REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 440/2008

tat-30 ta' Mejju 2008

li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH)

(Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komuità Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament tal-Kunsill (KEE) Nru 793/93 u r-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 1488/94 kif ukoll id-Direttiva tal-Kunsill 76/769/KEE u d-Direttivi tal-Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 13(3) tiegħu,

Billi:

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1

Il-metodi ta' ttestjar li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament 1907/2006/KE huma stipulati fl-Anness għal dan ir-Regolament.

Artikolu 2

Il-Kummissjoni għandha teżamina mill-ġdid, meta dan ikun f'loku, il-metodi ta' ttestjar li fih dan ir-Regolament, bil-għan li tissostitwixxi, tnaqqas jew tirfina l-ittestjar fuq l-annimali vertebrati.

Artikolu 3

Ir-referenzi kollha għall-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE għandhom jinftiehmu bħala referenzi għal dan ir-Regolament.

Artikolu 4

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea.

(1) ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1. kif ikkoreġut bil-ĠU L 136, 29.5.2007, p. 3.

(2) ĠU 196, 16.8.1967, p. 1. Id-Direttiva kif emendata l-aħħar bid-Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (ĠU L 396, 30.12.2006, p. 850) – għandha tiġi aġġornata bir-referenzi rilevanti mal-pubblikazzjoni tat-30 ATP.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. It-tielet edizjoni riveduta. Pubblikazzjoni tal-NU, Nru.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, paġna 342. Test O.2: Test għall-likwidu ossidanti

The following data are typical for a pMMA standard:

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.

ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of explosion risk.

Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Other reference substances of low log Pow

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86,5175.

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525

NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use -Determination of partition coefficient -Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339.

J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675

W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) -Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

Il-ħin mejjet to jista' jkun iddeterminat bl-użu jew ta' serje omologa (eż. n-alkyl methyl ketones) jew mill-komposti organiċi mhux miżmuma (eż. thiourea jew formamide). Għal kalkolu tal-ħin mejjet to bl-użu tas-serje omologa, sett ta' mill-anqas seba' membri tas-serje omologa jiġi injettat u ż-żmien ta' retenzjoni rispettivament jiġi ddeterminat. Il-ħinijiet ta' retenzjoni mhux analizzati tr (n c + 1) jiġu pplottjati bħala funzjoni ta' tr(n c) u l-linja bejn żewġ punti ta' interċezzjoni a u l-anglu b ta' l-ekwazzjoni ta' regressjoni:

NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility -Flask method

NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility -Column elution method

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa -Vapour pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa -Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

Determination of the density of soils

Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method

Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method

Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)

Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)

Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)

Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)

Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)

Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)

Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 15 oC)

Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of plastics and elastomers; determination of density

Specific gravity and density of plastics by displacement

Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method

Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method

Part III: Use and test

Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. , New York, 1959, vol. I, Part 1.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of distillation characteristics

Method for determination of distillation of petroleum products

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.

Standard test method for pour point of petroleum oils

Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite -Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of the freezing point

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

Method for the determination of crystallizing point

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

Testing methods for melting point of chemical products.

Method for the determination of melting point and/or melting range

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.

R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

PARTI B: METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSIĊITÀ U EFFETTI OĦRA TAS-SAĦĦA

WERREJ

DAĦLA ĠENERALI 143

B.1.bis. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA 145

B.1.tris. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA 158

B.2. TOSSIĊITÀ AKUTA (TEĦID MAN-NIFS) 174

B.3. TOSSIĊITÀ AKUTA (DERMALI) 178

B.4. TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-ĠILDA 182

B.5. TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TA' L-GĦAJNEJN 191

B.6. SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA 202

B.7. DOŻA REPETUTA (28 jum) TOSSIĊITÀ (ORALI) 210

B.8. DOŻI REPETUTI (28 jum) TOSSIĊITÀ (TEĦID MAN-NIFS) 216

B.9. DOŻI REPETUTI (28 jum) TOSSIĊITÀ (DERMALI) 221

B.10. MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VITRO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MAMMIFERI 225

B.11. MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VIVO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI 233

B.12. MUTAĠENIĊITÀ – TEST MIKRONUKLEU IN VIVO GĦAL ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI 240

B.13/14. MUTAĠENIĊITÀ – TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' BATTERJI 248

B.15. IT-TIBDIL TAL-ĠENE – SACCHAROMYCES CEREVISIAE 256

B.16. IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTISTA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE 259

B.17. MUTAĠENEĊITÀ – TEST TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENE TAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI IN VITRO 262

B.18. DANNI U RIMEDJI TAD-DNA – SINTESI MHUX FL-ISKEDA TAD-DNA – ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO 271

B.19. ANALIŻI IN VITRO TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID OĦT 275

B.20. TEST REESSIV LI JIKKAĠUNA L-MEWT U LI HUWA SKOND IS-SESS F’ DROSOPHILA MELANOGASTER 279

B.21. TEST TAT-TIBDIL TAL-ĠENI F’ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO 282

B.22. TEST LETALI DOMINANTI TAL-MAMMALI ĠERRIERA 285

B.23. TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI 288

B.24. TEST TAT-TIKEK FIL-PIL TAL-ĠRIEDEN 295

B.25. IT-TRASLOKAZZJONI TAL-ĠRIEDEN LI TITTIEĦED 298

B.26. EŻAMI TA’ TOSSIĊITA ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA 302

B.27. EŻAMI TA’ TOSSIĊITÀ ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA 308

B.28. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA STUDJU DERMALI TAD- DOŻA RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA 314

B.29. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN SUB-KRONIKU STUDJU TAD-DOŻA TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA 318

B.30. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ KRONIKA 323

B.31. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ FL-IŻVILUPP PRENATALI 329

B.32. TEST TAL-KARĊINOĠENIĊITÀ 338

B.33. TEST MAGĦQUD TA’ TOSSIĊITÀ KRONIKA/KARĊINOĠENITÁ 344

B.34. TEST TA’ TOSSIĊITÀ FUQ IR-RIPRODUZZJONI FUQ ĠENERAZZJONI WAĦDA 351

B.35. STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ ĠENERAZZJONIJIET 355

B.36. TOSSIKOKINETISTA’ 365

B.37. ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS WARA L-ESPOŻIZZJONI AKUTA 369

B.38. ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS STUDJU TA' DOŻA RIPETUTTA GĦAL 28 ĠURNATA 374

B.39. TEST IN VIVO TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI 378

B.40. IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO : IT-TEST TAR-REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER – TRANSCUTANEAL ELECTRICAL RESISTANCE) 384

B.40.BIS. IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO : IT-TEST TAL-MUDELL TAL-ĠILDA UMANA 394

B.41. IT-TEST TAL-FOTOTOSSIĊITÀ IN VITRO 3T3 NRU 400

B.42. SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA: ASSAĠĠ LOKALI TAN-NODULA TAL-LIMFA 414

B.43. STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÁ FL-ANNIMALI GERRIEMA 420

B.44. L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VIVO 432

B.45. L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VITRO 438

DAĦLA ĠENERALI

A. KARATTERIZZAZZJONI TAS-SUSTANZA GĦAT-TEST

Il-kompożizzjoni tas-sustanza għat-test, inklużi l-impuritajiet l-iktar importanti, u l-proprjetajiet fiżiko-kimiċi relevanti tagħha inkluża l-istabilità, għandha tkun magħrufa qabel il-bidu ta’ kwalunkwe studju għat-tossiċità.

Il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza għat-test jagħtu informazzjoni importanti fl-għażla election of the route of administration, the design of each particular study and the handling and storage of the test substance.

L-iżvilupp ta’ metodu analitiku għad-determinazzjoni tas-sustanza għat-test (inklużi l-impuritajiet prinċipali meta hu possibbli) fil-midjum tad-dożaġġ u l-materjal bijoloġiku għandu jiġi qabel il-bidu ta’ l-istudju.

L-informazzjoni kollha li għandha x’taqsam ma’ l-identifikazzjoni, il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi, il-purità, u l-imġiba tas-sustanza għat-test għandhom jiġu inklużi fir-rapport tat-test.

