Id-Direttiva tal-Kummissjoni 1999/27/KE ta’ l-20 ta’ April 1999 li tistabilixxi metodi Komunitarji ta’ l-analiżi għad-determinazzjoni ta’ amprolju, diklażuril u karbadoks fl-għalf u li temenda d-Direttivi 71/250/KEE, 73/46/KEE u tħassar id-Direttiva 74/203/KEETest b’rilevanza għaż-ŻEE



Official Journal L 118 , 06/05/1999 P. 0036 - 0052

CS.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

ET.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

HU.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

LT.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

LV.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

MT.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

PL.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

SK.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251

SL.ES Chapter 3 Volume 25 P. 235 - 251



Id-Direttiva tal-Kummissjoni 1999/27/KE ta’ l-20 ta’ April 1999 li tistabilixxi metodi Komunitarji ta’ l-analiżi għad-determinazzjoni ta’ amprolju, diklażuril u karbadoks fl-għalf u li temenda d-Direttivi 71/250/KEE, 73/46/KEE u tħassar id-Direttiva 74/203/KEE (Test b’rilevanza għaż-ŻEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni ta’ metodi Komunitarji ta’ teħid ta’ kampjuni u l-analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [1], kif l-aħħar emendata bl-Att ta’ l-Adezzjoni ta’ l-Awstrija, l-Finlandja u l-Isvezja, u b’mod partikolari l-Artikolu 2 tagħha, (1) Billi d-Direttiva 70/373/KEE tistabilixxi li kontrolli uffiċjali ta’ l-għalf bl-iskop ta’ kontroll tal-konformità mal-ħtiġiet li joriġinaw permezz tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet aministrattivi li jirregolaw il-kwalità u l-komposizzjoni tagħhom għandhom jitwettqu bl-użu ta’ metodi Komunitarji ta’ teħid ta’ kampjuni u l-analiżi; (2) Billi d-Direttiva tal-Kunsill 70/524/KEE tat-23 ta’ Novembru 1970 li tikkonċerna additivi fl-għalf [2], kif l-aħħar emendata bir-Regolament tal-Kummissjoni 45/199 [3] tistabilixxi li l-kontenut ta’ l-amprolju u d-diklażuril għandu jiġi indikat fuq l-ittikkettar meta dawn is-sustanzi huma miżjuda ma’ taħlitiet minn qabel u fl-għalf; billi l-awtorizzazzjoni ta’ karbadoks għall-użu bħala additiv għall-għalf ġiet irtirata bir-Regolament tal-Kummissjoni 2788/98 tat-22 ta’ Diċembru 1988 li jemenda d-Direttiva tal-Kunsill 70/524/KEE li tikkonċerna l-addittivi fl-għalf fir-rigward ta’ l-irtirar ta’ l-awtorizzazzjoni għal ċerti promoturi ta’ tkabbir [4] u kontroll uffiċjali ta’ l-użu possibbli illegali ta’ sustanzi pprojbiti huwa neċessarju; (3) Billi metodi Komunitarji ta’ analiżi għandhom jiġu stabbiliti għall-kontroll ta’ dawn is-sustanzi; (4) Billi l-ewwel Direttiva tal-Kummissjoni 71/250/KEE tal-15 ta’ Ġunju 1971 li tistabilixxi metodi Komunitarji ta’ l-analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [5], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 98/54/KE [6] tistabilixxi metodi ta’ l-analiżi, inter alia, għad-determinazzjoni ta’ żejt tal-mustarda u teobromin; billi l-metodi deskritti m’għad- homx aktar validi fid-dawl ta’ l-avvanzi fit-tagħrif xjentifiku u tekniku għall-iskop intiż tagħhom; billi huwa għalhekk xieraq li dawn il-metodi jitħassru; (5) Billi r-raba’ Direttiva tal-Kumissjoni 73/46/KEE tal-5 ta’ Diċembru 1972 li tistabilixxi metodi Komunitarji ta’ l-analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [7], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 98/54/KE tistabilixxi metodi ta’ l-analiżi, inter alia, għad-determinazzjoni ta’ retinol (vitamina A); billi l-metodu deskritt m’għadux validu fid-dawl ta’ l-avvanzi fit-tagħrif xjentifiku u tekniku għall-iskop intiż; billi huwa għalhekk xieraq li l-metodu għal retinol jitħassar; (6) Billi l-ħames Direttiva tal-Kummissjoni 74/203/KEE tal-25 ta’ Marzu 1974 li tistabilixxi metodi Komunitarji ta’ l-analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ l-għalf [8], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva 81/680/KEE [9], tistabbilixxi metodi ta’ l-analiżi għad-determinazzjoni tal-prodotti tal-lamtu u tad-degradazzjoni tal-lamtu ta’ piż molekolari għoli fl-għalf li jkun fih il-kolletti tal-pitravi, il-polpa tal-pitravi, il-partijiet ta’ fuq jew il-weraq imqadda tal-pitravi, il-polpa tal-patata, il-ħmira mnixxfa, il-prodotti arrikkiti bl-inulina jew il-greaves, l-amprolju, l-etopabat, id-dinitolmid, in-nikarbażin u menadjon (il-vitamina K3); billi l-metodi kollha deskritti f’dik id-Direttiva m’għadhomx validi fid-dawl ta’ l-avvanzi fit-tagħrif xjentifiku u tekniku għall-iskop intiż tagħhom; billi huwa għalhekk xieraq li din id-Direttiva titħassar; (7) Billi l-miżuri li hemm provvediment dwarhom f’din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti dwar l-Għalf, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 L-Istati Membri għandhom jipprovdu li l-analiżi mwettqa bl-iskop tal-kontrolli uffiċjali tal-kontenut ta’ l-amprolju, d-diklażuril u l-karbadoks fl-għalf u fit-taħlitiet minn qabel huma mwettqa bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness t’hawnhekk. Artikolu 2 Id-Direttiva 71/250/KEE hija emendata kif ġej. 1. Fl-Artikolu 1 il-kliem "żejt tal-mustarda" u "teobromina" huma mħassra. 2. Il-Punti 8 u 13 ta’ l-Anness huma mħassra. Artikolu 3 Id-Direttiva 73/46/KEE hija emendata kif ġej. 1. Artikolu 2 huwa mħassar. 2. Anness II huwa mħassar. Artikolu 4 Id-Direttiva 74/203/KEE hija mħassra. Artikolu 5 L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ, sa mhux aktar tard mil-31 ta’ Ottubru 1999, il-liġijiet, ir-regolamenti jew id-deisposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa biex ikunu konformi mad-deisposizzjonijiet ta’ din id-Direttiva. Għandhom minnufih jinfurmaw lill-Kummissjoni bihom. Għandhom japplikaw il-miżuri mill-1 ta’ Novembru 1999. