REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 152/2009

tas-27 ta' Jannar 2009

li jistabbilixxi l-metodi ta' teħid ta' kampjuni u analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf

(Test b’relevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 882/2004 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tad-29 ta' April 2004 dwar il-kontrolli uffiċjali mwettqa biex tiġi żgurata l-verifikazzjoni tal-konformità mal-liġi tal-għalf u l-ikel, mas-saħħa tal-annimali u mar-regoli dwar il-welfare tal-annimali (1), u b’mod partikolari l-Artikolu 11(4)(a), (b) u (c) tiegħu,

Billi:

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1

It-teħid ta' kampjuni għall-kontroll uffiċjali tal-għalf, fir-rigward tad-determinazzjoni ta' kostitwenti, addittivi u sustanzi mhux mixtieqa, bl-eċċezzjoni ta' residwi ta' pestiċidi u mikro-organiżmi, għandu jsir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness I.

Artikolu 2

Il-preparazzjoni tal-kampjuni għall-analiżi u l-espressjoni tar-riżultati għandha ssir skont il-metodi stabbiliti fl-Anness II.

Artikolu 3

L-analiżi għall-kontroll uffiċjali tal-għalf għandha ssir bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness III (Metodi ta' analiżi biex tiġi kkontrollata l-kompożizzjoni tal-materjal tal-għalf u l-għalf kompost), fl-Anness IV (Metodi ta' analiżi biex jiġi kkontrollat il-livell ta' addittivi awtorizzati fl-għalf) u fl-Anness VI (Metodi ta' analiżi għad-determinazzjoni ta' kostitwenti li ġejjin mill-annimali għall-kontroll uffiċjali tal-għalf).

Artikolu 4

Il-valur ta' enerġija tal-għalf kompost għat-tjur għandu jiġi kkalkulat skont l-Anness VII.

Artikolu 5

Il-metodi ta' analiżi għall-kontroll tal-preżenza illegali ta' addittivi li m’għadhomx awtorizzati fl-għalf stabbiliti fl-Anness VIII għandhom jintużaw għal skopijiet ta' konferma.

Artikolu 6

Id-Direttivi 71/250/KEE, 71/393/KEE, 72/199/KEE, 73/46/KEE, 76/371/KEE, 76/372/KEE, 78/633/KEE, 81/715/KEE, 84/425/KEE, 86/174/KEE, 93/70/KEE, 93/117/KE, 98/64/KE, 1999/27/KE, 1999/76/KE, 2000/45/KE, 2002/70/KE u 2003/126/KE huma revokati.

Ir-referenzi għad-Direttivi revokati għandhom jiġu interpretati bħala referenzi għal dan ir-Regolament u għandhom jinqraw skont it-tabelli ta' korrelazzjoni fl-Anness IX.

Artikolu 7

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum ta' wara l-pubblikazzjoni tiegħu f’Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.

Dan għandu japplika mis-26 ta' Awwissu 2009.

(1) ĠU L 165, 30.4.2004, p. 1, ikkoreġut bil-ĠU L 191, 28.5.2004, p. 1.

(2) ĠU L 155, 12.7.1971, p. 13.

(3) ĠU L 279, 20.12.1971, p. 7.

(4) ĠU L 123, 29.5.1972, p. 6.

(5) ĠU L 83, 30.3.1973, p. 21.

(6) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 1.

(7) ĠU L 102, 15.4.1976, p. 8.

(8) ĠU L 206, 29.7.1978, p. 43.

(9) ĠU L 257, 10.9.1981, p. 38.

(10) ĠU L 238, 6.9.1984, p. 34.

(11) ĠU L 130, 16.5.1986, p. 53.

(12) ĠU L 234, 17.9.1993, p. 17.

(13) ĠU L 329, 30.12.1993, p. 54.

(14) ĠU L 257, 19.9.1998, p. 14.

(15) ĠU L 118, 6.5.1999, p. 36.

(16) ĠU L 207, 6.8.1999, p. 13.

(17) ĠU L 174, 13.7.2000, p. 32.

(18) ĠU L 209, 6.8.2002, p. 15.

(19) ĠU L 339, 24.12.2003, p. 78.

Soluzzjoni ta' kalibrar ta' amino acids standard biex jintużaw ma' hydrolysates, c = 5nmol/50μl cysteic acid u methionine sulphone u c = 10 nmml/50 μl tal-amino acids l-oħra. Dewweb 2,2 g sodium chloride (3.10) f'tazza ta' 100 ml ma' 30 ml citrate buffer (3.24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard tal-amino acids (3.27.1), 4,00 ml soluzzjoni standard cysteic acid u methionine sulphone (3.27.2) u 0,50 ml soluzzjoni stokk standard tal-istandard intern (3.27.3) jekk intuża. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-idrossidu tas-sodju (3.18).

ANNESS IV

METODI TA’ ANALIŻI GĦALL-KONTROLL TAL-LIVELL TA’ ADDITTIVI AWTORIZZATI FL-GĦALF

(A) DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A

1. Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ vitamina A (retinol) fl-għalf u f’taħlitiet minn qabel. Il-vitamina A tinkludi l-alkoħol all-trans-retinyl u cis-isomers tagħha li huma ddeterminati b’dan il-metodu. The content of vitamin A is expressed in International Units (IU) per kg. IU wieħed jikkorrispondi mal-attività ta’ 0,300 μg all-trans-vitamin A alkoħol jew 0,344 μg ta’ all-trans-vitamin A acetate jew 0,550 μg all-trans-vitamin A palmitate.

Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 000 IU vitamina A/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina A hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina A huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (RP-HPLC) bl-użu ta’ UV jew ditettur tal-fluworexxenza. Il-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-all-trans- vitamin A alkoħol u cis isomers tiegħu.

3. Reaġenti

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC

3.3. Metanol

3.4. Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml

3.5. Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7)

3.6. Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1. Soluzzjoni tas-sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi glycerol, ß = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8)

3.7. Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1)

3.8. 2-Propanol

3.9. Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.10. Nitroġenu, bla ossiġenu

3.11. All-trans-vitamin A acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 2,80 × 106 IU/g

3.11.1. Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.11) f’kunjett ta’ 100 ml iggradat. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.1.

3.12. All-trans-vitamin A palmitate, extra pur, ta’ attività ċertifikata, pereżempju 1,80 × 106 IU/g.

3.12.1. Soluzzjoni tal-istokk tal-all-trans-vitamin A palmitate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 80 mg ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka bl-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1 400 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont 5.6.3.2.

3.13. 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5)

4. Apparat

4.1. Evaporatur rotanti b’vakwu

4.2. Oġġetti tal-ħġieġ ambra

4.2.1. Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass

4.2.2. Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml

4.2.3. Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass

4.2.4. Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass

4.3. Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass

4.4. Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni

4.5.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti (kriterju ta’ prestazzjoni: ogħla livell wieħed biss għar-retinol isomers kollha fil-kundizzjonijiet-HPLC)

4.5.2. Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli

4.6. Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz

4.7. Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku

4.8. Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1. Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass

4.8.2. Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni.

5. Proċedura

Nota: Il-Vitamina A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina A.

5.2. Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, iżen sal-eqreb 1 mg, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3. Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.10) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fil-medda ta’ 5 IU/ml sa 30 IU/ml).

5.5. Determinazzjoni permezz HPLC

Il-vitamina A tissepara fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni titkejjel permezz ta’ ditettur bl-UV (325 nm) jew ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.9). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1): 250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm ippakkjar jew ekwivalenti Fażi mobbli (3.9): Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v). Rata ta’ tnixxija: 1 – 2 ml/min Ditettur (4.5.2): Ditettur tal-UV (325 nm) jew Ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 325 nm/emissjoni: 475 nm)

5.6. Kalibrar

5.6.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ standard tax-xogħol

Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni ta’ aċetat tal-vitamina A maħżuna (3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni ta’ palmitat tal-vitamina A maħżuna (3.12.1) f’kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesa’ 500 ml (4.2.1) u idrolizzah kif spjegat fil-5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentament agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif (3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u erġa’ dewweb ir-residwi f’10,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 IU vitamina A għal kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat skont il-5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’kunjett iggradat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita hija 56 IU vitamina A għal kull ml.

5.6.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol dilwita f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8, 5,6, 14,0 u 28,0 IU vitamina A għal kull ml.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Billi tuża l-medji tal-għoli tal-ogħla livelli (erjas) ipplottja grafika ta’ kalibrar li tikkunsidra r-riżultati tal-kontroll tal-UV (5.6.3.3).

5.6.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjonijiet standard

5.6.3.1. Soluzzjoni stokk tal-aċetat tal-vitamina A

Ippipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stokk tal-aċetat ta’ vitamina A (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( għall-aċetat tal-vitamina A=1 530 f’326 nm fi 2-propanol)

5.6.3.2. Soluzzjoni stokk tal-palmitat ta’ vitamina A

Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 IU vitamina A għal kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni dilwita ta’ palmitat ta’ vitamina A f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( għal palmitat tal-vitamina A=957 fi 326 nm f’2-propanoli)

5.6.3.3. Soluzzjoni ta’ standard ta’ ħidma ta’ vitamina A

Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni ta’ vitamina A mhux dilwita, preparata skont 5.6.1 f’kunjett iggradat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni f’kunjett iggradat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanol (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 IU vitamina A għal kull ml. Kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm.

Kalkolu tal-kontenut tal-vitamina A:

IU vitamina A/ml = E325 × 18,3

( għal alkoħol tal-vitamina A=1 821 fi 325 nm f’2-propanol)

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’IU/ml b’referenza għall-grafika ta’ kalibrar (5.6.2).

Il-kontenut tal-vitamina A w f’IU/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[UI/kg]

fejn:

c = konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’IU/ml V1 = volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml V2 = volum tal-alikwot meħud f’5.4 f’ml m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Osservazzjonijiet

7.1. Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina A huwa utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ karigi ta’ saponifikazzjonijiet (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2. Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3. Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni.

7.4. Biż-żejt tal-fwied tal-bakkaljaw u xaħmijiet puri oħra il-ħin ta’ saponifikazzjoni jrid jiġi estiż għal 45 – 60 minuta.

7.5. Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT.

7.6. Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ retinol isomers hija possibbli. Iżda f’dak il-każ l-għoli (erjas) tal-ogħla livelli kollha tas-cis u trans iżomeri jridu jingħaddu għall-kalkoli.

7.7. Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate.

7.8. Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide.

