jiżdiedu l-Annessi li ġejjin:

“

Appendiċi

METODU GĦAD-DETEZZJONI TAL-ĦALIB U TAL-KASEINAT TAL-BAQAR FIL-ĠOBON MAGĦMUL MILL-ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, MILL-ĦALIB TAL-MOGĦOŻ JEW MILL-ĦALIB TAL-BUFLU JEW MINN TAĦLITA TA' ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, TA' ĦALIB TAL-MOGĦOŻ U TA' ĦALIB TAL-BUFLU

1. SKOP

Id-detezzjoni tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar fil-ġobon magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini γ wara l-plażminoliżi.

2. KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Il-metodu huwa adattat għad-detezzjoni sensittiva u speċifika tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar, ittrattati bis-sħana jew le, f'ġobon frisk u mmaturat magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu. Huwa mhuwiex adattat għad-detezzjoni tal-adulterazzjoni tal-ħalib u tal-ġobon permezz tal-konċentrati tal-proteini tax-xorrox tal-ħalib tal-baqar ittrattati bis-sħana.

3. PRINĊIPJU TAL-METODU

3.1. L-iżolament tal-kaseini mill-ġobon u l-istandards ta' referenza

3.2. It-taħlil tal-kaseini iżolati u s-sottomissjoni għall-qsim permezz tal-plażmina (EC.3.4.21.7)

3.3. Iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina fil-preżenza tal-urea u t-tilwin tal-proteini

3.4. L-evalwazzjoni tal-profili tal-kaseini γ2 u γ3 imlewna (prova tal-preżenza tal-ħalib tal-baqar) billi l-profil miksub mill-kampjun jitqabbel ma' dawk miksubin fl-istess ġell mill-istandards ta' referenza li jkun fihom 0 % u 1 % ħalib tal-baqar.

4. REAĠENTI

Sakemm ma jkunx indikat mod ieħor, għandhom jintużaw biss sustanzi kimiċi ta' grad analitiku. L-ilma għandu jkun iddistillat darbtejn jew ikun pur b'mod ekwivalenti.

Nota: Id-dettalji li ġejjin japplikaw għall-ġellijiet tal-poliakrilammid li jitħejjew f'laboratorju u li jkun fihom l-urea, li jkunu kbar 265 mm b'125 mm b'0.25 mm. Fejn jintużaw ġellijiet ta' daqsijiet u ta' tipi oħrajn, għandu mnejn ikollhom jiġu aġġustati l-kundizzjonijiet tas-separazzjoni.

Iffukar iżoelettriku

4.1. Reaġenti għall-produzzjoni tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea

4.1.1. Soluzzjoni ewlenija tal-ġell

Ħoll:

4,85 grammi ta' akrilammid,

0,15 grammi ta' N, N′-metilen-bis-akrilammid (BIS),

48,05 gramma ta' urea, u

15,00-il gramma ta' gliċerol (87 % w/w)

fl-ilma u żid sa 100 ml u erfa' s-soluzzjoni fi flixkun tal-ħġieġ kannella fil-friġġ.

Nota: Tista' tinxtara soluzzjoni tal-akrilammid/BIS imħallta lesta biex tintuża b'mod preferenzjali minflok il-piżijiet iffissati tal-akrilammidi newrotossiċi li qed jiġu kkwotati. Meta t-tali soluzzjoni jkun fiha 30 % w/v ta' akrilammid u 0,8 % w/v ta' BIS, għall-formulazzjoni għandu jintuża volum ta' 16,2 ml minflok il-piżijiet iffissati. Is-soluzzjoni ewlenija tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' għaxart ijiem; jekk din ikollha konduttività ta' aktar minn 5 μS, iddejonizzaha billi tħawwadha ma' 2 g ta' amberlit MB-3 għal 30 minuta, imbagħad għaddiha minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm.

