(6)

L-Anness VII jinbidel b’li ġej: “ANNESS VII DETERMINAZZJONI TAL-PERĊENTWAL TA’ 2-GLYCERYL MONOPALMITATE 1. SKOP U QASAM TA’ APPLIKAZZJONI Dan il-metodu jiddeskrivi l-proċedura analitika biex jiġi ddeterminat il-perċentwal ta’ l-aċidu palmitiku fit-2 pożizzjoni tat-triglycerides permezz ta’ l-evalwazzjoni tat-2-glyceryl monopalmitate. Dan il-metodu huwa applikabbli għaż-żjut veġetali likwidi fit-temperatura ta’ l-ambjent (20 °C). 2. PRINĊIPJU Wara t-tħejjija, il-kampjun ta’ żejt huwa sottomess għall-azzjoni tal-lipażi pankreatiku: idroliżi parzjali u speċifiku fil-pożizzjonijiet 1 u 3 tal-molekula ta’ triglyceride ġġib magħha id-dehra tal-monoglycerides fil-pożizzjoni 2. Il-preċentwal ta’ 2-glyceril monopalmitate fil-frazzjoni ta’ monoglyceride jiġi ddeterminat, wara silylation, permezz ta’ kromatografija tal-gass fuq kolonna kapillari. 3. APPARAT U TAGĦMIR 3.1. Flask Erlenmeyer ta’ 25 ml. 3.2. Bikers ta’ 100, 250 u 300 ml. 3.3. Kolonna tal-ħġieġ għall-kromatografija, b’dijametru intern ta’ 21-23 mm, twila 400 mm, mgħammra bi pjanċa tal-ħġieġ sinterizzat u vit. 3.4. Provetti ta’ 10, 50, 100 u 200 ml. 3.5. Flaskijiet ta’ 100 u 250 ml. 3.6. Evaporatur ċirkolari. 3.7. Tubi għaċ-ċentrifuga bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml, b’tapp immolat. 3.8. Ċentrifuga għat-tubi ta’ 10 u 100 ml. 3.9. Termostat biex it-temperatura tinżamm f’ 40 ± 0,5 °C 3.10. Pipetti ggradwati ta’ 1 u 2 ml. 3.11. Siringa ipodermika ta’ 1 ml. 3.12. Mikrosiringa ta’ 100 μl. 3.13. Lenbut ta’ 1 000 ml 3.14. Kromatografu tal-gass għal kolonni kapillari, mgħammar b’injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna, u b’forn biex tinżamm temperatura ta’ madwar 1 °C. 3.15. Injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna. 3.16. Rilevatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u elettrometru. 3.17. Reġistratur-integratur adattat għall-elettrometru b’veloċità ta’ risposta ta’ mhux aktar minn sekonda, u b’veloċità tal-karta varjabbli. 3.18. Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tas-silika mdewba ta’ bejn 8 u 12-il metru, b’dijametru intern ta’ bejn 0,25 u 0,32 mm, miksija b’methylpolysiloxane jew b’phenyl methylpolysiloxane 5 %, bi ħxuna ta’ bejn 0,10 u 0,30 μm, li tista’ tintuża f’temperatura ta’ 370 °C. 3.19. Mikrosiringa ta’ 10 μl mgħammra b’labra iebsa, twila talanqas 7.5 cm, għall-injezzjoni diretta fuq il-kolonna. 4. REAĠENTI 4.1. Ġell tas-silika tad-daqs ta’ fraka ta’ bejn 0 063 u 0 200 mm (70/280 mesh), imħejji kif ġej: qiegħed il-ġell tas-silika ġewwa kapsula tal-porċellana, nixxef fil-forn f’temperatura ta’ 160 °C għal 4 sigħat, imbagħad kessaħ f’temperatura ta’ l-ambjent f’dessikatur. Żid volum ta’ ilma ewkivalent għal 5 % tal-piż tal-ġell tas-silika, kif ġej: ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 500 ml, iżen 152 g ġell tas-silika u żidlu 8 g ta’ ilma distillat, sodd it-tubu u ħawwad bil-mod sabiex l-ilma jinfirex b’mod uniformi. Ħalli joqgħod għal talanqas 12-il siegħa qabel l-użu. 4.2. n-hexane (għall-kromatografija). 