ANNESS VI

1. METODU

Dan il-metodu huwa ekwivalenti għall-OECD TG 221 (2006) (1). Kien hemm qbil wiesa' bejn l-awtoritajiet tal-UE li t-test tal-Lemna huwa alternattiva xierqa għal test tal-algal għal sustanzi li għandhom kulur qawwi (2)(3).

1.1. DAĦLA

Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal biex tiġi evalwata t-tossiċità ta’ sustanzi għall-pjanti akkwatiċi tal-ilma ħelu tal-ġeneru Lemna (ħażiż li jgħatti l-wiċċ tal-ilma qiegħed jew duckweed). Dan huwa bbażat fuq linji gwida eżistenti (4)(5)(6)(7)(8)(9) iżda jinkludi modifikazzjonijiet ta’ dawk il-metodi sabiex jirrifletti r-riċerka u konsultazzjoni riċenti fuq għadd ta' kwistjonijiet importanti. Il-metodu propost ġie vvalidat permezz ta’ ring-test internazzjonali (10).

Dan il-Metodu ta' ttestjar jiddeskrivi l-ittestjar għal tossiċità li juża Lemna gibba u Lemna minor, li t-tnejn li huma ġew studjati fit-tul u li huma s-suġġett tal-istandards imsemmija hawn fuq. It-tassonomija ta’ Lemna spp. hija diffiċli, peress li hija kkumplikata bl-eżistenza ta’ għażla wiesgħa ta’ fenotipi. Għalkemm varjabilità ġentika bħala reazzjoni għal sustanzi tossiċi tista’ tiġri fil-każ ta’ Lemna, bħalissa mhemmx dejta suffiċjenti dwar dan is-sors ta’ varjabilità li jissuġġerixxi klonu biex jintuża f’dan il-Metodu ta' ttestjar. Ta’ min jinnota li dan it-test ma jsirx b’mod fejn jiġi evitat kull kuntatt ma’ mikro-organiżmi oħra, iżda jittieħdu passi matul l-istadji tal-proċedura tat-test li jnaqqsu kemm jista’ jkun il-kontaminazzjoni minn organiżmi oħra.

Dettalji dwar ittestjar b’tiġdid (semi-statiku u flow-through) u mingħajr tiġdid (statiku) tas-soluzjoni tat-test huma deskritti. Skont ma jkunu l-għanijiet tat-test u r-rekwiżiti regolatorji, huwa rrakkomandat li tiġi kkunsidrata l-applikazzjoni ta’ metodi semi-statiċi u flow through, eż. għal sustanzi li malajr jintilfu minn soluzzjoni bħala riżultat ta’ volatilizzazzjoni, fotodegradazzjoni, preċipitazzjoni jew bijodegradazzjoni. Iktar indikazzjonijiet huma mgħotija fi (11).

1.2. DEFINIZZJONIJIET

Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet li ġejjin huma użati għall-għanijiet tal-Metodu tal-Ittestjar:

Bijomassa: hija l-piż niexef ta’ materja ħajja preżenti f'popolazzjoni. F’dan it-test, surrogati għal bijomassa, bħal ma huma għadd ta’ frondi u erja ta’ frondi, huma mkejla tipikament u l-użu tat-terminu “bijomassa” għalhekk jirreferi għal dawn il-kejlijiet ta’ surrogati wkoll.

Klorożi: huwa l-fenomenu ta’ meta jisfar it-tessut tal-frond.

Klonu: huwa organiżmu jew ċellula mnissla minn individwu wieħed permezz ta’ riproduzzjoni asesswali. Individwi mill-istess klonu huma, għalhekk, ġenetikament identiċi.

Kolonja: tfisser il-kollettiv tal-frond omm u l-frond bint (normalment 2 sa 4) imwaħħlin ma’ xulxin. Xi kultant issir referenza għaliha bħala pjanta.

ECx : hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test maħlula ġo midjum tat-test li jirriżulta minn x % (eż. 50 %) tnaqqis fit-tkabbir ta’ Lemna f’perjodu stabbilit ta’ espożizzjoni (li trid tkun imsemmija espleċitament jekk devjanti mid-dewmien sħiħ jew normali tat-test). Sabiex issir denotazzjoni li ma hijiex ambigwa ta’ valur ta’ EC li jidderiva mir-rata ta’ tkabbir jew rendiment, is-simbolu “ErC” huwa użat għar-rata ta’ tkabbir u “EyC” huwa użat għar-rendiment, segwit mill-varjabbli ta’ kejl użat, eż. (għadd ta' frond).

Flow-through: huwa test fejn is-soluzzjonijiet tat-test huma mibdula kontinwament.

Frond: hija struttura f’għamla ta’ werqa individwali/waħda ta’ pjanta duckweed. Hija l-iżgħar unità, i.e. individwali, kapaċi li tirriproduċi.

Gibbożità: tfisser frondi li jidhru mħattbin jew minfuħin.

Tkabbir: huwa żieda fil-varjabbli tal-kejl, eż. l-għadd tal-frondi, il-piż niexef, piż bil-likwidu jew l-erja tal-frond, tul il-perjodu tat-test.

Rata tat-tkabbir (rata medja ta’ tkabbir speċifiku): hija ż-żieda logaritmika fil-bijomassa waqt il-perjodu ta’ espożizzjoni.

Konċentrazzjoni Minima tal-Effett Osservat (LOEC): hija l-iktar konċentrazzjoni baxxa ttestjata li fiha jiġi osservat li s-sustanza għandha effett statistikament sinifikanti li jnaqqas it-tkabbir (b’valur p < 0.05) meta mqabbla mal-kontroll, f'ħin speċifiku ta’ espożizzjoni. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test b’valur ogħla mil-LOEC irid ikollhom effett daqs jew ikbar minn dawk osservati bil-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kundizzjonijiet ma jistgħux jiġu ssodisfatti, għandha spjegazzjoni sħiħa tingħata għalfejn il-LOEC (u għalhekk l-NOEC) ġie magħżul.

Varjabbli ta’ kejl: huma kull tip ta’ varjabbli li huma mkejla, biex jiġi espress il-punt ta’ tmiem tat-test, billi jintuża varjabbli ta’ rispons wieħed jew iktar varjabbli differenti. F’dan il-metodu l-għadd tal-frondi, l-erja tal-frondi, il-piż frisk u l-piż niexef huma varjabbli ta’ kejl.

Monokultura: hija kultura bi speċi waħda ta’ pjanta.

Nekrożi: hija tessut tal-frond mejjet (i.e. abjad jew imxarrab bl-ilma)

Konċentrazzjoni Bl-Ebda Effett Osservat (NOEC): hija l-konċentrazzjoni tat-test immedjatament taħt il-LOEC.

