(10)

Il-Kapitoli C.27, C.28, C.29 u C.30 huma miżjuda: “C.27 TEST TAT-TOSSIĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ SEDIMENT-ILMA BL-UŻU TA’ SEDIMENT IMĦALLAT DAĦLA 1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti għall-Linja Gwida tat-Test (TG) 218 (2004) tal-OECD. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa nfassal biex jivvaluta l-effetti ta’ espożizzjoni prolongata tal-kimiċi għal-larvi li jgħixu fis-sediment tad-dipteran tal-ilma ħelu Chironomus sp. Huwa bbażat fuq protokolli eżistenti tat-test tat-tossiċità għal Chironomus riparius u Chironomus tentans li ġew żviluppati fl-Ewropa (1)(2)(3) u fl-Amerika tat-Tramuntana (4)(5)(6)(7)(8) u sarilhom ir-ring test (1)(6)(9). Jistgħu jintużaw ukoll speċijiet oħra ta’ kironomidi iddokumentati sewwa, eż. Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Ix-xenarju ta’ espożizzjoni użat f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa sediment fortifikat bis-sustanza għall-ittestjar. L-għażla tax-xenarju adatt ta’ espożizzjoni tiddependi mill-applikazzjoni maħsuba tat-test. Ix-xenarju ta’ sediment fortifikat huwa maħsub li jissimula livelli akkumulati ta’ kimiċi li jippersistu fis-sediment. Din is-sistema ta’ espożizzjoni tinvolvi sediment fortifikat ta’ sistema ta’ ttestjar ta’ sediment-ilma. 3. Sustanzi li jeħtiġilhom ikunu ttestjati għal organiżmi li jgħixu f’sediment is-soltu jippersistu f’dan il-kompartiment tul perjodi twal ta’ żmien. L-organiżmi li jgħixu f’sediment jistgħu jkunu esposti permezz ta’ għadd ta’ rotot. L-importanza relattiva ta’ kull rotta ta’ espożizzjoni u taż-żmien meħud għal kull waħda biex tikkontribwixxi għall-effetti tossiċi globali, tiddependi mill-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-kimika konċernata. Għal sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log Kow > 5) jew għal sustanzi magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-inġestjoni ta’ ikel kontaminat tista’ tkun rotta sinifikanti ta’ espożizzjoni. Biex it-tossiċità ta’ sustanzi lipofiliċi ħafna ma tkunx sottovalutata, jista’ jitqies l-użu ta’ ikel miżjud mas-sediment qabel l-applikazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar. Biex jittieħdu r-rotot potenzjali kollha ta’ espożizzjoni l-fokus ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar ikun fuq espożizzjoni fit-tul. It-testijiet idumu madwar 20 - 28 jum għal C. riparius u C. yoshimatsui, u 28 - 65 jum għal C. tentans. Jekk tkun meħtieġa dejta għal żmien qasir għal għan speċifiku, pereżempju biex ikunu mistħarrġa l-effetti ta’ kimika instabbli, replikati addizzjonali jistgħu jitneħħew wara perjodu ta’ għaxart ijiem. 4. Il-punti ta’ tmiem imkejla huma l-għadd totali ta’ adulti li jkunu evolvew u ż-żmien li jkunu ħadu biex evolvew. Huwa rrakkomandat li l-kejl tas-sopravivenza u tat-tkabbir tal-larvi għandu jsir biss wara perjodu ta’ għaxart ijiem jekk tkun meħtieġa dejta addizzonali għal żmien qasir, billi jintużaw replikati addizzjonali skont il-każ. 5. Huwa rrakkomandat l-użu ta’ sediment formulat. Sediment formulat għandu diversi vantaġġi fuq sedimenti naturali: — il-varjabbiltà sperimentali titnaqqas minħabba li jifforma “matriċi standardizzata” riproduċibbli u l-ħtieġa li jinstabu sorsi ta’ sediment mhux kontaminati u nodfa tkun eliminata; — it-testijiet jistgħu jibdew f’kull żmien mingħajr ma jkun hemm varjabbiltà staġonali fis-sediment tat-test u ma jkunx hemm ħtieġa li s-sediment ikun ittrattat minn qabel biex titneħħa fawna indiġena; l-użu ta’ sediment formulat inaqqas ukoll l-ispiża b’rabta mal-ġabra mill-post ta’ ammonti suffiċjenti ta’ sediment għal testijiet ta’ rutina; — l-użu ta’ sediment formulat jippermetti li jsiru tqabbiliet ta’ tossiċità u gradazzjoni ta’ sustanzi b’dan il-mod. 6. Definizzjonijiet użati jingħataw fl-Appendiċi 1. PRINĊIPJU TAT-TEST 7. L-ewwel fażi ta’ larvi kironomidi jkunu esposti għal firxa ta’ konċentrazzjoni tal-kimika għall-ittestjar f’sistemi ta’ sediment u ilma. Is-sustanza għall-ittestjar tkun iffortifikata fis-sediment u l-larvi tal-ewwel fażi mbagħad jiddaħħlu f’bekkijiet tat-test li fihom il-konċentrazzjonijiet ta’ sediment u ilma jkunu saru stabbli. Ir-rata ta’ evoluzzjoni u żvilupp ta’ kironomidi titkejjel fit-tmiem tat-test. Is-sopravivenza u l-piż tal-larvi jistgħu jitkejlu wkoll wara 10 ijiem jekk ikun meħtieġ (billi jintużaw replikati addizzjonali skont kif ikun xieraq). Din id-dejta tkun analizzata jew billi jintuża mudell ta’ rigressjoni biex tkun stmata l-konċentrazzjoni li għandha tikkawża x % tnaqqis fl-evoluzzjoni, fis-sopravivenza jew fit-tkabbir tal-larvi (eż. EC15, EC50 eċċ.), jew billi jintuża ttestjar ta’ ipoteżi ta’ statistika biex ikun iddeterminat NOEC/LOEC. Dan tal-aħħar ikun jeħtieġlu tqabbil ta’ valuri ta’ effett ma’ valuri ta’ kontroll billi jintużaw testijiet ta’ statistika. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA GĦALL-ITTESTJAR 8. Is-solubilità fl-ilma tas-sustanza għall-ittestjar, il-pressjoni tal-fwar tagħha, il-partizzjoni mkejla jew ikkalkulata f’sediment u l-istabbiltà fl-ilma u fis-sediment għandhom ikun magħrufin. Għandu jkun disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar f’ilma ta’ fuq, f’ilma tal-pori u f’sediment b’akkuratezza magħrufa u rrapportata u b’limitu ta’ detezzjoni. Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali u l-purezza tas-sustanza għall-ittestjar. Dak li jiġrilha kimikament is-sustanza għall-ittestjar (eż. tixrid, degradazzjoni abijotika u bijotika, eċċ.) ukoll huwa informazzjoni utli. Aktar gwida għall-ittestjar ta’ sustanzi bi proprjetajiet fiżikokimiċi li jagħmluha diffiċli għalihom li jsirilhom it-test tingħata fi (12). KIMIĊI TA’ REFERENZA 9. Kimiċi ta’ referenza jistgħu jkunu ttestjati perjodikament bħala mezz li jiżgura li l-protokoll tat-test u l-kondizzjonijiet tat-test ikunu affidabbli. Eżempji ta’ sustanzi tossiċi ta’ referenza użati b’suċċess f’ring-tests u fi studji ta’ validazzjoni huma: lindane, trifluralin, pentaklorurfenol, klorur tal-kadmju u klorur tal-potassju (1)(2)(5)(6)(13). VALIDITÀ TAT-TEST 10. Biex it-test ikun validu japplikaw il-kondizzjonijiet li ġejjin: — l-evoluzzjoni fil-kontrolli għandha tkun mill-anqas 70 % fit-tmiem tat-test. (1)(6); — l-evoluzzjoni ta’ C. riparius u C. yoshimatsui għal adulti minn reċipjenti ta’ kontroll għandha sseħħ bejn 12 u 23 jum wara li jkunu ddaħħlu fir-reċipjenti; għal C. tentans, ikun meħtieġ perjodu ta’ 20 sa 65 jum. — fit-tmiem tat-test, il-pH u l-konċentrazzjoni tal-ossiġnu maħlul għandhom jitkejlu f’kull reċipjent. Il-konċentrazzjoni tal-ossiġnu għandha tkun mill-anqas 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV) fit-temperatura użata, u l-pH tal-ilma ta’ fuq għandu jkun fil-firxa ta’ 6-9 fir-reċipjenti kollha tal-ittestjar; — it-temperatura tal-ilma mhux suppost tvarja b’iktar minn ± 1,0 C. It-temperatura tal-ilma tista’ tkun ikkontrollata b’kamra iżotermika u f’dak il-każ it-temperatura tal-kamra għandha tkun ikkonfermata f’intervall xieraq ta’ ħin. DESKRIZZJONI TAL-METODU Reċipjenti tat-test 11. L-istudju jitwettaq f’bekkijiet tal-ħġieġ ta’ 600 ml b’dijametru qies ta’ 8 cm. Reċipjenti oħra jkunu tajbin, iżda għandhom jiggarantixxu fond sewwa tal-ilma ta’ fuq u tas-sediment. Il-wiċċ tas-sediment għandu jkun suffiċjenti biex jipprovdi 2 sa 3 cm2 għal kull larva. Il-proporzjon tal-fond tas-saff tas-sediment mal-fond tal-ilma ta’ fuq għandu jkun 1:4. Reċipjenti tat-test u apparat ieħor li jiġu f’kuntatt mas-sistema ta’ ttestjar għandhom ikunu magħmulin kollha mill-ħġieġ jew minn materjal ieħor kimikament inerti (eż. Teflon). Għażla ta’ speċi 12. L-ispeċi li għandha tintuża fit-test preferibbilment hija Chironomus riparius. Chironomus tentans hija adatta wkoll iżda aktar diffiċli biex tkun ittrattata u jeħtiġilha perjodu itwal ta’ test. Tista’ tintuża wkoll Chironomus yohimatsui. Dettalji ta’ metodi ta’ kultura jingħataw fl-Appendiċi 2 għal Chironomus riparius. Informazzjoni dwar kondizzjonijiet ta’ kultura hija wkoll disponibbli għal speċijiet oħra, jiġifieri għal Chironomus tentans (4) u Chironomus yoshimatsui (11). L-identifikazzjoni ta’ speċijiet għandha tkun ikkonfermata qabel l-ittestjar iżda ma tkunx meħtieġa qabel kull test jekk organiżmi jkunu ġejjin minn kultura interna. Sediment 13. Preferibbilment għandu jintuża sediment formulat (msejjaħ ukoll sediment rikostitwit, artifiċjali jew sintetiku). Iżda, jekk jintuża sediment naturali, dan għandu jkun ikkaratterizzat (huma wkoll irrakkomandati mill-anqas pH, kontenut ta’ karbonju organiku, determinazzjoni ta’ parametri oħra bħal proporzjon ta’ C/N u granulumetrija), u għandu jkun ħieles minn kull kontaminazzjoni u organiżmi oħra li jistgħu jikkompetu ma’, jew jikkunsmaw lill-kironomidi. Huwa wkoll irrakkomandat li, qabel ma jintuża f’test tat-tossiċità tal-kironomidi, is-sediment naturali jkun ikkondizzjonat għal sebat ijiem taħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test sussegwenti. Huwa rrakkomandat li f’dan it-test jintuża s-sediment formulat li ġej, ibbażat fuq il-ħamrija artifiċjali użata fil-Metodu ta’ Ttestjar C.8 (14) (1)(15)(16): (a) 4-5 % pit (piż fin-niexef): qrib kemm jista’ jkun pH 5,5 sa 6,0; huwa importanti li jintuża pit f’għamla ta’ trab, mitħun fin (partiċelli ta’ daqs ≤ 1 mm) u mnixxef bl-arja biss. (b) 20 % tafal tal-kawlina (piż fin-niexef) (kontenut ta’ kawlina preferibbilment aktar minn 30 %). (c) 75-76 % ramel tal-quartz (piż fin-niexef) (għandu jippredomina ramel fin b’aktar minn 50 % tal-partiċelli bejn 50 u 200 μm). (d) Jiżdied ilma dejonizzat biex jinkiseb kontenut ta’ rtuba tat-taħlita finali f’firxa ta’ 30-50 %. (e) Jiżdied karbonat tal-kalċju ta’ kwalità kimikament pura (CaCO3) biex ikun aġġustat il-pH tat-taħlita finali tas-sediment għal 7,0 ± 0,5. Il-kontenut ta’ karbonju organiku tat-taħlita finali għandu jkun 2 % (± 0,5 %) u għandu jkun aġġustat b’ammonti xierqa ta’ pit u ramel, skont (a) u (c). 14. Is-sors tal-pit, tafal tal-kawlina u ramel għandha tkun magħrufa. Il-komponenti tas-sediment għandhom ikunu eżaminati għan-nuqqas ta’ kontaminazzjoni kimika (eż. metalli tqal, komposti tal-organokloru, komposti organofosforużi, eċċ.). Eżempju għat-tħejjija tas-sediment formulat huwa deskritt fl-Appendiċi 3. It-taħlit ta’ kostitwenti nixfin ikun ukoll aċċettabbli jekk jintwera li wara li jkun żdied l-ilma ta’ fuq ma sseħħx separazzjoni tal-kostitwenti tas-sediment (eż. biċċiet tal-pit fil-wiċċ tal-ilma), u li l-pit jew is-sediment ikunu kkondizzjonati b’mod suffiċjenti. Ilma 15. Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristiċi kimiċi ta’ ilma dilwit b’mod aċċettabbli kif elenkat fl-Appendiċijiet 2 u 4 ikun tajjeb bħala ilma tat-test. Kull ilma tajjeb, ilma naturali (ilma tal-wiċċ jew ta’ taħt l-art), ilma rikostitwit (ara l-Appendiċi 2) jew ilma tal-vit li jkun tneħħielu l-kloru jkun aċċettabbli bħala ilma ta’ kultura u ilma tat-test jekk kironomidi jibqgħu jgħixu fih sakemm idumu l-kultura u t-testjar mingħajr ma juru sinjal ta’ stress. Fil-bidu tat-test, il-pH tal-ilma tat-test għandu jkun bejn 6 u 9 u t-total ta’ melħ minerali fl-ilma ma jkunx ogħla minn 400 mg/l bħala CaCO3. Iżda, jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-melħ minerali fl-ilma u s-sustanza għall-ittestjar, għandu jintuża ilma b’anqas melħ minerali (u għalhekk, m’għandux jintuża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni). Għandu jintuża l-istess tip ta’ ilma tul l-istudju kollu. Il-karatteristiċi tal-kwalità tal-ilma elenkati fl-Appendiċi 4 għandhom jitkejlu mill-anqas darbtejn fis-sena jew meta jkun hemm suspett li dawn il-karatteristiċi jkunu setgħu nbidlu b’mod sinifikanti. Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet - Sedimenti ffortifikati 16. Sedimenti mħalltin tal-konċentrazzjoni magħżula s-soltu jitħejjew biż-żieda ta’ soluzzjoni tas-sustanza għall-ittestjar direttament mas-sediment. Soluzzjoni ta’ stokkijiet tas-sustanza għall-ittestjar maħlula f’ilma dejonizzat titħallat mas-sediment formulat b’mitħan romblu, b’mikser tal-għalf jew billi titħallat bl-idejn. Jekk ftit titħallat fl-ilma, is-sustanza għall-ittestjar tista’ tinħall f’volum kemm jista’ jkun żgħir ta’ solvent organiku adatt (eż. eżanu, aċeton jew kloroform). Din is-soluzzjoni mbagħad titħallat ma’ 10 g ta’ ramel fin tal-quartz għal reċipjent wieħed tat-test. Is-solvent jitħalla jevapora u għandu jitneħħa għal kollox mir-ramel; ir-ramel imbagħad jitħallat mal-ammont adatt ta’ sediment għal kull bekk tat-test. Jistgħu jintużaw biss aġenti li jsiru volatili malajr biex iħollu, ixerrdu jew jemulsifaw is-sustanza għall-ittestjar. Huwa mfakkar li għandu jitqies ir-ramel ipprovdut mis-sustanza għall-ittestjar u mit-taħlita tar-ramel meta jkun qed jitħejja s-sediment (jiġifieri s-sediment għandu, għalhekk, jitħejja b’anqas ramel). Għandha tingħata attenzjoni biex ikun żgurat li s-sustanza għall-ittestjar miżjuda mas-sediment titqassam sewwa u ma’ kullimkien fis-sediment. Jekk ikun meħtieġ, jistgħu jkunu analizzati kampjuni sekondarji biex ikun iddeterminat il-grad ta’ omoġeneità. DISINN TAT-TEST 17. Id-disinn tat-test jirrelata mal-għażla tal-għadd u l-ispazjar tal-konċentrazzjonijiet tat-testijiet, mal-għadd ta’ reċipjenti għal kull konċentrazzjoni u mal-għadd ta’ larvi għal kull reċipjent. Huma deskritti disinji għal stima ta’ punti ta’ EC, għal stima ta’ NOEC u biex jitmexxa test ta’ limitu. Disinn għal analiżi b’rigressjoni 18. Il-konċentrazzjoni ta’ effetti (eż. EC15, EC50) u l-firxa ta’ konċentrazzjonijiet, li għalihom l-effett tas-sustanza għall-ittestjar hija ta’ interess, għandhom jingħaqdu bil-konċentrazzjonijiet inklużi fit-test. Ġeneralment, l-akkuratezza u l-aktar il-validità, li bihom ikunu jistgħu jsiru stimi ta’ konċentrazzjonijiet ta’ effetti (ECx), titjieb meta l-konċentrazzjoni ta’ effetti tkun fil-firxa ta’ konċentrazzjonijiet ittestjati. Estrapolazzjoni ħafna taħt il-konċentrazzjoni pożittiva l-aktar baxxa jew ‘il fuq mill-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun evitata. Test preliminari biex jinstabu firxiet ikun utli biex tintgħażel il-firxa ta’ konċentrazzjonijiet li jkollhom jintużaw (ara l-paragrafu 27)). 19. Jekk għandu jkun stmat ECx, għandhom ikunu ttestjati mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet u tliet replikati għal kull konċentrazzjoni. Huwa rrakkomandat li jintużaw konċentrazzjonijiet suffiċjenti ta’ testijiet biex titħalla ssir stima tajba ta’ mudell. Il-fattur bejn konċentrazzjonijiet m’għandux ikun akbar minn tnejn (tista’ ssir eċċezzjoni f’każijiet meta l-kurva ta’ rispons għad-doża jkollha anglu baxx). L-għadd ta’ replikati f’kull trattament jista’ jitnaqqas jekk l-għadd ta’ konċentrazzjonijiet tat-test b’risponsi differenti jiżdied. Iż-żieda fl-għadd ta’ replikati jew it-tnaqqis fit-tul tal-intervalli tal-konċentrazzjoni tat-test jittendu li jwasslu għal intervall idjaq ta’ kunfidenza għat-test. Ikunu meħtieġa replikati addizzjonali jekk għandhom ikunu stmati s-sopravivenza u t-tkabbir tal-larvi għal 10-ijiem. Disinn għal stima ta’ NOEC/LOEC 20. Jekk għandhom ikunu stmati LOEC jew NOEC, għandhom jintużaw ħames konċentrazzjonijiet tat-test b’mill-anqas erba’ replikati u l-fattur bejn konċentrazzjonijiet m’għandux ikun akbar minn tnejn. L-għadd ta’ replikati għandu jkun suffiċjenti biex tkun żgurata qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). Bir-rata ta’ żvilupp, Analiżi ta’ Varjanza (ANOVA) is-soltu tkun adatta, bħat-test Dunnett u t-test Williams (17)(18)(19)(20). Fil-proporzjon ta’ evoluzzjoni jistgħu jkunu użati t-testijiet Cochran-Armitage, dak eżatt ta’ Fisher (bil-korrezzjoni ta’ Bonferroni), jew ta’ Mantel-Haenszel. Test ta’ limitu 21. Ikun jista’ jsir test ta’ limitu (konċentrazzjoni ta’ test wieħed u kontroll) jekk ma jkun osservat ebda effett fit-test preliminari ta’ detezzjoni ta’ firxa. L-għan tat-test ta’ limitu huwa li jitwettaq test f’konċentrazzjoni għolja biżżejjed biex dawk li jieħdu deċiżjonijiet ikunu jistgħu jeskludu effetti tossiċi li jista’ jkun hemm tas-sustanza għall-ittestjar, u l-limitu jkun stabbilit f’konċentrazzjoni li ma tkunx mistennija li tidher f’kull sitwazzjoni. Huwa rrakkomandat 1 000 mg/kg (piż fin-niexef). Is-soltu jkunu meħtieġa mill-anqas sitt replikati kemm għat-trattament kif ukoll għall-kontroll. Għandha tintwera qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). B’rispons metriku (rata ta’ żvilupp u piż), it-t-test huwa metodu ta’ statistika adatt jekk dejta tissodisfa l-ħtiġijiet ta’ dan it-test (normalità, varjanzi omoġenji). Jista’ jintuża t-t-test ta’ varjanza inugwali jew test mhux parametriku, bħat-test Wilcoxon-Mann-Whithey, jekk dawn il-ħtiġijiet ma jkunux sodisfatti. Bil-proporzjon ta’ evoluzzjoni, it-test eżatt ta’ Fisher ikun adatt. PROĊEDURA Kondizzjonijiet ta’ espożizzjoni Tħejjija ta’ sistema ta’ sediment u ilma ffortifikati 22. Hija rrakkomandata l-proċedura ta’ fortifikazzjoni deskritta fil-Metodu ta’ Ttestjar C.8: Tossiċità għal Ħniex għal applikazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar (14). Is-sedimenti ffortifikati jitqiegħdu fir-reċipjenti u jiżdied ilma ta’ fuq biex jinġieb proporzjon ta’ volum ta’ sediment-ilma ta’ 1:4 (ara l-paragrafi 11 u 15). Il-fond tas-saff tas-sediment għandu jkun fil-firxa ta’ 1,5 - 3 cm.Biex ikunu evitati separazzjoni ta’ ingredjenti tas-sediment u sospensjoni mill-ġdid ta’ materjal fin matul iż-żieda ta’ ilma tat-test fil-kolonna tal-ilma, is-sediment jista’ jitgħatta b’diska tal-plastik waqt li jkun qed jitferra’ ilma fiha, u d-diska titneħħa minnufih wara. Apparati oħra jistgħu wkoll ikunu adatti. 23. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu mgħottijin (eż. bi platti tal-ħġieġ). Jekk ikun meħtieġ, matul l-istudju l-ilma jimtela sal-livell tal-volum oriġinali biex dan jagħmel tajjeb għall-evaporazzjoni tal-ilma. Dan għandu jsir billi jintuża ilma distillat jew dejonizzat biex ma jitħalliex jiżdied melħ. Stabilizzazzjoni 24. Malli jkun tħejja s-sediment iffortifikat bl-ilma ta’ fuq, tkun ħaġa mixtieqa li titħalla ssir partizzjoni tas-sustanza għall-ittestjar mill-fażi milwiema għas-sediment (3)(4)(6)(13). Preferibbilment dan għandu jsir skont il-kondizzjonijiet ta’ temperatura u tirwiħ użati fit-test. Żmien xieraq ta’ ekwilibrazzjoni huwa speċifiku għas-sediment u għall-kimika, u jista’ jieħu minn sigħat sa jiem u f’każijiet rari sa diversi ġimgħat (4-5 ġimgħat). Minħabba li dan iħalli żmien għal degradazzjoni ta’ ħafna kimiċi, ma jkunx mistenni ekwilibriju iżda huwa rrakkomandat perjodu ta’ ekwilibrazzjoni ta’ 48 siegħa. Fit-tmiem ta’ dan il-perjodu ulterjuri ta’ ekwilibrazzjoni, il-konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar għandha titkejjel fl-ilma ta’ fuq, fl-ilma tal-pori u fis-sediment, mill-anqas fl-ogħla konċentrazzjoni u f’waħda aktar baxxa (ara l-paragrafu 38). Dawn id-determinazzjonijiet analitiċi tas-sustanza għall-ittestjar jippermettu ssir kalkulazzjoni tal-bilanċ tal-massa u espressjoni ta’ riżultati abbażi ta’ konċentrazzjonijiet imkejla. Żieda ta’ organiżmi tat-test 25. Minn erba’ sa ħamest ijiem qabel ma l-organiżmi tat-test jiżdiedu fir-reċipjenti tat-test, għandhom jittieħdu kwantitajiet ta’ bajd mill-kulturi u jitqiegħdu f’reċipjenti żgħar f’midjum ta’ kulturi. Jista’ jintuża midjum qadim mill-kultura ta’ stokkijiet jew midjum li jkun għadu kif tħejja. Jekk jintuża dan tal-aħħar, ammont żgħir ta’ ikel eż. alka ħadra u/jew ftit qatriet żgħar ta’ filtrat minn sospensjoni mitħuna fin ta’ trofof ta’ ikel tal-ħut għandu jiżdied mal-midjum tal-kultura (ara l-Appendiċi 2). Għandhom jintużaw biss kwantijiet ta’ bajd miġbur frisk. Normalment, il-larvi jibdew ifaqqsu ftit jiem wara li jkun hemm il-bajd (2 sa 3 ijiem għal Chironomus riparius f’20 °C u 1 sa 4 ijiem għal Chironomus tentans fi 23 °C u Chironomus yoshimatui fi 25 °C) u jkun hemm tkabbir ta’ larvi f’erba’ fażijiet, kull fażi ddum 4-8 ijiem. Fit-test għandhom jintużaw larvi tal-ewwel fażi (2-3 jew 1-4 ijiem wara li jkunu faqqsu). Il-fażi ta’ pappamoski tista’ possibbilment tkun ivverifikata billi jintuża l-wisa’ tal-iskutella tar-ras (6). 26. Għoxrin larvi tal-ewwel fażi jkunu allokati kif jinzertaw lil kull reċipjent tat-test li jkun fih is-sediment imħallat u l-ilma, billi tintuża pipetta mingħajr ponta. It-tirwiħ tal-ilma għandu jieqaf waqt li l-larvi jkunu qed jiżdiedu fir-reċipjenti tat-test u jibqa’ hekk għal 24 siegħa oħra wara li jkunu żdiedu l-larvi (ara l-paragrafi 25 u 32). Skont it-tifsila tat-test użat (ara l-paragrafi 19 u 20), l-għadd ta’ larvi użati għal kull konċentrazzjoni jkun mill-anqas 60 għall-istima ta’ punti ta’ EC u 80 għal determinazzjoni ta’ NOEC. Konċentrazzjonijiet tat-test 27. Test ta’ detezzjoni ta’ firxa jista’ jkun utli biex tkun iddeterminata l-firxa ta’ konċentrazzjonijiet għat-test definittiv. Għal dan il-għan tintuża serje ta’ konċentrazzjonijiet spazjati fil-wisa’ tas-sustanza għall-ittestjar. Biex tkun ipprovduta l-istess densità tal-wiċċ għal kull kironomidu, li jkollu jintuża għat-test definittiv, kironomidi jkunu esposti għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar għal perjodu li jippermetti stima ta’ konċentrazzjonijiet adatti ta’ testijiet, u ma jkunx hemm ħtieġa ta’ replikati. 28. Il-konċentrazzjonijiet tat-test għat-test definittiv ikunu deċiżi abbażi tar-riżultat tat-test ta’ detezzjoni ta’ firxa. Mill-anqas għandhom jintużaw u jintgħażlu ħames konċentrazzjonijiet kif deskritt fil-paragrafi 18 sa 20. Kontrolli 29. Reċipjenti ta’ kontroll mingħajr sustanza għall-ittestjar iżda li jkunu jinkludu sediment għandhom ikunu inklużi fit-test bl-għadd xieraq ta’ replikati (ara l-paragrafi 19-20). Jekk ikun intuża solvent għal applikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar (ara l-paragrafu 16), għandu jiżdied kontroll ta’ solvent ta’ sediment. Sistema ta’ ttestjar 30. Jintużaw sistemi statiċi. Sistemi semistatiċi jew ta’ fluss kontinwu bl-ilma ta’ fuq jiġġedded kull tant jew kontinwament jistgħu jintużaw f’każijiet eċċezzjonali bħal pereżempju jekk speċifikazzjonijiet tal-kwalità tal-ilma jisfaw ma jkunux adatti għall-organiżmu tat-test jew jaffettwaw l-ekwilibriju kimiku (eż. livelli ta’ ossiġnu maħlul jinżlu baxxi ħafna, il-konċentrazzjoni ta’ prodotti ta’ ekskreta togħla żżejjed jew minerali jlissu minn sediment u jaffettwaw il-pH u/jew il-melħ minerali fl-ilma). Iżda metodi oħra biex titjieb il-kwalità tal-ilma ta’ fuq, bħal tirwiħ, għandhom normalment ikunu biżżejjed u jkunu ppreferuti. Ikel 31. Ikun meħtieġ li l-larvi jintemgħu, preferibbilment kuljum jew mill-anqas tliet darbiet fil-ġimgħa. L-ikel tal-ħut (sospensjoni fl-ilma jew ikel mitħun fin, eż. TetraMin jew TetraPhyll; ara d-dettalji fl-Appendiċi 2) fl-ammont ta’ 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg għal C. yoshimatui) għal kull larva kuljum jidher li jkun adegwat għal larvi żgħar għall-ewwel 10 ijiem. Jista’ jkun meħtieġ ftit aktar ikel għal larvi li jkollhom aktar żmien: 0,5 - 1 mg għal kull larva kuljum għandu jkun suffiċjenti għall-bqija tat-test. Ir-razzjon tal-ikel għandu jitnaqqas fit-trattamenti kollha u l-kontrolli jekk ikun hemm tkabbir fungali jew jekk fil-kontrolli jkunu osservati mwiet. Jekk ma jkunx jista’ jitwaqqaf żvilupp fungali t-test għandu jittenna. Meta jkunu qed jiġu ttestjati sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log Kow > 5), jew sustanzi magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-ammont ta’ ikel meħtieġ biex ikunu żgurati sopravivenza u tkabbir naturali tal-organiżmi jista’ jiżdied mas-sediment formulat qabel il-perjodu ta’ stabbilizzazzjoni. Għal dan, għandu jintuża materjal tal-pjanti minflok ikel tal-ħut, eż. tista’ tintuża żieda ta’ 0,5 % (piż fin-niexef) ta’ weraq mitħunn fin ta’ eż. ħorrieqa tnigges (Urtica dioica), ċawsla (Morus alba), silla bajda (Trifolium repens), spinaċi (Spinacia oleracea) jew ta’ materjal ieħor tal-pjanti (Cerophyl jew ċelluloża alfa). Kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni 32. Tirwiħ bil-mod tal-ilma ta’ fuq f’reċipjenti tat-test ikun ipprovdut preferibbilment 24 sigħat wara li jiżdiedu l-larvi u jitkompla matul it-test kollu (għandha tingħata attenzjoni biex il-konċentrazzjoni tal-ossiġnu maħlul ma tinżilx taħt 60 % ta’ ASV). Tirwiħ ikun ipprovdut permezz ta’ pipetta Pasteur tal-ħġieġ imwaħħla 2-3 cm ‘il fuq mis-saff tas-sediment (jiġifieri bużżieqa waħda jew ftit tal-ilma/sec). Meta jkunu qed jiġu ttestjati kimiċi volatili, jista’ jitqies li s-sistema tas-sediment-ilma ma titrewwaħx. 