4.3. Isopropanol. 4.4. Isopropanol, soluzzjoni milwiema 1/1 (V/V). 4.5. Lipażi pankreatika. Il-lipażi li tintuża għandu jkollha attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet ta’ lipażi għal kull mg (fis-suq jeżistu lipażi pankreatiċi b’attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet għal kull mg ta’ enżima). 4.6. Soluzzjoni stabbilizzanti ta’ trishydroxymethylaminomethane: soluzzjoni milwiema 1 M miġjuba sa pH 8 (kontroll potenzjometriku) permezz ta’ HCI kkonċentrat (1/1 V/V). 4.7. Sodju kolat, ta’ kwalità enżimatika, soluzzjoni milwiema 0,1 % (din is-soluzzjoni għandha tintuża sa 15-il jum wara l-preparazzjoni tagħha). 4.8. Klorur tal-kalċju, soluzzjoni milwiema 22 %. 4.9. Eter djetiliku għall-kromatografija. 4.10. Solvent ta l-iżvilupp: taħlita n-hexane/eter djetiliku (87/13) (V/V). 4.11. Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni ta’ 12 % fil-piż. 4.12. Phenolphthalein, soluzzjoni ta’ 1 % fl-etanol. 4.13. Gass portatur: idroġenu jew elju, għall-kromatorgrafija tal-gass. 4.14. Gassijiet awżiljari: – idroġenu, b’purità minima ta’ 99 %, mingħajr umidità jew sustanzi organiċi – u arja, għall-kromatografija tal-gass, bl-istess livell ta’ purità. 4.15. Reaġent ta’ silanizzazzjoni: taħlita pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (Fis-suq jeżistu soluzzjonijiet lesti għall-użu). Jistgħu jintużaw reaġenti oħrajn ta’ silylation, partikolarment bit-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilwiti ma’ l-istess volum ta’ anhydrous pyridine). 4.16. Kampjuni ta’ referenza: monoglycerides puri jew taħlitiet ta’ monoglycerides b’kompożizzjoni magħrufa tal-perċentwal, simili għal dik tal-kampjun. 5. PROĊEDURA 5.1. Tħejjija tal-kampjun 5.1.1. Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ inqas minn 3 % ma jeħtiġux jiġu newtralizzati qabel il-kromatografija tal-kolonna bil-ġell tas-silika. Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ aktar minn 3 % għandhom ikunu sottomessi għan-newtralizzazzjoni skond il-punt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Ferra’ 50 g żejt u 200 ml n-hexane fil-lenbut ta’ 1 000 ml (3.13). Żid 100 ml isopropanol u kwantità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 12 % (4.11) ekwivalenti għall-aċidità ħielsa taż-żejt, miżjuda b’5 %. Ħawwad sewwa għal minuta. Żid 100 ml ilma distillat, erġa’ ħawwad u ħalli joqgħod. Ferra’, imbagħad neħħi l-aħħar saff li fih is-sapun. Neħħi s-safef intermedji li jista’ jkun hemm (muċilaġni u sustanzi li ma jdubux). Aħsel is-soluzzjoni hexane taż-żejt newtralizzat b’porzjonijiet suċċessivi ta’ bejn 50 u 60 ml tas-soluzzjoni isopropanol/ilma 1/1 (V/V) (4.4) sakemm ma jibqax jidher il-kulur roża tal-phenolphthalein. Neħħi l-biċċa l-kbira mill-hexane permezz tad-distillazzjoni fil-vakwu (per eżempju, jista’ jintuża evaporatur ċirkolari) uttrasferixxi ż-żejt għal ġo flask ta’ 100 ml (3.5). Nixxef iż-żejt fil-vakwu sakemm is-solvent ikun tneħħa għal kollox. Fi tmiem din il-proċedura, l-aċidità taż-żejt għandha tkun inqas minn 0,5 %. 