7.9. F’każijiet ta’ analiżi ta’ vitamina A fi prodotti li jissostitwixxu l-ħalib, trid tingħata attenzjoni speċjali: — fis-saponifikazzjoni (5.2): minħabba l-ammont ta’ xaħam preżenti fil-kampjun, jista’ jkun hemm bżonn li jiżdied ammont tas-soluzzjoni ta’ potassium hydroxide (3.4); — fl-estrazzjoni (5.3): minħabba l-preżenza ta’ emulsjonijiet, jista’ jkun hemm bżonn ta’ addattament tal-proporzjon 2:1 tal-ilma/etanol. Biex tiċekkja jekk il-metodu ta’ analiżi applikat jiġġenerax riżultati affidabbli fuq din il-matriċi speċifika (sostitut tal-ħalib), irid jiġi applikat test tal-irkupru fuq porzjon għat-test addizzjonali. Jekk ir-rata ta’ rkupru hija inqas minn 80 %, ir-riżultat analitiku jrid jiġi emendat għall-irkupru.

8. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % meta mqabbla mal-ogħla riżultat.

9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (1)

Taħlit minn qabel Taħlit minn qabel kompost Konċentrat ta’ mineral Għalf tal-proteina Qażquż L 13 12 13 12 13 n 48 45 47 46 49 Medja [IU/kg] 17,02 x 106 1,21 x 106 537 100 151 800 18 070 sr [IU/kg] 0,51 x 106 0,039 x 106 22 080 12 280 682 r [IU/kg] 1,43 x 106 0,109 x 106 61 824 34 384 1 910 CVr [ %] 3,0 3,5 4,1 8,1 3,8 sR [IU/kg] 1,36 x 106 0,069 x 106 46 300 23 060 3 614 R [IU/kg] 3,81 x 106 0,193 x 106 129 640 64 568 10 119 CVR [ %] 8,0 6,2 8,6 15 20

L = numru ta’ laboratorji n = numru ta’ valuri singoli sr = devjazzjoni standard tar-ripetibilità sR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità r = ripetibilità R = riproduċibilità CVr = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità CVR = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(B) DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E

1. Għan u Skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi stabbilit il-livell tal-vitamina E fl-għalf u l-t-taħlitiet lesti minn qabel. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa mfisser bħala mg DL-α-tocopherol acetate għal kull kg. 1 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate jikkorrispondi għal 0,91 mg mg DL-α-tocopherol (vitamina E).

Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. Dan il-limitu ta’ kwantifikazzjoni jinkiseb biss b’ditettur tal-fluworexxenza. B’ditettur bl-UV, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa biss 10 mg/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni ta’ ethanolic potassium hydroxide u l-vitamina E hija estratta f’petroleum ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiddewweb fil-metanol u, jekk ikun hemm bżonn, jitħallat għall-konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (EK-FGLK) bl-użu ta’ ditettur bl-UV jew fluworexxenti.

3. Reaġenti

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroleum ħafif, medda ta’ togħlija 40 oC – 60 oC

3.3. Metanol

3.4. Soluzzjoni ta’ potassium hydroxide, c = 50 g/100 ml

3.5. Soluzzjoni ta’ sodium ascorbate, c = 10 g/100 ml (ara l-osservazzjoni 7.7)

3.6. Sodium sulphide, Na2S x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1. Soluzzjoni ta’ sodium sulphide, c = 0,5 mol/l fi gliċerol, β = 120 g/l (għal x = 9) (ara l-osservazzjonijiet 7.8)

3.7. Soluzzjoni ta’ phenolphthalein, c = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1)

3.8. Fażi mobbli għal HPLC: taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma, eż. 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata.

3.9. Nitroġenu, bla ossiġenu

3.10. DL-α-tocopherol acetate, extra pur, ta’ attività ċertifikata

3.10.1. Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol acetate. (Kontroll UV ara 5.6.1.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4).

3.11. DL-α-tocopherol, extra pur, ta’ attività attestata

3.11.1. Soluzzjoni stokk ta’ DL-α-tocopherol: Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 100 mg ta’ DL-α-tocopherol (3.11) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u żid sal-marka bl-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fih 1 mg DL-α-tocopherol. (Kontroll UV ara 5.6.2.3; stabbilizzazzjoni ara l-osservazzjonijijiet 7.4).

3.12. 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara l-osservazzjonijiet 7.5)

4. Apparat

4.1. Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.2. Oġġetti tal-ħġieġ ambra

4.2.1. Kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-sokit tal-ground-glass

4.2.2. Kunjetti ggradati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml

4.2.3. Għeniebet ta’ separazzjoni, konikali, 1 000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass

4.2.4. Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass

4.3. Kondensur Allihn, b’tul tal-jacket ta’ 300 mm, b’ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għall-pajp tat-tmigħ tal-gass

4.4. Karta filtru mitwija għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (eż. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni

4.5.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi, 250 mm × 4 mm, C18, ippakkjar ta’ 5 jew 10 μm, jew ekwivalenti

4.5.2. Ditettur bl-UV jew tal-fluworexxenza, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli

4.6. Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelloli quartz

4.7. Banju tal-ilma bi stirrer manjetiku

4.8. Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn:

4.8.1. Ċilindru tal-ħġieġ li jesa’ 1 l iffitjat bl-għonq u b’tapp tal-ground glass

4.8.2. Insert tal-ground glass mgħammar b’side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u ġett fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jkun jista’ jiġi ttrasferit f’lembut ta’ separazzjoni.

5. Proċedura

Nota: Il-Vitamina E hija sensittiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ ambra, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti b’folji tal-aluminju) u ossiġenu (flaxxja bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni l-arja fuq il-likwidu trid tinbidel b’nitroġenu (evita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor).

5.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Itħan il-kampjun sabiex jgħaddi minn passatur b’toqob ta’ 1 mm, filwaqt li toqgħod attent biex tevita l-ġenerazzjoni tas-sħana. It-tħin irid isir immedjatament qabel jintiżen u qabel is-saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E.

5.2. Saponifikazzjoni

Skont il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, iżen sal-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.12), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.6). Iffittja l-kondensur (4.3) mal-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju tal-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakemm ibaqbaq u ħallih jagħmel reflux għal 5 minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni tal-potassium hydroxide (3.4) fil-kondensur (4.3) u ħallih jagħmel reflux għal 25 minuta oħra, filwaqt li tħawwad taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali.

5.3. Estrazzjoni

Ittrasferixxi b’tiswib (decantation) is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni b’mod kwantittattiv billi tlaħlaħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal-lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml petroleum ħafif (3.2) u ittrasferixxi t-tlaħlitiet f’lembut ta’ separazzjoni jew fl-apparat tal-estrazzjoni. Il-proporzjon tal-ilma u l-etanol fis-soluzzjonijiet kombinati għandu jkun madwar 2:1. Ħawwad sew għal 2 minuti u ħallih joqgħod għal 2 minuti.

5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut ta’ separazzjoni (4.2.3)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ittrasferixxi s-saff tal-petroleum ħafif għal lembut ta’ separazzjoni ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2).

Aħsel l-estratti kkombinati fil-lembut ta’ separazzjoni darbtejn billi ddawwru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament b’ porzjonijiet ta’ ilma ta’ 100 ml oħrajn sakemm l-ilma jibqa’ bla kulur malli tiżdied soluzzjoni ta’ phenolphthalein (3.7) (ġeneralment taħslu erba’ darbiet ikun biżżejjed). Iffiltra l-estratt maħsul minn filtru ippjegat xott għall-fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż, f’kunjett iggradat ta’ 500 ml (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’50 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imla sal-marka bil-petroleum ħafif (3.2) u ħawwad sew.

5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8)

Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) ibdel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u qiegħed it-tarf t’isfel f’forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell tal-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa mil-linja tan-nitroġenu lis-side-arm, ittrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-petroleum ħafif f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 1 000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2) fiċ-ċilindru tal-ħġieġ, poġġi t-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq f’lembut ta’ separazzjoni bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ petroleum ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’50 ml ta’ porzjonijiet ta’ petroleum ħafif (3.2) u żid saffi ta’ petroleum ħafif fil-lembut ta’ separazzjoni.

Aħsel l-estratti ta’ petroleum ħafif imħallat kif deskritt f’5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn.

5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC

Ippipetta porzjon alikwota tas-soluzzjoni tal-petroleum ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) f’kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’temperatura tal-banju li ma tkunx aktar minn 40 oC. Erġa’ ġib mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid in-nitroġenu (3.9) u neħħi l-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li jibqa’ bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum magħruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ DL-α-tocopherol trid tkun fil-medda ta’ 5 μg/ml sa 30 μg/ml).

5.5. Determinazzjoni permezz HPLC

Vitamina E hija separata fuq kolonna ta’ fażi riversjata C18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija mkejla permezz ta’ ditettur tal-fluworexxenza (eċitazzjoni: 295 nm, emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm) (4.5.2).

Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.8). Ikkalkola l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ta’ bosta injezzjonijiet tal-istess soluzzjoni tal-kampjun u l-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar (5.6.2).

Kundizzjonijiet HPLC

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw diment li jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromografija b’likwidi (4.5.1): 250 mm × 4 mm, C18, 5 jew 10 μm, ippakkjar jew ekwivalenti Fażi mobbli (3.8): Taħlita ta’ metanol (3.3) u ilma eż. 980 + 20 (v + v). Rata ta’ tnixxija: 1 – 2 ml/min Ditettur (4.5.2) Ditettur fluworexxenti (eċitazzjoni: 295 nm/emissjoni: 330 nm) jew ditettur tal-UV (292 nm)

5.6. Kalibrar (DL-α-tocopherol acetate jew DL-α-tocopherol)

5.6.1. DL-α-tocopherol acetate standard

5.6.1.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjonita’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) f’kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (4.2.1) u idrolizza kif spjegat f’5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-petroleum ħafif (3.2) skont 5.3 u imla sa 500 ml bil-petroleum ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi sakemm jixxotta, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u erġa’ dewweb ir-residwi f’25,0 ml metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg DL-α-tocopherol acetate għal kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.1.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. Il-konċentrazzjonijiet nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg DL-α-tocopherol acetate, eż. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml u 2,28 μg/ml DL-α-tocopherol.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.1.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1)

Iddilwixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ DL-α-tocopherol acetate (3.10.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm.

L-assorbiment massimu għandu jkun f’284nm:

= 43,6 at 284 nm f’etanol

F’din it-taħlita irid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88.

5.6.2. DL-α-tocopherol standard

5.6.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol

Ittrasferixxi bil-pipetta 2 ml tas-soluzzjoni stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (3.3) u imla sal-marka bil-metanol. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg DL-α-tocopherol acetate kull ml. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu.

5.6.2.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u l-graff ta’ kalibrar

Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol f’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjonijiet ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml DL-α-tocopherol, i. e. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml DL-α-tocopherol acetate.

Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrar għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-ogħla livelli (erja). Permezz tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erja) ipplotja graff ta’ kalibrar.

