Id-Direttiva tal-Kummissjoni 98/64/KE tat-3 ta’ Settembru 1998 li jistabbilixxi metodi ta’ analiżi tal-Komunità għad-determinazzjoni ta’ amino-aċidi, żjut mhux raffinati u xaħmijiet, u olaquindox fl-għalf u li temenda d-Direttiva 71/393/KEETest b’relevanza għaż- ŻEE



Official Journal L 257 , 19/09/1998 P. 0014 - 0028

CS.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

ET.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

HU.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

LT.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

LV.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

MT.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

PL.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

SK.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447

SL.ES Chapter 3 Volume 23 P. 433 - 447



Id-Direttiva tal-Kummissjoni 98/64/KE tat-3 ta’ Settembru 1998 li jistabbilixxi metodi ta’ analiżi tal-Komunità għad-determinazzjoni ta’ amino-aċidi, żjut mhux raffinati u xaħmijiet, u olaquindox fl-għalf u li temenda d-Direttiva 71/393/KEE (Test b’relevanza għaż- ŻEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi il-Komunità Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 71/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni ta’ metodi tal-Komunità ta’ kampjunar u analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [1], kif emendat l-aħħar bl-Att ta’ Adeżjoni ta’ l-Awstrija, il-Fillandja u l-Isvezja, u b’mod partikolari l-Artikolu 2 tiegħu, Billi d-Direttiva 70/373/KEE tistipula li għandhom isiru kontrolli uffiċċjali ta’ l-għalf għall-għan li tkun iċċekkjata l-konformità mal-ħtiġijiet li jitqajjmu fil-liġijiet, regolamenti u dispożizzjonijiet amministrattivi li jirregolaw il-kwalità u komposizzjoni tagħhom bl-użu ta’ metodi tal-Komunità ta’ kampjunar u analiżi; Billi d-Direttiva tal-Kunsill 79/373/KEE tat-2 ta’ April 1979 dwar il-bejgħ ta’ għalf mħallat [2], emendata l-aħħar bid-Direttiva tal-Kummissjoni 97/47/KE [3], u d-Direttiva tal-Kunsill 93/74/KEE tat-13 ta’ Settembru 1993 dwar l-għalf maħsub għall-għanijiet partikolari ta’ nutriment [4], emendata bid-Direttiva 96/25/KE [5], tistipula li l-amino-aċidi u żjut mhux raffinati u xaħmijiet għandhom jitqiegħdu fuq it-tikketta ta’ l-għalf; Billi d-Direttiva tal-Kunsill 70/524/KEE tat-23 ta’ Novembru 1970 li tikkonċerna l-addittivi fl-għalf [6], emendat l-aħħar bid-Direttiva tal-Kummissjoni 98/19/KE [7], tistipula li l-kontenut ta’ olaquindox għandu jkun indikat fuq it-tikketta fejn din is-sustanza tiżdied mal-komposizzjonijiet ta’ għalf; Billi t-tieni Direttiva tal-Kummissjoni 71/393/KEE tat-18 ta’ Novembru 1971 tistabbilixxi metodi tal-Komunità ta’ analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [8], kif emendat l-aħħar bid-Direttiva tal-Kummissjoni 84/4/KEE [9], tfassal metodi għall-analiżi għal, inter alia, id-determinazzjoni ta’ żjut mhux irraffinati u xaħmijiet; billi huwa xieraq li l-metodu deskritt jinbidel; Billi l-metodi tal-Komunità ta’ analiżi għandhom jiġu stabbiliti sabiex jiġu ċċekkjati dawn is-sustanzi; Billi l-miżuri li hemm maħsuba f’din id-Direttiva huma konformi ma’ l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti fuq l-Għalf, ADOTTA DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Istati Membri għandhom jaraw li l-analiżi magħmula bi varjeta’ għall-kontrolli uffiċjali għall-kontenut ta’ l-aċidu amminiku, ta’ żejt mhux raffinat u xaħam, ta’ olaquindox fl-għalf isiru bl-użu ta’ metodi mfassla fl-Anness li jinsab hawn. Artikolu 2 Fl-Anness tad-Direttiva tal-Kummissjoni 71/393/KEE, punt ‘4. Determinazzjoni ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet’ jinbidel ma’ parti B ta’ l-anness ta’ din id-Direttiva. Artikolu 3 1. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, regolamenti u dispożizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex jikkonformaw ma’ din id-Direttiva sal-31 ta’ Dieċmbru 1998. Għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni minnufih dwar dan. Għandhom japplikaw dawn id-dispożizzjonijiet mill-1 ta’ Jannar 1999. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn il-miżuri, għandhom ikollhom fihom referenza għal din id-Direttiva jew ikunu akkumpanjati minn din ir-referenza fil-ħin tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-proċedura għat-tali referenza għandha tiġi adottata mill-Istati Membri. 2. L-Istati Membri għandhom jibagħtu lill-Kummissjoni t-test tad-dispożizzjonijiet ewlenin tal-liġi domestika li jadottaw fil-qasam regolat minn din id-Direttiva. Artikolu 4 Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fl-20 jum wara li tiġi ppubblikata fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Artikolu 5 Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri. Magħmul fi Brussel, 3 ta’ Settembru, 1998. Għall-Kummissjoni Franz Fischler Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU L 86, tas-6.4.1979, p. 30. [3] ĠU L 211, tal-5.8.1997, p. 45. [4] ĠU L 237, tat-22.9.1993, p. 23. [5] ĠU L 125, tat-23.5.1996, p. 35. [6] ĠU L 270, ta’ l-14.12.1970, p. 1. [7] ĠU L 96, tat-28.3.1998, p. 39. [8] ĠU L 279, ta’ l-20.12.1971, p. 7. [9] ĠU L 15, tat-18.1.1984, p. 28. -------------------------------------------------- L-ANNESS PARTI A DETERMIMAZZJONI TA’ AĊIDI AMMINICI 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ aċidi ħielsa (sintetiċi u naturali) u totali (marbutin peptide u ħielsa) fl-għalf, bl-użu ta’ analizzatur ta’ l-aċidu amminiku. Japplika għall-aċidi amminici li ġejjin: cycs(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, aċidu aspartiku, aċidu glutamiku, glycine, histidne, isoleucine, leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine u valine. Il-metodu ma jiddistingwix bejn l-imluħa ta’ l-aċidi amminici u ma jistax jagħmel distinzjoni bejn il-forom D u L ta’ l-aċidi amminici. M’huwiex validu għad-determinazzjoni ta’ analogi ta’ tryptophan jew hydroxy ta’ aċidi amminici. 