5.1.2. Ferra’ 1 g ta’ żejt ippreparat kif deskritt hawn fuq, ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1) u dewweb f’10 ml mit-taħlita ta’ l-iżvilupp (4.10). Ħalli s-soluzzjoni toqgħod għal talanqas kwarta qabel ma ssir il-kromatrografija fuq kolonna bil-ġell tas-silika. Jekk is-soluzzjoni tkun imċajpra, għaddiha miċ-ċentrifuga biex tiżgura l-aqwa kundizzjonijiet għall-kromatografija. (Jistgħu jintużaw skrataċ ta’ ġell tas-silika SPE ta’ 500 mg lesti għall-użu). 5.1.3. Tħejjija tal-kolonna kromatografika Ferra’ fil-kolonna (3.3) madwar 30 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), daħħal biċċa qoton fil-parti ta’ isfel tal-kolonna bl-għajnuna ta’ virga tal-ħġieġ; agħfas biex tneħħi l-arja. Ġo biker, ipprepara suspensjoni ta’ 25 g ġell tas-silika (4.1) f’madwar 80 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp, u ferragħ fil-kolonna bl-għajnuna ta’ lenbut. Iċċekkja li l-ġell kollu tas-silika jkun daħal fil-kolonna; aħsel bis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), iftaħ il-vit u ħalli l-livell tal-likwidu jilħaq madwar 2 mm ‘il fuq mil-livell superjuri tal-ġell tas-silika. 5.1.4. Kromatografija fuq kolonna Ġo flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1), iżen eżatt 1 g tal-kampjun imħejji skond il-punt 5.1. Dewweb il-kampjun f’10 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10). Ferragħ is-soluzzjoni fil-kolonna kromatografika mħejjija skond il-punt 5.1.3. Kemm jista’ jkun, tħarrikx is-superfiċje tal-kolonna. Iftaħ il-vit u ħalli s-soluzzjoni tal-kampjun tnixxi sakemm tilħaq il-livell tal-ġell tas-silika. Żviluppa b’150 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp. Aġġusta r-rata sa 2 ml/min (sabiex 150 ml inixxu fil-kolonna f’madwar 60-70 minuta). Irkupra l-eluzzjoni ġo flask ta’ 250 ml li jkun ġie mwieżen minn qabel. Evapora s-solvent fil-vakwu u neħħi l-aħħar traċċi tiegħu taħt kurrent ta’ nitroġenu. Iżen il-flask u ikkalkula l-estratt irkuprat. (Fil-każ li jkunu qed jintużaw skrataċ SPE tas-silika lesti għall-użu, ipproċedi kif ġej: Daħħal 1 ml mis-soluzzjoni (5.1.2.) ġo l-iskrataċ, imħejjija minn qabel b’3 ml ta’ n-hexane. Saffi s-soluzzjoni, u żviluppa b’4 ml ta’ n-hexane/eter djetiliku 1/1 (V/V). Irkupra s-soluzzjoni f’tubu ta’ 10 ml, u evapora taħt kurrent ta’ nitroġenu sakemm tkun nixfet. Esponi l-fdal niexef għal-lipażi pankreatika (5.2.). Huwa fondamentali li tivverifika l-kompożizzjoni ta’ aċidi grassi qabel u wara li jiġi mgħoddi mill-iskartoċċ SPE). 5.2. Idroliżi bil-lipażi pankreatika 5.2.1. Fit-tubu għaċ-ċentrifuga, iżen 0,1 g taż-żejt imħejji skond il-punt 5.1. Żid 2 ml mis-soluzzjoni stabbilizzanti (4.6.), 0,5 ml mis-soluzzjoni ta’ sodju kolat (4.7), u 0,2 ml mis-soluzzjoni ta’ klorur tal-kalċju, filwaqt li tħawwad sewwa wara kull żieda. Agħlaq it-tubu b’tapp li jissiġilla mħejji għal dan il-għan u qiegħdu fit-termostat f’temperatura ta’. 