ANNESS I

Skema għat-testijiet li jridu jitwettqu skont l-Artikoli 3, 4, 5, 7 u 8

1. PRINĊIPJI ĠENERALI DWAR IL-PREŻENZA TAL-PEST SPEĊIFIKAT

1.1. Il-preżenza tal-pest speċifikat tkun issuspettata fejn jinkiseb riżultat pożittiv fl-ewwel test ta’ detezzjoni li jitwettaq fuq il-pjanta speċifikata. Fil-każ tal-materjal tal-pjanti sintomatiku, l-ewwel test ta’ detezzjoni jista’ jkun iżolament selettiv.

1.2. Il-preżenza tal-pest speċifikat tiġi kkonfermata fil-kampjuni ta’ pjanti speċifikati sintomatiċi fil-każijiet li ġejjin: (a) meta l-ewwel test ta’ detezzjoni jkun iżolament selettiv li jirriżulta f’kolonji b’morfoloġija tipika: jinkisbu riżultati pożittivi minn żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni; (b) meta l-ewwel test ta’ detezzjoni jkun test differenti mill-iżolament selettiv: (i) jinkisbu riżultati pożittivi f’żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni wara li l-kampjun ikun iddaħħal f’iżolament selettiv; (ii) jinkisbu riżultati pożittivi fit-tieni test ta’ detezzjoni li ma jkunx iżolament selettiv.

1.3. Il-preżenza tal-pest speċifikat tiġi kkonfermata fil-kampjuni ta’ pjanti speċifikati asintomatiċi fil-każijiet li ġejjin: (a) meta jinkiseb riżultat pożittiv fit-tieni test ta’ detezzjoni dment li l-ewwel jew it-tieni test ta’ detezzjoni jkun test molekulari (bbażat fuq id-DNA) (reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali TaqMan® jew reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali konvenzjonali); (b) għall-kampjuni li jittieħdu fi Stat Membru jew f’żona ta’ Stat Membru fejn mhuwiex magħruf li jinsab il-pest speċifikat u għal kampjuni li joriġinaw minn Stat Membru ieħor: meta jinkiseb riżultat pożittiv fit-tieni test ta’ detezzjoni f’konformità mal-punt (a) u jinkisbu riżultati pożittivi f’żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni li jitwettqu wara li l-kampjun ikun iddaħħal fl-iżolament selettiv.

2. TESTIJIET

2.1. Testijiet ta’ detezzjoni

It-testijiet ta’ detezzjoni għandhom ikunu tali li b’mod konsistenti jindividwaw mill-inqas 104ċelloli/ml ta’ pellet sospiża mill-ġdid.

It-tieni test ta’ detezzjoni għandu jkun ibbażat fuq prinċipji bijoloġiċi differenti jew reġjuni tan-nukleotid differenti minn tal-ewwel test ta’ detezzjoni.

It-testijiet ta’ detezzjoni huma dawn li ġejjin:

(a) testijiet tal-immunofluworexxenza kif deskritti fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(b) Test FISH (van Beuningen et al. (1995) (1)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(c) L-iżolament kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; Għandha titwettaq waħda minn dawn iż-żewġ alternattivi: (i) l-iżolament dirett fuq mediums ta’ tkabbir semi-selettivi (jew mhux selettivi) kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (ii) wara l-arrikkiment permezz tal-bijoassaġġ, l-iżolament kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(d) test tar-reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali konvenzjonali bl-użu tal-primers ta’ Pastrik et al., (2000) (2), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(e) Testijiet tar-reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali TaqMan®bl-użu ta’ primers u sondi ta’: (i) Schaad et al. (1999) (3), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (l-hekk imsejjaħ test NYtor), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iii) Gudmestad et al. (2009) kif addattat minn Vreeburg et al. (2018)4, kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iv) Massart et al. (2014) (5), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

2.2. Testijiet ta’ identifikazzjoni

It-testijiet ta’ identifikazzjoni huma dawn li ġejjin:

(a) test tal-immunofluworexxenza kif deskritti fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(b) test tar-reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali (Pastrik (2000)) konvenzjonali, kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(c) Testijiet tar-reazzjoni katina bil-polimerażi f’ħin reali TaqMan® bl-użu ta’ primers u sondi ta’: (i) Schaad et al. (1999), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (ii) Vreeburg et al. (2018) (l-hekk imsejjaħ test NYtor), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iii) Gudmestad et al. (2009) kif addattat minn Vreeburg et al. (2018), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iv) Massart et al. (2014), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(d) Barcoding tad-DNA, kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

3. DIJAGRAMMI SEKWENZJALI TAL-PROĊEDURI

Dijagramma sekwenzjali Nru 1: Proċedura dijanjostika għall-preżenza tal-pest speċifikat f’kampjuni tal-pjanta speċifikata sintomatiċi.

a L-iżolament jista’ jintuża bħala l-ewwel jew it-tieni test ta’ detezzjoni. Jekk il-preżenza tal-pest speċifikat tkun issuspettata fuq il-medium ta’ tkabbir, il-kolonji għandhom jiġu ppurifikati biex jinkisbu kulturi puri li għandhom jitwettqu żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni fuqhom. Jenħtieġu riżultati pożittivi fiż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni biex tiġi kkonfermata l-preżenza tal-pest.

b It-tielet test ta’ detezzjoni għandu jkun ibbażat fuq prinċipji bijoloġiċi differenti jew fuq reġjuni differenti tan-nukleotid.

Dijagramma sekwenzjali Nru 2: Proċedura dijanjostika għall-preżenza tal-pest speċifikat f’kampjuni asintomatiċi tal-pjanta speċifikata.

a Ma għandux jintuża l-iżolament.

b It-tielet test ta’ detezzjoni għandu jkun ibbażat fuq prinċipji bijoloġiċi differenti jew fuq reġjuni tan-nukleotid differenti. Ma għandux jintuża l-iżolament.

c Għall-kampjuni msemmijin fil-punt (1.3)(b), il-konferma tal-preżenza tal-pest speċifikat wara t-tieni test ta’ detezzjoni pożittiv teħtieġ l-iżolament tal-pest speċifikat mill-kampjun, segwit minn żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni pożittivi.

4. TĦEJJIJA TAL-KAMPJUNI

4.1. Kampjuni minn tuberi asintomatiċi

Il-kampjun standard għandu jkun fih 200 tuberu għal kull test. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju għall-ipproċessar tal-qalba tan-naħa tal-għarqub biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

4.2. Kampjuni minn materjal tal-pjanti asintomatiku għajr it-tuberi

Id-detezzjoni ta’ infezzjonijiet latenti għandha titwettaq fuq kampjuni komposti ta’ segmenti miz-zokk. Il-proċedura tista’ tiġi applikata fuq sa 200 parti taz-zokk minn pjanti differenti f’kampjun wieħed. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju biex jiġu ddiżinfettati u pproċessati s-segmenti taz-zokk biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

4.3. Kampjuni minn pjanti speċifikati sintomatiċi

Għandhom jitneħħew sezzjonijiet tat-tessut b’mod asettiku miċ-ċirku vaskulari f’tuberu jew mill-ħjut vaskulari fiz-zkuk ta’ pjanti speċifikati li juru sintomi ta’ tibdil. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju biex dawn it-tessuti jiġu pproċessati biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta id-dettall fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.