2. Prinċipju 2.1. Aċidi amminiċi ħielsa L-aċidi amminici ħielsa jinħarġu bil-hydrochloric acid mħallat. Macromolecules nitroġeniċi koestratti jiġu ppreċipitati bis-sulfosalicylic acid u jitneħħew billi jiġu ffiltrati. Is-soluzzjoni ffiltrata tiġi aġġustata għal pH 2,20. L-aċidi amminici jiġu sseparati bi kromatografija tat-tip ion exchange u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninhydrin b’detezzjoni fotometrika f’570 nm. 2.2. Aċidi amminiċi totali Il-proċedura magħżula tiddependi fuq l-aċidi amminiċi li jkunu qegħdin jiġu investigati. Is-Cyst(e)ine u l-methionine għandhom jiġu ossidizzati għal cysteic acid u methionine sulphone rispettivament qabel ma ssir l-idrolisi. It-tyrosine għandu jiġi ddeterminat f’hydrolysates ta’ kampjuni mhux ossidizzati. L-aċidi amminiċi l-oħra kollha li huma mniżżlin fil-paragrafu 1 jistgħu jiġi ddeterminati sew fil-kampjun ossidizzat u sew f’dak li m’huwiex ossidizzat. L-ossidizzazzjoni ssir f’0 °Ċ b’taħlita ta’ performic acid/phenol.. Ir-reaġġent li jkun fadal jitkisser b’dissulfat tas-sodju. Il-kampjun ossidizzat jew mhux ossidizzat jiġi idrolizzat bil-hydrochloric acid (ċ = 6 mol/l) għal 23 siegħa. Il-hydrolysate jiġi aġġustat għal pH 2,20. L-aċidi amminiċi jiġu sseparati bi kromatografija tat-tip ion exchange u jiġu ddeterminati permezz ta’ reazzjoni man-ninhydrin b’detezzjoni fotometrika f’570 nm (440 nm għall-proline). 3. Reaġenti Għandu jintuża ilma ddistillat doppju jew ilma ta’ kwalità ekwivalenti (konduttività: 10 lS). 3.1. Perossidu ta’ idroġenu, w = 30 %. 3.2. Aċidu formiku, w = 98-100 %. 3.3. Phenol. 3.4. Sodium disulfite 3.5. Hydroxide tas-sodju: 3.6. 5-Sulfosalicylic acid dihydrate 3.7. Hydrochloric acid, densità bejn wieħed u ieħor 1,18 g/ml. 3.8. tri-Sodium citrate dihydrate. 3.9. 2,2Y-Thiodiethanol (thiodiglycol). 3.10. Klorat tas-sodju. 3.11. Ninhydrin. 3.12. Żejt ħafif mhux raffinat, jiftaħ jagħli bejn 40-60 °Ċ 3.13. Norleucine, jew komponent ieħor xieraq għall-użu bħala standard intern. 3.14. Gass tan-nitroġenu (: 10 ppm ossiġnu). 3.15. 1-Octanol. 3.16. Aċidi amminiċi. 3.16.1. Sustanzi standard imniżżlin fil-paragrafu 1. Komponenti puri li ma jkunx fihom ilma jew kristallizzazzjoni. Xott taħt vakum fuq P2O5 jew H2SO4 għal ġimgħa qabel l-użu. 3.16.2. Cysteic acid 3.16.3. Methionine sulphone. 3.17. Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju, ċ = 7,5 mol/l: Dewweb 300 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3.18. Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju, ċ = 1 mol/l: Dewweb 40 g NaOH (3.5) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3.19. Soluzzjoni ta’ formic acid-phenol: Ħallat 889 g formic acid (3.2) ma’ 111 g ilma u żid 4,73 g phenol (3.3). 3.20. Taħlita ta’ hydrolysis, ċ = 6 mol HCl/l li jkun fih 1 g phenol/l: Żid 1 g phenol (3.3) sa 492 ml HCI (3.7) u żid bl-ilma sakemm ikollok litru. 3.21. Taħlita għall-estrazzjoni, ċ = 0,1 mol HCI/l li jkun fih 2 % thiodiglycol: Ħu 8,2 ml HCI (3.7), żid bejn wieħed u ieħor 900 ml ilma, żid 20 ml thiodiglycol (3.9) u żid bl-ilma sakemm ikollok litru, (tħallatx 3.7 u 3.9 direttament). 3.22. 5-Sulfosalicylic acid, ß = 6 %: Dewweb 60 g 5-sulfosalicylic acid (3.6) fl-ilma u imla sakemm ikollok litru. 3.23. Taħlita għall-ossidizzazzjoni (Performic acid-phenol): Ħallat 0,5 ml perossidu ta’ l-idroġenu (3.1) ma’ 4.5 ml soluzzjoni ta’ formic acid-phenol (3.19) f’tazza żgħira. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ bejn 20-30!!! error character !!! Β!!! error character !!! Ί Ċ sabiex tifforma l-performic acid, imbagħad kessaħ f’banju ta’ ilma bis-silġ (15-il minuta) qabel ma żżid mal-kampjun. Attenzjoni: Evita l-kuntatt mal-ġilda u ilbes ilbies protettiv. 3.24. Citrate buffer, ċ = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Dewweb 19, 61 g sodium citrate (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) u 16,50 ml HCl (3.7) f’bejn wieħed u ieħor 800 ml ilma. Aġġusta l-pH għal 2.20. Żid bl-ilma sakemm ikollok litru. 3.25. Elution bufferse, ippreparati skond il-kondizzjonijiet ta’ l-analizzatur użat (4.9). 3.26. Reaġent tan-ninhydrin, ippreparat skond il-kondizzjonijiet ta’ l-analizzatur użat (4.9). 3.27. Soluzzjonijiet standard ta’ aċidi amminiċi. Dawn isoluzzjonijiet għandhom jitpoġġew taħt temperatura ta’ 5 °C. 3.27.1. Soluzzjoni standard ta’ amino aċidi (3.16.1). ċ = 2,5 μmol/ml minn kull wieħed fil-hydrochloric acid. Jista’ jinkiseb kummerċjalment 3.27.2. Soluzzjoni standard ta’ cysteic acid u methionine sulphone, ċ = 1,25 μmol/ml. Dewweb 0,2115 g cysteic acid (3.16.2) u 0,2265 g methionine sulphone (3.16.3) f’citrate buffer (3.24) fi flask iggradwat tal-litru u imla sal-marka bis-citrate buffer. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 12-il xahar. Din is-soluzzjoni ma tinużax jekk is-soluzjoni standard (3.27.1) ikun fiha cysteic acid u methionine sulphone. 3.27.3. Soluzzjoni standard ta’ l-istandard intern eż. norleucine, ċ = 20 μmol/ml. Dewweb 0,6560 g norleucine (3.13) f’citrate buffer (3.24) fi flask iggradwat u imla sa 250 ml bis-citrate buffer. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 6 xhur. 3.27.4. Soluzzjoni tal-kalibrazzjoni ta’ aċidi standard amminiċi biex jintużaw ma’ hydrolysates, ċ = 5nmol/50μl cysteic acid u methionine sulphone u ċ = 10 nmμl/50 μl ta’ l-aċidi amminiċi l-oħra. Dewweb 2,2 g klorat tas-sodju (3.10) f’tazza ta’ 100 ml ma’ 30 ml citrate buffer (3,24). Żid 4,00 ml soluzzjoni standard ta’ l-aċidi amminiċi (3.27.1), 4,00 ml soluzzjoni standard cysteic acid u methionine sulphone (3.27.2) u 0,50 ml soluzzjoni standard ta’ l-istandard intern (3.27.3) jekk intuża. Aġġġusta l-pH għal 2,20 bis-sodium hydroxide (3.18). Ittrasferixxi kwantittivament għal ġo flask gradwat ta’ 50ml u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24) u ħawwad. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 3 xhur. Ara wkoll l-osservazzjonijiet 9.1. 3.27.5. Soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni ta’ l-aċidi standard amminiċi għall-użu mal-hydrolysates ippreparati skond il-paragrafu 5.3.3.1. u għall-użu ma’ l-estratti (5.2). Is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni tiġi ppreparata skond 3.27.4 mingħajr il-klorat tas-sodju. Aħżnu f’temperatura taħt il-5 °Ċ għal mhux aktar minn 3 xhur. 4. Apparat 4.1. Flask bil-qiegħ tond ta’ 100 jew 250 ml li għandu reflux condenser imwaħħal miegħu. 4.2. Flixkun tal-ħġieġ borosilicate 100 ml bit-tapp bil-kamin b’kisja ta’ gomma/teflon (eż. Duran, Schott) sabiex jintuża fil-forn. 4.3. Forn b’ventilazzjoni sfurzata u regolatur tat-temperatura b’eżattezza aqwa minn 5 2 °Ċ. 4.4. pH-meter (tliet postijiet deċimali). 4.5. Membrane filter (0,2 μm). 4.6. Magna ċentrifuga. 4.7. Evaporatur tat-tip rotary vacuum. 4.8. Shaker mekkaniku jew oġġett li jħawwad manjetiku. 4.9. Analizzatur ta’ l-aċidi amminiċi jew apparat HPLC b’kolonna għall-ion exchange, tagħmir għan-ninhydrin, post column derivatization u detettur fotometriku. Il-kolonna timtela b’sulfonated polystyrene resins li huma kapaċi li jisseparaw l-aċidi amminiċi minn xulxin u minn materjali li huma ninhydrin-positive. Iċ-ċirkulazzjoni fit-tubi tal-buffer u tan-ninhydrin hija pprovduta minn pompi li għandhom stabilità ta’ ċirkolazzoni ta’ ± 0,5 % fil-perjodu li jkopri sew it-test tal-kalibrazzjoni standard kif ukoll l-analiżi tal-kampjun. B’xi ftit analizzatturi ta’ l-aċidu amminiku, jistgħu jintużaw proċeduri li fihom il-hydrolysate għandu konċentrazzjoni ta’ sodju ta’ ċ = 0,8 mol/l u jkun fih il-formic acid li jifdal mill-istadju ta’ l-ossidazzjoni. Oħrajn ma jagħtux separazzjoni sodisfaċenti ta’ ċerti aċidi amminiċi jekk il-hydrolysate ikun fih wisq aċidu formiku u/jew konċentrazzjonijiet għoljin ta’ sodium ion. F’dan il-każ il-volum ta’ aċidu jitnaqqas permezz ta’ evaporazzjoni għal bejn wieħed u ieħor 5 ml wara l-hydrolysis u qabel l-aġġustament tal-pH. L-evaporazzjoni għandha ssir f’vakwu f’temperatura massima ta’ 40 °Ċ. 5. Proċedura 5.1. Preparament tal-kampjun Il-kampjun jintaħan sabiex jgħaddi minn passatur ta’ 0,5 mm. Kampjuni li għandhom ħafna umdità għandhom jew jitnixxfu bl-arja f’temperatura ta’ mhux aktar minn 50 °Ċ jew jitnixxfu permezz ta’ friża qabel jintaħnu. Kampjuni b’kontenut għoli ta’ xaħam għandhom jiġu estratti b’żejt ħafif mhux raffinat (3.12) qabel ma jintaħnu. 5.2. Determinazzjoni ta’ aċidi amminiuċi ħielsa fl-għalf u taħlit li jkun sar minn qabel Iżen sa l-eqreb 0,2 mg ammont xieraq (1-5 g) tal-kampjun ippreparat (5.1), fi flask koniku u żid 100,0 ml mit-taħlita ta’ l-estrazzjoni (3.21). Ħawwad it-taħlita għal 60 minuta bl-użu ta’ shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku (4.8). Ħalli s-sediment joqgħod u itfa’ bil-pipetta 10,0 mis-supernatant solution f’tazza ta’ 100 ml. Żid 5,0 ml sulfosalicylic acid solution (3.22), mat-taħwid u kompli ħawwad bl-għajnuna ta’ stirrer manjetiku għal 5 minuti. Iffiltra jew iċċentrifuga s-supernatant sabiex jitneħħa kull preċipitat. Qiegħed 10,0 ml mis-soluzzjoni li tirriżulta ġo tazza ta’ 100 ml u aġġusta l-pH għal 2,20 bl-użu ta’ soluzzjoni ta’ sodium hydroxide (3.18), ittrasferixxi għal flask volumetriku ta’ volum xieraq bl-użu ta’ citrate buffer (3.24), u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24). Jekk qiegħed jintuża standard intern, żid 1,00ml mill-istandard intern (3.27.3) għal kull 100 ml soluzzjoni finali u imla sal-marka bil-buffer solution (3.24). Kompli għall-pass tal-kromatografija skond il-paragrafu 5.4. Jekk l-estratti m’humiex qegħdin jiġu eżaminati, għandhom jinħażnu taħt il-5 °Ċ. 5.3. Determinazzjoni ta’ l-aċidi amminiċi totali 5.3.1. Ossidazzjoni Iżen sa l-eqreb 0,2 mg minn 0,1 sa 1 g mill-kampjun ippreparat (5.1) f’: - flask bil-qiegħ tond ta’ 100 ml (4.1) għall-hydrolysis miftuħ (5.3.2.3) jew, - flask ta’ 250 ml bil-qiegħ tond (4.1) jekk hi meħtieġa konċentrazzjoni baxxa ta’ sodju (5.3.3.1) jew, - flixkun ta’ 100 ml b’tapp bil-kamin (4.2), (għall-hydrolysis magħluq 5.3.2.4). Il-porzjon tal-kampjun miżun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg u kontenut ta’ umdità ta’ mhux aktar minn 100 mg. Qiegħed il-flask/flixkun f’banju ilma bis-silġ u kessaħ sa 0 °Ċ, żid 5 ml mit-taħlita ta’ ossidazzjoni (3.23) u ħawwad bi spatula tal-ħġieġ bil-ponta mibruma. Issiġilla l-flask/flixkun li fih l-ispatula b’rita li ma jgħaddix arja minnha, qiegħed il-banju bl-ilma bis-silġ li fih ir-reċipjent issiġillat fi friġġ f’temperatura ta’ 0 °Ċ u ħalli għal 16-il siegħa. Wara 16-il siegħa neħħi mill-friġġ u skompona r-reaġent eċċessiv ta’ l-ossidazzjoni biż-żieda ta’ 0,84 g sodium disulfite (3.4). Ipproċedi għal 5.3.2.1. 5.3.2. Idroliżi 5.3.2.1. Idroliżi ta’ kampjuni ossidizzati Għall-kampun ossidizzat ippreparat skond 5.3.1 żid 25 ml taħlita ta’ idroliżi (3.20) u oqgħod attent li ma taħsilx xi residwu tal-kampjun li jeħel mal-ġnub tar-reċipjent u ta’ l-ispatula. Skond il-proċedura ta’ idroliżi li qiegħda tintuża, kompli skond 5.3.2.3 jew 5.3.2.4. 