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn il-miżuri, dawn għandu jkollhom referenza għal din id-Direttiva jew ikollhom magħhom din ir-referenza fil-waqt tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-Proċedura ta’ kif issir din ir-referenza għandha tiġi adottata mill-Istati Membri. Artikolu 6 Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fl-20 jum ta’ wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Artikolu 7 Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fl-20 ta’ April 1999. Għall-Kummissjonim Franz Fischler Membru tal-Kummissjoni [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU L 270, ta’ l-14.12.1970, p. 1. [3] ĠU L 6, tat-12.1.1999, p. 3. [4] ĠU L 347, tat-23.12.1998, p. 31. [5] ĠU L 155, tat-12.7.1971, p. 13. [6] ĠU L 208, ta’ l-24.7.1998, p. 49. [7] ĠU L 83, tat-30.3.1973, p. 21. [8] ĠU L 108, tat-22.4.1974, p. 7. [9] ĠU L 246, tad-29.8.1981, p.32. -------------------------------------------------- ANNESS Parti A DETERMINAZZJONI TA’ L-AMPROLJU 1-ġ(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl)-2-methyl-pyridinium chloride hydrochloride 1. L-għan u l-iskop Dan il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ l-amprolju fl-għalf u f’taħlitiet minn qabel. Il-limitu tal-iskoperta huwa 1 mg/kg, il-limitu tad-determinazzjoni huwa 25 mg/kg. 2. Il-Prinċipju Il-kampjun huwa estratt b’taħlita ta’ ilma-metanol. Wara d-diluwizzjoni mal-fażi mobbli u l-filtrazzjoni mill-membrana il-kontenut ta’ l-amprolju huwa ddeterminat permezz ta’ kromatografija f’ fażi likwida ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) bi skambju katoniku, bl-użu ta’ rivelatur UV. 3. Reaġenti 3.1. Il-Metanol. 3.2. L-Aċetonitril, grad HPLC. 3.3. L-Ilma, grad HPLC. 3.4. Soluzzjoni ta’ dihydrogen phosphate, c = 0,1 mol/l Dewweb 13.80 g sodium dihydrogen phosphate monohydrate fl-ilma (3.3) f’garafina mmarkata b’ 1000 ml, żid sal marka bl-ilma (3.3) u ħallat. 3.5. Soluzzjoni ta’ perklorat tas-sodju, c = 1,6 mol/l Dewweb 224,74 g monoidrat tal-perklorat tas-sodju fl-ilma (3.3) f’garafina mmarkata b’1000 ml, żid sal marka bl-ilma (3.3) u ħallat. 3.6. Il-fażi mobbli għal HPLC (ara l-osservazzjoni 9.1). Taħlita ta’ l-aċetonitril (3.2), soluzzjoni tas-sodium dihydrogen phosphate (3.4) u tas-soluzzjoni tal-perklorat tas-sodju (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Qabel l-użu iffiltra minn filtru tal-membrana a 0.22 μm (4.3) u neħħi l-gass mis-soluzzjoni (e.g. Fil-banju ultrasoniku (4.4) għal mill-inqas 15-il minuta). 3.7. Is-sustanza standard: l-amprolju pur, l-((4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)methyl)-2-methyl-pyridinium chloride hydrochloride, E 750 (ara 9.2). 3.7.1. Is-soluzzjoni standard tal-ħażna ta’ l-amprolju, 500 μg/ml Iżen sa l-eqreb 0,1 mg, 50 mg ta’ l-amprolju (3.7) f’garafina ta’ 100 ml immarkata, dewweb fi 80 ml metanol (3.1) u qiegħed il-garafina għal 10 minuti f’banju ultrasoniku (4.4). Wara t-trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura tal-kamra, żid sal-marka bl-ilma u ħallat. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.7.2. Is-soluzzjoni standard intermedja ta’ l-amprolju, 50 μg/ml Ippipetta 5 ml tas-soluzzjoni standard tal-ħażna (3.7.1) f’garafina mmarkata b’ 50 ml, żid sal marka bis-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.8) u ħallat. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.7.3. Is-soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni Ittrasferixxi 0,5, 1 u 2 ml tas-soluzzjoni intermedja standard (3.7.2) f’serje ta’ garafini ggradwati b’ 50 ml. Żid sal-marka bil-fażi mobbli (3.6) u ħallat. Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 0,5, 1 u 2 ìg ta’ l-amprolju għal kull ml rispettivament. Dawn is-soluzzjonijiet għandhom jiġu ppreparati friski qabel l-użu. 3.8. Is-solvent ta’ l-estrazzjoni Taħlita tal-metanol (3.1)-ilma 2 + 1 (v + v). 4. Apparat 4.1. Tagħmir HPLC b’sistema ta’ injezzjoni, adattata għall-volumi ta’ l-injezzjoni ta’ 100 μl. 4.1.1. Kolonna likwida kromatografika 125 mm x 4 mm, skambju katjoniku Nukleosil, ippakkjar 10 μm jew ekwivalenti 4.1.2. Rivelatur UV b’aġġustament varjabbli ta’ wavelength jew rivelatur b’serje ta’ dijodi. 4.2. Filtru tal-membrana, materjal PTFE, 0,45 μm. 4.3. Filtru tal-membrana, 0,22 μm. 4.4. Banju ultrasoniku 4.5. Shaker mekkaniku jew stirrer manjetiku. 5. Proċedura 5.1. Ġenerali 5.1.1. Forniment fl-imbjank Biex isir it-test ta’ l-irkupru (5.1.2) forniment fl-imbjankgħandu jkun analiżat biex jikkontrolla li la l-amprolju u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma huma presenti. Il-forniment fl-imbjank m’għandux ikun ta’ tip simili għal dak tal-kampjun u l-amprolju jew inkella s-sustanzi intereferenti m’għandhomx ikunu skoperti. 5.1.2. Test ta’ l-irkupru Test ta’ l-irkupru għandu jitwettaq bl-l-analiżi tal-forniment fl-imbjank li jkun ġie msaħħan b’żieda ta’ kwantità ta’ amprolju, simili għal dak presenti fil-kampjun. Sabiex jiġi msaħħaħ il-livell ta’ 100 mg/kg, ittrasferixxi 10 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard, (3.7.1) għal garafina konika ta’ 250 ml u ħalliha tevapora għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml. Żid 50 g tal-forniment fl-imbjank, ħawwad sewwa u ħalli għal 10 minuti u erġa’ ħawwad ħafna drabi qabel ma tipproċedi bil-pass ta’ l-estrazzjoni (5.2). Alternattivament, jekk forniment fl-imbjanksimili għal dak tal-kampjun mhux disponibbli (ara 5.1.1) it-test ta’ l-irkupru jista’ jitwettaq permezz tal-metodu ta’ soluzzjoni standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jiġi analiżżat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ amprolju simili għal dak diġà presenti fil-kampjun. Dan il kampjun huwa analiżżat flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat bit-tnaqqis. 5.2. Estrazzjoni 5.2.1. Taħlitiet minn qabel (kontenut < 1 % amprolju) u l-għalf Iżen sa l-eqreb 0,01 g, 5 sa 40 g tal-kampjun, jiddependi mill-kontenut ta’ l-amprolju, f’garafina konika 500 ml u żid 200 ml tas-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-garafina fil-banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-garafina mill-banju ultrasoniku u ħawwadha għal siegħa fuq ix-shaker jew ħawwad fl-istirrer manjetiku (4.5). Iddiluwixxi l-alikwot ta’ l-estratt bil-fażi mobbli (3.6) għall-kontenut ta’ l-amprolju ta’ 0,5 sa 2 ìg/ml u ħawwad (ara l-osservazzjoni 9.3). Iffiltra 5 sa 10 ml ta’ din is-soluzjoni diluwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.3). 