Ir-raba’ Direttiva Tal-Kummissjoni tal-5 ta’ Diċembru 1972 li tistabbilixxi l-metodi ta’ analiżi tal-Komunità għall-kontroll uffiċjali għall-għalf



Official Journal L 083 , 30/03/1973 P. 0021 - 0034

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 5 P. 0115

Greek special edition: Chapter 03 Volume 9 P. 0114

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 5 P. 0115

Spanish special edition: Chapter 03 Volume 6 P. 0230

Portuguese special edition Chapter 03 Volume 6 P. 0230

CS.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

ET.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

HU.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

LT.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

LV.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

MT.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

PL.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

SK.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25

SL.ES Chapter 03 Volume 02 P. 12 - 25



Ir-Raba’ Direttiva Tal-Kummissjoni tal-5 ta’ Diċembru 1972 li tistabbilixxi l-metodi ta’ analiżi tal-Komunità għall-kontroll uffiċjali għall-għalf (73/46/KEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jwaqqaf il-Komunità Ekonomika Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 [1] dwar l-introduzzjoni ta’ metodi ta’ kampjonar u analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf, kif emendat bid-Direttiva Nru 72/275/KEE tal-20 ta’ Lulju 1972 [2], u b’mod partikolari Artikolu 2 tagħha; Billi dik id-Direttiva teħtieġ illi l-kontrolli uffiċjali ta’ l-għalf jitwettaq billi jintużaw metodi ta’ kampjonar u analiżi tal-Komunità għall-iskop li tiġi verifikata l-konformità mal-ħtiġiet li ġejjin minn dispożizzjonijiet stpulati bil-liġi, Regolamenti jew azzjoni amministrattiva dwar il-kwalità u l-għamla ta’ l-għalf; Billi d-Direttivi Nru 71/250/KEE tal-15 ta’ Ġunju 1971 [3], Nru 71/393/KEE tat-18 ta’ Novembru 1971 [4] u Nru 72/199/KEE tas-27 ta’ April 1972 [5] diġà stabbilew numru ta’ metodi ta’ analiżi tal-Komunità; billi il-progress tax-xogħol minn dak iż-żmien jissuġġerixxi illi jiġi addottat ir-raba’ sett ta’ metodi; Billi l-miżuri li għalihom tipprovdi din id-Direttiva huma skond l-Opinjoni tal-Kumitat ta’ Ġestjoni għall-għalf; ADDOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Istati Membri għandhom jeħtieġu li l-analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf fir-rigward tal-kontenut ta’ umdità ta’ grass u żejt tal-annimali u l-ħxejjex u l-manjesju u l-kontenut ta’ fibra mhux maħduma ta’ l-għalf issir skond il-metodi deskritti f’Anness I li jinsab ma’ din id-Direttiva. Id-dispożizzjonijiet ġenerali stipulati fit-Taqsima 1 (Introduzzjoni) ta’ l-Anness li jinsab mal-Ewwel Direttiva tal-Kummissjoni Nru 71/250/KEE tal-15 ta’ Ġunju 1971 għandhom ikunu applikabbli għall-metodi deskritti f’Anness I li jinsab ma’ din id-Direttiva. Artikolu 2 L-Istati Membri għandhom jeħtieġu li l-analiżi għall-kontrolli uffiċjali ta’ l-għaj fir-rigward tal-kontenut tagħhom ta’ retinol (vitamina A), thiamine (aneurine, vitamina B1), aċidu ascorbic u dehydroascorbic (vitamina Ċ) jitwettqu skond il-metodi deskritti f’Anness II li jinsab ma’ din id-Direttiva. Id-dispożizzjonijiet ġenerali stipulati fit-Taqsima 1 (Introduzzjoni) ta’ l-Anness li jinsab ma’ l-Ewwel Direttiva tal-Kummissjoni Nru 71/250/KEE tal-15 ta’ Ġunju 1971, bl-eċċezzjoni tal-parti dwar il-preparazzjoni tal-kampjun li għandu jiġi analizzat, għandha tkun applikabbli għall-metodi deskritti f’Anness II li jinsab ma’ din id-Direttiva. Artikolu 3 L-Istati Membri għandhom, mhux aktar tard mill-1 ta’ Jannar 1974, idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-dispożizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex titħares din id-Direttiva. Għandhom jinnotifikaw minnufih lill-Kummissjoni b’dan. Artikolu 4 Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fil-5 ta’ Diċembru 1972. Għall-Kummissjoni S. L. Mansholt Il-President [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU L 171, tad-29.7.1972, p. 39. [3] ĠU L 155, tat-12.7.1971, p. 13. [4] ĠU L 279, tal-20.12.1971, p. 7. [5] ĠU L 123, tad-29.5.1972, p. 6. -------------------------------------------------- ANNESS I 1. STABBILITÀ TA’ L-UMDITÀ FIL-GRASS U Ż-ŻJUT TA’ L-ANNIMALI U L-ĦXEJJEX 1. Skop u Għan B’dan il-metodu huwa possibbli tistabilixxi l-kontenut ta’ ilma u s-sostanzi volatili tal-grass u ż-żjut ta’ l-annimali u l-ħxejjex. 2. Prinċipju Il-kampjun jitnixxef għall-piż kostanti ta’ 103 oC. It-telfa fil-massa tiġi stabbilita billi jintiżen. 3. Apparat 3.1. Dixx bil-qiegħ ċatt, ta’ materjal li jirreżisti għas-sadid, b’dijametru ta’ 8 sa 9 cm u madwar 3 cm għoli. 3.2. Termometru tal-merkurju b’bozza rinfurzata u b’tubu ta’ espansjoni fil-parti ta’ fuq, immarkat minn madwar 80 oC sa mill-anqas 110 oC, u twil madwar 10 cm. 3.3. Banju tar-ramel jew hot-plate ta’ l-elettriku. 3.4. Desikkatur, li jkunu fih aġent effiċjenti li jnixxef. 3.5. Miżien analitiku. 