Dan id-dokument ġie magħmul bil-ħsieb li jintu ża bħala għodda ta’ dokumentazzjoni u l-istituzzjonijiet ma jassumu l-ebda 
responsabbiltà g ħall-kontenut tieg ħu 
►B REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 440/2008  
tat-30 ta' Mejju 2008  
li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew 
u tal-Kunsill dwar ir-re ġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi 
kimiċi (REACH)  
(Test b'rilevanza g ħaż-ŻEE) 
(ĠU L 142, 31.5.2008, p. 1)  
Emendat minn:  
Ġurnal Uffi ċjali 
Nru Paġna Data  
►M1 Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 761/2009 tat-23 ta’ Lulju 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 1152/2010 tat-8 ta’ Di ċembru 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 640/2012 tas-6 ta’ Lulju 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 260/2014 tal-24 ta’ Jannar 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 900/2014 tal-15 ta' Lulju 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1
REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 440/2008  
tat-30 ta' Mejju 2008  
li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) 
Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir- reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' 
sustanzi kimi ċi (REACH)
 
(Test b'rilevanza g ħaż-ŻEE) 
IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,  
Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komuità Ewropea,  
Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament 
Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Di ċembru 2006 dwar ir-re ġistrazzjoni, 
il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimi ċi 
(REACH), li jistabbilixxi A ġenzija Ewropea g ħas-Sustanzi Kimi ċi, li 
jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li j ħassar ir-Regolament tal-Kunsill 
(KEE) Nru 793/93 u r-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 1488/94 kif ukoll id-Direttiva tal-Kunsill 76/769/KEE u d-Direttivi tal- Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE (
 1 ), 
u b'mod partikolari l-Artikolu 13(3) tieg ħu, 
Billi:  
(1) Skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006, metodi ta' ttestjar 
għandhom ji ġu adottati fuq il-livell tal-Komunità g ħall-finijiet 
ta' testijiet fuq sustanzi fejn tali testijiet huma me ħtieġa biex 
jiġġeneraw l-informazzjoni dwar il-karatteristi ċi intrinsi ċi ta' 
sustanzi.  
(2) Id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Ġunju 1967 
rigward l-approssimazzjoni tal-li ġijiet, tar-regolamenti u tad- 
dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l- 
imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolu żi ( 2 ) stipulat, fl- 
Anness V, metodi g ħad-determinazzjoni tal-proprjetajiet 
fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossi ċità ta' sustanzi u preparati. 
L-Anness V g ħad-Direttiva 67/548/KEE t ħassret bid- 
Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill, b'effett mill-1 ta' Ġunju 2008.
 
(3) Il-metodi ta' ttestjar li hemm fl-Anness V g ħad-Direttiva 67/548/ ­
KEE għandhom ji ġu inkorporati f'dan ir-Regolament.  
(4) Dan ir-Regolament ma jeskludix l-u żu ta' metodi o ħra ta' l- 
ittestjar, sakemm l-u żu tagħhom ikun kompatibbli ma' l- 
Artikolu 13(3) tar-Regolament 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1. kif ikkore ġut bil-ĠU L 136, 29.5.2007, p. 3. 
( 2 ) ĠU 196, 16.8.1967, p. 1. Id-Direttiva kif emendata l-a ħħar bid- 
Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill ( ĠU L 396, 
30.12.2006, p. 850)  – għandha tiġi aġġornata bir-referenzi rilevanti mal- 
pubblikazzjoni tat-30 ATP.
 (5) Il-prin ċipji tas-sostituzzjoni, it-tnaqqis u l-irfinar ta' l-u żu ta' l- 
annimali fi pro ċeduri għandhom ji ġu kkunsidrati bis-s ħiħ fid- 
disinn tal-metodi ta' ttestjar, partikolarment meta metodi f'lokhom u validati jsiru disponibbli biex jissostitwixxu, inaqqsu jew jirfinaw l-ittestjar fuq l-annimali.
 
(6) Id-dispo żizzjonijiet ta' dan ir-Regolament huma konformi ma' l- 
opinjoni tal-Kumitat stabbilit skond l-Artikolu 133 tar-Rego ­
lament (KE) Nru 1907/2006,  
ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:  
Artikolu 1  
Il-metodi ta' ttestjar li g ħandhom ji ġu applikati g ħall-finijiet tar- 
Regolament 1907/2006/KE huma stipulati fl-Anness g ħal dan ir-Rego ­
lament.  
Artikolu 2  
Il-Kummissjoni g ħandha teżamina mill- ġdid, meta dan ikun f'loku, il- 
metodi ta' ttestjar li fih dan ir-Regolament, bil-g ħan li tissostitwixxi, 
tnaqqas jew tirfina l-ittestjar fuq l-annimali vertebrati.  
Artikolu 3  
Ir-referenzi kollha g ħall-Anness V g ħad-Direttiva 67/548/KEE 
għandhom jinftiehmu b ħala referenzi g ħal dan ir-Regolament.  
Artikolu 4  
Dan ir-Regolament g ħandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal- 
pubblikazzjoni tieg ħu fil-Ġurnal Uffi ċjali ta' l-Unjoni Ewropea . 
Għandu japplika mill-1 ta' Ġunju 2008.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
ANNESS  
PARTI A: METODI G ĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-PROPRJETAJIET 
FIŻIKO-KIMI ĊI 
WERREJ 
A.1. TEMPERATURA TA' TIDWIB/IFFRI ŻAR 
A.2. TEMPERATURA TAT-TG ĦOLIJA 
A.3 DENSITÀ RELATTIVA A.4. PRESSJONI TA’ FWAR A.5. TENSJONI TAS-SUPERFI ĊJE 
A.6. SOLUBILITÀ FL-ILMA 
A.8. KOEFFI ĊJENT TAL-QSIM 
A.9. IL-PUNT TA' fjammabilità 
A.10. FJAMMABILITÀ (SOLIDI) 
A.11. FJAMMABILITÀ (GASSIJIET) A.12. FJAMMABILITÀ (KUNTATT MA' L-ILMA) 
A.13. PROPRJETAJIET PIROFORI ĊI TA' SOLIDI U LIKWIDI 
A.14. PROPRJETAJIET ESPLO ŻIVI 
A.15. TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ -(LIKWIDI 
U GASSIJIET) 
A.16. TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ RELATTIVA 
GĦAL SOLIDI 
A.17. PROPRJETAJIET OSSIDANTI (SOLIDI) 
A.18. IL-MEDJA TAL-PI Ż MOLEKULARI TAN-NUMRU U D- 
DISTRIBUZZJONI TAL-PI Ż MOLEKULARI TAL-POLIMERI 
A.19. KONTENUT TA' POLIMERI TA' PI Ż MOLEKULARI BAXX 
A.20. L-IM ĠIBA TAS-SOLUZZJONI/TA' L-ESTRAZZJONI TA' 
POLIMERI FL-ILMA 
A.21. PROPRJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI) A.22. ID-DIJAMETRU MEDJU ĠEOMETRIKU TAL-FIBRI PE ŻAT 
SKONT IT-TUL TAG ĦHOM
 
▼M4 
A.23. KOEFFI ĊJENT TAL-PARTIZZJONI (1-Ottanol/Ilma): METODU 
TA’ TĦAWWID BIL-MOD  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. TEMPERATURA TA' TIDWIB/IFFRI ŻAR 
1. METODU  
Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bba żati fuq il-linja gwida ta' 
l-OECD Test (1). Il-prin ċipji fundamentali huma mog ħtija fir- 
referenzi (2) u (3).  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodi u l-apparati mfissra g ħandhom ikunu applikati g ħad-deter­
minazzjoni tat-temperatura ta' tidwib ta' sustanzi, ming ħajr ebda 
restrizzjoni fir-rigward tal-grad ta' purità tag ħhom.  
L-għażla tal-metodu hija dipendenti fuq in-natura tas-sustanza li se 
tiġi ttestjata. B ħala konsegwenza l-fattur ta' limitazzjoni jkun skond, 
jekk is-sustanza tistax ti ġi mfarrka malajr jew le, b'diffikultà, jew 
xejn affattu.  
Għal xi sustanzi, id-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffri żar jew 
solidifikazzjoni hija aktar xierqa u l-istandards g ħal dawn id-deter ­
minazzjonijiet ġew inklużi wkoll f'dan il-metodu.  
Fejn, min ħabba il-proprjetajiet partikulari tas-sustanza, ebda wie ħed 
mill-parametri t'hawn fuq ma jista' jkun mkejjel b'mod konvenjenti, 
punt ta' tferrieg ħ jista' jkun xieraq.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
It-temperatura tat-tidwib hija mfissra b ħala t-temperatura li fiha t- 
transizzjoni f’fa żi minn stat solidu g ħal dak likwidu ssir fi 
pressjoni atmosferika u din it-temperatura tikkorrispondi idealment 
mat-temperatura ta' l-iffri żar. 
Peress li t-transizzjoni f’fa żi ta' bosta sustanzi titwettaq fuq skala ta' 
temperatura, ta' spiss hija mfissra b ħala l-iskala tat-tidwib.  
Konverżjoni ta' unitajiet (K g ħal o C) 
t = T - 273,15  
t: Temperatura Celsius, grad Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinamika, kelvin (K)  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta' referenza mhumiex me ħtieġa li jintu żaw fil-ka żijiet 
kollha meta tkun qed ti ġi investigata sustanza ġdida. Huma 
għandhom iservu primarjament biex ji ċċekkjaw ir-rendiment tal- 
metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' 
riżultati minn metodi o ħra. 
Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni huma mni żżla fir-referenzi (4).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR  
It-temperatura (l-iskala tat-temperatura) tat-transizzjoni f’fa żi mill- 
istat solidu g ħal dak likwidu jew mill-istat likwidu g ħal dak solidu 
hija determinata. Fil-prattika waqt it-tis ħin/tkessiħ ta' kampjun tas- 
sustanza g ħall-ittestjar fi pressjoni atmosferika t-temperaturi ta' 
tidwib/iffri żar inizjali u l-istadju finali tat-tidwib/iffri żar jiġu deter­
minati. Ħames tipi ta' metodi huma mfissra, ji ġifieri metodu kapillari, 
metodi ta' u ċuh ta'sħana, determinazzjonijiet ta' temperatura ta' 
ffriżar, metodi ta' anali żi termika, u determinazzjoni ta' punt ta' 
tferriegħ (kif żviluppat g ħaż-żjut tal-pitrolju).  
F’ċerti każijiet, jista' jkun konvenjenti li titkejjel it-temperatura ta' l- 
iffriżar flok it-temperatura ta' tidwib.  
1.4.1.  Metodu kapillari  
1.4.1.1.  Apparati li jiffissaw it-temperatura tat- tidwib b'banju ta' likwidu  
Ammont żgħir tas-sustanza mfarrka sewwa jitpo ġġa f’tubu kapillari 
u jiġi ppakkjat sewwa. It-tubu jissa ħħan, flimkien ma' termometru, 
u ż-żieda fit-temperatura ti ġi aġġustata għal inqas minn madwar 
l K/min matul it-tidwib innifsu. It-temperaturi tat-tidwib inizjali u finali ji ġu determinati.
 
1.4.1.2.  Apparati li jiffissaw it-temperatura tat-tidwib bi blokka tal-metall  
Kif imfisser ta ħt 1.4.1.1., ħlief li t-tubu kapillari u t-termometru 
jitpoġġew fi blokka msa ħħna tal-metall, u jistg ħu jkunu osservati 
minn ġo toqob fil-blokka.  
1.4.1.3.  Determinazzjoni permezz ta' foto ċellula  
Il-kampjun fit-tubu kapillari huwa msa ħħan awtomatikament f' ċi­
lindru tal-metall. Ra ġġ ta' dawl huwa dirett minn ġos-sustanza, 
permezz ta' toqba fi ċ-ċilindru, sa foto ċellula kalibrata b'mod pre ċiż. 
Il-proprjetajiet otti ċi ta' ħafna sustanzi jinbidlu minn opak g ħal tras­
parenti meta jkunu qed jiddewbu. L-intensità tad-dawl li til ħaq lill- 
fotoċellula tiżdied u tibg ħat sinjal ta' waqfien lill-indikatur di ġitali li 
jkun qed jaqra t-temperatura tat-termometru ta' re żistenza tal-platinu 
li jkun jinsab fil-kompartiment tat-tis ħin. Dan il-metodu mhuwiex 
adattat għal xi sustanzi b'kuluri qawwija.  
1.4.2.  Uċuh ta' Sħana 
1.4.2.1.  Il-bank s ħun Kofler  
Il-bank sħun Kofler ju ża biċċtejn tal-metall ta' konduttività termika 
differenti, imsa ħħna b'mod elettriku, bil-bank iddisinjat sabiex il- 
gradjent tat-temperatura huwa kwazi lineari matul it-tul tieg ħu. It- 
temperatura tal-bank s ħun tista' tinfirex minn 283 sa 573 K b'apparat 
speċjali li jaqra t-temperatura li jinkludi  runner  b'indiċi u marka ta' 
identifikazzjoni ma ħsubin għall-bank spe ċifiku. Bil-g ħan li tkun 
determinata temperatura tat-tidwib, is-sustanza titqieg ħed, f’saff 
irqiq, direttament fuq il-wi ċċ tal-bank s ħun. Fi ftit sekondi ti żviluppa 
linja ta' separazzjoni netta bejn il-fa żi fluwida u dik solida. It- 
temperatura fil-linja ta' separazzjoni tinqara bl-a ġġustament ta' l- 
indiċi mal-bqija tal-linja.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Mikroskopju tat-tidwib  
Bosta uċuh sħan tal-mikroskopju jintu żaw għad-determinazzjoni tat- 
temperaturi tat-tidwib bi kwantitajiet żgħar ferm ta' materjal. F' ħafna 
minn dawn l-u ċuh sħan it-temperatura titkejjel b'termokoppja 
sensittiva i żda xi drabi jintu żaw termometri tal-merkurju. Apparat 
tipiku għad-determinazzjoni tal-punt tat-tidwib fi stadju s ħun 
għandu kompartiment ta' s ħana li fiha pjan ċa metallika li fuqha 
jitqiegħed il-kampjun fuq  slide.  Iċ-ċentru tal-pjan ċa metallika 
għandu toqba li tippermetti d-d ħul tad-dawl mill-mera illuminanti 
tal-mikroskopju. Meta tkun qed tintu ża, il-kompartiment ting ħalaq 
bi pjanċa tal-ħġieġ biex teskludi l-arja mi ż-żona tal-kampjun.  
It-tisħin tal-kampjun huwa regolat minn reostat. G ħal kejl pre ċiż 
ħafna fuq sustanzi ottikament anisotropi ċi, jista' jintu ża dawl polar ­
izzat.  
1.4.2.3.  Metodu tal-menisku  
Dan il-metodu jintu ża b'mod spe ċifiku għal poliamidi  
It-temperatura li fiha l-ispostament tal-menisku ta ż-żejt tas-silikone, 
maqbud bejn il-wi ċċ sħun u għatu tal-ħġieġ sostnut mill-kampjun tal- 
poliamide li jkun qed jigi ttestjat.  
1.4.3.  Metodu biex tkun determinata t-temperatura ta' l-iffri żar 
Il-kampjun jitpo ġġa f’tubu tat-testijiet spe ċjali u jitpo ġġa f’apparat 
għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffri żar. Il-kampjun ji ġi 
mħawwad b' ġentilezza u kontinwament matul it-tkessi ħ u t- 
temperatura ti ġi mkejla f’intervalli adattati. Hekk kif it-temperatura 
tibqa' kostanti g ħal qari din it-temperatura (korretta g ħall-iżball tat- 
termometru) ti ġi reġistrata bħala t-temperatura ta' l-iffri żar. 
Għandu jkun evitat is -supercooling  billi jinżamm l-ekwilibriju bejn 
il-fażijiet solidi u likwidi.  
1.4.4.  Anali żi termika  
1.4.4.1  Anali żi termika differenzjali (ATD)  
Din it-teknika tirre ġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza 
u l-materjal ta' referenza b ħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s- 
sustanza u l-materjal ta' referenza huma su ġġetti għall-istess 
programm ta' temperatura kontrollata. Meta l-kampjun jg ħaddi 
minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija 
indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew e żotermika (iffri żar) 
mil-linja tal-ba żi tar-reġistru tat-temperatura.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Kalorimetrija differenzjali ta'l-iskennjar (KDS)  
Din it-teknika tirre ġistra d-differenza fl-ener ġija introdotta f’sustanza 
u dik introdotta f'materjal ta' referenza, b ħala funzjoni tat- 
temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma 
suġġetti għall-istess programm ta' temperatura kontrollata. Din l- 
enerġija hija l-ener ġija meħtieġa biex tin żamm żero d-differenza 
tat-temperatura bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza. Meta l- kampjun jg ħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, 
dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew 
eżotermika (iffri żar) mil-linja ta' ba żi tar-reġistru tal-fluss tas-s ħana.
 
1.4.5.  Punt ta' tferrieg ħ 
Dan il-metodu kien żviluppat biex jintu żaw maż-żjut tal-pitrolju 
u huwa adattat g ħal użu ma' sustanzi żejtnin b'temperaturi baxxi ta' 
l-iffriżar. 
Wara tis ħin preliminari, il-kampjun jitkessa ħ b'rata spe ċifika 
u eżaminat f’intervalli ta' 3 K g ħall-karatteristi ċi tat-tferrieg ħ. L- 
inqas temperatura li fiha ji ġi osservat moviment tas-sustanza ti ġi 
reġistrata bħala l-punt ta' tferrig ħ. 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
L-applikabilità u l-e żattezza tal-metodi differenti u żati għad-deter­
minazzjoni tat-temperatura tat-tidwib/skala tat-tidwib huma mni żżla 
fit-tabella li ġejja: 
TABELLA: APPLIKABILITÀ TAL-METODI  
A. Metodi kapillari  
Metodu ta' kejl Sustanzi li jistg ħu 
jitfarrku Sustanzi li ma 
jintaħnux malajr Skala ta' 
temperatura Kalkolu ta' l- 
eżattezza (  1 ) Standards e żistenti  
Apparati li 
jiffissaw it- temperatura ta' 
tidwib b'banju ta' 
likwidu iva g ħal ftit biss 273 sa 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Apparati li 
jiffissaw it- temperatura ta' 
tidwib bi blokka 
tal-metall iva g ħal ftit biss 293 sa >573 
K ± 0,5 K ISO 1218(E) 
Determinazzjoni 
permezz ta' foto ­ 
ċellula iva Bosta b'apparati 
ta' tagħmir 253 sa 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Uċuh sħan u metodi ta' ffri żar 
Metodu ta' kejl Sustanzi li jistg ħu 
jitfarrku Sustanzi li ma 
jitfarrkux malajr Skala ta' 
temperatura Kalkolu ta' l- 
eżattezza (  1 ) Standards e żistenti  
Il-bank sħun 
Kofler iva le 283 sa >573 
K ± 1K ANSI/ASTM 
D 3451-76 
Mikroskopju tat- 
tidwib iva g ħal ftit biss 273 sa >573 
K ± 0,5 K DIN 53736 
Metodu tal- 
menisku le Spe ċifikament 
għal poliamidi 293 sa >573 
K ± 0,5 K ISO 1218(E) 
Temperatura ta' l- 
iffriżar iva iva 223 sa 573 K ± 0,5 K e ż. BS 4695  
( 1 ) Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.  
C. Analiżi termika  
Metodu ta' kejl Sustanzi li jistg ħu 
jitfarrku Sustanzi li ma 
jitfarrkux malajr Skala ta' 
temperatura Kalkolu ta' l- 
eżattezza (  1 ) Standards e żistenti  
Analiżi termika 
differenzjali iva Iva 173 sa 1 273 
K sa 
600 K ± 0,5 
K sa 
1 273 K ± 2,0K ASTM E 537-76 
Kalorimetrija 
differenzjali ta' l- iskennjar iva iva 173 sa 1 273 
K sa 600 K 
± 0,5K sa 
1 273 K ± 2,0 
K ASTM E 537-76
 
( 1 ) Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.  
D. Punt ta' tferrig ħ 
Metodu ta' kejl Sustanzi li jistg ħu 
jitfarrku Sustanzi li ma 
jitfarrkux malajr Skala ta' 
temperatura Kalkolu ta' l- 
eżattezza (  1 ) Standards e żistenti  
Punt ta' tferrig ħ għal żjut tal- 
pitrolju 
u sustanzi 
żejtnin għal żjut tal- 
pitrolju 
u sustanzi 
żejtnin 223 sa 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI  
Il-proċeduri għal kważi l-metodi ta' ttestjar kollha tfissru fi standards 
internazzjonali u nazzjonali (Ara Appendi ċi 1) 
1.6.1.  Metodi permezz ta' tubu kapillari  
Meta jkunu su ġġetti għal żieda bil-mod tat-temperatura, sustanzi 
mfarrka f’mod fin is-soltu juru l-istadji ta' tidwib murija fil-figura 1.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figura 1
  
Matul id-determinazzjoni tat-temperatura tat-tidwib, it-temperaturi 
jiġu reġistrati fil-bidu ta' l-istadju tat-tidwib u b'dak finali.  
1.6.1.1.  Tagħmir li jiffissa t-temperatura ta' tidwib b'apparat ta' banju ta' 
likwidu  
Il-Figura 2 turi tip ta' apparat standardizzat tat-temperatura ta' tidwib 
magħmul mill- ħġieġ (JIS K 0064); l-ispe ċifikazzjonijiet kollha huma 
b'millimetri.  
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Banju ta' likwidu:  
Għandu jing ħażel likwidu adattat. L-g ħażla tal-likwidu tiddependi fuq 
it-temperatura tat-tidwib li g ħandha tiġi determinata, e ż. paraffin 
likwidu g ħal temperaturi tad-tidwib mhux og ħla minn 473 K, żejt 
tas-silikone g ħal temperaturi tat-tidwib mhux og ħla minn 573 K  
Għal temperaturi tat-tidwib fuq il-523 K, tista' tintu ża taħlita li 
tikkonsisti minn tliet partijiet a ċidu sulfuriku u żewġ partijiet sulfat 
tal-potassju (fi proporzjon tal-pi ż). Għandhom jittie ħdu 
prekawzjonijiet xierqa jekk tintu ża taħlita bħal din.  
Termometru:  
Għandhom jintu żaw biss dawk it-termometri li jissodisfaw ir- 
rekwiżiti ta' l-istandards li ġejjin jew l-ekwivalenti tag ħhom:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Proċedura:  
Is-sustanza niexfa titfarrak b'mod fin ħafna fi trab u titpo ġġa f’tubu 
kapillari, mag ħluq f’tarf minnhom, bil-g ħan li l-livell tal-mili jkun 
approssimattivament 3 mm wara li jkun ippakkjat sewwa. Biex 
jinkiseb kampjun ippakkjat uniformi, it-tubu kapillari g ħandha 
jitwaqqa' minn g ħoli approssimattiv ta' 700 mm minn tubu tal- 
ħġieġ b'mod vertikali fuq  watchg . 
It-tubu kapillari mimli jitpo ġġa fil-banju sabiex il-parti tan-nofs tal- 
bozza tal-merkurju tat-termometru tmiss it-tubu kapillari fil-parti fejn 
hemm il-kampjun. Is-soltu t-tubu kapillari ji ġi introdott fl-apparat 
madwar 10 K ta ħt it-temperatura tat-tidwib.  
Il-banju ta' likwidu jissa ħħan sabiex it-temperatura og ħla sa appros ­
simattivament 3 K/min. Il-likwidu g ħandu jitħawwad. F’madwar 10 
K taħt it-temperatura tat-tidwib mistennija r-rata ta ż-żieda fit- 
temperatura ti ġi aġġustata għal massimu ta' 1 K/min.  
Kalkolu:  
Il-kalkolu tat-temperatura tat-tidwib hija kif ġej: 
T = T  D + 0,00016 (T  D -T E ) n 
fejn: 
T = it-temperatura tat-tidwib korretta f’K  
T D = qari tat-temperatura mit-termometru D f’K  
T E = qari tat-temperatura mit-termometru E f’K  
n = numru ta' gradazzjonijiet tal- ħajta tal-merkurju fuq 
termometru D fil-parti li qieg ħda fil-wiċċ ta' l-ilma  
1.6.1.2  Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall  
Apparat:  
Dan jikkonsist fi:  
— blokka ċilindrika tal-metall, li l-parti ta' fuq tag ħha hija konkava 
u tifforma kompartiment (ara figura 3),  
— tapp tal-metall, b' żewġ toqob jew aktar, li jippermetti li tubi ji ġu 
mmuntati fil-blokka tal-metall,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— sistema ta' tis ħin, għall-blokka tal-metall, provduta, e ż., minn 
reżistenza elettrika inkorporata fil-blokka,  
— reostat g ħar-regolazzjoni tal-qawwa applikata, jekk jintu ża tisħin 
elettriku.  
— erba' twieqi ta' ħġieġ li jiflaħ għas-sħana fuq il- ġnub laterali tal- 
kompartiment, imqieg ħda dijametrikalment f’anglu rett ma' 
xulxin. Quddiem wa ħda minnhom tkun immuntata lenti g ħall- 
osservazzjoni tat-tubu kapillari. It-tliet twieqi l-o ħra jintużaw 
biex jinxteg ħel l-intern permezz ta' lampi,  
— tubu kapillari ta' ħġieġ li jirreżisti s-sħana magħluq minn na ħa 
waħda (ara 1.6.1.1).  
Ara l-istandards imsemmija f’ 1.6.1.1. Jistg ħu jintużaw ukoll apparati 
tal-kejl termoelettri ċi b'eżattezza komparabbli.  
Figura 3
  
1.6.1.3.  Determinazzjoni permezz ta' foto ċellula  
Apparat u pro ċedura:  
L-apparat jikkonsisti f’ kompartiment tal-metall b'sistema awtoma ­
tizzata ta' tis ħin. Tliet kapillari jimtlew skond il-1.6.1.1. 
u jitpoġġew fil-forn.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Huma disponibbli bosta żidiet lineari biex ikun kalibrat l-apparat u ż- 
żieda adattata fit-temperatura hija a ġġustata bl-elettriku b'rata kostanti 
u lineari mag ħżula minn qabel. Re ġistri juru t-temperatura attwali fil- 
forn u t-temperatura tas-sustanza fit-tubi kapillari.  
1.6.2.  Uċuh sħan 
1.6.2.1.  Il-bank s ħun Kofler  
Ara l-Appendi ċi 
1.6.2.2.  Mikroskopju tat-tidwib  
Ara l-Appendi ċi 
1.6.2.3.  Metodu tal-menisku (poliamidi)  
Ara l-Appendi ċi 
Ir-rata tat-tis ħin mit-temperatura tat-tidwib g ħandha tkun inqas minn 
1 K/min.  
1.6.3.  Metodi g ħad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffri żar 
Ara l-Appendi ċi 
1.6.4.  Anali żi termika  
1.6.4.1.  Anali żi termika differenzjali  
Ara l-Appendi ċi 
1.6.4.2.  Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar  
Ara l-Appendi ċi 
1.6.5.  Determinazzjoni tal-punt tat-tferrig ħ 
Ara l-Appendi ċi 
2. DATA  
Korrezzjoni tat-termometru hija ne ċessarja f’ xi ka żijiet. 
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— metodu u żat 
— speċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l- 
pass preliminari ta' purifikazzjoni, jekk ikun hemm,  
— kalkolu ta' l-e żattezza  
Il-medja talanqas żewġ kejlijiet li huma fl-iskala ta' l-e żattezza 
kalkulata (ara t-tabelli) hija re ġistrata bħala t-temperatura tat-tidwib.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Jekk id-differenza bejn it-temperatura fil-bidu u fl-istadju finali tat- 
tidwib hija fil-limiti ta' l-e żattezza tal-metodu, it-temperatura fl- 
istadju finali tat-tidwib tittie ħed bħala t-temperatura tat-tidwib; 
inkella ż-żewġ temperaturi g ħandhom ikunu rapportati.  
Jekk is-sustanza tiddekomponi jew tissaffa bis-sublimazzjoni qabel 
ma tintlaħaq it-temperatura, it-temperatura li fiha ji ġi osservat l-effett 
għandha tkun rapportata.  
L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu rapportati, b'mod spe ċjali fir-rigward 
ta' l-impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  
4. REFERENZI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 505–515.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Appendiċi 
Għal dettalji tekni ċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistg ħu jkunu kkonsultati 
bħala eżempju.  
1. Metodi kapillari  
1.1. Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the 
melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.  
1.2 Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen 
Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of 
“melting point”  
2. Elementi Imsa ħħnin 
2.1. Il-bank s ħun Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Mikroskopju tat-tidwib 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen.
 
2.3. Metodu tal-menisku (poliamidi) 
ISO 1218 (E) Plastics -poly ami des -determination 
of “melting point”  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion 
materials 
NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination 
du “point de fusion” methode du 
menisque  
3. Metodi g ħad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffri żar 
BS 4633 Method for the determination of cryst ­
allizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de petrole: determination de la 
temperature de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsiiuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines 
NF T 20-051 Methode de determination du point de 
cristallisation (point de Congelation 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Anali żi termika  
4.1. Anali żi termika differenzjali 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical DATA 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical DATA 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Determinazzjoni tal-punt tat-tferrieg ħ 
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du petrole: Point de trouble 
et point d'ecoulement limite -Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils –Determination of pour 
point ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. TEMPERATURA TAT-TG ĦOLIJA  
1. METODU  
Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bba żati fuq il-linjagwida tat- 
Test OECD (1). Il-prin ċipji fundamentali huma mog ħtija fir-referenzi 
(2) u (3).  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodi u l-apparati mfissra hawnhekk jistg ħu jiġu applikati g ħal 
likwidu u g ħal sustanzi li jiddewbu bil-mod f’ temperatura baxxa, 
bil-kondizzjoni li dawn ma jkollhomx xi reazzjoni kimika ta ħt it- 
temperatura tat-tg ħolija (eż.: awto-ossidazzjoni, traspo żizzjoni, degra ­
dazzjoni, e ċċ.). Il-metodi jistg ħu jiġu applikati g ħal sustanzi likwidi 
puri u impuri.  
Issir enfasi fuq il-metodi li ju żaw osservazzjoni permezz ta' foto ­ 
ċellula u anali żi termika, g ħaliex dawn il-metodi jippermettu d-deter ­
minazzjoni tat-temperaturi tat-tidwib kif ukoll dawk tat-tg ħolija. 
Barra dan, il-kejlijiet jistg ħu jsiru b'mod awtomatiku.  
Il-“metodu dinamiku” g ħandu l-vanta ġġ li jista' ji ġi applikat ukoll 
għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar u mhuwiex ne ċessarju li 
t-temperatura tat-tg ħolija tkun korretta sal-pressjoni normali (101,325 
kPa) għaliex il-pressjoni normali tista' ti ġi aġġustata matul il-kejl 
minn manostat.  
Rimarki:  
L-influwenza ta' impuritajiet fuq id-determinazzjoni tat-temperatura 
tat-tgħolija tiddependi l-aktar fuq in-natura ta' l-impurità. Meta fil- 
kampjun ikun hemm impuritajiet volatili, li jistg ħu jaffetwaw ir- 
riżultati, is-sustanza tista' ti ġi ppurifikata.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
It-temperatura normali tat-tg ħolija hija mfissra b ħala t-temperatura li 
fiha l-pressjoni tal-fwar tal-likwidu hija 101,325 kPa.  
Jekk it-temperatura tat-tg ħolija ma titkejjilx fi pressjoni atmosferika 
normali, id-dependenza tat-temperatura fuq il-pressjoni tal-fwar tista' 
tiġi deskritta bl-ekwazzjoni Clausius-Clapeyron:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ const : 
fejn: 
P = il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’ pascals  
ΔH v = is-sħana ta' evaporizzazzjoni tieg ħu f’ J mol  -1 
R = il-kostanti universali molari tal-gass = 8,314 mol  -1 K -1 
T = it-temperatura termodinamika, f’ K  
It-temperatura tat-tg ħolija hija murija skond il-pressjoni ta' l-ambjent 
matul il-kejl.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Bdil 
Pressjoni (unitajiet: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(“bar” għadha permessa i żda mhux rakkomandata)  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(l-unitajiet “mm Hg” u “Tor” mhumiex permessi).  
1 atm = atmosfera standard = 101 325 Pa 
(l-unità “atm” mhix permessa).  
Temperatura (unitajiet: K)  
t = T - 273,15 K  
t: temperatura Celsius, grad Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinamika, kelvin (K)  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
M'hemmx b żonn li jintu żaw sustanzi ta' referenza fil-ka żijietjiet 
kollha kull meta tkun qed ti ġi investigata sustanza ġdida. Huma 
primarjament qeg ħdin biex ikun i ċċekkjat ir-rendiment tal-metodu 
minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu paragun ma' ri żultati 
minn metodi o ħra. 
Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni jinsabu fil-metodi elenkati fl-Appendi ċi. 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR  
Ħames metodi g ħad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tg ħolija 
(skala tat-temperatura tat-tg ħolija) huma bba żati fuq il-kejl tat- 
temperatura tat-tg ħolija, tnejn o ħra huma bba żati fuq anali żi termika.  
1.4.1.  Determinazzjoni bl-u żu ta' l-ebulliometer  
L-ebulliometers kienu żviluppati ori ġinarjament g ħad-deter­
minazzjoni tal-pi ż molekulari permezz ta ż-żieda fit-temperatura tat- 
tgħolija, iżda huma adattati wkoll g ħal kejl eżatt tat-temperatura tat- 
tgħolija. Apparat sempli ċi ħafna huwa mfisser fl-ASTM D 1120-72 
(ara l-Appendi ċi). Il-likwidu jissa ħħan f’ dan l-apparat ta ħt 
kondizzjonijiet ta' ekwilibriju fi pressjoni atmosferika sakemm jiftaħ jagħli.
 
1.4.2.  Metodu dinamiku  
Dan il-metodu jinvolvi il-kejl tat-temperatura tar-rikondensazzjoni 
tal-fwar permezz ta' termometru adattat fir-rifluss waqt it-tg ħolija. 
B'dan il-metodu l-pressjoni tista' ti ġi varjata.  
1.4.3.  Metodu ta' distillazzjoni g ħat-temperatura tat-tg ħolija  
Dan il-metodu jinvolvi d-distillazzjoni tal-likwidu u l-kejl tat- 
temperatura tar-rikondensazzjoni tal-fwar u d-determinazzjoni ta' l- 
ammont ta' l-iddistillat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Metodu skond Siwoloboff  
Kampjun jissa ħħan f’ tubu g ħall-kampjun, li jkun mg ħaddas f’ 
likwidu ġo banju s ħun. Kapillari mg ħaqqda, li fiha bu żżieqa ta' l- 
arja fil-parti t'isfel, ti ġi mgħaddsa fit-tubu bil-kampjun.  
1.4.5.  Determinazzjoni permezz ta' foto ċellula  
Skond il-prin ċipju Siwoloboff, kejl foto-elettriku awtomatiku jsir bit- 
tlugħ tal-bżieżaq. 
1.4.6.  Anali żi termika differenzjali  
Din it-teknika tirre ġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza 
u l-materjal ta' referenza b ħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s- 
sustanza u l-materjal ta' referenza huma su ġġetti għall-istess 
programm kontrollat ta' temperatura. Meta l-kampjun jg ħaddi minn 
transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew e żotermika (iffri żar) mil- 
linja ta' ba żi tar-reġistru tat-temperatura.
 
1.4.7.  Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar  
Din it-teknika tirre ġistra d-differenza fl-ener ġija introdotta f’ sustanza 
u dik introdotta f'materjal ta' referenza, b ħala funzjoni tat- 
temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma 
suġġetti għall-istess programm kontrollat ta' temperatura. Din l- 
enerġija hija l-ener ġija meħtieġa biex id-differenza tat-temperatura 
bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza tin żamm żero. Meta l- 
kampjun jg ħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, 
dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tg ħolija) mil- 
linja ta' ba żi tar-reġistru tal-fluss tas-s ħana. 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
L-applikabbiltà u l-e żattezza tal-metodi differenti u żati għad-deter­
minazzjoni tat-temperatura tat-tg ħolija/ta' l-iskala tat-tg ħolija huma 
mniżżla fit-tabella 1:  
Tabella 1  
Paragun tal-metodi  
Metodu ta' kejl Kalkolu ta' l-e żattezza Standard e żistenti  
L-ebulliometer ± 1,4 K (sa 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (sa 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Il-metodu dinamiku ± 0,5 K (sa 600 K) (  2 ) 
Il-proċess ta' distillazzjoni (skala 
ta'tgħolija) ± 0,5 K (sa 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Il-metodu skond Siwoloboff ± 2 K (sa 600 K) (  2 ) 
Osservazzjoni permezz ta' foto ­ 
ċellula ± 0,3 K (sa 373 K) (  2 ) 
Il-kalorimetrija termika differenzjali ± 0,5 K (sa 600 K) 
± 2,0 K (sa 1 273 K) ASTM E 537-76 
Il-kalorimetrija differenzjali ta' l- 
iskennjar ± 0,5 K (sa 600 K) 
± 2,0 K (sa 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Din l-e żattezza hija valida biss g ħall-apparat sempli ċi kif eż. mfisser f‘ ASTM D 1120-72; tista’ tkun imtejba b’ 
apparati ebulliometer aktar sofistikati. 
( 2 ) Validi biss g ħal sustanzi puri. L-u żu f’ ċirkustanzi o ħra għandu jkun ġustifikat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI  
Kważi l-proċeduri għall-metodi ta' ttestjar kollhatfissru fi standards 
internazzjonali u nazzjonali (Ara l-Appendi ċi). 
1.6.1.  L-ebulliometer  
Ara l-Appendi ċi. 
1.6.2.  Il-metodu dinamiku  
Ara l-metodu ta' ttestjar A.4. g ħad-determinazzjoni tal-pressjoni tal- 
fwar.  
It-temperatura tat-tg ħolija osservata bi pressjoni applikata ta' 101,325 
kPa hija re ġistrata.  
1.6.3.  Il-pro ċess ta' distillazzjoni (skala tat-tg ħolija)  
Ara l-Appendi ċi. 
1.6.4.  Il-metodu skond Siwoloboff  
Il-kampjun jissa ħħan f'apparat ta' temperatura tat-tidwib f'tubu g ħall- 
kampjun, b'dijametru ta' approssimattivament 5 mm (figura 1).  
Il-figura 1 turi tip ta' apparat standardizzat ta' temperatura tat-tidwib 
u tat-tgħolija (JIS K 0064) (mag ħmul mill- ħġieġ, l-ispeċifi­
kazzjonijiet kollha f’ millimetri).  
Figura 1
  
Tubu kapillari (kapillari tat-tg ħolija) li huwa mag ħluq madwar 1 cm 
’il fuq mill-parti t’isfel tat-tubu jitpo ġġa fit-tubu g ħall-kampjun. Is- 
sustanza tat-test ti żdied sa livell tali li l-parti mg ħaqqda tal-kapillari 
tkun taħt il-wiċċ tal-likwidu. It-tubu g ħall-kampjun li fih il-kapillari 
tat-tgħolija huwa marbut mat-termometru permezz ta' lastiku jew 
huwa mwa ħħal b'irfid mal- ġenb (ara figura 2).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figura 2  
Il-prinċipju skond Siwoloboff  Figura 3  
Il-prinċipju mmodifikat
  
Il-banju ta' likwidu jintg ħażel skond it-temperatura tat-tg ħolija. F’ 
temperaturi ta' 573 K, jista' jintu ża żejt tas-silikone. Il-paraffina 
likwida tista' tintu ża biss sa 473 K. G ħall-bidu t-tis ħin tal-banju 
ta'likwidu g ħandu jkun a ġġustat sa żieda fit-temperatura ta' 3 
K/min. Il-banju ta' likwidu jrid jit ħawwad. F’ madwar 10 K ta ħt 
it-temperatura tat-tg ħolija mistennija, it-tis ħin jitnaqqas sabiex ir- 
rata fiż-żieda tat-temperatura tkun anqas minn 1 K/min. Meta tkun 
se tintlaħaq it-temperatura tat-tg ħolija, jibdew jitfa ċċaw b'mod rapidu 
bżieżaq fil-kapillari li tkun qed tag ħli. 
It-temperatura tat-tg ħolija hija dik it-temperatura li, fil-waqt ta' 
tkessiħ momentarju, is-serje ta' b żieżaq tieqaf u l-fluwidu f’ daqqa 
waħda jerġa' jibda tieg ħla fil-kapillari. Il-qari korrispondenti tat- 
termometru huwa t-temperatura tat-tg ħolija tas-sustanza.  
Fil-prinċipju mmodifikat (figura 3) t-temperatura tat-tg ħolija hija 
ddeterminata f’kapillari ta' temperatura tat-tidwib. Hija ti ġġebbed sa 
punt fin ta' madwar 2 cm fit-tul (a) u ammont żgħir tal-kampjun 
jinġibed ’il fuq. Il-parti l-miftu ħa tal-kapillari fin ting ħalaq billi 
tiddewweb, b'mod li jkun hemm buieqa ta' l-arja fit-tarf. Waqt it- 
tisħin fl-apparat tat-temperatura tat-tidwib (b) l-bu żżieqa ta' l-arja 
tespandi. It-temperatura tat-tg ħolija tikkorrispondi mat-temperatura 
li fiha t-tapp tas-sustanza jil ħaq il-livell tas-superfi ċje tal-banju ta' 
likwidu ( ċ). 
1.6.5.  Osservazzjoni permezz ta' foto ċellula  
Il-kampjun jissa ħħan f-tubu kapillari ġo blokka tal-metall imsa ħħna. 
Raġġ ta' dawl ji ġi dirett, f’toqob adattati fil-blokka, minn ġo s- 
sustanza g ħal fuq foto ċellula kkalibrata b'mod pre ċiż. 
Waqt iż-żieda fit-temperatura tal-kampjun, b żieżaq ta' l-arja singoli 
jitfaċċaw mill-kapillari li tkun qed tag ħli. Meta tintla ħaq it- 
temperatura tat-tg ħolija n-numru ta' b żieżaq jiżdied ħafna. Dan 
jikkawża bidla fl-intensità tad-dawl, irre ġistrata minn foto ċellula, 
u jagħti sinjal ta' waqfien lill-indikatur li jkun qed jaqra t-temperatura 
tat-termometru tal-platinu ta' re żistenza li jkun fil-blokka.  
Dan il-metodu huwa spe ċjalment utli g ħaliex jippermetti deter ­
minazzjonijiet ta ħt it-temperatura ambjentali sa 253,15 K (-20  o C) 
mingħajr ebda bidliet fl-apparat. Kemm jitpo ġġa l-istrument f'banju li 
jkessaħ. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Anali żi termika  
1.6.6.1.  Anali żi termika differenzjali  
Ara l-Appendi ċi. 
1.6.6.2.  Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar  
Ara l-Appendi ċi. 
2. DATA  
B'devjazzjonijiet żgħar mill-pressjoni normali (max. ± 5 kPa) it- 
temperaturi tat-tg ħolija huma normalizzati sa T  n permezz ta' l- 
ekwazzjoni numru-valur minn Sidney Young li ġejja: 
T n = T + (f  T x Δp) 
fejn: 
Δp = (101,325 – p) [nnota s-sinjal]  
P = il-kejl tal-pressjoni f’kPa  
f T = ir-rata ta' bidla fit-temperatura tat-tg ħolija bi pressjoni 
f’K/kPa  
T = it-temperatura tat-tg ħolija mkejla f’K  
T n = it-temperatura tat-tg ħolija korretta sal-pressjoni normali f’K  
Għal ħafna sustanzi l-fatturi tal-korrezzjoni tat-temperatura, f  T , u l- 
ekwazzjonijiet g ħall-approssimazzjoni tag ħhom huma inklu żi fl- 
istandards internazzjonali u nazzjonali msemmija hawn fuq.  
Eż, il-metodu tad-DIN 53171 isemmi l-korrezzjonijiet mhux bilfors 
eżatti li ġejjin għal solventi inklu żi fiż-żebgħa: 
Tabella 2  
Temperatura – il-fatturi ta' korrezzjonijiet f  t 
Temperatura T (K) Fattur ta' korrezzjoni f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 
373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 
448,15 0,37 
473,15 0,39 498,15 0,41 
523,15 0,4 
548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li 
ġejja: 
— il-metodu u żat 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l- 
istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,  
— kalkolu ta' l-e żattezza.  
Il-medja ta' mill-inqas żewġ temperaturi li huma fl-iskala tal-kalkolu 
ta' l-eżattezza (ara t-Tabella 1) hija rrapurtata b ħala t-temperatura tat- 
tgħolija.  
It-temperaturi tat-tg ħolija mkejla u l-medji tag ħhom għandhom ikunu 
ddikjarati u l-pressjoni (jiet) li fihom saru l-kejlijiet g ħandhom ikunu 
rrapurtati f’kPa. Il-pressjoni g ħandha tkun preferibbilment qrib il- 
pressjoni atmosferika normali.  
L-informazzjoni kollha u r-rimarki relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu rrapurtati, b'mod spe ċjali rigward 
l-impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  
4. REFERENZI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the 
Council C (81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental 
thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II.  
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, 
Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Inter ­
science Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Appendiċi 
Għal dettalji tekni ċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistg ħu jkunu kkonsultati 
bħala eżempju.  
1. L-ebulliometer  
1.1 Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Il-pro ċess ta' distillazzjoni (l-iskala tat-tg ħolija)  
ISO 918:1989: Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distil ­
lation characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, 
Bestimmung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et 
de l'intervalle de distillation  
3. L-anali żi termika differenzjali u l-kalorimetrija differenzjali ta' l- 
iskennjar  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of 
differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. DENSITÀ RELATTIVA  
1. METODU  
Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bba żati fuq il-linja gwida tat- 
Test OECD (1). Il-prin ċipji fundamentali huma mog ħtija fir-referenzi 
(2) u (3).  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodi g ħad-determinazzjoni tad-densità relattiva mfissra hawn 
huma applikabbli g ħal sustanzi solidi u likwidi, ming ħajr restrizzjoni 
fir-rigward tal-grad ta' purità tag ħhom. Id-diversi metodi li g ħandhom 
jintużaw huma mni żżla fit-tabella 1.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Id-densità relattiva D  20 4 ta' solidi jew likwidi hija l-proporzjoni bejn 
il-piż ta' volum tas-sustanza li trid ti ġi eżaminata, iddeterminata 
f’temperatura ta' 20  o C, u l-piż ta' l-istess volum ta' ilma, iddeter ­
minata f’temperatura ta' 4  o C. Id-densità relattiva ma g ħandhiex 
dimensjoni.  
Id-densità, P, ta' sustanza hija l-kwozjent tal-pi ż, m, u l-volum 
tagħha, v.  
Id-densità, P, ting ħata f’unitajiet SI, f’kg/m3.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA (1) (3)  
M'hemmx b żonn li jintu żaw sustanzi ta' referenza kull meta tkun qed 
tiġi investigata sustanza ġdida. Huma primarjament qeg ħdin biex 
ikun iċċekkjat ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien 
u sabiex jippermettu paragun ma' ri żultati minn metodi o ħra. 
1.4. TQABBIL TAL-METODI  
Jintużaw erba' klassijiet ta' metodi  
1.4.1.  Il-metodi ta ż-żamma fil-wi ċċ 
1.4.1.1.  Idrometru  (għal sustanzi likwidi)  
Jistgħu jinkisbu determinazzjonijiet tad-densità rapidi u e żatti 
biżżejjed permezz ta' idrometri li j żommu fil-wi ċċ, li jippermettu li 
d-densità ta' likwidu titqies mill-fond ta' l-immersjoni bil-qari ta' 
skala bi gradazzjoni.  
1.4.1.2.  Miżien idrostatiku  (għal sustanzi likwidi u solidi)  
Id-differenza bejn il-pi ż tal-kampjun g ħat-test imkejjel fl-ajru 
u f'likwidu adattat (e ż. l-ilma) tista' tintu ża biex tiddetermina d- 
densità tieg ħu. 
Għal solidi, id-densità mkejla hija kkunsidrata valida biss g ħal 
kampjun partikolari li jkun qed ji ġi eżaminat. G ħad-determinazzjoni 
tad-densità tal-likwidi, o ġġett ta' volum mag ħruf, v, jinti żen l-ewwel 
fl-arja u imbag ħad fil-likwidu.  
1.4.1.3.  Il-metodu ta' l-o ġġett mgħaddas  (għal sustanzi likwidi) (4)  
F’dan il-metodu, id-densità ta' likwidu hija ddeterminata mid- 
differenza bejn ir-ri żultati ta' kejl tal-likwidu qabel u wara l- 
immersjoni ta' o ġġett ta' volum mag ħruf fil-likwidu tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Metodi piknometri ċi 
Għal solidi jew likwidi, jistg ħu jintużaw piknometri ta' diversi forom 
u ta' volumi mag ħrufa. Id-densità hija kkalkulata mid-differenza fil- 
piż bejn il-piknometru mimli u vojt u l-volum mag ħruf tiegħu. 
1.4.3.  Piknometru g ħal paragun fl-arja  (għal solidi)  
Id-densità ta' solidu fi kwalunkwe forma tista' titkejjel f’temperatura 
ambjentali b'piknometru g ħal paragun bil-gass. Il-volum tas-sustanza 
jitkejjel fl-arja jew f’gass inert f’ ċilindru ta' volum varjabbli 
ikkalibrat. G ħal kalkolu tad-densità jittie ħed kejl wie ħed tal-piż 
wara li jsir il-kejl tal-volum.  
1.4.4.  Densitometru li joxxilla  (5) (6) (7)  
Id-densità ta' likwidu tista' titkejjel f’densitometru li joxxilla. 
Oxxillatur mekkaniku mibni fil-forma ta' tubu-U ji ġi vvibrat bil- 
frekwenza ta' re żonanza ta' l-oxxilatur li tiddependi fuq il-pi ż 
tiegħu. L-introduzzjoni ta' kampjun tbiddel il-frekwenza ta' 
reżonanza ta' l-oxxillatur. L-apparat g ħandu jiġi kkalibrat b' żewġ 
sustanzi likwidi ta' densitajiet mag ħrufa. Dawn is-sustanzi 
għandhom ikunu preferibbilment mag ħżula b'tali mod li d-densitajiet 
tagħhom ikopru l-iskala kollha li se titkejjel.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
L-applikabilità tal-metodi differenti u żati għad-determinazzjoni tad- 
densità relattiva hija mni żżla fit-tabella.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI  
L-istandards mog ħtija bħala eżempji, li g ħandhom ikunu kkonsultati 
għal dettalji tekni ċi addizzjonali, huma mehmu ża fl-Appendi ċi. 
Il-testijiet g ħandhom isiru f’temperatura ta' 20  o C, u għandhom isiru 
għall-inqas żewġ kejlijiet.  
2. DATA  
Ara l-istandards.  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— il-metodu u żat, 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l- 
istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,  
Id-densità relattiva,  D 20 
4 , għandha tkun irrappurtata kif imfisser f’1.2, 
flimkien ma' l-istat fi żiku tas-sustanza mkejla.  
L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod spe ċjali fir-rigward 
ta' l-impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabella  
Applikabilità tal-metodi  
Metodu ta' kejl Densità Viskożità dinamika 
massima possibbli Standards e żistenti 
solidu likwidu  
1.4.1.1. Idrometru iva 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Mi żien Idrostatiku 
(a) solidsi iva ISO 1183 (A) 
(b) likwidi iva 5 Pa s ISO 90 u 758 
1.4.1.3. Il-metodu ta' l-o ġġett 
mgħaddas iva 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Piknometru ISO 3507 
(a) solidi iva ISO 1183(B), 
NF T 20-053 
(b) likwidi iva 500 Pa s ISO 758 1.4.3 Piknometru g ħal paragun 
fl-arja iva DIN 55590 Teil 3, 
DIN53243 
1.4.4. Densitometru li joxxilla iva 5 Pa s
 
M4. REFERENZI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inter ­
science Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, 427–430.
 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elek ­
tronik, 1970, vol. 19, 297–302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.
 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Appendiċi 
Għal dettalji tekni ċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistg ħu jkunu kkonsultati 
bħala eżempju.  
1. Il-metodi ta ż-żamma fil-wi ċċ 
1.1 Idrometru 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydro ­
meters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters
 
1.2 Mi żien idrostatiku  
Għal sustanzi solidi  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids 
other than powders and cellular products 
– Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density  
Għal sustanzi likwidi  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related 
materials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3 Metodu tat-tag ħdis ta' l-o ġġett 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of 
density; immersed body method  
2. Metodi piknometri ċi 
2.1. G ħal sustanzi likwidi 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than l00. 10-6 m2 s-1 at 15
 o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than l00. 
10-6 m2 s-1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxi ­
mately 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high 
a vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids 
which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum 
products (graduated bicapillary 
pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum 
products by the capillary- stoppered 
pycnometer method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. G ħal sustanzi solidi 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use 
-Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Piknometru g ħat-tqabbil ma' l-arja  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; 
Pulverlack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. PRESSJONI TA’ FWAR  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalenti g ħall-OECD TG 104 (2004).  
1.1. INTORDUZZJONI  
Din il-ver żjoni riveduta ta’ metodu A 4 (1) tinkludi metodu 
addizzjonali, Metodu ta' effu żjoni: termogravimetrija i żotermali, 
maħsuba għal sustanzi kimi ċi bi pressjonijiet baxxi ħafna (sa 10  –10 
Pa). Fid-dawl ta’ b żonnijiet g ħal proċeduri, spe ċjalment relati mal- 
kisba ta’ pressjoni ta’ fwar g ħal sustanzi bi pressjoni baxxa ta’ fwar, 
proċeduri oħra ta’ dan il-metodu huma vvalutati mill- ġdid b’kon ­
nessjoni ma’ sensiliet o ħra ta’ applikabilità.  
Fl-ekwilibriju termodinamiku l-pressjoni ta’ fwar ta’ sustanza pura 
hija l-funzjoni ta’ temperatura biss. Il-prin ċipji fundamentali huma 
deskritti x’imkien ie ħor (2)(3).  
L-ebda pro ċedura ta’ kejl wa ħidha hija applikabbli g ħas-sensiela 
sħiħa ta’ pressjonijiet ta’ fwar minn inqas minn 10  –10 għal 
10 5 Pa. Tmien metodi biex titkejjel il-pressjoni ta’ fwar huma 
inklużi f’dan il-metodu li jista' ji ġi applikat f’sensiliet differenti ta’ 
pressjoni ta’ fwar. Il-metodi varji huma paragunati rigward l-appli ­
kazzjoni u s-sensiela ta' kejl f' Tabella 1. Il-metodi jistg ħu jiġu 
applikati biss g ħal komposti li ma jin ħallux fil-kundizzjonijiet tat- 
test. F’ka żijiet fejn il-metodi esperimentali ma jistg ħux jiġu applikati 
minħabba raġunijiet tekni ċi, il-pressjoni ta’ fwar tista’ ti ġi stmata, u 
metodu ta’ stima rrikmandat huwa spjegat fl-Appendi ċi. 
1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Il-pressjoni ta' fwar ta' sustanza hija definita b ħala l-pressjoni ta' 
saturazzjoni fuq sustanza solida jew likwida.  
L-unità SI ta’ pressjoni, li hija l-pascal (Pa), g ħandha tiġi użata. 
Unità oħrajn li ġew użati storikament se jing ħataw hawn ta ħt, 
flimkien mal-fatturi ta’ konver żjoni tagħhom: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosphere = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
L-unità SI ta’ temperatura hija l-kelvin (K). Il-konver żjoni ta’ gradi 
Celsius g ħal kelvin hija skont il-formula:  
T = t + 273,15  
fejn, T hija l-Kelvin jew temperatura termodinamika u t hija t- 
temperatura Celsius  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabella 1  
Metodu ta’ kejl Sustanzi Ripetibbiltà 
stmata Riproduċibbilità 
stmata Sensiela rakkom ­
andata Solid Liquid  
Metodu dinamiku Jin ħall malajr Iva sa 25 % 
1 sa 5 % sa 25 % 
1 sa 5 % 10 3 Pa sa 
2*10  3 Pa 
2*10  3 Pa sa 
10 5 Pa 
Metodu statiku Iva Iva 5 sa 10 % 5 sa 10 % 10 Pa sa 10  5 Pa 
10 –2 Pa sa 
10 5 Pa (  1 ) 
Metodu i żote­
niskopju Iva Iva 5 sa 10 % 5 sa 10 % 10  2 Pa sa 10  5 Pa 
Metodu ta' 
effużjoni: bilan ċ ta' 
pressjoni ta' fwar Iva Iva 5 sa 20 % sa 50 % 10  –3 sa 1 Pa 
Metodu ta' 
effużjoni: Ċellula 
Knudsen Iva Iva 10 sa 30 % — 10  –10 sa 1 P 
Metodu ta' 
effużjoni: termo ­
gravimetrija 
iżotermali Iva Iva 5 sa 30 % sa 50 % 10  –10 sa 1 Pa 
Metodu ta’ satu ­
razzjoni ta’ gass Iva Iva 10 sa 30 % sa 50 % 10  –10 sa 10  3 Pa 
Metodu ta’ dawwâr 
jdur fuqu nnifsu Iva Iva 10 sa 20 % — 10  –4 sa 0.5 Pa  
( 1 ) Meta tu¿a capacitance manometer  
1.3. PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
Ġeneralment, il-pressjoni ta’ fwar hija determinata f’temperaturi 
varji. F'sensiela ta’ temperatura limitata, il-logaritmu tal-pressjoni 
ta’ fwar ta’ sustanza pura hija funzjoni lineari tal-invers tat- 
temperatura termodinamika skont l-ekwazzjoni Clapeyron-Clausius simplifikata.
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constant  
fejn: 
p = huwa l-pressjoni ta’ fwar f’pascals  
ΔHv = is-s ħana ta’ vaporizzazzjoni f’J mol  –1 
R = il-kostanti universali ta’ gass, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = it-temperatura f’K  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta’ referenza ma g ħandhomx g ħalfejn jiġu użati. Huma utli 
primarjament biex ji ġi ċċekjat ir-rendiment ta’ metodu minn żmien 
għall-ieħor u kif ukoll biex jippermetti paragun bejn ri żultati ta’ 
metodi differenti.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.5.1.  Metodu dinamiku (Metodu ta’ Cottrell)  
1.5.1.1.  Prin ċipju 
Il-pressjoni ta’ fwar hija determinata billi titkejjel it-temperatura ta’ 
togħlija tas-sustanzi f’pressjonijiet varji spe ċifikati bejn wie ħed u 
ieħor 10  3 u 10  5 Pa. Dan il-metodu huwa wkoll irrikmandat g ħad- 
determinazzjoni tat-temperatura ta’ tog ħlija. Għal dak l-g ħan huwa 
utli sa 600K. It-temperaturi ta’ tog ħlija ta’ likwidi huma ċirka 0,1 °C 
ogħla f’fond ta’ 3 sa 4 ċm milli fil-wi ċċ minħabba pressjoni idros ­
tatika tal-kolonna ta’ likwidu. Fil-metodu Cottrell (4) it-termometru 
huwa mqieg ħed fil-fwar fuq il-wi ċċ tal-likwidu u l-likwidu jag ħli jiġi 
mġiegħel jippompja lilu nnifsu kontinwament fuq il-bozza tat-termo ­
metru. Saff irqiq ta’ likwidu li hu f’ekwilibrju mal-fwar fi pressjoni 
atmosferika jg ħatti l-bozza. It-termometru g ħalhekk jaqra l-punt ta’ 
togħlija veru, ming ħajr żbalji kka ġunati minn pressjoni ta’ s ħana 
eċċessiva u pressjoni idrostatika. Il-pompa li ori ġinarjament kienet 
użata minn Cottrell hija murija fil-figura 1. Tubu A jkun fih il- 
likwidu jag ħli. Fil ta’ platinu B issi ġillat fil-qieg ħ jgħin togħlija 
uniformi. It-tubu tal- ġenb C jag ħti għal kondensatur, u l-g ħant D 
jipprevjeni l-kondensat kiesa ħ milli jilħaq it-termometru E. Meta l- 
likwidu f’A jkun jag ħli, bżieżaq u likwidu maqbuda mil-lenbut ji ġu 
mferra’ mi ż-żewġ idejn tal-pompa F fuq il-bozza tat-termometru.  
Figura 1
  Figura 2
  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Pompa ta’ Cottrell (4)  
A: Akkopjament termiku  
B: Volum ta’ buffer ta’ vojt  
C: Arloġġ ta’ pressjoni  
D: Vojt  
E: Punt ta’ kejl  
F: Element li jsa ħħan ca. 150 W  
1.5.1.2.  Apparat  
Apparat mag ħmul b’reqqa kbira, li ju ża l-prinċipju Cottrell, huwa 
muri fil-figura 2. Jikkonsisti f'tubu b'sezzjoni ta' tog ħlija fil-parti l- 
iktar baxxa, apparat li jkessa ħ fil-parti tan-nofs, u ftu ħ u xifer fil-parti 
iktar ’il fuq. Il-pompa Cottrell hija mqieg ħda fis-sezzjoni ta’ tog ħlija 
li hija msa ħħna permezz ta’ cartridge elettriku. It-temperatura hija 
mkejla b’akkopjament termiku mg ħotti b'materjal li jifred, jew 
termometru ta' re żistenza li jid ħol minn max-xifer ta' fuq. Il-ftu ħ 
huwa mwa ħħal mas-sistema ta’ regolazzjoni ta’ pressjoni. Dan tal- 
aħħar jikkonsisti f’pompa ta’ vojt, volum ta’ buffer, manostat biex 
jerħi n-nitroġenu jidħol sabiex ti ġi regolata l-pressjoni u manometru.  
1.5.1.3.  Proċedura  
Is-sustanza hija mqieg ħda fis-sezzjoni ta’ tog ħlija. Jistg ħu jinħolqu 
problemi rigward solidi li mhumiex trab i żda dawn jistg ħu xi kultant 
jissolvew billi jissa ħħan il-materjal ta’ kes ħa li jgħatti. L-apparat 
huwa issi ġillat fix-xifer u jitne ħħa l-gass mis-sustanza. Sustanzi li 
jipproduċu ragħwa ma jistg ħux jiġu mkejla b’dan il-metodu.  
L-iktar pressjoni baxxa mixtieqa hija mbag ħad issettjata u s-sistema 
ta’ sħana hija mixg ħula. Fl-istess ħin, is-sensur tat-temperatura huwa 
mwaħħal ma’ re ġistratur.  
Ekwilibriju jintla ħaq meta temperatura kostanti ta’ tog ħlija hija rre ġ­
istrata waqt pressjoni kostanti. Irid ikun hemm attenzjoni partikolari biex jiġu evitati skossi waqt it-tog ħlija. Barra minn hekk, konden ­
sazzjoni s ħiħa trid isse ħħ fuq l-element li jkessa ħ. Meta tkun qed ti ġi 
ddeterminata l-pressjoni ta’ fwar ta’ solidi li jin ħallu b’mod baxx, 
għandha ting ħata attenzjoni biex il-kondensatur ma’ jit ħalliex jeħel.
 
Wara li ji ġi rreġistrat dan il-punt ta’ ekwilibrju, pressjoni og ħla tiġi 
ssettjata. Il-pro ċess ikompli b’dan il-mod sakemm tintla ħaq 10  5 Pa 
(ċirka 5 sa 10 punti ta’ kejl b’kollox). B ħala kontroll, punti ta’ 
ekwilibriju g ħandhom ji ġu ripetuti bi pressjonijiet inqas.  
1.5.2.  Metodu statiku  
1.5.2.1.  Prin ċipju 
Fil-metodu statiku (5), il-pressjoni ta’ fwar f’ekwilibriju termodi ­
namiku hija determinata f’temperatura spe ċifika. Dan il-metodu 
huwa xieraq g ħal sustanzi u likwidi u solidi multikomponenti fis- 
sensiela minn 10  –1 sa 10  5 u, jekk ikun hemm attenzjoni, anki fis- 
sensiela 1 sa 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Apparat  
It-tagħmir jikkonsisti f’banju b’temperatura kostanti (pre ċiżjoni ta’ 
± 0,2 K), kontenitur g ħall-kampjun imwa ħħal ma' fil ta' vojt, 
manometru u sistema li tirregola l-pressjoni. Il-kamra tal-kampjun 
(figura 3a) hija mwa ħħla mal-fil ta’ vojt permezz ta’ valvola u 
manometru differenzjali (Tubu U li fih likwidu xieraq tal-mano ­
metru) li jservi b ħala indikatur ta’ zero. Merkurju, silikoni u ftalati 
huma tajbin g ħal użu fil-manometru differenzjali, i żda dan jiddependi 
fuq is-sensiela ta’ pressjoni u l-m ġiba kimika tas-sustanza tat-test. 
Madankollu, min ħabba beżgħat ta’ natura ambjentali, l-u żu ta' 
merkurju g ħandu jiġi evitat, jekk possibbli. Is-sustanza tat-test ma 
għandiex tin ħall notevolment ġol-likwidu tat-tubu U, jew tag ħmel 
reazzjoni mieg ħu. Arloġġ ta’ pressjoni jista’ jintu ża minflok tubu 
U (figura 3b). G ħall-manometru, jista’ jintu ża l-merkurju fis- 
sensiela minn pressjoni normali ’l isfel sa 102 Pa, waqt li likwidi 
u ftalati ta’ silikon huma tajbin g ħal użu taħt 10  2 Pa ’l isfel sa 10 Pa. 
Hemm arlo ġġi ta’ pressjoni o ħrajn li jistg ħu jintużaw taħt 102 Pa u 
manometri ta’ kapa ċità ta’ membrana li tissa ħħan jistgħu anki jiġu 
użati taħt 10  –1 Pa. It-temperatura hija mkejla fuq il- ħajt ta' barra tal- 
kontenitur li jkun fih il-kampjun jew fil-kontenitur innifsu.  
1.5.2.3.  Proċedura  
Billi tuża l-apparat kif deskritt fil-figura 3a, imla t-tubu U bil-likwidu 
magħżul, li minnu jrid jitne ħħa l-gass f’temperatura g ħolja qabel ma 
jittieħdu l-valuri. Is-sustanza tat-test titqieg ħed fit-tag ħmir u minnha 
jitneħħa l-gass f’temperatura mnaqqsa. F'ka ż ta' kampjun b’kom ­
ponent multiplu, it-temperatura trid tkun baxxa bi żżejjed biex 
tiżgura li l-kompo żizzjoni tal-materjal ma tinbidilx. L-ekwilibriju 
jista’ jintla ħaq iktar malajr billi t ħawwad il-kampjun. Il-kampjun 
jista’ jiġi mkessa ħ b’nitroġenu likwidu jew sil ġ niexef, i żda 
għandha ting ħata attenzjoni sabiex ti ġi evitata l-kondensazzjoni tal- 
arja jew tal-likwidu tal-pompa. Bil-valvola fuq il-kontenitur kampjun 
miftuħa, għandha tiġi applikata aspirazzjoni g ħal ftit minuti sabiex 
titneħħa l-arja. Jekk ikun ne ċessarju, l-operazzjoni ta’ tne ħħija ta’ 
gass tiġi ripetuta g ħal diversi drabi.  
Figura 3a
  Figura 3b
  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Meta l-kampjun ji ġi msaħħan bil-valvola mag ħluqa, il-pressjoni tal- 
fwar tiżdied. Dan jibdel l-ekwilibriju tal-likwidu fit-tubu U. Sabiex 
jagħmel tajjeb g ħal dan, nitro ġenu jew arja jidda ħħal/tiddaħħal fit- 
tagħmir sakemm l-indikatur ta’ pressjoni differenzjali jer ġa’ jiġi żero. 
Il-pressjoni me ħtieġa għal dan tista’ tinqara mill-manometru jew 
minn għodda ta’ pre ċiżjoni ikbar. Din il-pressjoni taqbel mal- 
pressjoni ta’ fwar tas-sustanza fit-temperatura tal-kejl. Billi tu ża l- 
apparat deskritt fil-figura 3 b, il-pressjoni ta’ fwar tinqara diret ­
tament.  
Il-pressjoni ta’ fwar hija determinata f’intervalli ta’ temperaturi 
konvenjentement żgħar (ċirka 5 sa 10 punti ta’ kejl b’kollox) sal- 
massimu tat-temperatura mixtieqa.  
Indikazzjonijiet f’temperatura baxxa g ħandhom ji ġu ripetuti b ħala 
kontroll. Jekk il-valuri mi ġjuba mill-indikazzjonijiet ripetuti ma 
jaqblux mal-kurva li tindika temperatura g ħola, dan jista' jkun 
minħabba waħda minn dawn is-sitwazzjonijiet li ġejjin:  
i) il-kampjun g ħad fih l-arja (e ż fil-każ ta’ materjali visku żi ħafna) 
jew sustanzi b’tog ħlija baxxa li jo ħorġu waqt li jkun qed ji ġi 
msaħħan; 
ii) is-sustanza tkun su ġġetta għal reazzjoni kimika fis-sensiela ta’ 
temperaturi mist ħarrġa (eż dekompo żizzjoni, polimerizzazzjoni).  
1.5.3.  Metodu ta’ I żoteniskopju  
1.5.3.1.  Prin ċipju 
L-iżoteniskopju (6) hu bba żat fuq il-prin ċipju tal-metodu statiku. Il- 
metodu jinvolvi li tpo ġġi kampjun f’bozza mi żmuma f’temperatura 
kostanti u mwa ħħla ma’ manometru u pompa ta’ vojt. Impuritajiet 
iktar volatili mis-sustanza huma mne ħħija billi jitne ħħa l-gass fi 
pressjoni imnaqqsa. Il-pressjoni ta’ fwar tal-kampjun f’temperaturi magħżula hija bilan ċjata bi pressjoni mag ħrufa ta’ gass li ma 
jagħmilx reazzjoni. L-i żoteniskopju kien żviluppat biex ikejjel il- 
pressjoni ta' fwar ta' ċerti idrokarboni likwidi i żda hija adegwata 
għall-investigazzjoni ta' solidi wkoll. Il-metodu ma huwiex 
ġeneralment xieraq g ħal sistemi b’iktar minn komponent wie ħed. 
Ir-riżultati huma su ġġetti biss g ħal żbalji żgħar f’każ ta’ kampjuni 
ta’ impuritajiet mhux volatili. Is-sensiela rrikmandata hija 10
 2 sa 
10 5 Pa. 
1.5.3.2.  Apparat  
Eżempju ta’ tag ħmir ta’ kejl huwa muri fil-figura 4. Deskrizzjoni 
sħiħa tinsab f’ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Proċedura  
Fil-każ ta’ likwidi, is-sustanza nnifisha sservi b ħala l-likwidu fil- 
manometru differenzjali. Kwantità tal-likwidu, bi żżejjed biex timla 
l-bozza u l-iqsar sieq tal-manometru, hija mqieg ħda fuq l-i żotenis­
kopju. L-i żoteniskopju huwa mwa ħħal ma’ sistema ta’ vojt u 
mbattal, imbag ħad mimli bin-nitro ġenu. It-tbattil u t-tisfija tas- 
sistema huma ripetuti darbtjen biex jitne ħħa l-ossiġnu li jifdal. L- 
iżoteniskopju mimli huwa mqieg ħed f’pożizzjoni orizzontali sabiex 
il-kampjun jinxtered u jifforma saff irqieq fil-bozza tal-kampjun u 
manometru. Il-pressjoni tas-sistema titnaqqas g ħal 133 Pa u l- 
kampjun huwa msa ħħan bil-mod sakemm jag ħli (tneħħija ta’ 
gassijiet ma ħlula). L-iżoteniskpju huwa mbag ħad imqieg ħed b’ċertu 
mod li l-kampjun jirritorna lejn il-bozza u jimla s-sieq il-qasira tal- manometru. Il-pressjoni tin żamm 133 Pa. Il-qarnuna ma ħruġa ’l 
barra tal-bozza tal-kampjun hija msa ħħna bi fjamma żgħira 
sakemm il-fwar tal-kampjun li jo ħroġ jespandi bi żżejjed b’mod li 
jħarrek parti mill-kampjun mill-parti l-iktar ’l fuq tal-bozza u id 
tal-manometru u jqieg ħda fil-manometru, waqt li jo ħloq spazzju 
mimli bil-fwar u ħieles minn nitro ġenu. L-iżoteniskopju huwa 
mbagħad imqieg ħed f’banju b’temperatura kostanti, u l-pressjoni 
tan-nitro
ġenu hija a ġġustata sakemm ti ġi daqs dik tal-kampjun. Fl- 
ekwilibriju, il-pressjoni tan-nitro ġenu tiġi daqs dik tal-fwar tas- 
sustanza.  
Figura 4
  
F’każ ta’ solidi, u jiddependi fuq is-sensiliet ta’ pressjoni u 
temperatura, likwidi tal-manometru b ħal likwidi u ftalati ta’ silikon 
huma użati. Il-likwidu ta’ manometru bla gass huwa mqieg ħed ġol- 
biċċa maħruġa l-barra fuq l-id it-twila tal-i żoteniskopju. Imbag ħad is- 
solidu li se ji ġi mistħarreġ jitqiegħed fil-bozza ta’ kampjun u minnu 
jitneħħa l-gass f’temperatura g ħolja. Wara dak, l-i żoteniskopju ji ġi 
mmejjel sabiex il-likwidu ta’ manometru jkun jista’ jid ħol fit-tubu U.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Metodu ta' effu żjoni: bilan ċ ta’ pressjoni ta’ fwar  (7) 
1.5.4.1.  Prin ċipju 
Kampjun tas-sustanza tat-test ji ġi msaħħan f’forn żgħir u mqieg ħed 
f’vażett forma ta’ qampiena (bell jar) mbattal. Il-forn huwa mg ħotti 
b’għatu li fih toqob zg ħar ta’ dijametri mag ħrufa. Il-fwar tas- 
sustanza, li jo ħroġ minn wa ħda mit-toqob, huwa mmexxi g ħal fuq 
plattina ta’ mi żien sensittiv ħafna li huwa wkoll mag ħluq fil-va żett 
forma ta’ qampiena. F’xi di żinni l-plattina tal-mi żien hija mdawwra 
b’kaxxa li tkessa ħ li tipprovdi ħruġ ta' sħana 'l barra permezz ta’ 
konduzzjoni termika, u hija mkess ħa b’radjazzjoni sabiex il-fwar li 
joħroġ jikkondensa fuqha. Il-momentum tal-mer żuq ta’ fwar ja ħdem 
bħala forza fuq il-mi żien. Il-pressjoni ta’ fwar tista’ ti ġi b’żewġ 
modi: direttament mill-forza fuq il-plattina tal-mi żien u wkoll mir- 
rata ta' evaporazzjoni li tu ża l-ekwazzjoni Hertz-Knudsen (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
fejn: 
G = rata ta’ evaporazzjoni (kg s  –1 m –2 ) 
M = massa molari (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K)  
R = kostanti universali ta’ gass (J mol  –1 K –1 ) 
P = pressjoni ta’ fwar (Pa)  
Is-sensiela rrikmandata hija minn 10  –3 sa 1 Pa.  
1.5.4.2.  Apparat  
Il-prinċipju ġenerali tal-apparat huwa muri fil-figura 5.  
Figura 5
  
A: Sett ta’ ba żi F: Kaxxa li tkessa ħ u lasta li tkessa ħ 
B: Għodda bi spirall jimxi G: Forn evaporatur 
C: Va żett forma ta’ qampiena H: Kunjett Dewar b’nitro ġenu likwidu 
D: Mi żien bi plattina I: Kejl ta’ temperatura ta' kampjun 
E: Dispo żittiv li jkejjel il-vojt J: Sustanza tat-test  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Metodu ta' effu żjoni: Ċellula Knudsen  
1.5.5.1.  Prin ċipju 
Dan il-metodu huwa bba żat fuq stima tal-massa tas-sustanza tat-test 
ħierġa ’l barra g ħal kull unità ta' ħin ta' ċellula Knudsen (8) f’forma 
ta’ fwar, minn toqba żgħira ħafna f’kundizzjonijiet estremi ta’ vojt. 
Il-massa ta’ fwar li ħareġ tista’ tinstab jew billi ji ġi ddeterminat it-telf 
tal-massa ta ċ-ċellula jew billi ji ġi kkondensat il-fwar f’temperatura 
baxxa u ji ġi ddeterminat l-ammont ta’ sustanza volatilizzata permezz 
ta’ kromatografija. Il-pressjoni ta’ fwar hija kkalkulata billi ti ġi 
applikata r-relazzjoni ta’ Hertz-Knudsen (ara t-taqsima 1.5.4.1) ma’ fatturi korrettivi li jiddependu fuq il-parametri tal-apparat (9). Is- 
sensiela rrikmandata hija 10
 –10 to 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Apparat  
Il-prinċipju ġenerali tal-apparat huwa muri fil-figura 6.  
Figura 6
  
1: Konnessjoni mal-vojt 7: G ħatu meħjut 
2: Bjar minn termometru ta’ re żistenza tal- 
platinu jew kejl ta’ temperature u kontroll 8: Skorfini farfett 
3: Għatu għat-tank tal-vojt 9: Viti 
4: Ċirku-O 10: Ċelluli ta’ effu żjoni b’ħadid li ma jiss ­
addadx 
5: Tank tal-vojt tal-aluminju 11: Cartridge li ssa ħħan 
6: Dispo żittiv biex tinstalla u tne ħħi ċ-ċelloli 
ta’ effużjoni ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Metodu ta' effu żjoni: termogravimetrija i żotermali  
1.5.6.1.  Prin ċipju 
Dan il-metodu huwa bba żat fuq id-determinazzjoni ta’ rati a ċċelerati 
ta’ evaporazzjoni g ħas-sustanza tat-test f’temperaturi g ħolja u 
pressjoni ambjentali bl-u żu ta’ termogravimetrija (10)(15)(16)(17) ­
(18)(19)(20). Ir-rati ta’ evaporazzjoni v  T jirriżultaw billi ji ġi espost 
il-kompost mag ħżul għal atmosfera ta’ gass, li ma jag ħmilx 
reazzjoni, g ħaddej bil-mod, u ji ġi kkontrollat it-telf ta’pi ż f'tem­
peraturi i żotermali definiti T f’Kelvin fuq perjodi xierqa ta’ żmien. 
Il-pressjonijiet ta’ fwar p  T huma kkalkulati mill-valuri v  T billi tuża r- 
relazzjoni lineari bejn il-logaritmu tal-pressjoni ta’ fwar u l-logaritmu 
tar-rata ta’ evaporazzjoni. Jekk ne ċessarju, estrapolazzjoni lil 
temperaturi ta' 20 u 25 °C tista’ ssir b’anali żi ta’ regressjoni ta’ 
log p  T vs. 1/T. Dan il-metodu huwa tajjeb g ħal sustanzi bi press ­
jonijiet ta’ fwar baxxi sa 10  –10 Pa (10  –12 mbar) u b’purità qrib kemm 
jista’ jkun ta’ 100 % sabiex ti ġi evitata l-mi żinterpretazzjoni ta’ telf 
ta’ piż imkejjel.  
1.5.6.2.  Apparat  
Il-prinċipju ġenerali tat-tag ħmir esperimentali huwa muri fil-figura 7.  
Figura 7
  
Il-keffa li ġġorr il-kampjun, imdendel fuq mi żien micro f’kamra 
b’temperatura kkontrollata, huwa mi ġbud permezz ta' nixxieg ħa ta’ 
gass nitro ġenu niexef li j ġorr il-molekuli vaporizzati tas-sustanza tat- 
test lil hinn. Wara li t ħalli l-kamra, in-nixxieg ħa ta' gass hija 
ppurifikata b'unità ta' assorbiment.  
1.5.6.3.  Proċedura  
Is-sustanza ta’ test hija applikata fuq il-wi ċċ ta’ platt a ħrax tal-ħġieġ 
bħala saff omo ġeneju. Fil-ka ż ta’ solidi, il-keffa tixxarrab b’mod 
uniformi b’soluzzjoni tas-sustanza f’solvent xieraq u mnixxef f’at ­
mosfera inerta. G ħall-kejl, il-keffa miksija ti ġi mdendla g ħal ġol- 
analizzatur termogravimetriku u sussegwentement it-telf tal-pi ż 
tiegħu jiġi mkejjel kontinwament b ħala funzjoni ta’ ħin. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Ir-rata ta’ evaporazzjoni v  T f’temperatura definita hija ikkalkulata 
mit-telf ta’ pi ż m tal-platt tal-kampjun permezz ta’  
v T ¼ Δm 
F Ö t ðgcm  –2 h –1 Þ 
fejn F hija l-erja tal-wi ċċ tas-sustanzi ta' test miksija, normalment 
l-erja tal-wi ċċ tal-platt tal-kampjun, u t huwa l- ħin għat telf ta' pi ż 
Δm. 
Il-pressjoni ta’ fwar p  T hija kkalkulata fuq il-ba żi tal-funżjoni tagħha 
ta’ rata ta’ evaporazzjoni v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
fejn C u D huma kostanti spe ċifiċi għall-arranġament sperimentali 
użat, jiddependi fuq id-dijametru tal-kamra ta’ kejl u fuq ir-rata ta’ 
fluss ta’ gass. Dawn il-kostanti g ħandhom ji ġu ddeterminati darba 
billi jitkejjel sett ta’ komposti bi pressjoni ta’ fwar mag ħrufa u log p  T 
vs. log v  T li jmur lura (11)(21)(22).  
Ir-relazzjoni bejn il-pressjoni ta’ fwar p  T u t-temperatura T f’Kelvin 
tingħata permezz ta'  
Log p  T = A + B 1/T  
fejn A u B huma kostanti mi ġjuba permezz ta’ log p  T vs. 1/T li jmur 
lura. B’din l-ekwazzjoni, il-pressjoni ta’ fwar tista’ ti ġi kkalkulata 
għal kull temperatura o ħra b'estrapolazzjoni.  
1.5.7.  Metodu ta’ saturazzjoni ta’ gass  (23)  
1.5.7.1.  Prin ċipju 
Gass inert huwa mg ħoddi, f’temperatura ambjentali u b’rata mag ħrufa 
ta’ fluss, minn u fuq kampjun tas-sustanza tat-test, bil-mod bi żżejjed 
biex jiżgura saturazzjoni. Li tintla ħaq saturazzjoni fil-fa żi ta’ gass hija 
ta’ importanza kritika. Is-sustanza trasportata hija maqbuda, 
ġeneralment billi jintu ża assorbent, u l-ammont tag ħha jiġi ddeterminat. 
Bħala alternattiva g ħal qbid ta’ fwar u anali żi sussegwenti, tekniki 
analitiċi in-train, b ħal kromatografija ta’ gass, jistg ħu jiġu użati biex 
jiġi ddeterminat kwantitattivament l-ammont tal-materjal trasportat. Il- 
pressjoni ta’ fwar hija kkalkulata fuq l-assunzjoni li l-prin ċipju ideali 
ta’ gass huwa obdut u li l-pressjoni totali ta’ ta ħlita ta’ gassijiet hija 
daqs s-somma ta' pressjonijiet tal-gassijiet komponenti. Il-pressjoni parzjali tas-sustanza tat-test, i.e. il-pressjoni ta’ fwar, hija kkalkulata 
mill-volum totali ta’ gass mag ħruf u mill-pi ż tal-materjal trasportat.
 
Il-proċedura ta’ saturazzjoni ta’ gass hija applikabbli g ħal sustanzi 
kimiċi solidi jew likwidi. Tista’ ti ġi użata għal pressjonijiet ta’ fwar 
sa 10  –10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Dan il-metodu huwa l-iktar ta’ min 
joqgħod fuqu g ħal pressjonijiet ta’ fwar ta ħt 10  3 Pa. Fuq 103 Pa, il- 
pressjonijiet ta’ fwar huma ġeneralment stmati żżejjed, prob ­
abbilment min ħabba tiswir ta’ aerosol. Min ħabba li l-kejl ta’ 
pressjoni ta’ fwar isir f’temperatura ambjentali, m’hemmx b żonn li 
toħroġ dejta minn temperaturi g ħolja u ħruġ ta’ dejta f’temperaturi 
għolja, li ta’ spiss jikkaw żaw żbalji serji, huma evitati.  
1.5.7.2.  Apparat  
Din il-pro ċedura tirrikjedi l-u żu ta’ kaxxa b’temperatura kostanti. L- 
iskizz fil-Figura 8 juri kaxxa li fiha tlett kontenituri ta’ kampjuni solidi u tlieta o ħra għal kampjuni likwidi, li jippermetti anali żi trip­
likata ta’ kampjun solidu jew likwidu. It-temperatura hija kontrollata 
għal ± 0,5 °C jew a ħjar.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figura 8
  
Ġeneralment, nitro ġenu huwa u żat bħala gass inerti li j ġorr iżda, xi 
drabi, gass ie ħor jista’ jkun b żonnjuż (24). Il-gass li j ġorr għandu 
jkun niexef. In-nixxieg ħa ta’ gass tinqasam f’6 nixxig ħat, kontrollati 
minn valvoli labar (b’toqba ta’ ċirka 0.79 mm), u jid ħol fil-kaxxa 
minn tubu tar-ram ta’ 3.8 mm i.d. Wara ekwilibrazzjoni ta’ 
temperatura, il-gass jg ħaddi minn ġol-kampjun u t-trappola 
assorbenti u jo ħroġ minn ġol-kaxxa.  
Kampjuni solidi jidda ħħlu f’tubu tal- ħġieġ 5 mm i.d. bejn tappijiet 
ta’ suf tal- ħġieġ (ara Figura 9). Figura 10 turi kontenitur ta’ kampjun 
likwidu u sistema ta’ assorbiment. L-e ħfef metodu ta’ kif titkejjel il- 
pressjoni ta’ fwar ta’ likwidi huwa li jinksew żibeġ tal-ħġieġ bil- 
likwidu jew inkella jinkesa assorbent inert b ħal silika, u jimtela l- 
kontenitur b’dawn i ż-żibeġ. Bħala alternattiva, il-gass li j ġorr jista’ 
jiġi mġiegħel jgħaddi minn ħġieġ aħrax bil-pori u jbaqbaq minn ġo 
kolonna tas-sustanza likwida tat-test.  
Figura 9
  Figura 10
  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Is-sistema ta’ assorbent fiha sezzjoni assorbenti fuq quddiem u o ħra 
ta’ sostenn. Fi pressjonijiet ta’ fwar baxxi ħafna, ammonti żgħar biss 
jinżammu mill-assorbent u l-assorbiment fuq is-suf tal- ħġieġ u t-tubu 
tal-ħġieġ bejn il-kampjun u l-assorbent tista’ tkun problema serja.  
Trappoli mkess ħa b’CO  2 solidu huwa metodu effi ċjenti ieħor kif 
jinġabar il-materjal vaporizzat. Huma ma jikkaw żaw l-ebda 
pressjoni b’lura fuq il-kolonna tas-saturatur u huwa ħafif ħafna li 
kwantitattivament jitne ħħa l-materjal maqbud.  
1.5.7.3.  Proċedura  
Ir-rata ta' fluss tal-gass ħiereġ li jġorr hija mkejla f’temperatura 
ambjentali. Ir-rata ta’ fluss hija ċċekjata frekwentament matul l- 
esperiment biex ti żgura li hemm valur e żatt għall-volum totali ta’ 
gass li jġorr. Kontroll kontinwu b’apparat li jkejjel il-fluss tal-massa 
huwa preferut. Saturazzjoni tal-fa żi ta’ gass tista’ tirrikjedi ħin ta’ 
kuntatt konsiderevoli u g ħalhekk rati ta’ fluss aktarx baxxi (25).  
Fit-tmiem tal-esperiment, kemm is-sezzjoni ta’ quddiem u kemm dik 
ta’ sostenn tal-assorbent huma analizzati separatament. Il-kompost 
fuq kull sezzjoni huwa desorbit billi ji żdied solvent. Is-soluzzjonijiet 
li jirriżultaw huma analizzati kwantitattivament biex ji ġi ddeterminat 
il-piż desorbit minn kull sezzjoni. L-g ħażla tal-metodu analitiku (u 
anki l-għażla ta’ sorbent u solvent desorbenti) hija dettata min-natura 
tal-materjal tat-test. L-effi ċjenza ta’ desorbiment hija determinata billi 
jiġi injettat ammont mag ħruf ta’ kampjun fuq is-sorbent, tiddesorbjah 
u tanalizza l-ammont irkuprat. Huwa importanti li ti ġi ċċekjata l- 
effiċjenza ta’ desorbiment fejn jew qrib il-kon ċentrazzjoni tal- 
kampjun fil-kundizzjonijiet tat-test.  
Biex tiżgura li l-gass li j ġorr huwa saturat bis-sustanza tat-test, tliet 
rati differenti ta’ fluss ta’ gass huma u żati. Jekk il-pressjoni ta’ fwar 
ikkalkulata ma turi l-ebda dipendenza fuq ir-rata tal-fluss, il-gass 
huwa kkunsidrat b ħala saturat.  
Il-pressjoni tal-fwar hija kkalukulata permezz tal-ekwazzjoni:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
fejn: 
p = pressjoni ta’ fwar (Pa)  
W = massa ta’ sustanza ta’ test evaporata (g)  
V = volum ta’ gass saturat (m  3 ) 
R = kostanti universali ta’ gass 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K)  
M = massa molari tas-sustanza tat-test (g mol  –1 ) 
Volumi mkejla g ħandhom ji ġu rranġati għal differenzi ta' pressjoni u 
temperatura bejn id-dispo żittiv li jikkalkula l-fluss u s-saturatur.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Dawwar li jdur fuqu nnifsu  
1.5.8.1.  Prin ċipju 
Dan il-metodu ju ża arloġġ ta’ visko żità b’dawwâr li jdur fuqu nnifsu, 
li l-element ta’ kejl tieg ħu huwa ballun żgħir tal-ħadid li, meta jkun 
imdendel f’kamp manjetiku, jibda jdur fuqu nnifsu min ħabba kampi 
manjetiċi li jduru (26)(27)(28). Fonorivelaturi jippermettu li r-rata ta’ 
dawrien tieg ħu tiġi mkejla. Meta l-ballun ikun la ħaq veloċità ta’ 
dawrien stabbilita, normalment ċirka 400 dawra fis-sekonda, l- 
enerġija titwaqqaf u de ċelerazzjoni, min ħabba frizzjoni ta’ gass, 
isseħħ. It-tnaqqis fil-velo ċità ta’ dawrien hija mkejla b ħala funzjoni 
ta’ żmien. Il-pressjoni ta’ fwar hija mnaqqsa mit-tnaqqis ta’ velo ċità 
tal-ballun tal- ħadid ikkaw żat mill-pressjoni. Is-sensiela rrikmandata 
hija minn 10  –4 sa 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Apparat  
Diżinn skematiku tat-tag ħmir sperimentali huwa muri fil-figura 
11. Ir-ras ta' kejl hija mqieg ħda f’għeluq ta’ temperatura kostanti, 
irregolat b’0,1 °C. Il-kontenitur tal-kampjun hu mqieg ħed f’għeluq 
separat, irregolat ukoll b’0,1 °C. Il-partijiet l-o ħra kollha tat-tag ħmir 
huma mi żmuma f’temperatura og ħla biex tipprevjeni l-konden ­
sazzjoni. L-apparat kollu huwa mwa ħħal ma’ sistema elevata ta’ vojt.  
Figura 11
  
2. DEJTA U RAPPURTAR  
2.1. DEJTA  
Il-pressjoni ta’ fwar minn xi wie ħed mill-metodi t’hawn fuq g ħandha 
tiġi ddeterminata g ħal mill-inqas żewġ temperaturi. Tlieta jew iktar 
huma preferuti fis-sensiela minn 0 sa 50°, sabiex ti ġi ċċekjata l- 
linearità tal-kurva ta’ pressjoni ta' fwar. Fil-ka ż ta' metodu ta' 
Effużjoni (Ċellula Knudsen u termogravimetrija i żotermali) u 
metodu ta' saturazzjoni ta' Gass, 120 sa 150 °C hija rrikmandata għas-sensiela ta’ kejl ta’ temperatura minflok minn 0 sa 50 °C.
 
2.2. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— metodu u żat, ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— speċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u 
pass preliminarju ta’ purifikazzjoni, jekk ikun hemm,  
— mill-inqas żewġ valuri ta’ pressjoni ta’ fwar u temperatura — u 
preferibbilment tlieta jew iktar — rikjesti fis-sensiela minn 0 sa 50 °C (jew 120 sa 150 °C),
 
— mill-inqas wa ħda mit-temperaturi g ħandha tkun 25 °C jew inqas, 
jekk teknikament possibli skont il-metodu mag ħżul, 
— id-dejta kollha ori ġinali,  
— kurva ta’ log p versus 1/T,  
— stima tal-pressjoni ta’ fwar f’20 jew 25 °C.  
Jekk tran żizzjoni (bidla ta’ stat, dekompo żizzjoni) hija osservata, l- 
informazzjoni li ġejja għandha tiġi nnutata:  
— natura tal-bidla,  
— temperatura li fiha l-bidla sse ħħ fi pressjoni atmosferika,  
— pressjoni ta’ fwar f’10 u 20 °C inqas mit-temperatura ta’ 
tranżizzjoni u 10 u 20 °C iktar minn din it-temperatura 
(sakemm it-tran żizzjoni hija minn solidu g ħal gass).  
Kull informazzjoni u rimarki rilevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati għandhom ji ġi rrapurtati, spe ċjalment f’dak li g ħandu 
x’jaqsam ma’ impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  
3. LETTERATURA  
(1) Il-Ġurnal Uffi ċjali tal-Komunitajiet Ewropej  L 383 A, 26- 
47 (1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
(6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition 
temperature of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.
 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000)  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic deter ­
mination of small vapour pressures determination of the 
vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 
16 (1964), 22-28  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.
 
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science
 4 (1973) 137-147.  
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393-400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; 
Pesticide Science 13 (1982) 161-168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used 
in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 
150 °C.  
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal 
Register, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Appendiċi 
Metodu ta' stima  
INTORDUZZJONI  
Valuri stmati ta’ pressjoni ta’ fwar jistg ħu jintuzaw:  
— biex ji ġi deċiż liema metodu sperimentali huwa xieraq;  
— biex jipprovdu stima jew valur ta’ limitu f'ka żijiet fejn il-metodu sperimentali 
ma jistax ji ġi applikat min ħabba raġunijiet tekni ċi. 
METODU TA' STIMA  
Il-pressjoni ta’ fwar ta' likwidi u solidi tista’ ti ġi stmata bl-u żu tal-korrelazzjoni 
Watson modifikata (a). L-unika dejta sperimentali me ħtieġa huwa l-punt normali 
ta’ togħlija. Il-metodu huwa applikabbli g ħas-sensiela ta’ pressjoni minn 10  5 Pa 
sa 10  –5 Pa. 
Informazzjoni dettaljata fuq il-metodu hija mog ħtija fil-“Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods” (b). Ara wkoll OECD “Environmental Mono ­
graph” Nru.67 (c)  
PROĊEDURA TA’ KALKOLAZZJONI  
Il-pressjoni ta’ fwar hija kkalkulata kif ġej: 
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 6 6 6 4 3 
7 7 7 7 7 5
 
fejn: 
T = temperatura ta’ interess  
T b = punt ta’ tog ħlija normali  
P VP = pressjoni ta’ fwar f’temperatura T  
ΔH Vb = sħana ta’ vaporizzazzjoni  
ΔZ b = fattur ta’ kompressibilità (stmat f’ 0,97)  
m = fattur empiriku li jiddependi fuq l-istat fi żiku fit-temperatura ta’ 
interess  
Flimkien ma’,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
fejn, K  F hija fattur empiriku li jikkunsidra l-polarità tas-sustanza. G ħal xi tipi ta’ 
komposti, fatturi K  F huma elenkati f’riferenza (b).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Ħafna drabi, te żisti dejta fejn jing ħata l-punt ta’ tog ħlija f’pressjoni mnaqqsa. 
F’każ bħal dan, il-pressjoni ta’ fwar hija kkalkulata kif ġej: 
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m – 1 
ln T 
T 1 " #  
fejn, T  1 hija l-punt ta’ tog ħlija fil-pressjoni mnaqqsa P1.  
RAPPORT  
Meta jintu ża l-metodu ta’ stima, ir-rapport g ħandu jinkludi dokumentazzjoni 
komprensiva tal-kalkulazzjoni.  
LETTERATURA  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph Nru.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. TENSJONI TAS-SUPERFI ĊJE 
1. METODU  
Il-metodi mfissra huma bba żati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). 
Il-prinċipji fundamentali huma mog ħtija fir-referenzi (2).  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodi mfissra g ħandhom ji ġu applikati g ħall-kejl tat-tensjoni fuq 
is-superfi ċje ta' soluzzjonijiet ta' l-ilma.  
Qabel ma jsiru dawn it-testijiet huwa utli li jkollok informazzjoni 
preliminari dwar is-solubilità ta' l-ilma, l-istruttura, il-proprjetajiet ta' l-idrolisi u l-kon ċentrazzjoni g ħall-formazzjoni ta'  micelles  mis- 
sustanza.
 
Il-metodi li ġejjin japplikaw g ħall-parti l-kbira tas-sustanzi kimi ċi, 
mingħajr ebda restrizzjoni fir-rigward tal-grad tal-purità tag ħhom.  
Il-kejl tat-tensjoni tas-superfi ċje bil-metodu tat- tensiometer  bil-ħolqa 
huwa ristrett g ħal soluzzjonijiet fl-ilma b’visko żità dinamika ta' inqas 
minn approssimattivament 200 mPa s.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
L-entalpija ħielsa tas-superfi ċje għal kull unità ta' l-erja tas-superfi ċje 
hija msej ħa t-tensjoni tas-superfi ċje. 
It-tensjoni tas-superfi ċje tingħata bħala: 
N/m (unità SI) jew  
mN/m (sub-unità SI)  
1 N/m = 10  3 dini/cm  
1 mN/m = 1 dina/cm fis-sistema cgs li m'g ħadhiex tintu ża 
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta' referenza mhumiex me ħtieġa li jintu żaw fil-ka żijiet 
kollha meta tkun qed ti ġi investigata sustanza ġdida. Huma 
għandhom iservu primarjament biex minn żmien għal żmien 
jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu u sabiex jippermettu tqabbil ma' 
riżultati minn metodi o ħra. 
Sustanzi ta' referenza li jkopru firxa kbira ta' tensjoni tas-superfi ċje 
jingħataw fir-referenzi 1 u 3.  
1.4. PRIN ĊIPJI TAL-METODI  
Il-metodi huma bba żati fuq il-kejl tal-qawwa massima li hemm 
bżonn li tkun e żerċitata b'mod vertikali, fuq staffa jew ħolqa 
f’kuntatt mas-superfi ċje tal-likwidu li jkun qed ji ġi eżaminat 
imqiegħed f’reċipjent tal-kejl, bil-g ħan li jkun separat minn din is- 
superfiċje, jew fuq pjan ċa, bit-tarf f’kuntatt mas-superfi ċje, bil-għan 
li tinġibed ir-rita li tkun ffurmat.  
Sustanzi li jin ħallu fl-ilma f’millinqas kon ċentrazzjoni ta' 1 mg/l ji ġu 
ttestjati f’soluzzjoni fl-ilma f’kon ċentrazzjoni wa ħda. 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Dawn il-metodi kapa ċi jagħtu preċiżjoni akbar milli mistennija li 
tkun meħtieġa għall-valutazzjoni ambjentali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODI  
Soluzzjoni tas-sustanza tit ħejja f’ilma distillat. Il-kon ċentrazzjoni ta' 
din is-soluzzjoni g ħandha tkun 90 % tas-solubilità tas-saturazzjoni 
tas-sustanza fl-ilma, meta din il-kon ċentrazzjoni taqbe ż 
1 g/l, kon ċentrazzjoni ta' 1 g/l ti ġi użata għat-test. Mhux me ħtieġ 
li jkunu ttestjati sustanzi b'solubilità fl-ilma ta' inqas minn 1 mg/l.  
1.6.1.  Il-metodu tal-pjan ċa 
Ara ISO 304 u NF T 73-060 (A ġenti attivi fis-superfi ċje – deter ­
minazzjoni tat-tensjoni tas-superfi ċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).  
1.6.2.  Metodu ta' l-istaffa  
Ara ISO 304 u NF T 73-060 (A ġenti attivi fis-superfi ċje – deter ­
minazzjoni tat-tensjoni tas-superfi ċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).  
1.6.3.  Metodu tal- ħolqa 
Ara ISO 304 u NF T 73-060 (A ġenti attivi fis-superfi ċje – deter ­
minazzjoni tat-tensjoni tas-superfi ċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).  
1.6.4.  Il-metodu armonizzat tal- ħolqa ta' l-OECD  
1.6.4.1.  Apparat  
Tensiometers  disponibbli kummer ċjalment huma adegwati g ħal dan 
il-kejl. Huma jikkonsistu minn dawn l-elementi:  
— il-mejda mobbli g ħall-kampjun,  
— is-sistema ta' kejl tal-qawwa,  
— korp tal-kejl,  
— reċipjent tal-kejl.  
1.6.4.1.1. M e j d a m o b b l i g ħ a l l - k a m p j u n  
Il-mejda mobbli g ħall-kampjun tintu ża bħala rfid g ħar-reċipjent ta' 
kejl kontrollat tat-temperatura li j żomm il-likwidu g ħat-test. Flimkien 
mas-sistema ta' kejl tal-qawwa, hija mmuntata fuq struttura wieqfa.  
1.6.4.1.2. S i s t e m a t a ' k e j l t a l - q a w w a  
Is-sistema ta' kejl tal-qawwa (ara l-figura) tinsab fuq il-mejda li 
żżomm il-kampjun. L-i żball ta' kejl tal-qawwa m'g ħandux jaqbe ż ± 
10 -6 N, li jikkorrispondi mal-limitu ta' żball ta' ± 0,1 mg f’kejl ta' pi ż. 
F’bosta ka żijietjiet, l-iskala tal-kejl ta'  tensiometers  disponibbli 
kummerċjalment hija kkalibrata fi mN/m sabiex it-tensjoni tas- 
superfiċje tista' tinqara direttament f’mN/m b'e żattezza ta' 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. K o r p t a ' k e j l ( ħ o l q a )  
Il-ħolqa hija mag ħmula normalment minn wajer ta' platinu-iridju ta' 
madwar 0,4 mm ħxuna u ċirkumferenza medja ta' 60 mm. Il- ħolqa 
tal-wajer hija sospi ża orizzontalment minn pinn tal-metall u brazz tal- 
wajer għall-immuntar biex tkun stabbilita l-konnessjoni mas-sistema 
tal-kejl tal-forza (ara l-figura).  
Figura  
Korp tal-kejl  
(Id-dimensjonijiet kollha f’millimetri)
  
1.6.4.1.4. R e ċ i p j e n t t a l - k e j l  
Ir-reċipjent tal-kejl li fih is-sustanza tat-test li se ti ġi mkejla g ħandu 
jkun tal- ħġieġ b'temperatura kkontrollata. Huwa g ħandu jkun 
iddisinjat b'tali mod li matul il-kejl it-temperatura tal-likwidu tas- soluzzjoni g ħat-test u l-fa żi tal-gass “il fuq mis-superfi ċje tibqa” 
kostanti u li l-kampjun ma jistax jevapora. Huma a ċċettabbli 
reċipjenti ċilindriċi tal-ħġieġ li jkollhom dijametru intern ta' mhux 
inqas minn 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Preparazzjoni ta' l-apparat  
1.6.4.2.1. T i n d i f  
Reċipjenti tal- ħġieġ għandhom jitnaddfu bl-attenzjoni. Jekk 
neċessarju huma g ħandhom jin ħaslu b'aċidu kromo-sulfuriku, 
imbagħad b'aċidu fosforiku b ħall-ġulepp (minn 83 % sa 98 % 
mill-piż H 3 PO 4 ), imlaħlaħ sewwa fl-ilma tal-vit u fl-a ħħar maħsul 
b'ilma distillat g ħal darbtejn sakemm tinkiseb reazzjoni newtrali 
u sussegwentement imnixffa jew imla ħalħa b'parti mil-likwidu tal- 
kampjun li se jitkejjel.  
Il-ħolqa trid l-ewwel titla ħlaħ sewwa fl-ilma biex jitne ħħew xi 
sustanzi li jin ħallu fl-ilma, titg ħaddaa għal ftit fl-a ċidu kromo- 
sulfuriku, tin ħasel f’ilma distillat g ħal darbtejn sakemm tinkiseb 
reazzjoni newtrali u finalment tissa ħħan ftit fuq fjamma tal-metanol.  
Nota:  
Il-kontaminazzjoni minn sustanzi li ma jin ħallux jew li jinqerdu 
minn aċidu kromo-sulfuriku jew a ċidu fosforiku, b ħas-silikone, 
għandha titne ħħa permezz ta' solvent organiku adattat.  
1.6.4.2.2. K a l i b r a z z j o n i t a ' l - a p p a r a t  
Il-validazzjoni ta' l-apparat tikkonsisti mill-verifika tal-punt żero 
u minn a ġġustament sabiex l-indikazzjoni ta' l-istrument tippermetti 
determinazzjonali affidabbli f’mN/m.  
Immuntar:  
L-apparat g ħandu jkun invellat, e żempju permezz ta' livell ta' l- 
ispirtu fuq il-ba żi tat- tensiometer,  billi jiġu aġġustati l-viti fil-ba żi. 
Aġġustament tal-punt żero: 
Wara l-immuntar tal- ħolqa fuq l-apparat u qabel ma tkun mg ħaddsa 
fil-likwidu, l-indikazzjoni tat- tensiometer  għandha tkun a ġġustata 
għal żero u l-ħolqa ċċekkjata g ħall-parallelli żmu mal-likwidu tas- 
superfiċje. Għal dan il-g ħan, il-likwidu tas-superfi ċje jista' jintu ża 
bħala mera.  
Kalibrazzjonijiet:  
Il-kalibrazzjoni tat-test attwali tista' ssir permezz ta' wa ħda minn 
dawn iż-żewġ proċeduri:  
(a) Bl-użu ta' piż: proċedura bl-u żu ta' rikkieba ta' pi ż magħruf bejn 
0,1 u 1,0 g mqieg ħdin fuq il- ħolqa. Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φ a 
li miegħu jrid jiġi mmultiplikat il-qari kollu ta' l-istrumenti, 
għandu jkun ddeterminat skond l-ekwazzjoni (1).  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
fejn: 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = il-pi ż tar-rikkieb (g)  
g = l-a ċċellerazzjoni tal-gravità (981 cm s  -2 fil-livell tal-ba ħar) 
b = iċ-ċirkumferenza medja tal- ħolqa (cm)  
σ a = il-qari tat- tensiometer  wara li jitpo ġġa r-rikkieb fuq il- 
ħolqa (mN/m).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
(b) Bl-użu ta' l-ilma: pro ċedura li tu ża ilma pur li t-tensjoni tas- 
superfiċje tiegħu f’eżempju 23  o C hija ugwali g ħal 72,3 
mN/m. Din il-pro ċedura titwettaq b'aktar ħeffa mill-kalibrazzjoni 
tal-piż iżda dejjem hemm il-periklu li t-tensjoni tas-superfi ċje ta' 
l-ilma tkun iffalsifikata minn tra ċċi ta' kontaminazzjoni mis- 
surfattanti.  
Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φ a li miegħu jrid jiġi mmultiplikat 
il-qari kollu ta' l-istrument, g ħandu jkunu ddeterminat skond 
l-ekwazzjoni (2).  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
fejn: 
σ o = il-valur ċitat fil-letteratura g ħat-tensjoni tas-superfi ċje ta' 
l-ilma (mN/m)  
σ g = il-valur mkejjel tat-tensjoni tas-superfi ċje ta' l-ilma 
(mN/m) it-tnejn fl-istess temperatura.  
1.6.4.3.  Preparazzjoni tal-kampjuni  
Soluzzjonijiet fl-ilma g ħandhom jit ħejjew mis-sustanzi li se jkunu 
ttestjati, bl-u żu tal-kon ċentrazzjonijiet me ħtieġa fl-ilma, 
u m'għandhomx jinkludu xi sustanzi li ma n ħallux.  
Is-soluzzjoni trid tin żamm f’temperatura kostanti (± 0,5  o C). Ladarba t- 
tensjoni tas-superficje tas-soluzzjoni fir-re ċipjent tal-kejl tinbidel fuq 
perjodu ta' żmien, diversi kejlijiet g ħandhom isiru f’ ħinijiet differenti 
u ssir kurva li turi t-tensjoni tas-superfi ċje bħala funzjoni ta ż-żmien. 
Meta ma ssir ebda bidla o ħra, ikun intla ħaq stat ta' ekwilibriju.  
Kontaminazzjoni ta' trab jew ta' gassijiet minn sustanzi o ħra tinter­
ferixxi mal-kejl. Ix-xog ħol għalhekk għandu jitwettaq ta ħt għata ta' 
protezzjoni.  
1.6.5.  Kondizzjonijiet tat-test  
Il-kejl għandu jsir f’approssimattivament 20  o C u għandu jkun ikkon ­
trollat sa ± 0,5  o C, 
1.6.6.  L-e żekuzzjoni tat-test  
Is-soluzzjonijiet biex ji ġu mkejla g ħandhom ikunu trasferiti fir-re ċipjent 
tal-kejl imnaddaf sewwa, bl-attenzjoni biex ma jkunx hemm rag ħwa, 
u sussegwentement ir-re ċipjent tal-kejl g ħandu jitpo ġġa fuq il-mejda 
ta' l-apparat tat-test. Il-wi ċċ tal-mejda bir-re ċipjent tal-kejl g ħandu 
jittella’ sakemm il- ħolqa titgħaddas taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni li se 
titkejjel. Sussegwentement, il-wi ċċ tal-mejda jitbaxxa gradwalment 
u b'mod ibbalan ċjat b'rata ta' approssimattivament 0,5 cm/min) biex 
tinqala’ l- ħolqa mill-wi ċċ sakemm tintla ħaq il-forza massima. Is-saff 
likwidu mwa ħħal mal-ħolqa ma jridx jissepara mill- ħolqa. Wara li 
jintemmu l-kejlijiet, il- ħolqa għandha titbaxxa g ħal darb'oħra taħt il- 
wiċċ u l-kejl jiġi ripetut sakemm jintla ħaq valur ta' tensjoni tas-superfi ċje 
kostanti. Il- ħin tat-trasferiment tas-soluzzjoni g ħar-reċipjent tal-kejl 
għandu jkun irre ġistrat għal kull determinazzjoni. Il-qari g ħandu 
jittieħed fil-forza massima me ħtieġa biex il- ħolqa tinqala’ mill-wi ċċ 
tal-likwidu.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DATA  
Bil-għan li tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfi ċje, il-valur moqri 
f’mN/m fuq l-apparat g ħandu l-ewwel ji ġi mmultiplikat bil-fattur tal- 
kalibrazzjoni Φ a u Φ b (jiddependi fuq il-pro ċedura ta' kalibrazzjoni 
użata). Dan jag ħti valur li japplika biss approssimattivament 
u għalhekk je ħtieġ korrezzjoni.  
Harkins u Jordan (4) iddeterminaw b'mod empiriku fatturi ta' 
korrezzjoni g ħall-valuri tat-tensjoni tas-superfi ċje mkejla bil-metodu 
tal-ħolqa li huma dipendenti fuq id-dimensjonijiet tal- ħolqa, id- 
densità tal-likwidu u t-tensjoni tas-superfi ċje tiegħu. 
Peress li d-determinazzjoni tal-fattur ta' korrezzjoni g ħal kull kejl 
individwali mit-tabelli Harkins and Jordan te ħtieġ ħafna xog ħol, 
sabiex tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfi ċje għal soluzzjonijiet 
fl-ilma tista’ tintu ża l-proċedura simplifikata tal-qari tal-valuri kkor ­
reġuti tat-tensjoni tas-superfi ċje direttament mit-tabella. (G ħandha 
tintuża l-interpolazzjoni g ħall-qari fl-iskala bejn il-valuri tabulari).  
Tabella  
Korrezzjoni tat-tensjoni tas-superfi ċje mkejla  
Għal soluzzjonijiet fl-ilma biss, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (ra ġġ medju tal- ħolqa) 
r = 0,185 mm (ra ġġ medju tal- ħolqa)  
Valur Sperimentali (mN/m) Valur Ikkore ġut (mN/m) 
Kalibrazzjoni tal-pi ż (ara 1.6.4.2.2(a)) Kalibrazzjoni ta' l-ilma (ara 1.6.4.2.2 ­
(b)) 
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 
32 28,1 30,1 
34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 
54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Valur Sperimentali (mN/m) Valur Ikkore ġut (mN/m) 
Kalibrazzjoni tal-pi ż (ara 1.6.4.2.2(a)) Kalibrazzjoni ta' l-ilma (ara 1.6.4.2.2 ­
(b)) 
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Din it-tabella ġiet kompilata abba żi tal-korrezzjoni Harkins-Jordan. 
Hija simili g ħal dik fid-DIN Standard (DIN 53914) g ħall-ilma 
u soluzzjonijiet fl-ilma(densità ρ = 1 g/cm  3 ) u hija g ħall-ħolqa 
disponibbli kummer ċjalment li g ħandha d-dimensjonijiet R = 
9,55 mm (ra ġġ medju tal- ħolqa) u r = 0,185 mm (ra ġġ tal-wajer 
tal-ħolqa). It-tabella tipprovdi valuri kkorre ġuti għall-kejl tat- 
tensjoni tas-superfi ċje meħuda wara l-kalibrazzjoni bil-pi żijiet jew 
il-kalibrazzjoni bl-ilma.  
Alternattivament, ming ħajr il-kalibrazzjoni pre ċedenti, it-tensjoni tas- 
superfiċje tista' tkun ikkalkulata skond il-formula li ġejja: 
σ ¼ fxF 
4πR 
fejn: 
F = il-forza mkejla fuq id-dinamometru fil-punt tal-ksur tar-rita  
R = ir-ra ġġ tal-ħolqa 
f = il-fattur ta' korrezzjoni (1)  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— il-metodu u żat, 
— it-tip ta' ilma jew is-soluzzjoni u żat/a. 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),  
— ir-riżultati tal-kejl: it-tensjoni tas-superfi ċje (qari) li juri kemm il- 
qari individwali u l-medja aritmetika tag ħhom kif ukoll il-medja 
kkorreġuta (jikkunsidraw il-fattur tat-tag ħmir u t-tabella ta' 
korezzjoni),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— il-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni,  
— it-temperatura tat-test,  
— l-età tas-soluzzjoni u żata; b'mod partikulari l- ħin bejn it- 
Preparazzjoni u l-kejl tas-soluzzjoni,  
— id-deskrizzjoni tad-dipendenza fuq il- ħin tat-tensjoni tas- 
superfiċje wara t-trasferiment tas-soluzzjoni fir-re ċipjent tal-kejl.  
— l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod spe ċjali fir- 
rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  
3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Meta jkun ikkunsidrat il-fatt li l-ilma distillat g ħandu tensjoni tas- 
superfiċje ta' 72,75 mN/m f’20 C, sustanzi li juru tensjoni tas- 
superfiċje inqas minn 60 mN/m ta ħt il-kondizzjonijiet ta' dan il- 
metodu g ħandhom jitqiesu b ħala materjali attivi fis-superfi ċje. 
4. REFERENZI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. SOLUBILITÀ FL-ILMA  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG 
- Test Guideline) 105 (1995) tal-OECD. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa verżjoni riveduta tat-TG 105 ori ġinali li kienet adottata fl-1981. M’hemm 
l-ebda differenza sostanzjali bejn il-ver żjoni preżenti u dik tal-1981. Prin ċi­
pament li nbidel kien il-format. Ir-revi żjoni kienet ibba żata fuq il-Metodu ta’ 
Ttestjar tal-UE “Solubilità fl-Ilma” (
 1 ). 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
2. Is-solubilità fl-ilma ta’ sustanza tista’ tkun affettwata b’mod konsiderevoli 
mill-preżenza tal-impuritajiet. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jindirizza 
d-determinazzjoni tas-solubilità fl-ilma ta’ sustanzi essenzjalment puri li 
huma stabbli fl-ilma u mhux volatili. Qabel ma tkun iddeterminata 
s-solubilità fl-ilma, ikun utli li ting ħata ftit informazzjoni preliminari dwar 
is-sustanza g ħall-ittestjar, b ħall-formula strutturali, il-pressjoni tal-fwar, 
il-kostant ta’ disasso ċjazzjoni u l-idroli żi bħala funzjoni tal-pH.  
3. Żewġ metodi, il-metodu ta’ elu żjoni tal-kolonna u l-metodu tal-flixkun li 
jkopru rispettivament solubilitajiet ta ħt u fuq 10  –2 g/l huma deskritti f’dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar. Huwa wkoll deskritt test preliminari sempli ċi. Dan 
jippermetti d-determinazzjoni ta’ approssivament l-ammont xieraq ta’ 
kampjun li g ħandu jintu ża fit-test finali, kif ukoll i ż-żmien meħtieġ biex 
tinkiseb is-saturazzjoni.  
DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
4. Is-solubilità fl-ilma ta’ sustanza hija l-kon ċentrazzjoni massa tas-saturazzjoni 
tas-sustanza fl-ilma f’temperatura partikolari.  
5. Is-solubilità fl-ilma hija espressa f’massa ta’ solut g ħal kull volum ta’ 
soluzzjoni. L-unità SI hija kg/m  3 iżda tista’ tintu ża wkoll g/l.  
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
6. Il-kimi ċi ta’ referenza ma je ħtiġilhomx jintu żaw meta tkun qed ti ġi inves­
tigata sustanza g ħall-ittestjar.  
DESKRIZZJONI TAL-METODI  
Kundizzjonijiet tat-test  
7. Preferibbilment it-test isir f’20 ± 0,5 °C. It-temperatura g ħandha tin żamm 
kostanti fil-partijiet rilevanti kollha tal-apparat.  
Test preliminari  
8. Fi pro ċedura pass pass, ji żdiedu volumi ta’ ilma dejjem ikbar f’temperatura 
ambjentali ma’ madwar 0,1 g tal-kampjun (is-sustanzi solidi g ħall-ittestjar 
għandhom jinta ħnu) f’ċilindru bi gradazzjoni ta’ 10 ml mag ħluq b’tapp 
tal-ħġieġ. Wara kull żieda ta’ ammont ta’ ilma, it-ta ħlita titħawwad g ħal 
10 minuti u ti ġi kkontrollata vi żwalment g ħal xi partijiet tal-kampjun li 
ma jkunux in ħallu. Jekk wara żieda ta’ 10 ml ta’ ilma, il-kampjun jew 
partijiet minnu jibqg ħu ma jin ħallux, l-esperiment jitkompla f’ ċilindru  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
tal-kejl ta’ 100 ml. Is-solubilità approssimattiva tinsab fit-Tabella 1 hawn 
taħt, skont dak il-volum ta’ ilma li fih il-kampjun jin ħall kompletament. 
Meta s-solubilità tkun baxxa, jista’ jkun me ħtieġ ħin twil biex sustanza 
għall-ittestjar tin ħall u għandhom jing ħataw mill-anqas 24 sieg ħa. Jekk 
wara 24 sieg ħa s-sustanza g ħall-ittestjar tkun g ħadha ma n ħallitx, għandu 
jingħata aktar ħin (sa 96 sieg ħa) u għandu isir attentat ta’ aktar dilwizzjoni 
biex ikun a ċċertat jekk g ħandux jintu ża l-metodu ta’ elu żjoni tal-kolonna 
jew il-metodu tal-flixkun.  
Tabella 1  
ml ta’ ilma g ħal solubbli ta’ 
0,1 g 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
solubilità approssimattiva f’g/l > 1 000 1 000 
għal 200 200 għal 
100 100 għal 
50 50 għal 
10 10 għal 1 < 1  
Metodu ta’ elu żjoni tal-kolonna  
Prinċipju 
9. Dan il-metodu huwa bba żat fuq l-elu żjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar bl-ilma 
minn mikrokolonna li tkun mimlija b’materjal ta’ rfid inert, li qabel kienet tkun inksiet b’e ċċess ta’ sustanza g ħall-ittestjar (2). Is-solubilità fl-ilma 
tingħata bil-kon ċentrazzjoni massa tas-sustanza tal-materjal ta’ elu żjoni 
meta dan ikun la ħaq livell kostanti b ħala funzjoni ta’ ħin.
 
Apparat  
10. L-apparat jikkonsisti f’mikrokolonna (Figura 1), mi żmuma f’temperatura 
kostanti. Huwa mqabbad ma’ pompa ta’ ċirkolazzjoni mill- ġdid (Figura 2) 
jew ma’ re ċipjent ta’ livellar (Figura 3). Il-mikrokolonna jkun fiha rfid inert 
miżmum f’postu b’tapp żgħir tal-ħġieġ f’forma ta’ fibri li jservi wkoll biex 
jiffiltra l-parti ċelli l-barra. Materjali li possibbilment jistg ħu jintużaw bħala 
rfid huma bo ċċi tal-ħġieġ, trab tad-diatomi jew materjal inert ie ħor. 
11. Il-mikrokolonna murija fil-Figura 1 hija adattata g ħall-immuntar b’pompa ta’ 
ċirkolazzjoni mill- ġdid. Għandha spazju ta’ fuq li jipprovdi g ħal hames 
volumi ta’ ilma tal-qieg ħ (skartati fil-bidu tal-esperiment) u l-volum ta’ 
ħames kampjuni (me ħudin għal analiżi matul l-esperiment). Alternatti ­
vament, id-daqs jista’ jitnaqqas jekk ikun jista’ ji żdied l-ilma fis-sistema 
matul l-esperiment biex jie ħu post il- ħames volumi tal-qieg ħ inizjali 
mneħħija bl-impuritajiet. Il-kolonna hijaa mqabbda b’tubu ta’ materjal 
intert mal-pompa ta’ ċirkolazzjoni mill- ġdid, li kapa ċi twassal 25 ml/h. 
Il-pompa ta’ ċirkolazzjoni mill- ġdid tista tkun, pere żempju, pompa peri ­
staltika jew bil-membrana. G ħandha ting ħata attenzjoni biex ma jkun 
hemm ebda kontaminazzjoni u/jew assorbiment fil-materjal tat-tubu.  
12. Arran ġament skematiku bl-u żu ta’ reċipjent ta’ livellar jidher fil-Figura 3. 
F’dan l-arran ġament il-mikrokolonna jitwa ħħlilha rubinett tal-g ħeluq unidi ­
rezzjonali. Il-konnessjoni mar-re ċipjent ta’ livellar tikkonsisti f’ ġonta 
tal-qiegħ tal-ħġieġ u tubu mag ħmul minn materjal inert. Ir-rata ta’ fluss 
mir-reċipjent ta’ livellar g ħandha tkun madwar 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figura 1
  
Dimensjonijiet f’mm  
A. Konnessjoni g ħal ġonta tal-qieg ħ tal-ħġieġ 
B. Spazju ta’ fuq  
C. Ġewwa 5  
D. Barra 19  
E. Tapp tal- ħġieġ f’forma ta’ fibri  
F. Rubinett tal-g ħeluq 
Figura 2
  
A. Ekwilibrazzjoni atmosferika  
B. Apparat li jkejjel il-fluss  
C. Mikrokolonna  
D. Pompa ta’ ċirkolazzjoni kkontrollata termostatikament  
E. Pompa ta’ ċirkolazzjoni mill- ġdid 
F. Valv bidirezzjonali g ħal teħid ta’ kampjuni  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figura 3
  
A. Reċipjent ta’ livellar (e ż. flixkun kimiku ta’ 2,5 litri)  
B. Kolonna  
C. Akkumulatur ta’ frazzjoni  
D. Termostat  
E. Tubu tat-teflon  
F. Ġonta tal-qieg ħ tal-ħġieġ 
G. Livell tal-ilma (bejn it-termostat u l-kolonna, id-dijametru ta’ ġewwa 
huwa madwar 8 mm)  
13. Madwar 600 mg ta’ materjal ta’ rfid ji ġi ttrasferit g ħal ġo flixkun ta’ 50 ml 
b’qiegħ tond. Ammont adattat ta’ sustanza g ħall-ittestjar jin ħall f’solvent 
volatili ta’ kwalità ta’ rea ġent analitiku u ammont li jixraq ta’ din 
is-soluzzjoni ji żdied mal-materjal ta’ rfid. Is-solvent jevapora kompletament, 
eż. billi jintu ża evaporatur li jdur, inkella s-saturazzjoni tal-ilma ta’ rfid ma 
tinkisibx matul l-istadju ta’ elu żjoni minħabba li jkun hemm partizzjoni 
fil-wiċċ. Il-materjal ta’ rfid im ħejji jitgħaddas għal sagħtejn f’madwar 5 
ml ilma u s-sospensjoni titferra’ fil-mikrokolonna. Alternattivament, jista’ jitferra’ materjal ta’ rfid xott fil-mikrokolonna mimlija ilma u jit ħallew 
sagħtejn għal ekwilibrazzjoni.
 
14. Il-preparazzjoni tal-materjal ta’ rfid tista’ tikkaw ża l-problemi li jwasslu g ħal 
riżultati żbaljati, eż. meta s-sustanza g ħall-ittestjar tiddepo żita bħala żejt. 
Dawn il-problemi g ħandhom ikunu e żaminati u d-dettalji rrappurtati.  
Proċedura li tu ża pompa ta’ ċirkolazzjoni mill- ġdid 
15. Jinbeda l-fluss mill-kolonna. Huwa rrakkomandat li tintu ża rata ta’ fluss ta’ 
madwar 25 ml/h, li tikkorrispondi g ħal 10 volumi ta’ ilma tal-qieg ħ għal 
kull siegħa għall-kolonna deskritta. Mill-anqas l-ewwel hames volumi ta’ 
ilma tal-qieg ħ ikunu skartati biex jitne ħħew l-impuritajiet li jin ħallu fl-ilma. 
Wara dan, il-pompa tit ħalla taħdem sakemm ikun stabbilit ekwilibriju, kif 
iddefinit minn ħames kampjuni su ċċessivi li l-kon ċentrazzjonijiet tag ħhom 
ma jiddifferenzjawx b’aktar minn ± 30 % b’mod aleatorju. Dawn il-kampjuni g ħandhom ikunu sseparati wie ħed mill-ie ħor b’intervalli ta’ 
ħin li jikkorrispondu mal-mog ħdija ta’ mill-anqas g ħaxar volumi ta’ ilma 
tal-qiegħ. Skont il-metodu analitiku li jintu ża, jista’ jkun preferibbli li tkun 
stabbilita kurva ta’ kon ċentrazzjoni/ ħin biex turi li jkun intla ħaq ekwilibriju.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Proċedura li tu ża reċipjent ta’ livellar  
16. Frazzjonijiet su ċċessivi ta’ materjal ta’ elu żjoni għandhom jin ġabru u jiġu 
analizzati bil-metodu mag ħżul. Jintużaw frazzjonijiet mill-firxa tan-nofs 
tal-materjal ta’ elu żjoni, fejn il-kon ċentrazzjonijiet ikunu kostanti fi 
± 30 % f’mill-anqas ħames frazzjonijiet konsekuttivi, biex tkun iddeter ­
minata s-solubilità.  
17. Ilma ddistillat g ħal darbtejn huwa l-fluwidu ta’ elu żjoni ppreferut. Jista’ 
jintuża wkoll ilma dejonizzat b’qawwa ta’ re żistenza ‘l fuq minn 10 
megohms/cm u b’kontenut totali ta’ karbonju organiku anqas minn 0,01 %.  
18. Skont i ż-żewġ proċeduri, ter ġa’ ssir prova o ħra b’nofs ir-rata ta’ fluss 
tal-ewwel. Jekk ir-ri żultati taż-żewġ provi jkunu jaqblu, it-test ikun sodis ­
faċenti. Jekk is-solubilità mkejla tkun og ħla mir-rata ta’ fluss aktar baxxa, 
f’dak il-ka ż it-tnaqqis tar-rata ta’ fluss bin-nofs g ħandu jkompli sakemm 
żewġ provi su ċċessivi jag ħtu l-istess solubilità.  
19. Fiż-żewġ proċeduri, il-frazzjonijiet g ħandhom ikunu kkontrollati g ħall- 
preżenza ta’ materja li twa ħħal permezz ta’ e żami bl-effett Tyndall. 
Il-preżenza tal-parti ċelli tinvalida t-test u t-test g ħandu jkun ripetut wara 
titjib tal-azzjoni filtranti tal-kolonna.  
20. Il-pH ta’ kull kampjun g ħandha titkejjel, preferibbilment bl-u żu ta’ strixex 
indikaturi spe ċjali. 
Metodu tal-flixkun  
Prinċipju 
21. Is-sustanza g ħall-ittestjar (is-solidi g ħandhom jinta ħnu) tinħall fl-ilma f’tem ­
peratura ftit og ħla mit-temperatura tat-test. Meta tinkiseb is-saturazzjoni, 
it-taħlita titkessa ħ u tinżamm fit-temperatura tat-test. Alternattivament, u 
jekk ikun assigurat permezz tat-te ħid adattat ta’ kampjuni, li jkun intla ħaq 
l-ekwilibriju tas-saturazzjoni, il-kejl ikun jista’ jitwettaq direttament 
fit-temperatura tat-test. Sussegwentement il-kon ċentrazzjoni massa 
tas-sustanza g ħall-ittestjar fis-soluzzjoni fl-ilma, li m’g ħandhiex tinkludi xi 
partiċelli mhux ma ħlula, tkun iddeterminata b’metodu analitiku li jixraq (3).  
Apparat  
22. Hemm b żonn il-materjali li ġejjin:  
— ħġieġ u strumentazzjoni normali tal-laboratorju;  
— apparat g ħall-aġitazzjoni ta’ soluzzjonijiet f’temperatura kostanti 
kontrollata;  
— jekk ikun me ħtieġ għal emulsjonijiet, magna ċentrifuga (preferibbilment 
bit-termostat); u  
— apparat analitiku.  
Proċedura  
23. Il-kwantità ta’ sustanza g ħall-ittestjar ne ċessarja biex ikun issaturat il-volum 
mixtieq tal-ilma hija stmata mit-test preliminari. Tinti żen madwar ħames 
darbiet aktar ta’ dik il-kwantità f’kull wie ħed mit-tliet re ċipjenti tal- ħġieġ 
mgħammra b’tappijiet tal- ħġieġ (eż. tubi ċentrifuga, fliexken). Ji żdied f’kull 
reċipjent volum ta’ ilma, mag ħżul skont il-funzjoni tal-metodu analitiku u 
tal-iskala ta’ solubilità. Ir-re ċipjenti jing ħalqu sew u wara ji ġu mċaqalqa fi 
30 °C. G ħandu jintu ża apparat li j ċaqlaq jew i ħawwad li kapa ċi jaħdem 
f’temperatura kostanti, e ż. taħwid manjetiku f’banju tal-ilma bit-termostat. 
Wara ġurnata, wie ħed mir-reċipjenti jitne ħħa u jiġi ekwilibrat g ħal 24 sieg ħa 
fit-temperatura tat-test b’ ċaqliq okka żżjonali. Il-kontenuti tar-re ċipjent 
imbagħad jiġu ċċentrifugati fit-temperatura tat-test u l-kon ċentrazzjoni  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
tas-sustanza g ħall-ittestjar fil-fa żi fl-ilma ċar tkun iddeterminata b’metodu 
analitiku adattat. I ż-żewġ fliexken l-o ħra jkunu ttrattati bl-istess mod wara 
ekwilibrazzjoni inizjali fi 30 °C g ħal jumejn u tlett ijiem rispettivament. 
Jekk ir-ri żultati tal-kon ċentrazzjonijiet mkejla f’mill-anqas l-a ħħar żewġ 
reċipjenti ma jkunux differenti b’aktar minn 15 %, it-test ikun sodisfa ċenti. 
Jekk ir-riżultati mir-re ċipjenti 1, 2 u 3 juru tendenza ta’ valuri qed ji żdiedu, 
it-test kollu g ħandu jkun ripetut bl-u żu ta’ ħinijiet ta’ ekwilibrazzjoni itwal.  
24. It-test jista’ jitwettaq ming ħajr inkubazzjoni minn qabel fi 30 C. Bil-g ħan li 
tkun stmata r-rata li biha jkun stabbilit l-ekwilibriju tas-saturazzjoni, jittie ħdu 
kampjuni sakemm il- ħin tat-tħawwid ma jinfluwenzawx aktar il-kon ċen­
trazzjonijiet imkejla.  
25. Il-pH ta’ kull kampjun g ħandu jitkejjel, preferibbilment bl-u żu ta’ strixex 
indikaturi spe ċjali. 
Determinazzjonijiet analiti ċi 
26. Huwa ppreferut metodu spe ċifiku għas-sustanza min ħabba li ammonti żgħar 
ta’ impuritajiet li jin ħallu jistgħu jikkawżaw żbalji kbar fis-solubilità mkejla. 
Eżempji ta’ metodi b ħal dawn huma: kromatografija tal-gass jew likwida, 
titrazzjoni, fotometrija, voltametrija.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
Metodu ta’ elu żjoni tal-kolonna  
27. Għal kull prova li ssir, g ħandu jkun ikkalkulat il-valur medju u 
d-devjazzjoni standard minn mill-anqas ħames kampjuni konsekuttivi 
meħudin mis-saturazzjoni kostanti. Il-valuri medji miksubin mi ż-żewġ 
testijiet bi flussi differenti m’g ħandhomx ikunu differenti b’aktar minn 
30 %.  
Metodu tal-flixkun  
28. Ir-riżultati individwali g ħal kull wie ħed mit-tliet fliexken, li m’g ħandhomx 
ikunu differenti b’aktar minn 15 %, ting ħatalhom medja.  
Rapport tat-test  
Metodu ta’ elu żjoni tal-kolonna  
29. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— ir-riżultati tat-test preliminari;  
— l-identità tal-kimika u l-impuritajiet (stadju preliminari ta’ purifikazzjoni, 
jekk ikun hemm);  
— il-kon ċentrazzjonijiet, rati ta’ fluss u l-pH g ħal kull kampjun;  
— id-devjazzjonijiet medji u standard minn mill-anqas ħames kampjuni 
mis-saturazzjoni kostanti g ħal kull prova;  
— il-medja ta’ mill-anqas żewġ provi su ċċessivi;  
— it-temperatura tal-ilma matul il-pro ċess ta’ saturazzjoni;  
— il-metodu ta’ anali żi; 
— in-natura tal-materjal ta’ rfid;  
— il-preparazzjoni tal-materjal ta’ rfid;  
— solvent u żat; 
— xhieda ta’ kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test;  
— l-informazzjoni kollha rilevanti g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati, b’mod 
partikolari fir-rigward ta’ impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza g ħall- 
ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Metodu tal-flixkun  
30. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— ir-riżultati tat-test preliminari;  
— l-identità tal-kimika u l-impuritajiet (stadju preliminari ta’ purifikazzjoni, 
jekk ikun hemm);  
— id-determinazzjonijiet analiti ċi individwali u l-medja fejn aktar minn 
valur wie ħed kien iddeterminat g ħal kull flixkun;  
— il-pH ta’ kull kampjun;  
— il-medja tal-valuri g ħal fliexken differenti li kienu jaqblu;  
— it-temperatura tat-test;  
— il-metodu analitiku;  
— xhieda ta’ kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test;  
— l-informazzjoni kollha rilevanti g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati, b’mod 
partikolari fir-rigward ta’ impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza g ħall- 
ittestjar.  
LETTERATURA:  
(1) Id-Direttiva tal-Kummissjoni 92/69/KEE tal-31 Lulju 1992 li tadatta g ħall- 
progress tekniku g ħas-sbatax-il darba d-Direttiva 67/548/KEE rigward 
l-approssimazzjoni tal-li ġijiet, tar-regolamenti u tad-dispo żizzjonijiet ammin ­
istrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballa ġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi peri ­
kolużi (ĠU L 383, 29.12.1992, p. 113).  
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility - Column elution method. 3)  
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility - Flask method.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. KOEFFI ĊJENT TAL-QSIM  
1. METODU  
Il-metodu “ta ċ-ċaqliq tal-flixkun” imfisser huwa bba żat fuq il-linja 
gwida tat-Test OECD (1).  
1.1. DA ĦLA 
Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar il- 
formula strutturali, il-kostanti ta' disso ċjazzjoni, is-solubiltà ta' l-ilma, 
l-idrolisi, is-solubiltà ta' l-n-oktanol, it-tensjoni tas-superfi ċje tas- 
sustanza.  
Il-kejlijiet g ħandhom jittie ħdu fuq sustanzi jonizzabbli biss fil-forma 
mhux jonizzata tag ħhom (aċidu ħieles jew ba żi ħielsa) prodotti bl- 
użu ta' sustanza adattata b'pH ta' mill-anqas unità pH ta ħt (aċidu 
ħieles) jew fuq (bazi ħielsa) il-pK.  
Dan il-metodu tat-test jinkludi żewġ proċeduri separati: il-metodu 
taċ-ċaqliq tal-flixkun u l-kromatografija likwida ta' rendiment g ħoli 
(HPLC). Ta' l-ewwel hija applikabbli meta l-valur tal-log P  ow (ara 
isfel għad-definizzjonijiet) jaqa' fl-iskala minn - 2 sa 4 u ta' l-a ħħar 
fl-iskala minn 0 sa 6. Qabel ma titwettaq xi wa ħda mill-pro ċeduri 
sperimentali g ħandha l-ewwel tinkiseb stima preliminari tal-koef ­
fiċjent tal-qsim.  
Il-metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun japplika biss g ħal sustanzi essenz ­
jalment puri li jin ħallu fl-ilma u fl-n-oktanol. Ma japplikax g ħall- 
materjali attivi fuq is-superfi ċje (li għalihom g ħandu jkun provdut 
valur ikkalkulat jew stima bba żata fuq is-solubilitajiet individwali fl- 
n-oktanol u l-ilma).  
Il-metodu HPLC ma japplikax g ħall-aċidi u l-ba żijiet qawwija, 
komplessi metalli ċi, materjali attivi fuq is-superficje jew sustanzi li 
jirreaġġixxu ma' l-eluwent. G ħal dawn il-materjali, g ħandu jkun 
provdut valur ikkalkulat jew stima bba żata fuq is-solubilitajiet indi ­
vidwali fl-n-oktanol u l-ilma.  
Il-metodu HPLC huwa inqas sensittiv g ħall-preżenza ta' impuritajiet 
fil-kompost g ħat-test milli huwa l-metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun. 
Madankollu, f’xi ka żijietjiet impuritajiet jistg ħu jagħmlu l-interpre ­
tazzjoni tar-ri żultati diffi ċli minħabba li l-assenjazzjoni tal-qu ċċata 
ssir inċerta. Għal taħlitiet li jag ħtu faxxa mhux ri żolta, għandhom 
ikunu ddikjarati l-og ħla u l-inqas limiti tal-log P.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Il-koeffiċjent tal-qsim (P) huwa mfisser b ħala l-proporzjon tal-kon ċ­
entrazzjonijiet ta' l-ekwilibriju (c  i ) tas-sustanza ma ħlula f’sistema ta' 
żewġ fażijiet li tikkonsisti f’ żewġ solventi li ma jistg ħux jitħalltu. 
Fil-każ ta' l-n-oktanol u l-ilma:  
p ow ¼ c n Ä octanol 
c water 
Il-koeffiċjent tal-qsim (P) g ħalhekk huwa l-kwozjent ta ż-żewġ konċ­
entrazzjonijiet u normalment jing ħata fil-forma tal-logaritmu tieg ħu 
sa bażi 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
Sustanzi ta' referenza mhumiex me ħtieġa li jintu żaw fil-ka żijiet 
kollha meta tkun qed ti ġi investigata sustanza ġdida. Huma 
għandhom iservu primarjament biex ji ċċekkjaw r-rendiment tal- 
metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' 
riżultati minn metodi o ħra. 
Metodu HPLC  
Bil-għan li d-DATA mkejla g ħall-HPLC tal-kompost tkun relatata 
mal-valur P tieg ħu, għandu jkun stabbilit graff tal-log P vs DATA 
kromatografika bl-u żu ta' mill-inqas 6 punti ta' referenza. Huwa 
f’idejn dak li qed ju ża l-apparat li jag ħżel is-sustanzi ta' referenza 
adattati. Fejn huwa possibli, ta' l-inqas żewġ komposti ta' referenza 
għandu jkollhom P  ow akbar minn dak tas-sustanza g ħat-test, u P  ow 
ieħor taħt dak tas-sustanza g ħat-test. G ħall-valuri ta' log P inqas 
minn 4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibba żata fuq DATA miksuba 
bil-metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun. G ħall-valuri ta' log P inqas minn 
4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibba żata fuq il-valuri validati tal-lette ­
ratura jekk dawn jaqblu mal-valuri kkalkulati. G ħal aktar e żattezza, 
huwa preferibbli li jintg ħażlu komposti ta' referenza li huma struttur ­
alment relatati mas-sustanza g ħat-test.  
Listi estensivi ta' log P  ow għal bosta gruppi ta' kimi ċi huma 
disponibbli (2)(3). Jekk m'hemmx disponibbli DATA dwar il-koef ­
fiċjenti tal-qsim ta' komposti relatati strutturalment, imbag ħad tista' 
tintuża kalibrazzjoni aktar ġenerali, stabbilita ma' komposti ta' 
referenza o ħra. 
Lista ta' sustanzi ta' referenza rakkomandati u l-valuri P  ow huma 
mogħtija fl-Appendi ċi 2. 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODI  
1.4.1.  Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
Biex ikun iddeterminat il-koeffi ċjent tal-qsim, irid jinkiseb ekwi ­
libriju bejn il-komponenti kollha li jag ħmlu interazzjoni fis-sistema, 
u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi ma ħlula fiż-żewġ fażijiet jridu 
jkunu ddeterminati. Studju tal-letteratura fuq dan is-su ġġett jindika 
li jistgħu jintużaw bosta tekniki differenti biex ti ġi solvuta din il- 
problema, i.e. it-ta ħlit sewwa ta ż-żewġ fażijiet segwit bis-separazzoni 
tagħhom bil-g ħan li tkun iddeterminata l-kon ċentrazzjoni ta' l-ekwi ­
libriju għas-sustanza li tkun qed ti ġi eżaminata.  
1.4.2.  Metodu HPLC  
L-HPLC jitwettaq fuq kolonni analiti ċi ppakkjati b'fa żi solida 
disponibbli kummer ċjalment li fihom idrokarburi b'katina twila (e ż. 
C 8 , C  18 ) kimikament mg ħaqqda fuq is-silika. Kimi ċi injettati 
f’kolonna b ħal din jimxu mag ħha b'rati differenti min ħabba l-gradi 
differenti tal-qsim bejn il-fa żi mobbli u l-fa żi stazzjonarja idrok ­
arbonika. Ta ħlitiet ta' kimi ċi jitneħħewlhom is-sustanzi fl-ordni ta' 
l-idrofobi ċità tagħhom, l-ewwel il-kimi ċi li jinħallu fl-ilma u t-tieni 
l-kimiċi li jinħallu fiż-żejt, fi proporzjon mal-koeffi ċjent tal-qsim 
idrokarburi-ilma tag ħhom. Dan jippermetti li tkun stabbilita r- 
relazzjoni bejn il- ħin ta' retenzjoni fuq kolonna b ħal din (fa żi bil- 
kontra) u l-koeffi ċjent ta' l-n-oktanol/ilma. Il-koeffi ċjent tal-qsim ji ġi 
dedott mill-fattur ta' kapa ċità k, mog ħti bl-espressjoni:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
li fiha, t  r = huwa l- ħin ta' retenzjoni tas-sustanza g ħat-test, u t  o = il- 
ħin medju li te ħtieġ molekula solventi biex tg ħaddi mill-kolonna ( ħin 
mejjet).  
Mhumiex me ħtieġa metodi analiti ċi kwantitattivi u hija ne ċessarja 
biss id-determinazzjoni tal- ħin ta' elużjoni. 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
1.5.1.  Ripetibilità  
Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
Bil-għan li tkun assigurata l-e żattezza tal-koeffi ċjent tal-qsim, deter ­
minazzjonijiet duplikati jridu jsiru ta ħt tliet kondizzjonijiet ta' test 
differenti, fejn il-kwantità tas-sustanza spe ċifikata kif ukoll il- 
proporzjon tal-volumi tas-solvent jistg ħu jvarjaw. Il-valuri ddeter ­
minati tal-koeffi ċjent tal-qsim espressi b ħala l-logaritmi komuni 
tagħhom għandhom jid ħlu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ± 0,3 unitajiet 
logaritmiċi. 
Metodu HPLC  
Bil-għan li tikber il-fidu ċja fil-kejl, jridu jsiru determinazzjonijiet 
duplikati. Il-valuri ta' log P me ħuda minn kejl individwali 
għandhom jaqg ħu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ± 0,1 unitajiet loga ­
ritmiċi. 
1.5.2.  Sensittività  
Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
L-iskala ta' kejl tal-metodu hija ddeterminata bil-limitu ta' tfittxija tal- 
proċedura analitika. Dan g ħandu jippermetti l-valutazzjoni tal-valuri 
ta' log P  ow fil-kamp ta' varjabbiltà ta' - 2 sa 4 (f’okka żżjonijiet meta 
kondizzjonijiet japplikaw, dan il-kamp ta' varjabbiltà jista' jitkabbar għall-log P
 ow sa 5) meta l-kon ċentrazzjoni ta' sustanza ma ħlula f’xi 
waħda mill-fa żijiet mhijiex aktar minn 0,01 mol g ħal kull litru.  
Metodu HPLC  
Il-metodu HPLC jippermetti koeffi ċjenti tal-qsim li jkun stmat fil-log 
P ow fil-kamp ta' varjabbiltà minn 0 sa 6.  
Normalment, il-koeffi ċjent tal-qsim ta' kompost jista' jkun stmat sa ± 
1 unità logaritmika tal-valur ta ċ-ċaqliq tal-flixkun. Korrelazzjonijiet 
tipiċi jistgħu jinstabu fil-letteratura (4)(5)(6)(7)(8). E żattezza og ħla s- 
soltu tista' tinkiseb meta grafi ċi ta' korrelazzjoni huma bba żati fuq 
komposti ta' referenza ta' struttura simili (9).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Spe ċifiċità 
Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
Il-Liġi tal-Qsim ta' Nernst tapplika biss g ħal soluzzjonijiet dilwiti 
f’temperatura, pressjoni u pH kostanti. Hija tapplika strettament għal sustanza pura mxerrda bejn żewġ solventi puri. Jekk bosta 
sustanzi differenti ma ħlula jseħħu f’fażi waħda miż-żewġ fażijiet 
jew fiż-żewġ fażijiet fl-istess ħin, ir-riżultati jistg ħu jiġu affettwati.
 
Dissoċjazzjoni jew asso ċjazzjoni tal-molekuli ma ħlula tirri żulta 
f’devjazzjonijiet mill-Li ġi tal-Qsim ta' Nernst. Devjazzjonijiet b ħal 
dawn huma indikati mill-fatt li l-koeffi ċjent tal-qsim isir dipendenti 
fuq il-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni.  
Minħabba l-ekwilibriji multipli li huma mda ħħla, dan il-metodu ta' 
test m'għandux ikun applikat g ħal komposti jonizzati ming ħajr ma 
tkun applikata korrezzjoni. L-u żu ta' sustanza ta' protezzjoni flok l- 
ilma għandu jkun ikkunsidrat g ħal komposti b ħal dawn; il-pH ta' 
protezzjoni g ħandu jkun ta' l-inqas unità ta' 1 pH mill-pKa tas- 
sustanza u ting ħata attenzjoni g ħar-relevanza ta' dan il-pH g ħall- 
ambjent.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Stima preliminari tal-koeffi ċjent tal-qsim  
Il-koeffiċjent tal-qsim ji ġi stmat preferibbilment bl-u żu ta' metodu ta' 
kalkolu (ara Appendi ċi 1), jew fejn adattat, mill-proporzjon tas-solu ­
bilitajiet tas-sustanza g ħat-test fis-solventi puri (10).  
1.6.2.  Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
1.6.2.1.  Preparazzjoni  
n-Oktanol: Id-determinazzjoni tal-koeffi ċjent tal-qsim g ħandha ssir 
b'rijaġent ta' anali żi ta' purità g ħolja. 
Ilma: ilma distillat jew li kien distillat g ħal darbtejn f’apparat tal- 
ħġieġ jew kwarz g ħandu jintu ża. Għal komposti jonizzati, 
soluzzjonijiet ta' protezzjoni flok l-ilma g ħandhom jintu żaw jekk 
possibbli.  
Nota:  
M'għandux jintu ża ilma direttament minn apparat li jbiddel il-jone.  
1.6.2.1.1. P r e - s a t u r a z z j o n i t a s - s o l v e n t i  
Qabel ma koeffi ċjent tal-qsim ji ġi ddeterminat, il-fa żijiet tas-sistema 
tas-solvent ji ġu reċiprokament saturati bi ċ-ċaqliq fit-temperatura ta' l- 
esperiment. Biex isir dan, hija ħaġa prattika li ċċaqlaq żewġt 
ifliexken kbar bl-n-oktanol jew bl-ilma t-tnejn ta' purezza g ħolja bi 
kwantità suffi ċjenti tas-solvent l-ie ħor fuq xejker mekkaniku g ħal 24 
siegħa u mbag ħad jitħallew joqg ħodu għal ħin twil bi żżejjed li 
jippermetti li l-fa żijiet jisseparaw u jiksbu stat ta' saturazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r e p a r a z z j o n i g ħ a t - t e s t  
Il-volum s ħiħ tas-sistema b' żewġ fażijiet kważi jimla' r-re ċipjent tat- 
test. Dan jg ħin biex jevita telf ta' materjali min ħabba volatiliz ­
zazzjoni. Il-proporzjon tal-volum u l-kwantitajiet tas-sustanza li għandha tintu ża huma stabbiliti f’dawn li ġejjin:
 
— il-valutazzjoni preliminari tal-koeffi ċjent tal-qsim (ara hawn fuq),  
— il-kwantità minima tas-sustanza g ħat-test me ħtieġa għall- 
proċedura analitika, u  
— l-limitazzjoni tal-kon ċentrazzjoni massima g ħal kull fa żi ta' 0,01 
mol għal kull litru.  
Isiru t-tliet testijiet. F’ ta’ l-ewwel, tintu ża l-proporzjon ta' volum 
ikkalkulata ta' n-oktanol g ħall-ilma; fit-tieni, din il-proporzjon 
tinqasam fi tnejn; u fit-tielet, din il-proporzjon ti ġi mmultiplikat bi 
tnejn (eż. 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. I s - s u s t a n z a g ħ a t - t e s t  
Titħejja soluzzjoni ta' ri żerva f’n-oktanol pre-saturat fl-ilma. Il-kon ċ­
entrazzjoni tas-soluzzjoni ta' ri żerva għandha tkun iddeterminata bi 
preċiżjoni qabel ma tintu ża fid-determinazzjoni tal-koeffi ċjent tal- 
qsim. Is-soluzzjoni g ħandha tin ħażen taħt kondizzjonijiet li 
jiżguraw l-istabbiltà tag ħha. 
1.6.2.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-temperatura tat-test g ħandha tin żamm kostanti (± 1  o C) u fil-kamp 
ta' varjabbiltà ta' 20 sa 25  o C. 
1.6.2.3.  Proċedura tal-kejl  
1.6.2.3.1. K i s b a t a ' l - e k w i l i b r i j u t a l - q s i m  
Għal kull kondizzjoni tat-test g ħandhom jit ħejjew reċipjenti tat-test 
doppji li jkun fihom l-ammonti me ħtieġa, taż-żewġ solventi flimkien 
imkejla b'e żattezza bil-kwantità ne ċessarja ta' soluzzjoni ta' ri żerva.  
Il-fażijiet ta' l-n-oktanol g ħandhom jitkejlu bil-volum. Ir-re ċipjenti 
tat-test g ħandhom jew jitpo ġġew f’xejker adattat jew ji ċċaqalqu 
manwalment. Fejn jintu ża tubu ċentrifugu, metodu rakkomandat 
huwa li t-tubu jiddawwar malajr 180  o madwar l-assi trasversali 
tiegħu sabiex kwalunkwe arja maqbuda titla’ mi ż-żewġ fażijiet. L- 
esperjenza wriet li 50 dawra b ħal din is-soltu huma suffi ċjenti għall- 
kisba ta' l-ekwilibriju tal-qsim. G ħaċ-ċertezza, huma rakkomandati 
100 dawra f' ħames minuti.  
1.6.2.3.2. S e p a r a z z j o n i t a l - f a ż i 
Meta huwa ne ċessarju, bil-g ħan li jkunu separati l-fa żijiet, għandha 
titwettaq ċentrifugazzjoni tat-ta ħlita. Dan g ħandu jsir fi ċ-ċentrifugu 
tal-laboratorju mi żmum f'temperatura ambjentali, jew, jekk jintu ża 
ċentrifugu mhux kontrollat permezz tat-temperatura, it-tubi ta ċ- 
ċentrifugu g ħandhom jin żammu għall-ekwilibrazzjoni fit-temperatura 
tat-test għall-millanqas sieg ħa qabel l-anali żi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Anali żi 
Għad-determinazzjon tal-koeffi ċjent tal-qsim, huwa ne ċessarju li 
jkunu determinati l-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza g ħat-test fiż- 
żewġ fażijiet. Dan jista' jsir billi tittie ħed alikwota ta' kull wie ħed 
miż-żewġ fażijiet minn kull tubu g ħal kull kondizzjoni ta' test u ti ġi 
analizzata bil-pro ċedura mag ħżula. Il-kwantità totali ta' sustanza 
preżenti fiż-żewġ fażijiet għandha tkun ikkalkulata u mqabbla mal- 
kwantità tas-sustanza introdotta ori ġinarjament.  
Għandu jittie ħed kampjun tal-fa żi fl-ilma bi pro ċedura li 
timminimizza r-riskju li jkunu introdotti tra ċċi ta' n-oktanol. Tista' 
tintuża siringa tal- ħġieġ b'labbra li tista' tintrema biex jittie ħed 
kampjun tal-fa żi ta' l-ilma. Inizjalment is-siringa g ħandha tkun 
parzjalment mimlija bl-arja. L-ajra g ħandha titne ħħa bil-mod waqt 
li tkun qed tidda ħħal is-siringa fis-saff ta' l-n-oktanol. Volum adattat 
tal-fażi fl-ilma jin ġibed fis-siringa. Is-siringa titne ħħa malajr mis- 
soluzzjoni u l-labbra maqlug ħa. Il-kontenut tas-siringa jista' 
mbagħad jintuża bħala kampjun fl-ilma. Il-kon ċentrazzjoni fi ż-żewġ 
fażijiet separati g ħandha preferibbilment tkun iddeterminata minn 
metodu spe ċifiku għas-sustanza. E żempji ta' metodi analiti ċi li 
jistgħu jkunu adattati huma:  
— il-metodi fotometri ċi, 
— il-kromatografija tal-gass,  
— il-kromatogrfija likwida ta' rendiment g ħoli. 
1.6.3.  Metodu HPLC  
1.6.3.1.  Preparazzjoni  
Apparat  
Huwa me ħtieġ kromatografu likwidu, mg ħammar b'pompa ming ħajr 
vibrazzjoni u apparat ta' osservazzjoni adattat. Huwa rakkomandat li 
jintuża valv ta' injezzjoni b' ċirku ta' injezzjoni. Il-pre żenza ta' gruppi 
polari fil-fa żi stazzjonarja tista' tfixkel serjament il-prestazzjoni tal- 
kolonna HPLC. G ħalhekk, fa żijiet stazzjonarji g ħandhom ikollhom 
il-perċentwali minima tal-gruppi polari (11). Jista' jintu ża ppakkjar 
kummerċjali ta' mikropartikulati b'fa żi b'lura jew kolonni di ġà 
ppakkjati. Kolonna ta' protezzjoni tista' titpo ġġa bejn is-sistema ta' 
injezzjoni u l-kolonna analitika.  
Fażi mobbli  
Biex jitħejja s-solvent ta' elu żjoni jintu żaw metanol iggradat g ħall- 
HPLC jew ilma ggradat g ħall-HPLC u s-solvent jitne ħħilu l-gass 
qabel l-u żu. Għandha tintu ża elużjoni isokratika. G ħandhom 
jintużaw proporzjonijiet ta' metanol/ilma b'kontenut minimu ta' 
ilma ta' 25 %. Tipikament ta ħlita ta' 3:1 (v/v) metanol-ilma hija 
sodisfaċenti għall-elużjoni ta' komposti ta' log P 6 fi żmien sieg ħa, 
b'rata ta' fluss ta' 1 ml/min. G ħal komposti ta' log P g ħoli jista' jkun 
neċessarju li jitqassrilhom i ż-żmien ta' l-elu żjoni (u dak tal-komposti 
ta' referenza) billi titnaqqas il-polarità tal-fa żi mobbli jew it-tul tal- 
kolonna.  
Sustanzi b'solubiltà baxxa ħafna f’n-oktanol g ħandhom tendenza li 
jagħtu valuri ta' log P  ow baxxi u mhux normali bil-metodu HPLC; il- 
quċċata ta' komposti b ħal dawn xi drabi takkumpanja l-front tas- 
solvent. Dan probabbilment huwa min ħabba l-fatt li l-pro ċess tal- 
qsim huwa bilmod wisq biex jintla ħaq ekwilibriju fi ż–żmien norm ­
alment me ħtieġ għal separazzjoni HPLC. It-tnaqqis tar-rata tal-fluss 
u/jew it-tbaxxija tal-proporzjon metanol/ilma tista’/jistg ħu mbagħad 
tkun/ikunu effettivi biex jinkiseb valur affidabbli.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Il-komposti g ħat-test u ta' referenza g ħandhom ikunu solubbli fil-fa żi 
mobbli f’kon ċentrazzjonijiet suffi ċjenti li jippermettu l-osservazzjoni 
tagħhom. F’ka żijiet eċċezzjonali biss jistg ħu jintużaw additivi mat- 
taħlita metanol/ilma, g ħaliex l-additivi jibdlu l-proprjetajiet tal- 
kolonna. G ħal kromatogrammi b'additivi huwa obbligatorju li 
tintuża kolonna separata ta' l-istess tip. Jekk il-metanol/ilma 
mhuwiex adattat, ta ħlitiet oħra ta' solvent organiku-ilma jistg ħu 
jintużaw, eż. etanol-ilma jew  acetonitrile -ilma.  
Il-pH ta' l-eluwent huwa kritiku g ħal komposti jonizzabbli. Huwa 
għandu jkun fl-iskala operattiva tal-pH tal-kolonna, li s-soltu hija 
bejn 2 u 8. Hija rakkomandata protezzjoni. G ħandha ting ħata 
attenzjoni biex ikun evitat il-pre ċipitazzjoni tal-mel ħ u t-taħsir tal- 
kolonna li jse ħħu b'xi taħlitiet ta' fa żi organika/ta, protezzjoni. Kejl 
HPLC b'fa żijiet stazzjonarji bba żati fuq is-silika 'l fuq minn 
pH8 mhuwiex rakkomandat g ħaliex l-użu ta' fażi alkalina, mobbli 
tista' tikkaw ża nuqqas rapidu ta' prestazzjoni tal-kolonna.  
Sustanzi ma ħlula 
Il-komposti ta' referenza g ħandhom ikunu fil-forma l-aktar pura 
disponibbli. Komposti li se ji ġu użati għal skopijiet ta' test jew ta' 
kalibrazzjoni ji ġu maħlula jekk huwa possibli fil-fa żi mobbli.  
Kondizzjonijiet tat-test  
It-temperatura matul il-kejl m‘g ħandhiex tvarja b’aktar minn ± 2 K.  
1.6.3.2.  Kejl  
Kalkolu tal- ħin mejjet t  o 
Il-ħin mejjet t  o jista' jkun iddeterminat bl-u żu jew ta' serje omologa 
(eż. n-alkyl methyl ketones ) jew mill-komposti organi ċi mhux 
miżmuma (e ż. thiourea  jew  formamide ). Għal kalkolu tal- ħin 
mejjet t  o bl-użu tas-serje omologa, sett ta' mill-anqas seba' membri 
tas-serje omologa ji ġi injettat u ż-żmien ta' retenzjoni rispettivament 
jiġi ddeterminat. Il- ħinijiet ta' retenzjoni mhux analizzati t  r (n c + 1)  
jiġu pplottjati b ħala funzjoni ta' t  r(n c) u l-linja bejn żewġ punti ta' 
interċezzjoni a u l-anglu b ta' l-ekwazzjoni ta' regressjoni:  
t r(n c + 1) = a + b t  r(n c ) 
jiġu ddeterminati (n  c = n-numru ta' l-atomi tal-karbonju). Il- ħin 
mejjet t  o mbagħad huwa mog ħti bi:  
t o = a/(1-b)  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Graff ta' kalibrazzjoni  
Il-pass li jmiss huwa li tinbena plott ta' korrelazzjoni tal-valuri log 
k kontra log p g ħall-komposti ta' referenza adattati. Fil-prattika, sett 
ta' bejn 5 u 10 komposti ta' referenza standard li l-log p tag ħhom hija 
madwar l-iskala mistennija ji ġu injettati flimkien u ji ġu ddeterminati 
l-ħinijiet ta' retenzjoni, preferibbilment fuq integratur ta' l-irrekordjar 
mgħaqqad mas-sistema tat-tiftix. Il-logaritmi korrispondenti tal-fatturi 
ta' kapaċità, log k, huma kkalkulati u pplottjati b ħala funzjoni tal-log 
p ddeterminat bil-metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun. Il-kalibrazzjoni 
titwettaq f’intervalli regolari, g ħall-inqas darba kuljum, sabiex 
ikunu jistg ħu jiġu kkunsidrati l-bidliet possibbli fil-prestazzjoni tal- 
kolonna.  
Determinazzjoni tal-fattur tal-kapa ċità tas-sustanza g ħat-test  
Is-sustanza g ħat-test tiġi injettata fi kwantità żgħira kemm jista' jkun 
ta' fażi mobbli. Il- ħin ta' retenzjoni ji ġi ddeterminat (g ħal darbtejn), 
u b'hekk jippermetti l-kalkolu tal-fattur ta' kapa ċità k. Mill-graff tal- 
korrelazzjoni tal-komposti ta' referenza, il-koeffi ċjent tas-sustanza 
għat-test jista' ji ġi interpolat. G ħal koeffiċjenti baxxi ħafna u għolja 
ħafna, hija ne ċessarja l-estrapolazzjoni. F’dawk il-ka żijiet trid 
tingħata attenzjoni partikulari g ħal-limiti ta' validità tal-linja ta' 
rigressjoni.  
2. DATA  
Metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun  
L-affidabbiltà tal-valuri ddeterminati ta' P jistg ħu jkunu ppruvati bi 
tqabbil mal-mezzi tad-determinazzjonijiet dupplikati mal-medja globali.
 
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),  
— meta l-metodi ma japplikawx (e ż. materjal attiv fuq is-superfi ċje), 
għandhom ikun pprovdut valur ikkalkulat jew stima bba żat/a fuq 
is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u fl-ilma,  
— l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod spe ċjali fir- 
rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fi żiku tas-sustanza.  
Għall-metodu ta ċ-ċaqliq tal-flixkun:  
— ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,  
— it-temperatura tad-determinazzjoni,  
— id-DATA dwar il-pro ċeduri analiti ċi użati fid-determinazzjoni tal- 
konċentrazzjonijiet,  
— il-ħin u l-velo ċità taċ-ċentrifugazzjoni, jekk u żata, ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— il-kon ċentrazzjonijiet imkejla bi ż-żewġ fażijiet għal kull deter ­
minazzjoni (dan ifisser li total ta' 12-il kon ċentrazzjoni ji ġu rrap­
purtati),  
— il-piż tas-sustanza g ħat-test, il-volum ta' kull fa żi użata f’kull 
reċipjent tat-test u l-ammont totali kkalkulat ta' sustanza g ħat- 
test preżenti f’kull fa żi wara l-ekwilibrazzjoni,  
— il-valuri kkalkulati tal-koeffi ċjent tal-qsim (P) u l-medja 
għandhom ikunu rrapurtati g ħal kull sett ta' kondizzjonijiet tat- 
test kif g ħandu jsir ukoll g ħall-medja tad-determinazzjonijiet 
kollha. Jekk hemm suspett ta' dipendenza tal-kon ċentrazzjoni 
fuq il-koeffi ċjent tal-qsim, dan g ħandu jkun imni żżel fir-rapport,  
— id-devjazzjoni standard tal-valuri individwali P madwar il-medja 
tagħhom għandha tkun rrapurtata,  
— il-valur medju P tad-determinazzjonijiet kollha g ħandu jkun 
espress ukoll b ħala logartimu tieg ħu stess (ba żi 10),  
— il-P  ow teoretiku kkalkulat meta dan il-valur ġie ddeterminat jew 
meta l-valur imkejjel huwa > 10  4 , 
— il-pH ta' l-ilma u żat u tal-fa żi fl-ilma matul l-esperiment,  
— jekk jintu żaw protezzjonijiet, ġustifikazzjoni g ħall-użu tal- 
protezzjonijiet flok l-ilma, il-kompo żizzjoni, il-kon ċentrazzjoni 
u l-pH tal-protezzjonijiet, il-pH tal-fa żi fl-ilma qabel u wara l- 
esperiment.  
Metodu HPLC:  
— ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,  
— is-sustanza g ħat-test u ta' referenza u l-purità tag ħhom,  
— l-iskala tat-temperatura tad-determinazzjonijiet,  
— il-pH li fih isiru d-determinazzjonijiet,  
— id-dettalji tal-kolonna analitika u ta' protezzjoni, tal-fa żi mobbli 
u tal-mezzi tat-tiftix,  
— id-DATA ta' retenzjoni u l-valuri tal-log P fil-letteratura g ħall- 
komposti ta' referenza u żati fil-kalibrazzjoni,  
— id-dettalji tal-linja ta' rigressjoni ri żultanti (log K kontra log P),  
— id-DATA ta' retenzjoni medja u l-valur interpolat ta' log P g ħall- 
kompost g ħat-test,  
— id-deskrizzjoni tat-tag ħmir u l-kondizzjonijiet operattivi,  
— il-profili ta' l-elu żjoni, 
— il-kwantitajiet ta' sustanzi g ħat-test u ta' referenza mda ħħla fil- 
kolonna,  
— il-ħin mejjet u kif tkejjel.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. REFERENZI  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) -Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemo ­
sphere, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219 (1981).  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
675 
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339.
 
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial 
use -Determination of partition coefficient -Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382 
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biol ­
ogische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984,  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base11978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Appendiċi 1 
Metodi ta' stima/kalkolu  
DAĦLA 
Daħla ġenerali għall-metodi ta' kalkolu, DATA u e żempji huma pprovduti fil-  
Handbook of Chemical Property Estimation Methods  (a). 
Il-valuri kkalkulati tal-P  ow jistgħu jintużaw: 
— biex ikun de ċiż liema mill-metodi sperimentali huma adattati (skala ta ċ-ċaqliq 
tal-flixkun: log P  ow : minn - 2 sa 4, skala HPLC: log P  ow : minn 0 sa 6),  
— għall-għażla tal-kondizzjonijiet g ħat-test adattati (e ż. sustanzi ta' referenza 
għal proċeduri HPLC, proporzjon tal-volum n-oktanol/ilma g ħall-metodu 
taċ-ċaqliq tal-flixkun),  
— bħala verifika interna tal-laboratorju ta' żbalji sperimentali possibli,  
— għall-għoti ta' stima ta' P  ow - f'każijiet fejn il-metodi sperimentali ma jistg ħux 
jiġu applikati g ħal raġunijiet tekni ċi. 
METODU TA' STIMA  
Stima preliminari tal-koeffi ċjent tal-qsim  
Il-valur tal-koeffi ċjent tal-qsim jista' jkun stmat bl-u żu tas-solubilitajiet tas- 
sustanza tat-test f'solventi puri: G ħal din:  
P stmat ¼ saturazzjoni c  nÄoktanol  
saturazzjoni c  ilma 
METODI TA' KALKOLU  
Prinċipju tal-Metodi ta' Kalkolu  
Il-metodi kollha ta' kalkolu huma bba żati fuq il-frammentazzjoni formali tal- 
molekula b'sub-strutturi adattati li g ħalihom huma mag ħrufa żidiet affidabbli 
tal-log P  ow . Il-log P  ow tal-molekula kollha huwa mbag ħad ikkalkulat b ħala s- 
somma tal-valur tal-framment korrispondenti tieg ħu flimkien mas-somma tat- 
termini ta' korrezzjoni g ħal interazzjonijiet intramolekulari.  
Lista ta' kostanti ta' frammenti u termini ta' korrezzjoni huma disponibbli (b)(c) ­
(d)(e);. U ħud huma regolarment a ġġornati (b).  
Kriterji ta' kwalità  
B'mod ġenerali, l-affidabbiltà tal-metodu ta' kalkolu tonqos jekk ti żdied il-komp ­
lessità tal-kompost ta ħt studju. Fil-ka ż ta' molekuli sempli ċi b'piż molekulari baxx 
u grupp funzjonali jew tnejn, tista' tkun mistennija devjazzjoni ta' 0,1 sa 0,3 unitajiet ta' log P
 ow bejn ir-ri żultati tal-metodi ta' frammentazzjoni differenti 
u l-valur mkejjel. Fil-ka ż ta' molekuli aktar komplessi l-mar ġni ta' l-iżball jista' 
jkun akbar. Dan se jiddependi fuq l-affidabbiltà u d-disponibbiltà ta' kostanti ta' 
framment, kif ukoll fuq l-abbiltà biex jintg ħarfu l-interazzjonijeit intramolekulari 
(eż.. ir-rabtiet ta' l-idro ġenu) u l-u żu korrett tat-termini ta' korrezzjoni (inqas ta' 
problema bis-software tal-kompjuter CLOGP-3) (b). Fil-ka ż ta' komposti 
jonizzanti l-konsiderazzjoni korretta ta ċ-ċarġ u l-grad ta' jonizzazzjoni hija 
importanti.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Proċedura ta' kalkolu  
Il-metodu Hansch π- 
Il-kostanti tas-sostitwent idrofobiku ori ġinali, π, introdott minn Fujira et al. 
(f) huwa mfisser b ħala: 
π x = log P  ow (PhX) -log P  ow (PhH)  
fejn P  ow (PhX) huwa l-koeffi ċjent tal-qsim ta' derivattiv aromatiku u P  ow (PhH) 
dak tal-kompost ewlieni  
(eż.. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) -log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71).  
Skond id-definizzjoni tieg ħu l-metodu π japplika b'mod predominanti g ħal sosti­
tuzzjoni aromatika. Valuri π għal għadd kbir ta' sostitwenti ng ħataw f'tabelli 
(b)(c)(d). Huma u żati għall-kalkolu ta' log P  ow għall-molekuli jew substrutturi 
aromatiċi. 
Metodu Rekker  
Skond Rekker (g) il-valur tal-log P  ow huwa kkalkulat kif ġej: 
log P  ow ¼ ∑ 
i a i f i þ ∑ 
j ðtermini ta 0 interazzjoniÞ: 
fejn f  i jirrappreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti u a  i il- 
frekwenza ta' l-okkorrenza fil-molekula ta ħt eżami. It-termini ta' korrezzjoni 
jistgħu jiġu espressi b ħala multiplu integrali ta' kostanti wie ħed C  m (l-hekk 
imsejjaħ “kostanti ma ġiku”). Il-kostanti tal-frammenti f  i u C  m kienu ddeterminati 
minn lista ta' 1,054 valur sperimentali ta' P  ow (825 kompost) bl-u żu ta' l-anali żi 
ta' rigressjoni multipla (c)(h). Id-determinazzjoni tat-termini ta' interazzjoni titwettaq skond regoli fissi mfissra fil-letteratura (e)(h)(i).
 
Il-metodu Hansch-Leo  
Skond Hansch u Leo (c) il-valur tal-log P  ow huwa kkalkulat kif ġej: 
log P  ow ¼ ∑ 
i a i f i þ ∑ 
j b j F j 
fejn f  i jirrapreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti, F  j it-termini ta' 
korrezzjoni u a  i il-frekwenzi korrispondenti ta' l-okkorrenza. Lista ta' valuri 
atomiċi u ta' gruppi frammentali u lista ta' termini ta' korrezzjoni F  j (l-hekk 
imsejħa “fatturi”) iddeterminati bl-approssimazzjoni, inkisbet mill-valuri speri ­
mentali P  ow. It-termini ta' korrezzjoni kienu ordnati f'diversi klassijiet differenti 
(a)(c). Huwa relattivament komplikat u jitte ħed wisq ħin biex ikunu kkunsidrati r- 
regoli u t-termini ta' korrezzjoni kollha. Pakketti tas-software ġew żviluppati (b).  
Metodu Kombinat  
Il-kalkolu tal-log P  ow tal-molekuli komplessi tista' titjieb konsiderevolment, jekk 
il-molekula ti ġi tinqasam f'substrutturi akbar li g ħalihom hemm disponibbli valuri 
affidabbli tal-log P  ow jew mit-tabelli (b)(c) jew mill-kejl li wie ħed jagħmel. 
Frammenti b ħal dawn (e ż.. eteroċikli, antrakinone, a żobenżin) jistgħu mbagħad 
jiġu kkombinati mal-valuri Hansch π jew mal-kostanti tal-frammenti Rekker jew 
Leo. 
Rimarki  
i) Il-metodi ta' kalkolu jistg ħu jkunu applikati biss g ħal komposti jonizzati 
parzjalment jew s ħaħ meta huwa possibli li ji ġu kkunsidrati l-fatturi ta' 
korrezzjoni ne ċessarji.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Jekk wie ħed jassumi li hemm rabtiet idro ġeni intramolekulari, it-termini ta' 
korrezzjoni korrispondenti (approssimattivament unitajiet + 0,6 to + 1,0 log 
P ow ) jridu jiġu miżjuda (a). Indikazzjoni tal-pre żenza ta' rabtiet b ħal dawn 
jistgħu jinkisbu mill-mudelli tridimensjonali jew mid-DATA spettroskopika 
tal-molekula.  
iii) Jekk huma possibli bosta forom tawtomeri ċi, l-aktar forma probabbli g ħandha 
tintuża bħala bażi għall-kalkolu.  
iv) Ir-revi żjonijiet tal-listi tal-kostanti tal-frammenti g ħandhom jkunu segwiti bl- 
attenzjoni kollha.  
Rapport  
Meta jkunu qed jintu żaw metodi ta' kalkolu/stima, ir-rapport tat-test g ħandu, jekk 
huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— id-deskrizzjoni tas-sustanza (identità, impuritajiet, e ċċ.), 
— l-indikazzjoni ta' kwalunkwe rabta idro ġena intramolekulari possibli, disso ċ­
jazzjoni, ta ċ-ċarġ u kwalunkwe effett mhux tas-soltu ie ħor (eż.. tawto­
meriżmu), 
— id-deskrizzjoni tal-metodu ta' kalkolu,  
— l-identifikazzjoni jew il-provvista ta'  database , 
— il-pekularitajiet fil-g ħażla tal-frammenti,  
— id-dokumentazzjoni komprensiva tal-kalkolu.  
LETTERATURA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(ċ) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 
14,479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86,5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Appendici 2  
Sustanzi ta' Referenza Rakkomandati g ħal Metodu HPLC  
No. Reference Substance log P  ow pKa 
1 2-Butanone 0,3 
2 4-Acetylpyridine 0,5 
3 Aniline 0,9 4 Acetanilide 1,0 
5 Benzylalcohol 1,1 
6 p-Methoxyphenol 1,3 pKa = 10,26 
7 Phenoxy acetic acid 1,4 pKa = 3,12 
8 Phenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrophenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitrile 1,6 
11 Phenylacetonitrile 1,6 12 4-Methylbenzyl alcohol 1,6 
13 Acetophenone 1,7 
14 2-Nitrophenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-Nitrobenzoic acid 1,8 pKa = 3,47 
16 4-Chloraniline 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzene 1,9 
18 Cinnamic alcohol 1,9 
19 Benzoic acid 1,9 pKa = 4,19 20 p-Cresol 1,9 pKa = 10,17 
21 Cinnamic acid 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 Anisole 2,1 
23 Methylbenzoate 2,1 
24 Benzene 2,1 25 3-Methylbenzoic acid 2,4 pKa = 4,27 
26 4-Chlorophenol 2,4 pKa = 9,1 
27 Trichloroethylene 2,4 28 Atrazine 2,6 
29 Ethylbenzoate 2,6 
30 2,6-Dichlorobenzonitrile 2,6 
31 3-Chlorobenzoic acid 2,7 pKa = 3,82 
32 Toluene 2,7 33 1-Naphthol 2,7 pKa = 9,34 
34 2,3-Dichloroaniline 2,8 
35 Chlorobenzene 2,8 36 Allyl-phenylether 2,9 
37 Bromobenzene 3,0
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
No. Reference Substance log P  ow pKa 
38 Ethylbenzene 3,2 
39 Benzophenone 3,2 40 4-Phenylphenol 3,2 pKa = 9,54 41 Thymol 3,3 42 1,4-Dichlorobenzene 3,4 43 Diphenylamine 3,4 pKa = 0,79 44 Naphthalene 3,6 
45 Phenylbenzoate 3,6 
46 Isopropylbenzene 3,7 47 2,4,6-Trichlorophenol 3,7 pKa = 6 48 Biphenyl 4,0 49 Benzylbenzoate 4,0 50 2,4-Dinitro-6 sec. butyophenol 4,1 51 1,2,4-Trichlorobenzene 4,2 52 Dodecanoic acid 4,2 53 Diphenylether 4,2 54 n-Butylbenzene 4,5 
55 Phenanthrene 4,5 
56 Fluoranthene 4,7 57 Dibenzyl 4,8 58 2,6-Diphenylpyridine 4,9 59 Triphenylamine 5,7 60 DDT 6,2 
Other reference substances of low log P
 ow 
1 Nicotinic acid - 0,07  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. IL-PUNT TA' FJAMMABILITÀ  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar il-fjamm ­
abilità tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test. Il-pro ċedura tat-test 
hija applikabbli g ħas-sustanzi likwidi fejn il-fwar jista' jitqabbad 
permezz ta' g ħejun ta' fjammabilità tan-nar. Il-metodi tat-test 
mniżżla f’dan it-test huma biss affidabbli g ħall-iskala ta' punti ta' 
fjammabilità li huma spe ċifikati fil-metodi individwali.  
Il-possibiltà ta' reazzjonijiet kimi ċi bejn is-sustanza u fejn jin żamm 
il-kampjun g ħandha tkun ikkunsidrata meta jintg ħażel il-metodu li se 
jintuża. 
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Il-punt ta' infjammabilità huwa l-inqas temperatura, korretta g ħal 
pressjoni ta' 101,325 kPa, li fiha likwidu jevolvi l-fwar, ta ħt 
kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test, f’dak l-ammont li l-fwar fjammabbli/t-ta ħlita ta' arja huwa/hija prodott/a fir-re ċipjent tat-test.
 
Unitajiet: °C  
t = T - 273,15  
(t f’  o C u T f’K)  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta' referenza mhumiex me ħtieġa li jintu żaw fil-ka żijiet 
kollha meta tkun qed ti ġi investigata sustanza ġdida. Huma 
għandhom iservu primarjament biex ji ċċekkjaw ir-rendiment tal- 
metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' 
riżultati minn metodi o ħra. 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODI  
Is-sustanza titpo ġġa fir-reċipjent tat-test u tissa ħħan jew titkessa ħ sat- 
temperatura tat-test skond il-pro ċedura mfissra fil-metodu tat-test 
individwali. Testijiet dwar il-fjammabilità jitwettqu bil-g ħan li jkun 
aċċertat jekk il-kampjun qabadx jew le fit-temperatura tat-test.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
1.5.1.  Ripetibbilità  
Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala tal-fjammabilità u l-metodu tat- 
test użat; sa massimu ta' 2  o C. 
1.5.2.  Sensittività  
Is-sensittività tiddependi fuq il-metodu tat-test u żat. 
1.5.3.  Spe ċifiċità 
L-ispeċifiċità ta' wħud mill-metodi tat-test hija limitata g ħal ċerti 
skali ta' punti ta' fjammabilità u su ġġetti għal DATA relatata mas- 
sustanza (e ż. viskożità għolja). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Preparazzjonijiet  
Kampjun tas-sustanza g ħat-test jitpo ġġa f’apparat g ħat-test skond 
1.6.3.1 u/jew 1.6.3.2.  
Għas-sikurezza, huwa rakkomandat li metodu li jutilizza daqs żgħir 
ta' kampjun, circa 2 cm  3 , jintuża għal sustanzi ener ġetiċi jew tossi ċi. 
1.6.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
L-apparat, g ħandu, sakemm ikun konsistenti mas-sikurezza, jitpo ġġa 
f’pożizzjoni 'l-bog ħod mill-kurrent ta' l-arja.  
1.6.3.  L-e żekuzzjoni tat-test  
1.6.3.1.  Metodu ta' l-ekwilibriju  
Ara ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Metodu ta' non-ekwilibriju  
Apparat Abel:  
Ara BS 2000 parti 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Apparat Abel-Pensky:  
Ara EN 57, DIN 51755 parti 1 (g ħal temperaturi minn 5 sa 65  o C), 
DIN 51755 parti 2 (g ħal temperaturi ta ħt il-5 C), NF M07-036.  
Apparat Tag:  
Ara ASTM D 56.  
Apparat Pensky-Martens:  
Ara ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Rimarki:  
Meta l-punt ta' fjammabilità, iddeterminat permezz ta' metodu ta' 
non-ekwlibriju f’1.6.3.2., jinstab li huwa 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C jew 
55 ± 2  o C, għandu jkun ikkonfermat b'metodu ta' ekwilibriju bl-u żu 
ta' l-istess apparat.  
Il-metodi li jag ħtu t-temperatura tal-punt ta' fjammabilità biss jistg ħu 
jintużaw għal notifikazzjoni.  
Biex ikun iddeterminat il-punt ta' fjammabilità ta' likwidi visko żi 
(żebgħa, gomom u simili) li fihom solventi, jista' jintu ża biss 
apparat u jintu żaw biss metodi tat-test adattati g ħad-determinazzjoni 
tal-punt ta' fjammabilità ta' likwidi visko żi. 
Ara ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parti 1.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DATA  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),  
— il-metodu u żat għandu jkun dikjarat kif ukoll xi devjazzjonijiet 
possibbli,  
— ir-riżultati u xi rimarki addizzjonali relevanti g ħall-interpre ­
tazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
Xejn.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  FJAMMABILITÀ (SOLIDI)  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet 
splussivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test.  
Dan it-test g ħandu jkun applikat biss g ħal sustanzi tat-trab, mrammla 
jew qishom kolla.  
Bil-għan li ma ji ġux inklużi s-sustanzi kollha li jistg ħu jinxteg ħlu 
imma dawk biss li jin ħarqu malajr jew dawk li l-im ġiba tal-ħruq 
tagħhom hija fi kwalunkwe mod spe ċjalment perikolu ża, sustanzi li 
l-veloċità tal-ħruq tagħhom taqbe ż ċertu valur ta' limitu biss huma 
kkunsidrati b ħala fjammabbli ħafna.  
B'mod spe ċjali jista' jkun perikolu ż li inkandexxenza timxi permezz 
ta' trab metalliku min ħabba d-diffikultajiet fit-tifi ta' nar. Trabijiet 
metalliċi għandhom ikunu kkunsidrati b ħala fjammabli ħafna jekk 
huma jgħinu t-tixrid ta' l-inkandexxenza fil-pi ż fi żmien spe ċifikat.  
1.2. TIFSIRA U UNITAJIET  
Il-ħin tal-ħruq huwa muri f’sekondi.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Mhux spe ċifikati  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METOD  
Is-sustanza ti ġi ffurmata fi strixxa mhix maqtug ħa jew miċċa tat-trab 
ta' madwar 250 mm tul u test preliminari ta' orjentazzjoni ji ġi 
esegwit biex ikun iddeterminat jekk, mal-fjammabilità ta' fjamma tal-gass, issirx propagazzjoni bil- ħruq tal-fjamma jew bi ħruq bati 
mingħajr fjamma. Jekk isse ħħ propagazzjoni fuq 200 mm tal-mi ċċa 
f’ħin speċifikat allura jitwettaq programm ta' test s ħiħ biex tkun 
iddeterminata r-rata ta' ħruq.
 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Mhux definiti.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Test preliminari ta' orjentazzjoni  
Is-sustanza ti ġi ffurmata fi strixxa mhux miksura jew mi ċċa tat-trab 
madwar 250 mm tul u 20 mm wiesa’ b’10 mm g ħoli fuq pjan ċa tal- 
bażi mhux kombustibbli, mhux poru ża u b'kondu ċibilità ta' s ħana 
baxxa. Fjamma b’temperatura g ħolja minn berner tal-gass (dijametru 
minimu ta' 5 mm) ti ġi applikata fuq tarf tal-mi ċċa tat-trab sakemm it- 
trab jaqbad jew g ħal massimu ta' 2 minuti (5 minuti g ħal trab tal- 
metall jew g ħal liegi metalli ċi). Għandu jkun innotat jekk il- 
kombustjoni timxix matul 200 mm tal-mi ċċa fil-perjodu ta' test ta' 
4 minuti (jew 40 minuta g ħal trabijiet tal-metall). Jekk is-sustanza 
ma taqbadx u ma tmexxix il-kombustjoni permezz tal-fjammabilità 
bil-fjamma jew bin-nati bati bla fjamma matul 200 mm tal-mi ċċa tat- 
trab fil-perjodu ta' test ta’4 minuti (jew 40 minuta), allura s-sustanza m'għandhiex titqies b ħala fjammabbli ħafna u mhuwa me ħtieġ ebda 
test ieħor. Jekk is-sustanza tmexxi l-fjammabilità fuq 200 mm tal- 
miċċa tat-trab f’inqas minn 4 minuti, jew inqas minn 40 minuta g ħal 
trabijiet metalli ċi, għandha titwettaq il-pro ċedura mfissra hawn ta ħt 
(punt 1.6.2 u ta' wara).
 
1.6.2.  It-test tar-rata ta' fjammabilità  
1.6.2.1.  Preparazzjoni  
Sustanzi f'forma ta' trab jew mrammla ji ġu mimlija sfu żi f’forma ta' 
250 mm tul b'taqsima trasversali trijangulari ta' g ħoli intern ta' 
10 mm u wisa' ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal-metall ji ġu mmuntati 
fuq iż-żewġ naħat tal-forma b ħala limitazzjonijiet laterali li jo ħorġu 
2 mm ’il barra mit-tarf l-g ħoli tat-taqsima trasversali trijangulari 
(figura). Il-forma mbag ħad titwaddab tliet darbiet minn g ħoli ta' 
2 cm fuq superfi ċje solida. Jekk ikun ne ċessarju l-forma ter ġa’ tiġi 
mimlija. Il-limitazzjonijiet laterali mbag ħad jitneħħew u s-sustanza 
żejda titne ħħa. Pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poru ża 
u b’kondu ċibilità ta' s ħana baxxa titpo ġġa fuq il-forma, l-apparat 
jinqaleb u l-forma titne ħħa. 
Sustanzi b ħall-pejst ji ġu mdellka fuq pjan ċa tal-bażi mhux kombus ­
tibbli, mhux poru ża u b’kondu ċibilità ta' s ħana baxxa fil-forma ta' 
ħabel 250 mm fit-tul b'sezzjoni trasversali ta' madwar 1 cm  2 . 
1.6.2.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Fil-każ ta' sustanza sensittiva g ħall-umdità, it-test g ħandu jitwettaq 
malajr kemm jista' jkun wara li jitne ħħa mill-kontenitur.  
1.6.2.3.  L-eżekuzzjoni tat-test  
Irranġa l-gozz f’kurrent ta' arja f’armarju li ji ġbed id-du ħħan. 
Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffi ċjenti biex tevita li d-du ħħan joħroġ 
fil-laboratorju u m'g ħandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid 
ikun protett mill-kurrent ta' l-arja.  
Fjamma ta ħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5mm) 
jintuża biex ikun mixg ħul il-gozz minn na ħa waħda. Meta l-gozz 
ikun inħaraq sa distanza ta' 80 mm, titkejjel ir-rata ta' ħruq fuq il- 
100 mm li jmiss.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
It-test jitwettaq sitt darbiet, bl-u żu ta' pjan ċa nadifa u kies ħa kull 
darba, kemm-il darba ma jkunx osservat ri żultat pożittiv qabel.  
2. DATA  
Il-ħin tal-ħruq mit-test ta' orjentazzjoni preliminari (1.6.1.) u l-inqas 
ħin ta' ħruq sa sitt testijiet (1.6.2.3.) huma relevanti g ħall-valu­
tazzjoni.  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identifikazzjoni 
u impuritajiet),  
— id-deskrizzjoni tas-sustanza g ħat-test, l-istat fi żiku tagħha inkluż 
il-kontenut ta' l-umdità,  
— ir-riżultati mit-testijiet ta' orjentazzjoni preliminari u mit-test tar- 
rata ta' ħruq jekk ikunu saru,  
— ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati.  
3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Sustanzi f'forma ta' trab, imrammla jew b ħall-pejst g ħandhom ji ġu 
kkunsidrati b ħala fjammabbli ħafna meta l- ħin tal-ħruq fi kwalunkwe 
test skond il-pro ċedura tat-test mfisser f'1.6.2 huwa inqas minn 45 
sekonda. Trabijiet tal-metall u liegi tal-metall huma kkunsidrati b ħala 
fjammabbli ħafna meta huma jistg ħu jitqabbdu u l-fjamma jew i ż- 
żona ta' reazzjoni tinfirex fuq il-kampjun kollu f’10 minuti jew inqas.  
4. REFERENZI  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Appendiċi 
Figura  
Forom u a ċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz  
(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  FJAMMABILITÀ (GASSIJIET)  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Dan il-metodu jippermetti d-determinazzjoni ta' jekk gassijiet 
imħallta ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20  o C) u l- 
pressjoni atmosferika humiex fjammabbli u, jekk huma hekk, fuq liema skala ta' kon ċentrazzjonijiet. Ta ħlitiet ta' kon ċentrazzjonijiet 
li jiżdiedu tal-gass g ħat-test ma' l-arja ji ġu esposti g ħal spark 
elettriku u ji ġi osservat jekk jaqbdux.
 
1.2. TIFSIRA U UNITAJIET  
L-iskala ta' fjammabilità hija l-iskala ta' kon ċentrazzjoni bejn l-inqas 
u l-ogħla limiti ta' splu żjoni. L-inqas u l-og ħla limiti ta' splu żjoni 
huma dawk il-limiti ta' kon ċentrazzjoni ta' gass fjammabbli m ħallat 
ma' l-arja li fih ma sse ħħx propagazzjoni tal-fjamma.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Mhux spe ċifikati  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Il-konċentrazzjoni tal-gass fl-arja ti żdied pass pass u t-ta ħlita hija 
esposta f’kull stadju g ħal spark elettriku.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Mhux definiti.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Apparat  
Ir-reċipjent għat-test huwa ċilindru tal- ħġieġ vertikali li g ħandu 
dijametru intern ta' 50 mm u g ħoli minimu ta' 300 mm. L-elettrodi 
għall-fjammabilità huma separati b'distanza ta' 3 sa 5 mm u huma 
mpoġġija 600 mm fuq il-qieg ħ taċ-ċilindru. I ċ-ċilindru huwa 
mgħammar bi ftu ħ għar-rilaxx tal-pressjoni. L-apparat g ħandu 
jkollu protezzjoni biex inaqqas kwalunkwe ħsara minn splu żjoni. 
Bħala sors ta' fjammabilità jintu ża spark ta' induzzjoni permanenti ta' 
dewmien ta' 0,5 s, li huwa ġġenerat minn transformer ta' vulta ġġ 
għoli b'vulta ġġ ta' ħruġ minn 10 sa 15 kV (massimu ta' ener ġija 
ta' dħul 300 W). E żempju ta' apparat adattat huwa mfisser fir- 
referenza (2).  
1.6.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20  o C). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  L-e żekuzzjoni tat-test  
Konċentrazzjoni mag ħrufa ta' gass fl-arja ti ġi mdaħħla fiċ-ċilindru 
tal-gass, permezz ta' pompi li jippompjaw proporzjon tad-do ża. 
Spark jiġi mgħoddi mit-ta ħlita u ji ġi osservat jekk il-fjamma 
tinqatax wa ħedha jew mill-g ħajn tal-fjammabilità u tinfirix b'mod 
indipendenti. Il-kon ċentrazzjoni tal-gass tvarja fi stadji ta' 1 % vol. 
sakemm isse ħħ il-fjammabilità kif imfisser hawn fuq.  
Jekk l-istruttura kimika tal-gass tindika li ma tkunx fjammabbli 
u tista' ti ġi kkalkulata l-kompo żizzjoni tat-ta ħlita stojkjometrika bl- 
arja, imbag ħad taħlitiet fl-iskala minn 10 % anqas mill- 
kompożizzjoni stojkjometrika sa 10 % aktar minn din il- 
kompożizzjoni biss je ħtieġ li jkunu ttestjati fi stadji ta' 1 %.  
2. DATA  
L-okkorrenza tat-tixrid tal-fjamma hija l-unika DATA ta' inform ­
azzjoni relevanti g ħad-determinazzjoni ta' din il-proprjetà.  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identifikazzjoni 
u impuritajiet),  
— deskrizzjoni, bid-dimensjonijiet, ta' l-apparat u żat, 
— it-temperatura li fiha twettaq it-test,  
— il-kon ċentrazzjonijiet ippruvati u r-ri żultati miksuba,  
— ir-riżultat tat-test: gass mhux fjammabbli jew gass fjammabbli 
ħafna,  
— jekk ikun konklu ż li l-gass mhuwiex fjammabbli allura l-iskala ta' 
konċentrazzjoni li fuqha kien ippruvat fi stadji ta' 1 % g ħandha 
tkun iddikjarata,  
— ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati għandhom ikunu rrapurtati.  
4. REFERENZI  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard- 
Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vo156, 2, 126-127.Wortmann, T.Redeker und 
H.Schacke. 'Entwicklung
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  FJAMMABILITÀ (KUNTATT MA' L-ILMA)  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Dan il-metodu ta' test jista' jintu ża biex ikun iddeterminat jekk ir- 
reazzjoni ta' sustanza ma' l-ilma jew l-arja umda twassalx g ħall- 
iżvilupp ta' ammonti perikolu żi ta' gass jew gassijiet li jistg ħu 
jkunu fjammabbli ħafna.  
Il-metodu jista' ji ġi applikat g ħal sustanzi likwidi kif ukoll solidi. 
Dan il-metodu mhux applikabbli g ħal sustanzi li jitqabbdu spontan ­
jament meta ji ġu f’kuntatt ma' l-arja.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Fjammabbli ħafna: sustanzi li, f’kuntatt ma' l-ilma jew l-arja umda, 
jevolvu gassijiet fjammabbli ħafna fi kwantitajiet perikolu żi b'rata 
minima ta' 1 litru/kg g ħal kull sieg ħa. 
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Is-sustanza hija ttestjata skond is-sekwenza pass wara pass imfissra 
hawn taħt; jekk il-fjammabilità isse ħħ fi kwalunkwe pass, ebda test 
ieħor mhuwa me ħtieġ. Jekk ikun mag ħruf li s-sustanza ma tirrea ­ 
ġixxix b'mod vjolenti ma' l-ilma allura jsir pass 4 (1.3.4).  
1.3.1.  Pass 1  
Is-sustanza g ħat-test titpo ġġa f’reċipjent bl-ilma distillat f’20  o C 
u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew le.  
1.3.2.  Pass 2  
Is-sustanza g ħat-test titpo ġġa fuq karta filtru fuq il-wi ċċ ta' dixx li fih 
ilma distillat f’20  o C u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew 
le. Il-karta filtru tintu ża biss biex i żżomm lis-sustanza f’post wie ħed 
biex jikbru ċ-ċansijiet tal-fjammabilità.  
1.3.2.  Pass 3  
Is-sustanza g ħat-test hija mag ħmula f’gozz approssimattivament 2 cm 
għoli u 3 cm dijametru. Ftit qtar ta' ilma ji żdiedu mal-gozz u ji ġi 
nnotat jekk il-gass evolut jaqbadx jew le.  
1.3.4.  Pass 4  
Is-sustanza g ħat-test tiġi miżjuda ma' ilma distillat f’20 C u r-rata ta' 
evoluzzjoni tal-gass titkejjel fuq perjodu ta' seba' sig ħat, f’intervalli 
ta' siegħa. Jekk ir-rata ta' evoluzzjoni mhijiex kostanti, jew qed 
tiżdied wara seba’ sig ħat, il-ħin tal-kejl g ħandu jittawwal g ħal 
massimu ta' ħamest ijiem. It-test jista' jitwaqqaf jekk ir-rata fi 
kwalunkwe ħin taqbeż il-1 litru/kg g ħal kull sieg ħa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Mhux spe ċifikati  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Mhux definiti.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Pass 1  
1.6.1.1.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 C).  
1.6.1.2.  L-eżekuzzjoni tat-test  
Kwantità żgħira (approssimattivament 2 mm dijametru) tas-sustanza 
għat-test għandha titpo ġġa f'reċipjent li fih ilma distillat. G ħandu 
jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk se ħħitx il-fjamm ­
abbiltà tal-gass. Jekk isse ħħ il-fjammabbiltà tal-gass mhuwa me ħtieġ 
l-ebda test ie ħor tas-sustanza g ħaliex is-sustanza hija meqjusa b ħala 
perikoluża. 
1.6.2.  Pass 2  
1.6.2.1.  Apparat  
Karta filtru titpo ġġa tgħum fil-wi ċċ ta' l-ilma distillat fi kwalunkwe 
reċipjent adattat, e ż. dixx g ħall-evaporazzjoni b'dijametru ta' 
100 mm.  
1.6.2.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20  o C). 
1.6.2.3.  L-eżekuzzjoni tat-test  
Kwantità żgħira tas-sustanza g ħat-test (approssimattivament 2 mm 
dijametru) g ħandha titpo ġġa fin-nofs tal-karta filtru. G ħandu jkun 
innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk se ħħitx il-fjammabilità 
tal-gass. Jekk isse ħħ it-tqabbid tal-gass mhuwa me ħtieġ l-ebda test 
ieħor tas-sustanza g ħaliex is-sustanza hija meqjusa b ħala perikolu ża. 
1.6.3.  Pass 3  
1.6.3.1.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20  o C). 
1.6.3.2.  L-eżekuzzjoni tat-test  
Is-sustanza g ħat-test hija mag ħmula f’gozz approssimattivament 2 cm 
għoli u 3 cm dijametru bi ftit fond fil-qu ċċata. Jiżdiedu ftit qtar ta' 
ilma fil-post fond u g ħandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass 
u (ii) jekk se ħħitx il-fjammabilità tal-gass. Jekk isse ħħ il-fjamm ­
abbiltà tal-gass mhuwa me ħtieġ l-ebda test ie ħor tas-sustanza 
għaliex is-sustanza hija meqjusa b ħala perikolu ża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Pass 4  
1.6.4.1.  Apparat  
L-apparat ji ġi mmuntat kif jidher fil-figura.  
1.6.4.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Spezzjona l-kontenitur tas-sustanza g ħat-test għal xi trab < 500 μm 
(daqs tal-partikula). Jekk it-trab jikkostitwixxi aktar minn 1 % 
w/w tat-total, jew jekk il-kampjun jista' jitfarrak malajr, allura l- ammont kollu tas-sustanza g ħandu jitfarrak fi trab qabel it-test 
sabiex jippermetti tnaqqis fid-daqs tal-partikula matul il- ħażna u l- 
immaniġġar; inkella s-sustanza g ħandha tkun ittestjata kif tkun 
irċevuta. It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20
 o C) 
u pressjoni atmosferika.  
1.6.4.3.  L-eżekuzzjoni tat-test  
Minn 10 sa 20 ml ta' ilma jitpo ġġew fil-lembut tal-qtar ta' l-apparat 
u 10 g tas-sustanza jitpo ġġew fi flixkun koniku. Il-volum tal-gass li 
jevolvi jista' jitkejjel bi kwalunkwe mezz adattat. It-tapp tal-lembut tal-qtar ji ġi miftuħ biex iħalli l-ilma jid ħol fil-flixkun koniku u l- 
arloġġ tal-ħin jibda jit ħaddem. L-evoluzjoni tal-gass titkejjel kull 
siegħa matul perjodu ta' seba’ sig ħat. Jekk, matul dan il-perjodu, l- 
evoluzzjoni tal-gass hija irregolari, jew jekk, fi tmiem dan il-perjodu, ir-rata ta' l-evoluzzjoni tal-gass qed ti żdied, allura l-kejl g ħandu 
jitkompla sa ħamest ijiem. Jekk, fi kwalunkwe ħin tal-kejl ir-rata 
tal-gass taqbe ż il-1 litru/kg g ħal kull sieg ħa, it-test g ħandu jieqaf. 
It-test għandu jsir g ħal tliet darbiet.
 
Jekk l-identità kimika tal-gass ma tkunx mag ħrufa, il-gass g ħandu 
jkun analizzat. Meta l-gass jinkludi komponenti fjammabbli ħafna 
u mhux mag ħruf jekk it-ta ħlita kollha hijiex fjammabbli ħafna, 
taħlita ta' l-istess kompo żizzjoni g ħandha tit ħejja u tkun ppruvata 
skond il-metodu A.11.  
2. DATA  
Is-sustanza titqies li hija perikolu ża jekk:  
— isseħħ fjammabilità spontanja f’kull stadju tal-pro ċedura tat-test,  
jew 
— hemm evoluzzjoni ta' gass fjammabbli b'rata akbar minn 1 
litru/kg tas-sustanza g ħal kull sieg ħa. 
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibbli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identifikazzjoni 
u impuritajiet),  
— dettalji ta' kwalunkwe Preparazzjoni inizjali tas-sustanza g ħat- 
test, ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— ir-riżultati tat-testijiet (passi 1, 2, 3 u 4),  
— l-identità kimika tal-gass evolut,  
— ir-rata ta' evoluzzjoni ta' gass jekk pass 4 (1.6.4) jitwettaq,  
— kwalunkwe rimarki relevanti g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Appendiċi 
Figura  
Apparat
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  PROPRJETAJIET PIROFORI ĊI TA' SOLIDI U LIKWIDI  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Il-proċedura tat-test hija applikabbli g ħal sustanzi solidi jew likwidi, 
li, f’ammonti żgħar, jaqbdu spontanjament f’ ħin qasir wara li 
jagħmlu kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20  o C). 
Sustanzi li je ħtieġ li jkunu esposti g ħall-arja għal sigħat jew ġranet 
f’temperatura ambjentali jew f’temperaturi elevati qabel ma sse ħħ il- 
fjammabilità mhumiex koperti b'dan il-metodu ta' test.  
1.2 TIFSIRIET U UNITAJIET  
Sustanzi huma kkunsidrati li g ħandhom proprjetajiet pirofori ċi jekk 
huma jaqbdu jew jikkaw żaw ħruq sakemm l-o ġġett isir faħam skond 
il-kondizzjonijiet mfissra f’1.6.  
L-awto-fjammabilità ta' likwidi tista' tkun ittestjata bl-u żu tal-metodu 
A.15 Temperatura ta' awto-fjammabilità (likwidi u gassijiet).  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Mhux spe ċifikati.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Is-sustanza, kemm jekk solida kif ukoll likwida, ti żdied ma'  carrier  
inert u titqieg ħed f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali g ħal 
perjodu ta' ħames minuti. Jekk is-sustanzi likwidi ma jaqbdux allura 
huma assorbiti f’karta filtru u esposti g ħall-arja f’temperatura 
ambjentali (circa 20  o C) għal ħames minuti. Jekk solidu jew 
likwidu jaqbad, jew likwidu jaqbad jew jag ħmel ifaħħam karta 
filtru, allura s-sustanza hija meqjusa b ħala piroforika.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Ripetibbilità: min ħabba l-importanza fir-rigward tas-ikurezza, ri żultat 
pożittiv wieħed huwa suffi ċjenti biex is-sustanza ti ġi kkunsidrata 
bħala piroforika.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TEST  
1.6.1.  Apparat  
Kapsula tal-por ċellana ta' dijametru circa 10 cm ti ġi mimlija bi trab  
diatomaceous  sa għoli ta' madwar 5 mm f’temperatura ambjentali 
(circa 20  o C). 
Nota:  
It-trab  diatomaceous  jew kwalunkwe sustanza inerta komparabbli 
oħra li hija disponibbli b'mod ġenerali g ħandha titqies b ħala 
rappreżentattiva ta' ħamrija li fiha s-sustanza g ħat-test tista' tintefa' 
f'każ ta' inċident.  
Karta filtru niexfa hija me ħtieġa biex ikunu ttestjati likwidi li ma 
jaqbdux f'kuntatt ma' l-arja meta jkunu f'kuntatt ma'  carrier  inert.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  L-e żekuzzjoni tat-test  
a) Solidi trab  
Minn 1 sa 2 cm  3 mis-sustanza g ħat-test jitferraw minn g ħoli ta' circa 
1 m fuq superfi ċje mhux kombustibbli u ji ġi osservat jekk is- 
sustanza taqbadx matul it-tferrig ħ jew fi żmien ħames minuti wara 
li toqgħod. 
It-test jitwettaq sitt darbiet kemm-il darba ma sse ħħx il-fjammabilità.  
b) Likwidi  
Madwar 5 cm  3 mil-likwidu g ħat-test jitferra’ f’kapsula tal-por ċellana 
mħejjija u ji ġi osservat jekk is-sustanza taqbadx fi żmien ħames 
minuti.  
Jekk ma sse ħħ l-ebda fjammabilità f’sitt testijiet, g ħandhom jitwettqu 
dawn it-testijiet:  
Kampjun ta' 0,5 mm jintefa' permezz ta' siringa fuq karta filtru bit- 
tarf f’forma ta' serrieq u ji ġi osservat jekk isse ħħx fjammabilità jew 
ħruq sakemm titfa ħħam il-karta filtru fi żmien ħames minuti li 
jiżdied il-likwidu. It-test jitwettaq tliet darbiet kemm-il darba ma 
sseħħx il-fjammabbiltà u t-tfa ħħim. 
2. DATA  
2.1. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
It-test jista' jitwaqqaf hekk kif ise ħħ riżultat pożittiv f’xi wie ħed mit- 
testijiet.  
2.2. VALUTAZZJONI  
Jekk is-sustanza taqbad fi żmien ħames minuti meta ti żdied ma'  
courier  inert u tkun esposta g ħall-arja, jew jekk sustanza likwida 
tinħaraq sakemm issir fa ħam jew tqabbad karta filtru fi żmien 
ħames minuti meta mi żjuda jew esposta g ħall-arja, hija kkkunsidrata 
bħala piroforika.  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identifikazzjoni 
u impuritajiet),  
— ir-riżultat tat-test,  
— kwalunkwe rimarka relevanti g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  PROPRJETAJIET ESPLO ŻIVI 
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodu jipprovdi skema ta' testijiet biex ji ġi ddeterminat jekk 
sustanza solida jew f’forma ta' pejst tippre żentax perikolu ta' 
splużjoni meta tkun sottomessa g ħall-effett ta' fjamma (sensittività 
termika), jew g ħal xokk jew frizzjoni (sensittività g ħal stimuli 
mekkaniċi), u jekk sustanza likwida tippre żentax periklu ta' 
splużjoni meta sottomessa g ħall-effett ta' fjamma jew xokk.  
Il-metodu fih tliet partijiet:  
(a) test ta' sensittività termika (1);  
(b) test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' xokk (1);  
(ċ) test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' frizzjoni (1).  
Il-metodu jforni DATA biex tkun evalwata l-probabbiltà li tinbeda 
splużjoni permezz ta' ċerti stimuli komuni. Il-metodu mhuwiex 
maħsub biex ja ċċerta jekk sustanza hijiex kapa ċi li tesplodi ta ħt 
kwalunkwe kondizzjonijiet.  
Il-metodu huwa adattat biex ikun iddeterminat jekk sustanza 
tippreżentax periklu ta' splu żjoni (termika jew sensittività mekkanika) 
taħt kondizzjonijiet partikulari spe ċifikati fid-Direttiva. Huwa bba żat 
fuq numru ta' tipi ta'apparati li huma u żati ħafna internazzjonalment 
(1) u li s-soltu jag ħtu riżultati sinifikattivi. Huwa rikonoxxut li l- 
metodu mhuwiex definittiv. Apparat alternattiv g ħal dak spe ċifikat 
jista' jintu ża kemm-il darba huwa rikonoxxut internazzjonalment u li 
r-riżultati jistg ħu jkunu korrelatati adegwatament ma' dawk minn 
apparat spe ċifikat.  
M'hemmx g ħalfejn jitwettqu t-testijiet meta informazzjoni termodi ­
namika hija disponibbli (e ż. is-sħana tal-formazzjoni, is-s ħana tad- 
dekompożizzjoni) u/jew l-assenza ta' ċerti gruppi reattivi (2) fil- 
formula strutturali tistabbilixxi ming ħajr dubju ra ġjonevoli li s- 
sustanza mhijiex kapa ċi li tiddekomponi malajr bl-evoluzzjoni tal- 
gassijiet jew bir-rilaxx ta' s ħana (i.e. il-materjal ma jippre żenta l-ebda 
riskju ta' splu żjoni). Test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' 
frizzjoni mhuwiex me ħtieġ għal-likwidi.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Esplożiv: 
Sustanzi li jistg ħu jisplodu ta ħt l-effett ta' fjamma jew li huma 
sensittivi g ħal xokk jew frizzjoni fl-apparat spe ċifikat (jew li huma 
sensittivi mekkanikament aktar minn 1,3  dinitrobenzene  f’apparat 
alternattiv).  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
1,3-dinitrobenzene , prodott ta' kristallina teknika mg ħarbul biex 
jgħaddi minn 0,5 mm, g ħall-metodi ta' frizzjoni u ta' xokk.  
Perhydro -1.3.5- trinitro -1.3.5- triazine  (RDX,  hexogen , ċiklonite-CAS 
121-82-4), rikristallizzat minn  cyclohexogen  fl-ilma, mg ħarbel fl-ilma 
minn 250 μm u miżmum fuq g ħarbiel ta' 150 μm u mnixxef f’103 ± 
2 o C (għal erba' sig ħat) għat-tieni serje ta' frizzjoni u testijiet ta' 
xokk.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Testijiet preliminari huma ne ċessarji biex ikunu stabbiliti 
kondizzjonijiet bla periklu g ħall-eżekuzzjoni tat-tliet testijiet ta' 
sensittività.  
1.4.1.  Testijiet ta' sikurezza fl-immani ġġjar (3)  
Għal raġunijiet ta' sikurezza, qabel jitwettqu t-testijiet ewlenin, 
kampjuni żgħar ħafna (madwar 10 mg) tas-sustanza ji ġu soġġetti 
għas-sħana ming ħajr għeluq fi fjamma tal-gass, g ħal xokk fi 
kwalunkwe forma konvenjenti ta' apparat u g ħal frizzjoni bl-u żu ta' 
martell b'ras ta' l-injam kontra inkwina jew kwalunkwe forma ta' 
magna g ħall-frizzjoni. L-g ħan huwa li jkun assigurat jekk is- 
sustanza hijiex daqshekk sensittiva u esplo żiva li t-testijiet ta' sensit ­
tività preskritti, b'mod partikolari dak tas-sensittività termika, 
għandhomx jitwettqu bi prekawzjonijiet spe ċjali sabiex ji ġi evitat 
korriment ta' l-operatur.  
1.4.2.  Sensittività termika  
Il-metodu jinvolvi t-tis ħin tas-sustanza f’tubu ta' l-azzar, mag ħluq bi 
pjanċi miftuħa b'dijametri ta' toqob differenti, biex ikun iddeterminat 
jekk is-sustanza g ħandhiex tendenza li tisplodi ta ħt kondizzjonijiet ta' 
sħana intensa u g ħeluq definit.  
1.4.3.  Sensittività mekkanika (xokk)  
Il-metodu jinvolvi li s-sustanza tkun so ġġetta għal xokk minn pi ż 
speċifikat mwaqqa’ minn g ħoli speċifikat.  
1.4.4.  Sensittività mekkanika (frizzjoni)  
Il-metodu jinvoli li sustanza solida jew f’forma ta' pejst tkun so ġġetta 
għal frizzjoni bejn spuperfi ċje standard ta ħt kondizzjonijiet spe ċifiċi 
ta' tagħbija u moviment relattiv.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Mhux definiti.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Sensittività termika (effett ta' fjamma)  
1.6.1.1.  Apparat  
L-apparat jikkonsisti f’tubu ta' l-azzar li ma jer ġax jintuża bi 
strument li jag ħlaq u li jer ġa' jintuża (figura 1) installat fi strument 
ta' sħana u ta' protezzjoni. Kull tubu huwa mi ġbud minn pjan ċa ta' l- 
azzar (ara l-Appendi ċi) u li għandu dijametru intern ta' 24 mm, tul ta' 
75 mm u ħxuna tal-qoxra ta' 0,5 mm. It-tubu g ħandu flan ġ fil-ġenb 
tal-ftuħ biex ikun jista' jing ħalaq bl-immuntar tal-pjan ċa miftuħa. 
Dan jikkonsisti fi pjan ċa miftuħa li tirre żisti l-pressjoni, b'toqba 
ċentrali, marbuta sewwa ma' tubu bl-u żu ta' vit f’ żewġ partijiet (vit 
u skorfina bil-kamin). Il-vit u l-iskorfina bil-kamin huma mag ħmulin 
minn azzar tal-kromju-mangani ż (ara l-Appendi ċi) li ma jisparkjax sa 
800  o C. Il-pjan ċi miftuħin huma 6 mm ħoxnin, mag ħmula minn 
azzar reżistenti għas-sħana, u huma disponibbli b'firxa ta' dijametri 
fil-ftuħ. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Normalment is-sustanza ti ġi ttestjata kif tkun ri ċevuta għalkemm 
f’ċerti każijiet, eż. jekk ippressata, mag ħmula f’forma jew ikkon ­
densata b'xi mod ie ħor, ikun ne ċessarju li s-sustanza ti ġi ttestjata 
wara it-tifrik.  
Għal solidi, il-pi ż tal-materjal g ħall-użu f’kull test huwa ddeterminata 
bl-użu ta' testijiet f’ żewġ stadji f’forma niexfa. Tubu miksi bil-qatran 
jimtela b“9 cm  3 ta' sustanza u s-sustanza ti ġi kompatta b'forza ta' 80 
N applikata fuq it-trasversali totali tat-tubu. G ħal raġunijiet ta' 
sikurezza jew f’ka żijiet fejn il-forma fi żika tal-kampjun tista' 
tinbidel b'kompressjoni jistg ħu jintużaw proċeduri ta' mili o ħrajn, 
eż. jekk is-sustanza hija sensittiva ħafna għal frizzjoni allura l-ikkom ­
pattjar mhuwiex adattat. Jekk il-materjal huwa kompressibbli ji żdied 
aktar materjal u ji ġi kkompattjat sakemm it-tubu jimtela” sa 55 mm 
minn fuq. Il-pi ż totali użat biex jimtela’ t-tubu sal-livell ta' 55 mm 
huwa ddeterminat u jsiru żewġ żidiet oħra, kull wa ħda kkompattjata 
b'forza ta' 80N. Imbag ħad jiżdied il-materjal jew bl-ikkompattjar, jew 
billi jinħareġ barra, kif ikun me ħtieġ, sabiex it-tubu jit ħalla mimli sa 
livell ta' 15 mm minn fuq. Jitwettaq test ie ħor niexef, fil-bidu bi 
kwantità kkompattjata ta' terz mill-pi ż totali misjuba fl-ewwel test 
niexef. Żewġ żidiet oħra minn dawn isiru flimkien ma' ikkompattjar 
ta' 80 N u l-livell tas-sustanza fit-tubu ji ġi aġġustat sa 15 mm minn 
fuq biż-żieda jew bit-tnaqqis tal-materjal kif me ħtieġ. L-ammont ta' 
solidu ddeterminat fit-tieni test niexef jintu ża f’kull test; billi l-mili 
jitwettaq fi tliet ammonti ugwali, kull wie ħed kompressat sa 9 cm  3 
b'kull mod ta' forza ne ċessarju. (Dan jista' jkun iffa ċilitat bl-u żu ta' 
ħoloq li jo ħolqu spazju).  
Likwidi u ġels jintefg ħu fit-tubu sa g ħoli ta' 60 mm b'attenzjoni 
partikulari fejn jid ħlu l-ġels biex tkun evitata l-formazzjoni ta' 
spazju vojt. L-iskorfina bil-kamin tidda ħħal madwar it-tubu mill- 
qiegħ, tiddaħħal il-pjan ċa mtaqqba u l-vit ji ġi ssikkat wara l-appli ­
kazzjoni ta' ftit lubrikant bba żat fuq  disulphide tal-molibdenu . Huwa 
essenzjali li ji ġi ċċekkjat li xejn mis-sustanza ma jinqabad bejn il- 
flanġ u l-pjanċa, jew fil- ħjut. 
Is-sħana tiġi pprovduta mill-propan me ħud minn ċilindru industrijali, 
mgħammar b'regolatur tal-pressjoni (60 sa 70 mbar), permezz ta' 
arloġġ u distribwit ugwalment (kif indikat b'osservazzjoni vi żwali 
tal-fjammi mill-berners) minn manifold g ħal erba' berners. Il- 
berners huma lokalizzati madwar il-kompartiment tat-test kif jidher f’figura 1. L-erba' berners flimkien g ħandhom konsum ta' madwar 
3,2 litri ta' propan g ħal kull minuta. Jistg ħu jintuża gassijiet kombus ­
tibbli u berners alternattivi i żda r-rata tat-tis ħin trid tkun kif spe ċ­
ifikata fil-figura 3. G ħall-apparati kollha, ir-rata tat-tis ħin trid tkun 
iċċekkjata perjodikament bl-u żu ta' tubi mimlija b ’ dibutyl phthalate  
kif indikat fil-figura 3.
 
1.6.1.3.  L-eżekuzzjoni tat-testijiet  
Kull test jitwettaq sakemm jew it-tubu jitfarrak jew it-tubu jkun 
issaħħan għal ħames minuti. Test li jirri żulta fil-frammentazzjoni 
tat-tubu fi tliet bi ċċiet jew aktar, li f’xi ka żijiet jistgħu jkunu kkon ­
nettjati ma' xulxin bi strixxi dojoq tal-metall kif muri fil-figura 2, huwa evalwat b ħala wieħed li jag ħti splużjoni. Test li jirri żulta 
f’biċċiet inqas jew ebda frammentazzjoni ji ġi meqjus b ħala wieħed 
li ma tax splu żjoni.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
L-ewwel titwettaq serje ta' tliet testijiet bi pjan ċa mtaqqba b'di ­
jametru ta' 6,0 mm u, jekk ma tinkiseb ebda splu żjoni, titwettaq 
serje oħra ta' tliet testijiet bi pjan ċa mtaqqba b'dijametru ta' 
2,0 mm. Jekk isse ħħ splużjoni matul xi wa ħda mis-serje ta' testijiet 
allura mhumiex me ħtieġa aktar testijiet.  
1.6.1.4.  Valutazzjoni  
Ir-riżultat tat-test ji ġi kkunsidrat b ħala pożittiv jekk isse ħħ splużjoni 
f’xi waħda mis-serje ta' testijiet t'hawn fuq.  
1.6.2.  Sensittività mekkanika (xokk)  
1.6.2.1.  Apparat (figura 4)  
Il-partijiet essenzjali ta' apparat bil-martell li jaqa' tipiku huma 
blokka ta' l-azzar fondut bil-ba żi, inkwina, kolonna, gwidi, pi żijiet 
li jaqgħu, apparat g ħar-rilaxx u re ċipjent għall-kampjun. L-inkwina 
ta' l-azzar 100 mm (dijametru) x 70 mm (g ħoli) tiġi invitata mal-wi ċċ 
tal-blokka ta' l-azzar 230 mm (twila) x 250 mm (wiesa’) x 200 mm (għolja) b'ba żi fonduta 450 mm (twila) x 450 mm (wiesa’) x 60 mm 
(għolja). Kolonna mag ħmula minn tubu ta' l-azzar ming ħajr 
saldatura, tintrabat mar-re ċipjent invitat ma' wara tal-blokka ta' l- 
azzar. Erba' viti jorbtu lill-apparat ma' blokka tal-konkrit solida 60 x 60 x 60 cm b'tali mod li l-gwidi huma assolutament vertikali u l- piżijiet li jaqg ħu jistgħu jaqgħu liberament. Pi żijiet ta' 5 u 10 kg, 
magħmula minn azzar solidu, huma disponibbli g ħall-użu. Il-parti ta' 
fuq li tag ħmel impatt g ħal kull pi ż hija ta' azzar imwebbes, HRC 60 
sa 63, u g ħandha dijametru minimu ta' 25 mm.
 
Il-kampjun g ħat-test jing ħalaq f’apparat g ħax-xokk li jikkonsistit 
f’żewġ ċilindri ta' l-azzar solidu koassjali, wie ħed fuq l-ie ħor, 
f'ħolqa gwida ċilindrika m ħaffra. Iċ-ċilindri ta' l-azzar solidu 
għandhom ikunu ta' 10 (- 0,003, - 0,005) mm dijamtru u 10 mm 
għoli u jkollhom u ċuħ ippolixxjati, ġnub fit-tond (ra ġġ tal-kurvatura 
ta' 0,5 mm) u l-g ħebusija ta' HRC minn 58 sa 65. I ċ-ċilindru m ħaffer 
irid ikollu dijametru estern ta' 16 mm, toqba ppolixxjata ta' 10 (+ 0,005, + 0,010) mm u g ħoli ta' 13 mm. L-apparat g ħax-xokk ji ġi 
mmuntat fuq inkwina intermedjarja (26 mm dijametru u 26 mm 
għoli) magħmula minn azzar u ċċentrata b' ħolqa b'perforazzjonijiet 
biex tippermetti l- ħruġ ta' dħaħen.
 
1.6.2.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Il-volum tal-kampjun irid ikun 40 mm  3 , jew volum li huwa adattat 
ma' kwalunkwe apparat alternattiv. Sustanzi solidi g ħandhom ikunu 
ppruvati fi stat niexef u m ħejjija kif ġej: 
(a) sustanzi mfarrka ji ġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-g ħarbiel 
0,5 mm); dak kollu li jg ħaddi mill-g ħarbiel jintu ża għat-test;  
(b) sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kondensati ji ġu mkissra 
fi bċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mg ħarbula minn 0,5 sa 
1 mm dijametru tintu ża għat-test u g ħandha tkun rappre żentattiva 
tas-sustanza ori ġinali.  
Sustanzi pprovduti normalment b ħala pejst g ħandhom ikunu ppruvati 
fi stat niexef fejn possibbli jew, wara t-tne ħħija ta' l-ammont 
massimu possibbli ta' dilwent. Sustanzi likwidi ji ġu ppruvati bi 
spazju ta' 1 mm bejn i ċ-ċilindri ta' l-azzar ta' fuq u t’isfel.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  L-eżekuzzjoni tat-testijiet  
Jitwettqu serje ta' sitt testijiet bit-twaqqig ħ tal-piż ta' 10 kg minn 
0,40 m (40 J). Jekk tinkiseb splu żjoni matul is-sitt testijiet f’40 
J, trid titwettaq serje o ħra ta' sitt testijiet, bit-twaqqig ħ ta' piż ta' 
5 kg minn 0,15 m (7,5 J). F’apparati o ħrajn, il-kampjun jitqabbel 
mas-sustanza ta' referenza mag ħżula bl-użu ta' proċedura stabbilita 
(eż. bit-teknika ta' 'l fuq u 'l isfel e ċċ.). 
1.6.2.4.  Valutazzjoni  
Ir-riżultat tat-test ji ġi kkunsidrat po żittiv jekk splu żjoni (il-bidu ta' 
fjamma u/jew ta' rapport huma ekwivalenti g ħal splużjoni) isseħħ ta' 
l-inqas darba f'xi wie ħed mit-testijiet bl-apparat g ħax-xokk spe ċifikat 
jew il-kampjun huwa aktar sensittiv minn 1, 3– dinitrobenzene  jew 
RDX f’test tax-xokk alternattiv.  
1.6.3.  Sensittività mekkanika (frizzjoni)  
1.6.3.1.  Apparat (figura 5)  
L-apparat tal-frizzjoni jikkonsisti fi pjan ċa tal-bażi magħmula minn 
azzar fondut li fuqha ji ġi mmuntat l-apparat ta' frizzjoni. Dan 
jikkonsisti f’ ċilindru fiss tal-por ċellana u pjan ċa mobbli tal- 
porċellana. Il-pjan ċa tal-porċellana tin żamm fuq keri ġ li tiġri fuq 
żewġ gwidi. Il-keri ġ tiġi kkonnettjata ma' mutur ta' l-elettriku 
permezz ta' virga li tikkonnettja, kamm e ċċentriku u apparat ta' 
trażmissjoni adattat biex il-pjan ċa tal-por ċellana titmexxa, darba 
waħda, lura u'l quddiem ta ħt iċ-ċilindru tal-por ċellana għal distanza 
ta' 10 mm. I ċ-ċilindru jista' jitg ħabba b'eż. 120 jew 360 newtons.  
Il-pjanċi ċatti tal-por ċellana huma mag ħmula minn por ċellana teknika 
bajda (ħruxija minn 9 sa 32 μm) u għandhom dimensjonijiet 25 mm 
(tul) x 25 mm (wisa') × 5 mm (g ħoli). Iċ-ċilindru tal-por ċellana huwa 
magħmul ukoll minn por ċellana teknika bajda u huwa twil 
15 m, g ħandu dijametru ta' 10 mm u w ċuħ tal-ġnub sferikali 
ħorox b'raġġ ta' kurvatura ta' 10 mm.  
1.6.3.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Il-volum tal-kampjun irid ikun ta' 10 mm  3 , jew volum li huwa adattat 
għal kwalunkwe apparat alternattiv.  
Sustanzi solidi g ħandhom ikunu ttestjati fi stat niexef u m ħejjija kif 
ġej: 
(a) sustanzi mfarrka ji ġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-g ħarbiel 
0,5 mm); dak kollu li jg ħaddi mill-g ħarbiel jintu ża għat-test;  
(b) sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kkondensati ji ġu 
mkissra fi b ċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mg ħarbula ta' 
< 0,5 mm dijametru tintu ża għat-test.  
Sustanzi forniti normalment b ħala pejsts g ħandhom ikunu ppruvati fi 
stat niexef fejn huwa possibbli. Jekk is-sustanza ma tistax tit ħejja fi 
stat niexef, il-pejst (wara t-tne ħħija ta' l-ammont massimu possibbli 
ta' dilwent) ji ġi ppruvat b ħala liega 0,5 mm ħoxna, 2 mm wiesa’, 
10 mm twila, ippreparata ma' ta' qabel.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  L-eżekuzzjoni tat-testijiet  
Iċ-ċilindru tal-por ċellana jidda ħħal fil-kampjun g ħat-test u ti ġi 
applikata l-forza. Meta jkun qed jitwettaq it-test, il-marki ta' l- isponża tal-pjan ċa tal-porċellana jridu jkunu b'mod trasversali mad- 
direzzjoni tal-moviment. Trid ting ħata attenzjoni li ċ-ċilindru jistrie ħ 
fuq il-kampjun, li jkun hemm materjal tat-test suffi ċjenti taħt iċ- 
ċilindru u anke li l-pjan ċa timxi b'mod korrett ta ħt iċ-ċilindru. 
Għal sustanzi f’forma ta' pejst, gej ġ bi ħxuna ta' 0,5 mm b'xaqq ta' 
2 x 10 mm jintu ża biex tkun applikata s-sustanza mal-pjan ċa. Il- 
pjanċa tal-porċellana trid timxi 10 mm il quddiem u lura ta ħt iċ- 
ċilindru tal-por ċellana f’ħin ta' 0,44 sekondi. Kull parti tas-superfi ċje 
tal-pjanċa trid tintu ża darba biss; i ż-żewġt itruf ta' kull ċilindru jservu 
għal żewġ provi u kull wa ħda miż-ż
ewġ superfiċji tal-pjan ċa sservi 
għal tliet provi.  
Jitwettqu serje ta'sitt testijiet b'tag ħbija ta' 360 N. Jekk ri żultat 
pożittiv jinkiseb matul dawn is-sitt testijiet, serje o ħra ta' sitt 
testijiet trid titwettaq b'tag ħbija ta' 120 N. F’apparati o ħra, il- 
kampjun huwa mqabbel ma' sustanza ta' referenza mag ħżula bl-użu 
ta' proċedura stabbilita (e ż. teknika ta' ‘l fuq u ‘l isfel, e ċċ.). 
1.6.3.4.  Valutazzjoni  
Ir-riżultat tat-test ji ġi kkunsidrat po żittiv jekk splu żjoni (tifqig ħ u/jew 
rapport jew kombustibilità fi fjamma huma ekwivalenti g ħal 
splużjoni) titwettaq g ħall-inqas darba f'xi wie ħed mit-testijiet bl- 
apparat spe ċifiku ta' frizzjoni jew il-kriterji ekwivalenti f'test ta' 
frizzjoni alternattiv ikunu ssodisfati.  
2. DATA  
Fil-prinċipju, sustanza hija kkunsidrata li tippre żenta periklu ta' 
splużjoni fis-sens tad-Direttiva jekk ri żultat pożittiv jinkiseb fit-test 
termiku, bix-xokk jew bis-sensittività tal-frizzjoni.  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— identità, kompo żizzjoni, purità, kontenut ta' umdità e ċċ. tas- 
sustanza ttestjata.  
— il-forma fi żika tal-kampjun u jekk kienx imfarrak, miksur u/jew 
mgħarbul,  
— l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet g ħas-sensittività termika (e ż. 
piż b'kampjun, numru ta' frammenti e ċċ.), 
— l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet g ħas-sensittività mekkanika 
(eż. il-formazzjoni ta' ammonti konsiderevoli ta' du ħħan jew 
dekompożizzjoni kompleta ming ħajr rapport, fjammi, sparks, 
rapport, tifqig ħ eċċ.), 
— ir-riżultati ta' kull test,  
— jekk intu ża apparat alternattiv, trid ting ħata ġustifikazzjoni alter ­
nattiva kif ukoll xhieda ta' korelazzjoni bejn ri żultati miksuba 
b'apparat spe ċifiku u dawk miksuba b'apparat ekwivalenti,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— kwalunkwe kummenti utli b ħal referenza g ħal testijiet bi prodotti 
simili li jistg ħu jkunu relevanti g ħall-interpretazzjoni proprja tar- 
riżultati,  
— ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati.  
3.2. INTERPRETAZZJONI U VALUTAZZJONI TA' RI ŻULTATI  
Ir-rapport tat-test irid isemmi kwalunkwe ri żultati li huma kkunsidrati 
foloz, anomali jew mhux rappre żentattivi. Jekk xi wie ħed mir- 
riżultati għandu jitwarrab, g ħandha ting ħata spjegazzjoni u r- 
riżultati ta' l-ittestjar supplimentari. Sakemm ri żultat anomalu ma 
jkunx spjegat, irid ikun a ċċettat skond l-apparenza u u żat biex 
tkun ikklassifikata s-sustanza skond il-ka ż. 
4. REFERENZI  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol.3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use 
-Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Appendiċi 
Eżempju ta' spe ċifikazzjoni ta' materjal g ħal test ta' sensittività termika (ara 
DIN 1623)  
(1) Tubu: Spe ċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.0336.505 g  
(2) Pjanċa mħaffra: Spe ċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.4873  
(3) Il-vit fil-kamin u l-iskorfina: Spe ċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.3817  
Figura 1  
Apparat g ħat-test tas-sensittività termika  
(d-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figura 2  
Test tas-sensittività termika  
(eżempju ta' frammentazzjoni)
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figura 3  
Il-kalibrazzjoni tar-rata ta' tis ħin għat-test tas-sensittività termika
  
Il-kurvatura tat-temperatura/ ħin miksuba bit-tis ħin ta'  dibutyl phtalate  (27 cm  3 ) f'tubu mag ħluq 
(1,5 mm pjan ċa mħaffra) bl-u żu ta' rata ta' fluss tal-propan ta' 3,2 litru/minuta. It-temperatura 
tiġi mkejla b'termokoppja ta' azzar li ma jissaddadx miksi b’ chromel/alumel  ta' 1mm dijametru, 
impoġġija fiċ-ċentru 43 mm ta ħt ix-xifer tat-tubu. Ir-rata tat-tis ħin bejn 135  o C u 285  o C 
għandha tkun bejn 185 u 215 K/minuta.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figura 4  
Apparat g ħat-test bix-xokk  
(i-dimensjonijiet huma kollha f'millimetri)
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figura 4  
Kontinwazzjoni
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figura 5  
Apparat g ħas-sensittività tal-frizzjoni.
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ (LIKWIDI 
U GASSIJIET)  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Sustanzi esplo żivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l- 
arja f’temperatura ambjentali m‘g ħandhomx ikunu sottomessi g ħal 
dan it-test. Il-pro ċedura tat-test hija applikabbli g ħal gassijiet, 
likwidi u fwawar li, fil-pre żenza ta' l-arja, jistg ħu jitqabbdu b'su ­
perfiċje sħuna. 
It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità tista' titqies imnaqqsa b'mod 
konsiderevoli bil-pre żenza ta' impuritajiet kataliti ċi, b'materjal tas- 
superfiċje u b'volum akbar tar-re ċipjent tat-test.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Il-grad ta' l-awto-fjammabilità huwa espress f’termini ta' temperatura 
ta' awto-fjammabilità. It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità hija l- inqas temperatura li fiha s-sustanza g ħat-test taqbad meta m ħallta 
ma' l-arja ta ħt kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test.
 
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta' referenza huma ċitati fl-istandards (ara 1.6.3.). Huma 
għandhom iservu primarjament biex ji ċċekkjaw ir-rendiment tal- 
metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' 
riżultati minn metodi o ħra. 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Il-metodu jiddetermina t-temperatura minima tal-qoxra ta' ġewwa ta' 
reċipjent mag ħluq li tirri żulta fil-fjammabilità ta' gass, fwar jew 
likwidu injettat fir-re ċipjent.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala ta' l-awto-fjammabilità u l-metodu 
tat-test użat. 
Is-sensittività u l-ispe ċifiċità jiddependu fuq il-metodu tat-test u żat. 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Apparat  
L-apparat huwa mfisser fil-metodu riferut f’1.6.3.  
1.6.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Kampjun tas-sustanza tat-test ji ġi ttestjat skond il-metodu msemmi 
f’1.6.3.  
1.6.3.  L-e żekuzzjoni tat-test  
Ara IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DATA  
Irreġistra t-temperatura tat-test, il-pressjoni atmosferika, il-kwantità 
użata mill-kampjun u l-intervall ta' ħin sakemm issir il-fjammabilità.  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-ispeċifikazzjoni pre ċiża tas-sustanza (identifikazzjoni 
u impuritajiet),  
— il-kwantità ta' kampjun u żata, il-pressjoni atmosferika,  
— l-apparat u żat, 
— ir-riżultat tal-kejl (temperaturi tat-test, ri żultati li jirrigwardaw il- 
fjammabilità, u l-intervalli ta' ħin korrispondenti),  
— ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati.  
4. REFERENZI  
Xejn.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ RELATTIVA 
GĦAL SOLIDI  
1. METODU  
1.1 DA ĦLA 
Sustanzi esplo żivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l- 
arja f’temperatura ambjentali m'g ħandhomx ikunu sottomessi g ħal 
dan it-test.  
L-għan ta' dan it-test huwa li jipprovdi informazzjoni preliminari 
dwar l-awto-fjammabilità ta' sustanzi solidi f’temperaturi elevati.  
Jekk is-sħana li tiżviluppa jew b'reazzjoni tas-sustanza ma' l-ossi ġenu 
jew b’dekompo żizzjoni eżotermika ma tintilifx malajr bi żżejjed fil- 
madwar, ise ħħ awto-tisħin li jwassal g ħall-awto-fjammabilità. Awto- 
fjammabilità g ħalhekk isse ħħ meta r-rata ta' produzzjoni tas-s ħana 
taqbeż ir-rata tat-telf tas-s ħana. 
Il-proċedura tat-test hija utli b ħala test ta' skrinjar preliminari g ħal 
sustanzi solidi. Min ħabba n-natura komplessa tal-fjammabilità u l- 
kombustjoni ta' solidi, it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità ddeter ­
minata skond dan il-metodu ta' test g ħandha tintu ża għal għanijiet ta' 
tqabbil biss.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
It-temperatura ta' awto-fjammabilità kif miksuba b'dan il-metodu hija 
t-temperatura ambjentali minima espressa f’  o C li fiha ċertu volum ta' 
sustanza jaqbad ta ħt kondizzjonijiet definiti.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Xejn.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Ċertu volum tas-sustanza g ħat-test jitpo ġġa f’forn f’temperatura 
ambjentali; il-kurva tat-temperatura/ ħin relatata mal-kondizzjonijiet 
f’nofs il-kampjun ti ġi rreġistrata waqt li t-temperatura tal-forn 
tiżdied sa 400  o C, jew sal-punt tat-tidwib jekk dan huwa i żgħar, 
b'rata ta' 0,5  o C/min. G ħall-għan ta' dan it-test, it-temperatura tal- 
forn li fiha t-temperatura tal-kampjun til ħaq 400 C b'awto-tis ħin 
tissejjaħ it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Apparat  
1.6.1.1.  Forn  
Forn tal-laboratorju pprogrammat b'temperatura (volum ta' madwar 2 
litri) mgħammar b' ċirkolazzjoni ta' l-arja naturali u bi sfog g ħal 
splużjoni. Bil-g ħan li jkun evitat ir-riskju ta' splu żjoni potenzjali, 
kwalunkwe gassijiet ta' dekompo żizzjoni m‘g ħandhomx jit ħallew 
jagħmlu kuntatt ma' l-elementi elettri ċi tat-tisħin. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Kubu b'xibka tal-wajer irqiq  
Biċċa xibka tal-wajer irqiqa ta' l-azzar li ma jissaddadx b'fet ħiet ta' 
0,045 mm g ħandha tinqata' skond id-disinn f'figura 1. Ix-xibka 
għandha tintewa u tintrabat b'wajer f'forma ta' kubu bil-parti ta' 
fuq miftu ħa. 
1.6.1.3.  Termokoppji  
Termokoppji adattati.  
1.6.1.4.  Rekorder  
Kwalunkwe rekorder b' żewġ kanali kkalibrati minn 0 sa 600  o C jew 
vultaġġ korrispondenti.  
1.6.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
Is-sustanzi ji ġu ttestjati kif ri ċevuti.  
1.6.3.  L-e żekuzzjoni tat-test  
Il-kubu jimtela bis-sustanza g ħat-test u jittaptap bil-mod, u ti żdied 
aktar sustanza sakemm il-kubu jkun mimli kompletament. Il-kubu 
mbagħad jiġi sospiż fiċ-ċentru tal-forn f’temperatura ambjentali. 
Termokoppja titpo ġġa fiċ-ċentru tal-kubu u o ħra bejn il-kubu u l- 
ġenb tal-forn biex tirre ġistra t-temperatura tal-forn.  
It-temperaturi tal-forn u tal-kampjun ji ġu rreġistrati kontinwament 
waqt li t-temperatura tal-forn ti ġi miżjuda għal 400 C, jew g ħat- 
temperatura tat-tidwib jekk din tkun i żgħar, bir-rata ta' 0,5  o C/min.  
Meta s-sustanza tqabbad it-termokoppja kampjun turi żieda qawwija 
fit-temperatura og ħla mit-temperatura tal-forn.  
2. DATA  
It-temperatura tal-forn li fiha t-temperatura kampjun til ħaq l-400  o C 
b'awto-tis ħin hija relevanti g ħal valutazzjoni (ara figura 2).  
3. RAPPURTAR  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— deskrizzjoni tas-sustanza g ħat-test,  
— ir-riżultati tal-kejl inklu ża l-kurva tat-temperatura/ ħin, 
— ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati.  
4. REFERENZI  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flamm ­
ability of solids.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figura 1  
Disinn ta' kubu tat-test ta' 20 mm
  
Figura 2  
Kurva tipika tat-temperatura/ ħin
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  PROPRJETAJIET OSSIDANTI (SOLIDI)  
1. METODU  
1.1. DA ĦLA 
Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet 
esplożivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test.  
Dan it-test mhuwiex applikabbli g ħal likwidi, gassijiet, sustanza 
fjammabbli jew esplo żivi ħafna, jew perrossidi organi ċi. 
Dan it-test jista' ma jsirx meta e żami tal-formula strutturali jist ­
abbilixxi ming ħajr ebda dubju ra ġjonevoli li s-sustanza mhijiex 
kapaċi li tirreaġixxi eżotermikament ma' materjal kombustibbli.  
Bil-għan li jkun żgurat jekk it-test g ħandux jitwettaq bi 
prekawzjonijiet spe ċjali, għandu jitwettaq test preliminari.  
1.2. TIFSIRIET U UNITAJIET  
Ħin tal-kombustjoni: żmien ta' reazzjoni, f’sekondi, me ħud għaż- 
żona ta' reazzjoni biex timxi mal-gozz, wara l-pro ċedura mfissra 
f’1.6.  
Rata ta' kombustjoni: espressa f’millimetri g ħal kull sekonda.  
Rata massima ta' kombustjoni: l-og ħla valur ta' rati ta' kombustjoni 
miksuba b'ta ħlitiet li jinkludu minn 10 sa 90 % bil-pi ż ta' ossidant.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Nitrat tal-barju (grad analitiku) huwa u żat bħala sustanza ta' 
referenza g ħat-test u t-test preliminari.  
It-taħlita ta' referenza hija dik it-ta ħlita ta' nitrat tal-barju b' ċelluloża 
f’forma ta' trab, ippreparat skond 1.6, li g ħandu rata ta' kombustjoni 
massima (is-soltu ta ħlita b’60 % nitrat tal-barju bil-pi ż). 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Test preliminari jitwettaq fl-interess tas-sikurezza. Ma jkunx me ħtieġ 
aktar ittestjar meta t-test preliminari jindika b'mod ċar li s-sustanza 
għat-test għandha proprjetajiet ossidanti. Meta dan mhuwiex il-ka ż, 
is-sustanza mbag ħad għandha tkun so ġġetta għat-test sħiħ. 
Fit-test sħiħ, is-sustanza g ħat-test u sustanza kombustibbli definita 
tiġi mħallta fi proporzjonijiet diversi. Kull ta ħlita mbag ħad tiġi 
ffurmata f’gozz u l-gozz jitqabbad f’tarf minnu. Ir-rata ta' 
kombustjoni massima ddeterminata titqabbel mar-rata ta' kombustjoni 
massima tat-ta ħlita ta' referenza.  
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Jekk ikun me ħtieġ, kwalunkwe metodu ta' t ħin u taħlit huwa validu 
bil-kondizzjoni li d-differenza fir-rata ta' kombustjoni massima fis-sitt 
testijiet separati tarja mill-valur medju aritmetiku b'mhux aktar minn 
10 %.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1.  Preparazzjoni  
1.6.1.1.  Is-sustanza g ħat-test  
Naqqas il-kampjun g ħat-test għal daqs ta' partikula < 0,125 mm bl- 
użu tal-pro ċedura li ġejja: għarbel is-sustanza g ħat-test, it ħan il- 
frazzjoni li jkun baqa', irrepeti l-pro ċedura sakemm il-porzjon 
kollha għat-test tkun g ħaddiet mill-g ħarbiel.  
Jista' jintu ża kwalunkwe metodu ta' t ħin jew ta' tg ħarbil li jissodisfa 
l-kriterji ta' kwalità.  
Qabel titħejja t-taħlita s-sustanza titnixxef f’105  o C, sakemm jinkiseb 
il-piż kostanti. Jekk it-temperatura ta' dekompo żizzjoni tas-sustanza 
għat-test hija ta ħt il-105  o C, is-sustanza g ħandha titnixxef b'tem ­
peratura adattata iktar baxxa.  
1.6.1.2.  Sustanza kombustibbli  
Ċelluloża f’forma ta' trab hija u żata bħala sustanza kombustibbli. I ċ- 
ċelluloża għandha tkun tat-tip u żata għal kromatografija ta' saff irqiq 
jew għal kromatograija tal-kolonna. Wa ħda tat-tip b'fibri ta' tul ta' 
aktar minn 85 % bejn 0,020 u 0,075 mm instabu li kienu adattati. It- 
trab taċ-ċelluloża jiġi mgħoddi minn g ħarbiel b'toqob ta' daqs ta' 
0,125 mm. L-istess lott ta' ċelluloża għandu jintu ża matul it-test.  
Qabel titħejja t-taħlita, iċ-ċelluloża f’forma ta' trab titnixxef f’105  o C, 
sakemm jinkiseb pi ż kostanti.  
Jekk tintu ża ċ-ċana ta' l-injam fit-test preliminari, allura pprepara ċ- 
ċana ta' l-injam artab billi ti ġbor il-porzjon li tg ħaddi minn g ħarbiel 
b'toqob ta' 1,6 mm, ħallat sewwa, imbag ħad nixxef f’105  o C għal 
erba' sigħat f’saff ta' mhux o ħxon aktar minn 25 mm. Kessa ħ 
u aħżen f’kontenitur li fih ma jid ħolx arja mimli kemm sa kemm 
huwa prattiku u sakemm ikun me ħtieġ, preferibbilment fi żmien 24 
siegħa mit-tnixxif.  
1.6.1.3.  Għajn ta' fjammabiltà  
Fjamma ta ħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5 mm) 
għandha tintu ża bħala l-għajn ta' fjammabilità. Jekk tintu ża għajn ta' 
fjammabbiltà o ħra (eż. meta jsir it-test f’atmosfera inerta), id-desk ­
rizzjoni u l- ġustifikazzjoni g ħandhom ikunu rrapurtati.  
1.6.2.  L-e żekuzzjoni tat-test  
Nota:  
Taħlitiet ta' ossidaturi ma' ċelluloża jew ċana ta' l-injam iridu jkunu 
ttrattati b ħala potenzjalment splussivi u mmani ġġjati b'attenzjoni 
xierqa.  
1.6.2.1.  Test preliminari  
Is-sustanza mnixxfa hija m ħallta sewwa ma' ċelluloża mnixxfa jew 
ċana ta' l-injam fil-proporzjonijiet ta' 2 ta' sustanza g ħat-test għal 1 ta' 
ċelluloża jew ċana ta' l-injam bil-pi ż u t-taħlita tiġi ffurmata f’gozz 
żgħir forma ta' kon ta' dimensjonijiet 3,5 cm (dijametru tal-ba żi) 
x 2,5 cm (g ħoli) pemezz tal-mili, ming ħajr rass, ta' o ġġett li 
jifforma kon (e ż. lembut tal- ħġieġ tal-laboratorju bi ż-żennuna mag ħ­
luqa).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Il-gozz jitpo ġġa fuq pjan ċa tal-bażi li mhijiex kombustibbli, mhux 
poruża u b'konduttività baxxa ta' s ħana. It-test g ħandu jitwettaq 
f’armarju tad-du ħħan bħal f’1.6.2.2.  
L-għajn tal-fjammabbiltà jitressaq f’kuntatt mal-kon. Is-sa ħħa u d- 
dewmien tar-reazzjoni ri żultanti g ħandhom ikunu osservati 
u rreġistrati.  
Is-sustanza g ħandha tkun ikkunsidrata b ħala ossidanti jekk ir- 
reazzjoni hija qawwija.  
Fi kwalunkwe ka ż fejn ir-ri żultat huwa dubju ż, imbagħad ikun 
neċessarju li jsir it-test kollu mfisser hawn ta ħt. 
1.6.2.2.  It-test tas-serje  
Ipprepara ta ħlitiet ta' ossidatur ċelluloża li jkun fihom minn 10 sa 
90 % piż ta' ossidatur f’ żidiet ta' 10 %. F'ka żijiet li kwa żi qegħdin fl- 
istess limiti, ta ħlitiet ta' ossidatur ċelluloża intermedji g ħandhom 
jintużaw biex tinkiseb ir-rata ta' fjammabbiltà massima b'aktar 
preċiżjoni. 
Il-gozz ikun iffurmat permezz ta' forma. Din il-forma mag ħmula 
mill-metall, g ħandha tul ta' 250 mm b'taqsima trasversali trijangulari 
ta' għoli intern ta' 10 mm u wisa' interna ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal- 
metall jiġu mmuntati fuq i ż-żewġ naħat tal-forma f’direzzjoni lon ġi­
tudinali b ħala limitazzjonijiet laterali li jo ħorġu 2 mm “il barra mit- 
tarf l-għoli tat-taqsima trasversali trijangulari (figura). Dan l-arran ­ 
ġament jimtela liberament bi ftit ta ħlita żejda. Wara li l-forma 
tintefa” g ħal darba wa ħda minn g ħoli ta' 2 cm fuq superfi ċje 
solida, is-sustanza żejda li tibqa’ titne ħħa b’karta milwija. Il-limi ­
tazzjonijiet laterali jitne ħħew u t-trab li jibqa' ji ħi ċċattjat, permezz 
ta' romblu. Pjan ċa ta' ba żi mhux kombustibbli, mhux poru ża 
u b’konduttività ta' s ħana baxxa mbag ħad titpoġġa fuq il-forma, l- 
apparat jinqaleb u l-forma titne ħħa. 
Irranġa l-gozz fil-kurrent ta' l-arja f’armarju li ji ġbed id-du ħħan. 
Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffi ċjenti biex tevita li d-du ħħan joħroġ 
fil-laboratorju u m'g ħandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid 
ikun protett mill-kurrent ta' l-arja.  
Minħabba l-igroskopi ċità taċ-ċelluloża u ta' wħud mis-sustanzi g ħat- 
test, it-test g ħandu jitwettaq malajr kemm jista' jkun.  
Qabbad ġenb wieħed tal-gozz billi tressqu mal-fjamma.  
Kejjel il-ħin tar-reazzjoni fuq distanza ta' 200 mm wara li ż-żona ta' 
reazzjoni tinfirex sa distanza inizjali ta' 30 mm.  
It-test jitwettaq bis-sustanza ta' referenza u ta' l-inqas darba b'kull 
waħda mill-firxa ta' ta ħlitiet tas-sustanza g ħat-test ma ċ-ċelluloża. 
Jekk ir-rata ta' fjammabilità massima tinsab li hija akbar b'mod sini ­
fikanti minn dik tat-ta ħlita ta' referenza, it-test jista' jitwaqqaf; inkella 
t-test għandu jkun ripetut g ħal ħames darbiet g ħal kull wa ħda mit- 
tliet taħlitiet li jag ħtu l-aktar rata velo ċi ta' fjammabilità.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Jekk hemm suspett li r-ri żultat huwa po żittiv falz, allura t-test 
għandu jkun ripetut bl-u żu ta' sustanza inerta bl-istess daqs ta' 
partikula, b ħall-kieselguhr , flok iċ-ċelluloża. Alternattivament, it- 
taħlita tas-sustanza g ħat-test ma ċ-ċelluloża, li għandha l-aktar rata 
veloċi ta' fjammabilità, g ħandha tkun ittestjata mill- ġdid f’atmosfera 
inerta (< 2 % v/v kontenut ta' ossi ġnu). 
2. DATA  
Għal raġunijiet ta' sikurezza r-rata ta' fjammabilità massima – mhux 
il-valur medju – g ħandha tkun ikkunsidrata b ħala l-proprjetà 
ossidanti karatteristika tas-sustanza g ħat-test.  
L-ogħla valur tar-rata tal-fjammabilità f’serje ta' sitt testijiet ta' ta ħlita 
definita huwa relevanti g ħall-valutazzjoni.  
Pinġi graff ta' l-og ħla valur tar-rata tal-fjammabilità g ħal kull ta ħlita 
kontra l-kon ċentrazzjoni ta' l-ossidatur. Mill-graff ħu r-rata tal- 
fjammabilità massima.  
Is-sitt valuri mkejla tar-rata tal-fjammabilità f’serje miksuba mit- 
taħlita mar-rata ta' fjammabilità massima ma tridx tiddiferenzja 
mill-valur medju aritmetiku b'aktar minn 10 %; inkella l-metodi 
tat-tħin u t-taħlit jridu jittejbu.  
Qabbel ir-rata ta' fjammabilità massima miksuba mar-rata ta' fjamm ­
abilità massima tat-ta ħlita ta' referenza (ara 1.3).  
Jekk it-testijiet jitwettqu f’atmosfera inerta, ir-rata ta' reazzjoni 
massima titqabbel ma' dik tat-ta ħlita ta' referenza f’atmosfera inerta.  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
— l-identità, il-kompo żizzjoni, il-purità, il-kontenut ta' umdità e ċċ. 
tas-sustanza ttestjata;  
— kwalunkwe trattament tal-kampjun g ħat-test (eż. tħin, tnixxif);  
— l-għajn tal-fjammabbiltà u żata fit-testijiet;  
— ir-riżultati tal-kejl;  
— il-mod ta' reazzjoni (e ż. fjammabilità lelliexa fuq is-superfi ċje, 
fjammabilità tul il-massa kollha, kwalunkwe informazzjoni li 
tirrgwarda l-prodotti ta' kombustjoni, ...);  
— ir-rimarki rilevanti kollha g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati, 
inkluża deskrizzjoni ta' l-ener ġija fiżika (fjamma, spark, 
duħħan, ħruq bil-mod sakemm isir fa ħam, eċċ.) u t-tul ta' 
żmien approssimattiv prodott fit-test preliminari tas-sikurezza/ ­
skrinjar kemm g ħas-sustanza g ħat-test kif ukoll g ħal dik ta' 
referenza;  
— ir-riżultati minn testijiet b'sustanza inerta, jekk hemm;  
— ir-riżultati minn testijiet f’atmosfera inerta, jekk hemm.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Sustanza titqies li hija sustanza ossidanti meta:  
(a) fit-test preliminari, hemm reazzjoni vigoru ża; 
(b) fit-test s ħiħ, ir-rata ta' fjammabilità massima tat-ta ħlitiet ittestjati 
hija ogħla minn jew ugwali g ħar-rata ta' fjammabilità massima 
tat-taħlita ta' referenza ta ċ-ċelluloża u n-nitrat tal-barju.  
Bil-għan li jkun evitat po żittiv falz, ir-ri żultati miksuba meta s- 
sustanza g ħat-test tit ħallat ma' materjal inert u/jew meta jsir l- 
ittestjar ta ħt atmosfera inerta, g ħandhom ji ġu kkunsidrati wkoll fl- 
interpretazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Appendiċi 
Figura  
Forma u a ċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz  
(Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  IL-MEDJA TAL-PI Ż MOLEKULARI TAN-NUMRU U D- 
DISTRIBUZZJONI TAL-PI Ż MOLEKULARI TAL-POLIMERI  
1. METODU  
Dan il-metodu Kromotografiku bil-Permeazzjoni tal- Ġel huwa 
replika tal-OECD TG 118 (1996). Il-prin ċipji fundamentali u aktar 
informazzjoni teknika jinsabu fir-referenza 1.  
1.1. DA ĦLA 
Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk differenti, huwa 
impossibbli li ji ġi deskritt metodu wie ħed li jagħti l-kondizzjonijiet 
preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw g ħal kull 
sitwazzjoni u g ħal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal- 
polimeri. Partikolarment u ta' spiss, sistemi ta' polimeri komplessi mhumiex so ġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni tal- ġel 
(GPC). Meta l-GPC mhuwiex prattikabbli, l-pi ż molekulari jista' 
jiġi deċiż b'metodi o ħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-ka żijiet, 
għandhom jing ħataw id-dettalji u l- ġustifikazzjonijiet kollha g ħall- 
metodu u żat.
 
Il-metodu deskritt huwa bba żat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan 
l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif g ħandhom 
jitmexxew dawn l-esperimenti u kif g ħandha tiġi vvalutata d- 
DATA. F'ka ż illi hemm b żonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment 
jinbidlu, dawn il-bidliet iridu ji ġu ġustifikati. Jistg ħu jintużaw 
standards o ħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu 
deskritt ju ża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid mag ħruf għall-kali­
brazzjoni, u jista' jag ħti l-każ li jrid ji ġi modifikat biex jaqbel ma' 
ċerti polimeri, e ż. polimeri li jin ħallu fl-ilma u polimeri  long-chain 
branched.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Il-medja tal-pi ż molekulari tan-numru M  n u l-medja tal-pi ż 
molekulari tal-pi ż M w huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li 
ġejjin: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
fejn, 
H i huwa l-livell tas-sinjal ta' osservazzjoni mil-linja ta' ba żi għall- 
volum ta' retenzjoni V  i , 
M i huwa l-pi ż molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil-volum ta' 
retenzjoni V  i , u 
n huwa n-numru tal-punti ta' DATA.  
Il-wisa' tad-distribuzzjoni tal-pi ż molekulari, li hija mi żura tat-tixrid 
tas-sistema, ting ħata bil-proporzjon M  w /M n . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm b żonn ta' kalibrazzjoni. 
Normalment jintu żaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata 
u mibnija linearment u li g ħandhom pi ż molekulari medju M  n u M  w 
u distribuzzjoni ta' pi ż molekolari mag ħrufa. Il-kurva tal-kali ­
brazzjoni tista' tintu ża biss fid-determinazzjoni tal-pi ż molekulari 
tal-kampjun mhux mag ħruf jekk il-kondizzjonijiet g ħas-separazzjoni 
tal-kampjun u l-istandards intg ħażlu b'mod pre ċiżament l-istess.  
Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-pi ż molekulari u l-volum ta' 
elużjoni huwa validu biss ta ħt il-kondizzjonijiet spe ċifiċi ta' l- 
esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t- temperatura, s-solvent (jew ta ħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet 
tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal- 
kolonni.
 
Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri 
relattivi u huma deskritti b ħala “piżijiet molekulari ekwivalenti g ħall- 
polistiren”. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimi ċi 
bejn il-kampjun u l-istandards, il-pi żijiet molekulari jistg ħu 
jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards o ħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal- 
politin, il-metakrilat tal-polimetil, a ċidu poliakriliku, g ħandha 
titniżżel ir-raġuni.
 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' L-E ŻAMI  
Kemm id-distribuzzjoni tal-pi ż molekulari tal-kampjun kif ukoll il- 
piżijiet molekulari medji (M  n , M  w ) jistgħu jiġu ddeterminati billi 
jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu spe ċjali ta' kromatografija 
likwida fejn il-kampjun ji ġi separat skond il-valuri idrodinami ċi 
tal-kostitwenti individwali (2).  
Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jg ħaddi minn ġo kolonna mimlija 
b'materjal poru ż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu 
jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistg ħux. Il- 
passaġġ tal-molekoli kbar huwa, g ħalhekk, iqsar u g ħalhekk huma 
jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jg ħaddu iktar tard. L-i żgħar molekoli, b'ra ġġ idrodi­
namiku medju i żghar mill-pori tal- ġel jistgħu jippenetraw il-pori 
kollha. Dawn ikun elu żi l-aħħar.
 
Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l- 
ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffi ċli li wieħed jevita xi 
interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni 
u volumi mejtin jistg ħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2).  
L-osservazzjoni hija effetwata minn, e ż. l-indiċi refrattiv jew l-assor ­
biment tal-UV u tag ħti kurva tad-distribuzzjoni sempli ċi. 
Madankollu, biex il-kurva ting ħata valuri attwali tal-pi ż molekulari, 
huwa neċessarju li l-kolonna ti ġi kkalibrata billi polimeri ta' pi ż 
molekulari mag ħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitni żżlu 
'l isfel, e ż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, g ħandha 
tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mg ħawwġa minħabba denb fuq 
in-naħa baxxa tal-pi ż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l- 
kwantità, skond il-pi ż, ta' l-ispe ċi tal-piż molekulari varji, u l-fus 
orizzontali l-pi ż molekulari rre ġistrat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Livell Stabbilit: RSD) tal-volum ta' l- 
elużjoni għandha tkun a ħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l- 
analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard 
intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq 
il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid 
jiddependi fuq il-pi żijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-ka ż ta' 
standards tal-polistirene, valuri tipi ċi huma: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p huwa l-pi ż molekulari ta' l-istandard fil-qu ċċata tal-massimu)  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-E ŻAMI  
1.6.1.  Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistiren  
L-istandards tal-polistiren g ħandhom jin ħallu billi jit ħalltu b'at ­
tenzjoni fl-eluwent mag ħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant 
għandhom ji ġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet.  
Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards mag ħżula jiddependu fuq 
diversi fatturi: e ż. il-volum ta' l-injezjoni, il-visko żità tas-soluzzjoni 
u s-sensittività tad-ditekter analitiku. Il-volum massimu ta' l- injezzjoni g ħandu jiġi adattat g ħat-tul tal-kolonna biex ti ġi evitata 
tagħbija żejda. Volumi ta' injezzjoni tipi ċi għas-separazzjonijiet 
analitiċi bl-użu tal-GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma norm ­
alment bejn 40 u 100 μl. Volumi og ħla huma possibbli, imma 
m'għandhomx jaqbu 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' bejn il-volum 
ta' l-injezzjoni u l-kon ċentrazzjoni g ħandha tiġi ddeterminata qabel 
ma tiġi kkalibrata l-kolonna.
 
1.6.2.  Preparazzjoni tal-kampjun tas-soluzzjoni  
Fil-prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw g ħall-preparazzjoni tal- 
kampjuni tas-soluzzjonijiet. Il-kampjun g ħandu jin ħall f’solvent 
xieraq, eż. it-tetraidrofuran (THF), billi jit ħawwad bil-galbu. Ta ħt 
l-ebda ċirkostanza m'g ħandu jinħall permezz ta' banju ultrasoniku. 
Fejn huwa ne ċessarju, il-kampjun tas-soluzzjoni g ħandu jiġi 
ppurifikat permezz ta' filtru tal-membrana b'pori ta' daqs bejn 0,2 u 2 μm.
 
Il-preżenza ta' partikoli li ma n ħallux għanda titni żżel fir-rapport 
finali għar-raġuni li dawn jistg ħu jirriżultaw minn spe ċi ta' piż 
molekulari g ħoli. Għandu jintuza metodu xieraq biex ji ġi ddeterminat 
il-perċentaġġ skond il-pi ż tal-partikoli li n ħallu. Is-soluzzjonijiet 
għandhom jintu żaw fi-żmien 24 sieg ħa. 
1.6.3.  L-apparat  
— ġibjuni tas-solventi:  
— degasser  (fejn xieraq),  
— pompa  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— apparat biex inaqqas l-impuls (fejn hemm b żonn) 
— sistema ta' injezzjoni,  
— kolonni tal-kromatografija,  
— ditekter  
— flowmeter  (fejn hemm b żonn),  
— proċessur li jirrekordja d-DATA,  
— kontenitur g ħall-iskart  
Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas- 
solventi u żati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar g ħas-solvent THF).  
1.6.4.  L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi  
Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitg ħabba fuq il-kolonna bl- 
użu ta' auto-sampler  jew manwalment f' żona definita pre ċiżament. L- 
irtirar jew l-g ħafis tal- plunger  tas-siringa b'mod mg ħaġġel, jekk isir 
manwalment, jista' jikkaw ża bidliet fid-distribuzzjoni tal-pi ż 
molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent g ħandha, 
safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment 
għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il- flowrate  tkun 
madwar 1 ml/min.  
1.6.5.  Il-kolonna  
Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-u żu ta' kolonna 
sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. G ħadd ta' 
materjali poru żi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (e ż. daqs tal-pori, 
limiti ta' esklu żjoni) huma disponibbli kummer ċjalment. L-g ħażla tal- 
ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprje ­
tajiet tal-kampjun (volumi idrodinami ċi, distribuzzjoni tal-pi ż 
molekulari) u l-kondizzjonijiet spe ċifiċi għas-separazzjoni b ħas- 
solventi, t-temperatura u l- flowrate  (1) (2) (3).  
1.6.6.  Il-pjan ċi teoretiċi 
Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni u żati għas-separazzjoni 
għandhom ji ġu karatterizzati skond in-numru ta' pjan ċi teoretiċi. Dan 
jinvolvi, f’ka ż meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tag ħbija ta' 
soluzzjoni ta' etile ben żin jew ta' sustanza ma ħlula mhux b'polarità 
xierqa fuq kolonna ta' tul mag ħruf. In-numru ta' pjan ċi teoretiċi huwa 
mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
or N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
fejn, 
N = in-numru tal-pjan ċi teoretiċi 
V e = il-volum ta' elu żjoni fil-qu ċċata tal-massimu  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = il-qu ċċata tal-wisa' tal-linja ba żi 
W 1/2 = il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-g ħoli 
1.6.7.  L-effi ċjenza tas-separazzjoni  
Flimkien ma' l-ammont tal-pjan ċi teoretiċi, li hija kwantità li tist ­
abbilixxi il- bandwidth , l-effiċjenza tas-separazzjoni g ħandha sehem 
ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kali ­
brazzjoni. L-effi ċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir- 
relazzjoni li ġejja: 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
cross sectional area of the column ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
fejn, 
V e, M x = il-volum ta' elu żjoni għall-polistiren b'pi ż molekulari 
M x 
V e,(10.M x) = il-volum ta' elu żjoni għall-polistiren b'pi ż molekulari ta' 
għaxar darbiet iktar  
Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
fejn, 
V e1 , V e2 = il-volumi ta' elu żjoni taż-żewġ standards tal-polistiren 
fil-quċċata tal-massimu  
W 1 , W  2 = il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' ba żi 
M 1 , M  2 = il-piżijiet molekulari fil-qu ċċata tal-massimu (g ħandu 
jkun hemm differenza b' fattur ta' 10)  
Il-valur R g ħas-sistema tal-kolonni g ħandu jkun ikbar minn 1.7 (4).  
1.6.8.  Solventi  
Is-solventi kollha g ħandhom ikollhom purità g ħolja (għat-THF 
tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depo żitu tas-solventi (f'atmosfera ta' 
gass inert, jekk huwa ne ċessarju) g ħandu jkun kbir bi żżejjed għall- 
kalibrazzjoni tal-kolonna u g ħal diversi anali żijiet tal-kampjuni. Il- 
gass għandu jitne ħħa mis-solvent qabel ma jg ħaddi għall-kolonna 
minn ġo pompa.  
1.6.9.  Kontroll tat-temperatura  
It-temperatura tal-komponenti kru ċjali interni (i ċ-ċirku ta' injezzjoni 
(injection loop ), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) g ħandha tkun 
kostanti u konsistenti skond l-g ħażla tas-solvent.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Ditekter  
Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirre ġistra b'mod kwantitattiv il-kon ċen­
trazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex ji ġi evitat li l- 
quċċati jitwessg ħu, il-volum tal- cuvette  taċ-ċellula tad-ditekter 
għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'g ħandux ikun akbar 
minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u g ħal ditekters 
tal-viskożità. Normalment tintu ża rifrattometrija differenzjali g ħall- 
osservazzjoni. Madankollu, jekk me ħtieġ mill-proprjetajiet spe ċifiċi 
tal-kampjun jew tas-solvent ta' elu żjoni, jistg ħu jintużaw ditekters 
oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-visko żità, eċċ. 
2. DATA U RAPPURTAR  
2.1. DATA  
L-istandard DIN (1) g ħandu jiġi kkonsultat g ħall-kriterji ta' valu ­
tazzjoni dettaljata kif ukoll g ħall-kondizzjonijiet g ħall-ġbir u għall- 
proċessar ta' DATA.  
Għal kull kampjun g ħandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. 
Għandhom ji ġu analizzati individwalment.  
M n , M  w , M  w /M n u M  p għandhom ji ġu pprovduti g ħal kull kejl. 
Huwa ne ċessarju li ji ġi espliċitament indikat li l-valuri mkejla 
huma valuri relattivi ekwivalenti g ħall-piżijiet molekulari ta' l- 
istandard u żat. 
Wara li ji ġu ddeterminati il-volumi ta' ritenzjoni jew il- ħinijiet ta' 
ritenzjoni (possibbilment irran ġati permezz ta' standard intern), valuri 
log M  p (fejn M  p huwa l-massimu tal-qu ċċata ta' l-istandard tal-kali ­
brazzjoni) g ħandhom jitni żżlu ma' wie ħed minn dawk il-kwantitajiet. 
Mill-inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma ne ċessarji għal kull sett 
ta' għaxar piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma 
meħtieġa għall-kurva totali, u dan g ħandu jkopri l-pi ż molekulari 
stmat tal-kampjun. It-tarf baxx tal-kurva tal-kalibrazzjoni tal-pi ż 
molekulari huwa definit permezz ta' ben żin n-hexyl  jew sustanza 
maħlula mhux polari o ħra.xierqa Il-medja tan-numru u l-medja tal- 
piż molekulari huma ġeneralment iddeterminati permezz ta' pro ċessar 
tad-DATA elettronika bba żata fuq il-formuli tas-sezzjoni 1.2. F'ka ż li 
tintuża d-diġitazzjoni manwali, ASTM D 3536-91 jista' ji ġi kkon­
sultat (3).  
Il-kurva tad-distribuzzjoni g ħandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella 
jew figura (frekwenza differenzjali jew persenta ġġi tas-somom ma' 
log M). Fir-rappre żentazzjoni grafika, sett wie ħed ta' għaxar piżijiet 
molekulari huwa normalment wiesa' 4 cm u l-massimu tal-qu ċċata 
għandu jkun twil xi 8 cm. F'ka ż ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, 
d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % g ħandha tkun ta' xi 10 cm.  
2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
2.2.1.  Sustanza tat-test  
— informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, 
addittivi, impuritajiet),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, 
problemi.  
2.2.2.  Strumentazzjoni  
— kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tne ħħija ta' gass żejjed ta' l- 
eluwent, kompo żizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,  
— pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,  
— kolonni tas-separazzjoni (il-fabbrikant, l-informazzjoni kollha 
dwar il-karatteristi ċi tal-kolonni b ħad-daqs tal-pori, it-tip ta' 
materjal ta' separazzjoni e ċċ., in-numru, it-tul u l-ordni tal- 
kolonni u żati), 
— numru ta' pjan ċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), 
effiċjenza tas-separazzjoni (ri żoluzzjoni tas-sistema).  
— informazzjoni dwar is-simetrija tal-qu ċċati, 
— temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,  
— indikatur (prin ċipju tal-kejl, tip,  cuvette , volum),  
— flowmeter  jekk użat (il-fabbrikant, il-prin ċipju tal-kejl),  
— sistema g ħar-reġistrazzjoni u pro ċessar tad-DATA ( hardware  
u software ) 
2.2.3.  Kalibrazzjoni tas-sistema  
— deskrizzjoni dettaljata tal-metodu u żat biex tinbena l-kurva tal- 
kalibrazzjoni,  
— informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (e ż. 
koeffiċjent tal-korrelazzjoni,  error sum of squares  eċċ.), 
— informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l- 
approssimazzjonijiet li saru waqt il-pro ċedura esperimentali u l- 
valutazzjoni u l-pro ċessar tad-DATA,  
— il-kejl kollu u żat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni 
għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li 
ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:  
— l-isem tal-kampjun,  
— il-fabbrikant tal-kampjun,  
— il-valuri karatteristi ċi ta' l-istandards M  p , M  n , M  w u M  w /M n , 
kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif mi ġjuba minn kejl 
sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' deter ­
minazzjoni,  
— il-volum ta' l-injezzjoni u l-kon ċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— il-valur M  p użat għall-kalibrazzjoni,  
— il-valur ta' l-elu żjoni jew il- ħin taż-żamma kkore ġut imkejjel 
fl-ogħla punt massimu,  
— l-M  p kkalkulat fl-og ħla punt massimu,  
— il-persenta ġġ ta' żball ta' l-M  p kkalkulat u l-valur tal-kali ­
brazzjoni.  
2.2.4.  Valutazzjoni:  
— valutazzjoni fuq ba żi ta' ħin: il-metodi u żati biex tkun żgurata r- 
riproduzzjoni me ħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, 
eċċ.), 
— informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-ba żi tal- 
volum ta' l-elu żjoni jew il- ħin taż-żamma,  
— informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk qu ċċata mhijiex 
analizzata kompletament,  
— deskrizzjoni ta' metodi li jne ħħu x-xkiel, jekk u żati, 
— proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,  
— il-preżenza ta' partikoli mhux ma ħlulin, jekk hemm,  
— il-volum ta' l-injezzjoni ( μl) u l-kon ċentrazzjoni ta' l-injezzjoni 
(mg/ml),  
— osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu g ħal devjazzjonijiet 
mill-profil GPC ideali,  
— deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-pro ċeduri 
ta' l-ittestjar,  
— dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,  
— kwalunkwe informazzjoni o ħra u osservazzjonijiet rilevanti g ħall- 
interpretazzjoni tar-ri żultati,  
3. REFERENZI  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., u Bly, D. D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for 
Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for 
Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for 
Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size- Exclusion Chromatography. American Society for Testing 
and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Appendiċi 
Eżempji ta' metodi o ħra għad-determinazzjoni tal-pi ż numru medju 
molekulari (mn) g ħall-polimeri  
Il-kromatografija bil-permeazzjoni tal- ġel (GPC) hija l-metodu preferut g ħad- 
determinazzjoni ta' M  n , speċjalment meta huwa disponibbli sett ta' standards, li 
l-istruttura tag ħhom hija komparabbli ma' l-istruttura tal-polimer. Madankollu, 
fejn hemm diffikultajiet pratti ċi fl-użu tal-GPC jew fejn di ġà mistenni li s- 
sustanza ma tg ħaddix mill-kriterju regolatorju M  n (u li jeħtieġ konferma), 
metodi alternattivi o ħra huma disponibbli, b ħal: 
1. U żu ta' Proprjetajiet Kolligativi  
1.1 Ebulljoskopija/Krijoskopija  
tinvolvi l-kejl ta' l-elevazzjoni tat-temperatura tat-tg ħolija (ebulljos ­
kopija) jew id-depressjoni tat-temperatura ta' l-iffri żar (krijoskopija) 
ta' solvent, meta ji żdied il-polimer. Il-metodu huwa bba żat fuq il-fatt 
li l-effett tal-polimer ma ħlul fuq it-temperatura tat-tg ħolija/ta' l- 
iffriżar tal-likwidu jiddependi fuq il-pi ż molekulari tal-polimer (1)(2).  
Applikabilità, M  n < 20 000.  
1.2 Tbaxxija tal-Pressjoni tal-Fwar  
tinvolvi l-kejl tal-pressjoni tal-fwar minn likwidu ta' referenza 
magħżul qabel u wara ż-żieda ta' kwantitajiet mag ħrufa ta' polimer 
(1)(2).  
Applikabilità, M  n < 20 000 (teoretikament; i żda fil-prattika ta' valur 
limitat).  
1.3 L-O żmometrija tal-Membrana  
hija bbażata fuq il-prin ċipju ta' l-o żmosi, i.e. it-tendenza naturali ta' 
molekuli solventi li jg ħaddu minn membrana semi-permeabbli minn 
soluzzjoni dilwita g ħal soluzzjoni kon ċentrata biex jinkiseb l-ekwi ­
libriju. Fit-test, is-soluzzjoni dilwita hija f'kon ċentrazzjoni żero, waqt 
li s-soluzzjoni kon ċentrata fiha l-polimer. L-effett tal- ġbid tas-solvent 
mill-membrana jikkaw ża differenzjal tal-pressjoni li huwa dipendenti 
fuq il-kon ċentrazzjoni u l-pi ż molekulari tal-polimer (1)(3)(4).  
Applikabilità, M  n < 20 000 – 200 000.  
1.4 O żmometrija tal-Fa żi tal-Fwar.  
tinvolvi l-paragun tar-rata ta' evaporazzjoni ta'  aerosol  tas-solvent pur 
ma' mill-anqas tliet  aerosols  li fihom il-polimer f'kon ċentrazzjonijiet 
varji (1)(5)(6) Applikabbiltà M  n < 20 000.  
Analiżi tal-Grupp Terminali M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Anali żi tal-Grupp Terminali  
Biex jintu ża dan il-metodu, huwa me ħtieġ għarfien kemm ta' l- 
istruttura komplessiva tal-polimer kif ukoll in-natura tal-gruppi terminali tal-katina (li jridu jkunu distinti mill-iskeletru ewlieni b'eż.. NMR jew titrazzjoni/derivatizzazzjoni). Id-determinazzjoni 
tal-konċentrazzjoni molekulari tal-gruppi terminali pre żenti fuq il- 
polimer tista' twassal g ħal valur g ħall-piż molekulari (7) (8) (9).
 
Applikabbiltà, M  n sa 50 000 (b'affidabilità li tonqos).  
3. Referenzi  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 
25-52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  KONTENUT TA' POLIMERI TA' PI Ż MOLEKULARI BAXX  
1. METODU  
Dan il-metodu ta' kromatografija bil-permeazzjoni tal- ġel hu ripe ­
tizzjoni ta' l-OECD TG 119 (1996). Il-prin ċipji fundamentali 
u iktar informazzjoni teknika jinsabu b ħala riferenzi.  
1.1. DA ĦLA 
Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk varji, huwa 
impossibbli li ji ġi deskritt metodu wie ħed li jagħti l-kondizzjonijiet 
preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw g ħal kull 
sitwazzjoni u g ħal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal- 
polimeri. Ta' spiss u b'mod partikolari, sistemi ta' polimeri 
kumplessi mhumiex so ġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni 
tal-ġel (GPC). Meta il-GPC mhuwiex prattikabbli, il-pi ż molekulari 
jista' jiġi deċiż b'metodi o ħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-ka żijiet, 
għandhom jing ħataw id-dettalji u l- ġustifikazzjonijiet kollha g ħall- 
użu ta' dak il-metodu.  
Il-metodu deskritt huwa bba żat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan 
l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif g ħandhom 
jitmexxew dawn l-esperimenti u kif g ħandha tiġi vvalutata d- 
DATA. F'ka ż illi hemm b żonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment 
jinbidlu, dawn il-bidliet iridu ji ġu ġġustifikati. Jistg ħu jintużaw 
standards o ħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu 
deskritt ju ża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid mag ħruf għall-kali­
brazzjoni, u jista' jag ħti l-każ li jrid ji ġi modifikat biex jaqbel ma' 
ċerti polimeri, e ż. polimeri li jin ħallu fl-ilma u polimeri  long-chain 
branched . 
1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Piż molekulari baxx huwa deskritt arbitrarjament b ħala piż 
molekulari ta' inqas minn 1 000 dalton.  
Il-medja tal-pi ż molekulari tan-numru M  n u l-medja tal-pi ż 
molekulari tal-pi ż M w huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li 
ġejjin: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
fejn, 
H I = il-livell tas-sinjal tad-ditekter mil-linji ba żi għall-volum ta' 
retenzjoni V  i , 
M i = M  i huwa t-toqol molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil- 
volum ta' retenzjoni V  i , u n huwa n-numru tal-punti tad- 
DATA.  
Il-wisa' tad-distribuzzjoni tat-toqol molekulari, li hija mi żura tat- 
tixrid tas-sistema, huwa mog ħti bil-proporzjon M  w /M n . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. SUSTANZI TA' RIFERENZA  
Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm b żonn ta' kalibrazzjoni. 
Normalment jintu żaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata 
u mibnija linearment u li g ħandhom pi ż molekulari medju M  n u M  w 
u distribuzzjoni ta' pi ż molekolari mag ħrufa. Il-kurva tal-kali ­
brazzjoni tista' tintu ża biss fid-determinazzjoni tal-pi ż molekulari 
tal-kampjun mhux mag ħruf jekk il-kondizzjonijiet g ħas-separazzjoni 
tal-kampjun u l-istandards intg ħażlu b'mod pre ċiżament l-istess.  
Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-pi ż molekulari u l-volum ta' 
elużjoni huwa validu biss ta ħt il-kondizzjonijiet spe ċifiċi ta' l- 
esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t- temperatura, s-solvent (jew ta ħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet 
tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal- 
kolonni.
 
Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri 
relattivi u huma deskritti b ħala “piżijiet molekulari ekwivalenti g ħall- 
polistiren”. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimi ċi 
bejn il-kampjun u l-istandards, il-pi żijiet molekulari jistg ħu 
jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards o ħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal- 
politin, il-metakrilat tal-polimetil, a ċidu poliakriliku, g ħandha 
titniżżel ir-raġuni.
 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' L-E ŻAMINAZZJONI  
Kemm id-distribuzzjoni tal-pi ż molekulari tal-kampjun kif ukoll il- 
piżijiet molekulari medji (M  n , M  w ) jistgħu jiġu ddeterminati billi 
jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu spe ċjali ta' kromatografija 
likwida fejn il-kampjun ji ġi separat skond il-valuri idrodinami ċi 
tal-kostitwenti individwali (2).  
Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jg ħaddi minn ġo kolonna mimlija 
b'materjal poru ż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu 
jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistg ħux. Il- 
passaġġ tal-molekoli kbar huwa, g ħalhekk, iqsar u g ħalhekk huma 
jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jg ħaddu iktar tard. L-i żgħar molekoli, b'ra ġġ idrodi­
namiku medju i żgħar mill-pori tal- ġel jistgħu jippenetraw il-pori 
kollha. Dawn ikun elu żi l-aħħar.
 
Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l- 
ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffi ċli li wieħed jevita xi 
interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni 
u volumi mejtin jistg ħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2).  
L-osservazzjoni hija effetwata minn, e ż. l-indiċi refrattiv jew l-assor ­
biment tal-UV u tag ħti kurva tad-distribuzzjoni sempli ċi. 
Madankollu, biex il-kurva ting ħata valuri attwali tal-pi ż molekulari, 
huwa neċessarju li l-kolonna ti ġi kkalibrata billi polimeri ta' pi ż 
molekulari mag ħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitni żżlu 
'l isfel, e ż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, g ħandha 
tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mg ħawwġa minħabba denb fuq 
in-naħa baxxa tal-pi ż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l- 
kwantità, skond il-pi ż, ta' l-ispe ċi tal-piż molekulari varji, u l-fus 
orizzontali l-pi ż molekulari rre ġistrat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Il-kontenut tal-pi ż molekulari baxx huwa derivat minn din il-kurva. 
Il-kalkolu jista' jkun e żatt biss jekk l-ispe ċi ta' piż molekulari baxx 
iġibu ruħhom bl-istess mod fuq ba żi ta' piż għall-polimer s ħiħ. 
1.5. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Standard Relattiv: RSD) tal-volum ta' l- 
elużjoni għandha tkun a ħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l- 
analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard 
intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid 
jiddependi fuq il-pi żijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-ka ż ta' 
standards tal-polisterin, valuri tipi ċi huma: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p huwa l-pi ż molekulari ta' l-istandard fil-qu ċċata tal-massimu)  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-E ŻAMINAZZJONI  
1.6.1.  Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistirene  
L-istandards tal-polisterin huma ma ħlula permezz ta' ta ħlit bil-galbu 
fl-eluwent mag ħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant 
għandhom ji ġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet.  
Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards li ntag ħżlu huma dipendenti fuq 
fatturi varji, e ż. il-volum ta' injezzjoni, il-visko żità tas-soluzzjoni u s- 
sensittività ta' l-indikatur analitiku. Il-volum massimu ta' injezzjoni għandu jiġi adattat g ħat-tul tal-kolonna, sabiex ti ġi evitata t-tag ħbija 
żejda. Il-volumi tipi ċi ta' injezzjoni g ħal separazzjonijiet analiti ċi bl- 
użu ta' GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma normalment bejn 
40 u 100 μl. Volumi og ħla huma possibbli, imma m'g ħandhomx 
ikunu aktar minn 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' volum ta' injezzjoni 
ma' konċentrazzjoni g ħandha tiġi ddeterminata qabel il-kalibrazzjoni 
attwali tal-kolonna.
 
1.6.2.  Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun  
Bħala prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw g ħall-preparazzjoni tas- 
soluzzjonijiet tal-kampjun. Il-kampjun hu ma ħlul f'solvent xieraq, 
e.g. tetraidrofuran (THF), billi jit ħawwad bil-galbu. Ta ħt l-ebda 
ċirkustanzi m'g ħandu jiġi maħlul permezz ta' banju ultrasoniku. 
Meta me ħtieġ, is-soluzzjoni tal-kampjun hija ppurifikata permezz 
ta' filtru tal-membrana b'daqs tal-pori ta' bejn 0,2 u 2 μm. 
Il-preżenza ta' partikoli mhux ma ħlula għandha tiġi rreġistrata fir- 
rapport finali peress li dawn jistg ħu jkunu min ħabba speċi ta' piż 
molekulari g ħoli. Metodu xieraq g ħandu jintu ża' biex ji ġi 
ddeterminat il-persenta ġġ f’piż tal-partikoli mhux ma ħlula. Is- 
soluzzjonijiet g ħandhom jintu żaw fi żmien 24 sieg ħa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Korrezzjoni g ħal kontenut ta' impuritajiet u addittivi  
Korrezzjoni tal-kontenut ta' spe ċi ta' M < 1 000 g ħall-kontribuzzjoni 
minn komponenti spe ċifiċi mhux polimeri pre żenti (eż. impuritajiet 
u/jew addittivi) hija ġeneralment me ħtieġa, sakemm il-kontenut 
imkejjel mhux di ġà <1 %. Dan jinkiseb permezz ta' anali żi diretta 
tas-soluzzjoni polimera jew l-elu żjoni GPC.  
F'każijiet fejn l-elu żjoni, wara passa ġġ mill-kolonna, hija wisq 
dilwita g ħal analiżi ulterjuri, din g ħandha tiġi kkonċentrata. Jista' 
jkun hemm il- ħtieġa li l-elużjoni tiġi evaporata san-nixfa u ma ħlula 
mill-ġdid. Kon ċentrazzjoni ta' l-elu żjoni għandha tiġi miksuba ta ħt 
kondizzjonijiet li jassiguraw li l-ebda bidliet ma jse ħħu fl-elużjoni. It- 
trattament ta' l-elu żjoni wara l-pass tal-GPC hu dipendenti fuq il- 
metodu analitiku u żat għad-determinazzjoni kwantitattiva.  
1.6.4.  Apparat  
L-apparat GPC jinkludi l-komponenti li ġejjin:  
— reservoir tas-solventi,  
— degasser  (fejn hemm b żonn),  
— pompa,  
— apparat li jnaqqas l-impuls (fejn hemm b żonn),  
— sistema ta' injezzjoni,  
— kolonni tal-kromatografija,  
— indikatur,  
— flowmeter  (fejn hemm b żonn) 
— reġistratur-pro ċessur tad-data,  
— reċipjent għall-iskart.  
Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas- 
solventi u żati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar g ħas-solvent THF).  
1.6.5.  L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi  
Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitg ħabba fuq il-kolonna bl- 
użu ta' auto-sampler  jew manwalment f' żona definita pre ċiżament. L- 
irtirar jew l-g ħafis tal- plunger  tas-siringa b'mod mg ħaġġel, jekk isir 
manwalment, jista' jikkaw ża bidliet fid-distribuzzjoni tal-pi ż 
molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent g ħandha, 
safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment 
għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il- flowrate  tkun 
madwar 1 ml/min.  
1.6.6.  Il-kolonna  
Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-u żu ta' kolonna 
sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. G ħadd ta' 
materjali poru żi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (e ż. daqs tal-pori, 
limiti ta' esklu żjoni) huma disponibbli kummer ċjalment. L-g ħażla tal- 
ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprje ­
tajiet tal-kampjun (volumi idrodinami ċi, distribuzzjoni tal-pi ż 
molekulari) u l-kondizzjonijiet spe ċifiċi għas-separazzjoni b ħas- 
solventi, t-temperatura u l- flowrate  (1) (2) (3).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Il-pjan ċi teoretiċi 
Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni u żati għas-separazzjoni 
għandhom ji ġu karatterizzati skond in-numru ta' pjan ċi teoretiċi. Dan 
jinvolvi, f’ka ż meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tag ħbija ta' 
soluzzjoni ta' etile ben żin jew ta' sustanza ma ħlula mhux b'polarità 
xierqa fuq kolonna ta' tul mag ħruf. In-numru ta' pjan ċi teoretiċi huwa 
mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
or N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
fejn, 
N = in-numru tal-pjan ċi teoretiċi 
V e = il-volum ta' elu żjoni fil-qu ċċata tal-massimu  
W = il-qu ċċata tal-wisa' tal-linja ba żi 
W 1/2 = il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-g ħoli 
1.6.8.  L-effi ċjenza tas-separazzjoni  
Flimkien ma' l-ammont tal-pjan ċi teoretiċi, li hija kwantità li tist ­
abbilixxi il- bandwidth , l-effiċjenza tas-separazzjoni g ħandha sehem 
ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kali ­
brazzjoni. L-effi ċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir- 
relazzjoni li ġejja: 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
cross sectional area of the column ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
fejn, 
V e, M  x = il-volum ta' elu żjoni għall-polistiren b'pi ż molekulari 
M x 
V e,(10.M x) = il-volum ta' elu żjoni għall-polistiren b'pi ż molekulari ta' 
għaxar darbiet iktar  
Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej: 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
fejn, 
V e1 , V e2 = il-volumi ta' elu żjoni taż-żewġ standards tal-polistiren 
fil-quċċata tal-massimu  
W 1 , W  2 = il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' ba żi 
M 1 , M  2 = il-piżijiet molekulari fil-qu ċċata tal-massimu (g ħandu 
jkun hemm differenza b' fattur ta' 10)  
Il-valur R g ħas-sistema tal-kolonni g ħandu jkun ikbar minn 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Solventi  
Is-solventi kollha g ħandhom ikollhom purità g ħolja (għat-THF 
tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depo żitu tas-solventi (f'atmosfera ta' 
gass inert, jekk huwa ne ċessarju) g ħandu jkun kbir bi żżejjed għall- 
kalibrazzjoni tal-kolonna u g ħal diversi anali żijiet tal-kampjuni. Il- 
gass għandu jitne ħħa mis-solvent qabel ma jg ħaddi għall-kolonna 
minn ġo pompa.  
1.6.10.  Kontroll tat-temperatura  
It-temperatura tal-komponenti kru ċjali interni (i ċ-ċirku ta' injezzjoni 
(injection loop ), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) g ħandha tkun 
kostanti u konsistenti skond l-g ħażla tas-solvent.  
1.6.11.  Ditekter  
Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirre ġistra b'mod kwantitattiv il-kon ċen­
trazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex ji ġi evitat li l- 
quċċati jitwessg ħu, il-volum tal- cuvette  taċ-ċellula tad-ditekter 
għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'g ħandux ikun akbar 
minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u g ħal ditekters 
tal-viskożità. Normalment tintu ża rifrattometrija differenzjali g ħall- 
osservazzjoni. Madankollu, jekk me ħtieġ mill-proprjetajiet spe ċifiċi 
tal-kampjun jew tas-solvent ta' elu żjoni, jistg ħu jintużaw ditekters 
oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-visko żità, eċċ. 
2. DATA U RAPPURTAR  
2.1. DATA  
L-istandard DIN (1) g ħandu jiġi kkonsultat g ħall-kriterji ta' valu ­
tazzjoni dettaljata kif ukoll g ħall-kondizzjonijiet g ħall-ġbir u għall- 
proċessar ta' DATA.  
Għal kull kampjun g ħandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. 
Għandhom ji ġu analizzati individwalment. Fil-ka żijietjiet kollha hu 
essenjzali li ti ġi ddeterminata wkoll DATA minn  blanks , ittrattati ta ħt 
l-istess kondizzjonijiet tal-kampjun.  
Huwa me ħtieġ li jiġi indikat b'mod espli ċitu li l-valuri mkejla huma 
valuri relattivi ekwivalenti g ħall-piż molekulari ta' l-istandard u żat. 
Wara determinazzjoni tal-volumi ta ż-żamma jew tal- ħinijiet taż- 
żamma (possibilment ikkore ġuti bl-użu ta' standard intern), valuri 
log M  p (M p meqjus b ħala l-ogħla quċċata ta' l-istandard tal-kali ­
brazzjoni) jitni żżlu ħdejn waħda minn dawn il-kwantitajiet. Mill- 
inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma me ħtieġa għal kull sett ta' 
għaxaa piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma 
meħtieġa għall-kurva totali, li g ħandha tkopri l-pi ż molekulari stmat 
għall-kampjun. Il-punt ta' tmiem baxx tal-pi ż molekulari tal-kurva ta' 
kalibrazzjoni huwa mfisser minn  n-hexyl  benżin jew minn 
soluzzjonima ħlula mhux polari o ħra xierqa. Il-porzjon tal-kurva li 
jikkorrispondi g ħall-piż molekulari ta ħt 1 000 huwa ddeterminat 
u kkoreġut kif me ħtieġ għall-impuritajiet u l-addittivi. Il-kurvi ta' l- 
elużjoni huma ġeneralment stmati permezz ta' l-ippro ċessar elet ­
troniku tad-DATA. Fil-ka ż li tintuża diġitazzjoni manwali, ASTM 
D 3536-91 jista' ji ġi kkonsultat (3).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Jekk kwalunkwe polimer li ma jin ħallx jinżamm fil-kolonna, il-pi ż 
molekulari tieg ħu x'aktarx li jkun og ħla minn dak tal-frazzjoni li 
tinħall, u jekk ma ji ġix ikkunsidrat jista' jirri żulta fi stima 
eċċessiva tal-kontenut tal-pi ż molekulari baxx. Gwida g ħall- 
korrezzjoni tal-kontenut tal-pi ż molekulari baxx g ħall-polimer li ma 
jinħallx hija prevista fl-Anness.  
Il-kurva tad-distribuzzjoni g ħandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella 
jew figura (frekwenza differenzjali jew persenta ġġi tas-somom ma' 
log M). Fir-rappre żentazzjoni grafika, sett wie ħed ta' għaxar piżijiet 
molekulari huwa normalment wiesa' 4 cm u l-massimu tal-qu ċċata 
għandu jkun twil xi 8 cm. F'ka ż ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, 
d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % g ħandha tkun ta' xi 10 cm.  
2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
2.2.1.  Sustanza tat-test  
— informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, 
addittivi, impuritajiet),  
— deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, 
problemi.  
2.2.2.  Strumentazzjoni  
— kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tne ħħija ta' gass żejjed ta' l- 
eluwent, kompo żizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,  
— pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,  
— kolonni tas-separazzjoni (il-fabbrikant, l-informazzjoni kollha 
dwar il-karatteristi ċi tal-kolonni b ħad-daqs tal-pori, it-tip ta' 
materjal ta' separazzjoni e ċċ., in-numru, it-tul u l-ordni tal- 
kolonni u żati), 
— numru ta' pjan ċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), 
effiċjenza tas-separazzjoni (ri żoluzzjoni tas-sistema).  
— informazzjoni dwar is-simetrija tal-qu ċċati, 
— temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,  
— indikatur (prin ċipju tal-kejl, tip,  cuvette , volum),  
— flowmeter  jekk użat (il-fabbrikant, il-prin ċipju tal-kejl),  
— sistema g ħar-reġistrazzjoni u pro ċessar tad-DATA ( hardware  
u software ) 
2.2.3.  Kalibrazzjoni tas-sistema  
— deskrizzjoni dettaljata tal-metodu u żat biex tinbena l-kurva tal- 
kalibrazzjoni,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (e ż. 
koeffiċjent tal-korrelazzjoni,  error sum of squares  eċċ.), 
— informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l- 
approssimazzjonijiet li saru waqt il-pro ċedura esperimentali u l- 
valutazzjoni u l-pro ċessar tad-DATA,  
— il-kejl kollu u żat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni 
għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li 
ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:  
— l-isem tal-kampjun,  
— il-fabbrikant tal-kampjun,  
— il-valuri karatteristi ċi ta' l-istandards M  p , M  n , M  w u M  w /M n , 
kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif mi ġjuba minn kejl 
sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' deter ­
minazzjoni,  
— il-volum ta' l-injezzjoni u l-kon ċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,  
— il-valur M  p użat għall-kalibrazzjoni,  
— il-valur ta' l-elu żjoni jew il- ħin taż-żamma kkore ġut imkejjel 
fl-ogħla punt massimu,  
— l-M  p kkalkulat fl-og ħla punt massimu,  
— il-persenta ġġ ta' żball ta' l-M  p kkalkulat u l-valur tal-kali ­
brazzjoni.  
2.2.4.  Informazzjoni dwar il-kontenut polimeru ta' pi ż molekulari baxx  
— deskrizzjoni tal-metodi u żati fl-anali żi u l-mod li bih twettqu l- 
esperimenti;  
— informazzjoni dwar il-persenta ġġ ta' kontenut ta' spe ċi ta' piż 
molekulari baxx (w/w) relatat mal-kampjun totali,  
— informazzjoni dwar impuritajiet, addittivi u spe ċi oħra mhux 
polimeri f'persenta ġġ f’piż relatat mal-kampjun totali.  
2.2.5.  Valutazzjoni:  
— valutazzjoni fuq ba żi ta' ħin: il-metodi u żati biex tkun żgurata r- 
riproduzzjoni me ħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, 
eċċ.), 
— informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-ba żi tal- 
volum ta' l-elu żjoni jew il- ħin taż-żamma,  
— informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk qu ċċata mhijiex 
analizzata kompletament,  
— deskrizzjoni ta' metodi li jne ħħu x-xkiel, jekk u żati, 
— proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,  
— il-preżenza ta' partikoli mhux ma ħlulin, jekk hemm,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— il-volum ta' l-injezzjoni ( μl) u l-kon ċentrazzjoni ta' l-injezzjoni 
(mg/ml),  
— osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu g ħal devjazzjonijiet 
mill-profil GPC ideali,  
— deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-pro ċeduri 
ta' l-ittestjar,  
— dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,  
— kwalunkwe informazzjoni o ħra u osservazzjonijiet rilevanti g ħall- 
interpretazzjoni tar-ri żultati,  
3. REFERENZI  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philad ­
elphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Appendiċi 
Gwida g ħall-korrezzjoni tal-kontenut molekulari baxx g ħall-preżenza ta' 
polimeri insolubbli  
Meta hemm polimer insolubbli f'kampjun, dan jirri żulta f'telf tal-pi ż matul l- 
analiżi GPC. Il-polimer insolubbli jin żamm b'mod irriversibbli fuq il-kolonna 
jew il-filtru tal-kampjun waqt li l-porzjon solubbli tg ħaddi mill-kolonna. Fil- 
każ fejn iż-żieda fl-indi ċi rifrattiva (dn/dc) tal-polimer tista' tkun stmata jew 
imkejla, wie ħed jista' jistma’ l-pi ż tal-kampjun mitluf fuq il-kolonna. F'dak il- 
każ, wieħed jagħmel korrezzjoni bl-u żu ta' kalibrazzjoni esterna b'materjali 
standard ta' kon ċentrazzjoni mag ħrufa u dn/dc mag ħruf sabiex ikun ikkalibrat 
ir-reazzjoni tar-rifrattometru. Fl-e żempju hawn ta ħt jintuża standard  poly (methyl 
methacrylate)  (pMMA).  
Fil-kalibrazzjoni esterna g ħall-analiżi ta' polimeri akrili ċi, standard pMMA ta' 
konċentrazzjoni mag ħrufa fit-tetraidrofuran, ji ġi analizzat bil-GPC u d-data li 
tirriżulta tintuża biex jinsab il-kostanti tar-rifrattometru skond l-ekwazzjoni:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
fejn: 
K = il-kostanti tar-rifrattometru (f'microvolt second/ml),  
R = it-twe ġiba ta' l-istandard pMMA (f'microvolt/second),  
C = il-kon ċentrazzjoni ta' l-istandard pMMA (f'mg/ml),  
V = il-volum ta' l-injezzjoni (f'ml) u  
dn/dc = i ż-żieda fl-indi ċi rifrattiv g ħall-pMMA f'tetraidrofuran (f'ml/mg).  
The following data are typical for a pMMA standard:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg  
Il-valur K li jirri żulta, 3,05 × 10  11 imbagħad jintuża biex tkun ikkalkulata r- 
reazzjoni teoretika tad-ditekter jekk 100 % tal-polimer injettat kien elwat permezz 
tad-ditekter.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  L-IM ĠIBA TAS-SOLUZZJONI/TA' L-ESTRAZZJONI TA' 
POLIMERI FL-ILMA  
1. METODU  
Il-metodu deskritt huwa repetizzjoni tal-ver żjoni reveduta ta' l-OECD 
TG 120 (1997). Aktar informazzjoni teknika ting ħata bħala referenza (1).  
1.1. DA ĦLA 
Għal ċerti polimeri, b ħall-polimeri ta' emulsjoni, xog ħol ta' 
preparazzjoni inizjali jista' jkun me ħtieġ qabel ma jista' jintu ża' l- 
metodu stabbilit minn hawn 'il quddiem. Il-metodu mhuwiex 
applikabbli g ħal polimeri likwidi u g ħal polimeri li jirrea ġixxu ma' 
l-ilma taħt il-kondizzjonijiet ta' l-ittestjar.  
Meta l-metodu mhuwiex prattiku jew mhuwiex possibbli, l-im ġiba 
tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tista' ti ġi investigata permezz ta' 
metodi o ħrajn. F'ka żijiet bħal dawn, dettalji s ħaħ u ġustifikazzjoni 
sħiħa għandhom jing ħataw għall-metodu u żat. 
1.2. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Xejn.  
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR  
L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri f'sustanza ta' l- 
ilma hija ddeterminata bl-u żu tal-metodu tal-flixkun (ara A.6 is-solu ­
bilità fl-ilma, metodu tal-flixkun) bil-modifikazzjonijiet deskritti hawn taħt.
 
1.4. KRITERJI TA' KWALITÀ  
Xejn.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR  
1.5.1.  Apparat  
L-apparat li ġej hu me ħtieġ għall-metodu:  
— mezz ta' tifrik, e ż. mola għall-produzzjoni ta' partikoli ta' daqs 
magħruf, 
— apparat g ħat-tħawwid bil-possibiltà ta' kontroll tat-temperatura,  
— sistema ta' l-iffiltrar tal-membrana,  
— apparat analitiku xieraq,  
— għarbiela standardizzati.  
1.5.2.  Preparazzjoni tal-kampjun  
Kampjun rappre żentattiv g ħandu l-ewwel jitnaqqas sa daqs ta' 
partikolu bejn 0,125 u 0,25 mm bl-u żu ta' għarbiela xierqa. Jista' 
jkun meħtieġ tkessiħ għall-istabbilità tal-kampjun jew g ħall-proċess 
tad-tħin. Materjali ta' natura li tixbah il-lastiku jistg ħu jitfarrku fit- 
temperatura tan-nitro ġenu likwidu (1).  
Jekk il-frazzjon tad-daqs tal-partikolu me ħtieġ ma jistax jinkiseb, 
għandha tittie ħed azzjoni biex kemm jista' jkun jitnaqqas id-daqs 
tal-partikoli u r-ri żultat jiġi rrappurtat. Fir-rapport, huwa me ħtieġ li 
jiġi indikat il-mod li bih il-kampjun imfarrak kien ma ħżun qabel it- 
test. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Pro ċedura  
Tliet kampjuni ta' 10g tas-sustanza tat-test jinti żnu f'kull wie ħed 
minn tliet kontenituri li g ħandhom  stopper  tal-ħġieġ u jiżdiedu 
1 000 ml ta' ilma f’kull kontenitur. Jekk it-trattament ta' ammont 
ta' polimeru ta' 10 g jidher li mhuwiex prattikabbli, l-og ħla 
ammont li jmiss li jista' ji ġi ttrattat g ħandu jintu ża' u l-volum ta' 
ilma jiġi aġġustat skond dan.  
Stoppers  jitqiegħdu fuq il-kontenituri u ji ġu ssikkati u mbg ħad 
jitħawdu f'temperatura ta' 20  o C. Għandu jintu ża apparat ta' ċaqliq 
jew tħawwid li kapa ċi jaħdem f'temperatura kostanti. Wara perjodu 
ta' 24 sieg ħa, il-kontenut ta' kull kontenitur huwa ċċentrifugat 
u ffiltrat u l-kon ċentrazzjoni ta' polimer fil-fa żi ċara ta' l-ilma hija 
ddeterminata permezz ta' metodu analitiku xieraq. Jekk metodi 
analitiċi xierqa g ħall-fażi ta' l-ilma mhumiex disponibbli, is- 
solubilità/l-estrattività totali tista' ti ġi stmata mill-pi ż niexef tar- 
residwu tal-filtru jew tal-pre ċipitat iċċentrifugat.  
Is-soltu ikun hemm il- ħtieġa li jkun hemm differenza kwantitattiva 
bejn l-impuritajiet u l-addittivi min-na ħa l-waħda u l-ispe ċi ta' piż 
molekulari baxx min-na ħa l-oħra. Fil-ka ż ta' determinazzjoni 
gravimetrika, huwa importanti wkoll li titwettaq prova blank mingħajr sustanza g ħat-test sabiex jinkiseb g ħarfien dwar residwi li 
ġejjin mill-pro ċedura esperimentali.
 
L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri fl-ilma f’tem ­
peratura ta' 37  o C f’pH 2 u pH 9 tista' ti ġi ddeterminata bl-istess 
mod kif deskritt fit-twettiq ta' l-esperiment f‘temperatura ta' 20  o C. Il- 
valuri tal-pH jistg ħu jinkisbu bi ż-żieda jew sustanzi ta' protezzjoni 
xierqa jew ta' a ċidi jew ta' ba żi xierqa b ħal aċidu idrokloriku, a ċidu 
aċetiku, sodju ta' grad analitiku jew idrossidu tal-potassju jew NH  3 . 
Skond il-metodu ta' anali żi użat, għandhom jitwettqu test wie ħed jew 
żewġ testijiet. Meta metodi spe ċifiċi biżżejjed ikunu disponibbli 
għall-analiżi diretta tal-fa żi ta' l-ilma g ħall-komponent tal-polimer, 
test wie ħed kif deskritt hawn fuq g ħandu jkun bi żżejjed. 
Madankollu, meta dawn il-metodi mhumiex disponibbli u d-deter ­
minazzjoni ta' l-im ġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tal-polimer hija 
limitata g ħall-analiżi indiretta billi ji ġi iddeterminat biss il-kontenut 
totali ta' karbonju organiku (TOC) ta' l-estratt ta' l-ilma, test addizzjonali g ħandu jitwettaq. Dan it-test addizzjonali g ħandu 
wkoll jsir tliet darbiet, bl-u żu ta' kampjuni ta' polimeri li huma 10 
darbiet iżgħar u bl-istess ammonti ta' ilma u żati fl-ewwel test.
 
1.5.4.  Anali żi 
1.5.4.1.  Test imwettaq b'daqs wie ħed ta' kampjun  
Jista' jkun hemm metodi disposnibbli g ħall-analiżi diretta ta' 
komponenti polimeri fil-fa żi ta' l-ilma. Inkella, anali żi indiretta ta' 
komponenti polimeri ma ħlula/estratti, permezz tad-determinazzjoni 
tal-kontenut totali ta' partijiet li jin ħallu u l-korrezzjoni g ħal 
komponenti polimeri mhux spe ċifiċi, tista' wkoll ti ġi kkunsidrata.  
Analiżi tal-fażi ta' l-ilma g ħall-ispeċi polimerika totali hija possibbli:  
jew permezz ta' metodu sensittiv bi żżejjed, eż. 
— TOC li tu ża diġestjoni ta' persulfat jew dikromata biex tag ħti 
CO 2 segwita bi stima permezz ta' IR jew ta' anali żi kimika,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— spettrometrija atomika ta' l-assorbiment (AAS) jew l-emissjoni 
tal-plasma tag ħha magħquda b'mod induttiv (ICP) ekwivalenti 
għal silikone jew polimer li jkun fih il-metall,  
— assorbiment ta' l-UV jew spettrofluworimetrija g ħall-polimeri  
aryl, 
— LC-MS g ħal kampjuni ta' pi ż molekulari baxx.  
jew permezz ta' evaporazzjoni b'vakwu san-nixfa ta' l-estratt ta' l- 
ilma u anali żi spettroskopika (IR, UV, e ċċ.) jew AAS/ICP tar- 
residwu.  
Jekk anali żi tal-fażi ta' l-ilma fiha nnifisha mhijiex prattikabbli, l- 
estratt ta' l-ilma g ħandu jiġi estratt b'solvent organiku li ma jistax 
jitħallat ma' l-ilma, e ż. idrokarbonju klorinat. Is-solvent huwa 
mbagħad evaporat u r-residwu huwa analizzat kif imsemmi hawn 
fuq għall-kontenut polimeru notifikat. Kwalunkwe komponenti 
f'dan ir-residwu li huma identifikati b ħala impuritajiet jew addittivi 
għandhom jitnaqqsu g ħall-iskop tad-determinazzjoni tal-grad ta' 
soluzzjoni/ta' l-estrazzjoni tal-polimer nnifsu.  
Meta kwantitajiet relattivament kbar ta' dawn il-materjali huma 
preżenti, jista' jkun me ħtieġ li r-residwu ji ġi soġġett għal, eż. 
analiżi HPLC jew GC biex ji ġu differenzjati l-impuritajiet pre żenti 
li ġejjin mill-ispe ċi monomeri jew li ġejjin mill-monomeri sabiex il- 
kontenut veru ta' dawn ta' l-a ħħar jista' ji ġi ddeterminat.  
F'xi każijiet, jista' jkun suffi ċjenti li ssir evaporazzjoni sempli ċi tas- 
solvent organiku san-nixfa u li jinti żen ir-residwu niexef.  
1.5.4.2.  Test imwettaq b' żewġ daqsijiet differenti ta' kampjun  
L-estratti ta' l-ilma kollha huma analizzati g ħat-TOC.  
Determinazzjoni gravimetrika titwettaq fuq il-parti mhux ma ħlula/­
mhux estratta tal-kampjun. Jekk, wara ċ-ċentrifugazzjoni jew l- 
iffiltrar tal-kontenut ta' kull kontenitur, residwi polimeri jibqg ħu 
mwahħlin mal-ħajt tal-kontenitur, il-kontenitur g ħandu jitla ħlaħ bil- 
filtrat sa kemm il-kontenitur jitnaddaf mir-residwi vi żibbli kollha. 
Wara dan, il-filtrat huwa ċċentrifugat jew iffiltrat g ħal darb'oħra. 
Ir-residwi li jibqg ħu fuq il-filtru jew fit-tubu ta ċ-ċentrifugu 
jitnixxfu f’temperatura ta' 40  o C taħt vakwu u jinti żnu. It-tnixxif 
jitkompla sakemm jintla ħaq piż kostanti.  
2. DATA  
2.1. TEST IMWETTAQ B'DAQS WIE ĦED TAL-KAMPJUN  
Ir-riżultati individwali g ħal kull wie ħed mit-tliet fliexken u l-valuri 
medji għandhom jing ħataw u għandhom ikunu espressi f'unitajiet ta' 
piż għal kull volum tas-soluzzjoni (tipikament mg/l) jew pi ż għal 
kull piż ta' kampjun tal-polimeru (tipikament mg/g). Barra dan, it- 
telf ta' pi ż tal-kampjun (ikkalkulat b ħala l-piż tas-sustanza ma ħlula 
mnaqqsa mill-pi ż tal-kampjun inizjali) g ħandu wkoll jing ħata. Id- 
devjazzjonijiet relattivi standard (RSD) g ħandhom ji ġu kkalkulati. 
Figuri individwali g ħandhom jing ħataw għas-sustanza totali 
(polimer + addittivi essenzjali, e ċċ.) u għall-polimer biss (ji ġifieri 
wara t-tnaqqis tal-kontribuzzjoni minn dawn l-addittivi).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. TEST IMWETTAQ B' ŻEWĠ DAQSIJIET DIFFERENTI TAL- 
KAMPJUN  
Il-valuri TOC individwali ta' l-estratt ta' l-ilma ta ż-żewġ esperimenti 
ripetuti għal tliet darbiet u l-valur medju g ħal kull esperiment g ħandu 
jingħata espress b ħala unità ta' pi ż għal kull volum ta' soluzzjoni 
(tipikament mgC/1), kif ukoll f'unità ta' pi ż għal kull pi ż tal- 
kampjun inizjali (tipikament mgC/g).  
Jekk m'hemm l-ebda differenza bejn ir-ri żultati fil-proporzjonijiet 
għolja u baxxi tal-kampjun/ilma, dan jista' jindika li l-komponenti 
li setgħu jiġu estratti kienu fil-fatt estratti kollha. F'dan il-ka ż, analiżi 
diretta m'g ħandhiex normalment tkun me ħtieġa. 
Il-piżijiet individwali tar-residwi g ħandhom jing ħataw u jiġu espressi 
f'persenta ġġ tal-piżijiet inizjali tal-kampjuni. Il-medji g ħandhom ji ġu 
kkalkulati g ħal kull esperiment. Id-differenzi bejn 100 u l-persenta ġġi 
li nstabu jirrappre żentaw il-persenta ġġi ta' materjal li jin ħall u li jista' 
jiġi estratt fil-kampjun ori ġinali.  
3. RAPPURTAR  
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
3.1.1.  Is-sustanza g ħat-test  
— informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza g ħat-test (identità, 
addittivi, impuritajiet, kontenut ta' spe ċi ta' piż molekulari baxx).  
3.1.2.  Kondizzjonijiet esperimentali  
— deskrizzjoni tal-pro ċeduri użati u kondizzjonijiet esperimentali,  
— deskrizzjoni tal-metodi analiti ċi u ta' osservazzjoni.  
3.1.3.  Ri żultati  
— riżultati tal-kapa ċità li jin ħall/jiġi estratt f’mg/l; valuri medji 
u individwali g ħat-testijiet ta' l-estrazzjoni fis-soluzzjonijiet 
varji, imqassmin f'kontenut polimeru u impuritajiet, addittivi, eċċ.,
 
— riżultati tal-kapa ċità li jinħall/jiġi estratt f’mg/g ta' polimer,  
— valuri TOC ta' estratti ta' l-ilma, pi ż tas-sustanza li tin ħall u l- 
persentaġġi kkalkulati, jekk imkejlin,  
— il-pH ta' kull kampjun,  
— informazzjoni dwar il-valuri vojta,  
— fejn me ħtieġ, referenzi g ħall-instabilità kimika tas-sustanza tat- 
test, kemm matul il-pro ċess ta' l-ittestjar kif ukoll il-pro ċess 
analitiku,  
— l-informazzjoni kollha li hija importanti g ħall-interpretazzjoni tar- 
riżultati.  
4. REFERENZI  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  PROPRJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI)  
1. METODU  
1.1 INTRODUZZJONI  
Dan il-metodu tat-test huwa ddisinjat sabiex ikejjel il-potenzjal ta' 
sustanza likwida li żżid ir-rata tal- ħruq jew l-intensità tal- ħruq ta' 
sustanza kombustibbli, jew li tifforma ta ħlita ma' sustanza kombus ­
tibbli li tie ħu n-nar b'mod spontanju, meta it-tnejn ikunu komp ­
letament im ħallta. Dan huwa bba żat fuq it-test tan-NU dwar 
likwidi ossidizzanti (1) u huwa ekwivalenti g ħalih. B'danakollu, 
minħabba li dan il-metodu A.21 huwa primarjament iddisinjat biex 
jissodisfa l- ħtiġijiet tar-Regolament 1907/2006, huwa me ħtieg il- 
paragun ma' sustanza ta' referenza wa ħda. It-testijiet u l-paragun 
ma' sustanzi addizzjonali ta' referenza jistg ħu jkunu me ħtieġa meta 
jkun mistenni li r-ri żultati tat-test se jintu żaw għal skopijiet 
oħrajn. (  1 ) 
Dan it-test mhux bil-fors li jitwettaq meta l-e żami tal-formula 
struttrali jistabbilixxi lil hinn minn kull dubbju ra ġjonevoli li s- 
sustanza ma jistax ikollha reazzjoni e żotermika ma' materjal kombus ­
tibbli.  
Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar il-potenzjal 
tal-proprjetajiet esplo żivi tas-sustanza qabel ma jitwettaq it-test.  
Dan it-test mhux applikabbli g ħal solidi, gassijiet, sustanzi li huma 
ferm fjammabbli jew splussivi, jew perossidi organi ċi. 
Dan it-test jista' ma jsirx meta r-ri żultati tas-sustanza g ħat-test fit-test 
tan-NU g ħal likwidi ossidanti (1) ikunu di ġà disponibbli.  
1.2 DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Iż-żieda fil-ħin tal-pressjoni medja hija l-medja tal- ħinijiet imkejla 
għal taħlita li tkun g ħat-test sabiex tipprodu ċi żieda fil-pressjoni 
minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar minn dik atmosferika.  
1.3 SUSTANZA TA' REFERENZA  
65 % (w/w) a ċidu nitriku fl-ilma (grad analitiku) huwa me ħtieġ bħala 
sustanza ta' referenza (  2 ). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Kif, per e żempju, muri fil-kwadru tar-regolamenti ta' trasport tan-NU. 
( 2 ) L-aċidu għandu jiġi ttitrat qabel it-test sabiex ti ġi kkonfermata l-kon ċentrazzjoni tieg ħu.
 L-aħjar, jekk l-esperiment jipprevedi li r-ri żultati ta' dan it-test jistg ħu 
eventwalment ikunu u żati għal skopijiet o ħrajn (  1 ), l-ittestjar ta' 
sustanzi ta' referenza addizzjonali jista' jkun xieraq ukoll (  2 ). 
1.4 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-likwidu g ħat-test jit ħawwad fi proporzjon ta' 1: 1, bil-pi ż, ma' 
ċellulożi fibruża u jiġi introdott f’re ċipjent ta' pressjoni. Jekk waqt 
it-taħlit jew waqt il-mili jaqbad b'mod spontanju, l-ebda test ie ħor ma 
jkun meħtieġ. 
Jekk ma jaqbadx b'mod spontanju it-test kollu g ħandu jitwettaq. It- 
taħlita tisaħħan f'reċipjent ta' pressjoni u l- ħin medju jkun irre ġistrat 
għall-pressjoni li titla’ minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar mill- 
pressjoni atmosferika. Dan jitqabbel ma ż-żieda fil ħin tal-pressjoni 
medja għat-taħlita 1: 1 tas-sustanza(i) ta' referenza u ċ-ċellulożi. 
1.5 KRITERJA TA' KWALITÁ  
F'serje ta' ħames provi fuq sustanza wa ħda l-ebda ri żultat m'għandu 
jiddiferixxi b'aktar minn 30 % mill-medja aritmetika. Ir-ri żultati li 
jiddiferixxu b'aktar minn 30 % minn dik il-medja g ħandhom 
jitwarrbu, il-pro ċedura tat-ta ħlit jew tal-mili tittejjeb u t-test ji ġi 
ripetut.  
1.6 DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.6.1  Preparazzjoni  
1.6.1.1  Sustanza kombustibbli  
Sustanza xotta, fibru ża, biċ-ċellulożi b'fibra b'tul ta' bejn 50 
u 250 μm u dijametru medju ta' 25 μm, (  3 ) tintuża bħala l-materjal 
kombustibbli. Din titnixxef g ħal piż kostanti f'saff ta' mhux aktar 
minn 25 mm ħxuna f’105  o C għal 4 sigħat u tinżamm f'dessikatur, 
bid-dessikant, sakemm tibred u tkun me ħtieġa għall-użu. Il-kontenut 
ta' l-ilma ta ċ-ċellulożi xotta g ħandu jkun anqas minn 0,5 % f’pi ż 
xott (  4 ). Jekk me ħtieġ, il-ħin tat-tnixxif g ħandu jittawwal sabiex 
jintlaħaq dan il-livell (  5 ). L-istess lott ta' ċellulożi għandu jintu ża 
matul it-test kollu.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Kif, per e żempju, muri fil-kwadru tar-regolamenti ta' trasport tan-NU. 
( 2 ) Eż.: 50 % (w/w) a ċidu perkloriku u 40 % (w/w) klorat tas-sodju jintu żaw f’referenza 1. 
( 3 ) eż. Trab ta ċ-Ċelluloża għal — Kolonni tal-Kromatografija Whatman CF11, nru tal- 
katalgu 4021050. 
( 4 ) Konfermat minn (e ż.) titrazzjoni Karl-Fisher. 
( 5 ) Alternattivament, dan il-kontenut ta' ilma jista' jintla ħaq (eż.) b'tisħin f’105  o C taħt 
vakwu għal 24 h.
 1.6.1.2  Apparat  
1.6.1.2.1 R e ċ i p j e n t t a ' p r e s s j o n i  
Reċipjent ta‘ pressjoni huwa me ħtieġ. Ir-reċipjent jikkonsisti minn 
reċipjent ċilindriku ta' pressjoni ta' l-azzar 89 mm tul u 60 mm 
dijametru estern (ara l-figura 1). Żewġ pjanċi huma msawwra 
b'magna fuq in-na ħat opposti (il- cross section  tar-reċipjent b'hekk 
tonqos għal 50 mm) sabiex ikun iffa ċilitat it-twa ħħil tal-plagg li 
jqabbad u tat-tapp tal-vent. Ir-re ċipjent, b' ċirkonfernza interna ta' 
20 mm u ribattut f'kull tarf g ħall-fond ta' 19 mm u b'kamin li 
jaċċetta 1”  British Standard Pipe  (BSP) jew l-ekwivalenti 
metriku. It- take-off  tal-pressjoni, fl-g ħamla ta' drieg ħ laterali, ti ġi 
invitata fuq il-wi ċċ tal-kurva tar-re ċipjent ta' pressjoni, 35 mm 
minn tarf wie ħed u 90  o mill-pjanċi msawwra b'magna. Il-plagg 
għal dan jit ħaffer għal fond ta' 12 mm u jing ħata l-kamin sabiex 
jaċċetta 1/2” BSP (jew metriku ekwivalenti) fit-tarf l-ie ħor tad- 
driegħ. Jekk me ħtieġ, siġill inert jitwa ħħal sabiex jassigura si ġill 
li ma jg ħaddix gass minnu. Id-drieg ħ tal-ġenb jestendi g ħall- 
55 mm lil hinn mil-qafas tar-re ċipjent ta' pressjoni u jkollu ħofra 
interna ta' 6 mm. It-tarf tad-drieg ħ tal-ġenb ikun ribattut u jkollu 
kamin sabiex ja ċċetta transducer  tal-pressjoni tat-tip bid-dijaframma. 
Kwalunkwe apparat li jkejjel il-pressjoni jista' jintu ża basta dan ma 
jkunx effettwat minn gassijiet s ħan jew minn dikompo żizzjoni ta' 
prodotti u jkun kapa ċi jirrispondi g ħal rati ta' żieda fil-pressjoni ta' 
690-2 070 kPa f'mhux aktar minn 5ms.  
It-tarf l-aktar 'il bog ħod mid-drieg ħ tal-ġenb tar-re ċipjent ta‘ pressjoni 
jingħalaq bi plagg li jqabbad u li jkun mg ħammar b' żewg elettrodi, 
waħda insulata minn ġewwa, u l-o ħra mwaħħla ma' l- earth , mal- 
plagg taċ-ċilindru. It-tarf l-ie ħor tar-reċipjent ta‘ pressjoni jing ħaluq 
b'disk li tinfaqa' (pressjoni tat-tifqig ħ ta' madwar 2 200 kPa) 
miżmuma fil-post b'plagg li j żomm li jkollu ħofra ta' 20 mm. Jekk 
meħtieġ, siġill inert jintu ża mal-plagg li jqabbad sabiex ji żgura rabta 
tajba li ma jg ħaddix gass minnha. Stend ta' frid (il-figura 2) iservi 
sabiex iżomm l-immuntar fil-po żizzjoni t-tajba matul l-u żu. Dan 
normalment ikun jinkludi pjan ċa ta' l-azzar artab b'kejl ta' 235 mm 
× 184 mm × 6 mm u 185 mm tul b'sezzjoni kwadra m ħaffra (S.H.S.) 
70 mm × 70 mm × 4 mm.  
Sezzjoni tkun maqtug ħa minn kull wie ħed mill-ġnub opposti fit-tarf 
ta' l-S.H.S. hekk li tirri żulta struttura b' żewġ saqajn bil- ġenb ċatt li 
fuqha tistrie ħ box section  intatta b'tul ta' 86 mm. It-truf ta' dawn il- 
ġnub ċatti huma maqtug ħa għal angolu ta' 60  o mal-lat orizzontali 
u iwweldjati mal-pjan ċa tal-qieg ħ. Qasma bil-kejl ta' 22 mm wisa' 
x 46 mm fond tinqata’ b'mod mekkaniku fuq na ħa waħda fit-tarf ta' 
fuq tas-sezzjoni tal-qieg ħ hekk li l-immuntar tar-re ċipjent ta' 
pressjoni jitni żżel, it-tarf tal-plagg li jqabbad jidda ħħal l-ewwel, fil-  
box section  ta' l-irfid tas-sezzjoni, bid-drieg ħ tal-ġenb akkomodat 
f'dik il-qasma. Bi ċċa azzar 30 mm wisa' u 6 mm ħxuna tkun 
iwweldjata mal-wi ċċ intern l-aktar baxx tas-sezzjoni tal- box section  
sabiex taġixxa bħala spacer.  Żewġ skorfini  butterfly,  bil-kamin fuq 
il-wiċċ oppost, iservu sabiex i żommu r-re ċipjent ta' pressjoni 
f'pożizzjoni soda. Żewġ strippi 12 mm wiesa' mag ħmulin minn 
azzar ta' 6 mm ħxuna, iwweldjati mal-bi ċċiet tal-ġenb li jo ħorġu 
mill-bażi tal- box section , jirfdu r-re ċipjent tal-pressjoni minn ta ħt. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 S i s t e m a l i t a g ħ t i n - n a r  
Is-sistema li tag ħti n-nar tikkonsisti minn wajer ta' Ni/Cr twil 
25 cm b'dijametru ta' 0,6 mm u b’re żistenza ta' 3,85 
ohm/m. Il-wajer jinbaram, bl-u żu ta' virga b'dijametru ta' 5 mm, 
f'għamla ta' romblu u jintrabat ma' l-elettrodi tal-plagg li jqabbad. 
Ir-romblu g ħandu jkollu wa ħda mill-konfigurazzjonijiet murija fil- 
figura 3. Id-distanza bejn il-qieg ħ tar-reċipjent u l-parti t'isfel tar- 
romblu li jqabbad g ħandha tkun 20 mm. Jekk l-elettrodi ma 
jkunux a ġġustabbli, it-trufijiet tal-wajer li jqabbad bejn ir-romblu 
u l-qieg ħ tar-reċipjent għandhom ikunu insulati b'kisja ta ċ- 
ċeramika. Il-fil jissa ħħan b'kurrent kostanti ta' l-elettriku li jista' 
jforni mill-anqas 10 A.  
1.6.2  It-twettiq tat-test  ( 1 ) 
L-apparat, immuntat kollu kemm hu bit- transducer  tal-pressjoni u s- 
sistema tas-s ħana imma ming ħajr il-plattina li tinfaqa', huwa mirfud 
bit-tarf tal-plagg li jqabbad fin-na ħa t'isfel. 2,5 g mill-likwidu tat-test 
jitħallat ma' 2,5 g ta ċ-ċelluloża mnixxfa f 'beaker  tal-ħġieġ bl-użu ta' 
virga tal-ħġieġ għat-tħawwid (  2 ). Bħala prekawzjoni kontra l-periklu, 
it-tħawwid għandu jitwettaq wara tarka tas-sikurezza bejn l-operatur 
u t-taħlita. Jekk it-ta ħlita taqbad matul it-t ħawwid jew waqt il-mili, 
il-kumplament tat-test mhux me ħtieġ. It-taħlita tiżdied, fi porzjonijiet 
żgħar u bit-taptip, fir-re ċipjent tal-pressjoni waqt li jkun żgurat li t- 
taħlita tkun ippakkjata madwar il-bobina li tqabbad u li tkun f'kuntatt 
tajjeb mag ħha. Huwa importanti li l-bobina ma titg ħaffiġx waqt il- 
proċess ta' l-ippakkjar min ħabba li dan jista' jwassal g ħal riżultati 
ħżiena (  3 ). Il-plattina ti tinfaqa' titqieg ħed f'postha u l-plagg li j żomm 
jiġi invitat sewwa. Ir-re ċipjent kif hekk im ħejji jkun trasferit g ħal fuq 
l-istand ta' rfid ta' tqabbid, bil-plattina li tinfaqa' fuq in-na ħa ta' fuq, 
u r-reċipjent għandu jkun lokalizzat f'armarju ventilat xieraq jew 
inkella f' ċellula li tqabbad. L-g ħejun ta' l-elettriku jintrabat mat- 
trufijiet esterni tal-plagg li jqabbad u ji ġu applikati 10 A. Il- ħin 
minn meta jibda t-ta ħlit u jinxteg ħel l-elettriku m'g ħandux jeċċedi 
l-10 minuti.  
Is-sinjal prodott mit- transducer  tal-pressjoni jkun irre ġistrat fuq 
sistema xierqa li tippermetti kemm il-valutazzjoni u kif ukoll il- ġenerazzjoni ta' re ġistrazzjoni permanenti tal-profil tal- ħin mal- 
pressjoni (e ż. reġistratur b'kurrent qasir ma' re ġistratur  chart ). It- 
taħlita tissaħħan sakem il-plattina li tinfaqa' tinkiser jew sakemm 
mill-anqas ikunu g ħaddew 60 s. Jekk il-plattina li tinfaqa' ma 
tinkisirx, it-ta ħlita għandha titħalla tibdred qabel ma, b'galbu kbir, 
l-apparat ji żżarma, billi jittie ħdu l-prekawzjonijiet g ħal xi forza ta' 
pressjoni li jista jkun hemm. G ħandhom jitwettqu ħames provi bis- 
sustanza tat-test u bis-sustanza(i) tar-referenza. Il- ħin meħtieġ sabiex 
il-pressjoni titla’ minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika g ħandu jkun innotat. Il- ħin taż-żieda medja fil- 
pressjoni tkun ikkalkulata.
 
F'ċerti każijiet, is-sustanzi jistg ħu jiġġeneraw żieda fil-pressjoni 
(għolja wisq jew baxxa wisq), min ħabba r-reazzjonijiet kimi ċi li 
ma jkunux jikkaratterizzaw il-proprjetajiet ossidanti tas-sustanza. 
F'dawn il-ka żijiet, jista' jkun hemm il- ħtieġa li jkun ripetut it-test 
b'sustanza inerta, e ż. diatomit ( kieselguhr ), minflok i ċ-ċelluloża, 
sabiex tkun i ċċarata n-natura tar-reazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Taħlitiet ta' ossidanti ma ċ-ċelluloża għandhom jitqiesu b ħala potenzjalment esplo żiv 
u għandhom jintu żaw bil-galbu xieraq. 
( 2 ) Fil-prattika dan jista' jsir bil-preparament ta' ta ħlita ta' 1:1 ta' likwidu g ħat-test u ċelluloża 
f’ammont akbar milli me ħtieġ għat-test u bit-trasferiment ta' 5 ± 0,1 g fir-re ċipjent tal- 
pressjoni. It-ta ħlita għandha tiġi ppreparata friska g ħal kull esperiment. 
( 3 ) B'mod partikolari, il-kuntatt bejn it-tidwiriet ta' ħdejn xulxin tal-bobina g ħandu jiġi evitat.
 2. DATA  
Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm g ħas-sustanza tat-test u wkoll 
għas-sustanza(i) ta' referenza. Il- ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni g ħat- 
testijiet b'sustanza inerta, jekk imwettqa.  
2.1 TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm g ħas-sustanza tat-test u wkoll 
għas-sustanza(i) ta' referenza jkunu ikkalkulati.  
Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni g ħat-testijiet b'sustanza inerta, (jekk 
imwettqa) jkunu ikkalkulati.  
Uħud mill-e żempji tar-ri żultati huma murija fit-Tabella 1  
Tabella 1  
Eżempji tar-ri żultati  ( a ) 
Sustanza (  b ) Il-ħin taż-żieda medja fil-pressjoni ta' ta ħlita ta' 1:1 ma ċ- 
ċelluloża 
(ms) 
Dikromat ta' l-ammonju, ta ħlita saturata fl-ilma 20 800 
Nitrat tal-kal ċju, taħlita saturata fl-ilma 6 700 
Nitrat ferriku, ta ħlita saturata fl-ilma 4 133 
Perklorat tal-litjum, ta ħlita saturata fl-ilma 1 686 
Perklorat tal-magne żju, taħlita saturata fl-ilma 777 
Nitrat tan-nikil, ta ħlita saturata fl-ilma 6 250 
Aċidu nitriku, 65 % 4 767 (  c ) 
Aċidu perkoriku, 50 % 121 (  c ) 
Aċidu perkoriku, 55 % 59 
Nitrat tal-potassju, 30 % ta ħlita fl-ilma 26 690 
Nitrat tal-fidda, ta ħlita saturata fl-ilma — (  d ) 
Klorat tas-sodju, 40 % ta ħlita fl-ilma 2 555 (  c ) 
Nitrat tas-sodju, 45 % ta ħlita fl-ilma 4 133  
Sustanza inerta  
Ilma:Ċelluloża — (  d ) 
( a ) ara r-referenza (1) g ħall-klassifika skond l-iskema tat-trasport tan-NU. 
( b ) Is-soluzzjonijiet saturati g ħandhom jit ħejjew f’20  o C. 
( c ) Valur medju minn esperimenti komparattivi minn laboratorji differenti. 
( d ) Il-pressjoni massima ta' 2 070 kPA ma ntla ħqitx. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RAPPORT  
3.1 RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— l-identità, il-kompo żizzjoni, il-purità, e ċċ. tas-sustanza g ħat-test;  
— il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza g ħat-test;  
— il-proċedura użata għat-tnixxif ta ċ-ċelluloża; 
— il-kontenut ta' l-ilma u żat fiċ-ċelluloża; 
— ir-riżultati tal-kejl;  
— ir-riżultati mit-testijiet b'sustanza inerta, jekk ikun hemm;  
— il-ħinijiet medji ta ż-żieda fil-pressjoni kkalkulati;  
— xi devjazzjonijiet minn dan il-metodu u r-ra ġunijiet ta' dawn;  
— l-informazzjoni addizzjonali kollha, jew ir-rimarki, dwar l-inter ­
pretazzjoni tar-ri żultati;  
3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI (  1 ) 
Ir-riżultati tat-test huma vvalutati fuq il-ba żi ta': 
a) jekk it-ta ħlita tas-sustanza g ħat-test u ċ-ċelluloża jaqbdux b'mod 
spontanju; u  
b) il-paragun fil- ħin medju me ħtieġ sabiex il-pressjoni titla’ minn 
690 kPa g ħal 2 070 kPa, mas-sustanza(i) ta' referenza.  
Sustanza likwida g ħandha titqies ossidanti, meta:  
a) taħlita 1:1, fil-pi ż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża taqbad b'mod spon ­
tanju; jew  
b) taħlita 1:1, fil-pi ż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża turi żieda fil-ħin tal- 
medja tal-pressjoni li tkun anqas minn jew ugwali g ħal, żieda fil- 
ħin għal taħlita 1:1 fil-pi ż, ta' 65 % (w/w) a ċidu nitriku fl-ilma 
u ċelluloża. 
Sabiex ikunu evitati ri żultati pożittivi foloz, ir-ri żultati mog ħtija meta 
tiġi ttestjata s-sustanza g ħat-test ma' materjal inert, g ħandhom jitqiesu 
wkoll fl-interpretazzjoni tar-ri żultati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Ara r-referenza 1 g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati skond ir-regolamenti g ħat-trasport 
tan-NU bl-u żu ta' bosta sustanzi ta' referenza.
 4. REFERENZI  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. It-tielet edizjoni riveduta. Pubbli ­
kazzjoni tal-NU, Nru.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, pa ġna 
342. Test O.2: Test g ħall-likwidu ossidanti  
Figura 1  
Reċipjent tal-Pressjoni
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figura 2  
Stend għall-irfid
  
Figura 3  
Sistema li tqabbad
  
Nota: tista' tintu ża kwalunkwe konfigurazzjoni minn dawn.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  ID-DIJAMETRU MEDJU ĠEOMETRIKU TAL-FIBRI PE ŻAT 
SKONT IT-TUL TAG ĦHOM  
1. IL-METODU  
1.1. DA ĦLA 
Dan il-metodu jiddeskrivi pro ċedura li tkejjel id-Dijametru Medju 
Ġeometriku Pe żat Skont it-Tul [Length Weighted Geometric Mean 
Diameter] (LWGMD) ta' massa ta' Fibri Minerali Mag ħmula mill- 
Bniedem [Man Made Minerla Fibres] (MMMF). Min ħabba li l- 
LWGMD tal-popolazzjoni se jkollha probabbiltà ta' 95 % li tkun 
bejn il-livelli ta' kunfidenza ta' 95 % (LWGMD ± żewġ 
devjazzjonijiet standard) tal-kampjun, il-valur irrapportat (il-valur tat-test) se jkun l-inqas limitu ta' kunfidenza ta' 95 % tal-kampjun (iġifieri LWGMD — 2 devjazzjonijiet standard). Il-metodu huwa 
bbażat fuq aġġornament ( Ġunju 1994) ta' abbozz ta' pro ċedura indus ­
trijali HSE maqbula fil-laqg ħa bejn l-ECFIA u l-HSE f'Chester fis- 
26/9/93 u żviluppat g ħal u permezz ta’ tieni prova interlaboratorja (1, 
2). Dan il-metodu ta' kejl jista' jintu ża sabiex jikkaratterizza d- 
dijametru tal-fibra ta' sustanzi tal-massa jew prodotti li fihom l- 
MMMFs u jinkludu fibri ta' ċeramika refrattarja (RCF), fibri tal- 
ħġieġ magħmula mill-bniedem (MMVF), u fibri tal-kristallina u l- 
polikristallina.
 
L-ippeżar tat-tul huwa mod ta' kumpens g ħall-effett fuq id-distri ­
buzzjoni tad-dijametru kkaw żata bit-tkissir ta' fibri twal meta jkunu 
qed isiru l-kampjuni jew jitmiss il-materjal. Tintu ża statistika 
ġeometrika (medja ġeometrika) sabiex tkejjel id-distribuzzjoni tad- 
daqs tad-dijametri tal-MMMF g ħaliex ġeneralment dawn id- 
dijametri jkollhom distribuzzjonijiet tad-daqs li jqarbu n-norma loga ­
ritmika.  
Il-kejl tat-tul kif ukoll tad-dijametru huwa tedjanti u jie ħu ħafna ħin 
imma, jekk jitkejlu biss dawk il-fibri li jmissu linja infinitament irqieqa fuq il-firxa vi żiva ta’ SEM, imbag ħad il-probabbiltà li 
tingħażel waħda mill-fibri tkun proporzjonali g ħat-tul 
tagħha. Minħabba li b’hekk jitqies it-tul fil-kalkoli tal-ippe żar tat- 
tul, l-uniku kejl me ħtieġ huwa d-dijametru u l-LWGMD-2SE jista' 
jkun ikkalkulat kif deskritt.
 
1.2. TIFSIRIET  
Il-partikula : Oġġett li għandu proporzjon bejn it-tul u l-wisa' ta' 
inqas minn 3:1.  
Il-fibra : Oġġett li għandu proporzjon bejn it-tul u l-wisa' (aspect 
ratio) mill-inqas 3:1.  
1.3. AMBITU U LIMITAZZJONIJIET  
Il-metodu huwa ddisinjat sabiex janalizza d-distribuzzjoni ta’ 
dijametri li jkollhom valur medja bejn 0,5 μm u 6 μm. Dijametri 
ikbar jistg ħu jitkejlu bl-u żu ta' ingrandimenti minn SEM iktar baxxi 
iżda l-metodu se jkun dejjem iktar limitat fid-distribuzzjonijiet tal- 
fibra iktar fini u jekk id-dijametru medjan ikun inqas minn 0,5 μm, 
huwa rrakkomandat kejl permezz ta’ TEM (transmission electron 
microscope).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAL-ITTESTJAR  
Numru ta' kampjuni rappre żentattivi tal-qalba jittie ħdu mill-kutra tal- 
fibra jew ji ġu mislutin mill-massa tal-fibra. Il-fibri tal-massa jitqassru 
bl-użu ta' proċedura tat-tifrik u sottokampjun rappre żentattiv mxerred 
fl-ilma. Il-bi ċċiet jiġu estratti u ffiltrati minn filtru tal-polikarbonat 
b’pori tad-daqs 0,2 μm u jiġu ppreparati g ħal analiżi bl-użu ta' 
tekniki tal-iscanning electron microscope (SEM). Id-dijametri tal- fibri jitkejlu ta ħt ingrandiment tal-iskrin ta' × 10 000 jew ikbar (
 1 ) 
bl-użu ta' metodu ta' inter ċetazzjoni tal-linja sabiex tittie ħed stima 
imparzjali tad-dijametru medjan. L-inqas intervall tal-kunfidenza ta' 95 % (ibba żat fuq test unilaterali) ji ġi kkalkulat sabiex issir stima tal- 
iżjed valur baxx tal-medju ġeometriku tad-dijametru tal-fibra tal- 
materjal.
 
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL-ITTESTJAR  
1.5.1.  Il-prekawzjonijiet / is-sikurezza  
L-espożizzjoni tal-persuni g ħall-fibri fl-arja g ħandha tkun immini ­
mizzata u g ħandha tintu ża vetrina li tkun mg ħammra b’ventilatur 
għall-estrazzjoni jew kaxxa mg ħammra bl-ingwanti sabiex isir 
kuntatt mal-fibri niexfa. G ħandu jitwettaq monitora ġġ prejodiku 
tal-espożizzjoni tal-persuna sabiex ti ġi determinata l-effika ċja tal- 
metodi ta' kontroll. Meta jisir kuntatt mal-MMMFs g ħandhom 
jintlibsu l-ingwanti li jintremew sabiex tonqos l-irritazzjoni tal- ġilda 
u tkun evitata l-kontaminazzjoni min-na ħa għall-oħra. 
1.5.2.  L-apparat / it-tag ħmir 
— Pressa u dadi tal-mastri (b'kapa ċità li jipprodu ċu 10 MPa).  
— filtri kapillari tal-polikarbonat bid-daqs tal-pori ta' 0,2 μm 
(dijametru ta' 25 mm).  
— filtru ta’ membrana tal-ester ta ċ-ċelluloża bid-daqs tal-pori ta' 
5 μm sabiex jintu ża bħala filtru tal-appo ġġ. 
— Apparat tal- ħġieġ għall-filtrazzjoni (jew sistemi tal-filtrazzjoni li 
jintremew) li jie ħu filtri li g ħandhom dijametru ta' 25 mm (e ż. 
Millipore glass microanalysis kit, tat-tip nru XX10 025 00).  
— Ilma li jkun g ħadu kemm ġie ddistallat, iffiltrat minn filtru bid- 
daqs tal-pori ta' 0,2 μm sabiex jitne ħħew il-mikro-organi żmi. 
— Pulverizzatur li jkopri d-deheb jew deheb u palladju.  
— Scanning electron microscope li kapa ċi jirrisolvi sa' 10 nm u 
jkabbar b'10 000.  
— Mixxellanji: spatuli, xafra tal-iskarpell tat-tip 24, pinzetta, tubi 
tas-SEM, kolla tal-karbonju jew tejp ade żiv tal-karbonju, irbaba 
tal-fidda.  
— Sonda ultrasonika jew banju ultrasoniku li joqg ħod fuq bank  
— Core sampler jew cork borer, sabiex jie ħu l-kampjuni tal-qalba 
mill-kutra tal-MMMF  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Dan il-valur ta' ingrandiment huwa indikat g ħall-fibri tad-daqs 3 μm, għall-fibri tad-daqs 
6 μm ingrandiment ta' × 5 000 jaf ikun a ħjar.
 1.5.3.  Il-Pro ċedura tat-test  
1.5.3.1.  It-teħid tal-kampjuni  
Jintuża core sampler ta' 25 mm jew cork borer sabiex jittie ħdu 
kampjuni tal-profil trasversali. Dawn g ħandhom ikunu spazjati 
b'mod ekwu matul il-wisa’ ta' tul qasir tal-kutra jew me ħuda minn 
partijiet sporadi ċi jekk ikun hemm bi ċċiet twal tal-kutra 
disponibbli. L-istess tag ħmir jista' jintu ża sabiex ji ġu estratti 
kampjuni sporadi ċi minn fibri ma ħlula. Meta huwa possibli 
għandhom jittie ħdu sitt kampjuni, sabiex jirriflettu l-varjazzjonijiet 
tal-ispazju fil-materjal tal-massa.  
Is-sitt kampjuni tal-qalba g ħandhom jitfarku b’dada li jkollha 
dijametru ta' 50 mm b'10 Mpa. Il-materjal jit ħallat bi spatula u 
jerġa jiġi ppressat b'10 Mpa. Il-materjal imbag ħad jitneħħa mid- 
dada u jin ħażen fi flixkun tal- ħġieġ issiġillat. 
1.5.3.2.  Il-Preparazzjoni tal-Kampjun  
Fejn jeħtieġ, tista' titne ħħa il-kopertura organika li taqqad billi l-fibra 
titqiegħed ġo forn b'temperatura ta' 450 grad C g ħal madwar sieg ħa. 
Sabiex ikun sottodivi ż il-kampjun g ħandu jinqasam f'kon u fi kwarti 
(dan għandu jsir ġewwa vetrina tat-trab).  
Bl-użu ta' spatula, żid ammont żgħir (< 0,5 g) tal-kampjun 
ma' 100 ml ilma li jkun g ħadu kemm ġie ddistillat u ffiltrat minn 
ġo filtru b'membrana ta' 0,2 μm (sorsi alternattivi ta' ilma purissimu 
jistgħu jintużaw, jekk jirri żulta li huma xierqa). Ħallat sew bl-u żu ta' 
sonda ultrasonika li topera b'sa ħħa ta' 100 W u intunata sabiex 
tifforma ħofra fl-istruttura. (Jekk ma tkunx disponibbli sonda u ża l- 
metodu li ġej: ċaqlaq l'hemm u l'hawn u dawwar repetittivament g ħal 
madwar 30 sekonda; qieg ħdu f'banju ultrasoniku li joqg ħod fuq bank 
għal madwar ħames minuti; imbag ħad ċaqalqu l'hemm u l'hawn u 
dawwru repetittivament g ħal madwar 30 sekonda o ħra). 
Eżatt wara t-tixrid tal-fibra, ne ħħi numru ta' alikwoto (e ż. tliet 
alikwoti ta' 3, 6 u 10 ml) bl-u żu ta' pipetta bl-g ħonq wiesa (li tesa' 
2-5 ml).  
Iffiltra f'vakum kull alikwota b'filtru tal-polikarbonat ta' 0,2 μm 
appoġġjat b'filtru tal-appo ġġ li għandu pora MEC ta' 5 μm, bl-użu 
ta' lenbut tal-filtrazzjoni tal- ħġieġ ta' 25 mm li jkollu depo żitu tal- 
likwidu ċilindriku. Fil-lenbut g ħandhom jitqeg ħdu madwar 5 ml ta' 
ilma distillat iffiltrat u l-alikwot titqieg ħed bil-mod fl-ilma bl-u żu tal- 
pipetta fejn il-ponta tag ħha tinżamm taħt il-menisku. Il-pipetta u d- 
depożitu tal-likwidu iridu ji ġu mlaħalħa sew wara dan il-pro ċess bil- 
pipetta, g ħaliex il-fibri irqaq g ħandhom tendenza li jkunu i żjed fil- 
wiċċ. 
B'attenzjoni ne ħħi l-filtru u sseparah mill-filtru tal-appo ġġ qabel ma' 
tqiegħdu f'kontenitur biex jinxef.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Aqta sezzjoni daqs ta' kwart jew nofs tad-depo żitu ffiltrat b'xafra tal- 
iskarpell tat-tip 24 b’moviment ’l hinn u ’l hawn tal-id. B'attenzjoni 
waħħal is-sezzjoni maqtuha ma' trej tas-SEM permezz ta’ tejp tal- 
karbonju jew kolla tal-karbonju. G ħandhom ji ġu applikati l-irbaba 
tal-fidda f'tal-inqas tliet po żizzjonijiet sabiex jittejjeb il-kuntatt 
eletriku fit-truf tal-filtru u tat-trej. Meta l-kolla / l-irbaba tal-fidda 
tinxef/jinxfu, bil-pulverizzatur ag ħmel kopertura ta' madwar 50 nm 
ta' deheb jew deheb u palladju fuq il-wi ċċ tad-depo żitu. 
1.5.3.3.  Il-kalibrar tas-SEM u l-operat  
1.5.3.3.1. I l - k a l i b r a r  
Il-kalibrar tas-SEM g ħandu jkun ikkontrollat tal-inqas darba fil- 
ġimgħa (idealment darba kuljum) bl-u żu ta' xibka tal-kalibrazzjoni 
ċċertifikata. Il-kalibrar g ħandu jkun ikkontrollat skont standard i ċċer­
tifikat u jekk il-valur mkejjel (SEM) ma jkunx f’medda ta’ ± 2 % tal- 
valur iċċertifikat, il-kalibrar tas-SEM irid ikun a ġġustat u jer ġa jkun 
ikkontrollat.  
Is-SEM irid ikun kapa ċi jirrisolvi tal-inqas dijametru b'vi żibbiltà 
minima ta' 0,2 μm, bl-użu ta' matri ċi ta' kampjun reali, b'in ­
grandiment ta' x 2 000.  
1.5.3.3.2. L - o p e r a t  
Is-SEM g ħandu jkun operat fuq ingrandiment ta' 10 000 (  1 ) bl-użu ta' 
kundizzjonijiet li jag ħtu reżoluzzjoni tajba b'imma ġini aċċetabbli 
b'rati baxxi ta' skan b ħal, per e żempju, 5 sekondi g ħal kull 
ritratt. Għalkemm il- ħtiġijiet tal-operat ta' SEMs differenti jistg ħu 
ivarjaw, ġeneralment sabiex tinkiseb l-a ħjar viżibbiltà u re żoluzzjoni, 
b'materjali li relattivament g ħandhom daqs atomiku żgħir, għandhom 
jintużaw vultaġġi t'aċċelerazzjoni ta' bejn 5-10 keV issetjati fuq tikka 
ta' daqs żgħir u distanza tax-xog ħol qasira. Meta jkun qieg ħed isir it- 
travers lineari, g ħandha tintu ża inklinazzjoni ta' 0  o sabiex ikun mini ­
mizzat il-b żonn li ter ġa tiffoka jew, jekk is-SEM g ħandu stage 
ewċentrika, g ħandha tintu ża l-istage ew ċentrika Jista' jintu ża 
ingrandiment iktar baxx jekk il-materjal m'g ħandux fibri (b'dija ­
metru) żgħar u d-dijametri tal-fibri huma kbar (> 5 μm) 
1.5.3.4.  Il-kejl tad-daqs  
1.5.3.4.1. E ż a m i t a ħ t i n g r a n d i m e n t b a x x s a b i e x i k u n 
i v v a l u t a t l - k a m p j u n  
Fil-bidu l-kampjun g ħandu jiġi eżaminat ta ħt ingrandiment baxx 
sabiex isir tfittix g ħal evidenza ta' tag ħqid ta' fibri kbar u sabiex 
issir valutazzjoni tad-densità tal-fibri. Fil-ka ż ta' wisq g ħoqod huwa 
rrakomandat li ji ġi ppreparat kampjun ġdid. 
Huwa me ħtieġ li jitkejjel numru minimu ta' fibri g ħall-korettezza fl- 
istatistika u d-densità g ħolja tal-fibri taf tkun mixtieqa g ħaliex l- 
eżaminazzjoni tal-partijiet vojta tie ħu ħafna ħin u ma tag ħtix 
kontribut g ħall-analiżi. Madankollu, jekk il-filtru ikun mimli wisq, 
isir diffiċli biex jitkejlu l-fibri kollha li jistg ħu jiġu mkejla u, peress li 
li l-fibri ż-żgħar jistgħu jinħbew wara o ħrajn li huma ikbar, tista' ma 
tindunax bihom.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Għall-fibri tad-daqs 3 μm, ara n-nota ta' qabel.
 Il-parzjalità lejn stima e ċessiva tal-LWGMD tista' tirri żulta minn fibri 
li għandhom densità ta' iktar minn 150 fibra f'kull millimetru tal-linja 
traversa. Minn na ħa l-oħra, il-konċentrazzjonijiet tal-fibra baxxi j żidu 
l-ħin tal-anali żi u, spiss, finanzjarjament ikun jaqbel li ji ġi ppreparat 
kampjun b'densita tal-fibra i żjed viċin l-ottimu milli tkompli bl- 
għadd ta' filtri li g ħandhom kon ċentrazzjoni baxxa. L-a ħjar densità 
tal-fibra g ħandha tag ħti medju ta' madwar fibra wa ħda jew tnejn 
f'kull firxa vi żiva taħt ingrandiment ta' x 5 000. Minkejja dan, l- 
aħjar densità tiddependi fuq id-daqs (dijametru) tal-fibri, g ħalhekk 
jeħtieġ li l-operatur ju ża xi ġudizzju espert sabiex jidde ċidi jekk 
id-densità tal-fibra hijiex ottima jew le.  
1.5.3.4.2. L - i p p e ż a r s k o n t i t - t u l t a d - d i j a m e t r i t a l - f i b r i  
Jingħaddu biss dawk il-fibri li jmissu (jew jaqsmu) linja (infini ­
tament) rqiqa mpin ġija fuq l-iskrin tas-SEM. G ħal din ir-ra ġuni 
titpinġa linja orizzontali (jew vertikali) fi ċ-ċentru tal-iskrin.  
Alternattivament jitqieg ħed punt uniku fi ċ-ċentru tal-iskrin u ji ġi 
inizjat skan kontinwu f'direzzjoni wa ħda matul il-filtru. Kull fibra 
li għandha aspect ratio ikbar minn 3:1 li tmiss jew taqsam dan il- 
punt ikollha d-dijametru mkejjel u rre ġistrat.  
1.5.3.4.3. I l - k e j l t a d - d a q s t a l - f i b r a  
Huwa rrakkomandat li ji ġu mkejla minimu ta' 300 fibra. Kull fibra 
tiġi mkejla darba biss fil-punt tal-intersezzjoni mal-linja jew il-punt 
impinġi fuq l-imma ġini (jew vi ċin tal-punt tal-intersezzjoni jekk it- 
truf tal-fibri huma mo ħbija). Jekk tiltaqa' ma' fibri li g ħandhom profil 
sezzjonali mhux uniformi, g ħandu jintu ża kejl li jirrapre żenta l-medju 
tad-dijametru tal-fibra. G ħandha ting ħata attenzjoni g ħal kif jiġi 
definit it-tarf u kif ti ġi mkejla l-iqsar distanza bejn it-truf tal- 
fibra. Il-kejl tad-daqs jista' jsir on-line, jew off-line fuq imma ġini 
jew ritratti ma ħżuna. Huma rrakkomandati sistemi semi awtomati ċi 
li jkejlu l-imma ġini li jniżżlu d-dejta direttament fuq spreadsheet, 
għaliex inaqqsu t-telf ta' ħin, jeliminaw l-i żbalji tat-traskrizzjoni u 
l-kalkoli jistg ħu jiġu awtomatizzati.  
It-truf tal-fibri twal g ħadhom ikunu kkontrollati ta ħt ingrandiment 
baxx sabiex ti żgura li mhux qed jinbarmu lura ġol-firxa vi żiva u 
qed jiġu mkejla darba biss.  
2. ID-DEJTA  
2.1. IT-TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Normalment, iddijametri tal-fibri ma jkollhomx distribuzzjoni 
normali. Madankollu, permezz ta’ trasformazzjoni logaritmika jkun 
possibbli li tikseb distribuzzjoni li toqrob aktarlejn in-normal.  
Ikkalkula l-medju aritmetiku (medju lnD) u d-devjazzjoni standard 
(SD  lnD ) tal-logaritmu ta' valuri tal-ba żi e (lnD) tad-dijameteri (D) ta’ 
n fibri.. 
mean lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
Σ ðln D – mean ln DÞ 2 
n–1 s 
(2) 
Iddividi d-devjazzjoni standard bir-radi ċi kwadrata tan-numru (n) ta' 
kejl differenti sabiex tikseb id-devjazzjoni standard (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Naqqas g ħal darbtejn il-valur tad-devjazzjoni standard mill-medju u 
kkalkula l-esponenzjali ta' dan il-valur (il-medju bit-tnaqqis ta' żewġ 
devjazzjonijiet standard) sabiex to ħroġ il-medju ġeometriku bit- 
tnaqqis ta' żewġ devjazzjonijiet standard ġeometriċi. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi tal-inqas it-tag ħrif li ġej: 
— Il-valur tal-LWGMD-2SE.  
— Kwalunkwe devjazzjoni u b'mod partikolari dawk li jista' 
jkollhom effett fuq il-pre ċiżjoni jew il-korettezza tar-ri żultati 
bil-ġustifikazzjonijiet xierqa.  
4. IR-REFERENZI  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: 
Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  KOEFFI ĊJENT TAL-PARTIZZJONI (1-Ottanol/Ilma): METODU 
TA’ TĦAWWID BIL-MOD  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
123 (2006) tal-OECD. Il-valuri ta’ koeffi ċjent tal-partizzjoni (P  OW ) ta’ 1- 
ottanol/ilma sa log P  OW ta’ 8.2 ġew iddeterminati b’mod korrett bil-metodu 
ta’ tħawwid bil-mod (1). G ħalhekk dan huwa appro ċċ sperimentali adattat 
għad-determinazzjoni diretta ta’ P  OW ta’ sustanzi idrofobi ċi ħafna.  
2. Metodi o ħra għad-determinazzjoni tal-koeffi ċjent tal-partizzjoni ta’ 1-otta ­
nol/ilma (P  OW ) huma l-metodu ta’ ‘t ħawwid tal-flixkun’ (2), u 
d-determinazzjoni tal-P  OW minn mġiba ta’ ritenzjoni ta’ HPLC ta’ fa żi 
inversa (3). Il-metodu ta’ ‘t ħawwid tal-flixkun’ g ħandu tendenza g ħal 
oġġetti estraneji (artifacts) min ħabba t-trasferiment ta’ taqtiriet mikro ta’ 
ottanol fil-fa żi fl-ilma. B’valuri ji żdiedu tal-P  OW il-preżenza ta’ dawn 
it-taqtiriet fil-fa żi fl-ilma twassal g ħal stima e ċċessiva dejjem ti żdied 
tal-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar fl-ilma. G ħalhekk, l-u żu 
tiegħu huwa limitat g ħal sustanzi b’log P  OW < 4. It-tieni metodu joqg ħod 
fuq dejta solida ta’ valuri P  OW iddeterminati direttament biex jikkalibraw 
ir-relazzjoni bejn m ġiba ta’ ritenzjoni ta’ HPLC u valuri P  OW imkejla. 
Abbozz tal-linja gwida tal-OECD kien disponibbli biex ikunu ddeterminati 
l-koeffiċjenti tal-partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma ta’ sustanzi jonizzabbli (4) 
iżda m’għandhiex tibqa’ tintu ża. 
3. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar kien żviluppat fil-Pajji żi l-Baxxi. Il-pre ċiżjoni 
tal-metodi deskritti hawn kienet ivvalidata u ottimizzata fi studju ta’ vali ­
dazzjoni ta’ ring-test li fih kienu ħadu sehem 15-il laboratorju (5).  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
Sinifikat u u żu 
4. Għal sustanzi organi ċi inerti nstabu relazzjonijiet sinifikanti ħafna bejn koef ­
fiċjenti tal-partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma (P  OW ) u l-akkumulazzjoni bijolo ġika 
tagħhom fil- ħut. Minbarra dan, intwera li l-P  OW huwa korrelatat 
mat-tossiċità fil-ħut, kif ukoll ma’ sorbiment ta’ kimi ċi għal solidi b ħall- 
ħamrija u s-sedimenti. Fir-referenza (6) ing ħatat ħarsa ġenerali estensiva 
tar-relazzjonijiet.  
5. Kienet stabbilita varjetà wiesg ħa ta’ relazzjonijiet bejn il-koeffi ċjent 
tal-partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma u proprjetajiet o ħra ta’ sustanzi ta’ 
rilevanza g ħat-tossikolo ġija ambjentali u l-kimika. B ħala konsegwenza, 
il-koeffiċjent tal-partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma evolva b ħala parametru 
ewlieni fil-valutazzjoni tar-riskju ambjentali tal-kimi ċi, kif ukoll fit-tbassir 
ta’ x’jista’ ji ġri mill-kimi ċi fl-ambjent.  
Kamp ta’ applikazzjoni  
6. L-esperiment ta’ t ħawwid bil-mod jitqies li jnaqqas il-formazzjoni ta’ 
taqtiriet mikro minn taqtiriet ta’ 1-ottanol fil-fa żi tal-ilma. B ħala konseg ­
wenza, ma jkunx hemm stima e ċċessiva ta’ kon ċentrazzjoni fl-ilma 
minħabba molekuli ta’ sustanza g ħall-ittestjar asso ċjati ma’ taqtiriet b ħal 
dawn. G ħalhekk il-metodu ta’ t ħawwid bil-mod huwa partikolarment 
adattat għad-determinazzjoni ta’ P  OW għal sustanzi b’valuri mistennija ta’ 
log P  OW ta’ 5 u og ħla, li għalihom il-metodu ta’ t ħawwid tal-flixkun (2) 
ikollu tendenza li jrendi ri żultati żbaljati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINIZZJONI U UNITAJIET  
7. Il-koeffi ċjent tal-partizzjoni ta’ sustanza bejn ilma u solvent lipofiliku (1- 
ottanol) jikkaratterizza d-distribuzzjoni tal-ekwilibriju tal-kimika bejn i ż- 
żewġ fażijiet. Il-koeffi ċjent tal-partizzjoni bejn l-ilma u 1-ottanol (P  OW ) 
huwa definit b ħala l-proporzjon tal-kon ċentrazzjonijiet ta’ ekwilibriju 
tas-sustanza g ħall-ittestjar f’1-ottanol issaturat bl-ilma (C  O ) u ilma ssaturat 
b’1-ottanol (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Bħala proporzjon ta’ kon ċentrazzjonijiet m’g ħandux dimensjoni. Spiss 
jingħata l-bħala l-logaritmu g ħall-bażi 10 (log P  OW ). P  OW huwa dipendenti 
mit-temperatura u d-dejta rappurtata g ħandha tinkludi t-temperatura tal-kejl.  
PRINĊIPJU TAL-METODU  
8. Biex ikun iddeterminat il-koeffi ċjent tal-partizzjoni, l-ilma, 1-ottanol u 
s-sustanza g ħall-ittestjar ikunu ekwilibrati ma’ xulxin f’temperatura 
kostanti. Wara jkunu ddeterminati l-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza g ħall- 
ittestjar fi ż-żewġ fażijiet. 
9. Id-diffikultajiet sperimentali asso ċjati mal-formazzjoni ta’ taqtiriet mikro 
matul l-esperiment ta’ t ħawwid tal-flixkun jistg ħu jitnaqqsu fl-esperiment 
ta’ tħawwid bil-mod propost hawn. Fl-esperiment ta’ t ħawwid bil-mod, 
l-ilma, 1-ottanol u s-sustanza g ħall-ittestjar ikunu ekwilibrati f’reattur li 
jħawwad b ‘termostat mieg ħu. L-iskambju bejn il-fa żijiet ikun a ċċellerat 
bit-tħawwid. It-t ħawwid jintrodu ċi turbulenza limitata li ssa ħħaħ 
l-iskambju bejn 1-ottanol u l-ilma ming ħajr ma jkunu ffurmati taqtiriet 
mikro (1).  
APPLIKABBILTÀ TAT-TEST  
10. Minħabba li l-pre żenza ta’ sustanzi, minbarra s-sustanza g ħall-ittestjar, 
jistgħu jinfluwenzaw il-koeffi ċjent ta’ attività tas-sustanza g ħall-ittestjar, 
is-sustanza g ħall-ittestjar g ħandha tkun ittestjata b ħala sustanza pura. 
Għandha tintu ża l-ogħla purezza disponibbli kummer ċjalment g ħall- 
esperiment ta’ partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma.  
11. Dan il-metodu japplika g ħal sustanzi puri li ma jiddisasso ċjawx jew li 
jassoċjaw u li ma jurux attività interfa ċjali sinifikanti. Jista’ jkun applikat 
biex ikun iddeterminat il-proporzjon ta’ partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma g ħal 
sustanzi u ta ħlitiet bħal dawn. Meta l-metodu jintu ża għal taħlitiet, 
il-proporzjonijiet ta’ partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma determinati jkunu kondizzjonaLi u dipendenti mill-kompo żizzjoni kimika tat-ta ħlita ttestjata 
u mill-kompo żizzjoni elettrolitika u żata bħala fażi fl-ilma. Jekk jittie ħdu 
passi addizzjonali, il-metodu jkun applikabbli wkoll g ħal komposti li jiddis ­
assoċjaw jew li jasso ċjaw (il-paragrafu 12).
 
12. Minħabba ekwilibriji multipli fl-ilma u f’1-ottanol involuti fil-partizzjoni ta’ 
1-ottanol/ilma ta’ sustanzi li jiddisasso ċjaw bħall-aċidi organi ċi u l-fenoli, 
bażijiet organi ċi u sustanzi organometalli ċi, il-proporzjon ta’ partizzjoni 1- 
ottanol/ilma huwa kostant kondizzjonali dipendenti ħafna 
mill-kompo żizzjoni elettrolitika (7)(8). Id-determinazzjoni tal-proporzjon 
ta’ partizzjoni 1-ottanol/ilma, g ħalhekk, te ħtieġ li l-pH u l-kompo żizzjoni 
elettrolitika jkunu kkontrollati fl-esperiment u rrappurtati. G ħandu jkun 
hemm ġudizzju espert fl-evalwazzjoni ta’ dawn il-proporzjonijiet ta’ 
partizzjoni. Billi jintu ża l-valur ta’ kostant(i) ta’ disasso ċjazzjoni, ikun 
meħtieġ li jintgħażlu valuri ta’ pH adatti, b’mod li jkun iddeterminat 
proporzjon ta’ partizzjoni g ħal kull stat ta’ jonizzazzjoni. G ħandhom 
jintużaw bafers li ma jikkumplikawx meta jkunu ttestjati komposti organo ­
metalliċi (8). B’konsiderazzjoni tat-tag ħrif dwar il-kimika fl-ilma (kostanti 
ta’ kumplessazzjoni, kostanti ta’ disasso ċjazzjoni), il-kundizzjonijiet speri ­
mentali g ħandhom jintg ħażlu b’mod li tkun tist’a ti ġi stmata l-ispe ċjazzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar fil-fa żi fl-ilma. Is-sa ħħa jonika g ħandha tkun 
identika fl-esperimenti kollha billi jintu ża elettrolit b ħala sfond.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Jistg ħu jinqalgħu diffikultajiet fit-test meta jsir it-test g ħal sustanzi b’solu ­
bilità fl-ilma baxxa jew b’ P  OW għoli minħabba l-fatt li l-kon ċentrazzjonijiet 
fl-ilma jsiru baxxi ħafna b’mod li d-determinazzjoni akkurata tag ħhom tkun 
diffiċli. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jipprovdi gwida dwar kif tkun ittrattata 
din il-problema.  
INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA G ĦALL-ITTESTJAR  
14. Reaġenti kimi ċi għandhom ikunu ta’ grad analitiku jew ta’ purezza og ħla. 
Huwa rrakkomandat l-u żu ta’ sustanzi g ħall-ittestjar mhux b’tikketta, 
b’kompożizzjoni kimika mag ħrufa u preferibbilment b’purezza ta’ 
mill-anqas 99 %, jew ta’ sustanzi g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika 
b’kompożizzjoni kimika mag ħrufa u b’purezza radjukimika. Fil-ka ż ta’ traċ­ 
ċaturi ta’ nofs ħajja qasira, g ħandhom ikunu applikati l-korrezzjonijiet g ħad- 
degradazzjoni. Fil-ka ż ta’ sustanzi g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika, 
għandu jintu ża metodu analitiku spe ċifiku għal kimika biex ikun żgurat li 
r-radjuattività tkun relatata direttament mas-sustanza g ħall-ittestjar.  
15. Tista’ tinkiseb stima ta’ log P  OW billi jintu ża softwer disponibbli kummer ċ­
jalment g ħal stima ta’ log P  OW , jew billi jintu ża l-proporzjon 
tas-solubilitajiet fi ż-żewġ solventi.  
16. Qabel ma jsir esperiment ta’ t ħawwid bil-mod g ħad-determinazzjoni ta’ 
P OW , għandha tkun disponibbli l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza 
għall-ittestjar:  
(a) formula strutturali;  
(b) metodi analiti ċi adatti g ħad-determinazzjoni tal-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza fl-ilma u 1-ottanol;  
(c) kostant(i) ta’ disasso ċjazzjoni ta’ sustanzi jonizzabbli (Linja Gwida 112 
tal-OECD (9));  
(d) solubilità fl-ilma (10);  
(e) idroli żi abijotika] (11);  
(f) bijodegradabbiltà fa ċli (12);  
(g) pressjoni tal-fwar (13).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Tagħmir u apparat  
17. Ikun me ħtieġ tagħmir tal-laboratorju standard, b’mod partikolari, dan li ġej: 
— jintużaw ħawwadin manjeti ċi u vireg manjeti ċi li jħawdu miksijin 
bit-Teflon biex i ħawdu l-fa żi tal-ilma;  
— strumentazzjoni analitika, adattata g ħad-determinazzjoni tal-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar fil-kon ċentrazzjonijiet mistennija;  
— reċipjent għat-tħawwid b’tapp fil-qieg ħ. Skont stima tal-log P  OW u 
l-Limitu ta’ Detezzjoni (LOD) tal-kompost tat-test, irid jitqies l-u żu ta’ 
reċipjent ta’ reazzjoni tal-istess ġeometrija akbar minn ta’ litru wie ħed, 
biex ikun jista’ jinkiseb volum suffi ċjenti ta’ ilma g ħall-estrazzjoni u 
l-analiżi ta’ kimika. Dan se jirri żulta f’kon ċentrazzjonijiet og ħla 
fl-estratt tal-ilma u b’hekk ikun hemm determinazzjoni analitika aktar affidabbli. Fl-Appendi ċi 1 hemm tabella li tag ħti stimi tal-volum minimu 
meħtieġ, il-LOD tal-kompost, l-istima tal-log P
 OW tiegħu u s-solubilità 
fl-ilma tieg ħu. It-tabella hija bba żata fuq ir-relazzjoni bejn il-log P  OW u 
l-proporzjon bejn is-solubilitajiet f’ottanol u ilma, kif ippre żentat minn 
Pinsuwan et al. (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
fejn 
SR ¼ S oct=S w (fil-molarità);  
u r-relazzjoni mog ħtija minn Lyman (15) biex titbassar is-solubilità 
fl-ilma. Solubilitajiet tal-ilma kkalkulati bl-ekwazzjoni mog ħtija 
fl-Appendi ċi 1 għandhom jitqiesu b ħala l-ewwel stima. G ħandu jkun 
innotat li l-utent huwa liberu li ji ġġenera stima tas-solubilità fl-ilma 
permezz ta’ kwalunkwe relazzjoni li titqies li tirrappre żenta aħjar 
ir-relazzjoni bejn l-idrofobi ċità u s-solubilità. G ħal komposti solidi, 
l-inklużjoni ta’ punt ta’ tidwib fit-tbassir ta’ solubilità hija, pere żempju, 
irrakomandata. F’ka ż li tintuża ekwazzjoni modifikata, g ħandu jkun 
aċċertat li l-ekwazzjoni g ħall-kalkulazzjoni ta’ solubilità f’ottanol tkun 
għadha valida. Disinn skematiku ta’ re ċipjent tat-t ħawwid imdawwar 
bil-ħġieġ b’volum ta’ madwar litru wie ħed jidher fl-Appendi ċi 2. 
Il-proporzjonijiet tar-re ċipjent muri fl-Appendi ċi 2 kienu ppruvati li 
kienu favorevoli u g ħandhom jin żammu meta jintu ża apparat ta’ daqs 
differenti;  
— huma essenzjali mezzi biex it-temperatura tin żamm kostanti matul 
l-esperiment ta’ t ħawwid bil-mod.  
18. Ir-re ċipjenti għandhom ikunu mag ħmulin minn materjal inert b’mod li 
l-assorbiment mill-u ċuħ tar-reċipjenti jkun negli ġibbli.  
Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet g ħat-test  
19. Id-determinazzjoni tal-P  OW għandha ssir b’1-ottanol tal-og ħla purezza li 
jkun disponibbli kummer ċjalment (mill-anqas + 99 %). Hija rrakkomandata 
purifikazzjoni ta’ 1-ottanol b’estrazzjoni bl-a ċidu, bażi u ilma u sussegwen ­
tement bi tnixxif. Flimkien ma’ dan, tista’ tintu ża distillazzjoni g ħall-purifi­
kazzjoni ta’ 1-ottanol. G ħandu jintu ża 1-ottanol ippurifikat biex ikunu ppre ­
parati soluzzjonijiet standard tas-sustanzi g ħall-ittestjar. L-ilma li g ħandu 
jintuża fid-determinazzjoni ta’ P  OW għandu jkun ħġieġ jew quartz distillat, 
jew miksub minn sistema ta’ purifikazzjoni, jew jista’ jintu ża ilma ta’ grad 
HPLC. Tkun me ħtieġa filtrazzjoni permezz ta’ filtru ta’ 0,22 μm għall-ilma 
distillat, u g ħandhom ikunu inklu żi in bjanki biex ikun ivverifikat li 
fl-estratti kon ċentrati ma hemmx impuritajiet li jistg ħu jkunu ta’ tfixkil 
għas-sustanza g ħall-ittestjar. Jekk jintu ża filtru ta’ fibra tal- ħġieġ, dan 
għandu jitnaddaf billi jin ħema għal mill-anqas tliet sig ħat f’400 °C.  
20. Iż-żewġ solventi jkunu ssaturati re ċiprokament qabel l-esperiment billi jkunu 
ekwilibrati f’re ċipjent kbir bi żżejjed. Dan isir billi s-sistema f’ żewġ fażijiet 
titħawwad bil-mod g ħal jumejn.  
21. Tintg ħażel konċentrazzjoni adattata ta’ sustanza g ħall-ittestjar u tin ħall f’1- 
ottanol (saturat bl-ilma). Il-koeffi ċjent tal-partizzjoni ta’ 1-ottanol/ilma jkun 
jeħtieġlu jiġi ddeterminat f’soluzzjonijiet dilwiti f’1-ottanol u ilma. G ħalhekk 
il-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar m’g ħandhiex tkun aktar minn 
70 % tas-solubilità tag ħha b’kon ċentrazzjoni massima ta’ 0,1 M f’wie ħed 
miż-żewġ fażijiet (1). Is-soluzzjonijiet ta’ 1-ottanol u żati għall-esperiment 
għandhom ikunu ming ħajr sustanza g ħall-ittestjar solida sospi ża. 
22. L-ammont adattat ta’ sustanza g ħall-ittestjar jin ħall f’1-ottanol (saturat 
bl-ilma). Jekk l-istima ta’ log POW tkun aktar minn ħamsa, għandha 
tingħata attenzjoni biex is-soluzzjonijiet ta’ 1-ottanol u żati għall-esperiment 
ikunu ming ħajr sustanza g ħall-ittestjar solida sospi ża. Għal dak il-g ħan, qed 
tiġi segwita l-pro ċedura li ġejja għall-kimiċi b’valur stmat ta’ log P  OW > 5: 
— is-sustanza g ħall-ittestjar tin ħall f’1-ottanol (saturat bl-ilma);  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— is-soluzzjoni ting ħata ħin biżżejjed biex is-sustanza solida sospi ża 
toqgħod. Waqt li s-sustanza tkun qed toqg ħod, il-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar ti ġi mmonitorjata;  
— wara li l-kon ċentrazzjonijiet imkejla fis-soluzzjoni ta’ 1-ottanol ikunu 
kisbu valuri stabbli, is-soluzzjoni stokk ti ġi dilwita b’volum adattat ta’ 
1-ottanol;  
— il-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni stokk dilwita titkejjel. Jekk 
il-konċentrazzjoni mkejla tkun konsistenti mad-dilwizzjoni, 
is-soluzzjoni stokk dilwita tkun tista’ tintu ża fl-esperiment ta’ t ħawwid 
bil-mod.  
Estrazzjoni u anali żi ta’ kampjuni  
23. Għandu jintu ża metodu analitiku vvalidat g ħall-analiżi tas-sustanza g ħall- 
ittestjar. L-investigaturi g ħandhom jipprovdu xhieda li l-kon ċentrazzjonijiet 
f’1-ottanol saturat bl-ilma, kif ukoll fil-fa żi tal-ilma saturat b’1-ottanol matul 
l-esperiment ikunu ‘l fuq mil-limitu tal-metodu ta’ kwantifikazzjoni 
tal-proċeduri analiti ċi użati. L-irkupri analiti ċi tas-sustanza g ħall-ittestjar 
mill-fażi tal-ilma u mill-fa żi ta’ 1-ottanol ikun je ħtiġilhom jiġu stabbiliti 
qabel l-esperiment f’dawk il-ka żijiet li għalihom ikunu me ħtieġa metodi 
ta’ estrazzjoni. Is-sinjal analitiku jkun je ħtieġlu jiġi kkoreġut għal in 
bjanki u g ħandha ting ħata attenzjoni biex ma jse ħħux riporti ta’ analita 
minn kampjun g ħal ieħor. 
24. L-estrazzjoni tal-fa żi tal-ilma b’solvent organiku u kon ċentrazzjoni minn 
qabel tal-estratt aktarx li jkunu me ħtieġa qabel l-anali żi, minħabba kon ċen­
trazzjonijiet pjuttost baxxi ta’ sustanzi g ħall-ittestjar idrofobi ċi fil-fażi 
tal-ilma. G ħall-istess ra ġuni jkun me ħtieġ li jitnaqqsu l-kon ċentrazzjonijiet 
in bjank eventwali. G ħal dak il-g ħan, ikun me ħtieġ li jintużaw solventi ta’ 
purezza g ħolja, preferibbilment solventi g ħall-analiżi tar-residwi. Minbarra 
dan, li wie ħed jaħdem b’oġġetti tal-ħġieġ maħsulin sew minn qabel (e ż. 
ħasil b’solventi jew ħami f’temperatura g ħolja) jgħin biex tkun evitata 
l-kontaminazzjoni kro ċjata. 
25. Stima tal-log P  OW tista’ tinkiseb minn programm ta’ stima jew permezz ta’ 
ġudizzju espert. Jekk il-valur ikun og ħla minn sitta, f’dak il-ka ż 
korrezzjonijiet in bjank u r-riporti analita je ħtieġu jkunu mmonitorjati 
mill-qrib. Bl-istess mod, jekk l-istima ta’ log P  OW tkun aktar minn sitta, 
l-użu ta’ standard sostitut g ħall-korrezzjoni ta’ rkupru huwa obbligatorju, 
biex ikunu jistg ħu jintlaħqu fatturi ta’ kon ċentrazzjoni minn qabel. Huma 
kummerċjalment disponibbli g ħadd ta’ programmi tas-softwer g ħall-istima 
tal-log P  OW ( 1 ), eż. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) u ACD log 
P (19). Id-deskrizzjonijiet tal-appro ċċi tal-stima jinsabu fir-referenzi (20-22).  
26. Il-limiti ta’ kwantifikazzjoni (LOQ) g ħad-determinazzjoni tas-sustanza g ħall- 
ittestjar f’1-ottanol u l-ilma huma stabbiliti bl-u żu ta’ metodi a ċċettati. Bħala 
regola ba żika, il-limitu tal-metodu ta’ kwantifikazzjoni jista’ jkun 
iddeterminat b ħala l-kon ċentrazzjoni fl-ilma jew f’1-ottanol li tipprodu ċi 
proporzjon ta’ sinjal g ħal ħoss ta’ g ħaxra. Għandu jintg ħażel metodu 
adattat ta’ estrazzjoni u kon ċentrazzjoni minn qabel u l-irkupri analiti ċi 
għandhom ji ġu speċifikati wkoll. Jintg ħażel fattur adattat ta’ kon ċentrazzjoni 
minn qabel biex jinkiseb sinjal tad-daqs me ħtieġ malli jkun hemm deter ­
minazzjoni analitika.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Din l-informazzjoni ting ħata biss g ħall-konvenjenza ta’ min ju żahom. Programmi o ħra 
ekwivalenti tal-kompjuter jistg ħu jintużaw jekk ikun jista’ jintwera li jipprodu ċu l-istess 
riżultati.
 27. Abba żi tal-parametri tal-metodu analitiku u tal-kon ċentrazzjonijiet 
mistennija, ji ġi ddeterminat daqs approssimattiv tal-kampjun me ħtieġ 
għad-determinazzjoni korretta tal-kon ċentrazzjoni kompost. G ħandu jkun 
evitat l-u żu ta’ kampjuni tal-ilma li jkunu wisq żgħar biex jinkiseb sinjal 
analitiku suffi ċjenti. Għandu jkun evitat ukoll l-u żu ta’ kampjuni tal-ilma li 
jkunu eċċessivament kbar, g ħax inkella jista’ jkun li jifdal ftit wisq ilma 
għal għadd minimu ta’ anali żi meħtieġa (n = 5). Fl-Appendi ċi 1, il-volum 
minimu tal-kampjuni huwa indikat b ħala funzjoni tal-volum tar-re ċipjent, 
l-LOD tas-sustanza g ħall-ittestjar u s-solubilità tas-sustanza g ħall-ittestjar.  
28. Il-kwantifikazzjoni tas-sustanzi g ħall-ittestjar isse ħħ b’paragun mal-kurvi ta’ 
kalibrazzjoni tal-kompost rispettiv. Il-kon ċentrazzjonijiet fil-kampjuni 
analizzati g ħandhom ikunu kkategorizzati skont il-kon ċentrazzjonijiet 
tal-istandards.  
29. Għal sustanzi g ħall-ittestjar bi stima tal-log P  OW ogħla minn sitta, g ħandu 
jitħallat standard sostitut mal-ilma qabel l-estrazzjoni sabiex ikun irre ġistrat 
it-telf li jse ħħ matul l-estrazzjoni u l-kon ċentrazzjoni minn qabel 
tal-kampjuni tal-ilma. G ħal korrezzjoni korretta tal-irkupri, is-sostituti 
għandu jkollhom proprjetajiet li jkunu qrib ħafna ta’, jew identi ċi għal 
dawk tas-sustanza g ħall-ittestjar. Preferibbilment, g ħal dan il-g ħan jintużaw 
analogi b’tikketti isotopi ċi (stabbli) tas-sustanzi ta’ interess (pere żempju, 
perdewterat jew b’tikketti  13 C). Jekk l-u żu ta’ isotopi stabbli b’tikketta, 
jiġifieri  13 C jew  2 H, ma jkunx possibbli, g ħandu jintwera minn dejta 
affidabbli fil-letteratura li l-proprjetajiet fi żikokimiċi tas-sostitut huma qrib 
ħafna ta’ dawk tas-sustanza g ħall-ittestjar. Matul l-estrazzjoni ta’ 
likwidu-likwidu tal-fa żi tal-ilma jistg ħu jifformaw l-emulsjonijiet. Dawn 
jistgħu jitnaqqsu billi ji żdied il-mel ħ u l-emulsjoni tit ħalla toqgħod matul 
il-lejl. Il-metodi u żati għall-estrazzjoni u g ħall-konċentrazzjoni minn qabel 
tal-kampjuni je ħtiġilhom ikunu rrappurtati.  
30. Il-kampjuni me ħudin mill-fa żi ta’ 1-ottanol jistg ħu, jekk ikun me ħtieġ, jiġu 
dilwiti b’solvent adattat qabel l-anali żi. Minbarra dan, huwa rrakkomandat 
l-użu ta’ standards sostituti g ħal korrezzjoni ta’ rkupri g ħal sustanzi li 
għalihom l-esperimenti ta’ rkupru jkunu wrew grad g ħoli ta’ varjazzjoni 
fl-esperimenti ta’ rkupru (devjazzjoni standard relattiva > 10 %).  
31. Id-dettalji tal-metodu analitiku je ħtiġilhom ikunu rrappurtati. Dan jinkludi 
l-metodu tal-estrazzjoni, il-kon ċentrazzjoni minn qabel u fatturi ta’ 
dilwizzjoni, parametri ta’ strumenti, rutina ta’ kalibrazzjoni, firxa ta’ kali ­
brazzjoni, irkupru analitiku tas-sustanza g ħall-ittestjar mill-ilma, żieda ta’ 
standards sostituti g ħal korrezzjoni ta’ rkupri, valuri in bjank, limiti ta’ 
detezzjoni u limiti ta’ kwantifikazzjoni.  
Prestazzjoni tat-Test  
Proporzjonijiet ottimi tal-volum ta’ 1-ottanol/ilma  
32. Fl-għażla tal-volumi ta’ ilma u 1-ottanol, g ħandhom jitqiesu l-LOQ f’1- 
ottanol u l-ilma, il-fatturi ta’ kon ċentrazzjoni minn qabel applikati 
lill-kampjuni tal-ilma, il-volumi li tag ħhom ikunu ttie ħdu l-kampjuni f’1- 
ottanol u l-ilma, u l-kon ċentrazzjonijiet mistennija. G ħal raġunijiet ta’ speri ­
mentazzjoni, il-volum ta’ 1-ottanol fis-sistema ta’ t ħawwid bil-mod g ħandha 
tintgħażel b’mod li s-saff ta’ 1-ottanol ikun o ħxon biżżejjed (> 0,5 cm) 
sabiex jippermetti t-te ħid ta’ kampjuni tal-fa żi ta’ 1-ottanol ming ħajr ma 
jiddisturbah.  
33. Il-proporzjonijiet tipi ċi tal-fażijiet għad-determinazzjonijiet ta’ komposti 
b’log P  OW ta’ 4,5 u og ħla huma 20 sa 50 ml ta’ 1-ottanol u 950 sa 980 
ml ta’ ilma f’re ċipjent ta’ litru wie ħed. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Kundizzjonijiet tat-test  
34. Matul it-test ir-re ċipjent tar-reazzjoni g ħandu termostat biex inaqqas 
il-varjazzjoni tat-temperatura g ħal inqas minn 1 °C. L-anali żi għandha 
titwettaq f’25 °C.  
35. Is-sistema sperimentali g ħandha tkun protetta mid-dawl naturali billi 
l-esperiment isir f’kamra mudlama jew billi r-re ċipjent ta’ reazzjoni 
jitgħatta b’folja tal-aluminju.  
36. L-esperiment g ħandu jsir f’ambjent ħieles (kemm jista’ jkun) mit-trab.  
37. Is-sistema ta’ 1-ottanol-ilma tit ħawwad sakemm jinkiseb ekwilibriju. F’es ­
periment pilota jkun ivvalutat it-tul tal-perjodu ta’ ekwilibrazzjoni billi jsir esperiment ta’ t ħawwid bil-mod u perjodikament jittie ħed kampjun tal-ilma 
u ta’ 1-ottanol. Il-punti ta’ ħin ta’ teħid ta’ kampjun g ħandhom jitqassmu 
f’perjodu minimu ta’ ħames sigħat.
 
38. Kull determinazzjoni tal-P  OW għandha ssir billi jsiru mill-anqas tliet 
esperimenti indipendenti ta’ t ħawwid bil-mod.  
Determinazzjoni tal- ħin ta’ ekwilibrazzjoni  
39. Huwa pre żunt li l-ekwilibriju jinkiseb meta rigressjoni tal-proporzjon ta’ 
konċentrazzjoni ta’ 1-ottanol/ilma mal- ħin tul intervall ta’ ħin ta’ erba’ 
punti ta’ ħin trendi angolu li ma jkunx differenti b’mod sinifikanti minn 
żero f’livell p ta’ 0,05. Il- ħin minimu ta’ ekwilibrazzjoni huwa ta’ jum qabel 
ma jinbeda jittie ħed il-kampjun. B ħala regola, it-te ħid ta’ kampjuni ta’ 
sustanzi bi stima ta’ log P  OW ta’ anqas minn ħamsa jista’ jsir matul 
it-tieni u t-tielet jum. L-ekwilibrazzjoni jista’ jkollha tkun esti ża għal 
komposti aktar idrofobi ċi. Għal kompost b’log P  OW ta’ 8,23 (dekakloro ­
bifenil) 144 sieg ħa kienu suffi ċjenti għal ekwilibrazzjoni. L-ekwilibriju ji ġi 
vvalutat permezz ta’ te ħid ripetut ta’ kampjuni ta’ re ċipjent wie ħed. 
Bidu tal-esperiment  
40. Fil-bidu tal-esperiment ir-re ċipjent ta’ reazzjoni jimtela bl0ilma saturat b’1- 
ottanol. G ħandu jit ħalla jkun hemm ħin biżżejjed biex tintla ħaq 
it-temperatura tat-termostat.  
41. L-ammont mixtieq ta’ sustanza g ħall-ittestjar (ma ħlula fil-volum me ħtieġ ta’ 
1-ottanol saturat bl-ilma) ti żdied b’attenzjoni fir-re ċipjent ta’ reazzjoni. Dan 
huwa stadju kru ċjali fl-esperiment, min ħabba li g ħandu jkun evitat it-ta ħlit 
b’turbulenza ta ż-żewġ fażijiet. Għal dak il-g ħan, il-fażi ta’ 1-ottanol tista’ 
tgħaddi bil-mod minn pipetta mal- ħajt tar-reċipjent sperimentali, qrib il-wi ċċ 
tal-ilma. Wara tg ħaddi fi fluss tul il- ħajt tal-ħġieġ u tifforma rita ‘l fuq 
mill-fażi tal-ilma. Id-dikantar ta’ 1-ottanol direttament fil-flixkun g ħandu 
dejjem ji ġi evitat; it-taqtiriet ta’ 1-ottanol m’g ħandhomx jit ħallew jaqg ħu 
direttament fl-ilma.  
42. Wara li jibda t-t ħawwid, ir-rata ta’ t ħawwid għandha tiżdied bil-mod. Jekk 
il-muturi tat-t ħawwid ma jkunux jistg ħu jiġu aġġustati sewwa g ħandu jiġi 
kkunsidrat l-u żu ta’ trasformatur. Ir-rata ta’ t ħawwid għandha tiġi aġġustat 
sabiex tin ħoloq il-vorti ċi fil-interfa ċċa bejn l-ilma u 1-ottanol ta’ fond ta’ 0,5 
għal massimu ta’ 2,5 cm. Ir-rata ta’ t ħawwid għandha titnaqqas jekk il-fond 
tal-vortiċi jaqbeż it-2,5 cm; inkella jistg ħu jifformaw taqtiriet mikro 
mit-taqtiriet ta’ 1-ottanol fil-fa żi tal-ilma, li jwassal g ħal stima e ċċessiva 
tal-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar fl-ilma. Hija rrakkomandata 
r-rata massima ta’ t ħawwid ta’ 2,5 cm abba żi tas-sejbiet fl-istudju ta’ vali ­
dazzjoni tar-ring-test (5). Huwa kompromess bejn il-kisba ta’ rata mg ħaġġla 
ta’ ekwilibrazzjoni, filwaqt li tkun illimitata l-formazzjoni ta’ taqtiriet mikro 
ta’ 1-ottanol.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Teħid ta’ Kampjuni u Trattament tal-Kampjuni  
43. Il-ħawwad g ħandu jintefa qabel ma jittie ħdu l-kampjuni u l-likwidi 
għandhom jit ħallew jieqfu milli ji ċċaqalqu. Wara li jitlesta t-te ħid 
tal-kampjuni, il- ħawwad jer ġa’ jitqabbad bil-mod, kif deskritt hawn fuq, u 
mbagħad ir-rata ta’ t ħawwid tiżdied gradwalment.  
44. Il-fażi tal-ilma jitte ħdilha kampjun minn rubinett tal-g ħeluq fil-qieg ħ 
tar-reċipjent ta’ reazzjoni. Skarta dejjem il-volum mejjet ta’ ilma li jkun 
hemm fil-vitijiet (madwar 5 ml fir-re ċipjent muri fl-Appendi ċi 2). L-ilma 
fil-vitijiet ma jit ħawwadx u, g ħalhekk, ma jkunx f’ekwilibriju mal-bulk. 
Innota l-volum tal-kampjuni tal-ilma, u żgura li jitqies l-ammont ta’ 
sustanza g ħall-ittestjar li jkun hemm fl-ilma skartat meta tiffissa bilan ċ 
tal-massa. It-telfiet min ħabba l-evaporazzjoni g ħandhom ikunu mminimizzati 
billi l-ilma jit ħalla jgħaddi fi fluss ming ħajr taqlib fil-lembut separatorju, 
b’mod li ma jkunx hemm disturb tas-saff tal-ilma/1-ottanol.  
45. Il-kampjuni ta’ 1-ottanol jinkisbu billi tittie ħed alikwota żgħira (madwar 100 
μl) mis-saff ta’ 1-ottanol b’siringa ta’ 100 mikrolitru kollha kemm hija 
tal-ħġieġ u l-metall. G ħandha ting ħata attenzjoni li l-limitu ma jitqallibx. 
Il-volum tal-likwidu li jkun itte ħiedlu kampjun ji ġi rreġistrat. Alikwota 
żgħira hija bi żżejjed, min ħabba li l-kampjun ta’ 1-ottanol se ji ġi dilwit.  
46. Stadji mhux me ħtieġa ta’ trasferiment ta’ kampjuni g ħandhom ikunu evitati. 
Għal dak il-g ħan il-volum ta’ kampjun g ħandu jkun iddeterminat b’mod 
gravimetriku. F’ka ż ta’ kampjuni ta’ ilma dan ikun jista’ jinkiseb bil- ġbir 
tal-kampjun tal-ilma f’lembut separatorju li jkun di ġà fih il-volum me ħtieġ 
ta’ solvent.  
DEJTA U RAPPURTAR  
47. Skont dan il-Metodu ta’ Ttestjar, P  OW ikun iddeterminat billi jsiru tliet 
esperimenti ta’ t ħawwid bil-mod (tliet unitajiet sperimentali) bil-kompost li 
jkun qed ji ġi investigat li ju ża kundizzjonijiet identi ċi. Ir-rigressjoni u żata 
biex jintwera li jkun inkiseb ekwilibriju g ħandha tkun ibba żata fuq 
ir-riżultati ta’ mill-anqas erba’ determinazzjonijiet ta’ C  O /C W f’punti konse ­
kuttivi ta’ ħin. Dan jippermetti li tkun ikkalkulata varjanza b ħala kejl 
tal-inċertezza tal-valur medju miksub minn kull unità sperimentali.  
48. Il-P  OW jista’ jiġi kkaratterizzat mill-varjanza fid-dejta miksuba g ħal kull 
unità sperimentali. Din l-informazzjoni tintu ża biex ikun ikkalkulat il-P  OW 
bħala l-medja pe żata tar-riżultati tal-unitajiet sperimentali individwali. Biex 
isir dan, jintu ża bħala piż l-invers tal-varjanza tar-ri żultati tal-unitajiet speri ­
mentali. B ħala riżultat, dejta b’varjazzjoni kbira (espressa b ħala l-varjanza) 
u, għalhekk, b’anqas affidabbiltà, ikollha anqas influwenza fuq ir-ri żultat 
minn dejta b’varjanza baxxa.  
49. B’mod analo ġiku, tiġi kkalkulata d-devjazzjoni standard pe żata. Din tikkar ­
atterizza r-ripetibbiltà tal-kejl tal-P  OW . Valur baxx tad-devjazzjoni standard 
peżata jindika li d-determinazzjoni tal-P  OW kienet ripetibbli ħafna f’labor ­
atorju wie ħed. It-trattament formali tal-istatistika tad-dejta jinsab spjegat 
hawn taħt. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Trattament tar-ri żultati  
Wiri ta’ kisba ta’ ekwilibriju  
50. Il-logaritmu tal-proporzjon tal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar f’1- 
ottanol u ilma (log (C  O /C w )) huwa kkalkulat g ħal kull ħin ta’ teħid ta’ 
kampjuni. Il-kisba ta’ ekwilibriju kimiku tintwera billi dan il-proporzjon jitfassal f’konfront mal- ħin. Livell kostanti f’din il-grafika li jkun ibba żat 
f’mill-anqas fuq erba’ punti konsekuttivi ta’ ħin jindika li jkun inkiseb 
ekwilibriju, u li l-kompost ikun in ħall tassew f’1-ottanol. Jekk le, it-test 
ikun jeħtieġlu jitkompla sakemm erba’ punti su ċċessivi ta’ ħin jrendu 
angolu li ma jkunx differenti b’mod sinifikanti minn 0 f’livell p ta’ 0,05, 
li jindika li log C
 O /C w huwa indipendenti mill- ħin. 
Kalkolu ta’ Log P  OW 
51. Il-valur ta’ log P  OW tal-unità sperimentali huwa kkalkulat b ħala l-valur 
medju pe żat ta’ log C  o /C w għall-parti tal-kurva ta’ log C  o /C w vs il-ħin, li 
għalih ikun intwera l-ekwilibriju. Il-medja pe żata hija kkalkulata billi d-dejta 
tintiżen mal-invers tal-varjanza sabiex l-influwenza tad-dejta fuq ir-ri żultat 
finali tkun proporzjonata b’mod invers g ħall-inċertezza fid-dejta.  
Medja ta’ log P  OW 
52. Il-valur medju ta’ log P  OW ta’ unitajiet sperimentali differenti huwa 
kkalkulat b ħala l-medja tar-ri żultati tal-unitajiet sperimentali individwali 
ppeżati mal-varjanzi rispettivi tag ħhom.  
Il-kalkulazzjoni ssir kif ġej: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
fejn 
log P  OW,i = il-valur log P  OW tal-unità sperimentali i individwali;  
log P  OW,Av  = il-valur medju pe żat tad-determinazzjonijiet log P  OW indi­
vidwali;  
w i = il-piż statistiku assenjat lil valur log P  OW tal-unità speri ­
mentali i.  
Ir-reċiproku tal-varjanza ta’ log P  OW,i jintuża bħala w  i 
(w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ). 
53. L-iżball tal-medja ta’ log P  OW huma stmat b ħala r-ripetibbiltà ta’ log C  o /C w 
iddeterminat matul il-fa żi ta’ ekwilibriju fl-unitajiet sperimentali individwali. 
Huwa espress b ħala d-devjazzjoni standard pe żata ta’ log P  OW,Av  (σ log 
Pow,Av  ) li mbag ħad ikun kejl tal-i żball asso ċjat ma’ log P  OW,Av  . 
Id-devjazzjoni standard pe żata tista’ ti ġi kkomputata mill-varjanza pe żata 
var log Pow,Av  kif ġej: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Is-simbolu n huwa g ħall-għadd ta’ unitajiet sperimentali.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Rapport tat-test  
54. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanza g ħall-ittestjar:  
— isem komuni, isem tal-kimika, numru tal-CAS, formula strutturali (li 
tindika l-po żizzjoni tat-tikketta meta tintu ża sustanza b’tikketta radjo ­
loġika) u proprjetajiet fi żikokimiċi rilevanti (ara l-paragrafu 17);  
— purezza (impuritajiet) tas-sustanza g ħall-ittestjar;  
— purezza tat-tikketta ta’ kimi ċi b’tikketta u attività molari (fejn jixraq);  
— stima preliminari ta’ log P  ow , kif ukoll il-metodu u żat biex jo ħroġ 
il-valur.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dati tat-twettiq tal-istudji;  
— temperatura matul l-esperiment;  
— volumi ta’ 1-ottanol u ilma fil-bidu tat-test;  
— volumi ta’ kampjuni me ħudin ta’ 1-ottanol u ilma;  
— volumi ta’ 1-ottanol u ilma li jifdal fir-re ċipjenti tat-test;  
— deskrizzjoni tar-re ċipjenti tat-test u tal-kundizzjonijiet tat-t ħawwid 
(ġeometrija tal-virga tat-t ħawwid u tar-re ċipjent tat-test, l-g ħoli 
tal-vortiċi f’mm, u meta disponibbli: rata ta’ t ħawwid) u żati; 
— metodi analiti ċi użati biex ikunu ddeterminati s-sustanza g ħall-ittestjar u 
l-limitu tal-metodu ta’ kwantifikazzjoni;  
— ħinijiet ta’ te ħid ta’ kampjuni;  
— il-pH tal-fa żi fl-ilma u l-bafers u żati, meta l-pH ikun a ġġustat għal 
molekuli jonizzabbli;  
— għadd ta’ replikati.  
Riżultati:  
— ripetibbiltà u sensittività tal-metodi analiti ċi użati; 
— konċentrazzjonijiet iddeterminati tas-sustanza g ħall-ittestjar f’1-ottanol u 
ilma bħala funzjoni ta’ ħin; 
— wiri ta’ bilan ċ tal-massa;  
— temperatura u devjazzjoni standard jew il-firxa tat-temperatura matul 
l-esperiment;  
— ir-rigressjoni tal-proporzjon ta’ kon ċentrazzjoni f’konfront mal- ħin; 
— il-valur medju ta’ log P  ow,Av  u l-iżball standard tieg ħu; 
— diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— eżempji ta’ ċifri ta’ dejta mhux ma ħduma ta’ anali żi rappreżentattiva (id- 
dejta kollha mhux ma ħduma għandha tin ħażen skont standards tal-GLP), 
inklużi rkupri ta’ sostituti, u l-g ħadd ta’ livelli u żati fil-kalibrazzjoni 
(flimkien mal-kriterji g ħall-koeffiċjent ta’ korrelazzjoni tal-kurva ta’ kali ­
brazzjoni), u r-ri żultati ta’ garanzija tal-kwalità/kontroll tal-kwalità 
(QA/QC);  
— meta disponibbli: rapport ta’ validazzjoni tal-pro ċedura ta’ anali żi (li 
għandu jkun indikat fost ir-referenzi).  
LETTERATURA:  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
 
(2) Il-Kapitolu A.8 ta’ dan l-Anness, Koeffi ċjent tal-Partizzjoni.  
(3) Il-Kapitolu A.8 ta’ dan l-Anness, Koeffi ċjent tal-Partizzjoni.  
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Paris.  
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
(10) Il-Kapitolu A.6 ta’ dan l-Anness, Solubilità tal-Ilma.  
(11) Il-Kapitolu C.7 ta’ dan l-Anness, Degradazzjoni – Idroli żi ta’ Degra ­
dazzjoni Abijotika b ħala Funzjoni ta’ pH.  
(12) Il-Kapitolu C.4 - Parti II – VII (Metodu A sa F) ta’ dan l-Anness, Deter ­
minazzjoni ta’ Bijodegradabilità ‘Fa ċli’. 
(13) Il-Kapitolu A.4 ta’ dan l-Anness, Pressjoni tal-Fwar.  
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623- 
626. 
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, 
Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Kanada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, 
Reehl WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Appendiċi 1 
Spreadsheet g ħall-komputazzjoni ta’ volumi minimi ta’ ilma me ħtieġ għall- 
detezzjoni ta’ sustanzi g ħall-ittestjar ta’ valuri differenti ta’ log P  OW fil-fażi 
fl-ilma  
Suppożizzjonijiet:  
— Volum massimu ta’ alikwoti individwali = 10 % tal-volum totali; 5 alikwoti 
= 50 % tal-volum totali.  
— Koncentrazzjoni ta’ sustanzi ghall-ittestjar = 0,7 × solubilità f’fazi wahda jew 
ohra. F’ka ż ta’ konċentrazzjonijiet aktar baxxi, ikunu me ħtieġa volumi akbar.  
— Volum u żat għal determinazzjoni ta’ LOD = 100 ml.  
— log P  ow vs. log S  w u log P  ow vs. SR (S  oct /S w ) huma rappre żentazzjonijiet 
raġonevoli ta’relazzjonijiet g ħal sustanzi g ħall-ittestjar.  
Stima ta’ S  w 
log P  ow ekwazzjoni log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Stima ta’ S  oct 
log P  ow ekwazzjoni S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Total tal-Massa 
tas-sustanza g ħall- 
ittestjar 
(mg) Massa  oct /Massa  ilma Massa  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Massa  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 
2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 
7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 
9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Komputazzjoni ta’ volumi  
Volum minimu me ħtieġ għal fażi ta’ H  2 O f’kull kon ċentrazzjoni ta’ LOD  
log K  ow LOD (mikrogrammi/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volum użat 
għal LOD (l) 0,1 
Spjegazzjoni tal-Komputazzjonijiet  
Jirrappreżenta < 10 % tal-volum totali ta’ fa żi fl-ilma, re ċipjent ta’ ekwili ­
brazzjoni ta’ 1 litru.  
Jirrappreżenta < 10 % tal-volum totali ta’ fa żi fl-ilma, re ċipjent ta’ ekwili ­
brazzjoni ta’ 2 litri.  
Jirrappreżenta < 10 % tal-volum totali ta’ fa żi fl-ilma, re ċipjent ta’ ekwili ­
brazzjoni ta’ 5 litri.  
Jirrappreżenta < 10 % tal-volum totali ta’ fa żi fl-ilma, re ċipjent ta’ ekwili ­
brazzjoni ta’ 10 litri.  
Jeċċedi l-10 % ta’ re ċipjent ta’ ekwilibrazzjoni anke tal-10 litri.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Prospett ta’ volumi me ħtieġa, bħala funzjoni ta’ solubilità fl-ilma u Log P  ow 
Volum minimu me ħtieġ għal fażi ta’ H  2 O f’kull kon ċentrazzjoni ta’ LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (micrograms/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (micrograms/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volum użat għal LOD (l) 0,1  
Appendiċi 2 
Eżempju ta’ re ċipjent tat-test imdawwar bil- ħġieġ għall-esperiment ta’ 
tħawwid bil-mod g ħal determinazzjoni ta’ P  OW
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
PARTI B: METODI G ĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSI ĊITÀ U 
EFFETTI O ĦRA TAS-SA ĦĦA 
WERREJ 
DAĦLA ĠENERALI 
B.1.bis. TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA – PRO ĊEDURA G ĦAL DOŻA 
FISSA 
B.1.tris. TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA 
TOSSIKA AKUTA 
B.2. TOSSI ĊITÀ TA’ INALAZZJONI AKUTA 
B.3. TOSSI ĊITÀ AKUTA (DERMALI) 
B.4. TOSSI ĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRU ŻJONI TAL- 
ĠILDA 
B.5. TOSSI ĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRU ŻJONI TA' L- 
GĦAJNEJN 
B.6. SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA 
B.7. STUDJU DWAR IT-TOSSI ĊITÀ ORALI TA’ DO ŻA 
RIPETUTA KULL 28 JUM FIR-RODITURI 
B.8. TOSSI ĊITÀ TA’ INALAZZJONI SUBAKUTA: STUDJU TA’ 28 
JUM 
B.9. DO ŻI REPETUTI (28 jum) TOSSI ĊITÀ (DERMALI) 
B.10. MUTA ĠENIĊITÀ – TEST  IN VITRO  DWAR ANORMALITÀ 
FIL-KROMO ŻOMI TAL-MAMMIFERI 
B.11. MUTA ĠENIĊITÀ – TEST  IN VIVO  DWAR ANORMALITÀ 
FIL-KROMO ŻOMI TAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI 
B.12. MUTA ĠENIĊITÀ – TEST MIKRONUKLEU  IN VIVO  GĦAL 
ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI 
B.13/14. MUTA ĠENIĊITÀ – TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' 
BATTERJI 
B.15. IT-TIBDIL TAL- ĠENE –  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16. IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTISTA –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
B.17. MUTA ĠENEĊITÀ – TEST TAL-MUTAZZJONI TAL- ĠENE 
TAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI  IN VITRO  
B.18. DANNI U RIMEDJI TAD-DNA – SINTESI MHUX FL-ISKEDA 
TAD-DNA – ĊELLULI MAMMIFERI  IN VITRO  
B.19. ANALI ŻI IN VITRO  TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID O ĦT 
B.20. TEST REESSIV LI JIKKA ĠUNA L-MEWT U LI HUWA 
SKOND IS-SESS F’ DROSOPHILA MELANOGASTER  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. TEST TAT-TIBDIL TAL- ĠENI F’ĊELLULI MAMMIFERI  IN 
VITRO  
B.22. TEST LETALI DOMINANTI TAL-MAMMALI ĠERRIERA 
B.23. TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMO ŻOMI SPERMA ­
TOGONI TAL-MAMMIFERI 
B.24. TEST TAT-TIKEK FIL-PIL TAL- ĠRIEDEN 
B.25. IT-TRASLOKAZZJONI TAL- ĠRIEDEN LI TITTIE ĦED 
B.26. E ŻAMI TA’ TOSSI ĊITA ORALI SUB-KRONIKU 
ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DO ŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-U ŻU TA’ 
SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA 
B.27. E ŻAMI TA’ TOSSI ĊITÀ ORALI SUB-KRONIKU 
ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI 
RIPETUTA TA’ DO ŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-U ŻU TA’ 
SPEĊI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA 
B.28. STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA 
STUDJU DERMALI TAD- DO ŻA RIPETUT G ĦAL 90 
ĠURNATA LI JU ŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA 
B.29. TOSSI ĊITÀ TA’ INALAZZJONI SUBKRONIKA: STUDJU TA’ 
90 JUM 
B.30. STUDJI DWAR TOSSI ĊITÀ KRONIKA 
B.31. STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ FL-I ŻVILUPP PRENATALI 
B.32. STUDJI DWAR IL-KAR ĊINOĠENIĊITÀ 
B.33. STUDJI KON ĠUNTI DWAR TOSSI ĊITÀ KRONIKA/KAR ĊI­
NOĠENIĊITÀ 
B.34. TEST TA’ TOSSI ĊITÀ FUQ IR-RIPRODUZZJONI FUQ 
ĠENERAZZJONI WA ĦDA 
B.35. STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ 
ĠENERAZZJONIJIET 
B.36. TOSSIKOKINETI ĊI 
B.37. ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAS-SUSTANZI  
ORGANOPHOSPHORUS  WARA L-ESPO ŻIZZJONI AKUTA 
B.38. ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAS-SUSTANZI  
ORGANOPHOSPHORUS  STUDJU TA' DO ŻA RIPETUTTA 
GĦAL 28 ĠURNATA 
B.39. TEST  IN VIVO  TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' 
DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI 
B.40. IL-KORRO ŻJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : IT-TEST TAR- 
REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER – 
TRANSCUTANEAL ELECTRICAL RESISTANCE) 
B.40.BIS. IL-KORRO ŻJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : IT-TEST TAL- 
MUDELL TAL- ĠILDA UMANA  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. IT-TEST TAL-FOTOTOSSI ĊITÀ IN VITRO  3T3 NRU 
B.42. SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODULA 
TAL-LIMFA LOKALI 
B.43. STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSI ĊITÁ FL-ANNIMALI 
GERRIEMA 
B.44. L-ASSORBIMENT TAL- ĠILDA: IL-METODU  IN VIVO  
B.45. L-ASSORBIMENT TAL- ĠILDA: IL-METODU  IN VITRO  
B.46. IRRITAZZJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : METODU TA’ 
TTESTJAR TAL-EPIDERMIDE UMANA RIKOSTRUWITA 
B.47. IL-METODU TA' TTESTJAR TAL-OPA ĊITÀ U 
TAL-PERMEABILITÀ TAL-KORNEA TAL-BOVINI G ĦALL- 
IDENTIFIKAZZJONI TA' SUSTANZI KORRU ŻIVI U 
IRRITANTI SEVERI G ĦALL-GĦAJNEJN 
B.48. METODU TA' TTESTJAR TA' G ĦAJNEJN TAT-TI ĠIEĠ 
IŻOLATI G ĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TA' SUSTANZI 
KORRUŻIVI U IRRITANTI SEVERI G ĦALL-GĦAJNEJN 
B.49. TEST TAL-MIKRONUKLEU TA Ċ-ĊELLOLA MAMMIFERA  
IN VITRO  
B.50. SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODI 
TAL-LIMFA LOKALI: DA 
B.51. SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODULU 
LIMFATIKU LOKALI BRDU-ELISA  
▼M4 
B.52. TOSSI ĊITÀ TA’ INALAZZJONI AKUTA – METODU TA’ 
KLASSI AKUTA TOSSIKA  
▼M5 
B.53. STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAL-I ŻVILUPP 
B.54. BIJOASSA ĠĠ UTEROTROFIKU F'RODITURI: TEST TA' 
TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR G ĦAL PROPRJETAJIET 
ESTROĠENIĊI 
B.55. BIJOASSA ĠĠ HERSHBERGER F'FIRIEN: ASSA ĠĠ TA' 
TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR G ĦAL 
PROPRJETAJIET (ANTI)ANDRO ĠENIĊI 
B.56. STUDJU ESTI Ż TAT-TOSSI ĊITÀ RIPRODUTTIVA TA' 
ĠENERAZZJONI WA ĦDA 
B.57. H295R ASSA ĠĠ TAL-ISTEROJDO ĠENESI 
B.58. ASSA ĠĠI TAL-MUTAZZJONI TAL- ĠENI SOMATI ĊI U TAĊ- 
ĊELLOLI TAL- ĠERMI TA' RODITURI TRANS ĠENIĊI ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
DAĦLA ĠENERALI  
A. KARATTERIZZAZZJONI TAS-SUSTANZA G ĦAT-TEST  
Il-kompożizzjoni tas-sustanza g ħat-test, inklu żi l-impuritajiet l-iktar 
importanti, u l-proprjetajiet fi żiko-kimiċi relevanti tag ħha inkluża l- 
istabilità, g ħandha tkun mag ħrufa qabel il-bidu ta’ kwalunkwe studju 
għat-tossiċità. 
Il-proprjetajiet fi żiko-kimiċi tas-sustanza g ħat-test jag ħtu inform ­
azzjoni importanti fl-g ħażla election of the route of administration, 
the design of each particular study and the handling and storage of the test substance.
 
L-iżvilupp ta’ metodu analitiku g ħad-determinazzjoni tas-sustanza 
għat-test (inklu żi l-impuritajiet prin ċipali meta hu possibbli) fil- 
midjum tad-do żaġġ u l-materjal bijolo ġiku għandu jiġi qabel il- 
bidu ta’ l-istudju.  
L-informazzjoni kollha li g ħandha x’taqsam ma’ l-identifikazzjoni, 
il-proprjetajiet fi żiko-kimiċi, il-purità, u l-im ġiba tas-sustanza g ħat- 
test għandhom ji ġu inklużi fir-rapport tat-test.  
B. KURA TA’ L-ANNIMALI  
Il-kontroll strett tal-kundizzjonijiet ambjentali u l-kura b’seng ħa ta’ l- 
annimali huma essenzjali fl-ittestjar tat-tossi ċità 
(i) Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew l-annimali  
Il-kundizzjonijiet ambjentali fil-kmamar sperimentali jew l-ispazji 
magħluqa ta’ l-annimali g ħandhom ikunu xierqa g ħall-ispeċi li se 
jiġu ttestjati. G ħall-firien, ġrieden u fniek ta’ l-indi, il-kundizzjonijiet 
xierqa huma temperatura tal-kamra ta’ 22  o C ± 3  o C b’umdità 
relattiva minn 30 sa 70 %; g ħall-fniek it-temperatura g ħandha tkun 
ta’ 20  o C ± 3  o C b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %.  
Ċerti tekniki sperimentali huma partikularment sensittivi g ħall-effetti 
tat-temperatura u, f’dawn il-ka żijiet, id-dettalji tal-kundizzjonijiet 
xierqa huma inklu żi fid-deskrizzjoni tal-metodu tat-test. Fl-investi ­
gazzjonijiet kollha ta’ l-effetti tossi ċi, it-temperatura u l-umdità 
għandhom ji ġu mmoniterjati, irrekordjati, u inklu żi fir-raport finali 
ta’ l-istudju.  
Id-dwal g ħandhom ikunu artifi ċjali, is-sekwenza g ħandha tkun ta’ 
12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. Id-dettalji tas-sekwenza tad- 
dwal għandhom ji ġu rrekordjati u inklu żi fir-rapport finali ta’ l- 
istudju.  
Sakemm ma jkunx spe ċifikat mod ie ħor fil-metodu, l-annimali 
jistgħu jitpoġġew individwalment, jew jinqaflu fi gruppi żgħar ta’ 
l-istess sess; biex jinqaflu fi grupp, m’g ħandux ikun hemm iktar 
minn ħames annimali f’kull ga ġġa. 
Fir-rapporti ta’ l-esperimenti fuq l-annimali, huwa importanti li jidher 
ċar kif qed ji ġu maqfula l-annimali u n-numru ta’ annimali mpo ġġija 
f’kull gaġġa kemm waqt l-espo żizzjoni għall-kimika u kemm waqt 
kwalunkwe perjodu ta' osservazzjoni li ji ġi wara.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
(ii) Kundizzjonijiet ta’ l-g ħalf 
Id-dieti g ħandhom jissodisfaw il- ħtiġiet nutrizzjonali kollha ta’ l- 
ispeċi li qed ji ġu ttestjati. Fejn ji ġu amministrati s-sustanzi g ħat- 
test fid-dieta ta' l-annimali il-valur nutrizzjonali jista’ jonqos 
permezz ta' l-effett li s-sustanza u l-kostitwent tad-dieta jag ħmlu 
fuq xulxin. Il-possibbiltà ta’ reazzjoni b ħal din g ħandha ti ġi 
meqjusa meta ji ġu interpretati ir-ri żultati tat-testijiet. Id-dieti 
konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu jintużaw b'forniment illimitat 
ta' ilma g ħax-xorb. L-g ħażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mil- 
ħtieġa li tiġi żgurata taħlita xierqa tas-sustanza g ħat-test meta ti ġi 
somministrata b'dan il-metodu.  
Il-kontaminanti tad-dieta li jinfluwenzaw it-tossi ċità m’għandhomx 
ikunu pre żenti f’kon ċentrazzjonijiet li jinterferixxu.  
C. ITTESTJAR ALTERNATTIV  
L-Unjoni Ewropea g ħandha l-impenn li tippromwovi l-i żvilupp u l- 
validazzjoni ta’ tekniki alternattivi li jistg ħu jipprovdu l-istess livell 
ta’ informazzjoni b ħala testijiet kurrenti g ħall-annimali, i żda li jużaw 
inqas annimali, jikkaw żaw inqas tbatija jew jevitaw kompletament l- 
użu ta' annimali.  
Metodi bħal dawn, meta jsiru disponibbli, g ħandhom ji ġu kkunsidrati 
fejn hu possibbli g ħall-karatterizzazzjoni tal-periklu u l-klassifi ­
kazzjoni u l-ittikettjar konsegwenti g ħall-perikli intrinsi ċi u l-valu ­
tazzjoni g ħas-sigurtà tal-kimika.  
D. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI  
Meta t-testijiet ji ġu evalwati u interpretati, il-limitazzjonijiet safejn ir- 
riżultati ta' l-istudji ta' l-annimali u ta' l-in  vitro  jistgħu jkunu estra ­
polati direttament lill-bniedem iridu ji ġu kkunsidrati u g ħalhekk, l- 
evidenza ta’ effetti avversi fil-bnedmin, fejn huma disponibbli, jistgħu jintużaw għall-konfermazzjoni tar-ri żultati ta’ l-ittestjar.
 
E. REFERENZI TA’ LETTERATURA  
Bosta minn dawn il-metodi huma żviluppati fi ħdan l-istruttura tal- 
programm OECD  Testing Guidelines , u għandhom isiru skond il- 
prinċipji tal- Good Laboratory Practice , sabiex ji żguraw ‘l-a ċċet­
tazzjoni re ċiproka tad-data’ kemm jista’ jkun.  
Informazzjoni addizzjonali tinsab fir-referenzi msemmija fil-linji 
gwida ta' l-OECD u l-etteratura relevanti ppubblikata x’imkien ie ħor. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 BIS.  TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA – PRO ĊEDURA G ĦAL DOŻA 
FISSA  
1. METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti g ħal OECD TG 420 (2001)  
1.1. DA ĦLA 
Il-metodi tradizzjonali g ħall-istudju tat-tossi ċità akuta bl-u żu tal- 
mewt ta' l-annimali b ħala l-għan ewlieni. Fil-1984, resqien ġdid 
dwar it-testijiet tat-tossi ċità akuta kien ġie suġġerit mill-British Toxo ­
cology Society li huwa ibba żat fuq l-amministrazzjoni f'serje ta' 
livelli ta' do żi fissi (1). Ir-resqien evita l-u żu tal-mewt ta' l- 
annimali b ħala l-għan ewlieni, u minflok stra ħ fuq l-osservazzjonijiet 
ta' sinjali ċari tat-tossi ċità f'wieħed mis-serje ta' livelli ta' do żi fissi. 
Bsegwiment ta' studji  in vivo  tal-validazzjoni fil-UK (2) u f'medda 
internazzjonali (3), il-pro ċedura kienet adottata b ħala metodu tat-test 
fil-1992. Sussegwentament, il-propjetajiet statisti ċi tal-Proċedura ta' 
Doża Fissa kienu ġew evalwati bl-u żu ta' mudelli matemati ċi f'serje 
ta' studji (4) (5) (6). Flimkien, l-istudji  in vivo  u l-mudellar kienu 
were li l-pro ċedura hija riprodu ċibbli, bl-u żu anqas ta' annimali u 
tikkawża anqas tbag ħtija mill-metodi tradizzjonali u hija kapa ċi li 
tiggrada s-sustanzi f'manjera simili mal-metodi l-o ħrajn tat-testijiet 
tat-tossiċità akuta.  
Gwida dwar l-g ħażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq g ħal skop 
partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwar it-Testijiet tat-Tossiċità Akuta Orali (7). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll 
informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal- 
Metodu tat-test B.1 bis.
 
Huwa prin ċipju tal-metodu li fl-istudju ewlieni do żi tossiċi moderati 
biss ikunu u żati, u li l-amministrazzjoni tad-do żi li jkunu mistenna 
bħala letali g ħandhom ikunu evitati. Ukoll, id-do żi li huma mag ħrufa 
bħala li jikkaw żaw uġiegħ u tqallib żejjed, min ħabba l-azzjonijiet 
korrossivi jew ta' irritazzjoni qawwija, ma jkunx hemm ħtieġa li 
jkunu amministrati. Annimali moridondi, jew annimali li 
ovvjament ikunu bl-u ġiegħ jew li juru sinjali ta' tqallib sever u 
dewwiemi g ħandhom ikunu maqtula b'mod uman, u huma meqjusa 
fl-interpretazzjoni tar-ri żultati tat-test bl-istess mezz b ħal dawk l- 
annimali li jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterja ta' kif tittie ħed id- 
deċiżjoni sabiex ikunu maqtula l-annimali moribondi jew dawk li 
jkunu fi tbag ħtija kbira, u l-gwida g ħar-rikonoxximent ta' mewt 
prevista jew mistennija, huma s-su ġġett ta' Dokument ta' Gwida 
separat (8).  
Il-metodu jipprovdi informazzjoni dwar il-propjetajiet perikolu żi u 
jippermetti li s-sustanza tkun iggradata u ikklassifikata skond il- 
Globally Harmonised System (GHS) (Sistema Armonizzata 
Globali) g ħall-klassifika ta' kimika li to ħloq tossiċità akuta (9).  
Il-laboratorju tat-test g ħandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli 
kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni g ħandha tinkludi l-identifikaazzjoni u l-istruttura 
kimika tas-sustanza; il-propjetajiet fi żikokimiċi tagħha; ir-riżultati 
ta' xi testijiet o ħrajn In vitro  jew  in vivo  dwar is-sustanza' id- 
dettalji tossikolo ġiċi dwar sustanzi struttalment relatati; u l-u żu(i) 
antiċipati tas-sustanza. Din l-informazzjoni hija me ħtieġa sabiex 
tissodisfa lil dawk kollha ikkon ċernati li t-test huwa relevanti 
għall-protezzjoni tas-sa ħħa umana, u li jkun jg ħin fil-għażla ta' 
doża xierqa g ħal-bidu.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Tossiċita akuta orali : Tirreferi g ħall-effetti ħżiena li jse ħħu wara l- 
amministrazzjoni orali ta' do ża waħda ta' sustanza jew do żi multipli, 
matul 24 sieg ħa. 
Mewt imdewma : Tfisser li l-annimal ma jkunx u ma jidhirx 
moribond fi żmien 48 sieg ħa, imma li jmut aktar tard matul il- 
perjodu ta' osservazzjoni ta' 14-il jum.  
Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test li tkun somministrata. Id- 
doża hija espressa b ħala l-piż tas-susatanza tat-test g ħal kull unità tal- 
piż ta' l-annimal tat-test (e ż. mg/kg).  
Tossiċità evidenti : Hija terminolo ġija ġenerali li tiddeskrivi sinjali 
ċari tat-tossi ċita bħala segwiment ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza 
tat-test (ara (3) g ħall-eżempji) bħal ma hija d-do ża fissa segwenti 
aktar għolja li to ħloq uġiegħ waqqi jew sinjali dewwiema ta' 
tbagħtija qawwija, l-istatus ta' moribond (il-kriterja hija ippre żentatha 
fil-Humane Endpoints Guidance Document (8) (Dokument ta' Gwida dwar l-G ħanijiet Umani)), jew li l-probabbiltà ta' mortalità f'bosta 
annimali tista’ tkun mistennija.
 
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures . (Sistema tal-Klassifikazzjoni Armonizzata 
Globali dwar Sustanzi u Ta ħlitiet Kimi ċi.) Attività kon ġunta tal- 
OECD (is-sa ħħa umana u l-ambjent), il-Kumitat tan-NU ta' l- 
Esperti dwar it-Trasport ta' O ġġetti Perikolu żi (il-propjetajiet fi żiċi/­
kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni ta' periklu) u kordinata mill- 
Programm Interorganizzazzjonali g ħal Amministrazzjoni Soda tal- 
Kimika (IOMC).  
Mewt iminenti : Meta l-istat ta' moribond jew mewt ikun mistenni 
qabel il-ħin ta' l-osservazzjoni segwenti ippjanata. Sinjali indikattivi 
ta' dan l-istat f'annimali gerriema jistg ħu jinkludu konvul żjonijiet, 
posizzjoni laterali, mimduda, u roda. (Ara d-Dokument ta' Gwida 
dwar l-Umanita Immirata (8) g ħal aktar dettalji).  
LD 50 (doża letali medja):  Hija akkwistata b'mod statistiku minn 
doża waħda ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikka ġuna mewt 
f'50 fil-mija ta' l-annimali meta amministrati permezz tar-rotta orali. 
Il-valur LD  50 huwa espress f'termini ta' pi ż tas-sustanza tat-test g ħal 
kull unità tal-pi ż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).  
Limitu tad-do ża: Tirreferi g ħal doża fil-litu l-aktar g ħoli tagħha 
waqt it-testijiet (2 000 jew 5 000 mg/kg).  
L-istat moribondi : Huwa l-istat ta' qabel il-mewt jew ta' l-inabbiltà 
tas-sopravivenza, anki jekk ikun hemm trattament. (Ara d-Dokmunet 
ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).  
Mewt mistennija : Il-preżenza ta' sinjali klini ċi indikattivi tal-mewt fi 
żmien mistenni jew inkella fil- ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat 
ta' l-esperiment, per e żempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l- 
ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar 
aktar dettalji).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Gruppi ta' annimali ta' sess wie ħed huma mog ħtija doża fi proċedura 
mtarrġa bl-użu ta' dożi fissi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg (e ċċezzjon­
alment għal doża fissa addizzjonali ta' 5 000 mg/kg li tista’ tkun 
ikkonsidrata, ara s-sezzjoni 1.6.2.). Il-livell inizjali tad-do ża huwa 
magħżul fuq il-ba żi ta' l-istudju tas-sejbien b ħala d-doża mistennija 
li tipprodu ċi xi sinjali ta' tassi ċità mingħajr ma to ħloq l-effetti ta' 
tossiċità severa jew tal-mortalità. Is-sinjali klini ċi u l- kundizzjonijiet 
assoċjati ma l-u ġiegħ, sofferenza, u mewt iminenti, huma deskritti 
fid-dettall fi Gwida OECD separata, id-Dokument (8). L-annimali jistgħu jingħataw doża aktar g ħolja jew aktar baxxa, jiddependi 
mill-preżenza jew in-nuqqas ta' sinjali ta' tossi ċità jew mortalità. 
Din il-pro ċedura tin żamm sakemm id-do ża li toħloq tossi ċità 
evidenti jew ta' mewt wa ħda jew aktar, ikunu identifikati, jew 
meta l-ebda effetti ma jkunu jidhru fid-do ża l-aktar g ħolja jew 
meta l-imwiet ise ħħu fid-doża l-aktar baxxa.
 
1.4. ID–DESKRIZZJONI TAL–METODU TAT–TEST  
1.4.1.  L-g ħażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, g ħalkemm spe ċi 
oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun u żata. Normalment ikunu 
wżata il-femminili (7). Dan huwa min ħabba li list ħarriġ letterarju 
tat-testijiet konvenzjonali LD  50 juru li normalment ikun hemm ftit 
differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-ka żi meta d- 
differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn 
aktar sensittivi (10). B'dana kollu, jekk tag ħrif dwar il-propjetajiet 
tossikoloġiċi jew tossikineti ċi ta' kimi ċi strutturament relatati jindika 
li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess g ħandu 
jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni 
adekwata g ħandha tkun ipprovduta.  
Annimali żgħażagħ adulti u b'sa ħħithom tas-siltiet normalment u żati 
fil-laboratorju g ħandhom ikunu utilizzati. Il-femminili g ħandhom 
ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, 
fil-bidu ta' meta jkun sejjer jing ħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 
u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal- 
piż medju ta' dawk l-annimali li pre ċedentament ikun u ntu żaw għad- 
dożi. 
1.4.2.  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġeġ u ta' l-g ħalf 
It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 
22 o C (± 3  o C). Għalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill- 
anqas 30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it- 
tindif tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu 
jkun artifi ċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa 
dlam. G ħall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu 
ikunu użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L- 
annimali jistg ħu ikunu mi ġbura flimkien b ħala grupp skond id- 
doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull ga ġġa m'għandux ifixkel 
l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.  
1.4.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
L-animmali g ħandhom ikunu mag ħżula kif jinzerta, immarkati sabiex 
jippermettu identifikazzjoni individwali, u mi żmuma fil-ga ġġeġ 
tagħhom għal mill-anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-do żi sabiex 
jippermettu li jkunu akklamatti żati għall-kundizzjonijiet tal-labora ­
torju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Ġeneralment, is-sustanzi tat-test g ħandhom ikunu amministrati 
f'volum kostanti matul medda ta' do żi tat-testijiet bil-varjazzjoni 
tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-do żi. Meta, b'dana kollu, 
likwidu jew ta ħlita ikunu l-prodott finali, l-u żu ta' sustanza tat-test 
mingħajr trattib, i.e. kon ċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar 
relevanti g ħall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u 
hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe 
każ, il-volum massimu tad-do ża għall-amminsitrazzjoni m'g ħandux 
ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl- 
annimali gerriema, il-volum m'g ħandux normalment je ċċedi 
1ml/100g tal-pi ż tal-ġisem: b'dana kollu fil-ka ż ta' taħlitiet akweji, 
2 ml/100g tal-pi ż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal- 
formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-do ża, l-użu ta' ta ħlita/­
sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta 
possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-ta ħlita/sospenzjoni/ ­
emulsifikazzjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħ-ir- rum) u mbag ħad il- 
possibbiltà ta' likwidi o ħrajn. Għal likwidi o ħrajn apparti milli l- 
ilma, il- karatteristi ċ
i tossikolo ġiċi tal-likwidu g ħandhom ikunu 
magħrufa. Id-do żi għandhom ikunu ippreparati ftit qabel l-amminis ­
trazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun mag ħruha u turi li tkun a ċċettabbli.
 
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Amministrazzjoni tad-do żi 
Is-sustanza tat-tes hija somministrata f'do ża waħda b'mod sfurzat bl- 
użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F' ċir­
kostanzi mhux tas-soltu li fihom do ża waħda ma tkunx possibbli, id- 
doża tista’ ting ħata fi frazzjonijiet i żgħar matul perjodu li ma 
jeċċedix l-24 sieg ħa. 
L-annimali g ħandhom ikunu msajma qabel ma jing ħataw id-do ża (eż. 
għall-firien, l-ikel imma mhux ilma g ħandu jkun im ċaħħad għal ma 
tul il-lejl sal- ħin ta' l-esperiment; fil-ka ż ta' ġurdien, l-ikel imma 
mhux ilma g ħandu jkun im ċaħħad għal ma tul 3-4 sieg ħat). Wara 
l-perjodu tas-sawma, l-annimali g ħandhom ikunu mi żuna u s- 
sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun 
somministrata, l-ikel jista’ jkun im ċaħħad għal 3-4 sieg ħat oħra fil- 
każ tal-firien jew 1-2 sieg ħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-do ża tkun 
somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun 
meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi 
mit-tul tal-perjodu.  
1.5.2.  Studju ta' l-osservazzjoni  
L-iskop ta' l-istudju ta' l-osservazzjoni huwa li jippermetti l-g ħażla 
xierqa tad-do ża tal-bidu li tintu ża fl-istudju ewlieni. Is-sustanza tat- 
test hija somministrata lill-annimali singoli b'manjera sekwenzali 
skond il-karti tan-nixxija fl-Anness 1. L-istudju ta' l-osservazzjoni ikunu komplut meta d-de ċiżjoni dwar il-bidu tad-do ża għall-istudju 
ewlieni tkun tista’ tittie ħed (jew jekk il-mewt tkun apparenti fid-do ża 
l-baxxa kif stabbilita).
 
Id-doża tal-bidu g ħall-istudju ta' l-oisservazzjoni hija mag ħżulha 
minn livelli fissi ta' do żi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg b ħala doża 
mistennija li tipprodu ċi tossiċità evidenti ibba żata, meta possibbli, 
fuq evidenza mid-dettalji  In vivo  u In vitro  mill-istess kimika jew 
il-kimiċi ta' struttura relatata. Fin-nuqqas ta' tali informazzjoni, id- 
doża tal-bidu g ħandha tkun 3000 mg/kg.  
Perijodu ta' mill-anqas 24 sieg ħa għandu jkun im ħolli bejn l-g ħoti 
tad-doża lil kull annimal. L-annimali kollha g ħandhom ikunu 
osservati g ħal mil anqas 14-il jum.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
B'mod eċċezzjonali, u biss meta i ġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji 
speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel g ħoli ta' 5 000 
mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 3). G ħal raġunijiet li 
jikkonċernaw il- ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond 
GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skor ­
raġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm 
possibbiltà qawwija li r-ri żultati minn tali test ikollu relevanza 
diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-sa ħħa ta' l-annimali jew dik 
ambjentali.  
Fil-każi meta annimal ikun ittestjat fil-livell l-aktar baxx ta' do ża 
fissa (5 mg/kg) fl-istudju ta' l-osservazzjoni imut, il-pro ċeduira 
normali hija li jkun terminat l-istudju u li s-sustanza tkun assanjata għal-GHS, Kategorija 1 (kif muri fl-Anness 1). B'dana kollu, jekk 
aktar konferma tal-klassifika tkun me ħtieġa, proċedura supplementari 
voluntarja tista’ tkun imwettqa, kif ġej: It-tieni annimal ikunu mog ħti 
d-doża f’5 mg/kg. Jekk dan it-tieni annimal imut, allura il-Kategorija 
1 GHS tkun ikkonfermata u l-istudju jkun terminat immedjetament. Jekk it-tieni annimali jibqa ħaj, allura massimu ta' tlett annimali 
addizjnonali ikunu mogtoja d-do ża ta' 5 mg/kg. Min ħabba li jkun 
hemm riskju kbir ta' mortalità, dawn l-annimali g ħandhom ikunu 
mogjħtija d-doża b'mod sekwenzali sabiex ikun im ħares il-ġid ta' l- 
annimali. Fl-intervall ta' ħin bejn kull do ża għal kull annimal g ħandu 
jkun suffi ċjenti sabiex ikun stabbilit jekk l-annimal pre ċedenti jkunx 
sejjer jibqa ħaj. Jekk isse ħħ it-tieni mewt, is-sekwenza tad-do ża 
għandha tkun terminata immedjetament u l-ebda annimali o ħrajn 
ma jingħataw id-do ża. Minħabba l-okkorrenza tat-tieni mewt (irris ­
pettivemanet min-numru ta' l-annimali ittestjati fil-waqt tat- 
terminazzjoni) tid ħol fl-eżitu A (2 jew aktar imwiet), ir-regola tal- 
klassifika ta' l-Anness 2 fi 5 mg/kg do ża fissa tkun segwita (il- 
Kategorija 1 jew ikun hemm 2 jew aktar imwiet, jew il-Kategorija 
2 jekk ikun hemm mhux aktar minn mewt wa ħda). B'żieda, l-Anness 
4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida 
tkun implementata.  
1.5.3.  Studju ewlieni  
1.5.3.1.  Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-do żi 
L-azzjoni li g ħandha tittie ħed b'segwiment tat-testijiet fid-do ża tal- 
livell tal-bidu hija indikata fil-karti nixxija fl-Anness 2. Wa ħda mit- 
tlett azzjonijiet tkun me ħtieġa; jew li jieqfu t-testijiet u li tkun 
assenjata l-klassifikazzjoni tal-klassi tal-periklu xierqa, it-test f'do ża 
ta' livell g ħola jew test f'do ża f'livell aktar baxx. B'dana kollu, g ħall- 
protezzjoni ta' l-annimali, livell ta' do ża li jikkaġuna l-mewt fl-istudju 
ta' l-osservazzjoni m'g ħandhiex tkun u żata mill- ġdid fl-istudju 
ewlieni (ara l-Anness 2). L-esperjenza wriet li r-ri żultat probabbli 
fil-livell tad-do ża tal-bidu ikun dak li s-sustanza tista’ tkun klas ­
sifikata u li l-ebda aktar testijiet ma jkunu me ħtieġa. 
Total ta' ħames annimali ta' sess wie ħes ikun normalment u żat għal 
kull livell ta' do ża investigata. Il- ħames annimali g ħandhom ikunu 
magħmula minn annimal wie ħed mill-istudju ta' l-osservazzjoni li 
jkun ħa doża fil-livell mag ħżul flimkien ma erba annimali 
addizzjonali o ħrajn (apparti, ħaġa mhux tas-soltu, jekk il-livell tad- 
doża użat ma kienx inklu ż fl-istudju ta' l-osservazzjoni).  
L-intervall tal- ħin bejn id-do żi f'kull wie ħed mill-livelli huwa 
determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossi ċi. It-trat­
tament ta' l-annimali fid-do ża segwenti g ħandu jkun imdewwem 
sakemm wie ħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu 
ireċevew id-do ża preċedentament. Perijodu ta' minn 3 sa 4 ijiem bejn 
id-dożi f'kull livell huma rakkommandabbli, jekk ma ħtieġ, sabiex 
jippermetti g ħall-osservazzjoni tat-tossi ċità mdewma. L-intervall tal- 
ħin jista’ jkun a ġġustat kif xieraq, e ż. fil-każ ta' reazzjoni mhux 
konklussiva.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Meta l-użu tad-doża l-aktar g ħolja ta' 5 000 mg/kg ikun ikkonsidrat, 
il-proċedura kif elenkata fl-Appendi ċi 3 għandha tkun segwita (ara 
wkoll is-sezzjoni 1.6.2.).  
1.5.3.2.  Test tal-limitu  
It-test tal-limitu huwa primarjament u żat f'sitwazzjonijiet meta dak li 
jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat- 
test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossi ċita biss aktar mil-limitu 
regolatorju tad-do żi. L-informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-materjal 
tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tag ħrif dwar komposti simili li 
kienu ġew ittestjati jew minn ta ħlitiet jew prodotti simili li kienu 
ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persenta ġġ tal- 
komponenti mag ħrufa li huma ta' sinifikanza tossikolo ġika. F'dawk 
is-sitwazzjonijiet meta ftit jew l-ebda informazzjoni ma tkun 
disponibbli dwar it-tossi ċità tagħha, jew meta l-materjal tat-test 
ikun mistenni li huwa tossiku, it-test ewlieni g ħandu jkun imwettaq.  
Bl-użu tal-pro ċedura normali, studju ta' l-osservazzjoni li jibda 
b'doża ta' 2 000 mg/kg (jew b'mod e ċċezzjonali 5 000 mg/kg) 
segwit b'do ża fuq erba’ annimali o ħrajn f'dan il-livell iservi b ħala 
test tal-limitu g ħal din il-linja ta' gwida.  
1.6. OSSERVAZZJONIJIET  
L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel do ża mill-anqas 
darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 
siegħa, b'attenzjoni spe ċjali mogħtija matul l-ewwel 4 sieg ħat, u ta' 
kull minn hemm il-quddiem, g ħal total ta' 14-il jum, apparti minn 
meta jkun me ħtieġ li dawn jitne ħħew mill-istudju u li jkunu maqtula 
b'mod umanesk g ħal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella 
li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'g ħandhux 
ikun iffissat b'mod rigoru ż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni 
tossika, il- ħin ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ 
b'hekk ikun esti ż meta ikkonsidrat b ħala meħtieġ. Il-ħinijiet ta' meta 
jidhru jew jisparixxu s-sinjali tat-tossi ċità huma importanti, spe ċ­
jalment jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali tossi ċi jkunu 
mdewwma (11). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jin żammu għal kull annimal.
 
Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu me ħtieġa jekk l-annimali 
jkomplu juru sinjali ta' tossi ċità. L-osservazzjonijiet g ħandhom 
jinkludu xi tibdil fil- ġilda u s-suf, l-g ħajnejn, fil-membrani 
mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomi ċi u 
tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-im ġieba. 
Attenzjoni g ħandha tkun diretta g ħall-osservazzjonijiet ta' roda, 
konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letar ġija, irqad u koma. Il-prin ċipji u 
l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji g ħandhom ikunu ikkonsidrati (8). L-annimali misjuba 
f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' u ġieħ qawwi 
jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbg ħatija, għandhom ikunu maqtula 
b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula g ħal raġunijiet 
umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jkun 
reġistrat bi pre ċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.
 
1.6.1.  Piż tal-Ġisem  
Il-piżijiet ta' l-annimali individwali g ħandhom ikunu determinati 
kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill- anqas darba fil- ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-pi ż għandhom ikunu 
ikkalkolati u rre ġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqg ħu ħajjin 
għandhom ikunu mi żuna w imbag ħas maqtula b'mod umanitarju.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patolo ġija 
L-annimali kolha tat-test (inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li 
jkunu mne ħħija mill-istudju min ħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l- 
annimali) g ħandhom ikunu su ġġetti għal nekropsija ġenerali. It- 
tibdiliet patolo ġiċi ġenerali g ħandhom ikunu irre ġistrati għal kull 
annimal. E żaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza 
patoloġika ġenerali fl- annimali li jibqg ħu ħajjin għa 24 sieg ħa jew 
aktar wara li jkunu r ċevew id-do ża inizjali g ħandha wkoll tkun 
ikkunsidrata min ħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.  
2. DATA  
Data ta' l-annimal individwali g ħandha tkun ipprovduta. B' żieda ma 
dan, id-dettalji kollha g ħandhom ikunu mi ġbura f'sommarju, li juru 
għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali u żati, in-numru ta' 
annimali ji jkollhom sinjali ta' tossi ċità, in-numru ta' annimali li 
jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula g ħal raġunijiet 
umanitarji, il- ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u 
l-korsa tal- ħin ta' l-effetti tossi ċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s- 
sejbiet tan-nekropsija.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif 
xieraq:  
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika, il-purità, u meta relevanti, il-propjetajiet fi żiko- 
kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);  
— dettalji ta' l-identifikazzjoni, inklu ż in-numru CAS.  
Mezz (jekk applikabbli):  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz, jekk mhux sempli ċement 
ilma.  
Annimali tat-test:  
— speċi/tipi użati; 
— l-istatus mikrobiolo ġiku ta' l-annimali, meta mag ħruf; 
— in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklu żi, meta xieraq, ra ġor­
nament dwar l-u żu ta' maskili minflok femminili);  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, etc.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklu żi dettalji 
dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;  
— dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklu żi l- 
volumi tad-do żi u l-ħin ta' meta tkun ing ħata id-doża; 
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklu żi t-tip/sorsi 
tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);  
— ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Riżultati:  
— tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-do ża għal 
kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossi ċità, inklu żi l- 
effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);  
— tabulazzjoni tal-pi ż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jir ċievi d- 
doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil- ġimgħa, u il-ħin 
tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;  
— id-data u l- ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;  
— il-korsa tal- ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossi ċità u jekk 
dawn kienux riversibbli g ħal kull animal individwali;  
— is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, 
jekk disponibbli.  
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute 
toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of 
substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.
 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. 
Chem. Toxicol. 28, 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.
 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Stat ­
istical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.
 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 ġhttp://webnet1.oecd.org/ ­
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- 
no-24-no-0,FF.html ħ.
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
ANNESS 1  
FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU TA' OSSERVAZZJONI

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
ANNESS 2:  
FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU EWLIENI

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
ANNESS 3  
KRITERJI G ĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST 
B'VALURI MISTENNIJA TA’ LD  50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG 
MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA’ TESTIJIET  
Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija nti ża sabiex tiffa ċilita l-identifi ­
kazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta’ tossi ċità akuta 
baxxa imma li, skond ċerti ċirkustanzi jistg ħu jippreżentaw periklu g ħall-popu­
lazzjonijiet vulnerabbli. dawn is-sustanzi huma anti ċipati li jkollhom LD  50 orali 
jew tal-ġilda fil-medda ta’ 2 000-5 000 mg/kg jew b'do żi ekwivalenti g ħal rotot 
oħra. Is-sustanzi tat-test jistg ħu jkunu kklassifikati fil-kategorija tal-periklu 
definita bi: 2 000 mg/kg <LD  50 < 5 000 MG/KG (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn 
il-każi li ġejjin:  
a) jekk ikunu mi ġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta’ l- 
Anness 2, ibba żati fuq l-in ċidenti tal-mortalità;  
b) jekk evidenza affidabbli di ġà tkun disponibbli li tindika li l-LD  50 tkun fil- 
medda tal-valuri tal-Kategorija 5 jew li studji o ħrajn dwar l-annimali jew ta’ l- 
effetti tossi ċi fil-bnedmin umani jindikaw t ħassib għas-saħħa umana ta’ natura 
akuta;  
ċ) permezz ta’ estrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati g ħal 
klassi aktar perikolu ża milli mist ħoqq u  
— informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossi ċi sinifikanti fil- 
bnedmin, jew  
— xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir- 
rotta orali, jew  
— meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali klini ċi sinifikanti ta’ 
tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli g ħal 
dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew  
— meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabli tindika 
il-potenzjal g ħal effetti sinifikament akuti minn studji o ħrajn fuq l- 
annimali.  
TESTIJIET F'DO ŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG  
B'mod eċċezzjonali u biss meta ġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji spe ċifiċi, l-użu 
ta’ doża addizzjonali ffissata fil-livell l-g ħoli ta’ 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkun ­
sidrata. Bir-rikonoxximent tal- ħtieġa li jkun m ħares il-ġid ta’ l-annimali, testijiet 
fi 5 000 mg/kg huma skura ġġiti u għandhom biss ikunu kunsidrati meta jkun 
hemm possibiltà qawwija li r-ri żultati minn tali test ikollu relevanza diretta g ħall- 
ħarsien tas-sa ħħa ta’ l-annimali jew dik umana (9).  
Studju ta’ l-osservazzjoni  
Ir-regoli tad-de ċiżjoni li jirregolaw il-pro ċedura sekwenzjali ppre żentata fl- 
Anness 1 huma esti żi sabiex jinkludu l-livell ta’ do ża 5 000mg/kg. G ħalhekk, 
meta l-istudju ta’ l-osservazzjoni li jibda b'do ża ta’ 5 000 mg/kg ikun u żat, ir- 
riżultat A (mewt) ikun je ħtieġ it-tieni annimal li jkun ittestjat fi 2 000 mg/kg; ir- 
riżultat B u C (tossi ċità evidenti jew l-ebda tossi ċità) ikunu jippermettu l-g ħażla 
ta’ 5 000 mg/kg b ħala d-doża tal-bidu fl-istudju ewlieni. Bl-istess mod, jekk id- 
doża tal-bidu apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun u żata, allura t-test g ħandu 
jippreċedi għal 5 000 mg/kg fil-ka ż tar-riżultati B jew C fi 2 000 mg/kg; ir- 
riżultat A sussegwenti ta’ 5 000 mg/kg ikun jimponi studju ewlieni li jibda 
b'doża ta’ 2 000 mg/kg u r-ri żultati B u C ikunu jimponu studju ewlieni li 
jibda b'do ża ta’ 5 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Studju Ewlieni  
Ir-regoli tad-de ċiżjoni li jirregolaw il-pro ċedura sekwenzjali ppre żentata fl- 
Anness 2 huma esti żi sabiex jinkludu l-livell ta’ do ża 5 000 mg/kg. G ħalhekk, 
meta d-do ża ta’ l-istudju ewlieni li tibda bi 5 000 mg/kg tkun u żata, ir-riżultat 
A (≥ 2 imwiet) ikun je ħtieġ it-testijiet tat-tieni grupp fi 2 000 mg/kg; ir-ri żultat 
B (tossiċità evidenti u/jew ≤ mewt 1)jew C (l-ebda tossi ċità) ikun jirri żulta filli s- 
sustanza ma tkunx ikklassifikata skond il-GHS. L-istess, jekk id-do ża tal-bidu 
apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun u żata, allura t-test ikun jipro ċedi lejn il-5 000 
mg/kg fil-ka ż tar-riżultat C fi 2 000 mg/kg; ir-ri żultat A sussegwenti ta’ 5 000 
mg/kg ikun jirri żulta filli s-sustanza tkun assenjata g ħal GHS Kategorija 5 u r- 
riżultati B jew C ikunu jwasslu li s-sustanza ma tkunx ikklassifikata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
ANNESS 4  
METODU TAT-TEST B.1.  
bis Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu tran żitorju sat-tmiem s ħiħ ta' l-implimentazzjoni kollha tas-Sistema Armonizzata tal-Klassifika Globali (GHS) (me ħud 
mir-referenza (8))

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1TRIS.  TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL- 
KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalnti g ħal OECD TG 423 (2001)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Il-metodu tal-klassi tat-tossi ċità akuta (1) kif stabbilit f'dan it-test 
huwa l-pro ċedura sussegwenti ma l-u żu ta' 3 annimali ta' sess 
wieħed għal kull pass. Jiddependi mill-mortalità u/jew l-istat ta' 
modibondi li jkunu fih l-annimali, b ħala medja 2-3 passi jkunu 
meħtieġa sabiex jippermeti li jsir ġudizju dwar it-tossi ċità akuta 
tas-sustanza tat-test. Din il-pro ċedura hija riprodu ċibbli, tuża ftit 
annimali u hija kapa ċi li tiggrada sustanzi b'manjera simili g ħall- 
metodi l-o ħrajn tat-testijiet dwar it-tossi ċità akuta. Il-metodu tal- 
klassi tat-tossi ċità akuta huwa bba żat fuq evalwazzjonijiet biometri ċi 
(2) (3) (4) (5) b'do żi fissi, separati b'mod adekwat sabiex jippermettu 
li sustanza tkun iggradata g ħall-iskopijiet tal-klassifika u ta' l- 
assessjar tal-periklu. Il-metodu kif adottat fil-1996 kien ġie validat 
b'mod estensiv  in vivo  bi tqabbil mad-dettalji JD  50 akkwistati mil- 
letteratura, kemm nazzjonali (6) u dik internazzjonali (7).  
Gwida dwar l-g ħażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq g ħal skop 
partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwat it-Testijiet 
tat-Tossiċità Orali Akuta (8). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll 
informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal- metodu tat-test B. 1 tris.
 
