ Taqsima 8. (10) Trobbija jew bioassay jistgħu ma jirnexxux minħabba kompetizzjoni jew inħibizzjoni minn batterji saprofitiċi. Jekk jinkisbu riżultati pożittivi fit-testijiet ta’ skrining, iżda it-testijiet ta’ iżolazzjoni huma negattivi, irrepeti it-test ta’ iżolazzjoni mill-istess pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni jew billi jittieħdu aftar tessuti vaskulari minn-naħa ta’ l-għarqub minn tuberu maqtugħ mill-istess kampjun u, jekk hemm il- ħtieġa, jiġu ttestjati kampjuni oħra. (11) Identifikazzjoni korretta ta’ gruppi safja ta’ organiżmi preżunti C. m. subsp. sepedonicus tinkiseb permezz tat-testijiet imfassla f’ taqsima 9. (12) It-test ta’ patoġeniċità huwa mfassal f’ Taqsima 10.

1.3. Skema għall-iskoperta u identifikazzjoni ta’ clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus f’ kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi

(1) Ara taqsima 3.2 għan-numri kontenuti fil-kampjuni li huma irrikkmandati. (2) Metodi ta’ estrazzjoni tal-mikrobu patoġeniku u metodi ta’ konċentrazzjoni huma imfassla f’ taqsima 3.2. (3) Jekk mill-inqas żewġ testijiet ibbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti joħorġu pożittivi, iżolazzjoni u test ta’ konferma jridu jsiru. Ġib fis-seħħ mill-inqas test ta’ skrining wieħed. Meta it-test joħroġ negattivi il-kampjun jiġi meqjuż bħala negattiv. Jekk it-test joħroġ pożittiv it-tieni jew aktar testijiet ta’ skrining bbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti huma meħtieġa sabiex ikun hemm verifika tar-riżultat pożittiv. Jekk it-tieni test jew testijiet oħra jirriżultaw negattivi, il- kampjun huwa meqjus bħala negattiv. Testijiet oħra mhumhiex meħtieġa. (4) It-test ta’ iżolazzjoni selettiva u ta’ morfoloġija tal-kolonja tipika huma mfassla fi taqsima 8. (5) It- test ta’ IF huwa mfassal f’ Taqsima 4. (6) It- test tal- PCR huwa imfassal f’ Taqsima 6. (7) It- test ta’ FISH huwa mfassal f’ taqsima 5. (8) It- test tal- bioassay huwa mfassal f’ taqsima 7. (9) Trobbija jew bioassay jistgħu ma jirnexxux minħabba kompetizzjoni jew inħibzzjoni minn batterji saprofitiċi. Jekk jinkisbu riżultati pożittivi fit-testijiet ta’ skrining, iżda it-test ta’ iżolazzjoni joħroġ negattiv, irrepeti it-test ta’ iżolazzjoni u, jekk tinħass il-ħtieġa, ittestja kampjuni aaddizzjonali. (10) Identifikazzjoni akkurata ta’ gruppi safja ta’ organiżmi preżunti C. m. subsp. sepedonicus tinkiseb permezz tat-testijiet imfassla f’ taqsima 9. (11) It-test ta’ patoġeniċità huwa mfassal f’ taqsima 10.

2. EŻAMINAZZJONI VIŻWALI GĦALL-SINTOMI TA’ TAĦSIR ĊIRKULARI

2.1. Pjanti tal-patata

Fil-kundizzjonijiet klimatiċi Ewropej sintomi ma tantx jinstabu fl-egħlieqi u spiss jinstabu lejn tmiem l-istaġun. Barra dan is-sintomi huma ta’ spiss moħbija jew konfużi minn/ma’ mard ieħor, effetti ta’ żmien jew ħsarat mekkaniċi. Għalhekk jista’ jkun li is-sintomi ma jingħarux f’ispezzjonijiet ta’ l-egħlieqi. Is-sintomi ta’ dbiel huma differenti ħafna minn dawk tat-taħsir kannella; id-dbiel huwa proċess li jieħu aktar żmien u inizjalment huwa llimitat għall-marġini tal-weraq. Weraq żgħar li huma infettati jistgħu jibqgħu jikbru għalkemm ħafna inqas fiż-żoni infettati. Dan iwassal għal weraq b’ forma mhux tas-soltu. Weraq li huma affetwati minn tessuti vaskulari misdudin iktar l-isfel maz-zokk jiżviluppaw frekwentament partijiet interkostali kloritiċi ta’ lewn isfar jew oranġju. Weraq żgħar infettati, weraq oħra kif ukoll iż-żkuk jistgħu eventwalment imutu. Spiss il-weraq u tuberi jinxtorbu fid-daqs tagħhom. Ħafna drabi il-pjanti jieqfu jikbru. Stampi bil-kulur ta’ ġabra ta’ sintomi tinstab fuq il-portal tal-Kummissjoni: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2. Tuberi ta’ patata

l-ewwel sintomi huma ta’ apparenza tixbaħ il-ħġieġ jew kważi trasparenti tat-tessut mingħajr ma jirtabu mad-dawra tas-sistema vaskulari, l-iktar lejn in-naħa ta’ l-għarqub. Iċ-ċirklu vaskulari fin-naħa ta’ l-għarqub jista’ jkun ftit aktar skur mis-soltu. L-ewwel sintomu indentifikabli faċilment huwa meta iċ-ċirklu vaskulari jkollu kulur safrani u meta it-tuberu jingħafas bil-mod, joħrġu flussi forma ta’ pilastri ta’ materja ta’ apparenza qisu ġobon minn ġewwa it-tubi vaskulari. Dan il-materjal li joħroġ ikun fih miljuni ta’ batterji. It-tessut vaskulari jista’ jieħu lewn kannella u is-sintomi tat-tuberu f’dan l-istadju huma simili għal dawk tat-taħsir kannella kkawżata mir- Ralstonia solanacearum. Għall-bidu, dawn is-sintomi jistgħu jkunu taħt restrizzjoni għal parti waħda taċ-ċrklu, mhux neċessarjament lejn in-naħa ta’ l-għarqub u jistgħu gradwalment jestendu għaċ-ċirklu kollu. Filwaqt li l-infezzjoni tikber, jinqerdu it-tessuti vaskulari; il-kortiċi ta’ barra jista’ jissepara mill-kortiċi ta’ ġewwa. Fi stadji avvanzati ta’ infezzjoni, wieħed jinnota ċertu qsim fuq il-wiċċ ta’ barra tat-tuberu, li huma sikwit lewn kannella ħamrani fil-marġini tagħhom. Dan l-aħħar fl-Ewropa kien hemm bosta każijiet fejn il-kortiċi ċentrali tagħmel egħruq fl-istess ħin taċ-ċirklu vaskulari li jwassal għall-infezzjoni sekondarja bi tħaffir intern u nekrożi. Invażjoni sekondarja ta’ fungi jew batterji tista’ taħbi is-sintomi u jista’ jkun diffiċli, jekk mhux impossibli, li ssir distinzjoni bejn taħsir ċirkulari avvanzat u taħsir tuberali ieħor. Sintomi atipiċi jistgħu jkunu possibli. Stampi bil-kulur ta’ ġabra ta’ sintomi tinstab fuq il-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3. PREPARAZZJONI TAL- KAMPJUN

3.1. Tuberi ta’ patata

Nota:

— Id- daqs stàndard tal-kampjun huwa ta’ 200 tuberu per test. Aktar ġbir ta’ kampjuni intesiv jitlob iktar testijiet fuq kampjuni ta’ dan id-daqs. Numru akbar ta’ tuberi fil-kamjun jwassal għal tfixkil jew interpretazzjoni diffiċli tar riżultati. Iżda, proċeduri jistgħu jiġu applikati konvenjentament fuq kampjuni b’ inqas minn 200 tuberu fejn hemm inqas numru ta’ tuberi disponibbli għall- użu.

— Validazzjoni għall-metodi ta’ l-iskoperta kif imfassla hawn isfel hija bbażata fuq kampjuni ta’ 200 tuberu.

— L-estratt mill- patata mfassal hawn isfel jista’ jintuża wkoll biex wieħed jivverifika il-preżenza tal-batterju Ralstonia solanacearum li huwa il-kawża ta’ taħsir kannella fil- patata

Pre trattament mhux obbligatorju fuq il-kampjun qabel ma jiġi ppreparat:

Aħsel it-tuberi. Agħmel użu minn disinfettanti approprjati (komposti tal-kloru fejn ser isir it-test tal-PCR sabiex jinqered id-DNA eventwali ta’ organiżmu patoġeniku) u deterġenti bejn kull kampjun. Nixxef it-tuberi fl-arja. Din il-proċedura ta’ ħasil hija ta’ użu partikulari (iżda mhux neċessarja) għall-kampjuni li jippreżentaw eċċess ta’ ħamrija u jekk għandhom isiru it-test PCR jew iżolazzjoni diretta.

3.1.1. Neħħi permezz ta’ xafra nadifa u disinfettata jew sikkina tal-ħaxix, il-qoxra fin-naħa ta’ l-għarqub ta’ kull tuberu sabiex it-tessut vaskulari jiġi jidher. Aqta’ b’attenzjoni biċċa qalba tat-tessut vaskulari fin-naħa ta’ l-għarqub u żomm l-iktar ammont ta’ tessut mhux vaskulari kemm jista’ jkun. (ara il-portal: htpp://europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

Nota:

Ifred mill-oħrajn it-tuberi li għandhom xi sintoni sospetti ta’ taħsir ċirkulari u ttestja separatament.

Jekk waqt it-tneħijja tal-qalba, tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu, jiġu sospettati sintomi ta’ taħsir ċirkulkari, it-tuberu għandu jiġi spezzjonat viżwalment wara li jinqata’ minn-naħa ta’ l-għarqub. Kull tuberu maqtugħ li għandu sintomi sospetti jrid jiġi suberizzat għal żmien ta’ jumejn f’ temperatura ambjentali u it-tuberu irid jiġi merfugħ f’ kundizzjonijiet ta’ kwarantena (f'4 u 10 °C) sakemm ma jsiru t-testijiet kollha. It-tuberi kollha (inklużi dawk li għandhom sintomi sospetti) jridu jinżammu skond m’hu stipolat f’ Anness II.

3.1.2. Iġbor il-qlub meħudin minn-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu f’ reċipjenti mhux użati li jintremew wara li jiġu wżati u li jistgħu jingħalqu u/jew jiġu ssiġillati (jekk reċipjenti jiġu wżati iktar minn darba jridu jitnadfu sew u jiġu disinfettati permezz ta’ komposti bbażati fuq il- kloru). Jekk jista’ jkun, qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu jridu jiġu pproċessati mill- ewwel. Jekk dan ma jistax jkun, erfagħhom fil- kontenitur, mingħajr ma jiżdiedu sostanzi li jżommu il- kundizzjonijiet stabbli (buffer), ambjent refriġerat għal żmien ta’ mhux iktar minn 72 siegħa jew għal żmien ta’ mhux iktar minn 24 siegħa f’ temeratura ambjentali. Tnixxif u subeiżazzjoni tal-qlub, u tkattir ta’ organiżmi saprofitiċi waqt dan iż-żmien jistgħu ifixklu l-iskoperta tal-batterju tat-taħsir cirkulari.

3.1.3. Ipproċessa il-qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin: jew,

(a) Poġġi il-qlub f’ ammont (approssimativament 40 ml) suffiċjenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 3) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erbgħa siegħat f’ temperatura inqas minn 24 °C jew miżmuma għal 16 sa 24 siegħa taħt refrigerazzjoni.

(b) Omoġeniżża il-qlub b’ ammont suffiċenti (approssimativament 40 ml) ta’ kimika li żżomm il- kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 3), f’ apparat li jintuża għat- taħlit (eż Waring jew Ultra Thurax) jew billi jitgħaffġu f’ borża għall- immaċerazzjoni li tintrema wara l-użu tagħha (eż Stomacher or Bioreba polyethene ta’ kalibru qawwi, 150 mm × 250 mm; steriliżżat bir- raġġi) permezz ta’ mazza tal- lasktu jew apparat siewi għat-titħin (eż Homex).