5.6.2.3. Standardizzazzjoni tal-UV tas-soluzzjoni ta’ stokk ta’ tocopherol-DL-α (3.11.1)

Iddilwixxi 2,0 ml tas-soluzzjoni ta’ stokk DL-α-tocopherol (3.11.1) għal 25,0 ml b’etanol u kejjel l-ispettru tal-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu għandu jkun f’292nm:

= 75,8 at 292 nm f’etanol

F’din it-taħlita jrid jinkiseb valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6.

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun stabbilixxi l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (ikkalkolata bħala α-tocopherol acetate) b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.6.1.2 jew 5.6.2.2).

Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c = il-konċentrazzjoni tal-vitamina E (bħala α-tocopherol acetate) tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) μg/ml V1 = volum tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4), f’ml V2 = volum tal-alikwot meħud f’(5.4), f’ml m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Osservazzjonijiet

7.1. Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina E jista’ jkun utli li tikkombina l-estratti ta’ petroleum ħafif ta’ żewġ saponifikazzjonijiet-kargati (ammont miżun: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC.

7.2. Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam.

7.3. Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni.

7.4. Wara l-kejl spettrofotometriku tad-DL-α-tocopherol acetate jew tas-soluzzjoni tad-DL-α-tocopherol skont 5.6.1.3 jew 5.6.2.3 rispettivament żid bejn wieħed u ieħor 10 mg BHT (3.12) għas-soluzzjoni (3.10.1 jew 3.10.2) u żomm is-soluzzjoni fi friġġ (tul ta’ ħażna massima ta’ 4 gimgħat).

7.5. Hydroquinone jista’ jintuża minflok BHT.

7.6. Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali, is-separazzjoni ta’ α-, β-, γ- and δ-tocopherol hija possibbli.

7.7. Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 150 mg ascorbic acid minflok soluzzjoni ta’ sodium ascorbate.

7.8. Bejn wieħed u ieħor jista’ jintuża 50 mg EDTA minflok soluzzjoni ta’ sodium sulphide.

7.9. L-aċetat tal-vitamina E jidrolizza malajr taħt kundizzjonijiet alkaliniċi u għalhekk huwa sensittiv ħafna għall-ossidazzjoni, b’mod speċjali fil-preżenza ta’ elementi ta’ traċċa bħall-ħadid jew ram. Fil-każ tad-determinazzjoni ta’ vitamina E f’taħlitiet lesti minn qabel f’livelli ogħla minn 5 000 mg/kg, id-degradazzjoni tal-vitamina E tista’ tkun il-konsegwenza. għalhekk metodu HPLC inkluż diġestjoni enzimatika tal-formulazzjoni tal-vitamina E mingħajr il-fażi ta’ saponifikazzjoni bl-alkalina għandu jkun rakkomandat għall-konferma.

8. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun ma tridx tkun aktar minn 15 % fir-rigward tal-ogħla riżultat.

9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv (2)

Taħlit minn qabel Taħlit minn qabel tal-proteina Konċentrat ta’ mineral Għalf tal-proteina Qażquż L 12 12 12 12 12 n 48 48 48 48 48 medja [mg/kg] 17 380 1 187 926 315 61,3 sr [mg/kg] 384 45,3 25,2 13,0 2,3 r [mg/kg] 1 075 126,8 70,6 36,4 6,4 CVr [ %] 2,2 3,8 2,7 4,1 3,8 sR mg/kg] 830 65,0 55,5 18,9 7,8 R [mg/kg] 2 324 182,0 155,4 52,9 21,8 CVR [ %] 4,8 5,5 6,0 6,0 12,7

L = numru ta’ laboratorji n = numru ta’ valuri singoli sr = devjazzjoni standard tar-ripetibilità sR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità r = ripetibilità R = riproduċibilità CVr = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità CVR = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

(C) DETERMINAZZJONI TA’ OLIGOELEMENTI – ĦADID, RAM, MANGANIŻ U ŻINGU

1. Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu stabbiliti l-elementi traċċa ta’ ħadid, ram, manganiż u żingu fl-għalf. Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni huma:

— ħadid (Fe): 20 mg/kg

— ram (Cu): 10 mg/kg

— manganiż (Mn): 20 mg/kg

— żingu (Zn): 20 mg/kg

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrokloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ram, manganiż u żingu jiġu stabbiliti, wara dilwizzjoni xierqa, bl-atomic absorption spectrometry.

3. Reaġenti

Kummenti ta’ introduzzjoni

Għall-preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles mill-cations li għandhom jiġu stabbiliti, akkwistati jew b’distillar doppju tal-ilma jew f’tazza tal- borosilicate jew lampik tal-kwartz jew bi trattament doppju fuq raża ta’ skambju ta’ jonji.

Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku. Il-ħelsien mill-element li għandu jiġi stabbilit għandu jkun ivverifikat f’esperiment blank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom jiġu ppurifikati aktar.

Minflok is-soluzzjonijiet standard deskritti hawn taħt, jistgħu jintużaw soluzzjonijiet standard kummerċjali diment li dawn ikunu garantiti u jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu.

3.1. Aċidu idrokloriku. (d:1,19 g/ml).

3.2. Aċidu idrokloriku. (6 mol/litru).

3.3. Aċidu idrokloriku. (0,5 mol/litru).

3.4. Aċidu idrofluworiku 38 sa 40 % (v/v) li jkollu element ta’ kontenut ta’ ħadid (Fe) ta’ inqas minn 1 mg/litru u residwu wara l-evaporazzjoni ta’ inqas minn 10 mg (bħala sulfat)/litru

3.5. Aċidu sulfuriku. (d: 1,84 g/ml).

3.6. Perossidu tal-idroġenu. (bejn wieħed u ieħor 100 volum ta’ ossiġenu (30 % bil-piż)).

3.7. Soluzzjoni standard tal-ħadid (1 000 μg Fe/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: dewweb 1g ta’ fil tal-ħadid f’200 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), żid 16 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (3.6) u żid sa litru bl-ilma.

3.7.1. Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-ħadid (100 μg Fe/ml) ippreparata billi parti waħda tas-soluzzjoni standard (3.7) tiġi dilwita ma’ 9 partijiet ilma.

3.8. Soluzzjoni standard tar-ram (1 000 μg Cu/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ram f’għamla ta’ trab (a.p.) fi 25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), żid 5 ml ta’ perossidu tal-idroġenu (3.6) u żid sa litru bl-ilma

3.8.1. Soluzzjoni ta’ ħidma standard tar-ram (10 μg Cu/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.8) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.9. Soluzzjoni standard tal-manganiż (1 000 μg Mn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ta’ manganiż f’għamla ta’ trab f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.9.1. Soluzzjoni ta’ ħidma standard tal-manganiż (10 μg Mn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.9) ma’ 9 partijiet ta’ ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni li tirriżulta ma’ 9 partijiet ilma.

3.10. Soluzzjoni standard taż-żingu (1 000 μg Zn/ml) ippreparata kif ġej jew soluzzjoni ekwivalenti disponibbli kummerċjalment: — dewweb 1 g ta’ żingu f’għamla ta’ strixxa jew folja f’25 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

3.10.1. Soluzzjoni standard taż-żingu (10 μg Zn/ml) ippreparata bid-dilwizzjoni ta’ parti 1 tas-soluzzjoni standard (3.10) ma’ 9 partijiet ilma u wara ħallat parti 1 mis-soluzzjoni riżultanti ma’ 9 partijiet ta’ ilma.

3.11. Soluzzjoni ta’ klorur tal-lantanu: dewweb 12 g ta’ ossidu tal-lantanu f’150 ml ilma, żid 100 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2), u żid sa litru bl-ilma.

4. Apparat

4.1. Muffle furnace b’regolatur tat-temperatura u preferibbilment b’reġistru.

4.2. L-apparat tal-ħġieġ għandu jkun tat-tip ta’ borosilikat reżistenti u huwa rrakomandat li jintuża apparat li jkun riżervat esklussivament għad-determinazjoni ta’ elementi ta’ traċċa.

4.3. Atomic absorption spectrophotometer li jissodisfa l-ħtiġiet tal-metodu fir-rigward tas-sensittività u preċiżjoni fil-medda meħtieġa.

5. Proċedura (3)

5.1. Kampjuni li fihom materjal organiku

5.1.1. L-irmied u l-preparazzjoni tas-soluzzjoni għal analiżi (4)

5.1.1.1. Poġġi 5 sa 10 g ta’ kampjun miżun sal-eqreb 0,2 mg fi griġjol tal-kwartz jew tal-platinum (ara n-Nota (b)), nixxef f’forn f’105 oC u daħħal il-griġjol fil-muffle furnace kiesaħ (4.1). Agħlaq il-forn (ara n-Nota (c)) u gradwalment tella’ t-temperatura għal 450 sa 475 oC f’ħin ta’ 90 minuta. Żomm din it-temperatura għal 4 sa 16-il siegħa (eż. matul il-lejl) biex tneħħi l-materjal faħmi u imbagħad iftaħ il-forn u ħallih jibred (ara Nota (d)). Xarrab l-irmied bl-ilma u poġġihom f’beaker ta’ 250 ml. Aħsel il-griġjol b’total ta’ madwar 5 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1) u żid dan tal-aħħar bil-mod u b’attenzjoni fil-beaker (jista’ jkun hemm reazzjoni vigoruża minħabba l-formazzjoni tad-CO2). Żid l-aċidu idrokloriku (3.1) bit-taqtir b’aġitazzjoni sakemm l-effervexxenza tieqaf għal kollox. Evapora sakemm jixxotta, waqt li kultant tħawwad b’virga tal-ħġieġ. Wara żid 15 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2) mar-residwu segwit b’madwar 120 ml ilma. Ħawwad bil-virga tal-ħġieġ, li għandha titħalla fil-beaker, u għatti t-tazza b’watch-glass. Wassal bil-mod sat-togħlija u żomm il-punt tat-togħlija sakemm ebda rmied ma jkun jidher jinħall iktar. Iffiltra fuq karta tal-filtru ħielsa minn kull irmied u iġbor il-filtrat f’kunjett volumetriku ta’ 250 ml. Aħsel il-beaker u iffiltra b’5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku jaħraq (3.2) u darbtejn b’ilma jagħli. Imla l-kunjett volumetriku sal-marka bl-ilma (konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru).