5.2.2. Taħlitiet minn qabel (kontenut > = l % amprolju) Iżen sa l-eqreb 0,001 g, 1 sa 4 g tat-taħlita minn qabel, jiddependi fuq il-kontenut ta’ l-amprolju, f’garafina konika ta’ 500ml u żid 200ml tas-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.8). Qiegħed il-garafina f’banju ultrasoniku (4.4) u ħalli għal 15-il minuta. Neħħi l-garafina mill-banju ultrasoniku u ħawwad għal siegħa fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-istirrer manjetiku (4.5). Iddiluwixxi l-alikwot ta’ l-estratt bil-fażi mobbli (3.6) ma’ kontenut ta’ l-amprolju ta’ 0,5 sa 2 μg/ml u ħawwad. Iffiltra 5 sa 10ml ta’ din is-soluzzjoi ddiluwita minn filtru tal-membrana (4.2). Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.3). 5.3. Id-determinazzjoni HPLC 5.3.1. Parametri: Il-kondizzjonijiet li ġejjin huma offruti għall-gwida, kondizzjonijiet oħrajn jistgħu jiġu wżati sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti. Kolonna likwida kromatografika (4.1.1): | 125 mm 4 mm, skambju katoniku Nukleosil 10 SA, imballaġġ 10 lm, jew ekwivalenti. | Fażi mobbli (3.6): | Taħlita ta' aċetonitril (3.2), soluzzjoni ta' fosfat ta' didroġenu tas-sodju (3.4) u soluzzjoni ta' perklorat tas-sodju (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). | Rata tal-nixxija: | 0,7 sa 1 ml/min. | Wavelength tal-iskoperta: | 264 nm. | Volum ta' l-injezzjoni: | 100 μl. | Ikkontrolla l-istabilità tas-sistema kromatografika, u injetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.7.3) li jkun fiha 1,0 μg/ml, sakemm jintlaħħqu għoljiet medji u l-ħinijiet ta’ retenzjoni kostanti. 5.3.2. Grafika tal-kalibrazzjoni Injetta kull soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.7.3) diversi drabi u ddetermina l-medja ta’ l-għoli tal-quċċati għal kull konċentrazzjoni. Pinġi grafika tal-kalibrazzjoni billi tuża l-medja ta’ l-għoli tal-quċċati tas-soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti fi μg/ml bħala l-abscissae. 5.3.3. Is-soluzzjoni kampjun Injetta l-estratt kampjun (5.2) diversi drabi bl-użu ta’ l-istess volum kif meħud għas-soluzzjonijeit ta’ kalibrazzjoni u ddetermina l-medja ta’ l-għoli tal-peak (arja) tal-limiti ta’ l-amprolju. 6. Kalkolu tar-riżultati Mill-għoli medju (żona) tal-quċċati ta’ l-amprolju tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun fi μg/ml b’referenza għall-grafika tal-kalibrazzjoni (5.3.2). Il-kontenut ta’ l-amprolju "w" fi mg/kg tal-kampjun jingħata bil-formula li ġejja: m mg/kg meta: V = il-volum tas-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.8) f’ml skond 5.2 (jiġifieri 200 ml) β = konċentrazzjoni ta’ l-amprolju ta’ l-estratt tal-kampjun (5.2) fi μg/ml f = il-fattur ta’ diluwizzjoni skond 5.2 m = il-massa tal-porzjon tat-test fi g 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. Identità L-identità ta’ l-analite tista’ tiġi kkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża rivelatur ta’ serje ta’ dijodi li bih l-ispektra ta’ l-estratt tal-kampjun (5.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.7.3) li jkun fiha 2,0 cg/ml huma pparagunati. 7.1.1. Ko-kromatografija Estratt kampjun (5.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.7.3). L-ammont ta’ l-amprolju miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ l-amprolju li jinstab fl-estratt tal-kampjun. Biss l-għoli tal-quċċata ta’ l-amprolju għandu jitjieb wara li jittieħed akkont kemm ta’l-ammont miżjud u tad-diluwizzjoni ta’ l-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandu jkun fi ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-quċċata ta’ l-amprolju ta’ l-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ. 7.1.2. L-iskoperta tas-serje ta’ dijodi Ir-riżultati huma evalwati skond il-kriterji li ġejjin: (a) Il-wavelength ta’ l-assorbizzjoni massima tal-kampjun u ta’ l-ispektra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’ marġini ddeterminata mis-setgħa tar-risoluzzjoni tas-sistema tal-iskoperta. Għall-iskoperta ta’ serje ta’ dijodi dan huwa tipiku fi ± 2 nm. (b) Bejn 210 u 320 nm, il-kampjun u l-ispektra standardirreġistrati fl-apiċi tal-quċċata tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet ta’ l-ispektrum fil-firxa 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva. Din il-kriterja għandha tkun sodisfatt meta l-istess maxima huma presenti u fl-ebda punt osservat il-punt ta’ devjazzjoni bejn iż-żewġ spectra ma jeċċedi 15 % ta’ l-assorbizzjoni ta’ l-analit standard. (ċ) Bejn 210 u 320 nm, l-ispektra ta’ l-inklinazzjoni ‘l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ‘l isfel tal-quċċata prodotti mill-kampjun ta’ l-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet ta’ l-ispektrum fil-firxa ta’ 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva. Dan il-kriterju jiġI sodisfatt meta l-istess maxima huma presenti u meta fil-punti osservati kollha id-devjazzjoni bejn l-ispektra ma teċċedix 15 % ta’ l-assorbizzjoni ta’ l-ispektrum ta’ l-apiċi peak. Jekk waħda minn dawn il-kriterji ma tiġix sodisfatta, il-presenza ta’ l-analite ma tkunx ġiet ikkonfermata. 7.2. Rata ta’ repetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fl-istess kampjun m’għandhiex teċċedi: - 15 % relattiv għall-valur ogħla għal kontenuti ta’l-amprolju minn 25 mg/kg sa 500 mg/kg - 75 mg/kg għal kontenuti ta’ l-amprolju bejn 500 mg/kg u 1000 mg/kg - 7,5 % relattiv għall-valur l-aktar għoli għall-kontenuti ta’ l-amprolju ta’ aktar minn 1000 mg/kg 7.3. Irkupru Għal kampjun imsaħħaħ (fl-imbjank) l-irkupru għandu jkun mill-anqas 90 %. 8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Studju kollaborattiv kien ġie rranġat li fih tlett tipi ta’ għalf tat-tjur (il-kampjun 1-3), għalf minerali wieħed (il-kampjun 4) u taħlita waħda minn qabel (il-kampjun 5) kienu analizzati. Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja L : numru ta' laboratorji. n : numru ta' valuri singoli. sr : devjazzjoni standard tar-rata tar-repetizzjoni. CVr : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-repetizzjoni. sR : devjazzjoni standard tar-rata tar-riproduzzjoni. CVR : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-riproduzzjoni | Kampjun 1 (forniment fl-imbjank) | Kampjun 2 | Kampjun 3 | Kampjun 4 | Kampjun 5 | L | 14 | 14 | 14 | 14 | 15 | n | 56 | 56 | 56 | 56 | 60 | medja (mg/kg) | __ | 45,5 | 188 | 5129 | 25140 | sr (mg/kg) | __ | 2,26 | 3,57 | 178 | 550 | CVr (%) | __ | 4,95 | 1,90 | 3,46 | 2,20 | SR (mg/kg) | __ | 2,95 | 11,8 | 266 | 760 | CVR (%) | __ | 6,47 | 6,27 | 5,19 | 3,00 | Kontenut nominali (mg/kg) | __ | 50 | 200 | 5000 | 25000 | 9. Osservazzjonijiet 9.1. Jekk il-kampjun ikun fih it-tjamin, il-quċċata tat-tjamin fil-kromatogramma tidher ftit qabel il-quċċata ta’ l-amprolju. Wara dan il-metodu l-amprolju u t-tjamin għandhom jiġu separati. Jekk l-amprolju u t-tjamin mhumiex separati bil-kolonna (4.1.1) wżata f’dan il-metodu, issostitwixxi sa 50 % tal-porzjon ta’ l-aċetonitril tal-fażi mobbli (3.6) bil-metanol. 