Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/45/KE tas-6 ta’ Lulju 2000 li tistabbilixxi l-metodi ta’ analiżi Komunitarji għad-determinazzjoni ta’ vitmina A, vitamina E u triptofan f’għalfTest b’rilevanza għaż-ŻEE



Official Journal L 174 , 13/07/2000 P. 0032 - 0050

CS.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

ET.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

HU.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

LT.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

LV.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

MT.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

PL.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

SK.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30

SL.ES Chapter 3 Volume 30 P. 12 - 30



Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/45/KE tas-6 ta’ Lulju 2000 li tistabbilixxi l-metodi ta’ analiżi Komunitarji għad-determinazzjoni ta’ vitmina A, vitamina E u triptofan f’għalf (Test b’rilevanza għaż-ŻEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunitajiet Ewropej, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 fuq l-introduzzjoni tal-metodi ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi Komunitarji għal kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [1], kif l-aħħar emendat bl-Att ta’ Adeżjoni ta’ l-Awstrija, l-Finlandja u l-Isvezja [2], u partikolarment l-Artikolu 2 tagħhom Billi: (1) Id-Direttiva 70/373/KEE tisptipula li l-kontrolli uffiċjali ta’ l-għalf għal l-iskopijiet ta’ qbil ta’ kontroll mal-ħtiġijiet li skond il-liġijiet, regolamenti u dispożizzjonijiet amministrativi li jikkontrollaw il-kwalitá u kompożizzjoni tagħhom li jridu jsiru bl-użu tal-metodi Komunitarji ta’ teħid ta’ kampjuni u analiżi (2) Id-Direttiva tal-Kunsill 70/524/KEE tat-23 ta’ Novembru ta’ l-1970 dwar addittivi fl-għalf [3], kif emendat l-aħħar mir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 2439/1999 tas-17 ta’ Novembru 1999 [4] li tistipula li l-kontenut ta’ vitamina A u vitamina E irid ikun indikat fuq it-tikkettjar fejn dawn is-sustanzi huma miżjuda għal taħlitiet minn qabel u l-għalf. (3) Id-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE tat-2 ta’ April 1979 fuq marketing ta’ taħlit ta’ għalf [5] kif l-aħħar emendat mid-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/16/KE [6] u d-Direttiva tal-Kunsill 93/74/KEE tat-13 ta’ Settembru 1993 fuq għalf maħsub għal skopijiet nutrizzjonali partikolari [7], kif l-aħħar emendat mid- Direttiva 96/25/KE [8], li tistipula li aċidi amino se jiġu stipulati fit-tikkettjar ta’ l-għalf. (4) Metodi ta’ analiżi Komunitarji jridu jiġu stabbiliti għal kontroll ta’ dawn is-sustanzi. (5) Il-miżuri provduti f’din id-Direttiva huma bi qbil ma’ l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti għal Għalf, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA Artikolu 1 L-Istati Membri jridu jistipulaw li analiżi kontrollati bi skop ta’ kontrolli uffiċjali tal-kontenut ta’ vitamina A, vitamina E u triptofan ta’ għalf u taħlit minn qabel isiru bl-użu tal-metodu stipulat fl-Anness għalihom. Artikolu 2 l-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ, mhux aktar tard mill-31 t’Awissu 2000, il-liġijiet, regolamenti jew dispożizzjonijiet amministrativi neċessarji biex jaqblu mad-dispożizzjonijiet ta’ din id-Direttiva. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn il-miżuri, dawn għandhom ikollhom riferenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b’riferenza waqt il-pubblikazzjoni uffiċċjali tagħhom. Il-proċedura għal ċerta riferenza trid tiġi adottata mill-Istati Membri. Artikolu 3 Din id-Direttiva għanda tidħol fis-seħħ fl-20 ġurnata wara l-pubblikazzjoni fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Artikolu 4 Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri. Magħmul fi Brussel, fis-6 ta’ Lulju 2000. Għall-Kummissjoni David Byrne Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU C 241, tad-29.8.1994, p. 1. [3] ĠU L 270, ta’ l-14.12.1970, p. 1. [4] ĠU L 297, tat-18.11.1999, p. 8. [5] ĠU L 86, tas-6.4.1979, p. 30. [6] ĠU L 105, tat-3.5.2000, p. 36. [7] ĠU L 237, tat-22.9.1993, p. 23. [8] ĠU L 125, tat-23.5.1996, p. 35. -------------------------------------------------- L-ANNESS PARTI A DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA A 1. Skop u għan Il-kontenut ta’ vitamina A huwa espress f’Unitajiet Internazzjonali (UI) kull kg. UI wieħed jikkorrispondi ma’ l-attivitá ta’ 0,300 μg ta’ alkoħol ta’ trans-vitamina A-kollu jew 0,344 μg aċetat ta’ trans-vitamina A-kollu jew 0,550 μg palmitat ta’ trans-vitamina A-kollu Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2000 UI vitamina A/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun huwa idrolizzat b’soluzzjoni idrossida ta’ potassju etanoliku u l-vitamina A hija estratta f’pitrolju ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoni u r-residwu jiġi imdewweb f’metanoll u, jekk neċessaru, dilwit għal konċentrazzjoni meħtieġaIl-kontenut ta’ vitamina A huwa determinat b’eżekuzzjoni bil-kontra ta’ fażi għolja ta’ likwidu kromatografiku (EK-FGLK) bl-użu ta’ UV jew detettur florexxentiIl-parametri kromatografiċi huma magħżula sabiex ma jkunx hemm separazzjoni bejn l-alkohol ta’ trans-vitamina A u is-cis isomers tiegħu. 3. Reaġenti 3.1. Etanol, σ = 96 % 3.2. Pitrolju ħafif, skala ta’ dbaqbieq 40 sa 60 °C 3.3. Metanol 3.4. ta’ idrossidu potassju, β = 50g/100 ml 3.5. Soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju, β = 10 g/100 ml (ara 7.7 osservazzjonijiet) 3.6. Sulfid tas-sodju, Na2S · x H2O (x = 7-9) 3.6.1. Soluzzjoni ta’ sulfid tas-sodju, ċ = 0,5 mol/l in gliċerol, β = 120g/l (FORMA: x = 9) (ara 7.8 osservazzjonijiet) 3.7. Soluzzjoni fenolftalejn, β = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1) 3.8. 2-Propanol 3.9. Fażi mobbli għal HPLC taħlit ta’ metanol (3.3) u ilma, per eżempju 980 + 20 (v + v) L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna magħżulha. 3.10. Nitroġenu, bla ossiġenu 3.11. Aċetat-trans-vitamina A, extra pur, ta’ attivitá awtentikata, per eżempju 2,80 x 106 IU/g 3.11.1. Soluzzjoni ta’ l-istock ta’ l-aċetat ta’ -trans-vitamina A-kolluLi tiżen viċin 0,1 mg, 50 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.11) ġo kunjett gradwad 100 ml. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka ma’ l-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1400 UI vitamina A kull ml. Il-kontenut eżatt irid jiġi determinat akond il-5.6.3.1. 