5.3.2.2. Idroliżi ta’ kampjuni li m’humiex ossidizzati Iżen fi flask bil-qiegħ tond ta’ 100 ml jew 250 ml (4.1) jew flixkun ta’ 100 ml bit-tapp bil-kamin (4.2), sa l-eqreb 0,2 mg, minn 0,1 sa 1 g tal-kampjun ippreparat (5.1). Il-porzjon miżun tal-kampjun għandu jkollu kontenut ta’ nitroġenu ta’ bejn wieħed u ieħor 10 mg. B’attenzjoni żid 25 ml tat-taħlita ta’ l-idroliżi (3.20) u ħallat mal-kampjun. Kompli skond jew 5.3.2.3 jew 5.3.2.4. 5.3.2.3. Idroliżi miftuħ Żid 3 żibeġ tal-ħġieġ mat-taħlita fil-flask (ippreparat skond 5.3.2.1 jew 5.3.2.2) u għalli kontinwament taħt reflux għal 23 siegħa. Meta jitlesta l-idroliżi, aħsel il-kondensatur b’ 5 ml citrate buffer (3.24). Skonnettja l-flask u kessħu f’banju ta’ silġ. Kompli skond 5.3.3. 5.3.2.4. Idroliżi magħluq Poġġi l-flixkun li jkun fih it-taħlita ppreparata f’konformità ma’ 5.3.2.1 jew 5.3.2.2 f’forn (4.3) f’temperatura ta’ 110 °Ċ. Waqt l-ewwel siegħa sabiex tipprevjeni milli tiżdied il-pressjoni (minħabba l-evoluzzjoni ta’ sustanzi li fihom il-gass) u sabiex tipprevjeni xi splużjoni, poġġi t-tapp bil-kamin fuq ir-reċipjent. Tagħlaqx ir-reċipjent bit-tapp. Wara siegħa, għalaq ir-reċipjent bit-tapp u ħallih fil-forn (4.3) għal 23 siegħa. Meta jitlesta l-idroliżi, neħħi l-flixkun mill-forn, iftaħ it-tapp tal-flixkun b’attenzjoni u poġġi l-flixkun f’banju ta’ ilma bis-silġ. Ħalliħ jiksaħ. Skond il-proċedura għall-aġġustament tal-pH (5.3.3), ittrasferixxi kwantittivament il-kontenuti tal-flixkun għal ġo tazza ta’ 250 ml jew flask ta’ 250 ml bil-qiegħ tond bl-użu ta’ citrate buffer (3.24). Kompli skond 5.3.3. 5.3.3. Aġġustament tal-pH Skond it-tolleranza tas-sodju ta’ l-analizzatur ta’ l-aċidi amminiċi (4.9) kompli skond 5.3.3.1 jew 5.3.3.2 għall-aġġustament tal-pH. 5.3.3.1. Għal sistemi kromatografiċi (4.9) li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju: Huwa rrakkomandat li tintuża soluzzjoni standard interna (3.27.3) meta jintużaw l-analizzaturi ta’ l-aċidi amminiċi li jeħtieġu konċentrazzjoni baxxa tas-sodju (meta l-volum ta’ l-aċidu jkollu jitnaqqas). F’dan il-każ, żid 2,00 ml mis-soluzzjoni standard interna (3.27.3) mal-hydrolysate qabel l-evaporazzjoni. Żid 2 qatriet ta’ octanol (3.15) mal-hydrolysate miksub f’konformità mal-paragrafu 5.3.2.3 jew 5.3.2.4. Bl-użu ta’ rotary evaporator (4.7) naqqas il-volum sa 5-10 ml f’vakwu f’temperatura ta’ 40 °Ċ. Jekk il-volum aċċidentalment jitnaqqas għal inqas minn 5 ml il-hydrolysate għandu jintrema u l-analiżi terġa’ tibda. Aġġusta l-pH għal 2,20 bis-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3.18) u kompli għall-paragrafu 5.3.4. 5.3.3.2. Għall-Analizzaturi ta’ Aċidi Amminiċi l-oħrajn kollha (4.9) Ħu l-hydrolysates miksuba f’konformità ma’ 5.3.2.3 jew 5.3.2.4 u nnewtralizzahom parzjalment billi żżid filwaqt li tħawwad b’attenzjoni, 17-il ml soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (3.17) filwaqt li tiżgura li t-temperatura tinżamm taħt 40°Ċ. Aġġusta l-pH għal 2,20 f’temperatura ambjentali bl-użu tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3.17) u finalment soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (3.18). Kompli għal 5.3.4. 5.3.4. Kampjun ta’ soluzzjoni għall-kromatografija Ittrasferixxi kwantittivament il-hydrolysate bil-pH aġġustat (5.3.3.1 jew 5.3.3.2) bis-citrate buffer (3.24) għal ġo flask iggradwat ta’ 200 ml, u imla sal-marka bil-buffer (3.24). Jekk ma intużax diġà standard intern, żid 2,00 ml standard inter (3.27.3) u imla sal-marka bis-citrate buffer (3.24). Ħawwad sew. Kompli għall-istadju tal-kromatografija (5.4). Jekk il-kamjuni tas-soluzzjonijeit m’humiex ser jiġu eżaminati dakinhar stess għandhom jinħażnu taħt il-5 °Ċ. 5.4. Kromatografija Qabel il-kromatografija ġib l-estratt (5.2) jew tal-hydrolysate (5.3.4) għal temperatura ambjentali. Ħawwad it-taħlita u ffiltra ammont xieraq minn membrane filter ta’ 0,2 μm (4.5). Is-soluzzjoni ċara li tirriżulta tiġi suġġetta għal kromatografija tat-tip ion exchange bl-użu ta’ analizzatur ta’ l-aċidu amminiku (4.9). L-injezzjoni tista’ ssir b’mod manwali jew awtomatiku. Huwa importanti li tiżdid l-istess kwantità tas-soluzzjoni 5 0,5 % mal-kolonna għall-analiżi ta’ l-istandards u kampjuni ħlief meta jintuża standard intern, u li l-proporzjonijiet ta’ sodju:aċidu amminiku fis-soluzzjonijiet standard u kampjuni huma simili kemm jista’ jkun. B’mod ġenerali, il-frekwenza tar-runs tal-kalibrazzjoni tiddependi fuq l-istabilità tar-reaġent tan-ninhydrin u s-sistema analitika. L-istandard jew il-kampjun jiġi dilwit bis-citrate buffer (3.24) sabiex jagħti erja tal-quċċata ta’ l-istandard ta’ 30-200 % ta’ l-erja tal-quċċata tal-kampjun ta’ l-aċidu amminiku. Il-kromatografija ta’ l-aċidi amminiċi tvarja ftit skond it-tip ta’ l-analizzatur u r-reżina wżati. Is-sistema magħżula għandha tkun kapaċi li tissepara l-aċidi miniċi minn xulxin u mill-materjali li huma posittivi fin-ninhydrin. Fil-varjetà ta’ ħidma, is-sistema kromatografika għandha tagħti rispons lineari lit-tibdil fl-ammonti ta’ aċidi amminiċi miżjuda mal-kolonna. Waqt l-istadju tal-kromatografija japplikaw il-proporzjonijiet ta’ wied:quċċata msemmija hawn taħt, meta tiġi analizzata soluzzjoni ekwimolari (ta’ l-aċidi amminiċi li qegħdin jiġu ddeterminati). Is-soluzzjoni ekwimolari għandha jkollha mill-inqas 30 % tat-tagħbija massima ta’ kull aċidu amminiku li jista’ jitkejjel b’mod preċiż bis-sistema ta’ l-analizzatur ta’ l-aċidu amminiku(4.9). Għas-separazzjoni tat-threonine-serine l-proporzjon tal-wied:quċċata ta’ l-anqas minn żewġ aċidi amminiċi li huma overlapping fuq il-kromatogram ma għandux ikun aktar minn 2:10 (jekk huma ddeterminati biss is-cyst(e)ine, methionine, threonine u lysine, separazzjoni insuffiċjenti minn qċaċet qrib xulxin tinfluwenza d-determinazzjoni b’mod ħażin). Għall-aċidi amminiċi l-oħra kollha s-separazzjoni għandha tkun aħjar minn 1:10. Is-sistema għandha tiżgura li l-lysine huwa sseparat mill-‘lysine artifacts u ornithine. 