Nota:

Ir-riskju ta’ kontaminazzjoni huwa għoli meta il-kampjuni huma omogeniżżati permezz ta’ apparat għat-taħlit. Ħu prekawzjonijiet sabiex jiġu evitati generazzjoni ta’ taħlita ta’ particelli fl-arja waqt il-proċess ta’ estrazzjoni. Kun ċert li jintużaw xwabel ta’ l-apparat li jomoġeniżża steriliżżati għal kull kampjun. Jekk it-test tal-PCR għandu jkun evitat, aħseb sabiex tevita li jkun hemm kontaminazzjoni ta’ DNA minn kampjuni oħra fil-kontenituri jew apparat li jintuża biex issir it-taħna. It-taħna f’ boroż li jistgħu jintremew u l-użu ta’ tubi li jintremew wara l-użu huma kollha rrakkomandati fejn jintuża il- PCR.

3.1.4. Ferra il-likwidu li jibqa’wara. Jekk jidher eċċessivament imniġġeż, iċċarah jew permezz ta’ ċentrifugazzjoni lenta (mhux iktar minn 180 g għal għaxar minuti f’temperatura ta’ 4-10 °C) jew permezz ta’ filtrazzjoni fi vakwu (40-100 µm), il-filtri jinħaslu dejjem b’ iktar (~10 ml) kimika li żżomm il- kundizzjonijiet kimiċi stabbli. (buffer) (Appendiċi 3)

3.1.5. Ikkonċentra il-parti batterika permezz ta’ ċentrifugazzjoni bi veloċità ta’ 7 000 g għal hmistax il-minuta (jew 10 000 g għal 10 minuti) f’ temperatura ta’ bejn 4-10 °C u armi il-likwidu residwu mingħajr ma tħarbat ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni.

3.1.6. Poġġi ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni fi 1,5 ml ta’ kimika apposta li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli (pellet buffer) (Appendiċi 3). Uża 500 µl għall-ittestjar tas-C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl għal Ralstonia solanacearum u 500 µl għal raġunijiet ta’ referenza. Żid gliċerol steriliżżat sal-konċentrazzjoni finali ta’ 10-25 % (v/v) mal-500 µl tal-alikwot ta’ referenza u ma’l-alikwot li jifdal tat-test, ħawwad u erfa’ fi –16 to –24 °C (ġimgħat) jew fi 68 sa –86 °C (xhur). Ippreżerva l-alikwoti tat-test taħt temperatura ta’ 4-10 °C waqt it-testing.

Mhux affidabli li jsir iffriżar jew jinħallu ripetutament.

Jekk hemm il-ħtieġa ta’ trasport għall-estratt, kun ċert li jsir f’ kontenitur li jżomm il-kesħa fi żmien ta’ 24 sa 48 siegħa.

3.1.7. Huwa imperattiv li kull kontroll pożittiv u kampjuni għall-C. m. subsp. sepedonicus jiġu meqjusa separatament sabiex jiġi evitat il-kontaminazzjoni. Dan japplika fi pjastri ta’ l-IF u għat-testijiet kollha

3.2. Pjanti tal-patata

Nota:

Għal-kampjuni ta’ popolazzjonijiet ta’ C. m. subsp. sepedonicus moħbija huwa indikat li wieħed jittestja kampjuni komposti. Il- proċedura tista’ tiġi applikata faċilment għal kampjuni komposti minn ammont ta’ 200 parti ta’ zokk. (Fejn isiru studji dawn iridu jsiru fuq kampjuni repreżentattivi statistikament tal- popolazzjoni ta’ pjanti li qed tkun investigata.)

3.2.1. B’ sikkina nadifa u disinfettata jew b’ imqass taż-żabra, aqta’ biċċa fiha wieħed 1-2 ċm mill-bażi ta’ kull zokk, ftit iktar il-fuq mill-livell tal-ħamrija.

Disinfetta is-segmenti taz-zkuk permezz ta’ l-etanol 70 % u mill-ewwel nixxef permezz ta’ karta assorbenti.

Iġbor biċċiet taz-zkuk f’ kontenitur sterilliżżat skond dawn il-proċeduri ta’ ġbir ta’ kampjuni li ġejjin:

3.2.2. Ipproċessa is-segmenti taz-zkuk permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin: jew,

(a) Poġġi is-segmenti f’ ammont (approssimativament 40 ml) suffiċenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 3) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erba’ siegħat f’ temperatura inqas minn 24 °C jew 16 sa 24 siegħa f’refriġerazzjon, jew

(b) Ipproċessa mill- ewwel, billi ttaħħan is-segmenti f’ borża tat- titħin ħoxna (eż Stomacher jew Bioreba) bi volum approprjat ta’ buffer għall- estrazzjoni (appendiċi 3) permezz ta’ mazza tal-lasktu jew tagħmir apposta (eż Homex). Jekk dan mhux disponibbli, erfa’ is-segmenti taz-zkuk għal-mhux iktar minn 72 siegħa jew għal mhux iktar minn 24 siegħa f’temperatura ambjentali.

3.2.3. Ferra il-likwidu li jifdal wara li jkun qagħad għal 15 il-minuta.

3.2.4. Iktar kjarifikazzjoni dwar l-estrazzjoni u konċentrazzjoni tal-parti batterika mhumiex dejjem neċessarji iżda jistgħu jsiru billi issir filtrazzjoni u/jew ċentrifugazzjoni kif imfassal f’ taqsima 3.1.4 sa 3.1.6.

3.2.5. Aqsam fi tnejn il-kampjun pur jew ikkonċentrat f’ żewġ partijiet indaqs. Poġġi nofs f’4 sa 10 °C waqt it-test u erfa’ il-parti l-oħra b’10 sa 25 % (v/v) gliċerol steriliżżat fi –16 sa –24 °C (ġimgħat) jew fi –68 sa –86 °C (xhur) jekk ikun hemm il-ħtieġa ta’ iktar testijiet.

4. TEST IF

Prinċipju:

L-użu tat-test IF bħala test prinċipali ta’ skrining huwa irrikkmandat minħabba il-fatt li huwa ta min joqgħod fuqu sabiex jinkisbu il-livelli meħtieġa.

Meta jintuża it-test ta’ l-IF bħala metodu ta’ skrining prinċipali, u ir-riżultat joħroġ pożittiv, l- iżolazzjoni, PCR jew FISH jridu jitwetqu bħala test ta’ skrining ieħor. Meta it-test ta’ l-IF jintuża bħala it-tieni test ta’ skrining u ir-riżultat ta’ l-IF joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri hija meħtieġa sabiex tkun kompluta l-analiżi.

Nota:

Uża dejjem antikorpi poliklonali, meta it-test ta’ l-IF jintuża bħala metodu ta’ skrining prinċipali. Fil-każ ta’riżultat IF pożittiv b’antikorpi poliklonali skrining ieħor tal-kampjun permezz ta’ antikorpi monoklonali jista’ jipprovdi iktar speċifiċità iżda jista’ jirriżulta inqas sensittiv.

Uża antikorpi fuq varjetà ta’ C. m. subsp. Sepedonicus li sservi ta’ referenza. Huwa irrikkmandat li id-dożar jiġi ddeterminat għal-kull lott ġdid ta’ antikorpi. Id-dożar jissejjaħ bħala l-ogħla valur ta’ dilwizzjoni fejn issir ir-rejazzjoni ottimali meta tiġi ttestjata it-taħlita solida u likwida li fiha 105 sa 106 ċellula per ml ta’ varjetà omologa ta’ C. m. subsp. sepedonicus meta jintuża konjugat approprjat ta’ “fluorescein isothiocyanate” (FITC) skond ma jirrikmanda il-manufattur. Antisjeri fi stat ewlieni poliklonali jew monklonali validati kollha kellhom dożar IF ta’ mhux inqas minn 1:2000. Waqt it- testijiet, l-antikorpi jridu jiġu użati f’ dilwizzjoni (jiet) qrib jew eżattament il-valur tad-dożar. Uża antikorpi validati (ara il- portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

It-test irid isir fuq estratti minn kampjuni friski. Jekk tinħass il- ħtieġa, jista’ jsir fuq kampjuni jew estratti miżmuma fi –68 sa –86 °C taħt il-gliċerol. Il-gliċerol jista’ jitneħħa mill-kampjun permezz ta’ l-addizzjoni ta’ ml wieħed ta’ sostanza li żżomm il-kundizzjonijiet stabbli (pellet buffer) (Appendiċi 4), jsir mill ġdid proċess ta’ ċentrifugazzjoni għal 15-il minuta veloċità 7 000 g u jerġgħu jiħaltu fi volumi indaqs ta’ buffer. Dan huwa sikwit meħtieġ, speċjalmet jekk il- kampmpjuni jiġu ffissati mal-pjastra permezz tas- sħana meta jinżammu fuq fjamma (ara 2.2).

Ipprepara pjastri ta’ kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà oħra bħala referenza ta’ C. m. subsp. sepedonicus, imħalta f’ estratt tal patata, kif speċifikat f’ Appendiċi 2, u mhux obligatorjament fi buffer.

Tessut infettat naturalment (miżmum billi jkun lijofiliżżat jew iffriżat temperatura ta’–16 sa –24 °C) jrid jintuża fejn hu possibli bħala kontroll simili fuq l- istess pjastra.

Bħala kontroll negattiv, uża alikwoti ta’estratt mill-kampjun li preċedentament irriżulta negattiv

Uża pjastri tal-mikroskopju li fihom ħafna ħofor preferibilment għaxar aperturi ta’ dijametru ta’ sitt millimetri.

Eżamina il-materjal ta’ kontroll b’ metodu identiku għal dak użat għall-kampjun(i).

4.1. Ipprepara il-pjastri tat-test permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin:

(i) Għall-pellets li għandhom relattivament kontenut żgħir ta’ sedimentazzjoni ta’ lamtu: Qattar volum meqjus stàndard ta’ dilwizzjoni (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura — kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal aperturi ikbar) ta’ 1/100 tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni’ ta’ patata imħalta mill-ġdid, fl-ewwel apertura. Qattar volum simili ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ’’mhux dilwita (1/1) fuq l-aperturi li fadal fuq il- filliera. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 1.

(ii) Għal pellets oħra: Ipprepara dilwizzjonijiet deċimali (1/10, 1/100) tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid fil-buffer apposta. (pellet buffer) Qattar volum stàndard (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura — kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal apertura ikbar)tal- pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ta’ patata imħalta (imħallta mill-ġdid) mill-ġdid u kull dilwizzjoni fi filliera ta’ aperturi. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 2.

4.2. Nixxef il-qatriet f’ temperatuira ambjentali jew billi jissaħħan f’ temperatura ta’ 40 sa 45 °C. Iffissa iċ-ċelluli batteriċi mal-pjastra jew billi issaħħan (15-il minuta f’ temperatura ta’ 60 °C), billi jinżammu fuq fjamma, permezz ta’ l-etanol 95 % jew skond istruzzjonijiet speċifiċi mis-supplent ta’ l-antikorpi.

Jekk tinħass il-ħtieġa, pjastri ffissati jistgħu jintrefgħu f’ kontenitur apposta għat-tnixxif (dessicated box) għal żmien qasir kemm hemm bżonn (l-iktar żmien ta’ tlett xhur) qabel ma jsir testjar ieħor.

Proċedura IF:

(i) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat- test fi 4.1 (i): Ipprepara set ta’ dilwizzjonijiet doppji ta’ antikorpi fi buffer IF L- ewwel ħofra jrid ikollha 1/2 id-titru (T/2), l- oħrajn 1/4 tad-titru (T/4), 1/2 it- titru (T/2), id-dożar (T) u id- doppju tad-dożar (2T).

(ii) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat-test fi 4.1 (i): Ipprepara id- dilwizzjonijiet sabiex jinħadem it-test (WD) ta’ l-antikorpi fil-buffer ta’ l-IF. Id-dilwizzjoni li tintuża fit-tħarriġ tat-test taffetwa l-ispeċifiċità.