Fenotipa: hija l-karatteristiċi osservabbli ta’ organiżmu determinati mill-interazzjoni tal-ġeni tagħha mal-ambjent tagħha.

Varjabbli ta’ rispons: huma varjabbli li jintużaw għall-istima ta’ tossiċità derivata minn varjabbli mkejla li jiddeskrivu l-bijomassa b’metodi differenti ta’ kalkolu. Għal dan il-metodu, ir-rati ta’ tkabbir u r-rendiment huma varjabbli ta’ rispons derivati minn varjabbli ta’ kejl bħall-għadd ta' frondi, l-erja tal-frondi, il-piż frisk u l-piż niexef.

Test semi-statiku (ta’ tiġdid): huwa test li fih s-soluzzjoni tat-test hija perjodikament mibdula f’intervalli speċifiċi matul it-test.

Test statiku: huwa metodu tat-test mingħajr it-tiġdid tas-soluzzjoni tat-test matul it-test.

Punt ta’ tmiem tat-test: jiddeskrivi l-fattur ġenerali li jinbidel bis-sustanza kimika relattiva għall-kontroll bħala għan tat-test. F’dan il-metodu, il-punt ta’ tmien tat-test huwa l-inibizzjoni tat-tkabbir, li jista’ jiġi espress b’varjabbli differenti ta’ rispons li huma bbażati fuq varjabbli waħda jew iktar ta’ kejl.

Midjum tat-test: huwa l-midjum komplut ta’ tkabbir sintetiku li fuqu jikbru l-pjanti tat-test meta esposti għas-sustanza tat-test. Is-sustanza tat-test tiġi normalment maħlula fil-midjum tat-test.

Rendiment: huwa l-valur ta’ varjabbli ta’ kejl biex jesprimi bijomassa fit-tmiem tal-perjodu ta’ espożizzjoni li minnu jitnaqqas il-varjabbli ta’ kejl fil-bidu tal-perjodu tal-espożizzjoni

1.3. PRINĊIPJU TAT-TEST

Kulturi ta’ pjanti li jikbru b’mod esponenzjali, tal-ġeneru Lemna jitħallew jikbru bħala monokulturi f’konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza tat-test fuq perjodu ta’ sebat ijiem. L-għan tat-test huwa li tikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanza fuq it-tkabbir veġetattiv fuq dan il-perjodu, bbażat fuq valutazzjoni ta’ varjabbli ta’ kejl magħżula. L-għadd tal-frondi huwa l-varjabbli primarju tal-kejl. Mill-inqas varjabbli wieħed ieħor ta’ kejl (l-erja totali tal-frond, piż niexef jew piż frisk) hu mkejjel ukoll, peress li xi sustanzi jistgħu jaffetwaw varjabbli oħra ta’ kejl ħafna iktar minn numri tal-frond. Biex jiġu kkwantifikati l-effetti relatati mas-sustanza, it-tkabbir fis-soluzzjonijiet tat-test huwa mqabbel ma’ dak tal-kontrolli u l-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta’ x % ta’ inibizzjoni speċifika ta’ tkabbir (eż. 50 %) hija ddeterminata u espressa bħala l-ECx (eż EC50)

Il-punt ta’ tmiem tat-test huwa l-inibizzjoni ta’ tkabbir, espress bħala żieda logaritmika fil-varjabbli ta’ kejl (rata speċifika ta’ tkabbir medju) matul il-perjodu ta’ espożizzjoni. Mir-rati medji ta’ tkabbir speċifiku rreġistrati f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta’ x % ta’ inibizzjoni speċifika ta’ tkabbir (eż. 50 %) hija ddeterminata u espressa bħala l-ErCx (eż. ErC50).

Varjabbli ta’ rispons addizzjonali użat f’dan il-Metodu ta' ttestjar hu r-rendiment, li jista’ jkun neċessarju biex jiġu rispettati r-rekwiżiti regolatorji speċifiċi f’xi pajjiżi. Jiġi ddefinit bħala l-varjabbli ta’ kejl fit-tmiem tal-perjodu ta’ espożizzjoni li minnhom jitnaqqsu l-varjabbli fit-tmiem tal-perjodu ta’ espożizzjoni. Mir-rendiment irreġistrat f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-konċentrazzjoni li twassal għal rata ta’ x % ta’ rendiment (eż. 50 %) hija kkalkulata u espressa bħala EyCx (eż. EyC50).

Barra minn hekk, il-konċentrazzjoni minima tal-effett osservat (LOEC) u l-konċentrazzjoni bl-ebda effett osservat (NOEC) jistgħu jiġu ddeterminati statiskament.

1.4. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST

Metodu analitiku, b’sensittività xierqa għal kwantifikazzjoni tas-sustanza fil-midjum tat-test għandha tkun aċċessibbli.

Informazzjoni fuq is-sustanza tat-test li tista’ tkun utli biex jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula strutturali, purità, solubilità tal-ilma, stabbiltà fl-ilma u dawl, pKa, Kow, pressjoni tal-fwar u bijodegradabilità. Is-solubilità tal-ilma u l-pressjoni tal-fwar tista’ tiġi użata biex jiġi kkalkulat il-kostanti tal-Prinċipju ta’ Henry, li jindika jekk huwiex probabbli li jkun hemm telf sinifikanti matul il-perjodu tat-test. Dan juri jekk għandhomx jittieħdu passi sabiex dan it-telf jiġi kontrollat. Meta l-informazzjoni dwar is-solubilità u l-istabbiltà tas-sustanza tat-test m’hijiex ċerta, huwa rrakkomandat li dawn jiġu vvalutati taħt il-kundizzjonijiet tat-test, i.e. midjum ta’ tkabbir, temperatura, sistema ta’ dawl li għandha tintuża fit-test.

Meta l-kontroll tal-aċidità tal-midjum tat-test huwa partikolarment importanti, pereżempju. meta jiġu ttestjati metalli jew sustanzi li huma idrolitikament instabbli, iż-żieda ta’ buffer lill-midjum ta’ tkabbir huwa rrakkomandat (ara l-ewwel paragrafu fit-taqsima 1.7.4.). Iktar indikazzjonijiet għal ittestjar ta’ sustanzi b’karatteristiċi fiżikokemikali li jagħmilhom diffiċli biex jiġu ttestjati huwa pprovdut fi (11).

1.5. SUSTANZA TA’ REFERENZA

Sustanza/i ta’ referenza, bħal 3,5-dichlorophenol użat fir-ring test internazzjonali (10), tista’/jistgħu tiġi/jiġu ttestjat(i) bħala mezz ta’ kontroll tal-proċedura tat-test. Huwa opportun li tiġi ttestjata sustanza ta’ referenza mill-inqas darbtejn f’sena jew, meta l-ittestjar isir inqas frekwentement, b’mod parallel mad-determinazzjoni tat-tossiċità tas-sustanza tat-test.