9.2. Skond il-British Pharmacopoeia, l-ispektrum tas-soluzzjoni ta’ l-amprolju (c = 0,02 mol/l) f’aċidu idrokloriku (c = 0,1 mol/l) juri maxima fi 246 nm u 262 nm. L-assorbizzjoni għandha tammonta għal 0,84 b’ 246 nm u 0,80 b’ 262 nm. 9.3. L-estratt għandu dejjem jiġi diluwit bil-fażi mobbli, għax inkella l-ħin tar-retenzjoni tal-quċċata ta’ l-amprolju jista’ jiċċaqlaq b’mod sinifikanti, minħabba bidliet fis-saħħa jonika. PARTI B DETERMINAZZJONI TAD-DIKLAŻURIL (+)-4-chlorphenyl ġ2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) phenyl ħ acetonitrile. 1. Għan u Skop ta’ l-applikazzjoni Il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ diklażuril fl-għalf u taħlitiet minn qabel. Il-limitu ta’ l-iskoperta huwa 0,1 mg/kg, il-limtu tad-determinazzjoni huwa 0,5 mg/kg. 2. Prinċipju Wara ż-żieda ta’ standard internazzjonali, il-kampjyn huwa estratt b’metanol aċidifikat. Għall-għalf, l-alikwot ta’ l-estratt huwa ppurifikat fuq kartuċċa ta’ l-estrazzjoni ta’ fażi solida. Id-Diklażuril jinħareġ mill-kartuċċa b’taħlita tal-metanol aċidifikat u ta’ l-ilma. Wara l-evaporazzjoni, ir-residwu jinħall fi DMF/ilma. Għal taħlitiet minn qabel, l-estratt huwa evaporat u r-residwu jinħall fi DMF/ilma. Il-kontenut tad-diklażuril huwa ddeterminat bi kromatografija likwida high performance ta’ fażi riversata ternary gradient (HPLC) bl-użu tar-rivelatur UV. 3. Reaġenti 3.1. Ilma, grad HPLC. 3.2. Aċetat ta’ l-ammonju. 3.3. Sulfat ta’ l-idroġenu Tetrabutylammonium (TBHS). 3.4. Aċetonitril, grad HPLC. 3.5. Metanol, grad HPLC. 3.6. N,N-dimethylformamide (DMF). 3.7. Aċidu idrokloriku ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Sustanza standard: diklażuril II-24: (+)-4-chlorphenyl (2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl) phenyl) aċetonitrile b’purità garantita, E771. 3.8.1. Soluzzjoni ta’ ħażna standard ta’ dilażuril, 500 μg/ml. Iżen sa l-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard ta’ diklażuril (3.8) f’garafina ta’ 50 ml immarkata. Dewweb f’DMF (3.6), żid sal-marka b’ DMF (3.6) u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża garafina ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.8.2. Soluzzjoni standard tad-diklażuril, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard (3.8.1.) f’garafina mmarkata b’ 50 ml, żid sal marka bi DMF (3.6) u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża garafina ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.9. Sustanza standad interna: 2,6 dichloro-á-(4-chlorophenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2 (3H) - yl) á-methylbenzene-acetonitrile. 3.9.1. Soluzzjoni tal-ħażna standard interna, 500 μg/ml. Iżen sa l-eqreb 0,1 mg 25 mg tas-sustanza standard interna (3.9) f’garafina mmarkata b’ 50 ml. Dewweb fi DMF (3.6), żid sal marka b’ DMF (3.6) u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża garafina ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatur ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.9.2. Soluzzjoni standard interna, 50 μg/ml. Ittrasferixxi 5,00 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard interna (3.9.1) f’garafina mmarkata b’50ml, żid sal marka b’ DMF (3.6) u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża garafina ambra u aħżen fir-refriġeratur. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.9.3. Soluzzjoni interna standard għal taħlitiet minn qabel, p/1000 mg/ml (p = kontenut nominali ta’ diklażuril fit-taħlita minn qabel f’ mg/kg). Iżen sa l-eqreb 0,1 mg p/10 mg tas-sustanza standard interna f’garafina ta’ 100 ml immarkata, dewweb fi DMF (3.6) f’banju ultrasoniku (4.6), żid sal marka b’ DMF u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża garafina ambra u aħżen f’refriġeratur. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.10. Is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni, 2 μg/ml. Ippipetta 2,00 ml soluzzjoni standard ta’ diklażuril (3.8.2) u 2,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2) fi garafina ta’ 50 ml immarkata. Żid 16 ml DMF (3.6), żid sal-marka bl-ilma u ħallat. Din is-soluzzjoni għandha tkun ippreparata friska qabel l-użu. 3.11. C18 kartuċċa ta’ l-estrazzjoni ta’ fażi solida, e.g. Bond Elut, ta’ daqs: 1 cc, massa li tassorbi: 100 mg. 3.12. Solvent ta’ l-estrazzjoni: methanol aċidifikat. Ippipetta 5,0 ml aċidu idrokloriku (3.7) fi 1000 ml metanol (3.5), u ħallat. 3.13. Fażi mobbli għal HPLC. Elwent A: aċetat ta’ l-ammonju - soluzzjoni tas-sulfat ta’ l-idroġenu tetrabutylammonium. 3.13.1. Dewweb 5 g aċetat ta’ l-ammonju (3.2) u 3,4 g TBHS (3.3) f’ 1000 ml ilma (3.1) u ħallat. 3.13.2. Elwent B: aċetonitril (3.4). 3.13.3. Elwent C: metanol (3.5). 4. Apparat 4.1. Shaker mekkaniku. 4.2. Tagħmir għal ternary gradient HPLC. 4.2.1. Kolonna likwida kromatografika, Hypersil ODS, 3 μm imballaġġ, 100 mm x 4,6 mm, jew ekwivalenti. 4.2.2. Rivelatur UV b’aġġustament ta’ wavelength varjabbli jew rivelatur ta’ serje ta’ dijodi. 4.3. Evaporatur rotary tal-vakwu 4.4. Filtru tal-membrana, 0,45 μm. 4.5. Pajp tal-ġbir għall-vakwu. 4.6. Banju ultrasoniku 5. Proċedura 5.1. Ġenerali 5.1.1. Fornitura fil-bjank Fornitura fil-bjank għandha tkun analiżżata sabiex ikun hemm kontroll li la d-diklażuril u lanqas sustanzi interferenti ma jkunu presenti. Il-fornitura fil-bjank għandh jtkun simili għal dak tal-kampjun u l-l-analiżi diklażuril jew is-sustanzi interferenti m’għandhomx jiġu skoperti. 5.1.2. Test ta’ l-irkupru Test ta’ l-irkupru għandu jtiwettaq billi jkun analiżżat il-fornitura fil-bjankli tkun ġiet imsaħħa biż-żieda ta’ kwantità ta’ diklażuril simil għal dak presenti fil-kampjun. Sabiex tkun imsaħħa f’livell ta’ l mg/kg żid 0,1 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard (3.8.1.) għal 50 g ta’ fornitura fil-bjank, ħallat sewwa u ħalli għal 10 min, u erġa’ ħallat għal diversi drabi qabel ma tipproċedi (5.2.). Alternattivament, jekk fornitura fil-bjanksimili għal dik tal-kampjun mhijiex disponibbli (ara 5.1.1), it-test ta’ l-irkupru jista’ jitwettaq permezz tal-metodu addizzjonali standard. F’dan il-każ, il-kampjun li għandu jkun analiżżat huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ diklażuril, simili għal dik diġà presenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analiżżat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jkun ikkalkolat bit-tnaqqis. 