ANNESS I

Metodi ta’ ttestjar għad-detezzjoni u għall-identifikazzjoni tal-pest speċifikat imsemmi fl-Artikolu 3(2)

1. Ittestjar permezz tal-ispori

Għad-detezzjoni u għall-identifikazzjoni, jintużaw l-isporanġi tas-sajf u l-ispori mistrieħa, li jinkisbu mill-ħamrija wara t-tgħarbil, jew direttament mill-materjal tal-pjanti.

2. Metodi għad-detezzjoni

Għall-estrazzjoni tal-ispori tal-pest speċifikat mill-ħamrija, għandu jintuża wieħed mill-metodi li ġejjin:

(a) il-metodu ta’ tgħarbil tal-ħamrija, kif deskritt minn Pratt (1976) (1);

(b) il-metodu ta’ tgħarbil tal-ħamrija, kif deskritt minn van Leeuwen et al. (2005) (2);

(c) it-teknika ta’ ċentrifugazzjoni taż-żona għall-ipproċessar ta’ kampjuni bi throughput kbir, kif deskritt minn Wander et al. (2007) (3).

3. Metodi għall-identifikazzjoni

Wara l-estrazzjoni, l-ispori tal-pest speċifikat għandhom jiġu identifikati b’wieħed mill-metodi li ġejjin:

(a) identifikazzjoni morfoloġika taħt mikroskopju tad-dawl b’ingrandiment ta’ 100x sa 400x;

(b) PCR konvenzjonali bl-użu ta’ primers ibbażati fuq Lévesque et al. (2001) (4) u fuq van den Boogert et al. (2005) (5);

(c) PCR f’ħin reali bl-użu ta’ primers u sondi skont van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

(d) PCR f’ħin reali bl-użu ta’ primers u sondi skont Smith et al. (2014) (7).

4. Vijabbiltà tal-ispori mistrieħa

Id-determinazzjoni tal-vijabbiltà tal-ispori mistrieħa tista’ tinkiseb permezz ta’ eżaminazzjoni mikroskopika jew test bijoloġiku. Il-vijabbiltà tal-isporanġi tista’ tiġi ddeterminata permezz ta’ eżaminazzjoni mikroskopika tal-isporanġi mmuntati fil-laktofenol jew fl-ilma (Przetakiewicz 2015) (8). L-isporanġi b’kontenut granulari jew bi protoplasma kemxejn ittundjati jistgħu jitqiesu vijabbli. Dawk li jkunu plażmolizzati b’mod permanenti jew mingħajr ebda kontenut apparenti għandhom jitqiesu mejtin.

Bħala alternattiva, jew f’każ ta’ dubju, jista’ jsir test bijoloġiku, kif deskritt fil-punt 3 tal-Anness IV.

5. Determinazzjoni tal-patotipi

Id-determinazzjoni tal-patotipi tkun teħtieġ felul ġodda.

L-inokulu għat-test għandu jiġi prodott b’wieħed mill-metodi li ġejjin:

(a) il-metodu tal-SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture - Xjenza u Pariri għall-Agrikoltura Skoċċiża), li jikkonsisti miż-żewġ passi li ġejjin: (i) il-produzzjoni ta’ inokulu It-tessut il-qadim (kannella) tal-felul għandu jitkisser f’biċċiet żgħar u jitnixxef bl-arja f’temperatura ambjentali sakemm jibbies. It-tessut iebes għandu jintaħan manwalment jew mekkanikament. Il-materjal mitħun għandu jintgħarbel niexef, filwaqt li tinġabar il-frazzjoni minn 25 sa 75 μm, u mbagħad għandu jiġi estratt bl-użu tal-metodu tal-kloroform ta’ Pratt (1976)1; (ii) il-produzzjoni ta’ felul frisk Madwar 10 mg ta’ spori estratti mistrieħa għandhom jitferrxu fuq il-wiċċ ta’ 10 ml ilma sterili distillat f’Petri dish żgħir tal-plastik u għandhom jiġu inkubati fid-dlam f’temperatura ta’ 20 °C sal-ġerminazzjoni. It-tuberi tal-patata b’nebbieta żgħira b’tul ta’ madwar 1 sa 2 mm għandhom jitqiegħdu f’kaxxi tal-plastik trasparenti, miksija b’karta tixju niedja bin-nebbieta mmarkati jħarsu ’l fuq. In-nebbieta għandhom jiddawru b’ċirku ta’ Vaselina mdewba bl-użu ta’ siringa. Iċ-ċirku ma għandux jinkiser u għandu jkun għoli biżżejjed li jżomm is-sospensjoni tal-ispori mingħajr ma tnixxi. L-10 ml ta’ spori mistrieħa ġerminanti għandhom jerġgħu jiġu dilwiti sa 20 ml b’ilma sterili u jitqiegħdu fiċ-ċrieki bl-użu ta’ pipetta jew flixkun li jingħafas sakemm in-nebbieta tkun kompletament mgħaddsa fis-sospensjoni tal-ispori. Il-kaxxi tal-plastik għandhom jitgħattew bl-għotjien u jiġu inkubati għal 4 ijiem f’temperatura ta’ 10 °C, u wara dan, il-kaxxi għandhom jinfetħu, l-inokulu u ċ-ċrieki tal-Vaselina għandhom jitneħħew u l-kaxxi għandhom jiġu ttrasferiti f’serra mbexxa ħafif b’temperatura ta’ 15 sa 18 °C (mdawwla għal 16-il siegħa);

(b) il-metodu ta’ Spiekermann u Kothoff (1924) (9);

(c) il-metodu ta’ Potoček et al. (1991) (10);

(d) il-metodu ta’ Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11), Lemmerzahl 1930 (12), Noble u Glynne 1970 (13);

Għad-determinazzjoni tal-patotipi kollha magħrufa li huma rilevanti għall-Unjoni (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) u 38(Nevşehir), għandu jintuża test tal-infezzjoni differenzjali b’diversi varjetajiet tal-pjanta speċifikata kif indikat fit-tabella. It-test tal-infezzjoni għandu jitwettaq skont il-protokoll imsemmi fil-punt (d) (il-metodu ta’ Glynne-Lemmerzahl).

Sensittività selettiva tal-kultivari tal-patata għad-determinazzjoni tal-patotipi ta’ S. endobioticum

Kultivar Patotipi ta’ S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R “S”: Suxxettibbli “R”: Reżistenti *: jindika suxxettibbiltà dgħajfa tal-varjetà għal S. endobioticum (“preżenza ta’ żoni bis-sori mhux nekrotiċi mingħajr il-formazzjoni ta’ felul”).

(1) Pratt MA. 1976. Teknika ta’ tgħarbil bl-użu tal-ilma u ta’ flotazzjoni għad-detezzjoni ta’ sporanġi mistrieħa ta’ Synchytrium endobioticum fil-ħamrija. Annals of Applied Biology 82: 21 sa 29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 sa 31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 sa 174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200 sa 201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 sa 57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 sa 133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 sa 432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilbersky) Percival From Poland. American Journal of Potato Research 92: 704 sa 708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 sa 115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 sa 205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 sa 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. Metodu ssimplifikat ġdid għall-inokulazzjoni tal-kultivari tal-patata sabiex tiġi ttestjata r-reżistenza kontra l-felul. Züchter 2: 288 sa 297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 sa 135.