Dijagramma 1. Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 4.1(i) u 4.3(i)

Dilwizzjoni ta’ pellets re suspended 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Dilwizzjoni ta’ pellets re suspended (T = titru) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dilwizzjonijiet doppji ta’ antisjeru/antikorpi Kampjun 1 1 2 3 4 5 Duplikat ta’ kampjun 1 jew kampjun 2 6 7 8 9 10





Dijagramma 2. Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 4.1(ii) u 4.3(ii)

Dilwizzjoniji użati ta’ antisjeru/antikorpi 1/1 1/10 1/100 vojt vojt  Dilwizzjoni deċimali ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ri sospiża Kampjun 1 1 2 3 4 5 Duplikat ta’ kampjun 1 jew kampjun 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Irranġa il-pjastri fuq karta assorbenti niedja. Għatti kull apertura ta’ test komopletament permezz ta’ dilwizzjoni(jiet) ta’ antikorpi. Il-volum ta’ antikorpi fuq kull apertura jrid ikun mill-inqas il-volum ta’ l-estratt applikat.

Il-proċedura li ġejja trid issir fl-assenza ta’ istruzzjonijiet speċifiċi mis-supplent ta’ l-antikorpi.

4.3.2. Inkuba il-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’ temperatura ambjentali (18 sa 25 °C).

4.3.3. Ħawwad il-qatriet ta’ kull pjastra u laħlaħ bil- galbu fi buffer IF. Aħsel billi tagħddas għal 5 minuti fi buffer- Tween IF (Appendiċi 3) u wara fi buffer IF. Evita li tikkawża trasferiment fl-arja ta’ qtar żgħir li jistgħu jikkontaminaw wieħed ma’ l-ieħor. Neħħi bil-mod l-umdità żejda billi timsaħ bil-mod.

4.3.4. Irranġa il-pjastri fuq karta assorbenti niedja. Agħtti l-apertura tat-test bid-dilwit ta’ konjugat ta’ FITC użat fid-sejba tad-dożar. Il-volum tal-konjugat applikat fuq din l-apertura trid tkun identika għall-volum ta’ antikorpi użati.

4.3.5. Inkuba il-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’ temperatura ambjentali (18 sa 25 °C).

4.3.6. Neħħi il-qtar ta’ konjugat minn fuq il-pjastra billi ssir agitazzjoni tal-pjastra. Laħlaħ u aħsel bħal qabel (4.3.3).

Neħħi bil-mod kull umidità eċċessiva.

4.3.7. Qattar 5 sa 10 µl ta’ 0.1M gliċerol ibbufferjat bil-fosfat (Appendiċi 3) jew sostanza montanti li ma tiċċarax, li tinbiegħ kummerċjalment, fuq kull apertura applika pjastra żgħira sabiex tgħatti.

Interpretazzjoni tat-test IF:

4.4.1. Eżamina il-pjastri taħt mikroskopju efflowrexxenti bi filtri indikati għall-eċitazzjoni ta’ FITC, taħt iż-żejt jew immersjoni taħt l-ilma, f’ qawwa ta’ 500 sa 1 000. Ħares lejn l-aperturi minn żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin, u mad-dawra tagħhom. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku.

Ivverifika il-pjastra ta’ kontroll pożittiva l-ewwel. Iċ- ċelluli jridu jkunu fluworexxenti u imtebbgħin komopletament fid-dożar ta’ antikorpi immarkat jew fid-dilwizzjoni li tintuża għat-taħriġ tat-test. It-test IF (taqsima 4) irid isir mill-ġdid jekk issir aberrazjoni tat-tebgħa.

4.4.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli li għandhom morfoloġija karatteristika ta’ C. m. subsp. Sepedonicus fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L-intesità fluworexxenti trid tkun ekwivalenti jew ogħla minn dik tal-varjetà ta’ kontroll pożittiva fl-istess dilwizzjoni ta’ antikorpi. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworerxxenza dgħajjfa ma jridux jiġu meqjusa.

Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni it-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta il-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il- barra mill- apertura) fuq il-kisja tal-pjastra.

4.4.3. Hemm bosta problemi relatati mat-test ta’ l-immunofluworexxenza. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi rejaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal R. solanacearum jistgħu jinstabu fil-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub u fi pellets meħudin minn segmenti taz-zkuk.

4.4.4. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti b’ dimensjonijiet u morfoloġija tipika miksuba fid-dożar jew dilwizzjoni magħżula għat-test ta’ antikorpi kif imfassal fi 4.3.

4.4.5. Interpretazzjoni tat-test ta’l-IF:

(i) Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfoloġija karatteristika, ħu stima tan-numru ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula in-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid (Appendiċi 4). It-test IF joħroġ pożittiv għal kampjuni b’ mhux inqas minn 5 × 103 ċellula tipika per ml ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid. Il-kampjun huwa kkonsidrat potenzjalment ikkontaminat u testjar ieħor irid isir.

(ii) Ir- riżultat IF jissejjaħ negattiv għal kampjuni b’ inqas minn 5 × 103 per ml ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid u il- kampjun huwa meqjus bħala negattiv. Testing ieħor mhux meħtieġ.

5. TEST FISH

Prinċipju:

Meta jsir it-test ta’ l-FISH bħala it-test ta’ skrining ewlieni u joħroġ pożittiv, it-test IF jrid isir bħala it-tieni test ta’ skrining obligatorju. Meta it-test ta’ l-FISH jintuża bħala it-tieni test ta’ skrining u ir-riżultat joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri hija meħtieġa sabiex tkun kompluta id-dijanjosi.

Nota:

Uża oligo-sondi validati speċifiċi għal C. m. subsp. sepedonicus (Appendiċi 7). Testijiet preliminarji b’ dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa 104 ċelluli ta’ C. m. subsp. sepedonicus per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi.

Il-proċedura li ġejja trid issir fuq estratt mill-kampjun frisk iżda jista’ jsir ukoll b’ suċċess fuq estratt ta’ kampjun li kien ġie miżmum fil-gliċerol fi –16 sa–24 jew –68 sa –86 °C.

Bħala kontrolli negattivi, alikwoti ta’ kampjuni ta’ l-estratt li qabel ħarġu bħala testijiet negattivi għal C. m. subsp. sepedonicus jistgħu jintużaw.

Bħala kontroll pożittiv ipprepara taħlita li fihom 105 sa 106 ċellula per ml ta’ C. m. subsp. sepedonicus (eż varjetà NCPPB 4053 jew PD 406) fi 0,01M ta’ buffer fosfat (PB) minn kolonja bi żmieb ta’ trobbija ta’ 3-5 ijiem (preparazzjoni ara Appendiċi 2). Ipprepara pjastri ta’kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà, oħra bħala referenza ta’ C. m. subsp. sepedonicus, imħalta/sospiża f’ estratt tal-patata, kif speċifikat f’ Appendiċi 2.

L-użu ta’ oligo sondi ewbatterjali immarkati FITC joffri kontroll għall-preżemza ta’ ibridiżazzjoni, la tali proċess itebba’ l-ewbatteri kollha li huma preżenti fil-kampjun.

Eżamina il-materjal ta’ kontroll b’ metodu identiku għal dak użat għall-kampjun(i).

5.1. Fissaġġ ta’ l-estratt tal-patata

Il-protokoll li ġejjin huwa bbażat fuq Wullings et al., (1998):

5.1.1. Ipprepara taħlil fissanti (ara Appendiċi 7).

5.1.2. Qattar 100 µl ta’ kull estratt tal-kampjun fi tubu Eppendorf u iċċentrifuga għal 8 minuti, veloċità 7 000 g.

5.1.3. Neħħi il-likwidu supernatanti residwu u ħoll ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni fi 500 µl ta’ materjal fissativ ippreparat < 24 siegħa minn qabel. Għaddi minn vortiċi u inkuba għall-lejl kollu fi 4 °C.

Fissative alternattiv huwa l-etanol ta’ 96 %. Biex tagħmel użu minn dan, ħoll ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ta’ materjal solidui minn proċess 5.1.2 fi 50 µl PB konċentrazzjoni ta’0.01M u 50 µl ta’ etanol tad-96 %. Ħallat bi proċess ta’ vortiċi u inkuba fi 4 °C għall-30 sa 60 minuta.

5.1.4. Iċċentrifuga għal 8 minuti fi 7 000 g, neħħi il-likwidu residwu, supernatanti u erġa’ ħoll parzjalment ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni fi 75 µl 0,01M PB (ara Appendiċi 3).

5.1.5. Qattar tikek tat-taħlita riżultanti li ġiet iffissata fuq pjastra multitest nadifa kif imfassal fi dijagrama 3. Qiegħed żewġ kampjuni differenti fuq kull pjastra, li mhumhiex dilwiti u uża 10 µl sabiex tagħmel dilwizzjoni ta’1:100 (fi 0,01M PB). mit-taħlil li jifdal tal-kampjun (49 µl) tista’ tinżamm fi –20 °C wara iż-żieda ta’ volum wieħed ta’ 96 % etanol. Jekk l-it-test ta’ verifikazzjoni tal-konċentrazzjoni bl- FISH jinħtieġ jerġa’ jsir, neħħi l-etanol permezz ta’ ċentrifugazzjoni u żid volum ugwali ta’ 0,01M PB (ħallat f’appart ta’ vortiċi).

Dijagramma 3. Organizzazzjoni tal-pjastra għall-FISH

Kampjun 1 vojt vojt vojt Kampjun 2 apertura 1 apertura 2 apertura 3 apertura 4 apertura 5 Kampjun 1 vojt vojt vojt Kampjun 2 apertura 6 apertura 7 apertura 8 apertura 9 apertura 10 Coverslip 1 Coverslip 2

5.1.6. Nixxef il-pjastri fl-arja (jew fuq apparat apposta li jnixxef fi 37 °C) u ffissa fuq in-nar.

F’dan l-istadju il-proċedura tista’ tiġi sospiża u l-ibridizzazzjoni titkompla il-ġurnata ta’ wara. Il-pjastri jridu jinżammu ħielsa mit-trab u f’ temperatura ambjentali.

5.2. Pre-ibridizzazzjoni u ibridizzazzjoni

5.2.1. Ipprepara taħlil ta’10mg liżożimi (Sigma L-6876) fi 10 ml ta’ buffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH8.0). Din-taħlil tista’ tintrefa’ iżda il-proċess ta’ ffriżar u titħalla tinħall trid issir darba biss. Qiegħed f’kull ħofra li fiha il-kampjun daqs 50 μl ta’ taħlil ta’ liżożimi u inkuba għall-10 minuti f’temperatura ambjentali. Segwentament qiegħed il-pjastri f’ilam dimineralizzat, darba biss u nixef bil-karti li jintużaw għall-filtrazzjoni.

Alternattivament, minnflok il-liżożimi żid 50 μl ta’ 40-400μg ml–1 protejinase K fi buffer (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4)ma’ kull ħofra u inkuba fi 37 °C għal 30 minuta.

5.2.2. Iġbed l-ilma minn ġewwa iċ-ċelluli fi serje ta’ etanol fi gradi ta’ 50 %, 80 % u 96 % għal minuta kull wieħed. Nixxef il-pjastri fl-arja fuq holder apposta.

5.2.3. Ipprepara kompartiment ta’ inkubazzjoni niedi billi tiksi il-qiegħ ta’ kaxxa ssigillata b’ karti assorbenti jew karta ta’ filtrazzjoni mgħaddsa fi 1x hybmix (Appendiċi 7). Inkuba il-kaxxa minn qabel f’ forn ta’ l-ibridizzazzjoni temperatura ta’ 55 °C għal mhux inqas minn 10 minuti.

5.2.4. Ipprepara taħlil ta’ ibridizzazzjoni (Appendiċi 7) li jkun hemm daqs 45 μl għal kull pjastra, u inkuba minn qabel għal 5 minuti fi 55 °C.