3.12. Palmitat-trans-vitamina A, extra pur, ta’ attivitá awtentikata, per eżempju 1,80 x 106 UI/g 3.12.1. Soluzzjoni ta’ stock tal-palmitat trans-vitamina A-kolluLi tiżen viċin 0,1 mg, 80 mg ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.12) ġo kunjett gradwad 100 ml. Dewweb f’2-propanol (3.8) u wassal sal-marka ma’ l-istess solvent. Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 1400 UI vitamina A kull mlIl-kontenut eżatt irid jiġi determinat akond il-5.6.3.2. 3.13. 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara 7.5 osservazzjonijiet) 4. Apparat 4.1. Evaporatur rotanti li jiġbed l-arja 4.2. Oġġetti tal-ħġieġ għanbar 4.2.1. Kunjetti konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-socket tal-ħġieġ matt fil-qiegħ 4.2.2. Kunjetti gradwati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml 4.2.3. Lembuti li jisseparaw, konikali, 1000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass 4.2.4. Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass 4.3. Kondensur allihn, tul tal-jacket ta’ 300 mm, bil-ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għal pajp tal-gass 4.4. Karta filtru ippjegata għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (p.e. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) 4.5. Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni 4.5.1. Kolonna kromatografika likwida, 250 mm × 4 mm, Ċ18, 5 jew 10 μm pakkjar, jew ekwivalenti (kriterju ta’ eżekuzzjoni livell ta’ quċċata waħda biss għal kulliżomeru retinol fil-kundizzjonijiet-HPLC) 4.5.2. Detettur UV jew florexxenti, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli 4.6. Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelli quartz 4.7. Banju-ta’ l-ilma ma’ stirrer manjetiku 4.8. Apparat ta’ estrazzjoni (ara l-figura 1) li jikkonsisti minn: 4.8.1. Ċilindru tal-ħġieġ ta’ 1l kapaċitá iffitjat bl-għonq u tapp tal-ground glass 4.8.2. Insert tal-ground glass magħmmar bis-side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min ġo n-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u jet fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likiwdu ta’ fuq fiċ-ċilindru jista’ jiġi trasferit f’lembut li jissepara. 5. Proċedura Nota: A hija sensitiva għad-dawl (UV) u għall-ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ għanbar, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti bil-folja/i ta’ l-aluminju) u ossiġenu (u flaxjat bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni ta’ arja fuq il-likwidu trid tiġi mibdula b’nitroġenu (u tevita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor). 5.1. Preparazzjoni tal-kampjun Illima l-kampjun sabiex jgħaddi għarbiel imxebbek1 mm, b’attenzjoni li tiġi evitata l-ġenerazzjoni tas-sħanaIl-limar irid isir immedjatament qabel jintiżen u saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina A. 5.2. Saponifikazzjoni Skond il-kontenut tal-piż tal-vitamina A, sa’ l-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir ta’ 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ askorbat sodju (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta’ sulfid sodju (3.6) ffitja kondensur (4.3) mall-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju ta’ l-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7). Saħħan sakem ibaqbaq u ħallieħ jirriflaksja għal ħames minuti, Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni idrossida tal-potassju (3.4) minn ġol-kondensur (4.3) u ħalli jirriflaksja 25 minuta oħra, bl-istirring taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbagħad laħlaħ il-kondensur b’xi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali. 5.3. Estrazzjoni Itrasferixxi b’tiswib is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni fi kwantitajiet bit-tlaħlieħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għall-lembut li jissepara ta’ 1000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċessivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml pitrolju ħafif (3.2) u trasferixxi it-tlaħliħiet għal ġo lembut li jissepara għal ġo l-apparat ta’ l-estrazzjoniĦawwad sew għal żewġ minuti u ħallieh joqod għal żewġ minuti. 5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut li jissepara (4.2.3) Meta s-saffi ġew separati (ara osservazzjoni 7.3) trasferiment tas-saff tal-pitrolju ħafif għal lembut li jissepara ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2). Aħsel l-estratti magħquda fil-lembut li jissepara darbtejn billi iddawru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetittivament ma’ 100 ml porżjonijiet aktar sakemm l-ilma jibqa bla kulur fuq żidied ta’ soluzzjoni phenolphthalein (3.7) (bħala suffiċjenza tas-soltu aħsel erba’ darbiet). Iffiltra l-estratt maħsul minn ġo filtru ippjegat xott għal fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż ġo kunjett gradwat ta’ 500 (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’ 50 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2), imla sal-marka bil-pitrolju ħafif (3.2) u ħawwad sew. 5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8) Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) biddel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u għamel fil-pożizzjoni it-tarf tisfel forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell ta’ l-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa minn linja nitroġena lis-side-arm, itrasferixxi s-saff ta’ fuq tal-pitrolju ħafif għal ġo lembut li jissepara ta’ 1000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2) għal ġo ċ-ċilindru tal-ħġieġ, agħmel it-tapp u ħawwad sew. Ħalli is-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq għal ġol-lembut li jissepara bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2), imbgħat irdoppja b’ 50 ml ta’ porzjonijiet ta’ pitrolju ħafif (3.2) u żid saffi ta’ pitrolu ħafif fil-lembut li jissepara. Aħsel l-estratti ta’ pitrolju ħafif imħallat kif deskritt f’ 5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn. 5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC Ippipetta porzjoni alikwota tas-soluzzjoni tal-pitrolju ħafif (minn 5.3.1 jew 5.3.2) ġo kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’banju ta’ temperatura li ma teċċedix 40 °C. Aħżen mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid nitroġenu (3.10) u neħħi il-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi is-solvent li fadal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum mgħaruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ vitamina A trid tkun fl-iskala ta’ 5 UI/ml sa 30 UI/ml). 