1.6. VALIDITÀ TAT-TEST

Biex it-test ikun validu, il-ħin ta’ irduppjar tal-għadd tal-frondi fil-kontroll irid ikun inqas minn jumejn u nofs (60 siegħa), li jikkorispondi ma’ żieda ta’ bejn wieħed u ieħor seba’ darbiet f’sebat ijiem u rata medja ta’ tkabbir speċifiku ta’ 0.275 d–1. Permezz tal-kundizzjonijiet tal-midja u t-test deskritti fil-Metodu tal-Ittestjar, dan il-kriterju jista’ jintlaħaq bl-użu ta’ sistema ta’ ttestjar statiku (8). Huwa wkoll maħsub li dan il-kriterju jista’ jiġi milħuq taħt kundizzjonijiet ta’ ttestjar semi-statiku u flow-through. Kalkolu tal-ħin ta’ irduppjar huwa muri fit-taqsima 2.1.

1.7. DESKRIZZJONI TAL-METODU

1.7.1. Apparat

Kull tagħmir f’kuntatt mal-midja tat-test għandu jkun magħmul minn ħġieġ jew materjal ieħor li ma jagħmilx reazzjoni kimika. Tagħmir tal-ħġieġ użat għal-għanijiet tal-kultura u ittestjar għandu jiġi mnaddaf minn kull kontaminant kimiku li jista’ jipperkola fil-midjum tat-test u jrid ikun sterili. Il-kontenituri tat-test għandhom ikunu wiesgħa biżżejjed sabiex il-frondi ta’ kolonji differenti fil-kontenituri tal-kontroll jikbru mingħajr ma jirkbu lil xulxin fit-tmiem tat-test. Ma jimpurtax jekk l-għeruq imissu l-qiegħan tal-kontenituri tat-test, iżda fond minimu ta’ 20 mm u volum minimu ta’ 100 ml f’kull kontenitur tat-test huwa rrakkomandat. L-għażla tal-kontenituri tat-test ma hijiex ta’ importanza kbira sakemm dawk ir-rekwiżiti jiġu mħarsa. Ġarar tal-ħġieġ, plattini ta’ kristalizzazzjoni u plattini petri tal-ħġieġ ta’ daqsijiet adatti kollha rriżultaw xierqa. Kontentituri tal-ħġieġ għandhom ikunu mgħottija sabiex titnaqqas kemm jista’ jkun l-evoparazzjoni u l-kontaminazzjoni bi żball, waqt li titħalla l-bidla tal-arja neċessarja. Kontenturi tat-test xierqa, u partikolarment l-għotien, għandhom jevitaw dellijiet jew bidliet fil-karatteristiċi spettrali tad-dawl.

Il-kulturi u l-kontenituri tat-test ma għandhomx jinżammu flimkien. Dan l-aħjar li jsir permezz tal-użu ta’ kmamar ambjentali ta’ tkabbir, inkubaturi, jew kmamar separati. L-illuminazzjoni u t-temperatura għandhom ikunu jistgħu jiġu kkontrollati u miżmuma f’livell kostanti (ara t-taqsima 1.7.8).

1.7.2. Organiżmu tat-test

L-organiżmu użat għal dan it-test huwa jew Lemna gibba jew Lemna minor. Deskrizzjonijiet qosra ta’ speċi ta’ duckweed li ġew użati għal ittestjar għal tossiċità huma mogħtija fl-Appendiċi 1. Materjal ta’ pjanti jista’ jinkiseb minn kollezzjoni ta’ kultura, laboratorju ieħor jew mill-għalqa. Jekk miġbura mill-għalqa, il-pjanti għandhom jiġu miżmuma fil-kultura fl-istess midjum bħal dak użat għall-ittestjar mill-inqas għal tmien ġimgħat qabel l-użu. Siti ta’ għelieqi użati għal ġabra ta’ kulturi inizjali għandhom ikunu ħielsa minn sorsi ovvji ta’ kontaminazzjoni. Jekk miġjuba minn laboratorju ieħor jew minn kollezzjoni ta’ kultura għandhom jiġu miżmuma bl-istess mod mill-inqas għal tliet ġimgħat. Is-sors tal-materjal tal-pjanti jew tal-ispeċi jew klonu (jekk magħruf) użat għall-ittestjar għandu dejjem jiġi rrapurtat.

Monokulturi, li huma viżibilment ħielsa minn kontaminazzjoni minn organiżmi oħrajn bħal alga u protożoa, għandhom jiġu użati. Pjanti b’saħħithom ta’ L. minor jikkonsistu f’kolonji li jkollhom bejn żewġ jew ħames frondi, waqt li kolonji b’saħħithom ta’ L. gibba jista’ jkollhom sa seba’ frondi.

Il-kwalità u l-uniformità tal-pjanti użati għat-test ikollhom influwenza sinifikanti fuq ir-riżultat tat-test u għalhekk għandhom jintgħażlu bil-ħsieb. Pjanti żgħar li jikbru malajr mingħajr leżjonijiet li jidhru jew diskolorazzjoni (klorożi) għandhom jiġu użati. Kulturi ta’ kwalità tajba huma indikati b’inċidenza għolja ta’ kolonji li fihom mill-inqas żewġ frondi. Għadd kbir ta’ frondi waħedhom juri stress ambjentali, eż. limitazzjoni ta’ nutrijenti, u materjal ta’ pjanti minn kulturi bħal dawn ma għandux jintuża għal ittestjar.

1.7.3. Kultura

Biex tnaqqas il-frekwenza ta’ manteniment ta’ kulturi (eż. meta l-ebda Lemna test ma jkun ippjanat għal xi perjodu), il-kulturi jistgħu jinżammu f’illuminazzjoni u temperatura (4-10 °C) mnaqqsa. Dettalji ta’ produzzjoni ta’ kulturi huma mogħtija fl-Appendiċi 2. Sinjali ovvji ta’ kontaminazzjoni b’alga jew organiżmi oħrajn jirrikjedu sterilizzazzjoni tal-wiċċ ta’ sub-kampjun ta’ frondi Lemna, segwit bi trasferiment f’midjum ġdid (ara l-Appendiċi 2). F’dan il-każ, il-kultura kkontaminata li jibqa’ għandha tintrema.

Mill-inqas sebat ijiem qabel l-ittestjar, kolonji suffiċjenti huma trasferiti asettikament f’midjum sterili ġdid u kkultivati għal 7-10 ijiem taħt il-kundizzjonijiet tat-test.