4.1.2. Soluzzjoni tal-ġell

Ħejji soluzzjoni tal-ġell billi tħallat l-addittivi u l-amfoliti (*) mas-soluzzjoni ewlenija tal-ġell (ara l-punt 4.1.l):

9,0 ml tas-soluzzjoni ewlenija;

24 mg ta' β-alanina;

500 μl ta' amfolit b'pH ta' 3,5 sa 9,5;

250 μl ta' amfolit b'pH ta' 5 sa 7;

250 μl ta' amfolit b'pH ta' 6 sa 8.

Ħallat is-soluzzjoni tal-ġell u ħalli l-gass joħroġ minnha għal żewġ sa tliet minuti f'banju ultrasoniku jew f'vakwu.

Nota: Ħejji s-soluzzjoni tal-ġell eżatt qabel tferragħha (ara l-punt 6.2).

4.1.3. Soluzzjonijiet tal-katalizzaturi

4.1.3.1. N, N, N′ N′ — tetrametiletilendiammina (Temed)

4.1.3.2. Persulfat tal-ammonju (PER) ta' 40 % w/v:

Ħoll 800 mg ta' PER fl-ilma u żid sa 2 ml.

Nota: Dejjem uża soluzzjoni tal-PER li tkun għadha kemm tħejjiet.

4.2. Fluwidu ta' kuntatt

Kerosin jew paraffina likwida

4.3. Soluzzjoni anodika

Ħoll 5,77 g ta' aċidu fosforiku (ta' 85 % w/w) fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml.

4.4. Soluzzjoni katodika

Ħoll 2,00 g ta' idrossidu tas-sodju fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml.

Tħejjija tal-kampjun

4.5. Reaġenti għall-iżolament tal-proteini

4.5.1. Aċidu aċetiku dilwit (25,0 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali miżjud sa 100 ml bl-ilma)

4.5.2. Diklorometan

4.5.3. Aċeton

4.6. Soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini

Ħoll:

5,75 grammi ta' gliċerol (87 % w/w),

24,03 gramma ta' urea, u

250 milligramma ta' ditijotreitol

fl-ilma u żid sa 50 ml.

Nota: Erfa' s-soluzzjoni fil-friġġ; din tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' ġimgħa.

4.7. Reaġenti għall-qsim tal-kaseini permezz tal-plażmina

4.7.1. Soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju

Ittitra għal pH 8 soluzzjoni tal-idroġenukarbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml ilma) li jkun fiha l-aċidu etilendiamminatetraaċetiku ta' 0,05 mol/l (l-EDTA, 1,46 g/100 ml) permezz ta' soluzzjoni tal-karbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml ilma) li jkun fiha 0,05 mol/l ta' EDTA.

4.7.2. Plażmina bovina (EC.3.4.21.7), b'attività ta' mill-inqas 5 U/ml

4.7.3. Soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku għall-inibizzjoni enzimatika

Ħoll 2,624 g ta' aċidu aminokaprojku (aċidu 6-amino-n-eżanojku) f'100 ml ta' etanol ta' 40 % (v/v).

4.8. Standards

4.8.1. L-Istitut tal-Materjali u l-Kejl ta' Referenza tal-Kummissjoni, li jinsab f'B-2440 Geel, il-Belġju, għandu għad-dispożizzjoni standards ta' referenza ċċertifikati ta' taħlita tal-ħalib xkumat tal-mogħoż u tan-nagħaġ mizjud bit-tames li fiha 0 % u 1 % ħalib tal-baqar

4.8.2. Tħejjija tal-istandards temporanji għal-laboratorju tal-ħalib tal-buflu miżjud bit-tames li fih 0 % u 1 % ħalib tal-baqar