Is-sustanzi tat-test, fid-do żi li huma mag ħrufa li jikka ġunaw uġiegħ 
qawwi u tbatija min ħabba l-azzjonijiet korrossivi jew severament 
irritanti, ma jistg ħux ikunu amministrati. Annimali fl-g ħafja tal- 
mewt, jew annimali avvjament bl-u ġiegħ jew li juru sinjali ta' 
tbagħtija qawwija g ħandhom ikun u maqtula b'mod umanitarju, u 
huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-ri żultati tat-test bl-istess mod 
bħal dawk l-annimali li jmutu matul it-test. Il-kriterja sabiex 
tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula l-annimali fl-g ħafja tal-mewt 
jew dawk li jkunu jbag ħtu ħafna, u l-gwida dwar ir-rikonoxximent ta' 
mewt mistennija jew prevista, huma s-su ġġett ta' Dokument ta' 
Gwida separat (9).  
Dan il-metodu jutilizza do żi definiti bil-quddiem u r-ri żultati 
jippermettu li sustanza tkun gradata u klassifikata skond is-Sistema 
Globali Armonizzata g ħall-klassifika ta' kimi ċi li jikka ġunaw 
tossiċità akuta (10).  
Bħala prinċipju, il-metodu mhux inti ż li jippermetti l-kalkolu ta' 
LD 50 preċiża, imma fil-fatt jipperemetti g ħad-determinazzjoni ta' 
medded ta' esposizzjoni definita meta l-letalità tkun mistennija 
minħabba li l-mewt ta' proporzjoni ta' l-annimali tkun xorta wa ħda 
l-għan finali ewlieni ta' dan it-test. Il-metodu jippermetti g ħad-deter­
minazzjoni tal-valur LD  50 biss meta mill-anqas żewġ dożi jirriżultaw 
f'mortalità g ħola minn 0 % u anqas minn 100 %. L-u żu ta' għażla ta' 
dożi definiti bil-quddiem, independentament mis-sustanza tat-test, 
bil-klassifika espli ċitament marbuta man-numri ta' l-annimali 
osservati f'diversi sitwazzjonijiet ittejjeb l-opportunità g ħar- 
rapurtaġġ ta' bejn laboratorju u laboratorju, b'konsistenza u repat ­
abbilità.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Il-laboratorju tat-test g ħandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli 
kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali 
informazzjoni g ħandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas- 
sustanza, il-propjetajiet fi żikokimiċi tagħha; ir-riżultat ta' xi testijiet 
oħrajn In vivo  jew in vitro  dwar is-sustanza; id-dettalji tossikolo ġiċi 
dwar is-sustanzi strutturament relatati; u l-u żu antiċipat tas-sustanza. 
Din l-informazzjhoni hija me ħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha 
ikkonċernati li t-test huwa relevanti g ħall-protezzjoni tas-sa ħħa 
umana u li jkun ta' g ħajnuna fl-g ħażla tad-do ża tal-bidu l-aktar 
xierqa.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Tossiċità akuta orali:  Tirreferi g ħal dawk l-effetti ħżiena li jse ħħu 
wara l-amministrazzjoni orali ta' do ża singola ta' sustanza jew ta' 
dożi multipli mog ħtija matul 24 sieg ħa. 
Mewt imdewma:  Tfisser li annimal ma jmutx u ma jkunx jidher 
f'għafja tal-mewt fi żmien 48 sieg ħa imma li jmut aktar tard matul il- 
perjodu ta' l-osservazzjoni ta' 14-il jum.  
Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-do ża 
hija espressa b ħala piż tas-sustanza tat-test g ħal kull unità tal-pi ż ta' 
l-annimal ittestjat (e ż. mg/kg).  
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures. Is-Sistema tal-Klassifika Globali Armon ­
izzata għal Sustanzi u Ta ħlitiet Kimi ċi. Attività kon ġunta tal-OECD 
(is-saħħa umana u l-ambjent), Il-Kumitat ta' Esperti tal-NU dwar it- 
Trasport ta' O ġġetti Perikolu żi (il-propjetajiet fi żiċi/kimiċi) u l-ILO 
(kommunikazzjoni perikolu ża) u l-kordinazzjoni mill-Programm 
Interorganizzazzjonali g ħal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika 
(IOMC).  
Imwiet imminenti:  Meta l-istat fl-g ħafja tal-mewt jew il-mewt ikunu 
mistennija qabel il- ħin ippjanat segwenti ta' l-osservazzjoni. Sinjali 
indikattivi g ħal dan l-istat f'annimali gerriema jistg ħu jinkludu 
konvulżjonijiet, posizzjoni ta' ser ħan fuq il- ġemb, mitluqa fuq 
darhom, u treg ħid (Ara d-Dokument ta' Gwida ta' l-G ħan Finali 
b'mod Umanitarju (9) g ħal aktar dettalji).  
LD 50 (doża orali medja ta' l-mwiet):  Hija doża akkwistata b'mod 
statistiku ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikka ġuna l-mewt fi 
50 fil-mija ta' l-annimali meta amminsitrata bir-rotta orali. Il-valur LD
 50 huwa espress f'termini ta' pi ż tas-sustanza tat-test g ħal kull 
unità piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).  
Doża b'limitu:  Tirreferi g ħad-doża fil-limitu l-aktar g ħoli tat-testijiet 
(2 000 jew 5 000 mg/kg).  
Stat moribund (fl-g ħafja tal-mewt):  Huwa l-istat li jwassal g ħall- 
mewt jew ta' nuqqas ta' kapa ċità għal ħajja, anki jekk ittrattat (ara d- 
Dokument ta' Gwida dwar it-Tmiem Finali b'mod Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).
 
Mewt mistennija:  Il-preżenza ta' sinjali klini ċi indikattivi tal-mewt fi 
żmien mistenni jew inkella fil- ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat 
ta' l-esperiment, per e żempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l- 
ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (9) dwar 
aktar dettalji).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
Huwa l-prin ċipju tat-test li, ibba żat fuq il-pro ċedura ta' pass b'pass, 
bl-użu ta' numru minimu ta' annimali kull pass, informazzjoni 
suffiċjenti tkun akkwista dwar it-tossi ċità akuta tas- sustanza tat- 
test sabiex tiffa ċilita l-klassifika tag ħha. Is-sustanza hija ammen ­
istrata b'mod orali fuq grupp ta' annimali esperimentali b'wa ħda 
mid-dożi definiti. Is-sustanza hija ittestjata bl-u żu tal-proċedura tal- 
pass b'pass, kull pass jutilizza tlett annimali ta' sess wie ħed (norm ­
alment nisa). In-nuqqas jew il-pre żenza ta' mortalità relatata mal- 
kompost ta' l-anniamli bid-do ża. Ta' l-ewwel pass tkun tiddetermina 
l-pass segwenti, i.e.:  
— l-ebda aktar testijiet ma jkunu me ħtieġa, 
— id-doża fuq tlett annimali, bl-istess do ża, 
— id-doża fuq tlett annimali addizzjonali fil-livell aktar g ħoli 
segwenti jew fil-livell aktar baxx pre ċedenti.  
Id-dettalji tal-pro ċedura tat-test huma deskritti fl-Anness I. Il-metodu 
ikun jiffa ċilita ġudizju fir-rigward tal-klassifika ta' sustanza tat-test 
lejn waħda mis-serje tal-klassijiet ta' tossi ċità definiti bil-valuri fissi 
LD-50 bħala waqfien.  
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.4.1.  L-g ħażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, g ħalkemm spe ċi 
oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun u żata. Normalment ikunu 
wżata il-femminili (9). Dan huwa min ħabba li list ħarriġ letterarju 
tat-testijiet konvenzjonali LD-50 juru li normalment ikun hemm ftit 
differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-ka żi meta d- 
differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn 
aktar sensittivi (11). B'dana kollu, jekk tag ħrif dwar il-propjetajiet 
tossikoloġiċi jew tossikineti ċi ta' kimi ċi strutturament relatati jindika 
li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess g ħandu 
jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni 
adekwata g ħandha tkun ipprovduta.  
Annimali żgħażagħ adulti u b'sa ħħithom tas-siltiet normalment u żati 
fil-laboratorju g ħandhom ikunu utilizzati. Il-femminili g ħandhom 
ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jing ħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 
u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal- 
piż medju ta' dawk l-annimali li pre ċedentament ikun u ntu żaw għad- 
dożi.
 
1.4.2.  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 
22 o C (± 3  o C). Għalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill- 
anqas 30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it- 
tindif tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu 
jkun artifi ċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa 
dlam. G ħall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu 
ikunu użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L- 
annimali jistg ħu ikunu mi ġbura flimkien b ħala grupp skond id- 
doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull ga ġġa m'għandux ifixkel 
l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
L-annimali g ħandhom ikunu mag ħżula kif jinzerta, immarkati sabiex 
jippermettu identifikazzjoni individwali, u mi żmuma fil-ga ġġeġ 
tagħhom għal mil anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-do żi sabiex 
jippermettu li jkunu akklamatti żati għall-kundizzjonijiet tal-labora ­
torju.  
1.4.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Ġeneralment, is-sustanzi tat-test g ħandhom ikunu amministrati 
f'volum kostanti matul medda ta' do żi tat-testijiet bil-varjazzjoni 
tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-do żi. Meta, b'dana kollu, 
likwidu jew ta ħlita ikunu l-prodott finali, l-u żu ta' sustanza tat-test 
mingħajr trattib, i.e. kon ċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar 
relevanti g ħall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u 
hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe 
każ, il-volum massimu tad-do ża għall-amminsitrazzjoni m'g ħandux 
ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat 
f'waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl- 
annimali gerriema, il-volum m'g ħandux normalment je ċċedi 
1ml/100g tal-pi ż tal-ġisem: b'dana kollu fil-ka ż ta' taħlitiet akweji, 
2 ml/100g tal-pi ż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal- 
formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-do ża, l-użu ta' ta ħlita/­
sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-ta ħlita/sospenzjoni/ ­
emulsifikazzjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħ-ir- rum) u mbag ħad il- 
possibbiltà ta' likwidi o ħrajn. Għal likwidi o ħrajn apparti milli l- 
ilma, il- karatteristi ċ
i tossikolo ġiċi tal-likwidu g ħandhom ikunu 
magħrufa. Id-do żi għandhom ikunu ppreparati ftit qabel l-amminis ­
trazzjoni, sakemm l-istabbiltà tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l- 
użu tkun mag ħrufa u turi li tkun a ċċettabbli.  
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Amministrazzjoni tad-do żi 
Is-sustanza tat-test hija somministrata f'do ża waħda b'mod sfurzat bl- 
użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F' ċir­
kostanzi mhux tas-soltu li fihom do ża waħda ma tkunx possibbli, id- 
doża tista’ ting ħata fi frazzjonijiet i żgħar matul perjodu li ma 
jeċċedix l-24 sieg ħa. 
L-annimali g ħandhom ikunu msajma qabel ma jing ħataw id-do ża (eż. 
għall-firien, l-ikel imma mhux ilma g ħandu jkun im ċaħħad għal ma 
tul il-lejl sal- ħin ta' l-esperiment; fil-ka ż ta' ġurdien, l-ikel imma 
mhux ilma g ħandu jkun im ċaħħad għal ma tul 3-4 sieg ħat). Wara 
l-perjodu tas-sawma, l-annimali g ħandhom ikunu mi żuna u s- 
sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun 
somministrata, l-ikel jista’ jkun im ċaħħad għal 3-4 sieg ħat oħra fil- 
każ tal-firien jew 1-2 sieg ħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-do ża tkun 
somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun 
meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi 
mit-tul tal-perjodu.  
1.5.2.  Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-do żi 
Tlett annimali huma u żati għal kull pass. Il-livell tad-do ża li għandu 
jkun użat bħala d-doża tal-bidu jkun mag ħżul minn wie ħed minn 
erba’ livelli fissi, 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg pi ż tal-ġisem. Il-livell 
tad-doża tal-bidu g ħandu jkun dak li jkun l-aktar probabbli li 
jipproduċi mortalità f'u ħud mill-animali li jkunu re ċevew id-do ża. 
Il-karti tan-nixxija ta' l-Anness 1 jiddeskrivu l-pro ċedura li 
għandha tkun segwita g ħal kull wa ħda mid-do żi tal-bidu. B' żieda, 
l-Anness 4 jag ħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm 
GHS ġdida tkun implementata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Meta l-informazzjoni disponibbli tissu ġġerixxi li l-lortalità pjuttost li 
ma sseħħx fl-għola livell tal-bidu (2 000 mg/kg pi ż tal-ġisem), allura 
test tal-limitu g ħandu jkun imwettaq. Meta ma jkunx hemm inform ­
azzjoni dwar xi sustanza li g ħandha tkun ittestjata, g ħal raġunijiet tal- 
ġid ta' l-annimali, huwa rakkommandabbli li jsir u żu minn do ża tal- 
bidu ta' 300 mg/kg pi ż tal-ġisem.  
L-intervall tal- ħin bejn id-do żi f'kull wie ħed mill-livelli huwa 
determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossi ċi. It-trat­
tament ta' l-annimali fid-do ża segwenti g ħandu jkun imdewwem 
sakemm wie ħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu 
ireċevew id-do ża preċedentament.  
B'mod eċċezzjonali, u biss meta i ġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji 
speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel g ħoli ta' 5 000 
mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 2). G ħal raġunijiet li 
jikkonċernaw il- ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond 
GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skor ­
raġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm 
possibbiltà qawwija li r-ri żultati minn tali test ikollu relevanza 
diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-sa ħħa ta' l-annimali jew dik 
ambjentali.  
1.5.3.  Test tal-limitu  
It-test tal-limitu huwa primarjament u żat f'sitwazzjonijiet meta dak li 
jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat- 
test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossi ċita biss aktar mil-limitu 
regolatorju tad-do żi. L-informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-materjal 
tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tag ħrif dwar komposti simili li 
kienu ġew ittestjati jew minn ta ħlitiet jew prodotti simili li kienu 
ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persenta ġġ tal- 
komponenti mag ħrufa li huma ta' sinifikanza tossikolo ġika. F'dawk 
is-sitwazzjonijiet meta jkun ftit jew l-ebda informazzjoni dwar. It- 
tossiċità tagħha, jew li fiha l-materjal tat-test ikun mistenni li 
jirriżulta tossiku, it-test ewlieni g ħandu jkun imwettaq.  
Test tal-limitu f'do ża waħda fil-livell ta' 2 000 mg/kg pi ż tal-ġisem 
jista’ jitwettaq fuq sitt annimali (tlett annimali kull pass). B'mod 
eċċezzjonali, test tal-limitu b'do ża waħda fil-livell ta' 5 000 mg/kg 
jista’ jkun imwettaq fuq tlett annimali (ara l-Anness 2). Jekk il- mortalità tat-test relatata mas-sustanza tirri żulta, aktar testijiet fil- 
livell pre ċedenti aktar baxx jista’ jkun hemm il- ħtieġa li jitwettqu.
 
1.6. OSSERVAZZJONIJIET  
L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel do ża mill-anqas 
darba matul l-ewwel 30 minuta, perjodikament matul l-ewwel 24 
siegħa, b'attenzjoni spe ċjali mogħtija matul l-ewwel 4 sieg ħat, u ta' 
kull minn hemm il-quddiem, g ħal total ta' 14-il jum, apparti minn 
meta jkun me ħtieġ li dawn jitne ħħew mill-istudju u li jkunu maqtula 
b'mod umanesk g ħal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella 
li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'g ħandhux 
ikun iffissat b'mod rigoru ż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni 
tossika, il- ħilata' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ 
b'hekk ikun esti ż meta ikkonsidrat b ħala meħtieġ. Il-ħinijiet li fihom 
is-sinjali tat-tassi ċità) jkunu apparaenti jew li jisparixxu huma. 
Importanti, spe ċjalment meta jkun hemm tendenza li s-sinjali 
tossiċi jkunu mdewma (12). L-osservazzjonijiet kollha huma siste ­
matista’ment irre ġistrati, b'dettalji individwali jkunu jin żammu għal 
kull annimal.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu me ħtieġa jekk l-annimali 
jkomplu juru sinjali ta' tossi ċità. L-osservazzjonijiet g ħandhom 
jinkludu xi tibdil fil- ġilda u s-suf, l-g ħajnejn, fil-membrani 
mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomi ċi u 
tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-im ġieba. 
Attenzjoni g ħandha tkun diretta g ħall-osservazzjonijiet ta' roda, 
konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letar ġija, irqad u koma. Il-prin ċipji u 
l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji g ħandhom ikunu ikkonsidrati (9). L-annimali misjuba 
f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' u ġieħ qawwi 
jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbg ħatija, għandhom ikunu maqtula 
b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula g ħal raġunijiet 
umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jkun 
reġistrat bi pre ċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.
 
1.6.1.  Piż tal-ġisem  
Il-piżijiet ta' l-annimali individwali g ħandhom ikunu determinati 
kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill- 
anqas darba fil- ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-pi ż għandhom ikunu 
ikkalkolati u rre ġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqg ħu ħajjin 
għandhom ikunu mi żuna w imbag ħas maqtula b'mod umanitarju.  
1.6.2.  Patolo ġija 
L-annimali kolha tat-test (inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li 
jkunu mne ħħija mill-istudju min ħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l- 
annimali g ħandhom ikunu su ġġetti għal nekropsija ġenerali. It- 
tibdiliet patolo ġiċi ġenerali g ħandhom ikunu irre ġistrati għal kull 
annimal. E żaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza 
patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqg ħu ħajjin għa 24 sieg ħa jew 
aktar wara li jkunu r ċevew id-do ża inizjali g ħandha wkoll tkun 
ikkunsidrata min ħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.  
2. DATA  
Data ta' l-annimal individwali g ħandha tkun ipprovduta. B' żieda ma 
dan, id-dettalji kollha g ħandhom ikunu mi ġbura f'sommarju, li juru 
għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali u żati, in-numru ta' 
annimali ji jkollhom sinjali ta' tossi ċità, in-numru ta' annimali li 
jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula g ħal raġunijiet 
umanitarji, il- ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u 
l-korsa tal- ħin ta' l-effetti tossi ċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s- 
sejbiet tan-nekropsija.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. Rapport tat-test  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif 
xieraq:  
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fi żiko- 
kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);  
— dettalji ta' l-identifikazzjoni, inklu ż in-numru CAS.  
Mezz (jekk applikabbli):  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz, jekk mhux sempli ċement 
ilma.  
Annimali tat-test:  
— speċi/tipi użati; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— l-istatus mikrobiolo ġiku ta' l-annimali, meta mag ħruf; 
— in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklu żi, meta xieraq, ra ġor­
nament dwar l-u żu ta' maskili minflok femminili);  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, etc.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklu żi dettalji 
dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;  
— dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklu żi l- 
volumi tad-do żi u l-ħin ta' meta tkun ing ħata d-doża; 
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklu żi t-tip/sorsi 
tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);  
— ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.  
Riżultati:  
— tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-do ża għal 
kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossi ċità, inklu żi l- 
effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);  
— tabulazzjoni tal-pi ż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jir ċievi d- 
doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil- ġimgħa, u l-ħin 
tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;  
— id-data u l- ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;  
— il-korsa tal- ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossi ċità u jekk 
dawn kienux riversibbli g ħal kull animal individwali;  
— is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, 
jekk disponibbli.  
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati.  
Konklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New 
Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. 
Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.  
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.  
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method 
– An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on 
Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http://webnet1.oecd. 
org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521- 14-no-24-no-0,FF.html).
 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
ANNESS 1  
PROĊEDURA LI G ĦANDHA TKUN SEGWITA G ĦAL KULL WA ĦDA 
MID-DO ŻI TAL-BIDU  
RIMARKI ĠENERALI  
Għal kull do ża tal-bidu, l-iskemi rispettivi tat-testijiet, kif inklu żi f'dan l-Anness, 
jelenkaw il-pro ċedura li g ħandha tkun segwita.  
— Anness 1 a: Id-do ża tal-bidu hija: 5 mg/kg pi ż tal-ġisem  
— Anness 1 b: Id-do ża tal-bidu hija: 50 mg/kg pi ż tal-ġisem  
— Anness 1 c: Id-do ża tal-bidu hija: 300 mg/kg pi ż tal-ġisem  
— Anness 1 d: Id-do ża tal-bidu hija: 2 000 mg/kg pi ż tal-ġisem  
Jiddependi min-numru ta' annimali maqtula b'mod umanitarju jew ta' l-annimali 
mejta, il-pro ċedura tat-test g ħandha ssegwi il-vle ġeġ indikati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
ANNESS 1A  
PROĊEDURA TAT-TEST B'DO ŻA TAL-BIDU TA' 5 MG/KG PI Ż TAL-ĠISEM

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
ANNESS 1B  
PROĊEDURA TAT-TEST B'DO ŻA TAL-BIDU TA' 50 MG/KG PI Ż TAL-ĠISEM

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
ANNESS 1C  
PROĊEDURA TAT-TEST B'DO ŻA TAL-BIDU TA' 300 MG/KG PI Ż TAL-ĠISEM

 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
ANNESS ID  
PROĊEDURA TAT-TEST B'DO ŻA TAL-BIDU TA' 2 000 MG/KG PI Ż TAL-ĠISEM

 ANNESS 2  
KRITERJA G ĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST 
B'VALURI MISTENNIJA TA' LD  50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG 
MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA'TESTIJIET  
Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija nti ża sabiex tiffa ċilita l-identifi ­
kazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta' tossi ċità akuta 
baxxa imma li, skond ċerti ċirkostanzi jistg ħu jippreżentaw periklu g ħall-popu­
lazzjonijiet vulnerabbli. Dawn is-sustanzi huma anti ċipati li jkollhom LD  50 orali 
jew tal-ġilda fil-medda ta' 2 000 - 5 000 mg/kg jew b'do żi ekwivalenti g ħal rotot 
oħrajn. Is-sustanzi tat-test jistg ħu ikunu klassifikati fil-kategorija tal-periklu 
definita bi: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn 
il-każi li ġejjin:  
a) jekk ikunu mi ġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta' l- 
Anness 2, ibba żati fuq l-in ċidenti tal-mortalità;  
b) jekk evidenza affidabbli di ġà tkun disponibbli li tindika li l-LD  50 tkun fil- 
medda tal-valuri tal-Kategorija 5; jew li studji o ħrajn dwar l-annimali jew ta' 
l-effetti tossi ċi fil-bnedmin umani jindikaw t ħassib għas-saħħa umana ta' 
natura akuta;  
c) permezz ta' extrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati g ħal 
klassi aktar perikolu ża milli mist ħoqq; u  
— informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossi ċi sinifikati fil- 
bnedmin, jew  
— xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir- 
rotta orali, jew  
— meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali klini ċi sinifikanti ta' 
tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli g ħal 
dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew  
— meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabbli 
tindika l-potenzjal g ħal effetti sinifikament akuti minn studji o ħrajn fuq 
l-annimali.  
TESTIJIET F'DO ŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG  
Bir-rikonoxximent tal- ħtieġa li jkun im ħares il-ġid ta' l-annimali, testijiet fi 5 000 
mg/kg huma skurra ġiti u għandhom biss ikunu kkunsidrati meta jkun hemm 
possibbiltà qawwija li r-ri żultati minn test b ħal dan ikollu relevanza diretta 
għall protezzjoni tas-sa ħħa ta' l-annimali jew dik umana (10). L-ebda aktar 
testijiet m'g ħandhom ikunu mwettqa fil-livelli tad-do żi aktar għoljin.  
Meta t-testijiet ikunu je ħtieġu doża ta' 5 000 mg/kg, il-pass wie ħed biss (i.e. tliet 
annimali) huwa me ħtieġ. Jekk l-ewwel annimal li jkun ing ħata d-doża, imut, 
allura l-g ħoti tad-do żi għandu jippro ċedi fi 2 000 mg/kg skond il- flow chart  fl- 
Anness 1. Jekk l-ewwel annimal jibqa' ħaj, żewġ annimali o ħrajn għandhom 
jingħataw id-do ża. Jekk wie ħed biss mit-tliet annimali jmut, il-valur LD  50 
huwa mistenni li je ċċedi 5 000 mg/kg. Jekk żewġ annimali jmut, allura d-do ża 
tipproċedi fi 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
ANNESS 3  
B1c. METODU TAT-TEST Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu 
transitorju sakemm ikun hemm l-implementazzjoni s ħiħa tas-Sistema ta' Klassifika 
Armonizzata Globali (GHS) (me ħuda minn referenza (8))
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. TOSSIĊITÀ TA’ INALAZZJONI AKUTA  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test 403 
(2009) tal-OECD (1). Il-Linja Gwida 403 (TG 403) tat-Test ori ġinali dwar 
l-inalazzjoni akuta kienet adottata fl-1981. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.2 
rivedut (b ħala ekwivalenti g ħat-TG 403 riveduta) tfassal biex ikun aktar 
flessibbli, biex inaqqas l-u żu tal-annimali, u biex jissodisfa ħtiġijiet regola ­
torji. Il-Metodu ta’ Ttestjar rivedut fih żewġ tipi ta’ studji: protokoll 
Tradizzjonali LC  50 u protokoll ta’ Kon ċentrazzjoni x Żmien (C × t). 
Karatteristi ċi primarji ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar huma l-kapa ċità li 
jipprovdi relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni-rispons b’firxa minn ri żultati mhux 
letali għal dawk letali sabiex jag]ti kon ċentrazzjoni letali medjana (LC  50 ), 
livell limitu ta’ kon ċentrazzjoni mhux letali (e ż. LC01), u angolu, u biex 
possibbilment jidentifika suxxettibbiltà sesswali. Il-Protokoll C × t g ħandu 
jintuża meta jkun hemm ħtieġa regolatorja jew xjentifika spe ċifika li ssejja ħ 
għall-ittestjar ta’ annimali tul durati multipli ta’ żmien, bħal għall-finijiet ta’ 
ppjanar ta’ rispons g ħal emerġenza [eż. li jidderivaw valuri ta’ Linji Gwida 
ta’ Livelli ta’ Espo żizzjoni Akuta (AEGL), Linji Gwida ta’ Ppjanar g ħal 
Rispons ta’ Emer ġenza (ERPG), jew Livelli Limiti ta’ Espo żizzjoni 
Akuta (AETL)], jew g ħal ippjanar ta’ u żu ta’ artijiet.  
2. Gwida dwar it-tmexxija u l-interpretazzjoni tal-istudji dwar dan il-Metodu 
ta’ Ttestjar tinsab fid-Dokument ta’ Gwida dwar l-Ittestjar tat-Tossi ċità ta’ 
Inalazzjoni Akuta (GD 39) (2).  
3. Id-definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar jinsabu 
fl-aħħar ta’ dan il-kapitolu u f’GD 39 (2).  
4. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jg ħin għal karatterizzazzjoni ta’ kimi ċi u 
l-valutazzjoni tar-riskju kwantitattiv, u jippermetti li l-kimi ċi għall-ittestjar 
ikunu ggradati u kklassifikati skont ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 (3). GD 39 (2) jipprovdi gwida g ħall-għażla tal-Metodu ta’ Ttestjar adattat g ħal 
ittestjar akut. Meta tkun me ħtieġa informazzjoni dwar klassifikazzjoni u 
tikkettar biss, ġeneralment huwa rrakkomandat il-kapitolu B.52 ta’ dan 
l-Anness (4) [ara GD 39 (2)]. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.2 mhux maħsub speċifikatament g ħall-ittestjar ta’ materjali spe ċjalizzati, b ħal 
materjali isometri ċi jew fibru żi li ftit jin ħallu jew nanomaterjali manifat ­
turati.
 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
5. Qabel ma jitqies l-ittestjar skont dan il-Metodu ta’ Ttestjar l-informazzjoni 
kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi studji e żistenti (eż. 
il-kapitolu B.52 ta’ dan l-Anness (4)) li d-dejta tag ħhom tkun tappo ġġa li ma 
jsirx ittestjar addizzjonali, g ħandhom jitqiesu mil-laboratorji tal-ittestjar biex 
ikun imminimizzat l-u żu tal-annimali. L-informazzjoni li tista’ tassisti 
fl-għażla tal-ispe ċi, razza, sess, mod ta’ espo żizzjoni u kon ċentrazzjonijiet 
ta’ testijiet l-aktar adatti tinkludi l-identità, l-istruttura tal-kimika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; ir-ri żultati ta’ 
kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew  in vivo ; l-użijiet mistennija u 
l-potenzjal g ħal espożizzjoni umana; id-dejta (Q)SAR disponibbli u d-dejta 
tossikoloġika dwar sustanzi strutturalment relatati [ara GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. L-ittestjar ta’ kimi ċi għall-ittestjar, korru żivi u/jew irritanti f’kon ċen­
trazzjonijiet li jkunu mistennija jikkaw żaw uġigħ sever u/jew diffikultà 
għandu jkun evitat kemm jista’ jkun possibbli. Il-potenzjal korrusiv/irritanti 
għandu jiġi evalwat skont ġudizzju espert bl-u żu ta’ evidenza b ħall- 
esperjenza tal-bniedem jew tal-annimali (e ż. minn studji ripetuti ta’ do żi li 
jitwettqu f’kon ċentrazzjonijiet mhux korrusivi/irritanti), dejta e żistenti  in 
vitro  (eż. mill-kapitoli B.40, (5), B.40bis (6) ta’ dan l-Anness jew OECD 
TG 435 (7)), il-valuri tal-pH, informazzjoni minn sustanzi simili jew kwalunkwe dejta pertinenti o ħra, għall-iskop ta’ investifazzjoni dwar jekk 
jista’ ma jsirx iktar ittestjar. G ħal ħtiġijiet regolatorji spe ċifiċi (eż. għal 
skopijiet ta’ ippjanar ta’ emer ġenza), dan il-Metodu ta’ Ttestjar jista’ 
jintuża biex l-annimali ji ġu esposti g ħal dawn il-materjali g ħaliex 
jipprovdi d-direttur jew l-investigatur prin ċipali tal-istudju li g ħandu 
kontroll fuq is-selezzjoni tal-kon ċentrazzjonijeit fil-mira. Madankollu, 
il-konċentrazzjonijiet immirati ma g ħandhomx ji ġġeneraw effetti ta’ irri ­
tazzjoni/korru żivi severi, i żda biżż
ejjed biex jestendu l-kurva ta’ kon ċen­
trazzjoni-rispons g ħal livelli li jil ħqu l-għan regolatorju u xjentifiku 
tat-test. Dawn il-kon ċnetrazzjonijiet g ħandhom jing ħażlu abbażi ta’ każ 
b’każ u għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-kon ċen­
trazzjoni [see GD 39 (2)].  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
7. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.2 rivedut tfassal biex tinkiseb informazzjoni 
suffiċjenti dwar it-tossi ċità akuta ta’ kimika g ħall-ittestjar biex tkun tista’ ti ġi 
kklassifikata u biex jipprovdi dejta dwar il-letalità (e ż. LC  50, LC 01 u 
l-angolu) g ħal wieħed jew għaż-żewġ sessi kif me ħtieġ għall-valutazzjonijiet 
tar-riskji kwantitattivi. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar joffri żewġ metodi. 
L-ewwel metodu huwa protokoll tradizzjonali li fih gruppi ta’ annimali jiġu esposti g ħal konċentrazzjoni limitata (test ta’ limitu) jew g ħal serje 
ta’ konċentrazzjonijiet fi pro ċedura pass pass g ħal durata predeterminata 
normalment 4 sig ħat. Jistgħu japplikaw durati o ħra ta’ espo żizzjoni biex 
jaqdu skopijiet regolatorji spe ċifiċi. It-tieni metodu (C × t) huwa protokoll 
li fih gruppi ta’ annimali jkunu esposti g ħal waħda (konċentrazzjoni limitata) 
jew għal serje ta’ kon ċentrazzjonijiet multipli matul durati multipli.
 
8. L-annimali moribondi jew annimali li ċarament huma mu ġugħa jew li jkunu 
qed juru sinjali ta’ diffikultà severa jew fit-tul g ħandhom jinqatlu b’mod 
uman u jitqiesu fl-interpretazzjoni tar-ri żultat tat-test bl-istess mod b ħall- 
annimali li jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterji g ħal teħid tad-de ċiżjoni li 
annimali moribondi jew li jkunu qed ibatu ħafna jinqatlu, u gwida dwar 
ir-rikonoxximent ta’ mewta prevedibbli jew imminenti, huma s-su ġġett ta’ 
Document ta’ Gwida Nru 19 tal-OECD dwar il-Punti tat-Tmiem b’Mod Uman (8).
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla tal-ispe ċijiet tal-annimali  
9. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li norm ­
alment jintu żaw fil-laboratorju. L-ispe ċi preferuta hija l-far u g ħandha 
tingħata ġustifikazzjoni jekk jintu żaw speċijiet oħra. 
Preparazzjoni tal-annimali  
10. In-nisa g ħandhom ikunu qatt ma welldu u m’g ħandhomx ikunu tqal. Fil-jum 
ta’ espożizzjoni, l-annimali g ħandhom ikunu adulti żgħażagħ ta’ bejn 8 u 
12-il ġimgħa, u li jkunu ji żnu madwar ± 20 % tal-pi ż medju g ħal kull sess 
ta’ kwalunkwe annimal pre ċedentament qabel tal-istess età. L-annimali 
jintgħazlu b’mod ka żwali u jkunu mmarkati g ħal identifikazzjoni individ ­
walment. L-annimali jin żammu fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-anqas 5 ijiem 
qabel ma jibda t-test biex jidraw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. L-annimali għandhom ikunu draw ukoll l-apparat tat-test g ħal perjodu qasir qabel 
l-ittestjar, min ħabba li dan inaqqas it-tensjoni kkaw żata bl-introduzzjoni 
għall-ambjent il- ġdid.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Trobbija tal-annimali  
11. It-temperatura tal-kamra ta’ manutenzjoni tal-annimali esperimentali 
għandha tkun 22 ± 3 °C. L-umdità relattiva g ħandha idealment tin żamm 
fil-firxa ta’ 30 % sa 70 %, g ħalkemm dan jista’ ma jkunx possibbli meta 
jintuża l-ilma b ħala vejjikolu. Qabel u wara l-espo żizzjonijiet, l-annimali 
ġeneralment g ħandhom jitqieg ħdu f’gaġġa fi gruppi skont is-sess u 
l-konċentrazzjoni, i żda l-għadd ta’ annimali g ħal kull ga ġġa m’għandux 
ifixkel l-osservazzjoni ċara ta’ kull annimal u g ħandu jimminimizza t-telf 
minħabba l-kannibali żmu u l-ġlied. Meta l-annimali jkollhom ikunu esposti 
mill-imnie ħer biss, jista’ jkun je ħtiġilhom jidraw it-tubi ta’ tra żżin. It-tubi ta’ 
trażżin m’għandhomx jimponu tensjoni fi żika, termali u ta’ immobiliz ­
zazzjoni bla b żonn fuq l-annimali. It-tra żżin jista’ jaffettwa punti ta’ 
tmiem fiżjoloġiċi bħat-temperatura tal- ġisem (ipertermja) u/jew volum respi ­
ratorju minusklu. Jekk tkun disponibbli dejta ġenerika li turi li l-ebda bidliet 
bħal dawn ma jse ħħu sa kwalunkwe limitu konsiderevoli, f’dak il-ka ż ma 
jkunx me ħtieġ adattament minn qabel g ħat-tubi ta’ tra żżin. L-annimali 
esposti mill- ġisem kollu g ħal aerosol g ħandhom jing ħalqu individwalment 
matul l-espo żizzjoni biex ma jit ħallewx jiffiltraw l-aerosol tat-test mal-pil ta’ 
sħabhom fil-ga ġġa. Jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali u ċċertifikati 
mil-laboratorju, ħlief matul l-espo żizzjoni, flimkien ma’ provvista bla 
limitu ta’ ilma tax-xorb muni ċipali. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, 
bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl/12-il sieg ħa dlam.  
Kmamar tal-inalazzjoni  
12. In-natura tal-kimika g ħall-ittestjar u l-g ħan tat-test g ħandhom jitqiesu 
fl-għażla tal-kamra tal-inalazzjoni. Il-mod preferut ta’ espo żizzjoni huwa 
mill-imnie ħer biss (liema fra żi tinkludi r-ras biss, l-imnie ħer biss jew 
il-geddum biss). Espo żizzjoni mill-imnie ħer biss hija ġeneralment ippre ­
feruta għal studji ta’ aerosols likwidi jew solidi u g ħal fwar li jista’ 
jikkondensa biex jifforma l-aerosols. G ħanijiet spe ċjali tal-istudju jistg ħu 
jinkisbu a ħjar billi tintu ża modalità ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu, i żda 
dan għandu jkun i ġġustifikat fir-rapport tal-istudju. Biex tkun żgurata 
stabbiltà tal-atmosfera meta tintu ża kamra g ħall-ġisem kollu, il-volum 
totali tal-annimali tat-test m’g ħandux ikun aktar minn 5 % tal-volum 
tal-kamra. Il-prin ċipji tat-tekniki tal-espo żizzjoni mill-imnie ħer biss u 
mill-ġisem kollu u tal-vanta ġġi u l-iżvantaġġi partikolari tag ħhom huma 
deskritti f’GD 39 (2).  
KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Amministrazzjoni ta’ kon ċentrazzjonijiet  
13. L-espo żizzjonijiet mill-imnie ħer biss jistg ħu jkunu ta’ kwalunkwe durata sa 
6 sigħat għall-firien. Jekk il- ġrieden ikunu esposti mill-imnie ħer biss, 
l-espożizzjonijiet ġeneralment m’g ħandhomx ikunu itwal minn 4 sig ħat. 
Għandha ting ħata ġustifikazzjoni jekk ikunu me ħtieġa studji li jdumu 
aktar [ara GD 39 (2)]. L-annimali esposti g ħall-aerosols fi kmamar g ħall- 
ġisem kollu g ħandhom jing ħalqu individwalment biex ma jit ħallewx jibilg ħu 
kimika g ħall-ittestjar min ħabba t-tindif ta’ s ħabhom fil-ga ġġa. M’għandux 
jingħata għalf matul il-perjodu ta’ espo żizzzjoni. Jista’ jing ħata ilma matul 
l-espożizzjoni kollha mill- ġisem kollu.  
14. L-annimali jkunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar b ħala gass, fwar, 
aerosol, jew ta ħlita tagħhom. L-istat fi żiku li jkollu ji ġi ttestjat jiddependi 
mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar, il-kon ċentrazzjoni 
magħżula, u/jew il-forma fi żika li x’aktarx tkun pre żenti matul 
l-immaniġġar u l-użu tal-kimika g ħall-ittestjar. Il-kimi ċi għall-ittestjar igros ­
kopiku u reattivi kimikament g ħandhom ikunu ttestjati f’kundizzjonijiet ta’ 
arja xotta. G ħandha ting ħata attenzjoni biex ikun evitat li jkunu ġġenerati 
konċentrazzjonijiet li jistg ħu jisplodu.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli 
15. It-teħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħall-aerosols kollha u g ħall-fwar 
li jista’ jikkondensa biex jifforma l-aerosols. Biex jit ħalla jkun hemm 
espożizzjoni tar-re ġjuni kollha rilevanti tas-sistema respiratorja, huma rrak ­
komandati aerosols b’dijametri ajrudinami ċi ta’ medja massa (MMAD) 
f’firxa minn 1 sa 4 μm b’devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ) fil-firxa ta’ 
1,5 sa 3,0 (2) (9) (10). G ħalkemm g ħandu jsir sforz ra ġonevoli biex dan 
l-istandard jintla ħaq, għandu jing ħata ġudizzju espert jekk ma jkunx jista’ 
jintlaħaq. Pereżempju, id-d ħaħen tal-metall jistg ħu jkunu anqas minn dan 
l-istandard, u l-parti ċelli, fibri u materjali igroskopi ċi mimlijin (li jikbru 
fid-daqs fl-ambjent niedi tas-sistema respiratorja) jistg ħu jaqbżu dan 
l-istandard.  
Preparazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar f’vejjikolu  
16. Jista’ jintu ża vejjikolu biex ji ġġenera kon ċentrazzjoni u daqs ta’ parti ċelli 
xierqa tal-kimika g ħall-ittestjar fl-atmosfera. B ħala regola, l-ilma g ħandu 
jingħata preferenza. Il-materjal tal-parti ċelli jista’ jkun so ġġett għal 
proċessi mekkani ċi biex tinkiseb id-distribuzzjoni tad-daqs me ħtieġ ta’ 
partiċelli, iżda, għandha ting ħata attenzjoni biex il-kimika g ħall-ittestjar 
ma tiddekomponix jew tinbidel. F’ka żijiet fejn pro ċessi mekkani ċi jitqiesu 
li jkunu bidlu l-kompo żizzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (e ż. temperaturi 
estremi minn t ħin eċċessiv min ħabba l-frizzjoni), il-kompo żizzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tkun ivverifikata b’mod analitiku. 
Għandha ting ħata attenzjoni adegwata biex il-kimika g ħall-ittestjar ma 
tkunx ikkontaminata. Mhux me ħtieġ li jkunu ttestjati materjali granulari li 
ma jiżżartux li jkunu fformulati apposta biex ma jkunux jistg ħu jittieħdu 
man-nifs. G ħandu jintu ża test ta’ attrizzjoni biex jintwera li parti ċelli li 
jistgħu jittieħdu man-nifs ma jkunux prodotti meta jintmiss il-materjal 
granulari. Jekk test ta’ attrizzjoni jipprodu ċi sustanzi li jistg ħu jittieħdu 
man-nifs, g ħandu jsir test g ħat-tossiċità tal-inalazzjoni.  
Annimali ta’ kontroll  
17. Mhux me ħtieġ grupp ta’ kontroll konkurrenti negattiv (arja). Meta vejjikolu, 
minbarra l-ilma, jintu ża biex jassisti fil- ġenerazzjoni tal-atmosfera tat-test, 
grupp ta’ kontroll ta’ vejjikoli g ħandu jintu ża biss meta ma tkunx 
disponibbli dejta storika ta’ te ħid ta’ tossi ċità man-nifs. Jekk studju dwar 
it-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar ifformulata f’vejjikolu ma juri ebda 
tossiċità, isegwi li l-vejjikolu ma jkunx tossiku fil-kon ċentrazzjoni ttestjata; 
għalhekk ma jkunx me ħtieġ kontroll ta’ vejjikolu.  
MONITORA ĠĠ TAL-KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Fluss tal-arja fil-kamra  
18. Il-fluss tal-arja mal-kamra g ħandu jkun ikkontrollat sewwa, immonitorjat 
kontinwament u rre ġistrat mill-anqas kull sieg ħa matul kull espo żizzjoni. 
Il-monitora ġġ ta’ konċentrazzjoni atmosferika tat-test (jew stabbiltà) huwa 
kejl integrali tal-parametri dinami ċi kollha u jipprovdi mezz indirett g ħall- 
kontroll tal-parametri dinami ċi rilevanti kollha tal- ġenerazzjoni tal-atmosfera. 
Għandha ting ħata konsiderazzjoni spe ċjali biex tkun evitata inalazzjoni 
mill-ġdid fi kmamar g ħall-imnieħer biss f’ka żijiet fejn fluss tal-arja 
mis-sistema ta’ espo żizzjoni ma jkunx adegwat biex jipprovdi fluss 
dinamiku ta’ atmosfera tal-kimika g ħall-ittestjar. Hemm metodolo ġiji 
preskritti li jistg ħu jintużaw biex jintwera li inalazzjoni mill- ġdid ma ssirx 
skont il-kundizzjonijiet operattivi mag ħżula (2) (11). Il-kon ċentrazzjoni 
tal-ossiġenu għandha tkun mill-anqas ta’ 19 % u l-kon ċentrazzjoni 
tad-dijossidu tal-karbonju m’g ħandhiex tkun aktar minn 1 %. Jekk ikun 
hemm raġuni biex wie ħed jemmen li dawn l-istandards ma jkunux jistg ħu 
jintlaħqu, il-kon ċentrazzjonijiet tal-ossi ġnu u tad-dijossidu tal-karbonju 
għandhom jitkejlu.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatura tal-kamra u umdità relattiva  
19. It-temperatura tal-kamra g ħandha tin żamm għal 22 ± 3 °C. L-umdità 
relattiva fi ż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs, g ħal espożizzjonijiet kemm 
mill-imnie ħer biss kif ukoll mill- ġisem kollu, g ħandha tkun immonitorjata u 
rreġistrata mill-anqas tliet darbiet g ħal durati sa 4 sig ħat, u kull sieg ħa għal 
durati iqsar. L-umdità relattiva g ħandha idealment tin żamm fil-firxa ta’ 
30 % sa 70 %, i żda din jew ma tkunx tista’ tintla ħaq (eż. meta jkunu 
ttestjati ta ħlitiet ibba żati fl-ilma) jew ma tkunx tista’ titkejjel min ħabba 
interferenza minn kimika g ħall-ittestjar mal-metodu tal-ittestjar.  
Kimika g ħall-ittestjar: Kon ċentrazzjoni nominali  
20. Kull meta jkun fattibbli, il-kon ċentrazzjoni nominal tal-kamra ta’ 
espożizzjoni g ħandha tkun ikkalkulata u rre ġistrata. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali hija l-massa ġġenerata ta’ kimika g ħall-ittestjar divi ża bil-volum 
totali ta’ arja li tkun g ħaddiet mis-sistema tal-kamra. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali ma tintu żax biex tikkaratterizza l-espo żizzjoni tal-annimali, i żda 
paragun tal-kon ċentrazzjoni nominali u l-kon ċentrazzjoni attwali jag ħti indi­
kazzjoni tal-effi ċjenza tal- ġenerazzjoni tas-sistema tal-ittestjar, u, g ħalhekk, 
jista’ jintu ża biex jiżvela problemi ta’ ġenerazzjoni.  
Kimika g ħall-ittestjar: Kon ċentrazzjoni attwali  
21. Il-kon ċentrazzjoni attwali hija l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fi ż- 
żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs f’kamra tal-inalazzjoni. 
Il-konċentrazzjonijiet attwali jistg ħu jinkisbu b’metodi spe ċifiċi (eż. teħid 
dirett ta’ kampjuni, metodi ta’ assorbiment jew kimi ċi reattivi u karatteriz ­
zazzjoni analitika sussegwenti) jew b’metodi mhux spe ċifiċi bħal analiżi 
gravimetrika b’filtru. L-u żu ta’ anali żi gravimetrika huwa a ċċettabbli biss 
għal aerosols tat-trab b’komponent wie ħed jew għal aerosols ta’ likwidi ta’ 
volatilità baxxa u g ħandu jkun appo ġġat minn karatterizzazzjonijiet adattati 
ta’ qabel l-istudju spe ċifiċi għal kimika g ħall-ittestjar. Il-kon ċentrazzjoni ta’ 
aerosols tat-trab b’ ħafna komponenti tista’ wkoll tkun iddeterminata 
b’analiżi gravimetrika. I żda din te ħtieġ dejta analitika li turi li 
l-kompożizzjoni tal-materjal fl-arja tkun simili g ħall-materjal tal-bidu. Jekk 
din l-informazzjoni ma tkunx disponibbli, tista’ tkun me ħtieġa analiżi 
mill-ġdid tal-kimika g ħall-ittestjar (idealment fl-istat tag ħha fl-arja) f’in ­
tervalli regolari waqt li jkun g ħaddej l-istudju. G ħal aġenti tal-aerosols li 
jistgħu jevaporaw jew jissubblimaw, g ħandu jintwera li l-fa żijiet kollha 
nġabru bil-metodu mag ħżul. Il-kon ċentrazzjonijiet immirati, nominali u 
attwali g ħandhom ikunu pprovduti fir-rapport tal-istudju, i żda fl-anali żi 
jintużaw biss kon ċentrazzjonijiet attwali ta’ statistika biex ikunu kkalkulati 
l-valuri ta’ kon ċentrazzjonijiet letali.  
22. Għandu jintu ża lott wie ħed tal-kimika g ħall-ittestjar, jekk ikun possibbli, u 
l-kampjun tat-test g ħandu jinħażen f’kundizzjonijiet li j żommu l-purezza, 
l-omoġeneità u l-istabbiltà tieg ħu. Qabel ma jinbeda l-istudju, g ħandu jkun 
hemm karatterizzazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu ża l-purezza tag ħha, 
u jekk teknikament fattibbli, l-identità u l-kwantitajiet ta’ kontaminanti u 
impuritajiet identifikati. Dan jista’ jintwera bid-dejta li ġejja, iżda ma jkunx 
limitat g ħaliha: ħin ta’ ritenzjoni u erja relattiva fl-og ħla livell, pi ż 
molekulari minn spettrometrija tal-massa jew minn anali żi kromatografika 
ta’ gass, jew minn stimi o ħra. Għalkemm l-identità tal-kampjun tat-test mhix 
ir-responsabbiltà tal-laboratorju tat-test, jista’ jkun prudenti g ħal-laboratorju 
tat-test li jikkonferma l-karatterizzazzjoni tal-isponser mill-anqas b’mod limitat (e ż. lewn, natura fi żika, eċċ.).
 
23. L-atmosfera ta’ espo żizzjoni g ħandha tin żamm kemm prattikabbilment 
kostanti u tkun immonitorjata kontinwament u/jew f’intervalli skont 
il-metodu ta’ anali żi. Meta jittie ħed kampjun f’intervalli, il-kampjuni 
tal-atmosfera tal-kamra g ħandhom jittie ħdu mill-anqas darbtejn g ħal studju 
ta’ erba’ sig ħat. Jekk dan ma jkunx jista’ jsir min ħabba rati limitati ta’ fluss 
ta’ arja jew kon ċentrazzjonijiet baxxi, jista’ jin ġabar kampjun wie ħed tul 
il-perjodu kollu ta’ espo żizzzjoni. Jekk ise ħħ ċaqliq minn kampjun g ħal ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
kampjun, il-kon ċentrazzjonijiet ittestjati li jkun imiss g ħandhom ju żaw erba’ 
kampjuni g ħal kull espo żizzjoni. Kampjuni individwali ta’ kon ċen­
trazzjonijiet tal-kamra m’g ħandhomx jiddevjaw mill-kon ċentrazzjoni medja 
b’aktar minn ± 10 % g ħall-gassijiet u l-fwar jew ± 20 % g ħal aerosols 
likwidi jew solidi. L-ekwilibrazzjoni ta’ ħin ma’ kamra (t  95 ) għandha tkun 
ikkalkulata u rre ġistrata. Id-durata ta’ espo żizzjoni tkopri l- ħin li fih 
il-kimika g ħall-ittestjar tkun i ġġenerata u din tqis il- ħinijiet me ħtieġa biex 
jinkiseb t  95 . Il-gwida g ħall-istima ta’ t  95 tinsab f’GD 39 (2).  
24. Għal taħlitiet kumplessi ħafna li jikkonsistu f’gassijiet/fwar, u aerosols (e ż. 
atmosferi ta’ kombustjoni u kimi ċi għall-ittestjar im ħaddmin minn 
prodotti/mezzi ta’ u żu finali b’g ħan speċifiku), kull fa żi tista’ ta ġixxi 
b’mod differenti f’kamra tal-inalazzjoni, g ħalhekk g ħandha tintg ħażel 
mill-anqas sustanza (analita) wa ħda bħala indikatur, normalment 
is-sustanza attiva prin ċipali fit-ta ħlita, ta’ kull fa żi (gass/fwar u aerosol). 
Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun ta ħlita, il-kon ċentrazzjoni analitika 
għandha tkun irrappurtata fir-rigward tat-ta ħlita u mhux biss g ħas-sustanza 
jew għall-komponent (analita). L-informazzjoni addizzjonali dwar 
il-konċentrazzjonijiet attwali tinsab f’GD 39 (2).  
Kimika g ħall-ittestjar: Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli 
25. Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli tal-aerosols g ħandha tkun iddeter ­
minata mill-anqas darbtejn matul kull espo żizzjoni ta’ 4 sig ħat billi jintu ża 
impattur kaskata jew strument alternattiv b ħall-għodda ajrudinamika li tag ħti 
d-daqs tal-parti ċelli. Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza tar-ri żultati 
miksubin minn impattur kaskata jew strument alternattiv, f’dak il-ka ż 
l-istrument alternattiv ikun jista’ jintu ża tul l-istudju kollu. It-tieni mezz, 
bħal filtru gravimetriku jew impinger/gas bubbler, g ħandu jintu ża b’mod 
parallell mal-istrument primarju biex jikkonferma l-effi ċjenza tal-istrument 
primarju fil- ġbir. Il-kon ċentrazzjoni tal-massa miksuba b’anali żi tad-daqs 
tal-partiċelli għandha tkun fil-limiti ra ġjonevoli tal-kon ċentrazzjoni 
tal-massa miksuba b’anali żi b’filtru [ara GD 39 (2)]. Jekk tkun tista’ 
tintwera ekwivalenza fil-fa żi bikrija tal-istudju, f’dak il-ka ż il-kejlijiet ta’ 
konferma ulterjuri jistg ħu jitħallew barra. G ħal raġunijiet ta’ trattament 
xieraq tal-annimali, g ħandhom jittie ħdu miżuri biex tkun imminimizzata 
dejta inkonklussiva li tista’ twassal g ħal ħtieġa ta’ ripetizzjoni ta’ 
espożizzjoni. It-te ħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħal fwar jekk ikun 
hemm xi possibbiltà li tista’ tirri żulta kondensazzjoni ta’ fwar 
fil-formazzjoni ta’ aerosol, jew jekk jinstabu parti ċelli f’atmosfera ta’ fwar 
b’potenzjal g ħal fażijiet imħallta (ara l-paragrafu 15).  
PROĊEDURA  
26. Żewġ tipi ta’ studji huma deskritti hawn ta ħt: il-protokoll Tradizzjonali u 
l-protokoll C × t. I ż-żewġ protokolli jistg ħu jinkludu studju ta’ osser ­
vazzjoni, studju ewlieni, u/jew test ta’ limitu (protokoll Tradizzjonali) jew 
ittestjar f’kon ċentrazzjoni limitata (C × t). Jekk ikun mag ħruf li wie ħed miż- 
żewġ sessi jkun aktar suxxettibbli, id-direttur tal-istudji jista’ jag ħżel li 
jwettaq dawn l-istudji billi ju ża biss is-sess suxxettibbli. Jekk spe ċijiet ta’ 
rodituri minbarra l-firien ikunu esposti mill-imnie ħer biss, il-perjodi massimi 
ta’ espożizzjoni jistg ħu jkunu a ġġustati biex titnaqqas diffikultà spe ċifika 
għal speċi partikolari. Qabel il-bidu, g ħandha titqies id-dejta kollha 
disponibbli biex l-u żu ta’ annimali jkun mill-anqas. Pere żempju, dejta 
ġġenerata bl-u żu tal-kapitolu B.52 ta’ dan l-Anness (4) tista’ telimina 
l-ħtieġa ta’ studju ta’ osservazzjoni, u tista’ wkoll turi jekk wie ħed miż- 
żewġ sessi jkunx aktar suxxettibbli [ara GD 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
PROTOKOLL TRADIZZJONALI  
Konsiderazzjonijiet ġenerali: Protokoll tradizzjonali  
27. Fi studju tradizzjonali, il-gruppi ta’ annimali jkunu esposti g ħal kimika 
għall-ittestjar g ħal perjodu fiss ta’ żmien (ġeneralment 4 sig ħat) f’kamra 
tal-espożizzjoni mill-imnie ħer biss jew mill- ġisem kollu. L-annimali jkunu 
esposti g ħal konċentrazzjoni limitata (test ta’ limitu), jew g ħal mill-anqas 
tliet konċentrazzjonijiet fi pro ċedura pass pass (studju ewlieni). Studju ta’ 
osservazzjoni jista’ ji ġi qabel studju ewlieni sakemm ma tkunx te żisti diġà 
xi informazzjoni dwar il-kimika g ħall-ittestjar, b ħal studju B.52 li jkun sar 
qabel [ara GD 39 (2)].  
Studju ta’ osservazzjoni: Protokoll tradizzjonali  
28. Studju ta’ osservazzjoni jintu ża biex tkun stmata l-qawwa ta’ kimika g ħall- 
ittestjar, biex ikunu identifikati d-differenzi sesswali fis-suxxettibbiltà, u biex 
jassisti fl-g ħażla ta’ livelli ta’ kon ċentrazzjoni ta’ espo żizzjoni għall-istudju 
ewlieni jew g ħat-test tal-limitu. Meta tkun qed issir l-g ħażla tal-livelli ta’ 
konċentrazzjoni g ħall-istudju ta’ osservazzjoni, g ħandha tintu ża 
l-informazzjoni kollha disponibbli, inklu ża dejta (Q)SAR u dejta g ħal 
kimiċi simili. M’g ħandhomx ikunu esposti aktar minn tliet ir ġiel u tliet 
nisa f’kull kon ċentrazzjoni (jista’ jkun hemm ħtieġa ta’ 3 annimali/sess 
biex tkun stabbilita d-differenza sesswali). Studju ta’ osservazzjoni jista’ 
jikkonsisti f’kon ċentrazzjoni wa ħda, iżda jistgħu jiġu ttestjati aktar kon ċen­
trazzjonijiet jekk ikun me ħtieġ. Studju ta’ osservazzjoni m’g ħandux jittestja 
tant annimali u kon ċentrazzjonijiet li jkun jixbah studju ewlieni. Jista’ 
jintuża studju B.52 li kien sar qabel (4) minflok studju ta’ osservazzjoni 
[ara GD 39 (2)].  
Test ta’ limitu: Protokoll tradizzjonali  
29. Test ta’ limitu jintu ża meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun mag ħrufa jew tkun 
mistennija li tkun prattikament mhux tossika, ji ġifieri li tislet rispons tossiku 
‘l fuq biss mill-kon ċentrazzjoni regolatorja tal-limitu. F’test ta’ limitu, grupp 
wieħed ta’ tliet ir ġiel u tliet nisa jkun espost g ħall-kimika g ħall-ittestjar 
f’konċentrazzjoni limitata. L-informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika 
għall-ittestjar tista’ tinkiseb minn tag ħrif dwar kimi ċi ttestjati bl-istess 
mod, filwaqt li jitqiesu l-identità u l-per ċentwali ta’ komponenti mag ħrufin 
li jkunu ta’ sinifikat tossikolo ġiku. F’dawk is-sitwazzjonijiet fejn ikun hemm 
ftit jew ebda informazzjoni dwar it-tossi ċità tagħha, jew fejn il-kimika g ħall- 
ittestjar hija mistennija li tkun tossika, g ħandu jsir it-test ewlieni.  
30. L-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet ta’ limitu normalment tiddependi minn 
rekwiżiti regolatorji. Meta jintu ża r-Regolament (KE) Nru 1272/2008, 
il-konċentrazzjonijiet ta’ limitu g ħall-gassijiet, il-fwar u l-aerosols jkunu 
ta’ 20 000 ppm, 20 mg/l u 5 mg/l, rispettivament (jew il-kon ċentrazzjoni 
massima li tista’ tinkiseb) (3). Tista’ tkun ta’ sfida teknika li jkunu ġġenerati 
konċentrazzjonijiet ta’ limitu ta’ xi kimi ċi għall-ittestjar, spe ċjalment b ħala 
fwar u aerosols. Meta jkunu ttestjati l-aerosols, l-g ħan primarju g ħandu jkun 
li jinkiseb daqs ta’ parti ċelli li jkun jista’ jitte ħed man-nifs (MMAD ta’ 1- 
4 μm). Dan huwa possibbli g ħal kważi l-kimiċi kollha g ħall-ittestjar f’kon ċ­
entrazzjoni ta’ 2 mg/l. L-ittestjar ta’ aerosols f’aktar minn 2 mg/l g ħandu 
jkun ittentat biss jekk ikun jista’ jinkiseb daqs ta’ parti ċelli li jkun jista’ 
jittieħed man-nifs [ara GD 39 (2)]. Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 
jiskuraġġixxi l-ittestjar li je ċċedi konċentrazzjoni limitata g ħal raġunijiet 
ta’ trattament xieraq tal-annimali (3). Il-kon ċentrazzjoni limitata g ħandha 
titqies biss meta jkun hemm probabbiltà kbira li ri żultati ta’ test b ħal dan 
ikun se jkollhom rilevanza diretta g ħall-protezzjoni tas-sa ħħa tal-bniedem 
(3), u ting ħata ġustifikazzjoni fir-rapport ta’ studju. Fil-ka ż ta’ kimi ċi 
għall-ittestjar potenzjalment esplo żivi, għandha ting ħata attenzjoni biex 
ikunu evitati kundizzjonijiet favorevoli g ħal splużjoni. Biex ikun evitat 
l-użu mhux me ħtieġ tal-annimali, g ħandu jsir test ta’ prova ming ħajr 
l-annimali qabel it-test ta’ limitu sabiex ikun żgurat li l-kundizzjonijiet 
tal-kamra g ħat-test ta’ limitu jkunu jistg ħu jinkisbu.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Jekk ikunu osservati mortalità jew annimali moribondi fil-kon ċentrazzjoni 
limitata, ir-ri żultati tat-test ta’ limitu jistg ħu jservu b ħala studju ta’ osser ­
vazzjoni g ħal ittestjar ulterjuri f’kon ċentrazzjonijiet o ħra (ara l-istudju 
ewlieni). Jekk il-proprjetajiet fi żiċi jew kimi ċi ta’ kimika g ħall-ittestjar 
jagħmluha impossibbli li tinkiseb kon ċentrazzjoni limitata, g ħandha tiġi 
ttestjata l-kon ċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb. Jekk ikun hemm 
anqas minn 50 % ta’ letalità fil-kon ċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb, 
ma jkunx me ħtieġ aktar ittestjar. Jekk il-kon ċentrazzjoni limitata ma’ kinitx 
tista’ tinkiseb, ir-rapport ta’ studju g ħandu jipprovdi spjegazzjoni u dejta ta’ 
sostenn. Jekk il-kon ċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb ta’ fwar ma tislitx 
tossiċità, jista’ jkun me ħtieġ li tkun i ġġenerata kimika g ħall-ittestjar b ħala 
aerosol likwidu.  
Studju ewlieni: Protokoll tradizzjonali  
32. Studju ewlieni tipikament isir billi jintu żaw ħames irġiel u ħames nisa (jew 
5 annimali tas-sess suxxettibbli, jekk ikun mag ħruf) għal kull livell ta’ 
konċentrazzjoni, b’mill-anqas tliet livelli ta’ kon ċentrazzjoni. G ħandhom 
jintużaw livelli suffi ċjenti ta’ kon ċentrazzjoni biex tinkiseb anali żi robusta 
tal-istatistika. L-intervall ta’ żmien bejn il-gruppi ta’ espo żizzjoni huwa 
determinat malli jfaqqg ħu s-sinjali tossi ċi, kemm idumu u s-severità 
tagħhom. L-espo żizzjoni tal-annimali fil-livell ta’ kon ċentrazzjoni li jkun 
imiss għandha tit ħalla għal aktar tard sakemm ikun hemm kunfidenza 
raġonevoli ta’ sopravivenza g ħall-annimali li jkunu ġew ittestjati qabel. 
Dan jippermetti lid-direttur tal-istudju ja ġġusta l-kon ċentrazzjoni mmirata 
għall-grupp ta’ espo żizzjoni li jkun imiss. Min ħabba d-dipendenza fuq 
teknoloġiji sofistikati, dan mhux dejjem jista’ jkun prattikabbli fi studji 
dwar l-inalazzjoni, g ħalhekk l-espo żizzjoni tal-annimali fil-livell ta’ kon ċen­
trazzjoni li jkun imiss g ħandha tkun ibba żata fuq esperjenza pre ċedenti u fuq 
ġudizzju xjentifiku. GD 39 (2) g ħandu jkun ikkonsultat meta jkunu ttestjati 
it-taħlitiet.  
PROTOKOLL TAL-KON ĊENTRAZZJONI X ĦIN (C × T)  
Konsiderazzjonijiet ġenerali: Protokoll C × t  
33. Studju C × t pass pass jista’ jitqies b ħala alternattiva g ħall-protokoll 
Tradizzjonali g ħall-valutazzjoni tat-tossi ċità tal-inalazzjoni (12) (13) (14). 
Dan l-appro ċċ jippermetti li l-annimali jkunu esposti g ħal kimika g ħall- 
ittestjar f’diversi livelli ta’ kon ċentrazzjoni u g ħal durati multipli ta’ 
żmien. L-ittestjar kollu jsir f’kamra g ħall-imnieħer biss (kmamar g ħall- 
ġisem kollu mhumiex pratti ċi għal dan il-protokoll). Dijagramma tal-fluss 
tagħti illustrazzjoni ta’ dan il-protokoll fl-Appendi ċi 1. Anali żi ta’ simu ­
lazzjoni wriet li l-protokoll Tradizzjonali u l-protokoll C × t it-tnejn huma 
kapaċi jrendu valuri robusti ta’ LC  50 , iżda l-protokoll C × t huwa 
ġeneralment a ħjar biex irendi valuri robusti ta’ LC  01 u LC  10 (15).  
34. Anali żi ta’ simulazzjoni wriet li l-u żu ta’ żewġ annimali g ħal kull intervall 
ta’ C × t (wie ħed għal kull sess billi jintu żaw iż-żewġ sessi, jew tnejn 
tas-sess l-aktar suxxettibbli) jista’ ġeneralment ikun adegwat meta jkunu 
ttestjati durati ta’ 4 kon ċentrazzjonijiet u 5 espo żizzjonijiet fi studju 
ewlieni. F’xi ċirkostanzi, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li juża żewġ 
firien għal kull sess g ħal kull intervall C × t (15). L-u żu ta’ 2 annimali 
għal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni u punt ta’ ħin jista’ jnaqqas 
il-parzjalità u l-varjabbiltà tal-istimi, i żid ir-rata ta’ su ċċess tal-istimi, u 
jtejjeb il-kopertura tal-intervall ta’ kunfidenza. I żda f’każ li dan ma jkunx 
suffiċjenti biex jaqbel e żatt mad-dejta g ħall-istima (meta jintu ża annimal 
wieħed għal kull sess jew żewġ annimali tas-sess l-aktar suxxettibbli) 
tista’ wkoll tkun bi żżejjed il-ħames (5) espo żizzjoni ta’ kon ċentrazzjoni. 
Gwida ulterjuri dwar l-g ħadd ta’ annimali u kon ċentrazzjonijiet li 
għandhom jintu żaw fi studju C × t tinsab f’GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Studju ta’ osservazzjoni: Protokoll C × t  
35. Studju ta’ osservazzjoni jintu ża biex tkun stmata l-qawwa ta’ kimika g ħall- 
ittestjar u biex jassisti fl-g ħażla tal-livelli ta’ kon ċentrazzjoni ta’ espo żizzjoni 
għall-istudju ewlieni. Jista’ jkun me ħtieġ studju ta’ osservazzjoni li ju ża sa 
tliet annimali/sess/kon ċentrazzjoni [g ħad-dettalji ara l-Appendi ċi III ta’ GD 
39 (2)] biex tintg ħażel il-kon ċentrazzjoni tal-bidu adattata g ħall-istudju 
ewlieni u biex ikun imminimizzat l-g ħadd ta’ annimali u żati. Jista’ jkun 
meħtieġ li jintu żaw tliet annimali g ħal kull sess biex tkun stabbilita 
differenza sesswali. Dawn l-annimali g ħandhom ikunu esposti g ħal durata 
waħda, ġeneralment ta’ 240 minuta. Il-fattibbiltà tal- ġenerazzjoni 
tal-atmosfera adegwata tat-testijiet g ħandha tkun ivvalutata matul testijiet 
tekniċi li jsiru qabel ming ħajr annimali. Ġeneralment ma jkunx me ħtieġ li 
jsir studju ta’ osservazzjoni jekk tkun disponibbli dejta tal-mortalità mill-istudju B.52 (4). Meta tkun qed issir l-g ħażla tal-kon ċentrazzjoni 
inizjali mmirata fl-istudju B.2, id-direttur tal-istudju g ħandu jqis ix-xejriet 
tal-mortalità osservati f’kull studju B.52 disponibbli (4) g ħaż-żewġ sessi u 
għ
all-konċentrazzjonijiet kollha ttestjati [ara GD 39 (2)].  
Konċentrazzjoni inizjali: Protokoll C × t  
36. Il-kon ċentrazzjoni inizjali (Sessjoni ta’ Espo żizzjoni I) (Appendi ċi 1) tkun 
konċentrazzjoni limitata jew kon ċentrazzjoni mag ħżula mid-direttur 
tal-istudju abba żi tal-istudju ta’ osservazzjoni. Il-gruppi ta’ annimal 
wieħed/sess wie ħed ikunu esposti g ħal din il-kon ċentrazzjoni g ħal durati 
multipli (e ż. 15, 30, 60, 120, jew 240 minuta), li jirri żultaw f’g ħadd totali 
ta’ 10 annimali (msej ħa s-Sessjoni ta’ Espo żizzjoni I) (Appendi ċi 1). 
37. L-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet limitati normalment tiddependi minn 
rekwiżiti regolatorji. Meta jintu ża r-Regolament (KE) Nru 1272/2008, 
il-konċentrazzjonijiet limitati g ħall-gassijiet, il-fwar u l-aerosols jkunu ta’ 
20 000 ppm, 20 mg/l u 5 mg/l, rispettivament (jew il-kon ċentrazzjoni 
massima li tista’ tinkiseb) (3). Tista’ tkun ta’ sfida teknika li jkunu 
ġġenerati kon ċentrazzjonijiet ta’ limitu ta’ xi kimi ċi għall-ittestjar, spe ċ­
jalment b ħala fwar u aerosols. Meta jkunu ttestjati l-aerosols, l-g ħan 
għandu jkun li jinkiseb daqs ta’ parti ċelli li jkun jista’ jittie ħed man-nifs 
(jiġifieri MMAD ta’ 1-4 μm) f’kon ċentrazzjoni limitata ta’ 2 mg/l. Dan 
huwa possibbli b’ ħafna mill-kimi ċi għall-ittestjar. L-ittestjar tal-aerosols 
f’aktar minn 2 mg/l g ħandu jkun ippruvat biss jekk ikun jista’ jinkiseb 
daqs ta’ parti ċelli li jkun jista’ jittie ħed man-nifs [ara GD 39 (2)]. 
Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 jiskura ġġixxi l-ittestjar li je ċċedi konċ­
entrazzjoni limitata g ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali (3). 
L-itestjar li je ċċedi l-konċentrazzjoni limitata g ħandu jitqies biss meta jkun 
hemm probabbiltà kbira li r-ri żultati ta’ test b ħal dan se jkollhom rilevanza 
diretta għall-protezzjoni tas-sa ħħa tal-bniedem (3), u g ħandha ting ħata 
ġustifikazzjoni fir-rapport ta’ studju. Fil-ka ż ta’ kimiċi għall-ittestjar potenz ­
jalment esplo żivi, għandha ting ħata attenzjoni biex ikunu evitati 
kundizzjonijiet favorevoli g ħal splużjoni. Biex ikun evitat l-u żu mhux 
meħtieġ tal-annimali, g ħandha titwettaq e żekuzzjoni tat-test ming ħajr 
annimali qabel l-ittestjar fil-kon ċentrazzjoni inizjali biex ikun żgurat li 
l-kundizzjonijiet tal-kamra g ħal din il-kon ċentrazzjoni jkunu jistg ħu jinkisbu.  
38. Jekk ikunu osservati mortalità jew annimali moribondi fil-kon ċentrazzjoni 
inizjali, ir-ri żultati f’din il-kon ċentrazzjoni jistg ħu jservu b ħala punt tat-tluq 
għall-ittestjar ulterjuri f’kon ċentrazzjonijiet o ħra (ara l-istudju ewlieni). Meta 
l-proprjetajiet fi żiċi jew kimi ċi ta’ kimika g ħall-ittestjar jag ħmluha impos ­
sibbli li tinkiseb kon ċentrazzjoni limitata, il-kon ċentrazzjoni massima li tista’ 
tinkiseb g ħandha tiġi ttestjata. Jekk ikun hemm anqas minn 50 % ta’ letalità 
fil-konċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb, ma jkunx me ħtieġ aktar 
ittestjar. Jekk il-kon ċentrazzjoni limitata ma’ kinitx tista’ tinkiseb, 
ir-rapport ta’ studju g ħandu jipprovdi spjegazzjoni u dejta ta’ sostenn. 
Jekk il-kon ċentrazzjoni massima li tista’ tinkiseb ta’ fwar ma tislitx tossi ċità, 
jista’ jkun me ħtieġ li tkun i ġġenerata kimika g ħall-ittestjar b ħala aerosol 
likwidu.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Studju ewlieni: Protokoll C × t  
39. Il-kon ċentrazzjoni inizjali (Sessjoni ta’ Espo żizzjoni I) (Appendi ċi 1) 
ittestjata fl-istudju ewlieni tkun kon ċentrazzjoni limitata jew kon ċentrazzjoni 
magħżula mid-direttur tal-istudju abba żi tal-istudju ta’ osservazzjoni. Jekk 
tqkun ġiet osservata mortalità matul jew wara s-Sessjoni ta’ Espo żizzjoni I, 
l-espożizzjoni minima (C × t) li tirri żulta f’mortalità tittie ħed bħala gwida 
biex tkun stabbilità l-kon ċentrazzjoni u l-perjodi ta’ espo żizzjoni g ħas- 
Sessjoni ta’ Espo żizzjoni II. Kull Sessjoni ta’ Espo żizzjoni sussegwenti 
tkun tiddependi mis-sessjoni ta’ qabel (ara l-Appendi ċi 1). 
40. Għal ħafna kimi ċi għall-ittestjar ir-ri żultati miksubin fil-kon ċentrazzjoni 
inizjali, flimkien ma’ tliet sessjonijiet ta’ espo żizzjoni addizzjonali b’dis ­
tribuzzjoni anqas ta’ ħin (jiġifieri l-ispazjar ġeometriku ta’ perjodi ta’ 
espożizzzjoni kif indikat mill-fattur bejn perjodi su ċċessivi, ġeneralment 
√2), għandhom ikunu suffi ċjenti biex tkun stabbilita r-relazzjoni ta’ 
mortalità C × t (15), i żda jista’ jkun hemm xi benefi ċċju għall-użu ta’ 
ħames (5) kon ċentrazzjoni ta’ espo żizzjoni [ara l-Appendi ċi 1 u GD 39 
(2)]. Għal trattament matematiku tar-ri żultati għall-protokoll C × t, ara 
l-Appendi ċi 1. 
OSSERVAZZJONIJIET  
41. L-annimali g ħandhom ikunu osservati klinikament sikwit matul il-perjodu 
ta’ espożizzzjoni. Wara espo żizzjoni, l-osservazzjonijiet klini ċi għandhom 
isiru mill-anqas darbtejn fil-jum tal-espo żizzjoni jew aktar sikwit meta 
indikat mir-rispons tal-annimali g ħat-trattament, u mill-anqas darba kuljum 
minn hemm ‘il quddiem g ħal total ta’ 14-il jum. It-tul tal-perjodu ta’ osser ­
vazzjoni ma jkunx iffissat, i żda għandu jkun iddeterminat min-natura u mi ż- 
żmien meta jfaqqg ħu s-sinjali klini ċi u mit-tul tal-perjodu ta’ rkupru. 
Id-drabi li fihom jidhru u jg ħibu s-sinjali ta’ tossi ċità huma importanti, 
l-aktar jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali ta’ tossi ċità jdumu ma jidhru. 
L-osservazzjonijiet kollha ji ġu rreġistrati sistematikament b’re ġistri individ ­
walment mi żmumin għal kull annimal. L-annimali li jinstabu li jkunu f’kon ­
dizzjoni moribonda u annimali li juru u ġigħ sever u/jew sinjali li jdumu ta’ 
diffikultà g ħandhom jinqatlu b’mod uman g ħal raġunijiet ta’ trattament 
xieraq tal-annimali. G ħandha ting ħata attenzjoni meta jsiru e żamijiet g ħal 
sinjali klini ċi ta’ tossi ċità biex meta jidhru ftit g ħall-bidu u jkun hemm 
bidliet respiratorji li jg ħaddu malajr, li ji ġu minn pro ċedura ta’ espo żizzjoni, 
wieħed ma ji ħux żball u ja ħsibhom tossi ċità relatata ma’ kimika g ħall- 
ittestjar li tkun te ħtieġ il-qtil prematur tal-annimali. G ħandhom jitqiesu 
l-prinċipji u l-kriterji sommarji fid-Dokument ta’ Gwida dwar il-Punti ta’ 
Tmiem b’Mod Uman (GD 19) (7). Meta l-annimali jinqatlu g ħal raġunijiet 
umani jew jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jiġi rreġistrat b’mod pre ċiż 
kemm jista’ jkun.  
42. L-osservazzjonijiet mal- ġenb tal-ga ġġa għandhom jinkludu bidliet fil- ġilda u 
l-pil, l-għajnejn u l-membrani muku żi, u wkoll fis-sistema respiratorja, 
ċirkulatorja, awtonomika u nervu ża ċentrali, u fl-attività somatomotorja u 
x-xejriet ta’ m ġiba. Meta jkun possibbli, g ħandha tkun innotata kull divrenz ­
jazzjoni bejn l-effetti lokali u sistemi ċi. L-attenzjoni g ħandha tkun diretta 
għal osservazzjonijiet ta’ treg ħid, konvul żjonijiet, tbe żliq, dijarea, letar ġija, 
irqad u koma. Il-kejl tat-temperatura tar-rektum jista’ jipprovdi evidenza li ssostni bradipnea riflessa jew ipo/ipertermja relatati mat-trattament jew 
l-għeluq.
 
Piżijiet tal-ġisem  
43. Il-piżijiet individwali ta’ kull annimal g ħandhom ji ġu rreġistrati darba matul 
il-perjodu ta’ akklimatazzjoni, fil-jum ta’ espo żizzjoni qabel l-espo żizzjoni 
(jum 0), u mill-anqas fil-jiem 1, 3 u 7 (u kull ġimgħa minn hemm ‘il 
quddiem), u fil- ħin tal-mewt jew ewtanasja jekk jaqb żu l-ewwel (1) jum. 
Il-piż tal-ġisem huwa rikonoxxut b ħala indikatur kritiku tat-tossi ċità, 
għalhekk annimali li juru tnaqqis sostnut ta’ > 20 %, meta mqabbel ma’ 
valuri ta’ qabel l-istudju, g ħandhom ikunu mmonitorjati mill-qrib. 
L-annimali li jibqg ħu ħajjin jinti żnu u jinqatlu b’mod uman fi tmiem 
il-perjodu ta’ wara l-espo żizzjoni.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patoloġija 
44. L-annimali kollha tat-test, inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li jinqatlu 
bl-ewtanasja u jitne ħħew mill-istudju g ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq 
tal-annimali, g ħandhom ikunu so ġġetti għal awtopsja makroskopika. Jekk 
ma tkunx tista’ ssir l-awtopsja minnufih wara li jkun instab annimal mejjet, 
l-annimal g ħandu jitkessa ħ (mhux iffri żat) f’temperaturi baxxi bi żżejjed biex 
tkun imminimizzata l-awtoli żi. L-awtopsji g ħandhom isiru malajr kemm 
jista’ jkun, normalment f’jum jew tnejn. Il-bidliet patolo ġiċi makroskopi ċi 
kollha għandhom ji ġu rreġistrati għal kull annimal b’attenzjoni partikolari 
għal kull bidla fis-sistema respiratorja.  
45. L-eżamijiet addizzjonali inklu żi a priori dawk imfasslin apposta jistg ħu 
jitqiesu li jestendu l-valur interpretattiv tal-istudju, b ħall-kejl tal-pi ż 
tal-pulmun ta’ firien li jkunu baqg ħu ħajjin, u/jew li jipprovdu evidenza 
ta’ irritazzjoni b’e żami mikroskopiku tas-sistema respiratorja. L-organi 
eżaminati jistg ħu jinkludu wkoll dawk li juru evidenza ta’ patolo ġija 
makroskopika f’annimali li jibqg ħu jgħixu għal 24 sieg ħa jew aktar, u 
organi mag ħrufin jew mistennija li jkunu affettwati. L-e żami mikroskopiku 
tas-sistema respiratorja kollha jista’ jipprovdi informazzjoni utli dwar kimi ċi 
għall-ittestjar li huma reattivi mal-ilma, b ħal aċidi u kimi ċi igroskopi ċi għall- 
ittestjar.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
46. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwali fir-rigward 
tal-piżijiet tal- ġisem u s-sejbiet mill-awtopsji. Id-dejta dwar 
l-osservazzjonijiet klini ċi għandha tin ġabar fil-qosor f’forma tabulari, li 
turi għal kull grupp tat-test l-g ħadd ta’ annimali u żati, l-għadd ta’ 
annimali li jkunu wrew sinjali spe ċifiċi ta’ tossi ċità, l-għadd ta’ annimali 
li jkunu nstabu mejta matul it-test jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani, 
il-ħin tal-mewt ta’ annimali individwali, deskrizzjoni u kemm jie ħdu żmien 
l-effetti tossi ċi u r-riversibbiltà, u s-sejbiet mill-awtopsji.  
Rapport tat-test  
47. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skont il-ka ż: 
Annimali tat-test u trobbija  
— Deskrizzjoni tal-kundizzjonijiet tal-ga ġġa, inkluż: l-għadd (jew bidla 
fl-għadd) tal-annimali g ħal kull ga ġġa, il-materjal g ħall-irqad, 
it-temperatura ambjentali u l-umdità relattiva, il-fotoperjodu u identifi ­
kazzjoni tad-dieta;  
— Speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-użu ta’ spe ċi minbarra l-far;  
— Għadd, età u sess tal-annimali;  
— Metodu ta’ ka żwalità;  
— Dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu ż tip ta’ dieta/sors, sors 
tal-ilma);  
— Deskrizzjoni ta’ kull kondizzjonament qabel it-test, inklu żi dieta, kwar ­
antina u trattament g ħall-mard;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Kimika g ħall-ittestjar  
— Natura fi żika, purezza u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi 
(inkluża l-isomerizzazzjoni);  
— Dejta ta’ identifikazzjoni u n-Numru tar-Re ġistru tal-Chemical Abstract 
Services (CAS), jekk ikunu mag ħrufa;  
Vejjikolu  
— Ġustifikazzjoni g ħal użu ta’ vejjikolu u ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ 
vejjikolu (jekk ma jkunx ilma);  
— Dejta storika jew konkurrenti li turi li l-vejjikolu ma jfixkilx ir-ri żultat 
tal-istudju;  
Kamra tal-inalazzjoni  
— Deskrizzjoni tal-kamra tal-inalazzjoni inklu żi d-dimensjonijiet u l-volum;  
— Sors u deskrizzjoni tat-tag ħmir użat għall-espożizzjoni tal-annimali kif 
ukoll għall-ġenerazzjoni tal-atmosfera;  
— Tagħmir għall-kejl tat-temperatura, umdità, daqs tal-parti ċelli u kon ċen­
trazzjoni attwali;  
— Sors tal-arja u trattament tal-arja pprovduta/estratta u sistema u żata għal 
kondizzjonament;  
— Metodi u żati għall-kalibrazzjoni tat-tag ħmir biex tkun żgurata atmosfera 
omoġenea tat-test;  
— Differenza ta’ pressjoni (po żittiva jew negattiva);  
— Portijiet ta’ espo żizzjoni g ħal kull kamra (imnie ħer biss); tqeg ħid 
tal-annimali fis-sistema (il- ġisem kollu);  
— Omoġeneità/stabbiltà temporali tal-atmosfera tat-test;  
— Post tas-sensuri tat-temperatura u tal-umdità u te ħid ta’ kampjuni 
tal-atmosfera tat-test fil-kamra;  
— Rati tal-fluss tal-arja, rata tal-fluss tal-arja/port ta’ espo żizzjoni (imnie ħer 
biss), jew toqol tal-annimali/kamra (il- ġisem kollu);  
— Informazzjoni dwar it-tag ħmir użat għall-kejl tal-ossi ġenu u tad-dijossidu 
tal-karbonju, jekk applikabbli;  
— Ħin meħtieġ biex jintla ħaq ekwilibriju tal-kamra tal-inalazzjoni (t  95 ) 
— Għadd ta’ bidliet fil-volum kull sieg ħa; 
— Apparati ta’ metra ġġ (jekk applikabbli);  
Dejta ta’ espo żizzjoni  
— Motiv g ħal għażla ta’ kon ċentrazzjoni mmirata fl-istudju ewlieni;  
— Konċentrazzjonijiet nominali (massa totali tal-kimika g ħall-ittestjar 
iġġenerata g ħal ġol-kamra tal-inalazzjoni divi ża bil-volum ta’ arja li 
tkun għaddiet mill-kamra);  
— Konċentrazzjonijiet attwali tal-kimika g ħall-ittestjar mi ġbura miż-żona 
tal-inalazzjoni tal-annimali; g ħal taħlitiet li jipprodu ċu forom fi żiċi 
eteroġenji (gassijiet, fwar, aerosols); kull wa ħda tista’ tkun analizzata 
separatament;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— Il-kon ċentrazzjonijiet kollha tal-arja g ħandhom ikunu rrappurtati f’uni ­
tajiet ta’ massa (e ż. mg/l, mg/m  3 , eċċ.); unitajiet ta’ volum (e ż. ppm, 
ppb, eċċ.) jistgħu wkoll ikunu rrappurtati f’parente żi; 
— Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli, dijametru ajrudinamiku ta’ medja 
tal-massa (MMAD), u devjazzjoni ġeometrika standard ( σg), inklu ż 
il-metodi ta’ kalkulazzjoni tag ħhom. Għandha tkun irrappurtata anali żi 
waħda għal kull daqs ta’ parti ċelli; 
Kundizzjonijiet tat-test  
— Dettalji tal-preparazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi dettalji ta’ 
kwalunkwe pro ċedura użata biex jitnaqqas id-daqs tal-parti ċelli ta’ 
materjali solidi jew biex ikunu ppreparati soluzzjonijiet tal-kimika għall-ittestjar. F’ka żijiet fejn il-pro ċessi mekkani ċi jkunu setg ħu biddlu 
l-kompożizzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inkludi r-ri żultati tal-anali żi li 
tivverifika l-kompo żizzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar;
 
— Deskrizzjoni (preferibbilment inklu ża dijagramma) tat-tag ħmir użat biex 
tkun iġġenerata l-atmosfera tat-test u biex l-annimali jkunu esposti g ħall- 
atmosfera tat-test;  
— Dettalji tal-metodu analitiku kimiku u żat u l-validazzjoni tal-metodu 
(inkluża l-effiċjenza fl-irkupru tal-kimika g ħall-ittestjar mill-midjum 
tat-teħid tal-kampjuni);  
— Il-motiv g ħall-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test;  
Riżultati  
— Tabulazzjoni tat-temperatura tal-kamra, l-umdità u l-fluss tal-arja;  
— Tabulazzjoni tad-dejta ta’ kon ċentrazzjoni nominali u attwali tal-kamra;  
— Tabulazzjoni tad-dejta dwar id-daqs tal-parti ċelli, inklu żi dejta ta’ ġbir 
ta’ kampjuni analiti ċi, id-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli u 
l-kalkulazzjonijiet tal-MMAD u σ g ; 
— Tabulazzjoni tad-dejta ta’ rispons u tal-livell ta’ kon ċentrazzjoni g ħal 
kull annimal (ji ġifieri annimali li juru sinjali ta’ tossi ċità, inklu żi 
mortalità, natura, severità, żmien ta’ meta jfaqqg ħu u kemm idumu 
l-effetti);  
— Piżijiet tal-ġisem individwali tal-annimali mi ġburin għall-istudju; data u 
ħin tal-mewt jekk qabel l-ewtanasja skedata, kemm ikun g ħadda żmien 
minn meta faqqg ħu s-sinjali tat-tossi ċità u jekk dawn kinux riversibbli 
għal kull annimal;  
— Sejbiet minn awtopsji u sejbiet istopatolo ġiċi għal kull annimal, jekk 
disponibbli;  
— Stimi tal-letalità (e ż. LC  50 , LD  01 ) inklużi 95 % limiti ta’ kunfidenza, u 
angolu (jekk ipprovdut mill-metodu ta’ evalwazzjoni);  
— Relazzjoni tal-istatistika, inklu ża stima g ħall-esponent n (protokoll C × 
t). Għandu jkun ipprovdut l-isem tas-softwer tal-istatistika u żat; ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
— Għandha ssir enfa żi partikolari g ħad-deskrizzjoni ta’ metodi u żati biex 
jissodisfaw il-kriterji ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar, e ż. il-konċentrazzjoni 
limitata jew id-daqs tal-parti ċelli; 
— Għandu jkun indirizzat jekk jistax ikun hemm respirazzjoni tal-parti ċelli 
fid-dawl tas-sejbiet globali, spe ċjalment jekk il-kriterji tad-daqs 
tal-partiċelli ma setg ħux jitħarsu;  
— Għandha ting ħata spjegazzjoni jekk kienx hemm ħtieġa li b’mod uman 
jinqatlu l-annimali mu ġugħa jew li jkunu wrew sinjali ta’ diffikultà u li 
jdumu, abba żi tal-kriterji fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar 
il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (8);  
— Jekk l-ittestjar skont il-kapitolu B.52 ta’ dan l-Anness (4) ma baqax isir 
favur dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.2, g ħandhom ikunu pprovduti 
l-ġustifikazzjonijiet;  
— Il-konsistenza tal-metodi u żati biex ikunu ddeterminati l-kon ċen­
trazzjonijiet nominali u attwali, u r-relazzjoni tal-kon ċentrazzjoni 
attwali mal-kon ċentrazzjoni nominali g ħandhom ikunu inklu żi 
fil-valutazzjoni globali tal-istudju;  
— Il-kaw ża probbbali tal-mewt u l-modalità predominanti tal-azzjoni (sis ­
temika versus lokali) g ħandhom ikunu indirizzati.  
LETTERATURA:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]
 
(3) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u j ħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 
1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006 ( ĠU 
L 353, 31.12.2008, p. 1).  
(4) Il-Kapitolu B.52 ta’ dan l-Anness, Tossi ċità ta’ Inalazzjoni Akuta - Metodu 
ta’ Klassi Akuta Tossika (ATC).  
(5) Il-Kapitolu B.40 ta’ dan l-Anness: Korru żjoni tal-Ġilda In Vitro: Test ta’ 
Reżistenza Elettrika Transkutanea (TER).  
(6) Il-Kapitolu B.40bis ta’ dan l-Anness, Korru żjoni tal-Ġilda In Vitro: Test 
Mudell tal- Ġilda Umana.  
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin 
Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.  
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167.  
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Appendiċi 1 
Protokoll C × t  
1. Jista’ jitqies studju pass pass ta’ Kon ċentrazzjoni × Ħin (C × t) b ħala alter­
nattiva g ħall-protokoll Tradizzjonali biex tkun ivvalutata t-tossi ċità 
tal-inalazzjoni (12) (13) (14). Dan g ħandu jsir b’mod preferenzjalment 
meta jkun hemm ħtieġa regolatorja jew xjentifika spe ċifika li ssejja ħ 
għall-ittestjar ta’ annimali tul durati multipli ta’ żmien bħal ta’ ppjanar ta’ 
rispons għal emerġenza jew ippjanar ta’ u żu ta’ artijiet. Dan l-appro ċċ norm­
alment jibda bl-ittestjar f’kon ċentrazzjoni limitata (is-Sessjoni ta’ 
Espożizzjoni I) li fiha l-annimali jkunu esposti g ħal kimika g ħall-ittestjar 
għal ħames durati ta’ ħin (eż. 15, 30, 60, 120 u 240 minuta) biex id-durati 
multipli ta’ ħin jinkisbu f’Sessjoni ta’ Espo żizzjoni wa ħda (ara l-Figura 1). 
Meta jintu ża r-Regolament (KE) Nru 1272/2008, il-kon ċentrazzjonijiet 
limitati g ħall-gassijiet, fwar u aerosols jkunu ta’ 20 000 ppm, 20 mg/l, u 
5 mg/l, rispettivament. Dawn il-livelli jistg ħu jinqabżu biss jekk ikun hemm 
ħtieġa regolatorja jew xjentifika g ħall-ittestjar f’dawn il-livelli (ara 
l-paragrafu 37 fit-test ewlieni ta’ B.2).  
2. F’sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ftit jew l-ebda informazzjoni dwar 
it-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar, g ħandu jsir studju ta’ osservazzjoni li 
fih gruppi ta’ mhux aktar minn 3 annimali g ħal kull sess ikunu esposti g ħal 
konċentrazzjonijiet immirati mag ħżula mid-direttur tal-istudju, ġeneralment 
ta’ 240 minuta.  
3. Jekk kon ċentrazzjoni limitata tkun ittestjata matul is-Sessjoni ta’ 
Espożizzjoni I u tkun osservata mortalità ta’ anqas minn 50 %, ma jkunx 
hemm ħtieġa ta’ ttestjar addizzjonali. Jekk ikun hemm ħtieġa regolatorja jew 
xjentifika biex tkun stabbilità r-relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni/ ħin/rispons 
f’livelli og ħla mill-kon ċentrazzjoni limitata indikata, l-espo żizzjoni li jkun 
imiss għandha ssir f’livell og ħla bħall-konċentrazzjoni limitata g ħal darbtejn 
(jiġifieri 2L fil-Figura 1).  
4. Jekk tkun osservata t-tossi ċità fil-kon ċentrazzjoni limitata, ikun me ħtieġ 
ittestjar addizzjonali (studju ewlieni). Ddawn l-e żpożizzjonijiet addizzjonali 
jitwettqu f’kon ċentrazzjonijiet iktar baxxi (fil-Figura 1; Sessjonijiet ta’ 
Espożizzjoni II, III jew IV) jew f’kon ċentrazzjonijiet og ħla bl-użu ta’ 
durati iqsar (fil-Figura 1: Sessjoni ta’ Espo żizzjoni IV) bl-u żu ta’ durati li 
huma adattati u mhux daqshekk spazjati.  
5. It-test (kon ċentrazzjoni inizjali u kon ċentrazzjonijiet addizzjonali) isir billi 
jintuża annimal wie ħed/sess wie ħed għal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin 
jew b’2 annimali tas-sess aktar suxxettibbli g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt 
ta’ ħin. F’xi ċirkostanzi, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li jutilizza 2 
firien għal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin (jew 4 annimali 
tas-sess suxxettibbli g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin) (15). L-u żu ta’ 2 
annimali g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin ġeneralment 
inaqqas mill-parzjalità u mill-varjabbiltà tal-istimi, i żid ir-rata ta’ su ċċess ta’ 
stimi, u jtejjeb il-kopertura ta’ intervall ta’ kunfidenza relattiva g ħall- 
protokoll kif deskritt hawn. Aktar dettalji jing ħataw f’GD 39 (2).  
6. Idealment, kull sessjoni ta’ espo żizzjoni ssir f’jum wie ħed. Dan jag ħti 
l-opportunità biex l-espo żizzjoni li jkun imiss tit ħalla għal aktar tard 
sakemm ikun hemm kunfidenza ra ġonevoli ta’ sopravivenza, u tippermetti 
lid-direttur tal-istudju ja ġġusta l-kon ċentrazzjoni mmirata u d-durati g ħas- 
sessjoni ta’ espo żizzjoni li jkun imiss. Qed ji ġi rrakkomandat li kull sessjoni 
ta’ espożizzjoni tinbeda mal-grupp li se jkun espost l-i żjed fit-tul, ji ġifieri 
l-grupp ta’ espo żizzjoni ta’ 240 minuta, warajh il-grupp ta’ espo żizzjoni ta’ 
120 minuta, e ċċ. Jekk, pere żempju, l-annimali fil-grupp tal-240 minuta 
jibdew imutu wara 90 minuta jew juru sinjali severi ta’ tossi ċità (eż. 
tibidl estrem fix-xjera tat-te ħid tan-nifs b ħal nifs bi tbag ħtija), ma 
jagħmilx sens li grupp ji ġi espost g ħal 120 minuta g ħaliex il-mortalità 
proabbilment tkun 100 %. G ħalhekk id-direttur tal-istudju g ħandu jagħżel 
durati iqsar ta’ espo żizzjoni għal dik il-kon ċentrazzjoni (e ż. 90, 65, 45, 33 u 
25 minuta).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Il-kon ċentrazzjoni tal-kamra g ħandha titkejjel ta’ spiss biex tkun iddeter ­
minata l-kon ċentrazzjoni medja pe żata mal-ħin għal kull perjodu ta’ 
espożizzjoni. Kull meta jkun possibbli, g ħandu jintu ża l-ħin tal-mewt ta’ 
kull annimal (iktar milli d-durata ta’ espo żizzjoni) fl-anali żi ta’ statistika.  
8. Ir-riżultati tal-ewwel erba’ sessjonijiet ta’ espo żizzjoni g ħandhom ikunu 
eżaminati biex tkun identifikata differenza fid-dejta fil-kurva ta’ kon ċen­
trazzjoni- ħin (ara l-Figura 1). F’ka ż li ma jkunx hemm qbil bi żżejjed, 
tkun tista’ ssir espo żizzjoni addizzjonali (il- ħames (5) kon ċentrazzjoni). 
Għandhom jintg ħażlu durati ta’ kon ċentrazzjoni u espo żizzjoni g ħall- 
ħames espo żizzjoni (5) biex ikopru din id-differenza.  
9. Is-sessjonijiet ta’ espo żizzjoni kollha (inklu ża l-ewwel Sessjoni ta’ 
Espożizzjoni) jintu żaw biex tkun ikkalkulata r-relazzjoni ta’ kon ċen­
trazzjoni- ħin-rispons billi tintu ża Analiżi ta’ Statistika (16). Jekk ikun 
possibbli, g ħal kull intervall C × t, g ħandhom jintu żaw il-kon ċentrazzjoni 
medja pe żata mal-ħin u d-durata ta’ espo żizzjoni sal-mewt (jekk il-mewt 
isseħħ matul l-espo żizzjoni).  
Figura 1  
Illustrazzjoni ipotetika tar-relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni- ħin-mortalità 
fil-firien.
  
Simboli miftu ħa = superstiti; simboli mag ħluqa = annimali mejta  
Trijangli = nisa; ċrieki = rġiel 
Linja kontinwa = valuri LC  50 (firxa 7,5-240 min) g ħall-irġiel b’n = 1  
Linja maqsuma = valuri LC  50 (firxa 7,5-240 min) g ħan-nisa b’n = 1  
Linji ttikkjati = linji ta’ valuri LC  50 ipotetiċi għall-irġiel u għan-nisa jekk n kienet 
ugwali għal 2 (12).  
Glossarju  
Konċentrazzjoni:  
Ħin ta’ espo żizzjoni:  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Hawn ta ħt hawn eżempju tal-pro ċedura pass pass:  
Sessjoni ta’ Espo żizzjoni I – Ittestjar fil-kon ċentrazzjoni limitata (ara 
l-Figura 1)  
— 1 annimal g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin; total (  a ) 
— Konċentrazzjoni (  b ) = konċentrazzjoni limitata.  
— Esponi ħames gruppi ta’ annimali f’din il-kon ċentrazzjoni mmirata g ħal 
durati ta’ 15, 30, 60, 120 u 240 minuta, rispettivament.  
↓ 
Sessjoni ta’ Espo żizzjoni II  ( c ) – Studju Ewlieni  
— 1 annimal g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin; total ta’ 
10 annimali.  
— Esponi ħames gruppi ta’ annimali f’kon ċentrazzjoni (  d ) (1/2L) b’durati 
ta’ espożizzjoni ftit itwal (fattur √2 spazjat; ara l-Figura 1).  
↓ 
Sessjoni ta’ Espo żizzjoni III – Studju Ewlieni  
— 1 annimal g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin; total ta’ 
10 annimali.  
— Esponi ħames gruppi ta’ annimali f’kon ċentrazzjoni (  d ) (1/4L) b’durati 
ta’ espożizzjoni ftit itwal (fattur √2 spazjat; ara l-Figura 1).  
↓ 
Sessjoni ta’ Espo żizzjoni IV’ – Studju Ewlieni  
— 1 annimal g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin; total ta’ 
10 annimali.  
— Esponi ħames gruppi ta’ annimali f’kon ċentrazzjoni (  d ) (1/8L) b’durati 
ta’ espożizzjoni ftit itwal (fattur √2 spazjat; ara l-Figura 1).  
↓ jew ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Jekk ma tkunx disponibbli informazzjoni dwar is-suxxettibbiltà tas-sessi, jintu żaw firien 
taż-żewġ sessi, jiġifieri annimal wie ħed/sess wie ħed għal kull kon ċentrazzjoni. Abba żi ta’ 
informazzjoni e żistenti, jew jekk ikun jidher bi ċ-ċar matul din is-sessjoni ta’ espo żizzjoni 
li sess ikun aktar suxxettibbli mill-ie ħor, għandhom jintu żaw 10 annimali mis-sess 
suxxettibbli (2 annimali g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin) f’kull livell ta’ kon ċen­
trazzjoni matul l-ittestjar sussegwenti. ta’ 10 annimali 
( b ) Meta jintu ża r-Regolament (KE) Nru 1272/2008, il-kon ċentrazzjonijiet ta’ limitu g ħall- 
gassijiet, il-fwar u l-aerosols huma 20 000 ppm, 20 mg/l u 5 mg/l, rispettivament. F’ka ż 
ta’ tossiċità mistennija jew ibba żata fuq ir-ri żultati tal-istudju ta’ osservazzjoni, 
għandhom jintg ħażlu konċentrazzjonijiet tal-bidu aktar baxxi. F’ka ż ta’ ħtiġijiet rego ­
latorji jew xjentifi ċi, jistgħu jintużaw konċentrazzjonijiet og ħla. mmirata 
( c ) Idealment, l-espo żizzjoni tal-annimali fil-livell ta’ kon ċentrazzjoni li jkun imiss g ħandha 
ssir aktar tard sakemm ikun hemm kunfidenza ra ġonevoli ta’ sopravivenza g ħal annimali 
li jkunu ġew ittrattati qabel. Dan jippermetti lid-direttur tal-istudju ja ġġusta 
l-konċentrazzjoni mmirata u d-durati g ħas-sessjoni ta’ espo żizzjoni li tkun imiss. 
( d ) Id-doża minima (kon ċentrazzjoni × ħin) li tkun irri żultat f’mortalità matul l-ittestjar 
fil-konċentrazzjoni inizjali (l-ewwel sessjoni ta’ espo żizzjoni) tittie ħed bħala gwida 
biex tkun stabbilita t-ta ħlita li jkun imiss ta’ kon ċentrazzjoni u d-durati ta’ espo żizzjoni. 
Tipikament, il-kon ċentrazzjoni g ħandha tonqos b’darbtejn (1/2L) u l-annimali ji ġu esposti 
fuq firxa ġdida ta’ ħin b’grid iktar fina li tu ża diviżjoni ġeometrika ta’ perjodi ta’ 
espożizzjoni b’fattur ta’ 1.4 ( √2; ara r-referenza 11) matul il- ħin skont il-livell minimu 
tad-doża letali ( ħin × kon ċnetrazzjoni) osservat matul l-ewwel espo żizzjoni. F’din 
il-figura (Figura 1), il-mortalità fis-sessjoni ta’ espo żizzjoni I kienet osservata l-ewwel 
darba fil-15-il minuta; id-durati matul is-sessjoni II ikunu, g ħalhekk, huma ċċentrati għal 
madwar 30 minuta, u jkunu 15, 21 30, 42 u 60 minuta. Wara l-ewwel żewġ 
espożizzjonijiet, huwa rrakkomandat ħafna li d-dejta titfassal f’mod simili kif indikat 
hawn fuq, u li jkun ivverifikat jekk ir-relazzjoni bejn il-kon ċentrazzjoni u l- ħin 
ikollhiex angolu ta’ 45 grad (n = 1) jew jekk ir-relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni- ħin- 
rispons tkunx anqas wieqfa (e ż. n = 2) jew aktar wieqfa (e ż. n = 0,8). Fil-ka żijiet 
tal-aħħar huwa rrakkomandat ħafna li l-kon ċentrazzjonijiet u d-durati li jkun imiss 
ikunu adattati bl-istess mod. aktar baxxa
 Sessjoni ta’ Espo żizzjoni IV – Studju Ewlieni  
— 1 annimal g ħal kull sess g ħal kull kon ċentrazzjoni/punt ta’ ħin; total ta’ 
10 annimali.  
— Esponi ħames gruppi ta’ annimali f’kon ċentrazzjoni (  e ) (2L) b’durati ta’ 
espożizzjoni ftit aqsar (fattur √2 spazjat; ara l-Figura 1).  
Trattament matematiku tar-ri żultati għall-protokoll C × t  
11. Il-pro ċedura ta’ C × t b’4 jew 5 kon ċentrazzjonijiet ta’ espo żizzjoni u ħames 
durati trendi 20 jew 25 punt ta’ dejta, rispettivament. B’dawn il-punti ta’ 
dejta, ir-relazzjoni C × t tista’ tkun ikkalkulata billi tintu ża analiżi ta’ stat­
istika (16):  
Ekwazzjoni 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
fejn C = kon ċentrazzjoni; t = perjodu ta’ espo żizzjoni, jew  
Ekwazzjoni 2:  
Reazzjoni ¼ ƒðC n tÞ 
fejn n ¼ b 1=b 2: 
Bl-użu tal-ekwazzjoni 1, jista’ jkun ikkalkulat il-valur LC  50 għal perjodu ta’ 
ħin partikolari (e ż. 4 sigħat, siegħa 1, 30 minuta, jew kwalunkwe perjodu 
fil-firxa ta’ perjodi ta’ ħin ittestjati) bl-u żu ta’ P = 5 (50 % rispons). Innota 
li r-regola ta’ Haber tapplika biss meta n = 1. LC  01 jista’ jkun ikkalkulat 
bl-użu ta’ P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) F’ċerti każijiet jista’ jkun me ħtieġ li l-konċentrazzjoni ti żdied (2L) tul firxa ġdida ta’ ħin 
bi grid ter ġa aktar fina bl-u żu ta’ divi żjoni ġeometrika ta’ perjodi ta’ espo żizzzjoni 
b’fattur ta’ 1.4 ( √2) f’dak il- ħin skont il-livell minimu tal-kon ċentrazzjoni letali 
osservat matul l-ewwel espo żizzjoni. Id-durata minima ta’ espo żizzjoni għandha prefer ­
ibbilment tkun aktar minn 5 minuti; id-durata massima ta’ espo żizzjoni m’g ħandhiex 
tkun aktar minn 8 sig ħat.”
 B.3. TOSSI ĊITÀ AKUTA (DERMALI)  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).  
1.2. DEFINIZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test ti ġi applikata fuq il- ġilda f’do żi ggradwati lil 
bosta gruppi ta’ annimali sperimentali, do ża waħda użata għal kull 
grupp. Sussegwentement, isiru l-osservazzjonijiet ta’ l-effetti u ta’ l- 
imwiet. L-annimali, li jmutu waqt it-test issirilhom in-nekropsija u fl- aħħar tat-test din issir fuq dawk l-annimali li baqg ħu ħajjin.
 
Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali gravi u li jtulu ta’ tbatija 
u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Is-sustanzi g ħat-test f’do żaġġi 
magħrufa li jikkaw żaw l-uġigħ u t-tbatija min ħabba proprjetajiet 
korrużivi jew ta’ irritazzjoni m’g ħandhomx g ħalfejn jitwettqu.  
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Preparazzjonijiet  
L-annimali huma mi żmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet 
ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it- 
test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma mag ħżula b’mod 
kif jinzerta u assenjati lejn gruppi g ħat-trattament. Xi ftit qabel it- 
testijiet, il-pil huwa maqtug ħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l- 
annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun u żat imma g ħandu jkun 
imwettaq madwar 24 sieg ħa qabel it-test. Meta jsir il-qtug ħ jew it- 
tqaxxir tal-pil, kura g ħandha tittie ħed sabiex ikun evitat xi grif fil- 
ġilda li jkunu jistg ħu jibdlu l-permeabbiltà tag ħha. Mhux anqas minn 
10 % tal-wi ċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf g ħall-applikazzjoni 
tas-sustanza tat-test. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistg ħu ikunu 
pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test g ħandha tkun b’umidità 
suffiċjenti bl-ilma, jew, meta me ħtieġ, apparat adattat sabiex 
jassigura kuntatt tajjeb mal- ġilda. Meta ji ġi użat xi mezz, g ħandha 
tiġi kkunsidrata l-influwenza tieg ħu fuq il-penetrazzjoni tal- ġilda bis- 
sustanza g ħat-test. Is-sustanzi g ħat-test likwidi ġeneralment jintu żaw 
mhux ma ħlula. 
1.6.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.6.2.1.  Annimali sperimentali  
Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistg ħu jintużaw. Speċje 
oħrajn jistgħu jiġu użati imma l-u żu tagħhom ikun je ħtieġ ġustifi­
kazzjoni. G ħandhom jintu żaw karatteristi ċi tal-laboratorju u żati 
b’mod komuni. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil- 
piż ta’ l-annimali u żati m’għandhiex te ċċedi ± 20 % tal-valur 
medju kif xieraq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Numru u sess.  
Mill-anqas 5 annimali huma u żati f’kull livell tad-do ża. Iridu jkunu 
ta’ l-istess sess. Jekk jintu żaw dawk femminili, dawn qatt ma jkunu 
welldu u mhumiex tqal. Fejn l-informazzjoni hija disponibbli li turi li 
s-sess partikulari huwa iktar sensittiv, l-annimali ta’ dan is-sess 
għandhom jing ħataw id-do ża. 
Nota:  F’testijiet ta’ tossi ċità akuta b’annimali t’ordni og ħla minn tal- 
gerriema, l-u żu ta’ numri i żgħar għandu jiġi kkunsidrat. Id-do żi 
għandhom jing ħażlu bl-attenzjoni, u g ħandu jsir kull sforz sabiex 
id-dożi li huma xi ftit tossi ċi ma jinqab żux. F’testijiet b ħal dawn, 
l-amministrazzjoni tad-do żi letali tas-sustanza g ħat-test għandha tiġi 
evitata.  
1.6.2.3.  Livelli tad-do ża 
Dawn għandhom ikunu bi żżejjed bħala numru, mill-inqas tlieta, u 
spazjati b’mod xieraq sabiex jipprodu ċu gruppi ta’ test b’medda ta’ 
effetti tossi ċi u rati ta’ mortalità. Kwalunkwe effetti korru żivi jew ta’ 
irritazzjoni g ħandhom ji ġu kkunsidrati meta ji ġu deċiżi l-livelli tad- 
doża. Id-data g ħandha tkun bi żżejjed biex tipprodu ċi kurva li turi d- 
doża/ir-rispons u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni 
aċċettabbli ta’ l- LD  50 
1.6.2.4.  Test ta’ limitazzjoni  
Test ta’ limitu f’livell wie ħed ta’ doża ta’ mill-inqas 2 000 mg/kg ta’ 
piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fi gruppi ta’ 5 annimali maskili u 5 
femminili, bl-u żu tal-proċeduri deskritti hawn fuq. Jekk ikun hemm 
mortalità compound-related jista’ ji ġi kkunsidrat studju s ħiħ. 
1.6.2.5.  Perijodu ta’ l-Osservazzjoni  
Il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħandu jkun ta’ mill-inqas 14-il jum. 
Madankollu, it-tul ta’ l-osservazzjoni m’g ħandux ikun issettjat stret ­
tament. G ħandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossi ċi, ir-rata ta’  
onset  tagħhom u t-tul tal-perjodu ta’ rkupru, u g ħalhekk jista’ ji ġi 
estiż jekk ikun me ħtieġ. Il-ħin li fih is-sinjali tat-tossi ċità jidhru u 
jisparixxu, i ż-żmien li jie ħdu u l-ħin tal-mewt huma importanti, spe ċ­
jalment jekk ikun hemm it-tendenza li jtulu l-imwiet.  
1.6.3.  Il-pro ċedura  
L-annimali g ħandhom jin żammu f’ga ġeġ individwali. Is-sustanza 
għat-test għandha tiġi applikata b’mod uniformi fuq żona, li hija 
bejn wie ħed u ieħor 10 % ta ż-żona totali tal-wi ċċ tal-ġisem 
B’sustanzi ferm tossi ċi, iż-żona tal-wi ċċ koperta tista’ tkun anqas 
imma kemm jista’ jkun mi ż-żona għandha tkun koperta b’saff 
irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli  
Matul l-24 sieg ħa tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni s-sustanza tat-test 
tinżamm f’kuntatt mal- ġilda b’gar ża poruża u faxxa mhux irri ­
tanti.Is-sit tat-test g ħandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex 
iżomm il-faxxex bil-gar ża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l- 
annimali ma jkunux jistg ħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. 
Restrizzjonijiet jistg ħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-in ġestjoni tas- 
sustanza tat-test, imma l-immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu 
rakkommandat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Fi tmiem il-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, g ħandhom jitne ħħew ir- 
residwi tas-sustanza g ħat-test, fejn hu prattikabbli, permezz ta’ 
l-ilma jew xi metodu xieraq ie ħor ta’ tindif tal- ġilda. 
L-osservazzjonijiet g ħandhom ji ġu rrekordjati sistematikament kif 
isiru. Ir-rekords individwali g ħandhom jin żammu għal kull animal. 
L-osservazzjonijiet g ħandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. E żami­
nazzjoni klinika bil-galbu g ħandha ssir mill-inqas darba kull ġurnata 
ta’ xogħol, l-osservazzjonijiet l-o ħra għandhom isiru kuljum 
b’azzjonijiet xierqa sabiex ji ġi minimizzat it-telf ta’ annimali mill- 
istudju eż. In-nekropsija jew ir-refri ġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li 
jinstabu mejta u l-i żolament jew il-qtil ta’ annimali dg ħajfa jew li 
qed imutu.  
L-osservazzjonijiet g ħandhom jinkludu tibdil fil- ġilda u l-pil, fl- 
għajnejn u membrani muko żji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirko­
latorji, awtonomi ċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività 
somatomotori u l-istil ta’ l-im ġiba. Għandha ting ħata attenzjoni 
partikulari g ħall-osservazzjoni ta’ tkexkix, konvul żjonijiet, ir-rieq, 
dijareja, il-letar ġija, l-irqad u l-koma. Il- ħin tal-mewt g ħandu jiġi 
rrekordjat kemm jista’ jkun bl-e żatt. L-annimali li jmutu waqt it- 
test u dawk li jibqg ħu ħajjin fi tmiem it-test huma su ġġetti għan- 
nekropsija. It-tibdil kollu patolo ġiku kbir g ħandu jiġi rrekordjat. Fejn 
hu indikat, it-tessuti g ħandhom jittie ħdu għall-eżaminazzjoni ħispa­
toloġika. 
Valutazzjoni tat-tossi ċità fis-sess l-ie ħor. 
Wara tmiem l-istudju ta’ sess wie ħed, mill-inqas grupp wie ħed ta’ 5 
annimali tas-sess l-ie ħor jingħata d-doża biex ji ġi stabbilit li l- 
annimali ta’ dan is-sess mhumiex iktar sensittivi g ħas-sustanza tat- 
test. L-użu ta’ inqas annimali jista’ jkun ġustifikat f’ ċirkostanzi indi ­
vidwali. Fejn hemm informazzjoni xierqa disponibbli li turi li l- 
annimali tas-sess li qed ji ġi ttestjat huma iktar sensittivi, l-ittestjar 
fuq l-annimali tas-sess l-ie ħor jista’ ma jsirx.  
2. DATA  
Id-data għandha tkun riassunta f’g ħamla tabulari, li turi g ħal kull 
grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il- ħin tal-mewt 
ta’ l-annimali individwali, in-numru ta’ l-annimali li juru sinjali o ħra 
ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossi ċi u s-sejbiet ta’ 
nekropsija. Il-pi żijiet individwali ta’ l-annimali g ħandhom ji ġu deter­
minati u rrekordjati ftit qabel is-sustanza g ħat-test tiġi applikata. 
Wara, dan isir kull ġimgħa u mal-mewt it-tibdiliet fil-pi ż 
għandhom ji ġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jibqg ħu 
ħajjin sa ġurnata wara. L-annimali li ji ġu maqtula b’mod uman 
minħabba t-tbatija u l-u ġigħ li huma  compound related  huma 
rrekordjati b ħala mwiet  compound-related . L-LD  50 għandu jiġi 
determinat minn metodu rikonoxxut.  
Il-valutazzjoni tad-data g ħandha tinkludi l-valutazzjoni tar- 
relazzjonijiet, jekk ikun hemm, bejn l-espo ħizzjoni ta’ l-annimali 
għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet 
kollha, inklu żi dawk ta’ im ġiba u dawk klini ċi, feriti kbar, tibdil fil- 
piż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe effetti tossi ċi oħra. 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— l-ispeċje, is-silta, is-sors, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, e ċċ.; 
— kundizzjonijiet tat-test (inklu żu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew 
mhux okklussivi);  
— il-livelli tad-do ża (inkluż il-mezz, jekk u żat, u l-kon ċentrazzjo­
ninijiet);  
— is-sess ta’ l-annimal li qed jing ħata d-doża; 
— it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons tas-sess u l-livell tad-do ża (i.e. 
in-numru ta’ l-annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test; in- 
numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossi ċità; in-numru ta’ 
annimali esposti);  
— il-ħin tal-mewt wara d-do żaġġ, ir-raġunijiet u l-kriterji u żati 
għall-qtil b’mod uman ta’ l-annimali;  
— l-osservazzjonijiet kollha;  
— il-valur LD  50 għas-sess su ġġett għal studju komplet, determinat 
f’14-il jum bil-metodu ta’ determinazzjoni spe ċifikat;  
— 95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza g ħall- LD  50 (fejn dan huwa 
provdut);  
— Il-kurva li turi id-do ża/il-mortalità fejn hu permess bil-metodu 
tad-determinazzjoni  
— Is-sejbiet tan-nekropsija;  
— Kwalunkwe sejbiet ħispatoloġiċi; 
— Ir-riżultati ta’ kwalunkwe test fuq is-sess l-ie ħor; 
— Id-diskussjoni tar-ri żultati (b’attenzjoni partikulari g ħall-effett li l- 
qtil b’mod uman ta’ l-annimali jista’ jkollu fuq il-valur kalkulat LD
 50 ); 
— L-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. TOSSI ĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRU ŻJONITAL- 
ĠILDA  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalnti g ħal OECD TG 404 (2002)  
1.1 INTRODUZZJONI  
Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu a ġġornat, attenzjoni spe ċjali 
kienet mog ħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li 
jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-inform ­
azzjoni e żistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu 
evitati testijiet ming ħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il- 
metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn 
deskritt g ħat-test  in vivo  dwar il-korru żjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, 
l-analiżi ta' l-evidenza pe żata għandu jkun imwettaq skond id-dettalji 
relevanti e żistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffi ċċjenti, 
dawn jistg ħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet 
sekwenzali (1). L-istrate ġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet 
validati u a ċċettabbli ta'  in vitro  u kemm provvediment dwarha b ħala 
Anness ta' dan il-metodu. B' żieda, meta xieraq, l-applikazzjoni 
suċċessiva, minflok simultanja, tat-tlett impjastri tat-test fuq l- 
annimal, fit-test inizjali  in vivo , hija rakkommandata.  
Fl-interess kemm ta' xjenza g ħaqlija u tal- ġid ta' l-annimali, testijiet  
in vivo  m'għandhomx ise ħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli 
kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal- ġilda mis- 
sustanza jkunu ġew evalwati b'anali żi tal-peżar bl-evidenza. Tali 
dettalji g ħandhom jinkludu evidenza minn studju e żistenti kemm 
fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza wa ħda struttarament relatati u 
it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru a ċidità jew alkalinità 
qawwija tas-sustanza (2) (3), u r-ri żultati minn testijiet validati u 
aċċettati kemm  in vitro  jew  ex vivo  (4) (5) (5a). Din l-anali żi 
għandha tnaqqas il- ħtieġa ta' testijiet  in vivo  dwar is-sustanzi 
b'korrossività/irritazzjoni tal- ġilda li dwarha evidenza suffi ċjenti 
tkun diġa eżistenti minn studju o ħrajn rigward i ż-żewġ għanijiet 
aħħarija.
 
Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta 
testijiet validati u a ċċettabbli,  in vitro  jew  ex vivo , dwar il- 
korrożjoni/irritazzjoni, hija inklu ża bħala Anness g ħal dan il- 
metodu. L-istrate ġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod 
unanimu, mill-parte ċipanti ta' laqg ħa ta' studju ta' l-OECD (6), u 
kienet ġiet adottata b ħala l-istrate ġija rakkommandata tat-testijiet 
fis-Sistema Armonizzata Globali g ħall-Klassifika ta' Sustanzi 
Kimiċi (GHS) (7). Huwa rakkommandabbli li din l-istrate ġija tat- 
testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet  in vivo . Għal 
sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass 
b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il- 
korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. G ħal sustanzi e żistenti b'inform ­
azzjoni mhux suffi ċjenti dwar il-korro żjoni/irritazzjoni tal- ġilda, l- 
istrateġija għanha tkun u żata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad- 
dettalji. L-u żu ta' strate ġija jew pro ċedura differenti tat-testijiet, jew 
ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, g ħandha tkun 
ġustifikata.  
Jekk determinazzjoni tal-korrossività jew irritazzjoni ma tkuns tista’ 
ssir bl-użu ta' l-anali żi tal-peżar ta' l-evidenza, konsistenti mal-istra ­
teġija sekwenzali tat-testijiet, test  in vivo  għandu jkun ikkonsidrat 
(ara l-Anness).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Irritazzjoni dermali (tal- ġilda):  Hija l-produzzjoni ta' ħsara river ­
sibbli tal- ġilda bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat- 
test għal 4 siegħat. 
Korrożjoni dermali (tal- ġilda):  Hija l-produzzjoni ta' ħsara irrevir ­
sibbli tal- ġilda nekro żi viżibbli mill-epidermis u sa ġewwa d-dermis, 
bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test g ħal sa 4 
siegħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma tipifikati b'ul ċeri, nixxija 
ta' demm, qoxra bid-demm, u, fit-tmiem ta' l-osservazzjoni matul 
14-il jum, b'tibdil tal-kulur min ħabba l-bjudija tal- ġilda, żoni sħaħ 
bi alopecia u farretti. Il- ħispatoloġija għandha tkun ikkonsidrata 
sabiex tevalwa feriti dubbju żi. 
1.3 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza li g ħandha tkun ittestjata hija applikata f'do ża singola 
mal-ġilda ta' annimal sperimentli; żoni tal-ġilda mhux trattati ta' l- 
annimal tat-test iservu g ħall-kontroll. Il-grad tal-korro żjoni/­
irritazzjoni ikun moqri u rre ġistrat matul intervalli spe ċifiċi u jkun 
aktar deskritt sabiex jipprovdi evalwazzjoni s ħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' 
żmien ta' l-istudju g ħandu jkun suffi ċjenti sabiex tkun evalwata r- 
riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati.  
L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew u ġiegħ severi, fi 
kwalunkwe waqt tat-test, g ħandhom ikunu maqtula b'mod umani ­
tarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex 
tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali 
moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstg ħab fir-referenza (8).  
1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1  Preparazzjoni tat-test  in vivo  
1.4.1.1  L-għażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek 
żgħażagħ adulti huma u żati. Ir-raġuni għall-użu ta' spe ċje oħrajn 
għandha tkun mog ħtija. 
1.4.1.2  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Madwar 24 sieg ħa qabel it-test, is-suf g ħandu jkun imne ħħi bi 
tqaxxir ta ż-żona dorsali minn fuq id-dhar ta' l-annimali. Kura 
għandha ting ħata li jkunu evitati xi brix tal- ġilda, u biss l-anniamli 
li huma b'sa ħħithom, b'ġilda ntatta, g ħandhom ikunu u żati. 
Uħud mit-tip tal-fniek g ħandhom irqajja folti ta' suf li huma aktar 
prominenti f' ċerti żminijiet tas-sena. Tali żoni ta' tkabbir ta' suf folt 
m'għandhomx ikunu u żati bħala s-siti tat-testijiet.  
1.4.1.3  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
L-annimali g ħandhom jinzammi f'ga ġġeġ individwali. It-temperatura 
tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 20  o C (± 3  o C), 
għall-fniek. G ħalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill-anqas 
30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif 
tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. 
Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu ikunu 
użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Pro ċedura tat-test  
1.4.2.1  L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test  
Is-sustanza tat-test g ħandha tkun applikata fuq żona żgħira (madwar 
6 cm  2 ) tal-ġilda u miksija b'bi ċċa garża, li tinżamm fil-post bi stikk 
mhux irritanti. Fil-ka żi meta l-applikazzjoni diretta ma tkunx 
possibbli (e ż. likwidi u ċerti dlik), is-sustanza tat-test g ħandha l- 
ewwel tkun applikata fuq bi ċċa garża, li imbag ħad tkun applikata 
mal-ġilda. Il-bi ċċa għandha tin żamm f'kuntatt ħafif mal- ġilda 
permezz ta' faxxa adattata semi-okklussiva, g ħal matul il-perjodu 
ta' l-espo żizzjoni. Jekk is-sustanza tat-test tkun applikata fuq bi ċċa, 
din għandha tkun imwa ħħla mal-ġilda b'tali mod li jkun hemm 
kuntatt tajjeb u distribuzzjoni uniformi tas-sustanza mal- ġilda. 
Aċċess mill-annimal lejn il-bi ċċa, jew l-in ġestjoni li t-te ħid man- 
nifs tas-sustanza tat-test m'g ħandux jitħalla li jse ħħ. 
Is-sustanzi likwidi huwa ġeneralment u żati ming ħajr ma jkunu 
mrattba. Meta jsiru t-testijiet ta' solidi (li jistg ħu ikunu pulverizzati, 
jekk hekk ikun meqjus b ħala meħtieġ), is-sustanza tat-test g ħandha 
tkun niedja b'ammont żgħir ilma (jew, meta me ħtieġ, b'xi likwidu 
adattat ie ħor) li jkun suffi ċjenti sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal- 
ġilda. Meta likwidi o ħrajn apparti milli l-ilma jkunu u żati, l- 
influwenza potenzali tal-likwidu fuq l-irritazzjoni tal- ġilda mis- 
sustanza tat-test g ħand tkun ferm minima, jekk ikun hemm.  
Fit-tmiem tal-perjodu ta' l-espo żizzjoni, li normalment ikun ta' 4 
siegħat, is-sustanza residwa tat-test g ħandha tkun imne ħħija, meta 
prattikabbli, bl-u żu ta' ilma jew b'xi solvent xieraq ming ħajr ma 
jbiddel ir-reazzjoni e żistenti jew l-integrità ta' l-epidermis.  
1.4.2.2  Livell tad-do ża 
Doża ta' 0,5 ml likwidu jew 0,5 g solidu jew dlik hija applikata ma ż- 
żona tat-test.  
1.4.2.3  It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korro żjoni dermali bl-u żu 
ta' annimal wie ħed) 
Huwa ferm rakkommandabbli li t-test  in vivo  jkun imwettaq iniz ­
jalment bl-u żu ta' annimal wie ħed, speċjalment meta s-sustanza tkun 
issusspetata li jkollha potenzal korrossiv. Dan huwa skond l-istra ­
teġija tat-testijiet sekwenzali (ara l-Anness 1).  
Meta sustanza tkun ġiet iġġudikata b ħala korrossiva fuq il-ba żi ta' l- 
analiżi ta' l-evidenza pe żata, l-ebda aktar testijiet fuq l-annimali ma 
jkunu me ħtieġa. Għal bosta mis-sustanzi li huma issusspettati b ħala 
korrossivi, aktar testijiet  in vivo  ma jkunux normalment me ħtieġa. 
B'dana kollu, f'dawk il-ka żi meta informazzjoni addizzjonali tin ħass 
li tkun me ħtieġa minħabba l-evidenza mhux suffi ċjenti, testijiet 
limitati ta' l-annimali jistg ħu jitwettqu bl-u żu ta' dan il-metodu: Sa 
tlett biċċiet tat-test huma applikati b'mod sekwenzali fuq l-annimal. 
L-ewwel bi ċċa tkun imne ħħija wara tlett minuti. Jekk l-ebda 
reazzjoni tal- ġilda ma tkun osservata, it-tieni bi ċċa tkun applikata u 
mneħħija wara sieg ħa. Jekk l-osservazzjonijiet f'dan l-istadju 
jindikaw li l-espo żizzjoni tista’ tit ħalla b'mod umanitarju, allura t- 
test ikun esti ż għal erba' sieg ħat, it-tielet bi ċċa tkun applikata u 
mneħħija wara erba' sieg ħat, u r-reazzjoni tkun gradata.  
Jekk effett korrossiv ikun osservat wara kwalunkwe mit-tlett 
espżizzjonijiet sekwenzali, it-test ikun immedjetament terminat. 
Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat wara li l-a ħħar biċċa tkun 
imneħħija, l-annimal ikun osservat g ħal 14-il jum, sakemm il- 
korrożjoni ma tkunx żviluppat f'xi punt aktar kmieni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
F'dawk il-ka żi li fihom is-sustanza tat-test ma tkunx mistennija li 
tipproduċi korrożjoni imma li tista’ tkun irritanti, bi ċċa waħda 
għandha tkun applikata ma annimal wie ħed għal erba' sieg ħat. 
1.4.2.4  Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni tal- ġilda b'an ­
nimali addizzjonali)  
Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat fit-test inizjali, l-irritant jew 
ir-reazzjoni negattiva g ħandhom ikunu ikkonfermati bl-u żu ta' żewġ 
annimali o ħrajn, kull wie ħed b'biċċa waħda, għal perjodu ta' 
espożizzjoni ta' erba' sieg ħat. Jekk effett irritanti jkun osservat fit- 
test inizjali, it-test konfermatorju jista’ jitwettaq b'mod sekwenzali, 
jew bl-espo żizzjoni ta' żewġ annimali simultanjament. Fil-ka ż 
eċċezzjoni, li fih it-test inizjali ma jkunx imwettaq, tnejn jew tlett 
annimali jistg ħu ikunu ittrattati b'bi ċċa waħda, li tkun imne ħħija wara 
erba' sieg ħat. Meta żewġ annimali huma u żati, jekk it-tnejn li huma 
juru l-istess reazzjoni, l-ebda testijiet o ħrajn ma huma me ħtieġa. 
Inkella, it-tielet annimal ikun ukoll ittestjat. Reazzjonijiet ekwovi ċi 
ikunu jeħtieġu avalwazzjoni bl-u żu ta' annimali addizzjonali.  
1.4.2.5  Perijodu ta' osservazzjoni  
It-tul ta' żmien ta' l-istudju g ġandu jkun suffi ċjenti sabiex tkun 
evalwata r-riversabbiltà jew in-nuqqas ta' riversabbiltà ta' l-effetti 
osservati. B'dana kollu l-esperiment g ħandu jkun terminat fi 
kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' 
uġiegħ jew tbag ħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti 
tar-riversabbilità, l-annimali g ħandhom ikunu osservati sa 14-il jum 
wara t-tne ħħija tal-biċċiet. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel 
l-14-il jum, l-esperiment g ħandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.  
1.4.2.6  Osservazzjonijiet klini ċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal- ġilda 
L-annimali kollha g ħandhom ikunu e żaminati g ħal sinjali ta' eritema 
u odema, u r-reazzjoni rre ġistrati wara 60 minuta, u imbag ħad fi 24, 
48 u 72 sieg ħa, wara t-tne ħħija tal-bi ċċa. Għattest inizjali fuq 
annimal wie ħed, is-sit tat-test ikun ukoll e żaminat immedjetament 
wara li l-bi ċċ tkun imne ħħija. Ir-reazzjoni dermali huma ggradati u 
rreġistrati skond il-gradi fit-tabella ta' hawn ta ħt. Jekk ikun hemm 
ħsara għall-ġilda li ma tistg ħax tkunidentifikata b ħala irritazzjoni jew 
korrożjoni wara 72 sieg ħa, l-osservazzjonijiet jistg ħu ikunu me ħtieġa 
sal-jum 14 sabiex tkun determinata r-riversibbiltà ta' l-effetti. B' żieda 
ma l-osservazzjonijiet ta' l-irritazzjoni, l-effetti tossi ċi kollha, b ħal ma 
huma n-nuqqas ta' xa ħam min ta ħt il-ġilda, u xi effett kuntrarji 
sistematiċi (eż. l-effetti fuq sinjali klini ċi ta' tossi ċità u l-pi ż tal- 
ġisem), għandhom ikunu deskritti bis-s ħiħ u rreġistrati. L-e żami­
nazzjoni ħistoġatoloġika għandha tkun ikkonsidrata sabiex tikkla ­
rifika r-reazzjonijiet b'mod ekwivoku.  
Il-gradar tar-reazzjonijiet tal- ġilda hija ne ċċessarjament su ġġestiva. 
Sabiex tkun im ħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni tal- 
ġilda u sabiex ikunu mg ħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk 
involuti fi ż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni 
tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet je ħtieġu li jkunu 
adekwatament im ħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif u żata (ara t- 
Tabella ta' hawn ta ħt). Gwida illustrata dwar l-iggradar ta' l-irri ­
tazzjoni tal- ġilda u feriti o ħrajn tista’ tkun ta' g ħajnuna (9).  
2. DATA  
2.1 PRE ŻENTAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Ir-riżultati ta' l-istudju g ħandhom ikunu mi ġbura f'sommarju f'g ħamla 
tabulari fir-rapport finali tat-test u g ħandhom ikopru l-punti kollha 
elenkati fis-sezzjoni 3.1.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 EVALWAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali g ħandhom ikunu evalwati b'kon ­
nessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma 
jkunux jirrapre żentaw norma assoluta g ħall-propjetajiet irritanti ta' xi 
materjaa, min ħabba li effetti o ħrajn tal-materjal taat-test huma wkoll 
evalwati. Minflok, marki individwali g ħandhom ikunu meqjusa b ħala 
valuri ta' referenza, li je ħtieġu li jkunu evalwati flimkien ma l-osser ­
vazzjonijiet l-o ħrajn kolha li jirri żultaaw mill-istudju.
 
Ir-riversibbilità tal-feriti dermali g ħandha wkoll tkun ikkunsidrata fl- 
evalwazzjoni tar-reazzjoni irritanti. Meta r-reazzjonijiet b ħal ma 
huma l-alope ċja (żoma limitat), iperkerato żi, iperpla żja u qxur, 
jippersistu fit-tmiem talk-perjodu ta' 14-il jum osservazzjoni, is- sustanza tat-test g ħandha tkun meqjusha b ħala irritanti.
 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1 RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Raġġunar dwar it-test in  vivo : Analiżi ta' l-evidenza mal-pi ż ra' 
informazzjoni pre-e żistenti qabel it-test, inklu żi r-riżultati minn 
strateġija ta' testijiet sekwenzali:  
— deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet 
preċedenti;  
— informazzjoni akkwistat f’kull stadju ta’ l-istrate ġija ta’ l-ittestjar;  
— deskrizzjoni tat-testijiet in  vitro  kif imwettqa, inklu żi d-dettalji 
tal-proċeduri, ir-ri żultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;  
— analiżi ta’ l-evidenza pe żata għat-twettieq ta’ l-istudju  in vivo.  
Is-sustanza tat-test:  
— dettalji ta’ l-identifikazzjoni (e ż. numru CAS; sorsi; purità; 
impuritajiet mag ħrufa; n-numru tal-lot);  
— in-natura fi żika u l-propjetajiet fi żikokimiċi (eż. pH, volatilità, 
solubilità, stabbilità);  
— jekk ta ħlita, il-komposizzjoni u l-persenta ġġi relattivi tal-kompo ­
nenti.  
Mezz:  
— l-identifikazzjoni, il-kon ċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum u żat; 
— il-ġustifikazzjoni tal-mezz u żat. 
Annimali tat-test:  
— l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta’ l-annimali apparti 
milli fniek albino;  
— in-numru ta’ l-annimaali g ħal kull sess;  
— il-piżijiet ta’ l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil- 
konklużjoni tat-test;  
— l-età fil-bidu ta’ l-istudju;  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, e ċċ. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— it-teknika taal-preparazzjoni tas-sit tal-bi ċċa; 
— id-dettalji tal-materjali u żat fil-biċċa u t-teknika tat-twa ħħil tal- 
biċċa; 
— dettalji dwar il-preparazzjoni, l-applikazzjoni u t-tne ħħija tas- 
susstanza tat-test.  
Riżultati:  
— tabulazzjoni tal-marki tar-reazzjoni/korro żjoni għal kull annimal 
fil-punti kollha tal- ħin tal-kejl;  
— deskrizzjonijiet tal-feriti kollha, kif osservati;  
— deskrizzjoni narrattiva tan-natura u l-grad ta’ l-irritazzjoni jew 
tal-korrożjoni osservati, u xi sejbiet ħistopatolo ġiċi; 
— id-deskrizzjoni ta’ xi Danni lokali o ħrajn (eż. tneħħija tax-xa ħam 
minn taħt il-ġilda) u l-effetti sistemati ċi b’żieda ma l-irritazzjoni 
jew il-korro żjoni dermali.  
— Diskussjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, “Skin Irritation”, 
European Chemical Industry, Ecology and Toxicology 
Centre, Brussels.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). 1. L-istudju ECVAM tal-validazzjoni inter ­
nazzjonali dwar testijiet  in vitro  għall-korrossività tal- ġilda. 
2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxi ­
cology  in vitro  12, pp. 483-524.
 
(5a) Metodu tat-test B.40, Korro żjoni tal-Ġilda 
(6) Programm ta’ Linji ta’ Gwida g ħat-Test OECD (1996): 
Rapport Finali tal-Grupp ta’ Studju OECD dwar l-Armon ­
izzazzjoni tal-Validazzjoni u l-A ċċettazzjoni tal-Kriterja dwar 
Metodi Alternattivi g ħal-Testijiet Tossikolo ġiċi. Li kien 
inżamm fi Solna, l-Isvezjam fit-22 – 24 ta’ Jannar 1996 
(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata 
tal-Perikoli g ħas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas- 
Sustanzi Kumi ċi, kif approvat mit-28 Laqg ħa Konġunta tal- 
Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta’ Ħidma dwart il-Kimika, 
Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Dokument ta’ Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l- 
Assessjar u l-U żu ta’ Sinjali Klini ċi bħala għanijiet finali 
umanitarji g ħall-annimali Sperimenti U żati fl-Evalwazzjoni 
tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Sa ħħa u s- 
Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Assessjar Nru. 
19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).  
(9) EPA (1990). Atlas tal-Feriti Dermali, (20T-2004). United States 
Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
(Disponibbli ma talba minn g ħand is-Segretarjat ta’ l-OECD).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabella I  
IGGRADAR TAR-REAZZJONIJIET TAL- ĠILDA  
Il-Formazzjoni ta’ l-Eritema u l-Eskar  
L-ebda eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Eritema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Eritema definita sewwa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Eritima moderata jew severa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Eritema severa ( ħmura ta’ la ħam nej) g ħall-formazzjoni ta’ l-eskar g ħall- 
prevenzjoni ta’ l-eritema gradata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Massimu possibli: 4  
Formazzjoni ta’ l-odema  
L-ebda oredma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Odema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Odema ħafifa (it-trufijiet ta ż-żona definiti sewwa b’ ħanek definit) . . . . 2 
Odema moderata (imqabb ża b’madwar 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Odema severa (imqabb ża b’aktar minn 1 mm u testendi lil hinn mi ż- 
żona esposta) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Massimu possibli: 4  
L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha titwettaq sabiex tikklarifika r- 
reazzjonijiet b’mod ekwoviku.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
ANNESS  
Strateġija ta' testijiet Sekwenzali dwar l-Irritazzjoni u l-Korro żjoni ta' l- 
Għajnejn  
KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI  
Fl-imnteressi ta' xjenza soda u l- ġid ta' l-annimali, huwa importanti li jkun evitat 
l-użu bla bżonn ta' l-annimali, u jkun imnaqqas it-testjar li aktar jipprodu ċi 
reazzjonijiet serveri fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza relatata mal-potenzal tag ħha ta' l-irritazzjoni/korro żjoni okulari g ħandha tkun evalwata 
bil-quddiem qabel ma jkunu ikkonsidrati t-testijiet  in vivo . Evidenza suffi ċjenti 
tista' tkun di ġa teżisti sabiex tikklassifika sustanza tat-test dwar l-irritazzjoni ta' l- 
għajnejn jew tal-potenzal tal-korro żjoni ming ħajr il-ħtieġa li jkunu mwettqa 
testijiet fuq l-annimali tal-laboratorju. G ħalhekk, l-utili żżażżjoni ta' l-anali żi 
peżata bl-evidenza u l-istrate ġija sussegwenti tat-testijiet g ħandha tnaqqas il- 
ħtieġa ta' testijiet  in vivo , speċjalemnt jekk is-sustanza aktarx li tipprodu ċi 
reazzjonijiet severi.
 
Huwa rakkommandabbli li l-anali żi ta' l-evidenza pe żata tkun u żata għall-eval­
wazzjoni ta' l-informazzjoni e żistenti li tappartieni g ħas-sustanzi ta' l-irritazzjoni 
u l-korro żjoni ta' l-g ħajnejn u sabiex tiddetermina jekk studju addizzjonali, 
apparti milli l-istudji  in vivo  fuq l-għajnejn, għandhom ikun u mwettqa sabiex 
jgħinu dwar il-karatteristi ċi ta' tali potenzal. Meta aktar studji huma me ħtieġa, 
huwa rakkommandabbli li l-istrate ġija ta' testijiet sekwenzali tkun utilizzata sabie 
tiżviluppa d-dettalji sperimentali relevanti. G ħal sustanzi li ma jkollhom l-ebda 
storja ta' testijiet, l-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali g ħandha tkun utilizzata 
sabiex ji żviluppa l-informazzjoni me ħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korro żjoni/­
irritazzjoni tag ħha fuq l-g ħajnejn. L-istrate ġija tat-testijiet deskritta f'dan l- 
Anness kienet ġiet żviluppata minn grupp ta' ħidma tal-OECD (1). Kienet susseg ­
wentament ikkonfermata u mkabbra fis-sistema tal-Klassifa Armonizzata 
Integrata dwar is-Sa ħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kimi ċi, kif 
ikkonfermata bit-28 Laqg ħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimi ċi u tal-Grupp ta' 
Ħidma dwar il-Kimi ċi, f'Novembru 1998 (2).  
Għalkemm din l-istrate ġija tat-testijiet mhix parti integrali tal-metodu tat-testijiet 
B.5, din tesprimi r-resqien rakkommandat g ħad-determinazzjoni tal-propjetajiet ta' 
l-irritazzjoni/korro żjoni ta' l-g ħajnejn. Dan ir-resqien jirrapre żenta kemm l-a ħjar 
prassi u l-mira etika dwar testijiet  in vivo  ta' l-irritazzjoni korro żjoni ta' l- 
għajnejn. Il-metodu tat-testijiet jipprovdi gwida g ħat-twettieq tat-test  in vivo  
u sommarji u fatturi li g ħandhom ikunu ndirizzati qabel ma jkun ikkonsidrat 
tali test. L-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali tipprovdi r-resqien ta' l-evidenza 
peżata għall-evalwazzjoni ta' informazzjoni e żistenti dwar il-propjetajiet ta' l- 
irritazzjoni/kjorro żjoni ta' l-g ħajnejn, ta'sustanza, u tar-resqien imtarra ġ għall- 
ġenerazzjoni ta' l-informazzjoni relevanti dwar sustanzi li dwarhom studju 
addizzjonali huma me ħtieġa jew li dwarhom l-ebda studji ma kienu twettqu. L- 
istrateġija tinkludi it-twettieq, l-ewwel ta' testijiet tal-validazzjoni u l-a ċċettazzjoni  
in vitro  jew  ex vivo , u imbag ħad il-metodu tat-test B.4 ta' studji dwar l- 
irritazzjoni/korro żjoni tal-ġilda skond i ċ-ċirkostanzi spe ċifiċi (3) (4).  
DESKRIZZJONI TA' L-ISTRATE ĠIJA GĦAL TESTIJIET PASS B'PASS  
Qabel ma jitwettqu t-testijiet b ħala parti mill-istrate ġija tat-testijiet sekwen żjali 
(il-Figura), l-informazzjoni disponibbli kollha g ħandha tkun evalutata g ħad-deter­
minazzjoni tal- ħtieġa tat-testijiet  in vivo  fuq l-għajnejn. G ħalkemm informazzjoni 
sinifikanti tista' tkun akkwistata mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (e ż. pH 
estrema), it-totalità ta' l-informazzjoni e żistenti għandha tkun assessjata. L- 
informazzjoni relevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza f'dak il-ka ż, u ta' l- 
analogi strutturali tag ħha, għandhom ikunu evalutati fit-te ħid tad-deċiżjoni ta' l- 
evidenza pe żata, u r-ra ġjunar għad-deċiżjoni għandu jkun ippre żentat. L-emfasi 
primarja g ħandha tkun fuq l-informazzjoni jmana u ta' l-annimali e żistenti 
risward is-sustanza, segwita bl-e żitu tat-testijiet  in vitro  jew  ex vivo . L-istudji  
in vivo  ta' sustanzi korrosivi g ħandhom ikunu evitati, kull meta jkun possibbli. 
Il-fatturi meqjusa g ħall-istrateġija tat-testijiet, jinkludu:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Evalwazzjoni ta' l-informazzjoni e żistenti, umana u ta' l-annimali (il-Pass 1).  
Informazzjoni e żistenti umana, e ż. studji klini ċi u okkupazzjonali, u rapporti 
dwar il-ka ż, u/jew informazzjoni minn testijiet fuq l-annimali minn studji 
okulari g ħandhom ikun ikkunsidrata b ħala l-ewwel ħaġa, minħabba li dawn 
jipprovdu informazzjoni relatata direttament ma l-effetti fuq l-g ħajnejn. Wara 
dan, l-informazzjoni disponibbli mill-istudji umani u/jew ta' l-annimali, li 
jinvestigaw korro żjoni/irritazzjoni dermali, g ħandhom ikunu evalutati. Sustanzi 
b'korrossività mag ħrufa jew ta' irritazzjoni severa, fuq l-g ħajnejn, m'g ħandhomx 
ikunu imdeffsa fuq l-g ħajnejn ta' l-annimali, u l-anqas m'g ħandhom is-sustanzi li 
juru effetti korrossivi jew irritanti fuq il- ġilda; tali sustanzi g ħandhom ikunu 
meqjusa b ħala korrossivi u/jew irritanti g ħall-għajnejn, ukoll. Sustanzi b'evidenza 
suffiċjenti ta' non-korrossività u non-irritazzjoni, minn studji okulari pre ċedenti 
diġa mwettqa, g ħandhom ukoll ma jkunux ittestjati fi studji  in vivo  fuq l- 
għajnejn.  
Analiżi tar-relazzjonijietta’ l-attività strutturali (SAR) (il-Pass 2) . Ir-riżultati tat- 
testijiet ta' kimika strutturalment relatata g ħandhom ikunu ikkunsidrati, jekk 
disponibbli. Meta informazzjoni, umana u/jew ta' l-annimali, suffi ċjenti, tkun 
disponibbli dwar sustanzi jew ta ħlitiet strutturalment relatati ta' tali sustanzi li 
jindikaw il-potenzal tal-korro żjoni/irristazzjoni ta' l-g ħajnejn, dan g ħandu jkun 
present li s-sustanza tat-test tkun sejra tipprodu ċi l-istess reazzjonijiet. F'dawk 
il-każi, is-sustanza ma jkunx hemm ħtieġa tat-test tag ħha. Informazzjoni negattiva 
mill-istudji tas-sustanzi strutturalment relatati jew minn ta ħlitiet ta' tali sustanzi 
ma tkunx tikkostitwixxi eviden ża suffiċjenti tan-non-korrosività/non-irrittabbilità 
ta' sustanza permezz ta' l-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali. Ir-resqien SAR validat 
u aċċettat għandu jkun u żat sabiex jidentifika l-korro żjoni u l-irrirtazzjoni 
potenzali kemm ta' l-effett dermali u wkoll okulari.  
Propjetajiet fi żikokimiċi u r-reattivazzjoni kimika (il-Passa 3).  Is-sustanzi li 
jesebixxu pH estremi b ħal ma huma ≤ 2,0 jew ≥ 11,5 jistg ħu ikollhom effetti 
lokali ferm qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-ba żi għall-identifikazzjoni ta' 
sustanza b ħala korrossiva jew irritanti g ħall-għajnejn, allura ir-riserva a ċida/­
alkalina tag ħha (il-kapa ċità mewwieta) tista' wkoll tkun ikkunsidrata (5) (6). 
Jekk il-kapa ċità mewwieta tissu ġġerixxi lki sustanza ma tistg ħax tkun korrossiva 
għall-għajnejn, allura aktar testijiet g ħandhom ikunu mwettqa sabiex jikkon ­
fermaw dan, preferibbilment bl-u żu ta' test  in vitro  jew  ex vivo  validat 
u aċċettat (ara s-sezzjoni, il-pass 5 u 6).  
Konsiderazzjoni ta' informazzjoni e żistenti oħra (il-Pass 4).  L-informazzjoni 
disponibbli kollha dwar it-tossi ċità sistematika permezz tar-rotta dermali 
għandha tkun evalutata f'dan l-istadju. It-tossi ċità dermali akuta tas-sustanza 
tat-test għandha wkoll tkun ikkonsidrata. Jekk is-susrtanza tat-test tkun uriet li 
hija ferm tossika bir-rotta dermali, din ma tkunx te ħtieġ li tkun ittestjata fl- 
għajnejn. G ħalkemm mhux bilfors li ne ċessarjament hemm relazzjoni bejn it- 
tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korro żjonu ta' l-g ħajnejn, dan jista' jkun 
preżent jekk a ġent li huwa ferm tossiku via ir-rotta dermali, dan ikun ukoll 
jesebixxi tossi ċità għolja meta jkun imqieg ħed fuq l-g ħajnejn. Tali informazzjoni 
tista' wkoll tkun ikkonsidrata bejn il-Passi 2 u 3.  
Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (il-Passi 5 u 6).  Is-sustanzi li jkunu 
wrew propjetajiet severi korrossivi jew irritanti f'test in  vitro  jew ex vivo  (7) (8) li 
jkunu ġew validati u a ċċettati għall-istudju spe ċifikament dwar il-kossossività/ ­
irritazzjoni ta' l-g ħajnejn jew tal- ġilda, ma je ħtieġx li jkunu ittestjati fuq l- 
annimali. Jista' jkun pre żent li tali sustanzi jkunu jipprodu ċu l-istess effetti 
severi  in vivo . Jekk it-testijiet  in vitro /ex vivo  validati u a ċċettati ma jkunux 
disponibbli, wie ħed għandu jevita il-Passi 5 u 6 u jippro ċiedi direttament 
għall-Pass 7.  
Assessjar ta' l-irritazzjoni jew tal-korro żjoni dermali in vivo tas-sustanza (il-Pass 
7). Meta evidenza mhux suffi ċjenti tkun te żisti li permezz tag ħha tista' titwettaq 
analiżi konklussiva ta' l-evidenza pe żata tal-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrossività 
ta' l-għajnejn minn sustanza, li tkun ibba żata fuq inforazzjoni mill-istudji elenkati 
hawn fuq, il-potenzal ta' l-irritazzjoni/korro żjoni in vivo  għandha l-ewwel tkun 
evalutata, bl-u żu tal-metodu B.4 (4) u ta' l-Anness li hemm mieg ħu (9). Jekk is- 
sustanza turi li tipprodu ċi korrożjoni jew irritazzjoni severa tal- ġilda, din g ħandha 
tkun ikkunsidrata b ħala li hija irritant korrossiv g ħall-għajnejn sakemm info ­
mazzjoni o ħra tkun tappo ġġja konklu żjoni alternattiva. B'hekk, it-test  in vivo  
fuq l-għajnejn ma jkunx hemm ħtieġa li jitwettaq. Jekk is-sustanza ma tkunx 
korrossiva jew severament irritanti g ħall-ġilda, it-test  in vivo  fuq l-għajnejn 
jenħtieġ li jkun imwettaq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Test in vivo fuq il-fniek (il-Passi 8 u 9):  Testijiet okulari  in vivo  għandhom ikunu 
mibdija b'test inizjali li ju ża annimali wie ħed. Jekk ir-ri żultati ta' dan it-test 
jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva g ħall-għajnejn, 
aktar testiet ma jkunx me ħtieġa. Jekk dak it-test ma ji żvelax xi effetti korrossivi 
jew severi, test konfermatorju ikun imwettaq b' żewġ annimali o ħrajn. 
REFERENZI  
(1) Programm ta' Linji ta' Gwida g ħat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal- 
Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-A ċċet­
tazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi g ħal-Testijiet Tossikolo ġiċi. Li 
inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www1.oecd.org/ 
ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli 
għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumi ċi, kif 
approvat mit-28 Laqg ħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' 
Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.  
(4) Metodu tat-testijiet B.4. Tossi ċità akuta: Irritazzjoni/korru żjoni dermali.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227- 
231. 
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet  in vitro  għall-korros ­
sività tal- ġilda. 2. Ir-ri żultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv 
Toxicology  in vitro  12, pp. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figura  
STRATE ĠIJA G ĦAT-TESTIJIET U L-EVELWAZZJONL LA' L-LRRL 
LAZZJONI/KORRO ŻJONI DERM ALL
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. TOSSI ĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRU ŻJONI TA' L- 
GĦAJNEJN  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalnti g ħal OECD TG 405 (2002)  
1.1 INTRODUZZJONI  
Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu a ġġornat, attenzjoni spe ċjali 
kienet mog ħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li 
jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-inform ­
azzjoni e żistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu 
evitati testijiet ming ħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il- 
metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn 
deskritt g ħat-est  in vivo  dwar il-korru żjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, 
l-analiżi ta' l-evidenza pe żata għandu jkun imwettaq (1) skond id- 
dettalji relevanti e żistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux 
suffiċċjenti, dawn jistg ħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni 
ta' testijiet sekwenzali (2)(3). L-istrate ġija tat-testijiet tinkludi it- 
twettieq ta' testijiet validati u a ċċettabbli ta'  in vitro  u kemm prov ­
vediment dwarha b ħala Anness ta' dan il-metodu. B' żieda, l-użu tat- 
test in vivo  ta' l-irritazzjoni/korru żjoni dermali, sabiex ikun hemm 
tbassir tal-korru żjoni ta' l-g ħajnejn qabel il–kunsiderazzjoni tat-test  
in vivo  ta' l-għajnejn, huwa rakkommandabbli.  
Fl-interess kemm ta' xjenza g ħaqlija u tal- ġid ta' l-annimali, testijiet  
in vivo  m'għandhomx ise ħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli 
kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal- ġilda mis- 
sustanza jkunu ġew evalwati b'anali żi tal-peżar bl-evidenza. Tali 
dettalji g ħandhom jinkludu evidenza minn studju e żistenti kemm 
fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' 
korrossività/irritazzjoni ta' sustanza wa ħda struttarament relatati u 
it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru a ċidità jew alkalinità 
qawwija tas-sustanza (4) (5), u r-ri żultati minn testijiet validati u 
aċċettati kemm  in vitro  jew ex vivo  (6) (6a). L-istudji setg ħu kienu 
ġew imwettqa pre ċedentament g ħal, jew bħala riżultat ta', l-anali żi ta' 
l-evidenza pe żata. 
Għal-ċerti sustanzi, tali anali żi tista’ tindika l- ħtieġa għal studji  in 
vivo dwar il-potenzal tas-sustanza g ħal korrożjoni/irritazzjoni okulari. 
F'tali każi, qabel ma jkun ikkunsidrat l-u żu tat-test  in vivo  fuq l- 
għajnejn, studju preferibbilemt  in vivo  ta' l-effetti dermali mis- 
sustanza g ħandu jkun l-ewwel nett imwettaq u evalwat bi qbil 
mal-metodu tat-testijiet B.4 (7). L-applikazzjoni ta' l-anali żi ta' l- 
evidenża peżata u ta' l-istrate ġija sekwenzali tat-testijiet g ħandhom 
inaqqsu l- ħtieġa tat-testijiet  in vivo  dwar il-korrossività/irritazzjoni ta' 
l-għajnejn mis-sustanza li dwarha evidenza suffi ċjenti tkun di ġa 
teżisti minn studju o ħrajn. Jekk id-determinazzjoni tal-potenzal tal- 
korrożjoni jew l-irritazzjoni ta' l-g ħajnejn ma tistg ħax issir bl-istra ­
teġija tat-testijier sekwenzali, anki wara t-twettieq ta' studju  in vivo  
tal-korrożjoni u l-irritazzjoni dermali, test in  vivo  tal-korro żjoni/­
irritazzjoni ta' l-g ħajnejn jista’ jkun imwettaq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta' 
testijiet validati u a ċċettabbli,  in vitro  jew  ex vivo , dwar il- 
korrożjoni/irritazzjoni, hija inklu ża bħala Anness g ħal dan il- 
metodu. L-istrate ġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod 
unanimu, mill-parte ċipanti ta' laqg ħa ta' studju ta' l-OECD (8), u 
kienet ġiet adottata b ħala l-istrate ġija rakkommandata tat-testijiet 
fis-Sistema Armonizzata Globali g ħall-Klassifika ta' Sustanzi 
Kimiċi (GHS) (9). Huwa rakkommandabbli li din l-istrate ġija tat- 
testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet  in vivo . Għal 
sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass 
b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il- 
korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. G ħal sustanzi e żistenti b'inform ­
azzjoni mhux suffi ċjenti dwar il-korro żjoni/irritazzjoni tal- ġilda, l- 
istrateġija għanha tkun u żata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad- 
dettalji. L-u żu ta' strate ġija jew pro ċedura differenti tat-testijiet, jew 
ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, g ħandha tkun 
ġustifikata.  
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Irritazzjoni g ħal għajnejn:  Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil- 
għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal- 
part esterna ta' l-g ħajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 
21 jum mill-applikazzjoni.  
Korrożjoni ta' l-g ħajnejn:  Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil- 
għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal- 
part esterna ta' l-g ħajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 
21 jum mill-applikazzjoni.  
1.3 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test hija applikata f'do ża singola ma wa ħda mill- 
għajnejn ta' l-annimal tal-prova; l-g ħajn mhux trattata isservi b ħala 
kontroll. Il-grad ta' l-irritazzjoni/korro żjoni ta' l-g ħajn huwa evalwat 
billi jkunu immarkati l-feriti ta' kon ġunktiva, l-kornea, u l-iris, matul 
intervalli spe ċifiċi. Effetti o ħrajn fil-għajn u l-effetti kuntrarji siste ­
matiċi huma wkoll deskritti sabiex jipprovdu evalwazzjoni s ħiħa ta' 
l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju g ħandu jkun suffi ċjenti sabiex 
tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l- 
effetti osservati.  
L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew u ġiegħ severi, fi 
kwalunkwe waqt tat-test, g ħandhom ikunu maqtula b'mod umani ­
tarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali 
moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstg ħab fir-referenza (10).
 
1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1  Preparazzjoni tat-test  in vivo  
1.4.1.1  L-għażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek 
żgħażagħ adulti huma u żati. Ir-raġuni għall-użu ta' spe ċje oħrajn 
għandha tkun mog ħtija. 
1.4.1.2  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Iż-żewġ għajnejn ta' kull annumal sperimentali provi żjonalment 
magħżul għat-testijiet g ħandu jkun e żaminat fi żmien 24 sieg ħa 
qabel ma jibda t-test. L-annimali li juru irritazzjoni fl-g ħajnejn, 
difetti okulari, jew li ħsara korneali pre-e żistenti m'g ħandhomx 
ikunu użati. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
L-annimali g ħandhom jinzammi f'ga ġġeġ individwali. It-temperatura 
tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 20  o C (± 3  o C), 
għall-fniek. G ħalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill-anqas 
30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif 
tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. 
Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu ikunu 
użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb.  
1.4.2  Pro ċedura tat-test  
1.4.2.1  L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test  
Is-sustanza tat-test g ħandha tkun imqieg ħda fuq il- ħofra konġunk­
tivali ta' wa ħda mill-g ħajnejn ta' kull annimal wara li l-g ħatu tan- 
naħa t'isfel ta' l-g ħajn ikun in ġibed lil himm mill-bo ċċa ta' l-għajn. Il- 
għotjien jkunu imbag ħad b'ġentilezza mi żmuma flimkien g ħal 
madwar sekonda sabiex ikun prevenut it-telf tal-materjal. L-g ħajn 
l-oħra, li tibqa ming ħajr trattament, isservi b ħala kontroll.  
1.4.2.2  Irrigazzjoni  
L-għajnejn ta' l-annimali tat-test m'g ħandhomx ikunu ma ħsula għal 
mill-anqas 24 sieg ħa wara li tkun saret l-istallazzjoni tas-sustanza tat- 
test, apparti milli fil-ka ż ta' solidi (ara s-sezzjoni 1.4.2.3.2), u fil-ka ż 
ta' effetti korrossivi jew irritanti immedjati. Wara 24 sieg ħa, hasla 
sewwa tista’ ssir jekk dan ikun meqjus b ħala xieraq.  
L-użu ta' grupp satellit ta' annimali g ħall-inverigazzjoni ta' l- 
infuwenza tal- ħasil mhux rakkommandabbi, sakemm ma jkunx 
xjetifikament ġustifikat. Jekk grupp satellit ikun me ħtieġ, 
għandhom ikunu u żati żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal- ħasil 
gġandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, e ż. il-ħiun tal-ħasil; il- 
komposizzjoni u t-temperatura tat-ta ħlita tal-ħasil; it-tul ta' żmien, 
il-volum, u l-velo ċità ta' l-applikazzjoni.  
1.4.2.3  Livell tad-do ża 
1.4.2.3.1  It-testijiet tal-likwidi  
Għat-testijiet tal-likwidi, do ża ta' 0,1 ml hija u żata. Tbexxix bil- 
pompa m'g ħandux ikunu u żat għall-istallazzjoni diretta ġewwa il- 
għajn. It-tbexxix tal-likwidu g ħandu jkun imne ħħi u miġbur f'kon ­
tenitur qabel ma jkun installat 0,1 ml ġewwa l-g ħajn. 
1.4.2.3.2  Testijiet tas-solidi  
Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, dlik, u sustanzi partikolati, l-ammont 
użat għandu jkollu volum ta' 0,1 ml jew ġiż ta' mhux aktar minn 
100 mg. Il-materjal tat-test g ħandu jkun mit ħun fi trab fin. Il-volum 
tal-materjal solidu g ħandu jkun imkejjel wara li jkun kumpatt 
b'ġentilezza, e ż. bit-tektik tal-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza 
solida tat-test ma tkun ġiet imneħħija mill-g ħajn ta' l-annimal tat- 
tesr b'mekkani żmi fiżjoloġiċi waqt l-ewwel punt fil- ħin ta' l-osse ­
razzjoni ta' sieg ħa wara t-trattament, il-g ħajn tista’ tkun imla ħalħa 
b'ilma bil-mel ħ jew distillat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Testijiet ta' aerosols  
Huwa rakkommandat li t-tbexxix kollu bil-pompa u l-aerosols ikun 
miġbur qabel l-istallazzjoni ġewwa l-g ħajn. L-eċċezzjoni wa ħda hija 
għas-sustanzi f'kontenituri aerosol ta ħt pressjoni, li ma jistg ħux ikunu 
miġbura min ħabba l-vaporizzazzjoni. F'tali ka żi, l-għajn għandha 
tinżamm miftu ħha, u s-sustanza tat-test somministrata fuq l-g ħajn 
bi spunt wie ħed għal madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm, 
direttament minn quddiem il-g ħajn. Din id-distanza tista’ tvarja 
jiddependi mill-pressa tat-tbexxix u l-kontenuti. Kura g ħandha 
tittieħed li ma ssirx ħsara lill-g ħajn mill-pressa tat-tbexxix. F'ka żi 
xierqa, jista’ jkun hemm il- ħtieġa li jkun evalutat il-potenzal dwar 
ħsara “mekkaanika” ta' l-g ħajn mill-qawwa tat-tbexxix.  
Estimi tad-do ża minn aerosol jistg ħu isiru bit-test tas-simulazzjoni kif 
ġej: Is-sustanza hija mbexxa fuq karta ta' l-u żin minn fet ħa d-daqs ta' 
għajn ta' fenek imqieg ħda direttament qabel il-karta. I ż-żieda fil-pi ż 
tal-karta hija u żata sabiex ikun ikkalkolat l-ammont imbexxex fuq il- 
għajn. Għal sustanzi volatili, id-do ża tista’ tkun ikkalkolata bl-u żin 
ta' kontenitur ri ċevitur qabel u wara t-tne ħħija tal-matyerjal tat-test.  
1.4.2.4  It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korro żjoni ta' l-g ħajn bl- 
użu ta' annimal wie ħed) 
Kif spjegat fl-istrate ġija sekwenzali tat-testijiet (ara l-Anness 1), 
huwa ferm rakkommandabbli li t-test  in vivo  ikun imwettaq iniz ­
jalment bl-u żu ta' annimal wie ħed. 
Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament 
irritanti jew korrosiva g ħall-għajnejn bl-u żu tal-proċedura deskritta, 
aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari ma jkunx me ħtieġa. 
1.4.2.5  Anastesija lokali  
L-anastesija lokali tista’ tkun u żata fuq il-ba żi ta' każ b'każ. Jekk l- 
analiżi ta' l-evidenza pe żata jindika li s-sustanza jkollha l-potenzal li 
tikkaġuna l-uġiegħ, jew jekk test inizzjali juri li reazzjoni ta' u ġiegħ 
tkun tirriżulta, anastesija lokali tista’ tkun u żata qabel l-istallazzjoni 
tas-sustanza tat-test. It-tip, il-kon ċentrazzjoni, u d-do ża ta' l-anastesija 
lokali għandhom ikunu mag ħżula bir-reqqa sabiex jassiguraw li d- 
differenzi fir-reazzjoni g ħas-sustanza tat-test ma jkunux jirri żultaw 
mill-użu tiegħu. Il-għajn tal-kontrol g ħandha bl-istess mod tkun 
anastetizzata.  
1.4.2.6  Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni ta' l-g ħajn b'an­
nimali addizzjonali)  
Jekk effett korrossic ma jkunx osservat fit-test inizjali, ir-reazzjoni 
irritanti jew negattiva g ħandha tkun ikkonfermata bl-u żu ta' sa żewġ 
annimali addizzjonali. Jekk effett irritanti sever ikun osservat fit-test inizjali li jindika l-possibbiltà ta' effett qawwi (mhux riversibbli) fit- testijiet konformatorji, huwa rakkommandat li t-test konformatorju 
jkun imwettaq b'manjera sekwenzali fuq annimal wie ħed kull 
darba, pjuttost milli l-espo żizzjoni ta' żewġ annimali b'mod simul ­
tanju. Jekk it-tieni annimal ji żvela effetti severi korrossivi jew irri ­
tanti, it-test m'g ġandux jitkompla. Annimali addizzjonali jistg ħu 
ikunu me ħtieġa sabiex jikkonfermaw ir-reazzjonijiet ħfief jew 
moderati ta' l-irritant.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Perijodu ta' osservazzjoni  
It-tul ta' żmien ta' l-istudju g ħandu jkun suffi ċjenti sabiex tkun 
evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. B'dana kollum l-esperiment g ħandu jkun terminat fi 
kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' 
uġiegħ jew tbag ħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti 
riversibbli, l-annimali g ħandhom ikunu osservati normalment g ħal 
21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Jekk l-irriver ­
sibbiltà tkun osservata qabel l-21 jum, l-esperiment g ħandu jkun 
imwaqqaf f'dak il-waqt.
 
1.4.2.7.1  Osservazzjonijiet klini ċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet ta' l-g ħajn 
L-għajnejn għandhom ikunu e żaminati fi 1, 24, 48 u 72 sieg ħa wara 
l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. L-annimali g ħandhom jin żammu 
fit-test mhux aktar milli me ħtieġ la darba informazzjoni definita tkun 
ġiet akkwistata. L-annimali li juru kon tinwament u ġiegħ u tbagħtija 
severa għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk, ming ħajt dewmien, 
u s-sustana tkun assessjata kif applikabbli. L-annimali b'dawn il-feriti 
ta' l-għajnejn wara li jkun kellhom l-istallazzjoni g ħandhom ikunu 
maqtula b'mod umanesk: Xi toqba fil-kornea jew ul ċera sinifikanti 
tal-kornea, inklu ża s-stafiloma; demm fil-parti anterjuri ta' l-g ħajn; 
opaċità grad 4 tal-kornea li tippersisti g ħal 48 siegha; nuqqas ta' 
reazzjoni g ħad-dawl (nuqqas ta' reazzjoni radiali grad 2) li tippersisti 
għal 72 siegha; ul ċera fil-membrana konjunktivali; nekro żi tal- 
membrana konjunktivali jew niktitanti; jew qoxra mejta. Dan huwa 
minħabba l-fatt li tali feriti, ġeneralment, ma humiex riversibbli.  
L-annimali li ma ji żviluppawx feriti okulari jistg ħu ikunu mne ħħija 
mhux aktar kmieni minn 3 ijiem wara l-istallazzjoni. L-annimali b'feriti ħfief jew moderati g ħandhom ikunu osservati sakemm il- 
ferita tkun fieqet, jew g ħal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun 
terminat. L-osservazzjonijiet g ħandhom ikunu mwettqa fi 7, 14, u 
21 jum sabiex ikun determinat l-istat tal-feriti, u r-riversabbiltà jew in-non-riversabbiltà tag ħhom.
 
Il-gradi tar-reazzjoni okkulati (kon ġunktiva, kornea u iris) g ħandhom 
ikunu irre ġistrati wara kull e żami (Tabella I). Xi feriti o ħrajn ta' l- 
għajnejn (e ż. imtappna, imtebba) jew effetti ħżiena sistemati ċi 
għandhom ukoll ikunu rrapurtati.  
L-eżami tar-reazzjonijiet jistg ħu ikunu fa ċilitati bl-u żu tal-loupe 
binokulari, lampa-maqsuma ta' l-idejn, biomikroskopju, jew xi 
apparat ie ħor xieraq. Wara r-re ġistrazzjoni ta' l-osservazzjoni fi 24 
siegħa, il-għajnejn jistg ħu wkoll ikunu e żaminati bil-g ħajnuna tal- 
florixxin.  
Il-gradar tar-reazzjonijiet okulari hija ne ċċessarjament su ġġestiva. 
Sabiex tkun im ħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni 
okulari u sabiex ikunu mg ħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk 
involuti fi ż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni 
tagħhom, il-persunall li jwettaq l-osservazzjonijiet je ħtieġu li jkunu 
adekwatament im ħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif u żata ara t- 
Tabella ta' hawn ta ħt). 
2. DATA  
2.2 EVALWAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali g ħandhom ikunu evalwati b'kon ­
nessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità 
tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma 
jkunux jirrapre żentaw norma assoluta g ħall-propjetajiet irritanti ta' xi 
materja, min ħabba li effetti o ħrajn tal-materjal tat-test huma wkoll 
evalwati. Minflok, il-marki individwali g ħandhom ikunu riveduti 
bħala valuri ta' referenza u jag ħmlu sens biss meta jkunu sostnuti 
b'deskrizzjoni s ħiħa u l-evalwazzjoni ta' l-osservazzjonijiet kollha.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1 RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Raġunar dwar it-test  in vivo : Analiżi ta' l-evidenza pe żata ta' inform ­
azzjoni pre-e żistenti qabel it-test, inklu żi r-riżultati minn strate ġija ta' 
testijiet sekwenzali:  
— deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet 
preċedenti;  
— informazzjoni akkwistat f'kull stadju ta' l-istrate ġija ta' l-ittestjar;  
— deskrizzjoni tat-testijiet  in vitro  kif imwettqa, inklu żi d-dettalji 
tal-proċeduri, ir-ri żultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;  
— deskrizzjoni ta' l-istudju  in vivo  dwar l-irritazzjoni/korro żjoni 
dermali li jkun ġie mwettaq, inklu żi r-riżultati akkwistati;  
— analiżi ta' l-evidenza pe żata għat-twettieq ta' l-istudju  in vivo  
Is-sustanza tat-test:  
— dettalji ta' l-identifikazzjoni (e ż. numru CAS; sorsi; purità; 
impuritajiet mag ħrufa; n-numru tal-lot);  
— in-natura fi żika u l-propjetajiet fi żikokimiċi (eż. pH, volatilità, 
solubilità, stabbilità, reattività fl-ilma);  
— jekk ta ħlita, il-komposizzjoni u l-persenta ġġi relattivi tal-kompo ­
nenti;  
— jekk anastesija lokali tkun ġiet użata, l-identifikazzjoni, il-purità, 
it-tip, id-do ża, u l-potenzal ta' interazzjoni mas-sustanza tat-test.  
Mezz:  
— l-identifikazzjoni, il-kon ċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum u żat; 
— il-ġustifikazzjoni tal-mezz u żat. 
Annimali tat-test:  
— l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta' l-annimali apparti milli 
fniek albino;  
— l-età ta' kull annimal fil-bidu ta' l-istudju;  
— in-numru ta' l-annimali ta' kull sess u żati fit-test u fil-grupp ta' 
kontroll (jekk me ħtieġ); 
— il-piżijiet ta' l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil- 
konklużjoni tat-test;  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, e ċċ. 
Riżultati:  
— deskrizzjoni tal-metodu u żat biex tkun immarkata l-irritazzjoni 
f'kull ħil ta' l-osservazzjoni (e ż. lampa maqsuma ta' l-idejn, 
bimikroskopju, florexxin);  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni dwar l-irritamnt/korrosiv 
għal kull annimali f'kull ħin ta' l-osservazzjoni jew sa kemm 
kull animal ikun tne ħħa mit-test;  
— deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura ta' l-irritazzjoni jew tal- 
korrożjoni osservata;  
— deskrizzjoni ta' xi ferita o ħra osservata fil-g ħajn (eż. vaskulariz ­
zazzjoni, formazzjoni imtappna, wa ħħalija, tgħagħjja); 
— deskrizzjoni ta' effetti ħżiena mhux okulari, lokali u sistemati ċi, u 
s-sejbiet ħistopatolo ġiċi, jekk ikun hemm.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
3.2 INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
L-estrapolazzjoni tar-r żultati ta' l-istudji dwar l-irritazzjoni ta' l-g ħajn 
li jkun twettqu fuq l-annimali tal-laboratorju lejn bnedmin umani hija 
valida biss sa grad limitat. F' ħafna każi, il-fenek albimo huwa iktar 
sensittiv mill-bnedmin dwar l-irritanti okulari jew g ħall-korrossivi.  
Attenzjoni g ħandha ting ħata fl-interpretazzjoni tad-dettalji sabiex 
tkun esklu ża xi irritazzjoni li tirri żulta minn infezzjoni sekondarja.  
4. REFERENZI  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19-26.
 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
 
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet  in vitro  għall-korrossività tal- ġilda. 2. Ir- 
riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxi ­
cology  in vitro  12, pp. 483–524.
 
(6a) Metodu tat-test B.40, Korro żjoni tal-Ġilda 
(7) Metodu tat-testijiet B.4. Tossi ċità akuta Irritazzjoni/korru żjoni 
dermali.  
(8) Programm ta' Linji ta' Gwida g ħat-Test OECD (1996): Rapport 
Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal- Validazzjoni u l-A ċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alter ­
nattivi għal-Testijiet Tossikolo ġiċi. Li inżamm fi Solna, l- 
Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www.oecd.org/ehs/test/ 
background.htm).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata 
tal-Perikoli g ħas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas- 
Sustanzi Kumi ċi, kif approvat mit-28 Laqg ħa Konġunta tal- 
Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, 
Novembru 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).  
(10) Dokument ta' Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l- 
Użu ta' Sinjali Klini ċi bħala għanijiet finali umanitarji g ħall- 
annimali Sperimenti U żati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, 
Pubblikazzjonijiet dwar is-Sa ħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje 
dwar it-Testijiet u l-Istudju Nru. 19 (http://www.oecd.org/ehs/ 
test/monos.htm).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabella I  
L-IGGRADAR TAL-FERITI OKULARI  
Il-kornea  
L-opaċità: il-grad ta’ densità (il-qari g ħandu jsittie ħed mill-iktar żona densa) (*) 
L-ebda ul ċerazzjoni jew opa ċità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Żoni mferrxa jew diffu żi ta’ opaċità (minnbarra l-oskurità ħafifa jew il- 
leqqa normali); id-dettaliji ta’ l-iris huma vi żibbli sew . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Żona transluscent  li tidher fa ċilment; id-dettalji ta’ l-iris kemmxejn 
imdallma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Żona nacrous ; l-ebda dettal ta’ l-iris ma jidher; id-daqs tal-pupill 
bilkemm jidher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Kornea opaka; l-iris ma tidhirx mill-opa ċità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Il-massimu possibbli: 4  
NOTI  
(*) Iż-żona ta’ l-opa ċità tal-kornea trid ti ġi nnutata  
L-iris  
Normali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . 0 
Tikmix fond, kon ġestjoni, infi ħ, circumcorneal hyperaemia  ħafifa; Jew 
l-injezzjoni; l-iris li tirrea ġixxi għad-dawl (reazzjoni g ħajjiena hija 
meqjusa b ħala effetts) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Emoraġġija, ħsara grossa, jew l-ebda reazzjoni g ħad-dawl . . . . . . . . . . . 2  
Il-massimu possibbli: 2  
Conjunctivae  
Il-ħmura (tirreferi g ħall- conjunctivae palpebrali u bulbari; il-kornea u l-iris huma 
esklużi) 
Normali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . 0 
Xi vini tad-demm  hyperaemic  (injettati) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Diffuż, kulur aħmar skur; il-vini individwali ma jidhrux fa ċilment . . . 2 
Diffuż aħmar mimli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3  
Il-massimu possibbli: 3  
Chemosis  
l-infiħ (jirreferi g ħall-kpiepel u/jew il-membrani li ji ċċaqalqu) 
Normali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . 0 
Xi nfiħ iktar min-normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Infiħ ovvju, b’aver żjoni parzjali tal-kpiepel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
L-infiħ, bil-kpiepel kwa żi nofshom mag ħluqin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
L-infiħ, bil-kpiepel iktar minn nofshom mag ħluqin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Il-massimu possibbli: 4  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
ANNESS  
Strateġija ta' testijiet Sekwenzali dwar l-Irritazzjoni u l-Korro żjoni ta' l- 
Għajnejn  
KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI  
Fl-imnteressi ta' xjenza soda u l- ġid ta' l-annimali, huwa importanti li jkun evitat 
l-użu bla bżonn ta' l-annimali, u jkun imnaqqas it-testjar li aktar jipprodu ċi 
reazzjonijiet serveri fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza relatata mal-potenzal tag ħha ta' l-irritazzjoni/korro żjoni okulari g ħandha tkun evalwata 
bil-quddiem qabel ma jkunu ikkonsidrati t-testijiet  in vivo . Evidenza suffi ċjenti 
tista' tkun di ġa teżisti sabiex tikklassifika sustanza tat-test dwar l-irritazzjoni ta' l- 
għajnejn jew tal-potenzal tal-korro żjoni ming ħajr il-ħtieġa li jkunu mwettqa 
testijiet fuq l-annimali tal-laboratorju. G ħalhekk, l-utilizzsazzjoni ta' l-anali żi 
peżata bl-evidenza u l-istrate ġija sussegwenti tat-testijiet g ħandha tnaqqas il- 
ħtieġa ta' testijiet  in vivo , speċjalemnt jekk is-sustanza aktarx li tipprodu ċi 
reazzjonijiet severi.
 
Huwa rakkommandabbli li l-anali żi ta' l-evidenza pe żata tkun u żata għall-eval­
wazzjoni ta' l-informazzjoni e żistenti li tappartieni g ħas-sustanzi ta' l-irritazzjoni 
u l-korro żjoni ta' l-g ħajnejn u sabiex tiddetermina jekk studju addizzjonali, 
apparti milli l-istudji  in vivo  fuq l-għajnejn, għandhom ikun u mwettqa sabiex 
jgħinu dwar il-karatteristi ċi ta' tali potenzal. Meta aktar studji huma me ħtieġa, 
huwa rakkommandabbli li l-istrate ġija ta' testijiet sekwenzali tkun utilizzata sabie 
tiżviluppa d-dettalji sperimentali relevanti. G ħal sustanzi li ma jkollhom l-ebda 
storja ta' testijiet, l-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali g ħandha tkun utilizzata 
sabiex ji żviluppa l-informazzjoni me ħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korro żjoni/­
irritazzjoni tag ħha fuq l-g ħajnejn. L-istrate ġija tat-testijiet deskritta f'dan l- 
Anness kienet ġiet żviluppata minn grupp ta' ħidma tal-OECD (1). Kienet susseg ­
wentament ikkonfermata u mkabbra fis-sistema tal-Klassifa Armonizzata 
Integrata dwar is-Sa ħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kimi ċi, kif 
ikkonfermata bit-28 Laqg ħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimi ċi u tal-Grupp ta' 
Ħidma dwar il-Kimi ċi, f'Novembru 1998 (2).  
Għalkemm din l-istrate ġija tat-testijiet mhix parti integrali tal-metodu tat-testijiet 
B.5, din tesprimi r-resqien rakkommandat g ħad-determinazzjoni tal-propjetajiet ta' 
l-irritazzjoni/korro żjoni ta' l-g ħajnejn. Dan ir-resqien jirrapre żenta kemm l-a ħjar 
prassi u l-mira etika dwar testijiet  in vivo  ta' l-irritazzjoni korro żjoni ta' l- 
għajnejn. Il-metodu tat-testijiet jipprovdi gwida g ħat-twettieq tat-test  in vivo  
u sommarji u fatturi li g ħandhom ikunu ndirizzati qabel ma jkun ikkonsidrat 
tali test. L-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali tipprovdi r-resqien ta' l-evidenza 
peżata għall-evalwazzjoni ta' informazzjoni e żistenti dwar il-propjetajiet ta' l- 
irritazzjoni/kjorro żjoni ta' l-g ħajnejn, ta'sustanza, u tar-resqien imtarra ġ għall- 
ġenerazzjoni ta' l-informazzjoni relevanti dwar sustanzi li dwarhom studju 
addizzjonali huma me ħtieġa jew li dwarhom l-ebda studji ma kienu twettqu. L- 
istrateġija tinkludi it-twettieq, l-ewwel ta' testijiet tal-validazzjoni u l-a ċċettazzjoni  
in vitro  jew  ex vivo , u imbag ħad il-metodu tat-test B.4 ta' studji dwar l- 
irritazzjoni/korro żjoni tal-ġilda skond i ċ-ċirkostanzi spe ċifiċi (3) (4).  
DESKRIZZJONI TA' L-ISTRATE ĠIJA GĦAL TESTIJIET PASS B'PASS  
Qamel ma jitqettqu t-testijiet b ħala parti mill-istrate ġija tat-testijiet sekwen żjali 
(il-Figura), l-informazzjoni disponibbli kollha g ħandha tkun evalutata g ħad-deter­
minazzjoni tal- ħtieġa tat-testijiet  in vivo  fuq l-għajnejn. G ħalkemm informazzjoni 
sinifikanti tista' tkun akkwistata mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (e ż. pH 
estrema), it-totalità ta' l-informazzjoni e żistenti għandha tkun assessjata. L- 
informazzjoni relevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza f'dak il-ka ż, u ta' l- 
analogi strutturali tag ħha, għandhom ikunu evalutati fit-te ħid tad-deċiżjoni ta' l- 
evidenza pe żata, u r-ra ġjunar għad-deċiżjoni għandu jkun ippre żentat. L-emfasi 
primarja g ħandha tkun fuq l-informazzjoni jmana u ta' l-annimali e żistenti 
risward is-sustanza, segwita bl-e żitu tat-testijiet  in vitro  jew  ex vivo . L-istudji  
in vivo  ta' sustanzi korrosivi g ħandhom ikunu evitati, kull meta jkun possibbli. 
Il-fatturi meqjusa g ħall-istrateġija tat-testijiet, jinkludu:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Evalwazzjoni ta' l-informazzjoni e żistenti, umana u ta' l-annimali (il-Pass 1).  
Informazzjoni e żistenti umana, e ż. studji klini ċi u okkupazzjonali, u rapporti 
dwar il-ka ż, u/jew informazzjoni minn testijiet fuq l-annimali minn studji 
okulari g ħandhom ikun ikkunsidrata b ħala l-ewwel ħaġa, minħabba li dawn 
jipprovdu informazzjoni relatata direttament ma l-effetti fuq l-g ħajnejn. Wara 
dan, l-informazzjoni disponibbli mill-istudji umani u/jew ta' l-annimali, li 
jinvestigaw korro żjoni/irritazzjoni dermali, g ħandhom ikunu evalutati. Sustanzi 
b'korrossività mag ħrufa jew ta' irritazzjoni severa, fuq l-g ħajnejn, m'g ħandhomx 
ikunu imdeffsa fuq l-g ħajnejn ta' l-annimali, u l-anqas m'g ħandhom is-sustanzi li 
juru effetti korrossivi jew irritanti fuq il- ġilda; tali sustanzi g ħandhom ikunu 
meqjusa b ħala korrossivi u/jew irritanti g ħall-għajnejn, ukoll. Sustanzi b'evidenza 
suffiċjenti ta' non-korrossività u non-irritazzjoni, minn studji okulari pre ċedenti 
diġa mwettqa, g ħandhom ukoll ma jkunux ittestjati fi studji  in vivo  fuq l- 
għajnejn.  
Analiżi tar-relazzjonijietta’ l-attività strutturali (SAR) (il-Pass 2 ). Ir-riżultati tat- 
testijiet ta' kimika strutturalment relatata g ħandhom ikunu ikkunsidrati, jekk 
disponibbli. Meta informazzjoni, umana u/jew ta' l-annimali, suffi ċjenti, tkun 
disponibbli dwar sustanzi jew ta ħlitiet strutturalment relatati ta' tali sustanzi li 
jindikaw il-potenzal tal-korro żjoni/irristazzjoni ta' l-g ħajnejn, dan g ħandu jkun 
present li s-sustanza tat-test tkun sejra tipprodu ċi l-istess reazzjonijiet. F'dawk 
il-każi, is-sustanza ma jkunx hemm ħtieġa tat-test tag ħha. Informazzjoni negattiva 
mill-istudji tas-sustanzi strutturalment relatati jew minn ta ħlitiet ta' tali sustanzi 
ma tkunx tikkostitwixxi eviden ża suffiċjenti tan-non-korrosività/non-irrittabbilità 
ta' sustanza permezz ta' l-istrate ġija tat-testijiet sekwenzali. Ir-resqien SAR validat 
u aċċettat għandu jkun u żat sabiex jidentifika l-korro żjoni u l-irrirtazzjoni 
potenzali kemm ta' l-effett dermali u wkoll okulari.  
Propjetajiet fi żikokimiċi u r-reattivazzjoni kimika (il-Passa 3).  Is-sustanzi li 
jesebixxu pH estremi b ħal ma huma ≤2.0 jew ≥11.5 jistg ħu ikollhom effetti 
lokali ferm qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-ba żi għall-identifikazzjoni ta' 
sustanza b ħala korrossiva jew irritanti g ħall-għajnejn, allura ir-riserva a ċida/­
alkalina tag ħha (il-kapa ċità mewwitea) tista' wkoll tkun ikkunsidrata (5) (6). 
Jekk il-kapa ċità mewwieta tissu ġġerixxi lki sustanza ma tistg ħax tkun korrossiva 
għall-għajnejn, allura aktar testijiet g ħandhom ikunu mwettqa sabiex jikkon ­
fermaw dan, preferibbilment bl-u żu ta' test  in vitro  jew  ex vivo  validat 
u aċċettat (ara s-sezzjoni, il-pass 5 u 6).  
Konsiderazzjoni ta' informazzjoni e żistenti oħra (il-Pass 4).  L-informazzjoni 
disponibbli kollha dwar it-tossi ċità sistematika permezz tar-rotta dermali 
għandha tkun evalutata f'dan l- istadju. It-tossi ċità dermali akuta tas-sustanza 
tat-test għandha wkoll tkun ikkonsidrata. Jekk is-susrtanza tat-test tkun uriet li 
hija ferm tossika bir-rotta dermali, din ma tkunx te ħtieġ li tkun ittestjata fl- 
għajnejn. G ħalkemm mhux bilfors li ne ċessarjament hemm relazzjoni bejn it- 
tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korro żjonu ta' l-g ħajnejn, dan jista' jkun 
preżent jekk a ġent li huwa ferm tossiku via ir-rotta dermali, dan ikun ukoll 
jesebixxi tossi ċità għolja meta jkun imqieg ħed fuq l-g ħajnejn. Tali informazzjoni 
tista' wkoll tkun ikkonsidrata bejn il-Passi 2 u 3.  
Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (il-Passi 5 u 6).  Is-sustanzi li jkunu 
wrew propjetajiet severi korrossivi jew irritanti f'test in  vitro  jew ex vivo  (7) (8) li 
jkunu ġew validati u a ċċettati għall-istudju spe ċifikament dwar il-kossossività/ ­
irritazzjoni ta' l-g ħajnejn jew tal- ġilda, ma je ħtieġx li jkunu ittestjati fuq l- 
annimali. Jista' jkun pre żent li tali sustanzi jkunu jipprodu ċu l-istess effetti 
severi  in vivo . Jekk it-testijiet  in vitro /ex vivo  validati u a ċċettati ma jkunux 
disponibbli, wie ħed għandu jevita il-Passi 5 u 6 u jippro ċiedi direttament 
għall-Pass 7.  
Assessjar ta' l-irritazzjoni jew tal-korro żjoni dermali in vivo tas-sustanza (il-Pass 
7). Meta evidenza mhux suffi ċjenti tkun te żisti li permezz tag ħha tista' titwettaq 
analiżi konklussiva ta' l-evidenza pe żata tal-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrossività 
ta' l-għajnejn minn sustanza, li tkun ibba żata fuq inforazzjoni mill-istudji elenkati 
hawn fuq, il-potenzal ta' l-irritazzjoni/korro żjoni in vivo  għandha l-ewwel tkun 
evalutata, bl-u żu tal-metodu B.4 (4) u ta' l-Anness li hemm mieg ħu (9). Jekk is- 
sustanza turi li tipprodu ċi korrożjoni jew irritazzjoni severa tal- ġilda, din g ħandha 
tkun ikkunsidrata b ħala li hija irritant korrossiv g ħall-għajnejn sakemm info ­
mazzjoni o ħra tkun tappo ġġja konklu żjoni alternattiva. B'hekk, it-test  in vivo  
fuq l-għajnejn ma jkunx hemm ħtieġa li jitwettaq. Jekk is-sustanza ma tkunx 
korrossiva jew severament irritanti g ħall-ġilda, it-test  in vivo  fuq l-għajnejn 
jenħtieġ li jkun imwettaq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Test in vivo fuq il-fniek (il-Passi 8 u 9):  Testijiet okulari  in vivo  għandhom ikunu 
mibdija b'test inizjali li ju ża annimali wie ħed. Jekk ir-ri żultati ta' dan it-test 
jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva g ħall-għajnejn, 
aktar testiet ma jkunx me ħtieġa. Jekk dak it-test ma ji żvelax xi effetti korrossivi 
jew severi, test konfermatorju ikun imwettaq b' żewġ annimali o ħrajn. 
REFERENZI  
(1) Programm ta' Linji ta' Gwida g ħat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal- 
Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-A ċċet­
tazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi g ħal-Testijiet Tossikolo ġiċi. Li 
inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www1.oecd.org/ 
ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli 
għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumi ċi, kif 
approvat mit-28 Laqg ħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' 
Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.  
(4) Metodu tat-testijiet B.4. Tossi ċità akuta: Irritazzjoni/korru żjoni dermali.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet  in vitro  għall-korros ­
sività tal- ġilda. 2. Ir-ri żultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv 
Toxicology  in vitro  12, pp. 483–524.
 
(8) Metodu tat-test B.40, Korro żjoni tal-Ġilda 
(9) Anness tal-Metodu tat-Test B.4: Strate ġija ta' testijiet Sekwenzali dwar 
l-Irritazzjoni u l-Korro żjoni tal-ġilda. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figura  
Strateġija għat-testijiet u l-evelwazzjom ta' L-Irritazzjoni/korro żjoni dermali
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Rimarki:  
Is-sensittività u l-abbiltà tat-testijiet li jinteb ħu b’sensitizzaturu 
potenzali g ħall-ġilda umana huma meqjusa b ħala importanti fis- 
sistema tal-klassifikazzjoni dwar it-tossi ċità relevanti g ħas-saħħa 
pubblika.  
M’hemm l-ebda metodu wie ħed ta’ test li b’mod adegwat jidentifika 
s-sustanzi kollha bil-potenzjal g ħas-sensitizzazzjoni tal- ġilda umana u 
li huwa relevanti g ħas-sustanzi kollha.  
Fatturi b ħalma huma l-karatterist ċi fiżiċi ta’ sustanza, inklu ża l- 
abbiltà tag ħha li tippenetra l- ġilda, għandhom ikunu meqjusa fil- 
għażla tat-test.  
Żewġ tipi ta’ testijiet bl-u żu tal-fniek ta’ l-indi ġew żviluppati: 
testijiet tat-tip ad ġuvanti, li fihom l-istat eller ġiku jkun ippotenzjat 
bit-taħlil jew bis-sospensjoni tas-sustanza tat-test fi Freunds 
Complete Adjuvant (FCA), u f’testijiet mhux ad ġuvanti.  
Testijiet tat-tip ad ġuvanti pjuttost li jkunu aktar e żatti fit-tbassir ta’ 
effett sensitizzanti probabbli tal- ġilda ta’ sustanza fuq il-bniedem 
milli dawk il-metodi li ma jutilizzawx il-Freunds Complete Adjuvant u huma g ħalhekk il-metodi preferiti.
 
It-test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi (GPMT) huwa test 
tat-tip adġuvanti ferm u żat. Għalkemm diversi metodi o ħrajn jistgħu 
jkunu użati għas-sejbien tal-potenzjal ta’ sustanza li tikka ġuna 
reazzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda, il-GPMT huwa meqjusa 
bħala li huma t-teknika ad ġuvinanti preferuta.  
B’ħafna mill-klassijiet kimi ċi, testijiet mhux-ad ġuvinanti (dak 
preferut huwa t-test Buehler) huma meqjusa b ħala li huma anqas 
sensittivi.  
F’ċerti każi jista’ jkun hemm ra ġunijiet tajbin g ħall-għażla tat-test 
Buehler li jinvolvi applikazzjoni topika pjuttost milli l-injezzjoni intradermali u żata fit-Test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi. 
Ġustifikazzjoni xjentifika g ħandha tkun mog ħtija meta t-test Buehler 
ikun użat.
 
It-Test tal-Massimizzazzjoni tal-fenek ta’ l-Indi (GPMT) u t-test 
Buehler huma deskritti f’dan il-metodu. Metodi o ħrajn jistg ħu 
ikunu użati basta li dawn ikunu validati tajjeb u l- ġustifikazzjoni 
xjentifika tkun mog ħtija. 
Jekk ikun jidher ri żultat pożittiv f’test ta’ screening rikonoxxut, 
sustanza tat-test jista’ ji ġi ddisinjat b ħala sensitizzatur potenzjali, u 
jista’ ma jkunx me ħtieġ test ieħor fuq il-fniek ta’ l-Indi. Madankollu, 
jekk ikun hemm ri żultat negattiv f’test b ħal dan, it-test fuq il-fniek 
ta’ l-Indi jrid isir bil-pro ċedura deskritta f’dan il-metodu tat-test.  
Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Is-sensitizzazzjoni tal- ġilda: (kuntatt aller ġiku dermatitis ) hija 
reazzjoni immunolo ġikament  cutaneous  għas-sustanza. Fil-bniedem, 
ir-rispons jista’ jkun karatterizzat minn  pruritis, erythema, oedema, 
papules, vesicles, bullae  jew kombinazzjoni ta’ dawn. Fi spe ċje oħra 
ir-reazzjonijiet jistg ħu ivarjaw u l- erythemau  l- oedema  biss jistg ħu 
jidhru.  
Espożizzjoni ta’ induzzjoni: espo żizzjoni sperimentali ta’ su ġġett 
għal sustanza tat-test bil- ħsieb li joħloq stat ipersensittiv.  
Il-perjodu ta’ induzzjoni: perjodu ta’ mill-inqas ġimgħa wara l- 
espożizzjoni ta’ induzzjoni li matulu jista’ ji żviluppa stat ipersen ­
sittiv.  
Espożizzjoni ta’ t ħaqqieq: espo żizzjoni sperimentali ta’ su ġġett li 
jkun ġie trattat qabel g ħas-sustanza tat-test wara l-perjodu ta’ 
induzzjoni, sabiex ji ġi determinat jekk is-su ġġett jirrea ġixxix 
b’mod ipersensittiv.  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Is-sensittività u l-kredibilità tat-teknika sperimentali g ħandha tiġi 
valutata kull sitt xhur bl-u żu tas-sustanzi, li huma mag ħrufa li 
jkollhom proprjetajiet ta’ sensitizzazzjoni g ħall-ġilda ħfief għal 
moderati.  
F’test mag ħmul sew, huwa mistenni li g ħal sesitizzaturi ħfief għal 
moderati jkun hemm rispons ta’ mill-inqas 30 % f’test ad ġuvinanti u 
mill-inqas 15 % f’test li mhux ad ġuvinanti.  
Is-sustanzi li ġejjin huma preferuti.  
Numri CAS Numri EINECS Ismijiet EINECS Ismijiet komuni  
101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyde α-hexylcinnamaldehyde 
149-30-4 205-736-8 Benzothiazole-2-thiol (mercap ­
tobenzothiazole) kaptax 
94-09-7 202-303-5 Benzocaine norcaine  
Jista’ jkun hemm ċirkustanzi fejn, b’ ġustifikazzjoni adegwata 
mogħtija jistgħu jintużaw sustanzi ta’ kontroll o ħra li jissodisfaw 
il-kriterji t’hawn fuq.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
L-annimali g ħat-test huma esposti fil-bidu g ħas-sustanza tat-test 
permezz ta’ injezzjonijiet intradermali u/jew applikazzjoni epidermali 
espożizzjoni ta’ induzzjoni). Wara perjodu ta’ waqfa ta’ minn 10 sa 
14-il jum (perjodu ta’ induzzjoni), li matulu jista’ ji żviluppa rispons 
ta’ immunità, l-annimali ji ġu esposti g ħal doża ta’ tħaqqieq. Il-grad u 
l-firxa tar-reazzjoni tal- ġilda għall-espożizzjoni ta’ t ħaqqieq fl- 
annimali g ħat-test huma mqabbla ma’ dak li ntwera fl-annimali ta’ 
kontroll li j ġarrbu l-istess trattament waqt l-induzzjoni u jir ċievu l- 
espożizzjoni ta’ t ħaqqieq.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODI TAT-TEST  
Jekk it-tne ħħija tas-sustanza tat-test hija me ħtieġa, dan g ħandu 
jinkiseb bl-u żu ta’ l-ilma jew solvent xieraq ming ħajr bidla fir- 
rispons li jkun hemm jew fl-integrità ta’ l-epidermi.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Test ta’ Massimizzazzjoni tal-Fniek ta’ l-Indi (TMFI)  
1.5.1.1. P r e p a r a z z j o n i j i e t  
Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw g ħall- 
kundizzjonijiet tal-laboratorju mill-inqas 5 ijiem qabel it-test. Qabel 
it-test, l-annimali jing ħażlu bl-addo ċċ fi gruppi ta’ trattament. It- 
tneħħija tax-xag ħar isir permezz ta’ l-ikklippjar, tqaxxir jew possi ­
bilment depolazzjoni kemikali, skond il-metodu tat-test u żat. 
Għandha ting ħata attenzjoni sabiex il- ġilda ma ti ġix migrufa. L- 
annimali jinti żnu qabel jibda t-test u fi tmiemu.  
1.5.1.2. K u n d i z z j o n i j i e t t a t - t e s t  
1.5.1.2.1. Annimali g ħat-test  
Razzez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment u żati fil-laboratorju 
huma utilizzati  
1.5.1.2.2. In-numru u s-sess  
Annimali maskili u/jew femminili jistg ħu ikunu u żati. Jekk ikunu 
użati femminili, dawn g ħandhom ikunu femminili li qatt ma 
welldu u li mhumiex tqal.  
Minimu ta’ 10 annimali huma u żati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 5 
fil-grupp tal-kontroll. Meta inqas minn 20 test u 10 fniek ta’ l-Indi jkunu ntu żaw, u mhux possibbli tikkonkludi li s-sustanza g ħat-test 
hija sensitizzatur, huwa rakkomandat ħafna li ji ġu ttestjati iktar 
annimali sabiex ikun hemm mill-inqas total ta’ 20 test u 10 annimali tal-kontroll.
 
1.5.1.2.3. Livelli tad-do żi 
Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija a ġġustata lejn livell li 
jipproduċi xi ftit ta’ l-evidenza ta’ l-irritazzjoni tal- ġilda, imma li 
tkun tollerata tajjeb mill-annimali matul kull stadju ta’ l-induzzjoni. 
Il-konċentrazzjoni u żata għandha tkun il-massimu li ma jipprodu ċi l- 
ebda evidenza ta’ l-irritazzjoni tal- ġilda f’annimali li mhumiex sensi ­
tizzati. Dawn il-kon ċentrazzjoninijiet jistg ħu jkunu determinati fi 
skala żgħira b’żewġ jew tliet annimali waqt l-istudju pilota ladarba 
informazzjoni o ħra ma tkunx disponibbli. L-annimali trattati bl-FCA 
għandhom ji ġu kkunsidrati g ħal dan il-g ħan. 
1.5.1.3. I l - P r o ċ e d u r a  
1.5.1.3.1. L-induzzjoni  
Jum 0 – il-grupp ittrattat  
Il-pari segwenti ta’ injezzjonijiet intradermali, kull wa ħda ta’ 0,1 ml, 
huma mog ħtija fiż-żona ta’ l-ispalla li ma jkollhiex suf hekk li kull 
wieħed mill-pari jkun fuq kull na ħa taċ-ċentru ta’ l-annimal.  
Injezzjoni 1: it-ta ħlita ta’ (v/v) FCA/l-ilma jew salin fi żjoloġiku 1:1  
Injezzjoni 2: is-sustanza tat-test, bil-mezz xieraq u bil-kon ċen­
trazzjoni mag ħżula 
Injezzjoni 3:is-sustanza tat-test bil-kon ċentrazzjoni mag ħżula ffor­
mulata f’ta ħlita 1:1 (v/v) FCA/ilma jew salin fi żjoloġiku ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Fl-injezzjoni 3, is-sustanzi li jin ħallu fl-ilma huma mdewba fil-fa żi 
akweja qabel it-ta ħlit ma’ l-FCA. Is-sustanzi liposolubbli jew inso ­
lubbli huma mdendla fl-FCA qabel il-kombinazzjoni mal-fa żi 
akweja. Il-kon ċentrazzjoni finali tas-sustanza g ħat-test g ħandha 
tkun ugwali g ħal dik użata fit-2 injezzjoni.  
L-injezzjonijiet 1 u 2 jing ħataw waħda wara l-o ħra u qrib ir-ras 
kemm jista’ jkun, waqt illi l-injezzjoni 3 tkun lejn il-parti kawdjali taż-żona tat-test.
 
Jum 0 – il-grupp tal-kontroll  
It-tliet pari ta’ injezzjonijiet intradermali ta’ 0,1 ml f’volum il-wa ħda 
jingħataw fl-istess żoni bħal fl-annimali trattati.  
Injezzjoni 1: it-ta ħlita (v/v) FCA/ilma jew salin fi żjoliġiku 1:1  
Injezzjoni 2: il-mezz mhux ma ħlul fl-ilma  
Injezzjoni 3: formulazzjoni ta’ 50 % w/v tal-mezz f’ta ħlita (v/v) 
FCA/ilma jew salin fi żjoloġiku 1:1  
5-7 jum – gruppi ta’ kontroll trattati  
Bejn wie ħed u ieħor erbgħa u għoxrin sieg ħa qabel l-applikazzjoni 
ta’ l-induzzjoni topikali, jekk is-sustanza mhix irritanti g ħall-ġilda, 
iż-żona tat-test, wara l-ikklippjar u/jew it-tqaxxir ti ġi trattata b’0,5 ml 
ta’ 10 % mis- sulfat lawrju tas-sodju fil-va żelina, sabiex tin ħoloq 
irritazzjoni lokali.  
Jum 6-8 tal-grupp trattat  
Iż-żona tat-test ter ġa’ titnaddaf mis-suf.  Filter paper  (2 x 4 ċm) 
titgħabba kollha bis-sustanza g ħat-test f’mezz xieraq u applikata 
fuq iż-żona tat-test u mi żmuma f’kuntatt permezz ta’ faxxa 
okklussiva g ħal 48 sieg ħa. L-għażla tal-mezz g ħandha tkun 
ġustifikata. Is-solidi ji ġu pulverizzati b’mod fin u inkorporati 
f’mezz xieraq. Il-likwidi jistg ħu jiġu applikati ming ħajr taħlit bl- 
ilma jekk inhu xieraq.  
Jum 6-8 grupp ta’ kontroll  
Iż-żona tat-test ter ġa’ titnaddaf mis-suf. Il-mezz biss huwa applikat 
b’mod simili li ż-żona tat-test u mi żmum f’kuntatt permezz ta’ faxxa 
okklussiva g ħal 48 sieg ħa. 
1.5.1.3.2. It-t ħaqqieq  
Jum 20-22 gruppi ta’ kontroll trattati  
Il-ġenbejn huma trattati u l-annimali tal-kontroll huma mnaddfa mix- 
xagħar. Biċċa jew kapsula li jkun fiha s-sustanza tat-test hija 
applikata ma’ wie ħed mill-ġnub ta’ l-annimali ittratati u l-bi ċċa 
jew il-kapsula mil-mezz biss mal- ġemb l-ieħor. Il-biċċiet huma 
miżmuma b’faxxa okklussiva g ħal 24 sieg ħa. 
L-osservazzjoni u l-iggradar: gruppi ta’ kontroll trattati  
— Bejn wie ħed u ieħor 21 sieg ħa wara t-tne ħħija tal-biċċa, iż-żona 
mħaqqa hija mnaddfa u kklippjata u/jew imqaxxra u depilata 
jekk ikun me ħtieġ, 
— Bejn wie ħed u ieħor 3 sigħat wara (bejn wie ħed u ieħor 48 
siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tat-t ħaqqieq) ir-reazzjoni tal- 
ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi li jidhru fl- 
appendiċi; 
— Bejn wie ħed u ieħor 24 sieg ħa wara din l-osservazzjoni, it-tieni 
osservazzjoni (72 sieg ħa) hija mwettqa u rrekordjata g ħal 
darb’oħra. 
Il-qari bl-addo ċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u tat-test huwa nkura ġġit. 
Sabiex ikunu kjarifikati r-ri żultati miksuba fl-ewwel t ħaqqieqa, t-tieni 
tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun 
meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel wa ħda. Tħaqqieq għat- 
tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll ori ġinali. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Ir-reazzjoni kollha tal- ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklu żi r- 
reazzjonijiet sistemati ċi li jirriżultaw mill-pro ċeduri ta’ l-induzzjoni 
u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala 
ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendi ċi). Proċeduri 
oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal- ħxuna tat-tinja tal- 
ġilda, tista’ titwettaq sabiex ji ġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbju żi. 
1.5.2.  It-test Buehler  
1.5.2.1. P r e p a r a z z j o n i j i e t  
Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw g ħall- 
kundizzjonijiet tal-laboratorju 5 ijiem qabel it-test. Qabel it-test, l- annimali jin ġabru kif jinzerta u assenjati g ħall-gruppi ta’ trattament. 
Il-pil jitne ħħa billi jiġi kklippjat, imqaxxar jew possibilment depilat 
kimikament skond il-metodu tat-test u żat. Għandha ting ħata 
attenzjoni sabiex tkun evitata li ssir xi ħsara lill-ġilda. L-annimali 
jintiżnu qabel ma jibda t-test u fi tmiemu.
 
1.5.2.2. I l - k u n d i z z j o n i j i e t t a t - t e s t  
1.5.2.2.1. L-annimali g ħat-test  
Razez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment u żati fil-labortatorju 
huma utlizzati.  
1.5.2.2.2. Numru u sess.  
Annimali maskili u/jew femminili jistg ħu jintużaw. Jekk ikunu u żati 
femminili, dawn g ħandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li 
mhumiex tqal.  
Minimu ta’ 20 annimal huma u żati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 10 
fil-grupp tal-kontroll.  
1.5.2.2.3. Il-livelli tad-do żi 
Għal kull stadju ta’ l-induzzjoni, il-kon ċentrazzjonini tas-sustanza 
tat-test hija a ġġustata għal-ogħla livell possibbli biex tipprodu ċi irri­
tazzjoni ħafifa imma mhux e ċċessiva. Il-kon ċentrazzjoni m ħaqqa 
għandha tkun il-massimu tad-do ża mhux irritanti. Jekk ikun 
meħtieġ il-konċentrazzjonini xierqa tista’ ti ġi determinata minn 
studju pilota bl-u żu ta’ żewġ jew tliet annimali.  
Għall-materjali tat-test li jin ħallu fl-ilma, huwa xieraq li jintu ża l- 
ilma jew soluzzjoni m ħallta bl-ilma li ma tikkaw żax irritazzjoni ta’  
surfactant  bħala l-mezz. G ħal materjali tat-test o ħra 80 % ta’ l- 
etanol/l-ilma huwa preferut g ħall-induzzjoni u t-t ħaqqieq ta’ l-  
acetone.  
1.5.2.3. I l - p r o ċ e d u r a  
1.5.2.3.1. L-induzzjoni  
Jum 0 – il-grupp trattat  
Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (ikklippjat). Is-sistema tal-bi ċċa 
għat-test għandha titg ħabba tajjeb bis-sustanza g ħat-test f’mezz 
xieraq (l-g ħażla tal-mezz g ħandha tkun ġustifikata; is-sustanzi g ħat- 
test likwidi jistg ħu jiġu applikati ming ħajr ma jit ħalltu bl-ilma, jekk 
ikun xieraq).  
Is-sistema tal-bi ċċa għat-test hija applikata fuq i ż-żona tat-test u 
miżmuma f’kuntatt permezz ta’ bi ċċa okklussiva jew kapsula u 
faxxa xierqa g ħal 6 sigħat. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Is-sistema tal-bi ċċa għat-test trid tkun okklussiva. Bi ċċa tal-qoton 
hija adattata u tista’ tkun tonda jew kwadra, i żda għandha tkun 
bejn wieħed u ieħor minn 4-6 cm  2 . Iż-żamma permezz ta’ żamma 
xierqa hija preferuta sabiex ti żgura l-okklu żjoni. Jekk ji ġi użat it- 
tqarwis, espo żizzjonijiet addizzjonali jistg ħu jkunu me ħtieġa. 
Jum 0 – il-grupp tal-kontroll  
Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (bl-ikklippjar). Il-mezz biss 
huwa applikat b’manjera simili b ħal dik g ħall-grupp trattat. Is- 
sistema tal-bi ċċa għat-test tin żamm f’kuntatt mal- ġilda b’biċċa jew 
kapsula oklussiva u faxxa xierqa g ħal 6 sigħat. Jekk jista’ jintwera li 
grupp ta’ kontroll falz mhux me ħtieġ, jista’ jintu ża grupp ta’ kontroll 
naive.  
Jiem 6-8 u 13-15 – il-grupp ta’ kontroll trattat  
Titwettaq l-istess applikazzjoni b ħal fil-jum 0 fuq l-istess żona għat- 
test (nadifa mill-pil jekk ikun me ħtieġ) tal-ġenb fil-jum 6-8, u g ħal 
darb’oħra fil-jum 13-15.  
1.5.2.3.2. It-t ħaqqieq  
Il-jum 27-29 – il-grupp ta’ kontroll trattat  
Il-ġenb li ma ġiex trattat ta’ l-annimali ta’ kontroll u trattati jitnaddaf 
mill-pil (bl-ikklippjar). Bi ċċa okklussiva jew kabina li jkun fiha l- 
ammont xieraq tas-sustanza g ħat-test tiġi applikata fil-massimu tal- 
konċentrazzjoni li mhix irritanti fuq il- ġenb mhux trattat ta’ wara ta’ 
l-annimali ta’ kontroll u trattati.  
Fejn jgħodd, biċċa okklussiva jew kabina bil-mezz biss ti ġi applikata 
fuq il-ġenb mhux trattat ta’ quddiem ta’ l-annimali li huma kemm 
kontrollati u kemm trattati. Il-bi ċċiet jew kabini huma mi żmuma 
f’kuntatt permezz ta’ faxex xierqa g ħal 6 sigħat. 
1.5.2.3.3. L-osservazzjoni u l-iggradar  
— Bejn wie ħed u ieħor 21 sieg ħa wara t-tne ħħija tal-biċċa, ż-żona 
mħaqqa hija mnaddfa mill-pil;  
— Bejn wie ħed u ieħor tliet sig ħat aktar tard (bejn wie ħed u ieħor 
30 siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tal-bi ċċa tat-tħaqqieq) ir- 
reazzjoni tal- ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi 
murija fl-appendi ċi; 
— Bejn wie ħed u ieħor 24 sieg ħa wara l-osservazzjoni ta’ 30 sieg ħa, 
(bejn wie ħed u ieħor 54 sieg ħa wara l-applikazzjoni tal-bi ċċa tat- 
tħaqqieq) ir-reazzjonijiet tal- ġilda huma g ħal darb’oħra osservati 
u rrekordjati.  
Il-qari bl-addo ċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u g ħat-test huwa nkur ­
aġġit. 
Sabiex ikunu kjarifikati r-ri żultati miksuba fl-ewwel t ħaqqieqa, t-tieni 
tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun 
meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel wa ħda. Tħaqqieq għat- 
tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll ori ġinali. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Ir-reazzjoni kollha tal- ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklu żi r- 
reazzjonijiet sistemati ċi li jirriżultaw mill-pro ċeduri ta’ l-induzzjoni 
u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala 
ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendi ċi). Proċeduri 
oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal- ħxuna tat-tinja tal- 
ġilda, tista’ titwettaq sabiex ji ġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbju żi 
2. DATA (GPMT u t-test buehler)  
Id-data g ħandha tkun riassunta f’g ħamla tabulari, li turi g ħal kull 
annimal individwali r-reazzjonijiet tal- ġilda għal kull perjodu ta’ l- 
osservazzjoni.  
3. RAPPURTA ĠĠ (GPMT u t-test Buehler)  
Jekk l-i screening  isir qabel it-test fuq il-fenek ta’ l-Indi, id-desk ­
rizzjoni jew ir-referenza tat-test (e ż. It-Test ta’ l-Infi ħ tal-Widnejn 
tal-Ġurdien (TIW Ġ), inklużi d-dettalji tal-pro ċedura, iridu jing ħataw 
flimkien mar-ri żultati miksuba mas-sustanzi tat-test u tar-referenza.  
Rapport tat-test (GPMT u t-test Buehler)  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
Annimali g ħat-test:  
— ir-razza tal-fniek ta’ l-indi u żata; 
— in-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;  
— is-sors. Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew. Id-dieta e ċċ.; 
— il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u fi tmiemu.  
Il-kundizzjonijiet tat-test  
— it-teknika tal-preparazzjoni ta ż-żona tal-bi ċċa; 
— id-dettalji tal-materjali tal-bi ċċa użati u t-teknika tal-bi ċċa; 
— ir-riżultat ta’ l-istudju pilota bil-konklu żjoni fuq l-induzzjoni u l- 
konċentrazzjonijiet tat-t ħaqqieq li jridu jintu żaw fit-test;  
— id-dettalji tal-preparazzjoni tas-sustanza g ħat-test, l-applikazzjoni 
u t-tneħħija; 
— il-ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-mezz;  
— il-mezz u l-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza g ħat-test użati għall- 
induzzjoni u l-espo żizzjonijiet tat-t ħaqqieq u l-ammont totali tas- 
sustanza applikata g ħall-induzzjoni u g ħattħaqqieq.  
Ir-riżultati:  
— taqsira tar-ri żultati ta’ l-a ħħar ċekkjatura g ħas-sensittività u g ħall- 
kredibilità (ara 1.3) inklu ża l-informazzjoni fuq is-sustanza, il- 
konċentrazzjoni u l-mezz u żat; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— ta’ kull annimal inklu ża s-sistema ta’ gradazzjoni;  
— deskrizzjoni narrativa ta’ l-effetti tan-natura u tal-gradi osservati;  
— kwalunkwe sejbiet hispatolo ġiċi. 
Id-diskussjoni tar-ri żultati  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
Dan il-metodu huwa analogu g ħal OECD TG 406  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Appendiċi 
TABELLA  
L-iskala ta' gradazzjoni ta' Magnusson/Kligman g ħall-evalwazzjoni tat-test 
għar-reazzjonijiet tal-bi ċċa tat-tħaqqieq  
0 = l-ebda bidla ċara 
1 = erythema  moderata jew fi dbabar  
2 = erythema  moderata u konfluwenti  
3 = erythema  intensa u nef ħa ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. STUDJU DWAR IT-TOSSI ĊITÀ ORALI TA’ DO ŻA RIPETUTA 
KULL 28 JUM FIR-RODITURI  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test 407 
(2008) tal-OECD. Il-Linja Gwida tat-Test 407 ori ġinali kienet adottata 
fl-1981. Fl-1995 kienet adottata ver żjoni riveduta, biex tinkiseb inform ­
azzjoni addizzjonali mill-annimal u żat fl-istudju, b’mod partikolari dwar 
in-newrotossi ċità u l-immunotossi ċità. 
2. Fl-1998, l-OECD bdiet attività ta’ prijorità kbira, biex tirrevedi l-Linji 
Gwida tat-Testijiet e żistenti u biex ti żviluppa Linji Gwida tat-Testijiet 
ġodda għat-tgħarbil u l-ittestjar ta’ interferenti endokrinali potenzjali (8). 
Element wie ħed tal-attività kien li tkun a ġġornata l-linja gwida e żistenti 
tal-OECD g ħal “studju dwar it-tossi ċità orali ta’ do ża ripetuta kull 28 jum 
fir-rodituri” (TG 407) b’parametri adatti biex tkun individwata attività endokrinali ta’ kimi ċi għall-ittestjar. Din il-pro ċedura għaddiet minn 
programmm internazzjonali estensiv biex tittestjata g ħar-rilevanza u 
l-prattikabbiltà tal-parametri addizzjonali, il-prestazzjoni ta’ dawn 
il-parametri g ħal kimiċi b’attività (anti)estro ġenika, (anti)andro ġenika u 
(anti)tirojde, l-intra- u l-inter-riprodu ċibbiltà tal-laboratorju u l-interferenza 
tal-parametri l- ġodda ma’ dawk me ħtieġa mit-TG 407 ta’ qabel. L-ammont 
kbir ta’ dejta li nkisbet b’hekk kienet ikkompilata u evalwata fid-dettall 
f’rapport komprensiv tal-OECD (9). Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.7 aġġornat (bħala ekwivalenti g ħat-TG 407) huwa r-ri żultat tal-esperjenza u 
r-riżultati miksubin matul il-programmm tat-test internazzjonali. Dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar jippermetti li ċerti effetti medjati mis-sistema endok ­
rinali jitqieg ħdu f’kuntest ma’ effetti tossikolo ġiċi oħra.
 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
3. Fil-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi ta’ kimika, 
id-determinazzjoni ta’ tossi ċità orali bl-uzu ta’ do żi ripetuti tista’ ssir wara 
li tkun inkisbet l-informazzjoni inizjali dwar it-tossi ċità bl-ittestjar ta’ 
tossiċità akuta. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ma ħsub biex ikunu inves ­
tigati l-effetti fuq varjetà wiesg ħa ħafna ta’ miri potenzjali ta’ tossi ċità. 
Jipprovdi informazzjoni dwar il-perikli g ħas-saħħa li jista’ jkun hemm li 
x’aktarx jinqalg ħu minn espo żizzjoni ripetuta tul perjodu ta’ żmien relatti ­
vament qasir, inklu żi effetti fuq is-sistema nervu ża, immunitarja u endok ­
rinali. Dwar dawn il-punti ta’ tmiem partikolari, g ħandu jidentifika kimi ċi 
b’potenzjal newrotossiku, li jistg ħu jagħtu lok għal investigazzjoni ulterjuri 
fil-fond ta’ dan l-aspett, u kimi ċi li joħolqu interferenza fil-fi żjoloġija 
tat-tirojde. Jista’ jipprovdi wkoll dejta dwar kimi ċi li jaffettwaw l-organi 
riproduttivi tar-ra ġel u/jew tal-mara f’annimali adulti żgħażagħ u jista’ 
jagħti indikazzjoni tal-effetti immunolo ġiċi. 
4. Ir-riżultati minn dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.7 g ħandhom jintu żaw għall- 
identifikazzjoni ta’ perikli u l-valutazzjoni tar-riskju. Ir-ri żultati miksubin 
mill-parametri relatati mal-endokrinali g ħandhom jitqiesu fil-kuntest 
tal-“Qafas Kun ċettwali tal-OECD g ħall-Ittestjar u g ħall-Valutazzjoni ta’ 
Sustanzi Kimi ċi li Jqallbu l-Endokrinali” (11). Il-metodu jinkuldi l-istudju 
dwar id-do ża bażika ripetuta ta’ tossi ċità li jista’ jintu ża għal kimiċi li 
dwarhom ma jkunx jista’ jsir studju ta’ 90 jum (e ż. meta l-volum 
tal-produzzjoni ma jkunx je ċċedi ċerti limiti) jew b ħala preliminari g ħal 
studju fit-tul. Id-durata tal-espo żizzjoni għandha tkun ta’ 28 jum.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Il-programm internazzjonali imwettaq skont il-validazzjoni ta’ parametri 
adatti biex potenzjalment tinstab attività endokrinali ta’ kimika g ħall- 
ittestjar wera li l-kwalità tad-dejta miksuba b’dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.7 tkun tiddependi ħafna mill-esperjenza mil-laboratorju tat-test. Dan 
jirrelata spe ċifikatament g ħad-determinazzjoni istopatolo ġika ta’ bidliet 
ċikliċi fl-organi riproduttivi tal-mara u g ħad-determinazzjoni tal-pi ż 
tal-organi żgħar dipendenti mill-ormoni li jkunu diffi ċli jiġu ddissektjati. 
Ġiet żviluppata gwida dwar l-istopatolo ġija (19). Hija disponibbli fuq 
is-sit tal-Internet pubbliku tal-OECD dwar il-Linji Gwida tat-Testijiet. Hija 
maħsuba biex tassisti lill-patolo ġisti fl-eżamijiet tag ħhom u tg ħin biex 
tiżdied is-sensittività tal-anali żi. Varjetà ta’ parametri nstab li kienu indik ­
attivi ta’ tossi ċità relatata mal-endokrinali u ġew inkorporati fil-Metodu ta’ 
Ttestjar. Parametri li g ħalihom kienet disponibbli dejta insuffi ċjenti bħala 
prova ta’ utilità jew li wrew biss evidenza dg ħajfa fil-programm ta’ vali ­
dazzjoni tal-kapa ċità tagħhom biex jg ħinu fid-detezzjoni tal-interferenti 
endokrinali huma proposti b ħala punti tat-tmiem fakultattivi (ara 
Appendiċi 2).
 
6. Abba żi ta’ dejta ġġenerata fil-pro ċess ta’ validazzjoni, g ħandu jkun enfa ­
sizzat li s-sensittività ta’ din l-anali żi mhix suffi ċjenti biex tidentifika 
s-sustanzi kollha b’modalitajiet ta’ azzjoni (anti)andro ġeniċi jew (anti)es ­
troġeniċi (9). Il-Metodu ta’ Ttestjar ma jsirx fi stadju tal- ħajja li jkun 
l-aktar sensittiv g ħal taqlib endokrinali. Il-Metodu ta’ Ttestjar, madankollu, 
matul il-pro ċess ta’ validazzjoni identifika sustanzi li kienu jaffettwaw 
b’mod dg ħajjef u b’sa ħħtu l-funzjoni tat-tirojde, u sustanzi endokrinali 
attivi f’sa ħħithom u moderati li kienu qed ja ġixxu permezz ta’ re ċetturi 
ta’ estroġenu jew andro ġenu, iżda kważi fil-każijiet kollha naqas milli jiden ­
tifika sustanzi endokrinali attivi li b’mod dg ħajjef jaffettwaw re ċetturi ta’ 
estroġenu jew andro ġenu. Għalhekk ma jistax ikun deskritt b ħala analiżi ta’ 
tgħarbil għal attività endokrinali.  
7. Konsegwentement, in-nuqqas ta’ effetti relatati ma’ dawn il-modalitajiet ta’ 
azzjoni ma jistax jitqies b ħala evidenza g ħan-nuqqas ta’ effetti fuq is-sistema 
endokrinali. Fir-rigward tal-effetti medjati mis-sistema endokrinali, il-karatterizzazzjoni ta’ sustanzi m’g ħandhiex, g ħalhekk, tkun ibba żata fuq 
ir-riżultati ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar wa ħdu iżda għandha tkun u żata 
f’approċċ ta’ piż ta’ evidenza li jinkorpora d-dejta kollha e żistenti dwar 
kimika biex tkun ikkaratterizzata attività endokrinali potenzjali. G ħal din 
ir-raġuni, it-teħid regolatorju tad-de ċiżjonijiet dwar attività endokrinali (kar ­
atterizzazzjoni ta’ sustanzi) g ħandu jkun appro ċċ fuq bażi wiesgħa, li ma 
jistrieħx biss fuq ri żultati minn applikazzjoni ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar.
 
8. Huwa rrikonoxxut li l-pro ċeduri kollha bba żati fuq l-annimali jkunu 
konformi ma’ standards lokali ta’ kura tal-annimali; id-deskrizzjonijiet ta’ 
kura u trattament li jinsabu hawn ta ħt huma standards minimi ta’ 
prestazzjoni, u g ħandhom je ħdulhom posthom regolamenti lokali jekk 
ikunu aktar stretti. Gwida ulterjuri dwar it-trattament uman tal-annimali tingħata mill-OECD (14).
 
9. Id-definizzjonijiet u żati jingħataw fl-Appendi ċi 1. 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
10. Il-kimika g ħall-ittestjar hija amministrata oralment kuljum f’do żi gradwati lil 
diversi gruppi ta’ annimali g ħall-esperimenti, b’livell ta’ do ża waħda għal 
kull grupp g ħal perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni 
l-annimali jkunu osservati mill-qrib, kull jum g ħal sinjali ta’ tossi ċità. 
L-annimali li jmutu jew li jinqatlu bl-ewtanasja matul it-test issirilhom 
awtopsja u fit-tmiem tat-test l-annimali li jkunu baqg ħu ħajjin jinqatlu 
bl-ewtanasja u ssirilhom awtopsja. Studju ta’ 28 jum jipprovdi informazzjoni  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
dwar l-effetti ta’ espo żizzjoni orali ripetuta u jista’ jindika l- ħtieġa ta’ aktar 
studji ta’ aktar tul ta’ żmien. Jista’ jipprovdi wkoll informazzjoni dwar 
l-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet g ħal studji ta’ aktar tul ta’ żmien. Id-dejta 
derivata mill-u żu tal-Metodu ta’ Ttestjar g ħandha tippermetti 
l-karatterizzazzjoni tat-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar, g ħall-indikazzjoni 
tar-reazzjoni tad-do ża u d-determinazzjoni tal-Livell Bla Effett Ħażin 
Osservat (NOAEL).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ spe ċi ta’ annimali  
11. L-ispe ċi preferuta ta’ rodituri huwa l-far, g ħalkemm jistg ħu jintużaw 
speċijiet oħra ta’ rodituri. G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni dettaljata jekk 
il-parametri spe ċifikati f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.7 ikunu investigati fi 
speċijiet oħra ta’ rodituri. G ħalkemm huwa bijolo ġikament plaw żibbli li 
speċijiet oħra għandhom jirrispondu g ħal sustanzi tossi ċi bl-istess mod 
bħall-far, l-u żu ta’ spe ċijiet iżgħar jista’ jirri żulta f’aktar varjabbiltà 
minħabba sfidi tekni ċi ta’ dissektjar ta’ organi i żgħar. Fil-programm inter ­
nazzjonali ta’ validazzjoni g ħad-detezzjoni ta’ interferenti endokrinali, il-far 
kien l-unika spe ċi użata. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ 
f’saħħithom ta’ razez li komunement jintu żaw fil-laboratorju. In-nisa 
m’għandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx jkunu tqal. G ħandu jinbeda 
dożaġġ malli jkun fattibbli wara l-ftim, u, f’kull ka ż, qabel ma l-annimali 
ikollhom disa’ ġimgħat. Malli jinbeda l-istudju l-varjazzjoni fil-pi ż 
tal-annimali u żati għandha tkun minima u m’g ħandhiex taqbe ż ± 20 % 
tal-piż medju ta ż-żewġ sessi. Meta ting ħata doża orali ripetuta b ħala 
preliminari g ħal studju ta’ aktar fit-tul, ikun preferibbli li l-annimali 
mill-istess razza u sors jintu żaw fiż-żewġ studji.  
Abitazzjoni u g ħalf 
12. Il-pro ċeduri kollha g ħandhom ikunu konformi ma’ standards lokali tal-kura 
tal-annmali tal-laboratorju. It-temperatura fil-kamra tal-esperimenti 
tal-annimali g ħandha tkun 22 °C (± 3 °C). G ħalkemm l-umdità relattiva 
għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma tkunx aktar minn 
70 % għajr għal matul il- ħasil tal-kamra, il-mira g ħandha tkun ta’ 50- 
60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, billi l-fotoperjodu jkun ta’ 12-il 
siegħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. Fir-rigward tal-g ħalf, jistgħu jintużaw dieti 
konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill- ħtieġa li tkun żgurata 
taħlita adattata ta’ kimika g ħall-ittestjar meta tkun amministrata b’dan 
il-metodu. L-annimali g ħandhom jabitaw b ħala grupp fi gruppi żgħar 
tal-istess sess; l-annimali jistg ħu jabitaw individwalment jekk dan ikun 
ġustifikat xjentifikament. G ħal gruppi f’ga ġeġ, m’għandux ikun hemm 
aktar minn ħames annimali jabitaw f’ga ġġa waħda.
 
13. L-għalf għandu jkun analizzat regolarment g ħall-kontaminanti. G ħandu 
jinżamm kampjun tad-dieta sakemm ikun iffinalizzat ir-rapport.  
Preparazzjoni tal-annimali  
14. L-annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ikunu assenjati b’mod ka żwali 
lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. Il-ga ġeġ għandhom ikunu rran ġati 
b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti li jista’ jkun hemm min ħabba 
t-tqegħid tal-gaġeġ. L-annimali g ħandhom ikunu identifikati individwalment 
u jinżammu fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-anqas ħamest ijiem qabel ma jibda 
l-istudju tat-trattament biex ikunu jistg ħu jidraw il-kundizzjonijiet 
tal-laboratorju.  
Preparazzjoni ta’ do żi 
15. Il-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata b’gavage (bil-forza) jew mad-dieta 
jew mal-ilma tax-xorb. Il-metodu ta’ amministrazzjoni orali jkun jiddependi 
mill-għan tal-istudju, u mill-proprjetajiet fi żiċi/kimiċi/tossikokineti ċi 
tal-kimika g ħall-ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Meta jkun me ħtieġ, il-kimika g ħall-ittestjar tin ħall jew ti ġi sospiża f’vej­
jikolu adattat. Huwa rrakkomandat li, kull meta jkun possibbli, l-ewwel 
għandu jitqies l-u żu ta’ soluzzjoni/sospensjoni fl-ilma, segwit minn 
konsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/sospensjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħa) u 
mbagħad possibbilment b’soluzzjoni f’vejjikoli o ħra. Għal vejjikoli o ħra 
minbarra ilma l-karatteristi ċi tossiċi tal-vejjikolu g ħandhom ikunu 
magħrufa. L-istabbiltà tal-kimika g ħall-ittestjar fil-vejjikolu g ħandha tkun 
iddeterminata.  
PROĊEDURA  
Għadd u sess tal-annimali  
17. Mill-anqas 10 annimali ( ħames nisa u ħames irġiel) għandhom ikunu u żati 
fil-livell ta’ kull do ża. Jekk tkun ippjanata ewtanasja interim, l-g ħadd 
għandu jiżdied bl-g ħadd skedat ta’ annimalii li jinqatlu bl-ewtanasja qabel 
jitlesta l-istudju. G ħandha ting ħata konsiderazzjoni g ħal grupp satellitarju 
addizzjonali ta’ g ħaxar annimali ( ħamsa għal kull sess) fil-grupp ta’ 
kontroll u f’dak tad-do ża l-aktar g ħolja għall-osservazzjoni ta’ riversibbiltà, 
persistenza jew okkorrenza mdewma ta’ effetti tossi ċi, għal mill-anqas 14-il 
jum wara it-trattament.  
Dożaġġ 
18. Ġeneralment, g ħandhom jintu żaw mill-anqas tliet gruppi ta’ test u grupp ta’ 
kontroll, i żda jekk minn valutazzjoni ta’ dejta o ħra, ma jkunu mistennija 
l-ebda effetti f’do ża ta’ 1 000 mg/kg bw/d, ikun jista’ jsir test ta’ limitu. 
Jekk ma jkun hemm l-ebda dejta adattata disponibbli, jista’ jsir studju dwar tiftix ta’ firxa (annimali tal-istess razza u sors) b ħala għajnuna għad-deter­
minazzjoni tad-do żi li jkollhom jintu żaw. Ħlief għal trattament bil-kimika 
għall-ittestjar, l-annimali fil-grupp ta’ kontroll g ħandhom ikunu trattati 
b’mod identiku b ħal tas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintu ża vejjikolu 
biex tkun amministrata l-kimika g ħall-ittestjar, il-grupp ta’ kontroll g ħandu 
jirċievi l-vejjikolu fl-og ħla volum u żat.
 
19. Il-livelli tad-do ża għandhom jintg ħażlu billi titqies kull dejta e żistenti dwar 
it-tossiċità u (tossiko-) kinetika disponibbli g ħall-kimika g ħall-ittestjar u g ħal 
kimiċi relatati. L-og ħla livell ta’ do ża għandu jintg ħażel bil-għan li jġib 
effetti tossi ċi iżda mhux il-mewt jew tbatija severa. Minn hemm ‘il 
quddiem, g ħandha tintg ħażel sekwenza dejjem tonqos tal-livelli tad-do ża 
biex jintwera kull rispons relatat ma’ do żaġġ u l-ebda effetti ħżiena 
osservati fl-aktar livell baxx tad-do ża (NOAEL). Intervalli ta’ darbtejn jew 
erba’ darbiet ta’ spiss ikunu l-a ħjar biex ikunu stabbiliti l-livelli ne żlin 
tad-dożi, u ż-żieda tar-raba’ grupp tat-test sikwit spiss hija preferibbli 
milli jintu żaw intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 10) bejn 
id-dożaġġi. 
20. Meta jkun hemm tossi ċità ġenerali osservata (e ż. piż tal-ġisem ridott, effetti 
tal-fwied, qalb, pulmun jew kliewi, e ċċ.) jew tibdiliet o ħra li jistg ħu ma 
jkunux risponsi tossi ċi (eż. konsum anqas ta’ ikel, tkabbir tal-fwied), l-effetti 
osservati fuq punti ta’ tmiem sensittivi immunitarji, newrolo ġiċi jew endok ­
rinali għandhon ikunu interpretati b’kawtela.  
Test ta’ limitu  
21. Jekk test b’livell ta’ do ża waħda ta’ mill-anqas 1 000 mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem/jum jew, g ħall-amministrazzjoni tad-dieta jew tal-ilma tax-xorb, 
ta’ perċentwali ekwivalenti fid-dieta, jew ta’ ilma tax-xorb (abba żi ta’ deter ­
minazzjonijiet ta’ pi ż tal-ġisem), billi jintu żaw il-proċeduri deskritti g ħal dan 
l-istudju, ma jipprodu ċi l-ebda effetti tossi ċi osservabbli u jekk ma tkunx 
mistennija tossi ċità bbażata fuq dejta minn kimi ċi relatati strutturalment, 
f’dak il-ka ż studju s ħiħ bl-użu ta’ tliet livelli ta’ do ża jista’ ma jitqisx li 
jkun meħtieġ. It-test ta’ limitu japplika ħlief meta espo żizzjoni umana 
tindika l- ħtieġa li jkollu jintu ża livell og ħla ta’ doża. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Amministrazzjoni ta’ do żi 
22. L-annimali jing ħataw doża b’kimika g ħall-ittestjar kuljum 7 ijiem fil- ġimgħa 
għal perjodu ta’ 28 jum. Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata 
b’gavage, dan g ħandu jsir b’do ża waħda lill-annimali billi jintu ża tubu 
tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni adattat. Il-volum massimu 
tal-likwidu li jkun jista’ ji ġi amministrat f’waqt wie ħed ikun jiddependi 
mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum m’g ħandux ikun aktar minn 1 
ml/100 g tal-pi ż tal-ġisem ħlief fil-ka ż ta’ soluzzjonijiet fl-ilma fejn 
jistgħu jintużaw 2 ml/100 g tal-pi ż tal-ġisem. Ħlief għal kimiċi irritanti 
jew korru żivi, li normalment juru effetti ta’ irritazzjoni b’kon ċentrazzjonijiet 
ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test g ħandha tkun imminimizzata billi 
l-konċentrazzjoni tkun a ġġustata biex ikun żgurat volum kostanti fil-livelli 
kollha tad-do ża. 
23. Għall-kimiċi amministrati permezz tad-dieta jew l-ilma tax-xorb, huwa 
importanti jkun żgurat li l-kwantitajiet tal-kimika g ħall-ittestjar involuta 
ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilan ċ tal-ilma. Meta l-kimika 
għall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta jistg ħu jintużaw konċentrazzjoni 
kostanti ta’ dieta (ppm) jew livell wie ħed kostanti ta’ do ża skont il-pi ż 
tal-ġisem tal-annimali; l-alternattiva u żata għandha tkun spe ċifikata. G ħal 
kimika amministrata b’gavage, id-do ża għandha ting ħata f’ħinijiet simili 
għal kull jum, u a ġġustata kif me ħtieġ biex jin żamm livell wie ħed 
kostanti ta’ do ża skont il-pi ż tal-ġisem tal-annimal. Meta jintu ża studju ta’ 
doża ripetuta b ħala preliminari g ħal studju fit-tul, g ħandha tintu ża dieta 
simili fiż-żewġ studji.  
Osservazzjonijiet  
24. Il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħandu jkun ta’ 28 jum. L-annimali fi grupp 
satellitarju skedati g ħall-osservazzjonijiet ta’ segwitu g ħandhom jin żammu 
għal mill-anqas 14-il jum ming ħajr trattament biex tinstab okkorrenza 
mdewma, jew persistenza ta’, jew irkupru minn effetti tossi ċi. 
25. Osservazzjonijiet klini ċi ġenerali għandhom isiru mill-anqas darba kuljum, 
preferibbilment fl-istess ħin(ijiet) kull jum u jkun meqjus il-perjodu massimu 
tal-effetti anti ċipati wara do żaġġ. Il-kundizzjoni tas-sa ħħa tal-annimali 
għandha tiġi rreġistrata. Mill-anqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha ji ġu 
osservati g ħall-morbidità u l-mortalità.  
26. Għal darba qabel l-ewwel espo żizzjoni (biex jit ħallew isiru paraguni skont 
is-suġġett), u mill-anqas darba fil- ġimgħa minn hemm ‘il quddiem, 
għandhom isiru osservazzjonijiet klini ċi dettaljati fl-annimali kollha. Dawn 
l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru barra mill-ga ġġa ta’ abitazzjoni f’arena 
standard u preferibbilment fl-istess ħin tal-jum f’kull okka żjoni. Għandhom 
ikunu rre ġistrati sewwa, preferibbilment billi jintu żaw sistemi ta’ punti, 
iddefiniti espli ċitament mil-laboratorju tal-ittestjar. G ħandu jsir sforz biex 
ikun żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test ikunu minimi u li 
l-osservazzjonijiet preferibbilment jitmexxew minn osservaturi li ma jkunux jafu bit-trattament. Sinjali nnotati g ħandhom jinkludu, i żda ma jkunux 
limitati g ħal, bidliet fil- ġilda, pil, g ħajnejn, membrani muku żi, okkorrenza 
ta’ sekrezzjonijiet u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (e ż. dmugħ, 
erezzjoni tal-pil, daqs tal-pupilli, xejra respiratorja mhux tas-soltu). Bidliet fil-mixja, qag ħda u rispons g ħal immani ġġar, kif ukoll il-pre żenza ta’ 
movimenti kloni ċi jew toni ċi, stereotipi (e ż. tindif e ċċessiv, dawran ripe ­
tittiv) jew im ġiba biżarra (eż. awtomutilazzjoni, mixi b’lura) g ħandhom 
ukoll ikunu rre ġistrati (2).
 
27. Fir-raba’ ġimgħa ta’ espo żizzjoni għandhom isiru valutazzjoni tar-reattività 
sensorja g ħal stimuli ta’ tipi differenti (2) (e ż. stimuli tas-smig ħ, viżivi u 
proprjoċettivi) (3)(4)(5), valutazzjoni tal-qawwa tal-qabda (6) u tal-attività 
motorja (7). Aktar dettalji tal-pro ċeduri li jistg ħu jkunu segwiti jing ħataw 
fir-referenzi rispettivi. I żda, jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi minbarra 
dawk fir-referenzi.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Osservazzjonijiet funzjonali mag ħmulin fir-raba’ ġimgħa ta’ espo żizzjoni 
jistgħu jitħallew barra meta l-istudju jsir b ħala studju preliminari g ħal 
studju subkroniku (ta’ 90 jum) sussegwenti. F’dak il-ka ż, 
l-osservazzjonijiet funzjonali g ħandhom ikunu inklu żi f’dan studju ta’ 
segwitu. Min-na ħa l-oħra, id-disponibbiltà ta’ dejta dwar osservazzjonijiet 
funzjonali mill-istudju ta’ do ża ripetuta tista’ssa ħħaħ il-kapaċità biex 
jintgħażlu dożi għal studju subkroniku sussegwenti.  
29. Bħala eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistg ħu wkoll jit ħallew barra 
għal gruppi li xort’o ħra juru sinjali ta’ tossi ċità tant li tfixkel b’mod sini ­
fikanti l-prestazzjoni funzjonali tat-test.  
30. F’awtopsja, i ċ-ċiklu estru ż tan-nisa kollha jista’ ji ġi ddeterminat (b’mod 
fakultattiv) billi jittie ħdu tiċpisiet (smears) va ġinali. Dawn 
l-osservazzjonijiet se jipprovdu informazzjoni dwar l-istadju ta ċ-ċiklu 
estruż meta jsir il-qtil u jg ħinu fl-evalwazzjoni istolo ġika ta’ tessuti sensittivi 
tal-estroġenu [ara l-gwida dwar l-istopatolo ġija (19)].  
Piż tal-ġisem u konsum tal-ikel/ilma  
31. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu mill-anqas darba fil- ġimgħa. Il-kejlijiet 
tal-konsum tal-ikel g ħandu jsir mill-anqas kull ġimgħa. Jekk il-kimika g ħall- 
ittestjar tkun amministrata permezz tal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma 
għandu wkoll jitkejjel mill-anqas kull ġimgħa. 
Ematoloġija 
32. L-eżamijiet ematolo ġiċi li ġejjin għandhom isiru fit-tmiem tal-perjodu 
tat-test: ematokrit, kon ċentrazzjonijiet tal-emoglobina, g ħadd ta’ eritro ċiti, 
retikuloċiti, għadd totali u differenzjali ta’ lewko ċiti, għadd ta’ pjastrini u 
kejl ta’ ħin/potenzjal g ħal emboli żmu. Determinazzjonijiet o ħra li għandhom 
isiru, jekk il-kimika g ħall-ittestjar jew il-metaboliti putattivi tag ħha jkollhom 
jew ikunu ssuspettati li jkollhom proprjetajiet ossidanti, jinkludu kon ċen­
trazzjoni ta’ metemoglobina u l-korpi ta’ Heinz.  
33. Il-kampjuni tad-demm g ħandhom jittie ħdu minn sit imsemmi e żatt qabel jew 
bħala parti mill-pro ċedura għall-ewtanasja tal-annimali, u g ħandhom 
jinħażnu f’kundizzjonijiet xierqa. L-annimali g ħandhom jin żammu 
msajmin tul il-lejl qabel l-ewtanasja (  1 ). 
Bijokimika klinika  
34. Id-determinazzjonijiet ta’ bijokimika klinika g ħall-investigazzjoni tal-effetti 
tossiċi maġġuri f’tessuti u, spe ċifikatament, ta’ effetti fuq il-kliewi u l-fwied, 
għandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm miksubin mill-annimali kollha 
eżatt qabel jew b ħala parti mill-pro ċedura għall-ewtanasja tal-annimali 
(minbarra dawk misjubin moribondi u/jew li jinqatlu bl-ewtanasja qabel ma jintemm l-istudju). Investigazzjonijiet ta’ pla żma jew serum g ħandhom 
jinkludu sodju, potassju, gluko żju, kolesterol totali, urea, kreatinina, proteina 
totali u albumina, mill-anqas żewġ enzimi indikattivi ta’ effetti epato ċellulari 
(bħal alanin aminotransfera żi, aspartate aminotransfera żi, fosfatażi alkalina, 
γ-glutamil trans-peptidase u glutamat ta’ deidro ġenażi), u aċidi tal-biljari. 
Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ ori ġini epatika jew ori ġinijiet oħra) u ta’ 
bilirubina jistg ħu jipprovdu informazzjoni utli f’ ċerti ċirkostanzi.
 
35. B’mod fakultattiv, id-determinazzjonijiet ta’ anali żi tal-awrina jistg ħu jsiru 
matul l-aħħar ġimgħa tal-istudju bl-u żu ta’ ġbir ta’ volum ta’ awrina li jkun 
itteħdilha l-ħin; dehra, volum, o żmolalità jew gravità spe ċifika, pH, proteina, 
glukożju u demm/ ċelluli tad-demm.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Għal għadd ta’ kejlijiet ta’ serum u pla żma, l-aktar g ħall-glukożju, is-sawm tul il-lejl ikun 
ippreferut. Ir-ra ġuni ewlenija g ħal din il-preferenza hija li aktar varjabbiltà li g ħandha 
inevitabbilment tirri żulta minn nuqqas ta’ sawm, g ħandha tendenza li ta ħbi effetti aktar 
sottili u tag ħmel l-interpretazzjoni diffi ċli. Min-na ħa l-oħra, iżda, is-sawm tul il-lejl jista’ 
joħloq interferenza fil-metaboli żmu ġenerali tal-annimali u, partikolarment fl-istudji dwar 
l-għalf, jista’ jiddisturba l-espo żizzjoni ta’ kuljum g ħall-kimika g ħall-ittestjar. Jekk ikun 
adottat sawm tul il-lejl, id-determinazzjonijiet bijokimi ċi kliniċi għandhom isiru wara li 
jkunu twettqu l-osservazzjonijiet funzjonali fir-raba’ (4) ġimgħa tal-istudju.
 36. Flimkien ma’ dan, g ħandhom jitqiesu studji biex ikunu investigati markaturi 
ta’ plażma jew serum ta’ ħsara ġenerali għal tessuti. Determinazzjonijiet 
oħra li għandhom isiru, jekk il-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall- 
ittestjar ikunu jistg ħu jew ikunu ssuspettati li jaffettwaw profili metaboli ċi 
relatati, jinkludu kal ċju, fosfat, trigli ċeridi, ormoni spe ċifiċi u kolinestera żi. 
Dawn jeħtiġilhom ikunu identifikati g ħal kimiċi f’ċerti klassijiet jew abba żi 
ta’ każ każ. 
37. Għalkemm fl-evalwazzjoni internazzjonali tal-punti ta’ tmiem relatati 
mal-endokrinali ma setax jintwera vanta ġġ ċar għad-determinazzjoni 
tal-ormoni tat-tirojde (T3, T4) u TSH, jista’ jkun utli li jin żammu 
kampjuni ta’ pla żma jew serum biex jitkejlu T3, T4 u TSH (fakultattivi) 
jekk ikun hemm indikazzjoni ta’ effett fuq l-assi pitwitarja-tirojde. Dawn 
il-kampjuni jistg ħu jkunu ffri żati f’- 20° g ħall-ħżin. Il-fatturi li ġejjin jistg ħu 
jinfluwenzaw il-varjabbiltà u l-kon ċentrazzjonijiet assoluti 
tad-determinazzjonijiet tal-ormoni:  
— il-ħin tal-qatla min ħabba varjazzjonijiet tul il-jum tal-kon ċentrazzjonijiet 
tal-ormoni  
— il-metodu tal-qatla biex tkun evitata tensjoni bla b żonn għall-annimali li 
tista’ taffettwa l-kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni  
— is-settijiet tat-testijiet g ħad-determinazzjonijiet tal-ormoni li jistg ħu jkunu 
differenti mill-kurvi standard tag ħhom.  
L-identifikazzjoni definittiva ta’ kimi ċi tat-tirojde attiva hija l-aktar 
affidabbli b’anali żi istopatolo ġika milli bil-livelli tal-ormoni.  
38. Kampjuni ta’ pla żma maħsubin spe ċifikatament g ħal determinazzjoni 
tal-ormoni g ħandhom jinkisbu f’ ħin komparabbli tal-jum. Huwa rrak ­
komandat li ting ħata konsiderazzjoni lid-determinazzjonijiet ta’ T3, T4 u 
TSH mibdija bba żati fuq alterazzjonijiet ta’ istopatolo ġija tat-tirojde. 
Il-valuri numeri ċi miksubin meta jkunu analizzati l-kon ċentrazzjonijiet 
tal-ormoni jkunu differenti fost diversi settijiet ta’ anali żi kummer ċjali. Għal­
daqstant, jista’ ma jkunx possibbli li jkunu pprovduti kriterji ta’ prestazzjoni bbażati fuq dejta storika uniformi. Alternattivament, il-laboratorji g ħandhom 
jagħmlu sforzi biex i żommu koeffi ċjenti ta’ kontroll ta’ varjazzjoni ta ħt 25 
għal T3 u T4 u ta ħt 35 għal TSH. Il-kon ċentrazzjonijiet kollha g ħandhom 
ikunu rre ġistrati f’ng/ml.
 
39. Jekk ba żi tad-dejta storika ma tkunx adegwata, g ħandha ting ħata konsider ­
azzjoni lid-determinazzjoni ta’ varjabbli ematolo ġiċi u ta’ bijokimika klinika 
qabel ma jibda d-do żaġġ jew preferibbilment f’sett ta’ annimali mhux 
inklużi fil-gruppi ta’ esperimenti.  
PATOLO ĠIJA 
Awtopsja makroskopika  
40. L-annimali kollha fl-istudju g ħandhom ikunu sso ġġettati għal awtopsja 
makroskopika s ħiħa u dettaljata li tkun tinkludi e żami bir-reqqa tal-wi ċċ 
estern tal- ġisem, tal-fet ħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, tora ċiċi u 
abdominali u tal-kontenuti tag ħhom. Il- fwied, il-kliewi, l-adrenali,  
it-testikoli, l-epididimi, il-prostata + il-b żieżaq seminali bi glandoli  
tal-koagulazzjoni kollha flimkien, it-timu, il-milsa, il-mo ħħ u l-qalb 
tal-annimali kollha (minbarra ta’ dawk misjubin moribondi u/jew li jinqatlu bl-ewtanasja qabel ma intemm l-istudju) g ħandhom jintraqmu 
minn kull tessut imwa ħħal magħhom, kif jixraq, u l-pi ż tagħhom 
fl-imxarrab g ħandu jittie ħed malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni 
biex ikun evitat it-tnixxif. G ħandha tkun e żerċitata attenzjoni meta jsir 
it-tirqim tal-kumpless tal-prostata biex ikun evitat li jittaqqbu l-b żieżaq 
seminali mimlijin fluwidu. Alternattivament, il-b żieżaq seminali u 
l-prostata jistg ħu jintraqmu u jinti żnu wara l-fissazzjoni.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Flimkien ma’ dan, żewġ tessuti o ħra jistgħu, imma mhux bilfors, jinti żnu 
malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni, biex ikun evitat it-tnixxif: ovarji 
akkoppjati (pi ż fl-imxarrab) u l-utru, inklu ż iċ-ċerviċi (il-gwida dwar 
it-tneħħija u l-preparazzjoni tat-tessuti tal-utru g ħal-kejl tal-pi ż hija 
pprovduta fit-TG 440 tal-OECD (18)).  
42. Il-piż tat-tirojde (fakultattiv) jista’ ji ġi ddeterminat wara l-fissazzjoni. 
It-tirqim g ħandu jsir ukol b’reqqa kbira u biss wara l-fissazzjoni biex tkun 
evitata l-ħsara lit-tessut. Il- ħsara fit-tessut tista’ tippre ġudika anali żi istopa­
toloġika. 
43. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu ppreservati f’midjum ta’ fissazzjoni 
l-aktar adattat kemm g ħat-tip ta’ tessut, kif ukoll g ħall-eżami istopatolo ġiku 
maħsub sussegwentement (ara l-paragrafu 47):  il-leżjonijiet kbar kollha,  il- 
moħħ (reġjuni rappre żentattivi inklu żi ċ-ċerebru, i ċ-ċervellett u 
l-meżoċefalu),  in-nerv vertebrali, l-g ħajnejn, l-istonku, l-imsaren żgħar u 
kbar (inklu żi l-irqajja’ ta’ Peyer), il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, il-milsa, 
il-qalb, it-timu, it-tirojde, it-trakea u l-pulmuni (ippreservati b’inflazzjoni b’fissattiv u wara b’immersjoni),
 il-gonadi (testikoli u ovarji), l-organi  
sesswali a ċċessorji (utru u ċerviċi, epididimi, prostata u b żieżaq seminali 
bi glandoli tal-koagulazzjoni),  il-vaġina, il-bu żżieqa tal-awrina, in-nodi  
limfatiċi [minbarra n-nodu ta’ tisfija l-aktar qrib g ħandu jittie ħed nodu 
limfatiku ie ħor skont il-prassi tal-laboratorju (15)], in-nerv periferali 
(xjatiku jew tibjali) preferibbilment qrib ħafna tal-muskolu,  il-muskolu  
skeletali u l- għadam, bil- mudullun tal-g ħadam (taqsima jew, alternatti ­
vament, aspirat tal-mudullun tal-g ħadam imqieg ħed frisk). Huwa rrak ­
komandat li t-testikoli jkunu ffissati b’immersjoni f’fissattiv ta’ Bouin jew 
f’dak modifikat ta’ Davidson (16) (17). It-tunika albu ġinea għandha 
tittaqqab bil-mod u mhux fil-fond fi ż-żewġ poli tal-organu b’labra biex 
jitħalla jkun hemm penetrazzjoni malajr tal-fissattiv. Is-sejbiet klini ċi u 
oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li jkunu e żaminati tessuti addizzjonali. 
Għandu wkoll ikun ippreservat kull organu li x’aktarx ikun meqjus b ħala 
organu mmirat abba żi tal-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall-ittestjar.  
44. It-tessuti li ġejjin jistg ħu jagħtu indikazzjoni siewja tal-effetti relatati 
mal-endokrinali: Il-gonadi (ovarji u testikoli), organi sesswali a ċċessorji (l- 
utru inklu ż iċ-ċerviċi, l-epididimi, il-b żieżaq seminali bi glandoli 
tal-koagulazzjoni, il-prostata dorsolaterali u l-ventrali), il-va ġina, 
il-pitwitarja, il-glandola mammarja tar-ra ġel, il-glandola tirojde u 
l-adrenali. Il-bidliet fil-glandoli mammarji tar-ra ġel ma kinux iddokumentati 
b’mod suffi ċjenti iżda dan il-parametru jista’ jkun sensittiv ħafna għal 
sustanzi b’azzjoni estro ġenika. L-osservazzjoni ta’ organi/tessuti li 
mhumiex elenkati fil-paragrafu 43 hija fakultattiva (ara l-Appendi ċi 2). 
45. Il-Gwida dwar l-istopatolo ġija (19) tag ħti aktar informazzjoni dwar 
id-dissezzjoni, fissazzjoni, tqassim f’taqsimiet u l-istopatolo ġija ta’ tessuti 
endokrinali.  
46. Fil-programmm tat-test internazzjonali nkisbet xi evidenza li effetti endok ­
rinali sottili minn kimi ċi b’qawwa baxxa biex jaffettwaw l-omeosta żi 
tal-ormon sesswali jistg ħu jkunu identifikati bid-disturb 
tas-sinkronizzazzjoni ta ċ-ċiklu estru ż f’tessuti differenti u mhux daqshekk 
b’alterazzjonijiet istopatolo ġiċi sfaċċati f’organi sesswali tal-mara. 
Għalkemm ma nkisbet l-ebda prova definittiva g ħall-effetti b ħal dawn, 
huwa rrakkomandat li evidenza ta’ asinkronija li jista’ jkun hemm ta ċ- 
ċiklu estru ż għandha titqies fl-interpretazzjoni tal-istopatolo ġija tal-ovarji 
(ċelluli follikulari, tekali u mrammlin), tal-utru, ta ċ-ċerviċi u tal-va ġina. 
Jekk ikun ivvalutat, l-istadju ta ċ-ċiklu kif iddeterminat minn ti ċpisiet 
vaġinali jista’ jkun inklu ż ukoll f’dan il-paragun.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Istopatolo ġija 
47. Għandha ssir istopatolo ġija sħiħa fuq l-organi u t-tessuti ppreservati 
tal-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ do ża għolja. Dawn 
l-eżamijiet g ħandhom ikunu esti żi għal annimali tal-gruppi l-o ħra kollha 
ta’ dożaġġ, jekk ikunu osservati bidliet relatati ma’ trattament fil-grupp ta’ 
doża għolja. 
48. Il-leżjonijiet kbar kollha g ħandhom ikunu e żaminati.  
49. Meta jintu ża grupp satellitarju, l-istopatolo ġija għandha ssir fuq tessuti u 
organi identifikati b ħala li juru effetti fil-gruppi ttrattati.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
50. Għandha tkun ipprovduta dejta individwali. Addizzjonalment, id-dejta kollha 
għandha tin ġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp tat-test 
l-għadd ta’ annimali fil-bidu tat-test, l-g ħadd ta’ annimali li jkunu nstabu 
mejta matul it-test jew li jkunu nqatlu bl-ewtanasja g ħal raġunijiet umani u 
l-ħin ta’ kull mewta jew ewtanasja, l-g ħadd li juri sinjali ta’ tossi ċità, desk­
rizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, inklu ż il-waqt meta jfaqqg ħu, kemm 
idumu u kemm ikun sever kull effett tossiku, l-g ħadd ta’ annimali li juru 
leżjonijiet, it-tip ta’ le żjonijiet, is-severità tag ħhom u l-per ċentwali 
tal-annimali li juru kull tip ta’ le żjoni. 
51. Meta jkun possibbli, ir-ri żultati numeri ċi għandhom ikunu evalwati 
b’metodu ta’ statistika ġeneralment a ċċettabbli u adattat. Il-paraguni 
tal-effett tul firxa tad-do ża għandhom jevitaw l-u żu ta’ testijiet-t multipli. 
Il-metodi ta’ statistika g ħandhom jintg ħażlu matul it-tfassil tal-istudju.  
52. Għall-kontroll tal-kwalità huwa propost li tin ġabar dejta storika ta’ kontroll 
u li għad-dejta numerika jkunu kkalkulati l-koeffi ċjenti ta’ varjazzjoni, spe ċ­
jalment g ħall-parametri li jkollhom rabta ma’ detezzjoni ta’ interferent 
endokrinali. Din id-dejta tista’ tintu ża għal finijiet ta’ paragun meta jkunu 
evalwati studji attwali.  
Rapport tat-test  
53. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— natura fi żika, purezza u proprjetajiet fi żikokimiċi; 
— dejta ta’ identifikazzjoni.  
Vejjikolu (fejn xieraq):  
— ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ vejjikolu, jekk ma jkunx ilma.  
Annimali tat-test:  
— speċi/razza użata; 
— għadd, età u sess tal-annimali;  
— sors, kundizzjonijiet ta’ abitazzjoni, dieta, e ċċ.; 
— piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.  
— ġustifikazzjoni g ħal speċi jekk ma jkunx far  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— motiv g ħall-għażla tal-livell ta’ do ża; 
— dettalji tal-formulazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar/preparazzjoni tad-dieta, 
konċentrazzjoni miksuba, stabbiltà u omo ġeneità tal-preparazzjoni;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— dettalji tal-amministrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar;  
— konver żjoni minn dieta/kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar ta’ ilma 
tax-xorb (ppm) g ħad-doża attwali (mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum), jekk 
applikabbli;  
— dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma.  
Punti ta’ tmiem fakultattivi investigati  
— lista ta’ punti ta’ tmiem fakultattivi investigati  
Riżultati:  
— piż tal-ġisem/bidliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— konsum ta’ ikel, u konsum ta’ ilma, jekk applikabbli;  
— dejta ta’ reazzjoni tossika skont is-sess u livell ta’ do ża, inklużi sinjali ta’ 
tossiċità; 
— natura, severità u durata ta’ osservazzjonijiet klini ċi (jekk reversibbli jew 
le); 
— attività sensorja, qawwa tal-qabda u valutazzjonijiet tal-attività motorja;  
— testijiet ematolo ġiċi b’valuri ba żi rilevanti;  
— testijiet ta’ bijokimika klinika b’valuri linja ba żi rilevanti;  
— piż tal-ġisem waqt l-ewtanasja u dejta dwar il-pi żijiet tal-organi;  
— sejbiet minn awtopsji;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha istopatolo ġiċi; 
— dejta ta’ assorbiment jekk disponibbli;  
— trattament ta’ statistika ta’ ri żultati, fejn jixraq.  
Diskussjoni dwar ri żultati.  
Konklużjonijiet  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Androġeniċità hija l-kapa ċità ta’ kimika li ta ġixxi bħal ormon andro ġeniku 
naturali (e ż. testosteron) f’organi żmu mammiferu.  
Antiandro ġeniċità hija l-kapa ċità ta’ kimika li tra żżan l-azzjoni ta’ ormon andro ­ 
ġeniku naturali (e ż. testosteron) f’organi żmu mammiferu.  
Antiestro ġeniċità hija l-kapa ċità ta’ kimika li tra żżan l-azzjoni ta’ ormon estro ­ 
ġeniku naturali (e ż. estradijol 17ß) f’organi żmu mammiferu.  
Attività tal-antitirojde  hija l-kapa ċità ta’ kimika li tra żżan l-azzjoni ta’ ormon 
naturali tat-tirojde (e ż. T 3 ) f’organi żmu mammiferu.  
Dożaġġ huwa terminu ġenerali li jinkludi do ża, il-frekwenza tag ħha u d-durata 
ta’ dożaġġ. 
Doża hija l-ammont ta’ kimika g ħall-ittestjar amministrata. Id-do ża hija espressa 
bħala piż tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal kull unità ta’ pi ż tal-ġisem ta’ annimal 
tat-test għal kull jum (e ż. mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum), jew b ħala konċentrazzjoni 
kostanti ta’ dieta.  
Tossiċità evidenti  huwa terminu ġenerali li jiddeskrivi sinjali ċari ta’ tossi ċità 
wara li tkun ġiet amministrata kimika g ħall-ittestjar. Dawn g ħandhom ikunu 
suffiċjenti għal valutazzjoni tal-periklu and g ħandhom ikunu tali li żieda 
fid-doża amministrata tista’ tkun mistennija li tirri żulta fl-iżvilupp ta’ sinjali ta’ 
tossiċità estrema u probabbilment mortalità.  
NOAEL  hija l-abbrevjazzjoni g ħall-livell bla effett ħażin osservat. Dan huwa 
l-ogħla livell ta’ do ża fejn l-ebda sejbiet ħżiena relatati ma’ trattament ma 
jkunu osservati min ħabba trattament.  
Estroġeniċità hija l-kapa ċità ta’ kimika li ta ġixxi bħal ormon estro ġeniku naturali 
(eż. estradijol 17ß) f’organi żmu mammiferu.  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  
Attività tat-tirojde  hija l-kapa ċità ta’ kimika li ta ġixxi bħal ormon naturali 
tat-tirojde (e ż. T 3 ) f’organi żmu mammiferu.  
Validazzjoni  hija proċess xjentifiku mfassal biex jikkaratterizza r-rekwi żiti oper­
attivi u l-limitazzjonijiet ta’ metodu ta’ ttestjar u biex juri l-affidabbiltà u 
r-rilevanza tieg ħu għal għan partikolari.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Appendiċi 2 
Punti ta’ tmiem rakkomandati g ħall-detezzjoni ta’ interferenti 
endokrinali (EDs) f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.7  
Punti ta’ tmiem obbligatorji Punti ta’ tmiem fakultattivi 
Piż 
— Testikoli 
— Epididimi 
— Adrenali 
— Prostata + b żieżaq seminali bi 
glandoli tal-koagulazzjoni — Ovarji 
— Utru, inklu ż ċerviċi 
— Tirojde  
Istopatolo ġija 
— Gonadi: 
— Testikoli u — Ovarji 
— Organi sesswali a ċċessorji: 
— Epididimi, — Prostata + bu żżieqa seminali bi 
glandoli tal-koagulazzjoni 
— Utru, inklu ż ċerviċi 
— Adrenali — Tirojde 
— Vaġina — Tiċpisiet vaġinali 
— Glandoli mammarji tar-ra ġel 
— Pitwitarja
 
Kejl ta’ ormoni  
— Livelli ta’ ċirkolazzjoni ta’ T3, T4 
— Livelli ta’ ċirkolazzjoni ta’ TSH  
LETTERATURA:  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neur ­
otoxicity.  
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60  
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neur ­
otoxicol. Teratol. 13: 599-609.  
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
(11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l
 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on 
Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/ EDTA/M(2006)3.
 
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/ MONO(2000)7.
 
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
 
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE u Heindel JJ 
(eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.  
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 
524-533.
 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterot ­
rophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
 
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of 
Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. TOSSIĊITÀ TA’ INALAZZJONI SUBAKUTA: STUDJU TA’ 28 JUM  
SOMMARJU  
Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.8 rivedut tfassal biex jikkaratterizza b’mod s ħiħ 
it-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar bir-rotta tal-inalazzjoni wara espo żizzjoni 
ripetuta g ħal perjodu limitat ta’ żmien (28 jum), u biex jipprovdi dejta g ħal 
valutazzjonijiet tar-riskju ta’ inalazzjoni kwantitattiva. Gruppi ta’ mill-anqas 5 rġiel u 5 nisa rodituri jkunu esposti 6 sig ħat kuljum g ħal 28 jum g ħal a) 
il-kimika g ħall-ittestjar fi tliet livelli jew aktar ta’ kon ċentrazzjoni, b) arja 
filtrata (kontroll negattiv), u/jew c) il-vejjikolu (kontroll ta’ vejjikolu). 
L-annimali jkunu esposti ġeneralment g ħal 5 ijiem fil- ġimgħa iżda espożizzjoni 
għal 7 ijiem fil- ġimgħa hija wkoll permessa. L-i ġiel u nisa jkunu dejjem ittestjati, 
iżda jkunu jistg ħu jiġu esposti f’livelli differenti ta’ kon ċentrazzjoni jekk ikun 
magħruf li sess wie ħed ikun aktar suxxettibbli g ħal kimika partikolari g ħall- 
ittestjar. Dan il-metodu jippermetti lid-direttur tal-istudju jkun flessibbli biex jinkludi gruppi satellitarji (riversibbli), ħasil tal-bronkoalveolari (BAL), testijiet 
newroloġiċi u patolo ġija klinika addizzjonali u evalwazzjonijiet istopatoli ġiċi biex 
it-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar tkun ikkaratterizzata a ħjar.
 
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test 412 
(2009) tal-OECD. Il-Linja Gwida tat-Test 412 (TG 412) ori ġinali dwar 
inalazzjoni subakuta kienet adottata fl-1981 (1). Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.8 (bħala ekwivalenti g ħat-TG 412 riveduta) kien a ġġornat biex jirrifletti 
l-istat tax-xjenza u biex jissodisfa l- ħtiġijiet regolatorji pre żenti u futuri.
 
2. Dan il-metodu jg ħin biex ikunu kkaratterizzati effetti ħżiena wara 
espożizzjoni ripetuta kuljum ta’ inalazzjoni g ħal kimika g ħall-ittestjar g ħal 
28 jum. Id-dejta derivata minn studji dwar tossi ċità ta’ inalazzjoni subakuta 
tista’ tintu ża għal valutazzjonijiet tar-riskji kwantitattivi [jekk ma jkunux 
segwiti minn studju ta’ 90 jum dwar tossi ċità ta’ inalazzjoni subkronika 
(Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness)]. Id-dejta tista’ tipprovdi wkoll inform ­
azzjoni dwar l-g ħażla ta’ kon ċentrazzjonijiet g ħal studji g ħal aktar fit-tul 
bħall-istudju ta’ 90 jum dwar it-tossi ċità ta’ inalazzjoni subkronika. Dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar mhux ma ħsub speċifikatament g ħall-ittestjar ta’ nano ­
materjali. Id-definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar 
huma pprovduti fl-a ħħar ta’ dan il-kapitolu u fid-Dokument ta’ Gwida 39 
(2). 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
3. L-informazzjoni kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha 
titqies mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma jsir l-istudju biex tissa ħħaħ 
il-kwalità tal-istudju u biex l-u żu tal-annimali jkun mill-anqas. 
L-informazzjoni li g ħandha tassisti fl-g ħażla ta’ kon ċentrazzjonijiet ta’ 
testijiet adatti tista’ tinkludi l-identità, l-istruttura tal-kimika, u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; ir-ri żultati ta’ 
kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew  in vivo ; użu/ijiet anti ċipat(i) u 
potenzjal g ħal espożizzjoni umana; dejta (Q)SAR disponibbli u dejta tossi ­
koloġika dwar kimi ċi relatati strutturalment; u dejta derivata minn ittestjar 
tat-tossiċità ta’ inalazzjoni akuta. Jekk tkun mistennija jew osservata newro ­
tossiċità waqt li jkun g ħaddej l-istudju, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li 
jinkludi evalwazzjonijiet xierqa b ħal gaġġa funzjonali ta’ 
osservazzjoni (FOB) u kejl ta’ attività motorja. G ħalkemm l-g ħażla sewwa 
tal-ħin ta’ espo żizzjonijiet relattivi g ħal eżamijiet spe ċifiċi tista’ tkun kritika, 
il-prestazzjoni ta’ dawn l-attivitajiet addizzjonali m’g ħandhiex tfixkel 
id-disinn ba żiku tal-istudju.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Id-dilwizzjonijiet ta’ kimi ċi għall-ittestjar korru żivi jew irritanti jistg ħu jiġu 
ttestjati f’kon ċentrazzjonijiet li g ħandhom jirrendu l-grad mixtieq ta’ tossi ċità 
[irreferi g ħal GD 39 (2)]. Meta l-annimali jkunu esposti g ħal dawn 
il-materjali, il-kon ċentrazzjonijiet immirati g ħandhom ikunu baxxi 
biżżejjed li ma jo ħolqux uġigħ kbir u diffikultà, i żda biżżejjed biex 
jestendu l-kurva ta’ kon ċentrazzjoni-rispons g ħal livelli li jil ħqu l-għan rego­
latorju u xjentifiku tat-test. Dawn il-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom jintg ħażlu 
abbażi ta’ każ każ, preferibbilment imsejsa fuq studju mfassal b’mod 
adegwat ta’ detezzjoni ta’ firxa li jipprovdi informazzjoni dwar il-punt ta’ 
tmiem kritiku, dwar kull livell limitu ta’ irritazzjoni u dwar il- ħin ta’ meta 
beda (ara l-paragrafi 11-13). G ħandha ting ħata l-ġustifikazzjoni g ħall-għażla 
ta’ konċentrazzjoni.  
5. L-annimali moribondi jew annimali li jkunu jidhru li jkunu mu ġugħa jew li 
juru sinjali ta’ diffikultà severa u fit-tul g ħandhom jinqatlu b’mod uman. 
L-annimali moribondi jitqiesu bl-istess mod b ħal annimali li jmutu waqt 
it-test. Il-kriterji g ħat-teħid tad-deċiżjoni li jinqatlu annimali moribondi jew 
li jkunu qed ibatu ħafna, u gwida biex ikun mag ħruf meta l-mewt tkun tista’ 
titbassar jew tkun waslet qrib ħafna, huma s-su ġġett ta’ Dokument ta’ 
Gwida tal-OECD dwar il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (3).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ Spe ċi tal-Annimali  
6. Għandhom jintu żaw rodituri adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li 
komunement jintu żaw fil-laboratorju. L-ispe ċi preferuta hija l-far. G ħandha 
tingħata ġustifikazzjoni jekk jintu żaw speċijiet oħra. 
Preparazzjoni tal-annimali  
7. Nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx ikunu tqal. Fil-jum li fih 
jintgħażlu b’mod ka żwali, l-annimali g ħandhom ikunu adulti żgħażagħ li 
jkunu minn 7 sa 9 ġimgħat fl-età. Il-pi żijiet tal-ġisem għandhom ikunu ta’ 
±20 % tal-pi ż medju g ħal kull sess. L-annimali jintg ħażlu b’mod ka żwali, 
jiġu mmarkati g ħal identifikazzjoni individwalment, u jin żammu fil-ga ġeġ 
tagħhom għal mill-anqas 5 ijiem qabel ma jibda t-test biex jidraw 
il-kundizzjonijiet tal-laboratorju.  
Trobbija tal-annimali  
8. L-annimali g ħandhom ikunu identifikati individwalment, jekk ikun possibbli 
bi transponders ta ħt il-ġilda, biex ikunu ffa ċilitati l-osservazzjonijiet u tkun 
evitata l-konfu żjoni. It-temperatura tal-kamra ta’ manutenzjoni tal-annimali 
esperimentali g ħandha tkun 22 ± 3 °C. L-umdità relattiva g ħandha idealment 
tinżamm fil-firxa ta’ 30 % sa 70 %, g ħalkemm dan jista’ ma jkunx possibbli 
meta jintu ża l-ilma b ħala vejjikolu. Qabel u wara l-espo żizzjonijiet, 
l-annimali ġeneralment g ħandhom jitqieg ħdu f’gaġġa fi gruppi skont 
is-sess u l-kon ċentrazzjoni, i żda l-għadd ta’ annimali g ħal kull ga ġġa 
m’għandux ifixkel l-osservazzjoni ċara ta’ kull annimal u g ħandu 
jimminimizza t-telf min ħabba kannibali żmu u ġlied. Meta l-annimali 
jkollhom ikunu esposti mill-imnie ħer biss, jista’ jkun je ħtiġilhom jidraw 
it-tubi ta’ tra żżin. It-tubi ta’ tra żżin m’għandhomx jimponu tensjoni fi żika, 
termali u ta’ immobilizzazzjoni bla b żonn fuq l-annimali. It-tra żżin jista’ 
jaffettwa punti ta’ tmiem fi żjoloġiċi bħat-temperatura tal- ġisem (ipertermja) 
u/jew volum respiratorju minusklu. Jekk tkun disponibbli dejta ġenerika li 
turi li ebda bidliet b ħal dawn ma jse ħħu sa ċertu limitu konsiderevoli, f’dak 
il-każ ma jkunx me ħtieġ adattament minn qabel g ħat-tubi ta’ tra żżin. 
L-annimali esposti mill- ġisem kollu g ħal aerosol g ħandhom jing ħalqu indi­
vidwalment matul l-espo żizzjoni biex ma jit ħallewx jiffiltraw l-aerosol 
tat-test mal-pil ta’ s ħabhom fil-ga ġġa. Jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali 
u ċċertifikati mil-laboratorju, ħlief matul espo żizzjoni, flimkien ma’ 
provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb muni ċipali. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl/12-il sieg ħa dlam.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Kmamar tal-inalazzjoni  
9. In-natura tal-kimika g ħall-ittestjar u l-o ġġett tat-test g ħandhom jitqiesu 
fl-għażla tal-kamra tal-inalazzjoni. Il-modalità ppreferuta ta’ espo żizzjoni 
hija mill-imnie ħer biss (liema fra żi tinkludi r-ras biss, l-imnie ħer biss, jew 
il-geddum biss). Espo żizzjoni mill-imnie ħer biss hija ġeneralment ippre ­
feruta għal studji ta’ aerosols likwidi jew solidi u g ħal fwar li jista’ 
jikkondensa biex jifforma l-aerosols. G ħanijiet spe ċjali tal-istudju jistg ħu 
jinkisbu a ħjar billi tintu ża modalità ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu, i żda 
dan għandu jkun i ġġustifikat fir-rapport tal-istudju. Biex tkun żgurata 
stabbiltà tal-atmosfera meta tintu ża kamra g ħall-ġisem kollu, “il-volum” 
totali tal-annimali tat-test m’g ħandux ikun aktar minn 5 % tal-volum 
tal-kamra. Il-prin ċipji ta’ tekniki ta’ espo żizzjoni mill-imnie ħer biss u 
mill-ġisem kollu u tal-vanta ġġi u l-iżvantaġġi partikolari tag ħhom huma 
indirizzati f’GD 39 (2).  
STUDJI DWAR IT-TOSSI ĊITÀ 
Konċentrazzjonijiet limitati  
10. B’differenza minn studji akuti, m’hemmx kon ċentrazzjonijiet limitati 
ddefiniti fi studji ta’ 28 jum dwar tossi ċità ta’ inalazzjoni subakuta. 
Il-konċentrazzjoni massima ttestjata g ħandha tqis: 1) il-kon ċentrazzjoni 
massima li tista’ tinkiseb, 2) il-livell ta’ “l-ag ħar każ” ta’ espo żizzjoni 
umana, 3) il- ħtieġa li tinżamm provvista adegwata ta’ ossi ġenu, u/jew 4) 
konsiderazzjonijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali. Fin-nuqqas ta’ limiti 
abbażi ta’ dejta, jistg ħu jintużaw il-limiti akuti tar-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 (13) (ji ġifieri sa kon ċentrazzjoni massima ta’ 5 mg/l g ħal 
aerosols, 20 mg/l g ħal fwar u 20 000 ppm g ħal gassijiet); irreferi g ħal GD 
39 (2). G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni jekk ikun me ħtieġ li dawk il-limiti 
jinqabżu meta jkunu ttestjati gassijiet jew kimi ċi għall-ittestjar volatili ħafna 
(eż. refriġeranti). Il-kon ċentrazzjoni limitata g ħandha tislet tossi ċità inek­
wivoka ming ħajr ma tikkaw ża tensjoni bla b żonn għall-annimali jew 
tolqot it-tul tal- ħajja tagħhom (3).  
Studju dwar id-Detezzjoni ta’ Firxa  
11. Qabel ma jing ħata bidu g ħall-istudju ewlieni, jista’ jkun me ħtieġ li jsir 
studju dwar l-detezzjoni ta’ firxa. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa huwa aktar komprensiv minn studju ta’ osservazzjoni min ħabba li mhux limitat 
għal għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet. It-tag ħlim li hemm x’wie ħed jieħu minn 
studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jwassal biex l-istudju ewlieni 
jirnexxi. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’, pere żempju, jipprovdi 
informazzjoni teknika dwar metodi analiti ċi, teħid tad-daqs ta’ parti ċelli, 
sejbien ta’ mekkani żmi tossiċi, patoloġija klinika u dejta istopatolo ġika u 
stimi ta’ x’jista’ jkunu kon ċentrazzjonijiet ta’ NOAEL u MTC fi studju 
ewlieni. Id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li ju ża l-istudju dwar 
id-detezzjoni ta’ firxa biex jidentifika l-limitu tal-irritazzjoni tas-sistema 
respiratorja (e ż. bl-istopatolo ġija tas-sistema respiratorja, l-ittestjar 
tal-funzjoni pulmonarja jew il- ħasil tal-bronkoalveolari), il-kon ċentrazzjoni 
ogħla li hija tollerata ming ħajr tensjoni bla b żonn għall-annimali, u 
l-parametri li g ħandhom jikkaratterizzaw bl-a ħjar mod it-tossi ċità ta’ 
kimika għall-ittestjar.
 
12. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jikkonsisti f’livell wie ħed jew aktar 
ta’ konċentrazzjonijiet. M’g ħandhomx ikunu esposti aktar minn tliet ir ġiel u 
tliet nisa f’kull livell ta’ kon ċentrazzjoni. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa 
għandu jdum mill-anqas 5 ijiem u ġeneralment mhux aktar minn 14 jum. 
Il-motiv g ħall-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet g ħall-istudju ewlieni g ħandu 
jingħata fir-rapport ta’ studju. L-g ħan tal-istudju ewlieni huwa li tintwera 
relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni-rispons ibba żata fuq dak li huwa mistenni li 
jkun l-aktar punt ta’ tmiem sensittiv. Il-kon ċentrazzjoni baxxa g ħandha 
idealment tkun kon ċentrazzjoni ta’ ebda effett ħażin osservat, filwaqt li 
l-konċentrazzjoni g ħolja għandha tislet tossi ċità inekwivoka ming ħajr ma 
tikkawża tensjoni bla b żonn għall-annimali jew tolqot it-tul tal- ħajja 
tagħhom (3).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Meta tkun qed issir l-g ħażla ta’ livelli ta’ kon ċentrazzjoni g ħall-istudju dwar 
id-detezzjoni ta’ firxa, l-informazzjoni kollha disponibbli g ħandha titqies li 
tinkludi relazzjonijiet ta’ attività strutturata u dejta g ħal kimiċi simili (ara 
l-paragrafu 3). Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jivverifika/jirrifjuta dawk li jitqiesu li jkunu l-punti ta’ tmiem l-aktar sensittivi bba żati b’mod 
mekkaniku, e ż. inibizzjoni ta’ kolinestera żi minn organofosfati, formazzjoni 
ta’ metemoglobina minn a ġenti eritro ċitotossiċi, ormoni tat-tirojde (T3, T4) 
għal tirotossikanti, proteina, LDH, jew newtrofili f’ ħasil tal-bronkoalveolari 
għal partiċelli li ftit jin ħallu li ma jag ħmlux ħsara jew aerosols li jirritaw 
il-pulmun.
 
Studju Ewlieni  
14. L-istudju ewlieni dwar tossi ċità subakuta ġeneralment jikkonsisti fi tliet 
livelli ta’ kon ċentrazzjoni, u wkoll kontrolli konkurrenti negattivi (arja) 
u/jew ta’ vejjikoli skont il- ħtieġa (ara l-paragrafu 17). Id-dejta kollha 
disponibbli g ħandha tkun utilizzata b ħala għajnuna fl-g ħażla ta’ livelli 
adatti ta’ espo żizzjoni, inklu żi r-riżultati ta’ studji sistemi ċi ta’ tossi ċità, 
metaboliżmu u kinetika (g ħandha ssir enfa żi partikolari biex ikunu evitati 
livelli għoljin ta’ kon ċentrazzjoni li jissaturaw pro ċessi kineti ċi). Kull grupp 
ta’ test ikollu fih mill-anqas 10 rodituri (5 r ġiel u 5 nisa) li jkunu esposti 
għall-kimika g ħall-ittestjar g ħal 6 sig ħat kuljum fuq ba żi ta’ 5 ijiem 
fil-ġimgħa għal perjodu ta’ 4 ġimgħat (l-istudju jdum b’kollox 28 jum). 
L-annimali jistg ħu wkoll ikunu esposti 7 ijiem fil- ġimgħa (eż. meta 
l-ittestjar ikun ħa farmaċewtiċi man-nifs). Jekk ikun mag ħruf li wie ħed 
miż-żewġ sessi jkun aktar suxxettibbli g ħal kimika partikolari g ħall-ittestjar, 
is-sessi jkunu jistg ħu jiġu esposti f’livelli differenti ta’ kon ċentrazzjoni biex 
isir l-aħjar użu mill-kon ċentrazzjoni-rispons kif deskritt fil-paragrafu 15. 
Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra l-firien ikunu esposti mill-imnie ħer 
biss, il-perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu jkunu a ġġustati biex 
titnaqqas id-diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. G ħandu jkun 
ipprovdut motiv meta l-espo żizzjoni ddum anqas minn 6 sig ħat/jum, jew 
meta jkun me ħtieġ li jsir studju ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu li jdum 
aktar (eż. 22 sieg ħa/jum) [irreferi g ħal GD 39 (2)]. M’g ħandux jing ħata 
għalf matul il-perjodu ta’ espo żizzzjoni sakemm espo żizzjoni ma ddumx 
aktar minn 6 sig ħat. Jista’ jing ħata ilma matul l-espo żizzjoni kollha 
tal-ġisem kollu.  
15. Il-kon ċentrazzjonijiet immirati mag ħżulin għandhom jidentifikaw l-organu/i 
mmirat(i) u juru kon ċentrazzjoni-rispons ċari: 
— Il-livell g ħoli ta’ kon ċentrazzjoni g ħandu jirri żulta f’effetti tossi ċi iżda 
m’għandux jikkaw ża sinjali jew letalità li jdumu u li ma j ħallux li ssir 
evalwazzjoni li tag ħmel sens.  
— Il-livell(i) intermedju/i ta’ kon ċentrazzjoni g ħandhom ikunu spazjati biex 
jipproduċu gradazzjoni ta’ effetti tossi ċi bejn dawk tal-kon ċentrazzjoni 
baxxa u dawk tal-kon ċentrazzjoni g ħolja. 
— Il-livell baxx ta’ kon ċentrazzjoni g ħandu jipprodu ċi ftit jew ebda 
evidenza ta’ tossi ċità. 
Studju satellitarju (Riversibbiltà)  
16. Studju satellitarju (riversibbiltà) jista’ jintu ża biex ikunu osservati 
r-riversibbiltà, il-persistenza jew l-okkorrenza mdewma ta’ tossi ċità għal 
perjodu ta’ wara t-trattament ta’ tul xieraq, i żda ta’ mhux anqas minn 14- 
il jum. Gruppi satellitarji (riversibbli) jikkonsistu f’ ħames irġiel u ħames nisa 
esposti kontemporanjament mal-annimali tal-esperimenti fl-istudju ewlieni. Gruppi ta’ studju satellitarju (riversibbli) g ħandhom ikunu esposti g ħall- 
kimika g ħall-ittestjar fl-og ħla livell ta’ kon ċentrazzjoni u g ħandu jkun 
hemm arja konkurrenti u/jew kontrolli ta’ vejjikoli skont il- ħtieġa (ara 
l-paragrafu 17).
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Annimali tal-Kontroll  
17. L-annimali tal-kontroll negattiv (arja) konkurrenti g ħandhom ikunu 
mmaniġġati b’mod identiku g ħall-grupp ta’ annimali tat-test ħlief li huma 
jkunu esposti g ħal arja filtrata milli g ħal kimika g ħall-ittestjar. Meta l-ilma 
jew sustanza o ħra jintużaw biex jassistu il- ġenerazzjoni tal-atmosfera tat-test, 
fl-istudju g ħandu jkun inklu ż grupp ta’ kontroll ta’ vejjikoli, minflok grupp 
ta’ kontroll negattiv (arja). Kull meta jkun possibbli g ħandu jintu ża l-ilma 
bħala l-vejjikolu. Meta l-ilma jintu ża bħala l-vejjikolu, l-annimali ta’ kontroll 
għandhom ikunu esposti g ħall-arja bl-istess umdità relattiva b ħal tal-gruppi 
esposti. L-g ħażla ta’ vejjikolu adattat g ħandha tkun ibba żata fuq studju minn 
qabel immexxi sewwa jew fuq dejta storika. Jekk it-tossi ċità ta’ vejjikolu 
ma’ tkunx mag ħrufa sewwa, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li juża kemm 
kontroll negattiv (arja), kif ukoll kontroll ta’ vejjikolu, i żda dan għandu jkun 
skuraġġit bil-qawwa. Jekk dejta storika turi li vejjikolu ma jkunx tossiku, 
f’dak il-ka ż ma jkunx hemm ħtieġa għal grupp ta’ kontroll negattiv (arja) u 
għandu jintu ża biss kontroll ta’ vejjikolu. Jekk studju minn qabel ta’ kimika 
għall-ittestjar ifformulata f’vejjikolu ma turi ebda tossi ċità, isegwi li 
l-vejjikolu ma jkunx tossiku fil-kon ċentrazzjoni ttestjata u g ħandu jintu ża 
dan il-kontroll ta’ vejjikolu.  
KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Amministrazzjoni ta’ Kon ċentrazzjonijiet  
18. L-annimali jkunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar b ħala gass, fwar, 
aerosol, jew ta ħlita tagħhom. L-istat fi żiku li jkollu ji ġi ttestjat jiddependi 
mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar, il-kon ċentrazzjoni 
magħżula, u/jew il-forma fi żika li x’aktarx tkun pre żenti matul 
l-immaniġġar u l-użu tal-kimika g ħall-ittestjar. Il-kimi ċi għall-ittestjar igros ­
kopiku u reattivi kimikament g ħandhom ikunu ttestjati f’kundizzjonijiet ta’ 
arja xotta. G ħandha ting ħata attenzjoni biex ikun evitat li jkunu ġġenerati 
konċentrazzjonijiet esplussivi. Il-materjal tal-parti ċelli jista’ jkun so ġġett 
għal proċessi mekkani ċi biex jitnaqqas id-daqs tal-parti ċelli. Hija 
pprovduta gwida ulterjuri f’GD 39 (2).  
Distribuzzjoni tad-Daqs tal-Parti ċelli 
19. It-teħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħall-aerosols kollha u g ħall-fwar 
li jista’ jikkondensa biex jifforma l-aerosols. Biex tit ħalla jkun hemm 
espożizzjoni tar-re ġjuni kollha rilevanti tas-sistema respiratorja, huma rrak ­
komandati aerosols b’dijametri aerodinami ċi ta’ medjan ta’ massa (MMAD) 
f’firxa minn 1 sa 3 μm b’devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ) fil-firxa ta’ 
1,5 sa 3,0 (4). G ħalkemm g ħandu jsir sforz ra ġonevoli biex dan l-istandard 
jintlaħaq, għandu jkun ipprovdut ġudizzju espert jekk ma jkunx jista’ jint ­
laħaq. Pereżempju, il-parti ċelli tad-d ħaħen tal-metall jistg ħu jkunu anqas 
minn dan l-istandard, u l-parti ċelli u fibri ċċarġjati jistgħu jaqbżuh. 
Preparazzjoni tal-Kimika g ħall-Ittestjar f’Vejjikolu  
20. Idealment, il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tiġi ttestjata ming ħajr vejjikolu. 
Jekk ikun me ħtieġ jintuża vejjikolu biex ikunu ġġenerati l-kon ċentrazzjoni 
adattata tal-kimika g ħall-ittestjar u d-daqs tal-parti ċelli, l-ilma g ħandu 
jingħata preferenza. Kull darba li kimika g ħall-ittestjar tin ħall f’vejjikolu, 
l-istabbiltà tag ħha għandha tintwera.  
MONITORA ĠĠ TAL-KONDIZZJONIJIET TAL-ESPO ŻIZZJONI  
Fluss tal-Arja fil-Kamra  
21. Il-fluss tal-arja fil-kamra tal-espo żizzjoni għandu jkun ikkontrollat sewwa, 
immonitorjat kontinwament u rre ġistrat mill-anqas kull sieg ħa matul kull 
espożizzjoni. Il-monitora ġġ fil-ħin reali tat-kon ċentrazzjoni atmosferika 
tat-test (jew stabbiltà temporali) huwa kejl integrali tal-parametri dinami ċi 
kollha u jipprovdi mezzi indiretti g ħall-kontroll tal-parametri rilevanti u 
d-dinamiċi kollha tal-inalazzjoni. Jekk il-kon ċentrazzjoni tkun immonitorjata 
fil-ħin reali, il-frekwenza tal-kejl tal-flussi tal-arja tista’ titnaqqas sa kejl 
wieħed għal kull espo żizzjoni għal kull jum. G ħandha ting ħata konsider ­
azzjoni spe ċjali biex tkun evitata l-inalazzjoni mill- ġdid fil-kmamar g ħall- 
imnieħer biss. Il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġenu għandha tkun mill-anqas ta’  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
19 % u l-kon ċentrazzjoni tad-dijossidu tal-karbonju m’g ħandhiex tkun aktar 
minn 1 %. Jekk ikun hemm ra ġuni biex wie ħed jemmen li dan l-istandard 
ma jkunx jista’ jitla ħaq, il-kon ċentrazzjonijiet tal-ossi ġenu u tad-dijossidu 
tal-karbonju g ħandhom jitkejlu. Jekk il-kejlijiet fl-ewwel jum ta’ 
espożizzjoni juru li dawn il-gassijiet ikunu ta’ livelli tajbin, ma jkunux 
meħtieġa aktar kejlijiet.  
Temperatura tal-Kamra u Umdità Relattiva  
22. It-temperatura tal-kamra g ħandha tin żamm f’22 ± 3 °C. L-umdità relattiva 
fiż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs, g ħal espożizzjonijiet kemm 
mill-imnie ħer biss, kif ukoll mill- ġisem kollu, g ħandha tkun immonitorjata 
kontinwament u rre ġistrata kull sieg ħa matul kull espo żizzjoni meta jkun 
possibbli. L-umdità relattiva g ħandha preferibbilment tin żamm fil-firxa ta’ 
30 % sa 70 %, i żda din jew ma tkunx tista’ tintla ħaq (eż. meta jkunu 
ttestjati ta ħlitiet abba żi ta’ ilma) jew ma tkunx tista’ titkejjel min ħabba 
interferenza mill-kimika g ħall-ittestjar mal-Metodu ta’ Ttestjar.  
Kimika g ħall-Ittestjar: Kon ċentrazzjoni Nominali  
23. Kull meta jkun fattibbli, il-kon ċentrazzjoni nominali tal-kamra ta’ 
espożizzjoni g ħandha tkun ikkalkulata u rre ġistrata. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali hija l-massa ġġenerata ta’ kimika g ħall-ittestjar divi ża bil-volum 
totali ta’ arja li tkun g ħaddiet mis-sistema tal-kamra tal-inalazzjoni. 
Il-konċentrazzjoni nominali ma tintu żax biex tikkaratterizza l-espo żizzjoni 
tal-annimali, i żda hija paragun tal-kon ċentrazzjoni nominali u 
l-konċentrazzjoni attwali tag ħti indikazzjoni tal-effi ċjenza ta’ ġenerazzjoni 
tas-sistema tal-ittestjar, u, g ħalhekk, tista’ tintu ża biex jinkixfu l-problemi 
ta’ ġenerazzjoni.  
Kimika g ħall-Ittestjar: Kon ċentrazzjoni Attwali  
24. Il-kon ċentrazzjoni attwali hija l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar kif 
ikun itteħdilha l-kampjun tag ħha fiż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs 
f’kamra tal-inalazzjoni. Il-kon ċentrazzjonijiet attwali jistg ħu jinkisbu 
b’metodi spe ċifiċi (eż. teħid dirett ta’ kampjuni, metodi ta’ assorbiment 
jew kimi ċi reattivi, u karatterizzazzjoni analitika sussegwenti) jew 
b’metodi mhux spe ċifiċi bħal analiżi gravimetrika b’filtru. L-u żu ta’ 
analiżi gravimetrika huwa a ċċettabbli biss g ħal aerosols tat-trab b’kom ­
ponent wie ħed jew g ħal aerosols ta’ likwidi ta’ volatilità baxxa u g ħandu 
jkun appo ġġat minn karatterizzazzjonijiet adattati ta’ qabel l-istudju spe ċifiċi 
għall-kimika g ħall-ittestjar. Il-kon ċentrazzjoni ta’ aerosols tat-trab b’ ħafna 
komponenti tista’ wkoll tkun iddeterminata b’anali żi gravimetrika. I żda 
din teħtieġ dejta analitika li turi li l-kompo żizzjoni tal-materjal tal-ajru 
tkun simili g ħall-materjal tal-bidu. Jekk din l-informazzjoni ma tkunx 
disponibbli, tista’ tkun me ħtieġa analiżi mill-ġdid tal-kimika g ħall-ittestjar 
(idealment fl-istat tag ħha fl-arja) f’intervalli regolari waqt li jkun g ħaddej 
l-istudju. G ħal aġenti aerosolizzati li jistg ħu jevaporaw jew jissubblimaw, 
għandu jintwera li l-fa żijiet kollha kienu n ġabru bil-metodu mag ħżul. 
25. Għandu jintu ża lott wie ħed tal-kimika g ħall-ittestjar sakemm idum l-istudju, 
jekk ikun possibbli, u l-kampjun tat-test g ħandu jinħażen f’kundizzjonijiet li 
jżommu l-purezza, l-omo ġeneità u l-istabbiltà tieg ħu. Qabel ma jinbeda 
l-istudju, g ħandu jkun hemm karatterizzazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, 
inkluża l-purezza tag ħha, u jekk teknikament fattibbli, l-identità u 
l-kwantitajiet ta’ kontaminanti u impuritajiet identifikati. Dan jista’ jintwera i żda ma jkunx limitat mid-dejta li ġejja: ħin ta’ ritenzjoni u erja 
relattiva fl-og ħla livell, pi ż molekulari minn spettrometrija tal-massa jew 
minn anali żi kromatografika ta’ gass, jew minn stimi o ħra. Għalkemm 
l-identità tal-kampjun tat-test mhix ir-responsabbiltà tal-laboratorju tat-test, jista’ jkun prudenti g ħal-laboratorju tat-test li jikkonferma 
l-karatterizzazzjoni tal-isponser g ħall-anqas b’mod limitat (e ż. lewn, natura 
fiżika, eċċ.).
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. L-atmosfera ta’ espo żizzjoni għandha tin żamm kostanti daqa kemm ikun 
prattikabbli. Jista’ jintu ża apparat ta’ monitora ġġ f’ħin reali, b ħalma huwa 
fotomiter tal-aerosol g ħal aerosols jew analizzatur tal-idrokarbur totali g ħall- 
fwar biex tintwera l-istabbiltà tal-kundizzjonijiet ta’ espo żizzjoni. 
Il-konċentrazzjonijiet attwali tal-kamra g ħandhom jitkejlu mill-anqas 3 
darbiet matul kull jum ta’ espo żizzjoni għal kull livell ta’ kon ċentrazzjoni. 
Jekk dan ma jkunx jista’ jsir min ħabba rati limitati ta’ fluss ta’ arja jew 
minħabba kon ċentrazzjonijiet baxxi, ikun a ċċettabbli kampjun wie ħed għal 
kull perjodu ta’ espo żizzzjoni. Idealment, dan il-kampjun g ħandu mbag ħad 
jinġabar tul il-perjodu kollu ta’ espo żizzzjoni. Il-kampjuni individwali 
tal-konċentrazzjoni tal-kamra jistg ħu jkollhom devjazzjoni 
mill-konċentrazzjoni medja tal-kamra b’mhux aktar minn ± 10 % g ħall- 
gassijiet u l-fwar, u b’mhux aktar minn ± 20 % g ħall-aerosols likwidi jew 
solidi. Il- ħin biex tinkiseb ekwilibrazzjoni tal-kamra (t  95 ) għandu jkun 
ikkalkulat u rrappurtat. Id-durata ta’ espo żizzjoni tkopri l- ħin li fih 
il-kimika g ħall-ittestjar tkun i ġġenerata. Din tqis il- ħinijiet me ħtieġa biex 
jinkisbu l-ekwilibrazzjoni (t  95 ) u d-degradazzjoni tal-kamra. Il-gGwida 
għal stima ta’ t  95 tinsab f’GD 39 (2).  
27. Għal taħlitiet kumplessi ħafna li jikkonsistu f’gassijiet/fwar u aerosols (e ż. 
atmosferi ta’ kombustjoni u kimi ċi għall-ittestjar im ħaddmin minn 
prodotti/mezzi ta’ u żu finali b’g ħan speċifiku), kull fa żi tista’ ta ġixxi 
b’mod differenti f’kamra tal-inalazzjoni. G ħalhekk, g ħandha tintg ħażel 
mill-anqas sustanza indikatri ċi waħda (analita), normalment is-sustanza 
attiva prin ċipali fit-ta ħlita, ta’ kull fa żi (gass/fwar u aerosol). Meta 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun ta ħlita, il-kon ċentrazzjoni analitika g ħandha 
tkun irrappurtata fir-rigward tat-ta ħlita totali, u mhux biss g ħall-ingredjent 
attiv jew g ħas-sustanza indikatri ċi (analita). L-informazzjoni addizzjonali 
dwar kon ċentrazzjonijiet attwali tinsab f’GD 39 (2).  
Kimika g ħall-Ittestjar: Distribuzzjoni tad-Daqs tal-Parti ċelli 
28. Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli tal-aerosols g ħandha tkun iddeter ­
minata mill-anqas kull ġimgħa għal kull livell ta’ kon ċentrazzjoni billi 
jintuża impattur kaskata jew strument alternattiv, b ħall-għodda ajrudinamika 
li tagħti d-daqs lill-parti ċelli (APS). Jekk tkun tista’ tinkiseb ekwivalenza 
tar-riżultati miksubin minn impattur kaskata u mill-istrument alternattiv, 
f’dak il-ka ż l-istrument alternattiv ikun jista’ jintu ża tul l-istudju kollu.  
29. It-tieni mezz, b ħal filtru gravimetriku jew impinger/gas bubbler, g ħandu 
jintuża b’mod parallell mal-istrument primarju biex jikkonferma 
l-effiċjenza tal-istrument primarju fil- ġabra. Il-kon ċentrazzjoni tal-massa 
miksuba b’anali żi tad-daqs tal-parti ċelli għandha tkun fil-limiti ra ġonevoli 
tal-konċentrazzjoni tal-massa miksuba b’anali żi b’filtru [ara GD 39 (2)]. 
Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza fil-kon ċentrazzjonijiet kollha ttestjati 
fil-fażi bikrija tal-istudju, f’dak il-ka ż kejlijiet ta’ konferma ulterjuri jistg ħu 
jitħallew barra. Biex jin żamm trattament xieraq tal-annimali, g ħandhom 
jittieħdu miżuri biex tkun imminimizzata dejta inkonklussiva li tista’ 
twassal g ħal ħtieġa ta’ ripetizzjoni tal-istudju.  
30. It-teħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħal fwar jekk ikun hemm xi 
possibbiltà li tista’ tirri żulta kondensazzjoni ta’ fwar fil-formazzjoni ta’ 
aerosol, jew jekk jinstabu parti ċelli f’atmosfera ta’ fwar b’potenzjal g ħall- 
fażijiet imħallta.  
OSSERVAZZJONIJIET  
31. L-annimali g ħandhom ikunu osservati klinikament qabel, matul u wara 
l-perjodu ta’ espo żizzzjoni. Jistg ħu jkunu indikati osservazzjonijet aktar ta’ 
spiss skont ir-rispons tal-annimali matul l-espo żizzjoni. Meta l-osservazzjoni 
tal-annimali tkun imfixkla bl-u żu ta’ tubi ta’ tra żżin tal-annimali, bi kmamar 
għall-ġisem kollu mixg ħulin ħażin, jew b’atmosferi opaki, l-annimali 
għandhom ikunu osservati bir-reqqa wara l-espo żizzjoni. 
L-osservazzjonijiet qabel l-espo żizzjoni tal-jum li jkun imiss jistg ħu 
jivvalutaw kwalunkwe riversibbiltà jew effetti tossi ċi li jkunu marru aktar 
għall-agħar. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. L-osservazzjonijiet kollha ji ġu rreġistrati b’re ġistri individwali mi żmumin 
għal kull annimal. Meta l-annimali jinqatlu g ħal raġunijiet umani jew 
jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jiġi rreġistrat b’mod pre ċiż kemm 
jista’ jkun.  
33. L-osservazzjonijiet mal- ġenb tal-ga ġġa għandhom jinkludu bidliet fil- ġilda u 
l-pil, l-għajnejn, u l-membrani muku żi; il-bidliet fis-sistema respiratorja u 
ċirkulatorja, il-bidliet fis-sistema nervu ża, u l-bidliet fl-attività somato ­
motorja u fix-xejriet tal-im ġiba. Attenzjoni g ħandha tkun diretta g ħall-osser­
vazzjonijiet ta’ treg ħid, konvul żjonijiet, tbe żliq, dijarea, letar ġija, rqad u 
koma. Il-kejl tat-temparaturi tar-rektum jista’ jipprovdi evidenza li ssostni 
bradipnea riflessa jew ipo/ipertermja relatati mat-trattament jew l-g ħeluq. 
Jistgħu jkunu inklu żi valutazzjonijiet addizzjonali fil-protokoll ta’ studju 
bħal kinetika, monitora ġġ bijoloġiku, funzjoni tal-pulmun, ritenzjoni ta’ 
materjali li ftit jin ħallu li jinġemgħu fit-tessut tal-pulmun, u bidliet fl-im ġiba. 
PIŻIJIET TAL- ĠISEM  
34. Il-piżijiet tal-annimali indivdwali g ħandhom ji ġu rreġistrati ftit qabel 
l-ewwel espo żizzjoni (jum)), u darbtejn fil- ġimgħa wara din (pere żempju: 
nhar ta’ Ġimgħa u nhar ta’ Tnejn biex juru l-irkupru matul tmiem il- ġimgħa 
mingħajr espożizzjoni jew matul intervall tal- ħin biex jippermetti valu ­
azzjoni tat-tossi ċità sistematika) jew fil-mument tal-mewt jew l-ewtana żja. 
Jekk ma jkunx hemm effetti fl-ewwel ġimagħtejn (2), il-pi żijiet tal-ġisem 
jistgħu jitkejlu kull ġimgħa għall-bqija tal-istudju. L-annimali satellitarji 
(riversibbli) (jekk u żati) għandhom jibqg ħu jintiżnu kull ġimgħa tul 
il-perjodu kollu ta’ rkupru. Fi tmiem l-istudju, l-annimali kollha għandhom jinti żnu ftit qabel il-qatla biex tit ħalla ssir kalkulazzjoni 
imparzjali tal-proporzjonijiet tal-organi mal-pi żijiet tal-ġisem.
 
KONSUM TAL-IKEL U L-ILMA  
35. Il-konsum tal-ikel g ħandu jitkejjel kull ġimgħa. Il-konsum tal-ilma wkoll 
jista’ jitkejjel.  
PATOLO ĠIJA KLINIKA  
36. Il-valutazzjonijiet tal-patolo ġija klinika g ħandhom isiru g ħall-annimali 
kollha, inklu żi annimali ta’ kontroll u satellitarji (riversibbli), meta 
jinqatlu. L-intervall ta’ ħin bejn tmiem l-espo żizzjoni u l- ġbir tad-demm 
għandu jiġi rreġistrat, l-aktar meta l-kostituzzjoni mill- ġdid tal-punt ta’ 
tmiem indirizzat tkun mg ħaġġla. It-teħid ta’ kampjuni wara tmiem 
espożizzjoni huwa indikat g ħal dawk il-parametri b’nofs ħajja plażmatika 
qasira (eż. COHb, CHE, and MetHb).  
37. It-Tabella 1 telenka l-parametri ta’ patolo ġija klinika li ġeneralment ikunu 
meħtieġa għall-istudji tossikolo ġiċi kollha. L-anali żi tal-awrina ma tkunx 
meħtieġa abbażi ta’ rutina, i żda tista’ ssir meta titqies utli bba żata fuq 
tossiċità mistennija jew osservata. Id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li 
jivvaluta parametri addizzjonali biex jikkaratterizza a ħjar it-tossi ċità ta’ 
kimika għall-ittestjar (e ż. kolinestera żi, lipidi, ormoni, bilan ċ ta’ aċidu/bażi, 
metemoglobina jew korpi ta’ Heinz, kina żi tal-kreatina, proporzjon ta’ 
mjelojde/eritrojde, troponini, gassijiet ta’ demm arterjali, deidro ġenażi 
lattat, deidro ġenażi tas-sorbitol, glutamat ta’ deidro ġenażi u gamma 
glutamil transpeptida żi). ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabella 1  
Parametri Standard ta’ Patolo ġija Klinika  
Ematoloġija 
Għadd ta’ eritro ċiti 
Ematokrit 
Konċentrazzjoni ta’ emoglobina 
Emoglobina korpuskulari medja Volum korpuskulari medju 
Konċentrazzjoni ta’ emoglobina 
korpuskulari medja 
Retikuloċiti Għadd totali ta’ lewko ċiti 
Għadd differenzjali ta’ lewko ċiti 
Għadd ta’ pjastrini 
Potenzjal g ħal emboli żmu (agħżel 
wieħed): 
— Ħin protrombin 
— Ħin ta’ emboli żmu 
— Ħin tromboplastin parzjali
 
Kimika klinika  
Glukożju (*) 
Kolesterol totali Trigliċeridi 
Nitroġenu tal-urea tad-demm 
Bilirubina totali Kreatinina Proteina totali 
Albumina 
Globulina Aminotransfera żi tal-alanina 
Aspartate aminotransfera żi 
Fosfatażi alkalina 
Potassju 
Sodju Kalċju 
Fosforu 
Klorur
 
Analiżi tal-awrina (fakultattiva)  
Dehra (lewn u turbidità) 
Volum Gravità spe ċifika jew o żmolalità 
pH Proteina totali 
Glukożju 
Demm/ċelluli tad-demm
 
(*) Minħabba li perjodu ta’ sawm fit-tul jista’ jintrodu ċi parzjalità fil-kejl tal-gluko żju 
għall-annimali ttrattati ma’ dawk tal-kontroll, id-direttur tal-istudju g ħandu 
jiddetermina jekk ikunx sewwa li jsajjem lill-annimali. Jekk jintu ża perjodu ta’ 
sawm, dan g ħandu jkun adattat g ħall-ispeċi użata; għall-far dan jista’ jkun 16-il 
siegħa (sawm tul il-lejl). Determinazzjoni ta’ gluko żju għas-sawm tista’ ssir wara 
sawm tul il-lejl matul l-a ħħar ġimgħa ta’ espo żizzjoni, jew wara sawm tul il-lejl 
qabel awtopsja (f’dan l-a ħħar każ flimkien mal-parametri patolo ġiċi kliniċi l-oħra 
kollha).  
38. Meta jkun hemm evidenza li s-sistema respiratorja inferjuri (ji ġifieri, 
l-alveoli) tkun is-sit primarju ta’ depo żizzjoni u ritenzjoni, f’dak il-ka ż 
il-ħasil tal-bronkoalveolari (BAL) jista’ jkun it-teknika ta’ g ħażla biex 
ikunu analizzati kwantitattivament parametri b’effett ta’ do ża abbażi ta’ 
ipoteżi li jiffokaw fuq l-alveolitis, l-infjammazzjoni pulmonari, u 
l-fosfolipido żi. Dan jippermetti li jkunu investigati sewwa bidliet ta’ do ża- 
rispons u ta’ perkors ta’ żmien meta jkun hemm ħsara alveolari. Il-fluwidu 
BAL jista’ jkun analizzat g ħal għedud totali u differenzjali ta’ lewko ċiti, 
proteina totali u deidro ġenażi lattat. Parametri o ħra li jistg ħu jitqiesu huma 
dawk li jindikaw ħsara liżosomali, fosfolipido żi, fibrożi u infjammazzjoni 
irritanti jew aller ġika li tista’ tinkludi d-determinazzjoni ta’ ċitokines/ 
kejmokines proinfjammatorji. Il-kejlijiet BAL ġeneralment jikkumplimentaw 
ir-riżultati minn e żamijiet ta’ istopatolo ġija iżda ma jistg ħux jeħdulhom 
posthom. Gwida dwar kif isir il- ħasil tal-pulmuni tinsab f’GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
PATOLO ĠIJA MAKROSKOPIKA U PI ŻIJIET TAL-ORGANI  
39. L-annimali kollha tat-test, inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li 
jitneħħew mill-istudju g ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali, 
għandhom ikunu so ġġetti għal żvinar sħiħ (jekk ikun jista’ jsir) u g ħal 
awtopsja makroskopika. Il- ħin bejn it-tmiem tal-a ħħar espożizzjoni ta’ kull 
annimal u meta jinqatel g ħandu jiġi rreġistrat. Jekk ma tkunx tista’ ssir 
awtopsja minnufih wara li jkun instab annimal mejjet, l-annimal g ħandu 
jitkessaħ (mhux iffri żat) f’temperatura baxxa bi żżejjed biex tkun immini ­
mizzata awtoli żi. Awtopsji g ħandhom isiru malajr kemm jista’ jkun, norm ­
alment f’jum jew tnejn. Il-bidliet patolo ġiċi makroskopi ċi kollha g ħandhom 
jiġi rreġistrati għal kull annimal b’attenzjoni partikolari g ħal kull bidla 
fis-sistema respiratorja.  
40. It-Tabella 2 telenka l-organi u t-tessuti li g ħandhom ikunu ppreservati 
f’midjum adattat matul awtopsja makroskopika g ħal eżami istopatolo ġiku. 
Il-preservazzjoni tal-organi u tat-tessuti [mqeg ħdin flimkien] u ta’ kull 
organu u tessut ie ħor tkun fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju. L-organi 
mitkubin b’ tipa grassa  għandhom jintraqmu u jinti żnu mxarbin malajr 
kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni biex ikun evitat it-tnixxif. It-tirojde u l-epididimi g ħandhom jinti żnu biss jekk ikun me ħtieġ minħabba li ċ-ċelloli 
mill-irqim jistg ħu jfixklu l-evalwazzjoni istopatolo ġika. It-tessuti u l-organi 
għandhom jitqieg ħdu f’10 % ta’ formalina newtralizzata jew f’fissattiv 
adattat ie ħor malli ssir l-awtopsja, u mhux f’anqas minn 24-48 sieg ħa 
qabel l-irqim skont il-fissattiv li g ħandu jintu ża.
 
Tabella 2  
Organi u Tessuti Ippreservati Matul Awtopsja Makroskopika  
Adrenali  
Mudullun tal-g ħadam (u/jew aspirat frisk)  
Moħħ (inklu żi taqsimiet ta ċ-ċerebru, 
ċervellett, u medulla/me żoċefalu)  
[Għajnejn (retina, nerv ottiku) u tebqiet 
l-għajnejn]  
Qalb  
Kliewi  
Larinġi (3 livelli, 1 livell biex jinkludi l-ba żi 
tal-epiglotta)  
Fwied  
Pulmun  (id-denduliet kollha f’livell wie ħed, 
inklużi l-bronki ewlenin)  
Nodi limfati ċi mir-reġjun ilarju tal-pulmun, 
speċjalment g ħal kimiċi f’partiċelli għall- 
ittestjar li ftit jin ħallu. Għal eżamijiet u/jew 
studji aktar fil-fond b’fokus immunolo ġiku, 
jistgħu jitqiesu nodi limfati ċi addizzjonali, 
eż. dawk mir-re ġjuni medjastinali, ċervikali/ 
submandibulari u/jew awrikulari.  
It-tessuti na żofarinġali (mill-anqas 4 livelli; 1 
livell biex jinkludi l-kanal na żofarinġali u 
t-Tessut Limfojde b’Asso ċjazzjoni 
Nażali (NALT)  
Esofagu  
[Basla tax-xamm]  
Ovarji  Bżieżaq seminali  
Nerv vertebrali ( ċervikali, midtora ċiku u 
lumbari)  
Milsa  
Stonku  
Testikoli  
Timu  
Tirojde  
Trakea (mill-anqas 2 livelli inklu ża 1 
taqsima lon ġitudinali tul il-karina u 1 
taqsima trasversali)  
[Bużżieqa tal-awrina]  
Utru 
Il-leżjonijiet kbar kollha  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Il-pulmuni g ħandhom jitne ħħew intatti, jinti żnu u jidda ħħlu b’fissattivi adatti 
bi pressjoni ta’ 20-30 cm ta’ ilma biex ikun żgurat li tin żamm l-istruttura 
tagħhom (5). G ħandhom jin ġabru taqsimiet g ħad-denduliet kollha f’livell 
wieħed, inklu żi l-bronki ewlenin, i żda jekk isir il- ħasil tal-pulmuni, 
id-dendula mhux ma ħsula għandha titqieg ħed fit-taqsima bi tliet livelli 
(mhux taqsimiet tas-serje).  
42. Għandhom ikunu e żaminati mill-anqas 4 livelli tat-tessuti na żofarinġali, li 
wieħed minnhom g ħandu jinkludi l-kanal na żofarinġali, (5, 6, 7, 8, 9) biex 
jitħalla jsir e żami adegwat tal-epitelju mimli qxur, tran żizzjonali (respiratorju 
mhux vibrali), respiratorju (respiratorju vibrali) u tax-xamm, u tat-tessut 
limfatiku tat-tisfija (NALT; 10, 11). G ħandhom ikunu e żaminati tliet 
livelli tal-larin ġi, u wieħed minn dawn il-livelli g ħandu jinkludi l-ba żi 
tal-epiglotta (12). G ħandhom ikunu e żaminati mill-anqas żewġ livelli 
tat-trakea, inklu ża taqsima wa ħda lonġitudinali tul il-karina minn fejn 
il-bronki estrapulmonari jinqasmu fi tnejn u taqsima wa ħda trasversali.  
ISTOPATOLO ĠIJA 
43. Evalwazzjoni istopatolo ġika tal-organi u tat-tessuti kollha elenkati fit-Tabella 
2 għandha ssir g ħall-gruppi ta’ kontroll u ta’ kon ċentrazzjoni g ħolja, u għall- 
annimali kollha li jmutu jew jinqatlu matul l-istudju. G ħandha ting ħata 
attenzjoni partikulari lis-sistema respiratorja, organi mmirati u le żjonijiet 
kbar. L-organi u t-tessuti li jkollhom le żjonijiet fil-grupp ta’ kon ċentrazzjoni 
għolja għandhom ikunu e żaminati fil-gruppi kollha. Id-direttur tal-istudju 
jista’ jag ħżel li jag ħmel evalwazzjonijiet istopatoli ġiċi għal gruppi 
addizzjonali biex juri rispons ċar ta’ kon ċentrazzjoni. Meta jintu ża grupp 
satellitarju (riversibbli), g ħandha ssir evalwazzjoni istopatolo ġika għat-tessuti 
u l-organi kollha identifikati b ħala li jkunu juru effetti fil-gruppi ttrattati. 
Jekk ikun hemm g ħadd eċċessiv ta’ mwiet bikrija jew problemi o ħra 
fil-grupp ta’ espo żizzjoni g ħolja li jippre ġudikaw is-sinifikat tad-dejta, 
il-konċentrazzjoni aktar baxxa li jkun imiss g ħandha tkun e żaminata istopa ­
toloġikament. G ħandu jsir sforz biex osservazzjonijiet gravi jitqabblu ma’ 
sejbiet mikroskopi ċi. 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
44. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwali dwar il-pi żijiet 
tal-ġisem, il-konsum ta’ ikel, il-patolo ġija klinika, il-patolo ġija makros ­
kopika, il-pi żijiet ta’ organi u l-istopatolo ġija. Dejta dwar osservazzjonijiet 
kliniċi għandha tin ġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp 
tat-test l-g ħadd ta’ annimali u żati, l-għadd ta’ annimali li jkunu wrew sinjali 
speċifiċi ta’ tossi ċità, l-għadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta matul it-test 
jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani, il- ħin tal-mewt ta’ kull annimal, 
deskrizzjoni u perkors ta’ żmien ta’ effetti tossi ċi u riversibbiltà, u sejbiet 
minn awtopsji. Ir-ri żultati kollha, kwantitattivi u in ċidentali, g ħandhom 
ikunu evalwati b’metodu ta’ statistika adattat. Jista’ jintu ża kull metodu 
ta’ statistika ġeneralment a ċċettat u l-metodi ta’ statistika g ħandhom 
jintgħażlu matul it-tfassil tal-istudju.  
Rapport tat-Test  
45. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, kif jixraq:  
Annimali tat-test u trobbija  
— Deskrizzjoni tal-kundizzjonijiet tal-ga ġġa, inkluż: għadd (jew bidla 
fl-għadd) tal-annimali g ħal kull ga ġġa, materjal g ħall-irqad, temperatura 
ambjentali u umdità relattiva, fotoperjodu u identifikazzjoni tad-dieta.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— Speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-użu ta’ spe ċi minbarra l-far; 
Jistgħu jkunu pprovduti sors u dejta storika, jekk ikunu minn annimali 
esposti f’kundizzjonijiet simili ta’ espo żizzjoni, abitazzjoni u sawm.  
— Għadd, età u sess tal-annimali.  
— Metodu ta’ ka żwalità.  
— Deskrizzjoni ta’ kull kondizzjonament qabel it-test inklu żi dieta, kwar ­
antina u trattament g ħall-mard.  
Kimika g ħall-ittestjar  
— Natura fi żika, purezza, u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi 
(inkluża isomerizzazzjoni).  
— Dejta ta’ identifikazzjoni u n-Numru tar-Re ġistru tal-Chemical Abstract 
Services (CAS), jekk ikunu mag ħrufa;  
Vejjikolu  
— Ġustifikazzjoni g ħal użu ta’ vejjikolu u ġustifikazzjoni g ħal għażla 
tal-vejjikolu (jekk ma jkunx ilma);  
— Dejta storika jew konkurrenti li turi li l-vejjikolu ma jfixkilx ir-ri żultat 
tal-istudju;  
Kamra tal-inalazzjoni  
— Deskrizzjoni dettaljata tal-kamra tal-inalazzjoni inklu ż volum u dijag ­
ramma.  
— Sors u deskrizzjoni ta’ tag ħmir użat għall-espożizzjoni tal-annimali, kif 
ukoll ġenerazzjoni tal-atmosfera.  
— Tagħmir għall-kejl tat-temperatura, umdità, daqs ta’ parti ċelli u kon ċen­
trazzjoni attwali;  
— Sors ta’ arja u sistema u żata għal kondizzjonament.  
— Metodi u żati għall-kalibrazzjoni ta’ tag ħmir biex tkun żgurata atmosfera 
omoġenea tat-test.  
— Differenza ta’ pressjoni (po żittiva jew negattiva).  
— Portijiet ta’ espo żizzjoni g ħal kull kamra (imnie ħer biss); tqeg ħid 
tal-annimali fil-kamra ( ġisem kollu).  
— Stabbiltà tal-atmosfera tat-test.  
— Post tas-sensuri tat-temperatura u tal-umdità u te ħid ta’ kampjuni 
tal-atmosfera tat-test fil-kamra;  
— Trattament ta’ arja pprovduta/estratta.  
— Rati ta’ fluss tal-arja, rata ta’ fluss ta’ arja/port ta’ espo żizzjoni (mnie ħer 
biss), jew toqol tal-annimali/kamra ( ġisem kollu).  
— Ħin għall-ekwilibriju tal-kamra tal-inalazzjoni (t95).  
— Għadd ta’ bidliet fil-volum kull sieg ħa; 
— Apparati ta’ metra ġġ (jekk applikabbli).  
Dejta ta’ espo żizzjoni  
— Motiv g ħal għażla ta’ kon ċentrazzjoni mmirata fl-istudju ewlieni.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Konċentrazzjonijiet nominali (massa totali tal-kimika g ħall-ittestjar 
iġġenerata g ħal ġol-kamra tal-inalazzjoni divi ża bil-volum ta’ arja li 
tkun għaddiet mill-kamra).  
— Konċentrazzjonijiet attwali tal-kimika g ħall-ittestjar mi ġbura miż-żona 
tal-inalazzjoni tal-annimali; g ħal taħlitiet li jipprodu ċu forom fi żiċi 
eteroġenji (gassijiet, fwar, aerosols); kull wa ħda tista’ tkun analizzata 
separatament.  
— Il-kon ċentrazzjonijiet kollha tal-arja g ħandhom ikunu rrappurtati f’uni ­
tajiet ta’ massa (mg/l mg/m  3 , eċċ.) milli f’unitajiet ta’ volum (ppm, ppb, 
eċċ.). 
— Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli, dijametru ajrudinamiku ta’ medjan 
tal-massa (MMAD), u devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ), inkluż 
il-metodi ta’ kalkulazzjoni tag ħhom. Għandha tkun irrappurtata anali żi 
individwali ta’ kull daqs ta’ parti ċella. 
Kundizzjonijiet tat-test  
— Dettalji tal-preparazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi dettalji ta’ kull 
proċedura użata biex jitnaqqas id-daqs tal-parti ċelli ta’ solidi jew biex 
ikunu ppreparati soluzzjonijiet tal-kimika g ħall-ittestjar.  
— Deskrizzjoni (preferibbilment inklu ża dijagramma) tat-tag ħmir użat biex 
tkun iġġenerata l-atmosfera tat-test u biex l-annimali jkunu esposti g ħall- 
atmosfera tat-test.  
— Dettalji tat-tag ħmir użat biex jimmonitorja t-temperatura tal-kamra, 
l-umdità u l-fluss ta’ arja fil-kamra (ji ġifieri żvilupp ta’ kurva ta’ kali ­
brazzjoni).  
— Dettalji tat-tag ħmir użat biex jin ġabru kampjuni g ħad-determinazzjoni 
tal-konċentrazzjoni tal-kamra u d-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli. 
— Dettalji tal-metodu analitiku kimiku u żat u tal-validazzjoni tal-metodu 
(inkluża l-effiċjenza fl-irkupru tal-kimika g ħall-ittestjar mill-midjum 
tat-teħid tal-kampjuni);  
— Metodu ta’ ka żwalità fl-assenjazzjoni ta’ annimali lil gruppi ta’ ttestjar u 
ta’ kontroll.  
— Dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu żi tip ta’ dieta/sors, sors 
tal-ilma).  
— Il-motiv g ħall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet tat-test.  
Riżultati  
— Tabulazzjoni tat-temperatura tal-kamra, l-umdità u l-fluss tal-arja.  
— Tabulazzjoni tad-dejta ta’ kon ċentrazzjoni nominali u attwali tal-kamra.  
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar id-daqs tal-parti ċelli, inklu żi dejta ta’ ġbir ta’ 
kampjuni analiti ċi, distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli u kalku ­
lazzjonijiet tal-MMAD u σ g . 
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar rispons u ta’ livell ta’ kon ċentrazzjoni g ħal 
kull annimal (ji ġifieri, annimali li juru sinjali ta’ tossi ċità, inklu żi 
mortalità, natura, severità, i ż-żmien meta jfaqqg ħu u durata tal-effetti).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Tabulazzjoni tal-pi żijiet individwali ta’ kull annimal.  
— Tabulazzjoni tal-konsum tal-ikel  
— Tabulazzjoni ta’ dejta ta’ patolo ġija klinika  
— Sejbiet minn awtopsji u sejbiet istopatolo ġiċi għal kull annimal, jekk 
disponibbli.  
— Tabulazzjoni ta’ kull parametru ie ħor imkejjel  
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
— Għandha ssir enfa żi partikolari g ħad-deskrizzjoni tal-metodi u żati biex 
jissodisfaw il-kriterji ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar, e ż. il-konċentrazzjoni 
limitata jew id-daqs tal-parti ċelli. 
— Għandu jkun indirizzat jekk jistax ikun hemm respirazzjoni fil-parti ċelli, 
meqjusin is-sejbiet globali, spe ċjalment jekk il-kriterji tad-daqs 
tal-partiċelli ma setg ħux jitħarsu;  
— Il-konsistenza tal-metodi u żati biex ikunu ddeterminati 
l-konċentrazzjonijiet nominali u attwali, u r-relazzjoni ta’ kon ċen­
trazzjoni attwali mal-kon ċentrazzjoni nominali g ħandhom ikunu inklu żi 
fil-valutazzjoni globali tal-istudju;  
— Il-kaw ża probbbali tal-mewt u l-modalità predominanti tal-azzjoni (sis ­
temika versus lokali) g ħandhom ikunu indirizzati.  
— Għandha ting ħata spjegazzjoni jekk kienx hemm ħtieġa li b’mod uman 
jinqatlu annimali mu ġugħa jew li jkunu wrew sinjali ta’ diffikultà u li 
jdumu, abba żi tal-kriterji fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar 
il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (3).  
— L-organu/i mmirat(i) g ħandu/hom ji ġi/u identifikat/i.  
— NOAEL u LOAEL g ħandhom ikunu ddeterminati.  
LETTERATURA:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test 
Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in 
laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 
85: 231-238.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP u Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats 
and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, 
Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
 
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u j ħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 
1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006 ( ĠU 
L 353, 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-Ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. DOŻI REPETUTI (28 JUM) TOSSI ĊITÀ (DERMALI)  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Xejn.  
1.4. PRINCIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test hija somministrata b’mod orali, ta’ kuljum, b’do żi 
meqjusa lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, b’do ża waħda 
tkun użata ma kull grupp matul perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu 
ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex 
ikunu skoperti sinjali tat-tossi ċità. Annimali li jmutu matul it-test 
ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklu żjoni tat-test li l-annimali li 
jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.  
1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Preparazzjonijiet  
L-annimali huma mi żmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet 
tal-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem. Qabel it-test, annimali adulti 
żgħażagħ b’saħħithom huma mag ħżula b’mod kif jinzerta u assenjati 
lejn gruppi g ħat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa 
maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It- 
tqaxxir jista’ jkun u żat imma g ħandu jkun imwettaq madwar 24 
siegħa qabel it-test. Ir-repetizzjoni tal-qtug ħ jew tat-tqaxxir norm ­
alment ikun me ħtieġ f’intervalli ta’ madwar darba fil- ġimgħa. Meta 
jsir il-qtug ħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura g ħandha tittie ħed sabiex ikun 
evitat xi grif fil- ġilda li jkunu jistg ħu jibdlu l-permeabbiltà tag ħha. 
Mhux anqas minn 10 % tal-wi ċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf 
għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-pi ż ta’ l-annimali g ħandu 
jkun meqjus meta tkun de ċiża ż-żona li għandha tkun imnaddfa u l- 
qisien kollha tal-koperta. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistg ħu 
ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test g ħandha tkun 
b’umidità suffi ċjenti bl-ilma, jew, meta me ħtieġ, apparat adattat 
sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal- ġilda. Sustanzi likwidi tat-test 
huma ġeneralment u żati mingħajr ma jkunu mrattba. Applikazzjoni 
odjerna b ħala bażi ta’ minn ħamsa sa sebat ijiem fil- ġimgħa hija 
użata. 
1.6.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.6.2.1.  Annimali sperimentali  
Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistg ħu ikunu u żati. Speċje 
oħrajn jistgħu ikunu u żati imma l-u żu tagħhom ikun je ħtieġ ġustifi­
kazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-pi ż ta’ l-annimali 
użati m’għandhiex te ċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.  
1.6.2.2.  Numru u sess.  
Mill-anqas 10 annimali gerriema ( ħamsa femminili u ħamsa maskili) 
għandhom ikunu u żati f’kull livell ta’ do ża. Jekk ikunu u żati 
femminili, dawn g ħandhom ikunu femminili li qatt ma weldu u li 
ma humiex tqal. Jekk sagrifikar interim huwa ippjanat, in-numru ta’ l-annimali g ħandu jkun mi żjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li 
jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. B’ żieda, grupp 
satellita ta’ 10 annimali ( ħames annimali kull sess) jistg ħu ikunu 
ittrattati b’do ża ta’ livell g ħoli għal 28 jum u osservati g ħar-rivers­
abbiltà, persistenza, jew ghal okkurrenza mdewma ta’ l-effetti tossi ċi 
għal 14-il jum ta’ wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali 
ta’ kontroll ( ħames annimali kull sess) huwa wkoll u żat.
 
1.6.2.3.  Livell tad-do ża 
Mill-anqas tlett livelli ta’ do żi huma me ħtieġa bil-kontroll u mezz ta’ 
kontroll, jekk mezz ikun u żat. Il-perjodu ta’ l-osservazzjoni g ħandu 
jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt sieg ħat kuljum. G ħal sustanzi amministrati 
bi tmiegħ sfurzat, id-do ża għandha tkun mog ħtija f’ħinijiet simili 
f’kull jum u l-livelli tad-do ża għandhom ikunu a ġġustati matul l- 
intervalli (ta’ kull ġimgha jew ta’ darbtejn fil-gimg ħa) sabiex 
jinżamm livell ta’ do ża kostanti f’termini tal-pi ż ta’ l-annimal. 
Apparti milli t-trattament tas-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp 
tal-kontroll g ħandhom ikunu trattati b’mod identiku b ħal dawk 
suġġetti għat-test. Meta mezz ikun u żat sabiex jiffa ċilita l-għoti 
tad-doża, l-kontrolli g ħandhom ikollhom do ża bil-mezz bl-istess 
mod bħal gruppi ittrattati, u jir ċievu l-istess ammont ta’ mezz b ħal 
dak li jkunu ir ċevew il-grupp bil-livell ta’ l-og ħla doża. Il-livell ta’ l- 
ogħla doża għandu jirri żulta f’effetti tossi ċi imma ma jipprodu ċi l- 
ebda, jew ftit, imwiet. Il-livell tad-do ża l-aktar baxxa m’g ħandux 
jipproduċi xi evidenza ta’ tossi ċità. Meta jkun hemm estimi 
użabbli ta’ l-espo żizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx g ħandu 
jeċċedi dan. Idealment, il-livell medju tad-do ża għandu jipprodu ċi 
effetti tossi ċi minimi osservabbli. Jekk aktar minn do ża intermedja 
waħda tkun u żata, l-livelli tad-do ża għandhom ikunu spazzjati bi 
gradjazzjoni ta’ l-effetti tossi ċi. Fil-gruppi baxxi jew intermedji u 
f’dawk tal-kontroll, l-in ċidenza ta’ xi fatalitajiet g ħandha tkun 
baxxa sabiex tippermetti ewalwazzjoni sensibbli tar-ri żultati.  
Jekk l-applikazzjoni tas-sustanzi tat-test tipprodu ċi irritazzjoni severa 
tal-ġilda, l-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom ikunu mnaqqsa u dan jista’ 
jirriżulta fi tnaqqis fil, jew fl-assenza ta’, l-effetti tossi ċi l-oħrajn, fil- 
livell għoli tad-do ża. Aktar minn hekk, jekk il- ġilda tkon sofriet 
ħsara qawwija, jista’ jkun me ġtieġ li jkun imwaqqaf l-istudju u li 
jinbeda studju ġdid b’kon ċentrazzjoni aktar baxxa.  
1.6.2.4.  Test ta’ limitazzjoni  
Jekk studju preliminari fil-livell ta’ do ża ta’ 1 000 mg/kg, jew livell 
ta’ doża ogħla relattat ma l-espo żizzjoni umana possibbli meta dan 
ikunu mag ħruf, ma jipprodu ċi l-ebda effetti tossi ċi, aktar testijiet ma 
jkunu aktar meqjusa b ħala meħtieġa. 
1.6.2.5.  Perijodu ta’ l-Osservazzjoni  
L-annimali sperimentali g ħandhom ikunu osservati ta’ kuljum g ħal 
sinjali tat-tossi ċità. Il-ħin tal-mewt u ż-żmien li fih tidher jew 
tisparixxi t-tossi ċità għandhom ukoll ikunu irre ġistrati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Il-pro ċedura  
L-annimali g ħandhom jin żammu f’ga ġġeġ individwali. L-annimali 
jirċievu d-do ża bis-sustanza tat-test idealment fis-sebat ijiem tal- 
ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum. L-annimali f’xi grupp satellita 
skedat għall-osservazzjoni b’segwiment g ħandhom jin żammu għal 
14-il jum ie ħor mingħajr trattament sabiex tkun żvelata xi irkupru 
minn, jew il-persistenza ta’, l-effetti tossi ċi. Il-perjodu ta’ l-osser ­
vazzjoni g ħandu jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt sieg ħat kuljum.  
Is-sustanza tat-test g ħandha tkun applikata b’mod uniformi fuq żona 
li hija madwar 10 % ta ż-żona totali tal-wi ċċ tal-ġisem. B’sustanzi 
ferm tossi ċi, iż-żona tal-wi ċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm 
jista’ jkun mi ż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi 
kemm jista’ jkun possibbli.  
Matul l-espo żizzjoni s-sustanza tat-test tin żamm f’kuntatt mal- ġilda 
b’garża poruża u faxxa mhux irritanti. Is-sit tat-test g ħandu jkun 
aktar kopert b’mod xieraq sabiex i żomm il-faxxex bil-gar ża u s- 
sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistg ħu 
jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistg ħu jintużaw 
sabiex jipprevjenu l-in ġestjoni tas-sustanza tat-test, imma immobiliz ­
zazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat. B ħala alternattiva, 
“apparat b’g ħonq protettiv” jista’ jkun u żat. 
Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, ir-residwu tas-sustanza tat- 
test għandu jkun imne ħħi, meta prattikabbli, bl-u żu ta’ ilma jew xi 
metodu xieraq ie ħor tat-tindif tal- ġilda. 
L-annimali kollha g ħandhom ikunu osservati ta’ kuljum u s-sinjali 
tossiċi irreġistrati jkunu inklu żi, meta jsir it-tfaqqieg ħ, il-grad u t-tul 
ta’ żmien tagħhom. L-osservazzjonijiet g ħandhom jinkludu tibdil fil- 
ġilda u l-pil, fl-g ħajnejn u membrani muko żji, u anki fis-sistemi 
respiratorji, ċirkolatorji, awtonomi ċi u tas-sistema ċentrali tan- 
nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-im ġieba. Il-kejl 
għandu jsir ta’ kull ġimgħa dwar il-pi ż ta’ l-annimali. Huwa wkoll 
rakkommandat li l-konsum ta’ l-ikel ikun imkejjel ta’ kull ġimgħa. 
Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma me ħtieġa sabiex 
jassiguraw li l-annimali jkunu, sakemm ikun possibbli, mhux 
mitlufa mill-istudju min ħabba kaw żi oħrajn bħalma huma kanni ­
baliżmu, awtolo żi tan-nisġa jew mitlufa. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ 
l-istudju, dawk kollha li jkunu g ħadhom ħajjin fil-gruppi tat-trat ­
tament mhux-satellita, jkunu maqtula u awtopsija tkun imwettqa 
immedjatament. Annimali moribondi u annimali f’u ġiegħ jew 
strapazz sever g ħandhom ikunu mne ħħija meta dan ikun innutat, u 
maqtula sabiex tkun evitata l-mo ħqrija u titwettaq awtopsja ta’ wara 
l-mewt.  
L-eżami li ġejja għandha sse ħħ fit-tmiem tal-perjodu tat-test g ħall- 
annimali kollha, inklu żi dawk tal-kontrolli:  
1) ħematoloġija, inkluża mill-anqas il- ħematokrità, l-kon ċentrazzjoni 
tal-ħemaglobulini, l-g ħadd ta’ l-eritro ċiti, l-għadd totali u differ ­
enzali tal-lewto ċiti, u l-kejl tal-potenzal ta’ bo ċċi fid-demm;  
2) biokemistrija klinika tad-demm, inklu ż mill-anqas parametru 
wieħed tal-fwied u tal-funzjoni tal-kliewi: aminotransfera żi ta’ l- 
alanina tas-serum (qabel kienet mag ħrufa bħala t-transamina żi 
piruvika glutamika), il-aminotransfera żi aspartata tas-serum 
(qabel kienet mag ħrufa bħala t-transamina żi ossalo-a ċetika 
glutamika), in-nitro ġenu ta’ l-urea, l-albumina, il-kreatinin tad- 
demm, il-bilirubin totali u l-protein totali tas-serun.  
Determinazzjonijiet o ħrajn li jistg ħu jkunu me ħtieġa għal eval­
wazzjoni tossikologika adekwata, inklu ż il-kalċju, l-fosfru, l-klorid, 
is-sodju, il-putassa, l-gloko żju tas-sawm, l-anali żi tal-lipidi, l-ormoni, 
l-bilanċ tal-aċidu/bażi, l-metaemoglobina, l-attività kolinestera żi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Biokemistrija klinika addizzjonali tista’ tkun u żata, meta me ħtieġ, 
sabiex tkun esti ża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.  
1.6.4.  Nekopsija Grossa (awtopsija ta’ wara l-mewt)  
L-annimali kollha fl-istudju g ħandhom ikunu su ġġetti għall-awtopsja 
sħiħa grossa ta’ wara l-mewt. Mill-anqas il-fwied, il-kliewi, l- 
adrenali, u t-testi g ħandhom ikunu mi żuna niedja malajr kemm 
jista’ jkun poissibbli wara d-dissikazzjoni sabiex ikun evitat li 
jinxfu. Organi u ċerti nsiġ tal-ġisem (fwied, kliewi, il-milsa (l- 
marrara), it-testi, l-adrenali, l-qalb, u xi organi o ħrajn li juru feriti 
kbar jew tibdil fid-daqs) g ħandhom ikunu ippreservati f’medja xierqa 
għall-possibbiltà ta’ e żami futura ħistopatolo ġika. 
1.6.5.  Eżaminazzjoni ħistopatolo ġika 
Fil-grupp ta’ do ża għolja u fil-grupp ta’ kontroll, l-e żaminazzjoni 
ħistoloġika għandha tkun imwettqa fuq l-organi u l-insi ġ ippreservati. 
Organi u nsi ġ li juru difetti attribwibbli g ħas-sustanza tat-test fil- 
livell ta’ l-og ħla doża għandhom ikunu e żaminati fil-gruppi kollha 
tad-doża l-baxxa. L-annimali f’xi grupp satellita g ħandhom ikunu 
eżaminati ħistoloġikalment b’enfasi partikolari fuq l-organi u nsi ġ 
identifikati b ħala li juru effetti fil-gruppi l-o ħrajn ittrattati.  
2. DATA  
Id-data g ħandha tkun riassunta f’g ħamla tabulari, li turi g ħal kull 
grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u n-numru ta’ l-annimali li ji żvelaw kull tip ta’ ferita.
 
Ir-riżultati osservati kollha g ħabdhom ikunu evalwati b’metodu stat ­
istiku xieraq. Kwalunkwe metodu statistikali rikonoxxut jista’ jkun użat.
 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li 
ġejja: 
— id-dettalji dwar l-annimal (l-ispe ċje, silta, sorsi, il-kundizzjonijiet 
ambjentali, dieta, e ċċ.); 
— kundizzjonijiet tat-test (inklu żu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew 
mhux okklussivi);  
— il-livelli tad-do ża (inkluż il-mess, jekk u żat), u l-kon ċen­
trazzjonijiet;  
— il-livell ta’ l-ebda effett, meta possibbli;  
— dettalji dwar ir-reazzjoni tossika bis-sess u d-do ża; 
— il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqg ħu 
ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;  
— l-effetti tossi ċi jew oħrajn; 
— il-ħin ta’ l-osservazzjoni u kull sinjal annormali u l-korsa 
sussegwenti tieg ħu; 
— dettalji dwar l-ikel u pi ż tal-ġisem;  
— testijiet ħematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— testijiet ħematoloġiċi kliniċi użati u r-riżultati kollha;  
— is-sejbiet ta’ l-awtopsja ta’ wara l-mewt;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatolo ġiċi kollha;  
— trattament statistiku tar-ri żultati, meta xieraq;  
— diskussjoni tar-ri żultati;  
— interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTA ĠENIĊITÀ – TEST  IN VITRO  DWAR ANORMALITÀ 
FIL-KROMO ŻOMITAL-MAMMIFERI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 473, Test  in vitro  
dwar Anormalità fil-Kromo żomi tal-Mammiferi (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-għan tat-test  in vitro  dwar anormalità fil-kromo żomi huwa biex 
jiġu identifikati a ġenti li jikkaw żaw anormalitajiet strutturali fil- 
kromożomi f'kulturi ta' Ċelloli tal-mammiferi (1) (2) (3). Anormal ­
itajiet strutturali jistg ħu jkunu ta' żewġ tipi, kromo żomi jew 
kromatidi. Fil-ma ġġoranza ta' muta ġeni kimi ċi, anormalitajiet 
imġiegħela huma tat-tip kromatidu, i żda jirrikorru wkoll anormal ­
itajiet tat-tip ta' kromo żomi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li 
kimika g ħandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeri ċi. 
Madankollu, dan il-metodu mhux ma ħsub biex iqis anormalitajiet 
numeriċi u ma jintu żax normalment g ħal dak il-g ħan. Mutazzjonijiet 
fil-kromo żomi u ġrajjiet relatati huma l-kaw ża ta' ħafna mard 
ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet 
fil-kromo żomi u ġrajjiet relatati li jikkaw żaw alterazzjonijiet f'on ­
koġeni u f' ġeni ta' Ċelloli somati ċi li jrażżnu t-tumuri huma 
involuti fil- ħolqien tal-kan ċer fil-bniedem u annimali sperimentali.  
It-test  in vitro  ta' anormalità fil-kromo żomi jista’ jag ħmel użu minn 
kulturi ta' linji ta' Ċelloli stabbiliti, tipi ta' Ċelloli, jew kulturi ta' 
Ċelloli primarji. I ċ-ċelluli jing ħażlu fuq ba żi ta' kemm jistg ħu 
jikbru fil-kultura, l-istabbilità tal-karjotip, g ħadd ta' kromo żomi, 
diversità ta' kromo żomi u frekwenza spontanea ta' anormalitajiet 
fil-kromo żomi. 
Testijiet mag ħmula  in vitro  ġeneralment je ħtieġu l-użu ta' għejun 
essoġenu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni 
metabolika ma tista’x kompletament tkun b ħall-kundizzjonijiet  in 
vivo tal-mammiferi. G ħandha ting ħata attenzjoni biex ji ġu evitati 
kundizzjonijiet li jwasslu g ħal riżultati pożittivi li ma jirriflettux 
mutaġeneċità intrinsika u jistg ħu jinħolqu minn bidliet fil-pH, osmo ­
lalità jew livelli g ħoljin ta' ċitotossiċità (4) (5).  
It-test jintu ża biex jiġi kontrollat hemmx muta ġeni jew kar ċinoġeni 
fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma po żittivi f'dan it-test huma 
karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu ma hemmx korrelazzjoni 
perfetta bejn dan it-test u l-kar ċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni 
tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm xiedha dejjem tikber li 
jeżistu karċinoġeni li ma ji ġux żvelati b'dan it-test g ħax jidher li 
jaġixxu permezz ta' mekkani żmi li huma differenti minn ħsara 
diretta fid-DNA.  
Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Anormalità tat-tip kromatidu:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u g ħaqda mill- 
ġdid bejn kromatidi.  
Anormalità tat-tip tal-kromo żomi:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur, jew ksur u g ħaqda mill- ġdid, taż-żewġ kromatidi 
f'sit identiku.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikazzjoni:  proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni 
ta' DNA, in-nukleu ma jispi ċċax f'mito żi iżda jerġa' jibda perjodu 
ieħor S. Ir-ri żultat hu kromo żomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.  
Vojt:  leżjoni akromatika i żgħar mill-wisg ħa ta' kromatid wie ħed, u 
b'misallinjament minimu tal-kromatidi.  
Indiċi mitotiku:  il-paragun ta' Ċelloli fil-metafa żi diviżi min-numru 
totali ta' Ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' Ċelloli; indikazzjoni tal- 
livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni.  
Anormalità numerika:  bidla fin-numru ta' kromo żomi min-numru 
karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.  
Poliplojdi:  multiplu tan-numru aplojdu ta' kromo żomi ( n) minbarra 
n-numru diplojdu (ji ġifieri 3 n, 4n, eċċetera).  
Anormalità strutturali:  bidla fl-istruttura tal-kromo żomi li wie ħed 
jinduna biha bl-e żami mikroskopiku ta' l-istadju metafa żiku tad- 
diviżjoni ta' ċelluli, osservati b ħala tħassir u bi ċċiet, bidliet minn 
ġewwa u bidliet bejniethom.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Kulturi ta' Ċelloli huma esposti g ħas-sustanza tat-test kemm bl- 
attivazzjoni metabolika kif ukoll ming ħajrha. F'intervalli predeter ­
minati wara l-espo żizzjoni ta' kulturi ta' Ċelloli għas-sustanza tat- 
test, jiġu ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafa żi (eż. Colcemid® 
jew kolċiċina), Ċelloli ma ħsudin, mtebbg ħin u matafa żiċi jiġu 
analizzati ta ħt mikroskopju g ħall-preżenza ta' anormalitajiet fil- 
kromożomi. 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Ċelloli  
Jistgħu jintużaw varjetà ta' linji ta' Ċelloli, tipi ta' Ċelloli jew kulturi 
primarji ta' Ċelloli, inklu żi Ċelloli umani (e ż. fibroblasti ta' Chinese 
hamster, limfo ċiti tad-demm umani jew periferali mal-mammiferi 
oħrajn).  
1.4.1.2.  Il-kundizzjonijiet tal-medjum u tal-kulturi  
Għandhom jintu żaw medjum xieraq ta' kulturi, u kundizzjonijiet ta' 
inkubazzjoni (kontenituri g ħall-kulturi, kon ċentrazzjoni CO  2 , 
temperatura u umdità) sabiex jin żammu l-kulturi. Linji u tipi ta' 
ċelluli stabbiliti g ħandhom ji ġu kontrollati kull tant żmien għall- 
istabbilità fl-g ħadd ta' kromo żomi modali u g ħan-nuqqas ta' kontami ­
nazzjoni minn mikoplasma u m'g ħandhomx jintu żaw jekk ikunu 
kontaminati. G ħandu jkun mag ħruf ukoll il-perjodu normali ta' 
ċiklu ta' ċellula għaċ-ċelluli u g ħall-kundizzjonijiet tal-kulturi.  
1.4.1.3.  Preparazzjoni tal-kulturi  
Linji u tipi ta' Ċelloli stabbiliti: i ċ-ċelluli huma mnisslin minn ħażniet 
ta' kulturi, mi żrugħa f'medjum ta' kulturi f'dik id-densità li ti żgura li 
l-kulturi ma jil ħqux konfluwenza qabel il- ħsad, u inkubati f'te ­
peratura ta' 37  o C. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfoċiti: demm s ħiħ trattat b'antikoagulant (e ż. heparin) jew 
limfoċiti separati miksubin minn su ġġetti b'saħħithom jiżdiedu mal- 
madju tal-kulturi li jkun fih mito ġenu (eż. fitohaemagglutinin) u 
inkubati f'temperatura ta' 37  o C. 
1.4.1.4.  Attivazzjoni metabolika  
Iċ-ċelluli għandhom ji ġu esposti g ħas-sustanza tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fin-nuqqas ta' sistema xierqa ta' attivazzjoni meta ­
bolika. Is-sistema li l-aktar tintu ża huja dik tal-cofactor-supplemented 
post-mitochondrial fraction (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'a ġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 
1254 (6) (7) (8) (9), jew ta ħlita ta' fenobarbitone u β-naftoflavone 
(10) (11) (12).
 
Il-frazzjon post-mitochondrial tintu ża ġeneralment f'kon ċen­
trazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medju finali tat-test. Is- sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal- kimika li qed ti ġi ttestjata. F' ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li tintu ża 
aktar minn kon ċentrazzjoni wa ħda għall-frazzjon post-mitochondrial.
 
Numru ta' żviluppi, inklu ż il-ħolqien ta' linji ta' Ċelloli ġenetikament 
iġġenerati li jesprimu en żimi attivanti spe ċifiċi, jistgħu jkunu ta' 
potenzal g ħal attivazzjoni endo ġenea. L-g ħażla tal-linji ta' Ċelloli 
użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (e ż. bir-rilevanza tal- 
ċitikromu P450 isoenzim g ħall-metaboli żmu tas-sustanza tat-test).  
1.4.1.5.  Sustanza tat-test/Preparazzjoni  
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewwbin jew sospi żi 
f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta ċ-Ċelloli. Jistg ħu jiżdiedu sustanzi likwidi tat-test 
direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. 
Għandhom jintu żaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test 
kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-a ċċettab­
bilità tal- ħażna.
 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika bejn is- 
solvent/mezz u s-sustanza tat-test, u s-solvent/mezz g ħandu jkun 
kompatibbli mas-sopravivenza ta ċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk 
jintużaw solventi/mezzi o ħra minflok dawk l-aktar mag ħrufa, l- 
inklużjoni tagħhom għandha tkun appo ġġata b'informazzjoni li 
tindika l-kompatibilità tag ħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ 
jkun, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' solvent/mezz akwu ż. Meta 
jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organi ċi 
li jintużaw għandhom jkunu ming ħajr ilma. L-ilma jista’ jitne ħħa 
billi jintu ża passatur molekulari.  
1.4.2.2.  Konċentrazzjonijiet ta' espo żizzjoni  
Fost il-kriterji li g ħandhom jitqiesu biex ti ġi stabbilita l-og ħla konċ­
entrazzjoni hemm i ċ-ċitotossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u 
bidliet fil-pH jew osmolalità.  
Iċ-ċitossiċità għandha tiġi stabbilita kemm b'attivazzjoni metabolika, 
kif ukoll ming ħajrha, fl-esperiment prin ċipali billi tintu ża indi­
kazzjoni xierqa ta' l-integrità u tkabbir ta ċ-Ċelloli, bħal ma huma 
gradi ta' konfluwenza, g ħadd ta' Ċelloli vijabbli, jew indi ċi 
mitotiku. Jista’ jkun utli li ji ġu stabbiliti ċ-ċitossiċità u s-solubbilità 
f'esperiment preliminari.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Għandhom jintu żaw għall-inqas tliet kon ċentrazzjonijiet analizzabbli. 
Fejn ikun hemm i ċ-ċitossiċità, dawn il-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom 
ikopru medda mill-massimu g ħal ftit tossi ċità jew xejn; ġeneralment 
dan ifisser li l-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom ji ġu separati b'xejn 
aktar minn fattur bejn 2 u √10. Fiż-żmien tal- ħsad, l-ogħla konċen­
trazzjoni g ħandha turi riduzzjoni sinjifikanti fil-livell ta' konflu ­
wenza, fg ħadd ta' Ċelloli jew indi ċi mitotiku (kollha og ħla minn 
50 %). L-indi ċi mitotiku huwa biss mi żura indiretta ta' l-effetti 
ċitotossiċi/ċitostatiċi u jiddependi fuq il- ħin wara t-trattament. 
Madankollu, l-indi ċi mitotiku huwa a ċċettabbli g ħal kulturi ta' 
sospensjoni li fihom qisien tossi ċi oħra jistgħu jkunu diffi ċli u 
mhux pratti ċi. Bħala informazzjoni supplimentari tista’ tintu ża 
informazzjoni dwar kinetika ta ċ-ċiklu taċ-Ċelloli, bħal ma huwa ż- 
żmien medju ta' ġenerazzjoni (AGT). I żda l-AGT huwa medja totali 
li mhux dejjem ti żvela l-eżistenza ta' subpopolazzjonijiet li g ħadhom 
ma jidhrux, u żidiet minimi wkoll fi ż-żmien medju ta' ġenerazzjoni 
jistgħu jiġu assoċjati ma' dewmien sostanzjali fil- ħin ta' l-a ħjar 
riżultati dwar anormalitajiet.  
Għal sustanzi li relativament mhumiex ċitotossiċi, l-konċentrazzjoni 
massima tat-test g ħandha tkun 5 μl/ml, 5 mg/ml jew 0,01 M, liema 
minnhom ikun l-anqas.  
Għal sustanzi li relativament mhumiex solubbli li mhumiex tossi ċi 
f'konċentrazzjonijiet anqas mill-kon ċentrazzjoni li mhix solubbli, l- 
ogħla doża li tintuża għandha tkun kon ċentrazzjoni og ħla mil-limitu 
ta' solubbilità fil-medjum finali tal-kultura fl-a ħħar tal-perjodu ta' 
trattament. F' ċerti każijiet (eż. meta t-tossi ċità tirrikorri biss fuq 
livell ogħla mill-anqas kon ċentrazzjoni li mhix solubbli), hu tajjeb 
li jsir test b'aktar minn kon ċentrazzjoni wa ħda bi pre ċipitazzjoni 
viżibbli. Jista’ jkun utli li ssir stima tas-solubbilità fil-bidu u fl- 
aħħar tat-trattament, g ħax is-solubbilità tista’ tinbidel waqt l- 
espożizzjoni fis-sistema tat-test min ħabba fil-pre żenza ta' Ċelloli, 
serum S9, e ċċ. L-insolubbilità tista’ tintnebah bil-vista ming ħajr 
ebda għajnuna. Dak li jippre ċipita m'għandux ifixkel l-g ħadd. 
1.4.2.3.  Kontrolli negattivi u po żittivi 
Għandhom ji ġu inklużi f'kull esperiment kontrolli po żittivi u 
negattivi fl-isterss ħin (solvent jew mezz), kemm b'attivazzjoni meta ­
bolika kif ukoll ming ħajrha. Meta tintu ża l-attivazzjoni metabolika, l- 
kimika ta' kontroll po żittiv għandha tkun dik li te ħtieġ l-attivazzjoni 
biex tagħti riżultati muta ġeniċi. 
Il-kontrolli po żittivi għandhom jag ħmlu użu minn elasto ġen magħruf 
f'livelli ta' espo żizzjoni li huma mistennija li jag ħtu żieda ripro ­
duċibbli u li ting ħaraf fuq l-isfond li juri s-sensitività tas-sistema 
tat-test.  
Għandhom jing ħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli po żittivi sabiex 
l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad- 
dijappożittivi kodifikati g ħal min jaqrahom. E żempji ta' sustanzi 
pożittivi ta' kontroll jinkludu:  
Kondizzjoni ta' attivazzjoni meta ­
bolika Sustanza Nru SAK Nru Einecs  
Nuqqas ta' attivazzjoni 
essoġenea metabolika Activation Metil metanesulfonat 66-27-3 200-625-0 
Etil metanesulfonat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Kondizzjoni ta' attivazzjoni meta ­
bolika Sustanza Nru SAK Nru Einecs  
Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomiċina 50-07-7 200-008-6 
4-Nitrokwinolina- N-ossidu 56-57-5 200-281-1 
Preżenza ta' attivazzjoni 
essoġenea metabolika Activation Benżo(a)pirene 50-32-8 200-028-5 
Ċiklofosfamid 
Ċiklofosfamide monojdrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Jistgħu jintużaw sustanzi o ħra ta' kontroll po żittiv xieraq. G ħandu 
jiġi kkunsidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll po żittiv li huma relatati 
mal-klassi tal-kimika, meta dan hu disponibbli.  
F'kull żmien ta' ħsad għandhom ji ġu inklużi kontrolli negattivi, li 
jikkonsistu f'soilvent jew mezz biss fil-medjum tat-trattament, u ttrattati bl-istess mod b ħal kulturi ta' trattament. Barra minn dan, 
għandhom jintu żaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ikun 
hemm informazzjoni storika ta' kontrolli li turi li ma jkunx hemm effetti ta' ħsara jew muta ġeniċi mill-użu tas-solvent mag ħżul.
 
1.4.3.  Pro ċedura  
1.4.3.1.  Trattament bis-sustanza tat-test  
Celluli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-pre żenza 
u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika. It-trattament ta' limfoċiti għandu jibda madwar 487 sieg ħa wara l-istimulazzjoni 
mitoġenika.
 
1.4.3.2. Normalment jintu żaw kulturi duplikati f'kull kon ċentrazzjoni, u dan 
huwa rakkomandat bil-qawwi g ħal kulturi ta' kontroll negattiv/ ­
solvent. Billi varjazzjoni minima bejn kulturi duplikati tista’ tidher (13) (14), mill-informazzjoni storika, jista’ jkun a ċċettabbli li 
jintużaw kulturi singoli f'kull kon ċentrazzjoni.
 
Sustanzi gassu żi jew volatili g ħandhom ji ġu ttestjati b'metodi xierqa, 
bħal ma huma mezzi ta' kulturi mag ħluqin (15) (16).  
1.4.3.3.  Żmien tal-ħsad tal-kulturi  
Fl-ewwel esperiment, i ċ-Ċelloli għandhom ji ġu esposti g ħas-sustanza 
tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll ming ħajrha, għal 
3-6 siegħat, u jittie ħed kampjun f' ħin ekwivalenti g ħal madwar 1,5 it- 
tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali wara li jkun beda t-trattament (12). 
Jekk dan il-protokoll jag ħti riżultati negattivi kemm bl-attivazzjoni 
kif ukoll ming ħajrha, għandu jsir esperiment addizzjonali ming ħajr 
attivazzjoni, bi trattament kontinwu sakemm jittie ħed kampjun f' ħin 
ekwivalenti g ħal 1,5 it-tul ta ċ-ċiklu ta' ċellula normali. Ċerti kimiċi 
jistgħu jintneb ħu aktar fa ċilment b' ħinijiet ta' trattament/te ħid ta' 
kampjuni itwal minn 1,5 it-tul ta ċ-ċiklu. Riżultati negattivi b'atti ­
vazzjoni metabolika g ħandhom ji ġu konfermati g ħal kull ka ż parti­
kolari. F'dawk il-ka żijiet fejn mhux meqjus ne ċessarju li jkun hemm 
konferma tar-ri żultati negattivi, g ħandha ting ħata ġustifikazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Preparazzjoni tal-kromo żomi 
Il-kulturi ta ċ-Ċelloli jiġu ttrattati bi Colcemid® jew kol ċiċina norm­
alment għal 1-3 sieg ħat qabel il- ħsad. Kull kultura ta' ċellula tinħasad 
u tiġi proċessata separatament g ħall-preparazzjoni tal-kromo żomi. Il- 
preparazzjoni tal-kromo żomi tinvolvi t-trattament ipotoniku ta' 
Ċelloli, il-fissazzjoni u li jing ħataw kulur.  
1.4.3.5.  Anali żi 
Id-dijapożittivi kollha, inklu żi dawk ta' kontrolli po żittivi u negattivi, 
għandhom ji ġu kodifikati indipendentement qabel l-anali żi mikros­
kopika. Peress li l-pro ċeduri ta' fissazzjoni ta' spiss jirri żultaw fil-ksur 
ta' għadd ta' Ċelloli metafa żiċi bit-telf ta' kromo żomi, iċ-Ċelloli li 
jingħaddu għandu għalhekk ikollhom numru ta' ċentromeri ekwi ­
valenti g ħan-numru modali ≠ 2 għat-tipi kollha ta' Ċelloli. 
Għandhom jing ħaddu għall-inqas 200 metafa żi mifruxa sew g ħal 
kull konċentrazzjoni u kontroll, maqsumin b'mod ugwali bejn id- 
duplikati, jekk ikun applikabbli. Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta 
jiġi osservat numru akbar ta' anormalitajiet.  
Għalkemm l-g ħan tat-test huwa biex jinkixfu anormalitajiet strutturali 
fil-kromo żomi, u importanti li wie ħed jirreġistra poliplojdi u endore ­
duplikazzjoni meta wie ħed jinduna b'dawn.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-unità sperimentali hija ċ-ċellula, u g ħalhekk għandha ssir valu ­
tazzjoni tal-per ċentwali ta' Ċelloli b'anormalità (jiet) strutturali fil- 
kromożomi. Għandhom ji ġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet 
strutturali fil-kromo żomi bl-g ħadd u l-frekwenzi tag ħhom għal 
kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Il-vojt ji ġi reġistrat separatament 
u jsir rapport dwaru i żda ġeneralment ma ji ġix inkluż fil-frekwenza 
totali ta' l-anormalità.  
Għandhom ji ġu reġistrati ukoll mi żuri ta' ċitotossiċità li jittie ħdu fl- 
istess ħin għall-kulturi kollha ta' kontroll trattati u negattivi fl- 
esperimenti prin ċipali dwar l-anormalitajiet.  
Għandha ting ħata l-informazzjoni dwar kultura individwali. Barra 
minn dan, l-informazzjoni g ħandha ting ħata sommarjament f'forma 
ta' tabella.  
Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' ri żultat pożittiv ċar. 
Riżultati ekwivo ċi għandhom ji ġu ċċarati b'testijiet o ħra preferib ­
bilment billi jkun hemm modifika tal-kundizzjonijiet sperimentali. Il-ħtieġa li riżultati negattivi ji ġu konfermati ġiet diskussa fi 
1.4.3.3. Il-modifika ta' parametri ta' studju biex ti ġi estiża l-medda 
tal-kundizzjonijiet stmati g ħandha tiġi kkunsidrata f'esperimenti li 
jsiru wara. Il-parametri ta' studju li jistg ħu jiġu modifikati jinkludu 
l-ispazju tal-kon ċentrazzjoni u l-kundizzjonijiet ta' attivazzjoni meta ­
bolika.
 
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Hemm ħafna kriterji biex ji ġi stabbilit ri żultat pożittiv, bħal ma hi 
żieda relatata mal-kon ċentrazzjoni jew żieda riprodu ċibbli f'għadd ta' 
Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromo żomi. L-ewwel g ħandha tiġi kkun­
sidrata r-rilevanza bijolo ġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valu ­
tazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet (3) (13), jistg ħu jintużaw metodi ta' 
statistika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
L-importanza ta' l-istatistika ma g ħandhiex tkun l-uniku fattur deter ­
minanti g ħal riżultat pożittiv. Żieda fin-numru ta' Ċelloli poliplojdi 
tista’ tindika li s-sustanza tat-test g ħandha l-potenzal li twaqqaf il- 
proċessi mitoti ċi u li twassal g ħal anormalitajiet numeri ċi fil- 
kromożomi. Żieda fl-għadd ta' ċelluli bi kromo żomi endoreduplikati 
tista’ tindika li s-sustanza tat-test g ħandha l-potenzal li twaqqaf il- 
progressjoni ta ċ-ċiklu taċ-Ċelloli (17) (18).  
Sustanza ta' test li dwarha r-ri żultati ma jil ħqux il-kriterji fuq 
imsemmija titqies b ħala mhux muta ġenika f'din is-sistema.  
Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-ri żultati 
jistgħu jibqgħu ekwivo ċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' 
drabi li jirrepeti ru ħu l-esperiment.  
Ir-riżultati pożittivi minn test  in vitro  ta' anormalitajiet fil-kromo żomi 
jindikaw li s-sustanza tat-test to ħloq anormalitajiet strutturali fil- 
kromożomi f'Ċelloli somati ċi ta' kulturi ta' mammiferi. Ir-ri żultati 
negattivi jindikaw li, ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat- 
test ma to ħloqx anormalitajiet fil-kromo żomi f'Ċelloli somati ċi ta' 
kulturi ta' mammiferi.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Ċelloli:  
— tip u g ħejun taċ-Ċelloli;  
— karatteristi ċi karjotipi ċi u adattibilità tat-tip ta' ċellula użata; 
— nuqqas ta' mikoplasma, jekk ikun applikabbli;  
— informazzjoni dwar it-tul ta ċ-ċiklu taċ-ċellula;  
— sess ta' min jag ħti d-demm, demm s ħiħ jew limfo ċiti separati, 
nitroġenu użat; 
— numru ta' passa ġġi, jekk ikun applikabbli;  
— metodi g ħall-manutenzjoni tal-kulturi ta ċ-Ċelloli, jekk jkun 
applikabbli;  
— għadd modali ta' kromo żomi. 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafa żi, il-konċentrazzjoni 
tagħha u kemm iddum l-espo żizzjoni ta ċ-ċellula;  
— raġuni prinċipali għall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet u g ħadd ta' 
kulturi inklu żi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limi ­
tazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;  
— komposizzjoni tal-medja, kon ċentrazzjoni CO2 jekk tkun applik ­
abbli;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— volum tal-mezz u sustanza tat-test mi żjuda;  
— temperatura ta' l-inkubazzjoni;  
— perjodu ta' inkubazzjoni;  
— kemm idum it-trattament;  
— densità ta ċ-ċellula fiż-żriegħ, jekk ikun xieraq;  
— tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, 
inklużi krierji ta' a ċċettabilità;  
— kontrolli po żittivi u negattivi;  
— metodi ta' preparazzjoni ta' dijapo żitivi;  
— kriterji g ħall-għadd ta' anormalitajiet;  
— numru ta' metafa żijiet analizzati;  
— metodi biex titqies it-tossi ċità; 
— kriterji biex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi. 
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità, eż. grad ta' konfluwenza, informazzjoni dwar 
iċ-ċiklu taċ-ċellula, għadd ta' Ċelloli, indi ċi mitotiku;  
— sinjali ta' pre ċipitazzjoni;  
— informazzjoni dwar pH u l-osmolalità tal-medjum tat-trattament, 
jekk ikun stabbilit;  
— definizzjoni g ħall-anormalitajiet, inklu ż il-vojt;  
— numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromo żomi u tip ta' anormal ­
itajiet fil-kromo żomi mog ħtija separatament g ħal kull kultura 
trattata u ta' kontroll;  
— bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) 
u pożittiv;  
— informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u 
pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard.  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
 
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The  In vitro  Chro­
mosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation 
Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science 
Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 
(suppl.10), pp. 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.  
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
 
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
 
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/ ­
Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System  In 
vitro , I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister 
Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence 
of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In vitro , Mutation Res., 66, pp. 277-290.  
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in  In vitro  Genot­
oxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds),  In 
vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.
 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In vitro  Tests for Chro ­
mosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.  
(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from  In vitro  Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation 
of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge 
University Press, Cambridge, pp. 141-154.
 
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  In vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.  
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, 
Plenum, pp. 91-103.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Muta ­
genesis, 5, pp. 795-801.
 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 
119, pp. 403-413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTA ĠENIĊITÀ -TEST  IN VIVO  DWAR ANORMALITÀ FIL- 
KROMO ŻOMITAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 475, Test dwar 
Anormalità fil-Kromo żomi tal-Mudullun tal-Mammiferi (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
It-test  in vivo  dwar anormalitajiet fil-kromo żomi tal-mammiferi 
jintuża biex jinstabu anormalitajiet strutturali fil-kromo żomi 
miġjuba mis-sustanza tat-test fi ċ-Ċelloli tal-mudullun ta' annimali, 
normalment annimali gerriema (1) (2) (3)(4). Anormalitajiet strut ­
turali fil-kromo żomi jistg ħu jkunu ta' żewġ tipi, kromo żomi jew 
kromatidi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li kimika g ħandha l- 
potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeri ċi. Fil-maġġoranza ta' 
mutaġeni kimiċi, anormalitajiet im ġiegħela huma tat-tip kromatidu, 
iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromo żomi. 
Mutazzjonijiet fil-kromo żomi u ġrajjiet relatati huma l-kaw ża ta' 
ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li 
mutazzjonijiet fil-kromo żomi u ġrajjiet relatati li jikkaw żaw alter­
azzjonijiet f'onko ġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil- 
ħolqien tal-kan ċer fil-bniedem u sistemi sperimentali.  
Annimali gerriema jintu żaw ġeneralment f'dan it-test. Il-mudullun 
huwa t-tessut immirat f'dan it-test, g ħax huwa tessut vaskularizzat 
immense, u fih popolazzjoni ta' ċelluli li ji ċċiklaw rapidament li 
jistgħu jkunu fa ċilment iżolati u pro ċessati. Spe ċi oħra u tessuti 
mmirati mhumiex is-su ġġett ta' dan il-metodu.  
Dan it-test ta' anormalitajiet fil-kromo żomi huwa rilevanti spe ċ­
jalment fil-valutazzjoni ta' perikli muta ġeniċi għax jippermetti l- 
kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboli żmu in vivo , farmakokinetika 
u proċessi ta' tiswija ta' DNA g ħalkemm dawn jistg ħu jvarjaw fost l- 
ispeċi u fost it-tessuti. Test  in vivo  huwa utli ukoll g ħal investi ­
gazzjoni ulterjuri ta' effett muta ġeniku żvelat minn test  in vitro . 
Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma 
jwasslux g ħat-tessut immirat, mhux xieraq li jintu ża dan it-test.  
Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Anormalità tat-tip kromatidu:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u g ħaqda mill- 
ġdid bejn kromatidi.  
Anormalità tat-tip tal-kromo żomi:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur, jew ksur u g ħaqda mill- ġdid, taż-żewġ kromatidi 
f'sit identiku.  
Endoreduplikazzjoni:  proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni 
ta' DNA, in-nukleu ma jispi ċċax f'mito żi iżda jerġa' jibda perjodu 
ieħor S. Ir-ri żultat hu kromo żomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.  
Vojt:  leżjoni akromatika i żgħar mill-wisg ħa ta' kromatid wie ħed, u 
b'misallinjament minimu tal-kromatidi.  
Anormalità numerika:  bidla fin-numru ta' kromo żomi min-numru 
karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliplojdi:  multiplu tan-numru aplojdu ta' kromo żomi ( n) minbarra 
n-numru diplojdu (ji ġifieri 3 n, 4n, eċċetera).  
Anormalità strutturali:  bidla fl-istruttura tal-kromo żomi li wie ħed 
jinduna biha bl-e żami mikroskopiku ta' l-istadju metafa żiku tad- 
diviżjoni ta' ċelluli, osservati b ħala tħassir u bi ċċiet, bidliet minn 
ġewwa u bidliet bejniethom.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Annimali huma esposti g ħas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' 
espożizzjoni u huma sakrifikati f' ħinijiet xierqa wara t-trattament. 
Qabel ma ji ġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'a ġent li 
jwaqqaf l-metafa żi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbag ħad isiru 
preparazzjonijiet ta' kromo żomi miċ-Ċelloli tal-mudullun u ji ġu 
mtebbgħin, u ċ-ċelluli metafa żiċi jiġu analizzati g ħal anormalitajiet 
fil-kromo żomi. 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Selezzjoni ta' l-ispe ċi ta' l-annimali  
Normalment jintu żaw far, ġrieden u Ħamsters ċiniżi, iżda jista’ 
jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. G ħandhom 
jintużaw razez, li komunement jintu żaw fil-laboratorji, ta' annimali 
adulti b'sa ħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż 
ta' l-annimali g ħandha tkun minima u ma te ċċedix ± 20 % tal-medja 
tal-piż ta' kull sess.  
1.4.1.2.  Kundizzjonijiet ta' fejn jin żammu u x'jieklu  
Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Intro ­
duzzjoni ġenerali għat-Taqsima B i żda l-mira dwar l-umdità g ħandha 
tkun 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati ming ħajr skema 
għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-ga ġeġ għandhom jitqieg ħdu 
b'tali mod li ji ġu minimizzati effetti possibbli li jirri żultaw minn kif 
jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali ji ġu identifikati wie ħed wieħed. L- 
annimali ji ġu akklimatizzati g ħall-kundizzjonijiet tal-laboratorju 
għall-inqas g ħal ħamest ijiem.  
1.4.1.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewwbin jew sospi żi 
f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistg ħu jiġu 
ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il 
darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix la ċċettabbilità tal- 
ħażna.
 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Is-solvent/mezz ma g ħandux jipprodu ċi effetti tossi ċi fil-livelli ta' 
doża użata, u ma g ħandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni 
kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħra 
minflok dawk l-aktar mag ħrufa, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun 
appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tag ħhom. Hu 
rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' 
solvent/mezz akwu ż. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrolli  
Għandhom ji ġu inklużi għal kull wie ħed mis-sessi f'kull test kontrolli 
pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trat­
tament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll 
għandhom ji ġu trattati bl-istess mod b ħall-annimali fil-grupp ta' trat ­
tament.  
Il-kontrolli po żittivi għandhom jipprodu ċu anormalitajiet strutturali  in 
vivo f'livelli ta' espo żizzjoni li huma mistennija li jag ħtu żieda li tkun 
tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll po żittiv għandhom 
jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma ji żvelawx l-identità 
tad-dijapo żitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa a ċċettat li l- 
kontroll po żittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik 
tas-sustanza tat-test u jittie ħed kampjun darba wa ħda biss. Jista’ 
jiġi kkunsidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll po żittivi relatati mal- 
klassi ta' kimi ċi, meta dawn ikunu disponibbli. E żempji ta' sustanzi 
ta' kontroll po żittivi jinkludu:  
Sustanza Nru SAK Nru EINECS  
Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Etil nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 
Ciklofosfamide 
Ciklofosfamide monojdrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trijetilenemelamina 51-18-3 200-083-5
 
Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod 
ieħor trattati bl-istess mod b ħall-gruppi tat-trattament, g ħandhom 
jiġu inklużi għal kull perjodu ta' te ħid ta' kampjuni, sakemm ma 
jkunux disponibbli varjabbilità a ċċettabbli bejn l-annimali u 
frekwenżi ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromo żomi mill-inform ­
azzjoni storika tal-kontroll. Jekk ji ġi applikat it-te ħid ta' kampjun 
singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittie ħed il- 
kampjun. Barra minn dan, g ħandhom jintu żaw ukoll kontrolli 
mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u muta ġeniċi 
bl-uzu tas-solvent/mezz mag ħżul.
 
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Numru u sess ta' l-annimali  
Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll g ħandu jinkludi fih g ħall-inqas 
ħames annimali analizzabbli g ħal kull sess. Jekk fi ż-żmien ta' l- 
istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess 
speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espo żizzjoni li juru li ma hemm 
l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossi ċità bejn is-sessi, allura jkun 
suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wie ħed. Fejn l-espo żizzjoni 
umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, b ħal per eżempju 
b'ċerti aġenti farma ċewtiċi, it-test g ħandu jitwettaq b'annimali tas- 
sess xieraq.  
1.5.2.  Skeda tat-trattament  
Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati b ħala trat­
tament singolu. Is-sustanzi tat-test jistg ħu wkoll ji ġu somministrati 
bħala doża maqsuma, ji ġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata 
separati b'mhux aktar minn ftit sig ħat, biex ti ġi faċilitata s-somminis ­
trazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Re ġimi ta' do żi oħra 
għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Il-kampjuni g ħandhom jittie ħdu f'żewġ ħinijiet separati wara t-trat ­
tament f'ġurnata wa ħda. Għal annimali ġerriema l-ewwel intervall 
bejn it-te ħid ta' kampjuni huwa ta' tul ta' 1,5 i ċ-ċiklu normali ta' 
ċellula (dan ta' l-a ħħar huwa normalment ta' 12-18-il sieg ħa) wara 
t-trattament. Ladarba l- ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboli żmu tas- 
sustanza tat-test kif ukoll l-effetti tieg ħu fuq il-kinetika ta ċ-ċikli taċ- 
Ċelloli jistg ħu jaffettwaw i ż-żmien ottimali biex wie ħed jintneba ħ bl- 
anormalitajiet fil-kromo żomi, huwa rakkomandat li jittie ħed kampjun 
ieħor 24 sieg ħa wara li jkun ttie ħed l-ewwel kampjun. Jekk jintu żaw 
metodi ta' do żi ta' aktar minn ġurnata wa ħda, għandu jkun hemm ħin 
ta' teħid ta' kampjun wie ħed f'tulijiet ta' 1,5 i ċ-ċikli normali ta' ċellula 
wara l-aħħar trattament.  
Qabel is-sagrifi ċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment 
b'doża xierqa ta' a ġent li jwaqqaf l-metafa żi (eż. Colcemid® jew 
kolċiċina). Wara dan, jittie ħed kampjun mill-annimali f'intervalli 
xierqa. G ħall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 sieg ħat; 
għal Ħamsters ċiniżi dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5 sieg ħat. Iċ- 
Ċelloli jinħasdu mill-mudullun u ji ġu analizzati g ħal anormalitajiet 
fil-kromo żomi. 
1.5.3.  Livelli ta' do ża 
Jekk jitwettaq studju biex ti ġi skoperta l-medda g ħax ma jkunx 
hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan g ħandu jsir fl-istess 
laboratorju, jintu żaw l-istess spe ċi, razza, sess u metodu ta' trattament 
li għandhom jintu żaw fl-istudju prin ċipali (5). Jekk ikun hemm 
tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' do ża għall-ewwel perjodu ta' te ħid 
ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' do ża għandhom jkopru medda mill- 
massimu g ħal ftit jew l-ebda tossi ċità. L-ogħla doża hija mfissra 
bħala s-sinjali ta' tossi ċità li jipprodu ċu d-dożi hekk li livelli og ħla 
tad-doża, bbażati fuq l-istess re ġim ta' do żaġġ, huma mistennija li 
jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijolo ġiċi speċifiċi f'dożi 
baxxi mhux tossi ċi (bħal ma huma ormoni u nitro ġeni) jistgħu jkunu 
eċċezzjonijiet g ħall-kriterji ta' l-issettjar tad-do żi u għandhom ji ġu 
valutati fuq ba żi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id- 
doża li tipprodu ċi xi indikazzjoni ta' tossi ċità fil-mudullun (e ż. ogħla 
minn riduzzjoni ta' 50 % fl-indi ċi mitotiku).  
1.5.4.  Test tal-limitu  
Jekk test ta' do ża waħda ta' livell ta' g ħall-inqas 2 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem meta jitwettaq trattament wie ħed, jew b ħala żewġ trattamenti 
fl-istess ġurnata, ma jipprodu ċix effetti tossi ċi li wieħed jinduna 
bihom, u jekk ma tkun mistennija l- ġenotossiċità fuq il-ba żi ta' l- 
informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun ne ċessarju li jsir studju komplet bl-u żu ta' tliet livelli ta' 
dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-do ża huwa 2 000 
mg/kg/piż tal-ġisem/jum g ħal trattament sa 14-il ġurnata, u 1 000 
mg/kg/piż tal-ġisem/jum g ħal trattament ta' aktar minn 14-il 
ġurnata. L-espo żizzjoni umana mistennija tista’ tindika l- ħtieġa ta' 
livell ogħla ta' doża li għandu jintu ża fit-test tal-limitu.
 
1.5.5.  Somministrazzjoni ta' do żi 
Normalment is-sustanza tat-test ti ġi somministrata b'gavage billi 
jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew 
bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistg ħu jiġu 
aċċettati rotot o ħra ta' espo żizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li 
jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f' ħin wieħed 
jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'g ħandux 
ikun aktar minn 2 ml/100g pi ż tal-ġisem. L-u żu ta' volumi og ħla 
minn dawn g ħandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-ka ż ta' sustanzi li 
jirritaw jew korro żivi li normalment juru effetti aggravati b'kon ċen­
trazzjonijiet og ħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test g ħandha titnaqqas 
bl-aġġustament tal-kon ċentrazzjoni biex ji ġi żgurat volum kostanti 
fuq il-livelli kollha tad-do ża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Preparazzjoni tal-kromo żomi 
Minnufih wara s-sagrifi ċċju, il-mudullun ji ġi miksub, espost g ħal 
soluzzjoni ipotonika u ffissat. I ċ-Ċelloli imbag ħad jinfirxu fuq 
dijapożitivi u jing ħataw kulur.  
1.5.7.  Anali żi 
L-indiċi mitotiku g ħandu jiġi stabbilit b ħala miżura ta' ċitotossiċita 
f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal g ħal kull annimal trattat 
(inklużi kontrolli po żittivi) u annimali kontrollati negativament mhux 
trattati.  
Għandhom ji ġu analizzati g ħall-inqas 100 ċellula għal kull annimal. 
Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta ji ġi nnotat g ħadd kbir ta' 
anormalitajiet. Id-dijapo żitivi kollha, inklu żi dawk ta' kontrolli 
pożittivi u negattivi, g ħandhom ji ġu kodifikati indipendentement 
qabel l-anali żi mikroskopika. Billi l-pro ċeduri tal-preparazzjoni ta' 
dijapożitivi jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' g ħadd ta' metafa żi 
bit-telf ta' kromo żomi, iċ-Ċelloli li jing ħaddu għandu għalhekk 
ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali g ħan-numru 2n ± 2.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR- RI ŻULTATI  
L-informazzjoni dwar annimali individwali g ħandha ting ħata f'forma 
ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. G ħal kull annimal 
għandhom ji ġu valutati n-numru ta' Ċelloli li jing ħaddu, in-numru 
ta' anormalitajiet f'kull ċellula u l-per ċentwali ta' Ċelloli b'anormalità 
(jiet) strutturali fil-kromo żomi. Għandhom ji ġu elenkati t-tipi 
differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromo żomi bl-għadd u l- 
frekwenzi tag ħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt 
jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru i żda ġeneralment ma 
jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità. Jekk ma hemmx 
xiehda ta' differenza fir-ri żultat bejn i ż-żewġ sessi, l-informazzjoni 
dwar iż-żewġ sessi tista’ ting ħaqad għall-analiżi statistika.  
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Hemm ħafna kriterji biex ji ġi stabbilit ri żultat pożittiv, bħal ma hi 
żieda relatata mad-do ża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli b'anormalitajiet 
fil-kromo żomi jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fi 
grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' te ħid ta' kampjuni. 
L-ewwel g ħandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijolo ġika tar-riżultati. 
Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet (6), jistg ħu 
jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma 
għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti g ħal riżultat pożittiv. 
Riżultati ekwivo ċi għandhom ji ġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferi ­
bilment billi tintu ża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.  
Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza tat-test g ħandha l- 
potenzal li twassal g ħal anormalitajiet numeri ċi fil-kromo żomi. 
Żieda fl-endoreduplikazzjoni tista’ tindika li s-sustanza tat-test 
għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni ta ċ-ċiklu taċ-Ċelloli 
(7) (8).  
Sustanza ta' test li dwarha r-ri żultati ma jil ħqux il-kriterji fuq 
imsemmija titqies b ħala mhux muta ġenika f'dan it-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-ri żultati 
jistgħu jibqgħu ekwivo ċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' 
drabi li jirrepeti ru ħu l-esperiment.  
Ir-riżultati pożittivi minn test  in vivo  ta' anormalitajiet fil-kromo żomi 
jindikaw li s-sustanza tat-test to ħloq anormalitajiet strutturali fil- 
kromożomi fil-mudullun ta' l-ispe ċi ttestjata. Ir-ri żultati negattivi 
jindikaw li, ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma 
toħloqx anormalitajiet fil-mudullun ta' l-ispe ċi ttestjata.  
Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-meta ­
boliti tag ħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew spe ċifikatament it- 
tessut immirat (e ż. tossiċità sistemika).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Annimali ttestjati:  
— speċi/razza użati; 
— numru, età u sess ta' l-annimali;  
— għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jin żammu, dieta, e ċċ.; 
— piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inklu ża l-medda ta' 
piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard g ħal kull grupp.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— kontrolli po żittivi u negattivi (mezz/solvent);  
— informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;  
— raġuni prinċipali għall-għażla tad-doża; 
— dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;  
— metodi biex ji ġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet g ħaċ-ċirko­
lazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat;  
— konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test 
dieta/ilma g ħax-xorb g ħad doża attwali (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum) 
jekk tkun applikabbli;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;  
— deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u te ħid ta' 
kampjuni;  
— metodi biex titqies it-tossi ċità; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafa żi, il-konċentrazzjoni 
tagħha u kemm idum it-trattament;  
— metodi tal-preparazzjoni tad-dijapo żitivi;  
— kriterji g ħall-għadd ta' anormalitajiet;  
— numru ta' Ċelloli analizzati kull annimal;  
— kriterji biex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi. 
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— indiċi mitotiku;  
— tip u numru ta' anormalitajiet, mog ħtija separatament g ħal kull 
annimal;  
— numru totali ta' anormalitajiet g ħal kull grupp bil-mezzi u 
devjazzjonijiet standard;  
— numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet f'kull grupp bil-mezzi u 
devjazzjonijiet standard;  
— bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv;  
— informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil- 
meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv. 
Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry 
(eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.  
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. and Shelby, M. (1987), Mammalian  In vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.
 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., 
Bootman, J. and Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic 
Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee 
on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., 
Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working 
Group on the  in vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
 
(5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental 
Mutagen Society Working Group: Dose setting in  In vivo  Muta­
genicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cyto­
genetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge 
University Press, Cambridge, pp. 184-232.
 
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha- radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer 
Res., 43, pp. 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAĠENIĊITÀ-TEST MIKRONUKLEU  IN VIVO  GĦAL 
ERITRO ĊITE FIL-MAMMIFERI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 474, Test Mikro ­
nukleu għal Eritroċite fil-Mammiferi (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
It-test mikronukleu  in vivo  fil-mammiferi jintu ża biex jinstab jekk 
hemmx ħsara li tin ġieb mis-sustanza tat-test lill-kromo żomi jew l- 
apparat mitotiku ta' eritroblasti bl-anali żi ta' eritro ċiti meħuda bħala 
kampjuni fil-mudullun u/jew Ċelloli periferali tad-demm ta' annimali, 
ġeneralment annimali gerriema.  
L-għan tat-test mikronukleu huwa biex ji ġu identifikati sustanzi li 
jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirri żulta fil-formazzjoni ta' mikro ­
nukleji li jkun fihom bi ċċiet ta' residwi ta' kromo żomi jew 
kromożomi sħaħ. 
Meta eritroblast tal-mudullun ji żviluppa f'eritro ċite polikromatika, 
joħroġ in-nukleu prin ċipali; kull mikronukleu li jkun ġie ffurmat 
jista’ jibqa' lura fi ċ-ċitoplasma mod ie ħor anukleat. Il-vi żwaliz­
zazzjoni tal-mikronukleji hija fa ċilitata f'dawn i ċ-Ċelloli għax ma 
għandhomx nukleu prin ċipali. Żieda fil-frekwenza ta' eritro ċiti polik­
romatiċi mikronukleati fl-annimali trattati hija indikazzjoni ta' ħsara 
miġjuba fil-kromo żomi. 
Ġeneralment f'dan it-test ji ġi użat il-mudullun ta' annimali gerriema 
għax l-eritro ċiti polikromati ċi huma prodotti f'dak it-tessut. Il-qisien 
ta' eritro ċiti mikronukleati immaturi (polikromati ċi) fid-demm 
periferali huwa ugwalment a ċċettat f'kull spe ċi li fiha ġiet murija l- 
inabbiltà tal-milsa li tne ħħi eritroċiti mikronukleati, jew li tkun uriet 
sensittività adegwata biex tiskopri a ġenti li jikkaw żaw anormalitajiet 
fil-kromo żomi strutturali jew numeri ċi. Il-mikronukleji jistg ħu differ­
enzati b'g ħadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal- 
preżenza jew nuqqas ta' DNA kineto ċoru jew ċentromeriku fil-mikro ­
nukleji. Il-frekwenza ta' eritro ċiti mikronukleati immaturi (polikro ­
matiċi) hija l-punt prin ċipali ta' konklu żjoni. L-g ħadd ta' eritro ċiti 
maturi (normokromati ċi) fid-demm periferali li jkun fihom mikro ­
nukleji fost numru stabbilit ta' eritro ċiti maturi jista’ jintu ża ukoll 
bħala l-punt ta' konklu żjoni tal-valutazzjoni meta l-annimali ji ġu 
ttrattati g ħal erba' ġimgħat jew aktar.  
Dan it-test mikronukleu  in vivo  fil-mammiferi huwa spe ċjalment 
rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli muta ġeniċi għax jippermetti l- 
kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboli żmu in vivo , farmakokinetika 
u proċessi ta' tiswija tad-DNA g ħalkemm dawn jistg ħu jvarjaw fost l- 
ispeċi, fost it-tessuti u fost il-punti ġenetiċi ta' konklu żjoni. Eżami in 
vivo huwa utli ukoll g ħal investigazz ulterjuri ta' effett muta ġeniku 
żvelat b'sistema  in vitro . 
Jekk ikun hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, 
ma jilħaqx it-tessut immirat, mhux xieraq li jintu ża dan it-test.  
Ara ukoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Ċentromeru (Kineto ċoru):  reġjun(i) ta' kromo żomu li mag ħha 
huma asso ċjati fibri irqaq waqt d-divi żjoni taċ-ċellula, li jippermettu 
l-moviment b' ċertu ordni ta' kromo żomi sekondarji g ħat-truf ta' 
Ċelloli sekondarji.  
Mikronukleji:  nukleji żgħar, separate minn u addizzjonali g ħan- 
nukleji prin ċipali ta' Ċelloli, prodotti waqt it-telofa żi ta' mito żi 
(mejożi) permezz ta' bi ċċiet ta' residwi ta' kromo żomi jew 
kromożomi sħaħ. 
Eritroċite normokromatika:  eritroċite matura li ma g ħandhiex 
ribosomi u li tista’ ti ġi differenzata minn eritro ċiti polikromati ċi 
immaturi bit-tebg ħat selettivi g ħal ribosomi.  
Entroċite polikromatika:  eritroċite immatura, fi stadju intermedju 
ta' żvilupp, li xorta wa ħda fiha ribosomi u g ħalhekk tista’ ti ġi differ­
enzata minn eritro ċiti normokromati ċi maturi bit-tebg ħat selettivi 
għal ribosomi.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
L-annimali huma esposti g ħas-sustanza tat-test permezz ta' rotta 
xierqa. Jekk jintu ża l-mudullun, l-annimali ji ġu sakrifikati fi 
żminijiet xierqa wara t-trattament, jitne ħħa l-mudullun, u l-preparazz ­
jonijiet jsiru u jing ħataw il-kulur (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Meta 
jintuża demm periferali, id-demm jin ġabar f'ħinijiet xierqa wara t- 
trattament u wara li jsiru l-preparazzjonijiet u jing ħataw il-kulur (4) 
(8) (9) (10). G ħal studji b'demm periferali, g ħandu jgħaddi perjodu 
kemm jista’ jkun żgħir bejn l-a ħħar espożizzjoni u l- ħsad taċ-ċellula. 
Il-preparazzjonijiet ji ġu analizzati g ħall-preżenza ta' mikronukleji.  
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Għażla ta' l-ispe ċi ta' l-annimali  
Hu rakkomandat li jintu żaw ġrieden jew far, jekk jintu ża l-mudullun, 
iżda jista’ jintu ża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Meta 
jintuża demm periferali, hu rakkomandat li jintu żaw ġrieden. Iżda 
kull speċi xierqa ta' mammiferi tista’ tintu ża sakemm tkun spe ċi li 
fiha l-milsa ma tne ħħix eritroċiti mikronukleati, jew spe ċi li tkun 
uriet sensittività adegwata biex tiskopri a ġenti li jikkaw żaw anormal ­
itajiet fil-kromo żomi strutturali jew numeri ċi. Għandhom jintu żaw 
razez, li komunement jintu żaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti 
b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż ta' 
l-annimali g ħandha tkun minima u ma te ċċedix ± 20 % tal-medja 
tal-piż ta' kull sess.  
1.4.1.2.  Kundizzjonijiet ta' fejn jin żammu u x'jieklu  
Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Intro ­
duzzjoni ġenerali għat-Taqsima B i żda l-mira dwar l-umdità g ħandha 
tkun 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati ming ħajr skema 
għall-gruppi ta' kontroll u trattament. L-annimali ji ġu identifikati 
wieħed wieħed. L-annimali ji ġu akklimatizzati g ħall-kundizzjonijiet 
tal-laboratorju g ħall-inqas g ħal ħamest ijiem.. Il-ga ġeġ għandhom 
jitqiegħdu b'tali mod li ji ġu minimizzati effetti possibbli li jirri żultaw 
minn kif jitqieg ħdu l-gaġeġ. 
1.4.1.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewwbin jew sospi żi 
f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistg ħu jiġu 
ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il 
darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix la ċċettabbilità tal- 
ħażna.
 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Is-solvent/mezz ma g ħandux jipprodu ċi effetti tossi ċi fil-livelli ta' 
doża użata, u ma g ħandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni 
kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħra 
minflok dawk l-aktar mag ħrufa, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun 
appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tag ħhom. Hu 
rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' 
solvent/mezz akwu ż. 
1.4.2.2.  Kontrolli  
Għandhom ji ġu inklużi għal kull wie ħed mis-sessi f'kull test kontrolli 
pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trat­
tament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom ji ġu trattati bl-istess mod b ħall-annimali fil-gripp ta' trat ­
tament.
 
Il-kontrolli po żittivi għandhom jipprodu ċu mikronukleji  in vivo  
f'livelli ta' espo żizzjoni li huma mistennija li jag ħtu żieda li tkun 
tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll po żittiv għandhom 
jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma ji żvelawx l-identità 
tad-dijapo żitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa a ċċettat li l- 
kontroll po żittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik 
tas-sustanza tat-test u jittie ħed kampjun darba wa ħda biss. Barra 
minn dan, jista’ ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll po żittivi 
relatati mal-klassi ta' kimi ċi, meta dawn ikunu disponibbli. E żempji 
ta' sustanzi ta' kontroll po żittivi jinkludu:  
Sustanza Nru SAK Nru Einecs  
Etil metansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 
Ciklofosfamide 
ciklofosfamide monojdrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trijetilenemelamina 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod 
ieħor trattati bl-istess mod b ħall-gruppi tat-trattament, g ħandhom 
jiġu inklużi għal kull perjodu ta' te ħid ta' kampjuni, sakemm ma 
jkunux disponibbli varjabbilità a ċċettabbli bejn l-annimali u 
frekwenżi ta' Ċelloli b'mikronuleji mill-informazzjoni storika tal- 
kontroll. Jekk ji ġi applikat it-te ħid ta' kampjun singolu, l-aktar 
żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittie ħed il-kampjun. Barra 
minn dan, g ħandhom jintu żaw ukoll kontrolli mhux trattati 
sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u 
storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u muta ġeniċi bl-uzu 
tas-solvent/mezz mag ħżul. 
Jekk jintu ża demm periferali, ħampjun ta' qabel it-trattament jista’ 
jkun aċċettabbli b ħala kontroll negattiv fl-istess ħin, iżda fi studji 
qosra ta' demm periferali biss (e ż. 1-3 trattament(i)) meta l-inform ­
azzjoni li tirri żulta tkun fil-medda mistennija g ħall-kontroll storiku.  
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Numru u sess ta' l-annimali  
Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll g ħandu jinkludi fih g ħall-inqas 
ħames annimali analizzabbli g ħal kull sess (11). Jekk fi ż-żmien ta' l- 
istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espo żizzjoni li juru li ma hemm 
l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossi ċità bejn is-sessi, allura jkun 
suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wie ħed. Fejn l-espo żizzjoni 
umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, b ħal per eżempju 
b'ċerti aġenti farma ċewtiċi, it-test g ħandu jitwettaq b'annimali tas- 
sess xieraq.
 
1.5.2.  Skeda tat-trattament  
Ma jista’ ji ġi rakkomandat l-ebda trattament standard (ji ġifieri trat­
tament wie ħed, żewġ trattament jew aktar b'intervalli ta' 24 sieg ħa). 
Il-kampjuni minn re ġimi ta' do żi estiżi huma a ċċettabbli sakemm 
ikun ġie muri effett po żittiv għal dan l-istudju jew, g ħal studju 
negattiv, sakemm tkun ġiet murija tossi ċità sakemm tintu ża d-doża 
sal-limitu, u ting ħata doża sal-ħin tat-teħid ta' kampjuni. Is-sustanzi 
tat-test jistg ħu ukoll ji ġu somministrati b ħala doża maqsuma, ji ġifieri 
żewġ trattament fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit 
sigħat, biex ti ġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum kbir ta' 
materjal.  
It-test jista’ jsir f' żewġ modi:  
(a) l-annimali ji ġu ttrattati bis-sustanza tat-test darba. Il-kampjuni 
tal-mudullun jittie ħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wie ħed 
mhux qabel 24 sieg ħa wara t-trattament, i żda mhux aktar minn 
48 siegħa wara t-trattament b'intervalli xierqa bejn it-te ħid ta' 
kampjuni. It-te ħid ta' kampjuni qabel 24 sieg ħa wara t-trattament 
għandu jkun ġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittie ħdu 
għall-inqas darbtejn, l-ewwel wie ħed mhux qabel 36 sieg ħa wara 
t-trattament, b'intervalli xierqa wara t-te ħid ta' l-ewwel kampjun, 
iżda mhux aktar minn 72 sieg ħa. Meta ji ġi rikonoxxut ri żultat 
pożittiv wara t-te ħid wieħed ta' kampjuni, ma jkunx me ħtieġ 
aktar teħid ta' kampjuni;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
(b) Jekk jintu żaw żewġ trattament jew aktar kuljum (e ż. żewġ trat­
tamenti jew aktar f'intervalli ta' 24 sieg ħa), għandhom jin ġabru 
kampjuni darba bejn 18 u 24 sieg ħa wara l-a ħħar trattament 
riward il-mudullun u darba bejn 36 u 48 sieg ħa wara l-a ħħar 
trattament rigward demm periferali (12).  
Jistgħu jintużaw metodi o ħra ta' teħid ta' kampjuni, fejn dawn ikunu 
rilevanti.  
1.5.3.  Livelli ta' do ża 
Jekk jitwettaq studju biex ti ġi skoperta l-medda g ħax ma jkunx 
hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan g ħandu jsir fl-istess 
laboratorju, jintu żaw l-istess spe ċi, razza, sess u metodu ta' trattament 
li għandhom jintu żaw fl-istudju prin ċipali (13). Jekk ikun hemm 
tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' do ża għall-ewwel perjodu ta' te ħid 
ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' do ża għandhom jkopru medda mill- 
massimu g ħal ftit jew l-ebda tossi ċità. Fil-ħin ta' l-aħħat teħid ta' 
kampjuni, l-og ħla doża biss hi me ħtieġa li tintu ża. L-ogħla doża 
hija mfissra b ħala d-doża li tipprodu ċi sinjali ta' tossi ċità hekk li 
livelli og ħla tad-do ża, bbażati fuq l-istess re ġim ta' do żaġġ, huma 
mistennija li jikkaw żaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijolo ġiċi 
speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossi ċi (bħal ma huma ormoni u 
nitroġeni) jistg ħu jkunu e ċċezzjonijiet g ħall-kriterji ta' l-issettjar 
tad-dożi u għandhom ji ġu valutati fuq ba żi ta' każ b'każ. L-ogħla 
doża tista’ ukoll tfisser id-do ża li tipprodu ċi xi indikazzjoni ta' 
tossiċità fil-mudullun (e ż. tnaqqqis fil-proporzjon ta' eritro ċiti 
immaturi fost l-eritro ċiti totali fil-mudullun jew demm periferali).  
1.5.4.  Test tal-limitu  
Jekk test ta' do ża waħda ta' livell ta' g ħall-inqas 2 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem meta jitwettaq trattament wie ħed, jew b ħala żewġ trattamenti 
fl-istess ġurnata, ma jipprodu ċix effetti tossi ċi li wieħed jinduna 
bihom, u jekk ma tkunx mistennija l- ġenotossiċità fuq il-ba żi ta' l- 
informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun ne ċessarju li jsir studju komplet bl-u żu ta' tliet livelli ta' 
dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-do ża huwa 2 000 
mg/kg/piż tal-ġisem/jum g ħal trattament sa 14-il ġurnata, u 1 000 
mg/kg/piż tal-ġisem/jum g ħal trattament ta' aktar minn 14-il 
ġurnata. L-espo żizzjoni umana mistennija tista’ tindika l- ħtieġa ta' 
livell ogħla ta' doża li għandu jintu ża fit-test tal-limitu.
 
1.5.5.  Somministrazzjoni ta' do żi 
Normalment is-sustanza tat-test ti ġi somministrata b'gavage billi 
jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew 
bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistg ħu jiġu 
aċċettati rotot o ħra ta' espo żizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li 
jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f' ħin wieħed 
jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'g ħandux 
ikun aktar minn 2 ml/100g pi ż tal-ġisem. L-u żu ta' volumi og ħla 
minn dawn g ħandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-ka ż ta' sustanzi li 
jirritaw jew korro żivi li normalment juru effetti aggravati b'kon ċen­
trazzjonijiet og ħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test g ħandha titnaqqas 
bl-aġġustament tal-kon ċentrazzjoni biex ji ġi żgurat volum kostanti 
fuq il-livelli kollha tad-do ża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Preparazzjoni tal-mudullun/demm  
Iċ-Ċelloli tal-mudullun ġeneralment jinkisbu mill-wirk jew mill- 
qasba tas-sieq minnufih wara s-sagrifi ċċju. Komunement, i ċ-ċelluli 
jitneħħew mill-wirk jew mit-qasba tas-sieq, preparati u mog ħtija 
kulur permezz ta' metodi stabbiliti. Demm periferali jinkiseb mill- 
vina tad-denb jew arterja/vina o ħra xierqa. I ċ-Ċelloli tad-demm huma 
minnufih mog ħtija kulur supravitalment (8) (9) (10) jew isiru 
preparazzjonijiet biex jing ħataw il-kulur. L-u żu ta' kulur spe ċifiku 
ta' DNA (e ż. oranġjo akridin (14) jew Hoechst 33258 plus 
pyronin-Y (15)) jista’ jelimina xi u ħud mill-prodotti asso ċjati ma' 
l-użu ta' kulur mhux spe ċifiku DNA. Dan il-vanta ġġ ma jipprekludix 
l-użu ta' kuluri konvenzjonali (e ż. Giemsa). Jistg ħu jintużaw ukoll 
sistemi addizzjonali (e ż. kolonni ta' ċelluloża biex jitne ħħu Ċelloli 
nukleati (16)) i żda dawn is-sistemi intwerew li ja ħdmu adegwa ­
tament għall-preparazzjoni ta' mikronukleji fil-laboratorju.  
1.5.7.  Anali żi 
Il-proporzjon ta' eritro ċiti immaturi fost l-eritro ċiti totali 
(immaturi + maturi) ti ġi stabbilita g ħal kull annimal billi jing ħaddu 
għall-inqas 200 eritro ċiti għall-mudullun u 1 000 eritro ċiti għad- 
demm periferali (17). Id-dijapo żitivi kollha, inklu żi dawk ta' 
kontrolli po żittivi u negattivi, g ħandhom ji ġu kodifikati indipenden ­
tement qabel l-anali żi mikroskopika. Jing ħaddu għall-inqas 2 000 
eritroċiti immaturi g ħall-inċidenza ta' eritro ċiti immaturi mikronuk ­
leati. Tista’ tinkiseb iktar informazzjoni billi jing ħaddu eritro ċiti 
maturi g ħal mikronukleji. Meta ji ġu analizzati d-dijapo żitivi, il- 
proporzjon ta' eritro ċiti immaturi fost l-eritro ċiti totali ma 
għandhiex tkun inqas minn 20 % tal-valur ta' kontroll. Meta l- 
annimali ji ġu ttrattati kontinwament g ħal erba' ġimgħat jew aktar, 
jistgħu jingħaddu ukoll g ħall-inqas 2 000 eritro ċiti maturi g ħal kull 
annimal g ħall-inċidenza ta' mikronukleji. Is-sistemi ta' anali żi awto­
matizzata (anali żi ta' l-imma ġini u anali żi tal-fluss ċitometriku ta' 
sospensjonijiet ta' Ċelloli) huma a ċċettabbli b ħala alternattivi g ħall- 
valutazzjoni manwali jekk ikunu ġustifikati u validati kif xieraq.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-informazzjoni dwar annimali individwali g ħandha ting ħata f'forma 
ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. G ħal kull annimal li 
jiġi analizzat g ħandhom ji ġu elenkati separatament in-numru ta' erit ­
roċiti immaturi li jing ħaddu, in-numru ta' eritro ċiti immaturi mikro ­
nukleati, u n-numru ta' eritro ċiti immaturi fost l-eritro ċiti totali. Meta 
l-annimali ji ġu ttrattati kontinwament g ħal erba' ġimgħat jew aktar, 
għandha ting ħata wkoll l-informazzjoni dwar l-eritro ċiti maturi jekk 
din tinġabar. Għal kull annimal ting ħata l-proporzjon ta' eritro ċiti 
immaturi fost l-eritro ċiti totali u, jekk jitqies applikabbli, il- 
perċentwali ta' eritro ċiti mikronukleati. Jekk ma hemmx xiehda ta' 
differenza fir-ri żultat bejn i ż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar i ż- 
żewġ sessi tista’ ting ħaqad għall-analiżi statistika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Hemm ħafna kriterji biex ji ġi stabbilit ri żultat pożittiv, bħal ma hi 
żieda relatata mad-do ża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli mikronukleati jew 
żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli mikronukleati fi grupp singolu ta' 
trattament fi żmien singolu ta' te ħid ta' kampjuni. L-ewwel g ħandha 
tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijolo ġika tar-riżultati. Bħala għajnuna 
fil-valutazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet (18) (19), jistg ħu jintużaw 
metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma g ħandhiex 
tkun l-uniku fattur determinanti g ħal riżultat pożittiv. Riżultati 
ekwivoċi għandhom ji ġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment 
billi tintu ża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.  
Sustanza ta' test li dwarha r-ri żultati ma jil ħqux il-kriterji fuq 
imsemmija titqies b ħala mhux muta ġenika f'dan it-test.  
Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta'  
sustanza tat-test. Ir-ri żultati jistg ħu jibqgħu ekwivo ċi u inċerti irris­
pettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ru ħu l-esperiment. Ir- 
riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li s-sustanza tat- 
test toħloq mikronukleji li huma r-ri żultat ta' ħsara fil-kromo żomi 
jew ħsara lill-apparat mitotiku fl-eritroblasti ta' l-ispe ċi ttestjata. Ir- 
riżultati negattivi jindikaw li, ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, is- 
sustanza tat-test ma to ħloqx mikronukleji fl-eritro ċiti immaturi ta' l- 
ispeċi ttestjata.  
Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-meta ­
boliti tag ħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew spe ċifikatament it- 
tessut immirat (e ż. tossiċità sistemika).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Annimali ttestjati:  
— speċi/razza użati, 
— numru, età u sess ta' l-annimali;  
— għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jin żammu, dieta, e ċċ.; 
— piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inklu ża l-medda ta' 
piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard g ħal kull grupp.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— kontrolli po żittivi u negattivi (mezz/solvent);  
— informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-do ża; 
— dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;  
— metodi biex ji ġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet g ħaċ-ċirko­
lazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli;  
— konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test 
dieta/ilma g ħax-xorb g ħad doża attwali (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum) 
jekk tkun applikabbli;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;  
— deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u te ħid ta' 
kampjuni;  
— metodi tal-preparazzjoni tad-dijapo żitivi;  
— metodi biex titqies it-tossi ċità; 
— kriterji g ħall-għadd ta' eritro ċiti immaturi mikronukleati;  
— numru ta' ċelluli analizzati kull annimal;  
— kriterji biex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi. 
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— proporzjon ta' eritro ċiti immaturi fost l-eritro ċiti totali;  
— numru ta' eritro ċiti immaturi mikronukleati, mog ħtija separ ­
atament g ħal kull annimal;  
— devjazzjoni standard medja ± ta' eritro ċiti immaturi mikronukleati 
għal kull grupp;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi u metodi applikati;  
— informazzjoni negattiva kurrenti u storika;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv. 
— Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
— Kunklu żjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9-15.  
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.
 
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, 
M. F. and Heddle, J. A. (1990), The  In vivo  Micronucleus 
Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. 
Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. 
E. (1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: 
Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, 
Mutation Res., 245, pp. 245-249.  
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The 
Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/ ­
JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term 
mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, 
pp. 53-159.
 
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchi ­
crotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994),  in vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, 
Mutation Res., 312, pp. 293-304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
 
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., 
Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), 
Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in  In vivo  
Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
 
(14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.  
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for 
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97-99.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of  In vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation 
of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTA ĠENIĊITÀ -TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA 
TA' BATTERJI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 471, Test ta' 
Mutazzjoni Riversiva ta' Batterji (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji ju ża aċidu amino li je ħtieġ 
kundizzjonijiet ta'  Salmonella typhimurium  u Escherichia coli  biex 
jiġu żvelati mutazzjonijiet f'punti, li jinvolvu sostituzzjoni, żjieda jew 
tħassir ta' par wie ħed jew aktar ta' ba żijiet DNA (1) (2) (3). Il- 
prinċipju tat-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa li jiskopri 
mutazzjonijiet li jirrivertu mutazzjonijiet pre żenti fil-kundizzjonijiet 
tat-test u jirrestitwixxu l-kapa ċità funzjonali tal-batterja biex tissin ­
tesizza aċidu amino essenzali. Il-batterji li ji ġu lura jiġu skoperti 
mill-kapa ċità tagħhom li jikbru fl-assenza ta' l-a ċidu amino me ħtieġ 
mill-kundizzjonijiet tal- ġenitur tat-test.  
Mutazzjonijiet f'punti huma l-kaw ża ta' ħafna mard ġenetiku fil- 
bniedem u hemm xiehda sostanzjali li mutazzjonijiet f'punt f'on ­
koġeni u fil- ġeni ta' ċelluli somati ċi li jrażżnu t-tumuri huma 
involuti fil-formazzjoni ta' tumuri fil-bniedem u f'annimali ta' esperi ­
menti. It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa rapidu, mhux għali u relattivament fa ċli biex jitwettaq. Ħafna mill-kundizzjonijiet 
tat-test g ħandhom diversi karatteristi ċi li jag ħmuluhom aktar 
sensittivi g ħall-iskoperta ta' mutazzjonijiet inklu żi sekwenzi DNA 
responsivi fis-siti ta' reversjoni, permeabilità mi żjuda ta' Ċelloli 
għal molekuli kbar u l-eliminazzjoni ta' sistemi ta' riparazzjoni ta' 
DNA jew titjib ta' pro ċessi ta' riparazzjoni ta' DNA li huma suxxet ­
tibbli għall-iżbalji. L-ispe ċifiċità tal-kundizzjonijiet tat-test jistg ħu 
jipprovdu informazzjoni utli dwar it-tipi ta' mutazzjonijiet li huma kkaużati mill-a ġenti ġenotossiċi. Bażi ta' informazzjoni kbira ħafna 
ta' riżultati għal varjetà wiesg ħa ta' strutturi hija disponibbli g ħal 
testijiet ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji u ġew żviluppati metodo ­
loġiji stabbiliti sew biex jittestjaw il-kimi ċi b'karatteristi ċi diversi 
fi
żiko kimiċi, inklużi komposti li ji żvintaw.  
Ara wkoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Test ta' mutazzjoni riversiva  jew fi  Salmonella typhimurium  jew 
f'Escherichia coli  jiżvela mutazzjoni f'amino a ċidu li jeħtieġ karatter­
istika (histidine jew tryptophan, rispettivament) biex jipprodu ċi 
karatteristika indipendenti minn fornitura minn barra ta' a ċidu amino.  
Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni ta' koppji ta' ba żijiet huma 
aġenti li jikkaw żaw bidla fil-ba żi tad-DNA. F'test reversiv din il- 
bidla tista’ tirrikorri fil-lok tal-mutazzjoni ori ġinali, jew f'xi tieni 
lok fil-genome batteriku.  
Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fa żi tal-qari huma a ġenti li 
jikkawżaw iż-żieda jew itt ħassir ta' pari ta' ba żi waħda jew aktar 
fid-DNA, u b'hekk jibdlu l-fa żi tal-qari tar-RNA.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. KONSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU  
It-test tal-mutazzjoni batterika reversiva jutilizza Ċelloli prokarijoti ċi, 
li huma differenti minn Ċelloli tal-mammiferi fil-karatteristi ċi bħal 
ma huma l-assorbiment, il-metaboli żmu, l-istruttura tal-kromo żomi u 
l-proċessi ta' riparazzjoni tad-DNA. It-testijiet li jitwettqu  in vitro  
ġeneralment je ħtieġu l-użu ta' għejun eso ġenu għall-attivazzjoni 
metabolika. Sistemi ta' attivazzjoni metabolika  in vitro  ma jistg ħux 
jissimulaw kompletament il-kundizzjonijiet  in vivo  fil-mammiferi. 
Għalhekk it-test ma jag ħtix informazzjoni diretta fuq il-qawwa muta ­ 
ġenika u kar ċinoġenika ta' sustanza fil-mammiferi.  
It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika normalment jintu ża bħala l- 
ewwel pass g ħall-attività ġenolossika u, b'mod partikolari, g ħall- 
attività li to ħloq mutazzjoni puntiformi. Informazzjoni estensiva 
wriet li ħafna kimi ċi li huma posittivi f'dan it-test juru wkoll 
attività muta ġenika f'testijiet o ħra. Hemm e żempji ta' a ġenti 
mutaġeniċi li ma ji ġux żvelati b'dan it-test; ir-ra ġunijiet għal dawn 
in-nuqqasijiet jistg ħu jkunu attribwiti g ħan-natura spe ċifika tal-punt 
ta' laħħar żvelat, differenzi fl-attivazzjoni metabolika, jew differenzi 
fil-bijodisponibbilità. Minna ħa l-oħra, l-fatturi li jsa ħħu s-sensitività 
tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jistg ħu jwasslu g ħal sopra­
valutazzjoni ta' l-attivita muta ġenika.  
It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jista’ ma jkunx xieraq g ħall- 
valutazzjoni ta' ċerti klassijiet ta' kimi ċi, per eżempju komposti 
b'qawwa kbira batteri ċida (eż. ċerti antibijoti ċi) li dawk li huma 
maħsuba (jew huma mag ħrufa) li jiddisturbaw spe ċifikatament is- 
sitema ta' replika ta' Ċelloli fil-mammiferi (e ż. inibituri tat- 
topojsomerasi u ċerti analogi nukleosidi). F'dawn il-ka żijiet jistgħu 
jkunu aktar xierqa testijiet fuq mutazzjoni fil-mammiferi.  
Minkejja li ħafna mill-komposti li huma posittivi f'dan it-test huna 
karċinoġeni tal-mammiferi, il-korrelazzjoni mhijiex assoluta. 
Tiddependi fuq il-klassi tal-kimika u hemm kar ċinoġeni li ma 
jiġux żvelati b'dan it-test g ħax jaġixxu permezz ta' mekkani żmi 
oħra li mhumiex ġenotossiċi jew mekkani żmi li ma je żistux 
f'ċelluli batteri ċi. 
1.4. PRIN ĊIPJI TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sospensjonijiet ta ċ-Ċelloli batteri ċi jiġu esposti g ħas-sustanza tat- 
test fil-presenza u fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika 
esoġenea. Fil-metodu ta' inkorporazzjonmi fuq ba żi, dawn is- 
sospensjonijiet jit ħalltu ma' agar ta' kopertura u jitqieg ħdu fuq il- 
bażi minnufih fuq medjum minimu. Fil-metodu ta' qabel l-inku ­
bazzjoni, it-ta ħlita tat-trattament ti ġi inkubata u imbag ħad imħallta 
ma' agar ta' kopertura qabel titqieg ħed fuq ba żi fuq medjum minimu. 
Għaż-żewġ metodi ta' teknika, wara jumejn ta' inkubazzjoni jew 
tlieta, jing ħaddu l-kolonji revertanti u ji ġu mqabbla man-numru ta' 
kolonji revertanti spontanji fuq il-ba żijiet ta' kontroll tas-solvent.  
Ġew deskritti ħafna proċeduri għat-twettiq tat-test tal-mutazzjoni 
riversiva batterika. Fost dawk li ġeneralment jintu żaw hemm il- 
metodu ta' inkorporazzjoni fuq ba żi (1) (2) (3) (4), il-metodu ta' 
qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6) (7) (8), il-metodu ta' fluttwazzjoni 
(9) (10), u l-metodu tas-sospensjoni (11). Ġew deskritti modifiki 
għall-ittestjar ta' gassijiet jew fwar (12).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Il-proċeduri deskritti fil-metodu jappartjenu primarjament g ħall- 
metodi ta' l-inkorporazzjoni fuq ba żi u ta' qabel l-inkubazzjoni. 
Kull wie ħed minnhom huwa a ċċettabbli biex isiru esperimenti 
kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll ming ħajrha. Ċerti 
sustanzi jistg ħu jiġu żvelati b'mod aktar effi ċjenti meta jintu ża l- 
metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn is-sustanzi jappartjenu g ħal 
klassijiet kimi ċi li jinkludu nitrosamini alifati ċi short chain, metalli 
divalenti, aldejidi, komposti ta' koloranti a żo u dija żo, alkalojdi 
pirolliżidini, komposti allil u nitro komposti (3). Hu rikonoxxut 
ukoll li ċerti klassijiet ta' muta ġeni mhux dejjem ji ġu żvelati meta 
jintużaw proċeduri standard b ħal ma huma l-metodu ta' inkorpo ­
razzjoni fuq ba żi u l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn 
għandhom jitqiesu b ħala “każijiet speċjali” hu huwa bil-qawwa 
rakkomandat li jintu żaw proċeduri alternattivi biex ji ġu żvelati. Il- 
“każijiet speċjali” li ġejjin jistg ħu jiġu identifikati (flimkien ma' 
eżempji ta' pro ċeduri li jistg ħu jintuiżaw biex ji ġu żvelati): 
komposti ta' koloranti a żo u dijażo (3) (5) (6) (13), kimi ċI ta' gass­
sijiet u fwar (12) (14) (15) (16) u glikosidi (17) (18). Kull 
devjazzjoni mill-pro ċedura standard te ħtieġ li tkun ġustifikata xjen ­
tifikament.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.5.1.  Preparazzjonijiet  
1.5.1.1.  Batterja  
Kulturi friski ta' batterja g ħandhom jit ħallew jiżviluppaw sal-fa żi 
esponenzali tardiva jew il-fa żi bikrija stazzjonarja ta' l-I żvilupp 
(madwar 109 Ċelloli kull ml). Ma g ħandhomx jintu żaw kulturi fil- 
fażi stazzjonarja tardiva. Huwa essenzali li l-kulturi li jintu żaw fl- 
esperiment ikun fihom titolu g ħoli ta' batterja vijabbli. It-titolu jista’ 
jintwera jew mill-informazzjoni storika ta' kontroll fuq il-fa żijiet ta' 
żvilupp, jew minn kull anali żi permezz tad-determinazzjoni ta' l- 
għadd ta' Ċelloli vijabbli bl-esperiment tal-ba żi. 
It-temperatuta rakkomandata g ħall-inkubazzjoni hi ta' 37  o Ċ. 
Għandhom jintu żaw għallinqas ħames karatteristi ċi ta' batterji. Dawn 
għandhom jinkludu erba' karatteristi ċi ta' S. typhimurium  (TA 1535; 
TA 1537 jew TA97a jew TA97; TA98; u TA100) li ġew pruvati li 
huma ta' min wie ħed jorbot fuqhom u responsivi g ħar-riproduzzjoni 
bejn laboratorji. Dawn l-erba' karatteristi ċi S. typhimurium  għandhom 
pari bażiċi GC fuq il-lok ta' reversjoni primarja u huwa mag ħruf li 
jistgħu ma jiżvelawx ċerti mutaġeni ossidanti, a ġenti li jipprovokaw 
il-cross-linking u idra żini. Dawn is-sustanzi jistg ħu jiġu żvelati bil- 
karatteristi ċi ta' E. coli  WP2 jew  S. typhimurium  TA102 (19) li 
jkollhom par ta' ba żi AT fil-lok primarju ta' reversjoni. G ħalhekk 
it-tagħqid rakkomandat ta' karatteristi ċi huwa:  
— S. typhimurium  TA1535, u  
— S. typhimurium  TA1537 jew TA97 jew TA97a, u  
— S. typhimurium  TA98, u  
— S. typhimurium  TA100, u  
— E. coli  WP2 uvrA, jew  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), jew  S. 
typhimurium  TA102.  
Biex jiġu żvelati muta ġeni cross-linking jista’ jkun preferibbli li 
wieħed jinkludi TA102 jew li ti żdied karatteristika ta' riparazzjoni 
tad-DNA ta'  E. coli  (eż. E. coli  WP2 jew  E. coli  WP2 (pKM101)).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Għandhom jintu żaw proċeduri stabbiliti g ħall-preparazzjoni ta' 
kulturi primarji, verifika ta' l-immarkar u l- ħażna. Għandha 
tintwera l- ħtieġa ta' l-amino a ċidu għall-Iżvilupp għal kull kultura 
primarja ffri żata (istidina g ħal karatteristi ċi ta' S. typhimurium , u 
triptofan g ħal karatteristi ċi ta' E. coli ). Karatteristi ċi oħra fenotipi ċi 
għandhom ji ġu verifikati bl-istess mod, ji ġfieri: il-presenza jew l- 
assenza ta' plasmidi tal-fattur R fejn ikun xieraq (ji ġifieri r-resistenza 
għall-ampiċillina fil-karatteristi ċi ta' TA98, TA100, u TA97a jew 
TA97, WP2 uvrA u WP2 uvrA (pKM101), u resistenza g ħall- 
ampiċillina + tetra ċiklina fil-karatteristika TA 102); il-presenza ta' 
mutazzjonijiet karatteristi ċi (jiġifieri mutazzjoni rfa mutation fi  S. 
typhimurium  permezz ta' senmsitività g ħal kristalvjola, u mutazzjoni 
uvrA fi  E. coli  jew mutazzjoni uvrB mutation fi  S. typhimurium , 
permezz ta' sensitività g ħal dawl ultravjola) (2) (3). Il-karatteristi ċi 
għandhom ukoll jipprodu ċu numru ta' ba żijiet ta' kolonji revertanti 
spontanji fi ħdan il-meddiet ta' frekwenza mistennija mill-inform ­
azzjoni storika ta' kontroll tal-laboratorji u preferibbilment fil- 
medda msemmija fil-letteratura.  
1.5.1.2.  Medjum  
Jintuża agar minimu xieraq (e ż. li jkun fih medjum E minimu 
ta' Vogel-Bonner u gluko żju), u agar ta' kopertura li jkun fih 
istidina u bijotin jew triptofan biex jippermetti ftit divi żjonijiet ta' 
Ċelloli (1) (2) (9).  
1.5.1.3.  Attivazzjoni metabolika  
Il-batterja g ħandha tiġi esposta g ħas-sustanza tat-test kemm fil- 
presenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika 
xierqa. Is-sistema li normalment l-aktar tintu ża hija frazzjoni post 
mitokondrijali integrata ta' kofattur (S9) ippreparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattata b'a ġenti li jipprokuraw l-en żimi bħal ma 
huma l-Aroclor 1254 (1) (2) jew komposizzjoni ta' phenobarbitone u 
β-naphthoflavone (18) (20) (21). Il-frazzjoni post mitokondrijali 
normalment tintu ża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 5 sa 30 % 
v/v fit-taħlita S9. L-g ħażla u l-kundizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni 
metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tintu ża. F'ċerti 
każijiet, jista’ jkun xieraq li jintu żaw aktar minn kon ċentrazzjoni 
waħda ta' frazzjon post mitokondrijali. G ħal komposti ta' koloranti 
ażo u dijażo, jista’ jkun aktar xieraq li tintu ża sistema ta' attivazzjoni 
metabolika (6) (13).
 
1.5.1.4.  Sustanza/preparazzjoni tat-test  
Sustanzi solidi tat-test g ħandhom jiddewbu jew ji ġu sospiżi f'solventi 
jew mezzi xierqa u dilwiti kif ikun xieraq qabel ma ti ġi ttrattata l- 
batterja. Sustanzi likwidi tat-test jistg ħu jiżdiedu direttament mas- 
sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda sakemm l-informazzjoni ta' l- 
istabbilità ma turix li jistg ħu jinħażnu. 
Ma għandhux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/ ­
mezz mas-sustanza tat-test u dan is-solvent/mezz g ħandu jkun 
kompatibbli mas-sopravvivenza tal-batterja u ma' l-attività S9 (22). 
Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħra magħrufa, l-inklu żjoni tagħhom 
għandha tkun appo ġġata b'informazzjoni li tindika l-kompattibilità 
tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli g ħandu l- 
ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' solvent/mezz akkwu ż. Meta ji ġu 
ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organi ċi li 
jintużaw ma għandux ikollhom ilma.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.5.2.1.  Karatteristi ċi tat-test (Ara 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Konċentrazzjoni ta' l-espo żizzjoni  
Fost il-kriterji li g ħandhom jitqiesu meta ji ġi determinat l-og ħla 
ammont tas-sustanza tat-test li g ħandha tintu ża hemm il- ċitotossiċità 
u s-solubbilità fit-ta ħlita ta' trattament finali.  
Jista’ jkun utli li ji ġu stabbiliti t-tossi ċità u l-insolubbilità f'es ­
periment preliminari. I ċ-ċitossiċità tista’ ti ġi żvelata b'riduzzjoni fl- 
għadd ta' konolonji revertanti, bid-dehra ta' żvilupp a normali tal- 
fond, jew bil-grad ta' sopravivenza tal-kulturi ttratati. I ċ-ċitossiċità ta' 
sustanza tista’ tinbidel fil-pre żenza ta' sistemi ta' attivazzjoni meta ­
bolika. L-insolubbilità g ħandha tiġi stmata b ħala preċipitazzjoni fit- 
taħlita finali ta ħt il-kundizzjonijiet attwali tat-test u tkun evidenti 
għall-għajn mingħajr għanjuna.  
Il-konċentrazzjoni massima rakkomandata g ħat-test għal sustanzi 
solubbli li mhumiex ċitotossiċi hija 5mg/ba żi jew 5μl/bażi. Għal 
sustanzi li mhumiex ċitotossiċi u li ma jin ħallux fuq 5mg/ba żi jew 
5 μl/bażi u waħda mill-kon ċentrazzjonijiet ittestjati jew aktar 
għandha tkun mhux solubbli fit-ta ħlita finali tat-trattament. 
Sustanzi tat-test li huma di ġà ċitotossiċi taħt il-5mg/ba żi jew 5 
μl/bażi għandhom ji ġu ttestjati sa kon ċentrazzjoni ċitotossika. Dak 
li jippreċipita ma g ħandux jiddisturba l-g ħadd. 
Għandhom jintu żaw għallinqas ħames kon ċentrazzjonijiet differenti 
analizzabbli tas-sustanza tat-test b'madwar intervalli ta' semi loga ­
rittmi (jiġifieri √10) bejn punti tat-test g ħal esperiment inizjali. 
Jistgħu ikunu xierqa intervalli iqsar meta jkun qed ji ġi investigat 
rispons ta' kon ċentrazzjoni. Testjar g ħola mill- ċonċentrazzjoni ta' 
5mg/bażi jew 5 μl/bażi jista’ jiġi kkunsidrat meta ssir il-valutazzjoni 
ta' sustanzi li jkollhom ammonti sostanzjali ta' impuritajiet potenz ­
alment muta ġeniċi. 
1.5.2.3.  Kontrolli negattivi u po żittivi 
Kontrolli (solvent jew mezz) po żittivi u negattivi konkurrenti 
speċifiċi għall-kwalitajiet, kemm b'attivazzjoni metabolika jew 
mingħajr, għandhom ji ġu inklużi f'kull eżami. Għandhom jintg ħażlu 
konċentrazzjonijiet ta' kontrolli po żittivi li juru l-prestazzjoni effettiva 
ta' kull eżami. 
Għal eżamijiet li jag ħmlu użu minn sistema ta' attivazzjoni meta ­
bolika, is-sustanza (i) ta' referenza ta' kontoll po żittiv għandha(hom) 
tingħażel fuq ba żi tat-tip tal-kwalitajiet ta' batterja u żati. 
Is-sustanzi li ġejjin huma e żemmpji ta' kontrolli po żittivi xierqa g ħal 
eżamijiet ta' attivazzjoni metabolika:  
Nri CA NRI EINECS Ismijiet  
781-43-1 212-308-4 9,10- Dimetil-antra ċena 
57-97-6 200-359-5 7,12- Dimetilben ż(a)antraċena 
50-32-8 200-028-5 Benzo(a)pirena 
613-13-8 210-330-9 2-Amino-antra ċena ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Nri CA NRI EINECS Ismijiet  
50-18-0 Ċiklofosfamida 
6055-19-2 200-015-4 Monoidrat ta ċ-ċiklofosfamida  
Is-sustanza li ġejja hija kontroll po żittiv xieraq g ħall-metodu ta' 
attivazzjoni metabolika riduttiva:  
Nri CA NRI EINECS Ismijiet  
573-58-0 209-358-4 Congo Red  
It-2-Aminoantra ċena ma g ħandhiex tintu ża bħala l-uniku indikatur ta' 
l-effikaċja tat-taħlita S9. Jekk tintu ża t-2-aminoantra ċena, kull lott ta' 
S9 għandu jkun karatteri żat b'muta ġen li jeħtieġ l-attivazzjoni meta ­
bolika b'en żimi mikrosomali, e ż. benzo(a)pirena, dimetilbenz ­
antraċena. 
Is-sustanzi li ġejjin huma e żempji ta' kontrolli po żittivi skond 
karatteristi ċi speċifiċi għal eżamijiet imwettqa ming ħajr is-sistema 
ta' attivazzjoni metabolika esso ġena:  
NRI CAS NRI EINECS ISMIJIET Strain  
26628-22-8 247-852-1 A żidu tas-sodju TA 1535 u TA 100 
607-57-8 210-138-5 2 Mikro-fluworena TA 98 
90-45-9 201-995-6 9 Amino-akridina TA 1537, TA 97 u TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 u TA 97a 
80-15-9 201-254-7 Iperossidu tal-Kumena TA 102 50-07-7 200-008-6 Mitomycin C WP2 uvrA u TA102 70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-3-nitro-N-nitro ­
sogwanidina WP2, WP2uvrA u WP2uvrA 
(pK M101) 
56-57-5 200-281-1 4-Nitrokwinolina-1-ossidu WP2, WP2uvrA u 
WP2uvrA(pK M101) 
3688-53-7 Furilfuramida (AF2) Karatteristi ċi li fihom il-plasmid
 
Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll po żittiv xierqa 
oħra. Għandu jiġi kkunsidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll po żittiv li 
huma relatati ma' klassijiet ta' kimi ċi, meta dan ikun possibbli.  
Għandhom ji ġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss 
f'solvent jew mezz, ming ħajr sustanza tat-test, u mod ie ħor ittrattati 
bl-istess mod b ħal gruppi ta' trattament. B' żieda ma dan, g ħandhom 
jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakamm ma jkunx hemm 
informazzjoni storika ta' kontroll li turi li s-solvent mag ħżul ma 
jġibx effetti ta' ħsara jew muta ġeniċi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Pro ċedura  
Għall-metodu ta' inkorporazzjoni fuq ba żi (1) (2) (3) (4), ming ħajr l- 
attivazzjoni metabolika, normalment 0,05 jew 0,1 ml tas- soluzzjonijiet tat-test, 0,1 ml ta' kulturi friski ta' batterja (li jkun 
fihom madwar 108 ċelloli vijabbli u 0,5 ml ta' tarka sterili jit ħalltu 
ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. G ħall-eżami bl-attivazzjoni meta ­
bolika, normalment 0,5 ml tat-ta ħlita ta' l-attivazzjoni metabolika li 
jkun fiha ammont adegwat ta' frazzjoni post mitokondrijali (fil- 
medda ta' 5 sa 30 % v/v fit-ta ħlita ta' l-attivazzjoni metabolika) 
jitħalltu ma' agar ta' kopertura (2,0 ml) flimkien mal-batterja u 
mas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test. Il-kontenut ta' kull tubu ji ġi 
mħallat u jitferra fuq superfi ċi ta' bażi b'agar minimu. L-agar ta' 
kopertura jit ħalla jsir solidu qabel l-inkubazzjoni.
 
Għall-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6), is-sutanza tat- 
test/soluzzjoni tat-test ti ġi inkubata minn qabel mal-karatteristika tat- 
test (li jkun fiha madwar 108 Ċelloli vijabbli u t-tarka sterili jew is- 
sistema ta' attivazzjoni metabolika, 0,5ml) ġeneralment g ħal 
20 minuta jew aktar f'temperatura ta' 30- 37 Ċ qabel ma tit ħallat 
ma' l-agar ta' kopertura u titferra fuq superfi ċi ta' bażi ta' agar 
minimu. Ġeneralment 0,05 jew 0,1 ml tas-sustanza tat-test/soluzzjoni 
tat-test, 0,1 ml ta' batterja u 0,5ml ta' ta ħlita S9 jew tarka sterili 
jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. It-tubi g ħandhom 
jitħallew li tid ħol l-arja fihom fl-istadju ta' qabel l-inkubazzjoni 
billi jintu ża aġitatur.  
Biex issir stima xierqa tal-varjazzjoni, g ħandhom jintu żaw tarki 
ittriplikati g ħal kull livell ta' do ża. L-użu ta' tarka duplikata hija 
aċċettabbli meta xjentement ġustifikata. It-telfa ta' kull tant ta' ba żi 
ma tinvalidax it-test ne ċessarjament.  
Sustanzi gassu żi jew volatili g ħandhom ji ġu ttestjati b'metodi xierqa, 
bħalma huma mezzi mag ħluqa (12) (14) (15) (16).  
1.5.4.  Inkubazzjoni  
Il-bażijiet kollha f'e żami partikolari g ħandhom ji ġu inkubati ta' 37  o C 
għal 48-72 sieg ħa. Wara l-perjodu ta' inkubazzjoni, g ħandu jing ħadd 
in-numru ta' kolonji revertanti kull ba żi. 
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Informazzjoni g ħandha tiġi preżentata bħala numru ta' kolonji 
revertanti kull ba żi. Għandu jing ħata wkoll in-numru ta' kolonji 
revertanti kemm dwar ba żijiet ta' kontroll negattivi (kontroll tas- 
solvent, u kontroll mhux trattat, jekk ikun ġie użat) kif ukoll 
bażijiet ta' kontroll po żittivi. L-g ħadd ta' ba żijiet individwali, in- 
numru medju ta' kolonji revertanti kull ba żi u d-devjazzjoni 
standard g ħandhom ji ġu preżentati għas-sustanza tat-test u g ħall- 
kontrolli po żittivi u negattivi (mhux trattati u/jew tas-solvent).  
Ma hemmx ħtieġa ta' verifika g ħal rispons po żittiv ċar. Riżultati 
ambigwi g ħandhom ji ġu ċċarati b'permezz ta' aktar testijiet preferib ­
bilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. 
Riżultati negattivi g ħandhom ji ġu konfermati fuq il-ba żi ta' każ 
b'każ. F'dawk il-ka żijiet fejn il-konferma ta' ri żultati negattivi 
mhiex ikkunsidrata b ħala negattiva, trid ting ħata ġustifikazzjoni. 
Modifikazzjonijiet ta' parametri ta' studju sabiex ti ġi estiża l-medda 
tal-kundizzjonijiet stmati g ħandha tiġi kkonsidrata f'esperimenti ta' 
wara. Parametri ta' studju li jisg ħu jiġu modifikati jinkludu l- 
ispazjar tal-kon ċentrazzjoni, il-metodu ta' trattament (inkorporazzjoni 
mal-bażi jew qabel l-inkubazzjoni fil-likwidu), u kundizzjonijiet ta' 
attivazzjoni metabolika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TA' RI ŻULTATI  
Hemm diversi kriterji sabiex ji ġi determinat ri żultat pożittiv, bħal 
żieda ta' relata mal-kon ċentrazzjoni matul il-medda ttestjata u/jew 
żieda riprodu ċibbli f'kon ċentrazzjoni wa ħda jew aktar fin-numru ta' 
kolonji revertanti kull ba żi f'mill-inqas karatteristika wa ħda b'sistema 
ta' attivazzjoni metabolika jew ming ħajrha (23). G ħandha tiġi 
kunsidrata l-ewwel ir-rilevanza bijolo ġika tar-ri żultati. Jistg ħu 
jintużaw metodi ta' statistika b ħala għanjuna għal valutazzjoni tar- 
riżultati tat-test (24). Madankollu, is-sinjifikanza statistika ma 
għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti g ħal rispons po żittiv. 
Sustanza ta' test li dwarha r-ri żultati ma josservawx il-kriterji fuq 
imsemmija hija kkunsidrata b ħala mhux muta ġenika f'dan it-test.  
Minkejja li ħafna esperimenti jag ħtu riżultati ċari, pożittivi jew 
negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni mog ħtija ma tippermettix li 
jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-ri żultati 
jistgħu jibqgħu ambigwi jew dubbju żi rrispettivament min-numru ta' 
drabi li ji ġi ripetut l-esperiment.  
Riżultati po żittivi mit-test ta' mutazzjoni reversibbli batterika 
jindikaw li s-sustanza ti ġġenera mutazzjonijiet mal-punt permezz ta' 
sostituzzjonijiet fuq il-ba żi jew tibdiliet fil-parametri tal- ġenomu ta' 
jew Salmonella typhimurium  u/jew  Escherichia coli . Riżultati 
negattivi jindikaw li ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test is-sustanza tat- 
test mhix muta ġenika fl-ispe ċi ttestjati.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni g ħall-għażla tas-solvent/mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Karatteristi ċi: 
— Karatteristi ċi użati; 
— numru ta' ċelluli kull kultura;  
— dettalji tal-karatteristi ċi. 
Kundizzjonijiet tat-Test:  
— ammont tas-sustanza tat-test kull ba żi (mg/ba żi jew μl/bażi) 
flimkien mar-ra ġuni bażija għall-għażla tad-do ża u n-numru ta' 
bażijiet kull kon ċentrazzjoni;  
— medja u żata; 
— tip u komposizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklu żi 
l-kriterji ta' a ċċettazzjoni;  
— proċeduri tat-trattament.  
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— sinjali ta' pre ċipitazzjoni;  
— għadd ta' ba żijiet individwali;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— in-numru medju ta' kolonji rivertanti kull ba żi u devjazzjoni 
standard;  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;  
— informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u po żittiv, fl- 
istess ħin, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard;  
— informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u po żittiv, 
storiċi, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Konklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 
31, pp. 347-364.  
(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 
173-215.  
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.  
(4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Assay: 
A Report of the U.S. Environmental Protection Agency 
Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.
 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, 
pp. 91-96.  
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutage ­
nicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.
 
(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. 
Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.
 
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, 
pp. 167-177.  
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of 
mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42.  
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, 
J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. 
J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, 
Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium , Environmental Muta ­
genesis, 3, pp. 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 
307, pp. 335-344.  
(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and 
Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a 
Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.  
(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. 
Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. 
Mutagen., 19, pp. 2-141.  
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), 
Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. 
Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249- 
258.
 
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, 
L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic 
Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/ ­
Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421- 441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally 
Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in  Salmonella typhimurium , Cancer 
Res., 39, pp. 3780-3782.
 