1.7.4. Midjum tat-test

Midja differenti huma rrakkomandati għal Lemna minor u Lemna gibba, kif deskritt hawn taħt. L-inklużjoni ta’ buffer pH fil-midjum tat-test (MOPS (aċidu sulfoniku 4-morpholinepropane, CAS No: 1132-61-2; EINECS No: 214-478-5 f’midjum L. minor u NaHCO3 f’midjum L. gibba) għandha tiġi kkunsidrata akkuratament meta huwa suspettat li jista’ jagħmel reazzjoni mas-sustanza tat-test u jinfluwenza l-espressjoni tat-tossiċità tiegħu. Midjum Steinberg (12) huwa aċċettabbli wkoll sakemm jintlaħqu l-kriterji tal-validità.

Modifkazzjoni tal-istandard Svediż (SIS) midjum ta’ tkabbir Lemna huwa rrakkomandat għal produzzjoni ta’ kulturi ta’ L. minor u ttestjar tal-istess. Il-kompożizzjoni ta’ dan il-midjum hija mogħtija fl-Appendiċi 3.

Il-midjum ta’ tkabbir, 20X — AAP, kif deskritt fl-Appendiċi 3, huwa irrakkomandat għal produzzjoni ta’ kulturi u ttestjar ta’ L. gibba.

Il-midjum Steinberg, kif deskritt fl-Appendiċi 3, huwa wkoll adattat għal L. minor, iżda jista’ jintuża għal L. gibba sakemm il-kriterji tal-validità jintlaħqu.

1.7.5. Soluzzjonijiet tat-test

Soluzzjonijiet tat-test huma ġeneralment ippreparati bid-diluzzjoni ta’ soluzzjoni b'konċentrazzjoni standardizzata. Soluzzjonijiet b'konċentrazzjoni standardizzata tas-sustanza tat-test huma ġeneralment ippreparati billi tinħall is-sustanza fil-midjum tal-tkabbir.

L-iktar konċentrazzjoni għolja ttestjata tas-sustanza tat-test normalment ma għandiex teċċedi s-solubilità tal-ilma tas-sustanza taħt il-kundizzjonijiet tat-test. Għandu jiġi kkunsidrat iżda li Lemna spp. iżżomm fil-wiċċ u tista’ tiġi esposta għal sustanzi li jinġabru bejn l-ilma u l-arja (eż. sustanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma jew sustanzi idrofobiċi jew sustanzi attivi fil-wiċċ). F’ċirkustanzi bħal dawn, l-espożizzjoni tirriżulta minn materjal li ma huwiex fis-soluzzjoni u l-konċentrazzjonijiet tat-test, jistgħu, skont il-karatteristiċi tas-sustanza tat-test, jeċċedu s-solubilità tal-ilma. Għal sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu fl-ilma, jista’ jkun hemm bżonn li tiġi ppreparata soluzzjoni b'konċentrazzjoni standardizzata ħafna jew dispersjoni tas-sustanza bl-użu ta’ solvent organiku jew dispersant sabiex tiffaċilita ż-żieda ta’ kwantitajiet eżatt tas-sustanza tat-test lill-midjum tat-test u tgħin f’dispersjoni u x-xoljiment tagħha. Kull sforz għandu jsir sabiex jiġi evitat l-użu ta’ materjali bħal dawn. Ma għandu jkun hemm ebda fitotossiċità riżultanti minn użu ta’ solventi jew dispersanti awżiljarji. Pereżempju, solventi użati ta’ spiss li ma jikkawżawx fitotossiċità f’konċentrazzjonijiet sa 100 μl l–1 jinkludu acetone u dimethylformamide. Jekk jintuża solvent jew dispersant, il-konċentrazzjoni finali tiegħu għandha tiġi rrapurtata u minimizzata kemm jista’ jkun (100 μl·l–1), u kull trattament u kontroll għandu jkollu l-istess konċentrazzjoni ta’ solvent jew dispersant. Iktar indikazzjonijiet dwar l-użu ta’ dispersanti huma mogħtija fi (11).

1.7.6. Gruppi tat-test u kontroll

Tagħrif bil-quddiem dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test lil Lemna, eż. minn test li jsib il-gamma, jgħin fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-test adattati. Fit-test definittiv ta’ tossiċità, għandu jkun hemm mill-inqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test irranġati f’serje ġeometrika. Preferibbilment il-fattur ta’ separazzjoni bejn il-konċentrazzjonijiet tat-test ma għandux jeċċedi 3.2, iżda valur ikbar jista’ jintuża meta l-kurva ta’ rispons tal-konċentrazzjoni hija ċatta. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni jekk inqas minn ħames konċentrazzjonijiet huma użati. Mill-inqas tliet repliki għandhom jintużaw f’kull konċentrazzjoni tat-test.

Meta tiġi ssettjata l-gamma ta’ konċentrazzjonijiet tat-test (għal sejba ta’ gamma u/jew għat-test definittiv ta’ tossiċità), dawn li ġejjin għandhom jiġi kkunsidrati:

Kull test għandu jinkludi kontolli li jikkonsistu f’midjum tal-istess nutrijent, l-istess għadd ta' frondi u kolonji, kundizzjonijiet ambjentali u proċeduri bħall-kontenituri tat-test iżda mingħajr is-sustanza tat-test. Jekk solvent jew dispersant awżiljarju huwa użat, trattament ta’ kontroll addizzjonali bis-solvent/dispersant preżenti fl-istess konċentrazzjoni bħal tal-kontenituri għandu jiġi inkluż. L-għadd ta' kontenituri ta’ kontroll ripetut (u kontenituri ta’ solvent, jekk applikabbli) għandu jkun mill-inqas daqs, u idealment id-doppju, tal-għadd ta' vetturi użati għal kull konċentrazzjoni tat-test.

Jekk determinazzjoni ta’ NOEC ma hijiex rikjesta, id-diżinn tat-test jista’ jinbidel biex jiżdied l-għadd ta' konċentrazzjonijiet u jnaqqas l-għadd ta' repliki ta’ kull konċentrazzjoni. Madankollu, l-għadd ta' repliki ta’ kontroll iridu jkunu mill-inqas tlieta.

1.7.7. Espożizzjoni

Kolonji li jikkonsistu minn 2 sa 4 frondi li jidhru huma trasferiti mill-kultura inoculum u huma mpoġġija każwalment fil-kontenituri ta’ kontroll f’kundizzjonijiet asettiċi. Kull kontenitur tat-test għandhu jkollu total ta’ bejn disa’ jew tnax-il frond. L-għadd ta' frondi u kolonji jridu jkunu l-istess bħal dawk użati f’kull kontenitur tat-test. Esperjenza miksuba b’dan il-metodu u dejta tar-ring-test indikaw li jekk tuża tliet repliki għal kull trattament, b’kull replika jkollha minn disa’ sa’ tnax-il frond fil-bidu, dan huwa biżżejjed biex tinduna b’differenzi fit-tkabbir ta’ ċirka 4 sa 7 % ta’ inibizzjoni kkalkulat bir-rata ta’ tkabbir (10 sa 15 % ikkalkulata skont ir-rendiment) bejn it-trattamenti (10).