5.2.5. Qiegħed il-pjatri fuq pjanċa sħuna ta’ 45 °C u applika 10 μl ta’ taħlil ta’ l-ibridizzazzjoni fuq kull waħda mill-erba’ ħofriet fuq il-pjastra(i)

5.2.6. Għatti b’ żewġ għotjien tal ħġieġ (coverslips) fuq kull pjastra mingħajr ma tinqabad l-arja. Qiegħed il-pjastri fil-kompartiment niedi u mssaħħan u ibridiżża għal-lejl kollu fil-forn temperatura ta’ 55 °C, fid- dlam.

5.2.7. Ipprepara 3 tazzi ta’ litru wieħed ta’ ilma Ultra pur (UPW), 1 l ta’ 1x hybmix (334 ml 3x hybmix u 666 ml UPW) u 1 l ta’ 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix u 833 ml UPW). Pre-inkuba kull wieħed fi banju temperatura ta’ 55 °C.

5.2.8. Neħħi il-coverslips mill-pjastri u qiegħed il-pjastri fuq holder apposta.

5.2.9. Laħlaħ is-sonda in eċċess permezz ta’ inkubazzjoni għal 15 il-minuta fit-tazza bi 1x hybmix temperatura ta’ 55 °C.

5.2.10. Poġġi il-holder tal-pjastri fi 1/2 hybmix taħlil u inkuba għal 15 il-minuta oħra.

5.2.11. Għaddas il-pjastri brevement fil- UPW u qiegħdhom fuq biċċa karta assorbenti. Neħħi l’ umdità in eċċess billi tgħatti il-wiċċ b’ biċċa karta assorbenti. Qattar 5-10 μl ta’ taħlil montanti li ma tiċċarax (eŻ Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA jew ekwivalenti) fuq kull apertura u qiegħed coverslip kbir qies (24 × 60 mm) fuq il-pjastra kollha.

5.3. Interpretazzjoni tat-Test FISH

5.3.1. Osserva il-pjastri mill-ewwel permezz ta’ mikroskopju mgħammar b’ mikroskopija epifluworexxenti, qawwa ta’ 630 jew 1000x bil-proċedura ta’ immersjoni taħt iż- żejt. B’ filtru addattat għal fluorescein isothiocyanate (FITC) ċelluli ewbatteriċi, (inkluż ċelluli gram negattivi) fil-kampjun huma mtebbgħin lewn aħdar fluworexxenti. Taħt filtru għal tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, ċelluli imtebbgħin Cy3 ta’ C. m. subsp. sepedonicus jidhru ħomor fluworexxenti. Qabbel il-morfoloġija taċ-ċelluli ma’ dik tal-kontrolli pożittivi. Iċ-ċelluli jridu jidhru fluworexxenti sew u kompletament imtebbgħin. (taqsima 9.4) It- test FISH irid jerġa’ jsir jekk it-tebgħa hija abberrata. Osserva l-apertura billi tħares ma’ żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin u mad-dawra perimetrika. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku.

5.3.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli li għandhom morfoloġija karatteristika ta’ C. m. subsp. sepedonicus fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L-intensità fluworexxenti trid tkun daqs jew aħjar minn dik tal-varjetà fil-kontroll pożittiv. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworexxenza dgħajfa ma jridux jiġu meqjusa.

5.3.3. Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni it-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta il-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il- barra mill- apertura) fuq il-kisja tal-pjastra.

5.3.4. Hemm bosta problemi relatati ma’ l-ispeċifiċità tat-test ta’ l- FISH. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’ morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi rejaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal C. m. subsp. sepedonicus jistgħu jinstabu, għalkemm ħafna inqas spiss mill fl-IF test, fil-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub u fi pellets meħudin minn segmenti taz-zkuk.

5.3.5. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika, ara fi 5.3.2.

5.3.6. Interpretazzjoni tar- riżultat tat-test ta’ l-FISH:

(i) Riżultati validi tat-test ta’ l-FISH jinkisbu jekk ċelluli ħodor fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika ta’ C. m. subsp. sepedonicus huma osservati permezz tal-filtru FITC u jekk ċelluli ħomor fluworexxenti bil-filtru rhodamine jingħarfu f’ kull kontroll pożittiv u mhux f’ ebda kontrolli negattivi. Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfologija karatteristika, ħu stima tal-medja ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula in-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid (Appendiċi 4). Kampjuni li fihom mill-inqas 5x 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid huma kkonsidrati potenzjalment ikkontaminati. Tetsijiet oħrajn mhux meħtieġa. Kampjuni li fihom inqas minn 5 × 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni imħallta mill-ġdid huma kkonsidrati negattivi.

(ii) It-test FISH huwa negattiv jekk ċelluli ħomor fluworexxenti b’ qisien u morfoloġija tipika ta’ C. m. subsp. sepedonicus ma jidhrux bil-filtru rhodamine, dejjem jekk ċelluli ħomor jgħajtu, fluworexxenti tipiċi huma osservati fil-preparazzijiet ta’ kontrolli pożittivi meta jintuża il- filtru rhodamine.

6. TESTIJIET PCR

Prinċipji

Meta jsir it-test tal-PCR bħala it-test ta’ skrining ewlieni u joħroġ pożittiv, it-test IF jrid isir bħala ittieni test ta’ skrining obligatorju. Meta it-test ta’ l-IF jintuża bħala it-tieni test ta’ skrining u ir-riżultat ta’l-IF joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri hija meħtieġa sabiex tkun kompluta id-dijanjosi.

Użu komplet ta’ dan il-metodu bħala test ta’ skrining prinċipali huwa rrikmandat meta esperjenza speċalizzata ġiet miksuba.

Nota:

Testijiet preliminarji b’ dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa 104 ċellula ta’ C. m. subsp. sepedonicus per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi. Testijiet ta’ ottimizzazzjoni jistgħu jinħtieġu sabiex livelli massimi ta’ sensittività jinkisbu u speċifiċità f’ kull laboratorju.

Agħmel użu minn sustanzi rejaġġenti u protokolli tal-PCR li huma validati. Jekk possibli agħżel metodi li fihom kontroll intern.

Ħu prekawzjonijiet approprjati sabiex tevita kontaminazzjoni ta kampjuni ma’ DNA li qed ikun investigat. It-test tal-PCR irid isir minn esperti tekniċi, f’ laboratorji dedikati speċifikament għall- bijoloġija molekolari, ħalli wieħed inaqqas kemm jista’ jkun il-possibiltà ta’ kontaminazzjoni ma’ DNA li qed jkun investigat.

Kontrolli negattivi jridu dejjem (Għall-proċeduri ta’ l-estrazzjoni ta’ DNA u PCR) għandhom jiġu dejjem meqjusa bħala il-kampjuni finali fil-proċedura, sabiex jaċċertaw il-preżenza ta’ DNA minn sors ieħor.

Il-kontrolli negattivi li ġejjin jridu jiġu inklużi fit-test tal-PCR:

— Estratt mill-kampjun li preċedentament ħarġu negattivi għal C. m. subsp. Sepedonicus.

— Kontrolli għall-buffer użati għall-estrazzjoni tal-batterju u tad-DNA mill-kampjun.

— Taħlita mir-rejazzjoni fil-PCR.

Il-kontolli pożittivi li ġejjin għandhom jiġu inklużi:

— Alikwoti ta’ pellets risospiżi li magħhom ġie miżjud il-C. m. subsp. sepedonicus (għall- preparazzjoni ara Appendiċi 2).

— Taħlita ta’ 106 ċellula per ml ta’ C. m. subsp. sepedonicus fl-ilma minn iżolat aggressiv (eż NCPPB 2140 jew NCPPB 4053).

— Jekk hu possibli uża wkoll DNA estratt minn kontrolli pożittivi meta jsir il-PCR test.

Sabiex tiġi evitata il-posssibiltà ta’ kontaminazzjoni pprepara kontrolli pożittivi f’ ambjent separat mill-kampjuni li ħa jkunu ttestjati.

Estratti mill-kampjuni jridu jkunu kemm jista’ jkun safja minn ħamrija. Għalhekk jista’ jkun aħjar li wieħed jipprepara estratti minn patata maħsula jekk ser jintużaw protokolli ta’ PCR.

6.1. Metodi ta’ purifikazzjoni tad-DNA

Uża kampjuni ta’ kontroll pożittivi u negattivi kif imfassal hawn fuq.

Ipprepara il-materjal ta’ kontroll b’ metodu identiku għal dak użat għall-kampjun(i).

Hemm bosta metodi li jistgħu jintużaw għall-purifikazzjoni ta’ DNA li qed jiġi ttestjat għalih minn sustrati tal-kampjun, b’ hekk jitneħħew fatturi li jfixklu il-proċess PCR u rejazzjonijiet enżimatiċi oħra u tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ DNA li qed tiġi ttestjatha fil-kampjun ta’ l-estratt.

Il-metodi li ġejjin ġie ottimiżżati għal użu ma’ metodi PCR validati mfassla f’ Appendiċi 6.

6.1.(a) Metodi skond Pastrik (2000)

1. Qattar 220 µl ta’ buffer li jintuża għall-iproċessar f’unitajiet żgħar (lysis buffer) (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) fi tubu Eppendorf ta’ 1,5 ml.

2. Żid 100 µl ta’ l-estratt tal-kampjun u qiegħed fuq blokka sħuna jew ġewwa banju sħun ta’ 95 °C għal 10 min

3. Qiegħed it-tubu fis-silġ għal 5 min.

4. Żid 80 µl taħlil ta’ stokk ta’ liżożimi (50 mg Liżożimi għal kull ml fi 10 mM Tris HCl, pH 8,0) u inkuba f’temperatura ta’ 37 °C għal 30 minuta.

5. Żid 220 µl ta’ Easy DNA ® solution A (Invitrogen), ħallat sew permezz ta’ vortiċi u inkuba f’temperatura ta’ 65 °C għal 30 minuta.

6. Żid 100 µl ta’ Easy DNA ® solution B (Invitrogen), ħallat permezz ta’ vortiċi bis-saħħa sakemm il-precipitate jimxi liberament fit-tubu u l-kampjun hu magħqud b’mod uniformi.

7. Żid 500 µl ta’ kloroform u vortex sakemm il-viskożità tonqos u t-taħlita hi omoġenja.

8. Iċċentrifuga fi 15 000 g għal 20 minuta f’temperatura ta’ 4 °C sabiex tissepara l-fażijiet u tifforma l-interfażi.

9. Ittrasferixxi l-fażi ta’ fuq ġo tubu Eppendorf ġdid.

10. Żid 1 ml ta’ 100 % ethanol (–20 °C) vortex għal ftit u poġġi fuq is-silċ f’inkubatur għal 10 minuti.

11. Iċċentrifuga fi 15 000 g għal 20 minuta f’temperatura ta’ 4 °C u neħħi l-ethanol mir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni.

12. Żid 500 µl 80 % ethanol (–20 °C) u ħallat billi taqleb it-tubu.

13. Iċċentrifuga fi 15 000 g għal 10 minuta f’temperatura ta’ 4 °C, żomm il-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni u neħħi l-ethanol.

14. Ħalli l-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni tinxef fl-arja jew f’DNA speed vac.

15. Erġa’ ħallat ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni f’100 µl UPW sterili u ħalli f’temperatura tal-kamra għal mill-anqas 20 minuta.

16. Aħżen f’temperatura ta’ –20 °C sakemm ikun hemm bżonn għal PCR.

17. Dawwar l-isfel il-precipitate abjad permezz taċ-ċentrifugazzjoni u uża 5 µl tas-supernatant li fih id-DNA għal PCR.

6.1.(b) Metodi oħrajn

Metodi oħra ta’ estrazzjoni tad-DNA (eż. Qiagen DNeasy Plant Kit) jistgħu jiġu applikati bil-kundizzjoni li jiġu ppruvati li huma effettivi indaqs fil-purifikazzjoni tad-DNA minn kampjuni ta’ kontroll li fihom 103 to 104 ċelluli patoġeni għal kull ml.

6.2. PCR

6.2.1. Ipprepara mudelli tat-test u kontroll għal PCR skond il-protokoll validat (Appendiċi 6). Ipprepara deċimal ta’ sostanza dilwita ta’ estratt ta’ kampjun tad-DNA (1:10 f’ UPW).