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. 
(1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285- 
291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
 
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genot­
oxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
 
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ ­
Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.  
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., 
Cambridge University Press, pp. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  IT-TIBDIL TAL- ĠENE –  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. IL-METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3 SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Hemm varjetà ta’ razez ta’ l-aplojde u tad-diplojde tal- ħmira 
Saccharomyces cerevisiae  li jistgħu jintużaw biex tkun ikkalkulata 
il-produzzjoni ta’ tibdil tal- ġene li huwa kka ġunat minn a ġenti kimiċi 
bl-attivazzjoni metabolika u ming ħajr dik l-attivazzjoni.  
Kienu użati sistemi ta’ tibdil ‘il-quddiem f’razez ta’ l-aplojde, b ħall- 
kalkolu tat-tibdil minn mutanti ( ade-1, ade -2) ħomor li je ħtieġu l- 
adenina, g ħal mutanti bojod doppji li je ħtieġu l-adenina u sistemi 
selettivi b ħall-ikkaġunar ta’ re żistenza għall-canavnaine u g ħaċ-ċiklo­
hessimida.  
Is-sistema ta’ tibdil b’lura li hija validata bil-mod l-iktar estensiv 
tinvolvi l-u żu tar-razza ta’ l-aplojde XV 185-14C li ġġorr il-bidliet 
nonsense ta’ l-okra  ade 2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 u  trp 5-48, li jistg ħu 
jinqalbu lura b’muta ġeni li jissostitwixxu l-ba żi u li jikka ġunaw 
tibdil spe ċifiku għas-sit jew tibdil li jra żżnu l-okra. XV 185-14C 
iġorr ukoll is-sinjal  his  1-7, li huwa bidla missense li tista’ 
tinqaleb lura prin ċipalment b’tibdil tat-tieni sit, u s-sinjal  hom  3-10 
li jista’ jinqaleb lura permezz ta’ muta ġeni frameshift..  
F’razez diplojdi ċI ta’ l- S. cerevisiae  l-unika razza li tintu ża b’mod 
estensiv hija D  7 li hija omozigota g ħal ilv 1-92.  
1.5. KRITERJI G ĦALL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Is-soluzzjonijiet tal-kimi ċi tat-test u l-kontroll g ħandhom ikunu ppre ­
parati eżatt qabel l-ittestjar, bl-u żu ta’ vettura xierqa. Fil-ka ż ta’ 
komposti organi ċi li ma jin ħallux fl-ilma, m’g ħandhiex tintu ża 
iktar minn ta ħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi organi ċi bħall-etanol, l- 
aċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il-kon ċentrazzjoni finali 
tal-vettura m’g ħandhiex taffettwa b’mod sinifikanti il-vijabilità ta ċ- 
ċelluli u l-karatteristi ċi tat-tkabbir.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
L - a t t i v a z z j o n i m e t a b o l i k a  
Iċ-ċelluli għandhom ikunu esposti g ħall-kimiċi tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika 
esoġena xierqa. Is-sistema li tintu ża l-iktar spiss hija frazzjoni post- 
mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali 
gerriema trattati minn qabel b’a ġenti li jikka ġunaw l-enzimi.  
L-użu ta’ spe ċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew 
proċeduri oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa g ħall-attivazzjoni meta ­
bolika.  
Kundizzjonijiet g ħat-test  
R a z e z u ż a t i g ħ a t - t e s t  
Ir-razza aplojdika XV 185-14C u r-razza diplojdika D  7 huma dawk li 
jintużaw l-iktar fl-istudji dwar it-tibdil fil- ġeni. Razez o ħrajn jistgħu 
ikunu xierqa ukoll.  
M e z z i  
Mezzi xierqa tal-kultura huma u żati għad-determinazzjoni tan-numri 
tas-sopravivenza u tat-tibdil.  
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i p o ż i t t i v i u n e g a t t i v i  
Kontrolli tas-solventi, posittivi, li m’humiex trattati g ħandhom isiru 
fl-istess ħin. Kimiċi xierqa g ħall-kontroll posittiv g ħandhom jintu żaw 
għal kull tarf spe ċifiku ta’ tibdil.  
I l - k o n ċ e n t r a z z j o n i t a ’ l - e s p o ż i z z j o n i  
Għall-inqas ħames kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin 
b’mod adegwat g ħandhom jintu żaw. Għal sustanzi tossi ċi, l-ogħla 
konċentrazzjoni ttestjata m’g ħandhiex tnaqqas is-sopravivenza g ħal 
inqas minn 5 % sa 10 %. Sustanzi li relattivament ma jin ħallux fl- 
ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità tag ħhom, bl- 
użu ta’ proċeduri xierqa. G ħal sustanzi li jin ħallu b’mod fa ċli fl-ilma 
u li m’humiex tossi ċi, l-ogħla konċentrazzjoni g ħandha tkun deter ­
minata skond il-ka ż. 
K u n d i z z j o n i j i e t g ħ a l l - i n k u b a z z j o n i  
Il-platti huma inkubati g ħal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 30  o C fid- 
dlam.  
F r e k w e n z i t a ’ t i b i l s p o n t a n j u  
Għandhom jintu żaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil spontanju 
ġewwa l-medda normali a ċċettata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
N u m r u t a ’ r e p l i k i  
Għandhom jintu żaw għall-inqas tliet repliki tal-platti g ħal kull kon ċ­
entrazzjoni g ħall-analiżi tal-prototrophs li jin ħalqu bit-tibdil tal- ġeni 
u għall-vijabilità ta ċ-ċelluli. Fil-ka ż ta’ esperimenti li ju żaw sinjali 
bħal hom  3-10 b’rata baxxa ta’ tibdil, in-numru ta’ platti li jintu żaw 
għandu jkun ikbar biex tinkiseb data rilevanti fis-sens statistiku.  
Il-Proċedura  
It-trattament tar-razez  S. cerevisiae  isir normalment bil-pro ċedura ta’ 
test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti 
inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 x 10 Ċelloli/ml 
huma esposti g ħall-kimika tat-test g ħal perjodu ta’ ħin sa 18-il sieg ħa 
f’temperatura ta’ 28-37  o C biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema 
ta’ attivazzjoni metabolika huwa mi żjud waqt it-trattament meta 
xieraq. Fl-a ħħar tat-trattament, i ċ-Ċelloli huma ċentrifugati, 
maħsulin u mi żrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, 
il-platti ji ġu eżaminati g ħas-sopravivenza u g ħall-ikkaġunar tat-tibdil 
tal-ġeni. Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, g ħandu jsir 
esperiment ie ħor bl-użu ta’ Ċelloli fil-fa żi wieqfa. Jekk l-ewwel 
esperiment huwa po żittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indi ­
pendenti xieraq.  
2. ID-DATA  
Id-data għandha tkun ippre żentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in- 
numru ta’ kolonji mg ħadda, in-numru ta’ mutanti, is-sopravivenza u 
l-frekwenza tal-mutanti. Ir-ri żultati kollha g ħandhom ikunu kkon ­
fermati f’esperiment indipendenti. Id-data g ħandha tkun evalwata 
bl-użu ta’ metodi statisti ċi xierqa.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandhu jkollu, fejn huwa possibbli, l-inform ­
azzjoni il ġejja: 
— ir-razza u żata; 
— il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fa żi wieqfa jew Ċelloli li qed 
jikbru, komposizzjoniiet tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l- inkubazzjoni, is-sistema g ħall-attivazzjoni metabolika;
 
— il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-livelli ta’ l-espo żizzjoni, il- 
proċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura tat-trattament, 
kontrolli po żittivi u negattivi;  
— in-numru ta’ kolonji mg ħadda, in-numru ta’ mutanti, is- 
sopravivenza u l-frekenza tal-mutanti, ir-relazzjoni do ża/risposta 
fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTIKA- SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI TAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Ir-rikombinazzjoni mitotika fis- Saccharomyces cerevisiae  tistà tkun 
osservata bejn il- ġeni (jew b’mod iktar ġenerali bejn ġene u ċ- 
ċentromeru tag ħha) u ġewwa l-ġeni. L-ewwel ka ż jissejjaħ il-qsim 
mitotiku u ji ġġenera prodotti re ċiproki filwat li t-tieni ka ż iktar spiss 
ma jkunx re ċiproku u jissejja ħ il-konversjoni tal- ġeni. Il-qsim huwa 
ġeneralment analizzat permezz tal-produzzjoni ta’ kolonji jew setturi 
omozigoti re ċessivi prodotti f’razza eterozigota, filwaq li l- 
konversjoni tal- ġeni hija analizzata permezz tal-produzzjoni ta’ 
revertants protorofi ċi prodotti f’razza eteroallelika auxotrophic li 
tkun qed i ġġorr żewġ alleli difettivi differenti ta’ l-istess ġene. Ir- 
razez li jintu żaw l-iktar spiss g ħall-iskoperta tal-konversjoni mitotika 
tal-ġeni huma D  4 (eteroalleliku f’ ade 2 u  trp 5) D  7 (eteroalleliku 
f’trp 5) BZ  34 (eteroalleliku f’ arg 4) u JD1 (eteroalleliku f’ his 4 u  
trp 5). Il-qsim mitotiku li jipprodu ċi setturi omozigoti ħomor u ro ża 
jistgħu ikunu analizzati f’D  5 jew D  7 (li jikkalkula ukoll il- 
konversjoni mitotika tal- ġeni u t-tibdil b’lura f’ ilv 1-92) fejn i ż- 
żewġ razez huma eteroalleli ċi għax jikkumplimentaw alleli ta’  ade 2. 
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
It-taħlitiet tal-kimi ċi tat-test u l-komposti g ħal-kontroll u g ħar- 
referenza g ħandhom ikunu ppreparati e żatt qabel l-ittestjar, bl-u żu 
ta’ vettura xierqa. Fil-ka ż ta’ komposti organi ċi li ma jin ħallux fl- 
ilma, m’g ħandhiex tintu ża iktar minn ta ħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi 
organiċi bħall-etanol, l-a ċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il- 
konċentrazzjoni finali tal-vettura m’g ħandhiex taffettwa b’mod sini ­
fikanti il-vijabilità ta ċ-ċelluli u l-karatteristi ċi tat-tkabbir.  
A t t i v a z z j o n i M e t a b o l i k a  
Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti g ħall-kimiċi tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika 
esoġena xierqa. Is-sistema li tintu ża l-iktar spiss hija frazzjoni post- 
mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali gerriema trattati minn qabel b’a ġenti li jikka ġunaw l-enzimi. L-u żu 
ta’ speċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew pro ċeduri 
oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa g ħall-attivazzjoni metabolika.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Kundizzjonijiet g ħat-test  
R a z e z u ż a t i g ħ a t - t e s t  
Ir-razez u żati l-iktar spiss huma d-diplojdi D  4 , D 5 , D 7 u JD1. L-u żu 
ta’ razez o ħrajn jista’ jkun xieraq.  
M e z z i  
Mezzi xierqa tal-kultura huma u żati għad-determinazzjoni tas- 
sopravivenza u tal-frekwenza tar-rikombinazzjoni mitotika.  
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Kontrolli tas-solventi, po żittivi, li m’humiex trattati g ħandhom isiru 
fl-istess ħin. Kimiċi xierqa g ħall-kontroll po żittiv għandhom jintu żaw 
għal kull tarf spe ċifiku tar-rikombinazzjoni.  
I l - k o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a ’ l - e s p o ż i z z j o n i  
Għall-inqas ħames kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin 
b’mod adegwat g ħandhom jintu żaw. Fost il-fatturi li g ħandu jittie ħed 
qies tagħhom hemm i ċ-ċitotossiċità u s-solubilità. Il-kon ċentrazzjoni 
l-iktar baxxa m’g ħandha jkollha l-ebda effett fuq il-vijabilità ta ċ- 
ċelluli. G ħal kimiċi tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni ttestjata 
m’għandhiex tnaqqas is-sopravivenza g ħal inqas minn 5 % sa 
10 %. Kimi ċi li relattivament ma jin ħallux fl-ilma g ħandhom ikunu 
ttestjati sal-limitu tas-solubilità tag ħhom, bl-u żu ta’ proċeduri xierqa. 
Għal sustanzi li jin ħallu b’mod fa ċli fl-ilma u li m’humiex tossi ċi, l- 
ogħla konċentrazzjoni g ħandha tkun determinata skond il-ka ż. 
Iċ-Ċelloli jistg ħu ikunu esposti g ħall-kimiċi tat-test jew fil-fa żi 
wieqfa tag ħhom jew waqt li jkunu qed jikbru g ħal perjodi ta’ ħin 
sa 18-il sieg ħa. Madankollu, g ħal ħinijiet twal ta’ trattament il-kulturi 
għandhom ikunu spezzjonati b’mikroskopju g ħal formazzjonijiet ta’ 
spori, li l-pre żenza tagħhom twassal g ħall-invalidità tat-test.  
K u n d i z z j o n i j i e t g ħ a l l - i n k u b a z z j o n i  
Il-platti huma inkubati fid-dlam g ħal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 
30 o C. Il-platti u żati għal setturi omo żigoti ħomor u ro ża li huma 
prodotti permezz tal-qsim mitotiku g ħandhom jin żammu f’refri ġe­
rejter (madwar 4  o C) għal ġurnata jew tnejn iktar qabel ma ji ġu 
eżaminati jit ħallew jiżviluppaw il-kolonji ippigmentati adegwati.  
F r e k w e n z i t a ’ r i k o m b i n a z z j o n i m i t o t i k a 
s p o n t a n j a  
Għandhom jintu żaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil ta’ rikombi ­
nazzjonijiet mitoti ċi spontanji ġewwa l-medda normali a ċċettata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
N u m r u t a ’ r e p l i k i  
Għandhom jintu żaw għall-inqas tliet repliki tal-platti g ħal kull kon ċ­
entrazzjoni g ħall-analiżi tal-prototrophs li jin ħalqu bil-konversjoni 
tal-ġeni mitoti ċi u għall-vijabilità. Fil-ka ż ta’ l-anali żi ta’ l- 
omozigosi re ċessiva prodotta bil-qsim mitotiku, in-numru ta’ platti 
għandu jiżdied biex ikun provvdut numru adegwat ta’ kolonji  
Il-Proċeduri  
It-trattament tar-razez  S. cerevisiae  isir normalment bil-pro ċedura ta’ 
test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti 
inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 × 10  7 Ċelloli/ml 
huma esposti g ħall-kimika tat-test g ħal perjodu ta’ ħin sa 18-il sieg ħa 
f’temperatura ta’ 28-37  o C biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema 
ta’ attivazzjoni metabolika huwa mi żjud waqt it-trattament meta 
xieraq.  
Fl-aħħar tat-trattament, i ċ-ċelluli huma ċentrifugati, ma ħsulin u 
miżrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, il-platti 
jiġu eżaminati g ħas-sopravivenza u g ħall-ikkaġunar tar-rikombi ­
nazzjoni mitotika.  
Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, g ħandu jsir esperiment ie ħor 
bl-użu ta’ Ċelloli fil-fa żi wieqfa. Jekk l-ewwel esperiment huwa 
pożittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indipendenti.  
2. ID-DATA  
Id-data għandha tkun ippre żentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in- 
numru ta’ kolonji mg ħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is- 
sopravivenza u l-frekwenza tar-rikombinanti.  
Ir-riżultati għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti.  
Id-data għandha tkun evalwata bl-u żu ta’ metodi statisti ċi xierqa.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
li ġejja: 
— ir-razza u żata; 
— il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fa żi wieqfa jew Ċelloli li qed 
jikbru, komposizzjoni tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l-inku ­
bazzjoni, is-sistema g ħall-attivazzjoni metabolika;  
— il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-kon ċentrazzjoni ta’ l- 
espożizzjoni, il-pro ċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura 
tat-trattament, kontrolli po żittivi u negattivi;  
— in-numru ta’ kolonji mg ħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is- 
sopravivenza u l-frekwenza tal-mutanti, ir-relazzjoni do ża/­
risposta fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTA ĠENEĊITÀ –TEST TAL-MUTAZZJONI TAL- 
ĠENETAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI  IN VITRO  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG 476, Test tal-Mutazzjoni 
tal-Ġene taċ-Ċellula tal-Mammiferi  In vitro  (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
It-test tal-mutazzjoni tal- ġene taċ-ċellula tal-mammiferi  in vitro  jista’ 
jintuża biex ji ġu żvelati mutazzjonijiet tal- ġene miġjuba minn 
sustanzi kimi ċi. Il-linji ta' Ċelloli xierqa jinkludu L5178Y Ċelloli 
mouse lymphoma, il-linji CHO, CHO-AS52 u V79 ta' ċelluli ta' 
Chinese hamster, u ċ-Ċelloli umani lymphoblastoid TK6 (1). 
F'dawn il-linji ta' Ċelloli l-punti tat-truf ġenetiċi li l-aktar jintu żaw 
ikejlu l-mutazzjoni fi thymidine kinase (TK) u hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), u trans ġene ta' xanthine-guanine 
phosphoribosyl transferase (XPRT). It-testijiet ta' mutazzjoni TK, 
HPRT u XPRT ji żvelaw dehriet differenti ta' ġrajjiet ġenetiċi. Il- 
lok awtosomali ta' l-TK u l-XPRT jista’ jippermetti l-i żvelar ta' 
ċerti ġrajjiet ġenetiċi (eż. ħafna tħassir) li mhumiex żvelati fil-locus 
HPRT locus fuq kromo żomi X (2)(3)(4)(5)(6).
 
Fit-test tal-mutazzjoni tal- ġene taċ-ċellula tal-mammiferi  in vitro , 
jistgħu jintużaw kulturi ta' linji ta' Ċelloli jew karatteristi ċi ta' Ċelloli. 
Iċ-Ċelloli li jintu żaw jingħażlu fuq il-ba żi tal-kapaċità tagħhom li jiżvi­
luppaw f'kultura u l-istabbilità fil-frekwenza ta' mutazzjoni spontanea.  
Ġeneralment it-testijiet imwettqa  in vitro  jeħtieġu l-użu ta' għejun 
esoġeneu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni 
metabolika ma tista’x tikkopja kompletament il-kundizzjonijiet  in 
vivo fil-mammiferi. Wie ħed għandu jevita kundizzjonijiet li jistg ħu 
jwasslu g ħal riżultati li ma jirriflettux muta ġeneċità intrinsika. Jista’ 
jkun hemm ri żultati posittivi li ma jirriflettux muta ġeneċità intrinsika 
minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli g ħolja ta' ċitotossiċità (7).  
Dan it-test jintu ża biex tiġi individwata l-possibbiltà ta' muta ġeni u 
karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma posittivi f'dan it- 
test huma kar ċinoġeni fil-mammiferi; madankollu, m'hemmx korre ­
lazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-kar ċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni 
tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm evidenza dejjem ti żdied li 
jeżistu karċinoġeni li ma ji ġux żvelati b'dan it-test g ħax jidhru li 
jaġixxu permezz ta' mekkani żmi oħra mhux ġenotossiċi jew 
mekkaniżmi li ma je żistux f'Ċelloli batteri ċi (6).  
Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B:  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Mutazzjoni 'l quddiem:  mutazzjoni tal- ġene mit-tip parental ital- 
forma mutanti li to ħloq alterazzjoni jew telf ta' l-attività en żimatika 
tal-funzjoni tal-proteina kodifikata.  
Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni tal-koppji tal-ba żi: sustanzi li 
jikkawżaw is-sostituzzjoni ta' koppji tal-ba żi waħda jew aktar fid- 
DNA.  
Mutaġeni li j ġibu l-mutazzjoni tal-fa żi tal-qari:  sustanzi li 
jikkawżaw iż-żieda jew itt ħassir ta' pari ta' ba żi waħda jew 
multipli fil-molekula tad-DNA.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Ħin ta' espressjoni fenotipika:  perjodu li fih prodotti ta' ġene mhux 
mibdula jitne ħħew mill-g ħadd ta' Ċelloli vijabbli.  
Frekwenza mutanti:  l-għadd ta' Ċelloli mutanti osservati divi żi bl- 
għadd ta' Ċelloli vijabbli.  
Żvilupp totali relattiv:  żieda fl-g ħadd taċ-Ċelloli tul i ż-żmien 
komparata ma' popolazzjoni ta' Ċelloli ta' kontroll; kalkolat b ħala 
l-prodott ta' l-i żvilupp tas-sospensjoni relattiv g ħaż-żminijiet ta' 
kontroll negattiv g ħall-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva g ħall- 
kontroll negattiv.  
Żvilupp tas-sospensjoni relattiv:  żieda fl-għadd taċ-Ċelloli tul il- 
perjodu ta' espressjoni relattiv g ħall-kontroll negattiv.  
Vijabilità:  l-effiċjenza tal-klonazzjoni ta ċ-ċelluli trattati fil- ħin ta' 
meta jitqieg ħdu fuq ba żi f'kundizzjonijiet selettivi wara l-perjodu 
ta' espressjoni.  
Sopravivenza:  l-effiċjenza tal-klonazzjoni ta ċ-Ċelloli trattati meta 
jitqiegħdu fuq ba żi wara li jintemm il-perjodu ta' trattament; 
ġeneralment is-sopravivenza hija espresso paragunata mas- 
sopravivenza tal-popolazzjoni ta ċ-Ċelloli ta' kontroll.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Iċ-Ċelloli li g ħandhom nuqqas ta' thymidine kinase (TK) min ħabba 
fil-mutazzjoni TK+/- > TK-/- huma re żistenti għall-effetti ċitotossiċi 
tal-pyrimidine analogue trifluorothymidine (TFT). I ċ-ċelluli 
profiċenti tat-Thymidine kinase huma sensittivi g ħat-TFT, li jo ħloq 
l-inibizzjoni tal-metaboli żmu ċellulari u jwaqqaf aktar divi żjoni fiċ- 
Ċelloli. B'hekk Ċelloli mutanti jistg ħu jipproliferaw fil-presenza tat- 
TFT, waqt li Ċelloli normali, li jkun fihom it-thymidine kinase, ma 
jistgħux. Bl-istess mod, Ċelloli li g ħandhom nuqqas ta' HPRT jew 
XPRT jing ħażlu skond ir-re żistenza għal 6-thioguanine (TG) jew 8- 
azaguanine (AG). Il-karatteristi ċi tas-sustanza tat-test g ħandhom ji ġu 
meqjusa sew jekk ji ġi ttestjat analogu tal-ba żi jew compost relatat 
ma' l-aġent selettiv f'xi wie ħed mit-testijiet tal-mutazzjoni tal- ġene 
taċ-ċellula fil-mammiferi. B ħala eżempju, g ħandha tiġi investigata 
kull tossi ċità selettiva suspettata bis-sustanza tat-test g ħal ċelluli 
mutanti u mhux mutanti. G ħalhekk, il-prestazzjoni tas-sistema/a ġent 
tas-selezzjoni g ħandha tiġi konfermata meta ji ġu ttestjati kimi ċi li 
huma strutturalment relatati ma' l-a ġent selettiv (8).  
Iċ-Ċelloli f'sospensjoni jew kultura monostrata huma esposti g ħas- 
sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll ming ­ 
ħajrha, gġal perjodu ta' żmien xieraq u subkulturati biex jippermettu 
l-espressjoni fenotipika qwabel is-selezzjoni mutanti (9) (10) (11) 
(12) (13). Normalment i ċ-ċitossiċità tiġi stabbilita billi titkejjel l- 
effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-i żvilupp 
totali relattiv tal-kulturi wara l-perjodu ta' trattament. Il-kulturi 
ttrattati jin żammu f'medjum ta' żvilupp għal perjodu ta' żmien suffi ċ­
jenti, karatteristiku ta' kull locus mag ħżul u tip ta' ċellula, biex 
jippermetti l-espressjoni fenotipika kwa żi ottimali tal-mutazzjonijiet 
magħmula. Il-frekwenza mutanti ti ġi stabbilita bl-inseminazzjoni ta; 
għadd magħruf ta' Ċelloli f'medjum li jkun fih l-a ġent selettiv biex 
jiġu żvelati Ċelloli mutanti u f'medjum ming ħajr aġent selettiv biex 
tiġi żvelata l-effi ċjenza tal-klonazzjoni (vijabilità). Wara perjodu 
xieraq ta' inkubazzjoni, jing ħaddu l-kolonji. Il-frekwenza mutanti hi 
derivate mill-g ħadd ta' kolonji mutanti f'medjum selettiv u l-g ħadd ta' 
kolonji f'medjum mhux selettiv.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Ċelloli  
Hemm varjetà ta' Ċelloli disponibbli g ħall-użu għal dan it-test inklu żi 
subkloni ta' Ċelloli ta' L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 jew TK6. It- 
tipi ta' Ċelloli użati f'dan it-test g ħandhom ikunu ddimostraw sensi ­
tività għal mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta' klonazzjoni u 
frekwenza mutanti spontanea stabbli. I ċ-Ċelloli għandhom ji ġu 
kontrollati g ħal kontaminazzjoni mill-mikoplasma u m'g ħandhomx 
jintużaw jekk ikunu kontaminati.  
It-test għandu jkun iddisinjat biex ikollu sensitività u qawwa preder ­
terminata. L-g ħadd ta' ċelluli, kulturi u kon ċentrazzjonijiet tas- 
sustanza tat-test u żati għandhom jirriflettu dawn il-parametri 
definiti (14). L-g ħadd minimu ta' Ċelloli vijabbli li jinqg ħu ħajjin 
wara it-trattament u li jintu żaw f'kull stadju tat-test g ħandu jkun 
msejjes fuq il-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Gwida ġenerali 
hija li jintu ża għadd ta' Ċelloli li hu g ħall-inqas 10 darbiet l-invers 
tal-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Madankollu, huwa 
rakkomandat li ji ġu utilizzati g ħall-inqas 106 Ċelloli. Informazzjoni 
storika xierqa dwar is-sistema ta ċ-ċellula użata għandha tkun 
disponibbli biex tindika l-prestazzjoni konsistenti tat-test.  
1.4.1.2.  Postijiet u kundizzjonijiet tal-kulturi  
Għandhom jintu żaw postijiet tal-kulturi xierqa, u kundizzjonijiet ta' 
inkubazzjoni (kontenituri tal-kulturi, temperatura, kon ċentrazzjoni ta' 
CO 2 u umdità). Il-postijiet g ħandhom jing ħażlu skond is-sistemi 
selettivi u t-tip ta' ċellula użati f'dan it-test. Huwa partikolarment 
importanti li l-kundizzjonijiet tal-kulturi jing ħażlu hekk li ji żguraw 
l-iżvilupp ottimali ta ċ-Ċelloli waqt il-perjodu ta' espressjoni u l- 
kapaċità tal-formazzjoni ta' kolonji ta' kemm i ċ-ċelluli mutanti kif 
ukoll dawk mhux mutanti.  
1.4.1.3.  Preparazzjoni tal-kulturi  
Iċ-Ċelloli huma propagati minn ħażniet ta' kulturi, inseminati 
f'medjum ta' kultura u inkubati f'temperatura ta' 37  o C. Qabel ma 
jintużaw f'dan it-test, il-kulturi g ħandhom jitnaddfu minn Ċelloli 
mutanti pre-e żistenti.  
1.4.1.4.  Attivazzjoni metabolika  
Iċ-ċelluli għandhom ji ġu esposti g ħas-sustanza tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika 
xierqa. Is-sistema l-aktar u żata hija frazzjoni post mitokondrijali 
supplimentata b'kofattur (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'a ġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroklor 
1254 (15) (16) (17) (18) jew ta ħlita ta' phenobarbitone u β-naph­
thoflavone (19) (20).
 
Normalment il-frazzjon post mitokondrijali tintu ża f'konċen­
trazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medjum finali tat-test. L-għażla u l-kundizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika 
tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tkun qed ti ġi ttestjata. 
F'ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li ti ġi utilizzata iktar minn kon ċen­
trazzjoni wa ħda tal-frazzjon post mitokondrijali.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Numru ta' żviluppi, inklu ża l-kostruzzjoni ta' linji ta' Ċelloli ta' in ġinerija 
ġenetika li jesprimu en żimi ta' attivazzjoni spe ċifika, jistg ħu jipprovdu l- 
potenzal g ħall-attivazzjoni endo ġenea. L-għażla tal-linji ta ċ-Ċelloli użati 
għandha tkun ġustifikata xjentifikament (e ż. bir-rilevanza ta' l-isoen żim 
ċitokromu P450 g ħall-metaboli żmu tas-sustanza tat-test).  
1.4.1.5.  Preparazzjoni tas-sustanza tat-test  
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewba jew sospi żi f'solventi 
jew mezzi xierqa u dilwiti jekk ikun xieraq qabel it-trattament ta ċ- 
Ċelloli. Sustanzi tat-test likwidi jistg ġu jiżdiedu direttament mas- 
sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda tas-sustanza tat-test sakemm l- 
informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-a ċċettabbilità tal- ħażna. 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Ma għandux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/ ­
mezz mas-sustanza tat-test u s-solvent/mezz g ħandu jkun kompa ­
tibbli mas-sopravivenza ta ċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk jintu żaw 
solventi/mezzi o ħra magħrufa, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun 
sostnuta b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tag ħhom. Huwa 
rakkomandat li kull fejn ikun possibbli l-ewwel ji ġi kkunsidrat l- 
użu ta' solvent/mezz akkwu ż. Meta ji ġu testjati sustanzi li 
mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organi ċi li jintu żaw ma 
għandhux ikollhom ilma. L-ilma jista’ jitne ħħa billi ji żdied 
passatur molekulari.  
1.4.2.2.  Konċentrazzjonijiet ta' espo żizzjoni  
Fost il-kriterji li g ħandhom jitqiesu biex ti ġi stabbilita l-og ħla konċ­
entrazzjoni hemm i ċ-ċitossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u 
bidliet fil-pH jew osmolalità.  
Iċ-ċitossiċita għandha tiġi stabbilita bl-attività metabolika jew ming ­ 
ħajrha fl-esperiment prin ċipali bl-u żu ta' indikazzjoni xierqa ta' 
integrità u żvilupp ta ċ-Ċelloli, bħal ma huma l-effi ċjenza tal-klon ­
azzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-i żvilupp totali relattiv. Jista’ 
jkun utli li ji ġu determinati ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment 
preliminari.  
Għandhom jintu żaw għall-inqas erba' kon ċentrazzjonijiet analiz ­
zabbli. Fejn ikun hemm i ċ-ċitossiċità, dawn il-kon ċentrazzjonijiet 
għandhom ikopru medda mill-massimu g ħal ftit jew l-ebda ċitos­
siċità. Dan normalment ifisser li l-livelli ta' ċitossiċità għandhom 
jiġu separati b'mhux i żjed minn fattur bejn 2 u √10. Jekk il-kon ċen­
trazzjoni massima hi msejsa fuq i ċ-ċitossiċità allura g ħandha 
tirriżulta f'madwar 10-20 % (i żda mhux inqas minn 10 %) 
sopravivenza relattiva (effi ċjenza ta' klonazzjoni relattiva) jew 
żvilupp totali relattiv. G ħal sustanzi relattivament mhux tossi ċi, il- 
konċentrazzjoni massima tat-test g ħandha tkun 5 mg/ml, 5 μl/ml, jew 
1,01 M, liema minnhom ikun l-anqas.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Sustanzi relattivament mhux solubbli g ħandhom ji ġu ttestjati sa jew 
lil hinn mil-limitu tag ħhom ta' solubilità ta ħt kundizzjonijiet ta' 
kulturi. Il-prova tas-solubbilità g ħandha tiġi stabbilita fil-medjum 
tat-trattament finali li g ħalih huma esposti ċ-Ċelloli. Jista’ jkun utli 
li tiġi valutata s-solubilità fil-bidu u fl-a ħħar tat-trattament, g ħax is- 
solubilità tista’ tinbidel waqt il-kors ta' l-espo żizzjoni fis-sistema tat- 
test minħabba fil-pre żenza ta' Ċelloli, S9, serum e ċċ. L-insolublità 
tista’ tiġi żvelata ming ħajr għajnuna lill-g ħajn. Il-pre ċipitat 
m'għandux jostakola l-g ħadd. 
1.4.2.3.  Kontrolli  
Għandhom ji ġu inklużi f'kull esperiment kontrolli posittivi u 
negattivi fl-istess ħin (solvent jew mezz), kemm bl-attivazzjoni meta ­
bolika kif ukoll ming ħajrha. Meta tintu ża l-attivazzjoni metabolika, 
il-kimika ta' kontroll posittiva g ħandha tkun dik li-te ħtieġ li l- 
attivazzjoni tag ħti rispons muta ġeniku.  
Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll posittiv jinkludu:  
Kondizzjoni ta' 
attivazzjoni meta ­
bolika Post Sustanza Nru CAS Nru EINECS  
Assenza ta' 
attivazzjoni meta ­
bolika esso ġenea HPRT Metansulfonat ta' l-etil 62-50-0 200-536-7 
Ethyl nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (kolonji 
żgħar u kbar) Methyl methanesulphonate 66-27-3 200-625-0 
XPRT Etil methanesulphonate 62-50-0 200-536-7 
Nitrosourea ta' l-etil 759-73-9 212-072-2 
Preżenza ta' 
attivazzjoni meta ­
bolika esso ġenea HPRT 3-Methylcholanthrene 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimethylbenzanthracen e 57-97-6 200-359-5 
TK (kolonji 
żgħar u kbar) Cyclophosphamide 50-18-0 200-015-4 
Cyclophosphamide monohydrate 6055-19-2 Benżo(a)pirena 50-32-8 200-028-5 
3-Metilkolantrena 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodimethylamine (g ħal 
livelli għoljin ta' S-9) 62-75-9 200-549-8 
Benżo(a)pirena 50-32-8 200-028-5
 
Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll posittiv o ħra 
xierqa, eż. jekk laboratorju jkollu ba żi ta' informazzjoni storika fuq 
5-bromo 2'-deoxyuridine (Nru CAS 59-14-3, Nru EINECS 200-415- 9), tista’ tintu ża ukoll din is-sustanza ta' referenza. Meta jkunu 
disponibbli, g ħandu jiġi kkunsidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll 
posittiv relatat ma' klassi ta' kimika.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Għandhom ji ġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss 
f'solvent jew mezz fil-medjum ta' trattament, u trattati bl-istess 
mod bħall-gruppi ta' trattament. B' żieda ma' dan g ħandhom 
jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm l-informazzjoni 
storika ta' kontroll turi li ma jkunx hemm effetti dannu żi jew 
mutaġeniċi kkaużati mis-solvent mag ħżul. 
1.4.3.  Pro ċedura  
1.4.3.1.  Trattament bis-sustanza tat-test  
Iċ-Ċelloli li jipproliferaw g ħandhom ji ġu esposti g ħas-sustanza tat- 
test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll ming ħajrha. L- 
espożizzjoni g ħandha tkun g ħal perjodu xieraq ta' żmien (norm ­
alment 3-6 sig ħat hu effettiv). Il- ħin ta' l-espo żizzjoni jista’ 
jittawwal fuq ċiklu ta' Ċelloli wie ħed jew aktar.  
Jistgħu jintużaw kulturi ttrattati duplikati jew singoli ma' kull kon ċ­
entrazzjoni ttestjata. Meta jintu żaw kulturi singoli, l-g ħadd ta' kon ċ­
entrazzjonijiet g ħandu jiżdied biex ji ġi żgurat li jkun hemm numru 
adegwat ta' kulturi g ħall-analiżi (eż. għall-inqas tmien kon ċen­
trazzjonijiet analizzabbli). G ħandhom jintu żaw kulturi ta' kontroll 
negattivi duplikati (solvent).  
Sustanzi gassu żi jew volatili g ħandhom ji ġu ttestjati b'metodi xierqa, 
bħal ma huma f'kontenituri mag ħluqa ta' kulturi (21) (22).  
1.4.3.2.  Tkejjil ta' sopravivanza, vijabbilità u frekwenza tal-mutazzjonijiet  
Fl-aħħar tal-perjodu ta' espo żizzjoni, iċ-ċelluli jinħaslu u jitqieg ħdu 
f'kulturi biex ti ġi determinata s-sopravivenza u biex jippermettu l- 
espressjoni tal-fenotip mutanti. It-tkejjil ta ċ-ċitossiċità billi ti ġi deter­
minata l-effi ċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l- 
iżvilupp totali relattiv tal-kulturi normalment jinbeda wara l- 
perjodu ta' trattament.  
Kull locus g ħandu ħtieġa ta' żmien minimu definit biex jippermetti l- 
espressjoni fenotipika kwa żi ottimali tal-mutanti ġodda li jkunu 
nħolqu (HPRT u XPRT je ħtieġu għall-inqas 6-8 ijiem, u TK g ħall- 
inqas jumejn). I ċ-Ċelloli jitkabbru f'medjum b'a ġent(i) selettiv(i) jew 
mingħajru(hom) g ħad-determinazzjoni ta' l-g ħadd ta' mutanti u l- 
effiċjenza tal-klonazzjoni, rispettivament. It-tkejjil tal-vijabilità (li 
jintuża biex ti ġi kalkolata l-frekenza tal-mutazzjonijiet) jinbeda fl- 
aħħar tal-perjodu ta' espressjoni billi jitqieg ħdu fuq ba żi fil-medjum 
mhux selettiv.  
Jekk is-sustanza tat-test tkun posittiva fit-test tal-L5178Y TK+/-, il- 
qies tal-kolonji g ħandu jiġi rilevat fuq g ħall-inqas wa ħda mill-kulturi 
tat-test (l-og ħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontrolli negattivi 
u posittivi. Jekk is-sustanza tat-test hi negattiva fit-test L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji g ħandu jiġi rilevat fuq il-kontrolli 
negattivi u posittivi. Fi studji li ju żaw il-TK6TK+/-, g ħandu 
jitwettaq ukoll il-qies tal-kolonji.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-informazzjoni g ħandha tinkludi d-determinazzjoni ta ċ-ċitossiċità u 
l-vijabilità, l-g ħadd ta' kolonji, u l-frekwenzi ta' mutazzjonijiet g ħall- 
kulturi ta' trattament u ta' kontroll. Fil-ka ż ta' rispons posittiv fit-test 
tal-L5178Y TK+/-, il-kolonji jing ħaddu billi jintu ża l-kriterju ta' 
kolonji żgħar u kbar f'g ħall-inqas kon ċentrazzjoni wa ħda tas- 
sustanza tat-test (l-og ħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontroll 
negattiv u posittiv. In-natura molekulari u ċitoġenetika ta' kolonji ta' 
mutazzjonijiet kemm kbar kif ukoll żgħar ġiet esplorata fid-dettall 
(23) (24). Fit-test tat-TK+/-, il-kolonji jing ħaddu billi jintu ża l- 
kriterju ta' tkabbir normali (kbar) u tkabbir bil-mod ( żgħar) ta' 
kolonji. (25). I ċ-Ċelloli ta' mutazzjoni li jkunu sofrew l-aktar ħsara 
ġenetika estensiva g ħandhom żminijiet ta' duplikazzjoni aktar 
prolongati u g ħalhekk jiffurmaw kolonji żgħar. Din il- ħsara tipi­
kament tinfirex fl-iskala mit-telf tal- ġene intier g ħal devjazzjonijiet 
viżibbli karjotipikament tal-kromo żomi. Il-presenza ta' kolonji żgħar 
mutanti ġiet assoċjata ma' kimi ċi li jipprodu ċu alterazzjonijiet kbar 
fil-kromo żomi (26). Ċelloli mutanti li jkunu ġew affettwati anqas 
serjament jikbru b'rati simili g ħal dawk ta' Ċelloli parentali u 
jifformaw kolonji kbar.  
Għandu jing ħata l-ammont ta' sopravivenza (effi ċjenzi ta' klonazzjoni 
relattivi) jew l-i żvilupp totali relattiv. Il-frekwenza tal-mutazzjoni 
għandha tiġi espressa b ħala n-numru ta' ċelluli mutanti paragunat 
man-numru ta' Ċelloli li jibqg ħu ħajjin.  
Għandha ting ħata l-informazzjoni dwar il-kulturi differenti. B' żieda 
ma' dan, g ħandu jing ħata sommarju ta' l-informazzjoni kollha fil- 
forma ta' tabella.  
Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv ċar. Ir- 
riżultati dubbju żi għandhom ji ġu ċċarati bżaktar testijiet preferib ­
bilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi g ħandhom ji ġu konfermati fuq ba żi ta' każ b'każ. 
F'dawk ilka żijiet fejn il-konferma ta' ri żultati negattivi mhijiex kkun ­
sidrata bħala meħtieġa, għandha ting ħata ġustifikazzjoni. G ħandha 
tiġi kkunsidrata l-modifika tal-parametri ta' studju biex tkabbar il- 
medda tal-kundizzjonijiet valutati f'esperimenti li jsiru wara minħabba f'riżultati dubbju żi jew negattivi. Parametri ta' studju li 
jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-intervall bejn id-do żi valutati u l- 
kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.
 
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Hemm ħafna kriterji biex ji ġi stabbilit risultat posittiv, b ħal żieda 
relatata mal-kon ċentrazzjoni jew żieda riprodu ċibbli fil-frekwenza 
ta' mutazzjonijiet. L-ewwel g ħandha titqies ir-rilevanza bijolo ġika 
tar-risultati. Jistg ħu jintużaw metodi ta' statistika b ħala għajnuna 
fil-valutazzjoni tar-risultati tat-test. Is-sinjifikanza statistika ma 
għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti g ħal rispons posittiv.  
Sustanza ta' test li dwarha ir-risultati ma jil ħqux l-kriterji fuq 
imsemmija hija meqjusa b ħala mhux muta ġenika f'din is-sistema.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Għalkemm il-bi ċċa l-kbira ta' l-istudji jag ħtu risultati ċari posittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni mog ħtija ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir- 
risultati jistg ħu jibqgħu dubbju żi jew mhux ċari minkejja n-numru 
ta' drabi li ji ġi ripetut l-esperiment.  
Risultati posittivi mit-test tal-mutazzjoni tal- ġene taċ-ċellula tal- 
mammiferi  in vitro  jindikaw li s-sustanza tat-test to ħloq 
mutazzjonijiet tal- ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi u żati. 
Rispons popsittiv dwar il-kon ċentrazzjoni li huwa riprodu ċibbli 
huwa ta' valur kbir. Risultati negattivi jindikaw li, ta ħt il- 
kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma to ħloqx mutazzjonijiet 
tal-ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi u żati. 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Ċelloli:  
— tip u g ħejun taċ-Ċelloli;  
— numru ta' kulturi ta ċ-Ċelloli;  
— numru ta' passa ġġi, jekk ikun applikabbli;  
— metodi g ħall-manutenzjoni tal-kulturi ta ċ-Ċelloli, jekk jkun 
applikabbli;  
— assenza tal-mikoplasma.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— raġuni prinċipali għall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet u g ħadd ta' 
kulturi inklu żi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limi ­
tazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;  
— komposizzjoni tal-medja, kon ċentrazzjoni CO  2 ; 
— konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— volum tal-mezz u sustanza tat-test mi żjuda;  
— temperatura ta' l-inkubazzjoni;  
— perjodu ta' inkubazzjoni;  
— kemm idum it-trattament;  
— densità ta ċ-ċellula waqt it-trattament;  
— tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, 
inklużi krierji ta' a ċċettabilità;  
— kontrolli po żittivi u negattivi;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— tul tal-perjodu ta' espressjoni (inklu ż in-numru ta' ċelluli fiż- 
żriegħ, u skedi ta' subkulturi u alimentazzjoni, jekk ikun xieraq);  
— aġenti selettivi;  
— kriterji biex it-testijiet jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi; 
— metodi u żati biex jing ħadd in-numru ta' Ċelloli viabbli u mutanti;  
— definizzjoni ta' kolonji li dwarhom jitqiesu l-qies u t-tip (inklu żi 
kriterji għal kolonji “ żgħar” u “kbar”, kif xieraq).  
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— sinjali ta' pre ċipitazzjoni;  
— informazzjoni dwar pH u l-osmolalità waqt l-espo żizzjoni għas- 
sustanza tat-test, jekk ikun stabbilit;  
— qies tal-kolonja jekk re ġistrat għall-inqas g ħall-kontrolli negattivi 
u posittivi;  
— adegwatezza tal-laboratorju biex ji ġu żvelati mutazzjonijiet 
f'kolonji żgħar bis sistema L5178Y TK+/-, fejn ikun xieraq;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) 
u pożittiv;  
— informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u 
pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;  
— frekwenza ta' mutazzjonijiet.  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindal, 
K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell 
Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E.H.Y. and Malling H.V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, pp. 1306-1312.  
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, 
Mutation Res. 94, pp. 467-485.  
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 
394-403.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C.S., and Stankowski, Jr. L.F., (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128.  
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr. L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standard ­
isation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, 
pp. 235-239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and 
Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in 
L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental 
Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase 
System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.
 
(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. 
F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phos ­
phoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.
 
(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A 
Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT 
Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences 
are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.
 
(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosul ­
phonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl 
Methanosulphonate – and ICR 191 Induced Mutation in AS52 
Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.  
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure 
for the L5178Y/TK+/- -TK+/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of 
Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, 
New York, pp. 239-268.  
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, 
Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101.
 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373.
 
(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, 
pp. 347-364.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108.
 
(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173- 
215. 
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in:  In vitro  Genot­
oxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177.
 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in:  In vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. 
J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), 
Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, 
Plenum, pp. 91-103.
 
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Muta ­
genesis, 5, pp. 795-801.  
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. 
and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at 
the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse 
Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.  
(24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Triflu ­
oronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- – 
Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.  
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 
89-102.
 
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DANNI URIMEDJITAD-DNA -SINTESI MHUX FL- 
ISKEDATAD-DNA- ĊELLULI MAMMIFERI  IN VITRO  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
It-test tas-Sintesi tad-DNA li mhux fl-iskeda (UDS) ikejjel is-sintesi 
tar-rimedju tad-DNA wara l-qtug ħ u t-tneħħija ta’ ġibda ta’ DNA li 
jkun fiha r-re ġjun ta’ dannu kka ġunat minn a ġenti kimiċi u fiżiċi. It- 
test huwa bba żat fuq l-inkorporazzjoni ta’ tritju mmarkat thymidine  
3 H-TdR) fid-DNA ta’ Ċelloli mammiferi li m’humhiex fil-fa żi S taċ- 
ċiklu taċ-ċellula. It-te ħid ta’  3 H-TdR jista’ jkun determinat bl-awtor ­
adjografija jew bix-xintillar likwidu bl-g ħadd (LSC) tad-DNA mi ċ- 
Ċelloli trattati. Ċelluli mammiferi fil-koltura, jekk ma jintu żawx 
hepatocytes primarji tal- ġrieden huma trattati bl-a ġent tat-test bis- 
sistema u mig ħajr is-sistema eso ġena għall-attivazzjoni metabolika. 
UDS jista’ jitkejjel ukoll f’sistemi  in vivo . 
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Il-kimiċi tat-test u s-sustanzi g ħall-kontoll u g ħar-referenzi g ħandhom 
ikunu ppreparati f’mezz tat-tkabbir jew ma ħlula jew sospi żi f’vetturi 
xierqa u mbag ħad dilwit f’mezz g ħat-tkabbir g ħall-użu fl-anali żi. Il- 
konċentrazzjoni finali tal-vettura m’g ħandhiex taffettwa l-vijabilità 
taċ-Ċelloli.  
Kulturi primarji ta’ hepatocytes tal- ġrieden, limfo ċite tal-bnedmin u 
razez taċ-Ċelloli stabbiliti (e ż. fibroblast tad-diplojde tal-bnedmin) 
jistgħu jintużaw fl-anali żi. 
Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti g ħall-kimika tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema g ħall-attivazzjoni metabolika 
xierqa.  
Kundizzjonijiet tat-test  
N u m r u t a ’ k u l t u r i  
Għall-inqas żewġ kulturi ta’ Ċelloli għall-awtoradjografija u sitt 
kulturi (jew inqas jekk i ġġustifikat b’mod xjentifiku) g ħad-deter­
minazzjonijiet LSC UDS huma me ħtieġa għal kull punt sperimentali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Għandhom ikunu inklu żi fl-esperiment kontrolli po żittivi u negattivi 
(mhux trattati u/jew vettura) fl-istess ħin bl-attivazzjoni metabolika u 
mingħajr l-attivazzjoni metabolika.  
Eżempji ta’ kontrolli po żittivi għall-analiżi tal-hepatocytes tal- ġrieden 
jinkludu 7,12-dimetilben żatraċene (7,12-DMBA) jew 2-a ċetilam­
minofluworin (2-AAF). Fil-ka ż ta’ razez ta’ Ċelloli stabbiliti 4- 
nitrokwinolina-N-ossidu (4-NQO) huwa e żempju ta’ kontroll 
pożittiv kemm g ħall-analiżi awtoradjografika kif ukoll l-anali żi 
LSC ming ħajr attivazzjoni metabolika; N-dimetilnitosammina huwa 
eżempju ta’ kontroll po żittiv kompost meta jintu żaw sistemi g ħall- 
attivazzjoi metabolika.  
K o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a ’ l - e s p o ż i z z j o n i  
Għandhom jintu żaw numru ta’ kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat- 
test fuq medda adegwata biex tkun definita r-risposta. L-og ħla konċ­
entrazzjoni g ħandha jkollha xi effetti ċitotossiċi. Komposti li relatti ­
vament ma jin ħallux fl-ilma g ħandhom ikunu ttestjati sal-limiti ta’ l- 
insolubilità tag ħhom. Għal kimiċi li jinħallu faċilment fl-ilma u li 
m’humhiex tossi ċi, l-ogħla konċentrazzjoni tal-kimika tat-test 
għandha tkun determinata skond il-ka ż. 
Ċ e l l o l i  
Mezzi għat-tkabbir xierqa, il-kon ċentrazzjoni CO  2 , it-temperatura u l- 
umdità għandhom ikunu u żati fil-manteniment tal-kulturi. Razez ta ċ- 
Ċelloli stabbiliti g ħandhom ikunu kkontrollati b’mod perjodiku g ħal 
kontaminazzjoni tal- Mycoplasma . 
L - a t t i v a z z j o n i M e t a b o l i k a  
Mal-kulturi primarji hepatocyte ma tintu żax sistema g ħall- 
attivazzjoni metabolika. Razez ta ċ-Ċelloli stabbiliti u l-limfo ċiti 
huma esposti g ħas-sustanza tat-test kemm fil-pre żenza kif ukoll fl- 
assenza ta’ sistema xierqa g ħall-attivazzjoni metabolika.  
Proċedura  
P r e p a r a z z j o n i t a l - k u l t u r i  
Razez taċ-Ċelloli stabbiliti huma ġġenerati minn kulturi ta’ l-istokk 
(eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tne ħħija), miżrugħin f’vetturi g ħall- 
kultura f’densità xierqa, u inkubati f’37  o C. 
Kulturi g ħal żmien qasir ta’ hepatocytes tal- ġrieden huma stabbiliti 
billi l-hepatocytes disso ċjati reċentement jit ħallew f’mezz xieraq biex 
jeħlu mal-wi ċċ li jkun qed jikber.  
Kulturi tal-limfo ċite tal-bnedmin jitwaqqfu bl-u żu ta’ tekni ċi xierqa.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
T r a t t a m e n t t a l - k u l t u r i b i s - s u s t a n z a t a t - t e s t  
Hepatocytes primarji tal- ġrieden  
Hepatocytes tal- ġrieden iżolati reċentement huma trattati bis-sustanza 
tat-test f’mezz li fih  3 H-TdR għal tul ta’ żmien xieraq. Fl-a ħħar tal- 
perjodu tat-trattament, il-mezz g ħandu jitne ħħa minn ma ċ-Ċelloli, li 
mbagħad għandhom ikunu mla ħalħin, imwa ħħlin u mnixxfin. L- 
islajds g ħandhom ikunu mg ħaddsa f’emulsjoni awtoradjografika 
(jista’ jintu ża film alternattiv li jqaxxar), esposti, żviluppati, 
mlewwnin u mg ħadda.  
Razez taċ-Ċelloli stabbiliti u limfo ċiti 
Tekniċi awtoradjografi ċi: Il-kulturi ta ċ-Ċelloli huma esposti g ħas- 
sustanza tat-test g ħal-tul ta’ żmien xieraq u wara jkunu trattati b’  
3 H-TdR. Il- ħiniiet għandhom ikunu gvernati min-natura tas-sustanza, 
l-attività ta’ sistemi metaboli ċi u t-tip ta’ Ċelloli. Biex tkun skoperta 
l-quċċata ta’ UDS,  3 H-TdR g ħandu jkun mi żjud jew fl-istess ħin 
mas-sustanza tat-test jew wara ftit minuti wara l-espo żizzjoni għas- 
sustanza tat-test. L-g ħażla bejn dawn i ż-żewġ proċeduri għandha 
tkun influwenzata mill-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza tat- test u
 3 H-TdR. Sabiex issir differenza bejn UDS u replika ta’ DNA 
semi-konservattiva, din ta’ l-a ħħar tista’ tkun inibita, per e żempju, bl- 
użu ta’ mezz nieqes mill-arginina, kontenut baxx ta’ serum jew bl- 
idrossiurea fil-mezz tal-kultura.  
Kejl LSC tal-UDS: Qabel it-trattament bis-sustanza tat-test, id-d ħul 
taċ-Ċelloli fil fa żi S għandu jkun imwaqqaf kif deskritt hawn fuq; i ċ- 
Ċelloli mbag ħad għandhom ikunu esposti g ħall-kimika tat-test kif 
deskritt g ħall-awtoradjografija. Fl-a ħħar tal-perjodu ta’ l-inku ­
bazzjoni, id-DNA g ħandu jinħareġ miċ-Ċelloli u l-kontenut totali 
ta’ DNA, u l-mi żura ta’ inkorporazzjoni ta’  3 H-TdR g ħandhom 
ikunu determinati.  
Għandu jkun innotat li, fejn jintu żaw il-limfo ċiti tal-bnedmin fit- 
tekniċI msemmija hawn fuq, it-tra żżin tar-replika tad-DNA semi- 
konservattiva m’huwiex me ħtieġ f’kulturi li m’humhiex stimolati.  
Analiżi 
D e t e r m i n a z z j o n i j i e t a w t o r a d j o g r a f i ċ i 
Fid-determinazzjoni ta’ UDS fi ċ-Ċelloli fil-kultura, in-nuklei fil-fa żi 
S ma jing ħaddux. G ħall-inqas 50 ċellula għal kull kon ċentrazzjoni 
għandha ting ħad. L-islajds g ħandhom jing ħataw kodi ċI qabel ma 
jingħaddu. Għandhom jing ħaddu bosta oqsma kif jinzertaw separati 
sew fuq kull slajd. L-ammont ta’  3 H-TdR inkorporat fi ċ-ċitoplasma 
għandu jkun determinat billi jing ħaddu tlett partijiet b’daqs ta’ 
nukleu fiċ-ċitoplasma ta’ kull ċellula li ting ħadd. 
D e t e r m i n a z z j o n i j i e t L S C  
Għandu jintu ża numru adegwat ta’ kulturi f’kull kon ċentrazzjoni u 
fil-kontrolli fid-determinazzjonijiet LSC UDS.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Ir-riżultati kollha g ħandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipen ­
denti.  
2. ID-DATA  
Id-data għandha tkun ippre żentata f’forma ta’ tabelli.  
2.1. DETERMINAZZJONIJIET AWTORADJOGRAFI ĊI 
L-ammont ta’  3 H-TdR inkorporat fi ċ-ċitoplasma u n-numru ta’ frak li 
jinstabu fuq in-nukleu ta ċ-ċellula għandhom ikunu miktubin separati.  
Il-medja, il-medjan u l-mode jistg ħu jintużaw biex jiddeskrivu d- 
distribuzzjoni tal-mi żura ta’  3 H-TdR inkorporat fi ċ-ċitoplasma u n- 
numru ta’ frak g ħal kull nukleu.  
2.2. DETERMINAZZJONIJIET LSC  
Għal determinazzjonijiet LSC, l-inkorporazzjoni ta’  3 H-TdR għandha 
tkun irrapportata b ħala dpm/μg DNA. Il-medja dpm/ μg DNA b’dev ­
jazzjoni standard tista’ tintu ża biex tiddeskrivi d-distribuzzjoni ta’ l- 
inkorporazzjoni.  
Id-data għandha tkun evalwata bl-u żu ta’ metodi statisti ċi xierqa.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
li ġejja: 
— iċ-Ċelloli użati, id-densità u n-numru tal-passa ġġ waqt it-trat ­
tament, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli;  
— il-metodi u żati biex jin żammu l-kulturi ta ċ-Ċelloli inklu żi l- 
mezzi, it-temperatura u l-kon ċentrazzjoni ta’ CO  2 ; 
— is-sustanza tat-test, il-vettura, il-kon ċentrazzjonijiet u r-ra ġuni 
għas-selezzjoni tal- kon ċentrazzjonijiet u żati fl-anali żi; 
— id-dettalji tas-sistemi g ħall-attivazzjoni metabolika;  
— l-iskeda g ħat-trattament;  
— kontrolli po żittivi u negattivi;  
— teknika awtoradjografika u żata; 
— proċeduri użati biex jitwaqqaf id-d ħul ta’ Ċelloli fil-fa żi S; 
— proċeduri użati għall-ħruġ ta’ DNA u d-determinazzjoni tal- 
kontenut totali ta’ DNA fid-determinazzjoni LSC;  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-risposta, fejn possibbli;  
— il-valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  ANALI ŻI IN VITRO  TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID O ĦT 
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
L-analiżi ta’ l-Iskambju ta’ Kromatid O ħt (SCE) huwa test fuq żmien 
qasir għall-iskoperta ta’ skambji re ċiproki ta’ NA bejn żewġ 
kromatidi a ħwa ta’ kromosoma li tirdoppja. L-SCE’s jirrappre żentaw 
l-interkambju ta’ prodotti tar-replika tad-DNA f’postijiet li jidhru li huma omologi. Il-pro ċess ta’ l-iskambju pre żumibbilment jinvolvi l- 
ksur u tg ħaqqid mill- ġdid tad-DNA, g ħalkemm ftit huwa mag ħruf 
dwar il-ba żi molekulari tieg ħu. L-iskoperta ta’ SCE’s te ħtieġ xi mod 
ta’ tikkettjar differenti tal-kromatidi a ħwa u dan jista’ jinkiseb bl- 
inkorporazzjoni ta’ bromodeossiuridina (BrdU) fid-DNA kromo ­
somali għal żewġ ċikli taċ-Ċelloli.
 
Ċelloli mammiferi  in vitro  huma esposti g ħall-kimika tat-test b’s- 
sitema għall-attivazzjoni metabolika eso ġena mammifera kif ukoll 
mingħajrha, jekk xieraq, u kkulturati g ħal żewġ dawriet ta’ repliki 
f’mezz li fih il-BrdU. Wara t-trattament b’inibitur tal-mag ħżel (eż. il- 
kolkiċina) biex ikunu akkumulati ċ-Ċelloli fi stat ta’ mitosi simili 
għall-metafasi (c-metafasi), i ċ-Ċelloli huma ma ħsuda u jsiru l- 
preparazzjonijiet tal-kromosomi.  
1.5. KRITERJI G ĦALL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Preparazzjonijiet  
— Fl-anali żi jistgħu jintużaw kulturi primarji, (limfo ċiti tal- 
bnedmin) jew razez ta ċ Ċelloli stabbiliti (e ż. Ċelloli ovarji tal- 
ħamsters ċiniżi). Ir-razez ta ċ-Ċelloli għandhom ikunu kkontrollati 
għall-kontaminazzjoni tal- Mycoplasma . 
— Għandhom jintu żaw mezzi tal-kultura u kundizzjonijiet ta’ l- 
inkubazzjoni xierqa (e ż. temperatura, re ċipjenti għall-kultura, 
CO 2 , konċentrazzjoni u umdità),  
— Sustanzi tat-test jistg ħu ikunu ppreparati fil-mezzi g ħall-kultura 
jew maħlula jew sospi żi f’vetturi xierqa qabel it-trattament ta ċ- 
Ċelloli. Il-kon ċentrazzjoni finali ta’ vettura fis-sistema tal-kultura 
m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikattiv il-vijabilità jew ir-rata 
ta’ tkabbir ta ċ-Ċelloli u l-effetti fuq il-frekwenza SCE g ħandhom 
ikunu kontrollati b’solvent ta’ kontroll,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti g ħas-sustanza tat-test kemm 
fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema g ħall-attivazzjoni 
metabolika mammifera eso ġena. B’mod alternattiv, meta 
jintużaw ċelluli b’attività metabolika intrinsika, ir-rata u n- 
natura ta’ l-attività g ħandhom ikunu xierqa g ħall-klassi tal- 
kimika li tkun qed ti ġi ttestjata.  
1.6.2.  Kundizzjonijiet g ħat-test  
1 . 6 . 2 . 1 .  N u m r u t a ’ k u l t u r i  
Għandhom jintu żaw għall-inqas kulturi doppji g ħal kull punt speri ­
mentali.  
1 . 6 . 2 . 2 .  L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Kontrolli po żittivi, li ju żaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll 
kompost li je ħtieġ attivazzjoni metabolika, g ħandhom ikunu inklu żi 
f’kull esperiment; kontroll tal-vettura g ħandu jintu ża ukoll.  
Dawn li ġejjin huma e żempji ta’ sustanzi li jistg ħu jintużaw bħala 
kontrolli posittivi:  
— komposti attivi diretti:  
— etilmetansulfonat,  
— komposti attivi indiretti:  
— ċiklofosfamida.  
Meta xieraq, kontroll po żittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika 
bħall-kimika fit-test jista’ jkun inklu ż. 
1 . 6 . 2 . 3 .  K o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a ’ l - e s p o ż i z z j o n i  
Għandhom jintu żaw għall-inqas tlett kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza 
tat-test mqassma b’mod adegwat. L-og ħla konċentrazzjoni g ħandha 
toħloq effett tossiku sinifikanti i żda xorta g ħandha tippermetti r- 
replika adegwata ta ċ-Ċelloli. Sustanzi li relattivament ma jin ħallux 
fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità bl-u żu ta’ 
proċeduri xierqa. G ħal sustanzi li m’humhiex tossi ċi u li jin ħallu 
faċilment fl-ilma, l-og ħla konċentrazzjoni tas-sustanza g ħattest 
għandha tkun determinata skond il-ka ż. 
1.6.3.  Pro ċedura  
1 . 6 . 3 . 1 .  P r e p a r a z z j o n i t a l - k u l t u r i  
Ir-razez ta ċ-Ċelloli stabbiliti huma ġenerati minn kulturi ta’ l-istokk 
(eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tne ħħija), miżrugħin f’reċipjenti tal- 
kultura f’densità xierqa u inkubati f’37  o C. Għal kulturi b’saff 
wieħed, in-numru ta’ ċelluli għal kull re ċipjent tal-kultura g ħandu 
jkun aġġustat sabiex il-kulturi ma jkunux ħafna iktar minn 50 % 
konfluwenti fi ż-żmien tal- ħsad. Alternattivament, i ċ-ċelluli jistg ħu 
jintużaw f’kultra ta’ sospensjoni. Il-kulturi tal-limfo ċita tal-bnedmin 
huma mwaqqfa minn demm eparinizzat, bl-u żu ta’ tekni ċi xierqa, u 
inkubati f’37  o C. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
1 . 6 . 3 . 2 .  I t - t r a t t a m e n t  
Iċ-Ċelloli li qeg ħdin fl-istadju ta’ tkabbir esponenzali huma esposti 
għas-sustanza tat-test g ħal perjodi ta’ ħin adegwat; fil-bi ċċa l-kbira 
tal-każijiet siegħa jew sag ħtejn jistgħu ikunu effettivi, i żda l-ħin tat- 
trattament jista’ jkun esti ż sa żewġ ċikli taċ-Ċelloli f’ċerti każijiet. 
Ċelluli li m’g ħandhomx attività metabolika intrinsika suffi ċjenti 
għandhom ikunu esposti g ħall-kimika tat-test fil-pre żenza u fl- 
assenza ta’ sistema g ħall-attivazzjoni metabolika xierqa. Fl-a ħħar 
tal-perjodu g ħall-espożizzjoni, i ċ-Ċelloli jinħaslu mis-sustanza tat- 
test u jiġu kulturati g ħal żewġ dawriet ta’ replika fil-pre żenza ta’ 
BrdU għall-ħin sħiħ tal-kultura ta’ żewġ ċikli ta’ Ċelloli.  
Kulturi tal-limfo ċita tal-bnedmin huma trattati waqt li jkunu f’kun ­
dizzjoni semisinkronika.  
Iċ-Ċelloli huma analizzati fit-tieni divi żjoni tagħhom wara t-trat ­
tament, bl-assigurazzjoni li l-istadji ta ċ-ċikli taċ-Ċelloli li huma l- 
iktar sensittivi kienu esposti g ħall-kimika. Il-kulturi kollha li huma 
miżjuda bil-BrdU g ħandhom ikunu ttrattati fid-dlam jew f’dawl baxx 
minn lampi inkandexxenti sal- ħsad taċ-Ċelloli sabiex titnaqqas sal- 
minimu il-fotolisi ta’ DNA li fiha l-BrdU.  
1 . 6 . 3 . 3 .  I l - ħ s a d t a ċ - Ċ e l l o l i  
Il-kulturi ta ċ-Ċelloli huma trattati b’inibitur tal-mag ħżel (eż. l- 
kolkiċina) bejn sieg ħa u erba’ sieg ħat qabel il- ħsad. Kull kultura 
hija maħsuda u pro ċessata b’mod separat g ħall-preparazzjoni tal- 
kromosomi.  
1 . 6 . 3 . 4 .  I l - p r e p a r a z z j o n i u t - t i l w i n t a l - k r o m o s o m i  
Il-preparazzjonijiet tal-kromosomi isiru permezz ta’ tekni ċi ċito­ 
ġenetiċi standard. It-tilwin ta’ l-islajds biex juru l-SCEs jista’ jsir 
b’bosta tekni ċi, (eż. il-metodu tal-fluworexxenza flimkien ma’ 
Giemsa).  
1 . 6 . 3 . 5 .  L - A n a l i ż i 
In-numru ta’ Ċelloli analizzati g ħandu jkun ibba żat fuq il-frekwenza 
tal-kontroll spontanju ta’ SCE. Is-soltu, g ħall-inqas 25 metafasi 
mqassmin sew g ħal kull kultura huma analizzati g ħal SCEs. L- 
islajds jing ħataw kodi ċi qabel l-anali żi. Fil-limfo ċiti tal-bnedmin 
huma analizzati biss dawk il-metafasijiet li fihom 46 centromeres. F’razez ta’ Ċelloli stabbiliti huma analizzati biss il-metafasijiet li 
fihom ±2 ċentromeri tan-numru modali. G ħandu jkun indikat jekk 
it-tibdil ċentromeriku tat-tikketta huwa mmarkat b ħala SCE. Ir- 
riżultati għandhom ikunu konfermati f’esperiment indipendenti.
 
2. ID-DATA  
Id-data g ħandha tkun ippre żentata f’forma ta’ tabelli. In-numru ta’ 
SCEs għal kull metafasi u n-numru ta’ SCE’s g ħal kull kromosoma 
għal kull metafasi g ħandhom jitni żżlu b’mod separat g ħall-kulturi 
kollha trattati u kontrollati.  
Id-data g ħandha tkun evalwata bl-u żu ta’ metodi staitisti ċi xierqa.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
il ġejja: 
— Iċ-Ċelloli użati, il-metodi u żati biex jin żammu l-kulturi ta ċ- 
Ċelloli;  
— Il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-kon ċen­
trazzjoni ta’ CO  2 il- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il- 
vettura u żata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, il- ħin tat-trat ­
tament, l-inibitur tal-mag ħżel użat, il-kon ċentrazzjoni tieg ħu u 
t-tul tat-trattament bih, it-tip ta’ sistema g ħall-attivazzjoni 
mammifera u żata, kontrolli po żittivi u negattivi;  
— In-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli għal kull punt sperimentali;  
— id-dettalji tat-teknika u żata għall-preparazzjoni ta’ l-islajds;  
— in-numru ta’ metafasijiet analizzati (id-data g ħandha ting ħata 
separata g ħal kull kultura);  
— il-medja tan-numru ta’ SCE g ħal kull ċellula u g ħal kull 
kromosoma (id-data g ħandha ting ħata separata g ħal kull kultura);  
— il-kriterji biex jing ħad SCE;  
— ir-raġuni għall-għażla tad-doża; 
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-risposta, jekk tapplika;  
— il-valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  TEST RE ĊESSIV LI JIKKA ĠUNA L-MEWT U LI HUWA 
SKOND IS-SESS F’ DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
It-test reċessiv li jikka ġuna l-mewt u li huwa skond is-sess (SLRL) li 
juża d- Drosophila melanogaster  josserva t-tibdil li jsir, kemm tibdil 
tal-punt kif ukoll t ħassir żgħir, fir-razza tal-mikrobu ta’ l-insett. Dan 
it-test huwa anali żi tat-tibdil ‘il-quddiem u huwa kapa ċi isib tibdil 
f’madwar 800 post fuq il-kromosoma-X; Dawn jirrappre żentaw 
madwar 80 % tal-postijiet tal-kromosoma-X. Il-kromosoma-X 
tirrappreżenta madwar wie ħed minn ħamsa tal- ġenomu ta’ l-aplojde 
kollu.  
Tibdiliet fil-kromosoma-X tad- Drosophila melanogaster  huma feno ­
tipikament espressi fl-ir ġiel li jġorru l-ġene mutanti. Meta t-tibdil 
jikkaġuna l-mewt fil-kundizzjoni emizigota, il-pre żenza tieg ħu hija 
deduċibbli mill-assenza ta’ wa ħda mill-klassijiet ta’ frie ħ tas-sess 
maskili mi ż-żewġ klassijiet li s-soltu jkunu prodotti minn mara 
eterożigota. It-test SLRL jie ħu vantaġġ minn dawn il-fatti permezz 
ta’ kromosomi mmarkati u rran ġati b’mod spe ċjail. 
1.5. KRITERJI G ĦALL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
S t o k k  
Annimali tas-sess maskili ta’ stokk tat-tip salva ġġ definit sew u 
annimali tas-sess femminili ta’ l-istokk Muller-5 jistg ħu jintużaw. 
Stokk femminili ie ħor immarkat b’mod xieraq b’kromosomi 
multipli maqlubin jistg ħu jintużaw ukoll.  
S u s t a n z a t a t - t e s t  
Is-sustanzi tat-test g ħandhom ikunu ma ħlulin fl-ilma. Sustanzi li ma 
jinħallux fl-ilma jistg ħu ikunu ma ħlula jew sospi żi f’vetturi xierqa 
(eż. taħlita ta’ etanol u Tween-60 jew 80), u mbag ħad jinħallu fl-ilma 
jew fl-ilma bil-mel ħ qabel ma jkunu amministrati. Id-Dimetilsul ­
fossidu (DMSO) g ħandu jkun evitat b ħala vettura.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
I n - n u m r u t a ’ a n n i m a l i  
It-test għandu jkun iddi żinjat b’sensitività u sa ħħa predeterminata. Il- 
frekwenza ta’ tibdil spontanju osservata fil-kontroll xieraq jinfluwenza b’mod qawwi in-numru ta’ kromosomi trattati li għandhom ikunu analizzati.
 
I r - r o t t a t a ’ l - a m m i n i s t r a z z j o n i  
L-espożizzjoni tistà tkun orali, b’injezzjoni, jew bl-espo żizzjoni għal 
gassijiet jew fwar. Meta s-sustanza tat-test tittiekel dan jista’ jsir f’soluzzjoni taz-zokkor.
 
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Kontrolli negattivi (tal-vettura) u po żittivi għandhom ikunu inklu żi. 
Madankollu, jekk tkun disponibbli data xierqa tal-laboratorju dwar 
kontroll storiku, m’humhiex me ħtieġa kontrolli fl-istess ħin. 
L i v e l l i t a ’ e s p o ż i z z j o n i  
Għandhom jintu żaw tlett livelli ta’ espo żizzjoni. G ħal stima 
preliminary jista’ jintu ża livell wie ħed ta’ espo żizzjoni tas-sustanza 
tat-test, b’dak il-livell ta’ espo żizzjoni li jkun jew il-kon ċentrazzjoni 
massima tollerata jew dak li jipprodu ċi xi indikazzjoni ta’ tossi ċità. 
Għal sustanzi li m’humhiex tossi ċi għandha tintu ża espożizzjoni 
għall-ogħla konċentrazzjoni prattikabbli.  
P r o ċ e d u r a  
L-annimali tas-sess maskili tat-tip salva ġġ (li jkollhom bejn tlieta u 
ħamest ijiem) huma trattati bis-sustanza u mg ħammrin individ ­
walment ma’ e ċċess ta’ annimali femminili ver ġni mill-istokk 
Muller-5 jew minn stokk ie ħor immarkat b’mod xieraq (b’kro ­
mosomi X multipli maqlubin). L-annimali femminili ikunu mibdula b’verġni ġodda kull jumejn jew tlett ijiem biex ikun kopert i ċ-ċiklu 
kollu taċ-ċellula tal-mikrobu. Il-frie ħ ta’ dawn l-annimali femminili 
jiġu eżaminati g ħal effetti li jikka ġunaw il-mewt li jikkorrispondu 
ma’ l-effetti fuq l-isperma matura, l-ispermatidi fi stadju medju jew tard, l-ispermatidi fi stadju kmieni, spermato ċiti u spermatogonji 
waqt it-trattament.
 
Annimali tas-sess femminili eterozigoti F  7 mill-qasmiet msemmija 
hawn fuq jit ħallew jgħammru individwalment (ji ġifieri, femminili 
waħda f’kull kunjett) ma’ l-a ħwa tagħhom. Fil- ġenerazzjoni F  7 , 
kull kultura ti ġi eżaminata g ħall-assenza ta’ maskili tat-tip salva ġġ. 
Jekk ikun hemm kultura li tidher li telg ħet minn femminili F  1 li 
kienet qed i ġġorr letali fil-kromosoma X parentali (ji ġifieri ma 
jkunux osservati maskili bil-kromosoma trattata) il-frie ħ femminili 
ta’ dak l-annimal femminili li g ħandhom l-istess ġenotip għandhom 
ikunu ttestjati biex ikun assigurat jekk dik il-possibilità li tikka ġuna 
l-mewt hijhiex ripetuta fil- ġenerazzjoni ta’ wara.  
2. ID-DATA  
Id-data g ħandha tkun fil-forma ta’ tabelli li juru n-numru ta’ 
kromosomi-X ittestjati, in-numru ta’ annimali maskili li m’humhiex 
fertili u n-numru ta’ kromosomi li jikka ġunaw il-mewt f’kull kon ċen­
trazzjoni ta’ l-espo żizzjoni u g ħal kull perjodu ta’ tg ħammir għal kull 
maskil trattat. G ħandhom ikunu rrappurtati numri ta’ ġemgħat ta’ 
daqsijiet differenti g ħal kull maskil. Dawn ir-ri żultati għandhom 
ikunu kkonfermati f’esperiment separat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Għandhom ikunu u żati metodi statisti ċi xierqa fil-valutazzjoni ta’ 
testijiet re ċessivi li jikka ġunaw il-mewt u li huma skond is-sess. It- 
tgħaqqid ta’ letali re ċessivi li jori ġinaw minn maskil wie ħed 
għandhom jitqiesu u jkunu evalwati b’mod statistiku xieraq.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
il ġejja: 
— Stokk: l-istokk jew ir-razez ta’ Drosophilia u żati, iż-żmien ta’ l- 
insetti, in-numru ta’ annimali maskili trattati, in-numru ta’ annimali maskili sterili, in-numru ta’ kulturi F2 stabbiliti, in- numru ta’ kulturi F2 ming ħajr prodotti, in-numru ta’ 
kromosomi li j ġorru letali f’kull stadju ta ċ-ċellula tal-mikrobu;
 
— Il-kriterji biex ikun stabbilit id-daqs tal-gruppi trattati;  
— Il-kundizzjonijiet tat-test: deskrizzjoni dettaljata ta’ l-iskeda tat- 
trattament u tat-te ħid tal-kampjuni, il-livelli ta’ l-espo żizzjoni, 
data dwar it-tossi ċità, kontrolli negattivi (tas-solvent) u po żittivi, 
jekk xierqa;  
— Il-kriterji biex jing ħadd it-tibdil letali;  
— ir-relazzjoni bejn l-espo żizzjoni u l-effett fejn possibbli;  
— valutazzjoni tad-data;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21  TEST TAT-TIBDILTAL- ĠENI F’ĊELLULIMAMMIFERI  IN 
VITRO  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Sistemi tal-kultura ta ċ-Ċelloli mammiferi jistg ħu jintużaw għall- 
iskoperta ta’ tibdil ikka ġunat minn sustanzi kimi ċi. Linji ta ċ-Ċelloli li 
jintużaw ħafna jinkludu L5178Y ċelluli tal-limfoma tal- ġrieden u l-linji 
CHO u V-79 ta ċ-Ċelloli ta’ ħamsters ini żi. F’dawn il-linji ta ċ-ċelluli is- 
sistemi li jintu żaw l-iktar jikkalkulaw it-tibdil f’thymidine kinase (TK), 
hypoxanthine guanine phosphorybosyl transferase (HPRT) [21] u NA/K ATPase loci. Is-sistemi ta’ tibdil TK u HPRT isibu t-tibdil ta’ ba żi ta’ 
pari, tibdil frameshift u t ħassir żgħir; is-sistema NA/K issib biss it-tibdil 
ta’ bażi ta’ pari. Ċelloli nieqsin minn thymidine kinase (TK), min ħabba t- 
tibdil ‘l-quddiem TK – T K, huma re żistenti għall-bromodeossiuridina 
(BrdU), il-fluworodeossiuridina (FdU)jew it-trifluworotimidina (TFT) 
billi dawn l-antimetaboliti m’humiex inkorporati f’nukleotidi ta ċ- 
Ċelloli permezz tas-sistema ta’ l-enzimi tas-‘salvata ġġ‘ thymidine 
kinase; in-nukleotidi me ħtieġa għall-metaboli żmu taċ-ċelluli jinkisbu 
biss minn sintesi de novo. Madankollu, fil-presenza ta’ thymidine 
kinase BrdU, FdU jew TFT huma inkorporati fin-nukleotidi, bir- 
riżultat ta’ l-inibizzjoni tal-metaboli żmu taċ-Ċelloli u ċ
-ċitotossiċità. 
B’hekk iċ-Ċelloli mutanti jistg ħu jipproliferaw fil-pre żenza ta’ BrdU, 
FdU jew TFT filwaqt li ċ-Ċelloli normali, li fihom it-thymidine 
kinase, ma jistg ħux. B’mod simili, i ċ-Ċelloli nieqsin mill-HPRT 
jintgħażlu skond ir-re żistenza għal 8-ażagwanina (AG) jew 6-tiogwanina 
(TG). elluli b’ NA/K ATPase alterati jintg ħażlu skond ir-re żistenza għall- 
ouabain. I ċ-ċitotossiċità hija determinata billi jitkejjel l-effett tal-materjal 
tat-test fuq il-kapa ċitajiet għall-formazzjoni tal-kolonji (l-effi ċjenza ta’ l- 
ikklonjar) jew ir-rati tat-tkabbir tal-kulturi. Il-frekwenza tal-mutanti hija determinata billi jin żergħu numri mag ħrufa ta’ Ċelloli f’mezz li fih l- 
aġent selettiv g ħall-iskoperta ta’ Ċelloli mutanti, u f’mezz ming ħajr l- 
aġent selettiv biex ikunu determinati ċ-Ċelloli sopraviventi. Wara 
perjodu ta’ l-inkubazzjoni xieraq, il-kolonji jing ħaddu. Il-frekwenzi tal- 
mutanti huma mkejjla min-numru ta’ kolonji ta’ mutanti kkore ġuti għas- 
sopravivenza ta ċ-Ċelloli.
 
1.5. KRITERJI G ĦALL-KWALITÀ  
Xejn  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Ċ e l l o l i  
Hemm varjetà ta’ linji ta’ Ċelloli disponibbli g ħall-użu f’din l-anali żi. 
Dawn jinkludu subkloni ta’ L5178Y, Ċelloli CHO jew Ċelloli V-79 
b’sensitività murija g ħall-mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta’ l- 
ikklonjar u frekwenza baxxa ta’ tibdil spontanju. I ċ-Ċelloli jistg ħu 
ikunu kkontrollati b’mod perjodiku g ħall-istabilità tal-karjotip u 
għandhom ikunu kkontrollati g ħall-kontaminazzjoni tal-Mycoplasma. 
Jistgħu jintużaw tipi o ħra ta’ Ċelloli jekk il-validità tag ħhom bħala 
analiżi tat-tibdil tal- ġeni kkaġunat mill-kimi ċi tista’ tkun kompletament 
dokumentata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
M e z z  
Mezzi ta’ kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa (e ż. 
temperatura, vettura g ħall-kultura, kon ċentrazzjonijiet ta’ CO2 u 
umdità) g ħandhom jintu żaw. Mezzi u sera g ħandhom jintg ħażlu 
skond is-sistemi selettivi u t-tipi ta’ Ċelloli użati fl-anali żi. 
S u s t a n z a t a t - t e s t  
Sustanzi tat-test jistg ħu ikunu ppreparati f’mezzi g ħall-kultura jew 
maħlula jew sospi żi f’vetturi xierqa qabel it-trattament ta ċ-Ċelloli. Il- 
konċentrazzjoni finali tal-vettura fis-sistema tal-kultura m’g ħandhiex 
taffettwa il-vijabilità tar-rata tat-tkabbir.  
L - a t t i v a z z j o n i m e t a b o l i k a  
Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti g ħas-sustanza tat-test kemm fil- 
preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni tal-meta ­
boliżmu mammiferu eso ġenu xierqa. B’mod alternattiv, meta 
jintużaw tipi ta’ Ċelloli b’attività metabolika intrinsika ir-rata u n- 
natura ta’ l-attività g ħandhom ikunu mag ħrufa li huma xierqa g ħall- 
klassi kimika li qed tkun ittestjata.  
Kundizzjonijiet tat-test  
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Kontrolli po żittivi, li ju żaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll 
kompost li je ħtieġ attivazzjoni metabolika, g ħandhom ikunu inklu żi 
f’kull esperiment; kontroll negattiv (tal-vettura) g ħandu jintu ża ukoll.  
Dawn li ġejjin huma e żempji ta’ sustanzi li jistg ħu jintużaw bħala 
kontrolli posittivi:  
— komposti attivi diretti:  
— etilmetansulfonat;  
— hycanthone;  
— komposti attivi indiretti:  
— 2-aċetilamminofluworin;  
— 7,12-dimetilben żantraċene; 
— N-nitrosodimetilammina.  
Meta xieraq, kontroll po żittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika 
bħall-klassi kimika fit-test jista’ jkun inklu ż. 
K o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a ’ l - e s p o ż i z z j o n i  
Għandhom jintu żaw bosta kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test. 
Dawn il-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom jo ħolqu effett tossiku skond 
il-konċentrazzjoni, bl-og ħla konċentrazzjoni li to ħloq livell baxx ta’ 
sopravivenza u bis-sopravivenza fil-kon ċentrazzjoni l-iktar baxxa li 
tkun kwa żi l-istess daqs dik fil-kontroll negattiv. Sustanzi li relatti ­
vament ma jin ħallux fl-ilma g ħandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas- 
solubilità bl-u żu ta’ pro ċeduri xierqa. G ħal sustanzi li m’humhiex 
tossiċi u li jin ħallu faċilment fl-ilma, l-og ħla konċentrazzjoni tas- 
sustanza g ħat-test għandha tkun determinata skond il-ka ż. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Proċedura  
In-numru ta’ ċelluli użati għal kull kultura g ħandu jkun skond il- 
frekwenza ta’ tibdil spontanju; gwida ġenerali hija l-u żu ta’ numru 
ta’ ċelluli vijabbli li huwa g ħaxar darbiet l-invers tal-frekwenza tat- 
tibdil spontanju. I ċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti g ħal perjodu ta’ 
ħin xieraq, fil-bi ċċa l-kbira tal-ka żijiet bejn sag ħtejn u ħames sieg ħat 
huwa effettiv. Ċelluli ming ħajr attività metabolika intrinsika 
suffiċjenti għandhom ikunu esposti g ħas-sustanza tat-test fil- 
preżenza u fl-assenza ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika xierqa. 
Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, iċ-Ċelloli jinħaslu u jin ħelsu 
mis-sustanza tat-test u ji ġu kkultivati biex tkun determinata l-vija ­
bilità u biex tkun tistà sse ħħ l-espressjoni tal-fenotip tal-mutant. Fl- 
aħħar tal-perjodu ta’ l-espressjoni, li g ħandu jkun bi żżejjed biex 
jippermetti espressjoni fenotipika kwa żi ottima, i ċ-Ċelloli jitkabbru 
fil-mezz b’a ġenti selettivi kif ukoll ming ħajr aġenti selettivi g ħad- 
determinazzjoni tan-numri ta’ mutanti u l-vijabilità. Ir-ri żultati kollha 
jiġu ikkonfermati f’esperiment indipendenti.  
2. ID-DATA  
Id-data g ħandha tkun ippre żentata fil-forma ta’ tabelli. G ħandhom 
ikunu ppre żentati għadd u kontrolli individwali tal-platti g ħas- 
sustanza tat-test kemm g ħall-ikkaġunar tat-tibdil kif ukoll g ħas- 
sopravivenza. In-numru medju ta’ kolonji g ħal kull platt u d- 
devjazzjoni standard g ħandhom jing ħataw ukoll. Il-frekwenza tat- 
tibdil għandha tkun espressa b ħala n-numru ta’ mutanti skond in- 
numru ta’ Ċelloli sopraviventi. L-effi ċjenzi tas-sopravivenza u ta’ l- 
ikklonjar huma espressi b ħala perċentwali tal-livell tal-kontroll. Id- 
data għandha tkun evalwata bl-u żu ta’ metodi xierqa ta’ l-istatistika.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
li ġejja: 
— ir-razza u żata, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli, il-metodi biex 
jinżammu l-kulturi ta ċ-Ċelloli;  
— il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-kon ċen­
trazzjoni ta’ CO2, il- kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il- 
vettura użata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, it-tul ta’ l-inku ­
bazzjoni, it-tul tal-perjodu g ħall-espressjoni (inklu ż in-numru ta’ 
Ċelloli miżrugħin u subkulturi u skedi ta’ l-ikel, jekk xierqa), it- 
tul tat-trattament, id-densità ta ċ-ċelluli waqt it-trattament is- 
sistema g ħall-attivazzjoni metabolika, il-kundizzjonijiet tat-trat ­
tament: il-kon ċentrazzjoni ta’ l-espo żizzjoni, il-pro ċedura u t-tul 
tat-trattament, it-tip ta’ sistema g ħall-attivazzjoni metabolika 
mammifera u żata, kontrolli po żittivi u negattivi, l-a ġent selettiv 
użat; ir-raġuni għall-għażla tad-doża; 
— il-metodu u żat biex ikunu enumerati n-numri ta’ Ċelloli vijabbli 
u mutanti;  
— valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  TEST LETALI DOMINANTI TAL-MAMMALI GERRIEMA  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Effetti letali dominanti jikkaw żaw il-mewt embrijonika jew tal-fetu. 
L-induzzjoni ta’ letali dominanti bl-espo żizzjoni g ħal sustanza 
kimika tindika li s-sustanza affetwat it-tessut ġerminali ta’ l-ispe ċi 
tat-test. Huwa a ċċettat b’mod ġenerali li l-letali dominanti huma 
dovuti għad-dannu kromosomali (anomaliji strutturali u numeri ċi). 
Il-mewt embrijonika jekk ikunu trattati l-annimali femminili tista’ 
tkun ukoll ri żultat ta’ l-effetti tossi ċi. 
Ġeneralment, l-annimali tas-sess maskil huma esposti g ħall-kompost 
tat-test u mg ħammra ma’ annimali tas-sess femminili li huma ver ġni 
u li m’humhiex trattati. Id-diversi stadji ta ċ-ċellula tal-mikrobu 
jistgħu ikunu ttestjati b’mod separat bl-u żu ta’ intervalli sekwenzali 
fit-tgħammir. I ż-żieda fl-impjanti mejtin f’kull wa ħda tas-sess 
femminil fil-grupp trattat divi ż bin-numru ta’ impjanti mejtin f’kull 
waħda tas-sess femminil fil-grupp tal-kontroll turi t-telfa ta’ wara l- 
impjantazzjoni. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni tista’ tkun stimata 
fuq il-bażi ta’ l-għadd corpora lutea jew billi jitqabblu l-impjanti 
totali f’kull wa ħda tas-sess femminili fil-gruppi trattati u tal- 
kontroll. L-effett letali dominanti totali huwa t-total tat-telf ta’ qabel u ta’ wara l-impjantazzjoni. Il-kalkolu ta’ l-effett letali 
dominanti totali huwa bba żat fuq it-tqabbil ta’ impjanti ħajjin 
f’kull wa ħda mis-sess femminili fil-grupp tat-test ma’ l-impjanti 
ħajjin f’kull wa ħda mis-sess femminili fil-grupp tal-kontroll. 
Tnaqqis fin-numru ta’ impjanti f’ ċerti intervalli jista’ jkun ir- 
riżultat tal-qtil ta’ Ċelloli (jiġifieri spermato ċiti u/jew spermatogonji).
 
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Meta possibbli, is-sustanzi tat-test g ħandhom ikunu ma ħlula jew 
sospiżi f’soluzzjoni miel ħa isotonika. Kimi ċi li ma’ jin ħallux fl- 
ilma jistg ħu ikunu ma ħlula jew sospi żi f’vetturi xierqa. Il-vettura 
użata m’għandhiex tfixkel il-kimika tat-test u lanqas m’ghandha 
tipproduċi effetti tossi ċi. Preparazzjonijiet ġodda tal-kimika tat-test 
għandhom ikunu u żati. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Kundizzjonijiet tat-test  
R o t t a t a ’ l - a m m i n i s t r a z z j o n i  
Ġeneralment il-kompost tat-test g ħandu jkun amministrat darba biss. 
Tista’ tkun u żata skeda ta’ trattament ripetuta bba żata fuq inform ­
azzjoni tossikolo ġika. Ir-rotot normali g ħall-amministrazzjoni huma 
l-intubazzjoni orali jew l-injezzjoni fil-peritonew. Rotot o ħrajn għall- 
amministrazzjoni jistg ħu ikunu xierqa.  
A n n i m a l i s p e r i m e n t a l i  
Ġrieden u firien huma rrakkommandati b ħala speċi tat-test. Annimali 
kompletament maturi fis-sens sesswali u b’sa ħħithom huma 
magħżulin bl-addo ċċ u assenjati f’gruppi g ħat-trattament u gruppi 
tal-kontroll.  
I n - n u m r u u s - s e s s  
Għandu jintu ża numru adegwat mis-sess maskili li huma trattati, u 
għandu jittie ħed qies tal-varjazzjoni spontanja tal-karattru bijolo ġiku 
li jkun qieg ħed jiġi evalwat. In-numru mag ħżul għandu jkun ibba żat 
fuq is-sensitività pre-determinata ta’ l-osservazzjoni u l-qawwa tas- sinifikazzjoni. Per e żempju f’test tipiku, in-numru ta’ annimali tas- 
sess maskili f’kull grupp ta’ do ża għandu jkun bi żżejjed biex 
jipprovdu bejn 30 u 50 annimali nisa tqal f’kull intervall ta’ 
tgħammir
 
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Ġeneralment g ħandhom ikunu inklu żi f’kull esperiment kontrolli 
pożittivi u negattivi (vettura). Meta jkunu disponibbli ri żultati ta’ 
kontrolli po żittivi minn esperimenti li saru re ċentement fl-istess 
laboratorju dawn ir-ri żultati jistg ħu jintużaw minflok kontroll 
pożittiv fl-istess ħin. Sustanzi ta’ kontroll po żittiv għandhom 
jintużaw f’doża baxxa xierqa (e ż. MMS, fil-peritonew, f’10 mg/ ­
kilogramma) biex tkun murija s-sensitività tat-test.  
L i v e l l t a d - d o ż a 
Normalment, g ħandhom jintu żaw tliet livelli ta’ do ża. Id-doża l- 
għolja għandha tipprodu ċi sinjali ta’ tossi ċità jew fertilità mnaqqsa 
f’annimali trattati. F’ ċerti każijiet doża waħda ta’ livell g ħoli tistà 
tkun suffi ċjenti.  
T e s t t a l - l i m i t u  
Sustanzi li m’humhiex tossi ċi għandhom ikunu ttestjati b’5 g/ ­
kilogramma b’amministrazzjoni wa ħda jew b’1 g/kilogramma/jum 
b’amministrazzjoni ripetuta.  
Proċedura  
Bosta skedi ta’ trattament huma disponibbli. L-iktar u żata hija l- 
amministrazzjoni wa ħda tas-sustanza tat-test. Jistg ħu jintużaw skedi 
oħrajn tat-trattament.  
Annimali individwali tas-sess maskil huma mg ħammrin sekwenz ­
alment ma’ wa ħda jew żewġ annimali tas-sess femminili li huma 
verġni u li m’humhiex trattati, f’intervalli xierqa wara t-trattament. 
Annimali femminili g ħandhom jit ħallew ma’ dawk maskili g ħall- 
inqas għat-tul ta’ ciklu estrus wie ħed jew sakemm ise ħħ it- 
tgħammir kif determinat bil-pre żenza ta’ l-isperma fil-va ġina jew 
bil-preżenza ta’ tapp va ġinali. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
In-numru ta’ tg ħammir wara t-trattament huwa ggvernat bl-iskeda 
tat-trattament u g ħandu jassigura li jkun hemm kampjun ta’ l- 
istadji kollha ta ċ-Ċelloli tal-mikrobu wara t-trattament.  
L-annimali femminili huma sagrifikati fit-tieni parti tat-tqala u l- 
kontenut ta’ l-utru huwa e żaminat biex ikun determinat in-numru 
ta’ impjanti mejtin u ħajjin. L-ovarji jistg ħu ikunu e żaminati biex 
ikun determinat in-numru ta’ corpora lutea.  
2. ID-DATA  
Id-data g ħandha tkun f’forma ta’ tabelli biex turi n-numru ta’ 
annimali maskili, in-numru ta’ femminili tqal, u n-numru ta’ annimali femminili li m’humhiex tqal. Ir-ri żultati ta’ kull 
tgħammir, inklu ża l-identità ta’ kull animal maskil u feminili. 
Għandhom ikunu rrappurtati b’mod individwali. G ħal kull animal 
femminili, il- ġimgħa tat-tgħammir, il-livell tad-do ża li ngħatat lill- 
annimal maskil, il-frekwenza ta’ impjanti ħajjin u ta’ impjanti mejtin 
għanhom ikunu imni żżla.
 
Il-kalkolu ta’ l-effett letali dominanti totali huwa bba żat fuq it-tqabbil 
ta’ l-impjanti ħajjin għal kull annimal femminili fil-grupp tat-test ma’ 
l-impjanti ħajjin għal kull animal femminili fil-grupp ta’ kontroll. Il- 
proporzjon ta’ l-impjanti mejtin g ħal dawk ħajjin mill-grupp tat-trat ­
tament mqabbel ma’ l-istess proporzjon mill-grupp tal-kontroll huwa 
analizzat biex juri t-telf ta’ wara l-impjantazzjoni.  
Jekk id-data tkun imni żżla bħala mewt kmieni jew tard, it-tabelli 
għandhom jag ħmluha ċara. Jekk it-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni 
ikun stimat, g ħandu jkun irrappurtat. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni 
jista’ jkun ikkalkulat b ħala diskrepanza bejn in-numru ta’ corpora 
lutea u n-numru ta’ impjanti jew b ħala tnaqqis in-numru medju ta’ 
impjanti g ħal kull uteru meta mqabbel ma’ tg ħammir ta’ kontroll.  
Id-data għandha tkun evalwata bl-u żu ta’ metodi statisti ċi xierqa.  
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni 
li ġejja: 
— l-ispeċi, ir-razza, i ż-żmien u l-pi ż ta’ l-annimali u żati, in-numru 
ta’ annimali ta’ kull sess fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u 
kontroll;  
— is-sustanza tat-test, il-vettura, il-livelli tad-do ża ttestjati u r-ra ġuni 
għall-għażla tad-doża, kontrolli po żittivi u negattivi, data dwar it- 
tossiċità; 
— ir-rotta u l-iskeda tat-trattament;  
— l-iskeda tat-tg ħammir;  
— il-metodu u żat biex ikun determinat li sar it-tg ħammir;  
— il-ħin tas-sagrifi ċċju; 
— il-kriterji biex jing ħaddu letali dominanti;  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-risposta, jekk tapplika;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMO ŻOMI 
SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 483, Test dwar 
Anormalità fil-Kromo żomi Spermatogoni tal-Mammiferi (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-għan tat-test  in vivo  dwar anormalitajiet fil-kromo żomi sperma ­
togoni tal-mammiferi huwa biex ji ġu identifikati sustanzi li 
jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromo żomi fiċ-Ċelloli sper ­
matogoni tal-mammiferi (1) (2) (3) (4) (5). Anormalitajiet strutturali 
jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromo żomi jew kromatidi. Fil- 
maġġoranza ta' muta ġeni kimiċi, anormalitajiet im ġiegħela huma 
tat-tip kromatidu, i żda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' 
kromożomi. Dan il-metodu mhux inti ż biex jitkejlu l-anormalitajiet 
numeriċi u ma jintu żax bħala rutina g ħal dak il-g ħan. Mutazzjonijiet 
fil-kromo żomi u ġrajjiet relatati huma l-kaw ża ta' ħafna mard 
ġenetiku fil-bniedem.  
Dan it-test ikejjel l- ġrajjiet tal-kromo żomi fiċ-Ċelloli spermatogoni u, 
għalhekk, hu ma ħsub li jipprevedi l-mutazzjonijiet ġenetiċi fiċ-ċelluli 
ġerminali.  
Annimali gerriema jintu żaw generalment f'dan it-test. Dan it-test 
ċitoġenetiku ji żvela anormalitajiet fil-kromo żomi f'mitosi sperma ­
togoni. Ċelloli oħra mmirati mhumix l-o ġġett ta' dan il-metodu.  
Sabiex ji ġu żvelati anormalitajiet tat-tip kromatid f' Ċelloli sperma ­
togoni, għandha tiġi eżaminata l-ewwel divi żjoni taċ-ċellula mitotika 
qabel ma jintilfu dawn il-le żjonijiet f'divi żjonijiet sussegwenti ta ċ- 
Ċelloli. Tista’ tinkiseb informazzjoni addizzjonali minn Ċelloli sper ­
matogoni trattati bl-analisi tal-kromo żomi mejoti ċi għal anormal ­
itajiet tat-tip tal-kromo żomi fil-metafa żi tad-dijakinesis I meta ċ- 
Ċelloli ttrattati jsiru spermato ċiti. 
Dan it-test  in vivo  huwa inti ż biex jinvestiga jekk muta ġeni ta' 
Ċelloli somati ċi jkunux attivi f' Ċelloli ġerminali. B' żieda ma' dan, 
it-test spermatogonu huwa rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' meta ­
boliżmu in vivo , farmakokinetika u pro ċessi ta' tiswija ta' DNA.
 
Jeżisti numru ta' ġenerazzjonijiet ta' spermatogoni fit-testikoli bi 
spettru ta' sensitività g ħat-trattament kimiku. G ħalhekk, l-anormal ­
itajiet żvelati jirrappre żentaw rispons medju ta' popolazzjonijiet ta' 
Ċelloli spermatogoni ttrattati, bi predominanza ta' Ċelloli sperma ­
togoni differenzati li jkunu aktar numeru żi. Skond il-posizzjoni 
tagħhom fit-testikoli, ġenerazzjonijiet differenti ta' spermatogoni 
jistgħu jew ma jistg ħux ikunu esposti g ħal ċirkolazzjoni ġenerali, 
minħabba fil-barriera fi żika u fiżjoloġika ta' ċelluli Sertoli u l- 
barriera ematotestikolari.  
Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma 
jwasslux g ħat-tessut immirat, mhux xieraq li jintu ża dan it-test.  
Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Anormalità tat-tip kromatidu:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u g ħaqda mill- 
ġdid bejn kromatidi.  
Anormalità tat-tip tal-kromo żomi:  ħsara strutturali fil-kromo żomi 
espressa b ħala ksur, jew ksur u g ħaqda mill- ġdid, taż-żewġ kromatidi 
f'sit identiku.  
Vojt:  leżjoni akromatika i żgħar mill-wisg ħa ta' kromatid wie ħed, u 
b'misallinjament minimu tal-kromatidi.  
Anormalità numerika:  bidla fin-numru ta' kromo żomi min-numru 
karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.  
Poliplojdi:  multiplu tan-numru aplojdu ta' kromo żomi ( n) minbarra 
n-numru diplojdu (ji ġifieri 3 n, 4n, eċċetera).  
Anormalità strutturali:  bidla fl-istruttura tal-kromo żomi li wie ħed 
jinduna biha bl-e żami mikroskopiku ta' l-istadju metafa żiku tad- 
diviżjoni ta' ċelluli, osservati b ħala tħassir u bi ċċiet, bidliet minn 
ġewwa u bidliet bejniethom.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Annimali huma esposti g ħas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' 
espożizzjoni u huma sakrifikati f' ħinijiet xierqa wara t-trattament. 
Qabel ma ji ġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'sustanza li 
twaqqaf il-metafa żi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbag ħad isiru 
preparazzjonijiet ta' kromo żomi miċ-Ċelloli ġerminali u ji ġu 
mtebbgħin, u ċ-Ċelloli metafa żiċi jiġu analizzati g ħal anormalitajiet 
fil-kromo żomi. 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Selezzjoni ta' l-ispe ċi ta' l-annimali  
Normalment jintu żaw ħamsters ċiniżi u ġrieden. Madankollu, jistg ħu 
jintużaw l-annimali maskili ta' spe ċi oħra ta' mammiferi xierqa. 
Għandhom jintu żaw razez, li komunement jintu żaw fil-laboratorji, 
ta' annimali adulti b'sa ħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il- 
varjazzjoni fil-pi ż ta' l-annimali g ħandha tkun minima u ma 
teċċedix ± 20 % tal-medja tal-pi ż. 
1.4.1.2.  Kundizzjonijiet ta' fejn jin żammu u x'jieklu  
Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Intro ­
duzzjoni ġenerali għat-Taqsima B i żda l-mira dwar l-umdità g ħandha 
tkun 50-60 %.  
1.4.1.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati ming ħajr skema 
għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-ga ġeġ għandhom jitqieg ħdu 
b'tali mod li ji ġu minimizzati effetti possibbli li jirri żultaw minn kif 
jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali ji ġu identifikati wie ħed wieħed. L- 
annimali ji ġu akklimatizzati g ħall-kundizzjonijiet tal-laboratorju 
għall-inqas g ħal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewwbin jew sospi żi 
f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistg ħu jiġu 
ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il 
darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix la ċċettabbilità tal- 
ħażna.
 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Is-solvent/mezz ma g ħandux jipprodu ċi effetti tossi ċi fil-livelli ta' 
doża użata, u ma g ħandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni 
kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħra 
minflok dawk l-aktar mag ħrufa, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun 
appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tag ħhom. Hu 
rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' 
solvent/mezz akkwu ż. 
1.4.2.2.  Kontrolli  
Għandhom ji ġu inklużi f'kull test kontrolli po żittivi u negattivi fl- 
isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, 
l-annimali fil-gruppi tal-kontroll g ħandhom ji ġu trattati bl-istess mod 
bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.  
Il-kontrolli po żittivi għandhom jipprodu ċu anormalitajiet strutturali 
fil-kromo żomi in vivo  fiċ-Ċelloli spermatogoni meta ji ġu sommin ­
istrati f'livelli ta' espo żizzjoni li huma mistennija li jag ħtu żieda li 
tkun tidher fuq l-isfond.  
Dożi ta' kontroll po żittiv għandhom jing ħażlu sabiex l-effetti jkunu 
ċari iżda ma ji żvelawx immedjatament l-identità tad-dijapo żitivi 
kodifikati lil min jaqrahom. Huwa a ċċettat li l-kontroll po żittiv jiġi 
somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u 
jittieħed kampjun darba wa ħda biss. Barra minn dan, jista’ ji ġi kkun­
sidrat l-u żu ta' kimi ċi ta' kontroll po żittivi relatati mal-klassi ta' 
kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. E żempji ta' sustanzi ta' 
kontroll po żittivi jinkludu:  
Sustanza Nru CAS Nru EINECS  
Ċiklofosfamid 
Monojdrat ta ċ-ċiklofosfamid 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Ċiklohessilamina 108-91-8 203-629-0 
Mitomiċin-C 50-07-7 200-008-6 
Akrilamid monomeriku 79-06-1 201-173-7 Trietilenemelamina 51-18-3 200-083-5
 
Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod 
ieħor trattati bl-istess mod b ħall-gruppi tat-trattament, g ħandhom 
jiġu inklużi għal kull perjodu ta' te ħid ta' kampjuni, sakemm ma 
jkunux disponibbli varjabbilità a ċċettabbli bejn l-annimali u 
frekwenżi ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromo żomi mill-inform ­
azzjoni storika tal-kontroll. Barra minn dan, g ħandhom jintu żaw 
ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni 
ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u 
mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz mag ħżul. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Numru ta' l-annimali  
Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll g ħandu jinkludi fih g ħall-inqas 
ħames annimali maskili analizzabbli  
1.5.2.  Skeda tat-trattament  
Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati darba jew 
tnejn (jiġifieri bħala trattament singolu jew żewġ trattamenti). Is- 
sustanzi tat-test jistg ħu wkoll ji ġu somministrati b ħala doża 
maqsuma, ji ġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati 
b'mhux aktar minn ftit sig ħat, biex ti ġi faċilitata s-somministrazzjoni 
ta' volum qawwi ta' materjal. Re ġimi ta' do żi oħra għandhom ikunu 
ġustifikati xjentifikament.  
Fil-grupp ta' l-og ħla doża jittieħdu żewġ kampjuni wara t-trattament. 
Ladarba l-kinetika ta ċ-ċikli taċ-Ċelloli tista’ ti ġi influwenzata bis- 
sustanza tat-test, jintu żaw ħinijiet għat-teħid ta' kampjuni wie ħed 
bikri u l-ie ħor tard madwar 24 u 48 sieg ħa wara t-trattament. G ħal 
dożi ogħla mill-l-og ħla doża għandu jittie ħed żin ta' te ħid ta' 
kampjun ta' 24 sieg ħa jew ta' 1,5 it-tul ta ċ-ċiklu ta' ċellula wara t- 
trattament, sakemm ma jkunx mag ħruf li jkun hemm ħin ta' teħid ta' 
kampjun ie ħor aktar xieraq g ħall-iżvelar ta' l-effetti.  
B'żieda ma' dan, jistg ħu jintużaw ħinijiet ta' te ħid ta' kampjun o ħra. 
Per eżempju fil-ka ż ta' kimi ċi li jistg ħu jikkaw żaw telf ta' 
kromożomi, jew jistg ħu jkollhom effetti indipendenti mill-fa żi S, 
kull wieħed mill-ħinijiet ta' te ħid ta' kampjuni huwa xieraq.  
Il-konvenjenza ta' skeda ta' trattament ripetut g ħandha tiġi iden­
tifikata fuq ba żi ta' każ b'każ. Wara skeda ta' trattament ripetut l- 
annimali g ħandhom imbag ħad jiġu sakrifikati 24 sieg ħa (1,5 tul ta' 
ċiklu ta' ċellula) wara l-a ħħar trattament. Jistg ħu jintużaw ħinijiet ta' 
teħid ta' kampjun addizzjonali meta jkun xieraq.  
Qabel is-sagrifi ċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment 
b'doża xierqa ta' sustanza li twaqqaf l-metafa żi (eż. Colcemid® 
jew kolċiċina). Wara dan, jittie ħed kampjun mill-annimali f'intervalli 
xierqa. G ħall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 sieg ħat; 
għal Ħamsters ċiniżi dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5 sieg ħat. 
1.5.3.  Livelli ta' do ża 
Jekk jitwettaq studju biex ti ġi skoperta l-medda g ħax ma jkunx 
hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan g ħandu jsir fl-istess 
laboratorju, jintu żaw l-istess spe ċi, razza, sess u metodu ta' trattament 
li għandhom jintu żaw fl-istudju prin ċipali (7). Jekk ikun hemm 
tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' do ża għall-ewwel perjodu ta' te ħid 
ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' do ża għandhom jkopru medda mill- 
massimu g ħal ftit jew l-ebda tossi ċità. L-ogħla doża hija mfissra 
bħala s-sinjali ta' tossi ċità li jipprodu ċu d-dożi hekk li livelli og ħla 
tad-doża, bbażati fuq l-istess re ġim ta' do żaġġ, huma mistennija li 
jikkawżaw il-mewt.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Is-sustanzi b'attivitajiet bijolo ġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossi ċi 
(bħal ma huma ormoni u nitro ġeni) jistg ħu jkunu e ċċezzjonijiet 
għall-kriterji ta' l-issettjar tad-do żi u għandhom ji ġu valutati fuq 
bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-do ża li 
tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossi ċità fiċ-Ċelloli spermatogoni (e ż. 
riduzzjoni fil-paragun bejn mitosi spermatogoni u l-ewwel jew it- 
tieni metafasi mejotika; din ir-riduzzjoni ma g ħandhiex te ċċedi 
50 %).  
1.5.4.  Test tal-limitu  
Jekk test ta' do ża waħda ta' livell ta' g ħall-inqas 2 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem/ġurnata meta jitwettaq trattament wie ħed, jew b ħala żewġ 
trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipprodu ċix effetti tossi ċi li wieħed 
jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l- ġenotossiċità fuq il-ba żi 
ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun ne ċessarju li jsir studju komplet bl-u żu ta' tliet 
livelli ta' do żaġġ. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l- 
ħtieġa ta' livell og ħla ta' doża li għandu jintu ża fit-test tal-limitu.
 
1.5.5.  Somministrazzjoni ta' do żi 
Normalment is-sustanza tat-test ti ġi somministrata b'gavage billi 
jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew 
bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistg ħu jiġu 
aċċettati rotot o ħra ta' espo żizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li 
jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f' ħin wieħed 
jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'g ħandux 
ikun aktar minn 2 ml/100g pi ż tal-ġisem. L-u żu ta' volumi og ħla 
minn dawn g ħandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-ka ż ta' sustanzi li 
jirritaw jew korro żivi li normalment juru effetti aggravati b'kon ċen­
trazzjonijiet og ħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test g ħandha titnaqqas 
bl-aġġustament tal-kon ċentrazzjoni biex ji ġi żgurat volum kostanti 
fuq il-livelli kollha tad-do ża. 
1.5.6.  Preparazzjoni tal-kromo żomi 
Minnufih wara s-sagrifi ċċju, jinkisbu s-sospensjonijiet ta ċ-Ċelloli 
minn test wie ħed jew mi ż-żewġ testijiet, esposti g ħal soluzzjoni 
ipotonika u ffissati. I ċ-Ċelloli imbag ħad jinfirxu fuq dijapo żitivi u 
jingħataw kulur.  
1.5.7.  Anali żi 
Għandhom ji ġu analizzati g ħall-inqas 100 metafa żi mferxin sew g ħal 
kull annimal (ji ġifieri minimu ta' 500 metafa żi kull grupp). Dan in- 
numru jista’ jitnaqqas meta ji ġi nnotat g ħadd kbir ta' anormalitajiet. 
Id-dijapożitivi kollha, inklu żi dawk ta' kontrolli po żittivi u negattivi, 
għandhom ji ġu kodifikati indipendentement qabel l-anali żi mikros­
kopika. Billi l-pro ċeduri ta' fissazzjoni jirri żultaw ħafna drabi fil-ksur 
ta' għadd ta' metafa żi bit-telf ta' kromo żomi, iċ-Ċelloli li jing ħaddu 
għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali g ħan- 
numru 2n ± 2.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-informazzjoni dwar annimali individwali g ħandha ting ħata f'forma 
ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. G ħal kull annimal 
għandhom ji ġu valutati n-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet strutturali 
tal-kromo żomi u in-numru ta' anormalitajiet fil-kromo żomi f'kull 
ċellula. G ħandhom ji ġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet 
strutturali fil-kromo żomi bl-g ħadd u l-frekwenzi tag ħhom għal 
gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt ji ġi reġistrat separatament 
u jsir rapport dwaru i żda ġeneralment ma ji ġix inkluż fil-frekwenza 
totali ta' l-anormalità.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Jekk tiġi osservata l-mitosi kif ukoll il-mejosi, il-paragun bejn mitosi 
spermatogoni u l-ewwel u t-tieni metafa żi mejotiċi għandu jiġi 
determinat b ħala misura ta' ċitossiċità għall-annimali kollha trattati 
u ta' kontroll negattiv f'kampjun totali ta' 100 ċellula divisibbli g ħal 
kull annimal biex ji ġi stabbilit l-effett ċitotossiku possibbli. Jekk ti ġi 
osservata mitosi biss, l-indi ċi tal-mitosi g ħandu jiġi determinat 
f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal.  
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Hemm ħafna kriterji biex ji ġi stabbilit ri żultat pożittiv, bħal ma hi 
żieda relatata mad-do ża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli b'anormalitajiet 
fil-kromo żomi jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fi 
grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' te ħid ta' kampjuni. 
L-ewwel g ħandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijolo ġika tar-riżultati. 
Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet (8), jistg ħu 
jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma 
għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti g ħal riżultat pożittiv. 
Riżultati ekwivo ċi għandhom ji ġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferi ­
bilment billi tintu ża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.  
Sustanza ta' test li dwarha r-ri żultati ma jil ħqux il-kriterji fuq 
imsemmija titqies b ħala mhux muta ġenika f'dan it-test.  
Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-ri żultati 
jistgħu jibqgħu ekwivo ċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' 
drabi li jirrepeti ru ħu l-esperiment.  
Ir-riżultati pożittivi minn test  in vivo  ta' anormalitajiet fil-kromo żomi 
spermatogoni jindikaw li s-sustanza tat-test to ħloq anormalitajiet 
strutturali fi ċ-Ċelloli ġerminali ta' l-ispe ċi ttestjata. Ir-ri żultati 
negattivi jindikaw li, ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat- 
test ma to ħloqx anormalitajiet fi ċ-Ċelloli ġerminali ta' l-ispe ċi 
ttestjata.  
Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-meta ­
boliti tagħha jilħqu t-tessut immirat.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz;  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Annimali ttestjati:  
— speċi/razza użati; 
— numru u età ta' l-annimali;  
— għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jin żammu, dieta, e ċċ.; 
— piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inklu ża l-medda ta' 
piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard g ħal kull grupp.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;  
— raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-do ża; 
— raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;  
— dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— raġjuni prinċipali għall-ħinijiet tas-sagrifi ċċju; 
— konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test 
dieta/ilma g ħax-xorb g ħad doża attwali (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum) 
jekk tkun applikabbli;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;  
— deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u te ħid ta' 
kampjuni;  
— metodi biex titqies it-tossi ċità; 
— identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafa żi, il-konċentrazzjoni 
tagħha u kemm idum it-trattament;  
— metodi tal-preparazzjoni tad-dijapo żitivi;  
— kriterji g ħall-għadd ta' anormalitajiet;  
— numru ta' Ċelloli analizzati kull annimal;  
— kriterji biex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi. 
Riżultati:  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— indiċi mitotiku;  
— paragun bejn mitosi spermnatogoni u l-ewwel u t-tieni metafasi 
mejotiċi; 
— tip u numru ta' anormalitajiet, mog ħtija separatament g ħal kull 
annimal;  
— numru totali ta' anormalitajiet g ħal kull grupp;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn ikun possibbli;  
— analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv;  
— informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil- 
meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;  
— informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv;  
— bidliet fil-plojdi, jekk jidhru.  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. REFERENZI  
(1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Sperma ­
togonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Spec ­
ifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., 
Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477- 484.
 
(2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.  
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
 
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, 
Mutation Res., 52, pp. 207-209.  
(6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on 
Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.
 
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental 
Mutagen Society Working Group: Dose setting in  In vivo  Muta­
genicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  TEST TAT-TIKEK FIL-PIL TAL- ĠRIEDEN  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. TIFSIRA  
Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Dan huwa test  in vivo  tal-ġrieden li fih l-embriju li jkun qed 
jiżviluppa jkun espost g ħall-kimika. I ċ-Ċelloli li g ħalihom huwa 
mmirat it-test fl-embrija li jkun ċed jiżviluppa huma l-melanoblasts, 
u l-ġeni mmirati huma dawk li jikkontrollaw il-pigmentazzjoni tal- 
pil. L-embriji li jkunu qed ji żviluppaw huma eterozigoti g ħal numru 
ta’ dawn il- ġeni tal-kulur tal-pil. Tibdil fil-, jew telf ta’ (b’varjetà ta’ 
eventi ġenetiċi), l-allel dominanti ta’ din il- ġene f’melanoblast 
jirriżulta fl-espressjoni tal-fenotip re ċessiv fiċ-Ċelloli dixxendenti, li 
tikkostitwixxi tikka ta’ kulur mibdul fil-pil tal- ġurdien li jirri żulta. In- 
numru ta’ frie ħ b’dawn it-tikek, tibdil, jing ħadd u l-frekwenza 
tagħhom hija mqabbla ma’ dik fost il-frie ħ li jirriżultaw minn 
embriji trattati bis-solvent biss. It-test tal- ġrieden g ħat-tikek 
josserva tibdil somatiku pre żunt fiċ-ċelloli tal-fetu.  
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU G ĦAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Meta possibbli, il-kimi ċi tat-test g ħandhom ikunu ma ħlula jew 
sospiżi f’soluzzjoni miel ħa isotonika. Kimi ċi li ma jin ħallux fl-ilma 
jiġu maħlula jew sospi żi f’vetturi xierqa. Il-vettura u żata 
m’għandhiex tfixkel il-kimika tat-test jew tipprodu ċi effetti tossi ċi. 
Għandhom jintu żaw preparazzjonijiet ġodda tal-kimika tat-test.  
A n n i m a l i s p e r i m e n t a l i  
Il-ġrieden tar-razza T (nonagouti, a/a; ċinċilla, ta’ l-g ħajn roża, cchp/­
cchp; kannella, b/b; dilwiti, ta’ widnejhom qosra, d se/d se; animal 
b’tikek fil-pil ta’ żewġ ilwien, s/s) huma mg ħammra jew mar-razza 
HT (pallidi, nonagouti, brakjopodi, pa a bp/pa a bp; tentuxi gri ż, ln 
fz/ln fz; perla pe/pe) jew ma’ C57 BL (nonagouti, a/a). Qasmiet xierqa oħrajn bħal bejn NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) u DBA 
(nonagouti, a/a; kannella, b/b; dilwiti d/d) jistg ħu jintużaw jekk 
jipproduċu frieħ nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
I n - n u m r u u s - s e s s  
Għandhom ikunu trattati bi żżejjed annimali femminili tqal biex 
jipprovdu numru xieraq ta’ frie ħ li jgħixu għal kull livell tad-do ża 
użata. Id-daqs xieraq tal-kampjuni huwa skond in-numru ta’ tikek 
osservat fil- ġrieden trattati u l-iskala ta’ data ta’ kontroll. Ri żultat 
negattiv huwa a ċċettabbli biss meta jing ħaddu għall-inqas 300 fer ħ 
minn annimali tas-sess femminili trattati bl-og ħla doża. 
L - u ż u t a ’ k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Għandha tkun disponibbli data ta’ kontroll fl-istess ħin minn ġrieden 
trattati bil-vettura biss (kontrolli negattivi). Data storika ta’ kontroll 
mill-istess laboratorju jista’ jintu ża biex tiżdied is-sensitività tat-test 
jekk ikunu omo ġenji. Data ta’ kontroll po żittiv miksuba re ċentement 
fl-istess laboratorju g ħal trattament b’kimika mag ħrufa li turi l- 
mutaġeniċità b’dan it-test g ħandha tkun disponibbli jekk l-ebda 
mutaġeniċità tal-kimika tat-test ma tkunx osservata.  
R o t t a t a ’ l - a m m i n i s t r a z z j o n i  
Ir-rotot normali ta’ l-amministrazzjoni huma l-intubazzjoni orali jew 
l-injezzjoni fil-peritonew ta’ l-annimali tas-sess femminili li huma tqal. It-trattament permezz tat-te ħid bin-nifs jew rotot o ħra ta’ l- 
amministrazzjoni huma u żati meta xierqa.
 
L i v e l l i t a d - d o ż a 
Huma użati għall-inqas żewġ livelli tad-do ża inkluża waħda li turi 
sinjali ta’ tossi ċità jew daqs i żgħar tal-boton. G ħal kimiċi li 
m’humhiex tossi ċi għandha tkun u żata espożizzjoni g ħall-ogħla 
doża prattikabbli.  
Proċedura  
Ġeneralment jing ħata trattament wie ħed fil-ġurnata 8, 9 jew 10 tat- 
tqala, u l- ġurnata meta kien osservat it-tapp va ġinali għall-ewwel 
darba ting ħadd bħala ġurnata wa ħda. Dawn il- ġranet jikkorrispondu 
ma’ 7,25, 8,25, u 9,25 ġurnata wara l-kon ċepiment. Jistg ħu jintużaw 
trattamenti su ċċessivi f’dawn il- ġranet.  
A n a l i ż i 
Il-frieħ jingħataw kodi ċi u jiġu eżaminati g ħat-tikek bejn tlieta u 
erba’ ġimgħat wara t-twelid. Hemm tlett klassijiet ta’ tikek li 
jingħażlu: 
(a) tikek bojod sa 5 mm mil-linja f’nofs i ż-żaqq li huma pre żunti li 
jirriżultaw mill-qtil ta ċ-Ċelloli (WMVS);  
(b) tikek sofor, li jixb ħu lill-agouti, asso ċjati mal-mammae, l-organi 
ġenitali, il-gri żmejn, mal-partijiet ta’ l-abt u ingwinali u f’nofs il- 
moħħ, li huma pre żunti li jirri żultaw mill-middivrenzar (MDS); u  
(ċ) tikek pigmentati u bojod mqassmin bl-addo ċċ fuq il-pil li huma 
preżunti li jirri żultaw minn tibdil somatiku (RS).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
It-tlett klassijiet huma e żaminati kollha imma l-a ħħar klassi biss, RS, 
hija ta’ rilevanza ġenetika. Problemi ta’ distinzjoni bejn MDS u RS 
jistgħu ikunu solvuti permezz ta’ mikroskopija fluworixxenti ta’ 
kampjuni tax-xag ħar tal-pil.  
Anormalitajiet morfolo ġiċi kbar li huma ovvji tal-frie ħ għandhom 
ikunu nnotati.  
2. ID-DATA  
Id-data g ħandha tkun ippre żentata bħala numru totali ta’ frie ħ 
eżaminati u n-numru ta’ dawk li g ħandhom tikka wa ħda jew iżjed 
li huma pre żunti li huma tikek tat-tibdil somatiku. Data tat-trattament 
u tal-kontroll negattiv huma mqabbla permezz ta’ metodi xierqa. Id- data hija ppre żentata ukoll fuaq ba żi skond il-boton.
 
3. IR-RAPPURTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandhu jkollu, fejn huwa possibbli, l-inform ­
azzjoni il ġejja: 
— ir-razez ta’ l-annimali u żati fil-qsim;  
— in-numru ta’ annimali femminili tqal fil-grupp ta’ sperimen ­
tazzjoni u ta’ kontroll;  
— Id-daqs medju tal-boton tal-frie ħ fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u 
ta’ kontroll fil- ħin tat-twelid u fil- ħin tal-ftim;  
— Il-livell/livelli tad-do ża tal-kimika tat-test;  
— Is-solvent u żat; 
— Il-ġurnata tat-tqala li fiha ng ħata t-trattament;  
— Ir-rotta tat-trattament;  
— In-numru totali ta’ frie ħ eżaminat, u n-numru li g ħandhom 
WMVS, MDS u RS fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u ta’ kontroll;  
— Anormalitajiet morfolo ġIċI kbar;  
— Ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-risposta ta’ l-RS meta possibbli;  
— valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  IT-TRASLOKAZZJONI TAL- ĠRIEDEN LI TITTIE ĦED 
1. METODU  
1.1 INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2 DEFINIZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3 IS-SOSTANZI TAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
It-test tat-traslokazzjoni tal- ġrieden li tittie ħed jiskopri it-tibdiliet 
strutturali u numeri ċi fil-kromo żomi fiċ-ċelloli mammarji tal-mikrob 
kif rkuprati fil-wild ta’ l-annimali ta’ l-ewwel ġenerazzjoni. It-tipi ta’ 
tibdiliet fil-kromo żomi skoperti huma traslokazzjonijiet re ċiproċi u, 
jekk il-wild femminili jkunu inklu żi, it-telf tal-kromo żom-X. Dawk li 
jġorru t-traslokazzjonijiet u il-femminili-XO juru fertilità mnaqqsa li 
hija użata biex jintg ħażel il-wild ta’ l-annimali F  1 għall-analiżi 
ċitoġenetika. L-isterilità kompleta hija kkaw żata minn ċerti tipi ta’ 
traslokazzjonijiet (X-autosome u tat-tip c-t). It-traslokazzjonijiet huma osservati ċitoġenetikament fi ċ-ċelloli mejoti ċi fil-metafa żi 
tad-dijakinesi I ta’ l-individwi maskili, jew ir ġiel F
 1 jew il-wild 
irġiel tan-nisa F  1 . In-nisa-XO huma ċitoġenetikament identifikati 
mill-presenza ta’ 39 kromo żomi biss fil-mitosi tal-mudullun ta’ l- 
għadma.  
1.5 IL-KRITERJU TAL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Il-preparazzjonijiet  
Il-kimiċi tat-testijiet huma ma ħlulin fl-ilma tal-mel ħ isotoniku. Jekk 
ikunu insolubbli dawn ji ġu maħlula jew sospi żi fil-vetturi adattati. Is- 
soluzzjonijiet ippreparati friski tal-kompost tat-test ji ġu użati. Jekk 
vettura hija u żata biex ikun fa ċilitat id-dosa ġġ, dan m’g ħandu ifixkel 
il-kompost tat-test jew jipprodu ċi effetti tossi ċi. 
I l - m o d t a ’ l - a m m i n i s t r a z z j o n i  
Il-modi ta’ l-amministrazzjoni huma normalment intubazzjoni orali 
jew injezzjoni fil-peritonew. Il-modi l-o ħra ta’ l-amministrazzjoni 
jistgħu jkunu adattati.  
L - a n n i m a l i t a ’ l - e s p e r i m e n t a z z j o n i  
Biex ikunu fa ċilitat it-tag ħmir u l-verifikazzjonijiet ċitoloġika dawn l- 
esperimenti huma mag ħmula fuq il- ġrieden. L-ebda razza ta’ ġurdin 
m’hija me ħtieġa. Madanakollu, il-medja tad-daqs tal-boton tar-razza 
għandu jkun aktar minn tmienja u g ħandu jkun relattivament 
kostanti.  
Annimali b’sa ħħithom u maturi sesswalment huma u żati. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
I n - n u m r u t a ’ l - a n n i m a l i  
In-numru ta’ l-annimali ne ċessarju jiddependi fuq il-frekwenza 
spontanja tat-traslokazzjoni u r-rata minima ta’ induzzjoni me ħtieġa 
għal riżultati pożittivi.  
It-test huwa normalment mag ħmul permezz ta’ anali żi tal-wild ir ġiel 
F 1 . Minn ta’ l-anqas 500 wild ir ġiel F  1 għandhom ikunu ttestjati g ħal 
kull grupp ta’ do ża. Jekk il-wild nisa F  1 ikunu nklu żi, 300 raġel u 
300 mara huma me ħtieġa. 
L - u ż u t a l - k o n t r o l l i n e g a t t i v i u p o ż i t t i v i  
Id-data adattata tal-kontroll, miksuba mill-kontroll konkorrenti u 
storiku g ħandha tkun disponibbli. Meta’ r-ri żultati pożittivi aċċet­
tabbli tal-kontroll huma disponibbli mill-esperimenti mag ħmula 
riċentement fl-istess laboratorju dawn ir-ri żultati jistg ħu jkunu u żati 
minflok il-kontroll konkorrenti po żittiv. 
I l - l i v e l l i t a d - d o ż a 
Il-livell wie ħed tad-do ża huwa ttestjat, normalment l-g ħola doża 
assoċċjata mal-produzzjoni ta’ l-effetti tossi ċi minimi, i żda 
mingħajr ma’ taffettwa l-a ġir riproduttiv jew is-soppravivenza. Biex 
tkun stabbilita relazzjoni do ża/rispons żewġ dożi addizzjonali aktar 
baxxi huma me ħtieġa. Għall-kimiċi li mhumiex tossi ċi l-espożizzjoni 
għad-doża massima prattikabbli g ħandhu tkun u żata. 
Il-proċedura  
I t - t r a t t a m e n t u t - t g ħ a m m i r  
Żewġ ċedoli ta’ trattament huma disponibbli. L-amministrazzjoni 
waħda tas-sostanzi tat-test hija dik l-aktar u żata. L-amministrazzjoniji 
tas-sostanza tat-test fuq sebat ijiem fil- ġimgħa għal 35 ġurnata tista’ 
wkoll tkun u żata. In-numri ta’ tg ħammiriet wara t-trattament huma 
kontrollati mi ċ-ċedola tat-trattament u g ħandu jiżgura li kull stadju 
taċ-ċellola tal-mikrobu trattata jkun me ħud kampjun minnu. Fl-a ħħar 
tal-perjodu tat-tg ħammir in-nisa ji ġu msakkra f’ga ġeġ separati. Meta’ 
n-nisa jwelldu, id-data, id-daqs tal-boton u s-sess tal-wild g ħandhom 
ikunu rekordjati. L-ulied ir ġiel kollha jinfatmu u l-ulied nisa huma 
mormija sakemm dawn ma jkunux inklu żi fl-esperiment.  
L - i t t e s t j a r g ħ a t - t r a s l o k a z z j o n i j i e t e r o ż i g o ż i t a ’  
Wieħed miż-żewġ metodi possibli huwa u żat: 
— L-ittestjar tal-fertilità ta’ l-ulied F  1 u l-verifikazzjoni sussegwenti 
ta’ dawk li possibilment i ġorru t-traslokazzjoni bl-anali żi ċitoġe­
netika;  
— L-anali żi ċitoġenetika ta’ l-ulied ir ġiel F  1 kollha ming ħajr għażla 
minn qabel bl-ittestjar tal-fertilità.  
(a) L-ittestjar tal-fertilità  
Il-fertilità mnaqqsa ta’l-individwu F  1 tista’ tkun stabbilita bl- 
osservazzjoni tad-daqs tal-boton u/jew l-anali żi tal-kontenut ta’ 
l-utru tas-sie ħba nisa.  
Il-kriterji biex tkun determinata l-fertilità normali u mnaqqsa 
għandhom ikunu stabbiliti g ħar-razza tal- ġrieden użata. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
L-osservazzjoni tad-daqs tal-boton: L-ir ġiel F  1 li għandhom 
ikunu ttestjati g ħandhom ikunu maqfula ġo gaġeġ individ­
walment man-nisa jew mill-istess esperiment jew mill-kolonja. Il-gaġeġ huma spezzjonati kuljum mit-18 il- ġurnata wara t- 
tgħammir. Id-daqs tal-boton u s-sess ta’ l-ulied F
 2 huma 
rrekordjati mal-wild u l-botnijiet huma mormija minn dak in- 
nhar ‘l hemm. Jekk l-ulied nisa F  1 ikunu ttestjati l-ulied F  2 tal- 
botnijiet i ż-żgħar huma mi żmuma għall-aktar testijiet. Dawk li 
jġorru t-traslokazzjoni u huma nisa huma verifikati bl-anali żi 
ċitoġenetika g ħal traslokazzjoni fi kwalunkwe mill-ulied ir ġiel 
tagħhom. In-nisa-XO huma mag ħrufa mill-bidla fir-rata 
mqabbla tas-sess fost l-ulied tag ħhom minn 1:1 sa 1:2 ir ġiel vs. 
nisa. Fil-pro ċedura sekwenzali, l-annimali normali F  1 huma 
eliminati minn aktar testijiet jekk l-ewwel boton F  2 jilħaq jew 
jaqbeż il-valur normali predeterminat, altrimenti boton it-tieni jew 
it-tielet boton F  2 huwa osservat.  
L-annimali F  1 li ma jistg ħux ikunu klassifikati b ħala normali 
wara l-osservazzjoni ta’ sa tlett botnijiet F  2 jiġu jew ittestjati 
aktar bl-anali żi tal-kontenut ta’ l-utru tas-sie ħba nisa jew diret ­
tament so ġġetti għall-analiżi ċitoġenetika.  
L-analiżi tal-kontenut ta’ l-utru: It-tnaqqis fid-daqs tal-boton ta’ 
dawk li j ġorru t-traslokazzjoni huwa min ħabba għall-mewt 
embrijonika u g ħalhekk numru kbir ta’ impjanti mejta huwa 
indikattiv tal-pre żenza tat-traslokazzjoni fl-annimal li qed ji ġi 
ttestjat. L-ir ġiel F  1 li għandhom ikunu ttestjati g ħandhom ikunu 
mgħammra ma’ tnejn jew tlett nisa kull wie ħed. Il-kon ċepiment 
huwa stabbilit bl-ispezzjoni ta’ kuljum g ħall-plakek tal-va ġina 
kull filgħodu. In-nisa huma sakrifikati minn 14 sa 16 il-jum 
wara u l-impjanti ħajjin u mejtin fl-utri tag ħhom huma rekordjati.  
(b) L-anali żi ċitoġenetika  
Il-preparazzjonijiet tat-test huma mag ħmula bit-teknika tat-tnixxif 
bl-arja. Dawk li j ġorru t-traslokazzjoni huma identifikati bil- 
presenza ta’ konfigurazzjonijiet multivalenti fil-metfa żi dijakinesi 
I fl-ispermato ċiti primarji. L-osservazzjoni ta’ mill-anqas żewġ 
ċelloli bl-asso ċjazzjoni multivalenti tikkostitwixxi l-evidenza 
meħtieġa li l-annimal ittestjat huwa dak li j ġorr it-traslokazzjoni.  
Jekk l-ebda selezzjoni ta’ tg ħammir ma tkun saret l-ir ġiel F  1 
kollha huma spezzjonati ċitoġenetikament. Il-minimu ta’ 25 
ċellola tal-metafa żi dijakine żi I għal kull ra ġel għandu jkun 
milħuq mikroskopikament. L-e żaminazzjoni tal-metafa żi 
mitotika, fl-ispermatogonia jew l-g ħadma tal-mudullun, hija 
meħtieġa fl-irġiel F  1 bit-testikoli żgħar u t-tnaqqis mejotiku 
qabel id-dijakine żi jew mis-sospetti tan-nisa F  1 . Il-presenza ta’ 
kromożoma twila u/jew qasira b’mod abnormali f’kull wa ħda 
mill-10 ċelloli hija evidenza g ħat-traslokazzjoni partikolari ta’ l- 
irġiel sterili (tip c-t). Xi ftit traslokazzjonijiet X-awtosomati ċi li 
jikkawżaw l-isterilità fl-ir ġiel jistgħu biss ikunu identifikati bl- 
analiżi tal-gruppi tal-kromo żomi mitoti ċi. Il-presenza ta’ 39 
kromożomi fl-10 mito żi kollha hija evidenza g ħall-kundizzjoni 
XO f’mara.  
2. ID-DATA  
Id-data hija pre żentata fil-forma ta’ tabelli.  
Il-medja tad-daqs tal-boton u r-rata tas-sess mit-tag ħmir tal-ġenituri 
fit-twelid u l-ftiem huma rappurtati g ħal kull intervall ta’ tg ħammir.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Għall-assessjar tal-fertilità ta’ l-annimali F  1 , il-medja tad-daqs tal- 
boton ta’ tg ħammiriet kollha normali u d-daqsijiet tal-botnijiet indi ­
vidwali ta’ dawk li j ġorru t-traslokazzjoni F  1 huma pre żentati. Għall- 
analiżi tal-kontenut ta’ l-utru, il-medja tan-numru ta’ l-impjanti ħajjin 
u mejtin ta’ tg ħammiriet normali u n-numri individwali ta’ l-impjanti 
ħajjin u mejtin g ħal kull tg ħammira ta’ dawk li j ġorru t-traslo ­
kazzjoni F  1 huma rappurtati.  
Għall-analiżi ċitoġenetika tal-metafa żi-dijakine żi I, in-numri tat-tipi 
tal-konfigurazzjonijiet multivalenti u n-numru totali ta ċ-ċelloli huma 
mniżżla għal kull wie ħed li jġorr it-traslokazzjoni.  
Għall-individwi F  1 sterili, in-numru totali tat-tg ħammiriet u t-tul tal- 
perjodu tat-tg ħammir huma rappurtati. Il-pi ż tat-testikoli u d-dettalji 
ta’ l-anali żi ċitoġenetika huma mog ħtija. 
Għan-nisa XO, il-medja tad-daqs tal-boton, ir-rata tas-sess ta’ l-ulied 
F 2 u r-riżultati ta’ l-anali żi ċitoġenetika huma rappurtati.  
Fejn ikunu possibli dawk li j ġorru t-traslokazzjoni F  1 huma 
magħżula minn qabel bit-testijiet tal-fertilità, it-tabelli g ħandhom 
jinkludi l-informazzjoni fuq kemm minn dawn kienu konfermati eterożigoti tat-traslokazzjoni.
 
Id-data mill-kontrolli negattivi u l-esperimenti po żittivi tal-kontroll 
huma rappurtati.  
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1 IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandhu, jekk possibbli, jkun fih l-informazzjoni li 
ġejja: 
— ir-razza tal- ġrieden, iż-żmien ta’ l-annimali, il-pi ż ta’ l-annimali 
trattati;  
— in-numri ta’ l-annimali ġenituri ta’ kull sess fil-gruppi esperi ­
mentali jew kontrollati;  
— il-kundizzjonijiet ta’ l-ittestjar, id-deskrizzjoni dettaljata tat-trat ­
tament, il-livelli tad-do ża, is-solventi, i ċ-ċedola tat-tg ħammir;  
— in-numru u s-sess ta’ l-ulied g ħal kull mara, in-numru u s-sess ta’ 
l-ulied mi żjud għall-analiżi tat-traslokazzjoni;  
— il-ħin u l-kriterji g ħall-analiżi tat-traslokazzjoni;  
— in-numru u d-deskrizzjoni dettaljata ta’ dawk li j ġorru t-traslo ­
kazzjoni, inklu ża d-data tat-tg ħammir u d-data tal-kontenut ta’ l- 
utru, jekk applikabbli;  
— il-proċeduri ċitoġenetiċI u d-detallji ta’ l-anali żi mikroskopika, 
preferibbilment bl-istampi;  
— il-valutazzjoni statistika;  
— id-diskussjoni tar-ri żultati;  
— l-interpretazzjoni tar-ri żultati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2 IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. IR-REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  EŻAMI TA’ TOSSI ĊITA ORALI SUB-KRONIKU 
ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI 
RIPETUTA TA’ DO ŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-U ŻU TA’ 
SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA  
1. METODU  
Il-metodu g ħat-test tat-tossi ċità orali sub-kronika huwa replika ta’ l- 
OECD TG 408 (1998)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi ta’ 
kemikali, id-determinazzjoni tat-tossi ċità orali sub-kronika bl-u żu 
ta’ dożi repetuti tista’ ssir wara li l-informazzjoni tal-bidu fuq it- 
tossiċità tinkiseb mit-testijiet g ħat-tossiċità b’do ża akuta jew 
repetuta g ħal 28 jum. L-istudju ta’ 90 jum jipprovdi informazzjoni 
fuq il-perikli g ħas-saħħa possibbli li fa ċilment jista’ jkun hemm 
minħabba espo żizzjoni repetuta fuq perjodu imtawwal ta’ żmien li 
jkopri l-maturazzjoni u t-tkabbir minn wara l-ftim sal-fa żi adulta. L- 
istudju se jipprovdi informazzjoni fuq l-effetti tossi ċi prinċipali, 
jindika l-organi b ħala mira u l-possibiltà ta’ akkumulazzjoni, u 
jista’ jipprovdi kalkolu ta’ livell ta’ espo żizzjoni bl-ebda effett 
avvers osservat li jista’ jintu ża fl-għażla tal-livelli ta’ do ża għal 
studji kroni ċi u biex ji ġu stabbiliti kriterji ta’ sigurtà g ħall- 
espożizzjoni umana.  
Il-metodu jkompli jenfasizza l- endpoints  newrolo ġiċi u jagħti indi­
kazzjoni ta’ effetti immunolo ġiċi u riproduttivi. Ting ħata importanza 
wkoll għall-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet klini ċi bil-galbu ta’ l- 
annimali, sabiex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Dan l- 
istudju g ħandu jippermetti l-identifikazzjoni tal-kemikali bil- 
potenzjal li jikkaw żaw effetti newrotossi ċi, immunolo ġiċi jew 
organi riproduttivi, li jistg ħu jwasslu g ħal iktar investigazzjoni bir- 
reqqa.  
Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Id-doża: huwa l-ammont tas-sustanza tat-test somministrat. Id-do ża 
tissarraf f’pi ż (g, mg) jew f’pi ż tas-sustanza tat-test per unit tal-pi ż 
ta’ l-annimal g ħat-test (eż. Mg/kg), jew f’kon ċentrazzjonijiet dieteti ċi 
kostanti (ppm).  
Id-dożaġġ: huwa terminu ġenerali li jikkomprendi d-do ża, il- 
frekwenza tag ħha u t-tul ta ż-żmien tad-do żaġġ. 
NOAEL:  hija l-abbrevjazzjoni g ħal no-observed-adverse-effect level  
(livell bl-ebda effett avvers osservat) u huwa l-og ħla livel ta’ do ża 
fejn l-ebda sejbiet relatati ma’ trattament avers ma ġew osservati.  
1.3 PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza sperimentali g ħanda tkun somministrata kuljum, b’mod 
orali, f’do żi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, 
doża waħda għal kull grupp g ħall-perjodu ta’ 90 jum. Matul il- 
perjodu ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati mill-qrib għal sinjali ta’ tossi ċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul l- 
istudju huma sottoposti g ħall-nekroskopija, u fi tmiem it-test dawk 
l-annimali li jsalvaw ji ġu maqtula wkoll u sottoposti g ħan-nekros ­
kopija.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  It-t ħejjija ta’ l-annimali  
Għandhom ji ġu użati annimali b’sa ħħithom li jkunu adattaw ru ħhom 
għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mill-inqas 5 ijiem u li ma 
kienux su ġġetti għal preoċeduri sperimentali qabel. L-annimali g ħat- 
test għandhom ikunu karatterizzati skond l-ispe ċje, ir-razza, is-sors, 
is-sess, il-pi ż u/jew l-età. L-annimali g ħandhom ji ġu assenjati g ħall- 
gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Il-ga ġeġ għandhom jitqieg ħdu 
b’tali mod li l-effetti possibbli min ħabba t-tqeg ħid tal-gaġġa jiġu 
minimizzati. Kull annimal g ħandu jkollu numru ta’ identifikazzjoni.  
1.4.2.  It-t ħejjija tad-do żi 
Is-sustanza g ħat-test tiġi somministrata bil-fors jew fid-dieta jew fl- 
ilma għax-xorb. Il-metodu tas-somministrazzjoni orali jiddependi 
mill-għan ta’ l-istudju, u mill-proprjetatjiet fi żiko/kimiċi tal-materjal 
għat-test.  
Fejn hu me ħtieġ, is-sustanza g ħat-test tin ħall jew tiġi sospiża f’mezz 
xieraq. Huwa rakkomandabbli li, kull fejn hu possibbli, ji ġi kkun­
sidrat l-ewwel l-u żu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea, u wara ti ġi 
kkunsidrata soluzzjoni/emulsjoni fi ż-żejt (eż. Iż-żejt tal-qam ħ) 
imbagħad bis-soluzzjoni possibbli f’mezzi o ħra. Għall-mezzi li 
mhumiex ilma l-karatteristi ċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu mag ħrufa. 
L-istabilità tas-sustanza g ħat-test taħt il-kundizzjonijiet ta’ somminis ­
trazzjoni g ħandha tiġi determinata.  
1.4.3.  Il-Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.3.1.  L-annimali sperimentali  
L-ispeċi l-aktar preferit huwa l-far g ħalkemm jisg ħu jintużaw speċi 
gerriema o ħra, eż. Il-ġurdien. G ħandhom jintu żaw razez li huma 
komunement utilizzati fil-laboratorju ta’ annimali żgħar u b’sa ħ­ 
ħithom. In-nisa qatt ma jkunu welldu u mhmiex tqal. Id-do żaġġ 
għandu jibda kemm jista’ jkun malajr wara l-ftim u qabel ma l- 
annimali jkollhom disa’ ġimghat. Fil-bidu ta’ l-istudju, il-varjazzjoni 
fil-piż ta’ l-annimali u żati m’għandux jaqbe ż + 20 % tal-valur medju 
ta’ kull sess. Fejn isir studju preliminari g ħal studju fit-tul fuq it- 
tossiċità kronika, annimali mill-istess razza u spe ċi għandhom 
jintużaw fiż-żewġ studji.  
1.4.3.2.  In-numru u s-sess  
Mill-inqas 20 annimal (10 nisa u 10 r ġiel) għandhom jintu żaw f’kull 
livell tad-do ża. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru g ħandu 
jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel tmiem l- 
istudju. Skond l-g ħarfien ta’ qabel dwar l-analogu kemikali jew 
magħluq, għandu jiġi kkunsidrat li ji żdied grupp satellita ta’ 
għaxar annimali ( ħamsa għal kull sess) fil-grupp ta’ kontroll u ta’ 
l-ogħla doża għall-osservazzjoni tar-riversibbiltà jew tal-persistenza 
ta’ kwalunkwe effetti tossi ċi, wara l-perjodu ta’ trattament. It-tul ta’ 
żmien ta’ dan il-perjodu post-trattament g ħandu jiġi determinat 
b’mod xieraq skond l-effetti li ġew osservati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Il-livelli tad-do ża 
Ghandhom jintu żaw mill-inqas tlett livelli ta’ do ża u kontroll wie ħed, 
ħlief fejn hemm test ta’ limitu (ara 1.4.3.4.). Il-livelli tad-do ża jistgħu 
jkunu bba żati fuq ir-ri żultati tad-do ża repetuta jew ta’ l-istudju tas- 
sejbiet tal-meddda u g ħandhom jikkunsidraw kwalunkwe data tossi ­
koloġika u tossikokinetika disponibbli li te żisti għas-sustanza tat-test 
jew l-annimali relatati. Sakemm ma tkunx limitata min-natura fi żiko- 
kemikali jew l-effetti bijolo ġiċi tas-sustanza g ħat-test, l-og ħla livell 
ta’ doża għandu jiġi magħżul bl-għan li jġib it-tossi ċità iżda mhux il- 
mewt jew it-tbatija qawwija. Sekwenza nie żla tal-livell ta’ do ża 
għandha ting ħażel bl-għan li turi kwalunkwe rispons relata mad- 
dożaġġ u l-livell b’ebda effett avvers osservat (NOAEL) fl-iktar 
livell baxx tad-do ża. Intervalli t wo to four fold  huma ta’ spiss 
ottimali biex ji ġu ssettjati il-livelli ne żlin tad-do ża u ż-żieda tar- 
raba’ grupp g ħat-test huwa ppreferut ta’ spiss iktar mill-intervalli 
kbar (eż. iktar minn fattur ta’ bejn wie ħed u ieħor 6-10) bejn id- 
dożaġġi. 
Il-grupp ta’ kontroll g ħandu jkun grupp mhux trattat jew grupp ta’ 
kontroll b’mezz jekk il-mezz jintu ża fis-somministrazzjoni tas- 
sustanza g ħat-test. Ħlief għat-trattament bis-sustanza g ħat-test, l- 
annimali fil-grupp ta’ kontroll g ħandhom ji ġu trattati bl-istess mod 
ta’ dawk fil-gruppi g ħat-test. Jekk jintu ża l-mezz, il-grupp ta’ 
kontroll g ħandu jirċievi l-mezz fl-og ħla volum u żat. Jekk sustanza 
għat-test tiġi somministrata fid-dieta u tikkaw ża dħul dietetiku 
mnaqqas, imbag ħad grupp ta’ kontroll li jkun ġie magħluf jista’ 
jgħin jiddistingwu bejn tnaqqis min ħabba l-palatabilità jew 
minħabba l-alterazzjonijiet tossikolo ġiċi fil-mudell g ħattest.  
Il-karatteristi ċi tal-mezz u additivi o ħra li ġejjin għandhom ji ġu 
kkunsidrati kif xieraq: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu, jew ir-retenzjoni tas-sustanza g ħat-test; u l-effetti 
fuq il-konsum ta’ l-ikel u x-xorb jew fuq l-istatus nutrizzjonali ta’ 
l-annimali.
 
1.4.3.4.  It-test tal-limitu  
Jekk test f’livell wie ħed ta’ do ża ekwivalenti g ħal mill-inqas 1 000 
mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/ġurnata, bl-u żu tal-proċeduri deskritti g ħal 
dan l-istudju, jipprodu ċi in- no-observed-adverse-effects  (l-ebda 
effetti b’avvers mhux osservat) u jekk it-tossi ċità ma tkunx 
mistennija bba żata fuq id-data minn sustanzi relatati strutturalment, 
allura studju komplut bl-u żu ta’ tliet livelli ta’ do ża ma jkunx 
meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espo żizzjoni umana 
tindika il- ħtieġa li jiġi użat livell og ħla ta’ doża. 
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Is-somministrazzjoni tad-do żi 
L-annimali jing ħataw id-do żaġġ bis-sustanza g ħat-test sebat ijiem 
kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 jum. Kwalunkwe  regime  ta’ 
dożaġġ ieħor, eż. Ħamest ijiem fil- ġimgħa, irid ikun ġustifikat. 
Meta s-sustanza g ħat-test tiġi somministrata bil-fors, dan g ħandu 
jsir f’doża waħda bl-użu ta’ tubu g ħall-istonku jew intubazzjoni  
cannula  xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ ji ġi sommin ­
istrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal. Il-volum m’g ħandux 
ikun iktar minn 1 ml/100g tal-pi ż tal-ġisem, ħlief fil-ka ż ta’ 
soluzzjonijiet akwei fejn 2 ml/100g tal-pi ż tal-ġisem jista’ jintu ża. 
Ħlief għal sustanzi korru żivi jew ta’ irritazzjoni, li normalment 
jiżvelaw effetti ag ħar b’konċentrazzjonijiet og ħla, il-varjabbiltà fil- 
volum tat-test g ħandha tipi minimizzata billi ti ġi aġġustata l-kon ċen­
trazzjoni sabiex ti ħgura volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Għal dawk is-sustanzi somministrati permezz tad-dieta jew l-ilma 
għax-xorb huwa importanti li ji ġi żgurat li l-kwantitajiet tas- 
sustanza g ħat-test involuta ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew 
il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta s-sustanza g ħat-test hija somministrata 
fid-dieta jew kon ċentrazzjoni dietetika kostanti (ppm) jew livell ta’ 
doża kostanti f’termini tal-pi ż tal-ġisem ta’ l-annimal jistg ħu 
jintużaw. L-użu alternattiv irid ji ġi speċifikat. Għas-sustanza li ti ġi 
somministrata bil-fors, id-do ża għandha ting ħata f’ħinijiet simili 
kuljum, u a ġġustata kif ikun me ħtieġ sabiex jin żamm livell ta’ 
doża kostanti f’termini tal-pi ż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn qed 
jintuża studju ta’ 90 jum b ħala studju preliminarju g ħal dak li jtul 
dwar it-tossi ċità kronika, g ħandha tintu ża dieta simili fi ż-żewġ studji.  
1.5.2.  L-osservazzjonijiet  
Il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħandu jkun mill-inqas ta’ 90 jum. L- 
annimali fi grupp satellita li huma skedati g ħal follow-up  ta’ l-osser ­
vazzjonijiet g ħandhom jin żammu għal perjodu xieraq ming ħajr trat­
tament sabiex tidher il-persistenza ta’, jew l-irkupru mill-effetti 
tossiċi. 
L-osservazzjonijiet klini ċi ġenereali g ħandhom isiru mill-inqas darba 
kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum, waqt illi ji ġi 
meqjus il-perjodu  peak  ta’ l-effetti anti ċipati wara d-do żaġġ. Il- 
kundizzjoni klinika ta’ l-annimali g ħandha tiġi rrekordjata. Mill- 
inqas darbtejn kuljum, normalment fil-bidu u fi tmiem il-jum, l- 
annimali kollha ji ġu spezzjonati g ħal sinjali ta’ morbidità jew ta’ 
mortalità.  
Ta’ l-inqas darba qabel l-ewwel espo żizzjoni (sabiex ikun hemm lok 
għall-paraguni fi ħdan is-su ġġett), u darba fil- ġimgħa wara dan, l- 
osservazzjonijiet klini ċi dettaljati g ħandhom isiru g ħall-annimali 
kollha. Dawn l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru barra l-ga ġġa fejn 
jitpoġġew, preferebbilment f’arena standard u f’ ħinijiet simili kull 
darba. Għandhom ji ġu rrekordjati tajjeb, preferebbilment bl-u żu ta’ 
sistemi ta’ mmarkar, definiti b’mod ċar mil-laboratorju g ħall-ittestjar. 
Għandu jsir sforz sabiex ji ġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil- 
kundizzjonijiet ta’ l-osservazzjoni huma minimali. Is-sinjali nnutati għandhom jinkludu, i żda mhux ikunu limitati g ħalihom, it-tibdil fil- 
ġilda, fil-pil, fl-g ħajnejn, fil-membrani muku żi, l-okkorrenza ta’ 
tnixxija u ta’ l-eskrementi u ta’ l-attività awtonomika (e ż. il-lakri­
mazzjoni, il-  pilo-erection , id-daqs tal-pupill, is-sistema respiratorja 
mhux normali). It-tibdil fil-mixja, fil-po żizzjoni u r-rispons g ħall- 
imaniġġjar kif ukoll il-pre żenza ta’ ċaqliq kloniku jew toniku, l- 
isterjotipi (e ż. grooming  eċċessiv, tidwir tond repetittiv) jew im ġiba 
stramba (e ż. Awto-mutilazzjoni, il-mixi b’lura) g ħandhom ji ġu 
rrekordjati wkoll (1).
 
Lejn tmiem il-perjodu ta’ l-espo żizzjoni u mhux qabel il-11-il 
ġimgħa, għandha ssir reattività sensorjali g ħal stimuli ta’ tipi 
differenti (1) (e ż. awditorjali, stimuli vi żwali u  proprioceptive ) (2), 
(3), (4), il-valutazzjoni tas-sa ħħa tal-qabda (5) u l-valutazzjoni  motor 
activity  (6). Dettalji o ħra fuq il-pro ċeduri li jistg ħu jsegwu qeg ħdin 
fir-referenzi rispettivi. Madankollu, il-pro ċeduri alternattivi apparti 
dawk referenzjati jistg ħu jintużaw ukoll.  
L-osservazzjonijiet funzjonali mag ħmula lejn tmiem l-istudju jistg ħu 
jitħallew barra meta d-data fuq l-osservazzjonijiet funzjonali tista’ 
tittieħed minn studji o ħra u l-osservazzjonijiet klini ċi ta’ kuljum 
ma wrew l-ebda deficits funzjonali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Ħlief f’eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistg ħu jitħallew 
barra wkoll g ħal gruppi li juru sinjali ta’ tossi ċità b’tali mod li 
jfixklu b’mod sinifikanti l-prestazzjoni funzjonali tat-test.  
1.5.2.1.  Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb  
L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu mill-inqas darba fil- ġimgħa. Il- 
konsum ta’ l-ikel u tax-xorb g ħandu jitkejjel g ħallinqas kull ġimgħa. 
Jekk is-sustanza g ħat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma g ħax- 
xorb, il-konsum ta’ l-ilma g ħandu jitkejjel g ħallinqas kull ġimgħa 
wkoll. Il-konsum ta’ l-ilma jista’ jitqies ukoll g ħal studji dieteti ċi 
jew ta’ ikel mog ħti bil-fors li matulu l-attività tax-xorb tista’ ti ġi 
tinbidel.  
1.5.2.2.  Il-ħematoloġija u l-Bijokemistrija Klinika  
Il-kampjuni tad-demm g ħandhom jittie ħdu minn site imsemmija u 
maħżuna, jekk applikabbli, f’kundizzjonijiet xierqa. Fi tmiem il- 
perjodu g ħat-test, il-kampjuni jin ġabru eżatti qabel jew b ħala parti 
mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali, u ma ħżuna f’kundizzjonijiet 
xierqa  
L-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi li ġejjin għandhom isiru fi tmiem 
il-perjodu g ħat-test u meta kwalunkwe kampjuni tad-demm interim 
ikunu nġabru: Haematocrit,  konċentrazzjoni ta’  haemoglobin,  l-għadd 
ta’ l-  erythrocyte,  l-għadd totali u differenzjali tal- leucocyte , l-għadd 
tal- platelet  u l-kejl tal- ħin/potenzjal tal-bo ċċi fid-demm.  
Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw 
effetti prin ċipali tossi ċi fit-tessuti u, spe ċifikament, l-effetti fuq il- 
kliewi u fuq il-fwied, g ħandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm 
miksuba mill-annimali kollha e żatti qabel jew b ħala parti mill- 
proċedura tal-qtil ta’ l-annimali (apparti ta’ dawk li jinstabu qed 
imutu u/jew jinqatlu). B’mod simili g ħall-investigazzjonijiet ħemato­
loġiċi, jista’ jsir it-te ħid tal-kampjuni interim g ħat-testijiet bijo ­
kemikali klini ċi. Huwa rakkomandat is-sawm mal-lejl ta’ l-annimali 
qabel it-te ħid tal-kampjuni tad-demm (  1 ). Id-determinazzjonijiet tal- 
plasma jew serum g ħandhom jinkludu is-sodju, il-putassa, il- 
glokożju, il-kolestorol totali, l-urea, in-nitro ġenu fid-demm mill- 
urea, il- creatinine , il-proteini u l-albumin totali, u iktar minn żewġ 
enzimi li juru l-effetti hepato ċellulari (b ħalma huma l- alanine amino ­
transferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, gamma glutamyl transpeptidase, u sorbitol dehydrogenase ). Il-kejl 
ta’ enzimi addizzjonali (ta’ ori ġini epatika jew o ħra) u aċidi tal- bile li 
jistgħu jipprovdu informazzjoni utli ta ħt ċerti ċirkostanzi, jista’ ji ġi 
nkluż ukoll.
 
B’għażla, id-determinazzjonijiet ta’ l-anali żi ta’ l-urina li ġejjin 
jistgħu jsiru waqt l-a ħħar ġimgħa ta’ l-istudju bl-u żu tal-ġbir bil- 
ħin tal-volum ta’ l-urina; l-apparenza, il-volum, l- osmolality  jew 
gravità spe ċifika, pH, il-proteini, il-gluko żju u d-demm/i ċ-ċelloli 
tad-demm.  
Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ 
ħsara ġenerali g ħat-tessuti g ħandhom ji ġu kkunsidrati. Deter ­
minazzjonijiet o ħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet 
magħrufa tas-sustanza g ħat-test jistg ħu, jew huma suspettati li 
jaffettwaw il-profili metaboli ċi relatati jinkludu il-kal ċju, il-fosforu, 
il-fasting triglycerides, l-ormoni spe ċifiċi, il- methaemoglobin  u l-  
cholinesterase . Dawn iridu ji ġu identifikati g ħall-kimiċi f’ċerti klas­
sijiet jew fuq ba żi ta’ kull ka ż. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Għal numru ta' kejl fis-serum u fil-plasma, l-iktar g ħall-glukożju, is-sawm mal-lejl ikun 
iktar preferut. Ir-ra ġuni prinċipali għal din il-preferenza hi li l-varjabbiltà li qed ti żdied u 
li bla dubju se tirri żulta min-nuqqas ta' sawm, tg ħatti l-effetti l-iktar mo ħbija u l-inter ­
pretazzjoni tkun iktar diffi ċli. Min-na ħa l-oħra, madankollu, is-sawm mal-lejl jista’ jfixkel 
il-metaboli żmu ġenerali ta' l-annimali u, b'mod partikulari fl-istudji ta' l-g ħalf. Jista’ 
jfixkel ukoll l-espo żizzjoni ta' kuljum g ħas-sustanza tat-test. Jekk ji ġi adottat is-sawm 
mal-lejl, id-determinazzjonijiet bijokemikali u klini ċi għandhom jitwettqu wara t-twettieq 
ta' l-osservazzjonijiet funzjonali ta' l-istudju.
 Fuq kollox, hemm il-b żonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispe ċi u l- 
effett osservat u/jew mistenni mis-sustanza mog ħtija. 
Jekk id-data storika mhix adegwata, g ħandu jiġi kkunsidrat jekk il- 
varjabbli ematolo ġiċi u tal-bijokemistrija klini ċi għandhomx b żonn 
jiġu determinati qabel ma jibda d-do żaġġ u ġeneralment mhuwiex 
rakkomandabbli li din id-data ti ġi ġġenerata qabel it-trattament (7).  
1.5.2.3  Nekropsija Grossa  
L-annimali kollha fl-istudju g ħandhom ikunu su ġġetti għall-awtopsja 
sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi e żaminazzjoni bir-reqqa tal- 
wiċċ tal-ġisem, l-orifi ċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-tora ċi u 
dawk addominali u l-kontenut tag ħhom. Il-fwied, il-kliewi, l- 
adrenali, it-testi, l- epididymides , it-thymus , il-milsa, il-mo ħħ u l- 
qalb ta’ l-annimali kollha ( ħlief ta’ dawk li jkunu qed imutu u/jew 
jiġu maqtula) g ħandhom ji ġu trimmjati minn kwalunkwe tessut 
aderenti, kif xieraq, u g ħandhom ikunu mwie żna niedja malajr 
kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux.  
It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq 
kemm għat-tip ta’ tessut u kemm g ħall-eżaminazzjoni ħispatoloġika 
maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-mo ħħ (partijiet 
rappreżentattivi inklu żi iċ-ċerebrum, i ċ-ċerebelllum u l- medulla/­
pons ), il-korda spinali (fi tliet livelli: ċevikali,  mid-thoracic  u 
lumbar ) il-glandoli  pituitary, thyroid, parathyroid, thymus, 
oesophagus, salivary , l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklu żi l- 
Peyer 's patches ), il-fwied, il-frixa, kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, 
it-trakea u l-pulmuni (ippreservati bl-inflazzjoni bil- fixative  imbagħad 
bl-immersjoni), l-aorta, il- gonads , l-utru, l-organi sesswali a ċċes­
sorili, il-glandola mammarja femminili, il-prostata, il-bu żżieqa ta’ l- 
urina, il- gall bladder  (il-ġurdien), in-noduli limfati ċi (preferibbilment 
nodulu limfatiku wie ħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u 
oħra distanti mir-rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti 
sistematiċi), in-nerv periferali ( sciatic  jew  tibial ) preferebbilment 
viċin il-muskolu, u bi ċċa mill-mudullun (jew,  a fresh bone marrow 
aspirate ), il-ġilda u l-g ħajnejn (jekk ġew osservati xi tibdiliet waqt l- 
eżaminazzjonijiet oftalmolo ġiċi). Is-sejbiet klinikali u o ħrajn jistgħu 
jissuġġerixxu li hemm b żonn jiġu eżaminati tessuti addizzjonali. 
Kwalunkwe organi li jistg ħu jkunu organi-mira bba żati fuq il- 
proprjetajiet mag ħrufa tas-sustanza tat-test g ħandhom ji ġu ppre­
servati.  
1.5.2.4.  Il-ħispatoloġija 
Il-ħispatoloġija kompluta g ħandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti 
ppreservati ta’ l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ do ża 
għolja. Dawn l-e żaminazzjonijiet g ħandhom ji ġu estiżi għall- 
annimali tal-gruppi ta’ do żaġġ l-oħrajn ukoll, jekk it-tibdil relatat 
mat-trattament ji ġi osservat fil-grupp ta’ do ża għolja. 
1.5.2.5. Il-feriti grossi kollha g ħandhom ji ġu eżaminati.  
Meta jintu ża grupp satellita il- ħistopatolo ġija għandha ssir fuq it- 
tessuti u l-organi identifikati b ħala li qed juru l-effetti fil-gruppi 
trattati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
DATA U RAPPORTA ĠĠ 
2.1. DATA  
Id-data individwali g ħandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data 
kollha għandha tkun riassunta f’g ħamla tabulari, li turi g ħal kull 
grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ 
l-annimali nstabu mejta waqt it-test jew li nqatlu g ħal raġunijiet 
umani u l- ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil uman, in-numru li juri 
sinjali ta’ tossi ċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, 
inkluż il-ħin ta’ l-onset, it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti 
tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li g ħandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti 
u l-perċentwal ta’ l-annimali li g ħandhom kull tip ta’ ferita.  
2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
2.2.1.  Is-sustanza g ħat-test:  
— In-natura fi żika, il-purità u il-proprjetajiet fi żiko-kemikali;  
— Id-data ta’ identifikazzjoni;  
— Il-mezz (jekk inhu xieraq): il- ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal- 
mezz, jekk mhuwiex l-ilma.  
2.2.2.  L-ispe ċi għat-test:  
— l-ispeċi/is-silta u żati; 
— In-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;  
— Is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew, id-dieta e ċċ.; 
— Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test  
2.2.3.  Il-kundizzjonijiet g ħat-test:  
— Ir- rationale  għall-għażla tal-livell tad-do ża; 
— Id-dettalji tat-t ħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza g ħat- 
test, il-kon ċentrazzjoni miksuba u l-omo ġeneità tat-t ħejjija;  
— id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza g ħat-test;  
— Id-dożi kif inhuma tabil ħaqq (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum), u l-fattur 
tal-konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni tat-test g ħas-sustanza tad- 
dieta/l-ilma g ħax-xorb (ppm) g ħad-doża kif inhi tabil ħaqq, jekk 
applikabbli;  
— Id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma  
2.2.4.  Ir-ri żultati:  
— Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-pi ż tal-ġisem;  
— Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;  
— Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-do ża, inklużi s- 
sinjali tat-tossi ċità; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet klini ċi (jekk 
humiex riversibbli jew le);  
— Ir-riżultati ta’ l-e żaminazzjoni oftalmolo ġika; 
— l-attività sensorjali, is-sa ħħa tal-qabda ta’ l-id u l-valutazzjonijiet  
motor activity;  
— it-testijiet ematolo ġiċi bil-valuri  base-line  relevanti;  
— it-testijiet tal-bijokemistrija klinika bil-valuri  base-line  relevanti;  
— il-piż tal-ġisem terminali, il-pi żijiet ta’ l-organi u r- ratios  tal-piż 
ta’ l-organi u tal- ġisem;  
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatolo ġiċi kollha;  
— Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;  
— trattament statistiku tar-ri żultati, fejn hu xieraq;  
Id-diskussjoni tar-ri żultati;  
Konklużjonijiet.  
3.1. REFERENZI  
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neur ­
otoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Exam ­
ination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.  
Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.  
Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and 
Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: 
Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
 
Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method 
for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of 
Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233-236.  
Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., 
Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.
 
Weingand K., Brown G., Hall R.  et al . (1996). “Harmonisation of 
Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  EŻAMI TA’ TOSSI ĊITÀ ORALI SUB-KRONIKU 
ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI 
RIPETUTA TA’ DO ŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-U ŻU TA’ 
SPEĊI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA  
1. METODU  
Il-metodu g ħat-test tat-tossi ċità orali sub-kronika huwa replika ta’ l- 
OECD TG 409 (1998)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi ta’ 
kemikali, id-determinazzjoni tat-tossi ċità orali sub-kronika bl-u żu 
ta’ dożi repetuti tista’ ssir wara li l-informazzjoni tal-bidu fuq it- 
tossiċità tinkiseb mit-testijiet g ħat-tossiċità b’do ża akuta jew 
repetuta g ħal 28 jum. L-istudju ta’ 90 jum jipprovdi informazzjoni 
fuq il-perikli g ħas-saħħa possibbli li fa ċilment jista’ jkun hemm 
minħabba espo żizzjoni repetuta g ħal perjodu ta’ tkabbir mg ħaġġel 
sal-fażi adulta. L-istudju se jipprovdi informazzjoni fuq l-effetti 
tossiċi prinċipali, jindika l-organi b ħala mira u l-possibiltà ta’ 
akkumulazzjoni, u jista’ jipprovdi kalkolu ta’ livell ta’ espo żizzjoni 
bl-ebda effett avvers osservat li jista’ jintu ża fl-għażla tal-livelli ta’ 
doża għal studji kroni ċi u biex ji ġu stabbiliti kriterji ta’ sigurtà g ħall- 
espożizzjoni umana  
Dan il-metodu g ħat-test għandu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ l- 
effetti avversi min ħabba l-espo żizzjoni kemikali fl-ispe ċi li mhumiex 
gerriema u g ħandu jintu ża biss:  
— fejn l-effetti osservati fi studji o ħra jindikaw il- ħtieġa għal 
klarifikazzjoni/karatterizzazzjoni fit-tieni spe ċi, li mhix 
gerriema, jew  
— fejn l-istudji tossikokineti ċi jindikaw li l-u żu ta’ spe ċi mhux 
gerriema spe ċifika hija l-iktar g ħażla relevanti g ħall-annimal 
tal-laboratorju, jew  
— fejn ra ġunijiet spe ċifiċi oħra jiġġustifikaw l-u żu ta’ speċi li mhix 
gerriema.  
Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Id-doża: huwa l-ammont tas-sustanza tat-test somministrat. Id-do ża 
tissarraf f’pi ż (g, mg) jew f’pi ż tas-sustanza tat-test per unit tal-pi ż 
ta’ l-annimal g ħat-test (eż. Mg/kg), jew f’kon ċentrazzjonijiet dieteti ċi 
kostanti (ppm).  
Id-dożaġġ: huwa terminu ġenerali li jikkomprendi d-do ża, il- 
frekwenza tag ħha u t-tul ta ż-żmien tad-do żaġġ. 
NOAEL:  hija l-abbrevjazzjoni g ħal no-observed-adverse-effect level  
(livell bl-ebda effett avvers osservat) u huwa l-og ħla livell ta’ do ża 
fejn l-ebda sejbiet relatati ma’ trattament avvers ma ġew osservati.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza g ħat-test għandha tiġi somministrata kuljum, b’mod orali, 
f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, do ża 
waħda għal kull grupp g ħall-perjodu ta’ 90 jum. Matul il-perjodu 
ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati mill-qrib g ħal 
sinjali ta’ tossi ċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul l-istudju 
huma sottoposti g ħall-nekroskopija, u fi tmiem it-test dawk l- 
annimali li jsalvaw ji ġu maqtula wkoll u sottoposti g ħan-nekros ­
kopija.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  L-g ħażla ta’ l-ispe ċi ta’ l-annimali  
L-ispeċi li mhumiex gerriema l-aktar u żat huwa l-kelb, li g ħandu 
jkun ta’ razza definita. Il- beagle  (kelb żgħir tal-kaċċa) jintuża ta’ 
spiss. Jistg ħu jintużaw ukoll spe ċi oħra, eż. ħanżir, u ħnieżer 
żgħar. Il-primati mhumiex rakkomandabbli u l-u żu tagħhom 
għandu jkun ġustifikat. G ħandhom jintu żaw annimali żgħażagħ u 
b’saħħithom, u fil-ka ż tal-kelb, id-do żaġġ għandu jibda idealment 
mill-età ta’ erba’ sa sitt xhur u mhux aktar tard minn disa’ xhur. 
Meta jsir studju preliminari g ħal dak iktar fit-tul dwar it-tossi ċità 
kronika, l-istess spe ċi/razza għandha tintu ża fiż-żewġ studji.  
1.4.2.  It-t ħejjija ta’ l-annimali  
Għandhom ji ġu użati annimali b’sa ħħithom li jkunu adattaw ru ħhom 
għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju u li ma kinux su ġġetti għal 
proċeduri sperimentali qabel. It-tul ta’ żmien ta’ l-adattament 
jiddependi fuq l-ispe ċi magħżula u s-sors tag ħhom. Huma rakkom ­
andati mill-inqas 5 ijiem g ħall-klieb jew ħanżir tar-razza li ġejjin 
minn kolonja residenti u mill-inqas ħmistax għal dawk l-annimali 
li ġejjin minn sorsi esterni. L-annimali g ħat-test għandhom ikunu 
karatterizzati skond l-ispe ċje, ir-razza, is-sors, is-sess, il-pi ż u/jew 
l-età. L-annimali g ħandhom ji ġu assenjati bl-addo ċċ għall-gruppi 
tat-trattament u tal-kontroll. Il-ga ġeġ għandhom jitqieg ħdu b’tali 
mod li l-effetti possibbli min ħabba t-tqeg ħid tal-gaġġa jiġu mini­
mizzati. Kull annimal g ħandu jkollu numru ta’ identifikazzjoni  
1.4.3.  It-t ħejjija tad-do żi 
Is-sustanza g ħat-test tiġi somministrata fid-dieta jew fl-ilma g ħax- 
xorb, permezz ta’ l-g ħalf mogħti bil-fors jew fil-kapsuli. Il-metodu 
tas-somministrazzjoni orali jiddependi mill-g ħan ta’ l-istudju, u mill- 
proprjetatjiet fi żiko/kimiċi tal-materjal g ħat-test.  
Fejn hu me ħtieġ, is-sustanza g ħat-test tin ħall jew tiġi sospiża f’mezz 
xieraq. Huwa rakkomandabbli li, kull fejn hu possibbli, ji ġi kkun­
sidrat l-ewwel l-u żu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea, u wara ti ġi 
kkunsidrata soluzzjoni/emulsjoni fi ż-żejt (eż. Iż-żejt tal-qam ħ) 
imbagħad bis-soluzzjoni possibbli f’mezzi o ħra. Għall-mezzi li 
mhumiex ilma l-karatteristi ċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu mag ħrufa. 
L-istabilità tas-sustanza g ħat-test taħt il-kundizzjonijiet ta’ somminis ­
trazzjoni g ħandha tiġi determinata  
1.5. IL-PRO ĊEDURA  
1.5.1.  In-numru u s-sess ta’ l-annimali  
Mill-inqas 8 annimali (erba’ nisa u erba’ r ġiel) għandhom jintu żaw 
f’kull livell tad-do ża. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru 
għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel 
tmiem l-istudju. Skond l-g ħarfien ta’ qabel dwar is-sustanza jew l- 
analogu mag ħluq, għandu jiġi kkunsidrat li ji żdied grupp satellita ta’ 
8 annimali (erbg ħa għal kull sess) fil-grupp ta’ kontroll u ta’ l-og ħla 
doża għall-osservazzjoni tar-riversibbiltà jew tal-persistenza ta’ 
kwalunkwe effetti tossi ċi, wara l-perjodu ta’ trattament. It-tul ta’ 
żmien ta’ dan il-perjodu post-trattament g ħandu jiġi determinat 
b’mod xieraq skond l-effetti li ġew osservati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Id-do żaġġ 
Ghandhom jintu żaw mill-inqas tlett livelli ta’ do ża u kontroll wie ħed, 
ħlief fejn hemm test ta’ limitu (ara 1.5.3.). Il-livelli tad-do ża jistgħu 
jkunu bba żati fuq ir-ri żultati tad-do ża repetuta jew ta’ l-istudju tas- 
sejbiet tal-meddda u g ħandhom jikkunsidraw kwalunkwe data tossi ­
koloġika u tossikokinetika disponibbli li te żisti għall-compound tat- 
test jew il-materjali relatati. Sakemm ma tkunx limitata min-natura fiżiko-kemikali jew l-effetti bijolo ġiċi tas-sustanza g ħat-test, l-og ħla 
livell ta’ do ża għandu jiġi magħżul bl-għan li jġib it-tossi ċità iżda 
mhux il-mewt jew it-tbatija qawwija. Sekwenza nie żla tal-livell ta’ 
doża għandha ting ħażel bl-għan li turi kwalunkwe rispons relata 
mad-dożaġġ u l-livell b’ebda effett avvers osservat (NOAEL) fl- 
iktar livell baxx tad-do ża. Intervalli two to four fold huma ta’ 
spiss ottimali biex ji ġu ssettjati il-livelli ne żlin tad-do ża u ż-żieda 
tar-raba’ grupp g ħat-test huwa ppreferut ta’ spiss iktar mill-intervalli 
kbar (eż. iktar minn fattur ta’ bejn wie ħed u ie
ħor 6-10) bejn id- 
dożaġġi. 
Il-grupp ta’ kontroll g ħandu jkun grupp mhux trattat jew grupp ta’ 
kontroll b’mezz jekk il-mezz jintu ża fis-somministrazzjoni tas- 
sustanza g ħat-test. Ħlief għat-trattament bis-sustanza g ħat-test, l- 
annimali fil-grupp ta’ kontroll g ħandhom ji ġu trattati bl-istess mod 
ta’ dawk fil-gruppi g ħat-test. Jekk jintu ża l-mezz, il-grupp ta’ 
kontroll g ħandu jirċievi l-mezz fl-og ħla volum u żat. Jekk sustanza 
għat-test tiġi somministrata fid-dieta u tikkaw ża dħul dietetiku 
mnaqqas, imbag ħad grupp ta’ kontroll li jkun ġie magħluf jista’ 
jgħin biex jiddistingwu bejn tnaqqis min ħabba l-palatabilità jew 
minħabba l-alterazzjonijiet tossikolo ġiċi fil-mudell g ħattest.  
Il-karatteristi ċi tal-mezz u additivi o ħra li ġejjin għandhom ji ġu 
kkunsidrati kif xieraq: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-metaboli żmu, jew ir-retenzjoni tas-sustanza g ħat-test; l-effetti fuq 
il-proprjetajiet kemikali tas-sustanza g ħat-test u l-effetti fuq il- 
konsum ta’ l-ikel u x-xorb jew fuq l-istatus nutrizzjonali ta’ l- 
annimali.  
1.5.3.  It-test tal-limitu  
Jekk test f’livell wie ħed ta’ do ża ekwivalenti g ħal mill-inqas 
1 000mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/ġurnata, bl-u żu tal-proċeduri deskritti 
għal dan l-istudju, jipprodu ċi in-no-observed-adverse-effects  (l-ebda 
effetti avversi mhux osservati) u jekk it-tossi ċità ma tkunx mistennija 
bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura studju 
komplut bl-u żu ta’ tliet livelli ta’ do ża ma jkunx me ħtieġ. It-test tal- 
limitu japplika ħlief meta l-espo żizzjoni umana tindika il- ħtieġa li 
jiġi użat livell og ħla ta’ doża. 
1.5.4.  Is-somministrazzjoni tad-do żi 
L-annimali jing ħataw id-do żaġġ bis-sustanza g ħat-test sebat ijiem 
kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 jum. Kwalunkwe  regime  ta’ 
dożaġġ ieħor, eż. Ħamest ijiem fil- ġimgħa, irid ikun ġustifikat. 
Meta s-sustanza g ħat-test tiġi somministrata bil-fors, dan g ħandu 
jsir f’doża waħda bl-użu ta’ tubu g ħall-istonku jew intubazzjoni  
cannula  xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ ji ġi sommin ­
istrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal. Normalment il- 
volum għandu jinżamm baxx kemm jista’ jkun. Ħlief għal sustanzi 
korrużivi jew ta’ irritazzjoni, li normalment ji żvelaw effetti ag ħar 
b’konċentrazzjonijiet og ħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test g ħandha 
tiġi minimizzata billi ti ġi aġġustata l-kon ċentrazzjoni sabiex ti żgura 
volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Għal dawk is-sustanzi somministrati permezz tad-dieta jew l-ilma 
għax-xorb huwa importanti li ji ġi żgurat li l-kwantitajiet tas- 
sustanza g ħat-test involuta ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew 
il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta s-sustanza g ħat-test hija somministrata 
fid-dieta jew kon ċentrazzjoni dietetika kostanti (ppm) jew livell ta’ 
doża kostanti f’termini tal-pi ż tal-ġisem ta’ l-annimal jistg ħu 
jintużaw. L-użu alternattiv irid ji ġi speċifikat. Għas-sustanza li ti ġi 
somministrata bil-fors, id-do ża għandha ting ħata f’ħinijiet simili 
kuljum, u a ġġustata kif ikun me ħtieġ sabiex jin żamm livell ta’ 
doża kostanti f’termini tal-pi ż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn qed 
jintuża studju ta’ 90 jum b ħala studju preliminarju g ħal dak li jtul 
dwar it-tossi ċità kronika, g ħandha tintu ża dieta simili fi ż-żewġ studji.  
1.5.5.  L-osservazzjonijiet  
Il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħandu jkun mill-inqas ta’ 90 jum. L- 
annimali fi grupp satellita li huma skedati g ħal follow-up  ta’ l-osser ­
vazzjonijiet g ħandhom jin żammu għal perjodu xieraq ming ħajr trat­
tament sabiex tidher il-persistenza ta’, jew l-irkupru mill-effetti tossiċi.
 
L-osservazzjonijiet klini ċi ġenereali g ħandhom isiru mill-inqas darba 
kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum, waqt illi ji ġi 
meqjus il-perjodu  peak  ta’ l-effetti anti ċipati wara d-do żaġġ. Il- 
kundizzjoni klinika ta’ l-annimali g ħandha tiġi rrekordjata. Mill- 
inqas darbtejn kuljum, normalment fil-bidu u fi tmiem il-jum, l- 
annimali kollha g ħandhom ji ġu spezzjonati g ħal sinjali ta’ 
morbidità jew ta’ mortalità.  
Ta’ l-inqas darba qabel l-ewwel espo żizzjoni (sabiex ikun hemm lok 
għall-paraguni fi ħdan is-su ġġett), u darba fil- ġimgħa wara dan, l- 
osservazzjonijiet klini ċi dettaljati g ħandhom isiru g ħall-annimali 
kollha. Dawn l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru barra l-ga ġġa fejn 
jitpoġġew, preferebbilment f’arena standard u f’ ħinijiet simili kull 
darba. Għandu jsir sforz sabiex ji ġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil- 
kundizzjonijiet ta’ l-osservazzjoni huma minimali. Is-sinjali tat- tossiċità għandhom ji ġu rrekordjati tajjeb, inklu żi l-ħin ta’ l- onset,  
il-grad u t-tul ta’ żmien. L-osservazzjonijiet g ħandhom jinkludu, i żda 
mhux ikunu limitati g ħalihom, it-tibdil fil- ġilda, fil-pil, fl-g ħajnejn, 
fil-membrani muku żi, l-okkorrenza ta’ tnixxija u ta’ l-eskrementi u 
ta’ l-attività awtonomika (e ż. il-lakrimazzjoni, il-  pilo-erection , id- 
daqs tal-pupill, attività respiratorja mhux normali). Bidliet fil-mixja, 
fil-pożizzjoni u r-rispons g ħall-imaniġġjar kif ukoll il-pre żenza ta’ 
ċaqliq kloniku jew toniku, l-isterjotipi (e ż. grooming  eċċessiv, 
tidwir tond repetittiv) jew im ġiba stramba g ħandhom ji ġu rrekordjati.
 
L-eżaminazzjoni oftalmolo ġika, bl-u żu ta’ oftalmoskopju jew 
tagħmir xieraq ekwivalenti, G ħandha ssir qabel is-somministrazzjoni 
tas-sustanza g ħat-test u fi tmiem l-istudju, preferibbilment fl-annimali 
kollha iżda għallinqas fil-gruppi ta’ do ża għolja u ta’ kontroll. Jekk 
ikun hemm tibdil fl-g ħajnejn relatat mat-trattament l-annimali kollha 
għandhom ji ġu eżaminati.  
1.5.5.1.  Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb  
L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu mill-inqas darba fil- ġimgħa. Il- 
konsum ta’ l-ikel u tax-xorb g ħandu jitkejjel g ħallinqas kull ġimgħa. 
Jekk is-sustanza g ħat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma g ħax- 
xorb, il-konsum ta’ l-ilma g ħandu jitkejjel g ħallinqas kull ġimgħa 
wkoll. Il-konsum ta’ l-ilma jista’ jitqies ukoll g ħal studji dieteti ċi 
jew ta’ ikel mog ħti bil-fors li matulu l-attività tax-xorb tista’ tinbidel.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Il-ħematoloġija u l-Bijokemistrija Klinika  
Il-kampjuni tad-demm g ħandhom jittie ħdu minn site imsemmija u 
maħżuna, jekk applikabbli, f’kundizzjonijiet xierqa. Fi tmiem il- 
perjodu g ħat-test, il-kampjuni jin ġabru eżatti qabel jew b ħala parti 
mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali.  
Il-ħematoloġija, inklużi l-haematocrit , il-konċentrazzjoni ta’  haemog­
lobin , l-għadd ta’ l- erythrocyte , l-għadd totali u differenzjali tal-  
leukocyte , l-għadd tal- platelet  u l-kejl ta’ potenzjal g ħall-boċċi 
(clotting ) bħalma hu l- ħin ta’ l-iffurmar tal-bo ċċi, il-ħin tal-  
prothrombin , jew il-ħin tat- thromboplastin  għandhom ji ġu investigati 
fil-bidu ta’ l-istudju, imbag ħad jew f’intervalli ta’ xhur jew f’nofs 
triq tal-perjodu tat-test u fl-a ħħarnett fi tmiemu.  
Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw 
effetti prin ċipali tossi ċi fit-tessuti u, spe ċifikament, l-effetti fuq il- 
kliewi u fuq il-fwied, g ħandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm 
miksuba mill-annimali fil-bidu, imbag ħad f’intervalli ta’ xhur jew 
f’nofs it-test u fl-a ħħarnett fi tmiem il-perjodu tat-test. I ż-żoni tat- 
test li għandhom ji ġu kkunsidrati huma l-bilan ċ electrolyte, il-meta ­
boliżmu tal- carbohydrate, u l-funzjoni tal-fwied u l-kliewi. L-g ħażla 
tat-testijiet spe ċifiċi tkun influwenzata mill-osservazzjonijiet ta’ l- 
azzjoni tas-sustanza g ħattest. L-annimali g ħandhom ikunu sajmin 
għal perjodu xieraq g ħall-ispeċi u qabel it-te ħid tal-kampjuni tad- 
demm. Id-determinazzjonijiet su ġġeriti jinkludu l-kal ċju, il-fosfru, 
il-klorur, is-sodju, il-potassju, il-glukosju swami, l- alanine , l-amino­
transferase , l-aspartate aminotransferase , l-ornithine decarboxylase , 
il- gamma glutamyl transpeptidase , l-urea nitrogen , l-albumin , il- 
blood creatinine , it-total tal- bilirubin  u t-total tal-kejl tas- serum 
protein . 
Id-determinazzjonijiet ta’ l-anali żi ta’ l-urina g ħandhom isiru g ħal­
linqas fil-bidu, imbag ħad fin-nofs u fl-a ħħarnett fi tmiem l-istudjubl- 
użu tal-ġbir bil-ħin tal-volum ta’ l-urina. Id-determinazzjonijiet ta’ l- 
analiżi ta’ l-urina jinkludu l-apparenza, il-volum, l-  osmolality  jew il- 
gravità spe ċifika, il-pH, il-proteini, il-gluko żju u d-demm/i ċ-ċelloli 
tad-demm. Parametri addizzjonali jistg ħu jintużaw fejn hu me ħtieġ 
biex l-investigazzjoni ta’ l-effett(i) osservat(i) ti ġi estiża. 
Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar ta’ ħsara 
ġenerali għat-tessuti g ħandhom ji ġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet 
oħra li jistg ħu jkunu me ħtieġa għal evalwazzjoni tossikolo ġika 
adegwata jinkludu l-anali żi tal-lipidi, ta’ l-ormoni, tal-bilan ċ aċdu/­
bażi, tal- methaemoglobin, u ta’ l-inibizzjoni tal- cholinesterase. Il- 
bijokemistrija klinika addizzjonali tista’ tintu ża fejn hu me ħtieġ 
sabiex l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati ti ġi estiża. Dawn iridu 
jiġu identifikati g ħall-kimiċi f’ċerti klassijiet jew fuq ba żi ta’ kull 
każ. 
Fuq kollox, hemm il-b żonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispe ċi u l- 
effett osservat u/jew mistenni mis-sustanza mog ħtija. 
1.5.5.3.  Nekropsija Grossa  
L-annimali kollha fl-istudju g ħandhom ikunu su ġġetti għall-awtopsja 
sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi e żaminazzjoni bir-reqqa tal- 
wiċċ tal-ġisem, l-orifi ċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-tora ċi u 
dawk addominali u l-kontenut tag ħhom. Il-fwied bil- gall bladder , il- 
kliewi, l-adrenali, it-testi, l- epididymides , l-ovaries,  l-utru, it- thyroid  
(bil- parathyroids ) it-thymus , il-milsa, il-mo ħħ u l-qalb ta’ l-annimali 
kollha (ħlief ta’ dawk li jkunu qed imutu u/jew ji ġu maqtula) 
għandhom ji ġu trimmjati minn kwalunkwe tessut aderenti, kif 
xieraq, u g ħandhom ikunu mwie żna niedja malajr kemm jista’ jkun 
wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq 
kemm għat-tip ta’ tessut u kemm g ħall-eżaminazzjoni ħispatoloġika 
maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-mo ħħ (partijiet 
rappreżentattivi inklu żi iċ-ċerebrum, i ċ-ċerebelllum u l- medulla/­
pons ), il-korda spinali (fi tliet livelli: ċervikali,  mid-thoracic  u 
lumbar ) il-glandoli tal- pituitary,  l-għajnejn, il-glandoli tat- thyroid,  
tal-parathyroid,  tat- thymus,  ta l- oesophagus,  u dawk  salivary , l- 
istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklu żi l- Peyer 's patches ), il- 
fwied, il- gall bladder,  il-frixa, kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, 
it-trakea u l-pulmuni, l-aorta, il- gonads , l-utru, l-organi sesswali 
aċċessorili, il-glandola mammarja femminili, il-prostata, il-bu żżieqa 
ta’ l-urina, in-noduli limfati ċi (preferibbilment nodulu limfatiku 
wieħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u o ħra distanti mir- 
rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti sistemati ċi), in-nerv 
periferali ( sciatic  jew  tibial ) preferebbilment vi ċin il-muskolu, u 
biċċa mill-mudullun (u/jew,  a fresh bone marrow aspirate ) u l- 
ġilda. Is-sejbiet klinikali u o ħrajn jistg ħu jissuġġerixxu li hemm 
bżonn jiġu eżaminati tessuti addizzjonali. Kwalunkwe organi li 
jistgħu jkunu organi-mira bba żati fuq il-proprjetajiet mag ħrufa tas- 
sustanza tat-test g ħandhom ji ġu ppreservati.  
1.5.5.4.  Il-ħispatoloġija 
Il-ħispatoloġija kompluta g ħandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti 
ppreservati ta’g ħallinqas l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ 
doża għolja. L-eżaminazzjoni g ħandha tiġi estiża għall-annimali tal- 
gruppi ta’ do żaġġ l-oħra, jekk it-tibdil relatat mat-trattament ji ġi 
osservat fil-grupp ta’ do ża għolja. 
Il-feriti grossi kollha g ħandhom ji ġu eżaminati  
Meta jintu ża grupp satellita il- ħistopatolo ġija għandha ssir fuq it- 
tessuti u l-organi identifikati b ħala li qed juru l-effetti fil-gruppi 
trattati.  
2. DATA U RAPPORTA ĠĠ 
2.1. DATA  
Id-data individwali g ħandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data 
kollha għandha tkun riassunta f’g ħamla tabulari, li turi g ħal kull 
grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ 
l-annimali li nstabu mejta waqt it-test jew li nqatlu g ħal raġunijiet 
umani u l- ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil uman, in-numru li juri 
sinjali ta’ tossi ċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, 
inkluż il-ħin ta’ l- onset , it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti 
tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li g ħandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti 
u l-perċentwal ta’ l-annimali li g ħandhom kull tip ta’ ferita.  
Meta huwa applikabbli, ir-ri żultati numeri ċi għandhom ji ġu evalwati 
b’metodu ta’ statistika xieraq u ġeneralment a ċċettat. Il-metodi stat ­
istiċi u d-data li trid ti ġi analizzata g ħandha ting ħażel waqt id-disinn 
ta’ l-istudju.  
2.2. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Is-sustanza g ħat-test:  
— In-natura fi żika, il-purità u il-proprjetajiet fi żiko-kemikali;  
— Id-data ta’ identifikazzjoni;  
— Il-mezz (jekk inhu xieraq): il- ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal- 
mezz, jekk mhuwiex l-ilma.  
2.2.2.  L-ispe ċi għat-test:  
— l-ispeċi/is-silta u żati; 
— In-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;  
— Is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew, id-dieta e ċċ.; 
— Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.  
2.2.3.  Il-kundizzjonijiet g ħat-test:  
— Ir- rationale  għall-għażla tal-livell tad-do ża; 
— Id-dettalji tat-t ħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza g ħat- 
test, il-kon ċentrazzjoni; miksuba u l-omo ġeneità tat-t ħejjija;  
— id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza g ħat-test;  
— Id-dożi kif inhuma tabil ħaqq (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum), u l-fattur 
tal-konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni tat-test g ħas-sustanza tad- 
dieta/l-ilma g ħax-xorb (ppm) g ħad-doża kif inhi tabil ħaqq, jekk 
applikabbli;  
— Id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma.  
2.2.4.  Ir-ri żultati:  
— Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-pi ż tal-ġisem;  
— Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;  
— Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-do ża, inklużi s- 
sinjali tat-tossi ċità; 
— In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet klini ċi (jekk 
humiex riversibbli jew le);  
— L-eżaminazzjoni oftalmolo ġika; 
— it-testijiet ematolo ġiċi bil-valuri  base-line  relevanti;  
— it-testijiet tal-bijokemistrija klinika bil-valuri  base-line  relevanti;  
— il-piż tal-ġisem terminali, il-pi żijiet ta’ l-organi u r- ratios  tal-piż 
ta’ l-organi u tal- ġisem;  
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatolo ġiċi kollha;  
— Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;  
— trattament statistiku tar-ri żultati, fejn hu xieraq;  
Id-diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjonijiet.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA STUDJU 
DERMALI TAD-DO ŻA RIPETUT G ĦAL 90 ĠURNATA LI 
JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Xejn.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test hija applikata ta’ kuljum fuq il- ġilda f’do żi 
ggradati fuq g ħadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, do ża waħda 
għal kull grupp g ħal perjodu ta’ 90 ġurnata. Matul dan il-perjodu 
t’applikazzjoni l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex ji ġu 
skoperti sinjali ta’ tossi ċità. Annimali li jmutu waqt it-test issirilhom 
nekroskopija, u fit-tmiem tat-test l-annimali li jissopravivu ssirilhom 
nekroskopija.  
1.5. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Xejn.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
L-annimali huma mi żmumin ta ħt kundizzjonijiet ta’ sistemazzjoni u 
għalf esperimentali g ħal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel 
it-test annimali żgħar u b’saħħithom huma mag ħżulin u assenjati lil 
gruppi ttrattati u gruppi tal-kontroll. Ftit qabel it-testijiet il-fur huwa 
imqasqas mi ż-żona dorsali tat-tronk ta’ l-annimali tat-test. Taqxir 
jista’ jiġi użat iżda jista’ biss ji ġi magħmul bejn wie ħed u ieħor 
24 siegħa qabel it-test. Tqasqis jew taqxir ripetut huwa s-soltu 
meħtieġ bejn wie ħed u ieħor f’intervalli ta’ ġimgħa. Meta jitqasqas 
jew jitqaxxar il-fur wie ħed irid joqg ħod attent li jevita li jobrox il- 
ġilda. Mhux inqas minn 10 % tal-pi ż ta’ l-erja tas-superfi ċje tal- 
ġisem għandha tkun imnaddfa g ħall-applikazzjoni tas-sustanza tat- 
test. Il-pi ż ta’ l-annimal irid jittie ħed in kunsiderazzjoni meta jkun 
irid jiġi deċiż liema żona trid tkun imnaddfa u d-dimensjonijiet tal- 
kisi. Meta ji ġu ttestjati s-solidi, li jistg ħu jiġu magħmula fi trab jekk 
dan ikun xieraq, is-sustanza tat-test trid tkun imrattba bl-ilma jew, fejn meħ
tieġ, b’sustanza o ħra xierqa biex ti żgura kuntatt tajjeb mal- 
ġilda. Sustanzi likwidi tat-test huma ġeneralment u żati mhux 
iddilwiti. Applikazzjoni ta’ kuljum fuq ba żi ta’ ħamest ijiem fil- 
ġimgħa jew ta’ sebat ijiem fil- ġimgħa hija użata. 
Kundizzjonijiet tat-test  
A n n i m a l i e s p e r i m e n t a l i  
Il-far adult, il-fenek jew il-fenek ta’ l-Indi jista’ jkun u żat. Speċi 
oħrajn jistg ħu ikunu u żati iżda l-użu tagħhom ikun je ħtieġ ġustif­
kazzjoni. Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-pi żijiet 
għandha tkun ± 20 % tal-pi ż intermedju. Fejn ikun amministrat 
test sub-kroniku dermali b ħala minn studju preliminarju sa studju 
għal tul ta’ żmien, l-istess spe ċi u razza g ħandha tintu ża fiż-żewġ 
studji.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
N u m r u u s e s s  
Mill-inqas 20 annimal (10 ta’ sess femminili u 10 ta’ sess maskili) 
b’ġilda f’saħħitha għandhom ikunu u żati f’kull livell tad-do ża. L- 
annimali tas-sess femminili g ħandhom ikunu annimali li qatt ma 
welldu jew li m’humiex in ċinta. Jekk hu ppjanat li xi annimali se 
jkunu ssagrifikati fl-intervall in-numru tag ħhom għandu jkun mi żjud 
skond in-numru t’annimali skedat biex ji ġi ssagrifikat qabel it- 
terminu ta’ l-istudju. B’addizzjoni ma’ dan, grupp subordinat ta’ 20 annimal (10 annimali g ħal kull sess) jistg ħu jkunu ttrattati 
b’doża ta’ livell qawwi g ħal 90 ġurnata u osservati g ħal riversibilità, 
persistenza jew okkorrenza ttardjata ta’ effetti tossi ċi għal 28 ġurnata 
wara t-trattament.
 
L i v e l l i t a d - d o ż a 
Mill-inqas tliet livelli tad-do ża huma me ħtieġa b’kontroll jew 
b’sustanza ta’ kontroll jekk xi sustanza b ħal din hija u żata. Il- 
perjodu t’espo żizzjoni g ħandu jkun mill-inqas ta’ sitt sieg ħat 
kuljum. L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test g ħandha tkun 
magħmula f’ħinijiet simili kuljum, u l-ammont tas-sustanza 
applikata g ħandu jiġi aġġustat f’intervalli (ta’ kull ġimgħa jew ta’ 
kull ġimgħatejn) sabiex il-livell tad-do ża, f’termini ta’ pi ż tal-ġisem 
ta’ l-annimali, jin żamm kostanti. G ħajr għat-trattament bis-sustanza 
tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll g ħandhom ji ġu ttrattati 
b’manjiera identika ta’ dawk is-so ġġetti tal-grupp tat-test. Fejn 
sustanza tkun u żata sabiex ji ġi ffaċilitat id-do żaġġ, il-grupp tal- 
kontroll g ħandu jkun mog ħti doża bħal dik tal-gruppi ttrattati, u 
jirċievi l-istess ammont b ħal dak li jkun ri ċevut mill-grupp ta’ l- 
iktar livell qawwi ta’ do ża. L-iktar livell qawwi ta’ do ża għandu 
jirriżulta f’effetti tossi ċi iżda ma jipprodu ċi l-ebda, jew ftit, fatal ­
itajiet. L-inqas livell ta’ do ża m’għandux jipprodu ċi xi evidenza ta’ 
tossiċità. Fejn hemm estimazzjoni u żabbli ta’ espo żizzjoni umana l- 
inqas livell ta’ do ża jrid jaqbe ż lil din l-estimazzjoni. Idealment, il- 
livell ta’ do ża intermedju g ħandu jipprodu ċi effetti tossi ċi osservabbli 
minimi. Jekk iktar minn do ża waħda intermedja hija u żata, il-livelli 
tad-doża għandhom ikunu spazjati sabiex ti ġi prodotta gradazzjoni 
ta’ effetti tossi ċi. Fil-gruppi baxxi u intermedji, u fil-gruppi tal- 
kontroll, l-in ċidenza tal-fatalitajiet g ħandha tkun baxxa, biex 
tippermetti valutazzjoni sinjifiknti tar-ri żultati.  
Jekk l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test tipprodu ċi irritazzjoni severa 
tal-ġilda il-kon ċentrazzjonijiet g ħandhom ji ġu mnaqqsin u dan jista’ 
jirriżulta fi tnaqqis jew f’assenza ta’ effetti tossi ċi oħrajn fil-livell 
qawwi tad-do ża. Jekk lill- ġilda saritilha ħsara jista’ jkun ne ċessarju li 
l-istudju ji ġi terminat u jsir studju ie ħor b’konċentrazzjonijiet iktar 
baxxi.  
T e s t t a ’ l i m i t u  
Jekk studju preliminarju b’livell ta’ do ża ta’ 1 000 mg/kilogramma, 
jew doża ogħla, relatata ma’ espo żizzjoni umana possibbli, fejn hija 
magħrufa, ma jipprodu ċix l-ebda effetti tossi ċi, testijiet iktar minn 
hekk jistg ħu ma jkunux konsiderati ne ċessarji.  
P e r i j o d u t ’ o s s e r v a z z j o n i  
L-annimali esperimentali g ħandhom ikunu osservati ta’ kuljum g ħal 
sinjali ta’ tossi ċità. Il-ħin tal-mewt u l- ħin li fih jidhru s-sinjali tat- 
tossiċità għandhom ikunu mi żmumin.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
P r o ċ e d u r a  
L-annimali g ħandhom ji ġu magħluqin ġo gaġġa individwalment. L- 
annimali g ħandhom ji ġu ttrattati bis-sustanza tat-test, idealment fuq 
bażi ta’ sebat ijiem fil- ġimgħa, għal perjodu ta’ 90 ġurnata.  
L-annimali fi gruppi subordinati skedati g ħal osservazzjonijiet ta’ 
wara għandhom ji ġu miżmuma għal 28 ġurnata iktar ming ħajr trat­
tament sabiex ji ġi osservat l-irkupru mill-jew il-persistenza ta’ l- 
effetti tossi ċi. Il-ħin ta’ l-espo żizzjoni għandu jkun ta’ sitt sieg ħat 
kuljum.  
Is-sustanza tat-test g ħandha tkun applikata uniformement fuq żona li 
hija bejn wie ħed u ieħor 10 % tas-superfi ċje totali tal- ġisem. Fejn is- 
sustanzi huma tossi ċi ħafna, l-erja tas-superfi ċje miksija tista’ tkun 
inqas iżda l-istess ammont ta’ l-erja g ħandu jiġi miksi b’rita rqieqa u 
uniformi daqs kemm hu possibbli.  
Matul l-espo żizzjoni is-sustanza tat-test hija mi żmuma f’kuntatt mal- 
ġilda permezz gar ża poruża u b’tejp li ma jirritax. Is-sît tat-test 
għandu jkun miksi iktar minn hekk b’mod xieraq biex i żomm il- 
garża u s-sustanza tat-test u ji żgura li l-annimali ma jkunux jistg ħu 
jibilgħu is-sustanza tat-test. Ra żżâna jistgħu jiġu użati sabiex jippre ­
vejenu l-in ġestjoni tas-sustanza tat-test i żda l-immobilizzazzjoni 
kompleta tas-sustanza tat-test m’huwiex metodu rakkomandat.  
Fit-terminu tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, xi sustanza residwa tat-test 
għandha tiġi mneħħija fejn huwa prattiku permezz ta’ l-ilma jew 
b’metodu ie ħor xieraq li jnaddaf il- ġilda. 
L-annimali kollha g ħandhom ji ġu osservati ta’ kuljum u sinjali ta’ 
tossiċità għandhom ikunu mi żmuma, inklu ż il-ħin ta’ l-ewwel attakk 
tagħhom, il-grad tag ħhom u d-dewmien tag ħhom. L-osservazzjonijiet 
għandhom jinkludu tibdil fil- ġilda u fil-fur, fl-g ħajnejn u fil- 
membrani muku żi, kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkulatorji, awto ­
nomiċi u nervu żi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ 
komportament. Qjisien tal-konsum ta’ l-ikel g ħandhom jittie ħdu ta’ 
kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma 
neċessarju sabiex l-annimali ma ji ġux mitlufin mill-istudju 
minħabba kaw żi bħal kannibali żmu, awtolisi tat-tessuti jew 
minħabba li ji ġu mqiegħdin f’post ie ħor. Fit-terminu tal-perjodu ta’ 
l-istudju s-sopravissuti fil-gruppi tat-trattament mhux subordinati issi ­
rilhom nekroskopija. Annimali moribondi g ħandhom ji ġu mneħħija u 
għandha ssirilhom nekroskopija meta jkun av żat. 
Dawn l-e żamijiet huma s-soltu mag ħmulin fuq l-annimali kollha 
inklużi dawk tal-kontroll:  
(a) Eżami oftalmolo ġiku, bl-u żu ta’ oftalmoskopju jew tag ħmir 
addattat ekwivalenti, g ħandu jiġi magħmul qabel l-espo żizzjoni 
għas-sustanza tat-test u fit-terminu ta’ l-istudju, preferibbilment 
fuq kull animal i żda mill-inqas fuq l-annimali tad-do ża qawwija 
u fuq dawk tal-kontroll. Jekk tibdiliet fl-g ħajnejn huma skoperti 
l-annimali kollha g ħandhom ji ġu eżaminati.  
(b) Ematolo ġija, inklu żi l-ematokrit, il-kon ċentrazzjoni ta’ l-emog ­
lobina, il-kwantità ta’ l-eritro ċit, it-total u d-differenzali tal- 
kwantità ta’ l-eritro ċit, u l-qjies tal-potenzal tat-tag ħqid tad- 
demm, bħall-ħin tat-tagħqid, il-ħin tal-protrombin, il- ħin tat-trom ­
boplastin, jew il-kwantità tad-diski ż-żgħar fid-demm, g ħandhom 
ikunu nvestigati fit-terminu tal-perjodu tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
(ċ) Determinazzjoni tal-bijokimika tal-klinika fuq id-demm g ħandha 
tkun mag ħmula fit-terminu tal-perjodu tat-test. I ż-żoni tat-test li 
huma konsiderati xierqa g ħall-istudji kollha huma l-bilan ċ elet­
trolit, il-metaboli żmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal- 
kliewi. Is-selezzjoni ta’ testijiet spe ċifiċi jiġu nfluwenzati b’osser ­
vazzhonijiet fuq il-mod t’azzjoni tas-sustanza. Deter ­
minazzjonijiet su ġġeriti huma l-kal ċju, l-fosfru, l-kloru, s-sodju, 
l-potassju, il-glukosju tas-sawm (b’perjodu ta’ sawm addattat għall-ispeċi), transaminat tas-serkum glutamiku pirviku [6], trans ­
aminat tas-serum glutamiku o żaloċetiku [7], dekarbonat ta’ l- 
ornitin, transpeptidu tal-gamma glutamiku, nitro ġenu ta’ l-urea, 
albumina, kreatina tad-demm, u t-total tal-qjies tal-proteini tal- bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet o ħrajn li jistg ħu jkunu 
neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikolo ġika jinkludu anali żi 
tal-lipidi, ormoni, bilan ċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina 
u kolìnestera. Bijokimika tal-klinika addizzjonali tista’ tkun u żata 
fejn ikun ne ċessarju sabiex ti ġi estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti 
osservati.
 
(d) Anali żi kimika ta’ l-awrina m’hijiex me ħtieġa fuq bażi ta’ rutina 
iżda hija biss me ħtieġa meta hemm indikazzjoni bba żata fuq 
tossiċità mistennija jew osservata.  
Jekk id-data storika tal-linja ba żi m’hijiex adegwata, g ħandha 
tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-parametri tal-bijo ­
kimika ematolo ġika u klinika qabel ma jibda d-do żaġġ. 
N e k r o s k o p i j a t o t a l i  
L-annimali kollha g ħandhom ikunu so ġġetti għal nekroskopija totali 
u sħiħa li tinkludi e żami tas-superfi ċje esterna tal- ġisem, ta’ kull 
fetħa tal-ġisem, u tal- ħofor kranjali, tora ċiċi u addominali u l- 
kontenut tag ħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-parati ­
rojde), u t-testikoli g ħandhom ikunu pe żati friski malajr kemm jista’ 
jkun wara d-dissezzjoni sabiex ji ġi evitat li jixxottaw. L-organi u t- 
tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati g ħal xi eżamijiet istopa ­
toloġiċi futuri possibbli: il- ħsarat kbar fil- ġisem, il-mo ħħ – inklużi 
sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-g ħerq tal-mo ħħ li tgħaqqad il- 
medulla oblongata mat-talamu, il-korti ċi taċ-ċervellett u l-korti ċi 
celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l- 
utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il- ġilda), il-bu żżieqa tal-marrara, l- 
esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l- ilju, l-ilju, il-musrana l-g ħamja, il-musrana l- ħoxna, ir-rektum, il- 
bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappre żentattiva, (il- 
glandola tal- ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in- 
nerv periferali, (l-g ħajnejn), l-isternu bl-g ħadam tal-mudullun, (il- 
wirk, inklu ża s-superfi ċje artikulari), u (n-nerv li jg ħaddi minn ġos- 
sinsla fuq tliet livelli – ċervikali, tora ċiku tan-nofs u tal- ġenbejn). It- 
tessuti msemmijin fil-parentesi g ħandhom ji ġu eżaminati biss jekk 
jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossi ċità, jew permezz ta’ invol ­
viment ta’ l-organu li huwa t-targit.  
E ż a m i i s t o p a t o l o ġ i k u  
(a) Istopatolo ġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq ġilda normali u 
ttrattata u fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal- 
kontroll u tad-do ża qawwija.  
(b) Kull ħsara serja g ħandha tiġi eżaminata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 419
 
(ċ) Organi tat-targit fi gruppi ta’ do ża oħrajn għandhom ji ġu 
eżaminati.  
(d) Fejn il-firien huma u żati, il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi ta’ 
doża baxxa u imtermedja g ħandhom ji ġu soġġetti għal eżami 
istopatolo ġiku għal evidenza ta’ infezzjoni, billi dan jipprovdi 
valutazzjoni konvenjenti ta’ l-istat ta’ sa ħħa ta’ l-annimali. 
Eżami istopatolo ġiku iktar fil-fond jista’ ma jkunx me ħtieġ 
bħala rutina fuq l-annimali f’dawn il-gruppi, i żda għandu 
dejjem isir fl-organi li juru evidenza ta’ ħsara fil-gruppi ta’ 
doża qawwija.  
(e) Meta grupp subordinat huwa u żat, l-istopatolo ġija għandha tkun 
magħmula fuq it-tessuti u fuq l-organi identifikati b ħala li juru 
effetti fil-gruppi l-o ħrajn ittrattati.  
2. DATA  
Id-data g ħandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi g ħal 
kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat- 
test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara 
f’ġisimhom u l-persenta ġġ ta’ l-annimali li juru i ż-żewġ tipi ta’ ħsara. 
Ir-riżultati għandhom ji ġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. 
Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintu ża. 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk 
possibbli:  
— in-nisel ta’ l-ispe ċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispe ċi, il- 
kundizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta;  
— il-kundizzjonijiet tat-test;  
— il-livelli tad-do ża (inkluża xi sustanza, jekk u żata) u kon ċen­
trazzjonijiet;  
— data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-do ża; 
— il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli;  
— il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx 
sat-tmiem;  
— deskrizzjoni ta’ effetti tossi ċi jew effetti o ħrajn (b’attenzjoni 
partikolari g ħal skoperti tal-klinika);  
— il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien 
sussegwenti;  
— data ta’ l-g ħalf u tal-pi ż tal-ġisem;  
— skoperti oftalmolo ġiċi; 
— testijiet ematolo ġiċi użati u r-riżultati kollha;  
— testijiet tal-bijokimika tal-klinika u żati u r-riżultati kollha (inklu żi 
r-riżultati ta’ xi anali żi kimika ta’ l-awrina);  
— skoperti tan-nekroskopija;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatolo ġiċi kollha;  
— trattament ta’ l-istatistika tar-ri żultati fejn huwa xieraq;  
— diskussjoni tar-ri żultati;  
— interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
4. REFERENZI  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  TOSSIĊITÀ TA’ INALAZZJONI SUBKRONIKA: STUDJU TA’ 90 
JUM  
SOMMARJU  
Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.29 rivedut tfassal biex jikkaratterizza b’mod s ħiħ 
it-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar bir-rotta tal-inalazzjoni g ħal durata subkronika 
(90 jum), u biex jipprovdi dejta robusta g ħall-valutazzjonijiet tar-riskju ta’ 
inalazzjoni kwantitattiva. Gruppi ta’ 10 rodituri r ġiel u 10 nisa jkunu esposti 6 
sigħat kuljum matul perjodu ta’ 90 jum (13-il ġimgħa) għal a) il-kimika g ħall- 
ittestjar fi tliet livelli jew aktar ta’ kon ċentrazzjoni, b) l-arja ffiltrata (kontroll 
negattiv), u/jew c) il-vejjikolu (kontroll ta’ vejjikolu). L-annimali jkunu esposti 
ġeneralment g ħal 5 ijiem fil- ġimgħa iżda l-espo żizzjoni għal 7 ijiem fil- ġimgħa 
hija wkoll permessa. L-i ġiel u nisa jkunu dejjem ittestjati, i żda jkunu jistg ħu jiġu 
esposti f’livelli differenti ta’ kon ċentrazzjoni jekk ikun mag ħruf li sess wie ħed 
ikun aktar suxxettibbli g ħal kimika partikolari g ħall-ittestjar. Dan il-metodu 
jippermetti lid-direttur tal-istudju jkun flessibbli biex jinkludi gruppi satellitarji (riversibbli), qatliet interim, ħasil tal-bronkoalveolari (BAL), testijiet newrolo ġiċi 
u patoloġija klinika addizzjonali u evalwazzjonijiet istopatoli ġiċi biex it-tossi ċità 
ta’ kimika g ħall-ittestjar tkun ikkaratterizzata a ħjar.
 
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test 413 
(2009) tal-OECD. Il-Linja Gwida tat-Test 413 (TG 413) ori ġinali dwar 
inalazzjoni subkronika kienet adottata fl-1981 (1). Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.29 (b ħala ekwivalenti g ħat-TG 413 (2009) riveduta) kien 
aġġornat biex jirrifletti l-istat tax-xjenza u biex jissodisfa ħtiġijiet regolatorji 
preżenti u futuri.
 
2. Studji dwar tossi ċità ta’ inalazzjoni subkronika jintu żaw primarjament biex 
ikunu dderivati kon ċentrazzjonijiet regolatorji g ħall-valutazzjoni tar-riskju 
ta’ ħadddiema f’konfigurazzjonijiet okkupazjonali. Jintu żaw ukoll biex 
ikun ivvalutat riskju residenzjali, ta’ trasport u ambjentali g ħall-bniedem. 
Dan il-metodu jg ħin biex ikunu kkaratterizzati effetti ħżiena wara 
espożizzjoni ripetuta kuljum ta’ inalazzjoni g ħal kimika g ħall-ittestjar g ħal 
90 jum (madwar 10 % tal- ħajja kollha ta’ far). Id-dejta derivata minn studji 
dwar tossi ċità ta’ inalazzjoni subkronika tista’ tintu ża għal valutazzjonijiet 
tar-riskji kwantitattivi u g ħall-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet g ħal studji 
kroniċi. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar mhux ma ħsub speċifikatament g ħall- 
ittestjar tan-nanomaterjali. Id-definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar huma pprovduti fl-a ħħar ta’ dan il-kapitolu u 
fid-Dokument ta’ Gwida (GD) 39 (2).  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
3. L-informazzjoni kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha 
titqies mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma jsir l-istudju biex tissa ħħaħ 
il-kwalità tal-istudju u biex l-u żu tal-annimali jkun minimizzat. 
L-informazzjoni li g ħandha tassisti fl-g ħażla ta’ kon ċentrazzjonijiet ta’ 
testijiet adatti tista’ tinkludi l-identità, l-istruttura tal-kimika, u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; ir-ri żultati ta’ 
kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew  in vivo ; użu/ijiet anti ċipat(i) u 
potenzjal g ħal espożizzjoni umana; dejta (Q)SAR disponibbli u dejta tossi ­
koloġika dwar kimi ċi relatati strutturalment; u dejta derivata minn studji 
oħra ripetuti ta’ espo żizzjoni. Jekk tkun mistennija jew osservata newrotos ­
siċità waqt li jkun g ħaddej l-istudju, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li 
jinkludi evalwazzjonijiet xierqa b ħal gaġġa funzjonali ta’ 
osservazzjoni (FOB) u kejl ta’ attività motorja. G ħalkemm l-g ħażla sewwa 
tal-ħin ta’ espo żizzjonijiet relattivi g ħal eżamijiet spe ċifiċi tista’ tkun kritika, 
il-prestazzjoni ta’ dawn l-attivitajiet addizzjonali m’g ħandhiex tfixkel 
id-disinn ba żiku tal-istudju.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Dilwizzjonijiet ta’ kimi ċi għall-ittestjar korru żivi jew irritanti jistg ħu jiġu 
ttestjati f’kon ċentrazzjonijiet li g ħandhom irendu l-grad mixtieq ta’ tossi ċità. 
Jekk jogħġbok irreferi g ħal GD 39 (2) g ħal aktar informazzjoni. Meta 
l-annimali jkunu esposti g ħal dawn il-materjali, il-kon ċentrazzjonijiet 
immirati g ħandhom ikunu baxxi bi żżejjed li ma jo ħolqux uġigħ kbir u 
diffikultà, i żda biżżejjed biex jestendu l-kurva ta’ kon ċentrazzjoni-rispons 
għal livelli li jil ħqu l-għan regolatorju u xjentifiku tat-test. Dawn 
il-konċentrazzjonijiet g ħandhom jintg ħażlu abbażi ta’ każ każ, preferib ­
bilment imsejsa fuq studju mfassal b’mod adegwat ta’ detezzjoni ta’ firxa 
li jipprovdi informazzjoni dwar il-punt ta’ tmiem kritiku, dwar kull limitu ta’ 
irritazzjoni u dwar il- ħin ta’ meta beda (ara l-paragrafi 11-13). G ħandha 
tingħata l-ġustifikazzjoni g ħal għażla tal-kon ċentrazzjoni.  
5. L-annimali moribondi jew annimali li jkunu jidhru li jkunu mu ġugħa jew li 
juru sinjali ta’ diffikultà severa u fit-tul g ħandhom jinqatlu b’mod uman. 
L-annimali moribondi jitqiesu bl-istess mod b ħal annimali li jmutu waqt 
it-test. Il-kriterji g ħat-teħid tad-deċiżjoni li jinqatlu annimali moribondi jew 
li jkunu qed ibatu ħafna, u l-gwida biex ikun mag ħruf meta l-mewt tkun 
tista’ titbassar jew tkun waslet qrib ħafna, huma s-su ġġett ta’ Dokument ta’ 
Gwida tal-OECD dwar il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (3).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ Spe ċi tal-Annimali  
6. Għandhom jintu żaw rodituri adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li 
komunement jintu żaw fil-laboratorju. L-ispe ċi preferuta hija l-far. G ħandha 
tingħata ġustifikazzjoni jekk jintu żaw speċijiet oħra. 
Preparazzjoni tal-Annimali  
7. In-nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx ikunu tqal. Fil-jum li 
fih jintgħażlu b’mod ka żwali, l-annimali g ħandhom ikunu adulti żgħażagħ li 
jkunu minn 7 sa 9 ġimgħat fl-età. Il-pi żijiet tal-ġisem għandhom ikunu ta’ 
±20 % tal-pi ż medju g ħal kull sess. L-annimali jintg ħażlu b’mod ka żwali, 
jiġu mmarkati g ħal identifikazzjoni individwali, u jin żammu fil-ga ġeġ 
tagħhom għal mill-anqas 5 ijiem qabel ma jibda t-test biex jidraw 
il-kundizzjonijiet tal-laboratorju.  
Trobbija tal-Annimali  
8. L-annimali g ħandhom ikunu identifikati individwalment, preferibbilment bi 
transponders ta ħt il-ġilda, biex ikunu ffa ċilitati l-osservazzjonijiet u tkun 
evitata l-konfu żjoni. It-temperatura tal-kamra ta’ manutenzjoni tal-annimali 
esperimentali g ħandha tkun 22 ± 3 °C. L-umdità relattiva g ħandha idealment 
tinżamm fil-firxa ta’ 30 % sa 70 %, g ħalkemm dan jista’ ma jkunx possibbli 
meta jintu ża l-ilma b ħala vejjikolu. Qabel u wara l-espo żizzjonijiet, 
l-annimali ġeneralment g ħandhom jitqieg ħdu f’gaġġa fi gruppi skont 
is-sess u l-kon ċentrazzjoni, i żda l-għadd ta’ annimali g ħal kull ga ġġa 
m’għandux ifixkel l-osservazzjoni ċara ta’ kull annimal u g ħandu 
jimminimizza t-telf min ħabba kannibali żmu u ġlied. Meta l-annimali 
jkollhom ikunu esposti mill-imnie ħer biss, jista’ jkun je ħtiġilhom jidraw 
it-tubi ta’ tra żżin. It-tubi ta’ tra żżin m’għandhomx jimponu tensjoni fi żika, 
termali u ta’ immobilizzazzjoni bla b żonn fuq l-annimali. It-tra żżin jista’ 
jaffettwa punti ta’ tmiem fi żjoloġiċi bħat-temperatura tal- ġisem (ipertermja) 
u/jew volum respiratorju minusklu. Jekk tkun disponibbli dejta ġenerika li 
turi li ebda bidliet b ħal dawn ma jse ħħu sa ċertu limitu konsiderevoli, f’dak 
il-każ ma jkunx me ħtieġ adattament minn qabel g ħat-tubi ta’ tra żżin. 
L-annimali esposti mill- ġisem kollu g ħal aerosol g ħandhom jing ħalqu indi­
vidwalment matul l-espo żizzjoni biex ma jit ħallewx jiffiltraw l-aerosol 
tat-test mal-pil ta’ s ħabhom fil-ga ġġa. Jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali 
u ċċertifikati mil-laboratorju, ħlief matul espo żizzjoni, flimkien ma’ 
provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb muni ċipali. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl/12-il sieg ħa dlam.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Kmamar tal-Inalazzjoni  
9. In-natura tal-kimika g ħall-ittestjar u l-o ġġett tat-test g ħandhom jitqiesu 
fl-għażla tal-kamra tal-inalazzjoni. Il-modalità ppreferuta ta’ espo żizzjoni 
hija mill-imnie ħer biss (liema fra żi tinkludi r-ras biss, l-imnie ħer biss, jew 
il-geddum biss). Espo żizzjoni mill-imnie ħer biss hija ġeneralment ippre ­
feruta għal studji ta’ aerosols likwidi jew solidi u g ħal fwar li jista’ 
jikkondensa biex jifforma l-aerosols. G ħanijiet spe ċjali tal-istudju jistg ħu 
jinkisbu a ħjar billi tintu ża modalità ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu, i żda 
dan għandu jkun i ġġustifikat fir-rapport tal-istudju. Biex tkun żgurata 
stabbiltà tal-atmosfera meta tintu ża kamra g ħall-ġisem kollu, il-volum 
totali tal-annimali tat-test m’g ħandux ikun aktar minn 5 % tal-volum 
tal-kamra. Il-prin ċipji tat-tekniki tal-espo żizzjoni mill-imnie ħer biss u 
mill-ġisem kollu u tal-vanta ġġi u l-iżvantaġġi partikolari tag ħhom huma 
indirizzati f’GD 39 (2).  
STUDJI DWAR IT-TOSSI ĊITÀ 
Konċentrazzjonijiet Limitati  
10. B’differenza minn studji akuti, m’hemmx kon ċentrazzjonijiet ta’ limitu 
ddefiniti fi studji dwar it-tossi ċità ta’ inalazzjoni subkronika. 
Il-konċentrazzjoni massima ttestjata g ħandha tqis: 1) il-kon ċentrazzjoni 
massima li tista’ tinkiseb, 2) il-livell ta’ “l-ag ħar każ” ta’ espo żizzjoni 
umana, 3) il- ħtieġa li tinżamm provvista adegwata ta’ ossi ġenu, u/jew 4) 
konsiderazzjonijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali. Fin-nuqqas ta’ limiti 
abbażi ta’ dejta, jistg ħu jintużaw il-limiti akuti tar-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 (13) (ji ġifieri, sa kon ċentrazzjoni massima ta’ 5 mg/l g ħal 
aerosols, 20 mg/l g ħal fwar u 20 000 ppm g ħal gassijiet); irreferi g ħal GD 
39 (2). G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni jekk ikun me ħtieġ li dawk il-limiti 
jinqabżu meta jkunu ttestjati gassijiet jew kimi ċi għall-ittestjar volatili ħafna 
(eż. refriġeranti). Il-kon ċentrazzjoni limitata g ħandha tislet tossi ċità inek­
wivoka ming ħajr ma tikkaw ża tensjoni bla b żonn għall-annimali jew 
tolqot it-tul tal- ħajja tagħhom (3).  
Studju dwar id-Detezzjoni ta’ Firxa  
11. Qabel ma jing ħata bidu g ħall-istudju ewlieni, ġeneralment ikun me ħtieġ li 
jsir studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa huwa aktar komprensiv minn studju ta’ osservazzjoni min ħabba li mhux 
limitat għal għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet. It-tag ħlim li hemm x’wie ħed 
jieħu minn studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jwassal biex studju 
ewlieni jirnexxi. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’, pere żempju, 
jipprovdi informazzjoni teknika dwar metodi analiti ċi, teħid tad-daqs 
tal-partiċelli, sejbien ta’ mekkani żmi tossiċi, patoloġija klinika u dejta isto ­
patoloġika u stimi ta’ x’jistg ħu ikunu kon ċentrazzjonijiet NOAEL u MTC fi 
studju ewlieni. Id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li juża l-istudju dwar 
id-detezzjoni ta’ firxa biex jidentifika l-limitu ta’ irritazzjoni tas-sistema 
respiratorja (e ż. b’istopatolo ġija tas-sistema respiratorja, l-ittestjar 
tal-funzjoni pulmonarja jew il- ħasil tal-bronkoalveolari), il-kon ċentrazzjoni 
ogħla li hija tollerata ming ħajr tensjoni bla b żonn għall-annimali u 
l-parametri li g ħandhom jikkaratterizzaw bl-a ħjar mod it-tossi ċità ta’ 
kimika għall-ittestjar.
 
12. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jikkonsisti f’livell wie ħed jew aktar 
ta’ konċentrazzjonijiet. Skont il-punti ta’ tmiem mag ħżulin, għandhom ikunu 
esposti minn tlieta sa sitt ir ġiel u minn tlieta sa sitt nisa f’kull livell ta’ 
konċentrazzjoni. Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa g ħandu jdum mill-anqas 
5 ijiem u ġeneralment mhux aktar minn 28 jum. Il-motiv g ħall-għażla ta’ 
konċentrazzjonijiet g ħall-istudju ewlieni g ħandu jing ħata fir-rapport ta’ 
studju. L-g ħan tal-istudju ewlieni huwa li tintwera relazzjoni ta’ kon ċen­
trazzjoni-rispons ibba żata fuq dak li huwa mistenni li jkun l-aktar punt ta’ 
tmiem sensittiv. Il-kon ċentrazzjoni baxxa g ħandha idealment tkun kon ċen­
trazzjoni ta’ ebda effett ħażin osservat, filwaqt li l-kon ċentrazzjoni g ħolja 
għandha tislet tossi ċità inekwivoka ming ħajr ma tikkaw ża tensjoni bla b żonn 
għall-annimali jew tolqot it-tul tal- ħajja tagħhom (3).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Meta tkun qed issir l-g ħażla ta’ livelli ta’ kon ċentrazzjoni g ħall-istudju dwar 
id-detezzjoni ta’ firxa, l-informazzjoni kollha disponibbli g ħandha titqies li 
tinkludi relazzjonijiet ta’ attività strutturata u dejta g ħal kimiċi simili (ara 
l-paragrafu 3). Studju dwar id-detezzjoni ta’ firxa jista’ jivverifika/jirrifjuta dawk li jitqiesu li jkunu l-punti ta’ tmiem l-aktar sensittivi bba żati b’mod 
mekkaniku, e ż. inibizzjoni ta’ kolinestera żi b’organofosfati, formazzjoni ta’ 
metemoglobina b’a ġenti eritro ċitotossiċi, ormoni tat-tirojde (T3, T4) g ħal 
tirotossikanti, proteina, LDH jew newtrofili f’ ħasil tal-bronkoalveolari g ħal 
partiċelli li ftit jin ħallu li ma jag ħmlux ħsara jew aerosols li jirritaw 
il-pulmun.
 
Studju ewlieni  
14. L-istudju subkroniku ewlieni dwar tossi ċità ġeneralment jikkonsisti fi tliet 
livelli ta’ kon ċentrazzjoni, u wkoll kontrolli konkurrenti negattivi (arja) 
u/jew ta’ vejjikoli skont il- ħtieġa (ara l-paragrafu 18). Id-dejta kollha 
disponibbli g ħandha tkun utilizzata b ħala għajnuna fl-g ħażla ta’ livelli 
adatti ta’ espo żizzjoni, inklu żi r-riżultati ta’ studji sistemi ċi ta’ tossi ċità, 
metaboliżmu u kinetika (g ħandha ssir enfa żi partikolari biex ikunu evitati 
livelli għoljin ta’ kon ċentrazzjoni li jissaturaw pro ċessi kineti ċi). Kull grupp 
ta’ test ikollu fih 10 rodituri r ġiel u 10 nisa li jkunu esposti g ħall-kimika 
għall-ittestjar g ħal 6 sigħat kuljum fuq ba żi ta’ 5 ijiem fil- ġimgħa għal 
perjodu ta’ 13-il ġimgħa (l-eżami jdum b’kollox mill-anqas 90 jum). 
L-annimali jistg ħu wkoll ikunu esposti 7 ijiem fil- ġimgħa (eż. meta 
l-ittestjar ikun ħa l-farma ċewtiċi man-nifs). Jekk ikun mag ħruf li wie ħed 
miż-żewġ sessi jkun aktar suxxettibbli g ħal kimika partikolari g ħall-ittestjar, 
is-sessi jkunu jistg ħu jiġu esposti f’livelli differenti ta’ kon ċentrazzjoni biex 
isir l-aħjar użu mill-kon ċentrazzjoni-rispons kif deskritt fil-paragrafu 15. 
Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra l-firien ikunu esposti mill-imnie ħer 
biss, il-perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu jkunu a ġġustati biex 
titnaqqas id-diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. G ħandu jkun 
ipprovdut motiv meta l-espo żizzjoni ddum anqas minn 6 sig ħat/jum, jew 
meta jkun me ħtieġ li jsir studju ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu li jdum 
aktar (eż. 22 sieg ħa/jum) (irreferi g ħal GD 39) (2). M’g ħandux jing ħata 
għalf matul il-perjodu ta’ espo żizzzjoni sakemm espo żizzjoni ma ddumx 
aktar minn 6 sig ħat. Jista’ jing ħata l-ilma matul l-espo żizzjoni kollha 
mill-ġisem kollu.  
15. Il-kon ċentrazzjonijiet immirati mag ħżulin għandhom jidentifikaw l-organu/i 
mmirat(i) u juru kon ċentrazzjoni-rispons ċari: 
— Il-livell g ħoli ta’ kon ċentrazzjoni g ħandu jirri żulta f’effetti tossi ċi iżda 
m’għandux jikkaw ża sinjali jew letalità li jdumu u li ma j ħallux li ssir 
evalwazzjoni li tag ħmel sens.  
— Il-livell(i) intermedju/i ta’ kon ċentrazzjoni g ħandhom ikunu spazjati biex 
jipproduċu gradazzjoni ta’ effetti tossi ċi bejn dawk tal-kon ċentrazzjoni 
baxxa u dawk tal-kon ċentrazzjoni g ħolja. 
— Il-livell baxx ta’ kon ċentrazzjoni g ħandu jipprodu ċi ftit jew ebda 
evidenza ta’ tossi ċità. 
Qatliet Interim  
16. Jekk ikunu ppjanati qatliet interim, l-g ħadd ta’ annimali f’kull livell ta’ 
konċentrazzjoni g ħandu jiżdied bl-g ħadd li jkollhom jinqatlu qabel ma 
jitlesta l-istudju. G ħandu jing ħata l-motiv g ħal użu ta’ qatliet interim, u 
analiżi ta’ statistika g ħandha tag ħti spjegazzjoni sewwa tag ħhom. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Studju Satellitarju (Riversibbiltà)  
17. Studju satellitarju (riversibbiltà) jista’ jintu ża biex ikunu osservati 
r-riversibbiltà, il-persistenza jew l-okkorrenza mdewma ta’ tossi ċità għal 
perjodu ta’ wara trattament ta’ tul xieraq, i żda ta’ mhux anqas minn 14-il 
jum. Gruppi satellitarji (riversibbli) jikkonsistu f’10 r ġiel u 10 nisa esposti 
kontemporanjament mal-annimali tal-esperiment fl-istudju ewlieni. Gruppi ta’ studju satellitarju (riversibbli) g ħandhom ikunu esposti g ħall-kimika 
għall-ittestjar fl-og ħla livell ta’ kon ċentrazzjoni u g ħandu jkun hemm arja 
konkurrenti u/jew kontrolli ta’ vejjikoli skont il- ħtieġa (ara l-paragrafu 18).
 
Annimali tal-Kontroll  
18. L-annimali tal-kontroll negattiv (arja) konkurrenti g ħandhom ikunu 
mmaniġġati b’mod identiku g ħall-grupp ta’ annimali tat-test ħlief li huma 
jkunu esposti g ħal arja filtrata milli g ħal kimika g ħall-ittestjar. Meta l-ilma 
jew sustanza o ħra jintużaw biex jassistu biex tkun i ġġenerata l-atmosfera 
tat-test, fl-istudju g ħandu jkun inklu ż grupp ta’ kontroll ta’ vejjikoli, minflok 
grupp ta’ kontroll negattiv (arja). Kull meta jkun possibbli g ħandu jintu ża 
l-ilma bħala l-vejjikolu. Meta l-ilma jintu ża bħala l-vejjikolu, l-annimali ta’ 
kontroll g ħandhom ikunu esposti g ħal arja bl-istess umdità relattiva b ħal 
tal-gruppi esposti. L-g ħażla ta’ vejjikolu adattat g ħandha tkun ibba żata fuq 
studju minn qabel immexxi sewwa jew fuq dejta storika. Jekk it-tossi ċità ta’ 
vejjikolu ma’ tkunx mag ħrufa sewwa, id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li 
juża kemm kontroll negattiv (arja), kif ukoll kontroll ta’ vejjikolu, i żda dan 
għandu jkun skura ġġit ħafna Jekk dejta storika turi li vejjikolu ma jkunx 
tossiku, f’dak il-ka ż ma jkunx hemm ħtieġa għal grupp ta’ kontroll negattiv 
(arja) u g ħandu jintu ża biss kontroll tal-vejjikolu. Jekk studju minn qabel ta’ 
kimika għall-ittestjar ifformulata f’vejjikolu ma turi ebda tossi ċità, isegwi li 
l-vejjikolu ma jkunx tossiku fil-kon ċentrazzjoni ttestjata u g ħandu jintu ża 
dan il-kontroll ta’ vejjikolu.  
KONDIZZJONIJIET TAL-ESPO ŻIZZJONI  
Amministrazzjoni tal-Kon ċentrazzjonijiet  
19. L-annimali jkunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar b ħala gass, fwar, 
aerosol, jew ta ħlita tagħhom. L-istat fi żiku li jkollu ji ġi ttestjat jiddependi 
mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar, 
mill-konċentrazzjonijiet mag ħżulin, u/jew mill-forma fi żika li x’aktarx 
ħafna jkun hemm matul it-trattament u l-u żu tal-kimika g ħall-ittestjar. 
Il-kimiċi għall-ittestjar igroskopiku u reattivi kimikament g ħandhom ikunu 
ttestjati f’kundizzjonijiet ta’ arja xotta. G ħandha ting ħata attenzjoni biex 
ikun evitat li jkunu ġġenerati kon ċentrazzjonijiet esplussivi. Il-materjal 
tal-partiċelli jista’ jkun so ġġett għal proċessi mekkani ċi biex jitnaqqas 
id-daqs tal-parti ċelli. Gwida ulterjuri hija pprovduta f’GD 39 (2).  
Distribuzzjoni tad-Daqs tal-Parti ċelli 
20. It-teħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħall-aerosols kollha u g ħall-fwar 
li jista’ jikkondensa biex jifforma l-aerosols. Biex tit ħalla jkun hemm 
espożizzjoni tar-re ġjuni kollha rilevanti tas-sistema respiratorja, huma rrak ­
komandati aerosols b’dijametri ajrudinami ċi ta’ medjan tal-massa (MMAD) 
f’firxa minn 1 sa 3 μm b’devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ) fil-firxa ta’ 
1,5 sa 3,0 (4). G ħalkemm g ħandu jsir sforz ra ġonevoli biex dan l-istandard 
jintlaħaq, għandu jkun ipprovdut ġudizzju espert jekk ma jkunx jista’ jint ­
laħaq. Pereżempju, parti ċelli ta’ d ħaħen tal-metall ikunu i żgħar minn dan 
l-istandard, u parti ċelli u fibri ċċarġjati tad-dħaħen tal-metall jistg ħu jaqbżuh. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Preparazzjoni tal-Kimika g ħall-Ittestjar f’Vejjikolu  
21. Idealment, il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tiġi ttestjata ming ħajr vejjikolu. 
Jekk ikun me ħtieġ jintuża vejjikolu biex ikunu ġġenerati l-kon ċentrazzjoni 
adattata tal-kimika g ħall-ittestjar u d-daqs tal-parti ċelli, l-ilma g ħandu 
jingħata preferenza. Kull darba li kimika g ħall-ittestjar tin ħall f’vejjikolu, 
l-istabbiltà tag ħha għandha tintwera.  
MONITORA ĠĠ TAL-KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Fluss tal-Arja fil-Kamra  
22. Il-fluss tal-arja mal-kamra ta’ espo żizzjoni għandu jkun ikkontrollat sewwa, 
immonitorjat kontinwament u rre ġistrat mill-anqas kull sieg ħa matul kull 
espożizzjoni. Il-monitora ġġ f’ħin reali tat-kon ċentrazzjoni atmosferika 
tat-test (jew stabbiltà temporali) huwa kejl integrali tal-parametri dinami ċi 
kollha u jipprovdi mezzi indiretti g ħall-kontroll tal-parametri rilevanti u 
dinamiċi kollha tal-inalazzjoni. Jekk il-kon ċentrazzjoni tkun immonitorjata 
f’ħin reali, il-frekwenza tal-kejl ta’ flussi ta’ arja tista’ titnaqqas sa kejl 
wieħed għal kull espo żizzjoni għal kull jum. G ħandha ting ħata konsider ­
azzjoni spe ċjali biex ikun evitat te ħid mill-ġdid ta’ nifs fil-kmamar g ħall- 
imnieħer biss. Il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġenu għandha tkun mill-anqas ta’ 
19 % u l-kon ċentrazzjoni ta’ dijossidu tal-karbonju m’g ħandhiex tkun aktar 
minn 1 %. Jekk ikun hemm ra ġuni biex wie ħed jemmen li dan l-istandard 
ma jkunx jista’ jitla ħaq, il-kon ċentrazzjonijiet tal-ossi ġenu u tad-dijossidu 
tal-karbonju g ħandhom jitkejlu. Jekk il-kejlijiet fl-ewwel jum ta’ 
espożizzjoni juru li dawn il-gassijiet ikunu ta’ livelli tajbin, ma jkunux 
meħtieġa aktar kejlijiet.  
Temperatura tal-Kamra u Umdità Relattiva  
23. It-temperatura tal-kamra g ħandha tin żamm għal 22 ± 3 °C. L-umdità 
relattiva fi ż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs, g ħal espożizzjonijiet kemm 
mill-imnie ħer biss, kif ukoll mill- ġisem kollu, g ħandha tkun immonitorjata 
kontinwament u rre ġistrata kull sieg ħa matul kull espo żizzjoni meta jkun 
possibbli. L-umdità relattiva g ħandha preferibbilment tin żamm fil-firxa ta’ 
30 % sa 70 %, i żda din jew ma tkunx tista’ tintla ħaq (eż. meta jkunu 
ttestjati ta ħlitiet abba żi ta’ ilma) jew ma tkunx tista’ titkejjel min ħabba 
interferenza minn kimika g ħall-ittestjar mal-Metodu ta’ Ttestjar.  
Kimika g ħall-Ittestjar: Kon ċentrazzjoni Nominali  
24. Kull meta jkun fattibbli, il-kon ċentrazzjoni nominal tal-kamra 
tal-espożizzjoni g ħandha tkun ikkalkulata u rre ġistrata. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali hija l-massa ġġenerata ta’ kimika g ħall-ittestjar divi ża bil-volum 
totali ta’ arja li tkun g ħaddiet mis-sistema tal-kamra tal-inalazzjoni. 
Il-konċentrazzjoni nominali ma tintu żax biex tikkaratterizza l-espo żizzjoni 
tal-annimali, i żda hija paragun tal-kon ċentrazzjoni nominali u 
l-konċentrazzjoni attwali tag ħti indikazzjoni tal-effi ċjenza ta’ ġenerazzjoni 
tas-sistema tal-ittestjar, u, g ħalhekk, tista’ tintu ża biex jinkixfu problemi 
ta’ ġenerazzjoni.  
Kimika g ħall-Ittestjar: Kon ċentrazzjoni attwali  
25. Il-kon ċentrazzjoni attwali hija l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar kif 
ikun itteħdilha l-kampjun tag ħha fiż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs 
f’kamra tal-inalazzjoni. Kon ċentrazzjonijiet attwali jistg ħu jinkisbu jew 
b’metodi spe ċifiċi (eż. teħid dirett ta’ kampjuni, metodi ta’ assorbiment 
jew kimiċi reattivi u karatterizzazzjoni analitika sussegwenti) jew b’metodi 
mhux spe ċifiċi bħal analiżi gravimetrika b’filtru. L-u żu ta’ anali żi 
gravimetrika huwa a ċċettabbli biss g ħal aerosols tat-trab b’komponent 
wieħed jew g ħal aerosols ta’ likwidi ta’ volatilità baxxa u g ħandu jkun 
appoġġat minn karatterizzazzjonijiet adattati ta’ qabel l-istudju spe ċifiċi 
għall-kimika g ħall-ittestjar. Il-kon ċentrazzjoni ta’ aerosols tat-trab b’ ħafna ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
komponenti tista’ wkoll tkun iddeterminata b’anali żi gravimetrika. I żda din 
teħtieġ dejta analitika li turi li l-kompo żizzjoni ta’ materjal tal-ajru tkun 
simili għall-materjal tal-bidu. Jekk din l-informazzjoni ma tkunx disponibbli, 
tista’ tkun me ħtieġa analiżi mill-ġdid tal-kimika g ħall-ittestjar (idealment 
fl-istat tag ħha fl-arja) f’intervalli regolari waqt li jkun g ħaddej l-istudju. 
Għal aġenti aerosolizzati li jistg ħu jevaporaw jew jissubblimaw, g ħandu 
jintwera li l-fa żijiet kollha kienu n ġabru bil-metodu mag ħżul. 
26. Għandu jintu ża lott wie ħed tal-kimika g ħall-ittestjar sakemm idum l-istudju, 
jekk ikun possibbli, u l-kampjun tat-test g ħandu jinħażen f’kundizzjonijiet li 
jżommu l-purezza, l-omo ġeneità u l-istabbiltà tieg ħu. Qabel ma jinbeda 
l-istudju, g ħandu jkun hemm karatterizzazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, 
inkluża l-purezza tag ħha, u jekk teknikament fattibbli, l-identità u 
l-kwantitajiet ta’ kontaminanti u impuritajiet identifikati. Dan jista’ jintwera bid-dejta li ġejja, iżda ma jkunx limitat g ħaliha: ħin ta’ ritenzjoni 
u erja relattiva fl-og ħla livell, pi ż molekulari minn spettrometrija tal-massa 
jew minn anali żi kromatografika ta’ gass, jew minn stimi o ħra. Għalkemm 
l-identità tal-kampjun tat-test mhix ir-responsabbiltà tal-laboratorju tat-test, ikun prudenti g ħal-laboratorju tat-test li jikkonferma l-karatterizzazzjoni 
tal-isponser mill-anqas b’mod limitat (e ż. lewn, natura fi żika, eċċ.).
 
27. L-atmosfera ta’ espo żizzjoni għandha tin żamm kostanti daqs kemm ikun 
prattikabbli. Jista’ jintu ża apparat ta’ monitora ġġ f’ħin reali, b ħal fotomiter 
tal-aerosol g ħal aerosols jew analizzatur ta’ idrokarbur totali g ħal fwar biex 
tintwera l-istabbiltà tal-kundizzjonijiet ta’ espo żizzjoni. Kon ċentrazzjoni 
attwali tal-kamra g ħandha titkejjel mill-anqas 3 darbiet matul kull jum ta’ 
espożizzjoni għal kull livell ta’ kon ċentrazzjoni. Jekk dan ma jkunx jista’ 
jsir minħabba rati limitati ta’ fluss ta’ arja jew min ħabba kon ċentrazzjonijiet 
baxxi, kampjun wie ħed għal kull perjodu ta’ espo żizzzjoni jkun a ċċettabbli. 
Idealment, dan il-kampjun g ħandu mbag ħad jinġabar tul il-perjodu kollu ta’ 
espożizzzjoni. Il-kampjuni individwali tal-kon ċentrazzjoni tal-kamra jistg ħu 
jkollhom devjazzjoni mill-kon ċentrazzjoni medja tal-kamra b’mhux aktar 
minn ± 10 % g ħall-gassijiet u l-fwar, u b’mhux aktar minn ± 20 % g ħall- 
aerosols likwidi jew solidi. Il- ħin biex tinkiseb ekwilibrazzjoni tal-kamra 
(t 95 ) għandu jkun ikkalkulat u rrappurtat. Id-durata ta’ espo żizzjoni tkopri 
l-ħin li fih il-kimika g ħall-ittestjar tkun i ġġenerata. Din tqis il- ħinijiet 
meħtieġa biex jinkisbu l-ekwilibrazzjoni (t  95 ) u d-degradazzjoni tal-kamra. 
Gwida għal stima ta’ t  95 tinsab f’GD 39 (2).  
28. Għal taħlitiet kumplessi ħafna li jikkonsistu f’gassijiet/fwar u aerosols (e ż. 
atmosferi ta’ kombustjoni u kimi ċi għall-ittestjar im ħaddmin minn 
prodotti/mezzi ta’ u żu finali b’g ħan speċifiku), kull fa żi tista’ ta ġixxi 
b’mod differenti f’kamra tal-inalazzjoni. G ħalhekk g ħandha tintg ħażel 
mill-anqas sustanza indikatri ċi waħda (analita), normalment l-ingredjent 
prinċipali attiv fit-ta ħlita, ta’ kull fa żi (gass/fwar u aerosol). Meta l-kimika 
għall-ittestjar tkun ta ħlita, il-kon ċentrazzjoni analitika g ħandha tkun irrap ­
purtata fir-rigward tat-ta ħlita totali, u mhux biss g ħall-ingredjent attiv jew 
għas-sustanza indikatri ċi (analita). Informazzjoni addizzjonali dwar 
il-konċentrazzjonijiet attwali tinsab f’GD 39 (2).  
Kimika g ħall-Ittestjar: Distribuzzjoni tad-Daqs tal-Parti ċelli 
29. Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli tal-aerosols g ħandha tkun iddeter ­
minata mill-anqas kull ġimgħa għal kull livell ta’ kon ċentrazzjoni billi 
jintuża impattur kaskata jew strument alternattiv b ħall-għodda ajrudinamika 
li tagħti d-daqs tal-parti ċelli (APS). Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza 
tar-riżultati miksubin minn impattur kaskata u mill-istrument alternattiv, 
f’dak il-ka ż l-istrument alternattiv ikun jista’ jintu ża tul l-istudju kollu.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. It-tieni mezz, b ħal filtru gravimetriku jew impinger/gas bubbler, g ħandu 
jintuża flimkien mal-istrument primarju biex jikkonferma l-effi ċjenza 
tal-istrument primarju fil- ġabra. Il-kon ċentrazzjoni tal-massa miksuba 
b’analiżi tad-daqs ta’ parti ċelli għandha tkun fil-limiti ra ġjonevoli 
tal-konċentrazzjoni tal-massa miksuba b’anali żi b’filtru [ara GD 39 (2)]. 
Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza fil-kon ċentrazzjonijiet kollha ttestjati 
fil-fażi bikrija tal-istudju, f’dak il-ka ż il-kejlijiet ta’ konferma ulterjuri 
jistgħu jitħallew barra. Biex jin żamm trattament xieraq tal-annimali, 
għandhom jittie ħdu miżuri biex tkun imminimizzata dejta inkonklussiva li 
tista’ twassal g ħal ħtieġa ta’ ripetizzjoni ta’ studju.  
31. It-teħid tad-daqs ta’ parti ċelli għandu jsir g ħal fwar jekk ikun hemm xi 
possibbiltà li tista’ tirri żulta kondensazzjoni ta’ fwar fil-formazzjoni ta’ 
aerosol, jew jekk jinstabu parti ċelli f’atmosfera ta’ fwar b’potenzjal g ħal 
fażijiet imħallta.  
OSSERVAZZJONIJIET  
32. L-annimali g ħandhom ikunu osservati klinikament qabel, matul, u wara 
l-perjodu ta’ espo żizzzjoni. Jistg ħu jkunu indikati osservazzjonijet aktar ta’ 
spiss skont ir-rispons tal-annimali matul espo żizzjoni. Meta l-osservazzjoni 
tal-annimali tkun imfixkla bl-u żu ta’ tubi ta’ tra żżin tal-annimali, bi kmamar 
għall-ġisem kollu mixg ħulin ħażin, jew b’atmosferi opaki, l-annimali 
għandhom ikunu osservati bir-reqqa wara l-espo żizzjoni. 
L-osservazzjonijiet qabel l-espo żizzjoni tal-jum li jkun imiss tista’ 
tivvaluta kull riversibbiltà jew effetti tossi ċi li jkunu marru aktar g ħall-agħar. 
33. L-osservazzjonijiet kollha ji ġu rreġistrati b’re ġistri individwali mi żmumin 
għal kull annimal. Meta annimali jinqatlu g ħal raġunijiet umani jew 
jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jiġi rreġistrat b’mod pre ċiż kemm 
jista’ jkun.  
34. Osservazzjonijiet mal- ġenb tal-ga ġġa għandhom jinkludi bidliet fil- ġilda u 
l-pil, l-għajnejn, il-membrani muku żi; bidliet fis-sistema respiratorja u ċirku­
latorja; bidliet fis-sistema nervu ża; u bidliet f’attività somatomotorja u xejriet 
ta’ mġiba. L-attenzjoni g ħandha tkun diretta g ħal osservazzjonijiet ta’ 
tregħid, konvul żjonijiet, tbe żliq, dijarea, letar ġija, rqad u koma. Il-kejl 
tat-temparaturi tar-rektum jista’ jipprovdi evidenza li ssostni bradipnea riflessa jew ipo/ipertermja relatati mat-trattament jew l-g ħeluq. Valu ­
tazzjonijiet addizzjonali jistg ħu jkunu inklu żi fil-protokoll ta’ studju b ħal 
kinetika, monitora ġġ bijoloġiku, funzjoni tal-pulmun, ritenzjoni ta’ 
materjali li ftit jin ħallu li jinġemgħu fit-tessut tal-pulmun u bidliet ta’ m ġiba.
 
PIŻIJIET TAL- ĠISEM  
35. Il-piżijiet tal-annimali indivdwali g ħandhom ji ġu rreġistrati ftit qabel 
l-ewwel espo żizzjoni (jum 0), u darbtejn fil- ġimgħa wara din (pere żempju: 
nhar ta’ Ġimgħa u nhar ta’ Tnejn biex juru l-irkupru matul tmiem il- ġimgħa 
mingħajr espożizzjoni jew matul intervall tal- ħin biex jippermetti valu ­
azzjoni tat-tossi ċità sistematika) jew fil-mument tal-mewt jew l-ewtana żja. 
Jekk ma jkunx hemm effetti fl-ewwel 4 ġimgħat, il-piżijiet tal-ġisem jistg ħu 
jitkejlu kull ġimgħa għall-bqija tal-istudju. L-annimali satellitarji (riversibbli) 
(jekk użati) għandhom jibqg ħu jintiżnu kull ġimgħa tul il-perjodu kollu ta’ 
rkupru. Fi tmiem l-istudju, l-annimali kollha g ħandhom jinti żnu ftit qabel 
il-qatla biex tit ħalla ssir kalkulazzjoni imparzjali ta’ proporzjonijiet ta’ 
organi ma’ pi żijiet tal-ġisem.  
KONSUM TA’ IKEL U ILMA  
36. Il-konsum tal-ikel g ħandu jitkejjel kull ġimgħa. Il-konsum tal-ilma wkoll 
jista’ jitkejjel.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
PATOLO ĠIJA KLINIKA  
37. Valutazzjonijiet ta’ patolo ġija klinika g ħandhom isiru g ħall-annimali kollha, 
inklużi annimali ta’ kontrolli u satellitarji (riversibbli), meta jinqatlu. 
L-intervall ta’ ħin bejn tmiem espo żizzjoni u ġbir ta’ demm g ħandu jiġi 
rreġistrat, l-aktar meta l-kostituzzjoni mill- ġdid tal-punt ta’ tmiem indirizzat 
tkun mgħaġġla. It-teħid ta’ kampjuni wara tmiem espo żizzjoni huwa indikat 
għal dawk il-parametri b’nofs ħajja plażmatika qasira (e ż. COHb, CHE, u 
MetHb).  
38. It-Tabella 1 telenka l-parametri ta’ patolo ġija klinika li ġeneralment ikunu 
meħtieġa għall-istudji tossikolo ġiċi kollha. L-anali żi tal-awrina ma tkunx 
meħtieġa abbażi ta’ rutina, i żda tista’ ssir meta titqies utli bba żata fuq 
tossiċità mistennija jew osservata. Id-direttur tal-istudju jista’ jag ħżel li 
jivvaluta parametri addizzjonali biex jikkaratterizza a ħjar it-tossi ċità ta’ 
kimika għall-ittestjar (e ż. kolinestera żi, lipidi, ormoni, bilan ċ ta’ aċidu/bażi, 
metemoglobina jew korpi ta’ Heinz, kina żi tal-kreatina, proporzjon ta’ 
mjelojde/eritrojde, troponini, gassijiet ta’ demm arterjali, deidro ġenażi 
lattat, sorbital deidro ġenażi, glutamat ta’ deidro ġenażi u gamma glutamil 
transpeptida żi). 
Tabella 1  
Parametri Standard ta’ Patolo ġija Klinika  
Ematoloġija 
Għadd ta’ eritro ċiti 
Ematokrit Konċentrazzjoni ta’ emoglobina 
Emoglobina korpuskulari medja 
Volum korpuskulari medju Konċentrazzjoni ta’ emoglobina 
korpuskulari medja 
Retikuloċiti Għadd totali ta’ lewko ċiti 
Għadd differenzjali ta’ lewko ċiti 
Għadd ta’ pjastrini 
Potenzjal g ħal emboli żmu (agħżel 
wieħed): 
— Ħin protrombin 
— Ħin ta’ emboli żmu 
— Ħin tromboplastin parzjali
 
Kimika klinika  
Glukożju (*) 
Kolesterol totali 
Trigliċeridi 
Nitroġenu tal-urea tad-demm 
Bilirubina totali 
Kreatinina 
Proteina totali Albumina 
Globulina Aminotransfera żi tal-alanina 
Aspartate aminotransfera żi 
Fosfatażi alkalina 
Potassju Sodju 
Kalċju 
Fosforu Klorur
 
Analiżi tal-awrina (fakultattiva)  
Dehra (lewn u turbidità) 
Volum 
Gravità spe ċifika jew o żmolalità 
pH Proteina totali 
Glukożju 
Demm/ċelluli tad-demm  
(*) Minħabba li perjodu ta’ sawm fit-tul jista’ jintrodu ċi parzjalità fil-kejl tal-gluko żju 
għall-annimali ttrattati ma’ dawk ta’ kontroll, id-direttur tal-istudju g ħandu 
jiddetermina jekk ikunx sewwa li jsajjem lill-annimali. Jekk jintu ża perjodu ta’ 
sawm, dan g ħandu jkun adattat g ħall-ispeċi użata; għall-far dan jista’ jkun 16-il 
siegħa (sawm tul il-lejl). Id-determinazzjoni ta’ gluko żju għas-sawm tista’ ssir 
wara sawm tul il-lejl matul l-a ħħar ġimgħa ta’ espo żizzjoni, jew wara sawm tul 
il-lejl qabel awtopsja (f’dan l-a ħħar każ flimkien mal-parametri patolo ġiċi kliniċi 
l-oħra kollha).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Meta jkun hemm evidenza li s-sistema respiratorja inferjuri (ji ġifieri, 
l-alveoli) tkun is-sit primarju ta’ depo żizzjoni u ritenzjoni, f’dak il-ka ż 
il-ħasil tal-bronkoalveolari (BAL) jista’ jkun it-teknika ta’ g ħażla biex 
ikunu analizzati kwantitattivament parametri b’effett ta’ do ża abbażi ta’ 
ipoteżi li jiffokaw fuq alveolitis, infjammazzjoni pulmonari, u fosfolipido żi. 
Dan jippermetti li jkunu investigati sewwa bidliet ta’ do ża-rispons u ta’ 
perkors ta’ żmien meta jkun hemm ħsara alveolari. Il-fluwidu BAL jista’ 
jkun analizzat g ħal għedud totali u differenzjali ta’ lewko ċiti, proteina totali 
u deidroġenażi lattat. Parametri o ħra li jistg ħu jitqiesu huma dawk li 
jindikaw ħsara liżosomali, fosfolipido żi, fibrożi u infjammazzjoni irritanti 
jew aller ġika li tista’ tinkludi d-determinazzjoni ta’ ċitokines/kejmokines 
proinfjammatorji. Il-kejlijiet BAL ġeneralment jikkumplimentaw ir-ri żultati 
minn eżamijiet ta’ istopatolo ġija iżda ma jistg ħux jeħdulhom posthom. 
Gwida dwar kif isir ħasil tal-pulmuni tinsab f’GD 39 (2).  
EŻAMI OFTALMOLO ĠIKU 
40. Bl-u żu ta’ oftalmoskopju jew apparat ekwivalenti, e żamijiet oftalmolo ġiċi 
tal-fundus, tal-medja refrattiva, tal-iris u tal-kon ġuntiva għandhom isiru 
għall-annimali kollha qabel l-amministrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, u 
għal gruppi kollha ta’ kon ċentrazzjoni g ħolja u ta’ kontrolli fit-tmiem. 
Jekk jinstab li jkun hemm bidliet fl-g ħajnejn, l-annimali kollha fil-gruppi 
l-oħra għandhom ikunu e żaminati, inklu ż il-grupp satellitarju (riversibbiltà).  
PATOLO ĠIJA MAKROSKOPIKA U PI ŻIJIET TA’ ORGANI  
41. L-annimali kollha tat-test, inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li 
jitneħħew mill-istudju g ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali, 
għandhom ikunu so ġġetti għal żvinar sħiħ (jekk ikun jista’ jsir) u g ħal 
awtopsja makroskopika. Il- ħin bejn it-tmiem tal-a ħħar espożizzjoni ta’ kull 
annimal u meta jinqatel g ħandu jiġi rreġistrat. Jekk ma tkunx tista’ ssir 
awtopsja minnufih wara li jkun instab annimal mejjet, l-annimal g ħandu 
jitkessaħ (mhux iffri żat) f’temperatura baxxa bi żżejjed biex tkun immini ­
mizzata l-awtoli żi. L-awtopsji g ħandhom isiru malajr kemm jista’ jkun, 
normalment f’jum jew tnejn. Il-bidliet patolo ġiċi makroskopi ċi kollha 
għandhom ji ġu rreġistrati għal kull annimal b’attenzjoni partikolari g ħal 
kull bidla fis-sistema respiratorja.  
42. It-Tabella 2 telenka l-organi u t-tessuti li g ħandhom ikunu ppreservati 
f’midjum adattat matul awtopsja makroskopika g ħal eżami istopatolo ġiku. 
Il-preservazzjoni tal-organi u tat-tessuti [mqeg ħdin flimkien] u ta’ kull 
organu u tessut ie ħor tkun fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju. L-organi 
mitkubin b’ tipa grassa  għandhom jintraqmu u jinti żnu mxarbin malajr 
kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni biex ikun evitat it-tnixxif. It-tirojde u 
l-epididimi g ħandhom jinti żnu biss jekk ikun me ħtieġ minħabba li ċ-ċelloli 
mill-irqim jistg ħu jfixklu l-evalwazzjoni istopatolo ġika. It-tessuti u l-organi 
għandhom jitqieg ħdu f’10 % ta’ formalina newtralizzata jew f’fissattiv 
adattat ie ħor malli ssir l-awtopsja, u mhux f’anqas minn 24-48 sieg ħa 
qabel l-irqim skont il-fissattiv li g ħandu jintu ża. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
Tabella 2  
Organi u Tessuti Ippreservati Matul Awtopsja Makroskopika  
Adrenali  
Aorta  
Mudullun tal-g ħadam (u/jew aspirat frisk)  
Moħħ (inklu żi taqsimiet ta ċ-ċerebru, 
ċervellett, u medulla/me żoċefalu)  
Il-musrana l-g ħamja  
Il-musrana l- ħoxna  
Duwodenu  
[Epididimi ] 
[Għajnejn (retina, nerv ottiku) u tebqiet 
l-għajnejn]  
Wirk u l-g ħadma tar-ri ġel 
Il-bużżieqa tal-marrara (fejn ikun hemm)  
[Glandoli ta’ Harder]  
Qalb  
Ileu 
Jejunum  
Kliewi  
[Glandoli tad-dmug ħ (straorbitali)]  
Larinġi (3 livelli inklu ża l-bażi tal-epiglotta)  
Fwied  
Pulmun  (id-denduliet kollha f’livell wie ħed, 
inklużi l-bronki ewlenin)  
Nodi limfati ċi mir-reġjun ilarju tal-pulmun, 
speċjalment g ħal kimiċi f’partiċelli għall- 
ittestjar li ftit jin ħallu. Għal eżamijiet u/jew 
studji aktar fil-fond b’fokus immunolo ġiku, 
jistgħu jitqiesu nodi limfati ċi addizzjonali, 
eż. dawk mir-re ġjuni medjastinali, ċervikali/ 
submandibulari u/jew awrikulari.  
Nodi limfati ċi (distali mill-portal ta’ d ħul) 
Glandola mammarja (mara)  
Muskolu (koxxa)  
Tessuti na żofarinġali (mill-anqas 4 livelli; 1 
livell biex jinkludi l-kanal na żofarinġali u 
t-Tessut Limfojde b’Asso ċjazzjoni 
Nażali (NALT))  Esofagu  
[Basla tax-xamm]  
Ovarji  
Frixa  
Paratirojdi  
Nerv periferali (xjatiku jew tibjali, preferib ­
bilment qrib muskolu)  
Pitwitarja  
Prostata  
Il-musrana d-dritta  
Glandoli tal-b żieq 
Bżieżaq seminali  
Ġilda 
Nerv vertebrali ( ċervikali, midtora ċiku u 
lumbari)  
Milsa  
Sternu  
Stonku  
Snien  
Testikoli  
Timu  
Tirojdi  
[Lsien]  
Trakea (mill-anqas 2 livelli inklu żi taqsima 1 
lonġitudinali tul il-karina u taqsima 1 tras ­
versali)  
[Ureteru]  
[Uretra]  
Bużżieqa tal-awrina  
Utru  
Organu mmirat  
Il-leżjonijiet u l-mases kollha kbar  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Il-pulmuni g ħandhom jitne ħħew intatti, jinti żnu u jidda ħħlu b’fissattivi adatti 
bi pressjoni ta’ 20-30 cm ta’ ilma biex ikun żgurat li tin żamm l-istruttura 
tal-pulmuni (5). G ħandhom jin ġabru taqsimiet g ħad-denduliet kollha f’livell 
wieħed, inklu żi l-bronki ewlenin, i żda jekk isir il- ħasil tal-pulmuni, 
id-dendula mhux ma ħsula għandha titqieg ħed fit-taqsima bi tliet livelli 
(mhux taqsimiet tas-serje).  
44. Għandhom ikunu e żaminati mill-anqas 4 livelli tat tessuti na żofarinġali, li 
wieħed minnhom g ħandu jinkludi l-kanal na żofarinġali (5) (6) (7) (8) (9) 
biex jitħalla jsir e żami adegwat tal-epitelju mimli qxur, tran żizzjonali (respi ­
ratorju mhux vibrali), respiratorju (respiratorju vibrali) u tax-xamm, u 
tat-tessut limfatiku ta’ tisfija (NALT) (10) (11). G ħandhom ikunu 
eżaminati tliet livelli tal-larin ġi, u wieħed minn dawn il-livelli g ħandu 
jinkludi l-ba żi tal-epiglotta (12). G ħandhom ikunu e żaminati mill-anqas 
żewġ livelli tat-trakea, inklu ża taqsima wa ħda lonġitudinali tul il-karina 
minn fejn il-bronki estrapulmonari jinqasmu fi tnejn u taqsima wa ħda tras­
versali.  
ISTOPATOLO ĠIJA 
45. Evalwazzjoni istopatolo ġika tal-organi u tat-tessuti kollha elenkati fit-Tabella 
2 għandha ssir g ħall-gruppi ta’ kontroll u ta’ kon ċentrazzjoni g ħolja, u bħall- 
annimali kollha li jmutu jew jinqatlu matul l-istudju. G ħandha ting ħata 
attenzjoni partikulari lis-sistema respiratorja, organi mmirati u le żjonijiet 
kbar. L-organi u t-tessuti li jkollhom le żjonijiet fil-grupp ta’ kon ċentrazzjoni 
għolja għandhom ikunu e żaminati fil-gruppi kollha. Id-direttur tal-istudju 
jista’ jag ħżel li jag ħmel evalwazzjonijiet istopatoli ġiċi għal gruppi 
addizzjonali biex juri rispons ċar ta’ kon ċentrazzjoni. Meta jintu ża grupp 
satellitarju (riversibbli), g ħandha ssir evalwazzjoni istopatolo ġika għat-tessuti 
u l-organi kollha identifikati b ħala li jkunu juru effetti fil-gruppi ttrattati. 
Jekk ikun hemm g ħadd eċċessiv ta’ mwiet bikrija jew problemi o ħra 
fil-grupp ta’ espo żizzjoni g ħolja li jippre ġudikaw is-sinifikat tad-dejta, 
il-konċentrazzjoni aktar baxxa li jkun imiss g ħandha tkun e żaminata istopa ­
toloġikament. G ħandu jsir sforz biex osservazzjonijiet gravi jitqabblu ma’ 
sejbiet mikroskopi ċi. 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
46. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwali dwar il-pi żijiet 
tal-ġisem, il-konsum ta’ ikel, il-patolo ġija klinika, il-patolo ġija makros ­
kopika, il-pi żijiet tal-organi u l-istopatolo ġija. Dejta dwar osservazzjonijiet 
kliniċi għandha tin ġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp 
tat-test l-g ħadd ta’ annimali u żati, l-għadd ta’ annimali li jkunu wrew sinjali 
speċifiċi ta’ tossi ċità, l-għadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta matul it-test 
jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani, il- ħin tal-mewt ta’ kull annimal, 
deskrizzjoni u perkors ta’ żmien ta’ effetti tossi ċi u riversibbiltà, u sejbiet 
minn awtopsji. Ir-ri żultati kollha, kwantitattivi u in ċidentali, g ħandhom 
ikunu evalwati b’metodu ta’ statistika adattat. Jista’ jintu ża kull metodu 
ta’ statistika ġeneralment a ċċettat u l-metodi ta’ statistika g ħandhom 
jintgħażlu matul it-tfassil tal-istudju.  
Rapport tat-Test  
47. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skont il-ka ż: 
Annimali tat-test u trobbija  
— Deskrizzjoni tal-kundizzjonijiet tal-ga ġġa, inkluż: għadd (jew bidla 
fl-għadd) tal-annimali g ħal kull ga ġġa, materjal g ħall-irqad, temperatura 
ambjentali u umdità relattiva, fotoperjodu u identifikazzjoni tad-dieta.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— Speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-użu ta’ spe ċi minbarra l-far; 
Jistgħu jkunu pprovduti sors u dejta storika, jekk ikunu g ħal annimali 
esposti f’kundizzjonijiet simili ta’ espo żizzjoni, abitazzjoni u sawm.  
— Għadd, età u sess tal-annimali.  
— Metodu ta’ ka żwalità.  
— Deskrizzjoni ta’ kull kondizzjonament qabel it-test inklu żi dieta, kwar ­
antina u trattament g ħall-mard.  
Kimika g ħall-ittestjar  
— Natura fi żika, purezza, u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi 
(inkluża isomerizzazzjoni).  
— Dejta ta’ identifikazzjoni u n-Numru tar-Re ġistru tal-Chemical Abstract 
Services (CAS), jekk ikunu mag ħrufa;  
Vejjikolu  
— Ġustifikazzjoni g ħal użu ta’ vejjikolu u ġustifikazzjoni g ħal għażla 
tal-vejjikolu (jekk ma jkunx ilma);  
— Dejta storika jew konkurrenti li turi li l-vejjikolu ma jfixkilx ir-ri żultat 
tal-istudju;  
Kamra tal-inalazzjoni  
— Deskrizzjoni dettaljata tal-kamra tal-inalazzjoni inklu ż volum u dijag ­
ramma.  
— Sors u deskrizzjoni ta’ tag ħmir użati għall-espożizzjoni tal-annimali kif 
ukoll għall-ġenerazzjoni tal-atmosfera.  
— Tagħmir għall-kejl tat-temperatura, umdità, daqs ta’ parti ċelli u kon ċen­
trazzjoni attwali;  
— Sors ta’ arja u sistema u żata għal kondizzjonament.  
— Metodi u żati għall-kalibrazzjoni ta’ tag ħmir biex tkun żgurata atmosfera 
omoġenea tat-test.  
— Differenza ta’ pressjoni (po żittiva jew negattiva).  
— Portijiet ta’ espo żizzjoni għal kull kamra (imnie ħer biss); post tat-tqeg ħid 
tal-annimali fil-kamra ( ġisem kollu).  
— Stabbiltà tal-atmosfera tat-test.  
— Post tas-sensuri tat-temperatura u tal-umdità u te ħid ta’ kampjuni 
tal-atmosfera tat-test fil-kamra;  
— Trattament ta’ arja pprovduta/estratta.  
— Rati ta’ fluss tal-arja, rata ta’ fluss ta’ arja/port ta’ espo żizzjoni (mnie ħer 
biss), jew toqol tal-annimali/kamra ( ġisem kollu).  
— Ħin għall-ekwilibriju tal-kamra tal-inalazzjoni (t95).  
— Għadd ta’ bidliet fil-volum kull sieg ħa; 
— Apparati ta’ metra ġġ (jekk applikabbli).  
Dejta tal-espo żizzjoni  
— Motiv g ħal għażla ta’ kon ċentrazzjoni mmirata fl-istudju ewlieni.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Konċentrazzjonijiet nominali (massa totali tal-kimika g ħall-ittestjar 
iġġenerata g ħal ġol-kamra tal-inalazzjoni divi ża bil-volum ta’ arja li 
tkun għaddiet mill-kamra).  
— Konċentrazzjonijiet attwali tal-kimika g ħall-ittestjar mi ġbura miż-żona 
tal-inalazzjoni tal-annimali; g ħal taħlitiet li jipprodu ċu forom fi żiċi 
eteroġenji (gassijiet, fwar, aerosols); kull wa ħda tista’ tkun analizzata 
separatament.  
— Il-kon ċentrazzjonijiet kollha tal-arja g ħandhom ikunu rrappurtati f’uni ­
tajiet ta’ massa (mg/l mg/m  3 , eċċ.) milli f’unitajiet ta’ volum (ppm, ppb, 
eċċ.). 
— Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli, dijametru ajrudinamiku ta’ medjan 
tal-massa (MMAD), u devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ), inkluż 
il-metodi ta’ kalkulazzjoni tag ħhom. Anali żi waħda għal kull daqs ta’ 
partiċelli għandha tkun irrappurtata.  
Kundizzjonijiet tat-test  
— Dettalji tal-preparazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi dettalji ta’ 
kwalunkwe pro ċedura użata biex jitnaqqas id-daqs tal-parti ċelli ta’ 
materjali solidi jew biex ikunu ppreparati soluzzjonijiet tal-kimika 
għall-ittestjar.  
— Deskrizzjoni (preferibbilment inklu ża dijagramma) tat-tag ħmir użat biex 
tkun iġġenerata l-atmosfera tat-test u biex l-annimali jkunu esposti g ħall- 
atmosfera tat-test.  
— Dettalji tat-tag ħmir użat biex jimmonitorja t-temperatura tal-kamra, 
l-umdità u l-fluss ta’ arja fil-kamra (ji ġifieri żvilupp ta’ kurva ta’ kali ­
brazzjoni).  
— Dettalji tat-tag ħmir użat biex jin ġabru kampjuni g ħad-determinazzjoni 
tal-konċentrazzjoni tal-kamra u d-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli. 
— Dettalji tal-metodu analitiku kimiku u żat u tal-validazzjoni tal-metodu 
(inkluża l-effiċjenza fl-irkupru tal-kimika g ħall-ittestjar mill-midjum 
tat-teħid tal-kampjuni);  
— Metodu ta’ ka żwalità fl-assenjazzjoni ta’ annimali lil gruppi ta’ ttestjar u 
ta’ kontroll.  
— Dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu żi tip ta’ dieta/sors, sors 
tal-ilma).  
— Il-motiv g ħall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet tat-test.  
Riżultati  
— Tabulazzjoni tat-temperatura tal-kamra, l-umdità u l-fluss tal-arja.  
— Tabulazzjoni tad-dejta ta’ kon ċentrazzjoni nominali u attwali tal-kamra.  
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar id-daqs tal-parti ċelli, inklu żi dejta ta’ ġbir ta’ 
kampjuni analiti ċi, distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli u kalku ­
lazzjonijiet tal-MMAD u σ g . 
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar rispons u ta’ livell ta’ kon ċentrazzjoni g ħal 
kull annimal (ji ġifieri, annimali li juru sinjali ta’ tossi ċità, inklu żi 
mortalità, natura, severità, i ż-żmien meta jfaqqg ħu u durata tal-effetti).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Tabulazzjoni tal-pi żijiet individwali ta’ kull annimal.  
— Tabulazzjoni tal-konsum tal-ikel  
— Tabulazzjoni ta’ dejta ta’ patolo ġija klinika  
— Sejbiet minn awtopsji u sejbiet istopatolo ġiċi għal kull annimal, jekk 
disponibbli.  
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
— Għandha ssir enfa żi partikolari g ħad-deskrizzjoni tal-metodi u żati biex 
jissodisfaw il-kriterji ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar, e ż. il-konċentrazzjoni 
limitata jew id-daqs tal-parti ċelli. 
— Għandu jkun indirizzat jekk jistax ikun hemm respirazzjoni fil-parti ċelli, 
meqjusin is-sejbiet globali, spe ċjalment jekk il-kriterji tad-daqs 
tal-partiċelli ma setg ħux jitħarsu;  
— Il-konsistenza tal-metodi u żati biex ikunu ddeterminati 
l-konċentrazzjonijiet nominali u attwali, u r-relazzjoni ta’ kon ċen­
trazzjoni attwali mal-kon ċentrazzjoni nominali g ħandhom ikunu inklu żi 
fil-valutazzjoni globali tal-istudju;  
— Il-kaw ża probbbali tal-mewt u l-modalità predominanti tal-azzjoni (sis ­
temika versus lokali) g ħandhom ikunu indirizzati.  
— Għandha ting ħata spjegazzjoni jekk kienx hemm ħtieġa li b’mod uman 
jinqatlu annimali mu ġugħa jew li jkunu wrew sinjali ta’ diffikultà u li 
jdumu, abba żi tal-kriterji fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar 
il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (3).  
— L-organu/i mmirat(i) g ħandu/hom ji ġi/u identifikat/i.  
— NOAEL u LOAEL g ħandhom ikunu ddeterminati.  
LETTERATURA:  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test 
Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in 
laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 
85: 231-238.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP u Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, 
Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of 
nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u j ħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 
1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006 ( ĠU 
L 353, 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-Ittestjar:  Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  STUDJI DWAR TOSSI ĊITÀ KRONIKA  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
452 (2009) tal-OECD. It-TG 452 ori ġinali kienet adottata fl-1981. 
L-iżvilupp ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.30 rivedut tqies li kien 
meħtieġ biex jirrifletti żviluppi re ċenti fil-qasam tat-trattament xieraq 
tal-annimali u ta’ rekwi żiti regolatorji (1) (2) (3) (4). L-a ġġornament ta’ 
dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.30 twettaq flimkien ma’ revi żjonijiet 
tal-Kapitolu B.32 ta’ dan l-Anness: Studji dwar il-Kar ċinoġeniċità u 
tal-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness, Studji Kombinati dwar Tossi ċità 
Kronika/kar ċinoġeniċità, bil-g ħan li jinkiseb tag ħrif addizzjonali 
mill-annimali u żati fl-istudju u li jing ħataw aktar dettalji dwar l-g ħażla 
tad-doża. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal biex jintu ża fl-ittestjar 
ta’ firxa wiesg ħa ta’ kimi ċi, inkluż pestiċidi u kimi ċi industrijali.  
2. Il-ma ġġoranza tal-istudji dwar tossi ċità kronika jsiru fi spe ċijiet ta’ rodituri, 
u dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa, g ħalhekk, ma ħsub biex japplika prim ­
arjament g ħal studji mag ħmulin f’dawn l-ispe ċijiet. Jekk studji b ħal dawn 
ikunu me ħtieġa fi spe ċijiet ta’ annimali mhux rodituri, il-prin ċipji u 
l-proċeduri li l-profil tag ħhom jinsab f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar, flimkien 
ma’ dawk li l-profil tag ħhom jinsab fil-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: 
Studju dwar Tossi ċità Orali f’Annimali Mhux Rodituri ta’ Do ża Ripetuta 
għal 90 jum (5), jistg ħu wkoll ikunu applikati, b’modifiki xierqa, skont 
il-profil tag ħhom fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 tal-OECD dwar 
Tfassil u Twettiq ta’ Studji dwar Tossi ċità Kronika u Kar ċinoġeniċità (6).  
3. It-tliet rotot ewlenin ta’ amministrazzjoni u żati fi studji dwar tossi ċità 
kronika huma orali, dermali u ta’ inalazzjoni. L-g ħażla tar-rotta ta’ amminis ­
trazzjoni tiddependi mill-karatteristi ċi fiżiċi u kimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar 
u mir-rotta predominanti ta’ espo żizzjoni umana. Informazzjoni addizzjonali 
dwar l-għażla ta’ rotta ta’ espo żizzjoni hija pprovduta fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 tal-OECD (6).  
4. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jiffoka fuq espo żizzjoni permezz tar-rotta orali, 
ir-rotta li komunement l-aktar li tintu ża fi studji dwar tossi ċità kronika. 
Filwaqt li studji fit-tul dwar tossi ċità kronika li jinvolvu espo żizzjoni 
permezz tar-rotot dermali u ta’ inalazzjoni jistg ħu wkoll ikunu me ħtieġa 
għall-valutazzjonijiet tar-riskju g ħas-saħħa tal-bniedem u/jew jistg ħu jkunu 
rikjesti f’ ċerti reġimi regolatorji, i ż-żewġ rotot ta’ espo żizzjoni jinvolvu 
kumplessità teknika konsiderevoli. Studji b ħal dawn ikun je ħtiġilhom 
jitfasslu abba żi ta’ każ każ, għalkemm il-Metodu ta’ Ttestjar li l-profil 
tiegħu jidher hawn g ħall-valutazzjoni u l-evalwazzjoni ta’ tossi ċità kronika 
b’amministrazzjoni orali jista’ jifforma l-ba żi ta’ protokoll g ħal studji dwar 
inalazzjoni u/jew dermali, fir-rigward ta’ rakkomandazzjonijiet g ħal perjodi 
ta’ trattament, parametri klini ċi u patolo ġiċi, eċċ. Hemm gwida tal-OECD 
dwar l-amministrazzjoni ta’ kimi ċi għall-ittestjar bir-rotot ta’ inalazzjoni (6) 
(7) u dermali (6). Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (8) u l-Kapitolu B.29 ta’ 
dan l-Anness (9), flimkien mad-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar ittestjar ta’ inalazzjoni akuta (7), g ħandhom ikunu kkonsultati b’mod 
speċifiku fit-tfassil ta’ studji g ħal tul itwal ta’ żmien li jinvolvu espo żizzjoni 
permezz tar-rotta tal-inalazzjoni. Il-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness (10) 
għandu jkun ikkonsultat fil-ka ż ta’ ttestjar mag ħmul bir-rotta dermali.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. L-istudju dwar tossi ċità kronika jipprovdi informazzjoni dwar il-perikli g ħas- 
saħħa li jista’ jkun hemm li x’aktarx jinqalg ħu minn espo żizzjoni ripetuta tul 
parti konsiderevoli mill- ħajja kollha tal-ispe ċi użata. L-istudju g ħandu 
jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti tossi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar; 
jindika organi mmirati u l-possibbiltà ta’ akkumulazzjoni. Jista’ jipprovdi 
wkoll stima tal-livell bla effett ħażin osservat li tista’ tintu ża biex ikunu 
stabbiliti kriterji ta’ sikurezza g ħal espożizzjoni umana. Qed issir enfa żi 
wkoll dwar il- ħtieġa ta’ osservazzjonijiet klini ċi li jixirqu tal-annimali, 
biex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni.  
6. L-għanijiet tal-istudji koperti minn dan il-Metodu ta’ Ttestjar jinkludu:  
— L-identifikazzjoni tat-tossi ċità kronika ta’ kimika g ħall-ittestjar;  
— L-identifikazzjoni tal-organi mmirati;  
— Il-karatterizzazzjoni tar-relazzjoni ta’ do ża-rispons;  
— L-identifikazzjoni ta’ livell bla effett ħażin osservat (NOAEL) jew punt 
ta’ tluq biex tkun stabbilita Do ża ta’ Riferiment (BMD);  
— It-tbassir ta’ effetti ta’ tossi ċità kronika f’livelli ta’ espo żizzjoni umana;  
— Il-forniment ta’ dejta biex ikunu ttestjati ipote żijiet dwar modalità ta’ 
azzjoni (6).  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
7. Fil-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossikolo ġiċi ta’ kimika 
għall-ittestjar, l-informazzjoni kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall- 
ittestjar g ħandha titqies mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma jsir l-istudju, 
biex it-tfassil tal-istudju jiffoka fuq l-ittestjar b’aktar effi ċjenza għall- 
potenzjal ta’ tossi ċità kronika u biex l-u żu tal-annimali jkun mill-anqas. 
Informazzjoni li g ħandha tassisti fit-tifsila tal-istudju tinkludi l-identità, 
l-istruttura tal-kimika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; 
kull informazzjoni dwar il-modalità ta’ azzjoni; ri żultati ta’ kull test ta’ 
tossiċità in vitro  jew  in vivo ; użu/ijiet anti ċipat(i) u potenzjal g ħal 
espożizzjoni umana; dejta (Q)SAR disponibbli u dejta tossikolo ġika dwar 
kimiċi relatati strutturalment; dejta tossikokinetika disponibbli (do ża waħda 
u wkoll kinetika ta’ do ża ripetuta meta tkun disponibbli) u dejta derivata 
minn studji o ħra ripetuti ta’ espo żizzjonijiet. Id-determinazzjoni ta’ tossi ċità 
kronika g ħandha ssir biss wara li tkun inkisbet informazzjoni inizjali dwar 
tossiċità minn do ża ripetuta g ħal 28 jum u/jew minn testijiet ta’ tossi ċità 
għal 90 jum. Appro ċċ ta’ ttestjar f’fa żijiet għal ittestjar ta’ tossi ċità kronika 
għandu jitqies b ħala parti mill-valutazzjoni globali tal-effetti potenzjali 
ħżiena għas-saħħa ta’ kimika partikolari g ħall-ittestjar (11) (12) (13) (14).  
8. Il-metodi ta’ statistika l-aktar adatti g ħall-analiżi ta’ riżultati, meqjusin 
it-tifsila u l-g ħanijiet sperimentali, g ħandhom ikunu stabbiliti qabel ma 
jingħata bidu g ħall-istudju. Kwistjonijiet li g ħandhom jitqiesu jinkludu 
jekk l-istatistika g ħandhiex tinkludi a ġġustament g ħal sopravivenza u 
analiżi fil-każ ta’ tmiem ħesrem ta’ grupp wie ħed jew aktar. Gwida dwar 
l-analiżi xierqa ta’ statistika u referenzi ewlenin g ħal metodi ta’ statistika 
aċċettati internazzjonalment jing ħataw fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6), 
u wkoll fid-Dokument ta’ Gwida Nru 35 dwar l-anali żi u l-evalwazzjoni ta’ 
studji dwar Tossi ċità Kronika u Kar ċinoġeniċità (15).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Meta jkun qed isir studju dwar tossi ċità kronika, il-prin ċipji u 
l-konsiderazzjonijiet ta’ gwida li l-profil tag ħhom jinsab fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 19 tal-OECD dwar l-g ħarfien, il-valutazzjoni u l-u żu ta’ sinjali 
kliniċi bħala punti ta’ tmiem b’mod uman g ħal annimali g ħall-esperimenti 
użati f’evalwazzjoni tas-sikurezza (16), b’mod partikolari l-paragrafu 62 
tiegħu, għandhom ikunu segwiti dejjem. Dan il-paragrafuq jiddikjara li 
“Fi studji li jinvolvu do żaġġ ripetut, meta annimal juri sinjali klini ċi li 
huma progressivi, u jwasslu g ħal iktar deterjorament fil-kundizzjoni, 
għandha tittie ħed deċiżjoni infurmata dwar jekk l-annimal g ħandux 
jinqatel b’mod uman jew le. Id-de ċiżjoni għandha tinkludi konsiderazzjoni 
tal-valur tal-informazzjoni li g ħandha tinkiseb mill-manutenzjoni kontinwata 
ta’ dak l-annimal fl-istudju, relattiv g ħall-kundizzjoni ġenerali tieg ħu. Jekk 
tittieħed deċiżjoni biex l-annimal jibqa fit-test, il-frekwenza 
tal-osservazzjonijiet g ħandha tiżdied, skont il-b żonn. Jista’ jkun possibbli 
wkoll, ming ħajr ma jaffettwa b’mod avvers l-iskop tat-test, li d-do żaġġ 
jieqaf temporanjament jekk dan ħa jtaffi l-u ġigħ jew l-iskumdità, jew li 
tonqos id-do ża tat-test. ” 
10. Gwida dettaljata u diskussjoni dwar il-prin ċipji tal-għażla ta’ do ża għal 
studji dwar tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità tinsab fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 (6), kif ukoll f’ żewġ pubblikazzjonijiet tal-Internazzjonali 
Life Sciences Institute (17) (18). L-istrate ġija bażika tal-għażla tad-doża tkun 
tiddependi mill-g ħan jew g ħanijiet primarji tal-istudju (il-paragrafu 6). 
Fl-għażla ta’ livelli xierqa ta’ do ża, għandu jinkiseb bilan ċ bejn tgħarbil 
ta’ perikli minn na ħa waħda u karatterizzazzjoni ta’ risponsi g ħal dożi 
baxxi u r-rilevanza tag ħhom minn na ħa l-oħra. Dan huwa partikolarment 
rilevanti fis-sitwazzjoni fejn ikollu jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika u 
karċinoġeniċità (il-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness) (il-paragrafu 11).  
11. Għandha ting ħata konsiderazzjoni li jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika 
u karċinoġeniċità (il-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness), milli e żekuzzjoni 
separata ta’ studju dwar tossi ċità kronika (dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.30) 
u studju tal-kar ċinoġeniċità (il-Kapitolu B.32 ta’ dan l-Anness). It-test 
konġunt jipprovdi aktar effi ċjenza fir-rigward ta’ ħin u spejje ż imqabblin 
ma’ meta jsiru żewġ studji separati, ming ħajr ħsara għall-kwalità tad-dejta 
fil-fażi kronika jew fil-fa żi ta’ kar ċinoġeniċità. Iżda għandhom jitqiesu 
sewwa l-prin ċipji ta’ g ħażla ta’ do ża (paragrafi 9 u 20-25) meta jsir 
studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità (il-Kapitolu B.33 ta’ 
dan l-Anness), u huwa rikonoxxut ukoll li jistg ħu jkunu me ħtieġa studji 
separati f’ ċerti oqfsa regolatorji.  
12. Definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar jinsabu 
fl-aħħar ta’ dan il-kapitolu u fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6).  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
13. Il-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata kuljum f’do żi gradwati lil diversi 
gruppi ta’ annimali g ħall-esperimenti, normalment g ħal perjodu ta’ 12-il 
xahar, għalkemm jistg ħu jintgħażlu wkoll perjodi itwal jew aqsar skont 
rekwiżiti regolatorji (ara l-paragrafu 33). Dan il-perjodu jintg ħażel li jkun 
twil biżżejjed biex kull effett ta’ tossi ċità kumulattiva jsir jidher, ming ħajr 
l-effetti ta’ ta ħwid ta’ bidliet ġerjatriċi. Devjazzjonijiet minn perjodu ta’ 
espożizzjoni ta’ 12-il xahar g ħandhom ikunu ġġustifikati, l-aktar fil-ka ż 
ta’ perjodi aqsar. Il-kimika g ħall-ittestjar normalment tkun amministrata 
bir-rotta orali g ħalkemm l-ittestjar bir-rotta tal-inalazzjoni jew dermali 
jista’ wkoll ikun adattat. It-tifsila tal-istudju tista’ tinkludi wkoll qatla 
interim wa ħda jew aktar, e ż. fit-3 jew fis-6 xahar, u jistg ħu jkunu inklu żi 
gruppi addizzjonali ta’ annimali biex dan isir (ara l-paragrafu 19). Matul il-perjodu ta’ amministrazzjoni l-annimali jkunu osservati mill-qrib g ħal 
sinjali ta’ tossi ċità. L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul it-test issirilhom 
awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqg ħu ħajjin jinqatlu u 
ssirilhom awtopsja.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ spe ċi tal-annimali  
14. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar primarjament ikopri l-valutazzjoni u 
l-evalwazzjoni ta’ tossi ċità kronika f’rodituri (ara l-paragrafu 2), 
għalkemm huwa rikonoxxut li studji simili f’annimali mhux rodituri 
jistgħu jkunu rikjesti f’ ċerti reġimi regolatorji. L-g ħażla ta’ spe ċi għandha 
tkun iġġustifikata. It-tfassil u t-twettiq ta’ studji dwar tossi ċità kronika fi 
speċijiet ta’ annimali mhux rodituri, meta jkunu me ħtieġa, għandhom ikunu 
bbażati fuq il-prin ċipji li l-profil tag ħhom jinsab f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar 
flimkien ma’ dawk fil-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness, Studju dwar Tossi ċità 
Orali f’Annimali Mhux Rodituri ta’ Do ża Ripetuta g ħal 90 jum (5). Inform ­
azzjoni addizzjonali dwar g ħażla ta’ spe ċi u razza hija pprovduta 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6).  
15. F’dan il-Metodu ta’ Ttestjar, l-ispe ċi ppreferuta ta’ rodituri huwa l-far, 
għalkemm jistg ħu jintużaw speċijiet oħra ta’ rodituri, e ż. il-ġurdien. Firien 
u ġrieden kienu l-mudelli ppreferuti g ħall-esperimenti min ħabba l-ħajja 
relattivament qasira tag ħhom, l-użu kbir li jsir minnhom fi studji farmako ­
loġiċi u tossikolo ġiċi, is-suxxettibbiltà tag ħhom għal induzzjoni ta’ tumur u 
li minnhom hemm razez karatterizzati bi żżejjed. Bħala konsegwenza ta’ 
dawn il-karatteristi ċi, hemm ammont kbir ta’ informazzjoni dwar 
il-fiżjoloġija u l-patolo ġija tagħhom. Għandhom jintu żaw annimali adulti 
żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li komunement jintu żaw fil-laboratorju. 
L-istudju dwar tossi ċità kronika g ħandu jkun mag ħmul f’annimali 
mill-istess razza u sors b ħal dawk u żati fi studju/i preliminari dwar 
tossiċità li jdum(u) anqas. In-nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u 
m’għandhomx ikunu tqal.  
Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-g ħalf 
16. L-annimali jistg ħu jitqiedu jabitaw individwalment, jew jitqieg ħdu f’gaġeġ fi 
gruppi żgħar tal-istess sess; abitazzjoni individwali g ħal kull annimal 
għandha titqies biss jekk dan ikun ġustifikat xjentifikament (19) (20) (21). 
Il-gaġeġ għandhom ikunu rran ġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti li 
jista’ jkun hemm min ħabba t-tqeg ħid ta’ ga ġeġ. It-temperatura fil-kamra 
tal-esperimenti tal-annimali g ħandha tkun 22 °C (± 3 °C). G ħalkemm 
l-umdità relattiva g ħandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma 
taqbiżx 70 % minbarra matul il- ħasil tal-kamra, il-mira g ħandha tkun ta’ 
50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il 
siegħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. Dwar l-g ħalf, jistgħu jintużaw dieti konvenz ­
jonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. Id-dieta għandha tissodisfa l- ħtiġijiet nutrizzjonali kollha tal-ispe ċi ttestjata u 
l-kontenut ta’ kontaminanti tad-dieta, inklu żi iżda mhux limitatament g ħal 
residwi ta’ pesti ċidi, sustanzi organi ċi niġġiesa persistenti, fitoestro ġeni, 
metalli tqal u mikotossini, li jistg ħu jinfluwenzaw ir-ri ż
ultat tat-test, 
għandu jkun baxx kemm jista’ jkun. Informazzjoni analitika dwar il-livelli 
ta’ kontaminanti tan-nutrijent u tad-dieta g ħandha tkun i ġġenerata perjodi ­
kament, mill-anqas fil-bidu tal-istudju u meta jkun hemm bidla fil-lott u żat, 
u għandha tkun inklu ża fir-rapport finali. Bl-istess mod g ħandha tkun 
ipprovduta informazzjoni analitika dwar l-ilma tax-xorb u żat fl-istudju. 
L-għażla ta’ dieta tista’ tkun influwenzata mill- ħtieġa li tkun żgurata 
taħlita adattata ta’ kimika g ħall-ittestjar u biex ikunu sodisfatti l- ħtiġijiet 
nutrizzjonli tal-annimali meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata 
permezz tar-rotta tad-dieta.  
Preparazzjoni tal-annimali  
17. Għandhom jintu żaw annimali f’sa ħħithom, li jkunu ġew akklimatizzati g ħal 
kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mill-anqas 7 ijiem li ma kinux so ġġetti 
għal proċeduri sperimentali qabel. Fil-ka ż ta’ rodituri, id-do żaġġ tal-annimali 
għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara ftim u akklimatazzjoni u prefer ­
ibbilment qabel ma l-annimali jkun g ħandhom 8 ġimgħat. L-annimali tat-test 
għandhom ikunu kkaratterizzati fir-rigward ta’ spe ċi, razza, sors, sess, pi ż u 
età. Malli jinbeda l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż għal kull sess tal-annimali 
użati għandha tkun minimali u ma taqbi żx ± 20 % tal-pi ż medju tal-annimali 
kollha fl-istudju, separatament g ħal kull sess. L-annimali g ħandhom ikunu  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
assenjati b’mod ka żwali lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. Wara 
l-każwalità, m’g ħandux ikun hemm differenzi sinifikanti fil-pi żijiet medji 
tal-ġisem bejn gruppi f’kull sess. Jekk ikun hemm differenzi sinifikanti ta’ 
statistika, f’dak il-ka ż il-proċedura ta’ ka żwalità għandha tkun ripetuta, jekk 
ikun possibbli. Kull annimal g ħandu jkun assenjat numru ta’ identifikazzjoni 
uniku, u jkun immarkat b’mod permanenti b’dan in-numru b’tatù, b’impjant 
ta’ mikro ċipp jew b’metodu ie ħor adattat.  
PROĊEDURA  
Għadd u sess tal-annimali  
18. Għandhom jintu żaw iż-żewġ sessi. G ħandu jintu ża għadd suffi ċjenti ta’ 
annimali biex meta l-istudju jintemm ikun hemm annimali bi żżejjed f’kull 
grupp għal evalwazzjoni bijolo ġika u ta’ statistika bir-reqqa. G ħar-rodituri 
għandhom normalment jintu żaw mill-anqas 20 annimal minn kull sess minn 
kull grupp f’kull livell ta’ do ża, filwaqt li g ħal annimali mhux rodituri huwa 
rrakkomandat minimu ta’ 4 minn kull sess minn kull grupp. Fi studji li 
jinvolvu ġrieden, jistg ħu jkunu me ħtieġa annimali addizzjonali f’kull 
grupp ta’ do ża biex isiru d-determinazzjonijiet ematolo ġiċi meħtieġa kollha.  
Provvediment g ħal qatliet interim, gruppi satellitarji u annimali 
sentinelli  
19. L-istudju jista’ jag ħmel provvediment g ħal qatliet interim (mill-anqas 10 
annimali/sess/grupp), e ż. kull sitt xhur, biex jag ħti informazzjoni dwar 
il-progressjoni tal-bidliet tossikolo ġiċi u informazzjoni mekkanistika, jekk 
dan ikun ġustifikat xjentifikament. Fejn di ġà jkun hemm informazzjoni 
bħal din mill-istudji pre ċedenti ta’ tossi ċità ta’ do ża ripetuta dwar 
il-kimika g ħall-ittestjar, qatliet interim jistg ħu ma jkunux xjentifikament 
ġustifikati. Gruppi satellitarji jistg ħu wkoll ikunu inklu żi biex jimmonitorjaw 
ir-riversibbiltà ta’ kull bidla tossikolo ġika miġjuba mil-kimika g ħall-ittestjar 
li tkun investigata; dawn normalment ikunu ristretti g ħall-ogħla livell ta’ 
doża tal-istudju flimkien ma’ kontroll. Jista’ wkoll ikun inklu ż grupp 
addizzjonali ta’ annimali sentinelli (tipikament 5 annimali g ħal kull sess) 
għall-monitora ġġ ta’ stat ta’ mard, jekk ikun me ħtieġ, matul l-istudju (22). 
Jekk ikunu ppjanati qatliet interim jew li jidda ħħlu gruppi satellitarji jew ta’ 
sentinelli, l-g ħadd ta’ annimali inklu żi fit-tifsila tal-istudju g ħandu jiżdied 
bl-għadd skedat ta’ annimalii li jkollhom jinqatlu qabel ma jitlesta l-istudju. 
Dawn l-annimali g ħandhom normalment isirulhom l-istess osservazzjonijiet, 
inkluż il-piż tal-ġisem, konsum ta’ ikel/ilma, il-kejlijiet ematolo ġiċi u ta’ 
bijokimika klinika u investigazzjonijiet patolo ġiċi bħall-annimali fil-fa żi ta’ 
tossiċità kronika tal-istudju ewlieni, g ħalkemm jista’ wkoll ikun hemm prov ­
vediment (fil-gruppi ta’ qtil interim) biex il-kejlijiet ikunu ristretti g ħal 
miżuri speċifiċi ewlenin b ħal newrotossi ċità jew immunotossi ċità. 
Gruppi ta’ do żi u dożaġġ 
20. Gwida dwar l-aspetti kollha ta’ g ħażla ta’ doża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża 
hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6). Mill-anqas g ħandhom 
jintużaw tliet livelli ta’ do ża u kontroll konkurrenti, ħlief meta jsir test ta’ 
limitu (ara l-paragrafu 27). Il-livelli ta’ do ża ġeneralment ikunu bba żati fuq 
ir-riżultati ta’ studji aqsar dwar do ża ripetuta jew fuq tiftix ta’ firxa u 
għandhom iqiesu kull dejta tossikolo ġika u tossikokinetika e żistenti 
disponibbli g ħall-kimika g ħall-ittestjar jew g ħal kimiċi relatati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Sakemm ma jkunx limitat min-natura jew mill-effetti bijolo ġiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, normalment g ħandu jintg ħażel l-ogħla livell ta’ do ża biex 
ikunu identifikati l-organi prin ċipali u l-effetti tossi ċi filwaqt li jkunu 
evitati tbatija, tossi ċità severa, morbidità jew mewt. Filwaqt li jitqiesu 
l-fatturi li l-profil tag ħhom jinsab fil-paragrafu 22 hawn ta ħt, għandu 
jintgħażel l-ogħla livell ta’ do ża biex jislet evidenza ta’ tossi ċità, kif ikun 
jidher, pere żempju, minn tnaqqis fi ż-żieda fil-pi ż tal-ġisem (madwar 10 %).  
22. Iżda, skont x’ikunu l-g ħanijiet tal-istudju (ara l-paragrafu 6), tista’  tintgħażel 
l-ogħla doża anqas mid-do ża li tipprovdi evidenza ta’ tossi ċità, eż. jekk doża 
tislet effett avvers ta’ t ħassib iżda li madankollu jkollha ftit impatt fuq 
il-ħajja jew il-pi ż tal-ġisem. L-og ħladoża m’għandhiex tkun aktar minn 
1 000 mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum (do ża ta’ limitu, ara l-paragrafu 27).  
23. Jistg ħu jintgħażlu livelli ta’ do ża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża biex ikunu 
stabbiliti do ża-rispons u NOAEL jew ri żultat maħsub ieħor tal-istudju, e ż. 
BMD (ara l-paragrafu 25) fil-livell ta’ do ża l-aktar baxx. Fatturi li 
għandhom jitqiesu fl-g ħoti ta’ do żi aktar baxxi jinkludu l-angolu mistenni 
tal-kurva ta’ do ża-rispons, id-do żi li fihom jistg ħu jseħħu bidliet importanti 
fil-metaboli żmu jew il-modalità ta’ azzjoni tossika, fejn ikun mistenni limitu, 
jew fejn ikun mistenni punt ta’ tluq g ħal estrapolazzjoni ta’ do ża baxxa.  
24. L-ispazjar mag ħżul ta’ livelli ta’ do ża jkun jiddependi mill-karatteristi ċi 
tal-kimika g ħall-ittestjar, u ma jistax ikun preskritt f’dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar, i żda intervalli ta’ darbtejn jew erba’ darbiet ta’ spiss jipprovdu 
prestazzjoni tajba ta’ test meta jintu żaw biex ikunu stabbiliti l-livelli minn 
fuq għal isfel ta’ do żi, u ż-żieda tar-raba’ grupp ta’ test sikwit hija 
preferibbli mill-u żu ta’ intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ 
madwar 6-10) bejn do żaġġi. B’mod ġenerali l-u żu ta’ fatturi akbar minn 
10 għandu jkun evitat, u g ħandu jkun i ġġustifikat jekk ikun applikat.  
25. Kif spjegat aktar fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6), il-punti li g ħandhom 
jitqiesu fl-g ħażla ta’ doża jinkludu:  
— Nonlinearitajiet mag ħrufin jew suspettati jew punti ta’ infezzjoni 
fid-doża-rispons;  
— Tossikokinetika u firxa ta’ do żi fejn induzzjoni metabolika, saturazzjoni 
jew nonlinearità bejn do żi esterni u interni jse ħħu jew ma jse ħħux; 
— Leżjonijiet prekursuri, markaturi ta’ effett jew indikaturi tal-operazzjoni 
ta’ proċessi bijolo ġiċi ewlenin sottostanti;  
— Aspetti ewlenin (jew suspettati) ta’ modalità ta’ azzjoni, b ħal dożi li 
fihom tibda tfaqqa’ ċ-ċitotossiċità, livelli ta’ ormoni jit ħawdu, 
mekkaniżmi omeostati ċi jintgħelbu, eċċ; 
— Reġjuni tal-kurva ta’ do ża-rispons fejn tkun me ħtieġa stima partikol ­
arment robusta, e ż. fil-firxa tal-BMD anti ċipata jew limitu suspettat;  
— Konsiderazzjoni ta’ livelli anti ċipati ta’ espo żizzjoni umana.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Il-grupp ta’ kontroll g ħandu jkun grupp mhux ittrattat jew grupp ta’ kontroll 
ta’ vejjikoli jekk jintu ża vejjikolu biex tkun amministrata kimika g ħall- 
ittestjar. Ħlief għal trattament bil-kimika g ħall-ittestjar, annimali fil-grupp 
ta’ kontroll g ħandhom ikunu mani ġġati b’mod identiku b ħal dawk 
fil-gruppi tat-test. Jekk jintu ża vejjikolu, il-grupp ta’ kontroll g ħandu 
jirċievi l-vejjikolu fl-og ħla volum u żat fost il-gruppi ta’ do ża. Jekk kimika 
għall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, u tikkaw ża li jittieħed anqas ikel 
tad-dieta b’mod sinifikanti min ħabba dieta b’anqas palat, grupp ta’ kontroll 
addizzjonali ta’ tmig ħ lil pari jista’ jkun utli biex iservi ta’ kontroll aktar 
adattat.  
27. Jekk jista’ jkun anti ċipat, abba żi ta’ informazzjoni minn studji preliminari, li 
test f’livell ta’ do ża waħda, ekwivalenti g ħal mill-anqas 1 000 mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem/jum, billi jintu żaw il-pro ċeduri deskritti g ħal dan l-istudju, aktarx 
ma jipprodu ċix effetti ħżiena u ma tkunx mistennija tossi ċità abbażi ta’ dejta 
minn kimi ċi relatati strutturalment, f’dak il-ka ż studju sħiħ bl-użu ta’ tliet 
livelli ta’ do ża jista’ ma jitqisx li jkun me ħtieġ. Jista’ jkun japplika limitu ta’ 
1 000 mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum ħlief meta espo żizzjoni umana tindika 
l-ħtieġa li jkollu jintu ża livell og ħla ta’ doża. 
Preparazzjoni ta’ do żi u amministrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar  
28. Il-kimika g ħall-ittestjar normalment tkun amministrata oralment, permezz 
tad-dieta jew ilma tax-xorb, jew b’gavage. Informazzjoni addizzjonali 
dwar rotot u metodi ta’ amministrazzjoni hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6). Ir-rotta u l-metodu ta’ amministrazzjoni jkunu jiddependu mill-g ħan tal-istudju, mill-proprjetajiet fi żiċi/kimiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, mid-disponibbiltà bijolo ġika tagħha u mill-metodu ta’ 
espożizzjoni umana. G ħandu jkun ipprovdut motiv g ħar-rotta mag ħżula u 
għall-metodu ta’ amministrazzjoni. Fl-interessi ta’ trattament xieraq 
tal-annimali, gavage orali g ħandu normalment jintg ħażel biss g ħal dawk 
l-aġenti li għalihom din ir-rotta u l-metodu ta’ amministrazzjoni ra ġone­
volment jirrappre żentaw espo żizzjoni potenzjali umana (e ż. farmaċewtiċi). 
Għal kimiċi ta’ dieta jew ambjentali inklu żi pestiċidi, l-amministrazzjoni 
tipikament issir permezz tad-dieta jew b’ilma tax-xorb. I żda, għal xi 
xenarji, e ż. espożizzjoni okkupazzjonali, amministrazzjoni permezz ta’ 
rotot oħra tista’ tkun aktar adattata.
 
29. Meta jkun me ħtieġ, il-kimika g ħall-ittestjar tin ħall jew ti ġi sospiża f’vej­
jikolu adattat. G ħandhom jitqiesu l-karatteristi ċi li ġejjin tal-vejjikolu u 
addittivi o ħra, kif jixraq: effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-metaboli żmu, jew ir-ritenzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; effetti fuq 
il-proprjetajiet kimi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar li jistg ħu jibdlu 
l-karatteristi ċi tossiċi tagħha; u effetti fuq l-ikel jew fuq il-konsum tal-ilma 
jew fuq l-istat nutrizzjonali tal-annimali. Huwa rrakkomandat li, kull meta 
jkun possibbli, l-ewwel jitqies l-u żu ta’ soluzzjoni fl-ilma/sospensjoni, u 
wara titqies soluzzjoni/emulsjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħa) u mbag ħad 
possibbilment b’soluzzjoni f’vejjikoli o ħra. Għal vejjikoli o ħra minbarra 
ilma, il-karatteristi ċi tossiċi tal-vejjikolu g ħandhom ikunu mag ħrufa. 
Għandha tkun disponibbli informazzjoni dwar l-istabbiltà tal-kimika g ħall- 
ittestjar u l-omo ġeneità ta’ soluzzjonijiet ta’ do żaġġ jew dieti (kif jixraq) 
skont il-kundizzjonijiet ta’ amministrazzjoni (e ż. dieta).  
30. Għall-kimiċi amministrati permezz tad-dieta jew l-ilma tax-xorb, huwa 
importanti jkun żgurat li l-kwantitajiet tal-kimika g ħall-ittestjar involuta 
ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilan ċ tal-ilma. Fi studji fit-tul 
dwar tossi ċità bl-użu ta’ amministrazzjoni ta’ dieta, il-kon ċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fl-g ħalf m’għandhiex tkun aktar ‘il fuq mil-limitu 
ta’ 5 % tad-dieta totali, biex ikunu evitati żbilanċi nutrizzjonali. Meta 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, jistg ħu jintużaw jew 
konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta (mg/kg dieta jew ppm) jew livell 
wieħed kostanti ta’ do ża skont il-pi ż tal-ġisem tal-annimal (mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem), ikkalkulat kull ġimgħa. L-alternattiva u żata għandha tkun spe ċ­
ifikata.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Fil-ka ż ta’ amministrazzjoni orali, l-annimali jing ħataw doża bil-kimika 
għall-ittestjar kuljum (sebat ijiem fil- ġimgħa), normalment g ħal perjodu ta’ 
12-il xahar (ara wkoll il-paragrafu 33), g ħalkemm jista’ jkun me ħtieġ 
perjodu itwal skont rekwi żiti regolatorji. Kull re ġim ieħor ta’ do żaġġ, eż. 
ħamest ijiem fil- ġimgħa, jeħtieġlu jkun i ġġustifikat. Fil-ka ż ta’ amminis ­
trazzjoni dermali, annimali jkunu normalment ittrattati bil-kimika g ħall- 
ittestjar g ħal mill-anqas 6 sig ħat kuljum, 7 ijiem fil- ġimgħa, kif spe ċifikat 
fil-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness (10), g ħal perjodu ta’ 12 xahar. 
Espożizzjoni bir-rotta tal-inalazzjoni ssir g ħal 6 sigħat kuljum, 7 ijiem 
fil-ġimgħa, iżda tista’ tintu ża wkoll espo żizzjoni għal 5 ijiem fil- ġimgħa, 
jekk dan ikun ġustifikat. Il-perjodu ta’ espo żizzjoni jkun normalment g ħal 
perjodu ta’ 12 xahar. Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra l-firien ikunu 
esposti mill-imnie ħer biss, il-perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu 
jkunu aġġustati biex titnaqqas id-diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. 
Għandu jkun ipprovdut motiv meta tintu ża espożizzjoni li ddum anqas minn 
6 sigħat kuljum. Ara wkoll il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (8).  
32. Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata b’gavage lill-annimali dan 
għandu jsir billi jintu ża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni 
adattat, f’ ħinijiet simili kull jum. Normalment tkun amministrata do ża 
waħda darba kuljum, meta pere żempju kimika tkun irritant lokali, jista’ 
jkun possibbli li tin żamm ir-rata ta’ do ża kuljum billi din tkun amministrata 
bħala doża maqsuma (darbtejn kuljum). Il-volum massimu ta’ likwidu li 
jkun jista’ ji ġi amministrat f’waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs 
tal-annimal tat-test. Il-volum g ħandu jinżamm baxx daqs kemm ikun prattik ­
abbli, u normalment m’g ħandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-pi ż 
tal-ġisem għal rodituri (22). Il-varjabbiltà fil-volum tat-test g ħandha tkun 
imminimizzata billi l-kon ċentrazzjoni tkun a ġġustata biex ikun żgurat 
volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. Kimiċi li jistgħu jkunu korru żivi 
jew irritanti jkunu l-e ċċezzjoni, u jkun je ħtiġilhom jiġu dilwiti biex ikunu 
evitati effetti lokali severi. Ittestjar f’kon ċentrazzjonijiet li x’aktarx ikunu 
korrużivi jew irritanti g ħas-sistema gastrointestinali g ħandu jkun evitat.  
Durata tal-istudju  
33. Filwaqt li dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal primarjament b ħala 
studju ta’ 12-il xahar dwar tossi ċità kronika, it-tifsila tal-istudju tippermetti 
wkoll u tista’ tkun applikata g ħal studji jew li jdumu anqas (e ż. 6 jew 9 
xhur) jew aktar (e ż. 18 jew 24 xahar), skont ir-rekwi żiti ta’ reġimi rego­
latorji partikolari jew g ħal għanijiet mekkanisti ċi speċifiċi. Devjazzjonijiet 
minn espo żizzjoni li ddum 12-il xahar g ħandhom ikunu ġġustifikati, l-aktar 
fil-każ ta’ dawk li jdumu anqas. Gruppi satellitarji inklu żi għall-monitora ġġ 
tar-riversibbiltà ta’ kull bidla tossikolo ġika miġjuba mil-kimika g ħall-ittestjar 
li tkun investigata g ħandhom jin żammu ming ħajr dożaġġ għal perjodu ta’ 
mhux anqas minn 4 ġimgħat u ta’ mhux aktar minn terz ta’ kemm idum 
l-istudju totali wara li tkun intemmet espo żizzjoni. Gwida ulterjuri, inklu ża 
konsiderazzjoni ta’ sopravivenza fl-istudju, hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (6).
 
OSSERVAZZJONIJIET  
34. L-annimali kollha g ħandhom ikunu e żaminati g ħall-morbidità jew g ħall- 
mortalità, is-soltu fil-bidu u t-tmiem ta’ kull jum, inklu żi fi tmiem 
il-ġimgħa u l-btajjel. Osservazzjonijiet klini ċi ġenerali g ħandhom isiru 
mill-anqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin(ijiet) kull jum, 
filwaqt li jitqies il-perjodu massimu ta’ effetti anti ċipati wara do żaġġ 
fil-każ ta’ amministrazzjoni b’gavage.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Osservazzjonijiet klini ċi dettaljati g ħandhom isiru fuq l-annimali kollha 
mill-anqas darba qabel l-ewwel espo żizzjoni (biex jit ħallew isiru paraguni 
skont is-su ġġett), fi tmiem l-ewwel ġimgħa tal-istudju u kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-protokoll g ħal osservazzjonijiet g ħandu jkun mag ħmul 
b’mod li varjazzjonijiet bejn osservaturi individwali jkunu mminimizzati u 
indipendenti minn grupp ta’ test. Dawn l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru 
barra mill-ga ġġa ta’ abitazzjoni, preferibbilment f’arena standard u f’ ħinijiet 
simili għal kull jum f’kull okka żjoni. Huma g ħandhom ikunu rre ġistrati 
sewwa, preferibbilment billi jintu żaw sistemi ta’ punti, iddefiniti espli ċi­
tament mil-laboratorju tal-ittestjar. G ħandhom isiru sforzi biex ikun żgurat 
li varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet ta’ osservazzjoni jkunu minimi. Sinjali nnotati għandhom jinkludi, i żda ma jkunux limitati g ħal, bidliet fil- ġilda, pil, 
għajnejn, membrani muku żi, okkorrenza ta’ sekrezzjonijiet u eskrezzjonijiet 
u attività awtonomika (e ż. tidmigħ, erezzjoni tal-pil, daqs tal-pupilli, u xejra 
respiratorja mhux tas-soltu). Bidliet fil-mixja, qag ħda u rispons g ħal 
immaniġġar, kif ukoll il-pre żenza ta’ movimenti kloni ċi jew toni ċi, stereotipi 
(eż. tindif e ċċessiv, dawran ripetittiv) jew im ġiba biżarra (eż. awtomuti ­
lazzjoni, mixi b’lura) g ħ
andhom ukoll ikunu rre ġistrati (24).  
36. Eżami oftalmolo ġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tag ħmir ieħor adattat, 
għandu jsir fuq l-annimali kollha qabel l-ewwel amministrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar. Fit-tmiem tal-istudju, dan l-e żami għandu preferibbilment isir 
għall-annimali kollha i żda mill-anqas fid-do ża għolja u fil-gruppi ta’ 
kontroll. Jekk fl-g ħajnejn jinstabu bidliet relatati ma’ trattament, l-annimali 
kollha għandhom ikunu e żaminati. Jekk anali żi strutturali jew informazzjoni 
oħra jissuġġerixxu tossi ċità okulari, f’dak il-ka ż il-frekwenza ta’ e żami 
okulari għandha tiżdied.  
37. Għal kimiċi fejn testijiet pre ċedenti ta’ tossi ċità għal doża ripetuta g ħal 28 
jum u/jew g ħal 90 jum ikunu indikaw il-potenzjal li jikkaw żaw effetti 
newrotossi ċi, ikunu jistg ħu jsiru b’mod fakultativ valutazzjoni ta’ reattività 
sensorja g ħal stimuli ta’ tipi differenti (24) (e ż. stimuli tas-smig ħ, viżivi u 
proprjoċettivi) (25), (26), (27), valutazzjoni tal-qawwa tal-qabda (28) u valu ­
tazzjoni tal-attività motorja (29) qabel il-bidu tal-istudju u f’perjodi ta’ 3 
xhur wara li jkun beda l-istudju sa u inklu żi 12-il xahar, kif ukoll fit-tmiem 
tal-istudju (jekk ikun itwal minn 12-il xahar). Aktar dettalji tal-pro ċeduri li 
jistgħu jkunu segwiti jing ħataw fir-referenzi rispettivi. I żda jistgħu jintużaw 
proċeduri alternattivi minbarra dawk fir-referenzi.  
38. Għal kimiċi fejn testijiet pre ċedenti ta’ tossi ċità għal doża ripetuta g ħal 28 
jum u/jew g ħal 90 jum ikunu indikaw il-potenzjal li jikkaw żaw effetti 
immunotossi ċi, investigazzjonijiet ulterjuri ta’ dan il-punt ta’ tmiem ikunu 
jistgħu jsiru b’mod fakultattiv fit-tmiem.  
Piż tal-ġisem, konsum ta’ ikel/ilma u effi ċjenza fl-ikel  
39. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu meta jibda t-trattament, mill-anqas 
darba fil- ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa, u mill-anqas kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-kejlijiet ta’ konsum ta’ ikel u ta’ effi ċjenza fl-ikel 
għandhom isiru mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u 
mill-anqas kull xahar minn hemm ‘il quddiem. Il-konsum tal-ilma g ħandu 
jitkejjel mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 
xahar minn hemm ‘il quddiem meta l-kimika tkun amministrata fl-ilma 
tax-xorb. G ħandhom jitqies wkoll kejlijiet tal-konsum tal-ilma g ħal studji 
li fihom l-attività tax-xorb tinbidel.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Ematoloġija u bijokimika klinika  
40. Fi studji li jinvolvu rodituri, g ħandhom isiru e żamijiet ematolo ġiċi f’mill- 
anqas 10 annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp, kull 3, 6, u 12-il xahar, 
kif ukoll fit-tmiem tal-istudju (jekk ikun itwal minn 12-il xahar), billi jintu ża 
l-istess annimal il- ħin kollu. G ħal ġrieden, jistg ħu jkunu me ħtieġa annimali 
satellitarji biex isiru d-determinazzjonijiet ematolo ġiċi meħtieġa kollha (ara 
l-paragrafu 18). Fi studji ta’ annimali mhux rodituri, jittie ħdu kampjuni minn 
għadd iżgħar ta’ annimali (e ż. 4 annimali g ħal kull sess u g ħal kull grupp fi 
studji dwar il-klieb), f’ ħinijiet interim ta’ te ħid ta’ kampjuni u fit-tmiem kif 
deskritt g ħal rodituri. Il-kejlijiet kull 3 xhur, g ħal rodituri jew g ħal annimali 
mhux rodituri, jistg ħu ma jsirux jekk ma jkunu dehru ebda effetti fuq 
parametri ematolo ġiċi fi studju pre ċedenti ta’ 90 jum mag ħmul f’livelli 
komparabbli ta’ do ża. Għandhom jittie ħdu kampjuni tad-demm minn sit 
imsemmi, pere żempju b’titqib kardijaku jew minn sinus retroorbitali, b’anes ­
tesija.  
41. Il-lista ta’ parametri li ġejja għandha tkun investigata (30): G ħadd total u 
differenzjali ta’ lewko ċiti, għadd ta’ eritro ċiti, għadd ta’ pjastrini, kon ċen­
trazzjoni ta’ emoglobina, ematokrit (volum ta’ ċelluli ppakkjati), volum 
korpuskulari medju (MCV), emoglobina korpuskulari medja (MCH), kon ċ­
entrazzjoni ta’ emoglobina korpuskulari medja (MCHC), ħin protrombin u 
ħin tromboplastin parzjali attivat. Parametri ematolo ġiċi oħra bħal korpi ta’ 
Heinz jew morfolo ġija atipika o ħra ta’ eritro ċiti jew metemoglobina jistg ħu 
jitkejlu kif jixraq skont it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar. B’mod ġenerali, 
għandu jkun adottat appro ċċ flessibbli, skont l-effett osservat u/jew mistenni 
minn kimika partikolari g ħall-ittestjar. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar ikollha 
effett fuq is-sistema ematopojetika, jistg ħu jkunu indikati wkoll g ħedud ta’ 
retikoloċiti u ċitoloġija tal-mudullun tal-g ħadam, għalkemm dawn g ħandhom 
isiru b’rutina.  
42. Determinazzjonijiet ta’ bijokimika klinika g ħall-investigazzjoni ta’ effetti 
tossiċi maġġuri f’tessuti u, spe ċifikatament, ta’ effetti fuq il-kliewi u 
l-fwied, g ħandhom isiru fuq kampjuni tad-demm miksubin minn 
mill-anqas 10 annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp fl-istess intervalli 
ta’ ħin kif spe ċifikat għall-investigazzjonijiet ematolo ġiċi, billi jintu ża 
l-istess annimal il- ħin kollu. G ħal ġrieden, jistg ħu jkunu me ħtieġa 
annimali satellitarji biex isiru d-determinazzjonijiet ta’ bijokimika klinika kollha me ħtieġa. Fi studji ta’ annimali mhux rodituri, jittie ħdu kampjuni 
minn għadd iżgħar ta’ annimali (e ż. 4 annimali g ħal kull sess u g ħal kull 
grupp fi studji dwar il-klieb), f’ ħinijiet interim ta’ te ħid ta’ kampjuni u 
fit-tmiem kif deskritt g ħal rodituri. Jistg ħu ma jsirux kejlijiet kull 3 xhur 
għal rodituri jew g ħal annimali mhux rodituri jekk ma jkun deher ebda effett 
fuq parametri ta’ bijokimika klinika fi studju pre ċedenti ta’ 90 jum mag ħmul 
f’livelli komparabbli ta’ do ża. Huwa rrakkomandat is-sawm matul il-lejn 
tal-annimalli (bl-e ċċeżżjoni tal- ġrieden) qabel it-te ħid tal-kampjuni 
tad-dehem. Il-lista ta’ parametri li ġejja għ
andha tkun investigata (30): 
glukożju, urea (nitro ġenu tal-urea), kreatinina, proteina totali, albumina, 
kalċju, sodju, potassju, kolesterol totali, mill-anqas żewġ testijiet adatti 
għal evalwazzjoni epato ċellulari (aminotransfera żi tal-alanina, aspartate 
aminotransfera żi, glutamat ta’ deidro ġenażi, aċidi totali tal-bili) (31), u 
mill-anqas żewġ testijiet adatti g ħal evalwazzjoni epatobiljari (fosfata żi 
alkalina, gamma glutamil trasferimenta żi, 5’-nukleotida żi, bilirubina totali, 
aċidi totali tal-bili) (31). Parametri o ħra ta’ bijokimika klinika b ħal trig­
liċeridi sajmin, ormoni spe ċifiċi u kolinestera żi jistgħu jitkejlu kif jixraq, 
skont it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar. B’mod ġenerali, hemm ħtieġa ta’ 
approċċ flessibbli, skont l-effett osservat u/jew mistenni minn kimika parti ­
kolari għall-ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Determinazzjonijiet ta’ anali żi tal-awrina g ħandhom isiru fuq mill-anqas 10 
annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp fuq kampjuni mi ġburin fl-istess 
intervalli b ħal dawk g ħall-ematolo ġija u l-kimika klinika. Ma jkunx me ħtieġ 
isiru kejlijiet kull 3 xhur jekk ma jkun deher ebda effett fuq anali żi 
tal-awrina fi studju pre ċedenti ta’ 90 jum mag ħmul f’livelli komparabbli 
ta’ doża. Il-lista ta’ parametri li ġejja kienet inklu ża f’rakkomandazzjoni 
esperta dwar studji ta’ patolo ġija klinika (30): dehra, volum, o żmolalità 
jew gravità spe ċifika, pH, proteina totali u gluko żju. Determinazzjonijiet 
oħra jinkludu keton, urobilino ġenu, bilirubina u demm mo ħbi. Jistgħu 
jintużaw aktar parametri meta jkun me ħtieġ biex tkun esti ża 
l-investigazzjoni ta’ effett(i) osservat(i).  
44. Huwa meqjus b’mod ġenerali li je ħtieġu varjabbli ba żi ematolo ġiċi u ta’ 
bijokimika klinika qabel trattament g ħal studji dwar il-klieb, i żda ma jeħti­ 
ġilhomx ikunu ddeterminati fi studji dwar rodituri (30). I żda, jekk dejta ba żi 
storika (ara l-paragrafu 50) ma tkunx adegwata, g ħandu jitqies li tkun 
iġġenerata dejta b ħal din.  
Patoloġija 
Awtopsja makroskopika  
45. L-annimali kollha fl-istudju normalment g ħandhom ikunu sso ġġettati għal 
awtopsja makroskopika s ħiħa u dettaljata li tkun tinkludi e żami bir-reqqa 
tal-wiċċ estern tal- ġisem, tal-fet ħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, tora ċiċi u 
abdominali u tal-kontenuti tag ħhom. Iżda jista’ wkoll ikun hemm prov ­
vediment (fil-qatla interim jew fi gruppi satellitarji) biex kejlijiet ikunu ristretti g ħal miżuri speċifiċi ewlenin b ħal newrotossi ċità jew immunotos ­
siċità (ara l-paragrafu 19). Dawn l-annimali jistg ħu ma jkunux so ġġetti għal 
awtopsja u g ħall-proċeduri sussegwenti deskritti fil-paragrafi li ġejjin. 
L-annimali sentinelli jista’ jkun je ħtiġilhom awtopsja abba żi ta’ każ każ, 
fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju.
 
46. Piżijiet ta’ organi g ħandhom jin ġabru mill-annimali kollha, minbarra dawk 
esklużi bil-parti tal-a ħħar tal-paragrafu 45. L-adrenali, il-mo ħħ, l-epididimi, 
il-qalb, il-kliewi, il-fwied, l-ovarji, il-milsa, it-testikoli, it-tirojde (jinti żnu 
wara fissazzjoni, ma’ paratirojdi), u l-utru tal-annimali kollha (minbarra 
ta’ dawk misjubin qed imutu u/jew qed jinqatlu fil-frattemp) g ħandhom 
jintraqmu minn kull tessut imwa ħħal magħhom, kif jixraq, u l-pi ż 
tagħhom fl-imxarrab g ħandu jittie ħed malajr kemm jista’ jkun wara 
dissezzjoni biex ma jit ħalliex ikun hemm inxif. Fi studju li ju ża l-ġrieden, 
l-użin tal-glandoli adrenali huwa fakultattiv.  
47. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu ppreservati fil-midjum ta’ fissazzjoni 
l-aktar adattat kemm g ħat-tip ta’ tessut, kif ukoll g ħall-eżami istopatolo ġiku 
maħsub sussegwentement (32) (tessuti f’parente żi kwadri huma fakultattivi): 
il-leżjonijiet kbar kollha qalb frixa stonku (il-parti quddimija 
tal-istonku, stonku glan ­
dolari) 
glandola adrenali ileu glandola tal-paratirojde [snien] 
aorta jejunum nerv periferali testikoli 
moħħ (inklużi taqsimiet ta ċ- 
ċerebru, ċervellett, u 
medulla/me żoċefalu) kliewi pitwitarja timu 
il-musrana l-g ħamja glandola tad-dmug ħ 
(straorbitali) prostata tirojde 
ċerviċi fwied il-musrana d-dritta [lsien]  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
glandola tal-koagulazzjoni pulmun glandola tal-b żieq trakea 
il-musrana l- ħoxna nodi limfati ċi (kemm 
superfiċjali kif ukoll 
fondi) bużżieqa seminali bu żżieqa tal-awrina 
duwodenu glandola mammarja 
(bilfors g ħan-nisa u, 
jekk dissettabbli b’mod viżibbli, għall-irġiel) muskolu skeletali utru (inklu ż ċerviċi) 
epididymis [sistema respiratorja ta’ 
fuq, inklu żi mnieħer, 
turbinati u sinus paranażali] ġilda [ureteru] 
għajn (inklu ża r-retina) esofagu nerv vertebrali (fi tlett 
livelli: ċervikali, 
midtoraċiku u lumbari) [uretra] 
[wirk bl-g ħaksa] [basla tax-xamm] milsa va ġina 
bużżieqa tal-marrara (g ħal 
speċijiet minbarra l-far) ovarju [sternu], taqsima tal-mudullun 
tal-għadam u/jew aspirat 
frisk tal-mudullun tal-għadam 
Glandola ta’ Harder
 
Fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi g ħandhom 
ikunu ppreservati. Is-sejbiet klini ċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li 
jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. G ħandu wkoll ikun ippreservat kull 
organu li x’aktarx ikun meqjus b ħala organu mmirat abba żi 
tal-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall-ittestjar. Fi studji li jinvolvu 
r-rotta dermali ta’ amministrazzjoni, il-lista ta’ organi kif stabbilita g ħar- 
rotta orali g ħandhom ikunu ppreservati, u t-te ħid ta’ kampjuni spe ċifiċi u 
l-preservazzjoni tal- ġilda mis-sit ta’ applikazzjoni huma essenzjali. Fi studji 
ta’ inalazzjoni, il-lista ta’ tessuti ppreservati u e żaminati mis-sistema respi ­
ratorja għandha ssegwi r-rakkomandazzjonijiet tal-Kapitolu B.8 ta’ dan 
l-Anness (8) u tal-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness (9). G ħal organi/tessuti 
oħra (u b’żieda mat-tessuti ppreservati spe ċifikatament mis-sistema respira ­
torja) il-lista ta’ organi kif stabbilita g ħar-rotta orali g ħandha tkun e żaminata.  
Istopatolo ġija 
48. Hija disponibbli gwida dwar l-a ħjar prattiki fit-tmexxija ta’ studji dwar 
patoloġija tossikolo ġika (32). L-e żamijiet istopatolo ġiċi minimi g ħandhom 
ikunu:  
— it-tessuti kollha mill-gruppi ta’ do ża għolja u ta’ kontroll;  
— it-tessuti kollha minn annimali qed imutu jew li jkunu nqatlu matul 
l-istudju;  
— it-tessuti kollha li juru anormalitajiet makroskopi ċi; 
— tessuti mmirati jew tessuti li wrew bidliet relatati ma’ trattament 
fil-grupp ta’ do ża għolja, mill-annimali kollha fil-gruppi l-o ħra kollha 
ta’ doża; 
— fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi 
għandhom ikunu e żaminati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
49. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwalment g ħall- 
parametri kollha evalwati. Addizzjonalment, id-dejta kollha g ħandha 
tinġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp tat-test l-g ħadd 
ta’ annimali fil-bidu tat-test, l-g ħadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta 
matul it-test jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani u l- ħin ta’ kull 
mewta jew qatla b’mod uman, l-g ħadd ta’ annimali li juru sinjali ta’ 
tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, inklu ż iż-żmien 
meta jibdew ifaqqg ħu, durata u severità ta’ kull effett tossiku, l-g ħadd ta’ 
annimali li juru le żjonijiet, it-tip ta’ le żjonijiet u l-per ċentwali tal-annimali li 
juru kull tip ta’ le żjoni. Tabelli ta’ sommarji ta’ dejta g ħandhom jipprovdu 
l-mezzi u d-devjazzjonijiet standard (g ħal dejta ta’ test kontinwu) ta’ 
annimali li juru effetti tossi ċi jew le żjonijiet, minbarra l-gradazzjoni 
tal-leżjonijiet.  
50. Dejta storika ta’ kontroll tista’ tkun siewja fl-interpretazzjoni tar-ri żultati 
tal-istudju, e ż. fil-każ meta jkun hemm indikazzjonijiet li d-dejta 
pprovduta mill-kontrolli konkurrenti tkun sostanzjalment diversa meta mqabbla ma’ dejta re ċenti minn annimali ta’ kontroll mill-istess fa ċilità/ 
kolonja tat-test. Dejta storika ta’ kontroll, jekk tkun evalwata, g ħandha 
tkun sottomessa mill-istess laboratorju u tkun tirrelata ma’ annimali tal-istess età u razza ġġenerati matul il- ħames snin li jkunu ġew qabel 
l-istudju inkwistjoni.
 
51. Meta jkunu applikabbli, ri żultati numeri ċi għandhom ikunu evalwati 
b’metodu ta’ statistika ġeneralment a ċċettabbli u adattat. Il-metodi ta’ stat ­
istika u d-dejta li jkollha ti ġi analizzata g ħandhom jintg ħażlu matul it-tfassil 
tal-istudju (paragrafu 8). L-g ħażla għandha tipprovdi g ħal aġġustamenti ta’ 
sopravivenza, jekk ikun me ħtieġ. 
Rapport tat-test  
52. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-Ittestjar:  
— natura fi żika, purezza u proprjetajiet fi żikokimiċi; 
— dejta ta’ identifikazzjoni;  
— sors tal-kimika;  
— numru tal-lott;  
— ċertifikat tal-anali żi tal-kimika  
Vejjikolu (fejn xieraq):  
— ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ vejjikolu (jekk ma jkunx ilma).  
Annimali tat-test:  
— speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-għażla magħmula;  
— għadd, età u sess tal-annimali fil-bidu tat-test;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— sors, kundizzjonijiet ta’ abitazzjoni, dieta, e ċċ.; 
— piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— motiv g ħal rotta ta’ amministrazzjoni u g ħażla ta’ doża; 
— meta jkun applikabbli, il-metodi ta’ statistika u żati biex tkun analizzata 
d-dejta;  
— dettalji ta’ formulazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar/preparazzjoni tad-dieta;  
— dejta analitika dwar kon ċentrazzjoni miksuba, stabbiltà u omo ġeneità 
tal-preparazzjoni;  
— rotta ta’ amministrazzjoni u dettalji tal-amministrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar;  
— għal studji ta’ inalazzjoni, jekk hux l-imnie ħer jew il- ġisem kollu;  
— dożi attwali (mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum), u fattur ta’ konver żjoni minn 
konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (mg/kg jew ppm) ta’ dieta/ilma 
tax-xorb g ħad-doża attwali, jekk applikabbli;  
— dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma.  
Riżultati (għandhom ikunu ppre żentati sommarji tad-dejta tabulata u dejta 
dwar annimali individwali):  
— dejta dwar sopravivenza;  
— piż tal-ġisem/bidliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— konsum ta’ ikel, kalkulazzjonijiet ta’ effi ċjenza fl-ikel, jekk ikunu saru, u 
konsum tal-ilma jekk applikabbli;  
— dejta ta’ reazzjoni tossika skont is-sess u livell ta’ do ża, inklużi sinjali ta’ 
tossiċità; 
— natura, in ċidenza (u, jekk bil-punti, severità), u dewmien ta’ osser ­
vazzjonijiet klini ċi (jekk hux tran żitorji jew permanenti);  
— eżami oftalmolo ġiku; 
— testijiet ematolo ġiċi; 
— testijiet ta’ bijokimika klinika;  
— testijiet ta’ anali żi tal-awrina;  
— riżultat ta’ kull investigazzjoni ta’ newrotossi ċità jew immunotossi ċità 
— piż terminali tal- ġisem;  
— piżijiet ta’ organi (u l-proporzjonijiet tag ħhom, jekk applikabbli);  
— sejbiet minn awtopsji;  
— deskrizzjoni dettaljata tat-trattamenti kollha relatati ma’ sejbiet istopato ­
loġiċi; 
— dejta ta’ assorbiment jekk disponibbli;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Trattament ta’ statistika ta’ ri żultati, kif jixraq  
Diskussjoni dwar ri żultati inklu żi: 
— Doża: relazzjonijeit ta’ rispons  
— Konsiderazzjoni ta’ kwalunkwe informazzjoni dwar il-modalità 
tal-azzjoni  
— Diskussjoni dwar kull appro ċċ ta’ mudellar  
— Determinazzjoni ta’ BMD, NOAEL jew LOAEL  
— Dejta storika ta’ kontroll  
— Rilevanza g ħall-bnedmin  
Konklużjonijiet  
LETTERATURA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity character ­
ization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
(5) Il-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: Studju dwar Tossi ċità Orali dwar Do ża 
Ripetuta g ħal 90 Jum ta’ Test ta’ Subtossi ċità Kronika Orali f’Annimali 
Mhux Rodituri.  
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(8) Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subakuta: Studju 
ta’ 28 Jum.  
(9) Il-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subkronika: 
Studju ta’ 90 Jum.  
(10) Il-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness, Tossi ċità (Dermali) ta’ Do ża Ripetuta (28 
Jum).  
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modern ­
ization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(19) Id-Direttiva 2010/63/EU tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta’ 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal skopijiet 
xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).  
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(25) 999-1003 Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Exam ­
ination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neur ­
otoxicol. Teratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(31) EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatot ­
oxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Appendix 1  
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ FL-I ŻVILUPP PRENATALI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni g ħal OECD TG 414 (2001).  
1.1. INTRODUZZJONI  
Dan il-metodu ta' l-ittestjar żviluppanti tat-tossi ċità huwa iddisinjat li 
jipprovdi informazzjoni ġenerali li tikkon ċerna l-effetti ta' l- 
espożizzjoni prenatalifuq annimal tqil waqt it-test u fuq l- 
organiżmu żviluppanti in utero; dan jista’ jinkludi l-assessjar ta' l- 
effetti maternali kif ukoll il-mewt, anormalitjiet strutturali, jew it- 
tkabbir mibdul tal-fetu. Id-difetti funzjonali, g ħalkemm parti 
importanti fl-i żvilupp, ma humiex parti integrali ta' dan il-metodu 
tat-test. Dawn jistg ħu ikunu ittestjati g ħal studju separat jew b ħala 
żieda ma dan l-istudju bl-u żu tal-metodu tat-test g ħal newrotossi ċità 
ta' l-iżvilupp. G ħall-informazzjoni dwar it-testijiet g ħal defiċjenzi 
funzjonali u l-effetti l-o ħrajm ta' wara t-twelid, il-Metodu tat-Test 
għal studju tat-tossi ċità riproduttiva ta' żewġ ġenerazzjonijiet u l- 
istudju g ħal newrotossi ċità ta' l-i żvilupp għandu jkun ikkonsultat 
skond kif xieraq.  
Dan il-metodu tat-test jista’ je ħtieġ adattazzjoni spe ċifika f'każi indi­
vidwali fuq il-ba żi ta' tag ħrif speċifiku fuq, e ż. il-propjetajiet 
fiżikokimiċi jew tossikolo ġiċi tas-sustanza tat-test. Tali adattazzjoni 
hija aċċettabbli, meta evidenza xjentifika konvin ċenti tissuġġerixxi li 
l-adattazzjoni tkun twassal g ħal test aktar informattiv. F'tali ka ż, din 
l-evidenza xjentifika g ħandha tkun dokumentata bir-teqqa fir-rapport 
ta' l-istudju.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Tossikolo ġijata' l-i żvilupp:  l-istudju ta' l-effetti ħżiena fuq l- 
organiżmi ta' l-iżvilupp li jistg ħu jirriżultaw mill-espo żizzjoni qabel 
il-konċepiment, matul żvilupp ta qabel it-twelid, jew ta' wara t-twelid 
għaż-żmien mal-maturutà sesswali. Il-manifestazzjonijiet ma ġġuri tat- 
tossiċità ta' l-i żvilupp jinkludu, 1) il-mewt ta' l-organi żmu, 2) l- 
annormalità strutturali, 3) tibdil fit-tkabbir, u 4) defi ċjenza funzjonali. 
It-tossikolo ċija ta' l-iżvilupp kienet pre ċedentament ta' spiss referuta 
bħala teratol ġija. 
Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn 
linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organi żmu li jibqa ħaj, li jirri ­
priduċi jew li jadatta g ħall-ambjent. Fir-rigward tat-tossolo ġija ta' l- 
iżvilupp, meqjusha fis-sens l-aktar wiesa, din tinkludi kwalunkwe 
effett li jinterferixxi mal-i żvilupp normali tal-conceptus, kemm 
qabel u wara t-twelid.  
Tkabbir mibdul:  Tibdil fl-organu naxxenti jew fil-pi ż tal-ġisem jew 
fid-daqs.  
Alterazzjonijiet (annormalitajiet):  Alterazzjonijiet strutturali fl- 
iżvilupp li jinkludu kemm il-malformazzjonijiet u wkoll 
varjazzjonijiet (28).  
Malformazzjoni/Annormalità Ma ġġuri: Tibdil strutturali ikkun ­
sidrat bħala detrimentali g ħall-annimal (jista’ wkoll ikunu letali) u 
hija normalment rari.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Varjazzjoni/Annormalità Minuri:  Tibdil strutturali meqjus b ħala li 
jkollu ftit jew l-ebda effett strutturali fuq l-annimal; jista’ jkun 
temporanju jew jista’ jse ħħ relattivament ta' spiss fil-popolozzjoni 
tal-kontroll.  
Konċepiment:  Is-summa tad-derivattivi ta' ovum fertilizzat fi 
kwalunkwe stadju ta' l-i żvilupp mill-fertilizzazzjoni sat-twelid, 
inklużi l-membrani extra-embrijoni ċi kif ukoll l-embriju jew il-fetu.  
Implantazzjoni (nidazzjoni):  It-twaħħil tal-blasto ċista ma l-inforra 
epiteljali ta' l-uteru, inklu ż il-penetrazzjoni tag ħha mill-epiteljum 
uterin, u t-twa ħħil tagħha fil-endometrrijum.  
Embriju:  l-istadju kmieni jew żviluppanti ta' kwalunkwe organi żmu, 
speċjalment l-i żvilupp tal-prodott tal-fertilizzazzjoni tal-bajda wara l- 
assi t-twila tkun tidher u sakemm l-istrutturi ma ġġuri kollha jkunu 
preżenti. 
Embijotossi ċità: Detrimentali g ħall-istruttura normali, l-i żvilupp, it- 
tkabbir, u/jew il-viabbilità ta' embrijun.  
Fetu:  Il-wild mhux imwieled fil-perjodu post-embrijoniku.  
Fetutossi ċità: Detrimentali g ħall-istruttura normali, l-i żvilupp, it- 
tkabbir, u/jew il-viabbilità tal-fetu.  
Abort:  It-twarrib ta' qabel il-waqt mill-uteru tal-prodotti tal- 
konċepiment: ta' l-embrijun jew ta' fetu mhux-viabbli/  
Reżorpzjoni:  Konċepiment li, wara li jkun ġie impjantant fl-uteru, 
sussegwentament imut u jkun, jew kien, assorbit mill- ġdid. 
Reżorpzjoni kmieni:  Evidenza ta' l-implant ming ħajr embrijun/fetu 
rikonoxxibbli.  
Reżorpzjoni tard:  Embrijun jew fetu mejjet b; tibdiliet esterni 
deġenerattivi.  
NOAEL:  Abbrevjazzjoni g ħal-livell ta' l-ebda effett avvers ma huwa 
osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-g ħola doża 
jew livell ta' espo żizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati mat- 
trattament ma jkunu osservati.  
1.3. SUSTANZA TA' REFERENZA  
Xejn.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Normalment, is-sustanzaa tat-test hija somministrata fuq annimali 
tqal għal mill-anqas mill-impjantazzjoni sa jum wie ħed qabel il- 
jum skedat tal-qatla, li g ħandu jkun qrib kemm jista’ jkun 
possibbli g ħall-jum normali tal- ħlas mingħajr ir-riskju ta' inform ­
azzjoni li tirri żulta minn ħlas kmieni. Il-metodu tat-test mhux inti ż 
li jeżamina biss il-perjodu ta' lorgano ġenesi, (eż. il-jiem 5-15 fl- 
annimal gerriema, u l-jiem 6-18 fil-fenek) imma wkoll l-effettu 
mill-pre-impjantazzjoni, meta xieraq, mutul il-perjodu kollu tal- ġestjoni sal-jum ta' qabel is-sezzjoni ċesarja. Ftit qabel is-sezzjoni 
ċesarjaa, il-femminili jkunu maqtula, il-kontenuti ta l-utru jkunu 
eżaminati, u l-fetu huma evalwati g ħan anomalitajiet esterni 
viżibbli u għal nisġiet rotob u tibdiliet skeletali.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.5.1.  L-g ħażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
Huwa rrakkommandat li t-testijiet ikunu mwettqa fuq l-ispe ċje l-aktar 
relevanti, u li l-ispe ċje u r-razzez tal-laboratorju li huma normalment 
użati fit-testijiet dwar it-tossi ċità fl-iżvilupp prenatali, jkunu u żati. L- 
ispeċje ta' l-anniamli gerriema preferuta huja l-far u l-ispe ċje ta' 
annimali mhux ġeggiema huwa l-fenek. Ġustifikazzjoni g ħandha 
tkun ipprovduta jekk ikun u żat xi speċje ieħor. 
1.5.2.  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
It-temperatura tal-kamra ta' fejn jin żammu l-annimali ta' l-esperiment 
għandha tkun 22  o C (± 3o) g ħall-annimali gerriema u 18  o C (± 3  o ) 
għall-fniek. G ħalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill-anqas 
30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif 
tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. 
Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu ikunu 
użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb.  
Il-proċeduri ta' l-akkompanjament g ħandhom jitwettqu f'ga ġġeg 
adatti għal dak l-iskop. Meta ga ġġeg separati g ħall-annimali fl- 
akkompanjament huma preferuti, i ż-żamma ta' numru żgħt f'ġagga 
waħda huwa wkoll a ċċettabbli.  
1.5.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali b'sa ħħithom. Li jkunu ġew akklamatizzati g ħall- 
kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mil anqas 5 ijiem u li ma 
jkunux ġew suġġetti għal proċeduri pre ċedenti sperimentali, 
għandhom ikunu u żati. L-annimali tat-test g ħandhom ikunu karatter ­
izzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, pi ż u/jew l-età. L-annimali tal- 
gruppi kollha tat-test g ħandhom, kemm jista’ jkun prattikabbli, ikunu 
ta' piż u età uniformi. Femmini adulti żgħażagħ li jkunu g ħadu ma 
weldux g ħandhom ikunu u żati f'kull livell ta' do ża. Il-femminili 
għandhom ikunu mg ħammra ma maskili ta' l-istess spe ċje u razza, 
u t-tgħammir ma l-ulied g ħandu jkun evitat. G ħall-annimali gerriema, 
il-jum 0 tal-gestazzjoni huwa l-jum li fih il-buq va ġinali u/jew l- 
isperma huma osservati; g ħall-fniek il-jum 0 huwa normalment il- 
jum tal-coitus jew ta' l-inseminazzjoni artifi ċjali, jekk tkun u żata dik 
it-teknika. In-nisa mg ħammra g ħandhom ikunu aassenjati b'mod 
mingħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. Il- 
gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli 
minħabba t-tqeg ħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal 
għandu jkun assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. In-nisa 
mgħammra g ħandhom ikunu assenjati b'manjera ming ħajr preġ­
udizzju lejn il-gruppi ta' kontroll u tat-trattament, u jekk in-nisa 
jkunu mg ħammra f'lottijiet, l-annimali ta' kull lott g ħandhom ikunu 
imqassma b'mod egwali matul il-gruppi. Bl-istess mod, in-nisa seminati mill-istess ra ġel għandhom ikunu mqassma b'mod egwali 
matul il-gruppi.
 
1.6. PRO ĊEDURA  
1.6.1.  In-numru u s-sess ta' l-annimali  
Kull grupp tat-test u tal-kontroll g ħandu jinkludi numru suffi ċjenti ta' 
femminili li jirri żulta f'madwar 20 annimal femmini bis-sita ta' l- 
implantazzjoni fin-nekropsija. Gruppi ta' anqas minn 16 il-annimal bis-sita ta' l-implantazzjoni jista’ ma jkunx xieraq. Il-mortalià 
materna mhux ne ċessarjament tinvalida l-istudju, basta li din ma 
tkunx teċċedi madwar 10 %.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Preparazzjoni tad-do żi 
Jekk il-mezz jew l-adittiv l-ie ħor ikun u żat sabiex jiffa ċilita d-do ża, 
kunsiderazzjoni g ħandha tkun mog ħtija għal dawn il-karatteristi ċi li 
ġejjin: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu, 
u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet 
kimiċi tas-sustanza tat-test li jistg ħu joħolqu bidla fil-karatteristi ċi 
tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l- 
istat nutrizzjonali ta' l-annimali. Il-mezza la g ħandu jkun żviluppa­
tament tossiku u l-anqas li jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni.  
1.6.3.  Id-Do ża 
Normalment, is-sustanza tat-test g ħandha tkun somministrata ta' kull 
jum mill-impjantazzjoni (e ż. il-jum 5 minn wara t-tg ħammir) sal jum 
ta' qabel is-sezzjoni ne ċessarju kif skedata. Jekk l-istudji preliminarji, 
meta disponibbli, ma jkunux jindikaw potenzjal g ħoli dwar it-telf 
pre-impjantazzjoni, it-trattament jista’ jkun esti ż li jinkludi l- 
perjodu intier tal- ġestjoni, mit-tg ħamir sal-jum ta' qabel il-qatla 
skedata. Huwa ben mag ħruf li tqandil mhux sewwa jew xi ta ħbit 
matul it-tqala jista’ jirri żulta f'telf prenatali. Sabiex ikun hemm 
ħarsien kontra t-telf prenatali minn fatturi li ma humiex relatati 
mat-trattament, tqandil bla ħtieġa ta' annimali tqal kif ukoll ta ħbit 
minn fatturi barranija b ħal ma huma l- ħsejjes għandhom ikunu 
evitati.  
Mill-anqas tlett livelli ta' do żi u l-kontroll simultanju g ħandhom 
ikunu użati. Annimali b'sa ħħithom għandhom ikunu aassenjati 
b'mod ming ħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. 
Il-livelli tad-do ża għandhom ikunu mqassma sabiex jipprodu ċu l- 
effetti tossi ċi tal-grad tat-tossi ċità. Sakemm ma jkunx hemm limi ­
tazzjoni tal-propjetajiet tan-natura fi żika/limika jew biolo ġika tas- 
sustanza tat-test, l-g ħola doża għandha tkun mag ħżula bil-għan li 
jkunu introdotti xi tossi ċità ta' l-i żvilupp u/jew materna (sinjali 
kliniċi jew tnaqqis fil-pi ż tal-ġisem) imma mhux mewt jew 
sofferenza akuta. Mill-anqas livell ta' do ża waħda intermedja 
għandu jipprodu ċi effetti tossi ċi minimi osservati. Il-livell l-aktyar 
baxx m'g ħandux jipprodu ċi xi evidenza la ta' tossi ċità materna u l- 
anqas ta' l-i żvilupp. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-do ża 
għandha tkun mag ħżulha bil-g ħan li turi kwalunkwe reazzjoni 
relatata mad-do ża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat 
(NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex 
ikunu stabbiliti l-livelli tad-do ża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' 
grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-u żu ta' intervalli ferm 
twal (eż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-do żi. Għalkemm l-isteb ­
beliment tal-NOAEL materni huwa l-g ħan, l-istudji li ma jista’bbi ­
lixxux tali livell jistg ħu wkoll ikunu a ċċettabbli 91).  
Livelli ta' do żi għandhom ikunu mag ħżula billi tkun meqjusa xi 
informazzjoni e żistenti kif ukoll l-informazzjoni addizzjonali dwar 
il-metaboli żmu u t-tossikukineti ċi tas-sustanza tat-test jew tal- 
materjali relatati. Din l-infomazzjoni g ħandha wkoll tg ħin fid-demos ­
trazzjoni ta' l-adekwatezza ta' l-amministrazzjoni tad-do żar. 
Grupp ta' kontroll konkorrenti g ħandu jkun u żat. Dan il-grupp 
għandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz ta' grupp 
ta' kontroll jekk mezz ikun u żat fl-amministrazzjoni tas-sustanza tat- 
test. Il-gruppi kollha g ħandhom ikunu amministrati l-istess volum 
jew tas-sustanza tat-test jew tal-mezz. L-annimali fil-grupp(i) tal- kontroll g ħandhom ikunu mqandla bl-istess manjiera b ħal l- 
annimali fil-grupp tat-test. Il-gruppi bil-mezz ta' kontroll g ħandhom 
jirċievu l-mezz fl-g ħola ammont u żat (bħal fil-gruppi ta' l-anqas 
trattament).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Test tal-limitu  
Jekk test f'do ża ta' livell wie ħed ta' mill-anqas 1 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem/jum b'amministrazzjoni orali. Li jutilizza l-pro ċeduri deskritti 
għal dan l-istudju, ma tipprodu ċi leba tossi ċità osservabbli la fl- 
annimali tqal u l-anqas fil-pro ġenji tagħhom u jekk effett ma jkunx 
mistenni kif ibba żat fuq l-informazzjoni e żistenti (eż. minn ta ħlitiet 
strutturament u/jew metabilakament relatati), allura studju s ħiħ bl-użu 
ta' dożi fi tlett livelli g ħandu mnejn ikunu ikkonsidrat b ħala mhux 
meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista’ tindika il- ħtieġa għal- 
livell ta' do ża orali għola li tkun u żata fit-test tal-limitu. G ħal tipi 
oħrajn ta' l-amministrazzjoni, b ħal ma huwa t-te ħid man-nifs jew l- 
applikazzjoni dermali, il-propjetajiet fi żikukimiċi tas-sustanza tat-test 
ta' spiss jistg ħu jindikaw u jillimtaw il-massimu tal-livell attenibbli 
għall-espożizzjoni (per e żempju, l-applikazzjoni dermali m'g ħandhiex 
toħloq tossiċità lokali severa).  
1.6.5.  Amministrazzjoni tad-do żi 
Is-sustanza tat-test jew il-mezz normalment huwa amministrat bi 
intubazzjoni orali. Jekk tkun u żata rotta o ħra ta' l-amministrazzjoni, 
min jagħmel it-test g ħandu jipprovdi ġustifikazzjoni u ra ġjonar għal 
dik l-għażla, u modifiki xierqa jistg ħu li jkunu me ħtieġa (2) (3) (4). 
Is-sustanza tat-test g ħandha tkun somministrata bejn wie ħed u ieħor 
fl-istess ħin ta' kull jum.  
Id-doża lil annimali individwali g ħandha normalment tkun ibba żata 
fuq id-determinazzjoni tal-pi ż tal-ġisem kif l-aktar ri ċenti disponibbli. 
B'dana kollu, attenzjoni g ħandha tkun e żerċitata meta tkun a ġġustata 
d-doża ma tul l-a ħħar parti tremestra tat-tqala. Informazzjoni e żistenti 
għandha tkun u żata għall-għażla tad-doża sabiex tipprevjeni e ċċess 
tat-tossiċità materna. B'dana kollu, jekk e ċċess ta' tissi ċità jkun 
innutat fin-nisa ittrattati, dawk l-annimali g ħandhom ikunu maqtula 
b'mod umanesk. Jekk diveri annimali tqal juru sinjali ta' tossi ċità 
eċċessiva, kunsiderazzjoni g ħandha ting ħata għat-terminazzjoni ta' 
dak il-grupp fid-do ża. Jekk is-sustanza tkun somministrata b'ikel 
sfurzat, dan g ħandu preferibbilment ikun mog ħti bħala doża waħda 
lill-annimali bl-u żu ta' tubu lejn l-istinku jew xi canula ta' l-intu ­
bazzjoni xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun ammin ­
istrat f'waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. 
Il-volum m'g ħandux jeċċedi 1 ml/100 g pi ż tal-ġisem, apparti fil-ka ż 
ta' taħlitiet akweji meta 2 ml/100 g pi ż tal-ġisem jista’ jkun u żat. 
Meta jkun u żat iż-żejt tal-qam ħ-ir-rum, il-volum m'g ħandux jeċċedi 
0,4 ml.100 g pi ż tal-ġisem. Varjabbilità fil-volum tat-test g ħandha 
tkun minimizzata bl-a ġġustament tal-kon ċentrazzjonijiet sabiex ikun 
assigurat volum kostanti matul il-livelli kollha tad-do żi. 
1.6.6.  Osservazzjoni tan-nisa  
Osservazzjonijiet klini ċi għandhom jitwettqu u jkunu rre ġistrati mill- 
anqas darba kull jum, preferibbilment fl-istess ħin(ijiet) billi jkun 
ikkonsidrat il-perjodu l-aktar probabbli ta' l-effetti anti ċipati ta' 
wara d-do ża. Il-kundizzjoni ta' l-annimali g ħandha tkun irre ġistrata, 
inkluża l-mortalità, l-g ħafja tal-mewt, tibdil pertinenti fl-im ġieba, u s- 
sinjali kollha ta' tossi ċita barranija.  
1.6.7.  Il-pi ż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel  
L-annimali g ħandhom ikunu mi żuna fil-jum 0 tal- ġestazzjoni jew 
mhux aktar tard mill-jum 3 tal- ġestazzjoni jekk annimali 
mgħammra skond i ż-żmien huma fornuti min fekundament barrani, 
fl-ewwel jum tad-dp ża, mill-anqas kull 3 ijiem matul il-perjodu tad- 
doża u fil-jum tal-mewt kif skedata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Il-konsum ta' l-ikel g ħandu jkun irre ġistrat f'intervalli ta' tlett ijiem u 
għandu jkun jikkon ċidi mal-jiem tad-determinazzjoni tal-pi ż tal- 
ġisem.  
1.6.8.  Eżaminazzjoni ta' wara l-mewt  
In-nisa għandhom ikunu maqtula jum qabel il-jum mistenni tal- ħlas. 
Femminili li juri sinjali ta' abort jew ħlas prematur g ħall-iskeda tal- 
qatla għandhom ikunu maqtula u su ġġetti għal eżaminazzjoni 
makroskopika bir-reqqa.  
Filwaqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudju, il-mara tqila 
għandha tkun e żaminata b'makroskopiki g ħal xi annormalitajiet strut ­
turali jew tibdilied patolo ġiċi. L-evalwazzjoni tan-nisa matul is- 
sezzjon ċesarja u l-anali żi sussegwenti tal-fetu g ħandha tkun 
imwettqa, preferibbilment, ming ħajr tagħrif dwar il-grupp tat-trat ­
tament, sabiex jitnaqqas il-pre ġudizzju.  
1.6.9.  L-e żami tal-kontenuti uterini  
Immedjetament wara t-terminazzjoni jew malli jkun possibbli wara l- 
mewt, l-uteri g ħandhom ikunu mne ħħija u l-istat tat-tqala ta' l- 
annimal a ċċertat. L-uteri li jidhru mhux bit-tqala g ħandhom ikunu 
aktar eżaminati (e ż. bit-tiċpis bis-sulfid ta' l-ammonju g ħall-annimali 
gerriema u t-ti ċpis Salewski jew b'metodu alternattiv xieraq g ħall- 
fniek) sabiex ikun konfermat l-istatus mhux tat-tqala (5).  
Uteri tqal jinkludu l-g ħonq ta' l-uteri g ħandhom ikunu mi żuna. Il- 
piżijiet ta' l-uteri tqal m'g ħandhomx ikunu akkwistati minn annimali 
misjuba mejta waqt l-istudju.  
In-numru ta' corpora lutea g ħandu jkun determinat g ħall-annimali 
tqal. 
Il-kontenuti ta' l-uteri g ħandhom ikunu e żaminati g ħan-numru ta' 
embrijuni jew imwiet tal-feti jew feti viabbli. Il-grad ta' riassor ­
bazzjoni g ħandu jkun deskritt sabiex ikun ikkalkolat il- ġin relattiv 
tal-mewt tal-conceptus (ara s-sezzjoni 1.2).  
1.6.10.  L-eżami tal-feti  
Is-sess u l-pi ż tal-ġisem ta' kull fetu g ħandhom ikunu determinati.  
Kull fetu g ħandu jkun e żaminat għal tibdiliet esterni (6).  
Il-feti għandhom ikunu e żaminati g ħal tibdiliet skeletali u tal-partijiet 
rotob (eż. varjazzjonijiet u maformazzjonijiet jew anomaliji) (7) (8) 
(9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) 
(23) (24). Kategorizzazzjoni ta' l-alterazzjonijiet tal-feti hija preferibbli imma mhux me ħtieġa. Meta ssir il-kategorizzazzjoni, il- 
kriterja g ħad-definizzjoni ta' kull kategorija g ħandha tkun kjarament 
mistqarra. Attenzjoni partikolari g ħandha ting ħata għall-passaġġ 
riproduttiv li g ħandu jkun e żaminat għal sinjali ta' żvilupp mibdul.
 
Għall-annimali gerriema, madwar nofs kull lott tal-feti g ħandu jkun 
ippreparat u e żaminat g ħal tibdil skeletali. Il-kumplament g ħandu 
jkun preparat u e żaminat g ħal tibdil fil-partijiet rotob, bl-u żu ta' 
metodi aċċettati u xierqa b'sezzjonament serjali jew b'teknina bil- 
għaqal ta' dissessjoni grossa.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Għall-annimali mhux gerriema, e ż. fniek, il-feti kollha g ħandhom 
ikunu eżaminati kemm g ħall-partijiet rotob u wkoll g ħal alter­
azzjonijiet skeletali. L-i ġsma ta' dawn il-feti huma evalwati b'dis ­
sessjoni galbata g ħal tibdil fil-partijiet rotob, li jistg ħu jinkludu 
proċeduri għal aktar evalwazzjoni ta' l-istruttura kardijaka interna 
(25). Ir-rjus ta' nofs il-heti e żaminati b'dan il-mod g ħandhom ikunu 
mneħħija u ippro ċessati għal evalwazzjoni ta' alterazzjonijiet fil- 
partijiet rotob (inklu żi l-għajnejn, il-mo ħħ, il-passa ġġi nażali u l- 
ilsien), l-u żu ta' metodi normali ta' sezzjonar serjali (26) jew 
metodu egwalment sensittiv. L-i ġsma ta' dawn il-feti u l-kumplament 
tal-feti intatti g ħandhom ikunu ippro ċessati u e żaminati g ħal tibdil 
skeletali, bl-utilizzazzjoni ta' l-istess metodi kif deskritti g ħall- 
annimali gerriema.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Id-dettalji g ħandhom ikunu irrapurati individwalment g ħan-nisa kif 
ukoll għall-wild tag ħhom u mi ġbura b'sommarju f'g ħamla tabulari, li 
juru għal kull grupp tat-test u g ħal kull ġenerazzjoni, in-numru ta' l- 
annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula g ħal raġunijiet umanitarji, il- ħin ta' xi mewt jew 
qtil umanitarju, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' l-annimali li juru 
sinjali ta' tossi ċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossi ċità kif osservati, 
inkluż il-ħin ta' meta tkun skoppjat, it-tul ta' żmien, u s-severità ta' xi 
effetti tossi ċi, it-tiġ ta' l-osservazzjonijiet ta' l-embrijuni/feti, u l- 
informazzjoni l-o ħra kollha dwar it-traabi l-o ħrajn.
 
Riżultati numeri ċi għandhom ikun evalwati b'metodu statistiku xieraq 
bl-użu tal-grupp ta' wild b ħala unità tad-dettalji g ħall-analiżi. Metodu 
statistiku ġeneralment a ċċettabbli g ħandu jkun u żat, il-metodi stat ­
istiċi għandhom ikunu mag ħżula bħala parti mid-disinn g ħall-istudju 
u għandhom ikunu ġġustifikati. L-informazzjoni mill-annimali li 
jmutu qabel il-qtil skedat g ħandha wkol tkun irrapurtata. Dik l- 
informazzjoni tista’ tkun inklu ża fil-mezzi tal-grupp meta relevanti. 
Relevanza mid-dettalji akkwistati minn tali annimali, u g ħalhekk l- 
inklużjoni jew l-esklu żjoni minn xi mess ta' grupp(i), g ħandha tkun 
iġġustifikata u i ġġudikata fuq ba żi individwali.  
2.2. EVALWAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Is-sejbiet ta' l-istudju tat-Tossi ċità fl-Iżvilupp Prenatali g ħandhom 
ikunu evalwati f'termini ta' l-effetti osservati. L-evalwazzjoni 
għandha tinkludi din l-informazzjoni li ġejja: 
— riżultati tat-test materni u tal-embriju/fetu, inklu ża l-avalwazzjoni 
tar-relazzjoni, jew tan-nuqqas tag ħha, bejn l-espo żizzjoni ta' l- 
annimali g ħas-sustanza tat-test u l-in ċidenza u s-severità tas- 
sejbiet kollha;  
— ktiterja u żata għall-kategorizzazzjoni esterna tal-fetu, il-partijiet 
rotob, u l-alterazzjonijiet skeletali, jekk il-kategorizzazzjoni 
tkun seħħet; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— meta xieraq, id-dettalji stpri ċi tal-kontroll sabiex iqawwu l-inter ­
pretazzjoni tar-ri żultati ta' l-istidju;  
— in-numri u żati fil-kalkolu tal-persenta ġġi kollha jew ta' l-indi ċi; 
— analiżi statistika adekwata tas-sejbiet ta' l-istudju, meta xieraq, li 
għandha tinkludi informazzjoni suffi ċjenti dwar il-metodu ta' l- 
analiżi, sabiex riveditur/statistiku independenti jkun jista’ jevalwa 
mill-ġdid jew jer ġa jibni l-anali żi. 
Fi kwalunkwe studju li juri n-nuqqas ta' xi effetti tossi ċi, aktar 
investigazzjonijiet sabiex tkun stabbilita l-assorbazzjoni u l-biodis ­
ponabbiltà tas-sustanza tat-test g ħandhom ikunu meqjusa.  
2.3 INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Studju tat-tossi ċità fl-iżvilupp prenatali jkun jipprovdi informazzjoni 
dwar l-effetti ta' espo żizzjoni repetuta lejn sustanza matul it-tqala, 
fuq in-nisa, u l-i żvilupp intra-utru tal-wild tag ħhom. Ir-ri żultati ta' l- 
istudju għandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas-sejbier mill- 
istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokineti ċi u studji o ħrajn. La 
darba l-enfasi tkun kemm fuq it-tossi ċita enerali f'termini ta' 
tossiċita materna u wkoll fuq it-tossi ċità fl-iżvilupp fil-g ħan finali, 
ir-riżultati ta' l-istudju jkunu jippermettu sa ċertu limitu g ħal 
diskriminazzjoni bejn l-effetti ta' l-i żvilupp li jse ħħu fin-nuqqas ta' 
tossiċità ġenerali u dawk li huma imda ħħla biss f'livelli li huma 
wkoll tossi ċi għall-annimal matern (27).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni spe ċifika li ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u, meta relevanti, il-propjetajiet fi żikokimiċi; 
— l-identifikazzjoni, inklud in-numru CAS jekk mag ħruf/stabbilit;  
— purità.  
Mezz (jekk applikabbli):  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz, jekk mhux sempli ċement 
ilma.  
Annimali tat-test:  
— speċje u t-tipi u żati; 
— in-numru u l-età ta' l-annimali;  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, etc;  
— il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— ir-raġjonar għal-livell tad-do ża magħżula; 
— dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad- 
dieta, Il-kon ċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omo ġenità 
tal-preparazzjoni;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-kon ċ­
entrazzjoni (ppm) lejn do ża attwali 9mg/kg il-pi ż tal-ġisem/jum), 
jekk applikabbli;  
— kundizzjonijiet ambjentali;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.  
Riżultati:  
Dettalji tar-reazzjoni tossika materna bid-do ża, li tinkludi, imma 
mhux limitata g ħal-: 
— in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali li 
jkunu baqg ħu ħajjin, in-numru ta' nisa tqal, u n-numru ta' aborti, 
in-numru ta' annimali li jweldu kmieni;  
— il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux 
baqgħu ħajjin sakem maqtula;  
— dettalji mill-annimali li ma jkunux baqg ħu ħajjin tal-qtil skedat 
għandu jkun irrapurtat imam mhux inklu ż fil-paraguni statistic ċi 
inter-grupp;  
— il-jum ta' l-osservazzjoni ta' kull sinjal annormali kliniku u l- 
korsa sussegwenti tieg ħu; 
— il-piż tal-ġisem, tibdil fil-pi ż tal-ġisem u l-pi ż ta' l-utru bil- ħobla, 
inkluż, b'mod voluntarju, it-tibdil fil-pi ż tal-ġiesm korre ġut għall- 
piż ta' l-utru bil- ħobla;  
— il-konsum ta' l-ikel u, jekk imkejjel, il-konsum ta' l-ilma;  
— is-sejbiet tan-nekopsija, inklu ż il-piż ta' l-utru;  
— NOAEL valuri g ħall-effetti materni u ta' l-i żvilupp għandhom 
ikunu irraportati.  
L-għanijiet finali ta' l-i żvilupp bid-do ża għal grupp ta' frie ħ bl- 
impjanti, inklu żi: 
— in-numru ta' corpora lutea;  
— in-numru ta' implantazzjonijiet, in-numru u l-persenta ġġ ta' feti 
ħajjin u mejta u r- reassorbazzjonijiet;  
— in-numru l-persenta ġġ ta' telf pre- u post-implantazzjoni.  
L-għanijiet finali ta' l-i żvilupp bid-do ża għal grupp ta' frie ħ b'feti 
ħajjin, inklu żi: 
— in-numru u l-persenta ġġ ta' frieħ ħajjin;  
— relattività tas-sess;  
— il-piż tal-ġisem tal-fetu, preferibbilment bis-sess u bis-sessi 
flimkien;  
— alterazzjonijiet esterni, partijiet rotob, u malformazzjoni skeletali 
u alterazzjoni relevanti o ħrajn; 
— kriterja g ħall-kategorizzazzjoni jekk xierqa;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— in-numru totali u l-persenta ġġ ta' feti u frie ħ b'xi alterazzjoni 
esterna, partijiet rotob jew skeletali, kif ukoll it-tipi u l- 
inċidenzi ta' anomaliji individwali u alterazzjonijiet o ħrajn 
relevanti.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the 
Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark 
Doses for Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399- 
410. 
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386-398.
 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1-8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation 
Developmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und 
Experimentelle Pathologie  247:367.  
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology . D.H.M. 
Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171-173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Tech ­
niquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  Congenital Anomalies  32; 381-391.
 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47:229-242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.
 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of 
Morphology  127:291-306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313-320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9;:398-408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309-316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169-181.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual , pp. 163-173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41; 411-445.
 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61-63.
 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) 
Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313-355.  
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral 
Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratoge ­
nicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Muta ­
genesis  4; 181-188.  
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of 
the Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Tera ­
tology. In  Teratology: Principles and Techniques , Wilson 
J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology , Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung . 28; 233-239.  
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; 37-38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798-63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 
1) Teratology 55; 249-292.'  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  STUDJI DWAR IL-KAR ĊINOĠENIĊITÀ 
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
451 (2009) tal-OECD. It-TG 451 ori ġinali dwar Studji dwar 
il-Karċinoġeniċità kienet adottata fl-1981. L-i żvilupp ta’ dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar B.32 rivedut tqis li kien me ħtieġ biex jirrifletti żviluppi re ċenti 
fil-qasam tat-trattament xieraq tal-annimali u ta’ rekwi żiti regolatorji (2) 
(3) (4) (5) (6). L-a ġġornament ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.32 twettaq 
flimkien ma’ revi żjonijiet tal-Kapitolu B.30 ta’ dan l-Anness: Studji dwar 
tossiċità kronika, u tal-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness: Studji dwar Tossi ċità 
Kronika Kon ġunta\Karċinoġeniċità, u bil-g ħan li jinkiseb tag ħrif 
addizzjonali mill-annimali u żati fl-istudju u li jing ħataw aktar dettalji dwar 
għażla ta’ doża. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.32 huwa mfassal biex jintu ża 
fl-ittestjar ta’ firxa wiesg ħa ta’ kimi ċi, inklużi pestiċidi u kimi ċi industrijali. 
Għandu jkun innotat i żda li xi dettalji u rekwi żiti jistgħu jkunu differenti 
għal farmaċewtiċi (ara l-Gwida SIB tal-Konferenza Internazzjonali g ħall- 
Armonizzazzjoni (ICH) dwar Ittestjar g ħall-Karċinoġeniċità ta’ Farma ċew­
tiċi). 
2. Il-ma ġġoranza tal-istudji dwar il-kar ċinoġeniċità isiru fi spe ċijiet ta’ rodituri, 
u dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa, g ħalhekk, ma ħsub biex japplika prim ­
arjament g ħal studji mag ħmulin f’dawn l-ispe ċijiet. Jekk studji b ħal dawn 
ikunu me ħtieġa fi spe ċijiet ta’ annimali mhux rodituri, il-prin ċipji u 
l-proċeduri li l-profil tag ħhom jinsab f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar flimkien 
ma’ dawk li l-profil tag ħhom jinsab fil-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: 
Studju dwar Tossi ċità Orali f’Annimali Mhux Rodituri ta’ Do ża Ripetuta 
għal 90 jum (6), g ħandhom ikunu applikati, b’modifiki xierqa. Gwida 
ulterjuri hija disponibbli fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 tal-OECD 
dwar it-Tfassil u t-Twettiq ta’ Studji dwar Tossi ċità Kronika u Kar ċinoġe­
niċità (7).  
3. It-tliet rotot ewlenin ta’ amministrazzjoni u żati fi studji dwar 
il-Karċinoġeniċità huma orali, dermali u ta’ inalazzjoni. L-g ħażla tar-rotta 
ta’ amministrazzjoni tiddependi mill-karatteristi ċi fiżiċi u kimiċi tal-kimika 
għall-ittestjar u mir-rotta predominanti ta’ espo żizzjoni umana. Inform ­
azzjoni addizzjonali dwar g ħażla ta’ rotta ta’ espo żizzjoni hija pprovduta 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
4. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jiffoka fuq espo żizzjoni permezz tar-rotta orali, 
ir-rotta li komunement l-aktar li tintu ża fi studji dwar il-kar ċinoġeniċità. 
Filwaqt li studji dwar il-Kar ċinoġeniċità li jinvolvu espo żizzjoni permezz 
tar-rotot dermali u ta’ inalazzjoni jistg ħu wkoll ikunu me ħtieġa għall-valu­
tazzjonijiet tar-riskju g ħas-saħħa tal-bniedem u/jew jistg ħu jkunu rikjesti 
f’ċerti reġimi regolatorji, i ż-żewġ rotot ta’ espo żizzjoni jinvolvu kumplessità 
teknika konsiderevoli. Studji b ħal dawn ikun je ħtiġilhom jitfasslu abba żi ta’ 
każ każ, għalkemm il-Metodu ta’ Ttestjar li l-profil tieg ħu jidher hawn 
għall-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-kar ċinoġeniċità b’amministrazzjoni 
orali jista’ jifforma l-ba żi ta’ protokoll g ħal studji dwar inalazzjoni u/jew 
dermali, fir-rigward ta’ rakkomandazzjonijiet g ħal perjodi ta’ trattament, 
parametri klini ċi u patolo ġiċi, eċċ. Hemm gwida tal-OECD dwar 
l-amministrazzjoni ta’ kimi ċi għall-ittestjar bir-rotot dermali (7) u 
tal-inalazzjoni (7) (8). Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (9) u l-Kapitolu 
B.29 ta’ dan l-Anness (10), flimkien mad-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar ittestjar ta’ inalazzjoni akuta (8), g ħandhom ikunu kkonsultati b’mod 
speċifiku fit-tfassil ta’ studji g ħal tul itwal ta’ żmien li jinvolvu espo żizzjoni 
permezz tar-rotta tal-inalazzjoni. Il-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness (11) 
għandu jkun ikkonsultat fil-ka ż ta’ ttestjar mag ħmul bir-rotta dermali.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. L-istudju tal-kar ċinoġeniċità jipprovdi informazzjoni dwar il-perikli g ħas- 
saħħa li jista’ jkun hemm li x’aktarx jinqalg ħu minn espo żizzjoni ripetuta 
għal perjodu li jdum tul il- ħajja kollha tal-ispe ċi użata. L-istudju g ħandu 
jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti tossi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar, 
inkluża karċinoġeniċità potenzjali, u jista’ jindika organi mmirati u 
l-possibbiltà ta’ akkumulazzjoni. Jista’ jipprovdi stima tal-livell bla effett 
ħażin osservat g ħal effetti tossi ċi u, fil-ka ż ta’ karċinoġeni mhux ġenotossiċi, 
għal risponsi g ħal tumuri, li jistg ħu jintużaw biex ikunu stabbiliti kriterji ta’ 
sikurezza g ħal espożizzjoni umana. Qed issir enfa żi wkoll dwar il- ħtieġa ta’ 
osservazzjonijiet klini ċi sewwa tal-annimali, biex tinkiseb kemm jista’ jkun 
informazzjoni.  
6. L-għanijiet ta’ studji dwar il-kar ċinoġeniċità koperti minn dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar jinkludu:  
— L-identifikazzjoni tal-proprjetajiet kar ċinoġeniċi ta’ kimika g ħall-ittestjar, 
li tirriżulta f’żieda fl-in ċidenza ta’ neopla żmi, żieda fil-proporzjon ta’ 
neoplażmi malinni jew tnaqqis fi ż-żmien għad-dehra ta’ neopla żmi, 
mqabbel ma’ gruppi ta’ kontroll konkurrenti,  
— L-identifikazzjoni ta’ organu/i mmirat(i) ta’ kar ċinoġeniċità; 
— L-identifikazzjoni ta ż-żmien għad-dehra ta’ neopla żmi; 
— Karatterizzazzjoni tar-relazzjoni bejn it-tumur u r-reazzjoni g ħad-doża; 
— L-identifikazzjoni ta’ livell bla effett ħażin osservat (NOAEL) jew punt 
ta’ tluq biex tkun stabbilita Do ża ta’ Riferiment (BMD);  
— Estrapolazzjoni ta’ effetti kar ċinoġeniċi għal livelli ta’ espo żizzjoni 
umana għal doża baxxa;  
— Forniment ta’ dejta biex ikunu ttestjati ipote żijiet dwar modalità ta’ 
azzjoni (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
7. Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni ta’ kar ċinoġeniċità potenzjali ta’ kimika 
għall-ittestjar, l-informazzjoni kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall- 
ittestjar g ħandha titqies mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma jsir l-istudju, 
biex it-tfassil tal-istudju jiffoka fuq l-ittestjar b’aktar effi ċjenza għal 
potenzjal kar ċinoġeniku u biex l-u żu ta’ annimali jkun mill-anqas. Inform ­
azzjoni dwar, u konsiderazzjoni tal-modalità ta’ azzjoni ta’ kar ċinoġenu 
suspettat (2) (7) (12) (13) (14) (15) hija partikolarment importanti, minħabba li l-a ħjar disinn jista’ tkun differenti skont jekk il-kimika g ħall- 
ittestjar tkunx kar ċinoġenu ġenotossiku mag ħruf jew suspettat. Gwida 
ulterjuri dwar konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni tinsab 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).
 
8. Informazzjoni li g ħandha tassisti fit-tifsila tal-istudju tinkludi l-identità, 
l-istruttura tal-kimika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; 
riżultati ta’ kull test tat-tossi ċità in vitro  jew  in vivo , inklużi testijiet ta’ 
ġenotossiċità; użu/ijiet anti ċipat(i) u potenzjal g ħal espożizzjoni umana; 
dejta (Q)SAR disponibbli, muta ġeniċità/ġenotossiċità, karċinoġeniċità u 
dejta tossikolo ġika oħra dwar kimi ċi relatati strutturalment; dejta tossikoki ­
netika disponibbli (do ża waħda u wkoll kinetika ta’ do ża ripetuta meta tkun  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
disponibbli) u dejta derivata minn studji o ħra ripetuti ta’ espo żizzjonijiet. 
Valutazzjoni tal-kar ċinoġeniċità għandha ssir wara li tkun inkisbet inform ­
azzjoni inizjali dwar tossi ċità minn do ża ripetuta g ħal 28 jum u/jew minn 
testijiet ta’ tossi ċità għal 90 jum. Testijiet g ħal żmien qasir ta’ 
bidu-promozzjoni ta’ kan ċer jistgħu wkoll jipprovdu informazzjoni utli. 
Approċċ ta’ ttestjar f’fa żijiet għall- ittestjar tal-kar ċinoġeniċità għandu 
jitqies bħala parti mill-valutazzjoni globali tal-effetti potenzjali ħżiena 
għas-saħħa ta’ kimika partikolari g ħall-ittestjar (16) (17) (18) (19).  
9. Il-metodi ta’ statistika l-aktar adatti g ħall-analiżi ta’ riżultati, meqjusin 
it-tifsila u l-g ħanijiet sperimentali, g ħandhom ikunu stabbiliti qabel ma 
jingħata bidu g ħall-istudju. Kwistjonijiet li g ħandhom jitqiesu jinkludu 
jekk l-istatistika g ħandhiex tinkludi a ġġustament g ħal sopravivenza, anali żi 
ta’ riskji kumulattivi ta’ kan ċer relattiv g ħal kemm iddum is-sopravivenza, 
analiżi taż-żmien għal tumur u anali żi fil-każ ta’ tmiem ħesrem ta’ grupp 
wieħed jew aktar. Gwida dwar l-anali żi xierqa ta’ statistika u referenzi 
ewlenin g ħal metodi ta’ statistika a ċċettati internazzjonalment jing ħataw 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7), u wkoll fid-Dokument ta’ Gwida Nru 35 dwar l-anali żi u l-evalwazzjoni ta’ studji dwar tossi ċità kronika u 
karċinoġeniċità (20).
 
10. Fit-tmexxija ta’ studju tal-kar ċinoġeniċità, il-prin ċipji u l-konsiderazzjonijiet 
ta’ gwida li l-profil tag ħhom jinsab fid-Dokument ta’ Gwida Nru 19 
tal-OECD dwar l-g ħarfien, il-valutazzjoni u l-u żu ta’ sinjali klini ċi bħala 
punti ta’ tmiem b’mod uman g ħal annimali g ħall-esperimenti u żati f’ev­
alwazzjoni tas-sikurezza (21), b’mod partikolari l-paragrafu 62 tieg ħu, 
għandhom ikunu segwiti dejjem. Dan il-paragrafuq jiddikjara li “ Fi studji 
li jinvolvu do żaġġ ripetut, meta annimal juri sinjali klini ċi li huma prog ­
ressivi, u jwasslu g ħal iktar deterjorament fil-kundizzjoni, g ħandha tittie ħed 
deċiżjoni infurmata dwar jekk l-annimal g ħandux jinqatel b’mod uman jew 
le. Id-deċiżjoni għandha tinkludi konsiderazzjoni tal-valur tal-informazzjoni 
li għandha tinkiseb mill-manutenzjoni kontinwata ta’ dak l-annimal 
fl-istudju, relattiv g ħall-kundizzjoni ġenerali tieg ħu. Jekk tittie ħed deċiżjoni 
biex l-annimal jibqa fit-test, il-frekwenza tal-osservazzjonijiet g ħandha 
tiżdied, skont il-b żonn. Jista’ jkun possibbli wkoll, ming ħajr ma jaffettwa 
b’mod avvers l-iskop tat-test, li d-do żaġġ jieqaf temporanjament jekk dan ħa 
jtaffi l-uġigħ jew l-iskumdità, jew li tonqos id-do ża tat-test. ” 
11. Gwida dettaljata u diskussjoni dwar il-prin ċipji ta’ g ħażla ta’ do ża għal 
studji dwar tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità tinsab fi Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 (7), kif ukoll f’ żewġ pubblikazzjonijiet tal-Internazzjonali 
Life Sciences Institute (22) (23). L-istrate ġija bażika tal-għażla tad-doża tkun 
tiddependi mill-g ħan jew g ħanijiet primarji tal-istudju (il-paragrafu 6). 
Fl-għażla ta’ livelli xierqa ta’ do ża, għandu jinkiseb bilan ċ bejn tgħarbil 
ta’ perikli min na ħa waħda u karatterizzazzjoni ta’ risponsi g ħal dożi 
baxxi u r-rilevanza tag ħhom minn na ħa oħra. Dan huwa partikolarment 
rilevanti fis-sitwazzjoni fejn ikollu jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika 
u karċinoġeniċità (il-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness) (paragrafu 12).  
12. Għandha ting ħata konsiderazzjoni li jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika 
u karċinoġeniċità (il-Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness) milli e żekuzzjoni 
separata ta’ studju dwar tossi ċità kronika (il-Kapitolu B.30 ta’ dan 
l-Anness) u studju tal-kar ċinoġeniċità (dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.32). 
It-test kon ġunt jipprovdi aktar effi ċjenza fir-rigward ta’ ħin u spejje ż 
imqabblin ma’ meta jsiru żewġ studji separati, ming ħajr ħsara għall- 
kwalità tad-dejta fil-fa żi kronika jew fil-fa żi ta’ kar ċinoġeniċità. Iżda 
għandhom jitqiesu sewwa l-prin ċipji ta’ g ħażla ta’ do ża (paragrafi 11 u 
22-25) meta jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità (il- 
Kapitolu B.33 ta’ dan l-Anness), u huwa rikonoxxut ukoll li jistg ħu jkunu 
meħtieġa studji separati f’ ċerti oqfsa regolatorji.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar jinsabu 
fl-aħħar ta’ dan il-kapitolu u fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
14. Il-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata kuljum f’do żi gradwati lil diversi 
gruppi ta’ annimali tat-test g ħall-parti l-kbira tal- ħajja kollha tag ħhom, 
normalment bir-rotta orali. Ittestjar bl-inalazzjoni jew bir-rotta dermali 
jista’ wkoll ikun adattat. L-annimali jkunu osservati mill-qrib g ħal sinjali 
ta’ tossiċità u għall-iżvilupp ta’ le żjonijiet neoplasti ċi. L-annimali li jmutu 
jew li jinqatlu matul it-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali 
li jkunu baqg ħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom awtopsja.  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ spe ċi tal-annimal  
15. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar primarjament ikopri l-valutazzjoni u 
l-evalwazzjoni ta’ kar ċinoġeniċità f’rodituri (paragrafu 2). L-u żu ta’ 
speċijiet ta’ annimali mhux rodituri jista’ jitqies meta dejta disponibbli 
tissuġġerixxi li jkunu aktar rilevanti g ħat-tbassir ta’ effetti ta’ sa ħħa 
fil-bnedmin. L-g ħażla ta’ spe ċi għandha tkun i ġġustifikata. L-ispe ċi ppre­
feruta ta’ rodituri huwa l-far, g ħalkemm jistg ħu jintużaw speċijiet oħra ta’ 
rodituri, e ż. il-ġurdien. G ħalkemm l-u żu tal-ġurdien f’ittestjar 
tal-karċinoġeniċità jista’ jkollu utilità limitata (24) (25) (26), skont xi 
programmi regolatorji pre żenti l-ittestjar tal-kar ċinoġeniċità fil-ġurdien 
għadu meħtieġ sakemm ma jkunx de ċiż li studju b ħal dan ma jkunx 
meħtieġ xjentifikament. Firien u ġrieden kienu l-mudelli ppreferuti g ħall- 
esperimenti min ħabba l-ħajja relattivament qasira tag ħhom, l-użu kbir li jsir 
minnhom fi studji farmakolo ġiċi u tossikolo ġiċi, is-suxxettibbiltà tag ħhom 
għal induzzjoni ta’ tumur u li minnhom hemm razez karatterizzati bi żżejjed. 
Bħala konsegwenza ta’ dawn il-karatteristi ċi, hemm ammont kbir ta’ inform ­
azzjoni dwar il-fi żjoloġija u l-patolo ġija tagħhom. Informazzjoni 
addizzjonali dwar g ħażla ta’ spe ċi u razza hija pprovduta fid-Dokument 
ta’ Gwida Nru 116 (7).  
16. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li 
komunement jintu żaw fil-laboratorju. L-istudju tal-kar ċinoġeniċità għandu 
preferibbilment isir f’annimali mill-istess razza u sors b ħal dawk u żati fi 
studju/i preliminari dwar tossi ċità li jdum(u) anqas, g ħalkemm jekk annimali 
minn din ir-razza u sors ikunu mag ħrufa li jippre żentaw problemi biex 
jinkisbu l-kriterji normalment a ċċettati ta’ sopravivenza g ħal studji fit-tul 
[ara d-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7)], g ħandha ting ħata konsiderazzjoni 
għall-użu ta’ razza ta’ annimal li jkollha rata a ċċettabbli ta’ sopravivenza 
għall-istudju fit-tul. In-nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx 
ikunu tqal.  
Abitazzjoni u g ħalf 
17. L-annimali jistg ħu jitqiedu jabitaw individwalment, jew jitqieg ħdu f’gaġeġ fi 
gruppi żgħar tal-istess sess; abitazzjoni g ħal kull annimal wa ħdu għandha 
titqies biss jekk dan ikun ġustifikat xjentifikament (27) (28) (29). Ga ġeġ 
għandhom ikunu rran ġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti li jista’ jkun 
hemm min ħabba t-tqeg ħid ta’ gaġeġ. It-temperatura fil-kamra tal-esperimenti 
tal-annimali g ħandha tkun 22 °C (± 3 °C). G ħalkemm l-umdità relattiva 
għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma taqbi żx 70 % 
minbarra matul il- ħasil tal-kamra, il-mira g ħandha tkun ta’ 50-60 %. 
Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl, 
12-il sieg ħa dlam. Dwar g ħalf, jistg ħu jintużaw dieti konvenzjonali 
tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. Id-dieta g ħandha 
tissodisfa l- ħtiġijiet nutrizzjonali kollha tal-ispe ċi ttestjata u l-kontenut ta’ 
kontaminanti tad-dieta, inklu żi iżda mhux limitatament g ħal residwi ta’  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
pestiċidi, sustanzi organi ċi niġġiesa persistenti, fitoestro ġeni, metalli tqal u 
mikotossini, li jistg ħu jinfluwenzaw ir-ri żultat tat-test, g ħandu jkun baxx 
kemm jista’ jkun. Informazzjoni analitika dwar il-livelli ta’ kontaminanti tan-nutrijent u tad-dieta g ħandha tkun i ġġenerata perjodikament, mill-anqas 
fil-bidu tal-istudju u meta jkun hemm bidla fil-lott u żat, u għandha tkun 
inkluża fir-rapport finali. Bl-istess mod g ħandha tkun ipprovduta inform ­
azzjoni analitika dwar l-ilma tax-xorb u żat fl-istudju. L-g ħażla ta’ dieta 
tista’ tkun influwenzata mill- ħtieġa li tkun żgurata ta ħlita adattata ta’ 
kimika g ħall-ittestjar u biex ikunu sodisfatti l- ħtiġijiet nutrizzjonli 
tal-annimali meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata permezz 
tar-rotta tad-dieta.
 
Preparazzjoni tal-annimali  
18. Għandhom jintu żaw annimali f’sa ħħithom, li jkunu ġew akklimatizzati g ħal 
kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mill-anqas 7 ijiem li ma kinux so ġġetti 
għal proċeduri sperimentali qabel. Fil-ka ż ta’ rodituri, id-do żaġġ tal-annimali 
għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara ftim u akklimatazzjoni u prefer ­
ibbilment qabel mal-annimali jkun g ħandhom 8 ġimgħat. L-annimali tat-test 
għandhom ikunu kkaratterizzati fir-rigward ta’ spe ċi, razza, sors, sess, pi ż u 
età. Malli jinbeda l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż għal kull sess ta’ annimal 
użat għandha tkun minimali u ma taqbi żx ± 20 % tal-pi ż medju tal-annimali 
kollha fl-istudju, separatament g ħal kull sess. L-annimali g ħandhom ikunu 
assenjati b’mod ka żwali lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. Wara 
l-każwalità, m’g ħandux ikun hemm differenzi sinifikanti fil-pi żijiet medji 
tal-ġisem bejn gruppi f’kull sess. Jekk ikun hemm differenzi sinifikanti ta’ 
statistika, f’dak il-ka ż il-proċedura ta’ ka żwalità għandha tkun ripetuta, jekk 
ikun possibbli. Kull annimal g ħandu jkun assenjat numru ta’ identifikazzjoni 
uniku, u jkun immarkat b’mod permanenti b’dan in-numru b’tatù, b’impjant 
ta’ mikro ċipp jew b’metodu ie ħor adattat.  
PROĊEDURA  
Għadd u sess tal-annimali  
19. Għandhom jintu żaw iż-żewġ sessi. G ħandu jintu ża għadd suffi ċjenti ta’ 
annimali biex evalwazzjoni bijolo ġika u ta’ statistika bir-reqqa tkun 
possibbli. Kull grupp ta’ do ża u grupp ta’ kontroll konkurrenti g ħandhom, 
għalhekk, ikun fihom mill-anqas 50 annimal ta ż-żewġ sessi. Skont x’ikun 
l-għan tal-istudju, jista’ jkun possibbli li ti żdied il-qawwa ta’ statistika 
tal-istimi ewlenin billi annimali jkunu allokati b’mod differenzjali u mhux indaqs fil-gruppi varji ta’ do ża, b’aktar minn 50 annimal fil-gruppi ta’ do ża 
baxxa; eż. biex ikun stmat il-potenzjal kar ċinoġeniku f’do żi baxxi. I żda 
għandu jkun irrikonoxxut li żieda moderata fid-daqs ta’ grupp g ħandha 
tipprovdi relattivament ftit żieda fil-qawwa ta’ statistika tal-istudju. Aktar 
informazzjoni dwar tfassil ta’ statistika tal-istudju u g ħażla ta’ livelli ta’ do ża 
biex jintla ħaq il-massimu tal-qawwa ta’ statistika hija pprovduta 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).
 
Provvediment g ħal qatliet interim u gruppi satellitarji (sentinelli)  
20. L-istudju jista’ jipprovdi g ħal qatliet interim, e ż. fit-12-il xahar, biex jag ħti 
informazzjoni dwar il-progressjoni ta’ bidliet neoplasti ċi u informazzjoni 
mekkanistika, jekk dan ikun ġustifikat xjentifikament. Fejn di ġà jkun 
hemm informazzjoni b ħal din mill-istudji pre ċedenti ta’ tossi ċità ta’ do ża 
ripetuta dwar il-kimika g ħall-ittestjar, qatliet interim jistg ħu ma jkunux xjen ­
tifikament ġustifikati. Jekk qatliet interim ikunu inklu żi fit-tifsila tal-istudju, 
l-għadd ta’ annimali f’kull grupp ta’ do ża skedat g ħal qatla interim norm ­
alment ikun ta’ 10 annimali g ħal kull sess, u l-g ħadd totali ta’ annimali 
inklużi fit-tifsila tal-istudju g ħandu jiżdied bl-g ħadd skedat ta’ annimali li 
jkollhom jinqatlu qabel ma jitlesta l-istudju. Jista’ wkoll ikun inklu ż grupp 
addizzjonali ta’ annimali sentinelli (tipikament 5 annimali g ħal kull sess) 
għall-monitora ġġ tal-istatus ta’ mard, jekk ikun me ħtieġ, matul l-istudju 
(30). Gwida ulterjuri hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Gruppi ta’ do żi u dożaġġ 
21. Gwida dwar l-aspetti kollha ta’ g ħażla ta’ doża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża 
hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7). Mill-anqas g ħandhom 
jintużaw tliet livelli ta’ do ża u kontroll konkurrenti. Il-livelli ta’ do ża 
ġeneralment ikunu bba żati fuq ir-ri żultati ta’ studji aqsar dwar do ża 
ripetuta jew fuq tiftix ta’ firxa u g ħandhom iqiesu kull dejta tossikolo ġika 
u tossikokinetika e żistenti disponibbli g ħall-kimika g ħall-ittestjar jew g ħal 
kimiċi relatati.  
22. Sakemm ma jkunx limitat min-natura jew mill-effetti bijolo ġiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, g ħandu jintg ħażel l-ogħla livell ta’ do ża biex ikunu iden ­
tifikati l-organi prin ċipali u l-effetti tossi ċi filwaqt li jkunu evitati tbatija, 
tossiċità severa, morbidità jew mewt. Filwaqt li jitqiesu l-fatturi li l-profil 
tagħhom jinsab fil-paragrafu 23 hawn ta ħt, normalment g ħandu jintg ħażel 
l-ogħla livell ta’ do ża biex jislet evidenza ta’ tossi ċità, kif ikun jidher, 
pereżempju, minn tnaqqis fi ż-żieda fil-pi ż tal-ġisem (madwar 10 %). I żda, 
skont x’ikunu l-g ħanijiet tal-istudju (ara l-paragrafu 6), tista’  tintgħażel 
l-ogħla doża anqas mid-do ża li tipprovdi evidenza ta’ tossi ċità, eż. jekk 
doża tislet effett avvers ta’ t ħassib iżda li madankollu jkollha ftit impatt 
fuq il-ħajja jew il-pi ż tal-ġisem.  
23. Jistg ħu jintgħażlu livelli ta’ do ża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża biex ikunu 
stabbiliti do ża-rispons u, skont il-modalità ta’ azzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar, NOAEL jew ri żultat maħsub ieħor tal-istudju, e ż. BMD (ara 
l-paragrafu 25) fil-livell ta’ do ża l-aktar baxx. Fatturi li g ħandhom jitqiesu 
fl-għoti ta’ do żi aktar baxxi jinkludu l-angolu mistenni tal-kurva ta’ do ża- 
rispons, id-do żi li fihom jistg ħu jseħħu bidliet importanti fil-metaboli żmu 
jew il-modalità ta’ azzjoni tossika, fejn ikun mistenni limitu, jew fejn ikun mistenni punt ta’ tluq g ħal estrapolazzjoni ta’ do ża baxxa.
 
24. L-ispazjar mag ħżul ta’ livelli ta’ do ża jkun jiddependi mill-karatteristi ċi 
tal-kimika g ħall-ittestjar, u ma jistax ikun preskritt f’dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar, i żda intervalli ta’ darbtejn jew erba’ darbiet ta’ spiss jipprovdu 
prestazzjoni tajba ta’ test biex ikunu stabbiliti l-livelli minn fuq g ħal isfel 
ta’ dożi, u ż-żieda tar-raba’ grupp ta’ test sikwit hija preferibbli mill-u żu ta’ 
intervalli twal ħafna (eż. aktar minn fattur ta’ madwar 6-10) bejn do żaġġi. 
B’mod ġenerali, l-u żu ta’ fatturi akbar minn 10 g ħandu jkun evitat, u 
għandu jkun i ġġustifikata jekk ikun applikat.  
25. Kif diskuss ulterjorment fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7), punti li 
għandhom jitqiesu fl-g ħażla ta’ doża jinkludu:  
— Nonlinearitajiet mag ħrufin jew suspettati jew punti ta’ infezzjoni 
fid-doża-rispons;  
— Tossikokinetika u firxa ta’ do żi fejn induzzjoni metabolika, saturazzjoni 
jew nonlinearità bejn do żi esterni u interni jse ħħu jew ma jse ħħux; 
— Leżjonijiet prekursuri, markaturi ta’ effett jew indikaturi tal-operazzjoni 
ta’ proċessi bijolo ġiċi ewlenin sottostanti;  
— Aspetti ewlenin (jew suspettati) ta’ modalità ta’ azzjoni, b ħal dożi li 
fihom tibda tfaqqa’ ċ-ċitotossiċità, livelli ta’ ormoni jit ħawdu, 
mekkaniżmi omeostati ċi jintgħelbu, eċċ; ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— Reġjuni tal-kurva ta’ do ża-rispons fejn tkun me ħtieġa stima partikol ­
arment robusta, e ż. fil-firxa tal-BMD anti ċipata jew limitu suspettat;  
— Konsiderazzjoni ta’ livelli anti ċipati ta’ espo żizzjoni umana.  
26. Il-grupp ta’ kontroll g ħandu jkun grupp mhux ittrattat jew grupp ta’ kontroll 
ta’ vejjikoli jekk jintu ża vejjikolu biex tkun amministrata kimika g ħall- 
ittestjar. Ħlief għal trattament bil-kimika g ħall-ittestjar, annimali fil-grupp 
ta’ kontroll g ħandhom ikunu mani ġġati b’mod identiku b ħal dawk 
fil-gruppi tat-test. Jekk jintu ża vejjikolu, il-grupp ta’ kontroll g ħandu 
jirċievi l-vejjikolu fl-og ħla volum u żat fost il-gruppi ta’ do ża. Jekk kimika 
għall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, u tikkaw ża li jittieħed anqas ikel 
tad-dieta b’mod sinifikanti min ħabba dieta b’anqas palat, grupp ta’ kontroll 
addizzjonali ta’ tmig ħ lil pari jista’ jkun utli biex iservi ta’ kontroll aktar 
adattat.  
Preparazzjoni ta’ do żi u amministrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar  
27. Il-kimika g ħall-ittestjar normalment tkun amministrata oralment, permezz 
tad-dieta jew ilma tax-xorb, jew b’gavage. Informazzjoni addizzjonali 
dwar rotot u metodi ta’ amministrazzjoni hija pprovduta fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 (7). Ir-rotta u l-metodu ta’ amministrazzjoni jkunu jiddependi mill-g ħan tal-istudju, il-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, mid-disponibbiltà bijolo ġika tagħha u mill-metodu ta’ 
espożizzjoni umana. G ħandu jkun ipprovdut motiv g ħar-rotta mag ħżula u 
għall-metodu ta’ amministrazzjoni. Fl-interess ta’ trattament xieraq 
tal-annimali, gavage orali g ħandu normalment jintg ħażel biss g ħal dawk 
l-aġenti, li g ħalihom din ir-rotta u l-metodu ta’ amministrazzjoni ra ġone­
volment jirrappre żentaw espo żizzjoni potenzjali umana (e ż. farmaċewtiċi). 
Għal kimiċi ta’ dieta jew ambjentali inklu żi pestiċidi, l-amministrazzjoni 
tipikament issir permezz tad-dieta jew b’ilma tax-xorb. I żda, għal xi 
xenarji, e ż. espożizzjoni okkupazzjonali, amministrazzjoni permezz ta’ 
rotot oħra tista’ tkun aktar adattata.
 
28. Meta jkun me ħtieġ, il-kimika g ħall-ittestjar tin ħall jew ti ġi sospiża f’vej­
jikolu adattat. G ħandhom jitqiesu l-karatteristi ċi li ġejjin tal-vejjikolu u 
addittivi o ħra, kif jixraq: effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-metaboli żmu, jew ir-ritenzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; effetti fuq 
il-proprjetajiet kimi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar li jistg ħu jibdlu 
l-karatteristi ċi tossiċi tagħha; u effetti fuq l-ikel jew fuq il-konsum tal-ilma 
jew fuq l-istat nutrizzjonali tal-annimali. Huwa rrakkomandat li, kull meta 
jkun possibbli, l-ewwel jitqies l-u żu ta’ soluzzjoni fl-ilma/sospensjoni, u 
wara titqies soluzzjoni/emulsjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħa) u mbag ħad 
possibbilment b’soluzzjoni f’vejjikoli o ħra. Għal vejjikoli o ħra minbarra 
ilma, il-karatteristi ċi tossiċi tal-vejjikolu g ħandhom ikunu mag ħrufa. 
Għandha tkun disponibbli informazzjoni dwar l-istabbiltà tal-kimika g ħall- 
ittestjar u l-omo ġeneità ta’ soluzzjonijiet ta’ do żaġġ jew dieti (kif jixraq) 
skont il-kundizzjonijiet ta’ amministrazzjoni (e ż. dieta).  
29. Għall-kimiċi amministrati permezz tad-dieta jew l-ilma tax-xorb, huwa 
importanti jkun żgurat li l-kwantitajiet tal-kimika g ħall-ittestjar involuta 
ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilan ċ tal-ilma. Fi studji fit-tul 
dwar tossi ċità bl-użu ta’ amministrazzjoni ta’ dieta, il-kon ċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fl-g ħalf m’għandhiex tkun aktar ‘il fuq mil-limitu 
ta’ 5 % tad-dieta totali, biex ikunu evitati żbilanċi nutrizzjonali. Meta 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, jistg ħu jintużaw jew 
konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta (mg/kg dieta jew ppm) jew livell 
wieħed kostanti ta’ do ża skont il-pi ż tal-ġisem tal-annimal (mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem), ikkalkulat kull ġimgħa. L-alternattiva u żata għandha tkun spe ċ­
ifikata.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Fil-ka ż ta’ amministrazzjoni orali, l-annimali jing ħataw doża bil-kimika 
għall-ittestjar kuljum (sebat ijiem fil- ġimgħa), normalment g ħal perjodu ta’ 
24 xahar g ħal rodituri (ara wkoll il-paragrafu 32). Kull re ġim ieħor ta’ 
dożaġġ, eż. ħamest ijiem fil- ġimgħa, jeħtieġlu jkun iġġustifikat. Fil-ka ż ta’ 
amministrazzjoni dermali, annimali jkunu normalment ittrattati bil-kimika 
għall-ittestjar g ħal mill-anqas 6 sig ħat kuljum, 7 ijiem fil- ġimgħa, kif spe ċ­
ifikat fil-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness (11), g ħal perjodu ta’ 24 xahar. 
Espożizzjoni bir-rotta tal-inalazzjoni ssir g ħal 6 sigħat kuljum, 7 ijiem 
fil-ġimgħa, iżda tista’ tintu ża wkoll espo żizzjoni għal 5 ijiem fil- ġimgħa, 
jekk dan ikun ġustifikat. Il-perjodu ta’ espo żizzjoni jkun normalment g ħal 
perjodu ta’ 24 xahar. Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra l-firien ikunu 
esposti mill-imnie ħer biss, il-perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu 
jkunu aġġustati biex titnaqqas id-diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. 
Għandu jkun ipprovdut motiv meta tintu ża espożizzjoni li ddum anqas minn 
6 sigħat kuljum. Ara wkoll il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (9).  
31. Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata b’gavage lill-annimali, dan 
għandu jsir billi jintu ża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni 
adattat, f’ ħinijiet simili kull jum. Normalment tkun amministrata do ża 
waħda darba kuljum; fejn pere żempju kimika tkun irritant lokali, jista’ 
jkun possibbli li tin żamm ir-rata ta’ do ża kuljum billi din tkun amministrata 
bħala doża maqsuma (darbtejn kuljum). Il-volum massimu ta’ likwidu li 
jkun jista’ ji ġi amministrat f’waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs 
tal-annimal tat-test. Il-volum g ħandu jinżamm baxx daqs kemm ikun prattik ­
abbli, u normalment m’g ħandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-pi ż 
tal-ġisem għal rodituri (31). Il-varjabbiltà fil-volum tat-test g ħandha tkun 
imminimizzata billi l-kon ċentrazzjoni tkun a ġġustata biex ikun żgurat 
volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. Kimiċi li jistgħu jkunu korru żivi 
jew irritanti jkunu l-e ċċezzjoni, u jkun je ħtiġilhom jiġu dilwiti biex ikunu 
evitati effetti lokali severi. Ittestjar f’kon ċentrazzjonijiet li x’aktarx ikunu 
korrużivi jew irritanti g ħas-sistema gastrointestinali g ħandu jkun evitat.  
Durata tal-istudju  
32. Studju normalment idum 24 xahar g ħal rodituri, li jirrappre żenta 
l-maġġoranza tal- ħajja kollha normali tal-annimali li g ħandhom jintu żaw. 
Jistgħu jintużaw studji aqsar jew itwal, skont it-tul tal- ħajja tar-razza 
tal-ispeċijiet ta’ annimali fl-istudju, i żda għandhom ikunu ġġustifikati. 
Għal razez spe ċifiċi ta’ ġrieden, eż. AKR/J, C3H/J jew C57BL/6J durata 
ta’ 18-il xahar tista’ tkun aktar adattata. Dan li ġej jipprovdi xi gwida dwar 
durata, tmiem tal-istudju u sopravivenza; gwida ulterjuri, inklu ża konsider ­
azzjoni ta’ a ċċettabbiltà ta’ kar ċinoġeniċità negattiva relattiva g ħal 
sopravivenza fl-istudju, hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 
tal-OECD dwar it-Tfassil u t-Twettiq ta’ Studji dwar Tossi ċità Kronika u 
Karċinoġeniċità (7).  
— It-tmiem tal-istudju g ħandu jitqies meta l-g ħadd ta’ superstiti fil-gruppi 
ta’ doża aktar baxxa jew fil-grupp ta’ kontroll jin żel taħt il-25 fil-mija.  
— Fil-ka ż fejn il-grupp ta’ do ża għolja biss imut ħesrem min ħabba tossi ċità, 
dan m’għandux jikkaw ża t-tmiem tal-istudju.  
— Is-sopravivenza ta’ kull sess g ħandha titqies separatament.  
— L-istudju m’g ħandux ikun esti ż lil hinn mill-punt meta d-dejta 
disponibbli mill-istudju ma tkunx aktar suffi ċjenti biex tkun tista’ ssir 
evalwazzjoni valida statistikament.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OSSERVAZZJONIJIET  
33. L-annimali kollha g ħandhom ikunu e żaminati g ħall-morbidità jew g ħall- 
mortalità, is-soltu fil-bidu u fit-tmiem ta’ kull jum, inklu żi fi tmiem 
il-ġimgħa u l-btajjel. L-annimali g ħandhom addizzjonalment ikunu 
eżaminati darba kuljum g ħal sinjali spe ċifiċi ta’ rilevanza tossikolo ġika, 
filwaqt li jitqies il-perjodu massimu ta’ effetti anti ċipati wara do żaġġ 
fil-każ ta’ amministrazzjoni b’gavage. G ħandha ting ħata attenzjoni 
partikulari lil żvilupp ta’ tumuri; u g ħandu jiġi rreġistrat iż-żmien meta 
jfaqqgħu tumuri, post, dimensjonijiet, dehra u progressjoni ta’ kull tumur 
li jkun jidher sewwa u jista’ jintmess.  
Piż tal-ġisem, konsum ta’ ikel/ilma u effi ċjenza fl-ikel  
34. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu meta jibda t-trattament, mill-anqas 
darba fil- ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-kejlijiet ta’ konsum ta’ ikel u ta’ effi ċjenza fl-ikel 
għandhom isiru mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u 
mill-anqas kull xahar minn hemm ‘il quddiem. Il-konsum tal-ilma g ħandu 
jitkejjel mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 
xahar minn hemm ‘il quddiem meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun ammin ­
istrata f’ilma tax-xorb. G ħandhom jitqiesu wkoll kejlijiet tal-konsum 
tal-ilma g ħal studji li fihom l-attività tax-xorb tinbidel.  
Ematoloġija, bijokimika klinika u kejlijiet o ħra 
35. Biex jintla ħaq il-massimu tal-informazzjoni miksuba mill-istudju, spe ċ­
jalment g ħal konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni, ikunu jistg ħu 
jittieħdu kampjuni tad-demm g ħal ematolo ġija u bijokimika klinika, u dan 
fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju. Anali żi tal-awrina jista’ wkoll ikun 
adattat. Gwida ulterjuri dwar il-valur ta’ te ħid ta’ kampjuni b ħal dawn b ħala 
parti minn studju tal-kar ċinoġeniċità hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida 
Nru 116 (7). Jekk jitqies li jkun adattat, te ħid ta’ kampjuni tad-demm g ħal 
determinazzjonijiet ematolo ġiċi u ta’ kimika klinika u g ħal analiżi tal-awrina 
jistgħu jsiru b ħala parti minn qatla interim (paragrafu 20) u fi tmiem 
l-istudju fuq minimu ta’ 10 annimali g ħal kull sess g ħal kull grupp. 
Għandhom jittie ħdu kampjuni tad-demm minn sit imsemmi, pere żempju 
b’titqib kardijaku jew mis-sinus retroorbitali b’anestesija, u jin ħażnu, jekk 
applikabbli, f’kundizzjonijiet xierqa. Jistg ħu wkoll ikunu ppreparati ti ċpisiet 
għal eżami, partikolarment jekk ikun jidher li l-mudullun tal-g ħadam ikun 
l-organu mmirat, g ħalkemm il-valur ta’ e żami bħal dan għall-valutazzjoni ta’ 
potenzjal kar ċinoġeniku/onko ġeniku huwa dubju ż (32).  
PATOLO ĠIJA 
Awtopsja makroskopika  
36. L-annimali kollha fl-istudju ħlief annimali sentinelli (ara l-paragrafu 20) u 
annimali satellitarji o ħra għandhom ikunu sso ġġettati għall-awtopsja makros ­
kopika sħiħa u dettaljata li tkun tinkludi e żami bir-reqqa tal-wi ċċ estern 
tal-ġisem, tal-fet ħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, tora ċiċi u abdominali u 
tal-kontenuti tag ħhom. L-annimali sentinelli u annimali satellitarji o ħra jista’ 
jkun jeħtiġilhom awtopsja abba żi ta’ każ każ, fid-diskrezzjoni tad-direttur 
tal-istudju. Pi żijiet ta’ organi ma jkunux normalment parti minn studju 
karċinoġenesi, min ħabba li bidliet ġerjatriċi u, fi stadji ta’ wara, l-i żvilupp 
ta’ tumuri t ħawwad l-utilità ta’ dejta dwar pi żijiet ta’ organi. Huma jistg ħu, 
iżda, ikunu importanti biex jittie ħed piż ta’ valutazzjoni ta’ evidenza u 
speċjalment g ħal konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni. Jekk ma 
jkunux parti minn studju satellitarju, huma g ħandhom jin ġabru mhux aktar 
tard minn sena wara l-bidu tal-istudju.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu ppreservati fil-midjum ta’ fissazzjoni 
l-aktar adattat kemm g ħat-tip ta’ tessut, kif ukoll g ħall-eżami istopatolo ġiku 
maħsub sussegwentement (33) (tessuti f’parente żi kwadri huma fakultattivi): 
il-leżjonijiet kbar kollha qalb frixa stonku (il-parti quddimija 
tal-istonku, stonku glan ­
dolari) 
glandola adrenali ileu glandola tal-paratirojde [snien] 
aorta jejunum nerv periferali testikoli 
moħħ (inklużi taqsimiet ta ċ- 
ċerebru, ċervellett, u 
medulla/me żoċefalu) kliewi pitwitarja timu 
il-musrana l-g ħamja glandola tad-dmug ħ 
(straorbitali) prostata tirojde 
ċerviċi fwied il-musrana d-dritta [lsien] 
glandola tal-koagulazzjoni pulmun glandola tal-b żieq trakea 
il-musrana l- ħoxna nodi limfati ċi (kemm 
superfiċjali kif ukoll 
fondi) bużżieqa seminali bu żżieqa tal-awrina 
duwodenu glandola mammarja 
(bilfors g ħan-nisa u, 
jekk dissettabbli b’mod 
viżibbli, għall-irġiel) muskolu skeletali utru (inklu ż ċerviċi) 
epididymis [sistema respiratorja ta’ 
fuq, inklu żi mnieħer, 
turbinati u sinus paranażali] ġilda [ureteru] 
għajn (inklu ża r-retina) esofagu nerv vertebrali (fi tlett 
livelli: ċervikali, 
midtoraċiku u lumbari) [uretra] 
[wirk bl-g ħaksa] [basla tax-xamm] milsa va ġina 
bużżieqa tal-marrara (g ħal 
speċijiet minbarra l-far) ovarju [sternu], taqsima tal-mudullun 
tal-għadam u/jew aspirat 
frisk tal-mudullun 
tal-għadam 
Glandola ta’ Harder  
Fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi g ħandhom 
ikunu ppreservati. Is-sejbiet klini ċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li 
jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. G ħandu wkoll ikun ippreservat kull 
organu li x’aktarx ikun meqjus b ħala organu mmirat abba żi 
tal-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall-ittestjar. Fi studji li jinvolvu 
r-rotta dermali ta’ amministrazzjoni, il-lista ta’ organi kif stabbilita g ħar- 
rotta orali g ħandhom ikunu ppreservati, u t-te ħid ta’ kampjuni spe ċifiċi u 
l-preservazzjoni tal- ġilda mis-sit ta’ applikazzjoni huma essenzjali. Fi studji 
ta’ inalazzjoni, il-lista ta’ tessuti ppreservati u e żaminati mis-sistema respi ­
ratorja għandha ssegwi r-rakkomandazzjonijiet tal-Kapitoli B.8 u B.29 ta’ 
dan l-Anness. G ħal organi/tessuti o ħra (u b’żieda mat-tessuti ppreservati 
speċifikatament mis-sistema respiratorja) il-lista ta’ organi kif stabbilita 
għar-rotta orali g ħandha tkun e żaminata.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Istopatolo ġija 
38. Hija disponibbli gwida dwar l-a ħjar prattiki fit-tmexxija ta’ studji dwar 
patoloġija tossikolo ġika (33). Il-minimu ta’ tessuti e żaminati g ħandu jkun:  
— It-tessuti kollha mill-gruppi ta’ do ża għolja u ta’ kontroll;  
— It-tessuti kollha ta’ annimali qed imutu jew li jkunu nqatlu matul 
l-istudju;  
— It-tessuti kollha li juru anormalitajiet makroskopi ċi inklużi tumuri;  
— Meta bidliet istopatolo ġiċi relatati ma’ trattament ikunu osservati 
fil-grupp ta’ do ża għolja, dawk l-istess tessuti g ħandhom ikunu 
eżaminati mill-annimali kollha fil-gruppi l-o ħra kollha ta’ do ża; 
— Fil-ka ż ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi 
għandhom ikunu ppreservati.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
39. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwalment g ħall- 
parametri kollha evalwati. Addizzjonalment, id-dejta kollha g ħandha 
tinġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp tat-test l-g ħadd 
ta’ annimali fil-bidu tat-test, l-g ħadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta 
matul it-test jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani u l- ħin ta’ kull 
mewta jew qatla b’mod uman, l-g ħadd ta’ annimali li juru sinjali ta’ 
tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, inklu ż iż-żmien 
meta jibdew ifaqqg ħu, durata u severità ta’ kull effett tossiku, l-g ħadd ta’ 
annimali li juru le żjonijiet, it-tip ta’ le żjonijiet u l-per ċentwali tal-annimali li 
juru kull tip ta’ le żjoni. Tabelli ta’ sommarji ta’ dejta g ħandhom jipprovdu 
l-mezzi u d-devjazzjonijiet standard (g ħal dejta ta’ test kontinwu) ta’ 
annimali li juru effetti tossi ċi jew le żjonijiet, minbarra l-gradazzjoni 
tal-leżjonijiet.  
40. Dejta storika ta’ kontroll tista’ tkun siewja fl-interpretazzjoni tar-ri żultati 
tal-istudju, e ż. fil-każ meta jkun hemm indikazzjonijiet li d-dejta 
pprovduta mill-kontrolli konkurrenti tkun sostanzjalment diversa meta mqabbla ma’ dejta re ċenti minn annimali ta’ kontroll mill-istess fa ċilità/ 
kolonja tat-test. Dejta storika ta’ kontroll, jekk tkun evalwata, g ħandha 
tkun sottomessa mill-istess laboratorju u tkun tirrelata ma’ annimali 
tal-istess età u razza ġġenerati matul il- ħames snin li jkunu ġew qabel 
l-istudju inkwistjoni.
 
41. Meta jkunu applikabbli, ir-ri żultati numeri ċi għandhom ikunu evalwati 
b’metodu ta’ statistika ġeneralment a ċċettabbli u adattat. Il-metodi ta’ stat ­
istika u d-dejta li jkollha ti ġi analizzata g ħandhom jintg ħażlu matul it-tfassil 
tal-istudju (il-paragrafu 9). L-g ħażla għandha tipprovdi g ħal aġġustamenti ta’ 
sopravivenza, jekk ikun me ħtieġ. 
Rapport tat-test  
42. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-Ittestjar:  
— natura fi żika, purezza u proprjetajiet fi żikokimiċi; 
— dejta ta’ identifikazzjoni;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— sors tal-kimika;  
— numru tal-lott;  
— ċertifikat tal-anali żi tal-kimika;  
Vejjikolu (fejn xieraq):  
— ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ vejjikolu (jekk ma jkunx ilma);  
Annimali tat-test:  
— speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-għażla magħmula;  
— għadd, età u sess tal-annimali fil-bidu tat-test;  
— sors, kundizzjonijiet ta’ abitazzjoni, dieta, e ċċ.; 
— piżijiet individwali ta’ kull annimal fil-bidu tat-test;  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— motiv g ħal rotta ta’ amministrazzjoni u g ħażla ta’ doża; 
— meta jkun applikabbli, il-metodi ta’ statistika u żati biex tkun analizzata 
d-dejta;  
— dettalji ta’ formulazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar/preparazzjoni tad-dieta.  
— dejta analitika dwar kon ċentrazzjoni miksuba, stabbiltà u omo ġeneità 
tal-preparazzjoni;  
— rotta ta’ amministrazzjoni u dettalji tal-amministrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar;  
— għal studji ta’ inalazzjoni, jekk hux l-imnie ħer jew il- ġisem kollu;  
— dożi attwali (mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum), u fattur ta’ konver żjoni minn 
konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (mg/kg jew ppm) ta’ dieta/ilma 
tax-xorb g ħad-doża attwali, jekk applikabbli;  
— dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma.  
Riżultati (għandhom ikunu ppre żentati sommarju ta’ dejta tabulata u dejta 
dwar annimali individwali):  
Ġenerali  
— dejta dwar sopravivenza;  
— piż tal-ġisem/bidliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— konsum ta’ ikel, kalkulazzjonijiet ta’ effi ċjenza fl-ikel, jekk ikunu saru, u 
konsum tal-ilma, jekk applikabbli;  
— dejta tossikokinetika (jekk disponibbli);  
— oftalmoskopija (jekk disponibbli);  
— ematolo ġija (jekk disponibbli);  
— kimika klinika (jekk disponibbli);  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Sejbiet klini ċi 
— Sinjali ta’ tossi ċità; 
— Inċidenza (u, jekk bil-punti, severità) ta’ kull anormalità;  
— Natura, severità, u durata ta’ osservazzjonijiet klini ċi (jekk hux 
tranżitorji jew permanenti);  
Dejta dwar l-awtopsja  
— Piż terminali tal- ġisem;  
— Piżijiet ta’ organi u l-proporzjonijiet tag ħhom, jekk applikabbli;  
— Sejbiet minn awtopsji; in ċidenza u severità ta’ anormalitajiet;  
Istopatolo ġija 
— Sejbiet istopatolo ġiċi mhux neoplasti ċi; 
— Sejbiet istopatolo ġiċi neoplasti ċi; 
— Korrelazzjoni bejn sejbiet makroskopi ċi u mikroskopi ċi; 
— Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatolo ġiċi kollha relatati ma’ trat ­
tament inklu żi gradazzjonijiet ta’ severità;  
— Rapport ta’ kull evalwazzjoni bejn il-pari dwar is-slides;  
Trattament ta’ statistika ta’ ri żultati, kif jixraq  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati inklu żi 
— Diskussjoni dwar kull appro ċċ ta’ mudellar;  
— Relazzjonijiet ta’ do ża-rispons;  
— Dejta storika ta’ kontroll;  
— Qies ta’ kull informazzjoni dwar modalità ta’ azzjoni;  
— Determinazzjoni ta’ BMD, NOAEL jew LOAEL  
— Rilevanza g ħall-bnedmin;  
Konklużjonijiet  
LETTERATURA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity character ­
ization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Il-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: Studju dwar Tossi ċità Orali dwar Do ża 
Ripetuta g ħal 90 Jum ta’ Test ta’ Subtossi ċità Kronika Orali f’Annimali 
Mhux Rodituri.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subakuta Studju 
ta’ 28 Jum.  
(10) Il-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subkronika 
Studju ta’ 90 Jum.  
(11) Il-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness, Tossi ċità (Dermali) ta’ Do ża Ripetuta (28 
Jum).  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the 
Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on 
Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modern ­
ization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 
36: 1-7.  
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI 
Press, Washington, DC.  
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279- 284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.  
(27) Direttiva 2010/63/EU tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta’ 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal skopijiet 
xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of 
Health and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
(32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-ittejstjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B. 33.  STUDJI KON ĠUNTI DWAR TOSSI ĊITÀ KRONIKA/KAR ĊI­
NOĠENIĊITÀ 
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
453 (2009) tal-OECD. It-TG 453 ori ġinali kienet adottata fl-1981. 
L-iżvilupp ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.33 a ġġornat tqies li kien 
meħtieġ biex jirrifletti żviluppi re ċenti fil-qasam tat-trattament xieraq 
tal-annimali u ta’ rekwi żiti regolatorji (1) (2) (3) (4) (5). L-a ġġornament 
ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar B.33 twettaq flimkien ma’ revi żjonijiet 
tal-Kapitolu B.32 ta’ dan l-Anness: Studji dwar il-Kar ċinoġeniċità, u 
tal-Kapitolu B.30 ta’ dan l-Anness, studji dwar Tossi ċità Kronika, 
bil-għan li jinkiseb tag ħrif addizzjonali mill-annimali u żati fl-istudju u li 
jingħataw aktar dettalji dwar g ħażla ta’ do ża. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar 
huwa mfassal biex jintu ża fl-ittestjar ta’ firxa wiesg ħa ta’ kimi ċi, inklużi 
pestiċidi u kimi ċi industrijali. G ħandu jkun innotat i żda li xi dettalji u 
rekwiżiti jistgħu jkunu differenti g ħal farma ċewtiċi [ara l-Gwida SIB 
tal-Konferenza Internazzjonali g ħall-Armonizzazzjoni (ICH) dwar Ittestjar 
għall-Karċinoġeniċità ta’ Farma ċewtiċi]. 
2. Il-ma ġġoranza tal-istudji dwar tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità jsiru fi 
speċijiet ta’ rodituri u dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa, g ħalhekk, ma ħsub 
biex japplika primarjament g ħal studji mag ħmulin f’dawn l-ispe ċijiet. Jekk 
studji bħal dawn ikunu me ħtieġa fi speċijiet ta’ annimali mhux rodituri, 
il-prinċipji u l-pro ċeduri li tag ħhom jing ħata profil jistg ħu wkoll ikunu 
applikati, b’modifiki xierqa, flimkien ma’ dawk li l-profil tag ħhom jinsab 
fil-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: Studju dwar Tossi ċità Orali f’Annimali 
Mhux Rodituri ta’ Do ża Ripetuta g ħal 90 jum (6), skont il-profil tag ħhom 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 tal-OECD dwar it-Tfassil u t-Twettiq ta’ 
Studji dwar Tossi ċità Kronika u Kar ċinoġeniċità (7).  
3. It-tliet rotot ewlenin ta’ amministrazzjoni u żati fi studji dwar tossi ċità 
kronika/kar ċinoġeniċità huma orali, dermali u ta’ inalazzjoni. L-g ħażla 
tar-rotta ta’ amministrazzjoni tiddependi mill-karatteristi ċi fiżiċi u kimiċi 
tal-kimika g ħall-ittestjar u mir-rotta predominanti ta’ espo żizzjoni umana. 
Informazzjoni addizzjonali dwar g ħażla ta’ rotta ta’ espo żizzjoni hija 
pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
4. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jiffoka fuq espo żizzjoni permezz tar-rotta orali, 
ir-rotta li komunement l-aktar li tintu ża fi studji dwar tossi ċità kronika u 
karċinoġeniċità. Filwaqt li studji fit-tul li jinvolvu espo żizzjoni permezz 
tar-rotot dermali u ta’ inalazzjoni jistg ħu wkoll ikunu me ħtieġa għall-valu­
tazzjonijiet tar-riskju g ħas-saħħa tal-bniedem u/jew jistg ħu jkunu rikjesti 
f’ċerti reġimi regolatorji, i ż-żewġ rotot ta’ espo żizzjoni jinvolvu kumplessità 
teknika konsiderevoli. Studji b ħal dawn ikun je ħtiġilhom jitfasslu abba żi ta’ 
każ każ, għalkemm il-Metodu ta’ Ttestjar li l-profil tieg ħu jidher hawn 
għall-valutazzjoni u l-evalwazzjoni ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità 
b’amministrazzjoni orali jista’ jifforma l-ba żi ta’ protokoll g ħal studji 
dwar inalazzjoni u/jew dermali, fir-rigward ta’ rakkomandazzjonijiet g ħal 
perjodi ta’ trattament, parametri klini ċi u patolo ġiċi, eċċ. Hemm gwida 
tal-OECD dwar l-amministrazzjoni ta’ kimi ċi għall-ittestjar bir-rotot 
tal-inalazzjoni (7) (8) u dermali (7). Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (9) 
u l-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness (10), flimkien mad-Dokument ta’ Gwida 
tal-OECD dwar ittestjar ta’ inalazzjoni akuta (8), g ħandhom ikunu kkon ­
sultati b’mod spe ċifiku fit-tfassil ta’ studji g ħal tul itwal ta’ żmien li jinvolvu 
espożizzjoni permezz tar-rotta tal-inalazzjoni. Il-Kapitolu B.9 ta’ dan 
l-Anness (11) g ħandu jkun ikkonsultat fil-ka ż ta’ ttestjar mag ħmul 
bir-rotta dermali.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. L-istudju kon ġunt tat-tossi ċità kronika/kar ċinoġeniċità jipprovdi inform ­
azzjoni dwar il-perikli g ħas-saħħa li jista’ jkun hemm li x’aktarx jinqalg ħu 
minn espo żizzjoni ripetuta g ħal perjodu li jdum tul il- ħajja kollha tal-ispe ċi 
użata. L-istudju g ħandu jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti tossi ċi 
tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu ża karċinoġeniċità potenzjali, jindika organi 
mmirati u l-possibbiltà ta’ akkumulazzjoni. Jista’ jipprovdi stima tal-livell 
bla effett ħażin osservat g ħal effetti tossi ċi u, fil-ka ż ta’ karċinoġeni mhux 
ġenotossiċi, għal risponsi g ħal tumuri, li jistg ħu jintużaw biex ikunu stab ­
biliti kriterji ta’ sikurezza g ħal espożizzjoni umana. Qed issir enfa żi wkoll 
dwar il-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet klini ċi sewwa tal-annimali, biex tinkiseb 
kemm jista’ jkun informazzjoni.  
6. L-għanijiet ta’ studji dwar tossi ċità kronika/kar ċinoġeniċità koperti minn dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar jinkludu:  
— L-identifikazzjoni tal-proprjetajiet kar ċinoġeniċi ta’ kimika g ħall-ittestjar, 
li tirriżulta f’żieda fl-in ċidenza ta’ neopla żmi, żieda fil-proporzjon ta’ 
neoplażmi malinni jew tnaqqis fi ż-żmien għad-dehra ta’ neopla żmi, 
mqabbel ma’ gruppi ta’ kontroll konkurrenti,  
— Identifikazzjoni ta ż-żmien għad-dehra ta’ neopla żmi; 
— Identifikazzjoni tat-tossi ċità kronika tal-kimika g ħall-ittestjar;  
— Identifikazzjoni ta’ organu/i mmirat(i) ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġe­
niċità, 
— Karatterizzazzjoni tar-relazzjoni do ża-rispons,  
— Identifikazzjoni ta’ livell bla effett ħażin osservat (NOAEL) jew punt ta’ 
tluq biex tkun stabbilita Do ża ta’ Riferiment (BMD);  
— Estrapolazzjoni tal-effetti kar ċinoġeniċi għal livelli ta’ espo żizzjoni 
umana għal doża baxxa,  
— Tbassir ta’ effetti ta’ tossi ċità kronika f’livelli ta’ espo żizzjoni umana,  
— Forniment ta’ dejta biex ikunu ttestjati ipote żijiet dwar modalità ta’ 
azzjoni (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
7. Fil-valutazzjoni u l-evalwazzjoni tal-kar ċinoġeniċità potenzjali u tossi ċità 
kronika ta’ kimika g ħall-ittestjar, l-informazzjoni kollha disponibbli dwar 
il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha titqies mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma 
jsir l-istudju, biex it-tfassil tal-istudju jiffoka fuq l-ittestjar b’aktar effi ċjenza 
għall-proprjetajiet tossikolo ġiċi tagħha u biex l-u żu ta’ annimali jkun 
mill-anqas. Informazzjoni dwar, u konsiderazzjoni tal-modalità ta’ azzjoni 
ta’ karċinoġenu suspettat (2) (7) (12) (13) (14) (15) hija partikolarment 
importanti, min ħabba li l-a ħjar disinn jista’ tkun differenti skont jekk 
il-kimika g ħall-ittestjar tkunx kar ċinoġenu ġenotossiku mag ħruf jew 
suspettat. Gwida ulterjuri dwar konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni 
tinsab fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
8. Informazzjoni li g ħandha tassisti fit-tifsila tal-istudju tinkludi l-identità, 
l-istruttura tal-kimika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar; 
kwalunkwe informazzjoni dwar il-modalità ta’ azzjoni; ri żultati ta’ kull test 
tat-tossiċità in vitro  jew  in vivo , inklużi testijiet ta’ ġenotossiċità; użu/ijiet 
antiċipat(i) u potenzjal g ħal espożizzjoni umana; dejta (Q)SAR disponibbli, 
mutaġeniċità/ġenotossiċità, karċinoġeniċità u dejta tossikolo ġika oħra dwar 
kimiċi relatati strutturalment; dejta tossikokinetika disponibbli (do ża waħda 
u wkoll kinetika ta’ do ża ripetuta meta tkun disponibbli) u dejta derivata  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
minn studji o ħra ripetuti ta’ espo żizzjonijiet. Id-determinazzjoni ta’ tossi ċità 
kronika/kar ċinoġeniċità għandha ssir biss wara li tkun inkisbet informazzjoni 
inizjali dwar tossi ċità minn do ża ripetuta g ħal 28 jum u/jew minn testijiet ta’ 
tossiċità għal 90 jum. Testijiet g ħal żmien qasir ta’ bidu-promozzjoni ta’ 
kanċer jistgħu wkoll jipprovdu informazzjoni utli. Appro ċċ ta’ ttestjar 
f’fażijiet għall-ittestjar tal-kar ċinoġeniċità għandu jitqies b ħala parti 
mill-valutazzjoni globali tal-effetti potenzjali ħżiena għas-saħħa ta’ kimika 
partikolari g ħall-ittestjar (16) (17) (18) (19).  
9. Il-metodi ta’ statistika l-aktar adatti g ħall-analiżi ta’ riżultati, meqjusin 
it-tifsila u l-g ħanijiet sperimentali, g ħandhom ikunu stabbiliti qabel ma 
jingħata bidu g ħall-istudju. Kwistjonijiet li g ħandhom jitqiesu jinkludu 
jekk l-istatistika g ħandhiex tinkludi a ġġustament g ħal sopravivenza, anali żi 
ta’ riskji kumulattivi ta’ kan ċer relattiv g ħal kemm iddum is-sopravivenza, 
analiżi taż-żmien għal tumur u anali żi fil-każ ta’ tmiem ħesrem ta’ grupp 
wieħed jew aktar. Gwida dwar l-anali żi xierqa ta’ statistika u referenzi 
ewlenin g ħal metodi ta’ statistika a ċċettati internazzjonalment jing ħataw 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7), u wkoll fid-Dokument ta’ Gwida 
Nru 35 dwar l-anali żi u l-evalwazzjoni ta’studji dwar tossi ċità kronika u 
karċinoġeniċità (20).  
10. Fit-tmexxija ta’ studju tal-kar ċinoġeniċità, il-prin ċipji u l-konsiderazzjonijiet 
ta’ gwida li l-profil tag ħhom jinsab fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar 
l-għarfien, il-valutazzjoni u l-u żu ta’ sinjali klini ċi bħala punti ta’ tmiem 
b’mod uman g ħal annimali g ħall-esperimenti u żati f’evalwazzjoni 
tas-sikurezza (21), b’mod partikolari l-paragrafu 62 tieg ħu, għandhom 
ikunu segwiti dejjem. Dan il-paragrafuq jiddikjara li “ Fi studji li jinvolvu 
dożaġġ ripetut, meta annimal juri sinjali klini ċi li huma progressivi, u 
jwasslu g ħal iktar deterjorament fil-kundizzjoni, g ħandha tittie ħed 
deċiżjoni infurmata dwar jekk l-annimal g ħandux jinqatel b’mod uman 
jew le. Id-de ċiżjoni għandha tinkludi konsiderazzjoni tal-valur 
tal-informazzjoni li g ħandha tinkiseb mill-manutenzjoni kontinwata ta’ dak 
l-annimal fl-istudju, relattiv g ħall-kundizzjoni ġenerali tieg ħu. Jekk tittie ħed 
deċiżjoni biex l-annimal jibqa fit-test, il-frekwenza tal-osservazzjonijiet 
għandha tiżdied, skont il-b żonn. Jista’ jkun possibbli wkoll, ming ħajr ma 
jaffettwa b’mod avvers l-iskop tat-test, li d-do żaġġ jieqaf temporanjament 
jekk dan ħa jtaffi l-u ġigħ jew l-iskumdità, jew li tonqos id-do ża tat-test. ” 
11. Gwida dettaljata u diskussjoni dwar il-prin ċipji ta’ g ħażla ta’ do ża għal 
studji dwar tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità tinsab fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 (7), kif ukoll f’ żewġ pubblikazzjonijiet tal-Internazzjonali 
Life Sciences Institute (22) (23). L-istrate ġija bażika tal-għażla tad-doża tkun 
tiddependi mill-g ħan jew g ħanijiet primarji tal-istudju (il-paragrafu 6). 
Fl-għażla ta’ livelli xierqa ta’ do ża, għandu jinkiseb bilan ċ bejn tgħarbil 
ta’ perikli min na ħa waħda u karatterizzazzjoni ta’ risponsi g ħal dożi 
baxxi u r-rilevanza tag ħhom minn na ħa oħra. Dan huwa partikolarment 
rilevanti fil-ka ż ta’ dan l-istudju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġe­
niċità. 
12. Għandha ting ħata konsiderazzjoni li jsir dan l-istudju kon ġunt ta’ tossi ċità 
kronika u kar ċinoġeniċità, milli e żekuzzjoni separata ta’ studju dwar 
tossiċità kronika (il-Kapitolu B.30 ta’ dan l-Anness) u studju 
tal-karċinoġeniċità (il-Kapitolu B.32 ta’ dan l-Anness). It-test kon ġunt 
jipprovdi aktar effi ċjenza fir-rigward ta’ ħin u spejje ż, u xi tnaqqis fl-u żu 
ta’ annimali, mqabbel ma’ meta jsiru żewġ studji separati, ming ħajr ħsara 
għall-kwalità tad-dejta jew fil-fa żi kronika jew fil-fa żi ta’ karċinoġeniċità. 
Iżda għandhom jitqiesu sewwa l-prin ċipji ta’ għażla ta’ doża (paragrafi 11 u 
22-26) meta jsir studju kon ġunt ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità, u 
huwa rikonoxxut ukoll li jistg ħu jkunu me ħtieġa studji separati f’ ċerti oqfsa 
regolatorji. Gwida ulterjuri dwar it-tifsila tal-istudju kon ġunt ta’ tossi ċità 
kronika u kar ċinoġeniċità biex tinkiseb effi ċjenza massima tal-istudju 
fir-rigward ta’ possibbiltajiet g ħal tnaqqis f’g ħedud ta’ annimali u żati, kif 
ukoll permezz ta’ sistema komuni g ħad-diversi pro ċeduri sperimentali tinsab 
fi Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar jinsabu 
fl-aħħar ta’ dan il-kapitolu u fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
14. Id-disinn tal-istudju jikkonsisti f’ żewġ fażijiet parallelli, fa żi kronika u fa żi 
ta’ karċinoġeniċità (għad-durata ara l-paragrafi 34 u 35 rispettivament). 
Il-kimika g ħall-ittestjar normalment tkun amministrata bir-rotta orali 
għalkemm l-ittestjar bir-rotta tal-inalazzjoni jew dermali jista’ wkoll ikun 
adattat. G ħal fażi kronika, il-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata 
kuljum f’do żi gradwati lil diversi gruppi ta’ annimali tat-test, b’livell ta’ 
doża waħda għal kull grupp, normalment g ħal perjodu ta’ 12-il xahar, 
għalkemm jistg ħu jintgħażlu wkoll perjodi itwal jew aqsar skont rekwi żiti 
regolatorji (ara l-paragrafu 34). Dan il-perjodu jintg ħażel li jkun twil 
biżżejjed biex kull effett ta’ tossi ċità kumulattiva jsir jidher, ming ħajr 
l-effetti ta’ ta ħwid ta’ bidliet ġerjatriċi. It-tifsila tal-istudju tista’ tinkludi 
wkoll qatla interim wa ħda jew aktar, e ż. fit-tielet jew fis-sitt xahar, u 
jistgħu jkunu inklu żi gruppi addizzjonali ta’ annimali biex dan isir (ara 
l-paragrafu 20). Fil-fa żi ta’ kar ċinoġeniċità, il-kimika g ħall-ittestjar tkun 
amministrata kuljum lil diversi gruppi ta’ annimali tat-test g ħal porzjon 
kbir ta’ ħajjithom kollha. L-annimali fi ż-żewġ fażijiet ikunu osservati 
mill-qrib g ħal sinjali ta’ tossi ċità u għall-iżvilupp ta’ le żjonijiet neoplasti ċi. 
L-annimali li jmutu jew li jinqatlu matul it-test issirilhom awtopsja u, fit-tmiem tat-test, annimali li jkunu baqg ħu ħajjin jinqatlu u ssirilhom 
awtopsja.
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ spe ċi tal-annimali  
15. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar primarjament ikopri l-valutazzjoni u 
l-evalwazzjoni ta’ tossi ċità kronika u kar ċinoġeniċità f’rodituri (il- 
paragrafu 2). L-u żu ta’ spe ċijiet ta’ annimali mhux rodituri jista’ jitqies 
meta dejta disponibbli tissu ġġerixxi li jkunu aktar rilevanti g ħat-tbassir ta’ 
effetti ta’ sa ħħa fil-bnedmin. L-g ħażla ta’ spe ċi għandha tkun i ġġustifikata. 
L-ispeċi ppreferuta ta’ rodituri huwa l-far, g ħalkemm jistg ħu jintużaw 
speċijiet oħra ta’ rodituri, e ż. il-ġurdien. G ħalkemm l-u żu tal-ġurdien f’it ­
testjar tal-kar ċinoġeniċità jista’ jkollu utilità limitata (24) (25) (26), skont xi 
programmi regolatorji pre żenti l-ittestjar tal-kar ċinoġeniċità fil-ġurdien 
għadu meħtieġ sakemm ma jkunx de ċiż li studju b ħal dan ma jkunx 
meħtieġ xjentifikament. Firien u ġrieden kienu l-mudelli ppreferuti g ħall- 
esperimenti min ħabba l-ħajja relattivament qasira tag ħhom, l-użu kbir li jsir 
minnhom fi studji farmakolo ġiċi u tossikolo ġiċi, is-suxxettibbiltà tag ħhom 
għal induzzjoni ta’ tumur u li minnhom hemm razez karatterizzati bi żżejjed. 
Bħala konsegwenza ta’ dawn il-karatteristi ċi, hemm ammont kbir ta’ inform ­
azzjoni dwar il-fi żjoloġija u l-patolo ġija tagħhom. It-tfassil u t-twettiq ta’ 
studji dwar tossi ċità kronika/kar ċinoġeniċità fi spe ċijiet ta’ annimali mhux 
rodituri, meta jkunu me ħtieġa, għandhom ikunu bba żati fuq il-prin ċipji li 
l-profil tag ħhom jinsab f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar flimkien ma’ dawk 
fil-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: Studju dwar Tossi ċità Orali f’Annimali 
Mhux Rodituri ta’ Do ża Ripetuta g ħal 90 jum (6). Informazzjoni 
addizzjonali dwar g ħażla ta’ spe ċi u razza hija pprovduta fid-Dokument 
ta’ Gwida Nru 116 (7).  
16. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li 
komunement jintu żaw fil-laboratorju. L-istudju kon ġunt tat-tossi ċità kronika/ 
karċinoġeniċità għandu jsir f’annimali mill-istess razza u sors b ħal dawk 
użati fi studju/i preliminari dwar tossi ċità li jdum(u) anqas, g ħalkemm, 
jekk annimali minn din ir-razza u sors ikunu mag ħrufa li jippre żentaw 
problemi biex jinkisbu l-kriterji normalment a ċċettati ta’ sopravivenza g ħal 
studji fit-tul [ara d-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7)], g ħandu jitqies l-u żu 
ta’ razza ta’ annimal li jkollha rata a ċċettabli ta’ sopravivenza g ħall-istudju 
fit-tul. In-nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx ikunu tqal.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Kundizzjonijiet ta’ abitazzjoni u g ħalf 
17. L-annimali jistg ħu jitqiedu jabitaw individwalment, jew jitqieg ħdu f’gaġeġ fi 
gruppi żgħar tal-istess sess; abitazzjoni g ħal kull annimal wa ħdu għandha 
titqies biss jekk dan ikun ġustifikat xjentifikament (27) (28) (29). Il-ga ġeġ 
għandhom ikunu rran ġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti li jista’ jkun 
hemm min ħabba t-tqeg ħid ta’ gaġeġ. It-temperatura fil-kamra tal-esperimenti 
tal-annimali g ħandha tkun 22 °C (± 3 °C). G ħalkemm l-umdità relattiva 
għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma taqbi żx 70 % 
minbarra matul il- ħasil tal-kamra, il-mira g ħandha tkun ta’ 50-60 %. 
Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl, 
12-il sieg ħa dlam. Dwar l-g ħalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali 
tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. Id-dieta g ħandha 
tissodisfa l- ħtiġijiet nutrizzjonali kollha tal-ispe ċi ttestjata u l-kontenut ta’ 
kontaminanti tad-dieta, inklu żi iżda mhux limitatament g ħal residwi ta’ 
pestiċidi, sustanzi organi ċi niġġiesa persistenti, fitoestro ġeni, metalli tqal u 
mikotossini, li jistg ħu jinfluwenzaw ir-ri żultat tat-test, g ħandu jkun baxx 
kemm jista’ jkun. Informazzjoni analitika dwar il-livelli ta’ kontaminanti tan-nutrijent u tad-dieta g ħandha tkun i ġġenerata perjodikament, mill-anqas 
fil-bidu tal-istudju u meta jkun hemm bidla fil-lott u żat, u għandha tkun 
inkluża fir-rapport finali. Bl-istess mod g ħandha tkun ipprovduta inform ­
azzjoni analitika dwar l-ilma tax-xorb u żat fl-istudju. L-g ħażla ta’ dieta 
tista’ tkun influwenzata mill- ħtieġa li tkun żgurata ta ħlita adattata ta’ 
kimika g ħall-ittestjar u biex ikunu sodisfatti l- ħtiġijiet nutrizzjonli 
tal-annimali meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata permezz 
tar-rotta tad-dieta.
 