B. KURA TA’ L-ANNIMALI

Il-kontroll strett tal-kundizzjonijiet ambjentali u l-kura b’sengħa ta’ l-annimali huma essenzjali fl-ittestjar tat-tossiċità

(i) Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew l-annimali

Il-kundizzjonijiet ambjentali fil-kmamar sperimentali jew l-ispazji magħluqa ta’ l-annimali għandhom ikunu xierqa għall-ispeċi li se jiġu ttestjati. Għall-firien, ġrieden u fniek ta’ l-indi, il-kundizzjonijiet xierqa huma temperatura tal-kamra ta’ 22 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %; għall-fniek it-temperatura għandha tkun ta’ 20 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %.

Ċerti tekniki sperimentali huma partikularment sensittivi għall-effetti tat-temperatura u, f’dawn il-każijiet, id-dettalji tal-kundizzjonijiet xierqa huma inklużi fid-deskrizzjoni tal-metodu tat-test. Fl-investigazzjonijiet kollha ta’ l-effetti tossiċi, it-temperatura u l-umdità għandhom jiġu mmoniterjati, irrekordjati, u inklużi fir-raport finali ta’ l-istudju.

Id-dwal għandhom ikunu artifiċjali, is-sekwenza għandha tkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Id-dettalji tas-sekwenza tad-dwal għandhom jiġu rrekordjati u inklużi fir-rapport finali ta’ l-istudju.

Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor fil-metodu, l-annimali jistgħu jitpoġġew individwalment, jew jinqaflu fi gruppi żgħar ta’ l-istess sess; biex jinqaflu fi grupp, m’għandux ikun hemm iktar minn ħames annimali f’kull gaġġa.

Fir-rapporti ta’ l-esperimenti fuq l-annimali, huwa importanti li jidher ċar kif qed jiġu maqfula l-annimali u n-numru ta’ annimali mpoġġija f’kull gaġġa kemm waqt l-espożizzjoni għall-kimika u kemm waqt kwalunkwe perjodu ta' osservazzjoni li jiġi wara.

(ii) Kundizzjonijiet ta’ l-għalf

Id-dieti għandhom jissodisfaw il-ħtiġiet nutrizzjonali kollha ta’ l-ispeċi li qed jiġu ttestjati. Fejn jiġu amministrati s-sustanzi għat-test fid-dieta ta' l-annimali il-valur nutrizzjonali jista’ jonqos permezz ta' l-effett li s-sustanza u l-kostitwent tad-dieta jagħmlu fuq xulxin. Il-possibbiltà ta’ reazzjoni bħal din għandha tiġi meqjusa meta jiġu interpretati ir-riżultati tat-testijiet. Id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu jintużaw b'forniment illimitat ta' ilma għax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mil-ħtieġa li tiġi żgurata taħlita xierqa tas-sustanza għat-test meta tiġi somministrata b'dan il-metodu.

Il-kontaminanti tad-dieta li jinfluwenzaw it-tossiċità m’għandhomx ikunu preżenti f’konċentrazzjonijiet li jinterferixxu.

C. ITTESTJAR ALTERNATTIV

L-Unjoni Ewropea għandha l-impenn li tippromwovi l-iżvilupp u l-validazzjoni ta’ tekniki alternattivi li jistgħu jipprovdu l-istess livell ta’ informazzjoni bħala testijiet kurrenti għall-annimali, iżda li jużaw inqas annimali, jikkawżaw inqas tbatija jew jevitaw kompletament l-użu ta' annimali.

Metodi bħal dawn, meta jsiru disponibbli, għandhom jiġu kkunsidrati fejn hu possibbli għall-karatterizzazzjoni tal-periklu u l-klassifikazzjoni u l-ittikettjar konsegwenti għall-perikli intrinsiċi u l-valutazzjoni għas-sigurtà tal-kimika.

D. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI

Meta t-testijiet jiġu evalwati u interpretati, il-limitazzjonijiet safejn ir-riżultati ta' l-istudji ta' l-annimali u ta' l-in vitro jistgħu jkunu estrapolati direttament lill-bniedem iridu jiġu kkunsidrati u għalhekk, l-evidenza ta’ effetti avversi fil-bnedmin, fejn huma disponibbli, jistgħu jintużaw għall-konfermazzjoni tar-riżultati ta’ l-ittestjar.

E. REFERENZI TA’ LETTERATURA

Bosta minn dawn il-metodi huma żviluppati fi ħdan l-istruttura tal-programm OECD Testing Guidelines, u għandhom isiru skond il-prinċipji tal-Good Laboratory Practice, sabiex jiżguraw ‘l-aċċettazzjoni reċiproka tad-data’ kemm jista’ jkun.

Informazzjoni addizzjonali tinsab fir-referenzi msemmija fil-linji gwida ta' l-OECD u l-etteratura relevanti ppubblikata x’imkien ieħor.

B.1 BIS. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA

1. METODU

Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti għal OECD TG 420 (2001)

1.1. DAĦLA

Il-metodi tradizzjonali għall-istudju tat-tossiċità akuta bl-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni. Fil-1984, resqien ġdid dwar it-testijiet tat-tossiċità akuta kien ġie suġġerit mill-British Toxocology Society li huwa ibbażat fuq l-amministrazzjoni f'serje ta' livelli ta' dożi fissi (1). Ir-resqien evita l-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni, u minflok straħ fuq l-osservazzjonijiet ta' sinjali ċari tat-tossiċità f'wieħed mis-serje ta' livelli ta' dożi fissi. Bsegwiment ta' studji in vivo tal-validazzjoni fil-UK (2) u f'medda internazzjonali (3), il-proċedura kienet adottata bħala metodu tat-test fil-1992. Sussegwentament, il-propjetajiet statistiċi tal-Proċedura ta' Doża Fissa kienu ġew evalwati bl-użu ta' mudelli matematiċi f'serje ta' studji (4) (5) (6). Flimkien, l-istudji in vivo u l-mudellar kienu were li l-proċedura hija riproduċibbli, bl-użu anqas ta' annimali u tikkawża anqas tbagħtija mill-metodi tradizzjonali u hija kapaċi li tiggrada s-sustanzi f'manjera simili mal-metodi l-oħrajn tat-testijiet tat-tossiċità akuta.

Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwar it-Testijiet tat-Tossiċità Akuta Orali (7). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-Metodu tat-test B.1 bis.

Huwa prinċipju tal-metodu li fl-istudju ewlieni dożi tossiċi moderati biss ikunu użati, u li l-amministrazzjoni tad-dożi li jkunu mistenna bħala letali għandhom ikunu evitati. Ukoll, id-dożi li huma magħrufa bħala li jikkawżaw uġiegħ u tqallib żejjed, minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew ta' irritazzjoni qawwija, ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu amministrati. Annimali moridondi, jew annimali li ovvjament ikunu bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tqallib sever u dewwiemi għandhom ikunu maqtula b'mod uman, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mezz bħal dawk l-annimali li jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterja ta' kif tittieħed id-deċiżjoni sabiex ikunu maqtula l-annimali moribondi jew dawk li jkunu fi tbagħtija kbira, u l-gwida għar-rikonoxximent ta' mewt prevista jew mistennija, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (8).

Il-metodu jipprovdi informazzjoni dwar il-propjetajiet perikolużi u jippermetti li s-sustanza tkun iggradata u ikklassifikata skond il-Globally Harmonised System (GHS) (Sistema Armonizzata Globali) għall-klassifika ta' kimika li toħloq tossiċità akuta (9).

Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identifikaazzjoni u l-istruttura kimika tas-sustanza; il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' xi testijiet oħrajn In vitro jew in vivo dwar is-sustanza' id-dettalji tossikoloġiċi dwar sustanzi struttalment relatati; u l-użu(i) antiċipati tas-sustanza. Din l-informazzjoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana, u li jkun jgħin fil-għażla ta' doża xierqa għal-bidu.

1.2. DEFINIZZJONIJIET

Tossiċita akuta orali: Tirreferi għall-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża waħda ta' sustanza jew dożi multipli, matul 24 siegħa.

Mewt imdewma: Tfisser li l-annimal ma jkunx u ma jidhirx moribond fi żmien 48 siegħa, imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 14-il jum.

Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test li tkun somministrata. Id-doża hija espressa bħala l-piż tas-susatanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (eż. mg/kg).

Tossiċità evidenti: Hija terminoloġija ġenerali li tiddeskrivi sinjali ċari tat-tossiċita bħala segwiment ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test (ara (3) għall-eżempji) bħal ma hija d-doża fissa segwenti aktar għolja li toħloq uġiegħ waqqi jew sinjali dewwiema ta' tbagħtija qawwija, l-istatus ta' moribond (il-kriterja hija ippreżentatha fil-Humane Endpoints Guidance Document (8) (Dokument ta' Gwida dwar l-Għanijiet Umani)), jew li l-probabbiltà ta' mortalità f'bosta annimali tista’ tkun mistennija.

GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. (Sistema tal-Klassifikazzjoni Armonizzata Globali dwar Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi.) Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), il-Kumitat tan-NU ta' l-Esperti dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni ta' periklu) u kordinata mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).

Mewt iminenti: Meta l-istat ta' moribond jew mewt ikun mistenni qabel il-ħin ta' l-osservazzjoni segwenti ippjanata. Sinjali indikattivi ta' dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni laterali, mimduda, u roda. (Ara d-Dokument ta' Gwida dwar l-Umanita Immirata (8) għal aktar dettalji).

LD50 (doża letali medja): Hija akkwistata b'mod statistiku minn doża waħda ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna mewt f'50 fil-mija ta' l-annimali meta amministrati permezz tar-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).

Limitu tad-doża: Tirreferi għal doża fil-litu l-aktar għoli tagħha waqt it-testijiet (2 000 jew 5 000 mg/kg).

L-istat moribondi: Huwa l-istat ta' qabel il-mewt jew ta' l-inabbiltà tas-sopravivenza, anki jekk ikun hemm trattament. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).

Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).

1.3. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Gruppi ta' annimali ta' sess wieħed huma mogħtija doża fi proċedura mtarrġa bl-użu ta' dożi fissi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg (eċċezzjonalment għal doża fissa addizzjonali ta' 5 000 mg/kg li tista’ tkun ikkonsidrata, ara s-sezzjoni 1.6.2.). Il-livell inizjali tad-doża huwa magħżul fuq il-bażi ta' l-istudju tas-sejbien bħala d-doża mistennija li tipproduċi xi sinjali ta' tassiċità mingħajr ma toħloq l-effetti ta' tossiċità severa jew tal-mortalità. Is-sinjali kliniċi u l- kundizzjonijiet assoċjati ma l-uġiegħ, sofferenza, u mewt iminenti, huma deskritti fid-dettall fi Gwida OECD separata, id-Dokument (8). L-annimali jistgħu jingħataw doża aktar għolja jew aktar baxxa, jiddependi mill-preżenza jew in-nuqqas ta' sinjali ta' tossiċità jew mortalità. Din il-proċedura tinżamm sakemm id-doża li toħloq tossiċità evidenti jew ta' mewt waħda jew aktar, ikunu identifikati, jew meta l-ebda effetti ma jkunu jidhru fid-doża l-aktar għolja jew meta l-imwiet iseħħu fid-doża l-aktar baxxa.

1.4. ID–DESKRIZZJONI TAL–METODU TAT–TEST

1.4.1. L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (7). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (10). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.

Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.

1.4.2. Il-kundizzjonijiet tal-gaġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.

1.4.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

L-animmali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mill-anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.

1.4.4. Preparazzjoni tad-dożi

Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ippreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħruha u turi li tkun aċċettabbli.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Amministrazzjoni tad-dożi

Is-sustanza tat-tes hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.

L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.

1.5.2. Studju ta' l-osservazzjoni

L-iskop ta' l-istudju ta' l-osservazzjoni huwa li jippermetti l-għażla xierqa tad-doża tal-bidu li tintuża fl-istudju ewlieni. Is-sustanza tat-test hija somministrata lill-annimali singoli b'manjera sekwenzali skond il-karti tan-nixxija fl-Anness 1. L-istudju ta' l-osservazzjoni ikunu komplut meta d-deċiżjoni dwar il-bidu tad-doża għall-istudju ewlieni tkun tista’ tittieħed (jew jekk il-mewt tkun apparenti fid-doża l-baxxa kif stabbilita).

Id-doża tal-bidu għall-istudju ta' l-oisservazzjoni hija magħżulha minn livelli fissi ta' dożi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg bħala doża mistennija li tipproduċi tossiċità evidenti ibbażata, meta possibbli, fuq evidenza mid-dettalji In vivo u In vitro mill-istess kimika jew il-kimiċi ta' struttura relatata. Fin-nuqqas ta' tali informazzjoni, id-doża tal-bidu għandha tkun 3000 mg/kg.

Perijodu ta' mill-anqas 24 siegħa għandu jkun imħolli bejn l-għoti tad-doża lil kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal mil anqas 14-il jum.

B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 3). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.

Fil-każi meta annimal ikun ittestjat fil-livell l-aktar baxx ta' doża fissa (5 mg/kg) fl-istudju ta' l-osservazzjoni imut, il-proċeduira normali hija li jkun terminat l-istudju u li s-sustanza tkun assanjata għal-GHS, Kategorija 1 (kif muri fl-Anness 1). B'dana kollu, jekk aktar konferma tal-klassifika tkun meħtieġa, proċedura supplementari voluntarja tista’ tkun imwettqa, kif ġej: It-tieni annimal ikunu mogħti d-doża f’5 mg/kg. Jekk dan it-tieni annimal imut, allura il-Kategorija 1 GHS tkun ikkonfermata u l-istudju jkun terminat immedjetament. Jekk it-tieni annimali jibqa ħaj, allura massimu ta' tlett annimali addizjnonali ikunu mogtoja d-doża ta' 5 mg/kg. Minħabba li jkun hemm riskju kbir ta' mortalità, dawn l-annimali għandhom ikunu mogjħtija d-doża b'mod sekwenzali sabiex ikun imħares il-ġid ta' l-annimali. Fl-intervall ta' ħin bejn kull doża għal kull annimal għandu jkun suffiċjenti sabiex ikun stabbilit jekk l-annimal preċedenti jkunx sejjer jibqa ħaj. Jekk isseħħ it-tieni mewt, is-sekwenza tad-doża għandha tkun terminata immedjetament u l-ebda annimali oħrajn ma jingħataw id-doża. Minħabba l-okkorrenza tat-tieni mewt (irrispettivemanet min-numru ta' l-annimali ittestjati fil-waqt tat-terminazzjoni) tidħol fl-eżitu A (2 jew aktar imwiet), ir-regola tal-klassifika ta' l-Anness 2 fi 5 mg/kg doża fissa tkun segwita (il-Kategorija 1 jew ikun hemm 2 jew aktar imwiet, jew il-Kategorija 2 jekk ikun hemm mhux aktar minn mewt waħda). B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.

1.5.3. Studju ewlieni

1.5.3.1. Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi

L-azzjoni li għandha tittieħed b'segwiment tat-testijiet fid-doża tal-livell tal-bidu hija indikata fil-karti nixxija fl-Anness 2. Waħda mit-tlett azzjonijiet tkun meħtieġa; jew li jieqfu t-testijiet u li tkun assenjata l-klassifikazzjoni tal-klassi tal-periklu xierqa, it-test f'doża ta' livell għola jew test f'doża f'livell aktar baxx. B'dana kollu, għall-protezzjoni ta' l-annimali, livell ta' doża li jikkaġuna l-mewt fl-istudju ta' l-osservazzjoni m'għandhiex tkun użata mill-ġdid fl-istudju ewlieni (ara l-Anness 2). L-esperjenza wriet li r-riżultat probabbli fil-livell tad-doża tal-bidu ikun dak li s-sustanza tista’ tkun klassifikata u li l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa.

Total ta' ħames annimali ta' sess wieħes ikun normalment użat għal kull livell ta' doża investigata. Il-ħames annimali għandhom ikunu magħmula minn annimal wieħed mill-istudju ta' l-osservazzjoni li jkun ħa doża fil-livell magħżul flimkien ma erba annimali addizzjonali oħrajn (apparti, ħaġa mhux tas-soltu, jekk il-livell tad-doża użat ma kienx inkluż fl-istudju ta' l-osservazzjoni).

