Official Journal L 206 , 29/07/1978 P. 0043 - 0055

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 10 P. 0071

Greek special edition: Chapter 03 Volume 22 P. 0067

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 10 P. 0071

Spanish special edition: Chapter 03 Volume 14 P. 0230

Portuguese special edition Chapter 03 Volume 14 P. 0230



It-Tmien Direttiva tal-Kummissjoni tal-15 ta’ Ġunju 1978 li tistabbilixxi metodi tal-Komunità ta’ analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ għalf għal bhejjem (78/633/KEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ekonomika Ewropea, Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 70/373/KEE ta’ l-20 ta’ Lulju 1970 dwar l-introduzzjoni ta’ metodi tal-Komunità ta’ kampjunar u analiżi għall-kontroll uffiċjali ta’ għalf tal-bhejjem [1], kif l-aħħar emendata bl-Att ta’ l-Adeżjoni, u partikolarment l-Artikolu 2 tiegħu, Billi dik id-Direttiva teħtieġ li l-kontroll uffiċjali ta’ għalf għal bhejjem għandu jkun imwettaq bl-użu ta’ metodi tal-Komunità ta’ kampjunar u analiżi għall-iskop tal-verifika tal-konformità mal-ħtiġijiet li joriġinaw mid-dispożizzjonijiet stipulati b’liġi, regolament jew azzjoni amministrattiva li tikkonċerna l-kwalità u l-komposizzjoni ta’ l-għalf għal bhejjem, Billi d-Direttivi tal-Kunsill 71/250/KEE tal-15 ta’ Ġunju 1971 [2], 71/393/KEE tat-18 ta’ Novembru 1971 [3], 72/199/KEE tas-27 t’April 1972 [4], 73/46/KEE tal-5 ta’ Diċembru 1972 [5], 74/203/KEE tal-25 ta’ Marzu 1974 [6], 75/84/KEE ta’ l-20 ta’ Diċembru 1974 [7] u 76/373/KEE ta’ l-1 ta’ Marzu 1976 [8] diġà kienu stabillixxew numru ta’ metodi ta’ analiżi tal-Komunità; billi l-progress sa minn dak iż-żmien jagħmilha rakkomandabbli li jkun adottat it-tmien sett ta’ metodi; Billi l-miżuri previsti f’din id-Direttiva huma bi qbil ma’ l-opinjoni tal-Kumitat Permanenti ta’ Għalf għal Bhejjem, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Artikolu 1 1. Stati Membri għandhom jesiġu li l-analiżi għal kontrolli uffiċjali ta’ għalf għal bhejjem, f’dak li jirrigwarda l-kontenut fihom ta’ baċitraċina taż-żingu, flavophospholipol, ħadid, ramm, manganiż u żingu, li jkunu mwettqa bi qbil mal-metodi kif deskritti fl-Anness ta’ din id-Direttiva. 2. Id-dispożizzjonijiet ġenerali stipulati fil-Parti 1 "Introduzzjoni" ta’ l-Anness ta’ l-Ewwel Direttiva 71/250/KEE, bl-eċċezzjoni tal-parti li titratta mal-preparazzjoni tal-kampjun li għandu jkun analizzat, għandha tapplika għall-metodi deskritti fl-Anness ta’ din id-Direttiva. Artikolu 2 L-Istati Membri għandhom, fl-1 ta’ Jannar 1979, idaħħlu b’effett il-liġijiet, regolamenti u dispożizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex dawn ikunu konformi ma’ din id-Direttiva. Għandhom minnufih jinfurmaw lill-Kummissjoni dwar dan. Artikolu 3 Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri. Magħmula fi Brussel, fil-15 ta’ Ġunju 1978. Għall-Kummissjoni Finn Gundelach Viċi-President [1] ĠU L 170, tat-3.8.1970, p. 2. [2] ĠU L 155, tat-12.7.1971, p. 13. [3] ĠU L 279, ta'l-20.12.1971, p. 7. [4] ĠU L 123, tad-29.5.1972, p. 6. [5] ĠU L 83, tat-30.3.1973, p. 21. [6] ĠU L 108, tat-22.4.1974, p. 7. [7] ĠU L 32, tal-5.2.1975, p. 26. [8] ĠU L 102, tal-15.4.1976, p. 8. -------------------------------------------------- ANNESS 1. DETERMINAZZJONI TA’ BAĊITRAĊINA TAŻ-ŻINGU B’DIFFUŻJONI F’MEDJU AGAR 1. GĦAN U SKOP Il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ baċitraċina taż-żingu f’għalf għal bhejjem, konċentrati u taħlitiet lesti. Il-limitu l-aktar baxx ta’ determinazzjoni huwa 5 mg/kg (5 ppm) [1]. Il-metodu mhux validu fil-preżenza ta’ sustanzi li jfixklu, partikolarment ammonti kbar ta’ ramm u aċidu askorbiku. 2. PRINĊIPJU Il-kampjun huwa estratt fi ph2 b’taħlita ta’ aċidu metanol/ilma/idrokloriku. L-estratt huwa miġjub lejn ph 6.5, ikkonċentrat (fejn meħtieġ) jew imħallat. L-attività antibijotika tiegħu hija determinata bil-kejl tad-diffużjoni ta’ baċitraċina taż-żingu f’medju agar injettata bi Micrococcus luteus (Syn. M. flavus). Diffużjoni hija murija bil-formazzjoni ta’ żoni ta’ inibizzjoni tal-mikroorganiżmi. Id-dijametru ta’ dawn iż-żoni huwa meħud fi proporzjon dirett tal-logaritmika tal-konċentrazzjoni antibijotika matul il-medda tal-konċentrazzjonijiet antibijotiċi użati. 3. MIKROORGANIŻMU: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240 3.1. Żamma ta’ stock culture Injetta l-Micrococcus luteus fuq siltiet agar tal-medju tat-trobbija (4.1). Inkuba għal 24 siegħa f’minn 30 sa 37 °C, aħżen f’refriġeratur f’madwar 4 °C u injetta mill-ġdid kull ġimagħtejn fuq is-siltiet agar. 3.2. Preparazzjoni tas-sospensjoni batterjoloġika [2] Iġbor it-tkabbir minn fuq is-siltiet agar reċentament imħejjija (3.1) bi 2 sa 3 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). Uża din is-sospensjoni biex tinjetta 250 ml ta’ medju ta’ koltura (4.1) li tkun miżmuma f’vażett Roux u inkuba għal minn 18 sa 20 siegħa fi 30 sa 37 °C. Iġbor it-tkabbir tas-soluzzjoni tal-klorat tas-sodju (4.3) u ħallat. Iddilwixxi s-soluzzjoni lejn wieħed minn għaxra b’soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). Iddilwixxi s-soluzzjoni lejn wieħed minn għaxra b’soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). It-trasmissjoni tad-dawl tas-sospensjoni għandha tkun ta’ madwar 75 % imkejla, f’650 mm f’ċellola ta’ 1 cm kontra soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). 