Preparazzjoni tal-annimali  
18. Għandhom jintu żaw annimali f’sa ħħithom, li jkunu ġew akklimatizzati g ħal 
kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mill-anqas 7 ijiem li ma kinux so ġġetti 
għal proċeduri sperimentali qabel. Fil-ka ż ta’ rodituri, id-do żaġġ tal-annimali 
għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara ftim u akklimatazzjoni u prefer ­
ibbilment qabel mal-annimali jkun g ħandhom 8 ġimgħat. L-annimali tat-test 
għandhom ikunu kkaratterizzati fir-rigward ta’ spe ċi, razza, sors, sess, pi ż u 
età. Malli jinbeda l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż għal kull sess tal-annimali 
użati għandha tkun minimali u ma taqbi żx ± 20 % tal-pi ż medju tal-annimali 
kollha fl-istudju, separatament g ħal kull sess. L-annimali g ħandhom ikunu 
assenjati b’mod ka żwali lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. Wara 
l-każwalità, m’g ħandux ikun hemm differenzi sinifikanti fil-pi żijiet medji 
tal-ġisem bejn gruppi f’kull sess. Jekk ikun hemm differenzi sinifikanti ta’ 
statistika, f’dak il-ka ż il-proċedura ta’ ka żwalità għandha tkun ripetuta, jekk 
ikun possibbli. Kull annimal g ħandu jkun assenjat numru ta’ identifikazzjoni 
uniku, u jkun immarkat b’mod permanenti b’dan in-numru b’tatù, b’impjant 
ta’ mikro ċipp jew b’metodu ie ħor adattat.  
PROĊEDURA  
Għadd u sess tal-annimali  
19. Għandhom jintu żaw iż-żewġ sessi. G ħandu jintu ża għadd suffi ċjenti ta’ 
annimali biex evalwazzjoni bijolo ġika u ta’ statistika bir-reqqa tkun 
possibbli. G ħal rodituri, kull grupp ta’ do ża (skont il-profil tieg ħu 
fil-paragrafu 22) u grupp ta’ kontroll konkurrenti ma ħsub fil-fa żi ta’ karċi­
noġeniċità tal-istudju g ħandhom, g ħalhekk, ikun fihom mill-anqas 50 
annimal ta ż-żewġ sessi. Skont x’ikun l-g ħan tal-istudju, jista’ jkun 
possibbli li ti żdied il-qawwa ta’ statistika tal-istimi ewlenin billi annimali 
jkunu allokati b’mod differenzjali u mhux indaqs fil-gruppi varji ta’ do ża, 
b’aktar minn 50 annimal fil-gruppi ta’ do ża baxxa, e ż. biex ikun stmat 
il-potenzjal kar ċinoġeniku f’do żi baxxi. I żda għandu jkun irrikonoxxut li 
żieda moderata fid-daqs ta’ grupp g ħandha tipprovdi relattivament ftit 
żieda fil-qawwa ta’ statistika tal-istudju. Kull grupp ta’ do ża (skont  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
il-profil tieg ħu fil-paragrafu 22) u grupp ta’ kontroll konkurrenti ma ħsub 
għall-fażi ta’ tossi ċità kronika tal-istudju g ħandu jkun fihom mill-anqas 10 
annimali ta ż-żewġ sessi, fil-ka ż ta’ rodituri. G ħandu jkun innotat li dan 
l-għadd huwa aktar baxx minn dak fl-studju dwar tossi ċità kronika (il- 
Kapitolu B.30 ta’ dan l-Anness). L-interpretazzjoni tad-dejta mill-g ħadd 
imnaqqas ta’ annimali g ħal kull grupp fil-fa żi ta’ tossi ċità kronika ta’ dan 
l-istudju kon ġunt ikun, i żda, sostnut mid-dejta mill-g ħadd akbar ta’ annimali 
fil-fażi ta’ karċinoġeniċità tal-istudju. Fi studji li jinvolvu ġrieden, jistg ħu 
jkunu me ħtieġa annimali addizzjonali f’kull grupp ta’ do ża tal-fażi ta’ 
tossiċità kronika, biex isiru d-determinazzjonijiet ematolo ġiċi meħtieġa 
kollha. Aktar informazzjoni dwar tfassil ta’ statistika tal-istudju u g ħażla 
ta’ livelli ta’ do ża biex jintla ħaq il-massimu tal-qawwa ta’ statistika hija 
pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
Provvediment g ħal qatliet interim, grupp satellitarju u annimali 
sentinelli  
20. L-istudju jista’ jipprovdi g ħal qatliet interim, e ż. kull sitt xhur g ħall-fażi ta’ 
tossiċità kronika, biex jag ħti informazzjoni dwar progressjoni ta’ bidliet 
mhux neoplasti ċi u informazzjoni mekkanistika, jekk dan ikun ġustifikat 
xjentifikament. Fejn di ġà jkun hemm informazzjoni b ħal din mill-istudji 
preċedenti ta’ tossi ċità ta’ do ża ripetuta dwar il-kimika g ħall-ittestjar, 
qatliet interim jistg ħu ma jkunux xjentifikament ġustifikati. L-annimali 
użati fil-fażi ta’ tossi ċità kronika tal-istudju, li normalment iddum 12-il 
xahar (paragrafu 34), jipprovdu dejta dwar qatla interim fil-fa żi ta’ karċi­
noġeniċità tal-istudju, biex b’hekk jinkiseb tnaqqis fl-g ħadd ta’ annimali 
użati globalment. Gruppi satellitarji jistg ħu wkoll ikunu inklu żi fil-fażi ta’ 
tossiċità kronika tal-istudju, biex ikun hemm monitora ġġ tar-riversibbiltà ta’ 
kull bidla tossikolo ġika miġjuba mil-kimika g ħall-ittestjar li tkun investigata. 
Dawn jistg ħu jkunu ristretti g ħall-ogħla livell ta’ do ża tal-istudju flimkien 
ma’ kontroll. Jista’ wkoll ikun inklu ż grupp addizzjonali ta’ annimali 
sentinelli (tipikament 5 annimali g ħal kull sess) g ħall-monitora ġġ 
tal-istatus ta’ mard, jekk ikun me ħtieġ, matul l-istudju (30). Gwida 
ulterjuri dwar tifsila tal-istudju biex tinkludi qatliet interim, annimali satel ­
litarji u sentinelli, filwaqt li timminimizza l-g ħadd ta’ annimali u żati glob­
alment, hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7).  
21. Jekk annimali satellitarji u/jew qatliet interim ikunu inklu żi fit-tifsila 
tal-istudju, l-g ħadd ta’ annimali f’kull grupp ta’ do ża inklużi għal dan 
il-fini normalment ikun ta’ 10 annimali g ħaż-żewġ sessi, u l-g ħadd totali 
ta’ annimali inklu żi fit-tifsila tal-istudju g ħandu jiżdied bl-għadd skedat ta’ 
annimalii li jkollhom jinqatlu qabel ma jitlesta l-istudju. Qatla interim u annimali satellitarji g ħandhom normalment isirulhom l-istess osser ­
vazzjonijiet, inklu ż piż tal-ġisem, konsum ta’ ikel/ilma, kejlijiet ematolo ġiċi 
u ta’ bijokimika klinika u investigazzjonijiet patolo ġiċi bħall-annimali 
fil-fażi ta’ tossi ċità kronika tal-istudju ewlieni, g ħalkemm jista’ wkoll ikun 
hemm provvediment (fil-gruppi ta’ qtil interim) biex kejlijiet ikunu ristretti għal miżuri speċifiċi ewlenin b ħal newrotossi ċità jew immunotossi ċità.
 
Gruppi ta’ do żi u dożaġġ 
22. Gwida dwar l-aspetti kollha ta’ g ħażla ta’ doża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża 
hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7). Mill-anqas g ħandhom 
jintużaw tliet livelli ta’ do ża u kontroll konkurrenti, kemm g ħall-fażi kronika 
kif ukoll g ħall-fażi ta’ karċinoġeniċità. Il-livelli ta’ do ża ġeneralment ikunu 
bbażati fuq ir-ri żultati ta’ studji aqsar dwar do ża ripetuta jew fuq tiftix ta’ 
firxa u għandhom iqiesu kull dejta tossikolo ġika u tossikokinetika e żistenti 
disponibbli g ħall-kimika g ħall-ittestjar jew g ħal kimiċi relatati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Għall-fażi ta’ tossi ċità kronika tal-istudju, studju s ħiħ bl-użu ta’ tliet livelli 
ta’ doża jista’ ma jitqisx li jkun me ħtieġ, jekk ikun jista’ ji ġi antiċipat li test 
f’livell ta’ do ża waħda, ekwivalenti g ħal mill-anqas 1 000 mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem/jum, aktarx ma jipprodu ċix effetti ħżiena. Dan g ħandu jkun 
abbażi ta’ informazzjoni minn studji preliminari u konsiderazzjoni li 
tossiċità ma tkunx mistennija, abba żi ta’ dejta minn kimi ċi relatati struttur ­
alment. Jista’ jkun japplika limitu ta’ 1 000 mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum ħlief 
meta espo żizzjoni umana tindika l- ħtieġa li jkollu jintu ża livell og ħla ta’ 
doża. 
24. Sakemm ma jkunx limitat min-natura jew mill-effetti bijolo ġiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, g ħandu jintg ħażel l-ogħla livell ta’ do ża biex ikunu iden ­
tifikati l-organi prin ċipali u l-effetti tossi ċi filwaqt li jkunu evitati tbatija, 
tossiċità severa, morbidità jew mewt. G ħandu normalment jintg ħażel l-ogħla 
livell ta’ do ża biex jislet evidenza ta’ tossi ċità, kif ikun jidher, pere żempju, 
minn tnaqqis fi ż-żieda fil-pi ż tal-ġisem (madwar 10 %). I żda, skont x’ikunu 
l-għanijiet tal-istudju (ara l-paragrafu 6), tista’  tintgħażel l-ogħla doża anqas 
mid-doża li tipprovdi evidenza ta’ tossi ċità, eż. jekk do ża tislet effett ħażin 
ta’ tħassib, li madankollu jkollha ftit impatt fuq il- ħajja jew il-pi ż tal-ġisem.  
25. Jistg ħu jintgħażlu livelli ta’ do ża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża biex ikunu 
stabbiliti do ża-rispons u, skont il-modalità ta’ azzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar, NOAEL jew ri żultat maħsub ieħor tal-istudju, e ż. BMD (ara 
l-paragrafu 27). Fatturi li g ħandhom jitqiesu fl-g ħoti ta’ do żi aktar baxxi 
jinkludu l-angolu mistenni tal-kurva ta’ do ża-rispons, id-do żi li fihom 
jistgħu jseħħu bidliet importanti fil-metaboli żmu jew il-modalità ta’ 
azzjoni tossika, fejn ikun mistenni limitu, jew fejn ikun mistenni punt ta’ 
tluq għal estrapolazzjoni ta’ do ża baxxa. Fit-tmexxija ta’ studju kon ġunt 
dwar kar ċinoġeniċità/tossiċità kronika, l-g ħan primarju g ħandu jkun li 
tinkiseb informazzjoni g ħal finijiet ta’ valutazzjoni tar-riskju minn kar ċi­
noġeniċità, u informazzjoni dwar tossi ċità kronika tkun normalment g ħan 
sussidjarju. Wie ħed għandu jiftakar dan meta tkun qed issir l-g ħażla ta’ 
livelli ta’ do ża u spazjar ta’ livelli ta’ do ża għall-istudju.  
26. L-ispazjar mag ħżul ta’ livelli ta’ do ża jkun jiddependi mill-g ħanijiet 
tal-istudju u mill-karatteristi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar, u ma jistax ikun 
preskritt fid-dettall f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar, i żda intervalli ta’ darbtejn 
jew erba’ darbiet ta’ spiss jipprovdu prestazzjoni tajba ta’ test meta jintu żaw 
biex ikunu stabbiliti l-livelli minn fuq g ħal isfel ta’ do żi, u ż-żieda tar-raba’ 
grupp ta’ test sikwit hija preferibbli mill-u żu ta’ intervalli twal ħafna (eż. 
aktar minn fattur ta’ madwar 6-10) bejn do żaġġi. B’mod ġenerali l-u żu ta’ 
fatturi akbar minn 10 g ħandu jkun evitat, u g ħandu jkun i ġġustifikat jekk 
ikun applikat.  
27. Skont il-profil ulterjuri tag ħhom li jinsab fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 
(7), punti li g ħandhom jitqiesu fl-g ħażla ta’ doża jinkludu:  
— Nonlinearitajiet mag ħrufin jew suspettati jew punti ta’ infezzjoni 
fid-doża-rispons;  
— Tossikokinetika u firxa ta’ do żi fejn induzzjoni metabolika, saturazzjoni 
jew nonlinearità bejn do żi esterni u interni jse ħħu jew ma jse ħħux; 
— Leżjonijiet prekursuri, markaturi ta’ effett jew indikaturi tal-operazzjoni 
ta’ proċessi bijolo ġiċi ewlenin sottostanti;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— Aspetti ewlenin (jew suspettati) ta’ modalità ta’ azzjoni, b ħal dożi li 
fihom tibda tfaqqa’ ċ-ċitotossiċità, livelli ta’ ormoni jit ħawdu, 
mekkaniżmi omeostati ċi jintgħelbu, eċċ; 
— Reġjuni tal-kurva ta’ do ża-rispons fejn tkun me ħtieġa stima partikol ­
arment robusta, e ż. fil-firxa tal-BMD anti ċipata jew limitu suspettat;  
— Konsiderazzjonita’ livelli anti ċipati ta’ espo żizzjoni umana, spe ċjal­
mentfl-għażla ta’ dożi medji u baxxi.  
28. Il-grupp ta’ kontroll g ħandu jkun grupp mhux ittrattat jew grupp ta’ kontroll 
ta’ vejjikoli jekk jintu ża vejjikolu biex tkun amministrata kimika g ħall- 
ittestjar. Ħlief għal trattament bil-kimika g ħall-ittestjar, annimali fil-grupp 
ta’ kontroll g ħandhom ikunu mani ġġati b’mod identiku b ħal dawk 
fil-gruppi tat-test. Jekk jintu ża vejjikolu, il-grupp ta’ kontroll g ħandu 
jirċievi l-vejjikolu fl-og ħla volum u żat fost il-gruppi ta’ do ża. Jekk kimika 
għall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, u tikkaw ża li jittieħed anqas ikel 
tad-dieta b’mod sinifikanti min ħabba dieta b’anqas palat, grupp ta’ kontroll 
addizzjonali ta’ tmig ħ lil pari jista’ jkun utli biex iservi ta’ kontroll aktar 
adattat.  
Preparazzjoni ta’ do żi u amministrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar  
29. Il-kimika g ħall-ittestjar normalment tkun amministrata oralment, permezz 
tad-dieta jew ilma tax-xorb, jew b’gavage. Informazzjoni addizzjonali dwar rotot u metodi ta’ amministrazzjoni hija pprovduta fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 116 (7). Ir-rotta u l-metodu ta’ amministrazzjoni jkunu 
jiddependu mill-g ħan tal-istudju, mill-proprjetajiet fi żiċi/kimiċi tal-kimika 
għall-ittestjar, mid-disponibbiltà bijolo ġika tagħha, u mir-rotta predominanti 
u mill-metodu ta’ espo żizzjoni umana. G ħandu jkun ipprovdut motiv g ħar- 
rotta mag ħżula u għall-metodu ta’ amministrazzjoni. Fl-interessi ta’ trat ­
tament xieraq tal-annimali, gavage orali g ħandu normalment jintg ħażel 
biss għal dawk l-a ġenti li għalihom din ir-rotta u l-metodu ta’ amminis ­
trazzjoni ra ġonevolment jirrappre żentaw espo żizzjoni potenzjali umana (e ż. 
farmaċewtiċi). Għal kimiċi ta’ dieta jew ambjentali inklu żi pestiċidi, 
l-amministrazzjoni tipikament issir permezz tad-dieta jew b’ilma tax-xorb. Iżda, għal xi xenarji, e ż. espożizzjoni okkupazzjonali, amministrazzjoni 
permezz ta’ rotot o ħra tista’ tkun aktar adattata.
 
30. Meta jkun me ħtieġ, il-kimika g ħall-ittestjar tin ħall jew ti ġi sospiża f’vej­
jikolu adattat. G ħandhom jitqiesu l-karatteristi ċi li ġejjin tal-vejjikolu u 
addittivi o ħra, kif jixraq: effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-metaboli żmu, jew ir-ritenzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; effetti fuq 
il-proprjetajiet kimi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar li jistg ħu jibdlu 
l-karatteristi ċi tossiċi tagħha; u effetti fuq l-ikel jew fuq il-konsum tal-ilma 
jew fuq l-istat nutrizzjonali tal-annimali. Huwa rrakkomandat li, kull meta 
jkun possibbli, l-ewwel jitqies l-u żu ta’ soluzzjoni fl-ilma/sospensjoni, 
segwit minn konsiderazzjoni ta’ soluzzjoni/emulsjoni fi ż-żejt (eż. żejt 
tal-qamħa) u mbag ħad possibbilment b’soluzzjoni f’vejjikoli o ħra. Għal 
vejjikoli o ħra minbarra ilma, il-karatteristi ċi tossiċi tal-vejjikolu g ħandhom 
ikunu mag ħrufa. Għandha tkun disponibbli informazzjoni dwar l-istabbiltà 
tal-kimika g ħall-ittestjar u l-omo ġeneità ta’ soluzzjonijiet ta’ do żaġġ jew 
dieti (kif jixraq) skont il-kundizzjonijiet ta’ amministrazzjoni (e ż. dieta).  
31. Għall-kimiċi amministrati permezz tad-dieta jew l-ilma tax-xorb, huwa 
importanti jkun żgurat li l-kwantitajiet tal-kimika g ħall-ittestjar involuta 
ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilan ċ tal-ilma. Fi studji fit-tul 
dwar tossi ċità bl-użu ta’ amministrazzjoni ta’ dieta, il-kon ċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fl-g ħalf m’għandhiex tkun aktar ‘il fuq mil-limitu 
ta’ 5 % tad-dieta totali, biex ikunu evitati żbilanċi nutrizzjonali. Meta 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata fid-dieta, jistg ħu jintużaw jew 
konċentrazzjoni kostanti ta’ dieta (mg/kg dieta jew ppm), jew livell 
wieħed kostanti ta’ do ża skont il-pi ż tal-ġisem tal-annimal (mg/kg tal-pi ż 
tal-ġisem), ikkalkulat kull ġimgħa. L-alternattiva u żata għandha tkun spe ċ­
ifikata.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Fil-ka ż ta’ amministrazzjoni orali, l-annimali jing ħataw doża bil-kimika 
għall-ittestjar kuljum (sebat ijiem fil- ġimgħa) għal perjodu ta’ 12-il xahar 
(fażi kronika) jew 24 xahar (fa żi ta’ karċinoġeniċità), ara wkoll il-paragrafi 
33 u 34. Kwalunkwe re ġim ieħor ta’ dożaġġ, eż. ħamest ijiem fil- ġimgħa, 
jeħtieġlu jkun i ġġustifikat.. Fil-ka ż ta’ amministrazzjoni dermali, annimali 
jkunu normalment ittrattati bil-kimika g ħall-ittestjar g ħal mill-anqas 6 sig ħat 
kuljum, 7 ijiem fil- ġimgħa, kif spe ċifikat fil-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness 
(11), għal perjodu ta’ 12-il xahar (fa żi kronika) jew 24 xahar (fa żi ta’ 
karċinoġeniċità). Espo żizzjoni bir-rotta tal-inalazzjoni ssir g ħal 6 sigħat 
kuljum, 7 ijiem fil- ġimgħa, iżda tista’ tintu ża wkoll espo żizzjoni g ħal 5 
ijiem fil-ġimgħa, jekk dan ikun ġustifikat. Il-perjodu ta’ espo żizzjoni jkun 
normalment g ħal perjodu ta’ 12-il xahar (fa żi kronika) jew 24 xahar (fa żi ta’ 
karċinoġeniċità). Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra l-firien ikunu esposti 
mill-imnie ħer biss, il-perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu jkunu 
aġġustati biex titnaqqas id-diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. 
Għandu jkun ipprovdut motiv meta tintu ża espożizzjoni li ddum anqas 
minn 6 sig ħat kuljum. Ara wkoll il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (9).  
33. Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun amministrata b’gavage lill-annimali dan 
għandu jsir billi jintu ża tubu tal-istonku jew tubu rqiq ta’ intubazzjoni 
adattat, f’ ħinijiet simili kull jum. Normalment tkun amministrata do ża 
waħda darba kuljum, meta pere żempju kimika tkun irritant lokali, jista’ 
jkun possibbli li tin żamm ir-rata ta’ do ża kuljum billi din tkun amministrata 
bħala doża maqsuma (darbtejn kuljum). Il-volum massimu ta’ likwidu li 
jkun jista’ ji ġi amministrat f’waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs 
tal-annimal tat-test. Il-volum g ħandu jinżamm baxx daqs kemm ikun prattik ­
abbli, u normalment m’g ħandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-pi ż 
tal-ġisem għal rodituri (31). Il-varjabbiltà fil-volum tat-test g ħandha tkun 
imminimizzata billi l-kon ċentrazzjoni tkun a ġġustata biex ikun żgurat 
volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. Kimiċi li jistgħu jkunu korru żivi 
jew irritanti jkunu l-e ċċezzjoni, u jkun je ħtiġilhom jiġu dilwiti biex ikunu 
evitati effetti lokali severi. Ittestjar f’kon ċentrazzjonijiet li x’aktarx ikunu 
korrużivi jew irritanti g ħas-sistema gastrointestinali g ħandu jkun evitat.  
Durata tal-istudju  
34. Il-perjodu ta’ do żaġġ u durata tal-fa żi kronika ta’ dan l-istudju jkunu norm ­
alment ta’ 12-il xahar, g ħalkemm it-tifsila tal-istudju tippermetti wkoll u 
tista’ tkun applikata g ħal studji li jdumu anqas (e ż. 6 jew 9 xhur) jew 
aktar (eż. 18 jew 24 xhur), skont ir-rekwi żiti ta’ reġimi regolatorji partikolari 
jew għal għanijiet mekkanisti ċi speċifiċi. Devjazzjonijiet minn espo żizzjoni 
li ddum 12-il xahar g ħandhom ikunu ġġustifikati, l-aktar fil-ka ż ta’ dawk li 
jdumu anqas. Il-gruppi kollha ta’ do ża allokati lil din il-fa żi għandhom 
jintemmu fi ż-żmien indikat g ħal evalwazzjoni ta’ tossi ċità kronika u g ħal 
patoloġija mhux neoplastika. Gruppi satellitarji inklu żi għall-monitora ġġ 
tar-riversibbiltà ta’ kull bidla tossikolo ġika miġjuba mil-kimika g ħall- 
ittestjar li tkun investigata g ħandhom jin żammu ming ħajr dożaġġ għal 
perjodu ta’ mhux anqas minn 4 ġimgħat u ta’ mhux aktar minn terz ta’ 
kemm idum l-istudju totali wara li tkun intemmet espo żizzjoni.  
35. Id-durata tal-fa żi ta’ karċinoġeniċità ta’ dan l-istudju tkun normalment ta’ 24 
xahar għal rodituri, li jirrappre żenta l-ma ġġoranza tal- ħajja kollha normali 
tal-annimali li g ħandhom jintu żaw. Jistgħu jintużaw studji aqsar jew itwal, 
skont it-tul tal- ħajja tar-razza tal-ispe ċijiet ta’ annimali fl-istudju, i żda 
għandhom ikunu ġġustifikati. G ħal razez spe ċifiċi ta’ ġrieden, eż. AKR/J, 
C3H/J jew C57BL/6J durata ta’ 18-il xahar tista’ tkun aktar adattata. Dan li ġej jipprovdi xi gwida dwar durata, tmiem tal-istudju u sopravivenza; gwida 
ulterjuri, inklu ża konsiderazzjoni tal-a ċċettabbiltà ta’ studju ta’ kar ċinoġe­
niċità negattiva relattiva g ħal sopravivenza fl-istudju, hija pprovduta 
fid-Dokument ta’ Gwida Nru 116 (7):
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— It-tmiem tal-istudju g ħandu jitqies meta l-g ħadd ta’ superstiti fil-gruppi 
ta’ doża aktar baxxa jew fil-grupp ta’ kontroll jin żel taħt il-25 fil-mija.  
— Fil-ka ż fejn il-grupp ta’ do ża għolja biss imut ħesrem min ħabba tossi ċità, 
dan m’għandux jikkaw ża t-tmiem tal-istudju.  
— Is-sopravivenza ta’ kull sess g ħandha titqies separatament.  
— L-istudju m’g ħandux ikun esti ż lil hinn mill-punt meta d-dejta 
disponibbli mill-istudju ma tkunx aktar suffi ċjenti biex tkun tista’ ssir 
evalwazzjoni valida statistikament.  
OSSERVAZZJONIJIET (FA ŻI TA’ TOSSI ĊITÀ KRONIKA)  
36. L-annimali kollha g ħandhom ikunu e żaminati g ħall-morbidità jew g ħall- 
mortalità, is-soltu fil-bidu u t-tmiem ta’ kull jum, inklu żi fi tmiem 
il-ġimgħa u l-btajjel. Osservazzjonijiet klini ċi ġenerali g ħandhom isiru 
mill-anqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin(ijiet) kull jum, 
filwaqt li jitqies il-perjodu massimu ta’ effetti anti ċipati wara do żaġġ 
fil-każ ta’ amministrazzjoni b’gavage.  
37. Osservazzjonijiet klini ċi dettaljati g ħandhom isiru fuq l-annimali kollha 
mill-anqas darba qabel l-ewwel espo żizzjoni (biex jit ħallew isiru paraguni 
skont is-su ġġett), fi tmiem l-ewwel ġimgħa tal-istudju u kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-protokoll g ħal osservazzjonijiet g ħandu jkun mag ħmul 
b’mod li varjazzjonijiet bejn osservaturi individwali jkunu mminimizzati u indipendenti minn grupp ta’ test. Dawn l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru 
barra mill-ga ġġa ta’ abitazzjoni, preferibbilment f’arena standard u f’ ħinijiet 
simili għal kull jum f’kull okka żjoni. Huma g ħandhom ikunu rre ġistrati 
sewwa, preferibbilment billi jintu żaw sistemi ta’ punti, iddefiniti espli ċi­
tament mil-laboratorju tal-ittestjar. G ħandhom isiru sforzi biex ikun żgurat 
li varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet ta’ osservazzjoni jkunu minimi. Sinjali 
nnotati għandhom jinkludi, i żda ma jkunux limitati g ħal, bidliet fil- ġilda, pil, 
għajnejn, membrani muku żi, okkorrenza ta’ sekrezzjonijiet u eskrezzjonijiet 
u attività awtonomika (e ż. tidmigħ, erezzjoni tal-pil, daqs tal-pupilli, xejra 
respiratorja mhux tas-soltu). Bidliet fil-mixja, qag ħda u rispons g ħal 
immaniġġar, kif ukoll il-pre żenza ta’ movimenti kloni ċi jew toni ċi, stereotipi 
(eż. tindif e ċċessiv, dawran ripetittiv) jew im ġiba biżarra (eż. awtomuti ­
lazzjoni, mixi b’lura) g ħ
andhom ukoll ikunu rre ġistrati (32).  
38. Eżami oftalmolo ġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tag ħmir ieħor adattat, 
għandu jsir fuq l-annimali kollha qabel l-ewwel amministrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar. Fit-tmiem tal-istudju, dan l-e żami għandu preferibbilment isir 
għall-annimali kollha i żda mill-anqas fid-do ża għolja u fil-gruppi ta’ 
kontroll. Jekk fl-g ħajnejn jinstabu bidliet relatati ma’ trattament, l-annimali 
kollha għandhom ikunu e żaminati. Jekk anali żi strutturali jew informazzjoni 
oħra jissuġġerixxu tossi ċità okulari, f’dak il-ka ż il-frekwenza ta’ e żami 
okulari għandha tiżdied.  
39. Għal kimiċi fejn testijiet pre ċedenti ta’ tossi ċità għal doża ripetuta g ħal 28 
jum u/jew g ħal 90 jum ikunu indikaw il-potenzjal li jikkaw żaw effetti 
newrotossi ċi, reattività sensorja g ħal stimuli ta’ tipi differenti (32) (e ż. 
stimuli tas-smig ħ, viżivi u proprjo ċettivi) (33) (34) (35), ikunu jistg ħu 
jsiru b’mod fakultattiv valutazzjoni tal-qawwa ta’ qbid (36) u valutazzjoni 
tal-attività motorja (37) qabel il-bidu tal-istudju u f’perjodi ta’ 3 xhur wara li jkun beda l-istudju sa u inklu żi 12-il xahar, kif ukoll fit-tmiem tal-istudju 
(jekk ikun itwal minn 12-il xahar). Aktar dettalji tal-pro ċeduri li jistg ħu 
jkunu segwiti jing ħataw fir-referenzi rispettivi. I żda jistgħu jintużaw 
proċeduri alternattivi minbarra dawk fir-referenzi.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Għal kimiċi fejn testijiet pre ċedenti ta’ tossi ċità għal doża ripetuta g ħal 28 
jum u/jew g ħal 90 jum ikunu indikaw il-potenzjal li jikkaw żaw effetti 
immunotossi ċi, investigazzjonijiet ulterjuri ta’ dan il-punt ta’ tmiem ikunu 
jistgħu jsiru b’mod fakultattiv fit-tmiem.  
Piż tal-ġisem, konsum ta’ ikel/ilma u effi ċjenza fl-ikel  
41. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu meta jibda t-trattament, mill-anqas 
darba fil- ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-kejlijiet ta’ konsum ta’ ikel u ta’ effi ċjenza fl-ikel 
għandhom isiru mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u 
mill-anqas kull xahar minn hemm ‘il quddiem. Il-konsum tal-ilma g ħandu 
jitkejjel mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 
xahar minn hemm ‘il quddiem meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun ammin ­
istrata f’ilma tax-xorb. G ħandhom jitqies wkoll kejlijiet tal-konsum 
tal-ilma g ħal studji li fihom l-attività tax-xorb tinbidel.  
Ematoloġija u bijokimika klinika  
42. Fi studji li jinvolvu rodituri, g ħandhom isiru e żamijiet ematolo ġiċi fuq 
l-annimali kollha tal-istudju (10 annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp) 
kull 3, 6, u 12-il xahar, kif ukoll fit-tmiem tal-istudju (jekk ikun itwal minn 12-il xahar). G ħal ġrieden, jistg ħu jkunu me ħtieġa annimali satellitarji biex 
isiru d-determinazzjonijiet ematolo ġiċi meħtieġa kollha (ara l-paragrafu 19). 
Fi studji ta’ annimali mhux rodituri, jittie ħdu kampjuni minn g ħadd iżgħar 
ta’ annimali (e ż. 4 annimali g ħal kull sess u g ħal kull grupp fi studji dwar 
il-klieb), f’ ħinijiet interim ta’ te ħid ta’ kampjuni u fit-tmiem kif deskritt g ħal 
rodituri. Il-kejlijiet kull 3 xhur, g ħal rodituri jew g ħal annimali mhux 
rodituri, jistg ħu ma jsirux jekk ma jkunu dehru ebda effetti fuq parametri 
ematoloġiċi fi studju pre ċedenti ta’ 90 jum mag ħmul f’livelli komparabbli 
ta’ doża. Għandhom jittie ħdu kampjuni tad-demm minn sit imsemmi, 
pereżempju b’titqib kardijaku jew minn sinus retroorbitali, b’anestesija.
 
43. Il-lista ta’ parametri li ġejja għandha tkun investigata (38): G ħadd total u 
differenzjali ta’ lewko ċiti, għadd ta’ eritro ċiti, għadd ta’ pjastrini, kon ċen­
trazzjoni ta’ emoglobina, ematokrit (volum ta’ ċelluli ppakkjati), volum 
korpuskulari medju (MCV), emoglobina korpuskulari medja (MCH), kon ċ­
entrazzjoni ta’ emoglobina korpuskulari medja (MCHC), ħin protrombin u 
ħin tromboplastin parzjali attivat. Parametri ematolo ġiċi oħra bħal korpi ta’ 
Heinz jew morfolo ġija atipika o ħra ta’ eritro ċiti jew metemoglobina jistg ħu 
jitkejlu kif jixraq skont it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar. B’mod ġenerali, 
għandu jkun adottat appro ċċ flessibbli, skont l-effett osservat u/jew mistenni 
minn kimika partikolari g ħall-ittestjar. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar ikollha 
effett fuq is-sistema ematopojetika, jistg ħu jkunu indikati wkoll g ħedud ta’ 
retikoloċiti u ċitoloġija tal-mudullun tal-g ħadam, għalkemm dawn g ħandhom 
isiru b’rutina.  
44. Determinazzjonijiet ta’ bijokimika g ħall-investigazzjoni ta’ effetti tossi ċi 
maġġuri f’tessuti u, spe ċifikatament, ta’ effetti fuq il-kliewi u l-fwied, 
għandhom isiru fuq kampjuni tad-demm miksubin mill-annimali kollha 
tal-istudju (10 annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp), fl-istess intervalli 
ta’ ħin kif spe ċifikat għall-investigazzjonijiet ematolo ġiċi. Għal ġrieden, 
jistgħu jkunu me ħtieġa annimali satellitarji biex isiru d-determinazzjonijiet 
ta’ bijokimika klinika kollha me ħtieġa. Fi studji ta’ annimali mhux rodituri, 
jittieħdu kampjuni minn g ħadd iżgħar ta’ annimali (e ż. 4 annimali g ħal kull 
sess u għal kull grupp fi studji dwar il-klieb), f’ ħinijiet interim ta’ te ħid ta’ 
kampjuni u fit-tmiem kif deskritt g ħal rodituri. Jistg ħu ma jsirux kejlijiet 
kull 3 xhur g ħal rodituri jew g ħal annimali mhux rodituri jekk ma jkun 
deher ebda effett fuq parametri ta’ bijokimika klinika fi studju pre ċedenti ta’ 
90 jum mag ħmul f’livelli komparabbli ta’ do ża. Huwa rrakkomandat sawm  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
tul il-lejl g ħall-annimali (bl-e ċċezzjoni tal- ġrieden) qabel ma jittie ħdu 
kampjuni tad-demm (  1 ). Il-lista ta’ parametri li ġejja għandha tkun inves ­
tigata (38): gluko żju, urea (nitro ġenu tal-urea), kreatinina, proteina totali, 
albumina, kal ċju, sodju, potassju, kolesterol totali, mill-anqas żewġ 
testijiet adatti g ħal evalwazzjoni epato ċellulari (aminotransfera żi 
tal-alanina, aspartate aminotransfera żi, glutamat ta’ deidro ġenażi, aċidi 
totali tal-bili) (39), u mill-anqas żewġ testijiet adatti g ħal evalwazzjoni 
epatobiljari (fosfata żi alkalina, gamma glutamil trasferimenta żi, 5’- 
nukleotida żi, bilirubina totali, a ċidi totali tal-bili) (39). Parametri o ħra ta’ 
bijokimika klinika b ħal trigliċeridi sajmin, ormoni spe ċifiċi u kolinestera żi 
jistgħu jitkejlu kif jixraq, skont it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar. B’mod 
ġenerali, hemm ħtieġa ta’ appro ċċ flessibbli, skont l-effett osservat u/jew 
mistenni minn kimika partikolari g ħall-ittestjar.  
45. Determinazzjonijiet ta’ anali żi tal-awrina g ħandhom isiru fuq l-annimali 
kollha tal-istudju (10 annimali r ġiel u 10 nisa g ħal kull grupp), fuq 
kampjuni mi ġburin fl-istess intervalli b ħal dawk g ħall-ematolo ġija u 
l-kimika klinika. Ma jkunx me ħtieġ isiru kejlijiet kull 3 xhur jekk ma 
jkun deher ebda effett fuq anali żi tal-awrina fi studju pre ċedenti ta’ 90 
jum mag ħmul f’livelli komparabbli ta’ do ża. Il-lista ta’ parametri li ġejja 
kienet inklu ża f’rakkomandazzjoni esperta dwar studji ta’ patolo ġija klinika 
(38): dehra, volum, o żmolalità jew gravità spe ċifika, pH, proteina totali u 
glukożju. Determinazzjonijiet o ħra jinkludu keton, urobilino ġenu, bilirubina 
u demm mo ħbi. Jistgħu jintużaw aktar parametri meta jkun me ħtieġ biex 
tkun estiża l-investigazzjoni ta’ effett(i) osservat(i).  
46. Huwa meqjus b’mod ġenerali li je ħtieġu jkunu ddeterminati varjabbli ba żi 
ematoloġiċi u ta’ bijokimika klinika qabel trattament g ħal studji dwar 
il-klieb, i żda ma je ħtiġilhomx ikunu ddeterminati fi studji dwar rodituri 
(38). Iżda, jekk dejta ba żi storika (ara l-paragrafu 58) ma tkunx adegwata, 
għandu jitqies li tkun i ġġenerata dejta b ħal din.  
PATOLO ĠIJA 
Awtopsja makroskopika  
47. L-annimali kollha fl-istudju g ħandhom normalment ikunu sso ġġettati għal 
awtopsja makroskopika s ħiħa u dettaljata li tkun tinkludi e żami bir-reqqa 
tal-wiċċ estern tal- ġisem, tal-fet ħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, tora ċiċi u 
abdominali u tal-kontenuti tag ħhom. Iżda jista’ wkoll ikun hemm prov ­
vediment (fil-qatla interim jew fi gruppi satellitarji) biex kejlijiet ikunu 
ristretti g ħal miżuri speċifiċi ewlenin b ħal newrotossi ċità jew immunotos ­
siċità (ara l-paragrafu 21). Dawn l-annimali jistg ħu ma jkunux so ġġetti għal 
awtopsja u g ħall-proċeduri sussegwenti deskritti fil-paragrafi li ġejjin. 
L-annimali sentinelli jista’ jkun je ħtiġilhom awtopsja abba żi ta’ każ każ, 
fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Għal għadd ta’ kejlijiet ta’ serum u pla żma, notevolment l-aktar g ħall-glukożju, sawm 
matul il-lejl huwa ppreferut. Ir-ra ġuni ewlenija g ħal din il-preferenza hija li aktar 
varjabbiltà li g ħandha inevitabbilment tirri żulta minn nuqqas ta’ sawm, tittendi li ta ħbi 
effetti aktar sottili u tag ħmel l-interpretazzjoni diffi ċli. Iżda għandu jkun innotat li sawn 
tul il-lejl jista’ jo ħloq interferenza fil-metaboli żmu ġenerali tal-annimali u, b’mod parti ­
kolari fi studji dwar g ħoti ta’ ikel, jista’ jiddisturba l-espo żizzjoni ta’ kull jum g ħall- 
kimika għall-ittestjar. L-annimali kollha g ħandhom ikunu vvalutati fl-istess kondizzjoni 
fiżjoloġika, u valutazzjonijiet dettaljati jew newrolo ġiċi għandhom preferibbilment ikunu, 
għalhekk, skedati g ħal jum differenti milli g ħal teħid ta’ kampjuni ta’ bijokimika klinika.
 48. Piżijiet ta’ organi g ħandhom jin ġabru mill-annimali kollha, minbarra dawk 
esklużi bil-parti tal-a ħħar tal-paragrafu 47. L-adrenali, il-mo ħħ, l-epididimi, 
il-qalb, il-kliewi, il-fwied, l-ovarji, il-milsa, it-testikoli, it-tirojde (jinti żnu 
wara fissazzjoni, ma’ paratirojdi), u l-utru tal-annimali kollha (minbarra ta’ dawk misjubin qed imutu u/jew qed jinqatlu fil-frattemp) g ħandhom 
jintraqmu minn kull tessut imwa ħħal magħhom, kif jixraq, u l-pi ż 
tagħhom fl-imxarrab g ħandu jittie ħed malajr kemm jista’ jkun wara 
dissezzjoni biex ma jit ħalliex ikun hemm inxif.
 
49. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu ppreservati fil-midjum ta’ fissazzjoni 
l-aktar adattat kemm g ħat-tip ta’ tessut, kif ukoll g ħall-eżami istopatolo ġiku 
maħsub sussegwentement (40) (tessuti f’parente żi kwadri huma fakultattivi): 
il-leżjonijiet kbar kollha qalb frixa stonku (il-parti quddimija 
tal-istonku, stonku glan ­
dolari) 
glandola adrenali ileu glandola tal-paratirojde [snien] 
aorta jejunum nerv periferali testikoli 
moħħ (inklużi taqsimiet ta ċ- 
ċerebru, ċervellett, u 
medulla/me żoċefalu) kliewi pitwitarja timu 
il-musrana l-g ħamja glandola tad-dmug ħ 
(straorbitali) prostata tirojde 
ċerviċi fwied il-musrana d-dritta [lsien] 
glandola tal-koagulazzjoni pulmun glandola tal-b żieq trakea 
il-musrana l- ħoxna nodi limfati ċi (kemm 
superfiċjali kif ukoll 
fondi) bużżieqa seminali bu żżieqa tal-awrina 
duwodenu glandola mammarja 
(bilfors g ħan-nisa u, 
jekk dissettabbli b’mod 
viżibbli, għall-irġiel) muskolu skeletali utru (inklu ż ċerviċi) 
epididymis [sistema respiratorja ta’ 
fuq, inklu żi mnieħer, 
turbinati u sinus paranażali] ġilda [ureteru] 
għajn (inklu ża r-retina) esofagu nerv vertebrali (fi tlett 
livelli: ċervikali, 
midtoraċiku u lumbari) [uretra] 
[wirk bl-g ħaksa] [basla tax-xamm] milsa va ġina 
bużżieqa tal-marrara (g ħal 
speċijiet minbarra l-far) ovarju [sternu], taqsima tal-mudullun 
tal-għadam u/jew aspirat 
frisk tal-mudullun 
tal-għadam 
Glandola ta’ Harder  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi g ħandhom 
ikunu ppreservati. Is-sejbiet klini ċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li 
jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. G ħandu wkoll ikun ippreservat kull 
organu li x’aktarx ikun meqjus b ħala organu mmirat abba żi 
tal-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall-ittestjar. Fi studji li jinvolvu 
r-rotta dermali ta’ amministrazzjoni, il-lista ta’organi kif stabbilita g ħar- 
rotta orali g ħandha tkun e żaminata, u jkunu me ħtieġa teħid ta’ kampjuni 
speċifiċi u preservazzjoni tal- ġilda mis-sit ta’ applikazzjoni. Fi studji ta’ 
inalazzjoni, il-lista ta’ tessuti ppreservati u e żaminati mis-sistema respiratorja 
għandha ssegwi r-rakkomandazzjonijiet tal-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (9) 
u tal-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness (10). G ħal organi/tessuti o ħra (u 
b’żieda mat-tessuti ppreservati spe ċifikatament mis-sistema respiratorja) 
il-lista ta’ organi kif stabbilita g ħar-rotta orali g ħandha tkun e żaminata.  
Istopatolo ġija 
50. Hija disponibbli gwida dwar l-a ħjar prattiki fit-tmexxija ta’ studji dwar 
patoloġija tossikolo ġika (40). L-e żamijiet istopatolo ġiċi minimi g ħandhom 
ikunu:  
— it-tessuti kollha mill-gruppi ta’ do ża għolja u ta’ kontroll;  
— it-tessuti kollha minn annimali qed imutu jew li jkunu nqatlu matul 
l-istudju;  
— it-tessuti kollha li juru anormalitajiet makroskopi ċi; 
— it-tessuti mmirati jew tessuti li wrew bidliet relatati ma’ trattament 
fil-grupp ta’ do ża għolja, mill-annimali kollha fil-gruppi l-o ħra kollha 
ta’ doża; 
— fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi 
għandhom ikunu e żaminati.  
OSSERVAZZJONIJIET (FA ŻI TA’ KAR ĊINOĠENIĊITÀ)  
51. L-annimali kollha g ħandhom ikunu e żaminati g ħall-morbidità jew g ħall- 
mortalità, is-soltu fil-bidu u fit-tmiem ta’ kull jum, inklu żi fi tmiem 
il-ġimgħa u l-btajjel. L-annimali g ħandhom addizzjonalment ikunu 
eżaminati darba kuljum g ħal sinjali spe ċifiċi ta’ rilevanza tossikolo ġika. 
Fil-każ ta’ studji dwar gavage, annimali g ħandhom ikunu e żaminati 
fil-perjodu li ji ġi minnufih wara do żaġġ. Għandha ting ħata attenzjoni 
partikulari lil żvilupp ta’ tumuri; u g ħandu jiġi rreġistrat iż-żmien meta 
jfaqqgħu tumuri, post, dimensjonijiet, dehra u progressjoni ta’ kull tumur 
li jkun jidher sewwa u jista’ jintmess.  
52. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu meta jibda t-trattament, mill-anqas 
darba fil- ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull xahar minn 
hemm ‘il quddiem. Il-kejlijiet ta’ konsum ta’ ikel u ta’ effi ċjenza fl-ikel 
għandhom isiru mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u 
mill-anqas kull xahar minn hemm ‘il quddiem. Il-konsum tal-ilma g ħandu 
jitkejjel mill-anqas kull ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 
xahar minn hemm ‘il quddiem meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun ammin ­
istrata f’ilma tax-xorb. G ħandhom jitqies wkoll kejlijiet tal-konsum 
tal-ilma g ħal studji li fihom l-attività tax-xorb tinbidel.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Ematoloġija, bijokimika klinika u kejlijiet o ħra 
53. Biex jintla ħaq il-massimu tal-informazzjoni miksuba mill-istudju, spe ċ­
jalment g ħal konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni, ikunu jistg ħu 
jittieħdu kampjuni tad-demm g ħal ematolo ġija u bijokimika klinika, 
għalkemm dan ikun fid-diskrezzjoni tad-direttur tal-istudju. L-anali żi 
tal-awrina tista’ wkoll ikun adattata. Dejta dwar l-annimali u żati fil-fażi 
ta’ tossiċità kronika tal-istudju, li normalment iddum 12-il xahar (il- 
paragrafu 34) g ħandha tipprovdi informazzjoni dwar dawn il-parametri. 
Gwida ulterjuri dwar il-valur ta’ te ħid ta’ kampjuni b ħal dawn b ħala parti 
minn studju tal-kar ċinoġeniċità hija pprovduta fid-Dokument ta’ Gwida 
Nru 116 (7). Jekk jittie ħdu kampjuni tad-demm, dawn g ħandhom jin ġabru 
fit-tmiem tal-perjodu tat-test, e żatt qabel jew b ħala parti mill-pro ċedura 
għall-qtil tal-annimali. Huma g ħandhom jittie ħed minn sit imsemmi, 
pereżempju b’titqib kardijaku jew mis-sinus retroorbitali, b’anestesija. 
Jistgħu wkoll ikunu ppreparati ti ċpisiet għal eżami, partikolarment jekk 
ikun jidher li l-mudullun tal-g ħadam ikun l-organu mmirat, g ħalkemm 
il-valur ta’ e żami bħal dan ta’ ti ċpisiet tad-demm fil-fa żi ta’ karċinoġeniċità 
għall-valutazzjoni ta’ potenzjal kar ċinoġeniku/onko ġeniku huwa dubju ż (38).  
PATOLO ĠIJA 
Awtopsja makroskopika  
54. L-annimali kollha fl-istudju ħlief annimali sentinelli u annimali satellitarji 
oħra (ara l-paragrafu 20) g ħandhom ikunu sso ġġettati għal awtopsja makros ­
kopika sħiħa u dettaljata li tkun tinkludi e żami bir-reqqa tal-wi ċċ estern 
tal-ġisem, tal-fet ħiet kollha u tal-kavitajiet kranjali, tora ċiċi u abdominali u 
tal-kontenuti tag ħhom. L-annimali sentinelli u annimali satellitarji o ħra jista’ 
jkun jeħtiġilhom awtopsja abba żi ta’ każ każ, fid-diskrezzjoni tad-direttur 
tal-istudju. Pi żijiet ta’ organi ma jkunux normalment parti minn studju 
karċinoġenesi, min ħabba li bidliet ġerjatriċi u, fi stadji ta’ wara, l-i żvilupp 
ta’ tumuri t ħawwad l-utilità ta’ dejta dwar pi żijiet ta’ organi. Huma jistg ħu, 
iżda, ikunu importanti biex jittie ħed piż ta’ valutazzjoni ta’ evidenza u 
speċjalment g ħal konsiderazzjonijiet ta’ modalità ta’ azzjoni. Jekk ma 
jkunux parti minn studju satellitarju, huma g ħandhom jin ġabru mhux aktar 
tard minn sena wara l-bidu tal-istudju.  
55. It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu ppreservati fil-midjum ta’ fissazzjoni 
l-aktar adattat kemm g ħat-tip ta’ tessut, kif ukoll g ħall-eżami istopatolo ġiku 
maħsub sussegwentement (40) (tessuti f’parente żi kwadri huma fakultattivi): 
il-leżjonijiet kbar kollha qalb frixa stonku (il-parti quddimija 
tal-istonku, stonku glan ­
dolari) 
glandola adrenali ileu glandola tal-paratirojde [snien] aorta jejunum nerv periferali testikoli moħħ (inklużi taqsimiet ta ċ- 
ċerebru, ċervellett, u 
medulla/me żoċefalu) kliewi pitwitarja timu 
il-musrana l-g ħamja glandola tad-dmug ħ 
(straorbitali) prostata tirojde 
ċerviċi fwied il-musrana d-dritta [lsien] 
glandola tal-koagulazzjoni pulmun glandola tal-b żieq trakea 
il-musrana l- ħoxna nodi limfati ċi (kemm 
superfiċjali kif ukoll 
fondi) bużżieqa seminali bu żżieqa tal-awrina
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
duwodenu glandola mammarja 
(bilfors g ħan-nisa u, 
jekk dissettabbli b’mod viżibbli, għall-irġiel) muskolu skeletali utru (inklu ż ċerviċi) 
epididymis [sistema respiratorja ta’ 
fuq, inklu żi mnieħer, 
turbinati u sinus 
paranażali] ġilda [ureteru] 
għajn (inklu ża r-retina) esofagu nerv vertebrali (fi tlett 
livelli: ċervikali, 
midtoraċiku u lumbari) [uretra] 
[wirk bl-g ħaksa] [basla tax-xamm] milsa va ġina 
bużżieqa tal-marrara (g ħal 
speċijiet minbarra l-far) ovarju [sternu], taqsima tal-mudullun 
tal-għadam u/jew aspirat 
frisk tal-mudullun 
tal-għadam 
Glandola ta’ Harder
 
Fil-każ ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi g ħandhom 
ikunu ppreservati. Is-sejbiet klini ċi u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu l-ħtieġa li 
jkunu eżaminati tessuti addizzjonali. G ħandu wkoll ikun ippreservat kull 
organu li x’aktarx ikun meqjus b ħala organu mmirat abba żi 
tal-proprjetajiet mag ħrufa tal-kimika g ħall-ittestjar. Fi studji li jinvolvu 
r-rotta dermali ta’ amministrazzjoni, il-lista ta’organi kif stabbilita g ħar- 
rotta orali g ħandha tkun e żaminata, u jkunu me ħtieġa teħid ta’ kampjuni 
speċifiċi u preservazzjoni tal- ġilda mis-sit ta’ applikazzjoni. Fi studji ta’ 
inalazzjoni, il-lista ta’ tessuti ppreservati u e żaminati mis-sistema respiratorja 
għandha ssegwi r-rakkomandazzjonijiet tal-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness (8) 
u tal-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness (9). G ħal organi/tessuti o ħra (u b’żieda 
mat-tessuti ppreservati spe ċifikatament mis-sistema respiratorja) il-lista ta’ 
organi kif stabbilita g ħar-rotta orali g ħandha tkun e żaminata.  
Istopatolo ġija 
56. Hija disponibbli gwida dwar l-a ħjar prattiki fit-tmexxija ta’ studji dwar 
patoloġija tossikolo ġika (40). Il-minimu ta’ tessuti e żaminati g ħandu jkun:  
— It-tessuti kollha mill-gruppi ta’ do ża għolja u ta’ kontroll;  
— It-tessuti kollha ta’ annimali qed imutu jew li jkunu nqatlu matul 
l-istudju;  
— It-tessuti kollha li juru anormalitajiet makroskopi ċi inklużi tumuri;  
— Meta bidliet istopatolo ġiċi relatati ma’ trattament ikunu osservati 
fil-grupp ta’ do ża għolja, dawk l-istess tessuti g ħandhom ikunu 
eżaminati mill-annimali kollha fil-gruppi l-o ħra kollha ta’ do ża; 
— Fil-ka ż ta’ organi akkoppjati, e ż. kliewi, adrenali, i ż-żewġ organi 
għandhom ikunu ppreservati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DEJTA U RAPPURTAR (KAR ĊINOĠENIĊITÀ U TOSSI ĊITÀ 
KRONIKA)  
Dejta  
57. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwalment g ħall- 
parametri kollha evalwati. Addizzjonalment, id-dejta kollha g ħandha 
tinġabar fil-qosor f’forma tabulari li turi g ħal kull grupp tat-test l-g ħadd 
ta’ annimali fil-bidu tat-test, l-g ħadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta 
matul it-test jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani u l- ħin ta’ kull 
mewta jew qatla b’mod uman, l-g ħadd ta’ annimali li juru sinjali ta’ 
tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossi ċità osservati, inklu ż iż-żmien 
meta jibdew ifaqqg ħu, durata u severità ta’ kull effett tossiku, l-g ħadd ta’ 
annimali li juru le żjonijiet, it-tip ta’ le żjonijiet u l-per ċentwali tal-annimali li 
juru kull tip ta’ le żjoni. Tabelli ta’ sommarji ta’ dejta g ħandhom jipprovdu 
l-mezzi u d-devjazzjonijiet standard (g ħal dejta ta’ test kontinwu) ta’ 
annimali li juru effetti tossi ċi jew le żjonijiet, minbarra l-gradazzjoni 
tal-leżjonijiet.  
58. Dejta storika ta’ kontroll tista’ tkun siewja fl-interpretazzjoni tar-ri żultati 
tal-istudju, e ż., fil-każ meta jkun hemm indikazzjonijiet li d-dejta 
pprovduta mill-kontrolli konkurrenti tkun sostanzjalment diversa meta 
mqabbla ma’ dejta re ċenti minn annimali ta’ kontroll mill-istess fa ċilità/ 
kolonja tat-test. Dejta storika ta’ kontroll, jekk tkun evalwata, g ħandha 
tkun sottomessa mill-istess laboratorju, tkun tirrelata ma’ annimali 
tal-istess età u razza u ġġenerata matul il- ħames snin li jkunu ġew qabel 
l-istudju inkwistjoni.  
59. Meta jkunu applikabbli, ir-ri żultati numeri ċi għandhom ikunu evalwati 
b’metodu ta’ statistika ġeneralment a ċċettabbli u adattat. Il-metodi ta’ stat ­
istika u d-dejta li jkollha ti ġi analizzata g ħandhom jintg ħażlu matul it-tfassil 
tal-istudju (il-paragrafu 9). L-g ħażla għandha tipprovdi g ħal aġġustamenti ta’ 
sopravivenza, jekk ikun me ħtieġ. 
60. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— natura fi żika, purezza u proprjetajiet fi żikokimiċi; 
— dejta ta’ identifikazzjoni;  
— sors tal-kimika;  
— numru tal-lott;  
— ċertifikat tal-anali żi tal-kimika.  
Vejjikolu (fejn xieraq):  
— ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ vejjikolu (jekk ma jkunx ilma).  
Annimali tat-test:  
— speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-għażla magħmula;  
— għadd, età u sess tal-annimali fil-bidu tat-test;  
— sors, kundizzjonijiet ta’ abitazzjoni, dieta, e ċċ.; 
— piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— motiv g ħal rotta ta’ amministrazzjoni u g ħażla ta’ doża; 
— meta jkun applikabbli, il-metodi ta’ statistika u żati biex tkun analizzata 
d-dejta;  
— dettalji ta’ formulazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar/preparazzjoni tad-dieta;  
— dejta analitika dwar kon ċentrazzjoni miksuba, stabbiltà u omo ġeneità 
tal-preparazzjoni;  
— rotta ta’ amministrazzjoni u dettalji tal-amministrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar;  
— għal studji ta’ inalazzjoni, jekk hux l-imnie ħer jew il- ġisem kollu;  
— dożi attwali (mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/jum), u fattur ta’ konver żjoni minn 
konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (mg/kg jew ppm) ta’ dieta/ilma 
tax-xorb g ħad-doża attwali, jekk applikabbli;  
— dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma.  
Riżultati (għandhom ikunu ppre żentati sommarji tad-dejta tabulata u dejta 
dwar annimali individwali):  
Ġenerali  
— Dejta dwar sopravivenza;  
— Piż tal-ġisem/bidliet fil-pi ż tal-ġisem;  
— Konsum ta’ ikel, kalkulazzjonijiet ta’ effi ċjenza fl-ikel, jekk ikunu saru, 
u konsum tal-ilma jekk applikabbli;  
— Dejta tossikokinetika jekk disponibbli;  
— Oftalmoskopija (jekk disponibbli)  
— Ematolo ġija (jekk disponibbli)  
— Kimika klinika (jekk disponibbli)  
Sejbiet klini ċi 
— Sinjali ta’ tossi ċità; 
— Inċidenza (u, jekk bil-punti, severità) ta’ kull anormalità;  
— Natura, severità, u durata ta’ osservazzjonijiet klini ċi (jekk hux 
tranżitorji jew permanenti);  
Dejta dwar l-awtopsja  
— Piż terminali tal- ġisem;  
— Piżijiet ta’ organi u l-proporzjonijiet tag ħhom, jekk applikabbli;  
— Sejbiet minn awtopsji; in ċidenza u severità ta’ anormalitajiet.  
Istopatolo ġija 
— Sejbiet istopatolo ġiċi mhux neoplasti ċi, 
— Sejbiet istopatolo ġiċi neoplasti ċi, ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— Korrelazzjoni bejn sejbiet makroskopi ċi u mikroskopi ċi; 
— Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatolo ġiċi kollha relatati ma’ trat ­
tament inklu żi gradazzjonijiet ta’ severità;  
— Rapport ta’ kull evalwazzjoni bejn il-pari tas-slides  
Trattament ta’ statistika ta’ ri żultati, kif jixraq  
Diskussjoni dwar ri żultati inklu żi: 
— Diskussjoni dwar kull appro ċċ ta’ mudellar  
— Relazzjonijiet ta’ do ża-rispons  
— Dejta storika ta’ kontroll  
— Konsiderazzjoni ta’ kwalunkwe informazzjoni dwar il-modalità 
tal-azzjoni  
— Determinazzjoni ta’ BMD, NOAEL jew LOAEL  
— Rilevanza g ħall-bnedmin  
Konklużjonijiet  
LETTERATURA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.  
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity character ­
ization of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445  
(6) Il-Kapitolu B.27 ta’ dan l-Anness: Studju dwar Tossi ċità Orali dwar Do ża 
Ripetuta g ħal 90 Jum ta’ Test ta’ Subtossi ċità Kronika Orali f’Annimali 
Mhux Rodituri.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Il-Kapitolu B.8 ta’ dan l-Anness. Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subakuta: Studju 
ta’ 28 jum.  
(10) Il-Kapitolu B.29 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità tal-Inalazzjoni Subkronika: 
Studju ta’ 90 Jum.  
(11) Il-Kapitolu B.9 ta’ dan l-Anness, Tossi ċità (Dermali) ta’ Do ża Ripetuta (28 
Jum).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the 
Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modern ­
ization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.  
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. 
Toxicol. 36: 69-98.  
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the 
Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN u Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International 
Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279- 284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Id-Direttiva 2010/63/EU tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta’ 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal skopijiet 
xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and 
Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experi ­
ments. ISBN 3-906255-06-9.  
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.  
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity 
Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neur ­
otoxicol. Teratol. 13: 599-609.  
(38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(39) EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatot ­
oxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  TEST TA’ TOSSI ĊITÀ FUQ IR-RIPRODUZZJONI FUQ 
ĠENERAZZJONI WA ĦDA 
1. METODU  
1.1 INTRODUZZJONI  
Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.  
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.  
1.3 SUSTANZI G ĦAR-REFERENZA  
Xejn.  
1.4 PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza ittestjata hi somministrata f’do żi gradwati lil diversi 
gruppi ta’ nisa u r ġiel. L-irġiel għandhom ikunu iddo żati waqt li 
jkunu qed jikbru u g ħallinqas g ħal ċiklu spermato ġenetiku wie ħed 
(bejn wie ħed u ieħor 56 ġurnata għall-ġurdien u 70 ġurnata għall-far) 
sabiex joħroġ kwalunkwe effetti negattiv tas-sustanza ittestjata fuq l- 
ispermato ġenesi.  
Nisa tal-ġenerazzjoni parentali (P) g ħandhom ikunu iddo żati għal­
linqas għal żewġ ċikli totali ta’ sa ħna sesswali sabiex jo ħroġ 
kwalunkwe effett negattiv tas-sustanza ittestjata fuq din is-sa ħna 
sesswali. Imbag ħad l-annimali ji ġu mgħammra. Is-sustanza ittestjata 
tiġi somministrata li ż-żewġ sessi waqt il-perjodu ta’ tg ħammir u 
minn hemm ’il quddiem lin-nisa waqt it-tqala u g ħall-perjodu ta’ 
meta jkunu qed ireddg ħu mill-ħalib ta’ sidirhom. G ħall-amminis ­
trazzjoni permezz ta’ ġbid minn ġol-pulmuni, il-metodu jirrikjedi 
modifikazzjoni.  
1.5 KRITERJI KWALITATTIVI  
Xejn.  
1.6 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Preparazzjonijiet  
Qabel it-test, annimali zg ħazagħ u b’saħħithom huma assenjati kif 
ġie ġie fil-gruppi trattati u fil-gruppi ta’ kontroll. L-annimali huma 
miżmuma taħt kundizzjonijiet ta’ akkomodazzjoni u ikel g ħallinqas 
għal ħamest ijiem qabel it-test. Huwa rakkomandat li s-sustanza 
ittestjata tkun somministrata fid-dieta jew fl-ilma tax-xorb. Tipi 
oħra ta’ amministrazzjoni huma a ċċettabbli wkoll. L-annimali 
kollha għandhom ikunu iddo żati bl-istess metodu waqt il-perjodu 
sperimentali xieraq. Jekk jintu żaw xi sustanzi jew addittivi o ħrajn 
li jiffaċilitaw l-għoti tad-do ża, dawn g ħandhom ikunu mag ħrufa li ma 
jipproduċux effetti tossi ċi. L-għoti tad-do ża għandu jkun fuq ba żi ta’ 
sebat ijiem fil- ġimgħa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
A n n i m a l i s p e r i m e n t a l i  
Selection of species  
Il-far jew ġurdien huma l-ispe ċi preferuta. G ħandhom ikunu u żati 
annimali b’sa ħħithom li ma kienux su ġġetti għal proċeduri speri ­
mentali pre ċedenti. Razez b’fertilitá baxxa m’g ħandhomx ikunu 
użati. L-annimali ittestjati g ħandhom ikunu karatterizzati skond l- 
ispeċi, ir-razza, sess, pi ż u/jew etá.  
Għal valutazzjoni adegwata tal-fertilitá, kemm l-ir ġiel kif ukoll in- 
nisa għandhom ikunu studjati. Kull annimal g ħat-test u g ħall-kontroll 
għandu jkun fatmat qabel tibda ting ħata d-doża. 
Numru u sess  
Kull grupp trattat u ta’ kontroll g ħandu jkollu numru bi żżejjed ta’ 
annimali sabiex ikun hemm 20 mara tqila kwa żi lesta biex tixtri jew 
qrib. 
L-għan hu li hu li jkun hemm bi żżejjed tqala u frie ħ biex tkun 
assigurata valutazzjoni sinifikanti tal-potenzal li g ħandha s-sustanza 
biex taffettwa l-fertilitá, it-tqala u l-im ġieba maternali fl-annimali tal- 
ġenerazzjoni P u fl-annimali mhux miftumin, fl-i żvilupp u t-tkabbir 
ta’ frieħ ta’ l-F  1 mill-konċepiment sal-ftim.  
K u n d i z z j o n i j i e t t a t - t e s t  
Ilma u ikel g ħandhom ikunu provdut ad libitum. Meta jkunu vi ċin li 
jwelldu, in-nisa tqal g ħandhom ikunu mag ħluqa separatament 
f’gaġeġ għall-ħlas u jistg ħu jiġu provduti b’materjal biex jibnu il- 
bejta tagħhom.  
L i v e l l i t a ’ d o ż a 
Għandhom ji ġu użati għallinqas tliet gruppi trattati u wie ħed ta’ 
kontroll. Jekk tintu ża sustanza o ħra biex tkun somministrata s- 
sutsanza ittestjata, il-grupp ta’ kontroll g ħandu jirċievi din is- 
sustanza fl-g ħola volum u żata. Jekk sustanza ittestjata tikkaw ża 
tnaqqis fil-konsum tad-dieta, allura jista’ jkun ne ċessarju l-u żu ta’ 
grupp ta’ kontroll parallel. Idealment, sakemm mhux limitat bin- 
natura kimika/fi żika jew bl-effetti bijolo ġiċi tas-sustanza ittestjata, 
l-għola doża għandha tikka ġuna tossi ċità imma mhux mortalitá fl- 
annimali parentali (P). Id-do ża(i) intermedjarja(i) g ħandha tikka ġuna 
effetti tossi ċi minimi li jistg ħu jkunu attribwiti lis-sustanza ittestjata, 
u id-doża l-baxxa m’g ħandhiex tikka ġuna effetti negattivi osservabbli 
fuq il-ġenituri jew il-frie ħ. Meta somministrata permezz ta’ gavage 
jew kapsula, id-do ża mogħtija lil kull animal g ħandha tkun ibba żata 
fuq il-piż tal-ġisem ta’ l-annimal individwali u g ħandha tkun 
aġġustata kull ġimgħa minħabba tibdil fil-pi ż. Jekk mixtieq, fil-ka ż 
tan-nisa tqal, id-do żaġġi jistgħu jkunu ibba żati fuq il-pi ż tal-ġisem 
fil-ġurnata 0 jew 6 tat-tqala.  
T e s t l i m i t u  
Fil-każ ta’ sustanzi b'tossi ċità baxxa, jekk il-livell ta' do ża ta’ għal­
linqas 1 000 mg/kilogramm ma jipprodu ċix evidenza ta’ interferenza 
ma' l-imġieba riproduttiv, studji tad-do ża f'livelli o ħrajn jistgħu ma 
jiġux ikkunsidrati b żonnjużi. Jekk studju preliminari f’livell ta’ do ża 
qawwija, b’evidenza definite ta’ tossi ċità maternali, ma jurix effetti 
negattivi fuq il-fertilitá, studji tad-do ża f’livelli o ħra jistgħu ma jiġux 
ikkunsidrati b żonnjużi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Eżekuzzjoni tat-test  
S k e d i s p e r i m e n t a l i  
L-għoti tad-do ża ta' kuljum lill-ir ġiel parentali (P) g ħandu jibda meta 
jkollhom etá ta’ madwar ħames sa disa ġimgħat, war li jkunu 
infatmu u akklimatizzati ta’ l-iqas g ħal ħamest ijiem. G ħall-firien, 
l-għoti tad-do ża ikompli g ħal għaxar ġimgħat qabel il-perjodu ta’ 
tgħammir (tmien ġimgħat għal ġrieden). L-ir ġiel għandhom jinqatlu 
u eżaminati jew fit-tmiem tal-perjodu ta’ tg ħammir jew inkella dawn 
jinżammu fuq id-dieta tat-test g ħall-produzzjoni possibbli tat-tieni 
wild u g ħandhom jinqatlu u e żaminati ftit qabel it-tmiem ta' l- 
istudju. G ħal nisa parentali (P) l-g ħoti tad-do ża għandu jibda g ħal­
linqas wara ħamest ijiem ta’ akklimatizzazzjoni u jibqa’ sejjer 
almenu g ħal ġimgħatejn qabel it-tg ħammir. L-g ħoti ta’ kuljum tad- 
doża lin-nisa P g ħandu jibqa' sejjer matul it-tliet ġimgħat ta' 
tgħammir, it-tqala sal-ftim tal-frie ħ F 1 . Il-modifikazzjoni ta' l-iskeda 
ta' l-għoti tad-do ża fuq il-ba żi ta’ informazzjoni o ħra fuq is-sustanza 
ittestjat, b ħal induzzjoni tal-metaboli żmu jew bijo-akkumulazzjoni.  
P r o ċ e d u r a t a ’ t g ħ a m m i r  
Fl-istudju ta’ l-effetti tossi ċi fuq ir-riproduzzjoni jistg ħu jintużaw 
żewġ tipi ta’ tg ħammir, jew tg ħammir 1:1 (ra ġel wieħed għal mara 
waħda) jew 1:2 (ra ġel wieħed għal żewġ nisa).  
Ibbażat fuq tgħammir 1:1, mara wa ħda għandha titpo ġġa ma’ l-istess 
raġel sakemm ma sse ħħ riproduzzjoni jew ikunu g ħaddew tliet 
ġimgħat. Kull filg ħodu in-nisa g ħandhom ikunu e żaminati g ħall- 
preżenza ta’ sperma jew ta’ tappijiet va ġinali. Il-ġurnata 0 tat-tqala 
hi definita b ħala l-ġurnata meta jinstab tapp va ġinali jew tinstab l- 
isperma.  
Dawk il-pari li ma jitg ħammrux g ħandhom ikunu evalwati sabiex ti ġi 
definita l-kaw ża tan-nuqqas ta’ fertilitá apparenti.  
Jista’ jkun li din il-valutazzjoni tinvolvi pro ċeduri bħal li jiġu 
provduti opportunitajiet o ħra sabiex jitg ħammru ma' nisa jew ir ġiel 
oħra, eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi riproduttivi, u e żami­
nazzjoni ta ċ-ċiklu ta' sa ħna sesswali jew ta’ spermato ġenesi.  
D a q s i j i e t t a l - g r u p p i t a ’ u l i e d / f r i e ħ 
Annimali li ing ħatatilhom id-do ża waqt l-istudju tal-fertilitá huma 
permessi li jwelldu normalment u jrabbu l-frie ħ tagħhom sa l- 
istadju tal-ftim ming ħajr standardizzazzjoni tal-gruppi ta’ ulied/frie ħ. 
Fejn issir standardizzazzjoni, il-pro ċedura sussegwenti hi rakkom ­
andata. Bejn l-1 u r-4 ġurnata wara t-twelid, id-daqs ta' kull grupp 
ta’ ulied/frie ħ jista’ jkun irran ġat billi jkunu eliminati i ż-żgħar żejda 
b'tali mod li jkun hemm sa fejn hu possibbli, erba' subien u erbg ħat 
ibniet kull grupp ta' ulied/frie ħ. Fejn in-numru ta' frie ħ subien jew 
bniet jipprevenu milli jkun hemm erba' minn kull sess g ħal kull 
grupp ta' ulied, hu a ċċettabbli arran ġament parzjali (per e żempju, 
ħames subien u tlett ibniet). L-arran ġamenti m'humiex applikabbli 
għall-gruppi ta' ulied/frie ħ ta' inqas minn tmien frie ħ. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
O s s e r v a z z j o n i j i e t  
Matul dan il-perjodu tat-test, kull animal g ħandu jkun osservat g ħal­
linqas darba kuljum. Tibdil relevanti fl-im ġieba, sinjali ta’ diffikultá 
jew titwil tal-pro ċess tat-twelid u kull sinjal ta’ tossi ċità, inklu ż il- 
mortalitá g ħandhom ikunu irre ġistrati. Waqt il-perjodi ta’ qabel it- 
tgħammir u tat-tg ħammir, il-konsum ta’ l-ikel jista’ jkun imkejjel 
kuljum. Wara t-twelid u waqt it-treddig ħ, il-kejl tal-konsum ta’ l- 
ikel (u ta’ l-ilma meta s-sustanza ittestjata hi somministrata permezz ta’ l-ilma tax-xorb) g ħandu jittie ħed fl-istess ġurnata meta jinti żnu it- 
trabi l-ġodda. Irġiel u nisa P g ħandhom jinti żnu fl-ewwel ġurnata ta’ 
l-għoti tad-do ża u minn hemm ‘il quddiem kull ġimgħa. Dawn l- 
osservazzjonijiet g ħandhom ji ġu rreġistrati individwalment g ħal kull 
animal adult.
 
It-tul tat-tqala g ħandu jkun ikkalkulat mill- ġurnata 0 tat-tqala. Kull 
grupp ta’ ulied/frie ħ għandu jkun e żaminat kemm jista’ jkun malajr 
wara l-ħlas sabiex ji ġi stabbilit in-numru u s-sess tal-frie ħ, il-frieħ li 
twieldu mejta u dawk li twieldu ħajjin, u l-pre żenza ta’ anomaliji 
kbar.  
Il-frieħ mejta u dawk sagrifikati g ħandhom ikunu preservati u 
studjati g ħal xi difetti possibbli. Frie ħ ħajjin għandhom jing ħaddu 
u jintiżnu il-gruppi ta’ frie ħ fl-għodwa ta’ wara t-twelid, fir-4 u s-7 
ġurnata kif ukoll kull ġimgħa minn hemm ‘il quddiem sat-tmiem ta’ 
l-istudju, meta l-annimali g ħandhom jinti żnu individwalment.  
Anormalitajiet fi żiċi kif ukoll fl-im ġieba osservati fl-ommijiet jew fil- 
frieħ għandhom ji ġu rreġistrati.  
P a t o l o ġ i j a 
A w t o p s j a  
Fil-ħin tas-sagrifi ċċju jew tal-mewt waqt l-istudju, l-annimali tal- 
ġenerazzjoni P g ħandhom ji ġu eżaminati makroskopikament g ħal 
kwalunkwe anormalitajiet strutturali jew kambjamenti patolo ġiċi, 
b’attenzjoni spe ċjali tingħata lill-organi tas-sitema riproduttiva. 
Frieħ mejta jew moribondi g ħandhom ji ġu eżaminati g ħad-difetti.  
I s t o p a t o l o ġ i j a 
L-ovarji, l-utru, i ċ-ċerviċi, il-vaġina, it-testikoli, il-kanali twal ta’ 
wara l-bajd minn fejn tg ħaddi l-isperma, il-b żieżaq seminali, il- 
prostata, il-glandola li tag ħqqad, glandola pitwitarja u l-organu(i) 
immirati ta’ l-annimali P kollha g ħandhom ikunu preservati g ħal 
eżaminazzjoni mikroskopika. Fl-eventwalitá li dawn l-organi ma 
kinux eżaminati fi studji o ħrajn b’do ża multipla, dawn, fejn hu 
possibbli, g ħandhom ikunu e żaminati mikroskopikament fl-annimali 
kollha fil-gruppi trattati b’do ża għolja u fil-gruppi ta’ kontroll u 
f’annimali li jmutu waqt l-istudju.  
Organi, f’dawn l-annimali, li juru anormalitajiet, imbag ħad, 
għandhom ikunu e żaminati fl-annimali P l-o ħra kollha. F’dawn il- 
każijiet, għandha ssir e żaminazzjoni mikroskopika tat-tessuti kollha li 
juru kambjamenti patolo ġiċi kbar. Kif su ġġerit fil-pro ċeduri ta’ 
tgħammir, l-organi riproduttivi ta’ l-annimali suspettati b’infertilitá 
jistgħu jkunu su ġġetti għal eżaminazzjoni mikroskopika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DATA  
Id-data tista’ tkun mi ġbura fil-qosor f’forma tabulari, fejn g ħandhom 
jiġu murija in-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test f’kull grupp, in- 
numru ta’ r ġiel fertili, in-numru ta’ nisa tqal, it-tipi ta’ kambjamenti 
u l-persenta ġġ ta’ annimali li juru kull tip ta’ kambjament.  
Fejn hu possibbli, ir-ri żultati numeri ċi għandhom ji ġu evalwati 
b'metodu ta' statistika xieraq. kwalunkwe metodu ta' statistika aċċettat jista’ jintu ża
 
3. RAPPURTA ĠĠ 
3.1 RAPPORT TAT-TEST  
Jekk possibbli, ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni 
sussegwenti:  
— speċi/razza użata; 
— data tar-rispons tossiku skond is-sess u d-do ża, inkluż il-fertilitá, 
it-tqala u l- vijabilità;  
— il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali g ħex sal-ħin 
tas-sagrifi ċċju skedat jew sat-tmiem ta’ l-istudju;  
— tabella li turi il-pi ż ta’ kull grupp ta’ wlied, il-fer ż medju u l- 
piżijiet individwali tal-frie ħ fit-tmiem l-istudju;  
— effetti tossi ċi fuq ir-riproduzzjoni, fuq il-frie ħ u l-iżvilupp wara t- 
twelid;  
— il-ġurnata ta’ meta ġie osservat kull sinjal anormali u l-im ġieba 
sussegwenti tieg ħu; 
— id-data ta’ pi ż tal-ġisem għall-annimali P;  
— sejbiet nekroskopi ċi; 
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet mikroskopi ċi kollha;  
— trattament statistiku tar-ri żultati, fejn xieraq;  
— diskussjoni tar-ri żultati;  
— interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3.2 VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI  
Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.  
4. REFERENZI  
Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  STUDJU TAT-TOSSI ĊITÀ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ 
ĠENERAZZJONIJIET  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika g ħal OECD TG 416 (2001)  
1.1 INTRODUZZJONI  
Dan il-metodu g ħal testijiet riproduttivi fuq żewġ ġenerazzjonijiet 
huwa iddisinjat li jipprovdi informazzjomni ġenerali li tikkon ċerna 
l-effetti tas-sustanza tat-test fuq l-integrità u l-im ġieba tas-sistemi 
riproduttivi ta' l-ir ġiel u n-nisa, inklu ża l-funzjoni gonadali, i ċ-ċiklu 
ta' l-estru, l-im ġieba tat-tg ħammir, il-kon ċepiment, il- ġestazzjoni, il- 
parturazzjoni, il-lattazzjoni, u l-ftim, u it-rtkabbir u l-i żvilupp tal- 
wild. L-istudju jista’ wkoll jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti 
tas-sustanza tat-test fuq il-morbidità ta' frie ħ għadhom jitwieldu, il- 
mortalità, u d-dettalji preliminarji fuq l-i żvilupp tossiku ta' qabel it- 
twelid u ta' wara t-twelid u jservi b ħala gwida g ħal testijiet susseg ­
wenti. B' żieda ma l-istudju tat-tkabbir u l-i żvilupp tal- ġenerazzjoni 
F1, dan il-metodu tat-test huwa wkoll inti ż li jassessja l-integrità u l- 
imġieba tas-sistemi riproduttivi maskili u femminili kif ukoll it- 
tkabbir u l-i żvilupp tal- ġenerazzjoni F2. G ħal aktar informazzjoni 
dwar l-iżvilupp tossiku u d-defi ċjenzi funzjonali, jew partijiet 
addizzjonali ta' l-istudju jistg ħu inkorporati f'dan il-protokoll, 
b'konsulta mal-metodi tat-tossi ċità ta' l-i żvilupp u/jew in-newrot ­
assiċità ta' l-i żvilupp kif xieraq, jew inkella dawk il-miri finali 
jistgħu ikunu studjati fi studji separati, bl-u żu ta' metodi xierqa tat- 
test. 
1.2 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test hija somministrata f'do żi gradwali lil diversi 
gruppi maskili u femminili. L-ir ġiel tal-ġenerazzjoni P g ħandhom 
ikollhom id-do ża waqt li jkunu jikbru u g ħal mill-anqas ċiklu spera ­
toġenetiku s ħiħ wieħed (madwar 56 jum fil- ġrieden u 70 jum fil- 
firien) sabiex ikunu misjuba l-effetti ħżiena fuq l-ispermato ġeneżi. L- 
effetti fuq l-isperma huma determinati bin-numru ta' parametri ta' l- isperma (e ż. mortfolo ġija u l-motilità ta' l-isperma) u l-preparazzjoni 
tan-nisġiet u ħistopatolo ġija dettaljata. Jekk dettalji dwar l-ispermato ­ 
ġeneżi jkunu disponibbli minn studju pre ċedenti dwar do ża repetuta 
ta' tul ta' żmien suffui ċjenti, eż. studju ta' 90 jum, l-ir ġiel tal-ġener­
azzjoni P m'humiex me ħtieġa li jkunu nklu żi fl-evalwazzjoni. Huwa 
rakkommandabbli, b'dana kollu, li l-kampjuni jew ir-re ġistrazzjoni 
diġitali ta' l-isperma tal- ġeberazzjoni P jkunu ma ħżuna, sabiex jiff ­
aċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem. Femminili tal- ġenerazzjoni P 
għandhom ikollhom id-do ża matul it-tkabbir u g ħal diversi 
ċikli 
sħaħ ta' l-estru sabiex ikunu żvelati xi effetti ħżiena fuq in- 
normalità ta ċ-ċiklu ta' l-estru mis-sustanza tat-test. Is-sustanza tat- 
test hija somministrata lill-annimali parenti (P) matul it-tg ħammir, 
matul it-tqala ri żultanti, u matul il-ftim tal-wild tag ħhom F1. Fil- 
ftim, l-amministrazzjoni tas-sustanza jitkompla lejn il-wild 
F1 matul it-tkabbir tag ħhom lejn il-maturità, it-tg ħammir u l- 
produzzjoni tal- ġenerazzjoni F2, sakemm il- ġenerazzjoni F2 tkun 
imfattma.  
Osservazzjonijiet klini ċi u l-eżaminazzjonijiet patolo ġiċi huma 
mwettqa fuq l-annimali kollha g ħal sinjali tat-tossi ċità b'emfasi 
speċjali dwar l-effetti fuq l-integrità u l-im ġieba tas-sistemi ripro ­
duttivi maskili u femminili u dwar it-tkabbir u l-i żvilupp tal-wild 
tagħhom. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.3.1  L-g ħażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
Il-far huwa l-ispe ċje preferut g ħat-testijiet. Jekk ikunu u żati speċje 
oħrajn, ġustifikazzjoni g ħandha tkun mog ħtija u l-modifika xierqa 
ikunu me ħtieġa. Tipi b'fekundità baxxa jew li huma sew mag ħrufa 
li għandhom in ċidenza għolja ta' difetti fl-i żvilupp m'g ħandhomx 
ikunu użati. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż ta' l-annimali 
użati għandha tkun minima u ma te ċċedix 20 % tal-pi ż medju ta' kull 
sess. 
1.3.2  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 
22 o C (± 3  o C). Għalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill- 
anqas 30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it- 
tindif tal-kamra, l-g ħand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu 
jkun artifi ċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa 
dlam. G ħall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu 
ikunu użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-g ħażla 
tad-dieta tista’ tkun influwenzata bil- ħtieġa li tkun assigurata inter- 
taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta somministrata b'dan il- 
metodu.  
L-annimali jistg ħu jinżammu individwalment jew li jkunu f'ga ġġa 
bħala grupp żgħir ta' l-istess sess. Il-pro ċeduri ta' l-akkompanjament 
għandhom jitwettqu f'ga ġġeg adatti g ħal dak l-iskop. Wara l- 
evidenza tal-kopulazzjoni, in-nisa mg ħammra g ħandhom jinzammu 
waħda kull ga ġġa fil-gaġġeg tal-maternità sa kemm iwelldu. Firien 
mgħammra jistg ħu wkoll jin żammu fi gruppiu żgħat u imbag ħad 
ikunu separati minn jum sa tnejn qabel il-parturazzjoni. L-annimali mgħammra għandhom ikunu ipprovduti bil-materjali xierqa u definiti 
sabiex ikunu jistg ħu jippreparaw il-bejta, meta l-parturazzjoni tkun 
fil-qrib.
 
1.3.3  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali b'sa ħħithom, li jkunu ġew akklamatizzati g ħall- 
kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal mil anqas 5 ijiem u li ma 
jkunux ġew suġġetti għal proċeduri pre ċedenti sperimentali, 
għandhom ikunu u żati. L-annimali tat-test g ħandhom ikunu karatter ­
izzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, pi ż u/jew l-età. Kwalunkwe 
relazzjonijiet bejn l-a ħwa fost l-annimali g ħandha tkun mag ħrufa 
sabiex it-tg ħammir bejn l-a ħwa jkun evitat. L-annimali g ħandhom 
ikunu assenjati kif jinzerta lejn il-grupp tal-kuntroll u tat-trattament 
(stratifikazzjoni bil-pi ż tal-ġisem hija rakkommandabbli). Il-ga ġġeġ 
għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli min ħabba t- 
tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal g ħandu jkun 
assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. G ħall-ġenerazzjoni P, 
dan għandu jsir qabel ma tibda d-do ża. Għall-ġenertazzjoni F1, 
dan għandu jsir mat-ftim ta' dawk l-annimali li jkunu mag ħżula 
għat-tgħammir. Re ġistri li jindikaw l-origini tal-botom g ħandhom 
jinżammu għall-annimali F1 kollha mag ħżula. B'żieda, identifi ­
kazzjoni individwali tal-frie ħ malajr kemm jista’ jkun possibbli 
malli jitwieldu hija rakkommandabbli, meta l-u żin tal-frie ħ indi­
vidwali jew tat-testijiet funzjonali jkunu ikkonsidrati.  
L-annimali parenti (p) g ħandhom ikunu f'età ta' madwar 5 sa 9 
ġimgħat qabel il-bidu tad-do ża. L-annimali tal-gruppi kollha tat-test 
għandhom, kemm jista’ jkun prattikabbli, ikunu ta' pi ż u età 
uniformi.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 PRO ĊEDURA  
1.4.1  In-numru u s-sess ta' l-annimali  
Kull grupp tat-test u tal-kontroll g ħandu jinkludi numru suffi ċjenti ta' 
annimali sabiex iforni, preferibbilment mhux anqas minn 20 mara 
tqila, jew qrib tal-parturazzjoni. G ħal sustanzi li jikka ġunaw effetti 
mhux mixtieqa kif relatati mat-trattament (e ż. sterilità, tossi ċità 
eċċessiva f'do ża għolja), dan jista’ ma jkunx possibbli. L-g ħan 
huwa li jipprodu ċi tqalat bi ż-żejjed sabiex jassiguraw evalwazzjoni 
li tagħmel sens dwar il-potenzal tas-sustanza li taffettwa l-fertilità, it- 
tqala jew l-im ġieba materna u wkoll l-irdieg ħ, it-tkabbir u l-i żvilupp 
tal-wild F1 mill-kon ċepiment sal-maturità, u l-i żvilupp tal-botom 
tagħhom (F2) sa kemm ikunu mfattma. G ħalhekk, nuqqas li jkun 
milħuq in-numru mixtieq ta' annimali tqal (i.e. 20) mhux ne ċess­
arjament ji żvalida l-istudju u g ħandu jkun evalwat fuq il-ba żi ta' 
każ b'każ. 
1.4.2  Preparazzjoni tad-do żi 
Huwa rakkommandat li s-sustanza tat-test tkun somministrata 
oralment (ma l-ikel, ma l-ilma tax-xorb, jew b'ikel sfurzat) sakemm rotta oħra ta' l-amministrazzjoni (e ż. dermali jew man-nifs) tkun 
ikkonsidrata aktar xierqa.
 
Meta meħtieġ, is-sustanza tat-test tkun imdewwba jew sospi ża f'mezz 
xieraq. Huwa rakkommandat li, kull meta possibbli, l-u żu ta' taħlita/­
sospenzjoni akwea tkun meqjusa b ħala l-ewwel g ħażla, sewgeita bil- 
kunsiderazzjoni ta' ta ħlita/emulsjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħirrum) 
w imbag ħad b'xi ta ħlita oħra f'mezzi o ħrajn. Għal likwidi o ħrajn 
apparti milli l-ilma, il-karatteristi ċi tossikolo ġiċi tal-likwidu 
għandhom ikunu mag ħrufa. L-istabbilità tas-sustanza tat-test fil- 
mezz għandha tkun determinata.  
1.4.3  Id-Do ża 
Mill-anqas tlett livelli ta' do żi u l-kontroll simultanju g ħandhom 
ikunu użati. Sakemm ma tkunx limitata bin-natura fi żiko-kimika 
jew fl-effetti biolo ġiċi tas-sustanza tat-test, l-g ħola livell ta' do ża 
għandu jkun mag ħżul bil-għan li jindu ċi tossiċità imma mhux il- 
mewt jew xi sofferenza qawwija. Fil-ka ż ta' mewt mhux mistennija, 
l-istudji b'rata ta' mortalità ta' anqas minn madwar 10 fil-mijja fl- annimali parentali (P) tkun normalment xorta wa ħda aċċettabbli. 
Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-do ża għandha tkun mag ħżulha 
bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-do ża u l-livell ta' l- 
ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli 
huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-do ża dixxen­
denti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill- 
użu ta' intervalli ferm twal (e ż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-do żi. 
Għal-studju djetarji, l-ibtervall tad-do ża m'għanduk ikun ta' aktar 
minn tlett darbiet. Il-livelli tad-do ża għandhom ikunu mag ħżula 
billi tkun meqjusa l-informazzjoni e żistenti tat-tossi ċità, speċjalment 
ir-riżultati minn studji repetuti tad-do ża. Kwalunkwe informazzjoni 
disponibbli dwar il-mataboli żmu u l-kinetiki tal-kompost tat-test jew 
tal-materjali relatati g ħandhom ukoll ikunu ikkunsidrati. Din l-info ­
mazzjoni g ħandha wkoll tg ħin fid-demostrazzjoni ta' l-adekwatezza 
ta' L-amministrazzjoni tad-do żar. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Dan il-grupp g ħandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz 
ta' grupp ta' kontroll jekk mezz ikun u żat fl-amministrazzjoni tas- 
sustanza tat-test. Apparti milli g ħat-trattament bis-sustanza tat-test, l- 
annimali fil-grupp tal-kontroll g ħandhom ukoll ikunu mqandla 
b'manjera identika g ħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ikun u żat 
mezz, il-grupp tal-kontroll g ħandu jirċievi il-mezz fl-g ħola volum 
użat. Jek sustanza tat-test hija somministrata ma l-ikel, u to ħloq 
tnaqqis ta' l-ammont djetarju jew ta' l-utilizzazzjoni, allura l-u żu ta' 
grupp ta' kontroll mitmug ħa bħala par jista’ jkun ikkunsidrat b ħala 
meħtieġ. L-informazzjoni alternattiv minn studji tal-kontroll iddis ­
injati għall-evalwazzjoni ta' l-effetti ta' konsum imnaqqas ta' l-ikel 
fuq il-parametri riproduttivi tista’ tkun u żata minflok il-grupp 
konkorrenti li jkunu mitmug ħa bħala par.  
Konsiderazzjoni g ħandha tkun mog ħtija lil dawn il-karatteristi ċi li 
ġejjin dwar il-mezz jew xi addittivi o ħrajn: l-effetti fuq l-assor ­
bazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu, u ż-żamma jew it- 
twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimi ċi tas- 
sustanza tat-test li jistg ħu joħolqu bidla fil-karatteristi ċi tossiċi 
tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ilma jew ta' l-istat 
nutrizzjonali ta' l-annimali.  
1.4.4  Test tal-limitu  
Jekk studju orali f'livell ta' do ża waħda ta' mill-anqas 1 000 mg/kg 
piż tal-ġisem/kull jum jew, g ħall-amministrazzjoni ta' l-ikel jew ilma 
tax-xorb, persenta ġġ ekwivalenti fid-dieta jew fl-ima tax-xorb bl-u żu 
tal-proċeduri deskritti g ħal dan l-istudju, ma jipprodu ċu l-ebda effetti 
tossiċi osservabbli la fl-annimali parentali u l-anqas fil-wild tag ħhom 
u jekk it-tossi ċità ma tkunx mistennija kif ibba żata fuq informazzjoni 
minn komposti strutturament u/jew metabolikament relatati, allura 
studju sħiħ bl-użu ta' diversi livelli tad-do ża jistgħu ikunu meqjusa 
bħala mhux me ħtieġa. It-test tal-limitu huwa applikabbli apparti minn 
meta l-eposizzjoni umana tindika il- ħtieġa għal doża orali għola fil- 
livell użat. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, b ħal ma hija l- 
applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fi żiko-kimiċi tas- 
sustanza tat-test, b ħal kemm tin ħall, ta' spiss tista’ tindika u tillimita 
l-livell massimu attenibbli ta' l-espo żizzjoni.  
1.4.5  Amministrazzjoni tad-do żi 
L-annimali g ħandhom jing ħataw id-do ża bis-sustanza tat-test fuq il- 
bażi ta' 7-ijiem-fil- ġimgħa. Ir-rotta orali ta' l-amministrazzjoni (ma l- 
ikel, fl-ilma tax-xorb, jew bi tmieg ħ sfurżat) hija preferuta. Jekk rotta 
oħra ta' l-amministrazzjoni hija u żata, ġustifikazzjoni g ħandha tkun 
ipprovduta, u l-modifika xierqa jistg ħu ikunu me ħtieġa. L-annimali 
kollha għandhom jing ħataw id-do ża bl-istess metodu matul il-perjodu 
sperimentali kif xieraq. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata bi tmiegħ sfurzat, dan g ħandu jsir bl-u żu ta' tubu ta' l-istonku. Il-volum 
ta' likwidu amministrat f'darba wa ħda m'għandux jeċċedi 1 ml.100 g 
piż tal-ġisem (4,4 ml/100 g pi ż tal-ġisem huwa l-massimu g ħaż-żejt 
tal-qamħ-ir-rum), apparti milli fil-ka ż ta' taħlitiet akweji meta 
2 ml/100 g pi ż tal-ġisem jista’ jkun u żat. Apparti milli g ħal 
sustanzi irritanti jew korrossivi, li normalment ikununji żvelaw 
effetti eżasperanti b'kon ċentrazzjonijiet g ħola, varjabbilità fil-volum 
tat-test għandha tkun minimizzata bl-a
ġġustament tal-kon ċentrazzjoni 
sabiex tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. Fl-istudju 
bit-tmiegħ sfurzat, il-frie ħ ikunu normalment jir ċievu biss is-sustanza 
tat-test b'mod inderett minn meta jkunu jerdg ħu, sakemm id-do ża 
diretta tkun tibda g ħalihom meta jkunu miftuma. Fl-istudji tat-dieta 
jew ta' l-ilma tax-xorb, il-frie ħ ikunu addizzjonalment jir ċievu s- 
sustanza tat-test direttament meta huma jibdew jieklu wa ħedhom 
matul l-aħħar ġimgha tal-perjodu tal-lattazzjoni.G ħal sustanzi ammin ­
istrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test kif involuti ma 
jkunux jinterferixxu nat-nutriment normali jew mal-bilan ċ ta' l- 
ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata fid-dieta, kon ċen­
trazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' do ża kostanti f'termini 
tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal, jista’ jkun u żat; il-mod alternattiv u żat 
għandu jkun spe ċifikat. G ħal sustanza somministrata bi tmieg ħ 
sfurzat, id-do ża għandha tkun mog ħtija
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
f'ħinijiet simili ta' kull jum, u a ġġustata mill-anqas darba fil- ġimgħa 
sabiex jin żamm livell kostanti ta' do ża f'termini tal-pi ż tal-ġisem ta' l- 
annimal. Informazzjoni rigward id-distribuzzjoni pla ċentali għandha 
tkun ikkonsidrata meta tkun a ġġustata d-do ża fi tmieg ħ sfurzat 
ibbażżata fuq il-pi ż. 
1.4.6  Skedi sperimentali  
Id-doża ta' kull jum ta' l-ir ġiel u n-nisa parentali (P) g ħandha tibda 
meta dawn ikollhom età ta' 5 sa 9 ġimghat. Id-do ża ta' kull jum fl- 
irġiel u n-nisa F1 g ħandha tibda meta jkunu miftuma; din g ħandha 
tkun imfakkra fil-ka żi ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test 
permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, espo żizzjoni diretta tal- 
frieħ F1 għas-sustanza tat-test tista’ di ġa tkun se ħħet matul il- 
perjodu tal-lattazzjoni. G ħaż-żewġ sessi (P u F1), id-do ża għandha 
tibqa għal mill-anqas 10 ġimghat qabel il-perjodu tat-tg ħammir. Id- 
doża tinżamm kontinwa g ħaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta' 
ġimgħatejn waqt it-tg ħammir. L-irgiel g ħandhom ikunu maqtula 
b'mod umanesk u e żaminati meta ma jkunux aktar me ħtieġa għall- 
assessjar ta' l-effetti riproduttivi.  
Rigward in-nisa parentali (P), id-do ża għandha tin żamm kostanti 
matul it-tqala u sal-ftim tal-frie ħ F1. Konsiderazzjoni g ħandha 
tingħata għall-modifiki fl-iskeda tad-do ża ibbażati fuq l-inform ­
azzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test, inklu żi d-dettalji 
eżistenti tat-tossi ċità, l-induzzjoni tal-metaboli żmu jew tal-bio- 
akkumulazzjoni. Id-do ża lil annimali individwali g ħandha norm ­
alment tkun ibba żata fuq id-determinazzjoni tal-pi ż tal-ġisem kif l- 
aktar riċenti disponibbli. B'dana kollu, attenzjoni g ħandha tkun e żer­ 
ċitata meta tkun a ġġustata d-do ża matul l-a ħħar parti tremestra tat- 
tqala. It-trattament ta' l-ir ġiel u n-nisa P u F1 g ħandha tibqa sat- 
terminu.L-ir ġiel u n-nisa P u F1 adulti kollha g ħandhom ikunu 
maqtula b'mod umanesk meta ma jkunux aktar me ħtieġa dwar l- 
assessjar ta' l-effetti riproduttivi. Il-frie ħ F1 mhux mag ħżula għat- 
tgħammir u l-frie ħ kollha F2 g ħandhom ikunu maqtula b'mod 
umanesk wara li jkunu nfatmu.  
1.4.7  Pri ċedura tat-tg ħammir  
1.4.7.1  It-tg ħammir parentali (P)  
Għal kull tg ħammir, kull mara g ħandha tkun imqieg ħda ma ra ġel 
wieħed mill-istess livell ta' do ża (tgħammir 1: 1) sakemm ise ħħ il- 
kopulazzjoni jew wara li jkunu skadew 2 ġimghat. Ta' kull jum, in- 
nisa għandhom ikunu e żaminati g ħall-preżenza ta' sperma jew ta' buq 
vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala huwa definit b ħala l-jum ta' meta tapp 
vaġinali jew sperma jkunu misjuba. Fil-ka ż li l-par ma jirnexxix, it- 
tgħammir mill- ġdid ta' nisa ma r ġiel diġa ippruvari ta' l-istess grupp 
jista’ jkun ikkunsidrat. Pari mg ħammra għandhom ikunu kjarament 
identifikati f'dik id-data. It-tg ħammir ta' a ħwa għandu jkun evitat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2  Tgħammir F1  
Għat-tgħammir ta' l-ulied F1, mill-anqas ra ġel wieħed u mara wa ħda 
għandhom ikunu mag ħżula mal-ftiem minn kull boton g ħal tgħammir 
ma frieħ oħrajn ta' l-istess livell ta' do ża imma minn boton differenti, 
sabiex jipprodu ċu l-ġenerazzjoni F2. L-g ħażla tal-frie ħ minn kull 
boton għandha tkun kif jinzerta meta l-ebda differrenzi sinifikanti 
ma jkunu osservati fil-pi ż tal-ġisem jew fid-dehra, bejn is-sie ħba 
fl-istess botom. Fil-ka ż li differrenzi jkunu osservati, la ħjar rapreżent­
attivi minn kull botom g ħandhom ikunu mag ħżula. B'mod prag ­
matiku, dan la ħjar isir fuq il-ba żi tal-piż tal-ġisem imma jista’ jkun 
aktar xieraq fuq il-ba żi ta' l-apparenza. Il-wild F1 m'g ħandux ikun 
mgħammar sakemm ikunu la ħqu l-maturità sesswali kollha. Pari 
mingħajr proġenità għandhom ikunu evalwati sabiex tkun deter ­
minata l-kaw ża apparenti ta' l- infertilità. Dan jista’ jinvolvi tali 
proċeduri bħala opportunitajiet addizzjonali saniex jitg ħammru ma 
nisa jew ir ġiel oħrajn li di ġa kienu taw provam b'e żaminazzjoni 
mikroskopika ta' l-organi riproduttivi, u l-e żaminazzjoni ċikli ta' l- 
eteru jew ta' l-ispermato ġeneżi. 
1.4.7.3  It-tieni tg ħammir  
F'ċerti okka żżjonijiet, b ħala ma huma aterazzjoni relatati mat-trat ­
tament fid-daqs tal-botom jew fl-osservazzjoni ta' effett ekwivoku 
fl-ewwel tg ħamir, huwa rakkommandabbli li l-adulti P jew F1 
ikunu mg ħammra mill- ġdid sabiex jipprodu ċu it-tieni botom. Huwa 
rakkommandabbli li jkunu mg ħammra mill- ġdid in-nisa u l-ir ġiel, li 
ma jkunux ipprodu ċew botom meta mg ħammra ma o ħrajn diġa bi 
prova mis-sess oppost. Jekk il-produzzjoni tat-tieni botom tkun 
meqjusha b ħala meħtieġa f'waħda mill-ġenerazzjonijiet, l-annimali 
għandhom ikunu m, g ħammra mill- ġdid fi żmien madwar ġimgħa 
wara l-ftim ta' l-a ħħar botom.  
1.4.7.4  Id-daqs tal-botom  
L-annimali g ħandhom jit ħallew li jipprodu ċu l-botom b'mod normali 
u li jkabbru t-tfal tag ħhom sal-ftim. Standardizzazzjoni tad-daqs tal- 
botom hija volontarja. Meta ssir l-istandardizzazzjoni, il-metodu u żat 
għandu jkun deskritt fid-dettall.  
1.5 OSSERVAZZJONIJIET  
1.5.1  Osservazzjonijiet klini ċi 
Ossevazzjoni klinika ġenerali għandha ssir ta' kull jum u, fil-ka ż ta' 
tmiegħ tad-doża b'mod sfurzat, il- ħin tiegħu għandu jkun meqjus fl- 
għola perjodu anti ċipat ta' l-effetti ta' wara d-do ża. Tibdiliet fl- 
imġieba, sinjali ta' parturazzjoni diffi ċli jew imtawwla u s-sinjali 
kollha ta' tossi ċità għandhom ikunu irre ġistrati. B' żieda, eżami­
nazzjoni aktar dettaljata ta' kull annimal g ħandha tkun imwettqa 
fuq bażi ta' mill-anqas darba fil- ġimgħa u tista’ tkun imwettqa 
b'mod konvenjenti fl-okka żżjoni ta' meta l-annimal ikun mi żun. 
Darbtejn kull jum, matul tmiem il- ġimgħa darba kull jum, meta 
xieraq, l-annimali kollha g ħandhom ikunu osservati g ħal morbidità 
u l-mortalità.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Il-pi ż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma fl-annimali parenti  
L-annimali parentali (P u F1) g ħandhom ikunu mi żuna fl-ewwel jum 
tad-doża u mill-anqas darba fil- ġimgħa minn hemm il-quddiem. Nisa 
parentali (P u F1) g ħandhom ikunu mi żuna bħala minimu fil-jiem 
tal-gestjoni 0, 7, 14, u 20 jew 21, u matul il-jiem meta jreddg ħu jew 
fl-istess jiem b ħal meta jsir l-u żin tal-botom u fil-jum ta' meta l- 
annimali jkunu maqtula. Dawn l-osserbazzjonijiet g ħandhom ikunu 
irrapurtati individwalment g ħal kull annimal adult. Matul il-pperijodi 
ta' qabel it-tg ħammir u tal- ġestjoni, il-konsum ta' l-ikel g ħandu jkun 
imkejjel mill-anqas darba fil- ġimgħa. Il-konsum ta' l-ilma g ħandu 
jkun imkejjel b ħala minimu jekk is-sustanza tat-test tkun sommin ­
istrata fl-ilma.  
1.5.3  Iċ-ċikli esteru  
It-tul taċ-ċiklu esteru u n-normalità huma evalwati fin-nisa P u F1 
b'ti1pisa va ġinali qabel ma jsir it-tg ħammir, u l-a ħjar waqt it- 
tgħammir, sakemm tkun instabet evidenza tat-tg ħammir. Meta 
jkunu akkwistati ċ-ċelloli vaġinali ċervikali, attenzjoni g ħandha 
tingħata sabiex ikun evitat li ċaqlieq tal-muku ża u sussegwentament, 
l-induzzjoni ta' psewdo-tqala (1).  
1.5.4  Parametri ta' l-isperma  
L-irġiel P u F1 kollha, waqt it-teminazzjoni, il-pi ż tat-testis u ta' l- 
epididimi g ħandu jkun irre ġistrat u kull wie ħed mill-organi preservati 
għal eżaminazzjoni ħistopatolo ġika (ara s-sezzjoni 1.5.7, 1.5.8.1). 
Minn subset ta' mill-anqas g ħaxart irġiel ta' kull grupp P u F1, il- 
kumplament tat-testes u l-epididimidi g ħandhom ikunu u żati għall- 
ennumerazzjoni ta' l-ispermatidi omo ġenizzazzjoni-re żistenti u tar- 
riservi ta' l-isperma tal-cauda epididimali, rispettivament. G ħall- 
istess subset ta' r ġile, l-isperma mill-cauda epididymides jew vas 
deferens g ħandhom ikunu mi ġbura għall-evalwazzjoni tal-motilità 
ta' l-isperma u l-morfolo ġija ta' l-isperma. Jekk l-effetti relatati 
mat-trattament huma osservati jew meta jkun hemm evidenza minn studji oħrajn ta' effetti possibbli fuq l-ispermato ġeneżi, l-eval­
wazzjoni ta' l-isperma tista’ tkun imwettqa fuq l-ir ġiel kollha f'kull 
grupp ta' do ża; altrimenti l-enumerazzjoni tista’ tkun ristretta fuq l- 
irġiel P u F1 tal-kontroll u dawk ta' do ża għolja.
 
In-numru totali ta' spermatidi testikulari re żistenti-omogenizzazzjoni 
u l-isperma cauda epididimali g ħandhom ikunu innumerati (2) (3). Ir- 
riservi ta' l-isperma cauda jistg ħu ikunu derivati mill-kon ċentrazzjoni 
u l-volum ta' l-isperma f'sospenzjoni u żata sabiex ikunu mwettqa 
kompletament l-evalwazzjonijiet kwalitattivi, u n-numru ta' sperma rkuprat minn tg ħaffiġ u/jew omo ġenizzazzjoni sussegwenti tal- 
kumplament tal-materja cauda. L-enumerazzjoni g ħandha tkun 
imwettqa fuq subset mag ħżul ta' rġiel tal-gruppi ta' do żi kollha 
immedjetament wara l-qtil ta' l-annimali sakemm ma jkunx hemm ir-rekordings bil-video jew di ġitali, jew sakemm il-kampjuni jkunu 
ffriżati għal analiżi aktar tard. F'dawn il-ka żi, il-grupp tal-kontrolli u 
tad-doża għolja għandhom ikunu anali żżati l-ewwel. Jekk l-ebda 
effetti reletatati mat-trattament (e ż. effetti fuq l-g ħadd ta' l-isperma, 
il-motilità, jew il-morfolo ġija) jkunu jidhru, il-gruppi tad-do żi l- 
oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu analizzati. Meta l-effetti 
relatati mat-trattament ikunu innotati fil-grupp ta' do ża għolja, 
allura l-gruppi fid-do ża aktar baxxa g ħandhom ukoll ikunu evalwati.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Il-motilità epididimala (jew ductus deferens) g ħandha tkun evalwata 
jew irreġistrata fuq video immedjetament wara s-sagrifi ċju. L- 
isperma g ħandha tkun irkuprata waqt li tkun minimi żżata l-ħsaram 
u mrattba g ħall-analiżi tal-motilità bl-u żu ta' metodi accettabbli (4). 
Il-persenta ġġ ta' sperma motilment progressiva g ħandu jkun 
determinat jew su ġġettivament jew inkella o ġġettivament. Meta l- 
analiżi ta' moviment mg ħajjun mill-computer hija mwettqa (5) (6) 
(7) (8) (9) (10) id-derivazzjoni tal-motilità progressive tkun tistrie ħ 
fuq il-għatbiet definiti bl-u żu għal passaġġ ta' veloċità medja u l-linja 
dritta jew l-indi ċi lineari. Jekk il-kampjunu jkun ġew fotografi fuq 
videotape (11) jew l-immapini ikunu b'mod ie ħor reġistrati fil-waqt 
tan-nekropsija, anali żi sussegwenti biss ta' l-ir ġiel P u F1 tal-kontroll 
u ta' doża għolja tista’ tkun imwettqa, sakemm ma jkunx osdservati 
l-effetti relatati mat-trattament; f'dak il-ka ż, il-gruppi tad-do ża l- 
baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati. Fin-nuqqas ta' ima ġġini 
video jew di ġitali, il-kampjuni kollha fil-gruppi tat-trattament 
għandhom ikunu anali żżati man-nekropsija.  
Evalwazzjoni morfolo ġika tal-kampjun ta' l-isperma epididimali (jew 
van deferens) g ħandha tkun imwettqa. L-isperma (jew mill-anqas 
200 kull kampjun) g ħandha tkun e żaminata kif stabbilita, preparazz ­
jonijiet niedja (12) u klassifikata b ħala jew normali in annormali. L- 
eżempji ta' l-annormalitajiet ta' l-isperma morfolo ġika jkunu jindikaw 
fużjoni, irjus i żolati, u rjus u/jew denb ming ħajr forma. L-eval ­
wazzjoni g ħandha tkun imwettqa fuq subjet ta' r ġile magħżula fil- 
gruppi tad-do żi kollha jew immedkjetament wara l-qtil ta' l-annimali, 
jew, ibba żati fuq ir-rekordings tal-video jew di ġitali, f'ħin aktar tard. 
It-tiċpis, la darna stabbilit, jista’ wkoll ikun moqri aktar tard. F'dawn 
il-każi, il-grupp tal-kontrolli u tad-do ża għolja għandhom ikunu 
analiżżati l-ewwel. Jekk l-ebda effetti reletatati mat-trattament (e ż. 
effetti fuq l-g ħadd ta' l-isperma, il-motilità, jew il-morfolo ġija) 
jkunu jidhru, il-gruppi tad-do żi l-oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li 
jkunu analizzati. Meta l-effetti relatati mat-trattament ikunu innotati 
fil-grupp ta' do ża għolja, allura l-gruppi fid-do ża aktar baxxa 
għandhom ukoll ikunu evalwati.  
Jekk uħud mill-parametri ta' hawn fuq dwar l-evalwazzjoni ta' l- 
isperma jkunu di ġa ġew eżaminati b ħala parti minn studju siste ­
matiku tat-tossi ċità ta' mill-anqas 90 jum, dawn ma jkunu ne ċċess­
arjament je ħtieġu li jkunu repetuti fl-istidju ta' żewġ ġenerazzjonijiet. 
l-kampjuni jew ir-re ġistrazzjoni di ġitali ta' l-isperma tal- ġeberazzjoni 
P jkunu ma ħżuna, sabiex jiffa ċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem.  
1.5.5  Il-wild  
Kull botom g ħandu jkun e żaminat malajr kemm jista’ jkun possibbli 
wara l-ħlas (jum tal-attazzjoni 0) sabiex ikun stabbilit in-numru u s- 
sess tal-frie ħ, imweldin mejta, imweldin ħajjin, u il-pre żenza ta' 
annomalitajiet kbar. Frie ħ misjuba mejta fil-jum), jekk mhux 
maċerati, għandhom preferibbilment ikunu e żaminati g ħal difetti 
possibbli u l-kaw ża tal-mewt, u g ħandhom ikunu preservati. Frie ħ 
ħajjin għandhom ikunu mag ħduda u mi żuna individwalment mat- 
twelid (jum 0 tal-lattazzjoni) jew fil-jum 1, u fil-jiem regolati ta' l- użin minn hemm il-quddiem, e ż. fil-jiem 4, 7, 14, u 21 tal- 
lattazzjoni. Annormalitajiet fi żiċi jew ta' l-im ġieba osservati fl- 
ommijiet jew fil-frie ħ għandhom ikunu re ġistrati.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
L-iżvilupp fiżiku tal-frie ħ għandu jkun irre ġistrat l-aktar bi ż-żieda fil- 
piż tal-ġisem. Parametri fi żiċi oħrajn (eż. il-fetħa ta' l-għajnejn u l- 
widnejn, il- ħruġ tas-snien, it-tkabbir tax-xag ħar) jista’ jformi inform ­
azzjoni supplementari, imma dawn id-dettalji g ħandhom preferib ­
bilment ikunu evalwati fil-kuntest tad-dettalji tal-maturità sesswali 
(eż. l-età u l-pi ż tal-ġisem jew il-fet ħa vaġinali jew is-separazzjoni 
balano-preputial) (14). Investigazzjonijiet funzjonali (e ż. attivita 
motorili, funzjoni sensitorja, onto ġenija relfettiva) tal-fer ħ F1 qabel 
u/jew wara l-ftim, partikolarment dawk relatati mal-maturità sesswali, 
huma rakkommandati jekk tali investigazzjonijiet ma jkunux inklu żi 
fi studju separati. L-età tal-ftu ħ vaġinali u s-separazzjoni prepuzjali 
għandha tkun determinata g ħal dawk imfatma F1 mag ħżula għat- 
tgħammir, Distanza ano ġenitali għandha tkun imkejla fil-jum 0 ta' 
wara t-twelid fil-frie ħ F2 jekk istigata b'alterazzjonijiet fir-relattività 
tas-sess F1 jew bil-kalkolu tal-maturità sesswali.  
Osservazzjonijiet funzjonali jistg ħu ikunu m ħollija barra fi gruppi li 
altrimentri ji żvelaw sinjali ċari ta' effetti ħżiena (eż. tnaqqis sini ­
fikanti fl-akkwist tal-pi ż, eċċ.). Jekk l-investigazzjonijiet funzjonali 
jkunu mwettqa, dawn m'g ħandhomx isiru fuq il-frie ħ magħżula għat- 
tgħammir.  
1.5.6  Nekropsija ma ġġuri 
Fil-waqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudji, l-annimali 
parentali kollha (P u F1), il-frie ħ kollha b'annormalitajiet esterni 
jew sinjali klini ċi, kif ukoll wie ħed magħżul b'mod kif jinzerta, fer ħ/­
sess/botom, mi ż-żewġ ġenerazzjonijiet F1 u F2, g ħandu jkun 
eżaminat b'mod makroskopiku g ħal xi annormlitajiet structurali jew 
tibdil patilo ġiku. Attenzjoni spe ċjali għandha ting ħata lill-organi tas- 
sistema riproduttiva. Il-frie ħ li jinqatlu b'mod umanesk f'kundizzjoni 
morbonda u l-frie ħ mejta, meta ma jkunux ma ċerati, għandhom 
ikunu eżaminati g ħal difetti possibbli u/jew il-kaw ża tal-mewt, u 
ippreservati.  
L-uteri tan-nisa li jkun g ħadhom mhux mg ħammra għandhom ikunu 
eżaminati, f'tali manjera li ma tikkompromettix l-evalwazzjoni ħisto­
patoloġika, għall-preżenza u n-numru ta' siti ta' l-implantazzjoni.  
1.5.7  Il-pi ż ta' l-organi  
Fil-waqt tat-terminazzjoni, il-pi ż tal-ġisem u l-pi ż ta' dawn l-organi li 
ġejjin fl-annimali P u F1 parentali kollha g ħandu jkun determinat (l- 
organi bħala pari g ħandhom ikunu mi żuna individwalment):  
— l-utru, l-ovarji;  
— it-testi, l-epididimidi (total u cauda);  
— il-prostata';  
— il-bużżieqa seminali bil-glandoli koa ġjulanti u l-fluwidi tag ħhom 
u l-prostata (b ħala unità wa ħda); 
— il-moħħ, il-fwied, il-kliewi, il-milsa, il-glandola pitwarja, it- 
tirojde u l-glandoli adrenali u dawk l-organi fil-mira kif 
maagħrufa. 
Il-piżijiet ta' l-i ġsma fit-terminazzjoni g ħandhom ikunu determinati 
għall-frieħ Fċ u F2 li huma mag ħżula għan-nekropsija. Dawn l- 
organi li ġejjin minn fer ħ/sess/botom mag ħżula kif jinzerta (ara s- 
sezzjoni 1.5.6) g ħandhom ikuinu mi żuna. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Il-moħħ, il-milsa u t-timu. Ir-ri żultati tan-nekropsija ġenerali u l-pi ż 
ta' l-organi g ħandhom ikunu assessjati fil-kuntest ma l-osser ­
vazzjonijiet mag ħmula fi studji o ħrajn ta' do żi repetuti, meta prattik ­
abbli.  
1.5.8  Ħistopatolo ġija 
1.5.8.1  Annimali parentali  
L-organi u l-bi ċċiet li ġejjin ta' l-annimali parentali (P u F1), jew il- 
kampjuni rapre żentattivi tag ħhom, għandhom ikun stabbiliti u 
maħżuna f'medja xierqa g ħall-eżaminazzjoni ħistopatolo ġika. 
— il-vaġina, l-utru bil-g ħonq, u l-ovarji (ippreservati ġo fissant 
xieraq);  
— waħda mit-testi (ippreservata fil-fissattiv Bouis jew komparabbli), 
waħda minn ħaġa: epididima, l-bor ża seminali, l-prostata, u l- 
glandola koa ġjulanti;  
— oragnu(i) tal-mira pre ċedentament identifikati mill-annimali 
kollha P u F1 li huma mag ħżula għat-tgħammir.  
Ħistopatolo ġija sħiħa tal-organi u l-bi ċċiet presevati elenkati hawn 
fuq għandha tkun imwettqa g ħad-dożi l-għoljin kollha u l-annimali P 
u F1 mag ħżula għat-tgħammir. L-e żaminazzjoni ta' l-ovarji fl- 
annimali P hija voluntarja. L-organi li juru tibdiliet relatati mat-trat ­
tament għandhom ukoll ikunu e żaminati fil-gruppi tad-do ża l-baxxa 
u l-medja sabiex jg ħinu fl-elu ċidazzjoni tal-NOAEL. B' żieda, l- 
organi riproduttivi fl-annimali tad-do ża baxxa u medja li huma issus ­
spettati b'fertilità mnaqqsa, e ż. dawk li ma jirnexxilhomx 
jitgħammru, li jkunu tqal, l-irgiel li ma jimpregnawx, jew li 
jwelldu frie ħ b'saħħithom, jew dawk li ċ-ċikliċità estera jew in- 
numru ta' l-isperma, l-motilità, jew il-mofolo ġija tagħhom kienet 
affettwata, g ħandhom ikunu su ġġetti għal evalwazzjoni ħistopato­
loġika. Il-ferita kbar kollha b ħal ma huma l-atrofija jew it-tumuri 
għandhom ikunu e żaminati.  
Eżaminazzjoni ħistopatolo ġika testikulati dettaljata (e.g, bl-u żu tal- 
fissattiv Bouin, it-twa ħħil bill-paraaffin u s-sezzonijiet transervsjali 
ta' 4-5 μm ħxuna) għandhom ikunu mwettqa sabiex ikunu identifikati 
l-effetti relatati mat-trattament b ħal ma huma l-ispermatidi mi żmuma, 
is-saffi jew it-tipi nieqsa mil- ġermi taċ-ċelloli, iċ-ċelloli kbar multi ­
nukleati jew it-tg ħaffiġ taċ-ċelloli spermato ġeniċi fil-lumen (14). L- 
eżami ta' l-epididimi intatta g ħandu jinkludi il-kaput, il-korp u l- 
kaanula, li jista’ jkun imwettaq bl-evalwazzjoni tas-sezzjoni lon ġi­
tudinali. L-epididimi g ħandha tkun evalutata g ħall-infiltrazzjoni 
lewkoċita, tibdil fil-prevalenza tat-tipi ta ċ-ċelloli, it-tipi ta' ċelloli 
aberrenti, u l-isperma pato ġikitożi. Il-PAS u t-tbg ħajja ħematossilini 
jistgħu ikunu u żati għall-eżaminazzjoni ta' l-organi riproduttivi 
maskili.  
L-ovarju postlaktatjonali g ħandu jkollu l-folliki primordjali u tat- 
tkabbir kif ukoll il-corpora lutea l-kbira tal-lattazzjoni. L-e żami­
nazzjoni ħistopatolo ġika għandha tiżvela t-tnaqqis kwalitattiv tal- 
popolazzjoni tal-follika primordjali. Evalwazzjoni kwantitattiva tal- folliki primordjali g ħandha tkun imwettqa g ħall-femminili F1; in- 
numru ta' l-annimali, l-g ħażla tas-sezzjoni ovarja, u s-sezzjoni tad- 
daqs tal-kampjun g ħandha tkun statistikament xierqa g ħall-proċedura 
ta' l-evalwazzjoni u żata. L-eżaminazzjoni g ħandha tinkludi l- 
ennumerazzjoni tan-numru tal-folliki primordjali, li jistg ħu ikunu 
aggrupparti mal-filliki ż-żgħar tat-tkabbir, g ħal paragun ta' l-ovarji 
ittrattati u tal-kontrol (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2  Frie ħ mhux miftuma  
Il-partijiet ferm annormali u l-organi tal-mira mill-frie ħ kollha b'an ­
normallitajiet esterni jew sinjali klini ċi, kif ukoll minn wie ħed mill- 
grupp fer ħ/sess/botom mag ħżul kif jinzerta mi ż-żewġ ġener­
azzjonijiet F1 u F2 li ma jkunux ġew magħżula għat-tgħammir, 
għandhom ikunu iffissati u ma ħġżuna f'medja xierqa g ħall-eżami­
nazzjoni ħistopatolo ġika. Il-karatteristika s ħiħa ħistopatolo ġika tal- 
partijiet ippreservati g ħandha tkun imwettqa b'enfasi spe ċjali dwar 
l-organi tas-sistema reproduttiva.  
2. DATA  
2.1 TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Id-dettalji g ħandhom ikunu irrapurati individwalment g ħan-nisa kif 
ukoll għall-wild tag ħhom u mi ġbura b'sommarju f'g ħamla tabulari, li 
juru għal kull grupp tat-test u g ħal kull ġenerazzjoni, in-numru ta' l- 
annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula g ħal raġunijiet umanitarji, il- ħin ta' xi mewt jew 
qtil umanitarju, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' l-annimali li juru 
sinjali ta' tossi ċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossi ċità kif osservati, 
inkluż il-ħin ta' meta tkun skoppjat, it-tul ta' żmien, u s-severità ta' xi 
effetti tossi ċi, it-tiġ ta' l-osservazzjonijiet ta' l-embrijuni/feti, u l- 
informazzjoni l-o ħra kollha dwar it-trabi l-o ħrajn.
 
Metodu statistiku ġeneralment a ċċettabbli g ħandu jkun u żat' il- 
metodi statisti ċi għandhom ikunu mag ħżula bħala parti mid-disinn 
għall-istudju u g ħandhom ikunu i ġġustifikati. Il-mudelli statisti ċi bir- 
reazzjoni tad-do ża jistgħu ikunu utili g ħad-data ta' l-anali żi. Ir- 
rapport g ħandu jinkludi informazzjoni suffi ċjenti dwar il-metodu ta' 
l-analiżi u l-programm tal-kompjuter u żat, hekk li riveditur/statistiku 
independenti jkun jista’ jevalwa mill- ġdid u jikkostitwixxi mill- ġdid 
l-analiżi. 
2.2 EVALWAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Is-sejbiet ta' dan l-istudju tat-tossi ċità riproduttiva fuq żewġ ġener­
azzjhonijiet g ħandu jkun evalutat f'termini ta' l-effetti osservati, 
inklużi s-sejbiet tan-nekropsija u mikroskopi ċi. L-evalwazzjoni 
għandha tinkludi r-relazzjoni, jew in-nuqqas tag ħha, bejn id-do ża u 
s-sustanza tat-test u l-pre żenza jew l-assenza, l-in ċidenza jew is- 
sevirità ta' l-annormalitajiet, inklu żi l-feriti kbar, l-organi tal-mira 
identifikati, il-fertilità affettwata, l-annormalitajiet klini ċi, l-imġieba 
tar-riproduzzjoni u l-botom affettwati, it-tibdiliet fil-pi ż tal-ġisem, l- 
effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossi ċi oħrajn. Il-propjetajiet fi żiko- 
kimiċi tas-sustanza tat-test, u meta disponibbli, id-dettalji tossiko ­
kinetiċi għandhom ikunu meqjusa fil-kunsiderazzjoni meta jkunu 
evalutati r-ri żultati tat-test.  
Test tat-tossi ċità riproduttiva imwettqa kif suppost g ħandu jipprovdi 
estimi sodisfa ċenti tal-livbell bla ebda effett u rikonoxximent ta' l- 
effeti ħżiena fuq ir-riproduzzjoni, l-parturizzjoni, il-lattazzjoni, l- 
iżvilupp postnatli inklu ż it-tbakkir u l-i żvilupp sesswali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3 INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Studju tat-tossi ċita riproduttiva fuq żewġ ġenerazzjonijiet g ħandu 
jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' l-espo żizzjoni ripetuta ta' 
sustanza matul il-fa żijiet kollha ta ċ-ċiklu riproduttiv. Partikolarment, 
l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar il-parametri riproduttivi, u 
dwar l-iżvilupp, it-tlabbir, il-maturità u s-sopravvivenza tal-frie ħ. Ir- 
riżultati ta' l-istudju g ħandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas- 
sejbier mill-istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokineti ċi u studji 
oħrajn. Ir-ri żultati ta' dan l-istudju jistg ħu ikunu u żati fl-assessjar 
tal-ħtieġa ta' aktar testijiet tal-kimika. L-estrapolazzjoni tar-ri żultati 
ta' l-istudju mal-bniedem hija valida sa grad limitat. Dawn huma l- 
aħjar użati sabiex jipprovdu informazzjoni dwar il-livelli-ming ħajr- 
effett u l-espo żizzjoni umana (20) (21) (22) (23).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u, meta relevanti, il-propjetajiet fi żikokimiċi; 
— dettalji ta' l-identifikazzjoni;  
— purità.  
Mezz (jekk applikabbli):  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz, jekk mhux sempli ċement 
ilma.  
Annimali tat-test:  
— speċje/tipi użati; 
— in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, e ċċ.; 
— il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— ir-raġjonar għal-livell tad-do ża magħżula; 
— dettalji tat-test tal-preparazzjoni tal-formulazzjoni/dieta tas- 
sustanza, il-kon ċentazzjonijiet;  
— l-istabbilità u l-omo ġenità tal-preparazzjoni;  
— dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-kon ċ­
entrazzjoni (ppm) lejn do ża attwali 9 mg/kg il-pi ż tal-ġisem/jum), 
jekk applikabbli;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Riżultati:  
— il-konsum ta' l-ikel. Il-konsum ta' l-ilma, jekk disponibbli, l- 
effikaċja ta' l-ikel (i ż-żieda fil-pi ż tal-ġisem għal kull gramma 
ikel ikkunsmat), u l-konsum tal-materjal tat-test g ħall-annimali 
P u F1, apparti milli g ħall-perjodu tal-koabitazzjoni u g ħal 
mill-anqas l-a ħħar terz tal-lattazzjoni;  
— id-dettalji ta' l-assorbazzjoni (jekk disponibbli);  
— id-dettalji tal-pi ż tal-ġisem dwar l-annimali P u F ċ magħżula 
għat-tgħammir;  
— id-dettalji tal-pi ż tal-botom u l-frie ħ individwali;  
— il-piż tal-ġsem fil-waqt li jkunu sagrifikati u l-pi ż assolut u 
rtelattiv ta' l-organi g ħall-annimali parentali;  
— in-natura, s-severità u t-tul ta' l-osservazzjonijiet klini ċi (sew jekk 
reversibbli u anki jekk le);  
— il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux 
baqgħu ħajjin sakem maqtula;  
— dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u d-do ża, inklużi l-indiċi tat- 
tgammir, il-fertilità, il- ġestazzjoni, it-twelid, il-vijabbilità, u l- 
lattazzjoni; ir-rapport g ħandu jindika n-numri u żati fil-kalkoli 
ta' dawn l-indi ċi; 
— l-effetti tossi ċi jew oħrajn fuq ir-riproduzzjoni, il-frie ħ, it-tbabbir 
ta' wara t-twelid, e ċċ.; 
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatolo ġiċi kollha;  
— in-numru ta' nisa P u F1 fi ċ-ċiklu normali u t-tul ta ċ-ċiklu; 
— it-total tan-numru ta' l-isperma cauda epididimali, il-persenta ġġ 
progressive tal-motilità ta' l-isperma, il-persenta ġġ morfolo ġi­
kament normali, u l-persenta ġġ ta' l-ispetma b'kull annormalità 
identifikata;  
— iż-żmien satotg ħammir, inklu żi n-numru ta' jiem sakem isir it- 
tgħammir;  
— it-tul tal- ġestjoni;  
— in-numri ta' l-impjantazzjonijiet, corpora lutea, id-daqs tal-botom;  
— in-numru ta' twelid ħajjin u t-telf tal-post-impjantazzjoni;  
— in-numru ta' frie ħ b'annormalitajiet ferm vi żibbli, jekk determinati 
bin-numru tal-botom, g ħandu jkun irraportat;  
— dettalji dwar l-a ċċenni fiżiċi fil-frieħ u l-informazzjoni l-o ħra ta' 
l-iżvilupp post natali; la ċċenni fiżiċi evalwati g ħandhom ikunu 
ġustifikati;  
— dettalji dwar l-osservazzjonijiet funzjonali fil-frie ħ u l-adulti, kif 
applikabbli;  
— trattamentv statistiku tar-ri żultati, meta xieraq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet, inklu żi l-valuri NOAEL g ħall-effetti materni u fuq 
il-frieħ. 
4. REFERENZI  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Repro­
duction in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. 
Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  
12:92-108.  
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and 
Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  
Journal of Reproduction and Fertility  54:103-107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm 
Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the 
Rat. Reproductive Toxicology  5:39 44.
 
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a 
Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3):237- 244.  
(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6:267-273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dime ­
thanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409-421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: 
Methodologic Considerations.  Reproductive Toxicology  
5:449-458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using 
the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxi ­
cology , Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.  
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admin ­
istration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Video ­
micrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.
 
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.
 
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
 
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421-426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for 
Assessing Female Reproductive and Developmental Toxi ­
cology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. 
Hayes (ed.), Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379-383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian 
Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Repro ­
ductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. 
Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, 
DC. 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Prin ­
ciples and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOSSIKOKINETI ĊI 
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħat-TG 417 (2010) tal-OECD. 
Studji li je żaminaw it-tossikokinetika (TK) ta’ kimika g ħall-ittestjar isiru 
biex tinkiseb informazzjoni adegwata dwar l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-trasformazzjoni bijolo ġika (jiġifieri l-metaboli żmu) u l-eskrezzjoni tag ħha 
biex jgħinu tkun relatata l-kon ċentrazzjoni jew id-do ża mat-tossi ċità 
osservata u b ħala għajnuna biex jinftiehem il-mekkani żmu tagħha ta’ 
tossiċità. TK tista’ tg ħin biex jinftiehmu l-istudji tas-tossikolo ġija billi turi 
li l-annimali tat-test ikunu esposti b’mod sistematiku g ħall-kimika g ħall- 
ittestjar u billi ti żvela liema jkunu l-gruppi li ji ċċirkolaw (kimika/metaboliti 
prinċipali). Parametri ba żiċi ta’ TK iddeterminati minn dawn l-istudji 
għandhom jipprovdu wkoll informazzjoni dwar il-potenzjal g ħal akkumu ­
lazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar f’tessuti u/jew f’organi u l-potenzjal g ħal 
induzzjoni ta’ trasformazzjoni bijolo ġika bħala riżultat ta’ espo żizzjoni 
għall-kimika g ħall-ittestjar.  
2. Dejta ta’ TK tista’ tikkontribwixxi g ħall-valutazzjoni tal-adegwatezza u 
r-rilevanza ta’ dejta ta’ tossi ċità tal-annimali g ħal estrapolazzjoni ta’ 
periklu g ħall-bniedem u/jew g ħal valutazzjoni tar-riskju. Addizzjonalment, 
studji tossikokineti ċi jistgħu jipprovdu informazzjoni utli biex ikunu ddeter ­
minati l-livelli ta’ do ża għal studji dwar tossi ċità (kinetika lineari vs. mhux 
lineari), rotta ta’ effetti ta’ amministrazzjoni, disponibbiltà bijolo ġika u 
kwistjonijiet relatati ma’ tifsila tal-istudju. Ċertu tip ta’ dejta TK tista’ 
tintuża fl-iżvilupp ta’ mudell tossikokinetiku b’ba żi fiżjoloġika (PBTK).  
3. Hemm u żijiet importanti g ħal dejta dwar metaboliti/TK b ħal dawk li jissu ġ­ 
ġerixxu tossi ċitajiet possibbli u modalitajiet ta’ azzjoni u r-relazzjoni 
tagħhom għal livell ta’ do ża u rotta ta’ espo żizzjoni. Flimkien ma’ dan, 
dejta dwar metaboli żmu tista’ tipprovdi informazzjoni utli g ħal valutazzjoni 
tas-sinifikat tossikolo ġiku ta’ espo żizzjonijiet g ħal metabiliti prodotti 
esoġenikament tal-kimika g ħall-ittestjar.  
4. Dejta tossikokinetika adegwata tkun utli biex issostni l-a ċċettabbiltà u 
l-applikabbiltà ulterjuri ta’ relazzjonijiet kwantitattivi ta’ attività strutturata, approċċi ta’ read-across jew raggruppament fl-evalwazzjoni tas-sikurezza ta’ 
kimiċi. Dejta kinetika tista’ tintu ża wkoll g ħall-evalwazzjoni tar-rilevanza 
tossikoloġika ta’ studji o ħra (eż. in vivo /in vitro ).
 
5. Sakemm ma tissemmiex rotta o ħra ta’ amministrazzjoni (ara b’mod parti ­
kolari l-paragrafi 74-78), dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa applikabbli g ħal 
amministrazzjoni orali tal-kimika g ħall-ittestjar.  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
6. Sistemi regolatorji g ħandhom rekwi żiti u ħtiġijiet differenti dwar il-kejl ta’ 
punti ta’ tmiem u parametri relatati ma’ tossikokinetika g ħal klassijiet 
differenti ta’ kimi ċi (eż. pestiċidi, bijoċidi, kimiċi industrijali). Mhux b ħal 
Metodi ta’ Ttestjar kwa żi kollha dan il-Metodu ta’ Ttestjar jiddeskrivi 
l-ittestjar ta’ tossikokinetika, li jinvolvi kejlijiet u punti ta’ tmiem multipli. 
Fil-ġejjieni jistg ħu jkunu żviluppati diversi Metodi ta’ Ttestjar ġodda u/jew 
dokument(i) ta’ gwida biex jiddeskrivi/u kull punt ta’ tmiem separatament u f’aktar dettalji. Fil-ka ż ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar, liema testijiet jew 
valutazzjonijiet isiru huwa spe ċifikat mir-rekwi żiti u/jew ħtiġijiet ta’ kull 
sistema regolatorja.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Hemm diversi studji li jistg ħu jsiru biex tkun ivvalutata l-im ġiba ta’ TK ta’ 
kimika g ħall-ittestjar g ħal finijiet regolatorji. I żda, skont il- ħtiġijiet jew 
is-sitwazzjonijiet regolatorji partikolari, mhux dawn l-istudji kollha li jistgħu jkunu me ħtieġa għall-evalwazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar. 
Il-flessibbiltà, meqjusin il-karatteristi ċi tal-kimika g ħall-ittestjar li tkun qed 
tiġi investigata, hija me ħtieġa fit-tfassil ta’ studji ta’ tossikokinetika. F’xi 
każijiet, ċertu sett biss ta’ mistoqsijiet jista’ jkun je ħtieġlu jiġi esplorat biex 
ikun indirizzat t ħassib dwar perikli u riskji asso ċjati ma’ kimika g ħall- 
ittestjar. F’xi sitwazzjonijiet, dejta dwar TK tista’ tin ġabar bħala parti 
mill-evalwazzjoni fi studji o ħra ta’ tossikolo ġija. Għal sitwazzjonijiet o ħra, 
jistgħu jkunu me ħtieġa studji addizzjonali u/jew aktar estensivi dwar TK, 
skont ħtiġijiet regolatorji u/jew jekk jinqalg ħu mistoqsijiet ġodda bħala parti 
minn evalwazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar.
 
8. L-informazzjoni kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall-ittestjar u metaboliti 
u analogi rilevanti g ħandhom jitqiesu mil-laboratorju tal-ittestjar qabel ma 
jsir l-istudju biex tissa ħħaħ il-kwalità tal-istudju u jkun evitat u żu mhux 
meħtieġ ta’ annimali. Dan jista’ jinkludi dejta minn Metodi ta’ Ttestjar 
rilevanti o ħra (studji  in vivo , studji  in vitro , u/jew evalwazzjonijiet  in 
silico ). Proprjetajiet fi żikokimiċi, bħal koeffi ċjent tal-partizzjoni 
ottanol-ilma (espress b ħala log P  OW ), pKa, solubilità fl-ilma, pressjoni ta’ 
fwar u pi ż molekulari ta’ kimika jistg ħu jkunu utli g ħall-ippjanar ta’ studji u 
interpretazzjoni ta’ ri żultati. Dawn jistg ħu jkunu ddeterminati billi jintu żaw 
metodi adatti kif deskritti fil-Metodi ta’ Ttestjar rilevanti.  
LIMITAZZJONIJIET  
9. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar mhux imfassal biex jindirizza ċirkostanzi spe ċjali, 
bħall-annimal mara tqila jew tredda’ u wildha, jew biex jevalwa residwi 
potenzjali f’annimali esposti li jipprodu ċu ikel. Iżda d-dejta miksuba minn 
studju B.36 tista’ tipprovdi informazzjoni ta’ sfond biex tiggwida t-tifsila ta’ 
studji spe ċifiċi għal dawn l-investigazzjonijiet. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar 
mhux ma ħsub għall-ittestjar ta’ nanomaterjali. Rapport dwar e żami mill-ġdid 
preliminari ta’ Linji Gwida ta’ Testijiet tal-OECD g ħall-applikabbiltà 
tagħhom għal nanomaterjali jindika li t-TG 417 (ekwivalenti g ħal dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar B.36) tista’ ma tkunx tapplika g ħal nanomaterjali (1).  
DEFINIZZJONIJIET  
10. Definizzjonijiet u żati għall-fini ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar huma pprovduti 
fl-Appendi ċi. 
KONSIDERAZZJONIJIET TA’ TRATTAMENT XIERAQ 
TAL-ANNIMALI  
11. Gwida dwar trattament uman tal-annimali hija disponibbli fid-Dokument ta’ 
Gwida (GD) 19 (2) tal-OECD. Huwa rrakkomandat li GD 19 tal-OECD ikun ikkonsultat g ħall-istudji kollha  in vivo  jew  in vitro  deskritti f’dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.
 
DESKRIZZJONI tal-METODI  
Studji pilota  
12. L-użu ta’ studji pilota b ħal dawn huwa rrakkomandat u inkura ġġit għall- 
għażla ta’ parametri sperimentali g ħall-istudji ta’ tossikokinetika (e ż. meta­
boliżmu, bilan ċ ta’ piż, proċeduri analiti ċi, tiftix ta’ do ża, eżalazzjoni 
ta’CO  2 , eċċ.). Karatterizzazzjoni ta’ xi w ħud minn dawn il-parametri tista’ 
ma ġġibx il-ħtieġa tal-użu ta’ kimi ċi b’tikketta radjolo ġika. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Għażla ta’ annimali  
Speċijiet 
13. L-ispe ċi ta’ annimali (u razza) u żata għal ittestjar ta’ TK g ħandha preferib ­
bilment tkun l-istess b ħal dik użata fi studji tossikolo ġiċi oħra magħmulin 
bil-kimika g ħall-ittestjar ta’ interess. Normalment g ħandu jintu ża l-far 
minħabba li kien u żat b’mod estensiv g ħal studji tossikolo ġiċi. L-użu ta’ 
speċi oħra jew addizzjonali jista’ jkun awtorizzat jekk studji tossikolo ġiċi 
kritiċi juru evidenza ta’ tossi ċità sinifikanti f’dawn l-ispe ċijiet jew jekk 
jintwera li t-tossi ċità/tossikokinetika tag ħhom tkun aktar rilevanti g ħall- 
bnedmin. G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-ispe ċi ta’ 
annimal u razztu.  
14. Sakemm ma jing ħadx mod ie ħor, dan il-Metodu ta’ Ttestjar jirreferi g ħall-far 
bħala l-ispe ċi tat-test. Ċerti aspetti tal-metodu jistg ħu jkollhom ji ġu 
mmodifikati biex jintu żaw speċijiet oħra għal test.  
Età u Razza  
15. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom (normalment 
minn 6-12-il ġimgħa meta jsir id-do żaġġ) (ara wkoll il-paragrafi 13 u 14). 
Għandha ting ħata ġustifikazzjoni g ħall-użu ta’ annimali li ma jkunux adulti 
żgħażagħ. L-annimali kollha g ħandhom ikunu tal-istess età mal-bidu 
tal-istudju. Il-varjazzjoni fil-pi ż tal-annimali individwalment m’g ħandhiex 
tkun aktar minn ± 20 % tal-pi ż medju tal-grupp tat-test. Idealment ir-razza 
użata għandha tkun l-istess b ħal dik użata biex tkun idderivata d-database 
tossikoloġika għall-kimika g ħall-ittestjar.  
Għadd u sess tal-annimali  
16. M’għandhomx jintu żaw anqas minn erba’ annimali ta’ sess wie ħed għal kull 
doża ttestjata. G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni g ħas-sess tal-annimali u żat. 
Għandu jitqies l-u żu taż-żewġ sessi (erba’ r ġiel u erba’ nisa) jekk ikun 
hemm evidenza li ssostni differenzi sustanzjali fit-tossi ċità b’rabta mas-sessi.  
Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-g ħalf 
17. L-annimali ġeneralment g ħandhom jitqieg ħdu jgħixu individwalment matul 
il-perjodu tal-ittestjar. Abitazzjoni fi gruppi tista’ tkun i ġġustifikata f’ ċir­
kostanzi spe ċjali. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 
12-il sieg ħa dawl/12-il sieg ħa dlam. It-temperatura tal-kamra 
tal-esperimenti tal-annimali g ħandha tkun 22 °C (± 3 °C) u l-umdità 
relattiva 30-70 %. Dwar g ħalf, jistg ħu jintużaw dieti konvenzjonali 
tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb.  
Kimika g ħall-ittestjar  
18. Kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika bl-użu ta’  14 C għandha tintu ża 
għall-bilanċi kollha ta’ massa u g ħall-aspetti ta’ identifikazzjoni ta’ meta ­
boliti tal-istudju; i żda, jekk ikun jista’ jintwera li:  
— l-identifikazzjoni ta’ bilan ċ ta’ massa u ta’ metaboliti tkun tista’ ti ġi 
evalwata b’mod adegwat billi tintu ża l-kimika g ħall-ittestjar ming ħajr 
tikketta,  
— l-ispeċifiċità u s-sensittività analiti ċi tal-metodu u żat ma’ kimika g ħall- 
ittestjar mhux radjuattiva jkunu daqs jew akbar minn dawk li jkunu 
jistgħu jinkisbu bil-kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika, ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
f’dak il-ka ż ma jkunx hemm ħtieġa li tintuża kimika g ħall-ittestjar b’tikketta 
radjoloġika. Barra dan, jistg ħu jintużaw iżotopi oħra radjuattivi u stabbli, 
partikolarment jekk l-element ikun responsabbli g ħal jew ikun parti 
mill-porzjon tossiku tal-kimika g ħall-ittestjar. Jekk ikun possibbli, 
it-tikketta radjolo ġika għandha titqieg ħed f’porzjon ċentrali tal-molekula li 
tkun metabolikament stabbli (ma tkunx tista’ tinbidel, ma titne ħħiex meta­
bolikament b ħala CO  2 , u ma ssirx parti mill- ġemgħa ta’ karbonju biss 
tal-organi żmu). Tikkettar ta’ siti multipli jew re ġjuni speċifiċi tal-molekula 
jistgħu jkunu me ħtieġa biex ikun segwit x’ji ġri mil-kimika g ħall-ittestjar.  
19. Il-kimi ċi għall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika jew mhux b’tikketta radjo ­
loġika għandhom ikunu analizzati billi jintu żaw metodi adatti biex ikunu 
stabbiliti l-purezza u l-identità. Il-purezza radju tal-kimika g ħall-ittestjar 
radjuattiva g ħandha tkun l-og ħla li tista’ tinkiseb g ħal kimika partikolari 
għall-ittestjar (idealment hija g ħandha tkun aktar minn 95 %) u g ħandu 
jsir sforz ra ġonevoli biex ikunu identifikati impuritajiet li jkun hemm ta’ 
2 % jew aktar. Il-purezza, flimkien mal-identità u l-porzjon ta’ kull 
impurezza li tkun ġiet identifikata, g ħandhom ikunu rrappurtati. 
Programmi regolatorji individwalment jistg ħu jagħżlu li jipprovdu gwida 
addizzjonali b ħala għajnuna g ħad-definizzjoni u l-ispe ċifikazzjonijiet ta’ 
kimiċi għall-ittestjar mag ħmulin minn ta ħlitiet u metodi g ħad-deter­
minazzjoni tal-purezza.  
Għażla ta’ do ża 
Studju Pilota  
20. Is-soltu do ża orali wa ħda tkun suffi ċjenti għall-istudju pilota. Id-do ża 
m’għandhiex tkun tossika, i żda tkun g ħolja biżżejjed biex tit ħalla ssir iden ­
tifikazzjoni ta’ metaboliti fl-eskreta (u pla żma, skont il-ka ż), kif ukoll biex 
jitħares l-għan dikjarat tal-studju pilota kif innotat fil-paragrafu 12 ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  
Studji Ewlenin  
21. Għall-istudji ewlenin, ikun ippreferut minimu ta’ żewġ dożi minħabba li 
informazzjoni mi ġbura minn mill-anqas żewġ gruppi ta’ do ża tista’ tg ħin 
biex tkun stabbilita do ża fi studji o ħra dwar tossi ċità, u tgħin fil-valutazzjoni 
ta’ doża-rispons ta’ testijiet ta’ tossi ċità diġà disponibbli.  
22. Meta jkunu amministrati żewġ dożi, iż-żewġ dożi għandhom ikunu g ħoljin 
biżżejjed biex tit ħalla ssir identifikazzjoni ta’ metaboliti fl-eskreta (u 
fil-plażma, skont il-ka ż). Għandha titqies informazzjoni minn dejta 
disponibbli dwar tossi ċità għal għażla ta’ do ża. Jekk ma jkunx hemm 
informazzjoni (e ż. minn studji ta’ tossi ċità orali akuta li jirre ġistraw sinjali 
kliniċi ta’ tossi ċità, jew minn studji dwar tossi ċità ta’ do ża ripetuta) ikun 
jista’ jitqies valur g ħall-ogħla doża li tkun ta ħt l-istima ta’ LD  50 (rotot orali 
u dermali) jew LC  50 (rotta tal-inalazzjoni) jew ta ħt il-valur aktar baxx 
tal-stima tal-firxa ta’ tossi ċità akuta. Id-do ża aktar baxxa g ħandha tkun xi 
frazzjoni tad-do ża ogħla. 
23. Jekk ikun investigat livell wie ħed ta’ doża, idealment id-do ża għandha tkun 
għolja biżżejjed biex tit ħalla ssir identifikazzjoni ta’ metaboliti fl-eskreta (u 
fil-plażma, skont il-ka ż), filwaqt li ma tkunx prodotta tossi ċità li tkun tidher. 
Għandu jkun ipprovdut motiv g ħala ma jkunx ġie inkluż it-tieni livell ta’ 
doża. 
24. Jekk l-effett ta’ do ża fuq pro ċessi kineti ċi jkun jeħtieġlu jiġi stabbilit, żewġ 
dożi jistgħu ma jkunux suffi ċjenti u mill-anqas do ża waħda għandha tkun 
għolja biżżejjed biex tissatura dawk il-pro ċessi. Jekk l-erja ta ħt il-kurva 
tal-plażma ta’ kon ċentrazzjoni- ħin (AUC) ma tkunx lineari bejn żewġ 
livelli ta’ do ża użati fl-istudju ewlieni, din tkun indikazzjoni qawwija li 
tkun qed isse ħħ saturazzjoni ta’ pro ċess kinetiku wie ħed jew aktar xi 
mkien bejn i ż-żewġ livelli ta’ do ża. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Għal kimiċi għall-ittestjar ta’ tossi ċità baxxa, g ħandha tintu ża doża massima 
ta’ 1 000 mg/kg tal-pi ż tal-ġisem (rotot orali u dermali) (jekk 
l-amministrazzjoni tkun bir-rotta tal-inalazzjoni, irreferi g ħall-Kapitolu B.2 
ta’ dan l-Anness g ħal gwida; tipikament din id-do ża ma tkunx taqbe ż 2 
mg/l). Konsiderazzjonijiet spe ċifiċi għal kimika jistg ħu joħolqu l-ħtieġa ta’ 
doża ogħla skont ħtiġijiet regolatorji. G ħażla ta’ doża għandha dejjem tkun 
iġġustifikata.  
26. Dejta dwar do ża waħda tossikokinetika u ta’ distribuzzjoni ta’ tessuti tista’ 
tkun adegwati biex ikun iddeterminat il-potenzjal g ħal akkumulazzjoni u/jew 
persistenza. I żda f’xi ċirkostanzi tista’ tkun me ħtieġa amministrazzjoni ta’ 
doża ripetuta i) biex ikun indirizzat b’mod aktar s ħiħ il-potenzjal g ħal 
akkumulazzjoni u/jew persistenza jew bidliet f’TK (ji ġifieri, pere żempju, 
induzzjoni u inibizzjoni ta’ en żimi) jew ii) kif ikun mitlub mis-sistema 
regolatorja applikabbli. Fi studji li jinvolvu do żaġġ, filwaqt li amminis ­
trazzjoni ta’ do ża baxxa ripetuta s-soltu tkun suffi ċjenti, f’ċerti ċirkostanzi 
tista’ wkoll tkun me ħtieġa amministrazzjoni ta’ do ża għolja ripetuta (ara 
wkoll il-paragrafu 57).  
Amministrazzjoni ta’ Kimika g ħall-Ittestjar  
27. Il-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tin ħall jew ti ġi sospiża b’mod omo ġenju 
fl-istess vejjikolu u żat għall-istudji l-o ħra dwar tossi ċità ta’ gavage orali 
magħmulin bil-kimika g ħall-ittestjar, jekk tkun disponibbli informazzjoni 
dwar vejjikolu b ħal dan. G ħandu jkun ipprovdut motiv g ħall-għażla 
tal-vejjikolu. L-g ħażla tal-vejjikolu u l-volum ta’ do żaġġ għandhom 
jitqiesu fit-tfassil tal-istudju. Il-metodu tas-soltu ta’ amministrazzjoni huwa 
b’gavage; i żda amministrazzjoni b’kapsula tal- ġelatina jew b ħala taħlita ta’ 
dieta tista’ tkun vanta ġġuża f’sitwazzjonijiet spe ċifiċi (fiż-żewġ każijiet 
għandha ting ħata ġustifikazzjoni). G ħandha tkun ipprovduta verifika 
tad-doża attwali amministrata lil kull annimal.  
28. Il-volum massimu ta’ likwidu li g ħandu jkun amministrat b’gavage orali 
f’waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs tal-annimali tat-test, mit-tip ta’ 
vejjikolu ta’ do ża u minn jekk jing ħatax għalf jew le qabel ma tkun ammin ­
istrata l-kimika g ħall-ittestjar. G ħandu jing ħata l-motiv g ħala jkun ammin ­
istrat jew ristrett ikel qabel id-do żaġġ. Normalment il-volum g ħandu 
jinżamm baxx daqs kemm ikun prattikabbli g ħal vejjikoli jew tal-ilma jew 
mhux tal-ilma. Volumi ta’ do ża m’għandhomx normalment ikunu aktar 
minn 10 ml/kg tal-pi ż tal-ġisem għal rodituri. Volumi ta’ vejjikoli u żati 
għal aktar kimi ċi għall-ittestjar lipofili ċi jistgħu jibdew minn 4 ml/kg 
tal-piż tal-ġisem. G ħal dożaġġ ripetut, meta l-indikazzjoni tkun li 
m’għandux ikun hemm sawm kuljum, g ħandhom jitqiesu volumi ta’ do ża 
aktar baxxa (e ż. 2-4 ml/kg tal-pi ż tal-ġisem). Meta jkun possibbli, g ħandu 
jitqies l-u żu ta’ volum ta’ do ża konsistenti ma’ dak amministrat fi studji 
oħra dwar gavage orali g ħal kimika g ħall-ittestjar.  
29. L-amministrazzjoni intravenu ża (IV) tal-kimika g ħall-ittestjar u l-kejl 
tal-kimika g ħall-ittestjar fid-demm u/jew l-eskreta jistg ħu jintużaw biex jist ­
abbilixxu d-disponibbilità bijolo ġika jew l-assorbiment orali relattiv. G ħall- 
istudju IV, tkun amministrata do ża waħda (is-soltu ekwivalenti g ħad-doża 
orali baxxa i żda li ma taqbi żhiex – ara g ħażla ta’ doża) ta’ kimika g ħall- 
ittestjar billi jintu ża vejjikolu adattat. Dan il-materjal g ħandu jkun ammin ­
istrat f’volum xieraq (e ż. 1 ml/kg bw) fis-sit mag ħżul ta’ amministrazzjoni 
lil mill-anqas erba’ annimali tas-sess adattat (jistg ħu jintużaw iż-żewġ sessi, 
jekk dan ikun permess, ara l-paragrafu 16). Tkun me ħtieġa preparazzjoni ta’ 
doża maħlula kollha jew sospi ża għal amministrazzjoni IV tal-kimika g ħall- 
ittestjar. Il-vejjikolu g ħal amministrazzjoni IV m’g ħandux ifixkel l-integrità 
tad-demm jew il-fluss tad-demm. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar hija infu ża, ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
ir-rata ta’ infu żjoni għandha tkun irre ġistrata u standardizzata fost 
l-annimali, sakemm tintu ża pompa tal-infu żjoni. Għandha tintu ża 
l-anestesija jekk wie ħed idaħħal tubu rqiq fil-vina ġugulari (g ħal amminis ­
trazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar u/jew g ħal ġbir ta’ demm) jew jekk 
wieħed juża l-arterja femorali g ħal amministrazzjoni. G ħandha titqies 
bir-reqqa t-tip ta’ anestesija min ħabba li din tista’ jkollha effetti fuq 
it-tossikokinetika. L-annimali g ħandhom jit ħallew jirkupraw b’mod 
adegwat qabel amministrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar flimkien 
mal-vejjikolu.  
30. Jistg ħu japplikaw rotot o ħra ta’ amministrazzjoni, b ħal dawk dermali u ta’ 
inalazzjoni, (ara l-paragrafi 74-78) g ħal ċerti kimiċi għall-ittestjar, meqjusin 
il-proprjetajiet fi żikokimiċi tagħhom u l-u żu jew espo żizzjoni umana 
mistennija tag ħhom.  
Kejlijiet  
Bilanċ tal-massa  
31. Il-bilan ċ tal-massa huwa ddeterminat bl-g ħadd tal-per ċentwali tad-do ża (rad­
juattiva) amministrata li to ħroġ fl-awrina, fir-rawt u man-nifs, u 
bil-perċentwali li jkun hemm f’tessuti, karkassa residwali u ħasil ta’ ga ġeġ 
(ara l-paragrafu 46). Ġeneralment, irkupri totali ta’ kimika g ħall-ittestjar 
(radjuattività) amministrata fl-ammont ta’ > 90 % jitqiesu b ħala adegwati.  
Assorbiment  
32. Stima inizjali ta’ assorbiment tista’ tinkiseb billi jkun esklu ż il-perċentwali 
tad-doża fis-sistema gastrointestinali (GI) u/jew fir-rawt mid-determinazzjoni 
tal-bilanċ tal-massa. G ħall-kalkulazzjoni tal-assorbiment ta’ per ċentwali, ara 
l-paragrafu 33. G ħal investigazzjoni ta’ eskreta, ara l-paragrafi 44-49. Jekk 
l-ammont e żatt ta’ assorbiment wara li tkun ing ħatat doża orali ma jkunx 
jista’ jiġi stabbilit minn studji ta’ bilan ċ ta’ massa (e ż. fejn aktar minn 20 % 
tad-doża amministrata tkun fir-rawt), jista’ jkun hemm ħtieġa ta’ investi ­
gazzjonijiet ulterjuri. Dawn l-istudji jistg ħu jikkomprendu jew 1) amminis ­
trazzjoni orali ta’ kimika g ħall-ittestjar u kejl ta’ kimika g ħall-ittestjar fil-bili 
jew 2) amministrazzjoni orali u IV ta’ kimika g ħall-ittestjar u kejl ta’ kimika 
għall-ittestjar netta li tkun fl-awrina mag ħduda l-arja ta’ te ħid tan-nifs ‘il 
barra flimkien mal-karkassa minn kull wa ħda miż-żewġ rotot. F’wa ħda miż- 
żewġ tifsiliet tal-istudju, il-kejl tar-radjuattività jsir b ħala metodu sostitut 
għal analiżi speċifika għal kimika ta’ kimika g ħall-ittestjar flimkien ma’ 
metaboliti.  
33. Jekk jinbeda studju dwar eskrezzjoni ta’ bili, tipikament tintu ża r-rotta orali. 
F’dan istudju, il-kanali tal-bili ta’ mill-anqas erba’ annimali tas-sess adattat (jew taż-żewġ sessi, jekk dan ikun permess) g ħandu jidda ħħlilhom tubu rqiq 
u għandha tkun amministrata do ża waħda tal-kimika g ħall-ittestjar. Wara li 
tkun saret l-amministrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, eskrezzjoni ta’ 
radjuattività/kimika g ħall-ittestjar fil-bili g ħandha tkun immonitorjata 
sakemm je ħtieġ biex issir stima tal-per ċentwali tad-do ża amministrata li 
tkun ħarġet bħala eskreta permezz ta’ din ir-rotta, li tista’ tintu ża biex 
ikun ikkalkulat direttament kemm ikun sar assorbiment orali, kif ġej:
 
Assorbiment ta’ per ċentwali ¼ ðarjata’ teħid tan Ä nifs þ urine þ ‘il barra 
þ karkassa ming ħajr kontenuti tas Ä sistema GIÞ= 
ammont amministrat  Ü 100 
34. Għal xi klassijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar, sekrezzjoni diretta tad-do ża 
assorbita tista’ sse ħħ f’membrani intestinali kollha. F’ka żijiet bħal dawn 
il-kejl ta’ per ċentwali ta’ do ża f’rawt wara do ża orali lill-far b’tubu rqiq 
fil-kanal tal-bili ma jitqisx li jkun rappre żentattiv tad-do ża mhux assorbita. 
Huwa rrakkomandat li fejn ikun ma ħsub li sse ħħet sekrezzjoni intestinali, 
f’dak il-ka ż il-perċentwali ta’ do ża assorbita tkun ibba żata fuq l-assorbiment 
ikkalkulat mill-paragun tal-eskrezzjoni, wara li tkun saret ir-rotta orali, mar-rotta IV (far intatt jew b’tubu rqiq fil-kanal tal-bili) (ara l-paragrafu 35). Huwa rrakkomandat ukoll li meta jitqies li tkun me ħtieġa 
l-kwantifikazzjoni tas-sekrezzjoni intestinali, jitkejjel il-far b’tubu rqiq 
fil-kanali tal-bili wara amministrazzjoni ta’ do ża IV.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Disponibbiltà bijolo ġika 
35. Id-disponibbiltà bijolo ġika tista’ tkun iddeterminata mill-kinetika 
tal-plażma/tad-demm mill-gruppi orali u IV, kif deskritti fil-paragrafi 50- 
52, b’anali żi kimika spe ċifika tal-kimika g ħall-ittestjar u/jew ta’ metabolite/i 
rilevanti, li, g ħalhekk, ma tkunx te ħtieġ kimika g ħall-ittestjar b’tikketta 
radjoloġika. Il-kalkulazzjoni tad-disponibbiltà bijolo ġika (F) tal-kimika 
għall-ittestjar jew ta’ metabolite/i rilevanti tista’ mbag ħad issir kif ġej: 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
fejn ‘AUC’ tkun l-erja ta ħt il-kurva tal-pla żma ta’ kon ċentrazzjoni- ħin, u 
‘exp’ tkun ir-rotta sperimentali (orali, dermali jew permezz ta’ inalazzjoni).  
36. Għal użu f’valutazzjoni tar-riskju ta’ effetti sistemi ċi, id-disponibbiltà bijo ­
loġika tal-komponent tossiku tkun ġeneralment ippreferuta flok 
l-assorbiment ta’ per ċentwali meta kon ċentrazzjonijiet sistemi ċi minn 
studji dwar annimali jitqabblu ma’ dejta analoga ta’ monitora ġġ bijoloġiku 
minn studji dwar espo żizzjoni ta’ ħaddiema. Is-sitwazzjoni tista’ ssir aktar 
kumplessa jekk do żi jkunu fil-firxa mhux lineari; g ħalhekk huwa importanti 
li tgħarbil tossikokinetiku jiddetermina do żi fil-firxa lineari.  
Distribuzzjoni tat-Tessuti  
37. Tagħrif dwar id-distribuzzjoni ta’ tessuti ta’ kimika g ħall-ittestjar u/jew 
il-metaboliti tag ħha huwa important g ħall-identifikazzjoni ta’ tessuti 
mmirati u biex wie ħed jifhem il-mekkani żmi bażiċi ta’ tossi ċità u tinkiseb 
informazzjoni dwar il-potenzjal g ħal akkumulazzjoni u persistenza ta’ 
kimika g ħall-ittestjar u ta’ metaboliti. Il-per ċentwali tad-do ża totali (rad ­
juattiva) f’tessuti kif ukoll ta’ karkassa residwali g ħandhom mill-anqas 
jitkejlu fit-tmiem tal-esperiment ta’ eskrezzjoni (e ż. tipikament sa 7 ijiem 
wara doża jew anqas skont x’tag ħmel speċifikatament kimika g ħall-ittestjar). 
Meta ma tinstab ebda kimika g ħall-ittestjar f’tessuti fi tmiem ta’ studju (e ż. 
minħabba li l-kimika g ħall-ittestjar setg ħet kienet eliminata qabel intemm 
l-istudju min ħabba nofs ħajja qasira), g ħandha ting ħata attenzjoni biex ma 
jkunx hemm interpretazzjni ħażina tad-dejta. F’dan it-tip ta’ sitwazzjoni, 
id-distribuzzjoni ta’ tessuti g ħandha tkun investigata fil-mument 
tal-konċentrazzjoni massima tal-pla żma/tad-demm tal-kimika g ħall-ittestjar 
(u/jew tal-metabolite) (T  max ) jew tar-rata massima ta’ eskrezzjoni 
tal-awrina, kif jixraq (ara l-paragrafu 38). Barra dan, il- ġbir ta’ tessuti 
f’punti addizzjonali ta’ ħin jista’ jkun me ħtieġ biex jiddetermina 
d-distribuzzjoni ta’ tessuti tal-kimika g ħall-ittestjar u/jew tal-metaboliti 
tagħha, biex jevalwa d-dipendenza fuq il- ħin (fejn xieraq), biex jg ħin biex 
ikun stabbilit bilan ċ ta’ massa u/jew skont kif ikun me ħtieġ minn awtorità 
kompetenti. It-tessuti li g ħandhom jin ġabru jinkludu l-fwied, ix-xa ħam, 
is-sistema GI, il-kilwa, il-milsa, id-demm kollu, il-karkassa residwali, tessuti tal-organu mmirati u kwalunwke tessut ie ħod (eż. tirojde, 
l-eritroċiti, l-organi ta’ riproduzzjoni, il- ġidla, l-għajn (partikolarment f’an ­
nimali bix-xag ħar) ta’ sinifikanza potenzjali fl-evalwazzjoni tossikolo ġika 
tal-kimika g ħall-ittestjar. L-anali żi ta’ tessuti addizzjonali fl-istess punti ta’ 
ħin għandha tiġi kkunsidrata g ħall-utilizzazzjoni massima tal-annimali u 
fil-każ li t-tossi ċità tal-organu mmirat ti ġi osservata fl-istudji tat-tossi ċità 
subkronaka u kronaka. Il-kon ċentrazzjoni residwali (raju attiva) u 
l-proporzjonijiet ta’ tessut-g ħal-plażma (demm) g ħandhom ji ġu rreġistrati 
wkoll.
 
38. L-evalwazzjoni tad-distribuzzjoni ta’ tessuti f’punti addizzjonali ta’ ħin bħal 
fil-ħin ta’ kon ċentrazzjoni massima ta’ pla żma/demm (e ż. T max ) jew tar-rata 
massima ta’ eskrezzjoni tal-awrina, miksuba mill-esperimenti rispettivi kinetiċi tal-plażma/demm jew ta’ eskrezzjoni, tista’ wkoll tkun me ħtieġa 
jew mitluba minn awtorità kompetenti. Din l-informazzjoni tista’ tkun utli 
biex wie ħed jifhem it-tossi ċità u l-potenzjal g ħal akkumulazzjoni u 
persistenza ta’ kimika g ħall-ittestjar u ta’ metaboliti. G ħandha tkun 
ipprovduta ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ teħid ta’ kampjuni; il-kampjuni 
għal analiżi ġeneralment g ħandhom ikunu l-istess b ħal dawk ta’ hawn fuq 
(ara l-paragrafu 37).
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Il-kwantifikazzjoni tar-radjuattività g ħal studji dwar distribuzzjoni ta’ tessuti 
tista’ ssir billi jintu żaw dissezzjoni ta’ organi, omo ġenizzazzjoni, 
kombustjoni u/jew solubilizzazzjoni, segwiti bl-g ħadd ta’ xintillazzjonijiet 
likwidi (LSC) ta’ residwi maqbudin. Ċerti tekniki, li b ħalissa jinsabu 
f’diversi stadji ta’ żvilupp, e ż. awtoradjografija kwantitattiva tal- ġisem 
kollu u awtoradjografija re ċettriċi mikroskopika jistg ħu jkunu utli biex 
tkun iddeterminata d-distribuzzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar f’organi u/jew 
f’tessuti (3) (4).  
40. Għal rotot ta’ espo żizzjoni minbarra orali, g ħandhom jin ġabru tessuti 
speċifiċi u jkunu analizzati, b ħal pulmuni fi studji ta’ inalazzjoni u ġilda 
fi studji dermali. Ara l-paragrafi 74-78.  
Metaboliżmu 
41. Eskreta (u pla żma, kif jixraq) g ħandhom jin ġabru għal identifikazzjoni u 
kwantifikazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar u ta’ metaboliti mhux mibdulin kif 
deskritt fil-paragrafi 44-49. Il- ġabra flimkien tal-eskreta biex tkun iffa ċilitata 
l-identifikazzjoni ta’ metaboliti fi grupp ta’ do ża partikolari huwa a ċċet­
tabbli. It-te ħid ta’ profil ta’ metaboliti minn kull perjodu ta’ żmien huwa 
rrakkomandat. I żda, jekk nuqqas ta’ kampjun u/jew radjuattività ma j ħallux 
li jsir dan, il- ġmigħ ta’ awrina u rawt f’diversi punti ta’ ħin ikun aċċettabbli 
iżda l-ġmigħ fir-rigward tas-sessi jew tad-do żi kollha ma jkunx a ċċettabbli. 
Għandhom jintu żaw metodi kwalitattivi u kwantitattivi biex ikunu analizzati 
awrina, rawt, radjuattività skaduta minn annimali ttrattati, u bili jekk ikun xieraq.
 
42. Għandhom isiru sforzi ra ġonevoli biex ikunu identifikati l-metaboliti kollha 
li jkun hemm f’5 % jew aktar tad-do ża amministrata u biex tkun ipprovduta 
skema metabolika g ħall-kimika g ħall-ittestjar. G ħandhom ikunu identifikati 
kimiċi għall-ittestjar li kienu kkaratterizzati fl-eskreta b ħala li jikkomprendu 
5 % jew aktar tad-do ża amministrata. Identifikazzjoni tirreferi g ħad-deter­
minazzjoni strutturali e żatta ta’ komponenti. B’mod tipiku, identifikazzjoni 
tinkiseb jew b’kokromatografija tal-metabolite bi standards mag ħrufin billi 
jintużaw żewġ sistemi mhux b ħal xulxin jew b’tekniki b’kapa ċità għal iden­
tifikazzjoni strutturali po żittiva bħal spettrometrija tal-massa, re żonanza 
nukleari manjetika (NMR), e ċċ. Fil-każ ta’ kokromatografija, tekniki kroma ­
tografiċi li jutilizzaw l-istess fa żi stazzjonarja b’ żewġ sistemi differenti ta’ 
solventi ma jitqisux li jkunu verifika adegwata ta’ żewġ metodi ta’ identità 
ta’ metaboliti, min ħabba li l-metodi ma jkunux indipendenti. Identifikazzjoni 
b’kokromatografija g ħandha tinkiseb billi jintu żaw żewġ sistemi mhux b ħal 
xulxin, analitikament indipendenti b ħal kromatografija ta’ saff irqiq ta’ fa żi 
kuntrarja u normali (TLC) u kromatografija likwida ta’ prestazzjoni 
għolja (HPLC). Sakemm is-separazzjoni kromatografika tkun ta’ kwalità 
adattata, f’dak il-ka ż ma tkunx me ħtieġa konferma addizzjonali b’mezzi 
spettroskopi ċi. Alternattivament, identifikazzjoni mhux ambigwa tista’ 
tinkiseb billi jintu żaw metodi li jipprovdu informazzjoni strutturali b ħal: 
kromatografija likwida/spettrometrija tal-massa (LC-MS), jew kromatografija likwida/spettrometrija tal-massa tandem (LC-MS/MS), kromatografija 
tal-gass/spettrometrija tal-massa (GC-MS), u spettrometrija NMR.
 
43. Jekk ma tkunx tista’ ssir identifikazzjoni ta’ metaboliti f’5 % jew aktar 
tad-doża amministrata, g ħandha ting ħata ġustifikazzjoni/spjegazzjoni 
fir-rapport finali. Jista’ jkun xieraq li jkunu identifikati metaboliti li jkunu 
jirrappreżentaw anqas minn 5 % tad-do ża amministrata biex jinkiseb 
għarfien aħjar tal-passa ġġ metaboliku g ħall-valutazzjoni tal-periklu u/jew 
tar-riskju tal-kimika g ħall-ittestjar. G ħandha ting ħata konferma strutturali 
kull meta jkun possibbli. Din tista’ tinkludi te ħid ta’ profili fil-pla żma jew 
fid-demm jew f’tessuti o ħra. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Eskrezzjoni  
44. Ir-rata u l-kwantità ta’ eskrezzjoni tad-do ża amministrata g ħandhom ikunu 
ddeterminati billi jitkejjel il-per ċentwali ta’ do ża rkuprata (radjuattiva) 
mill-awrina, mir-rawt u mill-arja ta’ te ħid tan-nifs ‘il barra. Din id-dejta 
tgħin ukoll biex ikun stabbilit bilan ċ ta’ massa. Il-kwantitajiet ta’ kimika 
għall-ittestjar (radjuattività) eliminati fl-awrina, fir-rawt u fl-arja ta’ te ħid 
tan-nifs ‘il barra g ħandhom ikunu ddeterminati f’intervalli ta’ ħin adatti 
(ara l-paragrafi 47-49). Esperimenti ta’ do ża ripetuta g ħandhom jitfasslu 
sewwa biex jit ħalla jkun hemm ġbir ta’ dejta ta’ eskrezzjoni biex jit ħarsu 
l-għanijiet deskritti fil-paragrafu 26. Dan jippermetti li jkun hemm paragun 
ma’ esperimenti ta’ do ża waħda. 
45. Jekk studju pilota jkun wera li ma jkun ħareġ bħala eskreta fl-arja ta’ te ħid 
tan-nifs ‘il barra ebda ammont sinifikanti ta’ kimika g ħall-ittestjar (radjuat ­
tività) (skont il-paragrafu 49), f’dak il-ka ż l-arja ta’ te ħid tan-nifs ‘il barra 
ma jkunx je ħtiġilha tinġabar fl-istudju definittiv.  
46. Kull annimal g ħandu jitqieg ħed f’unità metabolika separata g ħall-ġbir ta’ 
eskreta (awrina, rawt u arja ta’ te ħid tan-nifs ‘il barra). Fit-tmiem ta’ kull 
perjodu ta’ ġbir (ara l-paragrafi 47-49), l-unitajiet metaboli ċi għandhom 
jitlaħalħu b’solvent adattat (dan huwa mag ħruf bħala “ħasil tal-ga ġġa”) 
biex ikun żgurat irkupru massimu tal-kimika g ħall-ittestjar (radjuattività). 
Il-ġbir ta’ eskreta g ħandu jintemm wara 7 ijiem, jew wara li mill-anqas 
90 % tad-do ża amministrata tkun ġiet irkuprata, skont liema minnhom ji ġi 
l-ewwel.  
47. Il-kwantitajiet totali ta’ kimika g ħall-ittestjar (radjuattività) fl-awrina 
għandhom ikunu ddeterminati f’mill-anqas żewġ punti ta’ ħin fl-ewwel 
jum tal-ġbir, li wie ħed minnhom g ħandu jkun f’24 sieg ħa wara d-do żaġġ, 
u kuljum minn hemm ‘il quddiem sakemm jintemm l-istudju. Ix-xewqa hija li l-għażla tkun ta’ aktar minn żewġ punti ta’ te ħid ta’ kampjuni fl-ewwel 
jum (eż. fis-6, fit-12 u fl-24 sieg ħa). Ir-riżultati ta’ studji pilota g ħandhom 
ikunu analizzati g ħal informazzjoni dwar punti ta’ ħin alternattivi jew 
addizzjonali biex isir il- ġbir. Għandu jkun ipprovdut motiv g ħal skedi ta’ 
ġbir.
 
48. Il-kwantitajiet totali ta’ kimika g ħall-ittestjar (radjuattività) f’rawt g ħandhom 
ikunu ddeterminati fuq ba żi ta’ kull jum li tibda fl-24 sieg ħa wara d-do żaġġ 
sakemm jintemm l-istudju, jekk studji pilota ma jissu ġġerux punti ta’ ħin 
alternattivi jew addizzjonali g ħal ġbir. Għandu jkun ipprovdut motiv g ħal 
skedi ta’ ġbir alternattivi.  
49. Il-ġbir ta’ CO  2 skadut u ta’ materjali volatili o ħra jista’ jitwaqqaf f’es ­
periment ta’ studju partikolari meta anqas minn 1 % tad-do ża amministrata 
tinstab fl-arja ta’ te ħid tan-nifs ‘il barra matul perjodu ta’ ġbir ta’ 24 sieg ħa. 
Studji ta’ Perkors ta’ Żmien  
Kinetika ta’ Pla żma/Demm  
50. Il-fini ta’ dawn l-istudji huwa li jinkisbu stimi ta’ parametri ba żiċi ta’ TK 
[eż. nofs ħajja C  max , T max, (t 1/2 ), AUC] g ħall-kimika g ħall-ittestjar. Dawn 
l-istudji jistg ħu jsiru b’do ża waħda jew, x’aktarx, b’ żewġ dożi jew aktar. 
Id-dożi għandhom ikunu stabbiliti skont kif ikunu ddeterminati min-natura 
tal-esperiment u/jew skont il-kwistjoni li tkun qed ti ġi indirizzata. Tista’ 
tkun me ħtieġa dejta kinetika biex ikunu solvuti kwistjonijiet b ħad- 
disponibbiltà bijolo ġika tal-kimika g ħall-ittestjar u/jew biex ikun i ċċarat 
l-effett ta’ do ża fuq ikklirjar (e ż. biex ikun i ċċarat jekk ikklirjar ikunx 
issaturat b’mod li jkun jiddependi minn do ża). 
51. Għal dawn l-istudji g ħandu jintu ża mhux anqas minn erba’ annimali ta’ sess 
wieħed għal kull grupp ta’ do ża. Għandha ting ħata ġustifikazzjoni g ħas-sess 
tal-annimali u żat. Għandu jitqies l-u żu taż-żewġ sessi (erba’ r ġiel u erba’ 
nisa) jekk ikun hemm evidenza li ssostni differenzi sustanzjali fit-tossi ċità 
b’rabta mas-sessi.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Wara li tkun amministrata l-kimika g ħall-ittestjar (b’tikketta radjolo ġika), 
għandhom jinkisbu kampjuni tad-demm minn kull annimal f’punti adatti 
ta’ ħin bl-użu ta’ metodolo ġija xierqa ta’ te ħid ta’ kampjuni. Il-volum u 
l-għadd ta’ kampjuni tad-demm li jistg ħu jinkisbu minn kull annimal jistg ħu 
jkunu llimitati minn effetti potenzjali ta’ te ħid ripetut ta’ kampjuni fuq 
is-saħħa/il-fiżjoloġija u/jew fuq is-sensittività tal-metodu analitiku. 
Kampjuni g ħandhom ikunu analizzati g ħal kull annimal g ħalih waħdu. 
F’xi ċirkostanzi (e ż. karatterizzazzjoni ta’ metaboliti), jista’ jkun me ħtieġ 
li jinġemgħu kampjuni minn aktar minn annimal wie ħed. Kampjuni 
miġmugħin għandhom ikunu identifikati b’mod ċar u għandha ting ħata 
spjegazzjoni g ħall-ġabra flimkien. Jekk tintu ża kimika g ħall-ittestjar 
b’tikketta radjolo ġika, anali żi tar-radjuattività totali li jkun hemm tista’ 
tkun adegwata. Jekk ikun hekk, radjuattività totali g ħandha tkun analizzata 
fid-demm u fil-pla żma kollha jew fil-pla żma u fiċ-ċelluli ħomor tad-demm 
biex titħalla ssir kalkulazzjoni tal-proporzjon ta’ demm/pla żma. F’ċirkostanzi 
oħra jistgħu jkunu me ħtieġa investigazzjonijiet aktar spe ċifiċi li jkunu 
jeħtieġu l-identifikazzjoni ta’ kompost u/jew ta’ metaboliti prin ċipali, jew 
ikun meħtieġ li jkun ivvalutat it-tg ħaqqid ta’ proteini.  
Tessuti Kineti ċi Oħra 
53. L-għan ta’ dawn l-istudji huwa li tinkiseb informazzjoni dwar il-perkors ta’ 
żmien biex ikunu indirizzati affarijiet relatati ma’ kwistjonijiet b ħal modalità 
tossika ta’ azzjoni, akkumulazzjoni bijolo ġika u persistenza bijolo ġika 
permezz ta’ determinazzjoni ta’ livelli ta’ kimika g ħall-ittestjar f’diversi 
tessuti. L-g ħażla ta’ tessuti u l-g ħadd ta’ punti ta’ ħin evalwati jkunu 
jiddependu mill-kwistjoni li jkollha tkun indirizzata u mid-database tossiko ­
loġika għall-kimika g ħall-ittestjar. It-tifsila ta’ dawn l-istudji addizzjonali ta’ 
tessuti kineti ċi għandha tqis informazzjoni mi ġbura kif deskritt fil-paragrafi 
37-40. Dawn l-istudji jistg ħu jinvolvu do żaġġ wieħed jew ripetut. G ħandu 
jkun ipprovdut motiv dettaljat g ħall-approċċ użat. 
54. Raġunijiet biex isiru studji o ħra dwar tessuti kineti ċi jistgħu jinkludu:  
— Evidenza ta’ nofs ħajja tad-demm esti ża, li tindika li jista’ jkun hemm 
akkumulazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar f’diversi tessuti jew  
— interess li wie ħed jara jekk ikunx inkiseb livell ta’ stat regolari f’tessuti 
speċifiċi (eż. fi studji dwar do żaġġ ripetut; ukoll jekk ikun jidher li 
nkiseb livell ta’ demm fi stat regolari ta’ kimika g ħall-ittestjar, jista’ 
jkun hemm interess li jkun a ċċertat li jkun intla ħaq livell ta’ stat 
regolari f’tessuti mmirati).  
55. Għal dawn it-tipi ta’ studji dwar perkors ta’ żmien, għandha tkun ammin ­
istrata do ża orali xierqa ta’ kimika g ħall-ittestjar lil mhux anqas minn erba’ 
annimali g ħal kull do ża għal kull punt ta’ ħin, u l-perkors ta’ żmien ta’ 
distribuzzjoni jkun immonitorjat f’tessuti mag ħżulin. Jista’ jintu ża sess 
wieħed biss, sakemm ma tkunx osservata tossi ċità speċifika għall-ġeneru. 
Jekk ikunux analizzati radjuattività totali jew kimika u/jew metaboliti prin ­ 
ċipali jkun jiddependi wkoll mit-tessut li jkun qed ji ġi eżaminat. G ħandha 
ssir valutazzjoni ta’ distribuzzjoni ta’ tessuti bl-u żu ta’ tekniki adatti.  
Induzzjoni/Inibizzjoni ta’ Enzimi  
56. Studji li jindirizzaw l-effetti li jista’ jkun hemm ta’ induzzjoni/inibizzjoni ta’ 
enzimi jew ta’ trasformazzjoni bijolo ġika ta’ kimika g ħall-ittestjar li tkun 
qed tiġi studjata jistg ħu jkunu me ħtieġa f’każ wieħed jew aktar li ġejjin:  
1. L-evidenza li jkun hemm tkun tindika relazzjoni bejn trasformazzjoni 
bijoloġika ta’ kimika g ħall-ittestjar u tossi ċità msaħħa; 
2. Id-dejta li jkun hemm dwar tossi ċità tkun tindika relazzjoni mhux lineari 
bejn doża u metaboli żmu; ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. Ir-riżultati ta’ studji dwar identifikazzjoni ta’ metaboliti juru identifi ­
kazzjoni ta’ metabolite li tista’ tkun tossika li setg ħet kienet prodotta 
minn passa ġġ ta’ enzima mi ġjuba mill-kimika g ħall-ittestjar;  
4. Fi spjegazzjoni ta’ effetti li jkun ippostulat li jkollhom rabta ma’ 
fenomini ta’ induzzjoni ta’ enzimi;  
5. Jekk ikunu osservati tibdiliet tossikolo ġiċi sinifikanti fil-profil metaboliku 
tal-kimika g ħall-ittestjar permezz ta’ esperimenti in vitro jew in vivo fi 
speċijiet jew f’kundizzjonijiet differenti, tista’ tkun me ħtieġa karatteriz ­
zazzjoni tal-enzima/i involuta/i (e ż. enzimi tal-Fa żi I bħal isoenzimi 
tas-sistema ta’ ossi ġenażi mono li jkunu jiddependu minn Ċitokromju 
P450, enzimi tal-Fa żi II bħal isoenzimi ta’ sulfotransfera żi jew glucu ­
ronosyl trasferimenta żi ta’ difosfat tal-uridina jew kull enzima rilevanti 
oħra). Din l-informazzjoni tista’ tintu ża biex tkun evalwata l-pertinenza 
ta’ estrapolazzjonijiet minn spe ċi għal speċi. 
57. Għandhom jintu żaw protokolli xierqa ta’ studji biex tkun evalwata kimika 
għall-ittestjar relatata ma’ bidliet f’TK, ivvalidati u ġġustifikati b ħala tajbin. 
Eżempji ta’ tifsiliet ta’ studji jikkonsistu f’do żaġġ ripetut b’kimika g ħall- 
ittestjar ming ħajr tikketta, segwiti b’do ża waħda b’tikketta radjolo ġika fl-14- 
il jum, jew b’do żaġġ ripetut b’kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika u 
b’teħid ta’ kampjuni fl-1, fis-7 u fl-14-il jum g ħal determinazzjoni ta’ profili 
ta’ metaboliti. Do żaġġ ripetut b’kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radjolo ġika 
jista’ wkoll jipprovdi informazzjoni dwar akkumulazzjoni bijolo ġika (ara 
l-paragrafu 26).  
APPROĊĊI SUPPLIMENTARI  
58. Appro ċċi supplimentari lil hinn mill-esperimenti in vivo deskritti f’dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar jistg ħu jipprovdu informazzjoni utli dwar 
l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu jew l-eliminazzjoni ta’ 
kimika għall-ittestjar f’ ċerti speċijiet. 
Użu ta’ informazzjoni  in vitro  
59. Jistg ħu jkunu indirizzati diversi mistoqsijiet dwar il-metaboli żmu tal-kimika 
għall-ittestjar fi studji  in vitro  billi jintu żaw sistemi ta’ ttestjar adatti. Jistg ħu 
jintużaw epatoċiti li jkunu g ħadhom kif ġew iżolati jew li kienu f’kultura u 
frazzjonijiet sub ċellulari (e ż. mikrożomi u ċitosoli jew frazzjoni S9) 
mill-fwied biex ikunu studjati metaboliti li jista’ jkun hemm. Metaboli żmu 
lokali fl-organu mmirat, e ż. il-pulmun, jista’ jkun ta’ interess g ħall-valu­
tazzjoni tar-riskju. G ħal dawn l-g ħanijiet, frazzjonijiet mikrosomali ta’ 
tessuti mmirati jistg ħu jkunu utli. Studji dwar mikro żomi jistg ħu jkunu 
utli biex ikunu indirizzati differenzi potenzjali dwar ġeneru u stadji 
tal-ħajja u biex ikunu kkaratterizzati parametri ta’ enzimi (K  m u V  max ) li 
jistgħu jkunu ta’ g ħajnuna fil-valutazzjoni ta’ dipendenza fuq do ża ta’ meta ­
boliżmu b’rabta ma’ livell ta’ kon ċentrazzjoni. Flimkien ma’ dan, 
mikrożomi jistg ħu jkunu utli biex ikunu identifikati l-en żimi mikrosomali 
speċifiċi involuti fil-metaboli żmu tal-kimika g ħall-ittestjar li jistg ħu jkunu 
rilevanti f’estrapolazzjoni ta’ spe ċijiet (ara wkoll il-paragrafu 56). 
Il-potenzjal g ħal induzzjoni ta’ trasformazzjoni bijolo ġika jista’ wkoll ikun 
eżaminat billi jintu żaw frazzjonijiet sub ċellulari tal-fwied (e ż. mikrożomi u 
ċitosoli) tal-annimali ttrattati minn qabel bil-kimika g ħall-ittestjar ta’ 
interess,  in vitro  permezz ta’ studji dwar induzzjoni ta’ epato ċite jew 
minn linji spe ċifiċi ta’ ċelluli li jkunu jesprimu enzimi rilevanti. F’ ċerti 
ċirkostanzi u f’kundizzjonijiet xierqa, frazzjonijiet sub ċellulari li jkunu 
ġejjin minn tessuti tal-bniedem jistg ħu jitqiesu biex jintu żaw biex ikunu 
ddeterminati differenzi li jista’ jkun hemm ta’ spe ċijiet fi trasformazzjoni 
bijoloġika. Ir-riżultati minn investigazzjonijiet  in vitro  jistgħu wkoll ikunu 
utli fl-iżvilupp ta’ mudelli PBTK (5).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Studji ta’ assorbiment dermali  in vitro  jistgħu jipprovdu informazzjoni 
supplimentari biex ikun ikkaratterizzat assorbiment (6).  
61. Kulturi ta’ ċelluli primarji minn ċelluli tal-fwied u ftieti friski ta’ tessuti 
jistgħu jintużaw biex ikunu indirizzati mistoqsijiet simili dwar mikro żomi 
tal-fwied. F’ ċerti każijiet, jista’ jkun possibbli jitwie ġbu mistoqsijiet spe ċifiċi 
billi jintu żaw linji ta’ ċelluli b’espressjoni definita tal-enzima rilevanti jew 
b’linji ta’ ċelluli maħdumin. F’certi ka żijiet, jista’ jkun utli li jkunu studjati 
l-inibizzjoni u l-induzzjoni ta’ iso żimi speċifiċi ta’ ċitokromju P450 (e ż. 
CYP1A1, 2E1, 1A2 u o ħrajn) u/jew en żimi tal-Fa żi II mill-kompost prin ­ 
ċipali billi jintu żaw studji  in vitro . Informazzjoni miksuba tista’ tkun utli 
għal komposti strutturati bl-istess mod.  
Użu ta’ Dejta Tossikokinetika minn Studji dwar Tossi ċità bħala 
Informazzjoni Komplimentari  
62. Anali żi ta’ kampjuni ta’ demm, tessuti u/jew eskreta miksubin meta jkun 
qed isir kull studju ie ħor dwar tossi ċità tista’ tipprovdi dejta dwar 
disponibbiltà bijolo ġika, bidliet f’kon ċentrazzjoni ta’ pla żma f’waqtha 
(AUC, C  max ), potenzjal g ħal akkumulazzjoni bijolo ġika, rati ta’ kklirjar u 
tibdiliet fil- ġeneru jew fi stadji tal- ħajja fil-metaboli żmu u fil-kinetika.  
63. Konsiderazzjoni tat-tifsila tal-istudju tista’ tintu ża biex jitwie ġbu mistoqsijiet 
relatati ma’: saturazzjoni ta’ assorbiment, trasformazzjoni bijolo ġika jew 
passaġġi ta’ eskrezzjoni f’livelli ta’ do żi ogħla; it-tħaddim ta’ passa ġġi meta­
boliċi ġodda f’do żi ogħla u l-limitazzjoni ta’ metaboliti tossi ċi għal dożi 
ogħla. 
64. Konsiderazzjonijiet o ħra dwar valutazzjoni tal-periklu jistg ħu jinkludu kwist ­
jonijiet bħal: 
— Sensittività relatata mal-età min ħabba differenzi fl-istatus tal-limitu bejn 
demm u mo ħħ, kilwa u/jew kapa ċitajiet ta’ di żintossifikazzjoni;  
— Sensittività ta’ subpopolazzjoni min ħabba differenzi f’kapa ċitajiet ta’ 
trasformazzjoni bijolo ġika jew differenzi o ħra ta’ TK;  
— Kemm tkun l-espo żizzjoni tal-fetu minn trasferiment ta’ kimi ċi 
mill-plaċenta jew tal-wild ġdid mill-irdig ħ. 
Użu ta’ Mudellar Tossikokinetiku  
65. Mudelli tossikokineti ċi jistgħu jkunu utli g ħal diversi aspetti ta’ valutazzjoni 
tal-periklu u tar-riskju b ħal, pereżempju fit-tbassir ta’ espo żizzjoni sistemika 
u ta’ do ża għal tessuti interni. Barra dan, jistg ħu jkunu indirizzati 
mistoqsijiet dwar modalità ta’ azzjoni, u dawk il-mudelli jistg ħu jipprovdu 
bażi għal estrapolazzjoni ma’ spe ċijiet, rotot ta’ espo żizzjoni, xejriet ta’ 
dożaġġ, u għal valutazzjoni tar-riskju g ħal bniedem. Dejta utli biex ikunu 
żviluppati mudelli ta’ PBTK g ħal kimika g ħall-ittestjar f’kull spe ċi parti­
kolari jinkludu 1) koeffi ċjenti ta’ partizzjoni, 2) kostanti ta’ kimika bijo ­
loġika u parametri fi żjoloġiċi, 3) parametri ta’ assorbiment spe ċifiċi għal 
rotta u 4) dejta kineta  in vivo  għal evalwazzjoni ta’ mudelli [e ż. parametri 
ta’ kklirjar g ħal passaġġi ta’ eskrezzjoni (> 10 %), K  m u V  max għal meta­
boliżmu]. Id-dejta ta’ esperimenti u żata fi żvilupp ta’ mudelli g ħandha tkun 
iġġenerata b’metodi xjentifikament tajbin, u r-ri żultati tal-mudelli g ħandhom 
ikunu vvalidati. Parametri spe ċifiċi għal kimiċi u għal speċijiet bħal rati ta’ 
assorbiment, partizzjoni ta’ tessuti tad-demm u kostanti ta’ rati metaboli ċi 
sikwit ikunu ddeterminati biex jiffa ċilitaw żvilupp ta’ mudelli mhux 
kompartimentali jew mudelli b’ba żi fiżjoloġika (7).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DEJTA U RAPPURTAR  
66. Huwa rrakkomandat li r-rapport tal-istudju jkun jinkludi werrej.  
Korp tar-Rapport  
67. Il-korp tar-rapport g ħandu jinkludi informazzjoni koperta minn dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar organizzata f’taqsimiet u paragrafi kif ġej: 
Sommarju  
68. Din it-taqsima tar-rapport tal-istudju g ħandha tinkludi sommarju tat-tifsila 
tal-istudju u deskrizzjoni ta’ metodi u żati. Għandha tag ħti wkoll prominenza 
lis-sejbiet ewlenin dwar bilan ċ ta’ massa, in-natura u l-kobor tal-metaboliti, 
residwu ta’ tessuti, rata ta’ kklirjar, potenzjal g ħal akkumulazzjoni bijo ­
loġika, differenzi sesswali, e ċċ. Is-sommarju g ħandu jkun ippre żentat 
b’dettalji suffi ċjenti biex tit ħalla ssir evalwazzjoni tas-sejbiet.  
Daħla 
69. Din it-taqsima tar-rapport g ħandha tinkludi l-g ħanijiet tal-istudju, il-motiv u 
t-tifsila, kif ukoll referenzi adatti u informazzjoni storika b ħala sfond.  
Materjali u Metodi  
70. Din it-taqsima tar-rapport g ħandha tinkludi deskrizzjonijiet dettaljati 
tal-informazzjoni kollha pertinenti, inklu żi: 
(a) Kimika g ħall-Ittestjar  
Din is-subtaqsima g ħandha tinkludi identifikazzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar: l-isem tal-kimika, l-istruttura molekulari, id-determinazzjoni 
kwalitattiva u kwantitattiva tal-kompo żizzjoni kimika tag ħha, 
il-purezza kimika u kull meta jkun possibbli, it-tip u l-kwantitajiet ta’ kull impurezza. G ħandha tinkludi wkoll informazzjoni dwar proprjetajiet 
fiżiċi/kimiċi, inkluż l-istat fiżiku, lewn, solubilità gross u/jew koeffi ċjent 
tal-partizzjoni, stabbiltà, u fejn xieraq, korru żività. Jekk tkun applik ­
abbli, għandha ting ħata informazzjoni dwar isomeri. Jekk il-kimika 
għall-ittestjar tkun b’tikketta radjolo ġika, f’din is-subtaqsima g ħandha 
tkun inklu ża informazzjoni dwar dan li ġej: it-tip ta’ radjonuklid, 
il-pożizzjoni tat-tikketta, attività spe ċifika u purezza radjukimika.
 
Għandhom ikunu ddikjarati t-tip jew id-deskrizzjoni ta’ kull vejjikolu, 
dilwent, a ġent ta’ sospensjoni u emulsifikatur jew materjal ie ħor użati 
biex tkun amministrata l-kimika g ħall-ittestjar.  
(b) Annimali tat-Test  
Din is-subtaqsima g ħandha tinkludi informazzjoni dwar l-annimali 
tat-test, inklu żi għażla u ġustifikazzjoni g ħal speċi, razza u età meta 
jibda l-istudju, sess, kif ukoll pi ż tal-ġisem, stat ta’ sa ħħa u trobbija 
tal-annimali.  
(c) Metodi  
Din is-subtaqsima g ħandha tinkludi dettalji tat-tifsila tal-istudju u 
l-metodolo ġija użata. Għandha tinkludi deskrizzjoni ta’:  
(1) Ġustifikazzjoni g ħal kull modifika ta’ rotta ta’ espo żizzjoni u 
kundizzjonijiet ta’ espo żizzjoni, jekk applikabbli;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
(2) Ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ livelli ta’ do ża; 
(3) Deskrizzjoni ta’ studji pilota u żati fit-tifsila sperimentali tal-istudji 
ta’ segwitu, jekk applikabbli. G ħandha tkun sottomessa dejta ta’ 
sostenn tal-istudju pilota;  
(4) Kif tkun t ħejjiet is-soluzzjoni tad-do żaġġ u t-tip ta’ solvent jew 
vejjikolu u żat, jekk ikun hemm;  
(5) Għadd ta’ gruppi ta’ trattament u g ħadd ta’ annimali g ħal kull 
grupp;  
(6) Livelli ta’ do żaġġ u volum (u attività spe ċifika tad-do ża meta 
tintuża r-radjuattività);  
(7) Rotta/rotot u metodi ta’ amministrazzjoni;  
(8) Frekwenza ta’ do żaġġ; 
(9) Perjodu ta’ sawm (jekk u żat); 
(10) Radjuattività totali g ħal kull annimal;  
(11) Mani ġġar tal-annimali;  
(12) Ġbir u mani ġġar ta’ kampjuni;  
(13) Metodi analiti ċi użati għal separazzjoni, kwantifikazzjoni u iden ­
tifikazzjoni ta’ metaboliti;  
(14) Limitu ta’ detezzjoni g ħall-metodi u żati; 
(15) Il-kejlijiet u pro ċeduri sperimentali o ħra użati (inkluża validazzjoni 
ta’ metodi g ħal analiżi ta’ metaboliti).  
(d) Anali żi ta’ Statistika  
Jekk tintu ża analiżi ta’ statistika biex ikunu analizzati s-sejbiet 
tal-istudju, f’dak il-ka ż għandha tkun inklu ża informazzjoni suffi ċjenti 
dwar il-metodu ta’ anali żi u l-programm tal-kompjuter u żat, biex 
reviżur/statistiku indipendenti jkun jista’ jevalwa mill- ġdid u jibni 
mill-ġdid l-anali żi. 
Fil-każ ta’ studji ta’ mudellar ta’ sistemi b ħal PBTK, il-pre żentazzjoni 
ta’ mudelli g ħandha tinkludi deskrizzjoni s ħiħa tal-mudell biex jit ħallew 
isiru rikostruzzjoni u validazzjoni indipendenti tal-mudell (ara 
l-paragrafu 65 u l-Appendi ċi: Definizzjonijiet).  
Riżultati  
71. Id-dejta kollha g ħandha tin ġabar fil-qosor u ti ġi ttabulata b’evalwazzjoni 
xierqa ta’ statistika u deskritta fit-test ta’ din it-taqsima. Dejta ta’ radjuat ­
tività mag ħduda għandha tin ġabar fil-qosor u tkun ippre żentata kif jixraq 
għall-istudju, tipikament b ħala ekwivalenti ta’ mikrogrammi jew milli ­
grammi g ħal kull massa ta’ kampjun, g ħalkemm ikunu jistg ħu jintużaw 
unitajiet o ħra. Din it-taqsima g ħandha tinkludi illustrazzjonijiet grafi ċi 
tas-sejbiet, riproduzzjoni ta’ dejta kromatografika u spettrometrika rappreżentattiva, identifikazzjoni ta’ metaboliti/kwantifikazzjoni u passa ġġi 
metaboliċi proposti, inklu ża struttura molekulari ta’ metaboliti. Flimkien ma’ 
dan, f’din it-taqsima g ħandha tkun inklu ża l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun 
tapplika:
 
(1) Kwantità u per ċentwali ta’ rkupru ta’ radjuattività fl-awrina, rawt, arja 
ta’ teħid tan-nifs ‘il barra, u ħasil tal-ga ġeġ mill-awrina u r-rawt.  
— Għal studji dermali, inkludi wkoll dejta dwar irkupru ta’ kimika 
għall-ittestjar minn ġilda ttrattata, minn ħasil ta’ ġlud u minn radjuat ­
tività residwali fl-apparat li jg ħatti l-ġilda u mill-unità metabolika, u 
inkludi wkoll ri żultati tal-istudju dwar ħasil dermali. G ħal aktar 
diskussjoni, ara l-paragrafi 74-77.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Għal studji ta’ inalazzjoni, inkludi wkoll dejta dwar irkupru ta’ 
kimika għall-ittestjar minn pulmuni u tessuti na żali (8). G ħal aktar 
diskussjoni, ara l-paragrafu 78.  
(2) Id-distribuzzjoni ta’ tessuti tkun irrappurtata b ħala perċentwali tad-do ża 
amministrata u tal-kon ċentrazzjoni (ekwivalenti ta’ mikrogrammi g ħal 
kull gramma ta’ tessuti), u proporzjonijiet ta’ tessut ma’ demm u ta’ 
tessut ma’ pla żma; 
(3) Bilan ċ ta’ materjali żviluppat minn kull studju li jinvolvi l-anali żi ta’ 
tessuti tal- ġisem u eskreta;  
(4) Konċentrazzjonijiet ta’ pla żma u parametri tossikokineti ċi (disponibbiltà 
bijoloġika, AUC, Cmax, Tmax, ikklirjar, nofs ħajja) wara amminis ­
trazzjoni mir-rotta/rotot rilevanti ta’ espo żizzjoni;  
(5) Rata u ammont ta’ assorbiment tal-kimika g ħall-ittestjar wara amminis ­
trazzjoni mir-rotta/rotot ta’ espo żizzjoni;  
(6) Kwantitajiet tal-kimika g ħall-ittestjar u ta’ metaboliti (irrapportati b ħala 
perċentwali tad-do ża amministrata) mi ġburin fl-eskreta;  
(7) Referenza g ħal dejta fl-appendi ċi li jkun fiha dejta dwar annimali indi ­
vidwalment g ħall-punti kollha ta’ tmiem ta’ kejlijiet (e ż. amminis ­
trazzjoni ta’ do ża, rkupru ta’ per ċentwali, kon ċentrazzjonijiet, 
parametri ta’ TK, e ċċ); 
(8) Figura bil-passa ġġi metaboli ċi proposti u l-istrutturi molekulari 
tal-metaboliti.  
Diskussjoni u Konlu żjonijiet  
72. F’din it-taqsima l-awtur g ħandu:  
(1) Jipprovdi passa ġġ metaboliku propost ibba żat fuq ir-ri żultati 
tal-metaboli żmu u fuq id-dispo żizzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar;  
(2) Jiddiskuti kull spe ċi u differenzi sesswali potenzjali dwar 
id-dispożizzjoni u/jew trasformazzjoni bijolo ġika tal-kimika g ħall- 
ittestjar;  
(3) Jittabula u jiddiskuti l-identifikazzjoni u l-kobor tal-metaboliti, ir-rati ta’ 
kklirjar, il-potenzjal g ħal akkumulazzjoni bijolo ġika u l-livell ta’ residwi 
ta’ tessuti ta’ ġenitur u/jew metabolite/i), kif ukoll bidliet, jekk ikun 
hemm, dipendenti minn do ża f’parametri ta’ TK, kif ikun jixraq;  
(4) Jintegra f’din it-taqsima kull dejta ta’ TK rilevanti miksuba waqt li 
kienu qed isiru studji dwar tossi ċità; 
(5) Jipprovdi konklu żjoni qasira li s-sejbiet tal-istudju jkunu jistg ħu 
jsostnuha;  
(6) Iżid it-Taqsimiet (skont il- ħtieġa jew kif ikun jixraq).  
73. Taqsimiet addizzjonali g ħandhom jintu żaw biex tidda ħħal informazzjoni 
bibliografika ta’ sostenn, tabelli, figuri, appendi ċijiet, eċċ. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ROTOT ALTERNATTIVI TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Dermali  
Trattament Dermali  
74. Din it-taqsima tipprovdi informazzjoni spe ċifika dwar investigazzjoni 
tas-tossikokinetika tal-kimika g ħall-ittestjar bir-rotta dermali. G ħall-assor­
biment dermal, g ħandu jiġi kkonsutat l-kapitolu B.44 ta’ dan l-Anness 
[Assorbiment tal- ġilda: il-metodu  in vivo  (9)]. Għal punti ta’ tmiem o ħra 
bħal distribuzzjoni u metaboli żmu, jista’ jintu ża dan il-Metodu ta’ Ttestjar 
B.36. Għandu jintu ża livell wie ħed jew aktar ta’ do ża għall-kimika g ħall- 
ittestjar fit-trattament dermali. Il-kimika g ħall-ittestjar (e ż. pura, dilwita jew 
materjal ifformulat li jkun fih il-kimika g ħall-ittestjar li tkun applikata fuq 
il-ġilda) għandha tkun l-istess (jew sostitut realistiku) b ħal dik li g ħaliha 
l-bnedmin jew spe ċi potenzjali o ħra mmirata jistg ħu jkunu esposti. Il-livell 
ta’ doża għandu jintg ħażel skont il-paragrafi 20-26 ta’ dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar. Fatturi li jistg ħu jitqiesu g ħal għażla ta’ do ża dermali jinkludu 
espożizzjoni mistennija mill-bniedem u/jew do żi li fihom tkun ġiet 
osservata tossi ċità fi studji o ħra dermali dwar tossi ċità. Id-do ża dermali 
għandha tin ħall, jekk ikun me ħtieġ, f’vejjikolu adattat u tkun applikata 
f’volum adegwat biex iwassal id-do żi. Ftit qabel l-ittestjar, il-pil g ħandu 
jitqasqas mill-erja dorsali tat-tronk tal-annimali tat-test. Jista’ jintu ża 
t-taqxir, i żda dan g ħandu jsir madwar 24 sieg ħa qabel it-test. Meta l-pil 
ikun qed jitqasqas jew jitqaxxar, wie ħed għandu joqg ħod attent biex jevita 
li jisloħ il-ġilda, ħaġa li tista’ tibdel l-permeabbiltà tag ħha. Madwar 10 % 
tal-wiċċ tal-ġisem għandu jitne ħħielu kollox minn fuqu biex tkun applikata 
l-kimika g ħall-ittestjar. G ħal kimiċi tossiċi ħafna, l-erja tal-wi ċċ koperta 
tista’ tkun anqas minn madwar 10 %, i żda kemm jista’ jkun ħafna 
mill-erja g ħandha tkun koperta b’rita rqiqa u uniformi. L-istess erja 
tal-wiċċ tat-trattament g ħandha tintu ża għall-gruppi tat-testijiet dermali 
kollha. L-erjas li tkun ing ħatathilhom do ża għandhom jit ħarsu b’kopertura 
adattata li tin żamm ferma f’postha. L-annimali g ħandhom jitqieg ħdu 
f’posthom individwalment.  
75. Għandu jsir studju dwar ħasil dermali biex ikun ivvalutat l-ammont tad-do ża 
applikata tal-kimika g ħall-ittestjar li jkun jista’ jitne ħħa mill-ġilda billi l-erja 
tal-ġilda ttrattata tin ħasel b’sapun ħafif u ilma. Dan l-istudju jista’ jg ħin 
ukoll biex ikun stabbilit bilan ċ ta’ massa meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun 
amministrata bir-rotta dermali. G ħal dan l-istudju ta’ ħasil dermali g ħandha 
tkun applikata do ża waħda tal-kimika g ħall-ittestjar lil żewġ annimali. 
L-għażla tal-livell tad-do ża jkun skont il-paragrafu 23 ta’ dan il-Metodu 
ta’ Ttestjar (ara wkoll il-paragrafu 76 g ħal diskussjoni dwar ħin ta’ 
kuntatt mal- ġilda). L-ammonti ta’ kimika g ħall-ittestjar irkuprati waqt 
il-ħasil għandhom ikunu ddeterminati biex tkun ivvalutata l-effika ċja 
tat-tneħħija tal-kimika g ħall-ittestjar bil-pro ċedura tal- ħasil. 
76. Sakemm ma tkunx tista’ ssir min ħabba l-possibbiltà ta’ korru żjoni, il-kimika 
għall-ittestjar g ħandha tkun applikata u tin żamm fuq il- ġilda għal minimu ta’ 
6 sigħat. Meta tkun ser titne ħħa l-kopertura, l-erja ttrattata g ħandha tin ħasel 
skont il-pro ċedura li l-profil tag ħha jinsab fl-istudju dwar il- ħasil dermali 
(ara l-paragrafu 75). Kemm il-kopertura kif ukoll il- ħasil għandhom ikunu 
analizzati g ħall-kimika g ħall-ittestjar residwali. Meta jintemmu l-istudji, kull 
annimal g ħandu jinqatel b’mod uman skont (2), u l- ġilda ttrattata titne ħħa. 
Parti adattata mill- ġilda ttrattata g ħandha tkun analizzata biex tkun iddeter ­
minata l-kimika g ħall-ittestjar residwali (radjuattività).  
77. Għall-valutazzjoni tossikokinetika ta’ farma ċewtiċi jistgħu jkunu me ħtieġa 
proċeduri different, skont is-sistema regolatorja xierqa.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inalazzjoni  
78. Għandha tintu ża konċentrazzjoni wa ħda (jew aktar jekk ikun me ħtieġ) ta’ 
kimika g ħall-ittestjar. Il-kon ċentrazzjoni g ħandha tintg ħażel skont 
il-paragrafi 20-26 ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar. Trattamenti ta’ inalazzjoni 
għandhom isiru billi jintu ża apparat g ħal “kon tal-imnie ħer” jew g ħal “ras 
biss” biex ma jit ħalliex ikun hemm assorbiment minn rotot ta’ espo żizzjoni 
alternati (8). Jekk jintu żaw kundizzjonijiet o ħra ta’ espo żizzjoni ta’ 
inalazzjoni, il- ġustifikazzjoni g ħall-modifika g ħandha tkun iddokumentata. 
Id-durata ta’ espo żizzjoni b’inalazzjoni g ħandha tkun iddefinita; espo żizzjoni 
tipika ddum bejn 4 u 6 sig ħat. 
LETTERATURA:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
 
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
(6) Il-Kapitolu B.45 ta’ dan l-Anness: Assorbiment mill- Ġilda: Metodu In 
Vitro.  
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiz ­
ation, International Programme on Chemical Safety.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Il-Kapitolu B.44 ta’ dan l-Anness: Assorbiment mill- Ġilda: Metodu In Vivo.  
(10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Appendiċi 
DEFINIZZJONIJIET  
Assorbiment:  Proċess(i) ta’ u żu ta’ kimi ċi fi u madwar it-tessuti. Assorbiment 
jirreferi g ħall-kompost prin ċipali u l-metaboliti kollha tieg ħu. Ma għandux ikun 
konfuż ma’ “disponibbiltà bijolo ġika”.  
Akkumulazzjoni (Akkumulazzjoni bijolo ġika):  Żieda fl-ammont ta’ kimika 
għall-ittestjar tul i ż-żmien f’tessuti (is-soltu tessuti xa ħmin, wara espo żizzjoni 
ripetuta); jekk it-te ħid ta’ kimika g ħall-ittestjar fil- ġisem ikun akbar mir-rata li 
biha titne ħħa, l-organi żmu jakkumula l-kimika g ħall-ittestjar u jistg ħu jseħħu 
konċentrazzjonijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar. Akkumulazzjoni bijolo ġika: 
ADME:  Akronimu g ħal ‘Assorbiment, Distribuzzjoni, Metaboli żmu, u Eskreta’.  
AUC:  (Erja taħt il-kurva tal-pla żma ta’ kon ċentrazzjoni- ħin): Erja ta ħt il-kurva 
f’parti ta’ kon ċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fil-pla żma tul i ż-żmien. 
Tirrappre żenta l-ammont totali ta’ kimika g ħall-ittestjar assorbit mill- ġisem 
f’perjodu predeterminat ta’ żmien. F’kundizzjonijiet lineari, l-AUC (minn ħin 
żero sal-infinità) tkun proporzjonali g ħall-ammont totali ta’ kimika g ħall- 
ittestjar assorbita mill- ġisem, irrispettivament mir-rata ta’ assorbiment.  
Awtoradjografija:  (Awtoradjografija tal- ġisem kollu): U żata biex ikun 
iddeterminat b’mod kwalitattiv u/jew kwantitattiv fejn ikunu jinsabu tessuti ta’ kimika g ħall-ittestjar radjuattiva, din it-teknika tu ża film ta’ ra ġġi-X jew aktar 
reċenti imma ġnijiet fosforizzati di ġitali biex tag ħmel jidhru molekuli jew b ċejjeċ 
ta’ molekuli b’tikketta radjuattiva billi tirre ġistra r-radjazzjoni ma ħruġa fl-oġġett 
studjat. Awtoradjografija kwantitattiva tal- ġisem kollu, mqabbla ma’ dissezzjoni 
ta’ organi, jista’ jkollha xi vanta ġġi għall-evalwazzjoni tad-distribuzzjoni ta’ 
kimika għall-ittestjar u g ħall-valutazzjoni ta’ rkupru globali u r-ri żoluzzjoni ta’ 
materjali radjuattivi f’tessuti. Vanta ġġ wieħed sinifikanti, pere żempju, huwa li 
tista’ tintu ża f’mudell ta’ annimal bix-xag ħar biex ikun ivvalutat jekk jistax 
ikun hemm asso ċjazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar ma’ melanin, li jista’ 
jgħaqqad ċerti molekuli. I żda, filwaqt li tista’ tipprovdi b’mod konvenjenti 
prospetti tal- ġisem kollu tas-siti ta’ tg ħaqqid ta’ kapa ċità għolja u affinità 
baxxa, din it-teknika tista’ tkun limitata biex jintg ħarrfu siti mmirati spe ċifiċi 
bħal siti li jg ħaqqdu re ċetturi fejn ikunu me ħtieġ
a relattivament ri żoluzzjoni 
għolja u sensittività g ħolja għal detezzjoni. Meta tintu ża awtoradjografija, 
esperimenti ma ħsubin biex jiddeterminaw bilan ċ ta’ massa ta’ kompost ammin ­
istrat għandhom isiru b ħala grupp separat jew fi studju separat mill-esperiment ta’ 
distribuzzjoni ta’ tessuti, fejn l-eskreta kollha (li tista’ tinkludi wkoll arja me ħuda 
‘l barra man-nifs) u karkassi s ħaħ ikunu omo ġenizzati u analizzati billi jing ħaddu 
b’xintillazzjoni likwida.  
Eskrazzjoni ta’ bili:  Eskrezzjoni mill-kanal tal-bili  
Akkumulazzjoni bijolo ġika: Ara “Akkumulazzjoni”.  
Disponibbiltà bijolo ġika: Frazzjoni ta’ do ża amministrata li til ħaq iċ-ċirko­
lazzjoni sistemika jew li tkun disponibbli fis-sit ta’ attività fi żjoloġika. Norm ­
alment, disponibbiltà bijolo ġika ta’ kimika g ħall-ittestjar tirreferi g ħall-kompost 
prinċipali, iżda tista’ tirreferi g ħall-metabolite tag ħha. Tqis biss forma wa ħda ta’ 
kimika.  Nota Bene:  disponibbiltà bijolo ġika u assorbiment mhumiex l-istess. 
Jista’ jkun hemm differenza bejn e ż. assorbiment orali (ji ġifieri pre żenza 
fil-ħajt tal-musrana u fi ċ-ċirkolazzjoni portali) u disponibbiltà bijolo ġika (jiġifieri 
preżenza f’demm sistemiku u f’tessuti) minn degradazzjoni kimika min ħabba 
metaboliżmu fil-ħajt tal-musrana jew trasport ta’ effluss lura g ħal-lumen intes ­
tinali jew metaboli żmu presistemiku fil-fwied, fost fatturi o ħra (10). Disponibbiltà 
bijoloġika tal-komponent tossiku (kompost prin ċipali jew metabolite) hija 
parametru kritiku fil-valutazzjoni tar-rikju g ħall-bniedem (estrapolazzjoni ta’ 
doża minn g ħoli għal baxx, estrapolazzjoni minn rotta g ħal rotta) g ħal deri­
vazzjoni ta’ valur intern minn NOAEL jew BDM esterni (do ża applikata). 
Għal effetti tal-fwied fuq amministrazzjoni orali, huwa l-assorbiment orali li 
jkun biżżejjed. Iżda għal kull effett minbarra fil-portal ta’ d ħul, hija 
d-disponibbiltà bijolo ġika li b’mod ġenerali tkun parametru aktar affidabbli 
għal użu ulterjuri fil-valutazzjoni tar-riskju, mhux l-assorbiment.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Bijopersistenza:  Ara “Persistenza”.  
Bijotrasformazzjoni:  Konverżjoni kimika (Normalment en żematika) ta’ kimika 
għall-ittestjar ta’ interess f’kimika differenti fil- ġisem. Sinonima ma’ “meta ­
boliżmu”.  
C max : Konċentrazzjoni massima (qu ċċata) ta’ demm (pla żma/serum) wara 
l-amminsitrazzjoni jew eskreta massima (qu ċċata) (f’urina jew rawt) wara 
l-amministrazzjoni.  
Rata ta’ kklirjar:  Miżura kwantitattiva tar-rata li fiha kimika g ħall-ittestjar 
titneħħa mid-demm, pla żma jew ċerta tessut f’kull unità ta’ ħin. 
Kompartament:  Parti strutturali jew bijokemikali (jew unità) ta’ ġisem, tessut 
jew ċellola, li hija separata mill-bqija.  
Mogħdiji ta’ dissotifikazzjoni:  Serje ta’ passi li jwasslu g ħall-eliminazzjoni ta’ 
kimiċi tossiċi mill-ġisem, permezz ta’ bidla metabolika jew eskrezzjoni.  
Distribuzzjoni:  Tixrid ta’ kimika g ħall-ittestjar u d-derivattivi tag ħha 
fl-organiżmu kollu.  
Enzimi/Iso żimi: Proteini li jikkatalizzaw ir-reazzjonijiet kimi ċi. Isożimi huma 
enzimi li jikkatalizzaw reazzjonijiet kimi ċi simili i żda huma differenti 
fis-sekwenza tal-a ċidi amino tag ħhom.  
Parametri enzimati ċi: K m : Kostant ta’ Michaelis u V  max : veloċità massima.  
Eskrezzjoni:  Proċess(i) li permezz tag ħhom titne ħħa kimika g ħall-ittestjar jew 
il-metaboliti tag ħha mill-ġisem.  
B’mod eso ġenu:  Introdotti minn jew prodotti barra mill-organi żmu jew 
mis-sistema.  
Estrapolazzjoni:  Inferenza ta’ valur wie ħed jew iktar mhux mag ħrufin abba żi ta’ 
dak li huwa mag ħruf jew ġie osservat.  
Nofs ħajja (t  1/2 ): Il-ħin neċessarju għall-konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar 
biex tonqos bin-nofs f’kompartament. Din tipikament tirreferi g ħall-konċen­
trazzjoni tal-pla żma jew l-ammont ta’ kimika g ħall-ittestjar fil- ġisem kollu.  
Induzzjoni/Induzzjoni ta’ enzimi:  Sinteżi tal-enzimi b ħala rispons g ħal stimulu 
ambjentali jew molekula li tindu ċi. 
Linearità/kineti ċi lineari:  Proċess huwa lineari fit-termini tal-kineti ċi meta r-rati 
kollha ta’ trasferiment bejn il-kompartamenti huma proporzjonati g ħall-ammonti 
jew il-kon ċentrazzjonijiet pre żenti, jiġifieri l-ewwel ordni. Konsekwentement, 
il-volumi tal-ikklirjar u d-distribuzzjoni huma kostanti, kif ukoll in-nofs ħajjiet. 
Il-konċentrazzjonijiet miksuba huma proporzjonati g ħar-rata ta’ do żaġġ 
(espożizzjoni), u l-akkumulazzjoni hija titbassar i żjed faċilment. Il-linearità/non 
linearità tista’ ti ġi vvalutata billi ji ġu mqabbla l-paramteri rilevanti, e ż. AUC, 
wara dozi differenti jew wara espo żizzjoni unika u ripetuta. Nuqqas ta’ 
dipendenza fuq id-do ża jista’ jkun indikattiv ta’ saturazzjoni tal-enzimi involuti 
fil-metaboli żmu tal-kompost, żieda fl-AUC wara espo żizzjoni ripetuta meta 
mqabbla ma ’ espo żizzjoni unika tista’ tkun indikattiva g ħall-inibizzjoni 
tal-metaboli żmu u nuqqas fl-AUC jista’ jkun indikattiv li qed jindu ċi 
l-metaboli żmu [ara wkoll (11)].  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Bilanċ tal-massa:  Kontabbiltà tal-kimika g ħall-ittestjar li tkun die ħla u ħierġa 
mis-sistema.  
Bilanċ tal-materjal:  Ara “bilan ċ tal-massa”.  
Mekkani żmu (Mod) ta’ tossi ċità/Mekkani żmu (Mod) ta’ azzjoni:  
Mekkaniżmu ta’ azzjoni jirreferi g ħal interazzjonijiet bijokimi ċi speċifiċi li 
fihom kimika g ħall-ittestjar tipprodu ċi l-effetti tag ħha. Mod ta’ azzjoni jirreferi 
għal mogħdiji iktar ġenerali li jwasslu g ħat-tossiċità ta’ kimika g ħall-ittestjar.  
Metaboli żmu: Sinonima ma’ “bijotrasformazzjoni”.  
Metaboliti:  Prodotti ta’ metaboli żmu jew pro ċessi metaboli ċi. 
Assorbiment Orali:  Il-perċentwal tad-do ża tal-kimika g ħall-ittestjar assorbita 
mis-sit tal-amminsitrazzjoni (ji ġifieri sistema tal-GI). Dan il-paramteru kritiku 
jista’ jintu ża biex wie ħed jifhem il-frazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar amministrata 
li tasal sal-vina portali, u sussegwentament il-fwied.  
Koeffiċjent tal-parti:  Magħruf ukoll b ħala l-koeffi ċjent tad-distribuzzjoni, huwa 
kejl tas-solubilità differenzjali ta’ kimika f’ żewġ solventi.  
Livelli tal-qu ċċata tad-demm (pla żma/serum):  Konċentrazzjoni massima 
(quċċata) tad-demm (pla żma/serum)wara l-amminstrazzjoni (ara wkoll “C  max ”). 
Persistenza (persistenza bijolo ġika):  Preżenza fit-tul ta’ kimika (f’sistema bijo ­
loġika) minħabba reżistenza għal degradazzjoni/eliminazzjoni.  
Aqra min-na ħa għall-oħra: L-informazzjoni dwar il-punt tat-tmiem g ħal kimika 
waħda jew aktar tintu ża biex isir tbassir tal-punt tat-tmiem g ħall-kimika mmirata.  
Awtoradjografija Mikroskopika tar-Ri ċevitur (jew Mikroawtoradjografija 
tar-Riċevitur):  Din it-teknika tista’ tintu ża biex tiskopri l-interazzjoni żenobi­
jotika ma’ siti tat-tessut spe ċifiċi jew popolazzjonijiet ta’ ċelloli bħal pereżempju 
fl-irbit tar-ri ċevituri jew mod spe ċifiku ta’ studji ta’ azzjoni li jistg ħu jirrikjedu 
riżoluzzjoni g ħolja u sensittività g ħolja li tista’ ma tkunx fattibbli ma’ tekniki 
oħra bħall-awtoradjografija tal- ġisem kollu.  
Rotta ta’ amministrazzjoni (orali, IV, dermali, inalazzjoni, e ċċ.): Tirreferi 
għall-mezzi li bihom kimi ċi jkunu amministrati lill- ġisem (eż. mill-ħalq 
b’gavage, mill- ħalq b’dieta, mill- ġilda, man-nifs ‘il ġewwa, mill-vina, e ċċ). 
Saturazzjoni:  Stat li bih wie ħed jew aktar mill-pro ċessi kineti ċi (eż. assorbiment, 
metaboliżmu jew ikklirjar) ikunu f’massimu (ji ġifieri ‘saturati’).  
Sensittività:  Kapaċità ta’ metodu jew ta’ strument li jiddistingwi bejn risponsi ta’ 
kejl li jirrappre żentaw livelli differenti ta’ interess varjabbli.  
Livelli ta’ stat stabbli tad-demm (pla żma):  L-istat mhux ekwilibrat ta’ sistema 
miftuħa li fiha l-forzi kollha li ja ġixxu fuq is-sistema huma e żattament kontrobi ­
lanċjati minn forzi ta’ oppo żizzjoni, f’tali manjiera li l-komponenti kollha tag ħha 
huma stazzjonarji fil-kon ċentrazzjoni g ħalkemm fis-sistema hemm fluss ta’ 
materjal.  
Mudellar ta’ Sistemi (Tossikokineti ċi bbażati fuq il-Fi żjoloġija, ibbażati fuq 
il-Farmakokinetika, Farmakokineti ċi bbażati fuq il-Fi żjoloġija, ibbażati fuq 
il-Bijoloġija, eċċ.): Mudell astratt li ju ża lingwa matematika biex jiddeskrivi 
l-aġir tas-sistema.  
Tessut immirat:  Tessut li fih ikun jidher effett prin ċipali avvers ta’ sustanza 
tossika.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Kimika g ħall-ittestjar:  Kwalunkwe kimika jew ta ħlita ttestjati bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu g ħall-Ittestjar.  
Distribuzzjoni tat-Tessuti:  Ċaqliq riversibbli ta’ kimika g ħall-ittestajr minn post 
fil-ġisem għall-post ie ħor. Id-distribuzzjoni tat-tessut tista’ ti ġi studjata 
mid-dissezzjoni ta’ organu, l-omo ġenizzazzjoni, il-kombustjoni u l-g ħadd ta’ 
xintillazzjonijiet likwidi jew permezz ta’ awtoradjografija kwalitattiva u/jew 
kwantitattiva tal- ġisem kollu. Tal-ewwel hija utli biex jinkisbu 
l-konċentrazzjoni u l-per ċentwali ta’ rkupru minn tessuti u mill-karakss li jifdal 
tal-istess annimali, i żda tista’ ma jkolliex ri żoluzzjoni g ħat-tessuti kollha u tista’ 
jkollha rkupru kumplessiv li huwa inqas mill-ideal (< 90 %). Ara d-definizzjoni 
għal tal-aħħar hawn fuq.  
T max : Ħin biex jintla ħaq C  max . 
Tossikokineti ċi (Farmakokineti ċi): Studju tal-assorbiment, distribuzzjoni, meta ­
boliżmu, eskrezzjoni ta’ kimi ċi tul iż-żmien.  
Validazzjoni tal-mudelli:  Proċess ta’ valutazzjoni tal-adegwatezza ta’ mudell 
biex jiddeskrivi b’mod konsistenti d-dejta disponibbli dwar it-tossikokinetika. 
Mudelli jistg ħu jkunu vvalutati permezz ta’ paragun ta’ statistika u vi żiv ta’ 
tbasssir ta’ mudelli b’valuri sperimentali ma’ varjabbli komuni indipendenti (eż. ħin). Kemm tkun l-evalwazzjoni g ħandu jkun i ġġustifikat b’rabta mal-u żu 
maħsub tal-mudell.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAS-SUSTANZI  
ORGANOPHOSPHORUS  WARA L-ESPO ŻIZZJONI AKUTA  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni ta’ l-effetti tossi ċi tas-sustanzi, 
huwa importanti li ji ġi ikkonsidrat il-potenzjal ta’ ċerti klassijiet ta’ 
sustanzi biex jikkaw ża tipi spe ċifiċi ta’ newrotossi ċità li jistg ħu ma 
jidrux fi studji tossi ċi oħra. Ċerti sustanzi  organophosphorus  jidru li 
jikkawżaw dewmien tan-newrotossi ċità u għandhom jitqisu kandidati 
għall-evalwazzjoni.  
Testijiet ta’  screening in vitro  jistgħu jitħaddmu biex jiddentifikaw 
dawk is-sustanzi, jistg ħu jikkaw żaw dewmien fil- polyneuropathy ; 
madankollu, sejbiet negattivi fl-istudji  in vitro  ma jipprovdux 
evidenza li s-sustanza tat-test mhiex  newrotossikant.  
Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Is-sustanzi  organophosphorus  jinkludu l-  organophosphorus esters, 
it-thioesters uncharged  jew  l-anhydrides  ta’ l-aċdi organophos ­
phoric, organophosphonic  jew  organophosphoramidic  jew ta’ l- 
aċdi phosphorothioic, phosphonothioic  jew  phosphorothioamidic 
relatati , jew sustanzi o ħra li jistg ħu jikkawżaw dewmien ta' newro ­
tossiċità li xi drabi tidher f'din il-klassi ta' sustanzi.  
Id-dewmien tan-newrotossi ċità huwa sindromu asso ċjat ma’  l-onset  
tad-dewmien prolungat ta’ l- ataxia, id-distal axonopathies  fil-korda 
spinali u n-nerv periferali, u l-inibizzjoni u x-xju ħija tan -neuropathy 
target esterase (NTE)  fit-tessut newrali.  
1.3. SUSTANZI TA’ REFERENZA  
Sustanza ta’ referenza tista’ ti ġi ttestjata bi grupp ta’ kontroll po żittiv 
li juri li ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test tal-laboratorju, ir-rispons ta’ l- 
ispeċi ittestjati ma nbidilx b’mod sinifikanti.  
Eżempju ta’ newrotossikant u żat f’irxa wisg ħa huwa il-fosfat  
tri–o–tolyl phosphate (Cas 78-30-8, Einecs 201-103-5, Cas  nomenk­
altura: l-a ċdu fosforiku,  tris(2–methylphenyl)ester),  magħruf ukoll 
bħala tris–o–cresylphosphate.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test ti ġi somministrata oralment lit-ti ġieġ domestiku 
f’doża waħda. Meta huwa xieraq, it-ti ġieġ huwa m ħares mill-effetti  
cholinergic  akuti. L-annimali ji ġu osservati g ħal 21 jum g ħal imġieba 
anormali,  ataxia  u paraliżi.. Il-kejl bijokemikali, b’mod partikolari l- 
inibizzjoni tan- neuropathy target esterase (NTE),  isir fuq it-ti ġieġ li 
jingħażel bl-addo ċċ minn kull grupp. Dan normalment isir 24 u 48 
siegħa wara d-do żaġġ.Wieħed u għoxrin jum wara l-espo żżizzjoni l- 
bqija tat-ti ġieġ jiġi maqtul u ssir l-e żaminazzjoni ħispatoloġika ta’ 
tessuti newrali mag ħżula. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.5.1.  Tħejjija  
Tiġieġ b’saħħtu u adult żagħżugħ li huwa ħieles minn mard virali u 
l-medikazzjoni li jfixxklu u li m’g ħandux anormalitajiet fil-mixja 
għandu jing ħażel bl-ado ċċ u assenjati g ħall-gruppi ta’ kontroll u 
ta’ trattament.G ħandu wkoll jadatta g ħall kundizzjonijiet tal- 
laboratorju g ħal mill-inqas 5 jiem qabel il-bidu ta’ l-istudju.  
Gaġeġ jew spazji mag ħluqa li huma kbar bi żżejjed biex jippermettu 
ċ-ċaqliq ħieles tat-ti ġieġ, u għandu jkun fa ċli biex tiġi osservata l- 
mixja tieg ħu. 
Id-dożaġġ bis-sustanza tat-test g ħandha normalment ting ħata 
oralment bl-g ħalf li jing ħata bilfors, kapsuli tal- ġelatina, jew 
metodu li jitqabbel mag ħhom. Il-likwidi jistg ħu jingħataw mhux 
imħallta bl-ilma jew ma ħlula f’mezz xieraq b ħal ma huwa ż-żejt 
tal-qamħ; jekk hu possibbli s-solidi g ħandhom jin ħallu la darba 
dożi kbar tas-solidi fil-kapsuli tal- ġelatina jistg ħu ma ji ġux 
assorbiti sew. G ħall-mezzi li mhumiex akwei il-karatteristi ċi tossiċi 
tal-mezz iridu jkunu mag ħrufa, u jekk le g ħandhom ji ġu determinati 
qabel it-test.  
1.5.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.5.2.1.  Annimali g ħat test  
It-tiġieġ żagħżugħ adult domestiku u li jbid ( Gallus gallus domes ­
ticus ), li għandu minn 8 sa 12-il xahar huwa rakkomandat. 
Għandhom jintu żaw daqsijiet u razez standard. Normalment it- 
tiġieġ għandu jitrabba f’kundizzjonijiet li jippermettu ċ-ċaqliq ħieles.  
1.5.2.2.  In-numru u s-sess  
Barra l-grupp tat-trattament, g ħandhom jintu żaw kemm il-grupp ta’ 
mezz ta’ control u kemm dak ta’ kontroll po żittiv. Il-grupp tal-mezz 
ta’ kontroll g ħandu jiġi trattat bl-istess mod tal-grupp g ħat-trattament, 
ħlief li s-somministrazzjoni tas-sustanza g ħat-test titne ħħa. 
Għandu jintu żaw numru bi żżejjed ta’ ti ġieġ f’kull grupp ta’ g ħasafar 
sabiex mill-inqas sitt g ħasafar jistg ħu jinqatlu g ħad-determinazzjoni 
bijokemikali (tlieta f’kull żewġ punti) u sitta jistg ħu jibqgħu jgħixu 
tul il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħall-patolo ġija ta’ 21 jum.  
Il-grupp ta’ kontroll po żittiv jista’ jse ħħ fl-istess ħin jew ikun grupp 
ta’ kontroll ri ċenti storiku. G ħandu mill-inqas ikollu sitt ti ġiġiet, 
trattati b’newrotossikant b’dewmien mag ħruf, tliet ti ġiġiet għall-bijo­
kemistrija u tliet ti ġiġiet għall-patolo ġija. Huwa rakkomandat la ġġor­
nament perjodiku tad-data storika. Data ġdida ta’ kontroll po żittiv 
għandha tiġi żviluppata meta xi element essenzjali (e ż. ir-razza, l- 
għalf u l-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew) ta kif isir it-test jinbidel 
mil-laboratorju attiv.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Il-livelli tad-do ża 
Għandu jsir studju preliminary bl-u żu ta’ numru xieraq ta’ ti ġieġ u 
ta’ gruppi ta’ livelli tad-do ża sabiex ji ġi stabbilit il-livell li se jintu ża 
fl-istudju prin ċipali. Il-mewt hija tipikament me ħtieġa f’dan l-istudju 
preliminari sabiex ti ġi stabbilita do ża adegwata ta’ l-istudju prin ­ 
ċipali. Madankollu, sabiex ti ġi evitata il-mewt min ħabba l-effetti  
cholinergic  akuti, jista’ jintu ża l-atropine  jew aġent protettiv ie ħor 
magħruf li ma jfixkilx ir-rispons tad-dewmien fin-newrotossi ċità. 
Varjetà ta’ metodi g ħat-test jistg ħu jintużaw biex ti ġi kkalkulata d- 
doża massima mhux letali tas-sustanzi g ħat-test (Ara l-metodu 
B.1bis). Id-data storika fit-ti ġieġa jew informazzjoni tossikolo ġika 
oħra tista’ tkun ta’ g ħajnuna fl-g ħażla tad-doża. 
Il-livell tad-do ża tas-sustanza g ħat-test fl-istudju prin ċipali għandu 
jkun għoli kemm jista’ jkun waqt li jitqiesu ir-ri żultati ta’ l-istudju 
preliminari g ħall-għażla tad-do ża u l-limitu fuqani tad-do ża tal-piż 
tal-ġisem ta’ 2 000 mg/kg. F’21 jum, kwalunkwe mortalità li tista’ 
sseħħ m’għandhiex tfixkel is-sopravivenza ta’ bi żżejjed annimali 
għall-bijokemistrija (sitta) u g ħall-istoloġija (sitta). L- atropine  jew 
aġent protettiv ie ħor, magħruf li ma jfixkilx ir-rispons tad-dewmien 
fin-newrotossi ċità, għandu jintu ża sabiex ti ġi evitata l-mewt 
minħabba effetti  cholinergic  akuti.  
1.5.2.4.  It-test tal-limitu  
Jekk test f’livell wie ħed ta’ do ża ekwivalenti g ħal mill-inqas 
2 000mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/ġurnata, bl-u żu tal-proċeduri deskritti 
għal dan l-istudju, jipprodu ċi in-no-observed-adverse-effects  (l-ebda 
effetti avversi osservati) u jekk it-tossi ċità ma tkunx mistennija 
bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura 
studju komplut bl-u żu ta’ tliet livelli ta’ do ża ma jkunx me ħtieġ. 
It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espo żizzjoni umana tindika il- 
ħtieġa li jiġi użat livell og ħla ta’ doża. 
1.5.3.  Il-perjodu ta’ l-Osservazzjoni  
Il-perjodu ta’ osservazzjoni g ħandu jkun ta’ 21 jum.  
1.5.4.  Il-pro ċedura  
Wara s-somministrazzjoni ta’ a ġent protettiv sabiex jevita l-mewt 
minħabba l-effett  cholinergic  akut, is-sustanza g ħat-test tiġi sommin ­
istrata f’do ża waħda. 
Osservazzjoni ġenerali  
L-Osservazzjonijiet g ħandhom jibdew mill-ewwel wara l- 
espożizzjoni. It-ti ġieġ kollu għandu jiġi osservat bosta drabi waqt 
l-ewwel jumejn imbag ħad mill-inqas darba kuljum g ħall-perjodu ta’ 
21 jum jew sal-qtil skedat. G ħandhom ji ġu rrekordjati s-sinjali kollha 
tat-tossiċità, inklużi l-ħin ta’ l- onset , it-tip, il-qawwa u d-dewmien ta’ 
l-anormalitajiet fl-im ġiba. L-ataxia  għandha titkejjel fuq skala 
ordinali ta’ gradazzjoni li tikkonsisti f’erba’ livelli u l-parali żi 
għandha ti ġi nnutata. Mill-inqas darbtejn fil- ġimgħa t-tiġieġ 
magħżul għall-patolo ġija għandu jinħareġ mill-gaġeġ u jiġi suġett 
għal perjodu ta’ attività  forced motor , bħal ngħidu aħna t-tlugħ 
mas-sellun, sabiex ti ġi faċilitata l-osservazzjoni ta’ l-effetti tossi ċi 
minimali. L-annimali li qed imutu u dawk fi tbattija jew u ġigħ 
għandhom jitne ħħew, jinqatlu b’mod uman u sottomessi g ħan- 
nekropsija.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
Il-piż tal-ġisem  
It-tiġieġ kollu għandu jintizen e żatt qabel is-somministrazzjoni tas- 
sustanza g ħat-test u mill-inqas darba fil- ġimgħa wara dan.  
Bijokemistrija  
Sitt tiġiġiet jingħażlu bl-adoċċ minn kull grupp tal-mezz ta’ kontroll 
u ta’ trattament, u tliet ti ġiġiet mill-grupp ta’ kontroll po żittiv (meta 
dan il-grupp ise ħħ fl-istess żmien), għandhom jinqatlu fi żmien ftit 
jiem wara d-do żaġġ. Il-moħħ u l-korda spinali lumbar ji ġu mħejjija u 
analizzati g ħall-attività ta’ l-inibizzjoni tan-neuropath target esterase. 
Barra minn hekk, itt ħejjija u l-anali żi tat-tessut tan-nerv xjatiku 
jistgħu jkunu ta’ g ħajnuna g ħall-attività ta’ l-inibizzjoni tan- 
neuropath target esterase. Normalment, tlett g ħasafar tal-grupp ta’ 
kontroll u ta’ kull trattament jinqatlu wara 24 sieg ħa u tlieta 
jinqatlu wara 48 sieg ħa. It-tlett ti ġiġiet tal-kontrolli po żittivi 
għandhom jinqatlu f’24 sieg ħa. Jekk l-osservazzjoni ta’ sinjali 
kliniċi ta’ intossikazzjoni (dan jista’ ji ġi evalwat permezz ta’ l-osser ­
vazzjoni tal- ħin ta’  l-onset  tas-sinjali  cholinergic)  juru li l-a ġent 
tossiku jista’ jitwarrab bil-mod allura huwa preferibbli li jittie ħed 
kampjun tat-tessut g ħal darbtejn minn kull wie ħed mit-tlett 
għasafar bejn 24 sa 72 sieg ħa wara d-do żaġġ. 
L-analiżi ta’ l-acetylcholinesterase (AChE) tista’ ssir ukoll fuq dawn 
il-kampjuni jekk ikun xieraq. Madankollu, ir-reattivazzjoni spontanja 
ta’ l- AChE tista’ sse ħħ in vivo , u b’hekk twassal g ħal nuqqas ta’ 
valutazzjoni dwar l-effika ċja tas-sustanza b ħala inibitur AChE.  
Nekropsija Grossa  
In-nekropsija grossa ta’ l-annimali kollha (skedati li jinqatlu u 
jinqatlu meta jkunu moribondi) g ħandha tinkludi l-osservazzjoni 
tad-dehra tal-mo ħħ u tal-korda spinali.  
L-eżaminazzjoni Ispatologika  
It-tessut newrali mill-annimali li jibqg ħu ħajjin fil-perjodu ta’ l-osser ­
vazzjoni u li ma jintu żawx għal studji bijokemikali g ħandhom ikunu 
suġġetti għall-eżaminazzjoni mikroskopika. It-tessuti g ħandhom ji ġu 
ffissati  in situ,  bl-użu ta’ tekniki ta’ perfu żjoni. Is-sezzjonijiet 
għandhom jinkludu ċ-ċerebellum (il-livell mid-lon ġitudinali), il-  
medulla oblongata , il-korda spinali, u n-nervituri periferali. Is- 
sezzjonijiet tal-korda spinali g ħandhom jittie ħdu mill-parti ċervikali 
ta’ fuq, mi ż-żoni mid-thoracic  u lumbo-sacral . Għandhom jittie ħdu 
sezzjonijiet mi ż-żona distal  tan-nerv tibjali u l-frieg ħi tiegħu sal- 
muskolu  gastrocnemial  u tan-nerv xjatiku. Is-sezzjonijiet g ħandhom 
jittebbgħu bi tbajja spe ċifiċi xierqa ta’  myelin u ta ’ l-axon.  
2. DATA  
Normalment ir-ri żultati negattivi fuq l- endpoints  magħżula f’dan il- 
metodu (l-osservazzjoni tal-bijokemistrija, ta’ l-ispatolo ġija u ta’ l- 
imġiba) ma jitolbux iktar ittestjar g ħad-dewmien tan-newrotossi ċità. 
Riżultati żbaljati jew inkonklussivi g ħal dawn  l-endpoints  jistgħu 
jitolbu evalwazzjoni addizjonali.  
Id-data individwali g ħandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data 
kollha għandha tkun imqassra f’g ħamla tabulari, li turi n-numru ta’ l- 
annimali g ħal kull grupp tat-test fil-bidu tieg ħu, in-numru ta’ l- 
annimali li g ħandhom il-feriti, l-effetti ta’ l-im ġiba jew dawk bijo ­
kemikali, it-tip u l-gravità ta’ dawn il-feriti jew effetti, u l-per ċentwal 
ta’ l-annimali li g ħandhom kull tip u gravità tal-feriti jew ta’ l-effett.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Is-sejbiet ta’ dan l-istudju g ħandhom ji ġu elvawati f’termini ta’ l- 
inċidenza, tal-gravità, u tal-korrelazzjoni tal-effetti ta’ l-im ġiba, ta’ 
dawk bijokemikali u dawk ispatolo ġiċi u kwalunkwe effetti o ħra 
osservati fil-gruppi ta’ kontroll u dawk trattati.  
Ir-riżultati numeri ċi għandhom ji ġu evalwati permezz ta’ metodi ta’ 
statistika xierqa u ġeneralment a ċċettabbli. Il-metodi ta’ statistika 
użati għandhom ji ġu magħżula waqt id-disinn ta’ l-istudju.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
IR-RAPPORTTAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
3.1. Annimali g ħat-test  
— l-ispeċi użati; 
— in-numru u l-età ta’ l-annimali;  
— is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew, eċċ,; 
— il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— id-dettalji tat-t ħejjija tas-sustanza g ħat-test, l-istabilità u l- 
omoġeneità fejn hu xieraq;  
— il-ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-mezz;  
— id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza g ħat-test;  
— id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma;  
— Ir-rationale g ħall-għażla tad-doża; 
— L-ispe ċifikazzjoni tad-do żi somministrati, inklu żi d-dettalji tal- 
mezz, tal-volum u tal-forma fi żika tal-materjal somministrat;  
— L-identità u d-dettalji tas-somministrazzjoni ta’ kwalunkwe a ġent 
protettiv.  
Riżultati:  
— id-data tal-pi ż tal-ġisem;  
— id-data tar-rispons tossiku fi grupp, inklu ża l-mortalità;  
— in-natura, l-gravità u d-dewmien ta ż-żmien ta’ l-osservazzjonijiet 
kliniċi (kemm jekk huma riversibbli jew le);  
— deskrizzjoni dettaljata tal-metodi u s-sejbiet bijokemikali;  
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha ispatolo ġiċi; 
— fejn hu xieraq, it-trattament statistiku tar-ri żultati.  
Id-diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
Dan il-metodu huwa analogu g ħal OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAS-SUSTANZI  
ORGANOPHOSPHORUS  STUDJU TA' DO ŻA RIPETUTTA 
GĦAL 28 ĠURNATA  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni ta’ l-effetti tossi ċi tas-sustanzi, 
huwa importanti li ji ġi ikkonsidrat il-potenzjal ta’ ċerti klassijiet ta’ 
sustanzi biex jikkaw ża tipi spe ċifiċi ta’ newrotossi ċità li jistg ħu ma 
jidrux fi studji tossi ċi oħra. Ċerti sustanzi organophosphorus jidru li 
jikkawżaw dewmien tan-newrotossi ċità u għandhom jitqisu kandidati 
għall-evalwazzjoni.  
Testijiet ta’  screening in vitro  jistgħu jitħaddmu biex jiddentifikaw 
dawk is-sustanzi jistg ħu jikkaw żaw dewmien fil- polyneuropathy ; 
madankollu, sejbiet negattivi fl-istudji  in vitro  ma jipprovdux 
evidenza li s-sustanza tat-test mhiex newrotossikant.  
Dan it-test ta’ 28 jum tad-dewmien tan-newrotossi ċità jipprovdi l- 
informazzjoni fuq il-perikli g ħas-saħħa possibli li jista’ jkun hemm 
minħabba espo żizzjonijiet repetuti f’perjodu limitat ta’ żmien. 
Jipprovdi informazzjoni fuq ir-rispons tad-do ża u jista’ jipprovdi 
kalkolu ta’  no-observed-adverse-effects  (l-ebda effetti avversi osser ­
vati), li jista’ jkun utli sabiex ji ġu stabbiliti l-kriterji ta’ sigurtà g ħall- 
espożizzjoni.  
Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Is-sustanzi  organophosphorus  jinkludu  l- organophosphorus esters, 
it-thioesters uncharged  jew l-anhydrides  ta' l-aċdi organophosphoric, 
organophosphonic  jew  organophosphoramidic  jew ta' l-a ċdi phos­
phorothioic, phosphonothioic  jew  phosphorothioamidic  relatati, jew 
sustanzi o ħra li jistg ħu jikkawżaw dewmien ta' newrotossi ċità li xi 
drabi tidher f'din il-klassi ta' sustanzi.  
Id-dewmien tan-newrotossi ċità huwa sindromu asso ċjat ma’ l-onset 
tad-dewmien prolungat ta’ l-ataxia, id-distal axonopathies fil-korda 
spinali u n-nerv periferali, u l-inibizzjoni u x-xju ħija tan- neuropathy 
target esterase (NTE ) fit-tessut newrali.  
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Id-dożi ta’ kuljum tas-sustanza g ħat-test huma somministrati 
oralment lit-ti ġieġ domestiku g ħal 28 jum. L-annimali ji ġu 
osservati g ħallinqas kuljum g ħal anormalitajiet fl-im ġiba, għall- 
ataxia  u għall-paraliżi sa 14-il jum wara l-a ħħar doża. Il-kejl bijo ­
kemikali, b’mod partikolari l-inibizzjoni  tan-neuropathy target 
esterase (NTE),  isir fuq it-ti ġieġ li jingħażel bl-addo ċċ minn kull 
grupp. Dan normalment isir 24 u 48 sieg ħa wara d-do żaġġ. 
Ħmistax wara l-a ħħar doża il-bqija tat-ti ġieġ jiġi maqtul u ssir e żami­
nazzjoni ispatolo ġika tat-tessuti newrali mag ħżula. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
Tiġieġ b’saħħtu u adult żagħżugħ li huwa ħieles minn mard virali u 
l-medikazzjoni li jfixxklu u li m’g ħandux anormalitajiet fil-mixja 
għandu jing ħażel bl-ado ċċ u assenjati g ħall-gruppi ta’ kontroll u 
ta’ trattament.G ħandu wkoll jadatta g ħall kundizzjonijiet tal- 
laboratorju g ħal mill-inqas 5 jiem qabel il-bidu ta’ l-istudju.  
Gaġeġ jew spazji mag ħluqa li huma kbar bi żżejjed biex jippermettu 
ċ-ċaqliq ħieles tat-ti ġieġ, u għandu jkun fa ċli biex tiġi osservata l- 
mixja tieg ħu. 
Id-dożaġġ orali kuljum, 7 ijiem fil- ġimgħa, għandu jitwettaq prefer ­
ibbilment permezz ta’ l-g ħalf mogħti bil-fors jew bis-sommis ­
trazzjoni tal-kapsuli tal- ġelatina. Il-likwidi jistg ħu jingħataw mhux 
imħallta bl-ilma jew ma ħlula f’mezz xieraq b ħal ma huwa ż-żejt 
tal-qamħ; jekk hu possibbli s-solidi g ħandhom jin ħallu la darba 
dożi kbar tas-solidi fil-kapsuli tal- ġelatina jistg ħu ma ji ġux 
assorbiti sew. G ħall-mezzi li mhumiex akwei il-karatteristi ċi tossiċi 
tal-mezz iridu jkunu mag ħrufa, u jekk le g ħandhom ji ġu determinati 
qabel it-test.  
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
Annimali g ħat-test  
It-tiġieġ żagħżugħ adult domestiku u li jbid (Gallus gallus domes ­
ticus), li g ħandu minn 8 sa 12-il xahar huwa rakkomandat. 
Għandhom jintu żaw daqsijiet u razez standard. Normalment it- 
tiġieġ għandu jitrabba f’kundizzjonijiet li jippermettu ċ-ċaqliq ħieles.  
In-numru u s-sess  
Ġeneralment g ħandhom jintu żaw mill-inqas tlett gruppi ta’ trattament 
u grupp ta’ kontroll tal-mezz. Il-grupp ta’ kontroll tal-mezz g ħandu 
jiġi trattat bl-istess mod b ħal dak ta’ trattament ħlief li s-somminis ­
trazzjoni tas-sustanza g ħat-test hija mne ħħija. 
Għandu jintu żaw numru bi żżejjed ta’ ti ġieġ f’kull grupp ta’ g ħasafar 
sabiex mill-inqas sitt g ħasafar jistg ħu jinqatlu g ħad-determinazzjoni 
bijokemikali (tlieta f’kull żewġ punti) u sitt g ħasafar jistg ħu jgħixu 
waqt l-14-il jum tal-perjodu ta’ osservazzjoni wara t-trattament g ħall- 
patoloġija. 
Livelli tad-do ża 
Il-livelli tad-do ża għandhom jing ħażlu waqt li jitqiesu r-ri żultati tat- 
test akut fuq id-dewmien tan-newrotossi ċità u kwalunkwe tossi ċità 
oħra li teżisti jew id-data kinetika disponibbli g ħall-compound  tat- 
test. L-og ħla livell tad-do ża għandu jing ħażel bl-għan li jkun hemm 
żieda ta’ effetti tossi ċi, preferibbilment tan-newrotossi ċità 
b’dewmien, i żda mhux ta’ mewt jew tbatija ovvja. Wara, 
sekwenza nie żla tal-livelli tad-do ża għandha ting ħażel bl-għan li 
jidher kwalunkwe rispons relatat mad-do ża u no-observed-adverse- 
effects  (l-ebda effetti avversi osservati), fl-iktar livell ta’ do ża baxx.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
Test ta’ limitazzjoni  
Jekk test f’livell wie ħed ta’ do ża ekwivalenti g ħal mill-inqas 
1 000mg/kg tal-pi ż tal-ġisem/ġurnata, bl-u żu tal-proċeduri deskritti 
għal dan l-istudju, jipprodu ċi in-no-observed-adverse-effects  (l-ebda 
effetti avversi osservati) u jekk it-tossi ċità ma tkunx mistennija 
bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura 
studju komplut bl-u żu ta’ tliet livelli ta’ do ża ma jkunx me ħtieġ. 
It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espo żizzjoni umana tindika il- 
ħtieġa li jiġi użat livell og ħla ta’ doża. 
Perjodu ta’ l-Osservazzjoni  
L-annimali kollha g ħandhom ji ġu osservati mill-inqas kuljum waqt 
il-perjodu ta’ l-espo żizzjoni u 14-il jum wara, sakemm ma jkunx 
hemm nekropsija skedata.  
1.4.3.  Pro ċedura  
Animals are dosed with the test substance on seven days per week 
for a period of 28 days.  
Osservazzjoni ġenerali  
L-osservazzjonijiet g ħandhom jibdew mill-ewwel wara li jibda t-trat ­
tament. It-ti ġieġ kollu għandu jiġi osservat mill-inqas darba kuljum 
f’kull wie ħed mit-28 jum ta’ trattament, u g ħal 14-il jum wara d- 
dożaġġ jew sal-qtil skedat. G ħandhom ji ġu rrekordjati is-sinjali 
kollha ta’ tossi ċità inklużi il-ħin ta’ l- onset  tagħhom, it-tip, il- 
gravità u d-dewmien ta’ żmien. L-osservazzjonijiet g ħandhom 
jinkludu, i żda mhux limitati g ħal, l-anormalitajiet ta’ fl-im ġiba. L-  
ataxia  għandha titkejjel fuq skala ordinali ta’ gradazzjoni li 
tikkonsisti f’erba’ livelli, u g ħandha tiġi nnutata l-parali żi. Mill- 
inqas darbtejn fil- ġimgħa it-tiġieġ għandu jittie ħed barra l-ga ġeġ u 
suġġett għal perjodu ta’ attività  forced motor , bħal ngħidu aħna t- 
tlugħ mas-sellum, sabiex ti ġi faċilitata l-osservazzjoni ta’ l-effetti 
tossiċi minimali. L-annimali moribondi li qed ibatu ħafna jew li 
huma mu ġugħa għandhom jitne ħħew, jinqatlu b’mod uman u 
sottoposti g ħan-nekropsija.  
Il-piż tal-ġisem 
It-tiġieġ kollu għandu jintizen e żatt qabel is-somministrazzjoni tas- 
sustanza g ħat-test u mill-inqas darba fil- ġimgħa wara dan.  
Bijokemistrija  
Sitt tiġiġiet magħżula bl-addo ċċ minn kull grupp ta’ trattament u ta’ 
kontroll tal-mezz, g ħandhom jinqatlu fi ftit jiem wara l-a ħħar doża. 
Il-moħħ u l-korda spinali  lumbar  jiġu mħejjija u analizzati g ħall- 
attività ta’ l-inibizzjoni tan- neuropath target esterase (NTE). B arra 
minn hekk, it-t ħejjija u l-anali żi tat-tessut tan-nerv xjatiku jistg ħu 
jkunu ta’ g ħajnuna g ħall-attività ta’ l-inibizzjoni tan- neuropath 
target esterase (NTE).  Normalment, tlett g ħasafar tal-grupp ta’ 
kontroll u ta’ kull trattament jinqatlu wara 24 sieg ħa u tlieta 
jinqatlu wara 48 sieg ħa wara l-a ħħar doża. Jekk id-data mill- 
istudju akut jew studju ie ħor (eż. it-tossikokineti ċi) turi li ħinijiet 
oħra tal-qtil wara d-do żaġġ finali huma preferibbli, mela g ħandhom 
jintużaw dawn il- ħinijiet u r- rationale  tiġi dokumentata.  
L-analiżi ta’ l-acetylcholinesterase (AChE) tista’ ssir ukoll fuq dawn 
il-kampjuni jekk ikun xieraq. Madankollu, ir-reattivazzjoni spontanja 
ta’ l- AChE tista’ sse ħħ in vivo , u b’hekk twassal g ħal nuqqas ta’ 
valutazzjoni dwar l-effika ċja tas-sustanza b ħala inibitur AChE.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
Nekropsija Grossa  
In-nekropsija grossa ta’ l-annimali kollha (skedati li jinqatlu u 
jinqatlu meta jkunu moribondi) g ħandha tinkludi l-osservazzjoni 
tad-dehra tal-mo ħħ u tal-korda spinali.  
L-eżaminazzjoni Ispatologika  
It-tessut newrali mill-annimali li jibqg ħu ħajjin fil-perjodu ta’ l-osser ­
vazzjoni u li ma jintu żawx għal studji bijokemikali g ħandhom ikunu 
suġġetti għall-eżaminazzjoni mikroskopika. It-tessuti g ħandhom ji ġu 
ffissati  in situ,  bl-użu ta’ tekniki ta’ perfu żjoni. Is-sezzjonijiet 
għandhom jinkludu ċ-ċerebellum (il-livell mid-lon ġitudinali), il-  
medulla oblongata , il-korda spinali, u n-nervituri periferali. Is- 
sezzjonijiet tal-korda spinali g ħandhom jittie ħdu mill-parti ċervikali 
ta’ fuq, mi ż-żoni mid-thoracic  u lumbo-sacral . Għandhom jittie ħdu 
sezzjonijiet mi ż-żona distal  tan-nerv tibjali u l-frieg ħi tiegħu sal- 
muskolu  gastrocnemial  u tan-nerv xjatiku. Is-sezzjonijiet g ħandhom 
jittebbgħu bi tbajja spe ċifiċi xierqa ta’  myelin u ta ’ l-axon.  Fil-bidu 
l-eżaminazzjoni mikroskopika g ħandha titwettaq fuq it-tessuti 
priservati tal-annimali kollha fil grupp ta’ kontroll u f’dak ta’ do ża 
għolja. Fejn hemm evidenza ta’ l-effetti fil-grupp ta’ do ża għolja, l- 
eżaminazzjoni mikroskopika g ħandha titwettaq ukoll fuq it-ti ġieġ li 
qedgħin fil-gruppi ta’ do ża intermedjarja u baxxa.  
2. DATA  
Normalment ir-ri żultati negattivi fuq l- endpoints  magħżula f’dan il- 
metodu (l-osservazzjoni tal-bijokemistrija, ta’ l-ispatolo ġija u ta’ l- 
imġiba) ma jitolbux iktar ittestjar g ħad-dewmien tan-newrotossi ċità. 
Riżultati żbaljati jew inkonklussivi g ħal dawn  l-endpoints  jistgħu 
jitolbu evalwazzjoni addizjonali.  
Id-data individwali g ħandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data 
kollha għandha tkun imqassra f’g ħamla tabulari, li turi n-numru ta’ l- 
annimali g ħal kull grupp tat-test fil-bidu tieg ħu, in-numru ta’ l- 
annimali li g ħandhom il-feriti, l-effetti ta’ l-im ġiba jew dawk bijo ­
kemikali, it-tip u l-gravità ta’ dawn il-feriti jew effetti, u l-per ċentwal 
ta’ l-annimali li g ħandhom kull tip u gravità tal-feriti jew ta’ l-effett.  
Is-sejbiet ta’ dan l-istudju g ħandhom ji ġu elvawati f’termini ta’ l- 
inċidenza, tal-gravità, u tal-korrelazzjoni tal-effetti ta’ l-im ġiba, ta’ 
dawk bijokemikali u dawk ispatolo ġiċi u kwalunkwe effetti o ħra 
osservati fil-gruppi ta’ kontroll u dawk trattati.  
Ir-riżultati numeri ċi għandhom ji ġu evalwati permezz ta’ metodi ta’ 
statistika xierqa u ġeneralment a ċċettabbli. Il-metodi ta’ statistika 
użati għandhom ji ġu magħżula waqt id-disinn ta’ l-istudju.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
3.1. Annimali g ħat-test  
— l-ispeċi użati; 
— in-numru u l-età ta’ l-annimali;  
— is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpo ġġew, eċċ,; 
— il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Kundizzjonijiet tat-test:  
— id-dettalji tat-t ħejjija tas-sustanza g ħat-test, l-istabilità u l- 
omoġeneità fejn hu xieraq;  
— il-ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-mezz;  
— id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza g ħat-test;  
— id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma;  
— Ir-rationale  għall-għażla tad-doża; 
— L-ispe ċifikazzjoni tad-do żi somministrati, inklu żi d-dettalji tal- 
mezz, tal-volum u tal-forma fi żika tal-materjal somministrat;  
— Ir-rationale  għall-għażla ta’ ħinijiet oħra għad-determinazzjoni 
bijokemikali jekk mhux 24 u 48 sieg ħa. 
3.3. Ri żultati:  
— id-data tal-pi ż tal-ġisem;  
— id-data ta r-rispons tossiku permezz tal-livell tad-do ża, inkluża l- 
mortalità;  
— l-ebda livell ta’ effett avvers osservat;  
— in-natura, l-gravità u d-dewmien ta ż-żmien ta’ l-osservazzjonijiet 
kliniċi (kemm jekk huma riversibbli jew le);  
— deskrizzjoni dettaljata tal-metodi u s-sejbiet bijokemikali;  
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha ispatolo ġiċi; 
— fejn hu xieraq, it-trattament statistiku tar-ri żultati.  
Id-diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
Dan il-metodu huwa analogu g ħal OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  TEST  IN VIVO  TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' 
DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 486  In vivo  ta' 
Sintesi Mhux Programmata ta' DNA (UDS) fuq Ċelloli tal-Fwied 
tal-Mammiferi (1997).  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-għan tat-test  in vivo  ta' sintesi mhux programmata ta' DNA (UDS) 
fuq Ċelloli tal-fwied tal-mammiferi huwa biex ji ġu identifikati 
sustanzi tat-test li jo ħolqu t-tiswija tad-DNA f' Ċelloli tal-fwied ta' 
annimali ttrattati (1), (2), (3), (4).  
Dan it-testr  in vivo  jipprovdi metodu g ħall-investigazzjoni ta' l-effetti 
ġenotossiċi ta' kimi ċi fil-fwied. Il-punt ta' l-a ħħar imkejjel jag ħti 
indikazzjoni tal- ħsara fid-DNA u t-tiswija sussegwenti fi ċ-Ċelloli 
tal-fwied. Il-fwied ġeneralment huwa l-lok ma ġġuri tal-metabolismu 
ta' komposti assorbiti. G ħalhekk huwa l-lok xieraq biex titkejjel il- 
ħsara fid-DNA  in vivo . 
Jekk ikun hemm prova li s-sustanza tat-test mhix ser til ħaq it-tessut 
immirat, mhuwiex xieraq li jintu ża dan it-test.  
L-aħħar punt ta' sintesi DNA (UDS) mhux programmata jitkejjel billi 
jiġi stabbilit l-assorbiment ta' nukleosidi mmarkati f' Ċelloli li ma 
jkunux g ħaddejin minn sintesi tad-DNA programmata (fasi S). Il- 
metodu ta' teknika l-aktar u żat huwa d-determinazzjoni ta' l-assor ­
biment ta' tritium thymidine immarkat (3H-TdR) bl-awtoradjografija. 
Preferibbilment jintu żaw il-fwied tal-far g ħat-testijiet  in vivo . Jistgħu 
jintużaw tessuti o ħra minklok il-fwied, i żda mhumiex is-su ġġett ta' 
dan il-metodu.  
L-iżvelar ta' rispons UDS jiddependi fuq in-numru ta' ba żi DNA 
exxissi u mibdula fuq il-lok tal- ħsara. Għalhell, it-test UDS huwa 
partikolarment ta' valur biex ti ġi żvelata r-riparazzjoni ta' segwenzi 
twal li ji ġu mis-sustanza (20 sa 30 ba żijiet). Bħala kuntrast, ir- 
riparazzjoni ta' segwenzi qosra (minn ba żi waħda sa tlieta) ti ġi 
żvelata b'sensitività anqas qawwija. Barra minn dan, jistg ħu 
jirriżultaw ġrajjiet muta ġeniċi minħabba fin-nuqqas ta' riparazzjoni, 
riparazzjoni ħażina jew replikazzjoni ħażina tal-leżjonijiet fid-DNA. 
L-estensjoni tar-rispons tal-UDS ma tag ħtix indikazzjoni dwar il- 
fedeltà tal-pro ċess ta' riparazzjoni. B' żieda ma' dan, huwa possibbli 
li li muta ġen jirrea ġixxi mad-DNA i żda l-ħsara fid-DNA ma 
tissewwix permezz ta' pro ċess ta' riparazzjoni exissa. In-nuqqas ta' 
informazzjoni spe ċifika dwar l-attività muta ġenika mog ħtija mit-test 
tal-UDS huwa kompensat bis-sensitività potenzali ta' dan il-punt aħħari għax jiġi mkejjel fil- ġenomu sħiħ.
 
Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Ċelloli li qed jissewwew:  Ċelloli li l-numru ta' grani nukleari netti 
tagħhom (NNG) huwa og ħla minn valur determinat minn qabel, li 
għandu jiġi ġustifikat fil-laboratorju li fih jitwettaq it-test.  
Grani nukleari netti (NNG):  miżura kwantitattiva g ħall-attività 
UDS taċ-Ċelloli f'testijiet UDS awtoradjografi ċi, kalkolati billi 
jitnaqqas in-numru medju ta' grani ċitoplasmiċi f'arei ċitoplasmiċi 
nukei ekwivalenti (CG) min-numru ta' grani nukleari (NG): NNG = NG - CG. L-g ħadd ta' NNG huma kalkolati g ħal Ċelloli indi ­
vidwali u imbag ħad addizzjonati ma' Ċelloli f'kultura, f'kulturi 
paralleli, e ċċ.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Sintesi DNA mhux skedata (UDS):  sintesi ta' riparazzjoni DNA 
wara l-exissjoni u t-tne ħħija ta' biċċa mid-DNA li jkun fiha re ġjun 
ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimi ċi jew aġenti fiżiċi. 
1.3. PRIN ĊIPJI TA' DAN IL-METODU TA' TEST  
It-test tal-UDS b' Ċelloli tal-fwied ta' mammiferi  in vivo  jindika 
sintesi ta' riparazzjoni DNA wara l-exissjoni u t-tne ħħija ta' biċċa 
mid-DNA li jkun fiha re ġjun ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimi ċi 
njew aġenti fiżiċi. It-test hu normalment msejjes fuq l-inkorpo ­
razzjoni ta' 3H-TdR fi ċ-ċelluli DNA tal-fwied li g ħandhom 
frekwenza baxxa ta' Ċelloli fil-fasi S ta ċ-ċiklu taċ-Ċelloli. It-te ħid 
ta' 3H-TdR ji ġi normalment stabbilit bl-awdjoradjografija, g ħax dan 
il-metodu ta' teknika mhuwiex suxxettibbli g ħal indħil minn Ċelloli 
fil-fasi S b ħal, per eżempju, konte ġġ ta' xintillazzjoni fil-fasi likwida.  
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.4.1.  Preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Selezzjonijiet ta' l-ispe ċi ta' annimali  
Normalment jintu ża l-far, minkejja li tista’ tintu ża kull spe ċi xierqa 
ta' mammiferi. G ħandhom jintu żaw partijiet ġeneralment u żati fil- 
laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom adulti. Fil-bidu ta' l- 
istudju l-varjazzjoni fil-pi ż ta' l-annimali g ħandha tkun minima u 
ma tkunx i żjed minn ± 20 % tal-pi ż medju g ħal kull wie ħed mis- 
sessi.  
1.4.1.2.  Kondizzjoinijiet ta' fejn jin żammu u x'jieklu  
Jiġu applikati l-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni 
ġenerali g ħat-Taqsima B g ħalhemm il-mira g ħall-umdità g ħandha 
tkun ta' 50 sa 60 %.  
1.4.1.3.  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali b'sa ħħithom żgħar adulti ji ġu assenjati ming ħajr ordni 
għall-gruppi ta' kontroll u ta' trattament. Il-ga ġeġ għandhom ikunu 
rranġati b'tali mod li jitnaqqsu l-effetti possibbli mil-fatt li jitqieg ħdu 
f'gaġeġ. L-annimali ji ġu identifikati wie ħed wieħed u jinżammu fil- 
gaġeġ tagħhom għallinqas g ħal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju 
biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju.  
1.4.1.4.  Sustanza tat-test/preparazzjoni  
Sustanzi tat-test solidi g ħandhom ji ġu mdewwbin jew sospi żi 
f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel 
it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistg ħu jiġu 
ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. G ħandhom 
jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il 
darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix la ċċettabbilità tal- 
ħażna. 
1.4.2.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1.  Solvent/mezz  
Is-solvent/mezz ma g ħandux jipprodu ċi effetti tossi ċi fil-livelli ta' 
doża użata, u ma g ħandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni 
kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħra 
minflok dawk l-aktar mag ħrufa, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun 
appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tag ħhom. Hu 
rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' 
solvent/mezz akkwu ż. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrolli  
Għandhom ji ġu inklużi f'kull parti indipendenti ta' l-esperiment 
kontrolli po żittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief 
għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal- 
kontroll g ħandhom ji ġu trattati bl-istess mod b ħall-annimali fil- 
grupp ta' trattament.  
Il-kontrolli po żittivi għandhom ikunu sustanzi mag ħrufa li jipprodu ċu 
UDS meta somministrati f'livelli ta' espo żizzjoni li huma meqjusa li 
jagħtu żieda li wie ħed jista’ jinnota fuq l-isfond. Kontrolli po żittivi li 
jeħtieġu attivazzjoni metabolika g ħandhom jintu żaw f'dożi li joħolqu 
rispons moderat (4). Id-do żi jistgħu jingħażlu sabiex l-effetti jkunu 
ċari iżda ma ji żvelawx immedjatament l-identità tad-dijapo żitivi 
kodifikati lil min jaqrahom. E żempji ta' sustanzi ta' kontroll 
pożittivi jinkludu:  
Ħinijiet ta' te ħid ta' kampjuni Sustanza Nru CAS Nru EINECS  
Teħid ta' kampjuni kmieni (2 sa 4 
sigħat) N-nitrosodimetilamina 62-75-9 200-249-8 
Teħid ta' kampjuni tard (12 sa 16-il 
siegħa) N-2-fluworenila ċetamide (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Jistgħu jintużaw kontrolli po żittivi oħra xierqa. Huwa a ċċettabbli li l- 
kontroll po żittiv għandu jiġi somministrat minn rotta differenti mis- 
sustanza tat-test.  
1.5. PRO ĊEDURA  
1.5.1.  Numru u sess ta' l-annimali  
Għandu jintu ża numru adegwat ta' annimali biex titqies il-varjazzjoni 
bijoloġika naturali f'rispons ta' test. In-numru ta' annimali g ħandu 
jkun għall-inqas tliet annimali analizzabbli kull grupp. Fejn ikun 
ġie akkumulat database storiku sinjifikattiv, annimal wie ħed jew 
tnejn biss jkunu me ħtieġa għall-gruppi ta' kontroll po żittivi u 
negattivi fl-istess ħin. 
Jekk fil-ħin li jsir l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli 
minn studji fl-istess spe ċje u li ju żaw l-istess rotta ta' espo żizzjoni 
li juru li ma hemms differenzi sostanzjali fit-tossi ċità bejn is-sessi, 
allura jkun bi żżejjed li t-test isir fuq sess wie ħed, preferibbilment dak 
maskil. Fejn l-espo żizzjoni umana g ħall-kimiċi tista’ tkun spe ċifika 
skond is-sess, b ħal ma hu per e żempju għal ċerti aġenti farma ċewtiċi, 
it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq.  
1.5.2.  Skeda tat-trattament  
Is-sustanzi tat-test ġeneralment ji ġu somministrati fi trattament 
singolu.  
1.5.3.  Livelli tad-do ża 
Normalment, jintu żaw għall-inqas żewġ livelli ta' do ża. L-ogħla doża 
hija mfissra b ħala d-doża li tipprodu ċi sinjali ta' tossi ċità hekk li 
livelli og ħla tad-do ża, bbażati fuq l-istess re ġim ta' do żaġġ, huma 
mistennija li jikkaw żaw il-mewt. Ġeneralment, l-inqas do ża għandha 
tkun minn 50 % sa 25 % ta' l-og ħla doża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Is-sustanzi b'attivitajiet bijolo ġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossi ċi 
(bħal ma huma ormoni u nitro ġeni) jistg ħu jkunu e ċċezzjonijiet 
għall-kriterji ta' l-issettjar tad-do żi u għandhom ji ġu valutati fuq 
bażi ta' każ b'każ. Jekk isir studju biex tinstab il-medda g ħax ma 
jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan g ħandu jsir fl- 
istess laboratorju, billi jintu żaw l-istess spe ċji, karatteristi ċi, sess u 
dożaġġ ta' trattament li jintu ża fl-istudju prin ċipali.  
L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-do ża li tipprodu ċi xi indikazzjoni 
ta' tossiċità fil-fwied (e ż. nukleji piknoti ċi). 
1.5.4.  Test tal-limitu  
Jekk test ta' do ża waħda ta' livell ta' g ħall-inqas 2 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem, meta jitwettaq trattament wie ħed, jew b ħala żewġ trattamenti 
fl-istess ġurnata, ma jipprodu ċix effetti tossi ċi li wieħed jinduna 
bihom, u jekk ma tkunx mistennija l- ġenotossiċità fuq il-ba żi ta' l- 
informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx 
li jkun ne ċessarju li jsir studju komplet. L-espo żizzjoni umana 
mistennija tista’ tindika l- ħtieġa ta' livell og ħla ta' doża li għandu 
jintuża fit-test tal-limitu.  
1.5.5.  Somministrazzjoni ta' do żi 
Normalment is-sustanza tat-test ti ġi somministrata b'gavage billi 
jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni. Fejn 
ikunu ġustifikati, jistg ħu jiġu aċċettati rotot o ħra ta' espo żizzjoni. 
Madankollu r-rotta intraperitonali mhix rakkomandata g ħax tista’ 
tesponi l-fwied direttament g ħas-sustanza tat-test minflok permezz 
tas-sistema ċirkolatorja. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ ji ġi 
somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f' ħin wieħed jiddependi fuq 
il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'g ħandux ikun aktar minn 
2 ml/100g pi ż tal-ġisem. L-u żu ta' volumi og ħla minn dawn 
għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-ka ż ta' sustanzi li jirritaw jew 
korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'kon ċentrazzjonijiet 
ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test g ħandha titnaqqas bl-a ġġus­
tament tal-kon ċentrazzjoni biex ji ġi żgurat volum kostanti fuq il- 
livelli kollha tad-do ża. 
1.5.6.  Preparazzjoni ta ċ-Ċelloli tal-fwied  
Iċ-Ċelloli tal-fwied huma ppreparati minn annimali ttrattati norm ­
alment 12 sa 16-il sieg ħa wara t-te ħid tad-do ża. Ġeneralment ikun 
meħtieġ teħid ta' kampjuni ie ħor addizzjonali u aktar kmieni (norm ­
almeny sag ħtejn sa erba' sig ħat wara t-trattament) kemm-il darba ma 
jkunx hemm rispons po żittiv ċar fi 12 sa 16-il sieg ħa. Madankollu t- 
teħid ta' kampjuni jista’ jsir f' ħinijiet oħra meta jkun ġustifikat fuq il- 
bażi ta' informazzjoni tossikokinetika.  
Normalment il-kulturi ta' perjodu qasir ta' Ċelloli ta' manniferi ji ġu 
stabbiliti billi l-fwied jitg ħatta fil-post bil-kolla ġenas u billi Ċelloli 
tal-fwied disso ċjati ġodda jitħallew jing ħaqdu ma' superfi ċji xierqa. 
Ċelloli tal-fwied minn annimali ta' kontroll negattiv g ħandu jkollhom 
vijabilità ta' g ħall-inqas 50 %.  
1.5.7.  Determinazzjoni ta' UDS  
Iċ-Ċelloli tal-fwied i żolati ġodda tal-mammiferi huma inkubati norm ­
alment b'medjum li jkun fih 3H-TdR g ħal tul ta' żmien xieraq, e ż. 
tliet sigħat sa tmienja. Fl-a ħħar tal-perjodu ta' inkubazzjoni, il- 
medjum g ħandu jitne ħħa miċ-Ċelloli, li imbag ħad jistgħu jiġu 
inkubati b'medjum li jkun fih e ċċess ta' timidina mhux ittikkettjata 
biex tnaqqas r-radjuattività mhux inkorporata ('cold chase'). Imbagħad iċ-Ċelloli jiġu mlaħalħa, ffissati u mnixxfin. G ħal 
ħinijiet ta' inkubazzjoni itwal, il-cold chase jista’ ma jkunx 
neċessarju. Id-dijapo żittivi jixxarbu b'emulsjoni awtoradjografika, 
jiġu esposti fid-dlam (e ż. imkessħin għal sebat ijiem sa erbatax-il 
ġurnata), żviluppati, mog ħtika l-kulur, u jing ħaddu il-grani tal-fidda 
esposti. Ji ġu ppreparati żewġ jew tliet dijapo żittivi minn kull 
annimal.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Anali żi 
Il-preparazzjonijiet tad-dijapo żittivi għandu jkollhom bi żżejjed 
Ċelloli ta' morfolo ġija normali li jippermettu valutazzjoni xierqa 
tal-UDS. Il-preparazzjonijiet ji ġu eżaminati mikroskopikament g ħal 
sinjali ta' tossi ċita qawwija (e ż. piknożi, livelli ridotti ta' radjutik ­
kettjar).  
Id-dijapożittivi għandhom ji ġu kodifikati qabel ma jibda l-g ħadd tal- 
grani. Normalment jing ħaddu 100 ċellula minn kull annimal minn 
għall-inqas żewġ dijapożittivi; l-għadd ta' inqas minn 100 ċellula/­
annimal g ħandu jkun ġustifikat. In-numru ta' grani ma jing ħaddx 
għan-nuklei tal-fasi S, i żda tista’ ti ġi reġistrata l-proporzjon ta' 
Ċelloli tal-fasi S.  
L-ammont ta' inkorporazzjoni ta' 3H-TdR fin-nuklei u ċ-ċitoplasma 
ta' Ċelloli morfolo ġikament normali, kif ppruvat bid-deposizzjoni ta' 
grani tal-fidda, g ħandu jiġi stabbilit b'metodi xierqa.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Għandha ting ħata informazzjoni individwali dwar dijapo żittivi u 
annimali. Barra minn dan. L-informazzjoni kollha g ħandha 
titqassar f'forma ta' tabella. L-g ħadd ta' g rani nukleari netti (NNG) 
għandu jiġi kalkolat g ħal kull ċellula, għal kull annimal u g ħal kull 
doża u ħin billi jitnaqqsu l-g ħadd ta' CG mill-g ħadd ta' NG. Jekk 
jingħaddu “iċ-Ċelloli li qed jissewwew”, il-kriterji g ħaċ-Ċelloli li qed 
jissewwew g ħandhom ikunu ġustifikati u msejsa fuq informazzjoni 
storika u ta' kontroll negattiv fl-istess ħin. Riżultati numeri ċi jistgħu 
jiġu valutati b'metodi statisti ċi. Jekk jintu żaw, it-testijiet statisti ċi 
għandhom jing ħażlu u jkunu ġustifikati qabel ma jitwettaq l-istudju.  
2.2. VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Eżempji ta' kriterji g ħal rispons po żittiv/negattiv jinkludu: 
pożittiv (i) il-valuri NNG og ħla minn limitu determinat 
minn qabel li hu ġustifikat fuq il-ba żi ta' 
informazzjoni storika tal-laboratorju; jew 
(ii) il-valuri NNG sinjifikatament og ħla minn 
kontroll fl-istess ħin; 
negattiv (i) il-valuri NNG fil-limitu/ta ħt il-limitu ta' 
kontroll storiku jew 
(ii) il-valuri NNG mhux sinjifikatament og ħla 
minn kontroll fl-istess ħin ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijolo ġika ta' l-informazzjoni: 
jiġifieri għandhom jitqiesu l-parametri b ħal ma huma l-varjazzjoni 
bejn l-annimali, r-relazzjoni g ħar-rispons g ħad-doża u ċ-ċitossiċità. 
Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet, jistg ħu 
jintużaw metodi ta' statistika. Madankollu, s-sinjifikanza statistika 
ma għandhiex tkun l-uniku fattur g ħal rispons po żittiv. 
Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi 
jew negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix 
li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-ri żultati 
jistgħu jibqgħu ekwivo ċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' 
drabi li jirrepeti ru ħu l-esperiment.  
Riżultat pożittiv minn test UDS b' Ċelloli tal-fwied tal-mammiferi  in 
vivo jindika li s-sustanza tat-test to ħloq ħsara fid-DNA ta ċ-Ċelloli tal- 
fwied tal-mammiferi  in vivo  li tista’ tissewwa b'sintesi tad-DNA 
mhux skedata  in vitro . Riżultat negattiv jindika li, ta ħt il- 
kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma to ħloqx ħsara fid- 
DNA li ti ġi żvelata b'dan it-test.  
Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test til ħaq iċ- 
ċirkolazzjoni ġenerali jew spe ċifikatament it-tessut immirat (e ż. 
tossiċità sistemika).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Solvent/mezz:  
— ġustifikazzjoni dwar l-g ħażla tal-mezz,  
— solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk 
magħrufa. 
Annimali ttestjati:  
— speċi/razza użati; 
— numru, età u sess ta' l-annimali;  
— għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jin żammu, dieta, e ċċ.; 
— piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inklu ża l-medda ta' 
piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard g ħal kull grupp.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— kontrolli po żittivi u negattivi (mezz/solvent);  
— informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;  
— raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-do ża; 
— dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;  
— metodi biex ji ġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet g ħaċ-ċirko­
lazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli;  
— konver żjoni mill-kon ċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test 
dieta/ilma g ħax-xorb g ħad doża attwali (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum) 
jekk tkun applikabbli;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;  
— deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u te ħid ta' 
kampjuni;  
— metodi biex titqies it-tossi ċità; 
— metodu tal-preparazzjoni u kultura ta ċ-Ċelloli tal-fwied;  
— teknika awtoradjografika u żata; 
— numru ta' dijapo żitivi ppreparati u numru ta' Ċelloli li jing ħaddu;  
— kriterji ta' valutazzjoni;  
— kriterji biex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew 
ekwivoċi. 
Riżultati:  
— valuri medji individwali tad-dijapo żittivi, ta' l-annimali u ta' 
gruppi għal grani nuklei, grani ċitoplasmiċi, u grani nukleari 
netti;  
— relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, jekk tkun disponibbli;  
— valutazzjoni statistika, jekk ikun hemm;  
— sinjali ta' tossi ċità; 
— informazzjoni dwar kontroll po żittiv u negattiv (solvent/mezz) fl- 
istess ħin; 
— informazzjoni dwar kontroll po żittiv u negattiv (solvent/mezz) 
storika bil-medda, mezzi u devjazzjonijiet standard;  
— numru ta' Ċelloli li qed jissewwew, jekk mag ħruf; 
— numru ta' Ċelloli tal-fasi S, jekk mag ħruf; 
— vijabilità ta ċ-ċelluli.  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
(1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In vivo  Rat. Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the  In vivo  Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, 
Mutation Res., 189, pp. 123-133.  
(3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., 
Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de 
G. (1993),  In vivo  Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and 
Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In vitro  and In vivo , Mutation Res., 312, pp. 263- 
285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial 
Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepa ­
tocytes Used for the  In vivo /In vitro  DNA Repair Assay 
(UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.  
(6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In vivo /In vitro  
Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  IL-KORRO ŻJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : IT-TEST TAR- 
REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER – 
TRANSCUTANEAL ELECTRICAL RESISTANCE)  
1. IL-METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent g ħall-OECD TG 430 (2004).  
1.1. DA ĦLA 
Il-korrożjoni tal-ġilda tirreferi g ħall-produzzjoni ta’ dannu irriver ­
sibbli fit-tessut tal- ġilda wara l-applikazzjoni ta’ materjal tat-test 
[kif definit mis-Sistema Globali Armonizzata g ħall-Klassifika u t- 
Tikkettjar ta’ Sustanzi u Komposti Kimi ċi (GHS –  Globally 
Harmonised System )] (1). Dan il-metodu jipprovdi pro ċedura li 
biha l-istima tal-korro żività ma ssirx f’annimali ħajjin.  
L-istima tal-korro żività tal- ġilda involviet tipikament l-u żu ta’ 
annimali tal-laboratorju (2). Itt ħassib għall-uġigħ u t-tbatija ta’ l- 
annimali involuti f’din il-pro ċedura ġie indirizzat fir-revi żjoni tal- 
Metodu tat-Test B.4 li jippermetti d-determinazzjoni tal-korro żività 
tal-ġilda bl-użu ta’ metodi alternattivi,  in vitro,  li jevitaw l-u ġigħ u t- 
tbatija.  
L-ewwel pass biex ji ġu definiti testijiet alternattivi li jistg ħu jintużaw 
għall-ittestjar tal-korro żività tal-ġilda kien it-twettiq ta’ studji tal-vali ­
dazzjoni minn qabel (3). Wara dan, studju ta’ validazzjoni formali ta’ metodi  in vitro  biex tiġi stmata l-korro żjoni tal-ġilda (4)(5) ġie 
mwettaq (6)(7)(8). Ir-ri żultat ta’ dawn l-istudji u letteratura o ħra 
ppubblikata wasslu g ħar-rakkomandazzjoni li jistg ħu jintużaw dawn 
it-testijiet g ħall-istima tal-korro żività tal-ġilda in vivo  (9)(10)(11): it- 
test tal-mudell tal- ġilda umana (ara l-Metodu tat-Test B.40bis) u t- 
test tar-re żistenza elettrika transkutanja (dan il-Metodu).
 
Studji ta’ validazzjoni u studji o ħrajn validati rrapportaw li l-figura 
tar-reżistenza elettrika transkutanja (TER) l- ġilda tal-firien (12)(13) 
tista’ tiddiskrimina fis-sod bejn il-korro żivi tal-ġilda mag ħrufin u 
sustanzi mhux korro żivi (5)(9).  
It-test deskritt f’dan il-Metodu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ 
sustanzi u komposti kimi ċi korrożivi. Jippermetti wkoll l-identifi ­
kazzjoni ta’ sustanzi u komposti mhux korro żivi meta tkun 
sostnuta mill-pi ż ta’ determinazzjoni tal-provi bl-u żu ta’ inform ­
azzjoni o ħra eżistenti (e ż. pH, struttura-attività-relazzjonijiet, data 
dwar l-umani u/jew l-annimali) (1)(2)(11)(14). Ma jag ħtix inform ­
azzjoni dwar l-irritazzjoni tal- ġilda, u lanqas ma jippermetti s-subkat ­
egorizzazzjoni ta’ sustanzi korro żivi kif permess fis-Sistema tal-Klas ­
sifika Globali Armonizzata (GHS) (1).  
Għal evalwazzjoni s ħiħa ta’ l-effetti lokali fuq il- ġilda wara 
espożizzjoni dermali unika, huwa rakkomandat li ti ġi segwita l-istra ­
teġija ta’ l-ittesttjar sekwenzjali kif mehmu ża mal-Metodu tat-Test 
B.4 (2) u provduta fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (1). Din l-istrate ġija ta’ l-ittestjar tinkludi t-twettiq ta’ testijiet  in 
vitro  għall-korrożjoni tal-ġilda (kif deskritt f’dan il-metodu) u l-irri ­
tazzjoni tal- ġilda qabel ma jitqies l-ittestjar fl-annimali ħajjin.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINIZZJONI  
Il-korrożjoni tal-ġilda in vivo : hija l-produzzjoni ta’ dannu irriver ­
sibbli tal- ġilda: jiġifieri nekro żi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d- 
dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza tat-test g ħal mhux aktar 
minn erba’ sig ħat. Ir-reazzjonijiet korro żivi hima tipifikati minn 
ulċeri, ħruġ ta’ demm, qxur bid-demm, u sa l-a ħħar ta’ l-osser ­
vazzjoni ta’ 14-il jum, tnaqqis ta’ kulur min ħabba li tibjad il- ġilda, 
żoni sħaħ ta’ alopecia , u ċikatriċi. Il-ħistopatoliġija għandha titqies 
biex jiġu evalwati le żjonijiet li dwarhom hemm dubju.  
Ir-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER):  hija kejl ta’ l- 
impendenza tal- ġilda, bħala valur ta’ re żistenza f’kilo Ohms. 
Metodu sempli ċi u robust biex ti ġi stmata l-funzjoni ta’ barrjera 
bir-rekordjar tal-passa ġġ tal-joni mill- ġilda bl-u żu ta’ apparat  
Wheatstone bridge . 
IS-SUSTANZI TA’ RIFERENZA  
Tabella 1  
Il-Kimiċi ta’ Riferenza  
Isem Nru EINECS Nru CAS  
1,2-Diaminopropane 201-155-9 78-90-0 Korro żiv Ħafna 
Aċidu Akriliku 201-177-9 79-10-7 Korro żiv Ħafna 
2-tert. Butylphenol 201-807-2 88-18-6 Korro żiv 
Idrossidu tal-potassju (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korro żiv 
Aċidu sulfuriku (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korro żiv 
Aċidu Oktanoiku (a ċidu kapriliku) 204-677-5 124-07-02 Korro żiv 
4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Mhux Korro żiv 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Mhux Korro żiv 
Phenethyl bromide 203-130-8 103-63-9 Mhux Korro żiv 
Tetrachloroethylene 204-825-9 27-18-4 Mhux Korro żiv 
Aċidu iżosteariku 250-178-0 30399-84-9 Mhux Korro żiv 
4-(Methylthio)-benzaldehyde 222-365-7 3446-89-7 Mhux Korro żiv 
Il-parti l-kbira tal-kimi ċi elenkati huma me ħuda mil-lista ta’ kimi ċi 
magħżula għall-istudju internazzjonali ta’ validazzjoni ECVAM (4). 
L-għażla tagħhom hija bba żata fuq dawn il-kriterji li ġejjin:  
i) għaddu indaqs ta’ sustanzi korro żivi u mhux korro żivi; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) sustanzi disponibbli kummer ċjalment li jkopru l-parti l-kbira tal- 
klassijiet ta’ kimi ċi rilevanti;  
iii) l-inklu żjoni ta’ sustanzi korro żivi ħafna kif ukoll dawk inqas 
korrożivi sabiex tkun possibbli d-diskriminazjoni bba żata fuq 
il-potenza korro żiva; 
iv) l-għażla tal-kimi ċi li jistg ħu jiġu mmani ġġjati f laboratorju 
mingħajr periklu serju minbarra l-korro żività.  
IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-materjal tat-test huwa applikat g ħal mhux aktar minn 24 sieg ħa fuq 
l-uċuħ epidermali ta’ ċrieki ta’ ġilda f sistema ta’ test b’ żewġ 
kompartimenti fejn i ċ-ċrieki ta’ ġilda jaħdmu bħala s-separazzjoni 
bejn il-kompartimenti. I ċ-ċrieki tal- ġilda jittie ħdu minn firien 
maqtula b’mod uman ta’ età ta’ 28-30 jum. Il-materjali korri żivi 
huma identifikati mill-abilità tag ħhom li jipprodu ċu telf ta’ 
integrita normali ta’  stratum corneum  u tal-funzjoni ta’ barrjera, li 
jitkejjel b ħala tnaqqis fit-TER ’l isfel minn livell ta’ limitu (12). 
Għat-TER tal-firien, intg ħażel valur ta’ limitu ta’ 5 k Ώ ibbażat 
fuq data estensiva g ħal varjetà kbira ta’ kimi ċi fejn il-ma ġġoranza 
l-kbira ta’ valuri kienu jew sew aktar ’il fuq (spiss > 10 k Ω), jew 
sew aktar ’l isfel (spiss < 3 k Ω) minn dan il-valur (12). B’mod 
ġenerali, il-materjali li mhumiex korro żivi fl-annimali i żda li huma 
irritanti jew mhux irritanti ma jnaqqsux it-TER inqas minn dan il- 
valur ta’ limitu. Barra minn hekk, l-u żu ta’ preparazzjonijiet ta’ ġilda 
oħrajn jew tag ħmir ieħor jista’ jibdel il-valur ta’ limitu, li je ħtieġ 
aktar validazzjoni.  
Huwa inkorporat fil-pro ċedura tat-test pass li jorbot i ż-żebgħa sabiex 
isir it-test ta’ konferma tar-ri żultati pożittivi fit-TER inklu żi valuri 
madwar 5 k Ω. Il-pass li jorbot i ż-żebgħa jiddetermina jekk i ż-żjieda 
fil permeabilità ionika hijiex min ħabba qirda fi żika tal-istratum 
corneum.  Il-metodu tat-TER bl-u żu tal-ġilda tal-firien wera li jista’ 
jbassar il-korro żività in vivo  fil-fenek evalwat ta ħt il-Metodu tat-Test 
B.4 (2). G ħandu jiġi nnutat li t-test tal-fenek  in vivo  huwa konser ­
vattiv ħafna fir-rigward tal-korro żività tal-ġilda u l-irritazzjoni tal- 
ġilda meta mqabbel mat-test tal-parti tal- ġilda umana (15).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
L-Annimali  
Il-firien huma l-ispe ċi ta’ għażla minħabba li s-sensittività tal- ġilda 
tagħhom għall-kimiċi f dan it-test di ġa ntweriet qabel (10). L-età 
(meta tin ġabar il-ġilda) u l-ispe ċi tal-far huma partikolarment 
importanti biex ji ġi żgurat li l-follikoli tax-xahar fil-fa żi dormanti 
qabel ma jibda t-tkabbir tax-xahar adult.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Ix-xahar dorsali u tal- ġenb minn firien żgħar, ta’ età ta’ madwar 22 
jum (derivati minn Wistar jew ferg ħa komparabbli), jitne ħħa bir- 
reqqa b’qattieg ħ ix-xahar żgħir. Imbag ħad l-annimali ji ġu maħsula 
billi jintmes ħu bl-attenzjoni, filwaqt li l-parti bix-xag ħar maqtug ħ tiġi 
mgħarrqa ftaħlita antibijotika (li per e żempju, fuha streptomycin, 
penisilin, chloramphenicol, u amphotericin, f kon ċentrazzjonijiet li 
huma effettivi biex jinibixxu t-tkabbir tal-batterji). L-annimali jerġgħu jiġu maħsula bl-anitibjoti ċi fit-tielet jew ir-raba’ jum wara 
l-ewwel ħasla u jintu żaw fi żmien 3 ijiem wara t-tieni ħasla, meta l- 
istratum corneum  ikun irkupra mit-tne ħħija tax-xahar.
 
Il-preparazzjoni ta ċ-ċrieki tal- ġilda 
L-annimali ji ġu maqtula b’mod uman meta jkollhom 28-30 jum; l-età 
hija kritika Il- ġilda dorso-laterali ta’ kull annimal imbag ħad titneħħa 
u jitneħħielha x-xa ħam subkutanju e ċċessiv billi jitqaxxar bl- 
attenzjoni minn mal- ġilda Iċ-ċrieki tal- ġilda, ta’ djametru ta’ 
madwar 20 mm kull wie ħed, jitneħħew. Il-ġilda tista’ ti ġi maħżuna 
qabel ma jintu żaw iċ-ċrieki fejn jidher li d-data tal-kontroll po żittiva 
u negattiva hija ekwivalenti g ħal dik miksuba b’ ġilda friska.  
Kull ċirku tal-ġilda jitqieg ħed fuq wie ħed mit-truf ta’ tubu PTFE 
(polytetrafluoroethylene), li ji żgura li l-wi ċċ epidermali huwa f 
kuntatt mat-tubu. Ċirku “O” tal-gomma huwa mwa ħħal billi 
jingħafas mat-tarf tat-tubu biex il- ġilda tinżamm f postha u t-tessut 
żejjed jiġi maqtug ħ. Id-dimensjonijiet tat-tubu u ta ċ-ċirku “O” 
jintwerew fil-Figura 2. I ċ-ċirku “O” tal- ġilda imbag ħad jiġi ssiġġillat 
bir-reqqa mat-tarf tat-tubu PTFE bl-ingwent. It-tubu huwa appo ġġjat 
minn molla ġewwa parti re ċettorja li fiha ta ħlita ta’ MgSO  4 
(154 mM) (Figura 1). I ċ-ċirku tal-ġilda għandha tiġi għal kollhox 
meqruda fit-ta ħlita ta’ MgSO  4 . Minn ġilda ta’ far wie ħed jistgħu 
jinkisbu daqs 10 – 15 ċirku tal-ġilda. 
Qabel ma jibdew it-testijiet, ir-re żistenza elettrika ta’ żewġ ċrieki tal- 
ġilda tiġi mkejla b ħala proċedura tal-kontroll tal-kwalità g ħal kull 
ġilda ta’ l-annimali. I ż-żewġ ċrieki għandhom jag ħtu valuri ta’ 
reżistenza akbar minn 10 k Ω biex jintu żaw il-bqija ta ċ-ċrieki għat- 
test. Jekk il-valur tar-re żistenza huwa inqas minn 10 k Ω, il-bqija ta ċ- 
ċrieki minn dik il- ġilda għandha tintrema.  
L-applikazzjoni tat-test u s-sustanzi tal-kontroll  
Għandhom jintu żaw kontrolli konkurrenti po żittivi u negattivi biex 
kull studju ji żgura ħidma tajba tal-mudell esperimentali. G ħandhom 
jintużaw ċ-ċrieki tal- ġilda minn animal wie ħed. Is-sustanzi tal- 
kontroll po żittivi jew negattivi su ġġeriti huma 10 M a ċidu idrok ­
loriku u ilma ddistillat, rispettivament.  
Is-sustanzi tat-test likwidi (150 μL) huma applikati b’mod uniformi 
mal-wiċċ eipdermali ġewwa t-tubu. Meta ji ġu ttestjati materjali 
solidi, huwa applikat ammont bi żżejjed ta’ solidu b’mod livell fuq 
iċ-ċirku sabiex ji ġi żgurat li l-wi ċċ kollu ta’ l-epidermis huwa kopert. 
Jiżdied l-ilma deioni żżat (150 μL) fuq is-solidu u t-tubu ji ġi aġitat bil- 
mod. Sabiex jinkiseb il-kuntatt massimu mal- ġilda, is-solidi jistg ħu 
jkunu jridu jissa ħħnu sa 30  o C biex tin ħall jew ti ġi mrattba s- 
sustanza tat-test, jew mit ħuna sabiex jipprodu ċu materjal granurali 
jew terra.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Jintużaw tliet ċrieki tal-ġilda għal kull sustanza tat-test u tal-kontroll. 
Is-sustanzi tat-test huma aplikati g ħal 24 sieg ħa f temperatura ta’ 20- 
23 C. Is-sustanza tat-test titne ħħa bil-ħasil b’mer żuq ta’ ilma tal-vit 
sa 30 C sakemm ma jista’ jitne ħħa ebda materjal ie ħor. 
Il-kejl tat-TER  
L-impedenza tal- ġilda titkejjel b ħala TER u titkejjel bl-u żu ta’ 
kurrent alternat, ta’ vulta ġġ baxx ta’ Wheatstone databridge (13). 
L-ispeċifikazzjonijiet ġenerali tal -bridge  huma vulta ġġ operattiv ta’ 
1-3 Volt, kurrent sinus jew rettangulari alternat ta’ 50 - 1 000 Hz, u 
firxa tal-kejl ta’ mhux inqas minn 0,1 – 30 k Ω. Id-databridge  użat fl- 
istudju tal-validazzjoni jkejjel l-induttanza, l-kapa ċitanza u r- 
reżistenza sa valuri ta’ 2 000 H, 2 000 μF, u 2 M Ω, rispettivament 
bi frekwenzi ta’ 100 Hz jew 1 kHz, bl-u żu ta’ valuri serje jew 
paralleli. G ħal-għanijiet tal-korro żività tat-TER il-kejl tal-figura 
huwa rrekordjat f re żistenza, bi frekwenzi ta’ 100 Hz u bl-u żu ta’ 
valuri serje. Qabel ma titkejjel ir-re żistenza elettrika, it-tensjoni tal- 
wiċċ tal-ġilda titnaqqas billi ji żdied volum suffi ċ jenti ta’ etanol 
70 % biex ikopri l-epidermis. Wara ftit sekondi, l-ethanol jitne ħħa 
mit-tubu u mbag ħad t-tessut ji ġi idratat billi ti żdied taħlita ta’ 3 mL 
MgSO  4 (154 mM). L-elettrodi  tad-databridge  jitqiegħdu fuq kull 
naħa taċ-ċirku tal-ġilda biex titkejjel ir-re żistenza f k Ω/ċirku tal- 
ġilda (Figura 1). Id-dimensjonijiet ta’ l-elettrodi u t-tul ta’ l- 
elettrodu espost ta ħt il-crocodile clips  jintwerew fil-Figura 2. Il- 
molla mwa ħħla ma’ l-elettrodu ta’ ġewwa tistrie ħ fuq il-parti ta’ 
fuq tat-tubu PTFE matul il-kejl tar-re żistenza sabiex ji ġi żgurat tul 
konsistenti ta’ l-elettrodu huwa meqrud fit-ta ħlita MgSO  4 . l-elettrodu 
ta’ barra jitqieg ħed ġewwa l-parti re ċettorja sabiex jistrie ħ fuq il- 
qiegħ ta’ dik il-parti. Id-distanza bejn il-molla u l-qieg ħ tat-tubu 
PTFE tin żamm kostanti (Figura 2), g ħaliex din id-distanza 
taffettwa l-valur ta’ re żistenza miksub. G ħalhekk, id-distanza bejn 
l-elettrodu ta’ ġewwa u ċ-ċirku tal-ġilda għandha tkun kostanti u 
minimali (1-2 mm).  
Jekk il-valur tar-re żistenza mkejjel huwa akbar minn 20 k Ω, dan 
jista’ jkun min ħabba li l-fdalijiet tas-sustanza tat-test jiksu l-wi ċċ 
eipdermali ta ċ-ċirku tal-ġilda. Wie ħed jista’ jipprova jkompli jne ħħi 
din il-kisja, per e żempju, billi jissi ġilla t-tubu PTFE bis-seba’ l-kbir 
bl-ingwanta u mbag ħad iħawdu għal madwar 10 sekondi; it-ta ħlita 
ta’ MgSO  4 tintrema u jer ġa’ jsir il-kejl tar-re żistenza b’ MgSO  4 ġdid. 
Il-karatteristi ċi u d-dimensjonijiet ta’ l-apparat tat-test u l-pro ċedura 
ta’ l-esperiment u żati jistgħu jinfluwenzaw il-valuri tat-TER miksuba. 
Il-limitu korro żiv ta’ 5 k Ω ġie żviluppat mid-data miksuba fl-apparat 
u l-proċdura speċifiċ i użati f dan il-Metodu. Jistg ħu jgħoddu valuri 
differenti tal-limitu u tal-kontroll jekk jinbidlu l-kundizzjonijiet tat- 
test jew jintu ża apparat differenti. G ħalhekk, huwa me ħtieġ li jiġu 
kkalibrati l-metodolo ġija u l-valuri tal-limiti tar-re żistenza bl-ittestjar 
ta’ serje ta’ standards ta’ riferenza mag ħżula mill-kimi ċi fl-istudju 
tal-validazzjoni (4) (5), jew minn klassijiet tal-kimi ċi li huma simili 
għal dawk li qed ji ġu investigati. Sett ta’ kimi ċi ta’ riferenza xierqa 
jintwera fit-Tabella 1.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
Il-Metodi ta’ l-Irbit ta ż-Żebgħa 
L-espożizzjoni ta’ xi materjali mhux korro żivi tista’ tirri żulta fi tnaqqis 
ta’ reżistenza ’l isfel mil-limitu ta’ 5 k Ω li jippermetti l-mog ħdija ta’ 
joni mi ll-i stratum corneum,  u b’hekk titnaqqas ir-re żistenza elettrika 
(5). Per eżempju, l-organi ċi newtri u l-kimi ċi li għandhom karatteristi ċi 
attivi fil-wi ċċ (inklużi deterġenti, emulsifikanti u surfattanti o ħrajn) 
jistgħu jneħħu l-lipidi tal- ġilda li l-barrjera jag ħmluha aktar permeabbli 
għall-joni. G ħalhekk, jekk il-valuri tat-TER huma inqas minn jew 
madwar 5 k Ω fin-nuqqas ta’ dannu vi żwali, tista’ ssir stima tal- 
penetrazzjoni ta ż-żebgħa fuq iċ-ċelloli tal-kontroll u dawk ittrattati 
sabiex jiġi determinat jekk il-valuri tat-TER miksuba kinux ir-ri żultat 
tal-permeabilità akbar tal- ġilda, jew tal-korro żjoni tal-ġilda (3)(5). Fil- 
każ ta’ l-aħħar fejn jinqasam l-i stratum corneum,  iż-żebgħa sulfor­
hodamine B, meta applikata mal-wi ċċ tal-ġilda tippenetra malajr u 
ttebba’ t-tessut ta’ ta ħt. Din iż-żebgħa partikolari hija stabbli g ħal 
varjetà kbira ta’ kimi ċi u mhijiex affettwata mill-pro ċedura ta’ l- 
estrazzjoni deskritta hawn ta ħt. 
L-applikazzjoni u t-tne ħħija taż-żebgħa Sulforhodamine B  
Wara l-istima tat-TER, is-sulfat tal-manje żju jintrema mit-tubu u l- ġilda 
tiġi eżaminata bir-retta g ħal dannu ovvju. Jekk ma hemm ebda dannu 
kbir ovvju, i ż-żebħa Sulforhodamine B dye (A ċidu Aħmar 52; C.I. 
45100; EINECS Numru 222-529-8; CAS numru 3520-42-1), 150 μL 
ta’ taħ lita ta’ 10 % (w/v) fl-ilma distillat ti ġi applikata fuq il-wi ċċ 
epidermali ta’ kull ċirku tal-ġilda għal sagħtejn. Dawn i ċ-ċrieki tal- 
ġilda mbag ħad jinħaslu bl-ilma tal-vit sa temperatura ambjentali g ħal 
madwar 10 sekonda biex titne ħħa ż-żebgħa eċċessiva/mhux u żata. Kull 
ċirku tal-ġilda mbag ħad jitneħħa bl-attenzjoni mit-tubu tal-PTFE u 
jitqiegħed fi flixkun (e ż. flixkun tal- ħġieġ tax-xintillazzjoni ta’ 
20 mL) li fih ilma deionizzat (8 mL). Il-fliexken ji ġu aġitati bil-mod 
għal 5 minuti sabiex titne ħħa żebgħa żejda mhux u żata. Din il- 
proċedura ta’ tla ħliħ imbagħad hija ripetuta, u wara dan jitne ħħew iċ- 
ċrieki tal-ġilda u jitqieg ħdu fi fliexken li fihom 5 ml ta’ 30 % (w/v)  
sodium dodecyl sulphate  (SDS) fl-ilma distillat u huma inkubati mal- 
lejl f’temperatura ta’ 60  o C. 
Wara l-inkubazzjoni, i ċ-ċirku tal-ġilda jitneħħa u jintrema u l-bqija 
tat-taħlita tiġi ċċentrifugata g ħal 8 minuti f’temperatura ta’ 21  o C 
(forza relattiva ċentrifugali ~175 x g). Kampjun ta’ 1 ml ta’ super ­
natant huwa m ħallat 1 f’5 (v/v) [i.e. 1 mL + 4 mL] ma’ 30 % (w/v) 
SDS fl-ilma ddistillat. Id-densità ottika (OD) tat-ta ħlita titkejjel 
f’565 nm.  
Il-kalkolu tal-kontenut ta ż-żebgħa 
Il-kontenut ta’ żebgħa sulforhodamine B g ħal kull ċirku huwa 
kkalkolat mill-valur ta’ l-OD (5) (il-koeffi ċjenti taż-żebgħa sulfor­
hodamine B ta’ 565 nm = 8,7 x l0  4 ; piż molekulari = 580). Il- 
kontenut ta ż-żebgħa huwa ddeterminat g ħal kull ċirku tal-ġilda bl- 
użu ta’ kurva xierqa tal-kalibrazzjoni u l-kontenut medju ta ż-żebgħa 
mbagħad jiġi kkalkolati g ħad-doppji.  
2. ID-DATA  
Il-valuri tar-re żistenza (k Ω) u l-valuri tal-kontenut medju ta ż-żebgħa 
(μg/ċirku), fejn xieraq, g ħall-materjal tat-test, kif ukoll g ħall-kontrolli 
pożittivi u negattivi g ħandhom ji ġu rrapportati f’forma ta’ tabella 
(data individwali tal-prova u medji ± S.D.), inklu ża d-data g ħall- 
esperimenti doppji/ripetuti, valuri medji u dawk individwali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIZULTATI  
Ir-riżultati medji tat-TER huma a ċċettati jekk il-valuri tal-kontroll 
pożittivi u negattivi konkorrenti jaqg ħu fl-iskali a ċċettabbli g ħall- 
metodi fil-laboratorju tat-test. L-iskali a ċċettabli tar-re żistenza għall- 
metodolo ġija u l-apparat deskritti hawn fuq jing ħataw f’din it-tabella 
li ġejja:  
Kontroll Sustanza Skala tar- 
reżistenza (k Ω) 
Pożittiv A ċidu idrokloriku 10M 0,5 – 1,0 
Negattiv Ilma ddistillat 10 – 25  
Ir-riżultati medji ta’ l-irbit ta ż-żebgħa huma a ċċettati b’kundizzjoni li 
l-valuri konkurrenti tal-kontroll jaqg ħu fl-iskali a ċċettabbli g ħall- 
metodu. Skali a ċċettabbli ssu ġġeriti tal-kontenut ta ż-żebgħa għas- 
sustanzi tal-kontroll g ħall-metodolo ġija u l-apparat deskritt hawn 
fuq jingħataw hawn isfel:  
Kontroll Sustanza Firxa tal- 
kontenut ta ż- 
żebgħa (μg/ 
ċirku) 
Pożittiv A ċidu idrokloriku 10M 40 – 100 
Negattiv Ilma ddistillat 15 – 35  
Is-sustanza tat-test jitqies mhux korro żiv għall-ġilda: 
i) jekk il-valur medju tat-TER miksub g ħas-sustanza tat-test huwa 
akbar minn 5 k Ω, jew  
ii) il-valur medju tat-TER huwa inqas minn jew daqs 5 k Ω, u 
— iċ-ċirku tal-ġilda ma juri ebda dannu ovvju, u  
— il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku huwa ferm inqas mill- 
kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku tal-kontroll po żittiv ta’ l- 
10M HCl miksuba fl-istess ħin. 
Is-sustanza tat-test titqies li hija korro żiva għall-ġilda: 
i) jekk il-valur medju tat-TER miksub g ħas-sustanza tat-test huwa 
inqas minn jew daqs 5 k Ω u ċ-ċirku tal-ġilda huwa ovvjament 
iddanneġġjat, jew  
ii) il-valur medju tat-TER huwa mean TER inqas minn jew daqs 5 
kΩ, u 
— iċ-ċirku tal-ġilda ma juri ebda dannu ovvju, i żda 
— il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku huwa akbar minn jew 
daqs il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku tal-kontroll 
pożittiv ta’ l-10M HCl miksuba fl-istess ħin. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. Ir-RAPPORTA ĠĠ TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi din l-informazzjoni li ġejja: 
Is-Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll:  
— l-isem/ismijiet tal-Kimika b ħall-isem IUPAC jew l-isem CAS u 
n-numru CAS, jekk mag ħruf; 
— is-safa u l-kompo żizzjoni tas-sustanza jew preparazzjoni (f 
perċentwali skond il-pi ż) u n-natura fi żika; 
— il-karatteristi ċi fiżiko-kimiċi bħall-istat fi żiku, pH, stabilità, 
solubbiltà fl-ilma, _ elevanti g ħat-twettiq ta’ l-istudju;  
— it-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk 
jgħodd (eż. tisħin, tħin); 
— l-istabilità, jekk mag ħrufa. 
L-annimali tat-test:  
— varjetà u sess u żati; 
— l-età ta’ l-annimali meta u żati bħala annimali donaturi;  
— l-għajn, il-kundizzjoni fejn jin żammu, dieta, e ċċ.; 
— id-dettalji tal-preparazzjoni tal- ġilda. 
Il-Kundizzjonijiet tat-Test:  
— il-kurvi tal-kalibrazzjoni g ħall-apparat tat-test;  
— il-kurvi tal-kalibrazzjoni g ħat-twettiq tat-test g ħar-rabta ta ż- 
żebgħa; 
— id-dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata biex jitkejjel it-TER;  
— id-dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata għall-istima ta’ l-irbit ta ż- 
żebgħa; jekk xieraq;  
— deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-pro ċeduri tat-test;  
— deskrizzjoni tal-kriterji ta’ l-evalwazzjoni u żati. 
Riżultati:  
— tabulazzjoni tad-data mit-TER u mill-valur ta’ l-irbit ta ż-żebgħa 
(jekk xieraq) g ħall-annimali indivdiwali u g ħal kampjuni tal- ġilda 
individwali;  
— deskrizzjoni ta’ kwalunkwe effett osservat.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet  
4. REFERENZI  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 
33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/ 
2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2. Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic.  in vitro  12, 471- 
482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  in vitro  12, 483- 524.
 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH 
Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In vitro  test 
methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxico ­
logical Methods, National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27 ta’ 
Marzu 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba mis- Segretarjat
 
12. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. 
(1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic.  in vitro  6, 191-194.  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709-720.  
15. Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
 
16. Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An  In 
vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic.  in vitro . 2, 7-17.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figura 1  
Apparat g ħall-figura tat-TER tal- ġilda tal-firien
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figura 2  
Dimensjonijiet tat-tubu tal-polytetrafluoroethylene (PFTE) u t-tubi re ċettorji u l- 
elettrodi u żati
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Il-fatturi kriti ċi ta’ l-apparat muri fuq:  
— id-djametru ġewwieni tat-tubu tal-PTFE;  
— it-tul ta’ l-elettrodi relattivi g ħat-tubu tal-PTFE u t-tubu re ċet­
torju, b’tali mod li ċ-ċirku tal-ġilda ma jintmessx mill-elettrodi 
u li tul standard ta’ l-elettrodu huwa f’kuntatt mat-ta ħlita ta’ l- 
MgSO  4 ; 
— l-ammont tat-ta ħlita ta’ l-MgSO  4 fit-tubu re ċettorju għandu jagħti 
fond ta’ likwidu, relattiv g ħal-livell fit-tubu tal-PFTE, kif muri 
fil-Figura 1;  
— iċ-ċirku tal-ġilda għandu jitwa ħħal tajjeb bi żżejjed mat-tubu tal- 
PFTE, b’tali mod li r-re żistenza elettrika hija kejl beru tal- 
karatteristi ċi tal-ġilda. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40.BIS.  IL-KORRO ŻJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : IT-TEST TAL- 
MUDELL TAL- ĠILDA UMANA  
1. IL-METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent g ħall-OECD TG 431 (2004).  
1.1 DA ĦLA 
Il-korrożjoni tal-ġilda tirreferi g ħall-produzzjoni ta’ dannu irriver ­
sibbli fit-tessut tal- ġilda wara l-applikazzjoni ta’ materjal tat-test 
[kif definit mis-Sistema Globali Armonizzata g ħall-Klassifika u t- 
Tikkettjar ta’ Sustanzi u Komposti Kimi ċi (GHS –  Globally 
Harmonised System )] (1). Dan il-metodu tat-test ma je ħtieġx l-użu 
ta’ annimali ħajjin jew tessut ta’ l-annimali g ħall-evalwazzjoni tal- 
korrożività tal-ġilda. 
L-istima tal-korro żività tal- ġilda involviet tipikament l-u żu ta’ 
annimali tal-laboratorju (2). Itt ħassib għall-uġigħ u t-tbatija involuti 
f’din il-pro ċedura ġie indirizzat fir-revi żjoni tal-Metodu tat-Test B.4 
li jippermetti d-determinazzjoni tal-korro żività tal-ġilda bl-użu ta’ 
metodi alternattivi,  in vitro,  li jevitaw l-u ġigħ u t-tbatija ta’ l- 
annimali.  
L-ewwel pass biex ji ġu definiti testijiet alternattivi li jistg ħu jintużaw 
għall-ittestjar tal-korro żività tal-ġilda kien it-twettiq ta’ studji tal-vali ­
dazzjoni minn qabel (3). Wara dan, studju ta’ validazzjoni formali ta’ 
metodi  in vitro  biex tiġi stmata l-korro żjoni tal-ġilda (4)(5) ġie 
mwettaq (6)(7)(8). Ir-ri żultat ta’ dawn l-istudji u letteratura o ħra 
ppubblikata wasslu g ħar-rakkomandazzjoni li jistg ħu jintużaw dawn 
it-testijiet g ħall-istima tal-korro żività tal-ġilda in vivo  (10)(11)12) ­
(13): it-test tal-mudell tal- ġilda umana (dan il-Metodu) u t-test tar- 
reżistenza elettrika transkutanja (ara l-Metodu tat-Test B.40).  
Studji ta’ validazzjoni u studji o ħrajn validati rrapportaw li t-testijiet 
li jużaw mudelli tal- ġilda umana (3)(4)(5)(9) jsitg ħu jiddiskriminaw 
b’mod dipendibbli bejn il-korro żivi tal-ġilda u sustanzi mhux 
korrożivi fuq il- ġilda. Il-protokoll tat-test jista’ wkoll jipprovdi indi ­
kazzjoni tad-distinzjoni bejn korro żivi tal-ġilda severi u dawk inqas 
severi.  
It-test deskritt f’dan il-Metodu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ 
sostanzi u ta ħlitiet kimi ċi korrożivi. Jippermetti wkoll l-identifi ­
kazzjoni ta’ sustanzi u ta ħlitiet mhux korro żivi meta tkun sostnuta 
mill-piż ta’ determinazzjoni tal-provi bl-u żu ta’ informazzjoni o ħra 
eżistenti (eż. pH, struttura-attività-relazzjonijiet, data dwar l-umani 
u/jew l-annimali) (1)(2)(13)(14). Normalment ma jag ħtix inform ­
azzjoni xierqa dwar l-irritazzjoni tal- ġilda, u lanqas ma jippermetti 
s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi korro żivi kif permess fis-Sistema 
tal-Klassifika Globali Armonizzata (GHS) (1).  
Għal evalwazzjoni s ħiħa ta’ l-effetti lokali fuq il- ġilda wara 
espożizzjoni dermali unika, huwa rakkomandat li ti ġi segwita l-istra ­
teġija tat-test sekwenzjali kif mehmu ża mal-Metodu tat-Test B.4 (2) 
u provduta fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (GHS) (1). Din l-istrate ġija tat-test tinkludi t-twettiq ta’ testijiet  in vitro  għall- 
korrożjoni tal-ġilda (kif deskritt f’dan il-metodu) u l-irritazzjoni tal- 
ġilda qabel ma jitqies l-ittestjar fl-annimali ħajjin.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Il-Korrożjoni tal-ġilda in vivo : hija l-produzzjoni ta’ dannu irriver ­
sibbli tal- ġilda: jiġifieri nekro żi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d- 
dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza tat-test g ħal mhux aktar 
minn erba’ sig ħat. Ir-reazzjonijiet korro żivi hima tipifikati minn 
ulċeri, ħruġ ta’ demm, qxur bid-demm, u sa l-a ħħar ta’ l-osser ­
vazzjoni ta’ 14-il jum, tnaqqis ta’ kulur min ħabba li tibjad il- ġilda, 
żoni sħaħ ta’ alopecia, u ċikatriċi. Il-ħistopatolo ġija għandha titqies 
biex jiġu evalwati le żjonijiet li dwarhom hemm dubju.  
Il-vijabilità ta ċ-ċelloli:  parametru li jkejjel l-attività totali ta’ popo ­
lazzjoni ta’ ċelloli (eż. l-abilità ta’ mitochondrial dehidrogenases 
ċellolari li jnaqqsu ż-żebgħa vitali MTT), li, skond il-punt tat- 
tmiem imkejjel u d-di żinn tat-test u żat, tikkorrelata ma’ l-g ħadd 
totali u/jew il-vitalità ta ċ-ċelloli.  
1.3 IS-SUSTANZI TA’ RIFERENZA  
Tabella 1  
Il-Kimiċi ta’ Riferenza  
Isem Nru EINECS Nru CAS  
1,2-Diaminopropane 201-155-9 78-90-0 Korro żiv Ħafna 
Aċidu Akriliku 201-177-9 79-10-7 Korro żiv Ħafna 
2-tert. Butylphenol 201-807-2 88-18-6 Korro żiv 
Potassium hydroxide (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korro żiv 
Aċidu sulfuriku (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korro żiv 
Aċidu Oktanoiku (a ċidu kapriliku) 204-677-5 124-07-02 Korro żiv 
4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Mhux Korro żiv 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Mhux Korro żiv 
Phenethyl bromide 203-130-8 103-63-9 Mhux Korro żiv 
Tetrachloroethylene 204-825-9 27-18-4 Mhux Korro żiv 
Aċidu iżosteariku 250-178-0 30399-84-9 Mhux Korro żiv 
4-(Methylthio)-benzaldehyde 222-365-7 3446-89-7 Mhux Korro żiv 
Il-parti l-kbira tal-kimi ċi elenkati huma me ħuda mil-lista ta’ kimi ċi 
magħżula għall-istudju internazzjonali ta’ validazzjoni ECVAM (4). 
L-għażla tagħhom hija bba żata fuq dawn il-kriterji li ġejjin:  
(i) numru indaqs ta’ sustanzi korro żivi u mhux korro żivi; 
(ii) sustanzi disponibbli kummer ċjalment li jkopru l-parti l-kbira tal- 
klassijiet ta’ kimi ċi rilevanti;  
(iii) l-inklu żjoni ta’ sustanzi korro żivi ħafna kif ukoll dawk inqas 
korrożivi sabiex tkun possibbli d-diskriminazzjoni bba żata fuq 
il-potenza korro żiva; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
(iv) l-għażla tal-kimi ċi li jistg ħu jiġu mmani ġġjati f’laboratorju 
mingħajr ażżard serju minbarra l-korro żività.  
IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-materjal tat-test huwa applikat topikament fuq mudell ta’ ġilda 
umana tri-dimensjonali li fih g ħall-inqas epidermis rikostruwit bi  
stratum corneum  funzjonali. Il-materjali korri żivi huma identifikati 
mill-abilità tag ħhom li jipprodu ċu tnaqqis fil-vijabbiltà ta ċ-ċelloli [kif 
iddeterminat, per e żempju, bl-u żu tal-figura tat-tnaqqis ta’ l-MTT 
(15)] ’l isfel minn livell ta’ limitu definiti matul perjodi spe ċifikati 
ta’ espożizzjoni. Il-prin ċipju tal-figura tal-mudell tal- ġilda umana hija 
bbażata fuq il-ba żi ta’ l-ipote żi li l-kimi ċi korrożivi jistgħu 
jippenetraw l-i stratum corneum  bid-diffu żjoni jew l-ero żjoni, u 
huma ċitotossiċi fuq is-saffi ta’ ċelloli ta’ ta ħt. 
Proċedura  
Il-Mudelli tal- ġilda umana  
Il-Mudelli tal- ġilda umana jistg ħu jinbnew jew jinkisbu kummer ċ­
jalment (e ż. il-mudelli EpiDerm  TM u EPISKIN  TM ) (16)(17)(18)(19) 
jew jistg ħu jiġu żviluppati jew mibnija fil-laboratorju tat-test 
(20)(21). Huwa rikonoxxut li l-u żu tal-ġilda umana huwa so ġġett 
għal kunsiderazzjonijiet u kundizzjonijiet eti ċi nazzjonali u inter ­
nazzjonali. Kwalunkwe mudell ġdid għandu jiġi vvalidat (g ħall- 
inqas sal-grad deskritt ta ħt 1.4.1.1.2). Il-Mudelli tal- ġilda umana 
użati għal dan it-test g ħandhom ikunu konformi ma’ dawn li ġejjin:  
1.4.1.1.1 I l - K u n d i z z j o n i j i e t t a l - M u d e l l i Ġ e n e r a l i :  
Għandhom jintu żaw keratinocytes umani biex jinbena l- epithelium . 
Għandhom ikunu pre żenti bosta saffi ta’ ċelloli epiteljali vjabbli ta ħt 
stratum corneum  funzjonali. Il-mudell tal- ġilda jista’ wkoll ikollu 
saff ta’ komponenti stromali. L-i stratum corneum  għandu jkollu 
bosta saffi bil-profil me ħtieġ ta’ lipidi biex jipprodu ċi barrjera funz ­
jonali bir-robustezza biex tirre żisti l-penetrazzjoni rapida tal-li 
jimmarkaw ċitotossiċi. Il-karatteristi ċi tal-konteniment tal-mudell 
għandhom jipprevjenu l-passa ġġ tal-materjal madwar l-i stratum 
corneum  fit-tessut vjabbli. Il-mog ħdija tal-kimi ċi tat-test madwar l- 
istratum corneum  twassal g ħall-immudellar fqir ta’ l-espo żizzjoni 
għall-ġilda. Il-mudell tal- ġilda għandu jkun ħieles mill-kontami ­
nazzjoni bil-batterji (inklu ż mikoplażma) jew fungi.  
1.4.1.1.2 I l - K u n d i z z j o n i j i e t t a l - M u d e l l i F u n z j o n a l i :  
Id-daqs tal-vijabbiltà normalment hija kkwantifikata bl-u żu ta’ MTT 
jew iż-żebgħat vitali o ħrajn ikkonvertiti metabolikament. F’dawn il- 
każijiet id-densità ottika (OD –  optical density ) taż-żebgħa estratta 
(solubilizzata) mit-tessut tal-kontroll negattiv g ħandha tkun g ħall- 
inqas 20 drabi akbar mill-OD tas-solvent ta’ l-estrazzjoni wa ħdu 
[għal perspettiva ġenerali ara (22)]. It-tessut tal-kontroll negattiv 
għandu jkun stabbli fil-kultura (jipprovdi kejl simili ta’ vijabbiltà) 
għal kemm idum il-perjodu ta’ l-espo żizzjoni tat-test. L-i stratum 
corneum  għandu jkun robust bi żżejjed biex jirre żisti l-penetrazzjoni 
mgħaġġla ta’ xi kimi ċi li jimmarkaw ċitotossiċi (eż. 1 % Triton X- 
100). Din il-karatteristika tista’ ti ġi stmata bil- ħin ta’ l-espo żizzjoni 
meħtieġ biex il-viajbbiltà ta ċ-ċelloli tonqos b’50 % (ET  50 ) (eż. għall- 
mudelli EpiDerm  TM u EPISKIN  TM dan huwa > sag ħtejn). It-tessut 
għandu juri r-reproduttività ma ż-żmien u preferibbilment bejn il- 
laboratorji. Barra minn dan g ħandhom ikunu jistg ħu jipprevedu l- 
potenzjal korro żiv tal-kimi ċi ta’ riferenza (ara t-Tabella 1) meta u żati 
fil-protokoll tat-test mag ħżul. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
L-applikazzjoni tat-test u s-sustanzi tal-kontroll  
Żewġ replikati tat-tessut jintu żaw għal kull trattament ( ħin ta’ l- 
espożizzjoni), inklu żi l-kontrolli. G ħall-materjali likwidi, g ħandha 
tkun applikata bi żżejjed sustanza tat-test biex tkopri l-wi ċċ tat-test 
b’mod uniformi: g ħadu jintuża mhux inqas minn 25 μL/cm  2 . Għall- 
materjali solidi, g ħandha tiġi applikata bi żżejjed sustanza tat-test biex 
tkopri l-ġilda b’mod indaqs, u g ħandha tiġi umdata b’ilma deonizzat 
jew distillat biex ji ġi żgurat kuntatt tajjeb mal- ġilda. Fejn xieraq, is- 
solidi għandhom ji ġu mitħuna għal terra qabel l-applikazzjoni. Il- 
metodu ta’ l-applikazzjoni g ħandu jkun xieraq g ħas-sustanza tat- 
test (ara e ż. r-referenza 5). Fl-a ħħar tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, 
il-materjal tat-test g ħandu jiġi maħsul bir-reqqa mill-wi ċċ tal-ġilda 
b’buffer  xieraq, jew 0,9 % NaCl.  
Għandhom jintu żaw kontrolli konkurrenti po żittivi u negattivi g ħal 
kull studju biex ti ġi żgurata l-ħidma xierqa tal-mudell esperimentali. 
Is-sustanzi tal-kontroll ppo żittiv suġġeriti huma l-a ċidu aċetiku 
glaċjali jew 8N KOH. Il-kontrolli negattivi su ġġeriti huma 0,9 % 
NaCl jew ilma.  
Il-kejl tal-vijabbiltà ta ċ-ċelloli  
Jistgħu jintużaw biss mudelli kwantitattivi, validati biex titkejjel il- 
vijabbiltà ta ċ-ċelloli. Barra minn dan, il-mi żura tal-vijabbiltà g ħandha 
tkun kompatibbli ma’ l-u żu f’kostruzzjoni ta’ tessut tri-dimensjonali. 
L-irbit ta ż-żebgħa mhux spe ċifiku m’g ħandux jinterferixxi mal-kejl 
tal-vijabbiltà. I ż-żebgħa ta’ l-irbit tal-proteini u dawk li ma jg ħaddux 
minn konver żjoni metabolika (e ż. l-aħmar newtrali) g ħalhekk 
mhumiex xierqa. Il-figura li tintu ża l-aktar spiss hija t-tnaqqis 
MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 
Thiazolyl blue: EINECS numru 206-069-5, CAS numru 298-93- 1)], li ntwera li jag ħti riżultati pre ċiżi u riprodu ċibbli (5) i żda 
jistgħu jintużaw oħrajn. Il-kampjun tal- ġilda jitqieg ħed f’taħlita ta’ 
MTT ta’ kon ċentrazzjoni (e ż. 0,3-1 mg/mL) f’temperatura ta’ inku ­
bazzjoni xierqa g ħal 3 sigħat. Il-prodott blu pre ċipitat ta’ formazan 
imbagħad huwa estratt bl-u żu ta’ solvent (isopropanol), u l-kon ċen­
trazzjoni tal-formazan hija mkejla b’determinazzjoni ta’ l-OD f’ wave­
length  bejn 540 u 595 nm.  
L-azzjoni kimika bil-materjal tat-test fuq i ż-żebgħa vitali tista’ timita 
dik tal-metaboli żmu ċellolari li jwassal g ħal stima falza tal-vijabbiltà. 
Dan intwera li jsir meta dan il-materjal tat-test mhuwiex imne ħħi 
għal kollox mill- ġilda bit-tla ħliħ (9). Jekk il-materjal tat-test ja ġixxi 
direttament fuq i ż-żebgħa vitali, g ħandhom jintu żaw kontrolli 
addizzjonali biex issir skoperta u korrezzjoni g ħall-interferenza tas- 
sustanzi tat-test mal-kejl tal-vijabbiltà (9)(23).  
2. DATA  
Għal kull tessut, il-valuri OD u d-data dwar il-per ċentwali kkalkolati 
tal-vjabbiltà ta ċ-ċelloli għall-materjal tat-test, il-kontrolli po żittivi u 
dawk negattivi g ħandhom ikunu rrapportati f’tabella, inklu ża d-data 
minn esperimenti ripetuti tar-repli ċi kif xieraq, valuri medji u indi ­
vidwali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIZULTATI  
Il-valuri ta’ l-OD miksuba g ħal kull kampjun tat-test jistg ħu jintużaw 
biex jiġi kkalkolat il-per ċentwal tal-vijabbiltà relattiva g ħall-kontroll 
negattiv, li hija stabbilita arbitrarjament b ħala 100 %. Il-limitu tal- 
perċentwal tal-vjabbiltà ta ċ-ċelloli li jiddistingwi l-materjali tat-test 
korrożivi u dawk mhux korro żivi (jew li jiddiskriminaw bejn il-klas ­
sijiet differenti, korro żivi), jew il-pro ċedura/i statistikali g ħall-eval­
wazzjoni tar-ri żultati u l-identifikazzjoni tal-materjali korro żivi, 
għandhom ji ġu definiti b’mod ċar u ddokumentati, u g ħandhom 
jintwerew li huma xierqa. B’mod ġenerali dawn il-valuri limiti 
huma stabbiliti waqt l-ottimizzazzjoni tat-test, ittestjati waqt fa żi ta’ 
validazzjoni qabel, u kkonfermati fi studju ta’ validazzjoni. B ħala 
eżempju, it-tbassir tal-Korro żività asso ċjata mal-mudell EpiDerm  TM 
huwa (9):  
Is-sustanza tat-test titqies li hija korro żiva għall-ġilda: 
(i) jekk il-vijabbiltà wara espo żizzjoni ta’ 3 minuti hija inqas minn 
50 %, jew  
(ii) jekk il-vijabbiltà wara espo żizzjoni ta’ 3 minuti hija akbar minn 
jew daqs 50 % u l-vjabbiltà wara espo żizzjoni ta’ sieg ħa hija 
inqas minn 15 %.  
Is-sustanza tat-test titqies li hija mhux korro żiva għall-ġilda: 
(i) jekk il-vijabbiltà wara espo żizzjoni ta’ 3 minuti hija akbar minn 
jew daqs 50 % u l-vjabbiltà wara espo żizzjoni ta’ sieg ħa hija 
akbar minn jew daqs 15 %.  
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORTA ĠĠ TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi din l-informazzjoni li ġejja: 
Is-Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll:  
— l-isem/ismijiet tal-Kimika b ħall-isem IUPAC jew l-isem CAS u l- 
CAS numru, jekk mag ħruf; 
— is-safa u l-kompo żizzjoni tas-sustanza jew preparazzjoni (f’per ­ 
ċentwali skond il-pi ż); 
— il-karatteristi ċi fiżiko-kimiċi bħall-istat fi żiku, pH, stabilità, 
solubbiltà fl-ilma, relevanti g ħat-twettiq ta’ l-istudju;  
— it-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk 
jgħodd (eż. tisħin, tħin); 
— l-istabilità, jekk mag ħrufa;  
Il-ġustifikazzjoni tal-mudell tal- ġilda u l-protokoll u żati. 
Il-kundizzjonijiet tat-test:  
— is-sistema ta ċ-ċelloli użata; 
— l-informazzjoni tal-kalibrazzjoni g ħall-apparat tal-kejl u żat biex 
titkejjel il-vjabbiltà ta ċ-ċelloli (eż. Spettrofotometru);  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— informazzjoni s ħiħa ta’ appo ġġ għall-mudell spe ċifiku tal-ġilda 
użata inkluż il-validità tagh ħa; 
— id-dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata; 
— id-dożi tat-test u żati; 
— deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-pro ċeduri tat-test;  
— referenza g ħad-data storika tal-mudell;  
— deskrizzjoni tal-kriterji ta’ l-evalwazzjoni u żati. 
Riżultati:  
— tabulazzjoni tad-data mill-kampjuni individwali tat-test;  
— deskrizzjoni ta’ kwalunkwe effett osservat.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjoni. 
4. REFERENZI  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assess ­
ment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. 
olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 
2. Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219-255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic.  In vitro  12, 471- 
482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  In vitro  12, 483-524.
 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
 
10. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
11. ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
of EpiDerm  TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In vitro  test 
methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxico ­
logical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
13. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba mis- 
Segretarjat  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709-720.
 
15. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytot ­
oxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.  
16. Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and 
Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic.  In vitro  8, 889-891.
 
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural character ­
ization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225.
 
18. Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, 
Pouradier DX (1994). The Episkin model: Successful recon ­
struction of human epidermis  in vitro . In In vitro  Skin Toxi ­
cology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 
133-140  
19. Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991).  In vitro  and post –transplantation differ ­
entiation of human keratinocytes grown on the human type 
IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: 310-319  
20. Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin 
keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. 
Cytotechnology 9, 163-171.  
21. Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.  
23. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study 
on in vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation 
by the Management Team. Toxic. InVItro 15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IT-TEST TAL-FOTOTOSSI ĊITÀ IN VITRO  3T3 NRU  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalenti g ħall-OECD TG 432 (2004).  
1.1. DA ĦLA 
Il-fototossi ċità hija definita b ħala reazzjoni tossika minn sustanza 
applikata fuq il- ġisem li hija mi ġbuda jew mi żjuda (apparenti 
f’livelli ta’ do żi aktar baxxi) wara l-espo żizzjoni sussegwenti g ħad- 
dawl, jew li hija indotta mill-irradjazzjoni tal- ġilda wara amminis ­
trazzjoni sistemika ta’ sustanza.  
It-test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU jintu ża biex jiġi identifikat 
il-potenzjal fototossiku ta’ sustanza tat-test indotta mill-kimika 
eċċitata wara l-espo żizzjoni għad-dawl. It-test jevalwa l-foto- ċitotos­
siċità bit-tnaqqis relattiv fil-vijabbiltà ta ċ-ċelloli esposti g ħall-kimika 
fil-preżenza kontra n-nuqqas tad-dawl. Is-sustanzi identifikati minn 
dan it-test x’aktarx ikunu fototossi ċi in vivo  wara applikazzjoni 
sistemika u tixrid mal- ġilda, jew wara applikazzjoni topikali.  
Bosta tipi ta’ kimi ċi ġew irrapportati li jindu ċu l-effetti fototossi ċi 
(1)(2)(3)(4). Il-karatteristika komuni tag ħhom hija l-abilità tag ħhom 
li jassorbu l-ener ġija tad-dawl fil-firxa tad-dawl tax-xemx. Skond l- 
ewwel li ġi tal-fotokimika (il-Li ġi ta’ Grotthaus-Draper), il-foto ­
reazzjoni te ħtieġ assorbiment suffi ċjenti ta’ ammonti ta’ dawl. 
Għalhekk qabel ma jitqies l-ittestjar biolo ġiku, spettru ta’ l-assor ­
biment UV/vis tal-kimika tat-test g ħandu jiġi ddeterminat skond il- 
Linja Gwida tat-Test 101 ta’ l-OECD. Ġie ssuġġerit li jekk il-koef ­
fiċjent ta’ l-estinzjoni/assorbiment molari huwa inqas minn 10 litru x 
mol-1 x cm-1 x’aktarx li l-kimika mhijiex fotoreattiva. Din il-kimika 
tista’ ma te ħtieġx li tiġi ttestjata fit-test  in vitro  3T3 NRU tal-foto ­
tossiċità jew kwalunkwe test ie ħor bioloġiku għall-effetti avversi 
fotokimiċi (1)(5). Ara wkoll l-Anness 1.  
L-affidabbiltà u r-rilevanza tat-test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU 
ġew evalwati dan la ħħar (6)(7)(8) (9). It-test tal-fototossi ċità in vitro  
3T3 NRU intwera li jbassar l-effetti ta’ fototossi ċità akuta fl-annimali 
u fl-umani  in vivo . It-test mhuwiex di żinjat li jbassar effetti avversi 
oħrajn li jistg ħu jirriżultaw minn azzjoni kkombinata ta’ kimika u d- 
dawl, eż. ma jindirizzax il-foto ġenotossiċtà, il-fotoaller ġija, jew il- 
fotokarċinoġeniċità, u lanqas ma jippermetti stima tas-sa ħħa tal-foto­
tossiċità. Barra minn dan, it-test ma ġiex diżinjat li jindirizza l- 
mekkaniżmi indiretti tal-fototossi ċità, l-effetti tal-metaboliti tas- 
sustanza tat-test, jew l-effetti tat-ta ħlitiet.  
Billi l-użu tas-sistemi metabolizzanti huwa rekwi żit ġenerali għat- 
testijiet kollha  in vitro  għall-basra ta’ potenzjal ġenotossiku jew 
karċinoġeniku, s’issa, fil-ka ż tal-fototossikolo ġija, hemm biss 
eżempji rari fejn it-trasformazzjoni metabolika hija me ħtieġa biex 
il-kimika ta ġixxi bħala fototissinu  in vivo  jew  in vitro . Għalhekk, 
la jitqies me ħtieġ u lanqas xjentifikament ġustifikat li dan it-test isir 
b’sistema ta’ attivazzjoni metabolika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Irradjanza:  fl-intensità ta’ in ċident tad-dawl ultravjola (UV) jew ta’ 
dawl viżibbli fuq wi ċċ, imkejjel f’W/m  2 or mW/cm  2 . 
Doża ta’ dawl:  il-kwantità (= intensità × ħin) ta’ radjazzjoni 
ultravjola (UV) jew vi żibbli fuq wi ċċ, espresso f’Joules (= W × s) 
għal kull arja tal-wi ċċ, eż. J/m  2 jew J/cm  2 . 
Wavebands tad-Dawl UV:  l-indikazzjonijiet rakkomandati mis-CIE 
(Commission Internationale de L’Eclairage) huma: UVA (315- 
400 nm), UVB (280-315 nm) u UVC (100-280 nm). Indikazzjonijiet oħrajn jintużaw ukoll; id-divi żjoni bejn UVB u UVA spiss titqieg ħed 
bħala 320 nm, u l-UVA tista’ tinqasam f’UV-A1 u UV-A2 u jsir 
qsim f’madwar 340 nm.
 
Il-vijabilità ta ċ-ċelloli:  parametru li jkejjel l-attività totali ta’ popo ­
lazzjoni ta’ ċelloli (eż. l-użu taż-żebħa vitali A ħmar Newtrali fil- 
liżożomi ċellulari), li, skond il-punt tat-tmiem imkejjel u d-di żinn 
tat-test u żat, tikkorrelata ma’ l-g ħadd totali u/jew il-vitalità ta ċ- 
ċelloli.  
Il-vijabilità ta ċ-ċelloli relattiva:  il-vijabilità ta ċ-ċelloli espressa b’re ­
lazzjoni mal-kontrolli solventi (negattivi) li ntu żaw fil-pro ċedura 
sħiħa tat-test (jew +Irr jew -Irr) i żda mhux ittrattati bil-kimika tat- 
test. 
PIF ( Photo-Irritation-Factor  – Fattur tal-Foto-Irritazzjoni):  fattur 
iġġenerat bit-tqabbil ta’ żewġ konċentrazzjonijiet effettivi ndaqs 
(IC 50 ) tal-kimika tat-test miksuba fin-nuqqas (-Irr) u fil-pre żenza 
(+Irr) ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika b’dawl UVA/vis.  
IC 50 : il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test li biha l-vijabilità ta ċ- 
ċelloli titnaqqas b’50 %.  
MPE ( Mean-Photo-Effect  – Foto-Effett-Medju):  kejl derivat mill- 
analiżi matematika tal-kurvi tar-reazzjoni tal-kon ċentrazzjoni 
miksuba fin-nuqqas (-Irr) u fil-pre żenza (+Irr) ta’ irradjazzjoni 
mhux ċitotossika bid-dawk UVA/vis.  
Fototossi ċità: reazzjoni tossika akuta li hija eli ċitata wara l-ewwel 
espożizzjoni tal- ġilda ma’ xi kimika u l-espo żizzjoni sussegwenti 
għad-dawl, jew li hija indotta b’mod simili mill-irradjazzjoni tal- 
ġilda wara l-amministrazzjoni sistemika ta’ kimika.  
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
It-test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU huwa bba żat fuq paragun 
taċ-ċitotossiċità ta’ kimika meta ti ġi ttestjata fil-pre żenza u fin- 
nuqqas ta’ espo żizzjoni għal doża mhux ċitotossika ta’ dawl tax- 
xemx simulata. I ċ-ċitotossiċità f’dan it-test hija espressa b ħal 
tnaqqis dipendenti fuq il-kon ċentrazzjoni ta’ l-u żu taż-żebgħa vitali 
Aħmar Newtrali meta mkejjel 24 sieg ħa wara t-trattament bil-kimika 
tat-test u l-irradjazzjoni (10). L-A ħmar Newtrali huwa żebgħa 
katjonika dg ħajfa li tippenetra t-tessut ta ċ-ċelloli malajr bin-nuqqas 
ta’ diffiżjoni, u takkumula b’mod inter ċellolari fil-li żożomi. L-alter ­
azzjonijiet tal-wi ċċ tat-tessut sensittiv li żożomali jwasslu g ħall- 
fraġilità liżożomali u tibdil ie ħor li gradwalment isiru irriversibbli. 
Dan it-tibdil ikka ġunat mill-azzjoni tax-xenobjoti ċi jirriżulta f’użu u 
rbit mnaqqsa ta’ l-A ħmar Newtrali. G ħalhekk huwa possibbli li ssir 
distinzjoni bejn i ċ-ċelloli vijabbli, dawk danne ġġjati u dawk mejtin, 
li huwa l-ba żi ta’ dan it-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Iċ-ċelloli Balb/c 3T3 jin żammu f’kultura g ħal 24 sieg ħa għall-form­
azzjoni ta’ monosaffi. Imbag ħad żewġ plattini 96-well g ħal kull 
kimika tat-test ji ġi pre-inkubati bi tmien kon ċentrazzjonijiet differenti 
tas-sustanza tat-test g ħal siegħa. Wara dan, wa ħda miż-żewġ plattini 
hija esposta g ħall-ogħla doża ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika 
filwaqt li l-plattina l-o ħra tinżamm fid-dlam. Fi ż-żewġ plattini il- 
mezz tat-trattament huwa sostitwit mill-mezz tal-kultura u wara 24 siegħa oħra ta’ inkubazzjoni, il-vijabilità ta ċ-ċelloli hija ddeterminata 
bl-użu ta’ l-A ħmar Newtrali. Il-vijabilità ta ċ-ċelloli hija espressa 
bħala persenta ġġ tal-kontrolli tas-solvent mhux ittrattati u hija kkal ­
kolata għal kull kon ċentrazzjoni tat-test. Biex jitbassar il-potenzjal 
fototossiku, ir-reazzjonijiet tal-kon ċentrazzjoni miksuba fil-pre żenza 
u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni huma mqabbla, normalment fil-livell 
ta’ l-IC
 50 , jiġifieri l-kon ċentrazzjoni li tnaqqas il-vijabilità ta ċ-ċelloli 
għal 50 % meta mqabbel mal-kontrolli mhux ittrattati.  
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1  Il-preparazzjonijiet  
1.4.1.1.  Iċ-ċelloli  
Linja permanenti tal-fibroblast ta ċ-ċelloli tal- ġrieden, Balb/c 3T3, 
klonu 31, jew mill-American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, Stati Uniti, jew mill-European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Renju Unit, intu żat fl- 
istudju tal-validazzjoni, u g ħalhekk huwa rakkomandat il-ksib minn 
depożitarju taċ-ċelloli kkwalifikat sew. Ċelloli jew linji ta ċ-ċelloli 
oħrajn jistg ħu jintużaw bl-istess pro ċedura tat-test jekk il- 
kundizzjonijiet tal-kultura huma adattati g ħall-bżonnijiet spe ċifiċi 
taċ-ċelloli, iżda l-ekwivalenza g ħandha tintwera.
 
Iċ-ċelloli għandhom ji ġu ċċekkjati b’mod regolari g ħan-nuqqas tal- 
kontaminazzjoni tal-mikopla żma u jintu żaw biss jekk ma tinstabx 
kontaminazzjoni (11).  
Huwa importanti li s-sensittività g ħall-UV ta ċ-ċelloli hija vverifikata 
b’mod regolari skond il-pro ċedura tal-kontroll tal-kwalità deskritta 
f’dan il-metodu. Min ħabba li s-sensittività ta ċ-ċelloli għall-UVA 
tista’ tiżdied bin-numru ta’ passa ġġi, għandhom jintu żaw ċelloli 
Balb/c 3T3 tan-numru l-aktar baxx ta’ passa ġġi possibbli li jista’ 
jinkiseb, preferibbilment inqas minn 100 (ara t-taqsima 1.4.2.2.2 u 
l-Anness 2).  
1.4.1.2.  Il-kundizzjonijiet tal-mezzi u tal-kultura  
Għandhom jintu żaw mezzi tal-kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inku ­
bazzjoni xierqa g ħall-passaġġ rutin taċ-ċelloli u matul il-pro ċedura 
tat-test, eż. għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 dawn huma DMEM (Dulbecco’s 
Modified Eagle’s Medium) supplimentati b’10 % seru ta’ l-g ħoġol 
għadu jitwieled, 4 mM glutamina, peni ċillina (100 IU), u  strep­
tomycin  (100 μg/mL), u inkubazzjoni umidifikata f’temperatura ta’ 
37 o C, 5-7,5 % CO  2 skond il- buffer  (ara t-taqsima 1.4.1.4, tieni 
paragrafu.). Huwa ta’ importanza partikolari li l-kundizzjonijiet tal- 
kultura ta ċ-ċelloli jiżguraw ħin taċ-ċiklu taċ-ċelloli fil-firxa normali 
storika ta ċ-ċelloli jew tal-linja ta ċ-ċelloli użati. 
1.4.1.3.  Il-preparazzjoni tal-kulturi  
Iċ-ċelloli minn kulturi ta’ ħażniet iffriżati huma mi żrugħa f’mezz tal- 
kultura ta’ densità approssimata u subkulturati g ħall-inqas darba 
qabel ma jintu żaw fit-test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Iċ-ċelloli użati għat-test tal-fototossi ċità jinżergħu fid-densità ż xierqa 
sabiex il-kulturi ma jil ħqux konfluwenza sa l-a ħħar tat-test, ji ġifieri 
meta l-vijabilità hija ddeterminata 48 sieg ħa wara ż-żriegħ taċ-ċelloli. 
Għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 imkabbra fi plattini 96-well, id-densità rrak ­
komandata ta ż-żriegħ taċ-ċelloli hija ta’ 1 x 10  4 ċelloli għal kull 
well.  
Għal kull test i ċ-ċelloli kimi ċi jiġu miżrugħa b’mod identiku f’ żewġ 
plattini separati 96-well, li mbag ħad jitgħaddew b’mod konkorrenti 
mill-proċedura sħiħa tat-test ta ħt kundizzjonijiet ta’ kultura identit ċi 
ħlief għat-terminu s ħiħ meta wa ħda mill-plattini ti ġi irradjata (+Irr) u 
l-oħra tinżamm fid-dlam (-Irr).  
1.4.1.4.  Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test  
Is-sustanzi tat-test g ħandhom ji ġu ppreparati friski, immedjatament 
qabel l-użu kemm-il darba d-data ma turix l-istabilità tag ħhom meta 
huma ma ħżuna. Huwa rrakkomandat li l-immani ġġjar kimiku kollu u 
t-trattament inizzjali ta ċ-ċelloli jsiru ta ħt kundizzjonijiet tad-dawl li 
jevitaw il-fotoattivazzjoni jew id-degradazzjoni tas-sustanza tat-test qabel l-irradjazzjoni.
 
Il-kimiċi tat-test g ħandhom jin ħallu f’taħlitiet ta’ mlu ħ buffered , eż. 
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS), jew ta ħlitiet buffer  oħrajn 
fiżjoloġikament ibbilan ċjati, li g ħandhom ikunu ħelsin minn 
komponenti ta’ proteini, komponenti li jassorbu d-dawl (e ż. kuluri 
li jindikaw il-pH u vitamini) sabiex ti ġi evitata l-interferenza matul l- 
irradjazzjoni. Ladarba matul l-irradjazzjoni ċ-ċelloli jinżammu għal 
madwar 50 minuta barra mill-inkubatur ta’ CO  2 , għandu jkun hemm 
attenzjoni li ti ġi evitata l-alkalizzazzjoni. Jekk jintu żaw buffers  
dgħajfin bħall-EBSS dan jista’ jinkiseb billi ċ- ċelloli jiġu inkubati 
f’7,5 % CO  2 . Jekk iċ-ċelloli jiġu inkubati f’5 % CO  2 biss, għandu 
jingħażel buffer  aktar qawwi.  
Il-kimiċi tat-test ta’ solubbiltà limitata fl-ilma g ħandhom jin ħallu 
f’solvent xieraq. Jekk jintu ża solvent, dan g ħandu jkun pre żenti 
f’volum kostanti fil-kulturi kollha, ji ġifieri fil-kontrolli negattivi (sol ­
venti) kif ukoll fil-kon ċentrazzjonijiet tal-kimika tat-test, u g ħandhom 
ikunu mhux ċitotossiċi f’dik il-kon ċentrazzjoni. Il-kon ċentrazzjonijiet 
tal-kimika tat-test g ħandhom jing ħażlu sabiex ji ġu evitati ta ħlitiet 
preċipitati jew imsa ħħbin. 
Dimethylsulphoxide (DMSO) u l-etanol (ETOH) huma s-solventi 
rrakkomandati. Jistg ħu jkunu xierqa solventi o ħrajn ta’ ċitotossiċità 
baxxa. Qabel ma jintu żaw, is-solventi kollha g ħandhom ji ġu stmati 
għal karatteristi ċi xierqa, e ż. reazzjoni mal-kimika tat-test, tnaqqis ta’ 
l-effett fototossiku, proprjetajiet  scavenging  radikali u/jew stabilità 
kimika fis-solvent.  
It-taħlit fil-vorti ċi u/jew is-sonikazzjoni u/jew it-tis ħin sa temperatura 
xierqa jistg ħu jintużaw biex ti ġu mgħejuna s-solubilazzjoni kemm-il 
darba dan ma jaffettwax l-istabilità tal-kimika tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Il-Kundizzjonijiet ta’ l-Irradjazzjoni  
1.4.1.5.1. L - g ħ a j n t a d - d a w l  
L-għażla ta’ għajn xieraq u ta’ filtri tad-dawl huwa fattur kru ċjali fl- 
ittestjar tal-fototossi ċità. Id-dawl ta’ l-UVA u tar-re ġjuni viżibbli 
normalment huwa normalment asso ċjat mar-reazzjonijiet fototossi ċi 
in vivo  (3)(12), filwaqt li ġeneralment il-UVB huwa inqas rilevanti 
iżda huwa ċitotossiku ħafna; iċ-ċitotossiċità tiżdied 1 000-darba 
għaliex il- wavelength  jinbidel minn 313 g ħal 280 nm (13). Il- 
kriterji għall-għażla ta’ l-g ħajn tad-dawl xieraq g ħandhom jinklu żu 
r-rekwiżit li l-għajd tad-dawl jag ħti wavelengths  assorbiti mill-kimika 
tat-test (spettru ta’ l-assorbiment) u li d-do ża tad-dawl (li tista’ 
tinkiseb f’ ħin ta’ espo żizzjoni ra ġonevoli) g ħandha tkun suffi ċjenti 
biex jinżammu l-kimi ċi magħrufin li huma foto ċitotossiċi. Barra 
minn dan, il- wavelengths  u d-dożi m’għandhomx ikunu ta’ ħsara 
żejda għas-sistema tat-test, e ż. l-emissjoni tas-s ħana (ir-re ġjun ta’ l- 
infra-aħmar).  
Is-simulazzjoni tad-dawl tax-xemx bis-simulaturi tax-xemx titqies li 
hija l-għajn ta’ dawl artifi ċjali ottimali. Id-distribuzzjoni ta’ l-ener ġija 
ta’ l-irradjazzjoni tas-simulatur tax-xemx iffiltrat g ħandha tkun qrib 
dik tad-dawl tal- ġurnata barra mog ħtija f’(14). Kemm l-arki ta’ 
Xenon u arki ta’ alid ta’ merkurju-metall  (doped)  jintużaw bħala 
simulaturi tax-xemx (15). Ta’ l-a ħħar għandu l-vanta ġġ li jagħti 
inqas sħana u huwa ir ħas, iżda kemm jaqbel mad-dawl tax-xemx 
huwa inqas perfett meta mqabbel ma’ dak ta’ l-arki tax-xenon. 
Minħabba li s-simulaturi kollha tax-xemx jag ħtu kwantitajiet ta’ 
UVB sinjifikanti g ħandhom ikunu ffiltrati biex inaqqasu l-  wave­
lengths  ta l-UVB li huma ċitotossiċi ħafna. Min ħabba li l-materjali 
tal-plastik tal-kultura ta ċ-ċelloli fihom stabbilizzanti tal-UV l-ispettru 
għandu jiġi mkejjel bl-istess tip ta’ g ħatu tal-plattina ta’ 96-well li se 
jintuża fl-anali żi. Irrispettivament mill-mi żuri meħuda biex partijiet 
mill-ispettru ji ġu mnaqqsa bl-iffiltrar jew b’effetti inevitabbli ta’ 
filtru tat-tag ħmir, l-ispettru rrekordjat ’l isfel minn dawn il-filtri 
m’għandhomx jiddevjaw mid-dawl tal- ġurnata barra standardizzat 
(14). Eżempju tad-distribuzzjoni ta’ l-irradjanza spettrali tas- 
simulatur tax-xemx iffiltrat u żat fl-istudju tal-validazzjoni tat-test 
tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU jing ħata f’(8)(16). Ara wkoll l- 
Anness 2 Figura 1.  
1.4.1.5.2 I d - D o ż i m e t r i j a  
L-intensità tad-dawl (irradjanza) g ħandha tiġi ċċekkjata b’mod 
regolari qabel kull test tal-fototossi ċità bl-użu ta’ miter ta’ l-UV 
xieraq tal-broadband. L-intensità g ħandha titkejjel bl-istess tip ta’ 
għatu tal-plattina ta’ 96-well li se jintu ża fl-anali żi. Il-miter ta’ l- 
UV għandu jkun ġie kkalibrat g ħall-għajn. Il-ħidma tal-miter ta’ l- 
UV għandha tiġi ċċekkjata, u g ħal dan l-g ħan l-użu ta’ miter ta’ l- 
UV ieħor, ta’ riferenza, ta’ l-istess tip u ta’ kalibrazzjoni identika 
huwa rrakkomandat. Idealment, f’intervalli akbar, g ħandu jintu ża 
spettroradjometru biex titkejjel l-irradjanza spettrali ta’ l-g ħajn tad- 
dawl iffiltrat u biex ti ġi ċċekkjata l-kalibrazzjoni tal-miter ta’ l-UV 
tal-broadband.  
Doża ta’ 5 J/cm  2 (kif imkejjel fil-firxa ta’ l-UVA) ġiet determinata li 
mhijiex ċitotossika g ħaċ-ċelloli Balb/c 3T3 u li hija qawwija bi żżejjet 
biex teċċita lill-kimi ċi biex jeli ċitaw reazzjonijiet fototossi ċi, (6) (17) 
eż. biex jinkiseb 5 J/cm  2 f’perjodu ta’ żmien ta’ 50 min, l-irradjanza 
ġiet aġġustata għal 1,7 mW/cm  2 . Ara l-Anness 2 Figura 2. Jekk 
tintuża linja oħra ta’ ċelloli jew g ħajn ta’ dawl differenti, id-do ża 
ta’ l-irradjazzjoni tista’ tkun trid ti ġi kkalibrata sabiex jista’ jing ħażel 
reġimen tad-do ża li ma jag ħmilx ħsara liċ-ċelloli iżda li hija bi żżejjed 
biex teċċita fototossini standard. Il- ħin ta’ l-espo żizzjoni għad-dawk 
huwa kkalkolat b’dan il-mod:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ Doża ta irradjazzjoni ðJ= cm  2 Þ Ü 1000 
irradjanza ðmW = cm  2 Þ Ü 60 (1J = 1 Wsec)  
1.4.2  Il-kundizzjonijiet tat-test  
1.4.2.1  Il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test  
Il-firxiet tal-kon ċentrazzjonijiet ta’ kimika ttestjata fil-pre żenza (+Irr) 
u fin-nuqqas (-Irr) tad-dawl g ħandhom ji ġu ddeterminati b’mod 
xieraq f’anali żijiet tas-sejba tal-firxa tad-do żi. Jista’ jkun utli li s- 
solubbiltà ti ġi smtata fil-bidu u fis-60 min (jew kwalunkwe ħin ta’ 
trattament huwa me ħtieġ), għaliex is-solubbiltà tista’ tinbidel ma ż- 
żmien jew matul l-espo żizzjoni. Biex ti ġi evitata t-tossi ċità indotta 
minn kundizzjonijiet ta’ kultura mhux xierqa jew minn kimi ċi ta’ 
aċidità jew alkalinità g ħolja, il-pH tal-kulturi ta ċ-ċelloli biż-żjieda tal- 
kimika tat-test g ħandu jkun fil-firxa 6,5 – 7,8.  
L-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test g ħandha tkun ġewwa l- 
kundizzjonijiet fi żjoloġiċi tat-test, e ż. għandhom ji ġu evitati l-istress 
ożmotiku u dak tal-pH. Skond il-kimika tat-test, jista’ jkun me ħtieġ li 
jitqiesu karatteristi ċi oħrajn fiżiċi-kimiċi bħala fatturi li jillimitaw 
logħla konċentrazzjoni tat-test. G ħal sustanzi relattivament insolubbli 
li mhumiex tossi ċi f’konċentrazzjonijiet sal-punt tas-saturazzjoni, l- 
ogħla konċentrazzjoni li tista’ tinkiseb g ħandha tiġi ttestjata. B’mod 
ġenerali, il-pre ċipitazzjoni tal-kimika tat-test fi kwalunkwe mill-kon ċ­
entrazzjonijiet tat-test g ħandha ti ġi evitata. Il-kon ċentrazzjoni 
massima ta’ sustanza tat-test m’g ħandhiex te ċċedi 1 000 μg/mL; l- 
ożmolarità m’g ħandhiex te ċċedi 10 mmolar. G ħandu jintu ża serje ta’ 
taħlit ġeometriku ta’ 8 kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test 
b’fattur kostanti tat-ta ħlit (ara t-taqsima 2.1, tieni paragrafu).  
Jekk hemm informazzjoni (minn esperiment g ħas-sejba tal-firxiet) li 
l-kimika tat-test mhijiex ċitotossika sal-kon ċentrazzjoni tal-limitu fl- 
esperiment fid-dlam (-Irr), i żda hija ċitotossika ħafna meta ti ġi 
irradjata (+Irr), il-firxiet tal-kon ċentrazzjoni li g ħandhom jing ħażlu 
għall-esperiment jistg ħu jkunu differenti minn dawk mag ħżula 
għall-esperiment (–Irr) biex jintla ħaq ir-rekwi żit tal-kwalità xierqa 
tad-data.  
1.4.2.2  Il-Kontrolli  
1.4.2.2.1 I s - s e n s i t t i v i t à g ħ a r - r a d j a z z j o n i t a ċ - ċ e l l o l i , l - 
i s t a b b i l i m e n t t a d - d a t a s t o r i k a :  
Iċ-ċelloli għandhom ji ġu ċċekkjati regolarment (madwar kull ħames 
passaġġ) għal sensittività g ħall-għajn tad-dawl billi ti ġi stmata l- 
vijabbiltà tag ħhom wara espo żizzjoni g ħal dożi akbar ta’ l-irrad ­
jazzjoni. Bosta do żi ta’ irradjazzjoni, inklu żi livelli sostanzjalment 
ogħla minn dawk u żati għat-test tal-Fototossi ċità 3T3 NRU 
għandhom jintu żaw f’din l-istima. Dawn id-do żi huma kkwantitati 
bil-mod l-aktar fa ċli bil-kejl tal-partijiet UV ta’ l-g ħajn tad-dawl. I ċ- 
ċelloli jiġu miżrugħa bid-densità u żata fit-test tal-fototissi ċità in vitro  
3T3 NRU u irradjati l-g ħada. Il-vijabbiltà ta ċ-ċelloli mbag ħad tiġi 
ddeterminata jum wara permezz ta’ l-u żu ta’ l-A ħmar Newtrali. 
Għandu jintwera li l-og ħla doża riżultanti li mhijiex ċitotossika (e ż. 
fl-istudju tal-validazzjoni: 5 J/cm  2 [UVA]) kienet bi żżejjed biex il- 
materjali ta’ riferenza (Tabella 1) ji ġu kklassifikati tajjeb.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2 I s - s e n s i t t i v i t à g ħ a r - r a d j a z z j o n i , l - i ċ ċ e k k j a r t a t - 
t e s t k u r r e n t i :  
It-test jilħaq il-kriterji ta’ kwalità jekk il-kontrolli irradjati negattivi/ ­
solventi juru vijabbiltà ta’ aktar minn 80 % meta mqabbel ma negattivi/solventi mhux irradjati.
 
1.4.2.2.3 I l - v i j a b b i l t à t a l - k o n t r o l l i s o l v e n t i  
Id-densità ottika assoluta (OD  540 NRU  ) ta’ l-Aħmar Newtrali estratt 
mill-kontrolli tas-solventi jindika jekk il-1 × 10  4 ċelloli miżrugħa 
f’kull well kibrux b’ ħin ta’ l-irduppjar normali matul il-jumejn ta’ 
l-analiżi. Test jil ħaq il-kriterji ta’ l-a ċċettazzjoni jekk l-OD  540 NRU  
medju tal-kontrolli mhux ittrattati huwa ≥ 0,4 (jiġifieri madwar 
għoxrin darba daqs l-assorbenza tas-solvent fl-isfond).  
1.4.2.2.4 I l - k o n t r o l l p o ż i t t i v :  
Kimika fototossika mag ħrufa għandha tiġi ttestjata fl-istess ħin ma’ 
kull test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU. Huwa rakkomandat il- 
chlorpromazine (CPZ). G ħal CPZ ittestjat bil-protokoll standard fit- 
test tal-fototossi ċità in vitro  3T3 NRU, ġew definiti dawn il-kriterji li 
ġejjin ta’ l-a ċċettazzjoni tat-test: CPZ irradjat (+Irr): IC  50 = 0,1 sa 2,0 
μg/ml, CPZ mhux irradjat (-Irr): IC  50 = 7,0 sa 90,0 μg/mL. l-Fattur 
tal-Foto Irritazzjoni (PIF), g ħandu jkun > 6. Il- ħidma storika tal- 
kontroll po żittiv għandha tiġi mmonitorjata.  
Kimiċi oħrajn fototossi ċi, xierqa g ħall-klassi tal-kimika jew il- 
karatteristi ċi tas-solubbiltà tal-kimika li qed ti ġi evalwata, jistg ħu 
jintużaw bħala l-kontrolli po żittivi konkurrenti minflok chlorpro ­
mazine.  
1.4.3  Il-pro ċedura tat-test (6)(7)(8)(16)(17):  
1.4.3.1  L-1 jum:  
Ferra’ 100 μL materjal tal-kultura fil-kontenituri periferali fi plattina 
tal-mikrotitru tal-kultura tat-tessut b’96-well (= vojta). F’dawj li jifdal, ferra’ 100 μL sospensjoni ta’ ċelloli ta’ 1 × 10
 5 ċelloli/mL 
fil-mezz tal-kultura (= 1 × 10  4 ċelloli/well). G ħandhom ji ġu ppre­
parati żewġ plattini g ħal kull serje ta’ kon ċentrazzjonijiet individwali 
tas-sustanza tat-test, u g ħall-kontrolli tas-solventi u dawk po żittivi.  
Inkuba ċ-ċelloli għal 24 sieg ħa (ara t-taqsima 1.4.1.2) sakemm 
jiffurmaw nofs monosaff konfluwenti. Dan il-perjodu ta’ inku ­
bazzjoni jippermetti l-irkupru ta ċ-ċelloli, l-aderenza u t-tkabbir espo ­
nenzjali.  
1.4.3.2  It-2 jum:  
Wara l-inkubazzjoni, ferra’ l-mezz tal-kultura mi ċ-ċelloli u a ħsel bl- 
attenzjoni b’150 μL tat-taħlita buffered  użata għall-inkubazzjoni. Żid 
100 μL tal- buffer  li jkun fih il-kon ċentrazzjoni xierqa tal-kimika jew 
tas-solvent tat-test (kontroll tas-solvent). Applika 8 kon ċen­
trazzjonijiet differenti tal-kimika tat-test. Inkuba ċ-ċelloli bis- 
sustanza tat-test fid-dlam g ħal 60 minuta (ara t-taqsima 1.4.1.2 u 
1.4.1.4 tieni paragrafu).  
Miż-żewġ plattini ppreparati g ħal kull serje ta’ kon ċentrazzjonijiet 
tas-sustanza tat-test u l-kontrolli, ting ħażel waħda, ġeneralment bl- 
addoċċ, għad-determinazzjoni ta ċ-ċitotossiċità (-Irr) (ji ġifieri l- 
plattina tal-kontroll), u wa ħda (il-plattina tat-trattament) g ħad-deter­
minazzjoni tal-fototossi ċità (+Irr).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Biex issir l-espo żizzjoni +Irr, irradja ċ-ċelloli f’temperatura 
ambjentali g ħal 50 minuta mill-g ħatu tal-plattina 96-well bl-og ħla 
doża ta’ radjazzjoni li mhijiex ċitotossika (ara wkoll l-Anness 2). 
Żomm il-plattini mhux irradjati (-Irr) f’temperatura tal-kamra 
f’kaxxa mudlama 50 min (= ħin ta’ l-espo żizzjoni għad-dawl).  
Ferra’ t-ta ħlita tat-test u a ħsel bir-reqqa bl-attenzjoni b’150 μL tat- 
taħlita buffered  użata għall-inkubazzjoni, i żda li ma fihiex il-materjal 
tat-test. Issostitwixxi l- buffer  bil-mezz tal-kultura u inkuba (ara t- 
taqsima 1.4.1.2.) g ħal lejl sħiħ (18-22 h).  
1.4.3.3  It-3 jum:  
1.4.3.3.1 L - e v a l w a z z j o n i m i k r o s k o p i k a  
Iċ-ċelloli għandhom ji ġu eżaminati g ħat-tkabbir, g ħall-morfolo ġija, u 
għall-integrità tal-monosaff bl-u żu ta’ mikroskopu b’fa żi tal-kuntrast. 
It-tibdil fil-morfolo ġija taċ-ċelloli u l-effetti fuq it-tkabbir ta ċ-ċelloli 
għandu jiġi rrekordjat.  
1.4.3.3.2 I t - t e s t t a ’ l - u ż u t a ’ l - A ħ m a r N e w t r a l i  
Aħsel iċ-ċelloli b’150 μL buffer  imsaħħan minn qabel. Ne ħħi t- 
taħlita tal-ħasil billi ttektek bil-mod. Żid 100 μL ta’ 50 μg/mL 
Aħmar Newtrali (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine 
hydrochloride, numru EINECS 209-035-8; numru CAS 553-24-2; C.I. 50040) f’mezz ming ħajr serum (16) u inkuba kif deskritt fil- 
paragrafu 1.4.1.2., g ħal 3 h.
 
Wara l-inkubazzjoni ne ħħi l-mezz ta’ NR, u a ħsel iċ-ċelloli b’150 μL 
mill- buffer . Ferra’ u ne ħħi l-żejjed bl-ixxugar jew bi ċ-ċentrifu­
gazzjoni.  
Żid preċiżament 150 μL taħlita NR desorb (ippreparata friska 49 
partijiet ilma + 50 partijiet etanol + 1 parti a ċidu aċetiku).  
Ħawwad il-plattina tal-mikrotitru bil-mnod fuq o ġġett li jħawwad il- 
plattina tal-mikrotitru g ħal 10 minuti sakemm l-NR ikun ġie estratt 
miċ-ċelloli u jkun iffurma ta ħlita omoġena. Kejjel id-densità ottika 
ta’ l-estratt ta’ l-NR f’540 nm fi spettrofotometru, bl-u żu tal-vojt 
bħala referenza. Issejvja d-data f’format xieraq ta’ fajl elettroniku 
għall-analiżi wara.  
2. ID-DATA  
IL-KWALITÀ U L-KWANTITÀ TAD-DATA  
Id-data tat-test tippermetti anali żi sinjifikanti tar-reazzjoni tal-kon ċen­
trazzjoni miksuba fil-pre żenza fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni, u jekk 
possibbli l-kon ċentrazzjoni tal-kimika tat-test li biha l-vijabilità hija 
mnaqqsa g ħal 50 % (IC  50 ). Jekk tinsab i ċ-ċitotossiċità, kemm il-firxa 
tal-konċentrazzjoni kif ukoll l-inter ċett tal-kon ċentrazzjonijiet indi ­
vidwali g ħandhom ji ġu stabbiliti b’tali mod li tkun possibbli li 
toqgħod kurva g ħad-data esperimentali.  
Għar-riżultati kemm ċarament po żittivi kif ukoll dawk ċarament 
negattivi (ara t-taqsima 2.3, l-ewwel paragrafu), l-esperiment 
primarju, sostnut minn esperiment(i) wie ħed jew aktar preliminary 
tas-sejba tad-do żi, jista’ jkun bi żżejjed.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Ir-riżultati ekwivo ċi, li huma fil-limitu, jew mhux ċari għandhom 
jiġu ċċarati bl-u żu ta’ aktar ittestjar (ara wkoll it-taqsima 2.4, tieni 
paragrafu). F’dawn il-ka żijiet, il-modifika tal-kundizzjonijiet esperi ­
mentali g ħandha tiġi kkunsidrata. Il-kundizzjonijiet esperimentali li 
jistgħu jiġu mmodifikati jinkludu l-firxa jew l-ispazjar tal-kon ċen­
trazzjoni, il- ħin ta’ qabel l-inkubazzjoni, u l- ħin ta’ l-espo żizzjoni 
għall-irradjazzjoni. Ħin iqsar ta’ espo żizzjoni jista’ jkun xieraq 
għall-kimiċi li mhumiex stabbli fl-ilma.  
L-EVALWAZZJONI TAR-RIZULTATI  
Biex tkun possibbli l-evalwazzjoni tad-data, jista’ ji ġi kkalkolat 
Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF) jew Foto Effett Medju (MPE –  
mean photo effect ). 
Għall-kalkolu tal-mi żuri tal-foto ċitossiċità (ara ta ħt), is-sett ta’ valuri 
diskreti tar-reazzjoni tal-kon ċentrazzjoni g ħandu jiġi approssimat 
b’kurva xierqa kontinwa tar-reazzjoni tal-kon ċentrazzjoni (mudell). 
It-tqegħid tal-kurva g ħad-data spiss isir b’metodu ta’ regressjoni 
mhux lineari (18). Biex ti ġi stmata l-influwenza tal-varjabbiltà tad- 
data fuq il-kurva mqieg ħda hija rrakkomandata pro ċedura  bootstrap . 
Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF) ji ġi kkalkolat bl-u żu ta’ din il- 
formula:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Jekk ma jistax ji ġi kkalkolat l-IC  50 fil-preżenza jew fin-nuqqas tad- 
dawl, PIF ma jistax ji ġi ddeterminat g ħall-materjal tat-test. Il-foto 
effett medju (MPE) huwa bba żat fuq it-tqabbil tal-kurvi s ħaħ tar- 
reazzjoni tal-kon ċentrazzjoni (19). Huwa ddefinit b ħala l-medju bil- 
piż tul sett rappre żentattiv ta’ valuri tal-foto effett  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Il-foto-effett PE  c fi kwalunkwe kon ċentrazzjoni C huwa definit b ħala 
l-prodott ta’ l-effett tar-reazzjoni RE  c u l-effett tad-do ża DE  c i.e. PE  c 
= RE  c x DE  c . L-effett tar-reazzjoni RE  c huwa d-differenza bejn ir- 
reazzjonijiet osservati fin-nuqqas u fil-pre żenza tad-dawl, ji ġifieri. 
RE c = R  c (-Irr) – R  c (+Irr). L-effett tad-do ża jingħata b’:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ 
fejn C* tirrappre żenta l-kon ċentrazzjoni ta’ l-ekwivalenza, ji ġifieri l- 
konċentrazzjoni li fiha r-reazzjoni ta’ +Irr hija daqs ir-reazzjoni ta’ 
–Irr fil-kon ċentrazzjoni C. Jekk C* ma tista’x ti ġi determinata 
minħabba li l-valuri tar-reazzjoni tal-kurva +Irr huma sistemati ­
kament og ħla jew aktar baxxi minn R  C (-Irr) l-effett tad-do ża huwa 
stabbilit b ħala 1. Il-fatturi tal-pi żijiet w  i jingħataw bl-og ħla valur ta’ 
reazzjoni, ji ġifieri w  i = MAX {R  i (+Irr), R  i (-Irr) }. Ix-xibka tal- 
kaxxi tal-kon ċentrazzjoni C  i tingħażel b’tali mod li l-istess g ħadd ta’ 
punti jaqa’ ta ħt kull wie ħed mill-intervalli tal-kon ċentrazzjoni definiti 
mill-valuri tal-kon ċentrazzjoni u żati fl-esperiment. Il-kalkolu ta’ l- 
MPE huwa ristrett g ħall-valur massimu ta’ kon ċentrazzjoni li fiha 
għall-inqas wa ħda miż-żewġ kurvi għadha turi valur ta’ reazzjoni ta’ 
mhux inqas minn 10 %. Jekk din il-kon ċentrazzjoni massima hija 
ogħla mill-og ħla konċentrazzjoni u żata fl-esperiment +Irr il-parti 
residwali tal-kurva +Irr hija stabbilita b ħala l-valur ta’ reazzjoni 
“0”. Skond jekk il-valur ta’ l-MPE huwiex akbar minn valur ta’ 
limitu mag ħżul tajjeb (MPE  c = 0,15), il-kimika hija kklassifikata 
bħala fototossika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Pakkett ta’ softwer g ħall-kalkolu tal-PIF u tal-MPE huwa disponibbli 
minn (20).  
L-INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Fuq bażi ta’ l-istudju tal-validazzjoni (8), sustanza tat-test b’PIF < 2 
jew MPE < 0,1 tbassar: “ebda fototossi ċità”. PIF > 2 u < 5 jew MPE 
> 0,1 u < 0,15 tbassar: “fototossi ċità probabbli”; u PIF > 5 jew MPE 
> 0,15 tbassar: “fototossi ċità”. 
Għal kwalunkwe laboratorju li jista’bbilixxi din l-anali żi għall-ewwel 
darba, il-materjali ta’ riferenza elenkati fit-Tabella 1 g ħandhom ji ġu 
ttestjati qabel ma ji ġu ttestjati s-sustanzi tat-test g ħall-istima foto ­
tossika. Il-valuri tal-PIF jew ta’ l-MPE g ħandhom ikunu qrib il- 
valuri msemmija fit-Tabella 1.  
Tabella 1  
Isem il-kimika Nru EINECS Nru CAS PIF MPE L-ogħla punt 
ta’ l-assorbim 
ent Solvent (  1 ) 
Amiodarone 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] >3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(fl-ispalla) ehanol 
Choloropromazi 
ne HCL 200-701-3 [69-09-0] >14,4 0,33-0,63 309 nm etanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] >71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitrile 
Anthracene 204-371-1 [120-12-7] >18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitrile Protoporphyrin 
IX, Disodium 256-815-9 [50865-01-5] >45,3 0,54-0,74 402 nm etanol 
L-Histidine [7006-35-1] no PIF 0,05-0,10 211 nm Ilma 
Hexacholorophe 
ne 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(fl-ispalla) etanol 
Sodium lauryl 
sulphate 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00-0,05 l-ebda 
assorbim ent Ilma
 
( 1 ) Solvent u żat biex jitkejjel l-assorbiment.  
L-INTERPRETAZZJONI TAD-DATA  
Jekk l-effetti fototossi ċi huma osservati biss fl-og ħla test tal-kon ċen­
trazzjoni (spe ċjalment g ħall-kimiċi tat-test li jin ħallu fl-ilma) jistg ħu 
jkunu me ħtieġa kunsiderazzjonijiet addizzjonali g ħall-istima ta’ l- 
azzard. Dawn jistg ħu jinkludu d-data dwar l-assorbiment mill- ġilda, 
u l-akkumulazzjoni tal-kimika fil- ġilda u/jew data minn testijiet 
oħrajn, eż. l-ittestjar tal-kimika fil- ġilda ta’ l-annimali jew umana  
in vitro , jew mudelli tal- ġilda. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Jekk ma tintwera ebda tossi ċità (+Irr u -Irr), u jekk is-solubilità 
llimitat il-kon ċentrazzjonijiet li setg ħu jiġu ttestjati, il-kompatibilità 
tas-sustanza tat-test ma’ l-anali żi tista’ ti ġi fid-dubju u t-testjar 
konfermatorju g ħandu jiġi kkonsidrat bl-u żu, eż. ta’ mudell ie ħor. 
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi g ħall-inqas din l-informazzjoni li 
ġejja: 
Is-Sustanza tat-Test:  
— id-data ta’ l-identifikazzjoni, ismijiet ġeneriċi komuni u n-numri 
IUPAC u CAS, jekk mag ħrufin;  
— in-natura fi żika u safa;  
— il-karatteristi ċi fiżikokimiċi jekk inhuma rilevanti g ħat-twettiq ta’ 
l-istudju;  
— l-ispettru ta’ l-assorbiment UV/vis;  
— l-istabilità, u l-fotostabilità jekk mag ħrufin.  
Solvent:  
— ġustifikazzjoni g ħall-għażla tas-solvent;  
— solubilita tal-kimika tat-test fis-solvent;  
— persenta ġġ tas-solvent pre żenti fil-mezz tat-trattament.  
Iċ-ċelloli  
— tip u g ħajn taċ-ċelloli;  
— nuqqas ta’ mycoplasma;  
— l-għadd tal-mog ħdija taċ-ċelloli, jekk mag ħruf; 
— Is-sensittività ta ċ-ċelloli għar-radjazzjoni, ddeterminata bit- 
tagħmir ta’ l-irradjazzjoni u żat fit-test tal-fototossi ċità in vitro  
3T3 NRU;  
Il-kundizzjonijiet tat-test (1);  inkubazzjoni qabel u wara t-trattament:  
— tip u kompo żizzjoni tal-mezz tal-kultura;  
— kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni (kon ċentrazzjoni ta’ CO  2 ; 
temperatura; umdità);  
— kemm iddum l-inkubazzjoni (qabel it-trattament; wara t-tratta ­
ment).  
Il-kundizzjonijiet tat-test (2);  trattament bil-kimika:  
— ir-raġuni għall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet tal-kimika tat-test 
użati fil-pre żenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni;  
— fil-każ ta’ solubilità limitata tal-kimika tat-test u ta’ nuqqas ta’ 
ċitotossiċità: ir-raġuni għall-ogħla konċentrazzjoni ttestjata;  
— tip u kompo żizzjoni tal-mezz tat-trattament (ta ħlita ta’ mel ħ 
buffered);  
— kemm idum it-trattament kimiku.  
Il-kundizzjonijiet tat-test (3);  l-irradjazzjoni:  
— ir-raġuni għall-għażla ta’ l-għajn tad-dawl u żat; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— manifattur u tip ta’ g ħajn tad-dawl u radjometru;  
— karatteristi ċi ta’ l-irradjanza spettrali ta’ l-g ħajn tad-dawl;  
— karatteristi ċi ta’ trażmissjoni u assorbiment tal-fitru/i u żat(i);  
— karatteristi ċi tar-radjometru u d-dettalji dwar il-kalibrazzjoni 
tiegħu; 
— distanza ta’ l-g ħajn tad-dawl mis-sistema tat-test;  
— l-irradjanza tal-UVA f’din id-distanza, espresso f’mW/cm  2 ; 
— kemm iddum l-espo żizzjoni tad-dawl UV/vis;  
— doża ta’ l-UVA (irradjanza x ħin), espressa f’J/cm  2 ; 
— temperatura tal-kulturi ta ċ-ċelloli matul l-irradjazzjoni u l-kulturi 
taċ-ċelloli li jin żammu fid-dlam konkorrentement.  
Il-kundizzjonijiet tat-test (4);  test tal-vijabilità ta’ l-A ħmar Newtrali:  
— kompo żizzjoni tal-mezz tat-trattament ta’ l-A ħmar Newtrali;  
— kemm iddum l-inkubazzjoni ta’ l-A ħmar Newtrali;  
— kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni (kon ċentrazzjoni ta’ CO  2 ; 
temperatura; umdità);  
— kundizzjonijiet ta’ l-estrazzjoni ta’ l-A ħmar Newtrali (estrattant; 
kemm idum);  
— wavelength  użata għall-qari spettrofotometriku tad-densità ottika 
ta’ l-Aħmar Newtrali;  
— tieni  wavelength  (referenza), jekk tintu ża; 
— kontenut ta’ vojt ta’ l-ispettrofotometru, jekk u żat. 
Riżultati:  
— il-vijabilità ta ċ-ċelloli miksuba f’kull kon ċentrazzjoni tal-kimika 
tat-test, espressa f’persenta ġġ ta’ vijabilità ta’ kontrolli solventi 
medji u konkorrenti;  
— kurvi tar-reazzjonijiet tal-kon ċentrazzjoni (kon ċentrazzjoni tal- 
kimika tat-test vs. vijabilità relattiva ta ċ-ċelloli) miksuba f’es ­
perimenti konkorrenti +Irr u -Irr;  
— analiżi tal-kurvi tar-reazzjoni tal-kon ċentrazzjoni: jekk possibbli, 
il-komputazzjoni/kalkolu ta’ l-IC  50 (+Irr) u IC  50 (-Irr);  
— tqabbil ta’ żewġ kurvi tar-reazzjonijiet tal-kon ċentrazzjoni 
miksuba fil-pre żenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni, bil-kalkolu 
tal-Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF), jew bil-kalkolu tal-Foto 
Effett Medju (MPE);  
— il-kriterji ta’ l-a ċċettazzjoni tat-test; il-kontroll konkurrenti tas- 
solvent:  
— il-vijabilità assoluta (densità ottika ta’ l-estratt ta’ l-A ħmar 
Newtrali) ta’ ċelloli irradjati u mhux irradjati;  
— id-data storika tal-kontrolli negattivi u dawk solventi; 
devjazzjonijiet medji u dawk standard;  
— kriterji ta’ l-a ċċettazzjoni tat-test; kontroll po żittiv konkurrenti;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+Irr) u IC  50 (-Irr) u PIF/MPE tal-kimika tal-kontroll po żittiv;  
— id-data storika tal-kontrolli po żittivi kimi ċi: IC  50 (+Irr) u IC  50 (-Irr) 
u PIF/MPE; devjazzjonijiet medji u dawk standard.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic.  In vitro  7: 95- 
102. 
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In “Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI-V.
 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314-348.
 
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In “The science of 
Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. Tieni edizzjoni, p 79-110.
 
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 “Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” 
Environment Directorate, OECD, Pari ġi.
 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., 
Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  
phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 
cell phototoxicity assay. Toxic.  In vitro  8, 793-796.
 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 ta’ Novembru 1997, ATLA, 26, 7-8.
 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic.  In vitro  
12, 305-327.
 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30 th -31 th October 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 
15 ta’ Marzu 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba 
mis-Segretarjat.  
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity deter ­
mination  in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.  
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In “Dermatotoxicology”, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. Ħames edizzjoni, p 515-530.
 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.  
14. ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
 
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 ta’ 
Settembru, 1998. 18 pa ġni. 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.
 
18. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127-138.
 
19. Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445-462.  
20. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_234- 
9687_1_1_1_1,00.html  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
L-ANNESS 1  
Ir-rwol tat-3T3 NRU PT fi strate ġija sekwenzjali g ħall-ittestjar tal-fototossi ċità tal-kimi ċi
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
L-ANNESS 2  
Figura 1  
Distribuzzjoni ta' poter spettrali tas-simulatur tax-xemx iffiltrat
  
(ara t-taqsima 1.4.1.5, tieni paragrafu)  
Il-Figura 1 tag ħti eżempju ta' distribuzzjoni ta' irradjanza spettrali a ċċettabbli ta' simulatur tax-xemx 
iffiltrat. Huwa mill-g ħajn ta' alid tal-metall  doped  fil-prova tal-validazzjoni tat-3T3 NRU PT (6) ­
(8)(17). L-effett ta' żewġ filtri differenti u żati u l-effett addizzjoni ta' filtri ta' l-g ħatu ta' plattina 96- 
well tal-kultura huma murija. Il-filtru H2 intu ża biss ma' sistemi tat-test li jistg ħu jittolleraw ammont 
ogħla ta' UVB (test tal-mudell tal- ġilda u ttest tal-foto ħemoliżi taċ-ċelloli ħomor tad-demm). Fit-3T3 
NRU-PT intu ża l-filtru H1. Il-figura turi li l-effett addizzjonali ta' filtru ta' l-g ħatu tal-plattina huwa 
l-aktar osservat fil-firxa ta' l-UVB, u xorta j ħallu biżżejjed UVB fl-ispettru ta' l-irradjazzjoni biex 
jiġu eċċitati l-kimi ċi li tipikament jassorbu l-firxa ta' l-UVB, b ħall-Amiodarone (ara t-Tabella 1).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figura 2  
Is-sensittività ta' l-irradjazzjoni ta ċ-ċelloli Balb/c 3T3 (kif imkejla fil-firxa UVA)  
Il-vijabilità ta ċ-ċelloli ( % u żu ta' l-Aħmar Newtrali tal-kontrolli skuri)
  
(ara t-taqsimiet 1.4.1.5.2 tieni paragrafu; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Is-sensittività ta ċ-ċelloli Balb/c 3T3 g ħall-irradjazzjoni mas-simulatur tax-xemx u żat fil-prova tal- 
validazzjoni tat-Test tal-Fototossi ċità 3T3NRU, kif imkejla fil-firxa ta' l-UVA. Il-figura turi r- 
riżultati miksuba f’7 laboratorji differenti fl-istudju tal-pre-validazzjoni (1). Filwaqt li ż-żewġ 
kurvi b'simboli miftu ħa nkisbu b' ċelloli li saru anzjani (numru g ħoli ta' passa ġġi), li kellhom ji ġu 
sostitwiti b' ħażniet ta' ċelloli ġodda il-kurvi bis-simboli li jispikkaw juru ċ-ċelloli b'tolleranza ta' 
irradjazzjoni a ċċettabbli.  
Minn din id-data ġiet derivata l-og ħla irradjazzjoni mhux ċitotossika ta' 5 J/cm  2 (linja ttikkjata 
vertikali). Il-linja ttikkjata orizzontali turi barra minn dan l-effett massimu a ċċettabli ta' l-irrad ­
jazzjoni mog ħti fil-paragrafu 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODULA 
TAL-LIMFA LOKALI  
INTRODUZZJONI  
1. Il-Linji gwida tal-OECD g ħall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimi ċi u l-Metodi ta’ 
Ttestjar tal-UE bba żati fuqhom ji ġu analizzati minn żmien għal żmien 
fid-dawl tal-progress xjentifiku, ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu, u konsider ­
azzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali. Il-Metodu ta’ Ttestjar oriġinali (TM) g ħad-determinazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda 
fil-ġurdien, l-Anali żi tan-Nodula tal-Limfa Lokali (LLNA; Linja Gwida 
ta’ Ttestjar 429 tal-OECD; il-Kapitolu B.42 ta’ dan l-Anness) ġie adottat 
qabel (1) Id-dettalji tal-validazzjoni tal-LLNA u anali żi tax-xogħol assoċjat 
ġew ippubblikati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). L-LLNA a ġġornata 
hija bbażata fuq l-evalwazzjoni tal-esperjenza u tad-dejta xjentifika (12). 
Dan huwa t-tieni TM imfassal g ħall-valutazzjoni tal-potenzjal tas-sustanzi 
kimiċi li jikkaw żaw sensitizzazzjoni tal- ġilda (sustanzi u ta ħlitiet) 
fl-annimali. It-TM l-ie ħor (jiġifieri l-Linja Gwida 406 tal-OECD g ħall- 
Ittestjar; il-Kapitolu B.6 ta’ dan l-Anness) ju ża testijiet fuq il-fniek 
tal-Indi, b'mod partikolari t-test ta’ massimizzazzjoni fuq il-fenek tal-Indi u t-test Buehler (13). L-LLNA tipprovdi vanta ġġi fuq il-B.6 u fuq il-Linja 
Gwida 406 tal-OECD g ħall-Ittestjar (13) fir-rigward tal-benessri 
tal-annimali. Dan it-TM a ġġornat tal-LLNA jinkludi sett ta’ Standards ta’ 
Prestazzjoni (PS) (Appendi ċi 1) li jistg ħu jintużaw fl-evalwazzjoni 
tal-istatus ta’ validazzjoni ta’ metodi ġodda u/jew mibdula ta’ ttestjar li 
huma mekkanikament u funzjonalment simili g ħal-LLNA, f'konformità 
mal-prinċipji tad-Dokument ta’ Gwida Nru 34 tal-OECD (14).
 
2. L-LLNA tistudja l-fa żi ta’ induzzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda u 
tipprovdi dejta kwantitattiva adattata g ħall-valutazzjoni tad-do ża u 
r-reazzjoni. G ħandu jiġi nnotat li s-sensitizzaturi ħfief/moderati li huma 
rrakkomandati b ħala sustanzi kimi ċi ta’ kontroll po żittiv adattati (PC) 
għall-metodi ta’ ttestjar fuq il-fniek tal-Indi (ji ġifieri B. 6; Linja Gwida 
406 tal-OECD g ħall-Ittestjar) (13) huma adattati wkoll g ħall-użu 
mal-LLNA (6) (8) (15). L-appro ċċ ta’ LLNA mnaqqsa (rLLNA), li tista' 
tuża sa 40 % inqas annimali huwa deskritt ukoll b ħala għażla f'dan it-TM 
(16) (17) (18). L-rLLNA tista' tintu ża meta jkun hemm ħtieġa regolatorja li 
tiġi kkonfermata previ żjoni negattiva tal-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni 
tal-ġilda, sakemm ikun hemm konformità mal-ispe ċifikazzjonijiet l-o ħrajn 
kollha ta’ protokoll tal-LLNA, kif deskritt f'dan it-TM. Il-previ żjoni ta’ eżitu 
negattiv g ħandha ssir fuq il-ba żi tal-informazzjoni kollha disponibbli kif 
deskritt fil-paragrafu 4. Qabel ma ji ġi applikat l-appro ċċ rLLNA, 
għandhom ji ġu pprovduti ġustifikazzjonijiet ċari u loġika xjentifika g ħall- 
użu tiegħu. Jekk, kontra dak mistenni, jinkiseb ri żultat pożittiv jew 
ekwivoku fl-rLLNA, jista' jkun me ħtieġ aktar ittestjar sabiex ti ġi interpretata 
jew iċċarata s-sejba. L-rLLNA ma g ħandhiex tintu ża għall-identifikazzjoni 
tal-periklu ta’ sustanzi ta’ testijiet li jikkaw żaw sensitizzazzjoni tal- ġilda 
meta tkun me ħtieġa informazzjoni dwar ir-relazzjoni bejn id-do ża u 
r-reazzjoni b ħas-subkategorizzazzjoni g ħar-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet u s-Sistema Globalment Armonizzata tan-NU 
tal-Klassifikazzjoni u t-Tikkettar tas-Sustan żi Kimiċi. 
DEFINIZZJONIJIET  
3. Id-definizzjonijiet u żati huma pprovduti fl-Appendi ċi 2. 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
4. L-LLNA tipprovdi metodu alternattiv g ħall-identifikazzjoni ta’ sustanzi 
kimiċi li jistgħu jikkaw żaw sensitizzazzjoni tal- ġilda. Dan mhux ne ċess­
arjament jimplika li l-LLNA g ħandha tintu ża minflok it-testijiet fuq 
il-fniek tal-Indi fil-ka żijiet kollha (ji ġifieri B.6; Linja Gwida 406 
tal-OECD g ħall-Ittestjar) (13), i żda pjuttost li l-anali żi għandha l-istess 
mertu u tista' tintu ża bħala alternattiva li fiha r-ri żultati po żittivi u 
negattivi ġeneralment ma jkunux je ħtieġu aktar konferma. Il-laboratorju 
tal-ittestjar g ħandu jikkunsidra l-informazzjoni disponibbli kollha fuq  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
is-sustanza tat-test qabel iwettaq l-istudju. Din l-informazzjoni g ħandha 
tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza tat-test; il-karatteristi ċi 
fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta’ kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew 
in vivo  fuq is-sustanza tat-test; u dejta tossikolo ġika dwar sustanzi kimi ċi 
strutturalment relatati. Din l-informazzjoni g ħandha titqies sabiex wie ħed 
jiddetermina jekk l-LLNA hijiex adattata g ħas-sustanza (min ħabba 
n-nuqqas ta’ kompatibbiltà ta’ tipi limitati ta’ sustanzi kimi ċi mal-LLNA- 
ara l-paragrafu 5) u sabiex tg ħin fl-għażla tad-doża. 
5. L-LLNA huwa metodu  in vivo  u, b'konsegwenza ta’ dan, ma jeliminax 
l-użu tal-annimali fil-valutazzjoni ta’ attività ta’ sensitizzazzjoni ta’ kuntatt 
allerġiku. Għandu, madankollu, il-potenzjal li jnaqqas l-g ħadd ta’ annimali 
meħtieġa għal dan il-g ħan. Barra minn hekk, l-LLNA toffri rfinar sostanzjali 
(inqas uġigħ u tbatija) fil-mod kif jintu żaw l-annimali g ħall-ittestjar 
tas-sensitizzazzjoni ta’ kuntatt aller ġiku. L-LLNA hija bba żata fuq 
il-konsiderazzjoni ta’ avvenimenti immunolo ġiċi stimulati b'sustanzi 
kimiċi matul il-fa żi induttiva tas-sensitizzazzjoni. G ħall-kuntrarju 
tat-testijiet fuq il-fenek tal-Indi (ji ġifieri B.6; Linja Gwida 406 tal-OECD 
għall-Ittestjar) (13) l-LLNA ma te ħtieġx li r-reazzjonijiet tal-ipersensittività 
tal-ġilda indotti bi sfida jkunu elu ċidati. Barra minn hekk, l-LLNA ma 
teħtieġx l-użu ta’ aġġuvant, bħal fil-każ tat-test tal-massimizzazzjoni fuq 
il-fenek tal-Indi (13). G ħalhekk, l-LLNA tnaqqas l-u ġigħ u t-tbatija 
tal-annimali. Minkejja l-vanta ġġi tal-LLNA fuq B.6 u l-Linja Gwida 406 
tal-OECD g ħall-Ittestjar, g ħandu jkun rikonoxxut li hemm ċerti limi­
tazzjonijiet li jistg ħu jkunu je ħtieġu l-użu ta’ B.6 jew tal-Linja Gwida 
406 tal-OECD g ħall-Ittestjar (13) (e ż. sejbiet negattivi foloz fl-LLNA 
b'ċerti metalli, sejbiet po żittivi foloz b' ċerti irritanti tal- ġilda [bħal ċerti 
sustanzi kimi ċi tat-tip tensjoattivi] (19) (20), jew solubbiltà tas-sustanza 
tat-test). Barra minn hekk, il-klassijiet ta’ sustanzi kimi ċi jew sustanzi li 
fihom gruppi funzjonali li ntwerew li ja ġixxu bħala konfondituri potenzjali 
(21) jistg ħu jeħtieġu l-użu ta’ testijiet fuq il-fniek tal-Indi (ji ġifieri B.6; 
Linja Gwida 406 tal-OECD g ħall-Ittestjar (13). Barra minn hekk, skont 
il-bażi tad-dejta ta’ validazzjoni limitata, li kienet tikkonsisti prin ċipalment 
minn formulazzjonijiet ta’ pesti ċidi, l-LLNA aktarx li tag ħti aktar ri żultat 
pożittiv mit-test fuq il-fniek tal-Indi g ħal dawn it-tipi ta’ sustanzi tat-test 
(22). Madankollu, meta wie ħed jeżamina l-formulazzjonijiet, jista' 
jikkunsidra li jinkludi sustanzi simili b'ri żultati mag ħrufa bħala sustanzi 
ta’ referenza sabiex juri li l-LLNA qieg ħda taħdem kif suppost (ara 
l-paragrafu 16). Minbarra dawn il-limitazzjonijiet identifikati, l-LLNA 
għandha tkun applikabbli g ħall-ittestjar ta’ kwalunkwe sustanza diment li 
ma jkunx hemm karatteristi ċi assoċjati ma’ dawn is-sustanzi li jistg ħu jinter­
ferixxu mal-e żattezza tal-LLNA.  
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
6. Il-prin ċipju bażiku wara l-LLNA huwa li s-sensitizzaturi jikkaw żaw 
il-proliferazzjoni ta’ limfo ċiti fin-noduli tal-limfa li jsaffu s-sit 
tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Din il-proliferazzjoni hija proporz ­
jonata mad-do ża u mal-qawwa tal-aller ġen applikat u tipprovdi mezz 
sempliċi ta’ kif wie ħed jikseb kejl kwantitattiv ta’ sensitizzazzjoni. 
Il-proliferazzjoni titkejjel billi wie ħed iqabbel il-proliferazzjoni medja 
f'kull grupp tat-test mal-proliferazzjoni medja fil-grupp ta’ kontroll ittrattati 
bil-mezzi (vehicle treated control, VC). Il-proporzjon tal-proliferazzjoni 
medja f'kull grupp ittrattat ma’ dak fil-grupp VC simultanju, imsejja ħ 
l-Indiċi ta’ Stimulazzjoni (SI), ji ġi stabbilit, u g ħandu jkun ≥ 3 qabel ma 
tkun meħtieġa l-klassifikazzjoni tas-sustanza tat-test b ħala sensitizzatur 
potenzjali tal- ġilda. Il-pro ċeduri deskritti hawnhekk huma bba żati fuq 
l-użu ta’ tikkettar radjoattiv  in vivo  għall-kejl ta’ żieda fl-għadd ta’ ċelloli 
proliferanti fin-noduli tal-limfa awrikolari li jsaffu. Madankollu, jistg ħu 
jintużaw għanijiet finali o ħrajn għall-valutazzjoni tal-g ħadd ta’ ċelloli 
proliferanti sakemm ir-rekwi żiti tal-PS ikunu g ħalkollox issodisfati 
(Appendi ċi 1). ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
DESKRIZZJONI TAL-ANALI ŻI 
L-għażla tal-ispe ċijiet tal-annimali  
7. Il-ġurdien huwa l-ispe ċi magħżula għal dan it-test. Jintu żaw ġrieden nisa 
adulti żgħażagħ tar-razza CBA/Ca jew CBA/J, li jkunu g ħadhom mhux 
mgħammra u mhux tqal. Fil-bidu tal-istudju, l-annimali g ħandu jkollhom 
bejn 8 u 12-il ġimgħa, u l-varjazzjoni fil-pi ż tal-annimali g ħandha tkun 
minima u ma taqbi żx l-20 % tal-pi ż medju. Inkella, jistg ħu jintużaw razez 
oħrajn u ġrieden irġiel meta tkun i ġġenerata bi żżejjed dejta li turi li ma 
jeżistux differenzi sinifikanti spe ċifiċi għar-razez u/jew g ħas-sess 
fir-reazzjoni g ħal-LLNA.  
Il-kundizzjonijiet tal-ga ġeġ u l-għalf 
8. Il-ġrieden għandhom jin żammu fi gruppi (23), sakemm ma ting ħatax loġika 
xjentifika adegwata g ħat-tqegħid tal-ġrieden f'ga ġeġ individwali. 
It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali g ħandha tkun ta’ 22 ± 3 
°C. Għalkemm l-umdità relattiva g ħandha tkun mill-inqas 30 % u preferib ­
bilment ma taqbi żx is-70 % ħlief waqt it-tindif tal-kamra, l-g ħan għandu 
jkun ta’ 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, b'sekwenza ta’ 12-il 
siegħa dawl, u 12-il sieg ħa dlam. G ħall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti 
konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista ming ħajr limitu ta’ ilma tax-xorb.  
It-tħejjija tal-annimali  
9. L-annimali g ħandhom jintg ħażlu b'mod aleatorju, immarkati sabiex ikunu 
jistgħu jiġu identifikati individwalment (i żda mingħajr l-ebda forma ta’ 
mmarkar fil-widnejn), u mi żmuma fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-inqas 
ħamest ijiem qabel ma jibda d-do żar sabiex ikunu jistg ħu jidraw 
il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel ma jibda t-trattament, l-annimali kollha għandhom ji ġu eżaminati sabiex ji ġi żgurat li ma jkollhom l-ebda 
ferita osservabbli fuq il- ġilda.
 
It-tħejjija tas-soluzzjonijiet g ħad-dożar 
10. Is-sustanzi kimi ċi solidi għandhom jin ħallu jew ji ġu sospiżi f'solventi/mezzi 
u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel l-applikazzjoni fuq il-widna tal- ġrieden. 
Is-sustanzi kimi ċi likwidi jistg ħu jiġu applikati wa ħedhom jew dilwiti qabel 
id-dożar. Is-sustanzi kimi ċi li ma jin ħallux, bħal dawk li naraw ġeneralment 
fl-apparat mediku, g ħandhom ikunu so ġġetti għal estrazzjoni e żaġerata 
f'solvent adattat sabiex ji żvelaw il-kostitwenti kollha li jistg ħu jiġu estratti 
għall-ittestjar qabel ji ġu applikati fuq il-widna tal- ġrieden. Is-sustanzi tat-test 
għandhom jit ħejjew kuljum sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix li 
jistgħu jinħażnu. 
Il-verifika tal-affidabbiltà  
11. Is-sustanzi kimi ċi ta’ kontroll po żittiv (PC) jintu żaw sabiex tintwera 
prestazzjoni xierqa tal-anali żi billi jirrea ġixxu b'sensittività adegwata u 
riproduċibbli bħala sustanza tat-test sensitizzanti li g ħaliha l-kobor 
tar-reazzjoni huwa kkaratterizzat sew. L-inklu żjoni ta’ PC simultanju hija 
rrakkomandata g ħaliex din turi l-kompetenza tal-laboratorju li jwettaq 
b'suċċess kull anali żi u tippermetti l-valutazzjoni u t-tqabbil 
tar-riprodu ċibbiltà fil-laboratorju u bejn il-laboratorji. Huwa me ħtieġ ukoll 
PC għal kull studju wkoll minn ċerti awtoritajiet regolatorji u g ħaldaqstant 
l-utenti huma m ħeġġa sabiex jikkonsultaw lill-awtoritajiet rilevanti qabel ma 
jwettqu l-LLNA. G ħalhekk, l-u żu ta’ rutina ta’ PC simultanju huwa rrak ­
komandat sabiex ti ġi evitata l- ħtieġa ta’ aktar ittestjar fuq l-annimali sabiex 
jintlaħqu r-rekwi żiti li jistg ħu jinħolqu mill-u żu ta’ PC perjodiku (ara 
l-paragrafu 12). Il-PC g ħandu jipprodu ċi reazzjoni tal-LLNA po żittiva 
f'livell ta’ esponiment li mistenni jag ħti żieda fl-SI > 3 fuq il-grupp ta’ 
kontroll negattiv (NC). Id-do ża tal-PC g ħandha tintg ħażel b'mod li ma  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
tikkawżax irritazzjoni e ċċessiva fil- ġilda jew tossi ċità sistemika u 
l-induzzjoni tkun riprodu ċibbli iżda mhux e ċċessiva (jiġifieri SI > 20 ikun 
eċċessiv). Il-PC preferuti huma 25 % e żil ċinnamaldeid (Chemical Abstracts 
Service [CAS] Nru tal-CAS 101-86-0) fl-a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v) 
u 5 % merkaptoben żotijażol (Nru tal-CAS 149-30-4) f' N,N-dimetil­
formammid (ara l-Appendi ċi 1, it-Tabella 1). Jista' jkun hemm ċirkostanzi 
fejn, min ħabba ġustifikazzjoni adegwata, jistg ħu jintużaw PCs o ħrajn, li 
jissodisfaw il-kriterji ta’ hawn fuq.  
12. Għalkemm l-inklu żjoni ta’ grupp ta’ PC simultanju hija rrakkomandata, 
jista' jkun hemm sitwazzjonijiet fejn l-ittestjar perjodiku (ji ġifieri f'intervalli 
≤ 6 xhur) tal-PC jista' jkun adegwat g ħal-laboratorji li jag ħmlu l-LLNA 
b'mod regolari  (jiġifieri jag ħmlu l-LLNA fi frekwenza ta’ mhux inqas 
minn darba fix-xahar) u g ħandhom ba żi tad-dejta ta’ PC storiku stabbilita 
li turi l-kapa ċità tal-laboratorju biex jikseb ri żultati riprodu ċibbli u e żatti 
b'PCs. Profi ċjenza adegwata bl-LLNA tista' tintwera b'su ċċess billi ji ġu 
ġġenerati ri żultati pożittivi konsistenti bil-PC f'mill-inqas 10 testijiet indi ­
pendenti li jsiru f'perjodu ta’ żmien raġonevoli (ji ġifieri inqas minn sena).  
13. Grupp ta’ PC simultanju g ħandu dejjem ikun inklu ż meta jkun hemm bidla 
fil-proċedura tal-LLNA (e ż. bidla fil-persunal im ħarreġ, bidla fil-materjali 
tal-metodu tat-test u/jew fir-rea ġenti, bidla fit-tag ħmir tal-metodu tat-test, 
bidla fis-sors tal-annimali tat-test), u dawn il-bidliet g ħandhom ikunu 
ddokumentati fir-rapporti tal-laboratorju. G ħandu jiġi kkunsidrat l-impatt 
ta’ dawn il-bidliet fuq l-adegwatezza tal-ba żi tad-dejta storika stabbilita 
qabel ma ti ġi deċiża l-ħtieġa li tkun stabbilita ba żi tad-dejta storika ġdida 
sabiex tiddokumenta l-konsistenza fir-ri żultati tal-PC.  
14. Ir-ri ċerkaturi g ħandhom ikunu konxji li d-de ċiżjoni li jsir studju tal-PC fuq 
bażi perjodika minflok fl-istess ħin għandha konsegwenzi fuq l-adegwatezza 
u l-aċċettabbiltà tar-ri żultati ta’ studju negattivi ġġenerati ming ħajr PC 
simultanju waqt l-intervall bejn kull studju tal-PC perjodiku. Pere żempju, 
jekk jinkiseb ri żultat negattiv falz fl-istudju tal-PC perjodiku, ir-ri żultati 
negattivi tas-sustanza tat-test miksuba fl-intervall bejn l-a ħħar studju 
tal-PC perjodiku a ċċettabbli u l-istudju tal-PC perjodiku mhux a ċċettabbli 
jistgħu jkunu dubju żi. L-implikazzjonijiet ta’ dawn l-e żiti għandhom ji ġu 
kkunsidrati b'attenzjoni meta ji ġi deċiż jekk għandhomx ikunu inklu żi PCs 
simultanji jew li jsiru biss PCs perjodi ċi. Għandu jiġi kkunsidrat ukoll l-u żu 
ta’ inqas annimali fil-grupp ta’ PC simultanju meta dan ikun i ġġustifikat 
xjentifikament u jekk il-laboratorju juri, fuq dejta storika spe ċifika għal- 
laboratorju, li jistg ħu jintużaw inqas ġrieden (12).  
15. Għalkemm il-PC g ħandu jiġi ttestjat fil-mezz li huwa mag ħruf li jqanqal 
reazzjoni konsistenti (e ż. aċetun: żejt taż-żebbuġa; 4:1, v/v), jista' jkun 
hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom l-ittestjar f'mezz mhux 
standard (formulazzjoni rilevanti klinikament/kimikament) ikun me ħtieġ 
ukoll (24). Jekk il-PC simultanju ji ġi ttestjat f'mezz differenti 
mis-sustanza tat-test, allura g ħandu jiġi inkluż VC separat g ħall-PC simul ­
tanju.  
16. F'ka żijiet fejn ikunu qeg ħdin jiġu vvalutati sustanzi tat-test ta’ klassi 
speċifika ta’ sustanzi kimi ċi jew firxa ta’ reazzjonijiet, is-sustanzi ta’ 
referenza jistg ħu jkunu utli wkoll sabiex juru li l-metodu ta’ ttestjar qed 
jaħdem sew sabiex isib il-potenzjal tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ dawn 
it-tipi ta’ sustanzi tat-test. Is-sustanzi ta’ referenza adattati g ħandu jkollhom 
il-karatteristi ċi li ġejjin:  
— xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta’ sustanzi tat-test li qeg ħdin 
jiġu ttestjati,  
— karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi magħrufa, 
— dejta ta’ appo ġġ mil-LLNA,  
— dejta ta’ appo ġġ minn mudelli o ħrajn ta’ annimali u/jew mill-bnedmin.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
IL-PROĊEDURA TAT-TEST  
Għadd ta’ annimali u livelli ta’ do ża 
17. Minimu ta’ erba' annimali g ħandhom jintu żaw għal kull grupp ta’ do ża, 
b'minimu ta’ tliet kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma’ 
grupp ta’ NC simultanju ttrattat biss bil-mezz g ħas-sustanza tat-test, u PC 
(simultanju jew re ċenti, ibba żat fuq il-politika tal-laboratorju fl-ikkunsidrar 
tal-paragrafi 11-15). G ħandu jiġi kkunsidrat l-ittestjar ta’ do żi multipli 
tal-PC, b'mod spe ċjali meta wie ħed jittestja l-PC fuq ba żi intermittenti. 
Ħlief għan-nuqqas ta’ trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi 
ta’ kontroll g ħandhom ikunu mmani ġġjati u ttrattati bl-istess mod b ħall- 
annimali fil-gruppi tat-trattament.  
18. L-għażla tad-do ża u tal-mezz g ħandha tkun ibba żata fuq 
ir-rakkomandazzjonijiet mog ħtija fir-referenzi (3) u (5). Do żi konsekuttivi 
normalment jintg ħażlu minn sensiela xierqa ta’ kon ċentrazzjonijiet b ħal 
100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, e ċċ. Loġika xjentifika 
adegwata g ħandha takkumpanja l-g ħażla tas-sensiela ta’ kon ċentrazzjonijiet 
użati. L-informazzjoni tossikolo ġika kollha e żistenti (eż. tossiċità akuta u 
irritazzjoni fil- ġilda) u l-informazzjoni strutturali u fi żikokimika dwar 
is-sustanza tat-test ta’ interess (u/jew sustanzi relatati strutturalment) 
għandhom ji ġu kkunsidrati meta jkunu disponibbli, fl-g ħażla tat-tliet kon ċ­
entrazzjonijiet konsekuttivi biex b'hekk l-og ħla konċentrazzjoni timmass ­
imizza l-esponiment filwaqt li tevita t-tossi ċità sistemika u/jew 
l-irritazzjoni lokali e ċċessiva fil- ġilda (3) (25). Fin-nuqqas ta’ informazzjoni 
bħal din, jista' jkun me ħtieġ test inizjali qabel l-iskrinjar (ara l-paragrafi 21- 
24). 
19. Il-mezz ma g ħandux jinterferixxi ma’ jew jinfluwenza r-ri żultat tat-test u 
għandu jintg ħażel fuq il-ba żi tal-massimizzazzjoni tas-solubbiltà sabiex 
tinkiseb l-og ħla konċentrazzjoni li tista' tinkiseb filwaqt li ti ġi prodotta 
soluzzjoni/sospensjoni adattata g ħall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. 
Il-mezzi rakkomandati huma a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v),  N,N -dime­
tilformammid, metiletilketon, propilen glikol, u dimetilsulfossidu (19) i żda 
jistgħu jintużaw oħrajn jekk ting ħata loġika xjentifika suffi ċjenti. F'ċerti 
sitwazzjonijiet jista' jkun me ħtieġ li jintuża solvent klinikament rilevanti 
jew il-formulazzjoni kummer ċjali li fiha s-sustanza tat-test tkun ikkummer ċ­
jalizzata b ħala kontroll addizzjonali. G ħandha ting ħata attenzjoni partikolari 
sabiex ikun żgurat li s-sustanzi tat-test idrofili ċi jkunu inkorporati f'sistema 
ta’ mezzi, li xxarrab il- ġilda u ma ċċarċarx mal-ewwel, permezz 
tal-inkorporazzjoni ta’ sustanzi li j ħollu xierqa (e ż. 1 % Pluronic® L92). 
Għalhekk, mezzi g ħalkollox likwidi g ħandhom ji ġu evitati.  
20. L-ippro ċessar ta’ noduli tal-limfa minn ġrieden individwali jippermetti 
l-valutazzjoni tal-varjabbiltà bejn l-annimali u tqabbil statistiku tad-differenza bejn is-sustanza tat-test u l-kejl tal-grupp VC (ara l-paragrafu 35). Barra minn hekk, il-valutazzjoni tal-possibbiltà li 
jitnaqqas l-g ħadd ta’ ġrieden fil-grupp PC hija fattibbli meta tin ġabar 
dejta dwar annimali individwali (12). Barra minn hekk, ċerti awtoritajiet 
regolatorji jitolbu l- ġbir ta’ dejta dwar annimali individwali. Madankollu, 
id-dejta dwar gruppi ta’ annimali tista' titqies a ċċettabbli minn ċerti awtori ­
tajiet regolatorji u f'dawn is-sitwazzjonijiet, l-utenti jista' jkollhom l-g ħażla 
li jiġbru kemm dejta dwar annimali individwali kif ukoll dejta dwar gruppi 
ta’ annimali.
 
Test ta’ qabel l-iskrinjar  
21. Fin-nuqqas ta’ informazzjoni sabiex tkun iddeterminata l-og ħla doża li 
għandha tiġi ttestjata (ara l-paragrafu (18), g ħandu jsir test ta’ qabel 
l-iskrinjar sabiex ji ġi ddefinit il-livell ta’ do ża xierqa li g ħandha tkun 
ittestjata fl-LLNA. L-iskop tat-test ta’ qabel l-iskrinjar huwa li jipprovdi 
gwida għall-għażla tal-livell massimu ta’ do ża li għandu jintu ża fl-istudju 
ewlieni tal-LLNA, meta l-informazzjoni dwar il-kon ċentrazzjoni li tikkaw ża 
tossiċità sistemika (ara l-paragrafu 24) u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva 
tal-ġilda (ara l-paragrafu 23) ma tkunx disponibbli. Il-livell massimu 
tad-doża ttestjata g ħandu jkun 100 % tas-sustanza tat-test g ħal-likwidi jew 
il-konċentrazzjoni massima possibbli g ħas-solidi jew g ħas-sospensjonijiet.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. It-test ta’ qabel l-iskrinjar isir skont l-istess kundizzjonijiet tal-istudju 
ewlieni tal-LLNA, ħlief għall-fatt li ma jkunx hemm valutazzjoni 
tal-proliferazzjoni tan-noduli tal-limfa u li jistg ħu jintużaw inqas annimali 
għal kull grupp ta’ do ża. Huwa ssu ġġerit li jintu ża annimal wie ħed jew 
tnejn għal kull grupp ta’ do ża. Il-ġrieden kollha ji ġu osservati kuljum g ħal 
kwalunkwe sinjal kliniku ta’ tossi ċità sistemika jew irritazzjoni lokali fis-sit 
tal-applikazzjoni. Il-pi żijiet tal-ġisem jiġu ddokumentati qabel it-test u wara 
li jintemm (Jum 6). Il-widnejn ta’ kull ġurdien jiġu osservati g ħall-eritema 
(ħmura) u jing ħataw punte ġġ skont it-Tabella 1 (25). Jittie ħed il-kejl 
tal-ħxuna tal-widna permezz ta’ gej ġ ta’ ħxuna ( eż. mikrometru di ġitali 
jew gejġ tal-ħxuna Peacock Dial) f'Jum 1 (qabel id-do ża), f'Jum 3 
(madwar 48 sieg ħa wara l-ewwel do ża), u f'Jum 6. Barra minn hekk, 
fis-sitt Jum, il- ħxuna tal-widna tista' ti ġi stabbilita permezz ta’ deter ­
minazzjonijiet tal-pi ż bl-immarkar tal-widnejn, li g ħandu jsir wara li 
l-annimali jinqatlu b'mod uman. L-irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda 
hija indikata b'punte ġġ ta’ eritema ≥ 3 u/jew żieda fil-ħxuna tal-widna ta’ 
≥ 25 % fi kwalunkwe jum tal-kejl (26) (27). L-og ħla doża magħżula għall- 
istudju ewlieni tal-LLNA tkun id-do ża l-aktar baxxa li jmiss fis-sensiela ta’ 
konċentrazzjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar (ara l-paragrafu 18) li ma tikkaw żax 
tossiċità sistemika u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda. 
Tabella 1  
Punteġġi għall-eritema  
Osservazzjoni Punte ġġ 
L-ebda eritema 0 
Ftit li xejn eritema (bil-kemm tidher) 1 Eritema definita sew 2 
Eritema moderata sa severa 3 
Eritema severa ( ħmura qawwija) sa formazzjoni ta’ tessut 
oħxon u danne ġġat li jipprevjeni l-klassifikazzjoni tal-eritema 4
 
23. Minbarra żieda ta’ 25 % fil- ħxuna tal-widna (26) (27), intu żat ukoll żieda 
statistikament sinifikanti fil- ħxuna tal-widna fil- ġrieden ittrattati meta 
mqabbla mal- ġrieden tal-kontroll sabiex ji ġu identifikati sustanzi irritanti 
fl-LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Madankollu, g ħalkemm 
jistgħu jseħħu żidiet statistikament sinifikanti meta l- ħxuna tal-widna tkun 
inqas minn 25 % dawn ma ġewx asso ċjati b'mod spe ċifiku ma’ irritazzjoni 
eċċessiva (30) (31) (32) (33) (34).  
24. L-osservazzjonijiet klini ċi li ġejjin jistg ħu jindikaw tossi ċità sistemika (35) 
(36) meta jintu żaw bħala parti minn valutazzjoni integrata u g ħalhekk 
jistgħu jindikaw il-livell massimu tad-do ża li għandha tintu ża fl-LLNA 
ewlenija: bidliet fil-funzjoni tas-sistema nervu ża (eż. pil wieqaf, atassja, 
rogħda, u konvul żjonijiet); bidliet fl-im ġiba (eż. aggressività, bidla 
fl-attività tal-indafa, bidla sinifikanti fil-livell ta’ attività); bidliet 
fit-tendenzi respiratorji (ji ġifieri bidliet fil-frekwenza u fl-intensità tan-nifs 
bħal dispnea, nifs maqtug ħ, u ħsejjes fil-pulmun (rales)), u bidliet 
fil-konsum tal-ikel u tal-ilma. Barra minn hekk, sinjali ta’ letar ġija u/jew 
nuqqas ta’ reazzjoni u kull sinjal kliniku ie ħor ta’ aktar minn u ġigħ jew 
tbatija żgħira jew momentanja, jew tnaqqis ta’ > 5 % fil-pi ż tal-ġisem 
mill-ewwel Jum sas-sitt Jum, u l-imwiet g ħandhom ji ġu kkunsidrati 
fil-valutazzjoni. Annimali li waslu biex imutu jew annimali li jkunu vi żib­
bilment mu ġugħa jew li juru sinjali ta’ tbatija kbira u persistenti g ħandhom 
jinqatlu b'mod uman (37).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Skeda ta’ sperimentazzjoni tal-istudju ewlieni  
25. L-iskeda ta’ sperimentazzjoni tal-anali żi hija kif ġej: 
— L-ewwel Jum:  Identifika individwalment u ħu nota tal-pi ż ta’ kull 
annimal u ta’ kwalunkwe osservazzjoni klinika. Applika 25 μL 
tad-dilwizzjoni xierqa tas-sustanza tat-test, il-mezz wa ħdu, jew il-PC 
(simultanja jew re ċenti, skont il-politika tal-laboratorju fl-ikkunsidrar 
tal-paragrafi 11-15), fuq il-wara ta’ kull widna.  
— It-tieni u t-tielet Jum:  Irrepeti l-pro ċedura ta’ applikazzjoni li g ħamilt 
fl-ewwel Jum.  
— Ir-raba' u l- ħames Jum:  L-ebda trattament.  
— Is-sitt jum:  Ħu nota tal-pi ż ta’ kull annimal. Injetta 250 μL ta’ 
soluzzjoni ta’ ilma bil-mel ħ ibbaferjata bil-fosfat (phosphate-buffered 
saline, PBS) sterili li fih 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) ta’ (  3 H)-metiltimidin 
ittritjat fil- ġrieden kollha tat-test u tal-kontroll permezz tal-vina 
fid-denb. Inkella, injetta 250 μL PBS sterili li fih 2 μCi (7,4 × 10  4 
Bq) ta’  125 I-jododeossiuridin u 10  –5 M fluworodeossiuridin fil- ġrieden 
kollha permezz tal-vina fid-denb. Ħames (5) sig ħat wara, oqtol 
l-annimali b'mod uman. Aqta' n-noduli limfati ċi awrikolari li jnixxu 
minn kull widna tal- ġrieden u ppro ċessa flimkien f'PBS g ħal kull 
annimal (metodu b'annimali individwali); inkella aqta' u i ġbor 
in-noduli limfati ċi minn kull widna f'PBS g ħal kull grupp ta’ trattament 
(metodu bi gruppi ta’ trattament mi ġbura). Id-dettalji u d-dijagrammi 
tal-identifikazzjoni u d-dissezzjoni tan-noduli limfati ċi tinsab 
fir-referenza (12). Sabiex tkompli tissorvelja r-reazzjoni lokali tal- ġilda 
fl-istudju ewlieni, jistg ħu jiġu inklużi parametri o ħrajn bħall-għoti ta’ 
punti għall-eritema fil-widna jew il-kejl tal- ħxuna tal-widna (miksuba 
kemm permezz ta’ gej ġ tal-ħxuna, kif ukoll permezz 
tad-determinazzjonijiet tal-pi żijiet bl-immarkar tal-widna fl-awtopsja) 
fil-protokoll tal-istudju.  
It-tħejjija tas-sospensjonijiet ta ċ-ċelloli  
26. Sospensjoni ta’ ċellola wa ħda ta’ ċelloli tan-noduli limfati ċi (LNC) 
maqtugħa minn żewġ naħat permezz tal-metodu b'annimali individwali 
jew inkella, il-metodu bi gruppi ta’ trattament mi ġbura titħejja permezz 
ta’ diżaggregazzjoni mekkanika ħafifa minn ġo garża ta’ 200 micron-tal- 
azzar inossidabbli jew teknika a ċċettabbli o ħra għall-ġenerazzjoni ta’ 
sospensjoni ta’ ċellola wa ħda. L-LNC jin ħaslu darbtejn b'e ċċess ta’ PBS 
u d-DNA ji ġi sseparat b'5 % a ċidu trikloroa ċetiku (TCA) f'4 °C g ħal 18-il 
siegħa (3). Il-pelits jew ji ġu sospiżi mill-ġdid f'1mL TCA u trasferiti 
f'kunjetti ta’ xintillazzjoni li jkun fihom 10mL ta’ likwidu ta’ xintillazzjoni 
għall-għadd ta’  3 H, jew trasferiti direttament f'tubi g ħall-għadd tal-gamma 
għall-għadd ta’  125 I. 
Determinazzjoni tal-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli (radjuattività inkorporata)  
27. L-inkorporazzjoni ta’  3 H-metiltimidin titkejjel bl-g ħadd ta’ xintillazzjoni β 
bħala diżintegrazzjonijiet kull minuta (DPM). L-inkorporazzjoni ta’  125 I- 
jododeossiuridin titkejjel bl-g ħadd ta’  125 I u hija espressa wkoll b ħala 
DPM. Skont il-metodu u żat, l-inkorporazzjoni hija espressa b ħala DPM/ 
ġurdien (metodu b'annimali individwali) jew DPM/grupp ta’ trattament 
(metodu bi gruppi ta’ trattament mi ġbura).  
LLNA mnaqqas  
28. F'ċerti sitwazzjonijiet, meta jkun hemm ħtieġa regolatorja li tkun ikkon ­
fermata l-previ żjoni negattiva tal-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda, 
jista' jintu ża protokoll fakultattiv ta’ rLLNA (16) (17) (18) b'inqas 
annimali, sakemm ikun hemm konformità mal-ispe ċifikazzjonijiet l-o ħrajn 
kollha tal-protokoll tal-LLNA f'dan it-TM. Qabel ma ji ġi applikat l-appro ċċ 
ta’ rLLNA, g ħandhom ji ġu pprovduti ġustifikazzjonijiet ċari u loġika xjen­
tifika għall-użu tiegħu. Jekk jinkiseb ri żultat pożittiv jew ekwivoku, jista' 
jkun meħtieġ aktar ittestjar sabiex is-sejba ti ġi interpretata jew i ċċarata.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. It-tnaqqis fl-g ħadd ta’ gruppi ta’ do żi huwa l-unika differenza bejn 
il-protokolli tal-metodi tat-testijiet LLNA u rLLNA u g ħal din ir-ra ġuni 
l-rLLNA ma tipprovdix informazzjoni dwar id-do ża u r-reazzjoni. 
Għalhekk, l-rLLNA ma g ħandhiex tintu ża meta tkun me ħtieġa inform ­
azzjoni dwar id-do ża u r-reazzjoni. B ħal-LLNA b'diversi do żi, 
il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ivvalutata fl-rLLNA g ħandha tkun 
il-konċentrazzjoni massima li ma tikkaw żax tossiċità sistemika evidenti 
u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda fil-ġurdien (ara l-paragrafu 18).  
OSSERVAZZJONIJIET  
Osservazzjonijiet klini ċi 
30. Kull ġurdien għandu jkun osservat b'attenzjoni mill-inqas darba kuljum g ħal 
kwalunkwe sinjal kliniku, kemm ta’ irritazzjoni lokali fil-post 
tal-applikazzjoni jew ta’ tossi ċità sistemika. L-osservazzjonijiet kollha ji ġu 
rreġistrati b'mod sistematiku u jin żammu rekords g ħal kull ġurdien. 
Il-pjanijiet ta’ sorveljanza g ħandhom jinkludu kriterji sabiex ji ġu identifikati 
mill-ewwel dawk il- ġrieden li juru tossi ċità sistemika, irritazzjoni lokali 
eċċessiva tal- ġilda, jew tmermir tal- ġilda għall-ewtana żja (37).  
Piżijiet tal-ġisem  
31. Kif iddikjarat fil-paragrafu 25, il-pi żijiet tal-ġisem tal-annimali individwali 
għandhom jitkejlu fil-bidu tat-test u fil-qatla b'mod uman li tkun skedata.  
KALKOLU TAR-RI ŻULTATI  
32. Ir-ri żultati għal kull grupp ta’ trattament huma espressi b ħala l-SI. Meta 
jintuża l-metodu b'annimali individwali, l-SI jinstab billi wie ħed jiddividi 
d-DPM/ġurdien medju f'kull grupp tas-sustanza tat-test, u l-grupp PC, 
bid-DPM/ ġurdien medju g ħall-grupp tas-solvent/VC. L-SI medju g ħall- 
VCs imbag ħad ikun wie ħed. Meta jintu ża l-metodu bi gruppi ta’ trattament 
miġbura, l-SI jinstab billi wie ħed jiddividi l-inkorporazzjoni radjuattiva 
miġbura għal kull grupp ta’ trattament bl-inkorporazzjoni tal-grupp VC 
miġbur; dan jag ħti SI medju.  
33. Il-pro ċess ta’ de ċiżjoni jqis ri żultat pożittiv meta l-SI ≥ 3. Madankollu, 
il-qawwa tad-do ża-reazzjoni, is-sinifikat statistiku u l-konsistenza 
tas-solvent/mezz u r-reazzjonijiet tal-PC jistg ħu jintużaw ukoll sabiex 
wieħed jiddetermina jekk ri żultat marġinali jiġix iddikjarat po żittiv (4)(5)(6).  
34. Jekk ikun je ħtieġ li jiġu ċċarati r-riżultati miksuba, g ħandhom ji ġu kkun­
sidrati d-diversi karatteristi ċi tas-sustanza tat-test, inklu ż jekk għandhiex 
relazzjoni strutturali ma’ sustanzi mag ħrufa li jo ħolqu sensitizzazzjoni 
fil-ġilda, jekk tikkaw żax irritazzjoni lokali e ċċessiva fil- ġilda tal-ġurdien, 
u n-natura tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni osservata. Dawn u 
konsiderazzjonijiet o ħrajn huma diskussi fid-dettall f'parti o ħra (7).  
35. Il-ġbir ta’ dejta dwar ir-radjuattività fil-livell tal- ġurdien individwali 
jippermetti anali żi statistika g ħall-preżenza u l-grad ta’ relazzjoni bejn 
id-doża u r-reazzjoni fid-dejta. Kull evalwazzjoni statistika tista' tinkludi 
valutazzjoni tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni kif ukoll tqabbil 
aġġustat kif xieraq tal-gruppi tat-test (e ż. grupp iddo żat f'pari ma’ tqabbil 
ta’ VC simultanji). L-anali żijiet statisti ċi jistgħu jinkludu, e ż. regressjoni 
lineari jew it-test ta’ William g ħall-evalwazzjoni tat-tendenzi tad-do ża u 
tar-reazzjoni, u t-test ta’ Dunnett g ħal tqabbil tal-pari. Meta jag ħżel 
metodu xieraq g ħall-analiżi statistika, ir-ri ċerkatur g ħandu jkun konxju 
mill-inugwaljanzi possibbli tad-differenzi u problemi o ħrajn relatati li 
jistgħu jeħtieġu trasformazzjoni tad-dejta jew anali żi statistika mhux 
parametrika. Fi kwalunkwe ka ż ir-riċerkatur jista' je ħtieġ li jagħmel 
kalkoli tal-SI u anali żijiet statisti ċi bi jew ming ħajr ċerti punti ta’ dejta (li 
xi drabi jissej ħu “anomaliji” (outliers)).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
36. Id-dejta g ħandha titqassar f'tabelli. Meta wie ħed juża l-metodu b'annimali 
individwali, g ħandu juri l-valuri DPM tal-annimal individwali, il-medja 
DPM/annimal tal-grupp, it-terminu tal-i żball asso ċjat tagħha (eż. SD, 
SEM), u l-SI medju g ħal kull grupp ta’ do ża meta mqabbel mal-grupp 
VC simultanju. Meta jintu ża l-metodu bi gruppi ta’ trattament mi ġbura, 
wieħed għandu juri l-medja tad-DPM u l-SI medju g ħal kull grupp ta’ 
doża mqabbel mal-grupp VC simultanju.  
Rapport tat-test  
37. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanzi tat-test u ta’ kontroll:  
— dejta dwar l-identifikazzjoni (e ż. in-numru tal-CAS u tal-KE, jekk 
disponibbli; is-sors; il-purità; l-impuritajiet mag ħrufa; in-numru tal-lott),  
— in-natura fi żika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi (eż. volatilità, stabbiltà, 
solubbiltà),  
— f'każ ta’ ta ħlita, il-kompo żizzjoni u l-per ċentwali relattivi 
tal-komponenti.  
Solvent/mezz:  
— dejta dwar l-identifikazzjoni (purità; kon ċentrazzjoni, fejn xieraq; 
il-volum u żat), 
— raġuni għall-għażla tal-mezz.  
Annimali tat-test:  
— is-sors tal- ġrieden CBA,  
— stat mikrobijolo ġiku tal-annimali, meta jkun mag ħruf, 
— l-għadd u l-età tal-annimali,  
— is-sors tal-annimali, il-kundizzjonijiet tal-ga ġeġ, id-dieta, e ċċ. 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dettalji dwar it-t ħejjija u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test,  
— raġuni għall-għażla tad-do ża (inklużi riżultati mit-test ta’ qabel 
l-iskrinjar, jekk ikun sar),  
— il-kon ċentrazzjonijiet tal-mezz u tas-sustanza tat-test u żati, u l-ammont 
totali tas-sustanza tat-test applikata,  
— dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu ż it-tip/is-sors tad-dieta, 
is-sors tal-ilma),  
— dettalji dwar l-iskedi tat-trattament u tat-te ħid ta’ kampjuni,  
— metodi ta’ kejl tat-tossi ċità, 
— kriterji li ntu żaw sabiex l-istudji ji ġu kkunsidrati po żittivi jew negattivi,  
— dettalji dwar kwalunkwe devjazzjoni mill-protokoll u spjegazzjoni dwar 
kif id-devjazzjoni taffettwa d-disinn u r-ri żultati tal-istudju.  
Kontroll tal-affidabbiltà:  
— sommarju tar-ri żultati tal-a ħħar kontroll tal-affidabbiltà, inklu ża inform­
azzjoni dwar is-sustanza tat-test, il-kon ċentrazzjoni u l-mezz u żat, 
— dejta dwar PC simultanju u/jew storiku u dwar NC simultanju g ħal- 
laboratorju li qed jag ħmel it-test,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— jekk ma kienx inklu ż PC simultanju, id-dejta u r-rapport tal-laboratorju 
għall-aktar PC perjodiku re ċenti u rapport li jag ħti dettalji dwar id-dejta 
tal-PC storiku g ħal-laboratorju li ji ġġustifika l-ba żi għaliex ma sarx PC 
simultanju.  
Riżultati:  
— piżijiet individwali tal- ġrieden fil-bidu tad-do żar u mal-qatla skedata; kif 
ukoll il-medja u t-terminu ta’ żball assoċjat (eż. SD, SEM) g ħal kull 
grupp ta’ trattament,  
— il-ħin tal-bidu u tas-sinjali ta’ tossi ċità, inklu ża l-irritazzjoni tal- ġilda 
fil-post fejn ing ħatat id-do ża, jekk ikun hemm, g ħal kull annimal,  
— tabella tal-valuri DPM u tal-valuri SI g ħal kull ġurdien (metodu b'an ­
nimali individwali) jew medji (metodu bi gruppi ta’ trattament mi ġbura) 
għal kull grupp ta’ trattament,  
— il-medja u t-terminu ta’ żball assoċjat (eż. SD, SEM) g ħad-DPM/ġurdien 
għal kull grupp ta’ trattament u r-ri żultati tal-anali żi tal-anomaliji g ħal 
kull grupp ta’ trattament meta jintu ża l-metodu b'annimali individwali,  
— l-SI kkalkulat u kejl xieraq ta’ varjabbiltà li jikkunsidra l-varjabbiltà 
bejn l-annimali kemm fis-sustanza tat-test kif ukoll fil-gruppi ta’ kontroll meta jintu ża l-metodu b'annimali individwali,
 
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni,  
— analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq.  
Diskussjoni tar-ri żultati:  
— kumment qasir dwar ir-ri żultati, l-anali żi tad-doża u r-reazzjoni, u 
analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq, b'konklu żjoni dwar jekk is-sustanza 
tat-test għandhiex titqies li tikkaw ża s-sensitizzazzjoni tal- ġilda. 
LETTERATURA  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165–169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 
13–31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory 
exercise,  J. Toxicol. Environ. Health , 53, 563–79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997.
 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258–273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274–286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249–257.
 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and 
Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay 
responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284.  
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185.  
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http:// ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test 
Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coor ­
dinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available 
at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http:// www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00. 
html]
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
 
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs. nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  
Toxicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506.
 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, 
R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60–68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Appendiċi 1 
Standards tal-prestazzjoni g ħall-valutazzjoni ta’ metodi ta’ ttestjar LLNA 
(Local Lymph Node Assay) simili jew modifikati g ħas-sensitizzazzjoni 
tal-ġilda 
INTRODUZZJONI  
1. L-għan tal-Istandards tal-Prestazzjoni (Performance Standards, PS) huwa li 
jikkomunikaw il-ba żi li fuqha l-metodi ta’ ttestjar, kemm ta’ spe ċjalità 
(jiġifieri bid-dritt tal-awtur, bil-marka kummer ċjali, irreġistrati) kif ukoll 
ġeneriċi jistgħu jiġu ddeterminati li g ħandhom bi żżejjed preċiżjoni u affid ­
abbiltà għal raġunijiet spe ċifiċi ta’ ttestjar. Dawn il-PS, ibba żati fuq metodi 
ta’ ttestjar validati u a ċċettati, jistg ħu jintużaw sabiex jevalwaw 
l-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni ta’ metodi simili o ħra (li fil-lingwa ġġ tat-taħdit 
komuni jissej ħu testijiet “me-too”) li huma bba żati fuq prin ċipji xjentifi ċi 
simili u sabiex ikejlu jew ibassru l-istess effett bijolo ġiku jew tossiku (14).  
2. Qabel l-adozzjoni tal-metodi modifikati (ji ġifieri, titjib potenzjali propost 
għal metodu ta’ ttestjar approvat), g ħandu jkun hemm evalwazzjoni 
sabiex ji ġi ddeterminat l-effett tal-bidliet proposti fuq il-prestazzjoni 
tat-test u sa fejn dawn il-bidliet jaffettwaw l-informazzjoni disponibbli 
għall-komponenti l-o ħra tal-pro ċess ta’ validazzjoni. Skont l-g ħadd u t-tip 
ta’ bidliet proposti, id-dejta u d-dokumentazzjoni ta’ prova ġġenerati għal 
dawk il-bidliet, dawn g ħandhom ikunu jew so ġġetti għall-istess pro ċess ta’ 
validazzjoni kif spjegat g ħal test ġdid, jew, jekk dan ikun xieraq, g ħal 
valutazzjoni limitata ta’ affidabbiltà u rilevanza billi jintu żaw il-PS stabbiliti 
(14).  
3. Metodi simili jew modifikati proposti g ħall-użu f'dan it-TM (Test Method) 
għandhom ji ġu evalwati sabiex ji ġu ddeterminati l-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni 
tagħhom billi jintu żaw sustanzi kimi ċi li jirrappre żentaw il-firxa s ħiħa 
tar-riżultati tal-LLNA. Sabiex ji ġi evitat l-u żu mhux ne ċessarju ta’ 
annimali, huwa ferm rakkomandat li l-i żviluppaturi tal-mudell jikkonsultaw 
lill-awtoritajiet xierqa qabel ma jibdew l-istudji ta’ validazzjoni, f'kon ­
formità mal-PS u l-gwida pprovduti f'dan it-TM.  
4. Dawn il-PS huma bba żati fuq il-PS (12) armonizzati tal-US-ICCVAM, 
l-EC-ECVAM u l-JaCVAM- Ġappuniż, sabiex ji ġu vvalidati ver żjonijiet 
simili jew modifikati tal-LLNA. Il-PS jikkonsistu fil-komponenti essenzjali 
tal-metodi ta’ ttestjar, is-sustanzi ta’ referenza rakkomandati u l-istandards 
għall-preċiżjoni u l-affidabbiltà li l-metodu propost g ħandu jilħaq jew 
jaqbeż. 
I. Komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar  
5. Sabiex ji ġi żgurat li metodu tal-LLNA simili jew modifikat huwa analogu 
b'mod funzjonali u mekkanistiku g ħal-LLNA u jkejjel l-istess effett bijo ­
loġiku, il-komponenti li ġejjin għandhom ji ġu inklużi fil-protokoll 
tal-metodu ta’ ttestjar:  
— Is-sustanza tat-test g ħandha tiġi applikata b'mod topiku fuq i ż-żewġ 
widnejn tal- ġurdien,  
— Il-proliferazzjoni tal-limfo ċiti għandha titkejjel fin-nodi limfati ċi li jkunu 
qed inixxu mill-post tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test,  
— Il-proliferazzjoni tal-limfo ċiti għandha titkejjel waqt il-fa żi ta’ 
induzzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda, ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Għas-sustanzi tat-test, l-og ħla doża magħżula għandha tkun 
il-konċentrazzjoni massima li ma tipprovokax tossi ċità sistemika u/jew 
irritazzjoni e ċċessiva tal- ġilda lokali fil- ġurdien. G ħal sustanzi kimi ċi ta’ 
referenza po żittivi, bħala minimu, l-og ħla doża għandha tkun g ħolja 
daqs il-valuri tal-EC3 (Kon ċentrazzjoni Stmata 3) tal-LLNA 
tas-sustanzi kimi ċi ta’ referenza korrispondenti (ara t-Tabella 1) 
mingħajr ma ti ġi prodotta tossi ċità sistemika u/jew irritazzjoni 
eċċessiva tal- ġilda lokali tal- ġurdien,  
— VC simultanju g ħandu jiġu inkluż f'kull studju u, fejn xieraq, g ħandu 
jintuża PC simultanju wkoll,  
— Għandu jintu ża minimu ta’ erba' annimali g ħal kull grupp ta’ do żi, 
— Tista' tin ġabar dejta individwali jew inkella fi grupp dwar l-annimali.  
F'każ li ma jintla ħaqx xi wie ħed minn dawn il-kriterji, dawn il-PS ma 
jistgħux jintużaw għall-validazzjoni ta’ metodu simili jew modifikat.  
II. Lista minima ta’ sustanzi kimi ċi ta’ referenza  
6. Il-PS (12) armonizzati tal-US-ICCVAM, l-EC-ECVAM u l-JaCVAM- 
Ġappuniż identifikaw 18-il sustanza kimika ta’ referenza minimi li 
għandhom jintu żaw u erba' sustanzi kimi ċi ta’ referenza fakultattivi (ji ġifieri 
sustanzi li jew ipprodu ċew riżultati pożittivi foloz jew inkella negattivi foloz 
fl-LLNA, meta mqabbla ma’ ri żultati fuq il-bnedim u fuq fniek tal-Indi 
(B.6, jew il-Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD) (13), u g ħaldaqstant, 
jipprovdu l-opportunità li tintwera prestazzjoni tajba daqs l-LLNA jew 
aħjar) li huma inklu żi fil-PS tal-LLNA. Il-kriterji tal-g ħażla għall-identifi ­
kazzjoni ta’ dawn is-sustanzi kimi ċi kienu:  
— Il-lista ta’ referenza tas-sustanzi kimi ċi rrappreżentat it-tipi ta’ sustanzi 
tipikament ittestjati g ħall-potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda u għall- 
firxa ta’ reazzjonijiet li l-LLNA kapa ċi jkejjel jew ibassar,  
— Is-sustanzi kellhom strutturi kimi ċi definiti sew,  
— Id-dejta tal-LLNA minn testijiet fuq ħnieżer tal-Indi (ji ġifieri B.6; 
il-Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD) (13) u (fejn possibbli) id-dejta mill-bnedmin kienet disponibbli g ħal kull sustanza, u
 
— Is-sustanzi kienu disponibbli minn sors kummer ċjali. 
Is-sustanzi kimi ċi ta’ referenza rakkomandati huma elenkati fit-Tabella 1. 
L-istudji li ju żaw is-sustanzi kimi ċi ta’ referenza proposti g ħandhom ji ġu 
evalwati fil-mezz li huma elenkati mieg ħu fit-Tabella 1. Fis-sitwazzjonijiet 
fejn sustanza elenkata ma tistax tkun disponibbli, jistg ħu jintużaw sustanzi 
oħra li jissodisfaw il-kriterji tal-g ħażla msemmija, b' ġustifikazzjoni 
adegwata.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabella 1  
Sustanzi kimi ċi ta' referenza rakkomandati g ħall-ps tal-LLNA  
Numru Sustanzi kimi ċi ( 1 ) Nru tal-CAS Forma Mezz (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Firxa attwali 
tal-EC3 LLNA vs. 
Fenek 
tal-Indi LLNA vs. 
Bniedem  
1 5-Kloro-2-metil-4-isotija żolin-3-on (CMI)/2- 
metil-4-isotija żolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Lik DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sol AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-Fenilendiammina 106-50-3 Sol AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Klorur tal-kobalt 7646-79-9 Sol DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Isoew ġenol 97-54-1 Lik AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 
6 2-Merkaptoben żotijażol 149-30-4 Sol DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 
7 Ċitral 5392-40-5 Lik AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 
8 HCA 101-86-0 Lik AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 
9 Ew ġenol 97-53-0 Lik AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Fenilben żoat 93-99-2 Sol AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 
11 Alko ħol ċinnamiku 104-54-1 Sol AOO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 
12 Urea tal-imida żolidinil 39236-46-9 Sol DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 
13 Metakrilat tal-metil 80-62-6 Lik AOO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 Kloroben żen 108-90-7 Lik AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
15 Isopropanol 67-63-0 Lik AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Numru Sustanzi kimi ċi ( 1 ) Nru tal-CAS Forma Mezz (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Firxa attwali 
tal-EC3 LLNA vs. 
Fenek 
tal-Indi LLNA vs. 
Bniedem  
16 A ċidu lattiku 50-21-5 Lik DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Sali ċilat tal-metil 119-36-8 Lik AOO 20 9 NA NA –/– –/– 
18 A ċidu saliċiliku 69-72-7 Sol AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Sustanzi fakultattivi sabiex Tintwera Prestazzjoni Mtejba Relatata mal-LLNA 
19 Sodju lauril sulfat 151-21-3 Sol DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Dimetakrilat tal-etilen glikol 97-90-5 Lik MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 
21 Ksilen 1330-20-7 Lik AOO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 
22 Klorur tan-nikil 7718-54-9 Sol DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Taqsiriet: AOO = a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v); Nru tal-CAS = Numru tal-Chemical Abstracts Service; DMF = N,N-dimetilformammid; DMSO = dimetil sulfossidu; DNCB =  2,4-dinitrokloroben żen; EC3 = stima ta’ 
konċentrazzjoni me ħtieġa sabiex ji ġi prodott indi ċi ta’ stimolazzjoni ta’ 3; GP = ri żultat tat-test fuq il-fenek tal-Indi (ji ġifieri B. 6 jew il-Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD) (13); HCA = e żil ċinnamaldeid; Lik = likwida; LLNA 
= riżultat tal-Anali żi tan-Nodula tal-Limfa Lokali tal- ġrieden (jiġifieri B. 42 jew il-Linja Gwida 429 tat-Test tal-OECD) (1); MEK = metil etil keton; NA = mhux applikabbli peress li l-indi ċi ta’ stimulazzjoni huwa ta’ < 3; NC = 
mhux ikkalkolata peress li d-dejta nkisbet minn studju wie ħed; Sol = solida; Veh = mezz tat-test. 
(*) Ġie supponut li s-sustanza mhijiex sensitizzatur fil-bnedmin min ħabba l-fatt li ma nstabu l-ebda ri żultati mit-test kliniku bl-impjastri (clinical patch test), mhijiex inklu ża bħala allerġen fis-sett tat-test bl-impjastri, u ma nstabu 
l-ebda rapporti ta’ ka żijiet ta’ sensitizzazzjoni fil-bnedmin. 
(**) Mhijiex disponibbli d-dejta mill-GP (fenek tal-Indi). 
( 1 ) Is-sustanzi kimi ċi għandhom jit ħejjew ta’ kuljum sakemm id-dejta ta’ stabbiltà ma turix l-a ċċettabilità tal- ħżin. 
( 2 ) Minħabba l-impatt potenzjali ta’ mezzi differenti fuq il-prestazzjoni tal-LLNA, g ħandu jintu ża l-mezz rakkomandat g ħal kull sustanza kimika ta’ referenza (24) (32). 
( 3 ) Il-valur medju fejn kien hemm disponibbli aktar minn valur wie ħed tal-EC3. G ħal sustanzi negattivi (ji ġifieri bl-indi ċi ta’ stimolazzjoni < 3), hija pprovduta l-og ħla konċentrazzjoni ttestjata. 
( 4 ) Għadd ta’ studji tal-LLNA li minnhom inkisbet id-dejta. 
( 5 ) Kummer ċjalment disponibbli b ħala Kathon CG (Nru tal-CAS 55965-84-9), li hija ta ħlita ta’ 3:1 ta’ CMI u MI. Il-kon ċentrazzjonijiet relattivi ta’ kull firxa ta’ komponenti minn 1,1 % sa 1,25 % (CMI) u 0,3 % sa 
0,45 % (MI). Il-komponenti inattivi huma sustanzi tal-mel ħ tal-manje żju (21,5 % sa 24 %) u nitrat tar-ram (0,15 % sa 0,17 %), bil-formulazzjoni li jifdal ta’ 74 % sa 77 % ilma. Kathon CG hija disp onibbli minnufih 
mingħand Sigma-Aldrich u Rohm and Haas (issa, Dow Chemical Corporation).
 III. Standards ta’ affidabbiltà u pre ċiżjoni ddefiniti  
7. Il-pre ċiżjoni ta’ metodu LLNA simili jew modifikat g ħandha tissodisfa jew 
taqbeż dik tal-PS tal-LLNA meta dan ji ġi evalwat permezz tat-18-il sustanza 
kimika ta’ referenza minimi li g ħandhom jintu żaw. Il-metodu l- ġdid jew 
modifikat g ħandu jirri żulta fil-klassifikazzjoni korretta fuq il-ba żi ta’ 
deċiżjoni ta’ “iva jew le”. Madankollu, il-metodu l- ġdid jew modifikat 
jista' ma jikklassifikax b'mod korrett is-sustanzi kimi ċi ta’ referenza 
minimi kollha li g ħandhom jintu żaw. Jekk, pere żempju, wie ħed 
mis-sensitizzaturi dg ħajfa jiġi kklassifikat ħażin, tista' titqies ra ġuni għall- 
klassifikazzjoni żbaljata u dejta addizzjonali adattata (pere żempju riżultati 
tat-test li jipprovdu klassifikazzjonijiet korretti g ħal sustanzi o ħra b'karatter ­
istiċi fiżiċi, kimiċi u sensitizzanti simili g ħal dawk tas-sustanza kimika ta’ 
referenza klassifikata ħażin) sabiex tintwera prestazzjoni ekwivalenti. 
F'dawn i ċ-ċirkostanzi, l-istatus ta’ validazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar 
LLNA l-ġdid jew modifikat ji ġi evalwat ka ż b'każ. 
Riproduċibbiltà intralaboratorja  
8. Sabiex ti ġi stabbilita r-riprodu ċibbiltà intralaboratorja, metodu LLNA ġdid 
jew modifikat g ħandu jiġi eżaminat billi tintu ża sustanza sensitizzanti li hija 
karatterizzata sew fl-LLNA. G ħaldaqstant, il-PS tal-LLNA huma bba żati fuq 
il-varjabbiltà tar-ri żultati minn testijiet ripetuti ta’ e żil ċinnamaldeid (HCA). 
Sabiex tiġi eżaminata l-affidabbiltà intralaboratorja, il-limitu stmat ta’ kon ċ­
entrazzjoni (ECt – treshold Estimated Concentration) g ħall-HCA g ħandhom 
jinġiebu minn erba' okka żjonijiet separati tal-inqas b' ġimgħa bejn it-testijiet. 
Riproduċibbiltà intralaboratorja a ċċettabbli hija indikata mill-abbiltà 
tal-laboratorju li f'kull test tal-HCA jikseb il-valuri tal-ECt ta’ bejn 5 % u 20 %, li jirrappre żentaw il-firxa ta’ 0,5-2,0 darbiet l-EC3 medja spe ċifikata 
għall-HCA (10 %) fl-LLNA (ara t-Tabella 1).
 