6. Kalkulazzjoni tar-riżultati L-erja tal-kampjun u l-qċaċet standard titkejjel għal kull aċidu amminiku individwali u jiġi kkalkulat l-ammont, fi g aċidu amminiku għal kull kg kampjun. g aċidu amminiku għal kull kg kampjun = Jekk jintuża standard intern immultiplika b’: A = erja ta’ quċċata, hydrolysate jew estratt B = erja ta’ quċċata, soluzzjoni standard ta’ kalibrazzjoni C = erja ta’ quċċata, standard intern f’hydrolysate jew estratt D = erja ta’ quċċata, standard intern, soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni standard MW = piż molekulari ta’ l-aċidu amminiku li qiegħed jiġi ddeterminat E = konċentrazzjoni ta’ standard f’lmol/ml W = piż tal-kampjun (g) (ikkoreġut għall-piż oriġinali jekk huwa mnixxef jew bix-xaħam imneħħi) F = ml hydrolysaet totali (5.3.4) jew kalkulazzjoni ml tal-volum ta’l-estratt totali dilwit (6.1). Is-Cystine u s-cysteine t-tnejn li huma huma ddeterminati bħala cicteic acid fil-hydrolysates ta’ kampjun ossidizzat, iżda huma kkalkulati bħala cyctine (C6H12N2O4S2, MW 240,30 billi jintuża MW 120,15 (= 0,5 x 240,30). Il-methionine huwa ddeterminat bħala methionine sulphone f’hydrolysates ta’ kampjun ossidizzat iżda kkalkulat bħala methionine billi jintuża MW tal-methionine: 149,21. Methionine ħieles miżjud huwa ddeterminat wara l-estrazzjoni bħala methionine, għall-kalkulazzjoni jintuża l-istess MW. 6.1. Il-volum totali dilwit ta’ estratti (F) għad-determinazzjoni ta’ aċidi amminiċi ħielsa (5.2) ikkalkulat kif ġej: F = 100 ml x x V = volum ta’ estratt finali 7. Evalwazzjoni tal-metodu Il-metodu ġie ittestjat meta pparagunat f’livell internazzjoni fl-1990 billi intużaw erba’ tipi differenti ta’ għalf (għalf tal-majjali mħallat, komposizzjoni tal-brojlers, konċentrazzjoni ta’ proteini,taħlit minn qabel). Ir-riżultati, wara eliminazzjoni ta’ dawk li jvarjaw ħafna, ta’ devjazzjoni medja u standard jingħataw fil-werrej ta’ hawn taħt: Medji f’g/kg Materjal | Aċidu amminiku | Threonine | Cyst(e)ine | Methionine | Lysine | Għalf tal-majjali mħallat | 6,94 n = 15 | 3,01 n = 17 | 3,27 n = 17 | 9,55 n = 13 | Komposizzjoni tal-brojlers | 9,31 n = 16 | 3,92 n = 18 | 5,08 n = 18 | 13,93 n = 16 | Konċentrat ta’ proteini | 22,32 n = 16 | 5,06 n = 17 | 12,01 n = 17 | 47,74 n = 15 | Taħlit minn qabel | 58,42 n = 16 | __ | 90,21 n = 16 | 98,03 n = 16 | n = numru ta’ laborotorji parteċipanti 7.1. Ripetittività Ir-ripetittività espressa bħala ‘fi ħdan l-istandard ta’ devjazzjoni tal-laboratorju’ tal-paragonar imsemmi hawn fuq jingħata fil-werrej ta’ hawn taħt: Fi ħdan id-devjazzjoni standard tal-laboratorju (Sr) fi g/kg Materjal għar-referenza | Aċidu amminiku | Threonine | Cyst(e)ine | Methionine | Lysine | Għalf tal-majjali mħallat | 0,13 n = 15 | 0,10 n = 17 | 0,11 n = 17 | 0,26 n = 13 | Komposizzjoni tal-brojlers | 0,20 n = 16 | 0,11 n = 18 | 0,16 n = 18 | 0,28 n = 16 | Konċentrat ta’ proteini | 0,48 n = 16 | 0,13 n = 17 | 0,27 n = 17 | 0,99 n = 15 | Taħlit minn qabel | 1,30 n = 16 | __ | 2,19 n = 16 | 2,06 n = 16 | n = numru ta’ laborotorji parteċipanti Koeffiċjent ta’ varjazzjoni ( %) għad-devjazzjoni standard fi ħdan il-laboratorju (Sc) Materjal għar-referenza | Aċicu amminiku | Threonine | Cyst(e)ine | Methionine | Lysine | Għalf tal-majjali mħallat | 1,9 n = 15 | 3,3 n = 17 | 3,4 n = 17 | 2,8 n = 13 | Komposizzjoni tal-brojlers | 2,1 n = 16 | 2,8 n = 18 | 3,1 n = 18 | 2,1 n = 16 | Konċentrat ta’ proteini | 2,7 n = 16 | 2,6 n = 17 | 2,2 n = 17 | 2,4 n = 15 | Taħlit minn qabel | 2,2 n = 16 | __ | 2,4 n = 16 | 2,1 n = 16 | n = numru ta’ laboratorji parteċipanti 7.2. Riproduċibilità Ir-riżultati għal bejn id-devjazzjoni standard tal-laboratorju mal-paragonar imsemmi hawn fuq huma mogħtija fil-werrej ta’ hawn taħt: Devjazzjoni standard bejn il-laboratorji (SR) f’g/kg Materjal għar-referenza | Aċidu amminiku | Threonine | Cyst(e)ine | Methionine | Lysine | Għalf tal-majjali mħallat | 0,28 n = 15 | 0,30 n = 17 | 0,23 n = 17 | 0,30 n = 13 | Komposizzjoni tal-brojlers | 0,48 n = 16 | 0,34 n = 18 | 0,55 n = 18 | 0,75 n = 16 | Konċentrat ta’ proteini | 0,85 n = 16 | 0,62 n = 17 | 1,57 n = 17 | 1,24 n = 15 | Taħlit minn qabel | 2,49 n = 16 | __ | 6,20 n = 16 | 6,62 n = 16 | n = numru ta’ laboratorji parteċipanti Koeffiċjent ta’ varjazzjoni ( %) għad-devjazzjoni standard bejn il-laboratorji (Sg) Materjal għar-referenza | Aċidu amminiku | Threonine | Cyst(e)ine | Methionine | Lysine | Għalf tal-majjali mħallat | 4,1 n = 15 | 9,9 n = 17 | 7,0 n = 17 | 3,2 n = 13 | Komposizzjoni tal-brojlers | 5,2 n = 16 | 8,8 n = 18 | 10,9 n = 18 | 5,4 n = 16 | Konċentrat ta’ proteini | 3,8 n = 16 | 12,3 n = 17 | 13,0 n = 17 | 3,0 n = 15 | Taħlit minn qabel | 4,3 n = 16 | __ | 6,9 n = 16 | 6,7 n = 16 | n = numru ta’ laborotorji parteċipanti 8. Użu ta’ materjali għar-referenza L-applikazzjoni korretta tal-metodu għandha tiġi vverifikata billi jsir kejl ripetut ta’ materjali għar-referenza ċċertifikati meta huma disponibbli. Kalibrazzjoni b’kalibrazzjoni ċċertifikata ta’ aċidu amminiku hija rrakommandata. 9. Osservazzjoni 9.1. Minħabba differenzi bejn l-analizzaturi ta’ l-aċidi amminiċi l-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet ta’ l-istandar ta’ aċidi amminiċi (ara 3.27.4 u 3.27.5) u tal-hydrolysate (ara 5.3.4) għandhom jittieħdu bħala gwida. Il-varji rispons lineari ta’ l-apparat għandu jiġi ċċekkjat għall-aċidi amminiċi kollha. Is-soluzzjoni standard tiġi dilwita bis-citrate buffer sabiex tagħti l-qċaċet f’nofs il-varjetà. 