4. Proċedura Iżen sa’ l-eqreb mg bejn wieħed u ieħor 20 g tal-kampjun omoġeniżżat fid-dixx niexef u miżun (3.1) li jkun fih it-termometru (3.2). Saħħan fuq il-banju tar-ramel jew il-hot-plate (3.3), ħawwad il-ħin kollu bit-termometru, sabiex it-temperatura tilħaq id-90 oC f’madwar 7 minuti. Naqqas is-sħana, osserva l-frekwenza li biha l-bżieżaq jitilgħu mill-qiegħ tad-dixx. It-temperatura ma tridx tkun ta’ aktar minn 105 oC. Kompli ħawwad, waqt li tobrox il-qiegħ tad-dixx, sakemm il-bżieżaq ma jibqgħux jiffurmaw. Sabiex wieħed jiżgura t-tneħħija sħiħa ta’l-umdità, erġa saħħan bosta drabi sa 103 oC ± 2 oC, kessaħ sa 93 oC bejn it-tisħin suċċessiv. Imbagħad ħallih jiksaħ għat-temperatura tal-kamra f’desikkatur (3.4) u iżen. Irrepeti din l-operazzjoni sakemm it-tnaqqis fil-massa bejn żewġ wiżniet suċċessivi ma teċċedix aktar iż-2 mg. N. B. Żieda fil-massa tal-kampjun wara bosta tisħin tindika l-ossidazzjoni tal-grass, f’dan il-każ wieħed irid jikkalkula r-riżultat mill-użin imwettaq minnufih qabel il-massa bdiet tiżdied. 5. Kalkolazzjoni tar-riżultati Il-kontenut ta’ l-umdità, bħala perċentwali tal-kampjun, huwa mogħti permezz tal-formola li ġejja: · M o fejn: M0 = massa, fi grammi, tal-kampjun tat-test; M1 = massa, fi grammi, tad-dixx bil-kontenut tiegħu qabel jissaħħan; M2 = massa, fi grammi, tad-dixx bil-kontenut tiegħu wara li jissaħħan. Riżultati aktar baxxi minn 0.05 % għandhom jiġi rekordjati bħala "iktar baxxi minn 0.05 %". Kemm jista’ jiġi repetut Id-differenza fl-umdità bejn ir-riżultati ta’ żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhomx jeċċedu 0.05 %, f’valur assolut. 2. STABBILITÀ TAL-MANJESJU — permezz ta’ assorbiment atomiku bl-ispettrofotometrija - 1. Skop u Għan B’dan il-metodu huwa possibbli li tiġi stabbilita l-kwantità ta’ manjesju fl-għalf. Huwa partikolarment xieraq sabiex jiġi stabbilit il-kontenut ta’ manjesju anqas minn 5 %. 2. Prinċipju Il-kampjun jingħamel irmied u jinħall fl-aċidu idrokloriku mħallat bl-ilma. Jekk ma jkun fih ebda sustanza organika, jinħall direttament fl-aċidu idrokloriku mħallat bl-ilma. Is-soluzzjoni hija mħallta bl-ilma u l-kontenut ta’ manjesju jiġi stabbilit permezz ta’ assorbiment atomiku bl-ispettrofotometrija f’285.2 nm, permezz ta’ tqabbil ma’ soluzzjonijiet standard. 3. Reaġenti 3.1. Aċidu idrokloriku a.p. d: 1.16. 3.2. Aċidu idrokloriku konċentrat a.p. d: 1.19. 3.3. Żigarella jew wajer tal-manjesju, jew b’sulfat tal-manjesju "heptahydrate", imnixxef f’temperatura tal-kamra. 3.4. Soluzzjoni tal-melħ istrontium (klorat jew nitrate) f’2.5 % (w/v) strontium (= 76.08 g SrC12 7 6H2O a.p., jew 60.38 g Sr (NO3)2 a.p.). 3.5. Soluzzjoni standard tal-manjesju: iżen sa l-eqreb mg 1 g ta’ manjesju (3.3) li qabel ikun tneħħilu bir-reqqa l-kisja ta’ ossidu, jew kwantità korrespondenti (10143 g) ta’ sulfat tal-manjesju heptahydrate (3.3). Poġġih ġo fjsakun bil-kejl ta’ 1000 ml, żid 80 ml aċidu idrokloriku (3.1), ħallih idub u żidu sa 1000 ml bl-ilma. 1 ml ta’ din it-taħlita fiha 1000 mg manjesju. 4. Apparat 4.1. Platinu, silica jew griġjol tal-porċellana biex jingħamel l-irmied fih. 4.2. Muffle furnace ta’ l-elettriku kkontrollat permezz ta’ termostat. 4.3. Assorbiment atomiku bl-ispettrofotometrija. 5. Proċedura 5.1. Il-preparazzjoni tat-taħlita tal-kampjun 5.1.1. Għalf magħmul biss minn sustanzi minerali Iżen sa l-eqreb mg 5 g tal-kampjun ġo flixkun tal-kelj ta’ 500 ml b’250 sa 300 ml ilma. Żid 40 ml aċidu idrokloriku (3.1), ħallih jagħli u żomm il-likwidu jagħli bil-mod għal 30 minuta. Ħallih jiksaħ, żidu sal-volum bl-ilma, ħalltu u ffiltrah f’buqar niexef minn ġo filtru dry pleated. Armi l-ewwel 30 ml tal-filtrat. Fil-preżenza tas-silica, ittratta 5 g tal-kampjun bi kwantità biżżejjed (15-30 ml) ta’ aċidu idrokloriku (3.2), evapora sakemm jinxef fuq banju tal-ilma u ttrasferixxi għal ġo forn f’105 oC għal siegħa. Ipproċedi bħal mit-tielet sentenza tal-5.1.2. 5.1.2. Għal magħmul fil-parti l-kbira tiegħu minn sustanzi minerali Iżen sal-eqreb mg 5 g tal-kampjun ġewwa griġjol u ġieb irmied f’550 oC fil-muffle furnace sakemm irmied li jkun ħieles minn frak karbonaċeju jinkiseb, u ħallih jiksaħ. Sabiex tneħħi is-silica, żid ma l-irmied kwantità biżżejjed (15-30 ml) ta’ aċidu idrokloriku (3.2), evapora sa kemm jinxef fuq banju ta’ l-ilma u ttrasferixxi għal ġo forn f’105 oC għal siegħa. Ittratta l-fdalijiet b’10 aċidu idrokloriku (3.1) u ttrasferixxi għal ġo buqar bil-kejl ta’ 500 ml billi tuża ilma sħun. Ħallih jiksaħ u żidu sal-volum bl-ilma. Ħaltu u ffiltrah għal ġo buqar nadif minn ġo filtru dry pleated. Armi l-ewwel 30 ml tal-filtrat. 5.1.3. Għalf magħmul fil-parti l-kbira minn sustanzi organiċi Iżen sa l-eqreb mg 5 g tal-kampjun ġo griġjol u ġieb irmied f’550 oC fil-muffle furnace sakemm jinkiseb irmied ħieles minn frak karbonaċeju. Ittratta l-irmied b’5 ml aċidu idrokloriku (3.2), evapora sa ma jinxef fuq banju ta’ l-ilma u mbagħad nixxfu għal siegħa fil-forn f’105 oC sabiex is-silica ma tkunx tista’ ddub. Ittratta l-irmied b’5 ml aċidu idrokloriku (3.1), ittrasferixxi għal ġo buqar bil-kejl ta’ 250 ml billi tuża ilma sħun, ħallih jagħli, ħallih jiksaħ u żidu sal-volum bl-ilma. Ħaltu u ffiltrah għal ġo buqar nadif minn ġo filtru dry pleated. Armi l-ewwel 30 ml tal-filtrat. 