4. MEDJU TA’ KOLTURA U REAĠENTI 4.1 Medju ta’ koltura [3] Peptone tal-laħam | 6,0 g | Tryptone | 4,0 g | Estratt tal-ħmira | 3,0 g | Estratt tal-laħam | 1,5 g | Glukożju | 1,0 g | Agar | 15,0 g | Ilma | 1000 ml | pH 6.5 sa 6.6 (wara sterilizzazzjoni) | | 4.2 Saġġ tal-medju [4] Tryptone | 10,0 g | Estratt tal-ħmira | 3,0 g | Estratt tal-laħam | 1,5 g | Glukożju | 1,0 g | Agar | 20,0 g | Tween 80 | 1 ml | Ilma | 1000 ml | pH 6.5 (wara sterilizzazzjoni) | | 4.3. Soluzzjoni tal-klorat tas-sodju 0.8 % (w/v): dewweb 8 g klorat tas-sodju a.p. f’ilma u dewweb għal 1000 ml; sterilizza. 4.4. Taħlita ta’ metanol, pur/ilma/aċidu idrokloriku a.p. (d: 1,18 sa 1,19): 80/17,5/2,5 (v/v/v). 4.5. Barriera tal-Fosfat, pH 6.5 Potassium hydrogen phosphate K2HPO4 a.p. (22.15 g). Potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 a.p. (27.85 g). Ilma sa 1000 ml. 4.6. Aċidu idrokloriku a.p. (d: 1.18 sa 1.19): 4.7. Aċidu idrokloriku a.p. (0.1 N). 4.8. Soluzzjoni ta’ sodium hydroxide 1 N a.p. 4.9. Soluzjoni ta’ Bromocresol vjola 0.04 % (w/v): dewweb 0.1 g ta’ bromocresol vjola fi 18.5 ml ta’ 0.01 N soluzjoni ta’ idrossidu tas-sodju. Wassal il-volum għal 250 ml b’ilma u ħawwad. 4.10. Sustanzi normali: baċitriċina taż-żingu ta’ attività magħrufa (fi i.u.). 5. SOLUZZJONIJIET NORMALI Iżen kwantità ta’ baċitraċina taż-żingu normali (4.10) li jikkorrispondi għal 1,050 i.u. (skond l-attività indikata). Żid 6 ml ta’ 0.1 N aċidu idrokloriku (4.7) u ħalli joqgħod għal 15-il minuta. Żid 30 ml ta’ ilma, aġġusta l-pH għal 4.5 b’barriera tal-fosfat pH 6.5 (4.5) (madwar 4 ml), żid il-volum għal 50 ml b’ilma u ħawwad sewwa (1 ml = 21 i.u.). Minn din is-soluzzjoni pprepara b’taħlita suċċessiva b’barrieratal-fosfat pH 6.5 (4.5) is-soluzzjonijiet li ġejjin: S8 | 0,42 i.u./ml | S4 | 0,21 i.u./ml | S2 | 0,105 i.u./ml | S1 | 0,0525 i.u./ml | 6. PREPARAZZJONI TA’ L-ESTRATT 6.1. Estrazzjoni 6.1.1. Konċentrati, taħlitiet imħejjija qabel u għalf mineralizzat Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 2.0 sa 5.0 g, żid 30 ml tat-taħlita (4.4) u ħawwad ftit. Iċċekkja li l-pH ikun bejn wieħed u ieħor 2. Ħawwad għal 10 minuti, żid 30 ml ta’ barriera tal-fosfat pH 6.5 (4.5) u ħawwad għal 15-il minuta. Iddilwixxi bil-barrieratal-fosfat (4.5) biex ikollok taħlita kif suppost ta’ baċitriċina taż-żingu ta’ 0.42 (i.u./ml) (= U8). 6.1.2. Konċentrati ta’ proteini Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 10.0 g, żid 50 ml tat-taħlita (4.4) u ħawwad ftit. Iċċekkja li l-pH ikun bejn wieħed u ieħor 2. Ħawwad għal 10 minuti, żid 50 ml ta’ barrieratal-fosfat pH 6.5 (4.5) u ħawwad għal 15-il minuta. Iddilwixxi bil-barriera tal-fosfat (4.5) biex ikollok taħlita kif suppost ta’ baċitriċina taż-żingu ta’ 0.42 (i.u./ml) (= U8). 6.1.3. Għalf ieħor Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 10.0 g (20.0 g għal taħlita kif suppost ta’ baċitriċina taż-żingu ta’ 5 mg/kg, żid 25 ml tat-taħlita (4.4) u omoġenizzata għal madwar 10 minuti. Żid 25 ml ta’ barriera tal-fosfat pH 6.5 (4.5), ħawwad għal 15-il minuta u ċċentrifuga. Ħu 20 ml tas-soluzzjoni supernatanti u aġġusta l-pH għal 6.5 permezz ta 1 N soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (4.8) b’soluzzjoni vjola tal-bromovresol (4.9) bħala indikatur. Evapora għal madwar 4 ml f’evoporatur rotanti f’temperatura li ma teċċedix 35 °C. Iddilwixxi dak li jibqa’ bl-ilma biex ikollok taħlita kif suppost ta’ baċitriċina taż-żingu ta’ 0.42 (i.u./ml) (= U8). 6.2. Soluzzjonijiet ta’ l-assaġġ Mis-soluzzjoni U8 ipprepara soluzzjonijiet U4 (taħlita kif suppost: 0.21 i.u./ml), U2 (taħlita kif suppost: 0,105 i.u./ml), u U1 (taħlita kif suppost: 0.0525 i.u/ml) permezz ta’ dilwizzjoni suċċessivi (1 + 1) b’barriera tal-fosfat (4.5). 7. PROĊEDURA TA’ L-ASSAĠĠ 7.1. Inokulazzjoni tal-medju ta’ l-assaġġ Inokula l-medju ta’ l-assaġġ (4.2) b’sospensjoni batterjoloġika (3.2) f’madwar 50 °C. Bi provi preliminari fuq pjanċi b’medju ta’ assaġġ (4.2) iddetermina l-kwantità ta’ sospensjoni batterjoloġika meħtieġa biex tagħti l-akbar żoni u ż-żoni l-aktar ċari ta’ inibizzjoni bil-konċentramenti varji ta’ baċitraċina taż-żingu. 