Il-ħalib xkumat jitħejja billi l-ħalib tal-baqar jew tal-buflu bl-ingrossa u mhux ipproċessat jingħadda għal 20 minuta minn magna ċentrifuga f'temperatura ta' 37 °C b'2 500 g. Wara li t-tubu u l-kontenut tiegħu jitberrdu malajr malajr sa ma jilħqu temperatura ta' 6 sa 8 °C, is-saff ta' fuq tax-xaħam jitneħħa kompletament. Biex jitħejja l-istandard ta' 1 % żid 5,00 ml ta' ħalib xkumat tal-baqar ma' 495 ml ta' ħalib xkumat tal-buflu f'bekk ta' litru u aġġusta l-pH għal 6,4 billi żżid l-aċidu lattiku dilwit (ta' 10 % w/v). Aġġusta t-temperatura għal 35 °C u żid 100 μl ta' tames tal-għoġol (attività tat-tames ta' 1: 10 000, jiġifieri ta' madwar 3 000 U/ml), ħawwad għal minuta u mbagħad ħalli l-bekk mgħotti għal siegħa b'fojl tal-aluminju f'temperatura ta' 35 °C sabiex tkun tista' tifforma l-baqta. Wara li tkun iffurmat il-baqta, il-ħalib kollu miżjud bit-tames jiġi lijofilizzat mingħajr ma jiġi omoġenizzat minn qabel u mingħajr ma jitneħħilu x-xorrox. Wara li jiġi lijofilizzat, jintaħan irqiq biex isir trab omoġenju. Biex jitħejja l-istandard ta' 0 %, għandha ssir l-istess proċedura bl-użu tal-ħalib xkumat pur tal-buflu. L-istandards għandhom jinħażnu f'temperatura ta' – 20 °C.

Nota: Huwa rrakkomandat li tiġi ċċekkjata l-purità tal-ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina qabel jitħejjew l-istandards.

Reaġenti għat-tilwin tal-proteini

4.9. Fissativ

Ħoll 150 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku fl-ilma u żid sa 1 000 ml.

4.10. Soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin

Żid l-ilma ddistillat ma' 500 ml ta' metanol u 200 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali sa ma jkollok 2 000 ml.

Nota: Ħejji s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin kuljum; din tista' titħejja billi tħallat l-istess volumi tas-soluzzjonijiet ewlenin tal-metanol ta' 50 % (v/v) u tal-aċidu aċetiku glaċjali ta' 20 % (v/v).

4.11. Soluzzjonijiet għat-tilwin

4.11.1. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 1)

Ħoll 3,0 g ta' Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) f'1 000 ml ta' metanol ta' 90 % (v/v) billi tuża ħawwad manjetiku (għal madwar 45 minuta) u għaddi s-soluzzjoni minn ġo żewġ filtri mitwijin ta' veloċità medja.

4.11.2. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 2)

Ħoll 5,0 g ta' sulfat tar-ram pentaidrat f'1 000 ml ta' aċidu aċetiku ta' 20 % (v/v).

4.11.3. Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni biex taħdem biha)

Ħallat flimkien 125 ml minn kull waħda mis-soluzzjonijiet ewlenin (4.11.1, 4.11.2) eżatt qabel it-tilwin.

Nota: Is-soluzzjoni għat-tilwin għandha titħejja dakinhar li tkun se tintuża.

5. °C

5.1. Ħġiġiet (ta' 265 mm b'125 mm b'4 mm); romblu tal-lasktu (wiesa' 15-il cm); mejda tal-livellar

5.2. Folja fejn jitqiegħed il-ġell (ta' 265 mm b'125 mm)

5.3. Folja li sservi ta' għata (ta' 280 mm b'125 mm). Qabbad strixxa tejp li jwaħħal (ta' 280 mm b'6 mm b'0,25 mm) ma' kull naħa twila ta' din il-folja (ara l-Figura 1)

5.4. Kamra tal-iffukar elettriku bi pjanċa tat-tkessiħ (pereżempju ta' 265 mm b'125 mm) u provvista tal-elettriku adattata (ta' ≥ 2,5 kV) jew apparat awtomatiku tal-elettroforeżi