5.2. Estrazzjoni 5.2.1. Għalf Iżen sa l-eqreb 0,01 g bejn wieħed u ieħor 50 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal garafina konika 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.2), 200 ml solvent ta’ l-estrazzjoni (3.12) u għalaq b’tapp il-garafina. Ħallat it-taħlita fuq ix-shaker (4.1) tul il-lejl. Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 20 ml tas-supernatant għal gewwa kontenitur adattat tal-ħġieġ u ddiluwixxi bi 20 ml ilma. Itrasferixxi din is-soluzzjoni fuq kartuċċa ta’ l-estrazzjoni (3.11), u għaddi minn vakwu ta’ l-applikazzjoni (4.5.). Aħsel il-kartuċċa bi 25ml tat-taħlita tas-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 65 + 35 (V + V). Warrab il-frazzjonijiet miġbura u elwata l-komposti bi 25ml tat-taħlita tas-solvent ta’ l-estrazzjoni (3.12) u bl-ilma, 80 + 20 (V + V). Evapora din il-frazzjoni sakemm tkun laħqet nixfa permezz ta’ l-evaporatur rotary (4.3) fi 60 °C. Dewweb ir-residwu f’ 1,0 ml DMF (3.6), żid 1,5 ml ilma (3.1) u ħallat. Iffiltra minn filtru tal-membrana (4.4). Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.3). 5.2.2. It-taħlitiet minn qabel Iżen sa l-eqreb 0,001 g bejn wieħed u ieħor 1 g tal-kampjun. Ittrasferixxi għal garafina konika 500 ml, żid 1,00 ml soluzzjoni standard interna (3.9.3), 200 ml solvent ta’ l-estrazzjoni (3.12) u għalaq b’tapp il-garafina. Ħallat it-taħlita tul il-lejl fuq ix-shaker (4.1). Ħalliha toqgħod għal 10 minuti. Ittrasferixxi l-alikwot ta’ 10000/p ml (p = kontenut nominali ta’ diklażuril fit-taħlita minn qabel fi mg/kg) tas-supernatant għal gewwa garafina bil-qiegħ tond ta’ daqs adattat. Evapora sakemm tkun nixfet, taħt pressjoni mnaqqsa bi 60 °C permezz ta’ l-evaporatur rotary (4.3). Erġa’ dewweb mill-ġdid ir-residwu fi 10,0 ml DMF (3.6), żid 15,0 ml ilma (3.1) u ħallat. Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.3). 5.3. Determinazzjoni HPLC 5.3.1. Parametri Il-kondizzjonijiet li ġejjin huma offruti għal-gwida, kondizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti. | | | | —Kolonna likwida kromatografika (4.2.1.): | 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm imballaġġ, jew ekwivalenti | —Fażi mobbli: | Elwent A (3.13.1): | Soluzzjoni ta' l-ilma ta' l-aċetat ta' l-ammonju u s-sulfat ta' l-idroġenu tetrabutyl-ammonium | Elwent B (3.13.2): | aċetonitril | Elwent C (3.13.3): | metanol | —Elution mode: | —inklinazzjoi linejari | —kondizzjonijiet inizjali: A + B + C = 60 + 20 + 20 (v + v + v) | —wara 10 minuti iggrada s-soluzzjoni għal 30 minuta għal: A + B+ C = 45 + 20 + 35 (v + v + v) | Aħsel bi B għal 10 minuti | —Ir-rata tan-nixxija: | 1,5-2 ml/min | —Il-volum ta' injezzjoni: | 20 μl | —Wavelength tar-rivelatur: | 280 ml | Ikkontrolla l-istabilità tas-sistema kromatografika billi tinjetta diversi drabi is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10), li jkun fiha 2 μg/ml, sakemm jintlaħqu għoli kostanti tal-quċċata u l-ħinijiet ta’ retenzjoni. 5.3.2. Is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni Injetta 20 >μl tas-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-quċċata (iż-żona) tad-diklazuril u l-quċċata standard interna. 5.3.3. Is-soluzzjoni kampjun Injetta 20 μl tas-soluzzjoni kampjun (5.2.1. jew 5.2.2.) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-quċċata (iż-żona) tad-diklażuril u l-quċċata standard interna. 6. Kalkolu tar-riżultati 6.1. Għalf Il-kontenut tad-dilżuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula li ġejja: h ·h h ·h · β ·10V mmg/kg meta hd,s = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) tad-diklażuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) hi,s = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) ta’ l-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.1) hd,c = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) tad-diklażuril fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) hi,c = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) ta’ l-istandard intern fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) βd,c = il-konċentrazzjoni ta’ diklażuril fis-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni fi μg/ml (3.10) m = il-massa tal-porzjon tat-test fi g. V = il-volum ta’ l-estratt tal-kampjun skond 5.2.1 (jiġifieri 2,5 ml) 6.2. Taħlitiet minn qabel Il-kontenut ta’ diklażuril w (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula: w = h ·h h ·h · β ·0,2 V·p mmg/kg meta hd,c = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) tad-diklażuril fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) hi,c = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) ta’ l-istandard intern fis-soluzzjoni ta’l-kalibrazzjoni (3.10) hd,s = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) tad-diklażuril fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) hi,s = l-għoli tal-quċċata (iż-żona) ta’ l-istandard intern fis-soluzzjoni kampjun (5.2.2) βd,c = il-konċentrazzjoni ta’ diklażuril fis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) m = il-massa tal-porzjon tat-test fi g V = il-volum ta’ l-estratt tal-kampjun skond 5.2.2 (jiġifieri 2,5 ml) p = il-kontenut nominali ta’ diklażuril fi mg/kg fit-taħlita minn qabel 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. Identità L-identità ta’ l-analit tista’ tkun ikkonfermata bil-kokromatografija, jew billi jintuża rivelatur ta’ serje ta’ dijodi li bih l-ispektra ta’ l-estratt tal-kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) u s-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10) huma pparagunati. 7.1.1. Ko-kromatografija Estratt kampjun (5.2.1 jew 5.2.2) huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.10. L-ammont ta’ diklażuril miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ diklażuril li jinstab fl-estratt tal-kampjun Biss l-għoli tal-quċċata tad-diklażuril u l-quċċata standard interna għandhom jitjiebu wara li jittieħed akkont kemm ta’ l-ammont miżjud u tad-diluwizzjoni ta’ l-estratt. Il-wisa’ tal-quċċata, f’nofs l-għoli tagħha, għandu jkun f’ ± 10 % tal-wisa’ oriġinali tal-quċċata tad-diklażuril jew tal-quċata standard interna ta’ l-estratt tal-kampjun mhux imsaħħaħ. 