L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament. Perijodu ta' minn 3 sa 4 ijiem bejn id-dożi f'kull livell huma rakkommandabbli, jekk maħtieġ, sabiex jippermetti għall-osservazzjoni tat-tossiċità mdewma. L-intervall tal-ħin jista’ jkun aġġustat kif xieraq, eż. fil-każ ta' reazzjoni mhux konklussiva.

Meta l-użu tad-doża l-aktar għolja ta' 5 000 mg/kg ikun ikkonsidrat, il-proċedura kif elenkata fl-Appendiċi 3 għandha tkun segwita (ara wkoll is-sezzjoni 1.6.2.).

1.5.3.2. Test tal-limitu

It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta ftit jew l-ebda informazzjoni ma tkun disponibbli dwar it-tossiċità tagħha, jew meta l-materjal tat-test ikun mistenni li huwa tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.

Bl-użu tal-proċedura normali, studju ta' l-osservazzjoni li jibda b'doża ta' 2 000 mg/kg (jew b'mod eċċezzjonali 5 000 mg/kg) segwit b'doża fuq erba’ annimali oħrajn f'dan il-livell iservi bħala test tal-limitu għal din il-linja ta' gwida.

1.6. OSSERVAZZJONIJIET

L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħin ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet ta' meta jidhru jew jisparixxu s-sinjali tat-tossiċità huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewwma (11). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.

Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (8). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.

1.6.1. Piż tal-Ġisem

Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.

1.6.2. Patoloġija

L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali) għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl- annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.

2. DATA

Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1. RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test: — in-natura fiżika, il-purità, u meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni); — dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli): — ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test: — speċi/tipi użati; — l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf; — in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili); — is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test: — dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat; — dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata id-doża; — dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma); — ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati: — tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti); — tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem; — il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u il-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula; — id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst; — il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali; — is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Kunklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 ġhttp://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.htmlħ.

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

ANNESS 1 FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU TA' OSSERVAZZJONI

ANNESS 2: FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU EWLIENI

ANNESS 3 KRITERJI GĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST B'VALURI MISTENNIJA TA’ LD50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA’ TESTIJIET Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija ntiża sabiex tiffaċilita l-identifikazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta’ tossiċità akuta baxxa imma li, skond ċerti ċirkustanzi jistgħu jippreżentaw periklu għall-populazzjonijiet vulnerabbli. dawn is-sustanzi huma antiċipati li jkollhom LD50 orali jew tal-ġilda fil-medda ta’ 2 000-5 000 mg/kg jew b'dożi ekwivalenti għal rotot oħra. Is-sustanzi tat-test jistgħu jkunu kklassifikati fil-kategorija tal-periklu definita bi: 2 000 mg/kg <LD50< 5 000 MG/KG (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn il-każi li ġejjin: a) jekk ikunu miġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta’ l-Anness 2, ibbażati fuq l-inċidenti tal-mortalità; b) jekk evidenza affidabbli diġà tkun disponibbli li tindika li l-LD50 tkun fil-medda tal-valuri tal-Kategorija 5 jew li studji oħrajn dwar l-annimali jew ta’ l-effetti tossiċi fil-bnedmin umani jindikaw tħassib għas-saħħa umana ta’ natura akuta; ċ) permezz ta’ estrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati għal klassi aktar perikoluża milli mistħoqq u — informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossiċi sinifikanti fil-bnedmin, jew — xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir-rotta orali, jew — meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali kliniċi sinifikanti ta’ tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli għal dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew — meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabli tindika il-potenzjal għal effetti sinifikament akuti minn studji oħrajn fuq l-annimali. TESTIJIET F'DOŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG B'mod eċċezzjonali u biss meta ġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta’ doża addizzjonali ffissata fil-livell l-għoli ta’ 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkunsidrata. Bir-rikonoxximent tal-ħtieġa li jkun mħares il-ġid ta’ l-annimali, testijiet fi 5 000 mg/kg huma skuraġġiti u għandhom biss ikunu kunsidrati meta jkun hemm possibiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-ħarsien tas-saħħa ta’ l-annimali jew dik umana (9). Studju ta’ l-osservazzjoni Ir-regoli tad-deċiżjoni li jirregolaw il-proċedura sekwenzjali ppreżentata fl-Anness 1 huma estiżi sabiex jinkludu l-livell ta’ doża 5 000mg/kg. Għalhekk, meta l-istudju ta’ l-osservazzjoni li jibda b'doża ta’ 5 000 mg/kg ikun użat, ir-riżultat A (mewt) ikun jeħtieġ it-tieni annimal li jkun ittestjat fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat B u C (tossiċità evidenti jew l-ebda tossiċità) ikunu jippermettu l-għażla ta’ 5 000 mg/kg bħala d-doża tal-bidu fl-istudju ewlieni. Bl-istess mod, jekk id-doża tal-bidu apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun użata, allura t-test għandu jippreċedi għal 5 000 mg/kg fil-każ tar-riżultati B jew C fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat A sussegwenti ta’ 5 000 mg/kg ikun jimponi studju ewlieni li jibda b'doża ta’ 2 000 mg/kg u r-riżultati B u C ikunu jimponu studju ewlieni li jibda b'doża ta’ 5 000 mg/kg. Studju Ewlieni Ir-regoli tad-deċiżjoni li jirregolaw il-proċedura sekwenzjali ppreżentata fl-Anness 2 huma estiżi sabiex jinkludu l-livell ta’ doża 5 000 mg/kg. Għalhekk, meta d-doża ta’ l-istudju ewlieni li tibda bi 5 000 mg/kg tkun użata, ir-riżultat A (≥ 2 imwiet) ikun jeħtieġ it-testijiet tat-tieni grupp fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat B (tossiċità evidenti u/jew ≤ mewt 1)jew C (l-ebda tossiċità) ikun jirriżulta filli s-sustanza ma tkunx ikklassifikata skond il-GHS. L-istess, jekk id-doża tal-bidu apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun użata, allura t-test ikun jiproċedi lejn il-5 000 mg/kg fil-każ tar-riżultat C fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat A sussegwenti ta’ 5 000 mg/kg ikun jirriżulta filli s-sustanza tkun assenjata għal GHS Kategorija 5 u r-riżultati B jew C ikunu jwasslu li s-sustanza ma tkunx ikklassifikata.

ANNESS 4 METODU TAT-TEST B.1. bis Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu tranżitorju sat-tmiem sħiħ ta' l-implimentazzjoni kollha tas-Sistema Armonizzata tal-Klassifika Globali (GHS) (meħud mir-referenza (8))

B.1TRIS. TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 423 (2001)

1.1. INTRODUZZJONI

Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta (1) kif stabbilit f'dan it-test huwa l-proċedura sussegwenti ma l-użu ta' 3 annimali ta' sess wieħed għal kull pass. Jiddependi mill-mortalità u/jew l-istat ta' modibondi li jkunu fih l-annimali, bħala medja 2-3 passi jkunu meħtieġa sabiex jippermeti li jsir ġudizju dwar it-tossiċità akuta tas-sustanza tat-test. Din il-proċedura hija riproduċibbli, tuża ftit annimali u hija kapaċi li tiggrada sustanzi b'manjera simili għall-metodi l-oħrajn tat-testijiet dwar it-tossiċità akuta. Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta huwa bbażat fuq evalwazzjonijiet biometriċi (2) (3) (4) (5) b'dożi fissi, separati b'mod adekwat sabiex jippermettu li sustanza tkun iggradata għall-iskopijiet tal-klassifika u ta' l-assessjar tal-periklu. Il-metodu kif adottat fil-1996 kien ġie validat b'mod estensiv in vivo bi tqabbil mad-dettalji JD50 akkwistati mil-letteratura, kemm nazzjonali (6) u dik internazzjonali (7).

Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwat it-Testijiet tat-Tossiċità Orali Akuta (8). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-metodu tat-test B. 1 tris.