5.1.1.2. Jekk ir-residwu fil-filtru jidher iswed (karbonju), erġa’ poġġih fil-forn u agħmlu mill-ġdid f’irmied f’450 sa 475 oC. Dan il-proċess ta’ rmied, li jeħtieġ biss ftit sigħat (madwar tlieta sa ħames sigħat), ikun intemm meta l-irmied jidher abjad jew kważi abjad. Dewweb ir-residwu f’madwar 2 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1), evapora sakemm jixxotta u żid 5 ml ta’ 6 mol/litru aċidu idrokloriku (3.2). Saħħan, iffiltra s-soluzzjoni fil-kunjett volumetriku u imla sal-marka b’ilma (Konċentrazzjoni tal-HCl madwar 0,5 mol/litru). Noti: (a) Fid-determinazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa huwa importanti li toqgħod attent għar-riskji ta’ kontaminazzjoni, b’mod partikolari b’żingu, ram u ħadid. għal din ir-raġuni, it-tagħmir użat fil-preparazzjoni tal-kampjuni għandu jkun ħieles minn dawn il-metalli. Biex jitnaqqas ir-riskju ġenerali ta’ kontaminazzjoni, aħdem f’atmosfera ħielsa mit-trab b’tagħmir skrupolużament nadif u apparat tal-ħġieġ maħsul b’galbu. Id-determinazzjoni ta’ żingu hija partikolarment sensittiva għal ħafna tipi ta’ kontaminazzjoni, eż. minn apparat tal-ħġieġ, reaġenti, trab, eċċ. (b) Il-piż tal-kampjun li jkun jeħtieġ li jsir irmied huwa kkalkolat mill-kontenut approssimattiv ta’ elementi ta’ traċċa tal-għalf fir-rigward tas-sensittività tal-ispettrofotometru użat. għal ċertu għalf li jkollu ftit elementi ta’ traċċa, jista’ jkun meħtieġ li tibda b’kampjun ta’ 10 sa 20 g u żżid għal soluzzjoni finali ta’ 100 ml biss. (ċ) L-operazzjoni ta’ rmied għandha titwettaq f’forn magħluq mingħajr dħul ta’ arja jew ossiġenu. (d) It-temperatura indikata mil-pijrometru m’għandhiex tkun aktar minn 475 oC.

5.1.2. Determinazzjoni spettrofotometrika

5.1.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar

Għal kull wieħed mill-elementi li jeħtieġ jiġi determinat, ipprepara mis-soluzzjonijiet standard tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 medda ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kalibrata jkollha konċentrazzjoni ta’ HCl ta’ madwar 0,5 mol/litru u (fil-każijiet ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ lanthanum chloride ekwivalenti għal 0,1 % La (w/v).

Il-konċentrazzjonijiet ta’ elementi ta’ traċċa magħżula jridu jkunu fil-medda ta’ sensittività tal-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, permezz ta’ eżempju, il-kompożizzjoni ta’ meded tipiċi ta’ soluzzjonijiet ta’ kalibrar; iżda jiddependi fuq it-tip u s-sensittività tal-ispettrofotometru wżat jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħrajn.

Ħadid

μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Ram

μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.8.1) (1 ml = 10 μg Fe) 0 1 2 4 6 8 10 ml HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8

Manganiż

μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

Żingu

μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml soluzzjoni standard tax-xogħol (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u żid sa 100 ml bl-ilma

5.1.2.2. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni għal analiżi

Għad-determinazzjoni ta’ ram, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tintuża direttament. Jekk meħtieġ, sabiex twassal il-konċentrazzjoni tagħha fi ħdan il-medda tas-soluzzjonijiet tal-kalibrar, porzjon alikwot jista’ jkun imseffed f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml u miżjud sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3).

Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, seffed porzjon alikwot tas-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 f’kunjett volumetriku ta’ 100 ml, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) u wassal sal-marka bi 0,5 mol/litru aċidu idrokloriku (3.3) ara wkoll punt 8 “Osservazjoni”).

5.1.2.3. Esperiment blank

L-esperiment blank għandu jinkludi l-passi kollha stabbiliti fil-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun jitħalla barra. Is-soluzjoni tal-kalibrar “0” m’għandhiex tintuża bħala l-blank.

5.1.2.4. Kejl tal-assorbiment atomiku

Kejjel l-assorbiment atomiku tal-soluzzjonijiet tal-kalibrar u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma tal-aċitelena ta’ ossiġinazzjoni tal-arja f’dawn il-“wavelengths” segwenti:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Wettaq kull kejl erba’ darbiet.

5.2. Għalf minerali

Jekk il-kampjun ma jkun fih ebda materjal organiku, m’hemmx għalfejn issir l-operazzjoni ta’ rmied qabel. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1.1. billi tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni bil-hydrofluoric acid tista’ titħalla barra.

6. Kalkolu tar-riżultati

Permezz ta’ kurva ta’ kalibrar, ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ elementi ta’ traċċa fis-soluzzjoni li għandha tiġi analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ elementi ta’ traċċa għal kull kilogramma tal-kampjun (ppm).

7. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jaqbżu:

— 5 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-element ta’ traċċa kkonċernat sa massimu ta’ 50 mg/kg;

— 10 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 50 u sa massimu 100 mg/kg;

— 10 mg/kg, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati minn 100 u sa massimu ta’ 200 mg/kg;

— 5 % tal-ogħla riżultat għall-kontenuti tal-elementi ta’ traċċa kkonċernati aktar minn 200 mg/kg.

8. Osservazzjoni

Il-preżenza ta’ kwantitajiet kbar ta’ fosfati tista’ tfixkel id-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu. Interferenza bħal din għandha tiġi kkoreġuta biż-żieda ta’ soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11). Jekk, madankollu, fil-kampjun, il-proporzjon tal-piż Ca + mg/P huwa > 2, iż-żieda tas-soluzzjoni ta’ lanthanum chloride (3.11) mas-soluzzjoni għall-analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrar tista’ titħalla barra.

(D) DETERMINAZZJONI TA’ HALOFUGINONE

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide

1. Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ halofuginone fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 1 mg/kg.

2. Prinċipju

Wara t-trattament b’ilma jaħraq, halofuginone jiġi estratt bħala l-bażi libera fl-ethyl acetate u sussegwentament imqassam bħala l-hydrochloride f’soluzzjoni ta’ aċidu milwiem. Dan l-estratt jiġi ppurifikat bi kromotografia tal-iskambju tal-jonji. Il-kontenut tal-halofuginone huwa ddeterminat bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC/MGKL) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3. Reaġenti

3.1. Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.2. Amberlite XAD-2 resin

3.3. Ammonium acetate

3.4. Ethyl acetate

3.5. Aċidu aċetiku, inġazzat

3.6. Sustanza standard tal-halofuginone (DL-trans-7-brome-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl] quinazoline-4-(3H)-one hydrobromide, E 764)

3.6.1. Soluzzjoni standard ta’ stokk ta’ halofuginone, 100 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ halofuginone (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, dewweb f’soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18), żid sal-marka bis-soluzzjoni buffer u ħawwad. Din it-taħlita tibqa’ stabbli għal tliet ġimgħat f’5 oC jekk merfugħa fid-dlam.

3.6.2. Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti ikkalibrati ta’ 100 ml, ittrasferixxi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.21) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom konċentrazzjonijiet ta’ 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 u 6,0 mg/ml ta’ halofuginone rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.7. Aċidu idrokloriku (ρ20 bejn wieħed u ieħor 1,16 g/ml).

3.8. Metanol

3.9. Silver nitrate

3.10. Sodium ascorbate

3.11. Sodium carbonate

3.12. Sodium chloride

3.13. EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt)

3.14. Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.15. Soluzzjoni ta’ sodium carbonate, c = 10 g/100 ml

3.16. Soluzzjoni ta’ sodium chloride-sodium carbonate saturata, c = 5 g/100 ml Dewweb 50 g ta’ sodium carbonate (3.11) fl-ilma, iddilwa sa 1 l u żid bil-klorur tas-sodju (3.12) sakemm is-soluzzjoni tkun saturata.

3.17. Aċidu idrokloriku, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Iddilwixxi 10 ml ta’ HCl (3.7) bl-ilma sa 1 l.

3.18. Soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate, bejn wieħed u ieħor 0,25 mol/l Dewweb 19,3 g ammonium acetate (3.3) u 30 ml aċidu aċetiku (3.5) fl-ilma (3.14) u ddilwixxi sa 1 l.

3.19. Preparazzjoni ta’ amberlite XAD-2 raża Aħsel kwantità xierqa ta’ Amberlite (3.2) bl-ilma sakemm il-joni tal-klorur kollha jitneħħew, kif indikat b’test tas-silver nitrate (3.20) magħmul fuq il-fażi milwiema mwarrba. Imbagħad aħsel ir-raża b’50 ml metanol (3.8), armi l-metanol u żomm ir-raża taħt il-metanol frisk.

3.20. Soluzzjoni tas-silver nitrate, bejn wieħed u ieħor 0,1 mol/l Dewweb 0,17 g ta’ silver nitrate (3.9) f’10 ml ilma.

3.21. Fażi mobbli HPLC Ħallat 500 ml aċetronil (3.1) ma’ 300 ml ta’ soluzzjoni buffer tal-ammonium acetate (3.18) u 1 200 ml tal-ilma (3.14). Aġġusta l-pH għal 4,3 billi tuża l-aċidu aċetiku (3.5). Iffiltra minn filtru ta’ 0,22 m (4.8) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). Din is-soluzzjoni tibqa’ stabbli għal xahar, jekk tinħażen fid-dlam f’reċipjent magħluq.

4. Apparat

4.1. Banju ultrasoniku

4.2. Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.3. Ċentrifuga

4.4. Tagħmir tal-HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur diode-array.

4.4.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi, ippakkjar ta’ 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm, jew kolonna ekwivalenti

4.5. Kolonna tal-ħġieġ (300 mm × 10 mm) mgħammra b’filtru tal-ħġieġ sileċju bi stopcock

4.6. Filtri tal-fibra tal-ħġieiġ, b’dijametru ta’ 150 mm

4.7. Filtri tal-membrana, 0,45 μm

4.8. Filtri tal-membrana, 0,22 μm

5. Proċedura

Nota Halofuginone bħala l-bażi libera huwa instabbli fis-soluzzjonijiet alkalini u tal-ethyl acetate. M’għandux jibqa’ fl-ethyl acetate għal iżjed minn 30 minuta.

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf blank għandu jiġi analizzat għall-verifika li la halofuginone u lanqas is-sustanzi interferenti ma jkunu preżenti.

5.1.2. Għandu jitwettaq test tal-irkupru billi jiġi analizzat l-għalf blank li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ halofuginone, simili għal dak preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ sa livell ta’ 3 mg/kg, żid 300 μl tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.6.1) sa 10 g tal-għalf blank, ħallat u stenna għal 10 minuti qabel ma tipproċiedi bil-pass tal-estrazzjoni (5.2). Nota: għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u fl-analiżi m’għandux jinstab halofuginone.