7.1.2. L-iskoperta tas-serje ta’ dijodi Ir-riżultati huma evalwati skond il-kriterji li ġejjin:: (a) Il-wavelength ta’ l-assorbizzjoni massima tal-kampjun u ta’ l-ispektra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’ marġini determinata mis-setgħa tar-risoluzzjoni tas-sistema tal-iskoperta. Għal skoperta ta’ serje ta’ dijodi dan huwa tipiku fi ± 2 nm. (b) Bejn 210 u 320 nm, il-kampjun u l-ispektra standard irreġistrati fl-apiċi tal-quċċata tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispektrum fil-firxa 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva. Dan il-kriterju għandu jiġi sodisfatt meta l-istess maxima huma presenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spectra ma jeċċedi 15 % ta’ l-assorbizzjoni ta’ l-analit standard. (ċ) Bejn 210 u 320 nm, l-ispektra tal-inklinazzjoni ‘l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ‘l isfel tal-quċċata prodott mill-kampjun ta’ l-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispektrum fil-firxa ta’ 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva. Dan il-kriterju tkun sodisfatt meta l-istess maxima huma presenti u meta fil-punti osservati kollha id-devjazzjoni bejn l-ispektra ma teċċedix 15 % ta’ l-assorbizzjoni tal-ispektrum ta’ l-apiċi tal-quċċata. Jekk waħda minn dawn il-kriterji ma tkunx sodisfatta, il-presenza ta’ l-analit ma tkun ġiet ikkonfermata. 7.2. Ir-Rata tar-repetizzjoni Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli mwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex teċċedi: - 30 % relattiv għall-valur ogħla għal kontenuti tad-diklażuril minn 0,5 mg/kg sa 2,5 mg/kg - 0,75 mg/kg għall-kontenuti ta’ diklażuril bejn 2,5 mg/kg u 5 mg/kg - 15 % relattiv għall-valur l-aktar għoli għal kontenuti ta’ diklażuril ta’ aktar minn 5 mg/kg 7.3. Irkupru Għal kampjun imsaħħaħ (fil-bjank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 80 %. 8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Studju kollaborattiv kien ġie rranġat li fih ħames kampjuni kienu analiżżati minn 11-il laboratorju. Dawn il-kampjuni kienu jikkonsistu minn żewġ taħlitiet minn qabel; waħda kienet imħallta b’matriċi organika (O 100) u l-oħra b’ matriċi inorganika (A 100). Il-kontenut teoretiku huwa 100 mg diklażuril għal kull kg. It-tliet taħlitiet ta’ l-għalf għat-tjur saru minn tlett produtturi differenti (NL) (L1/Z1/K1). Il-kontenut teoretiku huwa 1 mg diklażuril għal kull kg. Il-laboratorji ġew mogħtija istruzzjonijiet biex janaliżżaw kull wieħed mill-kampjuni għal darba jew darbtejn. (Informazzjoni aktar iddettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinsab fil-Ġurnal Internazzjonali ta’ AOAC, il-Volum 77, Nru 6, 1994, p. 1359-1361). Ir-riżultati huma mogħtija fit-tabella li ġejja: L : numru ta' laboratorji. n : numru ta' valuri singoli. sr : Devjazzjoni standardtar-rata tar-repetizzjoni. CVr : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-repetizzjoni.. SR : devjazzjoni standard tar-rata tar-riproduzzjoni CVR : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-repetizzjoni.. | Kampjun 1 A 100 | Kampjun 2 O 100 | Kampjun 3 L 1 | Kampjun 4 Z 1 | Kampjun 5 K 1 | L | 11 | 11 | 11 | 11 | 6 | n | 19 | 18 | 19 | 19 | 12 | Medja | 100,8 | 103,5 | 0,89 | 1,15 | 0,89 | Sr (mg/kg) | 5,88 | 7,64 | 0,15 | 0,02 | 0,03 | CVr (%) | 5,83 | 7,38 | 17,32 | 1,92 | 3,34 | SR (mg/kg) | 7,59 | 7,64 | 0,17 | 0,11 | 0,12 | CVR (%) | 7,53 | 7,38 | 18,61 | 9,67 | 13,65 | Kontenut nomanli (mg/kg) | 100 | 100 | 1 | 1 | 1 | 9. Osservazzjonijiet Ir-reazzjoni tad-diklażuril għandha tkun murija minn qabel bħala lineari tul il-firxa tal-konċentrazzjonijiet imkejjla. Parti C DETERMINAZZJONI TAL-KARBADOKS Methyl 3-(2-quinoxalinylmethylene)carbazate N1,N4-dioxide 1. Għan u Skop ta’ l-applikazzjoni Il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ karbadoks fl-għalf, taħlitiet minn qabel u preparati. Il-limitu tal-iskoperta huwa 1 mg/kg. Il-limtu tad-determinazzjoni huwa 10 mg/kg. 2. Prinċipju Il-kampjun huwa ekwilibrat bl-ilma u estratt bil-metanol-aċetonitril. Għall-għalf, porzjon alikwot ta’ l-estratt iffiltrat huwa soġġett għal tindifa fuq colonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju. Għal taħlitiet minn qabel u preparati porzjon alikwot ta’ l-estratt iffiltrat huwa ddiluwit ma’ konċentrazzjoni xierqa bl-ilma, bil-metanol u bl-aċetonitril. Il-kontenut tal-karbadoks huwa ddeterminat bi kromatografija likwida high performance ta’ fażi-maqluba (HPLC) bl-użu ta’ rivelatur UV 3. Ir-Riaġenti 3. Reaġenti 3.1. Metanol. 3.2. Aċetonitril, grad HPLC. 3.3. Aċidu aċetiku, w = 100 %. 3.4. Ossidu ta’ l-aluminju: newtrali, grad ta’ l-attività I. 3.5. Metanol-aċetonitril 1 + l (v + v). Ħallat 500 ml metanol (3.1) ma’ 500 ml aċetonitril (3.2). 3.6. Aċidu aċetiku, σ = 10 %. Iddiluwixxi 10 ml aċidu aċetiku (3.3) ma’ 100 ml bl-ilma. 3.7. Aċetat tas-sodju, CH3COONa. 3.8. Ilma, grad HPLC. 3.9. Soluzzjoni barriera ta’ l-aċetat, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0. Dewweb 0,82 g ta’ l-aċetat tas-sodju (3.7) f’ 700 ml ilma (3.8) u aġġusta l-pH għal 6,0 bl-aċidu aċetiku (3.6). Ittrasferixxi għal garafina mmarkata, żid sal-marka bl-ilma (3.8) u ħallat. 3.10. Fażi mobbli għal HPLC. Ħallat 825 ml tas-soluzzjoni barriera ta’ l-aċetat (3.9) b’ 175 ml ta’ l-aċetonitril (3.2). Iffiltra minn filtru 0,22 μm (4.5) u neħi l-gass mis-soluzzjoni (eż. b’ultrasonifikazzjoni għal 10 minuti). 3.11. Sustanza standard. Karbadoks pur: Methyl 3-(2-quinoxalinylmethylene)karbazat N1,N4-dioxide, E 850. 3.11.1. Soluzzjoni ħażna standard tal-karbadoks, 100 μg/ml (ara l-punt 5 - Proċedura): Iżen sa l-eqreb 0,1 mg, 25 mg tas-sustanza standard tal-karbadoks (3.11) f’garafina mmarkata ta’ 250 ml. Dewweb f’ metanol-aċetonitril (3.5) b’ultrasonifikazzjoni (4.7). Wara trattament ultrasoniku ġib is-soluzzjoni għat-temperatura tal-kamra, żid sal marka b’ metanol-aċetonitrile (3.5) u ħallat. Kebbeb il-garafina b’fojl ta’ l-aluminju jew uża apparat tal-ħġieġ ambri u aħżen f’refriġeratur. F’temperatura ta’ < = 4 °C is-soluzzjoni hija stabbli għal xahar. 