Is-sustanzi tat-test, fid-dożi li huma magħrufa li jikkaġunaw uġiegħ qawwi u tbatija minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew severament irritanti, ma jistgħux ikunu amministrati. Annimali fl-għafja tal-mewt, jew annimali avvjament bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tbagħtija qawwija għandhom ikun u maqtula b'mod umanitarju, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mod bħal dawk l-annimali li jmutu matul it-test. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula l-annimali fl-għafja tal-mewt jew dawk li jkunu jbagħtu ħafna, u l-gwida dwar ir-rikonoxximent ta' mewt mistennija jew prevista, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (9).

Dan il-metodu jutilizza dożi definiti bil-quddiem u r-riżultati jippermettu li sustanza tkun gradata u klassifikata skond is-Sistema Globali Armonizzata għall-klassifika ta' kimiċi li jikkaġunaw tossiċità akuta (10).

Bħala prinċipju, il-metodu mhux intiż li jippermetti l-kalkolu ta' LD50 preċiża, imma fil-fatt jipperemetti għad-determinazzjoni ta' medded ta' esposizzjoni definita meta l-letalità tkun mistennija minħabba li l-mewt ta' proporzjoni ta' l-annimali tkun xorta waħda l-għan finali ewlieni ta' dan it-test. Il-metodu jippermetti għad-determinazzjoni tal-valur LD50 biss meta mill-anqas żewġ dożi jirriżultaw f'mortalità għola minn 0 % u anqas minn 100 %. L-użu ta' għażla ta' dożi definiti bil-quddiem, independentament mis-sustanza tat-test, bil-klassifika espliċitament marbuta man-numri ta' l-annimali osservati f'diversi sitwazzjonijiet ittejjeb l-opportunità għar-rapurtaġġ ta' bejn laboratorju u laboratorju, b'konsistenza u repatabbilità.

Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza, il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultat ta' xi testijiet oħrajn In vivo jew in vitro dwar is-sustanza; id-dettalji tossikoloġiċi dwar is-sustanzi strutturament relatati; u l-użu antiċipat tas-sustanza. Din l-informazzjhoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana u li jkun ta' għajnuna fl-għażla tad-doża tal-bidu l-aktar xierqa.

1.2. DEFINIZZJONIJIET

Tossiċità akuta orali: Tirreferi għal dawk l-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża singola ta' sustanza jew ta' dożi multipli mogħtija matul 24 siegħa.

Mewt imdewma: Tfisser li annimal ma jmutx u ma jkunx jidher f'għafja tal-mewt fi żmien 48 siegħa imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' l-osservazzjoni ta' 14-il jum.

Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-doża hija espressa bħala piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal ittestjat (eż. mg/kg).

GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Is-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata għal Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi. Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), Il-Kumitat ta' Esperti tal-NU dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni perikoluża) u l-kordinazzjoni mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).

Imwiet imminenti: Meta l-istat fl-għafja tal-mewt jew il-mewt ikunu mistennija qabel il-ħin ippjanat segwenti ta' l-osservazzjoni. Sinjali indikattivi għal dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni ta' serħan fuq il-ġemb, mitluqa fuq darhom, u tregħid (Ara d-Dokument ta' Gwida ta' l-Għan Finali b'mod Umanitarju (9) għal aktar dettalji).

LD50 (doża orali medja ta' l-mwiet): Hija doża akkwistata b'mod statistiku ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna l-mewt fi 50 fil-mija ta' l-annimali meta amminsitrata bir-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).

Doża b'limitu: Tirreferi għad-doża fil-limitu l-aktar għoli tat-testijiet (2 000 jew 5 000 mg/kg).

Stat moribund (fl-għafja tal-mewt): Huwa l-istat li jwassal għall-mewt jew ta' nuqqas ta' kapaċità għal ħajja, anki jekk ittrattat (ara d-Dokument ta' Gwida dwar it-Tmiem Finali b'mod Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).

Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).

1.3. IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Huwa l-prinċipju tat-test li, ibbażat fuq il-proċedura ta' pass b'pass, bl-użu ta' numru minimu ta' annimali kull pass, informazzjoni suffiċjenti tkun akkwista dwar it-tossiċità akuta tas- sustanza tat-test sabiex tiffaċilita l-klassifika tagħha. Is-sustanza hija ammenistrata b'mod orali fuq grupp ta' annimali esperimentali b'waħda mid-dożi definiti. Is-sustanza hija ittestjata bl-użu tal-proċedura tal-pass b'pass, kull pass jutilizza tlett annimali ta' sess wieħed (normalment nisa). In-nuqqas jew il-preżenza ta' mortalità relatata mal-kompost ta' l-anniamli bid-doża. Ta' l-ewwel pass tkun tiddetermina l-pass segwenti, i.e.:

— l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa,

— id-doża fuq tlett annimali, bl-istess doża,

— id-doża fuq tlett annimali addizzjonali fil-livell aktar għoli segwenti jew fil-livell aktar baxx preċedenti.

Id-dettalji tal-proċedura tat-test huma deskritti fl-Anness I. Il-metodu ikun jiffaċilita ġudizju fir-rigward tal-klassifika ta' sustanza tat-test lejn waħda mis-serje tal-klassijiet ta' tossiċità definiti bil-valuri fissi LD-50 bħala waqfien.

1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.4.1. L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali

L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (9). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD-50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (11). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.

Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.

1.4.2. Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf

It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.

1.4.3. Preparazzjoni ta' l-annimali

L-annimali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mil anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.

1.4.4. Preparazzjoni tad-dożi

Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ppreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbiltà tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħrufa u turi li tkun aċċettabbli.

1.5. PROĊEDURA

1.5.1. Amministrazzjoni tad-dożi

Is-sustanza tat-test hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.

L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.

1.5.2. Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi

Tlett annimali huma użati għal kull pass. Il-livell tad-doża li għandu jkun użat bħala d-doża tal-bidu jkun magħżul minn wieħed minn erba’ livelli fissi, 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg piż tal-ġisem. Il-livell tad-doża tal-bidu għandu jkun dak li jkun l-aktar probabbli li jipproduċi mortalità f'uħud mill-animali li jkunu reċevew id-doża. Il-karti tan-nixxija ta' l-Anness 1 jiddeskrivu l-proċedura li għandha tkun segwita għal kull waħda mid-dożi tal-bidu. B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.

Meta l-informazzjoni disponibbli tissuġġerixxi li l-lortalità pjuttost li ma sseħħx fl-għola livell tal-bidu (2 000 mg/kg piż tal-ġisem), allura test tal-limitu għandu jkun imwettaq. Meta ma jkunx hemm informazzjoni dwar xi sustanza li għandha tkun ittestjata, għal raġunijiet tal-ġid ta' l-annimali, huwa rakkommandabbli li jsir użu minn doża tal-bidu ta' 300 mg/kg piż tal-ġisem.

L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament.

B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 2). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.

1.5.3. Test tal-limitu

It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta jkun ftit jew l-ebda informazzjoni dwar. It-tossiċità tagħha, jew li fiha l-materjal tat-test ikun mistenni li jirriżulta tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.

Test tal-limitu f'doża waħda fil-livell ta' 2 000 mg/kg piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fuq sitt annimali (tlett annimali kull pass). B'mod eċċezzjonali, test tal-limitu b'doża waħda fil-livell ta' 5 000 mg/kg jista’ jkun imwettaq fuq tlett annimali (ara l-Anness 2). Jekk il-mortalità tat-test relatata mas-sustanza tirriżulta, aktar testijiet fil-livell preċedenti aktar baxx jista’ jkun hemm il-ħtieġa li jitwettqu.

1.6. OSSERVAZZJONIJIET

L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perjodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħilata' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet li fihom is-sinjali tat-tassiċità) jkunu apparaenti jew li jisparixxu huma. Importanti, speċjalment meta jkun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewma (12). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.

Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (9). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.

1.6.1. Piż tal-ġisem

Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.

1.6.2. Patoloġija

L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.

2. DATA

Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1. Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:

Is-sustanza tat-test: — in-natura fiżika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni); — dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.

Mezz (jekk applikabbli): — ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.

Annimali tat-test: — speċi/tipi użati; — l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf; — in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili); — is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.