5.2. Kejl permezz ta’ assorbiment atomiku Billi żżid bl-ilma is-soluzzjoni standard (3.5), ipprepara mill-anqas 5 soluzzjonijiet ta’ referenza ta’ konċentrazzjoni li tiżdied, li tikkorrespondi mal-firxa ta’ l-aħjar miżuri fl-spettrofotometru. Żid ma’ kull soluzzjoni 10 ml soluzzjoni tal-melħ ta’ strontium (3.4) u imbagħad żidu sal-volum ta’ 100 ml bl-ilma. Żid bl-ilma b’parti waħda aliquot tal-filtrat miksub minn 5.1.1, 5.1.2 jew 5.1.3, sabiex jinkiseb konċentrat tal-manjesju li jkun fil-limiti tal-konċentrazzjoni tas-soluzzjonijiet ta’ referenza. Il-konċentrazzjoni ta’ l-aċidu idrokloriku ta’ din is-soluzzjoni m’għandix teċċedi 0.4 N. Żid 10 ml soluzzjoni tal-melħ strontium (3.4) u imbagħad żid sal-volum ta’ 100 ml bl-ilma. Kejjel l-assorbiment tas-soluzzjoni li għandha tiġi stabbilita u tas-soluzzjonijiet ta’ referenza f’285.2 nm. 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Ikkalukula l-kwantità tal-manjesju fil-kampjun b’relazzjoni mas-soluzzjonijiet ta’ referenza. Niżżel ir-riżultat bħala perċentwali tal-kampjun. Kemm jista’ jiġi ripetut Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhom × ikunu aktar minn 5 %, f’valur relattiv. 3. TIĠI STABBILITA L-FIBRA MHUX MAĦDUMA 1. Skop u Għan B’dan il-metodu huwa possibbili li jiġi stabbilita fl-għalf il-kwantità tas-sustanzi organiċi mingħajr grass li ma jdubux f’mezzi aċidi u alkaliniċi u huma deskritti konvenzjonalment bħala fibra mhux maħduma. 2. Prinċipju Il-kampjun, li jitneħħielu l-grass meħtieġ, huwa trattat suċċessivament b’soluzzjonijiet jagħlu ta’ aċidu sulfuriku u idrossidu tal-potassju ta’ konċentrazzjonijiet speċifikati. Il-fdalijiet jiġu separati permezz ta’ filtrazzjoniji fil-preżenza ta’ asbestos, maħsula, imnixxfa, miżuna u magħmula rmied f’900 oC. It-telf fil-piż riżultanti mill-proċess tat-tagħmiel f’irmied jikkorrespondi mal-fibra mhux maħduma preżenti fil-kampjun tat-test. 3. Reaġenti 3.1. Aċidu sulfuriku 0.26 N. 3.2. Asbestos trattat: Żid ma’ l-asbestor tat-tip użat bi griġjol Gooch madwar 5 darbiet daqs il-piż tiegħu aċidu idrokloriku (volum 1 aċidu idrokloriku, d: 1.19 + 3 volumi ta’ ilma). Għalli t-taħlita għal madwar 45 minuta, ħalliha tiksaħ u ffiltraha minn ġo lembut Buchner. Aħsel il-fdalijiet l-ewwel bl-ilma sakemm jisparixxi l-aċidu idrokloriku mill-ilma tal-ħasil, u imbagħad bl-acetone (3.6). Nixxef l-asbestos fil-forn tat-tnixxif u imbagħad agħamlu irmied għal sagħtejn f’900 oC. Ħallih jiksaħ u sommu ġo flixkun bit-tapp. L-Asbestos ittrattat b’dan il-mod jista’ jintuża bosta drabi. Għandu jkun ta’ l-ispeċifikazzjonijiet mogħtija f’5. dwar it-test bjank. 3.3. Emulsjoni kontra r-rawgħa (eż silikonju). 3.4. Soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju 0.23 N. 3.5. Aċidu idrokloriku 0.5 N. 3.6. Acetone. 3.7. Diethyl ether. 4. Apparat 4.1. Buqari ta’ kapaċità mill-anqas 600 ml, bil-marki tal-kejl fil-livell ta’ 200 ml. 4.2. Diski tal-porċellana ta’ dijametru ta’ madwar 80 mm u ta’ ħxuna ta’ madwar 4 mm, imtaqqbin b’madwar 32 toqba, kull waħda ta’ dijametru ta’ madwar 4 mm. 4.3. Buqari tal-"vacuum" bit-tappijiet tal-lastku li jesgħu madwar 2 litri, bil-marki tal-kejl fil-livell ta’ 800 ml u mwaħħlin b’lembut tal-ħġieġ ta’ dijametru ta’ 120 mm. 4.4. Platti tal-filtru ta’ dijamentru ta’ madwar 40 mm u ħoxnin madwar 4 mm, bit-truf imxenglin sabiex joqogħdu fil-kon tal-lembut (4.3), imtaqqab b’madwar 16-il toqba, kull waħda ta’ dijametru ta’ madwar 4 mm, u miksi b’xibka tal-wajer, b’daqs tax-xibka ta’ madwar mm 1. Iż-żewġ platti u x-xibka tal-wajer għandhom ikunu jirreżistu għall-aċidi u għall-alkali. 4.5. Griġjoli li jagħmlu rmied il-platinu jew is-silica. 4.6. Forn muffle ta’ l-elettriku kkontrollat permezz ta’ termostat. 4.7. Apparat li jnixxef. 4.8. Filtru ta’ l-asbestos: Dendel 2.0 g asbestos (3.2) f’100 ml ilma. Iffiltra taħt vakwu fuq platt tal-filtru miksi bix-xibka tal-wajer (4.4) u mpoġġi fil-lembut tal-buqar tal-vakwu (4.3). Iġbor il-filtrat u ffiltra għal darb’oħra minn ġo l-istess filtru. Skarta l-filtrat. 5. Proċedura Iżen sa l-eqreb mg 3 g tal-kampjun u 2 g asbestos ittrattat (3.2) ġo buqar (4.1), żid 200 ml aċidu sulfuriku (3.1) u ftit qtar ta’ l-emulsjoni kontra l-formazzjoni tar-rawgħa (3.3). Agħamlu jgħali malajr u ħallih jgħali għal eżattament 30 minuta. Sabiex iżomm volum kostanti, agħtti l-buqar b’apparat li jkessaħ bħal buqar bil-qiegħ tond ta’ madwar 500 ml li fih jiċċirkola l-ilma kiesaħ. Waqqfu milli jgħali billi żid madwar 50 ml ilma kiesaħ u ffiltrah minnufih taħt vakwu minn ġo filtru ta’ l-asbestos ippreparat minn qabel kif muri f’4.8. Aħsel il-fdalijiet b’ħames lottijiet ta’ madwar 100 ml ta’ ilma sħun ħafna sabiex tikseb volum finali tal-filtrat ta’ 800 ml. Ittrasferixxi il-fdalijiet b’mod kwantitattiv għal ġol-buqar (4.1) li l-ewwel ikun twaħħallu dixx tal-porċellana (4.2) sabiex jirregolah meta jgħali. Żid 200 ml soluzzjoni tal-idrossidu tal-putassju (3.4). Għallih malajr u ħallih jgħali għal eżattament 30 minuta. Żid madwar 50 ml ilma kiesaħ u ffiltrah minnufih taħt vakwu minn ġo filtru ta’ l-asbestos ippreparat minn qabel kif muri f’4.8. Aħsel il-fdalijiet b’ilma sħun ħafna sakemm l-ilma tal-ħasil ikun newtru (ittestjah bil-karta tal-litmus), imbagħad tlett darbiet bl-acetone (3.6) (madwar 100 ml acetone b’kollox). Ittrasferixxi l-fdalijiet b’mod kwantitattiv għal ġo griġjol li fih jintgħamel l-irmied (4.5), farrak fejn meħtieġ u nixxef għal piż kostanti fil-for li jnixxef f’ 130 oC. Ħallih jiksaħ fl-apparat li jnixxef (4.7) u iżen malajr. Poġġi l-griġjol fil-forn muffle (4.6) u ħallih isir irmied għal madwar 30 minuta f’900 oC. Ħallih jisaħ fl-apparat tat-tnixxif (4.7) u iżen malajr, Agħmel test bjank billi tapplika l-istess proċedura lill-asbestor ittrattat (3.2), imma mingħajr il-kampjun. It-tnaqqis fil-piż li jirriżulta mill-proċess ta’ l-irmied ta’ 6 g ta’ asbestos m’għandux ikun aktar minn 10 mg. 