Riproduċibbiltà interlaboratorja  
9. Ir-riprodu ċibbiltà interlaboratorja ta’ metodu LLNA ġdid jew modifikat 
għandha tiġi eżaminata billi jintu żaw żewġ sustanzi sensitizzanti li huma 
karatterizzati sew fl-LLNA. Il-PS tal-LLNA huma bba żati fuq il-varjabbiltà 
tar-riżultati minn testijiet tal-HCA u 2,4-dinitrokloroben żen (DNCB) f'labo ­
ratorji differenti. Il-valuri tal-ECt g ħandhom jin ġiebu b'mod indipendenti 
minn studju wie ħed imwettaq tal-inqas fi tliet laboratorji separati. Sabiex 
tintwera r-riprodu ċibbiltà interlaboratorja a ċċettabbli, kull laboratorju 
għandu jikseb il-valuri tal-ECt ta’ 5 % sa 20 % g ħall-HCA u ta’ 0,025 % 
sa 0,1 % g ħad-DNCB, li jirrappre żentaw il-medja ta’ 0,5-2,0 darbiet 
il-konċentrazzjonijiet medji tal-EC3 spe ċifikati g ħall-HCA (10 %) u 
d-DNCB (0,05 %), rispettivament, fl-LLNA (ara t-Tabella 1).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Appendiċi 2 
Definizzjonijiet  
Preċiżjoni: Il-viċinanza tal-qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri ta’ 
referenza a ċċettati. Hija mi żura ta’ prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u aspett 
wieħed ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintu ża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” 
sabiex ifisser il-proporzjon ta’ ri żultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (14).  
Sustanza ta’ riferiment:  Sustanza sensitizzanti jew mhux sensitizzanti u żata bħala 
standard g ħat-tqabbil ma’ sustanza tat-test. Is-sustanza ta’ riferiment g ħandu 
jkollha l-karatteristi ċi li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità 
strutturali u funzjonali g ħall-klassi ta’ sustanzi li jkunu qed ji ġu ttestjati; (iii) 
karatteristi ċi fiżikokimiċi magħrufa; (iv) dejta ta’ appo ġġ dwar effetti 
magħrufa, u (v) potenza mag ħrufa fil-firxa ta’ rispons mixtieq.  
Limitu stmat ta’ kon ċentrazzjoni (ECt):  Konċentrazzjoni stmata ta’ sustanza 
tat-test me ħtieġa sabiex ji ġi prodott indi ċi ta’ stimolazzjoni li huwa indikattiv 
ta’ rispons po żittiv. 
Konċentrazzjoni stmata ta’ tlieta (EC3):  Konċentrazzjoni stmata ta’ sustanza 
tat-test me ħtieġa sabiex ji ġi prodott indi ċi ta’ stimolazzjoni ta’ tlieta.  
Negattiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala negattiva jew mhux attiva 
b’metodu ta’ ttestjar, meta fil-fatt hija po żittiva jew attiva.  
Pożittiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala pożittiva jew attiva minn 
test, meta fil-fatt hija negattiva jew mhux attiva.  
Periklu:  Il-potenzjal g ħal effett avvers g ħas-saħħa jew għall-ambjent. L-effett 
avvers jidher biss jekk hemm esponiment ta’ livell suffi ċjenti.  
Riproduċibbiltà interlaboratorja:  Kejl sa fejn il-laboratorji kwalifikati differenti, 
li jużaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanzi tat-test, jistg ħu 
jipproduċu riżultati li huma simili b’mod kwalitattiv u kwantitattiv. 
Ir-riprodu ċibbiltà interlaboratorja hija ddeterminata matul il-pro ċessi ta’ vali ­
dazzjoni u ta’ validazzjoni minn qabel, u tindika sa fejn test jista’ ji ġi trasferit 
b’suċċess bejn laboratorji, u tissejja ħ ukoll riprodu ċibbiltà bejn laboratorji (14).  
Riproduċibbiltà intralaboratorja:  Determinazzjoni ta’ kemm il-persuni 
kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jista’ jirnexxilhom jirreplikaw ir-ri żultati 
billi jużaw protokoll spe ċifiku fi żminijiet differenti. Din tissejja ħ ukoll ripro ­
duċibbiltà fi ħdan il-laboratorju (14).  
Test “me-too”:  Espressjoni li ting ħad fit-taħdit komuni g ħal metodu ta’ ttestjar li 
huwa strutturalment u funzjonalment simili g ħal metodu ta’ ttestjar ta’ referenza 
validat u a ċċettat. Metodu ta’ ttestjar b ħal dan ikun kandidat g ħal validazzjoni 
rapida (“catch-up validation”). Jintu ża b’mod alternanti ma’ metodu ta’ ttestjar 
simili (14).  
Outlier:  Outlier hija osservazzjoni li hija mmarkata differenti minn valuri o ħra 
f’kampjun aleatorju minn popolazzjoni.  
Standards ta’ Prestazzjoni (PS):  Standards, ibba żati fuq metodu ta’ ttestjar 
validu, li jipprovdu ba żi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ metodu ta’ 
ttestjar propost li huwa simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Hemm inklu żi: 
(i) komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar; (ii) lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza mag ħżula minn fost is-sustanzi kimi ċi użati sabiex 
tintwera l-prestazzjoni a ċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (iii) il-livelli 
simili ta’ pre ċiżjoni u affidabbiltà, ibba żati fuq x’inkiseb g ħall-metodu ta’ ttestjar 
validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost g ħandu juri meta ji ġi evalwat billi tintu ża 
l-lista minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza (14).
 
Metodu ta’ ttestjar ta’ spe ċjalità:  Metodu ta’ ttestjar li l-manifattura u 
d-distribuzzjoni tieg ħu huma ristretti minn privattivi, drittijiet tal-awtur, marki 
kummerċjali, eċċ. ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Garanzija tal-kwalità:  Proċess ta’ ġestjoni li skontu ji ġu vvalutati l-aderenza 
mal-istandards ta’ ttestjar tal-laboratorji, ir-rekwi żiti u l-pro ċeduri ta’ żamma 
tar-rekords u l-pre ċiżjoni tat-trasferiment tad-dejta minn individwi li huma indi ­
pendenti minn dawk li jwettqu l-ittestjar.  
Sustanzi kimi ċi ta’ referenza:  Sustanzi kimi ċi magħżula għall-użu fil-proċess ta’ 
validazzjoni, li g ħalihom huma di ġà magħrufa r-reazzjonijiet fis-sistema ta’ 
ttestjar ta’ referenza  in vitro  jew  in vivo  jew l-ispe ċi ta’ interess. Dawn 
is-sustanzi kimi ċi għandhom ikunu rappre żentanti tal-klassijiet ta’ sustanzi 
kimiċi li għalihom huwa mistenni jintu ża l-metodu ta’ ttestjar, u dawn 
għandhom jirrappre żentaw il-firxa s ħiħa ta’ reazzjonijiet li jistg ħu jkunu 
mistennija mis-sustanzi kimi ċi li għalihom huwa mistenni li jintu ża dan 
il-metodu ta’ ttestjar, minn qawwija, g ħal dgħajfa, sa negattivi. Settijiet differenti 
ta’ sustanzi kimi ċi ta’ referenza jistg ħu jkunu me ħtieġa għall-istadji differenti 
tal-proċess ta’ validazzjoni, u g ħal metodi ta’ ttestjar u u żi tat-testijiet differenti 
(14).  
Rilevanza:  Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test g ħall-effett ta’ interess u jekk 
huwiex sinifikanti u utli g ħal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test 
għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijolo ġiku ta’ interess. 
Ir-rilevanza tinkorpora l-konsiderazzjoni tal-pre ċiżjon (konkordanza) ta’ metodu 
ta’ ttestjar (14).  
Affidabbiltà:  Kejl li jiddetermina kemm il-metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq 
b’mod riprodu ċibbli fi ħdan u bejn il-laboratorji ma ż-żmien, meta dan jitwettaq 
billi jintu ża l-istess protokoll. Din hija e żaminata billi ti ġi kkalkolata 
r-riproduċibbiltà intralaboratorja u dik interlaboratorja (14).  
Sensitizzazzjoni tal- ġilda:  Proċess immunolo ġiku li jitfa ċċa meta individwu 
suxxettibbli jkun espost b’mod topiku g ħal allerġen kimiku induttur, li jipprovoka 
rispons immuni fil- ġilda li jista’ jwassal g ħall-iżvilupp ta’ sensitizzazzjoni 
mal-kuntatt.  
Indiċi ta’ Stimolazzjoni (SI):  Valur ikkalkolat sabiex je żamina l-potenzjal ta’ 
sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ sustanza tat-test li huwa l-proporzjon 
tal-proliferazzjoni fil-gruppi ttrattati g ħal dik fil-grupp ta’ kontroll ta’ mezz simul ­
tanju.  
Sustanza tat-test (li hija msemmija wkoll sustanza kimika tat-test):  Kwalunkwe 
sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan it-TM.  
Metodu ta’ ttestjar validat:  Metodu ta’ ttestjar li g ħalih tlestew studji ta’ vali ­
dazzjoni sabiex ji ġu ddeterminati r-rilevanza (inklu ża l-preċiżjoni) u l-affidabbiltà 
għal skop spe ċifiku. Huwa importanti li ji ġi osservat li metodu ta’ ttestjar validat 
jista’ ma jkollux prestazzjoni suffi ċjenti f’termini ta’ pre ċiżjoni u affidabbiltà 
sabiex jitqies a ċċettabbli g ħall-iskop propost (14).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSI ĊITÀ FL-ANNIMALI 
GERRIEMA  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalenti g ħal OECD TG 424 (1997)  
Dan il-Metodu tat-test kien ġie ddisinjat sabiex jakkwista l-inform ­
azzjoni me ħtieġa ħalli jikkonferma jew aktar jikkaratterizza l- 
potenzal tan-newrotossi ċità ta' kimika f'annimali adulti. Jista’ jkun 
jew imwettaq flimkien mal-Metodi tat-Test e żistenti dwar l-istudji 
tat-tossiċità għal doża repetuta jew li jkun imwettaq b ħala studju 
separat. Huwa rakkommandat li il-OECD Guidance Document on 
Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) jkun ikkonsultat 
sabiex jgħin fid-disinn ta' l-istudji bba żati fuq dan il-metodu ta' Test. 
Dan huwa partikolarment importanti meta modifiki ta' l-osser ­
vazzjonijiet u tal-pro ċeduri tat-test kif rakkommandat g ħall-użu 
b'rutina ta' dan il-metodu jkunu kkonsidrati. Id-Dokument ta' 
Gwida kien ġie ippreparat sabiex jiffa ċilita l-għażla ta' pro ċeduri 
oħrajn tat-test g ħall-użu f'ċirkostanzi spe ċifiċi. 
L-assess ta' l-i żvilupp newrotossiku mhux is-su ġġett ta' dan il- 
Metodu.  
1.1 INTRODUZZJONI  
Fl-assess u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi tal-kimika, huwa 
importanti li jkun ikkonsidrat il-potenzal ta' l-effetti newrotossi ċi. 
Diġa fil-Metodu tat-test dwar tossi ċità sistematika g ħal doża 
repetuta, jinkludi osservazzjonijiet li j ħarsu dwar in-newrotossi ċità 
potenzali. Dan il-Metodu ta' Test jista’ jkun u żat dabiex jiddisinja 
studju ħalli jakkwista aktar informazzjoni dwar, jew jikkonferma, l- 
effetti newrotossi ċi, osservati fl-istudji tat-tossi ċità sistematika f'do ża 
repetuta. B'dana kollu, kunsiderazzjoni dwar in-newrotossi ċità 
potenzali ta' klassijiet ta' kimika jistg ħu jissuġġerixxu li dawn 
jistgħu ikunu evalwati a ħjar bl-użu ta' dan il-metodu ming ħajr indi­
kazzjonijiet pre ċedenti tan-newrotossi ċità potenzali minn studji tat- 
tossiċità sistematika minn do ża repetuta. U ħud mill-kunsider ­
azzjonijiet jinklu, per e żempju:  
— l-osservazzjoni ta' sinjali newrolo ġiċi jew feriti newropatolo ġiċi 
fl-istudji tossi ċi apparti milli l-istudji tat-tossi ċità sustematika 
f'doża repetura, jew  
— relazzjoni strutturali jew informazzjoni o ħra li torbothom ma 
newrotossikanti mag ħrufa. 
B'żieda jista’ jkun hemm okka żżjonijiet oħrajn meta l-u żu ta' dan il- 
metodu ta' test jista’ jkun xieraq; g ħal aktar dettalji ara (1).  
Dan il-Metodu kien ġie żviluppat sabiex ikun jista’ ji ġi mfassal ħalli 
jilħaq il-ħtiġiet partikolari sabiex jikkonferma l- ħistopatolo ġija 
speċifika u n-newrotossi ċità ta' l-im ġieba ta' kimika kif ukoll 
jipprovdi karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar-reazzjonijiet 
newrotossi ċi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Fil-passat, in-newrotossi ċità kienet imqabbla man-newropatija li 
tinvolvi feriti newropatolo ġiċi jew disfunzjonijiet newrolo ġiċi, 
bħala ma huma attakk ta' puplesija, parali żi jew roda. G ħalkemm 
in-newropatija hija manifestazzjoni importanti tan-newrotossi ċità, 
issa huwa ċar li hemm ħafna sinjali o ħrajn tat-tossi ċità tas-sistema 
nervuża (eż. it-telf tal-kordinament muturili, it-tnaqqis sensitorju, id- 
disfunzjonijiet fil-tg ħallim u l-memorja) li jistg ħu ma jkunux riflessi 
fl-istudji newropati ċi jew ta' tipi o ħrajn. 
Dan il-Metodu ta' Test newrotossiku huwa iddisinjat sabiex ji żvela 
newro-im ġieba ma ġġuri u l-effetti newropatholo ġiċi f'annimali 
gerriema adulti. Waqt l-effetti ta' l-im ġieba, anki fin-nuqqas ta' 
tibdiliet morfolo ġiċi, jistgħu jirreflettu fuq l-impatt ħażin ta' l- 
organiżmi, mhux it-tibdiliet ta' l-im ġieba kollha huma spe ċifiċi 
għas-sistema nervu ża. Għalhekk, xi tibdiliet osservati g ħandhom 
ikunu evalwati b'konnessjoni mad-dettalji ħistopatolo ġiċi, ħemato­
loġiċi jew biokemikali korrelattivi kif ukoll l-informazzjoni dwar 
tipi oħrajn tat-tossi ċità sistematika. It-testijiet me ħtieġa b'dan il- 
metodu sabiex jipprovdu karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar- 
reazzjonijiet newrotossi ċi jinkludu pro ċeduri ħistopatolo ġiċi jew ta' 
l-imġieba speċifiċi li jitgħu aktar ikunu appo ġġjati minn investi ­
gazzjonijiet elettrofi żjoloġiċi u/jew biokimi ċi (1) (2) (3) (4).  
In-newrotossikanti jistg ħu jaġixxu fuq numru ta' miri fi ħdan is- 
sistema nervu ża u b'varjetà ta' mekkani żmi. La darba l-ebda medda 
ta' testijiet ma hija kapa ċi li tassessja fil-profond il-potenzal newro ­
tossiku tas-sustanzi kollha, jista’ jkun me ħtieġ li jkunu utilizzati 
testijiet  in vivo  jew  in vitro  oħrajn speċifiċi għat-tip tan-bewrotos ­
siċità osservata jew anti ċipata.  
Dan il-Metodu tat-Test jista’ jkun u żat ukoll, b'konnessjoni mal- 
gwida stabbilita fid-Dokument ta' Gwida OECD dwar l-Istrate ġiji u 
l-Metodi tat-testijiet Newrotossi ċi (1) li huma iddisinjati b ħala intiżi 
li aktar jikkaratterizzaw jew i żidu s-sensittività tal-kwantifikazzjoni 
tar-reazzjoni tad-do ża sabiex ikun hemm estimi a ħjar tal-livell ta' l- 
effet mhux-osservat- ħażin jew li jissustanzja perikoli mag ġrufa jew 
issusspetati tal-kimika. Per e żempju, l-istudji jistg ħu ikunu iddisinjati 
li jidentifikaw u jevaljaw il-mekkani żmi newrotossi ċi jew li 
jissupplementaw l-informazzjoni di ġa disponibbli mill-u żu tal- 
proċeduri bażiċi fl-osservazzjoni newro-im ġieba u newropatolo ġiċi. 
Tali studji mhux bilfors li jiddupplikaw l-informazzjoni li tkun ġiet 
ġenerata mill-u żu tal-pro ċeduri normali rakkommandati f'dan il- 
metodu jekk tali dettalji jkunu di ġa disponibbli u li ma humiex 
meqjusa b ħala meħtieġa għall-interpretazzjoni tar-ri żultati ta' l- 
istudju.  
Dan l-istudju newrotossiku, meta u żat waħdu jew flimkien ma 
oħrajn, jipprovdi informazzjoni li tista’:  
— tidentifika jekk is-sistema nervu ża tkun affettwata b'mod 
permanenti jew riversibbli mill-kimika ittestjata;  
— tikkontiribwixxi l-karatterizzazzjoni tat-tibdiliet fis-sistema 
nervuża assoċċjati ma l-espo żizzjoni lejn il-kimika, u dwar ir- 
rikonoxximent tal-mekkani żmu bażiku; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— tiddetermina ir-relazzjoni tad-do ża u tar-reazzjoni tal- ħin sabiex 
ikun ikkalkolat il-livell ta' l-effett ħażin mhux-osservat (li jista’ 
jkun użat sabiex jista’bbilixxi kriterja b'sigurtà g ħall-kimika).  
Dan il-Metodu ta' Test ju ża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat- 
test. Rotot o ħrajn ta' l-amministrazzjoni (e ż. dermali jew man-nifs) 
jistgħu ikunu aktar xierqa, u jistg ħu jeħtieġu modifika g ħall-proċessi 
rakkommandati. Konsiderazzjonijiet ta' l-g ħażla tar-rotta ta' l-ammin ­
istrazzjoni jkunu jiddependu mill-profil ta' l-espo żizzjoni umana u l- 
informazzjoni disponibbli, tossikolo ġika jew kinetika.  
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn 
linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organi żmu li jibqa ħaj, li jirri ­
priduċi jew li jadatta g ħall-ambjent.  
Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-do ża 
hija espressa b ħala piż (g. Mg) jew b ħala piż tas-sustanza tat-test 
għal kul unità tal-pi ż ta' l-annimal tat-test (e ż. mg/Kg), jew b ħala 
konċentrazzjonijiet dietarju kostanti 9ppm).  
Dożaġġ: Huwa terminu ġenerali li jinklu żi d-doża, il-frekwenza 
tagħha u t-tul ta ż-żmien tad-do żaġġ. 
Newrotossi ċità: Hija it-tibdil ħażin fl-istruttura jew fil-funzjoni tas- 
sistema nervu ża li tirriżulta minn espo żizzjoni lejn a ġent kimiku, 
bioloġiku jew fi żiku. 
Newrotassikant:  Huwa l-a ġent kimiku, biolo ġiku jew fi żiku li jkollu 
l-potenzal li jo ħloq in-newrotossi ċità. 
NOAEL:  Hija l-abbrevjazzjoni g ħall-livell ta' l-ebda effett avvers ma 
huwa osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-g ħola 
doża jew livell ta' espo żizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati 
mat-trattament ma jkunu osservati.  
1.3 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-kimika tat-test hija somministrata bir-rotta orali matul medda ta' 
dożi lil diversi gruppi ta' annimali gerriema tal-laboratorju. Do żi 
repetuti huma normalment ma ħtieġa, u r-regola tad-do żaġġ tista’ 
tkun 18 jum, subkronika (90 jum) jew kronika (sena jew aktar). Il- proċeduri stabbilitu f'dan il-Metodu ta' test jistg ħu wkoll ikunu u żati 
għall-istudju tan-newrotossi ċità akuta. L-annimali huma ittestjati 
sabiex jippermettu s-sejbien jew il-karatterizzazzjoni ta' l-im ġieba 
u/jew l-annormalitajiet newrolo ġiċi. Medda ta' m ġieba li tista’ tkun 
affettwata bin-newrotossikanti hija assessjata matul kull perjodu ta' l- 
osservazzjoni. Fl-a ħħar tat-test, subset ta' annimali ta' kull sess minn 
kull grupp huma mxerrda  in situ  u s-sezzjonijiet tal-mo ħħ, l-ispina 
dorsaali, u n-nervi periferali huma ippreparati u e żaminati.
 
Meta l-istudju jkun imwettaq b ħala studju independenti sabiex 
jevalwa n-newrotossi ċità jew li jikkaratterizza l-effetti newrotossi ċi, 
l-annimali f'kull grupp ma li jkunux u żati għat-tixrid u l- ħistopato­
loġija sussegwenti 9 ara t-Tabella 1) jista’ jkun u żat għall-proċeduri 
newro-im ġieba speċifika, n-newropatolo ġija, in-newrokimika jew 
elettrofiżjoloġiċi li jistgħu jissuplementaw l-informazzjoni akkwistat 
mill-eżaminazzjonijiet normali me ħtieġa b'daan il-Metodu (1). Dawn 
il-proċeduri supplementaji jistg ħu ikunu partikolarment utili meta l- 
osservazzjonijiet empiri ċi jew l-effetti mistennija jindikaw tip jew 
mira speċifika tan-newrotossi ċità ta' kimika. B'mod alternattiv, il- 
kumplament ta' l-annimaali jistg ħu ikunu u żati għal evalwazzjonijiet 
bħal dawk mitluba fil-Metodi tat-testijiet g ħal studji tat-tossi ċità 
f'doża repetuta fl-annimali gerriema.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Meta l-pro ċeduri ta' dan il-Metodu ta' Test huma mi ġbura ma dawk 
tal-metodi ta' testijiet o ħrajn, numru suffi ċċjenti ta' annimali huwa 
meħtieġ sabiex jissodisfa l- ħtiġiet għall-osservazzjonijiet ta ż-żewġ 
studji.  
1.4 ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1  L-g ħażla ta' l-ispe ċje ta' l-annimali  
L-ispeċje preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, g ħalkemm 
speċje oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun u żata. Annimali 
żgħażagħ adulti u b'sa ħħithom tas-siltiet normalment u żati fil- 
laboratorju g ħandhom ikunu utilizzati. Il-femminili g ħandhom 
ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Id-do żaġġ 
għandu normalment jibda malajr kemm jista’ jkun possibbli wara 
l-ftim, preferibbilemnt mhux aktar tard minn meta l-annimali jkollhom sitt ġimghat, u, fi kwalunkwe ka ż, qabel ma l-annimali 
jkunu għalqu d-disa' ġimghat. B'dana kollu, meta dan l-istudju 
jseħħ flimkien ma studji o ħrajn, din il- ħtieġa ta' l-età tista’ tkun 
teħtieġ aġġustament. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż ta' l- 
annimali u żati għandha tkun minima u ma te ċċedix 20 % tal-pi ż 
medju ta' kull sess. Meta studju ta' do ża repetita ftul qasir ta' 
żmien ikun imwettaq b ħala preliminarju g ħal studju f'terminu fit- 
tul, l-annimali mill-istess ti ġ u sorsi g ħandhom ikunu u żati fiż- 
żewġ studji.
 
1.4.2  Il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeġ u ta' l-g ħalf 
It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali g ħandha tkun 
22 o C (± 3  o C). Għalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill- 
anqas 30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % apparti milli waqt it- 
tindif tal-kamra, l-g ħan għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu 
jkun artifi ċjali, is-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa 
dlam. Ħsejjes għoljin intermittenti g ħandhom jin żammu għall-anqas 
possibbli. G ħall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistg ħu 
ikunu użati b'forniment ming ħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-g ħażla 
tad-dieta tista’ tkun influwenzata bil- ħtieġa li tkun assigurata inter- 
taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta somministrata b'dan il- 
metodu. L-annimali jistg ħu jinżammu individwalment jew li jkunu 
f'gaġġa bħala grupp żgħir ta' l-istess sess.  
1.4.3  Preparazzjoni ta' l-annimali  
Annimali żgħażagħ b'saħħithom ikunu assenjati kif jinzerta g ħal 
gruppi ta' trattament u tal-kontroll. Il-ga ġġeġ għandhom ikunu 
irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli min ħabba t-tqeg ħid fil- 
gaġġeġ ikunu minimizzat. L-annimali huma identifikati b'mod 
uniku u mi żmuma fil-ga ġġeġ tagħhom għal mill-anqas (5) ħamest 
ijiem qabel il-bidu ta' l-istudju sabiex jippermetti g ħall-akklamitiz ­
zazzjoni lejn il-kundizzjonijiet tal-laboratorju.  
1.4.4  Rotta ta' l-amministrazzjoni u l-preparazzjoni tad-do żi 
Dan il-Metodu ta' Test ju ża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat- 
test. L-amminstrazzjoni orali tista’ tkun bi tmieg ħ sfurzat, ma l-ikel, 
jew fl-ilma tax-xorb, jew b'kapsuli. Rotot o ħrajn ta' l-amminis ­
trazzjoni (e ż. dermali jew man-nifs) jistg ħu ikunu aktar xierqa, u 
jistgħu jeħtieġu modifika g ħall-proċessi rakkommandati. Konsider ­
azzjonijiet ta' l-g ħażla tar-rotta ta' l-amministrazzjoni jkunu 
jiddependu mill-profil ta' l-espo żizzjoni umana u l-informazzjoni 
disponibbli, tossikolo ġika jew kinetika. Ir-ra ġġjunar għall-għażla 
tar-rotta ta' l-aamministrazzjoni kif ukoll il-modifiki li jirri żultaw 
għall-proċeduri ta' dan il-metodu ta' test g ħandhom ikun indikati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Meta meħtieġ, is-sustanza tat-test tkun imdewwba jew sospi ża f'mezz 
xieraq. Huwa rakkommandat li, kull meta possibbli, l-u żu ta' taħlita/­
sospenzjoni akwea tkun meqjusa b ħala l-ewwel g ħażla, sewgeita bil- 
kunsiderazzjoni ta' ta ħlita/emulsjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħirrum) 
w imbagħad b'xi ta ħlita oħra f'mezzi o ħrajn. Il-karatteristi ċi tossiċi 
tal-mezz g ħandhom ikun u mag ħrufa. B'żieda, kunsiderazzjoni 
għandha ting ħata għal dawn il-karatteristi ċi li ġejjin dwar il-mezz: 
l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu, u ż- 
żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet 
kimiċi tas-sustanza tat-test li jistg ħu joħolqu bidla fil-karatteristi ċi 
tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l- 
istat nutrizzjonali ta' l-annimali.  
1.5 PRO ĊEDURI  
1.5.1  Numru u sess ta' l-annimali  
Meta l-istudju jkun imwettaq b ħala studju separat, mill-anqas 20 
annimal (10 nisa u 10 ir ġiel) għandhom ikunu u żati għal kull 
grupp tad-do ża u tal-kontroll g ħall-evalwazzjoni ta' l-osser ­
vazzjonijiet dettaljarti klini ċi u funzjonali. Mill-anqas ħamest irġiel 
u ħames nisa, mag ħżula minn dawk l-10 tir ġiel u l-għaxar nisa, 
għandhom ikunu mxerrda  in situ  u użati għall-newro ħistopatolo ġija 
dettaljata fit-tmiem ta' l-istudju. Fil-ka żi meta numru limitat biss ta' 
annimali jkunu mog ħti d-doża fil-grupp osservat g ħas-sinjal ta' l- 
effetti newrotossi ċi, kunsiderazzjoni g ħandha tkun mog ħtija għall- 
inklużjoni ta' dawn l-annimali f'dawk mag ħżula għat-tixrid. Meta l- 
istudju jkun imwettaq flimien ma l-istudju tat-tossi ċità ta' do ża 
repetuta, numru adekwat ta' annimali g ħandu jkun u żat sabiex 
jilħaq l-għanijiet ta ż-żewġ studju. In-numru minimu ta' annimali 
f'kull grupp g ħad-diversi ġemgħat ta' studji huwa mog ħti fit-tabella 
1. Jekk sa dan it-tant ikun hemm qtil jew gruppi ta' rkupru g ħall- 
osservazzjoni tar-riversabbiltà, l-persistenza jew l-okkorrenza 
mdewma ta' l-effetti tossi ċi ta' wara t-trattament, ikunu ippjanati 
jew meta osservazzjonijiet supplementarji jkunu ikkonsidrati, allura n-numru ta' l-annimali g ħandu jkun mi żjud sabiex jassigura li n- 
numru ta' l-anniamli me ħtieġa għall-osservazzjoni u l- ħistopatolo ġija 
jkunu disponibbli.
 
1.5.2  Grupp ta' trattament u tal-kontroll  
Mill-anqas tlett gruppi ta' do ża u grupp tal-kontroll g ħandhom 
ġeneralment ikunu u żati, imma jekk mill-assessjar ta' informazzjoni 
oħra, l-ebda effetti ma jkunu mistennija fid-do ża repetuta ta' 1 000 
mg/kg pi ż tal-ġisem/jum, tast ta' limitu jkunu jkun imwettaq. Jekk 
ma jkun hemm l-ebda informazzjoni disponibbli, medda ta' studju 
tas-sejbien tista’ tkun imwettqa sabiex tg ħin fid-determinazzjoni tad- 
dożi li għandhom ikunu u żati. Apparti milli g ħat-trattament bis- 
sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll g ħandhom ukoll 
ikunu mqandla b'manjera identika g ħas-suġġetti tal-grupp tat-test. 
Jekk ikun u żat mezz, il-grupp tal-kontroll g ħandu jirċievi il-mezz 
fl-għola volum u żat. 
1.5.3  Verifika ta' l-affidabbiltà  
Il-laboratorju li jwettaq l-istudju g ħandu jippre żenta informazzjoni li 
turi il-kapa ċità tiegħu li jwettaq l-istudju u s-sensittività tal-pro ċeduri 
użati. Tali informazzjoni g ħandha tipprovdi evidenza ta' l-abbiltà li 
jiżvela u jikkwantifika, kif xieraq, tibdiliet fl-g ħanijiet finali differenti 
kif rakkommandati g ħall-osservazzjoni, b ħal ma huma sinjali awto ­
matiki, reattività sensorja, is-sa ħħa tal-qabda fid-dirg ħajn u s-saqajn u 
l-attività motorili. L-informazzjoni dwar il-kimika li tikkaw ża tipi 
differenti ta' reazzjonijiet newrotossi ċi u jistgħu ikunu u żati bħala 
kontroll po żittiv tas-sustanzi jista’ jinstg ħab fir-referenzi 2 sa 9. L- 
informazzjoni storika tista’ tkun u żata jekk l-aspetti essenzali tal- 
proċeduri. Sperimentali jibqg ħu l-istess. A ġġornament perjodiku ta' 
l-informazzjoni storika huwa rakkommandat. Informazzjoni ġdida li 
turi s-sensittività kontinwa tal-pro ċeduri għandha tkun żviluppata 
meta uħud mill-elementi essenzali ta' l-im ġieba tat-test jew tal- 
proċeduri tkun ġiet mibdula mill-laboratorju li jwettaq l-istudji.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  L-g ħażla tad-do ża 
Il-livelli tad-do ża għandhom ikunu mag ħżula billi tkun meqjusa xi 
informazzjoni pre ċedentament osservata tat-tossi ċità u l-kinetika 
disponibbli g ħall-kompost tat-test jew tal-materjali relatati. L-g ħola 
livell tad-do ża għandu jkun mag ħżul bil-għan li jindu ċi effetti newro ­
tossiċi jew effetti ċari sistematikament tossi ċi. Sekwenza dixxendenti 
tal-livelli tad-do ża għandha tkun mag ħżulha bil-g ħan li turi 
kwalunkwe reazzjoni relatata mad-do ża u l-livell ta' l-ebda effett 
ħażin mhu osservat (NOAEL). B ħala prinċipju, il-livelli tad-do ża 
għandhom ikunu hekk stabbiliti sabiex primarjament l-effetti tossi ċi 
fuq is-sistema nervu ża jistgħu ikunu distingwiti mill-effetti relatati 
mat-tossiċità sistematika. Tnejn sa erba' intervalli huma ta' spiss 
ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-do ża dixxendenti, u ż- 
żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-u żu ta' 
intervalli ferm twal (e ż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-do żi. 
Meta jkun hemm estimi ra ġjonevili ta' espo żizzjoni umana, dan 
għandu jkun meqjus.  
1.5.5  Test tal-limitu  
Jekk l-istudju fl-livell ta' do ża ta' mill-anqas 1 000 mg/kg pi ż tal- 
ġisem.kull jum, li ju ża l-proċeduri deskritti, ma jipprodu ċi l-ebda 
effetti newrotossi ċi u jekk it-tossi ċità ma tkunx mistennija meta 
ibbażata fuq l-informazzjoni mill-komposti strutturament relatati, 
allura studju s ħiħ li juża tlett livelli ta' do żi jista’ li ma jkunx 
meqjus b ħala meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista’ 
tindika il- ħtieġa għal-livell ta' do ża orali għola li tkun u żata fit-test 
tal-limitu. G ħal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, b ħal ma hija l- 
applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fi żiko-kimiċi tas- 
sustanza tat-test, b ħal kemm tin ħall, ta' spiss tista’ tindika u tillimita 
l-livell massimu attenibbli ta' l-espo żizzjoni. G ħat-twettieq ta' studju 
akut orali, id-do ża tat-test tal-limitu g ħandha tkun ma mill-anqas 
2 000 mg/kg.  
1.5.6  Amministrazzjoni tad-do żi 
L-annimali huma mog ħtija d-doża bis-sustanza tat-test, ta' kull jum, 
sebat ijiet kull ġimgħa, għal perjodu ta' mill-anqas 28 jum; l-u żu tar- 
regola tad-do ża ta' ħamest ijiem jew perjodu ta' espo żizzjoni aqsar, 
jeħtieġ li jkunu ġustifikati. Is-sustanza tat-test hija somministrata 
f'doża waħda b'mod sfurzat bl-u żu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi 
inubazzjoni canula xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wie ħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l- 
annimal tat-test. Il-volum m'g ħandux jeċċedi 1 ml/100 g pi ż tal- 
ġisem. b'dana kollu fil-ka ż ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100 g tal-pi ż 
tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Apparti milli g ħal sustanzi irritanti 
jew korrossivi, li normalment ikununji żvelaw effetti e żasperanti 
b'konċentrazzjonijiet g ħola, varjabbilità fil-volum tat-test g ħandha 
tkun minimizzata bl-a ġġustament tal-kon ċentrazzjoni sabiex 
tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża.
 
Għal sustanzi amministrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, 
huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test 
kif involuti ma jkunux jinterferixxu man-nutriment normali jew mal- bilanċ ta' l-ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata fid-dieta, 
konċentrazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' do ża kostanti 
f'termini tal-pi ż tal-ġisem ta' l-annimal, jista’ jkun u żat; il-mod alter ­
nattiv użat għandu jkun spe ċifikat. Għal sustanza somministrata bi 
tmiegħ sfurzat, id-do ża għandha tkun mog ħtija f'ħinijiet simili ta' kull 
jum, u aġġustata mill-anqas darba fil- ġimgħa sabiex jin żamm livell 
kostanti ta' do ża f'termini tal-pi ż tal-ġisem ta' l-annimal. Meta l- 
istudju tad-do ża repetuta ikun u żat bħala preliminarju g ħal studju 
f'terminu fit-tul, dieta simili g ħandha tkun u żata fiż-żewġ studji. 
F'ċirkostanzi mhuix tas-solti li fihom do ża waħda ma tkunx 
possibbli, id-do ża tista’ ting ħata fi frazzjonijiet i żgħar matul 
perjodu li ma je ċċedix l-24 sieg ħa.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 OSSERVAZZJONIJIET  
1.6.1  Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet u t-testijiet  
Fi studji ta' do ża repetuta, il-perjodu ta' l-osservazzjoni g ħandu jkopri 
l-perjodu tad-do żaġġ. Fi studju akuti, perjodu ta' 14-il jum post-trat ­
tament, g ħandu jkun osservat. G ħall-annimali fi gruppi satteliti li 
huma mi żmuma ming ħajr espożizzjoni matul perjodu tal-post-trat ­
tament, l-osservazzjonijiet g ħandhom ikopru wkoll dan il-perjodu.  
L-osservazzjonijiet g ħandhom isiru fi frekwenza suffi ċjenti sabiex 
iqawwu l-probabbilità tas-sejbien ta' xi annormalitajiet fl-im ġieba 
u/jew fin-newrolo ġija. L-osservazzjonijiet g ħandhom, preferib ­
bilment, isiru fl-istess ħinijiet ta' kull jum b'kunsiderazzjoni 
mogħtija għall-perjodu l-aktar qawwi ta' l-effetti anti ċipati wara d- 
dożaġġ. Il-frekwenza ta' l-osservazzjonijiet klini ċi u tat-testijiet funz ­
jonali huma mi ġbura f'sommarju fit-Tabella 2. Jekk informazzjoni 
kinetika jew informazzjoni o ħra minn studji pre ċedenti tindika il- 
ħtieġa ta' l-użu ta' punti differenti tal- ħon, it-testijiet jew il-perjodu 
post-osservazzjoni, skeda alternattiva g ħandha tkun adotta sabiex 
tkun akkwistata l-informazzjoni massima. Ir-ra ġunar għal tibdil ta' 
l-iskeda g ħandu jkun ipprovdut.  
1.6.1.1  Osservazzjonijiet dwar il-kundizzjonijiet ġenerali tas-sa ħħa u tal- 
mortalità/morbidità  
L-annimali kollha g ħandhom ikunu osservati bir-reqqa mill-anqas 
darba kull jum fir-rigward tal-kundizzjoni tas-sa ħħa tagħhom kif 
ukoll mill-anqas darbtejn kull jum dwar il-morbidità u l-moralità.  
1.6.1.2  Osservazzjonijiet klini ċi dettaljati  
Osservazzjonijiet klini ċi dettaljati g ħandhom isiru fuq l-annimali 
kollha mag ħżula għal dan l-iskop (ara t-Tabella 1), darba qabel l- 
ewwel espo żizzjoni (sabiex jippermetti g ħal paraguni fi ħdan is- 
suġġett), u f'ħinijiet differenti minn hemm il-quddiem, jiddependi 
mit-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). Osservazzjoni klini ċi dettaljati 
fuq gruppi satellita ta' l-irkupru g ħandhom isiru fit-tmiem tal-perjodu 
ta' l-irkupru. Osservazzjoni klini ċi dettaljati g ħandhom isiru il-barra 
mill-gaġġa ta' fejn jin żammu f'arena normali. Dawn g ħandhom ikunu 
reġistrati bir-reqqa bl-u żu ta' sistemi tal-marki li jinkludi kriterja jew 
skali tal-marki g ħal kull kejl fl-osservazzjonijiet. Il-kriterja jew l- 
iskali użati għandhom ikunu spli ċitament definiti mil-laboratorju 
tat-test. Sforz g ħandu jsir sabiex jassigura li l-varjazzjonijiet fil- 
kundizzjonijiet tat-test ikunu minimi (mhux sistematikament relatati 
mat-trattament) u li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa minn osser ­
vaturi mħarrġa li ma jkunux konxi bit-trattament attwali.  
Huwa rakkommandat li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa f'g ħamla 
strutturali li fiha kriterja ben definita (inklu ża d-definizzjoni tal- 
“medda” normali) ikunu sistematikament applikati ma kull annimal fuq waqt ta' l-osservazzjon. Il-“medda normali” g ħandha tkun adek ­
watament dokumentata. Is-sinjali osservati kollha g ħandhom ikunu 
reġistrati. Kull meta prattikabbli, il-magnitudini tas-sinjali osservati 
għandhom ukoll ikunu rekordjati. L-osservazzjonijiet klini ċi 
għandhom jinkludu, imma ma jkunx limitati g ħall-ambjament fil- 
ġilda, fis-suf, fl-g ħajnejn, fil-membrani muko żi, fl-okkorrenza tas- 
sekrazzjonijiet u tal- ħmieġ u l-attività awtomatika
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
(eż. lakrimazzjoni, piloerezzjoni, id-daqs tal-pupilla, g ħamla repi ­
ratorja mhux normali u/jew in-nifs mill- ħalq, xi sinjali mhux tas- 
soltu ta' l-urina jew tal-qlalet, u urina b'kulur stramb). Xi reazzjonijiet mhux tas-soltu fir-rigward tal-po żissjoni tal- ġisem, il-livell ta' l- 
attività (e ż. tnaqqis jew żieda fl-esplorazzjoni fl-arena normali) u l- 
kordinament tal-moviment, g ħandhom ukoll ikunu innotati. Tibdil 
fil-mixi (e ż. xengil, atassja), il-posizzjoni (e ż. b'darhom 
mgħawweġ) u r-reattività g ħat-tqandil, it-tqeg ħid jew stimulu 
ambjentali o ħraajn, kif ukoll il-pre żenta ta' movimenti kloni ċi jew 
toniċi, konvul żjonijiet jew rog ħda, stereotipi (e ż. kura żejda, 
movimenti mhux normali tar-ras, dawrien repetittiv) jew im ġieba 
stramba (e ż. gdim jew li jilg ħaqu b'mod e ċċessiv, mutilazzjoni 
tagħhom stess, mixi lura, vokalizzazzjoni) jew aggressjoni 
għandhom ikunu rekordjati.
 
1.6.1.3  Testijiet funzjonali  
L-istess b ħall-osservazzjonijiet klini ċi dettaljati, it-testijiet funzjonali 
għandhom ukoll ikunu mwettqa qabel l-espo żizzjoni pre ċedenti u ta' 
spiss minn hemm il-quddiem fuq l-annimali kollha mag ħżula għal 
dan l-iskop (ara t-Tabella 1) Il-frekwenza tat-testijiet funzjonali hija 
wkoll dipendenti fuq it-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). B' żieda mal- 
perijodi ta' l-osservazzjoni kif elenkati fit-Tabella 2, l-osser ­
vazzjonijiet funzjonali fuq gruppi satellita ta' l-irkupru g ħandhom 
ukoll isiru malajr kemm jista’ jkun possibbli lejn il-qtil tat- 
terminazzjoni. It-testijiet funzjonali g ħandhom jinkludu ir-reattività 
sensitorja g ħall-istimu ta' diversi modalitajiet, e ż. l-istimuli awditorji, 
viżwali u proprjoseptivi (5)(6)(7)), bl-assa ġġ tal-forza tad-dirg ħajn u 
s-saqajn (8) u l-assa ġġ ta' l-attività motorili (9). L-attività motorili 
għandha tkun imkejjla b'apparat awtomatiku li jkun kapa ċi jiżvela 
kemm it-tnaqqis u wkoll i ż-żidiet fl-attività. Jekk tkun u żata sistema 
definita o ħra, din g ħandha tkun kwantitattiva u s-sensittività u l- 
affiddabbilità tag ħha għandhom ikunu demonstrati. Kull apparat 
għandu jkun ittestjat sabiex jassigura affiddabbilità matul i ż-żmien 
u li jkun konsistenti bejn l-apparati. Aktar dettalji tal-pro ċeduri li 
jistgħu ikunu segwiti huma mog ħtija fir-referenzi rispettivi. Jekk 
ma jkun hemm l-ebda informazzjoni (e ż. attività strutturali, dettalji 
epidemjolo ġiċim studju tossikolo ġiċi oħrajn(sabiex jindikaw l-effetti 
newrotossi ċi potenzali, l-inklu żjoni ta' aktar testijiet spe ċjalizzati tal- 
funzjoni sensitorja u motorili jew tat-tg ħallim u tal-memorja, sabiex 
jeżaminaw dawn l-effetti possibbli f'aktar dettall, g ħandhom ikunu 
ikkonsidrati. Aktar informazzjoni dwar testijiet spe ċjalizzati u l-u żu 
tagħhom hija disponibbli fi (1).  
B'mod eċċezzjonali, l-annimali li ji żvelaw sinjali ta' tossi ċità sal- 
limitu li din tkun sinifikament tfixkel it-test funzjonali, dawn 
jistgħu jitħallew barra mit-test. Ġustifikazzjoni g ħall-eliminazzjoni 
ta' l-annimali minn test funzjonali g ħandha tkun ipprovduta.  
1.6.2  Il-pi ż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma  
Għal studju ta' sa 90 jum, l-annimali kollha g ħandhom ikunu mi żuna 
mill-anqas darba fil- ġimgħa u l-kejl g ħandu jittie ħed tal-konsum ta' l- 
ikel (konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija somministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil- ġimgħa. Għal studji fit-tul, l- 
annimali kollha g ħandhom ikunu mi żuna mill-anqas darba fil- 
ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 4 ġimgħat 
minn hemm il-quddiem. Il-kejl g ħandu jsir fuq il-konsum ta' l-ikel 
(il-konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija somministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil- ġimgħa għall-ewwel 13 il- ġimgħa u 
imbagħad f'madwar intervalli ta' tlett-xhur, sakemm l-istat tas-sa ħħa 
jew tat-tibdiliet fil-pi ż tal-ġisem jiddettaw mod ie ħor.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Optalmolo ġija 
Għal studji itwal minn 28 jum, l-e żaminazzjoni optalmolo ġika, bl- 
użu ta' optalmoskopju jew strument ekwivalenti addattat, g ħandha 
ssir qabel l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test u fit-terminazzjoni 
ta' l-istudju, preferibbilment fuq l-annimali kollha, imma mill-anqas 
fuq l-annimali f'do ża għolja u l-gruppi ta' kontroll. Jekk tibdiliet fl- 
għajnejn ikunu żvelati, jew, jekk sinjali klini ċi jindikaw il- ħtieġa, l- 
annimali kollha g ħandhom ikunu ezaminati. G ħal studji fit-tul, 
eżaminazzjoni optalmolo ġika għandha titwettaq mat-13-il ġimgħa. 
L-eżaminazzjonijiet optalmolo ġiċi ma humiex me ħtieġa jekk din l- 
informazzjoni tkun di ġa disponibbli minn studji o ħrajn ta' tul simili u 
f'livelli ta' do ża simili.  
1.6.4  Ħematoloġija u l-biokemistrija klinika  
Meta l-istudju newrtossiku jkun imwettaq flimkien ma studju tossiku 
sistematiku b'do ża repetuta, l-e żaminazzjonijiet ħematoloġiċi u d- 
determinazzjoni tal-biokemistrija klinika g ħandhom jitwattqu kif 
elenkat fil-Metodu rispettiv ta' l-istudju tossiku sistematiku. Il- ġbir 
tal-kampjuni g ħandu jkun imwettaq b'tali mod li xi effetti potenzali 
fuq in-newro-im ġieba jkunu minimizzati.  
1.6.5  Ħistopatolo ġija 
L-eżaminazzjoni newropatolo ġika għandha tkun iddisinjata sabiex 
tikkumplementa u testendi l-opsservazzjonijiet mag ħmula matul il- 
fażi in vivo  ta' l-istudju. Siltiet minn mill-anqas 5 annimali/sess/grupp 
(ara t-Tabella 1 u l-paragrafu li ġej) għandhom jitwettqu  in situ , bl- 
użu ta' perfu żjoni ġenerali rikonoxxuta u t-teknika tal-fissazzjoni (ara 
r-refernza 3, il-kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). Kwalunkwe tibdiliet kbar osservabbli g ħandhom ikunu irre ġistrati. Meta l-istudju 
jkun imwettaq b ħala aspett ta' l-istudju wa ħdu dwar in-newrotossi ċità 
hew sabiex jikkaratterizza l-effetti newrotossi ċi, il-kumplament ta' l- 
anniamli jistg ħu ikunu u żati jew g ħal newro-im ġieba speċifika (10) 
(11), newropatolo ġija (10) (11) (12) (13), mewrokimika (10) (11) 
(14) (15) jew elettropsikolo ġija (10) (11) (16) (17), pro ċeduri li 
jistgħu jissupplementaw il-pro ċeduri u l-e żaminazzjonijiet deskritti 
hemmhekk, jew sabiex i żidu in-numru ta' su ġġetti eżaminati g ħall- 
ħistopatolo ġija. Dawn il-pro ċeduri supplementaji jistg ħu ikunu parti ­
kolarment utili meta l-osservazzjonijiet empiri ċi jew l-effetti 
mistennija jindikaw tip jew mira spe ċifika tan-newrotossi ċità ta' 
kimika. B'mod alternattiv, il-kumplament ta' l-annimali jistg ħu 
wkoll ikunu u
żati għal evalwazzjoni patolo ġiċi ta' rutina kif 
deskritt fil-Metodu g ħal studju ta' do ża repetuta.  
Proċedura ta' tbg ħajja ġenerali, b ħal ma hija l- ħematossilin u l-eosin 
(H&E), g ħandha tkun imwettqa fuq il-kampjuni tal-bi ċċiet kollha 
mgħaddsa fil-paraffin, u e żaminazzjoni mikroiskopika g ħandha 
tkun imwettqa. Jekk ikunu osservati sinjali ta' newropatija periferali, jew jekk dawn ikunu issusspetati, kampjuni mg ħaddsa fil-plastika 
tan-nisġa tal-nervu periferali, g ħandha tkun e żaminata. Sinjali 
kliniċi jistgħu wkoll jissu ġġerixxi siti addizzjonali g ħall-eżami­
nazzjoni jew l-u żu ta' pro ċeduri spe ċjali tat-tbg ħajja. Gwida dwar 
siti addizzjonali tista’ tinsab fi (3) (4). Tbg ħajja speċjali xierqa 
sabiex jurutipi spe ċifiċi tat-tibdil patolo ġiku jistgħu wkoll ikunu ta' 
għajnuna (18).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Sezzjonijiet rapre żentattivi tas-sistema nervu ża ċentrali u periferali 
għandhom ikunu e żaminati b'mod ġistoloġiku (ara r-referenza 3, il- 
kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). I ż-żoni eżaminati 
għandhom normalment jinkludu: Il-parti ta' quddiem tal-mo ħħ, iċ- 
ċentru tal-cerebrum, inklu ża sezzjoni matul il-hippocampus, il- 
moħħ fin-nofs, il-cerebellum, il-pons, il-medulla oblongata, l- 
għajnejn bin-nerv ottiku u r-retina, l-ispina dorsali u t-tinfie ħ 
ċervikali u lumbari, il-gan ġilja ta' l-g ħerq dorsali, il-fibri dorsali u 
vetrali, in-nerv xjatiku prossimali, innerv tibjali prossimati (fl- 
irkoppa) u n-nerv tibjali fil-frieg ħi tal-musolu tal-pexxun. L-ispina 
dorsali u s-sezzjonijiet tan-nervi periferali g ħandhom jinkludu s- 
sezzjonijiet laterali jew transversjali u lon ġitudinali. Attenzjoni 
għandha tkun mog ħtija għas-sistema vaskulaturali u nervu ża. 
Kampjun tal-muskolu skeletali, partikolarment il-muskolu tal- 
pexxun, g ħandu wkoll ikun e żaminat. Attenzjoni spe ċjali għandha 
tingħata lis-siti bi struttura ċellullari u fibru ża u d-disinn fil-CNS u il- 
PNS mag ħrufa li huma partikolarment affettwati bin-newrotossikanti,  
Gwida dwar l-alterazzjonijiet newropatologikali li tipikament 
jirriżultaw minn espo żizzjoni tossika jistg ħu jinstabu fir-referenzi 
(3) (4). E żmai ta' pass b'pass tal-kampjuni tal-bi ċċiet huwa rakkom ­
mandat li fih is-sezzjonijiet minn grupp ta' do ża għolja jkunu l- 
ewwel paragunati ma dawk tal-grupp ta' kontroll. Jekk l-ebda tibdiliet newropatolo ġikali ma jkunu osservati fil-kampjuni minn 
dawn il-gruppi, anali żi sussegwenti ma tkunx me ħtieġa. Jekk alter ­
azzjonijiet newropatolo ġiċi jkunu osservati fil-grupp ta' do ża għolja, 
il-kampjun minn kull nis ġiet potenzalment affettwati, mill-gruppi 
tad-doża medja jew baxxa, g ħandhom imbag ħad ikunu kodifiklati 
u sekwenzalment e żaminati.
 
Jekk xi evidenza ta' alterazzjonijiet newropatolo ġikali tkun misjuba 
fl-eżaminazzjoni kwalitattiva, allura it-tieni e żaminazzjoni g ħandha 
tkun imwettqa fuq ir-re ġjuni kollha tas-sistema nervu ża li turi 
dawn l-alterazzjonijiet. Sezzjonijiet mill-gruppi tad-do żi kollha 
minn kull re ġjun potenzalment affettwat g ħandhom ikunu kodifikati 
u eżaminati kif jinzerta ming ħajr ma tkun mag ħrufa l-kodi ċi. Il- 
frekwenza u s-severità ta' kull ferita g ħandha tkun re ġistrata. Wara 
li r-reġjuni kollha mill-gruppi tad-do żi kollha jkunu ġew iggradati, il- 
kodiċi tista’ tkun żvelata ul-anali żi statistika mwettqa sabiex tevalwa 
r-relazzjonijiet do ża-reazzjoni. E żempji tal-gradi differenti tas- 
severità ta' kull ferita g ħandhom ikunu deskritti.  
Is-sejbiet newro ġatoloġiċi għandhom ikunu evalwati fil-kuntest ta' l- 
osservazzjoni u l-kejl ta' l-im ġieba, kif ukoll xi informazzjoni o ħra 
mill-istudji pre ċedenti u konkorrenti tat-tossi ċità sistematika dwar is- 
sustanza tat-test.  
2. DATA  
2.1 TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Data ta' l-annimal individwali g ħandha tkun ipprovduta. B' żieda, l- 
informazzjoni kollha g ħandha tkun mi ġbura f'sommarju, f'g ħamla 
tubulati, li turi g ħal kull test jew g ħal kull grupp, in-numru ta' l- 
annimali fil-bisu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta waqt 
it-test jew dawk maqtula g ħal raġunijiet umanitarji, u l- ħin tal-mewt 
jew tal-qtil umanitarju, in-numru li juru sinjali ta' tassi ċità, desk­
rizzjoni tas-sinjali tat-tossi ċità osservati, inklu ż il-ħin ta' meta 
jiskoppjaw, it-tul tal- ħin, it-tip u s-sevirità ta' effetti tossi ċi, in- 
numru ta' l-annimali li jkollhom feriti, inklu żi t-tipi u s-severità 
tal-feriti.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2 EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Is-sejbiet ta' l-istudju g ħandhom ikunu evalwati f'termini ta' l-in ċi­
denza, severità u korrelazzjoni ta' l-effetti newro-im ġieba u newro ­
patoloġiċi (l-effetti bewrokimi ċi jew elettrofi żjoloġiċi kif ukoll jekk 
l-eżaminazzjonijiet supplementari huma nklu żi) u xi effetti ħżiena 
oħrajn li jkunu osservati. Meta possibbli, r-ri żultati numeri ċi 
għandhom ikunu evalwati bil-metodu xieraq u ġeneralment statis ­
tikament a ċċettabbli. Il-motodi statisti ċi għandhom ikunu mag ħżula 
matul id-disinn ta' l-istudju.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1 RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika (inklu żi l-propjetajiet i żomeriċi, l-purità u 
fiżikokimiċi); 
— dettalji ta' l-identifikazzjoni.  
Mezz (jekk applikabbli):  
— il-ġustifikazzjoni tal-mezz u żat. 
Annimali tat-test:  
— speċje/tipi użati; 
— in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;  
— is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-ga ġġeg, id-dieta, etc;  
— il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad- 
dieta, Il-kon ċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omo ġenità 
tal-preparazzjoni;  
— speċifikazzjonijiet tad-do żi amministrati, inklu żi d-dettalji tal- 
mezz, il-volum u l-g ħamla fiżika tal-materjal amministrat;  
— dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;  
— ir-raġjonar għal-livell tad-do ża magħżula; 
— ir-raġġjonar tar-rotta u t-tul ta' żmien ta' l-espo żizzjoni;  
— skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-kon ċ­
entrazzjoni (ppm) lejn do ża attwali (mg/kg il-pi ż tal-ġisem/jum), 
jekk applikabbli;  
— dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.  
Osservazzjoni u pro ċedura tat-test:  
— dettalji ta' l-assenjar ta' l-annimali lejn kull grupp u tat-tixrid tas- 
sub-gruppi;  
— dettalji tas-sistemi tal-marki, inklu ża l-kriterja g ħall-iskali tal- 
marki dwar kull kejl fl-osservazzjonijiet klini ċi dettaljati;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— dettalji dwar it-testijiet funzjonali g ħar-reattività sensitorja lejn l- 
istimuli ta' modalitajiet differenti (e ż. awditorji, vi żwali u 
proprjoċettivi); għall-assessjar tal-forza tal-qabda tad-drieg ħ jew 
tas-sieq; g ħall-assessjar ta' l-attività motorili (inklu żi dettalji ta' 
apparat awtomatiku sabiex ji żvela l-attività); u l-pro ċeduri l- 
oħrajn kif u żati; 
— dettalji ta' l-e żaminazzjonijiet optalmolo ġiċi u, jekk xieraq, l- 
eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi u t-testijiet klini ċi tal-biokem ­
istrija bil-valuri relavanti tal-bidu;  
— dettalji g ħall-proċeduri newroim ġieba, newropatolo ġija, newro ­
kimika jew elettrofi żjoloġiċi speċifiċi. 
Riżultati:  
— il-piż tal-ġisem/tibdiliet fil-pi ż tal-ġisem, inklu żi l-piż tal-ġisem 
mal-qatla;  
— il-konsum ta' l-ikel u l-konsum ta' l-ilma, kif xieraq;  
— dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u l-livell tad-do ża, inklużi 
sinjali ta' tossi ċità jew mortalità;  
— in-natura, is-severità u t-tul ta' żmien (il-waqt ta' meta jiskoppja u 
l-korsa sussegwenti) ta' l-osservazzjonijiet klini ċi (sew jekk river ­
sibbli u anki jekk le);  
— deskrizzjoni dettaljata tar-ri żultati kollha tat-test funzjonali;  
— is-sejbiet tan-nekropsija;  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha, newroim ġieba, newropa ­
toloġikali, u newrokimi ċi jew elettrofi żjoloġiċi, jekk disponibbli;  
— id-dettalji ta' l-assorbazzjoni u l-metaboli żmu, (jekk disponibbli);  
— trattament statistiku tar-ri żultati, meta xieraq.  
Diskussjoni tar-ri żultati:  
— informazzjoni dwar ir-reazzjoni mad-do ża; 
— relazzjoni ma xi effetti tossi ċi oħrajn lejn konklu żjoni dwar il- 
potenzal newrotossiku tal-kimika tat-test;  
— il-livell ta' l-ebda effett ħazin ma jkun osservat.  
Kunklużjonijiet:  
— stqarrija spe ċifika dwar il-globalità newrotossika tal-kimika tat- 
test hija nkorra ġġita. 
4. REFERENZI  
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing 
Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals.  
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neur ­
ological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999- 
1003.  
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in 
Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267-283.  
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. 
Toxicol., 1, 233-236.  
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599-609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neur ­
otoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343-352.  
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neur ­
otoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotox ­
icology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Living ­
stone.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabella 1  
Numru minimu ta' annimali me ħtieġa għal kull grupp meta l-istudju newrotossiku ikun imwettaq separatament 
jew flimkien ma studji o ħrajn  
STUDJU NEWROTOSSIKU IMWETTAQ B ĦALA: 
Studju separate Studju flimkien mal- 
istudju ta’ 28 jum Studju flimkien mal- 
istudju ta 90 jum Studju flimkien mal- 
istudju dwar it-tossi ċità 
kronika  
Numru totali ta' l-annimali 
kull grupp 10 maskili u 10 
femminili 10 maskili u 10 
femminili 15 maskili u 15 
femminili 25 maskili u 25 
femminili 
Numru ta' annimali 
magħżula għal testijiet 
funzjonali, inklu żi l-osser­
vazzjonijiet klini ċi dettaljati 10 maskili u 10 
femminili 10 maskili u 10 
femminili 10 maskili u 10 
femminili 10 maskili u 10 
femminili 
Numru ta' annimali 
magħżula għal kull tixrid  in 
situ u n-newro ħispatoloġija 5 maskili u 5 
femminili 5 maskili u 5 
femminili 5 maskili u 5 
femminili 5 maskili u 5 
femminili 
Numru ta' annimali 
magħżula għall-osser­
vazzjonijiet ta' do żi tossiċi 
repetuti/subkroni ċi/koron 
iċi, il-ħematoloġija, il- 
biokemistrija klinika, il- ħispatoloġija, eċċ., kif 
indikat fil-Linji ta' Gwida 
rispettivi. 5 maskili u 5 
femminili 10 maskili u 10 
femminili † 20 maskili † u 20 
femminili † 
Osservazzjoni supple ­
mentarja, kif xieraq 5 maskili u 5 
femminili
 
† tinkludi ħames annimali mag ħżula għall-ittestjar funzjonali u osservazzjonijiet klini ċi bħala parti mill-istudju tan-newrotossi ċita ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabella 2  
Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet klini ċi u tat-testijiet funzjonali  
Tip ta' l-osservazzjoni It-tul ta' l-istudju 
Akut 28-jum 90-jum Kroniku  
L-annimali kollha Kondizzjoni 
ġenerali tas- 
saħħa Kull jum Kull jum Kull jum Kull jum 
Mortalià/ 
morbidità Darbtejn kull 
jum Darbtejn kull 
jum Darbtejn kull 
jum Darbtejn kull jum 
Fl-annimali 
magħżula għall- 
osservazzjonij iet 
funzjonali Osservazzjonij 
iet kliniċi 
dettaljati — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Fi żmien 8 
siegħat mid- 
doża fl- 
estimi tal- ħin 
l-aktar 
effettiv 
— Fil-jum 7 u 
14 ta' wara 
d-doża — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Darba fil- 
ġimgħa 
minn hem mil-quddiem — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Darba matul 
l-ewwel u t- tieni ġimgħa 
ta' l- 
espożizzjoni 
— Darba fix- 
xahar minn hemm il- 
quddiem — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Darba fit- 
tmiem ta' l- ewwel xahar ta' l- 
espożizzjoni 
— Darba kull 
tlett xhur, minn hemm 
il-quddiem 
Testijiet Funz ­
jonali — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Fi ż
mien 8 
siegħat mid- 
doża fl- 
estimi tal- ħin 
l-aktar 
effettiv 
— Fil-jum 7 u 
14 ta' wara d-doża — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Matul ir- 
raba' ġimgha 
tat-trat­
tament, kemm jista’ 
jkun qrib 
possibbli lejn it-tmiem tal-perjodu 
ta' l- 
espożizzjoni — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Darba matul 
l-ewwel u t- 
tieni ġimgħa 
ta' l- espożizzjoni 
— Darba fix- 
xahar minn hemm il- quddiem — Qabel l- 
ewwel espożizzjoni 
— Darba fit- 
tmiem ta' l- 
ewwel xahar ta' l- espożizzjoni 
— Darba kull 
tlett xhur, minn hemm il-quddiem
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  L-ASSORBIMENT TAL- ĠILDA: IL-METODU  IN VIVO  
1. IL-METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent g ħall-OECD TG 427 (2004).  
1.1 DA ĦLA 
L-espożizzjoni g ħal ħafna kimi ċi ssir l-aktar permezz tal- ġilda 
filwaqt li l-parti l-kbira ta’ l-istudji tossikolo ġi mwettqa fuq l- 
annimali tal-laboratorju ju żaw ir-rotta orali ta’ l-amministrazzjoni. 
L-istudju ta’ l-assorbiment perkutanju  in vivo  stabbilit f’din il-linja 
gwida jipprovdi l-kollegament me ħtieġ biex jiġi estrapolat mill- 
istudji orali meta jsiru l-valutazzjonijiet tas-sigurtà wara l- 
espożizzjoni dermali.  
Sustanza trid bilfors taqsam g ħadd kbir ta’ saffi ta’ ċelloli tal- ġilda 
qabel ma til ħaq iċ-ċirkolazzjoni. Il-pass li jiddetermina r-rata g ħall- 
parti l-kbira tas-sustanzi huwa l-i stratum corneum  li jikkonsisti 
f’ċelloli mejtin. Il-permeabbiltà mill- ġilda tiddependi kemm fuq il- 
lopofiliċità tal-kimika kif ukoll fuq il- ħxuna tas-saff barrani ta’ l- 
epidermis, ukoll fuq fatturi b ħall-piż molekulari u l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza. B’mod ġenerali, il- ġilda tal-firien u tal-fniek hija aktar 
permeabbli minn dik tal-bnedmin, filwaqt li l-permeabilità tal- ġilda 
tal-fniek ta’ l-indi u tax-xadini hija aktar simili g ħal dik ta’ l-umani.  
Il-metodi biex jitkejjel l-assorbiment perkutanju jistg ħu jitqassmu 
f’żewġ kategoriji;  in vivo  u in vitro . Il-metodu  in vivo  huwa 
kapaċi li jipprovdi informazzjoni tajba, f’bosta spe ċi tal-laboratorju, 
dwar l-assorbiment mill- ġilda. Aktar re ċenti, ġew żviluppati l-metodi  
in vitro . Dawn ju żaw it-trasport minn ġilda ta’ ħxuna sħiħa jew 
parzjali ta’ l-annimali jew umana lejn kontenitur ta’ l-ilma. Il- metodu  in vitro  huwa deskritt f’Metodu tat-Test separat (1). Huwa 
rrakkomandat li d-Dokument ta’ Gwida ta’ l-OECD g ħat-Twettiq ta’ 
l-Istudji dwar l-Assorbiment mill- Ġilda (2) ji ġi kkonsultat g ħall- 
għajnuna fl-g ħażla tal-metodu tal-aktar xieraq fis-sitwazzjoni, 
għaliex jipprovdi aktar dettalji dwar kemm huma xierqa l-metodi  
in vivo  u in vitro .
 
Il-metodu  in vivo , deskritt f’dan il-metodu, jippermetti d-deter ­
minazzjoni tal-penetrazzjoni tas-sustanza tat-test mill- ġilda għal 
ġewwa l-kompartiment sistemiku. It-teknika intu żat b’mod mifrux 
għal ħafna snin (3)(4)(5)(6)(7). G ħalkemm l-istudji  in vitro  dwar l- 
assorbiment perkutanju jistg ħu jkunu xierqa f’ ħafna każijiet, jista’ 
jkun hemm sitwazzjonijiet fejn studju  in vivo  biss jista’ jipprovdi 
d-data me ħtieġa. 
Il-vantaġġi tal-metodu  in vivo  huma li ju ża sistema li hija fi żjoloġi­
kament u metabolikament intatta, ju ża speċi li hija komuni g ħal 
bosta studji dwar it-tossi ċità u jista’ ji ġi mmodifikat g ħall-użu ma’ 
speċi oħrajn. L-iżvantaġġ huma li jintu żaw annimali ħajjin, il-b żonn 
ta’ materjal li huwa radjotikkettjat biex ji ġu ffaċilitati r-ri żultati 
dipendibbli, u d-diffikultajiet fid-determinazzjoni tal-fa żi ta’ l-assor ­
biment bikri u d-differenzi fil-permeabilità tal- ġilda ta’ l-ispe ċi 
preferita (firien) u tal-bniedem. Il- ġilda ta’ l-annimali normalment 
hija aktar permeabbli u g ħalhekk tista’ to ħloq stima kbira wisq 
dwar l-assorbiment perkutanju tal-bniedem (6)(8)(9). Is-sustanzi 
kawstiċi/korrożivi m’għandhomx ji ġu ttestjati fl-annimali ħajjin. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Doża mhux assorbita:  tirrappre żenta dik ma ħsula mill-wi ċċ tal- 
ġilida wara l-espo żizzjoni u kwalunkwe do ża preżenti fuq il- 
kopertura mhux poru ża, inkluża kwalunkwe do ża murija li ti żvinta 
minn fuq il- ġilda matul l-espo żizzjoni.  
Doża assorbita ( in vivo ): tinkludi dik pre żenti fl-urina, fil- ħasil tal- 
gaggi, fil-fe ċi, fl-arja skaduta (jekk ti ġi mkejla), fid-demm, fi ċ-ċelloli 
(jekk jinġabru) u fil-karkass li jifdal, wara t-tne ħħija tal-ġilda tas-sit 
ta’ l-applikazzjoni.  
Doża li tista’ ti ġi assorbita:  tirrappre żenta d-do ża preżenti fuq jew 
ġewwa l-ġilda wara l- ħasil. 
1.3 IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test, preferibbilment radjotikkettjata, hija applikata fuq 
il-ġilda mqaxxra ta’ annimali f’livell wie ħed jew aktar ta’ do ża 
xierqa fil-forma ta’ preparazzjoni fl-u żu rappre żentattiva. Il- 
preparazzjoni tat-test hija permessa li tibqa’ fil-kuntatt mal- ġilda 
għal perjodu ta’ żmien fiss ta ħt kopertura xierqa (mhux poru ża, 
semi-poru ża, jew poru ża) biex ti ġi mrażżna l-inġestjoni tal- 
preparazzjoni tat-test. Fl-a ħħar tal-ħin ta’ l-espo żizzjoni l-kopertura 
titneħħa u l-ġilda titnaddaf b’a ġent xieraq tat-tindif, il-kopertura u l- 
materjali tat-tindif jin żammu għall-analiżi u tiġi provduta kopertura 
oħra. L-annimali jin żammu qabel, matul u wara l-perjodu ta’ l- 
espożizzjoni f’ga ġġi tal-metaboli żmu individwali, u l- ħmieġ u l-arja 
minfuħa ‘l barra f’dawn il-perjodi jin ġabru għall-analiżi. Il-ġbir ta’ l- 
arja minfu ħa ‘l barra jista’ jit ħalla barra meta hemm bi żżejjed 
informazzjoni li ftit jew xejn metabolit radjoattiv ma ji ġi ffurmat. 
Normalment kull studju jinvolvi bosta gruppi ta’ annimali li se ji ġu 
esposti g ħall-preparazzjoni tat-test. Grupp wie ħed jinqatel fl-a ħħar 
tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni. Gruppi o ħrajn jinqatlu f’intervalli ta’ 
ħin skedati wara dan (2). Fl-a ħħar tal-ħin tat-teħid tal-kampjuni l- 
annimali li jifdal jinqatlu, jin ġabar id-demm g ħall-analiżi, jitneħħa s- 
sit ta’ l-applikazjoni g ħall-analiżi u l-karkass huwa anali żżat għal 
materjal li ma ġiex ekskretat. Il-kampjuni huma mog ħdija mill- 
esperiment b’mezzi xierqa u l-livell ta’ l-assorbiment perkutanju 
jiġi stmat (6)(8)(9).  
1.4 DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.4.1  L-g ħażla ta’ l-ispe ċi ta’ l-annimali  
Il-far huwa l-ispe ċi użata l-aktar spiss, i żda fergħat u speċi mingħajr 
suf li għandhom rati ta’ l-assorbiment tal- ġilda aktar simili g ħal dawk 
tal-bnedmin, jistg ħu jintużaw ukoll (3)(6)(7)(8)(9). G ħandhom 
jintużaw annimali adulti żgħażagħ u b’saħħithom ta’ sess uniku 
(is-sess normali huwa maskili) ta’ ferg ħat użati ħafna fil-laboratorji. 
Fil-bidu ta’ l-istudju, il-varjazzjoni tal-pi ż ta’ l-annimali u żati 
m’għandhiex te ċċedi ± 20 % tal-pi ż medju. B ħala eżempju, il- 
firien maskili ta’ 200 g – 250 g huma xierqa, b’mod partikolari fl- 
ogħla nofs ta’ din il-firxa.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2  L-g ħadd u s-sess ta’ l-annimali  
Għandu jintu ża għal kull preparazzjoni tat-test u g ħal kull ħin ta’ 
tmiem skedat, grupp ta’ mhux inqas minn erba’ annimali ta’ sess uniku. Kull grupp ta’ annimali jinqatel wara intervalli ta’ żmien 
differenti, per e żempju fl-a ħħar tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni (tipi ­
kament 6 sig ħat jew 24 sieg ħa) u fuq okkorrenzi sussegwenti (e ż. 
48 u 72 sieg ħa). Jekk hemm data disponibbli li juru differenzi 
sustanzjali fit-tossi ċità dermali bejn il-maskili u l-femminili, 
għandu jintg ħażel is-sess l-aktar sensittiv. Jekk ma hemmx data 
minn din, jista’ jintu ża kwalunkwe sess.
 
1.4.3  Il-kundizzjonijiet ta ż-żamma u l-g ħalf 
It-temperatura fil-kamra ta’ l-esperimenti ta’ l-annimali g ħandha tkun 
ta’ 22  o C (± 3  o C). Għalkemm l-umdità relattiva g ħandha tkun g ħall- 
inqas 30 % u preferibbilment ma te ċċedix 70 % ħlief matul it-tindif 
tal-kamra, wie ħed għandu jimmira lejn 50-60 %. Id-dawl g ħandu 
jkun artifi ċjali, u s-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa 
dlam. Għall-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju 
u għandhom ikunu liberament disponibbli flimken ma’ provvista 
mingħajr limitu ta’ ilma g ħax-xorb. Matul l-istudju, u preferibbilment 
ukoll matul l-akklimatizzazzjoni, l-annimali jin żammu individ ­
walment f’ga ġeġ tal-metaboli żmu. Ladarba t-twaqqig ħ ta’ l-ikel u 
ta’ l-ilma jista’ jikkomprometti r-ri żultati, il-probabbiltà ta’ dawn l- 
okkorrenzi g ħandha tiġi minimizzata.  
1.4.4  Il-preparazzjoni ta’ l-annimali  
L-annimali huma mmarkati biex tkun possibbli l-identifikazzjoni 
individwali u jin żammu fil-ga ġeġ tagħhom għall-inqas g ħal ħamest 
ijiet qabel ma jinbeda l-istudju biex tkun possibbli l-akklimatiz ­
zazzjoni g ħall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.  
Wara l-perjodu ta’ l-akklimatizzazzjoni, u madwar 24 sieg ħa qabel 
ma tingħata d-doża, kull animal ikollu parti ta’ ġilda fir-re ġjun ta’ l- 
ispallejn u d-dar imqaxxra. Il-karatteristi ċi ta’ permeazzjoni ta’ ġilda 
danneġġjata huma differenti mill- ġilda intatta u g ħandu jkun hemm 
attenzjoni li l- ġilda ma tinbaraxx. Wara t-tqaxxir u madwar 24 sieg ħa 
qabel ma ti ġi applikata s-sustanza tat-test, (ara t-tqsima 1.4.7) il-wi ċċ 
tal-ġilda għandu jintmesa ħ bl-aċeton biex jitne ħħa s-sebum. Mhijiex 
rakkomandata ħasla addizzjonali bis-sapun u bl-ilma g ħaliex ir- 
residwu tas-sapun jista’ jippromwovi l-assorbument tas-sustanza 
tat-test. I ż-żona għandha tkun kbira bi żżejjed biex tippermetti 
kalkolu dipendibbli ta’ l-ammont tal-kimika tat-test asssorbit, prefer ­
ibbilment g ħall-inqas 10 ċm 2 . Din iż-żona hija prattikabbli bil-firien 
ta’ piż tal-ġisem ta’ 200-250 g. Wara l-preparazzjoni, l-annimali ji ġu 
ritornati g ħal-gaġeġ tal-metaboli żmu. 
1.4.5  Is-sustanza tat-test  
Is-sustanza tat-test hija l-entità li l-karatteristi ċi tal-permeazzjoni 
tagħha għandhom ji ġu studjati. Idealment, is-sustanza tat-test 
għandha tiġi radjotikkettjata.  
1.4.6  Il-preparazzjoni tat-test  
Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test (e ż. materjal mhux im ħallat, 
imħallat jew ifformulat li fih il-kimika tat-test li hija applikata 
għall-ġilda(għandha tkun l-istess (jew surrogat realistiku) b ħal dik 
li għalihom jistg ħu jkunu esposti l-umani jew spe ċi oħrajn potenzjali 
mmirati. Kwalunkwe varjazzjoni mill-preparazzjoni “fl-u żu” għandha 
tkun iġġustifikata. Fejn me ħtieġ, is-sustanza tat-test hija ma ħlula jew 
sospiża f’kontenitur xieraq. G ħal kontenituri minbarra l-ilma, il- 
karatteristi ċi ta’ l-assorbiment u l-interazzjoni potenzjali mas- 
sustanza tat-test g ħandhom ikunu mag ħrufa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7  L-applikazzjoni tal- ġilda 
Sit ta’ applikazzjoni ta’ arja tal-wi ċċ speċifika hija ddefinita fuq wi ċċ 
il-ġilda. Ammont mag ħruf tal-preparazzjoni tat-test huwa mbag ħad 
applikat b’mod uniformi fuq is-sit. Dan l-ammont g ħandu norm ­
alment jimita l-espo żizzjoni potenzjali umana, tipikament 1- 
5 mg/ċm 2 għal solidu jew sa 10 μl/ċm 2 għal-likwidi. Kwantitajiet 
oħrajn għandhom ikunu ġġustifikati bil-kundizzjonijiet ta’ l-u żu 
mistenni, l-g ħanijiet ta’ l-istudju jew il-karatteristi ċi fiżiċi tal- 
preparazzjoni tat-test. Wara l-applikazzjoni, is-sit ittrattat g ħandu 
jiġi protett milli jintmess. E żempju ta’ tag ħmir tipiku jintwera fil- 
Figura 1. Normalment, is-sit ta’ l-applikazzjoni ji ġi protett b’ko ­
pertura mhux poru ża (eż. għata tal-gar ża tan-nylon permeabbli). 
Iżda, għal applikazzonijiet infiniti, is-sit ta’ l-applikazzjoni g ħandu 
jiġi okkluż. Fil-każ li l-evaporazzjoni ta’ sustanzi tat-test semi-volatili 
jnaqqas ir-rata ta’ l-irkupru tas-sustanza tat-test sa livell mhux a ċċet­
tabbli (ara wkoll it-taqsima 1.4.1.0, l-ewwel paragrafu), huwa 
neċessarju li s-sustanza li żvintat tiġi evaporata f’filtru tal-fa ħam li 
jkopri t-tag ħmir ta’ l-applikazzjoni (ara l-Figura 1). Huwa importanti 
li t-tagħmir ma jag ħmilx ħsara lill-ġilda, u lanqas ma jassorbi jew 
jirreaġixxi mal-preparazzjoni tat-test. L-annimali huma ritornati fil- 
gaġeġ tal-metaboli żmu individwali sabiex jin ġabar il-ħmieġ tagħhom.  
1.4.8  Kemm iddum l-espo żizzjoni u t-te ħid tal-kampjuni  
Id-dewmien ta’ l-espo żizzjoni huwa l-intervall bejn l-applikazzjoni u 
t-tneħħija ta’ preparazzjoni bil- ħasil tal-ġilda. Għandu jintu ża perjodu 
rilevanti ta’ l-espo żizzjoni (tipikament 6 sig ħat jew 24 sieg ħa) fuq 
bażi tad-dewmien ta’ l-espo żizzjoni mistennija umana. Wara l- 
perjodu ta’ l-espo żizzjoni, l-annimali jin żammu fil-ga ġeġ tal-meta ­
boliżmu sat-terminazzjoni kif ippjanat. L-annimali g ħandhom ji ġu 
osservati g ħal sinjali ta’ tossi ċità/reazzjonijiet mhux normali f’in ­
tervalli regolari g ħal kemm idum l-istudju kollu. Fla ħħar tal- 
perjodu ta’ l-espo żizzjoni, il- ġilda ttrattata g ħandha tiġi osservata 
għal sinjali vi żibbli ta’ irritazzjoni.  
Il-gaġeġ tal-metaboli żmu għandhom jippermettu l- ġbir separat ta’ l- 
urina u l-fe ċi matul l-istudju kollu. G ħandhom jippermettu l- ġbir ta’ 
diossidu tal-karbonju  14 C u komposti volatili ta’ karbonju  14 C, li 
għandhom ji ġu analizzati meta prodotti f’kwantitajiet kbar (> 5 %). 
L-urina, il-fe ċi u l-fluwidi intrappolati (e ż. diossidu tal-karbonju  14 C 
u komposti volatili ta’  14 C) għandhom jin ġabru individwalment minn 
kull gripp fil- ħin tat-teħid tal-kampjuni. Jekk hemm bi żżejjed inform ­
azzjoni li ftit metabolit radojattiv li ji żvinta, jew xejn, ma ji ġi 
ffurmat, jistg ħu jintużaw gaġeġ miftuħin. 
Matul il-perjodu ta’ l-espo żizzjoni, jin ġabru l-excreta, sa 24 sieg ħa 
wara l-ewwel kuntatt tal- ġilda u mbag ħad kuljum sa l-a ħħar ta’ l- 
esperiment. Filwaqt li normalment ikunu bi żżejjed tliet intervalli tal- 
ġbir ta’ l-excreta, l-g ħan ippjanat tal-preparazzjoni tat-test jew id-data 
kinetika e żistenti jistg ħu jissuġġerixxu punti ta’ żmien addizzjonali 
għall-istudju.  
Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espo żizzjoni it-tag ħmir protettiv jitne ħħa 
minn kull annimal u jitne ħħa minn kull annimal u jin żamm separat 
għall-analiżi. Jekk il- ġilda ttrattata ta’ l-annimali kollha g ħandha 
tinħasel għall-inqas 3 darbiet bl-a ġent tat-tindif bl-u żu ta’ tajjar 
xieraq. G ħandu jkun hemm attenzjoni biex ji ġi evitat il-kontami ­
nazzjoni ta’ partijiet o ħrajn tal-ġisem. L-a ġent tat-tindif g ħandu 
jirrappreżenta l-prattika normali ta’ l-i ġjene, eż. taħlita tas-sapun 
bl-ilma. Fl-a ħħar, il-ġilda għandha tiġi xxuttata. It-tajjar kollu u l- 
ħasil kollu g ħandhom jin żammu għall-analiżi. Għandha tiġi provduta 
kopertura friska biex is-sit ittrattat ta’ dawk l-annimali li jiffurmaw 
il-gruppi tal-punti ta’ ħin ta’ wara ji ġi protett, qabel ma jittie ħdu lura 
fil-gaġeġ individwali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9  Il-pro ċeduri terminali  
Għal kull grupp, l-annimali individwali g ħandhom jinqatlu fil- ħin 
ippjanat u d-demm jin ġabar għall-analiżi. It-tagħmir jew kopertura 
protettivi g ħandhom jitne ħħew għall-analiżi. Il-ġilda mis-sit ta’ l- 
applikazzjoni u minn żona simili ta’ ġilda mhux iddo żata u 
mqaxxra g ħandhom jitne ħħew minn kull annimali g ħal analiżi 
separata. Is-sit ta’ l-applikazzjoni jista’ jkun frazzjonat biex ji ġi 
sseparat l-i stratum corneum  mill-epidermis ta’ ta ħt biex ting ħata 
aktar informazzjoni dwar id-dispo żizzjoni tal-kimika tat-test. Id- 
determinazzjoni ta’ din id-dispo żizzjoni wara l-mog ħdija ta’ żmien 
ta’ l-espo żizzjoni g ħandha tipprovdi xi indikazzjoni tad-destin ta’ 
kwalunkwe kimika tat-test fl-i stratum corneum . Biex tkun fa ċli l- 
frazzjonazzjoni tal- ġilda (wara l-a ħħar ħasla tal-ġilda u l-qtil ta’ l- 
annimal) kull kopertura protettiva titne ħħa. Il-ġilda tas-sit ta’ l-appli ­
kazzjoni, bi ċ-ċirku anulari tal- ġilda madwarha, tinqata’ minn mal-far 
u tiġi mwaħħla b’labra fuq bi ċċa njama. Strixxa ta’ tejp ti ġi mwaħħla 
mal-wiċċ tal-ġilda bl-użu ta’ pressjoni bil-mod u t-tejp jitne ħħa 
flimkien ma’ parti mill-i stratum corneum . Jiġu applikati strixxi ta’ 
tejp oħrajn sakemm it-tejp ma jibqax je ħel mal-wi ċċ tal-ġilda, meta l- 
istratum corneum  kollu jkun tne ħħa. Għal kull animal, l-istrixxi 
kollha tat-tejp jistg ħu jiġu kkombinati f’kontenitur wie ħed li 
mbagħad jiżdied mieg ħu diġestant tat-tessut biex jissolubilizza l- 
istratum corneum . Jistgħu jitneħħew tessuti potenzjalment immirati 
għal kejl separat qabel ma ji ġi analiżżat il-karkass residwali g ħad- 
doża assorbita tal-karkass. Il-karkassi ta’ l-annimali individwali 
għandhom jin żammu għall-analiżi. Normalment l-organi mmirati 
jitneħħew għall-analiżi separata (jekk indikat minn studji o ħrajn). 
L-urina pre żenti fil-marrara fil-qtil ippjanat g ħandha tiżdied mal- 
ġabra ta’ l-urina ta’ qabel. Wara li jin ġabar il-ħmieġ mil-gaġeġ tal- 
metaboliżmu wara l-qtil fil- ħin ippjanat, il-ga ġeġ u l-bibien tag ħhom 
għandhom jin ħaslu b’solvent xieraq. G ħandu wkoll ji ġi analizzat 
tagħmir ieħor potenzjalment ikkontaminat.  
1.4.10  Anali żi 
Fl-istudji kollha g ħandu jinkiseb l-irkupru xieraq (ji ġifieri medja ta’ 
100 ± 10 % tar-radjoattività). L-irkupru barra minn din il-firxa 
għandu jiġi ġġustifikat. L-ammont tad-do ża somministrata f’kull 
kampjun g ħandu jiġi analizzat fi pro ċeduri validati kif xieraq.  
Il-kunsiderazzjonijiet statisti ċi għandhom jinkludu mi żura ta’ 
varjanza g ħar-replikati g ħal kull applikazzjoni.  
2. DATA  
Dan il-kejl g ħandu jsir g ħal kull annimal, f’kull ħin tat-teħid tal- 
kampjuni g ħall-kimika tat-test u/jew metabolite. Minbarra d-data 
individwali, id-data mi ġbura skond il- ħinijiet tat-te ħid tal-kampjuni 
għandha tiġi rrapportata b ħala medja.  
— kwantità asso ċjata ma’ l-applikazzjonijiet protettivi;  
— kwantità li tista’ tinqala’ minn mal- ġilda; 
— kwantità fi/fuq il- ġilda li ma tista’x tin ħasel minn mal- ġilda; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— kwantità fid-demm li ttie ħed bħala kampjun;  
— kwantità fl-excreta u fl-arja skaduta (jekk xieraq);  
— kwantità li jifdal fil-karkass u kwalunkwe organi mne ħħi għall- 
analiżi separata.  
Il-kwantità tas-sustanza tat-test u/jew metabolit fil- ħmieġ, fl-arja 
skaduta, fid-demm u fil-karkass tippermetti d-determinazzjoni ta’ l- 
ammont totali assorbit f’kull punt ta’ ħin. Jista’ jinkiseb ukoll 
kalkolu ta’ l-ammont ta’ kimika tat-test assorbit g ħal kull ċm 2 ta’ 
ġilda esposta g ħas-sustanza tat-test fil-perjodu ta’ l-espo żizzjoni.  
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1 IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport g ħandu jinkludi r-rekwi żiti stipulati fil-protokoll, inklu ża 
ġustifikazzjoni tas-sistema tat-test u żata u għandu tinkludi dawn li 
ġejjin:  
Is-Sustanza tat-Test:  
— id-data ta’ l-identifikazzjoni [e ż. CAS numru, jekk disponibbli; 
għajn; safa (safa radjokimika); impuritajiet mag ħrufin; numru tal- 
lott] 
— in-natura fi żika, il-karatteristi ċi fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, 
solubilità, stabilità, pi ż molekulari u P  ow ). 
Il-preparazzjoni tat-test:  
— formulazzjoni u ġustifikazzjoni ta’ l-u żu; 
— dettalji tal-preparazzjoni tat-test, l-ammont applikat, il-kon ċen­
trazzjoni miksuba, il-mezz, l-istabilità u l-omo ġeneità.  
L-annimal tat-test:  
— speċi/fergħa użata; 
— numbru, età u sess ta’ l-annimali;  
— għajn ta’ l-annimali, kundizzjonijiet ta ż-żamma, dieti, e ċċ.; 
— piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.  
Il-kundizzjonijiet tat-test:  
— dettalji ta’ l-amministrazzjoni tal-preparazzjoni tat-test (sit ta’ l- 
applikazzjoni, metodi ta’ l-esperiment, poro żità/nuqqas ta’ 
porożità, volum, estrazzjoni, skoperta);  
— dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u l-ilma.  
Riżultati:  
— sinjali ta’ tossi ċità; 
— data tabulata dwa l-assorbiment (espresso b ħala rata, ammont jew 
persentaġġ); ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— irkupri totali ta’ l-esperiment;  
— interpretazzjoni tar-ri żultati, tqabbil ma’ data disponibbli jew 
assorbiment perkutanju tal-kompost tat-test.  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
1. Metodu tat-Test B.45. L-Assorbiment tal- Ġilda: Metodu  In vitro  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.  
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements. J.  Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), 829-835.  
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment.  
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic . 28, 369-373.  
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol . 54, 399- 
404. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figura 1  
Eżempju ta’ Di żinn ta’ Tag ħmir Tipiku u żat biex ji ġi Definit u Protett Sit ta’ l- 
Applikazzjoni Dermali matul Studji  in vivo  ta’ l-Assorbiment Perkutanju
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  L-ASSORBIMENT TAL- ĠILDA: IL-METODU  IN VITRO  
1. IL-METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent g ħall-OECD TG 428 (2004).  
1.1 DA ĦLA 
Dan il-Metodu ġie ddiżinjat biex jipprovdi informazzjoni dwar l- 
assorbiment ta’ sustanza tat-test applikata g ħall-ġilda maqtug ħa 
barra. Jista’ ji ġi kkombinat mal-Metodu g ħall-Assorbiment tal- 
Ġilda: Il-Metodu  In vivo  (1), jew isir separatament. Huwa rrak ­
komandat li d-Dokument ta’ Gwida ta’ l-OECD g ħat-Twettiq ta’ l- 
Istudji dwar l-Assorbiment mill- Ġilda (2) ji ġi kkonsultat g ħall- 
għajnuna fid-disinn ta’ l-istudji bba żati fuq dan il-Metodu. Id- 
Dokument ta’ Gwida ġie ppreparat biex jiffa ċilita l-għażla ta’ 
proċeduri  in vitro  xierqa g ħall-użu f’ċirkostanzi spe ċifiċi, biex ti ġi 
żgurata d-dependibbiltà tar-ri żultati miksuba b’dan il-metodu.  
Il-metodi biex jitkejjel l-assorbiment perkutanju jistg ħu jitqassmu 
f’żewġ kategoriji;  in vivo  u in vitro . Il-metodi  in vivo  dwar l-assor ­
biment tal- ġilda huma stabbiliti sew u jipprovdu informazzjoni 
farmakokinetika f’firxa ta’ spe ċje ta’ l-annimali. Il-metodu  in vivo  
huwa deskritt separatament f’Metodu tat-Test ie ħor (1). Il-metodi  in 
vitro  ukoll intu żaw għal bosta snin biex jitkejjel l-assorbiment tal- 
ġilda. Għalkemm l-istudji tal-validazzjoni formali tal-metodi  in vitro  
koperti b’dan il-Metodu tat-Test ma sarux, l-esperti ta’ l-OECD qablu fl-1999 li kien hemm bi żżejjed data evalwata biex issostni l- 
metodu  in vitro  (3). Aktar dettalji li jissostanzjaw dan is-sostenn, 
inkluż għadd sinjifikanti ta’ paraguni diretti tal-metodi  in vitro  u in 
vivo,  jingħataw mad-Dokument ta’ Gwida (2). Hemm g ħadd ta’ 
monografi li je żaminaw dan is-su ġġett u jag ħtu sfond dettaljat 
dwar l-użu ta’ metodu  in vitro  (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Il- 
metodi  in vitro  jkejlu d-diffu żjoni tal-kimika fi u minn ġo l-ġilda 
lejn kontenitur tal-fluwidu u jistg ħu jużaw ġilda mhux vijabbli biex 
ikejlu d-diffu żjoni biss, jew ġilda attiva, metabolikament attiva, biex 
fl-istess ħin ikejlu d-diffu żjoni u l-metaboli żmu tal-ġ
ilda. Dawn il- 
metodi nstabu partikolarment utli b ħala skrin g ħat-tqabbil tat-twassil 
tal-kimika fi u minn ġo l-ġilda minn formolazzjonijiet differenti u 
jistgħu wkoll jipprovdu mudelli utli g ħall-istima ta’ l-assorbiment 
perkutanju mill- ġilda. 
Il-metodu  in vitro  jista’ ma jg ħoddx għas-sitazzjonijiet kollha jew 
għall-klassijiet kollha tal-kimi ċi. Jista’ jkun possibbli li jintu ża l- 
metodu tat-test  in vitro  għall-evalwazzjoni kwalitattiva inizzjali tal- 
penetrazzjoni tal- ġilda. F’xi ka żijiet jista’ jkun me ħtieġ li mbagħad 
ikun hemm id-data  in vivo . Id-dokument ta’ gwida (2) g ħandu jiġi 
kkonsultat g ħal aktar elaborazzjoni ta’ sitwazzjonijiet fejn ikun 
xieraq il-metodu  in vitro . Informazzjoni addizzjonali dettaljata biex 
tiġi sostnuta d-de ċiżjoni tingħata f’(3).  
Dan il-metodu jippre żenta l-prin ċipji ġenerali biex jitkejjel l-assor ­
biment dermali u t-twassil tas-sustanza tat-test bl-u żu tal-ġilda 
maqtugħa barra. Tista’ tintu ża l-ġilda minn bosta spe ċje mammiferi, 
inklużi l-bnedmin. Il-karatteristi ċi tal-permeabilità tal- ġilda jinżammu 
wara li tinqata’ minn mal- ġilda għaljiex l-ostakolu prin ċipali tad- 
diffużjoni huwa l-i stratum corneum  mhux vijabbli; it-trasport attiv 
tal-kimika mill- ġilda ma ġiex identifikat. Il- ġilda ntweriet li g ħandha 
l-kapaċità li timmetabolizza xi kimika matul l-assorbiment perkutanju 
(6), iżda dan il-pro ċess ma jillimitax ir-rata f’termini ta’ do ża 
attwalment assorbita, g ħalkemm jista’ jaffettwa n-natura ta’ 
materjal li da ħlet fis-sistema tad-demm.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Doża mhux assorbita:  tirrappre żenta dik ma ħsula mill-wi ċċ tal- 
ġilida wara l-espo żizzjoni u kwalunkwe do ża preżenti fuq il- 
kopertura mhux poruza, inklu ża kwalunkwe do ża murija li ti żvinta 
minn fuq il- ġilda matul l-espo żizzjoni.  
Doża assorbita ( in vitro ): massa tas-sustanza tat-test li til ħaq il- 
fluwidu re ċettur jew i ċ-ċirkolazzjoni sistemika f’ ħin speċifikat.  
Doża li tista’ ti ġi assorbita ( in vitro ): tirrappreżenta d-do ża preżenti 
fuq jew ġewwa l-ġilda wara l- ħasil. 
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test, li tista’ tkun radjotikkettjata, hija applikata fuq il- 
wiċċ ta’ kampjun tal- ġilda li jissepara żewġ kompartimenti ta’ ċellola 
tad-diffużjoni. Il-kimika tibqa’ fuq il- ġilda għal żmien speċifikat taħt 
kundizzjonijiet spe ċifikati, qabel ma titne ħħa bi proċedura xierqa tat- 
tindif. Jittie ħed kampjun tal-fluwidu re ċettorju f’punti matul l- 
esperiment u ji ġi analizzat g ħall-kimika tat-test u/jew metaboliti.  
Meta jintu żaw sistemi metabolikament attivi, il-metaboliti tal-kimika 
tat-test jistg ħu jiġu analizzati b’metodi xierqa. Fl-a ħħar ta’ l- 
esperiment, id-distribuzzjoni tal-kimika tat-test u l-metaboliti tag ħha 
jiġu kkwantifikat, meta jkun xieraq.  
Bl-użu ta’ kundizzjonijiet xierqa, li huma deskritti f’dan il-metodu u 
fid-dokument ta’ gwida (2), l-assorbiment ta’ sustanza tat-test matul 
terminu definit jitkejjel bl-anali żi tal-fluwidu re ċettorju u tal- ġilda 
ttrattata. Is-sustanza tat-test li jifdal fil- ġilda għandha titqies b ħala 
assorbita mill-valuri tal-fluwidu re ċettorji wa ħdu. L-anali żi tal- 
komponenti o ħrajn (materjal ma ħsul minn mal- ġilda u li jifdal fis- 
saffi tal-ġilda) tippermetti evalwazzjoni ulterjuri tad-data, inklu ża d- 
dispożizzjoni totali tas-sustanza tat-test u l-per ċentwal ta’ l-irkupru.  
Biex jintwera l-operat u d-dipendibbiltà tas-sistema tat-test fil- 
laboratorju tal- ħidma, ir-ri żultati għall-kimiċi rilevanti ta’ referenza 
għandhom ikunu disponibbli u bi qbil mal-letteratura pubblikata 
għall-metodu u żat. Dan ir-rekwi żit jista’ jintla ħaq billi ti ġi ttestjata 
sustanza xierqa ta’ riferenza (preferibbilment ta’ lipofili ċità qrib is- 
sustanza tat-test) b’mod konkurrenti mas-sustanza tat-test jew bil- proviżon ta’ data storika xierqa g ħal għadd ta’ sustanzi ta’ 
riferenza ta’ lipofili ċità differenti (e ż. il-kaffeina, l-a ċidu benżoiku, 
u t-testosterone).
 
1.4. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.4.1  Iċ-ċellola tad-diffu żjoni 
Ċellola tad-diffu żjoni tikkonsisti f’kompartiment donatur u kompar ­
timent reċettorju li bejniethom titqieg ħed il-ġilda (eżempju ta’ di żinn 
tipiku huwa provdut fil-Figura 1). I ċ-ċellola għandha tipprovdi si ġill 
tajjeb madwar il- ġilda, tippermetti t-te ħid faċli tal-kampjuni u ta ħlit 
tajjeb tat-ta ħlita reċettorja f’kuntatt mal-parti ta’ ta ħt tal-ġilda, u l- 
kontroll tajjeb tat-temperatura ta ċ-ċellola u l-kontenut tag ħha. Iċ- 
ċelloli stati ċi u li jippermettu d-diffu żjoni bit-tnixxija huma t-tnejn 
aċċettabbli. Normalment, il-kompartimenti donaturi jit ħallew mhux 
porużi matul l-espo żizzjoni g ħal doża tal-preparazzjoni tat-test. 
Madankollu, g ħal applikazzjonijiet infiniti u g ħal xi xenarji g ħal 
dożi finite, il-kompartimenti donaturi jistg ħu jkunu poru żi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Il-fluwidu re ċettorju  
L-użu ta’ fluwidu re ċettorju fiżjoloġikament kondu ċiv huwa preferit 
għalkemm jistg ħu jintużaw kemm-il darba huma ġġustifikati. Il- 
kompożizzjoni pre ċiża tal-fluwidu re ċettorju g ħandha tkun 
provduta. Is-solubilità xierqa tal-kimika tat-test fil-fluwidu re ċettorju 
għandha tintwera sabiex ma ta ġixxix bħala ostakolu g ħall-assor­
biment. Barra minn hekk, il-fluwidu re ċettorju m’g ħandux jaffettwa 
l-integrità tal-preparazzjoni tal- ġilda. F’sistema tat-tnixxija, ir-rata tat- 
tnixxija m’g ħandhiex tostakola d-diffu żjoni ta’ sostanza tat-test fil- 
fluwidu re ċettorju. F’sistema ta’ ċelloli stati ċi, il-fluwidu g ħandu jiġi 
mħawwad kontinwament u jittie ħdu l-kampjuni regolarment. Jekk il- 
metaboliżmu qed ji ġi studjat, il-fluwidu re ċettorju għandu jsostni l- 
vijabilità tal- ġilda tul l-esperiment kollu.  
1.4.3  Il-preparazzjonijiet tal- ġilda 
Tista’ tintu ża ġilda minn g ħejun umani jew ta’ l-annimali. Huwa 
rikonoxxut li l-u żu tal-ġilda umana huwa so ġġett għal kunsider ­
azzjonijiet u kundizzjonijiet eti ċi nazzjonali u internazzjonali. 
Għalkemm hija preferuta ġilda vijabbli, tista’ tinu ża wkoll ġilda 
mhux vijabbli kemm-il darba l-integrità tal- ġilda tista’ tintwera. 
Huma aċċettabbli membrani epidermali (separati en żimikament, 
bis-sħana jew kimikament) jew ġilda ta’ ħxuna maqsuma (tipikament 
ħoxna daqs 200-400 μm) ippreparati b’dermatome. Tista’ tintu ża 
ġilda ta’ ħxuna sħiħa iżda l-ħxuna eċċessiva  (ca. > 1 mm) 
għandha tiġi evitata kemm-il darba mhijiex spe ċifikament me ħtieġa 
għad-determinazzjoni tal-kimika tat-test fis-saffi tal- ġilda. L-għażla 
ta’ l-ispeċje, tas-sit anatomiku u tat-teknika preparattiva g ħandhom 
ikunu ġġustifikati. Id-data a ċċettabbli minn minimu ta’ erba’ replikati 
għal kull preparazzjoni tat-test hija me ħtieġa. 
1.4.4  L-integrità tal-Preparazzjoni tal- Ġilda 
Huwa essenzjali li l- ġilda hija ppreparata sew. L-immani ġġjar mhux 
xieraq jista’ jirri żulta f’dannu lill-i stratum corneu m, u għalhekk l- 
integrità tal- ġilda ppreparata g ħandha tiġi ċċekkjata. Meta ji ġi 
investigat il-metaboli żmu tal-ġilda, il-ġilda maqtug ħa barra friska 
għandha tintu ża mill-aktar fis possibbli, u ta ħt kundizzjonijiet 
magħrufa li jsostnu l-attività metabolika. B ħala gwida ġenerali, il- 
ġilda maqtug ħa barra friska g ħandha tintu ża fi żmien 24 sieg ħa, iżda 
l-perjodu a ċċettabbli tal- ħażna jista’ jvarja skond is-sistema ta’ l- 
enżimi involuti fil-metabolizzazzjoni u t-temperaturi tal- ħażna (13). 
Meta l-preparazzjonijiet tal- ġilda jkunu n ħażnu qabel ma jintu żaw, 
għandha ting ħata prova biex turi li l-funzjoni ta’ ostakolu n żammet.  
1.4.5  Is-sustanza tat-test  
Is-sustanza tat-test hija l-entità li l-karatteristi ċi tal-permeazzjoni 
tagħha għandhom ji ġu studjati. Idealment, is-sustanza tat-test 
għandha tiġi radjotikkettjata.  
1.4.6  Il-preparazzjoni tat-test  
Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test (e ż. materjal mhux im ħallat, 
imħallat jew ifformulat li fih il-kimika tat-test li hija applikata 
għall-ġilda għandha tkun l-istess (jew surrogat realistiku) b ħal dik 
li għalihom jistg ħu jkunu esposti l-umani jew spe ċje oħrajn 
potenzjali mmirati. Kwalunkwe varjazzjoni mill-preparazzjoni “fl- 
użu” għandha tkun i ġġustifikata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Il-Kon ċentrazzjonijiet u l-Formulazzjonijiet tas-Sustanzi tat-Test  
Normalment tintu ża aktar minn kon ċentrazzjoni wa ħda li hija 
mifruxa fuq l-og ħla espożizzjonijiet potenzjali umani. Bl-istess 
mod, għandu jitqies l-ittestjar ta’ firxa ta’ formulazzjonijiet tipi ċi. 
1.4.8  L-applikazzjoni tal- ġilda 
Taħt kundizzjonijiet normali ta’ espo żizzjoni umana g ħall-kimika, 
normalment ikun hemm do żi finiti. G ħalhekk, g ħandha titntu ża 
applikazzjoni li timita l-espo żizzjoni umana, normalment 1- 
5 mg/cm  2 ġilda għal solidu u sa 10 μl/cm2 għal-likwidi. Il- 
kwantità g ħandha tkun ġustifikata mill-kundizzjonijiet ta’ l-u żu 
mistenni, mill-g ħanijiet ta’ l-istudju jew mill-karatteristi ċi tal- 
preparazzjoni tat-test. Per e żempju, l-applikazzjonijiet g ħall-wiċċ 
tal-ġilda jistg ħu jkunu infiniti, fejn huma applikati volumi kbar 
għal kull żona ta’ unità.  
1.4.9  Temperatura  
Id-diffużjoni passiva tal-kimi ċi (u għalhekk l-assorbiment tag ħhom 
mill-ġilda) hija affettwata mit-temperatura. Il-kompartiment tad- 
diffużjoni u l-ġilda għandhom jin żammu f’temperatura kostanti qrib 
dik normali tal- ġilda ta’ 32+/-1  o C. Diżinji differenti ta ċ-ċelloli 
jeħtieġu temperaturi differenti tal-banju ta’ l-ilma jew tal-blokka 
msaħħna sabiex ji ġi żgurat li r-re ċettur/ġilda ikun/tkun fin-norma 
fiżjoloġika. L-umdità g ħandha preferibbilment tkun bejn it-30 u s- 
70 %.  
1.4.10  Kemm iddum l-espo żizzjoni u t-te ħid tal-kampjuni  
L-espożizzjoni tal- ġilda għall-preparazzjoni tat-test tista’ tkun g ħal 
kemm idum l-esperiment jew g ħal termini iqsar (ji ġifieri, biex ti ġi 
imitata espo żizzjoni umana ta’ tip spe ċifiku). Il- ġilda għandha 
tinħasel mill-preparazzjoni tat-test żejda b’aġent tat-tindif rilevanti, 
u t-tlaħliħ jinġabar għall-analiżi. Il-proċedura tat-tne ħħija tal- 
preparazzjoni tat-test tiddependi fuq il-kundizzjoni ta’ l-u żu 
mistenni, u g ħandha tiġi ġustifikata. Normalment huwa me ħtieġ 
perjodu tat-te ħid tal-kampjuni ta’ 24 sieg ħa biex tkun possibbli l- 
karatterizzazzjoni xierqa tal-profil ta’ l-assorbiment. Ladarba l- integrità tal- ġilda tista’ tibda tiddeterjora wara 24 sieg ħa, il-ħinijiet 
tat-teħid tal-kampjuni normalment m’g ħandhomx je ċċedu 24 sieg ħa. 
Għas-sustanzi tat-test li jippenetraw il- ġilda malajr, dan jista’ ma 
jkunx me ħtieġ, iżda, għas-sustanzi tat-test li jippenetraw bil-mod, 
jistgħu jkunu me ħ
tieġa perjodi itwal. Il-frekwenza tat-te ħid tal- 
kampjuni tal-fluwidu re ċettorju għandha tippermetti lill-profil ta' l- 
assorbiment tas-sustanza tat-test ji ġi ppreżentat grafikament.  
1.4.11  Il-pro ċeduri terminali  
Il-komponenti kollha tas-sistema tat-test g ħandhom ji ġu analizzati u 
l-irkupru g ħandu jiġi determinat. Dan jikludi l-kompartiment donator, 
it-tlaħliħ tal-wiċċ tal-ġilda, il-preparazzjoni tal- ġilda u l-fluwidu/ ­
kompartiment re ċettorju. F’xi ka żijiet, il-ġilda tista’ ti ġi frazzjonata 
fil-parti esposta tal- ġilda u l-parti tal- ġilda taħt il-flanġa tal-ġilda, u 
fl-istratum corneu m, l-epidermis u l-frazzjonijiet tad-dermis, g ħall- 
analiżi separata.  
1.4.12  L-anali żi 
Fl-istudji kollha g ħandu jinkiseb l-irkupru xieraq (il-mira g ħandha 
tkun medja ta’ 100+/-10 % tar-radjoattività u kwalunkwe devjazzjoni għandha tkun i ġġustifikata). L-ammont tas-sustanza tat-test fil- 
fluwidu re ċettorju, fil-preparazzjoni tal- ġilda, fil-ħasil tal-wi ċċ tal- 
ġilda u fit-tla ħliħ ta’ l-apparat g ħandu jiġi analizzat, bl-u żu ta’ 
teknika xierqa.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. ID-DATA  
L-analiżi tal-fluwidu re ċettorju, id-distribuzzjoni tal-kimika tas- 
sustanza tat-test fis-sistema tat-test u l-profil ta’ l-assorbiment mal- ħin, għandhom ji ġu ppreżentati. Meta jintu żaw kundizzjonijiet ta’ l- 
espożizzjoni g ħal dożi finita, il-kwantità ma ħsula mill- ġilda, il- 
kwantità asso ċjataa mal- ġilda (u f’saffi differenti tal- ġilda jekk 
analizzata) u l-ammont pre żenti fil-fluwidu re ċettorju (rata, u l- 
ammont jew per ċentwal tad-do ża applikata) g ħandhom ji ġu kkal­
kolati. L-assorbiment mill- ġilda jista’ kultant ji ġi espress bl-u żu 
tad-data tal-fluwidu re ċettorju biss. Madankollu meta s-sustanza tat- 
test tibqa’ fil- ġilda fl-aħħar ta’ l-istudju, jista’ jkun me ħtieġ li tiġi 
inkluża fl-ammont totali assorbit (ara l-paragafu 66 fir-referenza (3)). 
Meta jintu żaw kundizzjonijiet ta’ do żi infiniti ta’ espo żizzjoni id-data 
tista’ tippermetti l-kalkolu ta’ kostant tal-permeabilità (Kp). Ta ħt 
dawn il-kundizzjonijiet ta’ l-a ħħar, il-perċentwal assorbit mhuwiex 
rilevanti.
 
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport g ħandu jinkludi r-rekwi żiti stipulati fil-protokoll, inklu ża 
ġustifikazzjoni tas-sistema tat-test u żata u għandu tinkludi dawn li 
ġejjin:  
Is-Sustanza tat-Test:  
— in-natura fi żika, il-karatteristi ċi fiżikokimiċi (għall-inqas il-pi ż 
molekulari u log  P ow ), safa (safa radjokimika);  
— informazzjoni ta’ l-identifikazzjoni (e ż. lott numru);  
— solubilità fi fluwidu re ċettorju.  
Il-preparazzjoni tat-test:  
— formulazzjoni u ġustifikazzjoni ta’l-u żu; 
— omoġeneità.  
Il-kundizzjonijiet tat-test:  
— għejun u s-sit tal- ġilda, il-metodu tal-preparazzjoni, il- 
kundizzjonijiet tal- ħażna qabel l-u żu, kwalunkwe trattament 
qabel (tindif, trattament antibjotiku, e ċċ), kejl ta’ l-integrità tal- 
ġilda, stat metaboliku, ġustifikazzjoni ta’ l-u żu; 
— diżinn taċ-ċelloli, kompo żizzjoni tal-fluwidu re ċettorju, rata tat- 
tnixxija tal-fluwidu jew ħinijiet u pro ċeduri tat-te ħid tal- 
kampjuni;  
— dettalji ta’ l-applikazzjoni f test tal-preparazzjoni tat-test u l- 
kwantifikazzjoni tad-do ża applikata;  
— kemm iddum l-espo żizzjoni;  
— dettalji tat-tne ħħija tal-preparazzjonijiet mill- ġilda, eż. tlaħliħ tal- 
ġilda; 
— dettalji ta’ l-anali żi tal-ġilda u kwalunkwe teknika tal-frazzjon ­
azzjoni u żata biex tintwera d-distribuzzjoni tal- ġilda; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— proċeduri tal- ħasil taċ-ċelloli u tat-tag ħmir; 
— metodi ta’ l-esperimenti, tekni ċi ta’ l-estrazzjoni, limiti ta’ l- 
iskoperta u validazzjoni analitika tal-metodu.  
Riżultati:  
— irkupru totali ta’ l-esperiment (Do ża applikata ≡ Ħasil tal- 
ġilda + Ġilda + Fluwidu re ċettur + Ħasil taċ-Ċelloli);  
— tabulazzjoni ta’ l-irkupru individwali ta ċ-ċelloli f’kull kompar ­
timent;  
— profil ta’ l-assorbiment;  
— data tabulata dwar l-assorbiment (espressa b ħala rata, ammont 
jew perċentwal).  
Diskussjoni tar-ri żultati.  
Kunklużjonijiet.  
4. REFERENZI  
1. Metodu tat-Test B.44. L-Assorbiment tal- Ġilda: Metodu  In vivo . 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2 000)5. OECD, Paris.
 
4. Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5. Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s, RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241.
 
6. Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s. CRC 
Press, Boca Raton.  
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of 
Chemicals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous 
Absorption, ECETOC, Brussel.  
8. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et a l. (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13. Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitro ­
chlorobenzene  in vitro . Arch Toxicol 74: 356-365.  
Figura 1  
Eżempju ta’ Di żinn Tipiku ta’ Ċellola tad-Diffu żjoni Statika g ħall-Istudji  in 
vitro  ta’ l-Assorbiment Perkutanju
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IRRITAZZJONI TAL- ĠILDA  IN VITRO : METODU TA’ 
TTESTJAR TAL-EPIDERMIDE UMANA RIKOSTRUWITA  
INTRODUZZJONI  
1. Irritazzjoni tal- ġilda tirreferi g ħall-produzzjoni ta’ ħsara riversibbli fil- ġilda 
wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test g ħal massimu ta’ 4 sig ħat 
[kif iddefinit mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimi ċi (GHS —Globally Harmonized System of 
Classification and Labelling of Chemicals) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) u 
mir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet (1)(3)]. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar (TM) jipprovdi 
proċedura  in vitro  li tista' tintu ża għall-identifikazzjoni tal-periklu ta’ 
sustanzi kimi ċi irritanti (sustanzi u ta ħlitiet) f'konformità mal-GHS tan-NU 
u l-Kategorija 2 tas-CLP tal-UE (1) (2) (3). Fl-UE u f're ġjuni oħra, li ma 
adottawx il-Kategorija 3 (sustanzi irritanti minuri) tal-GHS tan-NU, dan 
it-TM jista' jintu ża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimi ċi mhux klas ­
sifikati, ji ġifieri dawk ta’ “L-Ebda Kategorija” fil-GHS tan-NU u fis-CLP 
tal-UE (1)(3). Dan it-TM jista' jintu ża sabiex jiddetermina l-irritazzjoni fuq 
il-ġilda tas-sustanzi kimi ċi bħala test sostitut wa ħdieni għall-ittestjar ta’ 
irritazzjoni tal- ġilda in vivo  fi ħdan strate ġija ta’ ttestjar imtarr ġa (il- 
Kapitolu 4 u l-Kapitolu B.4 f'dan l-Anness).
 
2. Ġeneralment, il-valutazzjoni tal-irritazzjoni tal- ġilda kienet tinvolvi l-u żu 
tal-annimali tal-laboratorju [il-Linja Gwida 404 tat-Test tal-OECD; 
il-Kapitolu B.4 f'dan l-Anness] (4). Fir-rigward tal-kwistjonijiet relatati 
mal-benesseri tal-annimali, il-B.4 ġie rivedut fl-2004 u sar jippermetti li 
tiġi ddeterminata l-korru żjoni/irritazzjoni tal- ġilda billi ti ġi applikata 
strateġija ta’ ttestjar imtarr ġa, billi jintu żaw metodi ta’ ttestjar  in vitro  jew 
ex vivo , u għalhekk jiġu evitati l-u ġigħ u t-tbatija tal-annimali. Tliet metodi 
ta’ ttestjar  in vitro  validati ġew adottati b ħala Linji Gwida 430, 431 u 435 
(5) (6) (7) tat-Test tal-OECD u tnejn minnhom b ħala l-Kapitoli B.40 u 
B.40bis ta’ dan l-Anness, li g ħandhom jintu żaw għall-parti korru żiva 
tal-istrateġija ta’ ttestjar imtarr ġa tal-B.4 jew tal-Linja Gwida (4) tat-Test 
tal-OECD.  
3. Dan it-TM jindirizza l-irritazzjoni tal- ġilda tal-punt tat-tmiem tas-sa ħħa 
umana. Huwa bba żat fuq epidermide umana rikostruwita (RhE— Recon ­
structed human Epidermis), li fid-disinn globali tag ħha (l-użu tal-keratino ċiti 
mhux trasformati mnissla mill-epidermide umana b ħala sors ta ċ-ċelloli u 
l-użu ta’ tessut u ċitoarkitettura rappre żentattivi) tixbah ħafna 
lill-karatteristi ċi bijokimi ċi u fiżjoloġiċi tas-saffi tal-wi ċċ tal-ġilda umana, 
jiġifieri l-epidermide. Dan it-TM jinkludi wkoll sett ta’ Standards ta’ 
Prestazzjoni (Appendi ċi 2) għall-valutazzjoni ta’ metodi simili u modifikati 
bbażati fuq l-RhE żviluppati mill-EC-ECVAM (European Centre for the 
Validation of Alternative Methods) (8), f'konformità mal-prin ċipji 
tad-Dokument ta’ Gwida Nru 34 tal-OECD (9).  
4. Hemm tliet metodi validati li jaderixxu ma’ dan it-TM. L-istudji ta’ prevali ­
dazzjoni, l-ottimizzazzjoni u l-validazzjoni tlestew g ħal metodu  in vitro  (10) 
(11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), li ju żaw mudell tal-RhE, 
disponibbli kummer ċjalment b ħala EpiSkin  TM (iddeżinjat il-Metodu ta’ 
Referenza Validat — VRM — Validated Reference Method). Żewġ 
metodi o ħra tal-RhE kummer ċjalment disponibbli ta’ irritazzjoni tal- ġilda 
in vitro  wrew riżultati simili g ħall-VRM skont il-validazzjoni bba żata fuq 
il-PS (21), u dawn huma l-metodi ta’ EpiDerm  TM SIT (EPI-200) u ta’ 
SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Qabel ma jkun jista' jintu ża metodu RhE  in vitro  simili jew modifikat 
propost g ħajr il-metodi tal-RHE ta’ VRM, ta’ EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
jew ta’ SkinEthic  TM RHE għal skopijiet regolatorji, g ħandhom ji ġu stabbiliti 
l-affidabbiltà, ir-rilevanza (pre ċiżjoni) u l-limitazzjonijiet tieg ħu għall-użu 
maħsub sabiex ji ġi żgurat li dan jista' jitqies b ħala wieħed simili g ħal dak 
tal-VRM, skont ir-rekwi żiti tal-PS stabbiliti f'dan it-TM (Appendi ċi 2). 
Barra minn hekk, huwa rakkomandat li ji ġi kkonsultat id-Dokument ta’ 
Sfond ta’ Spjegazzjoni tal-OECD dwar l-ittestjar ta’ irritazzjoni tal- ġilda 
in vitro  qabel l-i żvilupp u l-validazzjoni ta’ metodu RhE  in vitro  simili 
jew modifikat u qabel ma dan ji ġi sottomess g ħal adozzjoni regolatorja (23).  
DEFINIZZJONIJIET  
6. Id-definizzjonijiet u żati huma pprovduti fl-Appendi ċi 1. 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
7. Limitazzjoni tat-TM, kif muri mill-istudju ta’ validazzjoni (16), huwa li dan 
ma jippermettix il-klassifikazzjoni ta’ sustanzi kimi ċi għall-Kategorija 3 
(sustanzi irritanti minuri) fakultattiva tal-GHS tan-NU (1). Meta jintu ża 
bħala test sostitut parzjali, jista' jkun me ħtieġ ittestjar  in vivo  ta’ segwitu 
sabiex jiġi karatterizzat il-potenzjal s ħiħ ta’ irritazzjoni tal- ġilda (il-Kapitolu 
4 u l-Kapitolu B.4 ta’ dan l-Anness). Huwa rikonoxxut li l-u żu ta’ ġilda 
umana huwa so ġġett għal konsiderazzjonijiet u kundizzjonijiet eti ċi 
nazzjonali u internazzjonali.  
8. Dan it-TM jindirizza l-komponent ta’ irritazzjoni tal- ġilda in vitro  
tal-istrateġija ta’ ttestjar imtarr ġa tal-B.4 (Il-Linja Gwida 404 tat-Test 
tal-OECD) dwar l-irritazzjoni/il-korru żjoni dermali (4). Filwaqt li dan 
it-TM ma jipprovdix informazzjoni adegwata dwar il-korru żjoni tal-ġilda, 
għandu jiġi nnotat li l-B.40 bis (Linja Gwida 431 tat-Test tal-OECD) dwar 
il-korrużjoni tal-ġilda huwa bba żat fuq l-istess sistema ta’ ttestjar tal-RhE, 
għad li juża protokoll ie ħor (il-Kapitolu B.40 bis). Dan il-metodu huwa 
bbażat fuq il-mudelli tal-RhE billi jintu żaw keratino ċiti umani, li g ħal­
daqstant jirrappre żenta b'mod  in vitro  l-organu fil-mira tal-ispe ċi ta’ 
interess. Barra minn hekk, dan ikopri direttament il-pass inizjali 
tal-katina/mekkani żmu infjammatorja/u tal-azzjoni ( ħsara liċ-ċelloli u 
lit-tessut li tirri żulta fi trawma lokalizzata) li sse ħħ/jseħħ waqt 
l-irritazzjoni  in vivo . Ġiet ittestjata firxa wiesg ħa ta’ sustanzi kimi ċi 
fil-validazzjoni li hija l-ba żi ta’ dan it-TM u l-ba żi ta’ dejta empirika 
tal-istudju ta’ validazzjoni kienet tammonta g ħal total ta’ 58 sustanza 
kimika (16)(18)(23). Huwa applikabbli g ħal solidi, likwidi, semisolidi u 
xama'. Il-likwidi jistg ħu jkunu milwiema jew mhux milwiema; is-solidi 
jistgħu jkunu jin ħallu jew ma jin ħallux fl-ilma. Kull meta dan ikun 
possibbli, is-solidi g ħandhom jinta ħnu fi trab fin qabel l-applikazzoni; 
mhuwa me ħtieġ l-ebda trattament minn qabel tal-kampjun. Il-gassijiet u 
l-aerosols g ħadhom ma ġewx eżaminati fi studju ta’ validazzjoni (24). 
Filwaqt li huwa mifhum li dawn jistg ħu jiġu ttestjati billi tintu ża 
t-teknoloġija tal-RhE, it-TM attwali ma jippermettix l-ittestjar ta’ gassijiet 
u aerosols. G ħandu jiġi nnotat ukoll li sustanzi kimi ċi ferm ikkuluriti jistg ħu 
jinterferixxu mal-kejl tal-vijabbiltà ta ċ-ċellola u je ħtieġu l-użu ta’ kontrolli 
adattati g ħal korrezzjonijiet (ara l-paragrafi 24-26).  
9. Sessjoni wa ħda ta’ ttestjar mag ħmula minn tliet tessuti replikati g ħandha 
tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta l-klassifikazzjoni tkun 
inekwivokabbli. Madankollu, f'ka żijiet ta’ ri żultati li joqorbu ħafna lejn 
il-limitu, b ħal pereżempju kejl replikat mhux konkordanti u/jew vijabbiltà 
tal-perċentwal medju daqs 50 ± 5 %, g ħandha tiġi kkunsidrata t-tieni 
sessjoni, kif ukoll it-tielet wa ħda f'każ ta’ riżultati mhux konkordanti bejn 
l-ewwel żewġ sessjonijiet.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
10. Is-sustanza kimika tat-test hija applikata b'mod topiku g ħal mudell tal-RhE 
tridimensjonali, ifformata minn keratino ċiti mhux trasformati mnissla 
mill-epidermide umana, li ffurmaw ru ħhom f'mudell b'diversi saffi, ferm 
differenzjat ta’  epidermide  umana. Din tikkonsisti f'saff tal-qieg ħ, saff 
spinuż u saff granulari organizzati, u  stratum corneum  b'diversi saffi li 
jkun fih saffi lipidi lamellari inter ċellolari li jirrappre żentaw il-klassijiet 
lipidi ewlenin b'mod analogu g ħal dawk li jinstabu  in vivo . 
11. Irritazzjoni tal- ġilda pprovokata minn sustanzi kimi ċi, murija permezz ta’ 
eritema u edema, hija r-ri żultat ta’ katina ta’ avvenimenti li bdew 
mill-penetrazzjoni tal-i stratum corneum  u l-ħsara lis-saffi ta’ ta ħt 
il-keratino ċiti. Il-keratino ċiti li jkunu qed imutu jirrilaxxaw medjaturi li 
jibdew il-katina infjammatorja li ja ġixxu fuq i ċ-ċelloli fid- dermis , b'mod 
partikolari ċ-ċelloli stromali u endoteljali. Hija d-dilatazzjoni u 
l-permeabilità akbar ta ċ-ċelloli endoteljali li jipprodu ċu l-eritema u 
l-edema osservati (24). Il-metodi bba żati fuq l-RhE jkejlu l-avvenimenti 
tal-bidu tal-katina.  
12. Il-vijabbiltà ta ċ-ċelloli fil-mudelli tal-RhE titkejjel minn konver żjoni enzi­
matika tal-kulur vitali MTT [3-(4,5-Dimetiltija żol-2-il)-2,5-bromur 
tad-difeniltetra żolju, Thia żoljl blu; numru tal-CAS 298-93-1 f'mel ħ 
formażan blu li huwa mkejjel b'mod kwantitattiv wara l-estrazzjoni 
mit-tessuti (25). Sustanzi kimi ċi huma identifikati mill-abbiltà tag ħhom li 
jnaqqsu l-vijabbiltà ta ċ-ċellola taħt il-livelli massimi definiti (ji ġifieri ≤ 
50 %, għall-GHS tan-NU/Kategorija 2 tas-CLP tal-UE). Skont il-qafas rego ­
latorju li fih jintu żaw ir-riżultati ta’ dan it-TM, is-sustanzi kimi ċi li 
jipproduċu vijabbiltajiet ta ċ-ċellola og ħla mil-livell massimu definit, 
jistgħu jitqiesu b ħala mhux irritanti (ji ġifieri > 50 %, L-Ebda Kategorija).  
WIRI TAL-PROFI ĊJENZA  
13. Qabel l-u żu ta’ rutina ta’ kwalunkwe mit-tliet metodi validati li jaderixxu 
ma’ dan it-TM, il-laboratorji g ħandhom juru profi ċjenza teknika, billi ju żaw 
l-għaxar Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza elenkati fit-Tabella 1. G ħal metodi 
simili żviluppati skont dan it-TM jew g ħal modifiki ta’ kwalunkwe mit-tliet 
metodi validati, g ħandhom ji ġu ssodisfati r-rekwi żiti tal-PS spjegati 
fl-Appendi ċi 2 ta’ dan it-TM qabel ma jintu ża l-metodu g ħall-ittestjar rego ­
latorju.  
14. Bħala parti mill-e żerċizzju tal-profi ċjenza, huwa rrakkomandat li l-utent 
jivverifika l-karatteristi ċi ta’ protezzjoni tat-tessuti wara li dawn ji ġu 
riċevuti kif spe ċifikat mill-produttur tal-mudell tal-RhE. Dan huwa ta’ 
importanza partikolari jekk it-tessuti jintbag ħtu minn distanzi twal jew 
jekk idumu biex jaslu. Ladarba metodu jkun ġie stabbilit b'su ċċess u tkun 
intweriet profi ċjenza fl-u żu tiegħu, verifika b ħal din ma g ħandhiex tkun 
meħtieġa fuq ba żi ta’ rutina. Madankollu, meta jintu ża metodu b'rutina, 
huwa rrakkomandat li jibqg ħu jiġu vvalutati l-karatteristi ċi ta’ protezzjoni 
f'intervalli regolari.  
Tabella 1  
Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza  ( 1 ) 
Sustanza Kimika Nru tal-CAS Ri żultat in vivo  ( 2 ) Stat fi żiku GHS tan-NU/ 
Kategorija tas-CLP 
tal-UE  
aċidu naftila ċetiku 86-87-3 0 Solidu L-ebda Kat. 
isopropanol 67-63-0 0,3 Likwidu L-ebda Kat.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Sustanza Kimika Nru tal-CAS Ri żultat in vivo  ( 2 ) Stat fi żiku GHS tan-NU/ 
Kategorija tas-CLP 
tal-UE  
stearate tal-metil 112-61-8 1 Solidu L-ebda Kat. 
butirat tal-ettil 5870-93-9 1,7 Likwidu L-ebda Kat. 
(Kat. 3 fakult ­
attiva ) ( 3 ), ( 4 ) 
saliċilat tal-eżil 6259-76-3 2 Likwidu L-ebda Kat. 
(Kat. 3 fakult ­
attiva ) ( 3 ), ( 4 ) 
ċiklamen tal-aldeid 103-95-7 2,3 Likwidu Kat. 2 
1-bromoe żan 111-25-1 2,7 Likwidu Kat. 2 
idrossidu tal-potassju (5 % soluzzjoni 
milwiema) 1310-58-3 3 Likwidu Kat. 2 
1-metil-3-fenil-1-pipera żina 5271-27-2 3,3 Solidu Kat. 2 
Ettanal 111-71-7 3,4 Likwidu Kat. 2  
( 1 ) Dawn is-Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza huma sottosett tas-Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza u żati fl-istudju ta’ validazzjoni. 
( 2 ) Ir-riżultat in vivo  skont il-B.4 u l-Linja Gwida 404 tat-Test tal-OECD (4). 
( 3 ) Taħt dan il-Metodu ta’ Ttestjar, il-Kategorija 3 (irritanti minuri) fakultattiva tal-GHS tan-NU (1) hija meqjusa b ħala L-Ebda 
Kategorija. 
( 4 ) Il-Kategorija 3 fakultattiva tal-GHS tan-NU mhijiex applikabbli skont is-CLP tal-UE.  
PROĊEDURA  
15. Din li ġejja hija deskrizzjoni tal-komponenti u l-pro ċeduri ta’ metodu 
tal-RhE g ħal eżami ta’ irritazzjoni tal- ġilda. Mudell tal-RhE g ħandu jiġi 
rikostruwit, u jista' jit ħejja mill-persunal impjegat jew inkella miksub 
b'mod kummer ċjali. Hemm disponibbli pro ċeduri Standard ta’ Operat 
(SOPs— Standard Operating Procedures) g ħal EpiSkin™, EpiDerm  TM 
SIT (EPI-200) u SkinEthic  TM RHE (26)(27)(28). L-ittestjar g ħandu 
jitwettaq skont dawn li ġejjin:  
Komponenti tal-Metodu ta' ttestjar tal-RhE  
Kundizzjonijiet ġenerali  
16. Keratino ċiti umani mhux trasformati g ħandhom jintu żaw sabiex jer ġgħu 
jibnu l-epitelju. Is-saffi multipli ta’ ċelloli epitelji vijabbli (saff tal-qieg ħ, 
stratum spinosum, stratum granulosum ) għandhom ikunu pre żenti taħt 
stratum corneum  funzjonali. L- istratum corneum  għandu jkollu saffi 
multipli li jkun fihom il-profil lipidu essenzjali sabiex jipprodu ċu 
protezzjoni funzjonali robusta sabiex tirre żisti l-penetrazzjoni rapida ta’ 
sustanzi kimi ċi markaturi ċitotossiċi, pereżempju dode ċilsulfat tas-sodju 
(SDS — Sodium Dodecyl Sulphate) jew Triton X-100. Il-funzjoni ta’ protezzjoni g ħandha tintwera u tista' ti ġi eżaminata jew permezz ta’ deter ­
minazzjoni tal-kon ċentrazzjoni li fiha s-sustanza kimika markatri ċi tnaqqas 
il-vijabbiltà tat-tessuti b'50 % (IC
 50 ) wara ħin ta’ esponiment fiss, jew 
permezz ta’ determinazzjoni tal- ħin ta’ esponiment me ħtieġ sabiex 
il-vijabbiltà ta ċ-ċellola titnaqqas b'50 % (ET  50 ) wara l-applikazzjoni 
tas-sustanza kimika markatri ċi b'konċentrazzjoni spe ċifika u fissa. 
Il-karatteristi ċi ta’ trażżin tal-mudell tal-RhE g ħandhom iwaqqfu l-passa ġġ 
ta’ materjal madwar l-i stratum corneum  għat-tessut vijabbli, li nkella 
jwassal g ħal immudellar ta’ livell baxx tal-esponiment tal- ġilda. Il-mudell 
tal-RhE g ħandu jkun ħieles minn kontaminazzjoni minn batterji, vajrusijiet, 
majkoplasma, jew fungi.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Kundizzjonijiet funzjonali  
Vijabbiltà  
17. L-anali żi użata għad-determinazzjoni tad-daqs tal-vijabbiltà hija l-anali żi 
tal-MTT (25). L-utenti tal-mudell tal-RhE g ħandhom ji żguraw li kull lott 
mill-mudell tal-RhE u żat jissodisfa l-kriterji definiti g ħall-kontroll negattiv 
(NC — Negative Control). Id-densità ottika (OD — Optical Density) tas-solvent ta’ estrazzjoni wa ħedha għandha tkun żgħira biżżejjed, jiġifieri 
OD < 0,1. Firxa ta’ a ċċettabilità (l-og ħla limitu jew il-limitu inferjuri) g ħall- 
valuri tal-OD ta’ kontroll negattiv (fil-kundizzjonijiet tal-Metodu ta’ Ttestjar ta’ Irritazzjoni tal- Ġilda) hija stabbilita mill-i żviluppatur/fornitur tal-mudell 
tal-RhE, u l-firxiet ta’ a ċċettabilità g ħat-tliet metodi validati huma pprovduti 
fit-Tabella 2. G ħandu jiġi dokumentat li t-tessuti ttrattati bl-NC huma stabbli 
fil-kultura (jipprovdu kejl tal-vijabbiltà simili) sakemm idum il-perjodu tat-test ta’ esponiment.
 
Tabella 2  
Firxiet ta’ a ċċettabilità g ħall-valuri negattivi tal-OD ta’ kontroll  
Limitu inferjuri ta’ a ċċettabilità L-og ħla limitu ta’ a ċċettabilità  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Funzjoni ta’ protezzjoni  
18. L-i stratum corneum  u l-kompo żizzjoni lipida tieg ħu għandhom ikunu 
biżżejjed sabiex jirre żistu l-penetrazzjoni rapida tas-sustanzi kimi ċi 
markaturi ċitotossiċi, eżempju SDS jew Triton X-100, kif stmat minn 
IC 50 jew ET  50 (Tabella 3).  
Morfoloġija 
19. Għandu jitwettaq e żami istolo ġiku tal-mudell tal-RhE li juri struttura li 
tixbah lill- epidermide  umana (inklu ż l-istratum corneum  b'saffi multipli).  
Riproduċibbiltà  
20. Ir-ri żultati tas-sustanza kimika ta’ kontroll po żittiv (PC – Positive Control) u 
l-kontrolli negattivi (NC) tal-metodu ta’ ttestjar g ħandhom juru ripro ­
duċibbiltà ma ż-żmien.  
Kontroll tal-kwalità (QC – Quality Control)  
21. L-iżviluppatur/il-fornitur tal-mudell tal-RhE g ħandu jiżgura u juri li kull lott 
mill-mudell tal-RhE u żat jissodisfa l-kriterji tat-tnedija tal-produzzjoni 
definiti, fosthom dawk g ħall-vijabbiltà  (paragrafu 17), il- funzjoni ta’ 
protezzjoni  (paragrafu 18) u l- morfoloġija (paragrafu 19) huma l-aktar 
rilevanti. Din id-dejta g ħandha tiġi pprovduta lill-utenti tal-metodu, sabiex 
ikunu jistg ħu jinkludu din l-informazzjoni fir-rapport tat-test. Firxa ta’ 
aċċettabilità (l-og ħla limitu jew il-limitu inferjuri) g ħall-IC  50 jew għall- 
ET 50 għandhom ji ġu stabbiliti mill-i żviluppatur/fornitur tal-mudell tal-RhE 
(jew l-investigatur meta jintu ża l-mudell imfassal mill-persunal im ħaddem). 
Dawk ir-ri żultati li huma prodotti b'tessuti kkwalifikati biss jistg ħu jiġu 
aċċettati għal tbassir affidabbli ta’ klassifikazzjoni ta’ irritazzjoni. B ħal 
pereżempju, il-firxiet ta’ a ċċettabilità g ħat-tliet metodi validati huma 
pprovduti fit-Tabella 3.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabella 3  
Eżempji ta’ kriterji tal-QC ta’ rilaxx tal-lott  
Limitu inferjuri ta’ a ċċettabilità L-og ħla limitu ta’ a ċċettabilità  
EpiSkin  TM (SM) 
(trattament ta’ 18-il sieg ħa b’ SDS) 
(26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 hr ET  50 = 8,7 hr 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 hr ET  50 = 9,0 hr  
Applikazzjoni tas-Sustanzi Kimi ċi tat-Test u ta’ Kontroll  
22. Tal-inqas g ħandhom jintu żaw tliet repliki g ħal kull sustanza kimika tat-test 
u għall-kontrolli f'kull sessjoni. G ħal-likwidi kif ukoll g ħas-solidi, g ħandu 
jiġi applikat ammont suffi ċjenti ta’ sustanza kimika tat-test sabiex ikopri 
b'mod uniformi l-wi ċċ tal-epidermide  filwaqt li ti ġi evitata do ża infinita, 
jiġifieri għandu jintu ża minimu ta’ 25 μL/ċm 2 jew 25 mg/ ċm 2 . Għal solidi, 
il-wiċċ tal-epidermide  għandu jixxarrab b'ilma dejonizzat jew distillat qabel 
l-applikazzjoni, sabiex jitjieb il-kuntatt bejn is-sustanza kimika tat-test u l-wiċċ tal-epidermide . Kull meta dan ikun possibbli, is-solidi g ħandhom 
jiġu ttestjati b ħala trab fin. Fi tmiem il-perjodu ta’ esponiment, 
is-sustanza kimika tat-test g ħandha tin ħasel bir-reqqa mill-wi ċċ 
tal-epidermide  b'bafer milwiem, jew b'0,9 % NaCl. Skont liema wie ħed 
mit-tliet metodi tal-RhE validati jintu ża, il-perjodu ta’ esponiment ivarja 
bejn 15-il minuta u 60 minuta, u t-temperatura ta’ inkubazzjoni bejn 20 u 
37 °C. Dawn il-perjodi u t-temperaturi ta’ esponiment huma ottimizzati g ħal 
kull metodu tal-RhE u jirrappre żentaw karatteristi ċi intrinsiċi differenti 
tal-metodi, i żda għad-dettalji ara l-Pro ċeduri Standard ta’ Operazzjoni 
(SOPs) g ħall-metodi (26)(27)(28).
 
23. F'kull sessjoni g ħandhom jintu żaw NC u PC simultanji sabiex juru li 
l-vijabbiltà (mal-NC), il-funzjoni ta’ protezzjoni u s-sensittività tat-tessut li tirriżulta (mal-PC) tat-tessuti huma fi ħdan firxa ta’ a ċċettabilità storika 
definita. Il-PC issu ġġerit huwa ta’ SDS 5 % milwiemi. Is-sustanzi kimi ċi 
tal-NC huma ilma jew ilma bil-mel ħ ibbaferjat bil-fosfat (PBS — Phosphate 
Buffered Saline).
 
Kejl tal-Vijabbiltà ta ċ-Ċelloli  
24. L-aktar element importanti tal-pro ċedura tat-test huwa li l-kejl tal-vijabbiltà 
ma jsirx immedjatament wara l-esponiment g ħas-sustanzi kimi ċi tat-test, 
iżda wara perjodu, ta’ inkubazzjoni ta’ wara t-trattament tat-tessuti 
mlaħalħa f'mezz ġdid, twil bi żżejjed. Dan il-perjodu jippermetti kemm 
l-irkupru minn effetti ċitotossiċi dgħajfa kif ukoll il-manifestazzjoni 
tal-effetti ċitotossiċi b'mod ċar. Il-fażi ta’ ottimizzazzjoni tat-test (11) (12) 
(13) (14) (15) uriet li perjodu ta’ inkubazzjoni ta’ 42 sieg ħa wara 
t-trattament kien wie ħed ottimali.  
25. L-anali żi MTT hija metodu kwantitattiv validat li g ħandu jintu ża sabiex 
ikejjel il-vijabbiltà ta ċ-ċellola taħt dan it-TM. Hija kompatibbli mal-u żu 
f'bini ta’ tessut tridimensjonali. Il-kampjun tat-tessut jitqieg ħed f'soluzzjoni 
MTT b'kon ċentrazzjoni xierqa (e żempju 0,3 — 1 mg/mL) g ħal 3 sigħat. 
Imbagħad, il-prodott froma żan blu pre ċipitat jiġi estratt mit-tessut billi 
jintuża solvent (e żempju isopropanol, isopropanol a ċiduż), u 
l-konċentrazzjoni tal-forma żan titkejjel billi ti ġi determinata l-OD ta’ 570 
nm billi jintu ża filtru ta’ faxx ta’ frekwenza ta’ massimu ta’ ± 30 nm.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Il-karatteristi ċi ottiċi tas-sustanza kimika ta’ ttestjar jew l-azzjoni kimika 
tagħha fuq l-MTT jistg ħu jinterferixxu mal-anali żi u dan iwassal g ħal 
stima falza tal-vijabbiltà (g ħax is-sustanza kimika tat-test tista' tipprevjeni 
jew treġġa' lura l- ġenerazzjoni tal-kulur kif ukoll tikkaw żaha). Dan jista' 
jseħħ meta sustanza kimika tat-test spe ċifika ma titne ħħiex kompletament 
mit-tessut bi tla ħliħ jew meta din tippenetra l- epidermide . Jekk sustanza 
kimika tat-test ta ġixxi direttament fuq l-MTT (tnaqqas l-MTT), ikollha 
kulur naturali, jew issir ikkulurita matul it-trattament tat-tessut, g ħandhom 
jintużaw kontrolli addizzjonali sabiex ji ġu identifikati u kkore ġuti 
l-interferenzi tas-sustanzi kimi ċi tat-test mat-teknika ta’ kejl tal-vijabbiltà. 
Spjegazzjoni dettaljata dwar kif g ħandhom ji ġu kkoreġuti tnaqqis u inter ­
ferenzi diretti tal-MTT permezz ta’ a ġenti li jag ħtu l-kulur hija disponibbli 
fl-SOPs g ħat-tliet metodi validati (26)(27)(28).  
Kriterji ta’ a ċċettabilità  
27. Għal kull metodu li ju ża lottijiet tal-mudell tal-RhE validi (ara l-paragrafu 
21), it-tessuti ttrattati bl-NC g ħandhom jimmanifestaw OD li tirrefletti 
l-kwalità tat-tessuti li segwew il-passi ta’ kunsinna u ri ċevuta u l-pro ċessi 
kollha tal-protokoll. Valuri ta’ kontroll tal-OD ma g ħandhomx ikunu aktar 
baxxi mil-limiti storikament stabbiliti. B'mod simili, it-tessuti ttrattati 
bil-PC, ji ġifieri SDS 5 % milwiema, g ħandhom jirreflettu l-abbiltà 
tagħhom li jirrea ġixxu għal sustanza kimika irritanti ta ħt il-kundizzjonijiet 
tat-TM (26) (27) (28). G ħandhom ji ġu ddefiniti l-mi żuri assoċjati u adattati 
ta’ varjabbiltà bejn ir-repliki tat-tessuti (e żempju jekk jintu żaw 
devjazzjonijiet standard (SD — Standard Deviations) dawn g ħandhom 
ikunu fi ħdan l-intervall ta’ tolleranza unilaterali ta’ 95 % ikkalkolat 
mid-dejta storika; g ħall-SD tal-VRM < 18 %).  
Interpretazzjoni tal-Mudell tar-Ri żultati u Tbassir  
28. Il-valuri tal-OD miksuba minn kull sustanza kimika tat-test jistg ħu jintużaw 
sabiex jiġi kkalkolat il-per ċentwal ta’ vijabbiltà normalizzat g ħall-NC, li 
huwa stabbilit g ħal 100 %. Il-valur ta’ limitu ta’ per ċentwal tal-vijabbiltà 
ta’ ċellola li jiddistingwi sustanzi kimi ċi tat-test irritanti minn dawk mhux 
klassifikati u l-pro ċedura/i statistika/statisti ċi użata/i sabiex ji ġu evalwati 
r-riżultati u ji ġu identifikati s-sustanzi kimi ċi irritanti g ħandhom ji ġu 
ddefiniti u dokumentati b'mod ċar u għandu jintwera li dawn huma 
xierqa. Il-valuri ta’ limitu g ħat-tbassir tal-irritazzjoni huma pprovduti 
hawn taħt: 
— Is-sustanza kimika tat-test hija kkunsidrata b ħala irritanti g ħall-ġilda 
skont il-GHS tan-NU/il-Kategorija 2 tas-CLP tal-UE jekk il-vijabbiltà tat-tessut wara l-esponiment u l-inkubazzjoni ta’ wara t-trattament tkun 
inqas minn jew daqs ( ≤) 50 %,
 
— Skont il-qafas regolatorju li fih jintu żaw ir-riżultati ta’ dan it-TM, 
is-sustanza kimika tat-test tista' titqies b ħala mhux irritanti g ħall-ġilda 
skont L-Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU/is-CLP tal-UE jekk 
il-vijabbiltà tat-tessut wara l-esponiment u l-inkubazzjoni ta’ wara 
t-trattament tkun aktar minn (>) 50 %.  
DEJTA U RAPPORTAR  
Dejta  
29. Għal kull sessjoni, dejta minn tessuti replikati individwali (pere żempju 
valuri tal-OD u dejta dwar il-per ċentwal ikkalkolat ta’ vijabbiltà ta ċ- 
ċellola għal kull sustanza kimika tat-test, inklu ża l-klassifikazzjoni) 
għandha tiġi rrapportata f'forma tabulari, inklu ża d-dejta minn esperimenti 
ripetuti, kif ikun xieraq. Barra minn hekk, g ħandhom ji ġu rrapportati l-SD ± 
medji għal kull sessjoni. Interazzjonijiet osservati mar-rea ġent u s-sustanzi 
kimiċi tat-test ikkuluriti tal-MTT g ħandhom ji ġu rrapportati g ħal kull 
sustanza kimika ttestjata.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Rapport tat-test  
30. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanzi Kimi ċi tat-Test u ta’ Kontroll:  
— L-isem/l-ismijiet tas-sustanzi kimi ċi bħall-isem u n-numru tal-CAS, 
l-isem u n-numru tal-KE, jekk dawn ikunu mag ħrufa, 
— Il-purità u l-kompo żizzjoni tas-sustanza kimika (f'per ċentwal(i) skont 
il-piż), 
— Karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju (pere żempju 
l-istat fiżiku, l-istabbiltà, il-volatilità, il-pH u s-solubilità fl-ilma jekk 
dawn ikunu mag ħrufa),  
— Trattament tas-sustanzi kimi ċi tat-test/ta' kontroll qabel l-ittestjar, jekk 
applikabbli (pere żempju tis ħin, tħin), 
— Kundizzjonijiet ta’ ħżin. 
Ġustifikazzjoni tal-mudell tal-RhE u tal-protokoll u żati 
Kundizzjonijiet tat-Test:  
— Sistema ta’ ċelloli użati; 
— Informazzjoni ta’ appo ġġ kompluta g ħall-mudell tal-RhE spe ċifiku użat 
inkluża l-prestazzjoni tieg ħu. Din l-informazzjoni g ħandha tiġi inkluża, 
iżda ma għandhiex tkun limitata g ħal dawn:  
i) vijabbiltà;  
ii) funzjoni ta’ protezzjoni;  
iii) morfolo ġija; 
iv) riprodu ċibbiltà u prevedibbiltà;  
v) Kontrolli tal-kwalità (QC) tal-mudell,  
— Dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata, 
— Dożi tat-test u żati, dewmien tal-esponiment u l-perjodu ta’ inkubazzjoni 
wara t-trattament,  
— Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-pro ċedura tat-test,  
— Referenza g ħad-dejta storika tal-mudell. Din g ħandha tinkludi, i żda ma 
għandhiex tkun limitata g ħal: 
i) aċċettabilità tad-dejta tal-QC b'referenza g ħad-dejta storika 
tal-lottijiet;  
ii) aċċettabilità tal-valuri ta’ kontroll po żittivi u negattivi b'referenza 
għall-mezzi u l-meded ta’ kontroll po żittivi u negattivi,  
— Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ evalwazzjoni u żati, inkluża l-ġustifikazzjoni 
għall-għażla tal-punt (i) ta’ limitu g ħall-mudell ta’ tbassir,  
— Referenza g ħad-dejta storika ta’ kontroll.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Riżultati:  
— Tqassim tad-dejta f'forma tabulari minn sustanzi kimi ċi tat-test indi ­
vidwali g ħal kull sessjoni u g ħal kull kejl ta’ replika,  
— Indikazzjoni tal-kontrolli u żati għal sustanzi kimi ċi diretti li jnaqqsu 
l-MTT u/jew sustanzi kimi ċi tat-test li jer ħu l-kulur,  
— Deskrizzjoni ta’ effetti o ħra osservati.  
Diskussjoni dwar ir-ri żultati  
Konklużjoni 
LETTERATURA  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Tielet edizzjoni riveduta, UN New York and Geneva. Disponibbli fuq: [http://www.unece.org/trans/danger/ publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the “Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, ma ħruġ mill-Kumitat Xjentifiku 
Konsultattiv tal-ECVAM (ESAC30), 9 ta’ April 2009. Disponibbli fuq: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(3) Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u 
l-imballaġġ tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u j ħassar id-Direttivi 
67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) 
Nru 1907/2006. ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.  
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals Nru 404, OECD, Pari ġi. Disponibbli fuq: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals Nru 430, OECD, Pari ġi. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals Nru 431, OECD, Pari ġi. Disponibbli 
fuq: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals Nru 435, OECD, Pari ġi. 
Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) KE-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Disponibbli fuq: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment Nru 34, OECD, Pari ġi. 
Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. u Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. u Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in 
Vitro 16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. u Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. u Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests — An assessment 
of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. u Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329–349.
 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. u Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109–129.
 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. u Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559–601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. u 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603–619.
 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. u Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 
351–358.
 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Disponibbli fuq: [http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 ta’ Novembru 2008. Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.ec. europa.eu]
 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, Nru 137, OECD, Pari ġi. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/ 
document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]  
(24) Welss, T., Basketter, D.A. u Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irritation: 
fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. 
in Vitro 18, 231–243.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55–63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Ver żjoni 1.8 (Frar 2009), ECVAM Skin Irritation Vali ­
dation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min — 42 hours 
for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Disponibbli fuq: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Ver żjoni 7.0 (Riveduta Marzu 2009), Protokoll g ħal: In 
vitro  EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek 
Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Ver żjoni 2.0 (Frar 2009), SkinEthic skin irritation 
test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Disponibbli fuq: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., u Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7–18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) Id-Direttiva tal-kummissjoni 2001/59/KE tas-6 ta’ Awwissu 2001 li taddatta 
għall-progres tekniku g ħat-28 darba d-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE 
rigward l-approssimazzjoni tal-li ġijiet, tar-regolamenti u 
tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballa ġġ u 
l-ittikkettjar ta’ sustanzi perikolu żi, ĠU L 225, 21.8.2001, p. 1.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. u Robinson, M.K. (2004), Deter ­
mination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact 
Dermatitis 51, 1–4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. u Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal  
in vivo  data, ALTEX, 14, 359–365.
 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. u Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 
62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Appendiċi 1 
Definizzjonijiet  
Preċiżjoni:  Il-viċinanza tal-qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri ta’ 
referenza a ċċettati. Hija mi żura ta’ prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u aspett 
wieħed ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintu ża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” 
sabiex ifisser il-proporzjon ta’ ri żultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (14).  
Sustanza ta’ riferiment:  Sustanza sensitizzanti jew mhux sensitizzanti u żata bħala 
standard g ħat-tqabbil ma’ sustanza tat-test. Is-sustanza ta’ riferiment g ħandu 
jkollha l-karatteristi ċi li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità 
strutturali u funzjonali g ħall-klassi ta’ sustanzi li jkunu qed ji ġu ttestjati; (iii) 
karatteristi ċi fiżikokimiċi magħrufa; (iv) dejta ta’ appo ġġ dwar effetti 
magħrufa, u (v) potenza mag ħrufa fil-firxa ta’ rispons mixtieq.  
Limitu stmat ta’ kon ċentrazzjoni (ECt):  Konċentrazzjoni stmata ta’ sustanza 
tat-test me ħtieġa sabiex ji ġi prodott indi ċi ta’ stimolazzjoni li huwa indikattiv 
ta’ rispons po żittiv. 
Konċentrazzjoni stmata ta’ tlieta (EC3):  Konċentrazzjoni stmata ta’ sustanza 
tat-test me ħtieġa sabiex ji ġi prodott indi ċi ta’ stimolazzjoni ta’ tlieta.  
Negattiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala negattiv jew mhux attiva 
b’metodu ta’ ttestjar, meta fil-fatt hija po żittiva jew attiva.  
Pożittiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala pożittiva jew attiva minn 
test, meta fil-fatt hija negattiva jew mhux attiva.  
Periklu:  Il-potenzjal g ħal effett avvers g ħas-saħħa jew għall-ambjent. L-effett 
avvers jidher biss jekk hemm esponiment ta’ livell suffi ċjenti.  
Riproduċibbiltà interlaboratorja:  Kejl sa fejn il-laboratorji kwalifikati differenti, 
li jużaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanzi tat-test, jistg ħu 
jipproduċu riżultati li huma simili b’mod kwalitattiv u kwantitattiv. 
Ir-riprodu ċibbiltà interlaboratorja hija determinata matul il-pro ċessi ta’ vali ­
dazzjoni u ta’ validazzjoni minn qabel, u tindika sa fejn test jista’ ji ġi trasferit 
b’suċċess bejn laboratorji, u tissejja ħ ukoll riprodu ċibbiltà bejn laboratorji (14).  
Riproduċibbiltà intralaboratorja:  Determinazzjoni ta’ kemm il-persuni 
kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jista’ jirnexxilhom jirreplikaw ir-ri żultati 
billi jużaw protokoll spe ċifiku fi żminijiet differenti. Din tissejja ħ ukoll ripro ­
duċibbiltà fi ħdan il-laboratorju (14).  
Test “me-too”:  Espressjoni li ting ħad fit-taħdit komuni g ħal metodu ta’ ttestjar li 
huwa strutturalment u funzjonalment simili g ħal metodu ta’ ttestjar ta’ referenza 
validat u a ċċettat. Metodu ta’ ttestjar b ħal dan ikun kandidat g ħal validazzjoni 
rapida (“catch-up validation”). Jintu ża b’mod alternanti ma’ metodu ta’ ttestjar 
simili (14).  
Outlier:  Outlier hija osservazzjoni li hija mmarkata differenti minn valuri o ħra 
f’kampjun aleatorju minn popolazzjoni.  
Standards ta’ Prestazzjoni (PS):  Standards, ibba żati fuq metodu ta’ ttestjar 
validu, li jipprovdu ba żi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ metodu ta’ 
ttestjar propost li huwa simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Hemm inklu żi; 
(i) komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar; (ii) lista minima ta’ Sustanzi 
Kimiċi ta’ Referenza mag ħżula minn fost is-sustanzi kimi ċi użati sabiex 
tintwera l-prestazzjoni a ċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (iii) il-livelli 
simili ta’ pre ċiżjoni u affidabbiltà, ibba żati fuq x’inkiseb g ħall-metodu ta’ ttestjar 
validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost g ħandu juri meta ji ġi evalwat billi tintu ża 
l-lista minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza (14).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Metodu ta’ ttestjar ta’ spe ċjalità:  Metodu ta’ ttestjar li l-manifattura u 
d-distribuzzjoni tieg ħu huma ristretti minn privattivi, drittijiet tal-awtur, marki 
kummerċjali, eċċ. 
Garanzija tal-kwalità:  Proċess ta’ ġestjoni li skontu l-aderenza mal-istandards ta’ 
ttestjar tal-laboratorji, ir-rekwi żiti u l-pro ċeduri ta’ żamma tar-rekords u 
l-preċiżjoni tat-trasferiment tad-dejta ji ġu vvalutati minn individwi li huma indi ­
pendenti minn dawk li jwettqu l-ittestjar.  
Sustanzi kimi ċi ta’ referenza:  Sustanzi kimi ċi magħżula għall-użu fil-proċess ta’ 
validazzjoni, li g ħalihom huma di ġà magħrufa r-reazzjonijet fis-sistema ta’ ttestjar 
ta’ referenza  in vitro  jew in vivo  jew l-ispe ċi ta’ interess. Dawn is-sustanzi kimi ċi 
għandhom ikunu rappre żentanti tal-klassijiet ta’ sustanzi kimi ċi li għalihom huwa 
mistenni jintu ża l-metodu ta’ ttestjar, u dawn g ħandhom jirrappre żentaw il-firxa 
sħiħa ta’ reazzjonijiet li jistg ħu jkunu mistennija mis-sustanzi kimi ċi li għalihom 
huwa mistenni li jintu ża dan il-metodu ta’ ttestjar, minn qawwija, g ħal dgħajfa, 
sa negattivi. Settijiet differenti ta’ sustanzi kimi ċi ta’ referenza jistg ħu jkunu 
meħtieġa għall-istadji differenti tal-pro ċess ta’ validazzjoni, u g ħal metodi ta’ 
ttestjar u u żi tat-testijiet differenti (14).  
Rilevanza:  Deskrizzjoni tar-relazzjoni tat-test g ħall-effett ta’ interess u jekk 
huwiex sinifikanti u utli g ħal skop partikolari. Din tiddetermina kemm it-test 
għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijolo ġiku ta’ interess. 
Ir-rilevanza tinkorpora l-konsiderazzjoni tal-pre ċiżjon (konkordanza) ta’ metodu 
ta’ ttestjar (14).  
Affidabbiltà:  Kejl li jiddetermina kemm il-metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq 
b’mod riprodu ċibbli fi ħdan u bejn il-laboratorji ma ż-żmien, meta dan jitwettaq 
billi jintu ża l-istess protokoll. Din hija e żaminata billi ti ġi kkalkolata 
r-riproduċibbiltà intralaboratorja u dik interlaboratorja (14).  
Sensitizzazzjoni tal- ġilda:  Proċess immunolo ġiku li jitfa ċċa meta individwu 
suxxettibbli jkun espost b’mod topiku g ħal allerġen kimiku induttur, li jipprovoka 
rispons immuni fil- ġilda li jista’ jwassal g ħall-iżvilupp ta’ sensitizzazzjoni 
mal-kuntatt.  
Indiċi ta’ Stimolazzjoni (SI):  Valur ikkalkolat sabiex je żamina l-potenzjal ta’ 
sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ sustanza tat-test li huwa l-proporzjon 
tal-proliferazzjoni fil-gruppi ttrattati g ħal dik fil-grupp ta’ kontroll ta’ mezz simul ­
tanju.  
Sustanza tat-test (li hija msemmija wkoll sustanza kimika tat-test):  Kwalunkwe 
sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan it-TM.  
Metodu ta’ ttestjar validat:  Metodu ta’ ttestjar li g ħalih tlestew studji ta’ vali ­
dazzjoni sabiex ji ġu ddeterminati r-rilevanza (inklu ża l-preċiżjoni) u l-affidabbiltà 
għal skop spe ċifiku. Huwa importanti li ji ġi osservat li metodu ta’ ttestjar validat 
jista’ ma jkollux prestazzjoni suffi ċjenti f’termini ta’ pre ċiżjoni u affidabbiltà 
sabiex jitqies a ċċettabbli g ħall-iskop propost (14).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Appendiċi 2 
Standards ta’ prestazzjoni g ħall-valutazzjoni ta’ metodi ta’  epidermis  umana 
rikostruwita (RhE)  in vitro  simili jew immodifikati proposti g ħall-irritazzjoni 
tal-ġilda 
INTRODUZZJONI  
1. L-għan tal-Istandards tal-Prestazzjoni (PS) huwa li ti ġi kkomunikata l-ba żi li 
permezz tag ħha metodi ġodda, kemm proprjetarji (ji ġifieri, bi drittijiet 
tal-awtur, b’marka kummer ċjali, irreġistrati) kif ukoll mhux proprjetarji 
jistgħu jitqiesu li g ħandhom pre ċiżjoni u affidabbiltà suffi ċjenti għal 
skopijiet spe ċifiċi ta’ ttestjar. Dawn il-PS, ibba żati fuq metodi vvalidati u 
aċċettati, jistg ħu jintużaw għall-evalwazzjoni tal-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni 
ta’ metodi analogi o ħrajn (mag ħrufin bħala testijiet “me-too”) li huma 
bbażati fuq prin ċipji xjentifi ċi simili u jkejlu jew ibassru l-istess effett bijo ­
loġiku jew tossiku (9).  
2. Qabel l-adozzjoni ta’ metodi mmodifikati, ji ġifieri titjib potenzjali propost 
ta’ metodu approvat, g ħandu jkun hemm evalwazzjoni sabiex ikun stabbilit 
l-effett tal-bidliet proposti fuq ir-rendiment tat-test u sa liema punt dawn il-bidliet jaffettwaw l-informazzjoni disponibbli g ħall-komponenti l-o ħrajn 
tal-proċess ta’ validazzjoni. Skont l-g ħadd u t-tip ta’ bidliet proposti, 
id-dejta ġġenerata u d-dokumentazzjoni ta’ appo ġġ għal dawk il-bidliet, 
dawn jew g ħandhom ikunu so ġġetti għall-istess pro ċess ta’ validazzjoni 
kif deskritt g ħal test ġdid, kif ukoll, jekk xieraq, g ħal evalwazzjoni 
limitata tal-affidabbiltà u r-rilevanza permezz ta’ PS stabbiliti (9).
 
3. Metodi simili (me-too) jew immodifikati ta’ kwalunkwe wie ħed mit-tliet 
metodi vvalidati [EpiSkin™ (Metodu ta’ Referenza Vvalidat (Validated Reference Method — VRM)), EpiDerm™ SIT (EPI-200) u SkinEthic™ 
RHE] proposti g ħall-użu taħt dan it-TM g ħandhom ji ġu evalwati sabiex 
jiġu stabbiliti l-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni tagħhom permezz ta’ sustanzi 
kimiċi li jirrappre żentaw il-firxa s ħiħa tal-punte ġġi ta’ irritazzjoni Draize. 
Meta jiġu evalwati permezz tal-20 Sustanza kimika ta’ Referenza rrakkom ­
andati tal-PS (Tabella 1), il-metodi simili jew immodifikati proposti g ħandu 
jkollhom valuri ta’ affidabbiltà u pre ċiżjoni li jkunu komparabbli jew aqwa 
minn dawk li ħarġu mill-VRM (Tabella 2) (2) (16). Il-valuri ta’ affidabbiltà 
u preċiżjoni li għandhom jinkisbu huma pprovduti fil-paragrafi 8 sa 12 ta’ 
dan l-Appendi ċi. Sustanzi kimi ċi mhux ikklassifikati (Ebda Kategorija 
tal-UN GHS/EU CLP) u kklassifikati (Kategorija 2 tal-UN GHS/EU CLP) (1), li jirrappre żentaw klassijiet differenti ta’ sustanzi kimi ċi huma inklu żi, 
sabiex l-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni (is-sensittività, l-ispe ċifiċità u l-pre ċiżjoni 
ġenerali) tal-metodu propost jistg ħu jitqabblu ma’ dawk tal-VRM. 
L-affidabbiltà tal-metodu, kif ukoll il-kapa ċità tiegħu li jidentifika tajjeb 
sustanzi kimi ċi irritanti fil-Kategorija 2 tal-UN GHS/EU CLP u, skont 
il-qafas regolatorju li g ħalih tiġ
i prodotta d-dejta, il-kapa ċità tiegħu wkoll 
li jidentifika tajjeb sustanzi kimi ċi ta’ Ebda Kategorija tal-UN GHS/EU CLP 
(għandha tiġi stabbilita qabel l-u żu tiegħu għall-ittestjar ta’ sustanzi kimi ċi 
tat-test ġodda.  
4. Dawn il-PS huma bba żati fuq il-PS tal-EC-ECVAM (8), a ġġornati skont 
is-sistemi dwar il-klassifikazzjoni u t-tikkettar tal-UN GHS u tal-EU CLP 
(1) (3). Il-PS ori ġinali kienu definiti wara li tlesta l-istudju ta’ validazzjoni 
(21) u kienu bba żati fuq is-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-UE kif stipulata 
fid-Direttiva tal-Kummissjoni 2001/59/KE tas-6 ta’ Awwissu 2001 li tadatta 
għall-progress tekniku g ħat-28 darba d-Direttiva tal-Kunsill Nru 67/548/KEE 
dwar l-approssimazzjoni tal-li ġijiet, ir-regolamenti u d-dispo żizzjonijiet  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 666
 
amministrattivi rigward il-klassifikazzjoni, l-imballa ġġ u l-ittikkettjar 
tas-sustanzi perikolu żi ( 1 ). Minħabba l-adozzjoni tas-sistema UN GHS 
għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar fl-UE (EU CLP) (3), li se ħħet bejn 
il-finalizzazzjoni tal-istudju ta’ validazzjoni u t-tlestija ta’ dan it-TM, il-PS ġew aġġornati (8). Dan l-a ġġornament jirrigwarda l-aktar il-bidliet (i), 
fis-sett ta’ PS g ħas-Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza; u (ii), il-valuri definiti 
ta’ affidabbiltà u pre ċiżjoni (2) (23).
 
STANDARDS TA' PRESTAZZJONI G ĦAL METODI TA' TTESTJAR  IN 
VITRO  TAL-RhE G ĦALL-IRRITAZZJONI TAL- ĠILDA  
5. Il-PS jinkludi dawn it-tliet elementi (9):  
I) Komponenti Essenzjali tal-Metodu ta’ Ttestjar  
II) Lista Minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza  
III) Valuri Definiti ta’ Affidabbiltà u Pre ċiżjoni 
I) Komponenti Essenzjali tal-Metodu ta’ Ttestjar  
6. Dawn jikkonsistu f’elementi essenzjali strutturali, funzjonali u pro ċedurali 
ta’ metodu vvalidat li g ħandhom ikunu inklu żi fil-protokoll ta’ metodu 
mekkanikament u funzjonalment simili jew immodifikat propost. Dawn 
il-komponenti jinkludu karatteristi ċi uniċi tal-metodu, dettalji pro ċedurali 
kritiċi, u miżuri ta’ kontroll tal-kwalità. Il-konformità mal-komponenti 
essenzjali tal-metodu ta’ ttestjar tg ħin sabiex ti żgura li metodu propost 
ieħor simili jew immodifikat ikun ibba żat fuq l-istess kun ċetti bħall-VRM 
korrispondenti (9). Il-komponenti essenzjali tal-metodu ta’ ttestjar huma deskritti fid-dettall fil-paragrafi 16 sa 21 tat-TM u l-ittestjar g ħandu jsir 
skont dan li ġej:
 
— Il-kundizzjonijiet ġenerali (paragrafu 16),  
— Il-kundizzjonijiet funzjonali, li jinkludu:  
— vijabbiltà (paragrafu 17),  
— funzjoni ta’ barriera (paragrafu 18),  
— morfolo ġija (paragrafu 19),  
— riprodu ċibbiltà (paragrafu 20), u,  
— kontroll tal-kwalità (paragrafu 21).  
II) Lista Minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza  
7. Is-Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza jintu żaw sabiex ji ġi stabbilit jekk 
l-affidabbiltà u l-pre ċiżjoni ta’ metodu simili jew immodifikat propost, 
ippruvat li huwa strutturalment u funzjonalment simili bi żżejjed għall- 
VRM, jew li jirrappre żenta modifika żgħira ta’ wie ħed mit-tliet metodi 
vvalidati, humiex komparabbli jew aqwa minn dawk tal-VRM (2) (8) (16) (23). L-20 Sustanza Kimika ta’ Referenza rrakkomandati elenkati fit-Tabella 
1 jinkludu sustanzi kimi ċi li jirrappre żentaw klassijiet differenti ta’ sustanzi 
kimiċi (jiġifieri kategoriji ta’ sustanzi kimi ċi bbażati fuq gruppi funzjonali), 
u jirrappre żentaw il-firxa s ħiħa ta’ punte ġġi ta’ irritazzjoni Draize (minn 
xejn irritanti g ħal ferm irritanti) Is-sustanzi kimi ċi inklużi fil-lista jinkludu 
għaxar (10) sustanzi kimi ċi tal-Kategorija 2 tal-UN GHS/EU CLP u g ħaxar 
(10) sustanzi kimi ċi mhux kategorizzati, li minnhom tlieta huma sustanzi 
kimiċi fakultattivi tal-Kategorija 3 tal-UN GHS. Ta ħt dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar, il-Kategorija 3 fakultattiva hija meqjusa b ħala Ebda Kategorija. 
Is-sustanzi kimi ċi elenkati fit-Tabella 1 huma mag ħżula mis-sustanzi 
kimiċi użati fil-fażi ta’ ottimizzazzjoni li segwiet il-prevalidazzjoni u 
fl-istudju tal-validazzjoni tal-VRM, fir-rigward tal-funzjonalità kimika 
u l-istat fi żiku (14) (18). Dawn is-Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 667  
( 1 ) ĠU L 225, 21.8.2001, p. 1.
 jirrappreżentaw l-inqas g ħadd ta’ sustanzi kimi ċi li għandhom jintu żaw 
għall-evalwazzjoni tal-pre ċiżjoni u l-affidabbiltà ta’ metodu simili jew 
immodifikat propost, i żda ma g ħandhomx jintu żaw għall-iżvilupp ta’ 
metodi ġodda. F’sitwazzjonijiet fejn sustanza kimika elenkata ma tkunx 
disponibbli, jistg ħu jintużaw sustanzi kimi ċi oħrajn li g ħalihom hemm 
disponibbli dejta ta’ referenza  in vivo  adegwata, prin ċipalment 
mis-sustanzi kimi ċi użati fil-fa żi ta’ ottimizzazzjoni li segwiet 
il-prevalidazzjoni u fl-istudju tal-validazzjoni tal-VRM. Jekk ikun mixtieq, sustanzi kimi ċi oħrajn li jirrappre żentaw klassijiet ta’ sustanzi kimi ċi oħrajn 
u li għalihom hemm disponibbli dejta ta’ referenza  in vivo  adegwata jistg ħu 
jiżdiedu mal-lista minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza sabiex 
il-preċiżjoni tal-metodu propost ti ġi evalwata aktar.
 
Tabella 1:  
Lista Minima ta’ Sustanzi Kimi ċi ta’ Referenza g ħad-Determinazzjoni tal-Valuri tal-Pre ċiżjoni u l-Affidabbiltà 
għal Metodi Simili jew Immodifikati ta’ RhE g ħall-irritazzjoni tal- Ġilda ( 1 ) 
Sustanza Kimika Numru tal-CAS Stat Fi żiku Punte ġġin vivo  Kat. in vitro  
VRM Kat. in vivo  tal-UN 
GHS/EU CLP  
1-bromo-4-klorobutan 6940-78-9 Likwidu 0 Kat. 2 Ebda Kat. 
ftalat tad-dietil 84-66-2 Likwidu 0 Ebda Kat. Ebda Kat. aċidu naftil a ċetiku 86-87-3 Solidu 0 Ebda Kat. Ebda Kat. 
fenossi aċetat tal-allil 7493-74-5 Likwidu 0,3 Ebda Kat. Ebda Kat. 
isopropanol 67-63-0 Likwidu 0,3 Ebda Kat. Ebda Kat. 
4-metil-tijo-ben żaldeid 3446-89-7 Likwidu 1 Kat. 2 Ebda Kat. 
stearat tal-metil 112-61-8 Solidu 1 Ebda Kat. Ebda Kat. 
butirat tal-ettil 5870-93-9 Likwidu 1,7 Ebda Kat. Ebda Kat. 
saliċilat tal-eżil 6259-76-3 Likwidu 2 Ebda Kat. Ebda Kat. 
Ċinnamaldeid 104-55-2 Likwidu 2 Kat. 2 Ebda Kat. 
(Kat. 3 Fakult ­
attiva ) (
 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1 Likwidu 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
aldeid taċ-ċiklamen 103-95-7 Likwidu 2,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-bromoe żan 111-25-1 Likwidu 2,7 Kat. 2 Kat. 2 
2-klorometil-3,5-dimetil-4- 
metossipiridina HCl 86604-75-3 Solidu 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
disulfur tad-di-n-propil  ( 2 ) 629-19-6 Likwidu 3 Ebda Kat. Kat. 2  
idrossidu tal-potassju (5 % 
soluzzjoni milwiema) 1310-58-3 Likwidu 3 Kat. 2 Kat. 2 
benżentijol, 5-(1,1-dime ­
tiletil)-2-metil 7340-90-1 Likwidu 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-metil-3-fenil-1-pipera żina 5271-27-2 Solidu 3,3 Kat. 2 Kat. 2  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Sustanza Kimika Numru tal-CAS Stat Fi żiku Punte ġġin vivo  Kat. in vitro  
VRM Kat. in vivo  tal-UN 
GHS/EU CLP  
Ettanal 111-71-7 Likwidu 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
Tetrakloroetilen 127-18-4 Likwidu 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) L-għażla tas-sustanzi kimi ċi hija bba żata fuq il-kriterji li ġejjin: (i) is-sustanzi kimi ċi huma disponibbli kummer ċjalment; (ii) 
jirrappreżentaw il-firxa s ħiħa ta’ punte ġġi ta’ irritazzjoni Draize (minn xejn irritanti g ħal ferm irritanti); (iii) g ħandhom struttura 
kimika definita sew; (iv) jirrappre żentaw il-funzjonalità kimika u żata fil-pro ċess ta’ validazzjoni; u (v) mhumiex asso ċjati ma’ profil 
estremament tossiku (e ż. karċinoġeniċi jew tossi ċi għas-sistema riproduttiva) u mhumiex asso ċjati ma’ spejje ż projbittivi tar-rimi. 
( 2 ) Sustanzi kimi ċi irritanti fil-fenek i żda li għalihom hemm evidenza affidabbli li mhumiex irritanti fil-bnedmin (31) (32) (33). 
( 3 ) Taħt il-UN GHS, mhux fl-EU CLP.  
III) Valuri Definiti ta’ Affidabbiltà u Pre ċiżjoni 
8. Għall-finijiet tal-istabbiliment tal-affidabbiltà u r-rilevanza ta’ metodi 
proposti simili jew immodifikati li g ħandhom ji ġu trasferiti bejn 
il-laboratorji, l-20 Sustanza Kimika ta’ Referenza fit-Tabella 1 g ħandhom 
jiġu ttestjati mill-inqas fi tliet laboratorji. Madankollu, jekk il-metodu 
propost ser jintu ża f’laboratorju wie ħed biss ma jkunx me ħtieġ ittestjar 
f’diversi laboratorji g ħall-validazzjoni. Madankollu huwa essenzjali li 
dawn l-istudji ta’ validazzjoni ji ġu evalwati b’mod indipendenti minn enti ­
tajiet ta’ validazzjoni rikonoxxuti internazzjonalment, bi qbil ma’ linji gwida 
internazzjonali (9). F’kull laboratorju, l-20 Sustanza Kimika ta’ Referenza kollha għandhom ikunu ttestjati fi tliet sensiliet ta’ testijiet indipendenti 
magħmula b’lottijiet ta’ tessut differenti u f ħinijiet spazjati bi żżejjed 
bejniethom. Kull sensiela ta’ testijiet g ħandha tikkonsisti minn minimu ta’ 
tliet repliki ta’ tessut ittestjati fl-istess ħin għal kull sustanza kimika tat-test 
inkluża, NC u PC.
 
9. Il-kalkolu tal-valuri tal-affidabbiltà u tal-pre ċiżjoni tal-metodu propost 
għandu jsir bil-konsiderazzjoni tal-erba’ kriterji hawn ta ħt flimkien, 
filwaqt li ji ġi żgurat li l-valuri g ħall-affidabbiltà u r-rilevanza ji ġu kkalkulati 
b’mod konsistenti u definit minn qabel:  
1. Id-dejta minn sensiliet ta’ testijiet minn sekwenzi s ħaħ ta’ sensiliet ta’ 
testijiet biss tikkwalifika g ħall-kalkolu tal-metodu u tal-varjabbiltà u 
l-kapaċità ta’ previ żjoni fil-laboratorju u bejn il-laboratorji (pre ċiżjoni).  
2. Il-klassifikazzjoni finali g ħandha tinkiseb billi jintu ża l-valur medju 
tal-vijabbiltà fuq is-sensiliet differenti ta’ sekwenza s ħiħa ta’ sensiela 
ta’ testijiet.  
3. Id-dejta miksuba g ħal sustanzi kimi ċi li għandhom sekwenzi s ħaħ ta’ 
sensiliet ta’ testijiet fil-laboratorji parte ċipanti kollha biss tikkwalifika 
għall-kalkolu tal-metodu ta’ varjabbiltà bejn il-laboratorji.  
4. Il-kalkolu tal-valuri ta’ pre ċiżjoni għandu jsir fuq il-ba żi ta’ previ żjonijiet 
tal-laboratorju individwali miksuba g ħall-20 Sustanza ta’ Kimika ta’ 
Referenza mil-laboratorji parte ċipanti differenti.  
F’dan il-kuntest,  sekwenza ta’ sensiela ta’ testijiet  tikkonsisti fi tliet 
sensiliet ta’ testijiet indipendenti minn laboratorju wie ħed għal sustanza 
kimika tat-test wa ħda. Sekwenza s ħiħa ta’ sensiela ta’ testijiet  hija 
sekwenza ta’ sensiela ta’ testijiet minn laboratorju wie ħed għal sustanza 
kimika tat-test wa ħda fejn it-tliet sensiliet ta’ testijiet ikunu validi. Dan 
ifisser li kull sensiela invalida tinvalida sekwenza s ħiħa ta’ sensiela ta’ 
testijiet ta’ tliet sensiliet.  
Riproduċibbiltà fil-laboratorju  
10. Il-valutazzjoni tar-riprodu ċibbiltà fil-laboratorju g ħandha turi konkordanza 
ta’ klassifikazzjonijiet (Kategorija 2 jew Ebda Kategorija tal-UN GHS/EU CLP) miksuba f’sensiliet ta’ testijiet differenti u indipendenti tal-20 Sustanza 
Kimika ta’ Referenza f’laboratorju wie ħed ugwali g ħal jew aktar ( ≥) minn 
90 %.
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Riproduċibbiltà bejn il-laboratorji  
11. Il-valutazzjoni tar-riprodu ċibbiltà bejn il-laboratorji mhijiex me ħtieġa jekk 
il-metodu propost se jintu ża f’laboratorju wie ħed biss. G ħall-metodi li 
għandhom ji ġu ttrasferiti bejn il-laboratorji, il-konkordanza bejn 
il-klassifikazzjonijiet (Kategorija 2 jew Ebda Kategorija tal-UN GHS/EU CLP) miksuba f’sensiliet ta’ testijiet differenti u indipendenti tal-20 
Sustanza Kimika ta’ Referenza preferibbilment minn mill-inqas tliet 
laboratorji g ħandha tkun ugwali g ħal jew aktar ( ≥) minn 80 %.
 
Kapaċità ta’ previ żjoni (preċiżjoni)  
12. Il-pre ċiżjoni (sensittività, spe ċifiċità u preċiżjoni ġenerali) tal-metodu simili 
jew immodifikat propost g ħandha tkun komparabbli jew aqwa minn dik 
tal-VRM, filwaqt li ti ġi kkunsidrata informazzjoni addizzjonali relatata 
mar-rilevanza fl-ispe ċijiet ta’ interess (Tabella 2). Is-sensittività g ħandha 
tkun ugwali g ħal jew og ħla (≥) minn 80 % (2) (8) (23). Madankollu, 
hemm restrizzjoni spe ċifika oħra li tapplika g ħas-sensittività tal-metodu  in 
vitro propost inkwantu żewġ sustanzi kimi ċi tal-Kategorija 2  in vivo , 1- 
dekanol  u disulfur tad-di-n-propil,  jistgħu jiġu kklassifikati ħażin bħala 
Ebda Kategorija minn aktar minn laboratorju wie ħed parte ċipant. 
L-ispeċifiċità għandha tkun ugwali g ħal jew og ħla (≥) minn 70 % (2) (8) 
(23). Mhemmx aktar restrizzjonijiet rigward l-ispe ċifiċità tal-metodu  in vitro  
propost, ji ġifieri, kull laboratorju parte ċipant jista’ jikklassifika ħażin 
kwalunkwe sustanza kimika  in vivo  ta’ Ebda Kategorija sakemm 
l-ispeċifiċità finali tal-metodu ta’ ttestjar tkun f’firxa a ċċettabbli. 
L-preċiżjoni ġenerali għandha tkun ugwali g ħal jew og ħla (≥) minn 75 % 
(2) (8) (23). G ħalkemm is-sensittività tal-VRM ikkalkulata g ħall-20 
Sustanza Kimika ta’ Referenza elenkati fit-Tabella 1 hija ugwali g ħal 90 %, 
il-valur ta’ sensittività minimu definit me ħtieġ għal kwalunkwe metodu simili 
jew immodifikat sabiex ikun ikkunsidrat validu huwa stabbilit g ħal 80 % 
minħabba li kemm  1-dekanol  (sustanza kimika mar ġinali) u  disulfur tad-di- 
n-propil  (negattiv falz tal-VRM) huma mag ħrufa li mhumiex irritanti 
fil-bnedmin (31) (32) (33), g ħalkemm huma identifikati b ħala irritanti 
fit-test fuq il-fenek. Min ħabba li l-mudelli tal-RhE huma bba żati fuq ċelloli 
ta’ oriġini mill-bniedem, jistg ħu jbassru dawn is-sustanzi kimi ċi bħala mhux 
irritanti (Ebda Katergorija tal-UN GHS/EU CLP).  
Tabella 2.  
Valuri ta’ tbassir me ħtieġa għas-sensittività, l-ispe ċifiċità u l-pre ċiżjoni ġenerali g ħal kull 
metodu simili jew immodifikat sabiex ji ġi kkunsidrat validu.  
Sensittività Spe ċifiċità Pre ċiżjoni Ġenerali  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Kriterji ta’ A ċċettazzjoni tal-Istudju  
13. Huwa possibbli li test wie ħed jew aktar fuq sustanza kimika wa ħda jew 
aktar ma jissodisfax/jissodisfawx il-kriterji ta’ a ċċettazzjoni tat-test g ħat-test 
u għas-sustanzi kimi ċi ta’ kontroll jew ma jkunx/jkunux a ċċettabbli g ħal 
raġunijiet o ħrajn. Biex dejta nieqsa ti ġi kkumplimentata, g ħal kull 
sustanza kimika ta’ test huwa ammissibbli g ħadd massimu ta’ żewġ 
testijiet o ħrajn (“ittestjar mill- ġdid”). B’mod aktar pre ċiż, minħabba li 
fil-każ tal-ittestjar mill- ġdid il-PC u l-NC ukoll g ħandhom ikunu ttestjati 
fl-istess ħin, jista’ jsir g ħadd massimu ta’ żewġ sensiliet ta’ testijiet o ħra 
għal kull sustanza kimika tat-test.  
14. Huwa kon ċepibbli li anki wara l-ittestjar mill- ġdid, l-għadd minimu ta’ tliet 
sensiliet ta’ testijiet validi me ħtieġa għal kull sustanza kimika ttestjata ma 
jinkisibx g ħal kull Sustanza Kimika ta’ Referenza f’kull laboratorju 
parteċipant, li jwassal g ħal matriċi tad-dejta mhux kompluta. F’dawn 
il-każijiet it-tliet kriterji li ġejjin għandhom ji ġu ssodisfati kollha sabiex 
il-ġabriet tad-dejta jitqiesu a ċċettabbli:  
1. Kull wa ħda mill-20 Sustanza Kimika ta’ Referenza g ħandu jkollha 
mill-inqas sekwenza wa ħda sħiħa ta’ sensiela ta’ testijiet.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. F’kull wie ħed minn mill-inqas tliet laboratorji parte ċipanti, minimu ta’ 
85 % tas-sekwenzi tas-sensiliet ta’ testijiet g ħandhom ikunu s ħaħ (għal 
20 sustanza kimika, ji ġifieri 3 sekwenzi ta’ sensiela ta’ testijiet invalidi 
huma permessi f’laboratorju wie ħed). 
3. Minimu ta’ 90 % tas-sekwenzi kollha ta’ sensiliet ta’ testijiet minn 
mill-inqas tliet laboratorji g ħandhom ikunu s ħaħ (għal 20 sustanza 
kimika ttestjati fi tliet laboratorji; ji ġifieri sitt sekwenzi ta’ sensiela ta’ 
testijiet invalidi huma permessi b’kollox).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  IL-METODU TA' TTESTJAR TAL-OPA ĊITÀ U 
TAL-PERMEABILITÀ TAL-KORNEA TAL-BOVINI G ĦALL- 
IDENTIFIKAZZJONI TA' SUSTANZI KORRU ŻIVI U 
IRRITANTI SEVERI G ĦALL-GĦAJNEJN  
DAĦLA 
01. Il-metodu ta' ttestjar tal-Opa ċità u tal-Permeabilità tal-Kornea 
tal-Bovini (BCOP) huwa metodu ta' ttestjar  in vitro  li jista' jintu ża, f'ċerti 
ċirkustanzi u b'limitazzjonijiet spe ċifiċi, sabiex sustanzi u ta ħlitiet jiġu kklas­
sifikati bħala “sustanzi korru żivi u irritanti severi g ħall-għajnejn” (1) (2) (3). 
Għall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, irritanti severi huma ddefiniti b ħala 
dawk li jikkaw żaw leżjonijiet fl-g ħajnejn li jippersistu fil-fenek g ħal 
tal-anqas 21 jum wara l-amministrazzjoni. Filwaqt li ma jitqiesx validu 
bħala sostituzzjoni kompluta g ħat-test  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn il-fniek, 
il-BCOP huwa rrakkomandat biex jintu ża bħala strateġija ta' ttestjar imtarra ġ 
għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar regolatorji fi ħdan dominju spe ċifiku ta' 
applikabilità (4) (5). Is-sustanzi tat-test u t-ta ħlitiet (6) jistg ħu jiġu kklas­
sifikati bħala sustanzi korru żivi jew irritanti severi g ħall-għajnejn ming ħajr 
ma jsir aktar ittestjar fuq il-fniek. Sustanza li tag ħti riżultat negattiv tkun 
teħtieġ li tiġi ttestjata fuq il-fniek permezz ta' strate ġija ta' ttestjar 
sekwenzjali, kif deskritt fil-Linja Gwida g ħall-Ittestjar tal-OECD 405 (7) 
(il-kapitolu B.5 ta' dan l-Anness).  
02. L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-pro ċeduri użati 
għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza tat-test tikkaw ża korrużività 
jew irritazzjoni severa kif imkejla mill- ħila tas-sustanza li tikkaw ża 
opaċità jew żieda fil-permeabilità f'kornea bovina i żolata. L-effetti tossi ċi 
għall-kornea jitkejlu skont: (i) it-tra żmissjoni mnaqqsa tad-dawl (opa ċità), u 
(ii) iż-żieda fil-passa ġġ taż-żebgħa fluworexxina tas-sodju (permeabilità). 
Il-valutazzjonijiet tal-opa ċità u l-permeabilità tal-kornea wara esponiment 
għas-sustanza tat-test ji ġu kkombinati g ħad-derivazzjoni ta' Punte ġġ 
tal-Irritanza  In Vitro  (IVIS), li jintu ża biex ji ġi kklassifikat il-livell ta' 
kemm tikkaw ża irritazzjoni s-sustanza tat-test.  
03. L-irritanti g ħall-għajnejn li jikkaw żaw leżjonijiet li jitilqu f'anqas minn 
21 jum u sustanzi li mhumiex irritanti ġew ittestjati wkoll bl-u żu 
tal-metodu ta' ttestjar BCOP. Madankollu, l-akkuratezza u l-kredibilità tal-metodu ta' ttestjar BCOP g ħas-sustanzi f'dawn il-kategoriji ma ġewx 
evalwati b'mod formali.
 
04. Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendi ċi 1. 
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
05. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bba żat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar 
BCOP tal-Kumitat ta' Koordinazzjoni Intera ġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' 
Metodi Alternattivi (ICCVAM) (8), li ġie żviluppat wara studju ta' vali ­
dazzjoni internazzjonali (4)(5)(9), b'kontribuzzjonijiet mi ċ-Ċentru Ewropew 
għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż 
għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM). Il-protokoll huwa 
bbażat fuq tag ħrif miksub mill-Istitut g ħax-Xjenzi In Vitro (IIVS) u 
l-Protokoll 124 INVITTOX (10), li jirrappre żentaw il-protokoll u żat 
għall-istudju tal-prevalidazzjoni tal-assa ġġ BCOP, li twettaq bejn l-1997 u 
l-1998 u li kien sponsorjat mill-Komunità Ewropea. I ż-żewġ protokolli 
huma bba żati fuq il-metodolo ġija ta' assa ġġ BCOP li ġiet irrappurtata 
għall-ewwel darba minn Gautheron  et al  (11).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
06. Il-limitazzjonijiet identifikati g ħal dan il-metodu ta' ttestjar huma bba żati fuq 
ir-rati għoljin ta' po żittivi foloz g ħall-alkoħols u l-ketoni u r-rata g ħolja ta' 
negattivi foloz g ħas-solidi osservata fil-ba żi tad-dejta tal-validazzjoni (ara 
l-paragrafu 44) (5). Meta s-sustanzi ta' dawn il-klassijiet kimi ċi u fiżiċi 
jiġu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-BCOP skont is-sistemi ta' 
klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS titjieb b'mod sostanzjali (5). Abba żi 
tal-għan ta' dan l-assa ġġ (i.e., li jidentifika biss is-sustanzi korru żivi/irritanti 
severi għall-għajnejn), rati ta' negattivi foloz mhumiex kriti ċi minħabba li 
tali sustanzi sussegwentement ji ġu ttestjati fuq il-fniek jew b'testijiet o ħra in 
vitro  vvalidati b'mod xieraq, skont ir-rekwi żiti regolatorji, bl-u żu ta' 
strateġija ta' ttestjar sekwenzjali b'appro ċċ ibbażat fuq l-importanza 
tal-evidenza. Barra minn hekk, il-ba żi tad-dejta tal-validazzjoni attwali ma 
tippermettix evalwazzjoni xierqa ta' w ħud mill-klassijiet kimi ċi jew 
tal-prodotti ( eż., it-taħlitiet). Madankollu, l-investigaturi jistg ħu jqisu li 
jużaw dan il-metodu ta' ttestjar g ħat-tipi kollha ta' materjali tat-test 
(inklużi t-taħlitiet), fejn ri żultat pożittiv ikun jista' ji ġi aċċettat bħala 
indikattiv ta' reazzjoni g ħal sustanza korru żiva jew irritant sever 
għall-għajnejn. Madankollu, ri żultati po żittivi miksuba bl-alko ħols jew 
il-ketoni g ħandhom ji ġu interpretati b' ċertu kawtela min ħabba r-riskju ta' 
tbassir żejjed.  
07. Il-pro ċeduri kollha li jinvolvu g ħajnejn bovini u kornej bovini g ħandhom 
isegwu r-regolamenti u l-pro ċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar 
f'dak li g ħandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali dderivati 
mill-annimali, li jinkludu, i żda li mhumiex limitati g ħal, tessuti u fluwidi 
tat-tessuti. Il-prekawzjonijiet universali tal-laboratorji huma rrakkomandati 
(12).  
08. Limitazzjoni tal-metodu ta' ttestjar hija dik li, g ħalkemm il-metodu jqis u ħud 
mill-effetti fuq l-g ħajnejn evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritanza 
f'għajnejn il-fenek u sa ċertu punt is-severità tag ħhom, il-metodu ma jqisx 
feriti fil-kon ġuntiva u fil- ħabba tal-g ħajnejn. Barra dan, g ħalkemm 
ir-riversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax ti ġi evalwata  per se  fl-assaġġ 
BCOP, ġie propost, abba żi ta' studji fuq g ħajnejn il-fniek, li valutazzjoni 
tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintu ża biex issir distinzjoni bejn 
effetti riversibbli u dawk irriversibbli (13). Fl-a ħħar nett, il-BCOP ma jipper ­
mettix valutazzjoni tal-potenzjal g ħal tossiċità sistemika asso ċjata ma' 
esponiment tal-g ħajnejn.  
09. Qed isiru sforzi kontinwi sabiex ji ġu kkaratterizzati aktar il-limitazzjonijiet 
tal-assaġġ BCOP kif ukoll kemm huwa utli g ħall-identifikazzjoni ta' irritanti 
mhux severi u sustanzi li mhumex irritanti (ara wkoll il-paragrafu 45). L-utenti qed ji ġu inkora ġġuti wkoll jipprovdu lill-organizzazzjonijiet 
tal-validazzjoni b'kampjuni u/jew dejta g ħal evalwazzjoni formali ta' u żi 
futuri possibbli tal-metodu ta' ttestjar BCOP, inklu żi dawk 
għall-identifikazzjoni ta' irritanti mhux severi u sustanzi li mhumex irritanti.
 
10. Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qed jistabbilixxi dan 
l-assaġġ, għandhom jintu żaw is-sustanzi kimi ċi ta' profi ċjenza pprovduti 
fl-Appendi ċi 2. Laboratorju jista' ju ża dawn is-sustanzi kimi ċi biex juri 
l-kompetenza teknika tieg ħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar BCOP qabel 
ma jissottometti dejta tal-assa ġġ BCOP g ħall-finijiet tal-klassifikazzjoni 
regolatorja tal-perikli.  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
11. Il-metodu ta' ttestjar BCOP huwa mudell organotipiku li jipprovdi manu ­
tenzjoni fuq perjodu ta' żmien qasir tal-funzjoni fi żjoloġika u bijokimika 
normali tal-kornea tal-bovini  in vitro . F'dan il-metodu ta' ttestjar, il- ħsara 
mis-sustanza tat-test ti ġi vvalutata minn kejl kwantitattiv ta' bidliet fl-opa ċità 
u l-permeabilità tal-kornea permezz ta' opa ċitometru u spettrofotometru ta' 
dawl viżibbli, rispettivament. I ż-żewġ tipi ta' kejl jintu żaw biex ji ġi 
kkalkulat IVIS, li jintu ża biex tiġi assenjata kategorija ta' klassifikazzjoni 
ta' periklu ta' irritazzjoni  in vitro  għat-tbassir tal-potenzjal tas-sustanza 
tat-test li tikkaw ża irritazzjoni fl-g ħajnejn  in vivo  (ara l-kriterji 
tad-Deċiżjoni).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. Il-metodu ta' ttestjar BCOP ju ża kornej i żolati mill-g ħajnejn ta' bhejjem li 
jkunu għadhom kemm inqatlu. L-opa ċità tal-kornea titkejjel b'mod kwan ­
titattiv b ħala l-ammont ta' tra żmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. 
Il-permeabilità titkejjel b'mod kwantitattiv b ħala l-ammont ta' żebgħa 
fluworexxina tas-sodju li jg ħaddi min-na ħa għall-oħra tal-ħxuna kollha 
tal-kornea, kif individwat fil-midjum fil-kavità posterjuri. Is-sustanzi 
tat-test, li ji ġu introdotti fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqieg ħed 
il-kornea, ji ġu applikati fis-superfi ċje tal-epitelju tal-kornea. L-Appendi ċi 3 
tipprovdi deskrizzjoni u dijagramma tal-apparat fejn titqieg ħed il-kornea u żat 
fil-BCOP. L-apparat fejn titqieg ħed il-kornea jista' jinxtara minn sorsi 
differenti jew jista' jinbena.  
Is-Sors u l-Età tal-G ħajnejn Bovini u l-G ħażla tal-Ispe ċijiet tal-Annimali  
13. Bhejjem mibg ħuta l-biċċeriji tipikament jinqatlu jew g ħall-konsum 
mill-bniedem inkella g ħal użi kummer ċjali oħra. Bħala sors ta' kornej 
għall-użu fil-BCOP jintu żaw biss l-annimali b'sa ħħithom li jitqiesu xierqa 
biex jidħlu fil-katina tal-ikel tal-bniedem. Min ħabba li l-bhejjem g ħandhom 
skala wiesg ħa ta' piżijiet, skont ir-razza, l-età u s-sess, mhemmx pi ż irrak­
komandat g ħall-annimal meta ji ġi biex jinqatel.  
14. Meta jintu żaw għajnejn minn annimali ta' età differenti jistg ħu jirriżultaw 
varjazzjonijiet fid-dimensjonijiet tal-kornej. Kornej b'dijametru orizzontali > 30,5 mm u valuri tal- ħxuna ċentrali tal-kornea (CCT) ≥ 1 100 μm 
ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom aktar minn tmien snin, 
filwaqt li dawk b'dijametru orizzontali < 28,5 mm u CCT < 900 μm 
ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom anqas minn ħames snin 
(14). Min ħabba f'hekk, g ħajnejn minn bhejjem li jkollhom aktar minn 60 
xahar tipikament ma jintu żawx. Għajnejn minn bhejjem li jkollhom anqas 
minn 12-il xahar tradizzjonalment ma ntu żawx għaliex l-għajnejn ikunu 
għadhom qeg ħdin jiżviluppaw u l- ħxuna tal-kornea u d-dijametru 
tal-kornea jkunu i żgħar b'mod konsiderevoli minn dawk irrapportati 
għall-għajnejn mill-bhejjem adulti. Madankollu, l-u żu ta' kornej minn 
annimali żgħar (i.e., ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar) huwa permess 
minħabba li hemm xi vanta ġġi, bħal pereżempju disponibilità akbar, skala 
dejqa ta' etajiet, u inqas perikli marbuta ma' esponiment potenzjali tal- 
ħaddiema g ħall-Enċefalopatija Spon ġiforma Bovina (15). Min ħabba li 
aktar evalwazzjoni tal-effett tad-daqs jew il- ħxuna tal-kornea fuq 
is-sensibilità g ħal sustanzi korru żivi u irritanti tkun utli, l-utenti huma inkor
­
aġġuti jirrapportaw stima tal-età u/jew il-pi ż tal-annimali li jipprovdu 
l-kornej u żati fi studju.  
Ġbir u Trasport tal-G ħajnejn lejn il-Laboratorju  
15. L-għajnejn jin ġabru mill-impjegati tal-bi ċċerija. Sabiex kemm jista' jkun 
titnaqqas kull tip ta' ħsara fl-għajnejn, kemm dik mekkanika kif ukoll tipi 
oħra ta' ħsara, l-għajn għandha titne ħħa mill-ħofra tagħha mill-aktar fis 
possibbli wara l-mewt. Sabiex ji ġi evitat l-esponiment tal-g ħajnejn għal 
sustanzi potenzjalment irritanti, l-impjegati tal-bi ċċeriji ma g ħandhomx 
jużaw deterġenti meta jla ħilħu ras l-annimal.  
16. L-għajnejn g ħandhom jing ħaddsu kompletament f'soluzzjoni tal-mel ħ 
ekwilibrata ta' Hanks, (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) f're ċipjent 
ta' daqs adattat, u ttrasportati lejn il-laboratorju b'mod li kemm jista' jkun inaqqas id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. Min ħabba li 
l-għajnejn jin ġabru waqt il-pro ċess tal-qatla, dawn jistg ħu jiġu esposti g ħad- 
demm u g ħal sustanzi bijolo ġiċi oħra, inklużi batterji u mikroorgani żmi 
oħra. Għalhekk huwa importanti li ji ġi żgurat li r-riskju ta' kontaminazzjoni 
jitnaqqas kemm jista' jkun ( eż. billi r-re ċipjent li jkun fih l-g ħajnejn jin żamm 
fuq silġ imxarrab, billi ji żdiedu antibjoti ċi fl-HBSS li tintu ża għall-ħżin 
tal-għajnejn waqt it-trasport [ eż. 100 IU/mL ta' peni ċillina u 100 mg/mL 
ta' streptomi ċina]).
 ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. L-intervall tal- ħin li jgħaddi minn meta jin ġabru l-għajnejn u l-kornej 
jintużaw fil-BCOP g ħandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament 
għandhom jin ġabru u jintu żaw fl-istess ġurnata) u g ħandu jintwera li dan 
ma jikkompromettix ir-ri żultati tal-assa ġġ. Dawn ir-ri żultati huma bba żati 
fuq il-kriterji tal-g ħażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-reazzjonijiet 
tal-kontrolli po żittivi u negattivi. L-g ħajnejn kollha u żati fl-assa ġġ 
għandhom ikunu mill-istess grupp ta' g ħajnejn mi ġbura f'ġurnata spe ċifika.  
Kriterji tal-G ħażla għall-Għajnejn U żati fl-BCOP  
18. Malli jaslu fil-laboratorju l-g ħajnejn jiġu eżaminati bir-reqqa g ħad-difetti 
inklużi żieda fl-opa ċità, grif u neovaskularizzazzjoni. G ħandhom jintu żaw 
biss il-kornej minn g ħajnejn li ma jkollhom l-ebda difett ta' dan it-tip.  
19. Il-kwalità ta' kull kornea ti ġi evalwata wkoll fi stadji li jokkorru aktar 'il 
quddiem fl-assa ġġ. Kornej li jkollhom opa ċità akbar minn seba' unitajiet ta' 
opaċità (NOTA: l-opa ċitometru g ħandu jkun ikkalibrat mal-istandards ta' 
opaċità li jintu żaw biex ji ġu stabbiliti l-unitajiet ta' opa ċità, ara 
l-Appendi ċi 3) wara perjodu inizjali ta' ekwilibrazzjoni ta' sieg ħa 
għandhom jintremew.  
20. Kull grupp ta' trattament (sustanza tat-test, kontrolli negattivi u po żittivi 
konkorrenti) jikkonsisti minn minimu ta' tliet g ħajnejn. Fl-assa ġġ BCOP 
għandhom jintu żaw tliet kornej g ħall-kontroll negattiv. Min ħabba li 
l-kornej kollha jinqatg ħu barra mill-globu s ħiħ, u jitqieg ħdu fil-kavitajiet 
tal-kornej, il-manipulazzjoni tag ħhom tista' tirri żulta f'artefatti fil-valuri 
tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornej individwali (inklu ż il-kontroll 
negattiv). Barra minn hekk, il-valuri tal-opa ċità u l-permeabilità 
mill-kornej tal-kontroll negattiv jintu żaw biex jikkore ġu l-valuri tal-opa ċità 
u l-permeabilità tal-kornej tal-o ġġett tat-test u l-kornej tal-kontroll po żittiv 
fil-kalkoli tal-IVIS.  
PROĊEDURA  
Preparazzjoni tal-G ħajnejn  
21. Kornej li ma jkollhom l-ebda difett ji ġu ddissektjati b'tali mod li jibqa' minn 
2 sa 3 ċm ta' xifer tal-isklerotika sabiex jg ħin il-manipulazzjoni sussegwenti, 
u dan isir b'attenzjoni sabiex ti ġi evitata kwalunkwe ħsara fl-epitelju u 
l-endotelju. Kornej i żolati jitqieg ħdu f'apparat fejn titqieg ħed il-kornea 
ddisinjat spe ċjalment g ħal dan il-g ħan li jikkonsisti f'kavitajiet anterjuri u 
posterjuri, li jkunu f'kuntatt mal- ġenb epiteljali u l- ġenb endoteljali 
tal-kornea, rispettivament. I ż-żewġ kavitajiet jimtlew sax-xifer bil-midjum 
essenzjali minimu ta' Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) 
(l-ewwel il-kavità posterjuri), filwaqt li ji ġi żgurat li ma jifformawx b żieżaq. 
L-apparat imbag ħad jiġi kkalibrat g ħal tal-anqas sieg ħa f'temperatura ta' 
32 ± 1°C sabiex il-kornej jekwilibraw mal-midjum u jiksbu kemm jista' 
jkun possibbli attività metabolika normali (it-temperatura approssimattiva 
tas-superfi ċje tal-kornea  in vivo  hija 32 °C).  
22. Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, EMEM frisk u msa ħħan minn qabel 
jiżdied fiż-żewġ kavitajiet u jittie ħed l-ewwel qari tal-valuri tal-opa ċità 
għal kull kornea. Kwalunkwe kornea li jkollha ħsara makroskopika 
fit-tessut tag ħha ( eż., grif, pigmentazzjoni, neovaskularizzazzjoni) jew 
opaċità > 7 unitajiet ta' opa ċità tintrema. L-opa ċità medja tal-kornej kollha 
ekwilibrati ti ġi kkalkulata. Minimu ta' tliet kornej b'valuri ta' opa ċità qrib 
il-valur medjan g ħall-kornej kollha jintg ħażlu bħala kornej g ħall-kontroll 
negattiv (jew solvent). Il-kornej li jibqa' ji ġu ddistribwiti fi grupp ta' trat ­
tament u ta' kontroll po żittiv. ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Minħabba li l-kapa ċità tas-sħana tal-ilma hija og ħla minn dik tal-arja, l-ilma 
jipprovdi kundizzjonijiet ta' temperatura aktar stabbli g ħall-inkubazzjoni. 
Għalhekk, huwa rrakkomandat l-u żu ta' banju tal-ilma sabiex l-apparat 
fejn titqieg ħed il-kornea u l-kontenut tieg ħu jinżammu f'temperatura ta' 
32 ± 1°C. Madankollu, jistg ħu jintużaw ukoll inkubaturi tal-arja, filwaqt li 
jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tin żamm l-istabilità tat-temperatura ( eż., billi 
l-apparat u l-midja jissa ħħnu minn qabel).  
Applikazzjoni tas-Sustanza tat-Test  
24. Jintu żaw żewġ protokolli ta' trattament, wie ħed għal-likwidi u l-a ġenti tens­
joattivi (solidi jew likwidi), u ie ħor għal solidi li mhumiex a ġenti tens­
joattivi.  
25. Il-likwidi ji ġu ttestjati meta ma jkunux iddilwiti, filwaqt li l-a ġenti tens­
joattivi ji ġu ttestjati f'kon ċentrazzjoni ta' 10 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur 
tas-sodju ta' 0,9 %, ilma distillat, jew solvent ie ħor li jkun intwera li ma 
għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. Semisolidi, kremi u 
x-xema' kollha tipikament ji ġu ttestjati b ħala likwidi. G ħandha ti ġi 
pprovduta ġustifikazzjoni xierqa g ħal konċentrazzjonijiet ta' dilwizzjoni 
alternattivi. Il-kornej ji ġu esposti g ħal-likwidi u l-a ġenti tensjoattivi g ħal 
10 minuti. L-u żu ta' ħinijiet oħra ta' esponiment g ħandu jkun abba żi ta' 
raġuni xjentifika xierqa.  
26. Solidi li mhumiex a ġenti tensjoattivi tipikament ji ġu ttestjati b ħala 
soluzzjonijiet jew suspensjonijiet f'kon ċentrazzjoni ta' 20 % f'soluzzjoni 
tal-klorur tas-sodju ta' 0,9 %, ilma distillat, jew solvent ie ħor li jkun 
intwera li ma g ħandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. F' ċerti 
ċirkostanzi u b' ġustifikazzjoni xjentifika xierqa, is-solidi jistg ħu jiġu 
ttestjati puri b'applikazzjoni diretta fuq is-superfi ċje tal-kornea permezz 
tal-metodu tal-kavità miftu ħa (ara l-paragrafu 29). Il-kornej ji ġu esposti 
għas-solidi g ħal erba' sig ħat, iżda bħal ma jsir g ħal-likwidi u l-a ġenti tens­
joattivi, jistg ħu jintużaw ħinijiet ta' esponiment alternattivi abba żi ta' raġuni 
xjentifika xierqa.  
27. Jistg ħu jintużaw metodi ta' trattament differenti, skont in-natura fi żika u 
l-karatteristi ċi kimiċi (eż. solidi, likwidi, likwidi visku żi jew mhux 
viskużi) tas-sustanza tat-test. Il-fattur kritiku huwa li ji ġi żgurat li 
s-sustanza tat-test tkopri b'mod xieraq is-superfi ċje tal-epitelju u li titne ħħa 
b'mod xieraq waqt l-istadji tat-tla ħliħ. Metodu tal-kavità mag ħluqa tipi­
kament jintu ża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi mhux visku żi 
għal likwidi visku żi ftit, filwaqt li metodu tal-kavità miftu ħa tipikament 
jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi semivisku żi għal 
likwidi visku żi u għal solidi puri.  
28. Fil-metodu tal-kavità mag ħluqa, ammont tas-sustanza tat-test (750 μL) li 
jkun biżżejjed biex ikopri l-kavità anterjuri ji ġi introdott minn ġot-toqob 
tal-iddożar fuq is-superfi ċje ta' fuq tal-kavità, u t-toqob sussegwentement 
jiġu ssiġillati bit-tappieri tal-kavità waqt l-esponiment. Huwa importanti li 
jiġi żgurat li kull kornea ti ġi esposta g ħas-sustanza tat-test g ħall-intervall tal- 
ħin xieraq.  
29. Fil-metodu tal-kavità miftu ħa, iċ-ċirku li jsakkar it-tieqa u t-tieqa tal- ħġieġ 
jitneħħew mill-kavità anterjuri qabel ma jibda t-trattament. Il-kontroll jew 
is-sustanza tat-test (750 μL, jew bi żżejjed sustanza tat-test biex tkopri 
l-kornea kompletament) ji ġi/tiġi applikat(a) direttament fuq is-superfi ċje 
tal-epitelju tal-kornea permezz ta' mikropipetta. Jekk sustanza tat-test ma 
tkunx tista' ti ġi ppipettata fa ċilment, is-sustanza tat-test tista' tin ġibed 
permezz tal-pressjoni f'pipetta bi spostament po żittiv sabiex ji ġi ffaċilitat 
l-iddożar. Il-ponta tal-pipetta bi spostament po żittiv, tidda ħħal fil-ponta 
tad-distribuzzjoni tas-siringa sabiex il-materjal ikun jista' jin ġibed fil-ponta 
tal-pipetta ta ħt pressjoni. Imbag ħad jeħtieġ li l-pistun tal-pipetta jin ġibed 'il 
fuq fl-istess waqt li l-pistun tas-siringa jing ħafas 'l isfel. Jekk fil-ponta 
tal-pipetta jiffurmaw xi b żieżaq tal-arja, is-sustanza tat-test g ħandha 
titneħħa (tinħareġ 'il barra) u l-pro ċess jiġi ripetut sa mal-ponta timtela 
mingħajr ma jkun hemm b żieżaq tal-arja. Jekk ikun me ħtieġ, tista' tintu ża 
siringa normali (ming ħajr labra) min ħabba li din tippermetti l-kejl ta' volum 
akkurat tas-sustanza tat-test u applikazzjoni e ħfef fuq is-superfi ċje 
tal-epitelju tal-kornea. Wara l-iddo żar, it-tieqa tal- ħġieġ terġa' titqieg ħed 
fuq il-kavità anterjuri biex ter ġa' tinħoloq sistema mag ħluqa. ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubazzjoni wara l-esponiment  
30. Wara l-perjodu ta' esponiment, is-sustanza tat-test, is-sustanza tal-kontroll 
negattiv, jew tal-kontroll po żittiv titne ħħa mill-kavità anterjuri u l-epitelju 
jinħasel tal-anqas tliet darbiet (jew sakemm ma tkun tista' ti ġi osservata 
l-ebda evidenza vi żiva tas-sustanza tat-test) bl-EMEM (li jkun fih il-fenol 
aħmar). Midjum li jkun fih il-fenol a ħmar jintu ża għat-tlaħliħ minħabba li 
bidla fil-kulur tal-fenol a ħmar tista' ti ġi mmonitorjata sabiex ti ġi ddeter­
minata l-effika ċja tat-tlaħliħ ta' materjali a ċidużi jew alkalini. Il-kornej 
jinħaslu aktar minn tliet darbiet jekk il-fenol a ħmar jibqa' jibdel il-kulur 
(isfar jew vjola), jew is-sustanza tat-test tkun g ħadha viżibbli. Ladarba 
l-midjum ma jibqag ħlux sustanza tat-test, il-kornej jitla ħalħu għall-aħħar 
darba bl-EMEM (ming ħar fenol a ħmar). L-EMEM (ming ħajr fenol a ħmar) 
jintuża għall-aħħar tlaħliħa sabiex ji ġi żgurat li l-fenol a ħmar jitneħħa komp­
letament mill-kavità anterjuri qabel ma titkejjel l-opa ċità. Il-kavità anterjuri 
mbagħad terġa' timtela b'EMEM frisk ming ħajr fenol a ħmar. 
31. Għal-likwidi jew l-a ġenti tensjoattivi, wara t-tla ħliħ, il-kornej ji ġu inkubati 
għal sagħtejn oħra f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. F' ċerti ċirkostanzi ħin itwal 
ta' inkubazzjoni wara l-esponiment jista' jkun utli. Dan g ħandu jitqies skont 
il-każ. Kornej trattati b'solidi jitla ħalħu kompletament fi tmiem il-perjodu ta' 
esponiment li jdum erba' sig ħat, iżda ma jeħtiġux aktar inkubazzjoni.  
32. Fi tmiem il-perjodu ta' inkubazzjoni wara l-esponiment g ħal-likwidi u 
l-aġenti tensjoattivi u fi tmiem il-perjodu ta' esponiment ta' erba' sig ħat 
għas-solidi li mhumiex a ġenti tensjoattivi, ji ġu rreġistrati l-opa ċità u 
l-permeabilità ta' kull kornea. Barra minn hekk, kull kornea ti ġi osservata 
b'mod vi żiv u l-osservazzjonijiet pertinenti ji ġu rreġistrati (eż. tqaxxir 
tat-tessuti, sustanza tat-test residwa, opa ċità mhux uniformi). Dawn 
l-osservazzjonijiet jistg ħu jkunu importanti g ħax jistgħu jiġu riflessi minn 
varjazzjonijiet fil-qari tal-valuri tal-opa ċitometru.  
Sustanzi ta' Kontroll  
33. Kontrolli negattivi jew tas-solvent/tal-midjum u kontrolli po żittivi jiġu 
inklużi b'mod konkorrenti f'kull esperiment.  
34. Meta sustanza likwida ti ġi ttestjata f'100 %, kontroll negattiv ( eż., soluzzjoni 
tal-klorur tas-sodju ta' 0,9 % jew ilma distillat) ji ġi inkluż fil-metodu ta' 
ttestjar BCOP sabiex bidliet mhux spe ċifiċi fis-sistema tat-test ikunu jistg ħu 
jiġu individwati u sabiex ti ġi pprovduta linja ta' ba żi għall-punti tat-tmiem 
tal-assaġġ. Dan jiżgura wkoll li l-kundizzjonijiet tal-assa ġġ ma jirriżultawx 
b'mod li mhux xieraq f'reazzjoni irritanti.  
35. Meta ji ġi ttestjat likwidu dilwit, a ġent tensjoattiv jew solidu fil-metodu ta' 
ttestjar BCOP, b'mod konkorrenti, ji ġi inkluż grupp ta' kontroll 
tas-solvent/tal-midjum sabiex bidliet mhux spe ċifiċi fis-sistema tat-test 
ikunu jistg ħu jiġu individwati u sabiex ti ġi pprovduta linja ta' ba żi 
għall-punti tat-tmiem tal-assa ġġ. Jista' jintu ża biss solvent/midjum li jkun 
intwera li ma g ħandu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.  
36. F'kull esperiment ji ġi inkluż irritant g ħall-għajnejn mag ħruf sabiex ji ġi 
vverifikat li tkun ġiet ikkaw żata reazzjoni xierqa. Min ħabba li l-assa ġġ 
BCOP qed jintu ża f'dan it-test biex jidentifika sustanzi korru żivi jew 
irritanti severi, idealment il-kontroll po żittiv għandu jkun sustanza ta' 
referenza li tipprovoka reazzjoni severa f'dan il-metodu ta' ttestjar. 
Madankollu, sabiex ji ġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll 
pożittiv tista' ti ġi vvalutata, id-daqs tar-reazzjoni irritanti ma g ħandux ikun 
eċċessiv.  
37. Id-dimetilformammid jew l-idrossidu tas-sodju 1 % huma e żempji ta' 
kontrolli po żittivi għal sustanzi tat-test likwidi. E żempju ta' kontroll 
pożittiv għal sustanzi tat-test solidi huwa l-imida żol 20 % (pi ż mqabbel 
mal-volum) f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju 0,9 %.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Sustanzi ta' riferiment huma utli g ħall-evalwazzjoni tal-potenzjal li kimi ċi 
mhux mag ħrufa ta' klassi spe ċifika ta' kimi ċi jew prodotti jikkaw żaw irri­
tazzjoni g ħall-għajnejn, jew g ħall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li 
sustanza irritanti g ħall-għajnejn tikkaw ża irritazzjoni fi ħdan skala 
speċifika ta' reazzjonijiet ta' sustanzi irritanti.  
Punti tat-Tmiem Imkejla  
39. L-opa ċità tiġi ddeterminata mill-ammont ta' tra żmissjoni ta' dawl minn ġol- 
kornea. L-opa ċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' opa ċi­
tometru, li jag ħti valuri ta' opa ċità fuq skala kontinwa.  
40. Il-permeabilità ti ġi ddeterminata mill-ammont ta ż-żebgħa fluworexxina 
tas-sodju li tippenetra s-saffi kollha ta ċ-ċelluli tal-kornea ( i.e., l-epitelju 
fuq is-superfi ċje esterna tal-kornea g ħal ġol-endotelju fuq is-superf ċije 
interna tal-kornea). 1 mL ta' soluzzjoni ta' fluworexxina tas-sodju (4 jew 5 mg/mL meta ji ġu ttestjati likwidi jew a ġenti tensjoattivi jew solidi li 
mhumiex a ġenti tensjoattivi, rispettivament) ji żdied fil-kavità anterjuri 
tal-apparat fejn titqieg ħed il-kornea, li tkun f'kuntatt mal- ġenb epiteljali 
tal-kornea, filwaqt li l-kavità posterjuri, li tkun f'kuntatt mal- ġenb endoteljali 
tal-kornea, timtela b'EMEM frisk. L-apparat imbag ħad jiġi inkubat 
f'pożizzjoni orizzontali g ħal 90 ± 5 minuta f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. 
L-ammont ta' fluworexxina tas-sodju li jg ħaddi għal ġol-kavità posterjuri 
jitkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' spettrofotometru UV/VIS. Kejl spet ­
trofotometriku evalwat f'490 nm ji ġi rreġistrat bħala densità ottika (OD
 490 ) 
jew valuri ta' assorbanza li jitkejlu fuq skala kontinwa. Il-valuri ta' permea ­
bilità tal-fluworexxina ji ġu ddeterminati bl-u żu ta' valuri ta' OD  490 abbażi ta' 
spettrofotometru vi żibbli li ju ża traġitt ottiku standard ta' 1 ċm 
41. Alternattivament, jista' jintu ża qarrej tal-folja tal-mikrotitrazzjoni b'96 bir 
sakemm; (i) tkun tista' ti ġi stabbilita l-iskala ta' valuri lineari tal-qarrej 
tal-folja g ħad-determinazzjoni tal-valuri OD  490 ; u (ii), jintu ża l-volum 
korrett ta' kampjuni tal-fluworexxina fuq il-folja ta' 96 bir sabiex jinkisbu 
valuri ta' OD  490 ekwivalenti g ħat-traġitt ottiku standard ta' 1 ċm (dan jista' 
jkun li jkun je ħtieġ bir mimli kompletament [ ġeneralment 360mL]).  
DEJTA U RAPPURTAR  
Evalwazzjoni tad-Dejta  
42. Ladarba l-valuri (OD  490 ) tal-opaċità u l-permeabilità medja jkunu ġew 
ikkoreġuti għall-opaċità tal-isfond u l-valuri OD  490 tal-permeabilità 
tal-kontroll negattiv, il-valuri medji OD  490 tal-opaċità u l-permeabilità g ħal 
kull grupp ta' trattament g ħandhom ji ġu kkombinati f'formula dderivata 
empirikament sabiex ji ġi kkalkulat punte ġġ tal-irritanza  in vitro  (IVIS) 
għal kull grupp ta' trattament kif ġej: 
IVIS = valur medju tal-opa ċità + (15 × valur OD  490 medju tal-permeabilità)  
Sina et al.  (16) irrappurtaw li din il-formula ġiet idderivata matul studji 
interni u bejn laboratorju u ie ħor. Id-dejta ġġenerata g ħal serje ta' 36 
kompost fi studju fost bosta laboratorji ġiet soġġetta għal analiżi b'varjabbli 
mutlipli sabiex ti ġi ddeterminata l-ekwazzjoni tal-aqwa adattament bejn 
id-dejta  in vivo  u dik  in vitro . Din l-anali żi twettqet minn xjenzati f' żewġ 
kumpaniji separati, li dderivaw ekwazzjonijiet kwa żi identiċi. 
43. Il-valuri tal-opa ċità u tal-permeabilità g ħandhom ji ġu evalwati wkoll b'mod 
indipendenti sabiex ji ġi ddeterminat jekk sustanza tat-test tkunx ipprovokat 
korrużività jew irritazzjoni severa permezz ta' wie ħed biss mi ż-żewġ punti 
tat-tmiem (ara l-Kriterji tad-De ċiżjoni).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Kriterji tad-De ċiżjoni 
44. Sustanza li tipprovoka IVIS ≥ 55,1 tiġi ddefinita b ħala sustanza korru żiva 
jew irritant sever. Skont il-paragrafu 1, jekk is-sustanza tat-test ma ti ġix 
identifikata b ħala korru żiva għall-għajnejn jew irritant sever, g ħandu 
jitwettaq aktar ittestjar g ħall-finijiet ta' klassifikazzjoni u ttikkettar. 
Il-metodu ta' ttestjar BCOP g ħandu akkuratezza kumplessiva ta' 79 % 
(113/143) sa 81 % (119/147). rata po żittiva falza ta' 19 % (20/103) sa 
21 % (22/103), u rata negattiva falza ta' 16 % (7/43) sa 25 % (10/40), meta mqabbel mad-dejta, tal-metodu ta' ttestjar  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn 
il-fniek, ikklassifikata skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-EPA (1), l-UE 
(2), jew il-GHS (3). Meta sustanzi f' ċerti klassijiet kimi ċi (i.e., alkoħols, 
ketoni) jew fi żiċi (i.e., solidi) ikunu esklu żi mill-ba żi tad-dejta, 
l-akkuratezza tal-BCOP skont is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS tvarja minn 87 % (72/83) sa 92 % (78/85), ir-rati ta' po żittivi foloz 
ivarjaw minn 12 % (7/58) sa 16 % (9/56), u r-rati ta' negattivi foloz ivarjaw 
minn 0 % (0/27) sa 12 % (3/26).
 
45. Anke jekk g ħas-sustanza tat-test ma tinkiseb l-ebda klassifikazzjoni ta' 
sustanza korru żiva jew irritant sever g ħall-għajnejn, id-dejta BCOP tista' 
tkun utli, flimkien mad-dejta tat-test  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn il-fniek 
jew minn test  in vitro  vvalidat kif xieraq, sabiex ji ġu evalwati aktar 
il-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar BCOP kif ukoll kemm dan huwa 
utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li 
mhumex irritanti (qed ji ġi żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-u żu ta' 
metodi ta' ttestjar  in vitro  fuq l-għajnejn).  
Kriterji ta’ A ċċettazzjoni ta' Studju  
46. Test jitqies a ċċettabbli jekk il-kontroll po żittiv jagħti IVIS li jkun fi ħdan 
żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika attwali, li ti ġi aġġornata 
tal-anqas kull tliet xhur, jew kull darba li jitwettaq test a ċċettabbli f'labo ­
ratorji fejn it-testijiet ma jitwettqux b'mod frekwenti ( i.e., anqas minn darba 
fix-xahar). Ir-reazzjonijiet mill-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-midjum għandhom jirri żultaw f'valuri ta' opa ċità u permeabilità li jkunu anqas 
mill-ogħla limiti stabbiliti g ħall-valuri tal-opa ċità u l-permeabilità 
tal-isfond g ħall-kornej bovini trattati bil-kontroll negattiv jew 
tas-solvent/tal-midjum rispettiv.
 
Rapport tat-Test  
47. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi t-tag ħrif li ġej, jekk ikun rilevanti g ħat- 
twettiq tal-istudju:  
Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll  
Isem/Ismijiet kimiku/kimi ċi pereżempju l-isem strutturali u żat mir-Re ġistru 
tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimi ċi (CAS), u ismijiet o ħra, jekk 
ikunu mag ħrufa;  
In-Numru tar-Re ġistru CAS (RN), jekk ikun mag ħruf; 
Il-purità u l-kompo żizzjoni tas-sustanza jew it-ta ħlita (f'per ċentwal(i) skont 
il-piż), sakemm dan it-tag ħrif ikun disponibbli;  
Proprjetajiet fi żikokimiċi bħall-istat fi żiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, 
il-klassi kimika, is-solubilità fl-ilma rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju;  
It-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli 
(eż., it-tisħin, it-tħin); 
L-istabilità, jekk tkun mag ħrufa. ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Tagħrif dwar l-Isponser u l-Istallazzjoni tat-Test  
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-istallazzjoni tat-test u tad-direttur 
tal-istudju;  
Identifikazzjoni tas-sors tal-g ħajnejn ( i.e., l-istallazzjoni minn fejn in ġabru);  
Il-kundizzjonijiet tat-trasport u l- ħżin tal-għajnejn ( eż., id-data u l- ħin meta 
nġabru l-għajnejn, l-intervall tal- ħin qabel ma nbeda t-test, il-midja 
tat-trasport u l-kundizzjonijiet tat-temperatura, kwalunkwe antibijotiku li 
ntuża); 
Jekk disponibbli, karatteristi ċi speċifiċi tal-annimali minn fejn in ġabru 
l-għajnejn ( eż., età, sess, pi ż tal-annimal donatur).  
Ġustifikazzjoni tal-Metodu ta' Ttestjar u tal-Protokoll U żati 
Integrità tal-Metodu ta' Ttestjar  
Il-proċedura użata sabiex ti ġi żgurata l-integrità ( i.e., akkuratezza u affid ­
abilità) tal-metodu ta' ttestjar tul i ż-żmien ( eż., ittestjar perjodiku ta' sustanzi 
ta' profiċjenza, użu ta' dejta storika ta' kontrolli negattivi u po żittivi).  
Kriterji g ħal Test A ċċettabbli  
Firxiet aċċettabbli ta' kontrolli po żittivi u negattivi konkorrenti bba żati fuq 
dejta storika;  
Jekk applikabbli, firxiet a ċċettabbli ta' punti ta' riferiment ta' kontroll 
konkorrenti bba żati fuq dejta storika.  
Kundizzjonijiet tat-Test  
Deskrizzjoni tas-sistema tat-test u żata; 
Tip ta' apparat li ntu ża għat-tqegħid tal-kornea;  
Tagħrif dwar kalibrazzjoni g ħal apparat u żat għall-kejl tal-opa ċità u 
l-permeabilità ( eż., opaċitometru u spettrometru);  
Tagħrif dwar il-kornej bovini u żati, inklu żi dikjarazzjonijiet rigward 
il-kwalità tag ħhom;  
Dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata; 
Konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza tat-test u żata; 
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-pro ċedura tat-test;  
Referenza g ħad-dejta storika tal-mudell ( eż., kontrolli negattivi u po żittivi, 
sustanzi ta' profi ċjenza, sustanzi ta' riferiment);  
Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u żati. 
Riżultati  
Tabulazzjoni ta' dejta minn kampjuni individwali tat-test ( eż., valuri ta' 
opaċità u ta' OD  490 u IVIS ikkalkulati g ħas-sustanza tat-test u l-kontrolli 
pożittivi, negattivi u ta' riferiment [jekk inklu żi], irrappurtati f'forma tabulari, 
inkluża dejta minn esperimenti ripetuti ta' replikazzjoni kif ikun xieraq, u 
medji ± id-devjazzjoni standard g ħal kull esperiment);  
Deskrizzjoni ta' effetti o ħra osservati.  
Diskussjoni tar-Ri żultati  
Konklużjoni 
LETTERATURA  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
0(2) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u 
tal-Kunsill tas-16 ta' Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, 
l-ittikkettar u l-imballa ġġ tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u 
jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda 
r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.  
0(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Disponibbli fuq:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
0(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponibbli fuq:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
0(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(6) Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u 
tal-Kunsill tat-18 ta' Di ċembru 2006 dwar ir-Re ġistrazzjoni, 
il-Valutazzjoni, l-Awtorizzazzjoni u r-Restrizzjoni ta' Sustanzi 
Kimiċi (REACH), li jistabbilixxi A ġenzija Ewropea g ħas-Sustanzi 
Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li j ħassar 
ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) 
Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE 
tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni. ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponibbli fuq:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37 051368_ 
1_1_1_1,00.html]  
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxi ­
cology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alter ­
native Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07- 4517. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli 
fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italy: European Center for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. 
J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irri ­
tation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl Toxicol  
26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Akkuratezza:  Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u 
l-valuri ta’ referenza a ċċettati. Din hija mi żura tar-rendiment tal-metodu ta' ttestjar 
u aspett wie ħed ta' “rilevanza.” It-terminu spiss jintu ża b'mod alternanti ma' 
“konkordanza”, biex ifisser il-proporzjon ta' ri żultati pożittivi ta' metodu ta' 
ttestjar.  
Sustanza ta' riferiment:  Sustanza u żata bħala standard g ħal paragun ma' 
sustanza tat-test. Sustanza ta' riferiment g ħandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; 
(i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta' 
sustanzi li tkun qed ti ġi ttestjata; (iii) karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi magħrufa; (iv) 
dejta ta' appo ġġ dwar effetti mag ħrufa, u (v) potenza mag ħrufa fl-iskala 
tar-reazzjoni mixtieqa.  
Kornea:  Il-parti trasparenti tal-parti ta' quddiem tal-bo ċċa tal-għajn li tkopri l- 
ħabba tal-g ħajn u l-pupilla u t ħalli d-dawl jg ħaddi għal ġol-parti interna tal-g ħajn. 
Opaċità tal-kornea:  Kejl tal-estensjoni tal-opa ċità tal-kornea wara esponiment 
għal sustanza tat-test. Żieda fl-opa ċità tal-kornea hija indikattiva ta' ħsara 
fil-kornea. L-opa ċità tista' ti ġi evalwata b'mod su ġġettiv kif isir fit-test Draize 
li jsir fuq g ħajnejn il-fniek, jew b'mod o ġġettiv bi strument b ħal pereżempju 
“opaċitometru”.  
Permeabilità tal-kornea:  Kejl kwantitattiv tal- ħsara fl-epitelju tal-kornea billi 
jiġi ddeterminat l-ammont ta' żebgħa fluworexxina tas-sodju li tg ħaddi minn 
ġos-saffi kollha ta ċ-ċelluli tal-kornea.  
Kategorija tal-EPA 1:  Korrużiv (qerda irriversibbli tat-tessut tal-kornea) jew 
involviment tal-kornea jew irritazzjoni li tippersisti g ħal aktar minn 21 jum (1).  
Kategorija tal-UE R41:  Produzzjoni ta' ħsara fit-tessut tal-g ħajn, jew t ħassir 
fiżiku serju tal-vista, wara l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test fuq is-superfi ċje 
anterjuri tal-g ħajn, li ma jkunx kompletament riversibbli fi żmien 21 jum 
mill-applikazzjoni (2).  
Rata ta’ negattivi foloz:  Il-proporzjon tas-sustanzi po żittivi kollha identifikati 
b’mod falz b ħala negattivi permezz ta’ metodu ta’ ttestjar. Dan huwa wie ħed 
mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.  
Rata ta’ po żittivi foloz:  Il-proporzjon tas-sustanzi negattivi kollha identifikati 
b’mod falz b ħala pożittivi permezz ta’ metodu ta’ ttestjar. Dan huwa wie ħed 
mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.  
GHS (Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' 
Sustanzi Kimi ċi): Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimi ċi 
(sustanzi u ta ħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fi żiċi, 
sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, 
bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet 
ta’ prekawzjoni u skedi ta’ tag ħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tag ħrif dwar 
l-effetti avversi bil-g ħan li n-nies ikunu protetti (inklu żi min iħaddem, il- 
ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l- ħaddiema tal-emer ġenza) u 
l-ambjent (3).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
Kategorija tal-GHS 1:  Produzzjoni ta' ħsara fit-tessut tal-g ħajn, jew t ħassir 
fiżiku serju tal-vista, wara l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test fuq is-superfi ċje 
anterjuri tal-g ħajn, li ma jkunx kompletament riversibbli fi żmien 21 jum 
mill-applikazzjoni (3).  
Periklu:  Proprjetà inerenti ta' a ġent jew sitwazzjoni li g ħandha l-potenzjal 
tikkawża effetti avversi meta organi żmu, sistema jew (sub) popolazzjoni 
jiġi/tiġi espost(a) g ħal dak l-a ġent. 
Punteġġ tal-Irritanza  In Vitro  (IVIS):  Formula dderivata empirikament u żata 
fl-assaġġ BCOP fejn il-valuri medji tal-opa ċità u tal-permeabilità g ħal kull grupp 
ta' trattament ji ġu kkombinati f'punte ġġ in vitro  wieħed għal kull grupp ta' 
trattament. L- IVIS = valur medju tal-opa ċità + (15 x valur medju 
tal-permeabilità).  
Kontroll negattiv:  Replikazzjoni mhux trattata li fiha l-komponenti kollha 
tas-sistema tat-test. Dan il-kampjun ji ġi proċessat b'kampjuni ttrattati 
bis-sustanza tat-test u kampjuni ta' kontroll o ħra sabiex ji ġi ddeterminat jekk 
is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.  
Sustanzi li mhumiex irritanti:  Sustanzi li mhumiex ikklassifikati b ħala 
Kategorija I, II, jew III tal-EPA; Kategorija R41 jew R36 tal-UE; jew Kategorija tal-GHS 1, 2A, jew 2B irritanti g ħall-għajnejn.
 
Sustanza korru żiva għall-għajnejn:  (a) Sustanza li tikkaw ża ħsara irriversibbli 
fit-tessut tal-g ħajn; (b) Sustanzi li huma kklassifikati b ħala Kategorija 1 tal-GHS, 
Kategorija I tal-EPA, jew Kategorija R41 tal-UE irritanti g ħall-għajnejn (1) (2) (3).  
Irritant g ħall-għajnejn:  (a) Sustanza li tipprodu ċi bidla riversibbli fl-g ħajn wara 
li tiġi applikata fuq is-superfi ċje anterjuri tal-g ħajn; (b) Sustanzi li huma kklas ­
sifikati bħala Kategorija I jew II tal-EPA, Kategorija R36 tal-UE, jew Kategorija 
2A jew 2B tal-GHS irritanti g ħall-għajnejn (1) (2) (3).  
Irritant sever g ħall-għajnejn:  (a) Sustanza li tikkaw ża ħsara fit-tessut tal-g ħajn 
wara li ti ġi applikata fuq is-superfi ċje anterjuri tal-g ħajn u li ma titlaqx fi żmien 
21 jum tal-applikazzjoni jew tikkaw ża tħassir fiżiku serju tal-vista; (b) Sustanzi li 
huma kklassifikati b ħala Kategorija 1 tal-GHS, Kategorija I tal-EPA, jew 
Kategorija R41 tal-UE irritanti g ħall-għajnejn (1) (2) (3).  
Opaċitometru:  Strument li jintu ża sabiex titkejjel “l-opa ċità tal-kornea” billi 
jevalwa b'mod kwantitattiv it-tra żmissjoni tad-dawl minn ġol-kornea. 
L-istrument tipiku jkollu żewġ kompartimenti, kull wie ħed minnhom b'sors ta' 
dawl u foto ċellula tieg ħu stess. Kompartiment minnhom jintu ża għall-kornea 
trattata, filwaqt li l-ie ħor jintuża biex jikkalibra u ji żżera l-istrument. Dawl 
minn bozza tal-alo ġenu jitgħadda minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità 
vojta ming ħajr twieqi jew likwidu) g ħal ġo fotoċellula u jitqabbel mad-dawl 
mgħoddi minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha 
l-kornea, g ħal ġo fotoċellula. Id-differenza fit-tra żmissjoni tad-dawl 
mill-fotoċelluli titqabbel u valur numeriku ta' opa ċità jidher fuq displej di ġitali. 
Kontroll po żittiv:  Replikazzjoni li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema 
tat-test u trattata b'sustanza li jkun mag ħruf li tikkaw ża reazzjoni po żittiva. 
Sabiex ji ġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll po żittiv tista' ti ġi 
vvalutata tul i ż-żmien, id-daqs tar-reazzjoni severa ma g ħandux ikun e ċċessiv.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Affidabilità:  Qies ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riprodu ċibbli 
fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul i ż-żmien, meta jitwettaq skont l-istess 
protokoll. Ti ġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riprodu ċibilità fil-laboratorju u bejn 
laboratorju u ie ħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.  
Kontroll ta' solvent/midjum:  Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha 
tas-sistema tat-test, inklu ż is-solvent jew il-midjum li ji ġi pproċessat mas-sustanza 
tat-test trattata u kampjuni ta' kontroll o ħra sabiex ti ġi stabbilita l-ewwel reazzjoni 
għall-kampjuni trattati mis-sustanza tat-test ma ħlula fl-istess solvent jew midjum. 
Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk 
is-solvent jew il-midjum ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.  
Ittestjar imtarra ġ: Strateġija ta' ttestjar pass pass fejn it-tag ħrif kollu dwar 
sustanza tat-test ji ġi analizzat f'ordni spe ċifika, permezz ta' pro ċess fejn titqies 
l-evidenza f'kull livell sabiex ji ġi ddeterminat jekk hemmx bi żżejjed tag ħrif 
disponibbli g ħal deċiżjoni ta' klassifikazzjoni ta' periklu, qabel ma wie ħed 
jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal li sustanza tat-test tikkaw ża irri­
tazzjoni jista' ji ġi assenjat abba żi ta' tagħrif eżistenti, ma jkun me ħtieġ l-ebda 
ttestjar ie ħor. Jekk il-potenzjal li sustanza tat-test tikkaw ża irritazzjoni ma jkunx 
jista' jiġi assenjat abba żi tat-tagħrif eżistenti pro ċedura ta' ttestjar sekwenzjali pass 
pass għandha titwettaq fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni 
mhux ekwivoka.  
Metodu ta' ttestjar ivvalidat:  Metodu ta' ttestjar li g ħalih ikunu tlestew studji ta' 
validazzjoni sabiex ti ġi ddeterminata r-rilevanza (inklu ża l-akkuratezza) u 
l-affidabilità g ħal għan speċifiku. Huwa importanti li wie ħed jinnota li metodu 
ta' ttestjar ivvalidat jista' jkun li ma jkollux rendiment tajjeb bi żżejjed f'termini ta' 
akkuratezza u affidabilità sabiex jinstab a ċċettabli għall-għan propost.  
Importanza tal-evidenza:  Il-proċess fejn jitqiesu l-qawwiet u d-dg ħufijiet ta' 
biċċiet ta' informazzjoni varji sabiex tintla ħaq u tiġi appoġġata konklu żjoni 
rigward il-potenzjal ta' sustanza li tkun ta' periklu.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Appendiċi 2 
Sustanzi ta' profi ċjenza għall-metodu ta' ttestjar BCOP  
Qabel l-u żu ta' rutina ta' metodu ta' ttestjar li jaderixxi ma' dan il-metodu ta' 
ttestjar, il-laboratorji jista' jkun li jkunu jixtiequ juru l-profi ċjenza teknika billi 
jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-korru żività għall-għajnejn ta' 10 
sustanzi rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi ntg ħażlu biex 
jirrappreżentaw l-iskala ta' reazzjonijiet ta' irritazzjoni/korru żjoni fl-għajn, li 
hija bbażata fuq ir-ri żultati mit-test  in vivo  fuq għajnejn il-fniek (TG 405) ( i.e., 
il-Kategoriji 1, 2A, 2B, jew Mhux Ikklassifikata u Ttikkettata skont il-GHS tan-NU (3) (7). Madankollu, meta jitiqies kemm dawn l-assa ġġi huma utli 
b'mod li huwa vvalidat ( i.e., biex jiġu identifikati sustanzi korru żivi/irritanti 
severi għall-għajnejn), hemm biss żewġ riżultati għall-finijiet ta' klassifikazzjoni 
(sustanza korru żiva/irritant sever jew sustanza mhux korru żiva/irritant mhux 
sever) biex tintwera l-profi ċjenza. Kriterji o ħra tal-għażla kienu li s-sustanzi 
jkunu disponibbli b'mod kummer ċjali, ikun hemm disponibbli dejta ta' 
referenzi ta' kwalità g ħolja in vivo , u li jkun hemm dejta ta' kwalità g ħolja 
miż-żewġ metodi  in vitro  li għalihom qeg ħdin jiġu żviluppati l-Linji Gwida 
għall-Ittestjar. G ħal din ir-ra ġuni, sustanzi irritanti ntg ħażlu mil-lista rrakkom ­
andata mill-ICCVAM ta' 122 sustanza ta' referenza g ħall-validazzjoni ta' 
metodi ta' ttestjar ta' tossi ċità għall-għajnejn  in vitro  (ara l-Appendi ċi H: 
Sustanzi ta' Referenza Rrakkomandati mill-ICCVAM) (5). Id-dejta tar-referenzi hija disponibbli fid-Dokumenti ta' Anali żi tal-Isfond tal-ICCVAM g ħall-metodu 
ta' ttestjar BCOP u ta' G ħajnejn tat-Ti ġieġ Iżolati (Isolated Chicken Eye, ICE) 
(17) (18).
 
Tabella 1  
Sustanzi rrakkomandati biex tintwera profi ċjenza teknika mal-BCOP  
Sustanza CASRN Klassi Kimika (  1 ) Forma Fi żika Klassifikazzjoni  In 
Vivo ( 2 ) Klassifikazzjoni  In Vitro  ( 3 ) 
Klorur 
tal-benżalkonju 
(5 %) 8001-54-5 Kompost ta' onju Likwidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/Irritant 
Sever 
Kloressidin 55-56-1 Ammin, 
Ammidin Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/Irritant 
Sever 
Aċidu diben żojl- 
L-tartariku 2743-38-6 A ċidu karbos ­
siliku, Ester Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/Irritant 
Sever 
Imidażol 288-32-4 Etero ċikliku Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/Irritant 
Sever 
Aċidu trikloroa ­ 
ċetiku (30 %) 76-03-9 A ċidu karbos ­
siliku Likwidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/Irritant 
Sever 
2,6-dikloroben ż- 
ojl klorur 4659-45-4 Alid a ċil Likwidu Kategorija 2A Sustanza mhux korru żiva/Ir­
ritant mhux sever 
Etil-2-metila ċeto- 
aċetat 609-14-3 Keton, Ester Likwidu Kategorija 2B Sustanza mhux korru żiva/Ir­
ritant mhux sever 
Nitrat 
tal-ammonju 6484-52-2 Mel ħ inorganiku Solidu Kategorija 2A Sustanza mhux korru żiva/Ir­
ritant mhux sever  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Sustanza CASRN Klassi Kimika (  1 ) Forma Fi żika Klassifikazzjoni  In 
Vivo ( 2 ) Klassifikazzjoni  In Vitro  ( 3 ) 
Gliċerol 56-81-5 Alko ħol Likwidu Mhux Tikkettat Sustanza mhux korru żiva/Ir­
ritant mhux sever 
n-essan 110-54-3 Idrokarbonju 
(aċiliku) Likwidu Mhux tikkettat Sustanza mhux korru żiva/Ir­
ritant mhux sever  
Taqsiriet: CASRN = Numru tar-Re ġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimi ċi 
( 1 ) Klassijiet kimi ċi ġew assenjati lil kull sustanza tat-test li tu ża skema ta' klassifikazzjoni standard, abba żi tas-sistema ta' klassifi ­
kazzjoni tal-librerija nazzjonali tal-intestaturi tas-su ġġetti medi ċi tal-medi ċina (MeSH) (disponibbli fuq http//www.nlm.nih.gov/ 
mesh). 
( 2 ) Abbażi tar-riżultati mit-test  in vivo  fuq għajnejn il-fniek (OECD TG 405) u bl-u żu tal-GHS tan-NU (3)(7). 
( 3 ) Abbażi tar-riżultati fil-BCOP u l-ICE.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Appendiċi 3 
L-APPARAT TAL-BCOP FEJN TITQIEG ĦED IL-KORNEA  
1. L-apparat tal-BCOP fejn titqieg ħed il-kornea huwa mag ħmul minn materjal 
inerti ( eż., polipropilen). L-apparat huwa mag ħmul minn żewġ nofsijiet 
(kavità anterjuri u o ħra posterjuri), u g ħandu żewġ kavitajiet interni ċilindriċi 
simili. Kull kavità tesa' volum ta' 5 mL u hija magluqa b'tieqa tal- ħġieġ, li 
minn ġo fiha jiġi rreġistrat il-kejl tal-opa ċità. Kull wa ħda mill-kavitajiet 
interni hija ta' dijametru ta' 1,7 ċm u fond ta' 2,2 ċm (  1 ). Iċ-ċirku-o jitqieg ħed 
fil-kavità posterjuri biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Il-kornej jitqieg ħdu 
bil-parti tal-endotelju t ħares 'l isfel fuq i ċ-ċirku-o tal-kavitajiet posterjuri u 
l-kavitajiet anterjuri jitqieg ħdu fuq il-parti tal-epitelju tal-kornej. Il-kavitajiet 
jinżammu f'posthom permezz ta' tliet viti li jinsabu fuq it-truf esterni 
tal-kavità. Fl-a ħħar parti ta' kull kavità nsibu tieqa tal- ħġieġ li tista' 
titneħħa sabiex ikun hemm a ċċess faċli għall-kornea. Ċirku-o jitqieg ħed 
ukoll bejn it-tieqa tal- ħġieġ u l-kavità biex jipprevjeni kwalunkwe nixxija. 
Żewġ toqbiet fil-parti ta' fuq ta' kull kavità jippermettu l-introduzzjoni u 
t-tneħħija tal-midjum u l-komposti tat-test. Dawn jing ħalqu b'tappijiet 
tal-lastku waqt il-perjodi ta' trattament u ta' inkubazzjoni.
  
Glossarju  
Glass disc: Disk tal- ħġieġ 
PTFE-O-ring: Ċirku-O tal-PTFE  
Refill: Ftu ħ għall-mili  
Hanger: Gan ċ 
Cap: Tapp  
Nut: Skorfina  
O-ring: Ċirku-O  
Posterior compartment: Kompartiment posterjuri  
Anterior compartment: Kompartiment anterjuri  
Fixing screws: Viti g ħat-twaħħil ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Id-dimensjonijiet provduti huma bba żati fuq apparat fejn titqieg ħed il-kornea li jintu ża 
għal baqar ta' età li tvarja minn 12-il xahar sa 60 xahar. Fl-eventwalità li jintu żaw 
annimali ta' età minn 4 xhur sa 12-il xahar, l-apparat minflok ikollu ji ġi ddisinjat 
b'tali mod li kull kavità tesa' volum ta' 4 mL, u kull wa ħda mill-kavitajiet interni tkun 
ta' dijametru ta' 1,5 ċm u fond ta' 2,2 ċm. Fi kwalunkwe apparat iddisinjat ġdid fejn 
titqiegħed il-kornea, ,huwa importanti ħafna li l-proporzjon tal-erja tas-superfi ċje 
tal-kornea esposta mal-volum tal-kavità posterjuri ikun daqs il-proporzjon fl-apparat 
tradizzjonali. Dan huwa me ħtieġ sabiex ji ġi żgurat li l-valuri tal-permeabilità ji ġu ddeter­
minati b'mod korrett g ħall-kalkolu tal-IVIS permezz tal-formula proposta.
 L-OPAĊITOMETRU  
2. L-opa ċitometru huwa apparat li jkejjel it-tra żmissjoni tad-dawl. Dawl minn 
bozza tal-alo ġenu jitgħadda minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità vojta 
mingħajr twieqi jew likwidu) g ħal ġo fotoċellula u jitqabbel mad-dawl 
mgħoddi minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha 
l-kornea, g ħal ġo fotoċellula. Id-differenza fit-tra żmissjoni tad-dawl 
mill-fotoċelluli titqabbel u valur numeriku ta' opa ċità jidher fuq displej 
diġitali. L-unitajiet tal-opa ċità huma stabbiliti.  
3. L-opa ċitometru g ħandu jipprovdi reazzjoni lineari minn skala ta' qari ta' 
valuri ta' opa ċità li jkopru l-valuri tal-limiti u żati għal klassifiki differenti 
deskritti mill-Mudell ta' Previ żjoni ( i.e., sal-valur tal-limitu li jindika 
korrużività/irritanza severa). Sabiex ji ġi żgurat qari ta' valuri lineari u 
akkurat sa 75-80 unitajiet ta' opa ċità, jeħtieġ li l-opa ċitometru ji ġi 
kkalibrat bl-u żu ta' serje ta' kalibraturi. Il-kalibraturi (folji opaki 
tal-poliester) jitqieg ħdu fil-kavità tal-kalibrazzjoni (kavità tal-apparat fejn 
titqiegħed il-kornea ddisinjata biex takkomoda l-kalibraturi) u jinqraw fuq 
l-opaċitometru. Il-kavità tal-kalibrazzjoni hija ddisinjata b'tali mod li 
l-kalibraturi jin żammu bejn wie ħed u ieħor fl-istess distanza bejn id-dawl 
u l-fotoċellula fejn ikunu se jitqieg ħdu l-kornej waqt il-kejl tal-opa ċità. 
L-opaċitometru l-ewwel ji ġi kkalibrat g ħal 0 unitajiet ta' opa ċità bl-użu 
tal-kavità tal-kalibrazzjoni ming ħajr kalibratur. Imbag ħad tliet kalibraturi 
differenti jitqieg ħdu fil-kavità tal-kalibrazzjoni wie ħed wieħed u jitkejlu 
l-opaċitajiet. Il-kalibraturi 1, 2 u 3 g ħandhom jirri żultaw f'qari ta' valuri li 
jkun ugwali g ħall-valuri stabbiliti tag ħhom ta' 75, 150, u 225 unitajiet ta' 
opaċità, rispettivament, ± 5 %.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48  METODU TA' TTESTJAR TA' G ĦAJNEJN TAT-TI ĠIEĠ 
IŻOLATI G ĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TA' SUSTANZI 
KORRUŻIVI U IRRITANTI SEVERI G ĦALL-GĦAJNEJN  
DAĦLA 
01. Il-metodu ta' ttestjar ta' G ħajnejn tat-Ti ġieġ Iżolati (ICE) huwa metodu ta' 
ttestjar  in vitro  li jista' jintu ża, f'ċerti ċirkustanzi u b'limitazzjonijiet spe ċifiċi, 
sabiex sustanzi u ta ħlitiet jiġu kklassifikati b ħala sustanzi korru żivi u irritanti 
severi għall-għajnejn (1) (2) (3). G ħall-fini ta' dan il-metodu ta' ttestjar, 
irritanti severi huma ddefiniti b ħala dawk li jikkaw żaw leżjonijiet 
fl-għajnejn li jippersistu fil-fenek g ħal tal-anqas 21 jum wara 
l-amministrazzjoni. Filwaqt li ma jitqiesx validu b ħala sostituzzjoni 
kompluta g ħat-test  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn il-fniek, l-ICE huwa rrak ­
komandat biex jintu ża bħala strate ġija ta' ttestjar imtarra ġ 
għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar regolatorji fi ħdan dominju spe ċifiku ta' 
applikabilità (4) (5). Is-sustanzi u t-ta ħlitiet tat-test (6) li jkunu po żittivi 
fl-assaġġ jistgħu jiġu kklassifikati b ħala sustanzi korru żivi jew irritanti 
severi għall-għajnejn ming ħajr ma jsir aktar ittestjar fuq il-fniek. Sustanza 
li tagħti riżultat negattiv tkun te ħtieġ li tiġi ttestjata fuq il-fniek permezz ta' 
strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, kif deskritt fil-Linja Gwida g ħall-Ittestjar 
tal-OECD 405 (7) (il-kapitolu B.5 ta' dan l-Anness).  
02. L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-pro ċeduri użati 
għall-evalwazzjoni tal-potenzjal ta' sustanza tat-test li tikkaw ża korrużività 
jew irritanza severa potenzjali kif imkejla mill- ħila tas-sustanza li tikkaw ża 
tossiċità f'għajn ta' ti ġieġa mneħħija mill-ħofra tagħha. Effetti tossi ċi 
għall-kornea jitkejlu permezz ta' (i) valutazzjoni kwalitattiva tal-opa ċità, 
(ii) valutazzjoni kwalitattiva tal- ħsara għall-epitelju abba żi tal-applikazzjoni 
tal-fluworexxina fl-g ħajn (żamma tal-fluworexxina), (iii) kejl kwantitattiv ta' 
żieda fil-ħxuna (nef ħa), u (iv) evalwazzjoni kwalitattiva ta' ħsara morfo ­
loġika makroskopika fis-superfi ċje. Il-valutazzjonijiet tal-opa ċità, tan-nef ħa, 
u tal-ħsara fil-kornea wara l-esponiment g ħal sustanza tat-test ji ġu vvalutati 
b'mod individwali u ji ġu kkombinati sabiex ti ġi dderivata Klassifikazzjoni 
tal-Irritanza g ħall-Għajnejn.  
03. L-irritanti g ħall-għajnejn li jikkaw żaw leżjonijiet li jitilqu f'anqas minn 21 
jum u sustanzi li mhumiex irritanti ġew ittestjati wkoll bl-u żu tal-metodu ta' 
ttestjar ICE. Madankollu, l-akkuratezza u l-kredibilità tal-metodu ta' ttestjar ICE għas-sustanzi f'dawn il-kategoriji ma ġewx evalwati b'mod formali.
 
04. Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendi ċi 1. 
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
05. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bba żat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar ICE 
tal-Kumitat ta' Koordinazzjoni Intera ġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi 
Alternattivi (ICCVAM) (8), li ġie żviluppat b'segwitu g ħal studju ta' validazzjoni 
internazzjonali (4) (5) (9), b'kontribuzzjonijiet ming ħand iċ-Ċentru Ewropew 
għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż 
għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi, u l-Kwalità tal- Ħajja TNO 
tad-Dipartiment tat-Tossikolo ġija u Farmakolo ġija Applikata (il-Pajji żi 
l-Baxxi). Il-protokoll huwa bba żat fuq tag ħrif miksub minn protokolli ppub ­
blikati, kif ukoll il-protokoll attwali u żat mit-TNO (10) (11) (12) (13) (14).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
06. Il-limitazzjonijiet identifikati g ħal dan il-metodu huma bba żati fuq ir-rata ta' 
pożittivi foloz g ħall-alkoħols u r-rata ta' negattivi foloz g ħas-solidi u l-a ġenti 
tensjoattivi (ara l-paragrafu 47) (4). Meta s-sustanzi ta' dawn il-klassijiet kimiċi u fiżiċi jiġu esklużi mill-bażi tad-dejta, l-akkuratezza tal-ICE skont 
is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS titjieb b'mod sostanzjali 
(4). Abba żi tal-għan ta' dan l-assa ġġ (i.e., li jidentifika biss is-sustanzi 
korrużivi/irritanti severi g ħall-għajnejn), rati ta' negattivi foloz mhumiex 
kritiċi minħabba li tali sustanzi sussegwentement ji ġu ttestjati fuq il-fniek 
jew b'testijiet o ħra in vitro  vvalidati b'mod xieraq, skont ir-rekwi żiti rego­
latorji, bl-u żu ta' strate ġija ta' ttestjar sekwenzjali b'appro ċċ ibbażat fuq 
l-importanza tal-evidenza. Barra minn hekk, il-ba żi tad-dejta 
tal-validazzjoni attwali ma tippermettix evalwazzjoni xierqa ta' w ħud 
mill-klassijiet kimi ċi jew tal-prodotti ( eż., it-taħlitiet). Madankollu, 
l-investigaturi jistg ħu jqisu li ju żaw dan il-metodu ta' ttestjar g ħall-ittestjar 
tat-tipi kollha ta' materjali (inklu żi t-taħlitiet), fejn ri żultat poż
ittiv ikun jista' 
jiġi aċċettat bħala indikattiv ta' reazzjoni g ħal sustanza korru żiva jew irritant 
sever għall-għajnejn. Madankollu, ri żultati pożittivi miksuba bl-alko ħols 
għandhom ji ġu interpretati b' ċertu kawtela min ħabba r-riskju ta' tbassir 
żejjed.  
07. Il-pro ċeduri kollha li jinvolvu g ħajnejn tat-ti ġieġ għandhom isegwu 
r-regolamenti u l-pro ċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li 
għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali derivati mill-bnedmin 
jew l-annimali, li jinkludu, i żda li mhumiex limitati g ħal, tessuti u fluwidi 
tat-tessuti. Il-prekawzjonijiet universali tal-laboratorji huma rrakkomandati (15).
 
08. Limitazzjoni tal-metodu ta' ttestjar hija dik li, g ħalkemm il-metodu jqis u ħud 
mill-effetti fuq l-g ħajnejn evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritanza 
f'għajnejn il-fenek u sa ċertu punt is-severità tag ħhom, il-metodu ma jqisx 
feriti fil-kon ġuntiva u fil- ħabba tal-g ħajnejn. Barra dan, g ħalkemm 
ir-riversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax ti ġi evalwata  per se  fl-assaġġ 
ICE, ġie propost, abba żi ta' studji fuq g ħajnejn il-fniek, li valutazzjoni 
tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintu ża biex issir distinzjoni bejn 
effetti riversibbli u dawk irriversibbli (16). Fl-a ħħar nett, il-metodu ta' 
ttestjar ICE ma jippermettix valutazzjoni tal-potenzjal g ħal tossiċità 
sistemika asso ċjata ma' esponiment tal-g ħajnejn.  
09. Qed isiru sforzi kontinwi sabiex ji ġu kkarratterizzati aktar il-limitazzjonijiet 
tal-metodu ta' ttestjar ICE kif ukoll kemm huwa utli g ħall-identifikazzjoni ta' 
irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex irritanti (ara wkoll il-paragrafu 48). L-utenti qed ji ġu inkora ġġuti wkoll jipprovdu 
lill-organizzazzjonijiet ta' validazzjoni b'kampjuni u/jew dejta g ħal eval­
wazzjoni formali ta' u żi futuri possibbli tal-metodu ta' ttestjar ICE, inklu żi 
dawk għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li 
mhumex irritanti g ħall-għajnejn.
 
10. Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qed jistabbilixxi dan 
l-assaġġ, għandhom jintu żaw is-sustanzi kimi ċi ta' profi ċjenza pprovduti 
fl-Appendi ċi 2. Laboratorju jista' ju ża dawn is-sustanzi kimi ċi biex juri 
l-kompetenza teknika tieg ħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar ICE qabel 
ma jissottometti dejta tal-ICE g ħall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja 
tal-perikli.  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
11. Il-metodu ta' ttestjar ICE huwa mudell organotipiku li jipprovdi manu ­
tenzjoni fuq terminu ta' żmien qasir fuq g ħajnejn it-ti ġieġ in vitro . F'dan 
il-metodu ta' ttestjar, il- ħsara mis-sustanza tat-test ti ġi vvalutata 
bid-determinazzjoni tan-nef ħa, l-opaċità u ż-żamma tal-fluworexxina 
fil-kornea. Filwaqt li l-a ħħar żewġ parametri jinvolvu valutazzjoni kwalit ­
attiva, anali żi tan-nefħa fil-kornea tipprovdi valutazzjoni kwantitattiva. Kull 
kejl jew jinqaleb g ħal punteġġ kwantitattiv li jintu ża għall-kalkolu ta' Indi ċi 
ta' Irritazzjoni kumplessiv, inkella ji ġi assenjat kategorizzazzjoni kwantit ­
attiva li tintu ża biex ti ġi assenjata klassifikazzjoni tal-korru żività u 
l-irritanza severa g ħall-għajnejn  in vitro . Kull wie ħed minn dawn 
ir-riżultati mbag ħad ikun jista' jintu ża biex jipprevedi l-potenzjal ta' 
sustanza tat-test li tikkaw ża korrużività u irritanza severa g ħall-għajnejn  in 
vivo (ara l-Kriterji tad-De ċiżjoni).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Sors u Età ta' G ħajnejn it-Ti ġieġ 
12. Storikament, g ħal dan l-assa ġġ intużaw għajnejn li jkunu ttie ħdu mit-tiġieġ 
minn biċċerija fejn jinqatlu g ħall-konsum mill-bniedem, u b'hekk ġiet 
eliminata l- ħtieġa ta' annimali tal-laboratorju. Jintu żaw biss g ħajnejn ta' 
annimali b'sa ħħithom li huma xierqa li jid ħlu fil-katina alimentari 
tal-bniedem.  
13. Għalkemm ma twettaq l-ebda studju kontrollat g ħall-valutazzjoni tal-età 
ideali tat-ti ġieġ, l-età u l-pi ż tat-tiġieġ użati storikament f'dan il-metodu ta' 
ttestjar huma dawk ta' ti ġieġ tar-rebbieg ħa li tradizzjonalment ji ġu ppro­ 
ċessati minn bi ċċerija tat-tjur ( i.e., bejn wie ħed u ieħor ta' età ta' 7 
ġimgħat, u piż ta' 1,5 – 2,5 kg).  
Ġbir u Trasport tal-G ħajnejn lejn il-Laboratorju  
14. L-irjus g ħandhom jitne ħħew immedjatament wara s-sedazzjoni tat-ti ġieġ, 
ġeneralment b'xokk elettriku u in ċiżjoni tal-g ħonq għall-fsada. G ħandu jiġi 
lokalizzat sors lokali ta' ti ġieġ qrib il-laboratorju sabiex l-irjus tat-ti ġieġ jiġu 
ttrasferiti mill-bi ċċerija sal-laboratorju malajr bi żżejjed sabiex kemm jista' 
jkun jonqos/tonqos id-deterjoramnet u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. 
L-intervall tal- ħin li jgħaddi minn meta jin ġabru l-irjus tat-ti ġieġ u l-għajnejn 
jintużaw fil-metodu ta' ttestjar ICE g ħandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipi ­
kament fi żmien sag ħtejn) u g ħandu jintwera li dan ma jikkompromettix 
ir-riżultati tal-assa ġġ. Dawn ir-ri żultati huma bba żati fuq il-kriterji tal-g ħażla 
għall-għajnejn, kif ukoll ir-reazzjonijiet tal-kontrolli po żittivi u negattivi. 
L-għajnejn kollha u żati fl-assa ġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' 
għajnejn mi ġbura f'ġurnata spe ċifika.  
15. Minħabba l-fatt li l-g ħajnejn jiġu ddissektjati fil-laboratorju, l-irjus intatti 
jiġu ttrasportati mill-bi ċċerija f'temperatura ambjentali f'kaxex tal-plastik 
umdifikati b'xugamani mxarrba b'soluzzjoni i żotonika ta' ilma bil-mel ħ. 
Kriterji tal-G ħażla għall-Għajnejn U żati fl-ICE  
16. Għajnejn li jkollhom punte ġġ għoli ta' titbig ħ bil-fluworexxina ( i.e., > 0,5) 
jew punte ġġ għoli ta' opa ċità fil-kornea ( i.e., > 0,5) wara li jitne ħħew mill- 
ħofra tal-g ħajn jitwarrbu.  
17. Kull grupp ta' trattament u kontroll po żittiv konkorrenti jikkonsisti minn 
tal-anqas tliet g ħajnejn. Il-grupp ta' kontrolli negattivi jew il-kontroll 
tas-solvent (jekk jintu ża solvent li ma jkunx ilma bil-mel ħ) jikkonsisti 
minn tal-anqas g ħajn waħda. 
PROĊEDURA  
Preparazzjoni tal-G ħajnejn  
18. Tebqet il-g ħajn tinqata' barra b' ħafna attenzjoni sabiex ma ssir l-ebda ħsara 
fil-kornea. L-integrità tal-kornea ti ġi vvalutata malajr b'qatra fluworexxina 
tas-sodju 2 % (w/v) li ti ġi applikata fuq is-superfi ċje tal-kornea g ħal ftit 
sekondi, u mbag ħad titlaħlaħ b'soluzzjoni i żotonika ta' ilma bil-mel ħ. 
Għajnejn trattati bil-fluworexxina mbag ħad jiġu eżaminati b'mikroskopju 
tal-kornea sabiex ji ġi żgurat li l-kornea ma jkollha l-ebda ħsara ( i.e., 
punteġġi taż-żamma tal-fluworexxina u tal-opa ċità tal-kornea ≤ 0,5).  
19. Jekk l-g ħajn ma jkollha l-ebda ħsara tinqata' aktar, 'il barra mill-kranju 
b'attenzjoni kbira sabiex ma ssir l-ebda ħsara lill-kornea. Il-bo ċċa tal-għajn 
tinġibed mill-orbita billi wie ħed iżomm sod il-membrana tat-teg ħmiż 
b'forċipi kirurġiċi, u l-muskoli tal-g ħajn jinqatg ħu b'imqass mg ħawweġ u 
b'ponta spuntata. Huwa importanti li wie ħed jevita li jikkaw ża ħsara 
fil-kornea min ħabba pressjoni e ċċessiva ( i.e., artefatti ta' kompressjoni.)  
20. Meta l-g ħajn titneħħa mill-orbita, porzjon vi żibbli tan-nerv ottiku g ħandu 
jibqa' mwa ħħal. Ladarba titne ħħa mill-orbita, l-g ħajn titqieg ħed fuq kuttunar 
assorbenti u l-membrana tat-teg ħmiż u tessut konnettiv ie ħor jinqatg ħu. ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. L-għajn imneħħija mill-ħofra tagħha titqieg ħed fuq klamp tal-azzar li ma 
jissaddadx b'tali mod li l-kornea tkun f'po żizzjoni vertikali. Il-klamp 
imbagħad jiġi ttrasferit f'kavità fl-apparat tas-superfu żjoni (16). Il-klampi 
għandhom jitqieg ħdu fl-apparat tas-superfu żjoni b'tali mod li l-kornea 
kollha tkun qed ti ġi provduta bid-dripp tas-soluzzjoni i żotonika tal-ilma 
bil-melħ. Il-kavitajiet tal-apparat tas-superfu żjoni għandu jkollu temperatura 
kkontrollata ta' 32 ± 1,5 °C. L-Appendi ċi 3 jipprovdi dijagramma ta' apparat 
tipiku tas-superfu żjoni u l-klampi tal-g ħajnejn, li jistg ħu jinxtraw jew 
jinbnew. L-apparat jista' jitbiddel sabiex jissodisfa l- ħtiġijiet ta' laboratorju 
individwali ( eż., biex jakkomoda g ħadd differenti ta' g ħajnejn).  
22. Wara li jitqieg ħdu fl-apparat tas-superfu żjoni, l-għajnejn jer ġgħu jiġu 
eżaminati b'mikroskopju tal-kornea sabiex ji ġi żgurat li ma tkun saritilhom 
l-ebda ħsara waqt il-pro ċedura tad-dissezzjoni. Il- ħxuna tal-kornea 
fil-quċċata tal-kornea g ħandha titkejjel ukoll issa bl-u żu tal-apparat li 
jkejjel il-fond fuq il-mikroskopju tal-kornea. G ħajnejn; (i) b'punte ġġ ta' 
żamma ta' fluworexxina ta' > 0,5; (ii) opa ċità tal-kornea > 0,5; jew, (iii), 
kwalunkwe sinjal addizzjonali ta' ħsara għandhom ji ġu ssostitwiti. G ħal 
għajnejn li ma jitwarrbux abba żi ta' kwalunkwe minn dawn il-kriterji, 
għajnejn individwali bi ħxuna tal-kornea li tiddevja b'aktar minn 10 % 
mill-valur medju g ħall-għajnejn kollha g ħandhom jitwarrbu. L-utenti 
għandhom ikunu konxji li l-mikroskopji tal-kornea jistg ħu jagħtu kejl 
differenti ta' ħxuna tal-kornea jekk is-setting tal-wisa' tal-fet ħa tkun 
differenti. Il-wisa' tal-fet ħa għandha tkun immontata g ħal 0,095 mm.  
23. Ladarba l-g ħajnejn kollha ji ġu eżaminati u approvati, l-g ħajnejn jiġu 
inkubati g ħal madwar 45 sa 60 minuta sabiex ji ġu ekwilibrati mas-sistema 
tat-test qabel l-iddo żar. Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, ji ġi rreġistrat 
il-punt żero ta' referenza g ħall-ħxuna u l-opa ċità tal-kornea sabiex iservi 
bħala linja ta' ba żi (i.e., ħin = 0). Il-punte ġġ tal-fluworexxina ddeterminat 
fid-dissezzjoni jintu ża bħala l-ewwel kejl g ħal dak il-punt tat-tmiem.  
Applikazzjoni tas-Sustanza tat-Test  
24. Eżatt wara l-kejl tal-punt żero ta' referenza, l-g ħajn (fl-apparat fejn titq ­
iegħed) titneħħa mill-apparat tas-superfu żjoni, titqieg ħed f'pożizzjoni oriz ­
zontali, u s-sustanza tat-test ti ġi applikata fuq il-kornea.  
25. Sustanzi tat-test likwidi tipikament ji ġu ttestjati mhux iddilwiti, i żda jistgħu 
jiġu ddilwiti jekk dan jitqies ne ċessarju ( eż., bħala parti mit-tfassil 
tal-istudju). Is-solvent preferut g ħas-sustanzi dilwiti huwa l-ilma bil-mel ħ 
fiżjoloġiku. Madankollu, solventi alternattivi jistg ħu jintużaw ukoll ta ħt 
kundizzjonijiet kontrollati, i żda għandu jintwera li dawn ikunu solventi 
xierqa biex jintu żaw minflok l-ilma bil-mel ħ fiżjoloġiku. 
26. Sustanzi tat-test likwidi ji ġu applikati fuq il-kornea b'tali mod li s-superfi ċje 
sħiħa tal-kornea tkun miksija b'mod indaqs bis-sustanza tat-test; il-volum 
standard huwa 0,03 mL.  
27. Jekk possibbli, is-sustanzi solidi g ħandhom jinta ħnu f'mehrie ż u lida, sa ma 
jkunu kemm jista' jkun fini, jew f'g ħodda tat-t ħin komparabbli. It-trab ji ġi 
applikat fuq il-kornea b'tali mod li l-kornea tkun miksija b'mod uniformi bis-sustanza tat-test; l-ammont standard huwa 0,03 gm.
 
28. Is-sustanza tat-test (likwida jew solida) ti ġi applikata g ħal 10 sekondi u 
mbagħad titlaħlaħ minn fuq l-g ħajn bl-ilma bil-mel ħ iżotoniku (madwar 
20 mL) f'temperatura ambjentali. L-g ħajn (fl-apparat fejn titqieg ħed) 
imbagħad terġa' titqiegħed fl-apparat tas-superfu żjoni fil-po żizzjoni wieqfa 
oriġinali.  
Sustanzi ta' Kontroll  
29. Kontrolli negattivi jew tas-solvent/midjum konkorrenti g ħandhom ji ġu 
inklużi f'kull esperiment.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Meta jkunu qed ji ġu ttestjati likwidi f'100 % jew solidi, jintu ża ilma 
bil-melħ fiżjoloġiku bħala kontroll negattiv konkorrenti fil-metodu ta' 
ttestjar ICE sabiex ji ġu individwati bidliet mhux spe ċifiċi fis-sistema 
tat-test, u sabiex ji ġi żgurat li l-kundizzjonijiet tal-assa ġġ ma jirriżultawx 
bla bżonn f'reazzjoni irritanti.  
31. Meta jkunu qed ji ġu ttestjati likwidi ddilwiti, fil-metodu ta' ttestjar ICE ji ġi 
inkluż grupp ta' kontrolli tas-solvent/midjum konkorrenti sabiex ji ġu indi­
vidwati bidliet mhux spe ċifiċi fis-sistema tat-test, u sabiex ji ġi żgurat li 
l-kundizzjonijiet tal-assa ġġ ma jirri żultawx bla b żonn f'reazzjoni irritanti. 
Skont il-paragrafu 25, jista' jintu ża biss solvent/midjum li jkun intwera li 
ma jkollu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.  
32. F'kull esperiment ji ġi inkluż irritant g ħall-għajnejn mag ħruf sabiex ji ġi 
vverifikat li tkun ġiet ikkaw żata reazzjoni xierqa. Min ħabba li l-assa ġġ 
ICE qed jintu ża f'dan il-metodu ta' ttestjar biex jidentifika sustanzi 
korrużivi jew irritanti severi, il-kontroll po żittiv għandu jkun sustanza ta' 
referenza li tikkaw ża reazzjoni severa f'dan il-metodu ta' ttestjar. 
Madankollu, sabiex ji ġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll 
pożittiv tkun tista' ti ġi vvalutata tul i ż-żmien, id-daqs tar-reazzjoni severa 
ma għandux ikun e ċċessiv. Għandha tiġi ġġenerata bi żżejjed dejta  in vitro  
għall-kontroll po żittiv sabiex g ħall-kontroll po żittiv tkun tista' ti ġi kkalkulata 
skala ta' valuri ddefiniti statistikament li tkun a ċċettabbli. Jekk ma jkunx 
hemm disponibbli dejta storika xierqa tal-metodu ta' ttestjar ICE g ħal 
kontroll po żittiv partikolari, jista' jkun me ħtieġ li jitwettqu studji li 
jipprovdu dan it-tag ħrif. 
33. Eżempji ta' kontrolli po żittivi għal sustanzi tat-test likwidi huma l-a ċidu 
aċetiku 10 % jew il-klorur tal-ben żalkonju 5 %, filwaqt li e żempji ta' 
kontrolli po żittivi għal sustanzi tat-test solidi huma l-idrossidu tas-sodju 
jew l-imida żol. 
34. Sustanzi ta' riferiment huma utli g ħall-evalwazzjoni tal-potenzjal li kimi ċi 
mhux mag ħrufa ta' klassi spe ċifika ta' kimi ċi jew prodotti jikkaw żaw irri­
tazzjoni g ħall-għajnejn, jew g ħall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li 
sustanza irritanti g ħall-għajnejn tikkaw ża irritazzjoni fi ħdan skala 
speċifika ta' reazzjonijiet ta' sustanzi irritanti.  
Punti tat-Tmiem Imkejla  
35. Il-kornej trattati ji ġu evalwati qabel it-trattament u mbag ħad fit-30, fil-75, 
fil-120, fil-180 u fil-240 minuta (± 5 minuti) wara t-tla ħliħa ta' wara 
t-trattament. Dawn il-punti tal- ħin jipprovdu g ħadd xieraq ta' kejl tul 
il-perjodu tat-trattament ta' erba' sig ħat, filwaqt li j ħallu biżżejjed ħin 
jgħaddi bejn kejl u ie ħor sabiex isiru l-osservazzjonijiet ne ċessarji li 
għandhom isiru g ħall-għajnejn kollha.  
36. Il-punti tat-tmiem evalwati g ħall-opaċità, nefħa, żamma tal-fluworexxina 
fil-kornea u l-effetti morfolo ġiċi (eż., tħaffir jew illaxkar tal-epitelju). 
Il-punti tat-tmiem kollha, bl-e ċċezzjoni ta ż-żamma tal-fluworexxina (li ti ġi 
ddeterminata biss qabel it-trattament u 30 minuta wara l-esponiment g ħas- 
sustanza tat-test) ji ġu ddeterminati f'kull wie ħed mill-punti tal- ħin 
imsemmija hawn fuq.  
37. It-teħid ta' ritratti huwa rrakkomandat g ħad-dokumentazzjoni tal-opa ċità, iż- 
żamma tal-fluworexxina, l-effetti morfolo ġiċi fil-kornea u, jekk issir, 
l-istopatolo ġija. 
38. Wara l-e żami finali li jsir fir-raba' sieg ħa, l-utenti huma inkora ġġuti jippre ­
servaw l-g ħajnejn f'fissattiv xieraq ( eż., soluzzjoni buffer ta' formalina 
newtrali) g ħal eżami istopatolo ġiku possibbli.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. In-nef ħa fil-kornea ti ġi ddeterminata mill-kejl tal- ħxuna fil-kornea li jsir 
permezz ta' pakimetru ottiku fuq mikroskopju tal-kornea. In-nef ħa tiġi 
espressa b ħala perċentwal u ti ġi kkalkulata mill-kejl tal- ħxuna tal-kornea 
skont il-formula li ġejja: 
" 
ħxuna kornea ħin t Ä ħxuna kornea ħin ¼ 0 
ħxuna kornea ħin ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Il-per ċentwal medju tan-nef ħa fil-kornea g ħat-testijiet kollha tal-g ħajnejn jiġi 
kkalkulat g ħall-punti tal- ħin ta' osservazzjoni kollha. Abba żi tal-ogħla 
punteġġ medju g ħan-nefħa fil-kornea, kif ji ġi osservat fi kwalunkwe punt 
tal-ħin, jingħata punte ġġ tal-kategorija g ħal kull sustanza tat-test.  
41. Għall-punteġġ l-opaċità fil-kornea ti ġi kkalkulata skont il-parti tal-kornea li 
tkun opa ċifikata l-aktar. Il-valur medju tal-opa ċità fil-kornea g ħat-testijiet 
kollha tal-g ħajnejn ji ġi kkalkulat g ħall-punti tal- ħin ta' osservazzjoni 
kollha. Abba żi tal-ogħla punteġġ medju g ħall-opaċità fil-kornea, kif ji ġi 
osservat fi kwalunkwe punt tal- ħin, jingħata punte ġġ tal-kategorija g ħal 
kull sustanza tat-test (it-Tabella 1).  
Tabella 1  
Punteġġi tal-opaċità tal-kornea  
Punteġġ Osservazzjoni  
0 L-ebda opa ċità 
0,5 Opa ċità ħafifa ħafna 
1 Partijiet mifruxa jew imxerrda; id-dettalji tal- ħabba tal-g ħajn jidhru b'mod ċar 
2 Parti traslu ċida li tintlema ħ faċilment; id-dettalji tal- ħabba tal-g ħajn huma 
kemxejn oskuri 
3 Opa ċità severa fil-kornea; ma jidher l-ebda dettall spe ċifiku tal-ħabba tal-g ħajn; 
id-daqs tal-pupilla bilkemm jintlema ħ 
4 Opa ċità totali fil-kornea; il- ħabba tal-g ħajn hija invi żibbli 
42. Il-valur medju ta ż-żamma tal-fluworexxina g ħat-testijiet kollha tal-g ħajnejn 
jiġi kkalkulat biss g ħall-punt tal- ħin osservat fit-30 minuta, li jintu ża 
għall-punteġġ kumplessiv tal-kategorija g ħal kull sustanza tat-test (it- 
Tabella 2).  
Tabella 2  
Punteġġi taż-żamma tal-fluworexxina  
Punteġġ Osservazzjoni  
0 L-ebda żamma ta' fluworexxina 
0,5 Titbig ħ żgħir ħafna ta' ċelluli singli 
1 It-titbig ħ taċ-ċelluli singli mifrux mal-parti ttrattata tal-kornea 
2 Titbig ħ ta' ċelluli singli dens fokali jew konfluwenti 
3 Partijiet kbar konfluenti tal-kornea j żommu l-fluworexxina  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Effetti morfolo ġiċi inkluż “tħaffir” ta ċ-ċelluli tal-epitelju tal-kornea, 
“illaxkar” tal-epitelju, “ta ħrix” tas-superfi ċje tal-kornea u “twa ħħil” 
tas-sustanza tat-test mal-kornea. Dawn is-sejbiet jistg ħu jvarjaw fis-severità 
u jistgħu jokkorru b'mod simultanju. Il-klassifikazzjoni ta' dawn is-sejbiet 
hija suġġettiva skont l-interpretazzjoni tal-investigatur.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Evalwazzjoni tad-Dejta  
44. Ir-riżultati tal-opa ċità, in-nef ħa, u ż-żamma tal-fluworexxina fil-kornea 
għandhom ji ġu evalwati b'mod separat sabiex tin ħoloq klassi separata g ħal 
kull punt tat-tmiem. Il-klassijiet tal-ICE g ħal kull punt tat-tmiem imbag ħad 
jiġu kkombinati biex tin ħoloq Klassifikazzjoni tal-Irritanza g ħal kull 
sustanza tat-test.  
Kriterji tad-De ċiżjoni 
45. Ladarba kull punt tat-tmiem ikun ġie evalwat, il-klassijiet tal-ICE jistg ħu 
jiġu assenjati abba żi ta' skala ta' valuri ddeterminata minn qabel. 
L-interpretazzjoni tal- ħxuna tal-kornea (it-Tabella 3), l-opa ċità (it-Tabella 
4), u ż-żamma tal-fluworexxina (it-Tabella 5) bl-u żu ta' erba' klassijiet 
tal-ICE ssir skont l-iskali li ġejjin:  
Tabella 3  
Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE g ħall-ħxuna tal-kornea  
Nefħa Medja tal-Kornea (%) (*) Klassi tal-ICE  
0 sa 5 I 
> 5 sa 12 II 
> 12 sa 18 (> 75 min wara t-trattament) II 
> 12 sa 18 ( ≤ 75 min wara t-trattament) III 
> 18 sa 26 III 
> 26 sa 32 (> 75 min wara t-trattament) III 
> 26 sa 32 ( ≤ 75 min wara t-trattament) IV 
> 32 IV  
(*) Punte ġġi tan-nefħa fil-kornea jkunu applikabbli biss jekk il- ħxuna mkejla b'mikroskopju tal-kornea 
Haag-Streit BP900 b'apparat li jkejjel il-fond nru I u setting tal-wisa' tal-fet ħa ta' 9½, ekwivalenti g ħal 
0,095 mm. L-utenti g ħandhom ikunu konxji li l-mikroskopji tal-kornea jistg ħu jagħtu kejl differenti ta' 
ħxuna tal-kornea jekk is-setting tal-wisa' tal-fet ħa tkun differenti.  
Tabella 4  
Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE g ħall-opaċità 
Medja tal-Punte ġġ tal-Opaċità Massima (*) Klassi tal-ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 
1,6-2,5 III 
2,6-4,0 IV  
(*) Ara t-Tabella 1.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabella 5  
Kriterji tal-klassifikazzjoni tal-ICE g ħaż-żamma medja tal-fluworexxina  
Medja tal-Punte ġġ taż-Żamma tal-Fluworexxina fit- 
30 minuta ta' wara t-trattament (*) Klassi tal-ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 
1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Ara t-Tabella 2.  
46. Il-klassifikazzjoni kumplessiva tal-irritanza  in vitro  għal sustanza tat-test ti ġi 
vvalutata billi tinqara l-klassifikazzjoni ta' irritanza li tikkorrispondi għall-kombinazzjoni tal-kategoriji miksuba g ħan-nefħa fil-kornea, l-opa ċità 
fil-kornea, u ż-żamma tal-fluworexxina u bl-applikazzjoni tal-iskema 
ppreżentata fit-Tabella 6.
 
Tabella 6  
Klassifiki kumplessivi tal-irritanza  in vitro  
Klassifikazzjoni Kombinazzjonijiet tat-tliet (3) Punti tat-Tmiem  
Sustanza Korru żiva/Irritant Sever 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 
2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) Opaċità fil-kornea ≥ 3 fit-30 min (tal-anqas f'2 
għajnejn) 
Opaċità fil-kornea = 4 fi kwalunkwe ħin (tal- 
anqas f'żewġ (2) għajnejn) 
Illaxkar sever tal-epitelju (tal-anqas f'g ħajn 
waħda (1)
 
(*) Kombinazzjonijiet li probabbilment ma jokkorrux.  
47. Skont il-paragrafu 1, jekk is-sustanza tat-test ma ti ġix identifikata b ħala 
korrużiva għall-għajnejn jew irritant sever, g ħandu jitwettaq aktar ittestjar 
għall-finijiet ta' klassifikazzjoni u ttikkettar. Il-metodu ta' ttestjar ICE g ħandu 
akkuratezza kumplessiva ta' 83 % (120/144) sa 87 % (134/154), rata 
pożittiva falza ta' 6 % (7/122) sa 8 % (9/116), u rata negattiva falza ta' 
41 % (13/32) sa 50 % (15/30) g ħall-identifikazzjoni ta' sustanzi korru żivi u 
irritanti severi g ħall-għajnejn, meta mqabbel mad-dejta, tal-metodu ta' 
ttestjar  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn il-fniek, ikklassifikata skont is-sistemi 
ta' klassifikazzjoni tal-EPA (1), l-UE (2), jew il-GHS (3). Meta sustanzi f'ċerti klassijiet kimi ċi (i.e., alkoħols u aġenti tensjoattivi) u fi żiċi (i.e., 
solidi) ikunu esklu żi mill-ba żi tad-dejta, l-akkuratezza tal-ICE skont 
is-sistemi ta' klassifikazzjoni tal-UE, l-EPA u l-GHS tvarja minn 91 % 
(75/82) sa 92 % (69/75), ir-rati ta' po żittivi foloz ivarjaw minn 5 % 
(4/73) sa 6 % (4/70), u r-rati ta' negattivi foloz ivarjaw minn 29 % (2/7) sa 33 % (3/9) (4).
 
48. Anke jekk g ħas-sustanza tat-test ma tinkiseb l-ebda klassifikazzjoni ta' 
sustanza korru żiva jew irritant sever g ħall-għajnejn, id-dejta ICE tista' 
tkun utli, flimkien mad-dejta tat-test  in vivo  li jsir fuq g ħajnejn il-fniek 
jew minn test  in vitro  vvalidat kif xieraq, sabiex ji ġu evalwati aktar 
il-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar ICE kif ukoll kemm dan huwa utli għall-identifikazzjoni ta' irritanti li mhumiex severi u sustanzi li mhumex 
irritanti (qed ji ġi żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-u żu ta' metodi ta' 
ttestjar  in vitro  fuq l-għajnejn).
 ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Kriterji ta’ A ċċettazzjoni ta' Studju  
49. Test jitqies a ċċettabbli jekk il-kontrolli negattivi jew tal-midjum/solvent 
konkorrenti u l-kontrolli po żittivi konkorrenti jag ħtu Klassifikazzjoni 
tal-Irritanza simili g ħal dik li tinsab fil-klassijiet ta' irritanti severi/sustanzi 
korrużivi, rispettivament.  
Rapport tat-Test  
50. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi t-tag ħrif li ġej, jekk ikun rilevanti g ħat- 
twettiq tal-istudju:  
Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll  
Isem/Ismijiet kimiku/kimi ċi pereżempju l-isem strutturali u żat mir-Re ġistru 
tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimi ċi (CAS), u ismijiet o ħra, jekk 
ikunu mag ħrufa;  
In-Numru tar-Re ġistru CAS (RN), jekk ikun mag ħruf; 
Il-purità u l-kompo żizzjoni tas-sustanza jew it-ta ħlita (f'per ċentwal(i) skont 
il-piż), sakemm dan it-tag ħrif ikun disponibbli;  
Proprjetajiet fi żikokimiċi bħall-istat fi żiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, 
il-klassi kimika, is-solubilità fl-ilma rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju;  
It-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli 
(eż., it-tisħin, it-tħin); 
L-istabilità, jekk tkun mag ħrufa;  
Tagħrif dwar l-Isponser u l-Istallazzjoni tat-Test  
L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-istallazzjoni tat-test u tad-direttur 
tal-istudju;  
Identifikazzjoni tas-sors tal-g ħajnejn ( eż., l-istallazzjoni minn fejn in ġabru);  
Il-kundizzjonijiet tat-trasport u l- ħżin tal-għajnejn ( eż., id-data u l- ħin meta 
nġabru l-għajnejn, l-intervall tal- ħin qabel ma nbeda t-test);  
Jekk disponibbli, karatteristi ċi speċifiċi tal-annimali minn fejn in ġabru 
l-għajnejn ( eż., età, sess, pi ż tal-annimal donatur);  
Ġustifikazzjoni tal-Metodu ta' Ttestjar u tal-Protokoll U żati 
Integrità tal-Metodu ta' Ttestjar  
Il-proċedura użata sabiex ti ġi żgurata l-integrità ( i.e., akkuratezza u affid ­
abilità) tal-metodu ta' ttestjar tul i ż-żmien ( eż., ittestjar perjodiku ta' sustanzi 
ta' profiċjenza, użu ta' dejta storika ta' kontrolli negattivi u po żittivi).  
Kriterji g ħal Test A ċċettabbli  
Jekk applikabbli, firxiet a ċċettabbli ta' punti ta' riferiment ta' kontroll 
konkorrenti bba żati fuq dejta storika;  
Kundizzjonijiet tat-Test  
Deskrizzjoni tas-sistema tat-test u żata; 
Mikroskopju tal-kornea u żat (eż., il-mudell);  
Settings tal-istrument u żati għall-mikroskopju tal-kornea;  
Tagħrif dwar g ħajnejn it-ti ġieġ użati, inklu żi dikjarazzjonijiet rigward 
il-kwalità tag ħhom; ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Dettalji tal-pro ċedura tat-test u żata; 
Konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza tat-test u żata; 
Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-pro ċedura tat-test;  
Referenza g ħad-dejta storika tal-mudell ( eż., kontrolli negattivi u po żittivi, 
sustanzi ta' profi ċjenza, sustanzi ta' riferiment);  
Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u żati; 
Riżultati  
Deskrizzjoni ta' effetti o ħra osservati;  
Jekk xieraq, ritratti tal-g ħajn; 
Diskussjoni tar-Ri żultati  
Konklużjoni 
LETTERATURA  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
0(2) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u 
tal-Kunsill tas-16 ta' Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, 
l-ittikkettar u l-imballa ġġ tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u 
jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda 
r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.  
0(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classifi ­
cation and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN 
New York and Geneva, 2007. Disponibbli fuq:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
0(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. 
Disponibbli fuq:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
0(6) Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u 
tal-Kunsill tat-18 ta' Di ċembru 2006 dwar ir-Re ġistrazzjoni, 
il-Valutazzjoni, l-Awtorizzazzjoni u r-Restrizzjoni ta' Sustanzi 
Kimiċi (REACH), li jistabbilixxi A ġenzija Ewropea g ħas-Sustanzi 
Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li j ħassar 
ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) 
Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE 
tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni. ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponibbli fuq:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37 051368_ 
1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxi ­
cology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alter ­
native Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07- 4517. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Disponibbli fuq:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the 
enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alter ­
native to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.  
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Disponibbli fuq:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ ­
prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponibbli fuq:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponibbli fuq:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Akkuratezza:  Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u 
l-valuri ta’ referenza a ċċettati. Din hija mi żura tar-rendiment tal-metodu ta' ttestjar 
u aspett wie ħed ta' “rilevanza.” It-terminu spiss jintu ża b'mod alternanti ma' 
“konkordanza”, biex ifisser il-proporzjon ta' ri żultati pożittivi ta' metodu ta' 
ttestjar.  
Sustanza ta' riferiment:  Sustanza u żata bħala standard g ħal paragun ma' 
sustanza tat-test. Sustanza ta' riferiment g ħandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; 
(i), sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii), xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta' sustanzi li jkunu qed ji ġu ttestjati; (iii), karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi magħrufa; (iv), 
dejta ta' appo ġġ dwar effetti mag ħrufa; u (v), potenza mag ħrufa fl-iskala 
tar-reazzjoni mixtieqa
 
Kornea:  Il-parti trasparenti tal-parti ta' quddiem tal-bo ċċa tal-għajn li tkopri l- 
ħabba tal-g ħajn u l-pupilla u t ħalli d-dawl jg ħaddi għal ġol-parti interna tal-g ħajn. 
Opaċità tal-kornea:  Kejl tal-estensjoni tal-opa ċità tal-kornea wara esponiment 
għal sustanza tat-test. Żieda fl-opa ċità tal-kornea hija indikattiva ta' ħsara 
fil-kornea.  
Nefħa fil-kornea:  Kejl oġġettiv fit-test tal-ICE tal-estensjoni tad-distensjoni 
tal-kornea wara esponiment g ħas-sustanza tat-test. Din ti ġi espressa b ħala 
perċentwal u kkalkulata mill-ewwel kejl (qabel l-iddo żar) tal-ħxuna tal-kornea 
u l-ħxuna rreġistrata f'intervalli regolari wara esponiment g ħall-materjal tat-test, 
fit-test tal-ICE. Id-daqs tan-nef ħa tal-kornea huwa indikattiv ta' ħsara fil-kornea.  
Kategorija tal-EPA 1:  Korrużiv (qerda irriversibbli tat-tessut tal-kornea) jew 
involviment tal-kornea jew irritazzjoni li tippersisti g ħal aktar minn 21 jum (1).  
Kategorija tal-UE R41:  Produzzjoni ta' ħsara fit-tessut tal-g ħajn, jew t ħassir 
fiżiku serju tal-vista, wara l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test fuq is-superfi ċje 
anterjuri tal-g ħajn, li ma jkunx kompletament riversibbli fi żmien 21 jum 
mill-applikazzjoni (2).  
Rata ta’ negattivi foloz:  Il-proporzjon tas-sustanzi po żittivi kollha identifikati 
b’mod falz b ħala negattivi permezz ta’ metodu ta’ ttestjar. Dan huwa wie ħed 
mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.  
Rata ta’ po żittivi foloz:  Il-proporzjon tas-sustanzi negattivi kollha identifikati 
b’mod falz b ħala pożittivi permezz ta’ metodu ta’ ttestjar. Dan huwa wie ħed 
mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar.  
Żamma tal-fluworexxina:  Kejl su ġġettiv fit-test tal-ICE ta' kemm is-sodju 
tal-fluworexxina jin żamm miċ-ċelluli tal-epitelju fil-kornea wara l-esponiment 
għas-sustanza tat-test. L-ammont ta' fluworexxina li jin żamm huwa indikattiv 
tal-ħsara fl-epitelju tal-kornea.  
GHS (Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' 
Sustanzi Kimi ċi): Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimi ċi 
(sustanzi u ta ħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fi żiċi, 
sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, 
bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet 
ta’ prekawzjoni u skedi ta’ tag ħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tag ħrif dwar 
l-effetti avversi bil-g ħan li n-nies ikunu protetti (inklu żi min iħaddem, il- 
ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l- ħaddiema tal-emer ġenza) u 
l-ambjent (3).  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Kategorija tal-GHS 1:  Produzzjoni ta' ħsara fit-tessut tal-g ħajn, jew t ħassir 
fiżiku serju tal-vista, wara l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test fuq is-superfi ċje 
anterjuri tal-g ħajn, li ma jkunx kompletament riversibbli fi żmien 21 jum 
mill-applikazzjoni (3).  
Periklu:  Proprjetà inerenti ta' a ġent jew sitwazzjoni li g ħandha l-potenzjal 
tikkawża effetti avversi meta organi żmu, sistema jew (sub) popolazzjoni 
jiġi/tiġi espost(a) g ħal dak l-a ġent. 
Kontroll negattiv:  Replikazzjoni mhux trattata li fiha l-komponenti kollha 
tas-sistema tat-test. Dan il-kampjun ji ġi proċessat b'kampjuni ttrattati 
bis-sustanza tat-test u kampjuni ta' kontroll o ħra sabiex ji ġi ddeterminat jekk 
is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.  
Sustanzi li mhumiex irritanti:  Sustanzi li mhumiex ikklassifikati b ħala 
Kategorija I, II, jew III tal-EPA; Kategorija R41 jew R36 tal-UE; jew Kategorija 
tal-GHS 1, 2A, jew 2B irritanti tal-g ħajnejn (1)(2)(3).  
Sustanza korru żiva għall-għajnejn:  (a) Sustanza li tikkaw ża ħsara irriversibbli 
fl-għajnejn. (b) Sustanzi li huma kklassifikati b ħala Kategorija 1 tal-GHS, 
Kategorija I tal-EPA, jew Kategorija R41 tal-UE irritanti g ħall-għajnejn (1) (2) (3).  
Irritant g ħall-għajnejn:  (a) Sustanza li tipprodu ċi bidla riversibbli fl-g ħajn wara 
li tiġi applikata fuq is-superfi ċje anterjuri tal-g ħajn; (b) Sustanzi li mhumiex 
ikklassifikati b ħala Kategorija II jew III tal-EPA; Kategorija tal-UE R36; jew 
Kategorija tal-GHS 2A, jew 2B irritanti tal-g ħajnejn (1)(2)(3).  
Irritant sever g ħall-għajnejn:  (a) Sustanza li tikkaw ża ħsara fit-tessut tal-g ħajn 
wara li tiġi applikata fuq is-superfi ċje anterjuri tal-g ħajn u li ma tkunx riversibbli 
fi żmien 21 jum tal-applikazzjoni jew tikkaw ża tħassir fiżiku serju tal-vista. (b) 
Sustanzi li huma kklassifikati b ħala Kategorija 1 tal-GHS, Kategorija I tal-EPA, 
jew Kategorija R41 tal-UE irritanti g ħall-għajnejn (1) (2) (3).  
Kontroll po żittiv:  Replikazzjoni li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema 
tat-test u trattata b'sustanza li jkun mag ħruf li tikkaw ża reazzjoni po żittiva. 
Sabiex ji ġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll po żittiv tista' ti ġi 
vvalutata tul i ż-żmien, id-daqs tar-reazzjoni severa ma g ħandux ikun e ċċessiv.  
Affidabilità:  Qies ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riprodu ċibbli 
fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul i ż-żmien, meta jitwettaq skont l-istess 
protokoll. Ti ġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riprodu ċibilità fil-laboratorju u bejn 
laboratorju u ie ħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.  
Mikroskopju tal-kornea (slit-lamp microscope):  Strument li jintu ża biex 
l-għajn tiġi eżaminata b'mod dirett ta ħt l-ingrandiment ta' mikroskopju binokulari 
billi joħloq imma ġni dritta u stereoskopika. Fil-metodu ta' ttestjar ICE, dan 
l-istrument jntu ża biex wie ħed ikun jista' jara l-istrutturi anterjuri ta' g ħajn 
it-tiġieiġa kif ukoll biex ikejjel b'mod o ġġettiv il-ħxuna tal-kornea b'apparat li 
jitwaħħal mal-istrument u li jkejjel il-fond.  
Kontroll ta' solvent/midjum:  Kampjun mhux trattat li fih il-komponenti kollha 
tas-sistema tat-test, inklu ż is-solvent jew il-midjum li ji ġi pproċessat mas-sustanza 
tat-test trattata u kampjuni ta' kontroll o ħra sabiex ti ġi stabbilita l-ewwel reazzjoni 
għall-kampjuni trattati mis-sustanza tat-test ma ħlula fl-istess solvent jew midjum. 
Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv konkorrenti, dan il-kampjun juri wkoll jekk 
is-solvent jew il-midjum ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Ittestjar imtarra ġ: Strateġija ta' ttestjar pass pass fejn it-tag ħrif kollu dwar 
sustanza tat-test ji ġi analizzat f'ordni spe ċifika, permezz ta' pro ċess fejn titqies 
l-evidenza f'kull livell sabiex ji ġi ddeterminat jekk hemmx bi żżejjed tag ħrif 
disponibbli g ħal deċiżjoni ta' klassifikazzjoni ta' periklu, qabel ma wie ħed 
jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal li sustanza tat-test tikkaw ża irri­
tazzjoni jista' ji ġi assenjat abba żi ta' tagħrif eżistenti, ma jkun me ħtieġ l-ebda 
ttestjar ie ħor. Jekk il-potenzjal li sustanza tat-test tikkaw ża irritazzjoni ma jkunx 
jista' jiġi assenjat abba żi tat-tagħrif eżistenti pro ċedura ta' ttestjar sekwenzjali pass 
pass għandha titwettaq fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni 
mhux ekwivoka.  
Metodu ta' ttestjar ivvalidat:  Metodu ta' ttestjar li g ħalih ikunu tlestew studji ta' 
validazzjoni sabiex ti ġi ddeterminata r-rilevanza (inklu ża l-akkuratezza) u 
l-affidabilità g ħal għan speċifiku. Huwa importanti li wie ħed jinnota li metodu 
ta' ttestjar ivvalidat jista' jkun li ma jkollux rendiment tajjeb bi żżejjed f'termini ta' 
akkuratezza u affidabilità sabiex jinstab a ċċettabli għall-għan propost.  
Importanza tal-evidenza:  Il-proċess fejn jitqiesu l-qawwiet u d-dg ħufijiet ta' 
biċċiet ta' informazzjoni varji sabiex tintla ħaq u tiġi appoġġata konklu żjoni 
rigward il-potenzjal ta' sustanza li tkun ta' periklu.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Appendiċi 2 
SUSTANZI KIMI ĊI TA' PROFI ĊJENZA G ĦALL-METODU TA' TTESTJAR 
ICE 
Qabel l-u żu ta' rutina ta' metodu ta' ttestjar li jaderixxi ma' dan il-metodu ta' 
ttestjar, il-laboratorji jista' jkun li jkunu jixtiequ juru l-profi ċjenza teknika billi 
jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-korru żività għall-għajnejn ta' 10 
sustanzi rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi ntg ħażlu biex 
jirrappreżentaw l-iskala ta' reazzjonijiet ta' irritazzjoni/korru żjoni fl-għajn, li 
hija bbażata fuq ir-ri żultati mit-test  in vivo  fuq għajnejn il-fniek (TG 405) ( i.e., 
il-Kategoriji 1, 2A, 2B, jew Mhux Ikklassifikata jew Ittikkettata skont il-GHS 
tan-NU) (3)(7). Madankollu, meta jitiqies kemm dawn l-assa ġġi huma utli b'mod 
li huwa vvalidat ( i.e., biex jiġu identifikati sustanzi korru żivi/irritanti severi 
għall-għajnejn), hemm biss żewġ riżultati għall-finijiet ta' klassifikazzjoni 
(sustanza korru żiva/irritant sever jew sustanza mhux korru żiva/irritant mhux 
sever) biex tintwera l-profi ċjenza. Kriterji o ħra tal-għażla kienu li s-sustanzi 
jkunu disponibbli b'mod kummer ċjali, ikun hemm disponibbli dejta ta' 
referenzi ta' kwalità g ħolja in vivo , u li jkun hemm dejta ta' kwalità g ħolja 
miż-żewġ metodi  in vitro  li għalihom qeg ħdin jiġu żviluppati l-Linji Gwida 
għall-Ittestjar. G ħal din ir-ra ġuni, sustanzi irritanti ntg ħażlu mil-lista rrakkom ­
andata mill-ICCVAM ta' 122 sustanza ta' referenza g ħall-validazzjoni ta' 
metodi ta' ttestjar ta' tossi ċità għall-għajnejn  in vitro  (ara l-Appendi ċi H, Lista 
ta' Sustanzi ta' Referenza Rrakkomandati mill-ICCVAM)(4). Id-dejta tar-referenzi 
hija disponibbli fid-Dokumenti ta' Anali żi tal-Isfond tal-ICCVAM g ħall-metodi 
ta' ttestjar tal-Opa ċità u tal-Permeabilità tal-Kornea tal-Bovini (BCOP) u l-ICE 
(18) (19).  
Tabella 1  
Sustanzi rrakkomandati biex tintwera profi ċjenza teknika mal-ICE  
Sustanza kimika CASRN Klassi Kimika (  1 ) Forma Fi żika Klassifikazzjoni  In 
Vivo ( 2 ) Klassifikazzjoni  In 
Vitro  ( 3 ) 
Klorur 
tal-benżalkonju (5 %) 8001-54-5 Kompost ta' 
onju Likwidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/ 
Irritant Sever 
Kloressidin 55-56-1 Ammin, 
Ammidin Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/ 
Irritant Sever 
Aċidu diben żojl-L- 
tartariku 2743-38-6 A ċidu karbos ­
siliku, Ester Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/ 
Irritant Sever 
Imidażol 288-32-4 Etero ċikliku Solidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/ 
Irritant Sever 
Aċidu trikloroa ċetiku 
(30 %) 76-03-9 A ċidu karbos ­
siliku Likwidu Kategorija 1 Sustanza Korru żiva/ 
Irritant Sever 
2,6-dikloroben ż-ojl 
klorur 4659-45-4 Alid a ċil Likwidu Kategorija 2A Sustanza mhux 
korrużiva/Irritant 
mhux sever 
Etil-2-metila ċeto- 
aċetat 609-14-3 Keton, Ester Likwidu Kategorija 2B Sustanza mhux 
korrużiva/Irritant 
mhux sever 
Nitrat tal-ammonju 6484-52-2 Mel ħ inor­
ganiku Solidu Kategorija 2A Sustanza mhux 
korrużiva/Irritant 
mhux sever  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Sustanza kimika CASRN Klassi Kimika (  1 ) Forma Fi żika Klassifikazzjoni  In 
Vivo ( 2 ) Klassifikazzjoni  In 
Vitro  ( 3 ) 
Gliċerol 56-81-5 Alko ħol Likwidu Mhux tikkettat Sustanza mhux 
korrużiva/Irritant 
mhux sever 
n-essan 110-54-3 Idrokarbonju 
(aċiliku) Likwidu Mhux tikkettat Sustanza mhux 
korrużiva/Irritant 
mhux sever  
Taqsiriet: CASRN = Numru tar-Re ġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimi ċi 
( 1 ) Klassijiet kimi ċi ġew assenjati lil kull sustanza tat-test li tu ża skema ta' klassifikazzjoni standard, abba żi tas-sistema ta' klassifi ­
kazzjoni tal-librerija nazzjonali tal-intestaturi tas-su ġġetti mediċi tal-medi ċina (MeSH) (disponibbli fuq http//www.nlm.nih.gov/ 
mesh). 
( 2 ) Abbażi tar-riżultati mit-test  in vivo  fuq għajnejn il-fniek (OECD TG 405) u bl-u żu tal-GHS tan-NU (3)(7). 
( 3 ) Abbażi tar-riżultati fil-BCOP u l-ICE.  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Appendiċi 3 
Dijagrammi tal-apparat tas-superfu żjoni ICE u l-klampi tal-g ħajnejn  
(Ara Burton et al. (17) g ħal deskrizzjonijiet ġeneriċi addizzjonali tal-apparat tas-superfu żjoni u 
l-klampi tal-g ħajnejn)
  ▼M2 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  TEST TAL-MIKRONUKLEU TA Ċ-ĊELLOLA MAMMIFERA  
IN VITRO  
INTRODUZZJONI  
1. L-anali żi tal-mikronukleu  in vitro  (MNvit) hija test ta’ ġenotossiċità għall- 
individwazzjoni ta’ mikronuklei (MN) fi ċ-ċitoplażma ta’ ċelloli fl-interfa żi. 
Il-mikronuklei jistg ħu joriġinaw minn frammenti ta’ kromo żomi aċentriċi 
(jiġifieri li ma g ħandhomx ċentromer), jew kromo żomi sħaħ li ma 
jistgħux jemigraw lejn il-poli waqt l-istadju ta’ anafa żi tad-divi żjoni taċ- 
ċellola. L-anali żi tindividwa l-attività ta’ sustanzi kimi ċi klastoġeniċi u 
anewġeniċi (sustanzi u ta ħlitiet) (1) (2) f' ċelloli li g ħaddew mid-divi żjoni 
taċ-ċelloli wara l-esponiment g ħas-sustanza tat-test. Dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar (TM) jippermetti l-u żu ta’ protokolli bl-inibitur ta ċ-ċitokalażina B 
tal-polimerizzazzjoni tal-attina (actin polymerisation inhibitor cytochalasin B, cytoB) u ming ħajr dan l-inibitur. I ż-ż
ieda ta’ cytoB qabel il-mito żi 
mmirata tippermetti l-identifikazzjoni u l-anali żi selettiva tal-frekwenza 
tal-mikronuklei f' ċelloli li temmew mito żi waħda peress li dawn i ċ-ċelloli 
għandhom żewġ nuklei (3) (4). Dan it-TM jippermetti wkoll l-u żu ta’ 
protokolli ming ħajr imblokkatur ta ċ-ċitokineżi, sakemm ikun hemm 
evidenza li l-popolazzjoni ta’ ċelloli analizzati g ħaddiet minn mito żi. 
2. Minbarra l-u żu tal-anali żi tal-MNvit sabiex ji ġu identifikati sustanzi kimi ċi 
(sustanzi u ta ħlitiet) li jindu ċu l-mikronuklei, l-u żu ta’ imblokkatur ta ċ-ċito­
kineżi, it-tikkettar immunokimiku ta’ kinetochores, jew l-ibridizzazzjoni 
b'sondi ċentromeri ċi/telomeri ċi (ibridizzazzjoni  in situ  ta’ fluworexxenza 
(fluorescence  in situ  hybridisation — FISH)), ukoll jistg ħu jipprovdu 
informazzjoni dwar il-mekkani żmi ta’ ħsara fil-kromo żomi u 
tal-formazzjoni ta’ mikronuklei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 
(15) (16). Il-pro ċeduri ta’ tikkettar u ibridizzazzjoni jistg ħu jintużaw meta 
jkun hemm żieda fil-formazzjoni ta’ mikronuklei u l-investigatur ikun jixtieq 
jiddetermina jekk i ż-żieda kinitx ir-ri żultat ta’ avvenimenti klasto ġeniċi 
u/jew anew ġeniċi. 
3. Il-mikronuklei jirrappre żentaw ħsara li ġiet trażmessa lil ċelloli ġġenerati 
(daughter cells), filwaqt li aberrazzjonijiet tal-kromo żomi mag ħduda fiċ- 
ċelloli f'metafa żi jistgħu ma jiġux trażmessi. Min ħabba li l-mikronuklei 
fiċ-ċelloli fl-interfa żi jistgħu jiġu evalwati b'mod relattivament o ġġettiv, 
il-persunal tal-laboratorju je ħtieġ li jiddetermina biss jekk i ċ-ċelloli 
ddividewx u kemm-il ċellola fiha mikronukleu. G ħalhekk, 
il-preparazzjonijiet jistg ħu jingħaddu relattivament malajr u l-anali żi tista' 
tiġi awtomatizzata. Dan jag ħmilha prattika li eluf minflok mijiet ta’ ċelloli 
jingħaddu f'kull trattament, biex b'hekk ti żdied il-qawwa tal-anali żi. Fl-aħħar 
nett, min ħabba li l-mikronuklei jistg ħu joħorġu minn kromo żomi tardivi, 
hemm il-potenzjal li wie ħed jindividwa sustanzi li jindu ċu anewplojdi li 
huma diffi ċli li wieħed jistudjahom f'testijiet konvenzjonali tal-aberrazzjoni 
tal-kromo żomi, eż. Linja gwida tal-Ittestjar 473 tal-OECD (Kapitolu B.10 ta’ 
dan l-Anness) (17). Madankollu, l-anali żi tal-MNvit ma tippermettix g ħad- 
divrenzjar ta’ sustanzi kimi ċi li jindu ċu poliplojdi minn dawk li jindu ċu 
klastoġeniċità mingħajr tekniki spe ċjali bħall-FISH deskritta fil-paragrafu 2.  
4. L-anali żi tal-MNvit hija metodu  in vitro  li tipikament tu ża ċelloli 
tal-bniedem jew tal-annimali gerriema kkultivati. Hija tipprovdi ba żi 
komprensiva g ħall-investigazzjoni tal-potenzjal ta’ ħsara tal-kromo żomi in 
vitro  minħabba li jistg ħu jiġu individwati kemm l-anew ġeni kif ukoll 
il-klastoġeni. 
5. L-anali żi tal-MNvit hija b'sa ħħitha u effettiva f'varjetà ta’ tipi ta’ ċelloli, u 
fil-preżenza jew fin-nuqqas ta’ cytoB. Hemm dejta estensiva li tappo ġġa 
l-validità tal-anali żi tal-MNvit permezz ta’ diversi linji ta’ ċelloli 
tal-annimali gerriema (CHO, V79, CHL/IU, u L5178Y) u limfo ċiti 
tal-bniedem (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) 
(30) (31). Dawn jinkludu, b'mod partikolari, l-istudji ta’ validazzjoni inter ­
nazzjonali kkoordinati mis-Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) u r-rapporti tal-Grupp ta’ 
Ħidma Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal- Ġenotossiċità (4) (16). Id-dejta 
disponibbli ġiet evalwata mill- ġdid fi studju ta’ validazzjoni retrospettiv
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
skont il-pi ż tal-evidenza mi ċ-Ċentru Ewropew g ħall-Validazzjoni ta’ Metodi 
Alternattivi (ECVAM) tal-Kummissjoni Ewropea, u l-metodu tat-test ġie 
approvat b ħala xjentifikament validu mill-Kumitat Xjentifiku Konsultattiv 
tal-ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). Ġie deskritt l-u żu tal-linja ta’ ċelloli 
tal-bniedem limfoblastojdi TK6 (35), ċelloli HepG2 (36) (37) u ċelloli 
primarji tal-Embriju tal- Ħemster Sirjan (38), g ħalkemm ma ntu żawx fi 
studji ta’ validazzjoni.  
DEFINIZZJONIJIET  
6. Definizzjonijiet u żati huma pprovduti f'Appendi ċi 1. 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
7. It-testijiet li jsiru  in vitro  ġeneralment ikunu je ħtieġu l-użu ta’ sors e żoġenu 
ta’ attivazzjoni metabolika diment li ċ-ċelloli ma jkunux metabolikament 
kompetenti fir-rigward tas-sustanzi li jkunu qeg ħdin jiġu ttestjati. 
Is-sistema e żoġena ta’ attivazzjoni metabolika ma timitax g ħal kollox 
il-kundizzjonijiet  in vivo . Għandha ting ħata attenzjoni wkoll sabiex ji ġu 
evitati kundizzjonijiet li jwasslu g ħal riżultati pożittivi artefattwali li ma 
jirriflettux muta ġeniċità intrinsika, u li jistg ħu joħorġu minn fatturi b ħal 
bidliet ċari fil-pH jew osmolalità, jew permezz ta’ livelli g ħoljin ta’ ċitotos­
siċità (39) (40) (41). Jekk is-sustanza sustanza kimika tat-test to ħloq bidla 
fil-pH tal-mezz fil- ħin taż-żieda, il-pH g ħandu jiġi aġġustat, preferibbilment 
permezz tal-ibbaffjar tas-soluzzjoni tal-istokk sabiex il-volumi kollha 
tal-konċentrazzjonijiet kollha tat-test, u g ħall-kontrolli kollha, jibqg ħu 
l-istess.  
8. Biex wie ħed janalizza l-induzzjoni tal-mikronuklei, huwa essenzjali li 
l-mitożi tkun se ħħet kemm fil-kultivazzjonijiet ittrattati kif ukoll f'dawk 
mhux ittrattati. L-iktar stadju informattiv g ħall-għadd tal-mikronuklei huwa 
f'ċelloli li temmew mito żi waħda waqt jew wara t-trattament bis-sustanza 
tat-test.  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
9. Il-kultivazzjonijiet ta ċ-ċelloli ta’ ori ġini mill-bniedem jew mill-mammiferi 
huma esposti g ħas-sustanza tat-test kemm b'sors e żoġenu ta’ attivazzjoni 
metabolika kif ukoll ming ħajr dan is-sors diment li ma jintu żawx ċelloli 
b'kapaċità metabolizzanti adegwata. Sustanzi kimi ċi simultanji ta’ 
solvent/mezz (VC) u ta’ kontroll po żittiv (PC) huma inklu żi fit-testijiet 
kollha.  
10. Waqt jew wara l-esponiment g ħas-sustanza tat-test, i ċ-ċelloli jitkabbru g ħal 
perjodu suffi ċjenti sabiex il- ħsara fil-kromo żomi jew fil-mag ħżel twassal 
għall-formazzjoni tal-mikronuklei f' ċelloli fl-interfa żi. Għall-induzzjoni 
tal-anewplojdi, is-sustanza tat-test g ħandha normalment tkun pre żenti waqt 
il-mitożi. Ċelloli fl-interfa żi miġbura u mlewna ji ġu analizzati g ħall-preżenza 
ta’ mikronuklei. Idealment, il-mikronuklei g ħandhom jing ħaddu biss f'dawk 
iċ-ċelloli li jkunu temmew il-mito żi waqt l-esponiment g ħas-sustanza tat-test 
jew waqt il-perjodu ta’ wara l-esponiment, jekk jintu ża wieħed. F'kulti ­
vazzjonijiet li ġew ittrattati b'imblokkatur ta ċ-ċitokineżi, dan jinkiseb billi 
jingħaddu biss i ċ-ċelloli b'żewġ nuklei. Fin-nuqqas ta’ imblokkatur ta ċ-ċito­
kineżi, huwa importanti li jintwera li ċ-ċelloli analizzati aktarx li g ħaddew 
mid-diviżjoni taċ-ċelloli waqt jew wara l-esponiment g ħas-sustanza tat-test. 
Għall-protokolli kollha, huwa importanti li jintwera li l-proliferazzjoni ta ċ- 
ċelloli seħħet kemm fil-kultivazzjonijiet ta’ kontroll kif ukoll f'dawk 
ittrattati, u l-grad ta’ ċitotossiċità jew ċitostażi kkawżata mis-sustanza 
tat-test g ħandu jiġi vvalutat fil-kultivazzjonijiet (jew f'kultivazzjonijiet 
paralleli) li jing ħaddu għall-mikronuklei.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
DESKRIZZJONI TAL-ANALI ŻI 
Preparazzjonijiet  
11. Jistg ħu jintużaw limfoċiti primarji kkultivati periferi ċi tad-demm tal-bniedem 
(5) (19) (42) (43) u g ħadd ta’ linji ta’ ċelloli tal-annimali gerriema b ħal 
CHO, V79, CHL/IU, u ċelloli L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) 
(27) (28) (30). L-u żu ta’ linji u tipi o ħrajn ta’ ċelloli għandu jkun i ġġus­
tifikat abba żi tal-prestazzjoni tag ħhom murija fl-anali żi, kif deskritt 
fit-taqsima dwar il-Kriterji ta’ A ċċettazzjoni. Min ħabba li l-frekwenza 
tal-isfond tal-mikronuklei tinfluwenza s-sensittività tal-anali żi, huwa rrak ­
komandat li jintu żaw tipi ta’ ċelloli bi frekwenza ta’ sfond baxxa u 
stabbli ta’ formazzjoni ta’ mikronuklei.  
12. Il-limfo ċiti periferi ċi tad-demm tal-bniedem g ħandhom jinkisbu minn 
individwi żgħażagħ (ta' madwar 18-35 sena), b'sa ħħithom, ma jpejpux u li 
huma mag ħrufa li reċentement ma kinux esposti g ħal sustanzi kimi ċi ġeno­
tossiċi jew għar-radjazzjoni. Jekk jin ġabru ċelloli għall-użu mingħand aktar 
minn donatur wie ħed, l-għadd ta’ donaturi g ħandu jkun spe ċifikat. 
Il-frekwenza tal-mikronuklei ti żdied mal-età u din it-tendenza hija aktar 
ċara fin-nisa milli fl-ir ġiel (44) u dan g ħandu jiġi kkunsidrat fl-g ħażla ta’ 
ċelloli għall-ġbir minn donaturi.  
Il-kundizzjonijiet tal-mezzi u tal-kultivazzjoni  
13. Kundizzjonijiet xierqa tal-mezz ta’ kultivazzjoni u tal-inkubazzjoni (kon ­
tenituri ta’ kultivazzjoni, kon ċentrazzjoni ta’ CO  2 , temperatura, u umdità) 
għandhom jintu żaw għaż-żamma tal-kultivazzjonijiet. Linji u razez ta’ ċelloli 
stabbiliti g ħandhom ji ġu ċċekkjati regolarment g ħall-istabilità tal-g ħadd ta’ 
kromożomi modali u n-nuqqas ta’ kontaminazzjoni ta’ majkopla żma, u ma 
għandhomx jintu żaw jekk ikunu kkontaminati jew jekk l-g ħadd ta’ 
kromożomi modali jkun inbidel. Il- ħin normali ta ċ-ċiklu taċ-ċelloli għall- 
kundizzjonijiet ta’ kultivazzjoni u żati fil-laboratorju tal-ittestjar g ħandu jkun 
magħruf. Jekk jintu ża l-metodu ta’ imblukkar ta ċ-ċitokineżi allura 
l-konċentrazzjoni tal-inibitur ta ċ-ċitokineżi għandha tkun ottimizzata g ħat- 
tip partikolari ta ċ-ċellola u g ħandha tintwera li tipprodu ċi rendiment tajjeb 
ta’ ċelloli b'żewġ nuklei g ħall-għadd. 
Preparazzjoni tal-kultivazzjonijiet  
14. Linji u razez ta’ ċelloli stabbiliti: i ċ-ċelloli jitnisslu minn kultivazzjonijiet 
stokkjati, imqieg ħda fil-mezz ta’ kultivazzjoni f'densità tali li 
l-kultivazzjonijiet ma jil ħqux konfluwenza f'saffi uni ċi, u l-kultivazzjonijiet 
ta’ sospensjoni ma jil ħqux densità e ċċessiva qabel ma jin ġabru, u ji ġu 
inkubati f'temperatura ta’ 37 °C.  
15. Limfo ċiti: demm s ħiħ ittrattat b'antikoagulanti (e ż. eparina), jew limfo ċiti 
separati, huma kkultivati fil-pre żenza ta’ mito ġenu e ż. 
fitoemagglutinina (PHA) qabel l-esponiment g ħas-sustanza tat-test u cytoB.  
Attivazzjoni metabolika  
16. Għandhom jintu żaw sistemi e żoġeni ta’ metabolizzazzjoni meta jintu żaw 
ċelloli b'kapa ċità metabolika endo ġena inadegwata. Is-sistema li tintu ża 
l-aktar hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata b'kofattur (S9) imħejjija mill-fwied ta’ annimali gerriema ttrattati b'sustanzi li jindu ċu 
l-enzimi b ħall-Aroclor 1254 (45) (46) jew kombinazzjoni ta’ fenobarbiton 
u β-naftoflavon (46) (47) (48) (49). Din il-kombinazzjoni ma tmurx kontra 
l-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar il-Pollutanti Organi ċi Persistenti (50) u 
r-Regolament (KE) Nru 850/2004 dwar il-Pollutanti Organi ċi Persistenti (66) 
u ntweriet li hija daqstant effettiva daqs l-Aroclor 1254 g ħall-induzzjoni ta’ 
ossidażi b'funzjoni m ħallta (46) (47) (48) (49). Il-frazzjoni S9 tintu ża norm­
alment f'kon ċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1-10 % (v/v) fil-mezz tat-test 
finali. Il-kundizzjoni ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika tista' tiddependi 
mill-klassi ta’ sustanza kimika li qieg ħda tiġi ttestjata u f' ċerti każijiet jista' 
jkun xieraq li wie ħed juża aktar minn kon ċentrazzjoni wa ħda ta’ S9.
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Linji ta’ ċelloli mfassla ġenetikament li jesprimu enzimi attivanti spe ċifiċi 
tal-bniedem jew tal-annimali gerriema jistg ħu jeliminaw il- ħtieġa ta’ sistema 
ta’ attivazzjoni metabolika e żoġena, u jistg ħu jintużaw bħala ċ-ċelloli 
tat-test. F'dawn il-ka żijiet l-għażla tal-linji ta ċ-ċelloli użati għandha tkun 
iġġustifikata xjentifikament, e ż. skont ir-rilevanza tal-ossida żi b'funzjoni 
mħallta għall-metaboli żmu tas-sustanza tat-test (51), u r-reazzjoni tag ħhom 
għal klastoġeni u anew ġeni magħrufa (ara t-taqsima separata dwar il-Kriterji 
ta’ Aċċettabbiltà). G ħandu jkun rikonoxxut li s-sustanza li qieg ħda tiġi 
ttestjata tista' ma tkunx metabolizzata mill-ossida żi b'funzjoni m ħallta 
espressa; f'dan il-ka ż, ir-riżultati negattivi ma jindikawx li s-sustanza 
tat-test ma tistax tindu ċi mikronuklei.  
Preparazzjoni tas-sustanza tat-test  
18. Sustanzi kimi ċi solidi g ħandhom jin ħallu f'solventi jew mezzi xierqa u 
dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta ċ-ċelloli. Sustanzi kimi ċi 
likwidi jistg ħu jiżdiedu direttament fis-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel 
it-trattament. Gassijiet jew sustanzi kimi ċi volatili g ħandhom ji ġu ttestjati 
permezz ta’ modifikazzjonijiet xierqa g ħall-protokolli standard, b ħat-trat­
tament f'kontenituri ssi ġillati (52) (53). G ħandhom jintu żaw preparazzjonijiet 
friski tas-sustanza tat-test sakemm dejta ta’ stabilità ma turix li jistg ħu 
jinħażnu. 
Kundizzjonijiet tat-test  
Solventi/mezzi  
19. Is-solvent/mezz ma g ħandux jirrea ġixxi mas-sustanza tat-test, jew ikun 
inkompatibbli mas-sopravivenza ta ċ-ċelloli jew ma ż-żamma tal-attività 
tal-S9 fil-kon ċentrazzjoni u żata. Jekk jintu żaw solventi/mezzi o ħrajn 
minflok dawk stabbiliti sew (e ż. ilma, mezz ta’ kultivazzjoni ta ċ-ċelloli, 
sulfossidu tad-dimetil), l-u żu tagħhom għandu jkun appo ġġat minn dejta li 
tindika l-kompatibbiltà tag ħhom mas-sustanza tat-test u n-nuqqas ta’ 
tossiċità ġenetika tag ħhom. Huwa rrakkomandat li, kull fejn ikun possibbli, 
l-ewwel g ħandu jiġi kkunsidrat l-u żu ta’ solvent/mezz likwidu.  
L-użu ta’ cytoB b ħala imblokkatur ta ċ-ċitokineżi 
20. Waħda mill-aktar konsiderazzjonijiet importanti fil-prestazzjoni tal-anali żi 
tal-MNvit hija l-i żgurar li ċ-ċelloli mag ħduda temmew il-mito żi waqt 
it-trattament jew il-perjodu ta’ inkubazzjoni wara t-trattament, jekk jintu ża 
wieħed. CytoB hija s-sustanza li ntu żat l-aktar sabiex timblokka ċ-ċitokineżi 
minħabba li tinibixxi l- ġbir tal-attina, u b'hekk tipprevjeni s-separazzjoni ta ċ- 
ċelloli ġġenerati (daughter cells) wara l-mito żi, li twassal g ħall-formazzjoni 
ta’ ċelloli b'żewġ nuklei (5) (54) (55). L-g ħadd tal-mikronuklei, g ħalhekk, 
jista' jkun illimitat g ħal ċelloli li g ħaddew minn mito żi waqt jew wara 
t-trattament. L-effett tas-sustanza tat-test fuq il-kinetika tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jista' jitkejjel fl-istess ħin. Is-cytoB g ħandu jintu ża bħala 
imblokkatur ta ċ-ċitokineżi meta l-limfo ċiti tal-bniedem jintu żaw minħabba 
li l-ħinijiet taċ-ċikli taċ-
ċelloli jkunu varjabbli f'kultivazzjonijiet u fost 
id-donaturi u min ħabba li mhux il-limfo ċiti kollha jirrea ġixxu għall-PHA. 
Intużaw metodi o ħrajn fl-ittestjar ta’ linji ta’ ċelloli sabiex ji ġi stabbilit jekk 
iċ-ċelloli mag ħduda nqasmux; dawn huma indirizzati hawn ta ħt (ara 
l-paragrafu 26).  
21. Il-kon ċentrazzjoni xierqa ta’ cytoB g ħandha tkun stabbilita mil-laboratorju 
għal kull tip ta’ ċellola sabiex tinkiseb il-frekwenza ottimali ta’ ċelloli 
b'żewġ nuklei fil-kultivazzjonijiet ta’ kontroll fis-solvent/mezz. 
Il-konċentrazzjoni xierqa ta’ cytoB normalment tkun bejn 3 u 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Il-kejl tal-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-g ħażla 
tal-konċentrazzjonijiet ta’ esponiment  
22. Meta wie ħed jiddetermina l-og ħla konċentrazzjoni ta’ sustanza tat-test li 
għandha tkun ittestjata, il-kon ċentrazzjonijiet li g ħandhom il-kapa ċità li 
jipproduċu rispons po żittiv artefattwali, b ħal dawk li jipprodu ċu ċitotossiċità 
eċċessiva, il-pre ċipitazzjoni fil-mezz tal-kultivazzjoni, u bidliet ċari fil-pH 
jew osmolalità (39) (40) (41), g ħandhom ji ġu evitati.  
23. Il-kejl tal-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli jsir sabiex ikun żgurat li ċ-ċelloli ttrattati 
jkunu għaddew minn mito żi waqt l-anali żi u li t-trattamenti jsiru fil-livelli 
xierqa ta’ ċitotossiċità (ara l-Paragrafu 29). I ċ-ċitotossiċità għandha tkun 
stabbilita b'attivazzjoni metabolika jew ming ħajrha f'ċelloli li je ħtieġu 
attivazzjoni metabolika permezz ta ż-żieda relattiva fl-g ħadd taċ- 
ċelloli (RICC) jew irduppjar relattiv tal-popolazzjoni (RPD) (ara 
l-Appendi ċi 2 għall-formoli) sakemm ma tintu żax is-cytoB. Meta tintu ża 
s-cytoB, i ċ-ċitotossiċità tista' tkun stabbilita permezz tal-indi ċi ta’ 
replikazzjoni (RI) (ara Appendi ċi 2 għall-formola).  
24. It-trattament tal-kultivazzjonijiet b'cytoB, u l-kejl tal-frekwenzi relattivi ta’ 
ċelloli b'nukleu wie ħed, żewġ nuklei jew diversi nuklei fil-kultivazzjoni, 
jipprovdi metodu e żatt tal-kwantifikazzjoni tal-effett fuq il-proliferazzjoni 
taċ-ċelloli u l-attività ċitotossika jew ċitostatika ta’ trattament (5), u 
jiżgura li ċelloli li nqasmu waqt jew wara t-trattament biss ji ġu magħduda.  
25. Fi studji b'cytoB, i ċ-ċitostażi/ċitotossiċità tista' ti ġi kkwantifikata mill-indi ċi 
ta’ proliferazzjoni tal-imblokkatur ta ċ-ċitokineżi (CBPI) (5) (26) (56) jew 
tista' tinħareġ mill-RI minn mill-inqas 500 ċellola għal kull kultivazzjoni 
(ara Appendi ċi 2 għall-formuli). Meta s-cytoB jintu ża għall-valutazzjoni 
tal-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli, CBPI jew RI g ħandhom ji ġu stabbiliti minn 
mill-inqas 500 ċellola għal kull kultivazzjoni. Dan il-kejl fost o ħrajn jista' 
jintuża sabiex ti ġi stmata ċ-ċitotossiċità billi jitqabblu l-valuri 
fil-kultivazzjonijiet ittrattati u ta’ kontroll. Il-valutazzjoni ta’ indikaturi 
oħrajn ta’ ċitotossiċità (eż. konfluwenza, g ħadd ta’ ċelloli, apopto żi, 
nekrożi, għadd ta’ metafa żi) tista' tipprovdi informazzjoni utli.  
26. Fi studji ming ħajr cytoB, je ħtieġ li jintwera li ċ-ċelloli mag ħduda 
fil-kultivazzjoni inqasmu waqt jew wara t-trattament bis-sustanza tat-test, 
inkella jistg ħu jiġu prodotti reazzjonijiet negattivi foloz. Metodi li ntu żaw 
sabiex ikun żgurat li ċ-ċelloli maqsuma qeg ħdin jingħaddu jinkludu 
l-inkorporazzjoni u l-individwazzjoni sussegwenti tal-bromodeossiuridina 
(BrdU) g ħall-identifikazzjoni ta’ ċelloli li rreplikaw (57), il-formazzjoni ta’ 
kloni meta ċ-ċelloli minn linji ta’ ċelloli permanenti ji ġu ttrattati u 
magħduda  in situ  fuq slajd tal-mikroskopju (Indi ċi ta’ Proliferazzjoni (PI)) 
(25) (26) (27) (28), jew il-kejl ta’ Rduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) 
jew Żieda Relattiva fl-G ħadd taċ-Ċelloli (RICC) jew metodi o ħrajn ippruvati 
(16) (56) (58) (59) (ara Appendi ċi 2 għall-formoli). Il-valutazzjoni ta’ indi ­
katuri oħrajn għaċ-ċitotossiċità jew ċitostażi (eż. konfluwenza, g ħadd ta’ 
ċelloli, apopto żi, nekrożi, għadd ta’ metafa żi) tista' tipprovdi informazzjoni 
utli. 
27. Għallinqas g ħandhom ji ġu evalwati tliet kon ċentrazzjonijiet ta’ test analiz ­
zabbli. Sabiex jinkiseb dan, jista' jkun me ħtieġ li jsir l-esperiment permezz 
ta’ għadd akbar ta’ kon ċentrazzjonijiet spazjati vi ċin xulxin u li ti ġi 
analizzata l-formulazzjoni ta’ mikronuklei f'dawk il-kon ċentrazzjonijiet li 
jipprovdu l-firxa xierqa ta’ ċitotossiċitajiet. Strate ġija alternattiva hija li 
jsir test preliminari ta’ ċitotossiċità sabiex tonqos il-firxa g ħat-test definittiv.  
28. L-og ħla konċentrazzjoni g ħandha timmira li tipprodu ċi 55 ± 5 % ċitotos­
siċità. Livelli og ħla jistgħu jinduċu ħsara fil-kromo żomi bħala effett 
sekondarju ta’ ċitotossiċità (60). Meta sse ħħ ċitotossiċità, 
il-konċentrazzjonijiet tat-test mag ħżula għandhom ikopru firxa minn dik li 
tipproduċi 55 ± 5 % ċitotossiċità, sa ftit li xejn jew l-ebda ċitotossiċità. ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Jekk ma tkun osservata l-ebda ċitotossiċità jew pre ċipitat, l-og ħla konċen­
trazzjoni tat-test g ħandha tikkorrispondi g ħal 0,01 M, 5 mg/mL jew 5 
μl/mL, skont liema hija l-aktar baxxa. Il-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula 
għall-analiżi għandhom, ġeneralment, ikunu separati minn spazju ta’ mhux 
aktar minn 10. G ħal sustanzi tat-test li juru kurva ta’ kon ċentrazzjoni- 
reazzjoni wieqfa, jista' jkun me ħtieġ li l-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza 
tat-test jiġu spazjati aktar vi ċin xulxin sabiex il-kultivazzjonijiet fil-firxiet 
moderati u baxxi tat-tossi ċità jkunu mag ħduda wkoll.  
30. Meta s-solubbiltà tkun fattur li jillimita, il-kon ċentrazzjoni massima, jekk ma 
tkunx limitata bi ċ-ċitotossiċità, għandha tkun il-kon ċentrazzjoni l-aktar 
baxxa li fiha l-pre ċipitat minimu jkun vi żibbli fil-kultivazzjonijiet, sakemm 
ma jkunx hemm interferenza bl-g ħadd. L-evalwazzjoni tal-pre ċipitazzjoni 
għandha ssir permezz ta’ metodi b ħal mikroskopija ħafifa, l-innutar ta’ 
preċipitat li jippersisti, jew li jidher waqt il-kultivazzjoni (sal-a ħħar 
tat-trattament).  
Kontrolli  
31. Kontrolli simultanji po żittivi u b'solvent/mezz kemm b'attivazzjoni meta ­
bolika kif ukoll ming ħajrha għandhom ikunu inklu żi f'kull esperiment.  
32. PC huma me ħtieġa sabiex juru l-abbiltà ta ċ-ċelloli użati, u l-protokoll 
tat-test, li ji ġu identifikati l-klasto ġeni u l-anew ġeni, u sabiex tkun 
affermata l-kapa ċità metabolika tal-preparazzjoni S9. Il-PC g ħandu juża 
indutturi mag ħrufa ta’ formazzjoni ta’ mikronuklei f'kon ċentrazzjonijiet 
mistennija li jag ħtu żidiet żgħar iżda riprodu ċibbli fuq l-isfond, u li juru 
s-sensittività tas-sistema ta’ ttestjar. Il-kon ċentrazzjonijiet tal-PC g ħandhom 
jintgħażlu b'mod li l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx minnufih lill-qarrej 
l-identità tal-islajds ikkodifikati.  
33. Klasto ġenu li je ħtieġ attivazzjoni metabolika (e ż. ċiklofosfammid; 
benżo[a]piren) g ħandu jintu ża sabiex juri kemm il-kompetenza metabolika 
kif ukoll l-abbiltà tas-sistema tal-ittestjar li tindividwa l-klasto ġeni. PC 
oħrajn jistg ħu jintużaw jekk ikunu ġġustifikati. Min ħabba li ċerti PC li 
jeħtieġu attivazzjoni metabolika jistg ħu jkunu attivi ming ħajr attivazzjoni 
metabolika e żoġena taħt ċerti kundizzjonijiet ta’ trattament jew f' ċerti linji 
ta’ ċelloli, il-ħtieġa għal attivazzjoni metabolika, u l-attività tal-preparazzjoni 
S9, għandha tkun ittestjata fil-linja ta’ ċelloli mag ħżula u 
fil-konċentrazzjonijiet mag ħżula. 
34. Fil-pre żent, l-ebda anew ġen ma huwa mag ħruf li jeħtieġ attivazzjoni meta ­
bolika għall-attività ġenotossika tieg ħu (16). PC a ċċettati bħalissa għall- 
attività anew ġenika huma, pere żempju, kolki ċina u vinblastina. Sustanzi 
kimiċi oħrajn jistg ħu jintużaw jekk jindu ċu mikronuklei biss, jew prim ­
arjament, permezz ta’ attività anew ġenika. Sabiex ti ġi evitata l- ħtieġa għal 
żewġ PC (għall-klastoġeniċità u l-anew ġeniċità) mingħajr attivazzjoni meta ­
bolika, il-kontroll tal-anew ġeniċità jista' jservi b ħala l-PC ming ħajr S9, u 
l-kontroll tal-klasto ġeniċità jista' jintu ża għall-ittestjar tal-adegwatezza 
tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika u żata. PC kemm g ħall-klastoġeniċità 
u l-anewġeniċità għandu jintu ża fiċ-ċelloli li ma je ħtiġux S9. Il-PC issu ġ­ 
ġeriti huma inklu żi fl-Appendi ċi 3. 
35. L-użu ta’ PC relatati mal-klassi tas-sustanzi kimi ċi jista' jiġi kkunsidrat, meta 
jkunu disponibbli sustanzi kimi ċi adattati. Il-PC kollha u żati għandhom 
ikunu xierqa g ħat-tip ta’ ċellola u l-kundizzjonijiet ta’ attivazzjoni.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Kontrolli ta’ solvent/mezz g ħandhom ikunu inklu żi għal kull ħin ta’ ġbir. 
Barra minn hekk, NC mhux ittrattati (neqsin minn solvent/mezz) g ħandhom 
jintużaw ukoll diment li ma jkunx hemm dejta ta’ kontroll storika ppub ­
blikata jew tal-laboratorju li turi li l-ebda effett ġenotossiku jew effett 
dannuż ieħor ma jiġi kkawżat mis-solvent mag ħżul fil-kon ċentrazzjonijiet 
użati. 
PROĊEDURA TAT-TEST  
Skeda tat-Trattament  
37. Sabiex tkun massimizzata l-probabbiltà tal-identifikazzjoni ta’ anew ġenu jew 
klastoġenu li jaġixxu fi stadju spe ċifiku fiċ-ċiklu taċ-ċelloli, huwa importanti 
li għadd suffiċjenti ta’ ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test matul l-istadji 
kollha taċ-ċikli taċ-ċelloli tagħhom. Għalhekk, l-iskeda tat-trattament g ħal- 
linji taċ-ċelloli u l-kulturi ta ċ-ċelloli primarji jistg ħu jvarjaw kemmxejn minn 
dawk għal-limfoċiti, li jitolbu li l-istimulazzjoni mito ġenika tibda ċ-ċiklu 
taċ-ċelloli tagħhom, u dawn huma kkunsidrati fil-Paragrafi 41–43 (16).  
38. Il-konsiderazzjonijiet teoreti ċi, flimkien mal-informazzjoni ppubblikata (18) 
jindikaw li l-ma ġġoranza tal-anew ġeni u l-klasto ġeni ser ji ġu identifikati 
f'perjodu ta’ trattament g ħal żmien qasir ta’ 3 sa 6 sig ħat fil-preżenza u 
fin-nuqqas ta’ S9, segwiti mit-tne ħħija tas-sustanza tat-test u perjodu ta’ 
tkabbir ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli (6). G ħandhom jittie ħdu kampjuni ta ċ- 
ċelloli fi żmien ekwivalenti g ħal madwar 1,5–2,0 darba aktar mit-tul normali 
taċ-ċiklu taċ-ċelloli ( i.e. mhux ittrattati) wara l-bidu jew wara t-tmiem 
tat-trattament (Ara t-Tabella 1). Il-perjodi tat-te ħid tal-kampjuni jew 
tal-irkupru jistg ħu jiġu estiżi jekk ikun mag ħruf jew suspettat li s-sustanza 
tat-test taffettwa l-perjodu ċikliku taċ-ċelloli ( pereżempju  meta jiġu ttestjati 
l-analogi nukleo żidi). 
39. Minħabba ċ-ċitotossiċità potenzjali tal-preparazzjonijiet tal-S9 g ħaċ-ċelloli 
mammiferi kkultivati, trattament ta’ esponiment esti ż ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ 
ċelloli normali jintu ża biss fin-nuqqas ta’ S9. Fit-trattament esti ż, jiġu offruti 
għażliet biex jippermettu t-trattament ta ċ-ċelloli bis-sustanza kimika tat-test 
fin-nuqqas jew fil-pre żenza ta’ cytoB. Dawn l-g ħażliet jindirizzaw 
is-sitwazzjonijiet li jista' jkun hemm t ħassib dwarhom fir-rigward 
tal-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza tat-test u s-cytoB.  
40. L-iskedi ssu ġġeriti għat-trattament ta ċ-ċelloli huma ppre żentati fit-Tabella 1. 
Dawn l-iskedi ta’ trattament ġenerali jistg ħu jiġu mmodifikati skont 
l-istabilità jew ir-reattività tas-sustanza tat-test jew il-karatteristi ċi ta’ 
tkabbir partikolari ta ċ-ċelloli li jkunu qeg ħdin jintu żaw. It-trattamenti 
kollha għandhom jibdew u jintemmu waqt li ċ-ċelloli jkunu qeg ħdin 
jikbru b'mod esponenzjali. Dawn l-iskedi huma ppre żentati f'aktar dettall 
fil-paragrafi 41–47 li ġejjin.  
Tabella 1  
It-trattament ta ċ-ċelloli u l-perjodi tal- ħsad għall-analiżi tal-Mnvit  
Limfoċiti, ċelloli primarji u linji ta’ ċelloli 
ttrattati b'cytoB + S9 Trattament g ħal 3–6 sig ħat fil-preżenza ta’ S9; 
tneħħija tal-S9 u l-mezz tat-trattament; 
żieda ta’ mezz frisk u cytoB; 
ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar 
tard. 
– S9 
Esponiment qasir Trattament g ħal 3–6 sig ħat; 
tneħħija tal-mezz tat-trattament; 
żieda ta’ mezz frisk u cytoB; 
ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar 
tard. ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Esponiment esti ż Għażla A:  Trattament g ħal 1,5–2,0 ċikli ta’ 
ċelloli normali fil-pre żenza tas-cytoB; 
ħsad fi tmiem il-perjodu tal-esponiment.  
Għażla B:  Trattament g ħal 1,5–2,0 ċikli ta’ 
ċelloli normali; 
tneħħija tas-sustanza tat-test; 
żieda ta’ mezz frisk u cytoB; 
ħsad ta’ 1,5–2,0 ċikli ta’ ċelloli normali aktar 
tard. 
Linji ta’ ċelloli ttrattati ming ħajr cytoB 
(Identiċi għall-iskedi tat-trattament deskritti hawn fuq bl-e ċċezzjoni li ma ti żdied ebda cytoB)  
Limfoċiti, ċelloli primarji u linji ta’ ċelloli b'cytoB  
41. Għal-limfoċiti, l-aktar appro ċċ effiċjenti huwa li l-esponiment g ħas-sustanza 
tat-test jinbeda f'44-48 sieg ħa wara l-istimulazzjoni tal-PHA, meta tkun 
telqet is-sinkronizzazzjoni ta ċ-ċiklu (5). Fl-anali żi inizjali, i ċ-ċelloli jiġu 
ttrattati g ħal 3 sa 6 sig ħat bis-sustanza tat-test fin-nuqqas jew fil-pre żenza 
ta’ S9. Il-mezz tat-trattament jitne ħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk li jkun fih 
is-cytoB, u ċ-ċelloli jittie ħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali.  
42. Jekk i ż-żewġ testijiet inizjali tat-trattament qasir (3–6 sig ħat) ikunu negattivi 
jew ekwivo ċi, għandu jintu ża trattament ta’ esponiment esti ż sussegwenti 
mingħajr S9. Hemm żewġ għażliet ta’ trattament li huma disponibbli u 
ugwalment a ċċettabbli. Madankollu, jista' jkun aktar xieraq li ti ġi segwita 
l-Għażla A għal limfoċiti stimulati fejn it-tkabbir esponenzjali jista' jkun 
qiegħed jonqos f'96 sieg ħa wara l-istimulazzjoni. Barra minn hekk, 
il-kulturi ta ċ-ċelloli ma g ħandhomx ikunu la ħqu konfluwenza sal-perjodu 
finali tat-te ħid tal-kampjuni fl-G ħażla B.  
— Għażla A: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test g ħal 1,5–2,0 ċikli 
taċ-ċelloli normali, u jittie ħdu fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament,  
— Għażla B: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test g ħal 1,5–2,0 ċikli 
taċ-ċelloli normali. Il-mezz tat-trattament jitne ħħa u jiġi sostitwit b'mezz 
frisk, u ċ-ċelloli jittie ħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali 
addizzjonali.  
43. Iċ-ċelloli primarji u l-linji ta ċ-ċelloli għandhom ji ġu ttrattati b'mod simili 
għal-limfoċiti, ħlief li mhuwiex ne ċessarju li dawn ji ġu stimulati b'PHA g ħal 
44–48 sieg ħa. Ċelloli oħrajn minbarra l-limfo ċiti għandhom ikunu esposti 
b'tali mod li fi ż-żmien tat-terminazzjoni tal-istudju, i ċ-ċelloli jkunu g ħadhom 
fil-fażi msejħa “log-phase growth”.  
Linji ta’ ċelloli ming ħajr cytoB  
44. Iċ-ċelloli għandhom ji ġu ttrattati g ħal 3 sa 6 sig ħat fil-preżenza u fin-nuqqas 
ta’ S9. Il-mezz tat-trattament jitne ħħa u jiġi sostitwit b'mezz frisk, u ċ-ċelloli 
jittieħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Jekk i ż-żewġ testijiet inizjali tat-trattament qasir (3–6 sig ħat) ikunu negattivi 
jew ekwivo ċi, għandu jintu ża trattament ta’ esponiment esti ż sussegwenti 
(mingħajr S9). Hemm żewġ għażliet ta’ trattament li huma disponibbli, li 
t-tnejn huma ugwalment a ċċettabbli:  
— Għażla A: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test g ħal 1,5–2,0 ċikli 
taċ-ċelloli normali, u jittie ħdu fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament.  
— Għażla B: Iċ-ċelloli jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test g ħal 1,5–2,0 ċikli 
taċ-ċelloli normali. Il-mezz tat-trattament jitne ħħa u jiġi sostitwit b'mezz 
frisk, u ċ-ċelloli jittie ħdu wara 1,5–2,0 ċikli taċ-ċelloli normali 
addizzjonali.  
46. Fil-monosaffi, i ċ-ċelloli mitoti ċi (identifikabbli b ħala li huma tondi u 
maqlugħa mill-wi ċċ) jistgħu jkunu pre żenti fl-aħħar tat-trattament ta’ bejn 
3 u 6 sig ħat. Minħabba li dawn i ċ-ċelloli mitoti ċi jistgħu jinqalg ħu 
faċilment, huma jistg ħu jintilfu meta jitne ħħa l-mezz li jkun fih 
is-sustanza tat-test. G ħandha ting ħata attenzjoni g ħall-ġbir ta’ dawn meta 
jinħaslu l-kulturi, u li dawn ji ġu rritornati fil-kulturi, sabiex ji ġi evitat li 
jintilfu ċelloli li jkunu f'mito żi, u li jkunu f'riskju g ħal mikronuklei, fi ż- 
żmien tal-ħsad. 
L-għadd ta’ kulturi  
47. Għandhom jintu żaw kulturi doppji g ħal kull kon ċentrazzjoni tas-sustanza 
tat-test u g ħall-mezz/solvent u l-kulturi NC. Fejn tkun tista' tintwera 
varjazzjoni minima bejn il-kulturi doppji mill-informazzjoni storika 
tal-laboratorju, jista' jkun a ċċettabbli li jintu żaw kulturi singoli. Jekk 
jintużaw kulturi singoli, huwa rakkomandat li ji ġi analizzat g ħadd akbar 
ta’ konċentrazzjonijiet.  
Il-ħsad taċ-ċelloli u l-preparazzjoni tal-lametti  
48. Kull kultura ti ġi maħsuda u ppro ċessata separatament. Il-preparazzjoni ta ċ- 
ċelloli tista' tinvolvi trattament ipotoniku, i żda dan il-pass mhuwiex 
neċessarju jekk jinkiseb tifrix adegwat ta ċ-ċelloli b'mod ie ħor. Jistgħu 
jintużaw tekniki differenti fil-preparazzjoni tal-lametti sakemm jinkisbu 
preparazzjonijiet ta ċ-ċelloli ta’ kwalità g ħolja għall-għoti tal-punti. I ċ-ċito­
plasma ta ċ-ċelloli għandha tin żamm sabiex tkun tista' ssir l-iskoperta 
tal-mikronuklei u l-identifikazzjoni affidabbli (fil-metodu cytokinesis-block) ta ċ-ċelloli binukleati.
 
49. Il-lametti jistg ħu jingħataw il-kulur bl-u żu ta’ metodi varji, b ħal Giemsa jew 
żebgħat speċifiċi fluworexxenti tad-DNA (59). L-u żu ta’ kulur spe ċifiku ta’ 
DNA ( pereżempju  oranġjo akridin (61) jew Hoechst 33255 plus pyronin-Y 
(62)) jista' jelimina xi w ħud mill-prodotti asso ċjati mal-u żu ta’ kulur 
speċifiku mhux ta’ DNA. L-antikorpi antikinetokor, FISH bi probes pan ċen­
tromeriċi tad-DNA, jew it-tikkettar primed  in situ  bi primers spe ċifiċi 
panċentromeri ċi, flimkien ma’ counterstaining xieraq tad-DNA, jistg ħu 
jintużaw biex jidentifikaw il-kontenuti (kromo żomi/framment 
tal-kromo żomi) tal-mikronuklei jekk l-informazzjoni mekkanistika dwar 
il-formazzjoni tag ħhom tkun ta’ interess (15)(16). Jistg ħu jintużaw metodi 
oħrajn għal divrenzjar bejn il-klasto ġeni u l-anew ġeni jekk dawn ikunu 
wrew li huma effettivi.  
Analiżi 
50. Il-lametti kollha, inklu żi dawk tas-solvent/mezz u l-kontrolli, g ħandhom 
ikunu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-anali żi mikroskopika. Inkella, 
il-kampjuni kkodifikati jistg ħu jiġu analizzati bl-u żu ta’ sistema vvalidata u 
awtomatizzata ta’ anali żi tal-imma ġini jew ta’ anali żi tal-fluss ċitometriku.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. Fil-kulturi ttrattati b'cytoB, il-frekwenzi mikronuklei g ħandhom ji ġu 
analizzati mill-inqas f'2 000 ċellola binukleata g ħal kull kon ċentrazzjoni 
(mill-inqas 1 000 ċellola binukleata g ħal kull kultura; żewġ kulturi g ħal 
kull konċentrazzjoni). Jekk jintu żaw kulturi singoli, g ħandhom jing ħaddu 
mill-inqas 2 000 ċellola binukleata g ħal kull kon ċentrazzjoni minn dik 
il-kultura. Jekk g ħall-għoti tal-punti f'kull kon ċentrazzjoni jkunu disponibbli 
sostanzjalment inqas minn 1 000 ċellola binukleata g ħal kull kultura, jew 
2 000 f'ka ż li tintuża kultura singola, u jekk ma ti ġi osservata ebda żieda 
sinifikanti fil-mikronuklei, it-test g ħandu jiġi ripetut bl-u żu ta’ aktar ċelloli, 
jew f'kon ċentrazzjonijiet inqas tossi ċi, skont xi jkun l-aktar xieraq. G ħandha 
tingħata attenzjoni sabiex ma jing ħaddux ċelloli binukleati b'forom irregolari 
jew fejn i ż-żewġ nuklei jkunu jvarjaw ħafna fid-daqs; lanqas ma g ħandhom 
iċ-ċelloli binukleati ji ġu mħawdin ma ċ-ċelloli multinukleati mifruxa ħażin. 
Ċelloli li jkun fihom aktar minn żewġ nuklei ewlenin ma g ħandhomx ji ġu 
analizzati g ħall-mikronuklei, min ħabba li l-frekwenza ba żika 
tal-mikronukleu tista' tkun og ħla f'dawn i ċ-ċelloli (63) (64) L-g ħadd taċ- 
ċelloli mononukleati huwa a ċċettabbli jekk is-sustanza tat-test turi li tinter ­
ferixxi mal-attività tas-cytoB.  
52. Fil-linji ta’ ċelloli analizzati ming ħajr trattament tas-cytoB, il-mikronuklei 
għandhom jing ħaddu mill-inqas f'2 000 ċellola għal kull kon ċentrazzjoni 
(mill-inqas 1 000 ċellola għal kull kultura; żewġ kulturi g ħal kull kon ċen­
trazzjoni). Fejn tintu ża kultura wa ħda biss g ħal kull kon ċentrazzjoni, 
għandhom jing ħaddu mill-inqas 2 000 ċellola minn dik il-kultura.  
53. Meta tintu ża s-cytoB, g ħandhom ji ġu stabbiliti CBPI jew RI sabiex ti ġi 
vvalutata l-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli (ara l-Appendi ċi 2) bl-u żu ta’ 
mill-inqas 500 ċellola għal kull kultura. Meta t-trattamenti jitwettqu 
fin-nuqqas ta’ cytoB, huwa essenzjali li ti ġi pprovduta evidenza li ċ- 
ċelloli li jkunu qeg ħdin jingħaddu għaddew minn proliferazzjoni, kif 
diskuss fil-Paragrafi 24-27.  
Kriterji ta’ a ċċettabilità  
54. Laboratorju li jipproponi li ju ża l-analiżi tal-MNvit deskritta fit-TM g ħandu 
juri l-kapa ċità tiegħu li josserva b'mod affidabbli u pre ċiż sustanzi kimi ċi ta’ 
attività anew ġenika u klasto ġenika mag ħrufa, b'attivazzjoni metabolika u 
mingħajrha, kif ukoll sustanzi kimi ċi negattivi, bl-u żu tas-sustanzi kimi ċi 
ta’ referenza fl-Appendi ċi 3. Bħala evidenza tal-abbiltà tieg ħu li jwettaq 
dan it-TM b'mod korrett, il-laboratorju g ħandu jipprovdi evidenza li ċ- 
ċelloli li jkunu qeg ħdin jingħaddu għal formazzjoni mikronuklea jkunu 
temmew divi żjoni nukleari wa ħda jekk it-test jitwettaq ming ħajr l-użu ta’ 
cytoB.  
55. Is-sustanzi kimi ċi fl-Appendi ċi 3 huma rrakkomandati biex jintu żaw bħala 
sustanzi kimi ċi ta’ referenza. Jistg ħu jiġu inklużi sustanzi kimi ċi sostituti jew 
addizzjonali jekk l-attività tag ħhom tkun mag ħrufa u jekk jindu ċu mikro­
nuklei permezz tal-istess mekkani żmi ta’ azzjoni, u jekk dawn juru li huma 
rilevanti g ħas-sustanzi kimi ċi li għandhom ji ġu ttestjati bl-u żu tal-proċedura 
MNvit. Ġustifikazzjoni tista' tinkludi studju ta’ validazzjoni li japplika 
varjetà wiesg ħa ta’ sustanzi jew iffokat fuq spettru idjaq ibba żat fuq 
il-klassi kimika tas-sustanza tat-test jew il-mekkani żmu ta’ dannu li jkun 
qiegħed jiġi studjat.  
56. Il-kontroll tas-solvent/mezz u l-kulturi mhux ittrattati g ħandhom jag ħtu 
frekwenzi ta’ mikronuklei konsistenti u riprodu ċibbilment baxxi (tipikament 
5-25 mikronukleu/1 000 ċellola għat-tipi taċ-ċelloli identifikati fil-paragrafu 
11). Tipi o ħrajn ta’ ċelloli jista' jkollhom firxiet differenti ta’ reazzjonijiet li 
għandhom ji ġu stabbiliti meta ji ġu vvalidati biex jintu żaw fl-anali żi 
tal-MNvit. L-informazzjoni minn kontroll negattiv, solvent u PC g ħandha 
tintuża biex tistabbilixxi l-firxiet tal-kontroll storiku. Dawn il-valuri 
għandhom jintu żaw sabiex ti ġi deċiża l-adegwatezza tal-NC/PC simultanju 
għal esperiment.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Jekk g ħall-analiżi jiġu proposti bidliet żgħar fil-protokoll ( eż. l-użu ta’ 
tekniki ta’ g ħoti ta’ punti awtomatizzati minflok manwali; l-u żu ta’ tip ta’ 
ċellola ġdida) l-effika ċja tal-bidla g ħandha tintwera qabel ma l-protokoll 
immodifikat ikun jista' jitqies b ħala aċċettabbli biex jintu ża. It-turija 
tal-effikaċja tinkludi dimostrazzjoni li jistg ħu jiġu osservati l-mekkani żmi 
ewlenin tal-ksur tal-kromo żomi u l-ksib jew it-telf tag ħhom, u li jistg ħu 
jinkisbu ri żultati pożittivi u negattivi xierqa g ħall-klassi tas-sustanza indi ­
vidwali, jew il-firxa wiesg ħa ta’ sustanzi, li g ħandhom ji ġu ttestjati.  
INFORMAZZJONI U RAPPURTAR  
It-trattament tar-ri żultati  
58. Jekk tintu ża t-teknika cytokinesis-block, huma biss il-frekwenzi ta ċ-ċelloli 
binukleati b'mikronuklei (indipendenti mill-g ħadd ta’ mikronuklei g ħal kull 
ċellola) li g ħandhom jintu żaw fl-evalwazzjoni tal-induzzjoni tal-mikronuklei. 
L-għadd tan-numri ta’ ċelloli b'mikronuklea wa ħda, b'żewġ mikronuklei jew 
b'aktar mikronuklei jista' jipprovdi informazzjoni utli, i żda mhuwiex obbli ­
gatorju.  
59. Għandhom ji ġu stabbiliti mi żuri simultanji ta’ ċitotossiċità u/jew ċitostażi 
għall-kulturi kollha ttrattati jew ta’ kontroll tas-solvent/mezz (58). Is-CBPI 
jew l-RI g ħandhom ji ġu kkalkolati g ħall-kulturi kollha ttrattati u ta’ kontroll 
bħala kejl tad-dewmien ta ċ-ċiklu taċ-ċelloli meta jintu ża l-metodu 
cytokinesis-block. Fin-nuqqas ta’ cytoB, g ħandhom jintu żaw l-RPD, 
l-RICC jew il-PI (ara l-Appendi ċi 2). 
60. Għandha tiġi pprovduta informazzjoni dwar il-kultura individwali. Barra 
minn hekk, l-informazzjoni kollha g ħandha tin ġabar fil-qosor f'forma ta’ 
tabella.  
61. Sustanzi kimi ċi li jinduċu mikronuklei fl-anali żi tal-MNvit jistg ħu jagħmlu 
dan minħabba li jindu ċu ksur tal-kromo żomi, telf tal-kromo żomi jew kombi ­
nazzjoni tat-tnejn. Tista' tintu ża analiżi ulterjuri li tu ża antikorpi antikine ­
tokor, ċentromeri spe ċifiċi fi probes  in situ  jew metodi o ħrajn sabiex ji ġi 
stabbilit jekk il-mekkani żmu tal-induzzjoni tal-mikronuklei huwiex dovut 
għal attività klasto ġenika u/jew anew ġenika.  
Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
62. Ma hemm ebda ħtieġa għal verifika permezz ta’ ttestjar addizzjonali ta’ 
reazzjoni po żittiva jew negattiva ċara. Ir-riżultati ekwivo ċi jistgħu jiġu kkja­
rifikati permezz ta’ anali żi ta’ 1 000 ċellola oħra mill-kulturi kollha sabiex 
jiġi evitat it-telf tal-blinding. Jekk dan l-appro ċċ ma jsolvix ir-ri żultat, ikunu 
jridu jsiru aktar testijiet. Il-modifika tal-parametri ta’ studju fuq firxa 
wiesgħa jew dejqa ta’ kondizzjonijiet, kif xieraq, g ħandha tiġi kkunsidrata 
fl-esperimenti ta’ segwitu. Il-parametri ta’ studju li jistg ħu jiġu mmodifikati 
jinkludu l-ispazjar tal-kon ċentrazzjoni tat-test, l-g ħażla taż-żmien 
tat-trattament u l- ħsad taċ-ċelloli, u/jew il-kondizzjonijiet tal-attivazzjoni 
metabolika.  
63. Hemm bosta kriterji biex ji ġi stabbilit ri żultat pożittiv, bħal ma hija żieda 
relatata mal-kon ċentrazzjoni jew żieda statistikament sinifikanti fl-g ħadd ta’ 
ċelloli li fihom mikronuklei. L-ewwel g ħandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza 
bijoloġika tar-riżultati. Il-konsiderazzjoni ta’ jekk il-valuri osservati humiex 
fi ħdan jew barra l-firxa ta’ kontroll storiku tista' tipprovdi gwida 
fl-evalwazzjoni tas-sinifikat bijolo ġiku tar-reazzjoni. B ħala għajnuna 
fil-valutazzjoni tar-ri żultati tat-testijiet (65) jistg ħu jintużaw metodi ta’ stat ­
istika. Madankollu, ir-ri żultati tat-testijiet statisti ċi għandhom ji ġu vvalutati 
fir-rigward tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni. Fatturi o ħrajn li 
għandhom ji ġu kkunsidrati huma r-riprodu ċibbiltà u l-informazzjoni storika.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Għalkemm kwa żi l-esperimenti kollha jag ħtu riżultati ċari pożittivi jew 
negattivi, f'ka żijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir 
ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-reazzjonijiet 
jistgħu jibqgħu ekwivo ċi jew inċerti irrispettivament mill-g ħadd ta’ drabi 
li jkun ripetut l-esperiment.  
65. Ir-riżultati pożittivi mill-anali żi tal-MNvit jindikaw li s-sustanza tat-test 
toħloq ksur tal-kromo żomi jew telf tal-kromo żomi fiċ-ċelloli mammiferi 
kkulturati. Ir-ri żultati negattivi jindikaw li, ta ħt il-kondizzjonijiet tat-test 
użati, is-sustanza tat-test ma to ħloq ebda ksur tal-kromo żomi u/jew ksib 
jew telf ta’ ċelloli mammiferi kkulturati.  
Rapport tat-Test  
66. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi mill-inqas l-informazzjoni li ġejja, jekk 
tkun rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju:  
Sustanza kimika tat-test  
— informazzjoni dwar l-identifikazzjoni u n-Numru tar-Re ġistru 
tal-Chemical Abstract Services (CAS) u n-Numru tal-KE,  
— in-natura u l-purità fi żika, 
— il-karatteristi ċi fiżikokimiċi rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju,  
— ir-reattività tas-sustanza kimika tat-test mas-solvent/mezz jew il-mezzi 
tal-kultura ta ċ-ċelloli,  
Solvent/Mezz  
— ġustifikazzjoni g ħall-għażla tas-solvent/tal-mezz,  
— is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/fil-mezz,  
Ċelloli  
— it-tip u s-sors ta ċ-ċelloli użati, 
— l-adattabilità tat-tip ta’ ċelloli użati, 
— in-nuqqas ta’ majkoplasma, jekk applikabbli,  
— informazzjoni dwar it-tul ta ċ-ċiklu taċ-ċelloli, l-irduppjar ta ż-żmien jew 
l-indiċi tal-proliferazzjoni,  
— fejn jintu żaw limfo ċiti, is-sess, l-età u l-g ħadd ta’ donaturi tad-demm, 
jekk applikabbli,  
— fejn jintu żaw limfo ċiti, jekk id-demm s ħiħ jew il-limfo ċiti separati 
humiex esposti,  
— l-għadd ta’ passa ġġi, jekk applikabbli,  
— il-metodi u żati għall-manutenzjoni tal-kulturi ta ċ-ċelloli, jekk applik ­
abbli;  
— in-numru modali tal-kromo żomi, 
— iż-żmien normali ta ċ-ċiklu taċ-ċelloli (kontroll negattiv),  
Kondizzjonijiet tat-Test  
— l-identità ta ċ-ċitokineżi li timblokka s-sustanza (e ż. cytoB), jekk tintu ża, 
u l-konċentrazzjoni tag ħha, flimkien mat-tul tal-esponiment ta ċ-ċelloli,  
— ir-raġuni għall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet u l-g ħadd ta’ kulturi, inklu żi 
informazzjoni dwar i ċ-ċitotossiċità u l-limitazzjonijiet tas-solubilità, jekk 
ikunu disponibbli,  
— il-kompo żizzjoni tal-mezzi, il-kon ċentrazzjoni tas-CO  2 , jekk applikabbli,  
— il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— il-kon ċentrazzjoni (u/jew il-volum) tal-mezz u s-sustanza tat-test 
miżjuda,  
— it-temperatura u l- ħin tal-inkubazzjoni,  
— it-tul tat-trattament,  
— il-ħin tal-ħsad wara t-trattament,  
— id-densità ta ċ-ċelloli waqt l-injettar, jekk applikabbli,  
— it-tip u l-kompo żizzjoni tas-sistema tal-attivazzjoni metabolika, inklu żi 
l-kriterji tal-a ċċettabilità,  
— is-sustanzi kimi ċi ta’ kontroll po żittiv u l-kontrolli negattivi,  
— il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti u t-teknika u żata għall-għoti 
tal-kulur,  
— il-kriterji g ħall-identifikazzjoni tal-mikronuklei,  
— l-għadd ta’ ċelloli analizzati,  
— il-metodi g ħall-kejl ta ċ-ċitotossiċità, 
— kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti g ħaċ-ċitotossiċità, 
— il-kriterji sabiex l-istudji jitqiesu b ħala pożittivi, negattivi jew ekwivo ċi, 
— il-metodu/i tal-anali żi statistika u żata, 
— il-metodi, b ħall-użu ta’ antikorp kinetochore, sabiex jikkaratterizzaw 
jekk il-mikronuklei fihomx kromo żomi sħaħ jew frammentati, jekk 
applikabbli,  
Ir-riżultati  
— il-kejl ta ċ-ċitotossiċità użata, eż. CBPI jew RI fil-ka ż tal-metodu 
cytokinesis-block; RICC, RPD jew PI meta ma jintu żawx il-metodi ta’ 
cytokinesis-block; osservazzjonijiet o ħrajn meta applikabbli,  eż. 
konfluwenza ta ċ-ċelloli, apopto żi, nekro żi, l-għadd tal-metafa żi, 
il-frekwenza ta ċ-ċelloli binukleati,  
— sinjali ta’ pre ċipitazzjoni,  
— informazzjoni dwar il-pH u l-osmolalità tal-mezz tat-trattament, jekk 
ikun stabbilit,  
— definizzjoni ta ċ-ċelloli aċċettabbli g ħall-analiżi, 
— id-distribuzzjoni ta ċ-ċelloli mononukleati, binukleati u multinukleati jekk 
jintuża l-metodu cytokinesis-block,  
— l-għadd ta’ ċelloli b'mikronuklei mog ħtija separatament g ħal kull kultura 
ttrattata u kkontrollata, u jekk hux minn ċelloli binukleati jew mono ­
nukleati, fejn xieraq,  
— ir-relazzjoni bejn il-kon ċentrazzjoni u r-reazzjoni, fejn possibbli,  
— informazzjoni kimika simultanja (kon ċentrazzjonijiet u solventi) dwar 
il-kontroll negattiv (solvent/mezz) u po żittiv, 
— informazzjoni kimika storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u 
pożittiv, bil-meded, il-mezzi u l-intervall standard ta’ devjazzjoni u 
kunfidenza ( eż. 95 %),  
— analiżi statistika; il-valuri p, jekk ikun hemm.  
Diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjonijiet  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LETTERATURA  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4.  
(2) Parry, J.M. u Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15.  
(3) Fenech, M. u Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the 
micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246.  
(4) Kirsch–Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. u Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084–1104.  
(6) Fenech, M. u Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method 
in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose X-irradiation,  
Mutation Res. , 161, 193–198.  
(7) Eastmond, D.A. u Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43.
 
(8) Eastmond, D.A. u Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. u Adler, I.D. (1991), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. u Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence  
in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked 
mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. u Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and 
micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. u Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. u Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes 
following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using 
multicolor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation 
Res., 322, 9–20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. u Bentley, K.S. (1996), Fluor ­
escence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric 
probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233–245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. u Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211–219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. u Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus assay 
working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Linja 
Gwida tat-Test Nru 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, 
OECD, Pari ġi. Disponibbli fuq: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
u Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13–36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on 
the in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 
88–124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. u Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, 
V. Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. u Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. u Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. u Madle, 
S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM Working 
Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. u Madle, S. (1999), Chemically 
induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. u Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. u Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells — results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. u Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  in 
vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  
Mutation Res. , 517, 123–134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. u 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., u Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collab ­
orative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1–152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16–17 ta’ Novembru 2006, Disponibbli fuq: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Disponibbli fuq: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. u Sofuni, 
T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 
347, 105–115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. u Knas ­
meuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepatoma 
(HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. u Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. u Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70.  
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. u Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  
Mutation Res. , 257, 147–205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. u Okumura, K. (1992), Clastogenicity of 
low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297–305.  
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886.  
(42) Fenech, M. u Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., 
Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., 
Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. u Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international ba żi tad-dejta comparison for 
results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lympho ­
cytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on 
the frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. u Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. u Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55–65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. u Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. u Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic 
Activation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. u Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. u Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Disponibbli fuq: [http:// 
www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. u Parry, J.M. (1996), An investigation 
into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. u McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT 
Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, 
R.R., Costa, D.L. u Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne 
Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. u Brooks, A.L. (1983), Evaluation of 
an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. Muta ­
genesis  5, 795–801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a 
detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., u Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  in 
vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  
Mutation Res. , 521, 103–112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. u Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97–100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. u Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay 
in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. u Kirkland, D. (2008), Comparison of 
different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. u Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., u Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., u Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluor ­
escent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 u Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. u Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine 
orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation Res. , 120, 
241–247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. u 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymp ­
hocyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. u Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus test,  
In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow 
(ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467.  
(66) Ir-Regolament (KE) Nru 850/2004 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tad-29 ta’ April 2004 dwar pollutanti organi ċi persistenti u li jemenda 
d-Direttiva 79/117/KEE, ĠU L 229, 30.4.2004, p. 5.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Appendiċi 1 
Definizzjonijiet  
Anewġenu: kwalunkwe sustanza jew pro ċess li, meta jintera ġġixxu 
mal-komponenti ta ċ-ċiklu tad-divi żjoni taċ-ċellola mitotika u mejotika, iwasslu 
għal anewplojdija f’ ċelloli jew organi żmi. 
Anewplojdija:  kwalunkwe devjazzjoni mill-g ħadd ta’ diplojdi (jew aplojdi) 
normali ta’ kromo żomi minn kromo żomu wie ħed jew minn aktar minn 
kromożomu wieħed, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta’ kromo żomi (poli ­
plojdija).  
Apoptożi: mewta ta ċ-ċelloli kkaratterizzati minn serje ta’ passi li jwasslu g ħal 
diżintegrazzjoni ta ċ-ċelloli fil-partikoli mwa ħħlin mal-membrana li ji ġu mbagħad 
eliminati permezz ta’ fago ċitożi jew permezz ta’ tixrid.  
Proliferazzjoni ta ċ-ċelloli:  żieda fl-għadd ta’ ċelloli bħala riżultat ta’ divi żjoni 
mitotika ta ċ-ċelloli.  
Ċentromer:  reġjun tad-DNA ta’ kromo żomu wie ħed fejn i ż-żewġ kromatidi 
jinżammu flimkien u li fuqu hemm imwa ħħlin ġenb ma’ ġenb iż-żewġ kine­
tokori.  
Klastoġen: kull sustanza jew pro ċess li tikkaw ża aberrazzjonijiet kromosomali 
strutturali fil-popolazzjoni ta’ ċelloli jew organi żmi. 
Ċitokineżi: il-proċess ta’ divi żjoni taċ-ċelloli minnufih wara mito żi sabiex 
jifforma żewġ ċelloli żgħar, fejn kull wa ħda jkun fiha nukleu wie ħed. 
Indiċi ta’ Proliferazzjoni Blokk ta ċ-Ċitokineżi (Cytokinesis-Block Proliferation 
index (CBPI)):  il-proporzjon ta’ ċelloli tat-tieni divi żjoni fil-popolazzjoni 
ttrattata fir-rigward tal-kontroll mhux ittrattat (ara Appendi ċi 2 għall-formula).  
Ċitostażi: inibizzjoni tat-tkabbir ta ċ-ċelloli (ara Appendi ċi 2 għall-formula).  
Ċitotossiċità: effetti ta’ ħsara għall-istruttura jew g ħall-funzjoni ta ċ-ċelloli, li 
fl-aħħar mill-aħħar jikkaw żaw il-mewta ta ċ-ċelloli.  
Ġenotossiċità: terminu ġenerali li jinkludi kull tip ta’ ħsara fid-DNA jew 
kromożoma, inklu ż ksur, riarran ġamenti tal-adduttorji, mutazzjonijiet, aber ­
razzjonijiet tal-kromo żomi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta’ effetti ġeno­
tossiċi jirriżultaw f’mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromo żomi stabbli.  
Ċelloli interfa żi: ċelloli li mhumiex fil-fa żi mitotika.  
Kinetochore:  struttura li fiha l-proteini li ting ħaqad fiċ-ċentromer ta’ kromo żoma 
fejn il-fibri “spindle” jasso ċjaw waqt id-divi żjoni taċ-ċelloli, u dan jippermetti 
moviment ordnat tal-kromo żomi li jfaqqsu (daughter chromosomes) g ħall-poli 
taċ-ċelloli li jfaqqsu (daughter cells).  
Mikronuklei:  nuklei żgħar, separati minn u addizzjonali g ħan-nuklei prin ċipali ta’ 
ċelloli, prodotti waqt it-telofa żi ta’ mito żi jew mejo żi permezz frammenti ta’ 
kromożomi li jibqa’ jew kromo żomi sħaħ. 
Mitożi: diviżjoni tan-nukleu ta ċ-ċelloli li normalment jinqasam f’profa żi, 
prometafa żi, metafażi, anafażi u telofa żi. 
Indiċi mitotiku:  il-proporzjon ta’ ċelloli fil-metafa żi diviżi bl-għadd totali ta’ 
ċelloli osservati f’popolazzjoni ta’ ċelloli; indikazzjoni tal-ammont ta’ prolife ­
razzjoni ta’ ċelloli ta’ dik il-popolazzjoni.  
Mutaġeniku:  jipprodu ċi bidla ereditarja ta’ sekwenza(i) tal-pari tal-ba żi tad-DNA 
f’ġeni jew tal-istruttura tal-kromo żomi (aberrazzjonijiet tal-kromo żomi).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondisġunzjoni:  nuqqas min-na ħa tal-kromatidi f’pari milli jinfirdu u jissegregaw 
ruħhom sew sabiex ji żviluppaw ċelloli żgħar, u dan jirri żulta f’ċelloli żgħar 
b’għadd anormali ta’ kromo żomi. 
Poliplojdija:  aberrazzjonijiet numeri ċi tal-kromo żomi f’ċelloli jew organi żmi li 
jinvolvu sett(ijiet) s ħiħ(sħaħ) ta’ kromo żomi, meta mqabbla mal-kromo żomu jew 
kromożomi individwali (anewplojdija).  
Indiċi ta’ Proliferazzjoni (PI):  metodu g ħall-kejl ta ċ-ċitotossiċità meta ma 
tintużax cytoB (ara Appendi ċi 2 għall-formula).  
Żieda Relattiva fl-G ħadd taċ-Ċelloli (Relative Increase in Cell Count — RICC):  
metodu g ħall-kejl ta ċ-ċitotossiċità meta ma tintu żax cytoB (ara Appendi ċi 2 
għall-formula).  
Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (Relative Population Doubling — RPD):  
metodu g ħall-kejl ta ċ-ċitotossiċità meta ma tintu żax cytoB (ara Appendi ċi 2 
għall-formula).  
Indiċi tar-Replikazzjoni (RI):  il-proporzjon ta ċ-ċikli tad-divi żjoni taċ-ċelloli 
mwettqa f’kultura ttrattata, fir-rigward tal-kontroll mhux trattat, matul il-perjodu 
ta’ esponiment u l-irkupru (ara Appendi ċi 2 għall-formula).  
Sustanza kimika tat-test (li ssir referenza g ħaliha wkoll b ħala s-sustanza tat-test):  
Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan it-TM.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Appendiċi 2 
Formoli g ħal valutazzjoni ta ċ-ċitotossiċità 
1. Meta tintu ża cytoB , l-evalwazzjoni ta ċ-ċitotossiċità għandha tkun ibba żata 
fuq l-Indi ċi ta’ Profilerazzjoni Blokk ta ċ-Ċitokineżi (Cytokinesis-Block Prolif ­
eration Index — CBPI) jew l-Indi ċi Replikattiv (Replicative Index — RI) (16) 
(58). Is-CBPI jindika l-g ħadd medju ta’ ċikli taċ-ċelloli għal kull ċellola matul 
il-perjodu ta’ esponiment g ħal cytoB, u jista’ jintu ża biex jikkalkula 
l-proliferazzjoni ta ċ-ċelloli. L-RI jindika l-g ħadd relattiv ta’ nuklei fil-kulturi 
ttrattati meta mqabbel mal-kulturi ta’ kontroll u jista’ jintu ża biex jikkalkula 
l-% taċ-ċitostażi: 
% ta’ Ċitostażi = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
U: 
T = kultura tat-trattament kimiku bi prova  
C = kultura ta’ kontroll tal-mezz  
Meta:  
CBPI ¼ ððNru ta’ ċellolimononukleati Þ þ ð2 Ü Nru ta’ ċelloli binukleatiÞ þ ð3 Ü Nru ta’ ċelloli multinukleati ÞÞ 
ðNumru totali ta’ ċelloliÞ 
Għaldaqstant, CBPI ta’ 1 (i ċ-ċelloli kollha huma mononukleati) huwa ekwivalenti 
għal ċitostażi ta’ 100 %.  
Ċitostażi = 100 – RI  
RI ¼ ððNru ta’ ċelloli binukleatiÞ þ ð2 Ü Nru ta’ ċelloli multinukleati ÞÞ ö ðNumru totali ta’ ċelloliÞ T 
ððNru ta’ ċelloli binukleatiÞ þ ð2 Ü Nru ta’ ċelloli multinukleati ÞÞ ö ðNumru totali ta’ ċelloliÞ C Ü 100 
T = kulturi ttrattati  
C = kulturi ta’ kontroll  
2. B’hekk, RI ta’ 53 % ifisser li, meta mqabbel mal-g ħadd ta’ ċelloli li jkunu 
nqasmu biex jiffurmaw ċelloli binukleati u multinukleati fil-kultura ta’ kontroll, 
53 % biss ta’ dan l-g ħadd ġew diviżi fil-kultura trattata, ji ġifieri ċitostażi ta’ 47 %.  
3. Meta ma tintu żax cytoB , hija rrakkomandata evalwazzjoni ta ċ-ċitotossiċità 
fuq il-bażi taż-Żieda Relattiva fl-G ħadd taċ-Ċelloli (Relative Increase in Cell 
Counts — RICC) jew fuq l-Irduppjar tal-Popolazzjoni Relattiva (Relative Popu ­
lation Doubling — RPD) (58), min ħabba li t-tnejn iqisu l-proporzjon 
tal-popolazzjoni ta ċ-ċelloli li tkun iddividiet ru ħha. 
RICC ¼ ðŻieda fl Ä għadd ta’ ċelloli fil Ä kulturi ttrattati ðfinali – biduÞÞ 
ðŻieda fl Ä għadd ta’ ċelloli fil Ä kulturi ta’ kontroll ðfinali – biduÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðNru ta’ rduppjar fil  Ä Popolazzjoni fil Ä kulturi ttrattatiÞ 
ðNru ta’ rduppjar fil  Ä Popolazzjoni fil Ä kulturi ta’ kontroll Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
fejn: 
Irduppjar tal-popolazzjoni = [log (Numru ta’ ċelloli wara t-trattament ÷ Numru 
ta’ ċelloli inizjali)] ÷ log 2  
4. B’hekk, RICC, jew RPD ta’ 53 % jindika 47 % ċitotossiċità/ċitostażi. 
5. Billi jintu ża Indiċi ta’ Proliferazzjoni (Proliferation Index — PI), i ċ-ċitotos­
siċità tista’ ti ġi vvalutata pemrezz tal-g ħadd (scoring) tan-numru ta’ kloni li 
jikkonsistu f’ ċellola 1 (cl1), 2 ċelloli (cl2), 3 sa 4 ċelloli (cl4) u 5 sa 8 ċelloli 
(cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Il-PI ntu ża bħala parametru siewi u affidabbli ta ċ-ċitotossiċità wkoll g ħal 
linji ta’ ċelloli kkulturati  in situ  fin-nuqqas ta’ cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Appendiċi 3 
Sustanzi kimi ċi ta’ referenza rrakkomandati g ħall-valutazzjoni tal-prestazzjoni  ( 1 ) 
Kategorija Sustanza Kimika Nru tal-CAS Nru tal-KE  
1. Klasto ġeni attivi ming ħajr attivazzjoni metabolika 
Ċitosina arabinosida 147-94-4 205-705-9 
Mitomiċina C 50-07-7 200-008-6 
2. Klasto ġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika 
Benżo(a)piren 50-32-8 200-028-5 
Ċiklofosfammid 50-18-0 200-015-4 
3. Anew ġeni 
Kolkiċina 64-86-8 200-598-5 
Vinblastina 143–67-9 205-606-0 
4. Sustanzi negattivi 
Di-(2-etile żil)ftalat 117-81-7 204-211-0 
Aċidu nalidissiku 389-08-2 206-864-7 
Piren 129-00-0 204-927-3 Klorur tas-sodju 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Is-sustanzi kimi ċi ta’ referenza huma s-sustanzi kimi ċi rrakkomandati g ħall-użu. Is-sostituzzjoni jew i ż-żieda ta’ sustanzi kimi ċi 
fil-lista ta’ sustanzi kimi ċi ta’ referenza tista’ ssir jekk l-attività tag ħhom tkun mag ħrufa u jekk huma jindu ċu lill-mikronuklei 
bl-istess mekkani żmi ta’ azzjoni, u jekk jintwerew li huma rilevanti g ħas-sustanzi kimi ċi li jkunu sejrin ji ġu ttestjati permezz 
tal-proċedura MNvit. Skont x’ikun l-g ħan, il-ġustifikazzjoni tista’ tinkludi wkoll studju ta’ validazzjoni li ju ża firxa wiesg ħa ta’ 
sustanzi jew iffukat fuq spettru iktar dejjaq ibba żat fuq il-klassi tas-sustanza kimika jew il-mekkani żmu ta’ ħsara li jkun qieg ħed jiġi 
studjat.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODI 
TAL-LIMFA LOKALI: DA  
INTRODUZZJONI  
1. Il-Linji gwida tal-OECD g ħall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimi ċi u l-Metodi ta’ 
Ttestjar tal-UE bba żati fuqhom ji ġu analizzati minn żmien għal żmien 
fid-dawl tal-progress xjentifiku, ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu, u konsider ­
azzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali. L-ewwel Metodu tat-Test (TM) 
(B.42) g ħad-determinazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda fil-ġurdien, 
l-Analiżi tan-Nodi tal-Limfa Lokali (Local Lymph Node Assay — 
LLNA; Linja gwida 429 tat-Test tal-OECD) ġie rivedut (1). Id-dettalji 
tal-validazzjoni tal-LLNA u anali żi tax-xog ħol assoċjat ġew ippubblikati 
(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Fl-LLNA, tintu ża t-timidina jew jojdu radjoiso ­
topiku biex titkejjel il-proliferazzjoni tal-limfo ċiti u g ħaldaqstant, 
l-analiżi għandha u żu limitat fejn l-akkwi żizzjoni, l-u żu jew 
l-eliminazzjoni tar-radjuattività huma problemati ċi. L-LLNA: DA ( żvi­
luppat minn Daicel Chemical Industries, Ltd.) huwa modifikazzjoni mhux radjuattiva g ħal-LLNA, li tikkwantifika l-kontenut tat-trifosfat 
tal-adenożina (adenosine triphosphate, ATP) permezz ta’ bijoluminexxenza 
bħala indikatur tal-proliferazzjoni tal-limfo ċiti. Il-metodu ta’ ttestjar 
LLNA: DA ġie vvalidat u analizzat u rakkomandat minn panil inter ­
nazzjonali ta’ anali żi minn pari b ħala utli g ħall-identifikazzjoni ta’ 
sustanzi kimi ċi sensitizzanti u mhux sensitizzanti, b' ċerti limitazzjonijiet 
(10) (11) (12) (13). Dan it-TM huwa mfassal g ħ
all-valutazzjoni 
tal-potenzjal tas-sustanzi kimi ċi li jikkaw żaw sensitizzazzjoni tal- ġilda 
(sustanzi u ta ħlitiet) fl-annimali. Kapitolu B.6 ta’ dan l-Anness u Linja 
Gwida 406 tat-Test OECD ju żaw fniek tal-Indi, b'mod partikolari t-test ta’ 
massimizzazzjoni tal-fniek tal-Indi u t-test Buehler (14). L-LLNA 
(Kapitolu B.42 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 429 tat-Test OECD) u ż- 
żewġ modifikazzjonijiet mhux radjuattivi, LLNA: DA (Kapitolu B.50 ta’ 
dan l-Anness; Linja Gwida 442 A tat-Test OECD) u LLNA: BrdU-ELISA 
(Kapitolu B.51 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 442 B tat-Test OECD), 
kollha jipprovdu vanta ġġ fuq it-testijiet tal-fniek tal-Indi f'B.6 u fil-Linja 
Gwida 406 tat-Test OECD (14) f'termini ta’ tnaqqis u rfinar tal-u żu 
tal-annimali.  
2. B'mod simili g ħal-LLNA, l-LLNA: DA tistudja l-fa żi ta’ induzzjoni ta’ 
sensitizzazzjoni tal- ġilda u tipprovdi dejta kwantitattiva adattata g ħall-valu­
tazzjoni tad-do ża u r-reazzjoni. Barra minn hekk, abilità li jinkixfu sensi ­
tizzaturi tal- ġilda ming ħajr il-ħtieġa li tintu ża radjutikketta g ħad-DNA 
telimina l-potenzjal g ħal esponiment fuq il-post tax-xog ħol għal kwist­
jonijiet ta’ radjuattività u ta’ rimi ta’ skart. Min-na ħa tiegħu, dan jista' 
jippermetti g ħall-użu miżjud ta’ ġrieden għall-individwazzjoni ta’ sensitiz ­
zaturi tal- ġilda, li jnaqqas ulterjorment l-u żu tal-fniek tal-Indi g ħal testijiet 
għal potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda (jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 
tat-Test OECD) (14).  
DEFINIZZJONIJIET  
3. Definizzjonijiet u żati huma pprovduti f'Appendi ċi 1. 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
4. L-LLNA: DA huwa metodu tal-LLNA modifikat g ħall-identifikazzjoni 
tal-potenzjal ta’ sustanzi kimi ċi li jikkaw żaw sensitizzazzjoni fil- ġilda, b'limi ­
tazzjonijiet spe ċifiċi. Dan mhux ne ċessarjament jimplika li fil-ka żijiet kollha, 
l-LLNA: DA g ħandha tintu ża minflok it-testijiet fuq il-fniek tal-Indi (ji ġifieri 
B.6; Linja Gwida 406 tat-test OECD) (14), i żda pjuttost li l-anali żi għandha 
l-istess mertu u tista' tintu ża bħala alternattiva li fiha r-ri żultati pożittivi u 
negattivi ġeneralment ma jkunux je ħtieġu aktar konferma (10) (11). 
Il-laboratorju tal-ittestjar g ħandu jikkunsidra l-inform azzjoni disponibbli kollha 
fuq is-sustanza tat-test qabel iwettaq l-istudju. Din l-informazzjoni g ħandha  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza tat-test; il-karatteristi ċi 
fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta’ kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew in 
vivo fuq is-sustanza tat-test; u dejta tossikolo ġika dwar sustanzi kimi ċi struttur­
alment relatati. Din l-informazzjoni g ħandha titqies sabiex wie ħed jiddetermina 
jekk l-LLNA: DA huwiex adattat g ħas-sustanza (min ħabba n-nuqqas ta’ kompa ­
tibbiltà ta’ tipi limitati ta’ sustanzi kimi ċi mal-LLNA: DA [ara paragrafu 5]) u 
sabiex tgħin fl-għażla tad-doża. 
5. L-LLNA: DA huwa metodu  in vivo  u, b'konsegwenza ta’ dan, ma 
jeliminax l-u żu tal-annimali fil-valutazzjoni ta’ attività ta’ sensitizzazzjoni 
ta’ kuntatt aller ġiku. Huwa g ħandu, madankollu, il-potenzjal li jnaqqas 
l-għadd ta’ annimali me ħtieġa għal dan il-g ħan meta mqabbel 
mat-testijiet fuq il-fniek tal-Indi (B.6; Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD) (14). Barra minn hekk, l-LLNA: DA toffri rfinar sostanzjali (inqas uġigħ u dwejjaq) fil-mod kif l-annimali jintu żaw għal provi ta’ 
sensitizzazzjoni ta’ kuntatt aller ġiku, minħabba li b'differenza mill-B.6 u 
mil-Linja Gwida 406 tat-Test tal-OECD, l-LLNA: DA ma je ħtieġx li 
reazzjonijiet ta’ sensittività e ċċessiva dermali indotti mill-isfida ji ġu 
indikati. Minkejja l-vanta ġġi tal-LLNA: DA fuq B.6 u l-Linja Gwida 
406 tat-Test OECD (14), hemm xi limitazzjonijiet li jistg ħu jeħtieġu 
l-użu ta’ B.6 u l-Linja Gwida 406 tat-Test OECD (e ż. l-ittestjar ta’ ċerti 
metalli, sejbiet po żittivi foloz b' ċerti irritanti tal- ġilda [bħal xi sustanzi 
tat-tip tensjoattivi] (6) (1 u l-Kapitolu B.42 f'dan l-Anness), solubilità 
tas-sustanza tat-test). Barra minn hekk, il-klassijiet ta’ sustanzi kimi ċi 
jew sustanzi li fihom gruppi funzjonali li ntwerew li ja ġixxu bħala konfon ­
dituri potenzjali (16) jistg ħu jeħtieġu l-użu ta’ testijiet fuq il-fniek tal-Indi 
(jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-Test OECD (14)). Limitazzjonijiet li 
ġew identifikati g ħal-LLNA (1, u Kapitolu B.42 f'dan l-Anness) ġew 
rakkomandati sabiex japplikaw ukoll g ħal-LLNA: DA (10). Barra minn 
hekk, l-u żu tal-LLNA: DA ma jkunx xieraq g ħal sustanzi ta’ ttestjar li 
jaffettwaw il-livelli tal-ATP (e ż. sustanzi li jiffunzjonaw b ħala inibituri 
tal-ATP) jew dawk li jaffettwaw il-kejl pre ċiż ta’ ATP intra ċellolari (e ż. 
il-preżenza ta’ enzimi ta’ degradazzjoni tal-ATP, il-pre żenza ta’ ATP 
ekstraċellolari fin-nodi tal-limfa). Minbarra dawn il-limitazzjonijiet iden ­
tifikati, l-LLNA: DA g ħandu jkun applikabbli g ħall-ittestjar ta’ kwalunkwe 
sustanza diment li ma jkunx hemm karatteristi ċi assoċjati ma’ dawn 
is-sustanzi li jistg ħu jinterferixxu mal-e żattezza tal-LLNA: DA. Barra 
minn hekk, g ħandha ting ħata konsiderazzjoni g ħall-possibilità ta’ ri żulatati 
pożittivi tal-limitu meta jinkisbu valuri ta’ Indi ċi ta’ Stimulazzjoni (SI) ta’ 
bejn 1,8 u 2,5 (ara l-paragrafi 31-32). Dan huwa bba żat fuq il-ba żi ta’ dejta 
ta’ validazzjoni ta’ 44 sustanza li ju żaw SI ≥ 1,8 (ara paragrafu 6) li 
għalihom, l-LLNA: DA identifika b'mod korrett it-32 sensitizzatur 
tal-LLNA, i żda b'mod inkorrett identifika tlieta minn 12-il nonsensitiz ­
zaturi tal-LLNA b'valuri tal-SI ta’ bejn 1,8 u 2,5 (ji ġifieri linja tal-limitu 
pożittiva) (10). Madankollu, min ħabba li l-istess sett ta’ dejta ntu ża għall- 
issettjar tal-valuri SI u g ħall-kalkolu tal-karatteristi ċi ta’ tbassir tat-test, 
ir-riżultati ddikjarati jistg ħu jkunu stima e ċċessiva tal-karatteristi ċi ta’ 
tbassir reali.  
PRINĊIPJU TA' DAN IL-METODU TA' TTESTJAR  
6. Il-prin ċipju bażiku wara l-LLNA: DA huwa li s-sensitizzaturi jikkaw żaw 
il-proliferazzjoni ta’ limfo ċiti fin-noduli tal-limfa li jsaffu s-sit 
tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Din il-proliferazzjoni hija proporz ­
jonata mad-do ża u mal-qawwa tal-aller ġen applikat u tipprovdi mezz 
sempliċi ta’ kif wie ħed jikseb kejl kwantitattiv ta’ sensitizzazzjoni. 
Il-proliferazzjoni titkejjel billi wie ħed iqabbel il-proliferazzjoni medja 
f'kull grupp tat-test mal-proliferazzjoni medja fil-grupp ta’ kontroll ittrattati 
bil-mezzi (VC). Il-proporzjon tal-proliferazzjoni medja f'kull grupp ittrattat 
ma’ dak fil-grupp VC simultanju, imsejja ħ l-SI, jiġi stabbilit, u g ħandu ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
jkun ≥ 1,8 qabel ma tkun me ħtieġa evalwazzjoni ulterjuri tas-sustanza 
tat-test b ħala sensitizzatur potenzjali tal- ġilda. Il-pro ċeduri deskritti 
hawnhekk huma bba żati fuq l-u żu tal-kejl tal-kontenut ta’ ATP b'bijolu ­
minexxenza (mag ħrufa li tikkorrelata mal-g ħadd ta’ ċelloli ħajjin) (17) 
sabiex jiġi indikat g ħadd miżjud ta’ ċelloli ta’ proliferazzjoni fin-nodi 
tal-limfa awrikulari li jnixxu (18) (19). Il-metodu bijoluminexxenti ju ża 
l-enzima lu ċiferażi biex jikkatalizza l-formazzjoni tad-dawl minn ATP u 
luċiferin skont ir-reazzjoni li ġejja: 
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + Dawl  
L-intensità tad-dawl emess hija relatata b'mod lineari mal-kon ċentrazzjoni 
tal-ATP u hija mkejla permezz ta’ luminometru. L-anali żi ta’ luċiferin- 
luċiferażi hija metodu sensittiv g ħall-kwantifikazzjoni tal-ATP u żata 
f'firxa wiesg ħa ta’ applikazzjonijiet (20).  
DESKRIZZJONI TAL-ANALI ŻI 
Għażla tal-ispe ċi tal-annimali  
7. Il-ġurdien huwa l-ispe ċi tal-għażla għal dan it-test. Studji ta’ validazzjoni 
għal-LLNA: DA twettqu esklussivament bir-razza CBA/J li g ħaldaqstant 
hija kkunsidrata r-razza ppreferuta (12) (13). Jintu żaw ġrieden nisa adulti 
żgħar, li huma nulliparu żi u mhumiex tqal. Fil-bidu tal-istudju, l-annimali 
għandu jkollhom bejn 8 ġimgaħt u 12-il ġimgħa, u l-varjazzjoni fil-pi ż 
tal-annimali g ħandha tkun minima u ma taqbi żx l-20 % tal-pi ż medju. 
Inkella, jistg ħu jintużaw razez o ħrajn u ġrieden irġiel meta tkun i ġġenerata 
biżżejjed dejta li turi li ma je żistux differenzi sinifikanti spe ċifiċi għar- 
razez u/jew g ħas-sess fir-reazzjoni g ħal-LLNA: DA.  
Kundizzjoinijiet ta’ fejn jin żammu u x'jieklu  
8. Il-ġrieden għandhom jin żammu fi gruppi (21), sakemm ma ting ħatax 
loġika xjentifika adegwata g ħat-tqegħid tal-ġrieden f'ga ġeġ individwali. 
It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali g ħandha tkun ta’ 22 ± 
3 °C. G ħalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill-inqas 30 % u 
preferibbilment ma taqbi żx is-70 %, g ħajr waqt it-tindif tal-kamra, 
il-mira g ħandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, u 
s-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. G ħall-għalf, 
jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista 
mingħajr limitu ta’ ilma tax-xorb.  
It-tħejjija tal-annimali  
9. L-annimali g ħandhom jintg ħażlu b'mod aleatorju, immarkati sabiex ikunu 
jistgħu jiġu identifikati individwalment (i żda mingħajr l-ebda forma ta’ 
mmarkar fil-widnejn), u mi żmuma fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-inqas 
ħamest ijiem qabel ma jibda d-do żar sabiex ikunu jistg ħu jidraw 
il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel il-bidu tat-trattament, l-annimali kollha jiġu eżaminati sabiex ikun żgurat li huma ma jkollhom l-ebda 
feriti osservabbli fuq il- ġilda.
 
It-tħejjija tas-soluzzjonijiet g ħad-dożar 
10. Is-sustanzi kimi ċi solidi g ħandhom jin ħallu jew ji ġu sospiżi f'sol­
venti/mezzi u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel l-applikazzjoni fuq il-widna tal- ġrieden. Is-sustanzi kimi ċi likwidi jistg ħu jiġu applikati 
waħedhom jew dilwiti qabel id-do żar. Is-sustanzi kimi ċi li ma jin ħallux, 
bħal dawk li naraw ġeneralment fl-apparat mediku, g ħandhom ikunu 
soġġetti għal estrazzjoni e żaġerata f'solvent adattat sabiex ji żvelaw 
il-kostitwenti kollha li jistg ħu jiġu estratti g ħall-ittestjar qabel ji ġu 
applikati fuq il-widna tal- ġrieden. Is-sustanzi tat-test g ħandhom jit ħejjew 
kuljum sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix li jistg ħu jinħażnu.
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Il-verifika tal-affidabbiltà  
11. Sustanzi kimi ċi ta’ kontroll po żittiv (PC) jintu żaw sabiex tintwera 
prestazzjoni xierqa tal-anali żi billi jirrea ġixxu b'sensittività adegwata u 
riproduċibbli għal sustanza tat-test sensitizzanti li g ħaliha l-kobor 
tar-reazzjoni huwa kkaratterizzat sew. L-inklu żjoni ta’ PC simultanju hija 
rrakkomandata g ħaliex din turi l-kompetenza tal-laboratorju biex iwettaq 
b'suċċess kull anali żi u tippermetti l-valutazzjoni u t-tqabbil 
tar-riprodu ċibbiltà fil-laboratorju u bejn il-laboratorji. Xi awtoritajiet rego ­
latorji jeħtieġu wkoll PC g ħal kull studju u g ħaldaqstant, l-utenti huma 
mħeġġa jikkonsultaw mal-awtoritajiet rilevanti qabel iwettqu l-LLNA: DA. 
Għalhekk, l-u żu ta’ rutina ta’ PC simultanju huwa rrakkomandat sabiex 
tiġi evitata l- ħtieġa ta’ aktar ittestjar fuq l-annimali sabiex jintla ħqu tali 
rekwiżiti li jistg ħu jinħolqu mill-u żu ta’ PC perjodiku (ara l-paragrafu 12). 
Il-PC għandha tipprodu ċi reazzjoni tal-LLNA: DA po żittiva f'livell ta’ 
esponiment li mistenni jag ħti żieda fl-SI > 1,8 fuq il-grupp ta’ kontroll 
negattiv (NC). Id-do ża tal-PC g ħandha tintg ħażel b'mod li ma tikkaw żax 
irritazzjoni e ċċessiva fil- ġilda jew tossi ċità sistemika u l-induzzjoni hija 
riproduċibbli iżda mhux e ċċessiva (jiġifieri SI > 10 ikun jitqies e ċċessiv). 
PC ippreferuti huma 25 % e żil ċinnamaldeid (Numru tal-Chemical 
Abstracts Service [CAS] 101-86-0) u 25 % ew ġenol (numru tal-CAS 97- 
53-0,) fl-a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v). Jista' jkun hemm ċirkostanzi 
fejn, min ħabba ġustifikazzjoni adegwata, jistg ħu jintużaw PCs o ħrajn, li 
jissodisfaw il-kriterji ta’ hawn fuq.  
12. Filwaqt li l-inklu żjoni ta’ grupp ta’ PC simultanju hija rrakkomandata, 
jista' jkun hemm sitwazzjonijiet fejn l-ittestjar perjodiku (ji ġifieri f'in ­
tervalli ≤ 6 xhur) tal-PC jista' jkun adegwat g ħal-laboratorji li jag ħmlu 
l-LLNA: DA b'mod regolari (ji ġifieri jagħmlu l-LLNA: DA fi frekwenza 
ta’ mhux inqas minn darba fix-xahar) u g ħandhom ba żi tad-dejta ta’ PC 
storika stabbilita li turi l-kapa ċità tal-laboratorju biex jikseb ri żultati ripro ­
duċibbli u eżatti b'PCs. Profi ċjenza adegwata bl-LLNA: DA tista' tintwera 
b'suċċess billi ji ġu ġġenerati ri żultati pożittivi konsistenti bil-PC f'mill- 
inqas 10 testijiet indipendenti li jsiru f'perjodu ta’ żmien raġonevoli 
(jiġifieri inqas minn sena wa ħda). 
13. Grupp ta’ PC simultanju g ħandu dejjem ikun inklu ż meta jkun hemm bidla 
fil-proċedura tal-LLNA: DA (e ż. bidla fil-persunal im ħarreġ, bidla 
fil-materjali tal-metodu tat-test u/jew fir-rea ġenti, bidla fit-tag ħmir 
tal-metodu tat-test, bidla fis-sors tal-annimali tat-test), u dawn il-bidliet 
għandhom ji ġu ddokumentati fir-rapporti tal-laboratorju. G ħandu jiġi kkun­
sidrat l-impatt ta’ dawn il-bidliet fuq l-adegwatezza tal-ba żi tad-dejta 
storika stabbilita qabel ma ti ġi deċiża l-ħtieġa li tkun stabbilita ba żi 
tad-dejta storika ġdida sabiex tiddokumenta l-konsistenza fir-ri żultati 
tal-PC.  
14. Ir-ri ċerkaturi g ħandhom ikunu konxji li d-de ċiżjoni li jsir studju tal-PC fuq 
bażi perjodika minflok fl-istess ħin għandha konsegwenzi fuq 
l-adegwatezza u l-a ċċettabbiltà tar-ri żultati negattivi ta’ studju ġġenerati 
mingħajr PC simultanju waqt l-intervall bejn kull studju tal-PC perjodiku. 
Pereżempju, jekk jinkiseb ri żultat negattiv falz fl-istudju tal-PC perjodiku, 
ir-riżultati negattivi tas-sustanza tat-test miksuba fl-intervall bejn l-a ħħar 
studju tal-PC perjodika a ċċettabbli u l-istudju tal-PC perjodika mhux a ċċet­
tabbli jistg ħu jkunu dubju żi. L-implikazzjonijiet ta’ dawn l-e żiti għandhom 
ikunu kkunsidrati b'attenzjoni meta jkun de ċiż jekk għandhomx ikunu 
inklużi PCs simultanji jew li jsiru biss PCs perjodi ċi. Għandu jiġi kkun­
sidrat ukoll l-u żu ta’ inqas annimali fil-grupp ta’ PC simultanju meta dan 
ikun iġġustifikat xjentifikament u jekk il-laboratorju juri, fuq dejta storika 
speċifika għal-laboratorju, li jistg ħu jintużaw inqas ġrieden (22).  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Għalkemm il-PC g ħandu jiġi ttestjat f'mezz li huwa mag ħruf li jeli ċita 
reazzjoni konsistenti (e ż. l-aċetun: żejt taż-żebbuġa; 4:1, v/v), jista' jkun 
hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom it-testijiet b'mezz mhux 
regolari (formulazzjoni klinika/kimikament rilevanti) ikunu me ħtieġa 
wkoll (23). Jekk il-PC simultanju ji ġi ttestjat f'mezz differenti 
mis-sustanza tat-test, allura g ħandu jiġi inkluż VC separat g ħall-PC simul ­
tanju.  
16. F'ka żijiet fejn ikunu qeg ħdin jiġu vvalutati sustanzi tat-test ta’ klassi 
speċifika ta’ sustanzi kimi ċi jew firxa ta’ reazzjonijiet, is-sustanzi ta’ 
referenza jistg ħu jkunu utli wkoll sabiex juru li l-metodu ta’ ttestjar qed 
jaħdem sew sabiex jinstab il-potenzjal tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ 
dawn it-tipi ta’ sustanzi. Is-sustanzi ta’ referenza adattati g ħandu 
jkollhom il-karatteristi ċi li ġejjin:  
— xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta’ sustanzi tat-test li qeg ħdin 
jiġu ttestjati,  
— karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi magħrufa, 
— dejta ta’ appo ġġ mil-LLNA: DA,  
— dejta ta’ appo ġġ minn mudelli o ħrajn ta’ annimali u/jew mill-bnedmin.  
IL-PROĊEDURA TAT-TEST  
Għadd ta’ annimali u livelli tad-do ża 
17. Għal kull grupp ta’ do żi għandhom jintu żaw tal-inqas erba' annimali, 
b'minimu ta’ tliet kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma’ 
grupp ta’ NC simultanju ttrattat biss bil-mezz g ħas-sustanza tat-test, u 
PC (simultanja jew re ċenti, ibba żata fuq il-politika tal-laboratorju 
fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11-15). G ħandu jiġi kkunsidrat l-ittestjar ta’ 
dożi multipli tal-PC, b'mod spe ċjali meta wie ħed jittestja l-PC fuq ba żi 
intermittenti. Apparti n-nuqqas ta’ trattament bis-sustanza tat-test, 
l-annimali fil-gruppi ta’ kontroll g ħandhom ji ġu mmani ġġjati u trattati 
b'mod identiku b ħall-annimali fil-gruppi tat-trattament.  
18. L-g ħażla tad-do ża u tal-mezz g ħandha tkun ibba żata fuq 
ir-rakkomandazzjonijiet mog ħtija fir-referenzi (2) u (24). Do żi konsekuttivi 
normalment jintg ħażlu minn sensiela xierqa ta’ kon ċentrazzjonijiet b ħal 
100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, e ċċ. Loġika xjentifika 
adegwata g ħandha takkumpanja l-g ħażla tas-sensiela ta’ kon ċen­
trazzjonijiet u żati. L-informazzjoni tossikolo ġika kollha e żistenti (e ż. 
tossiċità akuta u irritazzjoni fil- ġilda) u l-informazzjoni strutturali u fi żiko­
kimika dwar is-sustanza tat-test ta’ interess (u/jew sustanzi relatati struttur ­
alment) g ħandhom ji ġu kkunsidrati meta jkunu disponibbli, fl-g ħażla 
tat-tliet kon ċentrazzjonijiet konsekuttivi biex b'hekk l-og ħla konċen­
trazzjoni timmassimizza l-esponiment filwaqt li tevita t-tossi ċità 
sistemika u/jew l-irritazzjoni lokali e ċċessiva fil- ġilda (24) (25). 
Fin-nuqqas ta’ informazzjoni b ħal din, jista' jkun me ħtieġ test inizjali 
qabel l-iskrinjar (ara l-paragrafi 21-24).  
19. Il-mezz ma g ħandux jinterferixxi ma’ jew jinfluwenza r-ri żultat tat-test u 
għandu jintg ħażel fuq il-ba żi tal-massimmizzazzjoni tas-solubbiltà sabiex 
tinkiseb l-og ħla konċentrazzjoni li tista' tinkiseb filwaqt li ti ġi prodotta 
soluzzjoni/sospensjoni adattata g ħall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. 
Il-mezzi rakkomandati huma a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v), N,N- 
dimetilformammid, metiletilketon, propilen glikol, u dimetilsulfossidu (6) 
iżda jistgħu jintużaw oħrajn jekk ting ħata loġika xjentifika suffi ċjenti. 
F'ċerti sitwazzjonijiet, jista' jkun me ħtieġ li jsir u żu minn solvent kimi ­
kament rilevanti jew mill-formulazzjoni kummer ċjali li fiha s-sustanza 
tat-test hija kkummer ċjalizzata b ħala kontroll addizzjonali. G ħandha 
tingħata attenzjoni partikolari sabiex ikun żgurat li s-sustanzi idrofili ċi 
jkunu inkorporati f'sistema ta’ mezzi, li xxarrab il- ġilda u ma ċċarċarx 
mal-ewwel, permezz tal-inkorporazzjoni ta’ sustanzi li j ħollu xierqa (e ż. 
1 % Pluronic® L92). G ħalhekk, mezzi likwidi g ħalkollox g ħandhom ji ġu 
evitati.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. L-ippro ċessar ta’ noduli tal-limfa minn ġrieden individwali jippermetti 
l-valutazzjoni tal-varjabbiltà bejn l-annimali u tqabbil statistiku 
tad-differenza bejn is-sustanza tat-test u l-kejl tal-grupp VC (ara paragrafu 33). Barra minn hekk, il-valutazzjoni tal-possibbiltà li jitnaqqas l-g ħadd ta’ ġrieden fil-grupp PC hija fattibbli meta tin ġabar 
dejta dwar annimali individwali (22). Barra minn hekk, ċerti awtoritajiet 
regolatorji jitolbu l- ġbir ta’ dejta dwar annimali individwali. Ġbir regolari 
ta’ dejta dwar annimali individwali jipprovdi vanta ġġ mil-lat tal-benesseri 
tal-annimal billi jevita ttestjar doppju li jkun me ħtieġ li kieku r-ri żultati 
tas-sustanza tat-test li tkun in ġabret oriġinarjament b'xi mod (e ż. permezz 
ta’ dejta mi ġbura dwar l-annimali) kellhom ji ġu kkunsidrati aktar tard 
mill-awtoritajiet regolatorji ma’ rekwi żiti oħrajn (eż. dejta individwali 
dwar l-annimali).
 
Test ta’ qabel l-iskrinjar  
21. Fin-nuqqas ta’ informazzjoni sabiex tkun stabbilita l-og ħla doża li għandha 
tiġi ttestjata (ara paragrafu 18), g ħandu jsir test ta’ qabel l-iskrinjar sabiex 
jiġi definit il-livell ta’ do ża xierqa li g ħandha tiġi ttestjata fl-LLNA: DA. 
L-iskop tat-test ta’ qabel l-iskrinjar huwa li jipprovdi gwida g ħall-għażla 
tal-livell tad-do ża massima li g ħandha tintu ża fl-istudju ewlieni tal-LLNA: 
DA, meta l-informazzjoni dwar il-kon ċentrazzjoni li tikkaw ża tossiċità 
sistemika (ara paragrafu 24) u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda 
(ara paragrafu 23) ma tkunx disponibbli. Il-livell massimu tad-do ża 
ttestjata g ħandu jkun 100 % tas-sustanza tat-test g ħal-likwidi jew 
il-konċentrazzjoni massima possibbli g ħas-solidi jew g ħas-sospensjonijiet.  
22. It-test ta’ qabel l-iskrinjar isir ta ħt l-istess kundizzjonijiet tal-istudju ewlieni 
tal-LLNA: DA, ħlief għall-fatt li ma hemmx valutazzjoni 
tal-proliferazzjoni tan-noduli tal-limfa u li jistg ħu jintużaw inqas 
annimali g ħal kull grupp ta’ do ża. Huwa ssu ġġerit li jintu ża annimal 
wieħed jew tnejn g ħal kull grupp ta’ do ża. Il-ġrieden kollha ji ġu 
osservati kuljum g ħal kwalunkwe sinjal kliniku ta’ tossi ċità sistemika 
jew irritazzjoni lokali fis-sit tal-applikazzjoni. Il-pi żijiet tal-ġisem jiġu 
ddokumentati qabel it-test u wara li jintemm (Jum 8). I ż-żewġ widniet 
ta’ kull ġurdien jiġu osservati g ħall-eritema u jing ħataw punte ġġ skont 
it-Tabella 1 (25). Jittie ħed il-kejl tal- ħxuna tal-widna permezz ta’ gej ġ 
ta’ ħxuna (eż. mikrometru di ġitali jew gej ġ tal-ħxuna Peacock Dial) 
f'Jum 1 (qabel id-do ża), f'Jum 3 (madwar 48 sieg ħa wara l-ewwel do ża), 
f'Jum 7 (24 sieg ħa qabel it-tmiem) u f'Jum 8. Barra minn hekk, f'Jum 8, 
il-ħxuna tal-widna tista' ti ġi stabbilita permezz ta’ determinazzjonijiet 
tal-piż bl-immarkar tal-widnejn, li g ħandu jsir wara li l-annimali jinqatlu 
b'mod uman. L-irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda hija indikata 
b'punteġġ ta’ eritema ≥ 3 u/jew ħxuna tal-widna ta’ ≥ 25 % fi 
kwalunkwe jum tal-kejl (26) (27). L-og ħla doża magħżula għall-istudju 
ewlieni tal-LLNA: DA tkun id-do ża l-aktar baxxa li jmiss fis-sensiela ta’ 
konċentrazzjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar (ara paragrafu 18) li ma tikkaw żax 
tossiċità sistemika u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda. 
Tabella 1  
Punteġġi għall-Eritema  
Osservazzjoni Punte ġġ 
L-ebda eritema 0 
Ftit li xejn eritema (bil-kemm tidher) 1 Eritema definita sew 2
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Osservazzjoni Punte ġġ 
Eritema moderata sa severa 3 
Eritema severa ( ħmura qawwija) sa formazzjoni ta’ tessut o ħxon u 
danneġġjat li jipprevjeni l-klassifikazzjoni tal-eritema 4 
23. Minbarra żieda ta’ 25 % fil- ħxuna tal-widna (26) (27), intu żat ukoll żieda 
statistikament sinifikanti fil- ħxuna tal-widna fil- ġrieden ittrattati meta 
mqabbla mal- ġrieden tal-kontroll sabiex ji ġu identifikati sustanzi irritanti 
fl-LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Madankollu, g ħalkemm jistg ħu 
jseħħu żidiet statistikament sinifikanti meta l- ħxuna tal-widna tkun inqas 
minn 25 % dawn ma ġewx asso ċjati b'mod spe ċifiku ma’ irritazzjoni 
eċċessiva (67) (31) (69) (70) (71).  
24. L-osservazzjonijiet klini ċi li ġejjin jistg ħu jindikaw tossi ċità sistemika (35) 
meta jintu żaw bħala parti minn valutazzjoni integrata u g ħalhekk jistg ħu 
jindikaw il-livell massimu tad-do ża li għandha tintu ża fl-LLNA: DA 
ewlenija: bidliet fil-funzjoni tas-sistema nervu ża (eż. pil wieqaf, atassja, 
rogħda, u konvul żjonijiet); bidliet fl-im ġiba (eż. aggressività, bidla 
fl-attività tal-indafa, bidla sinifikanti fil-livell ta’ attività); bidliet fit-tendenzi respiratorji (ji ġifieri bidliet fil-frekwenza u fl-intensità 
tan-nifs b ħal dispneja, nifs maqtug ħ, u ħsejjes mill-pulmun (rales)), u 
bidliet fil-konsum tal-ikel u tal-ilma. Barra minn hekk, sinjali ta’ letarġija u/jew nuqqas ta’ reazzjoni u kull sinjal kliniku ie ħor ta’ aktar 
minn uġigħ jew tbatija żgħira jew momentanja, jew tnaqqis ta’ > 5 % 
fil-piż tal-ġisem minn Jum 1 sa Jum 8 u mortalità, g ħandhom ji ġu kkun­
sidrati fl-evalwazzjoni. Annimali moribondi jew annimali li juru sinjali ta’ uġigħ jew dieqa severa g ħandhom jinqatlu b'mod uman (36).
 
Skeda sperimentali tal-istudju ewlieni  
25. L-iskeda sperimentali tal-anali żi hija kif ġej: 
— Jum 1:  Identifika individwalment u ħu nota tal-pi ż ta’ kull annimal u 
ta’ kwalunkwe osservazzjoni klinika. Applika soluzzjoni milwiema ta’ 1 % sodju lauril sulfat (SLS) fuq il-parti ta’ wara ta’ kull widna billi 
tuża pinzell imbill fis-soluzzjoni ta’ SLS sabiex tkopri d-dorsum ta’ 
kull widna b'erba' jew ħames pinzellati. Sieg ħa wara t-trattament 
bl-SLS, applika 25 μL tad-dilwizzjoni xierqa tas-sustanza tat-test, 
il-mezz wa ħdu, jew il-PC (simultanja jew re ċenti, skont il-politika 
tal-laboratorju fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11–15), fuq in-na ħa ta’ 
wara ta’ kull widna.
 
— Jiem 2, 3 u 7:  Irrepeti l-pro ċedura ta’ applikazzjoni ta’ qabel 
it-trattament bis-sustanza milwiema ta’ 1 % SLS u tas-sustanza tat-test imwettqa f'Jum 1.
 
— Jiem 4, 5 u 6:  L-ebda trattament.  
— Jum 8:  Ħu nota tal-pi ż ta’ kull annimal u ta’ kwalunkwe osservazzjoni 
klinika. Bejn wie ħed u ie ħor 24 sa 30 sieg ħa wara l-bidu 
tal-applikazzjoni f'Jum 7, oqtol l-annimali b'mod uman. Aqta' barra 
n-nodi limfati ċi awrikulari li jkunu qed inixxu minn kull widna 
tal-ġurdien u ppro ċessa separatament f'soluzzjoni ta’ ilma bil-mel ħ 
ibbaferjata bil-fosfat (PBS) g ħal kull annimal. Id-dettalji u 
d-dijagrammi tal-identifikazzjoni u d-dissezzjoni tan-noduli limfati ċi 
tinsab fir-referenza (22). Sabiex tkompli tissorvelja r-reazzjoni lokali 
tal-ġilda fl-istudju ewlieni, jistg ħu jiġu inklużi parametri o ħrajn bħall- 
għoti ta’ punti g ħall-eritema fil-widna jew il-kejl tal- ħxuna tal-widna 
(miksuba kemm permezz ta’ gej ġ tal-ħxuna, kif ukoll permezz 
tad-determinazzjonijiet tal-pi żijiet bl-immarkar tal-widna fl-awtopsja) 
fil-protokoll tal-istudju.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
It-tħejjija tas-sospensjonijiet ta ċ-ċelloli  
26. Minn kull ġurdien, tit ħejja sospensjoni ta’ ċellola singola ta’ ċelloli 
tan-nodi limfati ċi (LNC — lymph node cells) maqtug ħin bilateralment 
billi n-nodi limfati ċi jitpoġġew mgħaffġin bejn żewġ slajds tal- ħġieġ u 
tiġi applikata pressjoni ħafifa sabiex in-nodi jitg ħaffġu. Wara li ji ġi kkon­
fermat li t-tessut infirex irqiq, irqiq, issepara ż-żewġ slajds minn ma’ 
xulxin. Issospendi t-tessut fuq i ż-żewġ slajds fil-PBS billi żżomm kull 
slajd f'angolu fuq id-dixx Petri u filwaqt li tla ħlaħ b'PBS waqt li 
fl-istess ħin tqaxxar it-tessut mill-islajd bi scraper ta ċ-ċelloli. Barra minn 
hekk, in-nodi limfati ċi f'annimali NC huma żgħar, għalhekk operazzjoni 
attenta hija importanti sabiex ikun evitat kwalunkwe effett artifi ċjali fuq 
il-valuri SI. G ħandu jintu ża volum total ta’ 1 mL PBS g ħat-tlaħliħ taż- 
żewġ slajds. Is-sospensjoni tal-LNC fid-dixx Petri g ħandha tiġi omoġe­
nizzata kemmxejn bl-iscraper ta ċ-ċelloli. Imbag ħad jinġabar alikwott ta’ 
20 μL tas-sospensjoni tal-LNC b'mikropipetta, filwaqt li wie ħed joqgħod 
attent li ma ji ħux il-membrana li hija vi żibbli għall-għajn, u sussegwen ­
tament jit ħallat ma’ 1,98 mL tal-PBS biex jag ħti kampjun ta’ 2 mL. 
Imbagħad jitħejja t-tieni kampjun ta’ 2 mL, billi tintu ża l-istess 
proċedura sabiex jit ħejjew żewġ kampjuni g ħal kull annimal.  
Determinazzjoni tal-proliferazzjoni ċellolari (kejl tal-kontenut tal-ATP 
tal-limfoċiti) 
27. Żidiet fil-kontenut ta’ ATP fin-nodi limfati ċi jitkejlu bil-metodu lu ċiferin/ 
luċiferażi li juża kit tal-kejl tal-ATP, li jkejjel il-bijoluminexxenza f'Uni ­
tajiet ta’ Luminexxenza Relattiva (Relative Luminescence Units — RLU). Il-ħin tal-anali żi mill-ħin tal-qatla tal-annimal sal-kejl tal-kontenut ta’ ATP 
għal kull annimal individwali g ħandu jinżamm uniformi, fi żmien bejn 
wieħed u ieħor 30 minuta min ħabba li l-kontenut ta’ ATP huwa meqjus 
li gradwalment jonqos mal- ħin wara l-qatla tal-annimal (12). B'hekk, 
is-serje ta’ pro ċeduri mill-qtug ħ tan-nodi limfati ċi awrikulari sal-kejl 
tal-ATP g ħandha titlesta fi żmien 20 minuta permezz tal-iskeda ta’ 
żmien predeterminata li hija l-istess g ħal kull annimal. Il-luminexxenza 
tal-ATP g ħandha titkejjel f'kull kampjun ta’ 2 mL sabiex jin ġabar total 
ta’ żewġ kejlijiet ta’ ATP g ħal kull annimal. Il-luminexxenza tal-ATP 
medja ti ġi mbagħad stabbilita u u żata f'kalkoli sussegwenti (ara 
paragrafu 30).
 
OSSERVAZZJONIJIET  
Osservazzjonijiet klini ċi 
28. Kull ġurdien għandu jiġi osservat b'attenzjoni mill-inqas darba kuljum g ħal 
kwalunkwe sinjal kliniku, kemm ta’ irritazzjoni lokali fil-post tal-applikazzjoni jew ta’ tossi ċità sistemika. L-osservazzjonijiet kollha 
jiġu rreġistrati b'mod sistematiku u jin żammu rekords g ħal kull ġurdien. 
Il-pjanijiet ta’ sorveljanza g ħandhom jinkludu kriterji sabiex ji ġu iden­
tifikati mill-ewwel dawk il- ġrieden li juru tossi ċità sistemika, irritazzjoni 
lokali eċċessiva tal- ġilda, jew tmermir tal- ġilda għall-ewtana żja (36).
 
Piżijiet tal-ġisem  
29. Kif iddikjarat fil-paragrafu 25, il-pi żijiet tal-ġisem tal-annimali individwali 
għandhom jitkejlu fil-bidu tat-test u fil-qatla b'mod uman skedata.  
KALKOLU TAR-RI ŻULTATI  
30. Ir-ri żultati għal kull grupp ta’ trattament huma espressi b ħala l-SI medja. 
L-SI jinkiseb billi wie ħed jiddividi l-RLU/ ġurdien medju f'kull grupp 
tas-sustanza tat-test, u l-grupp tal-PC, bl-RLU/ ġurdien medju g ħall-grupp 
tas-solvent/VC. L-SI medju g ħall-VCs imbag ħad ikun wie ħed. ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Il-pro ċess tad-de ċiżjoni jqis ri żultat bħala pożittiv meta SI ≥ 1,8 (10). 
Madankollu, il-qawwa tar-relazzjoni tad-do ża-reazzjoni, is-sinifikat stat ­
istiku u l-konsistenza tas-solvent/mezz u r-reazzjonijiet tal-PC jistg ħu 
jintużaw ukoll sabiex wie ħed jiddetermina jekk ri żultat marġinali (jiġifieri 
valur SI bejn 1,8 u 2,5) ji ġix iddikjarat po żittiv (2) (3) (37).  
32. Għal rispons po żittiv marġinali bejn SI ta’ 1,8 u 2,5, l-utenti jistg ħu jkunu 
jridu jikkunsidraw informazzjoni addizzjonali b ħar-relazzjoni do ża- 
reazzjoni, evidenza ta’ tossi ċità sistemika jew irritazzjoni e ċċessiva, u 
fejn xieraq, sinifikat statistiku flimkien ma’ valuri SI sabiex ji ġi kkon­
fermat li tali ri żultati huma po żittivi (10). G ħandhom ji ġu kkunsidrati 
d-diversi karatteristi ċi tas-sustanza tat-test, inklu ż jekk g ħandhiex 
relazzjoni strutturali ma’ sustanzi mag ħrufa li jo ħolqu sensititizzazzjoni 
fil-ġilda, jekk tikkaw żax irritazzjoni e ċċessiva fil- ġilda tal-ġurdien, u 
n-natura tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni osservata. Dawn u 
konsiderazzjonijiet o ħrajn huma diskussi fid-dettall f'parti o ħra (4).  
33. Il-ġbir ta’ dejta fil-livell tal- ġurdien individwali jippermetti li ssir anali żi 
statistika g ħall-preżenza u l-grad ta’ relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni 
fid-dejta. Kull valutazzjoni statistika tista' tinkludi valutazzjoni tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni kif ukoll tqabbil a ġġustat kif 
xieraq tal-gruppi tat-test (e ż. grupp iddo żat f'pari kontra tqabbil ta’ 
kontroll ta’ solvent simultanju/VC simultanji). L-anali żijiet statisti ċi 
jistgħu jinkludu, e ż. regressjoni lineari jew it-test ta’ William g ħall-valu­
tazzjoni tat-tendenzi tad-do ża u tar-reazzjoni, u t-test ta’ Dunnett g ħal 
tqabbil tal-pari. Meta jag ħżel metodu xieraq g ħall-analiżi statistika, 
ir-riċerkatur g ħandu jkun konxju mill-inugwaljanzi possibbli 
tad-differenzi u problemi o ħrajn relatati li jistg ħu jeħtieġu trasformazzjoni 
tad-dejta jew anali żi statistika mhux parametrika. Fi kwalunkwe ka ż, 
ir-riċerkatur jista' je ħtieġ li jagħmel kalkoli tal-SI u anali żijiet statisti ċi bi 
jew ming ħajr ċerti punti ta’ dejta (li xi drabi jissej ħu “anomaliji” (out ­
liers)).
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
34. Id-dejta g ħandha ting ħata fil-qosor f'g ħamla ta’ tabella li turi l-valuri 
tal-RLU tal-annimal individwali, l-RLU medju tal-grupp/annimal, it-terminu ta’ żball asso ċjat tiegħu (eż. SD, SEM), u l-SI medju g ħal 
kull grupp ta’ do żi meta mqabbel mas-solvent/grupp ta’ kontroll 
tal-mezz simultanju.
 
Rapport tat-test  
35. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanzi kimi ċi tat-test u ta’ kontroll  
— dejta tal-identifikazzjoni (e ż. in-numru tal-CAS u tal-KE, jekk 
disponibbli; is-sors; il-purità; l-impuritajiet mag ħrufa; in-numru 
tal-lott),  
— in-natura fi żika u l-karatteristi ċi fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, stab ­
bilità, solubilità),  
— jekk ta ħlita, il-kompo żizzjoni u l-per ċentwali relattivi tal-komponenti,  
Solvent/mezz  
— dejta tal-identifikazzjoni (purità; kon ċentrazzjoni, fejn xieraq; il-volum 
użat), 
— raġuni għall-għażla tal-mezz,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Annimali tat-test  
— is-sors tal- ġrieden tas-CBA,  
— l-istatus mikrobijolo ġiku tal-annimali, meta jkun mag ħruf, 
— l-għadd u l-età tal-annimali,  
— is-sors tal-annimali, il-kundizzjonijiet tal-ga ġeġ, id-dieta, e ċċ., 
Kondizzjonijiet tat-test,  
— is-sors, in-numru tal-lott u assigurazzjoni tal-kwalità 
tal-manifattur/dejta ta’ kontroll tal-kwalità g ħall-kit tal-ATP,  
— dettalji dwar it-t ħejjija u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test,  
— raġuni għall-għażla tad-do ża (inklużi riżultati mit-test ta’ qabel 
l-iskrinjar, jekk ikun sar),  
— il-kon ċentrazzjonijiet tal-mezz u tas-sustanza tat-test u żati, u l-ammont 
totali tas-sustanza tat-test applikat,  
— dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu ż it-tip/is-sors tad-dieta, 
is-sors tal-ilma),  
— dettalji dwar l-iskedi tat-trattament u tat-te ħid ta’ kampjuni,  
— metodi ta’ kejl tat-tossi ċità, 
— kriterji li ntu żaw sabiex l-istudji ji ġu kkunsidrati po żittivi jew negattivi,  
— dettalji dwar kwalunkwe devjazzjoni mill-protokoll u spjegazzjoni 
dwar kif id-devjazzjoni taffettwa d-disinn u r-ri żultati tal-istudju,  
Verifika tal-affidabilità:  
— sommarju tar-ri żultati tal-a ħħar kontroll tal-affidabbiltà, inklu ża inform­
azzjoni dwar is-sustanza tat-test, il-kon ċentrazzjoni u l-mezz u żati, 
— PC simultanju u/jew storiku u dwar dejta negattiva simultanja (sol ­
vent/mezz) g ħal-laboratorju li qed jag ħmel it-test,  
— jekk ma kinitx inklu ża PC simultanja, id-data u r-rapport tal-laboratorju 
għall-aktar PC perjodika re ċenti u rapport li jag ħti dettalji dwar id-dejta 
tal-PC storika g ħal-laboratorju li ti ġġustifika l-ba żi għaliex ma saritx 
PC simultanja,  
Ir-riżultati,  
— piżijiet individwali tal- ġrieden fil-bidu tad-do żar u mal-qatla skedata; 
kif ukoll it-terminu ta’ żball medju u asso ċjat (eż. SD, SEM) g ħal kull 
grupp ta’ trattament,  
— il-ħin tal-bidu u tas-sinjali ta’ tossi ċità, inklu ża l-irritazzjoni tal- ġilda 
fil-post fejn ing ħatat id-do ża, jekk ikun hemm, g ħal kull annimal,  
— ħin tat-tmiem tal-annimal u ħin tal-kejl ATP g ħal kull annimal,  
— tabella tal-valuri RLU tal- ġurdien individwali u valuri SI g ħal kull 
grupp ta’ trattament tad-do ża, 
— terminu ta’ żball medju u asso ċjat (eż. SD, SEM) g ħal RLU/ġurdien 
għal kull grupp tat-trattament u r-ri żultati tal-anali żi ta’ barra g ħal kull 
grupp ta’ trattament,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— l-SI kkalkulat u kejl xieraq tal-varjabbiltà li jikkunsidra l-varjabbiltà 
bejn l-annimali kemm fis-sustanza tat-test kif ukoll fil-gruppi ta’ 
kontroll,  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni,  
— analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq,  
Diskussjoni tar-ri żultati  
— kumment qasir dwar ir-ri żultati, l-anali żi tad-doża u r-reazzjoni, u 
analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq, b'konklu żjoni dwar jekk is-sustanza 
tat-test għandhiex titqies li tikkaw ża s-sensitizzazzjoni tal- ġilda. 
LETTERATURA  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327–333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node 
assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins.  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274–286.  
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Character ­
ization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1–10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11–26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90–96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81–88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127–132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Devel ­
opment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and 
bacterial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27–34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 
13–31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs. 
nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].  
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195–206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83–94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60–68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health , 53 563–79.
 
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Preċiżjoni:  Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u 
l-valuri aċċettati ta’ referenza. Hija mi żura tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar 
u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintu ża b’mod alternanti ma’ 
“konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta’ ri żultati korretti ta’ metodu ta’ 
ttestjar (38).  
Sustanza ta’ riferiment:  Sustanza sensitizzanti jew mhux sensitizzanti u żata bħala 
standard g ħat-tqabbil ma’ sustanza tat-test. Is-sustanza ta’ riferiment g ħandu 
jkollha l-karatteristi ċi li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità 
strutturali u funzjonali g ħall-klassi ta’ sustanzi li jkunu qed ji ġu ttestjati; (iii) 
karatteristi ċi fiżikokimiċi magħrufa; (iv) dejta ta’ appo ġġ dwar effetti 
magħrufa, u (v) potenza mag ħrufa fil-firxa ta’ rispons mixtieq.  
Negattiv falz:  Sustanza identifikata ħażin bħala negattiva jew mhux attiva 
b’metodu ta’ ttestjar, meta fil-fatt hija po żittiva jew attiva.  
Pożittiv falz:  Sustanza identifikata ħażin bħala pożittiva jew attiva minn test, 
meta fil-fatt hija negattiva jew mhux attiva.  
Periklu:  Il-potenzjal g ħal effett avvers g ħas-saħħa jew għall-ambjent. L-effett 
avvers jidher biss jekk hemm esponiment ta’ livell suffi ċjenti.  
Riproduċibbiltà bejn laboratorju u ie ħor: Kejl ta’ kemm il-laboratorji kwalifikati 
differenti, li ju żaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanzi tat-test, jistg ħu 
jipproduċu riżultati li huma simili b’mod kwalitattiv u kwantitattiv. 
Ir-riprodu ċibbiltà bejn laboratorju u ie ħor hija determinata matul il-pro ċessi ta’ 
qabel il-validazzjoni u tal-validazzjoni, u tindika kemm it-test jista’ ji ġi trasferit 
b’suċċess bejn laboratorji, u din tissejja ħ ukoll riprodu ċibbiltà bejn laboratorji 
(38).  
Riproduċibbiltà intralaboratorja:  Determinazzjoni ta’ kemm il-persuni 
kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jista’ jirnexxilhom jirreplikaw ir-ri żultati 
billi jużaw protokoll spe ċifiku fi żminijiet differenti. Din tissejja ħ ukoll ripro ­
duċibbiltà fi ħdan il-laboratorju (38).  
Outlier:  Outlier hija osservazzjoni li hija mmarkata differenti minn valuri o ħrajn 
f’kampjun aleatorju minn popolazzjoni.  
Assigurazzjoni tal-kwalità:  Proċess ta’ ġestjoni li permezz tieg ħu huma vvalutati 
l-aderenza mal-istandards ta’ ttestjar tal-laboratorji, ir-rekwi żiti u l-pro ċeduri ta’ 
żamma tar-rekords u l-pre ċiżjoni tat-trasferiment tad-dejta minn individwi li huma 
indipendenti minn dawk li jwettqu l-ittestjar.  
Affidabilità:  Miżuri li bihom, metodu ta’ ttestjar jista’ ji ġi riprodott ma ż-żmien, 
fost u bejn il-laboratorji stess, meta jwettqu l-istess protokoll. Din hija vvalutata 
billi tiġi kkalkolata r-riprodu ċibbiltà fi ħdan laboratorju u bejn laboratorju u ie ħor 
(38).  
Is-sensitizzazzjoni tal- ġilda:  Proċess immunolo ġiku li jitfa ċċa meta individwu 
suxxettibbli jkun espost b’mod topiku g ħal allerġen kimiku ta’ induzzjoni, li 
jipprovoka rispons immuni fil- ġilda li jista’ jwassal g ħall-iżvilupp ta’ sensitiz ­
zazzjoni mal-kuntatt.  
Indiċi ta’ Stimulazzjoni (SI):  Valur ikkalkolat sabiex jivvaluta l-potenzjal ta’ 
sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ sustanza tat-test li huwa l-proporzjon 
tal-proliferazzjoni fil-gruppi ttrattati g ħal dak fil-grupp ta’ kontroll ta’ mezz 
simultanju.  
Sustanza tat-test (li ssir referenza g ħaliha wkoll b ħala s-sustanza kimika tat-test):  
Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan it-TM.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  SENSITIZZAZZJONI TAL- ĠILDA: ANALI ŻI TAN-NODULU 
LIMFATIKU LOKALI BRDU-ELISA  
INTRODUZZJONI  
1. Il-Linji gwida tal-OECD g ħall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimi ċi u l-Metodi ta’ 
Ttestjar tal-UE bba żati fuqhom ji ġu analizzati minn żmien għal żmien 
fid-dawl tal-progress xjentifiku, ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu, u konsider ­
azzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali. L-ewwel Metodu ta’ 
Ttestjar (TM) (B.42) g ħad-determinazzjoni tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda 
fil-ġurdien, l-Anali żi tan-Nodi tal-Limfa Lokali (Local Lymph Node 
Assay — LLNA; Linja gwida 429 tat-Test tal-OECD) ġie rivedut (1 u 
Kapitolu B.42 f'dan l-Anness). Id-dettalji tal-validazzjoni tal-LLNA u 
l-analiżi tax-xog ħol assoċjat magħha ġew ippubblikati (2) (3) (4) (5) (6) 
(7) (8) (9). Fl-LLNA, tintu ża timidina jew jojdu radjoisotopiku biex 
titkejjel il-proliferazzjoni tal-limfo ċiti u għaldaqstant, l-anali żi għandha 
użu limitat fejn l-akkwi żizzjoni, l-u żu jew l-eliminazzjoni tar-radjuattività 
huma problemati ċi. L-LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immuno ­
sorbent Assay (Anali żi Immunosorbenti Relatata ma’ Enzima)] huwa 
modifika mhux radjuattiva g ħat-TM tal-LLNA, li tu ża 5-bromo-2-deossiu ­
ridina (BrdU) mhux radjutikkettata (Chemical Abstracts Service [CAS] 
Nru 59-14-3) f'sistema ta’ test ibba żata fuq ELISA biex titkejjel 
il-proliferazzjoni tal-limfo ċiti. L-LLNA: BrdU-ELISA ġie vvalidat u 
rivedut u rakkomandat minn panil internazzjonali ta’ anali żi minn pari 
xjentifika u indipendenti meqjus utli g ħall-identifikazzjoni ta’ sustanzi 
kimiċi sensitizzanti u mhux sensitizzanti, b' ċerti limitazzjonijiet (10) (11) 
(12). Dan it-TM huwa mfassal g ħall-valutazzjoni tal-potenzjal tas-sustanzi 
kimiċi li jikkaw żaw sensitizzazzjoni tal- ġilda (sustanzi u ta ħlitiet) 
fl-annimali. Kapitolu B.6 ta’ dan l-Anness u l-Linja Gwida 406 tat-Test 
OECD ju żaw fniek tal-Indi, b'mod partikolari t-test ta’ massimizzazzjoni 
tal-fniek tal-Indi u t-test Buehler (13). L-LLNA (Kapitolu B.42 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 429 tat-Test OECD) u ż-żewġ modifikazzjonijiet 
mhux radjuattivi, LLNA: BrdU-ELISA (Kapitolu B.51 ta’ dan l-Anness; 
Linja Gwida 442 B tat-Test OECD) u LLNA: DA (Kapitolu B.50 ta’ dan l-Anness; Linja Gwida 442 A tat-Test OECD), kollha jipprovdu vanta ġġ 
fuq it-testijiet tal-fniek tal-Indi f'B.6 u fil-Linja Gwida 406 tat-Test OECD 
13) f'termini ta’ tnaqqis u rfinar tal-u żu tal-annimali.
 