Diżinn każwali għal post ta’ kontenituri tat-test fl-inkubatur huwa rikjest sabiex titnaqqas kemm jista’ jkun l-influwenza ta’ differenzi ta’ spazju fl-intensità tad-dawl jew it-temperatura. Diżinn ibblokkat jew ripożizzjonament każwali tal-kontenituri meta jsiru osservazzjonijiet (jew ripożizzjonament iktar frekwenti) hu rikjest ukoll.

Jekk test preliminari ta’ stabbilità juri li l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma tistax tinżamm (i.e. il-konċentrazzjoni imkejla taqa’ taħt 80 % tal-konċentrazzjoni inizjali mkejla) matul it-tul taż-żmien tat-test (sebat ijiem), l-użu ta' sistema ta’ ttestjar semistatiku hu rrakkomandat. F’dan il-każ, il-kolonji għandhom jiġu esposti għal soluzzjonijiet tat-test u kontroll preparati mill-ġdid f’mill-inqas żewġ okkażjonijiet matul it-test (eż. ġranet 3 u 5). Il-frekwenza ta’ espożizzjoni għal midjum ġdid jiddependi mill-istabbilità tas-sustanza tat-test; frekwenza iktar għolja tista’ tkun neċessarja biex jinżammu konċentrazzjonijiet kważi-kostanti ta’ sustanzi instabbli ħafna u volatili. F’xi ċirkustanzi, proċedura flow-through tista’ tkun neċessarja (11)(13).

Ix-xenarju ta’ espożizzjoni minn applikazzjoni ta’ weraq (sprej) mhijiex koperta f’dan il-Metodu ta' ttestjar, iżda ara (14).

1.7.8. Kundizzjonijiet ta’ inkubazzjoni

Dawl kontinwu fluworexxenti sħun jew frisk għandu jintuża biex jipprovdi intensità tad-dawl magħzula minn għażla ta’ 85-135 μE·m–2·s–1 meta mkejjel f’radjazzjoni attiva fotosintetika (400-700 nm) f’punti fl-istess distanza mis-sors ta’ dawl bħall-frondi Lemna (ekwivalenti għal 6 500-10 000 lux). Kull differenza mill-intensità tad-dawl magħżula fuq l-erja tat-test ma tistax tkun iktar minn ± 15 %. Il-metodu ta’ rivelazzjoni u kejl ta’ dawl, partikolarment it-tip ta’ sensur, jaffetwa l-valur imkejjel. Sensuri sferiċi (li jirrispondu għal dawl mill-angli kollha ta’ fuq jew taħt il-pjan ta’ kejl) u sensuri “cosine” (li jirrispondu għal dawl mill-angli kollha fuq il-pjan ta’ kejl) huma aħjar minn sensuri unidirezzjonali, u jagħtu riżultati ogħla għal sors ta’ iktar minn punt wieħed tat-tip deskritt hawn.

It-temperatura fil-kontenituri tat-test trid tkun ta’ 24 ± 2 °C. Il-pH tal-midjum ta’ kontroll ma għandiex tiżdied b’iktar minn 1,5 unità matul it-test. Madankollu, devjazzjoni ta' aktar minn 1,5 unità ma tinvalidax it-test meta jkun jista' jintwera li l-kriterji ta' validità ġew issodisfati. Trid tingħata kura addizzjonali għall-pH drift f'każijiet speċjali bħal meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli jew metalli. Ara (11) għal iktar indikazzjonijiet.

1.7.9. Tul ta' żmien

Dan it-test jintemm sebat ijiem wara li l-pjanti jiġu ttrasferiti fil-kontenituri tat-test.

1.7.10. Kejl u determinazzjonijiet analitiċi

Fil-bidu tat-test, l-għadd ta' frondi fil-kontenituri tat-test jingħadd u jiġi rrekordjat, b’attenzjoni li tiżgura li frondi sporġenti li jidhru b’mod ċar, huma kkunsidrati. Numri ta’ frondi li jidhru normali jew anormali, għandhom jiġu determinati fil-bidu tat-test, mill-inqas darba kull tlett ijiem matul il-perjodu ta’ espożizzjoni (i.e. f’mill-inqas 2 okkażjonijiet matul il-perjodu ta’ 7 ijiem), u meta t-test jiġi mitmum. Tibdil fl-iżvilupp tal-pjanti, eż. fid-daqs tal-frond, dehra, indikazzjoni ta’ nekrożi, klorożi jew gibbożità, xoljiment ta’ kolonji u telf ta’ abilità li żżomm f’wiċċ l-ilma, u fit-tul u dehra ta’ għeruq, għandhom jiġu nnutati. Karatteristiċi sinifikanti tal-midjum tat-test (eż preżenza ta’ materjal li ma nħallx, tkabbir ta’ alga fil-kontenitur tat-test) għandhom jiġu nnutati.

Barra minn determinazzjonijiet tal-għadd ta' frondi matul it-test, l-effetti tas-sustanza tat-test fuq waħda (jew iktar) mill-varjabbli ta’ kejl li ġejjin huma vvalutati wkoll:

L-erja totali tal-frond għandha l-vantaġġ li tista’ tiġi ddeterminata għal kull test u l-kontenitur tal-kontroll fil-bidu, matul u fit-tmiem tat-test. Piż niexef jew frisk għandu jiġi ddeterminat fil-bidu tat-test minn kampjun ta’ kultura ta’ inoculum rappreżentativ ta’ dak li jkun użat biex jinbeda t-test, u fit-tmiem tat-test bil-materjal ta’ pjanti minn kull kontenitur tat-test u kontroll. Jekk l-erja ta’ frond ma tkunx imkejla, piż niexef huwa preferut fuq piż frisk.

L-erja totali tal-frond, piż niexef u piż frisk jistgħu jiġu ddeterminati kif ġej:

1.7.10.1. Frekwenza ta’ kejl u determinazzjoni analitika

Jekk tintuża sistema ta’ ttestjar statiku, il-pH għandha tiġi mkejla fil-bidu u fit-tmiem tat-test. Jekk tintuża sistema ta’ ttestjar semistatiku, il-pH għandha tiġi mkejla f’kull lott ta’ soluzzjoni tat-test “ġdida” qabel kull tiġdid u f’soluzzjonijiet korrispondenti “użati”.