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Il-kontenut tal-fibra mhux maħduma, bħala perċentwali tal-kampjun, jingħata bil-proporzjon ta’: · 100 3 fejn: a = tnaqqis fil-piż wara l-proċess ta’ l-irmied matul id-determinazzjoni; b = tnaqqis fil-piż wara l-proċess ta’ l-irmied matul it-test bjank. Kemm jista’ jiġi repetut Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhomx jeċċedu: 0.3, f’valur assolut, għall-kontenuti tal-fibra mhux maħduma anqas minn 10 %; 3 %, f’valur relattiv, għall-kontenuti tal-fibra mhux maħduma ugwali għal jew aktar minn 10 %. 7. Osservazzjonijiet 7.1. L-għalf li jkun fih aktar minn 10 % żjut u grass għandu jitnaqqaslu l-grass qabel l-analiżi bid-diethyl ether (3.7). Sabiex isir dan, qiegħed il-kampjun tat-test (3 g miżuna sa l-eqreb mg) fuq filtru ta’l-asbestos (4.8). Iksi 3 darbiet b’madwar 50 ml diethyl ether (3.7) u kull darba ffiltra bir-reqqa taħt vakwu. Ittrasferixxi l-kampjun tat-test bill-grass imneħħi u l-asbestor b’mod kwantittattiv għal ġo buqar (4.1) u kompli l-analiżi kif muri f’5. 7.2. Għalf li fih żjut jew grass li ma jistgħux jitneħħew direttament għandu jitneħħilhom il-grass kif muri f’7.1 u jitneħħilhom il-grass darb’oħra wara li l-attakk ta’ l-aċidu jkun tlaħlaħ mill-fdalijiet. Sa biex tagħmel dan, aħsel dan l-attakk mill-fdalijiet 3 darbiet bl-acetone (3.6) (100 ml b’kollox), imbagħad 3 darbiet b’50 ml diethyl ether (3.7). Imbagħad ittrasferixxi l-fdalijiet b’mod kwantitattiv għal ġo buqar (4.1) u kompli l-analiżi kif muri fit-tieni paragrafu tal-5 (trattament b’soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju). 7.3. Jekk l-għalf ikun fih ħafna kalċju (iktar minn 2 % kalċju), qiegħed il-kampjun tat-test (3 g miżuna sa l-eqreb mg) ġo buqar (4.1) b’100 ml aċidu idrokloriku 0.5 N (3.5) u ħallih joqgħod sakemm jiksaħ f’temperatura friska għal 5 minuti. Iffiltra immedjatament u aħsel bl-ilma kiesaħ. Uża bħala għajnuna għall-filtrazzjoni 2.0 g ta’ asbestos kif speċifikat għat-togħlija bl-aċidu sulfuriku. Jekk il-filtrazzjoni tkun diffiċli, rattaba b’sospensjoni ta’ acetone (3.6). Imbagħad kompli kif muri fin-nru 5. -------------------------------------------------- ANNESS II 1. STABBILITÀ TAR-RETINOL (VITAMINA A) 1. Għan u skop B’dan il-metodu huwa possibbli tistabbilixxi l-kwantità ta’ retinol (Vitamina A) fl-għalf, konċentrat u t-taħlitiet minn qabel. Il-limitu ta’ isfel tad-determinazzjoni huwa 10000 IU/kg għall-ikel li fih kulur ogħli u 4000 IU/kg għall-oħrajn [1]. Il-prodotti huma kklassifikati f’żewġ gruppi, skond il-preżunt kontenut ta’ retinol tagħhom: Grupp A: kontenuti aktar baxxi minn 200000 IU/kg; Grupp B: kontenuti daqs jew akbar minn 200000 IU/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun jiġi idrolizzat meta jkun sħun b’soluzzjoni ta’ l-idrossidu tal-potassju f’mezz ta’ l-ethanol u fil-preżenza ta’ antiossidant jew f’atmosfera ta’ nitroġenu. It-taħlita tiġi estratta b’1,2-dichlorethane. L-estratt jiġi evaporat sa ma jinxef u ttrattat b’pitrolju ħafif. Is-soluzzjoni tiġi kkromatografata fuq kolonna ta’ ossidu ta’ aluminju (għall-prodotti ta’ Grupp B, il-kromatografija hija mitluba biss f’ċerti każijiet). Għall-prodotti ta’ Grupp A ir-retinol huwa stabbilit permezz ta’ spettrofotometrija f’610 nm wara żvilupp ta’ kumpless ikkulurit skond ir-reazzjoni Carr-Price; għall-prodotti ta’ Grupp B permezz ta’ spettrofotometrija fil-UV f’325 nm. 3. Reaġenti (a) użati għall-analiżi ta’ prodotti tal-Gruppi A u B 3.1. 96 % (v/v) etanol. 3.2. 10 % (w/v) soluzzjoni ta’ sodium ascorbate a.p., jew 3.3. Nitroġenu purifikat. 3.4. 50 % (w/v) soluzzjoni ta’ idrossidu tal-putassju a.p. 3.5. Soluzzjoni tal-idrossidu tal-putassju 1 N a.p. 3.6. Soluzzjoni tal-idrossidu tal-putassju 0.5 N a.p. 3.7. 1,2-dichlorethane a.p. 3.8. Pitrolju ħafif, firxa li fiha jagħli: 30-50 oC. Jekk meħtieġ, ippurifika kif ġej: ħawwad 1000 ml pitrolju ħafif ma lottijiet ta’ 20 ml ta’ aċidu sulfuriku konċentrat sakemm l-aċidu jibqa’ bla kulur. Neħħi l-aċidu u aħsel il-pitrolju ħafif suċċessivament b’500 ml ilma, darbtejn b’250 ml ta’ 10 % (w/v) soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju u tlett darbiet b’500 ml ilma. Neħħi s-saff ta’ l-ilma, nixxef il-pitrolju ħafif għal siegħa fuq faħam attiv u s-sulfat tas-sodju ħieles mill-ilma, ffiltra u ddistilla. 3.9. Ossidu ta’ l-aluminju, standardizzat skond Brockmann: agħmlu rmied għal 8 siegħat f’750 oC, kessaħ ġo dessikatur u żommu ġo flixkun tal-ħġieġ kannella b’tap tal-ħġieġ mitħun. Qabel ma tużaħ fil-kromatografija agħmlu niedi kif ġej: qiegħed ġo flixkun tal-ħġieġ kannella 10 g ta’ osidu tal-aluminju u 0.7 ml ta’ ilma, issiġilla b’tapp, erġa saħħan għal 5 minuti f’banju tal-misħun waqt li tħawwdu. Ħallih jiksaħ. Ivverifika l-attività ta’ l-aluminju hekk ippreparat billi tissuġġetta kwantità magħrufa ta’ retinol (3.17) (ca. 500 IU) mal-proċedura ta’ 5.3 u 5.4 u vverifika l-irkupru. 3.10. Ossidu ta’ l-aluminju bażiku, livell ta’ attività 1 (Woelm, Merck jew ekwivalenti). 3.11. Diethyl ether pur. Neħħi l-perossidi u t-traċċi tal-ilma permezz ta’ kromatografija fuq kolonna ta’ ossidu bażiku ta’ l-aluminju (3.10). (25 g ossidu ta’ l-aluminju għal kull 250 ml diethyl ether.) 