5.2. Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,1 g, 10 g mill-kampjun ippreparat, ġewwa tubu ċentrifugu tal-200 ml, żid 0,5 g ta’ sodium ascorbate (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) u 20 ml ilma u ħawwad. Qiegħed it-tubu għal 5 minuti f’banju bl-ilma (80 oC). Wara li jibred għat-temperatura ambjentali, żid 20 ml ta’ taħlita tas-sodium carbonate (3.15) u ħawwad. Żid minnufih 100 ml tal-ethyl acetate (3.4) u ħawwad bis-saħħa bl-idejn għal 15 il-sekonda. Imbagħad qiegħed it-tubu għal tliet minuti fil-banju ultrasoniku (4.1) u ħoll ftit it-tapp. Iċċentrifuga għal żewġ minuti u ferra’ l-fażi tal-ethyl acetate minn filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.6), għal f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml. Irrepeti l-estrazzjoni tal-kampjun bit-tieni porzjon ta’ 100 ml tal-ethyl acetate. Aħsel l-estratti miġmugħin għal minuta b’50 ml ta’ soluzzjoni ta’ sodium chloride saturated sodium carbonate (3.16) u armi s-saff milwiem.

Islet is-saff organiku għal minuta (1) b’50 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.17). għaddi s-saff aċiduż il-baxx f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 250 ml. Erġa’ islet is-saff organiku għal 1,5 minuti b’50 ml ieħor ta’ aċidu idrokloriku u għaqqad mal-ewwel estratt. Aħsel l-estratti magħqudin billi ddawwar għal bejn wieħed u ieħor 10 sekondi ma’ 10 ml tal-ethyl acetate (3.4).

Ittrasferixxi b’mod kwantitattiv is-saff milwiem għal kunjett b’qiegħ tond ta’ 250 ml u armi l-fażi organika. Evapora l-ethyl acetate kollu li jkun baqa’ mit-taħlita aċiduża bl-użu tal-evaporatur bil-pelikola rotanti (4.2). It-temperatura tal-banju bl-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Taħt vakwu ta’ bejn wieħed u ieħor of 25 mbar l-ethyl acetate kollu li jifdal għandu jitneħħa fi żmien 5 minuti fi 38 oC.

5.3. Tindifa

5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna tal-Amberlit

Kolonna XAD-2 tiġi ppreparata għal kull estratt tal-kampjun. Ittrasferixxi 10 g tal-Amberlit ippreparat (3.19) f’kolonna tal-ħġieġ (4.5) bil-metanol (3.8). Żid plagg żgħir tas-suf tal-ħġieġ mal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Battal il-metanol mill-kolonna u aħsel ir-raża b’100 ml ilma, filwaqt li twaqqaf in-nixxija hekk kif il-likwidu jilħaq il-parti tal-wiċċ tas-sodda tar-raża. Ħalli l-kolonna tekwilibra ruħha għal 10 minuti qabel l-użu. Qatt tħalli l-kolonna tixxotta.

5.3.2. Tindif tal-kampjun

Ittrasferixxi l-estratt (5.2) b’mod kwantitattiv lejn il-wiċċ tal-kolonna tal-Amberlit ippreparat (5.3.1) u saffi, filwaqt li twarrab it-tisfija. Ir-rata tat-tisfija m’għadhiex tkun aktar minn 20 ml/min. Laħlaħ il-kunjett bil-qiegħ tond b’20 ml hydrochlorid acid (3.17) u uża dan biex tlaħlaħ il-kolonna tar-raża. Onfoħ il-barra b’nixxija ta’ arja xi taħlita aċiduża li tkun baqgħet. Armi l-likwidu użat fil-ħasil. Żid 100 ml metanol (3.8) mal-kolonna u ħalli 5 sa 10 ml tal-ħasil, filwaqt li tiġbor is-soluzzjoni tal-ħasil f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Ħalli l-metanol li jkun baqa’ jekwilibra mar-raża għal 10 minuti u kompli t-tlaħliħ b’rata li ma taqbiżx 20 ml/min, u iġbor it-tlaħliħ fl-istess kunjett bil-qiegħ tond. Evapora l-metanol fuq l-evaporatur tal-pellikola rotanti (4.2), it-temperatura tal-banju tal-ilma m’għandiex tkun aktar minn 40 oC. Ittrasferixxi l-fdal b’mod kwantitattiv f’kunjett ikkalibrat ta’ 10 ml billi tuża l-fażi mobbli (3.21). Wassal sal-marka bil-fażi mobbli u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn filtru tal-membrana (4.7). Aħżen din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4. Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet segwenti huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn basta dawn jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli HPLC (3.21),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/min.

Wavelength tad-ditezzjoni: 243 nm

Volum tal-injezzjoni: 40 sa 100 μl.

Ivverifika l-istabbilità tas-sistema kromatografika, bl-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 3,0 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli (jew erjas) u ż-żmien ta’ żamma kostanti.

5.4.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) bosta drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar bl-użu tal-aqwa għoljiet jew żoni tal-medja tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg għal kull ml bħala l-axxiżi.

5.4.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum bħal dak meħud għas-soluzzjoni tal-kalibrar u iddetermina l-medja tal-għoli tal-ogħla livelli (iż-żona) tal-halofuginone.

6. Kalkolu tar-riżultati

Iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, mill-medja tal-għoli (erja) tal-ogħla livelli ta’ halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun bis-soluzzjoni kampjun b’referenza għall-graff tal-kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut tal-halofuginone w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c : konċentrazzjoni tal-halofuginone tas-soluzzjoni tal-kampjun fi μg/ml, m : piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tista’ tiġi ikkonfermata b’ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ dittetur tad-diode-array li bih huma mqabbla l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2) li fiha 6,0 μg/ml.

7.1.1. Ko-kromatografija

Estratt tal-kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.6.2). L-ammont ta’ halofuginone miżjud għandu jkun simili għal-ammont ikkalkolat ta’ halofuginone misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-halofuginone miżjud biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jitiqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll it-taħlit tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli masimu, għandha tkun madwar ± 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2. Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a) il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni tad-diode-array, din hija tipikament fi ħdan ± 2 nm;

(b) bejn 225 u 300 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard;

(c) bejn 225 u 300 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex tkun aktar minn 0,5 mg/kg għall-kontenut ta’ halofuginone sa 3 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (5) li fih ġew analizzati tliet kampjuni minn tmien laboratorji.

Riżultati

Kampjun A (blank) Mal-wasla Kampjun B (Mitħun) Kampjun C(Pritkuni) Mal-wasla Wara xahrejn Mal-wasla Wara xahrejn Medja [mg/kg] ND 2,80 2,42 2,89 2,45 SR [mg/kg] — 0,45 0,43 0,40 0,42 CVR [ %] — 16 18 14 17 Rec. [ %] 86 74 88 75

ND = mhux rilevat SR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità CVR = ko-effiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità ( %) Rec. = irkupru ( %)

E. DETERMINAZZJONI TA’ ROBENIDINE

1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride

1. Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġu ddeterminati l-livelli ta’ robenidine fl-għalf. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni huwa 5 mg/kg.

2. Prinċipju

Il-kampjun huwa estratt b’metanol aċidifikat. L-estratt jitnixxef u porzjon alikwot ikun soġġett għal tindifa sewwa fuq kolonna tal-ossidu tal-aluminju. Robenidine jitneħħa bil-ħasil mill-kolonna bil-metanol, konċentrat, u miżjud sa volum xieraq b’fażi mobbli. Il-kontenut ta’ robenidine jiġi stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja (HPLC – High performance liquid chromatography) b’fażi riversjata bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3. Reaġenti

3.1. Metanol

3.2. Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 4,0 ml aċidu idrokloriku (ρ20 = 1,18 g/ml) f’kunjett iggradat ta’ 500 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.1) u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha titħejja friska qabel l-użu.

3.3. Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.4. Passatur molekulari Tat-tip 3A, minn 8 sa 12-il malja (malji ta’ 1,6 – 2,5 mm, alumino-silicate kristallin, dijametru tal-pori 0,3 mm).

3.5. Attività aċiduża tal-ossidu tal-aluminju grad I tal-kromatografija b’kolonna Ittrasferixxi 100 g ossidu tal-aluminju f’kontenitur adatt u żid 2,0 ml ilma. Poġġi t-tapp u ħawwad għal bejn wieħed u ieħor 20 minuta. Aħżen f’kontenitur li għandu t-tapp magħluq sew.

3.6. Soluzzjoni tal-potassium dihydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,40 g ta’ potassium dihydrogen phosphate fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka u ħawwad.

3.7. Soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate, c = 0,025 mol/l Dewweb 3,55 g ta’ di-sodium hydrogen phosphate anidru (jew 4,45 g ta’ dihydrate jew 8,95 g ta’ dodecahydrate) fl-ilma (grad HPLC) f’kunjett iggradat ta’ 1 l, żid sal-marka u ħawwad.

3.8. Fażi mobbli tal-HPLC Ħawwad flimkien ir-reaġenti li ġejjin: 650 ml acetonitrile (3.3), 250 ml ilma (ekwivalenti għall-grad tal-HPLC), 50 ml soluzzjoni tal-potassium di-hydrogen phosphate (3.6), 50 ml soluzzjoni tad-di-sodium hydrogen phosphate (3.7). Għaddi minn filtru ta’ 0,22 μm (4.6) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni, (eżempju permezz ta’ ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti).

3.9. Sustanza standard Robenidine pur: 1,3-bis [(4-chlorobenzylidene)amino]guanidine – hydrochloride.

3.9.1. Soluzzjoni ta’ stokk standard ta’ Robenidine: 300 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 30 mg ta’ sustanza standard ta’ robenidine (3.9). Dewweb f’metanal aċidifikat (3.2) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.2. Soluzzjoni standard intermedjarja ta’ Robenidine: 12 μg/ml Ittrasferixxi 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 250 ml, żid sal-marka b’fażi mobbli (3.8) u ħawwad. geżwer il-kunjett bil-fojl tal-aluminju u aħżen f’post mudlam.

3.9.3. Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti kkalibrati ta’ 50 ml, ittrasferixxi 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 u 25,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedja (3.9.2). Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.8) u ħawwad. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 u 6,0 μg/ml ta’ robenidine rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew b’mod frisk qabel l-użu.

3.10. Ilma ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4. Apparat

4.1. Kolonna tal-ħġieġ Mibnija mill-ħġieġ tal-ambra mgħamra bi stopcock u b’reċipjent li jesa’ bejn wieħed u ieħor 150 ml, dijametru intern ta’ 10 sa 15 mm, tul ta’ 250 mm.