L-intensità tad-dawl għandha tiġi mkejla fil-kamra ta’ tkabbir, inkubatur jew kamra f’punti fl-istess distanza mis-sors ta’ dawl bħall-frondi Lemna. Kejl irid isir mill-inqas darba matul it-test. It-temperatura tal-midjum fil-kontenitur sostitwit miżmum fl-istess kundizzjonjiet tal-kamra ta’ tkabbir, inkubatur jew kamra għandhom jiġu rreġistrati mill-inqas darba kuljum.

Matul it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma ddeterminati f’intervalli xierqa. F’testijiet statiċi, ir-rekwiżit minimu huwa li jiġu ddeterminati l-konċentrazzjonijiet fil-bidu u fit-tmiem tat-test.

F’testijiet semi-statiċi fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma hijiex mistennija li tibqa’ fi ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali, hu neċessarju li f’kull tiġdid jiġu analizzati s-soluzzjonijiet tat-test preparati riċentement u l-istess soluzzjonijiet (ara t-tielet paragrafu fit-taqsima 1.7.7). Madankollu, għal dawk it-testijiet fejn il-konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza tat-test mhix fi ± 20 % tan-nominali, iżda fejn evidenza suffiċjenti tista’ tiġi pprovduta biex turi li l-konċentrazzjonijiet inizjali huma ripetibbli u stabbli (i.e. fil-gamma 80-120 % tal-konċentrazzjoni inizjali), determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jsiru biss fuq l-ogħla u l-iktar konċentrazzjonijiet baxxi tat-test. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test qabel it-tiġdid hemm biss bżonn li ssir f’replika waħda f’kull konċentrazzjoni tat-test (jew il-kontenut tal-kontenituri miġbura skont ir-replika).

Jekk jintuża test flow-through, sistema ta’ teħid ta' kampjuni simili għal dak deskritt għal testijiet semi-statiċi, inkluż l-analiżi fil-bidu, fin-nofs u fit-tmiem tat-test, huwa adegwat, iżda l-kejl ta’ soluzzjonijiet “użati” mhux idoneju f’dan il-każ. F’dan it-tip tat-test, ir-rata ta’ fluss ta’ dilwent u sustanzi tat-test jew soluzzjoni b'konċentrazzjoni standardizzata ta’ sustanza tat-test għadhom jiġu ċċekjati kuljum.

Jekk hemm evidenza li l-konċentrazzjoni tas-sustanza li qiegħda tiġi ttestjata kienet miżmuma b’mod sodisfaċenti fi ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew dik imkejla inizjalment, matul it-test, analiżi tar-riżultati tista’ tkun ibbażata fuq il-valuri nominali jew inizjali imkejla. Jekk id-devjazzjoni mill-konċentrazzjoni nominali jew dik inizjali mkejla hija ikbar minn ±20 %, analiżi tar-riżultati għandha tkun imsejsa fuq il-medja ġeometrika tal-konċentrazzjoni matul l-espożizzjoni jew mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test (11).

1.7.11. Test tal-limitu

F'għadd ta' ċirkustanzi, eż. meta test preliminarju jindika li s-sustanza tat-test ma għandha ebda effetti tossiċi fuq konċentrazzjonijiet sa 100 mg l–1, jew sal-limitu tas-solubilità fil-midjum tat-test (liema minnhom huwa l-iktar baxx), jista’ jsir test tal-limitu li jinvolvi tqabbil ta’ reazzjonijiet fi grupp ta’ kontroll u grupp ta’ trattament (100 mg l–1 jew konċentrazzjoni daqs il-limitu tas-solubilità). Huwa rrakkomandat b’enfasi li dan ikun mgħejjun b’analiżi tal-konċentrazzjoni ta’ espożizzjoni. Il-kundizzjonijiet tat-test u l-kriterji ta’ validità kollha deskritti qabel japplikaw għat-test tal-limitu, bl-eċċezzjoni li l-għadd ta' repliki ta’ trattament irid ikun irduppjat. Tkabbir fil-grupp ta’ kontroll u trattament jista’ jiġi analizzat permezz tat-test statistiku li jqabbel ir-riżultati medji, eż. Student’s t-test.

2. DEJTA U RAPPURTAR

2.1. ĦIN TA’ RDUPPJAR

Biex jiġi ddeterminat iż-zmien ta’ rduppjar (Td) tal-għadd tal-frondi u l-aderenza ma’ dan il-kriterju ta’ validità bl-istudju (it-taqsima 1.6), il-formula li ġejja hija użata flimkien ma’ dejta miġjuba mill-kontenituri tal-kontroll:

Td = ln 2/μ

fejn μ hija r-rata ta’ medja ta’ tkabbir speċifiku ddeterminat kif deskritt fl-ewwel u fit-tieni paragrafu fit-taqsima 2.2.1.

2.2. VARJABBLI TA’ RISPONS

L-għan tat-test hu li jiddetermina l-effett tas-sustanza tat-test fuq it-tkabbir veġetattiv ta’ Lemna. Dan il-Metodu ta' ttestjar jiddeskrivi żewġ varjabbli ta’ rispons, għax pajjiżi membri għandhom preferenzi u bżonnijiet regolatorji differenti. Sabiex ir-riżultati tat-testijiet ikunu aċċettabli fil-pajjiżi membri kollha, l-effetti għandhom jiġu vvalutati billi jintużaw kemm il-varjabbli (a) u kemm dik (b) li huma deskritti hawn taħt.

Għandu jiġi nnutat li l-valuri ta’ tossiċità kkalkulati permezz tal-użu ta’ dawn iż-żewġ varjabbli ta’ rispons ma jistgħux jiġu mqabbla u din id-differenza trid tiġi rikonoxxuta meta r-riżultati tat-test jiġu użati. Valuri ECx ibbażati fuq rata medja ta’ tkabbir speċifiku (ErCx) ikunu ġeneralment ogħla minn riżultati bbażati fuq ir-rendiment (EyCx) jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta’ dan il-Metodu ta' ttestjar jiġu rrispettati, minħabba l-bażi matematika tal-approċċi rispettivi. Dan ma għandux ikun interpretat bħala differenza fis-sensittività bejn iż-żewġ varjabbli ta’ rispons, sempliċement għax il-valuri huma differenti matematikament. Il-kunċett ta’ rata medja ta’ tkabbir speċifiku huwa bbażat fuq il-mudell ġenerali ta’ tkabbir esponenzjali ta’ duckweed f’kulturi mhux limitati, fejn it-tossiċità hija kkalkulata fuq il-bażi tal-effetti fuq ir-rata ta’ tkabbir mingħajr ma tkun dipendenti fuq il-livell assolut tar-rata speċifika ta’ tkabbir tal-kontroll, il-pendil tal-kurva konċentrazzjoni-rispons jew fuq id-dewmien tat-test. B’kuntrast, riżultati bbażati fuq il-varjabbli ta’ rispons tar-rendiment huma dipendenti fuq dawn il-varjabbli l-oħrajn kollha. EyCx hija dipendenti fuq ir-rata speċifika ta’ tkabbir tal-ispeċje tad-duckweed użata fit-test u fuq ir-rata massima speċifika ta’ tkabbir li tista’ tvarja bejn speċi jew anki kloni differenti. Dan il-varjabbli ta’ rispons ma għandux jintuża biex tqabbel is-sensittivita għal sustanzi tossiċi fost l-ispeċi tad-duckweed jew anki kloni differenti. Waqt li l-użu ta’ rata medja speċifika ta’ tkabbir biex tikkalkula t-tossiċita hija xjentifikament preferuta, kalkoli ta’ tossiċità bbażati fuq rendiment huma inklużi wkoll f’dan il-Metodu ta' ttestjar biex jissodisfaw ir-rekwiżiti regolatorji f’xi pajjiżi.