3.12. Soluzzjonijiet ta’ pitrolju ħafif (3.8) f’4, 8, 12, 16 u 20 % (v/v) diethyl ether (3.11). 3.13. Soluzzjoni ta’ sulfat tas-sodju 0.5 molari f’70 % (v/v) gliċerina, ippreparata mis-sulfat tas-sodju a.p. (b) użata biss għall-analiżi ta’ prodotti tal-Grupp A 3.14. Benzina cristaliżżabbli a.p. 3.15. Kloroformu a.p. Neħħi l-etanol, phosgene u t-traċċi ta’ ilma permezz ta’ kromatografija fuq kolonna ta’ ossidu bażiku ta’ aluminju (3.10) (50 g ta’ ossidu tal-aluminju għal kull 200 ml kloroformu; jingħata l-parir li jiġi ikkormatografat l-ewwel 50 ml ta’ eluate għat-tieni darba). 3.16. Reaġent Carr-Price: ħawwad madwar 25 g antimonju trikloridu a.p. (miżmum ġo dessikatur) b’100 ml kloroformu (3.15) sakemm is-soluzzjoni tkun saturata. Depożitu żgħir ta’ antimonju trikloridu ma’ jikkawżax problemi. Żid 2 ml acetic anhydride a.p. Żommu ġo refriġeratur ġo flixkun tal-ħġieġ kannella b’tap tal-ħġieġ mitħun. Il-soluzzjoni żżomm għal bosta ġimgħat. 3.17. Retinol — standardizzat spettrofotometrikalment. (ċ) użat biss għall-analiżi tal-prodotti tal-Grupp B 3.18. Isopropanol, għall-kromatografija. 4. Apparat 4.1. Banju tal-ilma. 4.2. Apparat għall-evaporazzjoni permezz ta’ vakwu b’buqari tondi ta’ kapaċitajiet differenti. 4.3. Tubi tal-kromatografija tal-ħġieġ (tul: 300 mm; dijametru intern: madwar 13 mm). 4.4. Spettrofotometru b’ċelloli ta’ 10 mm. Qisien fil-UV jeħtieġu ċelloli tas-silica. 4.5. Lampi tal-UV xierqa għall-365 nm. 5. Proċedura N. B. L-operazzjonijiet kollha għandhom jitwettqu l-bogħod mid-dawl dirett, fejn meħtieġ f’apparat tal-ħġieġ kannella. 5.1. Kampjun tat-Test Mill-kampjun diviż b’mod fin, ħu kampju tat-test proporzjonali għall-preżunt kontenut ta’ retinol, għalhekk: 0.1-1.0 g għall-konċentrati (kontenuti akbar minn 20000 IU/g); 3.0-5.0 g għal taħlitiet minn qabel (kontenuti ta’ bejn 400 u 20000 IU/g); 10-20 g għal taħlitiet minerali; 30 g għal prodotti tal-Grupp A. Minnufih qiegħed il-kampjun tat-test ġo buqar ta’ 500 ml b’tapp tal-ħġieġ mitħun. 5.2. Idrolisi u estrazzjoni [2] Żid suċċessivament għall-kampjun tat-test 40 ml etanol (3.1), 2 ml soluzzjoni ta’ sodium ascorbate (3.2) [3], 10 ml soluzzjoni ta’ idrossidu tal-postassju (3.4) u 2 ml soluzzjoni ta’ sodium sulphide (3.13). Saħħan għal 30 minuta f’70-80 oC taħt kondensatur reflux u mbagħad ħallih jiksaħ taħt nixxija ta’ ilma. Żid 50 ml etanol (3.1) u 100 ml 1,2-dichlorethane (3.7) (meħud b’pipetta). Ħawwad bis-saħħa u imbagħad ferra’ l-likwidu li jitla’ fil-wiċċ ġo kontenitur għat-tferriegħ. Żid mal-kontenitur 150 ml soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (3.5), ħawwad għal 30 sekonda u ħallih joqgħod sakemm jisseparaw is-saffi. Iġbor is-saffa tad-dichlorethane (is-saff ta’ isfel) f’kontenitur tat-tferriegħ, żid 40 ml soluzzjoni tal-idrosidu tal-potassju (3.6), ħawwad għal 10 sekondi u ħallih joqgħod sakemm jisseparaw is-saffi. Iġbor is-saff tad-dichlorethane f’kontenitur tat-tferriegħ u aħsel 6-8 darbiet b’lottijiet ta’ 40 ml ta’ ilma sakemm ikun ħieles mill-alkali (test tal-phenolphthalein). Iġbir is-saffa tad-dichlorethane u neħħi l-aħħar traċċi ta’ ilma billi tuża strixxi ta’ karta tal-filtru. Evapora sakemm jinxef parti mis-soluzzjoni taħt vakwu u fuq il-banju tal-ilma f’40 oC. Ittratta malajr il-fdalijiet b’5 ml pitrolju ħafif (3.8). Għall-prodotti ta’ Grupp A, ikkromatografa kif jidher f’5.3.1. Għall-prodotti ta’ Grupp B, ittrasferixxi is-soluzzjoni f’50 ml buqar bil-kejl, żidu sal-volum b’pitrolju ħafif (3.8), ħallat u kejjel id-densità ottika kif jidher f’5.4.2. 5.3. Kromatografija 5.3.1. Prodotti tal-Grupp A Imla tubu tal-kromatografija (4.3) sa ogħli ta’ 200 mm b’10 g ossidu tal-aluminju (3.9) li jkun ġie mħammeġ qabel bil-pitrolju ħafif (3.8). Daħħal is-soluzzjoni miksuba f’5.2 fit-tubu u minnufih żid 20 ml pitrolju ħafif (3.8). Aħsel suċċessivament b’lottijiet ta’ 10 ml ta’ soluzzjonijiet ta’ pitrolju ħafif f’4, 8, 12, 16 u 20 % diethyl ether (3.12) taħt pressjoni jew vakwu parzjali, bir-rata tal-qtar tkun ta’ 2 jew 3 qatriet kull sekonda. Il-karotene għandha tinħasel l-ewwel [4]. Ir-retinol huwa ġeneralment maħsul b’soluzzjoni ta’ pitrolju ħafif f’20 % diethyl ether (3.12). Il-ħasla tiġi segwita taħt dawl UV (irradjazzjoni qasira tal-kolonna bil-lampa tal-merkurju). Iż-żona florexxenti tar-retinol tissepara ċarament miż-żoni sofor tal-xanthophyll li jsegwuha. Iġbor il-frazzjoni tal-ħasla li fiha r-retinol f’buqar "Erlenmeyer". 5.3.2. Prodotti tal-Grupp B Il-Kromatografija għandha ssir biss jekk il-kejl tad-densità ottika miksub f’5.4.2 ma jikkonformax mal-ħtiġiet mogħtija f’5.4.2. Jekk il-kromatografija tkun meħtieġa, qiegħed fil-kolonna tal-kromatografija parti tas-soluzzjoni fil-pitrolju ħafif miksuba f’5.2, li jkun fiha madwar 500 IU ta’ retinol, u ikkromatografa kif jidher f’5.3.1. 5.4. Kejl tad-densità ottika 5.4.1. Prodotti tal-Grupp A Evapora sakemm jinxef taħt vakwu l-ħasla li fiha r-retinol miksub f’5.3.1. Ittratta l-fdalijiet b’2 ml petrol (3.14). Ħu 0.3 ml ta’ din is-soluzzjoni u żid 3 ml tar-reaġent Carr-Price (3.16). Jiżviluppa kulur blu. Kejjel id-densità ottika bi spettrofotometru f’610 nm eżattament 30 sekonda wara li tkun bdiet ir-reazzjoni. Stabilixxi il-kontenut ta’ retinol b’referenza għall-kurva standard miksuba minn soluzzjonijiet ta’ petrol ta’ konċentrazzjonijiet ta’ retinol standard li jiżdiedu ttrattati bir-reaġent Carr-Price (2 sa 16 IU retinol-standard (3.17) kull 0.3 ml petrol (3.14) +3 ml reaġent Carr-Price (3.16)). Il-kurva standard għandha tiġi verifikata regolarment u spiss billi tintuża s-soluzzjoni standard tar-reaġent Carr-Price u preparata friska. 