7.2. Tħejjija tal-pjanċi Diffużjoni mill-agar hija mwettqa fuq pjanċi b’erba’ konċentrati tas-soluzzjoni normali (S8, S4, S2, S1) u l-erba’ konċentrati tas-soluzzjoni ta’ l-assaġġ (U8, U4, U2, U1). Dawn l-erba’ konċentrati ta’ estratt u norma għandhom neċessarjament ikunu mqiegħda fuq kull pjanċa. Biex ikollok dan l-effett, agħżel pjanċi kbar biżżejjed li jippermettu mill-anqas tmien toqbiet b’dijametru ta’ 10 sa 13 mm u mhux anqas minn 30 mm bejn ċentri li ssir fil-medju agar. It-test jista’ jkun imwettaq fuq pjanċi li jikkonsistu f’folji tal-ħġieġ b’wiċċ ta’ l-aluminju jew ċirku tal-plastik imqiegħed fuq il-wiċċ, b’dijametru ta’ 200 mm u għoli ta’ 20 mm. Ferrgħa fuq il-pjanċi kwantità tal-medju (4.2), inokula bħal f’punt 7.1, biex tagħti saff ta’ madwar 2 mm ħxuna (50 ml għal pjanċa ta’ 200 mm dijametru). Ħalli li joqgħod f’pożizzjoni dritta, taqqab it-toqob u agħmilhom f’volumi mkejla eżatti ta’ assaġġ u soluzzjonijiet normali (bejn 0.10 u 0.15 ml kull toqba, skond id-dijametru). Applika kull konċentrazzjoni mill-anqas erba’ darbiet hekk li kull determinazzjoni tkun soġġetta għal evalwazzjoni ta’ 32 żona ta’ inibizzjoni. 7.3. Inkubazzjoni Inkuba l-pjanċi għal minn 16 sa 18-il siegħa fi 28 sa 30 °C. 8. EVALWAZZJONI Kejjel id-dijametru taż-żoni ta’ inibizzjoni lejn l-eqreb 0.1 mm. Irreġistra l-medja tal-kejl għal kull konċentrazzjoni fuq karta bi grafika semilogaritmika li turi l-logaritmika tal-konċentrazzjonijiet b’relazzjoni mad-dijametri taż-żoni ta’ inibizzjoni. Pinġi l-linji li l-aħjar li jidħlu kemm fis-soluzzjoni normali u l-estratt, per eżempji bħal hawn taħt. Iddetermina l-punt ta’ l-"aħjar dħul" tal-livell normali l-aktar baxx (SL) meta tuża l-formula: a) SL = 7 S + 4 S + S - 2 S Iddetermina l-punt ta’ l-"aħjar dħul" tal-livell normali l-aktar baxx (SL) meta tuża l-formula: b) SH = 7 S + 4 S + S - 2 S Bl-istess mod ikkalkula l-punti ta’ l-"aħjar dħul" ta’ l-anqas livell ta’ l-estratt (UL) u l-għola livell ta’ l-estratt (UH) billi tissostitwixxi U1, U2, U4, u U8 għal S1, S4 u S8 fil-formuli t’hawn fuq. Irreġistra l-valuri kkalkolati SL u SH fuq l-istess karta grafika u ġannathom biex tagħti l-linja ta’ "aħjar dħul" għas-soluzzjoni normali. B’mod simili rreġistra UL u UH u ġannathom biex tagħti l-linja ta’ l-"aħjar dħul" għall-estratt. Fin-nuqqas ta’ xi interferenza l-linji għandhom ikunu paralleli. Għal skopijiet prattiċi l-linji jistgħu jkunu meqjusa paralleli jekk il-valuri (SH-SL) u (UH-UL) ma jkunux jiddifferixxu b’aktar minn 10 % mill-valur medju. Jekk il-linji jinstabu li ma humiex paralleli, jew U1 u S1 inkella U8 u S8 jistgħu jkunu mwarrba u SL, SH, UL u UH ikkalkolati, bl-użu tal-formula alternattiva, biex tagħti linji alternattivi ta’ l-"aħjar dħul": SL = 5 S + 2 S - S 46 jew 6 b’) SH = 5 S + 2 S - S jew 6 u l-istess għal UL u UH. Il-linji alternattivi ta’ l-aħjar dħul għandhom ikunu vverifikati għal paralleliżmu bħal qabel. Il-fatt li r-riżultat ikun ġie kkalkolat minn tliet livelli għandu jkun innotat fir-rapport finali. Meta l-linji jkunu meqjusa bħala li huma paralleli, ikkalkula l-logaritmika ta’ l-attività relattiva (log. A) permezz ta’ waħda minn dawn il-formuli. Għal erba’ livelli × 0,602 U + U + S + S - U - U - S - S 2 Għal tliet livelli × 0,401 U + S - U - S 1 jew d’) log A = × 0,401 U + S - U - S Attività reali = attività ssoponuta x attività relattiva. Meta l-linji huma meqjusa bħala li ma humiex paralleli, irrepeti d-determinazzjoni. Jekk il-paralleliżmu ma jkunx milħuq, ikkalkola l-logaritmiku ta’ l-attività relattiva (log. A) permezz tal-formula (ċ). Ir-riżultat akkwistat għandu b’danakollu jkun meqjus bħala approssimattiv u dan għandu jkun innutat fir-rapport finali. 9. IR-REPETIZZJONI Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-ispess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jeċċedu: 20 % relatati ma’ l-għola valur għal kontenut ta’ baċitraċina taż-żingu minn 5 u sa massimu ta’ 25 mh/kg; 5 mg/kg, f’valur assolut, għal kwantità akbar minn 25 sa massimu ra’ 50 mg/kg; 10 % relatati ma l-ogħla valur għal kwantità ’l fuq minn 50 mg/kg. 2. DETERMINAZZJONI TA’ FLAVOPHOSPHOLIPOL B’DIFFUŻJONI F’MEDJU AGAR 1. GĦAN U SKOP Il-metodu huwa għad-determinazzjoni ta’ flavophospholipol f’għalf għal bhejjem, konċentrati u taħlitiet lesti minn qabel. Il-limitu l-aktar baxx ta’ determinazzjoni huwa 1 mg/kg (1 ppm). 2. PRINĊIPJU Il-kampjun huwa estratt b’metanol imdewweb billi jkun imsaħħan taħt rifluss. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, l-estratt huwa ppurifikat (fejn meħtieġ) bi trattament bi skambju ta’ joni ta’ reżini u mħallat. L-attività antibijotika tagħha hija ddeterminata bil-kejl tad-diffużjoni ta’ flavophospholipol f’medju agar inokulata bi Staphylococcus aureus. Id-diffużjoni hija murija bil-formazzjoni ta’ żoni ta’ inibizzjoni tal-mikro-organiżmi. Id-dijametru ta’ dawn iż-żoni huwa meħud fi proporzjon dirett tal-logaritmika tal-konċentrazzjoni antibijotika matul il-medda tal-konċentrazzjonijiet antibijotiċi użati. 3. MIKRO-ORGANIŻMU: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P 3.1. Żamma ta’ stock culture Injetta Staphylococcus aureus fuq siltiet agar tal-medju tat-trobbija (4.1). Inkuba għal 24 siegħa f’minn 30 sa 37 °C, aħżen f’refriġeraturf’madwar 4 °C u injetta mill-ġdid kull xahar fuq is-siltiet agar. 3.2. Preparazzjoni tas-sospensjoni batterjoloġika [5] Warrab żewġ tubi li jkun fihom l-"stock culture" (3.1) u injetthom mill-ġdid kull ġimgħa. Inkuba għal 24 siegħa fi 37 °C u aħżen f’refriġeraturf’madwar 4 °C. 24 siegħa qabel l-assaġġ, injetta b’dan it-tkabbir minn tnejn sa erba’ tubi li jkun fihom is-siltiet tal-medju tal-koltura (4.1). Inkuba għal minn 16 sa 18-il siegħa fi 37 °C. Agħmel sospensjoni tat-tkabbir f’soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). It-trasmissjoni tad-dawl tas-sospensjoni għandha tkun ta’ madwar 40 % imkejla f’5.8 mm f’ċellola ta’ 1 ċm kontra soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju (4.3). 