4.2. Shaker mekkaniku jew stirrer manjetika

4.3. Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.4. Tagħmir HPLC b’ditettur tal-ultravjola b’wavelength varjabbli jew ditettur tad-diode array li jaħdem fil-medda ta’ bejn 250 u 400 mm

4.4.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi: ippakkjar 300 mm × 4 mm, C18 10 μm jew ekwivalenti

4.5. Karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman gF/A jew ekwivalenti)

4.6. Filtri tal-membrana, 0,22 μm

4.7. Filtri tal-membrana, 0,45 μm

5. Proċedura

Nota: Robenidine huwa sensittiv għad-dawl. għandhom jintużaw oġġetti tal-ħġieġ tal-ambra fl-operazzjonijiet kollha.

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf blank għandu jkun analizzat biex ikun iċċekkjat li la robenidine u lanqas is-sustanzi li jikkaġunaw interferenza ma jkunu preżenti.

5.1.2. Għandu jsir eżami ta’ rkuprar billi ssir analiżi tal-għalf blank (5.1.1) li jkun ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ robenidine, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 60 mg/kg, ittrasferixxi 3,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.9.1) f’kunjett konikali tal-250 ml. Evapora s-soluzzjoni sa c. 0,5 ml fi fluss tan-nitroġenu. Żid 15 g tal-għalf blank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi għall-pass tal-estrazzjoni (5.2). Nota: Għall-għanijiet ta’ dan il-metodu, l-għalf blank għandu jkun tat-tip simili għal dak tal-kampjun u mill-analiżi robenidine m’għandux jinstab.

5.2. Estrazzjoni

Iżen sal-eqreb 0,01g, bejn wieħed u ieħor 15 g tal-kampjun ippreparat. Ittrasferixxi għal kunjett konikali ta’ 250 ml u żid 100,0 ml ta’ metanal aċidifikat (3.2), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker (4.2). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.5) u iġbor il-filtrat kollu f’kunjett konikali ta’ 150 ml. Żid passatur molekulari ta’ 7,5 g (3.4), agħlaq bit-tapp u ħawwad għal ħames minuti. Iffiltra minnufih minn karta filtru tal-fibra tal-ħġieġ. Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (5.3).

5.3. Purifikazzjoni

5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna ta’ aluminium-oxide

Daħħal plagg żgħir ta’ suf tal-ħġieġ fil-parti t’isfel tal-kolonna tal-ħġieġ (4.1) u għafsu l-isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ. Iżen 11,0 g tal-aluminium oxide ippreparat (3.5) u ttrasferixxi fil-kolonna. għandha tingħata attenzjoni biex titnaqqas kemm jista’ jkun l-espożizzjoni għall-arja matul din il-fażi. Taptap bil-mod il-kolonna mgħobbija fil-parti t’isfel tagħha biex l-aluminium-oxide joqgħod.

5.3.2. Purifikazzjoni tal-kampjun

Ittrasferixxi fil-kolonna bil-pipetta 5,0 ml tal-estratt tal-kampjun ippreparat f’(5.2). Serraħ il-ponta tal-pipetta qrib il-ħajt tal-kolonna u ħalli s-soluzzjoni tkun assorbita fuq l-aluminium oxide. Neħħi bil-ħasil robenidine mill-kolonna billi tuża 100 ml methanol (3.1), b’rata ta’ fluss ta’ 2 sa 3 ml/minuta u iġbor is-soluzzjoni li titneħħa f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ 250 ml. Evapora s-soluzzjoni tal-metanol sakemm jinxef taħt pressjoni mnaqqsa f’40 oC permezz ta’ evaporatur b’pellikola rotanti (4.3). Erġa’ dewweb ir-residwu f’3 sa 4 ml ta’ fażi mobbli (3.8) u ttrasferixxi b’mod kwantitattiv f’kunjett iggradat ta’ 10 ml. Laħlaħ il-kunjett b’diversi porzjonijiet ta’ 1 sa 2 ml tal-fażi mobbli u ttrasferixxi dawn it-tlaħliħiet fil-kunjett iggradat. Żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn 0,45 mm (4.7). Erfa’ din is-soluzzjoni għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4).

5.4. Determinazzjoni tal-HPLC

5.4.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, kundizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.4.1),

Fażi mobbli tal-HPLC (3.8),

Rata ta’ tnixxija: 1,5 sa 2 ml/minuta,

Wavelength tad-ditettur: 317 nm,

Volum tal-injezzjoni: 20 sa 50 μl.

Ikkontrolla l-istabbiltà tas-sistema kromatografika, billi tinjetta s-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) li fiha 3,6 μg/ml għal diversi drabi, sakemm jintlaħqu l-ogħla livelli u l-ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.4.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3) diversi drabi u kejjel l-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja l-kurva tal-kalibrar bl-użu tal-medja tal-ogħla livelli jew erjas tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’mg għal kull ml bħala axxiżi.

5.4.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratt tal-kampjun (5.3.2) diversi drabi, billi tuża l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrar u ddetermina l-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli tar-robenidine.

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-għoli medju (erja) tal-ogħla livelli ta’ robenidine tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrar (5.4.2).

Il-kontenut ta’ robenidine w (mg/kg) fil-kampjun huwa mogħti bil-formula segwenti:

fejn:

c = il-konċentrazzjoni ta’ robenidine tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml, m = piż tal-porzjoni tat-test fi grammi.

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tistà tigi kkonfermata b'ko-kromatografija, jew bl-użu ta’ ditettur diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.9.3) li fiha 6 μg/ml.

7.1.1. Ko-kromatografija

Estratt kampjun jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq tas-soluzzjoni ta’ kalibrar (3.9.3). L-ammont ta’ robenidine miżjud għandu jixbaħ lill-ammont stmat ta’ robenidine misjub fl-estratt tal-kampjun.

L-għoli tal-ogħla livell ta’ robenidine biss għandu jiżdied wara li jitqiesu kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħal livell, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali.

7.1.2. Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a) il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettri standard, irreġistrat fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġni stabbilit mis-saħħa tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni diode-array, din tipikament hija bejn wieħed u ieħor fi ħdan 2 nm;

(b) bejn 250 u 400 nm, il-kampjun u l-ispettri standard reġistrati fl-ogħla livell fuq il-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru ‘fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju huwa ssodisfat meta l-istess maxima jkunu preżenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spettri ma tkun aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-analit standard;

(c) bejn 250 u 400 nm, l-ispettri tal-parti ’il fuq, tal-apiċi u tal-parti ’l isfel tal-ogħla livell prodott mill-estratt tal-kampjun m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fi ħdan il-medda ta’ bejn 10 u 100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi ssodisfat meta jkunu preżenti l-istess maxima u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhiex taqbeż l-10 % tal-ogħla riżultat għal kontenut ta’ robenidine ogħla minn 15 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għal kampjun blank imsaħħaħ l-irkupru għandu jkun tal-anqas 85 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv tal-KE li fih, erba’ kampjuni tal-għalf tat-tjur u tal-fniek, f’forma mitħun jew ta’ pritkuni kienu analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella hawn taħt:

Tjur Fniek Mitħun Pritkuni Mitħun Pritkuni Medja [mg/kg] 27,00 27,99 43,6 40,1 sr [mg/kg] 1,46 1,26 1,44 1,66 CVr [ %] 5,4 4,5 3,3 4,1 SR [mg/kg] 4,36 3,36 4,61 3,91 CVR [ %] 16,1 12,0 10,6 9,7 Recovery [ %] 90,0 93,3 87,2 80,2

sr = devjazzjoni standard tar-ripetibilità CVr = koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % SR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità CVR = koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

(F) DETERMINAZZJONI TA’ DICLAZURIL

(+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl] acetonitrile.

1. Għan u skop

Il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ diclazuril fl-għalf u f’taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 0,1 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 0,5 mg/kg.

2. Prinċipju

Wara ż-żieda ta’ standard intern, il-kampjun jiġi estratt b’metanol aċidifikat. għall-għalf, l-alikwot tal-estratt huwa ppurifikat fuq cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 . Id-diclazuril jinħareġ mill-cartridge b’taħlita ta’ metanol aċidifikat u ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall f’DMF/ilma. għal taħlitiet lesti minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall f’DMF/ilma. Il-kontenut tad-diclazuril huwa stabbilit bi kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata b’ternary gradient (HPLC) bl-użu ta’ ditettur bl-UV.

3. Reaġenti

3.1. Ilma, ekwivalenti għall-grad ta’ HPLC

3.2. Ammonium acetate

3.3. Tetrabutylammonium hydrogen sulphate (TBHS)

3.4. Acetonitrile, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.5. Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.6. N, N-dimethylformamide (DMF)

3.7. Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Is-sustanza standard: diclazuril II-24 : (+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) phenyl] acetonitrile b’purità garantita, E771.

3.8.1. Soluzzjoni standard ta’ stokk ta' diclazuril, 500 g/ml. Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard ta’ diclazuril (3.8) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.8.2. Soluzzjoni standard Diclazuril, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9. Sustanza standard interna: 2,6 dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2 (3H) – yl) α-methylbenzene-acetonitrile

3.9.1. Soluzzjoni standard ta’ stokk interna, 500 μg/ml. Iżen sal-eqreb 0,1 mg 25 mg tas-sustanza standard interna (3.9) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.2. Soluzzjoni standard interna, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni standard interna maħżuna (3.9.1) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml, żid sal-marka b’DMF (3.6) u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.9.3. Soluzzjoni standard interna għal taħlitiet lesti minn qabel, p/1 000 mg/ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril f’taħlita lesta minn qabel f’mg/kg). Iżen sal-eqreb 0,1 mg p/10 mg tas-sustanza standard interna f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’DMF (3.6) f’banju ultrasoniku (4.6), żid sal-marka b’DMF u ħallat. geżwer il-kunjett b’fojl tal-aluminju jew uża kunjett ambra u aħżen fi friġġ. F’temperatura ta’ ≤ 4 oC is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar 1.

3.10. Is-soluzzjoni tal-kalibrar, 2 g/ml. Ippipetta 2,00 ml soluzzjoni standard ta’ diclazuril (3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2) f’kunjett iggradat ta’ 50 ml. Żid 16 ml DMF (3.6), żid sal-marka bl-ilma u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.11. Cartridge tal-estrazzjoni ta’ fażi solida C18 , e.g. Bond Elut, daqs: 1 cc, piż sorbenti: 100 mg.

3.12. Solvent tal-estrazzjoni: acidified methanol. Ippipetta 5,0 ml aċidu idrokloriku (3.7) f’1 000 ml metanol (3.5), u ħallat.