9.2. Fejn jintuża tagħmir ta’ kromatografija likwida ta’ esekuzzjoni għolja sabiex jiġu analizzati l-hydrolysates, il-kondizzjonijiet esperimentali għandhom jiġu ottimizzati f’konformità mar-rakkommandazzjonijiet tal-manifattur. 9.3. Meta tintuża’ l-applikazzjoni tal-metodu lill-għalf li jkun fih aktar minn 1 % klorat (konċentrat, għalf minerali, għalf supplimentari) jista’ jkun hemm nuqqas ta’ stima korretta tal-methionine u għandu jsir trattament speċjali. PARTI B DETERMINAZZJONI TA’ ŻJUT MHUX RAFFINATI U XAĦMIJIET 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet fl-għalf. Ma jkoprix l-analiżi ta’ żerriegħa taż-żejt u frott oleaġinuż definit fir-Regolament tal-Kunsill 136/66/KEE tat-22 ta’ Settembru 1966. L-użu taż-żewġ proċeduri deskritti hawn taħt jiddependi fuq in-natura u l-komposizzjoni ta’ l-għalf u r-raġuni għaliex tkun saret l-analiżi. 1.1. Proċedura A - Żjut mhux raffinati u xaħmijiet li jistgħu jiġi estratti direttament Dan il-metodu huwa applikabbli għall-materjali ta’ għalf li joriġinaw mill-pjanti, ħlief dawk inklużi fil-varjeta’ tal-proċedura B. 1.2. Proċedura B - Żjut mhux raffinati u xaħmijiet kollha Dan il-metodu japplika lill-materjali li joriġinaw mill-annimali u lill-komposizzjonijiet ta’ għalf kollha. Għandu jintuża għall-materjali kollha li minnhom ma jistgħux jiġu estratti ż-żjut u x-xaħmijiet mingħajr idroliżi minn qabel (eż glutini, ħmira, proteini tal-patata u prodotti soġġetti għall-proċessi bħalma huma l-estrużjoni, taqxir biċċa biċċa, u tisħin). 1.3. Interpretazzjoni ta’ riżultati Fil-każijiet kollha fejn jinkiseb riżultat ogħla billi tintuża l-Proċedura B milli bil-Proċedura A, ir-riżultat miksub mill-Proċedura A għandu jkun aċċettat bħala l-valur veru. 2. Prinċipju 2.1. Proċedura A Il-kampjun jiġi estratt b’żejt mhux raffinat ħafif. Is-solvent jiġi ddistillat u r-residwu mnixxef u miżun. 2.2. Proċedura B Il-kampjun jiġi ttrattat bit-tisħin bil-hydrochloric acid. It-taħlita titkessaħ u ffiltrata. Ir-residwu jinħasel u jitnixxef u jiġi sottomess għad-determinazzjoni skond il-Proċedura A. 3. Reaġenti 3.1. Żejt mhux raffinat ħafif, varjetà ta’ togħlija: 40 sa 60 °Ċ. Il-valur ta’ bromu għandu jkun anqas minn 1 u r-residwu ta’ evaporazzjoni inqas minn 2 mg/100ml. 3.2. Sulfat tas-sodju, anidru. 3.3. Hydrochloric acid, ċ = 3 mol HCl/l 3.4. Għajnuna għal-filtrazzjoni, eż. Kieselguhr, Hyflo-supercel. 4. Apparat 4.1. Apparat għall-estrazzjoni. Jekk mgħammar b’sifun (apparat Soxhlet), ir-rata tar-rifluss għandu jkun tali li jipproduċi xi 10 ċikli fis-siegħa; jekk huwa tat-tip mingħajr sifun, ir-rata ta’ rifluss għandha tkun xi 10 ml fil-minuta. 4.2. Vajlori għall-estrazzjoni, ħielsa minn materja li ddub f’żejt mhux raffinat ħafif u li għandhom porosità konsistenti mal-ħtiġijiet tal-punt 4.1. 4.3. Forn għat-tnixxif, jew forn tal-vakwu ssettjat f’temperatura ta’ 75 °Ċ ± 3°Ċ jew forn ta’ l-arja ssettjat f’temperatura ta’ 100 °Ċ ± 3°Ċ. 5. Proċedura 5.1. Proċedura A (ara l-punt 8.1) Iżen 5 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg, ittrasferixxih għal ġo vajlora ta’ l-estrazzjoni (4.2) u għattih b’biċċa tajjar mingħajr xaħam. Poġġi l-vajlora f’estrattur (4.1) u estratta għal sitt sigħat b’żejt mhux raffinat ħafif (3.1). Iġbor l-estratt taż-żejt ħafif mhux raffinat fi flask xott, miżun li jkun fih frak tal-ħaffiefa [1]. Iddistilla s-solvent. Nixxef ir-residwu billi żżomm il-flask fil-forn tat-tnixxif għal siegħa u nofs (4.3). Ħallih jiksah f’dissikatur u iżen. Erġa nixxef għal 30 minuta sabiex tiżgura li l-piż taż-żjut u x-xaħmijiet jibqa’ kostanti (telf ta’ piż bejn żewġ użin suċċessivi għandu jkun inqas minn 1mg). 5.2. Proċedura B Iżen 2,5 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg (ara l-punt 8.2), poġġi f’tazza ta’ 400 ml jew flask koniku ta’ 300 ml u żid 100 ml hydrochloric acid (3.3) u frak tal-ħaffiefa. Għatti t-tazza bi ħġieġa jew waħħal kondenser tar-rifluss mal-flask koniku. Saħħan it-taħlita sakemm tagħli bil-mod fuq nar baxx jew fuq pjanċa taħraq u ħalliha hemm għal siegħa. Tħallix il-prodott jeħel mal-ġnub tar-reċipjent. Kessaħ u żid kwantità mill-għajnuna tal-filtrazzjoni (3.4) biżżejjed biex jipprevjeni kull telf ta’ żejt u xaħam waqt il-filtrazzjoni. Iffiltra minn karta tal-filtru doppja, niedja, mingħajr xaħam. Aħsel ir-residwu f’ilma kiesaħ sakemm jinkiseb filtrat naturali. Iċċekkja li l-filtrat ma jkun fih l-ebda żjut jew xaħmijiet. Il-preżenza tagħhom tindika li l-kampjun għandu jinħareġ b’żejt ħafif mhux raffinat, bl-użu tal-Proċedura A, qabel il-hydrolysis. Poġġi l-karta tal-filtru doppja li jkun fiha r-residwu fuq ħġieġa u nixxef għal siegħa u nofs fil-forn ta’ l-arja (4.3) 100 °Ċ ± 3 °Ċ. Poġġi l-karta doppja tal-filtru li jkun fiha r-residwu xott f’vajlora ta’ l-estrazzjoni (4.2) u għatti b’biċċa tajjar mingħajr xaħam. Poġġi l-vajlora fl-estrattur (4.1) u kompli kif indikat fit-tieni u t-tielet paragrafi tal-punt 5.1. 6. Qari ta’ riżultat Esprimi l-piż tar-residwu bħala persentaġġ tal-kampjun. 7. Ripetittività Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli li jsiru fuq l-istess kampjun mill-istess analista ma għandhiex tkun aktar minn: - 0,2 % f’valur assolut, għal kontenuti ta’ żjut mhux raffinati u xaħmijiet anqas minn 5 %. - 4,0 % relattiv għall-ogħla riżultat għall-kontenuti ta’ 5 sa 10 %, - 0,4 % f’valur assolut, għal kontenuti l-fuq minn 10 %. 