3.11.2. Is-soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni Ittrasferixxi 2,0, 5,0, 10,0, u 20,0 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard (3.11.1) f’serje ta’ garafini kkalibrati ta’ 100 ml. Żid 30 ml ilma, żid sal marka bil-metanol-aċetonitril (3.5) u ħallat. Kebbeb il-garafina bil-fojl ta’ l-aluminju Dawn is-soluzzjonijiet jikkorrispondu għal 2,0, 5,0, 10,0 u 20,0 μg/ml ta’ karbadoks rispettivament. Is-soluzzjonijiet tal-kalibrazjoni għandhom ikunu ppreparati friski qabel l-użu. Nota: Għad-determinazzjoni tal-karbadoks fl-għalf li jkun fihom anqas minn 10 mg/kg, soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni b’konċentrazzjoni taħt 2,0 μg/ml għandhom jiġu ppreparati. 3.12. Taħlita ta’ l-ilma-(metanol-aċetonitrile) (3.5), 300 + 700 (v + v) Ħallat 300 ml ilma ma’ 700 ml tat-taħlita ta’ metanol-aċetonitril (3.5). 4. Apparat 4.1. Shaker tal-laboratorju jew stirrer manjetiku.. 4.2. Karta tal-filtru tal-fibra tal-ħġieġ (Whatman GF/A jew ekwivalenti). 4.3. Kolonna tal-ħġeiġ (tul 300 sa 400 mm, djametru intern bejn wieħed u ieħor 10 mm) b’ sintered glass frit u valvola draw - off. Nota: kolonna tal-ħġieġ bl-istopcock jew kolonna tal-ħġeiġ b’tarf angolat jistgħu ukoll jintużaw; f’dan il-każ, tapp żgħir tas-suf-tal-ħġieġ huwa mdaħħal fit-tarf tan-naħa t’isfel u jiġi mbuttat l-isfel bl-użu ta’ virga tal-ħġieġ 4.4. Tagħmir HPLC b’sistema ta’ l-injezzjoni, adattat għal volumi ta’ injezzjoni ta’ 20 μl. 4.4.1. Kolonna likwida kromatografika: 300 mm x 4 mm, C18, 10 μm imballaġġ jew ekwivalenti. 4.4.2. Rivelatur UV b’aġġustament varjabbli ta’ wavelength jew rivelatur ta’ serje ta’ dijodi li joperaw fil-firxa ta’ 225 sa 400 nm. 4.5. Filtru tal-membrana, 0.22 μm. 4.6. Filtru tal-membrana, 0.45 μm. 4.7. Banju ultrasoniku 5. Proċedura Nota: Il-karbadoks huwa sensittiv għad-dawl. Wettaq il-proċeduri kollha f’dawl baxx jew uża apparat tal-ħġieġ ambri jew apparati tal-ħġieġ imkebba f’fojl ta’ l-aluminju. 5.1. Ġenerali 5.1.1. Forniment fil-bjank. Biex isir it-test tal-irkupru (5.1.2) għandu jiġi analiżat forniment fil-bjank biex jikkontrolla li la l-karbadoks u lanqas is-sustanzi li jinterferixxu ma huma preżenti. Il-forniment fil-bjank għandu jkun simili għal dak tal-kampjun u mal-karbadoks ta’ l-analiżi jew mas-sustanzi interferenti m’għandhomx jiġu skoperti. 5.1.2. Test tal-irkupru. Test tal-irkupru għandu jitwettaq bl-analiżi tal-forniment fil-bjank (5.1.1) li jkun ġie imsaħħan b’żieda ta’ kwantità ta’ karbadoks, simili għal dak presenti fil-kampjun.. Sabiex tkun imsaħħa f’livell ta’ 50 mg/kg, ittrasferixxi 5,0 ml tas-soluzzjoni tal-ħażna standard (3.11.1) għal garafina konika 200 ml. Evapora s-soluzzjoni għal bejn wieħed u ieħor 0,5 ml f’banju tan-nitroġenu. Żid 50 g tal-forniment fil-bjank, ħawwad u ħalli għal 10 minuti qabel ma tipproċedi bil-pass ta’ l-estrazzjoni (5.2). Alternattivament, jekk forniment fil-bjank simili għal dik tal-kampjun ma jkunx disponibbli (ara 5.1.1), it-test tal-irkupru jista’ jitwettaq permezz tal-metodu addizzjonali standard. F’dan il-każ, il-kampjun huwa msaħħaħ bi kwantità ta’ karbadoks, simili għal dak diġà presenti fil-kampjun. Dan il-kampjun huwa analiżżat, flimkien mal-kampjun mhux imsaħħaħ u l-irkupru jista’ jiġi kkalkolat bit-tnaqqis. 5.2. Estrazzjoni 5.2.1. Għalf. Iżen sa l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 10 g tal-kampjun u ttrasferixxi għal garafina konika 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti. Żid 35,0 ml metanol-aċetonitril (3.5), għalaq b’tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-stirrer manjetiku (4.1). Iffiltra s-soluzzjoni minn karta tal-filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2). Żomm din is-soluzzjoni għall-pass ta’ purifikazzjoni (5.3). 5.2.2. Taħlitiet minn qabel (0,1 sa 2,0 %). Iżen sa l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 10 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal garafina konika 200 ml. Żid 15,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti.. Żid 35,0 ml metanol-aċetonitril (3.5), għalaq b’tapp u ħawwad għal 30 minuta fuq ix-shaker jew ħawwad fuq l-stirrer manjetiku (4.1) Iffiltra s-soluzzjoni minn karta tal-filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2). Ippipetta alikwot tal-filtrat f’garafina kalibrata ta’ 50ml. Żid 15,0 ml ilma, żid sal-marka bil-metanol-aċetonitril (3.5) u ħallat. Il-konċentrazzjoni karbadoks tas-soluzzjoni finali għandha bejn wieħed u ieħor tkun 10 μg/ml. Alikwot huwa ffiltrat minn filtru 0,45 μm (4.6). Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.4). 5.2.3. Preparati (> 2 %) Iżen sa l-eqreb 0,01 g, bejn wieħed u ieħor 0,2 g tal-kampjun mhux mitħun u ttrasferixxi għal garafina konika 250 ml Żid 45,0 ml ilma, ħawwad, u ekwilibra għal 5 minuti.. Żid 105,0 ml metanol-aċetonitril (3.5), għalaq b’tapp u omoġeniżża. Issonika (4.7) l-kampjun għal 15-il minuta u wara ħawwdu jew ħalltu għal 15-il minuta (4.1). Iffiltar s-soluzzjoni minn karta tal-filtru tal-fibra tal-ħġieġ (4.2). Iddiluwixxi l-alikwot tal-filtrat b’taħlita ta’ ilma-metanol-aċetonitril (3.12) għal konċentrazzjoni finali tal-karbadoks ta’ 10-15 μg/ml (għal preparat ta’ 10 %, il-fattur tad-diluwizzjoni huwa 10). L-alikwot huwa ffiltrat minn filtru 0,45 (4.6). Ipproċedi għad-determinazzjoni HPLC (5.4). 5.3. Purifikazzjoni 5.3.1. Preparazzjoni tal-kolonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju. Iżen 4 g ossidu ta’ l-aluminju (3.4) u ttrasferih għal-kolonna tal-ħġieġ (4.3). 5.3.2. Purifikazzjoni tal-kampjun. Applika 15 ml ta’ l-estratt iffiltrat (5.2.1) għall-kolonna ta’ l-ossidu ta’ l-aluminju u warrab l-ewwel 2 ml ta’ l-elwat. Iġbor il-5 ml li jmiss u ffiltra l-alikwot minn filtru 0.45 μm (4.6). Ipproċedi għad-determinazzjoni tal-HPLC (5.4). 5.4. Determinazzjoni HPLC 5.4.1. Parametri Il-kondizzjonijiet li ġejjin huma offruti għal-gwida, kondizzjonijiet oħrajn jistħu jintużaw sakemm jagħtu riżultati ekwivalenti.. Kolonna likwida kromatografika (4.1.1): | 300 mm × 4 mm, C18, 10 μm imballaġġ jew ekwivalenti | Il-fażi mobbli (3.6): | Taħlita ta' soluzzjoni barriera ta' l-aċetat (3.9) u ta' l-aċetonitril (3.2), 825 + 175 (v + v). | Ir-Rata tan-nixxija: | 1,5-2 ml/min. | Il-wavelength tal-iskoperta: | 365 nm. | Il-volum ta' l-injezzjoni: | 20 μl. | Ikkontrolla l-istabilità tas-sistema kromatografika, u injetta diversi drabi s-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.11.2) li jkun fiha 5,0 μg/ml, sakemm tintlaħħaq quċċata kostanti (żoni) u ħinijiet ta’ retenzjoni. 