3.13. Fażi mobbli għall-HPLC

3.13.1. Elwent A: soluzzjoni ta’ ammonium acetate – tetrabutylammonium hydrogen sulphate. Dewweb 5 g ammonium acetate (3.2) u 3,4 g TBHS (3.3) f’1 000 ml ilma (3.1) u ħallat.

3.13.2. Elwent B: acetonitrile (3.4).

3.13.3. Elwent C: metanol (3.5).

4. Apparat

4.1. Shaker mekkaniku

4.2. Tagħmir għal HPLC ta’ ternary gradient

4.2.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 m, 100 mm x 4,6 mm, jew ekwivalenti.

4.2.2. Ditettur bil-UV b’aġġustament varjabbli ta’ wavelength jew ditettur diode array

4.3. Evaporatur b’pellikola li taħdem b’sistema rotanti

4.4. Filtru tal-membrana, 0,45 μm.

4.5. Manifold b’vakwu.

4.6. Banju ultrasoniku

5. Proċedura

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf blank

Għalf blank għandu jiġi analizzat sabiex jiġi kkontrollat li la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu preżenti. L-għalf blank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u fl-analiżi, la diclazuril u lanqas sustanzi interferenti m’għandhom jiġu rilevati.

5.1.2. Test tal-irkupru

Għandu jtiwettaq test tal-irkupru billi jkun analizzat l-għalf blank li jkun ġie imsaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ diclazuril simili għal dak preżenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 1 mg/kg, żid 0,1 ml tas-soluzzjoni standard ta’ stokk (3.8.1.) għal 50 g ta’ għalf blank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (5.2.).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analizzat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ diclazuril, simili għal dik diġà preżenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analizzat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2. Estrazzjoni

5.2.1. Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku ta’ 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 20 ml tas-supernatant fil-kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddilwa b’20 ml ilma. Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq cartridge tal-estrazzjoni (3.11), u għaddi minn vakwu (4.5.). Aħsel il-cartridge b’25ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 65 + 35 (V + V). Armi l-frazzjonijiet miġbura u elwixxi l-komposti b’25 ml tat-taħlita tas-solvent tal-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Dewweb ir-residwu f’1,0 ml DMF (3.6), żid 1,5 ml ilma (3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (4.4). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2. Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal kunjett koniku 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.3), 200 ml solvent tal-estrazzjoni (3.12) u agħlaq il-kunjett b’tapp. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 10 000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diclazuril fit-taħlita lesta minn qabel f’mg/kg) tas-supernatant f’kunjett bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun għadha kif laħqet il-punt tal-inxif permezz tal-evaporatur b’sistema rotanti (4.3) f’60 oC. Erġa’ dewweb ir-residwu f’10,0 ml DMF (3.6), żid 15,0 ml ilma (3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3. Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħrajn sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.

Kolonna għal kromatografija b’likwidi (4.2.1.): 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, ippakkjar ta’ 3 μm, jew simili Fażi mobbli : Elwent A (3.13.1): Soluzzjoni fl-ilma ta’ ammonium acetate u tetrabutyl-ammonium Sulfat tal-idroġenu Elwent B (3.13.2): acetonitrile Elwent C (3.13.3): metanol Mod ta’ eluzzjoni : — inklinazzjoni lineari — kundizzjonijiet inizjali: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — wara 10 minuti ggrada s-soluzzjoni għal 30 minuta għal: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Aħsel b’B għal 10 min. Rata ta’ tnixxija: 1,5 – 2 ml/min Volum tal-injezzjoni: 20 μl Wavelength tad-ditettur: 280 nm

Ikkontrolla l-istabbilità tas-sistema kromatografika billi tinjetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10), li jkun fiha 2 g/ml, sakemm jintlaħqu ogħla livelli u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2. Soluzzjoni tal-kalibrar

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) għal diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

5.3.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta 20 μl tas-soluzzjoni kampjun (5.2.1. jew 5.2.2.) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril u l-ogħla livelli standard interni.

6. Kalkolu tar-riżultati

6.1. L-Għalf

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, s = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) hi, s = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) hd, c = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) hi, c = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) cd, c = il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni ta’ kalibrar f’g/ml (3.10) m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g. V = il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml)

6.2. Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut ta’ diclazuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

hd, c = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) hi, c = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10) hd, s = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) ta’ diclazuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) hi, s = l-ogħla parti tal-ogħla livell (erja) tal-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) cd, c = il-konċentrazzjoni ta’ diclazuril fis-soluzzjoni tal-kalibrar f’μg/ml (3.10) m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g. V = il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 (jiġifieri 25 ml) p = il-kontenut nominali ta’ diclazuril fi mg/kg fit-taħlita lesta minn qabel

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

L-identità tal-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża ditettur ta’ diode-array li bih jitqabblu l-ispettri tal-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10).

7.1.1. Ko-kromatografija

Kampjun estratt (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrar (3.10). L-ammont ta’ diclazuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diclazuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun

L-għoli tal-ogħla livell ta’ diclazuril u l-ogħla livell tal-istandard intern biss għandhom jitjiebu wara li jiġu kkunsidrati kemm l-ammont miżjud kif ukoll id-dilwizzjoni tal-estratt. Il-wisa’ tal-ogħla livell, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-ogħla livell tad-diclazuril jew tal-ogħla livell tal-istandard intern tal-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ.

7.1.2. Ditezzjoni b’diode-array

Ir-riżultati huma evalwati skont il-kriterji li ġejjin:

(a) Il-wavelength tal-assorbiment massimu tal-kampjun u tal-ispettra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-ogħla livell fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’marġini determinata bis-saħħa tar-riżoluzzjoni tas-sistema ta’ ditezzjoni. għad-ditezzjoni b’diode array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm.

(b) Bejn 230 u 320 nm, il-kampjun u l-ispettri standard irreġistrati fl-apiċi tal-ogħla livell tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta’ devjazzjoni bejn iż-żewġ spettra ma għandu jaqbeż 15 % tal-assorbiment tal-analit standard.

(c) Bejn 230 u 320 nm, l-ispettri tal-parti tiela’ ’l fuq, tal-apiċi u tal-parti nieżla ’l isfel tal-ogħla livell prodotti mill-kampjun tal-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispettru fil-medda ta’ 10-100 % tal-assorbiment relattiv. Dan il-kriterju jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati, id-devjazzjoni bejn l-ispettri ma tkunx aktar minn 15 % tal-assorbiment tal-ispettru tal-ogħla apiċi.

Jekk wieħed minn dawn il-kriterji ma jkunx ġie sodisfatt, il-preżenza tal-analit ma tkunx ġiet ikkonfermata.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

— 30 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril minn 0,5 mg/kg sa 2,5 mg/kg

— 0,75 mg/kg għall-kontenuti ta’ diclazuril bejn 2,5 mg/kg u 5 mg/kg

— 15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ diclazuril ta’ aktar minn 5 mg/kg

7.3. Irkupru

Għal kampjun imsaħħaħ (blank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv li fih ġew analizzati 5 kampjuni minn 11-il laboratorju. Dawn il-kampjuni kienu jikkonsistu minn żewġ taħlitiet lesti minn qabel; waħda kienet imħallta b’matriċi organika (O 100) u l-oħra b’matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diclazuril għal kull kg. It-tliet taħlitiet tal-għalf għat-tjur saru minn 3 produtturi differenti (NL) (L1/Z1/K1). Il-kontenut teoretiku huwa 1 mg diclazuril għal kull kg. Il-laboratorji ngħataw struzzjonijiet biex janalizzaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinstab fil-Journal of AOAC International, Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359-1361). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Kampjun 1 A 100 Kampjun 2 O 100 Kampjun 3 L1 Kampjun 4 Z1 Kampjun 5 K1 L 11 11 11 11 6 n 19 18 19 19 12 Medja 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89 Sr (mg/kg) 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 CVr ( %) 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34 SR (mg/kg) 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 CVR ( %) 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65 Kontenut nominali mg/kg) 100 100 1 1 1

L = numru ta’ laboratorji n = numru ta’ valuri singoli Sr = devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà CVr = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-ripetibilità SR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità CVR = koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-riproduċibilità

9. Osservazzjonijiet

Ir-reazzjoni ta’ diclazuril jeħtieġ li tkun intweriet preċedentament bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejla.

(G) DETERMINAZZJONI TA’ LASALOCID SODIUM

Melħ tas-sodju ta ’ polyether monocarboxylic acid prodott bi Streptomyces lasaliensis

1. Għan u skop

Dan il-metodu jagħmilha possibbli li jiġi ddeterminat il-livell ta’ lasalocid sodium fl-għalf u taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu ta’ ditezzjoni huwa ta’ 5 mg/kg, il-limitu ta’ kwantifikazzjoni huwa 10 mg/kg.

2. Prinċipju

Lasalocid sodium huwa estratt minn kampjun ta’ metanol aċidifikat u stabbilit mill-kromatografija b’likwidi ta’ prestazzjoni għolja b’fażi riversjata (HPLC) bl-użu ta’ ditettur spettrofluworimetriku.

3. Reaġenti

3.1. Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)

3.2. Orthophosphoric acid, w (w/w) = 85 %

3.3. Soluzzjoni ta’ orthophosphoric, c = 20 % Iddilwixxi 23,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) għal 100 ml ilma.

3.4. 6-Methyl-2-heptylamine (1,5-dimethylhexylamine), w (w/w) = 99 %

3.5. Metanol, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

3.6. Aċidu idrokloriku, densità = 1,19 g/ml

3.7. Soluzzjoni ta’ phosphate buffer, c = 0,01 mol/l Dewweb 1,36 g ta’ KH2PO4 (3.1) f’500 ml ta’ ilma (3.11), żid 3,5 ml ta’ orthophosphoric acid (3.2) u 10,0 ml ta’ 6-methyl-2-heptylamine (3.4). Aġġusta l-pH għal 4,0 b’soluzzjoni ta’ orthophosphoric acid (3.3) u ddilwa sa 1 000 ml bl-ilma (3.11).

3.8. Metanol aċidifikat Ittrasferixxi 5,0 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.6) f’kunjett iggradat ta’ 1 000 ml, żid sal-marka bil-metanol (3.5) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.9. Fażi HPLC mobbli, soluzzjoni phosphate buffer-methanol 5 + 95 (V + V) Ħallat 5ml tas-soluzzjoni tal-phosphate buffer (3.7) ma’ 95 ml ta’ metanol (3.5).

3.10. Sustanza standard tal-lasalocid sodium b’purità ggarantita, C34H53O8Na (melħ tas-sodju tal-aċidu polyether monocarboxylic prodott bi Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1. Soluzzjoni standard ta’ stokk ta' Lasalocid sodium, 500 μg/ml Iżen sal-eqreb 0,1 mg, 50 mg lasalocid sodium (3.10) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, dewweb f’metanol aċidifikat (3.8), żid sal-marka bl-istess solvent u ħawwad. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.2. Soluzzjoni standard intermedja ta' Lasalocid sodium, 50 μg/ml Iġbed b’pipetta 10,0 ml tas-soluzzjoni standard maħżuna (3.10.1) f’kunjett iggradat ta’ 100 ml, żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Din is-soluzzjoni trid titħejja friska qabel l-użu.