33. It-test jitmexxa f’temperatura kostanti ta’ 20 °C (± 2 °C). Għal C. tentans u C. yoshimatui t-temperaturi rakkomandati jkunu ta’ 23 °C u 25 °C (± 2 °C), rispettivament. Jintuża fotoperjodu ta’ 16-il siegħa u l-intensità tad-dawl għandha tkun 500 sa 1 000 lux. Durata tal-espożizzjoni 34. L-espożizzjoni tibda biż-żieda ta’ larvi fir-reċipjenti ffortifikati u ta’ kontroll. Id-durata massima tal-espożizzjoni tkun ta’ 28 jum għal C. riparius u C. yoshimatsui, u 65 jum għal C. tentans. Jekk pappamoski jevolvu qabel, it-test jista’ jitwaqqaf wara minimu ta’ ħamest ijiem wara li jkun evolva l-ewwel adult fil-kontroll. Osservazzjonijiet Emerġenza 35. Ikunu ddeterminati ż-żmien ta’ żvilupp u l-għadd totali ta’ pappamoski rġiel u nisa evoluti għal kollox. L-irġiel ikunu identifikati faċilment mill-antenni tagħhom kollha pjumi. 36. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu osservati mill-anqas tliet darbiet fil-ġimgħa biex issir valutazzjoni viżiva ta’ kull mġiba mhux normali (eż. tluq mis-sediment, għawm mhux tas-soltu), mqabbla mal-kontroll. Matul il-perjodu ta’ evoluzzjoni mistennija jkun meħtieġ li jsir għadd kuljum ta’ pappamoski li jkunu evolvew għalkollox. Is-sess u l-għadd ta’ pappamoski evoluti għalkollox ikunu rreġistrati kuljum. Wara identifikazzjoni l-pappamoski jitneħħew mir-reċipjenti. Kull kwantità ta’ bajd iddepożitata qabel ma jintemm it-test għandha tkun irreġistrata u mbagħad titneħħa biex larvi ma jitħallewx jerġgħu jidħlu fis-sediment. Ikun irreġistrat ukoll l-għadd ta’ pupae viżibbli li jkunu naqsu li jevolvu. Gwida dwar kejl ta’ evoluzzjoni hija pprovduta fl-Appendiċi 5. Tkabbir u sopravivenza 37. Jekk għandha tkun ipprovduta dejta dwar sopravivenza u tkabbir ta’ larvi għal 10 ijiem, għandhom ikunu inklużi reċipjenti addizzjonali tat-test mill-bidu, biex ikunu jistgħu jintużaw wara. Is-sediment minn dawn ir-reċipjenti addizzjonali jintgħarbel billi jintuża għarbiel ta’ 250 μm biex iżomm il-larvi. Kriterji għal mewt huma immobbiltà jew nuqqas ta’ reazzjoni għal stimulu mekkaniku. Larvi li ma jkunux irkuprati għandhom jingħaddu wkoll bħala mejtin (larvi li jkunu mietu fil-bidu tat-test setgħu kienu ġew iddegradati minn mikrobi). Ikunu ddeterminat il-piż fin-niexef (mingħajr irmied) tal-larvi li jkunu baqgħu ħajjin għal kull reċipjent tat-test u l-medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent. Ikun utli li jkun iddeterminat ta’ liema fażi jkunu l-larvi li jkunu baqgħu ħajjin; għal dak jista’ jintuża l-kejl tal-wisa’ tal-iskutella tar-ras ta’ kull larva. Kejlijiet analitiċi Konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar 38. Qabel ma jibda t-test (jiġifieri żieda ta’ larvi), jittieħdu kampjuni tas-sediment kollu minn mill-anqas reċipjent wieħed għal kull trattament għad-determinazzjoni analitika tal-konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar fis-sediment. Huwa rrakkomandat li, bħala minimu, kampjuni tal-ilma ta’ fuq, tal-ilma tal-pori u tas-sediment ikunu analizzati fil-bidu (ara l-paragrafu 24) u fit-tmiem tat-test, fl-ogħla konċentrazzjoni u f’waħda aktar baxxa. Dawn id-determinazzjonijiet ta’ konċentrazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar jagħtu tagħrif dwar l-imġiba/il-partizzjoni tas-sustanza għall-ittestjar fis-sistema ilma u sediment. 39. Meta jittieħdu kejlijiet intermedji (eż. fis-7 jum) u jekk l-analiżi jkun jeħtiġilha kampjuni kbar li ma jkunux jistgħu jittieħdu minn reċipjenti tat-test mingħajr ma tkun influwenzata s-sistema ta’ ttestjar, għandhom isiru determinazzjonijiet analitiċi fuq kampjuni minn reċipjenti addizzjonali tat-test ittrattati bl-istess mod (inkluża l-preżenza ta’ organiżmi tat-test) iżda mhux użati għal osservazzjonijiet bijoloġiċi. 40. Ċentrifugazzjoni pereżempju ta’ 10 000 g u 4 °C għal 30 min. hija l-proċedura rrakkomandata biex ikun iżolat ilma interstizjali. Iżda jekk is-sustanza għall-ittestjar tkun turi li filtri ma jassorbuhiex, tista’ wkoll tkun aċċettabbli l-filtrazzjoni. F’xi każijiet jista’ ma jkunx possibbli li jkunu analizzati konċentrazzjonijiet fl-ilma tal-pori minħabba li d-daqs tal-kampjun ikun żgħir wisq. Parametri fiżikokimiċi 41. Il-pH u t-temperatura tat-reċipjenti tat-test għandhom jitkejlu b’mod adatt (ara l-paragrafu 10). Melħ minerali fl-ilma u ammonja għandhom jitkejlu fil-kontrolli u f’reċipjent wieħed tat-test fl-ogħla konċentrazzjoni fil-bidu u fit-tmiem tat-test. DEJTA U RAPPURTAR Trattament ta’ riżultati 42. L-għan ta’ dan it-test huwa biex ikun iddeterminat l-effett tas-sustanza għall-ittestjar fuq ir-rata ta’ żvilupp u fuq l-għadd totali ta’ pappamoski rġiel u nisa evoluti għalkollox, jew fil-każ tal-effetti tat-test ta’ 10 ijiem fuq is-sopravivenza u l-piż tal-larvi. Jekk ma jkunx hemm indikazzjonijiet ta’ sensivitajiet differenti statistikament ta’ sessi, riżultati dwar irġiel u nisa jkunu jistgħu jinġabru għal analiżi ta’ statistika. Id-differenzi ta’ sensittività bejn is-sessi jistgħu jkunu ġġudikati statistikament pereżempju b’test ta’ tabella χ2-r x 2. Sopravivenza tal-larvi u l-medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent għandha tkun ikkalkulata wara 10 jiem meta jkun meħtieġ. 43. Konċentrazzjonijiet ta’ effetti espressi u bbażati fuq piż fin-niexef huma kkalkulati preferibbilment abbażi ta’ konċentrazzjonijiet ta’ sediment imkejla fil-bidu tat-test (ara l-pargrafu 38). 44. Biex tkun ikkomputata stima ta’ punti għall-EC50 jew għal kull ECx oħra, tista’ tintuża statistika għal kull reċipjent bħala replika vera. Biex ikun ikkalkulat intervall ta’ kunfidenza għal kull ECx għandha titqies il-varjabbiltà fost reċipjenti, jew għandu jintwera li din il-varjabbiltà tant tkun żgħira li tista’ ma titqisx. Meta l-mudell jitqiegħed minn Least Squares, għandha tkun applikata trasformazzjoni għall-istatistika għal kull reċipjent biex titjieb l-omoġeneità ta’ varjanza. Iżda, valuri ECx għandhom ikunu kkalkulati wara li r-rispons ikun ġie ttrasformat u ttieħed lura għall-valur oriġinali. 45. Meta l-analiżi ta’ statistika jkollha l-għan li tiddetermina NOEC/LOEC b’ittestjar ta’ ipoteżi, il-varjabbiltà fost reċipjenti jeħtiġilha titqies, eż. b’ANOVA f’aktar stadji. Alternattivament, aktar testijiet robusti (21) jistgħu jkunu adatti f’sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ksur tas-suppożizzjonijiet tas-soltu ta’ ANOVA. Proporzjon ta’ evoluzzjoni 46. Proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni huma dejta alternattiva mhux kontinwa, u jistgħu jkunu analizzati bit-test ta’ Cochran-Armitage applikat b’mod devoluttiv fejn tkun mistennija doża-rispons monotonika u din id-dejta tkun konsistenti ma’ din l-istennija. Jekk le, jistgħu jintużaw test eżatt ta’ Fisher jew dak ta’ Mantel-Haenszel b’valuri ‘p’ ta’ Bonferroni-Holm aġġustati. Jekk ikun hemm evidenza ta’ varjabbiltà akbar bejn replikati fl-istess konċentrazzjoni milli distribuzzjoni binomja tkun tindika (sikwit irriferuta bħala varjazzjoni “extrabinomja”), mbagħad għandhom jintużaw test robust ta’ Cochran-Armitage jew dak eżatt ta’ Fisher kif propost fi (21). L-għadd ta’ pappamoski evoluti għal kull reċipjent, ne, ikun iddeterminat u diviż bl-għadd ta’ larvi introdotti, na: fejn: ER = proporzjon ta’ evoluzzjoni ne = għadd ta’ pappamoski evoluti għal kull reċipjent na = għadd ta’ larvi introdotti għal kull reċipjent 47. Alternattiva li hija l-aktar adatta għal daqsijiet kbar ta’ kampjuni, meta jkun hemm varjanza extrabinomja, hija li l-proporzjon ta’ evoluzzjoni jkun ittrattat bħala rispons kontinwu u li jintużaw proċeduri bħat-test Williams meta tkun mistennija doża-rispons monotonika u tkun konsistenti ma’ din id-dejta ta’ ER. It-test Dunnett ikun adatt fejn il-monotoniċità ma tapplikax. Daqs kbir ta’ kampjun huwa ddefinit hawn bħala l-għadd evolut, u l-għadd mhux evolut ukoll ikun aktar minn ħamsa, abbażi ta’ kull replika (reċipjent). 48. Biex ikunu applikati metodi ta’ ANOVA, valuri ta’ ER għandhom l-ewwel ikunu ttrasformati bit-trasformazzjoni arcsin-sqrt jew bit-trasformazzjoni Freeman-Tukey biex tinkiseb distribuzzjoni normali approssimata u biex varjanzi jsiru ugwali. Jistgħu jkunu applikati t-testijiet Cochran-Armitage, dak eżatt ta’ Fisher (Bonferroni), jew it-test ta’ Mantel-Haenszel meta jintużaw il-frekwenzi assoluti. It-trasformazzjoni arcsin-sqrt tkun applikata billi jittieħed l-inverse sine (sin-1) tal-għerq kwadrat ta’ ER. 49. Għal proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni, valuri ECx ikunu kkalkulati billi tintuża analiżi ta’ rigressjoni (jew eż. probit (22), logit, Weibull, softwer kummerċjali adatt, eċċ.). Jekk analiżi ta’ rigressjoni tfalli (eż. meta jkun hemm anqas minn żewġ risponsi parzjali), jintużaw metodi mhux parametriċi oħra bħal medja mobbli jew interpolazzjoni sempliċi. Rata ta’ żvilupp 50. Il-ħin medju ta’ żvilupp jirrappreżenta t-tul medju ta’ żmien bejn id-dħul ta’ larvi (jum 0 tat-test) u l-evoluzzjoni tal-koorti sperimentali ta’ pappamoski. (Għall-kalkulazzjoni taż-żmien reali ta’ żvilupp, għandha titqies l-età tal-larvi fil-waqt tad-dħul). Ir-rata ta’ żvilupp hija r-reċiproka taż-żmien tal-iżvilupp (unità: 1/jum) u tirrappreżenta dik il-parti tal-iżvilupp tal-larva li sseħħ kuljum. Ir-rata ta’ żvilupp hija ppreferuta għall-evalwazzjoni ta’ dawn l-istudji dwar tossiċità ta’ sediment minħabba li l-varjanza tagħha hija aktar baxxa, u hija aktar omoġenja u eqreb distribuzzjoni normali kif imqabbla ma’ żmien ta’ żvilupp. Għalhekk, jistgħu jintużaw proċeduri ta’ test parametriku qawwija ma’ rata ta’ żvilupp milli ma’ żmien ta’ żvilupp. Għal rata ta’ żvilupp bħala reazzjoni kontinwa, jistgħu jkunu stmati valuri ECx billi tintuża analiżi ta’ rigressjoni (eż. (23), (24)). 