4. MEDJA TA’ KOLTURA U REAĠENTI 4.1. Medja ta’ koltura [6] Peptone tal-laħam | 6,0 g | Tryptone | 4,0 g | Estratt tal-ħmira | 3,0 g | Estratt tal-laħam | 1,5 g | Glukożju | 1,0 g | Agar | 15,0 g | Ilma | 1000 ml | ph 6.5 (wara sterilizzazzjoni) | | 4.2. Medja ta’ assaġġ 4.2.1. Saff bażiku [7] Peptone tal-laħam | 6,0 g | Estratt tal-ħmira | 3,0 g | Estratt tal-laħam | 1,5 g | Agar | 15,0 g | Ilma | 1000 ml | ph 6.5 (wara sterilizzazzjoni) | | 4.2.2. Saff ta’ żerriegħa Bħal għal punt 4.1, biż-żieda ta’ 2.0 g ta’ emulsjoni ta’ silikon kontra r-ragħwa [8]. 4.3. Soluzzjoni ta’ klorat tas-sodju 0.4 % (w/v): ħoll 4 g ta’ klorat tas-sodju a.p. f’ilma u iddilwixxi għal 1000 ml; sterilizza. 4.4. Metanol, pur. 4.5. Metanol 50 % (v/v): iddilwixxi għal 500 ml ta’ metanol (4.4) bi 500 ml ta’ ilma. 4.6. Metanol 50 % (v/v): iddilwixxi 800 ml ta’ metanol (4.4) bi 200 ml ta’ ilma. 4.7. Tris (hydroxymethyl) aminomethane a.p. 4.8. Soluzzjoni metanolika tal-klorat tal-putassa 1.5 % (w/v): iddilwixxi 1.5 g ta’ klorat tal- putassa a.p. fi 20 ml ta’ ilma, wassal il-volum għal 100 ml b’metanol (4.4). 4.9. Kambjatur ta’ jonju elettropożittiv: Dowex 50 W x 8, għarbiel ta’ 20 sa 50, għamla Na (cat. Serva No 41600) jew ekwivalenti. 4.10. Kambjatur Anjonju: Dowex1 x 2,għarbiel ta’ 20 sa 50, għamla CI (cat. Serva No 41010) jew ekwivalenti. Qabel l-użu, żomm għal minn 12 sa 14-il siegħa fi 80 % metanol (4.6). 4.11. Suf tal-ħġieġ. 4.12. Karta ta’ indikatur tal-pH (pH 6.6 sa 8.1). 4.13. Aċidu askorbiku. 4.14. Sustanza normali: flavophospholipol ta’ attività magħrufa. 5. APPARAT 5.1. Tubu tal-ħġieġ għal kromatografija, dijametru intern: 9 mm, tul: 150 sa 200 nn, mgħammar b’vit fil-parti d-dejqa tan-naħa t’isfel u ġonta ta’ ħġieġ maħkuk (biex tgħaqqad mal-lembut tat-tqattir (5.2) fit-tarf ta’ fuq. 5.2. Lembut tat-tqattir 250 ml, mgħammar b’vit u ġonta ta’ ħġieġ maħkuk. 5.3. Vażett konikali 250 ml b’ġonta ta’ ħġieġ maħkuk. 5.4. Kondensatur ta’ rifluss b’ġonta ta’ ħġieġ maħkuk. 6. SOLUZZJONIJIET NORMALI iddilwixxi biex ikun hemm "stock solution" li jkun fiha 100 μg flavophospholipol millilitru. Maħżuna f’vażetti bit-tappijiet fi 4 °C din is-soluzzjoni hija stabbili sa xaharejn. it-taħlitiet segwenti: S8 | 0,2 μg/ml | S4 | 0,1 μg/ml | S2 | 0,05 μg/ml | S1 | 0,025 μg/ml | 7. PREPARAZZJONI TA’ L-ESTRATT 7.1. Estrazzjoni 7.1.1. Konċentrati, taħlitiet imħejjija qabel u għalf mineralizzat Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 2.0 sa 5.0 g u żid madwar 150 mg ta’ aċidu askorbiku (4.13). Omoġenizza bi 150 ml ta’ 50 % metanol (4.5) f’vażett konikali (5.3) u aġġusta l-pH għal 8.1 sa 8.2 b’madwar 400 mg ta’ tris(hydroxymethyl)aminomethane (4.7). Ivverifika l-pH b’karta indikatur (4.12). Ħalli joqgħod għal 15-il minuta, aġġusta mill-ġdid il-pH għal 8.1 sa 8.2 bi tris(hydroxymethyl)aminomethane (4.7) u għalli għal 10 minuti taħt rifluss (5.4) b’taħwid kontinwu. Ħallih jibred, iċċentrifuga t-taħlita u ferragħ l-estratt. 7.1.2. Għalf ieħor Iżen kwantità ta’ kampjun ta’ 5.0 sa 30.0 g li jkun fiha mill-anqas 30 μg ta’ flavophospholipol. Omoġenizza bi 150 ml ta’ 50 % metanol (4.5) f’vażett konikali (5.3) u aġġusta l-pH għal 8.1 sa 8.2 b’madwar 400 mg ta’ tris(hydroxymethyl)aminomethane (4.7). Ivverifika l-pH b’karta indikatur (4.12). Ħalli joqgħod għal 15-il minuta, aġġusta mill-ġdid il-pH għal 8.1 sa 8.2 bi tris(hydroxymethyl)aminomethane (4.7) u għalli għal 10 minuti taħt rifluss (5.4) b’taħwid kontinwu. Ħallih jibred, iċċentrifuga t-taħlita u ferragħ l-estratt. 7.2. Purifikazzjoni (din tista’ tkun maqbuża għal konċentrati, taħlitiet imħejjija u għalf mineralizzat) Ħallat 110 ml ta’ l-estratt ma’ 11 g tal-kambjatur anjonju (4.9), għalli għal minuta taħt rifluss (5.4) b’taħwid kontinwu. Issepara l-kambjatur anjonju b’ċentrifugazzjoni jew filtrazzjoni. Ħallat 100 ml ta’ l-estratt ma’ 150 ml ta’ metanol (4.4) u aħżen is-soluzzjoni għal minn 12 sa 15-il siegħa f’ 4 °C. Iffiltra ’l barra l-massa flokkulenti waqt li tkun kiesħa. Deffes tapp tas-suf tal-ħġieġ (4.11) fil-qiegħ tat-tubu tal-ħġieġ (5.1), ferrgħa fit-tubu 5 ml tal-kambjatur anjonju (4.10) u aħsel il-kolonna bi 100 ml ta’ 80 % metanol (4.6). Bl-użu tal-lembut (5.2), ittrasferixxi lejn il-kolonna volum ta’ filtrat ta’ mill-anqas 100 ml li suppost jkun fih 16 μg ta’ flavophospholipol (200 ml għal kampjun ta’ 30 g ta’ għalf tal-bhejjem fi 1 ppm). Fejn meħtieġ, qabel l-applikar lejn il-kolonna, iddilwixxi l-filtrat bi 80 % metanol (4.6) biex takkwista kontenut mistenni ta’ flavophospholipol ta’ 16 μg/100 ml. Aġġusta r-rata tat-tnixxija għal madwar 2 ml/minuta. Armi l-effluwent. Imbagħad aħsel il-kolonna bi 50 ml ta’ 80 % metanol (4.6) u armi l-effluwent. Aħsel il-flavophospholipol b’soluzzjoni tal-metanol tal-klorat tal-putassa (4.8) waqt li żżomm ir-rata tat-tnixxija għal madwar 2 ml/minuta. Iġbor 50 ml tal-ħasil f’vażett bil-qisien, żid 30 ml ta’ ilma u ħawwad. Din is-soluzzjoni għandha jkollha kontenut ta’ flavophospholipol ta’ 0 72 μg/ml (= U8). 