6.2.2. Ipprepara t-taħlita ta’ rejazzjoni tal-PCR xierqa f’ambjent nieqes mill-kontaminazzjoni skond il-protokoll ippubblikat (Appendiċi 6). Il-protokoll tal-PCR validat huwa azzjoni multiplex li tinkorpora wkoll kontroll intern tal-PCR.

6.2.3. Żid 5 µl ta’ estratt tad-DNA għal kull 25 µl ta’ rejazzjoni tal-PCR f’tubi tal-PCR sterili.

6.2.4. Inkorpora kampjun ta’ kontroll negattiv li fih taħlita ta’ rejazzjoni tal-PCR biss u żid l-istess sors ta’ UPW kif kien użat fit-taħlita tal-PCR minflok il-kampjun.

6.2.5. Poġġi t-tubi fl-istess ċiklatur termali li ġie wżat fl-ittestjar preliminari u ħaddem il-programm PCR ottimizzat kif xieraq (Appendiċi 6).

6.3. Analiżi tal-prodott PCR

6.3.1. Ifred l-amplikoni permezz ta’ l-elektrofloreżi agarose gel. Ħaddem mill-anqas 12 µl tat-taħlita ta’ rejazzjoni tad-DNA amplifikata minn kull kampjun imħallat b’3 µl loading buffer (Appendiċi 6) f’2.0 % (w/v) agarose gels f’ tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendiċi 6) f’5-8 V għal kull ċm. Uża marker tad-DNA xieraq, eż. 100 bp ladder.

6.3.2. Ikxef is-sekwenzi tad-DNA billi ttebbgħa fl-ethidium bromide (0,5 mg per L) għal 30 sa 45 minuta u ħu l-prekawzjonijiet xierqa biex timmaniġġja dan il-mutagen.

6.3.3. Osserva l-gel imtebba taħt transilluminazzjoni UV short wave (eż. λ = 302 nm) għall-prodotti PCR amplifikati tad-daqs (Appendiċi 6) u dokument mistenni.

6.3.4. Għas-sejbiet/każijiet kollha ġodda ivverifika l-awtentiċità ta’ l-amplikon PCR billi twettaq analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enżimi fuq kampjun tad-DNA amplifikat li fadal billi tinkuba fl-aħjar temperatura u ħin b’enzima u buffer xierqa (ara l-Appendiċi 6). Ifred il-frammenti ttrattati bit-tisħin permezz ta’ l-elektroforeżi agarose gel bħal qabel u osserva disinn ta’ restrizzjoni ta’ frammenti karatteristiku taħt transilluminazzjoni UV wara tbajja ta’ l-ethidium bromide u kkompara mal-kontroll pożittiv diġeriti u mhux diġeriti.

Interpretazzjoni tar-riżultati tat-test PCR

It-test PCR hu negattiv jekk amplikon PCR speċifiku-C. m. subsp. Sepedonicus tad-daqs mistenni mhux osservat għall-kampjun in kwistjoni iżda hu osservat għall-kampjuni kollha ta’ kontroll pożittiv (fil-każ ta’ multiplex PCR b’primers ta’ kontroll intern ta’ speiċifiċità tal-pjanti: tieni prodott PCR tad-daqs mistenni għandu jkun amplifikat bil-kampjun in kwistjoni)

It-test PCR hu pożittiv jekk amplikon PCR speċifiku-C. m. subsp. Sepedonicus tad-daqs u restriction pattern mistenni (meta rikjest) hu osservat, bil-kundizzjoni lid an mhux amplifikat minn kwalukwe mill-kampjuni ta’ kontroll negattiv. Konferma li tista’ toqgħod fuqha ta’ riżultat pożittiv jista’ wkoll jinkiseb billi tirrepeti t-test b’tieni sett ta’ PCR primers (sezzjoni 9.3).

Nota:

Inibizzjoni tal-PCR tista’ tiġi suspettata jekk l-amplikon mistenni hu ottenut mill-kampjun ta’ kontroll pożittiv li fih C. m. subsp. Sepedonicus fl-ilma imam riżultati negattivi huma miksuba minn kontrolli pożittivi b’ C. m. subsp. Sepedonicus f’estratt tal-patata. F’protokolli tal-PCR multiplex b’kontrolli tal-PCR interni, inibizzjoni tar-rejazzjoni hi indikata meta l-ebda miż-żewġ amplikons huma miksuba.

Il-kontaminazzjoni tista’ tiġi suspettata jekk l-amplikon mistennija hu miksub minn waħda jew aktar tal-kontrolli negattivi.

7. TEST BIOASSAY

Nota:

Ittestjar preliminari permezz ta’ dan il-metodu għandu jippermetti detezzjoni riproduċibbli ta’ 103 sa 104 ta’ unitajiet ta’ formazzjoni ta’ kolonji ta’ C. m. subsp. sepedonicus għal kull ml miżjud lill-estratti ta’ kampjuni li qabel ttestjaw negattiv (preparazzjoni ara l-Appendiċi 2).

L-għola sensittività ta’ osservazzjoni tista’ tkun mistennija meta tuża estratti ta’ kampjuni ppreparati friski u kundizzjonijiet ta’ żvilupp ottimali. Iżda, l-metodu jista’ jigi applikat b’suċċess lill-estratti li gew miżmuma fil-gliċerol f’temperatura ta’ bejn –68 sa –86 °C.

Ċerti varjetajiet tal-brunġiel jipprovdu medju ta’ arrikkiment selettiv eċċellenti għat-tkabbir ta’ C. m. subsp. Sepedonicus anki fin-nuqqas ta’ sintomi, u jipprovdu wkoll test ta’ provenjenza bħala konfermazzjoni eċċellenti.

Il-kundizzjonijiet tat-tkabbir għandhom ikunu l-aktar favorevoli sabiex inaqqas ir-riskju ta’ riżultati tat-test foloz negattivi.

Għal dettalji tat-tkabbir, ara l-Appendiċi 8.

7.1. Iddistribwixxi dak kollu li fadal mill-allikwota test tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni mħallta mill-ġdid mis-sezzjoni 3.1.6 jew 3.2.5 bejn il-brunġiel permezz ta’ wieħed mill-metodi misjuba hawn taħt(7.3 jew 7.4). Uża biss pjanti fil-leaf stage 2-3 sa’ l-espansjoni sħiħa tat-tielet true leaf. Sabiex tassigura utilizzazzjoni sħiħa tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni mħallta mill-ġdid kif ukoll tilqim effettiv il-proċeduri mniżżla hawn taħt se jkollhom bżonn 15-25 brunġiel għal kull kampjun.

7.2. Issaqqix il-brunġiel għal ġurnata jew 2 qabel it-tilqim sabiex tnaqqas il-pressjoni fiċ-ċelluli.

Tilqim permezz ta’ tiċrita żgħira

7.3.1. Billi żżomm il-pjanta bejn żewġt iswaba, qattar qatra (bejn wieħed u ieħor 5 sa 10 µl) tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni mħallta fuq iz-zokk bejn il-kotiledoni u l-ewwel werqa.

7.3.2. Permezz ta’ skalpell sterilizzat, għamel tiċrita żgħira dijagonali, ta’ madwar 1.0ċm għat-tul u ta’ bejn wieħed u ieħor 2/3 tal-fond tal-ħxuna taż-żokk, billi tibda l-qatgħa minfejn toħroġ l-ewwel qatra.

7.3.3. Issiġilla il-qatgħa b’vażelina sterili minn siringa.

7.4. Tilqim bis-siringa

7.4.1 Laqqam iz-zkuk tal-brunġiela eżatt fuq il-kotiledoni bl-użu ta’ siringa mgħammra b’labra ipodermika (mhux anqas minn 23G). Iddistribwixxi il-kampjun bejn il-brunġiel.

7.5. Bħal fil-kaz tal-kontrolli pożittivi, laqqam 5 pjanti b’taħlita ta’ l-ilma ta’ 105 sa 106 ċelluli għal kull ml ta’ kultivazzjoni magħrufa ta’ C. m. subsp. Sepedonicus u, fejn hu possibbli, b’tessut tat-tuberu infettat b’mod naturali (ara s-sezzjoni 4) permezz ta’ l-istess metodu ta’ tilqim (7.3 jew 7.4).

7.6. Bħal fil-każ tal-kontroll negattiv, laqqam 5 pjanti b’buffer tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni sterili permezz ta’ l-istess metodu ta’ tilqim (7.3 jew 7.4).

7.7. Żviluppa l-pjanti f’faċilitajiet ta’ kwarantina f’tul ta’ żmien sa 4 ġimgħat f’temperatura ta’ 18 sa 24 °C. Żviluppa l-pjanti b’dawl biżżejjed u b’umdità għolja (70 sa 80 %) u ilma sabiex tipprevjeni li jgħerqu jew jitbielu minħabba f’nuqqas ta’ ilma. Ċelluli C. m. sepedonicus jinqatlu f’temperatura ta’ ‘l fuq minn 30 °C u l-aħjar temperatura hi ta’ 21 °C. Sabiex tevita l-kontaminazzjoni żviluppa l-pjanti ta’ kontroll pożittiv u dawk ta’ kontroll negattiv fuq bankijiet speratati b’mod ċar f’serer jew growth chambers jew, fejn l-ispazju hu limitat, assigura separazzjoni stretta bejn it-trattamenti. Jekk pjanti għall-kampjuni differenti għandhom jigu żviluppati viċin xulxin, sseparahom permezz ta’ skrinijiet adattati. Meta tkun qed tiffertilizza, tispezzjona u manipulazzjonijiet oħra, ogħqod attent ħafna sabiex tevita l-kontaminjazzjoni bejniethom. Hu essenzjali li s-serer u growth chambers jinżammu nieqsa minn kull insetti għaliex dawn jistgħu jittrasmettu l-batterju minn kampjun għal kampjun.

7.8. Wara ġimgħa ibda eżamina regolarment għal sintomi. Għodd in-numru ta’ pjanti li juru sintomi. C. m. subsp. Sepedonicus tikkawża li jitbielu l-weraq fil-brunġiel li jista’ jibda bħala telqa marġinali jew intervinali. Tessut li jitbiel jista’ inizjalment jidher aħdar skur jew b’irqajja iżda jsir aktar ċar qabel ma jsir nekrotiku. Dbiel intervinali ħafna drabi jkollhom apparenza żejtnija mimlija ilma. Tessut nekrotiku ħafna drabi jkollu marġni isfar jgħajjat. Il-pjanti mhumiex neċessarjament maqtula; Aktar ma jkun hemm perjodu twil qabel ma jisviluppaw is-sintomi, aktar ikun hemm iċ-ċans li dawn igħixu. Il-pjanti jistgħu joħorġu mill-infezzjoni. Brunġiel żgħir huma aktar suxxettibbli għal popolazzjonijiet baxxi ta’ C. m. subsp. Sepedonicus minn pjanti akbar, b’hekk in-neċessità li jintużaw pjanti fi jew eżatt qabel it-tielet leaf stage.

Dbiel jistgħu ukoll jiġu provokati minn popolazzjonijiet ta’ batterji oħra jew fungi preżenti fir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni tat-tessut tat-tuberu. Dawn jinkludu Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora u E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kif ukoll popolazzjonijiet kbar ta’ batterji saprofitiki. B’mod partikolari Erwinia chrysanthemi tista’ tikkawża sintomi tal-werqa u dbiel li hu simili ħafna għas-sintomi ta’ C. m. sepedonicus. L-unika differenza hi s-swidija taz-zkuk fil-każ ta’ infezzjonijiet Erwinia chrysanthemi. Dbiel ieħor jistgħu jingħarfu minn dawk ikkawżati minn C. m. subsp. Sepedonicus peress illi weraq sħaħ jew pjanti sħaħ jidbielu malajr. Anki tebgħa Gram tista’ tiġi ppreparata: dan it-test jiddifferenzja C. m. subsp. sepedonicus minn Erwinia spp.

