A.

Il-kontroll li jibblokka jew kompetittiv ta' ELISA għandu jsir skond il-protokoll li ġej: L-ELISA kompetittiv li juża monoclonal antibody 3-17-A3 huwa kaaċI jidentifika antibodies ta' kull tipi ta' serum magħrufa tal-virus tal-bluetongue (BTV). Il-prinċipju tal-kontroll huwa l-interruzzjoni tar-reazzjoni bejn l-antiġen tal-BTV u l-monoconal antibody speċifiku għal grupp (3-17-A3) b'addizzjoni tas-serum tal-kontroll. L-antibodies tal-BTV preżenti fis-serum tal-kontroll jibblokkaw ir-reattività tal-monoclonal antibody (Mab) u jirriżultaw fi tnaqqis ta' l-iżvilupp mistenni fil-kulur wara ż-żieda ta' l-enżimi msemmija anti-mouse antibody u chromogen/substrate. Is-serum jistgħu jkunu eżaminati b'dilution waħda ta' 1:5 (kontroll fuq post – appendiċi 1) jew jistgħu jkunu ddożati (titrazzjoni tas-serum – appendiċi 2) biex jagħtu dilution end-point. Valuri ta' inibizzjoni ogħla minn 50 % jistgħu jitqiesu bħala pożittivi. 1. Microtitre plates xierqa ta' l-ELISA. 2. Antiġen: ipprovdut bħala ċella ta' konċentrat estratt, ippreparat kif deskritt hawn taħt, u maħżun jew f'-20 °C jew -70 °C. 3. Buffer li jibblokka: salini tal-fosfat immewwet (PBS) li fih serum ta' 0,3 % BTV negattiv ta' l-ispeċi tal-baqra adulta, 0,1 % (v/v) Tween-20 (ipprovdut bħala għasel polyoxyethylene sorbiton monolaurate) f'PBS. 4. Monoclonal antibody: 3-17-A3 (ipprovduta bħala hybridoma tissue-culture supernatant) dirett lejn polypeptide VP7 speċifiku għall-grupp, maħżun bi -20 °C jew imnixxef iffriżat u mneħħi mill-ilma 1/100 b'buffer li jibblokka qabel l-użu. 5. Ikkonjuga: globulina tal-fenek kontra l-ġrieden (b'assorbiment u b'elużjoni) ikkonjugata għal horseradish peroxidase u miżmuma fid-dlam f'4 °C. 6. Chromogen u substrate: Orthophenylene diamine (OPD-chromogen) b'konċentrazzjoni aħħarija ta' 0,4 mg/ml f'ilma sterili ddistillat. Perossidu ta' l-idroġenu (30 % w/v-substrate) 0,05 % v/v miżjud immedjatament qabel l-użu (5μl H2O2 għal kull 10 ml OPD). (Uża l-OPD bl-attenzjoni – ilbes ingwanti tal-lakstu – mutaġen issuspettat). 7. Aċidu sulfuriku ta' massa 1 ta' sustanza: 26,6 ml ta' aċidu miżjud ma' 473,4 ml ta' ilma distillat. (Ftakar – dejjem żid l-aċidu ma' l-ilma, u qatt ilma ma' l-aċidu.) 8. Orbital shaker. 9. ELISA plate reader (il-kontroll jista' jinqara viżwalment). Cc: kontroll tal-konjugazzjoni (l-ebda serum/l-ebda monoclonal antibody); C++: kontroll ta' serum posittiv b'saħħtu; C+: kontroll ta' serum posittiv dgħajjef; C-: kontroll ta' serum negattiv; Cm: kontroll tal-monoclonal antibody (l-ebda serum).