7.3. Soluzzjonijiet ta’ l-assaġġ Fejn meħtieġ (i.e. meta l-purifikazzjoni tkun ġiet maqbuża), iddilwixxi l-estratt li jirriżulta f’punt 7.1.1 bi 50 % metanol (4.5) biex takkwista l-kontenut kif suppost ta’ flavophospholipol ta’ 0.2 μg/ml (= U8). Mis-soluzzjoni U8 ipprepara soluzzjonijiet U4 (taħlita kif suppost: 0.1 μg/ml), U2 (taħlita kif suppost: 0.05 μg/ml) u U1 (taħlita kif suppost: 0,025 μg/ml) permezz ta’ dilwiet suċċessivi (1 + 1) bi 50 % metanol (4.5). 8. PROĊEDURA TA’ ASSAĠĠ 8.1. Injezzjoni tal-medju ta’ l-assaġġ Injetta l-medju ta’ l-assaġġ (4.2.2) b’sospenzjoni batterjoloġika (3.2) f’madwar 50 °C. Bi provi preliminari fuq pjanċi bil-medju ta’ l-assaġġ (4.2.2) iddetermina l-kwantità tas-sospensjoni batterjoloġika meħtieġa biex tagħti l-akbar żoni u ż-żoni l-aktar ċari ta’ inibizzjoni mal-varji konċentrazzjonijiet ta’ flavophospholipol (madwar 30 ml/litru). 8.2. Preparazzjoni tal-pjanċi Diffużjoni mill-agarhija mwettqa fuq pjanċi bl-erba’ konċentrati tas-soluzzjoni normali (S8, S4, S2, S1) u l-erba’ konċentrati tas-soluzzjoni ta’ l-assaġġ (U8, U4, U2, U1). Dawn l-erba’ konċentrati ta’ estratt u norma għandhom neċessarjament ikunu mqiegħda fuq kull pjanċa. Għal dan l-iskop, agħżel pjanċi kbar biżżejjed biex jippermettu mill-anqas tmien toqbiet b’dijametru ta’ minn 10 sa 13 mm u mhux anqas minn 30 mm bejn ċentri li għandhom isiru fil-medju ta’ l-agar. It-test jista’ jkun imwettaq fuq pjanċi li jikkonsistu minn folji tal-ħġieġ b’wiċċ bl-aluminju jew ċirku tal-plastik imqiegħed fuq il-wiċċ, b’dijametru ta’ 200 mm u għoli ta’ 20 mm. Ferrgħa fuq il-pjanċi kwantità tal-medju (4.2.1) biex tagħti saff ta’ madwar 1 50 mm ħxuna (45 ml għal pjanċa ta’ 200 mm dijametru). Ħalli joqgħod f’pożizzjoni dritta u mbagħad poġġi saff fil-wiċċ ta’ kwantità tal-medju (4.2.2) injettata bħal f’punt 8.1 biex ikun hemm saff 1 mm oħxon (30 ml għal pjanċa ta’ 200 mm dijametru). Ħallih joqgħod mill-ġdid f’pożizzjoni dritta, taqqab it-toqob u agħmel fihom volumi mkejla eżatti ta’ soluzzjonijiet ta’ assaġġ u normali (bejn 0.10 u 0.15 m; kull toqba, skond id-dijamentru). Applika kull konċentrat mil-anqas erba’ darbiet hekk li kull determinazzjoni tkun soġġetta għall-evalwazzjoni ta’ 32 żoni ta’ inibizjoni. 8.3. Inkubar Inkuba l-pjanċi għal minn 16 sa 18-il siegħa fi 28 sa 30 °C. 9. EVALWAZZJONI Kejjel id-dijametru taż-żoni ta’ inibizzjoni sa l-eqreb 0.1 mm. Irreġistra l-medja tal-kejl għal kull konċentrazzjoni fuq karta grafika semilogaritmika li turi l-logaritma tal-konċentrazzjonijiet b’relazzjoni mad-dijametri taż-żoni ta’ inibizzjoni. Pinġi l-linji li l-aħjar li jidħlu kemm fis-soluzzjoni normali u wkoll fl-estratt, per eżempju skond is-segwenti. Iddetermina l-punt ta’ l-"aħjar li jidħlu" għal-livel normali l-aktar baxx (SL) billi tuża l-formula: a) SL = 7 S + 4 S + S - 2 S b) SH = 7 S + 4 S + S - 2 S Bl-istess mod ikkalkola l-punti li l-"aħjar li jidħlu" għal-livell l-aktar baxx ta’ l-estratt (UL) u l-livell l-aktar għoli ta’ l-estratt (UH) billi tissostitwixxi U1, U2, U4 u U8 għal S1, S2, S4 u S8 fil-formuli ta’ hawn fuq. Irreġistra l-valuri kkalkolati ta’ SL u SH fuq l-istess karta grafika u għaqqadhom biex jagħtu l-linja ta’ l-"aħjar dħul" għas-soluzzjoni normali. Bl-istess mod irreġistra UL u UH u għaqqadhom biex tagħti l-linja ta’ l-"aħjar dħul" għall-estratt. Fin-nuqqas ta’ xi interferenza l-linji għandhom ikunu paralleli. Għal skopijiet prattiċi l-linji jistgħu jkunu meqjusa paralleli jekk il-valuri (SH-SL) u (UH-UL) ma jkunux jiddifferixxu b’aktar minn 10 % mill-valur medju tagħhom. Jekk il-linji jinstabu li ma humiex paralleli, jew U1 u S1 inkella U8 u S8 jistgħu jkunu mwarrba u SL, SH, UL u UH ikkalkolati, bl-użu ta’ formula alternattiva, biex takkwista l-linji alternattivi ta’ l-"aħjar dħul": SL = 5 S + 2 S - S 46 jew 6 b’) SH = 5 S + 2 S - S jew 6 u l-istess għal UL u UH. Il-linji alternattivi ta’ l-"aħjar dħul" għandhom ikunu vverifikati għal parallelità bħal qabel. Il-fatt li r-riżultat jkun ġie kkalkolat minn tliet livelli għandu jkun innutat fir-rapport finali. Meta l-linji huma meqjusa bħala paralleli, ikkalkola l-logaritmika ta’ l-attività relattiva (log. A) permezz ta’ waħda mill-formuli segwenti. Għal erba’ livelli × 0,602 U + U + S + S - U - U - S - S 2 Għal tliet livelli × 0,401 U + S - U - S 1 jew d’) log A = × 0,401 U + S - U - S Attività reali = attività mistennija x attività relattiva. Meta l-linji jkunu meqjusa bħala li ma humiex paralleli, irrepeti d-determinazzjoni. Jekk il-paralleliżmu ma jkunx milħuq, ikkalkola l-logaritmika ta’ l-attività relattiva (log. A) permezz ta’ formula (ċ). Ir-riżultat akkwistat għandu b’danakollu jkun meqjus bħala approssimattiv u dan għandu jkun innutat fir-rapport finali. 