7.9. Malli jiġu osservati sintomi fil-brunġiel għandu jitwettaq twarrib mill-ġdid, bl-użu ta’ sezzjonijiet tat-tessut tal-werqa jew taz-zokk midbiel mill-pjanti (Ara 3.1 3 għall-maċerazzjoni tat-tessut. Iddiiżinfetta l-wiċċ tal-weraq u z-zkuk tal-brunġiel billi timsaħ b’70 % ethanol. Wettaq test IF jew PCR fuq il-fluwidu tal-brunġiel u iżola għal fuq medji adattati (selettivi) (ara s-sezzjoni 8) Tebgħa Gram (l-Appendiċi 9) tista’ wkoll tiġi ppreparata. Identifika kultivazzjonijiet purifikati ta’ C. m. subsp. sepedonicus preżunti u kkonferma l-patoġenità (ara s-sezzjoni 9 u 10).

7.10. Taħt ċerti ċirkostanzi, b’mod partikolari fejn il-kundizzjonijiet tat-tkabbir mhumiex mill-aqwa, jista’ jkun possibbli għal C. m. subsp. Sepedonicus li jeżisti bħala infezzjoni li għadha ma bdietx tiżviluppa fil-brunġiel anki wara perjodi ta’ inkubazzjoni sa 4 ġimgħat. Jekk ma jiġux osservati sintomi wara 4 ġimgħat, eżegwixxi IF/PCR fuq kampjun kompost ta’ sezzjonijiet taz-zokk ta’ 1 ċm ta’ kull pjanta ta’ l-ittestjar meħud aktar ‘il fuq mis-sit tat-tilqima. Jekk it-test ikun pożittiv għandu jiġi eżegwit iżolament mill-ġdid fuq medji adattati (selettivi) skond il-proċedura taħt is-sezzjoni 8. Identifika kultivazzjonijiet purifikati ta’ C. m. subsp. Sepedonicus preżunti u kkonferma l-patoġenità (is-sezzjoni 9 u 10).

Interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bioassay

Riżultati tat-test Bioassay validi huma miksuba meta pjanti tal-kontroll pozittiv juru sintomi tipiċi, il-batterju jista’ jiġi iżolat mill-ġdid minn dawn il-pjanti u l-ebda sintomi ma jinsabu fil-kontrolli negattivi.

It-test Bioassay huwa negattiv jekk il-pjanti ta’ l-ittestjar m’humiex infettati minn C. m. subsp. sepedonicus, u sakemm R. solanacearum huwa osservat f’kontrolli pożittivi.

It-test Bioassay huwa pożittiv jekk il-pjanti ta’ l-ittestjar huma infettati minn C. m. subsp. sepedonicus.

8. IŻOLAMENT TA’ C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Nota:

Id-djanjożi hi kompluta biss jekk C. m. subsp. Sepedonicus hu iżolat, sussegwentement identifikat (ara s-sezzjoni 9), u kkonfermat permezz ta’ test ta’ patoġenità (sezzjoni 10). Għalkemm C. m. subsp. Sepedonicus hu organiżmu fastidjuż, dan jista’ jiġi iżolat minn tessut sintomatiku.

Madankollu, jista’ joħroġ minnha billi tkabbar b’mod mgħaġġel batterji saprofitiċi u, b’hekk, iżolamenti diretti mit-tessut tall-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ’tat--tuberu jew zokk (sezzjonijiet 3.1.6 jew 3.2.5) huwa diffiċli. Permezz ta’ medju selettiv u sostanza dilwita tat-taħlita mill-ġdid tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni mill-qalba meħuda minn-naħa ta’ l-għarqub jew zkuk tal-patata iżolament dirett ta’ C. m. subsp. Sepedonicus jista’ jkun possibbli.

Iżolazzjonijiet għandhom isiru minn kull tuberu tal-patata sintomatiku jew partijiet taz-zkuk u mill-brunġiel fejn l-ebda sintomu mhu oservat iżda fejn test IF/PCR mill-kampjun kompost kien negattiv (ara sezzjoni 7.10). Maċerazzjoni taz-zkuk tal-brunġiel meta hemm il-bżonn għandu jitwettaq kif deskritt fis-sezzjoni 3.1.3.

Bħala kontrolli pożittivi, ipprepara sustenza dilwita deċimali minn taħlita ta’ 106 cfu għal kull ml ta’ C. m. subsp. sepedonicus (eż. NCPPB 4053 jew PD 406). Sabiex tevita kwalunkwe tip ta’ kontaminazzjoni, ipprepara koltrolli pożittivi sspearati totalment mill-kampjuni li jridu jiġu ttestjati.

Għal kull numru ta’ medju selettiv ppreparat ġdid il-konvenjenza tiegħu għat-tkabbir tal-patoġenu għandu jiġi ttestjat qabel ma jintuża sabiex jiġu ttestjati kampjuni ta’ rutina.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bhall-kampjun(i).

8.1. Pjastra selettiva

8.1.1. Minn allikwota ta’ 100 µl minn kampjun ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni tal-patata mħallta mill-ġdid jew fluwidu ta’ brunġiela agħmel dilwizzjonijiet ta’ għaxar darbiet f’ pellet buffer (l-Appendiċi 3).

8.1.2. L-iżolazzjoni minn pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ’ ta’ patata mhix dilwita normalment ma tirnexxix minħabba fid-drawwa ta’ l-iżvilupp fastidjuż ta’ Cms u kompetizzjoni mis-saprofiti. Peres illi l-batterju normalment jinsab f’popolazzjonijiet għolja f’tessuti infettati, is-saprofiti normalment jistgħu jiġu dilwiti ‘l barra, filwaqt li l-organiżmu patoġeniku jibqa’. B’hekk hu rrikmandat li tifrex 100 µl minn kull kampjun, 1/100 sa 1/10 000 dilwizzjonijiet għal fuq il-medju MTNA jew il-medju NCP-88 (l-Appendiċi 5) (jekk qed tuża dixxijiet petri b’dijametru ta’ 90 mm — aġġusta l-volum għal daqsijiet tad-dixx alternattivi), permezz ta’ l-użu ta’ spreaders (stikek tal-ħoki) u t-teknika ta’ l-ispread plate.

Nota:

strateġija alternattiva hi li tifrex l-allikwota tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni tal-patata inizjali ta’ 100 µl għal fuq l-ewwel pjastra agar permezz ta’ spreader u mbagħad neħħi l-ispreader għal tieni pjastra agar, billi tneħħi kull residwu li jibqa’ fuq l-ispreader; fl-aħħarnett irrepeti dan bit-tielet pjastra, ħalli b’hekk tagħti effett ta’ dilwizzjoni tal-pjastra via l-ispreader.

8.1.3. Poġġi l-pjastri f’inkubatur fid-dlam f’temperatura ta’ 21 sa 23 °C.

8.1.4. Eżaminazzjonijiet inizzjali tal-pjastri inkluż, b’referenza għall-pjastri ta’ kontroll, l-għadd ta’ kull kolonji li jixbħu il-C. m. subsp. Sepedonicus isiru wara 3 ijiem, b’għaddijiet oħra wara 5, 7, eventwalment wara 10 ijiem.

8.2. Purifikazzjoni ta’ kolonji suspettużi

Nota:

Is-subkultivazzjoni tal-kolonji li għandhom morfoloġija bħal ta’ C. m. subsp. Sepedonicus għandhom jitwettqu fuq medji YGM għat-tilqim tal-brunġiel u/jew identifikazzjoni li ġejjin; dan għandu jsir qabel ma l-pjanċi jikbru ż-żejjed i.e. preferibbilment wara 3-5 ijiem.

8.2.1. Ċappas kolonji li għandhom morfoloġija bħal ta’ C. m. subsp. Sepedonicus għal fuq wieħed mill-medji: (formuli jingħataw fl-Appendiċi 5):

nutrijent destrosju agar (għall-użu f’subkultivazzjonijiet biss),

yeast peptone glucose agar,

yeast extract mineral salts agar.

Inkuba f’temperatura ta’ 21 °C sa 24 °C għal massimu ta’ 10 ijiem.

C. m. subsp. sepedonicus jikber bil-mod, normalment jipproduċi kolonji tat-tip tikek, lewn il-krema u forma ta’ koppliet fi zmien 10 ijiem. (Ritratti ta’ kolonji tipiċi ta’ C. m. subsp. sepedonicus (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Erġa’ ċappas sabiex tistabbilixxi l-purità.

Ir-rati tat-tkabbir huma mtejba bis-subcultivazzjoni. Kolonji tipiċi huma bojod lewn il-krema jew l-avorju, ġieli sofor, ttundjati, lixxi, mgħollija, koppla konvessa, fluwidu-mucoid, b’ġnub sħaħ u normalment b’dijametru ta’ 1 sa 3 mm.

Tebgħa Gram sempliċi (Appendiċi 1) tista’ tgħin sabiex tagħżel kolonji għal testijiet oħrajn.

8.2.3. Identifika kultivazzjonijiet preżunti (ara s-Sezzjoni 9) u wettaq test ta’ patoġeniċità (ara s-Sezzjoni 10).

9. IDENTIFIKAZZJONI

Identifika kultivazzjonijiet puri ta’ kostitwenti iżolati ta’ R. solanacearum preżunti billi tuża għalmenu tnejn mit-testijiet li ġejjin bażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti.

Inkludi varjetajiet għal referenza magħrufa fejn hu xieraq għal kull test imwettaq.

9.1. Testijiet ta’ identifikazzjoni nutrizzjonali u enżimatiku

Iddetermina l-proprjetajiet fenotipiċi li ġejjin, li huma preżenti b’mod universali jew assenti f’ C. m. subsp. sepedonicus, skond il-metodi ta’ Lelliott u Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), Anonymous (1987).

Il-medji kollha għandhom jitpoġġew f’inkubatur f’temperatura ta’ 21 °C u eżaminati wara sitt ijiem. Jekk dawn ma kibrux, inkuba għal massimu ta’ 20 ġurnata.

It-testijiet kollha għandhom jinkludu kontroll C. m. subsp. Sepedonicus magħruf. Testijiet ta’ nutrizzjoni u fisjoloġiċi għandhom jitwettqu bl-użu ta’ sostanza tat-tilqim minn subkultivazzjonijiet nutrijent agar. Paraguni morfoloġiċi għandhom isiru minn kultivazzjonijiet agar nutrijent destrosju.

Testijiet Riżultat mistenni Test ta’ Ossidazzjoni/Fermentazzjoni (O/F) Inert jew ftit li xejn ossidabbli Attivitià ta’ oxidas – Tkabbir f’temperatura ta’ 37 °C – Attività ta’ urease – Idrolisi aesculin + Idrolisi tal-lamtu – jew dgħajjef Tolleranza ta’ 7 % NaCl – Produzzjoni indole – Attività ta’ Katalażi + Produzzjoni ta’ H2S – Utilizzazzjoni taċ-ċitrat – Likwifikazzjoni tal-ġelatina – Gliċerol aċidu – Aċidu mil-lattosju – jew dgħajjef Aċidu minn rhamnose – Aċidu minn salicin – Tebgħa Gram (Appendiċi 9) +

9.2. Test IF

(a) Ipprepara taħlita ta’ ċelluli ta’ madwar 106 għal kull ml f’IF buffer (Appendiċi 3).

(b) Ipprepara sostanza dilwita għal darbtejn ta’ antiserum xieraq.

(ċ) Applika l-proċedura IF (Sezzjoni 4).

(d) Test IF pożittiv jinkiseb jekk it-titru IF tal-kultivazzjoni huwa ekwivalenti għal dak tal-kontroll pożittiv.

9.3. Test PCR

(a) Ipprepara taħlita ta’ madwar 106 ċeluli għal kull ml f’ ilma ultra pur (UPW).

(b) Saħħan 100 µl tat-taħlita taċ-ċelluli f’tubi magħluqa f’heating block jew banjumarija jagħli f’temperatura ta’ 100 °C għal 4 minuti. Jekk hemm il-bżonn, iż-żieda ta’ NaOH ippreparat frisk għal konċentrazzjoni finali ta’ 0,05M jista’ jassisti l-liżi taċ-ċellula. Il-kampjuni jistgħu imbagħad jiġu maħżuna f’temperatura ta’ –16 sa –24 °C sakemm ikun hemm bżonn.