5.4.2. Prodotti tal-Grupp B Ħu parti aliquot tas-soluzzjoni fil-pitrolju ħafif miksuba f’5.2 li jkun fiha madwar 200 IU retinol. Evapora sakemm jinxef taħt vakwu u ttratta il-fdalijiet b’25 ml isopropanol (3.18). Kejjel id-densità ottika bi spettrofotometru f’325, 310 u 334 nm. L-assorbiment massimu jinsab f’325 nm. Il-kontenut ta’ retinol fis-soluzzjoni huwa kalkolat kif ġej: E325 · 18.30 = IU ta’ retinol/ml Iżda, l-proporzjon tad-densitajiet ottiċi E310 : E325 u E334 : E325 għandu jkun 6: 7 = 0·857. Jekk wieħed minn dawn il-proporzjonijiet jiddifferixxi sostanzjalment minn dan il-valur (0·880), il-kejl tad-densitajiet ottiċi għandu jkun preċedut mill-kromatografija skond il-metodu mogħti f’5.3.2. Jekk il-miżuri tad-densitajiet ottiċi li jsiru wara l-kromatografija juri li l-proporzjonijiet imsemmija hawn fuq għadhom differenti sostanzjalment mill-valur ta’ 0·857 (0·880), id-determinazzjoni għandha ssir skond il-metodu mogħti għall-prodotti ta’ Grupp A. 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Ikkalkula l-kontenut tar-retinol tal-kampju billi tieħu akkont tal-piż tal-kampjun tat-test u d-diluzzjonijiet mwettqa fil-kors tal-analiżi. Esprimi r-riżultati f’IU ta’ retinol kull kg ta’ għalf jew kull kg ta’ konċentrat jew taħlita minn qabel. Possibilità ta’ repetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhomx ikunu aktar minn: - 20 %, f’valur relattiv, għall-kontenuti ta’ retinol anqas minn 75000 IU/kg; - 15000 IU għal kontenuti bejn 75000 u 150000 IU/kg; - 10 %, f’valur relattiv, għal kontenuti bejn 150000 u 250000 IU/kg; - 25000 IU għal kontenuti bejn 25000 u 500000 IU/kg; - 5 %, f’valur relattiv, għal kontenuti akbar minn 500000 IU/kg. 2. STABBILITÀ TA’ THIAMINE (VITAMINA B1, ANEURINE) 1. Skop u Għan B’dan il-metodu huwa possibbli tistabilixxi il-kwantità ta’ thiamine (aneurine, Vitamina B1) fl-Għalf, konċentrati u taħlitiet minn qabel. Il-limitu tan-naħa ta’ isfel għad-determinazzjoni huwa 5 ppm. 2. Prinċipju Is-soluzzjoni hija ttrattat meta tkun għada sħuna bl-aċidu sulfuriku mħallat bl-ilma u imbagħad idrolizzat enżemikament. Is-soluzzjoni miksuba hija suġġetta għall-ossidazzjoni alkalina. It-thiochrome li jifforma jiġi estratt b’isobutanol u stabbilit permezz ta’ fluorometrija. 3. Reaġenti 3.1. 100 μg/ml soluzzjoni ta’ thiamine standard: ħoll 112.3 mg thiamine hydrochloride, imnixxef qabel taħt vakwu sa piż kostanti, f’1000 ml aċidu sulfuriku 0.2 N (3.2). Jekk maħżun ġo post frisk u mudlam, din is-soluzzjoni żżomm għal xahar. 3.2. Aċidu sulfuriku 0..2 N. 3.3. Sodium bisulphite pur. 3.4. 20 % (w/v) soluzzjoni ta’ potassium ferricyanide a.p. 3.5. 25 % (w/v) soluzzjoni ta’ potassium hydroxide a.p. 3.6. Taħtlita ta’ ossidazzjoni: Ħallat 2 ml soluzzjoni ta’ potassium ferricyanide (3.4) ma’ 48 ml soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju (3.5). Din it-taħlita ma żżomx għal aktar minn 4 siegħat. 3.7. Isobutanol a.p. 3.8. Soluzzjoni ta’ sodium acetate 2.5 N. 3.9. Preparazzjoni "multienzymatic" li jkun fiha protease, phosphatase u amylase (eż, Clarase). 3.10. 96 % (v/v) etanol. 4. Apparat 4.1. Banju tal-ilma. 4.2. Ċentrifuga (3500 rpm), b’tubi ta’ 30 sa 50 ml li jkun fihom tappijiet tal-ħġieġ mitħun. 4.3. Fluorimetru. 5. Proċedura 5.1. Idrolisi enżematiku Qiegħed ġo kull wieħed minn żewġ fliexken mmarkati ta’ 250ml, A u B, ammonti identiċi tal-kampjun diviż b’mod fin li jkun fih madwar 100 μg thiamine u 125 ml aċidu sulfuriku (3.2). Żid ukoll, mal-flixkun A biss, 1.0 ml soluzzjoni standard (3.1) (standard intern). Ħawwad il-fliexken bis-saħħa, qegħdhom fuq il-banju tal-ilma jgħali u żommhom hemmhekk għal 15-il minuta, ħawwad kultant. Ħallihom jiksħu sa madwar 45 oC. Ma’ kull flixkun żid 20 ml soluzzjoni ta’ sodium acetate (3.8) u 0.5 g preparazzjoni multienzemika (3.9), imbagħad ħallihom joqogħdu għal 20 minuta fit-temperatura tal-kamra. Żid 20 ml soluzzjoni ta’ sodium acetate (3.8), żid sal-volum bl-ilma, omoġeniżża u ffiltra. Iġbor il-filtrati A u B wara li tkun skartajt l-ewwel 15 ml. Ipprepara s-soluzzjonijiet li ġejjin: 5.1.1. Soluzzjoni ta’ referenza T Qiegħed ġo tubu taċ-ċentrifuga (4.2) 5 ml filtrat A u madwar 10 mg sodium bisulphite (3.3). Għarraq it-tubu fil-banju tal-ilma jagħli għal 15-il minuta u ħallih jiksaħ sat-temperatura tal-kamra. 5.1.2. Soluzzjonijiet A (standard intern) u B (kampjun) Qiegħed 5 ml tal-filtrat A f’tubu taċ-ċentrifuga (4.2) u 5 ml filtrat B f’tubu ieħor taċ-ċentrifuga (4.2). 5.2. Ossidazzjoni Żid mas-soluzzjonijiet T, A u B 5 ml tat-taħlita ta’ ossidazzjoni (3.6) u, minuta wara, 10 ml isobutanol (3.7). Għalaq it-tubi u ħawwad bis-saħħa għal 5 sekondi. Ħallihom joqgħodu għal minuta u iċċentrifuga sabiex tissepara s-saffi. Minn kull tubu ittrasferixxi 5 ml ta’ saff ta’ tal-likwidu li jitla’ fil-wiċċ isobutanol f’kull flixkun immarkat ta’ 25 ml, żid sa l-volum bl-etanol (3.10) u omoġeniżża (= estratti T, A u B). 