51. Għat-testijiet ta’ statistika li ġejjin, l-għadd ta’ pappamoski osservati f’jum ta’ spezzjoni x ikunu preżunti li jkunu evolvew fil-medja tal-intervall ta’ żmien bejn jum x u jum x-l (l = tul tal-intervall ta’ spezzjoni, is-soltu jum 1). Ir-rata medja ta’ żvilupp għal kull reċipjent (x) tkun ikkalkulata skont: fejn: : rata medja ta’ żvilupp għal kull reċipjent i : indiċi ta’ intervall ta’ spezzjoni m : għadd massimu ta’ intervalli ta’ spezzjoni : għadd ta’ pappamoski evoluti fl-intervall ta’ spezzjoni i ne : għadd totali ta’ pappamoski evoluti fit-tmiem tal-esperiment (= ) xi : rata ta’ żvilupp tal-pappamoski evoluti f’intervall i fejn: dayi : jum ta’ spezzjoni (jiem minħabba applikazzjoni) li : tul ta’ intervall ta’ spezzjoni i (jiem, is-soltu jum wieħed) Rapport tat-test 52. Ir-rapport tat-test għandu mill-anqas jipprovdi l-informazzjoni li ġejja: Sustanza għall-ittestjar: — natura fiżika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fiżikokimiċi (solubilità tal-ilma, pressjoni tal-fwar, koeffiċjent tal-partizzjoni fil-ħamrija (jew fis-sediment jekk ikunu disponibbli), stabbiltà fl-ilma, eċċ.); — dejta ta’ identifikazzjoni ta’ kimiċi (isem komuni, isem tal-kimika, formula strutturali, Numru tal-CAS, eċċ.) inklużi l-purezza u l-metodu għall-kwantifikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar. Speċi tat-test: — annimali użati għat-test: speċi, isem xjentifiku, sors ta’ organiżmi u kondizzjonijiet għat-trobbija; — informazzjoni dwar maniġġar ta’ kwantitajiet ta’ bajd u larvi; — l-età tal-annimali tat-test meta jkunu ddaħħlu fir-reċipjenti tat-test. Kondizzjonijiet tat-test: — sediment użat, jiġifieri sediment naturali jew formulat; — għal sediment naturali, post u deskrizzjoni ta’ sit ta’ teħid ta’ kampjuni ta’ sediment, inkluża, jekk ikun possibbli, storja ta’ kontaminazzjoni; karatteristiċi: pH, kontenut ta’ karbonju organiku, proporzjon ta’ C/N u granulumetrija (skont kif jixraq). — tħejjija tas-sediment formulat: ingredjenti u karatteristiċi (kontenut ta’ karbonju organiku, pH, rtubija, eċċ. fil-bidu tat-test); — tħejjija tal-ilma tat-test (jekk jintuża ilma rikostitwit) u karatteristiċi (konċentrazzjoni tal-ossiġnu, pH, konduttività, melħ minerali fl-ilma, eċċ. fil-bidu tat-test); — fond tas-sediment u ilma ta’ fuq; — volum tal-ilma ta’ fuq u tal-pori; piż ta’ sediment imxarrab bi jew mingħajr ilma tal-pori; — reċipjenti tat-test (materjal u daqs); — metodu ta’ fortifikazzjoni ta’ sediment: konċentrazzjonijiet ta’ testijiet użati, għadd ta’ replikati u użu ta’ solvent jekk ikun hemm; — fażi ta’ ekwilibriju ta’ stabbilizzazzjoni tas-sistema ta’ sediment-ilma fortifikata: durata u kondizzjonijiet; — kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni: temperatura, ċiklu ta’ dawl u intensità, tirwiħ (frekwenza u intensità); — informazzjoni dettaljata dwar għalf inkluż tip ta’ ikel, tħejjija, ammont u reġim ta’ għalf. Riżultati: — il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-konċentrazzjonijiet imkejla tat-testijiet u r-riżultati tal-analizi kollha biex tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar fir-reċipjent tat-test; — il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test, jiġifieri pH, temperatura, ossiġnu maħlul, melħ minerali fl-ilma u ammonja; — bdil ta’ ilma evaporat tat-test, jekk ikun hemm; — għadd ta’ pappamoski evoluti rġiel u nisa għal kull reċipjent u għal kull jum; — għadd ta’ larvi li jkunu naqsu li jevolvu bħala pappamoski għal kull reċipjent; — medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent, u għal kull fażi, skont il-każ; — perċentwali ta’ evoluzzjoni għal kull replika u konċentrazzjoni tat-test (pappamoski rġiel u nisa miġburin flimkien); — rata medja ta’ żvilupp ta’ pappamoski żviluppati għalkollox għal kull replika u rata ta’ trattament (pappamoski rġiel u nisa miġburin flimkien); — stimi ta’ punti ta’ tmiem tossiċi eż. ECx (u intervalli assoċjati ta’ kunfidenza), NOEC u/jew LOEC, u l-metodi ta’ statistika użati għad-determinazzjoni tagħhom; — diskussjoni tar-riżultati, inkluża kull influwenza fuq il-konklużjonijiet tar-riżultati tat-testijiet minn devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta’ Ttestjar. LETTERATURA: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke u H.Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Kanada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ u Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Kanada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Kanada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Test Method C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. (15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a żero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a żero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendiċi 1 DEFINIZZJONIJIET Għall-fini ta’dan il-Metodu ta’ Ttestjar jintużaw id-definizzjonijiet li ġejjin: Sediment ifformulat jew sediment rikostitwit, artifiċjali jew sintetiku, huwa taħlita ta’ materjali li jintużaw biex jimitaw l-komponenti fiżiċi ta’ sediment naturali. Ilma ta’ fuq huwa l-ilma li jitqiegħed fuq sediment fir-reċipjent tat-test. Ilma interstizjali jew ilma tal-pori huwa l-ilma li jokkupa l-ispazju bejn sediment u partiċelli tal-ħamrija. Sediment fortifikat huwa sediment li miegħu tkun żdiedet sustanza għall-ittestjar. Kimika għall-ittestjar: Kull sustanza jew taħlita ttestjata billi jintuża dan il-Metodu ta’ Ttestjar. Appendiċi 2 Rakkomandazzjonijiet għal kultura ta’ Chironomus riparius 1. Larvi ta’ Chironomus jistgħu jitkabbru f’dixxijiet ta’ kristallizzazzjoni jew f’kontenituri akbar. Ramel fin tal-quartz jitferrex f’saff irqiq ta’ madwar 5 as 10 mm fond fuq il-qiegħ tal-kontenitur. Kieselguhr (eż. Merck, Art 8117) ukoll intwera li huwa substrat adatt (saff irqaq ta’ sa ftit ħafna mm ikun biżżejjed). Wara jiżdied ilma adattat għal fond ta’ diversi cm. Il-livelli tal-ilma għandhom jimtlew kull meta huwa meħtieġ biex jieħdu post it-telf li jirriżulta mill-evaporazzjoni, u jkun ta’ repevenzjoni kontra d-dessekazzjoni. L-ilma jista’ jinbidel jekk ikun meħtieġ. Għandu jkun ipprovdut tirwiħ bil-mod. Ir-reċipjenti għat-tkabbir tal-larvi għandhom jinżammu f’gaġġa apposta li ma tħallix li l-adulti li jkunu qed jevolvu jaħarbu. Il-gaġġa għandha tkun kbira biżżejjed biex adulti evoluti ma jitħallewx jimirħu fi qtajja kbar, għax inkella tista’ ma ssirx kopulazzjoni (il-minimu huwa ta’ madwar 30 x 30 x 30 cm). 2. Gaġeġ għandhom jinżammu f’temperatura ambjentali jew f’kamra ambjentalment kostanti ta’ 20 + 2 °C b’perjodu fotografiku ta’ 16-il siegħa dawl (intensità madwar 1 000 lux), 8 sigħat dlam. Kien irrapportat li umdità tal-arja ta’ anqas minn 60 % RH tista’ tfixkel ir-riproduzzjoni. Ilma ta’ dilwizzjoni 3. Jista’ jintuża kull ilma tajjeb naturali jew sintetiku. Komunement jintużaw ilma tal-bir, ilma tal-vit li jkun tneħħielu l-kloru u midja artifiċjali (eż. il-midjum Elendt “M4” jew “M7”, ara hawn taħt). L-ilma għandu jitrewwaħ qabel ma jintuża. Jekk ikun meħtieġ, l-ilma tal-kultura jista’ jiġġedded billi l-ilma użat jitferra’ jew jgħaddi minn ġo sifun minn reċipjenti ta’ kultura b’attenzjoni mingħajr ma jinqerdu t-tubi tal-larvi. Tmigħ tal-larvi 4. Larvi ta’ Chironomus għandhom jintemgħu ikel ta’ trofof tal-ħut (TetraMin®, TetraPhyll® jew marka simili oħra ta’ ikel tal-ħut proprjetarju), f’bejn wieħed u ieħor 250 mg għal kull reċipjent kuljum. Dan jista’ jingħata bħala trab mitħun niexef jew bħala sospensjoni fl-ilma: 1,0 g ta’ ikel ta’ trofof jiżdied ma’ 20 ml ta’ ilma ta’ dilwizzjoni u jitħallat biex jagħti taħlita omoġenja. Din it-tħejjija tista’ tintema’ f’rata ta’ madwar 5 ml għal kull reċipjent kuljum (ixxejkja qabel ma tuża). Larvi li jkollhom aktar żmien jistgħu jirċievu aktar. 5. It-tmigħ jista’ jiġi aġġustat skont il-kwalità tal-ilma. Jekk il-midjum ta’ kultura ‘jissaħħab’, it-tmigħ għandu jitnaqqas. Żidiet ta’ ikel għandhom ikunu mmonitorjati b’attenzjoni. Ikel mill-anqas jikkawża tluq tal-larvi lejn il-kolonna tal-ilma, u ħafna ikel jikkawża aktar attività mikrobika u konċentrazzjonijiet tal-ossiġnu mnaqqsin. Iż-żewġ kondizzjonijiet jistgħu jġibu magħhom rati ta’ tkabbir imnaqqas. 6. Xi ċelluli ta’ alka ħadra (eż. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) jistgħu wkoll jiżdiedu meta jitqiegħdu f’reċipjenti ġodda ta’ kultura. Tmigħ ta’ adulti evoluti 7. Xi wħud minn dawk li jagħmlu esperimenti ssuġġerew li kuxxinett tat-tajjar mgħaddas f’soluzzjoni saturata tas-sukrożju jista’ jservi ta’ ikel għal adulti evoluti. Emerġenza 8. F’20 + 2 °C adulti jibdew jevolvu mir-reċipjenti għat-tkabbir tal-larvi wara bejn wieħed u ieħor 13 - 15-il jum. L-irġiel jintgħarfu malajr għax ikollhom antenni kollha pjumi. Kwantitajiet ta’ bajd 9. Malli l-adulti jkunu fil-gaġġa tat-trobbija, ir-reċipjenti kollha għat-tkabbir tal-larvi għandhom ikunu eżaminati tliet darbiet fil-ġimgħa għal tqegħid ta’ kwantitajiet ta’ bajd qisu ġelatina. Jekk ikun hemm, il-kwantitajiet ta’ bajd għandhom jitneħħew b’attenzjoni. Il-bajd għandu jkun ittrasferit għal ġo dixx żgħir li jkun fih kampjun tal-ilma tat-trobbija. Kwantitajiet ta’ bajd jintużaw biex jinbeda reċipjent ġdid ta’ kultura (eż. 2 - 4 kwantitajiet ta’ bajd/reċipjent) jew biex jintużaw għal testijiet tat-tossiċità. 10. Larvi tal-ewwel fażi għandhom ifaqqsu wara 2 - 3 ijiem. Reċipjenti ġodda ta’ kultura 11. Malli jkunu stabbiliti kulturi għandu jkun possibbli li jitqiegħed reċipjent ġdid ta’ kultura tal-larvi kull ġimgħa jew anqas ta’ spiss skont ħtiġijiet ta’ ttestjar, billi jitneħħew ir-reċipjenti aktar qodma wara li jkunu evolvew pappamoski adulti. Bl-użu ta’ din is-sistema jkun hemm provvista regolari ta’ adulti b’anqas maniġġar. Tħejjija ta’ soluzzjonijiet tat-testijiet “M4” and “M7” 12. Elendt (1990) iddeskriva l-midjum “M4”. Il-midjum “M7” jitħejja bħala l-midjum “M4” ħlief għas-sustanzi indikati fit-Tabella 1, li għalihom konċentrazzjonijiet ikunu erba’ darbiet aktar baxxi f’“M7” milli f’“M4”. Qed titħejja pubblikazzjoni dwar il-midjum “M7” (Elendt, komunikazzjoni personali). Is-soluzzjoni tat-test ma għandhiex tkun ippreparata skont Elendt u Bias (1990) għall-konċentrazzjonijiet ta’ NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 u K2HPO4 mogħtija għall-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet stokk mhumiex adegwati. Tħejjija tal-midjum “M7” 13. Kull soluzzjoni ta’ stokkijiet (I) titħejja waħda waħda u soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien (II) titħejja minn dawn is-soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) (ara Tabella 1). Ħamsin ml mis-soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien (II) u l-ammonti ta’ kull soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ makronutrijenti li jidhru fit-Tabella 2 ikunu 1 litru ta’ ilma dejonizzat biex jitħejja l-midjum “M7”. Titħejja soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini billi jiżdiedu tliet vitamini mal-ilma dejonizzat kif indikat fit-Tabella 3, u jiżdied 0,1 ml tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien ta’ vitamini mal-midjum “M7” finali ftit qabel ma jintuża. (Is-soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini tinħażen iffriżata f’alikwoti żgħar). Il-midjum jitrewwaħ u jkun stabbilizzat. LETTERATURA: BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Tabella 1 Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ mikroelementi għall-midjum M4 u M7 Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) Ammont (mg) magħmul minn sa 1 litru ta’ ilma dejonizzat Biex tħejji s-soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien (II): ħallat l-ammonti li ġejjin (ml) ta’ soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) u agħmel sa 1 litru ta’ ilma dejonizzat Konċentrazzjonijiet finali f’soluzzjonijiet tat-testijiet (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (8) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (8) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (8) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (8) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (8) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (8) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (8) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (8) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (8) (9) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (8) (9) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabella 2 Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ makronutrijenti għall-midjum M4 u M7 Ammont magħmul minn sa 1 litru ta’ ilma dejonizzat (mg) Ammont ta’ soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ makronutrijenti miżjudin biex jitħejja midjum M4 and M7 (ml/l) Konċentrazzjonijiet finali f’soluzzjonijiet tat-testijiet M4 u M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabella 3 Soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini għall-midjum M4 u M7. It-tliet soluzzjonijiet kollha ta’ vitamini jingħaqdu flimkien biex jagħmlu soluzzjoni waħda ta’ stokkijiet ta’ vitamini. Ammont magħmul minn sa 1 