8. Osservazzjonijiet 8.1. Għal prodotti b’kontenut għoli ta’ żjut u xaħmijiet, li huma diffiċli biex jintaħnu jew m’humiex xierqa biex minnhom jinħareġ kampjun għat-test imnaqqas b’mod omoġenu, kompli kif ġej. Iżen 20 g mill-kampjun sa l-eqreb 1 mg u ħallat ma’ 10 g jew aktar mis-sulfat tas-sodju anidru (3.2). Oħroġ b’żejt ħafif mhux raffinat (3.1) kif indikat fil-punt 5.1. Imla l-estratt miksub sa 500 ml b’żejt ħafif mhux raffinat (3.1) u ħawwad. Ħu 50 ml mis-soluzzjoni u poġġi fi flask żgħir, xott, miżun li jkun fih frak tal-ħaffiefa (2). Iddistilla s-solvent, ixxuttah u kompli kif indikat fl-aħħar paragrafu tal-punt 5.1. Elimina s-solvent mir-residwu ta’ l-estrazzjoni li jifdalfil-vajlora, farrak ir-residwu għal finezza ta’ 1 mm, erġa’ qiegħdu fil-vajlora ta’ l-estrazzjoni (iżżidx sulfat tas-sodju) u kompli kif indikat għat-tieni u t-tielet paragrafi tal-punt 5.1. Ikkalkula l-kontenut taż-żjut u x-xaħmijiet bħala persentaġġ tal-kampjun billi tuża l-formula li ġejja: (10 a + b) x 5 fejn: a = l-massa fi grammi tar-residwu wara l-ewwel estrazzjoni (parti aliquot ta’ l-estratt), b = massa fi grammi tar-residwu wara t-tieni estrazzjoni. 8.2. Għall-prodotti baxxi fiż-żjut u x-xaħmijiet il-kampjun għat-test jista’ jiżdied għal 5 g. 8.3. Ikel ta’ l-annimali tad-dar li jkun fih kontenut għoli ta’ ilma jista’ jkun hemm il-bżonn li jitħalltu mas-sulfat tas-sodju anidru qabel il-hydrolysis u l-estrazzjoni bħal ma hemm fil-proċedura B. 8.4. Fil-paragrafu 5.2 jista’ jkun effettiv aktar li jintuża ilma jaħraq minflok ilma kiesaħ sabiex jinħasel ir-residwu wara l-filtrazzjoni. 8.5. Il-ħin għat-tnixxif ta’ siegħa u nofs jista’ jkollu bżonn jittawwal għal xi għalf. Tnixxif eċċessiv għandu jiġi evitat għax dan jista’ jwassal għal riżultati baxxi. Jista’ jintuża microwave oven ukoll. 8.6. L-estrazzjoni minn qabel permezz tal-Proċedura A qabel l-idroliżi u r-riestrazzjoni hija rrakommandata permezz tal-Proċedura B jekk il-konteut ta’ żejt mhux raffinat/xaħam huwa akbar minn 15 %. Dan jiddependi xi ftit fuq in-natura ta’ l-għalf u n-natura taż-żejt-xaħam fl-għalf. PARTI Ċ DETERMINAZZJONI TA’ OLAQUINDOX (2-[N-2’-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxyde) 1. Għan u varjetà Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ olaquindox fl-għalf. Il-limitu baxx ta’ determinazzjoni huwa 5 mg/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun jiġi estratt b’taħlita ta’ ilma u methanol. Il-kontenut ta’ olaquindox jiġi ddeterminat b’eżekuzjoni għolja ta’ kromatografija likwida fil-fażi kontrarja (HPLC) bl-użu ta’ detettur tal-UV. 3. Reaġenti 3.1. Methanol. 3.2. Methanol, grad ta’ HPLC 3.3. Ilma, grad ta’ HPLC 3.4. Fażi mobili għall-HPLC Taħlita ta’ ilma (3.3)-methanol (3.2), 900 + 100 (V + V). 3.5. Sustanza standard: olaquinox pura 2-[N-2’-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-diossidu, E 851. 3.5.1. Soluzzjoni standard ta’ olaquindox maħżuna, 250 μg/ml Iżen sa’ l-eqreb 0,1 mg 50 mg olaquindox (3.5) fi flask iggradwat ta’ 200 ml u żid ċirka 190 ml ilma. Imbagħad qiegħed il-flask f’banju ultrasoniku (4.1) għal 20 min. Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni f’tempeatura ambjentali, imla sal-marka bl-ilma u ħawwad. Iksi l-flask b’fojl ta’ l-aluminju u aħżnu fi friġġ. Is-soluzzjoni għandha titħejja friska kull xahar. 3.5.2. Soluzzjoni standard intermedjarja ta’ olaquindox, 25 μg/ml Ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard maħżuna (3.5.1) fi flask iggradwat ta’ 100 ml, imla sal-marka bil-fażi mobbli (3.4) u ħawwad. Iksi l-flask b’fojl ta’ l-aluminju u aħżnu fi friġġ. Is-soluzzjoni għandha titħejja friska kuljum. 3.5.3. Soluzzjonijiet għall-kalibrazzjoni Ittrasferixxi f’serje ta’ flasks iggradwati ta’ 50 ml 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 u 20,o ml mis-soluzzjoni standard intermedjarja (3.5.2). Imla sal-marka bil-fażi mobbli (3.4) u ħawwad. Iksi l-flask b’fojl ta’ l-aluminju. Is-soluzzjonijiet jaqblu ma’ 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 u 10,0 μg ta’ aquindox kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jitħejjew friski kuljum. 4. Apparat 4.1. Banju ultrasoniku 4.2. Shaker mekkaniku 4.3. Tagħmir ta’ HPLC b’ditekter ultra-vjola ta’ wavelength varjabbli jew didekter diode array 4.3.1. Kolonna kromatografika likwida, 250mm x 4 mm, imballaġġ ta’ Ċ18, 10 μm, jew ekwivalenti. 4.4. Membrane filters, 0,45 μm 5. Proċedura Notament: L-olaquindox huwa sensittiv għad-dawl. Agħmel il-proċeduri taħt dawl baxx jew uża affarijiet tal-ħġieġ sofor. 5.1. Ġenerali 5.1.1. Għandu jiġi analizzat għalf mingħajr kampjun sabiex ikun iċċekkjat li la l-olquindox u lanqas sustanzi li jtellfu m’huma presenti. 5.1.2. Għandu jsir test ta’ rikupru billi jiġi analizzat l-għalf mingħajr kampjun li ssaħħaħ permezz ta’ żieda ta’ kwantità ta’ olaquindox, simili għal dik presenti fil-kampjun. Sabiex issaħħaħ f’livell ta’ 50 mg/kg, ittrasferixxi 10,0 ml mis-soluzzjoni standard maħżuna (3.5.1) għal ġo flask koniku u evapora s-soluzzjoni għal ċirka 0,5 ml. Żid 50 g mill-għalf mingħajr kampjun, ħawwad sew u ħallih għal 10 minuti u erġa’ ħawwad għal ħafna drabi qabel tkompli bil-pass ta’ l-estrazzjoni (5.2). Notament: Għall-għan ta’ dan il-metodu l-għalf mingħaajr kampjun għandu jkun simili fit-tip għal dak tal-kampjun u l-olaquindox m’għandux jinqabad. 5.2. Estrazzjoni Iżen sa’ l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 50 g mill-kampjun. Ittrasferixxi għal ġo flask koniku ta’ 1000 ml, żid 100 ml methanol (3.1) u poġġi l-flask għal 5 minuti f’banju ultrasoniku (4.1). Żid 410 ml ilma u ħalli fil-banju ultrasoniku għal 15-il minuta oħra. Neħħi l-flask mill-banju ultrasoniku, ħawdu għal 30 minuta fix-shaker (4.2) u ffiltra minn filtru mitwi. Ittrasferixxi 10,0 ml mill-filtrat fi flask iggradwat ta’ 20 ml, imla sal-marka bl-ilma u ħawwad. Alikwot jiġi ffiltrat minn membrane filter (4.4). (Ara 9. Osservazzjoni) Kompli għad-determinazzjoni HPLC (5.3). 