Kalkoli ta’ tossiċità għandhom ikunu bbażati fuq l-għadd tal-frondi u fuq varjabbli ta’ kejl ieħor addizzjonali (erja totali tal-frond, piż niexef u piż frisk), għaliex xi sustanzi jistgħu jaffetwaw varjabbli oħra ta’ kejl ħafna iktar mill-għadd tal-frondi. Dan l-effett ma jiġix rivelat billi tikkalkula l-għadd tal-frondi biss.

L-għadd ta' frondi kif ukoll kull varjabbli ieħor ta’ kejl reġistrat, i.e. erja totali tal-frond, piż niexef jew piż frisk, huma mniżżlin f’tabella flimkien mal-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi tat-test ta’ kull okkażjoni ta’ kejl. Analiżi tad-dejta sussegwenti eż. biex tikkalkula LOEC, NOEC jew ECx għandhom ikunu bbażati fuq il-valuri għar-repliki individwali u mhux fuq medji kkalkulati għal kull grupp ta’ trattament.

2.2.1. Ir-rata medja ta’ tkabbir speċifiku

Ir-rata medja ta’ tkabbir speċifiku għal perjodu speċifiku tiġi kkalkulata fuq iż-żjieda logaritmika fil-varjabbli ta’ tkabbir — numri ta’ frond u varjabbli ieħor ta’ kejl (erja totali ta’ frond, piż niexef jew piż frisk) — billi tintuża l-formula ta’ hawn taħt għal kull replika ta’ kontroll u trattamenti:

fejn:

Għal kull grupp ta’ trattament jew kontroll, ikkalkula valur medju għar-rata ta’ tkabbir flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni.

Ir-rata medja ta’ tkabbir speċifiku għandha tkun ikkalkulata għal-perjodu sħiħ tat-test (ħin “i” fil-formula ta’ hawn fuq huwa l-bidu tat-test u l-ħin “j” huwa t-tmiem tat-test). Għal kull konċentrazzjoni tat-test jew kontroll, ikkalkula valur medju għar-rata medja ta’ tkabbir flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni. Għandha tiġi wkoll stimata r-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni sabiex jiġu vvalutati effetti tas-sustanza tat-test li jivverifikaw ruħhom matul il-perjodu ta’ espożizzjoni (eż. billi jiġu eżaminati l-kurvi ta’ tkabbir trasformati f’logaritmi). Differenzi sostanzjali bejn ir-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni u r-rata medja ta’ tkabbir jindikaw devjazzjoni mit-tkabbir esponenzjali kostanti u għandha issir eżaminazzjoni bir-reqqa tal-kurvi ta’ tkabbir. F’dan il-każ, approċċ konservattiv ikun li jiġu mqabbla r-rati ta’ tkabbir speċifiku minn kulturi ittrattati waqt il-perjodu ta’ ħin ta’ inibizzjoni massima ma’ kontrolli waqt l-istess perjodu ta’ ħin.

Persentaġġ ta’ inibizzjoni tar-rata ta’ tkabbir (Ir) jista’ jiġi kkalkulat fuq kull konċentrazzjoni tat-test (grupp ta’ trattament) bil-formula li ġejja:

fejn:

2.2.2. Rendiment

Effetti fuq ir-rendiment huma determinati fuq il-bażi ta’ żewġ varjabbli ta’ kejl, għadd ta' frondi u varjabbli ieħor ta’ kejl (erja totali ta’ frond, piż niexef u piż frisk) preżenti f’kull kontenitur tat-test fil-bidu u fit-tmiem tat-test. Għal piż niexef u piż frisk, il-bijomassa tal-bidu hija ddeterminata fuq il-bażi ta’ kampjun ta’ frondi meħud mill-istess lott użat biex tlaqqam il-kontenituri tat-test (ara t-tieni paragrafu fit-taqsima 1.7.3). Għal kull konċentrazzjoni tat-test jew kontroll, ikkalkula valur medju għar-rendiment flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni. Il-persentaġġ medju ta’ inibizzjoni f’termini ta’ rendiment (% Iy) tista’ tiġi kkalkulata għal kull grupp ta’ trattament kif ġej:

fejn:

2.2.3. Ipplottjar ta’ kurvi ta’ rispons ta’ konċentrazzjoni

Għandhom jiġu pplottjati l-kurvi ta’ rispons ta’ konċentrazzjoni li juru l-persentaġġ medju ta’ inibizzjoni tal-varjabbli tar-rispons (Ir, jew Iy ikkalkulat kif muri fl-aħħar paragrafu tat-taqsima 2.2.1 jew fit-taqsima 2.2.2) u l-konċentrazzjoni logaritmika tas-sustanza tat-test.

2.2.4. Estimi ta’ ECx

Estimi ta’ ECx (eż. EC50) għandhom dejjem ikunu bbażati kemm fuq ir-rata medja ta’ tkabbir speċifiku (ErCx) kif ukoll fuq ir-rendiment (EyCx), u t-tnejn li huma għandhom ikunu bbażati fuq l-għadd tal-frondi u varjabbli ieħor ta’ kejl (erja totali ta’ frond, piż niexef, jew piż frisk). Dan għaliex hemm sustanzi tat-test li jinfluwenzaw l-għadd ta' frondi u l-varjabbli ta’ kejl oħra b’mod differenti. Il-parametri ta’ tossiċità mixtieqa huma għalhekk erba’ valuri ECx għal kull livell ta’ inibizzjoni kkalkulat: ErCx (għadd tal-frondi); ErCx (erja totali tal-frondi, piż niexef, jew piż frisk); EyCx (għadd tal-frondi); u EyCx (erja totali tal-frondi, piż niexef, jew piż frisk).