Kondizzjonijiet tat-test: — dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat; — dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata d-doża; — dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma); — ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.

Riżultati: — tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti); — tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem; — il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u l-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula; — id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst; — il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali; — is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.

Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.

Konklużjonijiet.

4. REFERENZI

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

ANNESS 1 PROĊEDURA LI GĦANDHA TKUN SEGWITA GĦAL KULL WAĦDA MID-DOŻI TAL-BIDU RIMARKI ĠENERALI Għal kull doża tal-bidu, l-iskemi rispettivi tat-testijiet, kif inklużi f'dan l-Anness, jelenkaw il-proċedura li għandha tkun segwita. — Anness 1 a: Id-doża tal-bidu hija: 5 mg/kg piż tal-ġisem — Anness 1 b: Id-doża tal-bidu hija: 50 mg/kg piż tal-ġisem — Anness 1 c: Id-doża tal-bidu hija: 300 mg/kg piż tal-ġisem — Anness 1 d: Id-doża tal-bidu hija: 2 000 mg/kg piż tal-ġisem Jiddependi min-numru ta' annimali maqtula b'mod umanitarju jew ta' l-annimali mejta, il-proċedura tat-test għandha ssegwi il-vleġeġ indikati. ANNESS 1A PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 5 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM ANNESS 1B PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 50 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM ANNESS 1C PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 300 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM ANNESS ID PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 2 000 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM

ANNESS 2 KRITERJA GĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST B'VALURI MISTENNIJA TA' LD50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA'TESTIJIET Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija ntiża sabiex tiffaċilita l-identifikazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta' tossiċità akuta baxxa imma li, skond ċerti ċirkostanzi jistgħu jippreżentaw periklu għall-populazzjonijiet vulnerabbli. Dawn is-sustanzi huma antiċipati li jkollhom LD50 orali jew tal-ġilda fil-medda ta' 2 000-5 000 mg/kg jew b'dożi ekwivalenti għal rotot oħrajn. Is-sustanzi tat-test jistgħu ikunu klassifikati fil-kategorija tal-periklu definita bi: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn il-każi li ġejjin: a) jekk ikunu miġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta' l-Anness 2, ibbażati fuq l-inċidenti tal-mortalità; b) jekk evidenza affidabbli diġà tkun disponibbli li tindika li l-LD50 tkun fil-medda tal-valuri tal-Kategorija 5; jew li studji oħrajn dwar l-annimali jew ta' l-effetti tossiċi fil-bnedmin umani jindikaw tħassib għas-saħħa umana ta' natura akuta; c) permezz ta' extrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati għal klassi aktar perikoluża milli mistħoqq; u — informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossiċi sinifikati fil-bnedmin, jew — xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir-rotta orali, jew — meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali kliniċi sinifikanti ta' tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli għal dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew — meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabbli tindika l-potenzjal għal effetti sinifikament akuti minn studji oħrajn fuq l-annimali. TESTIJIET F'DOŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG Bir-rikonoxximent tal-ħtieġa li jkun imħares il-ġid ta' l-annimali, testijiet fi 5 000 mg/kg huma skurraġiti u għandhom biss ikunu kkunsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn test bħal dan ikollu relevanza diretta għall protezzjoni tas-saħħa ta' l-annimali jew dik umana (10). L-ebda aktar testijiet m'għandhom ikunu mwettqa fil-livelli tad-dożi aktar għoljin. Meta t-testijiet ikunu jeħtieġu doża ta' 5 000 mg/kg, il-pass wieħed biss (i.e. tliet annimali) huwa meħtieġ. Jekk l-ewwel annimal li jkun ingħata d-doża, imut, allura l-għoti tad-dożi għandu jipproċedi fi 2 000 mg/kg skond il-flow chart fl-Anness 1. Jekk l-ewwel annimal jibqa' ħaj, żewġ annimali oħrajn għandhom jingħataw id-doża. Jekk wieħed biss mit-tliet annimali jmut, il-valur LD50 huwa mistenni li jeċċedi 5 000 mg/kg. Jekk żewġ annimali jmut, allura d-doża tipproċedi fi 2 000 mg/kg.

ANNESS 3 B1c. METODU TAT-TEST Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu transitorju sakemm ikun hemm l-implementazzjoni sħiħa tas-Sistema ta' Klassifika Armonizzata Globali (GHS) (meħuda minn referenza (8))

B.2. TOSSIĊITÀ AKUTA (TEĦID MAN-NIFS)

1. METODU

1.1. INTRODUZZJONI

Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, l-pressjoni tal-fwar, il-punt tat-taħlil, il-punt tat-togħlija, il-punt tal-leħħa jew ta’ l-isplussività (jekk applikabbli) tas-sustanza.

Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONIJIET

Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA

Xejn

1.4. PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Diversi gruppi ta’ annimali sperimentali huma esposti għal perjodu definittiv lejn is-sustanza tat-test f’konċentrazzjonini bi gradwazzjonijiet, b’konċentrazzjoni waħda tkun użata għal kull grupp. Sussegwentement l-effetti u l-imwiet jiġu osservati. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt

Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali qawwija u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Sustanzi f’dożaġġi għat-test li huma magħrufa li jikkawżaw it-tbatija u l-uġigħ minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni qawwija jistgħu ma jintużawx.

1.5. KRITERJI TA’ KWALITÀ

Xejn.

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.1. Preparazzjonijiet

L-annimali huma miżmuma b’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn in-numru meħtieġ ta’ gruppi. M’hemmx bżonn ikunu suġġetti għal espożizzjoni simulata sakemm dan ma jkunx indikat mit-tip ta’ apparat t’espożizzjoni li qed jintuża.

Sustanzi għat-test solidi jistgħu jkunu mikronizzati sabiex jinkisbu l-partiċelli ta’ daqs xieraq.

Meta meħtieġ, materjal adattat jista’ jkun miżjud mas-sustanza tat-test sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjoni xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk xi materjal jew addittivi oħrajn ikunu użati għall-faċilizzazzjoni tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi. Data storika tista’ tkun użata, jekk xieraq.

1.6.2. Il-kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.1. Annimali sperimentali

Sakemm ma jkunx hemm indikazzjonijiet mod ieħor, il-far huwa l-ispeċi preferita. Is-siltiet normalment użati fil-laboratorju ta’ l-annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.

1.6.2.2. Numru u sess.

Mill-anqas 10 gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li ma humiex tqal.

Nota: F’testijiet ta’ tossoċità akuta b’annimali ta’ ordni ogħla mill-gerriema għandhom jintużaw numri iżgħar. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni u għandu jsir kull sforz sabiex ma jinqabżux id-dożi li huma xi ftit tossiċi. F’testijiet bħal dawn għandha tiġi evitata l-amministrazzjoni ta’ dożi letali tas-sustanza għat-test.

1.6.2.3. Konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni

Dawn għandhom ikunu biżżejjed fin-numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq biex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva ta’ konċentrazzjoni ta’ mortalità u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ test tal-limitu LC50 1.6.2.4.

1.6.2.4. Test tal-limitu

Jekk ħames annimali għat-test maskili u ħamsa femminili jiġu esposti għal erba’ sigħat għal 20 mg għal kull litru ta’ gass jew 5 rug għal kull litru ta’ aerosol jew ta’ partiċella (jew fejn dan mhuwiex possibbli minħabba xi proprjetajiet tas-sustanza għat-test li huma fiżiċi jew kimiċi u inklużi dawk splussivi, il-massimu ta’ konċentrazzjoni li tista’ tintlaħaq) u ma tirriżulta l-ebda mortalità compound-related fi żmien 14-il jum iktar ittestjar jista’ ma jkunx meħtieġ. (18th ATP, dir. 93/21/KEE, Ll10/93)

1.6.2.5 Ħin ta’ l-espożizzjoni

It-tul ta’ l-espożizzjoni għandu jkun ta’ erba’ sigħat.