5.5. Krijostatu taċ-ċirkolazzjoni, ikkontrollat b'mod termostatiku f'temperatura ta' 12-il °C ± 0,5 °C

5.6. Magna ċentrifuga li tista' tiġi aġġustata sa 3 000 g

5.7. Strixxi tal-elettrodi (twal ≥ 265 mm)

5.8. Fliexken tal-plastik tat-taqtir għas-soluzzjonijiet anodiċi u katodiċi

5.9. Applikaturi tal-kampjuni (ta' 10 mm b'5 mm, b'karta filtru tal-visk jew b'adsorbiment baxx tal-proteini)

5.10. Dixxijiet tal-azzar inossidabbli jew tal-ħġieġ għat-tilwin u għat-tneħħija tat-tilwin (pereżempju tilari għall-għodod ta' 280 mm b'150 mm)

5.12. Omoġenizzatur bil-vireg aġġustabbli (b'xaft b'dijametru ta' 10 mm), li jkollu spid ta' bejn 8 000 u 20 000 rotazzjoni kull minuta

5.13. Ħawwad manjetiku

5.14. Banju ultrasoniku

5.15. Welder tar-riti

5.16. Mikropipetti ta' 25 μl

5.17. Konċentratur b'vakwu jew apparat għal-lijofilizzazzjoni

5.18. Banjumarija kkontrollat b'mod termostatiku li jista' jiġi aġġustat għal temperatura ta' 35 °C u ta' 40 °C ± 1 °C b'xejker

5.19. Densitometru li kapaċi jaqra f'medda tal-frekwenza ta' λ = 634 nm

6. PROĊEDURA

6.1. Tħejjija tal-kampjun

6.1.1. Iżolament tal-kaseini

Iżen ammont li huwa ekwivalenti għal massa niexfa ta' 5 g ta' ġobon jew tal-istandards ta' referenza f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni ta' 100 ml, żid 60 ml ilma ddistillat u omoġenizza l-kampjun b'omoġenizzatur bil-vireg (bi spid ta' bejn 8 000 u 10 000 rotazzjoni kull minuta). Aġġusta l-kampjun bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,6 u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Ferra' x-xaħam u x-xorrox, omoġenizza r-residwu bi spid ta' 20 000 rotazzjoni kull minuta f'40 ml ta' ilma ddistillat aġġustat bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,5, żid 20 ml ta' diklorometan (4.5.2), erġa' omoġenizza l-kampjun u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Neħħi bi spatula s-saff tal-kaseina li jkun qiegħed bejn il-fażi milwiema u dik organika (ara l-Figura 2) u battal iż-żewġ fażijiet. Omoġenizza mill-ġdid il-kaseina f'40 ml ta' ilma ddistillat (ara hawn fuq) u 20 ml ta' diklorometan (4.5.2) u għaddiha mill-magna ċentrifuga. Irrepeti din il-proċedura sakemm iż-żewġ fażijiet ta' estrazzjoni jitilfu l-kulur (darbtejn jew tlieta). Omoġenizza r-residwu tal-proteini b'50 ml ta' aċeton (4.5.3) u għaddih minn ġo karta filtru mitwija ta' veloċità medja. Aħsel ir-residwu fuq il-filtru b'żewġ porzjonijiet separati ta' 25 ml ta' aċeton kull darba u ħallih jinxef għall-arja jew f'kurrent tan-nitroġenu, imbagħad itħnu fin f'mehrież.

Nota: L-iżolati mnixxfin tal-kaseina għandhom jinżammu f'temperatura ta' – 20 °C.

6.1.2. Qsim tal-kaseini β permezz tal-plażmina biex jiġu intensifikati l-kaseini γ

Xerred 25 mg tal-kaseini iżolati (6.1.1) f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju (4.7.1) u omoġenizza għal 20 minuta billi tuża, pereżempju, trattament ultrasoniku. Saħħan għal 40 °C u żid 10 μl ta' plażmina (4.7.2), ħallat u inkuba għal siegħa f'temperatura ta' 40 °C filwaqt li ċċaqlaq b'mod kontinwu. Biex tinibixxi l-enzima, żid 20 μl ta' soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku (4.7.3), imbagħad żid 200 mg ta' urea solida u 2 mg ta' ditijotreitol.