5.2.2. Żid 20 mg lipażi, ħawwad bil-galbu (filwaqt li tevita li jixxarrab it-tapp), u qiegħed it-tubu fit-termostat għal eżatt 2 minuti, imbagħad aqilgħu, ħawdu sewwa għal eżatt minuta, u ħallih jiksaħ. 5.2.3. Żid 1 ml ta’ eter djetiliku, agħlaq bit-tapp u ħawwad sew, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga, u ittrasferixxi s-soluzzjoni ta’ eter ġo tubu nadif u niexef, bl-għajnuna ta’ mikrosiringa. 5.3. Tħejjija tad-derivattivi silanizzati u tal-kromatografija tal-gass 5.3.1. Bl-għajnuna ta’ mikrosiringa, daħħal 100 μl mis-soluzzjoni (5.2.3.) ġo tubu bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml. 5.3.2. Neħħi s-solvent taħt kurrent dgħajjef ta’ nitroġenu, żid 200 μl ta’ reaġent ta’ silanizzazzjoni (4.15.), agħlaq bit-tapp u ħalli joqgħod għal 20 minuta. 5.3.3. Wara 20 minuta, żid bejn 1 u 5 ml n-hexane (skond il-kundizzjonijiet kromatografiċi): is-soluzzjoni li tirriżulta hija lesta għall-kromatografija tal-gass. 5.4. Kromatografija tal-gass Il-kundizzjonijiet ta’ tħaddim huma dawn li ġejjin: — Temperatura ta’ l-injettur (on column) inqas mit-temperatura tat-tgħollija tas-solvent (68 °C); — Temperatura tar-rivelatur: 350 °C; — Temperatura tal-kolonna: programmar tat-temperatura tal-forn: 60 °C għal minuta, b’żieda ta’ 15 °C kull minuta sa 180 °C, imbagħad ta’ 5 °C kull minuta sa 340 °C, imbagħad 340 °C matul 13-il minuta; — Gass portatur: idroġenu jew elju, aġġustat għall-veloċità lineari xierqa sabiex tinkiseb r-riżoluzzjoni riflessa fil-Figura 1. Il-ħin tar-retenzjoni tat-triglyceride C54 għandu jkun ta’ 40 + 5 minuti (ara l-Figura 2); (Il-kundizzjonijiet ta’ tħaddim indikati hawn fuq jingħataw bħala proposta indikattiva. Kull operatur ikollu jaddattahom kif xieraq biex jilħqu r-reżoluzzjoni mixtieqa. It-tul tal-quċċata li tikkorrispondi għat-2-glyceryl monopalmitate għandu jkun ugwali għal talanqas 10 % mill-iskala tar-reġistratur). — L-ammont ta’ sostanza injettata: 0,5-1 μl mis-soluzzjoni (5 ml) ta’ n-hexane (5.3.3.). 5.4.1. Identifikazzjoni tal-qċaċet Il-monoglycerides individwali jiġu identifikati skond il-ħinijiet ta’ retenzjoni miksuba, u b’relazzjoni ma’ dawk miksuba bit-taħlitiet standard ta’ monoglycerides analizzati fl-istess kundizzjonijiet. 5.4.2. Evalwazzjoni kwantitattiva Is-superfiċje ta’ kull quċċata tiġi kkalkulata permezz ta’ integratur elettroniku. 6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI: Il-perċentwal ta’ glyceryl monopalmitate jiġi kkalkulat abbażi tar-relazzjoni bejn is-superfiċje tal-quċċata u t-total tas-superfiċji tal-qċaċet tal-monoglycerides kollha (ara l-Figura 2), skond il-formula: Glyceril monopalmitate (%): Fejn: Ax = is-superfiċje tal-quċċata li tikkorrispondi għall-glyceryl monopalmitate ΣA = it-total tas-superfiċji tal-qċaċet kollha tal-monoglycerides Ir-riżultat għandu jingħata b’ punt deċimali wieħed. 