2. B'mod simili g ħal-LLNA, l-LLNA: BrdU-ELISA tistudja l-fa żi 
tal-induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda u tipprovdi dejta kwantitattiva 
xierqa għall-valutazzjoni tar-reazzjoni tad-do ża. Barra minn hekk, abilità li 
jinkixfu sensitizzaturi tal- ġilda ming ħajr il-ħtieġa li tintu ża radjutikketta 
għad-DNA telimina l-potenzjal g ħal esponiment fuq il-post tax-xog ħol 
għal kwistjonijiet ta’ radjuattività u ta’ rimi ta’ skart. Min-na ħa tiegħu, 
dan jista' jippermetti g ħall-użu miżjud ta’ ġrieden għall-kxif ta’ sensitiz ­
zaturi tal- ġilda, li jnaqqas ulterjorment l-u żu tal-fniek tal-Indi g ħal testijiet 
għal potenzjal ta’ sensitizzazzjoni tal- ġilda (jiġifieri B.6; Linja Gwida 406 
tat-Test OECD) (13).  
DEFINIZZJONIJIET  
3. Id-definizzjonijiet u żati huma pprovduti fl-Appendi ċi 1. 
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
4. L-LLNA: BrdU-ELISA huwa metodu tal-LLNA modifikat g ħall-identifi ­
kazzjoni tal-potenzjal ta’ sustanzi kimi ċi li huma sensitizzanti g ħall-ġilda, 
b'limitazzjonijiet spe ċifiċi. Din id-do ża mhux ne ċessarjament timplika li 
f'kull każ, l-LLNA: BrdU-ELISA g ħandha tintu ża minflok l-LLNA jew 
it-testijiet fuq il-fniek tal-Indi (ji ġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-test 
OECD) (13), i żda pjuttost li l-anali żi għandha l-istess mertu u tista' 
tintuża bħala alternattiva li fiha r-ri żultati pożittivi u negattivi ġeneralment 
ma jkunux je ħtieġu aktar konferma (10) (11). Il-laboratorju tal-ittestjar 
għandu jikkunsidra l-informazzjoni disponibbli kollha fuq is-sustanza 
tat-test qabel iwettaq l-istudju. Din l-informazzjoni g ħandha tinkludi 
l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza tat-test; il-karatteristi ċi 
fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta’ kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  
jew in vivo  fuq is-sustanza tat-test; u dejta tossikolo ġika dwar sustanzi  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
kimiċi strutturalment relatati. Din l-informazzjoni g ħandha titqies sabiex 
wieħed jiddetermina jekk l-LLNA: BrdU-ELISA hijiex adattata g ħas- 
sustanza (min ħabba n-nuqqas ta’ kompatibbiltà ta’ tipi limitati ta’ 
sustanzi kimi ċi mal-LLNA: BrdU-ELISA [ara paragrafu 5]) u sabiex 
tgħin fl-għażla tad-doża. 
5. L-LLNA: BrdU-ELISA huwa metodu  in vivo  u, b'konsegwenza ta’ dan, 
ma jeliminax l-u żu tal-annimali fil-valutazzjoni ta’ attività ta’ sensitiz ­
zazzjoni ta’ kuntatt aller ġiku. Madankollu, g ħandu l-potenzjal li jnaqqas 
l-użu tal-annimali g ħal dan il-g ħan meta mqabbel mat-testijiet bil-fniek 
tal-Indi (B.6; Linja gwida 406 tal-OECD) (13). Barra minn hekk, 
l-LLNA: BrdU-ELISA joffri rfinar sostanzjali tal-mod kif jintu żaw 
l-annimali g ħall-ittestjar ta’ sensitizzazzjoni ta’ kuntatt aller ġiku, 
minħabba li b'differenza minn B.6. u mil-Linja Gwida 406 tat-Test 
OECD, l-LLNA: BrdU-ELISA ma je ħtieġx li r-reazzjonijiet ta’ ipersensit ­
tività dermali indotti bi sfida jkunu enfasizzati. Barra minn hekk, l-LLNA: BrdU-ELISA ma je ħtieġx l-użu ta’ aġġuvant, b ħal fil-każ tat-test 
tal-massimizzazzjoni tal-fenek tal-Indi (Kapitolu B.6 ta’ dan 
l-Anness,13). B'hekk, l-LLNA: BrdU-ELISA inaqqas id-dieqa 
tal-annimal. Minkejja l-vanta ġġi tal-LLNA: BrdU-ELISA fuq B.6 u 
l-Linja Gwida 406 tat-Test OECD (13), hemm xi limitazzjonijiet li 
jistgħu jeħtieġu l-użu ta’ B.6 u l-Linja Gwida 13 tat-Test OECD (e ż. 
l-ittestjar ta’ ċerti metalli, sejbiet po żittivi foloz b' ċerti irritanti tal- ġilda 
[bħal xi sustanzi tat-tip tensjoattivi] (6) (1, u l-Kapitolu B.42 f'dan 
l-Anness), solubilità tas-sustanza tat-test). Barra minn hekk, il-klassijiet 
ta’ sustanzi kimi ċi jew sustanzi li fihom gruppi funzjonali li ntwerew li 
jaġixxu bħala konfondituri potenzjali (15) jistg ħu jeħtieġu l-użu ta’ testijiet 
fuq il-fniek tal-Indi (ji ġifieri B.6; Linja Gwida 406 tat-Test OECD (13)). 
Limitazzjonijiet li 
ġew identifikati g ħal-LLNA (1, u Kapitolu B.42 f'dan 
l-Anness) ġew rakkomandati sabiex japplikaw ukoll g ħal-LLNA: 
BrdU-ELISA (10). Minbarra dawn il-limitazzjonijiet identifikati, l-LLNA: BrdU-ELISA g ħandu jkun applikabbli g ħall-ittestjar ta’ 
kwalunkwe sustanza kimika diment li ma jkunx hemm karatteristi ċi 
assoċjati ma’ dawn is-sustanzi kimi ċi li jistg ħu jinterferixxu 
mal-preċiżjoni tal-LLNA: BrdU-ELISA. Barra minn hekk, g ħandha 
tingħata konsiderazzjoni g ħall-possibilità ta’ ri żulatati po żittivi tal-limitu 
meta jinkisbu valuri ta’ Indi ċi ta’ Stimulazzjoni (SI) ta’ bejn 1,6 u 1,9 
(ara l-paragrafi 31-32). Dan huwa bba żat fuq il-ba żi ta’ dejta ta’ vali ­
dazzjoni ta’ 43 sustanza li ju żaw SI ≥ 1,6 (ara paragrafu 6) li g ħalihom, 
l-LLNA: BrdU-ELISA identifika b'mod korrett it-32 sensitizzatur tal-LLNA, i żda b'mod inkorrett identifika tnejn minn 11-il nonsensitizzatur 
tal-LLNA b'valuri tal-SI ta’ bejn 1,6 u 1,9 (ji ġifieri linja tal-limitu 
pożittiva) (10). Madankollu, min ħabba li l-istess sett ta’ dejta ntu ża 
għall-issettjar tal-valuri SI u g ħall-kalkolu tal-karatteristi ċi ta’ tbassir 
tat-test, ir-ri żultati ddikjarati jistg ħu jkunu stima e ċċessiva 
tal-karatteristi ċi ta’ tbassir reali.
 
PRINĊIPJI TA' DAN IL-METODU TA' TTESTJAR  
6. Il-prin ċipju bażiku wara l-LLNA: BrdU-ELISA huwa li s-sensitizzaturi 
jikkawżaw il-proliferazzjoni ta’ limfo ċiti fin-noduli tal-limfa li jsaffu s-sit 
tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Din il-proliferazzjoni hija proporz ­
jonata mad-do ża u mal-qawwa tal-aller ġen applikat u tipprovdi mezz 
sempliċi ta’ kif wie ħed jikseb kejl kwantitattiv ta’ sensitizzazzjoni. 
Il-proliferazzjoni titkejjel billi wie ħed iqabbel il-proliferazzjoni medja 
f'kull grupp tat-test mal-proliferazzjoni medja fil-grupp ta’ kontroll ittrattati 
bil-mezzi (VC). Il-proporzjon tal-proliferazzjoni medja f'kull grupp ittrattat ma’ dak fil-grupp VC simultanju, imsejja ħ l-SI, jiġi stabbilit, u g ħandu 
jkun ≥ 1,6 qabel ma tkun me ħtieġa evalwazzjoni ulterjuri tas-sustanza 
tat-test b ħala sensitizzatur potenzjali tal- ġilda. Il-pro ċeduri deskritti 
hawnhekk huma bba żati fuq l-u żu tal-kejl tal-kontenut tal-BrdU biex
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
jindika għadd miżjud ta’ ċelloli proliferanti fin-noduli tal-limfa awrikolari 
li jsaffu. BrdU huwa analogu ta’ timidina u ji ġi inkorporat b'mod simili 
fid-DNA ta’ ċelloli li jipproliferaw. L-inkorporazzjoni tal-BrdU titkejjel 
b'ELISA, li tu ża antikorp spe ċifiku għall-BrdU li huwa ttikkettat ukoll 
b'perossida żi. Meta ji żdied is-substrat, il-perossida żi jirreaġġixxi 
mas-substrat biex jipprodu ċi prodott ikkulurit li ji ġi kwantifikat b'as ­
sorbenza spe ċifika permezz ta’ qarrej tal-plakka f'livell ta’ microtitre.  
DESKRIZZJONI TAL-ANALI ŻI 
Għażla tal-ispe ċi tal-annimali  
7. Il-ġurdien huwa l-ispe ċi tal-għażla għal dan it-test. Studji ta’ validazzjoni 
għal-BrdU-ELISA twettqu esklussivament bir-razza CBA/JN li g ħal­
daqstant hija kkunsidrata r-razza ppreferuta (10) (12). Jintu żaw ġrieden 
nisa adulti żgħar, li huma nulliparu żi u mhumiex tqal. Fil-bidu 
tal-istudju, l-annimali g ħandu jkollhom bejn 8 ġimgħat u 12-il ġimgħa, 
u l-varjazzjoni fil-pi ż tal-annimali g ħandha tkun minima u ma taqbi żx 
l-20 % tal-pi ż medju. Inkella, jistg ħu jintużaw razez o ħrajn u ġrieden 
irġiel meta tkun i ġġenerata bi żżejjed dejta li turi li ma je żistux differenzi 
sinifikanti spe ċifiċi għar-razez u/jew g ħas-sess fir-reazzjoni g ħal-LLNA: 
BrdU-ELISA.  
Kundizzjonijiet ta’ fejn jin żammu u x'jieklu  
8. Il-ġrieden għandhom jin żammu fi gruppi (16), sakemm ma ting ħatax 
loġika xjentifika adegwata g ħat-tqegħid tal-ġrieden f'ga ġeġ individwali. 
It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali g ħandha tkun ta’ 22 ± 
3 °C. G ħalkemm l-umidità relattiva g ħandha tkun mill-inqas 30 % u 
preferibbilment ma taqbi żx is-70 %, g ħajr waqt it-tindif tal-kamra, 
il-mira g ħandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, u 
s-sekwenza tkun 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. G ħall-għalf, 
jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista 
mingħajr limitu ta’ ilma tax-xorb.  
It-tħejjija tal-annimali  
9. L-annimali g ħandhom jintg ħażlu b'mod aleatorju, immarkati sabiex ikunu 
jistgħu jiġu identifikati individwalment (i żda mingħajr l-ebda forma ta’ 
mmarkar fil-widnejn), u mi żmuma fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-inqas 
ħamest ijiem qabel ma jibda d-do żar sabiex ikunu jistg ħu jidraw 
il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel il-bidu tat-trattament, l-annimali 
kollha jiġu eżaaminati sabiex ikun żgurat li huma ma jkollhom l-ebda 
feriti osservabbli fuq il- ġilda. 
It-tħejjija tas-soluzzjonijiet g ħad-dożar 
10. Is-sustanzi kimi ċi solidi g ħandhom jin ħallu jew ji ġu sospiżi f'sol­
venti/mezzi u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel l-applikazzjoni fuq 
il-widna tal- ġrieden. Is-sustanzi kimi ċi likwidi jistg ħu jiġu applikati 
waħedhom jew dilwiti qabel id-do żar. Is-sustanzi kimi ċi li ma jin ħallux, 
bħal dawk li naraw ġeneralment fl-apparat mediku, g ħandhom ikunu 
soġġetti għal estrazzjoni e żaġerata f'solvent adattat sabiex ji żvelaw 
il-kostitwenti kollha li jistg ħu jiġu estratti g ħall-ittestjar qabel ji ġu 
applikati fuq il-widna tal- ġrieden. Is-sustanzi tat-test g ħandhom jit ħejjew 
kuljum sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix li jistg ħu jinħażnu. 
Il-verifika tal-affidabbiltà  
11. Sustanzi kimi ċi ta’ kontroll po żittiv (PC) jintu żaw sabiex tintwera 
prestazzjoni xierqa tal-anali żi billi jirrea ġixxu b'sensittività adegwata u 
riproduċibbli bħala sustanza tat-test sensitizzanti li g ħaliha l-kobor 
tar-reazzjoni huwa kkaratterizzat sew. L-inklu żjoni ta’ PC simultanju hija 
rrakkomandata g ħaliex dan juri l-kompetenza tal-laboratorju biex iwettaq 
b'suċċess kull anali żi u tippermetti l-valutazzjoni u t-tqabbil 
tar-riprodu ċibbiltà fil-laboratorju u bejn il-laboratorji. Xi awtoritajiet rego ­
latorji jeħtieġu wkoll PC g ħal kull studju u g ħaldaqstant, l-utenti huma 
mħeġġa jikkonsultaw mal-awtoritajiet rilevanti qabel iwettqu l-LLNA: 
BrdU-ELISA: G ħalhekk, l-u żu ta’ rutina ta’ PC simultanju huwa rrak ­
komandat sabiex ti ġi evitata l- ħtieġa ta’ aktar ittestjar fuq l-annimali 
sabiex jintla ħqu tali rekwi żiti li jistg ħu jinħolqu mill-u żu ta’ PC 
perjodiku (ara l-paragrafu 12). Il-PC g ħandu jipprodu ċi rispons po żittiv ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
tal-LLNA: BrdU-ELISA f'livell ta’ esponiment li mistenni jag ħti żieda 
fl-SI > 1,6 fuq il-grupp ta’ kontroll negattiv (NC). Id-do ża tal-PC 
għandha tintg ħażel b'mod li ma tikkaw żax irritazzjoni e ċċessiva fil- ġilda 
jew tossi ċità sistemika u l-induzzjoni hija riprodu ċibbli iżda mhux 
eċċessiva (ji ġifieri SI > 14 ikun jitqies e ċċessiv). PC ippreferuti huma 
25 % eżil ċinnamaldeid (Numru tal-CAS 101-86-0) u 25 % ew ġenol 
(numru tal-CAS 97-53-0) fl-a ċetun:żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v). Jista' jkun 
hemm ċirkostanzi fejn, min ħabba ġustifikazzjoni adegwata, jistg ħu 
jintużaw PCs o ħrajn, li jissodisfaw il-kriterji ta’ hawn fuq.  
12. Filwaqt li l-inklu żjoni ta’ grupp ta’ PC simultanju hija rrakkomandata, 
jista' jkun hemm sitwazzjonijiet fejn l-ittestjar perjodiku (ji ġifieri f'in ­
tervalli ≤ 6 xhur) tal-PC jista' jkun adegwat g ħal-laboratorji li jag ħmlu 
l-LLNA: BrdU-ELISA b'mod regolari (ji ġifieri jag ħmlu l-LLNA: 
BrdU-ELISA fi frekwenza ta’ mhux inqas minn darba fix-xahar) u għandhom ba żi tad-dejta ta’ PC storika stabbilita li turi l-kapa ċità 
tal-laboratorju biex jikseb ri żultati riprodu ċibbli u eżatti b'PCs. Profi ċjenza 
adegwata bl-LLNA: BrdU-ELISA tista' tintwera b'su ċċess billi ji ġu 
ġġenerati riżultati pożittivi konsistenti bil-PC mill-inqas f'10 testijiet indi ­
pendenti li jsiru f'perjodu ta’ żmien raġonevoli (ji ġifieri inqas minn sena 
waħda).
 
13. Grupp ta’ PC simultanju g ħandu dejjem ikun inklu ż meta jkun hemm bidla 
fil-proċedura tal-LLNA: BrdU-ELISA (e ż. bidla fil-persunal im ħarreġ, 
bidla fil-materjali tal-metodu tat-test u/jew fir-rea ġenti, bidla fit-tag ħmir 
tal-metodu tat-test, bidla fis-sors tal-annimali tat-test), u dawn il-bidliet 
għandhom ji ġu ddokumentati fir-rapporti tal-laboratorju. G ħandu jiġi kkun­
sidrat l-impatt ta’ dawn il-bidliet fuq l-adegwatezza tal-ba żi tad-dejta 
storika stabbilita qabel ma ti ġi deċiża l-ħtieġa li tkun stabbilita ba żi 
tad-dejta storika ġdida sabiex tiddokumenta l-konsistenza fir-ri żultati 
tal-PC.  
14. Ir-ri ċerkaturi g ħandhom ikunu konxji li d-de ċiżjoni li jsir studju tal-PC fuq 
bażi perjodika minflok fl-istess ħin għandha konsegwenzi fuq 
l-adegwatezza u l-a ċċettabbiltà tar-ri żultati ta’ studju negattivi ġġenerati 
mingħajr PC simultanju waqt l-intervall bejn kull studju tal-PC perjodiku. 
Pereżempju, jekk jinkiseb ri żultat negattiv falz fl-istudju tal-PC perjodiku, 
ir-riżultati negattivi tas-sustanza tat-test miksuba fl-intervall bejn l-a ħħar 
studju tal-PC perjodiku a ċċettabbli u l-istudju tal-PC perjodiku mhux 
aċċettabbli jistg ħu jkunu dubbju żi. L-implikazzjonijiet ta’ dawn l-e żiti 
għandhom ji ġu kkunsidrati b'attenzjoni meta jkun de ċiż jekk għandhomx 
ikunu inklu żi PCs simultanji jew li jsiru biss PCs perjodi ċi. Għandu jiġi 
kkunsidrat ukoll l-u żu ta’ inqas annimali fil-grupp ta’ PC simultanju meta 
dan ikun i ġġustifikat xjentifikament u jekk il-laboratorju juri, fuq dejta 
storika spe ċifika għal-laboratorju, li jistg ħu jintużaw inqas ġrieden (17).  
15. Għalkemm il-PC g ħandu jiġi ttestjat fil-mezz li huwa mag ħruf li jqanqal 
reazzjoni konsistenti (e ż. aċetun: żejt taż-żebbuġa; 4:1, v/v), jista' jkun 
hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom l-ittestjar f'mezz mhux 
standard (formulazzjoni rilevanti klinikament/kimikament) ikun me ħtieġ 
ukoll (18). Jekk il-PC simultanju ji ġi ttestjat f'mezz differenti 
mis-sustanza tat-test, allura g ħandu jiġi inkluż VC separat g ħall-PC simul ­
tanja.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. F'ka żijiet fejn ikunu qeg ħdin jiġu vvalutati sustanzi tat-test ta’ klassi 
speċifika ta’ sustanzi kimi ċi jew firxa ta’ reazzjonijiet, is-sustanzi ta’ 
referenza jistg ħu jkunu utli wkoll sabiex juru li l-metodu ta’ ttestjar qed 
jaħdem sew sabiex isib il-potenzjal tas-sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ dawn 
it-tipi ta’ sustanzi tat-test. Is-sustanzi ta’ referenza adattati g ħandu jkollhom 
il-karatteristi ċi li ġejjin:  
— xebh strutturali u funzjonali mal-klassi ta’ sustanzi tat-test li qeg ħdin 
jiġu ttestjati,  
— karatteristi ċi fiżiċi/kimiċi magħrufa, 
— dejta ta’ appo ġġ mil-LLNA: BrdU-ELISA,  
— dejta ta’ appo ġġ minn mudelli o ħrajn ta’ annimali u/jew mill-bnedmin.  
IL-PROĊEDURA TAT-TEST  
Għadd ta’ annimali u livelli tad-do ża 
17. Għal kull grupp ta’ do ża għandhom jintu żaw tal-inqas erba' annimali, 
b'minimu ta’ tliet kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma’ 
grupp ta’ NC simultanju ttrattat biss bil-mezz g ħas-sustanza tat-test, u 
grupp ta’ PC (simultanju jew re ċenti, ibba żat fuq il-politika 
tal-laboratorju fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11-15). G ħandu jiġi kkunsidrat 
l-ittestjar ta’ do żi multipli tal-PC, b'mod spe ċjali meta wie ħed jittestja l-PC 
fuq bażi intermittenti. Apparti fin-nuqqas ta’ trattament bis-sustanza 
tat-test, l-annimali fil-gruppi ta’ kontroll g ħandhom ji ġu ġestiti u ttrattati 
b'mod identiku g ħall-annimali fil-gruppi tat-trattament.  
18. L-g ħażla tad-do ża u tal-mezz g ħandha tkun ibba żata fuq 
ir-rakkomandazzjonijiet mog ħtija fir-referenzi 2 u 19. Do żi konsekuttivi 
normalment jintg ħażlu minn sensiela xierqa ta’ kon ċentrazzjonijiet b ħal 
100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, e ċċ. Loġika xjentifika 
adegwata g ħandha takkumpanja l-g ħażla tas-sensiela ta’ kon ċen­
trazzjonijiet u żati. L-informazzjoni tossikolo ġika kollha e żistenti (e ż. 
tossiċità akuta u irritazzjoni fil- ġilda) u l-informazzjoni strutturali u fi żiko­
kimika dwar is-sustanza tat-test ta’ interess (u/jew sustanzi relatati struttur ­
alment) g ħandhom ji ġu kkunsidrati meta jkunu disponibbli, fl-g ħażla 
tat-tliet kon ċentrazzjonijiet konsekuttivi biex b'hekk l-og ħla konċen­
trazzjoni timmassimizza l-esponiment filwaqt li tevita t-tossi ċità 
sistemika u/jew l-irritazzjoni lokali e ċċessiva fil- ġilda (19)(20 u Kapitolu 
B.4 ta’ dan l-Anness). Fin-nuqqas ta’ informazzjoni b ħal din, jista' jkun 
meħtieġ test inizjali qabel l-iskrinjar (ara l-paragrafi 21-24).  
19. Il-mezz ma g ħandux jinterferixxi ma’ jew jinfluwenza r-ri żultat tat-test u 
għandu jintg ħażel fuq il-ba żi tal-massimizzazzjoni tas-solubbiltà sabiex 
tinkiseb l-og ħla konċentrazzjoni li tista' tinkiseb filwaqt li ti ġi prodotta 
soluzzjoni/sospensjoni adattata g ħall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. 
Il-mezzi rakkomandati huma a ċetun: żejt taż-żebbuġa (4:1, v/v),  N,N -dime­
tilformammid, metiletilketon, propilen glikol, u dimetilsulfossidu (6) i żda 
jistgħu jintużaw oħrajn jekk ting ħata loġika xjentifika suffi ċjenti. F'ċerti 
sitwazzjonijiet, jista' jkun me ħtieġ li jsir u żu minn solvent kimikament 
rilevanti jew mill-formulazzjoni kummer ċjali li fiha s-sustanza tat-test 
hija kkummer ċjalizzata b ħala kontroll addizzjonali. G ħandha ting ħata 
attenzjoni partikolari sabiex ikun żgurat li s-sustanzi idrofili ċi tat-test 
ikunu inkorporati f'sistema ta’ mezzi, li xxarrab il- ġilda u ma ċċarċarx 
mal-ewwel, permezz tal-inkorporazzjoni ta’ sustanzi li j ħollu xierqa (e ż. 
1 % Pluronic® L92). G ħalhekk, mezzi g ħal kollox likwidi g ħandhom ji ġu 
evitati.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. L-ippro ċessar ta’ noduli tal-limfa minn ġrieden individwali jippermetti 
l-valutazzjoni tal-varjabbiltà bejn l-annimali u tqabbil statistiku 
tad-differenza bejn is-sustanza tat-test u l-kejl tal-grupp VC (ara paragrafu 33). Barra minn hekk, il-valutazzjoni tal-possibbiltà li jitnaqqas l-g ħadd ta’ ġrieden fil-grupp PC hija fattibbli meta tin ġabar 
dejta dwar annimali individwali (17). Barra minn hekk, ċerti awtoritajiet 
regolatorji jitolbu l- ġbir ta’ dejta dwar annimali individwali. Ġbir regolari 
ta’ dejta dwar annimali individwali jipprovdi vanta ġġ mil-lat tal-benesseri 
tal-annimal billi jevita ttestjar doppju li jkun me ħtieġ li kieku r-ri żultati 
tas-sustanza tat-test li tkun in ġabret oriġinarjament b'xi mod (e ż. permezz 
ta’ dejta mi ġbura dwar l-annimali) kellhom ji ġu kkunsidrati aktar tard 
mill-awtoritajiet regolatorji ma’ rekwi żiti oħrajn (eż. dejta individwali 
dwar l-annimali).
 
Test ta’ qabel l-iskrinjar  
21. Fin-nuqqas ta’ informazzjoni sabiex tkun stabbilita l-og ħla doża li għandha 
tiġi ttestjata (ara paragrafu 18), g ħandu jsir test ta’ qabel l-iskrinjar sabiex 
jiġi definit il-livell ta’ do ża xierqa li g ħandha tiġi ttestjata fl-LLNA: 
BrdU-ELISA. L-g ħan tat-test ta’ qabel l-iskrinjar huwa li jipprovdi 
gwida g ħall-għażla tal-livell tad-do ża massima g ħall-użu fl-istudju 
tal-LLNA:BrdU-ELISA prin ċipali, fejn informazzjoni dwar 
il-konċentrazzjoni li twassal g ħal tossiċità sistemika (ara paragrafu 24) 
u/jew għal irritazzjoni e ċċessiva lokali tal- ġilda (ara paragrafu 23) 
mhijiex disponibbli. Il-livell massimu tad-do ża ttestjata g ħandu jkun kon ċ­
entrazzjoni ta’ 100 % tas-sustanza tat-test g ħal-likwidi jew 
il-konċentrazzjoni massima possibbli g ħas-solidi jew g ħas-sospensjonijiet.  
22. It-test ta’ qabel l-iskrinjar isir ta ħt l-istess kundizzjonijiet tal-istudju ewlieni 
tal-LLNA: BrdU-ELISA, ħlief għall-fatt li ma hemmx valutazzjoni 
tal-proliferazzjoni tan-noduli tal-limfa u li jistg ħu jintużaw inqas 
annimali g ħal kull grupp ta’ do ża. Huwa ssu ġġerit li jintu ża annimal 
wieħed jew tnejn g ħal kull grupp ta’ do ża. Il-ġrieden kollha ji ġu 
osservati kuljum g ħal kwalunkwe sinjal kliniku ta’ tossi ċità sistemika 
jew irritazzjoni lokali fis-sit tal-applikazzjoni. Il-pi żijiet tal-ġisem jiġu 
ddokumentati qabel it-test u wara li jintemm (Jum 6). I ż-żewġ widniet 
ta’ kull ġurdien jiġu osservati g ħall-eritema u jing ħataw punte ġġ skont 
it-Tabella 1 (20, u Kapitolu B.4 ta’ dan l-Anness). Jittie ħed il-kejl 
tal-ħxuna tal-widna permezz ta’ gej ġ ta’ ħxuna (eż. mikrometru di ġitali 
jew gejġ tal-ħxuna Peacock Dial) fl-ewwel Jum (qabel id-do ża), fit-tielet 
Jum (madwar 48 sieg ħa wara l-ewwel do ża), u fis-sitt Jum. Barra minn 
hekk, fis-sitt Jum, il- ħxuna tal-widna tista' ti ġi stabbilita permezz ta’ deter ­
minazzjonijiet tal-pi ż bl-immarkar tal-widnejn, li g ħandu jsir wara li 
l-annimali jinqatlu b'mod uman. L-irritazzjoni lokali e ċċessiva tal- ġilda 
hija indikata b'punte ġġ ta’ eritema ≥ 3 u/jew ħxuna tal-widna ta’ ≥ 
25 % fi kwalunkwe jum tal-kejl (21) (22). L-og ħla doża magħżula għall- 
istudju ewlieni tal-LLNA: BrdU-ELISA tkun id-do ża l-aktar baxxa li jmiss 
fis-sensiela ta’ kon ċentrazzjonijiet ta’ qabel l-iskrinjar (ara paragrafu 18) li 
ma tikkaw żax tossiċità sistemika u/jew irritazzjoni lokali e ċċessiva 
tal-ġilda. 
Tabella 1  
Punteġġi għall-Eritema  
Osservazzjoni Punte ġġ 
L-ebda eritema 0 
Ftit li xejn eritema (bil-kemm tidher) 1 Eritema definita sew 2
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Osservazzjoni Punte ġġ 
Eritema moderata sa severa 3 
Eritema severa ( ħmura qawwija) sa formazzjoni ta’ tessut 
oħxon u danne ġġat li jipprevjeni l-klassifikazzjoni tal-eritema 4 
23. Minbarra żieda ta’ 25 % fil- ħxuna tal-widna (21) (22), intu żat ukoll żieda 
statistikament sinifikanti fil- ħxuna tal-widna fil- ġrieden ittrattati meta 
mqabbla mal- ġrieden tal-kontroll sabiex ji ġu identifikati sustanzi irritanti 
fl-LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Madankollu, g ħalkemm jistg ħu 
jseħħu żidiet statistikament sinifikanti meta l- ħxuna tal-widna tkun inqas 
minn 25 % dawn ma ġewx asso ċjati b'mod spe ċifiku ma’ irritazzjoni 
eċċessiva (25) (26) (27) (28) (29).  
24. L-osservazzjonijiet klini ċi li ġejjin jistg ħu jindikaw tossi ċità sistemika (30) 
meta jintu żaw bħala parti minn valutazzjoni integrata u g ħalhekk jistg ħu 
jindikaw il-livell massimu tad-do ża li għandha tintu ża fl-LLNA: 
BrdU-ELISA ewlenija: bidliet fil-funzjoni tas-sistema nervu ża (eż. pil 
wieqaf, atassja, rog ħda, u konvul żjonijiet); bidliet fl-im ġiba (eż. aggres­
sività, bidla fl-attività tal-indafa, bidla sinifikanti fil-livell ta’ attività); bidliet fit-tendenzi respiratorji (ji ġifieri bidliet fil-frekwenza u fl-intensità 
tan-nifs b ħal dispneja, nifs maqtug ħ, u ħsejjes mill-pulmun (rales), u 
bidliet fil-konsum tal-ikel u tal-ilma. Barra minn hekk, sinjali ta’ letarġija u/jew nuqqas ta’ reazzjoni u kull sinjal kliniku ie ħor ta’ aktar 
minn uġigħ jew tbatija żgħira jew momentanja, jew tnaqqis ta’ > 5 % 
fil-piż tal-ġisem minn Jum 1 sa Jum 6 u mortalità, g ħandhom ji ġu kkun­
sidrati fl-evalwazzjoni. Annimali moribondi jew annimali li juru sinjali ta’ uġigħ jew dieqa severa g ħandhom jinqatlu b'mod uman (31).
 
Skeda ta’ sperimentazzjoni tal-istudju ewlieni  
25. L-iskeda sperimentali tal-anali żi hija kif ġej: 
— Jum 1:  Identifika individwalment u ħu nota tal-pi ż ta’ kull annimal u 
ta’ kwalunkwe osservazzjoni klinika. Applika 25 μL tad-dilwizzjoni 
xierqa tas-sustanza tat-test, il-mezz wa ħdu, jew il-PC (simultanja jew 
reċenti, skont il-politika tal-laboratorju fl-ikkunsidrar tal-paragrafi 11- 
15), fuq in-na ħa ta’ wara ta’ kull widna.  
— Jiem 2 u 3:  Irrepeti l-pro ċedura ta’ applikazzjoni li g ħamilt f'Jum 1.  
— Jum 4:  L-ebda trattament.  
— Jum 5:  Injetta 0,5 mL (5 mg/ ġurdien) ta’ soluzzjoni BrdU (10 mg/mL) 
ġewwa l-peritonju.  
— Jum 6:  Ħu nota tal-pi ż ta’ kull annimal u ta’ kwalunkwe osservazzjoni 
klinika. Madwar 24 sieg ħa (24h) wara l-injezzjoni tal-BrdU, oqtol 
l-annimali b'mod uman. Aqta' barra n-nodi limfati ċi awrikulari li 
jkunu qed inixxu minn kull widna tal- ġurdien u ppro ċessa separ ­
atament f'ilma bil-mel ħ ibbaferjat bil-fosfat (PBS) g ħal kull annimal. 
Id-dettalji u d-dijagrammi tal-identifikazzjoni u d-dissezzjoni 
tan-noduli limfati ċi tinsab fir-referenza (17). Sabiex tkompli tissorvelja 
r-reazzjoni lokali tal- ġilda fl-istudju ewlieni, jistg ħu jiġu inklużi 
parametri o ħrajn bħall-għoti ta’ punti g ħall-eritema fil-widna jew 
il-kejl tal- ħxuna tal-widna (miksuba kemm permezz ta’ gej ġ 
tal-ħxuna, kif ukoll permezz tad-determinazzjonijiet tal-pi żijiet 
bl-immarkar tal-widna fl-awtopsja) fil-protokoll tal-istudju.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
It-tħejjija tas-sospensjonijiet ta ċ-ċelloli  
26. Minn kull ġurdien, tit ħejja sospensjoni ta’ ċellola wa ħdanija ta’ ċelloli 
tan-nodi limfati ċi (LNC — lymph node cells) maqtug ħin bilateralment 
b'diżaggregazzjoni mekkanika ħafifa permezz ta’ xibka tal-istainless steel 
b'malja ta’ 200 micron jew permezz ta’ teknika a ċċettabbli o ħra għall- 
ġenerazzjoni ta’ sospensjoni ta’ ċellola wa ħda (eż. użu ta’ pestle 
tal-plastik li tintrema wara l-u żu sabiex jitfarrku n-nodi limfati ċi segwit 
minn mog ħdija minn malja tan-najlon ta’ #70). Il-pro ċedura għat-tħejjija 
tas-sospensjoni LNC hija kritika f'din l-anali żi u għaldaqstant, kull 
operatur g ħandu jistabbilixxi l- ħila bil-quddiem. Barra minn hekk, 
in-nodi limfati ċi f'annimali NC huma żgħar, għalhekk operazzjoni attenta 
hija importanti sabiex ikun evitat kwalunkwe effett artifi ċjali fuq il-valuri 
SI. F'kull ka ż, il-volum fil-mira tas-sospensjoni LNC g ħandu jiġi aġġustat 
sa volum ottimizzat determinat (bejn wie ħed u ieħor 15 mL). Il-volum 
ottimizzat huwa bba żat fuq l-il ħiq ta’ assorbenza medja tal-grupp NC fi 
ħdan 0,1–0,2.  
Determinazzjoni tal-proliferazzjoni ċellolari (kejl tal-kontenut tal-BrdU 
fid-DNA ta’ limfo ċiti) 
27. Il-BrdU titkejjel b'ELISA permezz ta’ kit kummer ċjali ( eż. Roche Applied 
Science, Mannheim, Ġermanja, Numru tal-Katalgu 11 647 229 001). 
Fil-qosor, 100 μL tas-sospensjoni tal-LNC ti żdied mal-bjar ta’ mikroplatt 
b'qiegħ ċatt fi triplikat. Wara fissazzjoni u denaturazzjoni tal-LNC, 
l-antikorp kontra l-BrdU ji żdied ma’ kull bir u jit ħalla jirrea ġġixxi. Susseg ­
wentement, l-antikorp kontra l-BrdU jitne ħħa bil-ħasil u mbag ħad, 
is-soluzzjoni tas-substrat ti żdied u tit ħalla tipprodu ċi kromo ġen. 
Imbagħad titkejjel l-assorbenza ta’ 370 nm b'wavelength ta’ referenza ta’ 
492 nm. Fil-ka żijiet kollha, il-kundizzjonijiet tat-test tal-anali żi għandhom 
jiġu ottimizzati (ara paragrafu 26).  
OSSERVAZZJONIJIET  
Osservazzjonijiet klini ċi 
28. Kull ġurdien għandu jiġi osservat b'attenzjoni mill-inqas darba kuljum g ħal 
kwalunkwe sinjal kliniku, kemm ta’ irritazzjoni lokali fil-post 
tal-applikazzjoni jew ta’ tossi ċità sistemika. L-osservazzjonijiet kollha 
jiġu rreġistrati b'mod sistematiku u jin żammu rekords g ħal kull ġurdien. 
Il-pjani ta’ sorveljanza g ħandhom jinkludu kriterji sabiex ji ġu identifikati 
mill-ewwel dawk il- ġrieden li juru tossi ċità sistemika, irritazzjoni lokali 
eċċessiva tal- ġilda, jew tmermir tal- ġilda għall-ewtana żja (31).  
Piżijiet tal-ġisem  
29. Kif iddikjarat fil-paragrafu 25, il-pi żijiet tal-ġisem tal-annimali individwali 
għandhom jitkejlu fil-bidu tat-test u fil-qatla b'mod uman skedata.  
KALKOLU TAR-RI ŻULTATI  
30. Ir-ri żultati għal kull grupp ta’ trattament huma espressi b ħala l-SI medja. 
L-SI jinkiseb billi wie ħed jiddividi l-indi ċi medju ta’ ttikkettar 
tal-BrdU/ ġurdien f'kull grupp tas-sustanza tat-test u l-grupp tal-PC, 
bl-indiċi medju ta’ ttikkettar tal-BrdU g ħall-grupp tas-solvent/VC. L-SI 
medju għall-VCs imbag ħad ikun wie ħed. 
L-indiċi tat-tikkettar tal-BrdU huwa definit b ħala: 
Indiċi tat-tikkettar tal-BrdU = (ABS  em – ABS vojt  em ) – (ABS  ref – ABS vojt  ref ) 
Fejn; em = wavelength tal-emissjoni; u ref = wavelength ta’ referenza.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Il-pro ċess tad-de ċiżjoni jqis ri żultat bħala pożittiv meta SI ≥ 1,6 (10). 
Madankollu, il-qawwa tar-relazzjoni tad-do ża-reazzjoni, is-sinifikat stat ­
istiku u l-konsistenza tas-solvent/mezz u r-reazzjonijiet tal-PC jistg ħu 
jintużaw ukoll sabiex wie ħed jiddetermina jekk ri żultat marġinali (jiġifieri 
valur SI bejn 1,6 u 1,9) ji ġix iddikjarat po żittiv (3) (6) (32).  
32. Għal rispons po żittiv marġinali bejn SI ta’ 1,6 u 1,9, l-utenti jistg ħu jkunu 
jridu jikkunsidraw informazzjoni addizzjonali b ħar-relazzjoni do ża- 
reazzjoni, evidenza ta’ tossi ċità sistemika jew irritazzjoni e ċċessiva, u 
fejn xieraq, sinifikat statistiku flimkien ma’ valuri SI sabiex ji ġi kkon­
fermat li tali ri żultati huma po żittivi (10). G ħandhom ji ġu kkunsidrati 
d-diversi karatteristi ċi tas-sustanza tat-test, inklu ż jekk g ħandhiex 
relazzjoni strutturali ma’ sustanzi mag ħrufa li jo ħolqu sensititizzazzjoni 
fil-ġilda, jekk tikkaw żax irritazzjoni e ċċessiva fil- ġilda tal-ġurdien, u 
n-natura tad-do ża-reazzjoni osservata. Dawn u konsiderazzjonijiet o ħrajn 
huma diskussi fid-dettall x'imkien ie ħor f'dan id-dokument (4).  
33. Il-ġbir ta’ dejta fil-livell tal- ġurdien individwali jippermetti li ssir anali żi 
statistika g ħall-preżenza u l-grad ta’ relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni 
fid-dejta. Kull valutazzjoni statistika tista' tinkludi valutazzjoni tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni kif ukoll tqabbil a ġġustat kif 
xieraq tal-gruppi tat-test (e ż. grupp iddo żat f'pari kontra tqabbil ta’ 
kontroll ta’ solvent simultanju/VC simultanji). L-anali żijiet statisti ċi 
jistgħu jinkludu, e ż. regressjoni lineari jew it-test ta’ William g ħall-valu­
tazzjoni tat-tendenzi tad-do ża u tar-reazzjoni, u t-test ta’ Dunnett g ħal 
tqabbil tal-pari. Meta jag ħżel metodu xieraq g ħall-analiżi statistika, 
ir-riċerkatur g ħandu jkun konxju mill-inugwaljanzi possibbli 
tad-differenzi u problemi o ħrajn relatati li jistg ħu jeħtieġu trasformazzjoni 
tad-dejta jew anali żi statistika mhux parametrika. Fi kwalunkwe ka ż, 
ir-riċerkatur jista' je ħtieġ li jagħmel kalkoli tal-SI u anali żijiet statisti ċi 
b'ċerti punti ta’ dejta jew ming ħajrhom (li xi drabi jissej ħu “anomaliji” 
(outliers)).
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
34. Id-dejta g ħandha ting ħata fil-qosor f'g ħamla ta’ tabella li turi l-valuri 
tal-indiċi tat-tikkettar tal-BrdU tal-annimal individwali, l-indi ċi 
tat-tikkettar tal-BrdU medju tal-grupp/annimal, it-terminu ta’ żball 
assoċjat tiegħu (eż. SD, SEM), u l-SI medju g ħal kull grupp ta’ do ża 
meta mqabbel mas-solvent/grupp ta’ kontroll tal-mezz simultanju.  
Rapport tat-test  
35. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanzi kimi ċi tat-test u ta’ kontroll  
— dejta tal-identifikazzjoni (e ż. in-numru tal-CAS u tal-KE, jekk 
disponibbli; is-sors; il-purità; l-impuritajiet mag ħrufa; in-numru 
tal-lott),  
— in-natura fi żika u l-karatteristi ċi fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, stab ­
biltà, solubilità),  
— jekk ta ħlita, il-kompo żizzjoni u l-per ċentwali relattivi tal-komponenti,  
Solvent/mezz  
— dejta tal-identifikazzjoni (purità; kon ċentrazzjoni, fejn xieraq; il-volum 
użat); 
— raġuni għall-għażla tal-mezz,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Annimali tat-test  
— is-sors tal- ġrieden tas-CBA,  
— l-istatus mikrobijolo ġiku tal-annimali, meta jkun mag ħruf, 
— l-għadd u l-età tal-annimali,  
— is-sors tal-annimali, il-kundizzjonijiet tal-ga ġeġ, id-dieta, e ċċ., 
Kondizzjonijiet tat-test  
— is-sors, in-numru tal-lott u assigurazzjoni tal-kwalità 
tal-manifattur/dejta ta’ kontroll tal-kwalità (sensittività tal-antikorp u 
speċifiċità u l-limitu ta’ kxif) g ħall-kit tal-ELISA,  
— dettalji dwar it-t ħejjija u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test,  
— raġuni għall-għażla tad-do ża (inklużi riżultati mit-test ta’ qabel 
l-iskrinjar, jekk ikun sar),  
— il-kon ċentrazzjonijiet tal-mezz u tas-sustanza tat-test u żati, u l-ammont 
totali tas-sustanza tat-test applikata,  
— dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu ż it-tip/is-sors tad-dieta, 
is-sors tal-ilma),  
— dettalji dwar l-iskedi tat-trattament u tat-te ħid ta’ kampjuni,  
— metodi ta’ kejl tat-tossi ċità, 
— kriterji li ntu żaw sabiex l-istudji ji ġu kkunsidrati po żittivi jew negattivi,  
— dettalji dwar kwalunkwe devjazzjoni mill-protokoll u spjegazzjoni 
dwar kif id-devjazzjoni taffettwa d-disinn u r-ri żultati tal-istudju,  
Verifika tal-affidabilità  
— sommarju tar-ri żultati tal-a ħħar kontroll tal-affidabbiltà, inklu ża inform­
azzjoni dwar is-sustanza tat-test, il-kon ċentrazzjoni u l-mezz u żati, 
— PC simultanju u/jew storiku u dwar dejta ta’ kontroll negattiv 
simultanju (solvent/mezz) g ħal-laboratorju li qed jag ħmel it-test,  
— jekk ma kienx hemm inklu ż PC simultanju, id-dejta u r-rapport 
tal-laboratorju g ħall-aktar PC perjodiku re ċenti u rapport li jag ħti 
dettalji dwar id-dejta storika tal-PC g ħal-laboratorju li ti ġġustifika 
l-bażi għaliex ma sarx PC simultanju,  
Ir-riżultati  
— piżijiet individwali tal- ġrieden fil-bidu tad-do żar u mal-qatla b'mod 
uman skedata; kif ukoll il-medja u t-terminu ta’ żball asso ċjat (eż. 
SD, SEM) g ħal kull grupp ta’ trattament,  
— il-ħin tal-bidu u tas-sinjali ta’ tossi ċità, inklu ża l-irritazzjoni tal- ġilda 
fil-post fejn ing ħatat id-do ża, jekk ikun hemm, g ħal kull annimal,  
— tabella tal-valuri tal-indi ċi tat-tikkettar tal-BrdU u tal-valuri SI 
tal-ġurdien individwali g ħal kull grupp ta’ trattament,  
— terminu ta’ żball medju u asso ċjat (eż. SD, SEM) g ħal indiċi 
tat-tikkettar tal-BrdU/ ġurdien g ħal kull grupp tat-trattament u 
r-riżultati tal-anali żi ta’ barra g ħal kull grupp ta’ trattament,  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— l-SI kkalkulat u kejl xieraq tal-varjabbiltà li jikkunsidra l-varjabbiltà 
bejn l-annimali kemm fis-sustanza tat-test kif ukoll fil-gruppi ta’ 
kontroll,  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-reazzjoni,  
— analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq,  
Diskussjoni tar-ri żultati  
— kumment qasir dwar ir-ri żultati, l-anali żi tad-doża u r-reazzjoni, u 
analiżijiet statisti ċi, fejn xieraq, b'konklu żjoni dwar jekk is-sustanza 
tat-test għandhiex titqies li tikkaw ża s-sensitizzazzjoni tal- ġilda. 
LETTERATURA  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Linja Gwida 
tat-Test Nru 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pari ġi. 
Disponibbli fuq is-sit: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. u Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. u Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. u Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33.  
(5) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, 
H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employement of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Disponibbli fuq: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication Nru 10-7552 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Disponibbli fuq is-sit: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/ 
llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibbli fuq is-sit: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. u Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Linja Gwida tat-Test Nru 406, Guidelines 
for Testing of Chemicals, OECD, Pari ġi. Disponibbli fuq is-sit: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. u Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. u Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7 edizzjoni. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibbli fuq is-sit:[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.
 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Linja Gwida tat-Test 
Nru 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pari ġi. Disponibbli 
fuq is-sit: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. u DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Disponibbli fuq is-sit: [http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. u Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. u Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. u Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. u Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and 
comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. u Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round. 
Toxicol., 212, 60–68.
 
(28) Vohr, H.W. u Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. u Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023–1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponibbli fuq is-sit:[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ acutetox/Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment Nru 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariġi. Disponibbli fuq is-sit: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., 
Hastings, K.L. (1998). An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment Nru 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pari ġi. Disponibbli 
fuq is-sit: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Preċiżjoni:  Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-ri żultati tal-metodu ta’ ttestjar u 
l-valuri aċċettati ta’ referenza. Hija mi żura tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar 
u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintu ża b’mod alternanti ma’ 
“konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta’ ri żultati korretti ta’ metodu ta’ 
ttestjar (33).  
Sustanza ta’ riferiment:  Sustanza sensitizzanti jew mhux sensitizzanti u żata bħala 
standard g ħat-tqabbil ma’ sustanza tat-test. Sustanza ta’ riferiment g ħandu jkollha 
l-karatteristi ċi li ġejjin: (i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità strutturali u 
funzjonali g ħall-klassi ta’ sustanzi li jkunu qed ji ġu ttestjati; (iii) karatteristi ċi 
fiżiċi/kimiċi magħrufa; (iv) dejta ta’ appo ġġ dwar effetti mag ħrufa, u (v) potenza 
magħrufa fil-firxa ta’ rispons mixtieq.  
Negattiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala negattiv jew mhux attiva 
b’metodu ta’ ttestjar, meta fil-fatt hija po żittiva jew attiva (33).  
Pożittiv falz:  Sustanza tat-test identifikata ħażin bħala pożittiva jew attiva minn 
test, meta fil-fatt hija negattiva jew mhux attiva (33).  
Periklu:  Il-potenzjal g ħal effett avvers g ħas-saħħa jew għall-ambjent. L-effett 
avvers jidher biss jekk hemm esponiment ta’ livell suffi ċjenti.  
Riproduċibbiltà bejn laboratorju u ie ħor: Kejl ta’ kemm il-laboratorji kwalifikati 
differenti, li ju żaw l-istess protokoll u li jittestjaw l-istess sustanza tat-test, jistg ħu 
jipproduċu riżultati li huma simili b’mod kwalitattiv u kwantitattiv. 
Ir-riprodu ċibbiltà bejn laboratorju u ie ħor hija determinata matul il-pro ċessi ta’ 
qabel il-validazzjoni u tal-validazzjoni, u tindika kemm it-test jista’ ji ġi trasferit 
b’suċċess bejn laboratorji, u din tissejja ħ ukoll riprodu ċibbiltà bejn laboratorji 
(33).  
Riproduċibbiltà intralaboratorja:  Determinazzjoni ta’ kemm il-persuni 
kwalifikati fi ħdan l-istess laboratorju jista’ jirnexxilhom jirrepplikaw ir-ri żultati 
billi jużaw protokoll spe ċifiku fi żminijiet differenti. Din tissejja ħ ukoll ripro ­
duċibbiltà fi ħdan il-laboratorju (33).  
Outlier:  Outlier hija osservazzjoni li hija mmarkata differenti minn valuri o ħrajn 
f’kampjun aleatorju minn popolazzjoni.  
Garanzija tal-kwalità:  Proċess ta’ ġestjoni li permezz tieg ħu huma vvalutati 
l-aderenza mal-istandards ta’ ttestjar tal-laboratorji, ir-rekwi żiti u l-pro ċeduri ta’ 
żamma tar-rekords u l-pre ċiżjoni tat-trasferiment tad-dejta minn individwi li huma 
indipendenti minn dawk li jwettqu l-ittestjar.  
Affidabilità:  Miżuri li bihom, metodu ta’ ttestjar jista’ ji ġi riprodott ma ż-żmien, 
fost u bejn il-laboratorji stess, meta jwettqu l-istess protokoll. Din hija vvalutata billi tiġi kkalkolata r-riprodu ċibbiltà fi ħdan laboratorju u bejn laboratorju u ie ħor 
(33).
 
Is-sensitizzazzjoni tal- ġilda:  Proċess immunolo ġiku li jitfa ċċa meta individwu 
suxxettibbli jkun espost b’mod topiku g ħal allerġen kimiku ta’ induzzjoni, li 
jipprovoka reazzjoni immuni fil- ġilda li tista’ twassal g ħall-iżvilupp ta’ sensitiz ­
zazzjoni mal-kuntatt.  
Indiċi ta’ Stimolazzjoni (SI):  Valur ikkalkolat sabiex jivvaluta l-potenzjal ta’ 
sensitizzazzjoni tal- ġilda ta’ sustanza tat-test li huwa l-proporzjon 
tal-proliferazzjoni fil-gruppi ttrattati g ħal dak fil-grupp ta’ kontroll ta’ mezz 
simultanju.  
Sustanza tat-test (li ssir referenza g ħaliha wkoll b ħala s-sustanza kimika tat-test):  
Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan it-TM.  ▼M3 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  TOSSIĊITÀ TA’ INALAZZJONI AKUTA – METODU TA’ KLASSI 
AKUTA TOSSIKA  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
436 (2009) tal-OECD. L-ewwel TG 403 dwar inalazzjoni akuta kienet 
adottata fl-1981, u minn dak i ż-żmien ‘l hawn kienet irrriveduta (ara 
l-kapitolu B.2 ta’ dan l-Anness (1)). Żvilupp ta’ metodu ta’ Klassi ta’ 
Inalazzjoni Akuta Tossika (ATC) (2) (3) (4) tqies li kien xieraq wara l-adozzjoni tal-metodu ta’ ATC orali rivedut (il-kapitolu B.1 tris ta’ dan 
l-Anness) (5). Valutazzjoni retrospettiva tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ 
ttestjar ta’ ATC g ħal tossiċità ta’ inalazzjoni akuta wera li l-metodu kien 
tajjeb biex jintu ża għal finijiet ta’ Klassifikazzjoni u Tikkettar (6). Il-Metodu 
ta’ Ttestjar ta’ ATC ta’ inalazzjoni jippermetti l-u żu ta’ stadji wie ħed wara 
ieħor ta’ kon ċentrazzjonijiet immirati fissi biex tkun ipprovduta gradazzjoni 
ta’ tossiċità tal-kimika g ħall-ittestjar. Il-letalità tintu ża bħala punt ta’ tmiem 
ewlieni, i żda annimali f’u ġigħ sever jew f’diffikultà, fi tbatija jew f’mewta 
imminenti g ħandhom jinqatlu b’mod uman biex titnaqqas it-tbatija. Gwida 
dwar il-Punti tat-Tmiem b’Mod Uman huwa disponibbli fid-Dokument ta’ 
Gwida Nru 19 tal-OECD (7).
 
2. Gwida dwar kif isir dan il-Metodu ta’ Ttestjar jew l-interpretazzjoni tieg ħu 
tinsab fid-Dokument ta’ Gwida Nru 39 dwar Ittestjar tat-Tossi ċità ta’ 
Inalazzjoni Akuta (GD 39) (8).  
3. Definizzjonijiet u żati fil-kuntest ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar huma 
pprovduti fl-Appendi ċi 1 u f’GD 39 (8).  
4. Il-Metodu ta’ Ttestjar jipprovdi informazzjoni dwar il-proprjetajiet perikolu żi 
u jippermetti li l-kimika g ħall-ittestjar ti ġi ggradata u kklassifikata skont 
ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, ta’ kimi ċi li 
jikkawżaw tossiċità akuta (9). F’ka ż li jkunu me ħtieġa stimi ta’ punti ta’ 
valuri LC  50 jew anali żi ta’ konċentrazzjoni-rispons, il-kapitolu B.2 ta’ dan 
l-Anness (1) huwa l-Metodu ta’ Ttestjar adattat li g ħandu jintu ża. Gwida 
ulterjuri dwar g ħażla ta’ Metodu ta’ Ttestjar tinsab f’GD 39 (8). Dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar mhux ma ħsub l-aktar g ħall-ittestjar ta’ materjali spe ċ­
jalizzati, b ħal materjali i żometriċi jew fibru żi li ftit jin ħallu jew nanoma ­
terjali manifatturati.  
KONSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
5. Qabel ma jitqies l-ittestjar skont dan il-Metodu ta’ Ttestjar, l-informazzjoni 
kollha disponibbli dwar il-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi studji e żistenti li 
d-dejta tag ħhom issostni li ma jsirx ittestjar addizzjonali, g ħandhom 
jitqiesu mil-laboratorju tal-ittestjar biex l-u żu tal-annimali jkun mill-anqas. 
L-informazzjoni li tista’ tassisti fl-g ħażla tal-ispe ċi, razza, sess, mod ta’ 
espożizzjoni u kon ċentrazzjonijiet ta’ testijiet l-aktar adatti tinkludi 
l-identità, l-istruttura tal-kimika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika 
għall-ittestjar; ir-ri żultati ta’ kwalunkwe test ta’ tossi ċità in vitro  jew  in 
vivo; użu/ijiet anti ċipat(i) u potenzjal g ħal espożizzjoni umana; 
dejta (Q)SAR disponibbli u dejta tossikolo ġika dwar kimi ċi relatati struttur ­
alment. Kon ċentrazzjonijiet li jkunu mistennija jikkaw żaw uġigħ u diffikultà 
severi, min ħabba azzjonijiet korru żivi (  1 ) jew irritanti b’mod sever, 
m’għandhomx ikunu ttestjati b’dan il-Metodu ta’ Ttestjar [ara GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) L-evalwazzjoni tal-korru żività tista’ tkun ibba żata fuq ġudizzju espert billi tintu ża 
evidenza b ħal: esperjenza tal-bnedmin u tal-annimali, dejta e żistenti (in vitro), e ż. 
il-kapitolu B.40 (10), B.40 bis (11) ta’ dan l-anness jew TG 435 tal-OECD (12), 
valuri ta’ pH, informazzjoni minn kimi ċi simili jew dejta pertinenti o ħra.
 PRINĊIPJU TAT-TEST  
6. Huwa l-prin ċipju tat-test li abba żi ta’ proċedura pass pass, tinkiseb inform ­
azzjoni suffi ċjenti dwar it-tossi ċità ta’ inalazzjoni akuta tal-kimika g ħall- 
ittestjar matul perjodu ta’ espo żizzzjoni ta’ 4 sig ħat biex tkun tista’ ssir 
klassifikazzjoni. Jistg ħu japplikaw durati o ħra ta’ espo żizzjoni biex jaqdu 
għanijiet regolatorji spe ċifiċi. F’kull wie ħed mill-istadji definiti ta’ kon ċen­
trazzjoni, ikunu ttestjati 3 annimali ta ż-żewġ sessi. Skont il-mortalità u/jew 
l-istat moribond tal-annimali, 2 stadji jistg ħu jkunu suffi ċjenti biex jit ħalla 
jsir ġudizzju dwar it-tossi ċità akuta tal-kimika g ħall-ittestjar. Jekk tkun 
ipprovduta evidenza li sess wie ħed ikun aktar suxxettibbli mill-ie ħor, 
fil-każ it-test jista’ jitkompla mas-sess l-aktar suxxettibbli biss. Ir-ri żultat 
tal-istadju ta’ qabel g ħandu jiddetermina l-istadju li jkun imiss b’dan li:  
(a) Ma jkunx me ħtieġ ittestjar aktar,  
(b) Ittestjar ta’ tliet annimali g ħal kull sess, jew  
(c) Ittestjar b’6 annimali tas-sess aktar suxxettibbli biss, ji ġifieri l-istimi 
tal-limiti aktar baxxi tal-klassi tossika g ħandhom ikunu bba żati fuq 6 
annimali g ħal kull grupp ta’ test ta’ kon ċentrazzjoni, irrispettivament 
mis-sess.  
7. L-annimali moribondi jew annimali li jkunu jidhru li jkunu mu ġugħa jew li 
juru sinjali ta’ diffikultà severa u li ttul g ħandhom jinqatlu b’mod uman, u 
jitqiesu fl-interpretazzjoni tar-ri żultati tat-test bl-istess mod b ħall-annimali li 
jkunu mietu fit-test. Kriterji g ħat-teħid tad-de ċiżjoni li jinqatlu annimali 
moribondi jew li jkunu qed ibatu ħafna, u gwida biex ikun mag ħruf meta 
l-mewt tkun tista’ titbassar jew tkun waslet qrib ħafna, huma s-su ġġett 
tad-Dokument ta’ Gwida Nru 19 dwar Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (7).  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla ta’ spe ċi tal-annimali  
8. Għandhom jintu żaw annimali adulti żgħażagħ f’saħħithom ta’ razez li 
komunement jintu żaw fil-laboratorju. L-ispe ċi ppreferuta hija l-far u 
għandhom ikunu pprovduti ġustifikazzjonijiet jekk jintu żaw speċijiet oħra. 
Preparazzjoni tal-annimali  
9. Nisa m’g ħandhomx ikunu welldu u m’g ħandhomx ikunu tqal. Fil-jum ta’ 
espożizzjoni, annimali g ħandhom ikunu adulti żgħażagħ ta’ 8 sa 12-il 
ġimgħa fl-età, u l-pi żijiet tal-ġisem għandhom ikunu ta’ ±20 % tal-pi ż 
medju g ħal kull sess ta’ kull annimal espost qabel tal-istess età. 
L-annimali jintg ħażlu b’mod ka żwali, jiġu mmarkati g ħal identifikazzjoni 
individwali. L-annimali jin żammu fil-ga ġeġ tagħhom għal mill-anqas 5 
ijiem qabel ma jibda t-test biex jidraw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju. L-annimali g ħandhom ukoll ikunu akklimatizzati g ħall-apparat tat-test g ħal 
perjodu qasir qabel l-ittestjar, min ħabba li dan inaqqas it-tensjoni kkaw żata 
bl-introduzzjoni g ħall-ambjent il- ġdid.
 
Trobbija tal-annimali  
10. It-temperatura tal-kamra ta ż-żamma tal-annimali tal-esperimeti g ħandha tkun 
22 ± 3 °C. L-umdità relattiva g ħandha idealment tin żamm fil-firxa ta’ 30 % 
sa 70 %, g ħalkemm dan jista’ ma jkunx possibbli meta jintu ża l-ilma b ħala 
vejjikolu. Qabel u wara espo żizzjonijiet, l-annimali ġeneralment g ħandhom 
jitqiegħdu f’gaġġa fi gruppi skont is-sess u l-kon ċentrazzjoni, i żda l-għadd 
ta’ annimali g ħal kull ga ġġa m’għandux ifixkel l-osservazzjoni ċara ta’ kull 
annimal u g ħandu jimminimizza t-telf min ħabba kannibali żmu u ġlied. Meta 
annimali jkollhom ikunu esposti mill-imnie ħer biss, jista’ jkun je ħtiġilhom 
jidraw it-tubi ta’ tra żżin. It-tubi ta’ tra żżin m’għandhomx jimponu tensjoni 
fiżika, termali u ta’ immobilizzazzjoni bla b żonn fuq l-annimali. It-tra żżin 
jista’ jaffettwa punti ta’ tmiem fi żjoloġiċi bħat-temperatura tal- ġisem (iper ­
termja) u/jew volum respiratorju minusklu. Jekk dejta ġenerika tkun  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
disponibbli li turi li ebda bidliet b ħal dawn ma jse ħħu sa ċertu limitu 
konsiderevoli, f’dak il-ka ż ma jkunx me ħtieġ adattament minn qabel g ħat- 
tubi ta’ tra żżin. L-annimali esposti mill- ġisem kollu g ħal aerosol g ħandhom 
jingħalqu individwalment matul l-espo żizzjoni biex ma jit ħallewx jiffiltraw 
l-aerosol tat-test mal-pil ta’ s ħabhom fil-ga ġġa. Jistgħu jintużaw dieti 
konvenzjonali u ċċertifikati mil-laboratorju, ħlief matul espo żizzjoni, 
flimkien ma’ provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb muni ċipali. Id-dawl 
għandu jkun artifi ċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il sieg ħa dawl/12-il 
siegħa dlam.  
Kmamar tal-inalazzjoni  
11. In-natura tal-kimika g ħall-ittestjar u l-g ħan tat-test g ħandhom jitqiesu 
fl-għażla tal-kamra tal-inalazzjoni. Il-mod preferut ta’ espo żizzjoni huwa 
mill-imnie ħer biss (liema fra żi tinkludi r-ras biss, l-imnie ħer biss jew 
il-geddum biss). Espo żizzjoni mill-imnie ħer biss hija ġeneralment ippre ­
feruta għal studji ta’ aerosols likwidi jew solidi u g ħal fwar li jista’ 
jikkondensa biex jifforma l-aerosols. G ħanijiet spe ċjali tal-istudju jistg ħu 
jinkisbu a ħjar billi tintu ża modalità ta’ espo żizzjoni mill- ġisem kollu, i żda 
dan għandu jkun i ġġustifikat fir-rapport tal-istudju. Biex tkun żgurata 
stabbiltà tal-atmosfera meta tintu ża kamra g ħall-ġisem kollu, il-volum 
totali tal-annimali tat-test m’g ħandux ikun aktar minn 5 % tal-volum 
tal-kamra. Prin ċipji ta’ tekniki ta’ espo żizzjoni mill-imnie ħer biss u 
mill-ġisem kollu u tal-vanta ġġi u l-iżvantaġġi partikolari tag ħhom huma 
deskritti f’GD 39 (8).  
KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Amministrazzjonijiet ta’ kon ċentrazzjonijiet  
12. Huwa rrakkomandat li espo żizzjoni ddum erba’ sig ħat fissi, esklu ż ħin ta’ 
ekwilibrazzjoni. Jistg ħu jkunu me ħtieġa espożizzjonijiet li jdumu aktar biex 
jitħarsu rekwi żiti speċifiċi, iżda, għandha ting ħata ġustifikazzjoni fir-rapport 
ta’ studju [ara GD 39 (8)]. L-annimali esposti fi kmamar g ħall-ġisem kollu 
għandhom jing ħalqu individwalment biex ma jit ħallewx jibilg ħu kimika 
għall-ittestjar min ħabba tindif ta’ s ħabhom fil-ga ġġa. M’għandux jing ħata 
għalf matul il-perjodu ta’ espo żizzzjoni. Jista’ jing ħata ilma matul 
espożizzjoni kollha mill- ġisem kollu.  
13. L-annimali jkunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar b ħala gass, fwar, 
aerosol, jew ta ħlita tagħhom. L-istat fi żiku li jkollu ji ġi ttestjat jiddependi 
mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar, il-kon ċentrazzjoni 
magħżula, u/jew il-forma fi żika li x’aktarx tkun pre żenti matul 
l-immaniġġar u l-użu tal-kimika g ħall-ittestjar. Il-kimi ċi għall-ittestjar igros ­
kopiku u reattivi kimikament g ħandhom ikunu ttestjati f’kundizzjonijiet ta’ 
arja xotta. G ħandha ting ħata attenzjoni biex ikun evitat li jkunu ġġenerati 
konċentrazzjonijiet esplussivi.  
Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli 
14. It-teħid tad-daqs tal-parti ċelli għandu jsir g ħall-aerosols kollha u g ħall-fwar 
li jista’ jikkondensa biex jifforma l-aerosols. Biex jit ħalla jkun hemm 
espożizzjoni tar-re ġjuni kollha rilevanti tas-sistema respiratorja, huma rrak ­
komandati aerosols b’dijametri ajrudinami ċi ta’ medja massa (MMAD) 
f’firxa minn 1 sa 4 μm b’devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ) fil-firxa ta’ 
1,5 sa 3,0 (8) (13) (14). G ħalkemm g ħandu jsir sforz ra ġonevoli biex dan 
l-istandard jintla ħaq, għandu jing ħata ġudizzju espert jekk ma jkunx jista’ 
jintlaħaq. Pereżempju, d ħaħen tal-metall jistg ħu jkunu anqas minn dan 
l-istandard, u parti ċelli, fibri u materjali igroskopi ċi mimlijin (li jikbru 
fid-daqs fl-ambjent niedi tas-sistema respiratorja) jistg ħu jaqbżu dan 
l-istandard.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Preparazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar f’vejjikolu  
15. Jista’ jintu ża vejjikolu biex ji ġġenera kon ċentrazzjoni u daqs ta’ parti ċelli 
xierqa tal-kimika g ħall-ittestjar fl-atmosfera. B ħala regola, l-ilma g ħandu 
jingħata preferenza. Materjal ta’ parti ċelli jista’ jkun so ġġett għal proċessi 
mekkaniċi biex tinkiseb id-distribuzzjoni ta’ daqs me ħtieġ ta’ partiċelli, iżda 
għandha ting ħata attenzjoni li ma tit ħassarx jew tinbidel il-kimika g ħall- 
ittestjar. F’ka żijiet fejn pro ċessi mekkani ċi jitqiesu li jkunu bidlu 
l-kompożizzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (e ż. temperatura estrema minn 
tħin eċċessiv min ħabba frizzjoni), il-kompo żizzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar g ħandha tkun ivverifikata b’mod analitiku. G ħandha ting ħata 
attenzjoni adegwata biex il-kimika g ħall-ittestjar ma tkunx ikkontaminata. 
Ma jkunx me ħtieġ li jkunu ttestjati materjali mrammla mhux nutrittivi li 
jkunu fformulati apposta biex ma jkunux jistg ħu jittieħdu man-nifs. 
Għandu jintu ża test ta’ attrizzjoni biex jintwera li parti ċelli li jistg ħu 
jittieħdu man-nifs ma jkunux prodotti meta jkun itrattat materjal granulari. 
Jekk test ta’ attrizzjoni jipprodu ċi partiċelli li jkunu jistg ħu jittieħdu 
man-nifs, g ħandu jsir test g ħat-tossiċità li tittie ħed man-nifs.  
Annimali tal-kontroll  
16. Ma jkunx me ħtieġ grupp ta’ kontroll konkurrenti negattiv (arja). Meta 
vejjikolu, minbarra ilma, jintu ża biex jassisti biex tkun i ġġenerata 
l-atmosfera tat-test, grupp ta’ kontroll ta’ vejjikoli g ħandu jintu ża biss 
meta dejta storika ta’ te ħid ta’ tossi ċità man-nifs ma tkunx disponibbli. 
Jekk studju dwar tossi ċità ta’ kimika g ħall-ittestjar ifformulata f’vejjikolu 
ma juri ebda tossi ċità, isegwi li l-vejjikolu ma jkunx tossiku 
fil-konċentrazzjoni ttestjata; g ħalhekk ma jkunx me ħtieġ kontroll ta’ 
vejjikolu.  
MONITORA ĠĠ TAL-KONDIZZJONIJIET TA’ ESPO ŻIZZJONI  
Fluss tal-arja fil-kamra  
17. Il-fluss ta’ arja mal-kamra g ħandu jkun ikkontrollat sewwa, immonitorjat 
kontinwament u rre ġistrat mill-anqas kull sieg ħa matul kull espo żizzjoni. 
Il-monitora ġġ ta’ konċentrazzjoni atmosferika tat-test (jew stabbiltà) huwa 
kejl integrali tal-parametri dinami ċi kollha u jipprovdi mezzi indiretti g ħall- 
kontroll tal-parametri dinami ċi rilevanti kollha ta’ ġenerazzjoni ta’ 
atmosfera. G ħandha ting ħata konsiderazzjoni spe ċjali biex tkun evitata 
inalazzjoni mill- ġdid fi kmamar g ħall-imnieħer biss f’ka żijiet fejn fluss 
tal-arja mis-sistema ta’ espo żizzjoni ma jkunx adegwat biex jipprovdi 
fluss dinamiku ta’ atmosfera tal-kimika g ħall-ittestjar. Hemm metodolo ġiji 
preskritti li jistg ħu jintużaw biex jintwera li inalazzjoni mill- ġdid ma ssirx 
skont il-kundizzjonijiet operattivi mag ħżula (8) (15). Kon ċentrazzjoni ta’ 
ossiġenu għandha tkun mill-anqas ta’ 19 % u kon ċentrazzjoni ta’ dijossidu 
tal-karbonju m’g ħandhiex tkun aktar minn 1 %. Jekk ikun hemm ra ġuni 
biex wieħed jemmen li dawn l-istandards ma jkunux jistg ħu jintlaħqu, konċ­
entrazzjonijiet ta’ ossi ġenu u ta’ dijossidu tal-karbonju g ħandhom jitkejlu.  
Temperatura tal-kamra u umdità relattiva  
18. It-temperatura tal-kamra g ħandha tin żamm għall-22 ± 3 °C. L-umdità 
relattiva fi ż-żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs, g ħal espożizzjonijiet kemm 
mill-imnie ħer biss, kif ukoll mill- ġisem kollu, g ħandha tkun immonitorjata u 
rreġistrata mill-anqas tliet darbiet g ħal perjodi ta’ sa 4 sig ħat, u kull sieg ħa 
għal perjodi aqsar. L-umdità relattiva g ħandha idealment tin żamm fil-firxa 
ta’ 30 % sa 70 %, i żda din jew ma tkunx tista’ tintla ħaq (eż. meta jkunu 
ttestjati ta ħlitiet ibba żati fl-ilma) jew ma tkunx tista’ titkejjel min ħabba 
interferenza minn kimika g ħall-ittestjar mal-metodu tal-ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Kimika g ħall-ittestjar: kon ċentrazzjoni nominali  
19. Kull meta jkun fattibbli, il-kon ċentrazzjoni nominal tal-kamra ta’ 
espożizzjoni g ħandha tkun ikkalkulata u rre ġistrata. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali hija l-massa ġġenerata ta’ kimika g ħall-ittestjar divi ża bil-volum 
totali ta’ arja li tkun g ħaddiet mis-sistema tal-kamra. Il-kon ċentrazzjoni 
nominali ma tintu żax biex tikkaratterizza l-espo żizzjoni tal-annimali, i żda 
tintuża bħala paragun tal-kon ċentrazzjoni nominali, u l-kon ċentrazzjoni 
attwali tag ħti indikazzjoni tal-effi ċjenza ta’ ġenerazzjoni tas-sistema 
tal-ittestjar, u, g ħalhekk, tista’ tintu ża biex jinkixfu problemi ta’ ġener­
azzjoni.  
Kimika g ħall-ittestjar: kon ċentrazzjoni attwali  
20. Il-kon ċentrazzjoni attwali hija l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fi ż- 
żona fejn l-annimali jie ħdu n-nifs f’kamra tal-inalazzjoni. Kon ċen­
trazzjonijiet attwali jistg ħu jinkisbu jew b’metodi spe ċifiċi (eż. teħid dirett 
ta’ kampjuni, metodi ta’ assorbiment jew kimi ċi reattivi u karatterizzazzjoni 
analitika sussegwenti) jew b’metodi mhux spe ċifiċi bħal analiżi gravimetrika 
b’filtru. L-u żu ta’ anali żi gravimetrika huwa a ċċettabbli biss g ħal aerosols 
tat-trab b’komponent wie ħed jew g ħal aerosols ta’ likwidi ta’ volatilità 
baxxa u g ħandu jkun appo ġġat minn karatterizzazzjonijiet adattati ta’ 
qabel l-istudju spe ċifiċi għall-kimika g ħall-ittestjar. Il-kon ċentrazzjoni ta’ 
aerosols tat-trab b’ ħafna komponenti tista’ wkoll tkun iddeterminata 
b’analiżi gravimetrika. I żda din te ħtieġ dejta analitika li turi li 
l-kompożizzjoni ta’ materjal tal-ajru tkun simili g ħall-materjal tal-bidu. 
Jekk din l-informazzjoni ma tkunx disponibbli, tista’ tkun me ħtieġa analiżi 
mill-ġdid tal-kimika g ħall-ittestjar (idealment fl-istat tag ħha fl-arja) f’in ­
tervalli regolari waqt li jkun g ħaddej l-istudju. G ħal aġenti aerosolizzati li 
jistgħu jevaporaw jew jissubblimaw, g ħandu jintwera li l-fa żijiet kollha 
kienu n ġabru bil-metodu mag ħżul. Il-kon ċentrazzjonijiet immirati, 
nominali u attwali g ħandhom ikunu pprovduti fir-rapport tal-istudju, i żda 
konċentrazzjonijiet attwali biss jintu żaw fl-anali żi ta’ statistika biex ikunu 
kkalkulati valuri ta’ kon ċentrazzjonijiet letali.  
21. Għandu jintu ża lott wie ħed tal-kimika g ħall-ittestjar, jekk ikun possibbli, u 
l-kampjun tat-test g ħandu jinħażen f’kundizzjonijiet li j żommu l-purezza, 
l-omoġeneità u l-istabbiltà tieg ħu. Qabel ma jinbeda l-istudju, g ħandu jkun 
hemm karatterizzazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu ża l-purezza tag ħha, 
u jekk teknikament fattibbli, l-identità u l-kwantitajiet ta’ kontaminanti u 
impuritajiet identifikati. Dan jista’ jintwera bid-dejta li ġejja, iżda ma jkunx 
limitat g ħaliha: ħin ta’ ritenzjoni u erja relattiva fl-og ħla livell, pi ż 
molekulari minn spettrometrija tal-massa jew minn anali żi kromatografika 
ta’ gass, jew minn stimi o ħra. Għalkemm l-identità tal-kampjun tat-test mhix 
ir-responsabbiltà tal-laboratorju tat-test, ikun prudenti g ħal-laboratorju 
tat-test li jikkonferma l-karatterizzazzjoni tal-isponser mill-anqas b’mod limitat (e ż. lewn, natura fi żika, eċċ.).
 
22. L-atmosfera ta’ espo żizzjoni g ħandha tin żamm kemm prattikabbilment 
kostanti u tkun immonitorjata kontinwament u/jew kull tant skont 
il-metodu ta’ anali żi. Meta jintu ża t-teħid ta’ kampjuni kull tant, 
għandhom jittie ħdu kampjuni tal-atmosfera tal-kamra mill-anqas darbtejn 
għal studju ta’ erba’ sig ħat. Jekk dan ma jkunx jista’ jsir min ħabba rati 
limitati ta’ fluss ta’ arja jew kon ċentrazzjonijiet baxxi, ikun jista’ jin ġabar 
kampjun wie ħed tul il-perjodu kollu ta’ espo żizzzjoni. Jekk ise ħħ ċaqliq 
minn kampjun g ħal kampjun, il-kon ċentrazzjonijiet ittestjati li jkun imiss 
għandhom ju żaw erba’ kampjuni g ħal kull espo żizzjoni. Kampjuni indi ­
vidwali tal-kon ċentrazzjoni tal-kamra m’g ħandhomx jiddevjaw 
mill-konċentrazzjoni medja tal-kamra b’aktar minn ± 10 % g ħal gassijiet u 
fwar, u b’mhux aktar minn ± 20 % g ħal aerosols likwidi jew solidi. 
L-ekwilibrazzjoni ta’ ħin ma’ kamra (t  95 ) għandha tkun ikkalkulata u rre ġis­
trata. Id-durata ta’ espo żizzjoni tkopri l- ħin li fih il-kimika g ħall-ittestjar 
tkun iġġenerata u din tqis il- ħinijiet me ħtieġa biex jinkiseb t  95 . Gwida 
għal stima ta’ t  95 tinsab f’GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Għal kull ta ħlita kumplessa ħafna mag ħmula minn fwar/gassijiet u aerosols 
(eż. atmosferi ta’ kombustjoni u kimi ċi għall-ittestjar im ħaddmin minn 
prodotti/mezzi ta’ u żu finali b’g ħan speċifiku), kull fa żi tista’ ta ġixxi 
b’mod differenti f’kamra tal-inalazzjoni, g ħalhekk g ħandha tintg ħażel 
mill-anqas sustanza (analita) wa ħda bħala indikatur, normalment 
is-sustanza attiva prin ċipali fit-ta ħlita, ta’ kull fa żi (fwar/gass u aerosol). 
Meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun ta ħlita, il-kon ċentrazzjoni analitika 
għandha tkun irrappurtata g ħat-taħlita totali u mhux biss g ħall-ingredjent 
attiv jew g ħall-komponent (analita). Informazzjoni addizzjonali dwar kon ċ­
entrazzjonijiet attwali tinsab f’GD 39 (8).  
Kimika g ħall-ittestjar: distribuzzjoni tad-daqs ta’ parti ċelli 
24. Id-distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli tal-aerosols g ħandha tkun iddeter ­
minata mill-anqas darbtejn matul kull espo żizzjoni ta’ 4 sig ħat billi jintu ża 
impattur kaskata jew strument alternattiv b ħall-għodda ajrudinamika li tag ħti 
d-daqs tal-parti ċelli. Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza tar-ri żultati 
miksubin minn impattur kaskata jew strument alternattiv, f’dak il-ka ż 
l-istrument alternattiv ikun jista’ jintu ża tul l-istudju kollu. It-tieni mezz, 
bħal filtru gravimetriku jew impinger/gas bubbler, g ħandu jintu ża flimkien 
mal-istrument primarju biex jikkonferma l-effi ċjenza tal-istrument primarju 
fil-ġbir. Il-kon ċentrazzjoni tal-massa miksuba b’anali żi tad-daqs ta’ parti ċelli 
għandha tkun fil-limiti ra ġjonevoli tal-kon ċentrazzjoni tal-massa miksuba 
b’analiżi b’filtru [ara GD 39 (8)]. Jekk tkun tista’ tintwera ekwivalenza 
fil-fażi bikrija tal-istudju, f’dak il-ka ż kejlijiet ta’ konferma ulterjuri 
jistgħu jitħallew barra. G ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq tal-annimali, 
għandhom jittie ħdu miżuri li jimminimizzaw dejta inkonklussiva li tista’ 
twassal g ħal ħtieġa ta’ ripetizzjoni ta’ espo żizzjoni. Te ħid tad-daqs ta’ 
partiċelli għandu jsir g ħal fwar jekk ikun hemm xi possibbiltà li tista’ 
tirriżulta kondensazzjoni ta’ fwar fil-formazzjoni ta’ aerosol, jew jekk 
jinstabu parti ċelli f’atmosfera ta’ fwar b’potenzjal g ħal fażijiet imħallta 
(ara l-paragrafu 14).  
PROĊEDURA  
Test ewlieni  
25. Għal kull stadju jintu żaw tliet annimali g ħal kull sess, jew sitt annimali 
tas-sess aktar suxxettibbli. Jekk spe ċijiet ta’ rodituri minbarra firien ikunu 
esposti mill-imnie ħer biss, perjodi massimi ta’ espo żizzjoni jistg ħu jkunu 
aġġustati biex titnaqqas diffikultà spe ċifika għal speċi partikolari. Il-livell 
ta’ konċentrazzjoni li g ħandu jintu ża bħala d-doża tal-bidu jintg ħażel minn 
wieħed minn erba’ livelli fissi u l-livell ta’ kon ċentrazzjoni tal-bidu g ħandu 
jkun dak li l-aktar probabbli jipprodu ċi tossiċità f’xi annimali do żati. 
L-iskemi ta’ ttestjar g ħal gassijiet, fwar u aerosols (inklu żi fl-Appendi ċijiet 
2-4) jirrappre żentaw l-ittestjar b’valuri ta’ limitu tal-kategoriji ta’ CLP 1-4 
(9) għal gassijiet (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (Appendi ċi 2), għal fwar 
(0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (Appendi ċi 3) u għal aerosols (0,05, 0,5, 1, 5 
mg/l/4h) (Appendi ċi 4). Il-Kategorija 5, li mhix implimentata 
fir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 (9) hija relatata ma’ kon ċentrazzjonijiet 
‘il fuq mill-kon ċentrazzjonijiet rispettivi ta’ limitu. G ħal kull kon ċentrazzjoni 
tal-bidu tapplika l-iskema ta’ ttestjar rispettiva. Skont l-g ħadd ta’ annimali 
maqtula b’mod uman jew mejta, il-pro ċedura tat-test issegwi l-vle ġeġ 
indikati sakemm tkun tista’ ssir kategorizzazzjoni.  
26. L-intervall ta’ żmien bejn gruppi ta’ espo żizzjoni jkun iddeterminat malli 
jfaqqgħu sinjali tossi ċi, kemm idumu u s-severità tag ħhom. Espo żizzjoni ta’ 
annimali fil-livell ta’ kon ċentrazzjoni li jkun imiss g ħandha tittawwal 
sakemm ikun hemm kunfidenza ra ġonevoli fis-sopravivenza tal-annimali li 
jkunu ġew ittestjati qabel. Perjodu ta’ tlieta jew erbat ijiem bejn 
l-espożizzjonijiet f’kull livell ta’ kon ċentrazzjoni huwa rrakkomandat biex 
titħalla ssir l-osservazzjoni ta’ tossi ċità mdewma. L-intervall ta’ żmien jista’ 
jkun aġġustati skont il-ka ż, eż. f’każ ta’ risponsi inkonklusivi.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Test ta’ limitu  
27. It-test ta’ limitu jintu ża meta l-kimika g ħall-ittestjar tkun mag ħrufa jew 
mistennija li tkun kwa żi mhux tossika, ji ġifieri li tislet rispons tossiku ‘l 
fuq biss mill-kon ċentrazzjoni regolatorja ta’ limitu. Informazzjoni dwar 
it-tossiċità tal-kimika g ħall-ittestjar tista’ tinkiseb minn tag ħrif dwar 
sustanzi ttestjati simili jew minn ta ħlitiet simili, billi titqies l-identità u 
l-perċentwali ta’ komponenti mag ħrufin li jkunu ta’ sinifikat tossikolo ġiku. 
F’dawk is-sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ftit jew ebda informazzjoni dwar 
it-tossiċità tagħha, jew fejn il-kimika g ħall-ittestjar tkun mistennija li tkun 
tossika, g ħandu jsir it-test ewlieni [gwida ulterjuri tinsab f’GD 39 (8)].  
28. Bl-u żu tal-proċedura normali, tliet annimali g ħal kull sess, jew sitt annimali 
tas-sess aktar suxxettibbli, ikunu esposti f’kon ċentrazzjonijiet ta’ 20 000 
ppm għal gassijiet, 20 mg/l g ħal fwar u 5 mg/l g ħal trabijiet/raxxijiet, 
rispettivament (jekk ikunu jistg ħu jinkisbu), li jservu b ħala t-test ta’ limitu 
għal dan il-Metodu ta’ Ttestjar. Meta jkunu ttestjati aerosols, l-g ħan primarju 
għandu jkun li jinkiseb daqs ta’ parti ċelli li jkun jista’ jittie ħed man-nifs 
(jiġifieri MMAD ta’ 1-4 μm). Dan ikun possibbli g ħal kważi l-kimiċi kollha 
għall-ittestjar f’kon ċentrazzjoni ta’ 2 mg/l. Ittestjar ta’ aerosols f’aktar minn 
2 mg/l għandu jkun ittentat biss jekk ikun jista’ jinkiseb daqs ta’ parti ċelli li 
jkun jista’ jittie ħed man-nifs [ara GD 39 (8)]. Skont GHS (16), ittestjar li 
jkun jeċċedi konċentrazzjoni limitata huwa skura ġġit għal raġunijiet ta’ 
trattament xieraq tal-annimali. Ittestjar fil-Kategorija 5 GHS (16), li mhux 
implimentat fir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 (9), g ħandu jitqies biss 
meta jkun hemm probabbiltà kbira li ri żultati ta’ test b ħal dan ikun se 
jkollhom rilevanza diretta g ħall-protezzjoni tas-sa ħħa tal-bniedem, u 
tingħata ġustifikazzjoni fir-rapport ta’ studju. Fil-ka ż ta’ kimi ċi għall- 
ittestjar potenzjalment esplo żivi, għandha ting ħata attenzjoni biex ikunu 
evitati kundizzjonijiet favorevoli g ħal splużjoni. Biex ikun evitat l-u żu 
mhux me ħtieġ tal-annimali, g ħandu jsir test ta’ prova ming ħajr l-annimali 
qabel it-test ta’ limitu sabiex ikun żgurat li l-kundizzjonijiet tal-kamra g ħat- 
test ta’ limitu jkunu jistg ħu jinkisbu.  
OSSERVAZZJONIJIET  
29. L-annimali g ħandhom ikunu osservati klinikament sikwit matul il-perjodu 
ta’ espożizzzjoni. Wara espo żizzjoni, osservazzjonijiet klini ċi għandhom 
isiru mill-anqas darbtejn fil-jum ta’ espo żizzjoni jew aktar sikwit meta 
indikat mir-rispons tal-annimali g ħal trattament, u mill-anqas darba kuljum 
minn hemm ‘il quddiem g ħal total ta’ 14-il jum. It-tul tal-perjodu ta’ osser ­
vazzjoni ma jkunx iffissat, i żda għandu jkun iddeterminat min-natura u mi ż- 
żmien meta jfaqqg ħu sinjali klini ċi u mit-tul tal-perjodu ta’ rkupru. Id-drabi 
li fihom sinjali ta’ tossi ċità jidhru u jg ħibu huma importanti, l-aktar jekk 
ikun hemm tendenza li sinjali ta’ tossi ċità jdumu ma jidhru. 
L-osservazzjonijiet kollha ji ġu rreġistrati sistematikament b’re ġistri individ ­
walment mi żmumin għal kull annimal. L-annimali li jinstabu li jkunu f’kon ­
dizzjoni moribonda u annimali li juru u ġigħ sever u/jew sinjali li jdumu ta’ 
diffikultà g ħandhom jinqatlu b’mod uman g ħal raġunijiet ta’ trattament 
xieraq tal-annimali. G ħandha ting ħata attenzjoni meta jsiru e żamijiet g ħal 
sinjali klini ċi ta’ tossi ċità biex meta jidhru ftit g ħall-bidu u jkun hemm 
bidliet respiratorji li jg ħaddu malajr, li ji ġu minn pro ċedura ta’ espo żizzjoni, 
wieħed ma jiħux żball u jaħsibhom effetti relatati ma’ trattament. G ħandhom 
jitqiesu l-prin ċipji u l-kriterji mi ġburin fil-qosor fid-Dokument ta’ Gwida 
dwar il-Punti tat-Tmiem b’Mod Uman (7). Meta annimali jinqatlu g ħal 
raġunijiet umani jew jinstabu mejta, il- ħin tal-mewt g ħandu jiġi rreġistrat 
b’mod pre ċiż kemm jista’ jkun.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Osservazzjonijiet mal- ġenb tal-ga ġġa għandhom jinkludu bidliet fil- ġilda u 
l-pil, l-għajnejn u l-membrani muku żi, u wkoll fis-sistema respiratorja, 
ċirkulatorja, awtonomika u nervu ża ċentrali, u f’attività somatomotorja u 
xejriet ta’ m ġiba. Meta jkun possibbli, kull differenzjar bejn effetti lokali 
u sistemiċi għandu jkun innotat. Attenzjoni g ħandha tkun diretta g ħal osser­
vazzjonijiet ta’ treg ħid, konvul żjonijiet, tib żiq, dijarea, letar ġija, rqad u 
koma. Il-kejl ta’ temparaturi tar-rektum jista’ jipprovdi evidenza li ssostni bradipnea riflessa jew ta’ ipo/ipertermja relatati ma’ trattament jew g ħeluq.
 
Piżijiet tal-ġisem  
31. Il-piżijiet individwali ta’ kull annimal g ħandhom ji ġu rreġistrat darba matul 
l-perjodu ta’ akklimatazzjoni, fil-jum ta’ espo żizzjoni qabel espo żizzjoni 
(jum 0) u mill-anqas fil-jiem 1, 3 u 7 (u kull ġimgħa minn hemm ‘il 
quddiem), u fil- ħin tal-mewt jew ewtanasja jekk jinqabe ż jum 1. Il-pi ż 
tal-ġisem huwa rikonoxxut b ħala indikatur kritiku ta’ tossi ċità, u annimali 
li juru tnaqqis sostnut ta’ > 20 %, mqabbel ma’ valuri ta’ qabel l-istudju, 
għandhom ikunu mmonitorjati mill-qrib. L-annimali li jibqg ħu ħajjin 
jintiżnu u jinqatlu b’mod uman fi tmiem il-perjodu ta’ wara l-espo żizzjoni.  
Patoloġija 
32. L-annimali kollha tat-test, inklu żi dawk li jmutu matul it-test jew li jinqatlu 
bl-ewtanasja u jitne ħħew mill-istudju g ħal raġunijiet ta’ trattament xieraq 
tal-annimali, g ħandhom ikunu so ġġetti għal awtopsja makroskopika. Jekk 
ma tkunx tista’ ssir awtopsja minnufih wara li jkun instab annimal mejjet, 
l-annimal g ħandu jitkessa ħ (mhux iffri żat) f’temperaturi baxxi bi żżejjed biex 
tkun imminimizzata awtoli żi. Awtopsji g ħandhom isiru malajr kemm jista’ 
jkun, normalment f’jum jew tnejn. Il-bidliet patolo ġiċi makroskopi ċi kollha 
għandhom ji ġi rreġistrati għal kull annimal b’attenzjoni partikolari g ħal kull 
bidla fis-sistema respiratorja.  
33. Eżamijiet addizzjonali inklu żi a priori  dawk imfasslin apposta jistg ħu 
jitqiesu li jestendu l-valur interpretattiv tal-istudju, b ħall-kejl tal-pi ż 
tal-pulmun ta’ firien li jkunu baqg ħu ħajjin u/jew li jipprovdu evidenza 
ta’ irritazzjoni b’e żami mikroskopiku tas-sistema respiratorja. Organi 
eżaminati jistg ħu jinkludu dawk li juru evidenza ta’ patolo ġija makroskopika 
f’annimali li jibqg ħu jgħixu għal 24 sieg ħa jew aktar, u organi mag ħrufin 
jew mistennija li jkunu affettwati. L-e żami mikroskopiku tas-sistema respi ­
ratorja kollha jista’ jipprovdi informazzjoni utli dwar kimi ċi għall-ittestjar li 
huma reattivi mal-ilma, b ħal aċidi u kimi ċi igroskopi ċi għall-ittestjar.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Dejta  
34. Għandha tkun ipprovduta dejta dwar annimali individwali fir-rigward 
tal-piżijiet tal-ġisem u s-sejbiet mill-awtopsji. Dejta dwar osservazzjonijiet 
kliniċi għandha tin ġabar fil-qosor f’forma tabulari, li turi g ħal kull grupp 
tat-test l-g ħadd ta’ annimali u żati, l-għadd ta’ annimali li jkunu wrew sinjali 
speċifiċi ta’ tossi ċità, l-għadd ta’ annimali li jkunu nstabu mejta matul it-test 
jew li jkunu nqatlu g ħal raġunijiet umani, il- ħin tal-mewt ta’ kull annimal, 
deskrizzjoni u kemm jie ħdu żmien effetti tossi ċi u riversibbiltà, u sejbiet 
minn awtopsji.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Rapport tat-test  
35. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skont il-ka ż: 
Annimali tat-test u trobbija  
— Deskrizzjoni tal-kundizzjonijiet tal-ga ġġa, inkluż: għadd (jew bidla 
fl-għadd) tal-annimali g ħal kull ga ġġa, materjal g ħall-irqad, temperatura 
ambjentali u umdità relattiva, fotoperjodu u identifikazzjoni tad-dieta;  
— Speċi/razza użata u ġustifikazzjoni g ħall-użu ta’ spe ċi minbarra l-far;  
— Għadd, età u sess tal-annimali;  
— Metodu ta’ ka żwalità;  
— Dettalji tal-kwalità tal-ikel u tal-ilma (inklu ż tip ta’ dieta/sors, sors 
tal-ilma);  
— Deskrizzjoni ta’ kull kondizzjonament qabel it-test, inklu żi dieta, kwar ­
antina u trattament g ħall-mard;  
Kimika g ħall-ittestjar  
— Natura fi żika, purezza, u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi 
(inkluża isomerizzazzjoni).  
— Dejta ta’ identifikazzjoni u n-Numru tar-Re ġistru tal-Chemical Abstract 
Services (CAS), jekk ikunu mag ħrufa;  
Vejjikolu  
— Ġustifikazzjoni g ħal użu ta’ vejjikolu u ġustifikazzjoni g ħal għażla ta’ 
vejjikolu (jekk ma jkunx ilma);  
— Dejta storika jew konkurrenti li turi li l-vejjikolu ma jfixkilx ir-ri żultat 
tal-istudju;  
Kamra tal-inalazzjoni  
— Deskrizzjoni tal-kamra tal-inalazzjoni inklu żi d-dimensjonijiet u l-volum;  
— Sors u deskrizzjoni tat-tag ħmir użat għall-espożizzjoni tal-annimali kif 
ukoll għall-ġenerazzjoni tal-atmosfera;  
— Tagħmir għall-kejl tat-temperatura, umdità, daqs tal-parti ċelli u kon ċen­
trazzjoni attwali;  
— Sors ta’ arja, trattament ta’ arja pprovduta/estratta u sistema u żata għal 
kondizzjonament;  
— Metodi u żati għall-kalibrazzjoni tat-tag ħmir biex tkun żgurata atmosfera 
omoġenea tat-test;  
— Differenza ta’ pressjoni (po żittiva jew negattiva);  
— Portijiet ta’ espo żizzjoni g ħal kull kamra (imnie ħer biss); tqeg ħid 
tal-annimali fis-sistema ( ġisem kollu);  
— Omoġenità/stabbiltà temporali tal-atmosfera tat-test;  
— Post tas-sensuri tat-temperatura u tal-umdità u te ħid ta’ kampjuni 
tal-atmosfera tat-test fil-kamra;  
— Rati tal-fluss tal-arja, rata tal-fluss tal-arja/port ta’ espo żizzjoni (imnie ħer 
biss), jew toqol tal-annimali/kamra (il- ġisem kollu);  
— Informazzjoni dwar it-tag ħmir użat għall-kejl tal-ossi ġenu u tad-dijossidu 
tal-karbonju, jekk applikabbli;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— Ħin meħtieġ biex jintla ħaq ekwilibriju tal-kamra tal-inalazzjoni (t  95 ); 
— Għadd ta’ bidliet fil-volum kull sieg ħa; 
— Apparati ta’ metra ġġ (jekk applikabbli);  
Dejta ta’ espo żizzjoni  
— Motiv g ħal għażla ta’ kon ċentrazzjoni mmirata fl-istudju ewlieni;  
— Konċentrazzjonijiet nominali (massa totali tal-kimika g ħall-ittestjar 
iġġenerata g ħal ġol-kamra tal-inalazzjoni divi ża bil-volum ta’ arja li 
tkun għaddiet mill-kamra);  
— Konċentrazzjonijiet attwali tal-kimika g ħall-ittestjar mi ġbura miż-żona 
tal-inalazzjoni tal-annimali; g ħal taħlitiet tat-test li jipprodu ċu forom 
fiżiċi eteroġenji (gassijiet, fwar, aerosols); kull wa ħda tista’ tkun 
analizzata separatament;  
— Il-kon ċentrazzjonijiet kollha tal-arja g ħandhom ikunu rrappurtati f’uni ­
tajiet ta’ massa (e ż. mg/l, mg/m  3 , eċċ.); unitajiet ta’ volum (e ż. ppm, 
ppb) jistg ħu wkoll ikunu rrappurtati f’parente żi; 
— Distribuzzjoni tad-daqs tal-parti ċelli, dijametru ajrudinamiku ta’ medjan 
tal-massa (MMAD), u devjazzjoni ġeometrika standard ( σ g ), inkluż 
il-metodi ta’ kalkulazzjoni tag ħhom. Għandha tkun irrappurtata anali żi 
waħda għal kull daqs ta’ parti ċelli. 
Kundizzjonijiet tat-test  
— Dettalji tal-preparazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, inklu żi dettalji ta’ kull 
proċedura użata biex jitnaqqas id-daqs ta’ parti ċelli ta’ sustanzi jew biex 
ikunu ppreparati soluzzjonijiet tal-kimika g ħall-ittestjar. F’ka żijiet fejn 
il-proċessi mekkani ċi jkunu setg ħu biddlu l-kompo żizzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar, inkludi r-ri żultati tal-anali żi li tivverifika l-kompo żizzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar;  
— Deskrizzjoni (preferibbilment inklu ża dijagramma) tat-tag ħmir użat biex 
tkun iġġenerata l-atmosfera tat-test u biex l-annimali jkunu esposti g ħall- 
atmosfera tat-test;  
— Dettalji tal-metodu analitiku kimiku u żat u l-validazzjoni tal-metodu 
(inkluża l-effiċjenza fl-irkupru tal-kimika g ħall-ittestjar mill-midjum 
tat-teħid tal-kampjuni);  
— Il-motiv g ħall-għażla ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test;  
Riżultati  
— Tabulazzjoni tat-temperatura tal-kamra, l-umdità u l-fluss tal-arja;  
— Tabulazzjoni tad-dejta ta’ kon ċentrazzjoni nominali u attwali tal-kamra;  
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar id-daqs ta’ parti ċelli, inklu żi dejta ta’ ġbir ta’ 
kampjuni analiti ċi, distribuzzjoni tad-daqs ta’ parti ċelli u kalku ­
lazzjonijiet tal-MMAD u σ g ; 
— Tabulazzjoni ta’ dejta dwar rispons u ta’ livell ta’ kon ċentrazzjoni g ħal 
kull annimal (ji ġifieri annimali li juru sinjali ta’ tossi ċità, inklu żi 
mortalità, natura, severità, u durata tal-effetti);  
— Piżijiet individwali ta’ kull ġisem ta’ annimali mi ġburin f’jiem ta’ studju, 
data u ħin tal-mewt jekk qabel l-ewtanasja skedata; kemm ikun g ħadda 
żmien meta jfaqqg ħu sinjali ta’ tossi ċità, u jekk dawn kinitx riversibbli 
għal kull annimal;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— Sejbiet minn awtopsji u sejbiet istopatolo ġiċi għal kull annimal, jekk 
disponibbli;  
— Il-klassifikazzjoni tal-kategorija CLP u l-valur ta’ limitu LC  50 ; 
Diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
— Għandha ssir enfa żi partikolari g ħad-deskrizzjoni ta’ metodi u żati biex 
jissodisfaw il-kriterji ta’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar, e ż. il-konċentrazzjoni 
limitata jew id-daqs tal-parti ċelli; 
— Għandu jkun indirizzat jekk jistax ikun hemm respirazzjoni tal-parti ċelli 
fid-dawl tas-sejbiet globali, spe ċjalment jekk il-kriterji tad-daqs 
tal-partiċelli ma setg ħux jitħarsu;  
— Il-konsistenza tal-metodi u żati biex ikunu ddeterminati 
l-konċentrazzjonijiet nominali u attwali, u r-relazzjoni 
tal-konċentrazzjoni attwali mal-kon ċentrazzjoni nominali g ħandhom 
ikunu inklu żi fil-valutazzjoni globali tal-istudju;  
— Il-kaw ża probbbali tal-mewt u l-modalità predominanti ta’ azzjoni (sis ­
temika versus lokali) g ħandhom ikunu indirizzati;  
— Għandha ting ħata spjegazzjoni jekk kienx hemm ħtieġa li b’mod uman 
jinqatlu annimali mu ġugħa jew li jkunu wrew sinjali ta’ diffikultà u li 
jdumu, abba żi tal-kriterji fid-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar 
il-Punti ta’ Tmiem b’Mod Uman (7).  
LETTERATURA:  
(1) Il-Kapitolu B.2 ta’ dan l-Anness, Tossi ċità Akuta (Inalazzjoni).  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and 
Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification 
System.  Arch. Toxicol.  77: 243-254.  
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
(5) Il-Kapitolu B.1 tris ta’ dan l-Anness, Tossi ċità Orali Akuta — Metodu 
tal-Klassi Akuta Tossika.  
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/ env/testguidelines]
 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(9) Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tas-16 ta’ Di ċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballa ġġ 
tas-sustanzi u t-ta ħlitiet, li jemenda u j ħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 
1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006 ( ĠU 
L 353, 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Il-Kapitolu B.40 ta’ dan l-Anness: Korru żjoni tal-Ġilda In Vitro: Test ta’ 
Reżistenza Elettrika Transkutanea (TER).  
(11) Il-Kapitolu B.40 bis ta’ dan l-Anness: Korru żjoni tal-Ġilda In Vitro: Test 
Mudell tal- Ġilda Umana.  
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.
 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167  
(16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Disponibbli fuq: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_welcome_e.html]  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONI  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata bl-u żu ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Appendiċi 2 
Proċedura li g ħandha tkun segwita minn kull wa ħda 
mill-konċentrazzjonijiet tal-bidu g ħall-gassijiet (ppm/4h)  
Rimarki ġenerali (  1 ) 
Għal kull kon ċentrazzjoni tal-bidu, l-iskemi rispettivi ta’ ttestjar kif inklu żi f’din 
l-Appendi ċi jagħtu profil tal-pro ċedura li g ħandha tkun segwita.  
Appendiċi 2a:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 100 ppm  
Appendiċi 2b:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 500 ppm  
Appendiċi 2c:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 2 500 ppm  
Appendiċi 2d:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 20 000 ppm  
Skont kemm ikun l-g ħadd ta’ annimali maqtulin b’mod uman jew mejta, 
il-proċedura tat-test issegwi l-vle ġeġ indikati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Fit-tabelli li ġejjin qed issir referenza g ħall-GHS (Sistema Globali Armonizata ta’ Klas ­
sifikazzjoni u Tikkettar ta’ Kimi ċi GHS). L-ekwivalenti tal-UE huwa r-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008. Fil-ka ż ta’ Inalazzjoni Akuta ta’ Tossi ċità, ir-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 (9) ma jimplimentax il-Kategorija 5.
 Appendiċi 2a 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 100 ppm/4h g ħall-gassijiet
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Appendiċi 2b 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 500 ppm/4h g ħall-gassijiet
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Appendiċi 2c 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 2 500 ppm/4h g ħall- 
gassijiet
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Appendiċi 2d 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 20 000 ppm/4h g ħall-gassijiet
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Appendiċi 3 
Proċedura li g ħandha tkun segwita minn kull wa ħda 
mill-konċentrazzjonijiet tal-bidu g ħall-fwar (mg/l/4h)  
Rimarki ġenerali (  1 ) 
Għal kull kon ċentrazzjoni tal-bidu, l-iskemi rispettivi ta’ ttestjar kif inklu żi f’dan 
l-Appendi ċi jagħtu profil tal-pro ċedura li g ħandha tkun segwita.  
Appendiċi 3a:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 0,5 mg/l  
Appendiċi 3b:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 2,0 mg/l  
Appendiċi 3c:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 10 mg/l  
Appendiċi 3d:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 20 mg/l  
Skont kemm ikun l-g ħadd ta’ annimali maqtulin b’mod uman jew mejta, 
il-proċedura tat-test issegwi l-vle ġeġ indikati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Fit-tabelli li ġejjin qed issir referenza g ħall-GHS (Sistema Globali Armonizata ta’ Klas ­
sifikazzjoni u Tikkettar ta’ Kimi ċi GHS). L-ekwivalenti tal-UE huwa r-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008. Fil-ka ż ta’ Inalazzjoni Akuta ta’ Tossi ċità, ir-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 (9) ma jimplimentax il-Kategorija 5.
 Appendiċi 3a 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 0,5 mg/L/4h g ħall-fwar
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Appendiċi 3b 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 2 mg/L/4h g ħall-fwar
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Appendiċi 3c 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 10 mg/L/4h g ħall-fwar
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Appendiċi 3d 
Tossiċità ta’ Inalazzjoni Akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 20 mg/L/4h g ħall-fwar
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Appendiċi 4 
Proċedura li g ħandha tkun segwita minn kull wa ħda 
mill-konċentrazzjonijiet tal-bidu g ħal aerosols (mg/l/4h)  
Rimarki ġenerali (  1 ) 
Għal kull kon ċentrazzjoni tal-bidu, l-iskemi rispettivi ta’ ttestjar kif inklu żi f’dan 
l-Appendi ċi jagħtu profil tal-pro ċedura li g ħandha tkun segwita.  
Appendiċi 4a:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 0,05 mg/l  
Appendiċi 4b:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 0,5 mg/l  
Appendiċi 4c:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 1 mg/l  
Appendiċi 4d:  Il-konċentrazzjoni tal-bidu tkun ta’ 5 mg/l  
Skont kemm ikun l-g ħadd ta’ annimali maqtulin b’mod uman jew mejta, 
il-proċedura tat-test issegwi l-vle ġeġ indikati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Fit-tabelli li ġejjin qed issir referenza g ħall-GHS (Sistema Globali Armonizata ta’ Klas ­
sifikazzjoni u Tikkettar ta’ Kimi ċi GHS). L-ekwivalenti tal-UE huwa r-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008. Fil-ka ż ta’ Inalazzjoni Akuta ta’ Tossi ċità, ir-Regolament (KE) 
Nru 1272/2008 (9) ma jimplimentax il-Kategorija 5.
 Appendiċi 4a 
Tossiċità ta’ inalazzjoni akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 0,05 mg/L/4h g ħall-fwar
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Appendiċi 4b 
Tossiċità ta’ inalazzjoni akuta  
Proċedura testwalib’kon ċentrazzjonital-bidu ta’ 0,5 mg/L/4h g ħall- aerosoli
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Appendiċi 4c 
Tossiċità ta’ inalazzjoni akuta  
Proċedura testwalib’kon ċentrazzjonital-bidu ta’ 1 mg/L/4h g ħall- aerosoli
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Appendiċi 4d 
Tossiċità ta’ inalazzjoni akuta  
Proċedura testwali b’kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ 5 mg/L/4h g ħall- aerosoli
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSI ĊITÀ TAL-I ŻVILUPP  
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida dwar 
it-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 426 (2007). F' Ġunju 1995 f'Kopen ħagen, 
Grupp ta' Ħidma tal-OECD dwar it-Tossi ċità Riproduttiva u tal-I żvilupp 
tħaddet dwar il- ħtieġa li jiġu aġġornati l-linji gwida e żistenti tal-OECD 
dwar it-testijiet g ħat-tossiċità riproduttiva u tal-i żvilupp, u l-i żvilupp ta' 
linji gwida ġodda għall-punti a ħħarin li għadhom mhumiex koperti (1). 
Il-grupp ta' ħidma rrakkomanda li l-linja gwida dwar it-testijiet g ħan-newro ­
tossiċità tal-iżvilupp għandhom jinkitbu fuq il-ba żi ta' linja gwida tal-EPA 
tal-Istati Uniti, li minn dak i ż-żmien 'l hawn ġiet riveduta (2). F' Ġunju 1996, 
saret it-tieni laqg ħa ta' konsultazzjoni f'Kopen ħagen biex is-Segretarjat ji ġi 
pprovdut bi gwida fuq ir-ri żultat ta' linja gwida ġdida dwar it-testijiet dwar 
in-newrotossi ċità tal-iżvilupp, inklu żi l-elementi ewlenin, e ż., dettalji dwar 
l-għażla tal-ispe ċi ta' annimal, il-perjodu ta' do żaġġ, il-perjodu ta' ttestjar, 
il-punti a ħħarin li għandhom ji ġu vvalutati, u l-kriterji g ħall-evalwazzjoni 
tar-riżultati. Fl-1998 ġiet ippubblikata linja gwida tal-Istati Uniti dwar valu ­
tazzjoni tar-riskju ta' newrotossi ċità (3). F'Ottubru 2000 l-ewwel saret 
Laqgħa ta' Konsultazzjoni tal-Esperti tal-OECD u mbag ħad wara sar 
Workshop tal-Istitut tax-Xjenza tar-Riskji tal-ILSI u fl-2005 saret laqg ħa 
ta' konsultazzjoni tal-esperti f'Tokjo. Dawn il-laqg ħat saru biex ji ġu 
diskussi l-kwistjonijiet xjentifi ċi u tekniċi relatati mal-linja gwida kurrenti 
dwar it-testijiet u r-rakkomandazzjonijiet mil-laqg ħat (4)(5)(6)(7) ġew 
ikkunsidrati fl-i żvilupp ta' dan il-metodu ta' ttestjar. Iktar informazzjoni 
dwar il-kondotta, l-interpretazzjoni u t-terminolo ġija użata għal dan 
il-metodu ta' ttestjar tista' tinkiseb mid-Dokumenti ta' Gwida tal-OECD Nru 43 dwar l-“Ittestjar u l-Valutazzjoni tat-Tossi ċità Riproduttiva” (8) u 
Nru 20 dwar l-“Ittestjar tan-Newrotossi ċità”(9).
 
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
2. Hemm numru ta' sustanzi kimi ċi li huma mag ħrufin li jipprodu ċu effetti 
newrotossi ċi tal-iżvilupp fil-bniedem u spe ċi oħrajn (10)(11)(12)(13). 
Id-determinazzjoni tal-potenzjal g ħan-newrotossi ċità tal-iżvilupp jaf tkun 
meħtieġa biex jiġu vvalutati u evalwati l-karatteristi ċi tossiċi ta' sustanza 
kimika. L-istudji dwar in-newrotossi ċità tal-iżvilupp huma mfasslin sabiex 
jipprovdu dejta, inklu żi karatterizzazzjonijiet tar-rispons g ħad-doża, dwar 
l-effetti funzjonali u morfolo ġiċi potenzjali fuq is-sistema nervu ża fi 
żvilupp tal-ulied li jistg ħu jfeġġu minn esponiment fl-utru u kmieni fil- ħajja. 
3. Studju dwar in-newrotossi ċità tal-iżvilupp jista' jsir b ħala studju separat, 
inkorporat fi studju dwar it-tossi ċità riproduttiva u/jew dwar 
in-newrotissi ċità fl-adulti (e ż.,, il-metodi ta' ttestjar B.34 (14), B.35 (15), 
B.43 (16)), jew ji żdied ma' studji dwar it-tossi ċità tal-iżvilupp qabel 
it-twelid (e ż., il-metodu ta' ttestjar B.31 (17)). Meta l-istudju dwar 
in-newrotossi ċità tal-iżvilupp ikun inkorporat fi ħdan jew ikun marbut ma' 
studju ie ħor, importanti li tin żamm l-integrità ta ż-żewġ tipi ta' studju. 
L-ittestjar kollu g ħandu jikkonforma mal-le ġiżlazzjoni applikabbli jew 
il-linji gwida tal-gvern u istituzzjonali g ħall-użu ta' annimali 
tal-laboratorju fir-ri ċerka (eż., 18).  
4. Il-laboratorju tat-testijiet g ħandu jqis l-informazzjoni kollha g ħad- 
dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test qabel ma jag ħmel l-istudju. 
It-tali informazzjoni ser tinkludi l-identità u l-istruttura tas-sustanza kimika; 
il-proprjetajiet fi żikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' kwalunkwe test ie ħor in 
vitro  jew in vivo  dwar it-tossi ċità fuq is-sustanza kimika; dejta tossikolo ġika 
dwar sustanzi kimi ċi strutturalment relatati; u l-u żu/i antiċipat(i) tas-sustanza 
kimika. Din l-informazzjoni hija ne ċessarja biex dawk kollha kkon ċernati 
jkunu ssodisfati li t-test huwa rilevanti g ħall-protezzjoni tas-sa ħħa 
tal-bniedem, u ser tg ħin fl-għażla ta' doża ta' bidu xierqa.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
5. Is-sustanza kimika tat-test ting ħata lill-annimali matul it-tqala u t-treddig ħ. 
L-ommijiet ji ġu ttestjati biex ji ġu vvalutati l-effetti f'nisa tqal u li qed 
ireddgħu u dan jista' jipprovdi wkoll informazzjoni komparattiva 
(ommijiet versus ulied). L-ulied jing ħażlu b'mod aleatorju minn fost 
il-boton g ħal evalwazzjoni tan-newrotossi ċità. L-evalwazzjoni tikkonsisti 
f'osservazzjonijiet biex ji ġu identifikati anormalitajiet grossi fis-sistema 
newroloġika jew fl-im ġiba, inklu ża l-valutazzjoni tal-i żvilupp fi żiku, 
l-ontoġenija tal-im ġiba, l-attività motorja, il-funzjoni motorja u sensorjali, 
u t-tagħlim u l-memorja; u l-evalwazzjoni tal-pi żijiet tal-mo ħħ u 
n-newropatolo ġija matul l-i żvilupp ta' wara t-twelid u l-fa żi adulta.  
6. Meta l-metodu ta' ttestjar jitwettaq b ħala studju separat, jistg ħu jintużaw 
annimali disponibbli addizzjonali f'kull grupp g ħal proċeduri spe ċifiċi 
relatati man-newrom ġiba, in-newropatolo ġija, in-newrokimika jew 
l-elettrofiżjoloġija li jitstg ħu jżidu mad-dejta miksuba mill-anali żijiet 
rakkomandati minn dan il-metodu ta' ttestjar (16)(19)(20)(21). Il-pro ċeduri 
supplimentari jistg ħu jkunu partikolarment utli meta osservazzjoni empirika, 
effetti anti ċipati, jew mekkani żmu/modalità ta' azzjoni jindikaw tip spe ċifiku 
ta' newrotossi ċità. Dawn il-pro ċeduri supplimentali jistg ħu jintużaw 
fl-ommijiet kif ukoll fil-frie ħ. Barra minn hekk, pro ċeduri  ex vivo  jew  in 
vitro  jistgħu jintużaw ukoll, diment li dawn il-pro ċeduri ma jibdlux 
l-integrità tal-pro ċeduri  in vivo . 
TĦEJJIJIET G ĦAT-TEST  
L-għażla tal-ispe ċi tal-annimali  
7. L-ispe ċi ppreferuta g ħat-test hija l-far; jistg ħu jintużaw speċijiet oħrajn meta 
jkunu xierqa. Madankollu, il-jiem ta' tqala u ta' wara t-twelid spe ċifikati 
f'dan il-metodu ta' ttestjar huma spe ċifiċi għal razez u żati spiss ta' firien, u 
għandhom jing ħażlu jiem komparabbli jekk tintu ża speċi differenti jew 
razza mhux tas-soltu. L-u żu ta' spe ċijiet oħrajn għandu jkun i ġġustifikat 
fuq il-ba żi ta' dejta tossikolo ġika, farmakokinetika, u/jew o ħra. 
Il-ġustifikazzjoni g ħandha tinkludi d-disponibilità ta' valutazzjonijiet 
tan-newrom ġiba u n-newropatolo ġija ta' wara t-twelid spe ċifiċi għall- 
ispeċijiet. Jekk kien hemm test pre ċedenti li qajjem t ħassib, għandhom 
jiġu kkunsidrati l-ispe ċi/ir-razza li qajmu t ħassib. Min ħabba l-attributi ta' 
prestazzjoni li jvarjaw ta' razez ta' firien differenti, g ħandu jkun hemm 
evidenza li r-razza mag ħżula sabiex tintu ża għandha fekondità u risponsività 
adegwati. L-affidabilità u s-sensittività ta' spe ċijiet oħrajn biex ti ġi iden­
tifikata newrotossi ċità tal-iżvilupp għandhom ji ġu dokumentati.  
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
8. It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperimenti g ħandha tkun 22 
± 3 °C. Filwaqt li l-umdità relattiva g ħandha tkun tal-inqas 30 % u 
idealment ma taqbi żx is-70 % minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira 
għandha tkun 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali, b'sekwenza ta' 12- 
il siegħa dawl, 12-il sieg ħa dlam. Huwa possibbli wkoll li jinqeleb i ċ-ċiklu 
tad-dawl qabel it-tg ħammir u g ħad-durata tal-istudju, sabiex isiru valu ­
tazzjonijiet tal-punti a ħħarin funzjonali u tal-im ġiba matul il-perjodu 
mudlam (ta ħt dawl a ħmar), jiġifieri fil- ħin li matulu normalment 
l-annimali jkunu attivi (22). Kwalunkwe bidla fi ċ-ċiklu tad-dawl-dlam 
għandha tinkludi ħin adegwat biex dan i ċ-ċiklu jindera ħalli l-annimali 
jkunu jistg ħu jadattaw g ħaċ-ċiklu l-ġdid. Għall-għalf, jistgħu jintużaw 
dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tajjeb 
għax-xorb. It-tip ta' ikel u ilma g ħandu jiġi rrapportat u t-tnejn li huma 
għandhom ji ġu analizzati g ħal kontaminanti.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. L-annimali jistg ħu jitqiegħdu f'post wa ħedhom jew f'ga ġġa fi gruppi żgħar 
tal-istess sess. Il-pro ċeduri ta' tg ħammir għandhom jitwettqu f'ga ġeġ adattati 
għall-iskop. Wara evidenza ta' kopulazzjoni jew mhux iktar minn 15-il jum 
ta' tqala, l-annimali mg ħammrin g ħandhom jitqieg ħdu f'gaġeġ separati 
f'gaġeġ tal-ħlas jew tal-maternità. Il-ga ġeġ għandhom ji ġu rranġati b'tali 
mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli min ħabba l-po żizzjoni 
tal-gaġġa. L-annimali nisa mg ħammrin g ħandhom jing ħataw materjal 
tat-tibjit xieraq u definit meta jkunu waslu biex iwelldu. Huwa mag ħruf 
b'mod ġenerali li tqandil mhux kif suppost jew stress matul it-tqala jista' 
jirriżulta f'riżultati avversi, inklu ż korriment jew żvilupp alterat tal-fetu u 
wara t-twelid. B ħala protezzjoni kontra telf ta' feti min ħabba fatturi li 
mhumiex relatati mal-kura, l-annimali g ħandhom jitqandlu bir-reqqa matul 
it-tqala, u g ħandu jiġi evitat stress minn fatturi esterni b ħal storbju żejjed 
fuq barra.  
Tħejjija tal-annimali  
10. Għandhom jintu żaw annimali b'sa ħħithom, li draw il-kundizzjonijiet 
tal-laboratorju u li ma kinux so ġġetti għal proċeduri sperimentali 
fl-imgħoddi, sakemm l-istudju ma jkunx inkorporat fi studju ie ħor (ara 
l-paragrafu 3). L-annimali tat-test g ħandhom ji ġu karatterizati g ħall-ispeċi, 
ir-razza, is-sors, is-sess, il-pi ż u l-età. Kull annimal g ħandu jkun assenjat u 
jiġi mmarkat b'numru uniku ta' identifikazzjoni. Sa fejn dan ikun prattik ­
abbli, l-annimali tal-gruppi kollha tat-test g ħandhom ikunu tal-istess pi ż u 
età u fi ħdan il-medda normali tal-ispe ċi u r-razza studjata. F'kull livell ta' 
doża għandhom jintu żaw annimali nisa żgħażagħ li qatt ma welldu. A ħwa 
ma għandhomx jitg ħammru, u g ħandha tinxte ħet attenzjoni biex dan ji ġi 
żgurat. Il-Jum tat-Tqala (GD) 0 huwa l-jum li fih ikunu osservati l-plakka 
vaġinali u/jew l-isperma. G ħandu jing ħata ħin adegwat ta' akklimatiz ­
zazzjoni (e ż., 2-3 ijiem) meta jinxtraw annimali tqal minn fornitur. 
L-annimali tqal g ħandhom ji ġu assenjati b'mod ħieles minn pre ġudizzji 
fil-gruppi ta' kontroll u kura, u sa fejn dan ikun possibbli, g ħandhom 
jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi (e ż., proċedura aleatorja stratifikata hija 
rakkomandata biex tkun ipprovduta distribuzzjoni ndaqs fost il-gruppi kollha, bħal dik ibba żata fuq il-pi ż tal-ġisem). L-annimali nisa inseminati 
mill-istess ra ġel għandhom jitqassmu ndaqs bejn il-gruppi.
 
PROĊEDURA  
In-numru u s-sess tal-annimali  
11. Kull grupp tat-test u ta' kontroll g ħandu jkun fih numru suffi ċjenti ta' 
annimali nisa tqal li jridu jkunu esposti g ħas-sustanza kimika tat-test biex 
jiġi żgurat li ji ġi prodott numru suffi ċjenti ta' ulied g ħal evalwazzjoni 
tan-newrotossi ċità. Huwa rakkomandat totali ta' 20 boton f'kull livell ta' 
doża. Disinji tad-do żaġġ tal-grupp 'staggered' u tar-replikati huma awto ­
rizzati jekk jintla ħqu n-numri totali ta' boton f'kull grupp, u jekk jintu żaw 
mudelli statisti ċi xierqa biex jag ħtu kont g ħar-replikati.  
12. Dakinhar tal-jum wara t-twelid (PND) 4 jew qabel (il-jum tal- ħlas huwa 
PND 0), id-daqs ta' kull boton g ħandu jkun a ġġustat billi ji ġu eliminati 
l-frieħ żejda permezz ta' g ħażla aleatorja biex jin ħareġ daqs tal-boton 
uniformi g ħall-frieħ kollha (23). Id-daqs tal-boton ma g ħandux jaqbe ż 
id-daqs medju tal-boton g ħar-razza ta' rodituri u żata (8-12). Il-boton 
għandu jkollhom, kemm jista' jkun, numri ndaqs ta' frie ħ irġiel u nisa. 
L-eliminazzjoni selettiva tal-frie ħ, eż.,, fuq il-ba żi tal-piż tal-ġisem, 
mhijiex xierqa. Wara l-istandardizzazzjoni tal-boton (qtil g ħat-tnaqqis) u 
qabel iktar testijiet tal-punti a ħħarin funzjonali, il-frie ħ individwali li 
huma skedati g ħal testijiet ta' qabel il-ftim jew wara l-ftim g ħandhom 
jiġu identifikati b'mod uniku, billi jintu ża kwalunkwe metodu umanitarju 
xieraq għall-identifikazzjoni tal-frie ħ (eż., 24).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
L-assenjament ta' annimali g ħal testijiet funzjonali u tal-im ġiba, piżijiet 
tal-moħħ, u evalwazzjonijiet newropatolo ġiċi 
13. Il-metodu ta' ttestjar jippermetti li jittie ħdu diversi appro ċċi fir-rigward 
tal-assenjament tal-annimali esposti  in utero  u permezz ta' treddig ħ għal 
testijiet funzjonali u tal-im ġiba, maturità sesswali, determinazzjoni tal-pi ż 
tal-moħħ, u evalwazzjoni newropatolo ġika (25). Jistg ħu jiżdiedu wkoll 
testijiet o ħrajn tal-funzjoni tan-newrom ġiba (eż., l-imġiba soċjali), 
in-newrokimika jew in-newropatolo ġija fuq ba żi ta' każ b'każ, diment li 
ma tkunx kompromessal-integrità tat-testijiet ori ġinali meħtieġa. 
14. Il-frie ħ jingħażlu minn kull grupp ta' do ża u jiġu assenjati g ħal valu­
tazzjonijiet tal-punti a ħħarin fil-PND 4 jew wara. L-g ħażla tal-frie ħ 
għandha ssir b'tali mod li ż-żewġ sessi minn kull boton f'kull grupp ta' 
doża jkunu rappre żentati ndaqs fit-testijiet kollha kemm jista' jkun. G ħall- 
ittestjar tal-attività motorja, l-istess par ta' frie ħ irġiel u nisa g ħandhom ji ġu 
ttestjati fl-etajiet kollha ta' qabel il-ftim (ara l-paragrafu 35). G ħat-testijiet 
kollha l-o ħrajn, l-istess pari ta' annimali r ġiel u nisa jew o ħrajn separati 
jistgħu jiġu assenjati f'testijiet tal-im ġiba differenti. Frie ħ differenti jistg ħu 
jkunu jeħtieġu li jiġu assenjati g ħal testijiet ta' frie ħ li għadhom kif infatmu 
versus adult tal-funzjoni konjittiva sabiex ji ġi evitat it-tfixkil tal-effetti 
tal-età u t-ta ħriġ minn qabel f'dawk il-kejliet (26)(27). Fil-ftim (PND 21), 
il-frieħ li ma jing ħażlux għall-ittestjar jistg ħu jinqatlu b'mod dinjitu ż. 
Kwalunkwe alterazzjoni fl-assenjamenti tal-frie ħ għandha tiġi rrapportata. 
L-unità ta' kejl statistika g ħandha tkun il-boton (jew l-omm) u mhux 
il-grupp.  
15. Hemm modi differenti ta' kif frie ħ jiġu assenjati g ħal-eżamijiet, testijiet 
konjittivi, e żamijiet patolo ġiċi ta' qabel u wara l-ftim, e ċċ., (ara l-Figura 1 
għad-disinn ġenerali u l-Appendi ċi 1 għal eżempji ta' assenjament). 
In-numri minimi rakkomandati ta' annimali f'kull grupp ta' do ża għal 
eżamijiet ta' qabel u wara l-ftim huma kif ġejjin: 
Osservazzjonijiet klini ċi u piż tal-ġisem L-annimali 
Osservazzjonijiet klini ċi dettaljati 20/sess (1/sess/boton) 
Piż tal-moħħ (wara l-fissazzjoni) PND 11- 
22 10/sess (1/boton) 
Piż tal-moħħ (mhux fissat) ~ PND 70 10/sess (1/boton) 
Newropatolo ġija (fissazzjoni b'immersjoni 
jew b'perfusjoni) PND 11-22 10/sess (1/boton) 
Newropatolo ġija (fissazzjoni b'perfusjoni) 
PND ~70 10/sess (1/boton) 
Maturità sesswali 20/sess (1/sess/boton) 
Fażijiet oħrajn fl-iżvilupp (fakultattiva) L-annimali kollha 
Ontoġenija tal-im ġiba 20/sess (1/sess/boton) 
Attività motorja 20/sess (1/sess/boton) Funzjoni motorja u sensorja 20/sess (1/sess/boton) Tagħlim u memorja 10/sess (
 a ) (1/boton)  
( a ) Skont is-sensittività tat-testijiet tal-funzjoni konjittiva, g ħandha tiġi kkunsidrata 
investigazzjoni ta' numru kbir u og ħla ta' annimali, e ż., sa annimal ra ġel wieħed 
u annimal mara wa ħda għal kull boton (g ħall-assenjamenti tal-annimali ara 
l-Appendi ċi 1) (gwida ulterjuri dwar id-daqs tal-kampjun hija pprovduta 
fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dożaġġ 
16. Għandhom jintu żaw tal-inqas tliet livelli ta' do żi u kontroll konkurrenti. 
Il-livelli ta' do ża għandhom ikunu distanti bi żżejjed biex tin ħoloq 
gradazzjoni tal-effetti tossi ċi. Sakemm ma jkunx limitat mill-g ħamla fiżiko­
kimika jew il-proprjetajiet bijolo ġiċi tas-sustanza kimika, l-og ħla livell ta' 
doża għandu jing ħażel bl-għan li jikka ġuna xi tossi ċità materna (e ż.,, sinjali 
kliniċi, tnaqqis fi ż-żieda fil-pi ż tal-ġisem (mhux iktar minn 10 %) u/jew 
evidenza ta' tossi ċità li tillimita d-do ża f'organu fil-mira). Id-do ża għolja 
tista' tkun limitata g ħal 1 000 mg/kg/jum tal-pi ż tal-ġisem, b'xi 
eċċezzjonijiet. Pere żempju, l-esponiment mistenni tal-bniedem tista' tindika 
l-bżonn li jintu ża livell og ħla ta' doża. Inkella g ħandhom isiru studji pilota 
jew studji preliminari ta' sejbien tal-medda biex ji ġi determinat l-og ħla 
dożaġġ li għandu jipprodu ċi grad minimu ta' tossi ċità materna. Jekk 
intwera li s-sustanza kimika tat-test hija tossika g ħall-iżvilupp fi studju 
standard tat-tossi ċità tal-iżvilupp jew fi studju pilota, l-og ħla livell 
tad-doża għandu jkun id-do ża massima li ma tikka ġunax tossi ċità 
eċċessiva fl-ulied, jew mewt jew malformazzjonijiet  in utero  jew neonatali, 
biżżejjed biex tkun preklu ża evalwazzjoni sinifikanti ta' newrotossi ċità. 
L-inqas livell ta' do ża għandu jkollu l-g ħan li ma jipprodu ċi ebda 
evidenza ta' tossi ċità materna jew tal-i żvilupp, inklu ża newrotossi ċità. 
Għandha ting ħażel sekwenza dixxendenti ta' livelli ta' do ża bilgħan li 
jintwera kwalunkwe rispons relatat mad-do ża u Livell ta' Effett Avvers 
Mhux Osservat (NOAEL), jew do żi qrib il-limitu ta' identifikazzjoni li 
jippermettu li ti ġi determinata do ża ta' riferiment. Intervalli maqsuma fi 
tnejn sa erbg ħa spiss ikunu ottimali sabiex ji ġu stabbiliti l-livelli ta' do ża 
dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp ta' do ża spiss ikun ippreferut iktar 
mill-użu ta' intervalli kbar ħafna (eż., iktar minn fattur ta' 10) bejn 
id-dożaġġi. 
17. Il-livelli ta' do ża għandhom jing ħażlu filwaqt li tittie ħed f'kunsiderazzjoni 
d-dejta e żistenti kollha dwar it-tossi ċità kif ukoll l-informazzjoni 
addizzjonali dwar il-metaboli żmu u t-tossikokinetika tas-sustanza kimika 
tat-test jew materjali relatati. Din l-informazzjoni tista' tg ħin ukoll biex 
turi l-adegwatezza tal-iskeda tad-do żaġġ. Id-dożaġġ dirett tal-frie ħ għandu 
jitqies fuq il-ba żi tal-esponiment u l-informazzjoni farmakokinetika 
(28)(29). G ħandhom jittie ħdu f'kunsiderazzjoni bir-reqqa l-benefi ċċji u 
l-iżvantaġġi qabel ma jsiru studji tad-do żaġġ dirett (30).  
18. Il-grupp ta' kontroll konkurrenti g ħandu jkun grupp ta' kontroll b'kura finta 
jew grupp ta' kontroll b'veikolu jekk jintu ża veikolu fl-g ħoti tas-sustanza 
kimika. Normalment l-annimali g ħandhom jing ħataw l-istess volum ta' 
sustanzi kimi ċi jew veikolu tat-test fuq ba żi ta' piż tal-ġisem. Jekk jintu ża 
veikolu jew addittiv ie ħor biex ji ġi faċilitat id-do żaġġ, għandhom jittie ħdu 
f'kunsiderazzjoni l-karatteristi ċi li ġejjin: l-effetti fuq l-assorbiment, 
id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu jew i ż-żamma tas-susanza kimika tat-test; 
effetti fuq il-proprjetajiet kimi ċi tas-sustanza kimika tat-test li jistg ħu jibdlu 
l-karatteristi ċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' ikel jew ilma jew 
l-istatus nutrizzjonali tal-annimali. Il-veikolu ma g ħandux jikka ġuna effetti li 
jistgħu jfixklu l-interpretazzjoni tal-istudju u la g ħandu jkun tossiku g ħan- 
newromġiba u lanqas ma g ħandu jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni jew 
l-iżvilupp. G ħal veikoli ġodda, għandu jkun inklu ż grupp ta' kontroll 
b'kura finta minbarra grupp ta' kontroll bil-veikolu. L-annimali fil-grupp(i) 
ta' kontroll g ħandhom ji ġu ttrattati bl-istess mod b ħall-annimali tal-grupp 
tat-test.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
L-għoti ta' do żi 
19. Is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test g ħandhom jing ħataw bl-iktar rotta 
rilevanti g ħall-esponiment potenzjali tal-bniedem, u fuq il-ba żi ta' inform ­
azzjoni disponibbli dwar il-metaboli żmu u d-distribuzzjoni fl-annimali 
tat-test. Is-soltu, ir-rotta tal-amministrazzjoni tkun orali (e ż.,gavage, 
djetetika, permezz ta' ilma tax-xorb), i żda jistgħu jintużaw rotot o ħrajn 
(eż., dermali, te ħid man-nifs) skont il-karatteristi ċi u r-rotot ta' esponiment 
antiċipati jew mag ħrufin għall-bniedem (gwida ulterjuri hija pprovduta 
fid-Dokument ta' Gwida 43(8)). G ħandha tkun ipprovduta ġustifikazzjoni 
għar-rotta tal-amministrazzjoni mag ħżula. Is-sustanza kimika tat-test 
għandha ting ħata kuljum bejn wie ħed u ieħor fl-istess ħin tal-ġurnata.  
20. Normalment, id-do ża mogħtija lil kull annimal g ħandha tkun ibba żata fuq 
l-iktar determinazzjoni ri ċenti tal-pi ż tal-ġisem individwali. Madankollu, 
meta d-do żi jiġu aġġustati matul l-a ħħar terz tat-tqala, dan g ħandu jsir 
bir-reqqa. Jekk ti ġi osservata tossi ċità eċċessiva fl-ommijiet ikkurati, dawk 
l-annimali g ħandhom jinqatlu b'mod dinjitu ż. 
21. Bħala minimu, is-sustanza kimika jew il-veikolu tat-test g ħandhom 
jingħataw kuljum lil annimali nisa mg ħammrin mill- ħin tal-impjant 
(GD 6) sat-treddig ħ (PND 21), sabiex il- ħrief ikunu esposti g ħas-sustanza 
kimika tat-test matul l-i żvilupp newrolo ġiku ta' qabel u wara t-twelid. L-età 
li fiha jibda d-do żaġġ, u d-durata u l-frekwenza tad-do żaġġ, jistgħu jiġu 
aġġustati jekk l-evidenza tappo ġġja disinn sperimentali iktar rilevanti g ħal 
esponimenti tal-bniedem. Id-durati tad-do żaġġ għandhom ikunu a ġġustati 
għal speċijiet oħrajn biex ji ġi żgurat esponiment matul il-perjodi bikrin 
kollha tal-i żvilupp tal-mo ħħ (jiġifieri ekwivalenti g ħal tkabbir tal-mo ħħ 
tal-bniedem ta' qabel it-twelid u kmiem wara t-twelid). Id-do żaġġ jista' 
jibda mill-bidu tat-tqala (GD 0) g ħad li għandu jittie ħed f'kunsiderazzjoni 
l-potenzjal li s-sustanza kimika tat-test tikka ġuna telf ta' qabel l-impjant. 
Amministrazzjoni li tibda f'GD 6 tevita dan ir-riskju, i żda l-istadji ta' 
żvilupp bejn GD 0 u 6 ma jkunux ikkurati. Meta laboratorju jixtri 
annimali mg ħammrin bi ż-żmien, ikun imprattiku li d-do żaġġ jinbeda minn 
GD 0, u b'hekk GD 6 ikun jum ta' bidu tajjeb. Il-laboratorju tat-test g ħandu 
jfassal l-iskeda tad-do żaġġ skont l-informazzjoni rilevanti dwar l-effetti 
tas-sustanza kimika tat-test, l-esperjenza fl-img ħoddi, u kunsiderazzjonijiet 
loġistiċi; dan jista' jinkludi estensjoni tad-do żaġġ wara l-ftim. Id-do żaġġ ma 
għandux ise ħħ dakinhar tal- ħlas f'dawk l-annimali li ma jkunux g ħadhom 
welldu l-ulied tag ħhom kompletament. B'mod ġenerali, huwa supponut li 
l-esponiment tal-frie ħ ser isse ħħ permezz tal- ħalib matern; madankollu, 
dożaġġ dirett tal-frie ħ għandu jiġi kkunsidrat f'dawk il-ka żijiet fejn hemm 
nuqqas ta' evidenza ta' esponiment issuktat g ħall-ulied. L-evidenza 
tal-esponiment kontinwu tista' tinkiseb minn e ż.,, informazzjoni farmakoki ­
netika, tossi ċità tal-ulied jew bidliet fil-bijoswieq (28).  
OSSERVAZZJONIJIET  
Osservazzjonijiet tal-ommijiet  
22. L-ommijiet kollha g ħandhom ji ġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum 
fir-rigward tal-kundizzjoni tas-sa ħħa tagħhom, inklu ża l-morbidità u 
l-mortalità.  
23. Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, b'mod perjodiku g ħandhom isiru 
osservazzjonijiet klini ċi iktar dettaljati (tal-inqas darbtejn matul il-perjodu 
tad-dożaġġ fit-tqala u darbtejn matul il-perjodu ta' do żaġġ fit-treddig ħ) billi 
tal-inqas jintu żaw għaxar ommijiet g ħal kull livell ta' do ża. L-annimali 
għandhom ikunu osservati barra l-ga ġġa oriġinali minn tekni ċi mħarrġin li 
ma jafux bil-kura tal-annimali, billi jintu żaw proċeduri standardizzati ħalli 
jiġi minimizzat l-istress tal-annimali u l-pre ġudizzju tal-osservaturi, u ti ġi 
massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta dan ikun possibbli, huwa 
rakkomandat li l-osservazzjonijiet fi studju partikolari jsiru mill-istess 
tekniku.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Il-pre żenza tas-sinjali osservati g ħandha tiġi rreġistrata. Kull meta dan ikun 
possibbli, anki l-kobor tas-sinjali osservati g ħandu jiġi rreġistrat. 
L-osservazzjonijiet klini ċi għandhom jinkludu, i żda ma għandhomx ikunu 
limitati g ħal, bidliet fil- ġilda, il-pil, l-g ħajnejn, il-membrani muku żi, 
l-okkorrenza ta' tnixxijiet, u l-attività awtonomika (e ż., dmugħ, piloe­
rezzjoni, daqs tal- ħabba, xejra respiratorja mhux tas-soltu u/jew te ħid 
tan-nifs bil- ħalq, u kwalunkwe sinjal mhux tas-soltu ta' urina jew rawt).  
25. Kwalunkwe rispons mhux tas-soltu fir-rigward ta' po żizzjoni tal- ġisem, 
livell ta' attività (e ż., esplorazzjoni mnaqqsa jew mi żjuda taż-żona 
standard) u koordinazzjoni tal-moviment g ħandhom ji ġu osservati. Bidliet 
fil-mixja, (e ż., imferċħa, atassja), qag ħda (eż., ħotba) u r-reattività g ħat- 
tqandil, it-tqeg ħid jew stimuli ambjentali o ħrajn, kif ukoll il-pre żenza ta' 
movimenti kloni ċi jew toni ċi, konvulżjonijiet, rog ħda, sterjotipi (e ż.,mixmut 
wisq, ċaqliq tar-ras mhux tas-soltu, tidwir ripetittiv), im ġiba mhux tas-soltu 
(eż., gdim jew lag ħaq eċċessiv, awtomutilazzjoni, mixi lura, tle ħħin), jew 
aggressjoni g ħandhom ji ġu rreġistrati.  
26. Sinjali ta' tossi ċità għandhom ji ġu rreġistrati, inklu ż il-jum tal-bidu, il- ħin 
tal-ġurnata, il-grad, u d-durata.  
27. L-annimali g ħandhom ji ġu ppeżati fil-ħin tad-do żaġġ tal-inqas darba 
fil-ġimgħa matul l-istudju, darkinkhar jew qrib il-jum tal- ħlas, u fil-PND 
21 (ftim). G ħall-istudji ta' gavage, l-ommijiet g ħandhom jinti żnu tal-inqas 
darbtejn fil- ġimgħa. Id-dożi għandhom ikunu a ġġustati fil-ħin ta' kull deter ­
minazzjoni tal-pi ż tal-ġisem, kif xieraq. Il-konsum tal-ikel g ħandu jitkejjel 
kull ġimgħa tal-inqas matul it-tqala u t-treddig ħ. Il-konsum tal-ilma g ħandu 
jitkejjel tal-inqas darba fil- ġimgħa jekk l-esponiment ikun permezz 
tal-provvista tal-ilma.  
L-osservazzjonijiet fuq ulied  
28. L-ulied kollha g ħandhom ji ġu osservati bir-reqqa tal-inqas darba kuljum 
għal sinjali ta' tossi ċità u għall-morbilità u l-mortalità.  
29. Matul il-perjodi tal-kura u l-osservazzjoni, g ħandhom isiru osservazzjonijiet 
kliniċi iktar dettaljati tal-ulied. L-ulied (tal-inqas fer ħ/sess/boton wie ħed) 
għandhom ikunu osservati minn tekni ċi mħarrġin li ma jafux bil-kura 
tal-annimali, billi ju żaw proċeduri standardizzati biex ji ġi minimizzat 
il-preġudizzju u ti ġi massimizzata l-affidabilità bejn l-osservaturi. Meta 
dan ikun possibbli, huwa rakkomandat li l-osservazzjonijiet isiru 
mill-istess tekniku. B ħala minimu, il-punti a ħħarin deskritti fil-paragrafi 
24 u 25 g ħandhom ji ġu ssorveljati kif xieraq g ħall-istadju tal-i żvilupp taħt 
osservazzjonijiet.  
30. Is-sinjali kollha ta' tossi ċità fl-ulied g ħandhom ikunu rre ġistrati, inklu ż 
il-jum tal-bidu, il- ħin tal-ġurnata, il-grad u d-durata.  
Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp  
31. Bidliet fil-fa żijiet ta' żvilupp ta' qabel il-ftim (e ż., ftuħ tal-pinna, ftu ħ 
tal-għajnejn, spuntar tal-in ċiż) huma ferm korrelatati mal-pi ż tal-ġisem 
(30)(31). Il-pi ż tal-ġisem jista' jkun l-a ħjar indikatur ta' żvilupp fi żiku. 
Għaldaqstant, il-kejl tal-fa żijiet ta' żvilupp huwa rakkomandat biss meta 
jkun hemm evidenza minn qabel ta' dawn il-punti a ħħarin ser jipprovdu 
informazzjoni addizzjonali. Il-puntwalità g ħall-valutazzjoni ta' dawn 
il-parametri hija indikata fit-Tabella 1. Skont l-effetti anti ċipati, u 
r-riżultati tal-kejliet inizjali, jista' jkun rakkomandabbli li ji żdiedu punti 
tal-ħin addizzjonali jew li l-kejliet isiru fi stadji o ħrajn tal-iżvilupp.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Huwa rakkomandat li tintu ża l-età ta' wara l-att sesswali minflok l-età ta' 
wara t-twelid meta ji ġi vvalutat l-i żvilupp fiżiku (33). Jekk il-frie ħ jiġu 
ttestjati dakinhar tal-ftim, huwa rakkomandat li dan l-ittestjar isir qabel il-ftim propju biex ji ġi evitat effett ta' konfu żjoni mill-istress marbut 
mal-ftim. Barra minn hekk, kwalunkwe ttestjar ta' wara l-ftim tal-frie ħ ma 
għandux ise ħħ matul il-jumejn ta' wara l-ftim.
 
Tabella 1  
Il-puntwalità tal-valutazzjoni tal-fa żijiet fiżiċi u tal-i żvilupp, u punti a ħħarin 
funzjonali/tal-im ġiba ( a ) 
Perjodi tal-Età 
Punti Aħħarin Qabel il-ftim (  b ) Adolexxenza (  b ) Żgħażagħ ( b ) 
Fażijiet fiżiċi u tal-iżvilupp  
Piż tal-Ġisem u Osser ­
vazzjonijiet Klini ċi fil-ġimgħa ( c ) tal-inqas kull 
ġimgħatejn tal-inqas kull 
ġimgħatejn 
Piż tal-moħħ PND 22 (  d ) fit-terminazzjoni 
Newropatolo ġija PND 22 (  d ) fit-terminazzjoni 
Maturità sesswali — kif xieraq — Fażijiet o ħrajn 
tal-iżvilupp (
 e ) kif xieraq — —  
Punti aħħarin funzjonali/tal-im ġiba 
Ontoġenija tal-im ġiba Tal-inqas żewġ kejliet 
Attività motorja 
(inkluża d-drawwa) 1–3 darbiet (  f ) — darba 
Funzjoni motorja u 
sensorjali — darba darba 
Tagħlim u memorja — darba darba  
( a ) zDin it-tabella tippre żenta n-numru minimu ta' drabi meta g ħandhom isiru l-kejliet. Skont l-effetti 
antiċipati, u r-ri żultati tal-kejliet inizjali, jista' jkun rakkomandabbli li ji żdiedu punti ta' żmien 
addizzjonali (e ż., annimali mda ħħlin fl-età) jew li jitwettqu l-kejliet fi stadji o ħrajn tal-iżvilupp. 
( b ) Huwa rakkomandat li l-frie ħ ma jiġux ittestjati matul il-jumejn wara l-ftim (ara l-paragrafu 31). L-etajiet 
rakkomandati g ħall-ittestjar adoloxxenti huma: tag ħlim u memorja = PND 25 ± 2; funzjoni motorja u 
sensorjali = PND 25 ± 2. Etajiet rakkomandati g ħall-ittestjar ta' żgħażagħ huma PND 60-70. 
( c ) Il-piżijiet tal-ġisem għandhom jitkejlu tal-inqas darbtejn fil- ġimgħa meta l-frie ħ jiġu dożati direttament 
għall-aġġustament tad-do żi fi żmien ta' żieda rapida fil-pi ż tal-ġisem. 
( d ) Il-piżijiet tal-ġisem u n-newropatolo ġija jistgħu jiġu vvalutati f'xi żmien li ji ġi qabel (e ż., PND 11), jekk 
xieraq (ara l-paragrafu 39). 
( e ) Fażijiet oħrajn tal-iżvilupp minbarra l-pi ż tal-ġisem (eż., ftuħ tal-għajnejn) għandhom ji ġu rreġistrati meta 
xieraq (ara l-paragrafu 31). 
( f ) Ara l-paragrafu 35.  
33. Il-ħrief ħajjin għandhom jing ħaddu u jitqassmu skont is-sess e ż., permezz ta' 
spezzjoni vi żwali jew kejl tad-distanza ano ġenitali (34)(35), u kull fer ħ fi 
ħdan boton g ħandu jinti żen b'mod individwali fit-twelid jew ftit wara, 
tal-inqas darba fil- ġimgħa matul it-treddig ħ, u tal-inqas darba kull 
ġimgħatejn wara. Meta ti ġi evalwata l-maturità sesswali, l-età u l-pi ż 
tal-ġisem tal-annimal meta sse ħħ patenza va ġinali (36) jew separazzjoni 
preputjali (37) g ħandhom ji ġu ddeterminati g ħal tal-inqas annimal ra ġel 
wieħed u annimal mara wie ħed għal kull boton.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Ontoġenija tal-im ġiba 
34. L-onto ġenija tal-im ġibiet mag ħżulin għandha titkejjel f'tal-inqas fer ħ/ 
sess/boton wie ħed matul il-perjodu tal-età xieraq, bl-istess frie ħ li 
jintużaw fil-jiem kollha tat-test g ħall-imġibiet kollha vvalutati. Il-jiem 
tal-kejl g ħandhom jitqassmu b'mod regolari tul dak il-perjodu biex ti ġi 
definita l-bidla normali jew dik relatata mal-kura fl-onto ġenija ta' dik 
l-imġiba (38). Dawn li ġejjin huma xi e żempji ta' m ġibiet li tista' ti ġi 
vvalutata l-onto ġenija tagħhom: rifless sabiex l-annimal iqum fuq saqajh, 
ġeotassi negattiva u attività motorja (38)(39)(40).  
L-attività motorja  
35. L-attività motorja g ħandha tiġi ssorveljata (41)(42)(43)(44)(45) matul 
il-perjodi ta' età ta' qabel il-ftim u tal-adultezza. G ħall-ittestjar fil- ħin 
tal-ftim, ara l-paragrafu 32. Is-sessjoni tat-test g ħandha tkun twila 
biżżejjed biex tintwera drawwa bejn is-sessjonijiet g ħal kontrolli mhux 
ikkurati. L-u żu tal-attività motorja biex ti ġi vvalutata l-onto ġenija 
tal-imġiba huwa ferm rakkomandat. Jekk jintu ża bħala test tal-onto ġenija 
tal-imġiba, f'dak il-ka ż l-ittestjar g ħandu juża l-istess annimali g ħas-sess­
jonijiet kollha tat-test ta' qabel il-ftim. L-ittestjar g ħandu jkun spiss 
biżżejjed biex ti ġi vvalutata l-onto ġenija tad-drawwa fi ħdan is-sessjoni 
(44). Dan jista' jkun je ħtieġ tliet perjodi ta' żmien jew iktar qabel, u 
inkluż, il-jum tal-ftim (e ż., PND 13, 17, 21). L-ittestjar tal-istess annimali, 
jew sħab tal-boton, g ħandu jseħħ f'età adulta qrib tmiem l-istudju (e ż., PND 
60-70). L-ittestjar f'jiem addizzjonali jista' jsir kif ikun hemm b żonn. 
L-attività motorja g ħandha tiġi ssorveljata permezz ta' apparat awtomatizzat 
li jrireġistra l-attività li g ħandu jkun kapa ċi jidentifika kemm żidiet kif ukoll 
tnaqqisijiet fl-attività (ji ġifieri attività ba żi kif imkejla mill-istrument ma 
għandhiex tkun baxxa wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' 
tnaqqsijiet, u lanqas g ħolja wisq tant li tipprekludi l-qbid ta' żidiet 
fl-attività). Kull strument g ħandu jiġi ttestjat permezz ta' pro ċeduri 
standard biex tkun żgurata, kemm jista' jkun, l-affidabilità tal-operazzjoni 
bejn apparati u fost il-jiem. Kemm jista' jkun, il-gruppi tal-kura g ħandhom 
jiġu bbilanċjati bejn l-istrumenti. Kull annimal g ħandu jiġi ttestjat b'mod 
individwali. Il-gruppi tal-kura g ħandhom ikunu kontrobilan ċjati bejn ħinijiet 
tat-test biex ti ġi evitata konfu żjoni permezz tar-ritmi ċirkadjani tal-attività. 
Għandhom isiru sforzi biex ji ġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet 
tat-test huma minimi u mhumiex sistematikament relatati mal-kura. Fost 
il-varjabbli li jistg ħu jaffettwaw afna mi żuri tal-im ġiba, inklu ża l-attività 
motorja, hemm il-livell tal- ħoss, id-daqs u l-forma tal-ga ġġa tat-test, 
it-temperatura, l-umdità relattiva, il-kundizzjonijiet tad-dawl, l-irwejja ħ, 
l-użu tal-gaġġa oriġinali jew ga ġġa tat-test ġdida u distrazzjonijiet 
ambjentali.  
Il-funzjoni motorja u sensorjali  
36. Il-funzjoni motorja u sensorjali g ħandha tiġi analizzata f'dettall tal-inqas 
darba għall-perjodu adoloxxenti u darba matul il-perjodu ta ż-żgħożija (eż., 
PND 60-70). G ħall-ittestjar fi żmien il-ftim, ara l-paragrafu 32. G ħandu jsir 
ittestjar suffi ċjenti biex ji ġi żgurat kampjunar kwantitattiv adegwat 
tal-modalitajiet sensorjali (e ż., somatosensorjali, vestibulari) u 
l-funzjonijiet motorji (e ż.,saħħa, koordinazzjoni). Ftit e żempji ta' testijiet 
għall-funzjoni motorja u sensorjali huma rispons g ħal forza (46), rifless 
biex l-annimal iqum fuq saqajh (47)(48), drawwa ta' qatg ħa awditorja 
(40)(49)(50)(51)(52)(53)(54), u potenzjali evokati (55).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Testijiet tat-tag ħlim u tal-memorja  
37. Għandu jsir test tat-tag ħlim u l-memorja asso ċjattivi wara l-ftim (e ż.,, 25 
± 2 jum) u g ħal żgħażagħ (PND 60 u iktar). G ħall-ittestjar fi żmien il-ftim, 
ara l-paragrafu 32. L-istess test(ijiet) jew o ħrajn separati jistg ħu jintużaw 
f'dawn iż-żewġ stadji tal-i żvilupp. Jista' jkun hemm xi flessibilità fl-g ħażla 
tat-test(ijiet) g ħat-tagħlim u l-memorja f'firien li jkunu g ħadhom kif infatmu 
u adulti. Madankollu, it-test(ijiet) g ħandhom jitfasslu b'tali mod li jisso ­
disfaw żewġ kriterji. L-ewwel nett, it-tag ħlim għandu jiġi vvalutat jew 
bħala bidla fuq bosta provi jew sessjonijiet ripetuti ta' tag ħlim, jew, f'testijiet 
li jinvolvu prova wa ħda, b'referenza g ħal kundizzjoni li tivverifika hemmx 
effetti mhux asso ċjattivi tal-esperjenza ta' ta ħriġ. It-tieni, it-test(ijiet) g ħandu 
jinkludi xi kejl tal-memorja (tat-terminu qasir jew fit-tul) minbarra t-tag ħim 
oriġinali (kisba), i żda dan il-kejl tal-memorja ma jistax ikun irrapportat 
fin-nuqqas ta' mi żura ta' kisba miksuba mill-istess test. Jekk it-test(ijiet) 
tat-tagħlim u l-memorja juri/u effett tas-sustanza kimika tat-test, jistg ħu 
jiġu kkunsidrati testijiet addizzjonali biex ji ġu evitati interpretazzjonijiet 
alternattivi bba żati fuq alterazzjonijiet fil-kapa ċitajiet sensorjali, moti ­
vazzjonali u/jew motorji. Minbarra dawn i ż-żewġ kriterji ta' hawn fuq, 
huwa rakkomandat li t-test tat-tag ħlim u l-memorja jing ħażel fuq il-ba żi 
tas-sensittività murija tieg ħu għall-klassi tas-sustanza kimika investigata, 
jekk it-tali informazzjoni tkun disponibbli fit-tag ħrif. Fin-nuqqas ta' din 
l-informazzjoni, e żempji ta' testijiet li jistg ħu jsiru biex ji ġu ssodisfati 
-kriterji ta' hawn fuq jinkludu: evitar passiv (43)(56)(57), tlaqqig ħ ittardjat 
mal-pożizzjoni g ħall-far adult (58) u g ħall-far tarbija (59), 
il-kundizzjonament olfattiv (43)(60), il-labirint fl-ilma ta' Morris (61)(62)(63), il-labirint ta' Biel jew Cincinnati (64)(65), il-labirint b'fet ħiet 
radjali (66), il-labirint T (43), u l-kisba u ż-żamma ta' m ġiba kkontrollata 
minn skeda (26)(67)(68). Hemm testijiet addizzjonali deskritti fit-tag ħrif 
dwar firien li jkunu g ħadhom kif infatmu (26)(27) u firien adulti (19)(20).
 
Awtopsja  
38. L-annimali materni jistg ħu jiġu ewtanizzati wara l-ftim tal-ulied.  
39. L-evalwazzjoni newropatolo ġika tal-ulied ser issir billi jintu żaw tessuti minn 
annimali maqtulin b'mod dinjitu ż fil-PND 22 jew f'punt ta' żmien qabel bejn 
PND 11 u PND 22, kif ukoll fi tmiem l-istudju. G ħal ulied maqtulin 
sal-PND 22, g ħandhom ji ġu evalwati t-tessuti tal-mo ħħ; għal annimali 
maqtulin fit-tmiem, g ħandhom ji ġu evalwati kemm it-tessuti tas-sistema 
nervuża ċentrali (CNS) kif ukoll it-tessuti tas-sistema nervu ża 
periferali (PNS). L-annimali maqtulin fil-PND 22 jew qabel jistg ħu jiġu 
fissati jew permezz ta' immersjoni jew perfu żjoni. L-annimali maqtulin fi 
tmiem l-istudju g ħandhom ji ġu fissati permezz ta' perfu żjoni. L-aspetti 
kollha tat-t ħejjija tal-kampjuni ta' tessut, mill-perfu żjoni tal-annimali 
sad-dissezzjoni tal-kampjuni tat-tessuti, l-ippro ċessar tat-tessuti, u t-tilwin 
tas-slides g ħadhom iħaddmu disinn kontrobilan ċjat b'tali mod li kull lott 
ikun fih kampjuni rappre żentattivi minn kull grupp ta' do ża. Tista' tinstab 
gwida addizzjonali dwar in-newropatolo ġija fid-Dokument ta' Gwida 
tal-OECD Nru. 20(9), ara wkoll (103).  
L-ipproċessar ta' kampjuni tat-tessuti  
40. Għandha tittie ħed nota tal-anormalitajiet grossi kollha li jidhru fi żmien 
in-nekropsija. Il-kampjuni tat-tessut me ħudin għandhom jirrappre żentaw 
ir-reġjuni l-kbar kollha tas-sistema nervu ża. Il-kampjuni tat-tessut 
għandhom jin żammu b'mod fissattiv xieraq u ji ġu pproċessati skont 
protokolli standardizzati ppubblikati dwar l-istolo ġija (69)(70)(71)(103). 
L-impjantazzjoni tal-paraffina hija a ċċettabbli g ħal tessuti tas-CNS u 
l-PNS, iżda l-użu ta' ożmju wara l-fissazzjoni, flimkien ma' impjantazzjoni 
tal-eposside, jista' jkun xieraq meta jkun hemm b żonn ta' grad og ħla ta'  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
riżoluzzjoni (e ż.,għal nervi periferali meta tkun suspettata newropatija 
periferali u/jew anai żi morfometrika tan-nervi periferali). It-tessut tal-mo ħħ 
miġbur għal analiżi morfometrika g ħandu jiġi impjantat fil-midjums xierqa 
fil-livelli tad-do ża kollha fl-istess ħin sabiex ji ġu evitati o ġġetti li jiċkienu li 
jistgħu jkunu asso ċjati ma' ħażna mtawla f'fissattiv (6).  
Eżami newropatolo ġiku 
41. L-iskopijiet tal-e żami kwalitattiv huma:  
(i) li jidentifika re ġjuni fis-sistema nervu ża li jesibixxu evidenza ta' alter ­
azzjonijiet newropatolo ġiċi; 
(ii) li jidentifika tipi ta' alterazzjonijiet newropatolo ġiċi li jirriżultaw minn 
esponiment g ħas-sustanza kimika tat-test; u  
(iii) li jiddetermina l-medda tas-severità tal-alterazzjonijiet newropatolo ġiċi. 
It-taqsimiet istolo ġiċi rappreżentattivi mill-kampjuni tat-tessut g ħandhom 
jiġu eżaminati bil-mikroskopju minn patolo ġista mħarreġ kif xieraq g ħal 
evidenza ta' alterazzjonijiet newropatolo ġiċi. L-alterazzjonijiet newropato ­
loġiċi kollha g ħandhom ji ġu assenjati grad su ġġettiv li jindika s-severità. 
Tilwin b'ematossilina u eosina jista' jkun bi żżejjed biex ji ġu evalwati 
taqsimiet tal-mo ħħ minn annimali maqtulin b'mod dinjitu ż fil-PND 22, 
jew qabel. Madankollu, tilwin tal-mjelin (e ż.,, luxol fast blue/cresyl 
violet) u tilwin lewn il-fidda (e ż., tilwin ta' Bielschowsky jew Bodians) 
huma rakkomandati g ħat-taqsimiet tat-tessuti tas-CNS u l-PNS minn 
annimali maqtulin fi tmiem l-istudju. So ġġetti għall-ġudizzju professjonali 
tal-patolo ġista u t-tip ta' alterazzjonijiet osservati, tilwin ie ħor jista' jitqies 
xieraq biex ji ġu identifikati u kkaratterizzati tipi partikolari ta' alter ­
azzjonijiet (e ż., proteina a ċidika fibrillari glijali (GFAP) jew istokimika 
tal-lektina biex ji ġu vvalutati alterazzjonijiet glijali u mikroglijali (72), 
fluoro-jade biex ti ġi identifikata nekro żi (73)(74), jew tilwin tal-fidda 
speċifiku għad-deġenerazzjoni newrali (75)).  
42. Għandha ssir evalwazzjoni morfometrika (kwantitattiva) peress li din 
id-dejta tista' tg ħin fl-identifikazzjoni ta' effett relatat mal-kura u hija utli 
fl-interpretazzjoni tad-differenzi relatati mal-kura fil-pi ż tal-moħħ jew 
il-morfolo ġija (76)(77). It-tessut nervu ż għandu jiġi kampjunat u jit ħejja 
biex tkun tista' ssir evalwazzjoni morfometrika. L-evalwazzjonijiet morfo ­
metriċi jistgħu jinkludu e ż., kejliet lineari jew areali ta' re ġjuni speċifiċi 
tal-moħħ (78). Kejliet lineari jew areali je ħtieġu l-użu ta' taqsimiet 
omologi mag ħżulin bir-reqqa fuq il-ba żi ta' punti referenzjarji mikroskopi ċi 
affidabbli (6). Tista' tintu ża l-istereolo ġija biex ji ġu identifikati effetti 
relatati mal-kura fuq parametri b ħall-volum jew in-numru ta' ċelloli għal 
reġjuni newroanatomi ċi speċifiċi (79)(80)(81)(82)(83)(84).  
43. L-im ħuħ għandhom ji ġu eżaminati g ħal kwalunkwe evidenza ta' alter ­
azzjonijiet newropatolo ġiċi relatati mal-kura u g ħandhom jittie ħdu 
kampjuni adegwati mir-re ġjuni ewlenin kollha tal-mo ħħ (eż., il-basal 
olfattivi, il-korti ċi ċerebrali, l-ippokampu, il-gangliji tal-ba żi, it-talamu, 
l-ipotalamu, il-me żenċefalu (tektum, tegmentum, u pendunkuli ċerebrali), 
il-pont, il-medulla tawwalija, i ċ-ċervellett) biex ji ġi żgurat eżami dettaljat. 
Importanti li t-taqsimiet g ħall-annimali kollha jittie ħdu fl-istess pjan. F'adulti 
maqtulin b'mod dinjitu ż fi tmiem l-istudju, g ħandhom jittie ħdu kampjuni 
mit-taqsimiet rappre żentattivi tas-sinsla tad-dahar u l-PNS. I ż-żoni eżaminati 
għandhom jinkludu l-g ħajn bin-nerv ottiku u r-retina, is-sinsla tad-dahar 
fin-nefħiet ċervikali u lombari, il-fibri tal-g ħeruq dorsali u ventrali, 
in-nerv xjatiku prossimali, in-nerv tat-tibja prossimali (fl-irkoppa), u l-għeruq tal-muskolu tal-pexxul tan-nerv tat-tibja. It-taqsimiet tas-sinsla 
tad-dahar u tan-nerv periferali g ħandhom jinkludu kemm it-taqsimiet 
djagonali jew trasversali kif ukoll lon ġitudinali.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. L-evalwazzjoni newropatolo ġika għandha tinkludi e żami għal indi­
kazzjonijiet ta' ħsara tal-i żvilupp fis-sistema nerva ża 
(6)(85)(86)(87)(88)(89), minbarra l-alterazzjonijiet ċellolari (e ż., vakwo ­
lazzjoni newronali, de ġenrazzjoni, nekro żi) u bidliet fit-tessut (e ż., glijożi, 
infiltrazzjoni lewko ċitika, formazzjoni ċistika). F'dan ir-rigward, importanti 
li l-effetti relatati mal-kura ji ġu distinti minn avvenimenti normali 
tal-iżvilupp li jkunu mag ħrufin li jse ħħu fi stadju tal-i żvilupp li jikkor ­
rispondi g ħall-ħin tas-sagrifi ċċju (90). L-e żempji ta' alterazzjonijiet sini ­
fikanti li jindikaw ħsara tal-iżvilupp jinkludu, i żda mhumiex limitati g ħal: 
— alterazzjonijiet fid-daqs jew il-forma gross tal-basal olfattivi, i ċ-ċerebru 
jew iċ-ċervellett,  
— alterazzjonijiet fid-daqs relattiv tal-bosta re ġjuni tal-mo ħħ, inklużi tnaqq­
isijiet jew żidiet fid-daqs tar-re ġjuni li jirri żultaw mit-telf jew 
il-persistenza ta' popolazzjonijiet normalment temporanji ta' ċelloli jew 
projezzjonijiet assonali (e ż., saff ġerminali estern jew ċervellett, corpus 
callosum),  
— alterazzjonijiet fil-proliferazzjoni, il-migrazzjoni, u d-differenzazzjoni, 
kif indikat mi ż-żoni ta' apopto żi jew nekro żi eċċessiva, għoqiedi jew 
popolazzjonijiet mifruxin ta' newroni ektopi ċi, diżorjentati jew 
malformati jew alterazzjonijiet fid-daqs releattiv tal-bosta saffi ta' strutturi kortikali,
 
— alterazzjonijiet fil-mudelli ta' mjelinazzjoni, inklu ż tnaqqis ġenerali 
fid-daqs jew tilwin alterat ta' strutturi mjelinati,  
— evidenza ta' idro ċefalu, b'mod partikolari tkabbir tal-ventrikli, steno żi 
tal-akwedott ċerebrali u tidjiq tal-emisferi ċerebrali.  
Analiżi tar-relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons tal-alterazzjonijiet 
newropatolo ġiċi 
45. Hija rakkomandata l-pro ċedura bba żata fuq passi li ġejja għall-analiżijiet 
newropatolo ġiċi kwalitattivi u kwantitattivi. L-ewwel nett, it-taqsimiet 
mill-grupp ta' do ża għolja huma mqabblin ma' dawk tal-grupp ta' 
kontroll. Jekk ma tinstab ebda evidenza ta' alterazzjonijiet newropatolo ġiċi 
fl-annimali tal-grupp ta' do ża għolja, ma jkun hemm b żonn ta' ebda anali żi 
ulterjuri. Jekk tinsab evidenza ta' alterazzjonijiet newropatolo ġiċi fil-grupp 
ta' doża għolja, jiġu eżaminati l-annimali mill-gruppi ta' do ża intermedja u 
baxxa. Jekk il-grupp ta' do ża għolja jintemm min ħabba mewt jew tossi ċità 
oħra ta' konfu żjoni, il-gruppi ta' do ża għolja u intermedja g ħandhom ji ġu 
analizzati g ħal alterazzjonijiet newropatolo ġiċi. Jekk ikun hemm xi indi ­
kazzjoni ta' newrotosso ċità fil-gruppi ta' do ża baxxa, g ħandha ssir anali żi 
newropatolo ġika f'dawk il-gruppi. Jekk tinstab xi alterazzjoni newropato ­
loġika relatata mal-kura fl-e żami kwalitattiv jew kwantitattiv, g ħandha tiġi 
ddeterminata d-dipendenza fuq id-do ża tal-inċidenza, il-frekwenza u l-grad 
ta' severità tal-le żjonijiet jew tal-alterazzjonijiet morfometri ċi, fuq il-ba żi ta' 
evalwazzjoni tal-annimali kollha mill-gruppi ta' do ża kollha. f'din 
l-evalwazzjoni g ħandhom ikunu inklu żi r-reġjuni tal-mo ħħ li jesibixxu xi 
evidenza ta' alterazzjoni newropatolo ġika għandhom ikunu inklu żi. 
Ir-reġjuni kollha tal-mo ħħ li jesibixxu xi evidenza ta' alterazzjoni newropa ­
toloġika għandhom G ħal kull tip ta' le żjoni, għandhom ji ġu deskritti 
l-karatteristi ċi użati biex ji ġi definit kull grad ta' severità, billi ji ġu 
indikati l-karatteristi ċi użati għad-differenzazzjoni ta' kull grad. 
Il-frekwenza ta' kull tip ta' le żjoni u l-grad ta' severità tag ħha għandhom 
jiġu rreġistrati u g ħandha ssir anali żi statistika biex ti ġi evalwata l-g ħamla 
ta' relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons. Huwa rakkomandat li jintu żaw slides 
kodifikati (91).  
DEJTA U RAPPORTAR  
Dejta  
46. Id-dejta g ħandha tiġi rrapportata b'mod individwali u tin ġabar fil-qosor 
f'forma tabulari, li g ħal kull grupp tat-test turi t-tipi ta' bidla u n-numru 
ta' ommijiet, l-ulied skont is-sess, u l-boton li juru kull tip ta' bidla. Jekk 
ikun sar esponiment dirett tal-frie ħ wara t-twelid, g ħandhom ji ġu rrapportati 
r-rotta, id-durata u l-perjodu ta' esponiment.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati  
47. Studju dwar in-newrotossi ċità tal-iżvilupp ser jipprovdi informazzjoni dwar 
l-effetti ta' esponiment ripetut g ħal sustanza kimika matul żvilupp  in utero  
u kmieni wara t-twelid. Peress li jinxte ħet enfasi kemm fuq punti a ħħarin 
tat-tossiċità ġenerali kif ukoll tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp, ir-ri żultati 
tal-istudju ser jippermettu li ssir distinzjoni bejn effetti tan-newro żvilupp 
li jseħħu fin-nuqqas ta' tossi ċità materna, u dawk li jkunu espressi biss 
f'livelli li huma tossi ċi wkoll g ħall-annimal matern. Min ħabba 
l-interrelazzjonijiet kumplessi bejn id-disinn tal-istudji, l-anali żi statistika, 
u l-importanza bijolo ġika tad-dejta, interpretazzjoni adegwata tad-dejta 
dwar in-newrotossi ċità tal-iżvilupp ser tinvolvi ġudizzju tal-esperti 
(107)(109). L-interpretazzjoni tar-ri żultati tat-test g ħandha tuża approċċ ta' 
piż tal-evidenza (20)(92)(93)(94). G ħandhom ji ġu diskussi l-mudelli 
tas-sejbiet tal-im ġiba jew morfolo ġiċi, jekk ikunu pre żenti, kif ukoll 
evidenza tar-rispons g ħad-doża. Dejta mill-istudji kollha rilevanti g ħall-eval­
wazzjoni tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp, inklu żi studji jew rapporti ta' 
każijiet epidemjolo ġiċi tal-bniedem, u studji sperimentali fuq annimali 
(eż., dejta tossikokinetika, informazzjoni struttura-attività, dejta minn 
studji o ħrajn dwar it-tossi ċità) għandha tkun inklu ża f'din 
il-karatterizzazzjoni. Dan jinkludi r-relazzjoni bejn id-do żi tas-sustanza 
kimika tat-test u l-pre żenza jew in-nuqqas, l-in ċidenza, u d-daqs ta' 
kwalunkwe effett newrotissiku g ħal kull sess (20)(95).  
48. L-evalwazzjoni tad-dejta g ħandha tinkludi ta ħdita kemm fuq l-importanza 
bijoloġika kif ukoll dik statistika. L-anali żi statistika g ħandha titqies b ħala 
għodda li tiggwida minflok tiddetermina l-interpretazzjoni tad-dejta. 
In-nuqqas ta' importanza statistika ma g ħandux ikun l-unika ba żi għall- 
konklużjoni ta' nuqqas ta' effett relatat mal-kura, u lanqas mal-importanza 
statistika ma g ħandha tkun l-unika ġustifikazzjoni g ħall-konklu żjoni ta' 
effett relatat mal-kura. B ħala protezzjoni kontra sejbiet negattivi foloz u 
d-diffikultajiet inerenti fil-“prova ta' negattiv”, g ħandha tiġi diskussa dejta 
kontroll storiku u po żittiv disponibbli, spe ċjalment meta ma jkun hemm 
l-ebda effett relatat mal-kura (102)(106). Il-probabilità ta' po żittivi foloz 
għandha tiġi diskussa fid-dawl tal-evalwazzjoni statistika s ħiħa tad-dejta 
(96). L-evalwazzjoni g ħandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm 
waħda, bejn alterazzjonijiet newropatolo ġiċi u tal-im ġiba osservati.  
49. Ir-ri żultati kollha g ħandhom ji ġu analizzati billi jintu żaw mudelli statisti ċi 
xierqa għad-disinn sperimentali (108). L-g ħażla ta' anali żi parametrika jew 
nonparametrika g ħandha tkun i ġġustifikata billi ji ġu kkunsidrati fatturi 
bħall-għamla tad-dejta (trasformata jew le) u d-distribuzzjoni tag ħha, kif 
ukoll ir-robustezza relattiva tal-anali żi statistika mag ħżula. L-iskop u 
d-disinn tal-istudju g ħandhom jiggwida l-g ħażla tal-anali żijiet statist ċi biex 
jiġu minimizzati żbalji tat-Tip I (po żittiv falz) u tat-Tip II (negattiv 
falz)(96)(97)(104)(105). L-istudji tal-i żvilupp li ju żaw speċi li jwelldu 
ħafna frie ħ u li fihom ji ġu ttestjati diversi ħrief għal kull boton 
għandhom jinkludu l-boton fil-mudell statistiku b ħala protezzjoni kontra 
rati ta' żball tat-Tip I imkabbrin (98)(99)(100)(101). L-unità statistika 
tal-kejl g ħandha tkun il-boton u mhux il-fer ħ. L-esperimenti g ħandhom 
jitfasslu b'tali mod li l-a ħwa tal-boton ma jitqisux osservazzjonijiet indipen ­
denti. Kwalunkwe punt a ħħari mkejjel b'mod ripetut fl-istess su ġġett għandu 
jiġi analizzat billi jintu żaw mudelli statisti ċi li jieħdu f'kunsiderazzjoni 
n-nuqqas ta' dipendenza ta' dawk il-kejliet.  
Rapport tat-test  
50. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanza kimika tat-test:  
— in-natura fi żika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fi żjokimiċi, 
— dejta ta' identifikazzjoni, inklu ż is-sors,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— il-purità tal-preparazzjoni, u impuritajiet mag ħrufin u/jew anti ċipati.  
Veikolu (jekk xieraq):  
— ġustifikazzjoni tal-g ħażla tal-veikolu, jekk mhuwiex ilma jew soluzzjoni 
salmastra fi żjoloġika. 
Annimali tat-test:  
— l-ispeċi u r-razza u żati, u ġustifikazzjoni jekk ma jintu żax far,  
— il-fornitur tal-annimali tat-test,  
— in-numru, l-età fil-bidu, u s-sess tal-annimali,  
— is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, l-ilma, e ċċ., 
— il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— il-ħsieb wara l-g ħażla tal-livell ta' do ża, 
— il-ħsieb wara r-rotta tad-do żaġġ u l-perjodu ta' żmien,  
— l-ispeċifikazzjonijiet tad-do żi mogħtijin, inklu żi d-dettalji tal-veikolu, 
il-volum u l-forma fi żika tal-materjal mog ħti, 
— dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/il-preparazzjoni 
tad-dieta, il-kon ċentrazzjoni, l-istabilità u l-omo ġenità miksubin 
tal-preparazzjoni,  
— il-metodu u żat għall-identifikazzjoni unika tal-ommijiet u l-ulied,  
— deskrizzjoni dettaljata tal-pro ċedura/i aleatorja/i u żata/i biex l-ommijiet 
jiġu assenjati g ħal gruppi tal-kura, biex jing ħażlu l-frieħ għall-għażla, u 
biex il-frie ħ jiġu assenjati g ħal gruppi tat-test,  
— dettalji tal-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test,  
— konver żjoni minn kon ċentrazzjoni tad-dieta/ilma tax-xorb jew 
tas-sustanza kimika tat-test li tittie ħed man-nifs (ppm) g ħad-doża 
propja (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli,  
— il-kundizzjonijiet ambjentali,  
— dettalji tal-kwalità tal-ikel u l-ilma (e ż., tat-tapp, distillat);  
— id-dati ta' meta beda u spi ċċa l-istudju.  
Osservazzjonijiet u pro ċeduri tat-test:  
— deskrizzjoni dettaljata tal-pro ċeduri użati biex l-osservazzjonijiet u 
l-proċeduri jiġu standardizzati kif ukoll definizzjonijiet operazzjonali 
għall-punteġġ tal-osservazzjonijiet;  
— lista tal-pro ċeduri kollha tat-test u żati, u ġustifikazzjoni g ħall-użu 
tagħhom;  
— dettalji tal-pro ċeduri tal-im ġiba/funzjonali, patolo ġiċi, newrokimi ċi jew 
elettrofiżjoloġiċi użati, inklu żi informazzjoni u dettalji dwar strumenti 
awtomatizzati;  
— proċeduri għall-kalibra ġġ u l-iżgurar tal-ekwivalenza tal-istrumenti u 
l-ibbilanċjar tal-gruppi tal-kura fil-pro ċeduri tal-ittestjar;  
— ġustifikazzjoni qasira li tispjega kwalunkwe de ċiżjoni li tinvolvi 
ġudizzju professjonali.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Riżultati (individwali u sommarju, inklu żi l-medja u l-varjanza meta jkunu 
xierqa):  
— in-numru ta' annimali fil-bidu tal-istudju u n-numru fi tmiem l-istudju,  
— in-numru ta' annimali u boton u żati għal kull metodu tat-test,  
— in-numru ta' identifikazzjoni ta' kull annimal u l-boton li ġie minnu,  
— id-daqs tal-boton u l-pi ż medju fil-bidu skont is-sess,  
— dejta dwar il-pi ż tal-ġisem u dwar il-bidla fil-pi ż tal-ġisem, inklu ż il-piż 
tal-ġisem terminali g ħall-ommijiet u l-ulied,  
— dejta dwar il-konsum ta' ikel, u dejta dwar il-konsum ta' ilma jekk 
xierqa (eż., jekk is-sustanza kimika tat-test ting ħata permezz tal-ilma),  
— dejta dwar ir-rispons tossiku skont is-sess u l-livell ta' do ża, inklużi 
sinjali tat-tossi ċità jew il-mortalità, inklu żi l-ħin u l-kaw ża tal-mewt, 
jekk xieraq,  
— in-natura, is-severità, id-durata, il-jum tal-bidu, il- ħin tal-ġurnata, u 
l-kors sussegwenti tal-osservazzjonijiet klini ċi dettaljati,  
— il-punte ġġ f'kull fa żi tal-iżvilupp (il-pi ż, il-maturità sesswali u 
l-ontoġenija tal-im ġiba) f'kull ħin ta' osservazzjoni,  
— deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha tal-im ġiba, funzjonali, newropa ­
toloġiċi, newrokimi ċi, elettrofi żjoloġiċi skont is-sess, inklu żi kemm 
żidiet kif ukoll tnaqqisiet minn kontrolli,  
— sejbiet dwar in-nekropsija,  
— piżijiet tal-ġisem,  
— kwalunkwe dijanjosi msawra minn sinjali newrolo ġiċi u leżjonijiet, 
inklużi mard jew kundizzjonijiet li jse ħħu b'mod naturali,  
— stampi ta' sejbiet e żemplari,  
— stampi b'ener ġija baxxa biex ti ġi vvalutata l-omolo ġija tas-sezzjonijiet 
użati għall-morfometrija,  
— dejta dwar l-assorbiment u l-metaboli żmu, inklu ża dejta komplimentari 
minn studju tossikokinetiku separat, jekk disponibbli,  
— it-trattament statistiku tar-ri żultati, inklu żi mudelli statisti ċi użati biex 
tiġi analizzata d-dejta, u r-ri żultati, irrilevanti jekk kinux sinifikanti 
jew le,  
— lista tal-persunal tal-istudju, inklu ż it-taħriġ professjonali.  
Diskussjoni tar-ri żultati:  
— informazzjoni dwar ir-rispons g ħad-doża, skont is-sess u l-grupp,  
— relazzjoni ta' kwalunkwe effett tossiku ie ħor ma' konklu żjoni dwar 
il-potenzjal newrotissiku tas-sustanza kimika tat-test, skont is-sess u l-grupp,
 
— l-impatt ta' kwalunkwe informazzjoni tossikokinetika fuq 
il-konklużjonijiet,  
— is-similaritajiet tal-effetti ta' kwalunkwe newrotossiku mag ħruf, ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— dejta li ssostni l-affidabilità u s-sensittività tal-metodu tat-test (ji ġifieri 
dejta ta' kontroll storiku u po żittiv),  
— ir-relazzjonijiet, jekk je żistu, bejn l-effetti newropatolo ġiċi u funzjonali,  
— l-NOAEL jew id-do ża ta' riferiment g ħal ommijiet u ulied, skont is-sess 
u l-grupp.  
Konklużjonijiet:  
— diskussjoni dwar l-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta bba żata fuq 
ir-riżultati, inklu ża konklu żjoni dwar jekk is-sustanza kimika tat-test 
ikkaġunatx newrotossi ċità tal-iżvilupp u l-NOAEL.  
TAGĦRIF 
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Kopen ħagen, id-Danimarka, 
13-14 ta' Ġunju 1995.  
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239. Disponibbli fuq: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].  
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Disponibbli fuq: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral 
effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.  
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.
 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., 
Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropath ­
ology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.  
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., Stati Uniti, 23- 
25 ta' Ottubru 2000.  
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Pari ġi. Lulju 2008. Disponibbli fuq: [http://search.oecd.org/official ­
documents/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Pari ġi, Settembru 2003. Disponibbli 
fuq: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_ 1_1_1,00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quanti ­
tative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2  nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford 
University Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neurotox ­
icology, 1  st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
(14) Il-Kapitolu B.34 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossi ċità riproduttiva ta' 
ġenerazzjoni wa ħda. 
(15) Il-Kapitolu B.35 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossi ċità riproduttiva ta' 
żewġ ġenerazzjonijiet.  
(16) Il-Kapitolu B.43 ta' dan l-Anness, Studju dwar in-Newrotossi ċità 
fir-Rodituri.  
(17) Il-Kapitolu B.31 ta' dan l-Anness, Studju dwar it-tossi ċità tal-iżvilupp 
qabel it-twelid.  
(18) Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal 
skopijiet xjentifi ċi. ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33.  
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, Stati Uniti. Disponibbli fuq: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health 
Organization Publications, Ġinevra. Disponibbli fuq: [http:// 
www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods, 1  st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neur ­
otoxicol. Teratol., 19:499-509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.
 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  
Perinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic 
Press, Orlando.  
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.  
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.  
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5 A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phama ­
ceuticals for Human Use.
 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical 
considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.
 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.
 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial 
separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.
 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.  
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 67-100.  
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.  
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the 
measurement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychophar ­
macology , Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) 
Plenum Press, New York, pp. 37-82.  
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neur ­
otoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the 
rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assess ­
ments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.  
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neur ­
otoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory 
animals.Physiol. Behav., 64:661-669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589-591.  
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287- 
351 
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211.  
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced otot ­
oxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.
 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445.  
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. pp. 125-145.  
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.
 
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.
 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244.  
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479.  
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.
 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.  
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342-352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.  
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122-131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Wash ­
ington, DC, pp. 84-107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, Churchill Livingstone, Londra.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated 
evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, 
and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.  
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. 
Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for 
developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129–135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York.  
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A 
practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 
305-310.  
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.  
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.  
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61.  
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.  
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294-298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , 
Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70-74.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.
 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.  
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644 A.  
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Lade ­
foged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotox ­
icology, 5:113-126.  
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21-27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.
 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.
 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 
34:296-313.
 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.
 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.
 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266-287.
 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326-348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figura 1  
Skema ġenerali ta' ttestjar g ħat-testijiet funzjonali/tal-im ġiba, evalwazzjoni 
tan-newropatolo ġija, u l-pi żijiet tal-mo ħħ. Din id-dijagramma hija bba żata fuq 
id-deskrizzjoni fil-paragrafi 13-15 (PND = jum ta' wara t-twelid). L-e żempji tal-assenjament 
tal-annimali jing ħataw fl-Appendi ċi 1
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Appendiċi 1 
1. Eżempji ta' assenjamenti possibbli huma deskritti u mda ħħlin fit-tabelli 
t'hawn ta ħt. Dawn l-e żempji huma pprovduti biex jintwera li 
l-assenjament tal-annimali tal-istudju g ħal bosta paradigmi ta' ttestjar jista' 
jsir b'numru ta' modi differenti.  
L-Ewwel E żempju  
2. Sett wie ħed ta' 20 fer ħ/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għat-testijiet ta' qabel il-ftim tal-onto ġenija 
tal-imġiba. Minn dawn l-annimali, 10 ifrie ħ/sess/livell ta' do ża (jiġifieri 
raġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton) jinqatlu b'mod dinjitu ż 
fil-PND 22. L-im ħuħ jitneħħew, jintiżnu u jiġu pproċessati għal eval­
wazzjoni istopatolo ġika. Barra minn hekk, tin ġabar dejta dwar il-pi ż 
tal-moħħ billi jintu żaw imħuħ mill-10 ir ġiel u 10 nisa li jifdal g ħal kull 
livell ta' do ża. 
3. Sett ie ħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għat-testijiet funzjonali/tal-im ġiba ta' wara 
l-ftim (osservazzjonijiet klini ċi dettaljati, attività motorja, qatg ħa awtidotjra 
u ttestjar tal-funzjoni konjittiva fl-adoloxxenti) u valutazzjoni tal-età tal-maturità sesswali. Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/livell ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton), ji ġu anestetizzati 
u fissati permezz ta' perfu żjoni fi tmiem l-istudju (madwar il-PND 70). 
Wara fissazzjoni addizzjonali in situ, il-mo ħħ jitneħħa u jiġi pproċessat 
għal evalwazzjoni newropatolo ġika.
 
4. Għall-ittestjar tal-funzjoni konjittiva fi ż-żgħażagħ (eż., PND 60-70), jintu ża 
t-tielet sett ta' 20 fer ħ/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton). Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/grupp 
(raġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton) jinqatlu fi tmiem l-istudju u 
l-moħħ jitneħħa u jintiżen. 
5. L-20 annimal/sess/grupp li jifdal jit ħallew għal testijiet addizzjonali 
possibbli.  
Tabella 1  
Nru tal-fer ħ ( a ) Numru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Onto ġenija tal-im ġiba 
10 m + 10 f PND 22 pi ż tal-moħħ/newropa­
toloġija/morfometrija 
10 m + 10 f PND 22 pi ż tal-moħħ 
2 6 20 m + 20 f Osservazzjonijiet klini ċi 
dettaljati 
20 m + 20 f Attività motorja 20 m + 20 f Maturità sesswali 
20 m + 20 f Funzjoni motorja u sensorjali 
20 m + 20 f Tag ħlim u memorja (PND 25) 
10 m + 10 f Pi ż tal-mo ħħ/newropatolo ġija/ 
morfometrija ta' annimali 
żgħażagħ ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Nru tal-fer ħ ( a ) 
Numru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Tag ħlim u memorja ( żgħażagħ) 
10 m + 10 f Pi ż tal-mo ħħ ta' annimali 
żgħażagħ ~ PND 70 
4 8 — Annimali ta' ri żerva għal 
sostituti jew testijiet addizzjonali  
( a ) Għal dan l-e żempju, il-boton ji ġu separati u jitqassmu f'4 ir ġiel + 4 nisa; il-frie ħ 
irġiel jingħataw in-numru 1 sa 4, il-frie ħ nisa minn 5 sa 8.  
Eżempju 2  
6. Sett wie ħed ta' 20 fer ħ/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għall-ittestjar ta' qabel il-ftim 
tal-ontoġenija tal-im ġiba. Minn dawn l-annimali, 10 frie ħ/sess/livell ta' 
doża (raġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton), jinqatlu b'mod 
dinjituż fil-PND 11. L-im ħuħ jitneħħew, jintiżnu u jiġu pproċessati għal 
evalwazzjoni istopatolo ġika. 
7. Sett ie ħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' do ża (raġel wieħed u mara wa ħda 
għal kull boton) jintu ża għal eżamijiet ta' wara l-ftim (osservazzjonijiet 
kliniċi dettaljati, attività motorja, valutazzjoni tal-età ta' maturità sesswali 
u funzjoni motorja u sensorjali). Minn dawn l-annimali, 10 annimali/sess/ livell ta' do ża (jiġifieriraġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton) ji ġu 
anestetizzati u fissati permezz ta' perfu żjoni fi tmiem l-istudju (madwar 
il-PND 70). Wara fissazzjoni addizzjonali  in situ , il-moħħ jitneħħa, 
jintiżen u jiġi pproċessat għal evalwazzjoni newropatolo ġika.
 
8. Għall-ittestjar tal-funzjoni konjittiva f'annimali adoloxxenti u żgħażagħ, 10 
frieħ/sess/livell ta' do ża jintużaw (jiġifieri raġel wieħed u mara wa ħda għal 
kull boton). Jintu żaw annimali differenti g ħall-ittestjar g ħal testijiet 
tal-funzjoni konjittiva fil-PND 23 u żgħażagħ. Fi tmiem l-istudju, l-10 
annimali/sess/grupp ittestjati b ħala adulti jinqatlu, il-mo ħħ jitneħħa u 
jintiżen. 
9. L-20 annimal/sess/grupp li jifdal li ma jing ħażlux għall-ittestjar u ji ġu 
skartati fil-ftim.  
Tabella 2  
Nru tal-fer ħ ( a ) Nru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Onto ġenija tal-im ġiba 
10 m + 10 f PND 11 pi ż tal-moħħ/newropa­
toloġija/morfometrija 
2 6 20 m + 20 f Osservazzjonijiet klini ċi 
dettaljati 
20 m + 20 f Attività motorja 
20 m + 20 f Maturità sesswali 
20 m + 20 f Funzjoni motorja u sensorjali 10 m + 10 f Pi ż tal-mo ħħ/newropatolo ġija/ 
morfometrija ta' annimali 
żgħażagħ ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Nru tal-fer ħ ( a ) 
Nru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  b ) Tag ħlim u memorja (PND 23) 
3 7 10 m + 10 f (  b ) Tag ħlim u memorja ( żgħażagħ) 
Piż tal-mo ħħ ta' annimali 
żgħażagħ 
4 8 — Annimali maqtulin u skartati 
PND 21.  
( a ) Għal dan l-e żempju, il-boton ji ġu separati u jitqassmu f'4 ir ġiel + 4 nisa; il-frie ħ 
irġiel jingħataw in-numru 1 sa 4, il-frie ħ nisa minn 5 sa 8. 
( b ) Il-frieħ differenti jintu żaw għal testijiet konjittivi fil-PND 23 u f'annimali żgħażagħ 
(eż., boton żewġ/fard minn total ta' 20).  
Eżempju 3  
10. Sett wie ħed ta' 20 fer ħ/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għall-valutazzjoni tal-pi ż tal-moħħ u 
n-newropatolo ġija fil-PND 11. Minn dawn l-annimali, 10 frie ħ/sess/livell 
ta' doża (jiġifieri raġel wieħed u mara wa ħda għal kull boton) jinqatlu 
dinjituż fil-PND 11 u tne ħħew, intiżnu u ġew ippro ċessati 11-il mo ħħ 
għal evalwazzjoni istopatolo ġika. Barra minn hekk, tin ġabar dejta dwar 
il-piż tal-moħħ billi jintu żaw imħuħ mhux iffissati mill-10 annimali r ġiel 
u nisa li jifdal g ħal kull livell ta' do ża. 
11. Sett ie ħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għall-ontoġenija tal-im ġiba (attività motorja), 
eżamijiet ta' wara l-ftim (attività motorja u valutazzjoni tal-età tal-maturità 
sesswali), u ttestjar tal-funzjoni konjittiva fl-annimali adoloxxenti.  
12. Sett ie ħor ta' 20 annimal/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed u mara 
waħda għal kull boton) jintu ża għal testijiet tal-funzjoni motorja u sensorjali 
(qatgħa awditorja) u osservazzjonijiet klini ċi dettaljati. Minn dawn 
l-annimali, 10 annimali/sess/livell ta' do ża (jiġifieri raġel wieħed jew mara 
waħda għal kull boton) ji ġu anestetizzati u ffissati permezz ta' perfu żjoni fi 
tmiem l-istudju (madwar il-PND 70). Wara l-fissazzjoni addizzjonali  in situ , 
il-moħħ jitneħħa, jintiżen u jiġi pproċessat għal evalwazzjoni neweropato ­
loġika. 
13. Sett ie ħor ta' 20 fer ħ/sess/livell ta' do ża jintuża għall-ittestjar tal-funzjoni 
konjittiva f'annimali żgħażagħ (jiġifieri raġel wieħed u mara wa ħda għal 
kull boton). Minn dawn, 10 annimali/sess/grupp (ji ġifieri raġel wieħed u 
mara waħda għal kull boton) jinqatlu fi tmiem l-istudju, il-mo ħħ jitneħħa u 
jintiżen. 
Tabella 3  
Nru tal-fer ħ ( a ) Nru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
1 5 10 m + 10 f PND 11 pi ż tal-moħħ/newropa­
toloġija/morfometrija 
10 m + 10 f PND 11 pi ż tal-moħħ 
2 6 20 m + 20 f Onto ġenija tal-im ġiba (attività 
motorja) 
20 m + 20 f Attività motorja 
20 m + 20 f Maturità sesswali 
20 m + 20 f Tag ħlim u memorja (PND 27)  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Nru tal-fer ħ ( a ) 
Nru ta' frie ħ assenjati 
għat-test Eżami/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Qatg ħa awditorja (adoloxxenti u 
żgħażagħ) 
20 m + 20 f Osservazzjonijiet klini ċi 
dettaljati 
10 m + 10 f Pi ż tal-mo ħħ/newropatolo ġija/ 
morfometrija ta' annimali żgħażagħ ~PND 70 
4 8 20 m + 20 f Tag ħlim u memorja (annimali 
żgħażagħ) 
10 m + 10 f Pi ż tal-mo ħħ ta' annimali 
żgħażagħ
 
( a ) Għal dan l-e żempju, il-boton ji ġu separati u jitqassmu f'4 ir ġiel + 4 nisa; il-frie ħ 
irġiel jingħataw in-numru 1 sa 4, il-frie ħ nisa minn 5 sa 8.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Appendiċi 2 
Definizzjonijiet:  
Sustanza kimika: Sustanza jew ta ħlita 
Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża 
dan il-metodu ta' ttestjar  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  BIJOASSA ĠĠ UTEROTROFIKU F'RODITURI: TEST TA' 
TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR G ĦAL PROPRJETAJIET 
ESTROĠENIĊI 
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħall-Linja Gwida tat-Test (TG) 
tal-OECD Nru 440 (2007). L-OECD nediet attività ta' profil g ħoli fl-1998 
sabiex jiġu riveduti l-linji gwida e żistenti u ji ġu żviluppati linji gwida ġodda 
għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' sustanzi potenzjali li jfixklu s-sistema endok ­
rinali (1). Element minnhom tal-attività kien li ti żviluppa linja gwida tat-test 
għal Bijoassa ġġ Uterotrofiku ta' rodituri. Imbag ħad, il-Bijoassa ġġ Uterot­
rofiku tar-rodituri g ħaddha minn programm estensiv ta' validazzjoni inklu ża 
l-kompilazzjoni ta' dokument ta' sfond dettaljat (2)(3) u t-twettiq ta' studji 
estensivi fi ħdan u bejn laboratorji biex jintwerew ir-relevanza u 
r-riproduċibbiltà tal-bijoassa ġġ b'estroġen ta' referenza potenti, agonisti 
riċetturi dg ħajfin tal-estro ġen, antagnist ri ċettur qawwi tal-estro ġen, u 
sustanza kimika ta' referenza negattiva (4)(5)(6)(7)(8)(9). Dan il-metodu 
ta' ttestjar B.54 huwa r-ri żultat tal-esperjenza miksuba matul il-programm 
tat-test ta' validazzjoni u r-ri żultati miksubin fih b'agonisti estro ġeniċi. 
2. Il-Bijoassa ġġ Uterotrofiku huwa test ta' tg ħarbil b'terminu qasir li ori ġina 
fis-snin tletin (27)(28) u ġie standardizzat g ħall-ewwel darba g ħat-tgħarbil 
minn kumitat tal-esperti fl-1962 (32)(35). Huwa msejjes fuq i ż-żieda fil-pi ż 
uterin jew ir-rispons uterotrofiku (g ħal analiżi, ara 29). Jevalwa l- ħila ta' 
sustanza kimika sabiex tniedi attivitajiet bijolo ġiċi konsistenti ma' agonisti 
jew antagonisti ta' estro ġeni naturali (e ż. 17ß-estradjol), madankollu, l-u żu 
tagħha għall-identifikazzjoni ta' antagonist huwa ferm inqas komuni g ħall- 
agonisti. L-utru jirrispondi g ħal estroġeni b'żewġ modi. Rispons inizjali 
huwa żieda fil-pi ż minħabba imbibizzjoni ta' ilma. Dan ir-rispons huwa 
segwit minn żieda fil-pi ż minħabba tkabbir fit-tessut (30). Ir-risponsi 
tal-utri f'firien u ġrieden huma komparabbli b'mod kwalitattiv.  
3. Dan il-bijoassa ġġ iservi b ħala assaġġ in vivo  u l-applikazzjoni tieg ħu 
għandha titqies fil-kuntest tal-“Qafas Kun ċettwali tal-OECD g ħall-Ittestjar 
u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi li Jfixklu s-Sistema Endokrinali” (Appendi ċi 2). F'dan il-Qafas Kun ċettwali, il-Bijoassa ġġ Uterotrofiku 
jinsab fil-Livell 3 b ħala assaġġ in vivo  li jipprovdi dejta dwar mekkani żmu 
endokrinali uniku, ji ġifieri l-estro ġeniċità.
 
4. Il-Bijoassa ġġ Uterotrofiku huwa ma ħsub sabiex ikun inklu ż f'sensiela ta' 
testijiet  in vitro  u in vivo  biex jiġu identifikati sustanzi kimi ċi b'potenzjal 
li jinteraġixxu mas-sistema endokrinali, li finalment iwasslu g ħal valu­
tazzjonijiet tar-riskju g ħas-saħħa tal-bniedem jew l-ambjent. Il-programm 
ta' validazzjoni tal-OECD u ża kemm agonisti b'sa ħħithom kif ukoll 
dgħajfin biex jevalwa l-prestazzjoni tal-assa ġġ fl-identifikazzjoni ta' 
sustanzi kimi ċi estroġeniċi (4)(5)(6)(7)(8). B'hekk, is-sensittività 
tal-proċedura tat-test g ħal agonisti tal-estro ġen intweriet sew flimkien ma' 
riproduċibilità tajba intra u interlaboratorja.  
5. Fir-rigward tal-kimi ċi negattivi, fil-programm ta' valutazzjoni kienet inklu ża 
biss sustanza kimika “negattiva” ta' referenza wa ħda li diġà kienet irrap ­
portata negattiva minn assa ġġ uterotrofiku kif ukoll tqabbad mar-ri ċettur in 
vitro  u assaġġi ta' riċetturi, iżda ġiet evalwata dejta o ħra dwar it-testijiet, 
mhux relatata mal-programm ta' validazzjoni tal-OECD, li kompliet issostni 
l-ispeċifiċità tal-Bijoassa ġġ Uterotrofiku g ħat-tgħarbil ta' agonisti 
tal-estroġen (16).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI  
6. Agonisti u antagonisti tal-estro ġen jaġixxu bħala ligandi g ħal riċetturi 
tal-estroġen α and β u jistgħu jattivaw jew jinibixxu, rispettivament, 
l-azzjoni transkrizzjonali tar-ri ċetturi. Dan jista' jkollu l-potenzjal li 
jwassal g ħal perikli tas-sa ħħa avversa, inklu żi effetti fuq ir-riproduzzjoni 
u l-iżvilupp. G ħaldaqstant, hemm il-b żonn li sustanza kimika ti ġi 
vvalutata u evalwata b ħala agonista jew antagonista possibbli tal-estro ġen. 
Filwaqt li informattiva, l-affinità ta' ligand g ħal riċettur tal-estro ġen jew 
attivazzjoni transkrizzjonali ta' ġeni rapportaturi  in vitro  hija wa ħda 
mill-bosta determinanti ta' periklu possibbli. Determinanti o ħrajn jistg ħu 
jinkludu attivazzjoni u di żattivazzjoni metabolika malli jid ħlu fil-ġisem, 
distribuzzjoni f'tessuti fil-mira, u tne ħħija mill-ġisem, xi ħaġa li tal-inqas 
tiddependi b'mod parzjali fuq ir-rotta tal-amministrazzjoni u s-sustanza kimika li tkun qed ti ġi ttestjata. Dan iwassal g ħall-bżonn li titg ħarbel 
l-attività possibbli ta' sustanza kimika  in vivo  f'kundizzjonijiet rilevanti, 
sakemm il-karatteristi ċi dwar is-sustanza kimika rigward l-Assorbiment — 
id-Distribuzzjoni — il-Metaboli żmu — l-Eliminazzjoni (ADME) ma jkunux 
diġà pprovdew l-informazzjoni xierqa. It-tessuti tal-utri jirrispondu bi 
tkabbir mg ħaġġel u qawwi g ħall-istimolu mill-estro ġeni, b'mod partikolari 
f'rodituri tal-laboratorju, li g ħandhom ċiklu estru ż li jdum madwar 4 ijiem. 
Speċi ta' rodituri, b'mod partikolari l-firien, spiss jintu żaw fi studji dwar 
it-tossiċità għal karatterizzazzjoni tal-periki. G ħaldaqstant, l-utru tar-rodituri 
huwa organu mira xieraq g ħat-tgħarbil in vivo  ta' agonisti u antagonisti 
tal-estroġen. 
7. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bba żat fuq dawk il-protokolli m ħaddmin 
fl-istudju ta' validazzjoni tal-OECD li ntwera li huwa affidabbli u ripetibbli 
fi studji intra u interlaboratorji (5)(7). B ħalissa, hemm żewġ metodi 
disponibbli, ji ġifieri l-metodu tal-annimal mara adulta b'ovarettomija 
(metodu ovx-adult) u l-metodu tal-annimal mara immatura ming ħajr ovaret ­
tomija (metodu immatur). Fil-programm tat-test ta' validazzjoni tal-OECD 
intwera li ż-żewġ metodi g ħandhom sensittività u riprodu ċibbiltà paragun ­
abbli. Madankollu, l-immatur, peress li g ħandu assi ipotalamiku-pitwitarju- 
gonadali (HPG) intatt, huwa kemxejn inqas spe ċifiku iżda jkopri ambitu 
usa' ta' investigazzjoni mill-annimal ovarettomjat g ħaliex kapa ċi jwieġeb 
għal sustanzi kimi ċi li jintera ġixxu mal-assi HPG minflok ir-ri ċettur 
tal-estroġen biss. L-assi HGP tal-far huwa funzjonali fl-età ta' madwar 15- 
il jum. Qabel din, il-pubertà ma tistax tit ħaffef b'kuri b ħal GnRH. Malli 
l-annimali nisa jibdew jil ħqu l-pubertà, qabel il-ftu ħ vaġinali, l-annimali 
nisa ser ikollhom ċikli silenzju żi li ma jirri żultawx fi ftu ħ vaġinali jew 
ovulazzjoni, i żda hemm xi bidliet ormonali. Jekk sustanza kimika 
tistimola l-assi HPD b'mod dirett jew indirett, jirri żultaw pubertà preko ċi, 
ovluzzjoni bikrija u ftu ħ vaġinali mħaffef. Mhux biss is-sustanzi kimi ċi li 
jaġixxu fuq l-assi HPG jag ħmlu dan i żda ċerti dieti b'livelli og ħla ta' 
enerġija metabolizzabbli minn o ħrajn ser jistimolaw it-tkabbir u j ħaffu 
l-ftuħ vaġinali bla ma jkunu estro ġeniċi. It-tali sustanzi kimi ċi ma 
jinduċux rispons uterotrofiku f'annimali adulti OVX peress li l-assi HPG 
tagħhom ma ja ħdimx.  
8. Għal raġunijiet ta' benessri tal-annimali, g ħandha ting ħata preferenza 
lill-metodu billi jintu żaw firien immaturi, billi ti ġi evitata kura ta' qabel 
il-kirurġija tal-annimali u ji ġi evitat nuqqas ta' u żu possibbli ta' dawk 
l-annimali li jindikaw kwalunkwe evidenza ta' d ħul fil-fażi estruża (ara 
l-paragrafu 30).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Ir-rispons uterotrofiku mhuwiex kompletament ta' ori ġini estro ġenika, 
jiġifieri sustanzi kimi ċi li mhumiex agonisti jew antagonisti ta' estro ġeni 
jistgħu jipprovdu rispons ukoll. Pere żempju, do żi relattivament g ħoljin ta' 
proġesteron, testosteron, jew diversi pro ġestini sinteti ċi kollha jistg ħu 
jwasslu g ħal rispons stimolattiv (30). Kwalunkwe rispons jista' jkun 
analizzat b'mod istolo ġiku għal keratinizzazzjoni u kornifikazzjoni 
tal-vaġina (30). Tkun xi tkun l-ori ġini possibbli tar-rispons, ri żultat 
pożittiv ta' Bijoassa ġġ Uterotrofiku normalment g ħandu jniedi azzjonijiet 
għal iktar kjarifika. Evidenza addizzjonali tal-estro ġeniċità tista' ti ġi minn 
assaġġi in vitro , bħall-assaġġi li jaqbdu mal-ER u assa ġġi ta' attivazzjoni 
transkrizzjonali, jew minn assa ġġi in vivo  oħrajn bħall-assaġġ tal-pubertà 
tal-annimali nisa.  
10. Peress li l-Bijoassa ġġ Uterotrofiku jservi b ħala assaġġ tat-tgħarbil in vivo , 
l-approċċ ta' validazzjoni me ħud qeda kemm kunsiderazzjonijiet relatati 
mal-benessri tal-annimali kif ukoll strate ġija ta' ttestjar b'saffi. G ħal dan 
l-għan, sar sforz biex ji ġu vvalidti b'mod rigoru ż ir-riprodu ċibilità u 
s-sensittività g ħall-estroġeniċità — it-t ħassib ewlieni g ħal ħafna susanzi 
kimiċi-, filwaqt li ftit li xejn sar sforz fir-rigward tal-komponent 
tal-antiestro ġeniċità tal-assa ġġ. Huwa biss antiestro ġen wieħed b'attività 
b'saħħitha li ġie ttestjat peress li n-numru ta' sustanzi kimi ċi bi profil anti ­
estroġeniku ċar (mhux oskurat minn xi attività estro ġenika) huwa ferm 
limitat. B'hekk, dan il-metodu ta' ttestjar huwa ddedikat g ħall-protokoll 
estroġeniku, filwaqt li l-protokoll li jiddeskrivi l-modalità antagonista 
tal-assaġġ huwa inklu ż f'Dokument ta' Gwida (37). Ir-riprodu ċibilità u 
s-sensittività tal-assa ġġ għas-sustanzi kimi ċi b'attività purament antiestro ­ 
ġenika ser ikunu definiti b'mod iktar ċar iktar 'il quddiem, wara li 
l-proċedura tat-test tkun da ħlet fir-rutina tal-u żu għal ċertu żmien u jkunu 
ġew identifikati iktar sustanzi kimi ċi b'din il-modalità ta' azzjoni.  
11. Huwa rikonoxxut li l-pro ċeduri kollha bba żati fuq annimali ser jikkon ­
formaw mal-istandards lokali tal-indukrar tal-annimali; id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura stabbiliti hawn ta ħt huma standards minimi 
tal-prestazzjoni, u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali b ħad- 
Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal skopijiet 
xjentifiċi (38). Gwida ulterjuri dwar it-trattament umanitarju tal-annimali 
tingħata mill-OECD (25).
 
12. Bħal bl-assa ġġ kollha li ju żaw annimali ħajjin, importanti li jkun żgurat li 
d-dejta hija verament ne ċessarja qabel ma jinbeda l-assa ġġ. Pereżempju, 
żewġ kundizzjonijiet li fihom tista' tkun me ħtieġa d-dejta huma:  
— potenzjal g ħoli ta' esponiment (Livell 1 tal-Qafas Kun ċettwali, 
Appendiċi 2) jew indikazzjonijiet g ħal estroġeniċità (Livell 2) biex 
jiġi investigat jekk it-tali effetti jistg ħux iseħħu in vivo , 
— effetti li jindikaw estro ġeniċità f'testijiet  in vivo  tal-Livell 4 jew 5 biex 
ikun sostanzjat li l-effetti kienu relatati ma' mekkani żmu estroġeniku li 
ma jistax jintwera permezz ta' test  in vitro . 
13. Id-definizzjonijiet u żati f'dan il-metodu ta' ttestjar jing ħataw fl-Appendi ċi 1. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
14. Il-Bijoassa ġġ Uterotrofiku jiddependi g ħas-sensittività tieg ħu fuq sistema ta' 
ttestjar tal-annimali li fiha l-assi ipotalamiku-pitwitarju-ovarju mhuwiex 
funzjonali, xi ħaġa li twassal g ħal livelli endo ġeni baxxi ta' estro ġen li 
jiċċirkola. Dan ser ji żgura piż uterin ba żi baxx u medda massima ta' 
rispons g ħal estroġeni amministrati. Żewġ stati sensittivi tal-estro ġen 
fir-roditur mara jissodisfaw dan ir-rekwi żit: 
(i) annimali nisa immaturi wara l-ftim u qabel il-pubertà, u  
(ii) annimali nisa żgħażagħ wara ovarettomija b' ħin adegwat sabiex 
it-tessuti tal-utri jag ħmlu rigress.  
15. Is-sustanza kimika tat-test ting ħata kuljum permezz ta' gavage orali jew 
tilqima ta ħt il-ġilda. Dożi tas-sustanza kimika tat-test gradwati jing ħataw 
lil minimu ta' żewġ gruppi tal-kura (ara l-paragrafu 33 g ħal gwida) ta' 
annimali sperimentali billi jintu ża livell wie ħed ta' doża għal kull grupp u 
perjodu ta' g ħoti ta' tliet ijiem konsekuttivi g ħal metodu immatur u perjodu 
ta' għoti minimu ta' tliet ijiem konsekuttivi g ħall-metodu adulti ovx. 
L-annimali huma nekropsjati madwar 24 sieg ħa wara l-a ħħar doża. Għal 
agonisti tal-estro ġen, il-piż uterin medju tal-gruppi ta' annimali kkurati 
fir-rigward tal-grupp veikolu huwa vvalutat g ħal żieda statistikament 
importanti. Żieda statistikament importanti fil-pi ż uterin medju ta' grupp 
tat-test tindika rispons po żittiv f'dan il-bijoassa ġġ. 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla tal-ispe ċi ta' annimali  
16. Jistg ħu jintużaw razez ta' rodituri tal-laboratorju u żati spiss. B ħala eżempju, 
matul il-validazzjoni intu żaw ir-razez Sprague-Dawley u Wistar ta' firien. 
Razez b'utri mag ħrufin jew suspettati li huma inqas risponsivi ma 
għandhomx jintu żaw. Il-laboratorju g ħandu juri s-sensittività tar-razza 
użata kif deskritta fil-paragrafi 26 u 27.  
17. Il-far u l- ġurdien intu żaw spiss fil-Bijoassa ġġ Uterotrofiku sa mis-snin 
tletin. L-istudji ta' validazzjoni tal-OECD saru biss b'firien fuq il-ba żi ta' 
fehim li ż-żewġ speċi huma mistennija jkunu ekwivalenti u g ħalhekk, spe ċi 
waħda tkun bi żżejjed għall-validazzjoni madwar id-dinja sabiex ji ġu 
ffrankati ri żorsi u annimali. Il-far huwa l-ispe ċi tal-għażla f'ħafna 
mill-istudji dwar it-tossi ċità riproduttiva u tal-i żvilupp. Peress li te żisti 
database storika vasta g ħal firien u, g ħalhekk, sabiex jitwessa' l-ambitu 
tal-metodu ta' ttestjar tal-Bijoassa ġġ Utertrofiku f'rodituri g ħall-użu ta' 
ġrieden bħala speċi tat-test, sar studju limitat ta' validazzjoni ta' segwitu 
fil-ġrieden (16). Ing ħażel approċċ komparattiv b'numru limitat ta' sustanzi 
kimiċi tat-test, laboratorji li jie ħdu sehem u ming ħajr ittestjar ta' kampjun 
kodifikat sabiex jin żamm l-iskop ori ġinali biex ji ġu ffrankati ri żorsi u 
annimali. Dan l-istudju komparattiv ta' validazzjoni juri g ħall-Bijoassa ġġ 
Uterotrofiku fi ġrieden ovarjettomizzati żgħażagħ li, b'mod kwalitattiv u 
kwantitattiv, id-dejta miksuba f'firien u ġrieden jikkorrispondi sew g ħal 
xulxin. Meta r-ri żultat tal-Bijoassa ġġ Uterotrofiku jista' jkun preliminari 
għal studju fit-tul, dan jippermetti sabiex fi ż-żewġ studji jintu żaw 
annimali mill-istess razza u sors. L-appro ċċ komparattiv kien limitat 
għall-ġrieden OVX u r-rapport ma jipprovdix dejta robusta stabbilita biex 
jiġi vvalidat il-mudell immatur, u b'hekk il-mudell immatur g ħall-ġrieden 
mhuwiex ikkunsidrat ta ħt il-kamp ta' applikazzjoni tal-metodu ta' ttestjar 
kurrenti.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. B'hekk, f'xi ka żijiet, jistg ħu jintużaw ġrieden minflok firien. G ħandha 
tingħata ġustifikazzjoni g ħal din l-ispe ċi, fuq il-ba żi ta' kriterji tossikolo ġiċi, 
farmakokineti ċi u/jew o ħrajn. Jista' jkun hemm b żonn ta' modifiki 
tal-protokoll g ħall-ġrieden. Pere żempju, il-konsum ta' ikel tal- ġrieden fuq 
bażi tal-piż tal-ġisem huwa og ħla minn dak tal-firien u, g ħaldaqstant, 
il-kontenut ta' fitoestro ġen fl-ikel g ħandu jkun inqas g ħall-ġrieden milli 
għall-firien (9)(20)(22).  
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
19. Il-pro ċeduri kollha g ħandhom jikkonformaw ma' standards lokali ta' 
indukrar tal-annimali tal-laboratorju. Dawn id-deskrizzjonijiet tal-indukrar 
u l-kura huma standards minimi u ser ikunu sostitwiti minn regolamenti lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal 
skopijiet xjentifi ċi (38). It-temperatura fil-kamra tal-annimali sperimentali 
għandha tkun ta' 22 °C (b'medda ta' madwar ± 3 °C). L-umdità relattiva 
għandha tkun tal-inqas 30 % u idealment ma g ħandhiex taqbe ż massimu ta' 
70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra. Il-mira g ħandha tkun umdità 
relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali. Is-sekwenza 
tad-dawl ta' kuljum g ħandha tkun ta' 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam.
 
20. Id-dieta tal-laboratorju u l-ilma tax-xorb g ħandhom ikunu pprovduti  ad 
libitum . L-annimali żgħażagħ jistgħu jitrabbew f'post b'mod individwali 
jew jitqieg ħdu f'gaġġa fi gruppi li jaslu sa tliet annimali. Min ħabba l-età 
żgħira tal-annimali immaturi, huwa rakkomandat li jitrabbew fi grupp 
soċjali. 
21. Il-livelli g ħoljin ta' fitoestro ġeni f'dieti tal-laboratorju huma mag ħrufin li 
jżidu l-piżijiet uterini fir-rodituri sa grad g ħolji biżżejjed li jxekkel 
il-Bijoassa ġġ Uterotrofiku (13)(14)(15). Livelli g ħoljin ta' fitoestro ġeni u 
ta' enerġija metabolizzabbli f'dieti tal-laboratorju jistg ħu jirriżultaw 
f'pubertà bikrija wkoll, jekk jintu żaw annimali immaturi. Il-pre żenza ta' 
fitoestroġeni tirriżulta primarjament mill-inklu żjoni ta' prodotti tas-sojja u 
tal-alfalfa fid-dieti tal-laboratorju u ntwera li kon ċentrazzjonijiet ta' fitoes ­
troġeni jvarjaw minn lott g ħal ieħor ta' dieti standard tal-laboratorju (23). 
Il-piż tal-ġisem huwa varjabbli importanti, peress li l-kwantità ta' ikel 
ikkonsmat huwa relatat mal-pi ż tal-ġisem. Għalhekk, id-do ża propja ta' 
fitoestroġen ikkonsmata mill-istess dieta tista' tvarja bejn spe ċi u skont 
l-età (9). G ħal firien nisa immaturi, il-konsum tal-ikel fuq ba żi ta' piż 
tal-ġisem jista' jkun bejn wie ħed u ieħor id-doppju dak ta' firien adulti 
żgħażagħ b'ovarettomija. G ħal ġrieden żgħażagħ, il-konsum tal-ikel fuq 
bażi tal-piż tal-ġisem jista' jkun bejn wie ħed u ieħor erba' darbiet dak ta' 
firien żgħażagħ nisa b'ovarettomija.  
22. Madankollu, ir-ri żultati tal-Bijoassa ġġ Uterotrofiku (9)(17)(18)(19) juru li 
kwantitajiet limitati ta' fitoestro ġeni djeteti ċi huma a ċċettabbli u ma 
jnaqqsux is-sensittività tal-bijoassa ġġ. Bħala gwida, livelli djeteti ċi ta' fitoes ­
troġeni ma g ħandhomx jaqb żu it-350 μg tal-ekwivalenti ta' genistein/ 
gramma tad-dieta tal-laboratorju g ħal firien nisa immaturi Sprague 
Dawley u Wistar (6)(9). Dawn id-dieti g ħandhom ikunu xierqa wkoll 
meta jiġu ttestjati f'firien żgħażagħ b'ovarettomija g ħaliex il-konsum 
tal-ikel fuq ba żi ta' piż tal-ġisem huwa inqas f' żgħażagħ meta mqabbel 
ma' annimali immaturi. Jekk ser jintu żaw ġrieden adulti b'ovarettomija 
jew firien iktar sensittivi g ħal fitoestro ġeni, għandu jiġi kkunsidrat tnaqqis 
proporzjonat fil-livelli tal-fitoestro ġen fid-dieta (20). Barra minn hekk, 
id-differenzi f'ener ġija metabolika disponibbli minn dieti differenti jistg ħu 
jwasslu g ħal qabżiet fiż-żmien għall-bidu tal-pubertà (21)(22).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Qabel l-istudju, hemm b żonn li ssir g ħażla bir-reqqa ta' dieta ming ħajr livell 
għoli ta' fitoestro ġeni (għal gwida ara (6)(9)) jew ener ġija metabolizzabbli, 
li tista' tfixkel ir-ri żultati (15)(17)(19)(22)(36). L-i żgurar tal-prestazzjoni 
xierqa tas-sistema tat-test u żata mil-laboratorju kif spe ċifikat fil-paragrafi 
26 u 27 huwa kontroll importanti fuq dawn i ż-żewġ fatturi. B ħala salvag ­
wardja konsistenti ma' prattika tajba tal-laboratorju (GLP) g ħandu jsir 
kampjunar rappre żentattiv ta' kull lott ta' dieta mog ħtija matul l-istudju 
għal analiżi possibbli ta' kontenut fitoestro ġenu (eż. fil-każ ta' piż ta' 
kontroll uterin g ħoli relatat ma' kontrolli stori ċi jew rispons inadegwat 
għall-estroġen ta' referenza, 17 alfa etinil estradjol). L-alikwoti g ħandhom 
jiġu analizzati b ħala parti mill-istudju jew ji ġu ffriżati f'– 20  o C jew b'tali 
mod li jipprevjenu milli l-kampjun jiddekomponi qabel l-anali żi. 
24. Ċerti materjali tas-sodod jista' jkun fihom sustanzi kimi ċi estroġeniċi jew 
antiestroġeniċi li jseħħu b'mod naturali (e ż. iċ-ċifċiegħa tal-qam ħirrun hija 
magħrufa li taffettwa ċ-ċikliċità tal-firien u tidher li hija antiestro ġenika). 
Il-materjal tas-sodda mag ħżul għandu jkun fih livell minimu ta' fitoes ­
troġeni. 
Preparazzjoni tal-annimali  
25. Annimali sperimentali ming ħajr evidenza ta' xi marda jew anormalità fi żika 
jingħażlu b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u tal-kura. Il-ga ġeġ 
għandhom ji ġu rranġati b'tali mod li jkunu minimizzati l-effetti possibbli 
dovuti għat-tqegħid tal-gaġġa. L-annimali g ħandhom ji ġu identifikati b'mod 
uniku. Idealment, annimali immaturi g ħandhom jitqieg ħdu f'gaġġa ma' 
ommijiet jew ommijiet adottivi sal-ftim matul l-akklimatizzazzjoni. 
Il-perjodu ta' akklimatizzazzjoni qabel il-bidu tal-istudju g ħandu jkun ta' 
madwar 5 ijiem g ħal annimali żgħażagħ u għall-annimali immaturi ma' 
ommijiet jew ommijiet adottivi. Jekk l-annimali immaturi jinkisbu b ħala 
annimali li g ħadhom kif infatmu ming ħajr ommijiet, jista' jkun hemm 
bżonn ta' durata iqsar tal-perjodu ta' akklimatizzazzjoni peress li d-do żaġġ 
għandu jibda e żatt wara l-ftim (ara l-paragrafu 29).  
PROĊEDURA  
Verifika tal-Profi ċjenza tal-Laboratorju  
26. Jistg ħu jintużaw żewġ għażliet differenti biex ti ġi verifikata l-profi ċjenza 
tal-laboratorju:  
— Verifika perjodika, li tiddependi fuq studju ba żi inizjali ta' kontroll 
pożittiv (ara l-paragrafu 27). Tal-inqas kull 6 xhur u kull darba li 
jkun hemm bidla li tista' tinfluwenza l-prestazzjoni tal-assa ġġ (eż. 
formulazzjoni ġdida tad-dieta, bidla fil-persunal li jag ħmel 
dissezzjonijiet, bidla fir-razza jew il-fornituri tal-annimali, e ċċ), 
ir-risponsitività tas-sistema tat-test (mudell tal-annimal) g ħandha tiġi 
verifikata billi tintu ża doża xierqa (fuq il-ba żi tal-istudju ba żi ta' 
kontroll po żittiv deskritt fil-paragrafu 27) ta' estro ġen ta' referenza: 
17α-etinil estradjol (Nru tas-CAS 57-63-6) (EE),  
— L-użu ta' kontrolli konkurrenti, billi ji ġi inkluż grupp mog ħti doża 
xierqa ta' estro ġen ta' referenza f'kull assa ġġ. 
Jekk is-sistema ma twe ġibx kif mistenni, il-kundizzjonijiet sperimentali 
għandhom ji ġu eżaminati u modifikati kif xieraq. Huwa rakkomandat li 
d-doża ta' estro ġen ta' referenza tintu ża f'wieħed mill-appro ċċi tkun ta' 
madwar ED70 sa 80.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Studju Ba żi ta' Kontroll Po żittiv — Qabel ma laboratorju jwettaq studju 
b'dan il-metodu ta' ttestjar g ħall-ewwel darba, il-profi ċjenza tal-laboratorju 
għandha tintwera billi ti ġi ttestjata r-risponsività tal-mudell tal-annimal, billi 
jiġi stabbilit ir-rispons tad-do ża ta' estro ġen ta' referenza: 17 α-etinil estradjol 
(Nru tas-CAS 57-63-6) (EE) b'minimu ta' erba' do żi. Ir-rispons tal-pi ż uterin 
ser jitqabbel ma' dejta storika stabbilita (ara r-referenza (5)). Jekk dan 
l-istudju ba żi ta' kontroll po żittiv ma jrendix ir-ri żultati anti ċipati, 
il-kundizzjonijiet sperimentali g ħandhom ji ġu eżaminati u modifikati.  
In-numru u l-kundizzjoni tal-annimali  
28. Kull grupp ikkurat u ta' kontroll g ħandu jkun fih tal-inqas 6 annimali 
(kemm għall-protokoll tal-metodu immatur kif ukoll dak tal-adulti ovx).  
L-età tal-annimali immaturi  
29. Għall-Bijoassa ġġ Uterotrofiku b'annimali immaturi, irid ikun spe ċifikat 
il-jum tat-twelid. Id-do żaġġ għandu jibda kmieni bi żżejjed sabiex ji ġi 
żgurat li, fi tmiem l-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test, tkun g ħadha ma 
seħħitx iż-żieda fiżjoloġika tal-estro ġeni endoġenużi assoċjata mal-pubertà. 
Min-naħa l-oħra, hemm evidenza li annimali żgħar ħafna jistg ħu jkunu 
inqas sensittivi. G ħad-definizzjoni tal-età ottimali, kull laboratorju g ħandu 
jieħu f'kunsiderazzjoni d-dejta ta' sfond tieg ħu stess fuq il-maturità.  
Bħala gwida ġenerali, id-do żaġġ fil-firien jista' jibda minnufih wara l-ftim 
bikri fil-jum 18 ta' wara t-twelid (bil-jum tat-twelid li jkun il-jum 0 ta' wara t-twelid). Idealment, id-do żaġġ fil-firien g ħandu jitlesta fil-jum 21 ta' wara 
t-twelid i żda dejjem qabel il-jum 25 ta' wara twelid g ħax, wara din l-età, 
l-assi ipotalamiku-pitwitarju-ovarju jsir funzjonali u l-livelli ta' estro ġen 
endoġenu jistg ħu jibdew ji żdiedu b'żieda konkomitanti fil-medji tal-pi ż 
uterin bażi u żieda fid-devjazzjonijiet standard tal-grupp (2)(3)(10)(11)(12).
 
Proċedura għal ovarettomija  
30. Għall-far u l- ġurdien mara b'ovarettomija (gruppi ta' trattament u kontroll), 
l-ovarettomija g ħandha ssir fl-età ta' bejn 6 u 8 ġimgħat. Għall-firien, 
għandhom ikunu g ħaddew tal-inqas 14-il jum bejn l-ovarettomija u 
l-ewwel jum ta' g ħoti sabiex l-utri jkun jista' jag ħmel rigress g ħal linja 
bażi stabbli minima. G ħall-ġrieden, g ħandhom jg ħaddu tal-inqas 7 ijiem 
bejn l-ovarettomija u l-ewwel jum ta' g ħoti. Peress li ammonti żgħar ta' 
tessut tal-ovarji huma bi żżejjed biex ji ġu prodotti livelli ċirkolanti sinifikanti 
ta' estroġeni (3), l-annimali g ħandhom ji ġu ttestjati qabel l-u żu billi jiġu 
osservati ċelloli epiteljali kampjunati bit-tajjar mill-va ġina f'tal-inqas ħamest 
ijiem konsekuttivi (e ż., il-jiem 10-14 wara l-ovarettomija g ħall-firien). Jekk 
l-annimali jindikaw xi evidenza ta' d ħul fil-perjodu estru ż, l-annimali ma 
għandhomx jintu żaw. Barra minn hekk, fin-nekropsija, il-kampjuni 
tal-ovarji g ħandhom ji ġu eżaminati g ħal xi evidenza tal-pre żenza tat-tessut 
tal-ovarji. Jekk iva, l-annimal ma g ħandux jintu ża fil-kalkoli (3).  
31. Il-pro ċedura tal-ovarettomija tibda bl-annimal fir-rikombenza ventrali wara 
li l-annimal ji ġi anestetizzat kif xieraq. Il-qasma li tifta ħ il-ħajt tal-addome 
dorsolaterali g ħandha tkun ta' madwar 1 cm u parallela fil-punt nofsani bejn 
il-limitu inferjuri kostali u l-qoxra iljaka, u ftit millimetri laterali mill-mar ġni 
laterali tal-muskolu lombari. L-ovarju g ħandu jinqala' fejn jiltaqg ħu l-kanal 
salovarju u l-korp uterin. Wara l-konferma li ma jkun hemm ebda fsad 
qawwi, il- ħajt tal-addome g ħandu jing ħalaq bil-ħjata u l-ġilda għandha 
tingħalaq permezz ta' autoclips jew ħjata xierqa. Il-punti tal-lega 
jintwerew b'mod skematiku fil-Figura 1. G ħandha tintu ża analġeżija 
xierqa ta' wara l-operazzjoni kif rakkomandat minn veterinarju b'esperjenza 
fl-indukrar ta' rodituri.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Piż tal-ġisem  
32. Fil-metodu tal-adulti ovx, il-pi ż tal-ġisem u l-pi ż uterin mhumiex korrelatati 
għaliex il-pi ż uterin huwa affettwat minn ormoni b ħal estroġeni iżda mhux 
mill-fatturi ta' tkabbir li jirregolaw id-daqs tal- ġisem. Min-na ħa l-oħra, il-piż 
tal-ġisem huwa relatat mal-pi ż uterin fil-mudell immatur, waqt li jkun qed 
jimmatura (34). B'hekk, fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-pi ż tal-annimali 
użati, fil-mudell immatur, g ħandha tkun minima u ma taqbi żx ± 20 % 
tal-piż medju. Dan ifisser li d-daqs tal-boton g ħandu jkun standardizzat 
minn min jg ħammar, biex ji ġi żgurat li l-ulied ta' annimali minn ommijiet 
differenti ser jitg ħalfu bejn wie ħed u ieħor l-istess. L-annimali g ħandhom 
jiġu assenjati fi gruppi (kemm kontroll kif ukoll kura) permezz ta' distri ­
buzzjoni tal-pi ż aleatorja, sabiex il-pi ż medju tal- ġisem ta' kull grupp ma 
jkunx statistikament differenti minn kwalunkwe grupp ie ħor. Għandha 
tingħata kunsiderazzjoni biex ji ġi evitat l-assenjament ta' s ħab boton 
fl-istess grupp tal-kura sa fejn dan ikun prattikabbli bla ma ji żdied 
in-numru ta' boton li g ħandhom jintu żaw għall-investigazzjoni.  
Dożaġġ 
33. Sabiex ji ġi stabbilit jekk sustanza kimika tat-test jistax ikollha azzjoni estro ­ 
ġenika  in vivo , żewġ gruppi ta' do ża u kontroll normalment ikunu bi żżejjed 
u għalhekk, dan il-metodu huwa ppreferut g ħal raġunijiet marbuta 
mal-benessri tal-annimali. Jekk l-iskop huwa li jew tinkiseb kurva ta' rispons g ħad-doża jew li ssir estrapolazzjoni g ħal dożi inqas, hemm 
bżonn ta' tal-inqas 3 gruppi ta' do ża. Jekk ikun hemm b żonn ta' inform ­
azzjoni minbarra l-identifikazzjoni ta' attività estro ġenika (b ħal stima 
tal-potenza), g ħandha tiġi kkunsidrata skeda differenti tad-do żaġġ. Ħlief 
għall-kura bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll 
għandhom jitqandlu bl-istess mod b ħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk 
jintuża veikolu fl-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta' kontroll 
għandu jirċievi l-istess ammont ta' veikolu u żat mal-gruppi kkurati (jew 
l-ogħla volum u żat mal-gruppi tat-test jekk ikun differenti bejn il-gruppi).
 
34. F'dan il-ka ż, l-għan tal-Bijoassa ġġ Uterotrofiku huwa li jing ħażlu dożi li 
jiżguraw sopravvivenza tal-annimali u li huma ming ħajr tossiċità sinifikanti 
jew diffikultà g ħall-annimali wara tliet ijiem konsekuttivi ta' g ħoti 
tas-sustanza kimika sa do ża massima ta' 1 000 mg/kg/jum. Il-livelli kollha 
ta' doża għandhom ji ġu proposti u jing ħażlu filwaqt li tittie ħed f'kunsider ­
azzjoni kwalunkwe dejta (tossiko) kinetika u dwar it-tossi ċità eżistenti 
disponibbli g ħas-sustanza kimika tat-test jew materjali relatati. L-og ħla 
livell ta' do ża għandu l-ewwel nett jie ħu f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni 
dwar l-LD50 u/jew it-tossi ċità akuta sabiex ji ġu evitati mewt, tbatija severa 
jew diffikultà fl-annimali (24)(25)(26). L-og ħla doża għandha tirrappre żenta 
d-doża massima tollerata (MTD); studju li jsir f'livell tad-do ża li kkaġuna 
rispons uterotrofiku po żittiv tkun a ċċettata wkoll. G ħat-tgħarbil, intervalli 
kbar (eż. unitajiet ta' nofs log li jikkorrispondu g ħal progressjoni tad-do ża 
ta' 3,2 jew anki sa unitajiet ta' log wa ħda) bejn do żaġġi ġeneralment huma 
aċċettabbli. Jekk ma jkun hemm ebda dejta xierqa disponibbli, jista' 
jitwettaq studju ta' sejbien tal-medda biex jg ħin fid-determinazzjoni 
tad-dożi li għandhom jintu żaw. 
35. Inkella, jekk il-potenza estro ġenika ta' agonist tista' ti ġi stmata permezz ta' 
dejta  in vitro  (jew  in silico ), din tista' ti ġi kkunsidrata g ħall-għażla tad-doża. 
Pereżempju, l-ammont tas-sustanza kimika tat-test li tipprodu ċi risponsi 
uterotrofi ċi ekwivalenti g ħall-agonist ta' referenza (etinil estradjol) huwa 
stmat mill-potenzi  in vitro  relattivi tieg ħu għal etinil estradjol. L-og ħla 
doża tat-test ting ħata permezz ta' moltiplikazzjoni ta' din id-do ża ekwi­
valenti b'fattur xieraq, e ż. 10 jew 100.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Kunsiderazzjonijiet g ħas-sejbien tal-medda  
36. Jekk ikun hemm b żonn, jista' jsir studju preliminari ta' sejbien tal-medda bi 
ftit annimali. F'dan ir-rigward, id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 19 
(25) jista' jintu ża biex jiġu definiti s-sinjali klini ċi li jindikaw tossi ċità jew 
diffikultà tal-annimali. Jekk fattibbli fi ħdan dan l-istudju ta' sejbien 
tal-medda wara tliet ijiem ta' g ħoti, l-utri jistg ħu jinqatg ħu u jinti żnu 
madwar 24 wara l-a ħħar doża. Imbag ħad din id-dejta tkun tista' tintu ża 
biex tassisti fid-disinn tal-istudju ewlieni (ag ħżel dożi massimi u inferjuri 
aċċettabbli u rrakkomanda n-numru ta' gruppi tad-do ża). 
L-għoti ta' do żi 
37. Is-sustanza kimika tat-test ting ħata permezz ta' gavage orali jew tilqima ta ħt 
il-ġilda. Iridu jitqiesu kunsiderazzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali kif 
ukoll aspetti tossikolo ġiċi bħar-relevanza g ħar-rotta ta' esponiment 
tal-bniedem g ħas-sustanza kimika (e ż. gavage orali biex ti ġi simulata 
inġestjoni, tilqima ta ħt il-ġilda biex ji ġi simulat te ħid man-nifs jew adsor ­
biment dermali), il-proprjetajiet fi żiċi/kimiċi tal-materjal tat-test u spe ċ­
jalment informazzjoni tossikolo ġika eżistenti u dejta dwar il-metaboli żmu 
u l-kinetika (e ż. il-bżonn li jiġi evitat metaboli żmu first pass, effi ċjenza 
aħjar b'rotta partikolari) meta ting ħażel ir-rotta tal-amministrazzjoni.  
38. Huwa rakkomandat li, fejn ikun possibbli, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu ta' 
soluzzjoni/sospensjoni milwiema. I żda peress li ħafna mil-liganti 
tal-oestro ġenu jew il-prekursuri metaboli ċi tagħhom għandhom it-tendenza 
li jkunu odrofobi ċi, l-iktar appro ċċ komuni huwa li tintu ża soluzzjoni/sos ­
pensjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħirrun, tal-karawett, tal- ġunġlien jew ta ż- 
żebbuġa). Madankollu, dawn i ż-żjut għandhom kontenut kaloriku u ta' 
xaħam differenti, u b'hekk il-veikolu jista' jaffettwa l-konsum ta' ener ġija 
metabolizzabbli (ME) totali, u b'hekk potenzjalment jibdel il-punti a ħħarin 
imkejlin b ħall-piż uterin, spe ċjalment fil-metodu immatur (33). B'hekk, 
qabel l-istudju, kwalunkwe veikolu li g ħandu jintu ża għandu jiġi ttestjat 
fl-isfond tal-kontrolli bla veikoli. Is-sustanzi kimi ċi tat-test jistg ħu jinħallu 
f'ammont minimu ta' 95 % etanol jew solventi xierqa o ħrajn u dilwiti g ħall- 
konċentrazzjonijiet tal- ħidma finali fil-veikolu tat-test. Il-karatteristi ċi tossiċi 
tas-solvent iridu jkunu mag ħrufin, u g ħandhom ji ġu ttestjati fi grupp ta' 
kontroll separat bis-solventi biss. Jekk is-sustanza kimika tat-test titqies stabbli, tista' tintu ża azzjoni mekkanika ġentili vigoru ża u tat-tis ħin biex 
tassisti fil- ħall tas-sustanza kimika tat-test. G ħandha tiġi ddeterminata 
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. Jekk is-sustanza kimika tat-test tkun stabbli g ħad-durata tal-istudju, jista' jit ħejja alikwot tal-bidu 
tas-sustanza kimika, u d-dilwizzjonijiet tad-do żaġġ speċifikati jit ħejjew 
kuljum.
 
39. Il-puntwalità tad-do żaġġ ser tiddependi mill-mudell u żat (irreferi g ħall- 
paragrafu 29 g ħall-mudell immatur u g ħall-paragrafu 30 g ħall-mudell 
adulti ovx). Il-firien nisa immaturi jing ħataw doża bis-sustanza kimika 
tat-test kuljum g ħal tliet ijiem konsekuttivi. Hija rakkomandata wkoll kura 
ta' tliet ijiem g ħal firien nisa b'ovarettomija i żda esponimenti itwal huma 
aċċettabbli u jistg ħu jtejbu l-identifikazzjoni ta' sustanzi kimi ċi attivi 
dgħajfin. Fil- ġrieden nisa b'ovarettomija, durata tal-applikazzjoni ta' 3 
ijiem għandha tkun bi żżejjed ming ħajr vanta ġġ importanti permezz ta' 
estensjoni li tasal sa sebat ijiem g ħal agonisti b'sa ħħithom tal-estro ġen, 
madankollu, din ir-relazzjoni ma ntwerietx g ħal estroġeni dgħajfin 
fl-istudju ta' validazzjoni (16) u b'hekk id-do żaġġ għandu jkun esti ż sa 
sebat ijiem konsekuttivi fi ġrieden adulti ovx. Id-do ża għandha ting ħata 
bosta drabi kuljum. G ħandhom ikunu a ġġustati kif ikun hemm b żonn 
biex jin żamm livell kostanti tad-do ża f'termini ta' pi ż tal-ġisem 
tal-annimal (e ż., mg tas-sustanza kimika tat-test g ħal kull kg ta' pi ż 
tal-ġisem kuljum). Rigward il-volum tat-test, il-varjabbiltà tieg ħu, fuq ba żi 
ta' piż tal-ġisem, għandha ti ġi minimizzata billi ti ġi aġġustata 
l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' do żaġġ biex jiġi żgurat volum kostanti 
fuq bażi ta' piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-do ża u għal kwalunkwe rotta 
tal-amministrazzjoni.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Meta s-sustanza kimika tat-test ting ħata b'gavage, dan g ħandu jsir b'do ża 
waħda ta' kuljum lill-annimali billi jintu ża tubu tal-istonku jew cannula 
xierqa ta' intubazzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jing ħata 
f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. G ħandhom ji ġu segwiti 
l-linji gwida lokali dwar l-indukrar tal-annimali, i żda l-volum ma g ħandux 
jaqbeż il-5 ml/kg pi ż tal-ġisem, ħlief fil-ka ż ta' soluzzjonijiet milwiema fejn 
jista' jintu ża 10 ml/kg pi ż tal-ġisem.  
41. Meta s-sustanza kimika tat-test ting ħata permezz ta' tilqima ta ħt il-ġilda, dan 
għandu jsir b'do ża waħda ta' kuljum. Id-do żi għandhom jing ħataw 
fir-reġjuni dososkapulari jew lombari permezz ta' labra sterili (e ż. wisgħa 
ta' 23 jew 25) u siringa tuberkulina. It-tqaxxir tas-sit tat-tilqima huwa fakult ­
attiv. Għandhom ji ġu rreġistrati kwalunkwe telf, tnixxija fis-sit tat-tilqima 
jew dożaġġ inkomplut. Il-volum totali injettat f'kull far f' ġurnata ma 
għandux jaqbe ż il-5 ml/kg pi ż tal-ġisem, maqsum f'2 sti tat-tilqima, ħlief 
fil-każ ta' soluzzjoni milwiema fejn jista' jintu ża 10 ml/kg pi ż tal-ġisem.  
Osservazzjonijiet  
Osservazzjonijiet ġenerali u klini ċi 
42. Għandhom isiru osservazzjonijiet klini ċi ġenerali tal-inqas darba kuljum u 
b'mod iktar spiss meta jkunu osservati sinjali ta' tossi ċità. Idealment, 
l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru fl-istess ħin(ijiet) ta' kull ġurnata u 
filwaqt li jitqies il-perjodu tal-og ħla effetti anti ċipati wara d-do żaġġ. 
L-annimali kollha g ħandhom ji ġu osservati g ħall-mortalità, il-morbidità u 
sinjali klini ċi ġenerali b ħal bidlet fl-im ġiba, il-ġilda, il-pil, l-g ħajnejn, 
il-membrani muku żi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u 
l-attività awtonomika (e ż. dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal- ħabba, mudell 
respiratorju mhux tas-soltu).  
Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel  
43. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu għall-eqreb 0,1 g, billi jibdew ftit 
qabel il-bidu tal-kura, ji ġifieri meta l-annimali ji ġu allokati fi gruppi. 
Bħala kejl fakultattiv, l-ammont ta' ikel ikkonsmat matul il-perjodu 
tal-kura jista' jitkejjel g ħal kull ga ġġa billi jinti żnu dawk li jitg ħalfu. 
Ir-riżultati tal-konsum ta' ikel g ħandhom jing ħataw fi grammi g ħal kull 
far kuljum.  
Dissezzjoni u kejl tal-pi ż tal-utru  
44. Erbg ħa u għoxrin sieg ħa wara l-a ħħar kura, il-firien ser jinqatlu b'mod 
dinjituż. Idealment, l-ordni ta' nekropsija ser tkun aleatorja fost gruppi 
biex tiġi evitata progressjoni direttament 'il fuq jew 'l isfel ta' gruppi ta' 
doża li tista' taffettwa d-dejta b'mod li jkun diffi ċli jinqabad. L-g ħan 
tal-bijoassa ġġ huwa li jitkejjel kemm il-pi ż tal-utru mxarrab kif ukoll dak 
niexef. Il-pi ż imxarrab jinkludu l-utru u l-kontenuti tal-fluwidu luminali. 
Il-piż niexef huwa mkejjel wara li jitbattlu u jitne ħħew il-kontenuti 
luminali tal-utru.  
45. Qabel id-dissezzjoni, il-va ġina tiġi eżaminata g ħal-istatus tal-ftu ħ fl-annimali 
immaturi. Il-pro ċedura ta' dissezzjoni tibda billi jinfeta ħ il-ħajt tal-addome li 
jibda fis-simfi żi pubika. Imbag ħad, il-qarn tal-utru u l-ovarji, jekk ikunu 
preżenti, jinqalg ħu mill-ħajt tal-addome dorsali. L-appart tal-urina u 
l-uretri jitne ħħew min-na ħa ventrali u laterali tal-utru u l-va ġina. Adeżjoni 
fibruża bejn ir-rektum u l-va ġina tinqala' sakemm ikun jista' ji ġi identifikat 
fejn jiltaqg ħu l-orifiċju vaġinali u l- ġilda perineali. L-utru u l-va ġina 
jinqalgħu mill-ġisem billi ssir in ċiżjoni fil-ħajt vaġinali ftit 'il fuq 
mill-għaqda bejn il- ġilda perineali kif muri fil-Figura 2. L-utru g ħandu ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
jinqala' mill- ħajt tal-ġisem permezz ta' qatg ħa ġentili tal-me żenterija uterina 
fil-punt tat-tqabbid tag ħha fit-tul s ħiħ tal-lat dorsolaterali ta' kull qarn uterin. 
Ladarba jitne ħħa mill-ġisem, it-tqandil tal-uterin g ħandu jkun rapidu 
biżżejjed biex ti ġi evitata desikkazzjoni tat-tessuti. It-telf ta' pi ż minħabba 
desikkazzjoni jsir iktar importanti b'tessuti żgħar bħall-utru (23). Jekk 
l-ovarji jkunu pre żenti, l-ovarji jitne ħħew fil-kanal salovarju biex ji ġi 
evitat telf ta' fluwidu luminali mill-qarn uterin. Jekk l-annimal tkun saritlu ovarettomija, il-qtajja' g ħandhom ji ġu eżaminati g ħall-preżenza ta' xi tessut 
tal-ovarji. Xa ħam u tessut konnettiv żejda għandhom jinqatg ħu. Il-vaġina 
titneħħa mill-utru ftit ta ħt iċ-ċerviċi sabiex i ċ-ċerviċi jibqa' mal-korp uterin 
kif muri fil-Figura 2.
 
46. Kull utru g ħandu jiġi ttrasferit f'kontenitur immarkat b'mod uniku u li 
jintiżen (eż. petri-dish jew plastic weight boat) filwaqt li jitkompla 
l-indukrar biex ti ġi evitata desikkazzjoni qabel jinti żen (eż. karta xuga ftit 
imxarrba b'salmastru tista' titqieg ħed fil-kontenitur). L-utru bi fluwidu 
luminali ser jinti żen sal-eqreb 0,1 mg (pi ż tal-utru mxarrab).  
47. Imbag ħad kull utru ji ġi pproċessat b'mod individwali biex jitne ħħa l-fluwidu 
luminali. I ż-żewġ qrun tal-utru ser jittaqqbu jew jinqatg ħu b'mod lon ġi­
tudinali. L-utru jitqieg ħed fuq karta xuga ftit imxarrba (e ż. Whatman 
Nru 3) u tintmesa ħ ftit b'bi ċċa oħra ta' karta xuga ftit imxarrba biex 
il-fluwidu luminali jitne ħħa għal kollox. L-utru ming ħajr il-kontenuti 
luminali ser jinti żen sal-eqreb 0,1 mg (pi ż tal-utru niexef).  
48. Il-pi ż tal-utru fit-tmiem jista' jintu ża biex jiġi żgurat li ma nqab żitx l-età 
xierqa fil-far intatt immatur, madankollu, id-dejta storika tar-razza tal-far użata mil-laboratorju hija de ċiżiva f'dan ir-rigward (ara l-paragrafu 56 
għal interpretazzjoni tar-ri żultati).
 
Investigazzjonijiet fakultattivi  
49. Wara li jinti żen, l-utru jista' ji ġi ffissat f'formalin b'bafer newtrali ta' 10 % 
biex jiġi eżaminat b'mod istopatolo ġiku wara tilwim b'Ematossilina u 
Osina (HE). Il-va ġina tista' ti ġi studjata kif xieraq (ara l-paragrafu 9). 
Barra minn hekk, il-kejl morfometriku tal-epitelju endometrijali jista' jsir għal tqabbil kwantitattiv.
 
DEJTA U RAPPORTAR  
Dejta  
50. Id-dejta tal-istudju g ħandha tinkludi:  
— in-numru ta' annimali fil-bidu tal-assa ġġ, 
— in-numru u l-identità tal-annimali misjubin mejtin matul l-assa ġġ jew 
maqtulin g ħal raġunijiet umanitarji u d-data u l- ħin ta' kwalunkwe 
mewta jew qatla b'mod dinjitu ż, 
— in-numru u l-identità tal-annimali li juru sinjali ta' tossi ċità, u desk ­
rizzjoni tas-sinjali tat-tossi ċità osservata, inklu ż il-ħin tal-bidu, 
id-durata, is-severità ta' kwalunkwe effett tossiku, u  
— in-numru u l-identità tal-annimali li juru kwalunkwe le żjoni u desk ­
rizzjoni tat-tip ta' le żjonijiet.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Dejta individwali dwar l-annimali g ħandha tiġi rreġistrata għall-piżijiet 
tal-ġisem, il-pi ż uterin imxarrab, u l-pi ż uterin niexef. G ħandha tintu ża 
analiżi statistika one-tailed g ħall-agonisti biex ji ġi ddeterminat jekk l-g ħoti 
ta' sustanza kimika tat-test irri żultatx f'żieda statistikament importanti 
(p < 0,05) fil-pi ż uterin. Anali żijiet statisti ċi xierqa g ħandha ssir biex 
isiru testijiet g ħal bidliet relatati mal-kura fil-pi ż uterin niexef u mxarrab. 
Pereżempju, id-dejta tista' ti ġi evalwata permezz ta' anali żi tal-appro ċċ ta' 
kovarjanza (ANCOVA) bil-pi ż tal-ġisem fin-nekropsija b ħall-kovarjabbli. 
Tista' ssir trasformazzjoni logaritmika li tistabbilizza l-varjanza fuq 
id-dejta uterina qabel ma ssir l-anali żi tad-dejta. It-testijiet Dunnett u Hsu 
huma xierqa biex isir tqabbil ta' pari ta' kull grupp mog ħti doża ma' 
kontrolli veikolu u biex ji ġu kkalkolati l-intervalli ta' kunfidenza. Jistg ħu 
jintużaw plots residwi studentizzati biex jinqabdu punti ta' osservazzjoni 
distanti possibbli g ħall-valutazzjoni tal-omo ġenità tal-varjanzi. Dawn 
il-proċeduri ġew applikati fil-programm ta' validazzjoni tal-OECD bl-u żu 
tal-PROC GLM fis-Sistema ta' Anali żi Statistika (l-Istitut SAS, Cary, 
NC), verżjoni 8 (6)(7).  
52. Rapport finali g ħandu jinkludi:  
Faċilità ta' ttestjar:  
— Il-persunal responsabbli u r-responsabilitajiet tal-istudju tieg ħu, 
— Dejta mit-Test Ba żi ta' Kontroll Po żittiv u dejta perjodika ta' kontroll 
pożittiv (ara l-paragrafi 26 u 27),  
Sustanza kimika tat-test:  
— Il-karatterizzazzjoni tas-sustanzi kimi ċi tat-test,  
— L-għamla fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fi żjokimiċi, 
— Il-metodu u l-frekwenza tal-preparazzjoni tad-dilwizzjonijiet,  
— Kwalunkwe dejta ġġenerata fuq l-istabbiltà,  
— Kwalunkwe anali żi tas-soluzzjonijiet ta' do żaġġ, 
Veikolu:  
— Il-karatterizzazzjoni tal-veikolu tat-test (g ħamla, fornitur u lott),  
— Ġustifikazzjoni tal-g ħażla tal-veikolu (jekk mhux ilma),  
Annimali tat-test:  
— L-ispe ċi u r-razza u ġustifikazzjoni tal-g ħażla tagħhom,  
— Il-fornitur u l-fa ċilità speċifika tal-fornitur,  
— L-età mal-provvista bid-data tat-twelid,  
— Jekk l-annimali huma immaturi, jekk ġewx forniti mal-omm jew omm 
adottiva u d-data tal-ftim,  
— Dettalji dwar il-pro ċedura ta' akklimatizzazzjoni tal-annimali,  
— In-numru ta' annimali g ħal kull ga ġġa, 
— Dettalji u l-metodu ta' identifikazzjoni tal-annimal individwali u 
tal-grupp,  
Kundizzjonijiet tal-Assa ġġ: 
— Dettalji dwar il-pro ċess tal-ka żwalizzazzjoni (ji ġifieri l-metodu u żat), 
— Ir-raġuni għall-għażla tad-doża, ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— Dettalji dwar il-fomulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, 
il-konċentrazzjonijiet, l-istabbiltà u l-omo ġenità tagħha, 
— Dettalji tal-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test u r-ra ġuni għall-għażla 
tar-rotta ta' esponiment,  
— Id-dieta (isem, tip, fornitur, kontenut, u, jekk ikunu mag ħrufin, il-livelli 
tal-fitoestro ġen), 
— Is-sors ta' ilma (e ż., ilma tal-vit jew ilma ffiltrat) u l-provvista tal-ilma 
(b'tubi minn kontenitur kbir, fi fliexken, e ċċ.), 
— Il-bejta (l-isem, it-tip, il-fornitur, il-kontenut),  
— Reġistru tal-kundizzjonijiet tal-ga ġġa, l-intervall tad-dawl, it-temperatura 
u l-umdità fil-kamra, it-tindif tal-kamra,  
— Deskrizzjoni dettaljata tan-nekropsija u tal-pro ċeduri ta' w żin tal-utri  
— Deskrizzjoni tal-pro ċeduri statisti ċi, 
Riżultati  
Għal annimali individwali:  
— Il-piżijiet tal-ġisem individwali kollha ta' kuljum (mill-allokazzjoni fi 
gruppi san-nekropsija) (sal-eqreb 0,1 g),  
— L-età ta' kull annimal (fil-jiem li jibdew mill-jum tat-twelid b ħala l-jum 
0) meta jibda l-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test,  
— Id-data u l- ħin ta' kull g ħoti ta' do ża, 
— Il-volum u d-do żaġġ ikkalkolati mog ħtijin u l-osservazzjonijiet ta' 
kwalunkwe telf ta' do żaġġ matul jew wara l-g ħoti, 
— Reġistru ta' kuljum tal-qag ħda tal-annimal, inklu żi sintomi u osser ­
vazzjonijiet rilevanti,  
— Il-kaw ża tal-mewt issuspettata (jekk tinsab matul studju fi stat moribond 
jew mejjet),  
— Id-data u l- ħin tal-qti b'mod dinjitu ż b'intervall tal- ħin għall-aħħar 
dożaġġ, 
— Il-piż uterin imxarrab (sal-eqreb 0,1 mg) u kwalunkwe osservazzjoni ta' 
telf ta' fluwidu luminali matul id-dissezzjjoni u l-preparazzjoni biex jintiżen,
 
— Piż uterin niexef (sal-eqreb 0,1 mg),  
Għal kull grupp ta' annimali:  
— Il-piżijiet medji tal- ġisem ta' kuljum (sal-eqreb 0,1 g) u devjazzjonijiet 
standard (minn allokazzjoni fi gruppi permezz ta' nekropsija),  
— Medji tal-pi żijiet uterini mxarrbin u nixfin (sal-eqreb 0,1 mg) u 
devjazzjonijiet standard,  
— Jekk jitkejjel, il-konsum ta' ikel ta' kuljum (ikkalkolat b ħala grammi ta' 
ikel ikkonsmat g ħal kull annimal),  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— Ir-riżultati tal-anali żijiet statisti ċi li jqabblu kemm pi żijiet uterini 
mxarrbin kif ukoll nixfin ta' gruppi kkurati fir-rigward tal-istess kejliet 
fil-gruppi ta' kontroll veikoli,  
— Ir-riżultati tal-anali żi statistika li tqabbel il-pi ż sħiħ tal-ġisem u ż-żieda 
fil-piż tal-ġisem tal-gruppi kkurati relatati mal-istess kejliet fil-gruppi ta' 
kontroll veikoli.  
53. Sommarju tal-fatti importanti ta' gwida tal-metodu ta' ttestjar  
Firien Ġrieden  
Annimali  
Razza Razza ta' rodituri tal-laboratorju u żata spiss 
Numru ta' annimali Tal-inqas 6 annimali g ħal kull grupp ta' do ża 
Numru ta' gruppi Tal-inqas 2 gruppi tat-test (ara l-paragrafu 33 g ħal gwida) u 
grupp ta' kontroll negattiv 
Għal gwida dwar gruppi ta' kontroll po żittiv, ara l-paragrafi 26 
u 27  
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
T o fil-kamra tal-annimali 22°C ± 3°C 
Umdità relativa 50-60 % u mhux inqas minn 30 % jew iktar minn 70 % Sekwenza tad-dawl ta' 
kuljum 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam 
Dieta u ilma tajjeb g ħax- 
xorb Ad libitum 
Post tat-trobbija B'mod individwali jew fi gruppi sa tliet annimali (trobbija fi 
grupp soċjali hija rakkomandata g ħal annimali immaturi) 
Dieta u bejta Livell baxx ta' fitoestro ġeni rakkomandati fid-dieta u l-bejta  
Protokoll  
Metodu Metodu immatur ming ħajr 
ovarjettomija (dak preferut). 
Metodu ta' firien nisa adulti 
b'ovarettomija Metodu ta' ġrieden nisa adulti 
b'ovarettomija 
L-età tad-do żaġġ għal 
annimali immaturi Mhux qabel PND 18. 
Id-dożaġġ għandu jsir qabel 
PND 25 Mhux rilevanti fil-kamp ta' 
applikazzjoni tal-metodu ta' 
ttestjar attwali. 
Età tal-ovarettomija Età ta' bejn 6 u 8 ġimgħat. 
Età tad-do żaġġ għal 
annimali b'ovarettomija Għandhom ikunu g ħaddew 
tal-inqas 14-il jum bejn 
l-ovarettomija u l-1 jum ta' għoti. Għandhom ikunu g ħaddew 
tal-inqas 7 ijiem bejn 
l-ovarettomija u l-1 jum ta' għoti. 
Piż tal-ġisem Il-varjazzjoni fil-pi ż tal-ġisem għandha tkun minima u ma 
taqbiżx ± 20 % tal-pi
ż medju.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Firien Ġrieden  
Dożaġġ 
Rotta tal-amministrazzjoni Gavage orali jew tilqima ta ħt il-ġilda 
Frekwenza tal-g ħoti Do ża waħda kuljum 
Ammont ta' volum g ħal 
gavage u tilqima ≤ 5 ml/kg pi ż tal-ġisem (jew sa 10 ml/kg pi ż tal-ġisem f'każ ta' 
soluzzjonijiet milwiema) (f'2 siti ta' tilqim g ħar-rotta ta ħt 
il-ġilda) 
Durata tal-g ħoti 3 ijiem konsekuttivi g ħall- 
mudell immatur 
Tal-inqas 3 ijiem konsekuttivi 
għall-mudell OVX 7 ijiem konsekuttivi g ħall- 
mudell OVX 
Ħin tan-nekropsija Madwar 24 sieg ħa wara l-a ħħar doża 
Riżultati  
Rispons po żittiv Żieda statistikament sinifikanti tal-pi ż medju tal-utru (imxarrab 
u/jew niexef) 
Estroġen ta' referenza 17 α-etinil estradjol  
GWIDA G ĦALL-INTERPRETAZZJONI U L-A ĊĊETTAZZJONI 
TAR-RIŻULTATI  
54. B'mod ġenerali, test g ħall-estroġeniċità għandu jitqies po żittiv jekk ikun 
hemm żieda statistikament importanti fil-pi ż tal-utru (p< 0,05) tal-inqas 
fil-livell g ħoli tad-do ża meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll b'solvent. 
Riżultat pożittiv huwa appo ġġjat iktar mill-wiri ta' relazzjoni bijolo ġikament 
plawżibbli bejn id-do ża u d-daqs tar-rispons, filwaqt li jitfakkar li attivitajiet 
estroġeniċi u antiestro ġeniċi tas-sustanza kimika li jid ħlu f'xulxin jistg ħu 
jaffettwaw il-forma tal-kurva bejn id-do ża u r-rispons.  
55. Għandha ting ħata attenzjoni sabiex ma tinqabi żx id-doża massima tollerata 
ħalli tkun tista' ssir interpretazzjoni valida tad-dejta. Tnaqqis fil-pi ż 
tal-ġisem, sinjali klini ċi u sejbiet o ħrajn għandhom ji ġu vvalutati 
fid-dettall f'dan ir-rigward.  
56. Kunsiderazzjoni importanti g ħall-aċċettazzjoni tad-dejta mill-Bijoassa ġġ 
Uterotrofiku hija l-pi żijiet tal-utru tal-grupp ta' kontroll veikolu. Valuri ta' 
kontroll g ħoljin jitsg ħu jikkompromettu r-risponsitività tal-bijoassa ġġ u 
l-ħila li jiġu identifikati agonisti tal-estro ġen ferm dg ħajfin. Anali żijiet 
tat-tagħrif u d-dejta ġġenerata matul il-validazzjoni tal-Bijoassa ġġ Uterot­
rofiku jissu ġġerixxu li waqtiet ta' medji ta' kontroll g ħoljin iseħħu b'mod 
spontanju, b'mod partikolari f'annimali immaturi (2)(3)(6)(9). Peress li l-pi ż 
tal-utru ta' firien immaturi jiddependi fuq bosta varjabbli b ħar-razza u l-pi ż 
tal-ġisem, ma jista' jing ħata ebda limitu superjuri definittiv g ħall-piż tal-utru. 
Bħala gwida, jekk il-pi żijiet tal-utru niexef f'firien ta' kontroll immaturi 
jkunu ta' bejn 40 u 45 mg, ir-ri żultati għandhom jitqiesu b ħala suspettu żi 
u piżijiet tal-utri ta' iktar minn 45 mg jistg ħu jwasslu sabiex it-test jer ġa' 
jsir. Madankollu, dan irid jitqies fuq ba żi ta' każ b'każ (3)(6)(8). Meta jsiru 
testijiet f'firien adulti, ovarettomija inkompluta ser t ħalli tessut tal-ovarji li 
jista' jipprodu ċi estroġenu endo ġenu u jittardja r-rigressjoni tal-pi ż tal-utru.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Piżijiet tal-utru niexef tal-kontroll veikolu li huma inqas minn 0,09 % 
tal-piż tal-ġiesm għal firien nisa immaturi u inqas minn 0,04 % g ħal 
firien nisa żgħażagħ b'ovarettomija jidhru li jrendu ri żultati aċċettabbli 
(ara t-Tabella 31 (2)). Jekk il-pi żijiet tal-utru tal-kontroll ikunu ikbar 
minn dawn in-numru, g ħandhom ji ġu skrutinizzati bosta fatturi inklu żi 
l-età tal-annimali, ovarettomija xierqa, fitoestro ġeni djeteti ċi, u l-bqija, u 
riżultat ta' assa ġġ negattiv (ebda indikazzjoni ta' attività estro ġenika) 
għandu jintu ża bir-reqqa.  
58. Dejta storika g ħall-gruppi ta' kontroll veikolu g ħandha tin żamm 
fil-laboratorju. Dejta storika g ħal risponsi g ħal estroġeni ta' referenza 
pożittivi, bħal 17α-etinil estradjol, g ħandha tin żamm fil-laboratorju wkoll. 
Il-laboratorji jistg ħu jittestjaw ukoll ir-rispons g ħal agonisti tal-estro ġen 
dgħajfin li jkunu mag ħrufni. Din id-dejta kollha tista' titqabbel mad-dejta 
disponibbli (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) biex ji ġi żgurat li l-metodi tal-laboratorju 
jrendu biżżejjed sensittività.  
59. Il-pi żijiet tal-utru niexef urew inqas varjabbiltà matul l-istudju ta' vali ­
dazzjoni tal-OECD meta mqabblin mal-pi żijiet tal-utru mxarrab (6)(7). 
Madankollu, rispons importanti f'xi kejl jindika li s-sustanza kimika 
tat-test hija po żittiva għal attività estro ġenika.  
60. Ir-rispons uterotrofiku mhuwiex kompletament ta' ori ġini estro ġenika, 
madankollu, ri żultat po żittiv tal-Bijoassa ġġ Uterotrofiku g ħandu 
ġeneralment ji ġi interpretat b ħala evidenza g ħal potenzjal estro ġeniku in 
vivo, u normalment g ħandu jniedi azzjonijiet g ħal klassifikazzjoni 
ulterjuri (ara l-paragrafu 9 u l-‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’, Anness 2).
 
Figura 1  
Dijagramma skematika turi t-t ħennija kirur ġika tal-ovarji
  
Il-proċedura tibda billi jinfeta ħ il-ħajt tal-addome dorsolaterali fil-punt 
tan-nofs bejn il-limitu inferjuri kostali u l-qoxra iljaka, u ftit millimetri 
laterali g ħall-marġni laterali tal-muskolu lombari. Fi ħdan il-kavità 
tal-addome, g ħandhom ji ġu identifikati l-ovarji. Fuq pjan asettiku, 
imbagħad l-ovarji jitne ħħew fiżikament mill-kavità tal-addome, titqieg ħed 
ligatura bejn l-ovarju u l-utru biex ji ġi kkontrollat il-fsad, u l-ovarju jinqala' 
permezz ta' in ċiżjoni fuq il-ligatura fl-g ħaqda tal-kanal salovarju u kull qarn 
tal-utru. Wara l-konferma li ebda fsad importanti ma g ħadu jippersisti, 
il-ħajt tal-addome g ħandu jing ħalaq b'sutura, u ting ħalaq il-ġilda, eż., b'au­
toclips jew sutura. L-annimali g ħandhom jit ħallew jirkupraw u l-pi ż tal-utru 
għandu jitħalla jagħmel rigress g ħal tal-inqas 14-il jum wara l-u żu. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figura 2  
It-tneħħija u l-preparazzjoni tat-tessuti tal-utru g ħall-kejl tal-pi ż
 
Il-proċedura tibda billi jinfeta ħ il-ħajt tal-addome fis-simfi żi pubika. Imbag ħad, 
kull ovarju, jekk ikun pre żenti, u l-qarn tal-utru jitne ħħew mill-ħajt tal-addome 
dorsali. L-apparat tal-urina u l-uretri jitne ħħew mil-lat ventrali u laterali tal-utru u 
l-vaġina. L-ade żjoni fibru ża bejn ir-rektum u l-va ġina jinqalg ħu sakemm l-g ħaqda 
tal-orifiċju vaġinali u l- ġilda perineali jkunu jistg ħu jiġu identifikati. L-utru u 
l-vaġina jinqalg ħu mill-ġisem permezz ta' in ċiżjoni tal-ħajt vaġinali ftit 'il fuq 
mill-għaqda bejn il- ġilda perineali kif muri fil-figura. L-utru g ħandu jinqala' 
mill-ħajt tal-ġisem billi ssir qatg ħa ħafifa tal-me żenterija uterina fil-punt ma' 
fejn taqbad matul it-tul s ħiħ tal-aspett dorsolaterali ta' kull qarn uterin. Wara 
t-tneħħija mill-ġisem, ix-xa ħam żejjed u t-tessut konnettiv jinqata'. Jekk ikunu 
preżenti l-ovarji, l-ovarji jitne ħħew fil-kanal salovarju biex ji ġi evitat telf ta' 
fluwidu luminali mill-qarn uterin. Jekk l-annimal tkun saritlu ovarettomija, 
il-qtajja' g ħandhom ji ġu eżaminati g ħal-preżenza ta' xi tessut tal-ovarji. 
Il-vaġina titneħħa mill-utru e żatt taħt iċ-ċerviċi sabiex i ċ-ċerviċi jibqa' mal-korp 
uterin kif muri fil-figura. Imbag ħad l-utru jista' jinti żen. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET:  
Antiestro ġeniċità hija l-kapa ċità ta' sustanza kimika sabiex tra żżan l-azzjoni 
tal-estradjol 17ß f'organi żmu mammiferu.  
Sustanza kimika  tfisser sustanza jew ta ħlita. 
Data tat-twelid  hija l-jum 0 wara t-twelid.  
Dożaġġ hija terminu ġenerali li tinvolvi d-do ża, il-frekwenza tag ħha u d-durata 
tad-dożaġġ. 
Doża hija l-ammont ta' sustanza kimika mog ħtija. Għall-Bijoassa ġġ Uterotrofiku, 
id-doża tingħata bħala piż tas-sustanza kimika tat-test g ħal kull pi ż tal-ġisem ta' 
unità tal-annimal tat-test f'kull jum (e ż. mg/kg pi ż tal-ġisem/jum).  
Doża Massima Tollerabbli (MTD)  hija l-og ħla ammont ta' sustanza kimika li, 
meta tidda ħħal fil-ġisem, ma toqtolx lill-annimali tat-test (denotata b'LD  0 ) 
(IUPAC, 1993).  
Estroġeniċità hija l-kapa ċità li sustanza kimika ta ġixxi bħal estradjol 17ß f'or ­
ganiżmu mammiferu.  
Jum X wara t-twelid  huwa l-jum numru X tal- ħajja wara t-twelid.  
Sensitività  hija l-proporzjon tas-sustanzi kimi ċi pożittivi/attivi kollha li huma 
klassifikati kif suppost mit-test. Hija kejl tal-pre ċiżjoni għal metodu ta' ttestjar 
li jipprodu ċi riżultati kategori ċi, u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni 
tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar.  
Speċifiċità hija l-proporzjon tas-sustanzi kimi ċi negattivi/inattivi kollha li huma 
klassifikati kif suppost mit-test. Hija kejl tal-pre ċiżjoni għal metodu ta' ttestjar li 
jipproduċi riżultati kategori ċi u hija kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni 
tar-relevanza ta' metodu ta' ttestjar.  
Sustanza kimika tat-test  tfisser kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata 
permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.  
Uterotrofika  hija terminu u żata biex ti ġi deskritta influwenza po żittiva fuq 
it-tkabbir tat-tessuti tal-utru.  
Validazzjoni  hija proċess xjentifiku mfassal sabiex jikkaratterizza r-rekwi żiti u 
l-limitazzjonijiet operazzjonali ta' metodu ta' ttestjar u biex juri l-affidabilità u 
r-relevanza tieg ħu għal skop partikolari.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Appendiċi 2
 
VMG mamm: Grupp ta' Mmani ġġjar tal-Validazzjoni fuq Ittestjar u Valutazzjoni tal-Mammiferi
 NOTI GĦALL-QAFAS  
Nota 1:  Dħul fil-livelli kollha u ħruġ fil-livelli kollha huma possibbli u 
jiddependu fuq l-g ħamla tal- ħtiġijiet eżistenti ta' informazzjoni 
għal skopijiet ta' valutazzjoni tal-periklu u r-riskju  
Nota 2:  Fil-livell 5, l-ekotossikolo ġija għandha tinkludi punti a ħħarin li 
jindikaw mekkani żmi ta' effetti avversi, u l- ħsara potenzjali g ħall- 
popolazzjoni  
Nota 3:  Meta mudell multimodali jkopri diversi mill-assa ġġi tal-punt a ħħari 
uniku, dak il-mudell jie ħu post l-u żu ta' dawk l-assa ġġi tal-punt 
aħħari uniku  
Nota 4:  Il-valutazzjoni ta' kull sustanza kimika g ħandha tkun imsejsa fuq 
bażi ta' ka ż b'każ, filwaqt li tittie ħed f'kunsiderazzjoni 
l-informazzjoni kollha g ħad-dispożizzjoni, filwaqt li tibqa' 
mfakkra l-funzjoni tal-livelli tal-qafas.  
Nota 5:  Il-qafas ma g ħandux jitqies li jinkludi kollox b ħalissa. Fil-livelli 3, 
4 u 5 jinkludi assa ġġi li jew huma disponibbli jew inkella li 
għalihom qed issir validazzjoni. Fir-rigward ta' dawn tal-a ħħar, 
dawn huma inklu żi b'mod provvi żorju. Ladarba ji ġu żviluppati u 
vvalidati, dawn ser ji żdiedu b'mod formali mal-qafas.  
Nota 6:  Il-livell 5 ma g ħandux jitqies li jinkludi testijiet definittivi biss. 
It-testijiet inklu żi f'dak il-livell jitqiesu li jikkontribwixxu g ħall- 
valutazzjoni ġenerali tal-perikli u r-riskji.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
TAGĦRIF 
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 ta' Marzu 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterot ­
rophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic 
Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.  
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. 
ENV/JM/MONO(2006)33.
 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94.
 
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/ 
MONO(2006)34.
 
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549
 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — 
Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.  
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.
 
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolif ­
erative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally 
castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.  
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17 β- 
estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.  
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, 
Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10–15.
 
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650–651.  
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. 
Toxicol. 13:425–427.  
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health 
Perspec.106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the 
Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and 
Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157.  
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.
 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given 
different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the 
immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620.
 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of 
vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485.  
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343–347.  
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393.
 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601.
 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33–41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288–305.
 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291.  
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pari ġi. 
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184.  
(35) Booth AN, Bickoff EM u Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808.  
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). 
Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using 
in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414.  
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay 
Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
 
(38) Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal 
skopijiet xjentifi ċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  BIJOASSA ĠĠ HERSHBERGER F'FIRIEN: ASSA ĠĠ TA' 
TGĦARBIL TA' TERMINU QASIR G ĦAL PROPRJETAJIET 
(ANTI)ANDRO ĠENIĊI 
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tat-Test (TG) 
tal-OECD Nru 441 (2009). L-OECD nediet attività ta' prijorità g ħolja 
fl-1998 biex tirrevedi l-linji gwida e żistenti u ti żviluppa linji gwida ġodda 
għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' interferenti endokrinali potenzjali (1). Element 
minnhom tal-attività kien li ti żviluppa linja gwida tat-test g ħall-Bijoassa ġġ 
Hershberger tal-firien. Wara g ħexieren ta' snin ta' u żu mill-industrija farma ­ 
ċewtika, dan l-assa ġġ ġie standardizzat g ħall-ewwel darba minn kumitat 
uffiċjali tal-esperti fl-1962 b ħala għodda tat-tg ħarbil għal sustanzi kimi ċi 
androġeniċi (2). Fl-2001-2007, il-Bijoassa ġġ Hershberger tal-firien sarlu 
programm ta' validazzjoni estensiv inklu ża l-ġenerazzjoni ta' Dokument ta' 
Reviżjoni ta' Sfond (23), kompilazzjoni ta' dokument tal-metodi dettaljati 
(3), l-iżvilupp ta' gwida dwar id-dissezzjoni (21) u t-twettiq ta' studji intra u 
interlaboratorji estensivi biex jintwerew l-affidabilità u r-riprodu ċibilità 
tal-bijoassa ġġ. Dawn l-istudji ta' validazzjoni saru b'andro ġen ta' referenza 
qawwi (testosteron propjonat (TP)), żewġ androġeni sinteti ċi qawwijin 
(trenbolon a ċetat u metil testosteron), farma ċewtiku antiandro ġeniku 
qawwi (flutamid), inibitur qawwi tas-sinte żi (finasterid) tal-andro ġen 
naturali (diidrotestosteron-DHT), bosta pesti ċidi antiandro ġeniċi dgħajfin 
(linuron, vinklo żolina, pro ċimidon, p,p' DDE), inibitur qawwi ta' 5 α 
ridottasi (finasterid) u żewġ sustanzi kimi ċi negattivi mag ħrufin (dini ­
trofenol u nonilfenol) (4)(5)(6)(7)(8). Dan il-metodu ta' ttestjar huwa r-riżultat tal-esperjenza storika twila bil-bijoassa ġġ u l-esperjenza miksuba 
matul il-programm tat-test ta' validazzjoni u r-ri żultati miksubin bih.
 
2. Il-Bijoassa ġġ Hershberger huwa test ta' tg ħarbil in vivo  ta' terminu qasir li 
juża tessuti a ċċessorji tal-apparat riproduttiv tal-ir ġiel. L-assa ġġ oriġina 
fis-snin tletin u ġie modifikat fis-snin erbg ħin biex jinkludi muskoli 
risponsivi g ħall-androġen fl-apparat riproduttiv tal-ir ġiel (2) (9-15). 
Fis-snin sittin, ġew evalwati iktar minn 700 andro ġen possibbli billi 
ntużat verżjoni standardizzata tal-protokoll (2)(14), u l-u żu tal-assa ġġ 
kemm għal androġeni kif ukoll g ħal antiandro ġeni tqies li huwa metodu 
standard fis-snin sittin (2)(15). Il-bijoassa ġġ kurrenti huwa bba żat fuq 
il-bidliet fil-pi ż ta' ħames tessuti li jiddependi fuq l-andro ġen fil-far ra ġel 
peripubertali msewwi. Jevalwa l- ħila ta' sustanza kimika li tniedi attivitajiet 
bijoloġiċi konsistenti mal-agonisti andro ġeni, antagonisti jew inibituri ta' 5 α- 
ridottasi. Il- ħames tessuti fil-mira li jiddependu fuq l-andro ġen inklużi f'dan 
il-metodu ta' ttestjar huma l-prostata ventrali (VP), in-nuffata seminali (SV) (kif ukoll fluwidi u glandoli koagulanti), il-muskolu reffieg ħ 
ani-bulbokavernosu (LABC), il-glandoli ta' Cowper flimkien (COW) u 
r-ras tal-pene (GP). Fil-far ra ġel peripubertali msewwi, dawn il- ħames 
tessuti kollha kemm huma jwie ġbu għal andro
ġeni b'żieda fil-pi ż assolut. 
Meta dawn l-istess tessuti ji ġu stimolati biex ji żdiedu fil-pi ż permezz 
tal-għoti ta' andro ġen ta' referenza qawwi, dawn il- ħames tessuti kollha 
jwieġbu għall-antiandro ġeni bi tnaqqis fil-pi ż assolut. Il-mudell primarju 
għall-bijoassa ġġ Hershberger kien ir-ra ġel peripubertali msewwi b'kirur ġija, 
li ġie validat fil-Fa żijiet 1, 2 u 3 tal-programm ta' validazzjoni ta' 
Hershberger.  
3. Il-Bijoassa ġġ Hershberger iservi b ħala assaġġ mekkanistiku ta' tg ħarbil in 
vivo għal agonisti tal-andro ġen, antagonisti tal-andro ġen u inibituri ta' 5 α- 
ridottasi u l-applikazzjoni tieg ħu għandha titqies fil-kuuntest tal-“Qafas 
Kunċettwali tal-OECD g ħall-Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi li 
Jfixklu s-Sistema Endokrinali” (Appendi ċi 2). F'dan il-Qafas Kun ċettwali, 
il-Bijoassa ġġ Hershberger jinsab fil-Livell 3 b ħala assaġġ in vivo  li ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
jipprovdi dejta dwar mekkani żmu endokrinali wie ħed, jiġifieri (anti)an ­
droġeniċità. Huwa ma ħsub sabiex ikun inklu ż f'serje ta' testijiet  in vitro  u 
in vivo  biex jiġu identifikati sustanzi kimi ċi b'potenzjal li jintera ġixxu 
mas-sistema endokrinali, li finalment iwasslu g ħal valutazzjonijiet 
tal-periklu u r-riskju g ħas-saħħa tal-bniedem jew l-ambjent.  
4. Min ħabba tħassib relatat mal-benessri tal-annimali fil-pro ċedura ta' tiswija, 
intuża r-raġel intatt stimolat (mhux imsewwi) li jkun g ħadu kif infatam 
bħala mudell alternattiv g ħall-Bijoassa ġġ Hershberger biex ji ġi evitat 
il-pass tat-tiswija. Il-metodu tat-test tar-ra ġel stimolat li jkun g ħadu kif 
infatam ġie validat (24); madankollu, fl-istudji ta' validazzjoni, il-ver żjoni 
tar-raġel li jkun g ħadu kif infatam tal-Bijoassa ġġ Hershberger ma dehritx li 
kapaċi tidentifika effetti b'mod konsistenti fuq pi żijiet tal-organi li 
jiddependu fuq andro ġen minn antiandro ġeni dgħajfin bid-do żi ttestjati. 
Għalhekk, ma kienx inklu ż f'dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, peress 
li l-użu tiegħu jista' jipprovdi mhux biss benefi ċċji għall-benessri 
tal-annimali i żda jista' jipprovdi wkoll informazzjoni dwar modi o ħrajn ta' 
azzjoni, huwa disponibbli fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 115(25).  
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET  
5. L-agonisti u l-antagonisti tal-andro ġen jaġixxu bħala lega g ħar-riċettur 
tal-androġen u jistg ħu jattivaw jew jinibixxu, rispettivament, 
it-traskrizzjoni tal- ġeni kkontrollata mir-ri ċettur. Barra minn hekk, ċerti 
sustanzi kimi ċi jinibixxu l-konver żjoni ta' testosteron g ħall-androġenu 
naturali iktar qawwi diidrotestosteron f'xi tessuti tal-andro ġen fil-mira 
(inibituri ta' 5 α-ridottasi). It-tali sustanzi kimi ċi għandhom il-potenzjal li 
jwasslu g ħal perikli avversi g ħas-saħħa, inklużi effetti fuq ir-riproduzzjoni 
u l-iżvilupp. G ħalhekk, hemm b żonn regolatorju biex sustanza kimika ti ġi 
vvalutata u evalwata malajr b ħala agonist jew antagonist possibbli 
tal-androġen jew inibitur ta' 5 α-ridottasi. Filwaqt li informattiva, l-affinità 
tal-lega g ħal riċettur tal-andro ġen kif imkejla permezz tar-rabta tar-ri ċettur 
jew l-attivazzjoni transkrizzjonali tal- ġeni rapportaturi  in vitro  mhijiex 
l-uniku determinant ta' periklu possibbli. Determinanti o ħrajn jinkludu 
attivazzjoni u di żattivazzjoni metaboli ċi malli jid ħlu fil-ġisem, distribuzzjoni 
kimika biex jimmiraw g ħal tessuti, u tne ħħija mill-ġisem. Dan iwassal g ħall- 
bżonn li titg ħarbel l-attività possibbli ta' sustanza kimika  in vivo  f'kun­
dizzjonijiet u esponiment rilevanti. L-evalwazzjoni  in vivo  hija inqas 
kritika jekk ikunu mag ħrufin il-karatteristi ċi tas-sustanza kimika rigward 
Assorbiment –Distribuzzjoni — Metaboli żmu — Eliminazzjoni (ADME). 
Tessuti li jiddependu fuq andro ġen iwieġbu bi tkabbir rapidu u qawwi 
għall-istimolu minn andro ġeni, b'mod partikolari f'firien ir ġiel peripubertali 
msewwijin. Spe ċi rodituri, b'mod partikolari l-far, jintu żaw spiss ukoll 
fl-istudji dwar it-tossi ċità għall-karatterizzazzjoni tal-perikli. B'hekk, 
il-verżjoni l-assa ġġ, li tuża l-far peripubertali msewwi u l- ħames tessuti 
fil-mira f'dan l-assa ġġ, hija xierqa g ħat-tgħarbil in vivo  ta' agonisti u antag ­
onisti tal-andro ġen u inibituri ta' 5 α-ridottasi.  
6. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bba żat fuq dawk il-protokolli m ħaddmin 
fl-istudju ta' validazzjoni tal-OECD li ntwera li huma affidabbli u ripro ­
duċibbli fi studji intra u interlaboratorji (4)(5)(6)(7)(8). Kemm il-pro ċeduri 
androġeni kif ukoll dawk antiandro ġeni huma ppre żentati f'dan il-metodu ta' 
ttestjar.  
7. Għad li kien hemm xi varjazzjoni fid-do ża tat-TP u żata biex ji ġu identifikati 
antiandro ġeni fil-programm tal-OECD ta' validazzjoni tal-Bijoassa ġġ 
mil-laboratorji differenti (0,2 versus 0,4 mg/kg/d, tilqima ta ħt il-ġilda), ftit 
li xejn kien hemm differenza bejn dawn i ż-żewġ varjazzjonijiet fil-protokoll 
fil-ħila biex jaqbdu attività antiandro ġenika dg ħajfa jew qawwija. 
Madankollu, huwa ċar li d-do ża tat-TP ma g ħandhiex tkun g ħolja wisq 
tant li timblokka l-effetti ta' antagonisti dg ħajfin tar-ri ċettur 
tal-androġenu (AR) jew baxxa wisq tant li t-tessuti andro ġeniċi juru 
rispons tat-tkabbir batut anki ming ħajr il-koamministrazzjoni 
tal-antiandro ġen. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Ir-rispons tat-tkabbir tat-tessuti individwali li jiddependu fuq l-andro ġen 
mhuwiex ta' ori ġini kompletament andro ġenika, jiġifieri sustanzi kimi ċi 
minbarra agonisti andro ġeni li jibdlu l-pi ż ta' ċerti tessuti. Madankollu, 
ir-rispons g ħat-tkabbir ta' bosta tessuti fl-istess ħin isostni mekkani żmu 
iktar spe ċifiku għall-androġen. Pereżempju, do żi għoljin ta' estro ġeni 
qawwijin jistg ħu jżidu l-piż tal-infafet seminali; madankollu, it-tessuti 
l-oħrajn li jiddependu fuq l-andro ġen fl-assa ġġ ma jwiġbux b'mod simili. 
Is-sustanzi kimi ċi antiandro ġeniċi jistgħu jaġixxu jew b ħala antagonitsi 
tar-riċetturi andro ġeni jew inibituri ta' 5 α-ridottasi. L-inibituri ta' 5 α- 
ridottasi g ħandhom effett varjabbli, g ħaliex il-konver żjoni għal diidrotes ­
tosteron iktar qawwi tvarja skont it-tessut. L-antiandro ġeni li jinibixxu 5 α 
— ridottasi, b ħal finasterid, g ħandhom effetti li jin ħassu iktar fil-prostata 
ventrali minn tessuti o ħrajn meta mqabblin ma' antagonist AR qawwi, b ħal 
flutamid. Din id-differenza fir-rispons tat-tessut tista' tintu ża biex tin ħareġ 
differenza bejn modi ta' azzjoni medjati b'AR u dawk medjati b'5 α — 
ridottasi. Barra minn hekk, ir-ri ċettur tal-andro ġen huwa relatat fil-livell 
tal-evoluzzjoni ma' dak ta' ormoni tal-isterojdi o ħrajn, u xi ormoni o ħrajn, 
meta jing ħata b'livelli ta' do żaġġ għoljin suprafi żjoloġiċi, jista' jwa ħħal u 
jantagonizza l-effetti tat-TP li jippromwovu t-tkabbir (13). Barra minn hekk, huwa plaw żibbli wkoll li metaboli żmu msaħħaħ tal-isterojdi u t-tnaqqis 
konsegwenti tat-testosteron tas-serum jistg ħu jnaqqsu t-tkabbir tat-tessuti li 
jiddependu fuq l-andro ġen. Għalhekk, kwalunkwe e żitu pożittiv 
fil-Bijoassa ġġ Hershberger normalment g ħandu jiġi evalwat billi jintu ża 
approċċ ta' piż tal-evidenza, inklu żi assaġġi in vitro , bħall-assaġġi vinkolanti 
tal-AR u tar-ri ċetturi tal-estro ġen (ER) u l-assa ġġi ta' attivazzjoni trans ­
krizzjonali korrispondenti, jew minn assa ġġi in vivo  o
ħrajn li je żaminaw 
tessuti simili tal-andro ġen fil-mira b ħall-assaġġ pubertali tal-ir ġiel, l-assa ġġ 
tal-irġiel adulti intatti ta' 15-il jum, jew studji ta' do ża ripetuta ta' 28 jum 
jew 90 jum.  
9. L-esperjenza tindika li andro ġeni ksenobijoti ċi huma iktar rari minn anti ­
androġeni ksenobijoti ċi. Allura huwa mistenni li l-bijoassa ġġ Hershberger 
ser jintuża spiss g ħat-tgħarbil ta' antiandro ġeni. Madankollu, il-pro ċedura 
għall-ittestjar g ħal androġeni xorta wa ħda tista' tkun rakkomandata g ħal 
sustanzi kimi ċi sterojdali jew simili g ħall-isterojdi jew g ħal sustanzi 
kimiċi li għalihom indikazzjoni tal-effetti andro ġeniċi possibbli n ġiebet 
minn metodi li jinsabu fil-Livell 1 jew 2 tal-qafas kun ċettwali (Appendi ċi 
2). B'mod simili, effetti avversi asso ċjati ma' profili (anti)andro ġeniċi jistgħu 
jkunu osservati fl-assa ġġi tal-Livell 5, li jwasslu g ħall-bżonn li jiġi vvalutat 
jekk sustanza kimika toperax permezz ta' mod ta' azzjoni endokrinali.  
10. Huwa rikonoxxut li l-pro ċeduri kollha bba żati fuq l-annimali g ħandhom 
ikunu konformi mal-istandards lokali tal-indukrar tal-annimali; 
id-deskrizzjonijiet tal-indukrar u l-kura stabbiliti hawn ta ħt huma 
standards minimi tal-prestazzjoni, u ser ji ġu sostiwtiti minn regolamenti 
lokali bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal 
skopijiet xjentifi ċi (26). Iktar gwida dwar it-trattament umanitarju 
tal-annimali ting ħata mill-OECD (17).  
11. Bħal fi kwalunkwe bijoassa ġġ li juża annimali sperimentali, g ħandha 
tingħata kunsiderazzjoni attenta g ħall-ħtieġa li jitwettaq dan l-istudju. 
Bażikament, jista' jkun hemm żewġ raġunijiet għal deċiżjoni bħal din:  
— potenzjal ta' esponiment g ħoli (Livell 1 tal-Qafas Kun ċettwali) jew indi ­
kazzjonijiet g ħal (anti)andro ġeniċità f'assa ġġi in vitro  (Livell 2) li 
jappoġġjaw investigazzjonijiet dwar jekk it-tali effetti jistg ħux iseħħu 
in vivo,  
— effetti konsistenti ma' (anti)andro ġeniċità f'testijiet  in vivo  tal-Livell 4 
jew 5 li jsostnu investigazzjonijiet tal-mod ta' azzjoni spe ċifiku, eż., biex 
jiġi determinat jekk l-effetti kinux dovuti g ħal mekkani żmu (anti)andro ­ 
ġeniku.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Id-definizzjonijiet u żati f'dan il-metodu ta' ttestjar jing ħataw fl-Appendi ċi 1. 
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
13. Il-Bijoassa ġġ Hershberger jikseb is-sensittività tieg ħu billi ju ża rġiel bi 
produzzjoni minima ta' andro ġen endoġenu. Dan jinkiseb permezz tal-u żu 
ta' rġiel imsewwijin diment li jing ħata biżżejjed żmien wara t-tiswija biex 
jiġu mmirati tessuti g ħar-rigress lejn pi ż bażi minimu u uniformi. B'hekk, 
meta jsir tg ħarbil tal-attività andro ġenika potenzjali, hemm livelli endo ­ 
ġenużi baxxi ta' andro ġeni ċirkolanti, l-assi ipotalamiku — pitwitarju — 
gonadi ma jibqax kapa ċi jikkumpensa permezz ta' mekkani żmi ta' tag ħlif, 
il-ħila tat-tessuti biex iwie ġbu tkun massimizzata, u l-varjabbiltà tal-pi ż 
tat-tessut tal-bidu ti ġi minimizzata. Meta jsir tg ħarbil ta' attività antiandro ­ 
ġenika potenzjali, tista' tinkiseb żieda iktar konsistenti fil-pi ż tat-tessut meta 
t-tessuti jkunu stimolati permezz ta' andro ġen ta' referenza. B'hekk, 
il-Bijoassa ġġ Hershberger je ħtieġ biss 6 annimali g ħal kull grupp 
tad-doża filwaqt li assi o ħrajn bi rġiel pubertali jew adulti intatti jissu ġ­ 
ġerixxu li jintu żaw 15-il ra ġel f'kull grupp ta' do ża. 
14. It-tiswija ta' firien ir ġiel peripubertali g ħandha ssir b'mod xieraq billi 
jintużaw anasteti ċi u teknika asettika approvati. L-anal ġeżiċi għandhom 
jingħataw fl-ewwel ftit jiem wara l-kirur ġija biex ti ġi eliminata skumdità 
ta' wara l-kirur ġija. It-tiswija ssa ħħaħ il-preċiżjoni tal-assa ġġ biex jinqabdu 
androġeni u antiandro ġeni batuti billi telimina mekkani żmi kompensatorji 
endokrinali ta' rispons pre żenti fl-annimal intatt li jistg ħu jtaffu l-effetti 
tal-androġeni u l-antiandro ġeni mogħtijin u billi ti ġi eliminata l-varjabbiltà 
kbira bejn l-individwi f'livelli tat-testosteron tas-serum. B'hekk, it-tiswija 
tnaqqas in-numri ta' annimali me ħtieġa li jitg ħarblu għal dawn 
l-attivitajiet endokrinali.  
15. Meta jsir tg ħarbil għal attività andro ġenika potenzjali, is-sustanza kimika 
tat-test ting ħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima ta ħt il-ġilda (sc) 
għal perjodu ta' g ħaxart ijiem konsekuttivi. Is-sustanzi kimi ċi tat-test 
jingħataw lil tal-inqas żewġ gruppi tal-kura ta' annimali sperimentali li 
jużaw livell wie ħed ta' doża għal kull grupp. L-annimali huma nekropsjati 
madwar 24 sieg ħa wara l-a ħħar doża. Żieda statistikament sinifikanti f' żewġ 
piżijiet ta' organi fil-mira jew iktar tal-gruppi tas-sustanzi kimi ċi tat-test 
imqabblin mal-grupp ta' kontroll veikolu tindika li s-sustanza kimika tat-test hija po żittiva għal attività andro ġenika potenzjali (Ara l-paragrafu 
60). L-andro ġeni, bħal trenbolon, li ma jistax ikun 5 α — ridott g ħandhom 
effetti li jin ħassu iktar fuq l-LABC u l-GP meta mqabblin mat-TP, i żda 
t-tessuti kollha g ħandhom juru tkabbir mi żjud.
 
16. Meta jsir tg ħarbil għal attività antiandro ġenika potenzjali, is-sustanza kimika 
tat-test ting ħata kuljum permezz ta' gavage orali jew tilqima ta ħt il-ġilda 
għal perjodu ta' g ħaxart ijiem konsekuttivi flimkien ma' do żi kuljum tat-TP 
(0,2 jew 0,4 mg/kg/jum) permezz ta' tilqima sc. Kien determinat fil-programm ta' validazzjoni li 0,2 jew 0,4 mg/kg/jum ta' TP jistg ħu 
jintużaw peress li t-tnejn kienu effettivi fil-qbid ta' antiandro ġeni u, 
għalhekk, do ża waħda biss g ħandha ting ħażel sabiex tintu ża fl-assaġġ. 
Dożi approvati tas-sustanza kimika tat-test jing ħataw lil tal-inqas tliet 
gruppi tal-kura mill-annimali sperimentali billi jintu ża livell ta' do ża 
wieħed għal kull grupp. L-annimali ji ġu nekropsjati madwar 24 sieg ħa 
wara l-aħħar doża. Tnaqqis statistikament sinifikanti f' żewġ piżijiet ta' 
organi fil-mira jew iktar tas-sustanza kimika tat-test flimkien mal-gruppi tat-TP imqabblin mal-grupp ta' kontroll b'TP biss jindika li s-sustanza 
kimika tat-test hija po żittiva għal attività antiandro ġenika potenzjali (Ara 
l-paragrafu 61).
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Għażla tal-ispe ċi u r-razza  
17. Il-far intu ża spiss fil-Bijoassa ġġ Hershberger sa mis-snin tletin. G ħad li 
huwa bijolo ġikament plaw żibbli li kemm il-far kif ukoll il- ġurdien juru 
risponsi simili, fuq il-ba żi ta' 70 sena esperjenza bil-mudell tal-far, il-far 
huwa l-ispe ċi tal-għażla għall-Bijoassa ġġ Hershberger. Barra minn hekk, 
peress li d-dejta tal-Bijoassa ġġ Hershberger tista' tkun preliminari g ħal 
studju pluri ġenerazzjonali fit-tul, dan jippermetti sabiex annimali 
mill-istess spe ċi, razza u sors jintu żaw fiż-żewġ studji.  
18. Dan il-protokoll jippermetti sabiex il-laboratorji jag ħżlu r-razza ta' far li 
għandha tintu ża fl-assaġġ li ġeneralment g ħandha tkun dik u żata stori­
kament mil-laboratorju li jie ħu sehem. Jistg ħu jintużaw ir-razez ta' firien 
tal-laboratorju u żati spiss; madankollu, razez li jimmaturaw ferm wara li 
jgħalqu t-42 jum ma g ħandhomx jintu żaw peress li tiswija ta' dawn l-ir ġiel 
meta jkollhom 42 jum tista' tipprekludi l-kejl tal-pi żijiet tar-ras tal-pene, li 
jista' jsir biss wara li l-prepuzju ji ġi separat mill-korp tal-pene. B'hekk, razez 
li ġejjin mill-far Fisher 344 ma g ħandhomx jintu żaw, ħlief f'każijiet rari. 
Il-far Fisher 344 g ħandu durati differenti tal-fa żijiet tal-iżvilupp sesswali 
meta mqabbel ma' razez o ħrajn użati iktar spiss b ħar-razez Sprague 
Dawley jew Wistar (16). Jekk tintu ża din ir-razza, il-laboratorju g ħandu 
jsewwihom f'età ftit ikbar u g ħandu jkun kapa ċi juri s-sensittività 
tar-razza u żata. Ir-raġuni għall-għażla tar-razza tal-far g ħandha tiġi ddik­
jarata b'mod ċar mil-laboratorju. Meta l-assa ġġ tat-tgħarbil jista' jkun 
preliminari g ħal studju orali b'do ża ripetuta, studju dwar ir-riproduzzjoni 
u l-iżvilupp, jew studju fit-tul, idealment intu żaw annimali mill-istess 
razza u sors fl-istudji kollha.  
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
19. Il-pro ċeduri kollha g ħandhom jikkonformaw mal-istandards lokali kollha 
dwar l-indukrar tal-annimali tal-laboratorju. Dawn id-deskrizzjonijiet ta' 
indukrar u kura huma standards minimi u ser ji ġu sostitwiti minn rego ­
lamenti lokali iktar strin ġenti, bħad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament 
Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal skopijiet xjentifi ċi (26). It-temperatura 
fil-kamra tal-annimali sperimentali g ħandha tkun 22 °C (b'medda ta' 
madwar ± 3 °C). L-umdità relattiva g ħandha tkun tal-inqas 30 % u 
idealment ma g ħandhiex taqbe ż massimu ta' 70 %, minbarra matul 
it-tindif tal-kamra. Il-mira g ħandha tkun umdità relattiva ta' 50-60 %. 
Id-dawl g ħandu jkun artifi ċjali. Is-sekwenza tad-dawl ta' kuljum g ħandha 
tkun ta' 12-il sieg ħa dawl, 12-il sieg ħa dlam.
 
20. It-trobbija f'post fi grupp hija ppreferuta iktar minn i żolament min ħabba 
l-età żgħira tal-annimali u l-fatt li l-firien huma annimali so ċjali. 
It-trobbija fi grupp ta' żewġ jew tliet annimali f'kull ga ġġa tevita ffullar u 
stress asso ċjat li jistg ħu jinterferixxu mal-kontroll ormonali tal-i żvilupp 
tat-tessut a ċċessorju tas-sess. Il-ga ġeġ għandhom jitnaddfu sew biex 
jinteħħew kontaminanti possibbli u ji ġu rranġati b'tali mod li ji ġu mini­
mizzati l-effetti possibbli dovuti g ħall-pożizzjoni tal-ga ġġa. Il-gaġeġ ta' 
daqs xieraq (~2 000 ċentimetru kwadru) ser jevitaw iffullar.  
21. Kull annimal g ħandu jkun identifikat b'mod individwali (e ż., marka jew 
tikketta mal-widna) billi jintu ża metodu umanitarju. Il-metodu ta' identifi ­
kazzjoni g ħandu jiġi rreġistrat.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Id-dieta tal-laboratorju u l-ilma tajjeb g ħax-xorb g ħandhom ji ġu pprovduti  
ad libitum . Il-laboratorju li jag ħmlu l-Bijoassa ġġ Hershberger g ħandhom 
jużaw id-dieta tal-laboratorju li normalment ju żaw fil-ħidma tagħhom ta' 
ttestjar ta' sustanzi kimi ċi. Fl-istudji ta' validazzjoni tal-Bijoassa ġġ, ma 
ġew osservati ebda effett jew varjabbiltà li kienu attribwibbli g ħad-dieta. 
Id-dieta u żata ser ti ġi rreġistrata u g ħandu jinżamm kampjun tad-dieta 
tal-laboratorju g ħal analiżi possibbli fil- ġejjieni.  
Il-kriterji ta' prestazzjoni g ħal piżijiet ta' organi li jiddependi fuq 
androġen 
23. Matul l-istudju ta' validazzjoni, ma kien hemm ebda evidenza li tnaqqis 
fil-piż tal-ġisem affettwa żidiet jew tnaqqisijiet fit-tkabbir tal-pi żijiet 
tat-tessut g ħal tessuti fil-mira (ji ġifieri, li g ħandhom jinti żnu f'dan l-istudju).  
24. Fost ir-razez differenti ta' firien u żati b'suċċess fil-programm ta' vali ­
dazzjoni, il-pi żijiet ta' organi li jiddependi fuq andro ġen huma ikbar 
fir-razez itqal ta' firien meta mqabblin ma' razez e ħfef. Għalhekk, 
il-kriterji ta' prestazzjoni tal-Bijoassa ġġ Hershberger ma jinkludux pi żijiet 
tal-organi assoluti mistennija g ħal kontrolli po żittivi u negattivi.  
25. Peress li l-Koeffi ċjent tal-Varjazzjoni (CV) g ħal tessut g ħandu relazzjoni 
inversa mas-sa ħħa statistika, il-kriterji ta' prestazzjoni tal-Bijassa ġġ 
Hershberger huma bba żati fuq valuri massimi tas-CV g ħal kull tessut 
(Tabella 1). Is-CVs jittie ħdu mill-istudji ta' validazzjoni tal-OECD. Fil-ka ż 
ta' riżultati negattivi, il-laboratorji g ħandhom je żaminaw is-CVs mill-grupp 
ta' kontroll u l-grupp ta' kura b'do ża għolja biex jiddeterminaw jekk 
inqabżux il-kriterji ta' prestazzjoni massimi tas-CV.  
26. L-istudju g ħandu jkun ripetut meta: 1) tlieta jew iktar mill-g ħaxar CVs 
individwali possibbli fil-gruppi ta' kontroll u ta' kura b'do ża għolja jaqbżu 
l-massimi mag ħżulin għal studji ta' agonisti u antagonisti fit-Tabella 1 u 2) 
tal-inqas żewġ tessuti fil-mira kienu mar ġinalment insinifikanti, ji ġifieri, 
valuri ta' ρ bejn 0,05 u 0,10.  
Tabella 1  
CVs massimi awtorizzabbli Determinati g ħat-Tessuti A ċċessorji tas-Sess 
fil-Mira g ħall-mudell imsewwi fl-Istudji ta' Validazzjoni tal-OECD  ( 1 ) 
Tessut Effetti antiandro ġeniċi Effetti andro ġeniċi 
Infafet seminali 40 % 40 % 
Prostata ventrali 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Glandoli ta' Cowper 35 % 55 % 
Ras tal-pene 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Is-CV limitu g ħal tessut partikolari ġie identifikat minn graff ta' valuri tas-CV — irran ġat 
mill-iżgħar b'mod sekwenzjali sal-ikbar — g ħall-mezzi kollha mill-esperimenti kollha 
fl-eżerċizzju ta' validazzjoni billi ntu ża mudell spe ċifiku (agonist jew antagonist). 
Is-CV limitu nqara mill-punt li fih l-inkrementi fin-nofs sal-og ħla CVs li jmiss 
fis-serje huma bil-bosta ikbar mill-ftit CVs ta' qabel — il-“valur kritiku”. Ta' min 
jinnota li g ħad li din l-anali żi identifikat “valuri kriti ċi” relattivament affidabbli g ħall- 
mudell ta' antagonist tal-assa ġġ, il-kurvi tas-CV g ħall-assaġġ ta' agonist uriet żieda iktar 
uniformi sabiex b'hekk, l-identifikazzjoni ta' CV limitu b'dan il-metodu saret kemxejn 
arbitrarja.
 PROĊEDURA  
Konformità regolatorja u verifika tal-laboratorju  
27. Għall-kuntrarju tal-assa ġġ Utertrofiku (Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness), wiri 
tal-konformità tal-laboratorju qabel it-tnedija tal-istudju mhijiex ne ċessarja 
għall-assaġġ Hershberger g ħaliex kontrolli po żittivi (Testosteron Propjonat u 
Flutamid) u negattivi fl-istess ħin isiru b ħala parti integrali tal-assa ġġ. 
In-numru u l-kundizzjoni tal-annimali  
28. Kull grupp ikkurat u tal-kontroll g ħandu jinkludi minimu ta' 6 annimali. 
Dan japplika kemm g ħall-protokoll andro ġeniku kif ukoll antiandro ġeniku.  
Tiswija  
29. Għandu jkun hemm perjodu inizjali ta' akklimatizzazzjoni ta' bosta jiem 
wara r-riċevuta tal-annimali biex ji ġi żgurat li l-annimali huma b'sa ħħithom 
u jikbru sew. Peress li annimali msewwijin qabel ma jg ħalqu 42 jum jew 
il-jum ta' wara t-twelid (pnd) 42 jistg ħu ma jurux separazzjoni prepuzjali, 
l-annimali g ħandhom jissewwew fil-pnd 42 jew wara, u mhux qabel. 
L-annimali jissewwew ta ħt anesteżija billi ssir in ċiżjoni fl-iskrotu u 
jitneħħew iż-żewġ testikoli u l-epididimidi b'ligatura tal-vini tad-demm u 
l-passaġġi seminali. Wara l-konfrma li ma jkun qed hemm l-ebda fsad, 
l-iskrotu g ħandu jing ħalaq b'sutura jew autoclips. L-annimali g ħandhom 
jiġu kkurati b'anal ġeżiċi għall-ewwel ftit jiem wara l-kirur ġija biex tittaffa 
kwalunkwe skumdità ta' wara l-kirur ġija. Jekk l-annimali msewwijin 
jinxtraw minn fornitur tal-annimali, l-età tal-annimali u l-istadju 
tal-maturità sesswali g ħandhom ikunu żgurati mill-fornituri.  
Akklimatizzazzjoni wara t-tiswija  
30. L-annimali g ħandhom ikomplu bl-akklimatizzazzjoni fil-kundizzjonijiet 
tal-laboratorju biex tkun tista' ssir ir-rigressjoni fil-pi żijiet tat-tessut 
fil-mira g ħal tal-inqas 7 ijiem wara t-tiswija. L-annimali g ħandhom ikunu 
osservati kuljum, u kwalunkwe annimal b'evidenza ta' marda jew anormal ­
itajiet fiżiċi għandu jitne ħħa. B'hekk, il-kura permezz ta' bidu tad-do żaġġ 
(fl-istudju) tista' tibda mindu jg ħalqu pnd 49 jum, i żda mhux wara l-pnd 60. 
L-età meta ssir in-nekropsija ma g ħandhiex tkun iktar mill-pnd 70. Din 
il-flessibilità tippermetti sabiex laboratorju jiskeda l- ħidma sperimentali 
b'mod effi ċjenti.  
Piż tal-ġisem u gruppi aleatorji  
31. Id-differenzi fil-pi żijiet tal-ġisem individwali huma sors ta' varjabbiltà 
fil-piżijiet tat-tessut kemm fi ħdan kif ukoll fost gruppi ta' annimali. I ż- 
żieda fil-vjarbabiltà tal-pi ż tat-tessut tirri żulta f'koeffi ċjent 
tal-varjazzjoni (CV) mi żjud u tnaqqas is-sa ħħa statistika tal-assa ġġ 
(kultant imsej ħa s-sensitività tal-assa ġġ). Għalhekk, varjazzjonijiet fil-pi ż 
tal-ġisem għandhom ikunu kkontrollati kemm b'mod sperimentali kif 
ukoll statistiku.  
32. Il-kontroll sperimentali jinvolvi l-produzzjoni ta' varjazzjonijiet żgħar fil-piż 
tal-ġisem fi ħdan u fost il-gruppi ta' studju. L-ewwel nett, annimali żgħar 
jew kbar wisq g ħandhom ji ġu evitati u ma jitqeg ħdux fil-grupp tal-istudju. 
Mal-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni tal-pi ż tal-annimali ma g ħandhiex taqbe ż 
± 20 % tal-pi ż medju (e ż. 175 g ± 35 g g ħal firien peripubertali msew ­
wijin). It-tieni, l-annimali g ħandhom ikunu assenjati fi gruppi (kemm ta' 
kontroll kif ukoll tal-kura) permezz ta' distribuzzjoni tal-pi ż b'mod aleatorju, 
sabiex il-pi ż medju tal- ġisem ta' kull grupp ma jkunx statistikament 
differenti minn xi grupp ie ħor. Il-pro ċedura blokk ta' tqassim aleatorju 
użata għandha tiġi rreġistrata.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Peress li t-tossi ċità tista' tnaqqas il-pi ż tal-ġisem tal-gruppi kkurati 
fir-rigward tal-grupp ta' kontroll, il-pi ż tal-ġisem fl-ewwel jum tal-g ħoti 
tas-sustanza kimika tat-test jista' jintu ża bħala kovarjant statistiku, mhux 
il-piż tal-ġisem fin-nekropsija.  
Dożaġġ 
34. Sabiex ji ġi stabbilit jekk sustanza kimika tat-test jistax ikollha azzjoni 
androġenika  in vivo , żewġ gruppi ta' do ża tas-sustanza kimika tat-test 
flimkien ma' kontrolli po żittivi u veikoli (negattivi) (Ara l-paragrafu 43) 
normalment ikunu bi żżejjed, u g ħalhekk, dan id-disinn huwa ppreferut 
għal raġunijiet ta' benessri tal-annimali. Jekk l-iskop ikun li jew tinkiseb 
kurva ta' rispons g ħad-doża jew li ssir estrapolazzjoni g ħal dożi inferjuri, 
tal-inqas ikun hemm b żonn ta' 3 gruppi ta' do ża. Jekk ikun hemm b żonn ta' 
informazzjoni minbarra identifikazzjoni tal-attività andro ġenika (bħal stima 
tal-potenza), g ħandha tiġi kkunsidrata skeda differenti tad-do żaġġ. Biex 
isiru testijiet g ħal antiandro ġeni, is-sustanza kimika tat-test ting ħata 
flimkien ma' agonist tal-andro ġen ta' referenza. G ħandhom jintu żaw 
tal-inqas 3 gruppi ta' ttestjar b'do żi differenti tas-sustanza kimika tat-test u 
kontroll po żittiv u negattiv (Ara l-paragrafu 44). Ħlief għat-trattament 
bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp ta' kontroll g ħandhom 
jitqandlu bl-istess mod b ħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk jintu ża 
veikolu fl-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp ta' kontroll g ħandu 
jirċievi l-veikolu fl-og ħla volum u żat bil-gruppi tat-test.  
35. Il-livelli kollha ta' do ża għandhom ikunu proposti u jing ħażlu filwaqt li 
tittieħed f'kunsiderazzjoni kwalunkwe dejta (tossiko)kinetika u dwar 
it-tossiċità eżistenti u g ħad-dispożizzjoni għas-sustanza kimika tat-test jew 
materjali relatati. L-ewwel nett, l-og ħla livell ta' do ża għandu jieħu f'kun­
siderazzjoni l-LD  50 u/jew informazzjoni dwar it-tossi ċità akuta sabiex ji ġu 
evitati mewt, tbatija severa jew diffikultà fl-annimali (17)(18)(19)(20) u, it-tieni, jie ħu f'kunsiderazzjoni l-informazzjoni disponibbli dwar id-do żi 
użati fi studji sottokroni ċi u kroni ċi. B'mod ġenerali, l-og ħla doża ma 
għandhiex tikka ġuna tnaqqis fil-pi ż finali tal- ġisem tal-annimali iktar 
minn 10 % tal-pi ż ta' kontroll. L-og ħla doża għandha tkun jew 1) l-og ħla 
doża li tiżgura sopravvivenza tal-annimali u li hija ming ħajr tossiċità jew 
diffikultà importanti g ħall-annimali wara 10 ijiem konsekuttivvi ta' g ħoti sa 
doża massima ta' 1 000 mg/kg/jum (Ara l-paragrafu 36) jew 2) do ża li 
tinduċi effetti (anti)andro ġeniċi, skont liema tkun l-inqas. G ħat-tgħarbil, 
intervalli kbar, e ż. unitajiet ta' nofs log (li jikkorrispondu g ħal progressjoni 
tad-doża ta' 3,2) jew anki unitajiet ta' log wa ħda, bejn do żaġġi ġeneralment 
huma aċċettabbli. Jekk ma hemm ebda dejta xierqa disponibbli, jista' jsir 
studju ta' sejbien tal-medda (Ara l-paragrafu 37) biex jg ħin 
fid-determinazzjoni tad-do żi li għandhom jintu
żaw. 
Livell tad-do ża ta' limitu  
36. Jekk test fid-do ża ta' limitu ta' 1 000 mg/kg pi ż tal-ġisem/jum u do ża inqas 
li juża l-proċeduri deskritti g ħal dan l-istudju jonqos milli jipprodu ċi bidla 
statistikament sinifikanti fil-pi żijiet tal-organi riproduttivi, f'dak il-ka ż, livelli 
addizzjonali ta' do żi jistgħu jitqiesu mhux ne ċessarji. Id-do ża ta' limitu 
tapplika ħlief meta dejta dwar esponiment tal-bniedem tindika l-b żonn li 
jintuża livell ta' do ża ogħla. 
Kunsiderazzjonijiet g ħas-sejba tal-medda  
37. Jekk ikun hemm b żonn, jista' jsir studju preliminari ta' sejbien tal-medda bi 
ftit annimali sabiex jing ħażlu gruppi ta' do ża xierqa [billi jintu żaw metodi 
għall-ittestjar tat-tossi ċità akuta (Kapitoli B.1 bis, B.1 tris ta' dan l-Anness 
(27), TG tal-OECD Nru 425 (19))]. L-g ħan fil-ka ż tal-Bijoassa ġġ 
Hershberger huwa li jag ħżel dożi li jiżguraw sopravvivenza tal-annimali u 
li huma ħielsa minn tossi ċità jew diffikultà importanti g ħall-annimali wara  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
għaxart ijiem konsekuttivi ta' g ħoti tas-sustanza kimika sa do ża limitu ta' 
1 000 mg/kg/jum kif stipulat fil-paragrafi 35 u 36. F'dan ir-rigward jista' 
jintuża Dokument Gwida tal-OECD (17) li jiddefinixxi sinjali klini ċi li 
jindikaw tossi ċità jew diffikultà fl-annimali. Jekk fattibbli fi ħdan dan 
l-istudju ta' sejbien tal-medda wara g ħaxart ijiem ta' g ħoti, it-tessuti 
fil-mira jistg ħu jinqatg ħu u jintiżnu madwar 24 sieg ħa wara li ting ħata 
l-aħħar doża. Imbagħad din id-dejta tkun tista' tintu ża biex tg ħin fl-għażla 
tad-dożi fl-istudju ewlieni.  
Sustazi kimi ċi ta' referenza u veikolu  
38. L-agonist tal-andro ġen ta' referenza g ħandu jkun Testosteron 
Propjonat (TP), Nru tas-CAS 57-82-5. Id-do żaġġ ta' referenza tat-TP jista' 
jkun jew 0,2 mg/kg-bw/jum jew inkella 0,4 mg/kg-bw/jum. L-antagonist tal-androġen ta' referenza g ħandu jkun Flutamid (FT), Nru tas-CAS 1311- 
84-7. Id-do żaġġ ta' referenza tal-FT g ħandu jkun ta' 3 mg/kg-bw/jum, u 
l-FT għandu jing ħata flimkien mad-do żaġġ ta' referenza tat-TP.
 
39. Huwa rakkomandat li, kull fejn ikun possibbli, l-ewwel ji ġi kkunsidrat l-u żu 
ta' soluzzjoni milwiema/sospensjoni. Madankollu, peress li ħafna ligandi 
tal-androġeni jew il-prekursuri metaboli ċi tagħhom għandhom it-tendenza 
li jkunu idrofobi ċi, l-iktar appro ċċ komuni huwa li tintu ża soluzzjoni/sos ­
pensjoni fi ż-żejt (eż. żejt tal-qam ħirrun, tal-karawett, tal- ġunġlien jew ta ż- 
żebbuġ). Is-sustanzi kimi ċi tat-test jistg ħu jinħallu f'ammont minimu ta' 
95 % etanol jew solventi xierqa o ħrajn u jiġu dilwiti f'kon ċentrazzjonijiet 
ta' użu finali fil-veikolu tat-test. Il-karatteristi ċi tossiċi tas-solvent g ħandhom 
ikunu mag ħrufin, u g ħandhom ikunu ttestjati fi grupp ta' kontroll separat 
b'solvent biss. Jekk is-sustanza kimika tat-test titqies stabbli, tista' tintu ża 
azzjoni mekkanika ħafifa ta' tis ħin u b'sa ħħitha biex tg ħin ħalli tinħall 
is-sustanza kimika tat-test. G ħandha ti ġi determinata l-istabbiltà 
tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. Jekk is-sustanza kimika tat-test 
hija stabbli g ħad-durata tal-istudju, ikun jista' jit ħejja alikwot tal-bidu 
tas-sustanza kimika tat-test, u d-dilwizzjonijiet spe ċifikati tad-do żaġġ ippre­
parati ta' kuljum b'attenzjoni biex ji ġu evitati kontaminazzjoni u ħela 
tal-kampjuni.  
L-għoti tad-do żi 
40. It-TP g ħandu jing ħata permezz ta' tilqima ta ħt il-ġilda, u l-FT permezz ta' 
gavage orali.  
41. Is-sustanza kimika tat-test ting ħata permezz ta' gavage orali jew tilqima ta ħt 
il-ġilda. Kunsiderazzjonijiet dwar il-benessri tal-annimali u l-proprjetajiet 
fiżiċi/kimiċi tas-sustanza kimika tat-test iridu jitqiesu meta ting ħażel 
ir-rotta tal-amministrazzjoni. Barra minn hekk, g ħandhom jittie ħdu f'kun­
siderazzjoni aspetti tossikolo ġiċi bħar-relevanza g ħar-rotta ta' esponiment 
tal-bniedem g ħas-sustanza kimika (e ż. gavage orali biex ti ġi simulata 
inġestjoni, tilqima ta ħt il-ġilda biex ji ġi simulat te ħid man-nifs jew adsor ­
biment dermali) u informazzjoni tossikolo ġika eżistenti u dejta dwar 
il-metaboli żmu u l-kinetika (e ż. il-bżonn li jiġi evitat metaboli żmu first 
pass, effi ċjenza aħjar b'rotta partikolari) qabel ma jinbeda ttestjar estensiv 
fit-tul, jekk jinkisbu ri żultati pożittivi permezz tat-tilqima.  
42. L-annimali g ħandhom jing ħataw doża bl-istess mod u sekwenza ta' ħin għal 
għaxart ijiem konsekuttivi b'intervalli ta' madwar 24 sieg ħa. Il-livell 
ta'dożaġġ għandu jiġi aġġustat kuljum fuq il-ba żi tal-kejl konkurrenti ta' 
kuljum tal-pi ż tal-ġisem. Il-volum tad-do ża u l-ħin li ting ħata għandu jiġi 
rreġistrat f'kull jum ta' esponiment. G ħandha ting ħata attenzjoni sabiex ma 
tinqabiżx id-doża massima deskritta fil-paragrafu 35 biex tkun tista' ssir 
interpretazzjoni valida tad-dejta. Tnaqqis fil-pi ż tal-ġisem, sinjali klini ċi u 
sejbiet o ħrajn għandhom ji ġu vvalutati f'dettall f'dan ir-rigward. G ħal 
gavage orali, g ħandhom jintu żaw tubu tal-istonku jew cannula xierqa ta' 
intubazzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jing ħata f'darba  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. G ħandhom ikunu segwiti l-linji 
gwida lokali dwar l-indukrar tal-annimali, i żda l-volum ma g ħandux 
jaqbeż il-5 ml/kg pi ż tal-ġisem, ħlief fil-ka ż ta' soluzzjonijiet milwiema 
fejn jista' jintu ża 10 ml/kg pi ż tal-ġisem. Għal tilqimiet ta ħt il-ġilda, 
id-dożi għandhom jing ħataw fir-re ġjuni dorsoskapulari u/jew lombari 
permezz ta' labra sterili (e ż. ħxuna ta' 23 jew 25) u siringa tuberkulina. 
It-tqaxxir tas-sit tat-tilqima huwa fakultattiv. G ħandhom ji ġu rreġistrati 
kwalunkwe telf, tnixxija fis-sit tat-tilqima jew do żaġġ inkomplut. Il-volum 
totali injettat lil kull far kuljum ma g ħandux jaqbe ż iż-0,5 ml/kg pi ż 
tal-ġisem.  
Proċeduri spe ċifiċi għal agonisti tal-andro ġen 
43. Għat-test għal agonisti tal-andro ġen, il-veikolu huwa l-kontroll negattiv, u 
l-grupp ikkurat b'TP huwa l-kontroll po żittiv. L-attività bijolo ġika 
konsistenti ma' agonisti tal-andro ġen hija ttestjata bl-g ħoti ta' sustanza 
kimika tat-test lil gruppi tal-kura bid-do żi magħżulin għal 10 ijiem konse ­
kuttivi. Il-pi żijiet tal- ħames tessuti a ċċessorji tas-sess mill-gruppi 
tas-sustanza kimika tat-test jitqabblu mal-grupp veikolu g ħal żidiet statis ­
tikament importanti fil-pi ż. 
Proċeduri spe ċifiċi għal antagonisti tal-andro ġen u inibituri ta' 5 α- 
ridottasi  
44. Għat-test għal antagonisti tal-andro ġe u inibituri ta' 5 α-ridottasi, il-grupp 
ikkurat b'TP huwa l-kontroll negattiv, u l-grupp koamministrat bid-do żi 
ta' referenza tat-TP u l-FT huwa l-kontroll po żittiv. L-attività bijolo ġika 
konsistenti ma' antagonisti tal-andro ġen u inibituri ta' 5 α-ridottasi hija 
ttestjata billi ting ħata doża ta' referenza ta' TP u bl-g ħoti tas-sustanza 
kimika tat-test g ħal 10 ijiem konsekuttivi. Il-pi żijiet tal-ħames tessuti 
aċċessorji tas-sess mit-TP flimkien mal-gruppi tas-sustanza kimika tat-test 
jitqabblu mal-grupp ta' referenza b'TP biss g ħal tnaqqisijiet statistikament 
sinifikanti fil-pi żijiet. 
OSSERVAZZJONIJIET  
Osservazzjonijiet klini ċi 
45. Osservazzjonijiet klini ċi ġenerali għandhom isiru tal-inqas darba kuljum u 
b'mod iktar spiss meta jkunu osservati sinjali ta' tossi ċità. Idealment, 
l-osservazzjonijiet g ħandhom isiru fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li 
jiġi kkunsidrat il-perjodu tal-og ħla effetti anti ċipati wara d-do żaġġ. 
L-annimali kollha g ħandhom ji ġu osservati g ħall-mortalità, il-morbidità u 
sinjali klini ċi ġenerali b ħal bidlet fl-im ġiba, il-ġilda, il-pil, l-g ħajnejn, 
il-membrani muku żi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u 
l-attività awtonomika (e ż. dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal- ħabba, mudell 
respiratorju mhux tas-soltu).  
46. Kwalunkwe annimal li jinstab mejjet g ħandu jitne ħħa u jiġi dispost 
mingħajr anali żi ulterjuri tad-dejta. Kwalunkwe mortalità tal-annimali 
qabel in-nekropsija g ħandha tkun inklu ża fir-reġistru tal-istudju ma' 
kwalunkwe ra ġuni apparenti g ħall-mortalità. Kwalunkwe annimal 
moribond g ħandu jinqatel b'mod dinjitu ż. Kwalunkwe annimal moribond 
li mbagħad jiġi ewtanizzat g ħandu jkun inklu ż fir-reġistru tal-istudju 
bir-raġunijiet apparenti g ħall-morbidità.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel  
47. L-annimali kollha g ħandhom jinti żnu kuljum sal-eqreb 0,1 g, b'bidu e żatt 
qabel ma tinbeda l-kura, ji ġifieri meta -annimali jitqassmi fi gruppi. B ħala 
kejl fakultattiv, l-ammont ta' ikel ikkonsmat matul il-perjodu tal-kura jista' jitkejjel skont kull ga ġġa billi jinti żnu dawk li jitg ħalfu. Ir-ri żultati 
tal-konsum tal-ikel g ħandhom jing ħataw fi grammi g ħal kull far kull jum.
 
Dissezzjoni u kejl tal-pi żijiet tat-tessuti u tal-organi  
48. Madwar 24 sieg ħa wara l-a ħħar għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-firien 
għandhom ji ġu ewtanizzati u żvinati skont il-pro ċeduri normali tal-kondotta 
fil-laboratorju, u g ħandha ssir in-nekropsija. Il-metodu ta' qtil dinjitu ż 
għandu jiġi rreġistrat fir-rapport tal-laboratorju.  
49. Idealment, l-ordni ta' nekropsija g ħandha tkun aleatorja fost il-gruppi biex 
tiġi evitata progressjoni direttament 'il fuq jew 'l isfel ta' gruppi ta' do ża li 
tista' taffettwa d-dejta. Kwalunkwe sejba fin-nekropsija, ji ġifieri bidliet pato ­
loġiċi/leżjonijiet vi żibbli għandha titni żżel u tiġi rreġistrata.  
50. Il-ħames tessuti li jiddependu fuq l-andro ġen (VP, SV, LABC, COW, GP) 
għandhom jinti żnu. Dawn it-tessuti g ħandhom jinqatg ħu, jitraqqmu bi 
preċiżjoni mit-tessut u x-xa ħam imqabbad żejjed, u g ħandhom ji ġu deter­
minati l-pi żijiet friski (mhux fissati) tag ħhom. Kull tessut g ħandu jitqandel 
b'attenzjoni partikolari biex ji ġi evitat it-telf ta' fluwidi u biex ti ġi evitata 
desikkazzjoni, li tista' tintrodu ċi żbalji importanti u varjabbiltà billi jitnaqqsu 
l-piżijiet irreġistrati. Ħafna mit-tessuti jistg ħu jkunu żgħar ħafna jew diffi ċli 
wisq biex issirilhom dissezzjoni, u dan ser jintrodu ċi varjabbiltà. G ħalhekk, 
importanti li l-persuni li jag ħmlu d-dissezzjoni tat-tessuti a ċċessorji tas-sess 
ikunu mid ħla tal-pro ċeduri standard ta' dissezzjoni g ħal dawn it-tessuti. 
Manwal tal-pro ċedura standard tal-operazzjoni (SOP) g ħad-dissezzjoni 
huwa disponibbli mill-OECD (21). Ta ħriġ attent skont il-gwida dwar 
l-SOP ser inaqqas sors potenzjali ta' varjazzjoni fl-istudju. Idealment, 
l-istess prosettur g ħandu jkun responsabbli g ħad-dissezzjoni ta' tessut parti ­
kolari biex ji ġu eliminati differenzi bejn individwi fl-ippro ċessar tat-tessuti. 
Jekk dan ma jkunx possibbli, in-nekropsija g ħandha titfassal b'tali mod li 
kull prosettur jag ħmel dissezzjoni ta' tessut partikolari mill-gruppi tal-kura 
kollha u mhux g ħal individwu wie ħed li jag ħmel dissezzjoni tat-tessuti 
kollha minn grupp ta' kontroll, filwaqt li ħaddieħor ikun responsabbli 
għall-grupp ikkurat. Kull tessut a ċċessorju tas-sess g ħandu jinti żen 
mingħajr tnixxif sal-eqreb 0,1 mg, u l-pi żijiet iridu ji ġu rreġistrati għal 
kull annimali.  
51. Ħafna mit-tessuti jistg ħu jkunu żgħar ħafna jew diffi ċli wisq biex issir 
dissezzjoni tag ħhom, u dan ser jintrodu ċi varjabbiltà. Ħidma fl-img ħoddi 
indikat medda ta' koeffi ċjent tal-varjazzjonijiet (CVs) li donnu jvarja fuq 
il-bażi tal-profi ċjenza tal-laboratorju. Fi ftit ka żijiet, fi ħdan laboratorju 
partikolari ġew osservati differenzi kbar fil-pi żijiet assoluti tat-tessuti 
bħall-VP u s-COWS.  
52. Il-kejl ta' fwied, kilwa f'par u adrenali f'par huwa fakultattiv. Mill- ġdid, 
it-tessuti g ħandu jitne ħħilhom kwalunkwe fascia u xa ħam imqabbad 
magħhom. Il-fwied g ħandu jinti żen u jiġi rreġistrat sal-eqreb 0,1 g u 
l-kliewi f'par u l-adrenali f'par g ħandhom jinti żnu u jiġu rreġistrati 
sal-eqreb 0,1 mg. Il-fwied, il-kilwa u l-adrenali mhumiex influwenzati 
minn andro ġeni biss; jipprovdu wkoll ħjiliet utli ta' tossi ċità sistemika.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Il-kejl tal-ormon luteinizzanti tas-serum (LH), l-orom li jistimola 
l-follikoli (FSH) u t-testosteron (T) huwa fakultattiv. Il-livelli tas-serum T 
huma utli biex ji ġi determinat jekk is-sustanza kimika tat-test tindu ċix meta­
boliżmu tal-fwied ta' testosteron, li jbaxxi l-livelli tas-serum. Ming ħajr 
id-dejta T, effett b ħal dan jista' jidher li ġej minn mekkani żmu antiandro ­ 
ġeniku. Il-livelli tal-LH jipprovdu informazzjoni dwar il- ħila ta' anti ­
androġenu sabiex mhux biss jonqsu l-pi żijiet tal-organi, i żda anki sabiex 
tiġi affettwata l-funzjoni ipotalamika-pitwitarja, li fi studji fit-tul tista' 
tinduċi tumuri fit-testikoli. L-FSH huwa ormon importanti g ħall-isper­
matoġenesi. Is-serum T4 u T3 huma kejl fakultattiv ukoll li jipprovdi 
informazzjoni supplimentari utli dwar il- ħila li tiġi interrotta omeosta żi 
tal-orom tat-tirojde. Jekk ser isiru l-kejliet tal-oromon, il-firien g ħandhom 
jiġu anestetizzati qabel in-nekropsija u g ħandu jittie ħed id-demm permezz 
ta' titqiba kardijaka, u l-metodu tal-aneste żija għandu jing ħażel b'attenzjoni 
sabiex ma jaffettwax il-kejl tal-ormon. Il-metodu tat-t ħejjija tas-serum, 
is-sors tar-radjuimmunoassa ġġ jew kits o ħrajn ta' kejl, il-pro ċeduri analiti ċi, 
u r-riżultati għandhom ji ġu rreġistrati. Il-livelli tal-LH g ħandhom ji ġu rrap­
portati bħala ng għal kull ml serum, u l-livell ta' T g ħandu jiġi rrapportat 
ukoll bħala ng għal kull ml serum.  
54. Id-dissezzjoni tat-tessuti hija deskritta kif ġej bi gwida dettaljata ta' 
dissezzjoni b'ritratti ppubblikati b ħala materjali supplementari b ħala parti 
mill-programm ta' validazzjoni (21). Hemm ukoll vidjo ta' dissezzjoni għad-dispożizzjoni mill-pa ġna fuq il-web tal-Korea Food and Drug Admin ­
istration (22).
 
— Bil-wi ċċ ventrali tal-annimal i ħares 'il fuq, ara jekk il-prepuzju tal-pene 
isseparax mir-ras tal-pene. Jekk iva, imbag ħad daħħal lura l-prepuzju u 
neħħi r-ras tal-pene, i żen (sal-eqreb 0,1 mg), u rre ġistra l-piż, 
— Iftaħ il-ġilda u l-ħajt tal-addome, biex tesponi l-vixxri. Jekk l-organi 
fakultattivi jinti żnu, neħħi u iżen il-fwied sal-eqreb 0,1 g, ne ħħi 
l-istonku u l-intestini u i żen il-kliewi f'par u l-adrenali f'par sal-eqreb 
0,1 mg. Din id-dissezzjoni tesponi l-apparat tal-urina u tibda 
d-dissezzjoni tat-tessuti a ċċessorji fil-mira tar-ra ġel, 
— Biex tag ħmel dissezzjoni tal-VP, issepara l-apparat tal-urina mis-saff 
tal-muskolu ventrali billi taqta' t-tessut konnettiv tul il-linja tan-nofs. 
Ċaqlaq l-apparat tal-urina lura lejn in-nuffati seminali (SV), biex 
tikxef il-lobi tax-xellug u tal-lemin tal-prostata ventrali (miksija b'saff xaħam). Bil-mod i ġbed ix-xa ħam mil-lobi tal-lemin u tax-xellug tal-VP. 
Bir-reqqa ċaqlaq il-lobu tal-lemin tal-VP mill-uretra u ag ħmel 
dissezzjoni tal-lobu mill-uretra. Filwatq li tibqa' żżomm il-lobu 
tal-lemin tal-VP, bil-mod ċaqlaq il-lobu tax-xellug tal-VP mill-uretra u 
mbagħad agħmel dissezzjoni; i żen sal-eqreb 0,1 mg u rre ġistra l-piż,
 
— Biex tag ħmel dissezzjoni tal-SVCG, ċaqlaq l-apparat tal-urina lejn 
id-denb, biex tesponi l-vas deferens u l-lobi tal-lemin u tax-xellug 
tan-nuffati seminali flimkien mal-glandoli koagulanti (SVCG). Evita tnixxija ta' fluwidu billi ssodd b'emostata fil-ba żi tal-SVCGs, fejn 
il-vas deferens jing ħaqad mal-uretra. Bil-mod ag ħmel dissezzjoni 
tal-SVCGs, bl-emostata f'postha ne ħħi x-xaħam u l-adnexa, qieg ħed 
f'użin tat-tara, ne ħħi l-emostata, u i żen sal-eqreb 0,1 mg u rre ġistra l-piż,
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Biex tag ħmel dissezzjoni tal-muskoli reffieg ħa bulbokavernosi ani 
plus (LABC), il-muskoli u l-ba żi tal-pene ji ġu esposti. Il-muskoli LA 
jiksu l-kolon, filwaqt li l-muskoli anterjuri tal-LA u l-BC jaqbdu mal-basal tal-pene. Il- ġilda u l-adnexa mir-re ġjuni perianali li jestendi 
mill-bażi tal-pene sat-tarf anterjuri tal-anus jitne ħħew. Il-muskoli tal-BC 
jiġu dissezzjonati b'mod gradwali mill-basla u t-tessuti tal-pene. Il-kolon 
tinqata' fi tnejn u, l-LABC s ħaħ jistgħu jiġu dissezzjonati u jitne ħħew. 
L-LABC g ħandu jitne ħħilhom ix-xa ħam u l-adnexa, jinti żnu sal-eqreb 
0,1 mg, u ji ġi rreġistrat il-pi ż tagħhom,
 
— Wara li jitne ħħew l-LABC, il-glandoli ttondjati ta' Cowper jew 
bulboretrali (COW) isiru vi żibbli fil-ba żi ta', u ftit dorsali g ħal, basal 
tal-pene. Hemm b żonn li ssir dissezzjoni bir-reqqa biex ji ġi evitat milli 
tintlaqat il-kapsula rqiqa ħalli tiġi evitata tnixxija ta' fluwidi. I żen 
is-COW f'par sal-eqreb 0,1 mg, u rre ġistra l-piż, 
— Barra minn hekk, jekk jintilef fluwidu minn xi glandola matul 
in-nekropsija u d-dissezzjoni, dan g ħandu jiġi rreġistrat.  
55. Jekk l-evalwazzjoni ta' kull sustanza kimika tkun te ħtieġ nekropsija ta' iktar 
annimali minn dak li huwa ra ġonevoli g ħal jum wie ħed, il-bidu tal-istudju 
jista' jkun imxekkel g ħal jumejn konsekuttivi, u dan jirri żulta fix-xekkil 
tan-nekropsija u l- ħidma relatata g ħal jumejn. Jekk ikun hemm xekkil 
bħal dan, g ħandhom jintu żaw nofs l-annimali g ħal kull grupp tal-kura 
kull jum.  
56. Għandha ssir dispo żizzjoni b'mod xieraq tal-karkassi wara n-nekropsija.  
RAPPORTAR  
Dejta  
57. Id-dejta g ħandha tiġi rrapportata b'mod individwali (ji ġifieri l-piż tal-ġisem, 
il-piżijiet tat-tessut a ċċessorju tas-sesss, kejliet fakultattivi u risponsi u 
osservazzjonijiet o ħrajn) u g ħal kull grupp ta' annimali (medji u 
devjazzjonijiet standard ta' kull kejl me ħud). Id-dejta g ħandha tin ġabar 
fil-qosor f'forma ta' tabella. Id-dejta g ħandha turi n-numru ta' annimali 
fil-bidu tat-test, in-numru ta' annimali misjubin mejtin matul it-test jew misjubin li qed juru sinjali ta' tossi ċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossi ċità 
osservati, inklu żi l-ħin tal-bidu, id-durata u s-severità.
 
58. Rapport finali g ħandu jinkludi:  
Faċilità tal-ittestjar  
— Isem il-fa ċilità, il-post,  
— Id-direttur tal-istudju u persunal ie ħor u r-responsabilitajiet ta' studju 
tiegħu, 
— Id-dati li fihom beda u ntemm l-istudju, ji ġifieri l-ewwel jum tal-g ħoti 
tas-sustanza kimika tat-test u l-a ħħar jum ta' nekropsija, rispettivament.  
Sustanza kimika tat-test  
— Is-sors, in-numru tal-lott, l-identità, il-purità, l-indirizz s ħiħ tal-fornitur u 
l-karatterizzazzjoni tas-sustanza/i kimika/kimi ċi, 
— L-għamla fiżika u, fejn rilevanti, il-proprjetajiet fi żjokimiċi, 
— Il-kundizzjonijiet ta' ħżin u l-metodu u l-frekwenza tal-preparazzjoni 
tad-dilwizzjoni,  
— Kwalunkwe dejta ġġenerata fuq l-istabbiltà,  
— Kwalunkwe anali żi tas-soluzzjonijiet/sospensjonijiet tad-do żaġġ. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Veikolu  
— Il-karatterizzazzjoni tal-veikolu (identità, fornitur u Nru tal-lott),  
— Ġustifikazzjoni tal-g ħażla tal-veikolu (jekk mhuwiex ilma).  
Annimali tat-test u pro ċeduri ta' trobbija tal-annimali  
— L-ispe ċi/ir-razza u żata u r-ra ġuni għall-għażla, 
— Is-sors jew il-fornitur tal-annimali, inklu ż l-indirizz s ħiħ, 
— In-numru u l-età tal-annimali forniti,  
— Il-kundizzjonijiet fil-post tat-trobbija (temperatura, dawl, u l-bqija),  
— Id-dieta (isem, tip, fornitur, numru tal-lott, kontenut u, jekk mag ħrufin, 
il-livelli ta' fitoestro ġeni), 
— Il-bejta (isem, tip, fornitur, kontenut),  
— Il-kundizzjonijiet fil-ga ġeġ u n-numru ta' annimali f'kull ga ġġa. 
Kundizzjonijiet tal-Assa ġġ 
— L-età tat-tiswija u d-durata tal-akklimatizzazzjoni wara t-tiswija,  
— Il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tal-istudju (sal-eqreb 0,1 g),  
— Il-pro ċess ta' tqassim aleatorju u rekord tal-assenjament g ħal veikolu, 
referenza, gruppi tas-sustanza kimika tat-test, u ga ġeġ, 
— Devjazzjoni medja u standard tal-pi żijiet tal-ġisem għal kull grupp g ħal 
kull jum li jinti żnu fih tul l-istudju kollu,  
— Ir-raġuni għall-għażla tad-doża, 
— Ir-rotta tal-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u r-ra ġuni għall- 
għażla tar-rotta ta' esponiment,  
— Jekk assa ġġ għall-antiandro ġeniċità, it-trattament bit-TP (do ża u volum),  
— It-trattament bis-sustanza kimika tat-test (do ża u volum),  
— Il-ħin tad-dożaġġ, 
— Il-pro ċeduri tan-nekropsija, inklu żi mezzi ta' żvinar u kwalunkwe 
anesteżija, 
— Jekk isiru anali żijiet tas-serum, g ħandhom ji ġu pprovduti dettalji dwar 
il-metodu. Pere żempju, jekk tintu ża l-RIA, g ħandhom ji ġu rrapportati 
l-proċedura tal-RIA, is-sors tal-kits tal-RIA, id-dati ta' skadenza tal-kits, 
il-proċedura għall-għadd tax-xintillar, u l-istandardizzazzjoni.  
Riżultati  
— L-osservazzjonijiet ta' kuljum g ħal kull annimal matul id-do żaġġ, 
inklużi: 
— Il-piżijiet tal-ġisem (sal-eqreb 0.1 g),  
— Is-sinjali klini ċi (jekk ikun hemm),  
— Kwalunkwe kejl jew noti ta' konsum tal-ikel.  
— L-osservazzjonijiet fin-nekropsija g ħal kull annimal, inklu żi: ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— Id-data tan-nekropsija,  
— Il-grupp tal-kura tal-annimali,  
— L-ID tal-annimali,  
— Il-prosettur,  
— Il-ħin tal-ġurnata li fih isiru n-nekropsija u d-dissezzjoni,  
— L-età tal-annimali,  
— Il-piż tal-ġisem finali fin-nekropsija, filwaqt li ji ġu osservati kwalunkwe 
żieda jew tnaqqis statistikament sinifikanti,  
— L-ordni tal-i żvinar u d-dissezzjoni tal-annimali fin-nekropsija,  
— Il-piżijiet tal-ħames tessuti fil-mira li jiddependu fuq l-andro ġen: 
— Il-prostata ventrali (sal-eqreb 0,1 mg),  
— In-nuffati seminali flimkien mal-glandoli koagulanti, inklu ż fluwidu 
(f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),  
— Il-kumpless tal-muskolu reffieg ħ bulbokavernosu ani plus (sal-eqreb 0.1 
mg), 
— Il-glandoli ta' Cowper (pi ż frisk — f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),  
— Ir-ras tal-pene (pi ż frisk sal-eqreb 0,1 mg);  
— Il-piżijiet tat-tessuti fakultattivi, jekk isiru:  
— Il-fwied (sal-eqreb 0,1 g),  
— Il-kilwa (f'pari, sal-eqreb 0,1 mg),  
— Adrenali (f'pari, sal-eqreb 0,1 mg);  
— Rimarki u kummenti ġenerali,  
— Analiżijiet tal-ormoni tas-serum, jekk isiru.  
— Serum LH (fakultattiv — ng g ħal kull ml serum), u  
— Serum T (fakultattiv — ng g ħal kull ml serum);  
— Rimarki u kummenti ġenerali.  
Sommarju tad-dejta  
Id-dejta g ħandha tin ġabar f'sommarju f'forma ta' tabella li jkun fiha d-daqs 
tal-kampjun g ħal kull grupp, il-medja tal-valur, u l-i żball standard 
tad-devjazzjoni medja jew standard. It-tabelli g ħandhom jinkludu pi żijiet 
tal-ġisem fin-nekropsija, il-bidliet fil-pi ż tal-ġisem mill-bidu tad-do żaġġ 
san-nekropsija, il-pi żijiet tat-tessuti a ċċessorji tas-sess fil-mira, u 
kwalunkwe pi ż fakultattiv ta' organi.  
Diskussjoni tar-ri żultati  
Analiżi tar-riżultati  
59. Il-pi żijiet tal-ġisem u l-organi fin-nekropsija g ħandhom ji ġu analizzati b'mod 
statistiku g ħal karatteristi ċi bħall-omoġenità tal-varjanza bi trasform ­
azzjonijiet xierqa tad-dejta kif ikun hemm b żonn. Il-gruppi tal-kura 
għandhom jitqabblu ma' grupp ta' kontroll billi jintu żaw tekniki b ħal 
ANOVA segwiti minn tqabbil bejn pari (e ż. it-test ‘one tailed’ ta' 
Dunnett) u l-kriterju g ħad-differenza statistika, pere żempju, p ≤ 0,05. 
Dawk il-gruppi li jiksbu importanza statistika g ħandhom ji ġu identifikati. 
Madankollu, pi żijiet ta' “organi relattivi” g ħandhom ji ġu evitati min ħabba 
s-suppożizzjonijiet statisti ċi invalidi li jinsabu fil-qalba ta' din 
il-manipulazzjoni tad-dejta.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Għall-agoniżmu tal-andro ġen, il-kontroll g ħandu jkun il-grupp tat-test 
b'veikolu biss. Il-karatteristi ċi tal-mod ta' azzjoni ta' sustanza kimika 
tat-test jistg ħu jwasslu g ħal risponsi relattivi differenti bejn it-tessuti, 
pereżempju trenbolon, li ma jistg ħux ikunu 5 alfa-ridotti, g ħandu effetti li 
jinħassu iktar fuq l-LABC u l-GP meta mqabbel mat-TP. Żieda statis ­
tikament importanti (p ≤ 0,05) fi kwalunkwe tnejn jew iktar mill- ħames 
piżijiet tat-tessuti fil-mira li jiddependu fuq andro ġen (VP, LABC, GP, 
CG u SVCG) g ħandha titqies ri żultat ta' agonist tal-andro ġen pożittiv, u 
t-tessuti kollha fil-mira g ħandhom juru xi graad ta' tkabbir mi żjud. Eval ­
wazzjoni kombinata tar-risponsi tat-tessuti tal-organi sesswali a ċċessorji 
kollha (ASO) tista' tinkiseb billi ssir anali żi xierqa tad-dejta plurivarjata. 
Din tista' ttejjeb l-anali żi, speċjalment f'ka żijiet fejn tessut wie ħed biss 
jagħti rispons statistikament importanti.  
61. Għall-antagoni żmu tal-andro ġen, il-kontroll g ħandu jkun il-grupp tat-test 
tal-androġen ta' referenza (testosteron propjonat biss). Il-karatteristi ċi 
tal-mod ta' azzjoni ta' sustanza kimika tat-test jistg ħu jwasslu g ħal 
risponsi relattivi differenti bejn it-tessuti, pere żempju inibituri ta' 5 alfa α- 
ridottasi, b ħal finasterid, g ħandhom effetti li jin ħassu iktar fuq il-prostata 
ventrali milli tessuti o ħrajn meta mqabblin ma' antagonisti qawwijin tal-AR, 
bħal flutamid. Tnaqqis statistikament importanti (p ≤ 0,05) fi kwalunkwe 
tnejn jew iktar mill- ħames piżijiet tat-tessuti fil-mira li jiddependu fuq 
l-androġen (VP, LABC, GP, CG u SVCG) relatat mat-trattament bit-TP 
waħdu għandu jitqies b ħala riżultat tal-antagonist tal-andro ġen pożittiv u 
t-tessuti kollha fil-mira g ħandhom juru xi grad ta' tkabbir imnaqqas. 
L-evalwazzjoni kombinata tar-risponsi kollha tat-tessut g ħall-ASO jistg ħu 
jiġu arkivjati billi tintu ża analiżi xierqa tad-dejta plurivarjata. Din tista' 
ttejjeb l-anali żi, speċjalment f'ka żijiet fejn tessut wie ħed biss jag ħti 
rispons statistikament importanti.  
62. Id-dejta g ħandha tin ġabar fil-qosor f'forma ta' tabella li jkun fiha l-medja, 
l-iżball standard tal-medja (devjazzjoni standard tkun a ċċettabbli wkoll) u 
d-daqs tal-kampjun g ħal kull grupp. It-tabelli ta' dejta individwali g ħandhom 
ikunu inklu żi wkoll. Il-valuri individwali, il-medja, il-valuri ta' SE (SD) u 
CV għad-dejta tal-kontroll g ħandhom ji ġu eżaminati biex ji ġi determinat 
jekk jilħqux kriterji a ċċettabbli g ħal konsistenza ma' valuri stori ċi misten­
nijin. CVs li jaqb żu l-valuri tas-CV elenkati fit-Tabella 1 (ara l-paragrafi 25 
u 26) għal kull pi ż tal-organu g ħandhom jiddeterminaw jekk hemmx żbalji 
fir-reġistrazzjoni jew it-tid ħil tad-dejta jew jekk il-laboratorju g ħadux laħaq 
livell eċċezzjonali ta' dissezzjoni pre ċiża tat-tessuti li jiddependu fuq 
l-androġen u jekk hemmx b żonn ta' iktar ta ħriġ/prattika. Ġeneralment, 
CVs (id-devjazzjoni standard maqsuma bil-pi ż medju tal-organi) huma 
riproduċibbli minn laboratorju g ħal ieħor u minn studju g ħal ieħor. 
Id-dejta ppre żentata għandha tinkludi tal-inqas: il-pi żijiet tal-prostata 
ventrali, in-nuffata seminali, il-muskolu reffieg ħ bulbukavernosu ani plus, 
il-glandoli ta' Cowper, ir-ras tal-pene, il-fwied u l- ġisem u l-bidla fil-pi ż 
tal-ġisem mill-bidu tad-do żaġġ san-nekropsija. Id-dejta tista' ti ġi ppreżentata 
wkoll wara a ġġusatment tal-kovarjanza g ħall-piż tal-ġisem, iżda din ma 
għandhiex tie ħu post pre żentazzjoni tad-dejta mhux a ġġustata. Barra minn 
hekk, jekk fl-ebda wie ħed mill-gruppi ma sse ħħ separazzjoni 
prepuzjali (PPS), l-in ċidenza tal-PPS g ħandha tiġi rreġistrata u titqabbel 
b'mod statistiku mal-grupp tal-kontroll permezz tat-test Fisher Exact.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Fil-verifika tad-dejta mda ħħla fil-kompjuter mal-iskedi tad-dejta ori ġinali 
għall-preċiżjoni, il-valuri tal-pi ż tal-organi li mhumiex bijolo ġikament 
plawżibbli jew li jvarjaw b'iktar minn tliet devjazzjonijiet standard 
mill-medji tal-grupp tat-trattament g ħandhom ji ġu skrutinizzati bir-reqqa u 
jaf ikollhom b żonn jitwarrbu, peress li aktarx ikunu żbalji fir-re ġistrazzjoni.  
64. It-tqabbil tar-ri żultati tal-istudju mal-valuri tas-CV tal-OECD (fit-Tabella 1) 
spiss ikun pass importanti fl-interpretazzjoni dwar il-validità tar-ri żultati 
tal-istudju. Id-dejta storika g ħall-gruppi tal-kontroll tal-veikolu g ħandha 
tinżamm fil-laboratorju. Id-dejta storika g ħar-risponsi g ħal sustanzi kimi ċi 
ta' referenza po żittivi, bħal TP u FT, g ħandha tin żamm fil-laboratorju wkoll. 
Il-laboratorju jistg ħu jittestjaw b'mod perjodiku wkoll ir-rispons g ħal 
agonisti u antagonisti dg ħajfin mag ħrufin tal-andro ġen u jżommu din 
id-dejta. Din id-dejta tista' titqabbel mad-dejta disponibbli tal-OECD biex jiġi żgurat li l-metodi tal-laboratorju jrendu pre ċiżjoni u sa ħħa statistiċi 
suffiċjenti.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET:  
Androġenika  hija terminu u żat biex ti ġi deskritta influwenza po żittiva fuq 
it-tkabbir tat-tessuti li jiddependu fuq l-andro ġen 
Antiandro ġenika  hija l-ħila ta' sustanza kimika sabiex tra żżan l-azzjoni ta' TP 
f'organiżmu mammiferu.  
Sustanza kimika  tfisser sustanza jew ta ħlita. 
Data tat-twelid  hija l-jum 0 wara t-twelid.  
Doża hija l-ammont ta' sustanza kimika mog ħtija. Għall-Bijoassa ġġ Hershberger, 
id-doża tingħata bħala piż tas-sustanza kimika tat-test g ħal kull pi ż tal-ġisem ta' 
unità tal-annimal tat-test f'kull jum (e ż. mg/kg pi ż tal-ġisem/jum).  
Dożaġġ hija terminu ġenerali li tinvolvi d-do ża, il-frekwenza tag ħha u d-durata 
tad-dożaġġ. 
Moribond  hija terminu u żata biex tiddeskrivi annimal fi stat riesaq lejn il-mewt, 
jiġifieri qrib il-punt tal-mewt.  
Jum X wara t-twelid  huwa l-jum numru X tal- ħajja wara t-twelid.  
Sensitività  hija l-ħila ta' metodu ta' ttestjar biex jidentifika b'mod korrett sustanzi 
kimiċi li għandhom il-proprjetà li qed ji ġu ttestjati g ħaliha.  
Speċifiċità hija l-ħila ta' metodu ta' ttestjar biex jidentifika b'mod korrett sustanzi 
kimiċi li ma g ħandhomx il-proprjetà li qed ji ġu ttestjati g ħaliha.  
Sustanza kimika tat-test  tfisser kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata 
permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.  
Validazzjoni  hija proċess xjentifiku mfassal biex ji ġu karatterizzati r-rekwi żiti u 
l-limitazzjonijiet operazzjonali ta' metodu ta' ttestjar u biex tintwera l-affidabilità u r-relevanza tieg ħu għal skop partikolari.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Appendiċi 2
 
VMG mamm: Grupp ta' Mmani ġġjar tal-Validazzjoni fuq Ittestjar u Valutazzjoni tal-Mammiferi
 NOTI GĦALL-QAFAS  
Nota 1:  Dħul fil-livelli kollha u ħruġ fil-livelli kollha huma possibbli u 
jiddependu fuq l-g ħamla tal- ħtiġijiet eżistenti ta' informazzjoni 
għal skopijiet ta' valutazzjoni tal-periklu u r-riskju.  
Nota 2:  Fil-livell 5, l-ekotossikolo ġija għandha tinkludi punti a ħħarin li 
jindikaw mekkani żmi ta' effetti avversi, u l- ħsara potenzjali g ħall- 
popolazzjoni.  
Nota 3:  Meta mudell multimodali jkopri diversi mill-assa ġġi tal-punt a ħħari 
uniku, dak il-mudell jie ħu post l-u żu ta' dawk l-assa ġġi tal-punt 
aħħari uniku.  
Nota 4:  Il-valutazzjoni ta' kull sustanza kimika g ħandha tkun imsejsa fuq 
bażi ta' ka ż b'każ, filwaqt li tittie ħed f'kunsiderazzjoni 
l-informazzjoni kollha g ħad-dispożizzjoni, filwaqt li tibqa' 
mfakkra l-funzjoni tal-livelli tal-qafas.  
Nota 5:  Il-qafas ma g ħandux jitqies li jinkludi kollox b ħalissa. Fil-livelli 3, 
4 u 5 jinkludi assa ġġi li jew huma disponibbli jew inkella li 
għalihom qed issir validazzjoni. Fir-rigward ta' dawn tal-a ħħar, 
dawn huma inklu żi b'mod provvi żorju. Ladarba ji ġu żviluppati u 
vvalidati, dawn ser ji żdiedu b'mod formali mal-qafas.  
Nota 6:  Il-livell 5 ma g ħandux jitqies li jinkludi testijiet definittivi biss. 
It-testijiet inklu żi f'dak il-livell jitqiesu li jikkontribwixxu g ħall- 
valutazzjoni ġenerali tal-perikli u r-riskji.  
TAGĦRIF 
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 ta' Marzu 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols 
in Toxicology  16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the vali ­
dation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environ ­
mental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment 
N
 o 62. ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple 
Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on 
Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.
 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422.  
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314.  
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.
 
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.
 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.  
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.
 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p. 38.  
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
 
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pari ġi. 
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist 
and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. Ara, t-taqsima II, Il-gwida dwar id-dissezzjoni pprovduta lil-laboratorji: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/ 
suppl.pdf
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Gwida b'referenza vi żwali dwar 
il-proċedura ta' assa ġġ Hershberger, inklu ż filmat ta' dissezzjoni. http:// 
rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html  
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic prop ­
erties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' 
Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintu żaw għal 
skopijiet xjentifi ċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).  
(27) Il-kapitoli li ġejjin ta' dan l-Anness:  
B.1 bis, Tossi ċità orali akuta — pro ċedura b'do ża fissa  
B.1 tris, Tossi ċità orali akuta — metodu tal-klassi tossika akuta  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  STUDJU ESTI Ż TAT-TOSSI ĊITÀ RIPRODUTTIVA TA' 
ĠENERAZZJONI WA ĦDA 
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida 
tat-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 443 (2012). Huwa bba żat fuq il-proposta 
tal-Kumitat Tekniku tal- International Life Science Institute (ILSI)-Health and Environmental Sciences Institute (HESI), Agricultural Chemical Safety 
Assessment (ACSA) g ħal studju esti ż dwar ir-riproduttività ta' ġenerazzjoni 
waħda fl-istadju tal- ħajja F
 1 kif ippubblikata f'Cooper et al., 2006 (1). Sar 
ħafna titjib u kien hemm ħafna kjarifiki fit-tifsila tal-istudju sabiex ti ġi 
pprovduta flessibilità u sabiex ti ġi enfasizzata l-importanza tal-bidu 
b'għarfien eżistenti, filwaqt li jintu żaw osservazzjonijiet tul il- ħajja biex 
jiġi ggwidat u jitfassal l-ittestjar. Dan il-metodu ta' ttestjar jipprovdi desk ­
rizzjoni dettaljata tal-kondotta operazzjonali ta' Studju Esti ż tat-Tossi ċità 
Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Wa ħda. Il-metodu ta' ttestjar jiddeskrivi tliet 
koorti ta' annimali F  1 : 
Koorta 1:: valutazzjoni tal-punti a ħħarin tar-riproduzzjoni/l-i żvilupp; din 
il-koorta tista' ti ġi estiża biex tinkludi ġenerazzjoni F  2 , 
Koorta 2:: valutazzjoni tal-impatt potenzjali tal-esponiment kimiku fuq 
is-sistema nervu ża li tkun fil-pro ċess ta' żvilupp,  
Koorta 3:: valutazzjoni tal-impatt potenzjali tal-esponiment kimiku fuq 
is-sistema immuni li tkun fil-pro ċess ta' żvilupp.  
2. Deċiżonijiet dwar jekk ti ġix ivvalutata t-tieni ġenerazzjoni u biex titne ħħa 
koorta tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp u/jew koorta tal-immunotossi ċità 
tal-iżvilupp għandhom jirriflettu g ħarfien eżistenti għas-sustanza kimika li 
tkun qed ti ġi evalwata, kif ukoll il-b żonnijiet tal-bosta awtoritajiet regola ­
torji. L-iskop tal-metodu ta' ttestjar huwa li jipprovdi dettalji dwar kif jista' 
jsir l-istudju u li jindirizza kif g ħandha tiġi evalwata kull koorta.  
3. Il-pro ċedura għad-deċiżjoni dwar l-iskattar intern g ħall-produzzjoni tat-tieni 
ġenerazzjoni hija deskritta fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 117 (39) 
għal dawk l-awtoritajiet regolatorji li ju żaw skattaturi interni.  
KUNSIDERAZZJONIJIET U G ĦANIJIET INIZJALI  
4. L-għan ewlieni tal-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni 
Waħda huwa li jevalwa l-istadji tal- ħajja speċifiċi mhux koperti minn tipi 
oħrajn ta' studji tat-tossi ċità u jittestja g ħal effetti li jistg ħu jseħħu minħabba 
esponiment kimiku qabel u wara t-twelid. G ħal punti a ħħarin riproduttivi, 
huwa previst li, b ħala l-ewwel pass u meta tkun disponibbli, tintu ża inform­
azzjoni minn studji b'do ża ripetuta (inklu żi studji ta' tg ħarbil dwar 
it-tossiċità riproduttiva, e ż., TG tal-OECD Nru 422 (32)), jew assa ġġi ta' 
tgħarbil ta' interferenti endokrinali fuq terminu qasir, (e ż., Assaġġ uterot­
rofiku — metodu ta' ttestjar B.54 (36); u l-assa ġġ Hershberger — metodu 
ta' ttestjar B.55 (37)) biex jinqabdu effetti fuq organi riproduttivi g ħall-irġiel 
u n-nisa. Dan jista' jinkludi spermato ġenesi (istopatolo ġija testikolari) g ħall- 
irġiel u ċikli estru żi, għadd tal-follikoli/maturità tal-oo ċiti u integrità 
tal-ovarji (istopatolo ġija) għan-nisa. Imbag ħad, l-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità 
Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Wa ħda jservi b ħala test g ħal punti a ħħarin 
riproduttivi li je ħtieġu l-interazzjoni ta' r ġiel ma' nisa, nisa ma' conceptus, u 
nisa ma' ulied u l- ġenerazzjoni F  1 generation sa wara l-maturità sesswali 
(ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151 li jsostni dan il-metodu ta' 
ttestjar (40)).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Il-metodu ta' ttestjar huwa mfassal sabiex jipprovdi evalwazzjoni tal-effetti 
ta' qabel u wara t-twelid tas-sustanzi kimi ċi fuq l-iżvilupp kif ukoll eval ­
wazzjoni dettaljata tat-tossi ċità sistemika f'nisa tqal u li qed ireddg ħu u 
wlied żgħar u adulti. Anali żi dettaljata tal-punti a ħħarin ewlenin 
tal-iżvilupp, b ħall-vijabbiltà tal-wild, is-sa ħħa ta' dawk li g ħadhom kif 
jitwieldu, l-istatus tal-i żvilupp fit-twelid, u l-i żvilupp fiżiku u funzjonali 
sal-adultezza, hija mistennija tidentifika organi spe ċifiċi fil-mira fl-ulied. 
Barra minn hekk, l-istudju ser jipprovdi u/jew jikkonferma informazzjoni dwar l-effetti ta' sustanza kimika tat-test fuq l-integrità u l-prestazzjoni 
tas-sistemi riproduttivi ta' r ġiel u nisa adulti. B'mod spe ċifiku, iżda mhux 
biss, jiġu kkunsidrati l-parametri li ġejjin: il-funzjoni gonadali, i ċ-ċiklu 
estruż, il-maturità tal-isperma epdidimali, l-im ġiba tat-tg ħammir, it-twelid, 
it-tqala, il- ħlas, u t-treddig ħ. Barra minn hekk, l-informazzjoni miksuba 
mill-valutazzjonijiet tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp u tal-immunotossi ċità 
tal-iżvilupp ser tikkaratterizza l-effetti potenzjali f'dawk is-sistemi. Id-dejta 
miksuba minn dawn it-testijiet g ħandha tippermetti li ssir id-determinazzjoni 
tal-Livelli ta' Effett Avvers Mhux Osservat (NOAELs), l-Inqas Livelli ta' 
Effett Avvers Osservat (LOAELs) u/jew do żi ta' riferiment g ħall-bosta punti 
aħħarin u/jew tintu ża biex tikkaratterizza l-effetti misjubin fi studji 
preċedenti b'do ża ripetuta u/jew isservi ta' gwida g
ħat-testijiet sussegwenti.  
6. Fil-Figura 1 hemm ippre żentata tpin ġija skematika tal-protokoll. Is-sustanza 
kimika tat-test ting ħata kontinwament f'do żi gradwati lil bosta gruppi ta' 
rġiel u nisa sesswalment maturi. Din il- ġenerazzjoni parentali (P) hija 
dożata għal perjodu definit qabel it-tg ħammir (mag ħżul fuq il-ba żi 
tal-informazzjoni disponibbli tas-sustanza kimika tat-test; i żda għal 
tal-inqas ġimgħatejn) u perjodu ta' tg ħammir ta' ġimgħatejn. Irġiel P 
ikomplu ji ġu kkurati tal-inqas sal-ftim tal-F  1 . Għandhom ji ġu kkurati g ħal 
tal-inqas 10 ġimgħat. Jistgħu jiġu kkurati iktar jekk ikun hemm b żonn li 
jiġu ċċarati l-effetti fuq ir-riproduzzjoni. Il-kura tan-nisa P tkompli matul 
it-tqala u t-treddig ħ sat-terminazzjoni wara l-ftim tal-boton tag ħhom 
(jiġifieri 8-10 ġimgħat ta' kura). L-ulied F  1 jirċievu iktar kura bis-sustanza 
kimika tat-test mill-ftim sal-adultezza. Jekk ti ġi vvalutata t-tieni ġener­
azzjoni (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 117 (39)), l-ulied F  1 
ser jinżammu bil-kura sal-ftim tal-F  2 , jew sa tmiem l-istudju.  
7. Osservazzjonijiet klini ċi u eżamijiet patolo ġiċi jsiru fuq l-annimali kollha 
għal sinjali ta' tossi ċità, b'enfasi spe ċjali fuq l-integrità u l-prestazzjoni 
tas-sistemi riproduttivi ta' r ġiel u nisa u s-sa ħħa, it-tkabbir, l-i żvilupp u 
l-funzjoni tal-ulied. Fil-ftim, l-ulied mag ħżulin jiġu assenjati f'sottogruppi 
speċifiċi (koorti 1-3, ara l-paragrafi 33 u 34 u l-Figura 1) g ħal iktar investi ­
gazzjonijiet, inklu żi l-maturità sesswali, l-integrità u l-funzjoni tal-organu 
riproduttiv, il-punti a ħħarin newrolo ġiċi u tal-im ġiba, u l-funzjonijiet 
immuni.  
8. Fit-twettiq tal-istudju, g ħandhom ji ġu segwiti l-prin ċipji ta' gwida u 
l-kunsiderazzjonijiet spjegati fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 19 dwar ir-rikonoxximent, il-valutazzjoni, u l-u żu ta' sinjali klini ċi bħala 
punti a ħħarin umanitarji g ħal annimali sperimentali u żati 
fl-evalwazzjonijiet tas-sikurezza (34).
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Meta jkun hemm disponibbli numru suffi ċjenti ta' studji biex ikun żgurat 
l-impatt ta' din it-tifsila l- ġdida tal-istudju, il-metodu ta' ttestjar ser ji ġi 
analizzat u jekk ikun hemm b żonn rivedut fid-dawl tal-esperjenzi miksubin.  
Figura 1  
Skema tal-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Wa ħda
 
DESKRIZZJONIJIET TAL-METODU/PREPARAZZJONIJIET G ĦAT- 
TEST  
Annimali  
Għażla tal-ispe ċi u r-razza tal-annimali  
10. L-għażla tal-ispe ċi għat-test tat-tossi ċità riproduttiva g ħandha tiġi kkun­
sidrata bir-reqqa fid-dawl tal-informazzjoni kollha g ħad-dispożizzjoni. 
Madankollu, min ħabba d-dejta ta' sfond estensiva u l-komparabbiltà g ħat- 
testijiet tat-tossi ċità ġenerali, normalment il-far ikun l-ispe ċi preferuta, u 
l-kriterji u r-rakkomandazzjonijiet mog ħtijin f'dan il-metodu ta' ttestjar 
jirreferu g ħal din l-ispe ċi. Jekk jintu żaw speċi oħrajn, għandha ting ħata 
ġustifikazzjoni u ser ikun hemm b żonn li jsiru l-modifiki xierqa. Ma 
għandhomx jintu żaw razez b'fekondità baxxa jew in ċidenza g ħolja 
magħrufa sew ta' difetti spontanji fl-i żvilupp.  
L-età, il-pi ż tal-ġisem u l-kriterji ta' inklu żjoni 
11. Għandhom jintu żaw annimali parentali b'sa ħħithom li ma kinux so ġġetti 
għal proċeduri sperimentali fl-img ħoddi. Kemm l-ir ġiel kif ukoll in-nisa 
għandhom ikunu studjati u n-nisa g ħandhom ikunu qatt ma welldu u 
mhux tqal. L-annimali P g ħandhom ikunu la ħqu l-maturità sesswali, ta' 
piż simili (dawk tal-istess sess) fil-bidu tad-do żaġġ, età simili (madwar 90 
jum) fit-tg ħammir, u jirrappre żentaw l-ispe ċi u r-razza fl-istudju. L-annimali 
għandhom ji ġu akklimatizzati g ħal tal-inqas 5 ijiem wara li jaslu. 
L-annimali jitqassmu b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll u kura, b'tali 
mod li jirri żutla f'valuri medji komparabbli tal-pi ż tal-ġisem bejn il-gruppi 
(jiġifieri ± 20 % tal-medja).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
12. It-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperiment g ħandha tkun ta' 22 °C 
(± 3 °C). L-umdità relattiva g ħandha tkun bejn 30-70 %, b'medda ideali ta' 
50–60 %. Id-dawl artifi ċjali għandu jitfassal g ħal 12-il sieg ħa dawl, 12-il 
siegħa dlam. Jistg ħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista 
illimitata ta' ilma tajjeb g ħax-xorb. G ħandha ting ħata attenzjoni bir-reqqa 
għall-kontenut ta' fitoestro ġen tad-dieta, peress li livell g ħoli ta' fitoestro ġen 
fid-dieta jista' jaffettwa xi punti a ħħarin tar-riproduzzjoni. Huma rakkom ­
andati dieti standaradizzati b'formula miftu ħa li fihom tnaqqsu s-sustanzi 
kimiċi estroġeniċi (2)(30). L-g ħażla tad-dieta tista' tkun influwenzata 
mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta 
tingħata b'dan il-metodu. Il-kontenut, l-omo ġenità u l-istabbiltà 
tas-sustanza kimika tat-test fid-dieti g ħandhom ji ġu verifikati. L-g ħalf u 
l-ilma tajjeb g ħax-xorb g ħandhom ji ġu analizzati b'mod regolari g ħal 
kontaminanti. Il-kampjuni ta' kull lott tad-dieta u żata matul l-istudju 
għandhom jin żammu f'kundizzjonijiet xierqa (e ż., iffriżati f'– 20 °C), 
sakemm ji ġi finalizzat ir-rapport, f'ka ż li r-riżultati jeħtieġu iktar anali żi 
tal-ingredjenti tad-dieta.  
13. L-annimali g ħandhom jitqieg ħdu f'gaġeġ fi gruppi żgħar tal-istess sess u 
grupp tal-kura. Jistg ħu jitqiegħdu f'gaġġa b'mod individwali biex ji ġu evitati 
korrimenti possibbli (e ż., irġiel wara l-perjodu ta' tg ħammir). Il-pro ċeduri ta' 
tgħammir għandhom isiru f'ga ġeġ xierqa. Wara evidenza ta' kopulazzjoni, 
in-nisa li huma supponuti tqal jitqieg ħdu f'gaġeġ separati g ħall-ħlas jew 
il-maternità fejn ikunu pprovduti b'materjali xierqa u definiti tat-tibjit. Il-boton jitqieg ħdu ma' ommhom sal-ftim. Annimali F
 1 għandhom jitq ­
iegħdu fi gruppi żgħar tal-istess sess u grupp tal-kura mill-ftim sat-tmiem. 
Jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat, l-annimali jistg ħu jitqiegħdu f'gaġġa 
b'mod individawli. Il-livell ta' fitoestro ġeni li jinsab fil-materjal tat-tibjit 
magħżul għandu jkun minimu =.  
Numru u identifikazzjoni tal-annimali  
14. Is-soltu, kull test u grupp ta' kontroll g ħandu jkun fih numru suffi ċjenti ta' 
pari tat-tg ħammir biex tal-inqas ikun hemm 20 mara tqila f'kull grupp 
tad-doża. L-għan huwa li ji ġu prodotti bi żżejjed nisa tqal ħalli tkun 
żgurata evalwazzjoni valida tal-potenzjal tas-sustanza kimika sabiex 
taffettwa l-fertilità, it-tqala u l-im ġiba materna tal- ġenerazzjoni P u 
t-tkabbir u l-i żvilupp tal-ulied F  1 , mit-twelid sal-maturità. Nuqqas ta' 
kisba tan-numru mixtieq ta' annimali tqal mhux bilfors jinvalida l-istudju u għandu jiġi evalwat fuq ba żi ta' każ b'każ, filwaqt li ti ġi kkunsidrata 
relazzjoni kaw żali possibbli mas-sustanza kimika tat-test.
 
15. Kull annimal P ji ġi assenjat numru uniku ta' identifikazzjoni qabel jibda 
d-dożaġġ. Jekk id-dejta storika tal-laboratorju tissu ġġerixxi li sehem 
importanti ta' nisa jistg ħu ma jurux ċikli estrużi regolari (4 jew 5 ijiem), 
huwa rakkomandat li ssir valutazzjoni ta ċ-ċikli estrużi qabel tibda l-kura. 
Inkella, id-daqs tal-grupp jista' ji żdied biex ji ġi żgurat li tal-inqas 20 mara 
f'kull grupp ikollha ċikli estrużi regolari (4 jew 5 ijiem) fil-bidu tal-kura. 
L-ulied F  1 kollha jiġu identifikati b'mod uniku meta ji ġu eżaminati g ħall- 
ewwel darba dawk li jkunu g ħadhom kif twieldu fil-jum ta' wara 
t-twelid (PND) 0 jew 1. Ir-re ġistrazzjonijiet li jindikaw il-boton ta' ori ġini 
għandhom jin żammu għall-annimali F  1 , u F  2 kollha fejn applikabbli, matul 
l-istudju kollu.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Is-sustanza kimika tat-test  
L-informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza kimika tat-test  
16. L-anali żi tal-informazzjoni e żistenti hija importanti g ħal deċiżjonijiet dwar 
ir-rotta tal-amministrazzjoni, l-g ħażla tal-veikolu, l-g ħażla tal-ispe ċi 
tal-annimali, l-g ħażla tad-do żaġġi u l-modifiki potenzjali tal-iskeda 
tad-dożaġġ. Għaldaqstant, l-informazzjoni kollha li hemm g ħad- 
dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika tat-test, ji ġifieri proprjetajiet 
fiżikokimiċi, tossikokineti ċi (inkluż metaboli żmu speċifiku għall-ispeċi), 
tossikodinami ċi, relazzjonijiet bejn l-istruttura u l-attività (SARs), pro ċessi 
metaboliċi in vitro , riżultati ta' studji pre ċedenti dwar it-tossi ċità u inform ­
azzjoni rilevanti dwar analogi strutturali g ħandhom jittie ħdu f'kunsider ­
azzjoni fl-ippjanar tal-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġener­
azzjoni Wa ħda. Informazzjoni preliminari dwar l-assorbiment, 
id-distribuzzjoni, il-metaboli żmu u l-eliminazzjoni (ADME) u 
l-bijoakkumulazzjoni tista' tinkiseb mill-istruttura kimika, id-dejta fi żiko­
kimika, il-firxa ta' proteina tal-pla żma li tg ħaqqad jew studji 
tossikokineti ċi (TK), filwaqt li r-ri żultati minn studji tat-tossi ċità jagħtu 
informazzjoni addizzjonali, e ż., dwar in-NOAEL, il-metaboli żmu jew 
l-induzzjoni tal-metaboli żmu. 
Kunsiderazzjoni tad-dejta tossikokinetika  
17. Għad li mhijiex me ħtieġa, dejta dwar it-TK minn studji li saru fl-img ħotti 
ta' sejbien tal-medda tad-do ża jew o ħrajn huma ferm utli fl-ippjanar 
tat-tifsila tal-istudju, l-g ħażla tal-livelli tad-do ża u l-interpretazzjoni 
tar-riżultati. Hija partikolarment utli dejta li: 1) tivverifika l-esponiment ta' 
feti u frie ħ li qed jiżviluppaw g ħas-sustanza kimika tat-test (jew metaboliti 
rilevanti), 2) tipprovdi stima tad-do żimentrija interna, u 3) tevalwa g ħal 
saturazzjoni potenzjali li tiddependi fuq id-do ża tal-proċessi kineti ċi. Dejta 
addizzjonali dwar it-TK, b ħal profili tal-metaboliti, korsijiet tal- ħin ta' kon ċ­
entrazzjoni, e ċċ. għandha tiġi kkunsidrata wkoll jekk tkun disponibbli. Dejta 
supplimentari dwar it-TK tista' tin ġabar ukoll matul l-istudju ewlieni, diment 
li ma xxekkilx il- ġbir u l-interpretazzjoni tal-punti a ħħarin ewlenin 
tal-istudju.  
Bħala gwida ġenerali, is-sett ta' dejta li ġej dwar it-TK ikun utli fl-ippjanar 
tal-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Wa ħda: 
— Tqala tard (e ż., Jum tat-Tqala 20) — demm matern u demm tal-fetu,  
— Nofs it-treddig ħ (PND 10) — demm matern, demm tal-fer ħ u/jew ħalib, 
— Ftit wara l-ftim (e ż., PND 28) — kampjuni tad-demm tal-annimal li 
nfatam.  
Għandu jkun hemm flessibbiltà fid-determinazzjoni tal-analiti spe ċifiċi (eż. 
sustanza kimika u/jew metaboliti tal- ġenitur) u l-iskema tal-kampjunar. 
Pereżempju, in-numru u l-puntwalità tal- ġbir tal-kampjun f'jum partikolari 
tal-kampjunar ser ikunu jiddependu fuq ir-rotta ta' esponiment u l-g ħarfien 
minn qabel dwar il-proprjetajiet tat-TK f'annimali mhux tqal. G ħal studji 
djetetiċi, il-kampjunar f' ħin konsistenti wie ħed f'kull wie ħed minn dawn 
il-jiem huwa bi żżejjed, filwaqt li d-do żaġġ b'gavage jista' jkun je ħtieġ 
ħinijiet traddizzjonali ta' kampjunar biex tinkiseb stima a ħjar tal-medda ta' 
dożi interni. Madankollu, m'hemmx b żonn li jiġi ġġenerat perjodu ta' żmien 
b'konċentrazzjoni s ħiħa f'xi wie ħed mill-jiem tal-kampjun. Jekk ikun hemm 
bżonn, id-demm jista' jin ġabar skont is-sess fi ħdan il-boton g ħal analiżijiet 
tal-fetu u tal-annimali li g ħadhom kif twieldu.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Rotta tal-amministrazzjoni  
18. L-għażla tar-rotta g ħandha tieħu f'kunsiderazzjoni l-iktar rotta/rotot rilevanti 
għall-esponiment tal-bniedem. G ħad li l-protokoll huwa mfassal g ħall-għoti 
tas-sustanza kimika tat-test permzz tad-dieta, jista' ji ġi modifikat biex din 
tingħata b'rotot o ħrajn (ilma tajjeb g ħax-xorb, gavage, te ħid man-nifs, 
dermali), skont il-karatteristi ċi tas-sustanza kimika u l-informazzjoni 
meħtieġa. 
Għażla tal-veikolu  
19. Meta jkun hemm b żonn, is-sustanza kimika tat-test tin ħall jew ti ġi sospiża 
f'veikolu xieraq. Huwa rakkomandat li, meta dan ikun possibbli, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-u żu ta' soluzzjoni/sospensjoni milwiema, segwit minn 
kunsiderazzjoni ta' soluzzjoni/sospensjoni fi ż-żejt (eż., żejt tal-qam ħirrun). 
Għal veikolu li mhumiex ilma, g ħandhom ikunu mag ħrufin il-karatteristi ċi 
tossiċi tal-veikolu. L-u żu ta' veikoli b'tossi ċità intrinsika potenzjali g ħandu 
jiġi evitat (e ż., aċetun, DMSO). G ħandha tiġi ddeterminata l-istabbiltà 
tas-sustanza kimika tat-test fil-veikolu. G ħandhom jittie ħdu f'kunsider ­
azzjoni l-karatteristi ċi li ġejjin jekk jintu ża veikolu jew addittiv ie ħor biex 
jitħaffef id-do żaġġ: effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, 
il-metaboli żmu jew i ż-żamma tas-sustanza kimika tat-test; effetti fuq 
il-proprjetajiet kimi ċi tas-sustanza kimika tat-test li jistg ħu jibdlu 
l-karatteristi ċi tossiċi tagħha; u effetti fuq il-konsum ta' ilma jew ikel jew 
l-istatus nutrizzjonali tal-annimali.
 
Għażla tad-do ża 
20. Normalment, l-istudju g ħandu jinkludi tal-inqas tliet livelli tad-do ża u 
kontroll konkurrenti. Meta jing ħażlu livelli xierqa tad-do ża, l-investigatur 
għandu jqis l-informazzjoni kollha g ħad-dispożizzjoni, inklu ża inform ­
azzjoni dwar id-do żaġġ minn studji li saru qabel, dejta dwar it-TK minn 
annimali tqal jew mhux tqal, kemm ise ħħ trasferiment fit-treddig ħ, u stimi 
tal-esponiment tal-bniedem. Jekk hemm dejta dwar it-TK disponibbli li tindika saturazzjoni li tiddependi fuq id-do ża tal-proċessi tat-TK, g ħandha 
tingħata attenzjoni sabiex ji ġu evitati livelli tad-do ża għoljin li jesibixxu 
b'mod ċar saturazzjoni, diment li ovvjament l-esponimenti tal-bniedem 
ikunu mistennijin ikunu f'livell ferm inqas mill-punt ta' saturazzjoni. F'dawn il-ka żijiet, l-ogħla livell tad-do ża għandu jkun il-punt ta' inflezzjoni, 
jew ftit og ħla minnu, g ħat-tranżizzjoni lejn im ġiba mhux lineari tat-TK.
 
21. Fin-nuqqas ta' dejta rilevanti dwar it-TK, il-livelli tad-do ża għandhom ikunu 
bbażati fuq effetti tossi ċi, sakemm ma jkunux limtiati mill-g ħamla fiżika/ 
kimika tas-sustanza kimika tat-test. Jekk il-livelli tad-do ża jkunu bba żati fuq 
it-tossiċità, l-ogħla doża għandha ting ħażel bl-għan li tikka ġuna xi tossi ċità 
sistemika, i żda mhux mewt jew tbatija severa tal-annimali.  
22. Għandha ting ħażel sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-do ża sabiex jintwera 
kwalunkwe effett relatat mad-do ża u sabiex ji ġu stabbiliti NOAELs jew 
dożi qrib il-limitu ta' identifikazzjoni li jippermetti sabiex ti ġi derivata 
doża ta' riferiment g ħall-iktar punt(i) a ħħari(n) sensittiv(i). Biex ji ġi evitat 
spazju kbir bejn id-do żż tal-NOAELs u l-LOAELs, spiss intervalli d-doppju 
jew erba' darbiet ta' xulxin ikunu ottimali. I ż-żieda tar-raba' grupp tat-test 
spiss ikun ippreferut milli jintu ża intervall kbir ħafna (eż., fattur ta' iktar 
minn 10) bejn id-do żi. 
23. Ħlief għall-kura bis-sustanza kimika tat-test, l-annimali fil-grupp ta' kontroll 
jiġu ttrattati bl-istess mod b ħas-suġġetti tal-grupp tat-test. Dan il-grupp ma 
għandux jing ħata kura jew kura finta jew grupp ta' kontroll b'veikolu jekk 
jintuża veikolu fl-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintu ża veikolu, 
il-grupp ta' kontroll g ħandu jirċievi l-veikolu fl-og ħla volum u żat. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Test tal-limitu  
24. Jekk ma hemm ebda evidenza ta' tossi ċità b'doża ta' tal-inqas 1 000 mg/kg 
piż tal-ġisem/jum fi studji b'do ża ripetuta, jew jekk ma tkunx mistennija 
tossiċità fuq il-ba żi ta' dejta minn sustanzi kimi ċi relatati fil-livell strutturali 
u/jew metaboliku, li jindikaw similarità fil-proprjetajiet metaboli ċi in vivo /in 
vitro , jista' ma jkunx hemm b żonn ta' studju li ju ża bosta livelli ta' do ża. 
F'dawn il-ka żijiet, l-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni 
Waħda jista' jsir billi jintu ża grupp ta' kontroll u do ża waħda ta' tal-inqas 
1 000 mg/kg pi ż tal-ġisem/jum. Madankollu, jekk tinsab evidenza g ħal 
tossiċità riproduttiva jew tal-i żvilupp f'din id-do ża ta' limitu, ser ikun 
hemm b żonn ta' studji b'livelli inqas tad-do ża biex ji ġi identifikat 
NOAEL. Dawn il-kunsiderazzjonijiet tat-test ta' limitu japplikaw biss meta 
l-esponiment tal-bniedem ma jkunx jindika l-b żonn ta' livell ta' do ża ogħla. 
PROĊEDURI  
Esponiment tal-ulied  
25. L-esponiment djetetiku huwa l-metodu ppreferut tal-g ħoti. Jekk isiru studji 
b'gavage, ta' min jinnota li l-frie ħ normalment jir ċievu s-sustanza kimika 
tat-test b'mod indirett mill- ħalib biss, sakemm jibda d-do żaġġ dirett 
tagħhom fil-ftim. Fi studji dwar id-dieta jew l-ilma tajjeb g ħax-xorb, 
il-frieħ jirċievu wkoll is-sustanza kimika tat-test direttament meta jibdew 
jieklu wa ħedhom matul l-a ħħar ġimgħa tal-perjodu tat-treddig ħ Għandhom 
jiġu kkunsidrati modifiki fit-tifsila tal-istudju meta l-eskrezzjoni tas-sustanza 
kimika tat-test fil- ħalib tkun batuta u meta jkun hemm nuqqas ta' evidenza 
għal esponiment kontinwu tal-ulied. F'dawn il-ka żijiet, għandu jiġi kkun­
sidrat do żaġġ dirett tal-frie ħ matul il-perjodu tat-treddig ħ fuq il-ba żi 
tal-informazzjoni disponibbli dwar it-TK, it-tossiti ċtà tal-ulied jew bidliet 
fil-bijomarkaturi (3)(4). G ħandhom jing ħataw kunsiderazzjoni attenta 
l-benefiċċji u l-iżvantaġġi qabel ma jsiru studji tad-do żaġġ dirett fuq frie ħ 
li għadhom fil-fa żi tat-treddig ħ (5). 
Skeda tad-do żaġġ u għoti tad-do żi 
26. Jista' jkun hemm disponibbli ċerta informazzjoni dwar i ċ-ċikli estru żi, 
l-istopatolo ġija tal-apparat riproduttiv tal-ir ġiel u n-nisa u anali żi 
tal-isperma epididimali/testikolari minn studji li saru fl-img ħoddi dwar 
it-tossiċità b'doża ripetuta ta' durata adegwata. G ħalhekk, id-durata 
tal-kura qabel it-tg ħammir fl-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' 
Ġenerazzjoni Wa ħda hija mfassla sabiex tidentifika l-effetti fuq bidliet funz ­
jonali li jistg ħu jinterferixxu mal-im ġiba tat-tg ħammir u l-fertilizzazzjoni. 
Il-kura ta' qabel it-tg ħammir għandha tkun twila bi żżejjed biex jinkisbu 
kundizzjonijiet ta' esponiment bi stat kostanti fl-ir ġiel u n-nisa P. F' ħafna 
mill-każijiet, kura ta' qabel it-tg ħammir ta' ġimgħatejn għaż-żewġ sessi 
titqies li hija adegwata. G ħan-nisa, din tkopri 3-4 ċikli estru żi sħaħ u 
għandha tkun bi żżejjed biex taqbad kwalunkwe effett avvers fuq i ċ-ċikliċità. 
Għall-irġiel, din hija ekwivalenti g ħaż-żmien me ħtieġ għal tranżitu 
epididimali tal-ispermato żoa li qed timmatura u g ħandha tippermetti li 
jiġu identifikati l-effetti posttestikolari fuq l-isperma (matul l-a ħħar stadji 
tal-ispermjazzjoni u l-maturità tal-isperma epididimali) fit-tg ħammir. Fil- ħin 
tat-terminazzjoni, meta jkunu skedati istopatolo ġija testikolari u epididimali 
u analiżi tal-parametri tal-isperma, l-ir ġiel P u F  1 ser ikunu ġew esposti g ħal 
tal-inqas pro ċess spermato ġeniku wie ħed sħiħ ((6)(7)(8)(9) u d-Dokument 
ta' Gwida tal-OECD Nru 151(40)).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Ix-xenarji ta' esponiment ta' qabel it-tg ħammir g ħall-irġiel jistgħu jiġu 
adattati jekk fl-istudju pre ċedenti jkunu ġew oidentifikati b'mod ċar 
tossiċità testikolari (indeboliment tal-ispermato ġenesi) jew effetti fuq 
l-integrità u l-funzjoni tal-isperma. B'mod simili, g ħan-nisa, l-effetti 
magħrufin tas-sustanza kimika tat-test fuq i ċ-ċiklu estru ż u b'hekk anki 
r-riċettività sesswali, jistg ħu jiġġustifikaw xenarji ta' esponiment ta' qabel 
it-tgħammir differenti. F'ka żijiet speċjali, jista' jkun a ċċettabbli li kura 
tan-nisa P tinbeda biss wara li jkun inkiseb kampjun po żittiv għall- 
isperma (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151(40)).  
28. Ladarba ji ġi stabbilit il-perjodu ta' do żaġġ ta' qabel it-tg ħammir, l-annimali 
għandhom jir ċievu s-sustanza kimika tat-test kontinwament fuq ba żi ta' 7 
ijiem/ġimgħa san-nekropsija. L-annimali kollha g ħandhom jing ħataw 
id-doża bl-istess metodu. Id-do żaġġ għandu jkompli matul il-perjodu ta' 
tgħammir ta' ġimgħatejn u, g ħan-nisa P, matul it-tqala u t-treddig ħ 
sal-jum tat-terminazzjoni tal-annimal miftum. L-ir ġiel għandhom ji ġu 
kkurati bl-istess mod sat-terminazzjoni fi ż-żmien meta l-annimali F  1 
jinfatmu. G ħan-nekropsija, g ħandha ting ħata prijorità lil nisa li g ħandhom 
jiġu nekropsjati fuq numru ikbar ta' jiem, skont il-fa ċilitajiet tal-laboratorju. 
Sakemm ma jkunx di ġà nbeda matul il-perjodu tat-treddig ħ, dożaġġ dirett 
tal-irġiel u n-nisa F  1 magħżulin għandu jinbeda fil-ftim u jkompli 
san-nekropsija skedata, skont l-assenjament tal-koorti.  
29. Għal sustanzi kimi ċi mogħtijin permezz tad-dieta jew ilma tajjeb g ħax-xorb, 
importanti li ji ġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza kimika tat-test involuti 
ma jxekklux in-nutrizzjoni jew il-bilan ċ tal-ilma normali. Meta s-sustanza 
kimika tat-test ting ħata fid-dieta, jistg ħu jitħaddmu jew kon ċentrazzjoni 
djetetika kostanti (ppm) jew livell ta' do ża kostanti f'termini tal-pi ż 
tal-ġisem tal-annimal; l-g ħażla li ssir g ħandha tiġi speċifikata.  
30. Meta s-sustanza kimika tat-test ting ħata b'gavage, il-volum ta' likwidu 
mogħti f'darba normalment ma g ħandux jaqbe ż il-1 ml/100 g pi ż 
tal-ġisem (0,4 ml/100 g pi ż tal-ġisem huwa l-massimu g ħaż-żejt, eż., żejt 
tal-qamħirrun). Ħlief għal sustanzi kimi ċi irritanti jew korro żivi, li norm ­
alment juru effetti aggravat f'kon ċentrazzjonijiet og ħla, il-varjabbiltà 
fil-volum tat-test g ħandha ti ġi minimizzata billi ti ġi aġġustata 
l-konċentrazzjoni biex ji ġi żgurat volum kostanti fil-livelli kollha 
tad-doża. Il-kura g ħandha ting ħata f'ħinijiet simili ta' kull ġurnata. Norm ­
alment id-do ża lil kull annimal g ħandha tkun ibba żata fuq l-iktar deter ­
minazzjoni ri ċenti tal-pi ż tal-ġisem individwali u ti ġi aġġustata tal-inqas 
kull ġimgħa fl-irġiel adulti u n-nisa adulti mhux tqal, u kull jumejn f'nisa 
tqal u annimali F  1 meta ting ħata qabel il-ftim u matul il- ġimgħatejn ta' wara 
l-ftim. Jekk id-dejta dwar it-TK tindika trasferiment baxx tal-pla ċenta 
tas-sustanza kimika tat-test, id-do ża b'gavage matul l-a ħħar ġimgħa 
tat-tqala jista' jkollha b żonn tiġi aġġustata biex ji ġi evitat g ħoti ta' do ża 
tossika wisq lill-omm. In-nisa ma g ħandhomx ji ġu kkurati b'gavage, jew 
xi rotta o ħra tal-kura meta l-animal ikun je ħtieġ li jitqandel, dakinhar 
tal-ħlas; omissjoni tal-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test dakinhar hija ppre ­
feruta milli tfixkil tal-pro ċess tat-twelid.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Tgħammir  
31. Kull mara P g ħandha titqg ħed ma' ra ġel waħdu magħżul b'mod aleatorju u 
mhux relatat mill-istess grupp tad-do żaġġ (tlaqqig ħ 1:1) sakemm ti ġi 
osservata evidenza ta' kopulazzjoni jew wara li jg ħaddu ġimgħatejn. Jekk 
ma jkunx hemm bi żżejjed irġiel, pereżempju min ħabba mewt ta' r ġiel qabel 
it-tlaqqigħ, ir-raġel/l-irġiel li di ġà tgħammru jistg ħu jitlaqqg ħu (1:1) 
mat-tieni mara/nisa b'tali mod li n-nisa kollha jkunu tlaqqg ħu ma' raġel. 
Il-jum 0 tat-tqala huwa definit b ħala l-jum li fih ti ġi kkonfermata evidenza 
ta' tgħammir (jinstabu l-plakka va ġinali jew sperma). L-annimali g ħandhom 
jiġu separati malajr kemm jista' jkun wara li ti ġi osservata evidenza ta' 
kopulazzjoni. Jekk ma jkunx se ħħ tgħammir wara ġimgħatejn, l-annimali 
għandhom ji ġu separati ming ħajr ebda opportunità o ħra ta' tgħammir. Il-pari 
li jitgħammru għandhom ikunu identifikati b'mod ċar fid-dejta.  
Daqs tal-boton  
32. Fil-jum 4 wara t-twelid, id-daqs ta' kull boton jista' ji ġi aġġustat billi ji ġu 
eliminati l-frie ħ żejda permezz ta' g ħażla aleatorja b'tali mod li jirri żultaw, 
kemm jista' jkun, ħamest ir ġiel u ħames nisa g ħal kull boton. 
L-eliminazzjoni selettiva tal-frie ħ, eż., fuq il-ba żi tal-piż tal-ġisem, mhijiex 
xierqa. Mull meta n-numru ta' frie ħ irġiel jew nisa jipprevjeni milli jkun 
hemm ħamsa minn kull sess g ħal kull boton, huwa a ċċettabbli li jsir a ġġus­
tament parzjali (pere żempju, sitt ir ġiel u erba' nisa).  
L-għażla tal-frie ħ għall-istudji ta' wara l-ftim (ara l-Figura 1)  
33. Fil-ftim (madwar PND 21), jing ħażlu frieħ mill-boton kollha g ħad- 
dispożizzjoni sa 20 g ħal kull do ża u grupp ta' kontroll biex isiru iktar 
eżamijiet u dawn jin żammu sal-maturità sesswali (sakemm ma jkunx 
hemm bżonn li jsiru testijiet qabel). Il-frie ħ jingħażlu b'mod aleatorju, 
bl-eċċezzjoni li annimali mhux żviluppati (dawk b'pi ż tal-ġisem f'livell 
iktar minn żewġ devjazzjonijiet standard inqas mill-pi ż medju tal-frie ħ 
tal-boton rispettiv) ma g ħandhomx ikunu inklu żi, peress li huwa 
improbabbli li ser ikunu jirrappre żentaw il-grupp tal-kura.  
Fil-PND 21, il-frie ħ F 1 magħżulin jiġu assenjati b'mod aleatorju f'wa ħda 
mit-tliet koorti tal-annimali, kif ġej: 
Koorta 1 (1 A u 1B) == Ittestjar tat-tossi ċità riproduttiva/tal-i żvilupp,  
Koorta 2 (2 A u 2B) == Ittestjar tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp,  
Koorta 3 == Ittestjar tan-immunotossi ċità tal-iżvilupp.  
Koorta 1 A:: Ra ġel wieħed u mara/boton/grupp 1 (20/sess/grupp): g ħażla ta' 
prijorità g ħall-valutazzjoni primarja tal-effetti fuq is-sistemi riproduttivi u 
tat-tossiċità ġenerali.  
Koorta 1B:: Ra ġel wieħed u mara/boton/grupp 1 (20/sess/grupp): g ħażla ta' 
prijorità g ħal valutazzjoni ta' segwitu tal-prestazzjoni riproduttiva permezz 
ta' tgħammir ta' annimali F1, meta ji ġu vvalutati (ara d-Dokument ta' Gwida 
tal-OECD Nru 117(39)), u g ħall-kisba ta' dejta addizzjonali dwar 
l-istopatolo ġija f'każijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endokrinali suspettati, 
jew meta r-ri żulati mill-koorta 1 A jfixklu.  
Koorta 2 A:: Total ta' 20 fer ħ għal kull grupp (10 ir ġiel u 10 nisa g ħal kull 
grupp; raġel wieħed jew mara wa ħda għal kull boton) assenjati g ħal ittestjar 
tan-newrom ġiba segwit minn valutazzjoni tan-newroistopatolo ġija bħala 
adulti.  
Koorta 2B:: Total ta' 20 fer ħ għal kull grupp (10 ir ġiel u 10 nisa g ħal kull 
grupp; ra ġel wieħed jew mara wa ħda għal kull boton) assenjati g ħal valu­
tazzjoni tan-newroistopatolo ġija fil-ftim (PND 21 jew PND 22). Jekk ma 
jkunx hemm bi żżejjed annimali, g ħandha ting ħata preferenza l-assenjazzjoni 
tal-annimali fil-Koorta 2 A.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Koorta 3:: Total ta' 20 fer ħ għal kull grupp (10 ir ġiel u 10 nisa g ħal kull 
grupp; wie ħed/waħda għal kull boton, fejn possibbli). Jista' jkun hemm 
bżonn ta' frie ħ addizzjonali mill-grupp tal-kontroll biex ja ġixxu bħala 
annimali tal-kontroll po żittiv fl-assa ġġ tar-rispons tal-antikorpi dipendenti 
fuq iċ-ċellola T (TDAR) fil-PND 56 ± 3.  
34. Jekk ma jkunx hemm bi żżejjed frie ħ f'boton biex iservu l-koorti kollha, 
il-koorta 1 tie ħu preċedenza, peress li tista' tkun esti ża ħalli tipprodu ċi 
ġenerazzjoni F  2 . Jistgħu jiġu assenjati frie ħ addizzjonali fi kwalunkwe 
waħda mill-koorti f'ka ż ta' tħassib spe ċifiku, eż., jekk sustanza kimika 
tkun suspettata li hija newrotossikant jew tossikant riproduttiv. Dawn il-frieħ jistgħu jintużaw għal eżamijiet f'punti ta' żmien differenti jew 
għall-evalwazzjoni ta' punti a ħħarin supplementari. Il-frie ħ li ma ji ġux 
assenjati f'koorti ser ji ġu sottomessi g ħall-bijokimika klinika (paragrafu 
55) u nekropsija grossa (paragrafu 68).
 
It-tieni tg ħammir tal-annimali P  
35. Normalment it-tieni tg ħammir ma jkunx rakkomandat g ħall-annimali P, 
peress li jekk ise ħħ tintilef informazzjoni importanti fuq in-numru ta' siti 
ta' impjant (u b'hekk dejta ta' telf wara l-impjant u perinatali, indikaturi ta' potenzjal terato ġeniku possibbli) g ħall-ewwel boton. Il-b żonn li jiġi verifikat 
jew evidenzjat effett f'nisa esposti ji ġi ssodisfat a ħjar billi l-istudju ji ġi estiż 
ħalli jinkludi tg ħammir tal- ġenerazzjoni F
 1 . Madankollu, it-tieni tg ħammir 
tal-irġiel P ma' nisa mhux ikkurati dejjem huwa possibbiltà ħalli sejbiet 
ekwivoċi jiġu ċċarati jew g ħall-karatterizzazzjoni ulterjuri tal-effetti fuq 
il-fertilità osservati fl-ewwel tg ħammir.  
OSSERVAZZJONIJIET FIL- ĦAJJA  
Osservazzjonijiet klini ċi 
36. Għall-annimali P u dawk F  1 magħżulin, issir osservazzjoni klinika ġenerali 
darba kull jum. Fil-ka ż ta' dożaġġ b'gavage, it-twaqqit tal-osservazzjonijiet 
kliniċi għandu jkun qabel u wara d-do żaġġ (għal sinjali possibbli ta' 
tossiċità assoċjata mal-qu ċċata tal-kon ċentrazzjoni tal-pla żma). Bidliet 
pertinenti fl-im ġiba, sinjali ta' ħlas diffiċli jew imtawwal u s-sinjali kollha 
ta' tossiċità huma rre ġistrati. Darbtejn kuljum, u fi tmiem il- ġimgħa darba 
kuljum, l-annimali kollha ji ġu osservati g ħal tossiċità severa, morbidità u 
mortalità.  
37. Barra minn hekk, isir e żami iktar dettaljat tal-annimali P u F  1 kollha (wara 
l-ftim) fuq ba żi ta' kull ġimgħa u għal konvenjenza dan jista' jsir meta 
l-annimal jinti żen, b'tali mod li jitnaqqas l-istess marbut mat-tqandil. 
L-osservazzjonijiet g ħandhom isiru bir-reqqa u ji ġu rreġistrati billi 
jintużaw sistemi ta' punte ġġ li ġew definti mil-laboratorju ta' ttestjar. 
Għandom isiru sforzi biex ji ġi żgurat li varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet 
tat-test huma minimi. Is-sinjali osservati g ħandhom jinkludu, i żda 
mhumiex limitati g ħal, bidliet fil- ġilda, il-pil, l-g ħajnejn, il-membrani 
mukużi, l-okkorrenza ta' tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtonomika 
(eż., dmugħ, piloerezzjoni, daqs tal- ħabba, xejra respiratorja mhux 
tas-soltu). Bidliet fil-mixja, il-po żizzjoni, ir-rispons g ħat-tqandil, kif ukoll 
il-preżenza ta' movimenti kloni ċi jew toni ċi, sterotipija (e ż., traqqim 
eċċessiv, dawran ripetittiv) jew im ġiba stramba (e ż., awtomutilazzjoni, 
mixi lura) g ħandhom ji ġu rreġistrati wkoll.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Piż tal-ġisem u konsum ta' ikel/ilma  
38. L-annimali P jinti żnu fl-ewwel jum tad-do żaġġ u tal-inqas kull ġimgħa 
minn hemm 'il quddiem. Barra minn hekk, nisa P jinti żnu matul 
it-treddigħ fl-istess jiem b ħall-użin tal-frie ħ fil-boton tag ħhom (ara 
l-paragrafu 44). L-annimali F  1 kollha jinti żnu għalihom fil-ftim (PND 21) 
u tal-inqas darba fil- ġimgħa minn hemm 'il quddiem. Il-pi ż tal-ġisem jiġi 
rreġistrat ukoll dakinhar li jil ħqu l-pubertà (isse ħħ is-separazzjoni prepuzjali 
jew il-patenza va ġinali). L-annimali kollha jinti żnu fis-sagrifi ċċju. 
39. Matul l-istudju, il-konsum ta' ikel u ilma (fil-ka ż ta' għoti tas-sustanza 
kimika tat-test fl-ilma tajjeb g ħax-xorb) huma rre ġistrati tal-inqas darba 
fil-ġimgħa fl-istess jiem b ħala piżijiet tal-ġisem tal-annimal ( ħlief matul 
il-koabitazzjoni). Il-konsum ta' ikel ta' kull ga ġġa ta' annimali F  1 huwa 
rreġistrat kull ġimgħa b'bidu mill-g ħażla f'koorta rispettiva.  
Ċikli estru żi 
40. Informazzjoni preliminari dwar l-effetti relatati mas-sustanza kimika tat-test 
fuq iċ-ċiklu estru ż jaf diġà tkun disponibbli minn studji pre ċedenti dwar 
it-tossiċità b'doża ripetuta, u tista' tintu ża fit-tfassil ta' protokoll spe ċifiku 
għas-sustanza kimika tat-test g ħall-Istudju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' 
Ġenerazzjoni Wa ħda. Normalment, il-valutazzjoni ta ċ-ċikliċità estru ża 
(permezz ta' ċitoloġija vaġinali) ser tibda fil-bidu tal-perjodu tal-kura 
sal-konferma ta' tg ħammir jew fi tmiem il-perjodu ta' tg ħammir ta' 
ġimgħatejn. Jekk in-nisa tg ħarblu għal ċikli estrużi normali qabel il-kura, 
ikun utli li jkomplu jittie ħdu kampjuni hekk kif tinbeda l-kura, i żda jekk 
ikun hemm t ħassib dwar effetti mhux spe ċifiċi fil-bidu tal-kura (b ħal tnaqqis 
inizjali ċar fil-konsum ta' ikel), f'dak il-ka ż l-annimali jistg ħu jitħallew 
jadattaw g ħall-kura sa ġimgaħtejn qabel il-bidu tal-perjodu ta' kampjunar 
ta' ġimgħatejn li jwassal g ħat-tgħammir. Jekk il-perjodu ta' kura tan-nisa ji ġi 
estiż b'dan il-mod (ji ġifieri kura ta' qabel it-tg ħammir għal 4 ġimgħat), f'dak 
il-każ għandhom jittie ħdu f'kunsiderazzjoni x-xiri ta' annimali i żgħar u 
l-estensjoni tal-perjodu tal-kura fuq l-ir ġiel qabel it-tlaqqig ħ. Meta 
jinkisbu ċelloli vaġinali/ċervikali, g ħandha ting ħata attenzjoni sabiex ti ġi 
evitata disturbanza tal-muko ża u mbag ħad, l-induzzjoni tal-psewdotqala 
(10)(11).  
41. Il-kampjuni me ħudin mill-va ġina għandhom ji ġu eżaminati kuljum g ħan- 
nisa F  1 kollha fil-koorta 1 A, wara l-bidu tal-patenza va ġinali, sakemm 
jiġi rreġistrat l-ewwel kampjun keratinizzat, sabiex ji ġi ddeterminat 
l-intervall ta ż-żmien bejn i ż-żewġ avvenimenti. I ċ-ċikli estru żi għan-nisa 
F 1 kollha fil-koorta 1 A g ħandu jiġi ssorveljat ukoll g ħal perjodu ta' 
ġimgħatejn, b'bidu minn madwar il-PND 75. Barra minn hekk, jekk ikun 
hemm bżonn li jsir tg ħammir tal- ġenerazzjoni F  1 , iċ-ċitoloġija vaġinali 
fil-koorta 1B ser tkun segwita minn żmien it-tlaqqig ħ sakemm tinstab 
evidenza ta' tg ħammir.  
Tgħammir u tqala  
42. Minbarra l-punti a ħħarin standard (e ż., piż tal-ġisem, konsum ta' ikel, osser ­
vazzjonijiet klini ċi inklużi verifiki tal-mortalità/morbidità), ji ġu rreġistrati 
d-dati tat-tg ħammir, id-data ta' inseminazzjoni u d-data tal- ħlas u jiġu kkal­
kolati l-intervall ta' qabel l-att sesswali (tlaqqig ħ sal-inseminazzjoni) u 
d-durata tat-tqala (inseminazzjoni sal- ħlas). In-nisa P g ħandhom ji ġu 
eżaminati bir-reqqa fi żmien il-ħlas mistenni g ħal kwalunkwe sinjal ta' 
distoċja. Kwalunkwe anormalità fl-im ġiba tat-tibjit jew il-prestazzjoni 
tat-treddig ħ għandha tiġi rreġistrata.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Il-jum li fih ise ħħ il-ħlas huwa l-jum tat-treddig ħ 0 (LD 0) g ħall-omm u 
l-jum ta' wara t-twelid 0 (PND 0) g ħall-wild. Inkella, it-tqabbil kollha jista' 
jkun imsejjes fuq żmien ta' wara l-att sesswali biex ti ġi eliminata konfu żjoni 
ta' dejta tal-i żvilupp ta' wara t-twelid, min ħabba differenzi fid-durata 
tat-tqala; madankollu, it-twaqqit relatat mal- ħlas għandu jiġi rreġistrat 
ukoll. Dan huwa spe ċjalment importanti meta s-sustanza kimika tat-test 
teżerċita influwenza fuq id-durata tat-tqala.  
Parametri tal-ulied  
44. Kull boton g ħandu jiġi eżaminat malajr kemm jista' jkun wara l- ħlas (PND 
0 jew 1) biex ji ġu stabbiliti n-numru u s-sess tal-frie ħ, ulied imwielda 
mejtin, ulied imwielda ħajjin, u l-pre żenza ta' anomaliji grossi (anormal ­
itajiet estrenament vi żibbli, inklu żi palat maqsum; emorra ġiji taħt il-ġilda; 
kulur jew tonalità mhux tas-soltu tal- ġilda; preżenza tal-kurdun; nuqqas ta' 
ħalib fl-istonku; pre żenza ta' tnixxijiet nixfin). Barra minn hekk, l-ewwel 
eżami kliniku tan-neonati g ħandu jinkludi valutazzjoni kwalitattiva 
tat-temperatura tal- ġisem, l-istat tal-attività u r-reazzjoni g ħat-tqandil. 
Il-frieħ misjubin mejtin fil-PND 0 jew fi żmien iktar tard g ħandhom ji ġu 
eżaminati g ħal difetti u kaw żi tal-mewt possibbli. Il-frie ħ ħajjin jingħaddu u 
jintiżnu b'mod individwali fil-PND 0 jew PND 1, u b'mod regolari wara, 
eż., tal-inqas fil-PND 4, 7, 14, u 21. E żamijiet klini ċi, kif applikabbli g ħall- 
età tal-annimali, g ħandhom ji ġu ripetuti meta jinti żnu l-ulied, jew iktar spiss 
jekk isiru sejbiet spe ċifiċi għall-każ fit-twelid. Is-sinjali osservati jistg ħu 
jinkludu, i żda ma jistg ħux ikunu limitati g ħal, anormalitajiet esterni, 
bidliet fil- ġilda, il-pi ż, l-għajnejn, il-membrani muku żi, l-okkorrenza ta' 
tnixxijiet u eskrezzjonijiet u attività awtomatika. Bidliet fil-mixja, 
il-pożizzjoni, ir-rispons g ħat-tqandil, kif ukoll il-pre żenza ta' movimenti 
kloniċi jew toni ċi, sterjotipija jew im ġiba stramba, g ħandhom ji ġu rreġistrati 
wkoll.  
45. Id-distanza ano ġenitali (AGD) ta' kull fer ħ għandha titkejjel tal-inqas darba 
mill-PND 0 sal-PND 4. Il-pi ż tal-ġisem tal-frie ħ għandu jinġabar dakinhar li 
titkejjel l-AGD u l-AGD g ħandha tiġi normalizzata g ħal kejl tad-daqs 
tal-ferħ, idealment l-g ħerq kwadrat tal-pi ż tal-ġisem (12). Il-pre żenza ta' 
bżieżel/areoli fi frie ħ irġiel għandhom ji ġu verifikati fil-PND 12 jew 13.  
46. L-annimali F  1 kollha mag ħżulin huma evalwati kuljum g ħal separazzjoni 
balano-prepuzjali jew patenza va ġinali għall-irġiel/nisa rispettivament b'bidu 
qabel il-jum mistenni g ħall-kisba ta' dawn il-punti a ħħarin biex jinstab jekk 
maturità sesswali sse ħħx kmieni. G ħandha tittie ħed nota ta' kwalunkwe 
anormalità tal-organi ġenitali, b ħal ħajta vaġinali persistenti, ipospadija 
jew pene maqsum. Il-maturità sesswali tal-annimali F  1 titqabbel 
mal-iżvilupp fi żiku billi ji ġu determinati l-età u l-pi ż tal-ġisem 
fis-separazzjoni balano-prepuzjali jew il-ftu ħ vaġinali għall-irġiel/nisa rispet ­
tivament (13).  
Valutazzjoni tan-newrotossi ċità potenzjali tal-i żvilupp (koorti 2 A u 2B)  
47. Għaxar annimali r ġiel u 10 nisa tal-koorta 2 A u 10 annimali r ġiel u 10 nisa 
tal-koorta 2B, minn kull grupp tal-kura (g ħal kull koorta: ra ġel 1 jew mara 
1 għal kull boton; kull boton rappre żentat minn tal-inqas fer ħ 1; għażla 
aleatorja) g ħandhom jintu żaw għall-valutazzjonijiet tan-newrotossi ċità. 
L-annimali tal-koorta 2 A g ħandhom ikunu so ġġetti għal valutazzjonijiet 
tal-qatgħa awditorja, il-batterija osservazzjonali funzjonali, l-attività 
motorja (ara l-paragrafi 48-50), u n-newropatolo ġija (ara l-paragrafi 74- 
75). Għandhom isiru sforzi biex ji ġi żgurat li varjazzjonijiet 
fil-kundizzjonijiet kollha tat-test huma minimi u mhumiex sistematikament  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
relatati mal-kura. Fost il-varjabbli li jitsg ħu jaffettwaw l-im ġiba huma 
l-livell tal- ħoss (eż. storbju intermittenti), it-temperatura, l-umdità, id-dawl, 
l-irwejjaħ, il-ħin tal-ġurnata, u distrazzjonijiet ambjentali. Ir-ri żultati 
tal-assaġġi tan-newrotossi ċità għandhom ji ġu interpretati fir-rigward 
tal-meded stori ċi xierqa ta' referenza tal-kontroll. L-annimali tal-koorta 2B 
għandhom jintu żaw għall-valutazzjoni tan-newropatolo ġija fil-PND 21 jew 
PND 22 (ara l-paragrafi 74-75).  
48. Fil-PND 24 (± 1 jum) g ħandu jsir test ta' qatg ħa awditorja billi jintu żaw 
annimali fil-koorta 2 A. Il-jum tat-test g ħandu jkun kontrobilan ċjat bejn 
il-gruppi tal-kura u ta' kontroll. Kull sessjoni tikkonsisti f'50 prova. Fit-twettiq tat-test tal-qatg ħa awditorja, g ħandha ti ġi determinata 
l-amplitudni medja tar-rispons f'kull blokka ta' 10 provi (5 blokok ta' 10 
provi), bil-kundizzjonijiet tat-test ottimizzati ħalli tiġi prodotta drawwa bejn 
is-sessjonijiet. Dawn il-pro ċeduri għandhom ikunu konsistenti mal-metodu 
ta' ttestjar B.53 (35).
 
49. Fi żmien xieraq bejn il-PND 63 u l-PND 75, l-annimali tal-koorta 2 A ji ġu 
soġġetti għal batterija osservazzjonali funzjonali u test awtomatizzat 
tal-attività motorja. Dawn il-pro ċeduri għandhom ikunu konsistenti 
mal-metodi ta' ttestjar B.43 (33) u B.53 (35). Il-batterija osservazzjonali 
funzjonali tinkludi deskrizzjoni deskrizzjoni dettaljata tad-dehra, l-im ġiba 
u l-integrità funzjonali tas-su ġġett. Din hija vvalutata permezz ta' osser ­
vazzjonijiet fil-ga ġġa ta' oriġini, wara t-te ħid f'arena standard g ħal osser­
vazzjoni (fil-miftu ħ) fejn l-annimal ji ċċaqlaq b'libertà, u permezz ta' testijiet 
manipolattivi. It-testijiet g ħandhom jimxu mill-inqas sal-iktar interattivi. 
Lista ta' mi żuri hija ppre żentata fl-Appendi ċi 1. L-annimali kollha 
għandhom ji ġu osservati bir-reqqa minn osservaturi m ħarrġin li mhumiex 
konxji bl-istatus tal-kura tal-annimali, billi jintu żaw proċeduri standardizzati 
ħalli tiġi minimizzata l-varjabbiltà tal-osservaturi. Fejn possibbli, huwa 
rakkomandat li l-istess osservatur jevalwa l-annimali f'test partikolari. Jekk dan mhuwiex possibbli, hemm b żonn li tintwera l-affidabbiltà ta' 
bejn l-ossevaturi. G ħal kull parametru fil-batterija tal-ittestjar tal-im ġiba, 
għandhom jintu żaw gradi espli ċiti definiti b'mod operazzjonali u kriterji 
tal-punteġġ. Jekk possibbli, g ħandhom ji ġu żviluppati mi żuri kwantitattivi 
oġġettivi għal punti a ħħarin osservazzjonali, li jinvolvu klassifikazzjoni 
so
ġġettiva. G ħal attività motorja, kull annimali ji ġi ttestjat b'mod indi ­
vidwali. Is-sessjoni tat-test g ħandha tkun twila bi żżejjed biex tintwera 
drawwa bejn is-sessjonijiet g ħall-kontrolli. L-attività motorja g ħandha tiġi 
ssorveljata permezz ta' apparat awtomatizzat ta' re ġistrazzjoni tal-attività li 
għandu jkun kapa ċi jidentifika kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet fl-attività 
(jiġifieri l-attività ba żi kif imkejla mill-apparat ma g ħandhiex tkun baxxa 
wisq tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' tnaqqisiet, u lanqas g ħolja wisq 
tant li tipprekludi l-identifikazzjoni ta' żidiet fl-attivit). Kull apparat g ħandu 
jkun ittestjat permezz ta' pro ċeduri standard ħalli tiġi żgurata, kemm jista' 
jkun, l-affidabbiltà tal-operazzjoni bejn l-apparati u bejn il-jiem differenti. Kemm jista' jkun, il-gruppi tal-kura g ħandhom ikunu bbilan ċjati bejn 
l-apparati. Il-gruppi tal-kura g ħandhom ikunu kontrobilan ċjati bejn 
il-ħinijiet tat-test ħalli tiġi evitata konfu żjoni minħabba ritmi ċirkadjani ta' 
attività.
 
50. Jekk l-informazzjoni e żistenti tindika l-b żonn li jsir ittestjar funzjonali ie ħor 
(eż., sensorjali, so ċjali, konjittiv), dawn g ħandhom ji ġu integrati bla ma 
jikkompromettu l-integrità tal-evalwazzjonijiet l-o ħrajn li saru fl-istudju. 
Jekk dan l-ittestjar isir fl-istess annimali kif u żat għall-ittestjar tal-qatg ħa 
awditorja standard, il-batterija osservazzjonali funzjonali u l-attività motorja, 
għandhom ji ġu skedati testijiet differenti ħalli jiġi minimizzat ir-riskju ta' 
xekkil tal-integrità ta' dawn it-testijiet. Pro ċeduri supplementari jistg ħu 
jkunu partikolarment utli meta osservazzjoni empirika, effetti anti ċipati, 
jew il-mekkanistika/il-mod ta' azzjoni jindikaw tip sie ċifiku ta' newrotos ­
siċità. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Valutazzjoni tal-immunotossi ċità potenzjali tal-i żvilupp (koorta 3)  
51. Fil-PND 56 (± 3 ijiem), 10 annimali r ġiel u 10 nisa tal-koorta 3 minn kull 
grupp tal-kura (ra ġel 1 u mara 1 g ħal kull boton; il-boton kollha 
rappreżentati minn tal-inqas fer ħ wieħed; magħżulin b'mod aleatorju) 
għandhom jintu żaw f'assa ġġ tar-rispons tal-antikorpi b'dipendenza fuq i ċ- 
ċellola T, ji ġifieri r-rispons primarju tal-antikorpi IgM g ħal antiġen li 
jiddependi fuq i ċ-ċellola T, b ħal Ċelloli Ħomor tad-Demm 
tan-Nagħaġ (SRBC) jew Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), konsistenti 
ma' proċeduri kurrenti ta' ttestjar tal-immunotossitià (14)(15). Ir-rispons jista' 
jiġi evalwat permezz ta' g ħadd taċ-ċelloli speċifiċi li jifformaw plakka (PF) 
fil-milsa jew billi ji ġi determinat it-titru tal-antikorp IgM spe ċifiku għal 
SRBC jew KLH fis-serum minn ELISA, fl-og ħla livell tar-rispons. 
Ir-risponsi tipikament jil ħqu l-ogħla livell erba' (rispons tal-PFC) jew 
ħamest (ELISA) ijiem wara l-immunizzazzjoni ġol-vina. Jekk ir-rispons 
primarju tal-antikorpi ji ġi assaġġat permezz tal-g ħadd ta' ċelloli li 
jifformaw plakka, huwa permessibbli li ji ġu evalwati sottogruppi ta' 
annimali f'jiem separati, diment li: l-immunizzazzjoni u s-sagrifi ċċju 
tas-sottogruppi jsiru f' ċertu żmien b'tali mod li l-PFCs jing ħaddu fl-og ħla 
livelli tar-rispons; li s-sottogruppi jkun fihom numru ndaqs ulied ir ġiel u 
nisa mill-gruppi kollha tad-do ża, inklużi kontrolli; u li s-sottogruppi huma 
evalwati f'bejn wie ħed u ieħor l-istess età ta' wara t-twelid. L-esponiment 
għas-sustanza kimika tat-test ikompli sal-jum ta' qabel il- ġbir tal-milsa g ħar- 
rispons tal-PFC jew is-serum g ħall-assaġġ tal-ELISA.  
Valutazzjoni ta' segwitu tat-tossi ċità riproduttiva potenzjali (koorta 1B)  
52. L-annimali tal-koorta 1B jistg ħu jinżammu fil-kura wara l-PND 90 u 
jitgħammru wkoll sabiex tinkiseb ġenerazzjoni F  2 jekk ikun hemm b żonn. 
L-irġiel u n-nisa tal-istess grupp tad-do ża għandhom ikunu koabitati (biex 
jiġi evitat tlaqqig ħ ta' aħwa) għal massimu ta' ġimgħatejn, li jibdew 
mill-PND 90 jew wara, i żda mhux wara mill-PND 120. Il-pro ċeduri 
għandhom ikunu simili g ħal dawk g ħall-annimali P. Madankollu, fuq 
il-bażi ta' piż tal-evidenza, jista' jkun bi żżejjed li l-boton ji ġu terminati 
fil-PND 4 minflok ma jkunu segwiti sal-ftim jew iktar.  
OSSERVAZZJONIJIET TERMINALI  
Bijokimika klinika/Ematolo ġija 
53. L-effetti sistemi ċi għandhom ji ġu ssorveljati fl-annimali P. Il-kampjuni 
tad-demm wara sawm minn siti definit jittie ħdu minn g ħaxart irġiel u 
nisa P mag ħżulin b'mod aleatorju g ħal kull grupp tad-do ża 
fit-terminazzjoni, jin ħażnu f'kundizzjonijiet xierqa u ji ġu soġġetti għal 
ematoloġija parzjali jew fuq skala s ħiħa, bijokimika klinika, assa ġġ tat-T4 
u t-TSH jew e żamijiet o ħrajn issuġġeriti mill-profil tal-effetti mag ħruf 
tas-sustanza kimika tat-test (ara d-Dokument ta' Gwida tal-OECD 
Nru 151(40)). Il-parametri ematolo ġiċi li ġejjin għandhom ji ġu eżaminati: 
ematokrit, kon ċentrazzjoni ta' emoglobina, g ħadd tal-eritro ċita, għadd totali 
u differenzjali tal-lewko ċita, għadd tal-pjastrini u ħin/potenzjal ta' g ħoqiedi 
tad-demm. Investigazzjonijiet ta' pla żma jew serum g ħandhom jinkludu: 
glukożju, kolesterol totali, urea, kreatinina, proteina totali, albumina u 
tal-inqas żewġ enżini li jindikaw effetti epato ċellolari (b ħal alanina aminot ­
rasferasi, aspartati aminotrasferasi, alkalina fosfatasi, gamma glutamil trans ­
peptidasi u sorbitol deidro ġenasi). Il-kejliet ta' en żimi u aċidi biljari 
addizzjonali jistg ħu jipprovdu informazzjoni utli f' ċerti ċirkustanzi. Barra 
minn hekk, jista' jittie ħed demm mill-annimali kollha u dan g ħandu 
jinħażen għal analiżi possibbli iktar tard biex jg ħin ħalli jiġu ċċarati 
effetti ekwivokali jew sabiex ti ġi ġġenerata dejta dwar l-esponiment 
intern. Jekk ma jkunx se jsir it-tieni tg ħammir tal-annimali P, il-kampjuni 
tad-demm jittie ħdu eżatt qabel il-pro ċedura fis-sagrifi ċċju skedat, jew b ħala ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
parti minnha. F'ka ż li l-annimali jin żammu, il-kampjuni tad-demm g ħadhom 
jinġabru ftit jiem qabel ma l-annimali jitg ħammru għat-tieni darba. Sakemm 
id-dejta e żistenti minn studji b'do ża ripetuta ma jindikawx li l-parametru 
mhuwiex affettwat mis-sustanza kimika tat-test, g ħandha ssir urinali żi qabel 
it-terminazzjoni u g ħandhom ji ġu evalwati l-parametri li ġejin: id-dehra, 
il-volum, l-o żmolalità jew il-gravità spe ċifika, il-pH, il-proteina, 
il-glukożju, id-demm u ċ-ċelloli tad-demm, il-fdalijiet ta ċ-ċelloli. L-urina 
tista' tinġabar ukoll biex ti ġi ssorveljata l-eskrezzjoni tas-sustanza kimika 
tat-test u/jew il-metabolita/i.  
54. L-effetti sistemi ċi għandhom ji ġu ssorveljati wkoll fl-annimali F  1 . Kampjuni 
tad-demm wara sawm minn sit definit jittie ħdu minn g ħaxart irġiel u nisa 
magħżulin b'mod aleatorju mill-koorta 1 A g ħal kull do ża tal-grupp 
fit-terminazzjoni, jin ħażnu fil-kundizzjonijiet xierqa u ji ġu soġġetti għal 
bijokimika klinika standard, inklu ża l-valutazzjoni tal-livelli tas-serum 
għal ormoni tat-tirojde (T4 u TSH), ematolo ġija (għadd totali u differenzjali 
tal-lewko ċite flimkien mal-eritro ċite) u valutazzjonijiet tal-urinali żi. 
55. Il-frie ħ żejda fil-PND 4 huma so ġġetti għal nekropsija grossa u ting ħata 
kunsiderazzjoni g ħall-kejl tal-kon ċentrazzjonijiet tas-serum fl-ormon 
tat-tirojde (T4). Jekk ikun hemm b żonn, id-demm ta' dawk li jkunu 
għadhom kif twieldu (PND 4) jista' jin ġabar skont il-boton g ħal analiżijiet 
bijokimiċi/tal-ormon tat-tirojde. Id-demm jin ġabar ukoll g ħal analiżi tat-T4 
u t-TSH mill-frie ħ li għadhom kif infatmu so ġġetti għal nekropsija grossa 
fil-PND 22 (frie ħ F 1 mhux mag ħżulin għal koorti).  
Parametri tal-isperma  
56. Il-parametri tal-isperma g ħandhom jitkejlu fl-ir ġiel kollha tal- ġenerazzjoni P 
sakemm ma jkunx hemm dejta e żistenti x'turi li l-parametri tal-isperma 
mhumiex affettwati fi studju ta' 90 jum. E żami tal-parametri tal-isperma 
għandu jsir fl-ir ġiel kollha tal-koorta 1 A.  
57. Fit-terminazzjoni, il-pi żijiet tat-testikoli u tal-epididimi ji ġu rreġistrati għall- 
irġiel P u F  1 (koorta 1 A) kollha. Tal-inqas testikola wa ħda u epididima 
waħda jinżammu għal eżami istopatolo ġiku. L-epididima li jfidal tintu ża 
għal enumerazzjoni tar-ri żervi tal-isperma tal-epididima cauda (16)(17). 
Barra minn hekk, l-isperma mill-epididima auda (jew vas deferens) tinġabar billi jintu żaw il-metodi li jnaqqsu l- ħsara għall-evalwazzjoni 
tal-motilità u l-morfolo ġija tal-isperma (18).
 
58. Il-motilità tal-isperma tista' jew ti ġi evalwata minnufih wara s-sagrifi ċċju 
jew inkella ti ġi rreġistrata għal analiżi iktar tard. Il-per ċentwal ta' sperma 
motili b'mod progressiv jista' ji ġi determinat jew b'mod so ġġettiv jew 
oġġettiv permezz ta' anali żi taċ-ċaqliq assistita bil-kompjuter 
(19)(20)(21)(22)(23)(24). G ħall-evalwazzjoni tal-morfolo ġija tal-isperma, 
kampjun tal-isperma epididimali (jew vas deferens) g ħandu jiġi eżaminat 
bħala preparazzjonijiet fissi jew imxaarrbin (25) u tal-inqas 200 sper ­
matożoa għal kull kampjun g ħandhom ji ġu klassifikti jew b ħala normali 
(kemm ir-ras u l-bi ċċa tan-nofs/id-denb jidhru normali) jew inkella 
anormali. E żempji ta' anormalitajiet morfolo ġiċi tal-isperma jinkludu 
fużjoni, irjus i żolati, u rjus u/jew dnub sfigurati (26). Irjus tal-isperma 
sfigurati jew kbar jistg ħu jindikaw difetti fl-ispermjazzjoni.  
59. Jekk il-kampjuni tal-isperma jkunu ffri żati, il-kampjuni fissati u 
l-immaġnijet għall-analiżi tal-motilità tal-isperma ji ġu rreġistrati fil- ħin 
tan-nekropsija (27), anali żi sussegwenti tista' tkun ristretta g ħal irġiel 
tal-kontroll u dawk ta' do ża għolja. Madankollu, jekk ji ġu ossrevati effetti 
relatati mal-kura, il-gruppi ta' do ża inqas ikollhom ji ġu evalwati wkoll.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Nekropsija grossa  
60. Fi żmien it-terminazzjoni jew il-mewt prematura, l-annimali P u F  1 kollha 
jiġu nekropsjati u e żaminati b'mod mikroskopiku g ħal kwalunkwe anomalità 
strutturali jew bidla patolo ġika. Għandha ting ħata attenzjoni partikolari 
għal-organi tas-sistema riproduttiva. Il- ħrief li jinqatlu b'mod dinjitu ż f'kun­
dizzjoni moribonda u l- ħrief mejtin g ħandhom ji ġu rreġistrati u, meta jkunu 
għadhom sħaħ, jiġu eżaminati g ħal difetti possibbli u/jew kaw ża tal-mewt u 
jinżammu.  
61. Għal nisa P u F  1 adulti, kampjun va ġinali jiġi eżaminat dakinhar 
tan-nekropsija biex ji ġi determinat l-istadju ta ċ-ċiklu estru ż u tkun tista' 
ssir korrelazzjoni mal-istopatolo ġija fl-organi riproduttivi. L-utri tan-nisa P 
kollha (u n-nisa F  1 , jekk applikabbli) ji ġu eżaminati g ħall-preżenza u 
n-numru ta' siti tal-impjant, b'tali mod li ma jxekkilx l-evalwazzjoni istopa ­
toloġika. 
Piż tal-organi u preservazzjoni tat-tessuti — annimali adulti P u F  1 
62. Fil-ħin tat-terminazzjoni, il-pi żijiet tal-ġisem u l-pi żijiet imxarrbin tal-organi 
elenkati hawn ta ħt mill-annimali P kollha u l-adulti F  1 kollha, minn koorti 
rilevanti (kif spjegat hawn ta ħt), huma determinati malajr kemm jista' jkun 
wara d-dissezzjoni sabiex ji ġi evitat milli jinxfu. Imbag ħad, dawn l-organi 
għandhom ji ġu ppreservati fil-kundizzjonijiet xierqa. Sakemm ma jkunx 
speċifikat mod ie ħor, l-organi f'pari jistg ħu jintiżnu b'mod individwali jew 
flimkien, b'mod konsistenti mal-prattika tipika tal-laboratorju li jag ħmel 
ix-xogħol. 
— Utru (b'kanali salovarji u ċerviċi), ovarji,  
— Testikoli, epididimidi (total u cauda g ħall-kampuni u żati għall-għadd 
tal-isperma),  
— Prostata (il-partijiet dorsolaterali u ventrali f'daqqa). G ħandha ting ħata 
attenzjoni meta jinqatal-kumpless tal-prostata biex ji ġi evitat titqib 
tan-nuffati seminali mimlijin fluwidu. Fil-ka ż ta' effett relatat mal-kura 
fuq il-pi ż totali tal-prostata, is-segmenti dorsolaterali u ventrali 
għandhom ji ġu dissezzjonati bir-reqqa wara l-fissazzjoni, u g ħandhom 
jintiżnu b'mod separat,  
— Nuffati seminali bi glandoli koagulanti u l-fluwidi tag ħhom (bħala unità 
waħda), 
— Moħħ, fwied, kliewi, qalb, milsa, il-glandoli tat-timu, pitwitarja, 
tat-tirojde (wara l-fissazzjoni), adrenali u l-organi jew it-tessuti fil-mira magħrufin.
 
63. Minbarra l-organi elenkati hawn fuq, kampjuni ta' nerv periferali, muskolu, 
sinsla tad-dahar, g ħajn flimkien man-nerv ottiku, apparat gastrointestinali, 
apparat tal-urina, pulmun, trakea (bit-tirojde u l-paratirojde mqabbdin), 
mudullun tal-g ħadam, vas deferens (ir ġiel), glandola tal- ħalib (irġiel u 
nisa) u va ġina għandhom ji ġu ppreservati f'kundizzjonijiet xierqa.  
64. L-organi kollha tal-annimali tal-koorta 1 A ser jinti żnu u ser ji ġu ppreservati 
għal istopatolo ġija. 
65. Għall-investigazzjoni ta' effetti immunotossi ċi kkaġunati qabel u wara 
t-twelid, 10 annimali r ġiel u 10 nisa mill-koorta 1 A minn kull grupp 
tal-kura (ra ġel wieħed jew mara wa ħda għal kull boton; il-boton kollha 
rappreżentati minn tal-inqas fer ħ 1; għażla aleatorja) ser ikunu so ġġetti 
għal dan li ġej fit-terminazzjoni:  
— ser jinti żnu n-nodi tal-limfa asso ċjati ma' u distanti mir-rotta ta' 
esponiment (minbarra l-pi ż tal-glandoli adrenali, it-timu u l-milsa, li 
diġà sar fl-annimali kollha tal-koorta 1 A),  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analiżi tal-limfo ċite splenika tas-sottopopolazzjoni (limfo ċiti T, limfo ċiti 
B ta' CD4+ u CD8+ u ċelloli qattiela naturali) billi jintu ża nofs il-milsa, 
bin-nofs l-ie ħor tal-milsa jin żamm għal evalwazzjoni istopatolo ġika. 
Analiżi tas-sottopopolazzjoni tal-limfo ċite splenika f'annimali mhux 
immunizzati (koorta 1 A) ser tiddetermina jekk l-esponiment huwiex 
relatat ma' bidla fid-distribuzzjoni immunolo ġika fi stat kostanti ta' 
limfoċiti “li jgħinu” (CD4+) jew ċitotossiċi (CD8+) li ġejjin mit-timu jew 
ċelloli qattiela naturali (NK) (risponsi rapidi g ħal ċelloli neoplasti ċi u pato­ 
ġeni). 
66. Għall-annimali tal-koorta 1B, g ħandhom jinti żnu l-organi li ġejjin u ji ġu 
pproċessati għall-istadju tal-blokk it-tessuti korrispondenti li ġejjin:  
— Vaġina (ming ħajr ma tinti żen), 
— Utru bi ċ-ċerviċi, 
— Ovarji,  
— Testikoli (tal-inqas wa ħda), 
— Epididimidi,  
— Nuffati seminali u glandoli koagulanti,  
— Prostata,  
— Pitwitarja,  
— Organi fil-mira identifikati.  
L-istopatolo ġija fil-koorta 1B issir jekk ir-ri żultati mill-koorta 1 A jo ħolqu 
ekwivoku jew f'ka żijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endokrinali ssuspettati.  
67. Il-koorti 2 A u 2B: Ittestjar tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp (PND 21 jew 
PND 22 u ulied adulti). L-annimali tal-koorta 2 A huma terminati wara 
ttestjar tal-im ġiba, bil-pi ż tal-moħħ irreġistrat u newroistopatolo ġija sħiħa 
għal skopijiet ta' valutazzjoni tan-newrotossi ċità. L-annimali tal-koorta 2B 
huma terminati fil-PND 21 jew PND 22, bil-pi ż tal-moħħ irreġistrat u eżami 
mikroskopiku tal-mo ħħ għal finijiet tal-valutazzjoni tan-newrotossi ċità. 
Il-fissazzjoni tal-perfu żjoni hija me ħtieġa għall-annimali tal-koorta 2 A u 
fakultattiva g ħal annimali tal-koorta 2B, kif stipulat fil-metodu ta' ttestar 
B.53 (35).  
Piż tal-organi u preservazzjoni tat-tessuti — Annimali F  1 miftumin  
68. Il-frie ħ mhux mag ħżulin għal koorti, inklu żi frieħ żgħar wisq, huma 
terminati wara l-ftim, fil-PND 22, sakemm ir-ri żultati ma jindikawx 
il-bżonn ta' iktar investigazzjonijiet matul il- ħajja. Il-frie ħ terminati huma 
soġġetti għal nekropsija grossa inklu ża valutazzjoni tal-organi riproduttivi, 
kif deskritti fil-paragrafi 62 u 63. G ħal massimu ta' 10 frie ħ għal kull sess 
għal kull grupp, minn kemm jista' jkun boton, il-mo ħħ, il-milsa, u t-timu 
għandhom jinti żnu u jinżammu f'kundizzjonijiet xierqa. Barra minn hekk, 
it-tessuti mammarji g ħal dawn il-frie ħ irġiel u nisa jistg ħu jiġu ppreservati 
għal analiżijiet mikroskopi ċi ulterjuri (  1 ) (ara d-Dokument ta' Gwida 
tal-OECD Nru 151 (40)). L-anomalitajiet grossi u t-tessuti fil-mira għandhom jin żammu għal eżami istolo ġiku possibbli.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Ir-riċerka wriet li l-glandola tal- ħalib, spe ċjalment fl-i żvilupp tal-glandola tal- ħalib 
fil-ħajja bikrija, hija punt a ħħari sensittiv g ħal azzjoni estro ġena. Huwa rakkomandat 
li, meta jkunu validati, f'dan il-metodu ta' ttestjar g ħandhom ikunu inklu żi l-punti 
aħħarin li jinvolvu l-glandoli tal- ħalib tal-frie ħ taż-żewġ sessi.
 Istopatolo ġija — annimali P  
69. Istopatolo ġija sħiħa tal-organi elenkati fil-paragrafi 62 u 63 issir g ħall- 
annimali P kollha tad-do ża għolja u ta' kontroll. L-organi li juru bidliet 
relatati mal-kura g ħandhom ji ġu eżaminati fl-annimali kollha fil-gruppi ta' 
doża inqas sabiex jg ħinu fid-determinazzjoni ta' NOAEL. Barra minn hekk, 
l-organi riproduttivi tal-annimali kollha ssuspettati b'fertilità mnaqqsa, e ż., 
dawk li naqsu milli jitg ħammru, iwelldu, inisslu, jew iwelldu wlied b'sa ħ­ 
ħithom, jew li g ħalihom ġew affettwati ċ-ċikliċità estrużi jew in-numru, 
il-motilità, jew il-morfolo ġija tal-isperma u l-le żjonijiet gross kollha 
għandhom ikunu so ġġetti għal evalwazzjoni istopatolo ġika. 
Istopatolo ġija — Annimali F  1 
Annimali tal-koorta 1  
70. Issir istopatolo ġija sħiħa tal-organi elenkati fil-paragrafi 62 u 63 g ħall- 
annimali adulti kollha ta' do ża għolja u tal-kontroll mill-koorta 1 A. 
Il-boton kollha g ħandhom ikunu rappre żentanti minn tal-inqas fer ħ 1 għal 
kull sess. L-organi u t-tessuti li juru bidliet relatati mal-kura u l-le żjonijiet 
gross kollha g ħandhom ikunu e żaminati fl-annimali kollha fil-gruppi ta' 
doża inqas biex jg ħinu fid-determinazzjoni ta' NOAEL. G ħall-evalwazzjoni 
ta' effetti kka ġunati qabel u wara t-twelid fuq organi limfojdi, g ħandha tiġi 
evalwata wkoll l-istopatolo ġija ta' 10 annimali r ġiel u 10 nisa mill-koorta 1 
A fuq in-nodi tal-limfa u l-mudullun tal-g ħadam mi ġburin wara 
l-evalwazzjoni istopatolo ġika tat-timu, il-milsa, u l-glandoli adrenali li 
diġà saret fl-annimali 1 A kollha.  
71. Tessuti riproduttivi u endokrinali mill-annimali kollha tal-koorta 1B, ippro ­ 
ċessati għall-istadju tal-blokk kif spjegat fil-paragrafu 66, g ħandhom ji ġu 
eżaminati g ħal istopatolo ġija f'każijiet ta' tossikanti riproduttivi jew endok ­
rinali ssuspettati. Il-koorta 1B g ħandu jsirilha wkoll e żami istolo ġiku jekk 
ir-riżultati mill-koorta 1 A jo ħolqu ekwivoku.  
72. L-ovarji ta' nisa adulti g ħandu jkun fihom follikoli primordjali u li qed 
jikbru, kif ukoll corpora lutea; g ħalhekk, e żami istopatolo ġiku għandu 
jkollu l-għan li jidentifika evalwazzjoni kwantitattiva tal-follikoli primordjali 
u oħrjan żgħar li qed jikbru, kif ukoll corpora lutea, f'nisa F  1 ; in-numru ta' 
annimali, l-g ħażla tas-sezzjoni tal-ovarji, u d-daqs tal-kampjun tas-sezzjoni 
għandhom ikunu statistikament xierqa g ħall-proċedura ta' evalwazzjoni 
użata. L-enumerazzjoni follikolari tista' ssir g ħall-ewwel fuq annimali 
tal-kontroll u ta' do ża għolja, u fil-ka ż ta' effett avvers f'dawn tal-a ħħar, 
għandhom ji ġu eżaminati do żi inqas. L-e żami għandu jinkludi enumer ­
azzjoni tan-numru ta' follikoli primordjali, li jista' jing ħaqad ma' follikoli 
żgħar li qed jikbru, g ħat-tqabbil ta' ovarji kkurati u tal-kontroll (ara 
d-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 151 (40)). Il-valutazzjoni tal-corpora lutea g ħandha ssir b'mod parallel mal-ittestjar ta ċ-ċikliċità 
estruża sabiex l-istadju ta ċ-ċiklu jkun jista' jittie ħed f'kunsiderazzjoni 
fil-valutazzjoni. Il-kanal salovarju, l-utru u l-va ġina jiġu eżaminati g ħal 
żvilupp xieraq tipiku tal-organi.
 
73. Eżamijiet dettaljati tal-itsopatolo ġija testikolari jsiru fuq l-ir ġiel F  1 sabiex 
jiġu identifikati effetti relatati mal-kuar fuq id-differenzazzjoni u l-i żvilupp 
tat-testikoli u fuq l-ispermato ġenesi (38). Meta jkun possibbli, g ħandhom 
jiġu eżaminati sezzjonijiet tax-xibka testikolari. Caput, corpus, u cauda 
tal-epididimi u l-vas deferens ji ġu eżaminati g ħal żvilupp xieraq tipiku 
tal-organi, kif ukoll g ħall-parametri me ħtieġa għall-irġiel P.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Annimali tal-koorta 2  
74. Issir newroistopatolo ġija għall-annimali kollha ta' do ża għolja u tal-kontroll 
tal-koorta 2 A g ħal kull sess wara li jitlesta l-ittestjar tan-newrom ġiba (wara 
PND 75, i żda mhux wara PND 90). L-istopatolo ġija tal-mo ħħ issir għall- 
annimali kollha ta' do ża għolja u tal-kontroll tal-koorta 2B g ħal kull sess 
fil-PND 21 jew PND 22. L-organi jew it-tessuti li juru bidliet relatati mal-kura g ħandhom ji ġu eżaminati wkoll g ħall-annimali fil-gruppi ta' 
doża inqas biex tit ħaffef id-determinazzjoni ta' NOAEL. G ħall-annimali 
tal-koorta 2 A u 2B, ji ġu eżaminati bosta sezzjonijiet mill-mo ħħ biex 
ikun jista' jsir e żami tal-basal olfattivi, il-korti ċi ċerebrali, l-ippokampu, 
il-gangliji tal-ba żi, it-talamu, l-ipotalamu, il-me żenċefalu (tekum, 
tegmentum, u pendunkuli ċerebrali), iz-zokk en ċefaliku u ċ-ċervellett. 
Għall-koorta 2 A biss, ji ġu eżaminati l-g ħajnejn (ir-retina u n-nerv ottiku) 
u kampjuni ta' nerv periferiku, muskolu u sinsla tad-dahar. Il-pro ċeduri 
newroistolo ġiċi kollha g ħandhom ikun konsistenti mal-metodu ta' ttestjar 
B.53 (35).
 
75. Għandhom isiru evalwazzjonijiet morfometri ċi (kwantitattivi) fuq żoni 
rappreżentattivi tal-mo ħħ (sezzjonijiet omologi mag ħżulin bir-reqqa fuq 
il-bażi ta' punti mikroskopi ċi ta' riferiment affidabbli) u jistg ħu jinkludu 
kejliet lineari u/jew areali ta' re ġjuni speċifiċi tal-moħħ. Għandhom 
jittieħdu tal-inqas tliet sezzjonijiet konsekuttivi f'kull punt ta' riferiment 
(livell) sabiex ting ħażel l-iktar sezzjoni omologa u rappre żentattiva g ħaż- 
żona speċifika tal-mo ħħ li ser ti ġi evalwata. In-newropatolo ġist għandu 
jeżerċita ġudizzju xieraq dwar jekk it-taqsimiet im ħejjin għall-kejl humiex 
omologi ma' o ħrajn fis-sett tal-kampjun u g ħaldaqstant, xierqa g ħal 
inklużjoni, peress li l-kejliet lineari b'mod partikolari jistg ħu jinbidlu fuq 
distanza relattivament qasira (28). Ma g ħandhomx jintu żaw sezzjonijiet 
mhux omologi. Filwaqt li l-g ħan huwa li jittie ħed kampjun tal-annimali 
kollha ri żervati għal dan l-g ħan (10/sess/livell tad-do ża), numri inqas 
xorta jistg ħu jkunu adegwati. Madankollu, kampjuni minn inqas minn 6 
annimali/sess/livell tad-do ża ġeneralment ma jitqisux bi żżejjed għall- 
finijiet ta' dan il-metodu ta' ttestjar. L-istereolo ġija tista' tintu ża biex tiden ­
tifika effetti relatati mal-kura fuq parametri b ħall-volum jew in-numru ta' 
ċelloli għar-reġjuni newroanatomi ċi speċifiċi. L-aspetti kollha tat-t ħejjija 
tal-kampjuni tat-tessuti, mill-fissazzjoni tat-tessuti, sad-dissezzjoni 
tal-kampjuni tat-tessuti, l-ippro ċessar tat-tessuti, u t-tilwin tas-slides, 
għandhom i ħaddmu disinn kontrobilan ċjat, b'tali mod li kull lott ikun fih 
kampjuni rappre żentattivi minn kull grupp tad-do ża. Meta jkunu ser 
jintużaw anali żijiet morfometri ċi jew stereolo ġiċi, it-tessut tal-mo ħħ 
għandu jitqieg ħed fil-midjums xierqa fil-livelli tad-do ża kollha fl-istess 
ħin sabiex ji ġu evitati ti ċkin tal-oġġetti assoċjat ma' ħżin prolungat f'fiss ­
attiv.  
RAPPORTAR  
Dejta  
76. Id-dejta ti ġi rrapportata b'mod individwali u tin ġabar fil-qosor f'forma ta' 
tabelli. Fejn xieraq, g ħal kull grupp tat-test u kull ġenerazzjoni, g ħandhom 
jiġu rrapportati dawn i ġejjin: in-numru ta' annimali fil-bidu tat-test, 
in-numru ta' annimali misjubin mejtin matul it-test jew inqatlu g ħal 
raġunijiet umanitarji, il- ħin ta' kwalunkwe mewta jew qtil umanitarju, 
in-numru ta' annimali fertili, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' nisa li qed iwelldu boton, u n-numru ta' annimali li qed juru sinjali ta' tossi ċità. 
Għandha tiġi rrapportata wkoll deskrizzjoni tat-tossi ċità, inklu żi l-ħin 
tal-bidu, id-durata u s-severità.
 