10. IR-REPETIZZJONI Id-differenzi bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jeċċedu: 0.5 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenut ta’ flavophospholipol minn 1 u sa massimu ta’ 2 mg/kg; 25 % relatati ma’ l-għola valur għal kontenut akbar minn 2 u sa massimu ta’ 10 mg/kg; 20 % relatati ma l-għola valur għal kontenut akbar minn 10 u sa massimu ta’ 25 mg/kg; 5 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenut akbar minn 25 u sa massimu ta’ 50 mg/kg; 10 % relatati mal-valur l-aktar għoli għal kontenut ’il fuq minn 50 mg/kg. 3. DETERMINAZZJONI TA’ OLIGOELEMENTI - ĦADID, RAMM, MANGANIŻ U ŻINGU 1. GĦAN U SKOP Il-metodu jagħmilha possibbli għad-determinazzjoni ta’ oligoelementi, ħadid, ramm, manganiż u żingu f’għalf għal bhejjem. Il-limiti l-aktar baxxi tad-determinazzjoni huma: ħadid (Fe): 20 mg/kg ramm (Cu): 10 mg/kg manganiż (Mn): 20 mg/kg żingu (Zn): 20 mg/kg 2. PRINĊIPJU Il-kampjun huwa mdaħħal fis-soluzzjoni fl-aċidu idrikloriku wara l-qerda tal-materja organika, jekk ikun hemm. L-elementi ħadid, ramm, manganiż u żingu huma determinati, wara taħlit xieraq, bil-atomic absorption spectrometry. 3. REAĠENTI Kummenti ta’ introduzzjoni Għal preparazzjoni tar-reaġenti u soluzzjonijiet analitiċi uża ilma ħieles minn ijonji elettropożittivi li għandhom ikunu determinati, akkwistati jew b’distillar doppju ta’ l-ilma jew f’tazza borosillikata jew lampik tal-kwarz jew bi trattament doppju fuq reżina ta’ skambju ta’ ijonji. Ir-reaġenti għandhom ikunu mill-anqas ta’ grad analitiku (a.p.). Ħelsien mill-element li għandu jkun determinat għandu jkun ivverifikat f’esperiment imbjank. Jekk meħtieġ, ir-reaġenti għandhom ikunu purifikati aktar. Minflok is-soluzzjonijiet normali deskritti hawn taħt, soluzzjonijiet kummerċjali normali jistgħu jintużaw basta li dawn ikunu garantiti u li jkunu ġew ivverifikati qabel l-użu. 3.1. Aċidu idrokloriku a.p. (d: 1719). 3.2. Aċidu idrokloriku a.p. (6 N). 3.3. Aċidu idrokloriku a.p. (0 75 N). 3.4. Aċidu idroflworiku 38 sa 40 % (v/v) li jkollu element ta’ kontenut ta’ ħadid ta’ anqas minn 1 mg Fe/litru u residwu wara evaporazzjoni ta’ anqas minn 10 mg (bħala sulfat)/litru. 3.5. Aċidu sulforiku a.p. (d: 1784). 3.6. Perossidu ta’ l-idroġenu a.p. (approssimament 100 volumi ta’ ossigenu (30 % bil-piż)). 3.7. Soluzzjoni normali tal-ħadid (1000 μg Fe/ml) ippreparata kif ġej: Dewweb 1g ta’ fil tal-ħadid a.p. fi 200 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2), żid 16 ml ta’ perossidu ta’ l-idroġenu (3.6) u wassal għal litru wieħed bl-ilma. 3.7.1. Soluzzjoni normali tal-ħadid (100 μg Fe/ml) ippreparata bit-taħlit tas-soluzzjoni normali (3.7) 1 + 9 ma’ l-ilma. 3.8. Soluzzjoni normali tar-ramm (1000 μg Cu/ml) ippreparata kif ġej: Dewweb 1 g ta’ ramm f’għamla ta’ trab (a.p.) fi 25 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2), żid 5 ml ta’ perossidu ta’ l-idroġenu (3.6) u wassal għal litru wieħed bl-ilma. 3.8.1. Soluzzjoni normali ta’ ramm (10 μg Cu/ml) ippreparata bit-taħlit tas-soluzzjoni normali (3.8) 1 + 9 ma’ ilma u mbagħad billi ddewweb is-soluzzjoni li tirriżulta 1 + 9 bl-ilma. 3.9. Soluzzjoni normali tal-manganiż (1000 μg Mn/ml) ippreparata kif ġej: Dewweb 1 g ta’ manganiż f’għamla ta’ trab (a.p.) fi 25 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2), u wassal għal litru wieħed bl-ilma. 3.9.1. Soluzzjoni normali ta’ manganiż (10 μg Mn/ml) ippreparata bit-taħlit tas-soluzzjoni normali (3.9) 1 + 9 bl-ilma u mbagħad billi ddewweb is-soluzzjoni li tirriżulta 1 + 9 bl-ilma. 3.10. Soluzzjoni normali taż-żingu (1000 μg Zn/ml) ippreparata kif ġej: Dewweb 1 g ta’ żingu f’għamla ta’ strippa jew folja (a.p.) fi 25 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2), u wassal għal litru wieħed bl-ilma. 3.10.1. Soluzzjoni normali taż-żingu (10 μg Zn/ml) ippreparata bit-taħlit tas-soluzzjoni normali (3.10) 1 + 9 bl-ilma u mbagħad billi ddewweb is-soluzzjoni li tirriżulta 1 + 9 bl-ilma. 3.11. Soluzzjoni ta’ klorat tal-lantanju ippreparata kif ġej: Dewweb 12 g ta’ ossidu tal-lantanju fi 150 ml ilma, żid 100 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2), u wassal għal litru wieħed bl-ilma. 4. APPARAT 4.1. Forn fgat b’regolatur tat-temperatura u reġistru. 4.2. L-apparat tal-ħġieġ għandu jkun reżistenti tat-tip borosillikat u huwa rrakomandat li jintuża apparat li jkun riservat esklussivament għad-determinazjoni ta’ oligoelementi. 4.3. Girġjol tal-platinum u (jekk trid) girġjol tal-kwarz. 4.4. Atomic absorption spectrophotometer li jilħaq il-ħtiġijiet tal-metodu f’dak li jirrigwarda s-sensittività u l-preċiżjoni fil-medda meħtieġa. 