litru ta’ ilma dejonizzat (mg) Ammont ta’ soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini miżjudin biex jitħejja midjum M4 u M7 (ml/l) Konċentrazzjonijiet finali f’soluzzjonijiet tat-testijiet M4 u M7 (mg/l) Kloridrat tat-tijamina 750 0,1 0,075 Ċjanokobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Bijotina 7,5 0,1 0,00075 LETTERATURA Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Appendiċi 3 TĦEJJIJA TA’ SEDIMENT FORMULAT Kompożizzjoni tas-sediment Il-kompożizzjoni tas-sediment formulat għandha tkun kif ġej: Kostitwent Karatteristiċi % ta’ sediment piż fin-niexef Pit Pit ta’ ħażiż Sphagnum, qrib kemm jista’ jkun ta’ pH 5,5-6,0 mingħajr ma tibqa’ tidher il-pjanta, mitħun fin (partiċelli ta’ daqs ≤ 1 mm) u mnixxef bl-arja 4 - 5 Ramel tal-quartz Daqs ta’ ramla: > 50 % tal-partiċelli għandhom ikunu fil-firxa ta’ 50-200 μm 75 - 76 Tafal tal-kawlina Kontenut ta’ kawlina ≥ 30 % 20 Karbonju organiku Aġġustat biż-żieda ta’ pit u ramel 2 (± 0,5) Karbonat tal-kalċju CaCO3,pulverizzat, kemikament pur 0,05 - 0,1 Ilma Konduttività ≤ 10 μS/cm 30 - 50 Tħejjija Il-pit jitnixxef bl-arja u jintaħan fi trab fin. Titħejja sospensjoni tal-ammont meħtieġ ta’ trab tal-pit f’ilma dejonizzat billi jintuża apparat ta’ omoġeneizzazzjoni ta’ prestazzjoni għolja. Il-pH ta’ din is-sospensjoni jiġi aġġustat sa 5,5 ± 0,5 b’CaCO3. Is-sospensjoni tiġi kkondizzjonata għal mill-anqas jumejn billi titħawwad bil-mod f’20 ± 2 °C, biex il-pH isir stabbli u jistabbilixxi komponent mikrobiku stabbli. Il-pH jerġa’ jitkejjel u għandu jkun 6,0 ± 0,5. Mbagħad is-sospensjoni tal-pit titħallat mal-kostitwenti l-oħra (ramel u tafal tal-kawlina) u ma’ ilma dejonizzat biex jinkiseb sediment omoġenju b’kontenut ta’ ilma f’firxa ta’ 30-50 % tal-piż fin-niexef tas-sediment. Il-pH tat-taħlita finali jerġa’ jitkejjel għal darb’oħra u jiġi aġġustat għal 6,5 sa 7,5 b’CaCO3 jekk ikun meħtieġ. Jittieħdu kampjuni tas-sediment biex ikun iddeterminat il-piż fin-niexef u l-kontenut ta’ karbonju organiku. Mbagħad, qabel ma jintuża fit-test tat-tossiċità tal-kironomidi, huwa rrakkomandat li s-sediment formulat ikun ikkondizzjonat għal sebat ijiem taħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test sussegwenti. Ħżin Il-kostitwenti nixfin għat-tħejjija tas-sediment artifiċjali jistgħu jinħażnu f’post niexef u frisk f’temperatura ambjentali. Is-sediment formulat (mxarrab) m’għandux jinħażen qabel ma jsir użu minnu fit-test. Għandu jintuża minnufih wara l-perjodu ta’ kondizzjonament ta’ 7 ijiem li jtemm it-tħejjija tiegħu. LETTERATURA: Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness. Tossiċità għal Ħniex. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Appendiċi 4 Karatteristiċi kimiċi ta’ ilma ta’ dilwizzjoni aċċettbbli Sustanza Konċentrazzjonijiet Materja partikulata < 20 mg/l Karbonju organiku totali < 2 mg/l Ammonja mhux jonizzata < 1 μg/l Ebusija bħala CaCO3 < 400 mg/l (***) Kloru residwali < 10 μg/l Pestiċidi organofosforużi totali < 50 ng/l Pestiċidi organokloriċi totali flimkien ma’ poliklorobifenili < 50 ng/l Kloru organiku totali < 25 ng/l Appendiċi 5 Gwida għall-monitoraġġ tal-evoluzzjoni ta’ larvi kironomidi Sifuni ta’ evoluzzjoni jitqiegħdu fuq il-bekkijiet tat-test. Dawn is-sifuni jkunu meħtieġa mill-20 jum sa meta jintemm it-test. Eżempju ta’ sifun li jintuża huwa pinġut hawn taħt: C. 28. TEST TAT-TOSSIĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ SEDIMENT-ILMA BL-UŻU TA’ ILMA FORTIFIKAT DAĦLA 1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti għat-TG tal-OECD 219 (2004). Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal biex jivvaluta l-effetti ta’ espożizzjoni prolongata tal-kimiċi għal-larva li tgħix fis-sediment tad-dipteran tal-ilma ħelu Chironomus sp. Huwa primarjament ibbażat fuq il-linja gwida BBA li tuża sistema tat-test sediment-ilma bil-ħamrija artifiċjali, u x-xenarju ta’ espożizzjoni tal-kolonna tal-ilma (1). Iqis ukoll protokolli eżistenti ta’ testijiet tat-tossiċità għal Chironomus riparius u Chironomus tentans li kienu żviluppati fl-Ewropa u fl-Amerika ta’ Fuq (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) u kienu ring-tested (1)(6)(9). Jistgħu jintużaw ukoll speċijiet oħra ta’ kironomidi iddokumentati sewwa, eż. Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Ix-xenarju ta’ espożizzjoni użat f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ta’ ilma fortifikat. L-għażla tax-xenarju adatt ta’ espożizzjoni tiddependi mill-applikazzjoni maħsuba tat-test. Ix-xenarju ta’ espożizzjoni għall-ilma, li jinvolvi kolonna fortifikata ta’ ilma, huwa maħsub li jkun jixbah sprej ta’ pestiċidi meta jgħaddi mal-kurrent, u jkopri l-konċentrazzjonijiet meta fil-bidu jilħqu l-aqwa tagħhom f’ilma tal-pori. Huwa wkoll utli għal tipi oħra ta’ espożizzjoni (inkluż tixrid kimiku) ħlief għal proċessi ta’ akkumulazzjoni li jdumu aktar mill-perjodu tat-test. 3. Sustanzi li jeħtiġilhom ikunu ttestjati għal organiżmi li jgħixu f’sediment is-soltu jippersistu f’dan il-kompartiment tul perjodi twal ta’ żmien. L-organiżmi li jgħixu f’sediment jistgħu jkunu esposti permezz ta’ għadd ta’ rotot. L-importanza relattiva ta’ kull rotta ta’ espożizzjoni u taż-żmien meħud għal kull waħda biex tikkontribwixxi għall-effetti tossiċi globali, tiddependi mill-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-kimika konċernata. Għal sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log Kow > 5) jew għal sustanzi magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-inġestjoni ta’ ikel kontaminat tista’ tkun rotta sinifikanti ta’ espożizzjoni. Biex it-tossiċità ta’ sustanzi lipofiliċi ħafna ma tkunx sottovalutata, jista’ jitqies l-użu ta’ ikel miżjud mas-sediment qabel l-applikazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar. Biex jittieħdu r-rotot potenzjali kollha ta’ espożizzjoni l-fokus ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar ikun fuq espożizzjoni fit-tul. It-testijiet idumu madwar 20 - 28 jum għal C. riparius u C. yoshimatsui, u 28 - 65 jum għal C. tentans. Jekk tkun meħtieġa dejta għal żmien qasir għal għan speċifiku, pereżempju biex ikunu mistħarrġa l-effetti ta’ kimiċi instabbli, replikati addizzjonali jistgħu jitneħħew wara perjodu ta’ għaxart ijiem. 4. Il-punti ta’ tmiem imkejla huma l-għadd totali ta’ adulti li jkunu evolvew u ż-żmien li jkunu ħadu biex evolvew. Huwa rrakkomandat li l-kejl tas-sopravivenza u tat-tkabbir tal-larvi għandu jsir biss wara perjodu ta’ għaxart ijiem jekk tkun meħtieġa dejta addizzonali għal żmien qasir, billi jintużaw replikati addizzjonali skont il-każ. 5. Huwa rrakkomandat l-użu ta’ sediment formulat. Sediment formulat għandu diversi vantaġġi fuq sedimenti naturali: — il-varjabbiltà sperimentali titnaqqas minħabba li jifforma “matriċi standardizzata” riproduċibbli u l-ħtieġa li jinstabu sorsi ta’ sediment mhux kontaminati u nodfa tkun eliminata; — it-testijiet jistgħu jibdew f’kull żmien mingħajr ma jkun hemm varjabbiltà staġonali fis-sediment tat-test u ma jkunx hemm ħtieġa li s-sediment ikun ittrattat minn qabel biex titneħħa fawna indiġena; l-użu ta’ sediment formulat inaqqas ukoll l-ispiża b’rabta mal-ġabra mill-post ta’ ammonti suffiċjenti ta’ sediment għal testijiet ta’ rutina; — l-użu ta’ sediment formulat jippermetti li jsiru tqabbiliet ta’ tossiċità u gradazzjoni ta’ sustanzi b’dan il-mod: dejta dwar tossiċità minn testijiet b’sediment naturali u artifiċjali kienet komparabbli għal diversi kimiċi (2). 6. Definizzjonijiet użati jingħataw fl-Appendiċi 1. PRINĊIPJU TAT-TEST 7. L-ewwel fażi ta’ larvi kironomidi jkunu esposti għal firxa ta’ konċentrazzjoni tal-kimika għall-ittestjar f’sistemi ta’ sediment-ilma. It-test jibda billi l-larvi tal-ewwel fażi jitqiegħdu fil-bekkijiet tat-test li jkun fihom is-sistema ta’ sediment-ilma u sussegwentement is-sustanza għall-ittestjar tiġi ffortifikata mal-ilma. Ir-rata ta’ evoluzzjoni u żvilupp ta’ kironomidi titkejjel fit-tmiem tat-test. Is-sopravivenza u l-piż tal-larvi jistgħu jitkejlu wkoll wara 10 ijiem jekk ikun meħtieġ (billi jintużaw replikati addizzjonali skont kif ikun xieraq). Din id-dejta tkun analizzata jew billi jintuża mudell ta’ rigressjoni biex tkun stmata l-konċentrazzjoni li għandha tikkawża x % tnaqqis fl-evoluzzjoni, fis-sopravivenza jew fit-tkabbir tal-larvi (eż. EC15, EC50, eċċ.), jew billi jintuża ttestjar ta’ ipoteżi ta’ statistika biex ikun iddeterminat NOEC/LOEC. Dan tal-aħħar ikun jeħtieġlu tqabbil ta’ valuri ta’ effett ma’ valuri ta’ kontroll billi jintużaw testijiet ta’ statistika. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA GĦALL-ITTESTJAR 8. Is-solubilità fl-ilma tas-sustanza għall-ittestjar, il-pressjoni tal-fwar tagħha, il-partizzjoni mkejla jew ikkalkulata f’sediment u l-istabbiltà fl-ilma u fis-sediment għandhom ikun magħrufin. Għandu jkun disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar f’ilma ta’ fuq, f’ilma tal-pori u f’sediment b’akkuratezza magħrufa u rrapportata u b’limitu ta’ detezzjoni. Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali u l-purezza tas-sustanza għall-ittestjar. Dak li jiġrilha kimikament is-sustanza għall-ittestjar (eż. tixrid, degradazzjoni abijotika u bijotika, eċċ.) ukoll huwa informazzjoni utli. Aktar gwida għall-ittestjar ta’ sustanzi bi proprjetajiet fiżikokimiċi li jagħmluha diffiċli għalihom li jsirilhom it-test tingħata fi (12). KIMIĊI TA’ REFERENZA 9. Kimiċi ta’ referenza jistgħu jkunu ttestjati perjodikament bħala mezz li jiżgura li l-protokoll tat-test u l-kondizzjonijiet tat-test ikunu affidabbli. Eżempji ta’ sustanzi tossiċi ta’ referenza użati b’suċċess f’ring-tests u fi studji ta’ validazzjoni huma: lindane, trifluralin, pentaklorofenol, klorur tal-kamdju u klorur tal-potassju. (1)(2)(5)(6)(13). VALIDITÀ TAT-TEST 10. Biex it-test ikun validu japplikaw il-kondizzjonijiet li ġejjin: — l-evoluzzjoni fil-kontrolli għandha tkun mill-anqas 70 % fit-tmiem tat-test. (1)(6); — l-evoluzzjoni ta’ C. riparius u C. yoshimatsui għal adulti minn reċipjenti ta’ kontroll għandha sseħħ bejn 12 u 23 jum wara li jkunu ddaħħlu fir-reċipjenti; għal C. tentans, ikun meħtieġ perjodu ta’ 20 sa 65 jum. — fit-tmiem tat-test, il-pH u l-konċentrazzjoni tal-ossiġnu maħlul għandhom jitkejlu f’kull reċipjent. Il-konċentrazzjoni tal-ossiġnu għandha tkun mill-anqas 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV) fit-temperatura użata, u l-pH tal-ilma ta’ fuq għandu jkun fil-firxa ta’ 6-9 fir-reċipjenti kollha tal-ittestjar; — it-temperatura tal-ilma mhux suppost tkun differenti b’iktar minn ± 1,0 °C. It-temperatura tal-ilma tista’ tkun ikkontrollata b’kamra iżotermika u f’dak il-każ it-temperatura tal-kamra għandha tkun ikkonfermata f’intervall xierqa ta’ ħin. DESKRIZZJONI TAL-METODU Reċipjenti tat-test 11. L-istudju jitmexxa f’bekkijiet tal-ħġieġ ta’ 600 ml b’dijametru qies ta’ 8 cm. Reċipjenti oħra jkunu tajbin, iżda għandhom jiggarantixxu fond sewwa tal-ilma ta’ fuq u tas-sediment. Il-wiċċ tas-sediment għandu jkun suffiċjenti biex jipprovdi 2 sa 3 cm2 għal kull larva. Il-proporzjon tal-fond tas-saff tas-sediment mal-fond tal-ilma ta’ fuq għandu jkun 1:4. Reċipjenti tat-test u apparat ieħor li jiġu f’kuntatt mas-sistema ta’ ttestjar għandhom ikunu magħmulin kollha mill-ħġieġ jew minn materjal ieħor kimikament inerti (eż. Teflon). Għażla ta’ speċi 12. L-ispeċi li għandha tintuża fit-test preferibbilment hija Chironomus riparius. Chironomus tentans hija adatta wkoll iżda aktar diffiċli biex tkun ittrattata u jeħtiġilha perjodu itwal ta’ test. Tista’ tintuża wkoll Chironomus yohimatsui. Dettalji ta’ metodi ta’ kultura jingħataw fl-Appendiċi 2 għal Chironomus riparius. Informazzjoni dwar kondizzjonijiet ta’ kultura hija wkoll disponibbli għal speċijiet oħra, jiġifieri għal Chironomus tentans (4) u Chironomus yoshimatsui (11). L-identifikazzjoni