Appendiċi 1: Format ta' spot dilution (1:5) (40 serum/platt) Kontrolli Serum ta' kontroll 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ Ġ Cm Cm 40 G Cm Cm 40



Appendiċi 2: Forma tat-titrazzjoni tas-serum (10 serum/platt) Kontrolli Serum ta' kontroll 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 Ġ Cm Cm 1:320 1:320 G Cm Cm 1:640 1:640 Kontroll ta' konjugazzjoni (Cc) : Il-Wells 1A u 1B huwa kontroll mingħajr kampjun ta' l-antiġen u l-konjugi ta' BTV. Dan jista' jintuża biex l-ELISA reader ma jaqrax. Kontrol Mab (Cm) : Il-kolonni 1 u 2, ir-ringieli Ġ u G huma l-kontroll tal-monoclonal antibody u fihom l-antiġen tal-BTV, il-monoclonal antibody u l-konjugi. Dawn ir-reċipjenti jirrappreżentaw il-kulur massimu. Il-medja tal-qari tad-densità ottika minn dan il-kontroll tirrappreżenta il-0 % valur ta' inibizzjoni. Kontroll Posittiv (C++, C-) : Il-kolonni 1 u 2, ir-ringieli Ċ-D-E-F. Dawn ir-reċipjenti fihom l-antiġen tal-BTV, l-antiserum posittiv b'saħħtu u dgħajjef, l-Mab, u l-konjugi. Kontroll Negattiv (C-) : Ir-reċipjenti 2A u 2B huma kontrolli negattivi, li fihom l-antiġen tal-BTV, l-antiserum negattiv tal-BTV, l-Mab, u l-konjugi. Serum tal-kontrolli : Għal stħarriġiet seroloġiċi fuq skala għolja u screening mgħaġġel, is-serum jista' jkun eżaminat f'taħlita waħda ta' 1:5 (Appendiċi 1). B'mod alternattiv, 10 serum jistgħu jkunu eżaminati fuq medda ta' taħlit minn 1:5 sa 1:640 (Appendiċi 2). Dan jagħti xi indikazzjoni tat-titra ta' l-antibody fis-serum tal-kontroll. 1. Ħallat l-antiġen tal-BTV antiġen għall-konċentrazzjoni qabel it-titrazzjoni fil-PBS, ivvibra għal ftit ħin (jekk sonicator mhux disponibbli, ittrasferixxi l-likwidu bil-pipetta vigorożament) u żid 50 μl mal-wells kollha tal-pjanċa ta' l-ELISA. Tektek il-ġnubijiet tal-pjanċa biex jitferrex l-antiġen. 2. Inkuba għal 37 °C għal 60 minuta f'orbital shaker. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet billi jimtlew u jitbattlu r-reċipjenti b'PBS mhux sterili u nixxef b'karta li tassorbi. 3. Reċipjenti ta' kontroll: Żid 100 μl ta' blocking buffer għar-reċipjenti ta' Cc. Żid 50 μl ta' serum ta' kontroll pożittiv u negattiv, f'taħlita ta' 1:5 (10 μl serum + 40 μl blocking buffer), għar-reċipjenti rispettivi C–, C+ u C++. Żid 50 μl ta' blocking buffer mar-reċipjenti tal-kontroll tal-Mab. Metodu tat-titrazzjoni fuq punt: Żid taħlit ta' 1:5 għal kull serum tal-kontroll fil-blocking buffer biex ikunu duplikati r-reċipjentti tal-kolonni 3 sa 12 (10 μl serum + 40 μl blocking buffer), jew Metodu tat-titrazzjoni tas-serum: Ħejji serje ta' taħlit doppju għal kull kampjun tal-kontroll (1:5 sa 1:640) fil-blocking buffer fuq tmien reċipjenti ta' kolonni singoli 3 sa 12. 4. Minnufih wara l-addizzjoni tas-serum tal-kontroll, ħallat l-Mab 1:100 fil-blocking buffer u żid 50 μl għar-reċipjenti kollha tal-pjanċa għajr għall-kontroll ta' bla kampjuni. 