5.5. Determinazzjoni permezz ta’ HPLC Vitamina A hija separata fuq kolonna ta’ fażi bil-kontra Ċ18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija miżurata b’mezz ta’ detettur UV (325 nm) jew detettur florexxenti (eċitazzjoni: 325 nm, emissjoni: 475 nm) (4.5.2). Injetta porzjoni alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’ 5.4 u elute bil-fażi mobbli (3.9). Ikkalkola l-għoli ta’ l-livell għoli (żona) ta’ bosta injezzjonijiet ta’ l-istess soluzzjoni tal-kampjun l-għoli tal-livell għoli (żona) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni (5.6.2). Kundizzjonijiet HPLC Il-kundizzjonijiet li jmiss huma offruti għal gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw dment li jagħtu riżultati ekwivalenti. Kolonna kromografika likwida (4.5.1): | 250 mm x 4 mm, Ċ18, 5 jew 10 µm ippakjar, jew ekwivalenti | Fażi mobbli (3.9): | Taħlita ta' metanol (3.3) u ilma, p.e. 980 + 20 (v + v) | Rata ta' tnixxija: | 1-2 ml/min | Detettur (4.5.2): | Detettur UV (325 nm) jew detettur florexxenti (eċċitazzjoni: 325 nm/emissjoni: 475 nm) 475 nm) | 5.6. Kalibrazzjoni 5.6.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet ta’ standard tax-xogħol Ippipetta 20 ml ta’ soluzzjoni ta’ stock aċetat tal-vitamina A (3.11.1) jew 20 ml tas-soluzzjoni ta’ stock palmitat tal-vitamina A (3.12.1) ġo kunjett konikali jew tal-qiegħ ċatt li jesgħa 500 ml (4.2.1) u idrolizzah kif spjegat fil-5.2, imma mingħajr żieda ta’ BHT. Sussegwentament agħmel estrazzjoni bil-pitrolju ħafif (3.2) skond l-5.3 u imla sa 500 ml bil-pitrolju ħafif (3.2). Evapora 100 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi xott, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.10) u erġa dewweb ir-residwi ġo 10,0 ml ta’ metanol (3.3). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 560 UI vitamina A kull mlIl-kontenut eżatt irid jiġi determinat akond il-5.6.3.3. Is-soluzzjoni standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu. Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol ġo kunjett gradwat ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwadIl-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol imħallta hija 56 UI vitamina A kull ml. 5.6.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni u l-grafika ta’ kalibrazzjoni Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 5,0 u 10,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ xogħol ġo serje ta’ kunjetti gradwati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwadIl-konċentrazzjoni nominali ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,8 5,6, 14,0 u 28,0 UI vitamina A kull ml. Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni għal bosta drabi u stabbilixxi l-għoli tal-livell l-għoli (żoni). Uża l-għoli tal-livell għoli (żoni) ipplottja grafika ta’ kalibrazzjoni li tikkonsidra ir-riżultati tal-kontroll UV (5.6.3.3). 5.6.3. Standardizzazzjoni UV tas-soluzzjonijiet standard 5.6.3.1. Soluzzjoni ta’ stock aċetat tal-vitamina A Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A (3.11.1) ġo kunjett gradwat (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 UI vitamina A kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ aċetat ta’ vitamina A ġo kunjett gradwat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 UI vitamina A kull ml. Kejjel l-ispektrum ta’ l-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm. Kalkolazzjoni tal-kontenut tal-vitamina A: +++++ TIFF +++++ 5.6.3.2. Soluzzjoni ta’ stock palmitat ta’ vitamina A Ippipetta 2,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ palmitat ta’ vitamina A (3.12.1) ġo kunjett gradwat ta’ 50 ml (4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 56 UI vitamina A kull ml. Ippipetta 3,0 ml ta’ din is-soluzzjoni standard ta’ palmitat ta’ vitamina A ġo kunjett gradwat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 UI vitamina A kull ml. Kejjel l-ispektrum ta’ l-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm. Kalkolazzjoni tal-kontenut tal-vitamina A: +++++ TIFF +++++ 5.6.3.3. Soluzzjoni ta’ standard ta’ xogħol ta’ vitamina A Ippipetta 3,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ vitamina A mhux imħallta, preparata skond 5.6.1 ġo kunjett gradwat ta’ 50 ml(4.2.2) u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Ippipetta 5,0 ml ta’ din is-soluzzjoni ġo kunjett gradwat ta’ 25 ml u imla sal-marka b’2-propanoli (3.8). Il-konċentrazzjoni nominali ta’ din is-soluzzjoni hija 6,72 UI vitamina A kull ml. Kejjel l-ispektrum ta’ l-UV ta’ din is-soluzzjoni kontra 2-propanoli (3.8) fl-ispettrofotometru (4.6) bejn 300 nm u 400 nm. L-estinsjoni massima trid tkun bejn 325 nm u 327 nm. Kalkolazzjoni tal-kontenut tal-vitamina A: +++++ TIFF +++++ 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina A tas-soluzzjoni tal-kampjun li tiddetermina il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’UI/ml b’referenza għal grafika ta’ kalibrazzjoni (5.6.2). Il-kontenut tal-vitamina A w f’UI/kg tal-kampjun tinagħta bil-formula li jmiss: w = 500 . β . V . 1000 V . m IU/kg ta’ fejn: β = konċentrazzjoni tal-vitamina A tas-solizzujoni tal-kampjun (5.4) f’UI/ml V1 = volum ta’ soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml V2 = volum ta’ aliquot meħud f’ 5.4 f’ml m = massa ta’-porzjoni tat-test fi g 7. Osservazzjonijiet 7.1. Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina A huwa ta’ użu li tikkombina l-estratti ta’ pitrolju ħafif ta’ żewġ saponifikazzjonijiet-imposti (ammont peżat: 25 g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC. 7.2. Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam. 7.3. Jekk separazzjoni ta’ fażi mas-seħħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni. 7.4. Biż-żejt tal-fwied tal-bakkaljaw u xaħmijiet puri oħra il-ħin ta’ saponifikazzjoni jrid jiġi estiż għal 45-60 minuti. 7.5. Hydroquinone jista’ jiġi użat minflok il-BHT. 7.6. Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali s-separazzjoni ta’ iżomeri retinol huwa possibbli. 7.7. Bejn wieħed u ieħor 150 mg ta’ aċidu assorbiku jista’ jintuża minflok soluzzjoni ta’ sodju askorbat. 7.8. Bejn wieħed u ieħor 50 mg EDTA jista’ jintuża minflok soluzzjoni ta’ sulfide sodju. 8. Abilitá ta’ ripetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralelli isiru fuq l-istess kampjun ma jridx jeċċedi 15 % relativ għal riżultati aktar għolja. 