1.6.2.6. Apparat:

L-annimali għandhom ikunu ttestjati bl-apparat tan-nifs iddisinjat għas-sostenn ta’ nixxija ta’ arja dinamika ta’ mill-anqas 12-il kambjamenti ta’ l-arja fis-siegħa, sabiex ikun assigurat kontenut adekwat ta’ l-ossiġenu u espożizzjoni ta’ l-atmosfera mqassma b’mod egwali. Meta kabina tkun użata, d-disinn tagħha għandu jimminimizza l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jimminimizzaw l-espożizzjoni tagħhom man-nifs tas-sustanza tat-test. Bħala regola ġenerali sabiex tkun assigurata l-istabbilità ta’ l-atmosfera fil-kabina il-“volum” totali ta’ l-annimali tat-test m’għandux jeċċedi 5 % tal-volum tal-kabina tat-test. Ħalq-nażali, ir-ras biss, jew l-ispazji tal-kabina ta’ l-espożizzjoni jista’ jkun użat; bl-ewwel tnejn għandhom jgħinu li jimminimizzaw l-ammont tas-sustanza tat-test b’meżżi oħrajn.

1.6.2.7. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni

Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ 14-il jum. Madankollu, id-dewmien ta’ l-osservazzjonijiet m’għandux ikun strettament fiss. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata tagħhom ta’ onset u t-tul ta’ żmien ta’ rkupru, għalhekk meta hu meħtieġ jista’ jiġi estiż. Il-ħin li fih is-sinjali ta’ tossiċità jidhru u jisparixxu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk hemm it-tendenza li l-imwiet itulu.

1.6.3. Il-proċedura

Ftit qabel l-espożizzjoni, l-annimali jintiżnu, imbagħad jiġu esposti għall-konċentrazzjoni tat-test fl-apparat magħżul għal erba’ sigħat, wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-kabina. It-temperatura li fiha t-test ikun imwettaq għandha tinżamm fi 22 ± 3 oC. Idealment, l-umdità relattiva għandha tinżamm bejn 30 u 70 %, imma f’ċerti kazi (eż. it-testijiet ta’ uħud mill-aerosols) dan jista’ ma jkunx prattikabbli. Iż-żamma ta’ pressjoni kemxejn negattiva ġewwa l-kabina (≥ 5 mm ta’ ilma) tkun tipprevjeni l-ħruġ tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. L-ikel u l-ilma għandhom ikunu miċħuda matul l-espożizzjoni. Sistemi xierqa għandhom jintużaw għall-ġenerazzjoni u l-monitoraġġ ta’ l-atmosfera tat-test. Is-sistema għandha tassigura li kundizzjonijiet stabbli ta’ l-espożizzjoni jintlaħqu malajr kemm jista’ jkun. Il-kurrent ta’ l-arja għandu jkun aġġustat sabiex jassigura li l-kundizzjonijiet matul il-kabina ta’ l-espożizzjoni jkunu omoġenji.

Il-kejl jew l-moniteraġġ għandu jsir:

(a) tar-rata tal-kurrent ta’ l-arja (b’mod kontinwu).

(b) il-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejla fiż-żona ta’ fejn jittieħed in-nifs mill-inqas tliet darbiet waqt l-espożizzjoni (x’uħud mill-atmosferi, eż. L-aerosols f’konċentrazzjonijiet għoljin jistgħu jeħtieġu monitoraġġ iktar frekwenti). Il-konċentrazzjonijiet m’għandhomx ivarjaw b’aktar minn ± 15 % tal-medja tal-valur. B’danakollu, fil-każ ta’ uħud mill-aerosols, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax ikun milħuq u medda aktar wiesa tkun għalhekk aċċettabbli. Għall-aerosols għandhom isiru analiżi għad-daqs tal-partiċelli kemm hemm bżonn (mill-inqas darba kull grupp ta’ test).

(ċ) tat-temperatura u l-umdità, kontinwament jekk possibbli.

Matul u wara l-espożizzjoni, osservazzjoni hija mwettqa u reġistrata b’mod sistematiku; dettalji individwali għandhom jinżammu għal kull annimal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Mill-inqas darba kuljum għandha ssir eżaminazzjoni klinika tajba, osservazzjonijiet oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa li jittieħdu sabiex jimminimizzaw it-telf ta’ l-annimali mill-istudju, eż. In-nekropsija jew refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew qed imutu.

L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki s-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri, l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Attenzjoni partikulari għandha tingħata għall-osservazzjoni ta’ l-imġiba respiratorja, it-tkexkix, il-konvulżjonijiet, ir-rieq, id-dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jittieħed kemm jista’ jkun bl-eżatt. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati fil-ġimgħa wara l-espożizzjoni u mal-mewt.

L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fl-aħħar tat-test huma suġġetti għan-nekropsija b’referenza partikulari għal kwalunkwe bidliet fil-parti respiratorja ta’ fuq u t’isfel. It-tibdil patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, għandhom jittieħdu t-tessuti għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.

2. DATA

Id-data għandha tkun miġbura u mqassra f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali, in-numru ta’ l-annimali li għandhom sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija It-tibdiliet fil-piż iridu jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jgħixu iktar minn jum wieħed. Dawk l-annimali li jmutu b’mod uman minħabba tbatija li compound-related u minħabba l-uġigħ jiġu rrekordjati bħala mwiet compound-related. L- LC50 għandu jiġi determinat permezz ta’ metodu rikonoxxut. L-evalwazzjoni tad-data għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm, bejn l-espożizzjoni ta’ l-annimal għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha nklużi l-anormalitajiet kliniċi u fl-imġiba, feriti, tibdil fil-piż tal-ġisem, mortalità u effetti tossiċi oħra.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1. RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

— l-ispeċi, is-silta, is-sorsi, il-kundizzjonijiet ambjentali, id-dieta, eċċ.,

— il-kundizzjonijiet tat-test: Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni, inkluż id-disinn, it-tip, il-qisien, is-sorsi ta’ l-arja, is-sistema għall-ġenerazzjoni ta’ l-aerosols, metodu għall-kondizzjonar ta’ l-arja u l-metodu taż-żamma ta’ lannimali fil-kabina tat-test, meta din tkun użata. L-apparat għall-kejl tat-temperatura, l-umdità, il-koncentrazzjonijiet ta’ l-aerosol u d-distrubuzzjoni tad-daqs tal-particelli, għandhom ikunu deskritti.

Data ta’ l-espożizzjoni:

Dawn għandhom ikunu tabulati u preżentati mal-valuri medji u l-kejl tal-varjabbiltà (eż. devjazzjoni normali) u għandhom, meta possibbli, jinkludu:

(a) ir-rati tal-kurrent ta’ l-arja matul l-apparat tat-teħid man-nifs;

(b) it-temperatura u l-umdità ta’ l-arja;

(ċ) il-konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza ta’ kif infuża fl-apparat tat-teħid man-nifs, diviża bil-volum ta’ l-arja);

(d) in-natura tal-mezz, jekk użat;

(e) il-konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tat-teħid tan-nifs waqt it-test;

(f) Il-massa tad-dijametru erodinamiku medjan (MMAD) u d-devjazzjoni ġeometrika normali (GSD);

(g) Il-perjodu ta’ l-ekwilibrazzjoni;

(h) Il-perjodu ta’ l-espożizzjoni; — it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons bil-livell tas-sess u espożizzjoni (i.e. in-numru ta’ annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in- numru ta’ annimali esposti); — il-ħin tal-mewt matul jew wara l-espożizzjoni, ir-raġunijiet u l-kriterji użati għall-qtil uman ta’ l-annimali, — l-osservazzjonijiet kollha; — il-valur LC50 għal kull sess determinat fi tmiem il-perjodu t’osservazzjoni; (bil-metodu tal-kalkulazzjoni speċifikat); — 95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza għall- LC50 (fejn dan jista’ jiġi provdut); — il-kurva tad-doża/mortalità (fejn hu permess bil-metodu tad-determinazzjoni); — sejbiet tan-nekropsija; — kwalunkwe sejbiet hispatoloġiċi; — id-diskussjoni tar-riżultati (għandha tingħata attenzjoni partikulari lill-effett li l-qtil uman ta’ l-annimali waqt it-test jista’ jkollu fuq il-valur LC50 kalkulat); — deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha; — l-interpretazzjoni tar-riżultati.