77. Ir-ri żultati numeri ċi għandhom ji ġu rrapportati permezz ta' metodu statistiku 
xieraq u a ċċettat. Il-metodi statisti ċi għandhom jing ħażlu bħala parti 
mid-disinn tal-istudju u g ħandhom jindirizzaw kif xieraq dejta mhux 
normali (e ż., dejta tal-g ħadd), dejta ċċensurata (e ż., ħin ta' osservazzjoni 
limitat), nuqqas ta' indipendenza (e ż., effetti tal-boton u mi żuri ripetuti) u  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
varjanzi mhux indaqs. Mudelli m ħalltin lineari ġeneralizzati u mudelli ta' 
rispons għad-doża jkopru klassi wiesg ħa ta' għodod analiti ċi li jistgħu jkunu 
xierqa għad-dejta ġġenerata f'dan il-metodu ta' ttestjar. Ir-rapport g ħandu 
jinkludi bi żżejjed informazzjoni dwar il-metodu ta' anali żi u l-programm 
tal-kompjuter u żat, sabiex statitsiku/revi żur indipendenti jkun jista' jevalwa/ 
jerġa' jevalwa l-anali żi. 
Evalwazzjoni tar-ri żultati  
78. Is-sejbiet g ħandhom ji ġu evalwati f'termini tal-effetti osservati, inklu żi 
sejbiet mikroskopi ċi u fin-nekropsija. L-evalwazzjoni tinkludi r-relazzjoni, 
jew in-nuqqas tag ħha, bejn id-do ża u l-pre żenza, l-in ċidenza u s-severità 
tal-anormalitajiet, inklu żi leżjonijiet grossi. G ħandhom ji ġu vvalutati wkoll 
l-organi fil-mira, il-fertilità, l-anormalitajiet klini ċi, il-prestazzjoni ripro ­
duttiva u tal-boton, il-bidliet fil-pi ż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe 
effett tossiku u tal-i żvilupp ieħor. Għandha ting ħata attenzjoni spe ċjali lil 
bidliet spe ċifiċi għas-sess. Il-proprjetajiet fi żikokimiċi tas-sustanza kimika 
tat-test, u meta disponibbli, dejta dwar it-TK, inklu żi t-trasferiment 
plaċentali u l-eskrezzjoni tal- ħalib, għandhom ji ġu kkunsidrati wkoll meta 
jiġu evalwati r-ri żultati tat-test.  
Rapport tat-test  
79. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja miksuba f'dan 
l-istudju minn annimali P, F  1 u annimali F  2 (fejn rilevanti):  
Sustanza kimika tat-test:  
— L-informazzjoni rilevanti disponibbli kollha dwar il-proprjetajiet kimi ċi, 
tossikokineti ċi u tissikodinami ċi tas-sustanza kimika tat-test,  
— Id-dejta ta' identifikazzjoni,  
— Il-purità.  
Veikolu (jekk xieraq):  
— Il-ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-veikolu jekk mhuwiex ilma.  
Annimali tat-test:  
— L-ispe ċi/ir-razza u żati, 
— In-numru, l-età u s-sess tal-annimali,  
— Is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, il-materjali 
tat-tibjit, e ċċ., 
— Il-piżijiet individwali tal-annimali fil-bidu tat-test,  
— Dejta dwar il-kampjun va ġinali għal nisa P qabel tinbeda l-kura (jekk 
id-dejta tin ġabar f'dak i ż-żmien),  
— Rekords dwar it-tlaqqig ħ tal-ġenerazzjoni P li jindikaw is-sie ħeb u 
s-sieħba li tgħammru u s-su ċċess tat-tgħammir,  
— Rekords dwar il-boton ta' ori ġini għall-annimali adulti tal- ġenerazzjoni 
F 1 . 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— Ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-livell tad-do ża, 
— Dettalji tal-formulazzjoni tas-sustanza kimika tat-test/preparazzjoni 
tad-dieta, il-kon ċentrazzjonijiet miksubin,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— L-istabbiltà u l-omo ġenità tal-preparazzjoni fil-veikolu jew it-trasportatur 
(eż., dieta, ilma tajjeb g ħax-xorb), fid-demm u/jew il- ħalib 
bil-kundizzjonijiet ta' u żu u ħżin bejn l-u żi, 
— Dettalji tal-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test,  
— Konver żjoni minn kon ċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (ppm) 
f'ilma tajjeb g ħax-xorb/dieta g ħad-doża miksuba (mg/kg pi ż 
tal-ġisem/jum), jekk applikabbli,  
— Dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u l-ilma (inklu ża l-kompo żizzjoni 
tad-dieta, jekk disponibbli),  
— Deskrizzjoni dettaljata tal-pro ċeduri ta' ka żwalizzazzjoni biex jing ħażlu 
frieħ għas-separazzjoni u biex ji ġu assenjati frie ħ għall-gruppi tat-test,  
— Il-kundizzjonijiet ambjentali,  
— Il-lista tal-persunal tal-istudju, inklu ż it-taħriġ professjonali.  
Riżultati (sommarju u dejta individwali skont is-sess u d-do ża): 
— Konsum ta' ikel, konsum ta' ilma jekk disponibbli, effi ċjenza tal-ikel 
(żieda fil-pi ż tal-ġisem għal kull gramma ikel ikkonsmat, ħlief għall- 
perjodu ta' koabitazzjoni u matul it-treddig ħ), u konsum tas-sustanza 
kimika tat-test (g ħal għoti permezz ta' dieta/ilma tajjeb g ħax-xorb) 
għall-annimali P u F  1 , 
— Dejta dwar l-assorbiment (jekk disponibbli),  
— Dejta dwar il-pi ż tal-ġisem għall-annimali P,  
— Dejta dwar il-pi ż tal-ġisem għall-annimali F  1 magħżulin wara l-ftim,  
— Il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali baqg ħux ħajjin wara 
t-terminazzjoni,  
— L-għamla, is-severità u d-durata tal-osservazzjonijiet klini ċi (jekk 
humiex riversibbli jew le),  
— Dejta dwar l-ematolo ġija, l-urinali żi u l-kimika klinika inklu żi TSH u 
T4, 
— Analiżi fenotipika ta ċ-ċelloli tal-milsa ( ċelloli T, B, NK),  
— Ċelloli tal-mudullun tal-g ħadam,  
— Dejta dwar ir-rispons tossiku,  
— In-numru ta' nisa P u F  1 b'ċiklu estru ż normali jew anormali u d-durata 
taċ-ċiklu, 
— Żmien sat-tg ħammir (intervall qabel l-att sesswali, in-numru ta' jiem 
bejn it-tlaqqig ħ u t-tgħammir),  
— Effetti tossi ċi jew o ħrajn fuq ir-riproduzzjoni, inklu żi numri u 
perċentwali ta' annimali li rnexxew fit-tg ħammir, it-tqala, il- ħlas u 
t-treddigħ, ta' rġiel li kkaġunaw it-tqala, ta' nisa b'sinjali ta' disto ċja/ħlas 
prolungat jew diffi ċli, 
— Id-durata tat-tqala u, jekk disponibbli, tal- ħlas, 
— In-numri ta' impjanti, id-daqs tal-boton u l-per ċentwal ta' frie ħ irġiel, 
— In-numru u l-per ċentwal ta' telf ta' wara l-impjant, annimali mwielda 
ħajjin u annimali mwielda mejtin,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— Dejta dwar il-pi ż tal-boton u l-pi ż tal-frieħ (irġiel, nisa u f'daqqa), 
in-numru ta' annimali li baqg ħu żgħar jekk determinat,  
— In-numru ta' frie ħ b'anormalitajiet ferm vi żibbli,  
— Effetti tossi ċi jew o ħrajn fuq l-ulied, it-tkabbir wara t-twelid, 
il-vijabbiltà, e ċċ., 
— Dejta dwar punti ta' riferiment fi żiċi fi frieħ u dejta o ħra dwar l-i żvilupp 
wara t-twelid,  
— Dejta dwar il-maturità sesswali ta' annimali F  1 , 
— Dejta dwar osservazzjonijiet funzjonali fi frie ħ u adulti, skont kif 
appilkabbli,  
— Il-piż tal-ġisem fis-sagrifi ċċju u dejta dwar il-pi ż tal-organi relattiv u 
assolut għal annimali P u annimali adulti F  1 , 
— Is-sejbiet fin-nekropsija,  
— Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet istopatolo ġiċi kollha,  
— In-numru totali ta' sperma epididimali cauda, il-per ċentwal ta' sperma 
progressivament motili, il-per ċentwal ta' sperma morfolo ġikament 
normali, u l-per ċentwal ta' sperma b'kull anormalità identifikata g ħal 
irġiel P u F  1 , 
— In-numri u l-istadji tal-maturità tal-follikoli li jinsabu fl-ovarji tan-nisa P 
u F  1 , fejn applikabbli,  
— Enumerazzjoni tal-corpora lutea fl-ovarji tan-nisa F  1 , 
— Trattament statistiku tar-ri żultati, fejn xieraq.  
Parametri tal-koorta 2:  
— Deskrizzjoni dettaljata tal-pro ċeduri użati biex ji ġu standardizzati osser ­
vazzjonijiet u pro ċeduri kif ukoll definizzjonijiet operazzjonali g ħall- 
għoti ta' punte ġġ għall-osservazzjonijiet,  
— Lista tal-pro ċeduri kollha tat-test u żati, u ġustifikazzjoni g ħall-użu 
tagħhom,  
— Dettalji tal-pro ċeduri tal-im ġiba/funzjonali, newropatolo ġiċi u morfo ­
metriċi użati, inklu ża informazzjoni u dettalji dwar apparati 
awtomatizzati,  
— Proċeduri għall-kalibra ġġ u l-iżgurar tal-ekwivalenza tal-apparati u 
l-ibbilanċjar tal-gruppi tal-kura fil-pro ċeduri ta' ttestjar,  
— Ġustifikazzjoni qasira li tispjega kwalunkwe de ċiżjoni li tinvolvi 
ġudizzju professjonali,  
— Deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha dwar l-im ġiba/funzjonali, 
newropatolo ġiċi u morfometri ċi skont is-sess u l-grupp tad-do ża, 
inklużi kemm żidiet kif ukoll tnaqqisiet mill-kontrolli,  
— Il-piż tal-moħħ, 
— Kwalunkwe dijanjosi li ġejja minn sinjali newrolo ġiċi u leżjonijiet, 
inkluż mard jew kundizzjonijiet li jse ħħu b'mod naturali,  
— Stampi ta' sejbiet e żemplari,  
— Stampi b'ener ġija baxxa biex ti ġi vvalutata l-omolo ġija tas-sezzjonijiet 
użati għall-morfometrija,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— Trattament statistiku tar-ri żultati, inklu żi l-mudelli statisti ċi użati biex 
tiġi analizzata d-dejta, r-ri żultati, indipendentement minn jekk kinux 
sinifikanti jew le,  
— Ir-relazzjoni ta' kwalunkwe effett tossiku ie ħor ma' konklu żjoni dwar 
il-potenzjal newrotossiku tas-sustanza kimika tat-test, skont is-sess u l-grupp tad-do ża,
 
— L-impatt ta' kwalunkwe informazzjoni tossikokinetika fuq 
il-konklużjonijiet,  
— Dejta li ssostni l-affidabbiltà u s-sensittività tal-metodu ta' ttestjar 
(jiġifieri dejta tal-kontroll po żittiv u storiku),  
— Ir-relazzjonijiet, jekk je żistu, bejn l-effetti newropatolo ġiċi u funzjonali,  
— L-NOAEL jew id-do ża ta' riferiment g ħal ommijiet u wlied, skont 
is-sess u l-grupp tad-do ża, 
— Diskussjoni tal-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta fuq il-ba żi tar-riżultati, 
inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika kka ġunatx newrotos ­
siċità tal-iżvilupp u l-NOAEL.  
Parametri tal-koorta 3:  
— Titri tal-antikorp IgM tas-serum (sensitizzazzjoni g ħal SRBC jew KLH), 
jew unitajiet PFC IgM tal-milsa (sensitizzazzjoni g ħal SRBC);  
— It-twettiq tal-metodu TDAR g ħandu jkun ikkonfermat b ħala parti 
mill-proċess ta' ottimizzazzjoni mil-laboratorju li j ħejji l-assa ġġ għall- 
ewwel darba, u b'mod perjodiku (e ż. kull sena) mil-laboratorji kollha;  
— Diskussjoni tal-interpretazzjoni ġenerali tad-dejta fuq il-ba żi tar-riżultati, 
inkluża konklużjoni dwar jekk is-sustanza kimika kka ġunatx immuno ­
tossiċità tal-iżvilupp u l-NOAEL;  
Diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjonijiet, inklu żi l-valuri tal-NOAEL g ħal effetti fuq il- ġenituri u 
l-ulied  
Għandha tiġi pprovduta wkoll l-informazzjoni kollha mhux miksuba matul 
l-istudju, i żda li hija utli g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati (eż., similaritajiet 
tal-effetti g ħal kwalunkwe newrotossikant mag ħruf). 
Interpretazzjoni tar-Ri żultati  
80. Studju Esti ż tat-Tossi ċità Riproduttiva ta' Ġenerazzjoni Wa ħda ser jipprovdi 
informazzjoni dwar l-effetti ta' esponiment ripetut g ħal sustanza kimika 
matul il-fa żijiet kollha ta ċ-ċiklu riproduttiv, kif ikun hemm b żonn. B'mod 
partikolari, l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar is-sistema riproduttiva, u 
dwar l-iżvilupp, it-tkabbir, is-sopravvivenza u l-punti a ħħarin funzjonali 
tal-ulied sal-PND 90.  
81. L-interpretazzjoni tar-ri żultati tal-istudju g ħandhom jie ħdu f'kunsiderazzjoni 
l-informazzjoni kollha g ħad-dispożizzjoni dwar is-sustanza kimika, inklu żi 
proprjetajiet fi żikokimiċi, tat-TK u tossikodinami ċi, l-informazzjoni rilevanti 
disponibbli dwar analogi strutturali, u ri żultati ta' studji dwar it-tossi ċità li 
saru qabel bis-sustanza kimika tat-test (e ż., tossiċità akuta, tossi ċità wara 
applikazzjoni ripetuta, studji mekkanisti ċi u studji li jivvalutaw jekk hemmx 
differenzi kwalitattivi u kwantitattivi sostanzjali bejn l-ispe ċi fi proprjetajiet 
metaboliċi in vivo /in vitro ). Ir-riżultati tan-nekropsija grossa u tal-pi ż 
tal-organi g ħandhom ji ġu vvalutati fil-kuntest ma' osservazzjonijiet li jsiru 
fi studji o ħrajn b'do ża ripetuta, meta dan ikun fattibbli. It-tnaqqisiet 
fit-tkabbir tal-ulied jistg ħu jitqiesu f'relazzjoni ma' influwenza tas-sustanza 
kimika tat-test fuq il-kompo żizzjoni tal- ħalib (29).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Koorta 2 (Newrotossi ċità tal-iżvilupp)  
82. Ir-ri żultati tan-newrom ġiba u n-newropatolo ġija għandhom ji ġu interpretati 
fil-kuntest tas-sejbiet kollha, billi jintu ża approċċ tal-piż tal-evidenza b' ġu­
dizzju espert. G ħandhom ji ġu diskussi l-mudelli tas-sejbiet tal-im ġiba jew 
morfoloġiċi, jekk ikunu pre żenti, kif ukoll evidenza tar-rispons g ħad-doża. 
L-evalwazzjoni tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp, inklu żi studji epidemjolo ġiċi 
tal-bniedem jew rapporti tal-ka ż, u studji sperimentali ta' annimali (e ż. dejta 
tossikokinetika, informazzjoni dwar l-istruttura-attività, dejta minn studji oħrajn tat-tossi ċità) għandha tkun inklu ża f'din il-karatterizzazzjoni. Eval ­
wazzjoni tad-dejta g ħandha tinkludi diskussjoni kemm tal-importanza bijo ­
loġika kif ukoll statistika. L-evalwazzjoni g ħandha tinkludi r-relazzjoni, 
jekk ikun hemm wa ħda, bejn l-alterazzjonijiet newropatolo ġiċi u 
tal-imġiba osservati. G ħal gwida dwar l-interpretazzjoni tar-ri żultati 
tan-newrotossi ċità tal-iżvilupp, irreferi g ħall-metodu ta' ttestjar B.53 (35) u 
Tyl et al., 2008 (31).
 
Koorta 3 (Immunotossi ċità tal-iżvilupp)  
83. Trażżin jew tis ħiħ tal-funzjoni immuni kif ivvalutata bit-TDAR (rispons 
tal-antikorpi li jiddependu fuq i ċ-ċelloli T), g ħandhom ji ġu evalwati 
fil-kuntest tal-osservazzjonijiet kollha li jkunu saru. Is-sinifikanza tal-e żitu 
tat-TDAR tista' tkun sostnuta b'effetti o ħrajn fuq indikaturi relatati immuno ­
loġikament (e ż., ċellolarità tal-mudullun tal-g ħadam, il-pi ż u l-ispatolo ġija 
tat-tessuti limfojdi, id-distribuzzjoni tas-sottosett tal-limfo ċite). L-effetti 
stabbiliti bit-TDAR jistg ħu jkunu inqas sinifikanti f'ka ż ta' tossi ċitajiet 
oħrajn osservati f'kon ċentrazzjonijiet i żgħar ta' esponiment.  
84. Id-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 43 g ħandu jiġi kkonsultat g ħal 
għajnuna fl-interpetazzjoni tar-ri żultati dwar ir-riproduzzjoni u 
n-newrotossi ċità (26).  
TAGĦRIF 
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69-98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530- 536.
 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, 
Washington, DC.  
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.
 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating 
Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxico­
logical Sciences , 49, 1-4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction — a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293-327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356-369.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1-21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408-415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84-97.  
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383-390.
 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial 
Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male 
Rat’,  Biological Reproduction , 17, 298-303.  
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunot ­
oxicity Testing’,  Methods , 41, 9-19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23-35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92-108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm 
Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  
Journal of Reproduction and Fertility ,54, 103-107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Repro­
ductive Toxicology ,5, 39-44.
 
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237- 244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267-273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409-421.  
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 449- 
458. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Kompjuter-Assisted Sperm 
Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the 
Hamilton-Thorn Motility Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , 
Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.  
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401-415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491-505.  
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Pari ġi. 
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330-337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee 
(2006), ‘A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’,  Toxicological 
Pathology , 34, 296-313.  
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8-16.
 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. 
Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Vari ­
ations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley 
Rats’,  Environmental health perspectives,  115(12), 1717-1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neur ­
otoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349-381.
 
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , Linja Gwida tal-OECD 
għall-Ittestjar ta' Sustanzi Kimi ċi, Nru 422, OECD, Pari ġi. 
(33) Il-Kapitolu B.43 ta' dan l-Anness, Studju tan-Newrotossi ċità fir-Rodituri  
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Pari ġi.
 
(35) Il-Kapitolu B.53 ta' dan l-Anness, Studju tan-Newrotossi ċità tal-Iżvilupp  
(36) Il-Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness, Bijoassa ġġ Uterotrofiku fir-Rodituri: 
Test ta' Tg ħarbil fuq terminu qasir g ħal Proprjetajiet Estro ġeniċi 
(37) Il-Kapitolu B.55 ta' dan l-Anness, Il-Bijoassa ġġ Hershberger fil-Firien: 
Assaġġ ta' Tgħarbil fuq Terminu Qasir g ħal Proprjietajiet (Anti)An ­
droġeniċi ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Pari ġi. 
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Kanada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Pari ġi.
 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Pari ġi.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Appendiċi 1 
Miżuri u osservazzjonijiet inkludi fil-batterija osservazzjonali funzjonali (Koorta 2A)  
Gaġġa ta' Oriġini u fil-Bera ħ Manipolattivi Fi żjoloġiċi 
Pożizzjoni Fa ċilità ta' tne ħħija Temperatura 
Kloniċi u Toniċi Involuntarji Fa ċilità ta' tqandil Pi ż tal-ġisem 
Għeluq tal-Kappell tal-G ħajn Ton tal-Muskolu Rispons tal- ħabba 
Piloerezzjoni Rispons g ħall-Viċinanza Daqs tal- ħabba 
Salivazzjoni Rispons g ħall-Mess 
Dmugħ Rispons Awditorju 
Tleħħin Rispons g ħal Qarsa tad-Denb 
Qawmien f'po żizzjoni wieqfa Rispons g ħal Qawmien 
f'Pożizzjoni Dritta 
Anormalitajiet fil-mixja Ftu ħ tas-Sieq ta' N żul 
Koxjenza Sa ħħa fl-Għalfsa tas-Sieq ta' 
Quddiem 
Sterjotipija Sa ħħa fl-Għalfsa tas-Sieq ta' 
Wara 
Imġiba Stramba 
Razez 
Anormalitajiet fit-Te ħid tan-Nifs  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Appendiċi 2 
DEFINIZZJONIJIET:  
Sustanza Kimika:  Sustanza jew ta ħlita. 
Sustanza Kimika tat-Test:  Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata permezz ta' 
dan il-metodu ta' ttestjar.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R ASSA ĠĠ TAL-ISTEROJDO ĠENESI  
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida dwar 
it-Testijiet (TG) tal-OECD Nru 456 (2011). Fl-1998, l-OECD nediet 
attività ta' prijorità g ħolja biex tirrevedi linji gwida dwar it-testijiet e żistenti, 
u tiżviluppa ġodda, għat-tgħarbil u l-ittestjar ta' sustanzi kimi ċi interferenti 
endokrinali potenzjali. Il-Qafas Kun ċenttwali tal-2002 tal-OECD g ħall- 
Ittestjar u l-Valutazzjoni tas-Sustanzi Kimi ċi Interferenti Endokrinali 
jinvolvi ħames livelli, b'kull livell li jikkorrispondi g ħal livell differenti ta' 
kumplessità bijolo ġika (1). L-Assa ġġ tal-Isterojdo ġenesi  in vitro  H295R 
(H295R) deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar ju ża linja ta' ċelloli adrenok ­
arċinoma tal-bniedem ( ċelloli NCI-H295R) u jikkostitwixxi “assa ġġ in vitro  
tat-2 livell, li jipprovdi dejta mekkanistika”, li g ħandu jintu ża għal finijiet ta' 
tgħarbil u prijoritizzazzjoni. L-i żvilupp u l-istandardizzazzjoni tal-assa ġġ 
bħala tgħarbil għal effetti kimi ċi fuq sterojdo ġenesi, spe ċifikament 
il-produzzjoni ta' 17 β-estradjol (E2) u testosteron (T), twettqu fi pro ċess 
b'bosta stadji. L-assa ġġ H295R ġie ottimizzat u vvalidat (2)(3)(4)(5).  
2. L-għan tal-Assa ġġ tal-Isterojdo ġenesi H295R huwa li jidentifika sustanzi 
kimiċi li jaffettwaw il-produzzjoni ta' E2 u T. L-assa ġġ H295R huwa 
maħsub sabiex jidentifika ksenobijoti ċi li bħala s-sit(i) fil-mira tag ħhom 
għandhom il-komponenti endo ġeni li jinvolvu l-mog ħdija bijokimika intra ­ 
ċellolari li tibda bis-sekwenza ta' reazzjonijiet mill-kolesterol 
sal-produzzjoni ta' E2 u/jew T. L-assa ġġ H295R mhuwiex ma ħsub sabiex 
jidentifika sustanzi kimi ċi li jaffettwaw l-isterojdo ġenesi min ħabba effetti 
fuq l-assi ipotalamiku-pitwitarju-gonadali (HPG). L-g ħan tal-assa ġġ huwa 
li jipprovdi twe ġiba IVA/LE fir-rigward tal-potenzjal ta' sustanza kimika li 
tikkaġuna jew tinibixxi l-produzzjoni ta' T u E2; madankollu, jistg ħu 
jinkisbu ri żultati kwantitattivi f' ċerti każijiet (ara l-paragrafi 53 u 54). 
Ir-riżultati tal-assa ġġ jingħataw bħala bidliet relattivi fil-produzzjoni 
tal-ormini meta mqabbla mal-kontrolli ta' solventi (SCs). L-assa ġġ ma 
għandux l-g ħan li jipprovdi informazzjoni mekkanistika spe ċifika dwar 
l-interazzjoni tas-sustanza kimika tat-test mas-sistema endokrinali. Saret 
riċerka billi ntu żat il-linja ta' ċelloli ħalli jiġu identifikati effetti fuq 
enżimi speċifiċi u ormoni intermedjati b ħall-proġesteron (2).  
3. Id-definizzjonijiet u t-taqsiriet u żati f'dan il-metodu ta' ttestjar huma deskritti 
fl-Appendi ċi. Protokoll dettaljat inklu żi struzzjonijiet dwar kif tipprepara 
soluzzjonijiet, tikkultiva ċelloli u twettaq diversi aspetti tat-test huwa 
disponibbli b ħala Appendi ċi I-III tad-dokument tal-OECD ‘Multi- 
Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify 
Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ (4).  
KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI  
4. Ħames enżimi differenti li jikka ġunaw sitt reazzjonijiet differenti huma 
involuti f'bijosinte żi tal-ormon tal-isterojdi tas-sess. Il-konver żjoni 
enżimatika tal-kolesterol g ħal pregnenolon mi ċ-ċitokromu P450 (CYP) 
enżima kolsterol monossi ġenasi li jaqtal-katina laterali (CYP11 A) jikkos ­
titwixxi l-pass inizjali f'serje ta' reazzjonijiet bijokimi ċi li jwasslu g ħal 
sinteżi tal-prodotti finali tal-isterojdi. Skont l-ordni ta ż-żewġ reazzjonijiet 
ta' wara, il-mog ħdija sterojdo ġenika tinqasam f' żewġ mogħdijiet, 
il-mogħdija idrossisterojdi Δ 5 u l-mogħdija ketosterojdi Δ 4 , li jiltaqg ħu 
fil-produzzjoni tal-androstenedjon (Figura 1).  
5. Androstenedjon huwa konvertit f'testosteron (T) minn 17 β-idrossisterojd 
deidroġenasi (17 β-HSD). It-testosteron huwa kemm prodott intermedjat kif 
ukoll ormon tal-prodott finali. Fir-ra ġel, T jista' ji ġi konvertit 
f'diidrotestosteron (DHT) permezz ta' 5 α-ridottasi, li tinsab fil-membrani 
ċellolari, envelopp nukleari, u retikulu endopla żmiku tat-tessuti fil-mira ta' 
azzjoni andro ġenika bħall-prostata u n-nuffati seminali. DHT huwa note ­
volment iktar qawwi b ħala andro ġen milli T u jitqies li huwa ormon 
tal-prodott finali wkoll. L-assa ġġ H295R ma jkejjilx id-DHT (ara 
l-paragrafu 10).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. L-en żima fil-mog ħdija sterojdo ġenika li tikkonverti sustanzi kimi ċi 
androġeniċi f'sustanzi kimi ċi estroġeniċi hija aromata żi (CYP19). CYP19 
tibdel T f'17 β-estradjol (E2) u androstenedjon f'estron. E2 u T jitqiesu 
ormoni tal-prodott finali tal-mog ħdija sterojdo ġenika.  
7. L-ispe ċifiċità tal-attività tal-ljasi ta' CYP17 tvarja g ħas-sottostrati inter ­
medjati bejn l-ispe ċi. Fil-bniedem, l-en żina tiffavorixxi sottostrati 
tal-mogħdija idrossisterojdi Δ 5 (pregnenolon), filwaqt li sottostrati 
fil-mogħdija ketosterojdi Δ 6 (proġesteron) huma ffavoriti fil-far (19). 
Dawn id-differenzi fl-attività tal-ljasi ta' CYP17 jistg ħu jispjegaw u ħud 
mid-differenzi li jiddependu fuq l-ispe ċi bħala rispons g ħal sustanzi 
kimiċi li jibdlu l-isterojdo ġenesi  in vivo  (6). Intwera li ċ-ċelloli H295 
jirriflettu l-iktar mill-qrib l-espressjoni tal-en żima adrenali u l-mudell ta' 
produzzjoni tal-isterojdi ta' bniedem adult (20), i żda huma mag ħrufin li 
jesprimu en żimi kemm g ħall-mogħdija idrossisterojdi Δ 5 kif ukoll dik ketos ­
terojdi Δ 6 għas-sinteżi tal-andro ġen (7)(11)(13)(15).  
Figura 1  
Mogħdija sterojdo ġenika f'ċelloli H295R
  
Nota:  
L-enżimi huma fil-korsiv, l-ormoni huma skurati u l-vle ġeġ jindikaw 
id-direzzjoni tas-sinte żi. L-isfond gri ż jindika mog ħdijiet/prodotti kortikos ­
terojdi. Il-mog ħdijiet/prodotti sterojdi tas-sess g ħandhom ċirku madwarhom. 
CYP = ċitokroma P450; HSD = idrossisterojdi deidro ġenasi; DHEA = 
deidroepjandrosteron.  
8. Il-linja ta' ċelloli adreno-kar ċinoma H295R tal-bniedem hija mudell  in vitro  
utli għall-investigazzjoni tal-effetti fuq sinte żi tal-ormon sterojde 
(2)(7)(8)(9)(10). Il-linja ta' ċelloli H295R tesprimi ġeni li jikkodifikaw 
għall-enżimi ewlenin kollha g ħall-isterojdo ġenesi osservata iktar 'il fuq 
(11)(15) (Figura 1). Din hija proprjetà unika g ħaliex l-espressjoni  in vivo  
ta' dawn il- ġeni hija spe ċifika għat-tessut u l-istadju tal-i żvilupp b'tipikament 
ebda tessut wa ħdu jew stadju tal-i żvilupp wa ħdu li jesprimi l- ġeni kollha 
involuti fl-isterojdo ġenesi (2). I ċ-ċelloli H295R g ħandhom karatteristi ċi 
fiżjoloġiċi ta' ċelloli adrenali ta' fetu tal-bniedem żonalment mhux differ ­
enzjati (11). I ċ-ċelloli jirrappre żentaw sistema  in vitro  unika peress li  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
għandhom il- ħila li jiprodu ċu l-ormoni sterojdi kollha fil-korti ċi adrenali 
adult u l-gonadi, biex b'hekk ikun jista' jsir ittestjar g ħal effetti kemm fuq 
sinteżi kortikosterojdi kif ukoll fuq il-produzzjoni tal-ormoni tal-isterojdi 
tas-sess b ħal androġeni u estro ġeni, għad li l-assa ġġ kien validat biss biex 
jidentifika bidliet fit-T u E2. Il-bidliet irre ġistrati mis-sistema tat-test 
fil-forma ta' bidla fil-produzzjoni ta' T u E2 jistg ħu jkunu ir-ri żultat ta' 
firxa ta' interazzjonijiet differenti tas-sustanzi kimi ċi tat-test b'funzjonijiet 
sterojdoġeniċi li huma espressi mi ċ-ċelloli H295R. Dawn jinkludu 
l-modulazzjoni tal-espressjoni, sinte żi jew funzjoni ta' en żimi involuti 
fil-produzzjoni, it-trasformazzjoni, jew l-eliminazzjoni ta' ormoni ta' 
sterojdi (12)(13)(14). L-inibizzjoni tal-produzzjoni ta' ormoni tista' tkun dovuta g ħal tagħqid kompetittiv dirett ma' en żema fil-mog ħdija, impatt 
fuq kofatturi b ħall-NADPH (Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfat) u 
cAMP (Adeno żina Monofosfat ċiklika), u/jew żieda fil-metaboli żmu 
tal-isterojdi jew it-tra żżin tal-espressjoni tal- ġeni ta' ċerti enżimi 
fil-mogħdija tal-isterojdo ġenesi. Filwaqt li l-inibizzjoni tista' tkun funzjoni 
kemm ta' pro ċessi diretti kif ukoll indetti involuti fil-produzzjoni ta' ormoni, 
normalment l-induzzjoni tkun ta' g ħamla indiretta, b ħal permezz tal-effett 
fuq kofatturi b ħall-NADPH u s-cAMP (b ħal fil-ka
ż ta' forskolin), tnaqqis 
fil-metaboli żmu tal-isterojdi (13), u/jew sopraregolamentazzjoni 
tal-espressjoni tal- ġeni sterojdo ġeniċi. 
9. L-assa ġġ H295R g ħandu bosta vanta ġġi: 
— Jippermetti li ji ġu identifikat kemm żidiet kif ukoll tnaqqisijiet 
fil-produzzjoni ta' T kif ukoll E2,  
— Jippermetti li ssir valutazzjoni diretta tal-impatt potenzjali ta' sustanza 
kimika fuq il-vijabbiltà/i ċ-ċitotossiċità taċ-ċelloli. Din hija karatteristika 
importanti peress li b'hekk tkun tista' ssir diskriminazzjoni bejn l-effetti li huma dovuti g ħal ċitotossiċità minn dawk dovuti g ħall-interazzjoni 
diretta tas-sustanzi kimi ċi mal-mog ħdijiet sterojdo ġeniċi, li mhijiex 
possibbli f'sistemi ta' espjanti tat-tessut li jikkonsisti f'diversi tipi ta' 
ċelloli b'sensittivitajiet u funzjonalitajiet varji,
 
— Ma je ħtieġx l-użu ta' annimali,  
— Il-linja ta' ċelloli ta' H295R hija disponibbli b'mod kummer ċjali. 
10. Il-limitazzjonijiet ewlenin tal-assa ġġ huma kif ġej: 
— Il-kapa ċità metabolika tieg ħu mhijiex mag ħrufa iżda aktarx kemxejn 
limitata; b'hekk, sustanzi kimi ċi li jeħtieġu jkunu metabolikament 
attivi aktarx li mhux ser jinstabu f'dan l-assa ġġ. 
— Peress li ġej mit-tessut adrenali, H295R fih l-en żimi li kapa ċi jipprodu ċu 
l-glukokortikojdi u l-mineralkortikojdi kif ukoll l-ormoni tas-sess; għalhekk, l-effetti fuq il-produzzjoni ta' glukokortikojdi u mineralkor ­
tikojdi jistg ħu jinfluwenzaw il-livelli ta' T u E2 osservati fl-assa ġġ,
 
— Ma jkejjilx DHT u, g ħalhekk, ma jkunx mistenni jsib sustanzi kimi ċi li 
jinibixxu 5 α-ridottasi, f'liema ka ż jista' jintu ża l-assaġġ Hershberger 
(16),  
— L-assa ġġ H295R mhuwiex ser jidentifika sustanzi kimi ċi li jinterferixxu 
mal-isterojdo ġenesi billi jaffettwaw l-assi ipotalamiku-pitwitarju- 
gonadali (HPG) peress li dan jista' jkun studjat biss f'annimali s ħaħ. 
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
11. L-iskop tal-assa ġġ huwa l-identifikazzjoni tas-sustanzi kimi ċi li jaffettwaw 
il-produzzjoni ta' T u E2. T huwa wkoll intermedju fil-mog ħdija għall- 
produzzjoni ta' E2. L-assa ġġ jista' jidentifika sustanzi kimi ċi li tipikament 
jinibixxu jew jindu ċu l-enżimi tal-mog ħdija tal-isterojdo ġenesi.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Normalment l-assa ġġ isir f'kundizzjonijiet standard tal-koltura ta ċ-ċelloli fi 
platti tal-koltura b'24 toqba. Inkella, jistg ħu jintużaw daqsijiet o ħrajn 
tal-platti g ħat-twettiq tal-assa ġġ; madankollu, kundizzjonijiet ta ż-żriegħ u 
sperimentali g ħandhom ji ġu aġġustati kif xieraq biex tin żamm aderenza 
mal-kriterji tal-prestazzjoni.  
13. Wara perjodu ta' akklimatizzazzjoni ta' 24 sieg ħa fi platti b'bosta toqob, i ċ- 
ċelloli jiġu esposti g ħal 48 sieg ħa għal seba' kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza 
kimika tat-test f'tal-inqas tripilikat. Solvent u inibitur u induttur mag ħruf 
tal-produzzjoni tal-ormoni jintu żaw b'kon ċentrazzjoni fissa b ħala kontrolli 
negattivi u po żittivi. Fi tmiem il-perjodu ta' esponiment, il-midjum jitne ħħa 
minn kull toqba. Il-varjabbiltà ta ċ-ċelloli f'kull toqba ti ġi analizzata e żatt 
wara t-tne ħħija tal-midjum. Il-kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni fil-midjum 
jistgħu jitkejlu permezz ta' firxa ta' metodi inklu żi kits ta' kejl tal-ormoni 
kummerċjalment disponibbli u/jew tekniki strumentali b ħal spettrometrjia 
tal-massa tal-kromatografija likwida (LC-MS). Id-dejta ting ħata bħala 
bidla fid-daqs relatata mal-kontroll tas-solvent u l-Inqas Kon ċentrazzjoni 
b'Effett Osservata (LOEC). Jekk l-assa ġġ ikun negattiv, l-og ħla konċenet­
razzjoni ttestjata ti ġi rrapportata b ħala l-Kon ċentrazzjoni bl-Ebda Effett 
Osservat (NOEC). Konklu żjonijiet dwar il- ħila ta' sustanza kimika biex 
taffettwa l-isterojdo ġenesi għandhom ikunu bba żati fuq tal-inqas żewġ 
testijiet indipendenti. L-ewwel test jista' ja ħdem bħala test ta' sejbien 
tal-medda b'a ġġustament sussegwenti tal-kon ċentrazzjonijiet g ħat-testijiet 2 
u 3, jekk applikabbli, jekk jinstabu problemi relatati mas-solubilità jew i ċ- 
ċitotossiċità jew jekk l-attività tas-sustanza kimika tkun tidher li waslet fi 
tmiem il-medda tal-kon ċentrazzjonijiet ittestjati.  
PROĊEDURA TAL-KOLTURA  
Linja Ċellolari  
14. Iċ-ċelloli NCI-H295R huma kummer ċjalment disponibbli mill-American 
Type Culture Collections (ATCC) wara li ji ġi ffirmat Material Transfer 
Agreement (MTA) (  1 ). 
Introduzzjoni  
15. Min ħabba bidliet fil-kapa ċità ta' produzzjoni ta' E2 ta ċ-ċelloli b'età/mog ħdija 
li jikbru (2), i ċ-ċelloli għandhom ikunu kolturati wara protokoll spe ċifiku 
qabel jintu żaw u għandha tittie ħed nota tan-numru ta' mog ħdijiet mindu ċ- 
ċelloli tne ħħew mill-fri ża kif ukoll in-numru tal-mog ħdjia li fiha ġew 
iffriżati ċ-ċelloli u tqieg ħdu f'ħażna tan-nitro ġenu likwidu. L-ewwel 
numru jindika n-numru tal-mog ħdija propja ta ċ-ċellola u t-tieni numru 
jiddeskrivi n-numru tal-mog ħdija li fiha ċ-ċelloli ġew iffriżati u tqieg ħdu 
għall-ħżin. Pereżempju, ċelloli li kienu ffri żati wara l- ħames mo ħdija u 
tneħħew mill-fri ża u mbag ħad inqasmu tliet darbiet (4 mog ħdijiet jekk i ċ- 
ċelloli maħlul frisk jing ħaddu bħala l-1 mog ħdija) wara li ġew ikkolturati 
mill-ġdid jitniżżlu bħala l-mog ħdija 4.5. E żempju ta' skema ta' enumerar 
hija rappre żentata fl-Appendi ċi I tar-rapport ta' validazzjoni (4).  
16. Midjum tal- ħażna jintuża bħala l-bażi għall-midjums supplimentati u 
tal-iffriżar. Il-midjum supplimentat huwa komponent ne ċessarju g ħall- 
koltura ta ċ-ċelloli. Il-midjum tal-iffri żar huwa mfassal b'mod spe ċifiku 
biex ikun jista' jsir iffri żar ħieles minn impatti ta ċ-ċelloli għal ħżin fit-tul. 
Qabel l-u żu, Nu-serum (jew serum komparabbli bi proprjetajiet indaqs li 
ntwera li jipprodu ċi dejta li tissodisfa l-prestazzjoni tat-test u r-rekwi żiti ta' 
Kontroll tal-Kwalità (QC)), li huwa kostitwent ta' midjums supplimentati, għandu jiġi analizzat g ħal konċentrazzjonijiet ta' sfond ta' T u E2. 
Il-preparazzjoni ta' dawn is-soluzzjonijiet hija deskritta fl-Appendi ċi II 
tar-rapport ta' validazzjoni (4).
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Wara l-bidu tal-koltura ta' ċellola H295R minn lott ori ġinali tal-ATCC, i ċ- 
ċelloli għandhom jitkabbru g ħal ħames mog ħdijiet (jiġifieri ċ-ċelloli 
jinqasmu 4 darbiet). Imbag ħad, iċ-ċelloli tal- ħames mog ħdija jiġu ffriżati 
f'nitroġenu likwidu g ħall-ħżin. Qabel l-iffri żar taċ-ċelloli, fi platt tal-QC isir 
kampjun ta ċ-ċelloli tar-raba' mog ħdija preċedenti (Ara l-paragrafu 36 u 37) 
biex jiġi verifikat jekk il-produzzjoni ba żi tal-ormoni u r-rispons g ħal 
sustanzi kimi ċi tal-kontroll p żittiv jissodisfawx il-kriterji ta' kontroll 
tal-kwalità tal-assa ġġ kif definiti fit-Tabella 5.  
18. Iċ-ċelloli H295R iridu ji ġu kkolturati, iffri żati u jinħażnu f'nitroġenu likwidu 
biex jiġi żgurat li dejjemm ikun hemm ċelloli tal-mog ħdija/età xierqa 
disponibbli g ħal koltura u u żu. In-numru massimu ta' mog ħdijiet wara li 
jittieħed lott ġdid (  1 ) jew iffri żat (  2 ) ta' ċelloli f'koltura li huwa a ċċettabbli 
għall-użu fl-assa ġġ H295R ma g ħandux jaqbe ż l-10. Pere żempju, 
il-mogħdijiet aċċettabbli g ħall-kolturi ta' ċelloli minn lott iffri żat 
fil-mogħdija 5 ikun minn 4.5 sa 10.5. G ħal ċelloli li jinbdew minn dawn 
il-lottijiet iffri żati, għandha tiġi segwita l-pro ċedura deskritta fil-paragrafu 
19. Dawn i ċ-ċelloli għandhom ji ġu kkolturati g ħa tal-inqas erba' (4) mog ħ­
dijiet addizzjonali (mog ħdija 4.5) qabel ma jintu żaw fl-ittestjar.  
Ċelloli tal-Bidu mill- Ħażna Ffriżata 
19. Il-pro ċedura għall-bidu ta ċ-ċelloli minn ħażna ffriżata għandha tintu ża meta 
lott ġdid ta' ċelloli jitne ħħa mill-ħżin f'nitro ġenu likwidu g ħall-fini ta' 
koltura u ttestjar. Id-dettalji g ħal din il-pro ċedura huma stabbiliti 
fl-Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4). I ċ-ċelloli jitne ħħew minn 
ħażna f'nitroġenu likwidu, jin ħallu malajr, jitqieg ħdu f'midjum supplimentat 
f'tubu ċentrifugu f'temperatura ambjentali, jer ġgħu jiġu sospiżi f'midjum 
supplimentat, u ji ġu ttrasferiti fi flask tal-koltura. Il-midjum g ħandu 
jinbidel l-g ħada. Iċ-ċelloli H295R huma kolativati f'inkubatur f'37 °C 
b'5 % CO  2 f'atmosfera tal-arja u l-midjum jinbidel 2-3 darbiet fil- ġimgħa. 
Meta ċ-ċelloli jkunu madwar 85-90 % konfluwenti, g ħandhom jinqasmu. 
Il-qsim ta ċ-ċelloli huwa ne ċessarju biex ji ġu żgurati s-sa ħħa u t-tkabbir 
taċ-ċelloli u sabiex jin żammu ċelloli għat-twettiq ta' bijoassa ġġi. Iċ-ċelloli 
jitlaħalħu tliet darbiet b'salmastru b'bafer tal-fosfat (PBS, bla Ca  2+ Mg 2+. ) u 
jitneħħew mill-flask tal-koltura billi ti żdied enżima xierqa ta' qlug ħ, eż., 
tripsina, f'PBS (bla Ca  2+ Mg 2+ ). Eżatt wara li ċ-ċelloli jinqalg ħu 
mill-flask tal-koltura, l-azzjoni tal-en żima għandha titwaqqaf billi ji żdied 
il-midjum supplimentat bi proporzjon ta' 3X il-volum u żat għat-trattament 
bl-enżima. Iċ-ċelloli jitqieg ħdu f'tubu ċentrifugu, ji ġu ċentrifugati f'tem ­
peratura ambjentali, is-supernatant jitne ħħa u l-pellet ta' ċelloli jerġa' jiġi 
sospiż f'midjum supplimentat. L-ammont xieraq ta' soluzzjoni ta ċ-ċellola 
jitqiegħed fil-flask il- ġdid tal-koltura. L-ammont ta' soluzzjoni ta ċ-ċellola 
għandu jiġi aġġustat sabiex i ċ-ċelloli jkunu konfluwenti fi żmien 5-7 
ijiem. Il-proporzjon sottokultivat rakkomandat huwa 1:3 sa 1:4. Il-platt għandu jiġi mmarkat bir-reqqa. I ċ-ċelloli issa lseti biex jintu żaw fl-assa ġġ 
u ċ-ċelloli żejda għandhom ji ġu ffriż
ati f'nitro ġenu likwidu kif spjegat 
fil-paragrafu 20.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) “Lott ġdid” tirreferi g ħal lott fjamant ta' ċelloli riċevut mill-ATCC. 
( 2 ) “Lott iffri żat” tirreferi g ħal ċelloli li ġew ikkolturati qabel u mbag ħad ġew iffriżati 
f'laboratorju ie ħor li mhuwiex l-ATCC.
 Iffriżar ta' Ċelloli H295R (preparazzjoni ta' ċelloli għal ħżin f'nitro ġenu 
likwidu)  
20. Biex ji ġu ppreparati ċelloli H295R g ħall-iffriżar, il-proċedura deskritta hawn 
fuq għall-qsim ta ċ-ċelloli għandha tiġi segwita sal-istadju ta' sospensjoni 
mill-ġdid tal-pellet ta ċ-ċelloli f'qieg ħ it-tubu ċentrifugu. Hawnhekk, 
il-pellet ta ċ-ċelloli jerġa' jiġi sospiż f'midjum ta' ffri żar. Is-soluzzjoni ti ġi 
ttrasferita f'kunjett krijo ġeniku, immarkata kif xieraq, u ffri żata f'– 80 °C 
għal 24 sieg ħa u wara l-kunjett krijo ġeniku jiġi ttrasferit f'nitro ġenu likwidu 
għall-ħżin. Id-dettalji g ħal din il-pro ċedura huma stabbiliti fl-Appendi ċi III 
tar-rapport ta' validazzjoni (4).  
Tqegħid fil-Platti u Preinkubazzjoni ta' Ċelloli għall-Ittestjar  
21. In-numru ta' platti b'24 toqba, ippreparati kif spjegat fil-paragrafu 19, li ser 
ikunu me ħtieġa skont in-numru ta' sustanzi kimi ċi li għandom jiġu ttestjati u 
l-konfluwenza ta ċ-ċelloli fil-platti tal-koltura. B ħala regola ġenrrali, flask 
wieħed tal-koltura (75 cm  2 ) b'ċelloli konfluwenti ta' 80-90 % ser iforni 
biżżejjed ċelloli għal platt wie ħed sa 1,5 (b'24 toqba) b'densità fil-mira ta' 
200 000 sa 300 000 ċellola għal kull ml tal-midjum, u dan jirri żulta f'kon ­
fluwenza ta' madwar 50-60 % fit-toqob wara 24 sieg ħa (Figura 2). Tipi ­
kament, din hija d-densità ottimali ta ċ-ċelloli għall-produzzjoni ta' ormoni 
fl-assaġġ. F'densitajiet og ħla, il-mudelli ta' produzzjoni ta' T kif ukoll E2 
jinbidlu. Qabel ma jsir l-assa ġġ għall-ewwel darba, huwa rakkomandat li 
jiġu ttestjati densitajiet ta' żriegħ differenti ta' bejn 200 000 u 300 000 
ċellola għal kull ml, u li d-densità li tirri żulta f'konfluwenza ta' 50-60 % 
fit-toqba wara 24 sieg ħa tingħażel għal iktar esperimenti.  
Figura 2  
Fotomikrografija ta' ċelloli H295R b'densità ta' żriegħ ta' 50 % fi platt tal-koltura b'24 
toqba me ħuda fit-tarf (A) u ċ-ċentru (B) ta' toqba
  
22. Il-midjum ji ġi pipettat mill-flask tal-kultura, u ċ-ċelloli jitla ħalħu 3 darbiet 
b'PBS sterili (bla Ca  2+ Mg 2+ ). Tiżdied soluzzjoni ta' en żima (f'PBS) biex 
taqla' ċ-ċelloli mill-flask tal-koltura. Wara żmien xieraq g ħall-qlugħ taċ- 
ċelloli, l-azzjoni tal-en żima għandha titwaqqaf bi ż-żieda ta' midjum suppli ­
mentat bi proprozjon ta' 3X il-volum u żat għat-trattament bl-en żima. Iċ- 
ċelloli jitqieg ħdu f'tubu ċentrifugu, ċentrifugati f'temperatura ambjentali, 
is-supernatant jitne ħħa, u l-pellet ta ċ-ċelloli jerġa' jiġi sospiż f'midjum  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
supplimentat. Id-densità ta ċ-ċelloli tiġi kkalkolata billi jintu żaw, eż., emoċi­
tometru jew kalkolatur ta ċ-ċelloli. Is-soluzzjoni ta ċ-ċelloli għandha tiġi 
dilwita sad-densità mixtieqa tat-tqeg ħid fil-platt u tit ħawwad sew biex ti ġi 
żgurata densità omo ġena taċ-ċelloli. Iċ-ċelloli għandhom jitqieg ħdu fi platt 
b'1 ml tas-soluzzjoni ta' ċelloli/toqba u l-platti u t-toqob immarkati. Il-platti 
li fihom isir żriegħ jiġu inkubati f'37 °C f'5 % CO  2 f'atmosfera tal-ajru g ħal 
24 siegħa biex iċ-ċelloli jkunu jistg ħu jaqbdu mat-toqob.  
REKWIŻITI TA' KONTROLL TAL-KWALITÀ  
23. Huwa kru ċjali li l-volumi e żatti tas-soluzzjonijiet u l-kampjuni jitwasslu 
fit-toqob matul id-do żaġġ għaliex dawn il-volumi jiddeterminaw 
il-konċentrazzjonijiet u żati fil-kalkoli tar-ri żultati tal-assa ġġ. 
24. Qabel il-bidu tal-koltura ta ċ-ċelloli u kwalunkwe ttestjar sussegwenti, kull 
laboratorju g ħandu juri s-sensittività tas-sistema ta' kejl tal-ormoni tag ħha 
(paragrafi 29-31).  
25. Jekk ser jintu żaw assaġġi ta' kejl tal-ormoni bba żati fuq antikorpi, 
is-sustanzi kimi ċi li ser ji ġu ttestjati g ħandhom ji ġu analizzati g ħall- 
potenzjal tag ħhom li jinterferixxu mas-ssitema ta' kejl u żata biex ji ġu kwan­
tifikati T u E2 kif spjegat fil-paragrafu 32 qabel jinbeda l-ittestjar.  
26. DMSO huwa s-solvent rakkomandat g ħall-assaġġ. Jekk jintu ża solvent alter ­
nattiv, għandhom ji ġu determinati dawn li ġejjin:  
— Is-solubilità tas-sustanza kimika tat-test, il-forskolin u l-prokloraz 
fis-solvent, u  
— Iċ-ċitotossitià b ħala funzjoni tal-kon ċentrazzjoni tas-solvent.  
Huwa rakkomandat li l-kon ċentrazzjoni massima awtorizzabbli tas-solvent 
ma għandhiex taqbe ż 10 × dilwizzjoni tal-inqas kon ċentrazzjoni ċitotossika 
tas-solvent.  
27. Qabel ma jag ħmel it-testijiet g ħall-ewwel darba, il-laboratorju g ħandu 
jagħmel esperiment kwalifikattiv li juri li l-laboratorju kapa ċi jżomm u 
jilħaq il-kundizzjonijiet xierqa me ħtieġa tal-koltura ta ċ-ċelloli u 
tal-esperimenti g ħall-ittestjar tas-sustanza kimika kif spjegat fil-paragrafi 
33-35.  
28. Meta jinbeda l-ittestjar g ħal lott ġdid, għandu jsir platt tal-kontroll qabel ma 
jintuża lott ġdid ta' ċelloli ħalli tiġi evalwata l-prestazzjoni ta ċ-ċelloli kif 
deskritt fil-paragrafi 36 u 37.  
Prestazzjoni tas-Sistema ta' Kejl tal-Ormoni  
Sensittivià, reqqa, pre ċiżjoni tal-metodu u l-kontroreattività tieg ħu ma' 
matriċi kampjun  
29. Kull laboratorju jista' ju ża sistema ta' kejl tal-ormoni tal-g ħażla tiegħu għall- 
analiżi tal-produzzjoni ta' T u E2 minn ċelloli H295R diment li tissodisfa 
l-kriterji ta' prestazzjoni, inklu ż il-imitu ta' Kwantifikazzjoni (LOQ). Nomin ­
alment, dawn huma 100 pg/ml g ħal T u 10 pg/ml g ħal E2, li huma bba żati 
fuq il-livelli ormonali ba żi fl-istudji ta' validazzjoni. Madankollu, livelli 
ogħla jew inqas jistg ħu jkunu xierqa skont il-livelli tal-ormoni ba żi 
miksubin fil-laboratorju inkarigat. Qabel ma jsiru l-platti tal-QC u t-testijiet, il-laboratorju g ħandu juri li l-assa ġġ tal-ormon li ser jintu ża 
jista' jkejjel kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni f'midjum supplimentat b'reqqa 
u preċiżjoni suffi ċjenti sabiex jissodisfa l-kriterji tal-QC spe ċifikati
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
fit-Tabelli 1 u 5 billi ji ġi analizzat midjum supplimentat mi żjud b'kontroll 
intern tal-ormoni. Ma' kull midjum supplimentat g ħandhom ji żdiedu 
tal-inqas tliet kon ċentrazzjonijiet ta' kull ormon (e ż., 100, 500 u 2 500 
pg/ml T; 10, 50 u 250 pg/ml E2; jew l-inqas kon ċentrazzjonijiet possibbli 
fuq il-ba żi tal-limiti ta' identifikazzjoni tas-sistema ta' kejl tal-ormoni 
magħżulin jistg ħu jintużaw għall-inqas kon ċentrazzjonijiet mi żjudin għal 
T u E2) u ji ġu analizzati. Kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni mkejlin ta' 
kampjuni mhux estrattati g ħandhom ikunu fi ħdan konċentrazzjonijiet 
nominali ta' 30 %, u l-varjazzjoni ta' bejn il-kejliet replikati tal-istess 
kampjun ma g ħandhiex taqbe ż il-25 % (ara wkoll it-Tabella 8 g ħal 
kriterji addizzjonali tal-QC). Jekk dawn il-kriterji tal-QC ji ġu ssodisfati, 
huwa supponut li l-assa ġġ magħżul tal-kejl tal-ormoni huwa e żatt u 
preċiż biżżejjed u ma jid ħolx f'kontroreazzjoni ma' komponenti fil-midjum 
(matriċi kampjun) b'tali mod li tkun mistennija influwenza importanti fuq 
l-eżitu tal-assa ġġ. F'dan il-ka ż, ma jkun hemm b żonn li ssir ebda estrazzjoni 
ta' kampjuni qabel il-kejl tal-ormoni.  
30. F'ka ż li l-kriterji tal-QC fit-tabelli 1 u 8 ma jkunux issodisfati, jista' jkun li 
qed iseħħ effett matri ċi sinifikanti, u g ħandu jsir esperiment b'midjum 
miżjud estratt. E żempju ta' pro ċedura ta' estrazzjoni huwa deskritt 
fl-Appendi ċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4). Il-kejliet 
tal-konċentrazzjonijiet ta' ormini fil-kampjuni estrattati g ħandhom isiru 
tliet darbiet (  1 ). Jekk jista' jintwera li wara l-estrazzjoni l-komponenti 
tal-midjum ma jinterferixxux mal-metodu ta' identifikazzjoni tal-orom kif definit mill-kriterji tal-QC, l-esperimenti kollha li jsiru wara g ħandhom isiru 
billi jintu żaw kampjuni estrattati. Jekk il-kriterji tal-QC ma jkunux jistg ħu 
jiġu ssodisfati wara l-estrazzjoni, is-sistema ta' kejl tal-ormoni u żata mhijeix 
xierqa għall-fini tal-Assa ġġ tal-Isterojdo ġenesi H295R, u g ħandu jintu ża 
metodu alternattiva ta' identifikazzjoni tal-ormoni.
 
Kurva standard  
31. Il-kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni tal-kontrolli tas-solvent (SC) g ħandhom 
ikunu jaqg ħu fi ħdan is-sehem lineari tal-kurva standard. Idealment, 
il-valuri tal-SC g ħandhom ikunu jaqg ħu ħdejn in-nofs tas-sehem lineari 
biex jiġi żgurat li l-induzzjoni u l-inibizzjoni tas-sinte żi tal-ormoni jistg ħu 
jitkejlu. Id-dilwizzjonijiet tal-midjum (jew estratti) li g ħandhom jitkejlu jridu 
jingħażlu kif xieraq. Ir-reazzjoni lineari trid ti ġi determinata permezz ta' 
approċċ statistiku.  
Test tal-interferenza kimika  
32. Jekk ser jintu żaw assaġġi bbażati fuq antikorpi b ħal Assaġġi Immuno ­
sorbenti Marbutin mal-En żimi (ELISAs) u Assa ġġi Radjuimmuni (RIAs) 
biex jitkelju l-ormoni, kull sustanza kimika g ħandha tiġi ttestjata g ħal inter­
ferenza potenzjali mas-sistema ta' kejl tal-ormoni li ser tintu ża qabel jinbeda 
l-ittestjar propju tas-sustanzi kimi ċi (Appendi ċi III tar-rapport ta' vali ­
dazzjoni (4)) g ħaliex uħud mill-karatteristi ċi jistgħu jinterferixxu ma' 
dawn it-testijiet (17). Jekk isse ħħ interferenza li hija ≥ 20 % 
tal-produzzjoni tal-ormoni ba żi għal T u/jew E2 kif determinat 
mill-anali żi tal-ormoni, it-Test ta' Interferenza tal-Assa ġġ tal-Ormoni 
mas-Sustanza Kimika (kif deskritt fl-Appendi ċi III tar-rapport ta' vali ­
dazzjoni (4) taqsima 5.0) g ħandu jsir fuq id-dilwizzjonijiet kollha 
tas-soluzzjonijiet tal- ħażna tas-sustanza kimika tat-test ħalli jiġi identifikat 
id-doża limitu li biha sse ħħ interferenza sinifikanti ( ≥ 20 %). Jekk  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Nota: Jekk ikun hemm b żonn estrazzjonijiet, isiru tliet kejliet identi ċi għal kull estratt. 
Kull kampjun ser ji ġi estrattat darba biss.
 l-interferenza hija inqas minn 30 %, ir-ri żultati jistg ħu jiġu kkoreġuti għall- 
interferenza. Jekk l-interferenza taqbe ż it-30 %, id-dejta tkun invalida u 
għandha titwarrab id-dejta f'dawn il-kon ċentrazzjonijiet. Jekk isse ħħ inter­
ferenza sinifikanti ta' sustanza kimika tat-test ma' sistema ta' kejl tal-ormoni f'iktar minn kon ċentrazzjoni mhux ċitotossika wa ħda, għandha tintu ża 
sistema differenti ta' kejl tal-ormoni. Sabiex ti ġi evitata interferenza minn 
sustanzi kimi ċi kontaminanti, huwa rakkomandat li l-ormoni ji ġu estrattati 
mill-midjum permezz ta' solvent xieraq, il-metodi possibbli jistg ħu jinkisbu 
mir-rapport ta' validazzjoni (4).
 
Tabella 1  
Kriterji ta' prestazzjoni tas-sistemi ta' kejl tal-ormoni  
Parametru Kriterju  
Sensittività tal-Metodu ta' Kejl Limitu tal-Kwantifikazzjoni (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Effiċjenza tal-Estrazzjoni 
tal-Ormoni (biss meta jkun hemm 
bżonn estrazzjoni) Ir-rati medji ta' rkupru (fuq il-ba żi ta' 
miżuri trippli) g ħall-ammonti 
miżjudin tal-ormon ma g ħandhomx 
imorru oltre 30 % mill-ammont li żdied. 
Interferenza Kimika (sistemi 
bbażati fuq l-antikorpi biss) Ma għandha sse ħħ ebda kontroreat ­
tività sostanzjali ( ≥ 30 % 
tal-produzzjoni tal-ormon ba żi 
tal-ormon rappre żentattiv) ma' 
kwalunkwe wie ħed mill-ormoni 
prodotti mi ċ-ċelloli (
 b ) ( c ) 
( a ) Nota : Il-limiti ta' mmani ġġjar tal-metodi huma bba żati fuq il-valuri ta' produzzjoni 
tal-ormon ba żi pprovduti fit-Tabella 5 u huma bba żati fuq il-prestazzjoni. Jekk 
tista' tinkiseb produzzjoni ikbar tal-ormon ba żi, il-limitu jista' jkun ikbar. 
( b ) Ċerti antikorpi ta' T u E2 jistg ħu jagħmlu kontroreazzjoni ma' androstendjon u 
estron, rispettivament, f'per ċentwal og ħla. F'dawn il-ka żijiet, mhuwiex possibbli li 
jiġu determinati bi pre ċiżjoni l-effetti fuq 17 β-HSD. Madankollu, id-dejta xorta 
tista' tipprovdi tag ħrif utli dwar l-effetti fuq il-produzzjoni ta' estro ġen jew 
androġen inġenerali. F'dawn il-ka żijiet, id-dejta g ħandha ting ħata bħala risponsi 
tal-androġen/estroġen flok E2 u T. 
( c ) Dawn jinkludu: kolesterol, pregnenolon, pro ġesteron, 11-deossikortikosteron, 
kortikosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon,17 α-proġesteron, deossikorti żol, 
kortiżol, DHEA, androstenedjon, estron.  
Test tal-Profi ċjenza tal-Laboratorju  
33. Qabel ma ji ġu ttestjati sustanzi kimi ċi mhux mag ħrufin, laboratorju g ħandu 
juri li kapa ċi jikseb u j żomm kundizzjonijiet xierqa g ħall-koltura ta ċ-ċelloli 
u t-testijiet me ħtieġa għat-twettiq b'su ċċess tal-assa ġġ billi jag ħmel test 
tal-profiċjenza tal-laboratorju. Peress li t-twettiq ta' assa ġġ huwa marbut 
direttament mal-persunal tal-laboratorju li jwettaq l-assa ġġ, dawn 
il-proċeduri għandhom ji ġu parzjalment ripetuti jekk isse ħħ bidla 
fil-persunal tal-laboratorju.  
34. Dan it-test tal-profi ċjenza ser isir fl-istess kundizzjonijiet elenkati 
fil-paragrafi 38 sa 40 billi ċ-ċelloli jiġu esposti g ħal 7 konċentrazzjonijiet 
li jiżdiedu ta' indutturi u inibituri qawwijin, moderati u dg ħajfin kif ukoll 
sustanza kimika negattiva (ara t-Tabella 2). B'mod spe ċifiku, is-sustanzi 
kimiku li g ħandhom ji ġu ttestjati jinkludu l-induttur b'sa ħħtu forskolin 
(Nru tas-CAS 66575-29-9); l-inibitur b'sa ħħtu prokloraz (Nru tas-CAS 
67747-09-5); l-induttur moderat atra żina (Nru tas-CAS 1912-24-9); 
l-inibitur moderat aminoglutetimid (Nru tas-CAS 125-84-8); l-induttur  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
dgħajjef (produzzjoni ta' E2) u inibitur dg ħajjef (produzzjoni ta' T) bisfenol 
A (Nru tas-CAS 80-05-7); u l-gonadotropina korjonika umana tas-sustanza 
kimika negattiva (HCG) (Nru tas-CAS 9002-61-3) kif muri fit-Tabella 2. Isiru platti separati g ħas-sustanzi kimi ċi kollha billi jintu ża l-format kif muri 
fit-Tabella 6. Platt tal-QC minnhom (Tabella 4, paragrafi 36-37) g ħandu 
jkun inklu ż fit-test ta' kuljum g ħas-sustanzi kimi ċi tal-profi ċjenza.
 
Tabella 2:  
Sustanzi kimi ċi tal-profi ċjenza u kon ċentrazzjonijiet ta' esponiment  
Sustanza kimika 
tal-profiċjenza Konċentrazzjonijiet tat-Test [ μM] 
Prokloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrażina 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimid 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Kontroll tas-solvent (DMSO) (0), 1 μl DMSO/toqba  
L-esponiment ta' H295R g ħal sustanzi kimi ċi tal-profi ċjenza għandha ssir fi 
platti b'24 toqba matul it-test tal-profi ċjenza tal-laboratorju. Id-do żaġġ huwa 
f'μM għad-dożi kollha tas-sustanza kimika tat-test. Id-do żi għandhom 
jingħataw f'DMSO b'0,1 % v/v g ħal kull toqba. Il-kon ċentrazzjonijiet 
kollha tat-test g ħandhom ji ġu ttestjati f'toqob trippli (Tabella 6). Platti 
separati ji ġu ttestjati g ħal kull sustanza kimika. Platt tal-QC minnhom 
huwa inklu ż ma' kull test ta' kuljum.  
35. L-anali żi tal-vijabbiltà ta ċ-ċellola u tal-ormon g ħandha ssir kif stipulat 
fil-paragrafi 42 sa 46. Il-valur limitu (l-inqas kon ċentrazzjoni b'effett 
osservata, LOEC) u d-de ċiżjoni ta' klassifikazzjoni g ħandhom ji ġu rrap­
portati u jitqabblu mal-valuri fit-Tabella 3. Id-dejta titqies a ċċettabbli jekk 
tissodisfa l-LOEC u l-klassifikazzjoni tad-de ċiżjoni fit-Tabella 3.  
Tabella 3:  
Valuri limitu (LOECs) u klassifikazzjonijiet tad-de ċiżjoni għas-Sustanzi Kimi ċi 
tal-Profiċjenza  
Nru tas-CAS LOEC [μM] Klassifikazzjoni tad-De ċiżjoni 
T E2 T E2  
Prokloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inibizzjoni) + (Inibizzjoni) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Induzzjoni) + (Induzzjoni) 
Atrażina 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Induzzjoni) + (Induzzjoni) 
Aminoglutetimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inibizzjoni) + (Inibizzjoni)  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
Nru tas-CAS LOEC [μM] Klassifikazzjoni tad-De ċiżjoni 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inibizzjoni) + (Induzzjoni) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a Negattiva Negattiva  
( a ) +, pożittiva 
n/a: mhux applikabbli peress li ma g ħandha sse ħħ ebda bidla wara esponiment g ħal konċentrazzjonijiet mhux 
ċitotossiċi tal-kontroll negattiv.  
Platti tal-Kontroll tal-Kwalità  
36. Il-platt tal-kontroll tal-kwalità (QC) jintu ża biex tiġi verifikata l-prestazzjoni 
taċ-ċelloli H295R f'kundizzjonijiet standard tal-koltura, u biex ti ġi stabbilita 
database storika g ħal konċentrazzjonijiet ta' ormoni f'kontrolli solventi, 
kontrolli po żittivi u negattivi, kif ukoll kejliet o ħrajn tal-QC ma ż-żmien.  
— Il-prestazzjoni ta ċ-ċelloli H295R g ħandha tiġi vvalutata billi jintu ża platt 
tal-QC għal kull lott ġdid mill-ATCC jew wara li tintu ża ħażna ffriżata 
qabel ta' ċelloli għall-ewwel darba sakemm ma jkunx sar test 
tal-profiċjenza tal-laboratorju (paragrafi 32-34) b'dak il-lott ta' ċelloli,  
— Platt tal-QC jipprovdi valutazzjoni s ħiħa tal-kundizzjonijiet tal-assa ġġ 
(eż., il-vijabbiltà ta ċ-ċelloli, il-kontrolli tas-solvent, il-kontrolli 
negattivi u po żittivi, kif ukoll il-varjabbiltà intra u interassa ġġi) meta 
jiġu ttestjati s-sustanzi kimi ċi u għandu jkun parti minn kull test.  
37. It-test tal-QC isir fi platt b'24 toqba u jsegwi l-istess pro ċeduri ta' inku ­
bazzjoni, do żaġġ, vijabbiltà/ ċitotossiċità taċ-ċelloli, estrazzjoni tal-ormon u 
analiżi tal-ormon deskritti fil-paragrafi 38 sa 46 g ħall-ittestjar ta' sustanzi 
kimiċi. Il-platt tal-QC fih vojta, kontrolli tas-solvent, u żewġ konċen­
trazzjonijiet ta' induttur mag ħruf (forskolin, 1, 10 μM) u inibitur (prokloraz, 
0,1, 1 μM) tas-sinte żi ta' E2 u T. Barra minn hekk, MeOH jintu ża f'toqob 
magħżulin bħala kontroll po żittiv għall-assaġġ tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità. 
Deskrizzjoni dettajlata tat-tifsila tal-platt hija pprovdta fit-Tabella 4. 
Il-kriterji li g ħandhom ji ġu ssodisfati fil-platt tal-QC huma elenkati 
fit-Tabella 5. Il-produzzjoni minima tal-ormon ba żi għal T u E2 g ħandha 
tiġi ssodisfata kemm fil-kontroll tas-solvent kif ukoll fit-toqob vojta.  
Tabella 4  
Tifsira tal-platt tal-kontroll tal-kwalità g ħall-ittestjar tal-prestazzjoni ta' ċelloli H295R 
mhux esposti u ċelloli esposti g ħal inibituri mag ħrufin (PRO = prokloraz) u 
stimulaturi (FOR = forskolin) tal-produzzjoni ta' E2 u T. Wara li jintemm l-esperiment ta' esponiment u jitne ħħa l-midjum, ser ti żdied soluzzjoni ta' metanol ta' 
70 % mat-toqob kollha ta' MeOH biex isservi ta' kontroll po żittiv għaċ-ċitotossiċità (ara 
l-assaġġ taċ-ċitotossiċità fl-Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4))
 
1 2 3 4 5 6  
A Vojta (  a ) Vojta (  a ) Vojta (  a ) Vojta (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Vojta (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Vojta (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Ċelloli f'toqob Vojta jir ċievu midjum biss (ji ġifieri ebda solvent). 
( b ) Metanol (MeOH) ser ji żdied wara  li jintemm l-esponiment u l-midjum jitne ħħa minn dawn it-toqob. 
( c ) Kontroll tas-solvent tad-DMSO (1 μl/toqba).  
Tabella 5  
Kriterji tal-prestazzjoni g ħall-Platt tal-Kontroll tal-Kwalità  
T E2  
Produzzjoni ba żi ta' 
ormon fil-kontroll 
solvent (SC) ≥ 5 darbiet l-LOQ ≥ 2,5 darbiet l-LOQ 
Induzzjoni (10 μM 
forskolin) ≥ 1,5 darbiet l-SC ≥ 7,5 darbiet l-SC 
Inibizzjoni (1 μM 
prokloraz) ≤ 0,5 darbiet l-SC ≤ 0,5 darbiet l-SC  
PROĊEDURA TA' ESPONIMENT G ĦAL SUSTANZA KIMIKA  
38. Iċ-ċelloli preinkubati jitne ħħew mill-inkubatur (paragrafu 21) u ji ġu kkon­
trollati taħt mikroskopju biex ji ġi żgurat li huma f'kundizzjoni tajba (kemm 
qabdu, il-morfolo ġija) qabel id-do żaġġ. 
39. Iċ-ċelloli jitqieg ħdu f'kabina tal-bijosikurezza u l-midjum supplimentat 
jitneħħa u jinbidel ma' midjum supplimentat ġdid (1 ml/toqba). DMSO 
huwa s-solvent ippreferut g ħal dan il-metodu ta' ttestjar. Madankollu, jekk 
hemm ra ġunijiet sabiex jintu żaw solventi o ħrajn, għandha tiġi deskritta 
r-raġuni xjentifika. I ċ-ċelloli huma esposti g ħas-sustanza kimika ta' ttestjar 
b'żieda ta' 1 μl tas-soluzzjoni tal- ħażna xierqa fid-DMSO (ara l-Appendi ċi II 
tar-rapport ta' validazzjoni (4)) g ħal kull 1 ml midjum supplimentat (volum 
tat-toqba). Dan jirri żulta f'kon ċentrazzjoni finali ta' 0,1 % DMSO fit-toqob. 
Biex jiġi żgurat taħlit adegwat, ġeneralment huwa ppreferut li s-soluzzjoni 
tal-ħażna xierqa tas-sustanza kimika tat-test fid-DMSO tit ħallat ma' midjum 
supplimentat biex tinkiseb il-kon ċentrazzjoni finali mixtieqa g ħal kull do ża, 
u t-taħlita tiżdied ma' kull toqba e żatt wara t-tne ħħija tal-midjum il-qadim. 
Jekk tintu ża din l-g ħażla, il-kon ċentrazzjoni tad-DMSO (0,1 %) g ħandha 
tibqa' konsistenti bejn it-toqob kollha. It-toqob li fihom l-ikbar żewġ konċ­
entrazzjonijiet ji ġu vvalutati vi żwalment g ħal formazzjoni ta' pre ċipitati jew 
dardir bħala indikazzjoni ta' solubilità inkompluta tas-sustanza kimika 
tat-test billi jintu ża sterjomikroskopju. Jekk ji ġu osservati dawn 
il-kundizzjonijiet (dardir, formazzjoni ta' pre ċipitati), it-toqob li fihom 
l-inqas kon ċentrazzjonijiet li jmiss ji ġu eżaminati wkoll (u l-bqija) u 
l-konċentrazzjonijiet li ma dda ħħlux kompletament fis-soluzzjoni 
għandhom ji ġu esklużi minn evalwazzjoni u anali żi ulterjuri. Il-platt 
jittieħed lura fl-inkubatur f'37 °C f'5 % CO  2 f'atmosfera tal-arja g ħal 48 
siegħa. It-tifsila tal-platt tas-sustanza kimika tat-test tintwera fit-Tabella 6. 
Il-ħażniet 1 -7 juru tfassil b'do żijiet li jiżdiedu tas-sustanza kimika tat-test.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabella 6  
Skematika tad-do żaġġ għall-esponiment ta' ċelloli H295R biex ji ġu ttestjati sustanzi 
kimiċi fi platt b'24 toqba  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Ħażna 4 Ħażna 4 Ħażna 4 
B Ħażna 1 Ħażna 1 Ħażna 1 Ħażna 5 Ħażna 5 Ħażna 5 
C Ħażna 2 Ħażna 2 Ħażna 2 Ħażna 6 Ħażna 6 Ħażna 6 
D Ħażna 3 Ħażna 3 Ħażna 3 Ħażna 7 Ħażna 7 Ħażna 7 
40. Wara 48 sieg ħa, il-platti ta' esponiment jitne ħħew mill-inkubatur u kull 
toqba tiġi kkontrollata ta ħt il-mikroskopju g ħall-kundizzjoni ta ċ-ċelloli 
(kemm qabdu, il-morfolo ġija, il-grad ta' konfluwenza) u sinjali ta' ċitotos­
siċità. Il-midjum minn kull toqba jinqasam f' żewġ ammonti ndaqs (madwar 
490 μl kull wie ħed) u jiġi ttrasferit f' żewġ kunjetti separati mmarkati kif 
xieraq (jiġifieri alikwota wa ħda biex ji ġi pprovdut kampjun ta' ri żerva għal 
kull toqba). Biex ji ġi evitat milli jinxfu ċ-ċelloli, il-midjum jitne ħħa ringiela, 
ringiela jew kolonna, kolonna u ji ġi sostitwit ma' midjum g ħall-assaġġ 
tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità taċ-ċelloli. Jekk il-vijabbiltà/ ċitotossiċità taċ- 
ċelloli ma titkejjilx mill-ewwel, ji żdied 200 μl PBS b'Ca  2+ u Mg  2+ f'kull 
toqba. Il-midjums ji ġu ffriżati f'– 80 °C sa ma jsir iktar ippro ċessar biex 
jiġu analizzati l-kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni (ara l-paragrafi 44-46). 
Filwaqt li T u E2 f'midjum mi żmum f'– 80 °C huma ġeneralment stabbli 
għal tal-inqas 3 xhur, l-istabbiltà tal-ormoni matul il- ħżin għandha tiġi 
dokumentata fi ħdan kull laboratorju.  
41. Eżatt wara li jitne ħħa l-midjum, ji ġu determinati l-vijabblità/ ċitotossiċità taċ- 
ċelloli għal kull platt ta' esponiment.  
Determinazzjoni tal-Vijabbiltà ta ċ-Ċelloli  
42. Assa ġġ tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità taċ-ċelloli tal-g ħażla tista' tintu ża biex jiġi 
determinat l-impatt potenzjali tas-sustanza kimika tat-test fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli. L-assa ġġ għandu jkun jista' jipprovdi kejl veru tal-per ċentwal 
ta' ċelloli vijabbil pre żenti f'toqba, jew g ħandu jintwera li dan huwa diret ­
tament paragunabbli (funzjoni lineari ta') mal-Assa ġġ Live/Dead® (ara 
l-Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4)). Assa ġġ alternattiv li 
ntwera li ja ħdem daqstantie ħor huwa t-test MTT [3-(4,5-dimetiltja żol-2- 
yl)-2,5-difenil tetra żolju bromur] (18). Il-valutazzjoni tal-vijabbiltà ta ċ- 
ċelloli bl-u żu tal-metodi ta' hawn fuq hija kejl relattiv li mhux bilfors juri 
relazzjonijiet lineari man-numru assolut ta' ċelloli f'toqba. G ħalhekk, 
l-analist g ħandu jagħmel valutazzjoni vi żwali parallela so ġġettiva ta' kull 
toqba, u g ħandhom jittie ħdu ritratti di ġitali tal-SCs u tal-ikbar żewġ konċen­
trazzjonijiet mhux tossi ċi li mbagħad jiġu arkivjati biex tkun tista' ssir valu ­
tazzjoni iktar tard tad-densità vera ta ċ
-ċelloli jekk ikun hemm b żonn. Jekk 
spezzjoni vi żwali jew kif muri mill-assa ġġ tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità jidher li 
hemm żieda fin-numru ta' ċelloli, iż-żieda apparenti trid ti ġi verifikata. Jekk 
tiġi verifikata żieda fin-numri ta' ċelloli, din g ħandha tiġi ddikjarata 
fir-rapport tat-test. Il-vijabbiltà ta ċ-ċelloli ser ting ħata b'mod relattiv g ħar- 
rispons medju fl-SCs, li jitqies li huwa ċelloli vijabbli 100 %, u hija kkal ­
kolata kif xieraq g ħall-assaġġ tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità taċ-ċeloli li jintu ża. 
Għall-assaġġ tal-MTT, tista' tintu ża l-formula li ġejja: ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% ċelloli vijabbli =  (rispons fit-toqba – rispons medju f'toqob mog ħtija 
MeOH [= 100 % mejtin]) ÷ (rispons medju f'toqob SC – rispons medju 
f'toqob mog ħtija MeOH [= 100 % mejtin])  
43. Toqob b'varjabbiltà inqas minn 80 %, relatati mal-vijabbiltà medja fl-SCs (= 
100 % vijabbiltà), ma g ħandhomx ikunu inklu żi fl-analiżi tad-dejta finali. 
L-inibizzjoni tal-isterojdo ġenesi li sse ħħ fil-preżenza ta' kwa żi 20 % ċito­
tossiċità għandha tiġi evalwata bir-reqqa biex ji ġi żgurat li ċ-ċitotossiċità 
mhijiex il-kaw ża għall-inibizzjoni.  
Analiżi tal-Ormoni  
44. Kull laboratorju jista' ju ża sistema ta' kejl tal-ormoni tal-g ħażla tiegħu għall- 
analiżi ta' T u E2. Jistg ħu jintużaw alikwoti ta' ri żerva ta' midjum minn kull 
grupp tal-kura biex jit ħejjew dilwizzjonijiet ħalli l-kon ċentrazzjoni ti ġi fi 
ħdan il-parti lineari tal-kurva standard. Kif osservat fil-paragrafu 29, kull 
laboratorju g ħandu juri l-konformità tas-sistema ta' kejl tal-ormoni tieg ħu 
(eż., ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) mal-kriterji tal-QC billi janalizza 
midjum supplimentat mi żjud b'kontroll tal-ormon intern qabel ma jwettaq 
testijiet tal-QC jew ittestjar ta' sustanzi kimi ċi. Sabiex ji ġi żgurat li 
l-komponenti tas-sistema tat-test ma jxekklux il-kejl tal-ormoni, l-ormoni jista' jkollhom b żonn jiġu estrattati mill-midjums qabel ma jitkejlu (ara 
l-paragrafu 30 g ħall-kundizzjonijiet li fihom ikun hemm jew ma jkunx 
hemm bżonn estrazzjoni). Huwa rakkomandat li ssir estrazzjoni wara 
l-proċeduri fl-Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4).
 
45. Jekk qed tintu ża kitt kummer ċjali tat-testijiet biex titkejjel il-produzzjoni 
tal-ormoni, l-anali żi tal-ormoni g ħandha ssir kif spe ċifikat fil-manwali 
pprovduti mill-manifattur tal-kitt tat-testijiet. Ħafna mill-manifatturi 
għandhom pro ċedura unika li biha jsiru l-anali żijiet tal-ormoni. 
Id-dilwizzjonijiet tal-kampjuni jridu ji ġu aġġustati b'tali mod li 
l-konċentrazzjonijiet mistennija tal-ormoni g ħall-kontrolli tas-solvent 
jaqgħu fi ħdan iċ-ċentru tal-medda lineari tal-kurva standard tal-assa ġġ 
individwali (Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4)). Valuri li 
jaqgħu barra s-sehem lineari tal-kurva standard g ħandhom ji ġu rrifjutati.  
46. Il-kon ċentrazzjonijiet tal-ormoni finali huma kkalkolati kif ġej: 
Eżempju: 
Estratti: 450 μl midjum 
Rikostitwiti f': 250 μl bafer tal-assa ġġ 
Dilwizzjoni fl-Assa ġġ: 1:10 (biex il-kampjuni ji ġi fi ħdan 
il-medda lineari tal-kurva standard) 
Konċentrazzjoni ta' Ormoni 
fl-Assaġġ: 150 pg/ml (di ġà aġġustata għall-konċen­
trazzjoni g ħal kull ml tal-kampjun 
fl-assaġġ) 
Irkupru: 89 % Konċentrazzjoni tal-ormoni 
finali = (Konċentrazzjoni tal-ormoni (g ħal kull 
ml) ÷ irkupru) (fattur ta' dilwizzjoni) 
Konċentrazzjoni tal-ormoni 
finali = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Għażla tal-kon ċentrazzjonijiet tat-test  
47. Għandhom isiru tal-inqas żewġ testijiet indipendenti tal-assa ġġ. Sakemm 
informazzjoni pre ċedenti dwar il-limitu ta' solubilità jew i ċ-ċitotossiċità 
ma tipprovdix ba żi għall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet tat-test, huwa 
rakkomandat li l-kon ċentrazzjonijiet tat-test g ħall-ewwel test ikollhom 
intervalli ta' log  10 b'10  -3 M li tkun il-kon ċentrazzjoni massima. Jekk 
is-sustanza kimika hija solubbli, u mhux ċitotossika fl-ebda 
mill-konċentrazzjonijiet ittestjati, u l-ewwel test ikun negattiv g ħall-konċen­
trazzjonijiet kollha, mela dan irid ji ġi kkonfermat f'test wie ħed jew iktar 
billi jintu żaw l-istess kundizzjonijiet b ħal dawk fl-ewwel test li sar (Tabella 
7). Jekk ir-ri żultati tal-ewwel test huma  ekwivoċi (jiġifieri l-bidla ta' drabi 
hija statistikament sinifikanti mill-SC f'kon ċentrazzjoni wa ħda biss) jew 
pożittivi (jiġifieri l-bidla ta' drabi f' żewġ konċentrazzjonijiet ma ġenb jew 
iktar hija statistikament sinifikanti), it-test g ħandu jiġi ripetut kif indikat 
fit-Tabella 7 billi ji ġu rfinati l-kon ċentrazzjonijiet tat-test mag ħżulin. 
Il-konċentrazzjonijiet tat-test fit-tieni u t-tielet test (jekk applikabbli) 
għandhom ji ġu aġġustati fuq il-ba żi tar-riżultati tal-kon ċentrazzjonijiet 
parentesi li ġew ittestjati inizjalment li kka ġunaw effeett billi ntu ża 
intervall ta' kon ċentrazzjoni ta' 1/2-log (e ż., jekk it-test ori ġinali ta' 0,001, 
0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM irriżulta f'induzzjonijiet b'1 u 10 μM, 
il-konċentrazzjonijiet ittestjati fit-tieni test g ħandhom ikunu 0,1, 0,3, 1, 3, 
10, 30, 100 μM), sakemm ma jkunx hemm b żonn li jintu żaw konċen­
trazzjonijiet inqas biex jinkiesb LOEC. Fl-a ħħar każ, tal-inqas ħames kon ċ­
entrazzjonijiet ta ħt l-inqas kon ċentrazzjoni ttestjata fl-ewwel test g ħandhom 
jintużaw fit-tieni test billi tintu ża skala ta' 1/2-log. Jekk it-tieni test ma 
jikkonfermax l-ewwel test (ji ġifieri l-importanza statistika ma sse ħħx 
fil-konċentrazzjoni li qabel ittestjat po żittiva, inkrement tal-kon ċentrazzjoni 
ta' ± 1), g ħandu jsir it-tielet esperiment billi jintu żaw il-kundizzjonijiet 
oriġinali ta' ttestjar. Ri żultati ekwivo ċi fl-ewwel test jitqiesu negattivi jekk 
l-effett osservat ma jkunx jista' ji ġi kkonfermat fl-ebda wie ħed miż-żewġ 
testijiet ta' wara. Ri żultati ekwivo ċi jitiqesu risponsi (effett) po żittivi meta 
r-rispons ikun jista' ji ġi kkonfermat f'tal-inqast testie ħor fi ħdan inkrement 
tal-konċentrazzjoni ta' ± 1 (ara t-taqsima 55 g ħall-Proċedura ta' Interpre ­
tazzjoni tad-Dejta).  
Tabella 7  
Matriċi tad-deċiżjonijiet g ħal xenarji ta' e żitu possibbli  
Test 1 Test 2 Test 3 De ċiżjoni 
Xenarju De ċiżjoni Xenarju De ċiżjoni Xenarju Po żittiva Negattiva  
Negattiv Konferma (  a ) Negattiv Waqfa X 
Negattiv Konferma (  a ) Po żittiv Irfinar (  b ) Negattiv X 
Ekwivoku (  c ) Irfinar (  b ) Negattiv Konferma (  a ) Negattiv X 
Ekwivoku (  c ) Irfinar (  b ) Negattiv Konferma (  a ) Po żittiv X 
Ekwivoku (  c ) Irfinar (  b ) Po żittiv X 
Pożittiv Irfinar (  b ) Negattiv Konferma (  a ) Po żittiv X  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Test 1 Test 2 Test 3 De ċiżjoni 
Xenarju De ċiżjoni Xenarju De ċiżjoni Xenarju Po żittiva Negattiva  
Negattiv Konferma (  a ) Po żittiv Irfinar (  b ) Po żittiv X 
Pożittiv Irfinar (  b ) Po żittiv Waqfa X  
( a ) Ikkonferma test pre ċedenti bl-u żu tal-istess tifsila tal-esperiment. 
( b ) Erġa' ttestja l-assa ġġ b'intervall ta' kon ċentrazzjoni ta' 1/2-log (parentesi tal-kon ċentrazzjoni li ttestjat notevolment differenti 
fl-esperiment pre ċedenti). 
( c ) Bidla ta' drabi f'kon ċentrazzjoni wa ħda hija b'mod sinifikatament differenti fil-livell statistiku mill-SC  
Kontroll tal-Kwalità tal-Platt tat-Test  
48. Minbarra l-il ħuq tal-kriterji g ħall-platt tal-QC, g ħandhom ji ġu ssodisfati 
kriterji oħrajn tal-kwalità li jappartjenu g ħal varjazzjoni a ċċettabbli bejn 
toqob replikati, esperimenti replikati, linearità u sensittività tas-sistemi ta' kejl tal-ormoni, varjabbiltà bejn kejliet replikati tal-ormini tal-istess 
kampjun, u rkupru tal-per ċentwal ta' żidiet mal-ormoni wara estrazzjoni 
tal-midjum (jekk applikabbli; ara l-Paragrafu 30 rigward ir-rekwi żiti ta' 
estrazzjoni) u dawn huma pprovduti fit-Tabella 8. Id-dejta g ħandha tkun 
taqa' fi ħdan il-meded a ċċettabbli definiti g ħal kull parametri li g ħandu 
jitqies għal evalwazzjoni ulterjuri. Jekk dawn il-kriterji ma jkunux isso ­
disfati, l-ispreadsheet g ħandha tinnota li l-kriterji tal-QC ma ġewx isso ­
disfati għall-kampjun inkwistjoni, u li l-kampjun g ħandu jerġa' jerġa' jiġi 
analizzat jew jitne ħħa mis-sett tad-dejta.
 
Tabella 8  
Meded u/jew varjazzjoni a ċċettabbli (%) g ħall-parametri tal-platt tat-test tal-assa ġġ ta' 
H295R  
(LOQ: Limitu ta' Kwantifikazzjoni tas-sistema ta' mmani ġġjar tal-ormoni. CV: Koeffi ċjent 
tal-varjazzjoni; SC: Kontroll tas-Solvent; DPM: Di żintegrazzjonijiet fil-minuta)  
Tqabbil Bejn T E2  
Produzzjoni tal-ormoni 
bażi f'SCs Darbiet ikbar mil-LOQ ≥ 5 darbiet 
iktar ≥ 2,5 darbiet 
iktar 
Esperimenti tal-Esponiment 
— Fi ħdan is-CV tal-Platt 
għal SCs (Toqob Replikati) Konċentrazzjonijiet 
Assoluti ≤ 30 % ≤ 30 % 
Esperimenti tal-Esponiment 
— Bejn CV tal-Platt g ħal 
SCs (Esperimenti 
Replikati) Bidla fi Drabi Ikbar ≤ 30 % ≤ 30 % 
Sistema ta' Kejl tal-Ormoni 
— Sensittività Tnaqqis fi drabi identi ­
fikabbli relatat mal-SC ≥ 5 darbiet 
inqas ≥ 2,5 darbiet 
inqas 
Sistema ta' Kejl tal-Ormoni 
— CV tal-Kejl Replikat għal SCs (
 a ) Konċentrazzjonijiet 
Assoluti ≤ 25 % ≤ 25 % 
Estrazzjoni tal-Midjum — 
Irkupru tal-Istandard Intern 
3H (Jekk Applikabbli) DPM ≥ 65 % Nominali  
( a ) B'referenza g ħall-kejliet replikati tal-istess kampjun  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALIŻI U RAPPORTAR TAD-DEJTA  
Analiżi tad-Dejta  
49. Biex ji ġu evalwati ż-żieda/it-tnaqqis relatati fi produzzjoni tal-ormoni kumi ­
kament alterata, ir-ri żultati għandhom ji ġu normalizzati g ħall-valur medju 
tal-SC ta' kull platt tat-test, u r-ri żultati espressi b ħala bidliet relatati mal-SC 
f'kull platt tat-test. Id-dejta kollha g ħandha tiġi espressa b ħala devjazzjoni 
standard (SD) medja ta' ± 1.  
50. Dejta dwar l-ormoni mit-toqob fejn i ċ-ċitotossiċità kienet inqas minn 20 % 
biss għandha tkun inklu ża fl-anali żi tad-dejta. Il-bidliet relatati g ħandhom 
jiġu kkalkolati kif ġej: 
Bidla Relattiva =  (Konċentrazzjoni ta' ormoni f'kull toqba) ÷ (Kon ċen­
trazzjoni medja tal-ormoni fit-toqob kollha ta' kontroll tas-solvent).  
51. Jekk permezz ta' spezzjoni vi żwali tat-toqba jew kif muri mill-assa ġġ 
tal-vijabbiltà/ ċitotossiċità deskritti fil-paragrafu 42 jidher li hemm żieda 
fin-numru ta' ċelloli, iż-żieda apparenti trid ti ġi verifikata. Jekk ti ġi 
verifikata żieda fin-numri ta ċ-ċelloli, din g ħandha ti ġi ddikjarata 
fir-rapport tat-test.  
52. Qabel ma jsiru anali żijiet statisti ċi, għandhom ji ġu evalwati 
s-suppożizzjonijiet tan-normalità u l-omo ġenità tal-varjanza. In-normalità 
għandha tiġi evalwata billi jintu żaw plots standard tal-probabilità jew 
metodu statistiku xieraq ie ħor (eż., test ta' Shapiro-Wilk). Jekk normalment 
ma ssirx distribuzzjoni tad-dejta (bidliet fi drabi), g ħandu jsir tentattiv ta' 
trasformazzjoni tad-dejta biex tkun approssimata distribuzzjoni normali. 
Jekk normalment issir distribuzzjoni jew ti ġi approssimata distribuzzjoni 
normali tad-dejta, id-differenzi bejn il-gruppi ta' kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza kimika u l-SCs g ħandhom ji ġu analizzati billi jintu ża test 
parametriku (e ż., it-Test ta' Dunnett) bil- konċentrazzjoni  li hija l-varjabbli 
indipendenti, u r- rispons  (bidla fi drabi) il-varjabbli dipendenti. Jekk norm ­
alment id-dejta ma ti ġix distribwita, g ħandu jintu ża test xieraq mhux 
parametriku (e ż., it-test ta' Kruskal Wallis, it-test Steel's Many-one rank). 
Id-differenzi jitqiesu sinifikanti f'p ≤ 0,05. L-evalwazzjonijiet statisti ċi jsiru 
fuq il-bażi tal-valuri medji g ħal kull toqba li jirrappre żentaw punti ta' dejta 
replikati indipendenti. Huwa anti ċipat li min ħabba l-intervall kbir tad-do żi 
fl-ewwel test (skala log  10 ) f'ħafna każijiet mhuwiex ser ikun possibbli li ji ġu 
deskritti relazzjonijiet ċari bejn il-kon ċentrazzjoni u r-rispons fejn l-ikbar 
żewġ dożi ser ikunu fis-sehem lineari tal-kurva sigmojde. G ħaldaqstant, 
għall-ewwel test jew kwalunkwe sett ta' dejta ie ħor fejn isse ħħ din 
il-kundizzjoni (e ż., fejn ma tkun tista' ti ġi stmata ebda effika ċja massima), 
ser jiġu applikati statistiki varjabbli fissi tat-tip I kif deskritti iktar 'il fuq.  
53. Jekk ikun hemm iktar minn żewġ punti ta' dejta fis-sehem lineari tal-kurva 
u meta jkunu jistg ħu jiġu kkalkolati l-effika ċji massimi — kif inhu anti ċipat 
għal uħud mit-tieni testijiet li jsiru billi jintu ża intervall semi-log ta' kon ċen­
trazzjonijiet ta' esponiment — g ħandu jintu ża mudell ta' rigressjoni probit, 
logit jew ie ħor xieraq biex ji ġu kkalkolati l-kon ċentrazzjonijiet effettivi (e ż., 
EC50 u EC20).  
54. Għandhom ji ġu pprovduti ri żultati kemm f'format grafiku (graffs bil-kolonni 
li jirrappre żentaw l-SD medja +/- 1) u f'tabella (LOEC/NOEC, direzzjoni 
tal-effett, u l-qawwa tar-rispons massimu li hija parti mis-sehem do ża- 
rispons tad-dejta) (ara l-Figura 3 g ħal eżempju). Valutazzjoni tad-dejta 
titqies valida biss jekk tkun ġiet ibbażata fuq tal-inqas żewġ testijiet li 
jkunu saru b'mod indipendenti. Esperiment jew test jitqies importanti jekk ikun sar f'data differenti billi jintu ża sett ġdid ta' soluzzjonijiet u kontrolli. 
Il-medda ta' kon ċentrazzjoni u żata fit-testijiet 2 u 3 (jekk ikun hemm 
bżonnhom) tista' titfassal fuq il-ba żi tar-riżultati tat-test 1 biex ti ġi definita 
aħjar il-medda do ża-rispons li fiha l-LOEC (ara l-paragrafu 47).
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figura 3  
Eżempju tal-pre żentazzjoni u l-evalwazzjoni tad-dejta miksuba matul it-twettiq tal-Assa ġġ ta' H295R f'format 
grafiku u tabulari.  
(L-asteriski jindikaw differenzi statistikament sinifikanti mill-kontroll tas-solvent (p< 0,05). (LOEC: L-inqas 
konċentrazzjoni effettiva osservata; Bidla Mass: Sa ħħa massima tar-rispons osservat fi kwalunkwe kon ċentrazzjoni 
relatata mar-rispons medju tal-SC (= 1))
  
Sustanza Kimika LOEC Bidla Mass  
Forskolin 0,01 0,15-il darba 
Letrożol 0,001 29 darba  
Proċedura ta' Interpretazzjoni tad-Dejta  
55. Sustanza kimika tat-test ti ġi ġġudikata po żittiva jekk l-induzzjoni bi drabi 
tkun statistikament differenti ( p ≤ 0,05) mill-kontroll tas-solvent f' żewġ 
konċentrazzjonijiet ma ġenb xulxin f'tal-inqas żewġ testijiet indipendenti 
(Tabella 7). Sustanza kimika tat-test ti ġi ġġudikata negattiva wara żewġ 
testijiet negattivi indipendenti, jew fi tliet testijiet, li jinvolvu żewġ 
testijiet negattivi u test ekwivoku jew po żittiv. Jekk id-dejta ġġenerata fi 
tliet esperimenti indipendenti ma tissodisfax il-kriterji ta' de ċiżjoni elenkati 
fit-Tabella 7, ir-ri żultati tal-esperiment ma jkunux interpretabbli. Ir-ri żultati 
f'konċentrazzjonijiet li jaqb żu l-limitu tas-solubilità jew f'kon ċentrazzjonijiet 
ċitotossiċi ma għandhomx ikunu inklu żi fl-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
Rapport tat-Test  
56. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Faċilità ta' ttestjar  
— Isem il-fa ċilità u l-post,  
— Id-direttur tal-istudju u persunal ie ħor u r-responsabilitajiet ta' studju 
tiegħu, 
— Id-dati li fihom beda u ntemm l-istudju.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Sustanza kimika tat-test, rea ġenti u kontrolli  
— L-identità (isem/Nru tas-CAS kif xieraq), is-sors, in-numru tal-lott, 
il-purità, il-fornitur, u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, 
ir-reaġenti u l-kontrolli,  
— L-għamla fiżika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi rilevanti tas-sustanza 
kimika tat-test,  
— Il-kundizzjonijiet tal- ħżin u l-metodu tal-frekwenza tat-t ħejjija 
tas-sustanzi kimi ċi tat-test, ir-rea ġenti u l-kontrolli,  
— L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test.  
Ċelloli  
— Is-sors u t-tip ta' ċelloli,  
— In-numru ta' mog ħdijiet taċ-ċelloli (identifikatur tal-mog ħdijiet taċ- 
ċelloli) taċ-ċelloli użati fit-test,  
— Deskrizzjoni tal-pro ċeduri għall-manutenzjoni tal-kolturi ta ċ-ċelloli.  
Rekwiżiti ta' qabel l-ittestjar (jekk applikabbli)  
— Deskrizzjoni u ri żultati tat-test ta' interferenza tal-assa ġġ tal-ormoni 
mas-sustanza kimi ċi, 
— Deskrizzjoni u ri żultati tal-kejliet tal-effi ċjenza tal-estrazzjoni tal-ormoni,  
— Il-kurvi standard u ta' kalibrazzjoni g ħall-assaġġi analitiċi li għandom 
ikunu inklu żi, 
— Il-limiti ta' identifikazzjoni g ħall-assaġġi analitiċi magħżulin, 
Kundizzjonijiet tat-test  
— Il-kompo żizzjoni tal-midjums,  
— Il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test,  
— Id-densità ta ċ-ċelloli (kon ċentrazzjonijiet stmati jew imkejlin ta ċ-ċelloli 
wara 24 u 48 sieg ħa), 
— Is-solubilità tas-sustanza kimika tat-test (limitu tas-solubilità, jekk deter ­
minat),  
— Il-ħin u l-kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni.  
Riżultati tat-test  
— Dejta mhux ippro ċessata għal kull toqba g ħal kontrolli u sustanzi kimi ċi 
tat-test–kull kejl replikat fil-forma ta' dejta ori ġinali pprovduta 
mill-istrument u żat biex titkejjel il-produzzjoni tal-ormoni (e ż., OD, 
unitajiet tal-fluworexxenza, DPM, e ċċ.), 
— Il-validazzjoni tan-normalità jew l-ispjegazzjoni tat-trasformazzjoni 
tad-dejta;  
— Ir-risponsi medji +/- 1 SD g ħal kull toqba mkejla,  
— Dejta dwar i ċ-ċitotossiċità (konċentrazzjonijiet tat-test li kka ġunaw ċito­
tossiċità), 
— Konferma li ġew issodisfati r-rekwi żiti tal-QC,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— Il-bidla relattiva mqabla mal-kontroll tas-solventi kkore ġut għaċ-ċitotos­
siċità, 
— Graff bil-kolonni li juri relattiv (bidla ta' drabi) f'kul kon ċentrazzjoni, 
SD u sinifikanza statistika kif spjegat fil-paragrafu 49-54.  
Interpretazzjoni tad-dejta  
— Applikazzjoni tal-pro ċedura ta' interpretazzjoni tad-dejta g ħar-riżultati u 
diskussjoni tas-sejbiet,  
Diskussjoni  
— Hemm xi indikazzjoni mill-istudju dwar il-possibilità li d-dejta dwar 
T/E2 tista' tkun influwenzata minn effetti indiretti fuq il-mog ħdijiet 
glukokortikojdi u mineralikortikojdi?  
Konklużjonijiet  
TAGĦRIF 
(1) OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and 
Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, fl-Appendi ċi 2 għall- 
Kapitolu B.54 ta' dan l-Anness.  
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone 
production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114-124.
 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23 — 30.
 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/ 
MONO(2010)31, Pari ġi. Disponibbli fuq [http://www.oecd.org/document/ 
30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html]  
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Pari ġi. Disponibbli fuq: [http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Disponibbli 
fuq: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_ 
29_05.pdf]  
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78-89.
 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44-54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model devel ­
opment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265-272.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137-1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adreno ­
cortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488-5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line,  Chemosphere,  80:578-584.
 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. 
and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 
and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148.  
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731-737.
 
(16) Il-Kapitolu B.55 ta' dan l-Anness: Bijoassa ġġ Hershberger f'Firien: Assa ġġ 
ta' Tgħarbil ta' Terminu Qasir g ħal Proprjetajiet (Anti)Andro ġeniċi. 
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222-231.  
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55-63.  
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
492.
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Appendiċi 
DEFINIZZJONIJIET:  
Konfluwenza  tirreferi g ħall-kopertura jew il-proliferazzjoni li ċ-ċelloli jitħallew 
jagħmlu tul jew fi ħdan il-midjum tal-koltura.  
Sustanza kimika  tfisser sustanza jew ta ħlita. 
CV tirreferi g ħall-koeffiċjent tal-varjazzjoni, u hija definita b ħala l-proporzjon 
tad-devjazzjoni standard ta' distribuzzjoni g ħall-medja aritmetiku tag ħha. 
CYP  tirreferi g ħall-monoossi ġenasi taċ-ċitokroma P450, familja ta' ġeni u 
l-enżimi prodotti minnhom li huma involuti fl-iskattar ta' firxa wiesg ħa ta' 
reazzjonijiet bijokimi ċi inklużi s-sinteżi u l-metaboli żmu tal-ormoni sterojdi.  
DPM  hija diżintegrazzjoni fil-minuta. Hija n-numru ta' atomi fi kwantità parti ­
kolari ta' materjal radjuattiv li huwa identifikat li ntilef f'minuta.  
E2 hija 17β-estradjol, l-iktar estro ġen importanti fis-sistemi tal-mammiferi.  
Ċelloli H295R  huma ċelloli adrenokar ċinoma tal-bniedem li g ħandhom 
il-karatteristi ċi fiżjoloġiċi ta' ċelloli adrenali tal-fetu tal-bniedem mhux differ ­
enzjati b'mod żonali u li jresprimu l-en żimi kollha tal-mog ħdija 
tal-isterojdo ġenesi. Huma disponibbli mill-ATCC.  
Midjum tal-iffri żar jintuża biex jiġu ffriżati u jinħażnu ċelloli ffriżati. Jikkonsisti 
f'midjum tal- ħżin flimkien ma' BD NuSerum u dimetil sulfossidu.  
Medda Lineari  hija l-medda fi ħdan il-kurva standard g ħal sistema ta' kejl 
tal-ormoni li fiha r-ri żultati jkunu proporzjonati g ħall-konċentrazzjoni tal-analit 
preżenti fil-kampjun.  
LOQ  tfisser  “Limitu ta' Kwantifikazzjoni” , u hija l-inqas kwantità ta' sustanza 
kimika li tista' ti ġi distinta min-nuqqas ta' dik is-sustanza kimika (valur vojt) fi 
ħdan limitu ta' kunfidenza ddikjarat. G ħall-fini ta' dan il-metodu, l-LOQ tipi ­
kament hija definita mill-manifattur tas-sistemi tat-test jekk ma jkunx spe ċifikat 
b'mod differenti.  
LOEC  l-Inqas Kon ċentrazzjoni b'Effett Osservata, l-inqas livell ta' kon ċen­
trazzjoni li fih ir-rispons tal-assa ġġ ikun statistikament differenti minn dak 
tal-kontroll tas-solvent.  
NOEC  hija l-Kon ċentrazzjoni bl-Ebda Effett Osservat, li hija l-og ħla konċen­
trazzjoni ttestjata jekk l-assa ġġ ma jipprovdix rispons po żittiv. 
Mogħdija hija n-numru ta' drabi li ċ-ċelloli jinqasmu wara t-tnedija ta' koltura 
minn ħażna. Il-mog ħdija inizjali li nbdiet mill- ħażna ffriżata hija assenjata 
n-numru wie ħed (1). Iċ-ċelloli li nqasmu darba ji ġu mmarkati mog ħdija 2, eċċ. 
PBS hija s-salmastru bafer fosfat ta' Dulbecco.  
Kontroll tal-Kwalità , imqassra QC, tirreferi g ħall-kejliet me ħtieġa biex ti ġi 
żgurata dejta valida.  
Platt ta' kontroll tal-kwalità  huwa platt b'24 toqba li fih żewġ konċen­
trazzjonijiet tal-kontrolli po żittivi u negattivi biex ti ġi ssorveljata l-prestazzjoni 
ta' lott ġdid ta' ċelloli jew biex ji ġu pprovduti l-kontrolli po żittivi għall-assaġġ 
meta jiġu ttestjati sustanzi kimi ċi. 
Test huwa esperiment indipendenti kkaratterizzat minn sett ġdid ta' soluzzjonijiet 
u kontrolli.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Midjum tal- ħżin huwa l-ba żi għall-preparazzjoni ta' rea ġenti oħrajn. Jikkonsisti 
f'taħlita 1:1 ta' Dulbecco's Modified Eagle's Medium u t-ta ħlita tan-Nutrijenti 
F-12 ta' Ham (DMEM/F12) f'bafer ta' 15 mM HEPES bla fenol a ħmar jew 
bikarbonat tas-sodju. Il-bikarbonat tas-sodju ji żdied bħala l-bafer, ara 
l-Appendi ċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4).  
Midjum supplimentat  jikkonsisti f'midjum tal- ħżin flimkien ma' BD Nu-Serum 
u taħlita primjum ITS+, ara l-Appendi ċi II tar-rapport ta' validazzjoni (4).  
Sterojdoġenesi  hija l-mog ħdija sintetika li twassal mill-kolesterol g ħad-diversi 
ormoni sterojdi. Bosta intermedjati fil-mog ħdija tas-sinte żi tal-isterojdi b ħal 
proġestron u testosteron huma ormoni importanti meta wa ħedhom iżda jservu 
wkoll ta' prekursuri g ħal ormoni lil hinn fil-mog ħdija sintetika.  
T tfisser testosteron, wie ħed mill-iktar żewġ androġeni importanti fis-sistemi 
mammiferi.  
Sustanza kimika tat-test  hija kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi ntu ża 
dan il-metodu ta' ttestjar.  
Platt tat-test  huwa l-platt li fih i ċ-ċelloli H295R ji ġu esposti g ħal sustanzi kimi ċi 
tat-test. Il-platti tat-test fihom il-kontroll tas-solvent u s-sustanza kimika tat-test 
f'seba' livelli ta' kon ċentrazzjoni fi triplikat.  
Tripsina 1X  hija soluzzjoni dilwita tat-tripsina tal-en żima, proteasi tas-serina 
pankreatika, u żata biex tillaxka ċ-ċelloli minn platt ta' koltivazzjoni ta ċ-ċelloli, 
ara l-Appendi ċi III tar-rapport ta' validazzjoni (4).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  ASSAĠĠI TAL-MUTAZZJONI TAL- ĠENI SOMATI ĊI U TA Ċ- 
ĊELLOLI TAL- ĠERMI TA' RODITURI TRANS ĠENIĊI 
INTRODUZZJONI  
1. Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti g ħal-Linja Gwida tal-OECD 
dwar it-Testijiet (TG) Nru 488 (2013). Il-metodi ta' ttestjar tal-UE huma disponibbi g ħal firxa wiesg ħa ta' assa ġġi tal-mutazzjoni  in vitro  li kapaċi 
jidentifikaw mutazzjonijiet fil-kromo żomi u/jew fil- ġeni. Hemm metodi ta' 
ttestjar għal punti a ħħarin in vivo  (jiġifieri aberrazzjonijiet tal-kromo żomi u 
sinteżi mhux skedata tad-DNA); madankollu, dawn ma jkejlux 
il-mutazzjonijiet tal- ġeni. Assa ġġi tal-mutazzjoni ta' Rodituri 
Transġeniċi (TGR) jissodisfaw il-b żonn ta' testijiet  in vivo  prattiċi u 
disponibbli b'mod komuni g ħal mutazzjonijiet ta' ġeni.
 
2. L-assa ġġi tal-mutazzjoni ta' TGR ġew analizzati b'mod estensiv (24)(33). 
Jużaw firien u ġrieden trans ġeniċi li fihom bosta kopji ta' vetturi pla żmidi 
integrati b'mod kromo żomali jew phage shuttle. It-trans ġeni fihom ġeni 
rapportaturi g ħall-identifikazzjoni ta' bosta tipi ta' mutazzjonijiet ikka ġunati  
in vivo  mis-sustanzi kimi ċi tat-test.  
3. Mutazzjonijiet li jfe ġġu f'roditur jing ħataw punte ġġ billi jiġi rkuprat 
it-transġene u jiġi analizzat il-fenotip tal- ġene rapportatur f'ospitant batterjali 
defiċjenti għall-ġene rapportatur. L-assa ġġi tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR 
ikejlu mutazzjonijiet ikka ġunati f'ġeni ġenetikament newtrali rkuprati minn 
prattikament kwalunkwe tessut tar-roditur. G ħalhekk, dawn l-assa ġġi 
jgħelbu ħafna mil-limitazzjonijiet e żistenti asso ċjati mal-istudju ta' 
mutazzjoni tal- ġeni in vivo  f'ġeni endoġeni (eż. tessuti limitati xierqa g ħal 
analiżi, għażla negattiva/po żittiva kontra mutazzjonijiet).  
4. Il-pi ż tal-evidenza jissu ġġerixxi li t-trans ġeni jwieġbu għall-mutaġeni b'mod 
simili għal ġeni endoġeni, speċjalment fir-rigward tal-identifikazzjoni ta' 
sostituzzjonijiet ta' pari ba żi, mutazzjonijiet fil-bidla tal-qafas, u t ħassiriet 
u tidħiliet żgħar(24).  
5. Il-Workshops Internazzjonali dwar l-Ittestjar tal- Ġenotossiċità (IWGT) 
approvaw l-inklu żjoni tal-assa ġġi tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR g ħall-iden­
tifikazzjoni  in vivo  ta' mutazzjonijiet fil- ġeni, u rrakkomandaw protokoll 
għall-implimentazzjoni tag ħhom (15)(29). Dan il-metodu ta' ttestjar huwa 
bbażat fuq dawn ir-rakkomandazzjonijiet. Anali żi ulterjuri li ssostni l-u żu ta' 
dan il-protokoll tista' tinkiseb f'(16).  
6. Huwa an ċipat li fil- ġejjieni jista' jkun possibbli li assa ġġ tal-mutazzjoni 
tal-ġeni ta' TGR jing ħaqad ma' studju tat-tossi ċità tad-do ża ripetuta 
(Kapitolu B.7 ta' dan l-Anness). Madankollu, hemm b żonn ta' dejta biex 
jiġi żgurat li s-sensittività tal-assa ġġi tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR mhijiex 
affettwata mill-perjodu iqsar ta' żmien ta' jum bejn tmiem il-perjodu ta' 
għoti u l-ħin tal-kampjunar, kif u żat fl-istudju tat-tossikolo ġija b'doża 
ripetuta, imqabbel mat-3 ijiem u żati fl-assa ġġi tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' 
TGR. Hemm b żonn dejta wkoll biex tindika li l-prestazzjoni tal-assa ġġ 
b'doża ripetuta mhijiex affettwata b'mod avvers billi ntu żat razza ta' 
rodituri trans ġeniċi minflok razez ta' rodituri tradizzjonali. Meta din 
id-dejta tkun disponibbli, dan il-metodu ta' ttestjar ser ji ġi aġġornat.  
7. Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendi ċi. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI  
8. L-assa ġġi tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR li g ħalihom hemm disponibbli 
biżżejjed dejta biex issostni l-u żu tagħhom f'dan il-metodu ta' ttestjar 
huma: ġurdien batterjofago  lacZ  (Muta™Mouse); ġurdien pla żmidu  lacZ ; 
ġurdien u far  gpt delta ( gpt u Spi  – ); ġurdien u far  lacI  (Big Blue®), kif 
isiru f'kundizzjonijiet standard. Barra minn hekk, l-assa ġġ ta' għażla 
pożittiva  cII jista' jintu ża għall-evalwazzjoni ta' mutazzjonijiet fil-mudelli 
Big Blue® u Muta™Mouse. Normalment, il-muta ġenesi fil-mudelli ta' 
TGR tiġi vvalutata b ħala frekwenza tal-mutanti; madankollu, jekk ikun 
hemm bżonn, anali żi molekolari tal-mutazzjonijiet tista' tipprovdi iktar 
informazzjoni (ara l-paragrafu 24).  
9. Dawn it-testijiet ta' mutazzjoni tal- ġeni in vivo  fuq rodituri huma spe ċ­
jalment rilevanti g ħall-valutazzjoni tal-periklu muta ġeniku peress li 
r-risponsi tal-assa ġġi huma dipendenti fuq metaboli żmu in vivo , farmakoki ­
netika, pro ċessi ta' tiswija tad-DNA, u sinte żi tat-transle żjoni tad-DNA, 
għad li dawn jistg ħu jvarjaw bejn l-ispe ċi, bejn it-tessuti u bejn it-tipi ta' 
ħsara fid-DNA. Assa ġġ in vivo  għal mutazzjonijiet tal- ġeni huwa utli g ħal 
investigazzjoni ulterjuri ta' effett muta ġeniku identifikat minn sistema  in 
vitro , u bħala segwitu g ħar-riżultati tat-testijiet billi jintu żaw punti a ħħarin 
in vivo  oħrajn (24). Minbarra li hija asso ċjata b'mod kaw żali mal-induzzjoni 
tal-kanċer, il-mutazzjoni tal- ġeni hija punt a ħħari rilevanti g ħat-tbassir ta' 
mard mhux kan ċeruż ibbażat fuq mutazzjoni f'tessuti somati ċi (12)(13) kif 
ukoll mard trasmess permezz tal-linja ġerminali.  
10. Jekk hemm evidenza li s-sustanza kimika tat-test, jew metabolita rilevanti, 
ma hi ser til ħaq ebda tessut ta' interess, ma jkunx xieraq li jsir assa ġġ 
tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR.  
IL-PRINĊIPJU TAT-TEST  
11. Fl-assa ġġi deskritti fil-paragrafu 8, il- ġene fil-mira huwa ta' ori ġini batterjali 
jew batterjofaga, u l-mezz ta' rkupru mid-DNA ġenomika tar-rodituri huwa 
permezz ta' inkorproazzjoni tat-trans ġene f'vettur batterjofagu λ jew vettur 
shuttle pla żmid. Il-pro ċedura tinvolvi l-estrazzjoni tad-DNA ġenomiku 
mit-tessut ta' interess tar-rodituri, l-ippro ċessar  in vitro  tad-DNA 
ġenomiku (ji ġifieri l-imballa ġġ ta' vetturi λ, jew il-ligazzjoni u 
l-elettroporazzjoni ta' pla żmidi għall-irkupru tal-vettur shuttle), u 
l-identifikazzjoni sussegwenti ta' mutazzjonijiet f'ospitanti batterjali f'kun ­
dizzjonijiet xierqa. L-assa ġġi jħaddmu trans ġeni newtrali li malajr jistg ħu 
jiġu rkuprati minn ħafna mit-tessuti.  
12. L-esperiment ba żiku tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' TGR jinvolvi kura tar-roditur 
b'sustanza kimika fuq perjodu ta' żmien. Is-sustanzi kimi ċi jistgħu jingħtaw 
permezz ta' kwalunkwe rotta xierqa, inklu ża impjantazzjoni (e ż. ittestjar ta' 
apparat mediku). Il-perjodu totali li matulu annimali jing ħata d-doża 
jissejjaħ il-perjodu tal-g ħoti. L-għoti normalment ikun segwit minn 
perjodu ta' żmien, qabel is-sagrifi ċċju, li matulu s-sustanza kimika ma 
tingħatax u li matulu l-le żjonijiet tad-DNA mhux imsewwijin ji ġu fissati 
f'mutazzjonijiet stabbli. Fit-tag ħrif, dan il-perjodu ssejja ħ b'modi o ħrajn 
bħala l-ħin ta' manifestazzjoni, il- ħin ta' fissazzjoni jew il- ħin ta' espressjoni; 
tmiem dan il-perjodu huwa ħin il-kampjunar (15)(29). Wara li l-annimal ji ġi 
sagrifikat, id-DNA ġenomiku ji ġi iżolat mit-tessut(i) ta' interess u ji ġi 
purifikat.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Id-dejta g ħal tessut wie ħed għal kull annimal minn imballa ġġi/ligazzjonijiet 
diversi normalment ti ġi aggregata, u l-frekwenza tal-mutanti ġeneralment 
tiġi evalwata billi jintu żaw total ta' bejn 10  5 u 10  7 unità li jifformaw 
plakka jew kolonja. Meta jintu żaw metodi tal-g ħażla pożittiva, l-unitajiet 
totali li jifformaw plakka ji ġu determinat b'sett separat ta' platti mhux 
selettivi.  
14. Il-metodi tal-g ħażla pożittiva ġew żviluppati biex tit ħaffef l-identifikazzjoni 
tal-mutazzjonijiet kemm fil- ġene gpt [ġurdien u far  gpt delta , fenotip  gpt  – 
(20)(22)(28)] kif ukoll il- ġene lacZ  [Muta™Mouse jew ġurdien pla żmidu  
lacZ (3)(10)(11)(30)]; filwaqt li l-mutazzjonijiet tal- ġeni lacI  f'annimali Big 
Blue® ji ġu identifikati permezz ta' metodu mhux selettiv li jidentifika 
mutanti permezz tal- ġenerazzjoni ta' plakek ikkuluriti (ko ħol). 
Il-metodolo ġija tal-għażla pożittiva hija fis-se ħħ ukoll sabiex tidentifika 
mutazzjonijiet tal-punt li jfe ġġu fil-ġene cII tal-vettur shuttle batterjofago 
λ [ġurdien jew far Big Blue®, u Muta™Mouse (17)] u mutazzjonijiet 
imħassrin fil- ġeni λ red u gam  [għażla ta' Spi  — fil-ġurdien u l-far  gpt 
delta (21)(22)(28)]. Il-frekwenza tal-mutanti ti ġi kkalkolata billi jinqasam 
in-numru ta' plakek/pla żmidi li fihom mutazzjonijiet fit-trans ġene bin-numru 
totali ta' plakek/pla żmidi rkuprati mill-istess kampjun ta' DNA. Fl-istudji ta' 
mutazzjoni tal- ġeni tad-DNA, il-frekwenza tal-mutanti hija l-parametru rrap ­
portat. Barra minn hekk, frekwenza tal-mutazzjoni tista' ti ġi ddeterminata 
bħala l-frazzjon ta ċ-ċelloli li j ġorru mutazzjonijiet indipendenti; dan 
il-kalkolu je ħtieġ korrezzjoni g ħal espansjoni klonika permezz ta' 
sekwenzjar tal-mutanti rkuprati(24).  
15. Il-mutazzjonijiet punte ġġati fl-assa ġġi tal-mutazzjoni tal-punt  lacI, lacZ, cII  
u gpt jikkonsistu primarjament f'mutazzjonijiet tas-sostituzzjoni tal-pari ba żi, 
mutazzjonijiet ta' bidla fil-qafas u tid ħiliet/tħassiriet żgħar. Is-sehem relattiv 
ta' dawn it-tipi ta' mutazzjoni fost mutazzjonijiet spontanji huwa simili g ħal 
dak li deher fil- ġene endoġenu Hprt . Tħassiriet kbar jinqabdu biss bl-g ħażla 
Spi — u l-assaġġi plażmidi lacZ  (24). Il-mutazzjonijiet ta' interess huma 
mutazzjonijiet  in vivo  li jfeġġu fil-ġurdien jew fil-far. Mutazzjonijiet  in 
vivo u ex vivo , li jistg ħu jfeġġu matul l-irkupru, ir-replikazzjoni jew 
it-tiswija tal-fago/pla żmidi huma relattivament rari, u f'xi sistemi jistg ħu 
jkunu identifikati b'mod spe ċifiku, jew esklu żi mis-sistema tal-g ħażla pożit­
tiva/tal-ospitant batterjali.  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Preparazzjonijiet  
Għażla tal-ispe ċi ta' annimali  
16. Bħalissa hemm disponibbli firxa ta' mudelli ta' identifikazzjoni 
tal-mutazzjoni tal- ġeni ta' ġrieden trans ġeniċi, u dawn is-sistemi ntu żaw 
b'mod iktar mifrux minn mudelli ta' firien trans ġeniċi. Jekk jidher ċar li 
l-far huwa mudell iktar xieraq mill- ġurdien (e ż. meta ssir investigazzjoni 
tal-mekkani żmu ta' kar ċinoġenesi għal tumur li jidher biss f'firien, biex issir 
korrelazzjoni ma' studju dwar it-tossi ċità fil-firien, jew jekk ikun mag ħruf li 
l-metaboli żmu tal-far huwa jirrappre żenta aħjar il-metaboli żmu 
tal-bniedem), g ħandu jiġi kkunsidrat l-u żu ta' mudelli tal-far trans ġeniku.  
Kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija u tal-g ħalf 
17. Idealment, it-temperatura fil-kamra tal-annimali tal-esperimenti g ħandha 
tkun ta' 22 °C (± 3 °C). G ħad li l-umdità relattiva g ħandha tkun tal-inqas 
30 % u idealment ma taqbi żx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra, l-g ħan 
għandu jkun li tin żamm umdità relattiva ta' 50-60 %. Id-dawl g ħandu jkun 
artifiċjali, u b'sekwenza ta' kuljum ta' 12-il sieg ħa dawl, segwiti minn 12-il 
siegħa dlam. G ħall-għalf, jistg ħu jintu żaw dieti  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista illimitata ta' ilma tajjeb g ħax-xorb. 
L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-b żonn li tiġi żgurata taħlita 
xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta ting ħata minn din ir-rotta. 
L-annimali g ħandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa) 
tal-istess sess jekk ma tkun mistennija ebda m ġiba aggressiva. L-annimali 
jistgħu jitrabbew wa ħedhom jekk dan ikun xjentifikament i ġġustifikat.  
Preparazzjoni tal-annimali  
18. Annimali żgħażagħ b'saħħithom li la ħqu l-maturità sesswali (g ħalqu 8-12-il 
ġimgħa fil-bidu tal-kura) ji ġu assenjati b'mod aleatorju fil-gruppi ta' kontroll 
u tal-kura. L-annimali ji ġu identifikati b'mod uniku. L-annimali ji ġu akkli­
matizzati g ħall-kundizzjonijiet tal-laboratorju g ħal tal-inqas ħamest ijiem. 
Il-gaġeġ għandhom ji ġu rranġati b'tali mod li l-effetti possibbli dovuti 
għat-tqegħid tal-gaġġa jiġu minimizzati. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni 
fil-piż tal-annimali g ħandha tkun minima u ma taqbi żx ± 20 % tal-pi ż 
medju ta' kull sess.  
Preparazzjoni tad-do żi 
19. Is-sustanzi kimi ċi solidi tat-test g ħandhom jin ħallu jew ji ġu sospiżi 
f'solventi jew veikoli xierqa jew jit ħalltu f'dieta jew ilma tajjeb g ħax-xorb 
qabel id-do żaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimi ċi likwidi tat-test jistg ħu jiġu 
dożati direttament jew ji ġu dilwiti qabel id-do żaġġ. Għal esponimenti 
bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimi ċi tat-test jistg ħu jingħataw bħala gass, 
fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fi żjokimiċi tagħhom. 
Għandhom jintu żaw preparazzjonijiet friski tas-sustanza kimika tat-test 
sakemm id-dejta dwar l-istabbiltà maturix l-a ċċettabbiltà tal- ħżin. 
Kundizzjonijiet tat-test  
Solvent/veikolu  
20. Is-solvent/il-veikolu ma g ħandhomx jipprodu ċu effetti tossi ċi fil-volumi 
tad-doża użati, u ma g ħandhomx ikunu ssuspettati b'reazzjoni kimika 
mas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintu żaw solventi/veikoli o ħrajn li 
mhumiex mag ħrufin sew, l-inklu żjoni tagħhom għandha tkun sostnuta 
permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tag ħhom. Huwa 
rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel ji ġi kkkunsidrat l-u żu ta' solvent/ 
veikolu milwiem.  
Kontrolli Po żittivi 
21. Normalment g ħandhom jintu żaw annimali konkurrenti bil-kontroll po żittiv. 
Madankollu, g ħal laboratorji li wrew kompetenza (ara l-paragrafu 23) u li 
użaw dawn l-assa ġġi spiss, DNA minn annimali pre ċedenti kkurati 
bil-kontroll po żittiv jista' jkun inklu ż ma' kull studju b ħala konferma 
tas-suċċess tal-metodu. It-tali DNA mill-esperimenti fl-img ħoddi għandu 
jinkiseb mill-istess spe ċi u tessuti ta' interess, u jin ħażen kif xieraq (ara 
l-paragrafu 36). Meta jintu żaw kontrolli po żittivi konkurrenti, m'hemmx 
bżonn li jing ħataw mill-istess rotta b ħas-sustanza kimika tat-test; 
madankollu, il-kontrolli po żittivi għandhom ikunu mag ħrufin li jindu ċu 
mutazzjonijiet f'tessut wie ħed jew iktar ta' interess g ħas-sustanza kimika 
tat-test. Id-do żi tas-sustanzi kimi ċi tal-kontroll po żittiv għandhom 
jingħażlu sabiex jipprodu ċu effetti dg ħajfin jew moderati li b'mod kritiku 
jivvalutaw il-prestazzjoni u s-sensittività tal-assa ġġ. Fit-Tabella 1 hemm 
inklużi eżempji ta' sustanzi kimi ċi tal-kontroll po żittiv u uħud mit-tessuti 
fil-mira tag ħhom. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabella 1  
Eżempji ta' sustanzi kimi ċi tal-kontroll po żittiv u uħud mit-tessuti fil-mira tag ħhom  
Sustanza kimika tal-kontroll 
pożittiv u Nru tas-CAS Isem EINECS u Nru tal- 
EINECS Karatteristi ċi Tessut fil-Mira tal-Mutazzjoni 
Far Ġurdien  
N-Ethyl-N-nitrosourea 
[Nru tas-CAS 759-73-9] N-Ethyl-N-nitrosourea 
[212-072-2] Mutaġen li jaġixxi 
dirett Fwied, 
pulmin Mudullun 
tal-għadam, kolon, 
epitelju koloniku, 
intestin, fwied, 
pulmun, milsa, kilwa, ċelloli 
granulosi tal-ovarji, 
ċelloli ġerminali 
tal-irġiel 
Etil carbamate (uretan) 
[CAS no. 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutaġen, jeħtieġ 
metaboliżmu iżda 
jipproduċi biss 
effetti dg ħajfin Mudullun 
tal-għadam, 
prestonku, intestin żgħir, fwied, 
pulmun, milsa 
2,4-Djaminotoluen 
[Nru tas-CAS 95-80-7] 4-Metil-m-fenile ­
nedjamin 
[202-453-1] Mutaġen, jeħtieġ 
metaboliżmu, 
pożittiv ukoll 
fl-assaġġ Spi
 - Fwied Fwied 
Benżo[a]piren 
[Nru tas-CAS 50-32-8] Benżo[def]krisen 
[200-028-5] Mutaġen, jeħtieġ 
metaboliżmu Fwied, 
omenta, Mudullun 
tal-għadam, sider, 
kolon, prestonku, 
stonku glandolari, qalb, fwied, pulmun, ċelloli 
ġerminali tal-ir ġiel
 
Kontrolli negattivi  
22. Il-kontrolli negattivi, ikkurati b'solvent jew veikolu wa ħdu, u nkella kkurati 
bl-istess mod b ħall-gruppi tal-kura, g ħandhom ikunu inklu żi għal kull ħin 
tal-kampjunar. Fin-nuqqas ta' dejta tal-kontroll storika jew ippubblikata li turi li ma kien indott ebda effett ta' t ħassir jew muta ġeniku 
mis-solvent/veikolu mag ħżul, il-kontrolli mhux ikkurati g ħandhom ikunu 
inklużi wkoll g ħal kull ħin tal-kampjunar sabiex ti ġi stabbilita a ċċettabbiltà 
tal-kontroll tal-veikolu.
 
Verifika tal-profi ċjenza tal-laboratorju  
23. Il-kompetenza f'dawn l-assa ġġi għandha tiġi stabbilita billi tintwera l- ħila ta' 
riproduzzjoni tar-ri żultati mistennija minn dejta ppubblikata (24) g ħal: 1) 
frekwenzi tal-mutanti b'sustanzi kimi ċi tal-kontroll po żittiv (inklu żi risponsi 
dgħajfin) bħal dawk elenkati fit-Tabella 1, nonmuta ġeni, u kontrolli 
tal-veikolu; u 2) irkupru tat-trans ġene minn DNA ġenomiku (e ż. effiċjenza 
fl-imballa ġġ). 
Sekwenzjar tal-mutanti  
24. Għal applikazzjonijiet regolatorji, is-sekwenzjar tad-DNA tal-mutanti 
mhuwiex me ħtieġ, b'mod partikolari meta jinkiseb ri żultat ċar pożittiv jew 
negattiv. Madankollu, id-dejta tas-sekwejzjar tista' tkun utli meta tkun osservata varjazzjoni g ħolja bejn l-individwi. F'dawn il-ka żijiet, 
is-sekwenzjar jista' jintu ża biex jitwarrbu l-possibilitajiet ta' jackpots jew 
avvenimenti klonali billi ji ġi identifikat is-sehem ta' mutanti uni ċi minn 
tessut partikolari. Sekwenzjar g ħal madwar 10 minuti g ħal kull tessut
 ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
għal kull annimal g ħandu jkun bi żżejjed għad-determinazzjoni sempli ċi ta' 
jekk il-mutanti klonali jikkontribwixxux g ħall-frekwenza tal-mutanti; 
is-sekwenzjar ta' ammont li jasal sa 25 mutant jista' jkun me ħtieġ biex 
tiġi korretta b'mod matematiku l-frekwenza tal-mutanti g ħall-klonalità. 
Is-sekwenzjar tal-mutanti jista' ji ġi kkunsidrat ukoll meta jinstabu żidiet 
żgħar fil-frekwenza tal-mutanti (ji ġifieri kemm jinqab żu l-valuri 
tal-kontroll mhux ikkurat). Differenzi fl-ispettru tal-mutanti bejn il-kolonji tal-muatnti minn annimali kkurati u mhux ikkurati jistg ħu jsostnu effett 
mutaġeniku (29). Barra minn hekk, l-ispettri ta' mutazzjoni jistg ħu jkunu 
utli għall-iżvilupp ta' ipote żijiet mekkanisti ċi. Meta s-sekwenzjar ikun ser 
jiġi inkluż bħala parti mill-protokoll tal-istudju, g ħandha ting ħata attenzjoni 
speċjali fit-tfassil tat-tali studji, b'mod partikolari fir-rigward tan-numru ta' 
mutanti sekwenzjati g ħal kull kampjun, biex tinkiseb bi żżejjed saħħa skont 
il-mudell statistiku u żat (ara l-paragrafu 43).
 
PROĊEDURA  
In-Numru u s-Sess tal-Annimali  
25. In-numru ta' annimali g ħal kull grupp g ħandu jkun determinat minn qabel 
biex ikun bi żżejjed ħalli jipprovdi s-sa ħħa statistika me ħtieġa biex tal-inqas 
jiġi identifikat irdoppjar fil-frekwenza tal-mutanti. Id-daqsijiet tal-grupp ser 
ikunu jikkonsistu f'minimu ta' ħames annimali; madankollu, jekk is-sa ħħa 
statistika ma tkunx bi żżejjed, in-numru ta' annimali g ħandu jiżdied kif 
meħtieġ. Normalment g ħandhom jintu żaw annimali r ġiel. Jista' jkun 
hemm ka żijiet li fihom l-ittestjar ta' nisa biss ikun i ġġustifikat; pere żempju, 
meta jiġu ttestjati medi ċini speċifiċi għal nisa bnedmin, jew meta ji ġi 
investigat il-metaboli żmu speċifiku għan-nisa. Jekk ikun hemm bi żżejjed 
differenzi bejn is-sessi f'termini ta' tossi ċità jew metaboli żmu, f'dak il-ka ż 
ikun hemm b żonn kemm ta' r ġiel kif ukoll ta' nisa.  
Il-Perjodu tal-G ħoti 
26. Fuq il-ba żi tal-osservazzjonijiet li l-mutazzjonijiet jakkumulaw ma' kull 
kura, hemm b żonn ta' skeda b'do żaġġ ripetut, b'kuri ta' kuljum g ħal 
perjodu ta' 28 jum. Ġeneralment dan jitqies li huwa a ċċettabbli kemm 
għall-produzzjoni ta' akkumulazzjoni suffi ċjenti ta' mutazzjonijiet minn 
mutaġeni dgħajfin, kif ukoll g ħall-għoti ta' żmien adegwat g ħall-esponiment 
sabiex ji ġu identifikati mutazzjonijiet f'organi bi proliferazzjoni baxxa. 
Skedi alternattivi tal-kura jistg ħu jkunu xierqa g ħal ċerti evalwazzjonijiet, 
u dawn l-iskedi tad-do żaġġ alternattivi g ħandhom ikunu ġġustifikati xjen ­
tifikament fil-protokoll. Il-kuri ma g ħandhomx ikunu iqsar mi ż-żmien 
meħtieġ għall-induzzjoni s ħiħa tal-enżimi metabolizzanti rilevanti kollha, 
u kuri iqsar jistg ħu jkunu je ħtieġu l-użu ta' bosta żminijiet tal-kampjunar 
li jkunu xierqa g ħal organi b'rati differenti ta' proliferazzjoni. Xorta wa ħda 
dejjem g ħandha tintu ża l-informazzjoni kollha disponibbli (e ż. dwar 
it-tossiċità ġenerali jew il-metaboli żmu u l-farmakokinetika) meta ji ġi ġġus­
tifikat protokoll, spe ċjalment meta jkun hemm devjazzjoni 
mir-rakkomandazzjonijiet standard ta' hawn fuq. Filwaqt li jistg ħu jżidu 
s-sensittività, durati tal-kura itwal minn 8 ġimgħat għandhom ji ġu spjegati 
b'mod ċar u ġġustifikati, peress li żminijiet itwal tal-kura jistg ħu jipprodu ċu 
żieda apparenti fil-frekwenza tal-mutanti permezz ta' espansjoni klonali (29).  
Livelli tad-Do ża 
27. Il-livelli tad-do ża għandhom ikunu bba żati fuq ir-ri żultati ta' studju ta' 
sejbien tal-medda tad-do ża li jkejjel it-tossi ċità ġenerali li ng ħatat 
mill-istess rotta ta' esponiment, jew fuq ir-ri żultati ta' studji pre żistenti 
dwar it-tossi ċità sottoakuta. Jistg ħu jintużaw annimali mhux trans ġeniċi 
tal-istess razza ta' rodituri g ħad-determinazzjoni tal-meded tad-do ża. 
Fit-test ewlieni, sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons g ħad-doża, ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 22) u 
tal-inqas tliet livelli tad-do ża b'intervalli xierqa, ħlief meta tkun intu żat 
id-doża limitu (ara l-paragrafu 28). L-og ħla doża għandha tkun id-Do ża 
Massima Tollerata (MTD). L-MTD hija definita b ħala d-doża li tipprodu ċi 
sinjali ta' tossi ċità b'tali mod li livelli og ħla tad-doża, fuq il-ba żi tal-istess 
skeda tad-do żaġġ, jipprodu ċu letalità. Is-sustanzi kimi ċi b'attivitajiet bijo ­
loġiċi speċifiċi f'dożi mhux tossi ċi baxxi (b ħal ormoni u mito ġeni), u 
sustanzi kimi ċi li jesibixxu saturazzjoni ta' proprjetajiet tossikokineti ċi 
jistgħu jkunu e ċċezzjonijiet g ħall-kriterji ta' tfassil tad-do żi u għandhom 
jiġu evalwati fuq ba żi ta' każ b'każ. Il-livelli tad-do ża użati għandhom 
ikopru medda mill-massimu sa tossi ċità baxxa jew ine żistenti.  
Test tal-limitu  
28. Jekk esperimenti dwar is-sejbien tal-medda tad-do ża, jew dejta e żistenti 
minn razez ta' rodituri relatati, jindikaw li skeda tal-kura ta' tal-inqas 
id-doża limitu (ara iktar 'l isfel) ma tipprodu ċi ebda effetti tossi ċi osser­
vabbli, u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-ba żi ta' dejta minn 
sustanzi klini ċi strutturalment relatati, f'dak il-ka ż jista' ma jitqiesx li hemm 
bżonn ta' studju s ħiħ billi jintu żaw tliet livelli tad-do ża. Għal perjodu 
tal-għoti ta' 28 jum (ji ġifieri 28 kura ta' kuljum), id-do ża limitu hija ta' 
1 000 mg/kg pi ż tal-ġisem/jum. G ħal perjodi tal-g ħoti ta' 14-il jum jew 
inqas, id-do ża limitu hija ta' 2 000 mg/kg/pi ż tal-ġisem/jum (l-iskedi 
tad-dożaġġ li jvarjaw minn 28 kura ta' kuljum g ħandhom ji ġu ġġustifikati 
b'mod xjentifiku fil-protokoll; ara l-paragrafu 26).  
L-Għoti tad-Do żi 
29. Normalment, is-sustanza kimika tat-test ting ħata b'gavage billi jintu ża tubu 
fl-istonku jew kannula xierqa ta' intubazzjoni. B'mod ġenerali, meta jitfassal 
assaġġ għandha ti ġi kkunsidrata r-rotta anti ċipata tal-esponiment 
tal-bniedem. G ħalhekk, rotot o ħrajn ta' esponiment (b ħal ilma tajjeb g ħax- 
xorb, taħt il-ġilda, ġol-vina, topikali, te ħid man-nifs, intratrakeali, mad-dieta, 
jew impjant) jistg ħu jkunu a ċċettabbli meta jkunu jistg ħu jiġu ġġustifikati. 
Tilqima intraperitoneali mhijiex rakkomandata peress li mhijiex rotta fi żjo­
loġikament rilevanti ta' esponiment tal-bniedem. Il-volum massimu ta' 
likwidu li jista' jing ħata b'gavage jew tilqima f'darba wa ħda jiddependi 
mid-daqs tal-annimal tat-test. Il-volum ma g ħandux jaqbe ż iż-2 ml/100 g 
piż tal-ġisem. L-u żu ta' volumi og ħla minn dan g ħandu jiġi ġġustifikat. 
Ħlief għal sustanzi kimi ċi irritanti jew korru żivi, li normalment juru 
effetti mg ħarrqin f'kon ċentrazzjonijiet og ħla, il-varjabbiltà fil-volum 
tat-test għandha tiġi minimizzata billi ti ġi aġġustata l-kon ċentrazzjoni ħalli 
jiġi żgurat volum kostanti fil-livelli kollha tad-do ża. 
Żmien tal-Kampjunar  
Ċelloli Somati ċi 
30. Iż-żmien tal-kampjunar huwa varjabbli kritiku g ħaliex huwa ddeterminat 
mill-perjodu me ħtieġ sabiex il-mutazzjonijiet ji ġu fissi. Dan il-perjodu 
huwa spe ċifiku għat-tessut u jidher li huwa relatat mal- ħin tad-dawran 
tal-popolazzjoni ta ċ-ċelloli, bil-mudullun tal-g ħadam u l-intestin li 
għandhom ripsons rapidu u l-fwied ferm inqas. Kompromess xieraq g ħall- 
kejl ta' frekwenzi mutanti kemm f'tessuti bi proliferazzjoni rapida kif ukoll 
dawk bi proliferazzjoni iktar bil-mod huwa kuri kuljum g ħal 28 jum konse ­
kuttiv (kif indikat fil-paragrafu 26) u kampjunar tliet ijiem wara l-a ħħar 
kura; għad li l-frekwenza massima tal-mutanti tista' ma tfe ġġx f'tessuti bi 
proliferazzjoni bil-mod f'dawn il-kundizzjonijiet. Jekk it-tessuti bi prolife ­
razzjoni bil-mod ikunu ta' importanza partikolari, f'dak il-ka ż żmien 
tal-kampjunar iktar tard ta' 28 jum wara l-perjodu tal-g ħoti ta' 28 jum 
jista' jkun iktar adattat (16)(29). F'xi ka żijiet, iż-żmien tal-kampjunar iktar 
tard jieħu post iż-żmien ta' kampjunar ta' 3 ijiem, u jkun je ħtieġ ġustifi­
kazzjoni xjentifika.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Ċelloli ġerminali  
31. L-assa ġġi ta' TGR huma adattati g ħall-istudju tal-induzzjoni tal-mutazzjoni 
tal-ġeni f'ċelloli ġerminali fl-ir ġiel (7)(8)(27), li fihom it-twaqqit u l-kinetika 
tal-ispermato ġenesi ġew definiti sew (27). In-numri inferjuri ta' ova 
disponibbli g ħal analiżi, anki wara superovulazzjoni, u l-fatt li ma hemm 
ebda sinte żi tad-DNA fl-oo ċite, jipprekludu d-determinazzjoni 
tal-mutazzjoni f' ċelloli ġerminali tan-nisa bl-u żu ta' assaġġi transġeniċi (31).  
32. Iż-żminijiet tal-kampjunar g ħaċ-ċelloli ġerminali tal-ir ġiel għandhom 
jingħażlu b'tali mod li jittie ħed kampjun tal-medda tat-tipi ta' ċelloli 
esposti fi ħdan l-iżvilupp ta ċ-ċelloli ġerminali, u b'hekk l-istadju fil-mira 
fil-kampjunar ikun ġie espost bi żżejjed. Iż-żmien għall-progressjoni ta ċ- 
ċelloli ġerminali li qed ji żviluppaw minn ċelloli staminali spermatogonjali 
sa sperma matura li til ħaq il-vas deferens/epididimi cauda huwa ta' ~49 jum 
għall-ġrieden (36) u ~70 jum g ħall-firien (34)(35). Wara esponiment g ħal 
28 jum b'perjodu ta' kampjunar sussegwenti ta' tliet ijiem, l-isperma 
akkumulata mi ġbura mill-vas deferens/epididimi cauda (7)(8) ser 
tirrappreżenta popolazzjoni ta' ċelloli esposti matul madwar il-fa żi aħħarija 
tal-ispermato ġenesi, li tinkludi l-perjodu mejotiku u postmejotiku, i żda 
mhux il-perjodu spermatogonjali jew ta ċ-ċelloli staminali. Sabiex jittie ħed 
kampjun adegwat ta ċ-ċelloli fil-vas deferens/epididimi cauda li kienu ċelloli 
staminali spermatogonjali matul il-perjodu tal-esponiment, hemm b żonn ta' 
żmien addizzjonali tal-kampjunar ta' tal-inqas 7 ġimgħat (ġrieden) jew 10 
ġimgħat (firien) wara li tintemm il-kura.  
33. Ċelloli estru żi minn tubuli seminiferu żi wara skeda ta' 28 + 3 ijiem jinvolvu 
popolazzjoni m ħallta arrikkita g ħall-istadji kollha ta ċ-ċelloli ġerminali 
fil-fażi tal-iżvilupp (7)(8). Il-kampjunar ta' dawn i ċ-ċelloli għall-identifi ­
kazzjoni tal-mutazzjoni tal- ġeni ma jipprovdix valutazzjoni pre ċiża 
tal-istadji li fihom ji ġu indotti l-mutazzjonijiet ta ċ-ċelloli ġerminali daqs 
kemm tista' tinkiseb mill-kampjunar tal-ispermato żoa mill-vas deferens/ 
epididimi cauda (peress li hemm medda ta' tipi ta' ċelloli ġerminali kamp ­
junati mit-tubuli, u ser ikun hemm xi ċelloli somati ċi li jikkontaminaw din 
il-popolazzjoni ta' ċelloli). Madankollu, il-kampjunar ta' ċelloli minn tubuli 
seminiferu żi minbarra l-ispermato żoa mill-vas deferens/epididimi cauda 
wara skeda ta' kampjunar ta' 28 + 3 jum biss jipprovdi ċerta kopertura 
taċ-ċelloli esposti tul il-ma ġġoranza tal-fa żijiet tal-i żvilupp ta ċ-ċelloli 
ġerminali, u jista' jkun utli g ħall-identifikazzjoni ta' xi muta ġeni taċ-ċelloli 
ġerminali.  
Osservazzjonijiet  
34. Għandhom isiru osservazzjonijiet klini ċi ġenerali tal-inqas darba kuljum, 
idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u ji ġi kkunsidrat il-perjodu bl-og ħla 
livell ta' effetti anti ċipati wara d-do żaġġ. Il-kundizzjoni tas-sa ħħa 
tal-annimali g ħandha tiġi rreġistrata. Tal-inqas darbtejn kuljum, l-annimali 
kollha għandhom ikunu osservati g ħal morbidità u mortalità. L-annimali 
kollha għandhom jinti żnu tal-inqas darba fil- ġimgħa, u fis-sagrifi ċċju. 
Il-kejliet tal-konsum tal-ikel g ħandu jsir tal-inqs darba kull ġimgħa. Jekk 
is-sustanza tat-test ting ħata permezz tal-ilma tajjeb g ħax-xorb, il-konsum 
tal-ilma g ħandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil- ġimgħa. 
L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossi ċità eċċessiva 
għandhom ji ġu ewtanizzati qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (23).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Ġbir tat-Tessuti  
35. Ir-ra ġuni għall-ġbir tat-tessuti g ħandha tkun definita bi ċ-ċar. Peress li 
mhuwiex possibbli li ti ġi studjata l-induzzjoni tal-mutazzjoni fi prattikament 
l-ebda studju, l-g ħażla tat-tessuti li g ħandhom jin ġabru għandha tkun 
imsejsa fuq ir-ra ġuni għat-twettiq tal-istudju u kwalunkwe dejta e żistenti 
dwar muta ġeniċità, karċinoġeniċità jew tossi ċità għas-sustanza kimika inves ­
tigata. Fatturi importanti li g ħandhom ji ġu kkunsidrati g ħandhom jinkludu 
r-rotta tal-amministrazzjoni (fuq il-ba żi tar-rotta/rotot probabbli ta' 
esponiment g ħall-bniedem), id-distribuzzjoni mbassra tat-tessuti, u 
l-mekkani żmu ta' azzjoni possibbli. Fin-nuqqas ta' kwalunkwe inform ­
azzjoni ta' sfnod, g ħandhom jin ġabru bosta tessuti somati ċi li jistg ħu 
jkunu ta' interess. Dawn g ħandhom jirrappre żentaw tessuti bi proliferazzjoni 
rapida, bi proliferazzjoni bil-mod, u tas-sit ta' kuntatt. Barra minn hekk, għandhom jin ġabru u jin ħażnu spermato żoa mill-vas deferens/epididimi 
cauda u ċelloli ġerminali fil-fa żi tal-iż
vilupp mit-tubuli seminiferu żi (kif 
deskritti fil-paragrafi 32 u 33) fil-ka ż li fil-ġejjieni jkun hemm b żonn ta' 
analiżi tal-muta ġeniċità taċ-ċelloli ġerminali. G ħandhom jinkisbu l-pi żijiet 
tal-organi, u g ħall-organi l-kbar, g ħandha tin ġabar l-istess żona 
mill-annimali kollha.  
Il-Ħżin tat-Tessuti u d-DNA  
36. It-tessuti (jew omo ġenati tat-tessuti) g ħandhom jin ħażnu f'– 70 °C jew inqas 
u jintużaw għall-iżolament tad-DNA fi żmien 5 snin. DNA i żolat, maħżun 
imkessaħ f'4 °C f'bafer xieraq, g ħandu jintu ża b'mod ottimali g ħall-analiżi 
tal-mutazzjoni fi żmien sena.  
Għażla tat-Tessuti g ħal Analiżi tal-Mutanti  
37. L-għażla tat-tessuti g ħandha tkun ibba żata fuq kunsiderazzjonijiet b ħal: 1) 
ir-rotta tal-amministrazzjoni jew is-sit tal-ewwel kuntatt (e ż. l-istonku glan ­
dolari jekk l-g ħoti jsir b'mod orali, il-fwied jekk l-g ħoti jsir bit-te ħid 
man-nifs, jew il- ġilda jekk intu żat applikazzjoni topikali); u 2) parametri 
farmakokineti ċi osservati fi studji dwar it-tossi ċità ġenerali, li jindikaw 
dispożizzjoni żamma jew akkumulazzjoni ta' tessut, jew l-organi fil-mira 
għat-tossiċità. Jekk l-istudji jsiru b ħala segwitu g ħal studji dwar 
il-karċinoġeniċità, għandhom ji ġu kkunsidrati t-tessuti fil-mira g ħall-karċi­
noġeniċità. L-għażla tat-tessuti g ħal analiżi għandha timmassimizza 
l-identifikazzjoni ta' sustanzi kimi ċi li huma muta ġeni in vitro  li jaġixxu 
b'mod dirett, metabolizzati malajr, ferm reattivi jew ftit li xejn assorbiti, jew 
dawk li g ħalihom it-tessut fil-mira huwa determinat mir-rotta 
tal-amministrazzjoni (6).  
38. Fin-nuqqas ta' informazzjoni ta' sfond u filwaqt li jittie ħed f'kunsiderazzjoni 
s-sit ta' kuntatt dovut g ħar-rotta tal-amministrazzjoni, il-fwied u tal-inqas 
tessut wie ħed b'divi żjoni rapida (e ż. stonku glandolari, mudullun 
tal-għadam) għandhom ji ġu evalwati g ħal mutaġeniċità. F'ħafna każijiet, 
ir-rekwiżiti ta' hawn fuq jistg ħu jinkisbu mill-anali żi ta' żewġ tessuti 
magħżulin bir-reqqa, i żda f'xi ka żijiet, ikun hemm b żonn tlieta jew iktar. 
Jekk hemm ra ġunijiet g ħal tħassib spe ċifiku dwar l-effetti ta ċ-ċelloli 
ġerminali, inklu żi risponsi po żittivi f'ċelloli somati ċi, it-tessuti ta ċ-ċelloli 
ġerminali g ħandhom ji ġu evalwati g ħal mutazzjonijiet.  
Metodi tal-Kejl  
39. Metodi standard tal-laboratorju jew ippubblikati g ħall-identifikazzjoni ta' 
mutanti huma disponibbli g ħall-mudelli trans ġeniċi rakkomandati: batter ­
jofago lambda u pla żmidi lacZ  (30); ġrieden  lacI  (2)(18); ġrieden  gpt 
delta (22); firien  gpt delta (28);  cII (17). Il-modifiki g ħandhom ji ġu ġġus­
tifikati u dokumenti kif xieraq. Id-dejta minn imballa ġġi multipli tista' ti ġi 
aggregata u tintu ża biex jintla ħaq numru adegwat ta' plakek jew kolonji. 
Madankollu, il-b żonn ta' numru ikbar ta' reazzjonijiet tal-imballa ġġ biex 
jintlaħaq in-numru xieraq ta' plakek jista' jkun indikazzjoni ta' kwalità 
batuta tad-DNA. F'dawn il-ka żijiet, id-dejta g ħandha tiġi kkunsidrata 
bir-reqqa g ħaliex tista' ma tkunx affidabbli. In-numru totali ottimali ta'  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
plakek jew kolonji g ħal kull kampjun tad-DNA huwa rregolat 
mill-probabilità statistika ta' identifikazzjoni ta' bi żżejjed numri ta' mutanti 
bi frekwenza partikolari ta' mutanti spontanji. B'mod ġenerali, hemm b żonn 
ta' minimu ta' 125 000 sa 300 000 plakka jekk il-frekwenza ta' mutanti spontanji tkun fl-ordni ta' 3 × 10
 -5 (15). Għall-assaġġ lacI  Big Blue®, 
huwa importanti li jintwera li l-medda s ħiħa ta' fenotipi tal-kulur 
tal-mutanti tista' ti ġi identifikata permezz tal-inklu żjoni ta' kontrolli 
tal-kulur xierqa konkurrenti ma' kull platt. It-tessuti u l-kampjuni ri żultanti 
(oġġetti) għandhom ji ġu pproċessati u analizzati billi jintu ża disinn blokk, li 
fihom l-o ġġetti mill-grupp tal-kontroll tal-veikolu/tas-solvent, il-grupp 
tal-kontroll po żittiv (jekk jintu ża) jew id-DNA tal-kontroll po żittiv (fejn 
xieraq), u l-gruppi kollha tal-kura huma ppro ċessati flimkien.  
DEJTA U RAPPORTAR  
Trattament tar-Ri żultati  
40. Dejta dwar l-annimali individwali g ħandha tiġi ppreżentata f'forma ta' 
tabelli. L-unità sperimentli hija l-annimal. Ir-rapport g ħandu jinkludi 
n-numru totali ta' unitajiet li jifformaw plakka (pfu) jew unitajiet li jifformaw kolonja (cfu), in-numru ta' mutanti, u l-frekwenza tal-mutanti 
għal kull tessut minn kull annimal. Jekk hemm bosta reazzjonijiet 
tal-imballa ġġ/salvataġġ, għandu jiġi rrapportat in-numru ta' reazzjonijiet 
għal kull kampjun tad-DNA. Filwaqt li d-dejta g ħal kull reazzjoni indi ­
vidwali g ħandha tin żamm, il-pfu jew is-cfu biss iridu ji ġu rrapportati. 
Għandha tiġi rrapportata d-dejta dwar it-tossi ċità u s-sinjali klini ċi skont 
il-paragrafu 34. Kwalunkwe ri żultat ta' sekwenzjar g ħandu jiġi ppreżentat 
għal kull mutant analizzat, u g ħandhom jintwerew il-kalkoli tal-frekwenza 
tal-mutazzjoni li rri żultaw għal kull annimal u tessut.
 
Evalwazzjoni Statistika u Interpretazzjoni tar-Ri żultati  
41. Hemm diversi kriterji g ħad-determinazzjoni ta' ri żultat pożittiv, bħal żieda 
relatata mad-do ża fil-frekwenza tal-mutanti, jew żieda ċara fil-frekwenza 
tal-mutanti fi grupp ta' do ża wieħed meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll 
tas-solvent/veikolu. Tal-inqas tliet gruppi tad-do ża kkurati g ħandhom ji ġu 
analizzati sabiex ti ġi pprovduta bi żżejjed dejta g ħal analiżi tar-rispons g ħad- 
doża. Filwaqt li r-relevanza bijolo ġika tar-ri żultati għandha tkun 
il-kunsiderazzjoni primarja, jistg ħu jintużaw metodi statisti ċi xierqa b ħala 
għajnuna fl-evalwazzjoni tar-ri żultati tat-test (4)(14)(15)(25)(26). It-testijiet 
statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal b ħala l-unità sperimentali.  
42. Sustanza kimika tat-test li g ħaliha r-riżultati ma jissodisfawx il-kriterji ta' 
hawn fuq fi kwalunkwe tessut titqies mhux muta ġenika f'dan l-assa ġġ. Għal 
relevanza bijolo ġika ta' riżultat negattiv, l-esponiment g ħat-tessut g ħandu 
jiġi kkonfermat.  
43. Għal analiżijiet tas-sekwenzjar tad-DNA, hemm disponibbli g ħadd ta' 
approċċi statistiċi biex jassistu fl-interpretazzjoni tar-ri żultati (1)(5)(9)(19).  
44. Kunsiderazzjoni ta' jekk il-valuri osservati humiex fi ħdan jew barra 
l-medda ta' kontroll storiku tista' tipprovdi gwida meta ti ġi evalwata 
s-sinifikanza bijolo ġika tar-rispons (32).  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Rapport tat-test  
45. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanza kimika tat-test:  
— id-dejta ta' identifikazzjoni u n-nru tas-CAS, jekk ikunu mag ħrufin,  
— is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli,  
— l-għamla fiżika u l-purità,  
— il-proprjetajiet fi żjokimiċi rilevanti g ħat-twettiq tal-istudju,  
— l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, jekk mag ħrufa. 
Solvent/veikolu:  
— il-ġustifikazzjoni g ħall-għażla tal-veikolu,  
— is-solubilità u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, 
jekk mag ħruf, 
— il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djeteti ċi, tal-ilma tajjeb g ħax-xorb 
jew tat-te ħid man-nifs,  
— id-determinazzjonijiet analiti ċi dwar il-formulazzjonijiet (e ż., l-istabbiltà, 
l-omoġenità, il-kon ċentrazzjonijiet nominali).  
Annimali tat-test:  
— l-ispeċi/ir-razza u żata u ġustifikazzjoni g ħall-għażla, 
— in-numru, l-età u s-sess tal-annimali,  
— is-sors, il-kundizzjonijiet tal-post tat-trobbija, id-dieta, e ċċ., 
— il-piż individwali tal-annimali fil-bidu tat-test, inklu żi l-medda tal-pi ż 
tal-ġisem, id-devjazzjoni medja u standard g ħal kull grupp.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dejta tal-kontroll po żittiv u negattiv (veikolu/solvent),  
— dejta mill-istudju ta' sejbien tal-medda,  
— ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-do ża, 
— dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test,  
— dettalji dwar l-g ħoti tas-sustanza kimika tat-test,  
— ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni,  
— metodi g ħall-kejl tat-tossi ċità tal-annimali, inklu żi, fejn disponibbli, 
l-analiżijiet istopatolo ġiċi jew ematolo ġiċi u l-frekwenza li biha saru 
l-osservazzjonijiet u ttie ħdu l-piżijiet tal-ġisem tal-annimali,  
— metodi g ħall-verifika li s-sustanza kimika tat-test la ħqet it-tessut fil-mira, 
jew ċirkolazzjoni ġenerali, jekk inkisbu ri żultati negattivi,  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— id-doża propja (mg/kg pi ż tal-ġisem/jum) ikkalkolata 
mill-konċentrazzjoni u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test 
fid-dieta/ilma tajjeb g ħax-xorb (ppm), jekk applikabbli,  
— dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u l-ilma,  
— deskrizzjoni dettaljata tal-iskedi tal-kura u l-kampjunar u ġustifi­
kazzjonijiet g ħall-għażliet, 
— il-metodu tal-ewtana żja, 
— il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti,  
— il-metodi g ħall-iżolament tad-DNA ġenomiku tar-rodituri, b'salvata ġġ 
tat-transġene minn DNA ġenomiku, u t-trasferiment ta' DNA trans ­ 
ġeniku għal ospitant batterjali,  
— is-sors u n-numri tal-lott ta ċ-ċelloli, il-kitts u r-rea ġenti kollha (fejn 
applikabbli),  
— il-metodi g ħall-enumerar tal-mutanti,  
— il-metodi g ħall-analiżi molekolari tal-mutanti u l-u żu fil-korrezzjoni 
għall-klonalità u/jew il-kalkolu tal-frekwenzi tal-mutazzjoni, jekk 
applikabbli.  
Riżultati:  
— il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklu żi 
sinjali tat-tossi ċità, 
— il-piżijiet tal-ġisem u l-organi fis-sagrifi ċċju, 
— għal kull tessut/annimal, in-numru ta' mutanti, in-numru ta' plakek jew 
kolonji evalwati, il-frekwenza tal-mutanti,  
— għal kull grupp ta' tessuti/annimali, in-numru ta' reazzjonijiet 
tal-imballa ġġ għal kull kampjun tad-DNA, in-numru totali ta' mutanti, 
il-frekwenza medja tal-mutanti, id-devjazzjoni standard,  
— ir-relazzjoni bejn id-do ża u r-rispons, fejn possibbli,  
— għal kull tessut/annimal, in-numru ta' mutanti indipendenti u 
l-frekwenza medja tal-mutazzjoni, fejn saret anali żi molekolari 
tal-mutazzjonijiet,  
— dejta ta' kontroll negattiv konkurrenti u storiku b'meded, medji u 
devjazzjonijiet standard,  
— dejta ta' kontroll po żittiv konkurrenti (jew kontroll po żittiv tad-DNA 
mhux konkurrenti),  
— determinazzjonijiet analiti ċi, jekk disponibbli (e ż. konċentrazzjonijiet 
tad-DNA u żati fl-imballa ġġ, dejta dwar is-sekwenzjar tad-DNA),  
— l-anali żijiet statisti ċi u l-metodi applikati.  
Diskussjoni tar-ri żultati  
Konklużjoni ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
TAGĦRIF 
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391-396.  
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659  
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by 
Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485-7489.
 
(8) Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197-212.
 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971–7975.
 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125-136.  
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96-106 . 
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253-259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. 
Mutagen. , 41: 1-6.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  
Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA , 93(17): 9073–9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi — and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.
 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  — Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N
 o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Pari ġi. 
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/ 
MONO(2009)7, OECD, Pari ġi. 
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory 
Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. 
Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo 
Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta 
Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6- diaminotoluene Structural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  
Transgenic Mutation Assays’,  Mutation Res ., 540: 141-151.
 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  Tech­
nologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  Plenum 
Press, New York, NY, Stati Uniti, pp. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1-2): 117- 
123. 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
 
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation 
Assays , Series on Testing and Assessment, N  o 145, ENV/JM/ 
MONO(2011)20, OECD, Pari ġi. 
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals semi ­
niferous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 
198-236.  
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The 
Epididymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, il-Pajji żi l-Baxxi, pp. 1071-1148.
 
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Appendiċi 
DEFINIZZJONIJIET:  
Perjodu ta' g ħoti: il-perjodu totali li matulu annimal jing ħata d-doża. 
Sostituzzjoni ta' pari ba żi: tip ta' mutazzjoni li tikka ġuna s-sostituzzjoni ta' ba żi 
tan-nukleotid tad-DNA ma' ba żi oħra tan-nukleotid tad-DNA.  
Kapsida : il-qoxra tal-proteina li tiksi partikula ta' vajrus.  
Sustanza kimika : sustanza jew ta ħlita. 
Espansjoni klonali : il-prodzzjoni ta' ħafna ċelloli minn ċellola (mutanti) wa ħda. 
Unità li tifforma kolonja (cfu) : kejl ta' numri batterjali vijabbli.  
Konkatameru : bijomolekola kontinwa twila msawra minn diversi kopji identi ċi 
marbutin f'serje.  
Sit tal-cos : segment ta' 12-nukleotid ta' DNA b'filament wie ħed li jeżisti fiż- 
żewġt itruf tal- ġenoma b' żewġ filamenti tal-lambda batterjofago.  
Tħassir : mutazzjoni li fiha jintilef nukleotid (sekwenzjali) wie ħded jew iktar 
mill-ġenoma.  
Elettroporazzjoni : l-applikazzjoni ta' polsazzjonijiet elettri ċi biex ti żdied 
il-permeabbiltà tal-membrani ta ċ-ċelloli.  
Ġene endo ġenu: ġene nattiv g ħall-ġenoma.  
Varjazzjoni extrabinomjali : varjabbiltà ikbar fi stimi ripetuti ta' sehem 
tal-popolazzjoni minn dik li tkun mistennija jekk il-popolazzjoni kellha distri ­
buzzjoni binomjali.  
Mutazzjoni ta' bdil tal-qafas : mutazzjoni ġenetika kka ġunata minn tid ħiliet jew 
tħassiriet ta' numru ta' nukleotidi li ma jistax jinqasam b'mod s ħiħ minn tlieta fi 
ħdan sekwenza tad-DNA li jikkodifika g ħal proteina/peptid.  
Tidħil: iż-żieda ta' par ba żi ta' nukleotid wie ħed jew iktar f'sekwenza tad-DNA.  
Jackpot : numru kbir ta' mutanti li fe ġġu permezz ta' espansjoni klonali minn 
mutazzjoni wa ħda. 
Tħassiriet kbar : tħassiriet fid-DNA ta' iktar minn bosta kiloba żijiet (li effetti ­
vament ji ġu identifikati bl-g ħażla ta' Spi  — u l-assaġġi ta' plażmidi lacZ).  
Ligazzjon : il-kovalenti li jorbtu żewġt itruf ta' molekoli tad-DNA li ju żaw ligażi 
tad-DNA.  
Mitoġen: sustanza kimika li tistimola ċellola biex tibda divi żjoni taċ-ċelloli, li 
twassal g ħal mitożi (jiġifieri divi żjoni taċ-ċelloli).  
Ġene newtrali : ġene li mhuwiex affettwat minn pressjonijiet selettivi po żittivi 
jew negattivi.  
Imballaġġ: is-sinteżi ta' partikuli fago infettivi minn preparazzjoni ta' kapsida 
fago u proteini tad-denb u konkatameru ta' molekoli fago tad-DNA. U żati spiss 
għall-imballa ġġ ta' DNA kklonat f'vettur lambda (separat minn siti ta' cos) f'par ­
tikuli lambda infettu żi. 
Effiċjenza tal-imballa ġġ: l-effiċjenza li biha l-batterjofagi mballa ġġati huma 
rkuprati f'batterji ospitanti.  ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Unità li tifforma plakek (pfu) : kejl tan-numri batterjofagi vijabbli.  
Mutazzjoni tal-punt : terminu ġenerali għal mutazzjoni li taffettwa biss sekwenza 
żgħira ta' DNA inklu żi tidħiliet żgħar, tħassiriet, u sostituzzjonijiet ta' pari ba żi. 
Għażla pożittiva : metodu li jippermetti mutanti biss sabiex jibqg ħu ħajjin.  
Ġene rapportatur : ġene li l-prodott tal- ġene mutanti tieg ħu huwa identifikat 
malajr.  
Żmien tal-kampjunar : tmiem il-perjodu ta' żmien, qabel is-sagrifi ċċju, li matulu 
s-sustanza kimika ma ting ħatax u li matulha l-le żjonijiet mhux ippro ċessati 
tad-DNA huma fissi f'mutazzjonijiet stabbli.  
Vettur shuttle : vettur mibni sabiex ikun jista' jistag ħna f'żewġ speċi ospitanti 
differenti; skont dan, id-DNA mda ħħal f'vettur shuttle jista' ji ġi ttestjat jew 
immanipolat f' żewġ tipi ta' ċelloli differenti jew żewġ organiżmi differenti.  
Sustanzaz kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża 
dan il-metodu ta' ttestjar.  
Transġeniku : ta', relatat ma', jew li huwa organi żmu li l-ġenoma tieg ħu hija 
alterata mit-trasferiment ta' ġene jew ġeni minn spe ċijiet oħrajn. ▼M5 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
PARTI Ċ: IL-METODI G ĦAD-DETERMINAZZJONI TA' 
L-EKOTOSSI ĊITÀ 
WERREJ 
C.1. TOSSI ĊITÀ AKUTA G ĦALL ĦUT 
C.2. IT-TEST TA' L-IMMOBBILIZZAZZJONI AKUTA  DAPHNIA 
SP. 
C.3. ALKA TAL-ILMA ĦELU U ĊANOBATTERJI, TEST TA’ 
INIBIZZJONI TAT-TKABBIR 
C.4. DETERMINAZZJONI TAL-BIJODEGRADABBILITÀ LESTA PARTI I. KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI 
PARTI II. DOC TEST TAT-TNE ĦĦIJA TAL-KULUR (Metodu C.4-A) 
PARTI III. TEST TA' L-G ĦAŻLA OECD MODIFIKATA (Metodu
 o C.4-B) 
PARTI IV. TEST TA' L-EVOLUZZJONI CO  2 (Metodu  o C.4-C) 
PARTI V. TEST TAR-RESPIROMETRIJA MANJOMETRIKA (Metodu 
C.4-D) 
PARTI VI. TEST TAL-FLIXKUN MAG ĦLUQ (Metodu  o C.4-E) 
PARTI VII. TEST M.I.T.I. (Metodu  o C.4-F) 
C.5. DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSI ĠENU 
BIOKEMIKALI 
C.6. DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSI ĠENU KEMIKALI 
C.7. ID-DEGRADAZZJONI – ID-DEGRADAZZJONI ANTIBI ­
JOTIKA: L-IDROLISI B ĦALA FUNZJONI TAL-PH 
C.8. IT-TOSSI ĊITÀ TAL- ĦNIEX 
C.9. ID-DEGREDAZZJONI BIJOLO ĠIKA 
C.10. TRATTAMENT TA’ SIMULAZZJONI TESTAEROBIKA 
TAD-DRANA ĠĠ: C.10-A: UNITAJIET TA’ ĦAMA ATTIVAT 
- C.10-B: BIJORITI 
C.11. BIODEGRADAZZJONI C.12. BIODEGRADAZZJONI C.13. BIJOKON ĊENTRAZZJONI:  FLOW-THROUGH FISH TEST  
Ċ.14. PROVA TA' L-I ŻVILUPP FI Ż-ŻGĦOŻIJA TAL- ĦUT 
C.15. PROVA TA' TOSSI ĊITÀ B'TERMINU QASIR FUQ  
EMBRIJONI  U STADJI TA' SAC- FRY TAL- ĦUT 
C.16. NA ĦAL – PROVA TA' TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA 
C.17. NA ĦAL – PROVA TA' TOSSI ĊITÀ AKUTA MILL-KUNTATT 
C.18. ADSORBIMENT/DESORBIMENT BL-U ŻU TAL-METODU 
TA' L-EKWILIBRIJU TA' GRUPPI
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ESTIMAZZJONI TAL-KOEFFI ĊJENT TA' ADSORPTION 
(K OC ) FUQ IL- ĦAMRIJA U FUQ ĦAMA TAD-DRENA ĠĠ 
BL-UŻU TA' KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDU LI 
JIPPERFORMA G ĦOLI (HPLC) 
C.20.  DAPHNIA MAGNA  REPRODUCTION TEST 
C.21. MIKROORGANI ŻMI TAL- ĦAMRIJA: TEST TAT-TRAS ­
FORMAZZJONI TAN- NITRO ĠENU 
C.22. MIKROORGANI ŻMI TAL- ĦAMRIJA: TEST TAT-TRAS ­
FORMAZZJONI TAL- KARBONJU 
C.23. TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIL- 
ĦAMRIJA 
C.24. TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIS- 
SEDIMENT TAS-SISTEMI AKWATI ĊI 
C.25. MINERALIZZAZZJONI LI TE ĦTIEĠ L-OSSIĠNU FL-ILMA 
TAL-WIĊĊ — TEST TAS-SIMULAZZJONI TAL-BIJODEGRA ­
DAZZJONI 
C.26.  LEMNA  SP. TEST TAL-INIBIZZJONI TAT-TKABBIR  
▼M4 
C.27. TEST TAT-TOSSI ĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ 
SEDIMENT-ILMA BL-U ŻU TA’ SEDIMENT IM ĦALLAT 
C.28. TEST TAT-TOSSI ĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ 
SEDIMENT-ILMA BL-U ŻU TA’ ILMA FORTIFIKAT 
C.29. BIJODEGRADABBILTÀ FA ĊLI - CO  2 F’REĊIPJENTI 
SSIĠILLATI (TEST TA’ SPAZJU FUQ) 
C.30. AKKUMULAZZJONI BIJOLO ĠIKA TA’ OLIGOCHAETES 
TERRESTRI  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. TOSSI ĊITÀ AKUTA G ĦALL ĦUT 
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-iskop ta' dan it-test huwa sabiex jiddetermina t-tossi ċita letali akuta 
ta' sustanza g ħall-ħut fl-ilma ħelu. Huwa mixtieq li jkun hemm, sa 
kemm ikun possibbli, informazzjoni dwar is-solubbiltà fl-ilma, il- pressjoni tal-fwar, l-istabbilità kimika, ilpkostanti tad-disasso ċ­
jazzjoni u tal-biodegrabbilità tas-sustanza sabiex tg ħin fil-għażla 
tal-metodu tat-test l-aktar xieraq (statiku, semi-statiku jew ta' 
kurrent kontinwu) sabiex ikunu assigurati l-kon ċentrazzjoninijiet 
kostanti sodisfa ċenti tas-sustanza tat-test matul il-perijodu tat-test.
 
Informazzjoni addizzjonali (per e żempju l-formula strutturali, il-grad 
tal-purità, n-natura u l-persenta ġġ ta' impuritajiet sinifikanti, l- 
preżenza u l-ammonti ta' addittivi, u l-koeffi ċjent tal-qasma n- 
oktonal/ilma) g ħandhom ikunu meqjusa kemm fl-ippjanar tat-test u 
fl-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Tossiċità akuta hija l-effett ħażin apparenti inti ż f'organiżmu matul 
perijodu qasir (jiem) ta' l-espo żizzjoni tieg ħu għal sustanza. Fit-test 
preżenti, tossi ċità akuta hija espressa b ħala l-kon ċentrazzjonini 
medjana letali (LC  50 ), jiġifieri l-kon ċentrazzjoni fl-ima li toqtol 
50 % f'lott ta' prova ta' ġut matul perijodu kontinwu ta' l-espo żizzjoni 
li għandu jkun mistqarr.  
Il-konċentrazzjoninijiet kollha tas-sustanza fit-test huma mog ħtija bil- 
piż/volum (milligrammi kull litru). Dawn jistg ħu ikunu espressi 
wkoll bħala piż bil-piż (mg.kg  -1 ). 
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanza ta' referenza tista tkun ittestjata b ħala mezz sabiex turi li l- 
kondizzjonijiet waqt it-test fil-laboratorju, ir-reazzjoni tal-ispe ċi 
ittestjati ma jkunux inbidlu b'mod sinifikanti.  
L-ebda sustanzi ta' referenza ma huma spe ċifikati f'din il-kitba.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Test limitat jista' jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex tkun 
determinata li il-LC  50 tkun akbar minn din il-kon ċentrazzjoni.  
Il-ħut hu espost g ħas-sustanza tat-test mi żjuda ma' l-ilma fil-medda 
tal-konċentrazzjonijiet g ħal perijodu ta' 96 sieg ħa. Il-mortalitajiet 
huma irre ġistrati fi mill-anqas intervalli ta' 24 sieg ħa, u l-kon ċen­
trazzjoninijiet li joqtlu 50 % tal- ħut (LC  50 ) f'kull żmien ta' l-osser ­
vazzjoni huma ikkalkolati, meta dan ikun possibbli  
1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
Il-kriterja tal-kwalità g ħandha tkun applikabbli g ħal-limitu tat-test kif 
ukoll għall-metodu tat-test kollu.  
Il-mortalità fil-kontrolli m'g ħandhiex te ċċedi 10 % (jew ħuta waħda 
jekk anqas minn g ħaxa jkunu w żati) sat-tmiem tat-test.  
Il-konċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb g ħandha tkun ta' aktar 
monn 60 % tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja matul i ż-żmien kollu.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test g ħandhom jin żammu sa fil- 
limitu ta' 80 % tal-kon ċentrazzjoninijiet inizjali matul i ż-żmien kollu 
tat-test.  
Għal sustanzi li jdubu fa ċilment fil-medja tat-test, b'hekk ifornu 
taħlitiet stabbli, i.e. dawk li ma jkollhomx reazzjoni volatili sini ­
fikanti, jkollhom degradazzjoni, ikunu idrolizzati jew adsorbiti, l- konċentrazzjoni inizjali tista tkun meqjusa b ħala ekwivalenti tal- 
konċentrazzjoni nominali. Evidenza g ħandha tkun ippre żentata li l- 
livelli tal-kon ċentrazzjonijiet ikunu n żammu matul it-test u li l- 
kriterja tal-kwalità kienet ġiet milħuqa.
 
Għal sustanzi li huma:  
(i) ftit li xejn jin ħallu fil-medja tat-test, jew  
(ii) kapaċi li jiffurmaw emulsjonijiet jew dispersjonijiet stabbli, 
inkella  
(iii) ma humiex stabbli f'ta ħlitiet akweji,  
l-konċentrazzjonini inizjali g ħandha tkun meqjusa b ħala l-kon ċen­
trazzjoni mkejla fit-ta ħlita (jew, jekk teknikament dan ma jkunx 
possibbli, imkejla f'kolonna ta' l-ilma) fil-bidu tat-test. Il-kon ċen­
trazzjoni g ħandha tkun determinata wara perijodu ta' ekwilibriju 
imma qabel l-introduzzjoni tal- ħut tat-test.  
Fi kwalunkwe minn dawn il-ka żi, aktar kejl g ħandu jsir matul it-test 
sabiex jikkonferma l-kon ċentrazzjoni attwali ta' l-espo żizzjoni jew li 
l-kriterja tal-kwalità tkun ġiet milħuqha.  
Il-pH m'g ħandux ivarja b'aktar minn unità wa ħda. 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Tlett tipi ta' pro ċedura jistg ħu ikunu w żati: 
Test statiku:  
Test tat-tossi ċità li fih l-ebda ċaqlieq ma jse ħħ tat-taħlita tat-test. (It- 
taħlitiet jinqg ħu mingħajr tibdil matul i ż-żmien kollu tat-test.)  
Test semi-statiku:  
Test ming ħajr ċaqlieq tat-ta ħlita tat-test, imma bit-ti ġdid regolari tal- 
lottijiet tat-ta ħlitiet tat-test eara perijodi mtawwla (e ż. 24 siegħa). 
Test biċ-ċaqlieq kontinwu:  
Test tat-tossi ċità li fih l-ilma jkun im ġedded regolarment fil-kabini 
tat-test, il-kimika li tkun ittestjata ti ġi trasportata ma l-ilma u żat għat- 
tiġdid tal-medja tat-test.  
1.6.1.  Rea ġenti 
1.6.1.1.  Taħlitiet tas-sustanzi tat-test  
Taħlitiet diġa lesti tas-sa ħħa meħtieġa huma preparati bit-tidwib tas- 
sustanza f'ilma de-jonizzat jew f'ilma skond 1.6.1.2.  
Il-konċentrazzjoni tat-test kif mag ħżula huma ippreparati bit-tidwib 
tat-taħlita diġà lest. Jekk kon ċentrazzjoninijiet g ħoljin huma ttestjati, 
is-sustanza tista' tkun imdewba direttament mat-trattib ta' l-ilma.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Is-sustanza g ħandha normalment tkun ittestjata biss sal-limitu tas- 
solubbilità tag ħha. Għal uħud mis-sustanzi (e ż. sustanzi li jkollhom 
solubbilità baxxa fl-ilma, jew P  ow9 għoli, jew dawk li jiffurmaw 
tixriq stabbli pjuttost milli ta ħlita vera fl-ilma), huwa a ċċettabbli li 
tintuża l-konċentrazzjonini tat-test aktar g ħolja mil-limitu tal-solub ­
bilità tas-sustanza sabiex ikun assigurat li s-solubbilità massima/ ­
stabbilità tal-kon ċentrazzjoni tkun intla ħqet. Huwa mportanti, b'dana ­
kollu, li din il-kon ċentrazzjoni ma tkunx b'mod ie ħor tħawwad is- 
sistema tat-test (e ż. li jkun hemm rita tas-sustanza fil-wi ċċ ta' l-ilma 
li ma tħallix li jse ħħ l-ossiġinazzjoni ta' l-ilma, e ċċ.). 
Tixrid ultrasoniku, solventi organi ċi, emulsifikaturi jew dispersanti 
jistgħu jintużaw bħala għajnuna għat-tħejjija tat-ta ħlitiet bil-lest ta' 
sustanzi b'solubbilità baxxa fl-ilma jew sabiex jg ħinu fit-tixrid ta' 
dawn is-sustanzi fil-medja tat-test. Meta tali sustanzi aw żiljarji 
huma w żati, il-kon ċentrazzjoninijiet kollha tat-test g ħandhom 
jinkludu l-istess ammont tas-sustanza aw żiljarja, u ħut addizzjonali 
tal-kontroll g ħandhom ikunu esposti g ħall-istess kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza aw żiljarja bħal dik użata fis-serje tat-test. Il-kon ċentrazzjoni 
ta' tali aw żiljarji għandha tkun minimizzata, imma fl-ebda ka ż 
m'għandha teċċedi 100 mg kull litru fil-medja tat-test.  
It-test għandu jkun imwettaq ming ħajr l-aġġustament tal-pH. Jekk 
ikun hemm evidenza ta' tibdil qawwi fil-pH, huwa rakkomandat li 
t-test għandu jkun repetut bi pH a ġġustat u r-ri żultati inklu żu fir- 
rapport. F'dak il-ka ż, il-valur tal-pH tat-ta ħlita bil-lest g ħandu jkun 
aġġustat għall-valur tal-pH ta' l-ilma tat-ta ħlit, sakemm ma jkunx 
hekk raġunijiet spe ċifiċi il-għala dan m'g ħandux isir. HCI u NaOH 
huma preferuti g ħal dan l-iskop. Dan l-a ġġustament tal-pH g ħandu 
jsir b'tali mod hekk li l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fit-ta ħlita 
bil-lest ma tkunx mibdula sa xi medda sinifikanti. Jekk ikun hemm 
xi reazzjoni kimika jew pre ċipitazzjoni fi żika tal-kompost tat-test 
ikkaġunata bl-a ġġustament, dan g ħandu jkun mistqarr.  
1.6.1.2.  Ilma ta ż-żamma u tat-trattib  
Forniment ta' ilma tax-xorb (mhux kontaminat b'kon ċentrazzjonijiet 
potenzalment ta' ħsara mill-klorin, metalli tqal jew sustanzi o ħrajn), 
ilma naturali ta kwalità tajba jew ilma rikostitwita (ara l-Appendi ċi I) 
jista jkun u żat. Ilmijiet b'ebusija totali ta' bejn 10 u 250 mg kull litru 
(bħala CaCO  3 ) u bi pH minn 6,0 sa 8,5 huma preferuti.  
1.6.2.  Apparat  
L-apparat kollu g ħandu jkun mag ħmul minn materjal kemikalment 
inert.  
— sistema ta' ta ħlil awtomatiku (g ħal test b'ċaqlieq kontinwu),  
— arloġġ ta' l-ossi ġenu, 
— apparat g ħad-determinazzjoni ta' l-ebusija ta' l-ilma,  
— apparat adekwat g ħall-kontroll tat-temperatura,  
— arloġġ pH.  
1.6.3.  Ħut tat-test  
Il-ħut għandu jkun f'kondizzjoni tajba tas-sa ħħa u ħieles minn xi 
malformazzjoni apparenti.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
L-ispeċi użati għandhom ikunu mag ħżula fuq il-ba żi ta' kriterja 
prattika, b ħalma hija d-disponibbiltà fa ċli tagħhom matul is-sena, l- 
faċilità tal-manutenzjoni, l-konvenjenza g ħat-testijiet, is-sensittività 
relattiva g ħall-kimika u xi fatturi ekonomi ċi, bioloġiċi u ekolo ġiċi 
li jistgħu jaffettwaw ir-ri żultati. Il-ħtieġa tal-kompattibbiltà tad-data 
akkwistat u l-armonizzazzjoni internazzjonali e żistenti (referenza 1) 
għandha wkoll tkun imfakkra meta ssir l-g ħażla tal-ispe ċi tal-ħut. 
Lista tal-ispe ċi tal-ħut li huma rakkommandati g ħat-twettieq ta' dan 
it-test hija mog ħtija fl-Appendi ċi 2; il-ħut irrigat (ta ż-żebra) u t-trotta 
ikkulurita huma l-ispe ċi preferuti.  
1.6.3.1.  Iż-zamma  
Il-ħut tat-test preferibbilment ji ġu minn lott wie ħed ta' l-istess tul u 
età. Il-ħut għandu jin żamm għal mill-anqas 12-il jum, fil- 
kondizzjonijiet kif ġejjin:  
tagħbija:  
xierqa għas-sistema (ri ċirkolazzjoni jew kurrent kontinwu) u l-ispe ċi 
tal-ħut, 
l-ilma:  
ara 1.6.1.2,  
dawl:  
12 sa 16-il sieg ħa ta' dawl kuljum,  
konċentrazzjoni ta' ossi ġenu mdewweb:  
mill-anqas 80 % tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja,  
ikel: 
tlett darbiet fil- ġimgħa jew kull jum, jieqaf 24 sieg ħa qabel il-bidu 
tat-test.  
1.6.3.2.  Mortalità  
B'segwiment tal-perijodu ta' 48 sieg ħa sakem joqg ħodu, il-mortali ­
tajiet huma re ġistrati u din il-kriterja li ġejja għandha tkun applikata:  
— aktar minn 10 % tal-popolazzjoni matul sebat ijiem:  
ċaħda tal-lott kollu kemm hu,  
— bejn 5 u 15 % tal-popolazzjoni:  
perijodu ta ż-żamma ikompli g ħal sebat ijiem addizzjonali.  
Jekk l-ebda mortalità ma sse ħħ, il-lott huwa a ċċettabbli, altri ­
mentri għandu jkun mi ċħud, 
— anqas minn 5 % tal-popolazzjoni:  
aċċettazzjoni tal-lott.  
1.6.4.  Adattazzjoni  
Il-ħut kollu g ħandu jkun espost g ħall-ilma tal-kwalità u tat- 
temperatura li jkunu w żati fit-test g ħal mill-anqas sebat ijiem qabel 
ma jintużaw. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Pro ċedura tat-test  
Test tas-sejba tal-medda jista jippre ċedi t-test definittiv, sabiex tkun 
akkwistata l-informazzjoni dwar il-medda tal-kon ċentrazzjonijiet li 
għandhom ikunu w żati fit-test ewlieni.  
Kontroll wie ħed mingħajr is-sustanza tat-test g ħandu jkun mag ħmul 
u, jekk relevanti, kontroll wie ħed li jkun fih sustanza aw żiljarja 
għandu wkoll ikun mag ħmul, b'żieda mas-serje tat-testijiet.  
Jiddependi mill-proprjetajiet fi żiċi u kimiċi tal-kompost tat-test, test 
statiku, semi-statiku jew bi ċ-ċaqlieq kontinwu g ħandu jkun mag ħżul 
skond kif xieraq, sabiex iwettaq il-kriterja tal-kwalità.  
Il-ħut huwa espost g ħas-sustanza kif deskritt hawn ta ħt: 
— tul ta' żmien: 96 sieg ħa 
— numru ta' l-annimali: mill-anqas 7 kull kon ċentrazzjoni,  
— tankijiet: ta' daqs adattat b'relazzjoni mat-tag ħbija rakkom ­
mandata,  
— tagħbija: tagħbija massima ta' 1 g kull litru g ħal testijiet stati ċi u 
semi-stati ċi hija rakkommandata; g ħal sistemi ta' ċaqlieq 
kontinwu, tag ħbija għola hija a ċċettabbli  
— konċentrazzjoni tat-test: Mill-anqas ħames kon ċentrazzjoninijiet li 
jiddifferixxu b'fattur kostanti li ma je ċċedix 2,2 u kemm jista 
jkun possibbli li jkopri l-medda ta' 0 sa 100 % mortalità.  
— ilma: ara 1.6.1.2,  
— dawl: 12 sa 16-il sieg ħa ta' dawl kuljum,  
— temperatura: xierqa g ħall-ispeċi (l-Appendi ċi 2) imma fi ħdan ± 
1 o C skond it-test partikolari,  
— konċentrazzjoni ta' ossi ġenu mdewweb: mhux anqas minn 60 % 
tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja fit-temperatura mag ħżula, 
— ikel: xejn.  
Il-ħut ikunu spezzjonati wara l-ewwel 2 sa 4 sieg ħat u mill-anqas 
matul intervalli ta' 24 sieg ħa. Il-ħut huma meqjusa b ħala mejta jekk 
meta jkunu minsusa fil-pedunkula kawdjali ma jipprodu ċu l-ebda 
reazzjoni u l-ebda movimenti tan-nifs ma jkunu vi żibbli. Il-ħut 
mejta jkunu mne ħħija malli dan ikun osservat u l-mortalitajiet 
huma reġistrati. Re ġistri jinżammu ta' annormalitajiet vi żibbli (eż. 
talf ta' l-ekwilibriju, tibdil fl-im ġieba ta' l-g ħawm, funzjoni respira ­
torja, pigmentazzjoni, e ċċ.). 
Il-kejl tal-pH, l-ossi ġenu mdewweb u tat-temperatura g ħandhom 
jitwettqu ta' kuljum.  
Test ta' limitazzjoni  
Bl-użu tal-proċeduri deskritti f'dan il-metodu tat-test, test tal-limi ­
tazzjoni jista jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex ikun muri li l-LC
 50 ikun akbar minn din il-kon ċentrazzjoni.  
Jekk in-natura tas-sustanza tkun tali li kon ċentrazzjoni ta' 100 mg 
kull litru fl-ima tat-test ma tistax tkun mil ħuqha, it-test tal-limi ­
tazzjoni g ħandu jkun imwettaq f'kon ċentrazzjoni egwali g ħas-solub­
bilità tas-sustanza (jew tal-kon ċentrazzjoni massima li tifforma tixrid 
stabbli) fil-medja u żata (ara wkoll il-punt 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
It-test tal-limitazzjoni g ħandu jkun imwettaq bl-u żu ta' minn 7 sa 10 
ħutiet, bl-istess numru ta' kontroll(i). (It-teorija binominali tiddetta li 
meta 10 ħutiet huma w żati b'mortalità żero, ikun hemm 99,9 % 
affidabbilità li l-LC  50 huwa akbar mill-kon ċentrazzjonini u żata 
f'dak it-test tal-limitazzjoni. Bi 7, 8 jew 8 ħutiet, l-assenza tal- 
mortalità tipprovdi mill-anqas 99 % affidabbilità li l-LC  50 huwa 
akbar mill-kon ċentrazzjoni u żata.) 
Jekk ikun hemm mortalijiet, studju s ħiħ għandu jkun imwettaq. Jekk 
effetti sub-letali huma osservati, dawn g ħandhom ikunu re ġistrati.  
2. DATA U EVALWAZZJONI  
Għal kull perijodu ta' meta l-osservazzjonijiet kienu re ġistrati (24, 
48, 72 u 96 sieg ħa), pinġi l-persenta ġġ tal-mortalità g ħal kull 
perijodu ta' l-espo żizzjoni kif rakkommandat kontra l-kon ċentrazzjoni 
fuq karta tal-probabbiltà logaritmika,  
Meta possibbli u g ħal ħin ta' l-osservazzjoni, l-LC  50 u l-limiti tal- 
kunfidenza (p = 0,05) g ħandhom ikunu ikkalkolati bl-u żu tal- 
proċeduri normali; dawn il-valuri g ħandhom ikunu mqarrba lejn 
wieħed, l-aktar lejn tnejn, figuri sinifikanti (e żempji tat-tqarrib lejn 
żewġ figuri: 170 g ħal 173,5; 0,13 g ħal 0,127; 1,2 g ħal 1,21).  
F'dawk il-ka żi meta l-linja mag ħwġa bil-kurva tal-kon ċentrazzjoni/ ­
persentaġġ tar-reazzjoni tkun wieqfa wisq sabiex tippermetti l-kalko ­
lazzjoni tal-LC  50 , estimi grafi ċi ta' dan il-valur huma suffi ċjenti.  
Meta żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi, b'relattività ta' 2,2 jag ħtu 
biss 0 u 100 % mortalità, dawn i ż-żewġ valuri huma suffi ċjenti 
sabiex jindikaw il-medda li fiha jkun jid ħol il-LC  50 . 
Jekk ikun osservat li l-istabbilità jew l-omo ġenità tas-sustanza tat-test 
ma jistghux jinzammu dan g ħandu jkun irrapportat u qies g ħandu 
jittieħed fl-interpretazzjoni tar-ri żultati.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li 
ġejja: 
— informazzjoni dwar il- ħut tat-test (isem xjentifiku, razza, fornitur, 
xi pre-trattament, daqs u numru u żat f'kull kon ċentrazzjoni tat- 
test);  
— is-sorsi tat-trattib – ilma u l-karatteristi ċi kimiċi maġġuri (pH, 
ebusija, temperatura);  
— fil-każ ta' sustanza b'solubilità akwea baxxa, l-metodu tal- 
preparazzjoni tat-ta ħlitiet kemm dawk im ħejjija lesti u tat-test;  
— konċentrazzjoni ta' xi sustanzi aw żiljarji;  
— lista tal-kon ċentrazzjonijiet u żati u xi informazzjoni disponibbli 
dwar l-istabbilità tal-kon ċentrazzjonijiet tal-kimika ittestjata fit- 
taħlita tat-test;  
— jekk anali żi kimika titwettaq, metodi w żati u r-ri żultati 
akkwistati;  
— r-riżultati tat-test tal-limitazzjoni, jew imwettaq;  
— ir-raġunijiet tal-g ħażla u d-dettalji tal-pro ċedura tat-test kif u żata 
(eż. statiku, semi-statiku, rata tad-do żar, rata ta ċ-ċaqlieq 
kontinwu, jekk huma mog ħti l-arja, t-tag ħbija tal-ħut, eċċ.); ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— deskrizzjoni ta' l-apparat tat-test;  
— l-organizzazzjoni tad-dawl;  
— il-kon ċentrazzjonijiet ta' l-ossi ġenu mdewweb, il-valuri pH u t- 
temperaturi tat-ta ħlitiet tat-test kull 24 sieg ħa; 
— evidenza tal-kriterja tal-kwalità li tkun ġiet imwettqa;  
— tabella li turi il-mortalità kumulattiva ta' kull kon ċentrazzjoni u l- 
kontroll (u l-kontroll bis-sustanza aw żiljarja, jekk me ħtieġ) f'kull 
wieħed mill-ħinijiet rakkommandati ta' l-osservazzjoni;  
— grafika tal-kon ċentrazzjoni/persenta ġġ tal-kurva tar-reazzjoni fit- 
tmiem ta' kull test;  
— jekk possibbli, l-valuri LC  50 f'kull wie ħed mill-hinijiet rakkom ­
mandati ta' l-osservazzjoni (bi 95 % tal-limiti ta' l-affidibbiltà);  
— proċedura statisti ċi wżati għad-determinazzjoni tal-valuri LC  50 ; 
— jekk tkun u żata sustanza ta' referenza, r-ri żultati akkwistati,  
— l-ogħla konċentrazzjoni tat-test li ma to ħloq l-ebda mortalità 
matul il-perijodu tat- test;  
— l-anqas kon ċentrazzjoni tat-test li to ħloq 100 % mortalità matul 
il-perijodu tat-test.  
4. REFERENZI  
(1) OECD, Pari ġi, 1981, Linji ta' Gwida tat-Testijiet 203, 
Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali u a ġġornamenti.  
(2) AFNOR – Determinazzjoni tat-tossi ċità akuta ta' sustanza mal- 
Brachydanio rerio -Metodi Stati ċi u ta' Caqlieq Kontinwu – 
NFT 90-303 Ġunju 1985.  
(3) AFNOR – Determinazzjoni tat-tossi ċità akuta ta' sustanza mal- 
Salmo gairdneri -Metodu Statiku – ta' Caqlieq Kontinwu – NFT 90-305 Ġunju 1985
 
(4) ISO 7346/1,/2 u/3 – Kwalità ta' l-ilma – Determinazzjoni tat- 
tossiċità letali akuta ta' sustanzi g ħall-ħut ta' l-ilma frisk (Bra ­
chydanio rerio Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). 
Parti 1: Metodu statiku. Parti 2: Metodu semi-statiku. Parti 3: 
Metodu bi ċ-ċaqlieq kontinwu.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsme ­
thoden – Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L 
(15).  
(7) JIS K 0102, Test tat-tossi ċità akuta g ħall-ħut. 
(8) NEN 6506 – Ilma – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van Poecilia reticulata, 1980.  
(9) Aġenzija tal- Ħarsien Ambjentali, Metodi g ħal testijiet tat- 
tossiċità akuta mal- ħut, makroinvertebrati u amfibji. Il- 
Kumitat dwar il-Metodi g ħat-Testijiet tat-Tossi ċità ma l- 
Organiżmi Akwati ċi, Serje tar-Ri ċerka Ekolo ġika EPA-660- 
75-009, 1975.  
(10) Aġenzija tal- Ħarsien Ambjentali, Laboratorju tal-monitera ġġ u 
sostenn ambjentali, Uffi ċju tar-Riċerka u Żvilupp, EPA-600/4- 
78-012, Jannar 1978.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Aġenzija tal- Ħarsien Ambjentali, Kontroll tas-Sustanza 
Tossika, Parti IV, 16 ta' Marzu 1979.  
(12) Metodi normali g ħall-eżaminazzjoni ta' l-ilma u l-ilma skartat, 
l-erbatax edizjoni, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Kummissjoni tal-Komunitajiet Ewropej, Programm tat-test 
Inter-Laboratorju li jikkon ċerna l- istudju ta' l-ekotossi ċità ta' 
sustanza kimika fir-rigward tal- ħut. Studju KEE D.8368, 
22 Marzu 1979.  
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, 
Grundlagen für die okotoxikologische Bewertung von Umwelt ­
chemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J.T. u Wilcoxon, F., Metodu simplifikat g ħall-eval­
wazzjoni ta' l-esperimenti ta' l-effetti tad-do ża, J. Pharm, Exp. 
Therap., 1949, vol. 96, 99.  
(16) Finney, D.J. Metodi Statisti ċi fl-Assa ġġ Bioloġiku. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Kejl tat-tossi ċità tat-tniġġis għall-ħut. Metodi tal- 
Bioassaġġ għal tossiċità akuta. Water Res., 1969, vol. 3, 793- 
821. 
(18) Sprague, J.B. Kejl tat-tossi ċità tat-tniġġis għall-ħut. II L-utiliz ­
zazzjoni u l-applikar tar-ri żultati tal-bioaassa ġġ. Water Res. 
1970, vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Metodi g ħal kalkolazzjoni ta' LC  50 . Fl-Eval ­
wazzjoni tat-Tossikolo ġija u l-Periklu Akwatiku (bl-edizjoni 
ta' F.I. Mayer u J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
 
(20) Stephan,  o C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. u Andrews, 
R.W. Programm tal-computer g ħal kalkolazzjoni ta' LC50. US 
EPA.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Appendiċi 1 
Ilma rikostitwit  
Eżempju ta' trattib xieraq ta' l-ilma  
Il-kimiċi kollha g ħandhom ikunu ta' grad analitiku.  
L-ilma għandu jkun distillat ta' kwalità tajba, jew ilma dejonizzat b'konduttività 
ta' anqas minn 5 μScm  -1 . 
Apparat g ħad-distillazzjoni ta' l-ilma m'g ħandux ikun fih xi partijiet mag ħmula 
mir-ramm.  
Taħlitiet bil-lest  
CaCI  2 . (Diħidrat tal-klorid tal-kal ċju): 
Dewweb fi, u wassal g ħal litru bl-ilma. 11,76 g 
MgSO  4 . (ħeptaidrat tas-sulfat tal-magne żju): 
Dewweb fi, u wassal g ħal litru bl-ilma. 4,93 g 
NaHCO  3 NaHCO3 (karbonat ta' l-idro ġenu tas-sodju): 
Dewweb fi, fl-ilma u wassal g ħal litru bl-ilma. 2,59 g 
KC1 (klorid tal-putassa): 
Dewweb fi, u wassal g ħal litru bl-ilma. 0,23 g  
Ilma rikostitwit g ħat-tidwib  
Ħawwad 25 ml ta' kull wie ħed ta' l-erba ta ħlitiet bil-lest u wassal sa litru bl-ilma.  
Qawwi bl-arja sakemm il-kon ċentrazzjonini ta' l-ossi ġenu mdewweb tkun egwali 
għall-valur tas-saturizzazzjoni ta' l-arja.  
Il-pH għandu jkun 7,8 ± 0,2.  
Jekk meħtieġ, aġġusta il-pH bi NaOH (idrossidu tas-sodju) jew HCI (a ċidu 
idrokloriku).  
L-ilma tat-trattib hekk ippreparat huwa mwarrab g ħal madwar 12-il sieg ħa u l- 
ebda arja aktar ma tkun mi żjuda.  
Is-somma tal-jonji Ca u Mg f'din it-ta ħlita hija ta' 2,5 mmol kull litru. Ir- 
relattività tal-jonji Ca:Mg hija 4:1 u tal-joni Na:K hija 10:1. L-alkalinità totali ta' din it-ta ħlita hija 0,8 mmol kull litru.
 
Kwalunkwe devjazzjoni fil-preparazzjoni ta' l-ilma tat-trattib m'g ħandhiex tibdel 
il-komposizzjoni jew il-proprjetajiet ta' l-ilma.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Appendiċi 2: 
Speċi ta' ħut rakkommandat g ħat–testijiet  
Speċje rakkommandati Medda rakkom ­
mandata tat- 
Temperatura tat- 
Test (  o C) Tul total rakkom ­
mandat ta' l- 
annimal tat-test 
(cm) 
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Ħut-Zebrab 20 sa 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Fathead minnow ( ħut ta' l-ilma 
ħelu) 20 sa 24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Karpjun komuni 20 sa 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  
Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850) Killifish ħamrani 20 sa 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20 sa 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, 
Centrarchidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) 
Bluegill 20 sa 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, 
Salmonidae)  (Walbaum 1988) Trota kulurita 12 sa 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Orfe dehbi 20 sa 24 6,0 ± 2,0
 
Ġabra  
Il-ħut elenkat hawn fuq huma fa ċli sabiex jitkabbru u/jew fa ċilment disponibbli 
matul is-sena kollha. Dawn jistg ħu ikunu mkabbra u ikkultivati jew fl-irzizet tal- 
ħut jew fil-laboratorju, f'kondizzjonijiet ikkontrollati dwar il-mard u l-parassiti, 
hekk li l-annimal tat-test ikunu b'sa ħħtu u ta' nisel mag ħruf. Dan il- ħut huwa 
disponibbli f' ħafna partijiet tad-dinja.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Appendiċi 3 
Eżempju tal-kon ċentrazzjonini: persenta ġġ tal-mortalità  
Eżempju tad-determinazzjoni ta' LC  50 bl-użu tal-karta  log-probit
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. IT-TEST TA' L-IMMOBBILIZZAZZJONI AKUTA  DAPHNIA SP.  
1. METODU  
Dan il-metodu tat-test ta' immobbilizzazzjoni akuta huwa ekwivalenti 
għall-OECD TG 202 (2004).  
1.1. DA ĦLA 
Dan il-metodu jiddeskrivi test ta' tossi ċità akuta biex ji ġu stmati l- 
effetti tal-kimi ċi lejn id-dafnidi. Intu żaw metodi tat-test e żistenti 
safejn possibbli (1)(2)(3).  
1.2 DEFINIZZJONIJIET  
Fil-kuntest ta' dan il-metodu, jintu żaw dawn id-definizzjonijiet li 
ġejjin:  
EC 5O : hija l-kon ċentrazzjoni stmata li timmobbilizza 50 % tad- 
dafnidi f'perjodu ta' espo żizzjoni dikjarat. Jekk tintu ża definizzjoni 
oħra, din għandha tiġi rrapportata, flimkien mar-riferenzi tag ħha. 
Immobilizzazzjoni:  Dawk l-annimali li huma li ma jistg ħux jgħumu 
fi żmien 15-il sekonda, wara a ġitazzjoni bil-mod tal-kontenitur tat- 
test jitqiesu li huma immobbilizzati (ukoll jekk g ħadhom jistg ħu 
jċaqalqu l-antenni tag ħhom).  
1.3. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Dafnidi żgħar, ta' eta' ta' inqas minn 24 sieg ħa fil-bidu tat-test, huma 
esposti g ħas-sustanza tat-test f'varjetà ta' kon ċentrazzjonijiet g ħal 
perjodu ta' 48 sieg ħa. L-immobbilizzazzjoni hija rrekordjata ma' l- 
24 siegħa u mat-48 sieg ħa u mqabbla mal-valuri tal-kontroll. Ir- 
riżultati huma analizzati sabiex ji ġi kkalkolat l-EC  5O fit-48 sieg ħa 
(ara t-taqsima 1,2 g ħad-definizzjonijiet). Id-determinazzjoni ta' l- 
EC 5O fl-24 sieg ħa mhijiex obbligatorja.  
1.4 L-INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Is-solubbiltà fl-imla u l-pressa tal-fwar tas-sustanza tat-test g ħandhom 
ikunu mag ħrufa u g ħandu jkunu disponibbli metodu analitiku 
affidabbli g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fit-ta ħlitiet tat-test b'ef ­
fiċjenza ta' l-irkupru rrapportata, u limitu tad-determinazzjoni. 
Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali, il-purità tas- 
sustanza, l-istabilità fl-ilma jew fid-dawl, P  ow u r-riżultati ta' test 
għall-bijodegradibbiltà lesta (ara l-metodu C.4).  
Nota: Il-gwida g ħall-ittestjar ta' sustanzi bil-kwalitajiet fi żiċi kimiċi li 
għamluhom diffi ċli li jiġu ttestjati hija pprovduta f' (4).  
1.5 IS–SUSTANZI TA' RIFERENZA  
Sustanza ta' riferenza tista' ti ġi ttestjata g ħal EC  5O bħala mezz biex 
jiġi żgurat li l-kondizzjonijiet tat-test huma affidabbli. It-tossikanti 
użati fit-testijiet- ċirku internazzjonali (1)(5) huma rrakkomandati 
għal dan l-g ħan (  1 ). It-test(ijiet) b'sustanza ta' riferenza g ħandhom 
preferibbilment isiru kull xahar u g ħall-inqas darbtejn fis-sena.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Ir-riżultati ta' dawn it-testijiet inter-laboratorji u Korri ġendum Tekniku g ħall-ISO 6341 
jagħtu EC  50 – 24 h tad-dikromat tal-potassju (K  2 Cr 2 O 7 ) fil-firxa bejn 0,6 mg/l u 1,7 mg/l.
 1.6 IL–KRITERJI TAL–KWALITÀ  
Biex test ikun validu, jg ħoddu dawn il-kriterji operattivi:  
— Fil-kontrolli, inklu ż il-kontroll li fih l-a ġent li jħoll, mhux aktar 
minn 10 % tad-dafnidi g ħandhom ikunu ġew immobilizzati;  
— Il-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu maħlul fl-aħħar tat-test g ħandha 
tkun ≥ 3 mg/l fil-kontenituri tal-kontroll u tat-test.  
Nota: Għall-ewwel kriterju, mhux aktar minn 10 % tad-dafnidi tal- 
kontroll g ħandhom juru immobilizzazzjoni jew sinjali o ħra ta' mard 
jew stress, per e żempju, diskolorazzjoni, m ġiba mhux normali b ħal li 
jinqabdu f'wi ċċ l-ilma.  
1.7 DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.7.1.  L-Apparat  
Il-kontenitur tat-test u apparat ie ħor li se ji ġi f'kuntatt mat-ta ħlitiet 
tat-test għandhom ikunu mag ħmula għal kollox mill- ħġieġ jew minn 
materjal ie ħor li huwa kimikament inert. Il-kontenituri tat-test norm ­
alment ikunu tubi tat-test tal- ħġieġ jew tazzi bi ż-żennuna; g ħandhom 
jitnaddfu qabel kull u żu bl-użu ta' proċeduri standard tal-laboratorju. 
Il-kontenituri tat-test g ħandhom ikunu koperti ħafif biex jitnaqqas it- 
telf ta' l-ilma min ħabba evaporazzjoni u biex ji ġi evitat id-d ħul tat- 
trab fit-ta ħlitiet. Is-sustanzi volatili g ħandhom l-ewwel ji ġu ttestjati 
f'kontenituri mag ħluqin li huma mimlijin sa fuq, u li huma kbar 
biżżejjed biex ji ġi prevenut li l-ossi ġnu jibda jillimita jew ikun 
baxx wisq (ara t-taqsima 1.6 u l-ewwel paragrafu tat-taqsima 1.8.3).  
Barra minn dan, jintu ża xi ftit mit-tag ħmir li ġej jew kollu: miter ta' 
l-ossiġnu (b'mikroelettrodu jew tag ħmir ieħor xieraq biex jitkejjel l- 
ossiġnu f'kampjuni b'volumi baxxi); miter tal-pH; apparat xieraq 
għall-kontroll tat-temperatura; tag ħmir għad-determinazzjoni tal- 
konċentrazzjoni totali tal-karbonu organiku (TOC –  total organic 
carbon concentration ); tagħmir għad- determinazzjoni tat-talba ta' 
l-ossiġnu kimiku (COD –  chemical oxygen demand ); tagħmir 
għad-determinazzjoni ta' l-ebusija, e ċċ. 
1.7.2  L-organi żmu tat-test  
Daphnia magna  Straus hija l-ispe ċje preferuta tat-test g ħalkemm 
speċje oħrajn Daphnia  xierqa jistg ħu jintużaw f'dan it-test (e ż. 
Daphnia pulex ). Fil-bidu tat-test, l-annimali g ħandu jkollhom inqas 
minn 24 sieg ħa u biex titnaqqas il-varjabbiltà, huwa rakkomandat 
bis-saħħa li ma jkunux l-ewwel frieg ħ tat-tifqisa. G ħandhom ikunu 
derivati minn tifqisa b'sa ħħitha (jiġifieri ma juru l-ebda sinjali ta' 
stress bħall-mortalità g ħolja, il-pre żenza ta' maskili u ephippia, 
dewmien fil-produzzjoni ta' l-ewwel tifqisa, annimali li jmurilhom 
il-kulur, e ċċ.). L-organi żmu kollha u żati għal test partikolari 
għandhom ikunu ori ġinaw mill-istess tifqisa ta' dafnidi. L-annimali 
tat-tifqisa g ħandhom jin żammu fil-kondizzjonijiet tal-kultura (dawl, 
temperatura, medju) simili g ħal dawk li g ħandhom jintu żaw fit-test. 
Jekk il-mezz tal-kultura tad-dafnidi li g ħandu jintu ża fit-test huwa 
differenti minn dak u żat għall-kultura rutina tad-dafnidi, hija prattika 
tajba li ji ġi inkluż test ta' l-akklimatizzazzjoni ta' qabel it-test. G ħal 
dak, id-dafnidi tat-tifqisa g ħandhom jin żammu fl-ilma tat-ta ħlit fit- 
temperatura tat-test g ħal mhux inqas minn 48 sieg ħa qabel il-bidu 
tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  L-ilma ta ż-żamma u tat-ta ħlit 
L-ilma naturali (l-ilma tal-wi ċċ u ta' l-art), l-ilma rikostitwit jew ilma 
tal-vit deklorinat huma a ċċettabbli b ħala ilma ta ż-żamma u tat-ta ħlit 
jekk id-dafnidi jissopravivu fihom g ħal kemm idum il-kulturazzjoni, 
l-akklimatizzazzjoni jew l-ittestjar ming ħajr ma jintwerew sinjal ta' 
stress. Kwalunkwe ilma li jikkonforma mal-karatteristi ċi kimiċi ta' 
ilma tat-ta ħlit aċċettabbli kif elenkat fl-Anness 1 huwa xieraq b ħala 
ilma tat-test. G ħandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat- 
test. L-ilma rikostitwit jista' jsir bi ż-żjieda ta' ammonti spe ċifiċi ta' 
reaġenti ta' grad analitiku mag ħruf għal ilma deonizzat jew distillat. 
Eżempji ta' ilma rikostitwit jing ħataw f'(1) (6) u fl-Anness 2. Innota 
li l-medja li fihom a ġenti li jikkombinaw jonu tal-metall ma' kompost 
kimiku ( chelating agent ), bħall-medji M4 u M7 fl-Anness 2, 
għandhom ji ġu evitati sustanzi tat-test li fihom il-metalli. Il-pH 
għandu jkun fil-firxa ta' 6 sa 9. Hija rrakkomandata l-ebusija bejn 
140 u 250 mg/l (b ħala CaCO  3 ) għal Daphnia Magna , filwaqt li tista' 
wkoll tkun xierqa ebusija inqas g ħal speċje oħrajn ta'  Daphnia . L- 
ilma tat-ta ħlit jista' ji ġi arjat qabel ma jintu ża għat-test sabiex il- 
konċentrazzjoni ta' l-ossi ġnu mħallat tkun laq ħet is-saturazzjoni.  
Jekk jintu ża l-ilma naturali, il-parametri tal-kwalità g ħandhom 
jitkejlu g ħall-inqas darbtejn fis-sena jew kull meta huwa ssuspettat 
li dawn il-karatteristu ċi setgħu nbidlu b'mod sinjifikanti (ara l- 
paragrafu ta' qabel u l-Anness 1). Il-kejl tal-metalli tqal (e ż. Cu, 
Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) g ħandu jsir ukoll. Jekk jintu ża ilma tal-vit 
deklorinat, l-anali żi kuljum tal-klorin hija mixtieqa. JEkk l-ilma tat- 
taħlit huwa minn g ħajn ta' l-ilma fil-wi ċċ jew fl-art, g ħandhom 
jitkejlu l-konduttività u l-karbonu organiku totali (TOC) jew it- talba għall-ossiġnu kimiku (COD).
 
1.7.4  It-ta ħlitiet tat-test  
It-taħlitiet tat-test tal-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula normalment huma 
ppreparati bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni ta' stokk. Is-soluzzjonijiet ta' 
stokk preferibbilment g ħandhom ji ġu ppreparati billi s-sustanza tat- 
test tinħall fl-ilma tat-ta ħlit. Sa fejn huwa possibbli, l-u żu tas- 
solventi, l-emulsifikanti jew id-dispersanti g ħandu jiġi evitat. 
Madankollu, dawn il-komposti jistg ħu jkunu me ħtieġa f'xi każijiet 
sabiex tiġi prodotta soluzzjoni ta' stokk li hija kkon ċentrata kif 
xieraq. Il-gwida dwar solventi, emulsifikanti u d-dispersanti xierqa tingħata f' (4). Fi kwalunkwe ka ż is-sustanza tat-test fit-ta ħlitiet tat- 
test m'għandhiex te ċċedi l-limitu ta' solubbiltà fl-ilma tat-ta ħlita.
 
It-test għandu jsir ming ħajr l-aġġustament tal-pH. Jekk il-pH ma 
jibqax fil-firxa 6 – 9, imbag ħad jista' jsir test ie ħor, bl-aġġustament 
tal-pH tas-soluzzjoni ta' stokk skond dak ta' l-ilma tat-ta ħlit qabel ma 
tiżdied is-sustanza tat-test. L-a ġġustament tal-pH g ħandu jsir b'tali 
mod li l-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' stokk ma tinbidilx sa 
livell sinjifikanti u li ma ti ġi kkaużata ebda reazzjoni kimika jew 
preċipitazzjoni tas-sustanza tat-test. Huma ppreferuti HCl u NaOH.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8 IL-PRO ĊEDURA  
1.8.1.  Il-kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.8.1.1.  Il-gruppi tat-test u l-kontrolli  
Il-kontenituri tat-test jimtlew bil-volumi xierqa ta' l-ilma tat-ta ħlit u t- 
taħlitiet tas-sustanza tat-test. Il-proporzjon tal-volum ta' arja/ilma 
għandha tkun identika g ħall-grupp tat-test u tal-kontroll. Imbag ħad 
id-dafnidi jitqieg ħdu fil-kontenituri tat-test. G ħall-inqas 20 annimal, 
preferibbilment maqsuma f'erba' gruppi ta' ħames annimali kull 
wieħed, għandhom jintu żaw għal kull kon ċentrazzjoni tat-test 
(jiġifieri volum ta' 10 ml g ħal ħames dafnidi g ħal kull vettura tat- 
test). It-test jista' jsir bl-u żu ta' tiġdid semi-statiku jew sistema ta' 
flow-through meta l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test mhijiex 
stabbli.  
Serje ta' kontroll wa ħda ta' l-ilma ta' dilwizzjoni kif wkoll, jekk 
rilevanti, serje ta' kontroll wa ħda li fiha l-a ġent solubilizzanti 
għandhom isiru flimkien mas-serje tat-trattament.  
1.8.1.2  Il-kon ċentrazzjonijiet tat-test  
Jista' jsir test biex tinsab il-firxa sabiex ti ġi ddeterminata l-firxa ta' 
konċentrazzjonijiet g ħat-test definittiv kemm-il darba ma tkunx 
disponibbli l-informazzjoni dwar it-tossi ċità tas-sustanza tat-test. 
Għal dan l-g ħan, id-dafnidi huma esposti g ħal serje ta' kon ċen­
trazzjonijiet spazjati ħafna tas-sustanza tat-test. Ħames dafnidi 
għandhom ji ġu esposti g ħal kull kon ċentrazzjoni tat-test g ħal 48 
siegħa jew inqas, u ma huma ne ċessarji ebda replikati. Il-perjodu 
ta' espożizzjoni jista' jitqassar (e ż. 24 sieg ħa jew inqas) jekk id- 
data xierqa g ħall-għan tat-test biex tinsab il-firxa tista' tinkiseb 
f'inqas żmien.  
Għandhom jintu żaw għall-inqas ħames kon ċentrazzjonijiet tat-test. 
Għandhom ji ġu rranġati f'serje ġeometriċi b'fattur ta' separazzjoni li 
preferibbilment ma je ċċedix 2,2. G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni 
jekk jintu żaw inqas minn ħames kon ċentrazzjonijiet. L-og ħla konċ­
entrazzjoni ttestjata g ħandha preferibbilment tirri żulta fl-immobbiliz ­
zazzjoni ta' 100 fil-mija, u l-kon ċentrazzjoni l-aktar baxxa ttestjata 
għandha preferibbilment ma tag ħti ebda effett osservabbli.  
1.8.1.3.  Il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni  
It-temperatura g ħandha tkun bejn 18  o C u 22  o C, u għal kull test 
uniku għandha tkun kostanti sa ± 1  o C. Huwa rakkomandat ċiklu ta' 
16-il sieg ħa dawl u 8 sig ħat dlam. Huwa a ċċettabbli wkoll id-dlam 
totali, spe ċjalment g ħas-sustanzi tat-test li mhumiex stabbli fid-dawl. 
Il-kontenituri tat-test m'g ħandhomx ji ġu arjati matul it-test.  
It-test isir ming ħajr aġġustament tal-pH. Id-dafnidi m'g ħandhomx 
jiġu mitmug ħa matul it-test.  
1.8.1.4  Kemm idum it-test  
It-test idum 48 sieg ħa. 
1.8.2  Osservazzjonijiet  
Kull kontenitur tat-test g ħandu jiġi vverifikat g ħal dafnidi immobi ­
lizzati fl-24 u fit-24 sieg ħa wara l-bidu tat-test. (ara t-taqsima 1,2 
għad-definizzjonijiet). Minbarra l-immobilità, kwalunkwe m ġieba 
jew dehra mhux normali g ħandha tiġi rrapportata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Kejl analitiku  
L-ossiġnu imħallat u l-pH ji ġu mkejla fil-bidu u fl-a ħħar tat-test fil- 
kontroll(i) u fl-og ħla konċentrazzjoni tas-sustanza. Il-kon ċentrazzjoni 
ta' l-ossiġnu maħlul fil-kontrolli g ħandha tkun skond il-kriterji tal- 
validità (ara t-taqsima 1.6). Il-pH normalment m'g ħandux ivarja 
b'aktar minn 1.5 unitajiet fi kwalunkwe test. Normalment it- temperatura ti ġi mkejla fil-kontenituri tal-kontroll jew fl-arja ta' l- 
ambjent u preferibbilment g ħandha tiġi rreġistrata kontinwament 
matul it-test, jew, b ħala minimu, fil-bidu u fl-a ħħar tat-test.
 
Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test g ħandha tiġi mkejla mhux 
inqas minn fl-og ħla konċentrazzjoni tat-test u f'dik l-aktar baxxa, 
fil-bidu u fl-a ħħar tat-test (4). Huwa rakkomandat li r-ri żultati 
jkunu bba żati fuq kon ċentrazzjonijiet imkejla. I żda, jekk hemm 
provi li juru li l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test in żammet 
b'mod sodisfa ċenti bejn ± 20 % tal-kon ċentrazzjoni nominali jew 
tal-bidu matul it-test kollu, ir-ri żultati jistg ħu jkunu bba żati fuq 
valuri mkejla nominali jew tal-bidu.  
1.9 IT-TEST TAL-LIMITU  
Bl-użu tal-proċeduri deskritti f'dan il-Metodu, jista' jsir test tal-limitu 
b'100 mg/l sustanza tat-test jew sa l-limitu ta' solubbiltà tag ħha fil- 
mezz tat-test (dak li huwa l-aktar baxx fosthom) sabiex jintwera li l- 
EC 5O huwa akbar minn din il-kon ċentrazzjoni. It-test tal-limitu 
għandu jsir bl-u żu ta' 20 dafnida (preferibbilment maqsuma f'erba' 
gruppi ta' ħamsa), bl-istess numru fil- kontroll(i). Jekk isse ħħ 
immobilizzazzjoni, g ħandu jsir studju s ħiħ. Għandha tiġi rrekordjata 
kwalunkwe m ġieba osservata li mhijiex normali.  
2. DATA  
Id-data għandha tiġi mqassra f'forma tabulari, li turi g ħal kull grupp 
ta' trattament u l-kontroll, l-g ħadd ta' dafnidi u żati, l-immobiliz ­
zazzjoni f'kull osservazzjoni. Il-persenta ġġ immobbilizzati fl-24 
siegħa u fit-48 sieg ħa huma mpin ġija fuq djagramma kontra l-kon ċ­
entrazzjonijiet tat-test. Id-data hija analizzata permezz ta' metodi statistiċi xierqa. (e ż. analiżi probit , eċċ.) biex ji ġu kkalkolati l- 
gradjenti tal-kurvi ta' l-EC
 5O b'limiti ta' kunfidenza ta' 95 % (p = 
0,05) (7) (8).  
Fejn il-metodi standard biex jin ħadem l- EC  5O , ma jgħoddux għad- 
data miksuba, l-og ħla konċentrazzjoni li ma tikka ġuna ebda immo ­
bilità u l-kon ċentrazzjoni l-aktar baxxa li tipprodu ċi immobilità ta' 
100 % g ħandhom jintu żaw bħala approssimazzjoni g ħall- EC  5O 
(għaliex dan huwa l-medju ġeometriku ta' dawn i ż-żewġ konċen­
trazzjonijiet).  
3. L-IRRAPPORTAR  
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi g ħall-inqas din l-informazzjoni li 
ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u l-karatteristi ċi fiżiċi-kimiċi; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— data ta' l-identifikazzjoni kimika, inklu ża l-purità.  
L-ispeċje tat-test:  
— l-għajn u l-ispe ċje tad- Daphnia , min jipprovdi l-g ħajn (jekk 
magħruf) u l- kondizzjonijiet tal-kultura u żati (inklu ża l-għajn, 
it-tip u l-ammont ta' l-ikel, il-frekwenza ta' l-g ħalf). 
Il-kondizzjonijiet tat-test:  
— deskrizzjoni tal-kontenituri tat-test: tip ta' kontenituri, volum tat- 
taħlita, għadd ta' dafnidi g ħal kull kontenitur tat-test, g ħadd ta' 
kontenituri tat-test (replikati) g ħal kull kon ċentrazzjoni;  
— metodi ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' stokk u tat-test 
inkluż l-użu ta' kwalunkwe solvent jew dispersanti, il-kon ċen­
trazzjonijiet u żati; 
— dettalji ta' l-ilma tat-ta ħlit: il-karatteristi ċi tal-kwaliità ta' l-g ħajn u 
ta' l-ilma (pH, ebusija, proporzjon Ca/Mg, proporzjon Na/K, 
alkalinità, konduttività, e ċċ.); 
— il-kompo żizzjoni ta' l-ilma kkostitwit mill- ġdid jekk jintu ża; 
— il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni: it-temperatura, l-intensità u l- 
perjodiċità tad- dawl, l- ossi ġnu maħlul, il-pH, e ċċ. 
Riżultati:  
— l-għadd u l-persenta ġġ ta' dafnidi li ġew immobilizzati jew li 
wrew xi effetti avversi (inklu ża mġieba mhux normali) fil- 
kontrolli u f'kull grupp ta' trattament, f'kull ħin ta' osservazzjoni 
u deskrizzjoni tan-natura ta' l-effetti osservati;  
— ir-riżultati u d-data tat-test imwettaq bis-sustanza ta' riferenza, 
jekk disponibbli;  
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tat-test u r-ri żultat ta' l-anali żi 
kollha biex ti ġi ddeterminata s-sustanza tat-test fil-kontenituri 
tat-test; l-effi ċjenza ta' l-irkupru u l-limitu tad-determinazzjoni 
għandhom ukoll ji ġu rrapportati;  
— il-kejl kollu fi żiku-kimiku tat-temperatura, tal-pH u ta' l-ossi ġenu 
maħlul li sar matul it-test;  
— l-EC  5O fl-48 sieg ħa għall-immobbilizzazzjoni b'intervalli ta' 
kunfidenza u graffs tal-mudell u żat għall-kalkolu tag ħhom, l- 
angolatura tal-kurvi tad-do żi ta' rispons u l-i żball standard 
tagħhom; il-pro ċeduri statisti ċi użati għad-determinazzjoni ta' l- 
EC 5O ; (dawn l-elementi ta' data g ħall-immobbilizzazzjoni fl-24 
siegħa għandhom ji ġu rrapurtati wkoll meta jkunu tkejlu)  
— spjegazzjoni ta' kwalunkwe devjazzjoni mill-Metodu tat-Test u 
jekk id-devjazzjoni affetwatx ir-ri żultati tat-test.  
4. REFERENZI  
1. ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the 
inhibition of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
2. EPA OPPTS 850,1010. (1996). Ecological Effects Test 
Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, 
Freshwater Daphnids.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3. Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
4. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
 
5. Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter- laboratory Test Programme concerning the study 
of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia  
6. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
7. Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 -American Society 
for Testing and Materials. Pp65-84  
8. Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
L-ANNESS 1  
XI KARATTERISTI ĊI KIMI ĊI TA' ILMA TAT-TA ĦLIT 
AĊĊETTABBLI  
Sustanza Kon ċentrazzjoni  
Materja f'parti ċelli < 20 mg/l 
Karbonu organiku totali < 2 mg/l 
Ammonja ming ħajr ioni < 1 μg/l 
Klorin residwali < 10 μg/l 
Il-pestiċidji organofosfori totali < 50 ng/l 
Il-pestiċidji organofosfori totali flimkien ma'  polychlorinated 
biphenyls  < 50 ng/l 
Il-klorin organiku totali < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
L-ANNESS 2  
EŻEMPJI TA' IL-A TAT-TEST KOSTITWIT MILL- ĠDID XIERAQ  
Ilma tat-test ISO (1)  
Soluzzjonijiet ta’ stokk (sustanza wa ħda) Biex tipprepara l-ilma kkos ­
titwit mill- ġdid, żid dawn il- 
volumi li ġejjin ta’ ta ħlitiet tat- 
tifqisiet ma’ litru ilma (*) Susstanza Ammont mi żjud ma’ litru 
ilma (*)  
Calcium chloride 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Sulfat tal-manje żju 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Bikarnobat tas-sodju 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kloridu tal-potassju 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Ilma ta’ safa xierqa, e ż. deonizzat, distillat jew  reverse osmosis  b’kondottività li 
preferibbilment ma te ċċedix 10 μS.cm  -1 . 
Il-mezz Elendt M7 u M4  
L-Akklimazzjoni g ħall-mezz Elendt M4 u M7  
Xi laboratorji esperjenzaw diffikoltà biex jittrasferixxu direttament id-Daphnia 
għall-mezz M4 u M7. Madankollu, inkiseb xi su ċċess bl-akklimazzjoni 
gradwali, ji ġifieri li ji ċċaqalqu mill-mezz tag ħhom għal 30 % Elendt, 
u mbagħad għal 60 % Elendt u mbag ħad għal 100 % Elendt. Jista’ jkun li 
l-perjodi ta’ akklimazzjoni jkunu je ħtieġu li jkunu twal daqs xahar.  
Il-preparazzjoni  
Element tra ċċa 
Soluzzjonijiet ta’ stokk separati (I) ta’ elementi tra ċċi individwali huma l-ewwel 
ippreparati f’ilma ta’ safa xierqa, e ż. deonizzat, distillat jew  reverse osmosis . 
Minn dawn it-ta ħlitiet tat-tifqisiet differenti (I) ta ħlita tat-tifqisiet o ħra (II) tiġi 
ppreparata, li jkun fiha l-elementi tra ċċi kollha (soluzzjoni kkombinata), ji ġifieri:  
Taħlita/i tat-tifqisa I (sustanza 
waħda) Ammont mi żjud ma’ 
lima (mg/l) Konċentrazzjoni 
(relatata mal-mezz M4) Biex tipprepara s-soluzzjoni ta’ stokk kkombinata 
II, żid dan l-ammont li ġej ta’ soluzzjoni ta’ stokk 
I ma’ l-ilma (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000- darba 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000- darba 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000- darba 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Taħlita/i tat-tifqisa I (sustanza 
waħda) Ammont mi żjud ma’ 
lima (mg/l) Konċentrazzjoni 
(relatata mal-mezz M4) Biex tipprepara s-soluzzjoni ta’ stokk kkombinata 
II, żid dan l-ammont li ġej ta’ soluzzjoni ta’ stokk 
I ma’ l-ilma (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000- darba 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000- darba 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000- darba 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000- darba 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000- darba 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000- darba 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000- darba 1,0 1,0 
KI 65 20 000- darba 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000- darba 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000- darba 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000- darba — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000- darba — — 
Kemm it-ta ħlitiet Na 2 EDTA u FeSO  4 huma ppreparati wa ħdehom, imferrg ħin flimkien u awtoklavati mill-ewwel. 
Dan jagħti: 
Taħlita 2 l EDTA 1 000- darba 20,0 5,0  
Mezzi M4 u M7  
Il-mezzi M4 u M7 huma ppreparati bl-u żu tas-soluzzjoni ta’ stokk II, il-makro- 
nutrienti u l-vitamini kif ġej: 
Ammont mi żjud ma’ l- 
ima (mg/l) Konċentrazzjoni 
(relatata mal- mezz M4) Ammont ta’ soluzzjoni ta’ stokk II mi żjuda mal- 
mezz ippreparat (ml/l) 
M4 M7  
Soluzzjoni ta’ stokk II 
(elementi tra ċċi kkom­
binati) 20-darba 50 50 
Taħlitiet tat- tifqisa makro 
nutrienti (sustanza wa ħda) 
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800 1 000- darba 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000- darba 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000- darba 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000- darba 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000- darba 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000- darba 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000- darba 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000- darba 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Ammont mi żjud ma’ l- 
ima (mg/l) Konċentrazzjoni 
(relatata mal- mezz M4) Ammont ta’ soluzzjoni ta’ stokk II mi żjuda mal- 
mezz ippreparat (ml/l) 
M4 M7  
Taħlita ta’ vitamini kkom ­
binati — 10 000- darba 0,1 0,1 
It-taħlita ta’ vitamini kkombinati hija ppreparata bi ż- żjieda tat-3 vitamini ma’ litru ta’ ilma, kif jidher hawn ta ħt: 
Thiamine hydrochloride 750 10 000- darba 
Cyanocobalamine (B  12 ) 10 10 000- darba 
Biotine 7,5 10 000- darba  
It-taħlita tal-vitamini kkombinati ti ġi maħżuna ffriżata f’alikwoti żgħar. Il- 
vitamini ji żdiedu mal-mezz ftit qabel l-u żu. 
N.B: Biex ti ġi evitata l-pre ċipitazzjoni ta’ l-imlu ħ meta jiġu ppreparati il-mezzi 
kollha, żid l-aliquots  tat-taħlitiet tat-tifqisiet sa madwar 500 – 800 ml ilma 
deonizzat u mbag ħad imla sa litru.  
N.B: L-ewwel pubblikazzjoni tal-mezz M4 tista’ tinsab f’Elendt, B. P. (1990). 
Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal 
damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. ALKA TAL-ILMA ĦELU U ĊANOBATTERJI, TEST TA’ 
INIBIZZJONI TAT-TKABBIR  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalenti g ħall-OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1. INTRODUZZJONI  
Il-Metodi ta’ Ttestjar ji ġu perjodikament riveduti u a ġġornati fid- 
dawl tal-progress xjentifiku. Il-Metodu ta’ Ttestjar C.2 kellu b żonn 
jiġi rivedut sabiex jinkludi spe ċijiet addizzjonali u sabiex jil ħaq ir- 
rekwiżiti tal-valutazzjoni tal-periklu u l-klassifikazzjoni tal-kimiki. Ir- 
reviżjoni tlestiet fuq il-ba żi ta' esperjenza prattika estensiva, progress 
xjentifiku fil-qasam ta’ studji tat-tossi ċità tal-alka, u u żu regolatorju 
estensiv, li se ħħew minn żmien l-adozzjoni ori ġinali.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Id-definizzjonijiet u t-taqsiriet li ġejjin huma u żati għall-għanijiet ta’ 
dan il-Metodu ta’ Ttestjar:  
Bijomassa : hija l-pi ż niexef ta’ materja ħajja preżenti f’popolazzjoni 
espress f'termini ta' volum partikolari; e ż. mg alka/litru soluzzjoni tat- 
test. Is-soltu l-“bijomassa” hija mfissra b ħala massa, i żda f’dan it- 
test, din il-kelma hija u żata sabiex tirreferi g ħall-massa skont il- 
volum. Ukoll f’dan it-test, sostituti g ħall-bijomassa, b ħall-għadd ta’ 
ċelloli, fluworexxenza, e ċċ. huma imkejla tipikament u l-u żu tat- 
terminu “bijomassa” g ħalhekk jirreferi g ħal dan il-kejl ta’ sosti ­
tuzzjoni ukoll.  
Koeffiċjent ta’ varjazzjoni : huwa kejl bla dimensjoni tal-varjabbiltà 
ta’ parametru, imfisser b ħala l-proporzjon tad-devjazzjoni fissa g ħall- 
medja. Dan jista’ wkoll ji ġi espressa b ħala valur per ċentwali. Il- 
koeffiċjent medju ta’ varjazzjoni tar-rata spe ċifika medja ta’ 
tkabbir f’koltivazzjonijiet ta’ kontroll replikati g ħandha tiġi kkal­
kulata kif ġej: 
1. Ikkalkula % CV tar-rata medja spe ċifika ta’ tkabbir mir-rati tat- 
tkabbir ta' kuljum/sezzjoni b'sezzjoni g ħar-replika rispettiva.  
2. Ikkalkula l-valur medju tal-valuri kollha kkalkulati fil-punt 1 
sabiex tikseb il-koeffi ċjent medju tal-varjazzjoni tar-rata 
speċifika ta’ tkabbir ta’ kuljum/sezzjoni b’sezzjoni f’kolti ­
vazzjonijiet ta’ kontroll replikati. ECx:  
hija l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test li ti ġi tinħall fil- 
midjum tat-test li tirri żulta f’x % (e ż. 50 %) tnaqqis fit-tkabbir 
tal-organi żmu tat-test fi żmien ċertu perjodu ta’ esponiment (li 
għandu jissemma espli ċitament jekk ivarja mit-tul massimu jew 
normali tat-test). Sabiex issir denotazzjoni li ma hijiex ambigwa ta’ 
valur ta’ EC li jidderiva mir-rata ta’ tkabbir jew mill-prodott, is- simboli “E
 r C” u “E  y C” jiġu użati rispettivament.  
Midjum ta’ tkabbir : huwa l-midjum s ħiħ sintetiku ta’ koltivazzjoni 
li fih jikbru l-alka tat-test meta ji ġu esposti g ħas-sustanza tat-test. Is- 
sustanza tat-test ti ġi normalment ma ħlula fil-midjum tat-test.  
Rata ta' tkabbir (rata medja spe ċifika ta' tkabbir) : hija ż-żieda 
logaritmika fil-bijomassa matul il-perjodu ta’ esponiment.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
L-Anqas Effett ta’ Kon ċentrazzjoni Osservat (LOEC) : hija l-inqas 
konċentrazzjoni ttestjata fejn is-sustanza hija osservata li jkollha 
effett ta’ tnaqqis fuq it-tkabbir li huwa statistikament sinifikanti (f’p, 0.05) meta mqabbla mal-kontroll, matul ċertu perjodu ta’ 
esponiment. Madankollu, il-kon ċentrazzjonijiet kollha tat-test li 
jkunu ’l fuq mil-LOEC g ħandu jkollhom effett li jag ħmel il-ħsara 
daqs jew akbar minn dawk osservati f’LOEC. Meta dawn i ż-żewġ 
kundizzjonijiet ma jkunux jistg ħu jiġu sodisfatti, trid ting ħata spje­
gazzjoni dettaljata g ħal kif l-LOEC (u g ħalhekk l-NOEC) ġie 
magħżul.
 
L-Ebda Effett ta’ Kon ċentrazzjoni Osservat (NOEC) : huwa l- 
konċentrazzjoni tat-test immedjatament ta ħt l-LOEC.  
Varjabbli ta’ rispons : hija varjabbli ta’ stima ta’ tossi ċità li ġejja 
minn parametri mkejla li jiddeskrivu l-bijomassa b’metodi ta’ 
kalkolu differenti. G ħal dan il-metodu, rati ta’ tkabbir u prodott 
huma varjabbli ta’ rispons li ġejjin mill-kejl dirett tal-bijomassa 
jew wieħed mis-sostituti msemmija.  
Rata spe ċifika ta’ tkabbir : hija varjazzjoni ta’ rispons mfissra b ħala 
l-kwozjent tad-differenza tal-logaritmi naturali ta’ parametru ta’ 
osservazzjoni (f’dan il-Metodu ta' Ttestjar, il-bijomassa) u l-perjodu ta’ ħin rispettivi.
 
Prodott : huwa l-valur ta’ kejl li jvarja fl-a ħħar tal-perjodu ta’ 
esponiment bi tnaqqis tal-valur tal-kejl li jvarja fil-bidu tal-perjodu tal-esponiment sabiex jesprimi ż-żieda fil-bijomassa matul it-test.
 
1.3. APPLIKABILITÀ TAT-TEST  
Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa applikat l-aktar fa ċilment għal 
sustanzi li jin ħallu fl-ilma li, ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, x’aktarx 
jibqgħu fl-ilma. G ħall-ittestjar ta’ sustanzi li ma jibqg ħux fl-ilma, li 
jixterdu ħafna, kuluriti, li g ħandhom livell baxx ta' solubilità fl-ilma 
jew sustanzi li jistg ħu jaffettwaw d-disponibbilità tan-nutrijenti jew 
minerali fil-midjum tat-test, ċertu modifikazzjonijiet tal-pro ċedura 
deskritta jistg ħu jkunu rikjesti (e ż. sistema mag ħluqa, kundizzjonar 
tar-reċipjenti tat-test). Gwida dwar modifikazzjonijiet approprjati hija 
mogħtija f'(2), (3) u (4).  
1.4. PRIN ĊIPJU TAT-TEST.  
L-għan ta’ dan it-test huwa li ji ġi determinat l-effett ta’ sustanza fuq 
it-tkabbir ta’ alka mikroskopika tal-ilma ħelu u/jew ċanobatterji. 
Organiżmi tat-test li jikbru esponenzjalment huma esposti g ħas- 
sustanza tat-test fi grupp ta’ koltivazzjonijiet g ħal perjodu norm ­
alment ta' 72 sieg ħa. Minkejja ż-żmien relattivament qasir g ħat- 
twettiq tat-test, jistg ħu jiġu vvalutati effetti fuq diversi ġener­
azzjonijiet.  
Ir-rispons tas-sistema huwa n-nuqqas ta’ tkabbir f’serje ta’ kolti ­
vazzjonijiet ta’ alka (unitajiet tat-test) esposti g ħall-konċen­
trazzjonijiet varji ta' sustanza tat-test. Ir-rispons huwa vvalutat bħala funzjoni tal-kon ċentrazzjoni tal- esponiment mqabbla mat- 
tkabbir medju tar-replika, koltivazzjonijiet kontrollati li ma humiex 
esposti. G ħal espressjoni s ħiħa tar-rispons tas-sistema g ħal effetti 
tossiċi (sensittività ottima), il-koltivazzjonijiet jit ħallew jikbru 
b’mod li ma huwiex esponenzjalment ristrett ta ħt kundizzjonijiet 
ta’ nutrizzjoni suffi ċjenti u dawl kontinwu g ħal perjodu ta’ żmien 
suffiċjenti sabiex jitkejjel it-tnaqqis tar-rata spe ċifika ta' tkabbir.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
It-tkabbir u l-inibizzjoni ta’ tkabbir huma kkwantifikati minn kejl tal- 
bijomassa tal-alka b ħala funzjoni tal- ħin. Il-bijomassa tal-alka hija 
mfissra b ħala l-piż niexef skont il-volum, e ż. mg alka/litru tas- 
soluzzjoni tat-test. Huwa madankollu diffi ċli li jitkejjel il-pi ż niexef 
u għalhekk jintu żaw parametri ta’ sostituzzjoni. Minn dawn is- 
sostituti, kwantitajiet ta’ ċelloli jintu żaw l-aktar ta’ spiss. Parametri 
oħra ta’ sostituzzjoni jinkludu volum ta’ ċellola, fluworexxenza, 
densità ottika, e ċċ. Fattur ta’ konver żjoni bejn il-kejl tal-parametru 
ta’ surrogazzjoni u l-bijomassa g ħandu jkun mag ħruf. 
Il-konklużjoni tat-test hija l-inibizzjoni tat-tkabbir, espress b ħala ż- 
żieda logaritmika fil-bijomassa (rata medja ta’ tkabbir spe ċifika) 
matul il-perjodu ta’ esponiment. Mir-rata medja ta’ tkabbir 
speċifika reġistrata f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-kon ċentrazzjoni 
ġġib magħha x % spe ċifikat ta' rata ta' inibizzjoni ta’ tkabbir (e ż. 
50 %) determinata u espressa b ħala l-E  r C x (eż. E r C 50 ). 
Għall-applikazzjoni ta' dan il-metodu fi ħdan il-qafas regolatorju tal- 
UE, il-kalkolu tar-ri żultati għandu jkun ibba żat fuq medja ta' rata ta' 
tkabbir spe ċifika għar-raġunijiet deskritti fit-taqsima 2.2 hawn 
taħt. Rispons varjabbli addizzjonali u żat f’dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar huwa prodott, li jista’ jkun me ħtieġ sabiex jintla ħqu 
rekwiżiti regolatorji spe ċifiċi f’ċertu pajji żi. Hija mfissra b ħala 
bijomassa fl-a ħħar tal-perjodu ta’ esponiment li minnha tnaqqas il- 
bijomassa fil-bidu tal-perjodu ta’ esponiment. Mill-prodott re ġistrat 
f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-kon ċentrazzjoni ġġib magħha x % 
speċifikat ta' rata ta' inibizzjoni ta’ prodott (e ż. 50 %) determinata u 
espressa b ħala l-E  y C x (eż. E y C 50 ). 
Minbarra dan, l-anqas effett ta’ kon ċentrazzjoni u żat (LOEC) u l- 
ebda effett ta' kon ċentrazzjoni osservat (NOEC) jista' ji ġi ddeterminat 
statistikament.  
1.5. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Informazjoni fuq is-sustanza tat-test, li tista’ tkun me ħtieġa sabiex 
jiġu stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test, tinkludi l-formula strutturali, 
purità, stabbiltà fid-dawl, stabbiltà ta ħt il-kundizzjonijiet tat-test, 
proprjetajiet ta’ assorbiment ta’ dawl, pKa, u ri żultati ta’ studji ta’ 
trasformazzjoni li jinkludu bijodegradabilità fl-ilma.  
Is-solubilità fl-ilma, il-koeffi ċjent ta’qsim tal-ilma tal-octanol (P  ow ) u 
l-pressa tal-fwar tas-sustanza tat-test g ħandhom ikunu mag ħrufa, u 
metodu li ġie validat g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis- 
soluzzjonijiet tat-test b're ġistrazzjoni tal-effi ċjenza ta' rkupru u l- 
limitu tal-kixfa g ħandhom ikunu disponibbli.  
1.6. IS-SUSTANZA TA’ REFERENZA  
Is-sustanza(i) ta' referenza, b ħal 3,5-dichlorophenol u żata fit-test 
internazzjonali ta ċ-ċirku (4), tista ti ġi ittestjata b ħala midjum ta’ 
iċċekkjar tal-pro ċedura tat-test. Il-potassju tad-dichromate jista’ ji ġi 
wkoll użat bħala sustanza ta’ referenza g ħal alka ħadra. Huwa 
desiderabbli li sustanza ta’ referenza ti ġi ttestjata minn tal-inqas 
darbtejn f’sena.  
1.7. VALIDITÀ TAT-TEST.  
Sabiex it-test ikun validu, g ħandu jkun hemm konformità mal-kriterji 
ta’ eżekuzzjoni li ġejjin: ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Il-bijomassa fil-koltivazzjonijiet ta ħt kontroll g ħandha tkun 
żdiedet esponenzjalment b’fattur ta’ mill-anqas 16 matul il- 
perjodu tat-test ta' 72 sieg ħa. Din tikkorrispondi g ħal rata ta’ 
tkabbir spe ċifika ta’ 0.92 ġurnata  –1 . Għall-ispeċi użata l-aktar 
ta' spiss, ir-rata ta' tkabbir is-soltu hija sostanzjalment og ħla 
(ara l-Appendi ċi 1). Dan il-kriterju ma jistax jintla ħaq meta 
jiġu użati l-ispeċi li jikbru aktar bil-mod minn dawk imni żżla 
fl-Appendi ċi 1. F’dan il-ka ż, il-perjodu tat-test g ħandu jiġi estiż 
sabiex jinkiseb tkabbir tal-inqas ta’ 16-il darba f’koltivazzjonijiet 
taħt kontroll, fil-waqt li t-tkabbir g ħandu jkun esponenzjali matul 
il-perjodu tat-test. Il-perjodu tat-test jista’ ji ġi mnaqqas tal-inqas 
għall-48 sieg ħa sabiex jin żamm tkabbir esponenzjali illimitat 
matul it-test, sakemm il-fattur ta' multiplikazzjoni minimu ta' 
16 jintlaħaq. 
— Il-koeffi ċjent medju ta’ varjazzjoni g ħall-rati ta’ tkabbir spe ċifiċi 
sezzjoni b’sezzjoni ( ġurnata 0-1, 1-2 u 2-3, g ħal testijiet ta' 72 
siegħa) f'koltivazzjonijiet ta ħt kontroll (ara t-taqsima 1.2 ta ħt 
“koeffiċjent ta' varjazzjoni”) ma jistg ħux jeċċedu 35 %. Ara it- 
tieni paragrafu fit-taqsima 2.2.1 g ħall-kalkulazzjoni ta’ rata ta’ 
tkabbir spe ċifika sezzjoni b’sezzjoni. Dan il-kriterju japplika 
għall-valur medju ta’ koeffi ċjenti ta’ varjazzjoni kkalkulati 
għall-koltivazzjonijiet ta ħt kontroll li huma replikati.  
— Il-koeffi ċjent ta’ varjazzjoni ta’ rati medji ta’ tkabbir spe ċifiċi 
matul il-perjodu s ħiħ tat-test f’koltivazzjonijiet ta ħt kontroll li 
huma replikati ma jridx je ċċedi 7 % f’testijiet bil- Pseudokirch ­
neriella subcapitata  u Desmodesmus subspicatus . Għal speċi 
ittestjati b’mod inqas ta’ spiss, il-valur ma jistax je ċċedi l-10 %.  
1.8. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.8.1.  Apparat  
Reċipjenti tat-test u apparat ie ħor, li ser ji ġu f’kuntatt mas- 
soluzzjonijiet tat-test g ħandhom ikunu mag ħmula totalment minn 
ħġieġ jew materjal ie ħor li huwa kimikament inattiv. L-apparat 
għandu jiġi maħsul sewwa sabiex ji ġi żgurat li l-ebda kontaminanti 
organiċi jew inorgani ċi jistgħu jindaħlu fit-tkabbir tal-alka jew fil- 
kompożizzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test.  
Ir-reċipjenti tat-test normalment ikunu fliexken tal- ħġieġ ta’ dimens ­
jonijiet li j ħallu volum suffi ċjenti ta’ koltivazzjoni g ħall-kejl matul it- 
test u trasferiment suffi ċjenti ta’ massa ta’ CO  2 mill-atmosfera (ara t- 
tieni paragrafu fit-taqsima 1.8.9). Ta’ min jinnota li l-volum tal- likwidu jrid ikun suffi ċjenti għal determinazzjonijiet analiti ċi (ara l- 
ħames paragrafu fit-taqsima 1.8.11).
 
Barra minnn hekk, xi u ħud jew kull wie ħed mill-apparat hawn ta ħt 
imsemmi huma me ħtieġa: 
— Apparat ta’ culturing: gabinett jew kamra hija rakkomandata, fejn 
it-temperatura ta’ inkubazzjoni mag ħżula tista’ ti ġi miżmuma 
għal ± 2 °C.  
— Strumenti ta’ kejl ta’ dawl: huwa importanti li ji ġi nnotat li l- 
metodu ta’ kejl tal-intensità tad-dawl, u b’mod partikolari t-tip ta’ 
riċevitur (kollettur), ser jaffettwa l-valur imkejjel. Preferib ­
bilment, il-kejl g ħandu jiġi magħmul permezz ta' ri ċevitur 
sferiku (4 π) (li jirrispondi g ħal dawl dirett u rifless mill-angoli 
kollha fuq u ta ħt il-pjan ta’ kejl), jew ri ċevitur ta’ 2 π (li 
jirrispondi g ħal dawl mill-angoli kollha ‘l fuq mill-pjan ta’ kejl).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Apparat sabiex jiddetermina l-bijomassa tal-alka. L-g ħadd ta' 
ċelloli, li huwa l-parametru ta’ sostituzzjoni u żat l-aktar ta’ 
spiss għall-bijomassa tal-alka, jista’ ji ġi magħmul permezz tal- 
użu ta’ magna li tg ħodd il-parti ċelli elettroni ċi, mikroskopju 
b’kamra tal-g ħadd, jew cytometer ta’ fluss. Sostituti o ħra għall- 
bijomassa jistg ħu jiġu mkejla permezz ta’ cytometer ta’ fluss, 
fluorimeter, spectrophotometer jew colorimeter. Fattur ta’ konverżjoni li jaqleb l-g ħadd ta’ ċelloli f’pi ż niexef huwa ta’ 
għajnuna sabiex isiru l-kalkulazzjonijiet. Sabiex ji ġi pprovdut 
kejl li jkun ta’ u żu f’kunċentrazzjonijiet baxxi ta’ bijomassa 
meta jintu ża spectrophotometer, jista’ jkun ne ċessarju li 
jintużaw tubi trasparenti (cuvettes) b’passa ġġ ta’ dawl minn tal- 
inqas ta’ 4 ċm.
 
1.8.2.  Organi żmi tat-test.  
X’uħud mill-ispe ċi ta’ alka mikroskopika u ċanobatterji li ma humiex 
imwaħħla jistgħu jiġu użati. Ġie ppruvat permezz tal-pro ċedura tat- 
test speċifikata f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar li r-razez imni żżla fl- 
Appendiċi 1 huma adattati..  
Jekk speċi oħra jiġu użati, ir-razza u/jew l-ori ġini għandhom ji ġu 
rrappurtati. G ħandu jiġi kkonfermat li t-tkabbir esponenzjali tal- 
alka mag ħżula għat-test jista’ jin żamm matul il-perjodu tat-test ta ħt 
il-kundizzjonijiet prevalenti.  
1.8.3.  Midjum ta’ tkabbir  
Żewġ midja alternattivi ta’ tkabbir, l-midja OECD u AAP, huma 
rakkomandati. Il-kompo żizzjoni ta’ dawn il-midja tidher fl- 
Appendiċi 2. Ta’ min jinnota li l-valur tal-pH inizjali u l-kapa ċita 
li tnaqqas l-impatt (tirregola ż-żieda ta’ pH) ta ż-żewġ midja huma 
differenti. G ħalhekk ir-ri żultati tat-testijiet jistg ħu jkunu differenti 
skont il-midjum u żat, partikolarment meta sustanzi li jonizzaw ji ġu 
ttestjati.  
Modifikazzjonijiet tal-midja ta’ tkabbir jistg ħu jkunu me ħtieġa għal 
ċertu għanijiet, eż. meta jiġu ttestjati metalli u chelating agents jew 
ittestjar g ħal valuri differenti ta’ pH. U żu ta’ midjum modifikat irid 
ikun deskritt f’dettal u ġustifikat (3)(4).  
1.8.4.  Kon ċentrazzjoni ta’ bijomassa inizjali  
Il-bijomassa inizjali f’koltivazzjonijiet tat-test g ħandha tkun l-istess 
fil-koltivazzjonijiet tat-test kollha u suffi ċjentement baxxa sabiex 
jitħalla tkabbir esponenzjali matul il-perjodu ta’ inkubazzjoni 
mingħajr riskju li jispi ċċaw in-nutrijenti. Il-bijomassa ori ġinali ma 
għandiex te ċċedi 0.5 mg/l b ħala piż niexef. Il-kon ċentrazzjonijiet 
ta’ ċelloli li ġejjin huma rakkomandati:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 x 10  3 -10 4 ċelloli/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 x 10  3 ċelloli/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 ċelloli/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 ċelloli/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 x 10  4 -10 5 ċelloli/ml  
1.8.5.  Kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test  
L-isfera ta’ kon ċentrazzjoni fejn l-effetti x’aktarx ji ġru tista’ ti ġi 
determinata fuq il-ba żi ta’ riżultati minn testijiet sabiex tinstab l- 
imsemmija sfera. G ħat-test finali definittiv, mill-inqas ħames kon ċen­
trazzjonijiet arran ġati f’serje ġeometrika b’fattur li ma je ċċedix 3.2 
għandu jing ħażel. Għal sustanzi tat-test li juru kurva ċatta ta’ rispons 
għal konċentrazzjoni, fattur og ħla jista’ jkun ġustifikat. Is-serjiet ta’ 
konċentrazzjoni g ħandhom preferibbilment jestendu fuq il-klassi li 
jikkawżaw rata ta’ inibizzjoni ta’ tkabbir ta’ alka ta’ 5-75 %.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Repliki u kontrolli  
Id-disinn tat-test g ħandu jinkludi tliet repliki f’kull kon ċentrazzjoni 
tat-test. Jekk id-determinazzjoni tan-NOEC ma huwiex me ħtieġ, id- 
disinn tat-test jista’ ji ġi mibdul sabiex ji żdiedu l-g ħadd ta’ kon ċen­
trazzjonijiet u jonqsu l-g ħadd ta’ repliki g ħal kull kon ċentrazzjoni. L- 
għadd ta’ repliki ta’ kontroll irid ikun minn tal-inqas tlieta, u 
idealment g ħandu jkun darbtejn l-g ħadd ta’ repliki u żati għal kull 
konċentrazzjoni tat-test.  
Sett separat ta’ soluzzjonijiet tat-test jista’ ji ġi ppreparat g ħal deter­
minazzjonijiet analiti ċi tal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test 
(ara r-raba’ u s-sitt paragrafi f’sezzjon 1.8.11).  
Meta materjal li j ħoll huwa u żat sabiex i ħoll is-sustanza tat-test, 
kontrolli addizzjonali li jikkontjenu l-materjal li j ħoll fl-istess kon ċ­
entrazzjoni b ħal dik użata fil-koltivazzjonijiet tat-test trid ti ġi inkluża 
fid-disinn tat-test.  
1.8.7.  Preparazzjoni ta’ koltivazzjoni mlaqqma  
Sabiex l-alka tat-test ti ġi adattata g ħall-kundizzjonijiet tat-test u ji ġi 
żgurat illi l-alke huma fil-fa żi ta' tkabbir esponenzjali meta u żati 
sabiex tinnokula s-soluzjonijiet tat-test, koltivazzjoni mlaqqma fil- 
midjum tat-test hija ippreparata 2-4 ijiem qabel il-bidu tat-test. Il- bijomassa tal-alka g ħandha tiġi irranġata sabiex t ħalli t-tkabbir espo ­
nenzjali jipprevali fil-koltivazzjoni mlaqqma sakemm it-test jibda. Il- 
koltivazzjoni mlaqqma g ħandha ti ġi inkubata ta ħt l-istess 
kundizzjonijiet tal-koltivazzjonijiet tat-test. Kejjel i ż-żieda tal- 
bijomassa fil-koltivazzjoni mlaqqma sabiex ti żgura li t-tkabbir 
huwa ġewwa l-portata normali g ħar-razza tat-test ta ħt kundizzjonijiet 
ta’ culturing. E żempju tal-pro ċedura għal culturing tal-alka huwa 
deskritt fl-Appendi ċi 3. Sabiex ji ġu evitati divi żjonijiet ta’ ċelloli 
sinkroniċi matul it-test, it-tieni pass ta’ propagazzjoni tal-kolti ­
vazzjoni mlaqqma jista’ jkun me ħtieġ.
 
1.8.8.  Preparazzjonijiet tas-soluzzjonijiet tat-test  
Is-soluzzjonijiet tat-test kollha jridu jikkontjenu l-istess kon ċen­
trazzjonijiet ta’ midjum ta’ tkabbir u bijomassa inizjali tal-alke tat- test. Soluzzjonijiet tat-test tal-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula soli­
tament huma ppreparati billi tit ħawwad soluzzjoni ta’ stock tas- 
sustanza tat-test mal-midjum ta’ tkabbir u koltivazzjoni mlaqqma. Soluzzjonijiet ta’ stock huma normalment ippreparati billi s- sustanza ti ġi maħlula fil-midjum tat-test.
 
Materjali li j ħollu, eż. acetone, alco ħol t-butyl u dimethyl formamide, 
jistgħu jiġu użati bħala reffieg ħa sabiex i żidu sustanzi li ma tantx 
jinħallu fl-ilma mal-midjum tat-test (2)(3). Il-kon ċentrazzjoni ta’ 
solventi ma g ħandhiex te ċcedi 100 μl/l, u l-istess kon ċentrazzjoni 
ta' solventi g ħandha tiġi miżjuda mal-koltivazzjonijiet kollha (li 
jinkludi l-kontrolli) fis-serjiet tat-test.  
1.8.9.  Inkubazzjoni  
Ir-reċipjenti tat-test g ħandhom jitg ħattew b’tap li tg ħaddi minnu l- 
arja. Ir-re ċipjenti jiġu mħawwda u mqieg ħda f’apparat ta’ culturing. 
Matul it-test huwa me ħtieġ li l-alke jin żammu f’sospensjoni u sabiex 
tiffaċilita trasferiment ta’ CO  2 . Għal dan il-g ħan, għandu jintu ża 
ċaqliq u ta ħwid kostanti. Il-koltivazzjonijiet g ħandhom ji ġu 
miżmuma b’temperatura fl-isfera ta’ 21 sa 24 °C, ikkontrollati b’ 
± 2 °C. G ħal speċi oħra minbarra dawk imni żżla fl-Appendi ċi 1, 
eż. speċi tropikali, temperaturi og ħla jistgħu jkunu xierqa, jekk il- 
kriterju ta’ validità jista’ jkun mil ħuq. Huwa rakkomandat li l- 
fliexken jitpo ġġew kif ġie ġie u li jer ġgħu jitpoġġew ta’ kuljum fl- 
inkubatur.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Il-pH tal-midjum ta’ kontroll ma g ħandux jiżdied b’aktar minn 1.5 
unità matul it-test. G ħal metalli u komposti li jonizzaw parzjalment 
b’pH madwar il-pH tat-test, jista’ jkun me ħtieġ li d-differenza fil-pH 
tiġi limitata sabiex jinkisbu ri żultati reprodu ċibbli u mfissra sew. 
Differenza ta’ < 0.5 pH unità hija teknikament fattibbli u tista’ ti ġi 
miksuba billi ti ġi żgurata rata ta’ trasferiment ta’ massa ta’ CO  2 
adegwata mill-arja tal-madwar tas-soluzzjoni tat-test, e ż. billi 
tiżdied ir-rata ta ċ-ċaqlieq. Possibilità o ħra hija li titnaqqas id- 
domanda g ħal CO  2 billi titnaqqas il-bijomassa tal-bidu jew it-tul 
tat-test.  
Il-wiċċ fejn il-koltivazzjonijiet huma inkubati g ħandu jirċievi illumi ­
nazzjoni fluworexxenti kontinwa u uniformi e ż. ta’ dawl tat-tip 
“cool-white” jew “daylight”. Razez ta’ alke u ċanobatterji jvarjaw 
fir-rekwiżiti tagħhom ta’ dawl. L-intensità tad-dawl g ħandha 
tintgħażel sabiex taqbel mal-organi żmu tat-test li jintu ża. Għall- 
ispeċi rakkomandata ta’ alka ħadra, l-intensità tad-dawl fil-livell 
tas-soluzzjonijiet tat-test g ħandha tintg ħażel mill-isfera ta’ 60- 
120 μE·m  –2 ·s –1 meta mkejla fl-isfera ta’ frekwenza effettiva fotosin ­
tetikament ta’ 400-700 nm meta jintu ża riċevitur xieraq. G ħadd ta' 
speċi, b’mod partikolari  Anabaena flos-aquae , jikbru sewwa f’inqas 
intensitajiet ta’ dawl u jistg ħu jġarrbu ħsarat f’intensitajiet g ħolja. 
Għal dawn l-ispe ċi għandha tintg ħażel intensità ta’ dawl medja fl- 
isfera ta’ 40-60 μE·m  –2 ·s –1 . (Għal għodod li jkejjlu d-dawl kalibrati 
f’lux, gamma ekwivalenti ta’ 4 440-8 880 lux g ħal dawl cool white 
tikkorrispondi approssimattivament g ħall-intensità ta’ dawl rakkom ­
andata ta' 60-120 μE·m  –2 ·s –1 ). L-intensità ta’ dawl ma g ħandiex 
tvarja aktar minn ± 15 % mill-intensità ta’ dawl medja fuq l-arja ta’ inkubazzjoni.
 
1.8.10.  Dewmien tat-test  
Id-dewmien tat-test normalment huwa ta' 72 sieg ħa. Però, żminijiet 
tat-test itwal jew iqsar jistg ħu jiġu użati, dejjem jekk il-kriterji ta’ 
validità fit-taqsima 1.7 jistg ħu jintlaħqu. 
1.8.11.  Kejl u determinazzjonijiet analiti ċi 
Il-bijomassa tal-alka f’kull flixkun hija determinata tal-inqas ta’ 
kuljum matul il-perjodu tat-test. Jekk il-kejl huwa mag ħmul fuq 
volumi żgħar imneħħija mis-soluzzjoni tat-test permezz tal-pipetta, 
dawn ma g ħandhomx jinbidlu.  
Kejl tal-bijomassa huwa mag ħmul bil-g ħadd manwali ta ċ-ċelloli 
permezz ta’ mikroskopju jew apparat elettroniku li jg ħodd il- 
partiċelli (permezz ta’ g ħadd ta’ ċelloli/jew bijovolum). Teknikajiet 
alternattivi, e ż. fluss ta’ cytometry, fluworexxenza in vitro jew in 
vivo chlorophyll 6)(7), jew densità ottika jistg ħu jintużaw jekk korre ­
lazzjoni li tag ħti sodisfazzjon mal-bijomassa tista’ ti ġi ppruvata fuq l- 
isfera tal-bijomassa li ti ġri fit-test.  
Il-pH tas-soluzzjonijiet g ħandu jiġi mkejjel fil-bidu u fl-a ħħar tat-test.  
Jekk il-pro ċedura analitika g ħad-determinazzjoni tas-sustanza tat-test 
fl-isfera ta’ kon ċentrazzjoni u żata hija disponibbli, is-soluzzjonijiet 
tat-test għandhom ji ġu analizzati sabiex il-kon ċentrazzjonijiet inizjali 
u ż-żamma tal-kon ċentrazzjonijiet esposti matul it-test ji ġu 
vverifikati.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Analiżi tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-bidu u fl-a ħħar tat- 
test tat-test ta’ kon ċentrazzjoni g ħolja u baxxa, u kon ċentrazzjoni 
madwar il-mistennija EC  50 tista' tkun suffi ċjenti fejn x’aktarx il- 
konċentrazzjonijiet esposti jvarjaw inqas minn 20 % mill-valuri 
nominali matul it-test. Anali żi tal-konċentrazzjonijiet kollha tat-test 
fil-bidu u fl-a ħħar tat-test hija rakkomandata fejn kon ċentrazzjonijiet 
x’aktarx ma jibqg ħux fil-80-120 % ta’ nominali. G ħal sustanzi tat- 
test li huma volatili, instabbli jew li jitferrxu ħafna, ikkampjunar 
addizzjonali g ħal analiżi b’intervalli ta’ 24 sieg ħa matul il-perjodu 
ta’ esponiment huwa rakkomandat sabiex ji ġi mfisser a ħjar it-telf tas- 
sustanza tat-test. G ħal dawn is-sustanzi, repliki żejda jkunu me ħtieġa. 
F’kull ka ż, determinazzjoni tal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test 
hemm bżonnha biss fi flixkun replikat f’kull kon ċentrazzjoni tat- 
test (jew fuq il-kontenut tal-fliexken mi ġjuba mir-replika).  
Midja tat-test ippreparati spe ċifikatament g ħall-analiżi ta’ kon ċen­
trazzjonijiet esposi matul it-test g ħandhom ji ġu ittrattati b’mod 
identiku g ħal dawk u żati sabiex isiru t-testijiet, i.e. g ħandhom ji ġu 
mlaqqmin b’alke u inkubati ta ħt kundizzjonijiet identi ċi. Jekk anali żi 
tal-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma ħlula hija me ħtieġa, jista’ 
jkun neċessarju li l-alke ji ġu sseparati minn mal-midjum. Separ ­
azzjoni g ħandha preferibbilment tkun mag ħmula permezz ta’ 
ċentrifugazzjoni b’g-force baxxa, suffi ċjenti sabiex tissettja l-alke.  
Jekk hemm evidenza li l-kon ċentrazzjoni tas-sustanzi li jkunu 
ittestjati ġiet miżmuma, b’mod sodisfa ċenti, f’± 20 % tal-kon ċen­
trazzjoni nominali jew imkejla inizjalment, matul it-test, anali żi tar- 
riżultati tista’ tkun ba żata fuq valuri inizjali jew imkejla inizjalment. 
Jekk id-devjazzjoni mill-kon ċentrazzjoni nominali jew imkejla iniz ­
jalment hija akbar minn ± 20 %, anali żi tar-riżultati għandha tkun 
bażata fuq medja ġeometrika matul l-esponiment jew fuq mudelli li 
jiddeskrivu n-nuqqas tal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test (3)(8).  
It-test ta’ inibizzjoni ta’ tkabbir ta’ alka hija sistema iktar dinamika 
ta’ ttestjar minn ħafna testijiet ta’ tossi ċità tal-ilma ta’ żmien qasir. 
Bħala konsegwenza, il-kon ċentrazzjonijiet attwalment esposti jistg ħu 
jkunu diffi ċli sabiex ji ġu mfissra, spe ċjalment g ħas-sustanzi li 
jinfirxu li ji ġu ttestjati f’kon ċentrazzjonijiet baxxi. F’dawn il- 
każijiet, jekk is-sustanza ma tibqax tidher mis-soluzzjoni permezz 
ta’ tifrix g ħal bijomassa tal-alka li dejjem ti żdied ma tfissirx li hija 
mitlufa mis-sistema tat-test. Meta r-ri żultat tat-test ji ġi analizzat, 
għandu jigi ċcekkjat jekk nuqqas fil-kon ċentrazzjoni tas-sustanza 
tat-test matul it-test huwa akkumpanjat min-nuqqas f’inibizzjoni ta’ 
tkabbir. Jekk dan huwa l-ka ż, applikazzjoni ta’ mudell xieraq li 
jiddeskrivi n-nuqqas ta’ kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test (8) 
jista’ jiġi kkunsidrat. Jekk le, jista’ jkun xieraq li l-anali żi tar- 
riżultati tista’ ti ġi bbażata fuq il-kon ċentrazzjonijiet inizjali 
(nominali jew imkejla).  
1.8.12.  Osservazzjonijiet o ħra 
Osservazzjoni mikroskopika g ħandha tiġi magħmula sabiex ti ġi 
vverifikata apparenza normali u f’sa ħħitha tal-koltivazzjoni 
mlaqqma u sabiex ti ġi osservata xi apparenza anormali tal-alke (kif 
tista’ tiġi kkawżata permezz ta’ esponiment g ħas-sustanza tat-test) fl- 
aħħar tat-test.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Test tal-limitu  
Taħt ċerti ċirkostanzi, e ż. meta test preliminari jindika li s-sustanza 
tat-test ma g ħandhiex effetti tossi ċi f'konċentrazzjionijiet sa 
100 mg·l  –1 jew sal-limitu li tin ħall fil-midjum tat-test (liema 
wieħed huwa l-anqas), test ta’ limitu li jinvolvi paragun ta’ risposti 
fi grupp ta’ kontroll u grupp wie ħed ta’ trattament (100 mg·l  –1 jew 
konċentrazzjoni li taqbel mal-limitu ta’ solubilità), jista’ jsir. Huwa 
rakkomandat ħafna li dan g ħandu jkun imsa ħħaħ b’analiżi tal-konċ­
entrazzjoni ta’ esponiment. Il-kundizzjonijiet tat-test kollha deskritti 
qabel u l-kriterji ta’ validità japplikaw g ħal test ta’ limitu, bl- 
eċċezzjoni li l-g ħadd ta’ repliki ta’ trattament irid ikun minn tal- 
inqas sitta. Ir-risposti varjabbli fil-grupp ta’ kontroll u ta’ trattament 
jiġu analizzati permezz tat-test statistiku sabiex ji ġu pparagunati 
medji, eż. Student’s t-test. Jekk varjazzjonijiet ta’ żewġ gruppi ma 
humiex l-istess, g ħandu jsir it-test irran ġat għal varjazzjonijiet li ma 
humiex egwali.  
1.8.14.  Modifika g ħal sustanzi b'kulur qawwi  
L-irradjazzjoni (l-intensità tad-dawl) g ħandha tkun qrib l-og ħla limitu 
tal-firxa stabbilita f'dan il-Metodu ta' Ttestjar: 120 μE m  -2 s-1  jew 
ogħla. 
Il-linja tad-dawl g ħandha titqassar billi jitnaqqas il-volum tas- 
soluzzjonijiet tat-test (fil-firxa ta' 5-25 ml).  
Għandu jitwettaq ċaqliq suffi ċjenti (pere żempju billi wie ħed 
iħawwad b'mod moderat) sabiex tintla ħaq frekwenza g ħolja ta' 
esponiment tal-alka g ħal irradjazzjoni g ħolja fis-superfi ċje tal- 
kultura.  
2. DEJTA  
2.1. PLOTTJAR TA’ KURVI TA’ TKABBIR  
Il-bijomassa fir-ri ċipjenti tat-test tista’ ti ġi espressa f’unità tal- 
parametru tas-sostituzzjoni u żata għall-kejl (e ż. L-għadd ta’ ċelloli, 
il-fluworexxenza).  
Qassam f’forma tabulari l-kon ċentrazzjoni stmata tal-bijomassa f’kol ­
tivazzjonijiet tat-test u kontroll flimkien mal-kon ċentrazzjonijiet tal- 
materjal tat-test u l- ħinijiet tal-kejl, re ġistrati b’ri żoluzzjoni minn tal- 
inqas sieg ħat sħaħ, sabiex tipprodu ċi plottijiet ta’ kurvi ta’ tkabbir. 
Kemm skali logaritmi ċi u skali lineari jistg ħu jkunu b żonnjuża f’dan 
l-istadju, imma skali logaritmi ċi huma obbligatorji u ġeneralment 
jagħtu preżentazzjoni a ħjar ta’ varjazzjonijiet fil-mudell ta’ tkabbir 
matul il-perjodu tat-test. Ta’ min jinnota li t-tkabbir esponenzjali jipproduċi linja dritta meta pplottjat fuq skala logaritmika, u li l- 
inklinazzjoni tal-linja (ni żla) tindika r-rata spe ċifika ta’ tkabbir.
 
Permezz tal-plots, e żamina jekk il-koltivazzjonijiet ta' kontroll 
jikbrux esponenzjalment bir-rata mistennija matul it-test. E żamina, 
b’mod kritiku l-punti kollha tad-dejta u l-apparenza tal-graffs, u ċċekkja d-dejta ori ġinali u l-pro ċeduri għal żbalji possibbli. 
Iċċekkja b’mod partikolari kwalunkwe punt dwar dejta li tidher li 
tiddevja bi żball sistematiku. Jekk huwa ovvju li żbalji proċedurali 
jistgħu jiġu identifikati u/jew ikkunsidrati probabbli, il-punt tad-dejta 
speċifiku jiġi mmarkat b ħala iżolat u ma huwiex inklu ż f’analiżi 
statistika sussegwenti. (Kon ċentrazzjoni ta’ alka ta’ żero f’wie ħed 
minn tnejn jew tliet re ċipjenti replikati jistg ħu jindikaw li r- 
reċipjent ma ġiex mlaqqam kif suppost, jew ma kienx imnaddaf 
b’mod xieraq. Ra ġunijiet għal ċaħda ta' punt ta' dejta b ħala iżolat 
iridu jiġu mniżżla b’mod ċar fir-rapport tat-test. Ra ġunijiet aċċettati 
huma biss (rari) żbalji proċedurali u mhux sempli ċement pre ċiżjoni 
ħażina. Pro
ċeduri ta’ statisti ċi għall-identifikazzjoni ta’ punti i żolati 
huma ta’ u żu limitat f’dan it-tip ta’ problema u ma jistg ħux jissos­
titwixxu ġudizzju ta’ espert. Punti i żolati (immarkati b ħala tali) 
għandhom preferibbilment jin żammu qalb il-punti tad-dejta fi 
kwalunkwe pre żentazzjoni sussegwenti ta’ dejta grafika jew tabulari.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. VARJABBLI TA’ RISPONS  
L-għan tat-test huwa li ji ġu ddeterminati l-effetti tas-sustanza tat-test 
fuq it-tkabbir tal-alke. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar jiddeskrivi żewġ 
varjabbli ta’ rispons, g ħax pajjiżi membri g ħandhom preferenzi u 
bżonnijiet regolatorji differenti. Sabiex ir-ri żultati tat-test ikunu 
applikabbli fil-pajji żi membri kollha, l-effetti g ħandhom ji ġu 
evalwati billi jintu żaw iż-żewġ varjabbli ta’ rispons (a) u (b) 
deskritti hawn ta ħt. 
(a) Rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku: dan il-varjabbli ta’ rispons 
huwa kkalkulat fuq il-ba żi taż-żieda logaritmika tal-bijomassa 
matul il-perjodu tat-test, espress bil- ġurnata.  
(b) Prodott: dan il-varjabbli ta’ rispons hija l-bijomassa fl-a ħħar tat- 
test b’nuqqas tal-bijomassa inizjali.  
Għall-applikazzjoni ta' dan il-metodu fi ħdan il-qafas regolatorju tal- 
UE, il-kalkolu tar-ri żultati għandu jkun ibba żat fuq medja ta' rata ta' 
tkabbir spe ċifika għar-raġunijiet deskritti hawn ta ħt. Għandu jiġi 
nnutat li valuri ta’ tossi ċità kkalkulati billi jintu żaw dawn i ż-żewġ 
varjabbli ta’ rispons ma humiex paragunabbli u din id-differenza trid tiġi rikonoxxuta meta jintu żaw ir-riżultati tat-test. Valuri EC
 x ibbażati 
fuq rata medja ta’ tkabbir spe ċifika (E  r C x ) ġeneralment ikunu og ħla 
mir-riżultati bba żati fuq prodott (E  y C x ) jekk il-kundizzjonijiet tat-test 
ta’ dan il-Metodu tat-test ji ġu osservati, min ħabba l-ba żi matematika 
tal-approċċi rispettivi. Dan ma g ħandux ji ġi interpretat b ħala 
differenza fis-sensittività bejn i ż-żewġ varjabbli ta’ rispons, imma 
sempliċement li l-valuri huma differenti matematikament. Il-kun ċett 
ta’ rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku hija ba żata fuq il-mudell ġenerali 
ta’ tkabbir esponenzjali ta’ alke f’koltivazzjonijiet mhux limitati, fejn 
it-tossiċità hija stmata fuq il-ba żi tal-effetti tar-rata ta’ tkabbir, 
mingħajr ma hija dipendenti fuq il-livell assolut tar-rata spe ċifika 
ta’ tkabbir tal-kontroll, fuq in-ni żla tal-kurva tal-kon ċentrazzjoni- 
rispons jew fuq id-dewmien tat-test. B’kuntrast, ri żultati bażati fuq 
ir-rispons varjabbli tal-prodott huma dipendenti fuq dawn il-varjabbli l-oħra. E
 y C x huwa dipendenti fuq ir-rata spe ċifika ta' tkabbir tal- 
ispeċi ta' alka u żata fit-test u fuq ir-rata massima ta’ tkabbir 
speċifiku li tista’ tvarja bejn spe ċijiet u kif ukoll bejn razez differenti 
ta’ alka. Dan il-varjabbli ta’ rispons ma g ħandux jiġi użat sabiex 
jipparaguna s-sensittività mat-tossi ċi qalb l-ispe ċi ta’ alka jew kif 
ukoll razez differenti. Fil-waqt li l-u żu ta’ rata medja ta’ tkabbir 
speċifiku sabiex ti ġi stmata t-tossi ċità huwa xjentifikament ippreferut, 
stimi ta’ tossi ċità bażati fuq prodott huma inklu żi wkoll f’dan il- 
Metodu tat-test sabiex ji ġu sodisfatti rekwi żiti regolatorji tal- 
mument f’ ċertu pajjiżi. 
2.2.1.  Rata medja ta’ tkabbir  
Ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku għal perjodu spe ċifiku hija kkal ­
kulata bħala ż-żieda logaritmika fil-bijomassa mill-ekwazjoni g ħal 
kull reċipjent singolu ta’ kontrolli u trattamenti:  
μ iÄj ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (ġurnata  –1 ) 
fejn: 
μ i-j : hija r-rata medja spe ċifika ta’ tkabbir minn ħin i sa j; 
X i : hija l-bijomassa fil- ħin i; 
X j : hija l-bijomassa fil- ħin j; ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Għal kull grupp ta’ trattament u grupp ta’ kontroll, ikkalkula valur 
medju għar-rata ta’ tkabbir flimkien mal-istimi ta’ varjazzjoni.  
Ikkalkula rata medja spe ċifika ta’ tkabbir fuq id-dewmien tat-test 
kollu (normalment ġranet 0-3), permezz ta’ u żu ta’ bijomassa 
mlaqqma b ħala l-valur tal-bidu minflok valur imkejjel tal-bidu, 
għax b’dan il-mod normalement tinkiseb pre ċiżjoni akbar. Jekk l- 
apparat u żat għal kejl tal-bijomassa j ħalli determinazzjoni bi żżejjed 
preċiża tal-bijomassa mlaqqma baxxa (e ż. cytometer ta’ fluss) allura 
l-konċentrazzjoni tal-bijomassa mkejla fil-bidu tista’ ti ġi użata. 
Ivvaluta wkoll ir-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni, ikkalkulati 
bħala r-rati ta’ tkabbir spe ċifiku f’kull ġurnata matul il-kors tat-test 
(ġranet 0-1, 1-2 u 2-3) u e żamina jekk ir-rata ta’ kontroll ta’ tkabbir 
tibqax kostanti (ara l-kriterji ta’ validità, sezzjon 1.7). Rata ta’ 
tkabbir spe ċifiku sinjifikatament aktar baxxa fl-ewwel ġurnata mir- 
rata medja totali ta' tkabbir spe ċifiku tista' tindika fa żi ta' dewmien. 
Fil-waqt li fa żi ta’ dewmien tista’ ti ġi minimizzata u prattikament 
eliminata f’koltivazzjonijiet ta' kontroll permezz ta’ propagazzjoni 
xierqa tal-prikoltivazzjoni, fa żi ta’ dewmien f’koltivazzjonijiet 
esposti tista’ tindika rkupru wara stress tossiku inizjali jew esponiment mnaqqsa min ħabba telf tas-sustanza tat-test (li tinkludi 
assorbiment fil-bijomassa tal-alka) wara esponiment inizjali. 
Għalhekk ir-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni tista’ ti ġi assessjata 
sabiex jiġu vvalutati l-effetti tas-sustanza tat-test li ji ġru matul il- 
perjodu ta’ esponiment. Differenzi sostanzjali bejn r-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni u r-rata medja ta’ tkabbir jindikaw devjazzjoni 
minn tkabbir esponenzjali kostanti u li e żaminazzjoni mill-qrib tal- 
kurvi ta’ tkabbir hija me ħtieġa.
 
Ikkalkula l-persenta ġġ ta’ inibizzjoni tar-rata ta’ tkabbir g ħal kull 
replika ta’ trattament mill-ekwazjoni:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
fejn: 
%I r : persenta ġġ ta’ inibizzjoni f’rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku;  
μ C : valur medju g ħal rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku (μ) fil-grupp 
ta’ kontroll;  
μ T : rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku għar-replika ta’ trattament;  
Meta solventi huma u żati sabiex ji ġu ppreparati soluzzjonijiet tat-test, 
il-kontrolli tas-solventi minflok il-kontrolli ming ħajr solventi 
għandhom ikunu u żati fil-kalkulazzjoni tal-persenta ġġ ta’ inibizzjoni.  
2.2.2.  Prodott  
Il-prodott huwa kkalkulat b ħala l-bijomassa fl-a ħħar tat-test li minnu 
titnaqqas l-bijomassa tal-bidu g ħal kull reċipjent singolu ta’ kontrolli 
u trattamenti. G ħal kull test ta’ kon ċentrazzjoni u kontroll, ikkalkula 
valur medju g ħall-prodott flimkien mal-istimi ta’ varjazzjoni. Il- 
persentaġġ ta’ inibizzjoni fil-prodott (%I  y ) jista’ ji ġi kkalkulat g ħal 
kull replika ta’ trattament kif ġej: 
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
fejn: 
% I  y : persenta ġġ ta’ inibizzjoni ta’ prodott;  
Y C : valur medju g ħall-prodott fil-grupp ta’ kontroll;  
Y T : valur g ħall-prodott g ħar-replika ta’ trattament.  
2.3. PLOTTJAR TA’ KURVA TA’ RISPONS TA’ KON ĊEN­
TRAZZJONI  
Ipplottja l-persenta ġġ ta’ inibizzjoni kontra l-logaritmu tal-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza tat-test u e żamina l-plot mill-qrib, ming ħajr 
ma tagħti każ ta’ xi punt ta’ dejta li ġie maqtug ħ waħdu bħala 
iżolat fl-ewwel fa żi. Daħħal linja lixxa min-nofs il-punti ta’ dejta 
fuq l-għajn jew permezz ta’ interpolazzjoni kompjuterizzata sabiex 
tieħu l-ewwel impressjoni tar-relazzjoni tal-kon ċentrazzjoni ta’ 
rispons, imbag ħad ipproċedi b’metodu aktar dettaljat, preferibbilment 
metodu ta’ statistika kompjuterizzata. Skont l-u żu intiż tad-dejta, il- 
kwalità (pre ċiżjoni) u l-ammont ta’ dejta, kif ukoll id-disponibblità 
ta’ għodda ta’ anali żi tad-dejta, jista’ ji ġi deċiż (u xi drabi ġġustifikat 
sew) li titwaqqaf l-anali żi tad-dejta f’dan l-istadju u sempli ċement 
jinqraw il-figuri prin ċipali EC  50 u EC  10 (u/jew EC  20 ) mill-kurva 
mdaħħla fuq l-g ħajn (ara wkoll it-taqsima ta' hawn ta ħt fuq effetti 
stimulatorji). Ra ġunijiet valida g ħax ma jintu żax metodu statistiku 
jistgħu jinkludu:  
— Dejta ma hijiex xierqa g ħal metodi kompjuterizzati sabiex 
tipproduċi riżultati li aktar tista’ torbot fuqhom milli jistg ħu 
jiġu ottenuti minn ġudizzju espert — f’tali sitwazzjonijiet xi 
programm ta’ kompjuter jistg ħu anke jfallu li jipprodu ċu 
soluzzjoni li tista’ turbot fuqha (ripetizzjonijiet jistg ħu ma 
jaqblux e ċċ.) 
— Reazzjonijiet ta’ tkabbir stimulatorji ma jistg ħux jiġu 
mmaniġġjati adegwatament permezz tal-u żu ta’ programmi ta’ 
kompjuter li huma disponibbli (ara ta ħt). 
2.4. PRO ĊEDURI STATISTI ĊI 
L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni-rispons kwan ­
titattivà permezz ta’ anali żi ta’ regressjoni. Huwa possibbli li tintu ża 
regressjoni lineari li hija mog ħtija piż wara li d-dejta ta’ rispons ti ġi 
trasformata b’mod lineari — pere żempju f’unità probit jew logit jew 
Weibull (9), imma pro ċeduri ta’ rigressjoni li mhumiex lineari, huma 
tekniki ppreferuti li jimmani ġġjaw aħjar irregolaritajiet fid-dejta li ma 
jistgħux jiġu evitati u devjazzjonijiet minn distribuzzjonijiet lixxi. 
Meta viċin iż-żero jew inibizzjoni totali, tali irregolaritajiet jistg ħu 
jiġu mkabbra bit-trasformazzjoni, li tinterferi mal-anali żi (9). Ta’ min 
jinnota li metodi standard ta’ anali żi permezz ta’ u żu ta’ trasform ­
azzjonijiet probit, logit, jew Weibull huma ma ħsuba għall-użu fuq 
dejta quantal (e ż. mortalità jew sopravvivenza), u jridu ji ġu 
mmodifikati sabiex jakkomodaw tkabbir jew dejta fuq il-bijomassa. Proċeduri spe ċifiċi għad-determinazzjoni ta’ valuri EC
 x minn dejta 
kontinwa jinsabu f’(10)(11) u (12). L-u żu ta’ anali żi ta’ rigressjoni 
mhux lineari hiwa spjegat f’aktar dettall fl-Appendi ċi 4. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Għal kull varjabbli ta’ rispons li g ħandu jiġi analizzat, u ża ir- 
relazzjoni kon ċentrazzjoni-rispons sabiex tikkalkula punt ta' stimi 
ta' valuri EC  x . Meta possibbli, il-limiti ta’ 95 % kunfidenza g ħal 
kull stima g ħandhom ji ġu ddeterminati. Id-d ħul sewwa tad-dejta ta’ 
rispons mal-mudell ta’ rigressjoni g ħandu jiġi vvalutat jew grafi ­
kament jew statistikament. Anali żi ta’ rigressjoni g ħandha tkun 
magħmula permezz tal-u żu ta’ reazzjonijiet ta’ repliki individwali, 
mhux b’midja ta’ grupp ta’ trattament. Jekk, però, id-d ħul ta’ kurva 
mhux lineari huwa diffi ċli jew ifalli min ħabba sparpaljar kbir fid- 
dejta, il-problema tista’ ti ġi evitata billi ssir ir-regressjoni fuq midja 
ta’ grupp b ħala mod prattiku sabiex titnaqqas l-influwenza ta’ i żolati 
suspetti. L-u żu ta’ din l-g ħażla għandu jiġi identifikat fir-rapport tat- 
test bħala devjazzjoni mill-pro ċedura normali g ħaliex il-qbil tal-kurva 
ma’ repliki individwali ma pprodu ċewx riżultat tajjeb.  
Stimi EC  50 u limiti ta’ kunfidenza jistg ħu jiġu wkoll miksuba 
permezz tal-u żu ta’ interpolazzjoni lineari b’bootstrapping (13), 
jekk mudelli/metodi disponibbli ta’ rigressjoni mhumiex tajbin 
għad-dejta.  
Għal stima tal-LOEC u g ħalhekk l-NOEC, u g ħal effetti tas-sustanza 
tat-test fuq ir-rata ta’ tkabbir, huwa ne ċessarju li jsir paragun tal- 
midja ta’ trattament permezz tal-u żu ta’ anali żi ta’ tekniki ta’ 
varjazzjoni (ANOVA). Il-medja g ħal kull kon ċentrazzjoni trid 
imbagħad tiġi pparagunata mal-medja ta’ kontroll permezz ta’ 
metodu tat-test xieraq ta’ paragun multiplu jew trend. It-test ta’ 
Dunnett jew Williams jista’ jkun ta’ g ħajnuna (14)(15)(16)(17)(18). 
Huwa ne ċessarju li tivvaluta jekk l-assunzjoni ta’ omo ġeneità ta’ 
varjazzjoni ANOVA tre ġix. Din il-valutazzjoni tista' ti ġi magħmula 
grafikament jew b’test formali (18). Testijiet xierqa huma dawk ta’ 
Levene jew Bartlett. Nuqqas li tintla ħaq l-assunzjoni ta' omo ġeneità 
ta’ varjazzjonijiet tista’ xi drabi ti ġi korretta bi trasformazzjoni loga ­
ritmika tad-dejta. Jekk etero ġeneità ta’ varjanza hija estrema u ma 
tistax tiġi korretta bi trasformazzjoni, anali żi b’metodi b ħal step- 
down Jonkheere trend tests g ħandha ti ġi kkunsidrata. Gwida 
addizzjonali g ħad-determinazzjoni tal-NOEC tinstab f’(12).  
Żviluppi xjentifi ċi reċenti wasslu g ħal rakkomandazzjoni sabiex ji ġi 
abbandunat il-kun ċett ta’ NOEC u jinbidel b’punti ta’ stima bba żati 
fuq regressjoni EC  x . Valur xieraq g ħal x ma ġiex stabbilit g ħal dan 
it-test tal-alka. Sfera ta’ 10 sa 20 % tidher li hija xierqa (tiddependi 
fuq il-varjabbli ta’ rispons mag ħżul), u preferibbilment kemm l-EC  10 
u l-EC  20 għandhom ji ġu rrappurtati.  
2.5. STIMULAZZJONI TA’ TKABBIR  
Stimulazzjoni ta’ tkabbir (inibizzjoni negattiva) f’kon ċentrazzjonijiet 
baxxi hija xi drabi osservata. Din tista’ tirri żulta jew minn hormesis 
(“stimulazzjoni tossika”) jew minnn żieda ta’ fatturi stimulanti ta’ 
tkabbir mal-materjal tat-test g ħall-inqas midjum u żat. Innota li ż- 
żieda ta’ nutrijenti inorgani ċi ma għandux ikollha effett dirett 
għaliex il-midjum tat-test g ħandu jżomm żieda ta’ nutrijenti matul 
it-test. Stimulazzjoni f’do ża baxxa tista’ ġeneralment ti ġi injorata 
f’kalkulazzjonijiet EC  50 sakemm ma tkunx estrema. Madankollu, 
jekk hija estrema, jew valur EC  x għal x baxxa g ħandu jiġi kkalkulat, 
proċeduri spe ċjali jistgħu ikunu me ħtieġa. Tħassir ta’ reazzjonijiet 
stimulatorji mill-anali żi tad-dejta g ħandhom ji ġu evitati jekk 
possibbli, u jekk software disponibbli li jda ħħal il-kurva ma jistax 
jaċċetta stimulazzjoni minuri, tista’ tintu ża interpolazzjoni lineari 
b’bootstrapping. Jekk l-istimulazzjoni hija estrema, l-u żu ta’ mudell 
ta’ hormesis jista’ ji ġi kkunsidrata (19).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. INIBIZZJONI TA’ TKABBIR MHUX TOSSIKU  
Materjali tat-test li jassorbu d-dawl jistg ħu jagħtu lok għal tnaqqis 
fir-rata ta’ tkabbir g ħaliex id-dellijiet inaqqsu l-ammont ta’ dawl 
disponibbli. Tali tipi ta’ effetti fi żiċi għandhom ikunu separati 
minn effetti tossi ċi b’modifikazzjoni fil-kundizzjonijiet tat-test u 
tal-ewwel g ħandhom ji ġu rappurtati separatament. Gwida tinstab 
f’(2) u (3).  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Il-perjodu tat-test irid jinkludi dan li ġej: 
Sustanza tat-test:  
— natura fi żika u proprjetajiet relevanti fi żjokemikali, li jinkludu 
limitu ta’ solubilità fl-ilma,  
— dejta g ħall-identifikazzjoni tal-kimika, li tinkludi purità.  
Speċi tat-test:  
— ir-razza, min jipprovdi jew sors u l-kundizzjonijiet ta’ kolti ­
vazzjoni u żati. 
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dejta tal-bidu tat-test u d-dewmien tieg ħu, 
— deskrizzjoni tad-disinn tat-test: re ċipjenti tat-test, il-volumi tal- 
koltivazzjonijiet, densità tal-bijomassa fil-bidu tat-test,  
— kompo żizzjoni tal-midjum,  
— konċentrazzjonijiet u repliki tat-test (e ż. Għadd ta’ repliki, g ħadd 
ta’ konċentrazzjonijiet tat-test u progressjoni ġeometrika li ġiet 
użata), 
— deskrizzjoni tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test, li tinkludi 
l-użu ta' materjali li jdewwbu e ċċ., 
— apparat ta’ culturing,  
— intensità ta’ dawl u kwalità (sors, omo ġenità),  
— temperatura,  
— konċentrazzjonijiet ittestjati: il-kon ċentrazzjonijiet tat-test 
nominali u kwalunkwe ri żultat ta’ anali żi sabiex tiddetermina l- 
konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fir-re ċipjent tat-test. L- 
effiċjenza ta’ rkupru tal-metodu u l-limitu ta’ kwantifikazzjoni 
fil-matriċi tat-test g ħandhom ikunu rappurtati,  
— kwalunkwe devjazzjoni minn dan il-Metodu ta’ Ttestjar,  
— metodu ta’ determinazzjoni tal-bijomassa u evidenza ta’ korre ­
lazzjoni bejn il-parametru mkejjel u l-pi ż niexef.  
Riżultati:  
— valuri pH fil-bidu u fl-a ħħar tat-test g ħal kull trattament,  
— bijomassa g ħal kull flixkun f’kull punt ta’ kejl u metodu sabiex 
titkejjel il-bijomassa,  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— kurvi ta’ tkabbir (plot ta' bijomassa kontra ħin), 
— varjabbli ta’ rispons kkalkulati g ħal kull trattament replikat, 
b’valuri medji u koeffi ċjent ta’ varjazzjoni g ħar-repliki,  
— preżentazzjoni grafika tar-relazzjoni kon ċentrazzjoni/effett,  
— stimi ta’ tossi ċità varjabbli ta’ rispons e ż. EC  50 , EC  10 , EC  20 u 
intervalli ta’ kunfidenza asso ċjati. Jekk ikkalkulati, LOEC u 
NOEC u l-metodi ta’ statistika u żati għad-determinazzjoni 
tagħhom,  
— jekk ANOVA ġiet użata, id-daqs tal-effett li jista’ ji ġi skopert 
(eż. Id-differenza l-inqas sinifikanti),  
— kwalunkwe stimulazzjoni ta’ tkabbir misjuba fi kwalunkwe trat ­
tament,  
— kwalunkwe effett ie ħor osservat, e ż. bidliet morfolo ġiċi tal-alke,  
— diskussjoni tar-ri żultati, li jinkludu kwalunkwe influwenza fuq ir- 
riżultat tat-test li tirri żulta minn devjazzjonijiet minn dan il- 
Metodu ta’ Ttestjar.  
4. LETTERATURA  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Ċanobatterji, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth 
inhibition tests with poorly soluble materials, volatile 
compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442  
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health 
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, 
no. 23.  
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16.  
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.
 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence deter ­
minations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Ocean ­
ography 22,5 (1977), pp.919-925  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological 
Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. 
Sci. Technol. 19, 713-718.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity 
Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, 
MN. 
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103-117.  
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Appendiċi 1 
Razez li ġie ppruvat li huma adattati g ħat-test  
Alke ħodor  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (qabel mag ħrufa bħala Selenastrum capri ­
cornutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (qabel mag ħrufa bħala Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Diatomi  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Ċanobatterji  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Sorsi tar-razez  
Ir-razez rakkomandati huma disponibbli f’koltivazzjonijiet unialkali mill- 
kollezzjonijiet li ġejjin (f’ordni alfabetiku):  
ATCC: Kollezzjoni ta’ Koltivazzjoni ta’ Tip Amerikan  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
USA  
CCAP, Kollezzjoni ta’ Koltivazzjoni ta’ Alke u Proto żoa 
Istitut ta’ Ekolo ġija tal-Ilma Ħelu, 
Laboratorju Windermere  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
SAG: Kollezzjoni ta’ Koltivazzjonijiet ta’ Alka  
Istitut tal-Fisjolo ġija tal-Pjanti  
Università ta’ Göttingen  
Nicholausberger Weg 18  
D-3400 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Kollezzjoni ta’ koltivazzjoni ta’ Alke  
Sezzjon ta’ Bijolo ġija Molekolari, Ċellulari u ta’ Żvilupp  
Skola tax-Xjenzi Bijolo ġiċi 
l-Università tat-Texas f’Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Apparenza u karatteristi ċi tal-ispe ċijiet rakkomandati  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Apparenza Mg ħawwġa, 
ċelloli singoli 
mibruma Ovali, fil-parti 
l-kbira ċelloli 
singoli virgi Ktajjen ta’ 
ċelloli ovali virgi 
Daqs (L × W) μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volum ta’ ċelloli(μm 3 /ċell) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Piż niexef ta ċ-ċelloli(mg/ ċell) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Rata ta’ tkabbir (  1 ) (ġurnata  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Imkejla b’apparat li jg ħodd partiċelli elettroni ċi 
( 2 ) Ikkalkulat mid-daqs 
( 3 ) Rata ta’ tkabbir osservata l-aktar ta’ spiss f’midjum OECD f’intensità ta’ dawl ta’madwar 70 μE·m  –2 ·s –1 u 21 °C  
Rakkomandazzjonijiet spe ċifiċi fuq Culturing u l-Immani ġġjar ta’ Spe ċi tat- 
test Rakkomandati  
Pseudokirchneriella subcapitata u Desmodesmus subspicatus  
Dawn l-alke ħodor huma ġeneralment fa ċli biex iżżommhom f’diversi midja ta’ 
koltivazzjoni. Informazzjoni fuq midja xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta’ koltivazzjoni. I ċ-ċelloli huma normalment solitarji, u kejl tad-densità ta ċ- 
ċelloli jista’ fa ċilment jiġi magħmul permezz ta’ apparat li jg ħodd partiċelli elet­
troniċi jew mikroskopju.
 
Anabaena flos-aquae  
Midja ta’ tkabbir varji jistg ħu jiġu użati biex tin żamm koltivazzjoni ta’ stokk. 
Huwa partikolarment importanti li ji ġi evitat li l-koltivazzjoni tit ħalla tgħaddi l- 
fażi ta’ tkabbir tal-log meta ti ġi mġedda, rkupru huwa diffi ċli f’dan il-punt.  
Anabaena flos-aquae  tiżviluppa ġabriet ta’ ktajjen ta’ ċelloli. Id-daqs ta’ dawn il- 
ġabriet jista’ jvarja mal-kundizzjonijiet ta’ culturing. Jista’ jkun ne ċessarju li 
jinkisru dawn il- ġabriet meta l-g ħadd bil-mikroskopju jew permezz ta’ apparat 
li jgħodd il-parti ċelli elettroni ċi huwa u żat għad-determinazzjoni tal-bijomassa.  
Sonikazzjoni tas-sub-kampjuni jistg ħu jiġu użati biex jinkisru l-ktajjen sabiex 
titnaqqas il-varjabilità fl-g ħadd. Sonikazzjoni itwal aktar milli me ħtieġ sabiex 
jinkisru l-ktajjen f’tulijiet aqsar jistg ħu jkissru ċ-ċelloli. L-intensità ta’ soni ­
kazzjoni u dewmien iridu jkunu identi ċi għal kull trattament.  
Għodd biżżejjed oqsma fuq il-hemocytometer (tal-anqas 400 ċellola) biex tg ħin 
tikkompensa g ħal varjabbilità. Dan itejjeb l-attendibilità ta’ determinazzjonijiet ta’ 
densità mikroskopi ċi. 
Apparat li jg ħodd il-parti ċelli elettroni ċi jista’ jiġi użat għad-determinazzjoni tal- 
volum totali ta’ ċelloli ta’ Anabaena wara li l-ktajjen ta’ ċelloli jinkisru b’sonifi ­
kazzjoni bil-g ħaqal. L-ener ġija tas-sonifikazzjoni g ħandha tiġi rranġata sabiex ji ġi 
evitat li l-ktajjen jinqasmu.  
Uża ħallât bil-bellieg ħa jew metodu simili adegwat sabiex ti żgura li s-sospensjoni 
ta’ alke biex ir-ri ċipjenti tat-test ji ġu mlaqqma hija m ħallta sew u b’mod 
omoġenju. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Kontenituri tat-test g ħandhom jitqieg ħdu fuq mejda orbitali jew ta’ t ħallit 
reċiproku b’madwar 150 dawra kull minuta. Alternattiva o ħra hija l-u żu ta’ 
ċaqlieq intermittenti sabiex titnaqqas it-tendenza ta’ Anabaena li tifforma 
ċapap. Jekk ikun hemm ċapap, għandha ting ħata attenzjoni sabiex ji ġu ottenuti 
kampjuni rappre żentattivi tal-kejl tal-bijomassa. Ċaqlieq qawwi qabel ma jittie ħdu 
l-kampjuni jista’ jkun ne ċessarju sabiex jiddi żintegraw ċapap ta’ alka.  
Synechococcus leopoliensis.  
Midja ta’ tkabbir varji jistg ħu jiġu użati biex tin żamm koltivazzjoni ta’ stokk. 
Informazzjoni fuq midja xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta’ kolti ­
vazzjoni.  
Synechococcus leopoliensis  tikber bħal ċelloli solitarji b’forma ta’ vireg. I ċ-ċelloli 
huma żgħar ħafna, li jikkomplika l-g ħadd permezz ta’ mikroskopju g ħal kejl tal- 
bijomassa. Apparati li jg ħoddu l-parti ċelli elettroni ċi mgħammra sabiex jg ħoddu 
partiċelli sad-daqs ta’ madwar 1 μm huma ta’ g ħajnuna. Kejl in vitro fluor ­
ometric huma applikabbli ukoll.  
Navicula pelliculosa  
Midja ta’ tkabbir varji jistg ħu jiġu użati biex tin żamm koltivazzjoni ta’ stokk. 
Informazzjoni fuq midja xierqa hija disponibbli mill-kollezzjonijiet ta’ kolti ­
vazzjoni. Innota li kompost li fih is-silika huwa me ħtieġ fil-midjum.  
Navicula pelliculosa  tista’ tifforma gruppi ta ħt ċerti kundizzjonijiet ta’ tkabbir. 
Minħabba l-produzzjoni ta’ lipidi ċ-ċelloli tal-alka xi drabi g ħandhom it-tendenza 
li jakkumulaw fil-wi ċċ. Taħt dawk ċ-ċirkustanzi, mi żuri speċjali jridu jittie ħdu 
meta sub-kampjuni huma me ħuda għad-determinazzjoni tal-bijomassa sabiex ji ġu 
miksuba kampjuni rappre żentattivi. Ta ħlit bil-saħħa, eż. bl-użu ta’ ħallât bil- 
belliegħa, jista’ jkun me ħtieġ. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Appendiċi 2 
Midja ta’ tkabbir  
Wieħed miż-żewġ midja ta’ tkabbir li ġejjin jista’ jintu ża: 
Midjum OECD: Midjum ori ġinali ta’ OECD TG 201, ukoll skont ISO 8692  
US. EPA midjum AAP ukoll skont ASTM.  
Meta dawn il-midja ji ġu ppreparati, kimi ċi reaġenti jew ta’ grad analitiku 
għandhom ji ġu użati u dejonizzati fl-ilma.  
Kompożizzjoni tal-midjum-AAP (US. EPA) u l-midjum OECD TG 201  
Komponent EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Il-proporzjon molari ta’ EDTA g ħal ħadid teċċedi bi ftit unità. Dan jipprevjeni l-pre ċipitazzjoni tal- ħadid u, 
fl-istess ħin, chelation ta’ jonji ta’ metalli tqal hija minimizzata.  
Fit-test bid-dijatomu Navicula pelliculosa, i ż-żewġ midja jridu jkunu suppli ­
mentati b’ Na  2 SiO  3 ·9H  2 0 sabiex tinkiseb kon ċentrazzjoni ta’ 1,4 mg Si/l.  
Il-pH tal-midjum jinkiseb f’ekwilibriju bejn is-sistema ta’ karbonat tas-sistema 
tal-midjum u l-pressjoni parzjali tas-CO  2 fl-arja atmosferika. Bejn wie ħed u ieħor 
ir-relazzjoni bejn pH b’25 °C u l-kon ċentrazzjoni tal-bikarbonat molari hija:  
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
B'15 mg NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (U.S. EPA midjum) u b’50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8,1 (OECD midjum).  
Komposti ta’ elementi tal-midja tat-test  
Element EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Preparazzjoni tal-midjum OECD  
Nutrijent Kon ċentrazzjoni f’soluzzjoni ta’ stokk 
Soluzzjoni ta’ stokk nru 1: makronutrijenti  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Soluzzjoni ta’ stokk nru 2: ħadid 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Soluzzjoni ta’ stokk nru 3: elementi ta’ tra ċċi 
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Soluzzjoni ta’ stokk nru 4: bikarbonat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Sterilizza s-soluzzjonijiet ta’ stokk permezz ta’ filtrazzjoni b’membrana (diametru 
medju tal-pori 0,2 μm) jew permezz ta’ autoclaving (120 °C, 15 min). Erfa’ s- 
soluzzjonijiet fid-dlam b’4 °C.  
Tagħmilx autoclave tas-soluzzjonijiet ta’ stokk 2 u 4, imma sterilizzahom 
permezz ta’ filtrazzjoni b’membrana.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Ipprepara midjum ta’ tkabbir billi żżid volum xieraq ta’ soluzzjonijiet ta’ stokk 1- 
4 mal-ilma  
Żid sa 500 ml ta’ ilma sterilizzat:  
— 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ stokk nru 1  
— 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ stokk nru 2  
— 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ stokk nru 3  
— 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ stokk nru 4  
Żid sa 1 000 ml b’ilma sterilizzat  
Ħalli ħin biżżejjed sabiex tekwilibrija l-midjum mas-CO  2 atmosferiku, jekk 
neċessarju b’bubbling b’arja sterili filterjata g ħal ftit ħin. 
Preparazzjoni tal-midjum U.S. EPA  
A1.1. Żid ml wie ħed ta’ kull soluzzjoni stokk fi A1.2.1–A1.2.7 sa bejn 
wieħed u ieħor 900 mL ta’ ilma dejonizzat jew distillat u ag ħmel 
dilwizzjoni sa 1L.  
A1.2. Soluzzjonijiet stokk ta’ makronutrijenti jsiru billi jin ħallu dawn li ġejjin 
fi 500ml ta’ ilma dejonizzat jew distillat. Reja ġġenti A1.2.1, A1.2.2, 
A1.2.3, u A1.2.4 jistg ħu jiġu kkombinati f’ soluzzjoni stokk wa ħda. 
A1.2.1.  NaNO  3 — 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O— 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O— 2,205 g.  
A1.2.4.  Soluzzjoni Kon ċentrata ta' Mikronutrijenti — (see A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O— 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 — 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 — 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O— Ara n-Nota A1.1.  
Nota A1.1-U żu għall-ispeċi diatom ittestjati biss. Jistg ħu jiġu miżjuda 
direttament (202,4 mg) jew permezz tas-soluzzjoni stokk biex jinkiseb 20 mg/L ta’ kon ċentrat finali fil-midjum.
 
A1.3. Soluzzjonijiet stokk ta’ mikronutrijenti jsiru billi jin ħallu dawn li ġejjin 
fi 500ml ta’ ilma dejonizzat jew distillat:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 — 92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O— 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 — 1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O— 79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O— 0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O— 3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O— 0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O— 150,000 mg.  
[Disodium (Ethylenedinitrilo) tetraacetate].  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O— 0,005 mg Ara Nota A1.2.  
Nota A1.2 — U ża biss fil-midjum ta’ kulturi stokk tal-ispe ċi diatom.  
A1.4. Altera l-pH sa 7,5± 0,1 permezz ta’ 0,1  N jew 1,0  N NaOH jew HCl.  
A1.5. Iffiltra l-midjum f’kontenitur sterilizzat permezz ta’ filtru bil-membrane 
ta' 0,22-μm jekk għandu jintu ża midjum li jg ħodd il-parti ċelli jew filtru 
0,45-μm magħandux jintu ża. 
A1.6. A ħżen il-midjum fid-dlam sa bejn wie ħed u ieħor 4 °C sakemm jintu ża. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Appendiċi 3 
Eżempju tal-pro ċedura għall-culturing tal-alke  
Osservazzjonijiet Ġenerali  
L-għan ta’ culturing fuq il-ba żi tal-proċedura li ġejja huwa li jinkisbu kolti ­
vazzjonijiet ta’ alka g ħal testijiet ta’ tossi ċità. 
Metodi xierqa jridu ji ġu użati sabiex ji ġi żgurat li l-koltivazzjonijiet ta’ alka ma 
jkunux infettati minn batteri. Koltivazzjonijiet axenic jistg ħu jkunu mixtieqa 
imma koltivazzjonijiet unialkali jridu ji ġu stabbiliti u u żati. 
L-operazzjonijiet kollha jridu jsiru f’kundizzjonijiet sterili sabiex kontaminazzjoni 
b’batteri u alke o ħra tiġi evitata.  
Apparat u materjal  
Ara taħt Metodu ta’ Ttestjar: Apparat.  
Proċeduri għall-kisba ta’ koltivazzjonijiet ta’ alka  
Preparazzjoni ta’ soluzzjoni ta’ nutrijent (midjum):  
Il-melħ kollu tan-nutrijenti tal-midjum huwa ppreparat b ħala soluzzjonijiet ta’ 
stokk kon ċentrati u merfug ħa fid-dlam u l-kes ħa. Dawn is-soluzzjonijiet huma 
sterilizzati b’filtrazzjoni jew b’autoclaving.  
Il-midjum huwa ppreparat billi ji żdied l-ammont korrett ta’ soluzzjoni ta’ stokk 
sabiex ji ġi sterilizzat ilma distillat, u dan isir b'attenzjoni biex l-ebda 
infezzjonijiet ma sse ħħ. Għal midjum solidu 0,8 fil-mija ta’ agar huwa mi żjud. 
Koltivazzjoni ta’ stokk:  
Il-koltivazzjonijiet ta’ stokk huma koltivazzjonijiet ta’ alka żgħar li regolarment 
jiġu trasferiti g ħal midjum ġdid sabiex ja ġixxu bħala materjal inizjali tat-test. 
Jekk il-koltivazzjonijiet ma jintu żawx regolarment, dawn ji ġu skrezjati fuq tubi 
ta’ agar. Dawn ji ġu ttrasferiti f’midjum ġdid tal-anqas darba kull xahrejn.  
Il-koltivazzjonijiet ta’ stokk jitkabbru fi fliexken konikali li jkun fihom l-midjum 
xieraq (volum madwar 100 ml). Meta l-alke ji ġu inkubati b’20 °C b’illumi ­
nazzjoni kontinwa, trasferiment ta’ darba f’ ġimgħa huwa me ħtieġ. 
Matul it-trasferiment, ammont ta’ koltivazzjoni “antika” hija trasferita b’pipetti 
sterili fi flixkun ta’ midjum frisk, biex ma’ spe ċi li tikber malajr il-kon ċen­
trazzjoni inizjali hija madwar 100 darba i żgħar milli fil-koltivazzjoni l-antika.  
Ir-rata ta’ tkabbir ta’ spe ċi tista’ tkun determinata mill-kurva ta’ tkabbir. Jekk hija 
magħrufa, huwa possibbli tistma d-densità f’liema l-koltivazzjoni g ħandha tkun 
trasferita g ħal midjum ġdid. Dan irid isir qabel ma l-koltivazzjoni til ħaq il-fażi 
tal-mewt.  
Pre-koltivazzjoni:  
Il-pre-koltivazzjoni hija ma ħsuba sabiex tag ħti ammont ta’ alke xieraq g ħat-tilqim 
ta’ koltivazzjonijiet tat-test. Il-pre-koltivazzjoni hija inkubata ta ħt il- 
kundizzjonijiet tat-test u u żata meta tkun g ħada qed tikber esponenzjalment, 
normalment wara perjodu ta’ inkubazzjoni ta’ minn jumejn sa 4 ijiem. Meta l- koltivazzjonijiet tal-alka jkun fihom ċelloli deformati jew anormali, dawn iridu 
jiġu imwarrba.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Appendiċi 4 
Analiżi ta’ dejta b’regressjoni mhux lineari  
Kunsiderazzjonijiet ġenerali  
Ir-rispons f’testijiet tal-alka u testijiet o ħra ta’ tkabbir tal-mikrobi — it-tkabbir tal- 
bijomassa huwa ta’ natura varjabbli kontinwu jew metriku — rata ta’ pro ċess 
jekk rata ta’ tkabbir hija u żata, u l-integrali tag ħha fuq il- ħin jekk il-bijomassa 
tiġi magħżula. It-tnejn huma referenzjati g ħar-rispons medja korrispondenti tal- 
kontrolli repliki li mhux esposti li juru rispons massimu g ħall-kundizzjonijiet 
imposti — b’dawl u temperatura b ħala fatturi determinanti prin ċipali f’test tal- 
alka. Is-sistema hija mqassma jew omo ġenja u l-bijomassa tista’ tidher b ħala 
kontinwazzjoni ming ħajr konsiderazzjoni ta ċ-ċelloli individwali. Il-varjazzjoni 
ta’ distribuzzjoni tat-tip ta’ rispons g ħal tali sistema g ħandha x’taqsam biss ma 
fatturi sperimentali (deskritti tipikament mil-log-normali jew distribuzzjonijiet 
normali ta’ żball). Dan huwa b’kuntrast g ħar-reazzjonijiet tipi ċi bioassay bi 
quantal dejta, g ħal-liema t-tolleranza (tipikament distribwita b’ żewġ modijiet) 
ta’ organi żmi individwali hija ta’ spiss assunta li hija l-komponenti varjabbli 
dominanti. Risposti ta’ kontroll hawn huma żero jew livell tal-isfond.  
Fis-sitwazzjoni li mhix ikkumplikata, ir-rispons normalizzat jew relattiv, r, jonqos 
monotonikament minn 1 (inibizzjoni żero) sa 0 (100 fil-mija inibizzjoni). Innota 
li r-risposti kollha g ħandhom żball assoċjat, u li inibizzjonijiet negattivi apparenti 
jistgħu jiġu kkalkulati b ħala riżultat ta’ żball ta’ ka żwali biss.  
Analiżi ta’ regressjoni  
Mudelli  
Analiżi ta’ regressjoni timmira li tiddeskrivi kwantitattivament il-kurva kon ċen­
trazzjoni-rispons fil-forma ta’ funzjoni matematika regressjoni Y = f (C) jew 
aktar ta’ spiss F (Z) fejn Z = log C. U żata inversament C = f  –1 (Y) tħalli l- 
kalkolu tal-figuri EC  x li jinkludi l- EC  50 , EC  10 u EC  20 , u l-95 % tag ħhom ta’ 
limiti ta’ kunfidenza. Diversi forom ta’ funzjonijiet sempli ċi matemati ċi 
għandhom ji ġu ppruvati sabiex ji ġu deskritti tajjeb ir-relazzjonijiet kon ċen­
trazzjoni-rispons miksuba f’testijiet ta’ inibizzjoni ta’ tkabbir ta’ alka. Funz ­
jonijiet jinkludu, pere żempju, l-ekwazjoni lo ġistika, l-ekwazjoni mhux simettrika 
Weibul u l-funzjoni ta’ distribuzzjoni log, li huma kollha kurvi bil-forma tal-ittra “S” (sigmoid) li asimptotikalment joqorbu wie ħed għal C → 0, u żero għal 
C → infinità.
 
L-użu ta’ mudelli ta’ funzjoni kontinwa threshold (e ż. il-mudell Koyman “g ħall- 
inibizzjoni tat-tkabbir tal-popolazzjoni” Kooijman et al. 1996) huwa proposta jew 
alternattiva re ċenti għal mudelli asimptoti ċi. Dan il-mudell jassumi xejn effetti 
f’konċentrazzjonijiet ta ħt ċertu livell, EC0+, li huwa stmat permezz ta’ estrapo ­
lazzjoni tar-relazzjoni rispons-kon ċentrazzjoni biex tinter ċetta l-bażi ta’ konċen­
trazzjoni permezz tal-u żu ta’ funzjoni kontinwa li ma hijiex differenzjabbli fil- 
punt tat-tluq.  
Innota li l-anali żi tista’ tkun sempli ċi minimizzazzjoni tas-somom tal-kwadrati 
varjabbli (tassumi varjanza kostanti) jew varjati mg ħobbija jekk l-etero ġenità tal- 
varjanza hija kompensata  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Proċedura  
Il-proċedura tista’ ti ġi mfissra kif ġej: agħżel ekwazjoni xierqa funzjonali, 
Y = f (C), u adattaha mad-dejta b’regressjoni li mhix lineari. Preferibbilment uża l-kejl minn kull flixkun individwali minflok il-valuri medji tar-replikati, 
sabiex to ħroġ kemm jista’ jkun informazzjoni mid-dejta. Jekk il-varjazzjoni 
hija għolja, fuq in-na ħa l-oħra, il-prattika tissu ġġerixxi li l-valuri medji tar- 
repliki jistg ħu jipprovdu stima matematika li aktar tista’ turbot fuqha, inqas 
influwenzata bi żbalji sistemati ċi fid-dejta, minn ma’ kull punt individwali ta’ 
dejta miżmum.
 
Ipplottja l-kurva adattata u d-data mkejla u e żamina jekk id-d ħul tal-kurva 
huwiex adegwat. Anali żi tar-residwi tista’ tkun g ħodda partikolarment ta’ 
għajnuna g ħal dan il-g ħan. Jekk ir-relazzjoni funzjonali mag ħżula biex 
iddaħħal r-rispons ta’ kon ċentrazjoni ma tiddeskrivix il-kurva kollha jew xi 
parti essenzjali tag ħha, bħar-rispons f’kon ċentrazzjonijiet baxxi sewwa, ħu 
għażla oħra ta’ dħul ta’ kurva — e ż. kurva mhux simettrika b ħall-funzjoni 
Weibul, minflok wa ħda simettrika. Inibizzjonijiet negattivi jistg ħu jkunu 
problema ma, pere żempju, il-funzjoni ta’ distribuzjoni tal-log-normali, li l-istess 
tiddomanda funzjoni ta’ regressjoni alternattiva. Ma huwiex rakkomandat li ji ġi 
assenjat żero jew valur po żittiv żgħir lil tali valuri negattivi g ħaliex dan 
jgħawweġ id-distribuzzjoni tal-i żball. Jista’ jkun adegwat li jsir d ħul ta’ kurvi 
separati fuq partijiet tal-kurva b ħall-parti ta’ inibizzjoni baxxa sabiex ji ġu stmati 
figuri EC  low x  . Ikkalkula mill-ekwazjoni mda ħħla (permezz ta’ “estimazzjoni 
inversa”, C = f  –1 (Y), stimi karatteristi ċi ta’ punt EC  x ’s, u rraporta b ħala 
minimu l-EC  50 u wieħed jew żewġ stimi EC  low x  . Esperjenza minn testijiet 
prattiċi turi li l-pre ċiżjoni tat-test tal-alka normalment t ħalli stima ra ġonevolment 
akkurata lejn livell ta’ inibizzjoni ta’ 10 % jekk punti ta’ data huma suffi ċjenti — 
sakemm ma jkunx hemm stimulazzjoni f’kon ċentrazzjonijiet baxxi b ħala fattur li 
jfixkel. Il-pre ċiżjoni ta’ stima EC  20 hija ta’ spiss konsiderevolment a ħjar minn dik 
ta’ EC  10 , għaliex l-EC  20 huwa ġeneralment ippo żizzjonat fuq il-parti bejn wie ħed 
u ieħor lineari tal-kurva ċentrali kon ċentrazzjoni rispons. Xi drabi huwa diffi ċli li 
ssir interpretazzjoni ta’ EC  10 minħabba stimulazzjoni ta’ tkabbir. G ħalhekk, 
filwaqt li l-EC  10 hija normalment miksuba b’akkurezza suffi ċjenti, huwa wkoll 
rakkomandat li tirraporta dejjem l-EC  20 . 
Fatturi ta’ u żin 
Il-varjanza esperimentali ma hijiex ġeneralment kostanti u tipikament tinkludi 
komponent proporzjonali, regressjoni mi żuna hija g ħalhekk b’vanta ġġ 
magħmula b’rutina. L-u żin ta’ fatturi g ħal tali anali żi huwa normalment assunt 
bi proporzjon invers g ħall-varjanza:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Ħafna programmi ta’ regressjoni j ħallu l-għażla ta’ anali żi ta’ regressjoni mi żuna 
ma’ fatturi mi żuna mniżżla f’tavola. B’mod konvenjenti, l-u żin ta’ fatturi g ħandu 
jiġi normalizzat billi dan ji ġi mmultiplikat b’n/ ∑ w i (n huwa l-g ħadd ta’ punti ta’ 
dejta) sabiex is-somma tag ħhom tiġi wieħed. 
Normalizzazzjoni ta’ risposti  
Normalizzazzjoni bir-rispons medja ta’ kontroll tag ħti problemi prin ċipali u tag ħti 
lok għal struttura ta’ varjazzjoni xi ftit ikkumplikata. Bit-tqassim tar-risposti bir- 
rispons medja ta’ kontroll sabiex jinkiseb il-persenta ġġ ta’ inibizzjoni, wie ħed 
jintroduċi żball addizzjonali ikkaw żat bi żball fuq il-medja ta’ kontroll. Sakemm 
dan l-iżball mhuwiex żgħir tant li mhux ta' importanza, l-u żin ta’ fatturi fil-limiti 
ta’ regressjoni u kunfidenza g ħandhom ji ġu kkoreġuti għal kovarjanza mal- 
kontroll (17). Innota li pre ċiżjoni għolja fuq il-rispons medju ta’ kontroll stmat 
hija importanti sabiex titnaqqas il-varjanza totali g ħar-rispons relattiv. Il-varjanza 
hija kif ġej: ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
sottoskritt I jirreferi g ħal-livell ta’ kon ċentrazzjoni i u sottoskritt 0 g ħall-kontrolli)  
Y i = Rispons relattiv = r  i /r 0 = 1 — I = f (C  i ) 
b’varjanza:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) (∂Y i /∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i /∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
u għax 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 u (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
b’dejta normalment distribwita u m  i u m  0 repliki:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
il-varjanza totali tar-rispons relattiva, Y  i għalhekk issir:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
L-iżball fuq il-medja ta’ kontroll huwa inversament proporzjonali g ħar-radiċi 
kwadrata tal-g ħadd tal-medja ta’ repliki ta’ kontroll u xi drabi jista’ jkun 
ġustifikat li jinkludi dejta storika u b’dan il-mod inaqqas l-i żball bil-kbir. 
Proċedura alternattiva hija li ma tinnormalizzax d-dejta u dda ħħal ir-risposti 
assoluti, inklu ż id-dejta ta’ rispons ta’ kontroll, imma li tintrodu ċi il-valur tar- 
rispons ta’ kontroll b ħala parametru addizzjonali sabiex ji ġi mdaħħal ma’ 
regressjoni non lineari. B’ekwazjoni tas-soltu ta’ regressjoni ta’ żewġ parametri, 
dan il-metodu je ħtieġ dħul ta’ 3 parametri, u g ħalhekk jitlob aktar punti ta’ dejta 
milli regressjoni non-lineari fuq dejta li hija normalizzata permezz ta’ rispons ta’ kontroll li hija ssetjata minn qabel.
 
Intervalli ta’ kunfidenza inversa  
Il-kalkulazzjoni ta’ intervalli ta’ kunfidenza ta’ regressjoni li mhix lineari bi stima 
inversa huma xi ftit ikkomplikati u mhux g ħażla standard disponibbli f’pakketti 
ta’ programmi ta’ statistika ta’ kompjuter ordinarju. Limiti ta’ kunfidenza appros ­
simattivi jistg ħu jiġu miksuba ma’ programmi standard ta’ regressjoni non-lineari 
ma’ riparametrizzazzjoni (Bruce u Versteeg, 1992), li jinvolvu l-kitba mill- ġdid 
tal-ekwazjoni matematika bil-punti ta’ stima mixtieqa, e ż. l-EC  10 u l-EC  50 bħala 
parametri li g ħandhom ji ġu stmati. ( Ħalli l-funzjoni tkun I = f’ ( α, β, konċen­
trazzjoni) u utilizza r-relazzjonijiet tad-definizzjoni f'( α, β, EC  10 ) = 0.1 u f ( α, β, 
EC 50 ) = 0.5 sabiex tissostitwixxi f’( α, β, konċentrazzjoni) b’funzjoni ekwivalenti 
g (EC  10 , EC  50 , konċentrazzjoni).  
Kalkulazzjoni aktar diretta (Andersen et al, 1998) hija mag ħmula permezz ta ż- 
żamma tal-ekwazjoni ori ġinali u l-u żu ta’ espansjoni ta’ Taylor madwar il-medji 
ta’ r  i u r 0 
Reċentement metodi “boot strap” saru popolari. Tali metodi ju żaw id-dejta 
mkejla u ġeneratur ta’ numru kif ġie ġie li jiddirezjona rikampjunar ta’ spiss, 
sabiex jistmaw varjazzjoni tad-distribuzzjoni empirika.  
Letteratura  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): Kon ċentrazzjonijiet 
bla effett f’testijiet ta’ inibizzjoni ta’ tkabbir ta’ alka. Ri ċerka tal-ilma, 30, 1625- 
1632.  
Bruce, R.D. u Versteeg, D.J.(1992) Pro ċedura Statistika g ħall-Immudellar 
Kontinwu ta’ Dejta Ekotossikolo ġika. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Dejta ekotossikolo ġika kontinwa valutata relattivament ma’ rispons ta’ 
kontroll. Ġurnal ta’ Statisti ċi, Agrikoli, Bijolo ġiċi u Ambjentali, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. DETERMINAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ “LESTA”  
PARTI I.  KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI  
I.1. INTRODUZZJONI  
Sitt metodi tat- ġtestijiet huma deskritti li jippermettu l-g ħażla tal- 
kimiċi għal biodegradabbilità lesta f; medja akwea arobika:  
(a) Karbonju Organiku Mdewweb (DOC) Bit-Tne ħħija tal-Kulur 
(Metodu  o C.4-A)  
(b) Għażla Modifikata OECD – DOC Bit-Tne ħħija tal-Kulur 
(Metodu  o C.4-B)  
(ċ) Evoluzzjoni tad-diossidu tal-karbonju (CO  2 ) (Test Sturm 
modifikat (Metodu  o C.4-C)  
(d) Respirometrija Manjometrika (Metodu  o C.4-D)  
(e) Flixkun mag ħluq (Metodu  o C.4-E)  
(f) MITI (Ministeru tal-Kummer ċ Internazzjonali u l-Industrija – 
Ġappun) (Metodu  o C.4-F)  
Konsiderazzjonijiet ġenerali u komuni g ħas-sitt testijiet kollha huma 
mogħtija fil-Parti I tal-metodu. Punti spe ċifiċi għal metodi indi ­
vidwali huma mog ħtija fil-Partijiet II sa VII. L-annessi fihom defi ­
nizzjonijiet, formuli u materjal ta' gwida.  
Eżerċizzju ta' tqabbil inter-laboratorju OECD, mag ħmul fil-1988, 
kien wera li l-metodi jag ħtu riżultati konsistenti. B'danakollu, 
jiddependi mill-karatteristi ċi fiżiċi tal-sustanza tat-test, wie ħed jew 
ieħor mill-metodi jista jkun preferut.  
I.2. SELEZZJONI TAL-METODU XIERAQ  
Sabiex ikun mag ħżul il-metodu l-aktar xieraq, informazzjoni dwar is- 
solubbiltà tal-kimika, pressa tal-fwar u l-karatteristi ċi ta' l-assor ­
bazzjoni huma essenzali. L-istruttura jew il-formula tal-kimika 
għandhom ikunu mag ħrufa sabiex ikun ikkalkolati l-valuri teoreti ċi 
u/jew il-verifika tal-valuri mkejla tal-parametri, e ż. ThOD, ThCO  2 , 
DOC, TOC, COD (ara l-Annessi I u II).  
Kimiki tat-test li jin ħallu fl-ilma g ħal mill-anqas 100 mg/l jistg ħu 
ikunu assessjati bil-metodi kollha, basta li dawn ma jkunux volatili u mhux-assorbanti. G ħal dawk il-kimiki li jin ħallu bilmod fl-ilma, li 
huma volatili jew assorbanti, metodi xierqa huma indikati fit-Tabella 
1. Il-manjera li biha l-kimi ċi li jinħallu bilmod fl-ilma u kimiki 
volatili jistg ħu ikunu ittratti kif deskritt fl-Anness III. Kimiki moder ­
atament volatili jistg ħu ikunu ittestjati bil-metodu DOC tat-Tne ħħija 
tal-Kulur jekk ikun hemm spazzju bi ż-żejjed tal-gass fir-re ċipjenti 
tat-test (li g ħandhom ikunu mag ħluqa sewwa). F'dan il-ka ż, kontrol 
abjotiku jista jkun stabbilit sabiex jippermetti g ħal xi telf fi żiku.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabella 1  
Applikabbiltà tal-metodi tat-test  
Test Metodu analitiku Adattabbilità g ħal taħlitiet li huma: 
Jinħallu ftit volatili assorbenti  
DOC Tne ħħija tal-kulur Karbonju organiku 
mdewweb — — +/– 
Mod. OECD Tne ħħija tal- 
kulur Karbonju organiku 
mdewweb — — +/– 
Evoluzzjoni CO  2 Respirometrija: Evoluzzjoni 
CO 2 + — + 
Respirometrija manometrika Respirometrija manome ­
trika: konsum ta' l-ossi ġenu + +/– + 
Flixkun mag ħluq Respirometrija: ossi ġenu 
mdewweb +/– + + 
MITI Respirometrija: konsum ta' 
l-ossiġenu + +/– +  
Informazzjoni dwar il-purità jew il-proporzjonijiet relattivi ta' 
komponenti ma ġġuri tal-materjal tat-test hija me ħtieġa għall-interpre ­
tazzjoni tar-ri żultati akkwistati, spe ċjalment meta r-ri żultati huma 
baxxi jew mar ġinali.  
Informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika tat-test mal-bakterja (l- 
Anness IV) tista tkun ferm utili g ħall-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet 
xierqa tat-test u tista tkun essenzjali g ħall-interpretazzjoni tajba tal- 
valuri tal-biodegradazzjoni baxxa.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sabiex tkun verifikata l-pro ċedura, kimi ċi ta' referenza li jil ħqu l- 
kriterja g ħal biodegradabbilità fa ċli huma ittestjati billi jkun hemm 
garafina xierqa b'mod parallel mal-provi nomali tat-test.  
Kimiċi xierqa huma l-anilin (iddistillat frisk), l-a ċetat tas-sodju u l- 
benżoat tas-sodju. Dawn il-kimi ċi ta' referenza kollhom 
jkollhom degradazzjoni b'dawn il-metodi meta l-ebda inoculum ma 
jkun deliberatament mi żjud. 
Huwa suġġerit li kika ta' referenza g ħandha tkun imfittxija li jkollha 
biodegradabbilità fa ċli imma me ħtieġa b'żieda ma l-inoculum. Il- 
ftalat ta' l-idro ġenu tal-putassa kien proponut imma aktar evidenza 
jeħtieġ li tkun akkwistata b'din is-sustanza qabel ma tista tkun 
aċċettata bħal sustanza ta' referenza.  
Fit-testijiet respirometri ċi, il-komposti li jkun fihom in-nitro ġenu 
jistgħu jaffettwaw l-akkwist ta' l-ossi ġenu minħabba n-nitrifikazzjoni 
(ara l-Annessi II u V).  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODI TAT-TEST  
Taħlita, jew sospenzjoni, tas-sustanza tat-test f'medja minerali, hija 
innokulata u inkubata permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi, fid-dlam 
jew f'dawl baxx hafna. L-ammont ta' DOC fit-ta ħlita tat-test 
minħabba l-inoculum g ħandu jin żamm baxx kemm jista jkun 
possibbli imqabbel ma l-ammont ta' DOC min ħabba s-sustanza tat- 
test. Ghandu jkun hemm mar ġini għall-attività endo ġenea ta' l- 
inoculum billi jkunu mwettqa testijiet parallelli fl-imbjank bl- inoculum imma ming ħajr is-sustanza tat-test, g ħalkemm l-attività 
endoġenea taċ-ċelloli fil-pre żenta tas-sustanza ma tkunx e żattament 
taqbel ma dik fil-kontroll endo ġeneu. Sustanza ta' referenza tkun 
utilizzata b'mod parallel g ħall-verifika ta' l-operazzjoni tal-pro ċeduri.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Ġeneralment, degradazzjoni hija segwita bid-determinazzjoni tal- 
parametri, b ħalma huma DOC, produzzjoni CO  2 bl-akkwist ta' l- 
ossiġenu, u l-kejl ikun me ħud f'intervalli ta' spiss suffi ċjenti sabiex 
jippermettu l-identifikazzjoni tal-bidu u tat-tmiem tal-biodegra ­
dazzjoni. B'respirometri awtomati ċi, il-kejl ikun kontinwu. DOC ta' 
kultant huwa mkejjel b' żieda ma parametru ie ħor, imma dan norm ­
alment ise ħħ biss fil-bidu u fit-tmiem tat-test. Anali żi kimika 
speċifika tista wkoll tkun u żata għall-assessjar tad-degradazzjoni 
primarja tas-sustanza tat-test, u sabiex tkun determinata l-kon ċen­
trazzjoni ta' xi sustanzi intermedji iffurmati (obligatorja fit-test 
MITI).  
Normalment, it-test idum 28 jum. B'danakollu, t-testijiet jistg ħu 
jieqfu qabel it-28 jum, i.e. malli l-kurva tal-bijodegredazzjoni tkun 
laħqet il-qu ċċata lixxa g ħal mill-anqas 3 determinazzjonijiet. It- 
testijiet jistg ħu wkoll ikunu mtawla lill hinn minn 28 jum meta l- 
kurva turi li l-biodegradazzjoni tkun bdiet imma l-qu ċċata lixxa ma 
tkunx intla ħqet fil-jum 28.  
I.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
1.5.1.  Reprodu ċibbiltà  
Minħabba n-natura tal-biodegradazzjoni u tal-popolazzjoni m ħallta 
tal-bakterja u żata bħala inocula, determinazzjonijiet g ħandhom 
jitwettqu mill-anqas b'mod doppju.  
Hija esperjenza komuni li akbar ma tkun il-kon ċentrazzjoni tal- 
mikro-organi żmi inizjalment mi żjuda mal-medja tat-test, aktar tkun 
żgħira l-varjazzjoni bejn ir-repetizzjonijiet. Testijiet bi ċ-ċrieki kienu 
wkoll urew li kien hemm varjazzjonijiet kbar bejn ir-ri żultati 
akkwistati minn laboratorji differenti, imma ftehim tajjeb huwa normalment akkwistat b'komposti fa ċilment biodegradabbli.
 
1.5.2.  Validità tat-test  
Test huwa meqjus b ħala validu jekk id-differenza ta' l-estremi fil- 
valuri tar-repetizzjoni tat-tne ħħija tal-kimika tat-test fil-qu ċċata lixxa, 
fit-tmiem tat-test jew fit-tmiem tas-sessjoni ta' 10 ijiem, kif xieraq, 
hija anqas minn 20 % u jekk il-per ċentwal tad-degradazzjoni tas- 
sustanza ta' referenza jkun la ħaq il-livell g ħal biodegradabbiltà fa ċli 
sa 14-il jum. Jekk wa ħda minn dawk il-kondizzjonijiet ma tkunx 
milħuqha, it-test g ħandu jkun repetut. Min ħabba l-limitazzjoni 
stretta tal-metodi, valuri baxxi mhux ne ċessarjament ifissru li s- 
sustanza tat-test ma tkun biodegradabbli permezz tal-kondizzjonijiet ambjentali, imma tindika li aktar xog ħol għandu jsir sabiex tkun 
stabbilita l-biodegradabbiltà.
 
Fit-test tat-tossi ċità, li jkun fih kemm it-test tas-sustanza u kimika ta' 
referenza, anqas minn 35 % degradazzjoni (ibba żat fuq DOC) jew 
anqas minn 25 % (ibba żata fuq ThOD jew ThCO  2 ) li tkun se ħħet 
matul l-14-il jum, il-kimika tat-test tista tkun meqjusa b ħala inibitri ċi 
(ara wkoll l-Anness IV). Is-serje ta' testijiet g ħandu jkun repetut, jekk 
possibbli bl-u żu ta' kon ċentrazzjoni aktar baxxa tal-kimika tat-test 
u/jew ta' kon ċentrazzjoni aktar g ħolja ta' l-inoculum, imma mhux 
aktar minn 30 mg solidi/litru.  
I.6. PROCEDURA ĠENERALI UPREPARAZZJONIJIET  
Il-kondizzjonijiet ġenerali applikabbli g ħat-testijiet huma riassunti fit- 
Tabella 2. Apparat u l-kondizzjonijiet sperimentali tal-kondizzjonijiet 
li jappartieni spe ċifikament g ħal test individwali huma deskritti aktar 
tard taħi l-intestatura g ħall-dak it-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabella 2  
Kundizzjonijiet tat-test  
Test DOC Tne ħħija 
tal-kulur Evoluzzjoni 
CO 2 Respirometrija 
manometrika Għażla 
modifikati Flixkun 
magħluq OECD MITI (1)  
Konċentraz­
zjoni tas- Sustanza tat- test hija b ħ 
ala mg/l 100 2-10 100 
mg DOC/l 10-40 10-20 10-40 mg ThOD/l 50-100 5-10 
Konċentraz­
zjoni ta' l- 
Inoculum 
(f'ċelloli/I, 
b'mod approssim ­
attiv) ≤ 30 mg/1 SS 
jew ≤ 100 ml effluwent/1 
(10
 7 - 10  8 ) 0,5 ml 
affluwent 
sekondarju/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml ta' l- 
effluwent/1 
(10 4 - 10  6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 - 10  8 ) 
Konċentraz­
zjoni ta' l- 
elementi fil- medja 
minerali (fi 
mg/l) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 
Na 86 8,6 17,2 
K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 preferib ­
bilment 7,0 
Temperatura 22 ± 2
 o C 25 + 1  o C 
DOC = Dissolved Organic Carbon 
(Karbonju organiku mdewweb) ThOD = Theoretical 
Oxygen Demand 
(Talba teoretika ta' l-ossiġenu) SS = Solidi sospi żi
 
I.6.1.  Ilma tat-trattib  
Ilma deonizzat jew distillat, ħieles minn kon ċentrazzjonijiet inibitorji 
ta' sustanzi tossi ċi (eż. Cu  ++ jonji) huwa w żat. Dan g ħandu jkun fih 
mhux aktar minn 10 % tal-kontenut tal-karbonju organiku introdott bil-materjal tat-test. Il-purità g ħolja ta' l-ilma tat-test hija me ħtiega 
sabiex telimina l-valuri g ħolja fl-imbjank. Kontaminazzjoni tista 
tirriżulta minn impuritajiet inerenti u wkoll minn re żini ta' l- 
iskambju tal-jonji u l-materjal lysed mill-bakterja u l-algae. G ħal 
kull serje ta' testijiet g ħandek tu ża lott wie ħed biss ta' ilma, 
ivverifikat bil-quddiem bl-anali żi DOC. Tali verifika ma tkunx 
meħtieġa għat-test tal-flixkun mag ħluq, imma l-konsum ta' l- 
ossiġenu ta' l-ilma g ħandu jkun baxx.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Ta ħlitiet bil-lest ta' komposti minerali  
Sabiex isiru t-ta ħlitiet tat-test, ta ħlitiet bil-lest tal-kon ċentrazzjonijiet 
xierqa jkunu mag ħmula minn komponenti minerali. Dawn it-ta ħlitiet 
bil-lest li ġejjin jistg ħu jkunu w żati (bil-fatturi differenti tat-trattib) 
għall-metodu DOC Tne ħħija bil-kulur, G ħażla OECD Modifikata, 
Evoluzzjoni CO  2 , Respirometrija Manometrika, it-test tal-Flixkun 
Magħluq. 
Il-fatturi tat-trattib u, g ħat-test MITI, il-preparazzjoni spe ċifika tal- 
medja minerali, huma mog ħtija taht l-intestaturi tat-testijiet spe ċifiċi. 
Taħlitiet bil-lest:  
Ipprepara t-ta ħlitiet bil-lest li ġejjin, bl-u żu ta' rea ġenti ta' grad 
analitiku. 
a Monopotassium dihydrogen orthophosphate, 
KH  2 PO 4 8,50 g 
Dipotassium monohydrogen orthophosphate, 
K 2 HPO  4 Disodium 21,75 g 
monohydrogen orthophosphate dihydrate 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O Klorid 33,40 g 
ta' l-ammonium NH  4 Cl 0,50 g 
Dewweb fl-ilma u wassal sa 1 litru. Il-pH tat- 
taħlita għandu jkun 7,4. 
b Klorid tal-kal ċji, anidriju, CaCl  2 27,50 g 
jew dihidrat tal-klorid tal-kal ċju CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g 
Dewweb fl-ilma u wassal sa litru 
c Eptaidrat tas-sulfat tal-magne żju, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru 
d Ħadid (III) eksaidrat tal-klorid, FeC1  3 . 6H  2 O 0,25 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru.  
Nota: Sabiex tkun evitata l- ħtieġa li tkun ippreparata din is- 
soluzzjonu immedjetament qabel l-u żu, żid qatra ta' HCL ikkon ċ­
entrat, jew 0,4 g mel ħ disodju ta' l-a ċidu ethylenediaminetetra- 
aċetiku (EDTA) kull litru.  
1.6.3.  Ta ħlitiet bil-lest ta' kimi ċi 
Per eżempju, dewweb 1-10 g, kif xieraq, tal-kimika tat-test jew ta' 
referenza, f'ilma de-jonizzata u wassal sa litru meta s-solubbiltà 
teċċedi 1 g/l. Altrimenti, ipprepara t-ta ħlitiet bil-lest fil-medja 
minerali jew żid il-kimika direttament mal-medja minerali. G ħat-trat­
tament ta' kimi ċi anqas solubbli, ara l-Anness III, imma fit-test MITI 
(il-Metodu  o C.4-F), la s-solventi u l-anqas l-a ġenti emulsifikanti 
m'għandhom ikunu w żati. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
1.6.4.  Inocula  
L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, 
effluwenti tad-drena ġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wi ċċ l-art u 
ħamrija jew minn ta ħlita ta' dawn. G ħal testijiet tar-Repirometrija ta' 
l-Evoluzzjoni jew Manjometika DOC Tne ħħija bil-Kulur, CO  2 , jekk 
il-ħama' attivata tkun u żata, dan g ħandu jkun me ħud minn impjant 
tat-trattament jew unità ta' skala ta' laboratorju li tir ċieci predomi ­
nantament drena ġġ domestiku. Kien instab li Inocula minn sorsi 
oħrajn tagħti tixrid aktar g ħoli tar-riżultati. Għall-għażla OECD 
Modifikata u t-testijiet tal-Flixkun Mag ħluq, inoculum ming ħajr il- 
frak tal-ħama' aktar imdewwb huwa me ħtieġ u s-sorsi preferita huwa 
l-effluwent sekondarju mill-impjant tat-trattament ta' l-ilma ta' l-iskart 
domestiku jew minn unita ta' skala ta' laboratorju. G ħat-test MITI, l- 
inoculum huwa akkwistat minn ta ħlita ta' sorsi u huwa deskritt ta ħt l- 
intestatura ta' dan it-test spe ċifiku.  
I.6.4.1.  Inoculum minn ħama' attivita  
Iġbor kampjun minn ħama' attivata friska mit-tank ta' l-arjazzjoni ta' 
l-impjant tat-trattament tad-drena ġġ jew minn unit ′ta' skala tal- 
laboratorju li predominantament jitratta d-drena ġġ domestiku. 
Warral il-parti ċelli rozzi, jekk me ħtieġ bil-filtrazzjoni minn passatur 
fin u wara dan zomm il- ħama f'mod erobiku.  
B'mod alternattiv, ħalli joqgħod, jew inkella g ħaddi miċ-ċentrufuga 
(eż. fi 1 100 g g ħal 10 min.) wara t-tne ħħija ta' xi parti ċelli rozzi. 
Warrab is-supernatant. Il- ħama tista tkun ma ħsula f'medja minerali. 
Issospendi l- ħama ikkon ċentrata f'medja minerali sabiex takkwista 
konċentrazzjoni ta' 3-5 g solidi sospi żi kull litru u imla bl-arja 
sakemm me ħtieġ. 
Il-ħama' għandha tkun mi ġbura proporzjonalment minn impjant ta' 
xogħol konvenzjonali. Jekk il- ħama jkun je ħtieġ li tinġabar minn 
impjant ta' trattament qawwi, jew ikun ma ħsub li jkun fiha inibituri, 
din għandha tkun ma ħsula. Ħalliha toqg ħod jew g ħaddi l-ħama' 
sospiża mill-ġdid minn ċentrifugu wara li tkun im ħallta sewwa, 
warrab is-supernatant u mill- ġdid erġa issospendi l- ħama' maħsula 
f'volum ie ħor tal-medja minerali. Irrepeti din il-pro ċedura sakemm 
il-ħama' tkun meqjusa b ħala ħielsa minn substrata jew inibitur 
eċċessivi.  
Wara li s-sopenzjoni s ħiħa mill-ġdid tkun akkwistata, jew b' ħama' 
mhux trattata, warrab il-pamkun immedjetament qabel l-u żu għad- 
determinazzjoni tal-pi ż xott tas-solidi sospi żi. 
Alternattiva o ħra hija li tkun omo ġenizzata l- ħama' attivata (3-5 g 
solidi sospi żi kull litru). Il- ħama' hija trattata f' ħawwadi mekkaniku 
għal 2 minuti f'velo ċità medja. Ħalli l-ħama' tal-ħawwadi toqg ħod 
għal 30 minuta jew aktar jekk hekk me ħtieġ u ferra l-likwidu g ħall- 
użu bħala inoculum bir-rata ta' 10 ml/l tal-medja minerali.  
I.6.4.2.  Sorsi o ħrajn ta' l-inoculum  
Dan jista jkun akkwistat minn effluwent sekondarju ta' l-impjant tat- 
trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li jir ċievi b'mod 
predominanti d-drena ġġ domestiku. I ġbor kampjun frisk u żommu 
erobiku waqt it-trasport. Ħallieh joqg ħod għal siegħa jew iffiltra 
minn karta rozza tal-filtru u żomm l-effluwent imferra jew il-filtrat 
erobiku sakemm ikunu me ħtieġa. Sa 100 ml ta' dan it-tip ta' 
inoculum jista jkun u żat ma kull litru ta' medja.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Sors ieħor għall-inoculum hija l-ilma tal-wi ċċ ta' l-art. F'dan il-ka ż, 
iġbor kampjun xieraq mill-ilma tal-wi ċċ, eż. xmara, g ħadira, u 
żommu erobiku sakemm ikun me ħtieġ. Jekk me ħtieġ, ikkonċentra 
l-inoculum bil-fitrazzjoni jew bi ċ-ċentrifugazzjoni.  
1.6.5.  Pre-kondizzjonat ta' l-inocula  
L-inocula tista tkun pre-kondizzjonata g ħall-kondizzjonijiet speri ­
mentali,, imma mhux pre-afattata g ħall-kimika tat-test. Il-pre-kondiz ­
zonjar jikkonsisti mill-arjazzjoni tal- ħama' attvita f'medja minerali 
jew effluwent sekondarju g ħal 5-7 tijiem fit-temperatura tat-test. Il- 
pre-kondizzjonar ta' kull tant itejjeb il-pr ċiżjoni tal-metodi tat-test bit- 
tnaqqis tal-valuri vojta. Huma meqjus b ħala mhux ne ċessarju il-pre- 
kondizzjonar ta' l-inoculum MITI.  
1.6.6.  Kontrolli abjoti ċi 
Meta meħtieġ, għandek tivverifika d-degradazzjoni abjotika possibbli 
tas-sustanza tat-test bid-determinazzjoni tat-tne ħħija ta' DOC, l- 
akkwist ta' l-ossi ġenu jew ta' l-evoluzzjoni tad-diossidu tal- 
karbonju f'kontrolli sterili li ma jkun fihom l-ebda inoculum. 
Sterlizza bil-filtrazzjoni minn membrana (0,2 - 0,45 mikrometri) 
jew biż-żieda ta' sustanza tossika xierqa fil-kon ċentrazzjoni adatta. 
Jekk tkun u żata l-membrana tal-filtrazzjoni, i ġbor kampjuni b'mod 
axettiku g ħaż-żamma tal-isterilità. Sakemm l-assorbazzjoni tal-kimika 
tat-test ma tkunx di ġa ġiet imwarrba minn qabel, testijiet li jkejlu l- 
biodegradazzjoni b ħala t-tneħħija ta' DOC, spe ċjalment bl-inocula 
tal-ħama' attivita, g ħandhom jinkludu kontroll abjotiku li huwa 
innokulat u ivvelenat.  
I.6.7.  Numru ta' garafini  
In-numru ta' garafini fi prova tipika huwa deskritt ta ħt l-intestaturi ta' 
kull wieħed mit-testijiet.  
It-tip ta' garafina li ġej jista jkun u żat: 
— Sospenzjoni tat-test: li jkun fiha s-sustanza tat-test u l-inoculum  
— Inoculumi fl-imbjank: li jkun fih biss l-inoculum  
— Proċedura tal-kontroll: li jkun fiha s-sustanza ta' referenza u l- 
inoculum  
— Kontroll ta' abjotiku sterili: sterili, li jkun fiha s-sustana tat-test 
(ara I.6.6)  
— Kontroll ta' l-adsorbazzjoni: li jkun fiha s-sustanza, l-inoculum u 
l-aġent sterilizzanti  
— Kontroll tat-tossi ċità: li jkun fiha s-sustanza tat-test, is-sustanza 
ta' referenza u l-inoculum  
Huwa mandatorju li d-determinazzjoni tas-sospenzjoni tat-test u l- 
imbjank ta' l-inoculum ise ħħ b'mod paralell. Huwa rakommandabbli 
li jsiru d-determinazzjonijiet fil-garafini l-o ħrajn b'mod parallel ukoll.  
Dan jista, b'danakollu, mhux dejjem ikun possibbli. Assigura li 
kampjoni jew qari suffi ċjenti jkunu me ħuda sabiex jippermettu t- 
tneħħija perċentwali fl-ispa żju ta' l-10 ijiem ta' l-assessjar.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DATA U EVALWAZZJONI  
Fil-kalkolu ta' D  t , id-degradazzjoni pre ċentwali, il-valuri medji tal- 
kejl duplikat tal-parametru fi ż-żewġ reċipjenti tat-test u l-imbjank ta' 
l-inoculum, ikunu w żati. Dawn il-formuli huma stabbiliti fis- 
sezzjonijiet ta' hawn ta ħt fit-testijiet spe ċifiċi. Il-korsa tad-degra ­
dazzjoni hija murija b'mod grafiku u l-perijodu ta' 10 ijiem huwa indikat. Ikkalkola u irrapporta l-per ċentwal tat-tne ħħija milħuq fit- 
tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem u l-valur tal-qu ċċata lixxa jew fit- 
tmiem tat-test, liema minnhom huwa xieraq.
 
Fit-testijiet respirometri ċi, l-komposti li jkun fihom in-nitro ġenu 
jistgħu jaffettwaw l-akkwist ta' l-ossi ġenu minħabba n-nitrifikazzjoni 
(ara l-Annessi II u V).  
I.7.1.  Degradazzjoni mkjela permezz tad-determinazzjoni DOC  
Id-degredazzjoni per ċentwali D  t kull darba li kampjun ikun mi ġbur 
għandha tkun ikkalkolata b'mod separat g ħal kull wa ħda mill-garafini 
li jkun fihom is-sustanza tat-test bl-u żu tal-valuri medji tal-kejn 
duplikat DOC sabiex il-validità tat-test tista tkun assessjata (ara I.5.2.). Hija ikkalkolata bl-u żu ta' din l-ekwazzjoni li ġejja:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
meta:  
D t = % degradazzjoni fil- ħin t, 
C o = il-medja tal-bidu tal-kon ċentrazzjoni ta' DOC tal-kultura 
inokulata fil-medju li jkun fih is-sustanza tat-test (mg 
DOC/l),  
C t = il-medja tal-kon ċentrazzjoni ta' DOC tal-kultura innokulata 
fil-medju li jkun fih is-sustanza fil- ħin t (mg DOC/l),  
C bo = il-medja tal-bidu tal-kon ċentrazzjonini ta' DOC fl-imbjank 
inokulata fil-medja minerali (mg DOC/l),  
C bt = il-medja tal-kon ċentrazzjoni ta' DOC fl-imbjank innokulata 
fil-medja minerali fil- ħin t (mg DOC/l),  
Il-konċentrazzjoninijiet kollha huma mkejla b'mod sperimentali.  
I.7.2.  Degradazzjoni mkjela permezz ta' anali żi speċifika  
Meta data analitika spe ċifika tkun disponibbli, wettaq il-kalko ­
lazzjoni tal-biodegredazzjoni primarja minn:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
meta:  
D t = % degradazzjoni fil- ħin t, normalment 28 jum,  
S a = ammont residwu tas-sustanza tat-test fil-medja inokulata fit- 
tmiem tat-test (mg),  
S b = l-ammont residwu tas-sustanza tat-test fit-test fl-imbjank bl- 
ima/medja li mag ħha tkun ġiet miżjuda biss is-sustanza tat- 
test (mg).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Degredazzjoni abjotika  
Meta jkun u żat il-kontroll abjotiku sterili, wettaq il-kalkolazzjoni tal- 
perċentali tad-degradazzjoni abjotika bl-u żu:% degradazzjoni abjotika  
% degradazzjoni abjotika  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
Meta:  
C s(o) = DOC Il-kon ċentrazzjonini sterili tal-kontroll fil-jum 0  
C s(t) = DOC Il-kon ċentrazzjonini sterili tal-kontroll fil-jum t  
I.8. RAPPURTA ĠĠ 
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li 
ġejja: 
— is-sustanzi tat-test u tar-referenza, u il-purità tag ħhom,  
— il-kondizzjoni tat-test,  
— inoculum: is-sit(i) tan-natura u l-kampjunar, kon ċentrazzjonini u 
xi trattament ta' pre-kondizzjonar;  
— il-proporzjon u n-natura tal-iskart industriali pre żenti fid-drena ġġ, 
jekk mag ħruf; 
— iż-żmien u t-temperatura tat-test;  
— fil-każ ta' kimika tat-test li ma tantx tin ħall, it-trattament mog ħti; 
— il-metodu tat-test applikat; ir-ra ġinijiet xjentifi ċi u l-ispeja ­
gazzjoni g ħandha tkun mog ħtija għal xi tibdil tal-pro ċedura;  
— il-folja tad-data;  
— kwalunkwe fenomena ta' l-inibizzjoni;  
— xi degradazzjoni abjotika osservata;  
— id-data spe ċifika kimika analitika, jekk disponibbli;  
— id-data analitika dwar l-intermedjati, jekk disponibbli;  
— il-grafika tad-degradazzjoni per ċentwali kontra l- ħin għat-test u s- 
sustanzi ta' referenza; il-fa żi li ddewwem il-process, il-fa żi tad- 
degradazzjoni, il- perijodu ta' 10 ijiem u l-linja g ħandha 
kjarament tkun indikata (l-Anness I). Jekk it-test ikun konformi 
mal-kriterja tal-validità, l-medja tal- per ċentwali tad-degra ­
dazzjoni fil-garafini li jkun fihom is-sustanza tat-test tista tkun użata għall-grafika.
 
— perċentwal tat-tne ħħija eata l-perijodu ta' 10 ijiem, u l-linja lixxa 
fil-quċċata jew fit-tmiem tat-test.  
PARTI II.  DOC TEST TAT-TNE ĦĦIJA TAL-KULUR  
(Metodu C.4-A)  
II.1. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata li jkun fiha kon ċen­
trazzjonini mag ħrufa tas-sustanza tat-test 10-40 mg DOC/l) b ħala l- 
unika sorsi nominali ta' karbonju organiku jkun mog ħti l-arja fid- 
dlam jew fid-dawl baxx fi 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Id-degradazzjoni hija segwita bl-anali żi DOC matul intervalli 
frekwenti matul perijodu ta' 28 jum. Il-grad tal-biodegradazzjoni 
huwa ikkalkolat bl-espressjoni tal-kon ċentrazzjoni DOC imne ħħija 
(ikkorreġuta għal dak fil-kontroll ta' l-inoculum fl-imbjank) b ħala 
perċentwali tal-kon ċentrazzjoni inizjali pre żenti. Il-grad tal-biodegra ­
dazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-anali żi kimika 
supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni.  
II.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
11.2.1.  Apparat  
(a) Garafini koni ċi, eż. 250 ml sa 2 1, jiddependi mill-volum 
meħtieġ għall- analiżi DOC;  
(b) Magna ta ċ-ċekċik li tista takkomoda l-garafini koni ċi, jew bil- 
kontroll awtomatiku tat-temperatura jew u żata fit-temperatura 
kostanti tal-kamra, u forza suffi ċjenti tal-potenza g ħaż-żamma 
tal-kondizzjonijiet etobi ċi fil-garafini kollha;  
(ċ) Apparat tal-filtrazzjoni, b'membrani xierqa;  
(d) Anali żattur DOC;  
(e) Apparat g ħad-determinazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb;  
(f) Ċentrifuga.  
11.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Għall-preparazzjoni tat-ta ħlitiet bil-lest, ara I.6.2.  
Ħawwad 10 ml tat-ta ħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat- 
taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.  
11.2.3.  Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum  
L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, 
effluwenti tad-drena ġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wi ċċ l-art u 
ħamrija jew minn ta ħlita ta' dawn.  
Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.  
11.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
Bħala eżempju, introdu ċi 800 ml porzjonijiet tal-medja minerali 
ġewwa garafini koni ċi 2 l u żid volumi suffi ċjenti tat-ta ħlitiet bil- 
lest tat-test u tas-sustanzi ta' referenza mal-garafini separati sabiex takkwista kon ċentrazzjoni kemikali ekwivalenti g ħal 10-40 mg 
DOC/1. Ivverifika l-valuri pH u a ġġusta, jekk me ħtieġ, għal 7,4. 
Inokula l-garafini b' ħama' attivita jew b'sorsi o ħrajn ta' l-inocula 
(ara I.6.4.), sabiex takkwista kon ċentrazzjoni mhux aktar minn 
30 mg solidi sospi żi fil-litru. Ipprepara wkoll il-kontrolli ta' l- 
inoculum fil-medja minerali imma ming ħajr il-kimika tat-test jew 
ta' referenza.
 
Jekk meħtieġ, uża reċipjent wie ħed sabiex tivverifika l-possibbiltà ta' 
l-effett inibitorju tal-kimika tat-test bl-inokulazzjoni tat-ta ħlita li jkun 
fiha, fil-medja minerali, kon ċentrazzjonijiet komparabbli kemm tal- 
kimika tat-test u dik ta' referenza.  
Ukoll, jekk me ħtieġ, organizza garafina sterili o ħra sabiex tivverifika 
jekk il-kimika tat-test tkun degradata abjotikament bl-u żu tat-taħlita 
mhux inokulata tal-kimika (ara I.6,6.).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
B'mod addizzjonali, jekk ikun hemm suspett li l-kimika tat-test tkun 
sinifikament assorbita fuq il- ħġieġ, ħama' eċċ., wettaq assessjar 
preliminari sabiex tkun determinata l-medda possibbli ta' l-assor ­
bazzjoni u b'hekk l-adattabbiltà tat-test g ħall-kimika (ara t-Tabella 
1). Organizza garafina li jkun fiha s-sustanza tat-test, l-inculum u 
l-aġent sterilizzanti.  
Wassal il-volumi fil-garafini kollha g ħal 1:1 bil-medja minerali u, 
wara t-taħwib, ħu kampjun minn kull garafina sabiex tiddetermina l- 
konċentrazzjonini inizjali ta' DOC (ara l-Anness II,4). G ħatti l-ftug ħ 
tal-garafini, e ż. b'liega ta' l-aluminju, b'tali mod hekk li tippermetti l- 
iskambju ħieles ta' l-arja bejn il-garafina u l-atmosfera tal-madwar. 
Imbagħad deffes ir-re ċipjenti fil-magna ta ċ-ċekċik għall-bidu tat-test.  
11.2.5.  Numru ta' garafini fi prova tipika  
Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test,  
Il-garafini 3 u 4: L-imbjank ta' l-inoculum,  
Il-garafina 5: Pro ċedura tal-kontroll preferibbilment  
u meta me ħtieġ: 
Il-garafina 6: Kontroll ta' abjotiku sterili  
Il-garafina 7: Kontroll ta' l-adsorbazzjoni  
Il-garafina 8: Kontroll tat-tossi ċità 
Ara wkoll I.6.7.  
II.2.6.  It-twettieq tat-test  
Matul it-test, iddetermina l-kon ċentrazzjonijiet ta' DOC f'kull 
garafina b'mod doppju f'intervalli tal- ħin magħruf, ta' spiss b'mod 
suffiċjenti sabiex tkun tista tiddetermina l-bidu tal-perijodu ta' 10 
ijiem u l-persenta ġġ tat-tneħħija fit-tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem. 
Ħu biss il-volum minimu tas-sospenzjoni tat-test me ħtieġ għal kull 
determinazzjoni.  
Qabel il-kampjunar g ħamel tajjeb g ħat-telf ta' l-evaporazzjoni mill- 
garafini bi ż-żieda ta' ilma tat-trattib (I.6.1) fl-ammont me ħtieġ, jekk 
ikun neċessarju. Ħawwad il-medja tal-kultura sewwa qabel ma ti ġbed 
il-kampjun u assigura li l-materjal li je ħel mal-ġnub tar-re ċipjenti 
jkun imdewweb jew sospi ż qabel il-kampjunar. Immedjetament 
iffiltra mill-membrana jew b' ċentrifuga (ara l-Anness II.4) wara li 
jkun inġabar il-kampjun. Analizza l-kampjuni tal-filtrat jew ta ċ- 
ċentrifuga l-istess jum, altrimentri a ħżen fi 2-4  o C għal massimu 
ta' 48 sieg ħa, jew f'anqas minn 18  o C għal perijodu twil.  
II.3. DATA U RAPPORTA ĠĠ 
II.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
Ikkalkola l-persenta ġġ tad-degradazzjoni fil ħin kif mog ħti taħt I.7.1. 
(determinazzjoni DOC) u, preferibbilment, ta ħt I.7.2. (anali żi speċ­
ifika).  
Irreġistra r-riżultati kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
11.3.2.  Validità tar-ri żultati  
Ara I.5.2.  
11.3.3.  Rappurta ġġ 
Ara I.8.  
II.4. FOLJA TAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti aktar il-quddiem.  
TEST DOK TAT-TNE ĦĦIJA TAL-KULU R  
1. LABORATORJU  
2. IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  
3. IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/l b ħala kimika  
Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, g ħal: mg/l b ħala kimika  
4. INOCULUM  
Sorsi:  
Trattament mog ħti: 
Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:  
Konċentrazzjoni ta' solidi sospi żi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l  
5. DETERMINAZZJONI TAL-KARBONJU  
Analizzatur tal-karbonju:  
Garafina Nru DOC wara jiem n (mg/I) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Kimika tat-test 
flimkien ma l- inoculum 
1 a
 1 
a 2 
a, medja 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medja 
C b(t) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Garafina Nru DOC wara jiem n (mg/I) 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
Inoculum fl- 
imbjank ming ħajr 
il-kimika tat-test 3 c 1 
c 2 
c, medja C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, medja 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALWAZZJONI TAD-DATA MHIX ITTRATTATA  
Garafina Nru % degradazzjoni wara n jiem 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Medja (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D1 u D  2 m'għandhiex tittie ħed il-medja tag ħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.  
Nota : formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kimika tar-referenza u 
l-kontrolli tat-tossi ċità. 
7. KONTROLLI ABJOTICI  (voluntarji)  
Żmien (jiem) 
0 t  
Konċ. DOC (mg/l) f'kontroll sterili C s(o) C s(t) 
% degradazzjoni abjotika  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ANAL ŻI TA' KIMIKA SPECIFIKA  (voluntarja)  
ammont residwu tal- kimika tat- 
test fit-tmiem (mg/l) % degradazzjoni primarja tat-test  
Kontroll sterili S  b ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
ammont residwu tal- kimika tat- 
test fit-tmiem (mg/l) % degradazzjoni primarja tat-test  
Medja tat-test inokulat S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTI III.  TEST TA' L-G ĦAŻLA OECD MODIFIKATA  
(Metodu  o C.4-B)  
III.1. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata li jkun fiha kon ċen­
trazzjoni mag ħrufa tas-sustanza tat-test (10-40 mg DOC/l) b ħala l- 
unika sorsi nominali ta' karbonju huwa inokulat b' 0,5 ml effluwent 
kull litru tal-medja. It-ta ħlita hija mog ħtija l-arja fid-dlam jew f'dawl 
baxx ħafna fi 22 ± 2  o C. 
Id-degradazzjoni hija segwita bl-anali żi DOC matul intervalli 
frekwenti matul perijodu ta' 28 jum. Il-grad tal-biodegradazzjoni 
huwa ikkalkolat bl-espressjoni tal-kon ċentrazzjonini DOC 
imneħħija (ikkorre ġuta għal dak fil-kontroll ta' l-inoculum fl- 
imbjank) b ħala perċentwali tal-kon ċentrazzjonini inizjali pre żenti. 
Il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat 
mill-anali żi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l- 
inkubazzjoni.  
III.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
III.2.1. Apparat  
a) Garafini koni ċi, eż. 250 ml sa 2 1itri, jiddependi mill-volum 
meħtieġ għall-analiżi DOC;  
b) Magna ta ċ-ċekċik – li tista takkomoda l-garafini koni ċi, jew bil- 
kontroll awtomatiku tat-temperatura jew u żata fit-temperatura 
kostanti tal-kamra, u forza suffi ċjenti tal-potenza g ħaż-żamma 
tal-kondizzjonijiet etobi ċi fil- garafini kollha;  
ċ) Apparat tal-filtrazzjoni, b'membrani xierqa;  
d) Analiżattur DOC;  
e) Apparat g ħad-determinazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb;  
f) Ċentrifuga.  
III.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Għall-preparazzjoni tat-ta ħlitiet bil-lest, ara I.6.2.  
Ħawwad 10 ml tat-ta ħlita (a) ma 80 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat- 
taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.  
Dan il-metodu ji ża biss 0,5 ml effluwent/litru b ħala inoculum u 
għalhekk il-medja jista jkun li tkun te ħtieġ li tkun imsa ħħa b'elementi 
traċċa u fatturi tat-tkabbir. Dan huwa mag ħmul biż-żieda ta' 1 ml 
kull wieħed mat-ta ħlitiet li ġejjin għal kull litru tal-medja finali:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Taħlita ta' l-element tra ċċa: 
Tetraidrat tas-sulfat tal-magne żja, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Aċidu Boriku, H  3 BO 3 57,2 mg 
Ħepaidrat tas-sulfat ta ż-żingu, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Ammonium heptamolybdate (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-ċelat (FeCl  3 aċidu ethylenediamine-tetra-a ċetiku) 100,0 mg 
Dewweb fi, u wassal g ħal 1 000 ml bl-ilma tat-trattib 
Taħlita tal-vitamina: 
Estratt tal- ħmira 15,0 mg  
Dewweb l-estratt tal- ħmira fi 100 ml ilma. Sterlizza bil-passa ġġ minn 
membrana 0,2 mikronji, jew g ħamilha friska.  
III.2.3.  Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum  
L-inoculum jkun akkwistat minn effluwent sekondarju ta' l-impjant 
tat-trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li jir ċievi 
b'mod predominanti d-drena ġġ domestiku. Ara I.6.4.2. u I.6.5.  
0,5 ml kull litru tal-medja minerali hija u żata. 
III.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
Bħala eżempju, introdu ċi 800 ml porzjonijiet tal-medja minerali 
ġewwa garafini koni ċi 2 l u żid volumi suffi ċjenti tat-ta ħlitiet bil- 
lest tat-test u tas-sustanzi ta' referenza mal-garafini separati sabiex 
takkwista kon ċentrazzjoni kemikali ekwivalenti g ħal 10-40 mg 
DOC/1. Ivverifika l-valur pH u a ġġusta, jekk me ħtieġ, għal 7,4. 
Innokula l-garafini fl-effluwent tad-drena ġġ fi 0,5 ml/litru (ara 
I.6.4.2.). Ippreparata wkoll il-kontrolli ta' l-inoculum fil-medja 
minerali ming ħajr il-kimika tat-test jew ta' referenza.  
Jekk meħtieġ, uża reċipjent wie ħed sabiex tivverifika l-possibbiltà ta' 
l-effett inibitorju tal-kimika tat-test bl-inokulazzjoni tat-ta ħlita li jkun 
fiha, fil-medja minerali, kon ċentrazzjonijiet komparabbli kemm tal- 
kimika tat-test u dik ta' referenza.  
Ukoll, jekk me ħtieġ, organizza garafina sterili o ħra sabiex tivverifika 
jekk il-kimika tat-test tkun degradat abjotikament bl-u żu tat-taħlita 
mhix inokulata tal-kimika (ara I.6,6.).  
B'mod addizzjonali, jekk ikun hemm suspett li l-kimika tat-test tkun 
sinifikament adsorbita fuq il- ħġieġ, ħama' eċċ., wettaq assessjar 
preliminari sabiex tkun determinata l-medda possibbli ta' l-adsor ­
bazzjoni u b'hekk l-adattabbiltà tat-test g ħall-kimika (ara t- Tabella 
1). Organizza garafina li jkun fiha s-sustanza tat-test, l-inculum u l- aġent sterilizzanti.
 
Wassal il-volumi fil-garafini kollha g ħal 1:1 bil-medja minerali u, 
wara t-taħwib, ħu kampjun minn kull garafina sabiex tiddetermina l- 
konċentrazzjonini inizjali ta' DOC (ara l-Anness II,4). G ħatti l-ftug ħ 
tal-garafini, e ż. b'liega ta' l-aluminju, b'tali mod hekk li tippermetti l- 
iskambju ħieles ta' l-arja bejn il-garafina u l-atmosfera tal-madwar. 
Imbagħad deffes ir-re ċipjenti fil-magna ta ċ-ċekċik għall-bidu tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Numru ta' garafini fi prova tipika  
Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test  
Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank  
Il-garafini 5: Pro ċedura tal-kontroll  
Preferibbilment u meta me ħtieġ: 
Il-garafini 6: Kontroll ta' abjotiku sterili  
Il-garafini 7: Kontroll ta' l-adsorbazzjoni  
Il-garafini 8: Kontroll tat-tossi ċità 
Ara wkoll I.6.7.  
III.2.6.  It-twettieq tat-test  
Matul it-test, iddetermina l-kon ċentrazzjoninijiet ta' DOC f'kull 
garafina b'mod doppju f'intervalli tal- ħin magħruf, ta' spiss b'mod 
suffiċjenti sabiex tkun tista tiddetermina l-bidu tal-perijodu ta' 10 
ijiem u l-ersenta ġġ tat-tneħħija fit-tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem. 
Ħu biss il-volum minimu tas-sospenzjoni tat-test me ħtieġ għal kull 
determinazzjoni.  
Qabel il-kampjunar g ħamel tajjeb g ħat-telf ta' l-evaporazzjoni mill- 
garafini bi ż-żieda ta' ilma tat-trattib (I.6.1) fl-ammont me ħtieġ, jekk 
ikun neċċessarju. Ħawwad il-medja tal-kultura sewwa qabel ma 
tiġbed il-kampjun u assigura li l-materjal li je ħel mal-ġnub tar- 
reċipjenti jkun imdewweb jew sospi ż qabel il-kampjunar. Immedja ­
tament iffiltra mill-membrana jew b' ċentrifuga (ara l-Anness II.4) 
wara li jkun in ġabar il-kampjun. Analizza l-kampjuni tal-filtrat jew 
taċ-ċentrifuga l-istess jum, altrimentri a ħżen fi 2-4  o C għal massimu 
ta' 48 sieg ħa, jew f'anqas minn 18  o C għal perijodu twil.  
III.3. DATA URAPPORTA ĠĠ 
III.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
Ikkalkola l-persenta ġġ tad-degradazzjoni fil ħin ta' kif mog ħti taħt 
I.7.1. (determinazzjoni DOC) u, voluntarjament, ta ħt I.7.2. (anali żi 
speċifika).  
Irreġistra r-riżultati kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.  
III.3.2. Validità tar-ri żultati  
Ara I.5.2.  
III.3.3. Rappurta ġġ 
Ara I.8.  
III.4. FOLJA TAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti aktar il-quddiem.  
TEST MODIFIKAT TAL-G ĦAŻLA OECD  
1. LABORATORJU  
2. IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/litru b ħala kimika  
Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, g ħal: mg/litru b ħala kimika  
4. INOCULUM  
Sorsi:  
Trattament mog ħti: 
Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:  
Konċentrazzjoni ta' solidi sospi żi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l  
5. DETERMINAZZJONI TAL-KARBONJU  
Analizzatur tal-karbonju:  
Garafina Nru DOC wara jiem n (mg/I) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Kimika tat-test 
flimkien ma l- 
inoculum 
1 a 1 
a 2 
a, medja 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medja 
C b(t) 
Inoculum fl- 
imbjank ming ħajr 
il-kimika tat-test 3 c 1 
c 2 
c, medja C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, medja 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALWAZZJONI TAD-DATAMHIX ITTRATTATA  
Garafina Nru % degradazzjoni wara n jiem 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Garafina Nru % degradazzjoni wara n jiem 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Medja (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 u D  2 m'għandhiex tittie ħed il-medja tag ħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.  
Nota : formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kimika tar-referenza u 
l-kontrolli tat-tossi ċità. 
7. KONTROLLI ABJOTICI  (voluntarji)  
Żmien (jiem) 
0 t  
Konċ. DOC (mg/l) f'kontroll sterili C s(o) C s(t) 
% degradazzjoni abjotika  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ANAL ŻI TA' KIMIKA SPECIFIKA  (voluntarja)  
Ammont residwu tal-kimika tat- 
test fit-tmiem % degradazzjoni primarja tat-test  
Kontroll sterili S  b 
Medja tat-test inokulat S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTI IV. TEST TA' L-EVOLUZZJONU CO  2 (METODU  o C.4-C)  
IV.1. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Volum imkejjel tal-medja minerali innokulata li jkun fiha kon ċen­
trazzjoni mag ħrufa tas-sustanza tat-test 10-40 mg DOC/l) b ħala l- 
unika sorsi nominali ta' karbonju organiku jkun mog ħti l-arja fid- 
dlam jew fid-dawl baxx. Id-degradazzjoni hija segwita matul 28 jiem bid-determinazzjoni tad-diossidu tal-karbonju prodott, li huwa marbut fil-barju jew fl-idossidu tas-sodju u li huma mkejjel bit- 
titrazzjoni ta' l-idrossu residwu b ħala karbonju mhux organiku. L- 
ammont tad-diossidu tal-karbonju prodott mit-test kimiku (ikkorre ġut 
għal dak derivat mill-inoculum fl-imbjank (huwa espress b ħala 
persentaġġ ta ThCO
 2 . Il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista 
wkoll ikun ikkalkolat mill-anali żi kimika supplemetari mwettqa fil- 
bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
IV.2.1.  Apparat  
a) Garafini, 2-5 litri, kull wa ħda mgħammra b'tubu ta' l-arjazzjoni li 
jwassal sa kwa żi il-qiegħ tar-reċipjent u bi ħruġ; 
b) Ħawwada manjeti ċi, għal meta jsir l-assessjar tal-kimika li ma 
tantx tinħall; 
ċ) Flixkien ta' assorbazzjoni tal-gass;  
d) Apparat g ħal kontroll u l-kejl tan-nixxija ta' l-arja;  
e) Apparat g ħat-tindig tad-diossidu tal-karbonju, g ħall-preparazzjoni 
ta' l-arja li hija ħielsa mid-dossidu tal-karbonju; jew b'mod alter ­
nattiv, ta ħlita ta' CO  2 ħieled mill-ossi ġenu u CO  2 ħieles min- 
nitroġenu, minn ċilindri tal-gass fil-proporzjonijiet korretti 
(20 % O  2 : 80 % N  2 ) jistgħu ikunu w żati; 
(f) Apparat g ħad-determinazzjoni tad-diossidu tal-karbonju, jew 
b'mod titrimetriku jew inkella f'xi g ħala ta' l-analizzatur tal- 
karbonju mhux- organiku;  
(g) Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);  
(h) Analiżattur DOC (voluntarju).  
IV.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Għall-preparazzjoni tat-ta ħlitiet bil-lest, ara I.6.2.  
Ħawwad 10 ml tat-ta ħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat- 
taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.  
IV.2.3.  Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum  
L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, 
effluwenti tad-drena ġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wi ċċ l-art u 
ħamrija jew minn ta ħlita ta' dawn.  
Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.  
IV.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
Bħala eżempju, il-volumi u l-pi żijiet li ġejjin jindikaw il-valuri g ħal 
garafini ta' 5-litri li jkun fihom 3 litri ta' sospensjoni. Jekk volumi iżgħar ikunu w żati, immodifika l-valuri kif me ħtieġ, imma assigura li 
d-diossidu tal-karbonju iffurmat jista jkun imkejjel bl-e żatezza.
 
Ma kull garafina ta' 5 litri żid 2 400 ml tal-medja minerali. Żid 
volum xieraq tal- ħama' attivata ippreparata (ara I.6.4.1 u I.6.5.) 
sabiex takkwista kon ċentrazzjoni ta' solidi sospi żi ta' mhux aktar 
minn 30 mg/l fit-ta ħlita finali 3 l ta' l-inokulat. B'mod alternattiv, 
l-ewwel dewweb il- ħama' ippreparata sabiex takkwista sospensjoni 
ta' 500-1 000 mg/l fil-medja minerali qabel ma żżid alikwott mal- 
kontenuti tal-garafina ta' 5-litri sabiex takkwista kon ċentrazzjoni ta' 
30 mg/l; dan jassigura pre ċiżjoni akbar. Sorsi o ħrajn ta' l-inoculum 
jistgħu ikunu w żati (ara I.6.4.2.).  
Daħħal l-arja f'dawn it-ta ħlitiet tal- CO  2 ħieles mill-arja matul il-lejl 
sabiex titnaddaf is-sistema mid-diossidu tal-karbonju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Żid il-materjal tat-test u s-sustanza ta' referenza, separatament, b ħala 
volum mag ħruf tat-taħlitiet lesti, f'garafini kopji sabiex takkwista l- 
konċentrazzjonijiet, kontribwiti bi ż-żieda tal-kimika, ta' 10 sa 20 mg 
DOC jew TOC/l; ħalli wħud mill-garafini ming ħajr iż-żieda tal- 
kimika b ħala kontrolli ta' l-inoculum. Żid sustanzi tat-test li 
jinħallu bilmod direttament fil-garafini u i żen jew ikkalkula il-ba żi 
tal-volum u opera kif deskritt fl-Anness III.  
Jekk meħtieġ, uża garafina wa ħda sabiex tivverifika l-effett inibitorju 
possibbli tat-kimika tat-test bi ż-żieda kemm tal-kimika tat-test u tar- 
referenza fl-istess kon ċentrazzjonijiet kif pre żenti fil-garafini l-o ħrajn. 
Ukoll, jekk me ħtieġ, organizza garafina sterili o ħra sabiex tivverifika 
jekk il-kimika tat-test tkun degradat abjotikament bl-u żu tat-taħlita 
mhux inokulata tal-kimika (ara I.6,6.). Sterilizza bi ż-żieda ta' 
sustanza tossika fil-kon ċentrazzjoni xierqa.  
Wassal il-volumi tas-sospenzi fil-garafina kollha g ħal 3 litri bi ż- 
żueda ta' medja minerali li pre ċedentament mog ħtija l-arja bi CO  2 
ħieles mill-arja. B'mod operattiv, il-kampjuni jistg ħu ikunu mi ġbura 
għall-analiżi DOC (ara l-Anness II.4(u/jew anali żi speċifika. Wa ħħal 
il-flixkien ta' l-assorbazzjoni mal- ħruġ tal-ġarafini.  
Jekk ikun u żat l-idrossidu tal-barju, wa ħħal tlett fliexken ta' l-assor ­
bazzjoni, b'kull wie ħed ikun fih 100 ml ta, 0,0125 M ta ħlita ta' l- 
idrossidu tal-barju, f'serje ta' garafini ta' 5-litri 'l wie ħed. It-taħlita 
għandha tkun ħielsa mis-sulfat u l-karbonat pre ċipitat u s-sa ħħa 
tagħha għandhom ikunu determinati immedjatament qabel l-u żu. 
Jekk ikun u żat l-idrossidu tas-sodju, wa ħħal żewġ nasses, it-tieni 
taġixxi bħala kontroll g ħad-demostrazzjoni li d-diossidu tal- 
karbonju kollu kien assorbit fl-ewwel wie ħed. Fliexken ta' l-assor ­
bazzjoni mg ħammra b'g ħeluq tal-flixkun tas-serum huma adatti. Żid 
200 ml 0,05 M idrossidu tas-sodju ma kull flixkun, li huwa 
suffiċjenti sabiex jassorbixxi l-kwantità totali tad-diossidu tal- 
karbonju evolut meta l-kimika tat-test tkun kompletament degradata. It-ta ħlita ta' l-idrossi tas-sodju, anki meta 
ippreparata friska, ikun fiha tra ċċi tal-karbonati, dan huma ikkorre ġut 
bit-tnaqqis tal-karbonat fl-imbjank.
 
IV.2.5.  Numru ta' garafini fi prova tipika  
Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test  
Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank  
Garafina 5: Pro ċedura tal-kontroll u,  
preferibbilment u meta me ħtieġ: 
Garafina 6: Kontroll ta' abjotiku sterili  
Garafina 7: Kontroll tat-tossi ċità 
Garafina 8: Kontroll tat-tossi ċità Ara wkoll I.6.7.  
IV.2.6.  It-twettieq tat-test  
Ibda t-test bit-tbaqbieq ta' CO  2 ħieles mill-arja matul is-sospenzjoni 
bir-rata ta' 30-100 ml/min. I ġbor il-kampjuni ta' l-assorbent diossidu 
tal-karbonju perjodikament g ħall-analiżi tal-kontenut CO  2 . Matul l- 
ewwel għaxart ijiem huwa rakkomndat li l-anali żi għandha tkun 
imwettqa fit-tieni jew fit-tielet jum u imbag ħad kull ħames jum 
sat-28 jum hekk li l-perijodu ta' l-10 ijiem jista jkun identifikat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Fit-28 jum, i ġbor il-kampjuni (voluntarja) g ħall-analiżi DOC u/jew 
speċifika, kejjel il-pH tas-sospenzjoni u żid 1 ml ta' l-a ċidu idrok ­
loriku ikkon ċentrar ma kull garafina; ag ħti l-arja lill-garafini matul il- 
lejn sabiex twarrab id-diossidu tal-karbonju pre żenti fis-sospenz ­
jonijiet tat-test. Fil-jum 29 ag ħmel l-aħħar analiżi tad-diossidu tal- 
karbonju evolut.  
Fil-jiem tal-kejl ta' CO  2 , aqla l-assorbatur ta' l-idrossidu tal-barju l- 
ebreb lejn il-garafina, ittitra t-ta ħlita ta' l-idrossidu bi HCl 0,05 M bl- 
użu tal-fenilftalejn b ħala indikatur. Mexxi l-assorbaturi li jkun fadat 
post aktar qrib tal-garafina u po ġġi assorbatur ġdid li jkun fih 100 ml 
ta' l-idrossidu tal-barju frisk 0,0125 M fit-tarf imbieg ħed tas-serje. 
Wettaq titrazzjonijiet kif me ħtieġ, per eżempju, meta l-pre ċipitazzjoni 
sostanzjali hija murija fl-ewwel nassa u qabel ma jkun evidenti fit- tieni, jew mill-anqas darba fil- ġimgħa. B'mod alternattiv, bi NaOH 
bħala assorbatur, i ġbed b'siringa kampjun żgħir (jiddependi mill- 
karatteristi ċi ta' l-analizzatur tal-karbonju u żat) tat-ta ħlita ta' l- 
idrossidu tas-sodju fl-assorbatur l-eqreb lejn il-garafina. Injetta diret ­
tament il-kampjun fil-parti IC ta' l-anilizzatur tal-karbonju g ħall- 
analiżi tad-diossidu tal-karbonju evolut.
 
Analizza l-kontenuti tat-tieni nassa biss fit-tmiem tat-test sabiex 
tikkorieġi għal xi ammont żejjed tad-diossidu tal-karbonju.  
IV.3. DATA U RAPPORTA ĠĠ 
IV.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
L-ammont ta' CO  2 fin-nassa ta' l-assorbatur meta ittrat huwa mog ħti 
bi: 
mgCO  2 = (100 x C  B - 0,5 x V x C  A ) x 44  
meta:  
V = il-volum ta' HC1 u żat għat-titrazzjoni tal-100 ml fl-assorbatur 
(ml).  
C B = il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita ta' l-idrossidu tal-barju (M),  
C A = l-konċentrazzjoni tat-ta ħlita ta' l-a ċidu idrokloriku (M),  
jekk C  B jkun 0,0125 M u C  A huwa 0,05 M, it-titrazzjoni g ħal 
100 ml idrossidu tal-barju hija 50 ml u l-pi ż ta' CO  2 huwa mog ħti bi: 
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCI titrated ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Hekk, f'dan il-ka ż, sabiex il-volum ta' HC1 titrat ikun ikkopnvertit 
għal mg tas-CO  2 prodott, il-fattur huwa 1,1.  
Ikkalkola l-pi żijiet ta' CO  2 prodott biss mill-inoculum u mill- 
iconulum flimkien mal-kimika tat-test bl-u żu tal-valuri rispettivi 
tat-titrazzjoni u d-differenza fil-pi ż ta' CO  2 prodott biss mill-kimika 
tat-test.  
Per eżempju, jekk l-inoculum biss jag ħti titrazzjoni ta' 48 ml u l- 
inoculum flimkien mal-kimika tat-test jag ħti 45 ml,  
CO 2 mill-inoculum = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 mill-inoculum flimkien mal-kimika tat-test = 1,1 × (50-45) = 
5,5 mg  
u bhekk il-pi ż ta' CO  2 prodott mill-kimika tat-test hija 3,3 mg.  
Il-persenta ġġ tal-biodegradazzjoni huwa ikkalkolat minn:  
% degrada żżjoni ¼ mg CO  2 prodott Ü 100 
ThCO  2 Ü mg kimika tat Ä test miżjuda 
jew, 
% degrada żżjoni ¼ mg CO  2 prodott Ü 100 
mg TO mi żjud mit Ä test Ü 3; 67 
3,67 ikun il-fattur tal-konver żjoni (44/12) g ħall-karbonju tad-diossidu 
tal-karbonju.  
Akkwista l-persenta ġġ tad-degradazzjoni wara kwalunkwe intervall 
ta' ħin biż-żieda tal-persenta ġġ tal-valuri ThCO  2 ikkalkolat g ħal kull 
waħda mill-jiem, sa dak il- ħin, li fih ikun imkejjel.  
Għall-assorbaturi idrossidu tas-sodju, ikkalkola l-ammont tad- 
diossidu tal-karbonju prodott, espressa b ħala IC (mg), bil-moltipli ­
kazzjoni tal-kon ċentrazzjoni ta' IC fl-assorbent bil-volum ta' l- 
assorbent.  
Ikkalkula l-persenta ġġ tad-degradazzjoni minn:  
% of ThCO  2 ¼ mg IC garafina Ä mg IC imbjank 
MG TOC mi żjud bħala kemikali g ħat Ä test Ü 100 
Ikkalkola DOC imne ħħija (voluntarja) kif deskritt ta ħt 1.7. Irre ġistra 
dawn u r-ri żultati l-oħrajn kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.  
IV.3.2.  Validità tar-ri żultati  
Il-kontenut IC tas-sospenzjoni tal-kimika tat-test fil-medja minerali 
fil-bidu tat-test g ħandu jkun anqas minn 5 % tal-TC, u t-total CO  2 ta' 
l-evoluzzjoni ta' l-inoculum fl-imbjank fit-tmiem tat-test g ħandu 
normalment je ċċedi 40 mg/l medja. Jekk valuri akbar minn 70 mg 
CO 2 /litru jkunu akkwistati, id-data u t-teknika sperimentali g ħandha 
tkun eżaminata b'mod kritiku.  
Ara wkoll I.5.2.  
IV.3.3.  Rapporta ġġ 
Ara I.8.  
IV.4. FOLJA TAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti aktar il-quddiem.  
TEST TA' L-EVOLUZZJONI TAD-DIOSSIDU TAL-KARBONJU  
(1) LABORATORJU  
(2) IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  
(3) IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/litru b ħala kimika  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Konċentrazzjoni inizjali fil-medja: mg/litru b ħala kimika  
Total C mi żjud mal-garafina: mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. INOCULUM  
Sorsi:  
Trattament mog ħti: 
Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:  
Konċentrazzjoni ta' solidi sospi żi fit-taħlita tar-reazzjoni: 
mg/litru  
Ħin 
(jum) CO 2 iffurmat 
Test (mg) CO 2 iffurmat 
imbjank (mg) CO 2 iffurmat Kumu ­
lattiv (mg) 
(Il-medja ta' l-imbjank  
minus  tat-test) ThCO  2 
Kumulattiv  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 medja 3 
4 medja 1 2 1 2 medja  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Nota: formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kimika tar-referenza u 
l-kontrolli tat-tossi ċità 
6. ANALI ŻI TAL-KARBONJU  (voluntarju)  
Analizzatur tal-karbonju:  
Żmien (jiem) Imbjank mg/l Kimika tat-test mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) jew fl-a ħħar ta' l-inkubazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC imne ħħi ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. DEGRADAZZJONI ABJOTIKA  (voluntarja)  
% degradazzjoni abjotika  ¼ CO  2 il Ä formazzjoni f ’garafina sterlili wara 28 jum  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100  
PARTI V.  TEST TAR-RESPIROMETRIJA MANJO- 
METRIKA  (Metodu C.4-D)  
V.1. PRIN ĊIPJU TAL-METODU  
Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata, li jkun fiha kon ċen­
trazzjoni mag ħrufa tal-kimika tat-test (100 mg/litru tas-sustanza tat- 
test, li tag ħti mill-anqas 50-100 mg ThOD/litru) b ħala s-sorsi unika 
nominali tal-karbonju organiku, hija m ħawwda f'garafina mag ħluqa 
f'temperatura kostanti (± 1  o C jew eqreb) g ħal sa 28 jum. Il-konsum 
ta' l-ossiġenu huwa determinat jew bil-kejl tal-kwanità ta' ossi ġenu 
(prodott b'mod elettolitiku) me ħtieġ għaż-żamma tal-volum tal-gass 
fil-garafina respirimetru, jew bit-tibdil fil-volum jew fil-pressjoni (jew ġemgħa tat-tnejn) fl-apparat. Id-diossidu tal-karbonju evolu 
huwa assorbit fit-tahlita ta' l-idrossidu tal-putassa jew f'xi assorbent 
xieraq ie ħor. L-ammont ta' ossi ġenu akkwistat bil-kimika tat-test 
(ikkorreġut għall-akwista mill-inoculim fl-imbjank, imwettaq b'mod 
parallel) huwa espress b ħala persenta ġġ ta' ThOD jew COD. B'mod 
voluntarju, il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun 
ikkalkolat mill-anali żi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit- 
tmiem ta' l-inkubazzjoni, u fl-a ħħar mill-aħħar il-biodegredazzjoni 
bl-analiżi DOC..
 
V.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
V.2.1.  Apparat  
a) respirometru xieraq;  
b) kontroll tat-temperatura, żamma ta' ± 1  o C jew aħjar; 
ċ) Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);  
d) analizzatur tal-karbonju (voluntarju).  
V.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Għall-preparazzjoni tat-ta ħlitiet bil-lest, ara I.6.2.  
Ħawwad 10 ml tat-ta ħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat- 
taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.  
V.2.3.  Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum  
L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, 
effluwenti tad-drena ġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wi ċċ l-art u 
ħamrija jew minn ta ħlita ta' dawn.  
Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.  
V.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
Ipprepara t-ta ħlitiet għat-test u l-kimika tar-referenza, f'lottijiet 
separati, f'medja minerali ekwivalenti g ħal konċentrazzjoni, norm ­
alment, ta' 100 mg kimika/litru (li tag ħti mill-anqas 50-100 mg 
ThOD/litru), bl-u żu tat-taħlitiet bil-lest.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Ikkalkola il-ThOD fuq il-ba żi tal-formazzjoni ta' l-imlu ħa ta' l- 
ammonium, sakemm nitrifikazzjoni tkun anti ċipata, meta l-kalko ­
lazzjoni g ħandha tkun ibba żata fuq il-formazzjoni nitrika (ara l- 
Anness II.2.)  
Iddetermina l-valuri pH u a ġġusta, jekk me ħtieġ, għal 7,4. ± 0,2.  
Sustanzi li ma tantx jin ħallu għandhom ikunu mi żjuda fi stadju aktar 
tard (ara hawn ta ħt). 
Jekk it-tossi ċita tal-kimika tat-test g ħandha tkun determinata, 
ipprepara ta ħlita oħra fil-medja minerali li jkun fiha kemm il- 
kimika tat-test u tar-referenza fl-istess kon ċentrazzjonijiet b ħal fit- 
taħlitiet individwali.  
Jekk il-kejl tat-te ħid fiżiku-kimiku ta' l-ossi ġenu huwa me ħtieġ, 
ipprepara ta ħlita tal-kimika tat-test fi, mormalment, 100 mh ThOD/ ­
litru li tkun ġiet sterilizzata bi ż-żieda ta' sustanza tassika adatta (ara 
I.6,6.).  
Introduċi l-volum me ħtieġ tat-taħlitiet tal-kimika tat-test u ta' 
referenza, rispettivament, mill-anqas fil-garafini duplikati. Żid ma 
garafini o ħrajn il-medja minerali biss (g ħal kontrolli ta' l-inoculum) 
u, jekk me ħtieġ, it-taħlita tal-kimika tat-test im ħallta/ta' referenza, u t- 
taħlita sterili.  
Jekk il-kimika tat-test ma tantx tkun tin ħall, żid sustanzi tat-test li 
jinħallu bil-mod direttament fil-garafini u i żen jew ikkalkula l-ba żi 
tal-volum u opera kif deskritt fl-Anness III. Żid l-idrossidu tal- 
putazza, gerbubi tal- ġir tas-soda jew assorbent ie ħor mal-kompar ­
timenti assorbatur CO  2 . 
V.2.5.  Numru ta' garafini fi prova tipika  
Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test  
Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank  
Il-garafini 5: Pro ċedura tal-kontroll preferibbilment, u meta me ħtieġ: 
Il-garafini 6: Kontroll sterili  
Il-garafini 7: Kontroll tat-tossi ċità 
Il-garafini 8: Kontroll tat-tossi ċità 
Ara wkoll I.6.7.  
V.2.6.  It-twettieq tat-test  
Ħalli l-garafini jil ħqu t-temperatura mixtieqa u inokula r-re ċipjenti 
xierqa bil- ħama' attivata ippreparata jew b'sors ie ħor ta' l-inoculum 
sabiex takkwista kon ċentrazzjoni ta' solidi sospi żi ta' mhux aktar 
minn 30 mg/litru. Ħejji l-apparat, qabbad il- ħawwadi u ivverifika li 
ma tgħaddix arja, u ibda bil-kejl tat-te ħid ta' l-ossi ġenu. Normalment 
l-ebda attenzjoni o ħra m'hija me ħtieġa apparti milli t-te ħid tal-qari u 
tal-virifika odjerna sabiex tara li t-temperatura korretta u t-ta ħwis 
adekwat ikun mantenut.  
Ikkalkola t-te ħid ta' l-ossi ġenu mill-qari me ħuda f'intervalli regolati u 
ta' spiss, bl-u żu tal-motodi rakkomandati mill-manifattur ta' l-apparat. 
Fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, normalment 28 jum, kejjel il-pH tal- kontenuti tal-garafini, spe ċjalment jekk it-te ħid ta' l-ossi ġenu jkun 
baxx jew aktar minn ThODNH
 4 (għal komposti li jkun fihom in- 
nitroġenu). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Jekk me ħtieġ, neħħli l-kampjuni mill-garafini respirometri, iniz ­
jalment u finalment, g ħall-analiżi ta' DOC jew kimika spe ċifika 
(ara l-Anness II.4). Fit-tne ħħija inizjali, assigura li l-volum tas- 
sospensjoni tat-test li jkun baqa' fil-garafina, jkun mag ħruf. Meta l- 
ossiġenu jkun me ħud mis-sustanza tat-test li jkun fiha l-N, 
iddetermina ż-żieda fil-kon ċentrazzjoni tan-nitrat u wettaq in- 
nitrazzjoni matul 28 jum u ikkalkola l-korrezzjoni g ħall-ossiġenu 
ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni (l-Anness V).  
V.3. DATA U RAPPORTA ĠĠ 
V.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
Iddividi l-akkwista ta' l-ossi ġenu (mg) tal-kimika tat-test wara hin 
pre-determina (korre ġut għal dak ta' l-inoculum tal-kontroll fl- 
imbjank wara l-istess ħin) bil-piż tat-kimika tat-test kif u żata. Dan 
iforni il-BOD espress b ħala mg ossi ġenu/mg kimika tat-test, i ġiefiri  
BOD ¼ ðmg O  2 teħid bil Ä kimika tat Ä test Ä mg O  2 teħid blÄÞÞ 
ðmg kimika tat Ä test fil Ä garafinaÞ 
mg O  2 kull mg kimika tat-test  
ikkalkola l-persenta ġġ tal-biodegradazzjoni jew minn:  
% bijodegradazzjoni  ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg kemikaliÞ 
ThODðmg O  2 kemikaliÞ Ü 100 
Jew inkella minn:  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg kemikaliÞ 
CODðmg O  2 kemikaliÞ Ü 100  
Għandu jkun innotat li dawn i ż-żewġ metodi mhux ne ċessarjament 
jagħtu l-istess valur, huwa preferibbli li jsir u żu mill-metodu 
preċedenti.  
Għal sustanzi tat-test li jkun fihom in-nitro ġenu, għamel użu mill- 
ThOD xieraq (NH  4 jew NO  3 ) skond ma jkun mag ħruf jew mistenni 
dwar l-okkorrenza tan-nitrifikazzjoni (l-Anness II.2). Jekk in-nitrifi ­
kazzjoni isse ħħ imma ma tkun kompluta, ikkalkola korrezzjoni g ħall- 
ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-kon ċentrazzjoni 
tan-nitrit u n-nitrat (l-Anness V).  
Meta determinazzjonijiet voluntarji tal-karbonju organiku u/jew ta' 
kimika spe ċifika jkun saru, ikkalkola il-persenta ġġ tad-degradazzjoni, 
kif deskritt ta ħt I.7.  
Irreġistra r-riżultati kollha dwara id-data fuq il-karti tad-data kif 
ipprovduta.  
V.3.2.  Validità tar-ri żultati  
It-teħid ta' l-ossi ġenu ta' l-inoculum fl-imbjank normalment huwa 20- 
30 mg O  2 /litru u m'g ħandux ikun aktar minn 60 mg/litru fi 28 jum. 
Valuri għola minn 60 mg/litru jkunu je ħtieġu eżaminazzjoni kritika 
tad-data u tat-tekniki sperimentali. Jekk il-valur tal-pH huwa l-barra 
mill-medda 6-8, 5 u l-konsum ta' l-ossi ġenu bil-kimika tat-test huwa 
anqas minn 60 %, it-test g ħandu jkun repetut b'kon ċentrazzjoni aktar 
baxxa tal-kimika tat-test.  
Ara wkoll I.5.2.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Rapporta ġġ 
Ara I.8.  
V.4. FOLJA TAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti aktar il-quddiem.  
TEST RESPIRATORJU MANOMETRIKU  
1. LABORATORJU  
2. IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  
3. IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/litru  
Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, C  o : mg/litru  
Volum fil-garafina tat-test (V): ml  
ThOD jew COD: mg O  2 /mg sustanza tat-test (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOCULUM  
Sorsi:  
Trattament mog ħti: 
Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:  
Konċentrazzjoni ta' solidi sospi żi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l  
5. TEĦID TA' L-OSSI ĠENU BIODEGRADABBILITÀ  
Jum 
0 7 14 21 28  
O 2 upt. (mg), 
kimika tat-test 1 
2 
a, medja 
O 2 upt. (mg) 
imbjank 3 
4 
b, medja 
BOD(mg) 
ikkorreġut (a 1 -b m ) 
(a 2 -b m ) 
BOD kull mg 
tal-kimika tat- test
 ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Jum 
0 7 14 21 28  
% degra­
dazzjoni  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Medja (*)  
V = Volum tal-medja fil-garafina tat-test 
(*) D  1 u D  2 m'għandhiex tittie ħed il-medja tag ħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.  
N.B.: Formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kimika tar-referenza u 
l-kontrolli tat-tossi ċità. 
6. KORREZZJONI G ĦAN-NITRIFIKAZZJONI  (ara l-Anness V)  
Jum 0 28 Differenza  
(i) Kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) (N) 
(ii) Ossi ġenu ekwivamenti (4,57 × N × V) (mg) — — 
(iii) Kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) (N) 
(iv) Ossi ġenu ekwivamenti (3,43 × N × V) (mg) — — 
(ii + iv) Ossi ġenu ekwivamenti totali — —  
7. ANALI ŻI TAL-KARBONJU  (volontarju)  
Analizzatur tal-karbonju:  
Żmien (jiem) mg/litru fl-imbjank Kimika tat-test mg/litru  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) jew fl-a ħħar ta' l-inkubazzjoni.  
% DOC imne ħħi ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100  
8. KIMIKA SPECIFIKA  (volontarja)  
S b = konċentrazzjoni fil-fi żiko0kimika (sterili) mal-kontroll ta' 
28 jum  
S a = konċentrazzjoni fil-garafina inokulta fi 28 jum.  
% biodegradazzjoni  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
9. DEGRADAZZJONI ABJOTIKA  (voluntarja)  
a = konsum ta' l-ossi ġenu f'garafini sterili wara 28 jum, (mg)  
konsum ta 0 l Ä ossiġenu ghall kull mg tal  Ä kimika tat Ä test ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(ara s-sezzjonijiet 1 u 3)  
% degradazzjoni abjotika  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
PARTI VI.  TEST TAL-FLIXKUN MAG ĦLUQ  (Metodu  o C.4-E)  
VI.1. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
It-taħlita tal-kimika tat-test f'medja minerali, normalment fi 2- 
5 mg/litru, hija inokulata b'relattivament numru żghir ta' mikro- 
organiżmi minn popolazzjoni m ħallta u mi żmuma fi fliexken, komp ­
letament mimlija u mag ħluqa, fid-dlam u f'temperatura kostanti. Id- 
degradazzjoni hija segwita bl-anali żi ta' l-ossi ġneu maħlul matul 
perijodu ta' 28 jum. L-ammont ta' ossi ġenu akkwistat bil-kimika 
tat-test, ikkorre ġut għall-akwista mill-inoculim fl-imbjank, imwettaq 
b'mod parallel, huwa espress b ħala persenta ġġ ta' ThOD jew COD.  
VI.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
VI.2.1.  Apparat  
a) Fliexken BOD, b'tappini tal- ħġieġ, eż. 250-300 ml;  
b) Banju ta' l-ilma jew inkubatur, g ħaż-żamma tal-fliexken f'tem ­
peratura kostanti (± 1  o C jew aħjar) bl-esklu żjoni tad-dawl;  
ċ) Fliexken tal- ħġieġ kbar (2-5 litri) g ħall-preparazzjoni tal-medja u 
għall- mili tal-fliexken BOD;  
d) Elettrodu u arlo ġġ ta' l-ossi ġenu, jew apparat u rea ġenti għat- 
titrazzjoni Winker.  
VI.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Għall-preparazzjoni tat-ta ħlitiet bil-lest, ara I.6.2.  
Ħawwad 1 (wie ħed) tat-taħlita (a) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat- 
taħwid. 
VI.2.3.  Preparazzjoni ta' l-inoculum  
L-inoculum huwa normalment akkwistat minn effluwent sekondarju 
ta' l-impjant tat-trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li 
jirċievi b'mod predominanti d-drena ġġ domestiku. Sors alternattiv 
ieħor għall-inoculum hija l-ilma tal-wi ċċ ta' l-art. Normalment l- 
użu huwa ta' taqtira wa ħda (0,05 ml) ma 5 ml tal-filtrat g ħal kull 
litru tal-medja; il-provi jistg ħu jeħtieġ li jiskopru l-a ħjar volum g ħal 
effluwent partikolari (ara I.6.4.2. u I.6.5.).  
VI.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
B'mod qawwi da ħħal l-arja f'medja minerali g ħal mill-anqas 
20 minuta. Wettaq kull wa ħda mis-serje tat-testijiet bil-medja 
akkwistata mill-istess lott. Ġeneralment, il-medja hija lesta g ħall- 
użu wara li tkun qag ħdet għal 20 sieg ħa, fit-temperatura tat-test. 
Iddetermina l-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb g ħall- 
iskopijiet tal-kontroll; il-valur g ħandu jkun madwar 0 mg/litru fi 
20 o C. Wettaq l-operazzjonijiet kollha tat-trasferiment u tal-mili tal- 
medja saturata bl-arja imma ming ħajr bżieżaq, per e żempju, bl-u żu 
ta' sifuni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Ipprepara grupp paralelli ta' fliexken BOD g ħad-determinazzjoni tat- 
test u l-kimika ta' referenza f'serje sperimentali simultanji. Organizza 
numru suffi ċjenti tal-flixkien BOD, inklu żi l-inoculum fl-imbjank, 
sabiex tippermetti mill-anqas kejl duplikat tal-konsum ta' l-ossi ġenu 
li jsir matul l-intervalli mixtieqa tat-test, per e żempju, wara 0, 7, 14, 
21 u 28 jum. Sabiex tassigura li tkun tista tidentifika l-perijodu ta' l- 
10 ijiem, aktar fliexken jistg ħu ikunu me ħtieġa. 
Żid medja minerali mimlija kollha bl-arja ma fliexken kbar hekk li 
jkunu mimlija g ħal madwar terz. Imbag ħad żid taħlitiet bil-lest 
suffiċjenti tal-kimika tat-test u tal-kimika ta' referenza sabiex 
tissepara l-flixken il-kbar hekk l-kon ċentrazzjoni finali tal-kimika 
tkun normalment mhux akbar minn 10 mg/litru. M'g ħandhek iżżid 
l-ebda kimika ma l-imbjank fil-medja tal-kontroll li tkun fi flixkun kbir ieħor.
 
Sabiex tassigura li l-attività ta' l-inoculum ma tkunx limitata, il-kon ċ­
entrazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb m'g ħandhiex tin żel aktar baxxa 
minn 0,5 mg/litru fil-fliexken BOD. Dawn jillimitaw il-kon ċen­
trazzjoni tal-kimika tat-test g ħal madwar 2 mg/litru. B'dana kollu, 
għal komposti b'degradibbiltà baxxa u dawk bi ThOD baxxa, 5- 
10 mg/litru jistg ħu ikunu w żati. F'uħud mill-ka żi, ikun rakom ­
mandabbli li twettaq b'mod parallel serje tal-kimika tat-test f' żewġ 
konċentrazzjonijiet differenti, per e żempju, 2 u 5 mg/litru. Norm ­
alment, g ħandhek twettaq il-kalkolu tal-ThOD fuq il-ba żi tal-form ­
azzjoni tal-mel ħ ta' l-ammonium, imma, jekk in-nitrifikazzjoni tkun 
mistennija jew ikun mag ħruf li sse ħħ, agħmel il-kalkolu fuq il-ba żi 
tal-formazzjoni tan-nitrat (ThOD  NO3 : ara l-Anness II.2). B'danakollu, 
jekk in-nitrifikazzjoni ma tkunx kompluta imma isse ħħ, għamel 
korrezzjoni g ħat-tibdil fil-kon ċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat, deter ­
minati fl-anali żi, (ara l-Anness V).  
Jekk it-tossi ċità tal-kimika tat-test g ħandha tkun investigata (fil-ka ż, 
per eżempju, tal-valur pre ċedenti baxx tal-biodegradabbiltà li jkun 
ġie misjub), serje o ħra ta' flixkien hija ne ċessarja.  
Ipprepara flixkun kbir ie ħor li jkun fih medja minerali bl-arja (sa 
madwar terz tal-volum tieg ħu) flimkien mal-kimika tat-test u l- 
kimika ta' referenza fil-kon ċentrazzjoni finali normalment l-istess 
bħal dawk fil-fliexken kbar l-o ħrajn. 
Inokula t-ta ħlitiet fil-fliexken il-kbar b'effluwent sekondarju (qatra 
waħda jew madwar 0,05 ml, ma 5 ml/litru) jew b'sorsi o ħra bħal 
ma hu l-ilma tax-xmara (ara I.6.4.2.). Finalment, wassal it-ta ħlitiet 
għall-volum b'medja minerali bl-arja bl-u żu ta' manka li til ħaq sal- 
qiegħ tal-flixkun sabiex takkwista ta ħlita adekwata.  
VI.2.5.  Numru ta' garafini fi prova tipika  
Fi prova tipika, il-fliexken li ġejjin huma w żati: 
— mill-anqas 10 li jkun fihom il-kimika tat-test u ta' l-inoculum 
(sospenzjoni tat-test),  
— mill-anqas 10 li jkun fihom biss l-inoculum (inoculum fl- 
imbjank),  
— mill-anqas 10 li jkun fihom il-kimika ta' referenza u ta' l- 
inoculum (kontroll tal-pro ċedura),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— u, meta me ħtieġ, 6 fliexken li jkun fihom il-kimika tat-test, 
kimika ta' referenza u l-inoculum (kontroll tat-tossi ċità). B'dana 
kollu, sabiex tassigura li tkun tista tidentifika l-perijodu ta' l-10 ijiem, madwar id-doppju ta' fliexken jistg ħu ikunu me ħtieġa.
 
VI.2.6. It-twettieq tat-test  
Forni kull ta ħlita ippreparata immedjetament ġewwa kull grupp 
rispettiv tal-fliexken BOD bil-manka mill-kwart tl-isfel (mhux mill- qiegħ) tal-flixkun kbir xieraq, hekk li l-fliexken BOD kollha jkunu 
kompletament mimlija. Taptap bil- ġentilizza sabiex tne ħħi xi bżieżaq 
ta' l-arja. Anali żża il-fliexken ħin-żero immedjetament g ħall-ossiġenu 
mdewweb bil-metodi Winkles jew bl-elettrodi. Il-kontenuti tal- fliexken jistghu jkunu preservati g ħal analiżi aktar tard bil-metodu 
Winkles bi ż-żieda tal-mangani ż (II) sulfat jew idrossidu tas-sodju (l- 
ewwel rea ġent Winkler). A ħżen bil-galbu l-fliexken mag ħluqa bl- 
istopponi, li jkun fihom l-ossi ġentu iffissat b ħala mangani ż 
kannella (III) ossidu idrat, fid-dlam fi 10-20
 o C għal mhux aktar 
minn 24 sieg ħa qabel ma tippro ċedi bil-kumplament tal-passi tal- 
metodu Winkler. Ag ħmel it-tappini fuq il-kumplament tal-flixkien, 
tassigura li l-ebda b żieżaq ta' l-arja ma jkunu mag ħluqa, u inkuba fi 
20 o C fid-dlam. Kull serja g ħandha tkun akkumpanjata b'serje 
paralella s ħiħa għad-determinazzjoni tal-medja in-bjank inokulata. 
Neħħi mill-anqas il-flixkien duplikati tas-serje kollha g ħall-abaliżi 
ta' l-ossiġenu mdewweb matul l-intervalli tal- ħin (mill-anqas kull 
ġimgħa) matul it-28 jum ta' l-inkubazzjoni.  
Kampjuni ta' kull ġimgħa għandhom jippermettu l-assessjar tat- 
tneħħija perċentwali fil-perijodu ta' 14-il jum, fil-waqt li l- 
kmpjunar ta' kull 3-4 ijiem g ħandu jippermetti li l-perijodu ta' 10 
ijiem li jkun identifikat, li jkun je ħtieġ madwar id-doppju ta' tant 
fliexken.  
Għal sustanzi tat-test li jkun fihom N, korrezzjonijiet g ħat-teħid ta' l- 
ossiġenu minn xi nitrifikazzjoni li sse ħħ, għandu jsir. Sabiex isir dan, 
uża l-metodu ta' l-elettrodi-O  2 għad-determinazzjoni tal-kon ċen­
trazzjoni ta' l-ossi ġenu mdewweb u imbag ħad warrab il-kampjun 
mill-flixkun BOD g ħall-analiżi tan-nitrit u n-nitrat. Mi ż-żieda fil- 
konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat, wettaq il-kalkolu ta' l-ossi ġenu 
użat (ara l-Anness V).  
VI.3. DATA U RAPPORTA ĠĠ 
VI.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
L-ewwel ag ħmel il-kalkolu tal-BOD e żerċitat wara kull perijodu ta' 
żmien billi tnaqqas l-e żawriment ta' l-ossi ġenu (mg O  2 /litru) ta' l- 
inoculum fl-imbjank minn dak esibit bit-test kimiku. Iddividi dan l- eżawriment ikkorre ġut bil-kon ċentrazzjoni (mg/litru) tal-kimika tat- 
test, sabiex takkwista l-BOD spe ċifika vġama mg ossi ġenu kull mg 
tal-kimika tat-test. Wettaq il-kalkolu tal-persenta ġġ tal-biodegrad ­
abbiltà billi tiddividi l-BOD spe ċifika bil-ThOD spe ċifika (ikkal ­
kolata skond l-Anness II,2) jew il-COD (determinata bl-anali żi, ara 
l-Anness II.3),b'hekk:
 
BOD ¼ ðmg O  2 teħid bil Ä kimika tat Ä test Ä mg O  2 teħid bl Ä imbjankÞ 
ðmg kimika tat Ä test fil Ä garafinaÞ ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
mg O  2 kull mg tal-kimika tat-test  
% biodegradazzjoni  ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikali g ħat Ä testÞ 
ThODðmg O  2=mg kemikali g ħat Ä testÞ Ü 100  
jew 
% degradation ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikali g ħat Ä testÞ 
CODðmg O  2=mg kemikali g ħat Ä testÞ Ü 100  
Għandu jkun innotat li dawn i ż-żewġ metodi mhux ne ċessarjament jag ħtu l-istess valur, 
huwa preferibbli li jsir u żu mill-metodu pre ċedenti.  
Għal sustanzi tat-test li jkun fihom in-nitro ġenu, għamel użu mill-ThOD xieraq (NH  4 
jew NO  3 ) skon ma jkun mag ħruf jew mistenni dwar l-okkorrenza tan-nitrifikazzjoni (l- 
Anness II.2). Jekk in-nitrifikazzjoni isse ħħ imma ma tkun kompluta, ikkalkola 
korrezzjoni g ħall-ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-kon ċentrazzjoni 
tan-nitrit u n-nitrat (l-Anness V).  
VI.3.2.  Validità tar-ri żultati  
L-eżawriment ta' l-ossi ġenu mill-imbjank ta' l-inoculum m'g ħandux jeċċedi 1,5 mg 
ossiġenu mdewwb/litru wara 28 jum. Valuri g ħola minn dan je ħtieġu investigazzjoni 
tat-tekniki sperimental. Il-kon ċentrazzjoni residwa ta' l-ossi ġenu fil-fliexken tat-test 
m'għandhiex tin żel għal anqas minn 0,5 mg/litru fi kwalunkwe żmien. Livelli hekk 
baxxi ta' l-ossi ġenu huma validi biss jekk il-metodu g ħad-determinazzjoni ta; l-ossi ġenu 
mdewweb tkun tista tkejjel tali livella bl-akbar e żatezza.  
Ara wkoll I.5.2.  
VI.3.3.  Rapporta ġġ 
Ara I.8.  
VI.4. FOLJA TAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti aktar il-quddiem.  
TEST TAL-FLIXKUN MAG ĦLUQ  
1. LABORATORJU  
2. IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  
3. IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/litru  
Konċentrazzjoni inizjali fil-flixkun: mg/litru  
ThOD jew COD: mg O  2 /mg sustanza tat-test  
4. INOCULUM  
Sorsi:  
Trattament mog ħti: ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:  
Konċentrazzjoni fit-ta ħlita tar-reazzjoni: mg/litru  
5. DETERMINAZZJONI DO  
Metodu: Winkler/elettrodu  
L-analiżi tal-garafini  
Iż-żmien ta' l-inkubazzjoni (d) DO (mg/1) 
0 n  1 n 2 
Imbjank (ming ħajr 
kimika) 1 C  1 
2 C  2 
Medja 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Kimika tat-test 1 a  1 
2 a  2 
Medja 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Nota: Formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kompost tar-referenza 
u l-kontrolli tat-tossi ċità. 
6. KORREZZJONI G ĦAN-NITRIFIKAZZJONI  (ara l-Anness V)  
Iż-żmien ta' l-inkubazzjoni (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) 
(ii) Tibdil tal-kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) — 
(iii) Ossi ġenu ekwivalenti (mg/litru) — 
(iv) Kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) 
(v) Tibdil tal-kon ċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru) — 
(vi) Ossi ġenu ekwivalenti (mg/litru) — 
(iii + vi) Ossi ġenu totali ekwivalenti (mg/litru) —  
7. EŻAWRIMENT DO: % DEGRADAZZJONI  
Degradazzjoni wara jiem n (mg/litru) 
n 1 n 2 n 3 
GARAFINA 1: (m  to – mtx ) – (m  bo – m  bx ) 
GARAFINA 2: (m  to – mtx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Degradazzjoni wara jiem n (mg/litru) 
n 1 n 2 n 3 
GARAFINA 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konk tat Ä test ThOD kemikali 
GARAFINA 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konk tat Ä test ThOD kemikaliof test  Ü ThOD chemical 
% D medja (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) bħala kondizzjoni stabbli(medja)  
m to = alur fil-garafina tat-test fil- ħin 0 
m tx = alur fil-garafina tat-test fil- ħin x 
m bo = l-valur medju ta' imbjank fil- ħin 0 
m bx = il-valur medju ta' imbjank fil- ħin x 
Applika wkoll il-korrezzjoni g ħan-nitrifikazzjoni minn iii+vi fis- 
sezzjoni 6.  
8. EŻAWRIMENT DO IMBJANK  
Konsum ta' l-ossi ġenu fl-imbjank: (m  bo – m  b28 ) mg/litru Dan il- 
konsum huwa importanti g ħall-validità tat-test. Dan g ħandu 
jkun anqas minn 1,5 mg/litru.  
PARTI VII.  TEST M.I.T.I.  (Metodu  o C.4-F)  
VII.1. PRIN ĊIPJUTAL-METODU  
It-teħid ta' l-ossi ġenu bit-ta ħlita mħawda, jew bis-sospensjoni, tal- 
kimika tat-test f'medja minerali, inokulata b'mikro-organi żmi speċ­
jalment imkabbra, mhux adattati, hija mkejla awtomatikament matul perijodu ta' 28 jum f'respirometri mag ħluq u fid-dlam fi 25 
± 1
 o C. Id-disossidu tal-karbonju evolut huwa assorbit bil- ġir tas- 
soda. Il-biodegradabbiltà hija espressa b ħala persenta ġġ tat-teħid ta' l- 
ossiġenu (ikkorre ġut għat-teħit fl-imbjank) tat-te ħid teoretiku 
(ThOD). Il-persenta ġġ tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll 
ikun ikkalkolat mill-anali żi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u 
fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, u fl-a ħħar mill-aħħar il-biodegredazzjoni 
bl-analiżi DOC.  
VII.2. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
VII.2.1.  Apparat  
a) Arloġġ BOD elettroliku awtomatiku jew respirometru normalment 
mgħammar b'6 fliexken, 300 ml il-wie ħed, u mgħammar b'kikkri 
sabiex ikun fihom l-assorbent CO  2 ; ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Kamra ta' temperatura kostanti u/jew banju ta' l-ilma fi 25  o C ± 
1 o C jew aħjar; 
ċ) Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);  
d) analiżattur tal-karbonju (voluntarju).  
VII.2.2.  Preparazzjoni tal-medja minerali  
Ipprepara t-ta ħlitiet bil-lest li ġejjin, bl-u żu ta' rea ġenti ta' grad 
analitiku u l-ilma (I.6.1.): 
a) Monopotassium dihydrogen ortho phosphate, 
KH  2 PO 4 8,50 g 
Dipotassium monohydrogen ortho phosphate, 
K 2 HPO  4 21,75 g 
Disodium monohydrogen ortho phosphate 
dodecahydrate Na  2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Klorid ta' l-ammonium, NH  4 Cl 1,70 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru. 
Il-valur pH tat-ta ħlita għandu jkun 7,2 
b) Eptaidrat tas-sulfat tal-magne żju, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru 
c) Klorid tal-kal ċji, anidriju, CaCl  2 27,50 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru. 
d) Ħadid (III) eksaidrat tal-klorid, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Dewweb fl-ilma u wassal g ħal-litru.  
Ħu 3 ml ta' kull ta ħlita (a), (b), (c) u (d) u wassal sa litru.  
VII.2.3.  Preparazzjoni ta' l-inoculum  
Iġbor kampjuni friski minn mhux anqas minn g ħaxar siti, l-aktar 
minn żoni ta' fejn varjetà ta' kimi ċi huma u żati u mormija. Minn 
siti bħalma huma l-impjanti tat-trattament tad-drena ġġ, trattament ta' 
l-iskart industrijali, xmajjar, g ħadajjer, ib ħra, iġbor litru tal-kampjun 
u tal-ħama', ħamrija tal-wi ċċ, ilma, e ċċ., u ħallat sewwa flimien. 
Wara li tne ħħi l-materja li jkun hemm fil-wi ċċ u tħalli li joqg ħod, 
aġġusta s-supernatant g ħal pH 7 ± 1 bl-idrossidu tas-sodju u l-a ċidu 
fosforiku.  
Uża l-volum xieraq mas-supernayant iffiltrat sabiex timla re ċipjent 
tal-“mili u ġbir” tal-ħama' attivata u ag ħti l-arja lil-likwidu g ħal 
madwar 231/2 sieg ħat. Tletin minuta wara li tkun waqfet l-arjazzjoni, 
warrab madwar ter ż tal-volum kollu tas-supernatant u żid volum 
egwali tat-ta ħlita (pH 7) li jkun fiha 0,1 % kull wie ħed tal- 
glukożju, peptun, u monoputassa orto fosfat, mal-materja li tkun 
qagħdet u erġa ibda bl-arjazzjoni. Irrepeti din il-pro ċedura darba 
kuljum. L-unità tal- ħama' għandha tkun operata skond il-prattika 
tajba: l-effluwenti g ħandhom ikunu ċari, t-temperatura g ħandha 
tinżamm fi 25 ± 2 C, il-pH g ħandu jkun 7 ± 1, il- ħama' għandha 
tkun qagħdet sewwa, b'arjazzjoni suffi ċjenti sabiex i żżomm it-ta ħlita 
erobika matul il- ħin kollu, il-prota żoa għandha tkun pre żenti u l- 
attività tal- ħama għandha tkun ittestjata kontra sustanza ta' 
referenza mill-anqas darba kull tlett xhur. Tutilizzax il- ħama' bħala 
inoculum sa mill-anqas xahar wie ħed mill-operazzjoni, imma mhux 
aktar tard minn erba' xhur. Minn hemm 'il quddiem, i ġbor kampjun 
minn mill-anqas 10 siti matul intervelli regolari, darba kull tlett xhur.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Sabiex iżżomm kemm il- ħama' friska u dik antika fl-istess attività, 
ħawwad is-supernatant iffiltrat ta' ħama' attivata bl-u żu ta' volum 
egwali tas-supernatant iffiltrat mat-ta ħlita ta' l-g ħaxar sorsi mi ġbura 
friski u wettaq il-kultura ta' dak il-likwir mi ġmugħ kif deskritt hawn 
fuq. Iġbor il-ħama' għall-użu bħala inoculum 18-24 sieg ħa wara liu l- 
unita tkun ġiet mimlija.  
VII.2.4.  Preparazzjoni tal-garafini  
Ipprepara dawn is-sitt garafini kif ġejjin:  
Nru. 1: kimika tat-test f'ilma mdewweb fi 100 mg/litru  
Nru. 2, 3 u 4: kimika tat-test f'minerali mdewweb fi 100 mg/litru  
Nru. 5: kimika tat-test (e ż. analin) f'medja minerali mdewwba fi 
100 mg/litru  
Nru. 6: medja minerali biss  
Żid il-kimika tat-test li ma tantx tin ħall fuq il-ba żi ta' piż jew volum 
jew ittratta kif deskritt fl-Anness III, apparti li la s-solventi u l-anqas 
l-aġenti emulsifikanti m'g ħandhom ikunu w żati. Żid l-assorbent tal- 
CO2 mal-garafini kollha fil-kikkri spe ċjali kif fornuti. A ġġusta l-pH 
fil-garafini nri. 2, 3 u 4 g ħal 7,0.  
VII.2.5.  It-twettieq tat-test  
Inokulta l-garafini nri. 2, 3 u 4 (sospensjoni tat-test, nru. 5 (kontroll 
ta' l-attività) u nru. 6 (inoculum fl-imbjank) b'volum żghir ta' l- 
inoculum sabiex ikun hemm kon ċentrazzjoni ta' 30 mg/litru ta' 
solidi sospi żi. Inoculum N huwa mi żjud mal-garafina nru. 1 li 
sservi bħala kontroll abjotiku. Ħejji l-apparat, qabbad il- ħawwadi u 
ivverifika li ma tg ħaddix arja, u ibda bil-kejl tat-te ħid ta' l-ossi ġenu 
taħt kondizzjonijiet fid-dlam. Ivverifika ta' kuljum, it-temperatura, l- 
ħawwadi u r-re ġistratur kowlometriku tat-te ħid ta' l-ossi ġenu, u 
innota xi kambjamenti fil-kulur tal-kontenuti tal-garafini. Aqra l- akkwist ta' l-ossi ġenu għas-sitt garafini direttament bil-metodu 
xieraq, per e żempju, mill-grafika tar-re ġistrazzjoni ta' sitt punti, li 
tipproduċi kurva BOD. Fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, normalment 
28 jum, kejjel il-pH tal-kontenuti tal-garafini u iddetermina l-kon ċen­
trazzjoni tal-kimika tat-test residwa u xi intermedju u, fil-ka ż ta' 
sustanza li tin ħall fl-ilma, il-kon ċentrazzjoni ta' DOC (l-Anness 
II.4). Agħti attenzjoni spe ċjali fil-ka ż ta' kimika volatili. Jekk nitrifi ­
kazzjoni tkun anti ċipata, iddetermina l-kon ċentrazzjoni tan-nitrat u 
tan-nitrit, jekk dan ikun possibbli.
 
VII.3. DATA URAPPORTA ĠĠ 
VII.3.1.  Trattament tar-ri żultati  
Iddividi l-akkwista ta' l-ossi ġenu (mg) tal-kimika tat-test wara hin 
pre-determina (korre ġut għal dak ta' l-inoculum tal-kontroll fl- 
imbjank wara l-istess ħin) bil-piż tat-kimika tat-test kif u żata. Dan 
iforni il-BOD espress b ħala mg ossi ġenu/mg kimika tat-test, ji ġifieri  
BOD ¼ ðmg O  2 teħid bil Ä kimika tat Ä test Ä mg O  2 teħid bl Ä imbjankÞ 
ðmg kimika tat Ä test fil Ä garafinaÞ 
mg O  2 per mg tal-kimika tat-test  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Il-persenta ġġ tal-biodegradazzjoni huwa imbag ħad akkwistat minn:  
% biodegradazzjoni  ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg kimikaÞ 
ThOD ðmg O  2=mg kimikaÞ Ü 100 %  
Għat-taħlitiet, ikkalkola il-ThOD mill-anali żi elementali, b ħal fil-każ 
ta' kompost sempli ċi. Uża il-ThOD (ThOD  NH4 jew ThOD  NO3 ) xierqa 
skond ta' jekk in-nitrifikazzjoni tkunx assenti jew kompluta (l- Anness II.2). Jekk b'danakollu, n-nitrifikazzjoni isse ħħ imma ma 
tkunx kompluta, ikkalkola korrezzjoni g ħall-ossiġenu ikkunsmat 
bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-kon ċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat 
(l-Anness V).
 
Ikkalkola l-persenta ġġ tal-biodegredazzjoni primarja mit-telf ta' 
kimika spe ċifika (paterna) (ara I.7,2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Jekk issib li kien hemm xi telf tal-kimika tat-test fil-garafina nru. 1, 
kejjel it-tne ħħija fiżiku-kimika, ag ħmel rapport dwar dan u u ża l- 
konċentrazzjoni tal-kimika tat-test (S  b ) wara 28 jum f din il- 
garafina sabiex tikkalkola l-persenta ġġ tal-biodegredazzjoni.  
Meta jsiru d-determinazzjonijiet ta' DOC (voluntarji), ikkalkola il- 
persentaġġ aħħari tal-biodegredazzjoni, minn:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100 %  
kif deskritt ta ħt il-punt I.7.1. Jekk issib li kien hemm xi telf tal-DOC 
fil-garafina nru. 1, kejjel it-tne ħħija fiżiku-kimika, u ża l-konċen­
trazzjoni DOC fdin il-garafina sabiex tikkalkola l-persenta ġġ tal- 
biodegredazzjoni.  
Irreġistra r-riżultati kollha dwara id-data fuq il-karti tad-data kif 
ipprovduta.  
VII.3.2.  Validità tar-ri żultati  
It-teħid ta' l-ossi ġenu ta' l-inoculum fl-imbjank normalment huwa 20- 
30 mg O  2 /litru u m'g ħandux ikun aktar minn 60 mg/litru fi 28 jum. 
Valuri għola minn 60 mg/litru jkunu je ħtieġu eżaminazzjoni kritika 
tad-data u tat-tekniki sperimentali. Jekk il-valur tal-pH huwa 'l barra 
mill-medda 6-8,5 u l-konsum ta' l-ossi ġenu bil-kimika tat-test huwa 
anqas minn 60 %, it-test g ħandu jkun repetut b'kon ċentrazzjoni aktar 
baxxa tal-kimika tat-test.  
Ara wkoll I.5.2.  
Jekk il-presenta ġġ tad-degradazzjoni ta' l-anilin ikkalkolat mill- 
konsum ta' l-ossi ġenu ma jkunx je ċċedi 40 % wara 7 tijiet u 65 % 
wara 14-il jum, it-test ikun meqjus b ħala invalidu.  
VII.3.3.  Rapporta ġġ 
Ara I.8.  
VII.4. FOLJATAD-DATA  
Eżempju tal-folja tad-data huwa mog ħti hawn ta ħt. 
TEST MITI (1)  
1. LABORATORJU  
2. IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Isem:  
Il-konċentrazzjoni tat-ta ħlita bil-lest: mg/l b ħala kimika  
Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, C  o : mg/l bħala kimika  
Volum tat-ta ħlita ta' reazzjoni, V: ml  
ThOD: mg O  2 /l 
4. INOCULUM  
Siti tal-kampjunar tal- ħama': 
1) … 6) … 
2) … 7) … 3) … 8) … 
4) … 9) … 
5) … 10) …
 
Konċentrazzjonijiet ta' solidi sospi żi fil-ħama' attivata wara l- 
akklamitizzazzjoni bid-drena ġġ sintetiku +… mg/litru  
Volum tal- ħama' attivata kull litru tal-medja finali =… ml  
Konċentrazzjoni tal- ħama' fil-medja finali =… mg/litru  
5. TEĦID TA' L-OSSI ĠENU BIODEGRADABBILITÀ  
Tip ta' respirometru u żat: 
(jum) 
0 7 14 21 28  
O 2 upt. (mg), 
kimika tat-test a 1 
a 2 
a 3 
O 2 upt. (mg), 
imbjank b 
Ikkorreġut O  2 
upt. (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
BOD kull mg tal- 
kimika tat-test ða Ä bÞ 
C o V Garafina 1. 
Garafina 2. Garafina 3. 
% degradazzjoni
 
BOD 
ThOD Ü 100  1 
2 
3 
medja (*)  
(*) bħala kondizzjoni stabbli(medja).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Nota: Formati simili jistg ħu ikunu w żati għall-kompost ta' referenza.  
6. ANALI ŻI TAL-KARBONJU  (voluntarju) : 
Analizzatur tal-karbonju:  
Garafina DOC 
% DOC imne ħħi Medja 
Imkejjel Ikkorre ġut 
Ilma + sustanza tat-test a — — 
Ilma + sustanza tat-test b  1 b1 – c 
Ilma + sustanza tat-test b  2 b 2 – c 
Ilma + sustanza tat-test b  3 b 3 – c 
Kontroll fl-imbjank c — — —  
% DOC imne ħħi ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. DATA SPECIFIKA KUMIKA ANALITIKA  
Ammont residwu tal-kimika tat-test fit- 
tmiem tat-test % degradazzjoni  
Test imbjank bl-ilma S  b 
meda inokulata S a1 
S a2 
S a3 
% degradation ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Ikkalkola il- % tad-degradazzjoni g ħall-garafini a1, a2 u a3 
rispettivament  
8. RIMARKI  
Il-kurva BOD kontra l- ħin, jekk disponibbli, g ħandha tkun 
mehmuża. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
ANNESS I  
ABBREVJAZZJONIJIET U DEFINIZZJONIJIET  
DO: Ossi ġenu mdewweb (mg/l) hija l-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu 
mdewweb f'kampjun akweju.  
BOD: Talba biokimika ta' l-ossi ġenu (g) hija l-ammont ta' l-ossi ġenu 
ikkunsmat mill-mikro-organi żmi meta ssir il-metabolizzazzjoni tal- 
kompost tat-test; espress wkoll b ħala g teħid ta' l-ossi ġenu kull g tal- 
kompost tat-test. (ara l-metodu C.5).  
COD: Talba ta' l-ossi ġenu Kimiku (g) hija l-ammont ta' orri ġenu ikkunsmat 
matul l-assidizzazzjoni ta' kompost tat-test bl-a ċidu dikromatiku ja ħraq; 
din tipprovdi g ħall-ammont tal-materja ossidizzabbli pre żenti; ukoll 
espressa b ħala g ossi ġenu ikkunsmat kull g tal-kompost tat-test. (ara 
l-metodu C.6).  
DOC: Karbonju organiku mdewweb huwa l-karbonju organiku pre żenti fit- 
taħlita jew li jg ħaddi minn filtru ta' 0,45 mikrometri jew jibqa fis-super ­
natant wara ċ-ċentrifigazzjoni fi 40 000 m.s  -2 (± 4 000 g) g ħal 15-il 
minuta.  
ThOD: Talba teoretika ta' l-ossi ġenu (mg) hija l-ammont totali ta' l-ossi ġenu 
meħtieġ għall-ossidizzazzjoni kompleta ta'kimika; hija ikkalkolata mill- 
formula molekulati (ara l-Anness II.2) u hija wkoll espress b ħala mg 
ossiġenu meħtieġ kull mg tal-kompost tat-test.  
ThCO  2 : Diossidu karbonju teoretiku (mg) hija l-kwantita ta' diossidu tal- 
karbonju ikkalkolat li jkun prodott mill-kontenut tal-karbonju mag ħruf 
jew imkejjel tal-kompost tat-test meta kompletament mineralizzat, ukoll espress b ħala mg diossidu tal-karbonju kull mg tal-kompost tat-test.
 
TOC: Karbonju organiku totali ta' kampjun huwa s-somma tal-karbonju 
organiku fit-ta ħlita u fissospenzjoni.  
IC: Karbonju inorganiku  
TC: Karbonju totali huwa s-somma tal-karbonju organiku u inorganiku 
preżenti f'kampjun.  
Biodegredazzjoni primarja:  
hija t-tibdil fl-istruttura kimika ta' sustanza, imwassla bl-azzjoni bjolo ġika, li 
tirriżulta mit-telf ta' proprjetà spe ċifika ta' dik is-sustanza.  
Biodegredazzjoni finalissima (erobika):  
hija l-livell tad-degradazzjoni akkwistata meta l-kompost tat-test ikun totalment 
utilizzat bil-mokroorgani żmi li jirri żulta fil-produzzjoni tad-diossidu tal-karbonju, 
ilma, mel ħ minerali u kostitwenti ġodda mikrobjali ċellulari (biomassa).  
Biodegrabbillità Pronta:  
klassifikazzjoni arbitrarja tal-kimika li tkun g ħaddiet minn ċerti testijiet spe ċifiċi 
tal-għażla għall-biodegradabbilità finalissima; dawn it-testijiet huma hekk 
strinġenti li huma assumiti li tali komposti jkunu malajr jew kompletament 
biodegradabbli f'ambjenti akweji permezz ta' kondizzjonijiet erobi ċi. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Biodegrabbillità Inerenti:  
klassifikazzjoni tal-kimika li dwarha jkun hemm evidenza ming ħajr ekwivoku tal- 
biodegradazzjoni (primarja jew finalissima) fi kwalunkwe test rikonoxxut tal- biodegradabbilità.
 
Trattabbilità:  
hija l-amenabbilità ta' komposti g ħat-tneħħija matul it-trattament biolo ġiku ta' l- 
ilma ta' l-iskart ming ħajr ma tkun affettwata b'mod ħażin l-operazzjoni normali 
tal-proċessi tat-trattament. Ġeneralment, komposti fa ċilment biodegradabbli 
jistgħu jkunu trattati, imma mhux il-komposti ineretament biodegradabbli huma 
hekk. Pro ċessi abjoti ċi jistgħu ukoll ikunu operabbli.  
L-ispazju  
taż-żmien mill-innokulazzjoni, fit-test tat-tne ħħija bil-kulur, sal-persenta ġġ tad- 
degradazzjoni, jkun żdied b'mill anqas 10 %. L-ispazju ta ż-żmien huwa ta' 
spiss varjabbli u riprodu ċibbli ħażin ħafna.  
Il-ħin tad-degradazzjoni  
huwa l-ħin mit-tmiem ta' l-ispazju tal- ħin sal-ħin li 90 % tal-livell massimu tad- 
degradazzjoni tkun ġiet milħuqha.  
Il-perijodu ta' 10 ijiem  
huma l-10 jiem li immedjetament isegwu l-akkwist ta' l-10 % degradazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
ANNESS II  
KALKOLU U DETERMINAZZJONI TA' PARAMETRI SOMMARJI 
XIERQA  
Jiddependi mill-metodu mag ħżul, ċerti parametri sommarji jkunu me ħtieġa. Is- 
sezzjoni li ġejja tiddeskrivi dderiva ta' dawn il-valuri. L-u żu ta' dawn il-parametri 
hija deskritta fil-metodi individwali.  
1. Kontenut tal-Karbonju  
Il-kontenut tal-karbonju huwa ikkalkolat minn komposizzjoni elementali 
magħrufa jew determinata bl-anali żi elementali tas-sustanza tat-test.  
2. ThOD = Theoretical Oxygen Demand (Talba teoretika ta' l-ossi ġenu)  
It-Talba teoretika ta' l-ossi ġenu (ThOD) tista tkun ikkalkolata jekk il- 
komposizzjoni elementali tkun mag ħrufa jew determinata b'anali żi 
elementali. Hija g ħal kompost:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
mingħajr nitrifikazzjoni,  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
jew bin-nitrifikazzjoni,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Talba ta' l-Ossi ġenu Kimiku (COD)  
It-Talba ta' l-Ossi ġenu Kimiku (COD) hija determinata skond il-metodu 
C.6. 
4. DOC = Dissolved Organic Carbon (Karbonju organiku mdewweb)  
Il-Karbonju organiku mdewweb (DOC) huwa bid-definizzjoni l-karbonju 
organiku ta' kwalunkwe kimika jew ta ħlita fl-ilma li tg ħaddi minn filtru 
0,45 mikrometri.  
Kampjuni mir-re ċipjenti tat-test huma mi ġbura u iffiltrati immedjatament 
minn apparat tal-filtrazzjoni blu żu ta' membrana filtranti xierqa. L-ewwel 
20 ml (l-ammont jista jkun imnaqqas meta jsir u żu minn filtranti żgħar) tal- 
filtrat ikunu mwarrba. Volumi ta' 10-20 ml jew anqas, jekk injettati (il- 
volum jiddependi mill-ammont me ħtieġ għall-analizzatur tal-karbonju) 
huma miżmuma għall-analizzar tal-karbonju. Il-kon ċentrazzjoni DOC hija 
determinata permezz ta' l-analizzatur tal-karbonju organiku li huwa kapa ċi 
li jkejjel b'e żatezza l-kon ċentrazzjoni tal-karbonju ekwivalenti g ħal, jew 
aktar baxxa minn 10 % tal-kon ċentrazzjoni DOC inizjali u żat fittest.  
Kampjuni iffiltrati li ma jkunux jistg ħu jiġu analizzati fl-istess jum utili 
jistgħu ikunu preservati bil- ħażna fir-refri ġeratur fi 2-4 °C g ħal 48 h, jew 
f'anqas minn 18 °C g ħal perijodu twil.  
Rimarki:  
Filtri tal-membra huma ta' spiss impregnati b'surfaktanti g ħall-idrofiliz ­
zazzjoni. B'hekk il-filtru jista jkun fih sa diversi mg ta' karbonju organiku solubbli li jkun jinterferixxi fid-determinazzjonijiet tal-biodegrad ­
abbilità. Surfaktanti u komposti organi ċi solubbli o ħrajn huma mne ħħija 
mill-filtri billi jkunu mog ħllija f'ilma dejonizzat g ħal tlett perijodi ta' 
siegħa kull wie ħed. Il-filtri jistg ħu mbagħad ikunu ma ħżuna fl-ilma g ħal 
ġimgħa waħda. Jekk ikunu w żati l-kartu ċċi tal-filtri, kull lott g ħandu jkun 
ivverifikat dwar il-konformità li dan ma jkunx jirrilaxxa karbonju organiku 
li jinħall.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Jiddependi mit-tip tal-filtri tal-membrana, l-kimika tat-test tista' tkun 
miżmuma bl-assorbazzjoni. Jista jkung ħalhekk rakkomandabbli li jkun 
assigurat li l-kimika tat-test ma tkunx mi żmuma bil-filtru.  
Centrifugazzjoni fi 40 000 m.sek 2 (4 000 g) g ħal 15-il minuta tista tkun 
użata għad-differenzazzjoni ta' TOC versus DOC minflok il-filtrazzjoni. Il- 
metodu mhux affidabbli fil-kon ċentrazzjoni inizjali ta' < 10 mg DOC/ ­
l ladarba jew mhux il-bakterja kollha tkun imne ħħija jew inkella l- 
karbonju b ħala parti tal-bakterja, pla żma tkun imdewba mill- ġdid. 
BIBLJOGRAFIJA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat.Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 
1965, P 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser-und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs-und StoffkenngroLen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu1 Wasserwesen (NAW) in DIN 
Deutsches Institut für Normung e.V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1),169.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
ANNESS III  
EVALWAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ TA' SUSTANZI LI 
FTIT LI XEJN JIN ĦALLU  
Fit-testijiet tal-biodegradabbilità b'sustanzi li ftit li xejn jin ħallu, l-aspetti li ġejjin 
għandhom jir ċievu attenzjoni spe ċjali. 
Waqt li l-likwidi omo ġenji rari jippre żentaw problemi tal-kampjunar, huwa 
rakommandabbli li materjali solidi jkunu omo ġenizzati bil-me żżi xierqa sabiex 
ikunu evitati żbalji minħabba n-nuqqa ta' omo ġenità.  
Attenzjoni spe ċjali għandha tkun mog ħtija meta kampjuni rappre żentattivi ta' ftit 
milligrammi huma me ħtieġa minn ta ħlitiet ta' kimika jew sustanzi b'ammonti 
żgħar ta' impuritajiet. Diversi g ħamliet ta' a ġitazzjoni matul it-testijiet tista tkun 
użata. Attanzjoni g ħandha ting ħata għall-użu biss ta' a ġitazzjoni suffi ċjenti sabiex 
il-kimika tin żamm imxerda, u sabiex ikunu evitati s ħana żejda, rgħawwa 
eċċessiva u forzi qawwija e ċċessivi.  
Jista jkun u żat emulsifikatur li jag ħti tixrid stabbli tal-kimika. Dan m'g ħandux 
ikun tossiku g ħall-bakterja u m'g ħandux ikun biodegradabbli jew li jo ħloq ir- 
rgħawwa bil-kondizzjonijiet tat-test.  
L-istess kriterja hija applikabbli g ħal solventi b ħalma hija applikabbli g ħall-emul­
sifikanti.  
Mhux rakkomandat li trasportaturi solidi jkunu w żati għal sustanzi solidi tat-test 
imma dawn jistg ħu ikunu adatti g ħal sustanzi żejtnija.  
Meta sustanzi aw żiljarji bħalma huma l-emulsifikanti, solventi u trasportaturi 
jkunu wżati, prova fl-imbjank li jkun fiha s-sustanza aw żiljarja, għandha tkun 
imwettqa.  
Kwalunkwe mit-tlett testijiet respirometri ċi C0  2 , BOD, MITI jistg ħu ikunu w żati 
fl-istudju tal-biodebradabbilità tal-komposti li ftit li xejn jin ħallu. 
BIBLJOGRAFIJA  
— de Morsier, A. et al.,  Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere,  1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P.,  The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere , 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
ANNESS IV  
EVALWAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ TA' KIMIKA 
SUSPETTATA LI TKUN TOSSIKA G ĦALL-INOCULUM  
Meta kimika hija su ġġetta għal testijiet ta' biodegradabbilità fa ċli u tidher li ma 
tkunx biodegradabbli, l-pro ċedura li ġejja hija rakommandabbli jew distinzjoni 
bejn l-inibizzjoni u l-inenità tkun mixtieqa (Reynolds et al., 1987).  
Inocula  simili jew identika g ħandha tkun u żata għat-testijiet tat-tossi ċità u l- 
biodegredazzjoni.  
Sabiex tkun assessjata t-tossi ċità tal-kimika studjata f'testijiet tal-biodegradibbiltà 
faċli, l-applikazzjoni ta' ġemgħa waħda ta' l-inibizzjoni tar-rata tar-Respirazzjoni 
tal-Ħama’ (test ta' l-inibizzjoni tar-respirazzjoni tal ħama attivata – Dir 
88/302/EEC), BOD u/jew il-metodi ta' l-Inibizzjoni tat-Tkabbir, g ħandhom 
ikunu jidħru jidhru xierqa.  
Jekk l-inibizzjoni min ħabba t-tossi ċità għandha tkun evitata, huwa su ġġerit li l- 
konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test u żata fit-testijiet tal-biodegradabbiltà fa ċli 
għandha tkun mhux anqas minn 1/10 tal-valuri EC  50 (jew anqas mill-valuri EC  20 ) 
akkwistati fit-testijiet tat-tossi ċità. Komposti b'valur EC  50 jew akbar minn 
300 mg/l aktarx li ma jkollhomx effetti tossi ċi fit-testijiet tal-biodehradabbiltà 
faċli. 
Il-valuri EC  50 ta;’ anqas minn 20 mg/l huma aktarx li jimponu problemi serji 
għal testijiet sussegwenti. Kon ċentrazzjoni tat-test baxxi g ħandhom ikunu u żati, li 
joħolqu l-ħtiega ta' l-u żu tat-test strin ġenti u sensittiv tal-Flixkun Mag ħluq jew l- 
użu ta' 14C – materjal bit-tikketta. B'mod alternattiv,  inoculum  akklamitizzat jista 
jippermetti li jkunu u żati konċentrazzjonijiet og ħla tas-sustanza tat-test. F'dan il- 
każ ta' l-aħħar, b'danakollu, l-kriterja spe ċifika tat-test tal-biodegradabbilità fa ċli li 
tintilef.  
BIBLJOGRAFIJA  
Reynolds, L. et al.,  Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability . Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
ANNESS V  
KORREZZJONI TAT-TE ĦID TA' L-OSSI ĠENU G ĦALL- 
INTERFERENZA BIN-NITRIFIKAZZJONI  
Żbalji min ħabba li ma tkunx ikkonsidrata n-nitrifikazzjoni fil-kalkolazzjoni tat- 
teħid ta' l-ossi ġenu bilbiodegradabbilità tas-sustanzi tat-test li ma jkun fihom 
N huma mar ġinali (mhux akbar minn 5 %), anki jekk l-ossidazzjoni ta' l- 
ammonju-N fil-medja isse ħħ b'mod erratiku b ħal bejn ir-re ċipjenti tat-test u l- 
imbjank. B'danakollu, g ħal sustanzi tat-test li jkun fihom N, żbalji serji jistg ħu 
iseħħu. 
Jekk in-nitrifikazzjoni tkun se ħħet imma ma tkunx kompluta, t-te ħid osservat ta' 
l-ossiġenu bit-ta ħlita tarreazzjoni jista' jkun ikkoerru ġut għall-ammont ta' l- 
ossiġenu użat fl-ammonju ossidizzanti g ħan-nitrit u nnitrat, jekk il-bidliet fil- 
konċentrazzjoni matul l-inkubazzjoni tan-nitrit u n-nitrat huma determinati 
bilkonsiderazzjoni ta' dawn l-ekwazzjonijiet li ġejjin: 
2 NH  4 Cl + 3O  2 = 2 HN O  2 + 2 HCI + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Globalment: 
2 NH  4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Mill-ekwazzjoni (1), l-akkwist ta' l-ossi ġenu bit-28 g ta' nitro ġenu li jkun jinsab 
fil-klorid ta' l-ammonium (BH  4 C1) li jkun ossidizzat g ħan-nitrit huwa 
96 g, i.e. fattur ta' 3,43 (96/28). Bl-istess mod, mill-ekwazzjoni (3), l-akkwist ta' l-ossi ġenu bit-28 g ta' nitro ġenu li jkun ossidizzat g ħan-nitrit huwa 
128 g, i.e. fattur ta' 4,57 (128/28).
 