Nota: Biex il-faxex iffukati tal-kaseina jkunu iktar simmetriċi, huwa rrakkomandat li s-soluzzjoni tiġi lijofilizzata wara li jiżdied l-aċidu aminokaprojku u li mbagħad ir-residwi jinħallu f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini (4.6).

6.2. Tħejjija tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea

Bl-għajnuna ta' ftit taqtiriet tal-ilma, irrombla l-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2) għal fuq ħġieġa (5.1), filwaqt li tneħħi l-ilma żejjed b'kartaxuga jew b'tixju. Irrombla l-folja li sservi ta' għata (5.3) bis-separaturi (0,25 mm) fuq ħġieġa oħra bl-istess mod. Qiegħed il-ħġieġa b'mod orizzontali fuq mejda tal-livellar.

Żid 10 μl ta' Temed (4.1.3.1) mas-soluzzjoni tal-ġell li tkun ħejjejt u li minnha tkun neħħejt l-arja (4.1.2), ħawwadha u żid 10 μl ta' soluzzjoni tal-PER (4.1.3.2), ħallatha sewwa u ferra' s-soluzzjoni mill-ewwel b'mod unit fiċ-ċentru tal-folja li sservi ta' għata. Qiegħed naħa waħda tal-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell (bin-naħa tal-folja 'l isfel) fuq il-ħġieġa tal-folja li sservi ta' għata u baxxiha bil-mod il-mod għal fuqha biex tifforma rita tal-ġell uniformi u mingħajr bżieżaq bejn il-folji (ara l-Figura 3). Niżżel b'attenzjoni l-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell kompletament billi tuża spatula rqiqa u poġġilha tliet ħġiġiet oħra fuqha biex iservu ta' piż. Wara li titlesta l-polimerizzazzjoni (proċess li jieħu madwar 60 minuta), neħħi l-ġell polimerizzat għal fuq il-folja fejn jitqiegħed il-ġell flimkien mal-folja li sservi ta' għata billi tiftaħ il-ħġiġiet minn ma' xulxin. Naddaf in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell b'attenzjoni biex tneħħi r-residwi tal-ġell u l-urea. Iwweldja s-“sandwiċ tal-ġell” biex tifforma tubu tar-rita u erfa' dan it-tubu fil-friġġ (għal perjodu massimu ta' sitt ġimgħat).

Nota: Il-folja li sservi ta' għata bis-separaturi tista' terġa' tintuża. Il-ġell tal-poliakrilammid jista' jinqata' f'biċċiet iżgħar, li huwa rrakkomandat meta jkun hemm ftit kampjuni jew f'każ li jintuża apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' daqs ta' 4,5 cm b'5 cm).

6.3. Iffukar iżoelettriku

Issettja t-termostat tat-tkessiħ f'temperatura ta' 12-il °C. Imsaħ in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell bil-kerosin (4.2), imbagħad itfa' ftit taqtiriet tal-kerosin fiċ-ċentru tal-blokka tat-tkessiħ. Wara rrombla s-“sandwiċ tal-ġell” fuqha, bin-naħa fejn jitqiegħed il-ġell 'l isfel, filwaqt li toqgħod attent li tevita l-bżieżaq. Imsaħ il-kerosin żejjed li jista' jkun hemm u neħħi l-folja li sservi ta' għata. Xarrab l-istrixxi tal-elettrodi bis-soluzzjonijiet tal-elettrodi (4.3 u 4.4), aqtagħhom skont it-tul tal-ġell u poġġihom fil-pożizzjonijiet ipprovduti (f'distanza ta' 9,5 cm mill-elettrodi).