ta’ speċijiet għandha tkun ikkonfermata qabel l-ittestjar iżda ma tkunx meħtieġa qabel kull test jekk organiżmi jkunu ġejjin minn kultura interna. Sediment 13. Preferibbilment għandu jintuża sediment formulat (msejjaħ ukoll sediment rikostitwit, artifiċjali jew sintetiku). Iżda, jekk jintuża sediment naturali, dan għandu jkun ikkaratterizzat (huma wkoll irrakkomandati mill-anqas pH, kontenut ta’ karbonju organiku, determinazzjoni ta’ parametri oħra bħal proporzjon ta’ C/N u granulumetrija), u għandu jkun ħieles minn kull kontaminazzjoni u organiżmi oħra li jistgħu jikkompetu ma’, jew jikkunsmaw lill-kironomidi. Huwa wkoll irrakkomandat li, qabel ma jintuża f’test tat-tossiċità tal-kironomidi, is-sediment naturali jkun ikkondizzjonat għal sebat ijiem taħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test sussegwenti. Huwa rrakkomandat li f’dan it-test jintuża s-sediment formulat li ġej, ibbażat fuq il-ħamrija artifiċjali użata fil-Metodu ta’ Ttestjar C.8 (14) (1)(15)(16): (a) 4-5 % pit (piż fin-niexef): qrib kemm jista’ jkun pH 5,5 sa 6,0; huwa importanti li jintuża pit f’għamla ta’ trab, mitħun fin (partiċelli ta’ daqs ≤ 1 mm) u mnixxef bl-arja biss. (b) 20 % tafal tal-kawlina (piż fin-niexef) (kontenut ta’ kawlina preferibbilment aktar minn 30 %). (c) 75-76 % ramel tal-quartz (piż fin-niexef) (għandu jippredomina ramel fin b’aktar minn 50 % tal-partiċelli bejn 50 u 200 μm). (d) jiżdied ilma dejonizzat biex jinkiseb kontenut ta’ rtuba tat-taħlita finali f’firxa ta’ 30 - 50 %. (e) Karbonat tal-kalċju ta’ kwalità kemikament pura (CaCO3) jiżdied, aġġusta l-pH tat-taħlita finali tas-sediment għal 7,0 ± 0,5. (f) Il-kontenut ta’ karbonju organiku tat-taħlita finali għandu jkun 2 % (± 0,5 %) u għandu jkun aġġustat b’ammonti xierqa ta’ pit u ramel, skont (a) u (c). 14. Is-sors tal-pit, tafal tal-kawlina u ramel għandha tkun magħrufa. Il-komponenti tas-sediment għandhom ikunu eżaminati għan-nuqqas ta’ kontaminazzjoni kimika (eż. metalli tqal, komposti tal-organokloru, komposti organofosforużi, eċċ.). Eżempju għat-tħejjija tas-sediment formulat huwa deskritt fl-Appendiċi 3. It-taħlit ta’ kostitwenti nixfin ikun ukoll aċċettabbli jekk jintwera li wara li jkun żdied l-ilma ta’ fuq ma sseħħx separazzjoni tal-kostitwenti tas-sediment (eż. biċċiet tal-pit fil-wiċċ tal-ilma), u li l-pit jew is-sediment ikunu kkondizzjonati b’mod suffiċjenti. Ilma 15. Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristiċi kimiċi ta’ ilma dilwit b’mod aċċettabbli kif elenkat fl-Appendiċijiet 2 u 4 ikun tajjeb bħala ilma tat-test. Kull ilma tajjeb, ilma naturali (ilma tal-wiċċ jew ta’ taħt l-art), ilma rikostitwit (ara l-Appendiċi 2) jew ilma tal-vit li jkun tneħħielu l-kloru jkun aċċettabbli bħala ilma ta’ kultura u ilma tat-test jekk kironomidi jibqgħu jgħixu fih sakemm idumu l-kultura u t-testjar mingħajr ma juru sinjal ta’ stress. Fil-bidu tat-test, il-pH tal-ilma tat-test għandu jkun bejn 6 u 9 u t-total ta’ melħ minerali fl-ilma ma jkunx ogħla minn 400 mg/l bħala CaCO3. Iżda, jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-melħ minerali fl-ilma u s-sustanza għall-ittestjar, għandu jintuża ilma b’anqas melħ minerali (u għalhekk, m’għandux jintuża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni). Għandu jintuża l-istess tip ta’ ilma tul l-istudju kollu. Il-karatteristiċi tal-kwalità tal-ilma elenkati fl-Appendiċi 4 għandhom jitkejlu mill-anqas darbtejn fis-sena jew meta jkun hemm suspett li dawn il-karatteristiċi jkunu setgħu nbidlu b’mod sinifikanti. Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet - Ilma fortifikat 16. Konċentrazzjonijiet ta’ testijiet ikunu kkalkulati abbażi ta’ konċentrazzjonijiet ta’ kolonni ta’ ilma, jiġifieri tal-ilma ta’ fuq is-sediment. Soluzzjonijiet tat-testijiet tal-konċentrazzjoni magħżula s-soltu jitħejjew b’dilwizzjoni ta’ soluzzjoni ta’ stokkijiet. Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet għandhom preferibbilment jitħejjew billi s-sustanza għall-ittestjar tinħall fil-midjum għall-ittestjar. F’xi każijiet jista’ jkun meħtieġ l-użu ta’ solventi jew aġenti ta’ tixrid biex tkun prodotta soluzzjoni ta’ stokkijiet konċentrata b’mod adatt. Eżempji ta’ solventi adatti huma aċetun, etanol, metanol, etere monoelitiku tal-glikol tal-etilen, etere tad-dimentil tal-glikol tal-etilen, formamidi tad-dimentil u glikol tat-trietilen. Aġenti ta’ tixrid li jistgħu jintużaw huma Cremophor RH40, Tween 80, ċelluloża tal-metil 0,01 % u HCO-40. Il-konċentrazzjoni ta’ aġent ta’ solubilità fil-midjum tal-ittestjar finali għandu jkun minimali (i.e. ≤ 0.,1 ml/l) u għandu jkun l-istess fit-trattamenti kollha. Meta jintuża aġent ta’ solubilità, m’għandux ikollu effetti sinifikanti fuq sopravivenza jew effett ħażin viżibbli fuq il-larvi kironomidi kif ikun żvelat minn kontroll ta’ solventi biss. Iżda għandu jsir kull sforz biex l-użu ta’ dawn il-materjali jkun evitat. DISINN TAT-TEST 17. Id-disinn tat-test jirrelata mal-għażla tal-għadd u l-ispazjar tal-konċentrazzjonijiet tat-testijiet, mal-għadd ta’ reċipjenti għal kull konċentrazzjoni u mal-għadd ta’ larvi għal kull reċipjent. Huma deskritti disinji għal stima ta’ punti ta’ EC, għal stima ta’ NOEC u biex jitmexxa test ta’ limitu. L-analiżi b’rigressjoni hija ppreferuta mill-approċċ ta’ ttestjar ta’ ipoteżi. Disinn għal analiżi b’rigressjoni 18. Il-konċentrazzjoni ta’ effetti (eż. EC15, EC50) u l-firxa ta’ konċentrazzjonijiet, li għalihom l-effett tas-sustanza għall-ittestjar hija ta’ interess, għandhom jingħaqdu bil-konċentrazzjonijiet inklużi fit-test. Ġeneralment, l-akkuratezza u l-aktar il-validità, li bihom ikunu jistgħu jsiru stimi ta’ konċentrazzjonijiet ta’ effetti (ECx), titjieb meta l-konċentrazzjoni ta’ effetti tkun fil-firxa ta’ konċentrazzjonijiet ittestjati. Estrapolazzjoni ħafna taħt il-konċentrazzjoni pożittiva l-aktar baxxa jew ‘il fuq mill-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun evitata. Test preliminari biex jinstabu firxiet ikun utli biex tintgħażel il-firxa ta’ konċentrazzjonijiet li jkollhom jintużaw (ara l-paragrafu 27)). 19. Jekk għandu jkun stmat ECx, għandhom ikunu ttestjati mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet u tliet replikati għal kull konċentrazzjoni. Fi kwalunkwe każ, huwa rrakkomandat li jintużaw konċentrazzjonijiet suffiċjenti ta’ testijiet biex titħalla ssir stima tajba ta’ mudell. Il-fattur bejn konċentrazzjonijiet m’għandux ikun akbar minn tnejn (tista’ ssir eċċezzjoni f’każijiet meta l-kurva ta’ rispons għad-doża jkollha anglu baxx). L-għadd ta’ replikati f’kull trattament jista’ jitnaqqas jekk l-għadd ta’ konċentrazzjonijiet tat-test b’risponsi differenti jiżdied. Iż-żieda fl-għadd ta’ replikati jew it-tnaqqis fit-tul tal-intervalli tal-konċentrazzjoni tat-test jittendu li jwasslu għal intervall idjaq ta’ kunfidenza għat-test. Ikunu meħtieġa replikati addizzjonali jekk għandhom ikunu stmati s-sopravivenza u t-tkabbir tal-larvi għal 10-ijiem. Disinn għal stima ta’ NOEC/LOEC 20. Jekk għandhom ikunu stmati LOEC jew NOEC, għandhom jintużaw ħames konċentrazzjonijiet tat-test b’mill-anqas erba’ replikati u l-fattur bejn konċentrazzjonijiet m’għandux ikun akbar minn tnejn. L-għadd ta’ replikati għandu jkun suffiċjenti biex tkun żgurata qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). Bir-rata ta’ żvilupp, Analiżi ta’ Varjanza (ANOVA) is-soltu tkun adatta, bħat-test Dunnett u t-test Williams (17)(18)(19)(20). Fil-proporzjon ta’ evoluzzjoni jistgħu jkunu użati t-testijiet Cochran-Armitage, dak eżatt ta’ Fisher (bil-korrezzjoni ta’ Bonferroni), jew ta’ Mantel-Haenszel. Test ta’ limitu 21. Ikun jista’ jsir test ta’ limitu (konċentrazzjoni ta’ test wieħed u kontroll) jekk ma jkun osservat ebda effett fit-test preliminari ta’ detezzjoni ta’ firxa. L-għan tat-test ta’ limitu huwa li jkun indikat li l-valur tossiku tas-sustanza għall-ittestjar ikun akbar mill-konċentrazzjoni ta’ limitu ttestjata. F’dan il-Metodu ta’ Ttestjar ma jistax isir suġġeriment għall-konċentrazzjoni rakkomandata; dan jitħalla fil-ġudizzju tar-regolatur. Is-soltu jkunu meħtieġa mill-anqas sitt replikati kemm għat-trattament kif ukoll għall-kontroll. Għandha tintwera qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). B’rispons metriku (rata ta’ żvilupp u piż), it-t-test huwa metodu ta’ statistika adatt jekk dejta tissodisfa l-ħtiġijiet ta’ dan it-test (normalità, varjanzi omoġenji). Jista’ jintuża t-t-test ta’ varjanza inugwali jew test mhux parametriku, bħat-test Wilcoxon-Mann-Whithey, jekk dawn il-ħtiġijiet ma jkunux sodisfatti. Bil-proporzjon ta’ evoluzzjoni, it-test eżatt ta’ Fisher ikun adatt. PROĊEDURA Kondizzjonijiet ta’ espożizzjoni Tħejjija ta’ sistema ta’ ilma u sediment fortifikati 22. Ammonti adatti ta’ sediment formulat (ara l-paragrafi 13-14 u Appendiċi 3) jiżdiedu fir-reċipjenti tat-test biex jifformaw saff ta’ mill-anqas 1,5 cm. L-ilma jiżdied għal fond ta’ 6 cm (ara paragrafu 15). Il-proporzjon tal-fond tas-saff tas-sediment u l-fond tal-ilma ma għandux jaqbeż 1:4 u s-saff tas-sediment ma għandux ikun iktar fond minn 3 cm. Is-sistema sediment-ilma għandha titħalla taħt tirwiħ ġentitli għal sebat ijiem qabel iż-żieda tal-organiżmi tat-test (ara l-paragrafu 14 u l-Appendiċi 3). Biex ikunu evitati separazzjoni ta’ ingredjenti tas-sediment u sospensjoni mill-ġdid ta’ materjal fin matul iż-żieda ta’ ilma tat-test fil-kolonna tal-ilma, is-sediment jista’ jitgħatta b’diska tal-plastik waqt li jkun qed jitferra’ ilma fiha, u d-diska titneħħa minnufih wara. Apparati oħra jistgħu wkoll ikunu adatti. 23. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu mgħottijin (eż. bi platti tal-ħġieġ). Jekk ikun meħtieġ, matul l-istudju l-ilma jimtela sal-livell tal-volum oriġinali biex dan jagħmel tajjeb għall-evaporazzjoni tal-ilma. Dan għandu jsir billi jintuża ilma distillat jew dejonizzat biex ma jitħalliex jiżdied melħ. Żieda ta’ organiżmi tat-test 24. Minn erba’ sa ħamest ijiem qabel ma l-organiżmi tat-test jiżdiedu fir-reċipjenti tat-test, għandhom jittieħdu kwantitajiet ta’ bajd mill-kulturi u jitqiegħdu f’reċipjenti żgħar f’midjum ta’ kulturi. Jista’ jintuża midjum qadim mill-kultura ta’ stokkijiet jew midjum li jkun għadu kif tħejja. Jekk jintuża dan tal-aħħar, ammont żgħir ta’ ikel eż. alka ħadra u/jew ftit qatriet żgħar ta’ filtrat minn sospensjoni mitħuna fin ta’ trofof ta’ ikel tal-ħut għandu jiżdied mal-midjum tal-kultura (ara l-Appendiċi 2). Għandhom jintużaw biss kwantijiet ta’ bajd miġbur frisk. Normalment, il-larvi jibdew ifaqqsu ftit jiem wara li jkun hemm il-bajd (2 sa 3 ijiem għal Chironomus riparius f’20 oC u 1 sa 4 ijiem għal Chironomus tentans fi 23 oC u Chironomus yoshimatui fi 25 oC) u jkun hemm tkabbir ta’ larvi f’erba’ fażijiet, kull fażi ddum 4-8 ijiem. Fit-test għandhom jintużaw larvi tal-ewwel fażi (2-3 jew 1-4 ijiem wara li jkunu faqqsu). Il-fażi ta’ pappamoski tista’ possibbilment tkun ivverifikata billi jintuża l-wisa’ tal-iskutella tar-ras (6). 25. Għoxrin larvi tal-ewwel fażi jkunu allokati kif jinzertaw lil kull reċipjent tat-test li jkun fih is-sediment imħallat u l-ilma, billi tintuża pipetta mingħajr ponta. It-tirwiħ tal-ilma għandu jieqaf waqt li l-larvi jkunu qed jiżdiedu fir-reċipjenti tat-test u jibqa’ hekk għal 24 siegħa oħra wara li jkunu żdiedu l-larvi (ara l-paragrafi 24 u 32). Skont it-tifsila tat-test użat (ara l-paragrafi 19 u 20), l-għadd ta’ larvi użati għal kull konċentrazzjoni jkun mill-anqas 60 għall-istima ta’ punti ta’ EC u 80 għal determinazzjoni ta’ NOEC. 26. Erbgħa u għoxrin siegħa wara li jkunu żdiedu l-larvi, is-sustanza għall-ittestjar titħallat fil-kolonna tal-ilma fuq, u jerġa’ jingħata tirwiħ. Ikunu applikati volumi żgħar ta’ soluzzjonijiet ta’ sustanzi għall-ittestjar taħt il-wiċċ tal-ilma billi tintuża pipetta. L-ilma ta’ fuq għandu mbagħad jitħallat b’attenzjoni biex is-sediment ma jitħarbatx. Konċentrazzjonijiet tat-test 27. Test ta’ detezzjoni ta’ firxa jista’ jkun utli biex tkun iddeterminata l-firxa ta’ konċentrazzjonijiet għat-test definittiv. Għal dan il-għan tintuża serje ta’ konċentrazzjonijiet spazjati fil-wisa’ tas-sustanza għall-ittestjar. Biex tkun ipprovduta l-istess densità tal-wiċċ għal kull kironomidu, li jkollu jintuża għat-test definittiv, kironomidi jkunu esposti għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar għal perjodu li jippermetti stima ta’ konċentrazzjonijiet adatti ta’ testijiet, u ma jkunx hemm ħtieġa ta’ replikati. 