5.3. Determinazzjoni ta’ l-HPLC 5.3.1. Parametri: Il-kondizzjonijiet li ġejjin qegħdin offruti bħala gwida, jistgħu jintużaw kondizzjonijiet oħra sakemm jagħtu l-istess riżultati. Kolonna analitika (4.3.1) Fażi mobbli (3.4): | taħlita ta' ilma (3.3) – methanol(3.2), 900 + 100 (V + V) | Rata ta' ċirkulazzjoni: | 1,5-2 ml/min. | Detection wavelength | 380 nm | Volum ta' injezzjoni: | 20 µl-100 µl | Iċċekkja l-istabbilità tas-sistema kromatografika, billi tinjetta ħafna drabi s-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3.5.3) li jkun fihom 2,5 μg/ml, sakemm jinkisbu għoli ta’ qċaċet u ħinijiet ta’ retenzjoni kostanti. 5.3.2. Graff tal-kalibrazzjoni Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.5.3) ħafna drabi u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erji) għal kull kalibrazzjoni. Pinġi l-graff ta’ kalibrazzjoni billi tuża’ l-għoli medji tal-qċaċet (erji) tas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrespondenti f’μg/ml bħala l-axxiżi. 5.3.3. Kapmpjun ta’ soluzzjoni Injetta il-kampjun ta’ l-estratt (5.2) ħafna drabi billi tuża’ l-istess volum meħud għas-soluzzjonijiet ta’ kalibrazzjoni u stabbilixxi l-għoli medju tal-quċċata (erja) tal-qċaċet ta’ olaquindox. 6. Kalkulazzjoni tar-riżultati Mill-għolji medju (erja) tal-qċaċet ta’ olaquindox tal-kampjun ta’ soluzzjoni stabbilixxi l-konċentrazzjoni tal-kampjun ta’ soluzzjoni f’μg/ml b’referenza għall-graff ta’ kalibrazzjoni (5.3.2). w = c x 1000m li fiha: c = konċentrazzjoni ta’ olaquindox tal-kampjun ta’ estratt (5.2) f’μg/ml. m = massa tal-kampjun tat-test fi g (5.2). 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. Identità L-identità ta’ l-analità tista’ tiġi kkonfermata permezz ta’ ko-kromatografija, jew billi jintuża’ didekter diode-array li bih l-ispettra tal-kampjun estratt (5.2) u s-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3.5.2) li fih 5,0 μg/ml huma mqabbla. 7.1.1. Co-kromatografija Kampjun estratt (5.2) jissaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq mis-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni (3.5.3). L-ammont ta’ olaquindox miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ olaquindox li jinsab fil-kampjun estratt. L-għoli tal-quċċata ta’ l-olaquindox biss għandu jkun imsaħħaħ wara li jkunu kkunsidrati sew l-ammont miżjud u sew id-dilwit ta’ l-estratt. Il-wisgħa tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandha tkun fi ħdan ± 10 % tal-wisgħa oriġinali tal-quċċata ta’ olaquindox tal-kampjun estratt mhux imsaħħaħ. 7.1.2. L-Iskoperta Diode array Ir-riżultati jiġu evalwati skond il-kriterji li ġejjin: (a) Il-mewġa manjetika ta’ assorbazzjoni massima tal-kampjun u ta’ l-ispettra standard, irrekordjat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandha tkun fi ħdan marġini stabbilita mis-saħħa tas-sistema ta’ detezzjoni li ssolvi. Għall-iskoperta diode-array dan huwa tipikament fi ħdan ± 2 nm. (b) Bejn 220 u 400 nm, il-kampjun u spettra standard irrekordjati fil-quċċata ta’ l-apiċi tal-kromatogramma, ma għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet ta’ l-ispektrum li jvarjaw bejn l-10-100 % ta’ assorbazzjoni relattiva. Din il-kriterja tintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u d-devjazzjoni bejn iż-żewġ spektra fl-ebda punt osservat ma taqbeż il-15 % ta’ l-assorbazzjoni ta’ l-analità standard. (ċ) Bejn 220 u 400 nm, l-ispektra tat-telgħa, apiċi u niżla tal-quċċata prodotti mill-istess kampjun estratt ma għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet ta’ l-ispektrum fi ħdan il-varjazzjoni 10-100 % ta’ l-assorbazzjoni relattiva. Din il-kriterja tintlaħaq meta l-istess massimi huma preżenti u meta fil-punti osservati kollha d-devjazzjoni bejn l-ispektra ma taqbiżx il-15 % ta’ l-assorbazzjoni ta’ l-ispektrum tal-quċċata ta’ l-apiċi. Jekk ma tintlaħaqx waħda minn dawn il-kriterji l-preżenza ta’ l-analità ma tkunx ġiet ikkonfermata. 7.2. Ripetittività Id-differenza bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazjzonijeit paralelli li jkunu saru fuq l-istess kampjun ma għandux jaqbeż il-15 % relattiv ma’ l-ogħla riżultat għall-kontenuti ta’ olaquindox bejn 10 u 20 mg/kg. 7.3. Rikupru Għal kampjun vojt imsaħħaħ ir-rikupru għandu jkun ta’ l-anqas 90 %. 8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Ġie rranġat studju kollaborattiv tal-KE li fih erba’ kampjuni ta’ għalf tal-qżieqeż li jinkludu għalf vojt ġew analizzati minn 13-il laboratorju. Ir-riżultati jingħataw hawn taħt: | Kampjun 1 | Kampjun 2 | Kampjun 3 | Kampjun 4 | L | 13 | 10 | 11 | 11 | n | 40 | 40 | 44 | 44 | medja (mg/kg) | __ | 14,6 | 48,0 | 95,4 | (Sr) (mg/kg) | __ | 0,82 | 2,05 | 6,36 | (SR) (mg/kg) | __ | 1,62 | 4,28 | 8,42 | CVr (%) | __ | 5,6 | 4,3 | 6,7 | CVR (%) | __ | 11,1 | 8,9 | 8,8 | Kontenut nominali (mg/kg) | __ | 15 | 50 | 100 | rikupru. (%) | __ | 97,3 | 96,0 | 95,4 | L : numru ta’ laboratorji n : numru ta’ valuri singli Sr : devjazzjoni standard ta’ ripetittività SR : devjazzjoni standard ta’ riproduċibbiltà CVr : koeffiċjent tal-varjazzjoni ta’ ripetittività CVR : koeffiċjent ta’ varjazzjoni ta’ riproduċibbiltà 9. Osservazzjoni Għalkemm il-metodu ma ġiex ivvalidat għal għalf li fih aktar minn 100 mg/kg olaquindox, jista’ jkun possibbli li jinkisbu riżultati sodisfaċenti billi jittieħed piż iżgħar tal-kampjun u/jew billi l-estratt jiġi dilwit (5.2) sabiex tintlaħaq konċentrazzjoni fi ħdan il-varjetà tal-graff ta’ kalibrazzjoni (5.3.2). [1] Billi ż-żejt jew xaħam għandu jgħaddi minn testijiet sussegwenti għall-kwalità, ibdel il-frak tal-ħaffiefa b’żibeġ tal-ħġieġ. --------------------------------------------------