9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv [1] L : numru ta' laboratorji n : numru ta' valuri waħedhom sr : devjazzjoni standard ta' abilitá ta' repetizzjoni sR : Devjazzjoni standard ta' riproduzzjonabilitá r : abilitá ta' repetizzjoni R : reproduċibilitá CVr : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' abilitá ta' repetizzjoni CVR : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' riproduttivitá | Taħlit min qabel Premix | Għalf imħallat min qabel | Konċentrat ta'mineral | Għalf ta' proteini | anżir żgħir | L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 | n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 | barley [UI/kg] | 17,02 × 106 | 1,21 × 106 | 537100 | 151800 | 18070 | sr [UI/kg] | 0,51 × 106 | 0,039 × 106 | 22080 | 12280 | 682 | r [UI/kg] | 1,43 × 106 | 0,109 × 106 | 61824 | 34384 | 1910 | ĊVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 | SR [UI/kg] | 1,36 × 106 | 0,069 × 106 | 46300 | 23060 | 3614 | >R [UI/kg] | 3,81 × 106 | 0,193 × 106 | 129640 | 64568 | 10119 | >ĊVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 | +++++ TIFF +++++ PARTI B DETERMINAZZJONI TAL-VITAMINA E 1. Skop u għan Il-kontenut ta’ vitamina E huwa espress bħala mg DL-α-tocopherol aċetat kull kg. 1 mg DL-α-tocopherol aċetat jikkorrispondi għal 0,91 mg DL-α- tocopherol (vitamina E). Il-limitu ta’ determinazzjoni huwa 2 mg vitamina E/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun huwa idrolizzar b’soluzzjoni idrossida ta’ potassju etanoliku u l-vitamina E hija estratta f’pitrolju ħafif. Is-solvent jitneħħa b’evaporazzjoniu r-residwu jiġi imdewweb f’metanoll u, jekk neċessaru, imġallat għal konċentrazzjoni meħtieġa. Il-kontenut ta’ vitamina E huwa determinat b’eżekuzzjoni bil-kontra ta’ fażi għolja ta’ likwidu kromatografiku (EK-FGLK) bl-użu ta’ UV jew detettur florexxenti. 3. Reaġenti 3.1. Etanol, σ = 96 % 3.2. Pitrolju ħafif, skala ta’ dbaqbieq 40 °C - 60 °C 3.3. Metanol 3.4. Sodju ta’ idrossidu potassju, β = 50 g/100 ml 3.5. Soluzzjoni ta’ askorbat tas-sodju, β = 10 g/100 ml (ara 7.7 osservazzjonijiet) 3.6. Sulfid tas-sodju, Na2S · x H2O (x = 7-9) 3.6.1. Soluzzjoni ta’ sulfid tas-sodju, ċ = 0,5 mol/l in gliċerol, β = 120 g/l (għal x = 9) (ara 7.8 osservazzjonijiet) 3.7. Soluzzjoni fenolftalejn, β = 2 g/100 ml fl-etanol (3.1) 3.8. taħlit ta’ metanol (3.3) u ilma, per eżempju 980 + 20 (v + v). L-iskala eżatta tiġi determinata mill-karatteristiċi tal-kolonna użata. 3.9. Nitroġenu, bla ossiġenu 3.10. DL-α-tokoferol aċetat, pur iżżejjed, ta’ attivitá attestata 3.10.1. Soluzzjoni ta’ stock ta’ l-aċetat tokoferol-DL-α-aċetatLi tiżen viċin 0,1 mg, 100 mg ta’ aċetat-tokoferol-DL-α (3.10) ġo kunjett gradwad ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u jsir sal-marka ma’ l-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fiha 1 mg aċtetat-tokoferol-DL-α. (Kontroll UV ara 5.6.1.3; stabilizzazzjoni ara 7.4 osservazzjoni). 3.11. Tokoferol-DL-α, pur iżżejjed, ta’ attivitá attestata 3.11.1. Li tiżen viċin 0,1 mg, 100 mg ta’ tokoferol-DL-α (3.10) ġo kunjett gradwad ta’ 100 ml. Dewweb fl-etanol (3.1) u jsir sal-marka ma’ l-istess solvent. 1 ml ta’ din is-soluzzjoni fiha 1 mg tokoferol-DL-α. (Kontroll UV ara 5.6.2.3; stabilizzazzjoni ara 7.4 osservazzjoni). 3.12. Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (ara 7.5 osservazzjonijiet) 4. Apparat 4.1. Evaporatur rotanti li jiġbed l-arja 4.2. Oġġetti tal-ħġieġ għanbar 4.2.1. Kunjetti konikali jew bil-qiegħ ċatt, 500 ml, bis-socket tal-ħġieġ fil-qiegħ 4.2.2. Kunjetti gradwati bit-tappijiet tal-ground-glass, bl-għonq dejjaq, 10, 25, 100 u 500 ml 4.2.3. Lembuti li jisseparaw, konikali, 1000 ml, bit-tappijiet tal-ground-glass 4.2.4. Kunjetti bil-forma ta’ lanġasa, 250 ml, bis-sockets tal-ground-glass 4.3. Kondensur allihn, tul tal-jacket ta’ 300 mm, bil-ġonta tal-ground-glass, bl-adapter għal pajp tal-gass 4.4. Karta filtru ippjegata għal separazzjoni tal-fażi, dijametru 185 mm (p.e. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) 4.5. Apparat HPLC bis-sistema ta’ injezzjoni 4.5.1. Kolonna kromatografika likwida, 250 mm × 4 mm, Ċ18, 5 jew 10 μm pakkjar, jew ekwivalenti 4.5.2. Detettur UV jew florexxenti, b’aġġustament tal-wavelength varjabbli 4.6. Spettrofotometru b’10 mm ta’ ċelli quartz 4.7. Banju-ta’ l-ilma ma’ stirrer manjetiku 4.8. Apparat ta’ estrazzjoni (ara figura 1) li tikkonsisti minn: 4.8.1. Ċilindru tal-ħġieġ ta’ 1 l kapaċitá iffitjata bl-għonq u tapp tal-ground glass 4.8.2. Insert tal-ground glass magħmmar bis-side-arm u tubu aġġustabbli li jgħaddi min ġo n-nofs. It-tubu aġġustabbli jrid ikollu t-tarf il-baxx tiegħu fil-forma ta’ U u jet fit-tarf opposta sabiex is-saff tal-likwidu ta’ fuq fiċ-ċilindru jista’ jiġi trasferit f’lembut li jissepara. 5. Proċedura Nota: Vitamina E hija sensitiva għad-dawl (UV) u għal ossidazzjoni. L-operazzjoni trid issir fin-nuqqas ta’ dawl (bl-użu ta’ oġġetti tal-ħġieġ għanbar, jew oġġetti tal-ħġieġ protetti bil-folja/i ta’ l-aluminju) u ossiġenu (u flaxjat bin-nitroġenu). Matul l-estrazzjoni ta’ arja fuq il-ikwidu trid tiġi mibdula b’nitroġenu (u tevita pressa eċċessiva billi tillaxka t-tapp minn ħin għall-ieħor). 5.1. Preparazzjoni tal-kampjun Illima il-kampjun sabiex jgħaddi għarbiel imxebbek 1 mm, bl-attenzjoni li tiġi evitata il-ġenerazzjoni tas-sħana. Il-limar irid isir immedjatament qabel jintiżen u saponifikazzjoni inkella jista’ jkun hemm telf ta’ vitamina E. 5.2. Saponifikazzjoni Skond il-kontenut tal-piż tal-vitamina E, sa’ l-eqreb 0,01 g, 2 g sa 25 g tal-kampjun f’kunjett ta’ 500 ml konikali jew bil-qiegħ ċatt (4.2.1). Żid suċċessivament bit-tidwir ta’ 130 ml etanol (3.1), bejn wieħed u ieħor 100 mg BHT (3.13), 2 ml soluzzjoni ta’ askorbat sodju (3.5) u 2 ml soluzzjoni ta; sulfid sodju (3.6). Iffitja l-kondensur (4.3) mall-kunjett u deffes il-kunjett fil-banju ta’ l-ilma bl-istirrer manjetiku (4.7) Saħħan sakem ibaqbaq u ħallieh jirrifaksja għal ħames minuti. Imbagħad żid 25 ml soluzzjoni idrossida tal-potassju (3.4) minn ġol-kondensur (4.3) u ħalli jirriflaksja 25 minuta oħra bl-istirring taħt tnixxija żgħira ta’ nitroġenu. Imbgħat laħlaħ il-kondensur bxi 20 ml ta’ ilma u kessaħ il-kontenut tal-kunjett f’temperatura ambjentali. 