5.4.2. Grafika tal-kalibrazzjoni Injetta kull waħda mis-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.11.2) diversi drabi u ddetermina l-għoli tal-quċċata (żoni) għal kull konċentrazzjoni. Pinġi l-grafika tal-kalibrazzjoni billi tuża l-għoli medju tal-quċċata jew iż-żoni tas-soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni bħala ordinati u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti fi μg/ml bħala l-proċess tal-qtugħ. 5.4.3. Is-soluzzjoni tal-kampjun. Injetta l-estratt kampjun ((5.3.2) għall-għalf, (5.2.2) għal taħlitiet minn qabel u (5.2.3) għal preparati) diversi drabi u ddetermina l-għoli medju tal-quċċata (iż-żona) tal-quċċata tal-karbadoks. 6. Kalkolu tar-riżultati Mill-għoli medju (żona) tal-quċċata tal-karbadoks tas-soluzzjoni kampjun iddetermina l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni kampjun fi μg/ml b’referenza għall-grafika tal-kalibrazzjoni (5.4.2). 6.1. Għalf: Il-kontenut tal-karbadoks "w" (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula li ġejja: m mg/kg meta: β = il-konċentrazzjoni tal-karbadoks ta’ l-estratt tal-kampjun (5.3.2) fi in μg/ml. V1 = il-volum ta’ l-estrazzjoni fi ml (jiġifieri 50). m = il-massa tal-porzjon tat-test fi g. 6.2. Taħlitiet minn qabel u l-preparati. Il-kontenut tal-karbadoks "w" (mg/kg) fil-kampjun jingħata bil-formula li ġejja: m mg/kg meta: β = il-konċentrazzjoni tal-karbadoks ta’ l-estratt tal-kampjun (5.2.2 jew 5.2.3) fi μg/ml. V2 = il-volum ta’ l-estrazzjoni fi ml (jiġifieri. 50 għal taħlitiet minn qabel; 150 għal preparati). f = fattur ta’ dilwent skond 5.2.2 (taħlitiet minn qabel) jew 5.2.3 (preparati). m = il-massa tal-porzjon tat-test fi g 7. Validazzjoni tar-riżultati 7.1. L-Identità L-identità ta’ l-analite tista’ tkun ikkonfermata bil-ko-kromatografija, jew billi jintuża rivelatur ta’ serje ta’ dijodi li bih l-ispektra ta’ l-estratt tal-kampjun u s-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.11.2) li jkun fiha 10,0 μg/ml huma mqabbla. 7.1.1. Ko-kromatografija. Estratt kampjun huwa msaħħaħ biż-żieda ta’ ammont xieraq ta’ soluzzjoni tal-kalibrazzjoni (3.11.2). L-ammont tal-karbadoks miżjud għandu jkun simili għall-ammont ta’ karbadoks li jinstab fl-estratt tal-kampjun. Biss l-għoli tal-quċċata tal-karbadoks għandu jitjieb wara li jittieħed akkont kemm ta’ l-ammont miżjud u tad-diluwizzjoni ta’ l-estratt.. Il-wisa’ tal-quċċata, u nofs l-għoli massimu tiegħu, għandhom ikunu f’bejn wieħed u ieħor 10 % tal-wisa’ oriġinali. 7.1.2. L-iskoperta tas-serje ta’ dijodi. Ir-riżultati huma evalwati skond il-kriterji li ġejjin: (a) Il-wavelength ta’ l-assorbizzjoni massima tal-kampjun u ta’ l-ispektra standard, irreġistrat fl-apiċi tal-quċċata fuq il-kromatogramma, għandu jkun l-istess f’ marġini determinata bis-setgħa tar-risoluzzjoni tas-sistema tal-iskoperta.. Għal skoperta ta’ serje ta’ dijodi dan huwa tipiku fi ± 2 nm.. (b) bejn 225 u 400 nm, il-kampjun u l-ispektra standard irreġistrati fl-apiċi tal-quċċata tal-kromatogramma, m’għandhomx ikunu differenti għal dawk il-partijiet tal-ispektrum fil-firxa 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva. Dan il-kriterju huwa sodisfatt meta l-istess maxima huma presenti u meta fl-ebda punt osservat id-devjazzjoni bejn iż-żewġ spectra teċċedi 15 % ta’ l-assorbizzjoni ta’ l-analite standard. (ċ) bejn 225 u 400 nm, l-ispektra ta’ l-inklinazzjoni ‘l fuq, l-apiċi u l-inklinazzjoni ‘l isfel tal-quċċata prodott mill-kampjun ta’ l-estratt m’għandhomx ikunu differenti minn xulxin għal dawk il-partijiet tal-ispektrum fil-firxa ta’ 10-100 % ta’ l-assorbizzjoni relattiva Dan il-kriterju jkun sodisfatt meta l-istess maxima huma preżenti u meta fil-punti kollha osservati id-devjazzjoni bejn l-ispektra ma teċċedix 15 % ta’ l-assorbizzjoni tal-ispektrum ta’ l-apiċi. Jekk waħda minn dawn il-kriterji ma tkunx sodisfatta, il-presenza ta’ l-analite ma tkunx ġiet ikkonfermata 7.2. Rata tar-repetizzjon. Għal kontenuti ta’ 10 mg/kg u aktar għoli, id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun m’għandhiex teċċedi 15 % relattiv għar-riżultat l-aktar għoli. 7.3. L-Irkupru. Għal kampjun imsaħħaħ (fil-bjank) l-irkupru għandu jkun mill-inqas 90 %. 8. Riżultati ta’ studju kollaborattiv Studju kollaborattiv kien ġie rranġat li fih sitt tipi ta’ għalf, erba’ taħlitiet minn qabel u tlett preparati ġew analizzati minn tmien laboratorji. Analiżi duplikati ġew imwettqa fuq kull kampjun. (Informazzjoni aktar dettaljata dwar dan l-istudju kollaborattiv tista’ tinsab fil-Ġurnal ta’ AOAC, il-Volum 71, 1998, p. 484-490). Ir-riżultati (esklużi dawk barra l-limitu) jidhru hawn taħt: L : numru ta’ laboratorji. N : numru ta’ valuri singoli. Sr : devjazzjoni standard tar-rata tar-repetizzjoni CVr : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-repetizzjoni. SR : devjazzjoni standard tar-rata tar-riproduzzjoni. CVR : il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tar-rata tar-riproduzzjoni. Tabella 1. Riżultati ta' l-istudju kollaborattiv għall-għalf | Kampjun 1 | Kampjun 2 | Kampjun 3 | Kampjun 4 | Kampjun 5 | Kampjun 6 | L | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | n | 15 | 14 | 15 | 15 | 15 | 15 | Medja (mg/kg) | 50,0 | 47,6 | 48,2 | 49,7 | 46,9 | 49,7 | Sr (mg/kg) | 2,90 | 2,69 | 1,38 | 1,55 | 1,52 | 2,12 | CVr (%) | 5,8 | 5,6 | 2,9 | 3,1 | 3,2 | 4,3 | SR (mg/kg) | 3,92 | 4,13 | 2,23 | 2,58 | 2,26 | 2,44 | CVR (%) | 7,8 | 8,7 | 4,6 | 5,2 | 4,8 | 4,9 | Kontenut nominali (mg/kg) | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | Tabella 2. Riżultati ta' l-istudju kollaborattiv taħlitiet minn qabel-preparati | Taħlitiet minn qabel | Preparati | L | 7 | 7 | 7 | 7 | 8 | 8 | 8 | n | 14 | 14 | 14 | 14 | 16 | 16 | 16 | Medja (g/kg) | 8,89 | 9,29 | 9,21 | 8,76 | 94,6 | 98,1 | 104 | Sr (g/kg) | 0,37 | 0,28 | 0,28 | 0,44 | 4,1 | 5,1 | 7,7 | CVr (%) | 4,2 | 3,0 | 3,0 | 5,0 | 4,3 | 5,2 | 7,4 | SR (g/kg) | 0,37 | 0,28 | 0,40 | 0,55 | 5,4 | 6,4 | 7,7 | CVR (%) | 4,2 | 3,0 | 4,3 | 6,3 | 5,7 | 6,5 | 7,4 | Kontenut nominali (g/kg) | 10,0 | 10,0 | 10,0 | 10,0 | 100 | 100 | 100 | --------------------------------------------------