Id-Direttiva tal-Kummissjoni tat-18 ta' Novembru 1987 li taddatta għall-progres tekniku għad-disa’ darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi perikolużi



Official Journal L 133 , 30/05/1988 P. 0001 - 0127

Finnish special edition: Chapter 15 Volume 14 P. 0003

Swedish special edition: Chapter 15 Volume 14 P. 0003

CS.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

ET.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

HU.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

LT.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

LV.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

MT.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

PL.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

SK.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216

SL.ES Chapter 13 Volume 009 P. 90 - 216



Id-Direttiva tal-Kummissjoni tat-18 ta' Novembru 1987 li taddatta għall-progres tekniku għad-disa’ darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi perikolużi (88/302/KEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ekonomika Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta’ Ġunju 1967 dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi perikolużi [1], kif emendata għas-sitt darba bid-Direttiva 79/831/KEE [2], u partikolarment l-Artikolu 19 tagħha, Billi l-Artikolu 3(1) tad-Direttiva 67/548/KEE jipprovdi li l-propjetajiet fiżiko-kimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta’ sustanzi u preparazzjonijiet għandhom ikunu ddeterminati skond il-metodi speċifikati fl-Anness V; Billi l-Artikolu 3(2) tad-Direttiva 67/548/KEE jipprovdi li l-periklu ambjentali veru jew potenzjali ta’ sustanza jew preparazzjoni għandu jkun stmat skond il-karatteristiċi stabbiliti fl-Annessi VII u VIII; Billi l-Anness V tal-verżjoni introdotta bid-Direttiva tal-Kummissjoni 84/449/KEE [3] preżentament fih biss dawk il-metodi tat-testijiet li jikkorrispondu għall-karatteristiċi dettaljati fl-Anness VII u li huwa meħtieġ ukoll li jkunu disponibbli metodi tat-testijiet li jikkorripondu għall-karatteristiċi dettaljati fl-Anness VIII; Billi l-miżuri li tipprovdi għalihom din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat għall-Adattament mal-Progress Tekniku tad-Direttivi dwar it-Tneħħija ta’ Barrieri Tekniċi għall-Kummerċ fis-Sustanzi u l-Preparazzjonijiet Perikolużi, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 It-test ta’ l-Anness ta’ din id-Direttiva huwa miżjud ma’ l-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE. Artikolu 2 L-Istati Membri għandhom jadottaw u jippubblikaw qabel il-31 ta’ Diċembru 1988 il-miżuri meħtieġa sabiex ikunu konformi ma’ din id-Direttiva,u għandhom minnufih jgħarrfu bihom lill-Kummissjoni. Huma għandhom japplikaw dawk il-miżuri mhux iktar tard mit-30 ta’ Ġunju 1989. Artikolu 3 Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fit-18 ta’ Novembru 1987. Għall-Kummissjoni Stanley Clinton Davis Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU C 196, tas-16.8.1967, p. 1/67. [2] ĠU L 259, tal-15.10.1979, p. 10. [3] ĠU L 251, tad-19.9.1984, p. 1. -------------------------------------------------- ANNESS Il-metodi ta’ prova deskritti hawnhekk huma għad-determinazzjoni ta’ ċerti propjetajiet tossikoloġiċi u ekotossikoloġiċi elenkati fl-Anness VIII tad-Direttiva tal-Kunsill 79/831/KEE. Huma deskritti metodi tal-prova tajbin fil-livell 1 u l-livell 2 ta’ l-Anness VIII, imma l-provi m’humiex suddiviżi bħala funzjoni tal-livelli differenti CONTENTS | Page | PART B: Methods for the determination of toxicity… | 4 | General Introduction: Part B… | 4 | Sub-chronic oral toxicity test: 90-day repeated oral dose using rodent species… | 8 | Sub-chronic oral toxicity test: 90-day repeated oral dose using non-rodent species… | 12 | Sub-chronic dermal toxicity study: 90-day repeated dermal dose study using rodent species… | 16 | Sub-chronic inhalation toxicity study: 90-day repeated inhalation dose study using rodent species… | 20 | Teratogenicity test — rodent and non-rodent… | 24 | Chronic toxicity test… | 27 | Carcinogenicity test… | 32 | Combined chronic toxicity/carcinogenicity test… | 37 | One-generation reproduction toxicity test… | 43 | Two-generation reproduction toxicity test… | 47 | Toxicokinetics… | 51 | Mutagenicity testing and screening for carcinogenicity:… | 55 | —Gene mutation — Saccharomyces cerevisiae… | 55 | —Mitotic recombination — Saccharomyces cerevisiae… | 58 | —In vitro mammalian cell gene mutation test… | 61 | —DNA damage and repair — unscheduled DNA synthesis — mammalian cells in vitro… | 64 | —Sister chromatid exchange assay in vitro… | 68 | —Sex-linked recessive lethal test in Drosophila melanogaster… | 71 | —In vitro mammalian cell transformation tests… | 73 | —Rodent dominant lethal test… | 76 | —In vivo mammalian germ-cell cytogenetics… | 79 | —Mouse spot test… | 82 | —Mouse heritable translocation… | 85 | PART C: Methods for the determination of ecotoxicity… | 88 | General Introduction: Part C… | 88 | Algal inhibition test… | 89 | Toxicity for earthworms: Artificial soil test… | 95 | Biodegradation: Zahn — Wellens test… | 99 | Biodegradation: Activated sludge simulation tests… | 106 | Biodegradation: Activated sludge respiration inhibition test… | 118 | Biodegradation: Modified SCAS test… | 123 | PARTI B: METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSIĊITÀ INTRODUZZJONI ĠENERALI: PARTI B STUDJI FIT-TUL TA’ ŻMIEN Studji kroniċi, subkroniċi u tal-kanċerogenesi Il-karatterizzazzjoni tas-sustanza eżaminata u tat-taħlita użata għat-trattament Il-kompożizzjoni tas-sustanza eżaminata, inkluż l-impuritajiet prinċipali u l-proprjetajiet fiżiko-kimiċi rilevanti, flimkien ma’l-istabilità, għandha tkun osservata qabel il-bidu ta’ kwalunkwe studju ta’ tossiċità. Il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza eżaminata jipprovdu nformazzjoni mportanti sabiex jintgħażel il-mod kif għandha tkun somministrata, il-proġettazzjoni ta’ l-istudji subkroniċi, kroniċi u kanċeroġenesi kif ukoll it-trattament u l-konservazzjoni tas-sustanza eżaminata. L-informazzjoni dwar l-istruttura kimika u l-proprjetajiet fiżiko-kimiċi jistgħu jipprovdu indikazzjoni dwar il-karatteristiċi ta’ l-assorbiment mill-mod ta’ somministrazzjoni prevista u l-possibbilitatjiet metaboliċi u d-distribuzzjoni tat-tessuti. Jista’ jagħti l-każ li jkun hemm informazzjoni dwar il-parametri tossikokinetiċi li jirriżultaw minn studji dwar it-tossiċità u tossikokinetiċi preċedenti. L-elaborazzjoni ta’ xi metodu analitiku għad-determinazzjoni kwalitativa u kwantitativa tas-sustanza eżaminata (inkluża l-impurità ta’ mportanza kbira meta huwa possibbli) fil-mezz tad-dozaġġ u fil-materjal bijoloġiku għandhom isiru qabel il-bidu ta’ kull studju. Annimali tal-laboratorju: ghażla ta’ l-ispeċji u razez Peress illi huwa neċessarju li t-trattament ta’ l-annimali jestendi għall-parti l-kbira minn ħajjithom, l-istudji huma nklinati li jkunu limitati għall-ispeċji sperimentali li jgħixu ftit u li l-mantentiment tagħhom huwa faċli. Huwa verament mixtieq illi ssir magħrufa l-inċidenza ta’ patoloġiji spontaneji u ta’ tumuri fuq ir-razez ta’ l-annimali użati meta dawn huma miżmuma f’kondizzjonijiet analoġi. Ir-razez għandhom ikunu karatterizzati tajjeb u mingħajr ebda difett konġenitali li jista’ jintervjeni. L-użu ta razez miksuba minn akkoppjamenti bejn razes ta’ l-istess demm jew ta’ ibridi tat-tip F1 jirrappreżentaw ċertu vantaġġi f’dan ir-rigward; iżda fejn huma disponibbli dati tal-bażi sufficjenti dwar razez li mhumiex ta’ l-istess demm, fejn huma użati annimali ta’ kolonji magħluqa, dawn ta’ l-aħħar huma aċċettabbli. Il-kura ta’ l-annimali, dieta u provvista ta’ l-ilma L-eżamijiet u l-istudji fuq l-annimali għandhom isiru skond ir-regolamenti nazzjonali u għandhom jieħdu kont tal-prinċipji umanitarji u ta’ l-iżviluppi internazzjonali fis-settur tal-benesseri ta’ l-annimali. Sabiex ikunu miksuba riżultati tajba, huwa neċessarju l-kontroll bir-reqqa tal-kondizzjonijiet ambjentali kif ukoll it-teknika adegwata tal-kura ta’ l-annimali. Fatturi bħall-kondizzjonijiet ta’ akkomodazzjoni, mard interkorrenti, it-terapija permezz ta’ farmaċi, l-impuritajiet fid-dieta, l-arja, l-ilma, il-friex u l-kura ta’ l-annimali in ġenerali jistgħu jinfluwixxu b’mod sinjifikanti fuq ir-riżultat ta’ l-istudju b’dożi ripetuti. In ġenerali, l-effetti ta’ l-isterilizzanti kimiċi fuq l-istudju għandhom ikunu osservati. Id-dieta ghandha tissoddisfa r-rekwiziti sustanzjużi kollha ta’ l-ispecji eżaminata u għandha tkun mingħajr ebda impurità li tista’ tinfluwenza r-rżzultat ta’ l-istudju. L-annimali gerriema għandhom ikunu mitmugħa u mogħtija x’jixorbu ad libitum b’ikel li jkun mibdul mill-inqas kull ġimgħa. Fil-preżent, jeżistu tlett tipi ta’ dieti li huma utilizzati: konvenzjonali, sintetiċi u dieti varji ta’ formula miftuħa. F’kwalunkwe dieta li tkun magħżula, il-fornituri għandhom ikunu ċerti permezz ta’ kontrolli perjodiċi dwar il-valur nutrittv u l-livell ta’ kontaminanti fid-dieta bażilari u jipprovdu din l-informazzjoni lill-laboratorju ma kull furnata ikel. Huwa verament mixtieq li jkunu magħrufa l-effetti ta’ reġim djetetiċi fuq il-metaboliżmu kif ukoll l-iżvilupp tat-tumuri u l-għixien twil ta’ l-annimali. Barra minn hekk, l-analiżi tal-kontrolli tad-dieta bażilari jistgħu isiru mill-laboratorju li jagħmel il-provi kemm għal dawk il-komponenti ta’ l-ikel, kif ukoll għal dawk il-kontaminati nvolontarji li jinkludu l-kanċerogenesi. F’dan il-każ, ir-riżultati ta’ l-analiżi għandhom ikunu miżmuma u riklużi fir-rapport finali dwar kull sustanza studjata. Il-kostitwenti djetetiċi komuni li huma magħrufa jinfluwenzaw il-kanċerogenità (ez: anti-ossidanti, aċidi grassi li mhumiex saturati, elenju) m’għandhomx ikunu preżenti f’konċentrazzjonijiet interferenti. Il-potenzali ta’ l-impatt ta’ diversi kontaminanti djetetiċi komuni fuq il-valutazzjoni tal-kanċeroġenità jindika illi attenzjoni partikolari għandha tingħata lill-preżenza, fid-dieta, ta’ fdalijiet ta’ antipestiċida, ta’ komponenti organo-klorwati, ta’ idrokarburi poliċikliċiaromatiċi, ta’ estroġeni, ta’ metall tqil, ta’ nitrosammini u mikotossinu. Meta s-sustanza sperimentata tkun somministrata fl-ilma jew fl-ikel, it-testijiet dwar l-istabbilità huma essenzali. Testijiet rigward l-omogeneità u ta’ l-istabbilità magħmula tajjeb qabel l-istudji bid-dożi ripetuti, għandhom ikunu użati sabiex tkun stabbilita l-frekwenza mitluba mill-preparazzjoni tad-dieta u l-kontrolli. Meta d-dieti huma sterellizati, għandhom ikunu osservati l-effetti ta’ dawn il-proċeduri fuq is-sustanza sperimentata u l-kostitwenti djetetiċi. Arranġamenti meħtieġa għandhom jitwettqu. Matul l-ittestjar tal-karċinoġeniċità ir-riċerkaturi għandhom ikunu konxji ta’ kontaminanti potenzali fl-ilma utilizzat. L-ilma approvat għall-konsum uman ġeneralment huwa soddisfaċenti u nformazzjoni dwar il-kompożizzjoni tiegħu għanda tkun disponibbli. Jista’ jagħti l-każ illi l-konċentrazzjoni fis-sustanza sperimentata fid-dieta tkun mibdula hekk kif l-annimali jikbru sabiex id-dħul raġjonevolment kostanti tas-sustanza sperimentata ikun miżmum skond kemm jiżen il-ġisem. Il-valur sustanzjuż tad-dieta ta’ kontroll u dik sperimentata għandu jkun kemm jista’ jkun simili. Għalhekk, il-valur sustanzjuż tas-sustanza sperimentata mħallta fid-dieta għanda tkun meqjusa. L-esperjenza tissuġerixxi illi sa 5% tas-sustanza sperimentata li mhijiex nutrittiva fid-dieta mhijiex se tintervjeni b’mod sinjifikattiv fil-valur nutrittiv tad-dieta. 1. Studji inalatori L-ebda prova bil-limitu hija speċifikata minħabba li ma nstabx possibbli sabiex ikun imfisser valur bil-limitu uniku ta’ espożizzjoni għall-inalazzjoni. 2. Studju ta’ teratoġenesi Il-metodu ta’ prova huwa primarjament dirett għas-somministrazzjoni orali. B’mod alternattiv, jistgħu jittieħdu rotot oħra skond il-proprjetajiet fiżiċi tas-sustanza sperimentata jew ir-rotta li x’aktarx tittieħed fl-espożizzjoni umana. F’dawn il-każijiet, il-metodu ta’ prova għandu jkun adattat billi jkunu kkunsidrati l-elementi approprjati tal-metodi ta’ prova ta’ 28 ġurnata. 