5. PROĊEDURA 5.1. Kampjuni li jkun fihom materjal organiku 5.1.1. L-irmied u l-preparazzjoni tas-soluzzjoni għal analiżi [9] (i) Qiegħed 5 sa 10 g ta’ kampjun miżun sa l-eqreb 0 72 mg fi griġjol tal-kwarz jew platinum (4.3) (ara Nota (b)), nixxef f’forn fi °C u daħħal il-griġjol fil-forn fgat li jkun kiesaħ (4.1). Agħlaq il-forn (ara Nota (ċ)) u gradwalment tella’ t-temperatura għal 450 sa 475 °C f’ħin ta’ 90 minuta. Żomm din it-temperatura għal minn 4 sa 16-il siegħa (eż. matul il-lejl) biex tneħħi l-meterjal karbonetiku u mbagħad iftaħ il-forn u ħallih jibred (ara Nota (d)). Aħsel il-griġjol b’total ta’ madwar 5 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1) u żid dan ta’ l-aħħar bil-mod u b’attenzjoni fit-tazza biż-żennuna (jista’ jkun hemm reazzjoni vigoruża minħabba l-formazzjoni tal-CO2) Żid l-aċidu idrokloriku (3.1) bit-taqtir b’aġitazzjoni sa kemm l-effervexxenza tieqaf kollha kemm hi. Evapora sakemm jixxotta, waqt li kultant tħawwad b’virga tal-ħġieġ. Wara żid 15 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2) mar-residwu segwit b’madwar 120 ml ilma. Ħawwad bil-virga tal-ħġieġ, li għandha titħalla fit-tazza biż-żennuna, u għatti t-tazza bi "ħġieġa ta’ l-arloġġ". Wassal b’ġentilezza lejn it-togħlija u żomm il-punt tat-togħlija sa kemm l-ebda irmied iktar ma jkun jidher li jista’ jinħall. Iffiltra fuq karta tal-filtru ħielsa minn kull irmied u iġbor il-filtrat f’vażett volumetriku ta’ 250 ml. Aħsel it-tazza biż-żennuna u iffiltra bi 5 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku sħun (3.2) u darbtejn b’ilma jagħli. Imla l-vażett volumetriku sal-marka b’ilma (HCI ikkonċentrat sa madwar 0.5 N). (ii) Jekk ir-residwu fil-filtru jidher iswed (karbonju), erġa’ poġġih fil-forn u rrendi mill-ġdid f’irmied fi 450 sa 475 °C. Dan l-irmied, li jenħtieġ biss ftit siegħat (madwar tlieta sa ħames sigħat), ikun komplut meta l-irmied jidher abjad jew kważi abjad. Dewweb ir-residwu f’madwar 2 ml ta’ aċidu idrokloriku (3.1), evapora sa kemm jixxotta u żid 5 ml ta’ 6 N aċidu idrokloriku (3.2). Saħħan, iffiltra s-soluzzjoni fil-vażett volumetriku u imla sal-marka b’ilma (HCL ikkonċentrat sa madwar 0.5 N). Noti: (a) Fid-determinazzjoni ta’ oligoelementi huwa importanti li tkun attent mir-riskju ta’ kontaminazzjoni, partikolarment b’żingu, ramm u ħadid. Għal din ir-raġuni, it-tagħmir użat fil-preparazzjoni tal-kampjuni għandu jkun ħieles minn dawn il-metalli. Biex jitnaqqas ir-riskju ġenerali ta’ kontaminazzjoni, aħdem f’atmosfera ħielsa mit-trab b’tagħmir skrupolużatament nadif u apparat tal-ħġieġ maħsul b’galbu. Id-determinazzjoni ta’ żingu hija partikolarment sensittiva għal ħafna tipi ta’ kontaminazzjoni, eż. minn apparat tal-ħġieġ, reaġenti, trab, eċċ. (b) Il-piż tal-kampjun li jkun sejjer isir irmied minnu huwa kkalkolat mill-kontenut approssimattiv ta’ oligoelementi ta’ l-għalf tal-bhejjem b’relazzjoni mas-sensittività ta’ l-ispettrofotometru wżat. Għal ċertu għalf għal bhejjem li jkollu ftit traċċi ta’ elementi jista’ jkun meħtieġ li jibda b’kampjun ta’ 10 sa 20 g u żżid għal soluzzjoni finali ta’ 100 ml. biss. (ċ) L-operazzjoni ta’ rmied għandha titwettaq f’forn magħluq mingħajr dħul ta’ arja jew ossiġenu. (d) It-temperatura indikata bil-pirometru m’għandhiex teċċedi 475 °C. 5.1.2. Determinazzjoni spettrofotometrika 5.1.2.1. Preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet kalibrati Għal kull wieħed mill-elementi li se jkunu determinati, ipprepara minn soluzzjonijiet normali tax-xogħol kif mogħtija fil-punti 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 u 3.10.1 medda ta’ soluzzjonijiet ikkalibrati, kull soluzzjoni kalibrata jkollha konċentrazzjoni HCl ta’ madwar 0.5 N u (fil-każi ta’ ħadid, manganiż u żingu) konċentrazzjoni ta’ klorat tal-lantanju ekwivalenti għal 0.1 % La (w/v). Il-konċentrazzjonijiet ta’ oligoelementi magħżul tidħol fil-medda ta’ sensittività ta’ l-ispettrofotometru użat. It-tabelli ta’ hawn taħt juru, bħala eżempju, il-komposizzjoni ta’ meddi tipiċi ta’ kalibrazzjoni ta’ soluzzjonijiet; jiddependi, b’danakollu, fuq it-tip u s-sensittività ta’ l-ispettrofotometru użat u jista’ jkun meħtieġ li jintgħażlu konċentrazzjonijiet oħra. Ħadid μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ml norma tax-xogħol soluzzjoni (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | + ml 6 N HCI (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | + 10 ml ta' soluzzjoni klorin tal-lantanu (3.11) u wassal għal 100 ml bl-ilma | Ramm μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 0,1 | ml norma tax-xogħol soluzzjoni (3.7.1) (1 ml = 100 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | + ml 6 N HCI (3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | Wassal għal 100 ml bl-ilma | Manganiż μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | ml norma tax-xogħol soluzzjoni (3.7.1) (1 ml = 100 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | + ml 6 N HCI (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | + 10 ml ta' soluzzjoni klorin tal-lantanu (3.11) u wassal għal 100 ml bl-ilma | Żingu μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | ml norma tax-xogħol soluzzjoni (3.7.1) (1 ml = 100 