5.3. Estrazzjoni Itrasferixxi b’tiswib is-soluzzjoni tas-saponifikazzjoni fi kwantitajiet bit-tlaħtieħ b’volum totali ta’ 250 ml ta’ ilma għal lembut li jissepara ta’ 1000 ml (4.2.3) jew għall-apparat ta’ estrazzjoni (4.8). Laħlaħ il-kunjett tas-saponifikazzjoni suċċesivament b’25 ml etanol (3.1) u 100 ml pitrolju ħafif (3.2) u trasferixxi it-tlaħliħiet għal ġo lembut li jissepara għal ġo l-apparat ta’ l-estrazzjoniIl-proporzjoni ta’ l-ilma u etanol fit-tagħqid ta’ soluzzjonijiet trid tkun xi 2:1. Ħawwad sew għal żewġ minuti u ħallieh joqod għal żewġ minuti. 5.3.1. Estrazzjoni bl-użu ta’ lembut li jissepara (4.2.3) Meta s-saffi ġew separati (ara osservazzjoni 7.3) trasferiment tas-saff tal-pitrolju ħafif għal lembut li jissepara ieħor (4.2.3). Irrepeti din l-estrazzjoni darbtejn, b’100 ml ta’ ptitrolju ħafif (3.2) u darbtejn, b’ 50 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2). Aħsel l-estratti magħquda fil-lembut li jissepara darbtejn billi iddawru bil-mod (biex tevita formazzjoni ta’ emulsjonijiet) b’porzjonijiet ta’ 100 ml ta’ ilma imbagħad ħawwad ripetetutament ma’ 100 ml porżjonijiet aktar sakemm l-ilma jibqa bla kulur fuq żidied ta’ soluzzjoni phenolphthalein (3.7) (ikun suffiċjenti li taħsel erba’ darbiet). Iffiltra l-estratt maħsul minn ġo filtru ippjegat xott għal fażi ta’ separazzjoni (4.4) biex tneħħi xi ilma sospiż ġo kunjett gradwat ta’ 500 (4.2.2). Laħlaħ il-lembut ta’ separazzjoni u l-filtru b’ 50 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2), imla sal-marka bil-pitrolju ħafif (3.2) u ħawwad sew. 5.3.2. Estrazzjoni bl-użu ta’ apparat ta’ estrazzjoni (4.8) Meta s-saffi jisseparaw (ara osservazzjoni 7.3) biddel it-tapp taċ-ċilindru tal-ħġieġ (4.8.1) bl-insert tal-ground glass (4.8.2) u għamel fil-pożizzjoni it-tarf t’isfel forma ta’ U tat-tubu aġġustabbli sakemm ikun eżatt fuq il-livell ta’ l-interface. Bl-applikazzjoni ta’ pressa minn linja nitroġena lis-side-arm, itrasferixxi is-saff ta’ fuq tal-pitrolju ħafif għal ġo lembut li jissepara ta’ 1000 ml (4.2.3). Żid 100 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2) għal ġo ċ-ċilindru tal-ħġieġ, agħlaq bit-tapp u ħawwad sew. Ħalli s-saffi jisseparaw u ittrasferixxi s-saff ta’ fuq għal ġol-lembut li jissepara bħal qabel. Irrepeti l-proċedura ta’ estrazzjoni b’100 ml ta’ pitrolju ħafif (3.2), imbagħad irdoppja b’ 50 ml ta’ porzjonijiet ta’ pitrolju ħafif (3.2) u żid saffi ta’ pitrolu ħafif fil-lembut li jissepara. Aħsel l-estratti ta’ pitrolju ħafif imħallat kif deskritt f’ 5.3.1 u ipproċedi kif deskritt hawn. 5.4. Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun għal HPLC Ippipetta porzjoni alikwota tas-soluzzjoni tal-pitrolju ħafif (min 5.3.1 jew 5.3.2) ġo kunjett bil-forma ta’ lanġasa ta’ 250 ml (4.2.4). Evapora s-solvent sakemm kważi jinxef fuq evaporatur rotanti (4.1) bi pressa imnaqqsa f’banju ta’ temperatura li ma teċċedix 40 °C. Aħżen mill-ġdid il-pressa atmosferika billi żżid nitroġenu (3.9) u neħħi il-kunjett mill-evaporatur rotanti. Neħħi s-solvent li fadal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u dewweb ir-residwu immedjatament f’volum mgħaruf (10-100 ml) ta’ metanol (3.3) (il-konċentrazzjoni ta’ tokoferol-DL-α irid ikun fl-iskala ta’ 5 μg/mlsa 30 μg/ml). 5.5. Determinazzjoni permezz ta’ HPLC Vitamina E hija separata fuq kolonna ta’ fażi bil-kontra Ċ18 (4.5.1) u l-konċentrazzjoni hija miżurata bl-użu ta’ detettur florexxenti (eċċitazzjoni: 330 nm) jew detettur UV (292 nm) (4.5.2). Injetta porzjon alikwota (p.e. 20 μl) ta’ soluzzjoni metanolika miksuba f’ 5.4 u elute bil-fażi mobbli (3,8). Ikkalkola l-għoli ta’ l-livell għoli (żoni) ta’ bosta injezzjonijiet ta’ l-istess soluzzjoni tal-kampjun l-għoli tal-livell għoli (żoni) ta’ bosta injezzjonijiet tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni (5.6.2). Kundizzjonijiet HPLC Il-kundizzjonijiet li jmiss huma offruti bħala gwida; kundizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw dment li jagħtu riżultati ekwivalenti. Kolonna grafika likwida (4.5.1): | 250 mm x 4 mm, Ċ18, 5 jew 10 µm ippakjar, jew ekwivalenti | Fażi mobbli (3,8): | Taħlita ta' metanol (3.3) u ilma, p.e. 980 + 20 (v + v) | Rata ta' tnixxija: | >1-2 ml/min | Detettur (4.5.2): | Detettur florexxenti (eċċitazzjoni:< nm/emissjoni:(292 nm) 330 nm) jew detettur UV (292 nm) | 5.6. Kalibrazzjoni (aċetat tokoferol jew - DL - α- tokoferol) 5.6.1. Aċetat DL-α - tokoferol standard 5.6.1.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoniji ta’ standard ta’ xogħol Ittrasferixxi bil-pipetta 25 ml tas-soluzzjoni stock ta’ aċtetat tokoferol-DL-α (3.10.1) ġo kunjett konikali jew bil-qiegħ ċatt ta’ 500 ml (4.2.1) u idrolizza kif spjegat f’5.2. Sussegwentement agħmel estrazzjoni bil-pitrolju ħafif (3.2) skond l-5.3 u imla sa 500 ml bil-pitrolju ħafif. Evapora 25 ml ta’ din l-estrazzjoni fuq evaporatur rotanti (ara 5.4) kważi xott, neħħi s-solvent li jifdal bi tnixxija ta’ nitroġenu (3.9) u erġa dewweb ir-residwi ġo 25,0 ml ta’ metanol (3.3). L-inqas konċentrazzjoni ta’ din is-soluzzjoni hija 45,5 μg DL-α-tokoferol kull ml, ekwivalenti għal 50 μg DL-α-tokoferol aċetat kull mlIs-soluzzjoni ta’ standard tax-xogħol iridu jkunu preparati mil-ġdid qabel l-użu. 5.6.1.2. Preparazjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni u l-grafika ta’ kalibrazzjoni Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol ġo serje ta’ kunjetti gradwati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjoni ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,5, 5,0, 10,0 u 25,0 μg DL-α-tokoferol aċetat, p.e. 2,28, 7,88, 9,10 μg/ml u 22,8 μg/ml DL-α-tokoferol. Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni għal bosta drabi u stabilixxi l-għoli tal-livell l-għoli (żoni). Bl-użu tal-livelli għolja (żoni) ipplotja grafika ta’ kalibrazzjoni. 5.6.1.3 5.6.1.3. Standardizzazzjoni ta’ UV tas-soluzzjoni ta’ stock ta’ l-aċetat tokoferol-DL-α (3.13.1) Ħallat 5,0 ml tas-soluzzjoni stock DL-α - tokoferol aċetat (3.10.1) għal 25,0 ml b’etanolu kejjel il-UV spektrum ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispektrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm. L-assorbiment massimu jrid ikun sa 284 nm: +++++ TIFF +++++ F’din it-taħlita valur ta’ estinsjoni ta’ 0,84 sa 0,88 irid jinkiseb. 5.6.2. DL-α - tokoferol standard 5.6.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjoniji ta’ standard ta’ xogħol Ittrasferixxi bil-pipetta 2,0 ml tas-soluzzjoni stock DL-α-tocopherol (3.11.1) ġo kunjett gradwat ta’ 50 ml, dewweb fil-metanol (3.3) u imla sal-marka bil-metanol. L-inqas konċentrazzjoni ta’ din is-soluzzjoni hija 40 μg DL-α-tocopherol kull ml, ekwivalenti għal 44,0 μg DL-α-tocopherol aċetat kull ml. Is-soluzzjoni ta’ standard tax-xogħol trid tkun preparata mill-ġdid qabel l-użu. 5.6.2.2. Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni u l-grafika ta’ kalibrazzjoni Ittrasferixxi 1,0, 2,0, 4,0 u 10,0 ml tas-soluzzjoni standard ta’ xogħol ġo serje ta’ kunjetti gradwati ta’ 20 ml, imla sal-marka bil-metanol (3.3) u ħawwad. L-inqas konċentrazzjoni ta’ dawn is-soluzzjonijiet huma 2,0, 4,0, 8,0 u 20,0 μg/ml DL-α-tokoferol, p.e. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml u 22,0 μg/ml DL-α-tocopherol aċetat. Injetta 20 μl min kull soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni għal bosta drabi u stabilixxi l-għoli tal-livell l-għoli (żoni). Bl-użu tal-livelli għolja (żoni) ipplotja grafika ta’ kalibrazzjoni. 5.6.2.3. Standardizzazzjoni ta’ UV tas-soluzzjoni ta’ stock ta’ tocopherol-DL-α (3.11.1) Ħallat 2,0 ml tas-soluzzjoni stock DL-α - tokoferol (3.11.1) għal 25,0 ml b’etanolu u kejjel il-UV spektrum ta’ din is-soluzzjoni kontra l-etanol (3.1) fl-ispektrofotometru (4.6) bejn 250 nm u 320 nm +++++ TIFF +++++ F’din it-taħlita valur ta’ estinsjoni ta’ 0,6 irid jinkiseb. 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Mill-għoli maħsub (żona) tal-livelli l-għolja tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun li tiddetermina il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun f’μg/ml (kalkolat bħala α-tocopherol aċetat) b’riferenza għal grafika ta’ kalibrazzjoni (5.6.1.2 jew 5.6.2.2). Il-kontenut tal-vitamina E w f’mg/kg tal-kampjun tingħata bil-formula li jmiss: +++++ TIFF +++++ fejn: β = konċentrazzjoni tal-vitamina E tas-soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’μg/ml V1 = volum ta’ soluzzjoni tal-kampjun (5.4) f’ml V2 = volum ta’ aliquot meħud f’ 5.4 f’ml m = massa ta’-porzjoni tat-test fi g 7. Osservazzjonijiet 7.1. Għal kampjuni b’konċentrazzjoni baxxa ta’ vitamina E huwa ta’ użu li jikkombina l-estratti tal-pitrolju ħafif ta’ żewġ charges ta’ saponifikazzjonijiet (ammont imwieżen: g) għal soluzzjoni waħda ta’ kampjun għal determinazzjoni -HPLC. 7.2. Il-piż tal-kampjun meħud għall-analiżi ma jridx ikun fih aktar min 2 g xaħam. 7.3. Jekk separazzjoni ta’ fażi ma sseħx żid bejn wieħed u ieħor 10 ml etanol (3.1) biex tikser l-emulsjoni. 7.4. Wara l-kejl spektrofotometriku tad-DL-α-tocopherol aċetat jew soluzzjoni tad-DL-α-tocopherol skond 5.6.1.3 jew 5.6.2.3 rispettivament żid bejn wieħed u ieħor 10 mg BHT (3.12) għas-soluzzjoni (3.10.1 jew 3.10.2) u żomm is-soluzzjoni f’refriġeratur (tul ta’ ħażna massima ta’ erba’ gimgħat). 7.5. Hydroquinone jista’ jiġi użat minflok il-BHT. 7.6. Bl-użu ta’ kolonna ta’ fażi normali s-separazzjoni ta’ α-, β-, χ- u δ-tocopherol huwa possibbli. 7.7. Bejn wieħed u ieħor 150 mg ta’ aċidu assorbiku jista’ jintuża minflok soluzzjoni ta’ sodju askorbat. 7.8. Bejn wieħed u ieħor 50 mg EDTA jista’ jintuża minflok soluzzjoni ta’ sulfide sodju. 8. Ripetabilitá Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralelli isiru fuq l-istess kampjun ma jridx jeċċedi 15 % relativ għal riżultati aktar għolja. 9. Riżultati ta’ studju kollaborattiv [2] L : numru ta' laboratorji n : numru ta' valuri waħedhom sr : devjazzjoni standard ta' abilitá ta' ripetizzjoni sR : Devjazzjoni standard ta' riproduzzjonibilitá r : ripetabilitá R : reproduttibilitá CVr : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' abilitá ta' ripetizzjoni CVR : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' riproduttivitá | Taħlit min qabel | Għalf imħallat min qabel | Konċentrat ta'concentrate mineral | Għalf ta' proteini | Ħanżir żgħir | L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 | tifsira [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 | sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 | r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 | ĊVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 | SR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 | R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 | ĊVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 | +++++ TIFF +++++ PARTI Ċ DETERMINAZZJONI TA’ TRIPTOFAN 1. Skop u għan l-metodu huwa għal determinazzjoni tat-total u tripotofan ħieles fl-għalf. Ma jiġix distingwit bejn forom D- u L-. 2. Prinċipju Għad-determinazzjoni ta’ trijofan totali, l-kampjun huwa idroliżżat taħt kondizzjonijiet alkalini ma’ soluzzjoni idrossida barjum saturata u imsaħħna sa 110 °C għal 20 siegħa. Wara li jiżdied standard ta’ idroliżi interna. Għad-determinazzjoni ta’ triptofan ħieles, il-kampjun huwa estratt taħt kondizzjonijiet aċidi ħfief fil-preżenza ta’ standard intern. It-triptofan u l-istandard intern fl-idroliżat jew fl-estratt huma determinati bil-HPLC b’detezzjoni florexxenti. 3. Reaġenti 3.1. Ilma iddistillat darbtejn jew ilma ta’ kwalitá ekwivalenti irid ikun użat (konduttivitá < 10 μS/ċm). 3.2. triptofan (puritá/kontenut = 99 %) imnixxef taħt frugħa fuq pentossidu fosfru 3.3. metil-triptofan (puritá/kontenut = 99 %), imnixxef taħt vakum fuq pentossidu fosfru 3.4. Okta-idrat idrossidu barju (kura trid tinnżamm biex ma jiġix esponut il-Ba(OH)2 · 8 H2O esklussivament fl-arja sabiex tiġi evitata formazzjoniformation ta’ BaCO3, li tiddisturba d-determinazzjoni) (ara osservazzjoni 9.3). 3.5. Idrossidu tas-sodju 3.6. Aċidu orto-fosforiku, w = 85 % 3.7. Aċidu idrokloriku, ρ20 = 1,19 μg/ml 3.8. Metanol, grad HPLC 3.9. Pitrolju ħafif, skala ta’ dbaqbieq 40-60 °C 3.10. Soluzzjoni idrossida tas-sodju, ċ = 1 mol/l: Dewweb 40,0 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sal-1 1bl-ilma (3.1). 3.11. Aċidu idroliku, ċ = 6 mol/l: Ħu 492 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. 3.12. Aċidu idroliku, ċ = 1 mol/l: Ħu 82 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. 3.13. Aċidu idroliku, ċ = 0,1 mol/l: Ħu 8,2 ml HCl (3.7) u imla sa 1 l bl-ilma. 3.14. Aċidu orto-fosforiku, ċ = 0,5 mol/l: Ħu 34 ml ta’ aċidu orto-fosforiku (3,6) u imla sa 1 l bl-ilma (3.1). 3.15. Soluzzjoni konċentrata ta’ triptofan (3.2), ċ = 2,50 μmol/ml: F’kunjett volumetriku ta’ 500 ml dewweb 0,2553 g triptofan (3.2) f’aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idroliku. Aħżen fi -18 °C għal massimu ta’ erba ġimgħat 3.16. Soluzzjoni standard konċentrata interna, ċ = 2,50 μmol/ml: F’kunjett volumetriku ta’ 500 ml dewweb 0,2728 g α-metil-triptofan (3,3) f’aċidu idrokloriku (3.13) u imla sal-marka bl-aċidu idroliku. Aħżen fi -18 °C għal massimu ta’ erba ġimgħat 3.17. Soluzzjoni standard ta’ kalibrazzjoni ta’ triptofan u standard intern: Ħu 2,00 ml ta’ soluzzjoni konċentrata ta’ triptofan (3.15), u 2,00 ml ta’ soluzzjoni standard interna konċentrata (α-metil-triptofan) (3.16).allat bl-ilma (3.1) u metanol (3.8) għal bejn wieħed u ieħor l-istess volum u għal bejn wieħed u ieħor l-istess konċentrazzjoni ta’ metanol (10-30 %) bħall-idroliżat imlesti. Din is-soluzzjoni trid tiġi preparata friska qabel l-użu. Protetta min dawl tax-xemx dirett waqt l-operazzjoni. 