3. Tossikokinetiċi Studji tossikokinetiċi jgħinu fl-interpretazzjoni u l-valutazzjoni tad-data tat-tossicità. L-iskop ta’ dawn l-istudji huwa sabiex ikunu kkjarifikati aspetti partikolari tat-tossiċita tal-kimika studjata u r-riżultati li jistgħu jgħinu fil-programmazzjoni ta’ studji oħra ta’ tossiċità. Mhuwiex maħsub illi f’kull każ għandhom ikunu determinati il-parametri. Is-sekwenza kompleta ta’ l-istudji tossikokinetiċi (l-assorbiment, l-eskrezzjoni, id-distribuzzjoni u l-metaboliżmu) tkun neċessarja f’każijiet rari biss. Għal uħud mill-komposti jistgħu ikunu neċessarji bidliet f’din is-sekwenza jew jista’ jkun suffiċjenti studju dwar doża unika. Definizzjonijiet Tossikokinetiċi: | l-istdju ta’ l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu u l-eskrezzjoni tas-sustanza sperimentata; | Assorbiment: | il-proċess jew il-proċessi li permezz tagħhom is-sustanza somministrata tkun assorbita mill-ġisem; | Eskrezzjoni: | il-proċess jew il-proċessi li permezz tagħhom is-sustanza somministrata u/jew il-metaboliti tagħha jkunu eliminati mill-ġisem. | Distribuzzjoni: | il-proċess jew il-proċessi li permezz tagħhom is-sustanza assorbita u/jew il-metaboliti tagħha jitqassmu fl-organiżmu | Metaboliżmu: | il-proċess jew il-proċessi li permezz tagħhom is-sustanza somministrata tkun mibdula b’mod strutturali fil-ġisem permezz ta’ reazzjoni enzimatika u dik li mhijiex enzimatika. | 4. Studju akut u sub-akut dwar it-tieni speċji L-għan ta’ l-istudju dwar it-tieni speċji huwa sabiex jikkumplementa il-konklużjonijiet li jirriżultaw mill-ewwel speċji. Fil-każ ta’ studju tat-tieni speċji, il-metodu ta’ prova ġja deskritt jista’ jintuża jew ikun adattat għal numru iżgħar ta’ annimali. 5. Studji dwar il-fertilità Fil-każijiet fejn tinħass il-ħtiega li ssir prova dwar ir-riproduzzjoni fi tlett ġenerazzjonijiet, jista’ jkun estiż il-metodu deskritt għall-prova dwar ir-riproduzzjoni ta’ żewg ġenerazzjonijiet sabiex jinkludi it-tielet ġenerazzjoni. 6. Studji dwar il-mutaġenicità Provi supplementari tal-mutaġeniċità inkluz l-iskreening tal-kanċeroġenicità Fl-Anness VII tad-Direttiva, studji supplimentari sabiex il-mutaġeniċità tkun investigata iktar jew il-pre-skreen tal-kanċeroġenicità huma msemmija. L-istudji msemmija f’dan il-kapitolu jistgħu b’mod ġenerali jintużaw sabiex ikunu nvestigati z-zewġ aspetti. Introduzzjoni L-ewwel valutazzjoni ta’ l-attività mutaġenika tas-sustanza tikkonsisti fir-riċerka tal-mutazzjoni ġenika (puntiforma) fil-batterja u l-ħsara kromosomika fiċ-ċelluli tal-mammiferi (in vitro jew in vivo); il-metodi xierqa għal din is-serje ta’ provi bażilari kienu msemmija qabel. Dan il-kapitolu jittratta dwar ir-riċerka supplimentari li hija neċessarja għall-verifikazzjoni jew l-estensjoni tar-riżultati miksuba matul is-serje ta’ provi bażilari u li tista’ tinuża għal numru ta’ raġunijiet: 1. sabiex ikunu kkonfermati r-riżultati miksuba fis-serje ta’ provi bażilari; 2. sabiex ikunu riċerkati eventi ġenetici li ma kienux studjati fis-serje ta’ provi bażilari; 3. sabiex tibda jew tkun estiża ir-riċerka in vivo. Għal dan il-għan il-firxa ta’ provi deskritti jinkludu sistemi ewkarjotiċi kemm in vitro kif ukoll in vivo u serje ta’ eventi ġenetiċi. Il-provi jipprovdu informazzjoni dwar mutazzjoni puntwali fl-organiżmi l-aktar ikkumplikati mill-batterja utilizzati fis-serje ta’ provi bażilari u jwessgħu l-informazzjoni dwar il-kapaċità tas-sustanza sabiex tikkawża aberrazzjonijiet kromosomiċi. Huma deskritti wkoll il-provi dwar l-eventi ġenetiċi li huma differenti minn mutazzjonijiet puntiformi u mill-aberazzjonijiet kromosomiċi. Dawn jipprovdu informazzjoni supplimentari u jistgħu ikunu approprjament utilizzati fl-iskemi ta’ l-analiżi. Bħala prinċipju ġenerali, meta programm ta’ riċerka ulterjuri dwar il-mutaġeniċità huwa kkunsidrat, għanda tkun provduta nformazzjoni addizzjonali rilevanti dwar il-potenzal mutaġeniku u/jew kanċeroġeniku ta’ dik is-sustanza. L-istudji li jistgħu ikunu adattati għal każ speċifiku jiddependu minn numru ta’ fatturi, inklużi l-karatteristiċi kemikali u fiżiċi tas-sustanza, ir-riżultati tal-provi batteroloġiċi u ċitoġenetiċi inizzjali, il-profil metaboliku tas-sustanza, ir-riżultati ta’ studji tossiċi oħra, u l-użu magħruf tas-sustanza. Minħabba in-numru ta’ fatturi li għandhom jitqiesu, m’huwiex approprjat li tintgħażel skema retta għall-għażla tal-provi. Madankollu, ċertu prinċipji ġenerali jistgħu iservu ta’ għajnuna. Jekk prova tirriżulta pożittiva matul ir-riċerka bażilari, l-istudji supplimentari għandhom mill-inqas jinkludu prova waħda sabiex ikunu osservat l-istess eventi ġenetiċi. Jekk iż-żewġ provi tar-riċerka bażilari jirriżultaw fin-negattiv, l-istudji supplimentari għandhom jinkludu prova tal-mutazzjonijiet ġenetiċi u waħda għall-aberrazzjonijiet kromosomiċi. Jista’ jkun opportun li tinkiseb data indikativa addizzjonali dwar l-effetti fuq id-DNA (imniżżla hawn taħt). Il-metodi li għandhom ikunu segwiti għal din ir-riċerka huma mniżżla hawn taħt a bażi tal-ġenetika riżultanti prinċipali. Studji dwar il-mutazzjoni genetika (puntiformi) Sabiex tkun investigata aktar il-kapaċità ta’ sustanza li tikkawża mutazzjonijiet ġenetici (puntiformi), waħda minn dawn il-provi segwenti tista’ tkun biżżejjed: (a) riċerka ta’ mutazzjoni ‘l quddiem jew lura permezz ta’ l-użu ta’ mikro-organiżmi ewkarijotiċi (Saccharomyces cerevisiae); (b) studji in vitro għar-riċerka tal-mutazzjoni ‘l quddiem f’ċelluli mammiferi; (c) studji tar-reċessivi letali marbuta mas-sess fid-Drosophila melanogaster; (d) studji in vivo tal-mutazzjonijiet fiċ-ċelluli somatiċi: prova tat-traslokazzjoni ereditarji tal-ġurdien. Studji tal-aberrazzjonijiet kronomsomiċi Sabiex tkun investigata aktar il-kapaċità ta’ sustanza li tikkawża aberrazzjonijiet kromosomiċi, jista’ jkun utilizzat wieħed mill-provi segwenti: (a) studji ċitoġenetiċi in vivo tal-mammiferi; Ghandha tkun inkluża l-analiżi tal-metafażi in vivo taċ-ċelluli tal-mudullun fil-każ li ma tkunx inkluża fil-valutazzjoni inizjali (serje ta’ provi bażilari). Jistgħu ukoll ikunu riċerkati ċelluli ġerminali ċitoġenetiċi in vivo; (b) Studji ċitoġenetiċi in vitro ta’ ċelluli mammiferi, jekk dan ma seħħx matul il-valutazzjoni inizjali; (c) Studji tal-letali dominanti fl-annimali gerriema (d) prova tat-traslokazzjoni ereditarji tal-ġurdien Esperimenti b’indikaturi għall-effetti fuq id-DNA Jeżistu metodi li jindikaw uħud mill-effetti fuq id-DNA iżda li m’għandhomx konsegwenzi mutaġeni bħala l-event finali. Dawn l-istudji jipprovdu nformazzjoni kumplimentari għal dik miksuba mill-istudji dwar il-mutaġeniċità, li jistgħu jirriżultaw utili għall-interpretazzjoni ta’ dan l-istudju. Meta tinħass il-ħtieġa, tista’ tintuża waħda mill-metodi li ġejjin billi jintużaw makrorganiżmi ewkarijotiċi jew ċelluli tal-mammiferi: (a) Rikombinazzjoni mitotika fis-Saccharomyces cerevisae; (b) Ħsara u tiswija tad-DNA – sinteżi tad-DNA li m’hijiex programmata – fiċ-ċelulli tal-mammiferi (in vitro); (c) Skambji ta’ kromatidi aħwa fiċ-ċelulli tal-mammiferi (in vitro). Provi oħra b’indikaturi għar-riċerka tal-potenzal tal-kanċeroġenu Jeżistu provi għar-riċerka tat-trasformazzjoni in vitro taċ-ċelluli tal-mamiferi li jkejlu il-kapaċità ta’ sustanza li tikkawza bidliet morfoliġiċi u komportamentali fil-kultura taċ-ċelluli. Huwa maħsub illi dan huwa relatat mat-trasformazzjoni malinja in vivo. Għat-trasformazzjoni jistgħu jintużaw numru ta’ tipi diversi ta’ ċelluli u jkunu segwiti kriterji diversi. Valutazzjoni tar-riskju ta’ l-effetti li jistgħu jintirtu fil-mammiferi Jezistu metodi sabiex jitkejjel fil-mammiferi l-effett li jista’ jintiret, ikkawżat minn mutazzjoni ġenetika (puntiformi), bħal prova tal-lokazzjoni speċifika fil-gurdien [1], jew sabiex ikunu stabbiliti l-aberrazzjonijiet kromosomiċi, bħala l-prova ta’ traslokazzjoni ereditarji tal-gurdien. Dawn il-metodi jistghu ikunu utilizzati meta jkun stmat ir-riskju ġenetiku possibbli tas-sustanza għall-bniedem. Madankollu, minħabba il-komplessità ta’ dawn il-provi u tan-numru kbir ta’ annimali neċessarji, b’mod partikolari għal dik il-prova tal-lokazzjoni speċifika, tinħtieġ ġustifikazzjoni tajba sabiex dawn il-provi jkunu esegwiti. EŻAMI TA’ TOSSIĊITA ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA 1. METODU 1.1 Introduzzjoni Ara Introduzzjoni Ġenerali Parti B 1.2 Definizzjonijiet Ara Introduzzjoni Ġenerali Parti B 1.3 Sustanzi Riferiti L-ebda 1.4 Prinċipji tal-metodu ta’ l-istudju Is-sustanza sperimentali għanda tkun somministrata kuljum, b’mod orali, f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali tal-laboratorju, doża waħda għal kull grupp għall-perjodu ta’ 90 ġurnata. Matul il-perjodu ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu osservati sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu matul l-istudju huma sottoposti għall-nekroskopija, u l-konklużjoni ta’ l-eżami ta’ dawk l-annimali li jsalvaw huma sottoposti għall-nekroskopija. 1.5 Kriterji kwalitativi L-ebda 1.6 Deskrizzjoni tal-metodu ta’ l-eżami Preparazzjoni L-annimali huma miżmuma f’kondizzjonijiet sperimentali ta’ akkomodazzjoni u nutrizzjoni għal mill-inqas hamest ijiem qabel ma jsir l-esperiment. Qabel ma jsir l-esperiment, l-annimal żgħar u b’saħħithom huma mħawwdin b’mod każwali u assenjati għall-gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Is-sustanza in eżami tista’ tkun somministrata fid-dieta, permezz ta’ pompa, f’kapsuli jew ilma tax-xorb. L-annimali kollha għandhom jingħataw id-doża bl-istess metodu matul il-perjodu kollu ta’ l-esperiment. Jekk jintużaw mezzi jew adittivi oħra sabiex ikun faċilitat il-metodu ta’ kif tingħata d-doża, dawn m’għandhomx jipproduċu effetti tossiċi. Kondizzjonijiet sperimentali Annimali sperimentali Sakemm ma jirriżultawx kontra-indikazzjonijiet, l-ispeċji l-aktar preferit huwa l-far. Għandhom jintużaw razes li huma komunement utilizzati fil-laboratorju ta’ annimali żgħar u b’saħħithom u d-doża għanda tibda idejalment qabel ma’ l-firien ikunu laħqu l-età ta’ sitt ġimghat (f’kull każ, iżda, mhux aktar minn tmien ġimgħat). Fil-bidu ta’ l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandux jaqbeż +20% tal-valur medju. Fejn isir studju sub-kroniku orali bħala preliminari għall-istudju fit-tul, l-istess speċji u razez għandhom jintużaw fiż-żewġ studji. Numru u sess Mill-inqas 20 annimal (10 nisa u 10 rġiel) għandhom ikunu utilizzati f’kull livell tad-doża. In-nisa għandhom ikunu nullipari u mhux tqal. Jekk huwa previst is-sagrifiċċju fl-f’intervalli, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali li huwa previst li sejrin ikunu sagrifikati qabel ma jkun terminat l-istudju. Barra minn hekk, grupp satelliti ta’ 20 annimal (10 annimali ta’ kull sess) jista’ jkun ittrattat bl-għola livell tad-doża għal 90 ġurnata u osservat għar-reversibilità, persistenza, jew okkorrenza ritardjata ta’ effetti tossiċi għal 28 ġurnata wara t-trattament. Livelli ta’ doża Ghandhom jintużaw mill-inqas tlett livelli ta’ doża u kontroll wieħed. Bl-eċċezzjoni għat-trattament bis-sustanza sperimentata, l-annimali tal-grupp tal-kontroll għandhom ikunu ttrattati b’mod identiku għall-dawk tal-grupp sperimentat. Fejn huwa użat mezz sabiex id-dożaġġ ikun faċilitat, il-kontrolli għandhom ikunu somministrati bid-doża b’dak il-mezz fl-istess mod tal-gruppi li huma ttrattati; l-annimali tal-kontroll għandhom jirċievu l-istess kwantità ta’ dak il-mezz bħal dik riċevuta mill-grupp ttrattat bil-livell ta’ l-għola doża. Il-livell ta’ l-għola doża għandu jipprovoka effetti tossiċi iżda ma jikkawżax jew jikkawża ftit imwiet. Dak il-livell ta’ doża l-iktar baxx m’għandux jipproduċi prova ta’ tossiċità. Meta teżisti valutazzjoni utili għall-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan il-valur. Idejalment, il-livell ta’ doża intermedju għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi u li jistghu jkunu osservati. Jekk tkun użata iktar minn doża intermedja, il-livelli ta’ doża għandhom ikunu maqsuma f’intervalli sabiex jipproduċu gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi ttrattati bil-livelli ta’ doża baxx u intermedju u fil-kontrolli, l-inċidenza ta’ konsegwenzi fatali għandha tkun baxxa sabiex tippermetti valutazzjoni sinifikattiva tar-riżultati. Meta s-sustanza sperimentata tkun somministrata fid-dieta, jistgħu ikunu utilizzati kemm konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm jew mg/kg ta’ ikel) jew livell ta’ doża kostanti skond il-piż tal-ġisem ta’ l-annimali; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Għal dik is-sustanza li tingħata permezz ta’ pompa, id-doża għandha tingħata kuljum u fl-istess ħin. Il-livelli ta’ doża għandhom ikunu adattati b’intervalli (kull ġimgħa jew kull ġimgħatejn) sabiex jinżamm il-livell ta’ doża kostanti skond il-piż tal-ġisem ta’ l-annimal. Studju limitat Jekk studju ta’ 90 ġurnata magħmul skond il-metodu mniżżel hawn taħt, f’livell ta’ doża ta’ 1000mg/kilogramma ta’ piż tal-ġisem/ġurnata, jew livell għoli ta’ doża relatat għall-espożizzjoni umana, (fejn din tkun osservata) ma tipproduċiex provi ta’ effetti tossiċi, provi oħra jistgħu jkunu kkunsidrati li mhumiex neċessarji. Għal dawk is-sustanzi ta’ tossiċità baxxa huwa importanti li jkun assikurat illi meta jkunu somministrati fid-dieta, il-kwantitajiet u l-proprjetajiet oħra tas-sustanza sperimentata nvoluti ma jintervjenux fil-bżonijiet nutrizzjonali normali. Perjodu ta’ osservazzjoni L-annimali kollha għandhom ikunu osservati kuljum u rreġistrati sinjali ta’ tossiċità inkluż il-ħin meta nbdiet, il-grad u d-dewmien. Il-ħin tal-mewt u l-ħin meta dehru u sparixxew sinjali ta’ tossiċità għandu jkun rreġistrat. Proċedura L-annimali ghandhom ikunu ttrattati bis-sustanza sperimentata idejalment sebat ijiem kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 ġurnata. L-annimali li jappartjenu għal grupp satellita previst għall-osservazzjonijiet li sejrin jitkomplew għandhom jinżammu għal perjodu ta’ 28 ġurnata mingħajr trattament sabiex ikun skopert il-fejqan jew il-persistenza ta’ l-effetti tossiċi. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu il-bidliet fil-ġilda u fil-pil, l-għajnejn u l-mukuż kif ukoll is-sistema nervuża u awtonomika, dik respiratorja u ċirkulatorja, l-attività somatomorja u dik komportamentali. Għandu jitkejjel il-konsum ta’ l-ikel (u l-konsum ta’ l-ilma meta s-sustanza sperimentata tingħata fl-ilma tax-xorb) u l-piż ta’ l-annimali kull ġimgħa. Osservazzjoni regolari ta’ l-annimali hija meħtieġa sabiex ikun evitat kemm jista’ jkun telf ta’ annimali mill-esperiment minħabba kawżi bħall-kannibaliżmu, l-awtolisi ta’ tessuti jew it-tqegħid ta’ xi ħaġa mhux f’postha. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ sperimentazzjoni dawk l-annimali li jibqgħu ħajja jkunu sottoposti għall-awtopsja. L-annimali mejta għandhom jitneħħew u jkunu sottoposti għall-awtopsja. L-eżamijiet is-segwenti iseħħu abitwalment ghall-annimali kollha inklużi l- kontrolli: (a) l-eżami oftalmoskopiku, li jsir permezz ta’ oftalmoskopju jew apparat adattat u li huwa l-istess, għandu jsir qabel ma tkun mogħtija s-sustanza sperimentata u fl-aħħar ta l-istudju, preferibbiliment fuq kull annimal iżda għall-inqas fuq dawk illi jkunu mogħtija dożaġġ għoli u dawk fil-gruppi ta’ kontroll. Jekk jinstabu tibdiliet fl-għajnejn, kull annimal għandu jkun eżaminat. (b) fl-aħħar tal-perjodu ta’ sperimentazzjoni, għandhom isiru s-segwenti analiżi:L-ematoloġija inkluż l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, l-għadd ta’ eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewokoċite, u l-miżura tal-potenzal ta’ demm magħqud bħaż-żmien li jieħu sabiex jagħqad, iż-żmien ta’ protrombina, iż-żmien tat-tromboplastina jew l-għadd ta’ pjastrina. (c) id-determinazzjoni tal-bijokimika klinika fuq id-demm għandha ssir fl-aħħar tal-perjodu ta’ sperimentazzjoni. Oqsma ta’ eżami li huma meqjusa xierqa għall-istudji kollha hima: il-bilanċ ta’ l-elettroliti, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. L-għazla ta’ eżamijiet speċifiċi jkun determinat mill-osservazzjonijiet fuq il-mod ta’azzjoni tas-sustanza. Huma suġġeriti s-segwenti kalkoli: kalċju, fosfru, klorur, sodju, potassju, glukosju sawmi (bil-perjodu ta’ sawm adattat għall-ispeċje), is-serum glutamiku piruviku transaminasi [2], is-serum glutamiku ossaliku transaminasi [3], ornitina dekarbossilasi, gamma glutamika transpeptidas, ażotu urejku, albumina, kreatinina tad-demm, bilirubina totali u kejl tal-proteini totali tas-serum. Determinazzjonijiet oħra li jistghu jkunu meħtieġa ghall-valutazzjoni tossikoloġika jinkludu l-analiżi tal-lipidi, ta’ l-ormoni, ekwilibriju ta’ l-aċtu/bażi, attività metaemoglobina u kolinesterasi. Determinazzjonijiet bijokimiċi supplimentari jistgħu jkunu użati, jekk huwa l-każ, sabiex ir-riċerka dwar l-effetti osservati tkun estiża. (d) l-analiżi ta’ l-awrina mhijiex rikjesta skond ir-rutina izda meta l-indikazzjoni tkun bbażata fuq it-tossiċità prevista jew osservata biss. Jekk id-data storika tal-linja bażi mhijiex suffiċjenti, qabel ma tingħata d-doża għandu jittieħed kont tad-determinazzjoni tal-parametri bijokimiċi. Nekroskopija makroskopika L-annimali kollha għandhom ikunu sottoposti għal nekroskopija makroskopika sħiħa li tinkludi l-eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ l-orifiċi kollha, tal-kavitajiet kranjali, tat-toraċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, il-glandoli adrenali u t-testikoli għandhom jintiżnu meta jkunu għadhom imxarrba u malajr kemm jista’ jkun wara li jkunu analizzati qabel ma jinxfu. L-organi u t-tessuti s-segwenti għandhom ikunu miżmuma tajjeb f’mezzi adattati għall-eżami istopatoloġiku li jista’ jsir fil-futur: kull leżjoni makroskopika, il-moħħ – inkluż partijiet tal-mudullun/pont, il-kortiċi taċ-ċervellet u l-kortiċi ċerebrali, il-glandoli pitwitarji, it-tirojde/il-paratirojde, kwalunkwe tessuti timiku, it-trakea u l-pulmun, il-qalb, l-aorta, (glandoli tar-rieq), il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonad, l-utru (organi ġenetali aċċessorji), (il-ġilda), l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, id-diġunu, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, il-musrana d-dritta, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il –glandola limfatika rapprezentattiva, (il-glandola mammarja femminili), (il-muskulatura tal-koxxa), in-nerv periferali, l-isternu bil-mudullun ta’ l-għadam, (l-għajnejn), (il-femur, inkluż is-superfiċje artikolari), (ix-xewka tad-dahar fuq tlett livelli – ċervikali, toraċi-medju, u l-ġenbejn) u (l-glandoli esorbitali tad-dmugħ). It-tessuti li jidhru fil-parentesi għandhom ikunu eżaminati biss jekk jidhru xi sintomi ta’ tossiċita jew indikazzjoni li huma l-organu mmirat involut). Eżami istopatoloġiku (a) L-eżami istopatoloġiku sħiħ għandu jsir fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi ttrattati b’livell għoli ta’dożaġġ u dawk fil-grupp tal-kontroll; (b) Il-leżjonijiet makroskopiċi kollha għandhom ikunu eżaminati; (c) L-eżami ta’ l-organi mmirati f’gruppi oħra ttrattati b’doża oħra; (d) Il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi ttrattati bid-dożaġġ ta’ livell baxx jew intermedju għandhom ikunu sottoposti għall-eżami istopatoloġiku sabiex tkun individwata xi infezzjoni, peress illi din ta’ l-aħħar tipprovdi valutazzjoni approprjata ta’ l-istat tas-saħħa ta’ l-annimal. Għandha tingħata attenzjoni partikolari lill-eżami istopatoloġiku tal-fwied u tal-kliewi f’dawn il-gruppi. Jista’ jagħti l-każ illi l-eżami istopatoloġiku utlerjuri ma jsirx ta’ sikwit fuq l-annimali f’dawn il-gruppi iżda għandu dejjem isir fl-organi li jippreżentaw provi ta’ leżjonijiet, fil-grupp trattat bl-għola livell ta’doża; (e) meta huwa utilizzat grupp satellita, ghandu jsir l-eżami istopatoloġiku ta’ t-tessuti u ta’ l-organi li jippreżentaw leżjonijiet fil-gruppi ttrattati. 2. DATA Id-data ghandha tkun imqassra f’forma ta’ tabella fejn ikun indikat għal kull grupp in-numru ta’ annimali fil-bidu tal-prova, in-numru ta’ annimali li juru leżjonijiet u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru kull tip ta’ leżjoni. Ir-riżultati għandhom ikunu evalwati bil-metodu ta’ l-istatistika approprjata. Kwalunkwe metodu ta’ statistka rikonoxxuta jista’ jkun użat. 3. IR-RAPPORT 3.1 Ir-rapport ta’ l-istudju Ir-rapport dwar il-prova għandu jkollu l-informazzjoni s-segwenti: - speċji, razez, sors, kondizzjonijiet ambjentali, dieta, - kondizzjonijiet sperimentali, - il-livelli tad-doża (inkluż il-mezzi użati, jekk huwa użat) u l- konċentrazzjonijiet, - livell mingħajr effett meta huwa possibbli, - data dwar ir-risposti tossiċi skond is-sess u d-doża, - il-ħin tal-mewt matul l-esperiment jew jekk l-annimali baqgħux ħajjin sa l-aħħar, - deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi jew effetti oħra, - il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anomalu jew ġrajjiet suċċessivi; - data dwar l-ikel u l-piż tal-ġisem, - riżultati oftalmoloġiċi, - analiżi ematoloġika użata u r-riżultati kollha, - analiżi tal-bijokimika klinikali użata u r-riżultati kollha (inkluż ir-riżultat ta’ kull analiżi ta’ l-awrina), - necropsy findings, - deskrizzjoni dettaljata dwar ir-riżultati, - l-elaborazzjoni statistka tar-riżultati, fejn huwa possibbli, - diskussjoni tar-riżultati, - interpretazzjoni tar-riżultati. 3.2 Valutazzjoni u nterpretazzjoni Ara Introduzzjoni Ġenerali, Parti B 4. REFERENZI Ara Introduzzjoni Ġenerali, Parti B EŻAMI TA’ TOSSIĊITA ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊJI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA 1. METODU 1.1 Introduzzjoni Ara Introduzzjoni Ġenerali Parti B 1.2 Definizzjonijiet Ara Introduzzjoni Ġenerali Parti B 1.3 Sustanzi Riferiti L-ebda 1.4 Prinċipji tal-metodu ta’ l-eżami Is-sustanza sperimentata għanda tkun somministrata kuljum, b’mod orali, f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali tal-laboratorju (li mhumiex annimali gerriema), doża waħda għal kull grupp għall-perjodu ta’ 90 ġurnata. Matul il-perjodu ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu osservati sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu matul l-eżami huma sottoposti għall-nekroskopija, fl-aħħar ta’ l-istudju dawk l-annimali li jsalvaw huma wkoll sottoposti għall-nekroskopija. 1.5 Kriterji kwalitativi L-ebda 1.6 Deskrizzjoni tal-metodu ta’ l-eżami Preparazzjoni L-annimali huma miżmuma f’kondizzjonijiet sperimentali ta’ akkomodazzjoni u nutrizzjoni għal mill-inqas ħamest ijiem qabel ma jsir l-esperiment. Qabel ma jsir l-esperiment, l-annimal żghar u b’saħħithom huma mħawwdin b’mod każwali u assenjati fill-gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Is-sustanza sperimentata tista’ tkun somministrata fid-dieta jew permezz ta’ kapsuli li tista’ tkun iktar komda. Mezzi oħra ta’ somministrazzjoni orali jistgħu jintużaw. L-annimali kollha għandhom jingħataw id-doża bl-istess metodu matul il-perjodu kollu ta’ l-esperiment. Jekk jintużaw mezzi jew adittivi oħra sabiex ikun faċilitat il-metodu ta’ kif tingħata d-doża, dawn m’għandhomx jipproduċu effetti tossiċi. Tista’ tintuża data storika skond il-ħtieġa. Kondizzjonijiet sperimentali Annimali sperimentali L-ispeċji ta’ l-annimali li mhumiex gerriema l-aktar utilizzat huwa l-kelb. Speċji oħra ta’ annimali li mhumiex gerriema jistgħu ikunu utilizzati. Għandhom jintużaw annimali żgħar u b’saħħithom, u fil-każ tal-kelb, id-dożaġġ għandu jibda idejalment mill-età ta’ erba’ sa sitt xhur u mhux aktar tard minn disa’ xhur. Meta jsir studju sub-kroniku orali bħala studju preliminari għal dak l-istudju li jsir fit-tul, l-istess specji/nisel għandu jintuża fiż-żewġ studji. Numru u sess Mill-inqas tmien annimali (erba’ nisa u erba’ rġiel) għandhom ikunu użati għal kull livell ta’ doża. Fl-aħħar ta’ l-istudju in-numru ta’ l-annimali għandu jiggarantixxi valutazzjoni sinifikattiva ta’ l-effetti tossiċi. Livelli ta’ doża Iridu jintużaw mill-inqas tlett livelli ta’ doża u kontroll wieħed. Bl-eċċezzjoni għat-trattament bis-sustanza sperimentata, l-annimali tal-grupp tal-kontroll għandhom ikunu ttrattati b’mod identiku għall-dawk tal-grupp sperimentat. Il-livell ta’ l-għola doża għandu jipprovoka effetti tossiċi izda ma jikkawżax jew jikkawża ftit imwiet. Dak il-livell ta’ doża l-iktar baxx m’għandux jipproduċi prova ta’ tossiċità. Meta teżisti valutazzjoni utili għall-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan il-valur. Idejalment, il-livell ta’ doża intermedju għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi u li jistgħu jkunu osservati. Jekk tkun użata iktar minn doża