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | + ml 6 N HCl (3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | + 10 ml ta' soluzzjoni klorin tal-lantanu (3.11) u wassal għal 100 ml bl-ilma | 5.1.2.2. Preparazzjoni ta’ soluzzjoni għal analiżi Għad-determinazzjoni ta’ ramm, is-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 tista’ normalment tkun użata direttament. Jekk meħtieġ li twassal il-konċentrazzjoni tagħha lejn il-medda tal-kalibrazzjoni tas-soluzzjonijiet, porzjon alikwot jista’ jkun imseffed fi 100 ml vażett volumetriku u miżjud sal-marka bi 0.5 N aċidu idrokloriku (3.3). Għad-determinazzjoni ta’ ħadid, manganiż u żingu, seffed porzjon alikwot tas-soluzzjoni mħejjija minn punt 5.1.1 fi 100 ml vażett volumetriku, żid 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ klorat tal-lantanju (3.11) u wassal sal-marka bi 0.5 N aċidu idrokloriku (3.3) ara wkoll punt 8 "Osservazzjonijiet"). 5.1.2.3. Esperiment in bjank L-esperiment in bjank għandu jinkludi l-passi kollha preskritti fil-proċedura ħlief li l-materjal tal-kampjun ikun imħolli barra. Is-soluzzjoni tal-kalibrazzjoni "0" m’għandhiex tintuża bħala l-in bjank. 5.1.2.4. Kejl ta’ l-assorbiment atomiku Kejjel l-assorbiment atomiku tas-soluzzjonijiet tal-kalibrazzjoni u tas-soluzzjoni li għandha tkun analizzata billi tuża fjamma ta’ l-aċitelena ta’ ossiġinazzjoni ta’ l-arja f’dawn il-"wavelengths" segwenti: Fe 248,3 nm Cu 324,8 nm Mn 279,5 nm Zn 213,8 nm Wettaq kull kejl erba’ darbiet. 5.2. Għalf minerali tal-bhejjem Jekk il-kampjun ma jkunx fih materjal organiku, l-operazzjoni ta’ rmied bil-quddiem m’hijiex meħtieġa. Ipproċedi kif deskritt fil-punt 5.1.1 (i) tibda mit-tieni paragrafu. L-evaporazzjoni b’aċidu idrofloriku tista’ titħalla barra. 6. KALKOLU TAR-RIŻULTATI Bl-użu ta’ kurva ta’ kalibrazzjoni, kkalkola l-konċentrament ta’ oligoelementi fis-soluzzjoni li għandha tkun analizzata u uri r-riżultat f’milligrammi ta’ oligoelementi kull kilogramma ta’ kampjun (ppm). 7. IR-REPETIZZJONI Id-differenza bejn ir-riżultati taż-żewġ determinazzjonijiet paralleli imwettqa fuq l-istess kampjun mill-istess analista m’għandhomx jeċċedu: - 5 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenuti ta’ oligoelementi kkonċernat sa massimu ta’ 50 mg/kg; - 10 % ta’ l-ogħla riżultat għal kontenut ta’ l-oligoelementi kkonċernat minn 50 u sa massimu 100 mg/kg; - 10 mg/kg, f’valur assolut, għal kontenut ta’ oligoelementi kkonċernat minn 100 u sa massimu ta’ 200 mg/kg; - 5 % ta’ l-għola riżultat għal kontenut ta’ oligoelementi kkonċernat ’il fuq minn 200 mg/kg. 8. OSSERVAZZJONI P ·2, soluzzjoni ta’ klorat tal-lantanju addizzjonali (3.11) għas-soluzzjoni għal analiżi u għas-soluzzjoni ta’ kalibrazzjoni tista’ titħalla barra. [1] 1 mg ta’ baċitraċina tal-żingu ta’ grad ta’ għalf tal-bhejjem hija ekwivalenti għal 42 unitajiet internazjonali (i.u.). [2] Metodi oħra jistgħu jintużaw basta li jkun ġie stabbilit li jagħtu sospensjoni batterjoloġika simili. [3] Xi medju ta’ koltura kummerċjali jew komposizzjoni simili u li tagħti l-istess riżultati tista’ tkun użata. [4] Xi medju ta’ koltura kummerċjali jew komposizzjoni simili u li tagħti l-istess riżultati tista’ tkun użata. [5] Metodi oħra jistgħu jintużaw basta li jkun ġie stabbilit li jagħtu sospensjoni batterjoloġika simili. [6] Xi medju ta’ koltura kummerċjali ta’ komposizzjoni simili u li tagħti l-istess riżultati tista’ tkun użata, e.g. medju ta’ oxoid antibijotika 1 (CM 327) b’żieda ta’ oxoid agar Nru 3 (L 13). [7] Xi medju ta’ koltura kummerċjali ta’ komposizzjoni simili u li tagħti l-istess riżultati tista’ tkun użata, e.g. medju ta’ oxoid antibijotika 2 (CM 335) b’żieda ta’ oxoid agar Nru 3 (L 13). [8] e.g. SE 2 minn Wacker Chemie GmbH, Munich. [9] Għalf aħdar (frisk jew imnixxef) pjuttost li jkun fih ammonti kbar ta’ silika tal-ħaxix, li tista’ żżomm fiha traċċi ta’ elementi u għandha tkun imneħħija. Għal kampjuni ta’ dan l-għalf tal-bhejjem, għalhekk, il-proċedura modikata segwenti għandha tkun segwita.Wettaq operazzjoni 5.1.1(i) sa l-istadju tal-filtrazzjoni. Aħsel il-karta tal-filtru, li jkun fiha r-residwu mhux maħlul, darbtejn b’ilma jagħli u qiegħda fi griġjol tal-platinum (4.3). Ixgħel il-forn fgat (4.1) b’temperatura taħt il-550 °C sa kemm il-materjal karbonetiku kollu jkun kompletament sparixxa. Ħallih jibred, żid ftit qtar ta’ ilma segwit b’minn 10 sa 15 ml ta’ aċidu idrofloriku (3.4) u evapora għal xuttaġini ta’ madwar 150 °C. Jekk tibqa’ xi silika fir-residwu, dewweb mill-ġdid fi ftit millilitri ta’ aċidu idrofloriku (3.4) u evapora sa kemm jixxotta. Żid ħames taqtiriet ta’ aċidu sulforiku (3.5) u saħħan sa kemm l-ebda fwar abjad ma jkun baqa’. Wara ż-żieda ta’ 5 ml ta’ 6 N aċidu idrifloriku (3.2) u madwar 30 ml ta’ ilma, saħħan, iffiltra s-soluzzjoni f’vażett volumetriku ta’ 250 ml u wassal sal-marka b’ilma (Konċentrazzjoni HCI ta’ madwar 0.5 N). Ipproċedi mbagħad bid-determinazzjoni minn punt 5.1.3 (formazzjoni). --------------------------------------------------