7. RAPPORT TA’ L-ANALIŻI Ir-rapport ta’ l-analiżi għandu jispeċifika: — ir-referenza għal dan il-metodu; — it-tagħrif kollu meħtieġ għall-identifikazzjoni kompleta tal-kampjun; — ir-riżultat ta’ l-analiżi; — kull devjazzjoni minn dan il-metodu, sew minħabba deċiżjoni tal-partijiet ikkonċernati sew minħabba raġuni oħra; — id-dettalji ta’ l-identifikazzjoni tal-laboratorju, id-data ta’ l-analiżi u l-firma tal-persuni responsabbli għaliha. Figura 1 Kromatogramma tal-prodotti tar-reazzjoni tas-silanizzazzjoni miksubin bl-azzjoni tal-lipażi fuq żejt taż-żebbuġa raffinat miżjud b’20 % ta’ żejt esterifikat (100 %). Figura 2 Kromatogramma ta’: A) Żejt taż-żebbuġa mhux esterifikat, wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. Kromatogramma ta’: B) żejt esterifikat wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. 8. NOTI Nota 1 TĦEJJIJA TAL-LIPAŻI Lipażi b’attività sodisfaċenti huma disponibbli fis-suq. Wieħed jista’ jippreparahom ukoll fil-laboratorju, kif ġej: Kessaħ 5 kg ta’ frixa friska tal-majjal sa 0 °C. Neħħi x-xaħam solidu u t-tessut konnettiv ta’ madwarha, u itħan ġo blender sakemm issir pasta likwida. Ħawwad din il-pasta għal bejn 4 u 6 sigħat ma’ 2,5 litru ta’ anhydrous acetone, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga. Oħroġ il-fdal tliet darbiet oħra bl-istess volum ta’ anhydrous acetone, imbagħad darbtejn b’taħlita acetone/eter djetiliku (1/1) (V/V), u darbtejn bl-eter djetiliku. Nixxef il-fdal matul 48 siegħa fil-vakwu biex jinkiseb trab stabbli li jżomm għal żmien twil fil-friġġ u protett mill-umdità. Nota 2. KONTROLLAR TA’ L-ATTIVITA’ LIPAŻIKA Ħejji emulsjoni ta’ żejt taż-żebbuġa kif ġej: Ġo mikser, ħawwad għal 10 minuti taħlita magħmula minn 165 ml soluzzjoni ta’ gomma arabika f’100 g/l, 15 g silġ mitħun u 20 ml żejt taż-żebbuġa newtralizzat minn qabel. Imbagħad daħħal 10 ml minn din l-emulsjoni f’biker ta’ 50 ml, imbagħad 0,3 ml minn soluzzjoni ta’ sodju kolat f’0,2 g/ml u 20 ml ilma distillat. Qiegħed il-biker ġo termostat regolat għal 37 °C; daħħal l-elettrodi tal-miter tal-pH u l-aġitatur bl-iskrun. Bl-għajnuna ta’ buretta, qattar soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N sakemm jintlaħaq livell pH ta’ 8,3. Żid kwantità ta’ sospensjoni ta’ trab tal-lipażi fl-ilma (0,1 g/ml ta’ lipażi). Malli l-miter tal-pH jindika livell pH ta’ 8.3, qabbad il-kronometru u żid is-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju billi tqattarha bir-ritmu meħtieġ biex il-livell pH jinżamm f’8.3. Innota kull minuta l-volum tas-soluzzjoni li jkun ġie kkunsmat. Irreġistra din l-informazzjoni fi grafika x/y, bil-ħin fuq l-assi x, u l-millilitri ta’ soluzzjoni ta’ alkali 0,1 N ikkunsmati biex jinżamm livell kostanti tal-pH fuq l-assi y. B’hekk għandha tinkiseb grafika lineari. L-attività tal-lipażi, imkejla f’unitajiet ta’ lipażi għal kull mg, tiġi kkalkolata bil-formula li ġejja: Fejn: A hija l-attività f’unitajiet ta’ lipażi/mg; V hija l-għadd ta’ millilitri ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N kull minuta (ikkalkulat abbażi tal-grafika); N hija n-normalità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju; m hija l-massa tal-lipażi tat-test f’mg. L-unità ta’ lipażi hija ddefinita bħala l-kwantità ta’ enżimi li jeħilsu 10 mikro-ekwivalenti ta’ aċidu kull minuta.”;