5. Inkuba għal 37 °C għal 60 minuta f'orbital shaker. Aħsel tliet darbiet bil-PBS u nixxef b'xuga. 6. Ħoll il-konċentrat ta' l-anti-mouse tal-fenek għal 1/5000 fil-blocking buffer u żid 50 μl għar-reċipjenti kollha tal-pjanċa. 7. Inkuba għal 37 °C għal 60 minuta f'orbital shaker. Aħsel tliet darbiet bil-PBS u nixxef b'xuga. 8. Ħoll l-OPD u minnufih qabel l-użu żid 5 μl ta' 30 % ta' perossidu ta' l-idroġenu għal kull 10 ml ta' OPD. Żid 50 μl mar-reċipjenti kollha tal-pjanċa. Ħalli l-kulur jiżviluppa għal madwar 10 minuti u waqqaf ir-reazzjoni b'1 M ta' aċidu sulfuriku (50 μl għal kull reċipjent). Il-kulur għandu jiżviluppa fir-reċipjenti tal-kontroll tal-Mab u f'dawk ir-reċipjenti li fihom serum mingħajr antibody tal-BTV. 9. Eżamina u rreġistra l-pjanċi jew viżwalment jew bl-użu ta' reader spettrofotometriku. Bl-użu tal-pakkett tas-software stampa l-valuri ta' l-OD values, u l-persentaġġ ta' l-inibizzjoni (PI) għall-eżami u s-serum tal-kontroll ibbażat fuq il-valur medju rreġistrat fir-reċipjenti tal-kontroll ta' l-antiġen. Id-data espressa bħala valuri ta' OD u PI jintużaw biex jitabbilixxu jekk l-eżami twettaq taħt il-limiti aċċettabbli. L-ogħla limiti tal-kontroll (UCL) u l-anqas limiti tal-kontroll (LCL) għall-kontroll tal-Mab (l-antiġen bl-addizzjoni tal-Mab fl-assenza ta-serum tal-kontroll) huma bejn il-valuri 0,4 u 1,4 ta' l-OD. Kull pjanċa li tonqos li tkun konformi mal-kriterji ta' hawn fuq trid titneħħa. Jekk pakkett tas-software tal-kompjuter mhux disponibbli, stampa l-valuri tal-OD bl-użu tal-printer ta' l-ELISA. Aħdem il-valur medju ta' l-OD għar-reċipjenti għall-kontroll ta' l-antiġen, li huma ekwivalenti għall-valur ta' 100 %. Stabbilixxi l-valur ta' 50 % ta' l-OD u manwalment aħdem il-possittività u n-negattività ta' kull kampjun. Il-persentaġġ tal-valur ta' l-inibizzjoni (PI) = 100 - (OD ta' kull kontroll/Medja ta' l-OD ta' Cm) × 100. Is-serum duplikat tar-reċipjenti tal-kontroll negattiv u r-reċipjenti duplikati ta' mingħajr kampjuni għandhom jirreġistraw valuri tal-PI ta'bejn +25 % u -25 %, u bejn +95 % u +105 %, rispettivament. In-nuqqas li jkunu f'dawn il-limiti ma jinvalidax il-pjanċa iżda jissuġġerixxi li l-kulur fl-isfond qed jiżviluppa. Is-serum duplikat tal-kontroll pożittiv b'saħħtu u dgħajjef għandu jirreġistra valuri tal-PI ta'bejn +81 % u +100 %, u bejn +51 % u +80 %, rispettivament. Il-livell tad-dijanjosi għas-serum tal-kontroll huwa 50 % (PI 50 % jew OD 50 %). Kampjuni li jirreġistraw valuri tal-PI > 50 % huma rreġistrati negattivi. Kampjuni li jirreġistraw valuri tal-PI 'il fuq u taħt il-livell tar-reċipjenti duplikati jitqiesu dubbjużi; it-tali kampjuni jistgħu jkunu eżaminati mill-ġdid fil-kontroll fuq punt u/jew fit-titrazzjoni. Kampjuni pożittivi jistgħu jkunu titrati wkoll biex jipprovdu indikazzjoni tal-livell ta' pożittività. Qari viżwali: Kampjuni pożittivi u negattivi jintgħarfu faċilment bl-għajnejn; kampjuni pożittivi dgħajfa jew negattivi b'saħħithom jistgħu jkunu diffiċli aktar biex ikunu interpretati bl-għajnejn. 