28. Il-konċentrazzjonijiet tat-test għat-test definittiv ikunu deċiżi abbażi tar-riżultat tat-test ta’ detezzjoni ta’ firxa. Mill-anqas għandhom jintużaw u jintgħażlu ħames konċentrazzjonijiet kif deskritt fil-paragrafi 18 sa 20. Kontrolli 29. Reċipjenti ta’ kontroll mingħajr sustanza għall-ittestjar iżda li jkunu jinkludu sediment għandhom ikunu inklużi fit-test bl-għadd xieraq ta’ replikati (ara l-paragrafi 19-20). Jekk ikun intuża solvent għal applikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar (ara l-paragrafu 16), għandu jiżdied kontroll ta’ solvent ta’ sediment. Sistema ta’ ttestjar 30. Jintużaw sistemi statiċi. Sistemi semistatiċi jew ta’ fluss kontinwu bl-ilma ta’ fuq jiġġedded kull tant jew kontinwament jistgħu jintużaw f’każijiet eċċezzjonali bħal pereżempju jekk speċifikazzjonijiet tal-kwalità tal-ilma jisfaw ma jkunux adatti għall-organiżmu tat-test jew jaffettwaw l-ekwilibriju kimiku (eż. livelli ta’ ossiġnu maħlul jinżlu baxxi ħafna, il-konċentrazzjoni ta’ prodotti ta’ ekskreta togħla żżejjed jew minerali jlissu minn sediment u jaffettwaw il-pH u/jew il-melħ minerali fl-ilma). Iżda metodi oħra biex titjieb il-kwalità tal-ilma ta’ fuq, bħal tirwiħ, għandhom normalment ikunu biżżejjed u jkunu ppreferuti. Ikel 31. Ikun meħtieġ li l-larvi jintemgħu, preferibbilment kuljum jew mill-anqas tliet darbiet fil-ġimgħa. L-ikel tal-ħut (sospensjoni fl-ilma jew ikel mitħun fin, eż. Tetra-Min jew Tetra-Phyll; ara d-dettalji fl-Appendiċi 2) fl-ammont ta’ 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg għal C. yoshimatui) għal kull larva kuljum jidher li jkun adegwat għal larvi żgħar għall-ewwel 10 ijiem. Jista’ jkun meħtieġ ftit aktar ikel għal larvi li jkollhom aktar żmien: 0,5 -1 mg għal kull larva kuljum għandu jkun suffiċjenti għall-bqija tat-test. Ir-razzjon tal-ikel għandu jitnaqqas fit-trattamenti kollha u jkun ikkontrollat jekk ikun hemm tkabbir fungali jew jekk fil-kontrolli jkunu osservati mwiet. Jekk ma jkunx jista’ jitwaqqaf żvilupp fungali t-test għandu jittenna. Meta jkunu qed jiġu ttestjati sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log Kow > 5), jew sustanzi magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-ammont ta’ ikel meħtieġ biex ikunu żgurati sopravivenza u tkabbir naturali tal-organiżmi jista’ jiżdied mas-sediment formulat qabel il-perjodu ta’ stabbilizzazzjoni. Għal dan, għandu jintuża materjal tal-pjanti minflok ikel tal-ħut, eż. tista’ tintuża żieda ta’ 0,5 % (piż fin-niexef) ta’ weraq mitħunn fin ta’ eż. ħorrieqa tnigges (Urtica dioica), ċawsla (Morus alba), silla bajda (Trifolium repens), spinaċi (Spinacia oleracea) jew ta’ materjal ieħor tal-pjanti (Cerophyl jew ċelluloża alfa). Kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni 32. Tirwiħ bil-mod tal-ilma ta’ fuq f’reċipjenti tat-test ikun ipprovdut preferibbilment 24 sigħat wara li jiżdiedu l-larvi u jitkompla matul it-test kollu (għandha tingħata attenzjoni biex il-konċentrazzjoni tal-ossiġnu maħlul ma tinżilx taħt 60 % ta’ ASV). Tirwiħ ikun ipprovdut permezz ta’ pipetta Pasteur tal-ħġieġ imwaħħla 2-3 cm ‘il fuq mis-saff tas-sediment (jiġifieri bużżieqa waħda jew ftit tal-ilma/sec). Meta jkunu qed jiġu ttestjati kimiċi volatili, jista’ jitqies li s-sistema tas-sediment-ilma ma titrewwaħx. 33. It-test jitmexxa f’temperatura kostanti ta’ 20 °C (± 2 °C). Għal C. tentans u C. yoshimatui t-temperaturi rakkomandati huma ta’ 23 °C u 25 °C (± 2 °C), rispettivament. Jintuża fotoperjodu ta’ 16-il siegħa u l-intensità tad-dawl għandha tkun 500 sa 1 000 lux. Durata tal-espożizzjoni 34. L-espożizzjoni tibda biż-żieda ta’ larvi fir-reċipjenti ffortifikati u ta’ kontroll. Id-durata massima tal-espożizzjoni tkun ta’ 28 jum għal C. riparius u C. yoshimatsui, u 65 jum għal C. tentans. Jekk pappamoski jevolvu qabel, it-test jista’ jitwaqqaf wara minimu ta’ ħamest ijiem wara li jkun evolva l-ewwel adult fil-kontroll. OSSERVAZZJONIJIET Emerġenza 35. Ikunu ddeterminati ż-żmien ta’ żvilupp u l-għadd totali ta’ pappamoski rġiel u nisa evoluti għalkollox. L-irġiel ikunu identifikati faċilment mill-antenni tagħhom kollha pjumi. 36. Ir-reċipjenti tat-test għandhom ikunu osservati mill-anqas tliet darbiet fil-ġimgħa biex issir valutazzjoni viżiva ta’ kull mġiba mhux normali (eż. tluq mis-sediment, għawm mhux tas-soltu), mqabbla mal-kontroll. Matul il-perjodu ta’ evoluzzjoni mistennija jkun meħtieġ li jsir għadd kuljum ta’ pappamoski li jkunu evolvew għalkollox. Is-sess u l-għadd ta’ pappamoski evoluti għalkollox ikunu rreġistrati kuljum. Wara identifikazzjoni l-pappamoski jitneħħew mir-reċipjenti. Kull kwantità ta’ bajd iddepożitata qabel ma jintemm it-test għandha tkun irreġistrata u mbagħad titneħħa biex larvi ma jitħallewx jerġgħu jidħlu fis-sediment. Ikun irreġistrat ukoll l-għadd ta’ pupae viżibbli li jkunu naqsu li jevolvu. Gwida dwar kejl ta’ evoluzzjoni hija pprovduta fl-Appendiċi 5. Tkabbir u sopravivenza 37. Jekk għandha tkun ipprovduta dejta dwar sopravivenza u tkabbir ta’ larvi għal 10 ijiem, għandhom ikunu inklużi reċipjenti addizzjonali tat-test mill-bidu, biex ikunu jistgħu jintużaw wara. Is-sediment minn dawn ir-reċipjenti addizzjonali jintgħarbel billi jintuża għarbiel ta’ 250 μm biex iżomm il-larvi. Kriterji għal mewt huma immobbiltà jew nuqqas ta’ reazzjoni għal stimulu mekkaniku. Larvi li ma jkunux irkuprati għandhom jingħaddu wkoll bħala mejtin (larvi li jkunu mietu fil-bidu tat-test setgħu kienu ġew iddegradati minn mikrobi). Ikunu ddeterminat il-piż fin-niexef (mingħajr irmied) tal-larvi li jkunu baqgħu ħajjin għal kull reċipjent tat-test u l-medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent. Ikun utli li jkun iddeterminat ta’ liema fażi jkunu l-larvi li jkunu baqgħu ħajjin; għal dak jista’ jintuża l-kejl tal-wisa’ tal-iskutella tar-ras ta’ kull larva. Kejlijiet analitiċi Konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar 38. Bħala minimu, kampjuni tal-ilma ta’ fuq, tal-ilma tal-pori u tas-sediment għandhom ikunu analizzati fil-bidu (preferibbilment siegħa wara applikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar) u fit-tmiem tat-test, fl-ogħla konċentrazzjoni u f’waħda aktar baxxa. Dawn id-determinazzjonijiet ta’ konċentrazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar jagħtu tagħrif dwar l-imġiba/il-partizzjoni tas-sustanza għall-ittestjar fis-sistema ilma u sediment. Teħid ta’ kampjuni ta’ sediment fil-bidu tat-test jista’ jinfluwenza s-sistema ta’ ttestjar (eż. tneħħija ta’ larvi tat-test), għalhekk għandhom jintużaw reċipjenti addizzjonali tat-test biex jitwettqu determinazzjonijiet analitiċi fil-bidu u matul it-test jekk ikun jixraq (ara l-paragrafu 39). Kejlijiet fis-sediment jistgħu ma jkunx meħtieġ jekk il-partizzjoni tas-sustanza għall-ittestjar bejn ilma u sediment tkun ġiet iddeterminata b’mod ċar fi studju dwar ilma/sediment f’kondizzjonijiet komparabbli (eż. proporzjon ta’ sediment ma’ ilma, tip ta’ applikazzjoni, kontenut ta’ karbonju organiku ta’ sediment). 39. Meta jittieħdu kejlijiet intermedji (eż. fis-7 jum) u jekk l-analiżi jkun jeħtiġilha kampjuni kbar li ma jkunux jistgħu jittieħdu minn reċipjenti tat-test mingħajr ma tkun influwenzata s-sistema ta’ ttestjar, għandhom isiru determinazzjonijiet analitiċi fuq kampjuni minn reċipjenti addizzjonali tat-test ittrattati bl-istess mod (inkluża l-preżenza ta’ organiżmi tat-test) iżda mhux użati għal osservazzjonijiet bijoloġiċi. 40. Ċentrifugazzjoni pereżempju ta’ 10 000 g u 4oC għal 30 min. hija l-proċedura rrakkomandata biex ikun iżolat ilma interstizjali. Iżda jekk is-sustanza għall-ittestjar tkun turi li filtri ma jassorbuhiex, tista’ wkoll tkun aċċettabbli l-filtrazzjoni. F’xi każijiet jista’ ma jkunx possibbli li jkunu analizzati konċentrazzjonijiet fl-ilma tal-pori minħabba li d-daqs tal-kampjun ikun żgħir wisq. Parametri fiżikokimiċi 41. Il-pH, ossiġnu maħlul fl-ilma tat-test u t-temperatura tat-reċipjenti tat-test għandhom jitkejlu b’mod adatt (ara l-paragrafu 10). Melħ minerali fl-ilma u ammonja għandhom jitkejlu fil-kontrolli u f’reċipjent wieħed tat-test fl-ogħla konċentrazzjoni fil-bidu u fit-tmiem tat-test. DEJTA U RAPPURTAR Trattament ta’ riżultati 42. L-għan ta’ dan it-test huwa biex ikun iddeterminat l-effett tas-sustanza għall-ittestjar fuq ir-rata ta’ żvilupp u fuq l-għadd totali ta’ pappamoski rġiel u nisa evoluti għalkollox, jew fil-każ tal-effetti tat-test ta’ 10 ijiem fuq is-sopravivenza u l-piż tal-larvi. Jekk ma jkunx hemm indikazzjonijiet ta’ sensivitajiet differenti statistikament ta’ sessi, riżultati dwar irġiel u nisa jkunu jistgħu jinġabru għal analiżi ta’ statistika. Id-differenzi ta’ sensittività bejn is-sessi jistgħu jkunu ġġudikati statistikament pereżempju b’test ta’ tabella χ2-r x 2. Sopravivenza tal-larvi u l-medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent għandha tkun ikkalkulata wara 10 jiem meta jkun meħtieġ. 43. Konċentrazzjonijiet ta’ effetti espressi bħala konċentrazzjonijiet fl-ilma ta’ fuq huma kkalkulati preferibbilment abbażi ta’ konċentrazzjonijiet imkejla fil-bidu tat-test (ara l-paragrafu 38). 44. Biex tkun ikkomputata stima ta’ punti għall-EC50 jew għal kull ECx oħra, tista’ tintuża statistika għal kull reċipjent bħala replika vera. Biex ikun ikkalkulat intervall ta’ kunfidenza għal kull ECx għandha titqies il-varjabbiltà fost reċipjenti, jew għandu jintwera li din il-varjabbiltà tant tkun żgħira li tista’ ma titqisx. Meta l-mudell jitqiegħed minn Least Squares, għandha tkun applikata trasformazzjoni għall-istatistika għal kull reċipjent biex titjieb l-omoġeneità ta’ varjanza. Iżda, valuri ECx għandhom ikunu kkalkulati wara li r-rispons ikun ġie ttrasformat u ttieħed lura għall-valur oriġinali. 45. Meta l-analiżi ta’ statistika jkollha l-għan li tiddetermina NOEC/LOEC b’ittestjar ta’ ipoteżi, il-varjabbiltà fost reċipjenti jeħtiġilha titqies, eż. b’ANOVA f’aktar stadji. Alternattivament, aktar testijiet robusti (21) jistgħu jkunu adatti f’sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ksur tas-suppożizzjonijiet tas-soltu ta’ ANOVA. Proporzjon ta’ evoluzzjoni 46. Proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni huma dejta alternattiva mhux kontinwa, u jistgħu jkunu analizzati bit-test ta’ Cochran-Armitage applikat b’mod devoluttiv fejn tkun mistennija doża-rispons monotonika u din id-dejta tkun konsistenti ma’ din l-istennija. Jekk le, jistgħu jintużaw test eżatt ta’ Fisher jew dak ta’ Mantel-Haenszel b’valuri ‘p’ ta’ Bonferroni-Holm aġġustati. Jekk ikun hemm evidenza ta’ varjabbiltà akbar bejn replikati fl-istess konċentrazzjoni milli distribuzzjoni binomja tkun tindika (sikwit irriferuta bħala varjazzjoni “extrabinomja”), mbagħad għandhom jintużaw test robust ta’ Cochran-Armitage jew dak eżatt ta’ Fisher kif propost fi (21). 47. L-għadd ta’ pappamoski evoluti għal kull reċipjent, ne, ikun iddeterminat u diviż bl-għadd ta’ larvi introdotti, na: fejn: ER = proporzjon ta’ evoluzzjoni ne = għadd ta’ pappamoski evoluti għal kull reċipjent na = għadd ta’ larvi introdotti għal kull reċipjent 48. Alternattiva li hija l-aktar adatta għal daqsijiet kbar ta’ kampjuni, meta jkun hemm varjanza extrabinomja, hija li l-proporzjon ta’ evoluzzjoni jkun ittrattat bħala rispons kontinwu u li jintużaw proċeduri bħat-test Williams meta tkun mistennija doża-rispons monotonika u tkun konsistenti ma’ din id-dejta ta’ ER. It-test Dunnett ikun adatt fejn il-monotoniċità ma tapplikax. Daqs kbir ta’ kampjun huwa ddefinit hawn bħala l-għadd evolut, u l-għadd mhux evolut ukoll ikun aktar minn ħamsa, abbażi ta’ kull replika (reċipjent). 