intermedja, il-livelli ta’ doża għandhom ikunu maqsuma f’intervalli sabiex jipproduċu gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi trattati bil-livelli ta’ doża baxxi u intermedjarji u fil-kontrolli, m’għandux ikun hemm każijiet ta’ mwiet. Meta s-sustanza sperimentata tkun somministrata fid-dieta, jistgħu ikunu utilizzati kemm konċentrazzjoni djetetika kostanti (ppm jew mg/kg ta’ ikel) jew livell ta’ doża kostanti skond il-piż tal-ġisem ta’ l-annimali; l-alternattiva użata għandha tkun speċifikata. Meta d-doza tinghata direttament, per ezempju permezz ta’ kapsuli, id-doża għandha tingħata kuljum u fl-istess ħin, u adattata skond il-kaz b’intervalli ta’ ġimgha sabiex jinżamm il-livell ta’ doża kostanti skond il-piż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn qiegħed isir studju sub-kroniku bħala studju preliminari għall-istudju li jsir fit-tul ta’ żmien, fiż-żewġ studji għandha tkun użata l-istess dieta. Studju limitat Jekk studju ta’ 90 ġurnata magħmul skond il-metodu mniżżel hawn taħt, f’livell ta’ doża ta; 1000mg/kilogramma ta’ piż tal-ġisem/ġurnata, jew livell għoli ta’ doża relatat għall-espożizzjoni umana, (fejn din tkun osservata) ma tipproduċiex provi ta’ effetti tossiċi, provi oħra jistgħu jkunu kkunsidrati li mhumiex neċessarji. Għal dawk is-sustanzi ta’ tossiċità baxxa huwa importanti li jkun assikurat illi meta jkunu somministrati fid-dieta, il-kwantitajiet u l-proprjetajiet oħra tas-sustanza sperimentata nvoluti ma jintervjenux fil-bżonnijiet nutrizzjonali normali. Perjodu ta’ osservazzjoni L-annimali kollha għandhom ikunu osservati kuljum u rreġistrati sinjali ta’ tossiċità inkluż il-ħin meta nbdiet, il-grad u d-dewmien. Il-ħin tal-mewt u l-ħin meta dehru u sparixxew sinjali ta’ tossiċità għandu jkun rreġistrat. Proċedura L-annimali ghandhom ikunu ttratati bis-sustanza sperimentata idejalment sebat ijiem kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 ġurnata. Izda, fuq il-bażi prinċipali tal-kunsiderazzjonijiet prattiċi, meta s-sustanza tingħata b’mod differenti minn dik li tingħata fid-dieta, id-dożaġġ bbażat fuq ħamest ijiem fil-ġimgħa huwa kkunsidrat aċċettabbli. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu, iżda ma jkunux limitati, għall-bidliet fil-ġilda u fil-pil, l-għajnejn u l-mukuż kif ukoll is-sistema nervuża u awtonomika, dik respiratorja u ċirkulatorja, l-attività somatomorja u dik komportamentali. Għandu jitkejjel il-konsum ta’ l-ikel (u l-konsum ta’ l-ilma meta s-sustanza sperimentata tingħata fl-ilma tax-xorb) u l-piż ta’ l-annimali kull ġimgħa. Għandu jsir eżami kliniku bir-reqqa ta’ l-annimali kull ġurnata skond miżuri xierqa sabiex ikun imnaqqas it-telf ta’ l-annimali ta’ l-istudju. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ espożizzjoni dawk l-annimali li jibqgħu ħajja jkunu sottoposti għall-awtopsja. L-annimali mejta għandhom jitneħħew u jkunu sottoposti għall-awtopsja. L-eżamijiet is-segwenti iseħħu abitwalment ghall-annimali kollha inklużi l-kontrolli: (a) l-eżami oftalmoskopiku, li jsir permezz ta’ oftalmoskopju jew apparat adattat u li huwa l-istess, għandu jsir qabel ma tkun mogħtija s-sustanza sperimentata u fl-aħħar ta l-istudju, preferibbiliment fuq kull annimal iżda għall-inqas fuq dawk illi jkunu mogħtija dożaġġ għoli u dawk fil-gruppi ta’ kontroll. Jekk jinstabu tibdiliet fl-għajnejn, kull annimal għandu jkun eżaminat. (b) fil-bidu ta’ l-istudju, u f’intervalli ta’ xahar jew fin-nofs tal-perjodu ta’ l-istudju u, fl-aħħar ta’ l-istudju, għandhom isiru s-segwenti analiżi: l-ematoloġija inkluż l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, l-għadd ta’ eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewokoċite, u l-miżura tal-potenzal ta’ demm magħqud bħaż-żmien li jieħu sabiex jagħqad, iż-żmien ta’ protrombina, iż-żmien tat-tromboplastina jew l-għadd ta’ pjastrina. (c) id-determinazzjoni tal-bijokimika klinika fuq id-demm għandha ssir fil-bidu ta’ l-istudju, u f’intervalli ta’ xahar jew fin-nofs tal-perjodu ta’ l-istudju u fl-aħħar ta’ l-istudju. Oqsma ta’ eżami li huma meqjusa xierqa għall-istudji kollha huma: il-bilanċ ta’ l-elettroliti, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. L-għażla ta’ l-eżamijiet speċifiċi jkun determinat mill-osservazzjonijiet fuq il-mod ta’azzjoni tas-sustanza. Huma suġġeriti s-segwenti kalkoli: kalċju, fosfru, klorur, sodju, potassju, glukosju swami (bil-perjodu ta’ sawm adattat għall-ispeċje), is-serum glutamiku piruviku transaminasi [4], is-serum glutamiku ossaliku transaminasi [5], ornitina dekarbossilasi, gamma glutamika transpeptidas, ażotu urejku, albumina, kreatina, it-total tal-qjies tal-proteini tal-bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikoloġika jinkludu analiżi tal-lipidi, ormoni, bilanċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina u kolìnestera. Bijokimika klinika addizzjonali tista’ tkun użata fejn neċessarju biex tiġi estiża linvestigazzjoni ta’ l-effetti osservati. Mammali mhux gerriema għadhom jiġu msawmin għal perijodu (mhux iktar minn 24 siegħa) qabel jittieħdulhom il-kampjuni tad-demm. (d) Analiżi kimika ta’ l-awrina m’hijiex meħtieġa fuq bażi ta’ rutina iżda hija biss meħtieġa meta hemm indikazzjoni bbażata fuq tossiċità mistennija jew osservata. Nekroskopija totali L-annimali kollha għandhom ikunu soġġetti għal nekroskopija totali u sħiħa li tinkludi eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ kull fetħa tal-ġisem, u tal-ħofor kranjali, toraċiċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-paratirojde), u t-testikoli għandhom ikunu peżati friski malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat li jixxottaw. L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati għal xi eżamijiet istopatoloġiċi futuri possibbli: il-ħsarat kbar fil-ġisem, il-moħħ – inklużi sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l-utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il-ġilda), il-bużżieqa tal-marrara, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappreżentattiva, (il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in-nerv periferali, (l-għajnejn), l-isternu bl-għadam tal-mudullun, (il-wirk, inkluża s-superfiċje artikulari), u (n-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli - ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn). It-tessuti msemmijin fil-parentesi għandhom jiġu eżaminati biss jekk jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossiċità, jew permezz ta’ involviment ta’ l-organu li huwa t-targit. Eżami istopatoloġiku Istopatoloġija sħiħa għandha tkun magħmula fuq l-organu u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal-kontroll u fil-gruppi tad-doża qawwija. Istopatoloġija oħra fil-gruppi ta’ dożi oħrajn għandha tiġi magħmula fuq organi u tessuti tagħhom li fil-gruppi tad-doża l-qawwija juru l-ħsara, jew fuq dawk li l-osservazzjonijiet tal-klinika li jindikaw dak il-bżonn. 2. DATA Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża. 3. RAPPORTAR 3.1. Rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli: - in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kondizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta, - il-kondizzjonijiet tat-test, - il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet, - data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża, - il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli, - il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem, - deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn (b’attenzjoni partikolari għal skoperti tal-klinika), - il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti, - data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem, - skoperti oftalmoloġiċi, - testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha, - testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina), - skoperti tan-nekroskopija, - dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha, - trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa xieraq, - diskussjoni tar-riżultati, - interpretazzjoni tar-riżultati. 3.2. Valutazzjoni u interpretazzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA STUDJU DERMALI TAD-DOŻA RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA 1. METODU 1.1. Introduzzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.2. Definizzjonijiet Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.3. Sustanzi ta’ referenza Xejn 1.4. Prinċipju tal-metodu tat-test Is-sustanza tat-test hija applikata ta’ kuljum fuq il-ġilda f’dożi ggradati fuq għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, doża waħda għal kull grupp għal perijodu ta’ 90 ġurnata. Matul dan il-perijodu t’applikazzjoni l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu waqt it-test issirilhom nekroskopija, u fit-tmiem tat-test l-annimali li jissopravivu ssirilhom nekroskopija. 1.5. Kriterji tal-kwalità Xejn. 1.6. Deskrizzjoni tal-metodu tat-test Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmumin taħt kondizzjonijiet ta’ sistemazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u gruppi tal-kontroll. Ftit qabel it-testijiet il-fur huwa imqasqas miż-żona dorsali tat-tronk ta’ l-annimali tat-test. Taqxir jista’ jiġi użat iżda jista’ biss jiġi magħmul bejn wieħed u ieħor 24 siegħa qabel it-test. Tqasqis jew taqxir ripetut huwa s-soltu meħtieġ bejn wieħed u ieħor f’intervalli ta’ ġimgħa. Meta jitqasqas jew jitqaxxar il-fur wieħed irid joqgħod attent li jevita li jobrox il-ġilda. Mhux inqas minn 10% tal-piż ta’ l-erja tas-superfiċje tal-ġisem għandha tkun imnaddfa għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-piż ta’ l-annimal irid jittieħed in konsiderazzjoni meta jkun irid jiġi deċiż liema żona trid tkun imnaddfa u d-dimensjonijiet tal-kisi. Meta jiġu ttestjati s-solidi, li jistgħu jiġu magħmula fi trab jekk dan ikun xieraq, is-sustanza tat-test trid tkun imrattba bl-ilma jew, fejn meħtieġ, b’sustanza oħra xierqa biex tiżgura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Sustanzi likwidi tat-test huma ġeneralment użati mhux iddilwiti. Applikazzjoni ta’ kuljum fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jew ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa hija użata. Kondizzjonijiet tat-test Annimali esperimentali Il-far adult, il-fenek jew il-fenek ta’ l-Indi jista’ jkun użat. Speċi oħrajn jistgħu ikunu użati iżda l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifkazzjoni. Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-piżijiet għandha tkun ± 20% tal-piż intermedju. Fejn ikun amministrat test sub-kroniku dermali bħala minn studju preliminarju sa studju għal tul ta’ żmien, l-istess speċi u razza għandha tintuża fiż-żewġ studji. Numru u sess Mill-inqas 20 annimal (10 ta’ sess femminili u 10 ta’ sess maskili) b’ġilda f’saħħitha għandhom ikunu użati f’kull livell tad-doża. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu annimali li qatt ma welldu jew li m’humiex inċinta. Jekk hu ppjanat li xi annimali se jkunu ssagrifikati fl-intervall in-numru tagħhom għandu jkun miżjud skond in-numru t’annimali skedat biex jiġi ssagrifikat qabel it-terminu ta’ l-istudju. B’addizzjoni ma’ dan, grupp subordinat ta’ 20 annimal (10 annimali għal kull sess) jistgħu jkunu ttrattati b’doża ta’ livell qawwi għal 90 ġurnata u osservati għal riversibilità, persistenza jew okkorrenza ttardjata ta’ effetti tossiċi għal 28 ġurnata wara t-trattament. Livelli tad-doża Mill-inqas tliet livelli tad-doża huma meħtieġa b’kontroll jew b’sustanza ta’ kontroll jekk xi sustanza bħal din hija użata. Il-perijodu t’esposizzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ sitt siegħat kuljum. L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tkun magħmula f’ħinijiet simili kuljum, u l-ammont tas-sustanza applikata għandu jiġi aġġustat f’intervalli (ta’ kull ġimgħa jew ta’ kull ġimgħatejn) sabiex il-livell tad-doża, f’termini ta’ piż tal-ġisem ta’ l-annimali, jinżamm kostanti. Għajr għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jiġu ttrattati b’manjiera identika ta’ dawk is-soġġetti tal-grupp tat-test. Fejn sustanza tkun użata sabiex jiġi ffaċilitat id-dożaġġ, il-grupp tal-kontroll għandu jkun mogħti doża bħal dik tal-gruppi ttrattati, u jirċievi l-istess ammont bħal dak li jkun riċevut mill-grupp ta’ l-iktar livell qawwi ta’ doża. L-iktar livell qawwi ta’ doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi iżda ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, fatalitajiet. L-inqas livell ta’ doża m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Fejn hemm estimazzjoni użabbli ta’ esposizzjoni umana l-inqas livell ta’ doża jrid jaqbeż lil din l-estimazzjoni. Idealment, il-livell ta’ doża intermedju għandu jipproduċi effetti tossiċi osservabbli minimi. Jekk iktar minn doża waħda intermedja hija użata, il-livelli tad-doża għandhom ikunu spazjati sabiex tiġi prodotta gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi u intermedji, u fil-gruppi tal-kontroll, l-inċidenza tal-fatalitajiet għandha tkun baxxa, biex tippermetti valutazzjoni sinjifiknti tar-riżultati. Jekk l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test tipproduċi irritazzjoni severa tal-ġilda il-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu mnaqqsin u dan jista’ jirriżulta fi tnaqqis jew f’assenza ta’ effetti tossiċi oħrajn fil-livell qawwi tad-doża. Jekk lill-ġilda saritilha ħsara jista’ jkun neċessarju li l-istudju jiġi terminat u jsir studju ieħor b’konċentrazzjonijiet iktar baxxi. Test ta’ limitu Jekk studju preliminarju b’livell ta’ doża ta’ 1000 mg/kilogramma, jew doża ogħla, relatata ma’ esposizzjoni umana possibbli, fejn hija magħrufa, ma jipproduċix l-ebda effetti tossiċi, testijiet iktar minn hekk jistgħu ma jkunux konsiderati neċessarji. Perijodu t’osservazzjoni L-annimali esperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità. Il-ħin tal-mewt u l-ħin li fih jidhru s-sinjali tat-tossiċità għandhom ikunu miżmumin. Proċedura L-annimali għandhom jiġu magħluqin ġo gaġġa individwalment. L-annimali għandhom jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test, idealment fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa, għal perijodu ta’ 90 ġurnata. L-annimali fi gruppi subordinati skedati għal osservazzjonijiet ta’ wara għandhom jiġu miżmuma għal 28 ġurnata iktar mingħajr trattament sabiex jiġi osservat l-irkupru mill-jew il-persistenza ta’ l-effetti tossiċi. Il-ħin ta’ l-esposizzjoni għandu jkun ta’ sitt siegħat kuljum. Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata uniformement fuq żona li hija bejn wieħed u ieħor 10% tas-superfiċje totali tal-ġisem. Fejn is-sustanzi huma tossiċi ħafna, l-erja tas-superfiċje miksija tista’ tkun inqas iżda l-istess ammont ta’ l-erja għandu jiġi miksi b’rita rqieqa u uniformi daqs kemm hu possibbli. Matul l-esposizzjoni is-sustanza tat-test hija miżmuma f’kuntatt mal-ġilda permezz garża poruża u b’tejp li ma jirritax. Is-sît tat-test għandu jkun miksi iktar minn hekk b’mod xieraq biex iżomm il-garża u s-sustanza tat-test u jiżgura li l-annimali ma jkunux jistgħu jibilgħu is-sustanza tat-test. Rażżâna jistgħu jiġu użati sabiex jipprevejenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test iżda l-immobilizzazzjoni kompleta tas-sustanza tat-test m’huwiex metodu rakkomandat. Fit-terminu tal-perijodu ta’ l-esposizzjoni, xi sustanza residwa tat-test għandha tiġi mneħħija fejn huwa prattiku permezz ta’ l-ilma jew b’metodu ieħor xieraq li jnaddaf il-ġilda. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati ta’ kuljum u sinjali ta’ tossiċità għandhom ikunu miżmuma, inkluż il-ħin ta’ l-ewwel attakk tagħhom, il-grad tagħhom u d-dewmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u fil-fur, fl-għajnejn u fil-membrani mukużi, kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkulatorji, awtonomiċi u nervużi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ komportament. Qjisien tal-konsum ta’ l-ikel għandhom jittieħdu ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma neċessarju sabiex l-annimali ma jiġux mitlufin mill-istudju minħabba kawżi bħal kannibaliżmu, awtolisi tat-tessuti jew minħabba li jiġu mqiegħdin f’post ieħor. Fit-terminu tal-perijodu ta’ l-istudju s-sopravissuti fil-gruppi tat-trattament mhux subordinati issirilhom nekroskopija. Annimali moribondi għandhom jiġu mneħħija u għandha ssirilhom nekroskopija meta jkun avżat. Dawn l-eżamijiet huma s-soltu magħmulin fuq l-annimali kollha inklużi dawk tal-kontroll: (a) Eżami oftalmoloġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tagħmir addattat ekwivalenti, għandu jiġi magħmul qabel l-esposizzjoni għas-sustanza tat-test u fit-terminu ta’ l-istudju, preferibbilment fuq kull animal iżda mill-inqas fuq l-annimali tad-doża qawwija u fuq dawk tal-kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn huma skoperti l-annimali kollha għandhom jiġu eżaminati. (b) Ematoloġija, inklużi l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, il-kwantità ta’ l-eritroċit, it-total u d-differenzali tal-kwantità ta’ l-eritroċit, u l-qjies tal-potenzal tat-tagħqid tad-demm, bħall-ħin tat-tagħqid, il-ħin tal-protrombin, il-ħin tat-tromboplastin, jew il-kwantità tad-diski ż-żgħar fid-demm, għandhom ikunu nvestigati fit-terminu tal-perijodu tat-test. (c) Determinazzjoni tal-bijokimika tal-klinika fuq id-demm għandha tkun magħmula fit-terminu tal-perijodu tat-test. Iż-żoni tat-test li huma konsiderati xierqa għall-istudji kollha huma l-bilanċ elettrolit, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. Is-selezzjoni ta’ testijiet speċifiċi jiġu nfluwenzati b’osservazzhonijiet fuq il-mod t’azzjoni tas-sustanza. Determinazzjonijiet suġġeriti huma l-kalċju, l-fosfru, l-kloru, s-sodju, l-potassju, il-glukosju tas-sawm (b’perijodu ta’ sawm addattat għall-ispeċi), transaminat tas-serkum glutamiku pirviku [6], transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [7], dekarbonat ta’ l-ornitin, transpeptidu tal-gamma glutamiku, nitroġenu ta’ l-urea, albumina, kreatina tad-demm, u t-total tal-qjies tal-proteini tal-bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikoloġika jinkludu analiżi tal-lipidi, ormoni, bilanċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina u kolìnestera. Bijokimika tal-klinika addizzjonali tista’ tkun użata fejn ikun neċessarju sabiex tiġi estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati. (d) Analiżi kimika ta’ l-awrina m’hijiex meħtieġa fuq bażi ta’ rutina iżda hija biss meħtieġa meta hemm indikazzjoni bbażata fuq tossiċità mistennija jew osservata. Jekk id-data storika tal-linja bażi m’hijiex adegwata, għandha tingħata konsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-parametri tal-bijokimika ematoloġika u klinika qabel ma jibda d-dożaġġ. Nekroskopija totali L-annimali kollha għandhom ikunu soġġetti għal nekroskopija totali u sħiħa li tinkludi eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ kull fetħa tal-ġisem, u tal-ħofor kranjali, toraċiċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-paratirojde), u t-testikoli għandhom ikunu peżati friski malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat li jixxottaw. L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati għal xi eżamijiet istopatoloġiċi futuri possibbli: il-ħsarat kbar fil-ġisem, il-moħħ – inklużi sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l-utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il-ġilda), il-bużżieqa tal-marrara, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappreżentattiva, (il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in-nerv periferali, (l-għajnejn), l-isternu bl-għadam tal-mudullun, (il-wirk, inkluża s-superfiċje artikulari), u (n-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli - ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn). It-tessuti msemmijin fil-parentesi għandhom jiġu eżaminati biss jekk jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossiċità, jew permezz ta’ involviment ta’ l-organu li huwa t-targit. Eżami istopatoloġiku (a) Istopatoloġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq ġilda normali u ttrattata u fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal-kontroll u tad-doża qawwija. (b) Kull ħsara serja għandha tiġi eżaminata. (c) Organi tat-targit fi gruppi ta’ doża oħrajn għandhom jiġu eżaminati. (d) Fejn il-firien huma użati, il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi ta’ doża baxxa u imtermedja għandhom jiġu soġġetti għal eżami istopatoloġiku għal evidenza ta’ infezzjoni, billi dan jipprovdi valutazzjoni konvenjenti ta’ l-istat ta’ saħħa ta’ l-annimali. Eżami istopatoloġiku iktar fil-fond jista’ ma jkunx meħtieġ bħala rutina fuq l-annimali f’dawn il-gruppi, iżda għandu dejjem isir fl-organi li juru evidenza ta’ ħsara fil-gruppi ta’ doża qawwija. (e) Meta grupp subordinat huwa użat, l-istopatoloġija għandha tkun magħmula fuq it-tessuti u fuq l-organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati. 2. DATA Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża. 3. RAPPORTAR 3.1. Rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli: - in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kondizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta, - il-kondizzjonijiet tat-test, - il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet, - data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża, - il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli, - il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem, - deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn (b’attenzjoni partikolari għal skoperti tal-klinika), - il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti, - data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem, - skoperti oftalmoloġiċi, - testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha, - testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina), - skoperti tan-nekroskopija, - dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha, - trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa xieraq, - diskussjoni tar-riżultati, - interpretazzjoni tar-riżultati. 3.2. Valutazzjoni u interpretazzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN SUB-KRONIKU STUDJU TAD-DOŻA TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA 1. METODU 1.1. Introduzzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.2. Definizzjonijiet Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.3. Sustanzi ta’ referenza Xejn 1.4. Prinċipju tal-metodu tat-test Għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali huma esposti ta’ kuljum għal perijodu definit għas-sustanza tat-test f’konċentrazzjonijiet gradati, b’konċentrazzjoni waħda użata għal kull grupp, għal perijodu ta’ 90 ġurnata. Fejn hemm sustanza użata biex tgħin il-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonijiet xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera, grupp ta’ kontroll ta’ din is-sustanza għandu jiġi użat. Matul dan il-perijodu t’applikazzjoni l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu waqt it-test issirilhom nekroskopija, u fit-tmiem tat-test l-annimali li jissopravivu ssirilhom nekroskopija. 1.5. Kriterji tal-kwalità Xejn. 1.6. Deskrizzjoni tal-metodu tat-test Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmumin taħt kondizzjonijiet ta’ sistemazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u gruppi tal-kontroll. Fejn ikun neċessarju, sustanza xierqa tista’ tiġi miżjuda mas-sustanza tat-test biex tgħin il-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonijiet xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk din is-sustanza jew addittivi oħrajn huma użati sAbiex jiffaċilitaw id-dożaġġ, dawn iridu jkunu magħrufa bħala li ma jipproduċux effett tossiku. Data storika tista’ tkun użata fejn huwa xieraq. Kondizzjonijiet tat-test Annimali esperimentali Għajr fejn ikun hemm kontra-indikazzjonijiet, il-far huwa l-ispeċ i preferuta. Razez t’annimali żgħar b’saħħithom komunement użati għal-laboratorju għandhom jiġu użati. Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-piżijiet għandha tkun ta’ ± 20% tal-piż intermedju. Fejn ikun amministrat test sub-kroniku tal-ġbid fil-pulmun bħala minn studju preliminarju sa studju għal tul ta’ żmien, l-istess speċi u razza għandha tintuża fiż-żewġ studji. Numru u sess Mill-inqas 20 annimal (10 ta’ sess femminili u 10 ta’ sess maskili) b’ġilda f’saħħitha għandhom ikunu użati f’kull livell tad-doża. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu annimali li qatt ma welldu jew li m’humiex inċinta. Jekk hu ppjanat li xi annimali se jkunu ssagrifikati fl-intervall in-numru tagħhom għandu jkun miżjud skond in-numru t’annimali skedat sabiex jiġi ssagrifikat qabel it-terminu ta’ l-istudju. B’addizzjoni ma’ dan, grupp subordinat ta’ 20 annimal (10 annimali għal kull sess) jistgħu jkunu ttrattati b’doża ta’ livell qawwi għal 90 ġurnata u osservati għal riversibilità, persistenza jew okkorrenza ttardjata ta’ effetti tossiċi għal 28 ġurnata wara t-trattament. Konċentrazzjonijiet ta’ l-esposizzjoni Mill-inqas tliet konċentrazzjonijiet huma meħtieġa, b’kontroll jew sustanza ta’ kontroll (li tikkorrispondi mal-konċentrazzjoni tas-sustanza fl-ogħla livell tagħha) jekk sustanza bħal din hija użata. Għajr għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jiġu ttrattati b’manjiera identika ta’ dawk is-soġġetti tal-grupp tat-test. L-iktar konċentrazzjoni qawwija għandha tirriżulta f’effetti tossiċi iżda ma tipproduċi l-ebda, jew ftit, fatalitajiet. Fejn jemm estimazzjoni użabbli ta’ esposizzjoni umana l-inqas livell ta’ jrid jaqbżu. Idealment, il-konċentrazzjoni intermedja għandha tipproduċi effetti tossiċi osservabbli minimi. Jekk iktar minn konċentrazzjoni waħda intermedja hija użata, il-konċentrazzjonijiet għandhom ikunu spazjati sabiex tiġi prodotta gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi u intermedji, u fil-gruppi tal-kontroll, l-inċidenza tal-fatalitajiet għandha tkun baxxa, biex tippermetti valutazzjoni sinjifikanti tar-riżultati. Ħin ta’ l-esposizzjoni Id-dewmien ta’ l-esposizzjoni ta’ kuljum għandha tkun ta’ sitt siegħat wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kompartiment. Dewmien ieħor jista’ jiġi użat sabiex jilħaq ħtiġijiet speċifiċi. Tagħmir L-annimali għandhom jiġu ttestjati f’tagħmir ta’ ġbid fil-pulmun magħmul biex iżomm fluss ta’ arja dinamiku ta’ mill-inqas 12 –il tibdila ta’ l-arja għal kull siegħa sabiex jiġi żgurat kontenut t’ossiġenu adegwat u atmosfera ta’ l-esposizzjoni distribwita fl-istess kwalità. Meta kompartiment jiġi użat, irid ikun disinjat b’mod li jnaqqas l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jżid l-esposizzjoni tagħhom sal-massimu għall-ġbid tas-sustanza tat-test fil-pulmun. Kompartimenti individwali għal esposizzjoni oro-nażali, għal esposizzjoni tar-ras biss, jew għal esposizzjoni tal-ġisem kollu jistgħu jiġu użati; l-ewwel tnejn inaqsu l-ammont li jinġibed permezz ta’ rotot oħrajn. Perijodu t’osservazzjoni L-annimali esperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità. Il-ħin tal-mewt u l-ħin li fih jidhru s-sinjali tat-tossiċità għandhom ikunu miżmumin. Proċedura L-annimali huma esposti għas-sustanza tat-test ta’ kuljum, minn ħames sa’ sebat ijiem fil-ġimgħa, għal perijodu ta’ 90 ġurnata. Annimali f’xi gruppi subordinati skedati għall-osservazzjonijiet ta’ wara għandhom jinżammu għal 28 ġurnata oħra mingħajr trattament sabiex jiġi skopert l-irkupru minn jew il-persistenza ta’ l-effetti tossiċi. It-temperatura li fiha t-test huwa magħmul għandha tkun miżmuma għal 22 ± 3 °C. Idealment, l-umdità relattiva għandha tkun miżmuma bejn it-30% u s-70%, iżda f’ċerti sitwazzjonijiet (pereżempju t-test ta’ l-ajrusol) dan jista’ ma jkunx prattiku. Ikel u xorb għandu jinżamm milli jingħata waqt l-esposizzjoni. Sistema dinamika ta’ ġbid fil-pulmun b’sistema xierqa ta’ konċentrazzjoni analitika għandha tiġi użata. Sabiex jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet xierqa ta’ l-esposizzjoni, test ta’ prova huwa rakkomandat. Il-fluss ta’ l-arja għandu jkun aġġustat biex jiżgura li l-kondizzjonijiet matul il-kompartiment ta’ l-esposizzjoni huwa omoġenu. Is-sistema għandha tiżgura li kondizzjonijiet t’esposizzjoni stabbli huma milħuqa malajr kemm jista’ jkun. Għandhom jiġu magħmulin qjisien jew osservar: (a) tar-rata tal-fluss ta’ l-arja (kontinwament); (b) tal-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejjla fiż-żona tan-nifs. Matul il-perijodu ta’ l-esposizzjoni ta’ kuljum il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 15% tal-valur intermedju. Iżda fil-każ tat-trabijiet u ta’ l-ajrusol, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax jiġi miksub u marġini usa’ jiġu aċċettabbli. Matul id-dewmien totali ta’ l-istudju, il-konċentrazzjonijiet minn jum għall-ieħor għandhom jinżammu kostanti daqs kemm huwa prattiku. Matul l-iżvilupp tas-sistema li tiġġenera, analiżi tad-daqs tal-partikoli għandha tkun magħmula biex jiġu stabbiliti l-konċetrazzjonijiet ta’ l-ajrusol. Matul l-esposizzjoni, analiżi għandha tiġi magħmula kemm ikun neċessarju sabiex tiġi determinata l-konsistenza tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli; (c) it-temperatura u l-umdità (d) matul u wara l-esposizzzjoni, osservazzjonijiet għandhom isiru u jiġu mniżżlin sistematikament; informazzjoni individwali għandha tinżamm għal kull annimal. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati ta’ kuljum u sinjali ta’ tossiċità għandhom ikunu miżmuma, inkluż il-ħin ta’ l-ewwel attakk, il-grad tagħhom u d-dewmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u fil-fur, fl-għajnejn u fil-membrani mukużi, kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkulatorji, awtonomiċi u nervużi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ komportament. Qjisien tal-konsum ta’ l-ikel għandhom jittieħdu ta’ kull ġimgħa. osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali hwa neċessarju sabiex l-annimali ma jiġux mitlufin mill-istudju minħabba kawżi bħal kannibaliżmu, awtolisi tat-tessuti jew minħabba li jiġu mqegħdin f’post ieħor. Fit-terminu tal-perijodu ta’ l-istudju s-sopravissuti fil-gruppi tat-trattament mhux subordinati ssirilhom nekroskopija. Annimali moribondi għandhom jiġu mneħħija u għandha ssirilhom nekroskopija meta jkun avżat. Dawn l-eżamijiet huma s-soltu magħmulin fuq l-annimali kollha inklużi dawk tal-kontroll: (a) Eżami oftalmoloġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tagħmir addattat ekwivalenti, għandu jiġi magħmul qabel l-esposizzjoni għas-sustanza tat-test u fit-terminu ta’ l-istudju, preferibbilment fuq kull animal iżda mill-inqas fuq l-annimali tad-doża qawwija u fuq dawk tal-kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn huma skoperti l-annimali kollha għandhom jiġu eżaminati. (b) Ematoloġija, inklużi l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, il-kwantità ta’ l-eritroċit, it-total u d-differenzali tal-kwantità ta’ l-eritroċit, u l-qjies tal-potenzal tat-tagħqid tad-demm, bħall-ħin tat-tagħqid, il-ħin tal-protrombin, il-ħin tat-tromboplastin, jew il-kwantità tad-diski ż-żgħar fid-demm, għandhom ikunu nvestigati fit-terminu tal-perijodu tat-test. (c) Determinazzjoni tal-bijokimika klinika fuq id-demm għandha tkun magħmula fit-terminu tal-perijodu tat-test. Iż-żoni tat-test li huma konsiderati xierqa għall-istudji kollha huma l-bilanċ elettrolit, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. Is-selezzjoni ta’ testijiet speċifiċi jiġu nfluwenzati b’osservazzhonijiet fuq il-mod t’azzjoni tas-sustanza. Determinazzjonijiet suġġeriti huma l-kalċju, l-fosfru, l-kloru, s-sodj, l-potassju, il-glukosju tas-sawm (b’perijodu ta’ sawm addattat għall-ispeċi), transaminat tas-serkum glutamiku pirviku [8], transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [9], dekarbonat ta’ l-ornitin, transpeptidu tal-gamma glutamiku, nitroġenu ta’ l-urea, albumina, kreatina tad-demm, u t-total tal-qjies tal-proteini tal-bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikoloġika jinkludu analiżi tal-lipidi, ormoni, bilanċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina u kolìnestera. Bijokimika klinika addizzjonali tista’ tkun użata fejn neċessarju biex tiġi estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati. (d) Analiżi kimika ta’ l-awrina m’hijiex meħtieġa fuq bażi ta’ rutina iżda hija biss meħtieġa meta hemm indikazzjoni bbażata fuq tossiċità mistennija jew osservata. Jekk id-data storika tal-linja bażi m’hijiex adegwata, għandha tingħata konsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-parametri tal-bijokimika ematoloġika u klinika qabel ma jibda d-dożaġġ. Nekroskopija totali L-annimali kollha għandhom ikunu soġġetti għal nekroskopija totali u sħiħa li tinkludi eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ kull fetħa tal-ġisem, u tal-ħofor kranjali, toraċiċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-paratirojde), u t-testikoli għandhom ikunu peżati friski malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat li jixxottaw. L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati għal xi eżamijiet istopatoloġiċi futuri possibbli: il-ħsarat kbar fil-ġisem, il-moħħ – inklużi sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l-utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il-ġilda), il-bużżieqa tal-marrara, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappreżentattiva, (il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in-nerv periferali, (l-għajnejn), l-isternu bl-għadam tal-mudullun, (il-wirk, inkluża s-superfiċje artikulari), u (n-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli - ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn). It-tessuti msemmijin fil-parentesi għandhom jiġu eżaminati biss jekk jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossiċità, jew permezz ta’ involviment ta’ l-organu li huwa t-targit. Eżami istopatoloġiku (a) Istopatoloġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq ġilda normali u ttrattata u fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal-kontroll u tad-doża qawwija. (b) Kull ħsara serja għandha tiġi eżaminata. (c) Organi tat-targit fi gruppi ta’ doża oħrajn għandhom jiġu eżaminati. (d) Il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi tad-doża baxxi u imtermedji għandhom ukoll ikunu soġġetti għal eżami istopatoloġiku; billi dan jipprovdi valutazzjoni konvenjenti ta’ l-istat ta’ saħħa ta’ l-annimali. Eżami istopatoloġiku iktar fil-fond jita’ ma jkunx meħtieġ bħala rutina fuq l-annimali f’dawn il-gruppi, iżda għandu dejjem isir fl-organi li juru evidenza ta’ ħsara fil-gruppi ta’ doża qawwija. (e) Meta grupp subordinat huwa użat, l-istopatoloġija għandha tkun magħmula fuq it-tessuti u fuq l-organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati. 2. DATA Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża. 3. RAPPORTAR 3.1. Rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli: - in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kondizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta, - il-kondizzjonijiet tat-test: Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-esposizzjoni: inkluż id-disinn, tip, dimensjonijiet, minn fejn tidħol l-arja, is-sistema tal-ġenerazzjoni ta’ partikoli separati u ajrusol, il-metodu tal-kondizzjonar ta’ l-arja, it-trattament ta’ l-egżost ta’ l-arja u l-metodu ta’ l-akkomodazzjoni ta’ l-annimali f’kompartimenti tat-tesst meta dawn huma użati. It-tagħmir għat-tkejjil tat-temperatura, umdità u, fejn xieraq, ta’ l-istabilità tal-konċentrazzjonijiet ta’ l-ajrusol jew id-daqs tal-paartikuli, għandhom jiġu deskritti. Data ta’ l-esposizzjoni: din għandha tkun imqiegħda f’lista u ppreżentata b’valuri intermedji u b’miżura ta’ varjabilità (per eżempju d-devjazzjoni ta’ l-istandard) u għandha tinkludi: (a) rati tal-fluss ta’ l-arja mit-tagħmir tal-ġbid fin-nifs; (b) temperatura u umdità ta’ l-arja; (c) konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza tat-test imqiegħda fit-tagħmir tal-ġbid tan-nifs diviż bil-volum ta’ l-arja); (d) in-natura ta’ sustanza oħra, jekk użata; (e) konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tan-nifs ittestjata; (f) daqsijiet medjani tal-partikoli (fejn xierqa), - data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża, - il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli, - il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem, - deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn (b’attenzjoni partikolari għal skoperti tal-klinika), - il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti, - data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem, - skoperti oftalmoloġiċi, - testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha, - testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina), - skoperti tan-nekroskopija, - dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha, - trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa xieraq, - diskussjoni tar-riżultati, - interpretazzjoni tar-riżultati. 