(ċ) Applika proċeduri PCR xierqa sabiex tamplifika C. m. subsp. sepedonicus specific amplikons (eż. Pastrik, 2000; ara l-Appendiċi 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999.

(d) Identifikazzjoni pożittiva ta’ C. m. subsp. sepedonicus tinkiseb jekk l-amplikoni tal-PCR huma ta’ l-istess daqs u għandhom l-istess poliformiżmi ta’ tul ta’ restrizzjoni tal-framment bħal dak għall-varjetà ta’ kontroll pożittiv.

9.4. Test FISH

(a) Ipprepara taħlita ta’ madwar 106 ċeluli għal kull ml f’ UPW.

(b) Applika l-proċedura FISH (Sezzjoni 5).

(ċ) Test FISH pożittiv hu miksub jekk l-istess rejazzjonijiet huma miksuba mill-kultivazzjoni u l-kontroll pożittiv.

9.5. Identifikazzjoni skond it-tip ta’ aċidi grassi (FAP)

(a) Kabbar il-kultivazzjoni fuq trypticase soy agar (Oxoid) għal 72 siegħa f’temperatura ta’ 21 °C (+/– 1°)

(b) Applika proċedura FAP xierqa (Janse, 1991; Stead, 1992).

(ċ) Test FAP pożittiv jinkiseb jekk il-profil tal-kultivazzjoni preżunta huwa identiku għal dik tal-kontroll pożittiv. Il-preżenza ta’ aċidi mħaxxna karatteritiċi huma 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 u 17:0 Anteiso huwa indikattiv ħafna ta’ C. m. sepedonicus. Ġeneri oħra bħal Curtobacterium, Arthrobacter u Micrococcus għandhom ukoll ftit minn dawn l-aċti iżda 15:1 Anteiso A huwa aċidu rari f’dawn il-batterji iżda jseħħ f’kull Clavibacter spp. F’bejn 1-5 %. F’ C. m. sepedonicus il-valur hu normalment ta’ xi 5 %.

9.6. BOX-PCR

(a) Ipprepara taħlita ta’ madwar 106 ċeluli għal kull ml f’ UPW.

(b) Applika t-test skond il-proċedura (Smith et al., 2001)

10. TEST TA’ KONFERMA

It-test ta’ patoġeniċità għandu jkun eżegwit bħala konferma finali ta’ djanjosi ta’ C. m. subsp. sepedonicus u għall-valutazzjoni ta’ l-aggressività tal-kultivazzjonijiet identifikati bħala C. m. subsp. Sepedonicus.

10.1. Ipprepara sostanza tat-tilqim ta’ madwar 106 ċelluli għal kull ml minn kultivazzjonijiet ta’ 3 ijiem ta’ l-iżolat li għandu jiġi ttestjat u varjetà ta’ kontroll pożittiv xieraq ta’ C. m. subsp. sepedonicus.

10.2. Laqqam 5-10 zkuk ta’ nebbieta tal-brunġiel f’ leaf stage 3 (sezzjoni 7.3 jew 7.4).

10.3. Inkuba f’temperatura ta’ 18-24 °C b’dawl suffiċjenti u umdità realttiva għolja b’ilma xieraq sabiex tiġi evitata l-għarqa jew it-tnixxif (sezzjoni 7.7). Fil-każ ta’ kultivazzjonijiet puri, dbiel tipiku għandu jseħħ fi żmien ġimgħatejn iżda pjanti li ma jurux sintomi (ara s-sezzjoni 7.8) wara dan iż-żmien għandhom jitpoġġew f’inkubatur għal massimu ta’ 3 ġimgħat f’temperaturi li jwassal għat-tkabbir tal-brunġiel iżda li ma jeċċedix 25 °C (Appendiċi 8). Jekk wara dan il-perjodu s-sintomi m’humiex preżenti, il-kultivazzjoni ma tistax tiġi kkonfermata bħala forma patogenika ta’ C. m. subsp. sepedonicus.

10.4. Iżola minn pjanti sintomatiċi billi tneħħi sezzjoni taz-zokk madwar 2 ċm fuq il-punt tat-tilqima. Farrak u hallat f’volum żgħir t’ilma distillat sterili jew 50 mM buffer tal-fosfat (Appendiċi 3). Iżola mit-taħlita billi tifrex jew iċċappas is-sustenza dilwita għal fuq MTNA u YPGA (Appendiċi 5), inkuba għal 3-5 ijiem f’temperatura ta’ 21-23 °C u osserva il-formazzjoni ta’ kolonji tipiċi ta’ C. m. subsp. sepedonicus.

Appendiċi 1 Laboratorji involuti fl-ottimizzazzjoni u l-validazzjoni tal-protokolli Laboratorju (1) Lokalità Pajjiż Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Vjenna u Linz L-Awstrija Departement Gewasbescherming Merelbeke Il-Belgju Plantedirektoratet Lyngby Id-Danimarka Central Science Laboratory York L-Ingilterra Scottish Agricultural science Agency Edinburgh L-Iskozja Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Franza Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Franza Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Il-Ġermanja Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Il-Ġermanja State Laboratory Dublin L-Irlanda Plantenziektenkundige Dienst Wageningen L-Olanda Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas In-Norveġja Direcção-Geral de Protecção das Culturas Liżbona Il-Portugall Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Is-Slovenja Centro Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Spanja (1) Ix-xjentist ta’ kuntatt: ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Appendiċi 2 Preparazzjoni ta’ kontrolli pożittivi u negattivi għat-testijiet ewlenin ta’ skrining tal-PCR/IF u FISH Ipproduċi kultivazzjoni ta’ 72 siegħa ta’ varjetà aggressiva ta’ C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 or PD 406] fuq medju basal MTNA u ħallat f’10 nM ta’ buffer tal-fosfat sabiex tikseb densità taċ-ċellula ta’ madwar 2 × 108 cfu għal kull ml. Dan huwa ġeneralment miksub permezz ta’ taħlita daqsxejn imdardra ekwivalenti għal densità ottika ta’ 0,20 f’600 nm. Neħħi l-qalba tan-naħa ta’ l-arqub ta’ 200 tuberu meħud minn produzzjoni tal-varjetà tal-ġilda bajda magħrufa li hi nieqsa minn C. m. subsp. sepedonicus. Ipproċessa t-truf ta’ l-arqub bħas-soltu u erġa’ ħallat ir-residwu ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni f’10 ml. Ipprepara 10 mikrovjali ta’ 1,5ml sterili b’900 µl tal-pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ’reġgħet giet mħallta. Ittrasferixxi 100 µl tat-taħlita ta’ C. m. subsp. Sepedonicus għall-ewwel mikrovjal. Vortex. Stabbilixxi livelli deċimali ta’ kontaminazzjoni billi tiddilwi aktar fil-ħames mikrovjali li jmiss. Is-sitt mikrovjali kkontaminati se jkunu wżati bhala kontrolli pożittivi. L-erba’ mikrovjali li mhux kontaminati se jkunu wżati bhala kontrolli negattivi. Ittikketta l-mikrovjali kif imiss. Ipprepara alikwoti ta’ 100 µl f’mikrovjali sterili ta’ 1,5 ml li b’hekk tikseb 9 replikajiet ta’ kull kampjun ta’ kontroll. Ahżen f’temperatura ta’ –16 sa –24 °C sakemm jintużaw. Il-preżenza u kwantifikazzjoni ta’ C. m. subsp. sepedonicus fil-kampjuni ta’ kontroll għandhom l-ewwel jiġu kkonfermati minn IF. Għat-test PCR, wettaq estratt tad-DNA mill-kampjuni pożittivi u negattivi b’kull serje ta’ kampjuni ta’ l-ittestjar. Għat-testijiet IF u FISH wettaq assays fuq kampjuni ta’ kontroll pożittivi u negattivi b’kull serje ta’ kampjuni tat-test. Għat-testijiet ta’ verifikazzjoni tal-konċentrazzjoni IF, FISH u PCR, C. m. subsp. sepedonicus għandu jkun osservat f’almenu 106 u 104 ċelluli/ml tal-kontrolli pożittivi u mhux f’kwalunkwe mill-kontrolli negattivi.

Appendiċi 3 Buffers għall-proċeduri tat-testijiet ĠENERALI: Buffers sterilizzati li mhux miftuħa jistgħu jinħażnu sa sena. 1. Buffers għall-proċedura ta’ estrazzjoni 1.1 Buffer ta’ estrazzjoni (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) Dan il-buffer jintuza għall-estrazzjoni tal-batterju mit-tessuti tal-pjanti permezz ta’ omoġenizzazzjoni jew taħlit. Na2HPO4 (anhydrous) 4,26 g KH2PO4 2.72 g Ilma distillat 1.00 L Iddissolvi l-ingredjenti, iċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Komponenti addizzjonali jistgħu jkunu utli kif ġej: Għan Kwantità (għal kull L) Biċċiet irqaq tal-Lubrol Deflocculant (*) 0.5 g DC silicone antifoam Aġent Anti-foam (*) 1.0 ml Tetrasodju pirofosfat Anti-ossidant 1.0 g Polyvinylpyrrolidone-40 000 (PVP-40) Binding ta’ inibituri tal-PCR 50 g 1.2 Buffer ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni (10 mM phosphate buffer, pH 7.2) Dan il-buffer jintuża għat-taħlita mill-ġdid u s-sostanza dilwita ta’ tuberu tal-patata tal-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub ta’ estratti tal-patata wara l-konċentrazzjoni f’pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni permezz taċ-ċentrifugazzjoni. Na2HPO4.12H2O 2.7 g NaH2PO4.2H2O 0.4 g Ilma distillat 1.00 L Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. 2. Buffers għat-test IF 2.1 Buffer IF (10 mM phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2) Dan il-buffer jintuża għad-dilwizzjoni ta’ l-antikorpi. Na2HPO4.12H2O 2.7 g NaH2PO4.2H2O 0.4 g NaCl 8.0 g Ilma distillat 1.0 L Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. 2.2 IF-buffer-Tween Dan il-buffer jintuża għall-ħasil ta’ pjastri. Żid 0.1 % Tween 20 lill-IF buffer. 2.3 Phosphate buffered glycerol, pH 7.6 Dan il-buffer jintuża bħala likwidu montanti fuq l-aperturi ta’ pjastri IF sabiex ikabbar il-fluworexxenza. Na2HPO4.12H2O 3.2 g NaH2PO4.2H2O 0.15 g Gliċerol 50 ml Ilma distillat 100 ml Taħlil montanti ta’ kontra ċ-ċarar jinsab fil-kummerċ eż Vectashield® (Vector Laboratories) jew Citifluor® (Leica). (*) Għall-użu mal-metodu ta’ estrazzjoni omogenizzanti.

Appendiċi 4 Determinazzjoni tal-livell ta’ kontaminazzjoni fit-testijiet IF u FISH 1. Għodd in-numru medju ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull aspett viżwali mikroskopiku (c) 2. Ikkalkula n-numru ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull slide window ta’ mikroskopju (C) C = c × S/s fejn S = l-erja tal-wiċċ ta’ l-apertura ta’ multispot slide u s = l-erja tal-wiċċ ta’ l-objective field

s = πi2/4G2K2 fejn i = field coefficient (ivarja minn 8 sa 24 skond it-tip okkulari) K = koeffiċjent tat-tubu (1 jew 1.25) G = tkabbir ta’ l-oġġettiv (100x, 40x eċċ.) 3. Ikkalkula n-numru ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull ml ta’ pellets li reġgħu ġew imħallta. N = C x 1 000/y x F fejn y = volum ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni li reggħet giet imħallta fuq kull apertura u F = fattur ta’ dilwizzjoni ta’ pellet ta’ materjal solidu li jifdal miċ-ċentrifugazzjoni ġiet imħallta mill-ġdid.