2.3. PROĊEDURA STATISTIKA

L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni konċentrazzjoni-rispons permezz ta’ analiżi ta’ regressjoni. Huwa possibbli li tiġi użata regressjoni medja lineari wara li ssir trasformazzjoni linearizzanti tad-dejta ta’ rispons — pereżempju f’unità probit jew logit jew Weibull (16), iżda proċeduri non-lineari ta’ regressjoni huma ppreferuti għax jittrattaw aħjar l-irregolaritajiet inevitabbli ta’ dejta u d-devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet lixxi. Qrib l-inibizzjoni żero jew inibizzjoni totali, dawn l-irregolaritajiet jistgħu jiġu mkabbra bit-trasformazzjoni, u dan ifixkel l-analiżi (16). Għandu jiġi nnutat li l-metodi standard ta’ analiżi li jużaw trasformazzjonijiet probit, logit jew Weibull huma maħsuba għal użu fuq dejta ta’ natura quantal (eż. mortalità jew sopravivenza), u għandhom jiġu mmodifikati biex jagħmlu tajjeb għal dejta tar-rata ta’ tkabbir jew rendiment. Proċeduri speċifiċi għad-determinazzjoni ta’ valuri ECx minn dejta kontinwa jistgħu jinstabu fi (17), (18), u (19).

Għal kull varjabbli ta’ rispons li jiġi analizzat, għandha tintuża r-relazzjoni konċentrazzjoni-rispons biex jiġu kkalkulati l-estimi ta’ punti ta’ valuri ECx. Fejn huwa possibbli, il-limiti ta’ kunfidenza tal-95 % għal kull stima għandhom jiġu ddeterminati. Il-livell ta’ kemm huwa tajjeb l-adattament tad-dejta ta’ rispons għall-mudell ta’ regressjoni għandu jiġi stmat grafikament jew statistikament. L-analiżi ta’ regressjoni għandha ssir bl-użu ta’ risponsi ta’ repliki individwali, u mhux medji ta’ gruppi ta’ trattament.

Stimi EC50 u limiti ta’ kunfidenza jistgħu wkoll jinkisbu bl-użu ta’ interpolazzjoni lineari b’sekwenza ta’ istruzzjonijiet inizjali (20), jekk il-mudelli/metodi ta’ regressjoni aċċessibbli mhumiex xierqa għad-dejta.

Għal stima tal-LOEC u għalhekk tal-NOEC, huwa neċessarju li jiġu mqabbla l-medji ta’ trattament permezz ta’ użu ta’ analiżi ta’ tekniki ta’ varjanza (ANOVA). Il-medja ta’ kull konċentrazzjoni għandha mbagħad tiġi mqabbla mal-medja ta’ kontroll billi jintuża metodu xieraq ta’ paragun multiplu jew metodu tat-test trend. Test ta’ Dunnett jew Williams jista’ jkun utli (21)(22)(23)(24). Huwa neċessarju li tivvaluta jekk l-ipotesi ANOVA ta’ omoġeneità ta’ varjanza treġix. Din il-valutazjoni tista’ ssir grafikament jew b’test formali (25). Testijiet adegwati huma dak ta' Levene jew Bartlett. Nuqqas li tintlaħaq l-ipotesi ta’ omoġeneità ta’ varjanzi tista’ xi drabi tiġi kkoreġuta permezz ta’ trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk l-eteroġeneità tal-varjanza hija estrema u ma tistax tiġi kkoreġuta bi trasformazzjoni, analiżi b’metodi bħal testijiet ta’ trend ’l isfel Jonkheere għandhom jiġu kkunsidrati. Iktar indikazzjoni dwar id-determinazzjoni tal-NOEC tista’ tinstab f’ (19).

Żviluppi xjentifiċi riċenti wasslu għal rakkomandazzjoni biex jiġi abbandunat il-kunċett tal-NOEC u minflok jinbidel bi stimi ECx ta’ punti bbażati fuq regressjoni. Valur xieraq għal x ma ġiex stabbilit għal dan il-Lemna test. Madankollu, sensiela ta’ minn 10 sa 20 % tidher xierqa (tiddependi fuq il-varjabbli ta’ rispons magħżul), u preferibbilment l-EC10 u l-EC20 għandhom jiġu rrapurtati t-tnejn li huma.

3. RAPPURTAR

3.1. RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi dawn li ġejjin:

Is-sustanza tat-test:

Speċi tat-test:

Kundizzjonijiet tat-test:

Riżultati:

4. LETTERATURA

The use of Lemna studies for coloured substances is detailed in Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals

Guidance on information requirements and chemical safety assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37-120 pp

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.

ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Appendiċi 1

Deskrizzjoni ta’ Lemna spp.

Il-pjanta akkwatika li komunement tissejjaħ bħala ħażiż li jgħatti l-wiċċ tal-ilma qiegħed (duckweed), Lemna spp., hija parti mill-familja Lemnaceae li għandha għadd ta’ speċi madwar id-dinja f’erba’ ġenera. Id-dehra u t-tassonomija differenti tagħhom ġew deskritti b’mod sħiħ (1)(2). Lemna gibba u L. minor huma speċi rappreżentattivi ta’ postijiet b’temperatura moderata u huma komunement użati għal testijiet ta’ tossiċità. Iż-żewġ speċi għandhom werqa biz-zokk (frond) tonda li żżomm fil-wiċċ jew taħt il-wiċċ tal-ilma, u għerq irqiq ħafna joħroġ minn nofs tal-wiċċ l-iktar baxx ta’ kull frond. Lemna spp. rari tipproduċi fjuri u l-pjanti jitnisslu billi veġetattivament jipproduċu frondi ġodda (3). B’kuntrast ma’ pjanti ixjaħ, iż-żgħar għandhom it-tendenza li jkunu iktar ċari, li jkollhom għeruq iqsar u jikkonsisti minn tnejn sa tliet frondi ta’ daqsijiet differenti. Id-daqs żgħir ta’ Lemna, l-istruttura sempliċi tagħha, ir-riproduzzjoni u l-ħin qasir ta’ ġenerazzjoni jagħmlu pjanti ta’ dan il-ġeneru tajbin ħafna għal ittestjar fil-laboratorju (4)(5).

Minħabba differenza probabbli bejn l-ispeċi, fis-sensittività, paraguni ta’ sensittività fost speċi waħda biss huma validi.

Eżempji ta’ speċi ta’ Lemna li ġew użati għal ittestjar: Referenza għal Speċi

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (bl-Iżvediż).

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Sorsi ta’ speċijiet ta’ Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 Tel: +1-416-978-3641 Fax:+1-416-978-5878 e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 United States phone 001 (919) 515-7572 astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University SE-106 91 STOCKHOLM SWEDEN Tel: +46 8 674 7240 Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA) FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlin Germany e-mail: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Letteratura

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.