3.2. Valutazzjoni u interpretazzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. STUDJU TAT-TERATOĠENIĊITÀ – MAMMALI GERRIEMA U MAMMALI MHUX GERRIEMA 1. METODU 1.1. Introduzzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.2. Definizzjonijiet Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.3. Sustanzi ta’ referenza Xejn. 1.4. Prinċipju tal-metodu tat-test Is-sustanza tat-test hija amministrata f’dożi gradati, jew f’konċentrazzjonijiet, għal mill-inqas dik il-parti tal-gravidanza li tkopri l-perijodu ta’ l-organoġenesi, lil għadd ta’ gruppi ta’ annimali esperimentali inċinta, b’doża waħda użata għal kull grupp. Ftit qabel id-data tat-twelid mistennija, l-omm għandha tiġi ssagrifikata, l-utru tagħha jiġi mneħħi u l-kontenut tiegħu jiġi eżaminat. Dan il-metodu tat-test ikopri t-tossiċità ta’ l-embriju u t-tossiċità tal-fetu. 1.5. Kriterji ta’ kwalità Xejn. 1.6. Deskrizzjoni tal-metodu tat-test Preparazzjonijiet Annimali tas-sess femminil verġni żgħar u b’saħħithom ta’ età u daqs komparabbli huma akklamatizzati għall-kondizzjonijiet tal-laboratorju għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test u wara dawn huma mgħammrin m’annimali tas-sess maskili ta’ fertilità stabbilita. Annimali tas-sess femminil inseminati huma magħżulin u assenjati lill-gruppi tat-trattament. It-tgħammir jista’ jkun magħmul jew b’mod naturali jew b’inseminazzjoni artifiċjali. Is-sustanza tat-test hija amministrata ta’ kuljum lill-annimali tas-sess femminil minn wara l-implantazzjoni sa ma jasal il-perijodu ta’ l-organoġenesi. Ġurnata qabel it-terminu, il-feti huma mwelldin b’isterektomija u eżaminati għal anormalitajiet fil-vixxri jew fl-iskeletru, inklużi ttradjar fl-iżvilupp, ittradjar ta’ l-ossifikazzjoni u emorraġiji intestinali. Kondizzjonijiet tat-test Annimali esperimentali L-ispeċi komunement użati huma l-far, il-ġurdien, il-ħamster u l-fenek. L-ispeċi preferuti huma l-far u l-fenek. Razez komunement użati għal-laboratorju għandhom jiġu użati. Ir-razza m’għandux ikollha feċundità baxxa u għandhom ikunu karatterizzati għar-reazzjoni tagħhom għat-teratoġen. L-annimali għandhom jitqiegħdu f’gaġġa individwalment. Numru u sess Mill-inqas 20 far, ġurdien jew ħamster inċinta jew 12 –il fenek inċinta huma meħtieġa għal kull livell ta’ doża. l-objettiv huwa li jiżgura li huma prodotti numru ta’ frieħ suffiċjanti li jippermettu valutazzjoni għall-potenzal teratoġeniku tas-sustanza. Livelli tad-doża Mill-inqas tliet livelli tad-doża u livell ta’ kontrollgħandhom jiġu użati. Meta s-sustanza tat-test hija amministrata permezz ta’ sustanza oħra, grupp ta’ kontroll ta’ din is-sustanza l-oħra għandu wkoll jiġI użat. Jekk xi sustanza bħal din hija użata, il-propjetajiet tossiċi tagħha għandhom ikunu magħrufa; din is-sustanza m’għandhiex tkun teratoġenika jew li jkollha effetti fuq ir-riproduzzjoni. Għajr għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom ikunu ttrattati b’manjiera identika bħal dawk is-soġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ma jkunx hemm limitu minħabba n-natura fiżika/kimika tas-sustanza jew minħabba l-propjetajiet bijoloġiċi tagħha, l-ogħla l-livell tad-doża għandu idealment jinduċi tossiċità materna bħal telf ta’ piż, iżda mhux iktar minn 10% ta’ mewt materna. Il-livell baxx ta’ doża m’għandux jinduċi effetti osservabbli attribwibbli għas-sustanza tat-test. Id-dosa intermedja għandha tkun spazjata ġeometrikament bejn il-livell ta’doża għoli u l-livell ta’ doża baxx. Test tal-limitu Fil-każ ta’ sustanzi ta’ tossiċità baxxa, jekk livell ta’ doża ta’ mill-inqas 1000 mg/kilogramma ma jipproduċix evidenza ta’ tossiċità ta’ l-embriju jew ta’ teratoġeniċità, studji fl-livelli ta’ doża oħrajn jistgħu ma jkunux konsiderati neċessarji. Żmien ta’ l-esposizzjoni Il-ġurnata 0 fit-test hija dik il-ġurnata li fiha huma osservati xi massa vaġinali u/jew sperma (fejn possibbli). Il-perijodu tad-doża għandu jkopri l-perijod ta’ organoġenesi maġġura. Dan jista’ jiġi meħud bħala l-ġranet 6 sa 15 għal-far u l-ġurdien, 6 sa 14 għall-ħamster, jew 6 sa 18 għall-fenek. Jekk il-ġurnata 0 hija bbażata fuq osservazzjoni tat-tagħmir jew inseminazzjoni artifiċjali, iż-żmien li ssemma għandu jkun aġġustat billi tiġi miżjuda ġurnata. Jew, bħala alternattiva, il-perijodu tad-dożagg jista’ jiġi estiż għal bejn wieħed u ieħor ġurnata qabel id-data tat-twelid mistennija. Perijodu t’osservazzjoni Eżami kliniku bir-reqqa għandu jiġi magħmul mill-inqas darba kuljum. Osservazzjonijiet addizzjonali għandhom jiġu magħmula ta’ kuljum b’azzjonijiet xierqa meħuda sabiex inaqqsu t-telf ta’ l-annimali matul l-istudju. Proċedura Is-sustanza tat-test hija amministrata mill-ħalq. Is-sustanza tat-test għandha tiġi amministrata bejn wieħed u ieħor ta’ kuljum fl-istess ħin tal-ġurnata. L-annimali tat-test tas-sess femminil għandhom ikunu ttrattati bis-sustanza tat-test ta’ kuljum matul il-perijodu ta’ trattament. Id-doża tista’ tkun ibbażata fuq il-piż ta’ dawn l-annimali fil-bidu ta’ l-amministrazzjoni tas-sustanza, jew, bħala alternattiva, skond iż-żieda rapida fil-piż li sseħħ waqt il-gravidanza, l-annimali jistgħu jkunu peżati perijodikament u d-doża tiġi bbażata fuq l-iktar determinazzjoni ta’ piż riċenti. Sinjali ta’ tossiċità għandhom jiġu mniżżlin hekk kif kienu osservati, inkluż bil-ħin ta’ l-ewwel attakk, il-grad u d-dewmien. L-annimali tas-sess femminil li juru sinjali t’abort jew twelid prematur għandhom ikunu ssagrifikati u soġġetti għal eżami makroskopiku. Il-perijodu t’osservazzjoni ta’ wara t-trattament għandu jkompli sa bejn wieħed u ieħor ġurnata qabel it-terminu; l-objettiv huwa li jiġi kopert ħafna mill-perijodu ta’ gravidanza iżda għandha tiġi evitata l-interpretazzjoni tar-riżultati kkomplikata li tista’ sseħħ fejn ikun hemm twelid naturali. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu, iżda mhux limitati għal, tibdil fil-ġilda u fil-fur, fl-għajnejn u fil-membrani mukużi, kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċI u nervużi ċentrali, l-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ mġieba. Qjisien għandhom jittieħdu ta’ kull ġimgħa tal-konsum ta’ l-ikel. L-annimali għandhom jiġu peżati ta’ kull ġimgħa. Nekroskopija Fil-mewt matul, jew fit-terminazzjoni ta’ l-istudju l-omm għandha tiġi eżaminata makroskopikament għal xi anormalitajiet strutturali jew tibdil patoloġiku li setgħu influwenzaw il-gravidanza. Immedjatament wara l-mewt, l-utru għandu jiġi mheħħi u l-kontenut tiegħu għandu jiġi eżaminat għall-mewt ta’ l-embriju jew tal-fetu u għan-numru tal-feti ħajjin. Huwa s-soltu possibbli li l-ħin tal-mewt in utero jiġi esstimat meta dan ikun ġara. Fil-firien u fil-fniek in-numru tal-corpora lutea jista’ jiġi determinat. Is-sess tal-feti għandu jiġi determinat u dawn għandhom jiġu peżati individwalment, u l-piż huwa mniżżel, u l-piż intermedju tal-feti għandu jiġi derivat. Wara t-tneħħija tal-feti mill-utru, kull wieħed mill-feti għandu jiġi eżaminat esternament. Għall-firien, ġrieden u ħamsters, minn terz sa nofs kull boton għandu jiġi ppreparat u eżaminat għal anomaliji skeletali u l-parti li tibqa’ minn dak il-boton għandha tiġi ppreparata u eżaminata għal anomaliji fit-tessuti r-rotob permezz ta’ metodi xierqa. Għall-fniek, kull wieħed mill-feti għandu jiġi eżaminat permezz ta’ dissezzjoni bir-reqqa għal anormalitajiet fil-vixxri u wara għandu jiġi eżaminat għal anomaliji skeletali. 2. DATA Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kienu inċinta, in-numru u l-persentaġġI tal-feti ħajjin u tal-feti b’xi anormalitajiet fit-tessuti r-rotob jew b’xi anormalitajiet skeletali u r-relazzjonijiet tagħhom mal-boton speċifiku. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża. 3. RAPPORTAR 3.1. Rapport tat-test Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli: - in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kondizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta, - il-kondizzjonijiet tat-test, - il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet, - data tar-rispons tossiku, bid-doża, - il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli, - il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem, - deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn, - il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti, - data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem, - dewmien tal-gravidanza u d-data tal-boton (inkluża data storika), - data tal-fetu (ħaj/mejjet, sess, difetti fit-tessuti r-rotob u difetti skeletali), - tal-boton (ħajjin/mejtin, sess, difetti fit-tessuti r-rotob u difetti skeletali ta’ kull boton), - - trattament statistiku tar-riżultati, - diskussjoni tar-riżultati, - interpretazzjoni tar-riżultati. 3.2. Valutazzjoni u interpretazzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 4. REFERENZI Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ KRONIKA 1. METODU 1.1. Introduzzjoni Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.2. Definizzjonijiet Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B. 1.3. Sustanzi ta’ referenza Xejn 1.4. Prinċipju tal-metodu tat-test Is-sustanza tat-test hija amministrata normali, sebat ijiem fil-ġimgħa, permezz ta’ rotta xierqa, lil għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, doża waħda għal kull grupp, għal porzjon prinċipali tat-tul tal-ħajja tagħhom. Matul u wara l-esposizzjoni, l-annimali esperimentali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità. 1.5. Kriterji ta’ kwalità Xejn. 1.6. Deskrizzjoni tal-metodu tat-test Preparazzjonijiet L-annimali huma miżmuma taħt kondizzjonijiet t’ akkomodazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test, annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u lill-gruppi tal-kontroll. Kondizzjonijiet tat-test Annimali esperimentali L-ispeċI preferuta hija l-far. Jekk ikun hemm bażi ta’ riżultati ta’ studji magħmulin qabel, speċi oħrajn (mammali gerriema jew dawk mhux gerriema) jistgħu jiġu użati. Razez t’annimali żgħar u b’saħħithom komunement użati fil-laboratorju għandhom ikunu użati u d-dożaġġ għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara l-ftim. Fil-bidu ta’ l-istudju il-varjazzjoni tal-piż fl-annimali m’għandhiex taqbeż l-± 20% tal-valur intermedju. Fejn jiġi magħmul test sub-kroniku orali bħala minn studju preliminarju sa studju fit-tul, l-istess speċi/nisel u razza għandhom jiġu użati fiż-żewġ studji. Numru u sess Għall-mammali gerriema mill-inqas 40 annimal (20 tas-sess femminil u 20 tas-sess maskil) għandhom jiġu użati f’kull livell ta’ doża u fil-grup tal-kontroll konkorrenti. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu dawk li qatt ma welldu jew li ma jkunux inċinta. Jekk huma ppjanati sagrifiċċji fl-intervall, in-numru għandu jiżdied bin-numru t’annimali skedati sabiex jiġu ssagrifikati qabel ma jkun lest l-istudju. Għall-mammali mhux gerriema numru iżgħar t’annimali, iżda mill-inqas erba’ għal kull sess għal kull grupp, huwa aċċettabbli. Livelli tad-doża u frekwenza ta’ l-esposizzjoni Mill-inqas tliet livelli għandhom jiġu użati b’żieda mal-grupp tal-kontroll konkorrenti. L-ogħla livell tad-doża għandu jislet sinjali definittivi ta’ tossiċità li tikkawża l-mewt eċċessiva. Il-livell baxx tad-doża m’għandux jipproduċi evidenza ta’ tossiċità. Id-doża intermedja għandha tiġi stabbilita fil-marġini tan-nofs bejn id-dożi l-għoljin u d-dożi l-baxxi. Is-selezzjoni tal-livelli tad-doża għandha tieħu in konsiderazzjoni d-data minn testijiet u studji ta’ tossiċità preċedenti. Il-frekwenza ta’ l-esposizzjoni hija normalment ta’ kuljum. Jekk il-kimika hija amministrata fl-ilma tax-xorb jew imħallta fid-dieta din għandha tkun ipprovduta kontinwament. Kontrolli Grupp ta’ kontroll konkorrenti li huwa identiku f’kull aspett għall-gruppi ttrattati, għajr għall-esposizzjoni għas-sustanza tat-test, għandu jiġi użat. F’ċirkostanzi speċjali, bħal fi studji ta’ ġbid fin-nifs li jinvolvu l-ajrusol jew l-użu t’emulsjonant t’attività bijoloġika mhux karatterizzata fi studji orali, grupp ta’ kontroll negattiv konkorrenti għandu wkoll jiġi użat. Il-grupp ta’ kontroll negattiv huwa ttrattat fl-istess manjiera bħal dik tal-gruppi tat-test għajr li l-annimali mhumiex esposti għas-sustanza tat-test jew għal xi sustanza oħra. Rotta ta’ l-amministrazzjoni Iż-żewġ rotot t’amministrazzjoni ewlenin huma l-ħalq u n-nifs. L-għażla tar-rotta t’amministrazzjoni tiddependi mill-karatteristiċi fiżiċi u kimiċi tas-sustanza tat-test u mir-rotta lit kun t’esposizzjoni fl-umani. L-użu tar-rotta dermali tipperżenta problemi prattiċi konsiderevoli. Tossiċità sistemika kronika li tirriżulta mill-assorbiment minn ġol-ġilda tista’ tkun normalment dedotta mir-riżultati ta’ test orali ieħor u mit-tagħrif ta’ kemm ikun hemm assorbiment minn ġol-ġilda derivati minn testijiet għat-tossiċità ġol-ġilda preċedenti. Studji orali Meta s-sustanza tat-test hija assorbita mill-apparat gastrointestinali, u jekk ir-rotta ta’ l-inġestjoni hija waħda li biha l-umani jistgħu jiġu esposti, ir-rotta orali ta’ l-amministrazzjoni hija preferuta jekk m’hemmx kontra-indikazzjonijiet. :-annimali jistgħu jirċievu s-sustanza tat-test fid-dieta, imdewwba fl-ilma tax-xorb jew mogħtija permezz ta’ kapsula. Idealment id-dożaġġ ta’ kuljum fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa għandu jiġi użat minħabba li dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jista’ jippermetti rkupru jew irtirar tat-tossiċità fil-perijodu li ma tkunx qed tiġi amministrata d-doża u b’hekk jiġI affettwat ir-riżultat u il-valutazzjoni sussegwenti. iżda, dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa huwa kkunsidrat bħala aċċettabbli jekk wieħed jibbaża fuq konsiderazzjonijiet prattiċi. Studji ta’ ġbid fin-nifs Peress li l-istudji tal-ġbid fin-nifs jippreżentaw problemi tekniċi ta’ komplessità ikbar mir-rotot t’amministrazzjoni l-oħrajn, direzzjoni iktar dettaljata fuq dan il-mod t’amministrazzjoni hija mogħtija hawnhekk. Wieħed għandu wkoll jinnota li istillazzjoni intratrakeali tista’ tikkostitwixxi alternattiva valida f’sitwazzjonijiet speċifiċi. Esposizzjonijiet għal tul ta’ żmien huma s-soltu mmudellati fuq esposizzjonijiet umani pproġettati, u l-annimali jingħataw jew esposizzjoni ta’ kuljum ta’ sitt siegħat wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kompartimenti, għal ħamest ijiem fil-ġimgħa (esposizzjoni intermittenti), jew, relevanti għal esposizzjoni possibbli ta’ l-ambjent, 22 sa 24 siegħat t’esposizzjoni għal kull jum għal sebat ijiem fil-ġimgħa (esposizzjoni kontinwa), b’bejn wieħed u ieħor siegħa biex jingħata l-għalf lill-annimali kuljum f’ħin simili u manteniment tal-kompartiment. Fiż-żewġ każijiet, l-annimali huma s-soltu esposti għal konċentrazzjonijiet fissi tas-sustanza tat-test. Differenza prinċipali bejn l-esposizzjoni intermittenti u l-esposizzjoni kontinwa hija dik li f’ta’ l-ewwel hemm perijodu ta’ 17 sa 18 –il siegħa li fih l-annimali jistgħu jirkupraw mill-effetti ta’ l-esposizzjoni ta’ kuljum, b’perijodi iktar twal ta’ rkupru matul tmiem il-ġimgħa. L-għażla t’ esposizzjoni intermittenti jew kontinwa tiddependi fuq l-objettivi ta’ l-istudju u fuq l-esposizzjoni umana li tiġi simulata. Iżda, ċerti diffikultajiet tekniċi għandhom jiġu kkunsidrati. Per eżempju, il-vantaġġi t’esposizzjoni kontinwa għas-simulazzjoni ta’ kondizzjonijiet ambjentali tista’ tiġi bbilanċjata bin-neċessità għall-ilma u l-għalf waqt l-esposizzjoni, u bil-bżonn għal iktar ġenerazzjoni kkumplikata (iżda li tkun iktar ta’ min jafdaha) t’ajrusol u ta’ fwar u ta’ tekniċi ta’ sorveljar. Kompartimenti ta’ l-esposizzjoni L-annimali għandhom jiġu ttestjati f’kompartimenti għall-ġbid fin-nifs disinnati sabiex iżommu fluss dinamiku ta’ mill inqas 12 –il bidla fl-arja għal kull siegħa biex b’hekk jiġi żgurat kontenut adegwat t’ossiġenu u atmosfera t’esposizzjoni li tkun distribwita fl-istess ammont. Il-kompartimenti tal-kontroll u ta’ l-esposizzjoni għandhom ikunu identiċi fil-kostruzzjoni u disinnati biex jiżguraw kondizzjonijiet t’esposizzjoni komparabbli f’kull rispett għajr fl-esposizzjoni għas-sustanza tat-test. Presssjoni ftit negattiva ġewwa l-kompartiment hija ġeneralment miżmuma biex tipprevjeni telf tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. Il-kompartimenti għandhom inaqqsu l-iffullar ta’ l-annimali tat-test. Bħala regola ġenerali, sabiex tiġi żgurata l-istabilità ta’ l-atmosfera tal-kompartiment, il-volum totali ta’ l-annimali tat-test m’għandhiex taqbeż il-5% tal-volum tal-kompartiment. Għandhom jiġu magħmulin qjisien jew osservar: (i) tal-fluss ta’ l-arja: ir-rata tal-fluss ta’ l-arja mill-kompartiment għandha tkun preferibbilment sorveljata kontinwament. (ii) tal-konċentrazzjoni: Matul il-perijodu ta’ l-esposizzjoni ta’ kuljum il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 15% tal-valur intermedju. (iii) tat-temperatura u l-umdità: għall-mammali gerriema, it-temperatura għandha tinżamm fi 22 ± 2 °C, u l-umdità fil-kompartiment fi 30 sa 70%, għajr fejn l-ilma huwa użat fis-sustanza tat-test fl-atmosfera tal-kompartiment. Preferibbilment dawn it-tnejn għandhom jiġu ssorveljati kontinwament; (iv) tal-qjisien tad-daqs tal-partikoli: id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli għandha tiġi ddeterminata fl-atmosferi tal-kompartimenti li tinvolvi ajrusol likwidu jew solidu. Il-partikoli ta’ l-ajrusol għandhom ikunu ta’ daqs respirabbli għad-daqs ta’ l-annimali użati. Kampjuni ta’ l-atmosferi tal-kompaartimenti għandhom jiġu meħuda fiż-żona tan-nifs ta’ l-annimali. Il-kampjun ta’ l-aarja għandu jkun rappreżentattiv tad-distribuzzjoni taal-paartikuli li għalihom l-annimali huma esposti u għandhom jagħmlu tajjeb, fuq bażi gravimetrika, għall-ajrusol anke fejn ħafna mill-ajrusol ma kienx respirabbli. Analiżi tad-daqs tal-partikoli għandha tiġI magħmula frekwentement matul l-iżvilupp tas-sistema ġenerarja biex tiżgura l-istabilità ta’ l-ajrusol u minn hemm ‘il quddiem, daqs kemm ikun neċessarju matul l-esposizzjonijiet biex tiġI determinate adegwatament il-konsistenza tad-distribuzzjoni tal-partikoli li għalihom l-annimali kienu ġew esposti. Dewmien ta’ l-istudju Id-dewmien tal-perijodu ta’ l-amministrazzjoni għandu jkun mill-inqas 12 –il xahar. Proċedura Osservazzjonijiet Eżaminazzjoni tal-klinika bir-reqqa għandha tiġi magħmula mill-inqas darba kuljum. Osservazzjonijiet addizzjonali għandhom jiġu magħmulin ta’ kuljum b’azzjonijiet xierqa meħuda sabiex inaqqsu t-telf ta’ l-annimali mill-istudju, per eżempju, nekroskopija jew tkessiħ ta’ dawk l-annimali li nstabu mejtin u iżolazzjoni jew sagrifikazzjoni ta’ l-annimali debboli jew moribondi. Osservazzjonijiet bir-reqqa għandhom jiġu magħmulin sabiex jiġu osservati l-ewwel attakki ta’ l-effetti tat-tossiċità u l-progressjoni tagħhom kif ukoll sabiex jitnaqqaas it-telf minħabba mard, awtolożi jew kannibaliżmu. Sinjali kliniċi, inklużi tibdiliet newroloġiċi u okulari kif ukoll il-mewt, għandhom jiġu mniżżlin għal kull animal. Il-ħin ta’ l-ewwel attak u l-progressjoni tal-kondizzjonijiet tossiċi, inklużu tumuri suspettati, għandhom jiġu mniżżlin. Il-piż tal-ġisem għandu jiġi mniżżel individwalment għal kull animal darba f’ġimgħa matul l-ewwel 13 –il ġimgħa tal-perijodu tat-test u mill-inqas darba kull erba’ ġimgħat minn hemm ‘il quddiem. Il-konsum ta’ l-ikel għandu jiġI determina darba f’ġimgħa matul l-ewwel 13 –il ġimgħa ta’ l-istudju, u wara f’intervalli ta’ tliet xhur jekk l-istat ta’ saħħa jew it-tibdiliet fil-piż ma jiddettawx mod ieħor. Eżami ematoloġiku Eżami ematoloġiku (per eżempju l-kontenut ta’ l-emoglobina, il-volum taċ-ċelloli, it-total taċ-ċelloli ħomor tad-demm, it-total taċ-ċelloli bojod tad-demm, id-diski żgħar tad-demm u l-miżuri l-oħrajn tal-potenzal tat-tgħaqqid tad-demm) għandu jiġi magħmul f’intervalli ta’ tliet xhur, sitt xhur u minn hemm ‘il quddiem f’bejn wieħed u ieħor sitt xhur interval u fit-terminu fuq kampjuni tad-demm miġburin mill-mammali mhux gerriema u minn 10 firien/sess ta’ kull grupp. Jekk ikun possibbli, il-kapjuni għandhom ikunu mill-istess firien f’kull interval. B’addizzjoni ma’ dan, kampjun ta’ qabel it-test għandu jiġi meħud mill-mammali mhux gerriema. Jekk l-osservazzjonijiet kliniċI juru deterjorament fis-saħħa ta’ l-annimali matul l-istudju, kwantità differenzali ta’ demm hija magħmula għall-gruppi iktar baxxi li jkun imiss biss jekk hemm diskrepanza kbira bejn l-ogħla grupp u l-gruppi tal-kontroll, jew jekk dan hwa ndikat bi skoperti patoloġiċi. Analiżi kimika ta’ l-awrina Kampjuni ta’ l-awrina minn kull mammalu mhux gerriemi u minn 10 firien/sess mill-gruppi kollha, jekk possibbli minn dawk l-istess firien fl-istess interval bħal fl-eżami ematoloġiku, għandhom jiġu miġbura għall-analiżi. dawn id-determinazzjonijiet li ġejjin għandhom jiġu magħmula jew minn annimali individwali jew fuq kampjun ta’ mammali gerriema ta’ l-istess sess u grupp: - apparenza: volum u densità għall-annimali individwali, - proteini, glukosju, ketoni, demm (semi-kwantitattivi), - mikroskopija tas-sediment (semi-kwantitattiva) Kimika tal-klinika F’intervalli ta’ bejn wieħed u ieħor sitt xhur u fit-terminu, kampjuni tad-demm huma meħuda għall-qjisien tal-kimika tal-klinika minn kull mammalu mhux gerriem u minn 10 firien/sess minn kull grupp, jekk possibbli, mill-istess firien f’kull interval. B’addizzjoni ma’ dan, kampjun ta’ qabel it-test għandu jiġi miġbur mill-mammali mhux gerriema. Il-plażma hija ppreparata minn dawn il-kampjuni u d-determinazzjonijiet li ġejjin għandhom jiġu magħmulin: - it-total tal-konċentrazzjoni tal-proteini, - il-konċentrazzjoni ta’ l-albumina, - testijiet tal-funzjoni tal-fwied (bħal l-attività tal-fosfat ta’ l-alkalina, l-attività tat-transaminat piruviku glutamiku [10] u l-attività tat-transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [11]), transpeptidu tal-gamma glutamiku, dekarbonat ta’ l-ornitin, - metaboliżmu tal-karboidrat bħal dak tal-glukosju tas-sawm, - testijiet tal-funzjoni tal-kliewi bħad-demm tan-nitroġenu ta’ l-urea. Nekroskopija totali Nekroskopija totali u sħiħa għandha tiġi magħmula fuq l-annimali kollha, inklużi fuq dawk li mietu matul l-esperiment jew dawk li ġew maqtula meta ġew misjuba f’kondizzjoni moribonda. Qabel is-sagrifikazzjoni, kampjuni tad-demm għandhom jiġu miġbura mill-annimali kollha, għall-kwantitajiet differenzali tad-demm. Il-ħsarat kollha visibbli, it-tumuri jew il-ħsarat suspettati li jkunu tumuri għandhom jiġu ppreservati. Wieħed għandu jipprova jirrelata l-osservazzjonijiet ma’ l-iskoperti mikroskopiċi. L-organi u t-tessuti kollha għandhom jiġu ppreservati għal eżami istopatoloġiku. Dan is-soltu jikkonċerna l-organi u t-tessuti li ġejjin: il-moħħ [12] (sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali), it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde (inkluż tal-paratirojde), it-tessut tat-timu, il-pulmuni (inkluża t-trakea), il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied [13], il-milsa, il-kliewi [14], l-adrenali [15], l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-frixa, il-gonadi [16], l-utru, l-organi ġenitali aċċessorji, il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil, il-ġilda, il-muskolatura, in-nerv periferali, in-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli - ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn, l-isternu bl-għadam tal-mudullun u l-għajnejn. In-nefħa tal-pulmuni u tal-bużżieqa ta’ l-awrina b’fissattiv huwa l-mezz ottimali li jippreserva dawn it-tessuti; in-nefħa tal-pulmuni fi studji tal-ġbid fin-nifs hija essenzali għal eżami istopatoloġiku xieraq. Fi studji speċjali bħal dawk tal-ġbid fin-nifs, l-apparat respiratorju kollu għandu jiġI studjat, inkluż l-imnieħer, il-farinġI u l-larinġi. Jekk eżamijiet kliniċi oħrajn huma magħmula, l-informazzjoni ottenuta minn dawn il-proċeduri għandha tkun għad-disposizzjoni qabel l-eżami mikroskopiku, minħabba li din tista’ tagħti direzzjoni sinjifikanti lill-patoloġista. Istopatoloġija It-tibdiliet kollha visibbli, partikolarment it-tumuri u ħsarat oħrajn li jseħħu fi kwalunkwe organu għandhom jiġu eżaminati mikroskopikament. B’żieda ma’ dan,