5.3. Tkejjil il-florexxenza Kejjel il-miżuri fil-kejl li fiha il-florimetru jagħti l-aħjar tweġiba għall-florexxenza tat-thiochrome. Irradja f’madwar 365 nm. Aġġusta l-istrument saż-żero billi tuża l-estratt T. Kejjel l-intensità tal-florexxenza tal-estratti A u B. 6. Kalkolazzoni tar-riżultati Il-kontenut ta’ thiamine f’mg/kg tal-kampjun jingħata bil-proporzjon: c fejn: a = l-intensità tal-florexxenza tal-estratt A (standard intern); b = l-intensità tal-florexxenza tal-estratt B (kampjun); c = piż tal-kampjun tat-test fi g; d = l-ammont ta’ thiamine fi μg miżjud mal-kampjun tat-test (standard intern). Possibilità ta’ repetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhomx jeċċedu: 10 %, f’valur relattiv, għal kontenuti anqas minn 500 mg/kg, u 5 %, f’valur relattiv, għal kontenuti daqs jew akbar minn 500 mg/kg. 3. STABBILITÀ TA’ L-AĊIDU ASCORBIC U L-AĊIDU DEHYDROASCORBIC (VITAMINA Ċ) 1. Skop u Għan B’dan il-metodu jagħmilha possibbli li tiġi stabbilita l-kwantità sħiħa tal-aċidi ascorbic u dehydroascorbic (Vitamina Ċ) fl-għalf, konċentrat u taħlitiet minn qabel. Il-limitu tan-naħa ta’ isfel tad-determinazzjoni huwa 5 ppm. Il-prodotti huma klassifikati f’żewġ gruppi, skond il-kontenut ta’ Vitamina Ċ preżunt fihom: Grupp A: kontenuti iktar baxxi minn 10 g/kg; Grupp B: kontenuti daqs jew akbar minn 10 g/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun huwa mdendel f’soluzzjoni miżjuda bl-ilma ta’ aċidu metafosforiku u estratt bil-kloroformu. Il-fażi bl-ilma hija ttrattata b’soluzzjoni ta’ 2,6-dichlorophenol-indophenol sabiex tittrasforma l-aċidu ascorbic f’aċidu dehydroascorbic, u imbagħad b’soluzzjoni ta’ 2,4-dinitrophenylhydrazine. Il-hydrazone li tifforma hija estratta b’taħlita ta’ ethyl acetate, aċidu aġetiku nġazzat u acetone. Il-soluzzjoni tiġi kromatografata fuq kolonna tal-ġel tas-silica, il-likwidu tal-ħasil jiġi evaporat sakemm jinxef u il-fdalijiet jiddewbu f’aċidu sulfuriku mħallat bl-ilma. Id-densità ottika tas-soluzzjoni hija mkejjla bi spettrofotometru f’509 nm. Għall-prodotti tal-Grupp A il-likwidu tal-ħasil li ġej mill-kromatografija fuq il-kolonna jiġi aktar suġġett għal saff irqieq ta’ kromatografija sabiex jiżola l-hydrazone. 3. Reaġenti 3.1. Soluzzjoni standard ta’ 0.05 % L-aċidu ascorbic: dewweb 50 mg L-aċidu ascorbic a.p. f’madwar 20 ml soluzzjoni ta’ aċidu metafosforiku (3.2) u żidu sa 100 ml bl-ilma. Ipprepara minnufih qabel l-użu. 3.2. 10 % (w/v) soluzzjoni tal-aċidu metafosforiku: wara li titħan f’meħrież, dewweb fl-ilma 200 g aċidu metafosforiku a.p. u żidu sa 2000 ml bl-ilma. Żommu f’4 oC. Dan jibqa’ stabbli għal ġimgħa. 3.3. Kloroformu a.p. 3.4. Soluzzjoni ta’ 0.5 % (w/v) 2,6-dichlorophenol-indophenol a.p. Ipprepara minnufih qabel l-użu. 3.5. Għajnuna għall-filtrazzjoni (S. u S. Nru 121 jew bħalu). 3.6. Soluzzjoni aċida ta’ 2 % (w/v) 2,4-dinitrophenylhydrazine: ħoll 2 g 2,4-dinitrophenylhydrazine f’100 ml aċidu sulfuriku mħallat bl-ilma (25 ml aċidu sulfuriku a.p., d: 1.84, miżjud billi żżidu sa 100 ml bl-ilma). Jekk maħżuna f’temperatura friska din is-soluzzjoni żżomm għal ġimgħa. 3.7. Nitroġenu, jew 3.8. "Dijossidu tal-karbun". 3.9. Taħlita ta’ ethyl acetate a.p./aċidu aċetiku nġazzat/acetone a.p.: 96/2/2 fil-volum. 3.10. Taħlita ta’ dichloromethane a.p./aċidu aċetiku nġazzat: 97/3 fil-volum. 3.11. Ġel tas-silica, qies tal-partiċella: 0.05 sa 0.2 mm. 3.12. Ġel tas-silica tal-grad Stahl H, għall-kromatografija tas-saff irqieq. 3.13. Aċidu sulfuriku miżjud bl-ilma: qiegħed 105 ml ta’ ilma fi flixkun bil-marki sa 200 ml, żidu sa l-voluma bl-aċidu sulfuriku a.p., d: 1.84. 3.14. Is-solvent li jaħsel għall-kromatografija ta’ saff irqieq: ħallat 75 ml diethyl ether a.p., 25 ml ethyl acetate a.p. u 4.0 ml 96 % (w/v) aċidu aċetiku a.p. Erġa għamlu mill-ġdid wara 2 jew 3 kromatografiji. 4. Apparat 4.1. Banju tal-ilma b’termostat imwaħħal u ffissat għal 20 oC. 4.2. Ċentrifuga (3500 rpm) b’tubi ta’ 40 sa 50 ml bit-tappijiet tal-ħġieġ mitħun. 4.3. Evaporatur bil-vakwu li jdur bi flixken ta’ 250 ml. 4.4. Tubi tal-kromatorgrafija tal-ħġieġ (tul: 100 mm, dijametru intern: 20 mm), b’diska sintered (eż tubi Allihn). 4.5. Spettrofotometru jew kolorimetru bil-filtri b’ċelloli ta’ 10 mm. 4.6. Apparat għall-kromatografija ta’ saff irqieq, b’platti tal-ġel tas-silica (3.12) miksija sa fond ta’ 0.5 sa 0.6 mm. (Platti magħmulin lesti huma xierqa.) Nixxef il-platti għal 2 1/2 sa 3 siegħat fil-forn tat-tnixxif f’120 sa 130 oC. Ħallihom jiksħu u imbagħad żommhom fl-apparat li jnixxef għal mill-anqas 24 siegħa qabel l-użu. 4.7. Il-forn tat-tnixxif għandu jkun issettjat f’120 sa 130 oC. 5. Proċedura 5.1. Estrazzjoni Qiegħed ġo kull wieħed minn żewġ fliexken mmarkati ta’ 250 ml (bit-tappijiet tal-ħġieġ mitħun), A u B, kwantitajiet l-istess ta’ kampjun maqsum fin li fih madwar 200 μg vitamina Ċ. Żid mal-flixkun A biss 0.4 ml soluzzjoni standard (3.1) u ħallat, billi tħawwad bil-mod (standard intern). Ma’ kull flixkun żid 30 ml kloroformu (3.3) u 25 ml soluzzjoni ta’ aċidu metafosforiku (3.2) f’4 oC. Hawwad għal ftit u imbagħad ħallih joqgħod għal 10 sa 15-il minuta. Żid 25 ml ilma, għalaq il-fliexken, ħawwad bis-saħħa għal 10 sekondi u ħallih joqgħod għal 10 sa 15-il minuta fil-banju tal-ilma (4.1). Iċċentrifuga sabiex tissepara il-fażi bl-ilma mill-fażi bil-kloroformu. Għamel l-operazzjonijiet fl-istess