3.2. L-EVALWAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI

Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).

4. REFERENZI

Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).

B.3. TOSSIĊITÀ AKUTA (DERMALI)

1. METODU

1.1. INTRODUZZJONI

Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).

1.2. DEFINIZZJONI

Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).

1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA

Xejn.

1.4. IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST

Is-sustanza tat-test tiġi applikata fuq il-ġilda f’dożi ggradwati lil bosta gruppi ta’ annimali sperimentali, doża waħda użata għal kull grupp. Sussegwentement, isiru l-osservazzjonijiet ta’ l-effetti u ta’ l-imwiet. L-annimali, li jmutu waqt it-test issirilhom in-nekropsija u fl-aħħar tat-test din issir fuq dawk l-annimali li baqgħu ħajjin.

Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali gravi u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Is-sustanzi għat-test f’dożaġġi magħrufa li jikkawżaw l-uġigħ u t-tbatija minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni m’għandhomx għalfejn jitwettqu.

1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ

Xejn

1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST

1.6.1. Preparazzjonijiet

L-annimali huma miżmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi għat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun użat imma għandu jkun imwettaq madwar 24 siegħa qabel it-test. Meta jsir il-qtugħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura għandha tittieħed sabiex ikun evitat xi grif fil-ġilda li jkunu jistgħu jibdlu l-permeabbiltà tagħha. Mhux anqas minn 10 % tal-wiċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistgħu ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test għandha tkun b’umidità suffiċjenti bl-ilma, jew, meta meħtieġ, apparat adattat sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta jiġi użat xi mezz, għandha tiġi kkunsidrata l-influwenza tiegħu fuq il-penetrazzjoni tal-ġilda bis-sustanza għat-test. Is-sustanzi għat-test likwidi ġeneralment jintużaw mhux maħlula.

1.6.2. Kundizzjonijiet tat-test

1.6.2.1. Annimali sperimentali

Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistgħu jintużaw. Speċje oħrajn jistgħu jiġu użati imma l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifikazzjoni. Għandhom jintużaw karatteristiċi tal-laboratorju użati b’mod komuni. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.

1.6.2.2. Numru u sess.

Mill-anqas 5 annimali huma użati f’kull livell tad-doża. Iridu jkunu ta’ l-istess sess. Jekk jintużaw dawk femminili, dawn qatt ma jkunu welldu u mhumiex tqal. Fejn l-informazzjoni hija disponibbli li turi li s-sess partikulari huwa iktar sensittiv, l-annimali ta’ dan is-sess għandhom jingħataw id-doża.

Nota: F’testijiet ta’ tossiċità akuta b’annimali t’ordni ogħla minn tal-gerriema, l-użu ta’ numri iżgħar għandu jiġi kkunsidrat. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni, u għandu jsir kull sforz sabiex id-dożi li huma xi ftit tossiċi ma jinqabżux. F’testijiet bħal dawn, l-amministrazzjoni tad-dożi letali tas-sustanza għat-test għandha tiġi evitata.

1.6.2.3. Livelli tad-doża

Dawn għandhom ikunu biżżejjed bħala numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq sabiex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Kwalunkwe effetti korrużivi jew ta’ irritazzjoni għandhom jiġu kkunsidrati meta jiġu deċiżi l-livelli tad-doża. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva li turi d-doża/ir-rispons u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ l- LD50

1.6.2.4. Test ta’ limitazzjoni

Test ta’ limitu f’livell wieħed ta’ doża ta’ mill-inqas 2 000 mg/kg ta’ piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fi gruppi ta’ 5 annimali maskili u 5 femminili, bl-użu tal-proċeduri deskritti hawn fuq. Jekk ikun hemm mortalità compound-related jista’ jiġi kkunsidrat studju sħiħ.

1.6.2.5. Perijodu ta’ l-Osservazzjoni

Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-inqas 14-il jum. Madankollu, it-tul ta’ l-osservazzjoni m’għandux ikun issettjat strettament. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata ta’ onset tagħhom u t-tul tal-perjodu ta’ rkupru, u għalhekk jista’ jiġi estiż jekk ikun meħtieġ. Il-ħin li fih is-sinjali tat-tossiċità jidhru u jisparixxu, iż-żmien li jieħdu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm it-tendenza li jtulu l-imwiet.

1.6.3. Il-proċedura

L-annimali għandhom jinżammu f’gaġeġ individwali. Is-sustanza għat-test għandha tiġi applikata b’mod uniformi fuq żona, li hija bejn wieħed u ieħor 10 % taż-żona totali tal-wiċċ tal-ġisem B’sustanzi ferm tossiċi, iż-żona tal-wiċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm jista’ jkun miż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli

Matul l-24 siegħa tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni s-sustanza tat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’garża poruża u faxxa mhux irritanti.Is-sit tat-test għandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex iżomm il-faxxex bil-garża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistgħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistgħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test, imma l-immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat.

Fi tmiem il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, għandhom jitneħħew ir-residwi tas-sustanza għat-test, fejn hu prattikabbli, permezz ta’ l-ilma jew xi metodu xieraq ieħor ta’ tindif tal-ġilda.

L-osservazzjonijiet għandhom jiġu rrekordjati sistematikament kif isiru. Ir-rekords individwali għandhom jinżammu għal kull animal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Eżaminazzjoni klinika bil-galbu għandha ssir mill-inqas darba kull ġurnata ta’ xogħol, l-osservazzjonijiet l-oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa sabiex jiġi minimizzat it-telf ta’ annimali mill-istudju eż. In-nekropsija jew ir-refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew li qed imutu.

L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Għandha tingħata attenzjoni partikulari għall-osservazzjoni ta’ tkexkix, konvulżjonijiet, ir-rieq, dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jiġi rrekordjat kemm jista’ jkun bl-eżatt. L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fi tmiem it-test huma suġġetti għan-nekropsija. It-tibdil kollu patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, it-tessuti għandhom jittieħdu għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.

Valutazzjoni tat-tossiċità fis-sess l-ieħor.

Wara tmiem l-istudju ta’ sess wieħed, mill-inqas grupp wieħed ta’ 5 annimali tas-sess l-ieħor jingħata d-doża biex jiġi stabbilit li l-annimali ta’ dan is-sess mhumiex iktar sensittivi għas-sustanza tat-test. L-użu ta’ inqas annimali jista’ jkun ġustifikat f’ċirkostanzi individwali. Fejn hemm informazzjoni xierqa disponibbli li turi li l-annimali tas-sess li qed jiġi ttestjat huma iktar sensittivi, l-ittestjar fuq l-annimali tas-sess l-ieħor jista’ ma jsirx.

2. DATA

Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali individwali, in-numru ta’ l-annimali li juru sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati u rrekordjati ftit qabel is-sustanza għat-test tiġi applikata. Wara, dan isir kull ġimgħa u mal-mewt it-tibdiliet fil-piż għandhom jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jibqgħu ħajjin sa ġurnata wara. L-annimali li jiġu maqtula b’mod uman minħabba t-tbatija u l-uġigħ li huma compound related huma rrekordjati bħala mwiet compound-related. L-LD50 għandu jiġi determinat minn metodu rikonoxxut.

Il-valutazzjoni tad-data għandha tinkludi l-valutazzjoni tar-relazzjonijiet, jekk ikun hemm, bejn l-espoħizzjoni ta’ l-annimali għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha, inklużi dawk ta’ imġiba u dawk kliniċi, feriti kbar, tibdil fil-piż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe effetti tossiċi oħra.

3. RAPPORTAĠĠ

3.1. RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

— l-ispeċje, is-silta, is-sors, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, eċċ.;

— kundizzjonijiet tat-test (inklużu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew mhux okklussivi);

— il-livelli tad-doża (inkluż il-mezz, jekk użat, u l-konċentrazzjoninijiet);

— is-sess ta’ l-annimal li qed jingħata d-doża;

— it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons tas-sess u l-livell tad-doża (i.e. in-numru ta’ l-annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test; in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in-numru ta’ annimali esposti);

— il-ħin ta