3.10.3. Soluzzjonijiet ta’ kalibrar F’serje ta’ kunjetti ggradati ta’ 50 ml ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard intermedjarja (3.10.2). Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrespondu għal 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 u 10,0 μg lasalocid sodium għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski qabel l-użu.

3.11. Ilma, ekwivalenti għall-grad tal-HPLC

4. Apparat

4.1. Banju ultrasoniku (jew banju tal-ilma li jiċċaqlaq) bil-kontroll tat-temperatura

4.2. Filtri membrana, 0,45 μm.

4.3. Tagħmir tal-HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattat għall-injettar ta’ volumi ta’ 20 l.

4.3.1. Kolonna għal kromatografija b’likwidi 125 mm x 4mm, b’fażi riversjata C18, ippakkjar ta’ 5 μm jew ekwivalenti

4.3.2. Spettrofluworimetru b’aġġustament tal-wavelength varjabbli ta’ wavelengths ta’ eċċitazzjoni u ta’ emissjoni

5. Proċedura

5.1. Ġenerali

5.1.1. Għalf blank

Biex isir l-eżami tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analizzat kampjun blank biex jiġi ivverifikat li la lasalocid sodium u lanqas sustanzi ta’ tfixkil ma jkunu preżenti. Il-kampjun blank għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u m’għandux ikun hemm lasalocid sodium jew sustanzi tat-tfixkil.

5.1.2. Test tal-irkupru

L-eżami tal-irkupru għandu jsir bl-analiżi tal-kampjun blank li kien ġie msaħħaħ biż-żieda ta’ kwantità ta’ lasalocid sodium, simili għal dik preżenti fil-kampjun. Biex issaħħaħ f’livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml tal-istandard tal-istokk (3.10.1) f’kunjett koniku ta’ 250ml u evapora s-soluzzjoni għal madwar 0,5 ml. Żid 50 g tal-kampjun blank, ħawwad sew u ħalli għal 10 minuti filwaqt li tħallat għal bosta drabi qabel ma tkompli bil-pass tal-estrazzjoni (5.2).

Inkella, jekk għalf blank simili għal dak tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), jista’ jitwettaq test tal-irkupru permezz tal-metodu ta’ żieda standard. F’dan il-każ il-kampjun li għandu jkun analizzat jiġi msaħħaħ bi kwantità ta’ lasalocid sodium simili għal dik li diġà hemm preżenti fil-kampjun. Dan l-kampjun huwa analizzat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru kkalkolat permezz ta’ tnaqqis.

5.2. Estrazzjoni

5.2.1. Għalf

Iżen sal-eqreb 0,01 g, minn 5 g sa 10 g tal-kampjun f’kunjett koniku ta’ 250 ml b’tapp. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) b’pipetta. Poġġi t-tapp b’mod laxk u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Ħallih joqgħod għal madwar siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2) f’reċipjent xieraq. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.2.2. Taħlitiet lesti minn qabel

Iżen sal-eqreb 0,001 g madwar 2 g ta’ taħlit lest minn qabel mhux mitħun f’kunjett iggradat ta’ 250 ml. Żid 100,0 ml ta’ metanol aċidifikat (3.8) u dawwar biex tferrex. Poġġi l-kunjett u l-kontenut f’banju ultrasoniku (4.1) f’madwar 40 oC għal 20 minuta, imbagħad neħħi u berred għat-temperatura ambjentali. Żid sal-marka bil-metanol aċidifikat (3.8) u ħallat kollox sew. Ħallih joqgħod għal siegħa 1 sakemm il-materjal sospiż ikun qagħad, imbagħad iffiltra porzjon alikwot minn filtru tal-membrana ta’ 0,45 μm (4.2). Żid volum xieraq tal-filtrat ċar b’metanol aċidifikat (3.8) biex tkun prodotta soluzzjoni finali tal-eżami li jkun fiha madwar 4 μg/ml ta’ lasalocid sodium. Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.3).

5.3. Determinazzjoni tal-HPLC

5.3.1. Parametri

Il-kundizzjonijiet li ġejjin huma offruti bħala gwida; jistgħu jintużaw kundizzjonijiet oħra, sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti:

Kolonna għal kromatografija b'likwidi (4.3.1.): 125 mm × 4 mm, fażi riversjata C18, 5 μm ippakkjar, jew ekwivalenti Fażi mobbli (3.9): Taħlita ta’ soluzzjoni ta’ phosphate buffer (3.7) u metanol (3.5), 5 + 95 (V + V) Rata ta’ tnixxija: 1,2 ml/min Wavelengths ta’ ditezzjoni: Eċċitazzjoni: 310 nm Emissjoni: 419 nm Volum tal-injezzjoni: 20 μl

Ivverifika l-istabbilta tas-sistema kromatografika, injetta s-soluzzjoni tal-kalibrar (3.10.3) li fiha 4,0 μgg/ml bosta drabi, sakemm jinkisbu l-ogħla livelli (jew erjas) u ħinijiet ta’ żamma kostanti.

5.3.2. Graff ta’ kalibrar

Injetta kull soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3) bosta drabi u stabbilixxi l-medja tal-għoli medju tal-ogħla livelli (erjas) għal kull konċentrazzjoni. Ipplottja graff ta’ kalibrar billi tuża l-medji tal-ogħla livelli (meded) bħala l-ordinati u l-konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu fi μg/ml bħala l-axxiżi.

5.3.3. Soluzzjoni tal-kampjun

Injetta l-estratti tal-kampjun miksubin fi 5.2.1 jew 5.2.2 bosta drabi, uża l-istess volum kif meħud fis-soluzzjoni ta’ kalibrar u stabbilixxi l-medja tal-ogħla livelli (meded) tal-ogħla livelli tas-sodju lasaloċidu.

6. Kalkolu tar-riżultati

Mill-medja tal-ogħla livelli (meded) prodotti mill-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.3.3) stabbilixxi l-konċentrazzjoni ta’ lasalocid sodium (μg/ml) b’riferenza għall-graff ta’ kalibrar.

6.1. Għalf

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c = il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.1) fi μg/ml V1 = volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.1 f’ml (jiġifieri 100) m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g

6.2. Taħlitiet lesti minn qabel

Il-kontenut tal-lasalocid sodium, w (mg/kg) fil-kampjun jingħata permezz tal-formula segwenti:

[mg/kg]

fejn:

c = il-konċentrazzjoni tal-lasalocid sodium tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.2.2) fi μg/ml V2 = il-volum tal-estratt tal-kampjun skont 5.2.2 f’ml (jiġifieri 250) f = il-fattur ta’ dilwizzjoni skont 5.2.2 m = il-piż tal-porzjon tat-test fi g

7. Validazzjoni tar-riżultati

7.1. Identità

Il-metodi bbażati fuq l-ispettrofluworometrija huma inqas soġġetti għal interferenza minn dawk li fihom tintuża d-ditezzjoni bl-UV. L-identità tal-analizzat tista’ tiġi ikkonfermata bil-ko-kromatografija.

7.1.1. Ko-kromatografija

L-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni ta’ kalibrar (3.10.3). L-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ lasalocid sodium li jinstab fl-estratt tal-kampjun. L-għoli tal-ogħla livell tal-lasalocid sodium biss għandu jittejjeb wara li jitqies l-ammont ta’ lasalocid sodium miżjud u d-dilwizzjoni tal-estratt. L-akbar wisa’, f’nofs l-għoli, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-akbar wisa’ oriġinali prodott mill-estratt mhux imsaħħaħ tal-kampjun.

7.2. Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli li twettqu fl-istess kampjun m’għandhomx jaqbżu:

— 15 % fir-rigward tal-ogħla valur għal kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 30 mg/kg sa 100 mg/kg;

— 15 mg/kg għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium minn 100 mg/kg sa 200 mg/kg

— 7,5 % fir-rigward tal-ogħla valur għall-kontenuti ta’ lasalocid sodium ta’ aktar minn 200 mg/kg.

7.3. Irkupru

Għall-kampjun (blank) imsaħħaħ, l-irkupru għandu jkun mill-anqas 80 %. għall-kampjuni msaħħa ta’ taħlit lest minn qabel, l-irkupru għandu jkun ta’ mill-inqas 90 %.

8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv

Ġie organizzat studju kollaborattiv (*) li fih, 2 taħlitiet lesti minn qabel (kampjuni 1 u 2) u 5 kampjuni ta’ għalf (kampjuni 3 – 7) ġew analizzati minn 12-il laboratorju. Saru analiżi duplikati fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja:

Kampjun 1 Taħlita lesta minn qabel għat-tiġieġ Kampjun 2 Taħlita lesta minn qabel għad-dundjani Kampjun 3 Prietken għad-dundjani Kampjun 4 Frak għat-tiġieġ Kampjun 5 Għalf għad-dundjani Kampjun 6 Għalf għat-tjur A Kampjun 7 Għalf għat-tjur B L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23 Medja [mg/kg] 5 050 16 200 76,5 78,4 92,9 48,3 32,6 sr [mg/kg] 107 408 1,71 2,23 2,27 1,93 1,75 CVr [ %] 2,12 2,52 2,24 2,84 2,44 4,00 5,37 sR [mg/kg] 286 883 3,85 7,32 5,29 3,47 3,49 CVR [ %] 5,66 5,45 5,03 9,34 5,69 7,18 10,70 Kontenut nominali [mg/kg] 5 000 (**) 16 000 (**) 80 (**) 105 (**) 120 (**) 50 (***) 35 (***)

L = numru ta’ laboratorji n = numru ta’ riżultati singoli sr = devjazzjoni standard tar-ripetibilità sR = devjazzjoni standard tar-riproduċibilità CVr = koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-ripetibbiltà, % CVR = koeffiċjent ta’ varjazzjoni tar-riproduċibilità, %

(1) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2) Imwettaq mill-Grupp ta’ Ħidma tal-għalf ta’ Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)

(3) Jistgħu jintużaw metodi ta’ diġestjoni oħrajn diment li dawn ikunu wrew li jwasslu għal riżultati simili (bħad-diġestjoni permezz tal-pressa bil-micowave).

(4) Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) jista’ jkun fih ammonti kbar ta’ silika tal-ħaxix, li tista’ żżomm fiha elementi ta’ traċċa u għandha titneħħa. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf, għalhekk, għandha tiġi segwita l-proċedura modifikata segwenti.