1. Aħsel 40-60 roux ta' ċelluli konfluenti BHK-21 tliet darbiet bil-medja ta' l-Eagle liberu mis-serum u nfetta bis-serotype 1 tal-virus tal-bluetongue fil-medja ta' l-Eagle liberu mis-serum. 2. Inkuba għal 37 °C u eżamina kuljum għall-effett ċitopatiku (CPE). 3. Meta s-CPE huma kompluti f'90 sa 100 % tal-folja taċ-ċelluli ta' kull roux, aħsad il-virus billi biċ-ċaqliq jitneħħew xi ċelluli li għadhom imwaħħlin mal-ħġieġa. 4. Dawwar b'2000 sa 3000 rpm biex iċ-ċelluli jissawwru f'gerbubiet. 5. Neħħi s-supernatant u ssospendi mill-ġdid iċ-ċelluli f'madwar 30 ml ta' PBS li fih 1 % “Sarkosyl” u 2 ml phenylmethylsulphonyl fluoride (lysis buffer). Dan jista' jikkawża ċ-ċelluli jifformaw gel u aktar lysis buffer jista' jkun miżjud biex inaqqas dan l-effett. (NB: phenylmethylsulphonyl fluoride jagħmel il-ħsara – uża b'kawtela kbira.) 6. Sfratta ċ-ċelluli għal 60 sekonda bl-użu ta' sonda ultrasonika b'wisa' ta' 30 mikron. 7. Dawwar b'10000 rpm għal 10 minuti. 8. Aħżen is-supernatant fi +4 °C u erġa' ssospendi il-gerbubiet tal-ċelluli li baqa' f'10 sa 20 ml ta' lysis buffer. 9. Ivvibra u ċċara, waqt li jinħażen is-supernatant f'kull stadju, total ta' tliet darbiet. 10. Agħqqad is-supernatants u dawwar b' 24000 rpm (100000 g) għal 120 minuta bi +4 °C fuq kuxinett ta' 5 ml ta' 40 % zokkor tal-kannamiela (w/v fi PBS) b'tubi taċ-ċentrifuga tat-30 ml ta' Beckmann u SW 28 rotor. 11. Neħħi s-supernatant, battal it-tubi sew, u erġa' ssospendi l-gerbuba fil-PBS bl-ivvibrar. Aħżen l-antiġen f'alikwoti fi -20 °C. Antiġen ta' l-ELISA tal-bluetongue huwa ttitrat b'ELISA indiretta. It-taħlit doppju ta' l-antiġen huwa ttitrat kontra taħlita kostanti (1/100) monoclonal antibody 3-17-A3. Il-protokoll huwa kif ġej: 1. Ittrita taħlita ta' 1:20 ta' l-antiġen tal-BTV fil-PBS tul pjanċa ta' mikrotitrat f'serje ta' taħlita doppja (50 μl/reċipjent) bl-użu ta' pipetta b'ħafna kanali. 2. Inkuba għal siegħa b'37 °C fuq orbital shaker. 3. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet bil-PBS. 4. Żid 50μl ta' monoclonal antibody 3-17-A3 (imħallat 1/100) f'kull reċipjent tal-pjanċa mikrotitrat. 5. Inkuba għal siegħa b'37 °C fuq orbital shaker. 6. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet bil-PBS. 7. Żid 50 μl ta' globulina anti-mouse tal-fenek ikkonjugata għal għerq mustarda, maħlula b'konċentrazzjoni ottimali ttitrata minn qabel, għal kull reċipjent ta' pjanċa mikrotitrata. 8. Inkuba għal siegħa b'37 °C fuq orbital shaker. 9. Żid is-substrate u l-chromogen kif deskritt qabel. Waqqaf ir-reazzjoni wara 10 minuti bl-addizzjoni ta' 1 Molar ta' aċidu sulfuriku (50 μl/kull reċipjent). Fl-analiżi kompetittiv tal-minerali, il-monoclonal antibody irid ikun iżżejjed, għalhekk taħlita ta' l-antiġen tintgħażel li taqa' fuq il-kurva tat-titrazzjoni (mhux fuq ir-reġjun tal-parti stabbli) li taħti madwar 0,8 OD wara 10 minuti.