3.18. Aċidu aċetiku 3.19. 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol 3.20. Etanolamina > 98 % 3.21. Soluzjoni ta’ 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) f’100 ml metanol (3.8) 3.22. Fażi mobbli għal HPLC: Soluzjoni ta’ 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) f’100 ml metanol (3.8). Aġġusta pH għal 5,00 bl-użu ta’ etanolamina (3.20). Imla sa’ 1000 ml bl-ilma (3.1) 4. Apparat 4.1. HPLC bid-detettur spektrofluorimetriku 4.2. Kolonna kromatografika likwida, 125 mm × 4 mm, Ċ18, 3 μm pakkjar, jew ekwivalenti 4.3. pH-metru 4.4. Kunjett polipropilina, kapaċitá 125 ml, bl-għonq u t-tap wiesgħajn. 4.5. Filtru membran, 0,45 μm 4.6. Autoclave, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar 4.7. Apparat li jħawwad mekkanikament jew ħawwad manjetiku 4.8. Ħawwad vortex 5. Procedura 5.1. Preparazzjoni ta’ kampjuni Il-kampjun huwa illimat biex jgħaddi min ġo għarbiel imxebbek ta’ 0,5 mm. Kampjun għolja fil-kwantitá ta’ l-umditá iridu jew jiġu imnixxfa bl-arja f’temperatura li ma teċċedix 50 °C jew imnixxfa frizati qabel ma jiġu illimati. Kampjuni b’kontenut għoli ta’ xaħam iridu jiġu estratti b’pitrolju ħafif (3.9) qabel ma jiġu illimati. 5.2. Determinazzjoni għal triptofan ħieles (estratt) Li tiżen viċin 1 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun separat (5.1), ġo kunjett konikali. Żid 100,0 ml aċidu idrokloriku, ċ = 0,1 mol/l (3.13) u 5,00 ml soluzzjoni standarnd interna konċentrata (3.16) Ħawwad għal 60 min. b;użu ta’ ħawwad mekkaniju jew ħawwad manjetiku (4.7). Ħalli is-sediment joqgħod u tella bil-pipetta 10,0 ml tas-soluzzjoni supernatant fit-tazza l-kbira taż-żennuna. Aġġusta l-pH sa 3,0 bl-użu ta’ sodju idrossidu, ċ = 1,0 mol/l (3.10). Żid metanol suffiċjenti (3.8) biex tagħti konċentrazzjoni ta’ bejn 10 u 30 % ta’ metanol fil-volum finali. Ittrasferixxi ġo kunjett volumetriku ta’ volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum neċessarju għal kromatografija (bejn wieħed u ieħor l-istess volum bħall-kalibrazzjoni ta’ soluzzjoni standard (3.17)). Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni min ġo 0,45 μm filtru membran (4.5) qabel injezzjoni fuq il-kolonna HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skond il-paragrafu 5.4. Ipproteġi soluzzjoni standard u estratti kontra dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli biex tanalizza l-estratti fl-istess ġurnata, l-estratti jistgħu jiġu maħżuna f’5 °C għal massimu ta’ tlett ijiem. 5.3. Determinazzjoni ta’ triptofan totali (idrolisat) Iżen viċin 0,2 mg min 0,1 sa 1 g tal-kampjun separat (5.1) ġo kunjett polipropilin. Il-porzjon tal-kampjun imwieżen irid ikollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ xi 10 mg. Żid 8,4 g Ckta-idrat idrossidu barju (3.4) u 10 ml ilma. Ħallat fuq ħawwad vortex (4.8) jew ħawwad manjetiku (4.7) Ħalli il-kalamita miksijja bit-teflon fit-taħlita. Aħsel il-ġnub tal-vessel b’4 ml ilma. Aqfel it-tap u u għalqu laxk. Trasferixxi għal ġo autoclave (4.6) bl-ilma u fwar ibaqbaq għal 30-60 minuta. Għala l-autoclave u autoclave f’10 (± 2) °C għal 20 siegħa. Sabiex tiġi evitata kristallizzazzjoni ta’ Ba(OH)2 · 8 H2O, żid it-taħlita sħuna bi 30 ml ilma li huwa f’temperatura ta’ kamra. Ħawwad bil-mod. Żid 2,00 ml soluzzjoni standard interna (α-tryptophan) konċentrata (3.16). Berred ir-reċipjenti fuq banju ilma/silġ għal 15 il-minuta. Żomm il-vessilu fl-banju li jberred u innewtralizza ma’ HCl, ċ = 6 mol/l (3.11) waqt li tħawwad u aġġusta l-pH to 3,0 bl-użu ta’ HCl, ċ = 1 mol/l (3.12). Żid metanol suffiċjenti biex tagħti konċentrazzjoni ta’ bejn 10 u 30 % ta’ metanol fil-volum finaliIttrasferixxi ġo kunjett volumetriku ta’ volum xieraq u ħallat bl-ilma għal volum definit għal volum definit neċessarju għal kromatografija (per eżempju 100 ml). Iż-żieda ta’ metanol ma tridx tikkawza preċipitazzjoni. Iffiltra ftit ml tas-soluzzjoni minn ġo 0,45 μm filtru membran (4.5) qabel injezzjoni fuq il-kolonna HPLC. Ipproċedi għal fażi tal-kromatografija skond il-paragrafu 5.4. Ipproteġi soluzzjoni standard u idroliżati kontra dawl tax-xemx dirett. Jekk ma jkunx possibbli biex tanalizza l-idroliżati fl-istess ġurnata, jistgħu jiġu maħżuna f’5 °C għal massimu ta’ tlett ijiem. 5.4. Determinazzjoni HPLC Il-kundizzjonijiet li jmiss għal eluzzjoni iżokratika huma offruti għal gwida; kondizzjonijiet oħra jistgħu jintużaw, iżda li jagħtu riżultati ekwivalenti (ara ukoll osservazzjonijiet 9.1 u9.2): Kolonna grafika likwida (4.2): | 125 mm x 4 mm, Ċ18, 3 μm pakkjar jew ekwivalenti | Temperatura tal-kolonna: | Temperatura ambjentali | Fażi mobbli (3,22): | Soluzzjoni ta' 3,00 g aċidu aċetiku (3.18) + 900 ml ilma (3.1) + 50.0 ml (3.21) ta' 1.1.1-trikloru-2-metil-2-propanol (3.19) f'metanol (3.8) (1 g/100 ml). Aġġusta pH għal 5,00 bl-użu ta' etanolamina (3.20). Imla sa' 1000 ml bl-ilma (3.1) | Rata ta' tnixxija: | 1 ml/min | totali tal-proċedura: | bejn wieħed u ieħor 34 min | Wavelength ta' detezzjoni: | 280 nm, emissjoni: 356 nm 356 nm | Volum ta' injezzjoni | 20 | 6. Kalkolazzjoni ta’ riżultati +++++ TIFF +++++ A = żona tal-livelli l-għolja ta’ standard intern, soluzzjoni standard ta’ kalibrazzjoni (3.17) B = żona ta’ livelli l-għolja ta’ triptofan, estratti (5.2) jew idrolisat (5.3) C = volum f’ml (2 ml) ta’ soluzzjoni triptofan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.17) D = konċentrazzjoni f’μmol/ml (= 2,50) ta’ soluzzjoni triptofan konċentrat (3.15) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.17) E = volum f’ml ta’ soluzzjoni standard interna konċentrata (3.16) miżjuda fl-estrazzjoni (5.2) (= 5,00 ml) jew għall-idrolisat (5.3) (= 2,00 ml) F = żona ta’ livelli l-għolja ta’ standard intern, estratt (5.2) jew idrolisat (5.3) G = żona tal-livelli l-għolja ta’ triptofan, soluzzjoni standard ta’ kalibrazzjoni (3.17) H = volum f’ml (= 2,00 ml) ta’ soluzzjoni standard internali konċentrat (3.16) miżjud fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.17) W = piż ta’ kampjun fi g (irranġat għal piż oriġinali jekk imnixxef u/jew jitneħħilu x-xaħam) MW = piż molekulari ta’ triptofan (= 204,23) 7. Ripetabilitá Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralelli isiru fuq l-istess kampjun ma jridx jeċċedi 10 % relativ għal riżultat aktar għoli. 