ANNESS I

Skema għat-testijiet li għandhom jitwettqu skont l-Artikoli 3, 4, 5, u 7

1. PRINĊIPJI ĠENERALI DWAR IL-PREŻENZA TAL-PEST SPEĊIFIKAT

1.1. Il-preżenza tal-pest speċifikat tkun issuspettata fejn jinkiseb riżultat pożittiv fl-ewwel test ta’ detezzjoni mwettaq fuq il-pjanta speċifikata, jew fuq kampjuni tal-ilma.

1.2. Il-preżenza tal-pest speċifikat tiġi kkonfermata fil-każijiet li ġejjin: (a) meta l-ewwel jew it-tieni test ta’ detezzjoni jkun iżolament selettiv li jirriżulta f’kolonji b’morfoloġija tipika, u jinkisbu riżultati pożittivi f’żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni mwettqa fuq il-kolonji; (b) meta l-ewwel u t-tieni testijiet ikunu testijiet differenti mill-iżolament selettiv, u jinkisbu riżultati pożittivi f’żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni wara li l-kampjun ikun ġie ssoġġettat għal iżolament selettiv li jirriżulta f’kolonji b’morfoloġija tipika. Wieħed minn dawk iż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni għandu jkun test imsemmi fil-punti 2.2(e), (f) u (g).

2. TESTIJIET

2.1. Testijiet ta’ detezzjoni

It-testijiet ta’ detezzjoni għandhom ikunu tali li b’mod konsistenti jindividwaw mill-inqas 104 ċellola/ml ta’ pellet sospiża mill-ġdid miksuba minn kampjuni asintomatiċi.

It-tieni test ta’ detezzjoni għandu jkun ibbażat fuq prinċipji bijoloġiċi differenti jew reġjuni tan-nukleotid differenti mill-ewwel test ta’ detezzjoni.

It-testijiet ta’ detezzjoni huma dawn li ġejjin:

(a) testijiet tal-immunofluworexxenza kif deskritti fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(b) l-iżolament tal-pest speċifikat fuq il-medium ta’ tkabbir semi-selettiv mSMSA, kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(c) test tal-PCR konvenzjonali bl-użu tal-primers ta’ Pastrik et al., (2002) (1), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(d) Testijiet tal-PCR TaqMan® f’ħin reali bl-użu ta’ primers u sondi ta’: (i) Weller et al. (2000) (2), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (bl-użu ta’ sonda TaqMan® immodifikata mis-sonda oriġinali deskritta minn Weller et al. (2000), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (l-hekk imsejjaħ test NYtor), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iv) Massart et al. (2014) (5), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(e) Test LAMP (amplifikazzjoni isotermika medjata minn loops) bl-użu tal-primers ta’ Lenarčič et al. (2014) (6) (għall-użu biss fuq materjal mill-pjanti sintomatiku), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

2.2. Testijiet ta’ identifikazzjoni

It-testijiet ta’ identifikazzjoni huma dawn li ġejjin:

(a) testijiet tal-immunofluworexxenza kif deskritti fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(b) testijiet tal-PCR konvenzjonali bl-użu tal-primers ta’ Pastrik et al. (2002), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(c) Testijiet tal-PCR TaqMan® f’ħin reali bl-użu ta’ primers u sondi ta’: (i) Weller et al. (2000), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (ii) Vreeburg et al. (2016) (bl-użu ta’ sonda TaqMan® immodifikata mis-sonda oriġinali deskritta minn Weller et al. (2000)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iii) Vreeburg et al. (2018) (l-hekk imsejjaħ test NYtor), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali; (iv) Massart et al. (2014), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(d) Test LAMP (amplifikazzjoni isotermika medjata minn loops) bl-użu tal-primers ta’ Lenarčič et al. (2014), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(e) test tal-PCR konvenzjonali multiplu speċifiku għall-filotip (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(f) Barcoding tad-DNA (Wicker et al. (2007) (9)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali;

(g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018) (10)), kif deskritt fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

3. DIJAGRAMMI SEKWENZJALI TAL-PROĊEDURI

Dijagramma sekwenzjali Nru 1: Proċedura dijanjostika għall-preżenza tal-pest speċifikat f’kampjuni tal-pjanta speċifikata.

a L-iżolament jista’ jintuża bħala l-ewwel jew it-tieni test ta’ detezzjoni. Jekk il-preżenza tal-pest speċifikat tkun issuspettata fuq il-medium ta’ tkabbir, il-kolonji għandhom jiġu ppurifikati biex jinkisbu kulturi puri li fuqhom għandhom jitwettqu żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni.

b Wieħed minn dawn iż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni għandu jkun test imsemmi fil-punti 2.2(e), (f) u (g). Huma meħtieġa riżultati pożittivi fiż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni biex tiġi kkonfermata l-preżenza tal-pest.

c It-tielet test ta’ detezzjoni għandu jkun ibbażat fuq prinċipji bijoloġiċi differenti jew fuq reġjuni tan-nukleotid differenti.

Dijagramma sekwenzjali Nru 2: Proċedura dijanjostika għall-pest speċifikat fil-kampjuni tal-ilma.

a Wieħed minn dawn iż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni għandu jkun test imsemmi fil-punti 2.2(e), (f) u (g). Huma meħtieġa riżultati pożittivi fiż-żewġ testijiet ta’ identifikazzjoni biex tiġi kkonfermata l-preżenza tal-pest.

4. PREPARAZZJONI TAL-KAMPJUNI

4.1. Kampjuni minn tuberi asintomatiċi

Il-kampjun standard għandu jkun fih 200 tuberu għal kull test. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju għall-ipproċessar tal-qalba tan-naħa tal-għarqub biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

4.2. Kampjuni minn pjanti speċifikati asintomatiċi

Id-detezzjoni ta’ infezzjonijiet latenti għandha titwettaq fuq kampjuni komposti ta’ segmenti miz-zokk jew miz-zokk iż-żgħir tal-werqa li jgħaqqad maz-zokk prinċipali. Il-proċedura tista’ tiġi applikata fuq sa 200 parti taz-zokk jew 200 zokk tal-werqa minn pjanti differenti f’kampjun wieħed. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju biex jiġu ddiżinfettati u pproċessati s-segmenti taz-zokk jew taz-zokk tal-werqa biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

4.3. Kampjuni minn materjal sintomatiku tal-pjanti speċifikati

Għandhom jitneħħew sezzjonijiet tat-tessut b’mod asettiku miċ-ċirku vaskulari f’tuberu tal-patata jew mis-saffi vaskulari fiz-zkuk ta’ pjanti speċifikati li juru sintomi ta’ tidbil. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju biex dawn it-tessuti jiġu pproċessati biex jinkiseb l-estratt għad-detezzjoni tal-pest speċifikat hija deskritta id-dettall fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

4.4. Kampjuni tal-ilma tal-wiċċ jew tar-riċirkolazzjoni (inkluż tal-ipproċessar tal-patata jew tal-effluwenti tad-drenaġġ)

It-test prinċipali għad-detezzjoni tal-pest speċifikat f’kampjuni tal-ilma tal-wiċċ, tal-ilma mis-sistemi ta’ riċirkolazzjoni u ta’ kampjuni tal-effluwent (l-industrija tal-ipproċessar tal-patata) huwa iżolament selettiv. Il-proċedura x-xierqa tal-laboratorju għall-ipproċessar tal-kampjuni tal-ilma hija deskritta fl-istandards dijanjostiċi internazzjonali.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. F’Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (edituri Allen C, Hayward AC & Prior P), pp. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (l-Istati Uniti).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.