49. Biex ikunu applikati metodi ta’ ANOVA, valuri ta’ ER għandhom l-ewwel ikunu ttrasformati bit-trasformazzjoni arcsin-sqrt jew bit-trasformazzjoni Freeman-Tukey biex tinkiseb distribuzzjoni normali approssimata u biex varjanzi jsiru ugwali. Jistgħu jkunu applikati t-testijiet Cochran-Armitage, dak eżatt ta’ Fisher (Bonferroni), jew it-test ta’ Mantel-Haenszel meta jintużaw il-frekwenzi assoluti. It-trasformazzjoni arcsin-sqrt tkun applikata billi jittieħed l-inverse sine (sin-1) tal-għerq kwadrat ta’ ER. 50. Għal proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni, valuri ECx ikunu kkalkulati billi tintuża analiżi ta’ rigressjoni (jew eż. probit (22), logit, Weibull, softwer kummerċjali adatt, eċċ.). Jekk analiżi ta’ rigressjoni tfalli (eż. meta jkun hemm anqas minn żewġ risponsi parzjali), jintużaw metodi mhux parametriċi oħra bħal medja mobbli jew interpolazzjoni sempliċi. Rata ta’ żvilupp 51. Il-ħin medju ta’ żvilupp jirrappreżenta t-tul medju ta’ żmien bejn id-dħul ta’ larvi (jum 0 tat-test) u l-evoluzzjoni tal-koorti sperimentali ta’ pappamoski. (Għall-kalkulazzjoni taż-żmien reali ta’ żvilupp, għandha titqies l-età tal-larvi fil-waqt tad-dħul). Ir-rata ta’ żvilupp hija r-reċiproka taż-żmien tal-iżvilupp (unità: 1/jum) u tirrappreżenta dik il-parti tal-iżvilupp tal-larva li sseħħ kuljum. Ir-rata ta’ żvilupp hija ppreferuta għall-evalwazzjoni ta’ dawn l-istudji dwar tossiċità ta’ sediment minħabba li l-varjanza tagħha hija aktar baxxa, u hija aktar omoġenja u eqreb distribuzzjoni normali kif imqabbla ma’ żmien ta’ żvilupp. Għalhekk, jistgħu jintużaw proċeduri ta’ test parametriku qawwija ma’ rata ta’ żvilupp milli ma’ żmien ta’ żvilupp. Għal rata ta’ żvilupp bħala reazzjoni kontinwa, jistgħu jkunu stmati valuri ECx billi tintuża analiżi ta’ rigressjoni (eż. (23), (24)). 52. Għat-testijiet ta’ statistika li ġejjin, l-għadd ta’ pappamoski osservati f’jum ta’ spezzjoni x ikunu preżunti li jkunu evolvew fil-medja tal-intervall ta’ żmien bejn jum x u jum x-l (l = tul tal-intervall ta’ spezzjoni, is-soltu jum 1). Ir-rata medja ta’ żvilupp għal kull reċipjent (x) tkun ikkalkulata skont: fejn: : rata medja ta’ żvilupp għal kull reċipjent i : indiċi ta’ intervall ta’ spezzjoni m : għadd massimu ta’ intervalli ta’ spezzjoni : għadd ta’ pappamoski evoluti fl-intervall ta’ spezzjoni i ne : għadd totali ta’ pappamoski evoluti fit-tmiem tal-esperiment (= ) xi : rata ta’ żvilupp tal-pappamoski evoluti f’intervall i fejn: dayi : jum ta’ spezzjoni (jiem minħabba applikazzjoni) li : tul ta’ intervall ta’ spezzjoni i (jiem, is-soltu jum wieħed) Rapport tat-test 53. Ir-rapport tat-test għandu mill-anqas jipprovdi l-informazzjoni li ġejja: Sustanza għall-ittestjar: — natura fiżika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fiżikokimiċi (solubilità tal-ilma, pressjoni tal-fwar, koeffiċjent tal-partizzjoni fil-ħamrija (jew fis-sediment jekk ikunu disponibbli), stabbiltà fl-ilma, eċċ.); — dejta ta’ identifikazzjoni ta’ kimiċi (isem komuni, isem tal-kimika, formula strutturali, Numru tal-CAS, eċċ.) inklużi l-purezza u l-metodu għall-kwantifikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar. Speċi tat-test: — annimali użati għat-test: speċi, isem xjentifiku, sors ta’ organiżmi u kondizzjonijiet għat-trobbija; — informazzjoni dwar maniġġar ta’ kwantitajiet ta’ bajd u larvi; — l-età tal-annimali tat-test meta jkunu ddaħħlu fir-reċipjenti tat-test. Kondizzjonijiet tat-test: — sediment użat, jiġifieri sediment naturali jew formulat; — għal sediment naturali, post u deskrizzjoni ta’ sit ta’ teħid ta’ kampjuni ta’ sediment, inkluża, jekk ikun possibbli, storja ta’ kontaminazzjoni; karatteristiċi: pH, kontenut ta’ karbonju organiku, proporzjon ta’ C/N u granulumetrija (skont kif jixraq). — tħejjija tas-sediment formulat: ingredjenti u karatteristiċi (kontenut ta’ karbonju organiku, pH, rtubija, eċċ. fil-bidu tat-test); — tħejjija tal-ilma tat-test (jekk jintuża ilma rikostitwit) u karatteristiċi (konċentrazzjoni tal-ossiġnu, pH, konduttività, melħ minerali fl-ilma, eċċ. fil-bidu tat-test); — fond tas-sediment u ilma ta’ fuq; — volum tal-ilma ta’ fuq u tal-pori; piż ta’ sediment imxarrab bi jew mingħajr ilma tal-pori; — reċipjenti tat-test (materjal u daqs); — metodu ta’ tħejjija ta’ soluzzjonijiet ta’ stokkijiet u konċentrazzjonijiet ta’ testijiet; — applikazzjoni ta’ sustanza għall-ittestjar: konċentrazzjonijiet ta’ testijiet użati, għadd ta’ replikati u użu ta’ solvent jekk ikun hemm; — kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni: temperatura, ċiklu ta’ dawl u intensità, tirwiħ (frekwenza u intensità); — informazzjoni dettaljata dwar għalf inkluż tip ta’ ikel, tħejjija, ammont u reġim ta’ għalf. Riżultati: — il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-konċentrazzjonijiet imkejla tat-testijiet u r-riżultati tal-analizi kollha biex tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni tas-sustanza għall-ittestjar fir-reċipjent tat-test; — il-kwalità tal-ilma fir-reċipjenti tat-test, jiġifieri pH, temperatura, ossiġnu maħlul, melħ minerali fl-ilma u ammonja; — bdil ta’ ilma evaporat tat-test, jekk ikun hemm; — għadd ta’ pappamoski evoluti rġiel u nisa għal kull reċipjent u għal kull jum; — għadd ta’ larvi li jkunu naqsu li jevolvu bħala pappamoski għal kull reċipjent; — medja tal-piż fin-niexef ta’ kull larva għal kull reċipjent, u għal kull fażi, skont il-każ; — perċentwali ta’ evoluzzjoni għal kull replika u konċentrazzjoni tat-test (pappamoski rġiel u nisa miġburin flimkien); — rata medja ta’ żvilupp ta’ pappamoski żviluppati għalkollox għal kull replika u rata ta’ trattament (pappamoski rġiel u nisa miġburin flimkien); — stimi ta’ punti ta’ tmiem tossiċi eż. CEx (u intervalli assoċjati ta’ kunfidenza), NOEC u/jew LOEC u l-metodi ta’ statistika użati għad-determinazzjoni tagħhom; — diskussjoni tar-riżultati, inkluża kull influwenza fuq il-konklużjonijiet tar-riżultati tat-testijiet minn devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta’ Ttestjar. LETTERATURA: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Kanada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Kanada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Kanada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness: Tossiċità għal Ħniex, (15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a żero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a żero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendiċi 1 DEFINIZZJONIJIET Għall-fini ta’dan il-metodu jintużaw id-definizzjonijiet li ġejjin: Sediment ifformulat jew sediment rikostitwit, artifiċjali jew sintetiku, huwa taħlita ta’ materjali li jintużaw biex jimitaw l-komponenti fiżiċi ta’ sediment naturali. Ilma ta’ fuq huwa l-ilma li jitqiegħed fuq sediment fir-reċipjent tat-test. Ilma interstizjali jew ilma tal-pori huwa l-ilma li jokkupa l-ispazju bejn sediment u partiċelli tal-ħamrija. Ilma fortifikat huwa l-ilma tat-test li miegħu tkun ġiet miżjuda s-sustanza għall-ittestjar. Kimika għall-ittestjar: Kull sustanza jew taħlita ttestjata billi jintuża dan il-Metodu ta’ Ttestjar. Appendiċi 2 Rakkomandazzjonijiet għal kultura ta’ Chironomus riparius 1. Larvi ta’ Chironomus jistgħu jitkabbru f’dixxijiet ta’ kristallizzazzjoni jew f’kontenituri akbar. Ramel fin tal-quartz jitferrex f’saff irqiq ta’ madwar 5 as 10 mm fond fuq il-qiegħ tal-kontenitur. Kieselguhr (eż. Merck, Art 8117) ukoll intwera li huwa substrat adatt (saff irqaq ta’ sa ftit ħafna mm ikun biżżejjed). Wara jiżdied ilma adattat għal fond ta’ diversi cm. Il-livelli tal-ilma għandhom jimtlew kull meta huwa meħtieġ biex jieħdu post it-telf li jirriżulta mill-evaporazzjoni, u jkun ta’ repevenzjoni kontra d-dessekazzjoni. L-ilma jista’ jinbidel jekk ikun meħtieġ. Għandu jkun ipprovdut tirwiħ bil-mod. Ir-reċipjenti għat-tkabbir tal-larvi għandhom jinżammu f’gaġġa apposta li ma tħallix li l-adulti li jkunu qed jevolvu jaħarbu. Il-gaġġa għandha tkun kbira biżżejjed biex adulti evoluti ma jitħallewx jimirħu fi qtajja kbar, għax inkella tista’ ma ssirx kopulazzjoni (il-minimu huwa ta’ madwar 30 x 30 x 30 cm). 2. Gaġeġ għandhom jinżammu f’temperatura ambjentali jew f’kamra ambjentalment kostanti ta’ 20 + 2 °C b’perjodu fotografiku ta’ 16-il siegħa dawl (intensità madwar 1 000 lux), 8 sigħat dlam. Kien irrapportat li umdità tal-arja ta’ anqas minn 60 % RH tista’ tfixkel ir-riproduzzjoni. Ilma ta’ dilwizzjoni 3. Jista’ jintuża kull ilma tajjeb naturali jew sintetiku. Komunement jintużaw ilma tal-bir, ilma tal-vit li jkun tneħħielu l-kloru u midja artifiċjali (eż. il-midjum Elendt “M4” jew “M7”, ara hawn taħt). L-ilma għandu jitrewwaħ qabel ma jintuża. Jekk ikun meħtieġ, l-ilma tal-kultura jista’ jiġġedded billi l-ilma użat jitferra’ jew jgħaddi minn ġo sifun minn reċipjenti ta’ kultura b’attenzjoni mingħajr ma jinqerdu t-tubi tal-larvi. Tmigħ tal-larvi 4. Larvi ta’ Chironomus għandhom jintemgħu ikel ta’ trofof tal-ħut (Tetra Min®, Tetra Phyll® jew marka simili oħra ta’ ikel tal-ħut proprjetarju), f’bejn wieħed u ieħor 250 mg għal kull reċipjent kuljum. Dan jista’ jingħata bħala trab mitħun niexef jew bħala sospensjoni fl-ilma: 1,0 g ta’ ikel ta’ trofof jiżdied ma’ 20 ml ta’ ilma ta’ dilwizzjoni u jitħallat biex jagħti taħlita omoġenja. Din it-tħejjija tista’ tintema’ f’rata ta’ madwar 5 ml għal kull reċipjent kuljum (ixxejkja qabel ma tuża). Larvi li jkollhom aktar żmien jistgħu jirċievu aktar. 5. It-tmigħ jista’ jiġi aġġustat skont il-kwalità tal-ilma. Jekk il-midjum ta’ kultura ‘jissaħħab’, it-tmigħ għandu jitnaqqas. Żidiet ta’ ikel għandhom ikunu mmonitorjati b’attenzjoni. Ikel mill-anqas jikkawża tluq tal-larvi lejn il-kolonna tal-ilma, u ħafna ikel jikkawża aktar attività mikrobika u konċentrazzjonijiet tal-ossiġnu mnaqqsin. Iż-żewġ kondizzjonijiet jistgħu jġibu magħhom rati ta’ tkabbir imnaqqas. 6. Xi ċelluli ta’ alka ħadra (eż. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) jistgħu wkoll jiżdiedu meta jitqiegħdu f’reċipjenti ġodda ta’ kultura. Tmigħ ta’ adulti evoluti 7. Xi wħud minn dawk li jagħmlu esperimenti ssuġġerew li kuxxinett tat-tajjar mgħaddas f’soluzzjoni saturata tas-sukrożju jista’ jservi ta’ ikel għal adulti evoluti. Emerġenza 8. F’20 + 2 °C adulti jibdew jevolvu mir-reċipjenti għat-tkabbir tal-larvi wara bejn wieħed u ieħor 13 - 15-il jum. L-irġiel jintgħarfu malajr għax ikollhom antenni kollha pjumi. Kwantitajiet ta’ bajd 9. Malli l-adulti jkunu fil-gaġġa tat-trobbija, ir-reċipjenti kollha għat-tkabbir tal-larvi għandhom ikunu eżaminati tliet darbiet fil-ġimgħa għal tqegħid ta’ kwantitajiet ta’ bajd qisu ġelatina. Jekk ikun hemm, il-kwantitajiet ta’ bajd għandhom jitneħħew b’attenzjoni. Il-bajd għandu jkun ittrasferit għal ġo dixx żgħir li jkun fih kampjun tal-ilma tat-trobbija. Kwantitajiet ta’ bajd jintużaw biex jinbeda reċipjent ġdid ta’ kultura (eż. 2 - 4 kwantitajiet ta’ bajd/reċipjent) jew biex jintużaw għal testijiet tat-tossiċità. 10. Larvi tal-ewwel fażi għandhom ifaqqsu wara 2 - 3 ijiem. Reċipjenti ġodda ta’ kultura 11. Malli jkunu stabbiliti kulturi għandu jkun possibbli li jitqiegħed reċipjent ġdid ta’ kultura tal-larvi kull ġimgħa jew anqas ta’ spiss skont ħtiġijiet ta’ ttestjar, billi jitneħħew ir-reċipjenti aktar qodma wara li jkunu evolvew pappamoski adulti. Bl-użu ta’ din is-sistema jkun hemm provvista regolari ta’ adulti b’anqas maniġġar. Tħejjija ta’ soluzzjonijiet tat-testijiet “M4” u “M7” 1