Kundizzjonijiet għall-iffukar iżoelettriku:

6.3.1. Daqs tal-ġell ta' 265 mm b'125 mm b'0,25 mm

Stadju Ħin (f'minuti) Vultaġġ (f'V) Kurrent (f'mA) Potenza (f'W) Sigħat volts (f'Vh) 1. Iffukar minn qabel 30 massimu 2 500 massimu 15 kostanti 4 madwar 300 2. Iffukar tal-kampjun (7) 60 massimu 2 500 massimu 15 kostanti 4 madwar 1 000 3. Iffukar finali 60 massimu 2 500 massimu 5 massimu 20 madwar 3 000 40 massimu 2 500 massimu 6 massimu 20 madwar 3 000 30 massimu 2 500 massimu 7 massimu 25 madwar 3 000

Nota: Jekk tinbidel il-ħxuna jew il-wisa' tal-ġellijiet, il-valuri tal-kurrent u tal-potenza għandhom jiġu aġġustati b'mod xieraq (pereżempju rdoppja l-valuri tal-kurrent elettriku u tal-potenza jekk jintuża ġell ta' 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Eżempju ta' programm ta' vultaġġ għall-apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' 5,0 cm b'4,5 cm), bl-elettrodi mingħajr strixxi applikati direttament għall-ġell.

Stadju Vultaġġ Kurrent Potenza Temperatura Sigħat volts 1. Iffukar minn qabel 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Iffukar tal-kampjun 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Iffukar 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Iffukar 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Qiegħed l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'0 Vh.

Neħħi l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'30 Vh.

6.4. Tilwin tal-proteini

6.4.1. Iffissar tal-proteini

Neħħi l-istrixxi tal-elettrodi immedjatament wara li twaqqaf il-magna u poġġi l-ġell immedjatament f'dixx għat-tilwin jew għat-tneħħija tat-tilwin li jkun mimli b'200 ml ta' fissativ (4.9); ħallih hemm għal 15-il minuta, filwaqt li ċċaqalqu l-ħin kollu.

6.4.2. Hasil u tilwin tal-ħġieġa tal-ġell

Skula kompletament il-fissativ u aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn għal 30 sekonda kull darba b'100 ml tas-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10). Ferra' s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin u imla d-dixx b'250 ml ta' soluzzjoni għat-tilwin (4.11.3); ħalliha tieħu l-kulur għal 45 minuta filwaqt li ċċaqlaqha bil-mod.

6.4.3. Tneħħija tat-tilwin mill-ħġieġa tal-ġell

Ferra' s-soluzzjoni għat-tilwin, aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn bl-użu ta' 100 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10) kull darba, imbagħad ċaqlaqha b'200 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin għal 15-il minuta u rrepeti l-istadju tat-tneħħija tat-tilwin mill-anqas darbtejn jew tlieta sakemm l-isfond jiċċara u jkun tilef il-kulur. Imbagħad laħlaħ il-ħġieġa tal-ġell bl-ilma ddistillat (2 × 2 minuti) u ħalliha tinxef għall-arja (għal sagħtejn sa tliet sigħat) jew nixxifha b'hairdryer (għal 10 sa 15-il minuta).

Nota 1: Eżegwixxi t-twaħħil, il-ħasil, it-tilwin u t-tneħħija tat-tilwin f'temperatura ta' 20 °C. Tużax temperaturi għoljin.

Nota 2: Jekk ikun ippreferut tilwin tal-fidda aktar sensittiv (pereżempju Kit tat-Tilwin tal-Fidda, Proteini (“Silver Staining Kit, Protein”), Pharmacia Biotech, Nru tal-Kodiċi 17-1150-01), kampjuni ta' kaseina ttrattati bil-plażmina għandhom jiġu dilwiti b'5 mg/ml.

7. EVALWAZZJONI

L-evalwazzjoni ssir billi jitqabblu l-profili tal-proteini tal-kampjun mhux magħruf mal-istandards ta' referenza dwar l-istess ġell. Id-detezzjoni tal-ħalib tal-baqar fil-ġobon mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż u mill-ħalib tal-buflu u minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu ssir permezz tal-kaseini γ2 u γ3, li l-punti iżoelettriċi tagħhom ivarjaw bejn pH 6,5 u pH 7,5 (il-Figuri 4 a u b u l-Figura 5). Il-limitu ta' detezzjoni huwa ta' anqas minn 0,5 %.