8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Studju kollaborattiv Komunitarju (ir-Raba’ interparagun) ġie irranġat fejn tlett kampjuni ġew analizzati min 12 il-laboratorju biex jattestaw il-metodu għal idrolisi. Analiżi (5) replikanti ġew eżegwiti fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li jmiss: L : numru ta' laboratorji li jissottomettu riżultati n : numru ta' riżultati singoli miżmuma biex jiġu eliminati outliers (identifikat min test ta' outlier Cochran, dixon) Sr : devjazzjoni standard ta' abilitá ta' repetizzjoni SR : devjazzjoni standard ta' riproduzzjonibilitá r : ripetabilitá R : reprodutibilitá ĊVr : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' abilitá ta' repetizzjoni, % ĊVR : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' riproduttivitá, % | Kampjun 1 Għalf tal-ħanżir | Kampjun 2 Għalf tal-ħanżir imsaħħaħ L-tryptophanbit-triptofan | Kampjun 3 Għalf konċentrat għal ħnieżer | L | 12 | 12 | 12 | n | 50 | 55 | 50 | Xgħir [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 | sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 | r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 | ĊVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 | SR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 | R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 | ĊVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 | Studju kollaborattiv Komunitarju ieħor (it-tielet interparagun) ġie irranġat fejn żewġ kampjuni ġew analizzati min 13 il-laboratorju biex jattestaw il-metodu għal estrazzjoni ta’ triptofan ħieles. Analiżi (5) replikanti ġew eżegwiti fuq kull kampjun. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li jmiss: L : numru ta' laboratorji li jissottomettu riżultati n : numru ta' riżultati singoli miżmuma biex jiġu eliminati outliers (identifikat min test ta' outlier Cochran, dixon) sr : devjazzjoni standard ta' abilitá ta' repetizzjoni sR : devjazzjoni standard ta' riproduzzjonibilitá r : ripetabilitá R : reproduċibilitá CVr : koeffiċjenza ta' varjazzjoni ta' abilitá ta' repetizzjoni, % CVR : koeffiċjenza ta' varjazzjoni ta' riproduttivitá, % | Kampjun 4 Taħlita ta' qamħ u soja | Kampjun 5 Taħlita ta' qamħ u soja (= kampjun 4 ) b'triptofan miżjud (0,457 g/kg) | L | 12 | 12 | n | 55 | 60 | Mezz [g/kg] | 0,391 | 0,931 | sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 | r [g/kg] | 0,014 | 0,034 | CVr [%] | 1,34 | 1,34 | SR [g/kg] | 0,018 | 0,048 | R [g/kg] | 0,050 | 0,134 | CVR [%] | 4,71 | 5,11 | Studju interkumparabbli Komunitarju ieħor ġie irranġat ta’ fejn erba’ kampjuni ġew analizzati min seba’ laboratorji bl-għan ta’ triptofan attestat għal idroliżi. Ir-riżultati ġew mogħtija taħt ħames analiżi Replikanti ġew eżegwita fuq kull kampjun. L : numru ta' laboratorji li jissottomettu riżultati n : numru ta' riżultati singoli miżmuma biex jiġu eliminati outliers (identifikat min test ta' outlier Cochran, Dixon) sr : devjazzjoni standard ta' abilitá ta' repetizzjoni sR : devjazzjoni standard ta' riproduzzjonibilitá r : ripetibilitá R : reprodutibilitá CVr : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' abilitá ta' repetizzjoni, % CVR : koeffiċjenti għal varjazzjoni ta' riproduttivitá, % | Kampjun 1 Għalf tal-ħanżir imħallat (CRM117) | Kampjun 2 Xgħajr ta' ħut b'xaħam baxx (CRM118) | Kampjun 3 Xgħajr tas-Soybean (CRM119) | Kampjun 4 Trab ta' ħalib xkumat (CRM120) | L | 7 | 7 | 7 | 7 | n | 25 | 30 | 30 | 30 | Xgħajr [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 | sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 | r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 | CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 | SR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 | R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 | CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 | 9. Osservazzjonijiet 9.1. Skond kundizzjonijiet kromatografiċi speċjali jistgħu jagħtu separazzjonijiet aħjar bejn triptofan u α-metil-triptofan. Eluzzjoni isokratika segwita b’tindif ta’ kolonna li titla: Kolonna grafika likwida | 125 mm x 4 mm, C18, 5 μm pakkjar jew ekwivalenti | Temperatura tal-kolonna: | 32 °C | Fażi mobbli: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V) B: Metanol | Program li jitla: | 0 min | 100 % A | 0 % B | 15 min | 100 % A | 0 % B | 17 min | 60 % A | 40 % B | 19 min | 60 % A | 40 % B | 21 min | 100 % A | 0 % B | 33 min | 100 % A | 0 % B | Rata ta' tnixxija: | 1,2 ml/min | Ħin totali tal-proċedura: | approximately 33 minutes bejn wieħed u ieħor 34 minuta | 9.2. Il-kromatografija dvarja skond it-tip ta’ HPLC u tal-materjal ta’ l-ippakkjar tal-kolonna użat. Is-sistema magħżula trid tkun kapaċi li tagħti separazzjoni ta’ linja ta’ bażi bejn it-triptofan u l-istandard intern. Madankollu huwa importanti li prodotti ta’ degradazzjoni ikunu separati mit-triptofan u l-istandard intern. Idrolistati mingħajr standard intern irid jitħaddem sabiex jiċċekja il-linja ta’ bażi taħt l-istandard intern għal impuritajiet. Huwa importanti li il-ħin ta’ tħaddim huwa twil suffiċjenti għall-eluzjoni ta’ kull prodott ta’ degradazzjoni, inkella l-livelli għolja ta’ elutazzjoni jistgħu jinterferixxu ma’ tħaddim kromatografiku sussegwenti. Fl-iskala ta’ l-operazzjoni, s-sistema kromatografika trid tingħata risposta lineari. Ir-risposta lineari trid tiġi titkejjel b’konċentrazzjoni kostanti (in-normal) ta’ l-istandard intern u konċentrazzjonijiet li jvarjaw ta’ triptofan. Huwa ta’ importanza li il-qies taż-żewġ livelli għolja ta’ standard intern u tat-triptofan huma fl-iskala lineari tas-sistema HPLC/Jekk il-livell/i tat-triptofan u/jew l-anqas ta’ l-istandard intern ma jkunx/u żgħar ħafna jew kbar ħafna l-analiżi iridu jiġu ripetuti ma’ qies ta’ kampjun ieħor u/jew l-volum mibdul finali. 9.3. Idrossidu barjum Dawn ir-riżultati f’soluzzjoni mhux ċara għall-determinazzjoni HPLC, li tista’ tipproduċi riżultati baxxi għal triptofan. [1] Kontrollata mill-grupp tax-xogħol ta’ l-għalf għal Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA). [2] Kontrollata mill-grupp tax-xogħol ta’ l-għalf għal Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA). --------------------------------------------------