Appendiċi 5 Medji għall-iżolazzjoni u l-kultivazzjoni ta’ C. m. subsp. sepedonicus (a) Medja ta’ tkabbir ġenerali Nutrijent Agar (NA) Nutrijent Agar (Difco) 23.0 g Ilma distillat 1.0 L Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Nutrijent dextrose agar (NDA) Difco bacto nutrient agar li fih 1 % D(+) glukosju (monoidratat). Sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 115 °C għal 20 minuta. Yeast peptone glucose agar (YPGA) Estratt tal-lamtu (Difco) 5.0 g Bacto-Peptone (Difco) 5.0 g D(+) Glukosju (monoidrata) 10.0 g Bacto-Agar (Difco) 15.0 g Ilma distillat 1.0 L Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta. Yeast extract mineral salts medium (YGM) Estratt tal-Bakto-lamtu (Difco) 2.0 g D(+) Glukosju (monoidratat) 2.5 g K2HPO4 0.25 g KH2PO4 0.25 g MgSO4.7H2O 0.1 g MnSO4.H2O 0.015 g NaCl 0.05 g FeSO4.7H2O 0.005 g Bacto-Agar (Difco) 18 g Ilma distillat 1.0 L Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza 0.5 volumi ta’ litru permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 115 °C għal 20 minuta. (b) Medja ta’ tkabbir selettiv validat Medju MTNA Hlief jekk iddikjarat mod iehor il-komponenti tal-medji kollha huma minn BDH. Estratt tal-lamtu (Difco) 2.0 g Mannitol 2.5 g K2HPO4 0.25 g KH2PO4 0.25 g NaCl 0.05 g MgSO4.7 H2O 0.1 g MnSO4.H2O 0.015 g FeSO4.7H2O 0.005 g Agar (Oxoid nru 1) 16.0 g Ilma distillat 1.0 L Ħoll l-ingredjenti, aġġusta l-pH għal 7.2. Wara l-autoclaving (f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta) u tberrid għal temperatura ta’ 50 °C, żid l-antibijotiċi: trimethoprim 0.06 g, nalidixic acid 0.002 g, amphotericin B 0.01 g. Taħlil ta’ stokk ta’ antibijotiċi: trimethoprim (Sigma) u nalidixic acid (Sigma) (it-tnejn b’ 5mg/ml), f’96 % methanol, amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) f’dimethyl sulfoxide. Taħliliet stokk huma sterilizzati bil-filter. Nota: Il-medju basal għandu tul ta’ żmien ta’ 3 xhur. Wara li jiżdiedu l-antibijotiċi t-tul ta’ żmien hu ta’ xahar meta dan ikun storjat imkessah fi friġġ. Medju NCP-88 Nutrijent agar (Difco) 23 g Estratt tal-lamtu (Difco) 2 g D-mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0.5 g MgSO4.7 H2O 0.25 g Ilma distillat 1.0 L Ħoll l-ingredjenti, aġġusta l-pH għal 7.2. Wara l-autoclaving u t-tberrid għal temperatura ta’ 50 °C, żid l-antibijotiċi li ġejjin: Polymyxin B sulphate (Sigma) 0.003g, nalidixic acid (Sigma) 0.008 g, Cycloheximide (Sigma) 0.2 g. Iddissolvi l-antibijotiċi f’taħliliet ta’ stokk kif ġej: nalidixic acid f’0.01 M NaOH, cycloheximide f’50 % ethanol, polymyxin B sulfat f’ilma distillat. Tahliliet stokk huma sterilizzati bil-filter. Nota: Il-medju basal għandu tul ta’ żmien ta’ 3 xhur. Wara li jiżdiedu l-antibijotiċi t-tul ta’ żmien hu ta’ xahar meta dan ikun storjat imkessaħ fi friġġ.

Appendiċi 6 Protokolli u reaggenti tal-PCR validati Nota: Testjar preliminari għandu jippermetti detezzjoni riprodiċibbli ta’ mill-anqas 103 to 104 ċelluli ta’ C. m. sepedonicus għal kull ml ta’ estratt tal-kampjun. L-Ittestjar preliminari għandu wkoll juri li m’hemm l-ebda riżultati pożittivi foloz b’ panel ta’ varjetajiet batteriċi magħżula. 1. Protokoll Multiplex PCR b’kontroll PCR intern (Pastrik, 2000) 1.1 Oligonucleotide primers Forward primer PSA-1 5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3' Reverse primer PSA -R 5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3' Forward primer NS-7-F 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3' Reverse Primer NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3' Daqs ta’ l-amplikon mistenni minn C. m. subsp. sepedonicus mudell DNA = 502 bp (PSA-primer set) Daqs amplikon mistenni mill-kontroll PCR intern 18S rRNA = 377 bp (sett ta’ primer NS) 1.2 Taħlita ta’ rejazzjoni tal-PCR Reaġġent Kwantità għal kull rejazzjoni Konċentrazzjoni finali UPW Sterili 15,725 µl 10x PCR buffer (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1.5 mM MgCl2) BSA (fraction V) (10 %) 0,25 µl 0.1 % Taħlita d-nTP (20mM) 0,125 µl 0.1 mM Primer PSA-1 (10 µM) 0.5 µl 0.2 µM Primer PSA-R (10 µM) 0.5 µl 0.2 µM Primer NS-7-F (10 µM) (2) 0.1 µl 0.04 µM Primer NS-8-R (10 µM) (2) 0.1 µl 0.04 µM Taq polymerase (5 U/µl) (1) 0.2 µl 1.0 U Volum tal-kampjun 5.0 µl Volum totali: 25.0 µl 1.3 Kundizzjonijiet ta’ rejazzjoni tal-PCR Ħaddem il-programm li ġej: ċiklu wieħed ta’: (i) 3 minuti f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) 10 ċikli ta’: (ii) Minuta f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) (iii) Minuta f’temperatura ta’ 64 °C (annealing of primers) (iv) Minuta f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) 25 ciklu ta’: (v) 30 sekonda f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) (vi) 30 sekonda f’temperatura ta’ 62 °C (annealing of primers) (vii) Minuta f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) ciklu wieħed ta’: (vii) 5 minuti f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni finali) (ix) żomm f’temperatura ta’ 4 °C Nota: Dan il-programm hu ottimizzat għall-użu b’ċiklatur termali MJ Research PTC 200. Modifikazzjoni tad-dewmien tal-fażijiet taċ-ċikli (ii), (iii) and (iv) jistgħu jkunu meħtieġa għall-użu ma’ mudelli oħra. 1.4 Analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enżimi ta’ l-amplikon. Prodotti PCR apmlIFikati mid-DNA C. m. subsp. sepedonicus jipproducu distinctive restriction fragment length polymorphism ma’ l-enżimi Bgl II wara inkubazzjoni f’temperatura ta’ 37 °C għal 30 minuta. Il-frammenti ta’ restrizzjoni miksuba minn framment C. m. subsp. sepedonicus-speċifiku huma 282 bp u 220 bp fid-daqs. 2. Preparazzjoni tal-Loading buffer 2.1 Bromphenol blue (10 %-taħlila stokk) Bromphenol blue 5 g Ilma distillat (bidest) 50 ml 2.2 Loading buffer Gliċerol (86 %) 3.5 ml Bromphenol blue (5.1) 300 µl Ilma distillat (bidest) 6.2 ml 3. 10x Tris Acetate EDTA (TAE) buffer, pH 8.0 Tris buffer 48.4 g Aċidu aċetiku glaċjali 11.42 ml EDTA (disodium salt) 3.72 g Ilma distillat 1.00 L Iddilwi għal 1X qabel l-użu. Jinsab ukoll fil-kummerċ (eż. Invitrogen jew ekwivalenti). (1) Il-metodu ġie vvalidat permezz ta’ l-użu ta’ polimerażi Taq minn Perkin Elmer (AmpliTaq jew Gold) u Gibco BRL. (2) Konċentrażzjoni ta’ primers NS-7-F u NS-8-R kienu ottimizzati għall-estratt tal-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub tal-patata permezz tal-metodu omoġenizzanti u l-purIFikazzjoni tad-DNA skond Pastrik (2000) (ara Sezzjoni 6.1.a) u 6.2). L-ottimizzazzjoni mill-ġdid ta’ konċentrazzjonijiet ta’ rejaġġenti se jkunu meħtieġa jekk estrazzjoni permezz ta’ taħlit jew metodi oħra ta’ iżolazzjoni tad-DNA huma wżati.

Appendiċi 7 Reaggenti validati għat-test FISH 1. Oligo-sondi Sonda Cms-speċifika CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Sonda ewbatterika EUB-338-FITC li mhux speċifiku: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt -3’ 2. Taħlil fissattiv [TWISSIJA! IL FISSATTIV FIH PARAFORMALDEHYDE LI HUWA TOSSIKU. ILBES L-INGWANTI U TIEHUX NIFS ‘IL ĠEWWA U HUWA RRIKKMANDAT LI WIEĦED JAĦDEM ĠEWWA FUME CUPBOARD] (i) Saħħan 9 ml ta’ ilma ta’ grad mollekulari (eż ilma pur (UPW)) għal xi 60 °C u żid 0.4 g paraformaldehyde. Il-Paraformaldehyde jiddissolvi ruħu wara li żżid 5 qatriet ta’ 1N NaOH u wara li thawwat b’oggett manjetiku li jħawwad. (ii) Aġġusta l-pH għal 7.0 permezz taż-żieda ta’ 0,1.1M phosphate buffer (PB; pH 7.0) u 5 qtari ta’ 1N HCl. Iċċekkja l-pH permezz ta’ strippi ta’ indikazzjoni u aġġusta, jekk ikun hemm bżonn b’ HCl jew NaOH. [TWISSIJA! TUŻAX METRU pH F’TAĦLIL LI FIHOM PARAFORMALEDHYDE] (iii) Iffiltra t-taħlil minn ġo membrane filter ta’ 0.22 µm u żomm nieqes mit-trab f’temperatura ta’ 4 °C sakemm jerġa’ jintuża. (iv) Nota: Taħlil fissattiv alternattiv: 96 % ethanol. 3. 3X Hybmix NaCl 2.7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7.4) EDTA (sterilizzat bil-filter u autoclaved) 15 mM Iddilwi sa 1X kif meħtieġ. 4. Hybridisation solution 1X Hybmix Sodium dodecyl sulphate (SDS) 0.01 % Sonda EUB 338 5 ng/μl Sonda CMSCY301 5 ng/μl Ipprepara kwantitajiet ta’ hybridisation solution skond il-kalkoli fit-Tabella 1. Għal kull pjastra (li fiha 2 kampjuni differenti duplikati) 90 μl ta’ hybridisation solution hu meħtieġ. Tabella 1: Kwantitajiet suġġeriti għall-preparazzjoni tat-tahlita ta’ hybridisation. Numru ta’ pjastri: 2 8 UPW Sterili 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Sonda EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Sonda CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Volum totali (μl) 90,0 360,0 NB. Aħżen it-taħlil kollu li fih oligo-sondi sensittivi għad-dawl fid-dlam f’temperatura ta’ –20 °C. Ipproteġi mid-dawl tax-xemx dirett jew dawl ta’ l-elettriku matul l-użu. 5. 0.1M Phosphate buffer, pH 7.0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Ilma distillat 1,00 L Iddissolvi l-ingredjenti, iċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Appendiċi 8 Kultivazzjoni tal-brunġiel Iżra’ ż-żerriegħ tal-brunġiela (Solanum melongena) f’kompost taż-żerriegħ pasturizzat. Aqla’ n-nebbieta minn postha u ħawwilha post iehor permezz ta’ fully expanded cotyledons (10 sa 14-il ġurnata) f’kompost tal-qsari pastorizzat. Il-brunġiel għandu jitkabbar f’serra bil-kundizzjonijiet ambjentali li ġejjin: Tul tal-ġurnata: 14-il siegħa jew, jekk itwal, dawl naturali tal-ġurnata; Temperatura: ġurnata: 21 sa 24 °C, lejl: 15 °C.

Varjetajiet suxxettibbli ta’ brungiel: “Black Beauty” “Long Tom”, “Rima”, “Balsas” Fornitur: ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.