7.1. Stima viżwali

Għall-evalwazzjoni viżwali tal-ammont ta' ħalib bovin, huwa rrakkomandat li jiġu aġġustati l-konċentrazzjonijiet tal-kampjuni u tal-istandards biex jinkiseb l-istess livell ta' intensità tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara “γ2 E, G, B” u“γ3 E, G, B” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5). Wara dan, l-ammont ta' ħalib bovin (anqas, daqs jew aktar minn 1 %) fil-kampjun mhux magħruf jista' jiġi aġġudikat direttament billi l-intensità tal-kaseini γ2 u γ3 bovini (ara “γ2 C” u“γ3 C” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5) titqabbel ma' dawk tal-istandards ta' referenza ta' 0 % u ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandards temporanji għal-laboratorju (bufli).

7.2. Stima densitometrika

Jekk tkun disponibbli, applika d-densitometrija (5.19) għall-kejl tal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 bovini ma' dik tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara l-Figura 5). Qabbel dan il-valur mal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 tal-istandard ta' referenza ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandard temporanju għal-laboratorju (bufli) analizzat fuq l-istess ġell.

Nota: Il-metodu jaħdem b'mod sodisfaċenti jekk ikun hemm sinjal pożittiv ċar għall-kaseini γ2 u γ3 bovini fl-istandard ta' referenza ta' 1 % iżda mhux fl-istandard ta' referenza ta' 0 %. Jekk le, ottimizza l-proċedura billi ssegwi bi preċiżjoni d-dettalji tal-metodu.

Kampjun jitqies li huwa pożittiv jekk il-kaseini γ2 u γ3 bovini jew il-proporzjonijiet tal-erja tal-quċċata korrispondenti jkunu daqs il-livell tal-istandard ta' referenza ta' 1 % jew akbar minnu.

8. BIBLIJOGRAFIJA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.,“Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L., “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I., Klostermeyer H.,“Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. Fi: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P., “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J., “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Tpinġija skematika tal-folja li sservi ta' għata

Figura 2

Saff ta' kaseina sospiż bejn il-fażi milwiema u dik organika wara ċ-ċentrifugazzjoni

Figura 3

It-teknika tal-“flapping” għall-ikkastjar ta' ġellijiet tal-poliakrilammid irqaq ħafna

a = it-tejp separatur (ta' 0,25 mm); b = il-folja li sservi ta' għata (5.3); c, e = il-ħġiġiet (5.1); d = soluzzjoni tal-ġell (4.1.2); f = il-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2).

Figura 4a

Iffukar iżoelettriku ta' kaseini minn ħalib tan-nagħaġ u tal-mogħoż li fih ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar, ittrattati bil-plażmina.

% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar, C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż.

Qed jintwera n-nofs ta' fuq tal-ġell IEF.

Figura 4b

Iffukar iżoelettriku tal-kaseini mill-ġobon magħmul minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu li jkun fihom ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar u li jkunu ġew ittrattati bil-plażmina.

% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar; 1 + = kampjun li fih 1 % ta' ħalib tal-baqar u spajkjat b'kaseina bovina pura f'nofs il-linja. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż, B = bufli.

Qed tintwera d-distanza totali ta' separazzjoni tal-ġell IEF.

Figura 5

Soprapożizzjoni tad-densitogrammi tal-istandards (STD) u tal-kampjuni tal-ġobon magħmul minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ u ta' ħalib tal-mogħoż wara l-iffukar iżoelettriku

a, b = standards li fihom 0 u 1 % ħalib tal-baqar; c-g = kampjuni tal-ġobon li fihom 0, 1, 2, 3 u 7 % ħalib tal-baqar. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż.

In-nofs ta' fuq tal-ġell IEF ġie skannjat b'λ = 634 nm.