ħin, kif deskritt hawn taħt, fuq l-estratti bl-ilma A (standard intern) u B. 5.2. Ossidazzjoni Billi tuża pipetta, ittrasferixxi 40 ml tas-soluzzjoni bl-ilma fil-wiċċ (bi sħab ħafif) miksuba f’5.1 għal tubu ta’ reazzjoni b’tap tal-ħġieġ mitħun, żid 0.5 sa 1 ml soluzzjoni 2,6-dichlorophenol-indophenol (3.4) u ħawwad. Kulur aħmar jiżviluppa li għandu jibqa’ għal mill-anqas 15-il minuta. Imbagħad żid madwar 300 mg għajnuna għall-filtrazzjoni (3.5), ħawwad u iffiltra minn ġo filtru pleated niexef. Il-filtrat m’għandux għalfejn ikun ċar. 5.3. Reazzjoni b’2,4-dinitrophenylhydrazine u estrazzjoni hydrazone Billi tuża pipetta, ittrasferixxi 10 ml tal-filtrat miksub f’5.2 għal tubu taċ-ċentrifuga (4.2), żid 2 ml soluzzjoni 2,4-dinitrophenylhydrazine (3.6) u ħawwad. Għaddi nixxija ta’ nitroġenu (3.7) u diossidu tal-karbonju (3.8) malajr minn ġo t-tubu, għalaq it-tubu u għarrqu għal madwar 15-il siegħa (matul il-lejl) fil-banju tal-ilma (4.1). Imbagħad żid 3 ml ilma, 20 ml tat-taħlita ethyl acetate/aċidu aċetiku nġazzat/acetone (3.9) u madwar 800 mg għajnuna għall-filtrazzjoni (3.5). Għalaq it-tubu, ħawwad bis-saħħa għal 30 sekonda u ċċentrifuga. Qiegħed 15 ml tal-fażi tal-likwidu li jitla’ fil-wiċċ fi flixkun tal-evaporazzjoni u evapora taħt pressjoni mnaqqsa fl-evaporatur li jdur (4.3) sakemm jinkiseb fdali żejtni. Dewwed il-fdalijiet f’2 ml ta’ taħlita ethyl acetate/aċidu aċetiku nġazzat/acetone (3.9) billi terġa ssaħħan sa f’50 oC, ħallih jiksaħ, żid 10 ml ta’ taħlita dichloromethane/aċidu aċetiku nġazzat (3.10) u ħawwad. 5.4. Kromatografija fuq kolonna Imla tubu tal-kromatografija (4.4) sa livell ta’ 30 mm bit-taħlita dichloromethane/aċidu aċetiku nġazzat (3.10). Dendel (waqt li tħawwad) 5 g ġel tas-silica (3.11) f’30 ml tat-taħlita dichloromethane/aċidu aċetiku nġazzat (3.10); ferrgħa l-likwidu ġo tubu. Ħallih joqgħod u imbagħad ikkompressaħ taħt nitroġenu (3.7) bi pressjoni baxxa. Ferrgħa għal ġo t-tubu is-soluzzjoni miksuba f’5.3, laħlaħ il-f, lixkun bi kwantità żgħira ta’ taħlita ta’ dichloromethane/aċidu aċetiku nġazzat (3.10) u ferrgħa għal ġo t-tubu, imbagħad imla dan tal-aħħar bit-taħlita (3.10) u ipproċedi sabiex taħsel il-kolonna bl-istess taħlita (3 jew 4 lottijiet ta’ madwar 5 ml) sakemm jinkiseb likwidu tat-tlaħliħ bla kulur. Skarta l-parti tal-likwidu tat-tlaħliħ li jkun kulurit isfar. Laħlaħ il-parti l-ħamranija fin-naħa ta’ fuq tal-kolonna bit-taħlita ta’ ethyl acetate/aċidu aċetiku nġazzat/acetone (3.9), iġbor il-likwidu tat-tlaħliħ u evapora sakemm jinxef. 5.4.1. Għall-Prodotti ta’ Grupp A (kontenuti ta’ vitamina C aktar baxxi minn 10 g/kg), dewweb il-fdalijiet f’2.0 ml tat-taħlita ta’ ethyl acetate/aċidu aċetiku nġazzat/acetone (3.9) u ikkromatografa minnufih fuq saff irqieq kif jidher f’5.5. 5.4.2. Għall-prodotti ta’ Grupp B (kontenuti ta’ vitamina C daqs jew aktar minn 10 g/kg), ittratta il-fdalijiet żejtnin b’4.0 ml bl-aċidu sulfuriku miżjud bl-ilma (3.13), ħawwad bis-saħħa ħalli d-dewweb il-fdalijiet kompletament u kejjel id-densità ottika kif jidher f’5.6. 5.5. Kromatografija ta’ saff irqieq Għamel l-operazzjonijiet doppji kif deskritt kif ġej. Qiegħed f’linja rqieqa fuq il-platt (4.6) 0.5 ml tas-soluzzjoni miksuba f’5.4.1. Billi tuża is-solvent tat-tlaħliħ (3.14) żviluppah għal mill-anqas 20 minuta f’tank saturat bil-fwar tas-solvent, sakemm żona ikkulurita roża hydrazone tiġi separata b’mod ċar. Ħallih jinxef fil-beraħ. Immarka il-limitu taż-żona r-roża, laqqat iż-żona bi spatula u b’mod kwantitattiv ittrasferixxi it-trab għal ġo tubu tal-kromatografija (4.4). Laħlaħ wara xulxin darba b’2 ml u darbtejn b’1.5 ml tat-taħlita ta’ ethyl acetate/aċidu aċetiku nġazzat/acetone (3.9). Iġbor il-likwidu tat-tlaħliħ fi flixkun żgħir (l-aħħar parti għandha tkun bla kulur). Evapora sakemm jinxef, ittratta il-fdalijiet żejtnin b’4.0 ml aċidu sulfuriku miżjud bl-ilma (3.13), ħawwad bil-qawwa sabiex iddewweb il-fdalijiet kompletament u kejjel id-densità ottika. 5.6. Tkejjil tad-densita’ ottika Kejjel id-densità ottika bi spettrofotometru f’509 nm 20 sa 30 minuta wara li iddewweb il-fdalijie fl-aċidu sulfuriku. Ħu l-kejl billi tqabblu mal-aċidu sulfuriku miżjud bl-ilma (3.13). 5.7. Test bjank Għamel test bjnak billi tapplika l-istess proċedura imma mingħajr il-kampjun. 6. Kalkolazzjoni tar-riżultati Il-kontenut tal-vitamina C tal-kampjun f’g per kg jingħata bil-proporzjon: · 2 · 10d fejn: a = densità ottika tal-bjank; b = densità ottika tas-soluzzjoni interna standard; c = densità ottika tas-soluzzjoni tal-kampjun; d = piż, fi grammi, tal-kampjun tat-test. Possibilità ta’ repetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ detereminazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhomx ikunu aktar minn: 10 %, f’valur relattiv, għall-kontenut ta’ vitamina C anqas minn 10 g/kg u 5 %, f’valur relattiv, għall-kontenuti daqs jew aktar minn 10 g/kg. [1] 1 IU = 0.3 μg ta’ retinol. [2] Għall- għalf mill-ħalib u l-prodotti b’tendenza li jaqgħdu jew jintefħu, irdoppja l-kwantità ta’ reaġenti murija fl-ewwel u fit-tieni paragrafi ta’ 5.2. [3] Għandu jiżdied is-sodium ascorbate meta l-idrolisi jsir ġo atmosfera ta’ nitroġenu. [4] Il-kontenut tal-karotene jista’ jiġi stabbilit bil-kejl tad-densità ottika f’450nm;E 1 %1 cm = 2600 --------------------------------------------------