Ladarba r-reazzjonijiet huma sekwenzali, li jkunu esegwiti minn spe ċje ta' 
bakterja distinta u differenti, huwa possibbli g ħall-konċentrazzjoni tan-nitrit li 
tiżdied jew tonqos; f'dan il-ka ż ta' laħħar, konċentrazzjoni ekwivalenti tan-nitrat 
ikun iffurmat. G ħalhekk, l-ossi ġenu ikkunsmat fil-formazzjoni ta' ornitrat hija 
4,75 multiplikata bi ż-żieda fil-kon ċentrazzjoni tan-nitrat, filwaqt li l-ossi ġenu 
assoċjaat mal-formazzjoni tan-nitri hija 3,43 multiplikata bi ż-żieda fil-kon ċen­
trazzjoni tan-nitrit jew bit-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni tag ħha, ittelf ta' l-ossi ġenu 
huwa - 3,43 moltiplikat bit-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni.  
Dan ifisser: 
0 2 ikkunsmat fil-formazzjoni tan-nitrat = 4,57 × i ż-żieda fil- 
konċentrazzjoni tan-nitrat (4) 
u 
0 2 ikkunsmat fil-formazzjoni tan-nitrit = 3,43 × i ż-żieda fil-kon ċ­
entrazzjoni tan-nitrit (5) 
u 
0 2 mitluf fl-g ħebien tan-nitrit = - 3,43 × it-tnaqqis fil-kon ċen­
trazzjoni tan-nitrat (6) 
Sabiex 
0 2 akkwistat min ħabba n-nitrifikazzjoni = ± 3,43 × il-kamb ­
jament fin-nitrit ikkon ċentrat + 4,57 ×i żida fin-nitrat ikkon ċ­
entrat. (7) 
u għalhekk 
0 2 akkwistat min ħabba l-ossidizzazzjoni C = l-akkwist totali 
osservat – l-akkwist min ħabba nnitrifikazzjoni (8) 
B'mod alternattiv, jekk it-total biss ta' l-N ossidizzat huwa determinat, l-akkwista 
ta' l-ossi ġenu min ħabba nnitrifikazzjonijista' jkun meqjus b ħala, fl-ewwel 
approssimazzjoni, 4,57 × i ż-żieda fl-N ossidizzat.  
Il-valur ikkorre ġut għall-konsum ta' l-ossi ġenu minħabba l-ossidizzazzjoni ta' 
C huwa mbag ħad imqabbel mal- ThOD NH  3 , kif ikkalkolat fl-Anness II.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5 DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSI ĠENU BIOKEMIKALI  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-iskop tal-metodu huwa l-kejl tat-talba ta' l-ossi ġenu biokemikali 
(BOD) ta' sustanzi organi ċi solidi u likwidi.  
L-informazzjoni elaborata b'dan it-test tappartjeni g ħal komposti li 
jinħallu fl-ilmal b'dana kollu, komposti volatili u dawk b'solubbiltà 
baxxa fl-ilma jistg ħu wkoll, g ħall-anqas fil-prin ċipju, jkunu ittestjati.  
Il-metodu huwa applikabbli biss g ħal dawk il-materja organi ċi tat- 
test li ma humiex inibitorji g ħall-bakterja fil-kon ċentrazzjoni u żata 
fit-test. Jekk il-materjal tat-test ma jkunx jin ħall fil-kon ċentrazzjoni 
tat-test, mi żuri speċjali, bħalma hu l-u żu ta' dispersjoni ultrasonika, 
jistgħu jkunu w żati sabiex tkun akkwistata dispersjoni tajba tal- 
materjal tat-test.  
Informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika tista tkun utili g ħall-inter­
pretazzjoni ta' ri żultati baxxi u fil-g ħażla tal-kon ċentrazzjonijiet 
xierqa tat-test.  
1.2. DEFINIZZJONI U UNITAJIET  
Il-BOD huwa definit b ħala l-massa ta' ossi ġenu mdewweb me ħtieġ 
minn volum spe ċifikat tat-ta ħlita tas-sustanza g ħall-proċess ta' l-ossi ­
dizzazzjoni biokimika skond il-kondizzjonijiet preskritti.  
Dawn ir-ri żultati huma espressi b ħala grammi tal-BOD f'kull gramma 
tas-sustanza ittestjata.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
L-użu ta' sustanza ta' referenza xierqa g ħall-verifika ta' l-attività ta' l- 
inoculum hija mixtieqa.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Ammont predominanti tas-sustanza, mdewweb jew imxerred b'medja 
adatta sew-arjata, huwa innokulat mal-mikro-organi żmi u inkubat 
f'temperatura kostanti ambjenti definita, f'post fid-dlam.  
Il-BOD huwa determinat bid-differenza tal-kontenut ta' l-ossi ġenu 
mdewweb fil-bidu u fit-tmien tat-test. It-tul ta' żmien tat-test 
għandu jkun mill-anqas ħamest ijiem u mhux aktaar minn 28 jum.  
Imbjank g ħandu jkun determinat f'assa ġġ parallel li ma jkun fih l- 
ebda sustanza tat-test.  
1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
Id-determinazzjoni BOD ma tistg ħax tkun meqjusa b ħala deter ­
minazzjoni valida tal-biodegradabbiltà ta' sustanza. Dan it-test jista 
biss ikun meqjus b ħala test ta' prova.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Taħlita jew tixrid preliminari tas-sustanza huwa ippreparat sabiex 
tkun akkwista l-kon ċentrazzjoni BOD kompatibbli mal-metodu 
użat. Il-BOD huwa mbag ħad determinat skond kwalunkwe metodu 
standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DATA U EVALWAZZJONI  
Il-BOD li jkun jinsab fit-ta ħlita preliminari huwa kalkolat skond il- 
metodu normalizzat mag ħżul, u konvertit fi grammi ta' BOD kull 
gramma tas-sustanza tat-test.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
Il-metodu u żat għandu jkun mistqarr.  
It-talba g ħall-ossiġenu biokemikali g ħandha tkun il-medja ta' mill- 
anqas tlett kejl validi.  
L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall-interpretazzjoni 
tar-riżultati għandhom ikunu irrappurtati, spe ċjalment f'dak li jirrig ­
wardja l-impuritajiet, l-istat fi żiku, l-effetti tossi ċi u l-komposizzjoni 
inerenti tas-sustanza.li jkunu jaffettwaw ir-ri żultati.  
L-użu ta' addittiv g ħall-inibizzjoni tan-nitrifikazzjoni biolo ġika 
għandu jkun irrappurtat.  
4. REFERENZI  
Lista ta' metodi standardizzati, per e żempju:  
NF T 90-103: Determinazzjoni tat-talba ta' l-ossi ġenu biokemikali.  
NBN 407: Talba ta' l-ossi ġenu biokemikali.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
Id-determinazzjoni tat-talba ta' l-ossi ġenu biokemikali, il-Metodu S 
għall-eżaminazzjoni ta' l-ilma u l-materjali asso ċjati, HMSO, 
Londra.  
ISO 5815: Determinazzjoni tat-talba ta' l-ossi ġenu biokemikali 
wara n jiem.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADAZZJONI — TALBA TA' L-OSSI ĠENU KEMIKALI  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-iskop tal-metodu huwa l-kejl tat-talba ta' l-ossi ġenu kemikali 
(COD) ta' sustanzi organi ċi solidi u likwidi f'manjera normali, arbit ­
rarja, skond kondizzjonijiet fissi tal-laboratorju.  
Informazzjoni dwar il-formula tas-sustanza tkun utili g ħat-twettieq 
tat-test u l-interpretazzjoni tar-ri żultat akkwistat (e ż. imluħa aloġe­
nizzati, imlu ħa ferrużi ta' komposti organi ċi, komposti organoklo ­
rini).  
1.2. DEFINIZZJONIJIET U U NITAJIET  
It-talba ta' l-ossi ġenu kemikali hija l-kejl ta' l-ossidabbilità ta' 
sustanza, espressa fl-ammont ekwivalenti ta' ossi ġenu ta' rea ġent 
ossidizzanti ikkunsmat mis-sustanza skond kondizzjonijiet fiss-tal- laboratorju.
 
Ir-riżultat huwa espress b ħala grammi tal-COD kull gramma tas- 
sustanza ittestjata.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Sustanzi ta' referenza ma je ħtieġux li jkunu w żati fil-każi kollha meta 
tkun investigata sustanza ġdida. Dawn g ħandhom primarjament 
iservu għall-kalibrazzjoni tal-metodu minn żmien għal żmien u 
sabiex jippermettu l-paragun mar-ri żultati tal-metodu applikat.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Ammont predeterminat tas-sustanza, imdewba jew imxerda fl-ilma, 
huwa ossidizzat bid-dikromat tal-putass f'medja qawwija ta' l-a ċidu 
sulfuriku bis-sulfat tal-fidda b ħala katalist, ta ħt reflus g ħal sagħtejn. 
Id-dikromat residwu huwa determinat bit-titrazzjoni mas-sulfat ta' l- 
ammonium ferru ż standardizzat.  
Fil-każ ta' sustanzi li jkun fihom il-klorin (  1 ), sulfat tal-merkurju 
huwa miżjud sabiex titnaqqas l-interferenza tal-klorid.  
1.5. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
Minħabba l-manjiera arbitrarja tad-determinazzjoni, il-COD huwa 
“indikatur ossidizzabbli” u bhala tali u żat bħala metodu prattiku 
fil-kejl tal-materja organika.  
Il-klorid jista jinterferixxi f'dan it-test, a ġenti inorgani ċi tat-tnaqqis 
jew ta' l-ossidizzazzjoni jistg ħu ukoll jinterferixxu mad-deter ­
minazzjoni tal-COD.  
Uħud mill-kompost ċikliċi u ħafna mis-sustanzi volaiti (e ż. aċidi 
xaħmija baxxi) ma humiex kompletament ossidizzati b'dan it-test.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
Taħlita jew tixrid preliminarji tas-sustanza huma ippreparati sabiex 
ikun akkwistat COD bejn 250 u 600 mg kull litru.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Wara l-u żu, is-soluzzjonijiet li fihom  salts  tal-merkurju g ħandhom ji ġu trattati sabiex ji ġi 
evitat it-tixrid tal- merkurju fl-ambjent.Altrimentri l-BOD huwa mbag ħad determinat 
skond kwalunkwe metodu xieraq standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.
 Rimarki:  
Fil-każ ta' sustanza li ma tantx tin ħall u mhux-dispersibbli, ammont 
ta' sustanza mi ġjuba trab fin jew sustanza likwida korrespondenti 
għal madwar S mg ta' COD tista tkun mi żuna u po ġġuta fl-apparat 
esperimentali bl-ilma.  
It-talba ta' l-ossi ġeni kemikali (COD) hija ta' spiss u spe ċjalment fil- 
każ ta' sustanzi li ma tantx jin ħallu, determinata b'mod vanta ġġuż 
ġewwa varjant tal-metodu, i.e., f'sistema mag ħluqa bl-ekwalizzatur 
tal-pressjoni (H. Kelkenberg, 1975). F'din il-modifika, l-komposti 
huma determinati biss b'diffikulta bil-metodu konvenzjonali. – e ż. 
aċidu aċetiku – jista ta' spiss ikun kwantifikat b'su ċċess. Il-metodu 
wkoll jonqos, b'dana kollu, fil-ka ż tal-pridin Jekk il-kon ċentrazzjoni 
tad-dikromat tal-putassa, kif preskritt fir-ref. (1), huma mtella g ħal 
0,25 N (0,0416 M), l-u żin dirett ta' 5-10 mg tas-sustanza huwa 
faċilitat, li huwa essenzali g ħad-determinazzjoni tal-COD ta' 
sustanzi li ma tantx jin ħallu fl-ilma (ref. (2)).  
Altrimenti l-BOD huwa mbag ħad determinat skond kwalunkwe 
metodu xieraq standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.  
2. DATA U EVALWAZZJONI  
Il-COD li jkun jinsab fil-garafina sperimentali huwa ikkalkolat skond 
il-metodu normalizzat mag ħżul, u ikkonvertit fi grammi ta' COD kull 
gramma tas-sustanza tat-test.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
Il-metodu u żat għandu jkun mistqarr.  
It-talba għall-ossiġenu kemikali g ħandha tkun il-medja ta' mill-anqas 
tlett kejl validi. L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti g ħall- 
interpretazzjoni tar-ri żultati għandhom ikunu irrappurtati, spe ċjalment 
f'dak li jirrigwardja l-impuritajiet, l-istat fi żiku, l-effetti tossi ċi u l- 
komposizzjoni inerenti tas-sustanza.li jkunu jaffetwaw ir-ri żultati.  
L-użu tas-sulfat tal-merkurju g ħal minimizzar ta' l-interferenza tal- 
klorid għandu jkun rapportat.  
4. REFERENZI  
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Lista ta' metodi standardizzati, per e żempju:  
NBN T 91-201 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' 
l-ossiġnu. 
ISBN 0 11 7512494 Id-domanda kemikali ta' l-ossi ġnu (il- 
valur tad- dichromate ) ta' l-ilmijiet imni ġġsa u waste waters.  
NFT 90-101 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' l- 
ossiġnu. 
DS 217 = L-anali żi ta' l-ilma Id-determinazzjoni tad-domanda 
kemikali ta' l-ossi ġnu. 
DIN 38409-H-41 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali 
ta' l-ossiġnu (COD) fil-medda li tasal iktar minn 15 mg kull 
litru.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Kwalità ta' l-ilma: talba ta' l-ossi ġenu kemikali 
metodi dikromati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. ID-DEGRADAZZJONI – ID-DEGRADAZZJONI ANTIBIJOTIKA: 
L-IDROLISI B ĦALA FUNZJONI TAL-PH  
1. METODU  
Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti g ħall-OECD TG 111 
(2004).  
1.1. DA ĦLA 
Il-kimiċi jistgħu jidħlu fl-ilmijiet tal-wi ċċ b'tali metodi b ħall-appli­
kazzjoni diretta, l-irxiex, l-ilma li jiskula, id-drena ġġ, ir-rimi ta' l- 
iskart, l-effluwent industrijali, domestiku jew agrikolu u d- 
depożizzjoni atmosferika u jistg ħu jiġu ttrasformati f'dawk l-ilmijiet 
minn pro ċessi kimiċi (eż. l-idrolisi, l-ossidazzjoni), fotokimi ċi u/jew 
mikrobjali. Din il-Linja Gwida tiddeskrivi metodu tat-test fil- 
laboratorju biex ji ġu stmati trasformazzjonijiet idroliti ċi abjotiċi tal- 
kimiċi f'sistemi akkwati ċi ta' valuri pH normalment misjuba fl- 
ambjent (pH 4 – 9) u hija bba żati fuq Linji Gwidi e żistenti (1)(2) ­
(3)(4)(5)(6)(7).  
L-esperimenti huma mwettqa sabiex ji ġu ddeterminati (i) ir-rata ta' l- 
idrolisi tas-sustanza tat-test b ħala funzjoni tal-pH u (ii) l-identità jew 
in-natura u r-rati tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti ta' l-idrolisi li għalihom jistg ħu jiġu esposti l-organi żmi. Dawn l-istudji jistg ħu 
jkunu me ħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati g ħall- 
ilma jew li x'aktarx jil ħqu l-ambjent b'me żżi oħrajn deskritti hawn 
fuq.
 
1.2. DEFINIZJONIJIET U UNITAJIET  
Ara l-Anness 2  
1.3. L-APPLIKABILITÀ TAL-METODU  
Il-metodu ġeneralment jg ħodd għal sustanzi kimi ċi (mingħajr tikketta 
jew bit-tikketta) li g ħalihom huwa disponibbli metodu analitiku bi 
preċiżjoni u sensittività bi żżejjed. Jgħodd għall-komposti ftit volatili 
u mhux volatili ta' solubbiltà suffi ċjenti fl-ilma. It-test ma g ħandux 
jgħodd għall-kimiċi li huma volatili ħafna mill-ilma (e ż. fumiganti, 
solventi organi ċi) u għalhekk ma jistax jin żamm fit-ta ħlita taħt il- 
kondizzjonijiet esperimentali ta' dan it-test. It-test jista' jkun diffi ċli li 
jitwettaq b'sustanzi ta' solubbiltà minima fl-ilma (8).  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Taħlitiet buffer  solubbli bl-ilma ta' valuri pH differenti (pH 4, 7 u 9) 
huma trattati bis-sustanza tat-test u inkubati fid-dlam ta ħt 
kondizzjonijiet tal-laboratorju kkontrollati (b'temperaturi kostanti). Wara intervalli xierqa ta' żmien, it-ta ħlitiet buffer  huma analizzati 
għas-sustanza tat-test u g ħall-prodotti ta' l-idrolisi. Bis-sustanza tat- 
test ittikkettjat (e ż.
 14 C), jista' ji ġi stabbilit bilan ċ tal-massa b'mod 
aktar faċli. 
Dan il-metodu tat-test huwa di żinjat bħala strateġija f'saffi li tintwera 
u hija spjegata fl-Anness 1, Kull saff huwa mibdi mir-ri żultati tas- 
saff ta' qablu.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. L-INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Is-sustanza tat-test ming ħajr tikketta jew bit-tikketta tista' tintu ża biex 
titkejjel ir-rata ta' l-idrolisi. Il-materjal ittikkettjat ġeneralment huwa 
preferut g ħall-istudju tar-rotta ta' l-idrolisi u biex jitwaqqaf il-bilan ċ 
tal-massa; i żda, f'każijiet speċjali, l-ittikkettjar jista' ma jkunx assolu ­
tament ne ċessarju. L-ittikkettjar ta'  14 C huwa rrakkomandat i żda l- 
użu ta' iżotopi oħrajn bħal 13 C, 15 N, 3 H, jista' jkun utli wkoll. Sa fejn 
possibbli, it-tikketta g ħandha tkun po żizzjonata fil-parti(jiet) l-aktar 
stabbli tal-molekula. Per e żempju, jekk is-sustanza tat-test fiha ċirku 
wieħed, it-tikkettjar fuq dan i ċ-ċirku huwa me ħtieġ; jekk is-sustanza 
tat-test fiha żewġ ċrieki jew aktar, jistg ħu jkunu me ħtieġa studji 
separati biex ji ġi evalwat id-destin ta' kull ċirku ttikkettjat u biex 
jinkiseb l-informazzjoni xierqa dwar il-formazzjoni tal-prodotti ta' l- idrolisi. Is-safa tas-sustanza tat-test g ħandha tkun mhux inqas minn 
95 %.
 
Qabel ma jsir it-test ta' l-idrolisi, g ħandha tkun disponibbli din l- 
informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza tat-test:  
a) is-solubbiltà fl-ilma [Il-Metodu tat-Test A.6];  
b) is-solubbiltà fis-solventi organi ċi; 
ċ) il-pressa tal-fwar [Metodu tat-Test A.4] u/jew il-kostant tal-Li ġi 
ta' Henry;  
d) il-koeffi ċjenti tal-qsim n-octanol/ilma [Il-Metodu tat-Test A.8];  
e) il-kostant tad-disso ċjazzjoni (pK  a ) [Linja Gwida 112 ta' l-OECD] 
(9); 
f) rata ta' fototrasformazzjoni diretta u indiretta fl-ilma fejn xieraq.  
Il-metodi analiti ċi għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza tat-test u, jekk 
huwa rilevanti, g ħall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti 
ta' l-idrolisi f'ta ħlitiet bl-ilma g ħandhom ikunu disponibbli (ara wkoll 
it-taqsima 1.7.2).  
1.6. IS-SUSTANZI TA' RIFERENZA  
Fejn possibbli, is-sustanzi ta' riferenza g ħandhom jintu żaw għall- 
identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi bil- metodi spettroskopi ċi u kromatografi ċi jew metodi o ħrajn sensittivi 
b'mod xieraq.
 
1.7. IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ  
1.7.1.  L-irkupru  
L-analiżi ta', għall-inqas, soluzzjonijiet  buffer  doppji jew ta' l-estratti 
tagħhom immedjatament wara ż-żjieda tas-sustanza tat-test tag ħti l- 
ewwel indikazzjoni tar-repetibbiltà tal-metodu analitiku u ta' l- uniformità tal-pro ċedura ta' l-applikazzjoni g ħas-sustanza tat-test. L- 
irkupru g ħal stadji aktar tard ta' l-esperimenti jing ħata bil-bilan ċi tal- 
massa rispettivi (meta jintu ża materjal ittikkettjat). L-irkupru g ħandu 
jvarja minn 90 % sa 110 % g ħal kimiċi ttikkettjati u mhux ittik ­
kettjati (7). Fil-ka ż li huwa teknikament diffi ċli li tintla ħaq din l- 
iskala, irkupru ta' 70 % g ħall-kimiċi mhux ittikkettjati, i żda għandha 
tingħata ġustifikazzjoni.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Ir-repetibbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku  
Ir-repetibbiltà tal-metodu/i analitiku/i ċi biex ti ġi kkwantifikata s- 
sustanza tat-test u l-prodotti ta' l-idrolisi f' ħinijiet aktar tard tista' 
tiġi vverifikata bl-anali żi doppja ta' l-istess ta ħlitiet buffer  (jew ta' 
l-estratti tag ħhom) wara li bi żżejjed kwantitajiet ta' prodotti ta' l- 
idroliġi jkunu ffurmaw g ħall-kwantifikazzjoni.  
Il-metodu analitiku g ħandu jkun sensittiv bi żżejjed biex il-kon ċen­
trazzjonijiet tas-sustanzi tat-test ji ġu kkwalifikati sa 10 % jew inqas 
mill-konċentrazzjonijiet inizjali. Jekk huwa rilevanti, il-metodi 
analitiċi għandhom ukoll ikunu sensittivi bi żżejjed biex ji ġi kkwan­
tifikat kwalunkwe prodott ta' l-idrolisi li jirrappre żenta 10 % jew 
aktar mill-applikat (fi kwalunkwe ħin matul l-istudju) sa 25 % jew 
inqas mill-kon ċentrazzjoni l-aktar g ħolja tagħha. 
1.7.3.  L-intervalli ta' kunfidenza g ħad-data kinetika ta' l-idrolisi  
L-intervalli ta' kunfidenza g ħandhom jin ħadmu u ji ġu ppreżentati 
għall-koeffiċjenti kollha tar-rigressjoni, il-kostanti tar-rati, il- half- 
lives, u kwalunkwe parametri kineti ċi oħrajn (eż. DT50).  
1.8. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.8.1.  It-tag ħmir u l-apparat  
L-istudju g ħandu jsir f'kontenituri tal- ħġieġ (eż. tubi tat-testijiet, 
fliexken żgħar) taħt kundizzjonijiet mudlama u sterili, jekk 
meħtieġ, kemm-il darba l-informazzjoni preliminiari (b ħall-koef­
fiċjenti tal-qsim ta' l-n-octanol-ilma) ma tindikax li s-sustanza tat- 
test tista' te ħel mal-ħġieġ. F'dawn il-ka żijiet, jistg ħu jkunu jridu 
jitqiesu materjali alternattivi (b ħal Teflon). Jista' wkoll ikun 
possibbli li tittaffa l-problema ta' twa ħħil mal-ħġieġ bl-użu ta' 
wieħed jew aktar minn dawn il-metodi:  
— id-determinazzjoni tal-massa tas-sustanza tat-test u tal-prodotti ta' 
l-idrolisi sorbiti mal-kontenitur tat-test;  
— l-użu ta' banju ultrasoniku;  
— tiġi żgurata ħasla bis-solventi ta' l-o ġġetti kollha tal- ħġieġ f'kull 
intervall tat-te ħid tal-kampjuni;  
— l-użu ta' prodotti formulati;  
— l-użu ta' ammont akbar ta' kosolvent g ħaż-żjieda tas-sustanza tat- 
test mas-sistema; jekk jintu ża kosolvent g ħandu jkun kosolvent li 
ma jidrolizzax is-sustanza tat-test.  
Normalment huma me ħtieġa oġġetti li jaġitaw il-banju ta' l-ilma u 
kkontrollati mit-temperatura jew inkubaturi kkontrollati termostati ­
kament g ħall-inkubazzjoni tat-ta ħlitiet differenti tat-test.  
Huwa me ħtieġ tagħmir standard tal-laboratorju, inklu ż b'mod parti ­
kolari, dawn li ġejjin 
— miter tal-pH;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— strumenti analiti ċi bħal tagħmir GC, HPLC, TLC, inklu żi s- 
sistemi xierqa ta' l-iskoperta biex ji ġu analizzati sustanzi radio ­
tikkettjati u mhux tikkettjati jew il-metodu tat-ta ħlit ta' l-iżotopi 
inversi;  
— l-istrumenti g ħall-iskopijiet ta' l-identifikazzjoni (e ż. MS, GC- 
MS, HPLC-MS, NMR, e ċċ.); 
— kalkulatur tal-fluworexxenza tal-likwidu;  
— lembub li jisseparaw g ħall-estrazzjoni ta' likwidi-likwidi;  
— strumentazzjoni biex ji ġu kkonċentrati t-ta ħlitiet u l-estratti (e ż. 
evaporator li jdur);  
— tagħmir li jikkontrolla t-temperatura (e ż. banju ta' l-ilma).  
Ir-reaġenti kimiċi jinkludu, per e żempju:  
— solventi organi ċi, grad analitiku, b ħal hexane, dichloromethane, 
eċċ.; 
— likwidu tal-fluworexxenza;  
— taħlitiet buffer  (għad-dettalji ara t-taqsima 1.8.3).  
L-oġġetti kollha tal- ħġieġ, l-ilma tal-grad ta' rea ġent u t-ta ħlitiet 
buffer  użati fit-testijiet ta' l-idrolisi g ħandhom ji ġu sterilizzati.  
1.8.2.  L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test  
Is-sustanza tat-test g ħandha tiġi applikata b ħala taħlita ilmija fit- 
taħlitiet buffer  differenti (ara l-Anness 3). Jekk huwa me ħtieġ għat- 
taħlit xieraq, l-u żu ta' ammonti żgħar ta' solventi li jit ħalltu fl-ilma 
(bħall-acetonitrile, acetone, etanol) huwa permess g ħall-applikazzjoni 
u d-distribuzzjoni tas-sustanza tat-test i żda dan ma g ħandux norm ­
alment je ċċedi 1 % v/v. Fil-ka ż li titqies kon ċentrazzjoni og ħla ta' 
solventi (e ż. fil-każ ta' sustanzi tat-test li ma tantx jin ħallu), dan jista' 
jkun permess biss meta jista' jintwera li s-solvent ma g ħandu ebda 
effett fuq l-idrolisi tas-sustanzi tat-test.  
L-użu ta' prodott formulat mhuwiex rakkomandat b ħala rutina, 
għaliex ma jistax ji ġi eskluż li l-ingredjenti tal-formulazzjoni 
jistgħu jinfluwenzaw il-pro ċess ta' l-idrolisi. Madankollu, g ħas- 
sustanzi tat-test li ma tantx jin ħallu fl-ilma jew g ħal sustanzi li 
jeħlu mal-ħġieġ (ara t-taqsima 1.8.1), l-u żu ta' materjal formulat 
jista' jkun alternattiv xieraq. G ħandha tintu ża konċentrazzjoni 
waħda tas-sustanza tat-test;  
ma għandhiex te ċċedi 0,01 M jew nofs il-kon ċentrazzjoni tas-satu ­
razzjoni (ara l-Anness 1).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  It-ta ħlitiet buffer  
It-test ta' l-idrolisi g ħandu jitwettaq f'valuri pH ta' 4, 7 u 9. G ħal dan 
l-iskop, it-ta ħlitiet buffer  għandhom ji ġu ppreparati bl-u żu ta' kimi ċi 
tal-grad ta' rea ġenti u ilma. Xi sistemi utli  buffer  huma ppre żentati fl- 
Anness 3. G ħandu jiġi nnutat li s-sistema  buffer  użata tista' 
tinfluwenza r-rata ta' l-idrolisi u fejn dan huwa osservat g ħandha 
tintuża sistema alternata ta'  buffer  ( 1 ). 
Il-pH ta' kull ta ħlita buffer  għandu jiġi vverifikat b' pH meter 
ikkalibrat sa pre ċiżjoni sa g ħall-inqas 0,1 fit-temperatura me ħtieġa. 
1.8.4.  Il-kondizzjonijiet tat-test  
1.8.4.1.  It-temperatura tat-test  
L-esperimenti ta' l-idrolisi g ħandhom isiru f'temperaturi kostanti. 
Għall-iskopijiet ta' l-estrapolazzjoni, huwa importanti li tin żamm it- 
temperatura sa g ħall-inqas ± 0,5  o C. 
Test preliminari (Livell 1) g ħandu jitwettaq f'temperatura ta' 50  o C 
jekk l-im ġieba idrolitika tas-sustanza tat-test mhijiex mag ħrufa. It- 
testijiet kineti ċi ta' Livell Og ħla għandhom isiru f'mhux inqas minn 
tliet temperaturi (inklu ż it-test ta' 50  o C) sakemm is-sustanza tat-test 
hija stabbli g ħall-idrolisi kif determinat mill-ittestjar tal-Livell 
1. Skala su ġġerita tat-temperatura hija 10-70  o C (preferibbilment 
f'għall-inqas temperatura wa ħda inqas minn 25  o C użat), li jinkludi 
t-temperatura tar-rapportar ta' 25  o C u l-parti l-kbira tat-temperaturi 
misjuba fil-qasam.  
1.8.4.2.  Dawl u ossi ġenu 
It-testijiet ta' l-idrolisi g ħandhom isiru bl-u żu ta' kwalunkwe metodu 
xieraq biex ji ġu evitati effetti fotoliti ċi. Il-miżuri kollha xierqa 
għandhom jittie ħdu biex ji ġi evitat l-ossi ġenu (eż. bit-tbaqbiq tal- 
helium, nitro ġenu jew argon g ħal 5 minuti qabel il-preparazzjoni 
tat-taħlita). 
1.8.4.3.  Kemm idum it-test  
It-test preliminari g ħandu jsir g ħal 5 ijiem filwaqt li t-testijiet tal- 
Livell Og ħla għandhom isiru sad-90 % idrolisi tas-sustanza tat-test 
jew għal 30 jum, skond x'ji ġi l-ewwel.  
1.8.5.  It-twettiq tat-test  
1.8.5.1.  It-test preliminari (Livell 1)  
It-test preliminari jsir f'temperatura ta' 50 ± 0,5  o C u pH 4,0, 7,0 u 
9,0. Jekk inqas minn 10 fil-mija ta' l-idrolisi ji ġi osservat wara 5 
ijiem (t  0,5 f'temperatura ta' 25  o C > 1 sena) is-sustanza tat-test titqies 
idrolitikament stabbli u, normalment, ma hu me ħtieġ ebda ttestjar 
addizzjonali. Jekk is-sustanza hija mag ħrufa li hija instabbli f'tem ­
peraturi ambjentalment rilevanti (  2 ), it-test preliminari mhuwiex 
meħtieġ. Il-metodu analitiku g ħandu jkun pre ċiż u sensittiv 
biżżejjed biex ji ġi skopert tnaqqis ta' 10 fil-mija fil-kon ċentrazzjoni 
inizjali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey u Mill jirrakkomandaw l-u żu ta' buffers tal-borate u ta' l-a ċetat minflok il-fosfat 
(11). 
( 2 ) Din l-informazzjoni tista' ti ġi minn g ħejun oħrajn bħad-data ta' l-idrolisi ta' komposti 
strutturalment simili mil- letteraturi jew minn testijiet o ħrajn preliminarji, semi-kwant ­
attivi bis-sustanza tat-test fi stadju aktar bikri ta' l-i żvilupp.
 1.8.5.2.  L-idrolisi ta' sustanzi mhux stabbli (Livell 2)  
It-test tal-Livell Og ħla (avvanzat) g ħandu jsir fil-valuri pH li fihom 
is-sustanza tat-test tinstab instabbli kif definit mit-test preliminari hawn fuq. It-ta ħlitiet buffered  tas-sustanza tat-test g ħandhom ikunu 
termostatati fit-temperaturi mag ħżula. Biex isir it-test g ħall-imġieba 
ta' l-ewwel ordni, kull reazzjoni tat-ta ħlita għandha tiġi analizzata 
f'intervalli ta' żmien li jipprovdu minimu ta' sitt punti ta' data 
spazjati bejn 10 % u 90 % ta' l-idrolisi tas-sustanza tat-test. Il- 
kampjuni replikati tat-test individwali (minimu ta' kampjuni 
duplikati li jinsabu f'kontenituri separati tar-reazzjoni) g ħandhom 
jitneħħew u l-kontenuti ji ġu analizzati f'kull wie ħed mis-sitt drabi 
tat-teħid tal-kampjuni (g ħal mhux inqas minn tnax-il punt tad-data 
doppja). L-u żu ta' kampjun kbir wie ħed li minnhom jitne ħħew l-  
aliquots  individwali tat-ta ħlita tat-test f'kull intervall tat-te ħid tal- 
kampjuni jitqies li mhux xieraq, g ħaliex ma jippermettix l-anali żi 
tal-varjabbiltà tad-data u jista' jwassal g ħal problemi bil-kontami ­
nazzjoni tat-ta ħlita tat-test. It-testijiet tal-konferma ta' l-isterilità 
għandhom isiru fl-a ħħar tat-test tal-Livell og ħla (jiġifieri f'90 % 
idrolisi jew 30 jum). I żda, jekk ma ti ġi osservata 
ebda degradazzjoni (ji ġifier t-trasformazzjoni), it-testijiet ta' l-isterilità 
ma jitqisux me ħtieġa.
 
1.8.5.3.  L-identifikazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi (Livell 3)  
Kwalunkwe prodott ewlieni ta' l-idrolisi g ħall-inqas dawk li 
jirrappreżentaw > 10 % tad-do ża applikata g ħandu jiġi identifikat 
b'metodi xierqa analitika.  
1.8.5.4.  Testijiet mhux obbligatorji  
It-testijiet addizzjonali f'valuri pH minbarra 4, 7 u 9 jistg ħu jkunu 
meħtieġa għal sustanza tat-test idrolitikament instabbli. Per e żempju, 
għall-iskopijiet fi żjoloġiċi jista' jkun me ħtieġ test taħt kondizzjonijiet 
aktar aċidużi (eż. pH 1.2) bl-u żu ta' temperatura unika fi żjoloġi­
kament rilevanti (37  o C). 
2. DATA  
L-ammonti tas-sustanza tat-test u tal-prodotti ta' l-idrolisi, jekk 
rilevanti, g ħandhom jing ħataw bħala perċentwal tal-kon ċentrazzjoni 
inizjali applikata u, fejn xieraq, b ħala mg/L g ħal kull interval tat- 
teħid tal-kampjuni u g ħal kull pH u temperatura tat-test. Barra minn 
dan, għandu jing ħata bilan ċ tal-massa f per ċentwali tal-kon ċen­
trazzjoni inizjali applikata meta ntu żat sustanza tat-test ittikkettjata.  
Preżentazzjoni grafika tad-data ta' logs trasformati tal-kon ċen­
trazzjonijiet tas-sustanza tat-test ma ż-żmien għandha tiġi rrapportata. 
Kwalunkwe prodott ewlieni ta' l-idrolisi g ħall-inqas dawk li 
jirrappreżentaw ≥ 10 % tad-do ża applikata li g ħandu jiġi identifikat 
bil-konċentrazzjonijiet tal-logs trasformati g ħandu wkoll jista' ji ġi 
ppjanat bl-istess mod b ħas-sustanza ewlenija biex jidhru r-rati tal- 
formazzjoni u tat-tnaqqis tag ħhom. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. IT-TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Determinazzjonijiet aktar pre ċiżi ta' half-lives  jew ta' valuri DT  50 
għandha tinkiseb bl-applikazzjoni ta' kalkoli xierqa tal-mudelli 
kinetiċi il-valuri  tal-half-life  u/jew DT  50 (inklużi l-limiti tal-kunfi ­
denza) għandhom ji ġu rrapportati g ħal kull pH u kull temperatura 
flimkien ma' deskrizzjoni tal-mudell u żat, l-ordni tal-kinetika u l- 
koeffiċjenti tad-determinazzjoni (r  2 ). Jekk xieraq, il-kalkoli 
għandhom ukoll ji ġu applikati g ħall-prodotti ta' l-idrolisi.  
Fil-każ ta' studju ta' rati mwettqa f temperaturi differenti, il-kostanti 
ta' l-idrolisi tal-psewdo-ewwel ordni (k  obs ) għandhom ji ġu deskritti 
bħala funzjoni tat-temperatura. Il-kalkolu g ħandu jiġi bbażat fuq 
kemm is-separazzjoni tal-kobs f kostanti tar-rati g ħall-idrolisi kata ­
lizzata bl-a ċidu, newtrali u kkatalizzati bil-ba żi (k  H , k neutral  , u k  OH 
rispettivament) u l-ekwazzjoni ta' Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
fejn Ai u Bi huma kostanti tar-rigressjoni mill-inter ċett u l-gradjent, 
rispettivament, tal-linji li joqog ħdu l-aħjar iġġenerati mir-rigress 
lineari ln ki kontra r-re ċiproku tat-temperatura assoluta f Kelvin 
(T). Bl-użu tar-relazzjonijiet ta' Arrhenius g ħall-idrolisi kkatalizzata 
aċida, newtrali u ba żi, il-kostanti tar-rata psewdo l-ewwel ordni, u 
għalhekk  half-lives  jistgħu jiġu kkalkolati g ħal temperaturi o ħrajn li 
għalihom id-determinazzjoni diretta esperimentali tal-kostant tar-rata 
mhijiex prattikabbli (10).  
2.2. L-EVALWAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Il-parti l-kbira tar-reazzjonijiet ta' l-idrolisi jsegwu r-rati apparenti 
tar-reazzjonijiet ta' l-ewwel ordni u, g ħalhekk, il -half-lives  huma 
indipendenti mill-kon ċentrazzjoni (ara l-ekwazzjoni 4 fl-Anness 2). 
Dan normalment jippermetti l-applikazzjoni tar-ri żultati tal- 
laboratorju determinati b ħala 10-  2 sa 10  -3 M għal kondizzjonijiet 
ambjentali ( ≤ 10  -6 M) (10). Bosta e żempji ta' ftehim tajjeb bejn ir- 
rati ta' l-idrolisi mkejla f'ilmijiet kemm puri kif ukoll naturali g ħal 
varjetà ta' kimi ċi ġew irrapportati minn Mabey u Mill (11), kemm-il 
darba kemm il-pH kif ukoll it-temperatura kienu tkejlu.  
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi g ħall-inqas din l-informazzjoni li 
ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— isem komuni, isem tal-kimika, CAS numru, formula strutturali (li 
tindika l- po żizzjoni tat-tikketta meta jintu ża materjal radjotik ­
kettjat) u karatteristi ċi rilevanti fi żiċi-kimiċi (ara t-taqsima 1.5);  
— purità (impuritajiet) tas-sustanza tat-test;  
— purità tat-tikketta ta' kimika ttikkettjata u attività molari (fejn 
xieraq).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— taħlitiet buffer : 
— dati u dettalji tal-preparazzjoni  
— buffers  u ilmijiet u żati; 
— molarità u pH tat-ta ħlitiet buffer . 
Il-kondizzjonijiet tat-test:  
— id-dati tat-twettiq ta' l-istudji;  
— l-ammont tas-sustanza tat-test applikati;  
— il-metodu u s-solventi (tip u ammont) u żati għall-applikazzjoni 
tas-sustanza tat-test;  
— il-volum tat-ta ħlitiet buffered  tas-sustanza tat-test inkubati;  
— deskrizzjoni tas-sistema ta' inkubazzjoni u żata; 
— pH u temperatura matul l-istudju;  
— ħinijiet tat-te ħid tal-kampjuni;  
— metodu/i ta' l-estrazzjoni;  
— metodi biex ji ġu kkwantifikati u identifikati s-sustanza tat-test u 
l-prodotti ta'l- idrolisi tag ħha fit-taħlitiet buffer ; 
— għadd ta' replikati.  
Riżultati:  
— repetibbiltà u sensittività tal-metodi analiti ċi użati; 
— rkupru (valuri % g ħal studju validu jing ħataw fit-taqsima 1.7.1);  
— data  replikata u mezzi f'forom tabulari;  
— bilanċ tal-massa matul u fl-a ħħar ta' l-istudji (meta tintu ża 
sustanza tat-test ittikkettjata);  
— riżultati tat-test preliminari;  
— diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati;  
— id- data u l-figuri kollha ori ġinali.  
Din l-informazzjoni li ġejja hija me ħtieġa biss meta hija ddeterminata 
r-rata ta' l- idrolisi:  
— ippjanar fuq dijagramma ta' kon ċentrazzjonijiet kontra ħin għas- 
sustanzi tat-testu, fejn xieraq, g ħall-prodotti ta' l-idrolisi g ħal kull 
valur ta' pH u temperatura;  
— tabelli tar-ri żultati ta' l-ekwazzjoni Arrhenius g ħat-temperatura 
20 o C/25  o C, bil-pH, kostant tar-rata [h-1 jew jum-1],  half-life  
jew DT50, temperaturi [  o C] inklużi limiti tal-kunfidenza u l- 
koeffiċjenti tal-korrelazzjoni (r  2 ) jew informazzjoni komparabbli;  
— rotta proposta ta' l-idrolisi.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. REFERENZI  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD 
Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. 
Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the 
placing of plant protection products on the market. Annex V: 
Fate and Behaviour in the Environment.  
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water 
and air.
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and 
Assessment Nr.23.  
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral 
presentation at the 14  th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental 
conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
ANNESS 1  
Tiered Hydrolysis Test Scheme
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
ANNESS 2  
Definizjonijiet u Unitajiet  
L-Unitajiet In d Inte  w fi kwalunkwe ka ż. 
Sustanza tat-Test:  kwalunkwe sustanza, kemm jekk il-kompost ewlieni kif ukoll 
prodotti rilevanti tat-trasformazzjoni.  
Prodotti tat-trasformazzjoni:  is-sustanzi kollha li jirri żultaw minn reazzjonijiet 
biotiċi jew abioti ċi tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test.  
Prodotti ta' l-idrolisi:  is-sustanzi kollha li jirri żultaw mir-reazzjonijiet tat-tras ­
formazzjoni idrolitika tas-sustanza tat-test.  
Idrolisi  tirreferi g ħal reazzjoni ta' sustanza tat-test RX ma' l-ilma, bl-iskambju 
nett tal-grupp X ma' l-OH fi ċ-ċentru tar-reazzjoni: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Ir-rata li biha l-kon ċentrazzjoni ta' RX tonqos f'dan il-pro ċess simplifikat ting ħata b' 
rata = k [H  2 O] [RX] reazzjoni tat-tieni ordni 
jew 
rata = k [RX] reazzjoni ta' l-ewwel ordni  
skond il-pass li jiddetermina r-rata. Min ħabba li l-ilma huwa pre żenti f'eċċess 
kbir meta mqabbel mas-sustanza tat-test, dan it-tip ta' reazzjoni normalment huwa 
deskritt bhala reazzjoni tal-psewdo-ewwel ordni fejn il-kostant tar-rata osservat 
jingħata bir-relazzjoni 
k obs = k [H  2 O] [2]  
u jista' jiġi ddeterminat mill-espressjoni (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
fejn 
t = ħin 
u C  o , C t = konċentrazzjonijiet ta' RX fil- ħinijiet 0 u t.  
L-unitajiet  ta' dan il-konstant g ħandhom id-dimensjonijiet ta' ( ħin) -1 u l-half-life  
tar-reazzjoni ( ħin biex 50 % ta' RX jirrea ġixxi) jing ħata b'  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Half-life : (t 0,5 ) huwa l- ħin meħud għal 50 % idrolisi ta' sustanza tat-test meta r- 
reazzjoni tista' ti ġi deskritta b'kineti ċi ta' l-ewwel ordni; huwa indipendenti mill- 
konċentrazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Jekk it-tpin ġija fuq djagramma tad- data ta' logs  ittrasformati ta'  data vs . ħin ma tindikax 
funzjoni lineari (ekwata ma' rata ta' reazzjoni ta' l-ewwel ordni), allura l-u żu ta' l- 
ekwazzjoni [3] mhuwiex xieraq biex ji ġi ddeterminat il-konstant tar-rata ta' l-idrolisi 
tal-kompost tat-test.
 DT 50 (Disappearance Time  (ħin biex jisparixxi) 50):  huwa l-ħin li fih il-kon ċ­
entrazzjoni tat-test titnaqqas b'50 %; huwa different mill- half-life  t 0,5 meta r- 
reazzjoni ma ssegwix kineti ċi ta' l-ewwel ordni.  
Stima ta' k f'temperatura differenti  
Meta l-konstanti tar-rata huma mag ħrufa għal żewġ temperaturi, il-kostanti tar- 
rata f'temperaturi o ħrajn jistg ħu jiġu kkalkolati bl-u żu ta' l-ekwazzjoni ta' 
Arrhenius:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T jew ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Tpinġija fid-djagramma ta' ln k versus 1/T tag ħti linja dritta bi gradjent ta'–E/R  
Fejn 
k = kostant tar-rata, imkejjel b'temperaturi differenti  
E = ener ġija ta' l-attivazzjoni [kJ/mol]  
T = temperatura assoluta [K]  
R = kostant tal-gass [8,314 J/mol.K]  
L-enerġija ta' l-attivazzjoni ġiet ikkalkolata bl-anali żi tar-rigressjoni jew l- 
ekwazzjoni li ġejja: 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
fejn: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
L-ANNESS 3  
Sistemi  Buffer  
A. CLARK U LUBS:  
Taħlitiet  Buffer  ta’ CLARK u LUBS  (*) 
Kompożizzjoni pH  
0,2 N HCl U 0,2 N KCl AT 20  o C 
47,5 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 1,0 
32,25 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 1,2 
20,75 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 1,4 
13,15 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 1,6 
8,3 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 1,8 
5,3 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 2,0 
3,35 ml. HCl + 25 ml. KCl m ħal. sa 100 ml 2,2  
0,1 M potassium biphthalate + 0,1 N HCl f'temperatura ta’ 20  o C 
46,70 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 2,2 
39,60 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 2,4 32,95 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 2,6 
26,42 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 2,8 
20,32 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 3,0 14,70 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 3,2 
9,90 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 3,4 
5,97 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 3,6 
2,63 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. biphthalate to 100 ml 3,8  
0,1 M potassium biphthalate + 0,1 N NaOH f'temperatura ta’ 20
 o C 
0,40 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 4,0 
3,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 4,2 7,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 4,4 
12,15 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 4,6 
17,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Il-valur pH irrapportati f'dawn it-tabelli ġew ikkalkolati mill-kejl potenzjali bl-u żu ta' ekwazzjonijiet standard 
ta' Sörensen (1909). Il-valuri pH korrispondenti huma 0,04 unitajiet og ħla mill-valuri tabulate.
 Kompożizzjoni pH  
23,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml 5,0 
29,95 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 5,2 
35,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml 5,4 39,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml 5,6 
43,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 5,8 45,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml 6,0
 
Taħlitiet  Buffer  ta’ CLARK u LUBS (Ikompli) 
0,1 M monopotassium phosphate + 0,1 N NaOH f'temperatura ta’ 20  o C 
5,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 6,0 8,60 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 6,2 
12,60 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 6,4 17,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 6,6 23,45 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 6,8 29,63 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 7,0 35,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 7,2 
39,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 7,4 
42,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 7,6 45,20 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 7,8 46,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 B0 3 in 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH f'temperatura ta’ 20  o C 
2,61 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 7,8 
3,97 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 8,0 
5,90 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 8,2 
8,50 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 8,4 
12,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 8,6 
16,30 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 8,8 
21,30 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 9,0 
26,70 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 9,2  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 9,4 
36,85 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 9,6 
40,80 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 9,8 
43,90 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. a ċidu boriku sa 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF U VLEESCHHOUWER:  
Buffers  taċ-ċitrat ta’ KOLTHOFF u VLEESCHHOUWER  (*) 
Kompożizzjoni pH  
0,1 M ċitrat tal-monopotassju u 0,1 N HCl f'temperatura ta’ 18  o C (*) 
49,7 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 2,2 
43,4 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 2,4 
36,8 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 2,6 
30,2 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 2,8 
23,6 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 3,0 
17,2 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 3,2 
10,7 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 3,4 
4,2 ml. 0,1 N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 3,6  
0,1 M ċitrat tal-monopotassju u 0,1 N NaOH f'temperatura ta’ 18  o C (*) 
2,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 3,8 
9,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 4,0 
16,3 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 4,2 
23,7 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 4,4 
31,5 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 4,6 
39,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 4,8 
46,7 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 5,0 
54,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 5,2 
61,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 5,4 
68,0 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 5,6 
74,4 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 5,8 
81,2 ml. 0,1 N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml 6,0  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Żid kristall żgħir ħafna ta' timol jew sustanza simili biex jitra żżan it-tkabbir tal-moffa.
 C. SÖRENSEN:  
Taħlitiet Borate ta’ SÖRENSEN  
Kompożizzjoni Sörensen 
18 o C Walbum, pH f'temperatura ta’ 
ml. Borax ml. HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Taħlitiet tal-fosfat ta’ SÖRENSEN  
Kompożizzjoni pH  
0,0667 M Monopotassium phosphate + 0,0667 M Disodium phosphate f'temperatura ta’ 
20 o C 
99,2 ml. KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml. KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml. KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml. KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml. KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml. KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml. KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml. KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml. KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml. KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml. KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml. KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml. KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml. KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml. KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml. KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. IT-TOSSI ĊITÀ TAL- ĦNIEX  
IT-TEST TAL- ĦAMRIJA ARTIFI ĊJALI  
1. IL-METODU  
1.1. L-INTRODUZZJONI  
F'dan it-test tal-laboratorju, is-sostanza tat-test hija mi żjuda mal- 
ħamrija artifi ċjali li l-ħniex ikunu mpo ġġija fiha g ħal 14-il ġurnata. 
Wara dan il-perjodu (u b'g ħażla wara sebat'ijiem) l-effett letali tas- 
sostanza fuq il- ħniex hija e żaminata. It-test jipprovdi metodu g ħal 
superviżjoni relativvament g ħall-perjodu qasir ta' l-effett tal-kimi ċi 
fuq il-ħniex, bit-te ħid tal-ġilda jew alimentari.  
1.2. ID-DEFINIZZJONI U L-UNITÀ  
LC 50 : Il-konċentrazzjoni tas-sostanza stmata b ħala li toqtol 50 % ta' 
l-annimali ttestjati waqt il-perjodu tat-test.  
1.3. IS-SOSTANZA TAR-REFERENZA  
Is-sostanza tar-referenza hija u żata perjodikament b ħala mezz ta' 
dimostrazzjoni li s-sensitività tas-sistema tat-test ma nbidlitx b'mod 
sinifikattiv.  
Il-chloroacetamide analitiku tal-grad huwa rakkomandat b ħala s- 
sostanza referenza.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
Il-ħamrija hija mezz varjabbli, u g ħalhekk għal dan it-test il- ħamrija 
artifiċjali tal-lom definita hija u żata. Il-ħniex adulti ta' l-ispe ċi Eisenia 
foetida (ara n-nota fl-Appendi ċi) huma mi żmuma f'ħamrija artifi ċjali 
definita trattata b'kon ċentrazzjonijiet differenti tas-sostanzi tat-test. Il- 
kontenut tal-kontenituri huwa mifrux fuq gabarre 14-il ġurnata (u 
b'għażla sebat'ijiem) wara l-bidu tat-test, u l- ħniex li jibqg ħu ħajjin 
f'kull kon ċentrazzjoni jkunu mag ħduda.  
1.5. IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ  
It-test huwa disinnjat biex ikun riprodu ċibbli kemm jista' jkun fir- 
rigward tas-substrat u l-organi żmu tat-test. Il-mortalità fil-kontrolli 
m'għandhix taqbe ż l-10 % fl-a ħħar tat-test, jew inkella it-test ikun 
invalidu.  
1.6. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Il-materjali  
1.6.1.1. I s - s u b s t r a t a t a t - t e s t  
Il-ħamrija artifi ċjali definita hija u żata bħala substrat ba żiku għat-test.  
(a) Is-substrata ba żika (il-persenta ġġi huma fit-termini tal-pi ż niexef)  
— 10 % pit Sphagnum (kemm jista' jkun l-aktar qrib g ħall-pH 
5,5 sa 6,0 bl- ebda fdalijiet tal-pjanti li jidhru u mit ħun fin),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % tafal tal-kawlina bi preferibbilment aktar minn 50 % 
kawlina,  
— Madwar 69 % ramel tal-kwarz industrijali (ramel fin 
dominanti b'aktar minn 50 % tal-qies tal-parti ċelli ta' 0,05 
sa 0,2mm). Jekk is-sostanza m'hijiex suffi ċjentament abbli 
li tinfirex fl-ilma, 10g g ħal kull kontenitur tat-test 
għandhom jin żammu disponibbli biex jit ħalltu mas-sostanza 
tat-test aktar tard, mi ż 
— Madwar 1 % karbonat tal-kal ċju (CaCO3), fi trab, kimi ­
kament pur, żjud biex il-pH jin ġieb sa 6,0 ± 0,5.  
(b) Is-substrata tat-test  
Is-substrata tat-test ikun fiha is-substrata ba żika, is-sostanza tat- 
test u l-ilma detonizzat.  
Il-kontenut ta' l-ilma huwa ta' madwar 25 sa 42 % tal-pi ż niexef 
tas-substrata ba żika. Il-kontenut ta' l-ilma tas-substrata huwa 
determinat billi jkun imnixxef kampjun g ħall-piż kostanti ta' 
105  o C. Il-kriterju prin ċipali huwa li l- ħamrija artifi ċjali 
għandha tkun imxarrba sal-punt fejn m'hemm l-ebda ilma 
qiegħed. Għandu jkun hemm attenzjoni meta' jkun qed isir it- 
taħlit biex tkun miksuba distribuzzjoni ugwali tas-sostanza tat- 
test u tas-substrata. Il-mod ta' kif tkun introdotta is-sostanza tat- 
test mas-substarata g ħandu jkun rappurtat.  
(ċ) Is-substrata tal-kontroll  
Is-substrata tal-kontoll fiha is-substrata ba żika u l-ilma. Jekk 
aġent adittiv ikun u żat, il-kontroll addizzjonali g ħandu jkun fih 
l-istess kwantità ta' l-a ġent addittiv.  
1.6.1.2. I l - k o n t e n i t u r i t a ' l - i t t e s t j a r  
Il-kontenituri tal- ħġieġ ta' madwar litru kapa ċità (adegwatament 
miksija bl-g ħatien tal-plastik, id-dixxijiet jew l-film tal-plastic bit- 
toqob għall-ventilazzjoni) mimlija b'ammont tas-substrata mxarrba 
tat-test jew tal-kontroll ekwivalenti g ħall-500g tal-pi ż niexef tas- 
substrata.  
1.6.2.  Il-kondizzjonijiet tat-test  
Il-kontenituri g ħandhom jin żammu fi kmamar klimati ċi f'temperatura 
ta' 20 ± 2  o C bid-dawl kontinwu. L-intensità tad-dawl g ħandha tkun 
ta' 400 sa 800 lux.  
Il-perjodu tat-test huwa ta' 14-il ġurnata, iżda l-mortalità tista' tkun 
stmata b'g ħażla ta' sebat'ijiem wara li jibda t-test  
1.6.3.  Il-pro ċedura tat-test  
I l - k o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a t - t e s t  
Il-konċentrazzjonijiet tas-sostanza tat-test huma espresse b ħala piż 
tas-sostanza g ħall-piż niexef tas-substrata ba żika (mg/kg).  
I t - t e s t b i e x j i n s t a b u l - l i m i t i  
Il-limiti tal-kon ċentrazzjonijiet li jikkaw ża mortalità ta' 0 sa 100 % 
biss jistgħu jkunu determinati f'test biex jinstabu l-limiti biex tkun 
provvduta l-informazzjoni fuq il-limiti tal-kon ċentrazzjonijiet li 
għandhom jintu żaw fit-test definittiv.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Is-sostanza g ħandha tkun ittestjata fil-kon ċentrazzjonijiet li ġejjin: 
1 000; 100; 10; 1; 0,1mg tas-sostanza/kilogramma tas-substrata tat- 
test (il-pi ż niexef).  
Jekk it-test s ħiħ definittiv g ħandu jkun mag ħmul, grupp wie ħed għal 
kull kon ċentrazzjoni u wie ħed għall-kontroll mhux trattat, kull 
wieħed b'għaxar ħniex, għandu jkun suffi ċjenti għat-test biex 
jinstabu l-limiti.  
I t - t e s t d e f i n i t t i v  
Ir-riżultati għat-test biex jinstabu l-limiti huma w żati biex jintg ħażlu 
minn ta' l-anqas ħames kon ċentrazzjonijiet f'serje ġeometrika li til ħaq 
eżatt il-limiti ta' bejn 0 sa 100 % tal-mortalità u li tinbidel b'fattur 
kostanti li ma jaqbi żx il-1,8.  
It-testijiet li ju żaw din is-serje ta' kon ċentrazzjoni g ħandhom i ħallu l- 
valur LC  50 u l-limiti tieg ħu ta' kunfidenza biex ikunu stmati kemm 
jista' jkun b'mod pre ċiż. 
Fit-test definittiv minn ta' l-anqas erba' gruppi tat-testijiet g ħal kull 
konċentrazzjoni u erba' kontrolli mhux trattati, kull wie ħed b'10 
ħniex, huma w żati. Ir-riżultati ta' dawn il-gruppi repliki huma 
mogħtija bħala devjazzjoni medja u standard.  
Meta' żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi, b'rata ta' 1,8, jag ħtu biss 
0 u 100 % mortalità, dawn i ż-żewġ valuri huma suffi ċjenti biex 
jindikaw il-limiti li fihom jaqa' l- LC  50 . 
I t - t a ħ l i t a t a s - s u b s t r a t a b a ż i k a t a t - t e s t u s - 
s o s t a n z a t a t - t e s t  
Is-substrata tat-test g ħandha, kull meta' jkun possibbli, tkun 
magħmula ming ħajr ebda a ġenti addizzjonali minbarra l-ilma. 
Immedjatament qabel il-bidu tat-test, l-emulsjoni jew it-tixrid tas- 
sostanza tat-test f'ilma ming ħajr jonji jew f'xi solvent ie ħor tiġi 
mħallta mas-substrata ba żika tat-test, jew sprejjat b'mod ugwali 
fuqha bi sprej fin kromotagrafiku jew ie ħor simili.  
Jekk ma tkunx tin ħall fl-ilma, is-sostanza tat-test tista' tkun ma ħlula 
f'volum żgħir kemm jista' jkun ta' solvent organiku adattat (e ż. 
hexane (idrokarbon likwidu), a ċeton jew kloroform).  
Dawk l-a ġenti biss li jtiru malajr jistg ħu jkunu w żati biex ikunu 
iħollu, jferrxu jew jemulsifaw is-sostanza tat-test. Is-substrata tat- 
test għandha tkun ventilata qabel l-u żu. L-ammont ta' ilma 
evaporat g ħandu jkun sostitwit. Il-kontroll g ħandu jkollu l-istess 
kwantità ta' kwalunkwe a ġenti addittiv.  
Jekk is-sostanza tat-test ma tkunx solubbli, li tista' tinfirex jew li 
tista' tkun emulsifata fis-solventi organi ċi, 10g tat-ta ħlita tar-ramel 
mitħun fin tal-kwarz u kwantità tas-sostanza tat-test ne ċessarja biex 
titratta 500g pi ż niexef tal- ħamrija artifi ċjali huma m ħallta ma 490g 
tal-piż niexef tas-substrata tat-test.  
Għall kull grupp tat-test, ammont tas-substrata tat-test imxarrba 
ekwivalenti g ħal 500g pi ż niexef ti ġi mpoġġija f'kull kontenitur 
tal-ħġieġ u 10 ħniex, li kienu kkondizzjonati g ħal 24 sieg ħa f'sub­
strata simili mxarrba u mbag ħad maħsula malajr u l-ilma żejjed 
mixrub fuq karta li tiffiltra qabel l-u żu, huma mpo ġġija fuq il-wi ċċ 
tas-substrata tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Il-kontenituri huma mg ħottija bl-g ħatien tal-plastic imtaqqba, bid- 
dixxijiet jew bil-film biex ikun evitat li s-substrata tinxef u dawn 
huma miżmumin ta ħt il-kondizzjonijiet tat-test g ħal 14-il ġurnata.  
L-istimi g ħandhom ikunu mag ħmula 14-il- ġurnata (u b'g ħażla seba' 
t'ijiem) wara li jkun mag ħmul it-test. Is-substrata ti ġi mifruxa fuq 
platt mag ħmul mill- ħġieġ jew ta' l-azzar li ma jissaddadx. Il- ħniex 
jiġu eżaminati u n-numru tal- ħniex li għexu għandu jkun determinat. 
Il-ħniex huma kkonsidrati mejta jekk dawn ma jirrispondux g ħal 
stimulu ġentili u mekkaniku mat-tarf ta' quddiem.  
Meta' l-eżaminazzjoni tkun mag ħmula fis-seba' ġurnata, il-kontenitur 
għandu jerġa' jimtela bis-substrata u l- ħniex li g ħex għandu jkun 
sostitwit fuq l-istess wi ċċ tas-substrata tat-test.  
1.6.4.  L-organi żmi tat-test  
L-organiżmi tat-test g ħandhom ikunu adulti ta' l- Eisenia foetida  (ara 
n-nota fl-Appendi ċi) (minn ta' l-anqas ta' żmien xahrejn bil-clitellum) 
tal-piż imxarrab ta' 300 sa 600 mg. (G ħall-metodu tat-tg ħammir ara 
l-Appendi ċi). 
2. ID-DATA  
2.1. IT-TRATTAMENT U L-VALUTAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Il-konċentrazzjonijiet tas-sostanza ttestjata huma rappurtati bir- 
referenza g ħall-persenta ġġi korrispondenti tal- ħniex mejta.  
Meta' d-data tkun adegwata il-valur ta' l- LC  50 u l-limiti tal- 
kunfidenza (p = 0,05) g ħandhom ikunu determinati billi jintu żaw 
il-metodi standard (Litchfield u Wilcoxon, 1949, g ħall-metodu ekwi ­
valenti). L- LC  50 għandu jkun mog ħti bħala mg tas-sostanza tat-test 
għal kull kilogramma tas-substrata tat-test (pi ż niexef).  
F'dawk il-ka żijiet meta' it-tidwira tal-kurva tal-kon ċentrazzjoni hija 
wisq wieqfa biex tippermetti l-kalkulazzjoni ta' l- LC  50 , stima grafika 
ta' dan il-valur hija suffi ċjenti.  
Meta' żewġ konċentrazzjonijiet b ħala rata ta' 1,8 jag ħtu biss 0 % u 
100 % mortalità, i ż-żewġ valuri huma suffi ċjenti biex jindikaw il- 
limiti li fihom jaqa' l-LC  50 . 
3. IR-RAPPORTA ĠĠ 
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test jekk possibbli, g ħandu, jkun fih dan li ġej: 
— id-dikjarazzjoni li t-test kien mag ħmul skond il-kriterji tal-kwalità 
msemmija aktar 'il fuq,  
— it-test mag ħmul (it-test li jsib il-limiti u/jew it-test definittiv),  
— id-deskrizzjoni e żatta tal-kondizzjonijiet tat-test jew id-dikja ­
razzjoni li t-test kien mag ħmul skond il-metodu; kwalunkwe 
devjazzjonijiet g ħandhom ikunu rappurtati,  
— id-deskrizzjoni e żatta ta' kif is-sostanza tat-test ti ġi mħallta mas- 
subtrata ba żika tat-test,  
— l-informazzjoni dwar l-organi żmi tat-test (l-ispe ċi, iż-żmien, il- 
medja u l-limiti tal-pi ż, il-kondizzjonijiet ta ż-żamma u n-nifs, 
il-fornitur),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— il-metodu u żat għad-determinazzjoni ta' l- LC  50 , 
— ir-riżultati tat-test inklu ża d-data kollha u żata, 
— id-deskrizzjoni tas-sintomi jew il-bidliet osservati fl-a ġir ta' l- 
organismi tat-test,  
— il-mortalità fil-kontrolli,  
— l- LC  50 jew il-kon ċentrazzjoni l-aktar g ħolja ttestjata ming ħajr il- 
mortalità u l-kon ċetnrazzjoni l-aktar baxxa b'mortalità ta' 100 %, 
14-il ġurnata (u b'g ħażla ta' seba' t'ijiem) wara li jkun mibdi t- 
test, 
— it-tpin ġija tal-kurva tal-kon ċentrazzjoni/respons,  
— ir-riżultati miksuba bis-sustanza tar-referenza, kemm jekk bl- 
assoċjazzjoni mat-test pre żenti jew mill-e żerċizzji ta' qabel tal- 
kontroll tal-kwalità.  
4. REFERENZI  
(1) OECD, Pari ġi, 1981, Test Guideline 207, id-De ċiżjoni tal- 
Kunsill C(81) 30 finali.  
(2) Edwards, C.A. and Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, Londra, 331pp.  
(3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Ècologie et 
Systèmatique, Institut National de la Recherche Agronomique, 
671 pp.  
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluation dose effect experiments. J.Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
 
(5) Il-Kummissjoni tal-Kommunitajiet Ewropej, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms, Rapport EUR 8714 EN, 1983.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag “Toxi żit­
atstest am Regenwurm Eisenia foetidia in kunstlichem 
Boden”, f': Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 
1986.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Appendiċi 
It-tgħammir u ż-żamma tal- ħniex qabel l-ittestjar  
Biex jitg ħammru l-annimali, 30 sa 50 ħanex adult, jitpo ġġew f'kaxxa tat- 
tgħammir bis-substrata friska u mne ħħija wara 14-il ġurnata. Dawn l-annimali 
jistgħu jkunu w żati għal gruppi o ħra tat-tgħammir. Il- ħniex imfaqqsa mill-fosdqa 
huma wżati għall-ittestjar meta’ jkunu maturi (ta ħt il-kondizzjonijiet preskritti 
wara xahrejn jew tlett xhur).  
Il-kondizzjonijiet ta ż-żamma u tat-tg ħammir  
Il-kamra klimatika: it-temperatura ta' 20 ± 2  o C preferibilment bid-dawl 
kontinwu (intensita’ ta' 400 sa 800 lux).  
Il-kaxxa tat-tg ħammir: il-kontenituri baxxi adattati tal-volum ta' 10 sa 20 l.  
Is-substrata: L- Eisenia foetida  tista' titrabba fl-eskrimenti ta' annimali 
varji. Huwa rakkomandat li b ħala mezz tat-tg ħammir 
tintuża taħlita ta' 50 % mill-volum pit u 50 % demel 
tal-baqar jew ta ż-żwiemel. Il-mezz g ħandu jkollu valur 
tal-pH ta' madwar 6 sa 7 (refolat bil-karbonju tal-kal ċju) 
u konduttività tal-jonje baxxa (anqas minn 6 mmhos jew 0,5 % kon ċentrazzjoni tal-mel ħ).
 
Is-substrata g ħandha tkun niedja i żda mhux imxarrba 
żżejjed.  
Il-proċeduri l-o ħra ta' su ċċess jistg ħu jkunu w żati 
minbarra l-metodu mog ħti hawn fuq.  
Nota : L-Eisenia foetida  teżisti f'żewġ razez li ċerti tassonomi sseparaw fi spe ċi 
(Bouche, 1972). Dawn huma morfolo ġikament simili minnbarra wa ħda, Eisenia 
foetida foetida , li għandha strixxi tipikament transversi jew faxxi fuq is-segmenti 
u l-oħra, Eisenia foetida andrei , li m'għandix dan u g ħandha kulur a ħmar 
varjegat. Fejn hu possibbli l- Eisenia foetida andrei  għandha tintu ża. L-ispeċi l- 
oħra jistgħu jkunu w żati jekk il-metodolo ġija neċessarja hija disponibbli.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. ID-DEGREDAZZJONI BIJOLO ĠIKA  
IT TEST TA' WELLENS –ZAHN  
1. IL-METODU  
1.1. L-INTRODUZZJONI  
Ir-raġuni tal-metodu hija l-valutazzjoni ta' bijodegradabilità potenzali 
u aħħarija tas-sostanzi li jin ħallu fl-ilma, li mhumiex volatili u 
organiċi meta' dawn ikunu esposti g ħall-konċentrazzjonijiet relatti ­
vament g ħoljin ta' mikroorgani żmi f'test statiku.  
L-assorbiment fi żikukimiku fuq is-solidi sospi żi jista' jsir u dan 
għandu jittie ħed in konsiderazzjoni meta' jkunu qeg ħdin jiġu inter­
pretati r-ri żultati (ara 3.2).  
Is-sostanzi li g ħandhom ikunu studjati huma w żati f'kon ċen­
trazzjonijiet li jikkorrispondu g ħall-valuri DOC fil-limiti ta' 50 sa 
400 mg/litru jew il-valuri COD fil-limiti ta' 100 sa 1 000 mg/litru 
(DOC = il-karbonju organiku ma ħlul; COD = id-domanda g ħall- 
ossiġnu kimiku). Dawn il-kon ċentrazzjonijiet relattivament g ħoljin 
għandhom il-vanta ġġ li huma affidabbli b'mod analitiku. Il- 
komposti bil-proprjetajiet tossi ċI jistgħu itawwlu jew iwaqqfu il- 
proċess ta' degradazzjoni.  
F'dan il-metodu, il-kejl tal-kon ċentrazzjoni tal-karboju organiku 
maħlul jew id-domanda g ħall-ossiġnu kimiku huwa w żat biex 
jistima il-bijodegradabilità a ħħarija tas-sostanza tat-test.  
L-użu simultanju tal-metodu spe ċifiku analitiku jista' jippermetti l- 
istimar tal-bijodegradazzjoni primarja tas-sostanza (it-tne ħħija ta' l- 
istruttura kimika ma ġġuri). 
Il-metodu huwa applikabbli biss g ħal dawk is-sostanzi organi ċi tat- 
test li, fil-kon ċentrazzjoni u żata fit-test:  
— huma solubbli fl-ilma ta ħt il-kondizzjonijiet tat-test,  
— għandhom pressjoni tal-fwar insinjifikanti ta ħt il-kondizzjonijiet 
tat-test,  
— li mhumiex inibitorji g ħall-batterji,  
— li huma mixruba fis-sistema tat-test biss sa' ċertu limitu,  
— li mhumiex mitlufa fir-rawha mis-soluzzjoni tat-test.  
L-informazzjoni fuq il-proporzjoni relattivi tal-komponenti ma ġġuri 
tal-materjal tat-test g ħandu jkun utli biex ikunu interpretati r-ri żultati 
miksuba, partikolarment f dawk il-ka żijiet fejn ir-ri żultati huma baxxi 
jew marġinali.  
L-informazzjoni fuq it-toxi ċità tas-sostanza g ħall-mikro-organi żmi 
hija mixtieqa g ħall-interpretazzjoni tar-ri żultati baxxi u fl-g ħażla 
tal-konċentrazzjoni adattati tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. ID-DEFINIZZJONIJIET U L-UNITAJIET  
L-ammont ta' degradazzjoni miksuba fl-a ħħar tat-test hija rappurtata 
bħala “Il-bijodegradabilità fiz-Zahn – it-test ta' Wellens”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
fejn: 
DT = id-degradazzjoni bijolo ġika ( %) fil- ħin T,  
CA = DOC (jew COD) valuri fit-ta ħlita tat-test imkejla tlett 
siegħat wara l-bidu tat-test (mg/l) (DOC = Il-Karbonju 
Organiku Ma ħlul, COD = Id-domanda g ħall-Ossiġnu 
Kimiku),  
CT = il-valuri DOC jew COD fit-ta ħlita tat-test fil- ħin tat-teħid 
tal-kampjun (mg/l),  
CB = il-valuri DOC jew COD tal-vojt fil- ħin tat-teħid tal- 
kampjun (mg/l),  
CBA = il-valuri DOC jew COD tal-vojt, mkejla tlett sieg ħat wara 
l-bidu tat-test (mg/l).  
Il-limitu tad-degradazzjoni huwa mi żjud għall-eqreb persenta ġġ sħiħ. 
Il-persenta ġġ tad-degradazzjoni huwa dikjarat b ħala l-persenta ġġ 
DOC (jew COD) ta' tne ħħija tas-sostanza ttestjata.  
Id-differenza bejn il-valur imkejjel wara tlett sieg ħat u l-valur inizjali 
kkalkulat jew preferibbilment imkejjel jista' jipprovdi informazzjoni 
utli fuq l-eliminazzjoni tas-sostanza (ara 3.2, L-interpretazzjoni tar- 
riżultati).  
1.3. IS-SOSTANZI TAR-REFERENZA  
F'ċerti każijiet meta' jkunu qeg ħdin jiġu investigati sostanzi ġodda s- 
sostanzi tar-referenza jistg ħu jkunu utli; madanakollu, s-sostanzi 
speċifiċI tar-referenza ma jistg ħux ikunu rakkomandati.  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
It-tajn oħxon attivat, in-nutrijenti minerali u l-materjali ta' l-ittestjar 
bħala l-unika sors tal-karbonju f'soluzzjoni mimlija ilma huma 
mpoġġija flimkien f're ċipjent tal- ħġieġ li jieħu minn litru sa erba' 
litri mgħammar b'a ġitatur u b'apparat li jag ħti l-arja. It-ta ħlita tiġi 
aġitata u mog ħtija l-arja f 20 to 25  o C taħt l-illuminazzjoni 
mferrxa jew f'kamra mudlama sa 28 ġurnata. Il-pro ċess 
ta' degradazzjoni ji ġi kkontrollat bid-determinazzjoni tal-valuri tad- 
DOC (jew is-COD) fis-soluzzjoni ffiltrata f'intervalli ta' kuljum jew 
f'intervalli o ħra tal-ħin adattati. Ir-rata tad-DOC (jew COD) eliminati 
wara kull intervall g ħall-valur tlett sieg ħat wara l-bidu hija espressa 
bħala persenta ġġ ta' bijodegradazzjoni u sservi b ħala kejl tal-limitu 
ta' degradazzjoni f'dan il- ħin. Ir-riżultat ikun impin ġi versus il- ħin 
biex jagħti l-kurva tal-bijodegradazzjoni.  
Meta' l-metodu spe ċifiku analitiku jkun u żat, it-tibdiliet fil-kon ċen­
trazzjoni tal-molekula ma ġġuri minħabba d-degradazzjoni tista' tkun 
imkejla (bijodegradabilità primarja).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ  
Ir-riprodu ċibilità ta' dan it-test ġie pruvat li hi sodisfa ċenti f'test 
ċirku. 
Is-sensittività tal-metodu hija determinata l-aktar mill-varjabilità tal- 
vojt u, anqas, mill-pre ċiżjoni tad-determinazzjoni tal-karbonju 
organiku ma ħlul u l-livell tal-kompost tal-likur tat-test.  
1.6. ID-DESKRIZZJONI TAL-PRO ĊEDURA TAT-TEST  
1.6.1.  Il-preparazzjonijiet  
1.6.1.1. I r - r e a ġ e n t i  
L-ilma tat-test: l-ilma tax-xorb bil-kontenut tal-karbonju organiku < 
5mg/litru. Il-kon ċentrazzjoni tal-jonji tal-kal ċju u tal-manjesju 
flimkien ma jistg ħux jaqbżu il-2,7 mmole/litru; jew inkella it-ta ħlit 
adegwat ma' l-ilma dejonizzat jew distillat huwa me ħtieġ. 
L-aċidu sulfuriku, ir-rea ġent analitiku (A.R.): 50 g/l 
Is-soluzzjoni ta' l-idrossidu tas-sodju A.R.: 40 g/l Is-soluzzjoni nutrijenti tal-minerali: ħoll f'litru ilma 
dejonizzat: 
Il-klorit ta' l-ammonja, NH4Cl, A.R.: 38,5 g Dihydrogenphosphate tas-sodju, NaH2PO4.2H2O, A.R.: 33,4 g 
Dihydrogenphosphate tal-potassju, KH2PO4, A.R.: 8,5 g 
di-potassium mono-hydrogenphosphate, K2HPO4, A.R.: 21,75 g.
 
It-taħlita sservi kemm b ħala nutrijent u kemm b ħala sistema ta'  
buffering.  
1.6.1.2. L - a p p a r a t  
Ir-reċipjenti tal- ħġieġ b'volum ta' litru sa erba' litri (e. ż. ir-reċipjenti 
ċilindriċi). 
L-aġitatur bi strument li j ħallat tal-ħġieġ jew tal-metall fuq maqbad 
adattat (l-istrument li j ħallat għandu jdur madwar 5 sa 10 cm fuq il- 
qiegħ tar-reċipjent). L-istrument li j ħallat u li hu manjetiku b' lasta 
twila minn 7 sa 10 cm tista' tkun u żata minflok.  
It-tubu tal- ħġieġ ta' 2 sa 4 mm fid-dijametru ta' ġewwa biex tkun 
introdotta l-arja. Il-ftu ħ tat-tubu g ħandu jkun ta' madwar 1 cm fuq il- 
qiegħ tar-reċipjent.  
ċentrifugu (madwar 3 550 g).  
Il-metru tal-pH.  
Il-metru ta' l-ossi ġnu maħlul. 
Il-filtri tal-karta.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
L-apparat tal-filtrazzjoni tal-membran.  
Il-filtri tal-membra, il-qies tal-pora ta' 0,45 nm. Il-filtri tal-membran 
huma adattati jekk huwa żgurat li huma la jer ħu l-karbonju u lanqas 
jassorbu s-sostanza fl-istadju tal-filtrazzjoni.  
It-tagħmir analitiku g ħad-determinazzjoni tal-kontenut tal-karbonju u 
tad-domanda ta' l-ossi ġnu kimiku.  
1.6.1.3. I l - p r e p a r a z z j o n i t a s - s o s t a n z a t a t - t i l q i m  
It-tajn oħxon attivat minn pjanta tat-trattament bijolo ġiku jiġi maħsul 
minn (b'mod repettitiv) ċentrifugazzjoni jew tqeg ħed bl-ilma tat-test 
(fuq).  
It-tajn oħxon attivat g ħandu jkun f'kondizzjoni adattata. Dan it-tajn 
huwa disponibbli minn pjanta tat-trattament ta' l-ilma li huwa skart li taħdem tajjeb. Biex jin ġabu kemm jista' jkun spe ċji u razzez 
differenti ta' batterji, jista' jkun a ħjar li titħallat is-sostanza tat- 
tilqim minn sorsi differenti (e. ż. il-pjanti tat-trattament differenti, l- 
estratti tal- ħamrija, l-ilma tax-xmara, e ċċ.). It-taħlita għandha tkun 
trattata kif deskritt hawn fuq.
 
Biex tkun i ċċekkjata l-attività tat-tajn o ħxon attivat ara “Il-kontroll 
funzjonali”, ta ħt. 
1.6.1.4. I l - p r e p a r a z z j o n i t a s - s o l u z z j o n i j i e t t a t - t e s t  
Żied mar-re ċipjent tat-test 500ml ta' l-ilma tat-test, 2,5 ml/litru tas- 
soluzzjoni nutrijenti u t-tajn o ħxon attivat f'ammont li jikkorrispondi 
għal 0,2 sa 1,0 g/litru ta' materjal niexef fit-ta ħlita finali. Żied 
soluzzjoni ta' l-istokk suffi ċjenti tas-sostanza li g ħandha tkun 
ittestjata biex b'hekk il-kon ċentrazzjoni DOC ta' 50 sa 400mg/litru 
tirriżulta fit-ta ħlita finali. Il-valuri tas-COD korrispondenti huma 100 
sa 1 000 mg/litru. G ħamel bl-ilma tat-test g ħall-volum totali ta' litru 
sa erba' litri. Il-volum totali li g ħandu jintg ħażel huwa dipendenti fuq 
in-numru ta' kampjuni li g ħandhom jittie ħdu għad-determinazzjoni 
tad-DOC jew tas-COD u l-volumi ne ċessarji g ħall-proċedura 
analitika.  
Normalment il-volum ta' żewġ litri jista' jitqies b ħala sodisfa ċenti. 
Minn ta' l-anqas re ċipjent wie ħed tal-kontroll (vojt) huwa mag ħmul 
biex jimxi parallel ma' kull serje tat-test; huwa fih biss tajn o ħxon 
attivat u s-soluzzjoni tan-nutrijenti minerali mag ħmul bl-ilma tat-test 
għall-istess volum totali b ħal fir-reċipjenti tat-test.  
1.6.2.  L-andament tat-test  
Ir-reċipjenti tat-test ji ġu aġitati bl-istrumenti li j ħalltu li huma 
manjetiċi jew skrejjen li jinbuttaw ta ħt illuminazzjoni mxerrda jew 
f'kamra mdallma f'20 sa 25  o C. L-għoti ta' l-arja huwa miksub bl-arja 
kompressata mnaddfa b'passatur tas-suf tal-qoton u bi flixkun tal- ħasil jekk ikun ne ċessarju. G ħandu jkun żgurat li t-tajn o ħxon ma 
joqgħodx u l-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġnu ma taqax ta ħt iż-2mg/litru.
 
Il-valur pH g ħandu jkun i ċċekkjat f'intervalli regolari (e. ż. kuljum) u 
irranġat għal pH 7 sa 8, jekk ikun ne ċessarju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
It-telf mill-evaporazzjoni huwa mag ħmul eżatt qabel kull te ħid tal- 
kampjun bl-ilma dejonizzat jew distillat fl-ammonti me ħtieġa. Il- 
proċedura tajba g ħandha timmarka l-livell tal-likwidu fuq ir- 
reċipjent qabel ma jibda t-test. Il-marki l- ġodda huma mag ħmula 
wara kull te ħid ta' kampjun (ming ħajr l-għoti ta' l-arja u t-ta ħwid). 
L-ewwel kampjuni huma dejjem me ħuda tlett sieg ħat wara l-bidu tat- 
test biex b'hekk ikun skopert l-assorbiment tal-materjali tat-test bit- tajn oħxon attivat.
 
L-eliminazzjoni tal-materjal tat-test huwa segwit bid-determinazzjoni 
tad-DOC jew tas-COD mag ħmula kuljum jew f'intervall ie ħor 
regolari. Il-kampjuni mir-re ċipjenti tat-test u l-vojt huma ffiltrati 
minn ġo filtru tal-karti ma ħsul sew. L-ewwel 5ml tas-soluzzjoni 
ffiltrata tat-test huma mormija. It-tajn o ħxon li huwa diffi ċli li 
tiffiltrah jista' jkun imne ħħi qabel bi ċ-ċentrifugazzjoni g ħal 
10 minuti. Id-determinazzjonijiet tad-DOC u s-COD huma magħmul doppji. It-test huwa mag ħmul sa 28 ġurnata.
 
Nota : Il-kampjuni li jibqg ħu turpid ji ġu ffiltrati minn ġo filtri tal- 
membran. Il-filtri tal-membran m'g ħandhom jer ħu jew jassorbu xi 
materjal organiku.  
I l - k o n t r o l l f u n z j o n a l i t a t - t a j n o ħ x o n a t t i v a t  
Ir-reċipjent li fih sostanza mag ħrufa għandu jkun mag ħmul parallel 
ma' kull serje ta' testijiet biex b'hekk tkun i ċċekkjata l-kapa ċità funz­
jonali tat-tajn o ħxon attivat. Id-diethyleneglycol kien misjub utli g ħal 
dan il-għan. 
L - a d a t t a m e n t  
Jekk l-anali żi huma mag ħmula f'intervalli relattivament qosra (e. ż. 
kuljum), l-adattament g ħandu jkun rikonoxxut b'mod ċar mill-kurva 
tad-degradazzjoni (ara l-Figura 2). It-test g ħalhekk m'g ħandux jibda 
immedjatament qabel il-weekend.  
Jekk l-adattament ise ħħ fl-aħħar tal-perjodu, it-test jista' jittawwal 
sakemm id-degradazzjoni tkun kompleta.  
Nota : Jekk tag ħrif aktar vast fuq l-a ġir tat-tajn o ħxon huwa me ħtieġ, 
l-istess tajn o ħxon attivat huwa espost darba o ħra għall-istess 
materjal tat-test skond il-pro ċedura li ġejja: 
Itfi l-aġitatur u l-apparat li jag ħti l-arja u ħalli t-tajn o ħxon attivat 
joqgħod. Neħħi s-sustanza li tg ħum f'wiċċ il-likwidu, imla sa żewġ 
litri bl-ilma tat-test, ħawwad g ħal 15-il minuta u ħalliħ jerġa 
joqgħod. Wara li s-sostanza li tg ħum f'wiċċ il-likwidu tkun 
imneħħija, uża t-tajn o ħxon li jibqa biex tirrepeti t-test bl-istess 
materjal skond 1.6.1.4 u 1.6.2, fuq. It-tajn o ħxon attivat jista' 
wkoll ikun i żolat biċ-ċentrifugazzjoni minfloq bit-tqeg ħid. 
It-tajn oħxon attivat jista' jkun im ħallat mat-tajn o ħxon frisk g ħal 
konċentrazzjoni ta' 0,2 sa 1 g pi ż niexef/litru.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
I l - m e z z i a n a l i t i ċ i 
Normalment il-kampjuni ji ġu ffiltrati minn ġo passatur tal-karti 
maħsul sew (g ħal ħasil uża l-ilma deonizzat).  
Il-kampjuni li jibqg ħu mdardra ji ġu ffiltrati minn ġo filtri tal- 
membran (0,45 μm). 
Il-konċentrazzjoni DOC hija determinata darbtejn fil-filtrati tal- 
kampjuni (l-ewwel 5ml ji ġu mormija) permezz ta' l-istrument tat- 
TOC. Jekk il-filtrat ma jistax ikun analizzat fl-istess ġurnata, 
għandu jkun merfug ħ fir-refriġeratur sal- ġurnata ta' wara. Irfig ħ 
għal aktar tul ta' żmien ma jistax ikun rakkomandat.  
Il-konċentrazzjoni COD hija determinata fil-filtrati tal-kampjuni b'ar ­
ranġatura analitika tas-COD bil-pro ċedura deskritta fir-referenza (2), 
hawn taħt. 
2. ID-DATA UL-VALUTAZZJONI  
Il-konċentrazzjoni tad-DOC u/jew tas-COD huma determinati minn 
ta' l-anqas darbtejn fil-kampjuni skond 1.6.2 hawn fuq. Id-degra ­
dazzjoni fil- ħin T hija kkalkulata skond il-formula (bid-defi ­
nizzjonijiet) mog ħtija taħt 1.2 hawn fuq.  
Il-limitu tad-degradazzjoni ji ġi mnaqqas jew mi żjud għall persenta ġġ 
sħiħ l-aktar qrib. L-ammont tad-degradazzjoni miksub fl-a ħħar tat- 
test huwa rappurtat b ħala il-“Biodegradabilità fiz-Zahn – it-test ta' 
Wellens”.  
Nota : Jekk id-degredazzjoni kompleta hija miksuba qabel il- ħin tat- 
test jispiċċa u dan ir-ri żultat huwa konfermat b'anali żi oħra fil- 
ġurnata ta' wara, it-test jista' jkun konklu ż. 
3. IR-RAPPORTAGG  
3.1. IR-RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, ikun fih dan li ġej: 
— il-kon ċentrazzjoni inizjali tas-sustanza,  
— l-informazzjoni l-o ħra kollha u r-ri żultati sperimentali rigward is- 
sustanza ttestjata, is-sostanza referenza jekk kienet u żata, u l-vojt,  
— il-kon ċentrazzjoni wara tlett sieg ħat, 
— il-kurva tal-biodegradazzjoni bid-deskrizzjoni,  
— id-data u l-post fejn l-organi żmi tat-test kienu me ħuda, l-istatus 
ta' l-adattament, il-kon ċentrazzjoni u żata, eċċ., 
— ir-raġunijiet xjentifi ċi għal kwalunkwe tibdiliet fil-pro ċedura tat- 
test. 
3.2. L-INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
It-tneħħija tad-DOC (COD) li ssir gradwalment fuq medda ta' ġranet 
jew ġimgħat tindika li s-sustanza tat-test qieg ħda tiġi biodegradata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Madanakollu, l-assorbiment fi żiko-kimiku jista', f' ċerti każijiet, 
jilgħab rwol u dan huwa indikat fejn hemm it-tne ħħija kompleta 
jew parzjali mill-bidu nett, fl-ewwel tlett sieg ħat, u d-differenza 
bejn il-likuri tal-kontroll u dawk li jg ħumu f'wi ċċ l-ilma tibqa 
f'livell baxx li ma jkunx mistenni.  
Aktar testijiet huma ne ċessarji jekk g ħandu jkun hemm distinzjoni 
bejn il-biodegradazzjoni (jew il-biodegradazzjoni parzjali) u l-assor ­
biment.  
Dan jista' jkun mag ħmul f'numru ta' modi, i żda dak l-aktar 
konvinċenti għandu jkun li tkun u żata is-sustanza li tg ħum f'wiċċ 
l-ilma jew it-tajn o ħxon bħala sustanza u żata għat-tilqim f'test tas-sett 
bażiku (preferibbilment f'test respirometriku).  
Is-sustanzi tat-test li jag ħtu tneħħija għolja u li ma tassorbix ta' DOC 
(COD) fittest g ħandhom ikunu meqjusa b ħala potenzalment biode ­
gradabbli. It-tne ħħija parzjali li ma tassorbix tindika li l-kimika hija 
minn ta' l-anqas so ġġetta għal ċerta biodegradazzjoni. It-tne ħħija 
baxxa jew l-ebda tne ħħija tad-DOC (COD) tista' tkun kaw ża ta' l- 
inibizzjoni tal-mikroorgani żmi mis-sostanza tat-test u dan jista' wkoll 
ikun mikxuf bil-lisi u t-telf tat-tajn o ħxon, li jag ħti sostanzi li jg ħumu 
fuq l-ilma li jkunu mdardra. Dan it-test g ħandu jkun ripetut billi 
tintuża konċentrazzjoi aktar baxxa tas-sostanza tat-test.  
L-użu tal-metodu spe ċifiku għall-komposti jew tas-sostanza tat-test 
bit-tikketta 14 C tista' t ħalli sensittività aktar g ħolja. Fil-ka ż tal- 
kompost tas-14C tat-test, l-irkuprar tal-14 CO  2 għandu jikkonferma 
li l-biodegradazzjoni se ħħet. 
Meta r-ri żultati jing ħataw fit-termini tal-bijodegradazzjoni primarja, 
għandha ting ħata spjegazzjoni jekk ikun possibbli fuq il-bidla ta' l- 
istruttura kimika li twassal g ħal telf fir-rispons tas-sustanza tat-test 
primarja.  
The validation of the analytical method must be given together with 
the response found on the blank test medium.  
4. IR-REFERENZI  
(1) OECD, Pari ġi, 1981, Test Guideline 302 B, Id-De ċiżjoni tal- 
Kunsill C (81) 30 finali.  
(2) L-Anness V C.9 Id-Degradazzjoni: Id-Domanda g ħall-Ossiġnu 
Kimiku, id-Direttiva tal-Kummissjoni 84/449/KEE, Il- Ġurnal 
Uffiċjali tal-Kommunitajiet Ewropej, Nru L 251, 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
L-Appendi ċi: 
L-EŻEMPJU TAL-VALUTAZZJONI 
Il-kompost organiku: L-a ċidu 4-Ethoxybenzoic 
Il-konċentrazzjoni teoretika tat-test: 600 mg/1 
Id-DOC teoretiku: 390 mg/l 
Is-sostanza tat-tilqim L-impjant tat-trattament tal- ħmieġ tad-drena ġġ 
ta' 
Il-konċentrazzjoni: gramma wa ħda tal-materjal niexef/litru 
L-istatus ta' l-adattament: mhux adattat 
L-analiżi: Id-determinazzjoni tad-DOC 
L-ammont tal-kampjuni: 3 ml Is-sostanza tal-kontroll: Diethyleneglycol 
Il-kompost tat-tossi ċità: L-ebda effetti toxi ċi taħt l-1 000 mg 
It-test użat: Il-fermentazzjoni tat-tubi tat- test
 
Il-ħin tat-test Is-sustanza tal-kontroll Is-sustanza tat-test 
Id-DOC 
vojt 
mg/1 Id-DOC 
mg/l Id-DOC nett 
mg/l Id-degra­
dazzjoni 
% Id-DOC 
mg/l Id-DOC nett 
mg/l Id-degra­
dazzjoni 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 siegħat 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 ġurnata 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 ġranet 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 
5 ġranet 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 
6 ġranet 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 
7 ġranet 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 
8 ġranet 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 
9 ġranet 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 
10 ġranet 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figura 1  
Eżempji tal-kurvi tal-bijodegradazzjoni
  
Figura 2  
Eżempji ta' l-adattazzjoni tat-tajn o ħxon
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  TRATTAMENT TA’ SIMULAZZJONI TESTAEROBIKA 
TAD-DRANA ĠĠ: C.10-A: UNITAJIET TA’ ĦAMA ATTIVAT - C.10-B: 
BIJORITI  
C.10-A: Unitajiet ta’ Ħama Attivat  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħall-Linja Gwida 
tat-Test (TG) 303 (2001) tal-OECD. Fil- ħamsinijiet (1950s) kien irrealizzat 
li tensjoattivi li kienu g ħadhom kif ġew introdotti kienu jikkaw żaw ragħwa 
eċċessiva f’impjanti tat-trattament ta’ ilma mormi u fix-xmajjar. Ma kinux 
tneħħew għalkollox fit-trattament aerobiku u f’xi ka żijiet kienu llimitaw 
it-tneħħija ta’ materja organika o ħra. Dan ġiegħel li jsiru ħafna investi ­
gazzjonijet dwar kif setg ħu jitneħħew tensjoattivi minn ilmijiet mormija u 
jekk kimi ċi ġodda prodotti mill-industrija setg ħux ikunu ttrattati b’ilma 
mormi. Biex dan isir, intu żaw unitajiet mudelli li kienu jirrappre żentaw 
iż-żewġ tipi ewlenin ta’ trattament aerobiku u bijolo ġiku ta’ ilma mormi 
(ħama attivat u jnixxi, jew iqattar, jiffiltra). Ma kienx ikun prattikabbli u 
kien jiswa ħafna li kull kimika ġdida titqassam u li jsir monitora ġġ ta’ 
impjanti tat-trattament ta’ skala kbira, anki fuq ba żi lokali.  
KONSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU  
Unitajiet ta’ ħama attivat  
2. Unitajiet mudell ta’ ħama attivat ġew deskritti li jvarjaw fid-daqs minn 300 
ml sa madwar 2 000 ml. U ħud imitaw ħafna l-impjanti ta’ skala reali, li 
jkollhom tankijiet li fihom toqg ħod il-ħama fejn il- ħama li jkun qag ħad jiġi 
ppumpjat lura fit-tank tal-arja, filwaqt li o ħrajn ma pprovdewx fa ċilitajiet 
tat-tqegħid, eż. Swisher (1). Id-daqs tal-apparat huwa kompromess: minn 
naħa waħda għandu jkun kbir bi żżejjed biex l-operazzjoni mekkanika 
tirnexxi u biex ikun ipprovdut volum suffi ċjenti ta’ kampjuni ming ħajr ma 
tintlaqat l-operazzjoni; filwaqt li minn na ħa oħra l-apparat m’g ħandux ikun 
daqshekk kbir li jkun je ħtieġlu spazju u materjali e ċċessivi.  
3. Żewġ għamliet ta’ apparat li ntu żaw b’mod estensiv u sodisfa ċenti huma 
l-unitajiet Husmann (2) u l-unitajiet ta’ Borma Poru ża (3)(4), tal-ewwel u żati 
fl-istudju ta’ tensjoattivi; dawn huma deskritti f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar. 
Oħrajn intużaw ukoll b’mod sodisfa ċenti, eż. Eckenfelder (5). Min ħabb li 
kienu jiswew relattivament ħafna u min ħabba l-isforz li kien me ħtieġ biex 
ikun applikat dan it-test ta’ simulazzjoni, kienu mist ħarrġa fl-istess żmien 
testijiet ta’ tg ħarbil aktar sempli ċi u orħos, li issa jinsabu inkorporati 
fil-kapitolu C.4 A-F ta’ dan l-Anness (6). L-esperjenza minn ħafna tens ­
joattivi u kimi ċi oħra wriet li dawk li g ħaddew mit-testijiet tat-tg ħarbil 
(bijodegradabbli fa ċilment) iddegradaw ukoll fit-test ta’ simulazzjoni. Xi 
wħud minn dawk li m’g ħaddewx mit-testijiet tat-tg ħarbil għaddew 
mit-testijiet tal-bijodegradabbiltà inerenti (il-Kapitoli C.12 (7) u C.19 (8) ta’ dan l-Anness), i żda ftit biss minn dan il-grupp tal-a ħħar kienu ddegradati 
fit-test ta’ simulazzjoni, filwaqt li dawk il-kimi ċi li m’għaddewx minn 
testijiet g ħall-bijodegradabbiltà inerenti ma ddegradawx fit-testijiet ta’ simu ­
lazzjoni (9)(10)(11).
 
4. Għal xi għanijiet, testijiet ta’ simulazzjoni mwettqin skont sett wie ħed ta’ 
kondizzjonijiet operazzjonali jkunu suffi ċjenti; ir-ri żultati jkunu espressi 
bħala perċentwali ta’ tne ħħija tal-kimika g ħall-ittestjar jew tal-karbonju 
organiku ma ħlul (DOC). Deskrizzjoni ta’ test b ħal dan ting ħata f’dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar. I żda, mhux b ħal verżjoni ta’ qabel ta’ dan 
il-Kapitolu, li ddeskriviet tip wie ħed biss ta’ apparat li jittratta drana ġġ ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
sintetiku fil-modalità akkoppjata bl-u żu ta’ metodu relattivament primittiv 
ta’ rimi ta’ ħama, dan it-test joffri g ħadd ta’ varjazzjonijiet. Huma deskritti 
alternattivi g ħat-tip ta’ apparat, modalità ta’ t ħaddim, drana ġġ u tneħħija ta’ 
rimi ta’ ħama. Dan it-test isegwi mill-qrib dak ta’ ISO 11733 (12), li kien 
eżaminat bir-reqqa matul it-t ħejjija tieg ħu, għalkemm il-metodu ma 
tqiegħedx għal ringtest.  
5. Għal għanijiet oħra, il-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent 
jeħtiġilha tkun mag ħrufa b’aktar akkuratezza u g ħal dan je ħtieġ metodu 
aktar estensiv. Pere żempju, ir-rata ta’ rimi ta’ ħama għandha tkun ikkon ­
trollata b’mod aktar pre ċiż tul kull ġurnata u tul il-perjodu tat-test, u unitajiet 
għandhom jit ħaddmu f’g ħadd ta’ rati ta’ rimi. G ħal metodu g ħal kollox 
komprensiv, testijiet g ħandhom isiru wkoll f’ żewġ jew fi tliet temperaturi 
differenti: metodu b ħal dan huwa deskritt minn Birch (13)(14) u huwa 
miġbur fil-qosor fl-Appendi ċi 6. Iżda t-tagħrif li għandna pre żentament 
mhux suffi ċjenti biex ikun de ċiż liema mill-mudelli kineti ċi huma 
applikabbli g ħall-bijodegradazzjoni ta’ kimi ċi fi trattament ta’ ilma mormi 
u ġeneralment fl-ambjent akwatiku. L-applikazzjoni tal-kinetika Monod, 
mogħtija fl-Appendi ċi 6 bħala eżempju, hija limitata g ħal kimiċi li jkun 
hemm f’1 mg/l u msemmija hawn fuq, i żda l-opinjoni ta’ xi w ħud hija li 
anki din fadlilha tkun issustanzjata. Testijiet f’kon ċentrazzjonijiet li jirriflettu 
aktar tassew dawk misjubin f’ilmijiet mormija huma indikati fl-Appendi ċi 7, 
iżda testijiet b ħal dawn, u dawk fl-Appendi ċi 6, huma inklu żi f’Appen ­
diċijiet minflok ma jin ħarġu bħala Metodi ta’ Ttestjar separati.  
Filtri  
6. Ingħatat anqas attenzjoni lil filtri mudelli li jnixxu, forsi min ħabba li huma 
aktar skomdi u anqas kompatti minn mudelli ta’ impjanti ta’ ħama attivat. 
Gerike  et al  żviluppaw unitajiet tal-filtri jnixxu (trickling) u operawhom 
fil-mod akkoppjat ((15). Dawn il-filtri kienu relattivament kbar (g ħoli ta’ 
2 m; volum ta’ 60 l) u kull wie ħed kien jirrikjedi sa 2 l/h ta’ drana ġġ. 
Baumann et al (16) issimulaw il-filtri li jnixxu billi da ħħlu strixxi 
tal-polyester “fleece” f’tubi ta’ 1 m (dijametru intern ta’ 14 mm) wara li 
l-istrixxi dda ħħlu fil-ħama attivata kon ċentrata għal 30 minuta. Il-kimika 
għall-ittestjar b ħala sors uniku ta’ C f’soluzzjoni ta’ mlu ħa minerali tferrat 
minn tubu vertikali u l-bijodegredazzjoni ġiet ivvalutata minn kejlijiet ta’ 
DOC fl-effluwent u d-CO  2 fil-gass li ħareġ. 
7. Biofiltri kienu ssimulati mod ie ħor (15); l-u ċuħ ta’ ġewwa ta’ tubi li jduru, 
inklinati f’angolu żgħir mal-orizzontali, tqeg ħdilhom drana ġġ (madwar 250 
ml/h) bi u ming ħajr il-kimika g ħall-ittestjar, u l-effluwenti mi ġbura kienu 
analizzati g ħal DOC u/jew g ħall-kimika spe ċifika tat-test.  
PRINĊIPJU TA’ TTESTJAR  
8. Dan il-metodu huwa mfassal biex ikunu ddeterminati l-eliminazzjoni u 
l-bijodegradazzjoni primarja u/jew finali ta’ kimi ċi organiċi li jinħallu 
fl-ilma b’mikroorgani żmi aerobi ċi f’sistema ta’ ttestjar im ħaddma kontin ­
wament li tissimula l-pro ċess ta’ ħama attivat. Midjum organiku fa ċilment 
bijodegradabbli u l-kimika organika tat-test huma s-sorsi ta’ karbonju u enerġija għall-mikroorgani żmi.
 
9. Żewġ unitajiet ta’ ttestjar im ħaddmin kontinwament (impjanti ta’ ħama 
attivat jew borom poru żi) jintużaw fl-istess waqt f’kondizzjonijiet identi ċi 
li jintgħażlu biex ikunu adatti g ħall-fini tat-test. Normalment il- ħin medju ta’ 
retenzjoni idrawlika jkun ta’ 6 sig ħat u l-ħama jkollu żmien medju ( żmien 
ta’ retenzjoni ta’ ħama) ta’ minn 6 sa 10 ijiem. Il- ħama jintrema b’wie ħed 
minn żewġ metodi, il-kimika g ħall-ittestjar normalment ti żdied f’kon ċen­
trazzjoni ta’ bejn 10 mg/l ta’ karbonju organiku ma ħlul (DOC) u 20 mg/l 
DOC, mal-influwent (midjum organiku) ta’ wa ħda biss mill-unitajiet. It-tieni 
unità tintu ża bħala unità ta’ kontroll biex tkun iddeterminata 
l-bijodegradazzjoni tal-midjum organiku.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. F’kampjuni me ħudin sikwit tal-effluwenti, ikun iddeterminat id-DOC, 
preferibbilment, jew id-domanda kimika ta’ ossi ġnu (COD), flimkien 
mal-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (jekk ikun me ħtieġ) b’analiżi 
speċifika, fl-effluwent mill-unità li tir ċievi l-kimika g ħall-ittestjar. 
Id-differenza bejn il-kon ċentrazzjonijiet ta’ effluwenti ta’ DOC jew ta’ 
COD fl-unitajiet ta’ ttestjar u ta’ kontroll hija pre żunta li tkun dovuta 
minħabba l-kimika g ħall-ittestjar jew il-metaboliti organi ċi tagħha. Din 
id-differenza titqabbel mal-kon ċentrazzjoni ta’ influwenti ta’ DOC jew ta’ 
COD min ħabba kimika g ħall-ittestjar mi żjuda biex tkun iddeterminata 
l-eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar.  
11. Il-bijodegradazzjoni tista’ normalment ting ħaraf minn bijosorbiment b’e żami 
sewwa tal-kurva ta’ eliminazzjoni- żmien/ħin u tista’ s-soltu tkun ikkon ­
fermata bl-applikazzjoni ta’ test g ħal bijodegradazzjoni fa ċli billi tintu ża 
tilqima akklimatizzata mill-unità li tir ċievi l-kimika g ħall-ittestjar.  
INFORMAZZJONI DWAR IL-KIMIKA G ĦALL-ITTESTJAR  
12. Il-purezza, is-solubilità fl-ilma, il-volatilità u l-karatteristi ċi ta’ sorbiment 
tal-kimika g ħall-ittestjar g ħandhom ikunu mag ħrufin biex tkun tista’ ssir 
interpretazzjoni korretta ta’ ri żultati. Normalment kimi ċi volatili u li ma 
jinħallux ma jistg ħux ikunu ttestjati sakemm ma jitte ħdux prekawzjonijiet 
speċjali (ara l-Appendi ċi 5). L-istruttura kimika, jew tal-anqas il-formula 
empirika, ukoll g ħandhom ikunu mag ħrufin biex ikunu kkalkulati valuri 
teoretiċi u/jew biex ikunu vverifikati valuri mkejla ta’ parametri, e ż. 
domanda teoretika ta’ ossi ġnu (ThOD), karbonju organiku ma ħlul (DOC) 
u domanda kimika ta’ ossi ġnu (COD).  
13. Informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal mikroorgani żmi 
(ara l-Appendi ċi 4) tista’ tkun utli biex jintg ħażlu konċentrazzjonijiet tat-test 
adatti u tista’ tkun essenzjali g ħall-interpretazzjoni korretta ta’ valuri baxxi 
ta’ bijodegradazzjoni.  
LIVELLI TA’ PASS  
14. Fl-applikazzjoni ori ġinali ta’ dan it-test ta’ simulazzjoni (konfermatorju) 
għall-bijodegradazzjoni primarja ta’ tensjoattivi, tkun me ħtieġa tneħħija ta’ 
aktar minn 80 % tal-kimika spe ċifika qabel ma t-tensjoattiv jitqieg ħed 
fis-suq. Jekk il-valur ta’ 80 % ma jintla ħaqx, jista’ jkun applikat dan 
it-test ta’ simulazzjoni (konfermatorju) u t-tensjoattiv ikun jista’ jitqieg ħed 
fis-suq biss jekk titne ħħa aktar minn 90 % tal-kimika spe ċifika. Għal kimiċi 
inġenerali mhix kwistjoni ta’ jekk ikunx hemm pass/falliment u l-valur ta’ 
perċentwali ta’ tne ħħija miksub jista’ jintu ża f’kalkulazzjonijiet prossimi 
tal-konċentrazzjoni ambjentali probabbli biex jintu ża fi stimi tal-perikli li 
jġibu kimiċi. Riżultati aktarx isegwu xejra ta’ kollox jew xejn. F’g ħadd 
ta’ studji tal-kimi ċi puri l-per ċentwali ta’ tne ħħija ta’ DOC instab li kien 
> 90 % f’aktar minn tliet kwarti u > 80 % f’aktar minn 90 % tal-kimi ċi li 
wrew xi grad sinifikanti ta’ bijodegradabbiltà.  
15. Relattivament ftit kimi ċi (eż. tensjoattivi) jinsabu fid-drana ġġ 
fil-konċentrazzjonijiet (madwar 10 mg C/l) u żati f’dan it-test. Xi kimi ċi 
jistgħu jkunu inibitorji f’dawn il-kon ċentrazzjonijiet, filwaqt li l-kinetika ta’ 
tneħħija ta’ oħrajn tista’ tkun differenti f’kon ċentrazzjonijiet baxxi. Tista’ ssir 
valutazzjoni aktar akkurata tad-degradazzjoni billi jintu żaw metodi modifikati, 
bl-użu ta’ kon ċentrazzjonijiet realistikament baxxi tal-kimika g ħall-ittestjar, u 
d-dejta mi ġbura tkun tista’ tintu ża biex ikunu kkalkulati kostanti kineti ċi. Iżda 
t-tekniki sperimentali me ħtieġa għadhom ma ġewx ivvalidati g ħalkollox u 
lanqas ma g ħadhom ġew stabbiliti l-mudelli kineti ċi li jiddeskrivu 
r-reazzjonijiet ta’ bijodegradazzjoni (ara l-Appendi ċi 7). ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
16. Biex ikun żgurat li l-pro ċedura sperimentali tkun qed titwettaq b’mod 
korrett, ikun utli kull tant żmien li jkunu ttestjati l-kimi ċi li l-imġiba 
tagħhom tkun mag ħrufa fl-istess waqt meta jkunu mist ħarġa l-kimiċi 
għall-ittestjar. Kimi ċi bħal dawn jinkludu a ċidu adipiku, 2-fenil fenol, 1- 
naftol, aċidu difeniku, 1-a ċidu naftoiku, e ċċ. (9)(10)(11).  
RIŻULTATI RIPRODU ĊIBBLI TA’ TESTIJIET  
17. Kien hemm bil-wisq anqas rapporti ta’ studji ta’ testijiet ta’ simulazzjoni 
milli ta’ testijiet g ħal bijodegradabbiltà fa ċli. Riprodu ċibbiltà bejn replikati 
(simultanji) hija tajba (f’10-15 %) g ħall-kimiċi għall-ittestjar iddegradati bi 
80 % jew aktar, i żda għall-kimiċi anqas iddegradati sewwa l-varjabbiltà hija 
akbar. Ukoll g ħal xi kimi ċi dubjużi kienu rre ġistrati riżultati differenti g ħal­
kollox minn xulxin (e ż. 10 %, 90 %) f’okka żjonijiet differenti fi żmien 9 
ġimgħat permessi fit-test.  
18. Ftit instabet differenza f’ri żultati miksubin bi ż-żewġ tipi ta’ apparat, i żda xi 
kimiċi kienu aktar iddegradati b’mod estensiv u konsistenti meta kien hemm 
dranaġġ domestiku milli minn drana ġġ sintetiku tal-OECD.  
DESKRIZZJONI TAL-METODU TA’ TTESTJAR  
Apparat  
Sistema ta’ ttestjar  
19. Is-sistema ta’ ttestjar g ħal kimika wa ħda ta’ ttestjar tikkonsisti minn unità ta’ 
ttestjar u minn unità ta’ kontroll; i żda meta ssir anali żi speċifika waħda 
(bijodegradazzjoni primarja), tkun me ħtieġa biss unità ta’ ttestjar. Tista’ 
tintuża unità wa ħda ta’ kontroll g ħal diversi unitajiet ta’ ttestjar li jir ċievu 
l-kimiċi għall-ittestjar li jkunu l-istess jew differenti. Fil-ka ż ta’ akkoppjar 
(Appendi ċi 3) kull unità ta’ ttestjar g ħandu jkollha unità ta’ kontroll tag ħha 
stess. Is-sistema ta’ ttestjar tista’ tkun jew ta’ mudell ta’ impjant ta’ ħama 
attivat, unità Husmann (Appendi ċi 1, Figura 1) jew borma poru ża 
(Appendi ċi 1, Figura 2). Fi ż-żewġ każijiet ikunu me ħtieġa reċipjenti ta’ 
ħżin ta’ daqs suffi ċjenti għall-influwenti u l-effluwenti, kif ukoll pompi 
biex jiddo żaw l-influwent, m ħallat ma’ soluzzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar 
jew b’mod separat.  
20. Kull unità ta’ impjant ta’ ħama attivat tikkonsisti minn re ċipjent ta’ tirwi ħ 
b’kapaċità magħrufa ta’ madwar 3 litri ta’ ħama attivat u li jkollu separatur 
(kjarifikatur sekondarju) li jkun jesa madwar 1,5 litri; il-volumi jistg ħu, sa 
ċertu punt, jinbidlu billi jkun a ġġustat l-għoli tas-separatur. Re ċipjenti ta’ 
daqs differenti jkunu permissibbli jekk jit ħaddmu b’pi żijiet idrawli ċi 
komparabbli. Jekk ma jkunx possibbli li t-temperatura fil-kamra tat-test tinżamm fil-firxa mixtieqa, huwa rrakkomandat li jintu żaw reċipjenti 
mdawrin bl-ilma b’temperatura kontrollata. Tintu ża pompa ta’ estrazzjoni 
bl-arja jew pompa tad-do żar biex tirri ċikla l-ħama attivat mis-separatur 
għar-reċipjent ta’ tirwi ħ, kontinwament jew kull tant f’intervalli regolari.
 
21. Is-sistema ta’ borma poru ża tikkonsisti minn ċilindru fuq ġewwa, poru ż 
b’qiegħ koniku mi żmum f’re ċipjent ftit akbar tal-istess forma, i żda li jkun 
magħmul minn materjal tal-plastik li minnu ma jg ħaddix l-ilma. Materjal 
adatt għar-reċipjent poru ż huwa l-polietilen poru ż b’pori ta’ daqs massimu 
ta’ 90 μm u ħoxnin 2 mm. Is-separazzjoni tal- ħama mill-midjum organiku 
ttrattat issir b’passa ġġ differenzjali minn na ħa għal oħra tal-ħajt poruż. 
Effluwenti jin ġabru fl-Ispazju annulari minn fejn ifuru g ħal ġor-reċipjent 
tal-ġbir. Ma jkun hemm ebda ħama qieg ħed u, għalhekk, ma ji ġix ħama ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
lura. Is-sistema kollha tista’ titrikkeb f’banjumarija kkontrollat termostati ­
kament. Borom poru żi jisfaw mi żdudin u jistg ħu jfuru fl-istadji tal-bidu. 
F’każ bħal dan, ibdel l-inforra poru ża b’waħda nadifa billi l-ewwel 
tgħaddi minn ġo sifun il- ħama mill-borma g ħal ġo barmil nadif u tne ħħi 
l-inforra mi żduda. Wara li timsa ħ sewwa ċ-ċilindru estern li minnu ma 
jgħaddix l-ilma, da ħħal inforra nadifa u er ġa’ qiegħed il-ħama fil-borma. 
Xi ħama li je ħel mal-ġnub tal-inforra mi żduda jitqaxxar bil-galbu u 
jittieħed band’o ħra. L-ewwel naddaf il-borom mi żduda billi tu ża ġett irqiq 
ta’ ilma biex tne ħħi l-ħama li jkun fadal u billi tg ħaddashom f’soluzzjoni 
dilwita ta’ ipoklorit tas-sodju, mbag ħad fl-ilma, u wara la ħlaħ sewwa 
bl-ilma.  
22. Għal tirwiħ tal-ħama fir-re ċipjenti ta’ tirwi ħ taż-żewġ sistemi, je ħtieġu 
tekniki adatti, pere żempju kubi sinterizzati ( ġebel diffu ż) u arja kkom ­
pressata. L-arja g ħandha titnaddaf, jekk ikun me ħtieġ, billi tgħaddi minn 
filtru adatt u tin ħasel. Mis-sistema g ħandha tgħaddi arja suffi ċjenti biex 
jinżammu kondizzjonijiet aerobi ċi u biex parti ċelli ta’ ħama jinżammu f’sos ­
pensjoni l- ħin kollu.  
Apparat ta’ filtrazzjoni jew ċentrifugu  
23. Ikun hemm apparat g ħall-filtrazzjoni ta’ kampjuni b’filtri ta’ membrani ta’ 
porożità adatta (dijametru ta’ apertura nominali ta’ 0,45 μm) li jassorbixxu 
l-kimiċi organiċi li jinħallu u jer ħu karbonju organiku fi grad minimu. Jekk 
jintużaw filtri li jer ħu karbonju organiku, a ħsel il-filtri sewwa b’ilma s ħun 
biex tneħħi karbonju organiku li jlissi. Alternattivament jista’ jintu ża 
ċentrifugu li jkun kapa ċi jipprodu ċi 40 000 m/s  2 . 
Tagħmir analitiku  
24. Apparat me ħtieġ biex ikun iddeterminat:  
— DOC (karbonju organiku ma ħlul) u TOC (karbonju organiku totali) jew 
COD (domanda kimika ta’ ossi ġnu); 
— kimika spe ċifika, jekk tkun me ħtieġa; 
— solidi sospi żi, pH, kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu fl-ilma;  
— temperatura, a ċidità u alkalinità;  
— ammonju, nitrit u nitrat, jekk it-test isir f’kondizzjonijiet ta’ nitrifi ­
kazzjoni.  
Ilma 
25. Ilma tal-vit, li jkun fih anqas minn 3 mg/l DOC. Iddetermina l-alkalinità 
jekk mhix6mag ħrufa diġà. 
26. Ilma dejonizzat, li jkun fih anqas minn 2 mg/l ta’ DOC.  
Midjum organiku  
27. Drana ġġ sintetiku, drana ġġ domestiku jew ta ħlita tat-tnejn huma permis ­
sibbli bħala l-midjum organiku. Intwera (11)(14) li l-u żu ta’ drana ġġ 
domestiku wa ħdu sikwit jag ħti perċentwali mi żjud ta’ tne ħħija ta’ DOC u 
anki jippermetti t-tne ħħija u l-bijodegradazzjoni ta’ xi kimi ċi li ma jkunux 
iddegradati bijolo ġikament meta jintu ża dranaġġ sintetiku tal-OECD. Barra 
dan, il-kostant jew i ż-żieda kull tant ta’ drana ġġ domestiku sikwit jag ħmlu 
stabbli l- ħama attivat, inklu ża l-kapaċità kruċjali li joqg ħod sewwa. 
Għalhekk huwa rrakkomandat l-u żu ta’ drana ġġ domestiku. Kejjel 
il-konċentrazzjoni ta’ DOC jew ta’ COD f’kull lott ġdid ta’ midjum 
organiku. L-a ċidità jew l-alkalinità tal-midjum organiku g ħandha tkun 
magħrufa. Il-midjum organiku jista’ jkun je ħtieġlu li jiżdiedlu lqug ħ 
xieraq (idro ġenu karbonat tas-sodju jew fosfat tal-potassju tad-diidro ġenu) 
jekk ikun ta’ a ċidità jew alkalinità baxxa, biex jin żamm pH ta’ madwar 7,5 
± 0,5 fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ matul it-test. Kemm ikollu ji żdied ilqug ħ, u 
meta jkollu ji żdied, għandu jkun de ċiż għal kull ka ż għalih waħdu. Meta 
jintużaw taħlitiet kontinwament jew kull tant, DOC (jew COD) tat-ta ħlita 
għandu jinżamm bejn wie ħed u ieħor f’valur kostanti, e ż. b’dilwizzjoni 
bl-ilma.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Dranaġġ sintetiku  
28. Ħoll f’kull litru ta’ ilma tal-vit: peptun, 160 mg; estratt tal-la ħam, 110 mg; 
urea, 30 mg; fosfat anidru tal-idro ġenu tad-dipotassju (K  2 HPO  4 ), 28 mg; 
klorur tas-sodju (NaCl), 7 mg; diidrat tal-klorur tal-kal ċju (CaCl  2 .2H  2 O), 4 
mg; ettaidrat tas-sulfat tal-manje żju ((Mg  2 SO 4 .7H  2 0), 2 mg. Dan id-drana ġġ 
sintetiku tal-OECD huwa e żempju u jag ħti konċentrazzjoni medja tad-DOC 
fl-influwent ta’ madwar 100 mg/l. Alternattivament, u ża kompożizzjonijiet 
oħrajn, b’madwar l-istess kon ċentrazzjoni tad-DOC, li huma eqreb g ħall- 
ħama reali. Jekk ikun me ħtieġ influwent inqas kon ċentrat, iddilwixxi 
d-dranaġġ sintentiku, pere żempju 1:1 bl-ilma tal-vit biex tikseb kon ċen­
trazzjoni ta’ maddwar 50 mg/l. Influwent iktar dg ħajjef bħal dan se 
jippermetti tkabbir a ħjar tal-organi żmi li jinnitrifikaw u din il-modifika 
għandha tintu ża jekk is-simulazzjoni tal-impjanti tal-ilma mormi li jinni ­
trifikaw g ħadnha tiġi investigata. Dan id-drana ġġ sintetiku jista’ jsir f’ilma 
distillat f’forma kon ċentrata u jin ħażen f’madwar 1 °C sa mhux aktar minn 
ġimgħa. Meta jkun hemm b żonnu, raqqu bl-ilma tal-vit. (Dan il-midjum 
mhux sodisfa ċenti, eż. il-konċentrazzjoni ta’ nitro ġenu hija g ħolja ħafna, 
relattivament b’kontenut ta’ karbonju baxx, i żda ma kien issu ġġerit xejn 
aħjar, ħlief li jiżdied aktar fosfat b ħala lqugħ u peptun żejjed).  
Dranaġġ domestiku  
29. Uża dranaġġ qiegħed frisk mi ġbur kuljum minn xog ħlijiet ta’ trattament li 
jirċievu b’mod predominanti drana ġġ domestiku. Dan g ħandu jinġabar, 
qabel sedimentazzjoni primarja, mill-kanal tat-tifwir tat-tank ta’ sedimen ­
tazzjoni primarja, jew mill-g ħalf għall-impjant tal- ħama attivat, u jkun 
kważi kollu ħieles minn parti ċelli raffi. Id-drana ġġ ikun jista’ jintu ża wara 
l-ħżin għal diversi jiem (i żda ġeneralment m’g ħandhomx jinqab żu sebgħat 
ijiem) f’madwar 4 °C, jekk ikun ippruvat li DOC (jew COD) ma jkunux 
naqsu b’mod sinifikanti (ji ġifieri b’anqas minn 20 %) matul il- ħżin. Biex 
ikun illimitat taqlib fis-sistema, DOC (jew COD) ta’ kull lott ġdid 
għandhom ikunu a ġġustati qabel ma jintu żaw għal valur kostanti xieraq, 
eż. b’dilwizzjoni bl-ilma tal-vit.  
Ħama attivat  
30. Iġbor ħama attivat g ħal tilqim mit-tank ta’ tirwi ħ ta’ impjant im ħaddem 
tajjeb ta’ trattament ta’ ilma mormi jew mil-laboratorju unità ta’ skala ta’ 
ħama attivat, li tittratta l-aktar drana ġġ domestiku.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet tal-kimika g ħall-ittestjar  
31. Għall-kimiċi li jinħallu b’mod adegwat, ħejji soluzzjonijiet ta’ stokkijiet 
f’konċentrazzjonijiet xierqa (e ż. 1 sa 5 g/l) f’ilma dejonizzat, jew 
fil-porzjon minerali tad-drana ġġ sintetiku. (g ħall-kimiċi li ma jin ħallux u li 
jkunu volatili, ara l-Appendi ċi 5). Iddetermina d-DOC u karbonju organiku 
totali (TOC) tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet u tenni l-kejlijiet g ħal kull lott ġdid. 
Jekk id-differenza bejn DOC u TOC tkun aktar minn 20 %, ivverifika jekk 
il-kimika g ħall-ittestjar tin ħallx fl-ilma. Qabbel id-DOC jew 
il-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar imkejla b’anali żi speċifika 
tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet mal-valur nominali, biex ta ċċerta jekk l-irkupru 
jkunx tajjeb bi żżejjed (normalment jista’ jkun mistenni li jkun > 90 %). 
Aċċerta, l-aktar g ħal tixrid, jekk jistax jintu ża DOC jew le b ħala 
parametru analitiku jew jekk tistax tintu ża biss teknika analitika b’mod 
speċifiku għall-kimika g ħall-ittestjar. Ċentrifugazzjoni tal-kampjuni tkun 
meħtieġa għal tixrid. G ħal kull lott ġdid, kejjel DOC, COD jew il-kimika 
għall-ittestjar ma’ anali żi speċifika. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Iddetermina pH tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet. Valuri estremi jindikaw li ż- 
żieda tal-kimika jista’ jkollha influwenza fuq pH tal- ħama attivat fis-sistema 
ta’ ttestjar. F’dan il-ka ż innewtralizza s-soluzzjoni ta’ stokkijiet biex tikseb 
pH ta’ 7 ± 0,5 b’ammonti żgħar ta’ aċidu jew ba żi inorgani ċi, iżda evita 
l-preċipitazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar.  
PROĊEDURA  
33. Il-pro ċedura hija deskritta g ħall-unitajiet ta’ impjanti ta’ ħama attivat; 
għandha tkun adattata xi ftit g ħas-sistema tal-borma poru ża. 
Tħejjija tat-tilqima  
34. Laqqam is-sistema ta’ ttestjar fil-bidu tat-test bil- ħama attivat jew b’tilqima 
li jkun fiha kon ċentrazzjoni baxxa ta’ mikroorgani żmi. Żomm it-tilqima 
mrewħa f’temperatura ambjentali sakemm tintu ża u użaha f’ħin ta’ 24 
siegħa. Fl-ewwel ka ż, ħu kampjun ta’ ħama attivat mit-tank ta’ tirwi ħ ta’ 
impjant bijolo ġiku mħaddem b’mod effi ċjenti ta’ trattament ta’ ilma mormi, 
jew ta’ impjant laboratorju ta’ trattament, li jir ċievi b’mod predominanti 
dranaġġ domestiku. Jekk kondizzjonijiet ta’ nitrifikazzjoni jkollhom ikunu 
ssimulati, ħu ħama minn impjant ta’ nitrifikazzjoni ta’ trattament ta’ ilma 
mormi. Iddetermina l-kon ċentrazzjoni ta’ solidi sospi żi u, jekk ikun me ħtieġ, 
ikkonċentra l-ħama billi t ħallieh joqg ħod biex il-volum mi żjud mas-sistema 
ta’ ttestjar ikun minimu. Żgura li kon ċentrazzjoni tal-bidu ta’ materja niexfa 
tkun madwar 2,5 g/l.  
35. Fit-tieni ka ż, uża 2 ml/l sa 10 ml/l ta’ effluwent minn impjant bijolo ġiku 
domestiku ta’ trattament ta’ ilma mormi b ħala tilqima. Biex tie ħu kemm 
jista’ jkun ħafna speċijiet differenti ta’ batterja, jista’ jkun ta’ g ħajnuna jekk 
iżżid tilqimiet minn diversi sorsi o ħra, pereżempju ilma tal-wi ċċ. F’dan 
il-każ, il-ħama attivat g ħandu jiżviluppa u jikber fis-sistema ta’ ttestjar.  
Dożaġġ ta’ midjum organiku  
36. Żgura li kontenituri ta’ influwenti u effluwenti u tubi minn re ċipjenti ta’ 
influwenti u g ħal reċipjenti ta’ effluwenti jitnaddfu sewwa biex tne ħħi 
tkabbir mikrobiku fil-bidu u matul it-test kollu. I ġbor flimkien is-sistemi 
ta’ ttestjar f’kamra fejn it-temperatura tkun ikkontrollata (normalment 
fil-firxa ta’ 20-25 C) jew u ża unitajiet ta’ ttestjar imdawrin bl-ilma. Ħejji 
volum suffi ċjenti tal-midjum organiku me ħtieġ (paragrafi 27-29). Fil-bidu 
imla r-reċipjent ta’ tirwi ħ u s-separatur bil-midjum organiku u żid it-tilqima 
(paragrafi 34, 35). Ibda t-tirwi ħ b’mod li l- ħama jinżamm f’sospensjoni u fi 
stat aerobiku u ibda ddo ża l-influwent u rri ċikla l-ħama qieg ħed. Iddoża 
l-midjum organiku barra mir-re ċipjenti ta’ ħżin għal ġor-reċipjenti ta’ 
tirwiħ (paragrafi 20, 21) tat-test u kkontrolla unitajiet u i ġbor l-effluwenti 
rispettivi f’re ċipjenti simili ta’ ħżin. Biex i ġġib il-ħin normali ta’ ritenzjoni 
idrawlika ta’ 6h, il-midjum organiku ji ġi ppumpjat f’0,5 l/h. Biex 
tikkonferma din ir-rata, kejjel l-ammont ta’ kuljum tal-midjum organiku ddożat billi tie ħu nota tat-tnaqqis fil-volumi tal-midjum fil-kontenituri 
tal-ħżin. Modalitajiet o ħra ta’ dożar ikunu me ħtieġa biex ikunu ddeterminati 
l-effetti ta’ meta jkun hemm re ħi kull tant u tag
ħbija “ħasda” tal-kimi ċi. 
37. Jekk il-midjum organiku jit ħejja biex jintu ża għal perjodu itwal minn jum 
wieħed (1), ikunu me ħtieġa tkessiħ f’madwar 4 °C jew metodi o ħra adatti 
ta’ konservazzjoni biex ma jit ħalliex ikun hemm tkabbir mikrobiku u bijode ­
gradazzjoni ‘l barra mill-unitàjiet ta’ ttestjar (paragrafu 29). Jekk jintu ża 
dranaġġ sintetiku, ikun possibbli tit ħejja, u tin ħażen f’madwar 4 °C, 
soluzzjoni kon ċentrata ta’ stokkijiet (e ż. 10 darbiet il-kon ċentrazzjoni 
normali, paragrafu 28). Din is-soluzzjoni ta’ stokkijiet tista’ tit ħallat 
sewwa mal-volum adatt ta’ ilma tal-vit qabel ma tintu ża; alternattivament, 
tista’ tkun ippumpjata direttament waqt li l-ammont adatt ta’ ilma tal-vit 
ikun ippumpjat separatament.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dożaġġ tal-kimika g ħall-ittestjar  
38. Żid volum adatt tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet tal-kimika g ħall-ittestjar 
(paragrafu 31) fir-re ċipjent ta’ ħżin tal-influwent jew iddo żah direttament 
b’pompa separata g ħal ġor-reċipjent ta’ tirwi ħ. Il-konċentrazzjoni medja 
normali tal-ittestjar fl-influwent g ħandha tkun bejn10 mg/l u 20 mg/l 
DOC, bil-kon ċentrazzjoni ta’ fuq ta’ mhux iktar minn 50 mg/l. Jekk 
is-solubilità fl-ilma tal-kimika g ħall-ittestjar tkun baxxa jew jekk aktarx 
iseħħu effetti tossi ċi, naqqas il-kon ċentrazzjoni g ħal 5 mg/l DOC jew anki 
anqas, iżda biss jekk ikun hemm u jitwettaq metodu analitiku spe ċifiku adatt 
(jistgħu jiżdiedu l-kimi ċi għall-ittestjar imxerrdin li ftit jin ħallu fl-ilma billi 
jintużaw tekniki spe ċjali ta’ do żar, ara l-Appendi ċi 5). 
39. Ibda żid il-kimika g ħall-ittestjar wara perjodu li fih is-sistema tkun saret 
stabbli u tkun qed tne ħħi DOC tal-midjum organiku b’mod effi ċjenti 
(madwar 80 %). Huwa importanti li tara li l-unitajiet kollha jkunu qed jaħdmu l-istess b’mod effi ċjenti qabel ma ti żdied kimika g ħall-ittestjar; 
jekk ma jkunux, is-soltu jkun ta’ g ħajnuna li ħama jitħallat ma’ ie ħor u li 
jerġgħu jitqassmu volumi ndaqs lil unitajiet individwali. Meta tintu ża tilqima 
ta’ (madwar) 2,5 g/l (pi ż fin-niexef) ta’ ħama attivat, il-kimika g ħall-ittestjar 
tista’ tiżdied mill-bidu tat-test min ħabba li żieda diretta ta’ aktar ammonti 
mill-bidu g ħandha l-vanta ġġ li l-ħama attivat ikun jista’ jadatta a ħjar għall- 
kimika g ħall-ittestjar. Ikun x’ikun il-mod li bih il-kimika g ħall-ittestjar 
tiżdied, huwa rrakkomandat li r-rata rilevanti ta’ fluss u/jew il-volumi 
fir-reċipjent(i) ta’ ħżin jitkejlu f’intervalli regolari.
 
Maniġġar ta’ ħama attivat  
40. Il-kon ċentrazzjoni ta’ solidi ta’ ħama attivat normalment issir stabbli bejn 
limiti matul it-test, b’mod indipendenti mit-tilqima u żata, fil-firxa ta’ 1 sa 3 
g/l (piż fin-niexef) skont il-kwalità u l-kon ċentrazzjoni tal-midjum organiku, 
kondizzjonijiet operazzjonali, in-natura tal-mikroorgani żmi li jkun hemm u 
l-influwenza tal-kimika g ħall-ittestjar.  
41. Iddetermina s-solidi sospi żi fir-reċipjenti ta’ tirwi ħ għall-anqas darba 
fil-ġimgħa u warrab ħama żejjed biex i żżomm il-kon ċentrazzjoni f’1 g/l sa 
3 g/l (piż fin-niexef), jew ikkontrolla kemm, b ħala medja, ikollha żmien 
il-ħama, f’valur kostanti, is-soltu fil-firxa ta’ 6 ijiem sa 10 ijiem. Jekk, 
pereżempju, jing ħażel żmien ta’ retenzjoni ta’ ħama ta’ 8 ijiem, ne ħħi 
kuljum 1/8 tal-volum tal- ħama attivat fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ u warrbu. 
Agħmel dan kuljum jew, a ħjar, permezz ta’ pompa ta ħdem awtomatikament 
minn ħin għal ieħor. Iż-żamma tal-kon ċentrazzjoni ta’ solidi sospi żi b’mod 
kostanti, jew f’limiti stretti, ma żżommx żmien kostanti ta’ retenzjoni ta’ 
ħama (SRT), li huwa l-varjabbli operazzjonali li jiddetermina l-valur 
tal-konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent.  
42. Matul it-test kollu, ne ħħi, mill-anqas kuljum, kull ħama li je ħel mal-ħitan 
tar-reċipjent ta’ tirwi ħ u mas-separatur biex jer ġa’ jkun sospi ż. Ikkontrolla u 
naddaf regolarment it-tubi kollha u s-sistema tat-tubi biex ma t ħallix tikber 
bijorita. Irri ċikla l-ħama li jkun qag ħad mis-separatur g ħal ġor-reċipjent ta’ 
tirwiħ, preferibbilment b’ippumpjar kull tant ħin. Ebda ri ċiklar ma jsir 
fis-sistema ta’ borma poru ża iżda żgura li borom ta’ ġewwa jidda ħħlu 
nodfa qabel ma l-volum fir-re ċipjent jog ħla b’mod sinifikanti (paragrafu 21).  
43. Jista’ jkun hemm ħama li ma joqg ħodx tajjeb u telf ta’ ħama fl-unitajiet ta’ 
impjanti Husmann. Dan jista’ jissewwa billi ssir azzjoni wa ħda jew aktar, 
elenkati hawn ta ħt, fl-istess waqt tat-test u tal-unitajiet ta’ kontroll:  
— ħama friska jew flocculi (pere żempju 2 ml/re ċipjent ta’ 50 g/l FeCl  3 ) 
jistgħu jiżdiedu f’intervalli regolari, e ż. kull ġimgħa, iżda aċċerta li ma 
jseħħu ebda reazzjoni jew pre ċipitazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar ma’ 
FeCl  3 ; ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— il-pompa ta’ estrazzjoni bl-arja tista’ ti ġi sostitwita b’pompa peristaltika, 
biex b’hekk ikun jista’ jkun hemm fluss ta’ ċirkulazzjoni mill- ġdid ta’ 
ħama li jkun kwa żi daqs il-fluss tal-influwent li jkollu jintu ża u li 
jippermetti żvilupp ta’ żona anaerobika fil- ħama qieg ħed (il-ġeometrija 
tal-pompa ta’ estrazzjoni bl-arja tillimita r-rata minima ta’ fluss ta’ ħama 
li jkun mar lura g ħal madwar 12-il darba ta’ dik tal-influwent);  
— ħama jista’ ji ġi ppumpjat minn ħin għal ieħor mis-separatur g ħal ġor- 
reċipjent ta’ tirwi ħ (eż. kull 5 min. kull 2,5 h biex ikun irri ċiklat 1 
l/h to 1,5 l/h;  
— jista’ jintu ża aġent mhux tossiku, kontra r-rag ħwa f’konċentrazzjoni 
minima biex ma jit ħalliex ikun hemm telf min ħabba r-rag ħwa (eż. 
żejt tas-silikon);  
— l-arja tista’ ti ġi mgħoddija mill- ħama fis-separatur bi skossi qosra, 
mfaqqa’ (e ż. 10 sek. kull sieg ħa); 
— il-midjum organiku jista’ ji ġi ddoċat f’intervalli fir-re ċipjent ta’ 
tirwiħ (eż. 3 minuti sa 10 minuti kull sieg ħa). 
Teħid ta’ kampjuni u anali żi 
44. F’intervalli regolari kejjel il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu maħlul, 
it-temperatura u l-valur pH tal- ħama attivat fir-re ċipjenti ta’ tirwi ħ. Żgura 
li dejjem ikun hemm ossi ġnu biżżejjed (> 2 mg/l) u li t-temperatura tin żamm 
fil-firxa me ħtieġa (normalment 20 °C sa 25 °C). Żomm il-pH f’7,5 ± 0,5 
billi tiddo ża ammonti żgħar ta’ bażi inorganiku jew a ċidu fir-re ċipjent ta’ 
tirwiħ jew fl-influwent, jew billi żżid il-kapa ċità ta’ lqug ħ tal-midjum 
organiku (ara l-paragrafu 27). Meta jkun hemm nitrifikazzjoni jkun 
prodott l-a ċidu, bl-ossidazzjoni ta’ 1 mg N tipprodu ċi l-ekwivalenti ta’ 
madwar 7 mg CO  3 . Kemm il-kejlijiet ikun ta’ spiss jiddependi 
mill-parametru li jkollu jitkejjel u mill-istabbiltà tas-sistema, u jista’ jvarja 
bejn kejl kuljum u kejl kull ġimgħa. 
45. Kejjel DOC jew COD fl-influwenti g ħar-reċipjenti ta’ kontroll u ttestjar. 
Kejjel il-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fl-influwent tat-test 
b’analiżi speċifika jew stmaha mill-kon ċentrazzjoni fis-soluzzjoni ta’ stok ­
kijiet (paragrafu 31), mill-volum u żat u mill-ammont ta’ drana ġġ iddożat 
għal ġol-unità ta’ ttestjar. Huwa rrakkomandat li l-kon ċentrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar tkun ikkalkulata biex titnaqqas il-varjabbiltà tad-dejta 
tal-konċentrazzjoni.  
46. Ħu kampjuni adatti mill-effluwent mi ġbur (eż. komposti ta’ 24 h) u ffiltra 
minn ġo membrana b’pori ta’ daqs ta’ 0,45 μm jew ag ħmel ċentrifugu 
minnhom f’madwar 40,000 m/s  2 għal madwar 15-il min. Centrifugu 
għandu jsir jekk il-filtrazzjoni tkun diffi ċli. Iddetermina DOC jew COD 
mill-anqas b’mod duplikat biex tkejjel il-bijodegradazzjoni finali u, jekk tkun me ħtieġa, il-bijodegradazzjoni primarja b’anali żi b’mod spe ċifiku 
għall-kimika g ħall-ittestjar.
 
47. L-użu ta’ COD jista’ j ġib miegħu problemi analiti ċi f’konċentrazzjonijiet 
baxxi u, g ħalhekk, huwa rrakkomandat biss jekk tintu ża konċentrazzjoni 
tat-test li tkun g ħolja biżżejjed (madwar 30 mg/l). Barra dan, g ħall-kimiċi 
li jassorbu ħafna, huwa rrakkomandat li l-ammont ta’ kimika assorbita 
fil-ħama titkejjel billi tintu ża teknika analitika b’mod spe ċifiku għall- 
kimika għall-ittestjar.  
48. Il-frekwenza ta’ te ħid ta’ kampjuni tiddependi minn kemm ikun mistenni 
jdum it-test. Frekwenza rakkomandata tkun ta’ tliet darbiet fil- ġimgħa. Malli 
l-unitajiet ikunu qed ja ħdmu b’mod effi ċjenti, ħalli minn ġimgħa sa mhux 
aktar minn 6 ġimgħat wara li l-kimika g ħall-ittestjar tkun idda ħħlet, biex din 
tadatta u til ħaq stat regolari. Preferibbilment ikseb mill-anqas 15-il valur 
validu fil-fa żi ta’ livell kostanti (paragrafu 59), li normalment iddum 3 
ġimgħat, għall-evalwazzjoni tar-ri żultat tat-test. It-test jista’ jitlesta jekk 
jintlaħaq grad suffi ċjenti ta’ eliminazzjoni (e ż. > 90 %) u jkunu disponibbli 
dawn il-15-il valur, li jirrappre żentaw anali żi magħmula kull jum tal- ġimgħa 
tul 3 ġimgħat. Normalment taqbi żx durata ta’ test ta’ aktar minn 12-il 
ġimgħa wara li tkun żdiedet il-kimika g ħall-ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Jekk il- ħama jinbidel f’nitrat jew f’nitritu u jekk l-effetti tal-kimika g ħall- 
ittestjar fuq in-nitrifikazzjoni jkollhom ikunu studjati, analizza kampjuni 
mill-effluwent tat-unitajiet ta’ ttestjar u ta’ kontroll mill-anqas darba fil-ġimgħa għall-ammonju u/jew nitrit flimkien ma’ nitrat.
 
50. L-anali żi kollha g ħandha ssir malajr kemm jista’ jkun, l-aktar 
id-determinazzjonijiet tan-nitro ġenu. Jekk anali żi jkollha ti ġi posposta, 
aħżen il-kampjuni f’madwar 4 °C fid-dlam fi fliexken mimlijin u 
magħluqin issikkati. Jekk kampjuni jkollhom jin ħażnu għal aktar minn 48 
siegħa, ippreservahom fil-fri ża, b’aċidifikazzjoni (e ż. 10 ml/l ta’ soluzzjoni 
ta’ 400 g/l ta’ a ċidu sulfuriku) jew bi ż-żieda ta’ kimika tossika adatta (e ż. 20 
ml/l ta’ soluzzjoni ta’ 10 g/l ta’ klorur tal-merkurju (II)). Żgura li t-teknika 
ta’ preservazzjoni ma tinfluwenzax ri żultati ta’ anali żi. 
Akkoppjar ta’ unitajiet ta’ ttestjar  
51. Jekk ikollu jintu ża akkoppjar (Appendi ċi 3), ibdel kuljum l-istess ammont 
ta’ ħama attivat (150 ml sa 1 500 ml g ħal reċipjenti ta’ tirwi ħ li jkun fihom 
3 litri ta’ likwidu) bejn ir-re ċipjenti ta’ tirwi ħ tal-unità ta’ ttestjar u l-unità ta’ 
kontroll tag ħha. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar tassorbixxi ħafna mill- ħama, 
ibdel biss is-supernatant tas-separaturi. Fi ż-żewġ każijiet uża fattur ta’ 
korrezzjoni biex tikkalkula r-ri żultat tat-test (paragrafu 55).  
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
52. Ikkalkula l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD tal-kimika 
għall-ittestjar g ħal kull valutazzjoni li jkun itte ħdilha l-ħin, billi tu ża 
l-ekwazzjoni:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
fejn 
D t = % ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD f’ ħin t 
C s = DOC jew COD fl-influwent min ħabba l-kimika g ħall-ittestjar, prefer ­
ibbilment stmat mis-soluzzjoni ta’ stokkijiet (mg/l)  
E = valur imkejjel ta’ DOC jew COD fl-effluwent tat-test f’ ħin t (mg/l)  
E o = valur imkejjel ta’ DOC jew COD fl-effluwent tal-kontroll f’ ħin t 
(mg/l)  
53. Il-grad ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD tal-midjum organiku fl-unità ta’ 
kontroll ikun ta’ informazzjoni utli biex tkun ivvalutata l-attività bijodegrad ­
attiva tal- ħama attivat matul it-test. Ikkalkula l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni 
bl-ekwazzjoni:  
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
fejn 
D B = % ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD tal-midjum organiku fl-unità 
ta’ kontroll f’ ħin t 
C M = DOC jew COD tal-midjum organiku fl-influwent tal-kontroll (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
B’mod fakultattiv, ikkalkula l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni DOC jew COD 
minħabba l-midjum organiku flimkien ma’ kimika g ħall-ittestjar fl-unità ta’ 
ttestjar bl-ekwazzjoni:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
fejn 
D T = % ta’ eliminazzjoni ta’ influwent totali tat-test DOC jew COD  
C T = DOC jew COD ta’ influwent totali tat-test jew ikkalkulat 
mis-soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (mg/l)  
54. Ikkalkula t-tne ħħija tal-kimika g ħall-ittestjar jekk din titkejjel b’metodu 
analitiku spe ċifiku f’valutazzjoni ta’ kull darba bl-ekwazzjoni:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
fejn 
D ST = % ta’ eliminazzjoni primarja ta’ kimika g ħall-ittestjar f’ ħin t 
S i = konċentrazzjoni mkejla jew stmata tal-kimika g ħall-ittestjar 
fl-influwent tat-test (mg/l)  
S e = konċentrazzjoni mkejla tal-kimika g ħall-ittestjar f’effluwent ta’ test 
f’ħin t (mg/l)  
55. Jekk tkun ntu żat il-modalità ta’ akkoppjar, ikkumpensa d-dilwizzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ bl-iskambju ta’ ħama billi 
tuża fattur ta’ korrezzjoni (ara l-Appendi ċi 3). Jekk ikunu ġew użati ħin 
medju ta’ retenzjoni idrawlika ta’ 6 sig ħat u skambju ta’ nofs il-volum 
tal-ħama attivat fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ, il-valuri determinati ta’ eliminazzjoni 
kuljum (D  t , paragrafu 52) ikollhom ikunu kkore ġuti biex jinkiseb il-grad 
veru ta’ eliminazzjoni, Dtc, tal-kimika g ħall-ittestjar bl-ekwazzjoni:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Espressjoni ta’ ri żultati tat-testijiet  
56. Immarka l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni D  t (jew D  tc ) u D  st , jekk ikunu 
disponibbli, kontra l- ħin (ara l-Appendi ċi 2). Mill-forma tal-kurva ta’ elimi ­
nazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar (per se jew b ħala DOC) jistg ħu jinstiltu xi 
konklużjonijiet dwar il-pro ċess ta’ tne ħħija. 
Sorbiment  
57. Jekk tkun osservata eliminazzjoni g ħolja ta’ DOC tal-kimika g ħall-ittestjar 
mill-bidu tat-test, il-kimika g ħall-ittestjar tkun probabbilment eliminata 
b’sorbiment fis-solidi ta’ ħama attivat. Ikun possibbli li dan ikun ippruvat 
billi tkun iddeterminata l-kimika g ħall-ittestjar assorbita b’anali żi speċifika. 
Mhux is-soltu li l-eliminazzjoni ta’ DOC tal-kimi ċi li jistgħu jkunu assorbiti 
tibqa’ għolja matul it-test kollu; normalment ikun hemm grad g ħoli ta’ 
tneħħija fil-bidu li bil-mod il-mod jin żel għal valur ta’ ekwilibriju. Jekk, 
iżda, il-kimika g ħall-ittestjar li tista’ tkun assorbita, setg ħet ikkawżat akkli­
matazzjoni tal-massa mikrobika b’xi mod jew ie ħor, l-eliminazzjoni ta’ DOC 
tal-kimika g ħall-ittestjar wara ti żdied u til ħaq valur livell kostanti g ħoli. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Fażi ta’ intervalli  
58. Bħal f’testijiet stati ċi, ta’ tgħarbil, ħafna kimi ċi għall-ittestjar je ħtieġu fażi ta’ 
intervalli qabel ma sse ħħ bijodegradazzjoni s ħiħa. Fil-fażi ta’ intervalli, 
isseħħ akklimatazzjoni jew adattament tal-batterja li tkun qed tiddegrada 
mingħajr ma kwa żi titneħħa l-kimika g ħall-ittestjar; mbag ħad iseħħ 
it-tkabbir tal-bidu ta’ dawn il-batterji. Din il-fa żi tintemm u l-fa żi ta’ degra ­
dazzjoni titqies li tkun bdiet meta jitne ħħa madwar 10 % tal-ammont 
tal-bidu ta’ kimika g ħall-ittestjar (wara li jkun tqies is-sorbiment, jekk 
iseħħ). Il-fażi ta’ intervalli sikwit tkun varjabbli ħafna u bilkemm ripro ­
duċibbli.  
Fażi ta’ livell kostanti  
59. Il-fażi ta’ livell kostanti ta’ kurva ta’ eliminazzjoni f’test kontinwu hija 
ddefinita b ħala dik il-fa żi li fiha sse ħħ id-degradazzjoni massima. Il-fa żi 
ta’ livell kostanti g ħandha tkun mill-anqas ta’ 3 ġimgħat u jkollha 
madwar 15-il valur validu mkejjel.  
Grad medju ta’ eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar  
60. Ikkalkula l-valur medju mill-valuri ta’ eliminazzjoni (D  t ) tal-kimika g ħall- 
ittestjar fil-fa żi ta’ livell kostanti. Mi ġjub għad-dritt sal-eqreb numru s ħiħ 
(1 %), dan ikun il-grad ta’ eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar. Huwa 
wkoll irrakkomandat li jkun ikkalkulat l-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % 
tal-valur medju.  
Eliminazzjoni ta’ midjum organiku  
61. Immarka l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew ta’ COD tal-midjum 
organiku fl-unità ta’ kontroll (D  B ) kontra l- ħin. Indika l-grad medju ta’ 
eliminazzjoni bl-istess mod b ħal tal-kimika g ħall-ittestjar (paragrafu 60).  
Indikazzjoni ta’ bijodegradazzjoni  
62. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar ma tassorbix b’mod sinifikanti l- ħama attivat, u 
l-kurva ta’ eliminazzjoni jkollha forma tipika ta’ kurva ta’ bijodegradazzjoni 
b’intervall, fa żijiet ta’ degradazzjoni u livell kostanti (paragrafi 58, 59), 
l-eliminazzjoni mkejla tista’ kwa żi fiċ-ċert tkun attribwita 
lill-bijodegradazzjoni. Jekk tkun se ħħet tneħħija inizjali g ħolja, it-test ta’ 
simulazzjoni ma jkunx jista’ jiddivrenzja bejn pro ċessi ta’ eliminazzjoni 
bijoloġiċi u abijoti ċi. F’każijiet bħal dawn, u f’ka żijiet oħra meta jkun 
hemm xi dubju dwar il-bijodegradazzjoni (e ż. jekk isir stripa ġġ), analizza 
l-kimiċi għall-ittestjar assorbiti jew ag ħmel testijiet stati ċi addizzjonali ta’ 
bijodegradazzjoni ibba żati fuq parametri li jindikaw b’mod ċar proċessi 
bijoloġiċi. Testijiet b ħal dawn huma l-metodi ta’ konsum ta’ ossi ġnu (il- 
Kapitolu C.4 D, E u F ta’ dan l-Anness (6)) jew test b’kejl ta’ produzzjoni ta’ diossidu tal-karbonju (il-Kapitolu C.4 C ta’ dan l-Anness (6)) jew 
il-metodu ta’ Spazju Fuq ta’ ISO (18), billi tintu ża tilqima esposta minn 
qabel mit-test ta’ simulazzjoni. Jekk kemm it-tne ħħija ta’ DOC, kif ukoll 
it-tneħħija ta’ kimika spe ċifika jkunu tkejlu, differenzi sinifikanti (tal-ewwel 
ikunu anqas minn tal-a ħħar) bejn il-per ċentwali mne ħħija jindikaw li kien 
hemm fl-effluwenti prodotti organi ċi intermedji li jistg ħu jkunu aktar diffi ċli 
li jiddegradaw milli l-kimika prin ċipali.
 
Validità ta’ ri żultati tat-testijiet  
63. Informazzjoni dwar im ġiba normali ta’ bijodegradazzjoni tat-tilqima tinkiseb 
jekk ikun iddeterminat il-grad ta’ eliminazzjoni tal-midjum organiku (paragrafu 53) fl-unità ta’ kontroll. Qis it-test b ħala validu jekk il-grad ta’ 
eliminazzjoni ta’ DOC jew ta’ COD fl-unità/unitajiet ta’ kontroll ikun > 
80 % wara ġimagħtejn u ma tkun saret ebda osservazzjoni mhux tas-soltu.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Jekk tkun intu żat kimika (ta’ referenza) bijodegradabbli fa ċilment, il-grad ta’ 
bijodegradazzjoni (D  t , paragrafu 52) g ħandu jkun > 90 %.  
65. Jekk it-test isir f’kondizzjonijiet ta’ nitrifikazzjoni, il-kon ċentrazzjoni medja 
fl-effluwenti g ħandha tkun < 1 mg/l ammonja-N u < 2 mg/l nitrit-N.  
66. Jekk dawn il-kriterji (paragrafi 63-65) ma jit ħarsux, tenni t-test billi tu ża 
tilqima minn sors differenti, ittestja kimika ta’ referenza, u e żamina 
mill-ġdid il-pro ċeduri kollha sperimentali.  
Rapport tat-test  
67. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi dan li ġej: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— dejta ta’ identifikazzjoni;  
— natura fi żika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi. 
Kondizzjonijiet tat-test:  
— tip ta’ sistema ta’ ttestjar; kull modifika g ħall-ittestjar tal-kimi ċi li ma 
jinħallux u jkunu volatili;  
— tip ta’ midjum organiku;  
— proporzjon u natura ta’ ilmijiet industrijali mormija fid-drana ġġ, jekk 
ikunu mag ħrufa;  
— tilqima, natura u sit(i) ta’ te ħid ta’ kampjuni, kon ċentrazzjoni u kull 
trattament minn qabel;  
— soluzzjoni ta’ stokkijiet tal-kimi ċi għall-ittestjar: kontenut ta’ DOC u ta’ 
TOC; kif tit ħejja, jekk ta’ sospensjoni; kon ċentrazzjoni tat-test u żata; 
raġunijiet jekk ikunu ‘l barra mill-firxa ta’ 10 - 20 mg/l DOC; metodu 
ta’ żieda; data tal-ewwel żieda; kull bidla;  
— kemm, b ħala medja, ikollha żmien il-ħama u ħin medju ta’ retenzjoni 
idrawlika; metodu ta’ rimi ta’ ħama; metodi li jeg ħlbu l-kwantitajiet, telf 
ta’ ħama, eċċ.; 
— tekniċi analitiċi użati; 
— temperatura tat-test;  
— kwalitajiet tal-kwantitajiet ta’ ħama, indi ċi ta’ volumi ta’ ħama (SVI), 
solidi sospi żi ta’ likwidu m ħallat (MLSS);  
— kull devjazzjoni minn pro ċeduri standard u kull ċirkostanza li setg ħet 
affettwat ri żultati.  
Riżultati tat-testijiet:  
— dejta mkejla kollha (DOC, COD, anali żi speċifika, pH, temperatura, 
konċentrazzjoni tal-ossi ġnu, solidi sospi żi, l-kimiċi N, jekk rilevanti;  
— il-valuri kollha kkalkolati ta’ D  t (jew D  tc ), D  B , D  St miksuba f’forma 
tabulari u l-kurvi ta’ eliminazzjoni;  
— informazzjoni dwar fa żijiet ta’ intervalli u ta’ livelli kostanti, durata ta’ 
testijiet, il-grad ta’ eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar u dak 
tal-midjum organiku fl-unità ta’ kontroll, flimkien ma’ informazzjoni dwar statistika u dikjarazzjonijiet dwar il-bijodegradabbiltà u l-validità 
tat-test;
 
— diskussjoni dwar ir-ri żultati.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LETTERATURA:  
(1) Swisher RD (1987). “Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
(2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents 
in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.  
(3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, 
Medmenham, UK.  
(4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
 
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Chapter C.4 of this Annex, Determination of ‘Ready’ Biodegradability.  
(7) Chapter C.12 of this Annex, Biodegradation - Modified SCAS Test.  
(8) Chapter C.19 of this Annex, Estimation of the Adsorption Coefficient 
(K OC ) on Soil and on Sewage Sludge Using High Performance Liquid 
Chromatography (HPLC).  
(9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 
3:157-173.  
(10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and 
conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
(11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
(12) ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biode ­
gradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge 
simulation test.  
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343.  
(15) Gerike P, Fischer WK u Holtmann W (1980). Biodegradability deter ­
minations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory 
test. Wat.Res. 14: 753-758.  
(16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
 
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91- 98 ISBN 011 751661 9.
 
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the 
analysis of inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Appendiċi 1 
Figura 1  
Tagħmir użat għall-valutazzjoni tal-bijodegradabbiltà  
Unità Husmann
  
A. Reċipjent ta’ ħżin 
B. Pompa tad-do żar 
C. Kompartiment ta’ tirwi ħ (3 l kapa ċità) 
D. Reċipjent ta’ sediment  E. Pompa ta’ estrazzjoni bl-arja  
F. Reċipjent ta’ ġbir 
G. Rewwie ħ 
H. Miter ta’ fluss ta’ arja  
Figura 2  
Tagħmir użat għall-valutazzjoni tal-bijodegradabbiltà  
Borma poru ża
 
A. Reċipjent ta’ ħżin 
B. Pompa tad-do żar 
C. Borma poru ża ta’ tirwi ħ 
D. Reċipjent ta’ barra impermeabbli  E. Reċipjent ta’ ġbir 
F. Diffu żur 
G. Miter ta’ fluss ta’ arja  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figura 3  
Dettalji ta’ re ċipjent ta’ tirwi ħ ta’ borma poru ża ta’ 3 litri
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Appendiċi 2 
Eżempju ta’ kurva ta’ eliminazzjoni
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Appendiċi 3 
[INFORMATTIV]  
AKKOPPJAR TAL-UNITAJIET TA’ TTESTJAR  
Għall-tentattiv biex il-mases mikrobi ċi jkunu ndaqs f’ ħama f’unità ta’ ttestjar, li 
tirċievi drana ġġ flimkien ma’ kimika g ħall-ittestjar, u f’unità ta’ kontroll, li 
tirċievi drana ġġ biss, kien introdott skambju ta’ ħama kuljum (1). Il-pro ċedura 
ssejħet akkoppjar u l-metodu huwa mag ħruf bħala unitajiet akkoppjati. 
L-akkoppjar g ħall-bidu kien isir billi kienu jintu żaw unitajiet Husmann ta’ 
ħama attivat, i żda kien isir ukoll b’unitajiet ta’ Borma Poru ża (2)(3). Ma kienu 
nstabu ebda differenzi sinifikanti f’ri żultati ta’ bejn unitajiet mhux akkoppjati u 
akkoppjati, kemm jekk ta’ Husmann jew ta’ Borma Poru ża, għalhekk m’hemm 
ebda vanta ġġ f’ħela’ ta’ żmien u ener ġija meħtieġa biex unitajiet ikunu 
akkoppjati.  
Skambju ta’ ħama jista’ jag ħti dehra ta’ tne ħħija tassew konsiderevoli, min ħabba 
li xi ftit mil-kimika g ħall-ittestjar ti ġi ttrasferita u l-kon ċentrazzjonijiet ta’ kimika 
għall-ittestjar fl-effluwenti ta’ test u kontroll isiru aktar kwa żi ndaqs. G ħalhekk 
ikollhom jintu żaw fatturi korrettivi, li jkunu jiddependu mill-frazzjoni skambjata 
u mill-ħin medju ta’ retenzjoni idrawlika. Kienu ppubblikati aktar dettalji 
tal-kalkulazzjoni (1).  
Ikkalkula l-grad ta’ eliminazzjoni kkore ġuta ta’ DOC jew COD billi tu ża 
l-formula ġenerali:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
fejn 
D tc = % ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD ikkore ġut 
D t = % ta’ eliminazzjoni ta’ DOC jew COD determinat  
a = frazzjoni ta’ skambju tal-volum tal-unitajiet ta’ ħama attivat  
r = ħin medju ta’ retenzjoni idrawlika (h)  
Jekk, pere żempju, nofs il-volum tat-tank ta’ tirwi ħ ikun skambjat (a = 0,5) u l- ħin 
medju ta’ retenzjoni idrawlika jkun 6 h, il-formula ta’ korrezzjoni tkuna:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LETTERATURA:  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.  
(2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD 
Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for 
Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, 
Stevenage, UK.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Appendiċi 4 
EVALWAZZJONI TA’ INIBIZZJONI TAL- ĦAMA ATTIVAT  
Proċess b’kimi ċi għall-ittestjar  
1. Kimika (jew ilma mormi) tista’ ma tkunx iddegradata jew imne ħħija fit-test 
ta’ simulazzjoni u jista’ wkoll ikollha effett inibitorju fuq il-mikroorgani żmi 
tal-ħama. Kimi ċi oħra jkunu ddegradati bijolo ġikament f’kon ċentrazzjonijiet 
baxxi iżda jkunu inibitorji f’kon ċentrazzjoni og ħla (ormesi). Effetti inibitorji 
setgħu kienu ġew żvelati fi stadju aktar bikri jew jistg ħu jkunu ddeterminati 
bl-applikazzjoni ta’ test tat-tossi ċità, bl-użu ta’ tilqima simili jew identika 
għal dik użata fit-test ta’ simulazzjoni (1). Metodi b ħal dawn jinibixxu 
konsum ta’ ossi ġnu (il-Kapitolu C.11 ta’ dan l-Anness (2) u ISO 8192(3)) 
jew inibizzjoni g ħal tkabbir ta’ organi żmi tal-ħama (ISO 15522 (4)).  
2. Fit-test ta’ simulazzjoni kull inibizzjoni tkun tidher mid-differenza ta’ 
karbonju organiku ma ħlul (DOC) jew mid-domanda kimika ta’ 
ossiġnu (COD) bejn l-effluwent mir-re ċipjent tat-test u dak mill-kontroll li 
jkun akbar minn DOC mi żjud bħala kimika g ħall-ittestjar. Espress mod 
ieħor, il-per ċentwali ta’ tne ħħija ta’ DOC (u domanda biokimika ta’ 
ossiġnu (BOD), domanda kimika ta’ ossi ġnu (COD), u/jew NH  + 4 ) 
tal-midjum organiku dwar trattament g ħandu jitnaqqas meta jkun hemm 
il-kimika g ħall-ittestjar. Jekk dan ise ħħ, it-test g ħandu jittenna billi 
titnaqqas il-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar sakemm jintla ħaq 
livell li fih ma sse ħħ ebda inibizzjoni u forsi titnaqqas aktar 
il-konċentrazzjoni sakemm il-kimika g ħall-ittestjar tkun iddegradata bijolo ġi­
kament. I żda jekk il-kimika g ħall-ittestjar (jew ilma mormi) ikollhom effetti 
ħżiena fuq il-pro ċess fil-kon ċentrazzjonijiet kollha ttestjati, l-indikazzjonijiet 
ikunu li l-kimika tkun diffi ċli, jekk mhux impossibbli, li tkun ttrattata bijo ­
loġikment, iżda jista’ jkun siewi li t-test jittenna b’ ħama attivat minn sors 
differenti u/jew il- ħama jkun so ġġett għal akklimatazzjoni gradwali.  
3. Bil-maqlub, jekk il-kimika g ħall-ittestjar tkun eliminata bijolo ġikament 
mal-ewwel attentat fit-test ta’ simulazzjoni, il-kon ċentrazzjoni tag ħha 
għandha ti żdied jekk ikun me ħtieġ li jkun mag ħruf jekk il-kimika 
jkollhiex tkun inibitorja.  
4. Wieħed għandu jiftakar meta jipprova jiddetermina l-gradi ta’ inibizzjoni li 
l-massa ta’ ħama attivat tista’ tinbidel, biex ma ż-żmien il-mikroorgani żmi 
jkunu jistg ħu jiżviluppaw tolleranza g ħal kimika inibitorja.  
5. Kalkulazzjoni ta’ grad ta’ inibizzjoni:  
Il-perċentwali globali ta’ tne ħħija ta’ R  o , ta’ BOD, DOC, COD, e ċċ., għall- 
unitajiet ta’ test u kontroll jista’ jkun ikkalkulat minn:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
fejn: 
I = kon ċentrazzjoni ta’ influwenti ta’ BOD, DOC, COD, e ċċ, għal 
reċipjenti ta’ ittestjar u kontroll (mg/l)  
E = kon ċentrazzjonijiet ta’ effluwenti rispettivi (mg/l).  
I u E għandhom ikunu kkore ġuti għal DOC min ħabba l-kimika g ħall- 
ittestjar fl-unitajiet ta’ test; mod ie ħor il-kalkulazzjonijiet ta’ per ċentwali 
ta’ inibizzjoni ma jkunux korretti.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Il-grad ta’ inibizzjoni kkaw żat meta jkun hemm il-kimika g ħall-ittestjar jista’ 
jiġi kkalkulat minn:  
% inibizzjoni ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
fejn: 
R c = perċentwali ta’ tne ħħija fir-reċipjenti ta’ kontroll  
R t = perċentwali ta’ tne ħħija fir-reċipjenti tal-ittestjar  
LETTERATURA:  
(1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Il-Kapitolu C.11 ta’ dan l-Anness, Bijodegradazzjoni - Test ta’ Inibizzjoni ta’ 
Respirazzjoni ta’ Ħama Attivat.  
(3) ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Appendiċi 5 
Kimiċi li ftit jin ħallu fl-ilma - kimi ċi volatili  
Kimiċi li ftit jin ħallu fl-ilma  
Ftit rapporti jidher li kienu ppubblikati dwar kimi ċi li ftit jin ħallu fl-ilma jew li 
ma jinħallux biex jitqieg ħdu għal testijiet li jissimulaw trattament ta’ ilma mormi 
(1)(2)(3).  
M’hemmx metodu wie ħed ta’ tixrid tal-kimika g ħall-ittestjar li huwa applikabbli 
għas-kimiċi kollha li ma jin ħallux. Tnejn mill-erba’ tipi ta’ metodu deskritti f’ISO 
10634 (4) jidhru li huma adatti biex isir attentat g ħal tixrid ta’ kimi ċi għal 
ittestjar ta’ simulazzjoni; huma l-u żu ta’ aġenti emulsjonanti u/jew ta’ ener ġija 
ultrasonika. G ħandha tkun iffissata l-istabbiltà tul mill-anqas perjodi ta’ 24 sieg ħa 
tat-tixrid li jirri żulta. Tixridiet stabbilizzati kif jixraq, mqieg ħda f’riżerva li 
titħawwad b’mod kostanti (paragrafu 38), ikunu mbag ħad iddożati mat-tank ta’ 
tirwiħ b’mod separat mid-drana ġġ domestiku (jew sintetiku).  
Jekk it-tixrid ikun stabbli, st ħarreġ kif il-kimika g ħall-ittestjar tista’ tkun iddeter ­
minata fil-forma mxerrda. Aktarx li DOC ma jkunx adatt, g ħalhekk ikollu jkun 
stabbilit metodu analitiku spe ċifiku għall-kimika g ħall-ittestjar li jkun jista’ ji ġi 
applikat g ħal effluwenti, g ħal solidi ta’ effluwenti u g ħal ħama attivat. X’ji ġri 
mil-kimika g ħall-ittestjar fis-simulazzjoni tal-pro ċess ta’ ħama attivat imbag ħad 
ikun iddeterminat f’fa żijiet likwidi u solidi. B’hekk ikun stabbilit “bilan ċ ta’ 
massa” biex ikun de ċiż jekk il-kimika g ħall-ittestjar kinitx iddegradata bijolo ġi­
kament. I żda dan jindika biss bijodegradazzjoni primarja. Il-wiri ta’ bijodegra ­
dazzjoni finali g ħandu jkun attentat bl-applikazzjoni ta’ test respirometriku g ħall- 
bijodegradabbiltà fa ċli (il-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness (5) C, F jew D) billi 
jintuża ħama ta’ tilqima espost g ħall-kimika g ħall-ittestjar fit-test ta’ simulazzjoni.  
Kimiċi volatili  
L-applikazzjoni ta’ simulazzjonijiet ta’ trattament ta’ ilma mormi g ħal kimiċi 
volatili hija kemm dibattibbli kif ukoll problematika. B ħal f’kimi ċi li ftit 
jinħallu fl-ilma, jidher li kienu ftit ħafna r-rapporti li kienu ppubblikati li 
jiddeskrivu testijiet ta’ simulazzjoni bl-u żu ta’ kimi ċi volatili. Ikun adattat tip 
konvenzjonali ta’ apparat li j ħallat kollox billi jissi ġilla t-tankijiet ta’ tirwi ħ u 
sediment, li jkejjel u jikkontrolla l-fluss ta’ arja billi jintu żaw miters ta’ flussi u 
billi l-gass li jo ħroġ jgħaddi minn sifuni biex tin ġabar materja organika volatili. 
F’xi każijiet tintu ża pompa li to ħloq vakwu biex ti ġbed il-gass li jo ħroġ minn 
sifun “kiesa ħ”, jew sifun ta’ tindif li jkun fih Tenax u ġell tas-silika g ħal analiżi 
kromatografika bil-gass. Il-kimika g ħall-ittestjar li jkun hemm fis-sifun tista’ tkun 
iddeterminata b’mod analitiku.  
It-test isir f’ żewġ partijiet. L-unitajiet l-ewwel jit ħaddmu ming ħajr ħama iżda 
bl-ilma sintetiku mormi flimkien ma’ kimika g ħall-ittestjar li tkun ippumpjata 
għal ġot-tank ta’ tirwi ħ. Jinġabru u jkunu analizzati kampjuni ta’ influwent, 
effluwent u gass rilaxxjat g ħall-kimika g ħall-ittestjar g ħal ftit jiem. Mid-dejta 
miġbura jista’ jkun ikkalkulat il-per ċentwali (R  vs ) tal-kimika g ħall-ittestjar 
imneżża’ mis-sistema.  
Mbagħad it-test bijolo ġiku normali (bil- ħama) isir f’kondizzjonijiet operazzjonali 
identiċi għal dawk fl-istudju ta’ stripa ġġ. Jitkejlu wkoll DOC u COD biex ikun 
ivverifikat li l-unitajiet ikunu qed ja ħdmu b’mod effi ċjenti. Kull tant żmien issir 
analiżi biex tkun iddeterminata l-kimika g ħall-ittestjar fl-influwent, effluwent u 
gass li jo ħroġ fl-ewwel parti tat-test; wara akklimatazzjoni ssir anali żi aktar ta’ 
spiss. Barra dan, mid-dejta fl-istat regolari, jistg ħu jkunu kkalkulati l-per ċentwali 
ta’ tneħħija tal-kimika g ħall-ittestjar mill-fa żi likwida bil-pro ċessi kollha (R  T ) 
(fiżiċi u bijolo ġiċi), kif ukoll il-proporzjon (R  V ) mneżża’ mis-sistema.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Kalkulazzjoni:  
(a) Fit-test mhux bijolo ġiku, il-per ċentwali (R  VP ) tal-materjal tat-test imne żża’ 
mis-sistema jista’ jkun ikkalkulat minn:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
fejn 
R VP = tneħħija ta’ kimika g ħall-ittestjar bil-volatilizzazzjoni (%),  
S VP = kimika g ħall-ittestjar mi ġbura f’sifun expressa b ħala konċentrazzjoni 
ekwivalenti f’fa żi likwida (mg/l),  
S IP = konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar f’influwent (mg/l).  
(b) Fit-test bijolo ġiku, il-per ċentwali (R  V ) tal-materjal tat-test mne żża’ 
mis-sistema jista’ jkun ikkalkulat minn:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
fejn 
R V = tneħħija ta’ kimika g ħall-ittestjar bil-volatilizzazzjoni f’test bijolo ġiku 
(%), 
S V = kimika g ħall-ittestjar mi ġbura f’sifun f’test bijolo ġiku, espressa b ħala 
konċentrazzjoni ekwivalenti f’influwent likwidu (mg/l),  
S I = konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar f’influwent (mg/l).  
(c) Fit-test bijolo ġiku, il-per ċentwali (R  T ) tal-kimika g ħall-ittestjar imne ħħija 
bil-proċessi kollha jing ħata bi:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
fejn 
S E = konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent (likwidu) 
(mg/l).  
(d) Għalhekk il-per ċentwali (R  BA ) mneħħija b’bijodegradazzjoni flimkien ma’ 
sorbiment jista’ jkun ikkalkulat minn:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Għandhom isiru testijiet separati biex ikun iddeterminat iddeterminat jekk 
il-kimika g ħall-ittestjar tkunx sorbita; jekk tkun, tista’ mbag ħad issir 
korrezzjoni ulterjuri.  
(e) Tqabbil bejn il-proporzjon ta’ kimika g ħall-ittestjar imne żża’ mis-sistemi 
tat-test bijolo ġiku (R  v ) u mhux bijolo ġiku (R  vp ) jindika l-effett globali li 
trattament bijolo ġiku jkun ħalla fuq l-emissjoni tal-kimika g ħall-ittestjar 
fl-atmosfera.  
Eżempju:  Benżen 
Żmien ta’ ritenzjoni ta’ ħama = 4 ijiem  
Dranaġġ sintetiku; żmien ta’ ritenzjoni = 8 sig ħat 
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Għalhekk,  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % u R  BA = 85 %.  
Ma kienx suppost li l-ben żen jiġi sorbit fil- ħama.  
LETTERATURA:  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. J. Wat. Pollut. 
Control Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and 
treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
(5) Il-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness: Determinazzjoni ta’ Bijodegradabbiltà 
‘Faċli’. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Appendiċi 6 
Effetti ta ż-żmien ta’ ritenzjoni ta’ ħama (SRT) fuq it-trattabbiltà ta’ 
kimiċi 
DAĦLA 
1. Il-metodu deskritt fit-test prin ċipali tfassal biex ikun a ċċertat jekk ikimi ċi 
ttestjati (is-soltu dawk mag ħrufin li huma bijodegradabbli b’mod inerenti, 
iżda mhux malajr) jistg ħux ikunu ddegradati bijolo ġikament fil-limiti 
imposti f’impjanti tat-trattament ta’ ilma mormi. Ir-ri żultati huma espressi 
skont per ċentwali ta’ tne ħħija u per ċentwali ta’ bijodegradazzjoni. 
Il-kondizzjonijiet ta’ t ħaddim tal-unitajiet ta’ ħama attivat u ta’ g ħażla ta’ 
influwent jippermettu x’aktarx varjazzjonijiet wiesg ħa f’konċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent. Testijiet isiru f’kon ċentrazzjoni 
nominali wa ħda biss ta’ solidi ta’ ħama jew f’ ħin nominali wie ħed ta’ 
retenzjoni ta’ ħama (SRT) u re ġimi ta’ rimi ta’ ħama deskritti jistg ħu 
jikkawżaw li l-valur ta’ SRT ivarja mhux ħażin matul it-test, kemm minn 
jum għal ieħor kif ukoll matul jum.  
2. F’dan il-varjant (1)(2) l-SRT huwa kkontrollat f’limiti ħafna aktar dojoq 
matul kull perjodu ta’ 24 sieg ħa (kif sewwasew ji ġri fuq l-iskala l-kbira) 
li jirriżulta f’kon ċentrazzjoni aktar kostanti fl-effluwenti. Huwa rrak ­
komandat drana ġġ domestiku min ħabba li jag ħti perċentwali ta’ tne ħħija 
aktar konsistenti u og ħla. L-effetti wkoll ta’ g ħadd ta’ valuri ta’ SRT 
ikunu mist ħarġa u fi studju aktar dettaljat ikunu jistg ħu jiġu ddeterminati 
l-effetti ta’ firxa ta’ temperaturi fuq kon ċentrazzjoni ta’ effluwenti.  
3. M’hemmx qbil ġenerali s’issa dwar liema mudelli kineti ċi joperaw meta 
kimiċi jiddegradaw bijolo ġikament ta ħt kondizzjonijiet fi trattament ta’ 
ilma mormi. Ġew magħżula l-mudell Monod tat-tkabbir tal-batterji u l-u żu 
tas-substrat (1)(2) biex ji ġu applikati g ħad-dejta mi ġbura, għaliex il-metodu 
kien intenzjonat li ji ġi applikat biss g ħall-kimiċi prodotti f’tunnellati kbar, li 
jirriżultaw f’kon ċentraazzjoni ta’ drana ġġ ta’ iktar minn 1 mg/l. Il-validità 
tal-mudell simplifikat u l-assunzjonaijiet li saru ġew stabbiliti permezz 
tal-użu ta’ serje ta’ ossilati tal-alko ħol li jkollhom gradi varji ta’ bijodegrad ­
abbilità primarja (2)(3).  
Nota.  Dan il-metodu ta’ varjant isegwi mill-qrib ħafna t-test ta’ dan 
il-metodu C.10-A ta’ ttestjar u dawk id-dettalji li huma biss differenti jingħataw hawnhekk aktar ‘l isfel.
 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
4. Unitajiet ta’ borom poru żi ta’ ħama attivat, mfasslin biex jiffa ċilitaw ir-rimi 
(kważi) kontinwu ta’ likwidu m ħallat li jippermettu kontroll pre ċiż ħafna 
tal-żmien ta’ retenzjoni ta’ ħama (SRT, jew θ s ), jitħaddmu fil-modalità mhux 
akkoppjata tul firxa ta’ SRTs u, fakultattivament, tul firxa ta’ temperaturi. Il-ħin ta’ ritenzjoni huwa normalment 2 sa 10 ijiem u t-temperatura bejn 5 u 
20 °C. Drana ġġ, preferibbilment domestiku, u soluzzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar jit ħalltu b’mod separat mal-unitajiet f’rati li jag ħtu ż-żmien meħtieġ 
ta’ retenzjoni ta’ drana ġġ (3 sa 6 sig ħat) u l-kon ċentrazzjoni me ħtieġa ta’ 
kimika għall-ittestjar fl-influwent. Unitajiet ta’ kontroll li ma jir ċievi ebda 
kimika għall-ittestjar jit ħaddmu b’mod parallel g ħal finijiet komparattivi.
 
5. Tipi o ħra ta’ apparat jistg ħu jintużaw iżda għandha tkun e żerċitata attenzjoni 
kbira biex ikun żgurat li jintla ħaq kontroll tajjeb ta’ SRT. Pere żempju, meta 
jintużaw impjanti, li jinkorporaw apparat ta’ sediment, jista’ jkun me ħtieġ li 
jsir tnaqqis g ħal telf ta’ solidi mill-effluwenti tal-impjant. Barra dan, 
għandhom jittie ħdu wkoll prekawzjonijiet spe ċjali biex ikunu evitati żbalji 
minħabba varjazzjoni fil-kwantità ta’ ħama fl-apparat ta’ sediment.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. L-unitajiet jit ħaddmu skont is-sett ta’ kondizzjonijiet mag ħżul għal kull 
waħda minnhom u, wara li jintla ħaq ekwilibriju, il-kon ċentrazzjonijiet 
medji ta’ stat regolari fl-effluwenti ta’ kimika g ħall-ittestjar u, fakultatti ­
vament f’DOC, jinkisbu tul perjodu ta’ madwar tliet ġimgħat. Minbarra li 
jkun ivvalutat il-per ċentwali ta’ tne ħħija ta’ kimika g ħall-ittestjar u, fakult ­
attivament DOC, ir-relazzjoni bejn kondizzjonijiet ta’ t ħaddim ta’ impjant u 
l-konċentrazzjoni fl-effluwent tkun espressa f’forma grafika. Minn dan ikunu 
jistgħu jiġu kkalkulati l-kostanti kineti ċi tentattivi u jkunu jistg ħu jiġu 
previsti l-kondizzjonijiet li fihom il-kimika g ħall-ittestjar tkun tista’ ti ġi 
ttrattata.  
INFORMAZZJONI DWAR IL-KIMIKA G ĦALL-ITTESTJAR  
7. Japplikaw il-paragrafi 12 u 13 tal-Kapitolu C.10 A.  
LIVELLI TA’ PASS  
8. Japplikaw il-paragrafi 14 u 15 tal-Kapitolu C.10 A.  
KIMIKA G ĦALL-ITTESTJAR TA’ REFERENZA  
9. Japplika l-paragrafi 16 tal-Kapitolu C.10 A.  
RIŻULTATI RIPRODU ĊIBBLI TA’ TESTIJIET  
10. Japplikaw il-paragrafi 17 u 18 tal-Kapitolu C.10 A.  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Apparat  
11. Unità adatta hija s-sistema modifikata ta’ borom poru żi (Appendi ċi 6.1). 
Tikkonsisti f’re ċipjent intern (jew inforra) mag ħmula minn polipropilin 
poruż ta’ 3.2 mm ħxuna u pori daqs bejn wie ħed u ieħor 90 μm, 
bil-minċott issaldjat mal-maqbad. (Dan jag ħmel unità aktar robusta minn 
dik deskritta fil-paragrafu 21 ta’ dan il-kapitolu, C.10 A). L-inforra titq ­
iegħed f’reċipjent estern tal-polietilen li minnu ma jg ħaddix ilma, li jkun 
magħmul minn żewġ partijiet: ba żi tonda li fiha jittaqqbu toqob biex fihom 
jitpoġġew żewġ linji tal-arja u linja g ħar-rimi tal- ħama, u ċilindru fin-na ħa 
ta’ fuq imwa ħħal bil-viti fil-ba żi u li jkollu fet ħa mqiegħda b’mod li tag ħti 
volum mag ħruf (3 l) fir-re ċipjent tal-borma poru ża. Waħda mil-linji tal-arja 
titwaħħlilha ġebla diffu ża u l-oħra tkun miftu ħa fit-tarf u mqieg ħda f’angolu 
kwadru mal- ġebla fil-borma. Din is-sistema tipprodu ċi t-turbulenza me ħtieġa 
biex ikun żgurat li l-kontenut tal-borma jkun t ħallat għalkollox, kif ukoll 
tipprovdi kon ċentrazzjonijiet ta’ ossi ġnu maħlul ta’ aktar minn 2 mg/l.  
12. L-għadd adatt ta’ unitajiet jin żamm f’temperaturi kontrollati li jvarjaw minn 
5 sa 20 °C (± 1 °C), f’banjijiet bl-ilma fi kmamar b’temperatura kostanti. Ikunu jen ħtieġu żewġ pompi biex jiddo żaw għal ġor-reċipjenti ta’ tirwi ħ 
is-soluzzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar u drana ġġ qiegħed fir-rati me ħtieġa 
(0-1.0 ml/min u 0-25 ml/min, rispettivament) u t-tielet pompa biex tne ħħi 
ħama mormi mir-re ċipjenti ta’ tirwi ħ. Ir-rata ta’ fluss ta’ ħama mormi 
tintlaħaq billi tintu ża pompa ssettjata f’rata og ħla u mħaddma minn ħin 
għal ieħor bl-użu ta’ swi ċċ tal-ħin, eż. li jaħdem għal 10 sekondi kull 
minuta, b’pompa b’rata ta’ ħruġ ta’ 3 ml/min li tirrendi rata ta’ rimi ta’ 
0,5 ml/min.
 
Apparat ta’ filtrazzjoni jew ċentrifugu  
13. Japplika l-paragrafu 23 tal-Kapitolu C.10 A.  
Apparat analitiku  
14. Japplika l-paragrafu 24 tal-Kapitolu C.10 A.  
Ilma ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Japplikaw il-paragrafi 25 u 26 tal-Kapitolu C.10 A.  
Midjum organiku  
16. Japplika l-paragrafu 27 tal-Kapitolu C.10 A.  
Dranaġġ sintetiku  
17. Japplika l-paragrafu 28 tal-Kapitolu C.10 A.  
Dranaġġ domestiku  
18. Japplika l-paragrafu 29 tal-Kapitolu C.10 A.  
Ħama attivat  
19. Japplika l-paragrafu 30 tal-Kapitolu C.10 A.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet tal-kimika g ħall-ittestjar  
20. Japplikaw il-paragrafi 31 u 32 tal-Kapitolu C.10 A.  
PROĊEDURA  
Tħejjija tat-tilqima  
21. Japplika biss il-paragrafu 34 tal-Kapitolu C.10 A – u ża ħama attivat (dwar 
2,5 g/l).  
Għadd ta’ unitajiet ta’ ttestjar  
22. Għal test sempli ċi, jiġifieri għall-kejl ta’ per ċentwali ta’ tne ħħija, ikun 
jeħtieġ SRT wie ħed biss, i żda biex tinkiseb dejta me ħtieġa biex jitkejlu 
kostanti kineti ċi tentattivi jkunu je ħtieġu 4 jew 5 valuri ta’ SRT. Is-soltu 
jintgħażlu valuri bejn 2 u 10 ijiem. Prattikament, ikun konvenjenti li jsir test 
f’4 jew 5 SRTs fl-istess waqt f’temperatura wa ħda; fi studji esti żi jintużaw 
l-istess valuri ta’ SRT, jew forsi firxa differenti ta’ valuri, f’temperaturi o ħra 
li jvarjaw minn 5 sa 20 °C. G ħal bijodegradazzjoni primarja (l-u żu ewlieni), 
normalment tkun me ħtieġa unità wa ħda għal kull sett ta’ kondizzjonijiet. 
Iżda għal bijodegradabbiltà finali tkun me ħtieġa unità ta’ kontroll, g ħal kull 
sett ta’ kondizzjonijiet, li tir ċievi drana ġġ iżda mhux kimika g ħall-ittestjar. 
Jekk il-kimika g ħall-ittestjar titqies li tkun fid-drana ġġ użat, ikun me ħtieġ li 
jintużaw unitajiet ta’ kontroll meta tkun qed ti ġi vvalutata bijodegradazzjoni 
primarja, u li ssir il-korrezzjoni me ħtieġa fil-kalkulazzjonijiet.  
Dożaġġ ta’ midjum organiku u kimika g ħall-ittestjar  
23. Japplikaw il-paragrafi 36 sa 39 tal-Kapitolu C.10 A, i żda nnota li 
s-soluzzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar tkun iddo żata separatament u li 
jintużaw diversi rati ta’ rimi ta’ ħama. Immonitorja u a ġġusta wkoll 
sikwit, jekk ikun me ħtieġ, sa ± 10 %, ir-rata ta’ fluss ta’ influwenti, 
effluwenti u rimi ta’ ħama, eż. darbtejn kuljum. Jekk jinqalg ħu diffikultajiet 
fil-metodi analiti ċi meta jintu ża dranaġġ domestiku, ag ħmel it-test bi 
dranaġġ sintetiku, i żda għandu jkun żgurat li midja differenti jag ħtu dejta 
kinetika komparabbli.  
Maniġġar ta’ unitajiet ta’ ħama attivat  
24. Japplikaw il-paragrafi 40 sa 43 tal-Kapitolu C.10 A, i żda kkontrolla l-SRT 
permezz tal- ħela “kostanti” tal- ħama biss.  
Teħid ta’ kampjuni u anali żi 
25. Japplikaw il-paragrafi 44 sa 50 tal-Kapitolu C.10 A, ħlief li 
l-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tkun iddeterminata u 
DOC ikun iddeterminat fakultattivament; m’g ħandux jintu ża COD.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
26. Japplikaw il-paragrafi 52 sa 54 tal-Kapitolu C.10 A.  
Espressjoni ta’ ri żultati tat-testijiet  
27. Japplikaw il-paragrafi 56 sa 62 tal-Kapitolu C.10 A.  
Kalkolu ta’ kostanti kineti ċi 
28. Huwa aktar realistiku li tkun ikkwotata l-kon ċentrazzjoni medja tal-istat 
regolari tal-kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent u li jkun deskritt kif dan 
ivarja ma’ kondizzjonijiet ta’ t ħaddim ta’ impjant milli li jkun ikkwotat 
il-perċentwali ta’ bijodegradazzjoni primarja. Dan jista’ jsir billi titqies 
l-ekwazzjoni (6) fl-Appendi ċi 6.2, li tista’ tirrendi valuri g ħal K  S , μ m u 
θ SC iż-żmien kritiku ta’ retenzjoni ta’ ħama.  
(Alternattivament, valuri approssimattivi ta’ K  S u μm jistgħu jinksibu 
permezz ta’ programm sempli ċi tal-kompjuter mfassal g ħall-kurva 
teoretika kkalkulata mill-ekwazzjoni 2 (Appendi ċi 6.2) għall-valuri esperi ­
mentali miksuba. G ħalkemm kwalunkwe soluzzjoni mog ħtija mhux se tkun 
unika, tista’ tinkiseb appromissazzjoni ra ġonevoli ta’ K  S u μ m .) 
Varjabbiltà ta’ ri żultati  
29. Hija esperjenza komuni li jinkisbu valuri varjabbli ta’ parametri kineti ċi għal 
kimiċi individwali. Huwa ma ħsub li l-kondizzjonijiet li fihom il- ħama jkun 
tkabbar, kif ukoll il-kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test u żat (bħal 
fil-paragrafu 5 u f’testijiet o ħra), għandhom effett kbir fuq il-valuri li 
jirriżultaw. Aspett wie ħed ta’ din il-varjabbiltà kien diskuss minn Grady  
et al  (4), li ssu ġġerew li t-termini “e żistenti” u “intrinsiku” g ħandhom 
ikunu applikati g ħal żewġ kondizzjonijiet estremi li jirrappre żentaw 
il-limiti ta’ stat li kultura tista’ til ħaq matul esperiment kinetiku. Jekk 
l-istat ma jit ħalliex jinbidel matul it-test, il-valuri tal-parametru kinetiku 
jirriflettu l-kondizzjonijiet fl-ambjent li minnu l-mikroorgani żmi jkunu 
ttieħdu; dawn il-valuri jissej ħu “eżistenti” jew e żistenti bħalissa. Fl-estrem 
l-ieħor, jekk kondizzjonijiet fit-test ikunu tali li jippermettu l-i żvilupp sħiħ 
tas-sistema li tissintetizza l-proteina billi tippermetti rata ta’ tkabbir kemm jista’ jkun massima, il-parametri kineti ċi miksubin jing ħad li jkunu “intrin ­
siċi”, u jkunu dipendenti biss minn natura tas-substrat u mit-tipi ta’ batterja 
fil-kultura. B ħala gwida, valuri e żistenti jinkisbu billi l-proporzjon ta’ kon ċ­
entrazzjoni ta’ substrat g ħal mikroorgani żmi kompetenti (S
 o /X o ) jinżamm 
baxx, eż. 0.025, u jkun hemm valuri intrinsi ċi meta l-proporzjon ikun 
għoli eż. mill-anqas 20. Fi ż-żewġ każijiet, S  o għandu jkun ugwali g ħal 
jew jaqbe ż il-valur rilevanti ta’ Ks, il-kostant ta’ nofs saturazzjoni.  
30. Il-varjabbiltà u aspetti o ħra ta’ bijodegradazzjoni kinetika kienu diskussi 
f’workshop ri ċenti ta’ SETAC (5). Minn studji b ħal dawn, rapportati u 
proġettati, għandha to ħroġ ma ddumx stampa aktar ċara ta’ kinetika li 
topera f’impjanti tat-trattament ta’ ilma mormi biex tg ħin ikun hemm inter ­
pretazzjoni a ħjar ta’ dejta e żistenti, kif ukoll biex tissu ġġerixxi disinji aktar 
rilevanti g ħal Metodi ta’ Ttestjar fil- ġejjieni.  
LETTERATURA:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF u Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter 
estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. 
Res., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Ewropa, Brussell.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Appendiċi 6.1  
Borma Poru ża b’Kontroll SRT
  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Appendiċi 6.2  
Kalkolu ta’ Kostanti kineti ċi 
1. Jekk wie ħed jassumi li l-kinetika Monod tapplika u meta jitqies bilan ċ ta’ 
massa ta’ solidi u substrat attivi fis-sistema kollha ta’ ħama attivat (1), 
jistgħu jinkisbu dawn l-espressjonijiet ta’ stat regolari li ġejjin:  
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
jew 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
Fejn:  
S 1 = konċentrazzjoni ta’ substrat fl-effluwent, (mg/l)  
K S = kostant ta’ nofs saturazzjoni, il-kon ċentrazzjoni li fiha μ = μ m /2 
(mg/l)  
μ = rata spe ċifika ta’ tkabbir (d  –1 ) 
μ m = valur massimu ta’ μ m (d –1 ) 
K d = rata spe ċifika ta’ di żintegrazzjoni ta’ solidi attivi (d  –1 ) 
θ S = żmien medju ta’ retenzjoni ta’ ħama, SRT (d)  
Eżami ta’ din l-ekwazzjoni jwassal g ħall-konklu żjonijiet li ġejjin:  
(i) Il-kon ċentrazzjoni tal-effluwenti hija indipendenti minn dik fl-influwent 
(S 0 ); għalhekk, il-per ċentwali ta’ bijodegradazzjoni tvarja 
mal-konċentrazzjoni tal-influwenti, S  0 . 
(ii) L-uniku parametru ta’ kontroll ta’ impjanti li jaffettwa S  1 huwa ż-żmien 
ta’ retenzjoni ta’ ħama, θ S . 
(iii) Għal konċentrazzjoni partikolari fl-influwent, S  0 , ikun hemm żmien 
kritiku ta’ retenzjoni ta’ ħama, b’mod li:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
Fejn:  
θ SC = żmien kritiku ta’ retenzjoni ta’ ħama, li ta ħtu l-mikroorgani żmi 
kompetenti jintefg ħu ‘l barra mal- ħasil tal-impjant.  
(iv) Minħabba li l-parametri l-o ħra fl-ekwazzjoni (2) huma asso ċjati ma’ 
kinetika ta’ tkabbir, it-temperatura aktarx taffettwa l-livell tas-substrat 
tal-effluwent u ż-żmien kritiku li jkollu l- ħama, jiġifieri ż-żmien ta’ 
ritenzjoni ta’ ħama meħtieġ biex jinkiseb ċertu grad ta’ trattament 
jiżdied mat-tnaqqis fit-temperatura.  
2. Minn bilan ċ ta’ massa ta’ solidi fis-sistema ta’ borma poru ża, u jekk wie ħed 
jassumi li l-kon ċentrazzjoni ta’ solidi fl-effluwent tal-impjant, X  2 , tkun 
baxxa mqabbla ma’ dik fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ, X  1 , il-żmien ta’ ritenzjoni 
ta’ ħama 
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
u 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
fejn 
V = volum tar-re ċipjent ta’ tirwi ħ (l) 
X 1 = konċentrazzjoni ta’ solidi fir-re ċipjent ta’ tirwi ħ (mg/l)  
X 2 = konċentrazzjoni ta’ solidi fl-effluwent (mg/l)  
Q 0 = rata ta’ fluss tal-influwent (l/d)  
Q 1 = rata ta’ fluss ta’ ħama mormi (l/d)  
Għalhekk ikun possibbli li jkun ikkontrollat i ż-żmien ta’ ritenzjoni ta’ ħama 
f’kull valur mag ħżul minn qabel bil-kontroll tar-rata ta’ fluss ta’ ħama 
mormi, Q  1 . 
Konklużjonijiet:  
3. L-għan ewlieni tat-test huwa, g ħalhekk, li j ħalli jkun hemm 
il-konċentrazzjoni tal-effluwenti, u b’hekk ikunu previsti l-livelli ta’ 
kimika għall-ittestjar fl-ilmijiet li jir ċevuhom.  
4. Bl-immarkar ta’ S  1 , vs. θ S , il-ħin kritiku ta’ retenzjoni ta’ ħama, θ SC , jista’ 
minn xi daqqiet ikun evalwat malajr, e ż. il-kurva 3 fil-Figura 1. Meta dan 
mhux possibbli, θ SC jista’ jiġi kkalkulat, flimkien ma’ valuri approssimattivi 
μ m u K  S , bl-immarkar ta’ S  1 , vs. S  1 •θ S . 
Arranġament mill- ġdid tal-ekwazzjoni (1) jag ħti 
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Jekk K  d jkun żgħir, allura 1 + θ s • K  d ~ 1 u [5] isir:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Għalhekk, il-grafika g ħandha tkun linja dritta (ara l-Figura 2) tal-anglu 1/ μ m 
u l-interċezzjoni K  S /μ m ; ukoll θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figura 1  
Tliet temperaturi; ħames SRTs
  
Figura 2  
Linja ta’ Rigressjoni SRT S  1 vs S  1 fuq T = 5 °C
  
Glossarju:  
Konċentrazzjoni ta’ effluwenti:  
Kurva:  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Appendiċi 7 
TEST F’FIRXA TA’ ( μg/l) KON ĊENTRAZZJONI BAXXA  
1. Ħafna kimi ċi normalment ikunu jinsabu fl-ambjent akwatiku, f’ilmijiet 
mormija wkoll, f’kon ċentrazzjonijiet baxxi ħafna (μg/l). F’kon ċen­
trazzjonijiet b ħal dawn probabbli li dawn ma jservux b ħala substrati 
primarji li jirri żultaw fi tkabbir, i żda x’aktarx li jiddegradaw f’substrati 
sekondarji, ming ħajr tkabbir, fl-istess żmien ma’ varjetà ta’ kimi ċi 
tal-karbonju li jse ħħu b’mod naturali. G ħaldaqstant id-degradazzjonijiet ta’ 
kimiċi bħal dawn ma jkunux jaqblu mal-mudell deskritt fl-Appendi ċi 6. 
Hemm ħafna mudelli li jistg ħu jkunu applikati u, skont il-kondizzjonijiet 
li jkun hemm f’sistemi ta’ trattament ta’ ilma mormi, aktar minn wie ħed 
jista’ jkun simultanjament operattiv. Tkun me ħtieġa ħafna aktar ri ċerka biex 
titfa’ dawl fuq din il-problema.  
2. Sadattant tista’ tkun segwita l-pro ċedura mog ħtija fit-test prin ċipali (il- 
Kapitolu C.10 A), i żda għall-bijodegradabbiltà primarja biss, billi jintu żaw 
konċentrazzjonijiet baxxi adatti (< 100 μg/l) u pro ċedura analitika vvalidata. 
Il-perċentwali ta’ bijodegradazzjoni jista’ jkun ikkalkulat (ara para. 54 
tal-Metodu ta’ Ttestjar) i żda għandhom jitqiesu pro ċessi abijoti ċi (sorbiment, 
volatilità, e ċċ.). Eżempju huwa l-istudju ta’ Nyholm u s ħabu (1)(2) li u żaw 
ċiklu ta’ 4 sig ħat f’sistema ta’ kuntatt. Irrapportaw kostanti psewdo 
tal-ewwel ordni g ħal 5 kimi ċi miżjuda f’drana ġġ sintetiku f’5 sa 100 μg/l. 
(Għall-aħħar bijodegredabbiltà l-kimi ċi għall-ittestajr bit-tikketta  14 C jistgħu 
jintużaw. Deskrizzjoni ta’ dan tmur lil hinn mill-kamp ta’ applikazzjoni ta’ 
dan il-Metodu ta’ Ttestjar min ħabba li s’issa g ħad m’hemmx pro ċeduri 
maqbula, g ħalkemm metodu propost g ħal ISO 14592 (3) g ħandu gwida 
dwar l-użu ta’ kimi ċi bit-tikketta  14 C 
Test SCAS  
3. Wara kien propost test aktar sempli ċi f’żewġ stadji (4)(5)(6); il-metodu ta’ 
ħama attivat nofsu kontinwu (SCAS) ikun segwit minn testijiet kineti ċi għal 
żmien qasir fuq kampjuni me ħudin minn unitajiet ta’ SCAS. Is-sistema 
SCAS tit ħaddem b’rati ta’ rimi ta’ ħama mag ħrufin (mhux b ħal metodu 
oriġinali tat-test C.12) u jidda ħħlilha drana ġġ sintetiku tal-OECD 
modifikat jew drana ġġ domestiku. Id-drana ġġ sintetiku kien immodifikat 
(minħabba bdil fil-valur tal-pH u ħama bi ftit sedimentazzjoni) bi ż-żieda 
ta’ fosfat b ħala lqugħ, estratt ta’ ħmira, klorur tal- ħadid (III) u tra ċċa ta’ 
element ta’ mel ħ u COD tieg ħu miżjud għal madwar 750 mg/l billi żdiedet 
il-konċentrazzjoni ta’ peptun u estratt tal-la ħam. L-unitajiet t ħaddmu f’ ċiklu 
ta’ 24 sieg ħa: tirwiħ għal 23 sieg ħa, rimi ta’ ħama, sedimentazzjoni, rtirar ta’ 
supernatant (effluwent) u kien segwit b’ żieda ta’ drana ġġ sintetiku flimkien 
ma’ kimika g ħall-ittestjar, sa 100 μg/l, (jiġifieri f’madwar l-istess kon ċen­
trazzjoni u żata fit-test g ħal żmien qasir). Darba fil- ġimgħa 10 % tat-total ta’ 
ħama nbidel b’ ħama frisk biex tin żamm massa mikrobika bilan ċjata. 
4. Il-kon ċentrazzjonijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar jitkejlu fil-bidu u fi tmiem 
tirwiħ u t-test jitkompla sakemm tinkiseb tne ħħija kostanti ta’ kimika 
għall-ittestjar; dan jie ħu minn ġimgħa sa diversi xhur.  
Test għal żmien qasir  
5. Ikun applikat test qasir (e ż. 8 sigħat) biex ikun iddeterminat il-kostant ta’ 
rata kinetika tal-ewwel grad (psewdo) g ħad-diżintegrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar f’ ħama attivat ta’ ori ġinijiet u stejjer mag ħrufin iżda differenti. 
B’mod partikolari, jittie ħdu kampjuni ta’ ħama mir-reatturi ta’ SCAS 
fit-tmiem ta’ perjodu ta’ tirwi ħ meta l-kon ċentrazzjoni ta’ substrat 
organiku tkun baxxa - matul il-perkors ta’ esperiment ta’ akklimatazzjoni 
(paragrafi 3, 4). Ħama jista’ jittie ħed ukoll minn unità parallela ta’ SCAS li  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
ma tkunx esposta g ħall-kimika g ħall-ittestjar, biex jitqabbel. Ta ħlitiet ta’ 
ħama u l-kimika g ħall-ittestjar mi żjuda f’żewġ konċentrazzjonijiet jew 
aktar fil-firxa 1-50 μg/l jitrew ħu, mingħajr ma ji żdied drana ġġ sintetiku 
jew substrat organiku ie ħor. il-kimika g ħall-ittestjar li tifdal f’soluzzjoni 
tkun iddeterminata f’intervalli regolari, e ż. kull sieg ħa skont kemm tkun 
degradabbli l-kimika, g ħal perjodu mhux itwal minn 24 sieg ħa. Kampjuni 
jkunu sso ġġettati għal azzjoni ċentrifuga qabel anali żi xierqa.  
Kalkulazzjonijiet  
6. Dejta mill-unitajiet ta’ SCAS tintu ża biex ikun ikkalkulat il-per ċentwali ta’ 
tneħħija ta’ kimika g ħall-ittestjar (paragrafu 54). Kostant ta’ rata medja, K  1 , 
(innormalizzat g ħal konċentrazzjoni ta’ solidi sospi żi) jista’ wkoll ikun 
ikkalkulat minn:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
fejn: 
t = ħin ta’ tirwi ħ (23h)  
C e = konċentrazzjoni fi tmiem ta’ perjodu ta’ tirwi ħ (μg/l) 
C i = konċentrazzjoni fil-bidu ta’ tirwi ħ (μg/l) 
SS = kon ċentrazzjoni ta’ solidi ta’ ħama attivat (g/l)  
7. Fit-test g ħal żmien qasir il-kon ċentrazzjoni log % li jifdal tkun immarkata 
skont il-ħin, u l-anglu tal-parti tal-bidu (10-50 % degradazzjoni) tal-grafika 
jkun ekwivalenti g ħal K  1 , il-kostant tal-ewwel grad (psewdo). Il-kostant ikun 
innormalizzat fir-rigward tal-kon ċentrazzjoni ta’ solidi ta’ ħama billi l-anglu 
jkun divi ż bil-konċentrazzjoni ta’ solidi ta’ ħama. Ir-ri żultat irrapportat 
għandu jinkludi wkoll dettalji ta’ kon ċentrazzjonijiet tal-bidu tal-kimika 
għall-ittestjar u solidi sospi żi, żmien ta’ ritenzjoni ta’ ħama, tagħbija u 
sors ta’ ħama, u dettalji ta’ espo żizzjoni minn qabel (jekk ikun hemm) 
għall-kimika g ħall-ittestjar.  
Varjabbiltà ta’ ri żultati  
8. Il-varjabbiltà u aspetti o ħra ta’ bijodegradazzjoni kinetika kienu diskussi 
f’workshop ri ċenti ta’ SETAC (7). Minn studji b ħal dawn, rapportati u 
proġettati, għandha to ħroġ ma ddumx stampa aktar ċara ta’ kinetika li 
topera f’impjanti tat-trattament ta’ ilma mormi biex tg ħin ikun hemm inter ­
pretazzjoni a ħjar ta’ dejta e żistenti, kif ukoll biex tissu ġġerixxi disinji aktar 
rilevanti g ħal Metodi ta’ Ttestjar fil- ġejjieni.  
LETTERATURA:  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and 
Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated 
sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.  
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low 
concentrations in water.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in 
activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 
851-864.
 
(5) Berg UT u Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and 
standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711- 735.
 
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biode ­
gradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. 
Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.  
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6
 th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Bijoriti  
DAĦLA 
1. Testijiet ta’ simulazzjoni normalment ikunu applikati g ħal kimiċi li ma 
jkunux g ħaddew minn test ta’ tg ħarbil għal bijodegradabbiltà fa ċli (il- 
Kapitolu C.4 A sa F ta’ dan l-Anness (9)), i żda li jkunu g ħaddew minn 
test għal bijodegradabbiltà inerenti. B’mod e ċċezzjonali t-testijiet ta’ simu ­
lazzjoni ji ġu applikati wkoll g ħal kwalunkwe kimika li dwarha tkun 
meħtieġa iktar informazzjoni, spe ċjalment kimi ċi ta’ ħafna tunnellati, u 
normalment ji ġi applikat it-test tal- ħama attivat (C.10 A). F’xi ċirkostanzi, 
madankollu, tkun me ħtieġa informazzjoni spe ċifika marbuta mal-a ġir ta’ 
kimika mal-metodi tat-trattament tal-ilma mormi inklu ż bijoriti, l-katar 
filtri li jnixxu jew li jqattru, kontatturi bijolo ġiċi li jduru, sodod fluwidizzati. 
Biex din il- ħtieġa tintlaqa’ kienu żviluppati diversi apparati.  
2. Gerike  et al . (1) użaw filtri li jqattru kbar fuq skala pilota li ġew utitlizzati 
fil-mudell akkoppjat. Dawn il-filtri ħadu ħafna spazju u kienu je ħtieġu 
volumi relattivament kbar ta’ drana ġġ jew drana ġġ sintetiku. Truesdale  et 
al. (2) iddeskrivew filtri i żgħar (6 piedi x 6 pulzieri dijametru) li g ħad­
dewlhom drana ġġ naturali ming ħajr tensjoattivi i żda li x’aktarx kienu 
għadhom je ħtieġu volumi kbar. Kienu me ħtieġa mhux anqas minn 14-il 
ġimgħa biex kienet żviluppata bijorita “matura” u kienu je ħtieġu minn 4 
sa 8 ġimgħat oħra wara li dda ħħal għall-ewwel darba t-tensjoattiv tat-test 
qabel ma saret akklimatazzjoni.  
3. Baumann  et al.  (3) żviluppaw filtru ħafna aktar i żgħar li uża “suf ver ġni” 
tal-poliester li qabel kien mg ħaddas f’ħama attivat b ħala l-midjum inerti li 
kien iżomm il-bijorita. il-kimika g ħall-ittestjar intu żat bħala l-uniku sors ta’ 
karbonju, u l-bijodegradabbiltà kienet ivvalutata minn kejlijiet ta’ karbonju 
organiku ma ħlul (DOC) fl-influwent u fl-effluwent, u mill-ammont ta’ CO  2 
fil-gass li jo ħroġ. 
4. Appro ċċ pjuttost differenti itti ħed minn Gloyna  et al.  (4) li vvintaw ir-reattur 
tubulari li jdur. Fuq il-wi ċċ ta’ ġewwa tat-tubu li jdur kienet tkabbret bijorita 
fuq l-erja mag ħrufa tal-wi ċċ bil-passa ġġ ta’ influwent imda ħħal fit-tarf ta’ 
fuq tat-tubu, inklinat f’angolu żgħir lejn l-orizzontali. Ir-reattur intu ża biex 
tkun studjata l-bijodegradabbiltà ta’ tensjoattivi (5), kif ukoll biex tkun 
mistħarrġa l-aħjar ħxuna ta’ bijorita u tixrid mir-rita (6). Dawn l-awturi 
tal-aħħar żviluppaw ulterjorment ir-reattur, inklu ż li mmoddifikawh biex 
ikun jista’ jiddetermina CO  2 fil-gass li jo ħroġ. 
5. Ir-reattur tubulari li jdur kien adottat mill-Kumitat Permanenti ta’ 
Analisti (UK) b ħala metodu standard g ħall-valutazzjoni kemm 
tal-bijodegradabbiltà ta’ kimi ċi (7) kif ukoll tat-trattabbiltà u tat-tossi ċità 
ta’ ilmijiet mormija (8). Il-metodu deskritt hawnhekk g ħandu l-vanta ġġi 
tas-sempli ċità, il-kumpattezza, ir-riprodu ċibbiltà u l- ħtieġa għal volumi 
relattivament żgħar ta’ midjum organiku.  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
6. Drana ġġ sintetiku jew domestiku, u l-kimika g ħall-ittestjar, f’ta ħlita jew 
waħedhom, ikunu applikati fuq il-wi ċċ ta’ ġewwa ta’ tubu inklinat li jdur 
bil-mod. Saff ta’ mikroorgani żmi, jixbhu lil dawk li jkun hemm fuq midja 
ta’ bijofiltri, jinbena fuq il-wi ċċ ta’ ġewwa. Il-kondizzjonijiet ta’ t ħaddim 
tar-reattur jintg ħażlu biex jeliminaw b’mod adegwata materja organika u, 
jekk ikun me ħtieġ, ossidazzjoni tal-ammonju.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Effluwent mit-tubu jin ġabar u jew joqg ħod u/jew ji ġi ffiltrat qabel anali żi 
għal karbonju organiku ma ħlul (DOC) u/jew g ħall-kimika g ħall-ittestjar 
b’metodu spe ċifiku. Unitajiet ta’ kontroll li ma jir ċievu ebda kimika g ħall- 
ittestjar jit ħaddmu b’mod parallel bl-istess kondizzjonijiet g ħal għanijiet 
komparattivi. Id-differenza bejn il-kon ċentrazzjonijiet ta’ DOC fl-effluwent 
u l-unitajiet ta’ test u kontroll hija pre żunta li tkun dovuta min ħabba 
l-kimika g ħall-ittestjar u l-metaboliti organi ċi tagħha. Din id-differenza 
titqabbel mal-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar mi żjuda (bħala 
DOC) biex tkun ikkalkulata l-eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar.  
8. Il-bijodegradazzjoni tista’ normalment ting ħaraf minn bijosorbiment b’e żami 
sewwa tal-kurva ta’ eliminazzjoni- żmien/ħin. Konferma s-soltu tkun tista’ 
tinkiseb billi jkun applikat test g ħal bijodegradazzjoni fa ċli (konsum ta’ 
ossiġnu jew produzzjoni ta’ diossidu tal-karbonju) billi tintu ża tilqima akkli ­
matizzata me ħuda fit-tmiem tat-test mir-reatturi li jir ċievu l-kimika g ħall- 
ittestjar.  
INFORMAZZJONI DWAR IL-KIMIKA G ĦALL-ITTESTJAR  
9. Il-purezza, is-solubilità fl-ilma, u l-karatteristi ċi volatili u ta’ sorbiment 
tal-kimika g ħall-ittestjar g ħandhom ikunu mag ħrufa biex jista’ jkun hemm 
interpretazzjoni korretta tar-ri żultati li jkollhom isiru.  
10. Normalment, kimi ċi volatili u li ftit jin ħallu ma jistg ħux ikunu t-testjati 
sakemm ma jitte ħdux prekawzjonijiet spe ċjali (ara l-Appendi ċi 5 
tal-Kapitolu C.10 A). L-istruttura kimika, jew g ħall-anqas il-formula 
empirika, g ħandhom wkoll ikunu mag ħrufa biex ikunu kkalkulati valuri 
teoretiċi u/jew biex ikunu vverifikati valuri mkejla ta’ parametri, e ż. 
domanda teoretika ta’ ossi ġnu (ThOD), DOC.  
11. Informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal mikroorgani żmi 
(ara l-Appendi ċi 4 tal-kapitolu C.10 A) jistg ħu jkunu utli biex jintg ħażlu 
konċentrazzjonijiet xierqa ta’ testijiet u jistg ħu jkunu essenzjali g ħall-inter­
pretazzjoni korretta ta’ valuri baxxi ta’ bijodegradazzjoni.  
LIVELLI TA’ PASS  
12. Oriġinarjament, il-bijodegradazzjoni primarja ta’ a ġenti tensjoattivi kien 
jeħtiġilha tilħaq 80 % jew aktar qabel ma l-kimika setg ħet titqieg ħed 
fis-suq. Jekk il-valur ta’ 80 % ma jintla ħaqx, jista’ jkun applikat dan 
it-test ta’ simulazzjoni (konfermatorju) u t-tensjoattiv ikun jista’ jitqieg ħed 
fis-suq biss jekk titne ħħa aktar minn 90 % tal-kimika spe ċifika. Għal kimiċi 
inġenerali mhix kwistjoni ta’ livell ta’ jekk ikunx hemm pass/falliment u 
l-valur ta’ per ċentwali ta’ tne ħħija jista’ jintu ża f’kalkulazzjonijiet prossimi 
tal-konċentrazzjoni ambjentali probabbli biex jintu ża fi stimi tal-perikli li 
jġibu kimiċi. F’għadd ta’ studji ta’ kimi ċi puri l-per ċentwali ta’ tne ħħija 
ta’ DOC instab li kien > 90 % f’aktar minn tliet kwarti, u > 80 % f’aktar minn 90 %, ta’ kimi ċi li wrew xi grad sinifikanti ta’ bijodegradabbiltà.
 
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
13. Biex ikun żgurat li l-pro ċedura sperimentali tkun qed titwettaq b’mod 
korrett, ikun utli kull tant żmien li jkunu ttestjati kimi ċi ta’ referenza li 
mġibthom tkun mag ħrufa. Kimi ċi bħal dawn jinkludu a ċidu adipiku, 2- 
fenil fenol, 1-naftol, a ċidu ‘difeniku’ u a ċidu 1-naftoiku.  
RIŻULTATI RIPRODU ĊIBBLI TAT-TESTIJIET  
14. Id-devjazzjoni standard relattiva f’testijiet instabet mil-laboratorju fir-Renju 
Unit li kienet ta’ 3,5 % u li bejn testijiet kienet ta’ 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Apparat  
Reatturi tubi li jduru  
15. L-apparat (ara l-figuri 1 u 2 fl-Appendi ċi 8) jikkonsisti minn sodda ta’ tubi 
tal-akrilik kull wie ħed 30,5 cm twil u 5 cm dijametru intern, appo ġġat fuq 
roti tal-lasktu li jkunu ġo qafas ta appo ġġ tal-metall. Kull tubu g ħandu xoffa, 
madwar 0,5 cm fonda, biex i żżommu fuq ir-roti, il-wi ċċ intern huwa 
magħmul aħrax bil-wire wool raff, u hemm xoffa interna fond 0,5 cm 
fit-tarf ta’ fuq (g ħalf) biex i żżomm il-likwidu. It-tubi huma inklinati 
f’angolu ta’ madwar grad wie ħed lejn l-orrizont biex jiksbu l- ħin 
tal-kuntatt me ħtieġ meta il-midjum tat-test ji ġi applikat g ħal tubu nadif. 
Ir-roti bil-lakstu jiddawru b’mutur ta’ velo ċità varjabbli, bil-mod. 
It-temperatura tat-tubi ti ġi kkontrollata b’installazzjoni f’kamra li g ħandha 
temperatura kostanti.  
16. Billi kull reattur tubu jing ħalaq ġewwa tubu ftit akbar, bil-g ħatu u jkun 
żgurat li ma jkunx jista’ jo ħroġ gass mill-konnessjonijiet, gass CO  2 li 
joħroġ ikun jista’ jin ġabar f’soluzzjoni ta’ alkalina g ħal kejl sussegwenti (6).  
17. Provvista ta’ 24 sieg ħa, għal kull tubu, ta’ midjum organiku b’kimika g ħall- 
ittestjar mi żjuda jekk applikabbli, titqieg ħed f’reċipjent ta’ ħżin (A) ta’ 20 
l (A) (ara l-Figura 2). Jekk ikun me ħtieġ, is-soluzzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar tista’ ti ġi ddożata separatament. Qrib il-qieg ħ ta’ kull re ċipjent ta’ 
ħżin ikun hemm fet ħa li tkun ikkunnettjata b’sistema adatta ta’ tubi, e ż. 
lastku tas-silikon, permezz ta’ pompa peristaltika (B), ma’ tubu ta’ ħruġ 
magħmul mill- ħġieġ jew silikon li jid ħol minn 2 sa 4 cm fit-tarf ta’ fuq 
(għalf) tat-tubu inklinat (C). L-effluwent jit ħalla jqattar mit-tarf ta’ isfel 
tat-tubu inklinat biex jin ġabar f’reċipjent ieħor ta’ ħżin (D). L-effluwent 
għandu joqg ħod jew ikun iffiltrat qabel anali żi. 
Apparat ċentrifugu ta’ filtrazzjoni  
18. Ikun hemm apparat g ħal filtrazzjoni ta’ kampjuni b’filtru ta’ membrani ta’ 
porożità adatta (dijametru ta’ apertura nominali ta’ 0,45 μm) li jassorbi 
kimiċi organiċi jew li jer ħi karbonju organiku g ħal grad minimu. Jekk 
jintużaw filtri li jer ħu karbonju organiku, a ħsilhom sewwa b’ilma s ħun 
biex tneħħi karbonju organiku li jlissi. Alternattivament jista’ jintu ża 
ċentrifugu li jkun kapa ċi jagħmel 40 000 m/sec  2 . 
19. Tagħmir analitiku biex ikun iddeterminat:  
— DOC/karbonju organiku totali (TOC) jew domanda kimika ta’ 
ossiġnu (COD);  
— kimika spe ċifika (HPLC, GC, e ċċ.) jekk tkun me ħtieġa; 
— pH, temperatura, a ċidità, alkalinità;  
— ammonju, nitrit, nitrat, jekk it-testijiet isiru f’kondizzjonijiet ta’ nitrifi ­
kazzjoni.  
Ilma 
20. Ilma tal-vit, li jkun fih anqas minn 3 mg/l DOC.  
21. Ilma distillat jew dejonizzat, li jkun fih anqas minn 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Midjum organiku  
22. Jista’ jintu ża dranaġġ sintetiku, drana ġġ domestiku jew ta ħlita tat-tnejn b ħala 
l-midjum organiku. Intwera li l-u żu ta’ drana ġġ domestiku wa ħdu sikwit 
jagħti perċentwali og ħla ta’ tne ħħija ta’ DOC (f’unitajiet ta’ ħama attivat) 
u jħalli wkoll li jkun hemm bijodegradazzjoni ta’ xi kimi ċi, li ma ji ġux 
iddegradati bijolo ġikament meta jintu ża dranaġġ sintetiku tal-OECD. 
Għalhekk huwa rrakkomandat l-u żu ta’ drana ġġ domestiku. Kejjel 
il-konċentrazzjoni ta’ DOC (jew COD) f’kull lott ġdid ta’ midjum 
organiku. L-a ċidità jew l-alkalinità tal-midjum organiku g ħandha tkun 
magħrufa. Il-midjum jista’ je ħtieġ li jiżdiedlu lqug ħ xieraq (idro ġenu 
karbonat tas-sodju jew fosfat tal-idro ġenu tal-potassju), jekk ikun ta’ 
aċidità jew alkalinità baxxi, biex jin żamm pH ta’ dwar 7,5 + 0,5 
fir-reattur matul it-test. L-ammont ta’ lqug ħ, u meta g ħandu jiżdied, 
għandhom ikunu de ċiżi każ każ. 
Dranaġġ sintetiku  
23. Ħoll f’kull litru ilma tal-vit: peptun, 160 mg; estratt tal-la ħam, 110 mg; urea, 
30 mg; fosfat anidru tal-idro ġenu tad-dipotassju (K  2 HPO  4 ), 28 mg; klorur 
tas-sodju, (NaCl), 7 mg; klorur tal-kal ċju diidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; sulfat 
tal-maġniżju eptaidrat ((Mg  4 SO 2 .7H20), 2 mg. Dan id-drana ġġ sintetiku 
tal-OECD huwa e żempju u jag ħti konċentrazzjoni medja tad-DOC 
fl-influwent ta’ madwar 100 mg/l. Alternattivament, u ża kompożizzjonijiet 
oħrajn, b’madwar l-istess kon ċentrazzjoni tad-DOC, li huma eqreb g ħad- 
dranaġġ reali. Dan id-drana ġġ sintetiku jista’ jsir f’ilma ddistillat f’forma 
kkonċentrata u jin ħażen f’madwar 1 °C sa mhux aktar minn ġimgħa. Meta 
jkun hemm b żonnu, raqqu bl-ilma tal-vit. (Dan il-midjum mhux sodisfa ċenti, 
eż. il-konċentrazzjoni ta’ nitro ġenu hija g ħolja ħafna, relattivament 
b’kontenut ta’ karbonju baxx, i żda ma kien issu ġġerit xejn a ħjar, ħlief li 
jiżdied aktar fosfat b ħala lqugħ u peptun żejjed).  
Dranaġġ domestiku  
24. Uża dranaġġ qiegħed frisk mi ġbur kuljum minn xog ħlijiet ta’ trattament li 
jirċievu b’mod predominanti drana ġġ domestiku. Dan g ħandu jinġabar 
mill-kanal tat-tifwir tat-tank ta’ sedimentazzjoni primarja, jew mill-g ħalf 
għall-impjant tal- ħama attivat, u jkun kwa żi kollu ħieles minn parti ċelli 
raffi. Id-drana ġġ ikun jista’ jintu ża wara l- ħżin għal diversi jiem f’madwar 
4 °C, jekk ikun ippruvat li DOC (jew COD) ma jkunux naqsu b’mod sinifikanti (ji ġifieri b’anqas minn 20 %) matul ħżin. Biex ikun illimitat 
taqlib fis-sistema, DOC (jew COD) ta’ kull lott ġdid għandhom ikunu 
aġġustati qabel ma jintu żaw għal valur kostanti xieraq, e ż. b’dilwizzjoni 
bl-ilma tal-vit.
 
Lubrikant  
25. Jistg ħu jintużaw gliċerol jew żejt taż-żebbuġa għal-lubrikazzjoni tar-rombli 
tal-pompa peristaltika: it-tnejn huma tajbin biex jintu żaw fuq tubi tal-lastku 
tas-silikon.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar  
26. Għal kimiċi li jinħallu b’mod adegwat ħejji soluzzjonijiet ta’ stokkijiet 
f’konċentrazzjonijiet xierqa (e ż. 1 sa 5 g/l) f’ilma dejonizzat jew 
fil-porzjon minerali tad-drana ġġ sintetiku. G ħall-kimiċi li ma jin ħallux, ara 
l-Appendi ċi 5 fil-kapitolu C.10-A. Dan il-metodu mhux tajjeb g ħal kimiċi 
volatili ming ħajr modifiki g ħar-reatturi tubu (paragrafu 16). Iddetermina 
DOC u TOC tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet u tenni l-kejlijiet g ħal kull lott 
ġdid. Jekk id-differenza bejn DOC u TOC tkun aktar minn 20 %, ivverifika 
jekk il-kimika g ħall-ittestjar tin ħallx fl-ilma. Qabbel DOC jew 
il-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar imkejla b’anali żi speċifika ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet mal-valur nominali biex ta ċċerta jekk l-irkupru 
jkunx tajjeb bi żżejjed (normalment jista’ jkun mistenni > 90 %). A ċċerta, 
l-aktar għal tixrid, jekk jistax jintu ża DOC jew le b ħala parametru analitiku 
jew jekk tistax tintu ża biss teknika analitika b’mod spe ċifiku għall-kimika 
għall-ittestjar. Ċentrifugazzjoni tal-kampjuni tkun me ħtieġa għal tixrid. G ħal 
kull lott ġdid, kejjel DOC, COD jew il-kimika g ħall-ittestjar ma’ anali żi 
speċifika.  
27. Iddetermina pH tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet. Valuri estremi jindikaw li ż- 
żieda tal-kimika jista’ jkollha influwenza fuq pH tal- ħama attivat fis-sistema 
ta’ ttestjar. F’dan il-ka ż innewtralizza s-soluzzjoni ta’ stokkijiet biex tikseb 
pH ta’ 7 ± 0,5 b’ammonti żgħar ta’ aċidu jew ba żi inorgani ċi, iżda evita 
l-preċipitazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar.  
PROĊEDURA  
Tħejjija ta’ midjum organiku g ħal dożar 
28. Żgura li kontenituri ta’ influwenti u effluwenti u tubi minn re ċipjenti ta’ 
influwenti u g ħal reċipjenti ta’ effluwenti jitnaddfu sewwa biex tne ħħi 
tkabbir mikrobiku, fil-bidu u matul it-test kollu.  
29. Ħejji d-drana ġġ sintetiku (paragrafu 23) frisk kuljum mis-solidi jew 
mis-soluzzjoni kon ċentrata ta’ stokkijiet b’dilwizzjoni adatta b’ilma tal-vit. 
Kejjel l-ammont me ħtieġ f’ċilindru u żid f’reċipjent nadif ta’ influenti. Jekk 
ikun meħtieġ, żid ukoll l-ammont me ħtieġ tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
tal-kimika g ħall-ittestjar jew tal-kimika ta’ referenza mad-drana ġġ sintetiku 
qabel id-dilwizzjoni. Jekk ikun aktar konvenjenti jew ta’ ħtieġa biex ikun 
evitat telf tal-kimika g ħall-ittestjar, ħejji soluzzjoni separata dilwita 
tal-kimika g ħall-ittestjar f’ri żerva separata u g ħaddi din fit-tubi inklinati 
permezz ta’ pompa differenti tad-do żaġġ. 
30. Alternattivament (u preferibbilment), u ża dranaġġ qiegħed domestiku 
(paragrafu 24) mi ġbur frisk kuljum jekk ikun possibbli.  
Tħaddim ta’ reatturi tubi li jduru  
31. Ikunu me ħtieġa żewġ reatturi tubi identi ċi għall-valutazzjoni ta’ kimika 
waħda ta’ ttestjar, u jitg ħaqqdu f’kamra b’temperatura kostanti normalment 
ta’ 22 ± 2 °C.  
32. Aġġusta l-pompi peristalti ċi biex iwasslu 250 ± 25 ml/h tal-midjum 
organiku (ming ħajr kimika g ħall-ittestjar) fit-tubi inklinati, li jiddawru bi 
18 ± 2 rpm. Applika l-lubrikant (paragrafu 25) lit-tubi tal-pompa fil-bidu 
u perjodikament permezz tat-test biex ti żgura funzjonament sewwa u biex 
ittawwal il- ħajja tas-sistema tat-tubi.  
33. Aġġusta l-angolu tax-xaqliba tat-tubi mal-orizzontali biex tipprodu ċi żmien 
ta’ residenza ta’ 125 ± 12,5 kull sekonda g ħall-għalf f’tubu nadif. Ag ħmel 
stima taż-żmien ta’ ritenzjoni billi żżid marka mhux bijolo ġika (eż. NaCl, 
kulurant inerti) lill-g ħalf: iż-żmien li l-kon ċentrazzjoni tie ħu biex til ħaq 
l-aqwa tag ħha fl-effluwent jitqies li jkun il- żmien medju ta’ retenzjoni 
(meta jkun hemm rita massima, i ż-żmien ta’ ritenzjoni jista’ ji żdied sa 
madwar 30 minuta).  
34. Dawn ir-rati, velo ċitajiet u ħinijiet instabu li jne ħħu b’mod adegwat (> 
80 %) ta’ DOC (jew ta’ COD) u li jipprodu ċu effluwenti nitrifikati. Ir-rata 
ta’ fluss g ħandha tinbidel jekk tne ħħija ma tkunx suffi ċjenti jew jekk 
il-prestazzjoni ta’ impjant partikolari ta’ trattament ikollha tkun issimulata. 
F’dan il-ka ż tal-aħħar, aġġusta r-rata ta’ do żar tal-midjum organiku sakemm 
il-prestazzjoni tar-reattur tkun taqbel ma’ dik tal-impjant ta’ trattament.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Tilqim  
35. Tilqim li jin ġarr mal-arja jista’ jkun suffi ċjenti biex jinbeda t-tkabbir ta’ 
mikroorgani żmi meta jintu ża dranaġġ sintetiku, i żda minbarra dak żid 1 
ml/l ta’ drana ġġ qiegħed mal-għalf għal 3 ijiem.  
Kejl 
36. F’intervalli regolari ara li r-rati ta’ do ża u l-volo ċitajiet ta’ tidwir ikunu 
fil-limiti me ħtieġa. Kejjel ukoll il-pH tal-effluwent, l-aktar jekk tkun 
mistennija nitrifikazzjoni.  
Teħid ta’ kampjuni u anali żi 
37. Il-metodu, xejra u frekwenza ta’ te ħid ta’ kampjuni jintg ħażlu biex ikunu 
adatti għall-fini tat-test. Pere żempju, ħu kampjuni ka żwali (jew f’daqqa) 
kampjuni ta’ influwent u effluwent, jew i ġbor kampjuni tul perjodu itwal, 
eż. 3-6 sig ħat. Fl-ewwel perjodu, ming ħajr kimika g ħall-ittestjar, ħu 
kampjuni darbtejn fil- ġimgħa. Iffiltra l-kampjuni minn membrani jew 
ċentrifugu f’madwar 40 000 m/sec  2 għal madwar 15-il minuta (paragrafu 
18). Jista’ jkun hemm il- ħtieġa li l-kampjuni joqog ħdu u/jew li jkunu 
ffiltrati b’mod raff qabel il-filtrazzjoni b’membrani. Iddetermina DOC (jew COD) mill-anqas b’mod duplikat u, jekk ikun me ħtieġ, BOD, ammonju u 
nitrit/nitrat.
 
38. Kull anali żi għandha ssir malajr kemm jista’ jkun wara l- ġbir u t-tħejjija 
tal-kampjuni. Jekk anali żi jkollha ti ġi posposta, a ħżen il-kampjuni f’madwar 
4 °C fid-dlam fi fliexken mimlijin u mag ħluqin issikkati. Jekk kampjuni 
jkollhom jin ħażnu għal aktar minn 48 sieg ħa, ippreservahom fil-fri ża, b’aċi­
difikazzjoni jew bi ż-żieda ta’ kimika tossika adatta (e ż. 20 ml/l ta’ 
soluzzjoni ta’ 10 g/l ta’ klorur tal-merkurju (II)). Żgura li t-teknika ta’ 
preservazzjoni ma tinfluwenzax ir-ri żultati ta’ anali żi. 
Perjodu tal-bidu (running-in)  
39. F’dan il-perjodu, il-bijorita tal-wi ċċ tikber biex til ħaq l-aħjar ħxuna, li s-soltu 
tieħu madwar ġimagħtejn u m’g ħandhiex tie ħu aktar minn 6 ġimgħat. 
It-tneħħija (paragrafu 44) ta’ DOC (jew ta’ COD) ti żdied u til ħaq valur 
ta’ livell kostanti. Meta l-fa żi ta’ livell kostanti tintla ħaq f’valur simili fi ż- 
żewġ tubi, jintg ħażel wieħed biex ikun ta’ kontroll fil-bqija tat-test, li matulu 
l-prestazzjoni tag ħhom għandha tibqa’ konsistenti.  
Dħul ta’ kimika g ħall-ittestjar  
40. F’dan l-istadju żied il-kimika g ħall-ittestjar mar-reattur l-ie ħor 
fil-konċentrazzjoni me ħtieġa, normalment 10-20 mg C/l. Il-kontroll 
ikompli jir ċievi l-midjum organiku wa ħdu. 
Perjodu ta’ akklimatazzjoni  
41. Kompli bl-anali żi darbtejn fil- ġimgħa għal DOC (jew COD) u, jekk ikollha 
tkun ivvalutata l-bijodegradabbiltà primarja, kejjel ukoll il-kon ċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar b’anali żi speċifika. Ħalli minn ġimgħa sa sitt 
ġimgħat (jew aktar f’kondizzjonijiet spe ċjali) wara li l-kimika g ħall- 
ittestjar tkun idda ħħlet għall-ewwel darba biex isse ħħ akklimatazzjoni. 
Meta l-per ċentwali ta’ tne ħħija (paragrafi 43-45) jil ħaq valur massimu, 
ikseb valuri validi minn 12-15 fil-fa żi ta’ livell kostanti tul madwar 3 
ġimgħat għal evalwazzjoni tal-per ċentwali medja ta’ tne ħħija. It-test jitqies 
lest jekk jintla ħaq grad g ħoli biżżejjed ta’ eliminazzjoni. Normalment, 
taqbiżx żmien ta’ 12-il ġimgħa ta’ kemm idum test wara l-ewwel żieda 
tal-kimika g ħall-ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Ħrif tar-rita  
42. It-tne ħħija f’daqqa ta’ kwantitajiet kbar ta’ rita żejda mit-tubi, jew ħrif, 
isseħħ relattivament f’intervalli regolari. Biex ti żgura li ma tkunx affettwata 
l-komparabbiltà ta’ ri żultati, ħalli t-testijiet ikopru mill-anqas żewġ ċikli kbar 
ta’ tkabbir u ħrif. 
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
43. Ikkalkula l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni ta’ DOC (jew ta’ COD) tal-kimika 
għall-ittestjar g ħal kull valutazzjoni li jkun itte ħdilha l-ħin billi tu ża 
l-ekwazzjoni:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
fejn 
D t = perċentwali ta’ eliminazzjoni ta’ DOC (jew ta’ COD) f’ ħin t; 
Cs = kon ċentrazzjoni ta’ DOC (jew ta’ COD) fl-influwent min ħabba 
l-kimika g ħall-ittestjar, preferibbilment stmata mill-kon ċentrazzjoni 
fi, u mill-volum mi żjud, tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet (mg/l);  
E = DOC (jew COD) mkejla fl-effluwent tat-test f’ ħin t (mg/l);  
Eo = DOC (jew COD) mkejla fl-effluwent tal-kontroll f’ ħin t (mg/l).  
Tenni l-kalkulazzjoni g ħall-kimika ta’ referenza, jekk ittestjata.  
Prestazzjoni tar-reattur ta’ kontroll  
44. Il-grad ta’ eliminazzjoni (D  B ) ta’ DOC (jew ta’ COD) tal-midjum organiku 
fir-reattur ta’ kontrolli huwa informazzjoni utli biex tkun ivvalutata l-attività 
bijodegradattiva tal-bijorita matul it-test. Ikkalkula l-per ċentwali ta’ elimi ­
nazzjoni bl-ekwazzjoni:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
fejn 
Cm = DOC (jew COD) tal-midjum organiku fl-influwent tal-kontroll 
(mg/l).  
45. Ikkalkula t-tne ħħija (D  ST ) tal-kimika g ħall-ittestjar, jekk titkejjel, b’metodu 
analitiku spe ċifiku f’valutazzjoni ta’ kull darba bl-ekwazzjoni:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
fejn 
Si = kon ċentrazzjoni mkejla jew, preferibbilment, stmata ta’ kimika g ħall- 
ittestjar fl-influwent tat-test (mg/l)  
Se = kon ċentrazzjoni mkejla tal-kimika g ħall-ittestjar fl-effluwent tat-test 
f’ħin t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Jekk il-metodu analitiku jag ħti valur po żittiv f’ekwivalenti ta’ drana ġġ mhux 
mibdul għal S  c mg/l, ikkalkula l-per ċentwali ta’ tne ħħija (D  SC ) minn:  
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Espressjoni ta’ ri żultati tat-testijiet  
46. Immarka l-per ċentwali ta’ eliminazzjoni D  t u D  ST (jew D  SC ), jekk ikunu 
disponibbli, kontra l- ħin (ara l-Appendi ċi 2 fil-Kapitolu C.10- A). Ħu 
l-medja (espressa sal-eqreb numru s ħiħ) u l-istandard ta’ devvjazzjoni 
tal-valuri 12-15 g ħal D  T (u għal D  ST , jekk ikunu disponibbli) miksubin 
fil-fażi ta’ livell kostanti b ħala l-perċentwali ta’ tne ħħija tal-kimika g ħall- 
ittestjar. Mill-forma tal-kurva ta’ eliminazzjoni, jistg ħu jinstiltu xi 
konklużjonijiet dwar il-pro ċessi ta’ tne ħħija. 
Sorbiment  
47. Jekk tkun osservata eliminazzjoni g ħolja ta’ DOC tal-kimika g ħall-ittestjar 
fil-bidu tat-test, il-kimika g ħall-ittestjar aktarx tkun eliminata b’sorbiment 
għal fuq il-bijorita. Jista’ jkun possibbli li dan ji ġi ppruvat permezz ta’ 
diterminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar assorbita fuq solidi ħrif mir-riti. 
Mhux normali g ħall-eliminazzjoni tad-DOC ta’ kimi ċi assorbiti li jibqg ħu 
għoljin matul it-test kollu; normalment, ikun hemm fil-bidu grad g ħoli ta’ 
tneħħija li bil-mod il-mod jin żel għal valur ta’ ekwilibriju. I żda jekk 
il-kimika g ħall-ittestjar assorbita setg ħet ikkaw żat akklimatazzjoni 
tal-massa mikrobika, l-eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar DOC susseg ­
wentement g ħandha tiżdied u til ħaq livell kostanti g ħoli. 
Fażi ta’ intervalli  
48. Bħal f’dawk stati ċi, f’testijiet ta’ tg ħarbil ħafna kimi ċi għall-ittestjar je ħtieġu 
fażi ta’ intervalli qabel ma sse ħħ bijodegradazzjoni s ħiħa. Fil-fażi ta’ inter ­
valli, akklimatazzjoni (jew adattament) tal-batterja kompetenti sse ħħ 
mingħajr ma kwa żi titneħħa l-kimika g ħall-ittestjar; mbag ħad iseħħ 
it-tkabbir tal-bidu ta’ dawn il-batterji. Din il-fa żi tintemm u l-fa żi ta’ degra ­
dazzjoni titqies arbitrarjament li tkun bdiet meta jitne ħħa madwar 10 % 
tal-ammont tal-bidu ta’ kimika g ħall-ittestjar (wara li jkun tqies 
is-sorbiment, jekk ise ħħ). Il-fażi ta’ intervalli sikwit tkun varjabbli ħafna u 
bilkemm riprodu ċibbli.  
Fażi ta’ livell kostanti  
49. Il-fażi ta’ livell kostanti ta’ kurva ta’ eliminazzjoni f’test kontinwu hija 
ddefinita b ħala dik il-fa żi li fiha sse ħħ id-degradazzjoni massima. Din 
il-fażi għandha ddum mill-anqas 3 ġimgħat u jkollha madwar 12-15-il 
valur validu mkejjel.  
Grad medju ta’ eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar  
50. Ikkalkula l-valur medju mill-valuri ta’ eliminazzjoni D  t (u D  s , jekk ikunu 
disponibbli) tal-kimika g ħall-ittestjar fil-fa żi ta’ livell kostanti. Mi ġjub għad- 
dritt sal-eqreb numru s ħiħ (1 %), dan ikun il-grad ta’ eliminazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar. Huwa wkoll irrakkomandat li jkun ikkalkulat 
l-intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % tal-valur medju. B’mod simili kkalkula 
l-grad medju (D  B ) ta’ eliminazzjoni tal-midjum organiku fir-re ċipjent ta’ 
kontroll.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indikazzjoni ta’ bijodegradazzjoni  
51. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar ma tassorbix b’mod sinifikanti mill-bijorita u 
l-kurva ta’ eliminazzjoni jkollha forma tipika ta’ kurva ta’ bijodegradazzjoni b’intervall, ta’ fa żijiet ta’ degradazzjoni u ta’ livell kostanti (paragrafi 48, 
49), l-eliminazzjoni mkejla tista’ kwa żi fiċ-ċert tkun attribwita 
lill-bijodegradazzjoni. Jekk tkun se ħħet tneħħija inizjali g ħolja, it-test ta’ 
simulazzjoni ma jkunx jista’ jiddivrenzja bejn pro ċessi ta’ eliminazzjoni 
bijoloġiċi u abijoti ċi. F’każijiet bħal dawn, u f’ka żijiet oħra fejn ikun 
hemm xi dubju dwar il-bijodegradazzjoni (e ż. jekk isir stripa ġġ), analizza 
kimika g ħall-ittestjar assorbita fuq kampjuni tar-rita jew ag ħmel testijiet 
statiċi addizzjonali (tg ħarbil) għall-bijodegradabbiltà ibba żati fuq parametri 
li jindikaw b’mod ċar proċessi bijolo ġiċi. Testijiet b ħal dawn huma l-metodi 
ta’ konsum ta’ ossi ġnu (Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness D, E u F) (9) jew test 
li jkejjel il-produzzjoni ta’ CO
 2 (Kapitolu C.4-C ta’ dan l-Anness) jew 
il-metodu Spazju Fuq) (10); u ża bħala tilqima esposta minn qabel bijorita 
mir-reattur adatt.  
52. Jekk kemm it-tne ħħija ta’ DOC, kif ukoll it-tne ħħija ta’ kimika spe ċifika 
jkunu tkejlu, differenzi sinifikanti (tal-ewwel ikunu anqas minn tal-a ħħar) 
bejn il-per ċentwali mne ħħija jindikaw li kien hemm fl-effluwenti prodotti 
organiċi intermedji, li jistg ħu jkunu aktar diffi ċli li jiddegradaw; dawn 
għandhom ikun mist ħarġa. 
Validità ta’ ri żultati tat-testijiet  
53. Qis it-test b ħala validu jekk il-grad ta’ eliminazzjoni (DB) ta’ DOC (jew ta’ 
COD) fl-unitajiet ta’ kontroll ikun > 80 % wara ġimagħtejn ta’ tħaddim u 
ma tkun saret ebda osservazzjoni mhux tas-soltu.  
54. Jekk kimika (ta’ referenza) bijodegradabbli fa ċilment tkun ġiet ittestjata, 
il-grad ta’ bijodegradazzjoni g ħandu jkun > 90 % u d-differenza bejn 
valuri duplikati m’g ħandhiex tkun akbar minn 5 %. Jekk dawn i ż-żewġ 
kriterji ma jit ħarsux, eżamina mill- ġdid il-pro ċeduri sperimentali u/jew 
ikseb drana ġġ domestiku minn sors ie ħor. 
55. Bl-istess mod, differenzi bejn valuri ta’ degradazzjoni minn unitajiet 
duplikati (jekk jintu żaw) li jittrattaw kimika g ħall-ittestjar m’g ħandhomx 
ikunu differenti b’aktar minn 5 %. Jekk dan il-kriterju ma jit ħarisx iżda 
t-tneħħija tkun g ħolja, kompli bl-anali żi għal tliet ġimgħat oħra. Jekk 
it-tneħħija tkun baxxa, st ħarreġ l-effetti inibitorji tal-kimika g ħall-ittestjar 
jekk ma jkunux mag ħrufin u tenni t-test f’kon ċentrazzjoni aktar baxxa ta’ 
kimika għall-ittestjar, jekk dak ikun fattibbli.  
Rapport tat-test  
56. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi dan li ġej: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— dejta ta’ identifikazzjoni;  
— natura fi żika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi. 
Kondizzjonijiet tat-test:  
— kull modifika g ħas-sistema ta’ ttestjar, l-aktar jekk ikunu ttestjati kimi ċi 
li ma jinħallux jew ikunu volatili;  
— tip ta’ midjum organiku;  
— proporzjon u natura ta’ skart industrijali fid-drana ġġ, jekk jintu żaw u 
jekk ikunu mag ħrufa;  
— metodu ta’ tilqim;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ kimi ċi għall-ittestjar – kontenut ta’ DOC 
(karbonju organiku ma ħlul) u TOC (karbonju organiku totali); kif 
titħejja, jekk ta’ sospensjoni; kon ċentrazzjoni(jiet) u żata/i tat-test, 
raġunijiet jekk ikunu ‘l barra mill-firxa 10-20 mg/l DOC; metodu ta’ 
żieda; data tal-ewwel żieda; kull bidla fil-kon ċentrazzjoni;  
— ħin medju ta’ retenzjoni idrawlika (b’ebda tkabbir); velo ċità ta’ 
rotazzjoni tat-tubu; angolu approssimattiv tax-xaqliba, jekk ikun 
possibbli;  
— dettalji ta’ ħrif; ħin u intensità;  
— temperatura tat-test u firxa;  
— tekniċi analitiċi użati. 
Riżultati tat-testijiet:  
— dejta mkejla kollha ta’ DOC, COD, anali żi speċifika, pH, temperatura, 
kimiċi N, jekk rilevanti;  
— id-dejta kollha kkalkolata ta’ D  t (jew D  tc ), D  B , D  St miksuba f’forma 
tabulari u l-kurvi ta’ eliminazzjoni;  
— informazzjoni dwar fa żijiet ta’ intervalli u ta’ livelli kostanti, durata ta’ 
testijiet, il-grad ta’ eliminazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar, tal-kimika ta’ 
referenza (jekk ittestjata) u tal-midjum organiku (fl-unità ta’ kontroll), 
flimkien ma’ dejta ta’ statistika u dikjarazzjonijiet dwar 
il-bijodegradabbiltà u l-validità tat-test;  
— diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
LETTERATURA:  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758.  
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
 
(3) Baumann U, Kuhn G u Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
 
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional 
trickling filter. JAOCS 43: 92-94.  
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London.
 
(9) Il-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness, Determinazzjoni ta’ Bijodegradabbiltà 
‘Faċli’ A-F.  
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Appendiċi 8 
Figura 1  
Tubi li jduru
  
Glossarju:  
Stampa tal-pjanta:  
Stampa A/B:  
Roti misjuqin:  
Roti ming ħajr ingrana ġġ: 
Mutur tal- ġbid: 
Dawrien tal-ger:  
Flanġ intern:  
Mekkaniżmu orizzontali:  
Ġbid ta’ ger im ċanfar:  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figura 2  
Dijagramma ta’ fluss
  
A: Tank tal-G ħalf 
B: Pompa Peristaltika  
C: Tubu li Jdur  
D: Reċipjent għal Ġbir ta’ Effluwenti  
DEFINIZZJONIJIET:  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  
Kimiċi: “Għandu jkun innotat li l-fra żi “kimika” tintu ża ġeneralment fil-ftehimiet 
tal-UNCED u f’dokumenti li ġew wara biex tinkludi sustanza, prodotti, ta ħlitiet, 
tħejjijiet, jew kull fra żi oħra li tista’ tintu ża f’sistemi e żistenti biex jindikaw 
“kopertura”.”  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIJODEGRADAZZJONI  
TEST TA' L-INIBIZZJONI TAR-RESPIRAZZJONI TAT-TAJN ATTIVAT  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
Il-metodu deskritt jistima l-effett ta' sostanza tat-test fuq il-mikror ­
ganiżmi billi jkejjel ir-rata ta' respirazzjoni f'kondizzjonijiet definiti 
fil-preżenza ta' kon ċentrazzjonijiet tas-sostanza tat-test.  
L-għan ta' dan il-metodu huwa li jg ħati metodu ta' screening li bi ħ 
is-sostanzi li jistg ħu jaffettwaw ħażin l-impjanti tat-trattament 
aerobiċi tal-mikrobi ji ġu individwati, u li jindika kon ċentrazzjonijiet 
xierqa li mhux inibitorji tas-sostanza tat-test li g ħandha tintu ża fit- 
testijiet tal-bijodegrabilità.  
Jista' jsir test li jiddefinixxi l-varjetà qabel it-test definittiv. Dan 
jipprovdi informazzjoni dwar il-varjetà ta' kon ċentrazzjonijiet li 
għandhom jintu żaw fit-test.  
Huma inklu żi ukoll żewġ testijiet ming ħajr is-sostanza tat-test, 
wieħed fil-bidu u lie ħor fl-aħħar tas-serje tat-testijiet. Kull ammont 
ta' tajn attivat g ħandu jiġi kkontrollat ukoll bl-u żu ta' sostanza ta' 
referenza.  
Dan il-metodu huwa l-aktar applikat g ħall-sostanzi li, min ħabba li 
dawn jinħallu fl-ilma u li ma evaporawx, x'aktarx li jibqg ħu fl-ilma.  
Għal sostanzi li ma tantx jin ħallu fl-ilma fis-sostanza tat-test, x'aktarx 
li ma jkunx possibbli li ji ġi ddeterminat l- EC  50 . 
Riżultati bba żati fuq il-b żonn ta' ossi ġinu jista' jwassal g ħal 
konklużjonijiet ħżiena meta s-sostanza tat-test jkolla l-propensità li 
tneħħi l-fosforilazzjoni ossidattiva akkopjata.  
Din l-informazzjoni waqt li jkun qed isir it-test hija b żonnjuża: 
— is-solubilità ta' l-ilma  
— il-pressjoni tal-fwar  
— il-forma strutturali  
— il-purità tas-sostanza tat-test.  
Rakkomandazzjoni  
It-tajn attivat jista' jkollu organi żmi potenzalment pato ġeniċi u 
għandu jiġi mmanovrat b'attenzjoni.  
1.2. DEFINIZZJONI U UNITAJIET  
Ir-rata ta' respirazzjoni hija l-konsum ta' ossi ġinu tal-mikrorgani żmi 
fl-ilma ma ħmuġ f tajn aerobiku, espressa ġeneralment b ħala mg O  2 
ta' tajn għal kull sieg ħa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Sabiex jiġi kkalkolat l-effett inibitorju tas-sostanza tat-test, f'kon ċen­
trazzjoni partikolari, ir-rata ta' respirazzjoni hija espressa b ħala 
perċentwali tal-medja ta' żewġ rati ta' kontroll respiratorju:  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ % perċentwalita’inibizzjoni  
Fejn:  
R s = rata ta' konsum ta' ossi ġinu f'kon ċentrazzjoni ttestjata ta' 
sostanza tat-test,  
R c1 = rata ta' konsum ta' l-ossi ġinu, kontroll 1,  
Rc 2 = rata ta' konsum ta' l-ossi ġinu, kontroll 2.  
EC 50 f'dan il-metodu huwa l-kon ċentrazzjoni tas-sostanza tat-test li 
fiha r-rata ta' respirazzjoni hija ta' 50 % ta' dik murija mill-kontroll taħt il-kondizzjonijiet deskritti f dan il-metodu.
 
1.3. SOSTANZI TA' REFERENZA  
Huwa rrakkomandat li 3,5-diklorofenol, b ħala inibitur mag ħruf ta' 
respirazzjoni, jintu ża bħala sostanza ta' referenza u ttestjat g ħall- 
EC 50 fuq kull ammont ta' tajn attivat b ħala mod ta' kontroll li s- 
sensittività tat-tajn ma tkunx anormali.  
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Ir-rata ta' respirazzjoni ta' tajn ativat mog ħti ammont standard ta' 
drenaġġ sintetiku huwa mkejjel wara ħin ta' kuntatt ta' 30 minuta 
jew tlett sieg ħat, jew it-tnejn li huma. Ir-rata ta' respirazzjoni ta' 
l-istess tajn attivat fil-pre żenza ta' varji kon ċentrazzjonijiet tas- 
sostanza tat-test ta ħt kondizzjonijiet identi ċi hija kkalkolata ukoll. 
L-effett inibitorju tas-sostanza tat-test f'kon ċentrazzjoni partikolari 
hija espressa b ħala perċentwali tar-rati medji ta' respirazzjoni ta' 
żewġ kontrolli. Valur EC  50 huwa kkalkolat mid-determinazzjonijiet 
ta' konċentrazzjonijiet differenti.  
1.5. KRITERJI TAL–KWALITÀ  
Ir-riżultati tat-testijiet huma validi jekk:  
— iż-żewġ rati ta' kontroll ta' respirazzjoni m'humiex ta' iktar minn 
15 % minn xulxin,  
— l- EC  50 (30 minuta u/jew tliet sieg ħat) ta' 3,5-diklorofenol huwa 
fl-ambitu a ċċettat ta' 5 sa 30 mg/litru.  
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Rea ġenti 
1.6.1.1. T a ħ l i t a t a s - s o s t a n z a t a t - t e s t  
Taħlit tas-sostanza tat-test huma ppreparati fil-bidu ta' l-istudju bl- 
użu ta' taħlita ta' l-istokk. Kon ċentrazzjoni ta' ta ħlita ta' l-istokk ta' 
0,5 g/litru hija adegwata jekk il-pro ċedura rrakkomandata hawn isfel 
hija segwita.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. T a ħ l i t a t a s - s o s t a n z a t a ' k o n t r o l l  
Taħlita ta' 5,5-diklorofenol tista', per e żempju, tkun ippreparata billi 
jinħallu 0,5 g 3,5-dikolorofenol f'10 ml ta' 1M NaOH, ma ħlula 
f'madwar 30 ml ta' ilma distillat, bi ż-żieda ta' 0,5 M H  2 SO 4 sal- 
punt ta' pre ċipitazzjoni in ċipjenti – madwar 8ml ta' 0,5 M H  2 SO 4 
għandu jkun me ħtieġ – u fl-aħħar billi t-ta ħlita tkun ma ħlula f'litru 
ta' ilma distillat. Il-pH g ħandu jkun ta' bejn 7 sa 8.  
1.6.1.3. D r e n a ġ ġ S i n t e t i k u  
Taħlita ta' drena ġġ sintetika issir billi jit ħalltu flimkien l-ammonti ta' 
sostanzi li ġejjin f'litru ilma:  
— 16 g Pepton  
— 11 g Estratti mil-la ħam 
— 3 g urea,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Nota 1 : Dan id-drena ġġ sintetiku huwa 100 darba iktar kon ċentrat 
minn dak deskritt fir-Rapport Tekniku OECD Metodu propost sabiex tiġi stabbilita l-bijodegrabilità ta' surfactants u żati fid-deter ġenti 
sintetiċi (Ġunju 11, 1976), bi ż-żieda tal-fosfat tad-dipotassju ta' 
l-idroġenu.
 
Nota 2 : Jekk it-ta ħlita preparata m'hijiex u żata immedjatament, din 
għandha tin żamm fid-dlam f'temperatura ta' bejn 0  o sa 4  o C, għal 
mhux aktar minn ġimgħa, f'kondizzjonijiet li ma jikkaw żaw l-ebda 
biddla fil-kompo żizzjoni tag ħha. It-taħlita tiġi ukoll sterilizzata qabel 
ma tintrefa, jew il-pepton u l-estratt tal-la ħam jista' ji żdied ftit qabel 
ma jsiru t-testijiet. Qabel l-u żu, dan g ħandu jkun im ħallat komp ­
letament u l-pH a ġġustat.  
1.6.2.  Apparat  
Apparat li jkejjel id-disinn pre ċiż m'huwiex kritiku. Madankollu, 
għandu jkun hemm spazju fil-parti l-g ħolja u l-parti 'l barra 
għandha teħel tajjeb bl-g ħonq tal-flixkun tal-kejl.  
Apparat nomali tal-laboratorju, u b'mod partikolari dan l-apparat li 
ġej huwa ne ċessarju:  
— apparat li jkejjel,  
— apparat li jippermetti l-aerjazzjoni,  
— elettrod li jkejjel il-pH u apparat li jkejjel,  
— eletrod ta' l- O  2 . 
1.6.3.  Preparazzjoni ta' l-inoculum  
It-tajn attivat minn impjant tat-trattament tad-drena ġġ predominament 
domestiku huwa u żat bħala l-inoculum micobiku g ħat-test.  
Jekk huwa ne ċessarju, meta jittie ħed lura fil-laboratorju, jistg ħu 
jitenħħew l-biċċiet il-kbar li jkunu qag ħdu għal perjodu qasir, e ż. 
15-il minuta, u billi jin ġibdu biċċiet fini mill-wi ċċ ta' l-ilma g ħall- 
użu. Alternattivament, it-tajn jista' jkun im ħallat bl-u żu ta' blender 
għall-ftit sekondi.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Aktar minn dan, jekk huwa ma ħsub li jeżisti materjal inibittorju, it- 
tajn jista' ji ġii maħsul bl-ilma tal-vit jew ta ħlita isotonika. Wara ċ- 
ċentrifugazzjoni, is-supernatant huwa ddekantat, (din il-pro ċedura 
hija ripetuta g ħal tlett darbiet)  
Ammont żgħir ta' tajn huwa mkejjel mill-pi ż u mnixxef. Minn dan 
ir-riżultat, l-ammont ta' tajn mxarrab jista' ji ġi kkalkolat li g ħandu 
jiġi sospendut fl-ilma sabiex jkun ottenut tajn attivat minn ta ħlita ta' 
biċċiet solidi sospi żi ta' bejn 2 u 4 g/litru. Dan il-livell jag ħti konċen­
trazzjoni ta' bejn 0,8 u 1,6 g/litru f'ta ħlita tat-test jekk il-pro ċedura 
rrakkomandata hawn isfel hija segwita.  
Jekk it-tajn ma jistg ħax jintuża fil-ġurnata ta' meta dan jkun in ġabar, 
50 ml ta' drena ġġ sintetiku huwa mi żjud ma' kull litru ta' tajn attivat 
li jkun ippreparat kif hawn fuq deskritt; dan g ħandu imbag ħad jiġi 
aerjat matul il-lejl f'temperatura ta' bejn 20 ± 2  o C. Dan jin żamm 
aerjat għall-użu matul il-jum. Qabel ma jintu ża, il-pH g ħandu 
jitkejjel u a ġġustat, jekk hemm b żonn, għall-pH 6 sa 8. It-ta ħlita 
bil-biċċiet sospi żi għandha ti ġi ddeterminata kif deskritt fil- 
paragrafu pre ċedenti.  
Jekk l-istess ammont ta' tajn huwa me ħtieġ sabiex ji ġi użat fil-ġranet 
sussegwenti (massimu ta' erbat ijiem), g ħandu jiżdied 50 ml ta' 
drenaġġ sintetiku g ħal kull litru ta' tajn l-a ħħar ta' kull ġurnata 
xogħol. 
1.6.4.  Kif g ħandu jsir it-test  
Ħin li għandu jie ħu/ta' 
kuntatt: 30 minuta u/jew tlett sieg ħat, li fihom 
issir l-aerjazzjoni 
Ilma: Ilma tax-xorb (deklorinat jekk me ħtieġ) 
Arloġġ ta' l-ossi ġinu Nadifa, ming ħajr żejt. Fluss ta' arja ta' 
0,5 sa 1 litru/minuta 
Fornitura ta' l-arja: Flixkun bil-qieg ħ ċatt, bħall-flixkun tat- 
tip BOD 
Apparat li jkejjel: Elettrod ta' ossi ġinu xieraq bil-fa ċilita' li 
jkejjel 
Taħlita ta' nutrijenti: Drena ġġ sintetiku (ara hawn fuq) 
Sostanza tat-test: Is-sostanza tat-test hija ppreparata fil- 
bidu tat-test 
Sostanza ta' referenza e ż. 3,5-diklorofenol (ta' l-anqas tlett 
konċentrazzjonijiet) 
Kontrolli: Kampjun inokulat ming ħajr s-sostanza 
tat-test 
Temperatura: 20 ± 2  o C. 
Proċedura esperimentali ssu ġġerita li tista' ti ġi segwita kemm g ħat- 
test u kemm g ħas-sostanza tar-referenza g ħall-perjodu ta'  
kuntatt ta' tlett sieg ħat hija mog ħtija hawn isfel:  
Ta' l-anqas ħames kon ċentrazzjonijiet, spazjati b'fattur kostanti 
preferibbilment li ma taqbi żx 3,2 għadha tkun u żata. 
Fil-ħin 0, 16 ml tad-drena ġġ sintetiku g ħandu jsir sa' 300 ml bl-ilma. 
200 ml ta' inoculum mikrobiku huma mi żjuda u t-ta ħlita totali 
(500ml) huma mferra' fl-ewwel kontenitur (l-ewwel kontroll C  1 ). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Il-kontenituri tat-test g ħandhom ji ġu aerjati kontinwament sabiex 
jassiguraw li l-O  2 maħlul fl-ilma ma jaqg ħax taħt 2,3 mg/litru u li, 
immeddjatament qabel ma ti ġI mkejla r-rata ta' respirazzjoni, il-kon ċ­
entrazzjoni ta' l- O  2 tkun ta' madwar 6,5 mg/litru.  
Wara 15-il minuta (il-15-il minuta huwa ħin arbitrarju imam 
konvenjenti b ħala interval) dan t'hawn fuq g ħandu jiġi ripetut, bl- 
eċċezzjoni li 100 ml tas-sostanza tat-test huma mi żjuda mas-16 ml ta' 
drenaġġ sintetiku u qabel ji żdied l-ilma sa 300 ml u inoculum 
mikobiku sabiex flimkien jag ħmlu volum ta' 500 ml. Din it-ta ħlita 
hija imbag ħad imferra' f'kontenitur ie ħor u aerjat kif imsemmi hawn 
fuq. Dan il-pro ċess huwa ripetut f'intervalli ta' 15-il minuta b'volumi 
differenti tas-sostanza tat-test sabiex tag ħti serje ta' kontenituri li 
fihom kon ċentrazzjonijiet differenti tas-sostanza tat-test. Fl-a ħħar, 
għandi jiġi ppreparat t-tieni kontroll (C  2 ). 
Wara tlett sieg ħat il-pH huwa mkejjel, u kampjun im ħallat sew tal- 
kontenuti ta' l-ewwel ħames kontenituri huwa mferra' fl-apparat li 
jkejjel u r-rata ta' respirazzjoni hija mkejla fuq perjodu sa' 10 minuti.  
Din id-determinazzjoni hija ripetuta fuq il-kontenut ta' kull kontenitur 
f'intervalli ta' 15-il minuta, b'mod li l- ħin tal-kuntatt f'kull kontenitur 
huwa ta' tlett sieg ħat. 
Is-sostanza ta' referenza huwa ttestjat f'kull kampjun ta' incolumu 
mikrobiku bl-istess mod.  
Reġim differenti (e ż. b'aktar minn arlo ġġ ta' l-ossiġinu wieħed) huwa 
neċessarju meta l-kejl g ħandu jsir wara 30 minuta ta' kuntatt.  
Jekk il-kejl ta' l-konsum ta' l-ossi ġinu kimikali huwa me ħtieġ, 
kontenituri o ħrajn huma ppreparati li fihom s-sostanza tat-test, 
drenaġġ sintetiku u ilma, imma ming ħajr tajn attivat. Il-konsum ta' 
l-ossiġinu jitkejjel u rrekordjat wara perjodu ta' aerjazzjoni ta' 
30 minuta u/jew tlett sieg ħat (ħin ta' kuntatt).  
2. DATA U VALUTAZZJONI  
Ir-rata ta' respirazzjoni hija kkalkolata mit-tra ċċi rrekordjati bejn 
madwar 6,5 mg O  2 /litru u 2,5 mg O  2 /litru, jew fuq perjodu ta' 
10 minuti meta r-rata ta' respirazzjoni tkun wa ħda baxxa. Il- 
porzjon tal-kurva tar-respirazzjoni li fuqha hija mkejla r-rata ta' respi ­
razzjoni g ħandha tkun lineari.  
Jekk ir-rati ta' respirazzjoni ta ż-żewġ kontrolli m'humiex fi 15 % 'l 
bogħod minn xulxin, jew l- EC  50 (30 minuta u/jew tlett sieg ħat) tas- 
sostanza ta' referenza ma tkunx f'mejda a ċċettata (5 sa 30 mg/litru 
għal 3,5 diklorofenol), it-test huwa invalidu u g ħandu jerġa' jsir.  
Il-perċentwali ta' l-inibizzjoni hija kkalkolata fuq kull test ta' kon ċen­
trazzjoni (ara 1.2.). Il-per ċentwal ta' l-inibizzjoni hija mpin ġijja mal- 
konċentrazzjoni fuq karta log-normal (jew log-probability), u b'hekk 
għandu jkun ottenut valur EC  50 . 
Limiti ta' konfidenza ta' 95 % g ħall-valuri EC  50 jistgħu jkunu stab ­
biliti mill-pro ċeduri standard.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RAPPURTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jkollu, sa fejn hu possibbli, dan li ġej: 
— is-sostanza tat-test: data li tidentifika l-kemikali  
— is-sistema tat-test: s-sors, kon ċentrazzjoni u kwalunkwe pre-trat ­
tament tat-tajn ativat,  
— kondizzjonijiet tat-test:  
— pH tar-reazzjoni tat-ta ħlita qabel ma ti ġi mkejla r-respi ­
razzjoni,  
— it-temperatura tat-test,  
— id-dewmien tat-test  
— is-sostanza ta' referenza u l-EC  50 tagħha mkejjel,  
— il-bżonn ta' l-ossi ġinu abijotiku (jekk hemm).  
— riżultati:  
— d- data kollha mkejla  
— il-kurva ta' l-inibizzjoni u l-metodu g ħall-kalkolazzjoni ta' 
l-EC  50 , 
— l-EC  50 u, jekk possibbli, l-limiti ta' konfidenza ta' 95 %, EC  20 
u EC  80 
— l-osservazzjonijiet kollha u kwalunkwe derivazzjonijiet minn 
dan il-metodu ta' ttestjar u li seta' influenza r-ri żultat.  
3.2. INTERPRETAZZJONI TAD– DATA  
Il-valur EC  50 għandu jiġi meqjus b ħala gwida g ħat-tossiċita 
probabbli tas-sostanza tat-test g ħat-trattament tajn attivat tad- 
drenaġġ jew għall-mikrorgani żmi ta' l-ilma tar-rimi, min ħabba li l- 
interazzjonijiet kumplessi li jse ħħu fl-ambjent ma jistg ħux ikunu 
akkuratament simulati t-testijiet tal-laboratorju. Aktar minn dan, is- 
sostanzi tat-test li jista' jkollhom effett inibitorju fuq l-ossidazzjoni ta' l-ammonja jistg ħu jipprodu ċu wkoll kurvi atipikali ta' inibizzjoni. 
B'hekk, dawn il-kurvi g ħandhom ji ġu interpretati b'attenzjoni.
 
4. REFERENZI  
(1) Standard Internazzjonali ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R., r-Ri ċerka dwar l-ilma 11, 1977, p. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Kemosfera 10, 1981, p. 
245. 
(4) ETAD (Asso ċċjazzjoni Ekolo ġika u Tossol ġika ta' l-Industrija 
tal-Prodotti li Jag ħtu l-Kulur), Metodu Rrakkomandat Nru.103, 
deskritt ukoll minn:  
(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.  
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.  
(7) OECD, Paris, 1981, Gwida tat-Test 209, De ċiżjoni tal-Kunsill 
nru. C(81) 30 finali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIJODEGRADAZZJONI  
TEST SCAS MODIFIKAT  
1. METODU  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-għan tal-metodu huwa l-valutazzjoni tal-bijodegrabilità a ħħarija 
potenzali tas-sostanzi organi ċi li jinħallu fl-ilma u li ma jinxfux 
malajr meta esposti g ħall-konċentrazzjonijiet relattivament g ħoljin 
ta' mikrorgani żmi fuq perjodu ta' żmien twil. Il-vijabbilità tal-mikror ­
ganiżmi hija mantenuta fuq dan il-perjodu bi ż-żieda ta' kuljum ta' 
dħul ta' drena ġġ. (Għar-rekwiżiti fi tmiem il- ġimgħa, id-drena ġġ jista' 
jinżamm f'temperatura ta' 4  o C. Alternattivament, id-drena ġġ 
sintetiku tat-test konfermatorju OECD jista' jintu ża.) 
L-assorbiment fi żiko-kemikali tal-bi ċċiet sospiżi jista' jse ħħ, u dan 
għandu jitqies meta ji ġu interpretati r-ri żultati (ara 3.2.).  
Minħabba l-perjodu twil ta' detenzjoni tal-fa żi likwida (36 sieg ħa), u 
ż-żieda intermittenti tan-nutrijenti, t-test ma jistimulax il- 
kondizzjonijeit esperjenzati fl-impjant tat-trattament tad-drena ġġ. Ir- 
riżultati miksuba mill-varji sostanzi tat-test jindikaw li t-test g ħandu 
potenzal g ħoli ta' biodegradazzjoni.  
Il-kondizzjonijiet provduti mit-test huma favorevoli ħafna għall- 
għażla u/jew l-adattazzjoni ta' mikrorgani żmi kapaċi jiddegradaw 
il-kompost tat-test. (Il-pro ċedura tista' tkun u żata wkoll sabiex 
tipproduċi inocula akkliatizzati g ħall-użu tagħhom f'testijiet o ħrajn.)  
F'dan il-metodu, l-kejl tal-kon ċentrazzjoni tal-karbon organiku 
maħlul huwa u żat sabiex jistima l-bijodegrabilità a ħħarija tas- 
sostanzi tat-test. Huwa preferibbli li ji ġi ddeterminat id-DOC wara 
l-aċidifikazzjoni u l-tindif milli b ħala d-differenza Ctotali – Cinor ­
ganika  
L-użu simultaneju ta' metodu spe ċifiku analitiku jista' jippermetti l- 
istima tad-degradazzjoni primarja tas-sostanza (ma jibqax tidher l- 
istruttura tal-kimika ori ġinali).  
Il-metodu huwa applikabbli biss g ħal dawk is-sostanzi organi ċi tat- 
test li, bil-kon ċentrazzjoni u żata fit-test:  
— jinħallu fl-ilma (ta' l-anqas 20mg organiku ma ħlul karbon/litru),  
— għandhom pressjoni ta' l-istijm negli ġibbli,  
— m'humiex inibittorji g ħall-batteri,  
— m'humiex assobiti b'mod sinifikattiv fis-sistema tat-test,  
— m'humiex mitlufa b'fowming mit-ta ħlita tat-test.  
Il-kontentut tal-karbon organiku tal-materjal tat-test g ħandu jiġi stab­
bilit. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Informazzjoni fuq il-porzjonijiet relattivi tal-komponenti l-ma ġġuri 
tal-materjal tat-test tkun b żonnjuża sabiex ji ġu interpretati r-ri żultati 
miksuba, partikolarment f'dawk il-ka żijiet fejn ir-ri żultati huma baxxi 
jew marġinali.  
Informazzjoni fuq it-tossi ċità għall-mikrorgani żmi tas-sostanza tista' 
tkun bżonnjuża sabiex tinterpreta r-ri żultati baxxi u fl-g ħażla ta' 
konċentrazzjoni xierqa tat-test.  
1.2. DEFINIZZJONJIET U UNITAJIET  
C T = konċentrazzjoni tal-kompost tat-test b ħala karbon organiku kif 
jinstab jew mi żjud mad-drena ġġ li jkun qag ħad fil-bidu tal- 
perjodu ta' aerjazzjoni (mg/litru),  
C t = konċentrazzjoni ta' karbon organiku ma ħlul li jinstab fit-ta ħlita 
supernatanta tat-test fit-tmien tal-perjodu ta' aerjazzjoni (mg/ ­
litru),  
C c = konċentrazzjoni ta' karbon organiku ma ħlul li jinstab fit-ta ħlita 
supernatanta tal-kontroll fit-tmien tal-perjodu ta' aerjazzjoni 
(mg/litru).  
Il-biodegradazzjoni hija definita b'dan il-metodu b ħala l-iskopariment 
tal-karbon organiku. Il-biodegradazzjoni tista' ti ġi espressa b ħala: 
1. Il-perċentwal tat-tne ħħija ta' D  da ta' l-ammont tas-sostanza 
miżjuda kuljum:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100  [1]  
fejn 
D da = degradazzjoni/ żieda ta' kuljum.  
2. Il-perċentwali tat-tne ħħija D  ssd ta' l-ammont tas-sostanza fil-bidu 
ta' kull jum:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2 (b)]  
fejn 
D ssd = degradazzjoni/bidu ta' sostanza tal- ġurnata;  
l-indiċi i u (i + 1) jirreferu g ħall-ġurnata li fiha sar il-kejl.  
Il-formula 2(a) hija rrakkomandata jekk l-effluwent DOC ivarja 
minn jum g ħal jum, filwaqt li l-formula 2(b) tista' tkun u żata meta 
l-effluwent DOC jibqa' relattivament kostanti minn ġurnata għall- 
oħra. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. SOSTANZI TA' REFERENZA  
Fċerti każijiet, meta xi sostanza ġdida tkun qed ti ġi investigata, s- 
sostanzi ta' referenza jistg ħu jkunu ta' benefi ċċju, però, m'hi rakkom ­
andata l-ebda sostanza ta' referenza hawnhekk.  
Id-data fuq bosta komposti evalwati fit-testijiet ring huma provduti 
(ara l-Appendi ċi 1) primarjament sabiex il-kalibrazzjoni tal-metodu 
tkun tista' ssir minn żmien għall-ieħor u sabiex tippermetti tqabbil 
tar-riżultati meta jkun applikat metodu ie ħor. 
1.4. METODU PRIN ĊIPALI TAT-TEST  
Tajn attivat minn impjant tat-trattament tad-drena ġġ huwa mpo ġġi 
f'unità ta' tajn attivat semikontinwu (SCAS). Il-kompost tat-test u d- 
drenaġġ li jkun qag ħad huma mi żjuda, u t-ta ħlita hija aerjata g ħall-23 
siegħa. L-aerjazzjoni hija imbag ħad imwaqqfa, it-tajn joqg ħod u t- 
taħlita supernatanta hija mne ħħija. 
It-tajn li jkun baqa' fil-kontenitur ta' aerjazzjoni huwa imbag ħad 
imħallat ma' alikwot ie ħor tal-kompost tat-test u d-drena ġġ, u ċ- 
ċiklu huwa imbag ħad ripetut.  
Il-bijodegradazzjoni hija stabbilita bid-determinazzjoni tal-kontenut 
tal-karbon organiku ma ħlul fit-taħlita supernatanta. Il-valur huwa 
imbagħad imqabbel ma dak misjub g ħat-taħlita miksuba mit-tubu 
ta' kontroll bid-do ża tad-drena ġġ li qagħad. 
Meta huwa u żat metodu spe ċifiku analitiku, t-tibdil fil-kon ċen­
trazzjoni tal-molekula ori ġinali min ħabba l-biodegradazzjoni tista' 
tiġi mkejla (bijodegrabilità primarja).  
1.5. KRITERJI TAL–KWALITÀ  
Ir-reprodu ċibilità ta' dan il-metodu bba żata fuq it-tne ħħija tal-karbon 
organiku ma ħlul għada ma ġietx stabilita. (Meta ti ġi kkonsidrata l- 
bijodegradazzjoni primarja, hija miksuba  data  preċiża ħafna għall- 
materjali li huma degradati estensivament.)  
Is-sensittività tal-metodu hija ddeterminata ħafna mill-varjabbilità tal- 
blank u, xi ftit inqas, mill-pre ċiżjoni tad-determinazzjoni tal-karbon 
organiku ma ħlul u l-livell tal-kompost tat-test fit-ta ħlita fil-bidu ta' 
kull ċiklu. 
1.6. DESKRIZZJONI TAL–PRO ĊEDRA TAT-TEST  
1.6.1.  Preparazzjonijiet  
Nurmu suffi ċjenti ta' unitajiet ta' aerjazzjoni nodfa, tista' ti ġi użata. l- 
unità SCAS ta' 1,5 litru ori ġinali u tubi li jda ħħlu l-arja (Figura 1) 
għall-kull sostanza tat-test u l-kontrolli huma mibnijin. Arja kkom ­
pressata fornita lill-unitajiet tat-test, mnaddfa b'tajjara, g ħandhom 
ikunu nodfa mill-karbon organiku u presaturati bl-ilma sabiex ji ġu 
mnaqqas t-telf min ħabba l-evaporazzjoni.  
Kampjun ta' ta ħlita, li fiha 1 sa 4 gr solidi/litru sospensjoni, hija 
miksuba mill-impjant tat-tajn attivat li jitratta predominament d- 
drenaġġ domestiku. Madwar 150 ml tat-ta ħlita huma me ħtieġa 
għall-kull unità ta' aerjazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Taħlit ta' l-istokk tas-sostanza tat-test hija ppreparata fl-ilma 
distillate; il-kon ċentrazzjoni normalment me ħtieġa hija ta' 400 mg/ ­
litru bħala karbon organiku li tag ħti konċentrazzjoni tal-kompost tat- 
test ta' 20 mg/litru fil-bidu ta' kull ċiklu ta' aerjazzjoni jekk ma sse ħħ 
l-ebda bijodegradazzjoni.  
Konċentrazzjonijiet og ħla huma permessi jekk it-tossi ċità tal-mikrog ­
aniżmi tippermettiha.  
Il-kontenut tal-karbon organiku tat-ta ħlita ta' l-istokk hija mkejla.  
1.6.2.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test għandu jsir f'temperatura ta' bejn 20 sa 25  o C. 
Għandha tintu ża konċentrazzjoni g ħolja tal-mikorgani żmi (minn 1 sa 
4 g/litru ta' solidi sospi żi), u l-perjodu effettiv ta'detenzjoni huwa ta' 
36 siegħa. Il-materjal karbona ċeju fid-drena ġġ huwa estensivament 
ossidizzat, normalment fi tmien sieg ħat wara li jkun inbeda ċ-ċiklu 
ta' aerjazzjoni. Wara dan, it-tajn jirrespira endo ġenament g ħall-bqijja 
tal-perjodu ta' aerjazzjoni, waqt dan il-perjodu l-uniku sostratt g ħad- 
disposizzjoni huwa l-kompost tat-test sakemm dan ma jkunx di ġa 
metabolizzat. Dawn il-fatturi, kkombinati mar-reinokulazzjoni ta' 
kuljum tat-test meta d-drena ġġ domestiku huwa u żat bħala l- 
materjal, jag ħti kondizzjonijiet favorevoli kemm g ħall-akklimatiz ­
zazzjoni u l-livelli g ħoljin ta' biodegradazzjoni.  
1.6.3.  Kif isir it-test  
Kampjun ta' ta ħlita minn impjant xieraq li jittratta predominalment 
tajn attivat jew unità tal-laboratorju huwa miksub u mi żmum 
aerobiku sakemm dan ikun u żat fil-laboratorju. Kull unità ta' 
aerjazzjoni kif ukoll l-unità ta' kontroll huma mimlijin b' 150ml tat-taħlita (jekk l-unita' ori ġinali SCAS hija u żata, immoltiplika l- 
volumi mog ħtija b' 10 darbiet) u l-aerjazzjoni b'hekk tkun bdiet. 
Wara 23 sieg ħa, l-aerjazzjoni hija mwaqqfa u t-tajn jit ħalla 
joqgħod għall-45 minuta. It-tapp ta' kull kontenitur jinfeta ħ, u 
għandhom jittie ħdu porzjonijiet ta' 100 ml tat-ta ħlita supernatanta. 
Kampjun ta' drena ġġ domestiku huma miksuba immedjatament 
qabel l-u żu, u 100 ml g ħandhom ji ġu miżjuda mat-tajn rimanenti 
f'kull unità ta' aerjazzjoni. L-aerjazzjoni g ħandha ter ġa tinbeda. 
F'dan l-istadju m'g ħandhom ji ġu miżjuda l-ebda materjali tat-test, u 
l-unitajiet huma mitmuma kuljum bid-drena ġġ domestiku biss 
sakemm it-ta ħlita supernatanta hija miksuba wara li jkun t ħalla jitq­
iegħed. Dan normalment jie ħu sa ġimgħatejn, li sa dak i ż-żmien il- 
karbon organiku ma ħlul fit-taħlita supernatanta fl-a ħħar taċ-ċiklu ta' 
aerjazzjoni twassal g ħal valur kostanti.
 
Fit-tmiem ta' dan il-perjodu, it-tajn individwali li jkun qag ħad huma 
mħallta, u għandu jiżdied 50 ml tat-tajn kompost li jirri żulta ma kull 
unità.  
95 ml tad-drena ġġ li jirriżulta u 5 ml ta' ilma huma mi żjuda ma' l- 
unitajiet ta' kontroll, u 95 ml tad-drena ġġ trattat u 5 ml tal-kompost 
xieraq tat-ta ħlita ta' l-istokk (400 mg/litru) huma mi żjuda ma' l- 
unitajiet tat-test. L-aerjazzjoni g ħandha ter ġa tinbeda u tkompli 
għal 23 sieg ħa. It-Tajn imbag ħad għandu jitħalla joqg ħod għal 
45 minuta u s-supernatant jittie ħed u annalizzat g ħall-kontenut ta' 
karbon organiku.  
Il-proċedura ta' mili u tne ħħija hija ripetuta regoalrment kuljum.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Qabel ma jit ħalla joqgħod, jaf ikun ne ċessarju li l-unitajiet jinaddfu 
sabiex jipprevjenu l-akkumulazzjoni ta' solidi 'l fuq mil-livell tal- 
likwidu. Barraxa differenti g ħandha tintu ża għal kull unità sabiex 
tiġi evitat l-kontaminazzjoni.  
Idejalment, il-karbonju organiku ma ħlul fit-taħlita supernatanta hija 
determinata kuljum, g ħalkemm anali żi inqas frekwenti tista' ssir 
ukoll. Qabel l-anali żi, it-taħlit huma ffiltrati permezz ta' filtri tal- 
membrena ma ħsula ta' 0,45 μm jew ċċentrifugati. Il-filtri tal- 
membrena huma xierqa jekk huwa assigurat li dawn ma jirrilaxxawx il-karbonju jew li ma jixorbux is-sostanza fil-fa żi tal-filtrazzjoni. It- 
temperatura tal-kampjun ma tistg ħax taqbeż l-40
 o C waqt li tkun 
qegħdha fiċ-ċentrifugu.  
It-tul tat-test tal-komposti li juru ftit jew xejn biodegradazzjoni hija 
indeterminata, imma l-esperjenza tissu ġġerixxi li din g ħandha tkun 
ta' l-anqas ta' 12-il ġimgħa, imma ta' mhux aktar minn 26 ġimgħa. 
2. DATA U VALUTAZZJONI  
Il-valuri tal-karbon organiku ma ħlul fit-taħlit supernatant ta' l- 
unitajiet tat-test u l-unitajiet ta' kontrol huma mpin ġija mal-ħin. 
Kif tkun qed ise ħħ il-biodegradazzjoni, il-livell misjub fit-test 
għandu jersaq lejn misjub g ħall-kontroll. La darba d-differenza 
bejn iż-żewġ livelli hija misjuba b ħala waħda kostanti fuq it-tlett 
kejliet konsekutivi, in-numru me ħtieġ ta' iktar kejl kif hemm b żonn 
sabiex ikun jista' jsir trattament statistikali tad-data u l-per ċentwali 
tal-biodegradazzjoni tal-kompost tat-test huwa kkalkolat (D  da jew 
D ssd , ara 1.2).  
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu, jekk possibbli, jkollu dan li ġej: 
— l-informazzjoni kollha fuq it-tip ta' drena ġġ, t-tip ta' unitajiet 
użati u r-ri żultati esperimentali dwar is-sostanza ttestjata, is- 
sostanza ta' referenza jekk u żata, u l-blank,  
— it-temperatura,  
— il-kurva ta' tne ħħija bid-deskrizzjoni, mod ta' kalkolazzjoni (ara 
1.2.),  
— d-data u l-lokazzjoni fejn, ittie ħed il-kampjun tat-tajn attivat u d- 
drenaġġ, status ta' adattazzjoni, kon ċentrazzjoni, e ċċ.., 
— raġunijiet xjentifi ċi għall-xi tibdil fil-pro ċedura tat-test,  
— firma u data.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Minħabba li s-sostanza li g ħandha tiġi ttestjata b'dan il-metodu mhux 
ser tkun biodegradabbli minn qabel, kwalunkwe tne ħħija ta' DOC 
minħabba l-biodegradazzjoni g ħandha tkun normalment gradwali fuq 
xi jiem jew ġimgħat, ħlief f'każijiet fejn l-akklimatizazzjoni se ħħ 
malajr kif indikat minn skompariment f'daqqa wa ħda li jseħħ wara 
ftit ġimgħat. 
Madankollu, l-assorbiment fi żikokemikali jista' xi kultant jkollu rwol 
importanti; dan huwa indikat meta jkun hemm tne ħħija kompleta jew 
parzjali tad-DOC mi żjud. Dak kollu li ji ġri sussegwentement 
jiddependi minn fatturi b ħall-gradi ta' assorbiment u l-kon ċen­
trazzjoni ta' bi ċċiet sospiżi fl-effluwenti mormi. Ġeneralment id- 
differenza bejn il-kon ċentrazzjoni ta' DOC fil-kontroll u t-test tat- 
taħlit supernatant ji żdied bil-mod minn valur inizjali baxx u din id- 
differenza tibqa' fil-valur ġdid għall-bqija ta' l-esperiment, sakemm 
ma sseħħx l-akklimatizazzjoni.  
Jekk għandha ssir distinzjoni bejn il-biodegradazzjoni (jew bijode ­
gradazzjoni parzjali) u l-assorbiment, huma ne ċessarji li jsiru aktar 
testijiet. Dan jista' jse ħħ f'numru ta' modi, imma l-iktar wie ħed 
konvinċenti huwa l-u żu ta' taħlita supernatanta, jew tajn, b ħala 
inoculum f'test ba żi (preferibbilment test respiromatiku).  
Is-sostanzi tat-test li jag ħtu rimi mhux assobiv g ħoli ta' DOC 
għandhom jitqiesu b ħala potenzalment biodegradabbli. Rimi 
parzjali, mhux assorbiv jindika li ta' l-anqas il-kemikali huwa soġġett għal xi biodegradazzjoni.
 
Rimi baxx, jew xejn, ta' DOC jista' jse ħħ minħabba l-inibizzjoni ta' 
mikrorgani żmi mis-sostanza tat-test u dan jista' jidher ukoll mill-le ża 
u t-telf tat-tajn, bir-rimi ta' supernatanti turbidi. Dan it-test g ħandu 
jiġI ripetut bl-u żu ta' konċentrazzjoni iktar baxxa tas-sostanza tat-test.  
L-użu tal-metodu analitiku spe ċifiku jew ta'  14 C-labelled sostanza tat- 
test tista' tippermetti aktar sensittività. Fil-ka ż ta' compost tat-test  
14 C, ir-rekupru tal-  14 CO 2 għandu jikkonferma li l-biodegradazzjoni 
tkun seħħet. 
Meta jing ħataw ukoll ir-ri żultati f'termini ta; biodegradazzjoni 
primarja, g ħandha ting ħata, sa fejn hu possibbli, spjegazzjoni dwar 
it-tibdil fl-istruttura kemikali li twassal g ħat-telf tar-ripons mis- 
sostanza ori ġinali tat-test.  
Il-validazzjoni tal-metodu analitiku g ħandha ting ħata flimkien mar- 
rispons li jinstab mill-materja tat-test blank.  
4. REFERENZI  
(1) OECD, Pari ġi, 1981, Linji Gwida g ħat-Testijet, 302 A, 
Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Appendiċi 1 
Test SCAS: e żempju tar-ri żultati  
Sostanza C T 
(mg/1) C t – C  c 
(mg/l) Perċentwali tal- 
biodegradazzjoni 
D da Dewmien tat-Test 
(ġranet)  
4-acetyl sulfonat tal-aminobenzene 17,2 2,0 85 40 
Sulfonat tat-tetra propylene benzene 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Diethylene tal-glikol 16,5 0,2 98,8 40 
Aniline 16,9 1,7 95,9 40 Cyclopentane tetra Karbossilat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Appendiċi 2 
Eżempju ta' l-apparatus tat-test
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIJOKON ĊENTRAZZJONI:  FLOW-THROUGH FISH TEST  
1. METODU  
Dan il-metodu ta' bijokon ċentrazzjoni hu repetizzjoni ta' l-OECD TG 
305 (1996).  
1.1. INTRODUZZJONI  
Dan il-metodu jiddiskrivi pro ċedura sabiex ji ġi karatterizzat il- 
potenzal tal-bijokon ċentrazzjoni ta' sustanzi fil- ħut taħt 
kondizzjonijiet li jg ħaddi minnhom. G ħalkemm ittestjar tar-re ġimi 
li jgħaddi minnu g ħandhom bil-wisq ji ġu preferuti, re ġimi semistati ċi 
huma permessi, ladarba l-kriterja tal-validità huma sodisfatti.  
Il-metodu jag ħti dettalji suffi ċjenti sabiex l-ittestjar ji ġi maħdum 
filwaqt li jippermetti libertà adegwata sabiex ji ġi xieraq id-disinn 
sperimentali g ħall-kondizzjonijiet f'laboratorji partikolari u sabiex 
jiġu varjati l-karatteristi ċi tat-test tas-sustanzi. Huwa aktar validament 
applikat g ħall-kimiċi organiċi stabbli b'valuri log tal-P  ow bejn il-1,5 u 
s-6,0 (1), i żda għadu jista' ji ġi applikat g ħall-sustanzi superlipholic (li 
jkollhom il-log tal-P  ow baxx > 6,0). L-istima li saret qabel tal-fattur 
tal-biokon ċentrazzjoni (BCF), xi kultant tiddenota b ħala K  B , ladarba 
t-tali sustanzi superlipophilic g ħandhom ikunu presumibbilment 
ogħla mill-fattur tal-stat stabbli (BCF  SS ) il-valur mistenni li ji ġi 
miksub mill-esperimenti tal-laboratorju. Stimi li saru qabel tal-fattur tal-biokon ċentrazzjoni g ħall-kimiċi organiċi b'valuri log tal-P
 ow sa 
bejn wieħed u ieħor 9,0 jistg ħu jiġu miksuba billi tkun u żata l- 
ekwazzjoni tal-Bintein et al (2). Il-parametri li jikkaratterizzaw il- potenzal tal-biokon ċentrazzjoni jinkludu r-rata kostanti tad-d ħul 
(k
 1 ), it-tisfija tar-rata kostanti (k  2 ) u l-BCF  SS . 
Sustanzi ta' l-ittestjar ittikettati tar-radjazzjoni jistg ħu jiffaċilitaw l- 
analiżi ta' l-ilma u tal-kampjuni tal- ħut u jistgħu jintużaw sabiex ji ġi 
ddeterminat/sabiex jiddetermina jekk l-identifikazzjoni u l- kwantifikazzjoni degradanti g ħandhomx ji ġu magħmula jew le. 
Jekk residwi totali radjuattivi jkunu mkejla (per e żempju permezz 
ta' kombustjoni jew tessut solubbli), il-BCF huwa bba żat fuq 
kompost tal- ġenitur, kull metabolite mi żmuma u wkoll karbonju 
assimilat. Il-BCFs bba żati fuq residwi totali radjuattivi ma jistg ħux, 
għalhekk, jkunu direttament imqabbla ma' BCF derivati minn anali żi 
kimika spe ċifika tal-kompost tal- ġenitur biss.
 
Proċeduri ta' tindifa sewwa jistg ħu jiġu mpjegati fl-istudji ttikettati 
tar-radjazzjoni sabiex ji ġi determinat il-BCF ibba żat fuq il-kompost 
tal-ġenitur, u l-metabolite ma ġġuri tistà ti ġi karatterizzata jekk ikun 
maħsub li jkun ne ċessarju. Huwa wkoll possibbli li tg ħaqqad l- 
istudju tal-metaboli żmu tal-ħut ma' l-istudju tal-biokon ċentrazzjoni 
bl'analiżi u l-identifikazzjoni tar-residwi fit-tessuti.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Biokonċentrazzjoni/bioakkumulazzjoni hija ż-żieda fil-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo jew fuq organi żmu (tessuti 
speċifiċi tiegħu) relattiv mal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta' l- 
ittestjar fil-mezz li ji ċċirkundah.  
Il-fattur tal-bijokon ċentrazzjoni (BCF jew K  B ) f'kull ħin matul il-fa żi 
tad-dħul ta' dan l-ittestjar ta' l-akkumulazzjoni hija l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq il-ħut jew it-tessuti spe ċifiċi tagħha 
(C f bħala μg/g (ppm)) divi żi mill-kon ċentrazzjoni tal-kimika fil-mezz 
li jdawru(Cw b ħala μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Il-fattur ta' l-istat stabbli tal-bijokon ċentrazzjoni (BCF  SS jew K  B ) ma 
jinbidilx b'mod sinifikattiv fuq perjodu m ġedded ta' żmien, il-kon ċ­
entrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar tal-mezz li jdawru matul dan il- perjodu ta' ħin.
 
Kondizzjoni jew stat stabbli hija mil ħuqa fl-għemil tas-sustanza ta' l- 
ittestjar bil- ħut (C  f ) kontra l- ħin meta l-kurva ssir parallela ma' l-assi 
tal-ħin u tlett anali żi taċ-C f magħmula fuq kampjuni me ħuda waqt l- 
intervalli ta' mill-inqas jumejn huma ma' l-± 20 % ta' xulxin, u ma 
hemmx differenzi sinifikattivi bejn it-tliet perjodi tat-te ħid tal- 
kampjuni. Meta l-kampjuni mi ġbura flimkien ikunu analizzati 
huma me ħtieġ mill-inqas erba' anali żi suċċessivi. Għas-sustanzi ta' 
l-ittestjar li huma me ħuda bil-mod jkun aktar xieraq li l-intervalli 
jkunu ta' sebat ijiem.  
Fatturi tal-bijokon ċentrazzjoni kalkulati direttament mir-rata kostanti 
kinetika (k  1 /k 2 ) huma msej ħa fattur tal-kon ċentrazzjoni kinetika, il- 
BCF  K . 
Il-qsim tal-koeffi ċjent ta' l-octanol-water (P  ow ) huwa l-proporzjon 
tas-solublità tal-kimika f'n-octanol u l-ilma fil-bilan ċ (metodu A.8) 
imfisser ukoll b ħala K  ow . Il-logaritmu tal-P  ow huwa wżat bħala indi­
kazzjoni tal-potenzal tal-kimika g ħall-biokon ċentrazzjoni ta' l- 
organiżmi akwati ċi. 
Il-fażi tal-ħruġ jew tad-d ħul huwa ż-żmien li matulu il- ħut jiġu 
esposti għall-ittestjar kimiku.  
Ir-rata kostanti tad-dhul (k  1 ) hija l-valur numeriku li jiddefinixxi r- 
rata taz-zieda fil-koncentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq l- 
ittestjar tal- ħut (jew tessuti spe ċifiċi tagħhom) meta l- ħut jkun espost 
għal dik il-kimika (k  1 huwa msejja ħ fl-ewwel ġurnata).  
Il-fażi ta' wara l- ħruġ jew tat-tisfija ta' l-impuritajiet (telf) huwa l- ħin, 
wara t-trasferiment ta' l-ittestjar tal- ħut mill-mezz li ji ġbor fih is- 
sustanza ta' l-ittestjar g ħal mezz liberu ta' dik is-sustanza, li matulu 
t-tisfija (jew it-telf nett) tas-sustanza mill- ħut ta' l-ittestjar (jew it- 
tessut spe ċifiku tieg ħu) jiġi studjat.  
Ir-rata tat-tisfija (telf) kostanti (k  2 ) huwa l-valur numeriku li 
jiddefinixxi r-rata tat-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta' l- 
ittestjar tal- ħut ta' l-ittestjar (jew it-tessuti spe ċifiċi tiegħu) wara t- 
trasferiment tal- ħut ta' l-ittestjar mill-mezz liberli ji ġbor fih is- 
sustanza ta' l-ittestjar (k  2 huwa msejja ħ fl-ewwel ġurnata).  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR  
L-ittestjar jikkonsisti f' żewġ fażijiet: il-fa żijiet tal-kxif (uptake) u ta' 
wara l-kxif (it-tisfija). Matul il-fa żi tad-dħul, gruppi separati ta' ħut 
ta' speċi waħda huma murija mill-inqas g ħal żewġ konċen­
trazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar. Imbag ħad jiġu trasferiti 
għall-mezz liberu tas-sustanza ta' l-ittestjar g ħall-fażi tat-tisfija. Il- 
fażi tat-tisfija hija dejjem ne ċessarja sakemm id-d ħul tas-sustanza 
matul il-fa żi tad-dħul kienet insinifikanti (e ż. il-BCF huwa inqas 
minn 10). Il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq il-ħut 
(jew it-tessut spe ċifiku tieghu) ji ġi segwit mi ż-żewġ fażijiet ta' l- 
ittestjar. Bi ż-żieda taż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar, grupp 
ta' kontroll tal- ħut huwa mi żmum taħt kondizzjonijiet identi ċi ħlief 
għall-assenza tas-sustanza ta' l-ittestjar, sabiex ji ġu konnessi effetti 
avversi possibbli osservati fl-ittestjar tal-bijokon ċentrazzjoni g ħall- 
grupp ta' kontroll li jaqbel u sabiex ji ġu miksuba kon ċentrazzjonijiet 
ta' l-isfond tas-sustanza ta' l-ittestjar.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Il-fażi tad-dħul titħaddem għal 28-il ġurnata sakemm jintwera li l- 
bilanċ intlaħaq qabel. Predizzjoni tat-tul tal-fa żi tad-dħul u l-ħin 
għall-istat stabbli tista' ti ġi magħmula mill-ekwazzjoni fl-Anness 
3. Il-perjodu tat-tisfija ji ġi mibdi mbag ħad billi l- ħut jiġi trasferit 
lill-istess mezz i żda mingħajr is-sustanza ta' l-ittestjar ġo reċipjent 
nadif ieħor. Fejn hu possibbli l-fattur tal-biokon ċentrazzjoni huwa 
kalkulat preferibbilment kemm b ħala l-proporzjon (BCF  SS ) tal-konċ­
entrament tal- ħut (C  f ) u fl-ilma (C  w ) għal dik li tidher stat stabbli u 
bħala fattur kinetiku tal-bijokon ċentrazzjoni (BCF  k ) bħala l- 
proporzjon tar-rati kostanti tad-d ħul (k  1 ) u t-tisfija (k  2 ) li jassumu 
l-kinetiċi ta' l-ewwel ordni. Jekk kineti ċi ta' l-ewwel ordni mhumiex 
ovvjament obduti, mudelli aktar kumplessi g ħandhom ji ġu mpjegati. 
(Anness 5).  
Jekk stat stabbli ma sse ħħx fi 28-il ġurnata, il-fa żi ta' l-uptake 
għandha tiġi estiża sakemm il-stat stabbli tintla ħaq, jew 60 jum, 
tiġi liema ti ġi l-ewwel; il-fa żi tat-tisfija tkun imbag ħad mibdija.  
Il-kostant tar-rata tad-d ħul, it-tisfija (telf) il-kostant tar-rata (jew il- 
kostanti, fejn mudelli aktar komplessi huma nvoluti), il-fattur tal- 
biokonċentrazzjoni, u fejn huwa possibbli, l-limiti tal-kunfidenza ta' 
kull wieħed minn dawn il-parametri huma kalkulati mill-mudell li 
jiddeskrivi bl-a ħjar mod il-kon ċentrazzjonijiet mkejla tas-sustanza ta' 
l-ittestjar tal- ħut u l-ilma.  
Il-BCF hija msej ħa bħala funzjoni ta' l-u żien imxarrab totali tal- ħut. 
Madankollu, g ħall-għanijiet spe ċjali, tessuti jew organi spe ċifiċi (eż. 
muskolu, fwied), jistghu jintu żaw jekk il- ħut huwa kbir bi żżejjed jew 
jekk il-ħut jista' jinqasam fi frazzjonijiet li jittieklu (maqtug ħ fi 
strixxi) u li ma jittieklux (vixxri). Ladarba, g ħal ħafna sustanzi 
organiċi, hemm relazzjoni ċara bejn il-potenzal g ħall-biokon ċen­
trazzjoni u l-lipophilicity, hemm ukoll relazzjoni korrispondenti 
bejn il-kontenut tal-lipidu tal- ħut ta' l-ittestjar u l-biokon ċentrazzjoni 
osservata tat-tali ħut. Għalhekk, sabiex dan is-sors ta' varjabilità ji ġi 
mnaqqas fir-ri żultati ta' l-ittestjar g ħal dawk is-sustanzi b'lipophilicity 
għolja (jiġifieri b'log tal-P  ow > 3), il-biokon ċentrazzjoni g ħandha tiġi 
espressa skond il-kontenut tal-lipidu mi żjud mal-pi ż tal-ġisem kollu.  
Il-kontenut tal-lipidu g ħandu jiġi determinat fuq l-istess materjal 
bijoloġiku ladarba huwa w żat sabiex jiddetermina l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza ta' l-ittestjar, meta possibbli.  
1.4. INFORMAZZJONI DWAR IS–SUSTANZA TA' L-ITTESTJAR  
Qabel ma jsir l-ittestjar g ħall-biokon ċentrazzjoini, din l-informazzjoni 
li ġejja għas-sustanza ta' l-ittestjar g ħandha tkun mag ħrufa:  
— solubilità fl-ilma;  
— koeffi ċjenti tal-qsim ta' l-octanol-water P  ow (indikat ukoll b ħala 
K ow , determinat minn metodu ta' l-HPLC A.8);  
— idrolisi;  
— fototrasformazzjoni ġo l-ilma determinata ta ħt illuminazzjoni 
solari jew illuminazzjoni solari simulata u ta ħt il-kondizzjonijiet 
ta' l-illuminazzjoni ta' l-ittestjar g ħall-bijokon ċentrazzjoni (3);  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— tensjoni tal-wi ċċ (jiġifieri għall-sustanzi fejn il-logaritmu tal-P  ow 
ma jistax ji ġi determinat);  
— pressjoni tal-fwar;  
— bijodegradibilità lesta (fejn xieraq).  
Informazzjoni o ħra meħtieġa hija t-tossi ċità għall-ispeċi tal-ħut li 
għandha tintu ża fl-ittestjar, preferibbilment l-asintot LC  50 (jiġifieri 
indipendenti mill-hin). Metodu analitiku xieraq, ta' reqqa mag ħrufa, 
preċiżjoni u sensittività, g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza ta' l- 
ittestjar fis-soluzzjonijiet ta' l-ittestjar u f'materjal biolo ġiku għandu 
jkun disponibbli, flimkien mad-dettalji tal-preparazzjoni tal-kampjun u tal-ħażna. Il-limitu ta' l-iskoperta analitika tas-sustanza ta' l-ittestjar 
kemm ta' l-ilma kif ukoll tat-tessuti tal- ħut għandhom ukoll ji ġu 
magħrufa. Meta sustanza ta' l-ittestjar bit-tikketta
 14 C hija użata, il- 
persentaġġ tar-radjuattività asso ċjat ma' l-impuritajiet g ħandu jiġi 
magħruf. 
1.5. VALIDITÀ TA' L-ITTESTJAR  
Il-kondizzjonijiet li jsegwu g ħandhom japplikaw sabiex l-ittestjar 
ikun validu:  
— il-varjazzjoni tat-temperatura hija inqas minn ± 2  o C, 
— il-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu maħlul ma jaqax ta ħt is-60 % 
tas-saturazzjoni,  
— il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-kmamar hija 
miżmuma sa l-± 20 % tal-medja tal-valuri mkejla matul il-fa żi 
tad-dħul, 
— il-mortalità jew effetti avversi o ħra/marda kemm fil-kontroll u fil- 
kura tal-ħut hija inqas minn 10 % fl-a ħħar ta' l-ittestjar; fejn l- 
ittestjar huwa m ġedded fuq ħafna ġimgħat jew xhur, mewt jew 
effetti avversi fi ż-żewġ settijiet tal- ħut għandha tkun inqas minn 
5 % kull xahar u ma taqbi żx it-30 % b'kollox.  
1.6. KOMPO ŻIZZJONIJIET TA' REFERENZA  
L-użu ta' kompo żizzjonijiet ta' referenza ta' potenzal tal-bijokon ċen­
trazzjoni mag ħruf ikun b żonnjuż sabiex il-pro ċedura sperimentali ti ġi 
ċekkjata, meta huwa me ħtieġ. Madankollu, sustanzi spe ċifiċi 
għadhom ma jistg ħux jiġu rakkomandati.  
1.7 DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR  
1.7.1.  Apparat  
Għandha ting ħata kura sabiex ikun jista' ji ġi evitat l-u żu tal-materjali, 
għall-partijiet kollha tat-tag ħmir, li jistg ħu jħollu, jaqbdu ma' jew 
ikollhom effett avvers fuq il- ħut. Tankijiet standard rettangulari jew 
ċilindriċi, magħmula minn materjal kimiku inerti u ta' kapa ċità adatta 
b'konformità mar-rata tal-karga jistg ħu jiġu wżati. L-użu ta' tubi tal- 
plastik artab g ħandu jiġi mnaqqas. Teflon (R), stainless steel u/jew 
tubi tal-ħġieġ huma preferibbilment u żati. L-esperjenza wriet li s- 
sustanzi b'koeffi ċjenti ta' l-assorbiment g ħolja, bħall-pyrethroids 
sintetiċi, ħġieġ silanised jista' jkun me ħtieġ. F'dawn is-sitwazzjonijiet 
it-tagħmir għandu jiġi mormi wara l-u żu. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Ilma  
L-ilma naturali huwa ġeneralment u żat fl-ittestjar u g ħandu jiġi 
miksub minn sors mhux ikkontaminat u ta' kwalità uniformi. L- ilma li jit ħallat għandu jkun ta' kwalità li g ħandha tippermetti s- 
sopravivenza ta' l-ispe ċi ta' ħut magħżula għad-dewmien ta' l-akkli ­
mazzjoniu perjodi ta' l-ittestjar ming ħajr kull apparenza jew im ġieba 
anormali. Idealment, g ħandu jiġi muri li l-ispe ċi għall-ittestjar jistg ħu 
jgħixu, jikbru u jirriprodu ċu fl-ilma li jit ħallat (eż. fil-kultura tal- 
laboratorju jew l-ittestjar tat-tossità ta ċ-ċiklu tal-ħajja). L-ilma 
għandu jkun karatterizzat mill-inqas minn pH, twebbis, solidi 
totali, karbonju organiku totali u, preferibbilment ammonju wkoll, 
nitrit u alkalinità u, g ħall-ispeċi marini, s-salinita. Il-parametri li 
huma importanti g ħall-aħjar benesseri tal- ħut huma mag ħrufa 
kollha, iżda l-Anness 1 jag ħti konċentrazzjonijiet massimi rakkom ­
andati ta' numru ta' parametri g ħal ilmijiet friski u marini ta' l- 
ittestjar.
 
L-ilma għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu ta' l-ittestjar. 
Il-valur tal-pH g ħandu jkun ta' bejn il-limiti ta' 6,0 sa 8,5, i żda matul 
l-ittestjar spe ċifiku għandu jkun bejn il-limiti ta' unitajiet ± 0,5 tal- 
pH. Sabiex ikun assigurat illi t-ta ħlit ta' l-ilma ma jinfluwenzax 
b'mod inkorrett ir-ri żultat ta' l-ittestjar (per e żempju, bit-tifsira tas- 
sustanza ta' l-ittestjar) jew avversament jaffettwa l-e żekuzzjoni ta' l- 
istokk tal- ħut, kampjuni g ħandhom ji ġu mogħtija kull ftit żmien 
għall-analiżi. Id-determinazzjoni ta' metalli tqal (e ż.. Cu, Pb, Zn, 
Hg, Cd, Ni), anjoni u cations (e ż. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO  4 ), 
pestiċidi (eż. pestiċidi organophosphorous totali u organochlorine 
totali), karbonju organiku totali u solidi sospi żi għandhom 
jintagħmlu, per e żempju, kull tlett xhur fejn ilma m ħallat huwa 
magħruf li l-kwalità hija relativament kostanti. Jekk il-kwalità ta' l- 
ilma ġiet murija b ħala kostanti mill-inqas fi żmien sena, id-deter ­
minazzjonijiet jistg ħu jkunu inqas frekwenti u l-intervalli mi żjuda 
(eż. kull sitt xhur).  
Il-kontenut naturali tal-partikola wkoll il-karbonju organiku totali 
(TOC) ta' l-ilma tat-ta ħlit għandu jkun baxx kemm jista' jkun 
sabiex ji ġi evitat l-assorbiment tas-sustanza ta' l-ittestjar g ħall- 
oġġett organiku li jista' jnaqqas il-biodisponibilità tieg ħu (4). Il- 
valur massimu a ċċettabbli huwa ta' 5 mg/l g ħall-oġġett partikolari 
(oġġett niexef/xott, li ma jag ħddix il-filtru ta' 0,45 μm) u 2 mg/l 
għall-karbonju totali organiku (ara Anness 1). Jekk hemm b żonn, 
l-ilma għandu jiġi filtrat qabel l-u żu. Il-kontribuzzjoni g ħall- 
kontenut organiku tal-karbonju fl-ilma mill- ħut ta' l-ittestjar 
(eskreta) u mir-residwi ta' l-ikel g ħandha tkun baxxa kemm jista' 
jkun. Matul l-ittestjar, il-kon ċentrazzjoni tal-karbonju organiku fir- 
reċipjent ta' l-ittestjar ma g ħandux jaqbe ż il-konċentrazzjoni tal- 
karbonju organiku li jori ġina mis-sustanza ta' l-ittestjar u, jekk ikun 
użat, l-aġent li jitħallat b'iktar minn 10 mg/l (± 20 %).  
1.7.3.  Soluzzjonijiet ta' l-ittestjar  
Soluzzjoni ta' l-istokk tas-sustanza ta' l-ittestjar hija preparata f'kon ċ­
entrazzjoni adattata. Is-soluzzjoni ta' l-istokk g ħandha preferibbilment 
tiġi preparata billi sempli ċiment tkun im ħallta u mċaqalqa s-sustanza 
ta' l-ittestjar fl-ilma li jit ħallat. L-u żu ta' solventi jew jew li jixterdu 
(aġenti li jit ħalltu) ma huwiex rakkomandat; madankollu dan jista' 
jseħħ f'xi okka żjonijiet sabiex tkun prodotta soluzzjoni ta' l-istokk 
ikkonċentrata xierqa. Solventi li jistg ħu jintużaw huma ethanol, 
methanol, eteru ethylene glikol monomethyl, eteru etheylene glikol dimethyl, dimethylformamide u glikol triethylene. Sustanzi li jixterdu 
li jistgħu jintużaw huma Cremophor RH40, Tween 80, methylcel ­
lulose 0,01 % u HCO-40. Kura g ħandha ting ħata meta jintu żaw 
aġenti lesti bijodigradabbli ladarba dawn jistg ħu jikkaw żaw 
problemi bit-tkabbir batteriku fl-ittestjar li jag ħaddi minnu. Is- 
sustanza ta' l-ittestjar jista' ti ġi tikettata bir-radjazzjoni u g ħandha 
tkun ta' l-akbar purità (e ż. preferibbilment > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Għat-testijiet li jg ħaddi minnhom, sistema li kontinwament 
tiddispensa u t ħallat soluzzjoni ta' l-istokk tas-sustanza ta' l-ittestjar 
(eż. pompa tal-miter, ta ħlit proporzjonali, sistema li tissatura) hija 
meħtieġa sabiex tikkunsinna l-kon ċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar tal- 
kmamar ta' l-ittestjar. Mill-inqas ħames sostituzzjonijiet tal-volum 
minn kull kamra ta' l-ittestjar kull ġurnata huma permessi. Il-mod 
li jgħaddi minnu g ħandu jkun preferut, i żda fejn dan m'huwiex 
possibbli (e ż. fejn l-organi żmi ta' l-ittestjar huma avversament 
affettwati) teknika semistatika tista' tintu ża ladarba l-kriterji tal- 
validità jkunu sodisfatti. Ir-rati li jimxu/jg ħaddu tas-soluzzjonijiet 
ta' l-istokk u l-ilma tat-ta ħlit għandhom it-tnejn ikunu kontrollati 
48-il sieg ħa qabel u mbag ħad mill-inqas kuljum matul l-ittestjar. 
F'dan il-kontroll tad-determinazzjoni tar-rata li tg ħaddi ta' kull 
kamra ta' l-ittestjar hija inklu ża u assigurata li ma tvarjax b'aktar 
minn 20 % jew ġo inkella bejn il-kmamar.  
1.7.4.  Selezzjoni ta' spe ċi 
Kriterji importanti fis-selezzjoni ta' l-ispe ċi huma li huma dejjem lesti 
disponibbli, jistg ħu jitkisbu f'daqsijiet konvenjenti u jistg ħu jkunu 
b'mod sodisfa ċenti mantenuti fil-laboratorju. Kriterji o ħra sabiex 
jiġu selezjonati l-ispe ċi tal-ħut jinkludu importanza rekreazzjonali, 
kummerċjali, ekolo ġika wkoll sensittività komparattiva, l-u żu li 
rnexxa qabel, e ċċ. 
Speċi rakkomandati g ħall-ittestjar huma stabbiliti fl-Anness 2. Spe ċi 
oħrajn jistg ħu jintużaw iżda il-proċedura ta' l-ittestjar jista' jkollha 
tiġi xierqa sabiex jing ħataw kondizzjonijiet xierqa ta' l-ittestjar. Ir- 
razzjonal g ħas-selezzjoni ta' l-ispe ċi u l-metodu sperimentali g ħandu 
jkun irrapportat f'dan il-ka ż. 
1.7.5.  Is-sehem tal- ħut 
Akklimatizza il-popolazzjoni ta' l-istokk tal- ħut mill-inqas g ħal 
ħmistax fl-ilma fit-temperatura ta' l-ittestjar u g ħalef fuq dieta 
suffiċjenti u ta' l-istess tip li jintu ża waqt l-ittestjar.  
Wara perjodu ta' 48-il sieg ħa jissetiljaw, l-imwiet huma rre ġistrati u 
l-kriterji li ġejjin huma applikati:  
— imwiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: 
jintrema n-numru s ħiħ tal-ħut, 
— imwiet ta' bejn il-5 u l-10 % tal-popolazzjoni f'sebat-ijiem: akli ­
matizza g ħal sebat ijiem o ħra, 
— imwiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat-ijiem: ta ċċetta 
l-grupp/numru ta' ħut – jekk ikun hemm aktar minn 5 % imwiet 
matul it-tieni sebat-ijiem tarmi il-grupp kollu.  
Tassigura li l- ħut użat fl-ittestjar huma liberi minn mard u a anormal ­
itajiet osservabbli. Skarta kull ħut infettat/marid. Il- ħut ma għandux 
jirċievi trattament g ħall-mard fil- ħmistax ta' qabel l-ittestjar, jew 
matul l-ittestjar.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. E ŻEKUZZJONI TA' L-ITTESTJAR  
1.8.1.  Ittestjar preliminari  
Jista' jkun utli li jitmexxa speriment preliminari sabiex jittejbu l- 
kondizzjonijiet ta' l-ittestjar ta' l-ittestjar definittiv, e ż. selezzjoni 
tal-konċentrazzjoni(ijiet) tas-sustanza ta' l-ittestjar, dewmien tad- 
dħul u fażijiet tat-tisfija.  
1.8.2.  Kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.8.2.1. D e w m i e n t a l - f a ż i t a d - d ħ u l 
Tbassir tad-dewmien tad-d ħul jista' jinkiseb minn esperjenza prattika 
(eż. minn studju li sar qabel jew minn kimika dwar l-akkumu ­
lazzjoni) jew minn ċerti relazzjonijiet empiri ċi li jużaw it-tag ħrif 
jew tas-solubilità ta' l-ilma jew il-koeffi ċjent tal-qsim ta' l-octanol/l- 
ilma tas-sustanza ta' l-ittestjar (ara Anness 3).  
Il-fażi ta' l-uptake g ħandha sse ħħ għall-28-il ġurnata sakemm jista' 
jintwera li l-bilan ċ ġie milħuq qabel. Jekk l-istat stabbli ma ntla ħaqx 
sa 28-il ġurnata, il-fa żi ta' l-uptake g ħandha tiġi estiża, tistabbilixxi 
aktar miżuri, sakemm l-istat stabbli ji ġi milħuq jew 60-il ġurnata, 
ikun liema jkun l-iqsar.  
1.8.2.2. D e w m i e n t a l - f a ż i t a t - t i s f i j a  
Perjodu ta' nofs id-dewmien tal-fa żi ta' l-uptake hija s-soltu suffi ċ­
jentement g ħal-riduzzjoni xierqa fil-pi ż tal-ġisem (eż. 95 %) tas- 
sustanza biex isse ħħ (ara Anness 3 g ħall-ispjegazzjoni ta' l-istima). 
Jekk il-ħin meħtieġ biex jintla ħaq 95 % tat-telf mhux prattikament 
twil, li jaqbe ż per eżempju darbtejn id-dewmien normali tal-fa żi tad- 
dħul (jiġifieri aktar minn 56-il ġurnata) perjodu iqsar jista' jkun u żat 
(jiġifieri sakemm il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar hija 
inqas minn 10 % tal-kon ċentrazzjoni tal-stat stabbli). Madankollu, 
għall-sustanzi li g ħandhom mudelli aktar kumplessi tad-d ħul u t- 
tisfija milli huma rappre żentati minn mudell tal- ħut ta' kumpartiment 
wieħed, ipprovdi kineti ċi ta' l-ewwel ordni, ippermetti fa żijiet tat- 
tisfija itwal g ħad-determinazzjoni tal-kostanti tar-rata tat-telf. Il- 
perjodu jista', madankollu, jkun immexxi mill-perjodu li fuqu l-kon ċ­
entrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-fdal tal- ħut fuq il-limitu ta' l- 
iskoperta analitika.  
1.8.2.3. N u m r i t a ' ħ u t t a ' l - i t t e s t j a r  
Għażel in-numri ta' ħut għal kull kon ċentrazzjoni ta' l-ittestjar b'mod 
li l-minimu ta' erbg ħa ħutiet għal kull kampjun huma/huwa 
disponibbli f'kull kampjun. Jekk poter statistiku ikbar huwa 
meħtieġ, aktar ħut għal kull kampjun g ħandu jkun ne ċessarju.  
Jekk ħut adult jintu ża, irraporta jekk humiex ir ġiel jew nisa, jew it- 
tnejn li jintu żaw fl-esperiment. Jekk i ż-żewġ sessi huma u żati, 
differenzi fil-kontenut tal-lipidu bejn is-sessi g ħandu jkun doku ­
mentat li ma g ħandux sinifikat qabel il-bidu ta' l-espo żizzjoni; 
iġbor flimkien l- ħut irġiel u nisa kollha jista' jkun ne ċessarju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
F'xi wieħed mill-ittestjar, il- ħut ta' l-istess pi ż huwa mag ħżul, b'mod 
li l-iżgħar mhumiex i żgħar minn tnejn minn tlieta tal-pi ż ta' l-ikbar 
ħut. Kollha g ħandhom ikunu ta' l-istess sena-klassi u ji ġu mill-istess 
sors. Ladarba l-pi ż u l-età/ ż-żmien ta' ħut jidhru xi kultant li 
għandhom xi effett sinifikanti fuq il-valuri tal-BCF (1) dawn id- 
dettalji huma rraportati b'reqqa. Huwa rakkomandat li sub-kampjun 
ta' l-istokk tal- ħut huma ppe żati qabel l-ittestjar sabiex ji ġi stimat il- 
piż medju.  
1.8.2.4. T a g ħ b i j a  
Proporzjoni g ħolja ta' l-ilma mal- ħut jintużaw sabiex tonqos ir- 
riduzzjoni fis-C  w ikkawżat miż-żieda ta' ħut fil-bidu ta' l-ittestjar u 
sabiex jiġi evitat it-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu mħallat. 
Huwa mportanti li r-rata tat-tag ħbija tkun xierqa g ħall-ispeċi ta' l- 
ittestjar u żat. F'kull ka ż, rata tat-tag ħbija ta' 0,1 sa 1,0 g ta' ħut (wet 
weight) g ħal kull litru fil- ġurnata hija normalment rakkomandata. 
Rati għolja tat-tag ħbija jistgħu jkunu u żati jekk ikun muri li l-kon ċ­
entrazzjonijiet me ħtieġa tas-sustanza ta' l-ittestjar jistg ħu jkunu 
mantnuti/mi żmuma f'limiti ta' ± 20 %, u li l-kon ċentrazzjoni ta' l- 
ossiġenu mħallat ma jaqax ta ħt saturazzjoni ta'60 %.  
Fl-għażla tar-reġimi xierqa tat-tag ħbija, reġistrazzjoni/account ta' l- 
abitat normali ta' l-ispe ċi tal-ħut huwa me ħud. Per e żempju, ħut li 
jgħix fil-qieg ħ jista' jirrikjedi qieg ħ ta' l-akwarjum ikbar g ħall-istess 
volum ta' ilma minn spe ċi ta' ħut pelaġiku. 
1.8.2.5. G ħ a l f 
Matul l-akklimazzjoni u l-perjodi ta' l-ittestjar, il- ħut jkunu mag ħllfa 
b'dieta xierqa ta' lipidi mag ħrufa u kontenut totali tal-proteini total 
protein content, f'ammont suffi ċjenti li j żommhom f'kondizzjoni 
sanitarja u li jmantni l-pi ż tal-ġisem. Il-ħut huma mag ħlufa kuljum 
mill-/permezz tal-perjodi ta' l-akklimazzjoni u l-perjodi ta' l-ittestjar f'livell ta' bejn wie ħed u ieħor ta' piż tal-ġisem ta' 1 sa 2 % kull 
ġurnata; din i żżomm il- kon ċentrazzjoni tal-lipidu f' ħafna speċi ta' 
ħut f'livell relattivament kostanti matul l-ittestjar. L-ammont ta' g ħalf 
għandu jerġa' jiġi kkalkulat, per e żempju, darba f' ġimgħa, sabiex ji ġu 
mantnuti pi ż tal-ġisem konsistenti u kontenut tal-lipidu. G ħal din il- 
kalkulazzjoni, il-pi ż tal-ħut f'kull kamra ta' l-ittestjar jista' jkun 
estimat mill-pi ż tal-ħut miġbura l-iktar re ċenti f'dik il-kamra. 
Tiżinx il-ħut li jibqa' fil-kamra.
 
Ikel mhux mittiekel u l- ħmieġ huma mog ħddija minn sifun siphoned 
kuljum mill-kamri ta' l-ittestjar e żatt wara l-g ħalf (30-il minuta sa 
siegħa). Il-kmamar huma mi żmuma ndaf kemm jista' jkun matul l- 
ittestjar sabiex il-kon ċentrazzjoni tas-sitwazzjoni organika tinzamm 
baxxa kemm jista' jkun, ladarba l-pre żenza tal-karbonju organiku 
jista' jillimita l-biodisponibilità tas-sustanza ta' l-ittestjar (1).  
Ladarba ħafna għalf ġej mill-ikel tal- ħut, l-għalf għandu jiġi analizzat 
għas-sustanza ta' l-ittestjar. Huwa ukoll mixtieq li l-g ħalf jiġi 
analizzat g ħall-pestiċidi u l-metalli tqal.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. D a w l u t e m p e r a t u r a  
Il-fotoperjodu huwa ġeneralment 12 sa 16-il sieg ħa u t-temperatura 
(± 2  o C) għandha tkun xierqa g ħall-ispeċi ta' l-ittestjar (ara l-Anness 
2). It-tip u l-karatteristi ċi ta' l-illuminazzjoni g ħandhom ikunu 
magħrufa. Kawtiela g ħandha tkun mog ħtija lill-possibbli fototrans ­
formazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ta ħt kondizzjonijiet ta' l-irrad ­
jazzjoni ta' l-istudju. Illuminazzjoni xierqa g ħandha tintu ża tevita 
espożizzjoni tal- ħut għal fotoprodotti mhux naturali. F'xi ka żijiet 
jista' jkun xieraq li jintu ża filtru sabiex ti ġi eżaminata/screen out l- 
irradjazzjoni tal-UV anqas minn 290 nm.  
1.8.2.7. K o n ċ e n t r a z z j o n i j i e t t a ' l - i t t e s t j a r  
Il-ħut huwa espost ta ħt kondizzjonijiet li jag ħddi minnhom g ħal mill- 
inqas żewġ konċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar fl-ilma. 
Normalment, l-g ħola (jew l-g ħola) konċentrazzjoni tas-sustanza ta' 
l-ittestjar hija mag ħżula li tkun ta' madwar 1 % ta' l-asintot intens 
tiegħu LC  50 , u sabiex ikunu mill-inqas ten-fold g ħola mill-limitu ta' 
l-iskoperta tag ħhom fl-ilma bil-metodu analitiku u żat. 
L-ogħla konċentrazzjoni ta' l-ittestjar tista' tkun determinata billi 
tiddividi l-akut 96h LC  50 bi proporzjon xieraq akut/kroniku (pro ­
porzjonijiet xierqa g ħal xi wħud mill-kimi ċi jistgħu ikunu bejn 
wieħed u ieħor tlieta sa 100). Jekk ikun possibbli, g ħażel il-konċen­
trazzjoni(jiet) l-o ħra b'mod li jiddistingwi ru ħu minn dak ta' fuq bil- 
fattur ta' g ħaxra 10. Jekk dan mhuwiex possibbli min ħabba fil-1 % 
tal-kriterja ta' l-LC  50 u l-limitu analitiku, fattur aktar baxx minn 10 
jista' jkun u żat jew l-u żu ta' sustanza ta' l-ittestjar ittikettata  14 C 
għandu jkun ikkunsidrat. L-ebda kon ċentrazzjoni u żata ma għandha 
tkun għola mis-solubilità tas-sustanza ta' l-ittestjar.  
Fejn aġent solubbli huwa u żat il-konċentrazzjoni tieg ħu ma għandiex 
tkun ikbar minn 0,1 ml/l u g ħandha tkun l-istess fir-re ċipjenti kollha 
ta' l-ittestjar. Il-kontribuzzjoni tieg ħu, flimkien mas-sustanza ta' l- 
ittestjar, il-kontenut kollu tal-karbonju organiku fl-ilma ta' l-ittestjar 
għandu jkun mag ħruf. Madankollu, kull sforz g ħandu jiġi magħmul 
sabiex jiġi evitat l-u żu tat-tali materjali.  
1.8.2.8. K o n t r o l l i  
Kontroll ta' l-ilma tat-ta ħlit jew jekk relevanti, kontroll li ji ġbor ġo 
fih l-aġent li titħallat should be run mi żjud mas-serje ta' l-ittestjar, 
ladarba kien stabbilit li l-a ġent ma g ħandu l-ebda effett fuq il- ħut. 
Jekk le, i ż-żewġ kontrolli g ħandhom jitwaqqfu/ji ġu stabbiliti.  
1.8.3.  Frekwenza tal-mi żuri tal-kwalità ta' l-ilma  
Matul l-ittestjar, l-ossi ġenu maħlul, TOC, pH u t-temperatura 
għandhom jitwie żnu fil-kontenuti kollha. Twebbis totali u salinità, 
jekk relevanti, g ħandhom ikunu mi żurati fil-kontrollijiet u re ċipjent 
fl-għola (l-għola) konċentrazzjoni. B ħala minimu, l-ossi ġenu mħallat 
u s-salinità, jekk relevanti, g ħandhom ikunu mi żurati tlett darbiet fil- 
bidu, għan-nofs u g ħall-aħħar tal-perjodu ta' l-uptake– u darba 
f'ġimgħa fil-perjodu tat-tisfija. TOC g ħandu jkun mi żurat fil-bidu 
ta' l-ittestjar (24 sieg ħa u 48 sieg ħa qabel l-inizjazzjoni ta' l- 
ittestjar tal-fa żi ta' l-uptake) qabel i ż-żieda tal-ħut u mill-inqas 
darba f'ġimgħa, kemm matul il-fa żi ta' l-uptake kif ukoll dik tat- 
tisfija. It-temperatura g ħandha tkun mi żurara kuljum, il-pH fil-bidu 
u fl-aħħar ta' kull perjodu u t-twebbis darba f'kull ittestjar. It- 
temperatura g ħandha preferibbilment ti ġi kkontrollata kontinwament 
mill-inqas f're ċipjent wie ħed. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Il-kontroll u l-anali żi tal-ħut u l-ilma  
1.8.4.1. S k e d a t a l - k o n t r o l l t a l - ħ u t u l - i l m a  
L-ilma mill-kmamar ta' l-ittestjar g ħad-determinazzjoni tal-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar tittie ħed għall-kampjun qabel i ż- 
żieda tal-ħut kemm matul il-fa żijiet tad-d ħul kif ukoll dik tat-tisfija. 
Bħala minimu, l-ilma fl-istess ħin tal-ħut u qabel l-g ħalf. Matul il- 
fażi tad-dħul, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar huma 
ddeterminati sabiex ti ġi kkontrollata l-konformità bil-kriterja tal- 
validità.  
Il-ħut huwa kkontrollat fuq mill-inqas ħames okka żjonijiet matul il- 
fażi ta' l-uptake u mill-inqas erbg ħa okkażjonijiet matul il-fa żi tat- 
tisfija. Ladarba fuq xi okka żjonijiet għandu tkun diffi ċli li tiġi kkal­
kulata stima pre ċiża raġonevoli tal-valur tal-BCF ibba żat fuq dan in- 
numru ta' kampjuni, spe ċjalment meta minbarra t-tisfija tal-kineti ċi 
ta' l-ewwel ordni huma ndikati, jista' jkun rakkomandat li jittie ħdu 
kampjuni bi frekwenza g ħola fiż-żewġ perjodi (ara Anness 4). Il- 
kampjuni ż-żejda huma mi żmuma u analizzati biss jekk ir-ri żultati ta' 
l-ewwel fa żi ta' l-anali żi turi li mhijiex adegwata g ħall-kalkulazzjoni 
tal-BCF bil-pre ċiżjoni mixtieqa.  
Eżempju ta' skeda a ċċettabbli tal-kontrolli huwa mog ħti fl-Anness 
4. Skedi o ħrajn jistg ħu jiġu kkalkulati mill-ewwel ju żaw valuri 
oħra assunti tal-P  ow sabiex jiġi kkalkulat il- ħin ta' l-espo żizzjoni 
għall-95 % tad-d ħul. 
It-teħid tal-kampjuni jitkompla matul il-fa żi ta' l-uptake sakemm 
kondizzjoni li ma tinbidilx ti ġi stabbilita jew 28-il jum, ikun liema 
jkun l-iqsar. Jekk l-istat stabbli ma jkunx intla ħaq f'28-il jum kontroll 
ikompli sakemm stat stabbli jkun intla ħaq jew g ħal 60 jum, ikun 
liema jkun l-iqsar. Qabel ma tinbeda l-fa żi tat-tisfija l- ħut jiġi trasferit 
f'tankijiet nodfa.  
1.8.4.2. K o n t r o l l u p r e p a r a z z j o n i t a l - k a m p j u n  
Kampjuni ta' l-ilma g ħall-analiżi huma miksuba, per e żempju, jmexxi 
minn ġo sifun minn punt ċentrali fil-kamra ta' l-ittestjar billi tag ħddi 
minn sifun minn tubi inerti minn punt ċentrali. Ladarba la l- 
filtrazzjoni lanqas billi jinfired il-likwidu mis-solidu ma jidher dejjem jissepara l-frazzjoni mhux bijodisponibbli (spe ċjalment 
għall-kimiċi superlipophilic, ji ġifieri, dawk il-kimi ċi b'log tal-P
 ow 
baxxa > 5) (1) (5), il-kampjuni jistg ħu ma jkunux su ġġetti għal 
dawk it-tratttamenti.  
Minflok, il-mi żuri għandhom jittie ħdu sabiex it-tankijiet jin żammu 
nodfa kemm jista' jkun u l-kontenut tal-karbonju organiku totali 
għandu jiġi kkontrollat kemm matul il-fa żijiet ta' l-uptake kif ukoll 
dik tat-tisfija.  
Numru xieraq ta' ħut (normalment minimu ta' erbg ħa) jiġu mneħħija 
mill-kmamar ta' l-ittestjar f'kull ħin tal-kampjuni. Il- ħut kkontrollati 
huma mla ħalħa malajr mill-ilma, blot “dry”, maqtula istantanjament 
billi jintu ża l-metodu l-iktar xieraq u uman, u mbag ħad ppeżati. 
Huwa preferibbli li ji ġu analizzati il- ħut u l-ilma immedjatament 
wara kontroll sabiex tkun evitata degradazzjoni jew aktar telf u sabiex ji ġi kkalkulata l-uptake approssimativ u r-rati tat-tisfija 
filwaqt li l-ittestjar jitkompla. Anali żi mmedjata tevita ukoll 
dewmien biex tiddetermina meta plateau jkun intla ħaq.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Fin-nuqqas ta' anali żi immedjata, il-kampjuni huma ma ħżuna 
b'metodu xieraq. Qabel il-bidu ta' l-istudju, l-informazzjoni fuq il- 
metodu propju tal- ħażna tas-sustanza ta' l- ittestjar partikolari – per 
eżempju, il-kes ħa qawwija, li tin żamm f 4  o C, id-dewmien tal- ħażna, 
il-qliegħ, eċċ. huma miksuba.  
1.8.4.3. K w a l i t à t a ' m e t o d u a n a l i t i k u  
Ladarba l-pro ċedura kollha tkun immexxija essenzalment bl-e żat­
tezza, pre ċiżjoni u sensittività tal-metodu analitiku u żat għas- 
sustanza ta' l-ittestjar, ikkontrolla permezz ta' esperiment li l- 
preċiżjoni u r-riprodu ċibilità ta' l-anali żi kemikali, kif ukoll l- 
irkupru tas-sustanza ta' l-ittestjar kemm mill-ilma kif ukoll mill- ħut 
huma sodisfa ċenti għall-metodu partikolari. Ukoll, ikkontrolla li s- 
sustanza ta' l-ittestjar mhijiex investigata fl-ilma tat-ta ħlit użat. 
Jekk neċessarju, il-valuri ta' C  w u C  f miksuba mill-ittestjar huma 
kkoreġuti għall-irkupri u l-valuri ta' l-isfond tal-kontrolli. Il- 
kampjuni tal- ħut u l-ilma huma mmexxija b'mod li ti ġi mnaqqsa l- 
kontaminazzjoni u t-telf (e ż. li jirriżultaw mill-assorbiment mill- 
proġett/l-għodda tat-te ħid tal-kampjuni).  
1.8.4.4. A n a l i z i t a l - k a m p j u n i t a l - ħ u t 
Jekk il-materjali radiolabeled huma u żati fl-ittestjar, huwa possibbli li 
tanalizza g ħal radio label totali (ji ġifieri ġenitur u metaboliti) jew, il- 
kampjuni jistg ħu jitnaddfu sabiex il-kompost tal- ġenitur jista' ji ġi 
analizzat separatament. Ukoll, l-akbar metaboliti jistg ħu jkunu 
karatterizzati f stat stabbli jew fl-a ħħar tal-fażi ta' l-uptake, tkun 
meta tkun l-iktar kmieni. Jekk il-BCF skond residwi radiolabeled 
totali hija ≥ 1 000 %, tista' ti ġi rakkomandata, u ċertament g ħal 
ċerti kategoriji ta' kimi ċi bħal ma huma il-pesti ċidi rakkomandati 
ħafna, sabiex jidentifikaw u jikkwantifikaw degradati li 
jirrappreżentaw ≥ 10 % tar-residwi totali fit-tessuti tal- ħut f stat 
stabbli. Jekk degradati li jirrappre żentaw ≥ 10 % tar-residwi radio ­
labeled totali fit-tessut tal- ħut huma identifikati u kwantifikati, 
imbagħad huwa rakkomandat ukoll li jiddentifikaw u jikkwantifikaw 
id-degradati fl-ilma ta' l-ittestjar.  
Il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar g ħandha s-soltu tkun 
determinata g ħal kull ħuta ndividwali mwie żna. Jekk dan mhux 
possibbli, il- ġbir tal-kampjuni fkull okka żjoni tat-te ħid tal-kampjuni 
tista' tiġi magħmula iżda l-pooling ma jirrestrin ġix il-proċeduri stat ­
istiċi li jistgħu jiġu appplikati mad/lid-data. Jekk pro ċedura statistika 
speċifika u l-poter huma konsiderazzjonijiet importanti, imbag ħad 
numru adegwat ta' ħut sabiex jallo ġġa il-proċedura tal-pooling 
mixtieqa u l-poter g ħandhom ji ġu nklużi fl-ittestjar (6) (7).  
Il-BCF g ħandu jiġi msemmi kemm b ħala funzjoni ta-pi ż mxarrab 
totali u, g ħal sustanzi lipholic g ħolja, bħala funzjoni tal-kontenut 
tal-lipidu. Il-kontenut tal-lipidu tal- ħut huwa ddeterminat fuq kull 
okkażjoni tal-kontroll jekk possibbli. Metodi g ħandhom jintu żaw 
għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-lipidu (referenzi 8 u 2 ta' 
Anness 3). It-teknika ta' l-estrazzjoni tal-Chloroform/methanol tista' tkun rakkomandata b ħala metodu standard (9). Il-metodi varji ma 
jagħtux valuri identi ċi (10), għalhekk huwa mportanti li jing ħataw 
id-dettalji tal-metodu u żat. Meta possibbli, l-anali żi għal-lipidu 
għandu jkun mag ħmul fuq l-istess estrazzjoni b ħal dik prodotta 
għas-sustanza ta' l-ittestjar, ladarba l-lipidi spiss g ħandhom ikunu 
mneħħija mill-estrazzjoni qabel ma jkun analizzat kromotografi ­
kament. Il-kontenut tal-lipidu tal- ħut (bħal mg/kg u żien imxarrab) 
fl-aħħar ta' l-esperiment ma g ħandux ivarja minn dak tal-bidu minn 
iktar minn ± 25 %. Is-solidi per ċentwali tat-tessut g ħandhom ukoll 
ikunu rrappurtatati sabiex jippermettu l-konversjoni tal-kon ċen­
trazzjoni tal-lipidu minn ba żi mxarrba g ħal waħda xotta.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR–RI ŻULTATI  
Il-kurva tad-d ħul tas-sustanza ta' l-ittestjar hija miksuba billi 
tgħaqqad il-ponot tal-kon ċentrazzjoni tag ħha ġo/fuq il-ħut (jew 
tessuti spe ċifiċi) fil-fażi tad-dħul kontra l- ħin fuq skali aritmeti ċi. 
Jekk il-kurva la ħqet kondizzjoni, ji ċifieri, ssir bejn wie ħed u ieħor 
asintotika ma' l-assi tal- ħin, il-kondizzjoni statika tal-BCF  SS hija 
kkalkulata minn:  
C f kondizzjoni stabbli ðmedjaÞ 
C w kondizzjoni stabbli ðmedjaÞ 
Meta l-ebda stat stabbli ma jkun intla ħaq, jista' jkun possibbli 
tikkalkula BCF  SS ta' preċiżjoni suffi ċjenti għal assessjar riskju ż 
minn “steady-state” bi 80 % (1,6/k  2 ) jew 95 % (3,0/k  2 ) ta' bilan ċ. 
Ukoll il-fattur tal-kon ċentrazzjoni (BCF  k ) huwa ddeterminat, b ħala l- 
proporzjon tal-k  1 /k 2 , l-ewwel żewġ kostanti kineti ċi ta' l-ewwel 
ordni. Il-kostant tar-rata tat-tisfija (k  2 ) hija s-soltu determinata mill- 
kurva tat-tisfija (ji ġifieri il-pro ġett tat-tnaqqis tal-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza ta' l-ittestjar fil- ħut mal-ħin). Il-kostant tar-rata tad-d ħul (k  1 ) 
huwa mbag ħad kkalkulat mog ħti k  2 u l-valur ta' Cf li ġej mill-kurva 
tad-dħul (ara wkoll Anness 5). Il-metodu preferut sabiex tikseb il- 
BCF  k u l-kostanti tar-rati, il- k  1 u l-k  2 , huwa li jintu żaw metodi ta' l- 
istima tal-parametru mhux lineari fuq komputer (11). Inkella, metodi 
grafiċi jistgħu jintużaw sabiex jikkalkulaw k  1 u k 2 . Jekk il-kurva tat- 
tisfija hija ovvjament mhux l-ewwel ordni, imbag ħad mudelli iktar 
kumplessi g ħandhom jintu żaw (ara referenzi fl-Anness 3) u parir 
minn espert tal-bijostatistika mfittex.  
2.2 INTERPRETAZZJONI TAR–RI ŻULTATI  
Ir-riżultati għandhom ji ġu nterpretati b'kawtela fejn kon ċen­
trazzjonijiet mi żurati/mkejla tas-soluzzjonijiet ta' l-ittestjar ise ħħu 
f'livelli qrib il-limitu ta' l-iskoperta tal-metodu analitiku.  
Dħul definit b'mod ċar u kurvi tat-telf huma indikazzjoni ta' data tal- 
biokonċentrazzjoni ta' kwalità tajba. Il-varjazzjoni fil-kostanti tad- 
dħul/t-tisfija bejn i ż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar g ħandha 
tkun inqas minn 20 %. Differenzi sinifikattivi osservati fir-rati tad- dħul/it-tisfija bejn i ż-żewġ konċentrazzjonijiet applikati ta' l-ittestjar 
għandhom ikunu rre ġistrati u spjegazzjonijiet possibbli mog ħtija. 
Ġeneralment il-limitu tal-kunfidenza tal-BCFs minn appro ċi ta' 
studji ddisinjati sew ± 20 %.
 
3. RAPPORTA ĠĠ 
Ir-rapport ta' l-ittestjar g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
3.1. SUSTANZA TA' L-ITTESTJAR  
— natura fi żika u, fejn relevanti, propertajiet fisiokemikali,  
— data ta' l-identifikazzjoni kemikali (li jinkludu il-kontenut tal- 
karbonju organiku, jekk huwa xieraq),  
— jekk ittikettata tar-radjazzjoni, il-posizzjoni pre ċiża ta' l-atomu(i) 
u l-persenta ġġ tar-radjuattività asso ċjata ma' l-impuritajiet.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. SPE ĊI TA' L-ITTESTJAR  
— ismijiet xjentifi ċi, sforz, sors, xi trattament li sar qabel, akkli ­
mazzjoni, żmien, limitu ta' daqs, e ċċ. 
3.3. IL–KONDIZZJONIJIET TA' L-ITTESTJAR  
— ittestja l-pro ċedura użata (e.ż. li jgħaddi minnha jew semistatika),  
— it-tip u l-karatteristi ċi ta' l-illuminazzjoni u żata u l-fotoperijodu(i),  
— id-disinn bi prova (e. ż. in-numru u l-kobor tal-kmamar ta' 
l-ittestjar, ir-rata tal-bdil tal-volum ta' l-ilma, in-numru tar- 
repliki, in-numru tal- ħut għal kull replika, in-numru tal-kon ċen­
trazzjonijiet ta' l-ittestjar, it-tul tal- ħin biex jidda ħħal il-materjal li 
jintuża u l-fażijiet tat-tisfija, il-frekwenza tat-te ħid tal-kampjuni 
għall-kampjuni tal- ħut u ta' l-ilma),  
— il-metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' l-iskorti u l- 
frekwenza tar-rinnovament (l-a ġent li jag ħmel xi ħaġa solubbli, 
il-konċentrazzjoni tieg ħu u l-kontribuzzjoni tieg ħu għall-kontenut 
organiku tal-karbonju ta' l-ilma ta' l-ittestjar g ħandu jing ħata, 
meta' jiġi wżat), 
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali ta' l-ittestjar, il-mezzi tal-valuri 
mkejla u d-devjazzjonijiet standard tag ħhom fil-bastimenti ta' l- 
ittestjar u l-metodu li bih dawn ġew miksuba,  
— l-egħjun ta' l-ilma dilwit, id-deskrizzjoni ta' xi trattament li jsir 
qabel, ir-ri żultati ta' xi dimostrazzjoni ta' l-abbilità tal- ħut ta' 
l-ittestjar li jg ħixu fl-ilma, u l-karatteristi ċi ta' l-ilma: il-pH, 
l-ebusija, it-temperatura, il-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġnu maħlul, 
il-livelli tal-kloru residwu (jekk mkejla), il-karbonju organiku 
totali, is-solidi mdendla, is-salinità tal-mezz ta' l-ittestjar (jekk xieraq) u xi kejl ie ħor magħmul,
 
— il-kwalità ta' l-ilma fil-bastimenti ta' l-ittestjar, il-pH, l-ebusija, it- 
TOC, it-temperatura u l-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu maħlul, 
— informazzjoni ddetaljata fuq l-g ħalf (per e żempju, it-tip ta' l-ikel, 
l-egħjun, il-komposizzjoni – g ħall-anqas tal-kontenut tal-lipidi u 
tal-proteini jekk possibli, l-ammont mog ħti u l-frekwenza),  
— informazzjoni fuq it-trattament tal-kampjuni tal- ħut u ta' l-ilma, 
inklużi d-dettalji tal-preparazzjoni, il- ħażna, il-qlig ħ u l-proċeduri 
analitiċi (u l-pre ċiżjoni) għas-sostanza ta' l-ittestjar u l-kontenut 
lipidu (jekk mkejla).  
3.4. IR–RI ŻULTATI:  
— ir-riżulatati minn kwalunkwe studji preliminari mag ħmula,  
— il-mortalità tal- ħut ikkontrollat u l- ħut f'kull kamra ta' l- 
espożizzjoni u kull a ġir li mhux normali li jkun osservat,  
— il-kontenut lipidu tal- ħut (jekk id-determinazzjoni fuq l-okka żjoni 
ta' l-ittestjar),  
— il-kurva (inklu ża l-informazzjoni mkejla kollha) li turi d-d ħul u 
it-tisfija tal-kimika ta' l-ittestjar fil- ħut, il-ħin għall-istat stabbli,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— Cf u Cw (b'devjazzjoni u l-mar ġni standard, jekk xieraq) g ħall- 
ħinijiet kollha tat-te ħid tal-kampjuni (Cf espressi fi μg/g piż 
mxarrab (ppm) tal- ġisem kollu jew tat-tessuti spe ċifikati 
tagħhom, e.ż. lipidu, u is-Cw fi μg/ml (ppm). Valuri tas-Cw 
għas-serje tal-kontroll (l-isfond g ħandu wkoll ji ġi rrappurtat),  
— il-fattur tal-bijo-kon ċentrazzjoni ta' l-istat stabbli (BCF  SS ) u/jew 
il-fattur tal-kon ċentrazzjoni kinetika (BCFK) u jekk applikabbli, 
95 % limiti tal-fidu ċja għall-kwantitajiet li ma jvarjawx tar-rati 
(telf) għad-dħul jew għat-tisfija (kollha espressi in relazzjoni mal- 
ġisem sħiħ u l-kontenut lipidu totali, jekk mkejjel, tat-tessut ta' l- 
annimal jew tat-tessut spe ċifikat tieg ħu), il-limiti tal-fidu ċja u d- 
devjazzjoni standard (kif disponibbli) u l-metodi ta' l-anali żi tal- 
komputazzjoni/ta' l-informazzjoni g ħal kull kon ċentrazzjoni ta' 
sostanza ta' l-ittestjar u żata, 
— fejn sostanzi bit-tikketta tar-radjazzjoni huma w żati, u jekk tkun 
meħtieġa, l-akkumulazzjoni ta' xi sostanzi ffurmati fil-meta ­
boliżmu skoperti tista' ti ġi ppreżentata,  
— kwalunkwe ħaġa li mhix tas-soltu dwar it-test, kwalunkwe 
devjazzjoni minn dawn il-pro ċeduri, u kwalunkwe informazzjoni 
relevanti o ħra. 
imminimizza r-ri żultati bħala 'mhux skoperti fil-limitu ta' l-iskoperta 
bl-iżvilupp tal-metodu ta' qabel it-test u d-disinn sperimentali', peress 
li dawn ir-ri żultati ma jistg ħux jiġu wżati għal-kalkulazzjonijiet tal- 
kwantitajiet li ma jvarjawx tar-rati.  
4. REFERENZI  
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.
 
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.
 
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
 
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
 
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 
20852, July 1975.  
(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human jew 
animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in 
Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) 
Research Triangle Park, N.C. 27711.  
(8) Compaan H. (1980) in “The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation ċ”, Ch. 
2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Nether ­
lands.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.  
(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. 
J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431- 1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 
1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
ANNESS 1  
Il-karatteristi ċi kemikali ta' l-ilma dilwit a ċċettabli  
Sostanza Il-limitu talkon ċen­
trazzjoni  
1 Materja f'sura ta' partikolari separati 5 mg/l 
2 Karbonju organiku totali 2 mg/l 
3 Ammonja mhux jonizzata 1 μg/l 
4 Kloru residwu 10 μg/l 
5 Pesti ċidi tal-fosfru organiku totali 50 ng/l 
6 Pesti ċidi tal-kloru organiku totali u bi-fenili  polychlor ­
inated  50 ng/l 
7 Kloru organiku totali 25 ng/l 
8 Aluminju 1 μg/l 
9 Arseniku 1 μg/l 
10 Kromju 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Ram 1 μg/l 
13 Ħadid 1 μg/l 
14 Ċomb 1 μg/l 
15 Nikil 1 μg/l 
16 Żingu 1 μg/l 
17 Kadmju 100 ng/l 
18 Merkurju 100 ng/l 19 Fidda 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
ANNESS 2  
L-ispeċi tal-ħut irrakkomandati g ħall-ittestjar  
Speċi rakkomandati Il-marġni 
rakkomandata 
Tat-temperatura 
ta’ l-ittestjar (  o C) It-tul totali 
rakkomandat ta’ 
l-annimal g ħall- 
ittestjar (cm)  
(1) Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) ħut-żebra 20 - 25 3,0 ± 0,5 
(2) Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) Fathead minnow 20 - 25 5,0 ± 2,0 
(3) Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Karpjun Komuni 20 - 25 5,0 ± 3,0 
(4) Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel)  Ricefish  20 - 25 4,0 ± 1,0 
(5) Poecilia reticulata (Teleostei,  Poeciliidae) (Peters) 
Guppy  20 - 25 3,0 ± 1,0 
(6) Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque)  Bluegill  20 - 25 5,0 ± 2,0 
(7) Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) 
(Walbaum) salamun tal-kulur 13 - 17 8,0 ± 4,0 
(8) Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Three-spined stickleback  18 - 20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A, Orti G. (1993) Proc. So ċjetà Rjali ta’ Londra, Serje B, Vol. 252, p ġ. 231.  
Diversi spe ċi ta’ l-estwarju u tal-ba ħar ġew użati f'pajjiżi differenti, per e żempju: 
Spot Leiostomus xanthurus  
Sheepshead minnow  Cyprinodon variegatus  
Silverside  Menidia beryllina  
Shiner perch  Cymatogaster aggregata  
English sole  Parophrys vetulus  
Staghorn sculpin  Leptocottus armatus  
Three-spined stikleback  Gasterosteus aculeatus  
Spnotta  Dicentracus labrax  
Arġentina  Alburnus alburnus  
Il-ġbir 
Il-ħut ta’ l-ilma ħelu mniżżel fit-tabella huwa fa ċli biex jittrabba u/jew huwa disponibbli b'mod vast 
matul is-sena, filwaqt li d-disponibbilità ta’ l-ispe ċi tal-baħar u ta’ l-estwarju huwa parzjalment 
limitat għall-pajjiżi rispettivi. Huma kapa ċi li jiġi mrobbi u kkultivat jew fil-farms tal- ħut jew fil- 
laboratorju, ta ħt kondizzjonijiet ta’ kontroll tal-mard u tal-parassiti, sabiex l-annimal ta’ l-ittestjar 
ikun b'saħħtu u ta’ nisel mag ħruf. Dawn il- ħut huma disponibbli f' ħafna partijiet tad-dinja.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
ANNESS 3  
It-tbassir tad-dewmien tal-fa żjijiet tad-d ħul u tat-tisfija  
1. It-tbassir tad-dewmien tal-fa żi tad-dħul 
Qabel jiġi magħmul it-test, l-istima tal- k  2 u għalhekk xi ftit mill-persenta ġġ 
tal-ħin meħtieġ biex jintla ħaq l-istat stabbli jista' jkun miksub mir- 
relazzjonijiet empiri ċi bejn il-k  2 u l-koeffi ċjenti tal-qsim ta' l- n-octanol /ta' 
l-ilma (P  ow ) jew k  2 u s-solubilità milwiema (s).  
L-istima tal-k  2 (ġurnata  -1 ) tista' tkun miksuba, per e żempju mir- 
relazzjonijiet empiri ċi li ġejjin (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) [ekwazzjoni 1]  
Għal relazzjonijiet o ħra ara r-referenza 2.  
Jekk il-koeffi ċjenti tal-qsim (P  ow ) mhuwiex mag ħruf, l-istima tista' tkun 
magħmula (3) mill-g ħarfien tas-solubilità milwiema (s) tas-sostanza billi 
tkun użata: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) [ekwazzjoni 2]  
fejn 
s = solubilità (moles/l): (n = 36).  
Dawn ir-relazzjonijiet japplikaw biss g ħall-kimiċi bil-valuri tal-logaritmu 
P ow bejn 2 u 6,5 (4).  
Il-ħin biex jintla ħaq xi persenta ġġ ta' l-istat stabbli jista' jkun miksub, billi 
tiġi applikata l-istima tal-k  2 , millekwazzjoni ġenerika kinetika li tiddeskrivi 
d-dħul u t-tisfija (il-kineti ċi ta' l-ewwel ordni):  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
Il-ħin biex jintla ħaq xi persenta ġġ ta' l-istat stabbli jista' jkun miksub, billi 
tiġi applikata  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ [ekwazzjoni 3]  
Meta' l-istat stabbli ji ġi avviċinat (t->∞), l-ekwazzjoni 3 tista' ti ġi mnaqqsa 
(5) (6) sa:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Għalhekk k  1 /k 2 .C w huwa appro ċċ għall-konċentrazzjoni fil- ħut bħala stat 
stabbli (C  f, s ). 
L-ekwazzjoni 3 tista' tkun transkritta g ħal: 
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t [ekwazzjoni 4]  
Meta' tiġi applikata l-ekwazzjoni 4, il- ħin biex jintla ħaq xi persenta ġġ ta' l- 
istat stabbli jista' jkun imbassar meta' l-k  2 huwa stimat minn qabel billi ti ġi 
użata l-ekwazzjoni 1 jew 2.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Bħala linja ta' gwida, l-a ħjar tul statistiku tal-fa żi tad-dħul għall-produzzjoni 
ta' l-informazzjoni statistikament a ċċettabbli (BCF  k ) huwa dak il-perjodu li 
huwa me ħtieġ għall-kurva tal-logaritmu tal-kon ċentrazzjoni tassostanza ta' 
l-ittestjar fil- ħut immarkata kontra l- ħin lineari biex jintla ħaq il-punt tan- 
nofs tiegħu, jew 1,6/k  2 , jew 80 % ta' l-istat stabbli imma mhux aktar minn 
3,0/k  2 jew 95 % ta' l-istat stabbli (7).  
Il-ħin biex jintla ħqu it-80 % ta' l-istat stabbli huwa (ekwazzjoni 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 or t 80 ¼ 1; 6 
k 2 [ekwazzjoni 5]  
Bl-istess mod il-95 % ta' l-istat stabbli huma:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 [ekwazzjoni 6]  
Per eżempju, it-tul tal-fa żi tad-dħul (‘il fuq) g ħas-sostanza ta' l-ittestjar bil- 
logaritmu P  ow = 4 jkun (meta' ji ġu wżati l-ekwazzjonijiet 1, 5 u 6) 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 jiem  -1 
jew fuq (80 %) = 1,6/0,652, i.e. 2,45 jiem (59 sig ħat) 
Fuq (95 %) = 3,0/0,652, i.e. 4,60 jiem (110 sig ħat) 
Bl-istess mod, g ħas-sostanza ta' l-ittestjar b' s = 10-  5 mol/l (logaritmu(i) = 
5,0), it-tul 'il fuq jkun (meta' ji ġu wżati l-ekwazzjonijiet 1, 2, 5 u 6):  
log 10 (P ow ) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 jiem  -1 
Fuq (80 %) = 1,6/0,246, i.e. 6,5 jiem (156 sig ħat) 
jew fuq (95 %) = 3,0/0,246, i.e. 12,2 jiem (293 sig ħat) 
B'mod alternattiv, l-espressjoni:  
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (sig ħat) 
tista' tiġi użata biex ji ġi kkalkolat il- ħin biex jintla ħaq l-istat stabbli effettiv 
(4). 
2. It-tbassir tat-tul tal-fa żi tat-tisfija  
It-tbassira tal- ħin meħtieġ biex jiġi mnaqqas il-pi ż tal-ġisem għal xi 
persentaġġ tal-konċentrazzjoni inizjali tista' wkoll ti ġi miksuba mill- 
ekwazzjoni ġenerali li tiddeskrivi d-d ħul u t-tisfija (il-kineti ċi ta' l-ewwel 
ordni) (1) (8).  
Għall-fażi tat-tisfija, C  w huwa assumat li huwa żero. L-ekwazzjoni tista' 
tkun ridotta g ħal: 
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f jew C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
fejn C  f, o hija l-kon ċentrazzjoni fil-bidu tal-perjodu tat-tisfija. 50 % tisfija 
tkun imbag ħad milħuqa fil-ħin (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 jew t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
B'mod simili 95 % tisfija g ħandha tintla ħaq fi:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Jekk 80 % tad-d ħul huma w żati għall-ewwel perjodu (1,6/k  2 ) u 95 % telf 
fil-fażi tat-tisfija (3,0/k2), g ħalhekk il-fa żi tat-tisfija huwa approssimatti ­
vament darbtejn it-tul tal-fa żi tad-dħul. 
Huwa importanti li jkun innotat, madankolllu, li l-istimi huma bba żati fuq 
is-supposizzjoni li l-iskemi tad-d ħul u tat-tisfija ser isegwu l-kineti ċi ta' l- 
ewwel ordni. Jekk il-kineti ċi ta' l-ewwel ordni huma ovvjament mhux 
osservati, mudelli aktar kumplessi g ħandhom jkunu u żati (eż. 
referenza (1)).  
Letteratura  (ta' l-Anness 3)  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 
1, pp 309-320.  
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of 
particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water 
Quality Institute.  
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp 4-10.
 
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.  
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.  
(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by 
Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.
 
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, pp 3-19.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
ANNESS 4  
Eżempju teoretiku ta' L–Iskeda tat–Te ħid tal–Kampjuni g ħat–Tests tal–Biokon ċentrazzjoni tas–Sostanzi 
bil–Logaritmu p  Ow = 4 
It-teħid tal-kampjuni tal- 
ħut Skeda tal- ħin tal-kampjun 
Numru tal-kampjuni ta' l- 
ilma Numru tal- ħut għal kull 
kampjun Il-frekwenza minima 
meħtieġa (ġranet) Teħid tal-kampjuni 
addizzjonal i  
Il-fażi tad-dħul -1 
0 2 (*) 
2 Iż-żieda ta' 45 sa 80 
ħuta 
L-ewwel 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
It-tieni 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
It-tielet 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
Ir-raba' 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
Il-ħames 4,7 2 6 
Il-fażi tat-tisfija It-trasferime nt tal ħut 
għall-ilma ming ħajr 
kimika ta' l-ittestjar 
Is-sitt 5,0 5,3 4 
(4) 
Is-seba' 5,9 7,0 4 
(4) 
It-tmien 9,3 11,2 4 
(4) 
Id-disa' 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) L-ilma kampjun wara li minimu ta' tlett kmamar b'volum huma kkunsinnati. 
Il-valuri fil-parentesi huma numri tal-kampjuni (ilma, ħut) li għandhom jittie ħdu jekk kampjuni addizzjonali g ħandhom ji ġu magħmula.  
NB: L-istima ta' qabel it-test tal-k  2 għal-logaritmu P  ow ta' 4,0 huwa 0,652 ġranet  ±1 . It-tul totali ta' l-esperiment huwa stabbilit g ħal 3 × 'il 
fuq =3 × 4,6 ġranet, i.e. 14 –il ġurnata. G ħall-istimar ta' l'fuq irreferi g ħall-Anness 3.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
ANNESS 5  
Mudell ta’ diskriminazzjoni  
Il-maġġoranza ta' l-informazzjoni tal-biokon ċentrazzjoni ġiet assumita li hija 
“raġonevolment” deskritta tajjeb b'mudell sempli ċi ta' żewġ kompartamenti/ żewġ 
parametri, kif indikati mill-kurva rettilineari li toqrob g ħall-punti talkon ċen­
trazzjonijiet fil- ħut, waqt il-fa żi tat-tisfija, meta’ dawn ji ġu mmarkati fuq karta 
tas-semi-log . (Fejn dawn il-punti ma jistg ħux jiġu deskritti b'kurva rettilineari 
allura mudelli aktar kumplessi g ħandhom ikunu u żati, ara, per e żempju, Spacie 
u Hamelink, referenza 1 fl-Anness 3).  
Il–metodu grafikali g ħad–determinazzjoni tal–kwantitajiet li ma jvarjawx 
tar–rata tat–tisfija (telf) K  2 
Immarka l-kon ċentrazzjoni tas-sostanza tat-test misjuba f'kull kampjun tal- ħut 
kontra l-ħin tat-teħid tal-kampjuni fuq karta  semi-log . Iż-żerżieqa ta' dik il-linja 
hija il-k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Innota li d-devjazzjonijiet mil-linja d-dritta jistg ħu jindikaw skema ta' tisfija aktar 
kumplessa mill-kineti ċi ta' l-ewwelordni. Il-metodu grafiku jista' ji ġi applikat biex 
ikunu riżolti tipi ta' tisfija li jiddevjaw mill-kineti ċi ta' l-ewwel ordni.  
Il–Metodu grafiku g ħad–Determinazzjoni tal–Kwantitajiet li ma jvarjawx 
tar–Rata tad–D ħul k  1 
Mogħtija l-k  2 , ikkalkula l-k  1 kif ġej: 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [ekwazzjoni 1]  
Il-valur tas-C  f jinqara mill-punt tan-nofs tal-kurva lixxa tad-d ħul prodotta mill- 
informazzjoni meta’ l-kon ċentrazzjoni tal-logaritmu ti ġi mmarkata kontra l- ħin 
(fuq skala aritmetika).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Il–metodu tal–kompjuter g ħal–kalkulazzjoni tal–kwantitajiet li ma jvarjawx 
tar–rati tad–d ħul u tat–tisfija (telf)  
Il-mezz preferut biex ji ġi miksub il-fattur tal-biokon ċentrazzjoni u l-kwantitajiet li 
ma jvarjawx tar-rata l-k  1 u l-k  2 huwa li ji ġu wżati metodi ta' parametri ta' stimar 
mhux lineari fuq kompjuter. Dawn il-programmi jsibu l-valuri g ħall- k  1 u l-k  2 
meta’ jkunu mog ħtija sett ta' informazzjoni tal-kon ċentrazzjoni tal- ħin sekwenzali 
u l-mudell:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c [ekwazzjoni 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c [ekwazzjoni 3]  
fejn t  c = il-ħin fl-aħħar tal-fażi tad-dħul. 
Dan l-appro ċċ jipprovdi stimi tad-devjazzjonijiet  standard  l-k  1 u l-k  2 . 
Peress illi l-k  2 fil-maġġoranza tal-ka żijiet jista' ji ġi stimat mill-kurva tat-tisfija bi 
preċiżjoni relattivament g ħolja, u peress illi korrelazzjoni qawwija te żisti bejn i ż- 
żewġ parametri l-k  1 u l-k  2 jekk stimati simultanjament, jista' jkun irrikkmandat li 
l-ewwel ji ġi kkalkolat il-k  2 mill-informazzjoni tat-tisfija biss, u sussegwentement 
jiġi kkalkolat il-k  1 mill-informazzjoni tad-d ħul billi ti ġi użata r-rigressjoni non- 
lineari.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  PROVATA' L-I ŻVILUPP FI Ż-ŻGĦOŻIJA TAL- ĦUT 
1. METODU  
Dan il-metodu tal-prova tat-tossi ċità fl-iżvilupp huwa replika ta' l- 
OECD TG 215 (2000).  
1.1. DA ĦLA 
Din il-prova hija ddisinjata biex isir stima ta' l-effetti ta' espo żizzjoni 
fit-tul għall-kimiċi fuq l-iżvilupp ta' hut żagħżugħ. Hija bba żata fuq 
metodu, żviluppat u ppruvat permezz ta' programm komparattiv bejn 
il-laboratorji (ring test) (1)(2) fl-Unjoni Ewropea, biex issir stima ta' 
l-effetti tal-kimi ċi fuq l-iżvilupp tal- ħut żagħżugħ ta' l-ispe ċi fil- 
ġeneru ta' Salamun ( Oncorynchus mykiss  – rainbow trout) ta ħt 
kondizzjonijiet flow-through. Spe ċi oħra li huma ddokumentati 
tajjeb jistg ħu jintużaw. Per e żempju, inkisbet esperjenza minn 
provi ta' l-i żvilupp bi ż-zebrafish ( Danio rerio ) ( 1 ) (3)(4) u bir- 
ricefish (medaka,  Oryzias latipes ) (5)(6)(7).  
Ara wkoll id-Da ħla Ġenerali l-Parti Ċ. 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Konċentrazzjoni l-aktar baxxa li tag ħti effett osservat (LOEC):  
hija l-iktar kon ċentrazzjoni baxxa ta' sustanza tal-prova li ġiet 
ippruvata li fiha s-sustanza hija osservata li g ħandha effett sinifikattiv 
(fi p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, il-kon ċen­
trazzjonijiet tal-prova kollha li huma aktar g ħoljin mil-LOEC 
għandu jkollhom effett perikolu ż daqs jew aktar minn dawk 
osservati fil-LOEC.  
Konċentrazzjoni li ma tag ħti l-ebda effett osservat (NOEC) : hija 
l-konċentrazzjoni tal-prova immedjatament ta ħt il-LOEC.  
EC x : f'dan il-metodu tal-prova hija l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tal- 
prova li tikka ġuna varjazzjoni fir-rata ta' żvilupp tal- ħut ta' x % meta 
mqabbla mal-kontrolli.  
Rata tat-tag ħbija:  hija l-piż imxarrab ta' ħut f'volum ta' ilma.  
Densità tal- ħżin: hija n-numru ta' ħut f'volum ta' ilma.  
Rata ta' żvilupp spe ċifika għall-ħuta individwali:  tesprimi r-rata 
ta' żvilupp ta' ħuta individwali bba żata fuq il-pi ż inizjali tag ħha. 
Rata ta' żvilupp medja spe ċifika għat-tank:  tesprimi r-rata ta' 
żvilupp medja ta' popolazzjoni ġo tank għal konċentrazzjoni wa ħda. 
Rata ta' żvilupp psewdo spe ċifika:  tesprimi r-rata ta' żvilupp indi ­
vidwali mqabbla mal-pi ż inizjali medju tal-popolazzjoni tat-tank.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. PRIN ĊIPJUTAL-METODU TAL-PROVA  
Ħut żagħżugħ f'fażi ta' żvilupp esponenzali huwa mqieg ħed, wara li 
jintiżen, f'kompartimenti tal-prova u huwa espost g ħal firxa ta' kon ċ­
entrazzjonijiet sotto-letali tas-sustanza tal-prova ma ħlula fl-ilma 
preferibbilment ta ħt kondizzjonijiet flow-through, jew, jekk dan 
mhux possibbli, ta ħt kondizzjonijiet semistati ċi (ta' tiġdid statiku) 
xierqa. It-tul ta' żmien tal-prova huwa ta' 28 jum. Il- ħut huwa 
mitmugħ kuljum. Ir-razzjon ta' l-ikel huwa bba żat fuq il-pi żijiet 
inizjali tal- ħut u jista' jer ġa' jiġi kkalkolat wara 14-il jum. Fit- 
tmiem tal-prova, il- ħut jerġa' jintiżen. L-effetti fuq ir-rati ta' 
żvilupp huma analizzati bl-u żu ta' mudell tar-rigressjoni sabiex issir 
stima tal-kon ċentrazzjoni li tikka ġuna varjazzjoni fir-rata ta' żvilupp 
ta' x %, i.e. EC  x (eż. EC  10 , EC  20 , jew EC  30 ). Alternattivament, id- 
data tista' titqabbel mal-valuri tal-kontroll sabiex ti ġi stabbilita l- 
konċentrazzjoni l-aktar baxxa li tag ħti effett osservat (LOEC) u 
għalhekk il-kon ċentrazzjoni li ma tag ħti l-ebda effett osservat 
(NOEC).  
1.5. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAL-PROVA  
Ir-riżultati tal-prova ta' tossi ċċità akuta (ara l-metodu tal-prova Ċ1). 
Dan jimplika li s-solubilità fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza 
tal-prova huma mag ħrufa u li metodu analitiku u ta' min joqg ħod 
fuqu għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis- soluzzjonijiet tal-prova 
bi preċiżjoni u b'limitu ta' osservazzjoni mag ħrufa u rraportati huwa 
disponibbli.  
Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali, purità tas-sustanza, 
stabbiltà fl-ilma u fid-dawl, pK  a , P ow u riżultati tal-prova g ħal bijodi­
gradibilità fil-pront (ara l-metodu tal-prova Ċ.4). 
1.5. VALIDITÀTAL–PROVA  
Sabiex il-prova tkun valida g ħandhom japplikaw il-kondizzjonijiet li 
ġejjin:  
— il-mortalità fil-kontroll(i) ma jistax je ċċedi l-10 % fit-tmiem tal- 
prova,  
— il-piż medju tal- ħut fil-kontroll(i) g ħandu jkun żdied biżżejjed 
biex jippermetti l-osservazzjoni tal-varjazzjoni minima tar-rata 
ta' żvilupp li hi meqjusa b ħala sinifikattiva. Prova permezz ta' 
programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (2) uriet li għal ħut ta' l-ispe ċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout) il-pi ż 
medju ta' ħut fil-kontrolli żdied mill-inqas bin-nofs (i.e. 50 %) 
tal-piż inizjali medju tag ħhom fmedda ta' 28 jum, e ż. piż inizjali: 
1 g/ħut (= 100 %), pi ż finali wara 28 jum: > 1,5 g/ ħut (≥ 150 %),
 
— il-kon ċentrazzjoni ta' ossi ġnu maħlul kienet mill-inqas 60 % tal- 
valur ta' saturazzjoni ta' l-arja (ASV) matul il-prova,  
— it-temperatura ta' l-ilma m'g ħandhiex tvarja b'aktar minn ± 1  o C 
bejn il-kompartimenti tal-prova fxi ħin partikolari matul il-prova 
u għandha tin żamm f firxa ta' 2  o C fil-firxiet ta' temperatura 
speċifikati għall-ispeċi tal-prova (l-Appendi ċi 1). 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL–PROVA  
1.6.1.  Apparat  
Tagħmir normali tal-laboratorju u spe ċjalment dan li ġej: 
— metri ta' l-ossi ġnu u tal-pH;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— tagħmir għad-determinazzjoni ta' l-ebusija u l-alkalinità ta' l-ilma;  
— tagħmir adegwat g ħall-kontroll tat-temperatura u preferibbilment 
moniturjar kontinwu;  
— tankijiet mag ħmula minn materjal li huwa inert g ħall-kimika u ta' 
kapaċità adattata skond it-tag ħbija u d-densità tal- ħżin rakkom ­
andati (ara it-taqsima 1.8.5 u l-Appendi ċi 1); 
— bilanċ preċiż kif xieraq (i.e. pre ċiż sa ± 0,5 %).  
1.6.2.  Ilma  
Kull ilma li fih l-ispe ċi tal-prova turi sopravivenza fit-tul u żvilupp 
adattat jista' jintu ża bħala ilma tal-prova. G ħandu jkun ta' kwalità 
kostanti matul il-perjodu tal-prova. Il-pH ta' l-ilma g ħandu jkun fil- 
firxa ta' 6,5 sa 8,5, imma matul prova partikolari g ħandu jkun f'firxa 
ta' ± 0,5 unitajiet tal-pH. Ebusija og ħla minn 140 mg/l (b ħala 
CaCO  3 ) hija rakkomandata. Sabiex ji ġi żgurat li l-ilma g ħat-taħlit 
ma jaffettwax ir-ri żultati tal-prova b'mod e ċessiv (per e żempju billi 
jbiddel il-karattru ġenerali tas-sustanza tal-prova), g ħandhom 
jittieħdu kampjuni f'intervalli g ħall-analiżi. Tiqjis ta' metalli tqal 
(eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd u Ni), anjoni u katjoni ma ġġuri (eż. Ca, 
Mg, Na, K, Cl u SO  4 ), pestiċidi (eż. pestiċidi ta' l-organofosforu 
totali u ta' l-organoklorin totali), karbonju organiku totali u solidi 
f'forma ta' suspensjoni g ħandu jsir, per e żempju, kull tliet xhur 
fejn l-ilma g ħat-taħlit huwa mag ħruf li hu ta' kwalità relattivament 
kostanti. Jekk il-kwalità ta' l-ilma intweriet li kienet konstanti matul ta' l-inqas sena, id-determinazzjonijiet jistg ħu jsiru inqas spiss u l- 
intervalli ji ġu estiżi (eż. kull sitt xhur). Xi karatteristi ċi kimiċi ta' 
ilma għat-taħlit li huwa a ċċettabbli huma elenkati fl-Appendi ċi 2.
 
1.6.3.  Soluzzjonijiet tal-prova  
Soluzzjonijiet tal-prova tal-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula huma 
preparati billi soluzzjoni tal- ħżin tiġi mħallta ma' l-ilma.  
Is-soluzzjoni tal- ħżin għandha preferibbilment tkun preparata 
sempliċiment billi s-sustanza tal-prova ti ġi mħallta jew a ġitata fl- 
ilma għat-taħlit bl-użu ta' mezzi mekkani ċi (eż. tħawwid jew ultra ­
sonikazzjoni). Kolonni ta' saturazzjoni (kolonni ta' solubilità) jistg ħu 
jintużaw biex tinkiseb soluzzjoni kon ċentrata tal- ħżin adattata.  
L-użu ta' solventi jew ta' a ġenti li jiffa ċilitaw is-solubbilità (disper ­
sants) jista' jkun me ħtieġ f'xi każijiet biex tkun mag ħmula soluzzjoni 
tal-ħżin ta' kon ċentrazzjoni adattata. E żempji ta' solventi adattati 
huma aċeton, etanol, metanol, dimethylsulfoxide, dimethylformamide 
u triethyleneglycol. E żempji ta' a ġenti li jiffa ċilitaw is-solubbilità 
(dispersants) adattati huma Cremophor RH40, Tween 80, Methyl ­
cellulose 0,01 % u HCO-40. Attenzjoni g ħandha tittie ħed meta 
jkunu qed jintu żaw aġenti li huma fa ċilment bijodigradabbli (e ż. 
aċeton) u/jew komposti li huma volatili ħafna għax dawn jistg ħu 
jikkaġunaw problemi bit-tkattir ta' batterja fil-provi flow-through. 
Meta jintu ża aġent li jiffa ċiltà s-solubbilità dan m'g ħandux jkollu 
effetti sinifikattivi fuq l-i żvilupp tal- ħut u l-inqas effetti negattivi 
viżibbli fuq il- ħut żagħżugħ kif svelat b'kontroll li ju ża s-solvent 
biss. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Għal provi flow-through, hija me ħtieġa sistema li kontinwament 
tqassam u t ħallat bl-ilma s-soluzzjoni tal- ħżin tas-sustanza tal-prova 
(eż. pompa li tkejjel u tqassam bil-miter, tag ħmir li jħallat is-sustanza 
ma' l-ilma b'mod proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) biex twassal serje ta' kon ċentrazzjonijiet lill-kompartimenti tal-prova. Ir-rati ta' 
ċaqliq tas-soluzzjonijiet tal- ħżin u ta' l-ilma g ħat-taħlit għandhom 
jiġu kkontrollati f'intervalli, preferibbilment ta' kuljum, matul il- 
prova u m'g ħandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul il-prova. 
Prova permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring 
test) (2) uriet li, g ħal ħut ta' l-ispe ċi fil-ġeneru ta' Salamun 
(rainbow trout), frekwenza tat-tne ħħija ta' l-ilma matul il-prova ta' 
6 litri/g ta' ħut/jum hija a ċċettabbli (ara it-taqsima 1.8.2.2).
 
Għal provi semi-stati ċi (ta' tiġdid), il-frekwenza ta' ti ġdid tal-likwidu 
tiddependi fuq l-istabbiltà tas-sustanza tal-prova, imma ti ġdid ta' 
kuljum ta' l-ilma huwa rakkomandat. Jekk, minn provi ta' stabbiltà 
preliminarji (ara t-taqsima 1.4), il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tal- 
prova ma tkunx stabbli (i.e. barra mill-firxa ta' 80-120 % tal kon ċen­
trazzjoni nominali jew taqa' inqas minn 80 % tal-kon ċentrazzjoni 
inizjali meqjusa) matul il-perjodu ta' ti ġdid, għandha ting ħata 
konsiderazzjoni g ħall-użu ta' prova flow-through.  
1.6.4.  Għażla ta' l-ispe ċi 
L-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun ( Oncorhynchus mykiss  – rainbow 
trout) huwa l-ispe ċi rakkomandat g ħal din il-prova peress li ħafna 
mill-esperjenza kienet akkwistata minn prova permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) b'dan l-ispe ċi (1) (2). 
Madankollu, spe ċi oħra li huma ddokumentati tajjeb jistg ħu 
jintużaw imma l-pro ċedura tal-prova g ħandha mnejn ikollha ti ġi 
adattata biex tipprovdi kondizzjonijiet tal-prova adattati. Per eżempju, esperjenza hija wkoll disponibbli bi ż-zebrafish ( Danio 
rerio ) (3) (4) u r-ricefish (medaka,  Oryzias latipes ) (5) (6) (7). Ir- 
raġuni fundamentali g ħall-għażla ta' l-ispe ċi u tal-metodu esperi ­
mentali g ħandhom ji ġu rraportati f'dan il-ka ż.
 
1.6.5.  Żamma tal- ħut 
Il-ħut tal-prova g ħandu jiġi magħżul minn popolazzjoni ta' stokk 
wieħed, preferibbilment mill-istess wild, li tkun ilha mi żmuma għal 
mill-inqas ġimagħtejn qabel il-prova ta ħt kondizzjonijiet ta' kwalità 
ta' l-ilma u ta' illuminazzjoni simili g ħal dawk u żati fil-prova. 
Għandhom jing ħataw razzjon minimu ta' ikel ta' 2 % tal-pi ż tal- 
ġisem kuljum u preferibbilment ta' 4 % tal-pi ż tal-ġisem kuljum 
matul il-perjodu ta ż-żamma u matul il-prova.  
Wara perjodu ta' stabbilizzazzjoni ta' 48 sieg ħa, l-imwiet ji ġu 
reġistrati u ji ġu applikati l-kriterji li ġejjin:  
— imwiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: il- 
grupp intier ji ġi mwarrab,  
— imwiet ta' bejn il-5 % u l-10 % tal-popolazzjoni: akklimatiz ­
zazzjoni g ħal sebat ijiem addizjonali, jekk aktar minn 5 % 
mortalità matul it-tieni sebat ijiem, il-grupp intier ji ġi mwarrab,  
— imwiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: a ċċetta 
l-grupp.  
Il-ħut m'għandux jir ċievi trattament g ħall-mard fil-gimag ħtejn ta' 
qabel il-prova, jew matul il-prova.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. DISINN TAL-PROVA  
L-“ippjanar tal-prova” huwa relatat ma' l-g ħażla tan-numru u ta' l- 
ispazjar tal-kon ċentrazzjonijiet tal-prova, in-numru ta' rankijiet g ħal 
kull livell ta' kon ċentrazzjoni u n-numru ta' ħut f'kull tank. 
Idealment, id-disinn tal-prova g ħandu jkun mag ħżul skond:  
— l-għan ta' l-istudju;  
— il-metodu ta' anali żi ta' l-istatistika li ser jintu ża; 
— id-disponibbiltà u l-ispi ża tar-riżorsi esperimentali.  
Il-prospett ta' l-g ħan għandu, jekk hu possibbli, jispe ċifika l-qawwa 
ta' l-istatistika li fiha ammont partikolari ta' differenza fid-daqs (e ż. 
fir-rata ta' żvilupp) huwa me ħtieġ biex jiġi osservat jew, alternatti ­
vament, il-pre ċiżjoni li biha l-EC  x (eż. fejn x = 10, 20, jew 30, u 
preferibbilment mhux inqas minn 10) hija me ħtieġa biex tkun stmata. 
Mingħajr dan, ma tistax ting ħata preskrizzjoni ferma tad-daqs ta' l- 
istudju.  
Huwa importanti li jing ħaraf li d-disinn li huwa l-a ħjar (jagħmel l- 
aħjar użu mir-riżorsi) għall-użu ma' metodu wie ħed ta' anali żi ta' l- 
istatistika mhuwiex ne ċessarjament l-ottimu g ħall-użu ma' ieħor. Id- 
disinn rakkomandat g ħall-istima ta' LOEC/NOEC g ħalhekk ma jkunx 
l-istess bħal dak rakkomandat g ħal analiżi bir-rigressjoni.  
F'għadd kbir ta' ka żijiet, anali żi bir-rigressjoni hija preferibbli minn 
analiżi tal-varjanza, g ħal raġunijiet iddiskutati minn Stephan u 
Rogers (8). Madankollu, meta ma jinstab l-ebda mudell tar- rigressjoni adattat (r
 2 < 0,9) in-NOEC/LOEC g ħandhom jintu żaw. 
1.7.1.  Disinn g ħal analiżi bir-rigressjoni  
Il-konsiderazzjonijiet importanti fid-disinn tal-prova li ser ti ġi 
analizzata bir-rigressjoni huma:  
— Huwa me ħtieġ li l-konċentrazzjoni li tag ħti effett (e ż. EC  10, 20, 30  ) 
u l-firxa ta' kon ċentrazzjonijiet li fiha l-effett tas-sustanza tal- 
prova huwa ta' interess, ikunu koperti mill-kon ċentrazzjonijiet 
inklużi fil-prova. Il-pre ċiżjoni li biha jistg ħu jsiru l-istimi tal- 
konċentrazzjonijiet li jag ħtu effett, tkun l-aqwa meta l-kon ċen­
trazzjoni li tag ħti effett tkun fin-nofs tal-firxa ta' kon ċen­
trazzjonijiet ppruvati. Prova preliminarja biex tinstab il-firxa 
tista' tkun ta' g ħajnuna biex jintg ħażlu l-konċentrazzjonijiet tal- 
prova xierqa.  
— Biex ikun possibbli li jsir mudellar sodisfa ċenti ta' l-istatistika, il- 
prova għandha tinkludi mill-inqas tank tal-kontroll wie ħed u 
ħames tankijiet addizjonali b'kon ċentrazzjonijiet differenti. Fejn 
xieraq, meta jintu ża aġent li jiffa ċilità s-solubbilità, barra mis- 
serje tal-prova g ħandu jsir kontroll wie ħed li jkun jinstab fih 
dan l-aġent fl-iktar kon ċentrazzjoni g ħolja li ġiet ppruvata (ara 
t-taqsimiet 1.8.3 u 1.8.4).  
— Serje ġeometrika jew logaritmika xierqa (9) (ara l-Appendi ċi 3) 
tista' tintu ża. L-ispazjar logaritmiku tal-kon ċentrazzjoni tal-prova 
għandha tkun preferuta.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— Jekk aktar minn sitt tankijiet huma disponibbli, it-tankijiet addiz ­
jonali għandhom jew jintu żaw biex jipprovdu replikazzjoni jew 
ikunu distribwiti mal-firxa tal-kon ċentrazzjonijiet sabiex jiffa ­ 
ċilitaw spazjar eqreb tal-livelli. Kemm il-wa ħda kif ukoll l-o ħra 
minn dawn il-mi żuri huma ugwalment mixtieqa.  
1.7.2.  Disinn g ħall-istima ta' NOEC/LOEC bl-u żu ta' l-anali żi tal- 
varjanza (ANOVA)  
Preferibbilment g ħandu jkun hemm tankijiet replikati f'kull kon ċen­
trazzjoni, u l-anali żi ta' l-istatistika g ħandha tkun fil-livell tat-tank 
(10). Ming ħajr tankijiet replikati, ma tista' ssir l-ebda kon ċessjoni 
għall-varjabilità bejn it-tankijiet aktar minn dik dovuta g ħall-ħut indi­
vidwali. Madankollu, l-esperjenza uriet (11) li l-varjabilità bejn it- tankijiet kienet żgħira ħafna meta mqabbla mal-varjabilità ġot-tank 
(i.e. bejn il- ħut) fil-każ eżaminat. G ħalhekk alternattiva li hi relatti ­
vament a ċċettabbli hi li ssir anali żi ta' l-istatistika fil-livell tal- ħut 
individwali.
 
Konvenzjonalment, jintu żaw mill-inqas ħames kon ċentrazzjonijiet 
tal-prova f'serje ġeometrika b'fattur li preferibbilment ma je ċċedix 
it-3,2.  
Ġeneralment, meta jsiru provi b'tankijiet replikati, in-numru ta' 
tankijiet tal-kontroll replikati u g ħalhekk in-numru ta' ħut għandu 
jkun id-doppju tan-numru f'kull wa ħda mill-kon ċentrazzjonijiet tal- 
prova, li g ħandhom ikunu ta' daqs ugwali (12) (13) (14). Min na ħa l- 
oħra, fin-nuqqas ta' tankijiet replikati, in-numru ta' ħut fil-grupp tal- 
kontroll g ħandu jkun l-istess b ħan-numru f'kull wa ħda mill-kon ċen­
trazzjonijiet tal-prova.  
Jekk l-ANOVA g ħandha tkun bba żata fuq it-tankijiet minflok fuq il- 
ħut individwali (li jkun jinvolvi jew l-immarkar individwali tal- ħut 
jew l-użu ta' rati ta' żvilupp “psewdo” spe ċifiċi (ara t-taqsima 2.1.2)), 
hemm il-ħtieġa li jkun hemm bi żżejjed replikazzjoni ta' tankijiet biex 
id-devjazzjoni standard ta' “tankijiet fil-kon ċentrazzjonijiet” tkun 
tista' tiġi determinata. Dan ifisser li l-gradi ta' ħelsien għall-iżbalji 
fl-analiżi tal-varjanza g ħandhom ikunu mill-inqas 5 (10). Jekk il- 
kontrolli biss huma replikati, hemm il-periklu li l-varjabilità fl- 
iżbalji tkun pre ġudikata g ħax għandha mnejn ti żdied skond il-valur 
medju tar-rata ta' żvilupp li ssemmiet. Peress li r-rata ta' żvilupp 
x'aktarx tonqos meta l-kon ċentrazzjoni ti żdied, dan ikollu tendenza 
li jwassal g ħal stima og ħla tal-varjabilità.  
1.8. PRO ĊEDURA  
1.8.1.  Għażla u użin tal-ħut tal-prova  
Huwa importanti li l-varjazzjoni fil-pi ż tal-ħut fil-bidu tal-prova ti ġi 
mnaqqsa kemm jista' jkun. Firxiet ta' daqs adattati g ħall-ispeċi 
differenti li huma rakkomandati g ħall-użu f'din il-prova jing ħataw 
fl-Appendi ċi 1. Għall-grupp kollu ta' ħut użat fil-prova, il-firxa ta' 
piżijiet individwali fil-bidu tal-prova g ħandha idealment tin żamm fil- 
± 10 % tal-pi ż medju aritmetiku u, f'kull ka ż, m'għandux jeċċedi l- 
25 %. Huwa rak komandat li sottokampjun ta' ħut jiġi peżat qabel il- 
prova sabiex issir stima tal-pi ż medju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
L-ikel għandu jinżamm mill-popolazzjoni tal- ħżin għal 24 sieg ħa 
qabel ma tibda l-prova. Il- ħut għandu imbag ħad jintgħażel saltwar ­
jament. Bl-u żu ta' anestetiku ġenerali (e ż. soluzzjoni fl-ilma ta' 
100 mg/l tricaine methane sulphonate (MS 222) newtralizzata bi ż- 
żieda ta' żewġ partijiet bikarbonat tas-sodju g ħal kull parti ta' MS 
222), il-ħut għandu jinti żen individwalment b ħala piż imxarrab 
(ixxugat) bil-pre ċiżjoni mniżżla fl-Appendi ċi 1. Dawk il- ħut li l-piż 
tagħhom ikun fil-firxa ma ħsuba għandhom jin żammu u g ħandhom 
imbagħad jiġu mqassma b'mod saltwarju bejn il-re ċipjenti tal-prova. 
Il-piż imxarrab totali tal- ħut f'kull re ċipjent tal-prova g ħandu jiġi 
reġistrat. L-u żu ta' anesteti ċi u bl-istess mod l-immani ġġjar tal-ħut 
(inkluż l-ixxugar u l-u żin) jista' jikka ġuna tensjoni u ħsara lill-ħut 
żagħżugħ, b'mod partikolari lil dawk l-ispe ċi ta' daqs żgħir. 
Għalhekk l-immani ġġjar ta' ħut żagħżugħ għandu jsir bl-akbar 
attenzjoni biex ji ġi evitat li l-annimali tal-prova tin ħolqilhom 
tensjoni u ħsara. 
Il-ħut jerġgħu jintiżnu fil-jum 28 tal-prova (ara t-taqsima 1.8.6). 
Madankollu, jekk ikun meqjus li hu me ħtieġ li jerġa' jiġi kkalkolat 
ir-razzjon ta' l-ikel, il- ħut jista' jer ġa' jintiżen fil-jum 14 tal-prova (ara 
t-taqsima 1.8.2.3). Metodu ie ħor bħall-metodu fotografiku jista' 
jintuża biex ji ġi stabbilit it-tibdil fid-daqs tal- ħut li fuq il-ba żi 
tiegħu r-razzjonijiet ta' l-ikel jistg ħu jiġu aġġustati.  
1.8.2.  Kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.8.2.1.  Tul ta' żmien  
It-tul ta' żmien tal-prova hi ≥ 28 jum.  
1.8.2.2.  Rati tat-tag ħbija u densitjiet tal- ħżin 
Huwa importanti li r-rata tat-tag ħbija u d-densità tal- ħżin huma 
xierqa għall-ispeċi tal-prova u żati (ara l-Appendi ċi 1). Jekk id- 
densità tal- ħżin tkun g ħolja wisq, allura jkun hemm tensjoni 
minħabba fl-iffullar esa ġerat li jirri żulta f'rati ta' żvilupp imnaqqsa 
u possibbilment fil-mard. Jekk tkun baxxa wisq, tista' tikka ġuna 
mġieba territorjali li tista' wkoll taffettwa l-i żvilupp. F'kull ka ż, ir- 
rata tat-tag ħbija għandha tkun baxxa bi żżejjed sabiex kon ċentrazzjoni 
ta' ossiġnu maħlul ta' mill-inqas 60 % ASV tista' tin żamm ming ħajr 
arjazzjoni. Programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (3) 
wera li, g ħall-ħut ta' l-ispe ċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout), 
rata tat-tag ħbija ta' 16 il- ħuta ta' dan l-ispe ċi ta' 3-5 g f'volum ta' 40- 
litru hija a ċċettabbli. Il-frekwenza rakkomandata g ħat-tneħħija ta l- 
ilma matul il-prova hija ta' 6 litri/g ta' ħut/jum.  
1.8.2.3.  Tmig ħ 
Il-ħut għandhom ji ġu mitmug ħa b'ikel xieraq (l-Appendi ċi 1) b'rata 
suffiċjenti li tikka ġuna rata ta' żvilupp aċċettabbli. G ħandha tittie ħed 
attenzjoni biex ji ġi evitat l-i żvilupp ta' mikrobi u d-dardir ta' l-ilma. 
Għall-ħut ta' l-ispe ċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout), rata ta' 
4 % tal-pi ż tagħom tal-ġisem kuljum g ħandha x'aktarx tissodisfa 
dawn il-kondizzjonijiet (2)(15)(16)(17). Ir-razzjon ta' kuljum jista' 
jitqassam f' żewġ porzjonijiet indaqs u jing ħata lill-ħut f'żewġ ikliet 
kuljum, imbeg ħdin b'ta' l-inqas ħames sigħat. Ir-razzjon huwa bba żat 
fuq il-piż totali inizjali tal- ħut f'kull re ċipjent tal-prova. Jekk il- ħut 
jerġgħu jintiżen fil-jum 14, ir-razzjon jer ġa' jiġi kkalkolat. L-ikel 
għandu jinżamm mill- ħut 24 sieg ħa qabel l-u żin. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
L-ikel li ma jittiekilx u l-materjal tal- ħmieġ ta' l-imsaren g ħandu 
jitneħħa kuljum mir-re ċipjenti tal-prova permezz ta' tindif bl- 
attenzjoni tal-qieg ħ ta' kull tank bl-irdig ħ. 
1.8.2.4.  Dawl u temperatura  
Il-fotoperjodu u t-temperatura ta' l-ilma g ħandhom ikunu xierqa 
għall-ispeċi tal-prova (l-Appendi ċi 1). 
1.8.3.  Kon ċentrazzjonijiet tal-prova  
Normalment ħames kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma 
meħtieġa, ikun xi jkun d-disinn tal-prova (ara t-taqsima 1.7.2). 
Tagħrif minn qabel tat- tossi ċità tas-sustanza tal-prova (e ż. minn 
prova akuta u/jew minn studji biex tinstab il-firxa) g ħandhom 
ikunu ta' g ħajnuna biex jintg ħażlu l-konċentrazzjonijiet tal-prova 
xierqa. G ħandha ting ħata ġustifikazzjoni jekk inqas minn ħames 
konċentrazzjonijiet huma u żati. L-og ħla konċentrazzjoni ppruvata 
m'għandhiex te ċċedi l-limitu tas-solubilità tas-sustanza fl-ilma.  
Fejn jintu ża aġent li jiffa ċilità s-solubbilità biex ig ħin fil- 
preparazzjoni tas-soluzzjoni tal- ħżin, il-kon ċentrazzjoni finali tieg ħu 
m'għanduz ikun aktar minn 0,1 ml/l u g ħandu preferibbilment ikun l- 
istess fir-re ċipjenti kollha tal-prova (ara t-taqsima 1.6.3). 
Madankollu, g ħandu jsir kull sforz biex ji ġi evitat l-u żu ta' 
materjali b ħal dawn.  
1.8.4.  Kontrolli  
In-numru ta' kontrolli bl-ilma tat-ta ħlit jiddependi fuq id-disinn tal- 
prova (ara t-taqsimiet 1.7-1.7.2). Jekk jintu ża aġent li jiffa ċilità s- 
solubbilità, allura l-istess numru ta' kontrolli bl-a ġenti li jiffa ċilitaw 
s-solubbilità daqs kontrolli bl-ilma tat-ta ħlit għandhom ji ġu inklużi 
wkoll.  
1.8.5.  Frekwenza ta' determinazzjonijiet analiti ċi u tiqjis  
Matul il-prova, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma 
determinati f'intervalli regolari (ara hawn ta ħt). 
Fil-provi flow-through, ir-rati ta' ċaqliq tas-soluzzjoni ta' ħżin 
dilwenti u tossikanti g ħandhom ji ġu kkontrollati f'intervalli, prefer ­
ibbilment kuljum, u m'g ħandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul 
il-prova. Fejn il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma 
mistennija li jkunu bejn il-± 20 % tal-valuri nominali (i.e. fil-firxa 
ta' 80-120 %; ara t-taqsimiet 1.6.2 u 1.6.3), huwa rakkomandat li, bħala minimu, il-kon ċentrazzjonijiet l-aktar g ħoljin u dawk l-aktar 
baxxi jiġu analizzati fil-bidu tal-prova u f'intervalli ta' kull ġimgħa 
wara dan. G ħall-prova fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova 
mhix mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri nominali (fuq il- bażi ta' data dwar l-istabbiltà tas-sustanza tal-prova), huwa me ħtieġ li 
jiġu analizzati l-kon ċentrazzjonijiet tal-prova kollha, imma bl-u żu ta' 
l-istess re ġim.
 
Fil-provi semi-stati ċi (ta' tiġdid) fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza 
tal-prova hija mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri nominali, huwa rakkomandat li, b ħala minimu, il-kon ċentrazzjonijiet tal-prova 
l-aktar għoljin u dawk l-aktar baxxi ji ġu analizzati meta ppreparati 
friski u immedjatament qabel it-ti ġdid fil-bidu ta' l-istudju u ta' kull 
ġimgħa wara dan. G ħall-provi fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza 
tal-prova mhix mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri 
nominali, il-kon ċentrazzjonijiet kollha tal-prova iridu ji ġu analizzati 
bl-użu ta' l-istess re ġim bħal dak użat għal sustanzi aktar stabbli.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Huwa rakkomandat li r-ri żultati jkunu bba żati fuq il-kon ċen­
trazzjonijiet meqjusa. Madankollu, jekk ikun hemm evidenza 
disponibbli biex turi li l-kon ċentrazzjoni ta' soluzzjoni tas-sustanza 
tal-prova in żammet b'mod sodisfa ċenti bejn il-± 20 % tal-kon ċen­
trazzjoni nominali jew tal-kon ċentrazzjoni inizjali meqjusa matul il- 
prova, allura r-ri żultati jistg ħu jkunu bba żati fuq valuri nominali jew 
meqjusa.  
Il-kampjuni jistg ħu jeħtieġu li jiġu ffiltrati (e ż. bl-użu ta' daqs tal-pori 
ta' 0,45 μm) jew so ġġetti għal azzjoni ċentrifuga. I ċ-ċentrifugazzjoni 
hija l-pro ċedura rakkomandata. Madankollu, jekk il-materjal tal- 
prova ma ji ġix assorbit mill-filtri, il-filtrazzjoni tista' tkun a ċċettabbli 
wkoll.  
Matul il-prova, g ħandhom jitqiesu l-ossi ġnu maħlul, il-pH u t- 
temperatura fir-re ċipjenti tal-prova kollha. L-ebusija totali, l-alkalinità 
u s-salinità (jekk relevanti) g ħandhom jitqiesu fil-kontrolli u f're ­ 
ċipjent wie ħed ta' l-og ħla konċentrazzjoni. B ħala minimu, l-ossi ġnu 
maħlul u s-salinità (jekk relevanti) g ħandhom jitqiesu tliet darbiet 
(fil-bidu, fin-nofs u fit-tmiem tal-prova). Fi provi semi-stati ċi, 
huwa rakkomandat li l-ossi ġnu maħlul jitqies aktar spiss, preferib ­
bilment qabel u wara kull ti ġdid ta' l-ilma jew mill-inqas darba fil- 
ġimgħa. Il-pH g ħandha titqies fil-bidu u fit-tmiem ta' kull ti ġdid ta' l- 
ilma fi prova tat-ti ġdid statiku u ta' l-inqas darba fil- ġimgħa fi provi 
flow-through. L-ebusija u l-alkalinità g ħandhom jitqiesu darba f'kull 
prova. It-temperatura preferibbilment g ħandha tkun ikkontrollata 
kontinwament f'mill-inqas re ċipjent wie ħed tal-prova.  
1.8.6.  Osservazzjonijiet  
Piż: Fit-tmiem tal-prova l- ħut kolha li jibqg ħu ħajjin għandhom 
jintiżnu bħala piż imxarrab (ixxugat) jew fi gruppi skond ir- 
reċipjent tal-prova jew individwalment. L-u żin ta' l-annimali bir- 
reċipjent tal-prova huwa preferibbli mill-u żin individwali li je ħtieġ 
li l-ħut ikun immarkat individwalment. Fil-ka ż ta' tiqjis tal-pi żijiet 
individwali g ħad-determinazzjoni tar-rata ta' żvilupp spe ċifika għall- 
ħuta individwali, il-metodu ta' teknika ta' l-immarkjar mag ħżula 
għandha tevita li to ħloq tensjoni fl-annimali (alternattivi g ħall- 
immarkjar bl-iffri żar jistgħu jkunu xierqa, e ż. l-użu ta' xlief fin ikku ­
lurit).  
Il-ħut għandu jkun e żaminat kuljum matul il-perjodu tal-prova u kull 
anormalità esterna (b ħal emorra ġija, telf tal-kulur) u m ġieba anormali 
nnotata. Kull mewt g ħandu jiġi rreġistrat u l- ħut mejjet jitne ħħa 
malajr kemm jista' jkun. Il- ħut mejjet ma ji ġix sostitwit, ir-rata tat- 
tagħbija u d-densità tal- ħżin huma bi żżejjed biex ji ġu evitati effetti 
fuq l-iżvilupp min ħabba bdil fin-numru ta' ħut f'kull tank. 
Madankollu, ir-rata ta' tmig ħ tkun teħtieġ li tiġi aġġustata.  
2. DATA  U RAPURTA ĠĠ 
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Huwa rakkomandat li espert ta' l-istatistika jkun involut kemm fid- 
disinn kif ukoll fl-anali żi tal-prova peress li dan il-metodu tal-prova 
jippermetti varjazzjoni konsiderevoli fid-disinn esperimentali b ħal 
per eżempju, fin-numru ta' kompartamenti tal-prova, numru ta' kon ċ­
entrazzjonijiet tal-prova, numru ta' ħut, eċċ. Minħabba l-għażliet li 
huma disponibbli fid-disinn tal-prova, gwida spe ċifika dwar il- 
proċedura ta' l-istatistika ma ting ħatax hawn.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Ir-rati ta' żvilupp m'g ħandhomx ji ġu kkalkolati g ħar-reċipjenti tal- 
prova fejn il-mortalità te ċċedi l-10 %. Madankollu, ir-rata tal- 
mortalità g ħandha tkun indikata g ħall-konċentrazzjonijiet tal-prova 
kollha.  
Ikun liema metodu li jintu ża biex tiġi analizzata d-data, il-kun ċett 
ċentrali huwa r-rata ta' żvilupp spe ċifika r bejn il- ħin t  1 u l-ħin t  2 . 
Din tista' ti ġi definita f' ħafna modi skond jekk il- ħut hux immarkat 
individwalment jew le jew skond jekk hix me ħtieġa l-medja g ħat- 
tank.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
fejn: 
r 1 = rata ta' żvilupp spe ċifika għall-ħuta individwali  
r 2 = rata ta' żvilupp medja spe ċifika għat-tank  
r 3 = rata ta' żvilupp “psewdo” spe ċifika 
w 1 , w 2 = rata ta' żvilupp medja spe ċifika għat-tank log  e 
w 1 = logaritmu tal-pi ż ta' ħuta individwali fil-bidu tal- 
perjodu ta' studju  
log e w 2 = l logaritmu tal-pi ż ta' ħuta individwali fit-tmiem tal- 
perjodu ta' studju  
log e W 1 = medja tal-logaritmi tal-valuri w1 g ħall-ħut fit-tank fil- 
bidu tal-perjodu ta' studju  
log e W 2 = medja tal-logaritmi tal-valuri w2 g ħall-ħut fit-tank fil- 
tmiem tal-perjodu ta' studju  
t 1 , t 2 = ħin (jiem) fil-bidu u fit-tmiem tal-perjodu ta' studju  
r 1 , r 2 , r 3 jistgħu jiġu kkalkolati g ħall-perjodu ta' minn 0-28 jum u, 
fejn xieraq (i.e. meta t-tiqis fil-jum 14 ikun sar) g ħall-perjodi ta' 
minn 0-14 u minn 14-28 jum.  
2.1.1.  Anali żi tar-riżultati bir-ri ġressjoni (mudellar tar-rispons g ħall- 
konċentrazzjoni)  
Dan il-metodu ta' anali żi jaqbel ma' relazzjoni tal-matematika 
adattata bejn ir-rata ta' żvilupp spe ċifika u l-kon ċentrazzjoni, u 
għalhekk jag ħmel possibbli l-istima ta' l-“EC  x ” i.e. kull valur ta' l- 
EC meħtieġ. Bl-użu ta' dan il-metodu l-kalkolu ta' r g ħall-ħut indi­
vidwali (r  1 ) mhux me ħtieġ u minflok, l-anali żi tista' tkun ibba żata 
fuq il-valur medju g ħat-tank ta' r (r  2 ). Dan il-metodu ta' l-a ħħar huwa 
preferut. Huwa wkoll aktar xieraq fil-ka ż li jintuża l-iżgħar speċi. 
Ir-rati ta' żvilupp medji spe ċifiċi għat-tank (r  2 ) għandhom ji ġu 
mmarkati fuq graff kontra l-kon ċentrazzjoni, sabiex ti ġi spezzjonata 
r-relazzjoni tar-rispons mal-kon ċentrazzjoni.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Sabiex tiġi mfissra r-relazzjoni bejn r  2 u l-konċentrazzjoni, g ħandu 
jintgħażel mudell xieraq u l-g ħażla tiegħu għandha tkun sostnuta 
b'raġunar xieraq.  
Jekk in-numri ta' ħut li jibqg ħu ħajjin f'kull tank ma jkunux l-istess, 
allura l-pro ċess ta' tqabbil tal-mudell, kemm jekk sempli ċi jew jekk 
mhux lineari, g ħandu jiġi peżat biex jippermetti g ħal gruppi ta' 
daqsijiet differenti.  
Il-metodu ta' tqabbil tal-mudell g ħandu jagħmel possibbli l-istima ta', 
per eżempju, l-EC  20 u tad-dispersjoni tieg ħu (jew l-i żball standard 
jew l-intervall ta' fidu ċja). Il-graff tal-mudell imqabbel g ħandu 
jintwera fir-rigward tad-data sabiex s-suffi ċjenza tat-tqabbil tal- 
mudell tista' tidher (8)(18)(19)(20).  
2.1.2.  Anali żi tar-riżultati għall-istima tal-LOEC  
Jekk il-prova tkun inkludiet ir-replikazzjoni tat-tankijiet fil-livelli 
kollha tal-kon ċentrazzjoni, l-istima tal-LOEC tista' tkun ibba żata 
fuq anali żi tal-varjanza (ANOVA) tar-rata ta' żvilupp medja 
speċifika għat-tank (ara t-taqsima 2.1), segwita minn metodu 
adattat (e ż. il-prova ta' Dunnett jew ta' Williams (12) (13) (14) 
(21)) għat-tqabbil tal-medja r g ħal kull kon ċentrazzjoni mal-medja 
r għall-kontrolli biex ti ġi identifikata l-aktar kon ċentrazzjoni baxxa li 
għaliha din id-differenza hija sinifikattiva f'livell ta' probabbiltà ta' 
0,05. Jekk is-supposizzjonijiet me ħtieġa għall-metodi parametric ċi 
ma jintla ħqux – distribuzzjoni mhux normali (e ż. il-prova ta' 
Shapiro-Wilk) jew varjanza etero ġena (il-prova ta' Bartlett), 
għandha ting ħata konsiderazzjoni g ħat-trasformazzjoni tad-data biex 
jiġu omoġenizzati l-varjanzi qabel ma ssir l-ANOVA, jew biex issir 
l-ANOVA mi żuna. 
Jekk il-prova ma tkunx inkludiet ir-replikazzjoni tat-tankijiet f'kull 
konċentrazzjoni, ANOVA bba żata fuq it-tankijiet ma tkunx sensittiva 
jew tkun impossibbli. F'din is-sitwazzjoni, kompromess a ċċettabbli 
hu li l-ANOVA tkun ibba żata fuq ir-rata ta' żvilupp “psewdo” 
speċifika r  3 għall-ħut individwali.  
Il-medja ta' l-r  3 għal kull kon ċentrazzjoni tal-prova tista' imbag ħad 
tiġi mqabbla mal-medja ta' l-r  3 għall-kontrolli. Il-LOEC tista' 
imbagħad tiġi identifikata b ħal qabel. G ħandu jiġi konoxxut li dan 
il-metodu ma jipprovdi l-ebda kon ċessjoni għal, l-anqas protezzjoni 
kontra, il-varjabilità bejn it-tankijiet, aktar minn dik li hi ġġustifikata 
mill-varjabilità ta' bejn il- ħut individwali. Madankollu, l-esperjenza 
uriet (8) li l-varjabilità bejn it-tankijiet kienet żgħira ħafna meta 
mqabbla mal-arjabilità ġot-tank (i.e. bejn il- ħut). Jekk il- ħut indi­
vidwali ma jkunx inklu ż fl-analiżi, il-metodu ta' identifikazzjoni ta'  
data anomala (outlier) u l- ġustifikazzjoni g ħall-użu tagħha għandhom 
ikunu provduti.  
2.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Ir-riżultati għandhom ikunu interpretati bl-attenzjoni fejn il-kon ċen­
trazzjonijiet meqjusa ta' tossikant fis-soluzzjonijiet tal-prova jse ħħu 
f'livelli qrib tal-limitu ta' osservazzjoni tal-metodu analitiku jew, fi provi semistati ċi, meta l- kon ċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova 
tonqos minn soluzzjoni ppreparata friska g ħal qabel ma ti ġġedded.
 
2.3. RAPPORT TAL-PROVA  
Ir-rapport tal-prova g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Sustanza tal-prova:  
— natura fi żika u proprjetajiet fi żiċikimiċi relevanti,  
— data  dwar l-identifikazzjoni kimika inklu ż il-purità u l-metodu 
analitiku g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza tal-prova fejn xieraq.  
2.3.2.  Spe ċi tal-prova:  
— possibbilment, l-isem xjentifku,  
— razza, daqs, fornitur, kull trattament li jkun sar minn qabel, e ċċ. 
2.3.3.  Kondizzjonijiet tal-prova:  
— proċedura tal-prova u żata (eż. semi-statiku/ta' ti ġdid, flow- 
through, tag ħbija, densità tal- ħżin, eċċ), 
— disinn tal-prova (e ż. numru ta' re ċipjenti tal-prova, kon ċen­
trazzjonijiet u repliki tal-prova, numru ta' ħut f'kull re ċipjent),  
— metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal- ħżin u frekwenza 
tat-tiġdid (l-aġent li jiffa ċiltà s-solubbilità u l-kon ċentrazzjoni 
tiegħu għandhom jing ħataw, meta u żati), 
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tal-prova, il-medji tal-valuri 
meqjusa u d-devjazzjonijiet mill-istandard tag ħhom fir-re ċipjenti 
tal-prova u l-metodu li bih dawn intla ħqu u evidenza li t-tiqjis 
jirreferi g ħall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova f'so ­
luzzjoni vera,  
— karatterisiti ċi ta' l-ilma g ħat-taħlit: pH, ebusija, alkalinità, 
temperatura, kon ċentrazzjoni ta' ossi ġnu maħlul, livelli residwali 
ta' klorin (jekk meqjusa), karbonju organiku totali, solidi f'forma ta' suspensjoni, salinità tal-likwidu tal-prova (jekk meqjus) u kull tiqjis ieħor li jsir,
 
— kwalità ta' l-ilma fir-re ċipjenti tal-prova: pH, ebusija, temperatura 
u konċentrazzjoni ta' ossi ġnu maħlul, 
— informazzjoni dettaljata dwar it-tmig ħ (eż. tip ta' ikel, g ħajn, 
ammont mog ħti u frekwenza).  
2.3.4.  Ri żultati:  
— evidenza li l-kontrolli la ħqu l-kriterju ta' validità g ħas-sopravi ­
venza, u data dwar l-imwiet li jse ħħu f'kull wa ħda mill-kon ċen­
trazzjonijiet tal-prova,  
— metodi ta' teknika ta l-istatistika analitika u żati, statistika bba żata 
fuq ir-repliki jew il- ħut, trattament tad-data u ġustifikazzjoni tal- 
metodi ta' teknika u żati, 
— data mqassma f'forma tabulari dwar il-pi ż ta' ħut individwali u l- 
piċ medju fil-jiem 0, 14 (jekk meqjusa) u 28, valuri tar-rati ta' 
żvilupp medji spe ċifiċi għat-tank jew psewdo spe ċifiċi (kif 
xieraq) għall-perjodi 0-28 jum jew possibbilment 0-14 u 14-28,  
— riżultati ta' l-anali żi ta' l-istatistika (i.e. anali żi tar-rigressjoni jew 
ANOVA) preferibbilment f'forma tabulari u grafika u l-LOEC (p 
= 0,05) u n- NOEC jew l-ECx ma', meta possibbli, l-i żbalji 
standard, kif xieraq,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— inċidenza ta' kull reazzjoni mhux tas-soltu mill- ħut u kull effett 
viżibbli ikka ġunat mis-sustanza tal-prova.  
3. REFERENZI  
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
Ir-Rapport tal-WRc Nru PRD 1388-M/2.  
(2) Ashley S., Mallett M. J and Grandy N. J. (1990). EEC: Ring Test 
of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the 
Growth Rate of Fish. Ir-Rapport Finali Lill-Kummissjoni tal- Komunitajiet Ewropej. Ir-Rapport tal-WRc Nru KEE: 2600-M.
 
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, p ġ. 1855-1870.  
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Bra ­
chydanio rerio): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, p ġ. 157-164.
 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in 
biological field. Medaka (killifish) biology and strains. 
Keigaku Publish. Tokio, Japan.  
(6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- 
term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Econ. Conta. Toxicol. 28, p ġ. 287-297.
 
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA- 600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, 
Minnesota.
 
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner u D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
pġ. 328-338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, 
coho salmon, jew atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Ir-Rapport EPS 1/RM/28, 81 pp. Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
 
(10) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 ta' 
Diċembru 1991.
 
(11) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, p ġ. 1096-1121.
 
(12) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, p ġ. 482-491.  
(13) Williams D. A. (1971). A test for differences between 
treatment means when several dose levels are compared with 
a zero dose control. Biometrics 27, p ġ. 103-117.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A 
technique using sequential feedings of different coloured food 
to determine food intake by individual rainbow trout, Oncor ­
hynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, p ġ. 
123-133.  
(15) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response 
in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, p ġ. 33-41.
 
(16) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Il- 
Kapitolu IX fit-Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, 
Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.  
(17) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, p ġ. 1485-1494.
 
(18) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). 
Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Ir-Rapport EA-6189 (American Petroleum Institute
 
(19) Publication, Nru 4468). Electric Power Research Institute, Palo 
Alto, CA.  
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for 
chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, 
Minnesota. Ir-Rapport Tekniku Nru 05-88 tan-National 
Effluent Toxicity Assessment Center. Settembru 1988. 12-il pp.
 
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, p ġ. 510-531.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
ANNESS 1  
SPEĊI TA' ĦUT RAKKOMANDAT G ĦALL-PROVA U KONDIZZJONIJIET TAL-PROVA ADATTATI  
Speċi Firxa rakkom ­
andata tat- 
temperatura tal- 
prova 
( o C) Fotoperjodu 
(sigħat) Firxa rakkom ­
andata għall-piż 
inizjali tal- ħut 
(g) Preċiżjoni meħtieġa 
fit-tiqjis Rata tat-tag ħbija 
(g/l) Densità tal- ħżin 
(kull litru) Ikel Tul tal-prova 
(jiem)  
Speċi rakkomandati  
Oncorhynchu s mykiss  L-ispeċi 
fil-ġeneru ta' Salamun 
(rainbow trout) 12,5 - 16,0 12 – 16 1 – 5 Sa l-eqreb 
100 mg 1,2 - 2,0 4 Ikel proprjetarju niexef 
magħmul minn ħut żgħir tas- 
salmonid ≥ 28 
Speċi oħra li huma ddoku ­
mentati tajjeb:  
Danio rerio  
zebrafish 21 – 25 12 – 16 0,050 - 0,100 Sa l-eqreb 1 mg 0,2 - 1,0 5 – 10 Ikel ħaj (Brachionus Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
ricefish (Medaka) 21 – 25 12 – 16 0,050 - 0,100 Sa l-eqreb 1 mg 0,2 - 1,0 5 – 20 Ikel ħaj (Brachionus Artemia ) ≥ 28
ANNESS 2  
XI KARATTERISTI ĊI KIMI ĊI TA' ILMA G ĦAT-TAĦLIT 
AĊĊETTABBLI  
Sustanza Kon ċentrazzjonijiet  
Materja f'partikoli < 20 mg/l 
Karbonju organiku totali < 2 mg/l 
Ammonja mhix jonizzata < 1 μg/l 
Klorin residwali < 10 μg/l 
Pestiċidi ta' l-organofosforu totali < 50 ng/l 
Pestiċidi ta' l-organoklorin totali bi ż-żjieda ta' bifenili 
poliklorinati < 50 ng/l 
Klorin organiku totali < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
ANNESS 3  
Serje logaritmika ta' kon ċentrazzjonijiet tajbin g ħat-test ta' tossi ċità (9)  
Kolonna (numru ta' kon ċentrazzjonijiet bejn 100 u 10, jew bejn 10 u 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Serje ta' ħames (jew iktar) kon ċentrazzjonijiet su ċċessivi jistg ħu jingħażlu minn kolonna. Il- mid-points  ta' bejn il-kon ċen­
trazzjonijiet f'kolonna (x) jinsabu f'kolonna (2x + 1). Il-valuri msemmija jistg ħu jirrappre żentaw kon ċentrazzjonijiet li jing ħadu 
bħala perċentwal f'volum jew pi ż (mg/l jew μg/l). Il-valuri jistg ħu jkunu multiplikati jew divi żi bi kwalunkwe  power of  10 kif inhu 
xieraq. Il-kolonna 1 tista' tintu ża jekk ikkun hemm in ċertezza konsiderevoli fil-livell ta' tossi ċità. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  PROVA TA' TOSSI ĊITÀ B'TERMINU QASIR FUQ  
EMBRIJONI  U STADJI TA' SAC-FRY TAL- ĦUT 
1. METODU  
Dan il-metodu ta' ittestjar g ħal tossiċità b'terminu qasir huwa replika 
tal-OECD TG 212 (1998).  
1.1. DA ĦLA 
Dan it-test ta' tossi ċità b'terminu qasir fuq embrijoni u stadji ta' sac- 
fry tal-ħut huwa prova b'terminu qasir fejn ji ġu esposti l-istadji tal- 
ħajja minn meta bajda ġdida tiġi fertilizzata sa l-istadju ta' sac-fry. 
Ebda ikel ma huwa provdut fit-test ta' l-embrijon u sac-fry, u t-test 
għandu jiġi terminat waqt li s-sac-fry g ħadhom ji ġu nutriti mill- 
membrana li tag ħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajda.  
L-għan ta' dan it-test huwa sabiex jiddefinixxi effetti letali, u sa ċertu 
punt effeti sub-letali ta' kimi ċi fuq l-istadji spe ċifiki u fuq l-ispe ċi 
ittestjati. Dan it-test jipprovdi informazzjoni utli b'tali mod li jista' (a) jifforma pont bejn testijiet letali u dawk sub-letali (b) jintu ża bħala 
test ta' screening g ħal test komplut fuq l-istadji kollha tal-bidu tal- 
ħajja jew g ħal test ta' tossi ċità kronika u (c) jista' jintu ża biex jiġu 
ittestjati spe ċi li it-tkabbir tag ħhom m'huwiex avvanzat biex ikopri 
biżżejjed il-perjodu ta' transizzjoni minn nutriment endo ġenu għal 
dak esoġenu.
 
Ta' min jiftakar li testijiet li jinkorporaw il-fa żijiet kollha tal- ħajja tal- 
ħuta huma ġeneralment su ġġetti li jag ħtu stima e żatta tat-tossi ċità 
kronika tal-kimi ċi għall-ħut, u kwalunkwe tnaqqis fl-espo żizzjoni 
fir-rigward ta' stadji tal- ħajja jistgħu inaqqsu is-sensittività ta' dan 
it-test u g ħalhekk jissottovalutaw it-tossi ċità kronika. G ħalhekk hu 
mistenni li t-test ta' l-embrijun u ta' l-istadji ta' sac-fry ikun inqas sensittiv minn dak ta' test komplut fuq l-istadji kollha tal-bidu tal- 
ħajja, partikolarment fejn jid ħlu kimiċi li għandhom lipofilità g ħolja 
(log P
 ow > 4) u kimi ċi b'mod ta' azzjoni tossika spe ċifika. 
Madankollu differenzi zg ħar bejn iż-żewġ testijiet huma mistennija 
għal kimiċi li m'għandhomx mod ta' azzjoni narkotika spe ċifika (1).  
Qabel ma' ġie ppublikat, dan it-test ta' l-embrijun u ta' sac-fry ġie 
ppruvat l-aktar fuq ħut ta' l-ilma ħelu Danio rerio  Hamilton- 
Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – mag ħruf aktar b ħala zebrafish). 
Għaldaqstant l-appendi ċi 1 jagħti gwida aktar dettaljata ta' l- 
eżekuzzjoni ta' dan it-test fuq din l-ispe ċi. Dan ma jeskludix l-u żu 
ta' speċi oħra għal liema di ġà hemm xi prova disponibbli (Tabella 1).  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Konċentrazzjoni minima b'effett sinjifikanti (LOEC): hija l-aktar 
konċentrazzjoni baxxa ttestjata mis-sustanza tat-test fejn is-sustanza 
ikollha effett sinifikattiv (f'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, kull kon ċentrazzjoni 'l fuq mill-LOEC g ħandu jkollha 
effett ta' ħsara daqs jew aktar minn dawk osservati fl-LOEC.
 
Konċentrazzjoni massima ming ħajr effetti sinifikanti (NOEC): hija l- 
prova ta' kon ċentrazzjoni e żatt taħt l-LOEC.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
L-istadji ta' l-embrijon u tas-sac-fry tal- ħut huma esposti g ħal 
sensiela ta' kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza g ħall-prova dissolta fl- 
ilma. Il-protokoll jippermetti g ħażla bejn pro ċedura semi-statika 
jew proċedura b'ċirkolazzjoni kontinwa. Din l-g ħażla tiddependi 
fuq in-natura tas-sustanza li ser ti ġi ittestjata. Dan it-test jibda billi 
jitpoġġew bajd fertilizzat fil-kontenituri u jintemm e żatt qabel ma l- 
membrana li tag ħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd ta' xi wa ħda mil-larva f'xi 
kontenitur tkun assorbita kompletament jew qabel ma l-kontrolli 
jibdew imutu tal- ġuħ. Effetti letali u sub-letali huma evalwati u 
mqabbla mal-valuri relattivi g ħall-kontrolli bl-iskop li ti ġi deter­
minata l-kon ċentrazzjoni minima b'effetti sinifikanti. L-alternattiva 
hi li jiġu analizzati billi jintuza mudell rigressiv sabiex tkun stmata 
il-konċentrazzjoni li tista' tikkaw ża effett per ċentwali (i.e. LC/ECx, 
fejn x hija effett % definit).  
1.4. INFORMAZZJONI FUQ IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Ir-riżultati ta' test ta' tossi ċità qawwija (ara metodu C.1) preferi ­
bilment ma' l-ispe ċi magħżula għal dan it-test, g ħanhom ikunu 
disponibbli. Ir-ri żultati jistg ħu jkunu utli biex tintg ħażel sensiela ta' 
konċentrazzjonijiet tat-test mill-istadji tal-bidu tal- ħajja. Is-solubilità 
ta' l-ilma (inklu ż is-solubilità fl-ilma tat-test) u l-pressa tal-fwar 
għandhom ikunu mag ħrufa. Għandu jkun hemm metodu ta' min 
jorbot fuqu disponibbli, g ħal kwantifikazzjoni tas-sustanza fis- 
soluzzjonijiet tat-test, b'e żattezza mag ħrufa u rappurtata kif ukoll il- 
limitu ta' rivelazzjoni.  
L-informazzjoni utli fuq is-sustanza tat-test sabiex ji ġu definiti il- 
kondizzjonijiet g ħall-eżekuzzjoni tat-test tinkludi il-formola strut ­
turali, il-purità tas-sustanza, dawl stabbli, stabilità fil-kondizzjonijiet 
ta' l-eżekuzzjoni tat-test, pKa, Pow u r-ri żultati ta' test ta' bijode ­
gradibiltà immedjata (ara metodu C.4).  
1.5. VALIDITÀ TAT-TEST  
Biex test ikun validu dawn il-kondizzjonijiet li ġejjin għandhom 
japplikaw:  
— is-sopravivenza komplessiva tal-bajd fertilizzat fil-kontrolli, u 
fejn hu relevanti, fil-kontenituri ta' solvent biss, g ħandha tkun 
aktar jew daqs il-limiti definiti fl-Annessi 2 u 3,  
— matul it-test, il-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġnu dissolt g ħandha tkun 
bejn 60 u 100 % tal-valur ta' l-arja saturata (ASV),  
— it-temperatura ta' l-ilma m'g ħandhiex tvarja b'iktar minn ± 1,5  o C 
bejn il-kompartamenti divesri jew bejn ġranet suċċessivi waqt il- 
ħin tat-test u g ħandha tkun fil-limitu tas-sensiliet spe ċifikati ta' 
temperaturi g ħall-ispeċi użati fit-test (Annessi 2 u 3).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Il-Kompartamenti tat-test  
Jista' jintu ża kull tip ta' re ċipjent tal- ħġieġ jew kimikament inerti. Id- 
dimensjonijiet tar-re ċipjenti għandhom ikunu kbar bi żżejjed sabiex 
ikunu konformi mar-rata ta' tag ħbija (ara taqsima 1.7.1.2). Hu 
rakkomandat li l-kompartamenti tat-test ikunu po żizzjonati kif ġie 
ġie fil-post fejn ser isir it-test. Jekk fil-laboratorju je żistu effetti 
sistematiċi kontrollabbli permezz ta' separazzjoni bi blokki, preferi ­
bilment g ħandu jintu ża disinn sperimentali bi blokki ta' daqs irre ­
golari fejn kull trattament ikun pre żenti f'kull blokka, monflok ma 
jintuża disinn kompletament irregolari. Jekk jintu ża il-metodu ta' 
għeluq, dan g ħandu jittie ħed in konsiderazzjoni fl-anali żi 
sussegwenti ta'  data . Il-kompartamenti tat-test g ħandhom ikunu 
imħarsa minn kwalunkwe interferenza.  
1.6.2.  Selezzjoni ta' spe ċi ta' ħut 
Speċi ta' ħut rakkomandat huma mni żżla f'tabella 1A. Din ma tipper ­
mettix l-u żu ta' speċi oħrajn (eżempji huma mog ħtija f'tabella 1B), 
iżda il-pro ċedura tat-test tista tkun adattata sabiex tipprovdi 
kondizzjonijiet adattati g ħat-test. F'dan il-ka ż, ir-raġuni li tiġġustifika 
l-għażla ta' l-ispe ċi u l-metodu esperimentali g ħandhom ikunu 
magħrufa. 
1.6.3.  Trobbija tal- ħut riptoduttiv  
Dettalji fuq i ż-żamma tal- ħut riproduttiv f'kondizjonijiet sodisfa ċenti 
jinstabu f'OECD TG 210 (  1 ) u f'referenzi (2) (3) (4) (5) (6).  
1.6.4.  Immani ġġjar ta' embrijoni u larva  
Embrijoni u larva jistg ħu ikunu esposti, fil-kontenitur ewlieni, f'kon ­
tenituri i żgħar bil-ġnub jew bit-truf miksija b'xibka sabiex 
jippermettu ċ-ċirkolazzjoni tas-sustanza tat-test madwar il-kontenitur. 
Wieħed jista jasal g ħal ċirkolazzjoni non turbolenti f'dawn il- 
kontenituri i żgħar billi jdendilhom ma' brazz b'tali mod li jkunu 
jistgħu jiċċaqalqu 'l fuq u 'l isfel i żda xorta wa ħda l-organi jibqg ħu 
mgħarrqa; tista' ti ġi użata wkoll sistema bis-sufun. Bajd iffertilizzat 
ta' ħut salmonidu jista' ji ġi sistemati fuq xkafef jew xbieki b'fet ħiet 
kbar biżżejjed li jippermettu il-bajd jg ħaddu wara it-tfaqqis. Il-pipetti 
tat-tip pasteur huma l-aktar adattati g ħat-tneħħija ta' l-embrijoni u tal- 
larva fit-testijiet semistati ċi b'tiġdid kuljum ta' l-ilma (ara paragrafu 
1.6.6).  
Il-kontenituri, il-gradilji jew ix-xbieki li ntu żaw biex i żommu l-bajd 
ġol-kontenitur ewlieni tat-test, g ħandhom jitne ħħew wara li jfaqqsu l- 
larva (  1 ), bl-eċċezzjoni li x-xbieki g ħandhom jit ħallew sabiex iwaqqfu 
l-ħut milli ja ħarbu. Jekk ikun hemmm il-b żonn li jiġu mċaqalqa il- 
larva, dawn m'g ħandhomx ikunu esposti g ħall-arja u m'g ħandhomx 
jintużaw xbiek biex ji ġu mħarrba ħut mill-kontenituri tal-bajd (pre ­
kawzjoni bhal din tista ma tkunx ne ċessarja għal speċ inqas delikat 
bħal per eżempju il-carp). Il- ħin tat-trasferiment ivarja skond l-ispe ċi u 
mhux dejjem ikun hemm b żonn ta' dan it-trasferiment. G ħat-teknika 
semistatika jistg ħu jintużaw buqari jew kontenituri baxxi, u jekk ikun 
hemm bżonn dawn ikunu armati b'xibka b ħala paraventu kemm kemm 
'il fuq mill-qig ħ tal-buqar. Jekk il-volum ta' dawn il-kontenituri huwa 
biżżejjed sabiex jaqbel mal-b żonn tat-tag ħbija, (ara 1.7.1.2) ma jkunx 
hemm bżonn ta' trasferiment ta' embrijoni u larva.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, “Fish, Early-life Stage Toxicity Test”.
 1.6.5.  Ilma  
Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristi ċi kimiċi ta' ilma dilwit kif 
imniżżel f'Appendi ċi 4 u ġo liema ilma l-ispe ċi użata fit-test turi 
kapaċità ta' sopravivenza almenu daqs dik deskritta f'Appendi ċi 2 
u 3, huwa ilma tajjeb biex ikun u żat fittest. L-ilma g ħandu jkun ta' 
kwalità kostanti matul il-perjodu tat-tets. Il-pH g ħandha tjin żamm fil- 
limitu ta' ± 0,5 unità pH. Sabiex ji ġi żgurat li l-ilma dilwit ma j ħallix 
effetti mhux mixtieqa fuq ir-ri żultat tat-test (per e żempju taħwid tas- 
sustanza), jew kuntrarjament jaffettwa il- ħut riproduttiv, g ħandhom 
jittieħdu kampjuni biex ji ġu analizzati regolarment. Qisien ta' metalli 
tqal (per e żempju. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd u Ni), anjoni u katjoni 
maġġuri (eż. Ca, Mg, Na, K, Cl u SO  4 ), pestiċidji (per e żempju 
pestiċidji b'organofosforu totali u organoklorin totali), karbon 
totalment organiku u solidi sopi żi għandhom ikunu mag ħmula kull 
tliet xhur, meta ilma tat-ta ħlit ikollu kwalità relattivament kostanti. 
Jekk il-kwalità ta' l-ilma tkun kostanti almenu g ħal sena, qatg ħat 
deciżivi jistgħu jkunu anqas frekwenti u l-intervalli jistg ħu jkunu 
anqas frekwenti (per e żempju kull sitt xhur).  
1.6.6.  Soluzzjonijiet tat-test  
Soluzzjonijet tat-test fuq il-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula, huma 
preparati b'ta ħlit ta' soluzzjoni ewlenija.  
Din is-soluzzjoni g ħall-ħażna għandha tkun preparata preferibilment 
billi is-sustanza tat-test tit ħallat u tit ħawwad ma' l-ilma b'mezzi 
mekkaniċi (per eżempju tqanqil u ultrasonikazzjoni). Sabiex ti ġi 
milħuqa soluzzjoni kon ċentrata ewlenija, jistg ħu jintużaw kolonni 
saturati (kolonni solubili). Sa fejn hu possibbli g ħandu jiġi evitat l- 
użu ta' solvents jew dipersants (a ġenti solubilizzanti); madankollu, 
ċertu komposizzjonijiet jistg ħu jiġu bżonnjużi f'ċerti każi sabiex ti ġi 
prodotta soluzzjoni kon ċentrata xierqa. E żempji ta' solvents adattati 
huma aċetun, ethanol, metanol, dimethylformamide u triethyleneg ­
lycol. Eżempji ta' dispersants adattati huma Cremophor RH40, 
Tween 80, methylcellulose 0,01 % and HCO-40. Meta jintu żaw 
aġenti li jkollhom bijo-degradibbiltà mg ħaġġla (per eżempju: aċetun) 
jew li jevaporaw malajr, wie ħed irid juża kawtela peress li dawn jistg ħu 
jikkawżaw problemi fil-kreazzjoni ta' batterja f'testijiet b' ċirkolazzjoni 
kontinwa. Meta jkun u żat aġent solubbli, dan m'g ħandux iħalli l-ebda 
effett sinifikanti fuq is-sopravivenza u l-anqas xi effett negattiv fuq l- istadji inizjali ta' ħajja kif juri il-kontroll li jkun solvent biss. 
Madankollu, g ħandu jsir kull sforz biex ji ġi evitat l-u żu ta' materjal 
bħal dan.
 
Għat-teknika semi-statika jistg ħu jintużaw żewġ proċeduri ta' ti ġdid 
differenti; jew (i) li ji ġu preparati soluzzjonijiet ġodda f'kontenituri 
nodfa u il-bajd ħaj u il-larva ji ġu trasferiti delikatament fil- 
kontenituri ġodda li jkollhom fihom volum żgħir mis-soluzzjoni il- 
qadima, kif ukoll ji ġi evitat li ji ġu esposti g ħall-arja, jew (ii) l- 
oganiżmi tat-test jin żammu fil-kontenituri filwaqt li proporzjon 
(almenu tliet kwarti) mill-ilma tat-test jinbidel. Il-frekwenza ta' 
tiġdid ta' dan il-mezz ikun jiddependi fuq l-istabilità tas-sustanza 
ittestejata, i żda tiġdid kuljum ta' l-ilma huwa rakkomandat. Jekk 
minn testijiet preliminari ta' stabilità (ara sezzjoni 1.4) jirri żulta li 
l-konċentrazzjoni tas-sustanza ittestjata m'hijiex stabbli (ji ġifieri barra 
mill-parametri 80-120 %, tal-kon ċentrazzjoni nominali jew inqas 
minn 80 % ta' tal-kon ċentrazzjoni imkejla inizjalment) waqt il- 
perjodu ta' ti ġdid, jeħtieġ li jittieħed in-konsiderazzjoni l-u żu ta' 
test b'ċirkolazzjoni kontinwa. Fi kwalunkwé ka ż jeħtieġ li jiġi 
evitat kull li ji ġu stressjati il-larvae waqt li l-ilma jkun qed ji ġġedded.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Testijiet b' ċirkolazzjoni kontinwa jirrikjedu sistema li kontinwament 
tiddispensa u t ħallat is-soluzzjoni inizjali (per e żempju metering 
pump, proportional diluter, saturator system) biex ikunu jistg ħu 
jipprovdi serje ta' kon ċentrazzjonijiet fil-kompartamenti tat-test. T 
Ir-rati ta' ċirkolazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u ta'l-ilma g ħat- 
taħlit m'għandhomx ivarjaw b'iktar minn 10 % matul it-test. Rata 
ta' ċirkolazzjoni ekwivalenti almenu g ħall-volum ta' ħames kompar ­
tamenti tat-test g ħal 24 sieg ħa hija adattata (2).  
1.7. PRO ĊEDURA  
Fil-letteratura wie ħed isib infornazzjoni utli fuq il-prestazzjoni ta' 
testijiet fuq l-embrijuni tal- ħut kif ukoll fuq it-testijiet ta' tossi ċità 
ta' sac-fry, b'xi e żempji jinstabu wkoll fil-biblijografija inklu ża ma' 
dan it-test (7) (8) (9).  
1.7.1.  Kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.7.1.1.  Tul ta' Żmien  
Dan it-test g ħandu jibda preferibilment fi żmien 30 minuta wara li 
jkunu ġew iffertilizzati l-bajd. L-embrijoni g ħandhom ji ġu mgħarrqa 
fis-soluzjoni tal-prova qabel jew e żatt wara li jkun beda l-istadju tal- 
qsim tal-blastodisc, imma dejjem qabel ma jkun beda l-istadju tal- 
gastrula. It-test ma jistax jinbeda immedjatament wara l-fertliz ­
zazzjoni jekk il-bajd ikun ġej mingħand sorsi kummer ċjali. Billi 
kull dewmien jista jinfluwenza serjament is-sensittività tat-test, it- 
test għandu jibda fi żmien tmien sig ħat wara il-fertilizzazzjoni. 
Billi il-larva ma jing ħatawx ikel waqt il-perjodu ta' espo żizzjoni, 
it-test għandu jintemm e żatt qabel ma tkun inxtorbot il-membrana 
li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd fi kwalunkwe mill-kompartamenti li 
qed isiru t-testijiet fihom jew qabel ma jkunu jew imutu min ħabba 
nuqqas ta' ikel. Id-dewmien jiddependi fuq l-ispe ċi li qed tkun u żata. 
F'l-Appendi ċi 2 u 3 wie ħed isib xi rakkomandazzjonijiet f'dan ir- 
rigward.  
1.7.1.2.  Tagħbija 
In-numru ta' bajd fertilizzat g ħandu jkun bi żżejjed sabiex jissodisfaw 
it-talbiet ta' l-istatistika. Dawn g ħandhom ikunu distribwiti kif ġie ġie 
fost it-trattamenti, u ghal kull kon ċentrazzjoni g ħandhom jintu żaw 
almenu 30 bajda fertilizzata imqassmin indaqs, (jew almenu ndaqs 
kemm jista' jkun billi jista' jkun diffi ċli li jkollok gruppi ndaqs meta 
tkun qed tu ża ċertu speċi) bejn almenu tliet kompartamenti replika. 
Ir-rata ta' tag ħbija (bijomassa skond il-volum tas-soluzzjoni ittestjata) 
għandha tkun baxxa bi żżejjed b'tali mod li tippermetti li tin żamm 
konċentrazzjoni ta' ossi ġnu dissolt ta' almenu 60 % ASV ming ħajr 
arjazzjoni. Huwa rakkomandat li g ħal testijiet b' ċirkolazzjoni 
kontinwa, ir-rata ta' tag ħbija ma taqbi żx 0,5 g/l g ħal 24 sieg ħa u 
ma taqbiżx 5 g/l ta' soluzzjoni fi kwalunkwé ħin (2).  
1.7.1.3.  Dawl u temperatura  
It-temperatura tal-fotoperjodu u ta' l-ilma g ħandha tkun wa ħda xierqa 
għall-ispeċi li qed ikunu ttestjati (Appendi ċi 2 u 3). Biex tkun ikkon ­
trollata it-temperatura ikun opportun li jintu ża reċipjent tat-test 
miżjud. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Kon ċentrazzjonijiet tat-test  
Normalment huma rikjesti ħames kon ċentrazzjonijiet tat-test li 
għandhom fattur ta' differenza kostanti u li ma jaqbi żx it-3,2. Fl- 
għażla tas-sensiela ta' kon ċentrazzjonijiet tat-test wie ħed għandu 
jieħu in-konsiderazzjoni il-kurva li tirrelata l-LC50 mal-perjodu ta' 
espożizzjoni fl-istudju ta' tossi ċità qawwija. F'xi ċirkostanzi, b ħal per 
eżempju f'testijiet tal-limitu, ikun aktar adattat li jintu żaw inqas minn 
ħames kon ċentrazzjonijiet kif ukoll l-intervall ta' kon ċentrazzjonijiet 
ikun aktar ristrett. Trid ting ħata spjegazzjoni jekk jintu żaw anqas 
minn ħames kon ċentrazzjonijiet. Kon ċentrazzjonijiet b'sustanza 
għola minn LC  50 f'69 siegħa jew 100mg/1, bl-ebda differneza ghal 
liema hija l-aktar baxxa, m'g ħandhomx g ħalfejn jiġu ttestjati. Is- 
sustanzi m'g ħandhomx ikunu ittestjati fl-ilma tat-test 'il fuq mil- 
limitu ta' solubilità tag ħhom.  
Meta aġent solubilizzanti ikun u żat biex jg ħin fil-preparazzjoni tas- 
soluzzjonijiet g ħat-test (ara sezzjoni 1.6.6), il-ko ċentrazzjoni finali 
fir-reċipjenti tat-test m'g ħandhomx ikunu aktar minn 0,1 ml/l u 
għandu jkun l-istess fir-re ċipjenti kollha.  
1.7.3.  Kontrolli  
Aparti il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza ittestjata, irid ji ġi ippreparat 
ukoll kontroll bl-ilma g ħat-taħlit (ripetuta skond il-b żonn) u event ­
walment kontroll ukoll bl-ilma li fih l-a ġent solubilizzanti (ripetut 
skond il-b żonn).  
1.7.4.  Frekwenza tad-determinazzjonijiet u qisien analiti ċi 
Waqt it-test, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza huma determinati f'in ­
tervalli regolari.  
Huwa rakkomandat li f'testijiet semi-stati ċi, il-konċentrazzjoni tat- 
test, li mistennija tibqa' fl-iskala ta' ± 20 % tal-valur nominali, (i.e. 
bejn 80-120 %; ara sezzjoni 1.4 u 1.6.6), l-g ħola u l-inqas kon ċen­
trazzjonijiet tat-test, ikunu analizzati meta jkunu g ħadhom kif ġew 
preparati u immedjatament qabel it-tibdil ta' l-ilma almenu tliet 
darbiet imqassmin tul il-perjodu tat-test (i.e. l-anali żi għandhom 
jiġu effettwati fuq kampjun ta' l-istess soluzzjoni li tkun g ħadha 
kemm ġiet ippreparata u wara fil-mument li ser tkun ħa tinbidel).  
Huwa ne ċessarju li fil-ka żi ta' testijiet fejn il-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza li qed ti ġi ittestjata m'hix mistennija li tibqa fil-limitu ta' 
± 20 % tal-valur nominali (fuq il-ba żi ta' data fuq l-iatbilità tas- 
sustanza) ji ġu analizzati il-kon ċentrazzjonijiet kollha tat-test, e żatt 
meta jkunu g ħadhom kif ġew preparati u kif ikunu qed jinbidlu, 
iżda tinżamm l-istess skema (i.e. fi tliet okka żjonijiet imqassma 
mat-test kollu). Id-determinazzjoni tas-sustanza ittestjata qabel it- 
tiġdid tas-soluzzjoni, g ħandha ssir fuq replika tar-re ċipjent għal 
kull kon ċentrazzjoni tat-test. L-intervalli ta' bejn id-deter ­
minazzjonijiet ma jridux ikunu aktar minn sebat ijiem. Huwa 
rakkomandat li ir-ri żultati ikunu ibba żati fuq kon ċentrazzjonijiet 
imkejla. Madankollu, jekk ikun hemm evidenza li turi li l-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza ittestjata fis-soluzzjoni hi fil-limitu ta' ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew tal-kon ċentrazzjoni mkejla iniz ­
jalment matul it-test, allura ir-ri żultati jistg ħu ikunu ba żati fuq 
valuri nominali jew fuq valuri imkejla inizjalment.
 
Għal testijiet b' ċirkolazzjoni kontinwa, l-u żu ta' reġim ta' kampjuni 
simili għal dak deskritt g ħal testijiet semistati ċi hu adattat (i żda f'dan 
il-każ, il-qisien ta' soluzzjonijiet antiki ma japplikawx). Madankollu, 
jekk it-test idum aktar minn sebat ijiem, huwa rakkomandat li 
jiżdiedu l-okka żjonijiet meta jittie ħdu kampjuni (e ż. tliet settijiet ta' 
qisien) biex tkun żgurata l-istabilità tal-kon ċentrazzjonijiet ittestjati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Jista' jagħti l-każ li il-kampjuni jkollhom b żonn li jiġu separati jew 
iffiltrati (E ż. billi jintu żaw pori ta' daqs 0,45 im). Madankollu, billi la 
s-separazzjoni u l-anqas il-filtrazzjoni ma jidher li dejjem jisseparaw il-frazzjoni non bijodisponibbli tat-test minn dik bijodisponibbli, il- kampjuni jistg ħu ma jiġux suġġetti għal dawk it-trattamenti.
 
Waqt it-test, l-ossi ġnu dissolt, il-pH u it-temperatura, g ħandhom ji ġu 
mkejla f'kull re ċipjent tat-test. L-ebusija kif ukoll is-salinità (jekk 
relevanti) totali, g ħandhom jitkejlu fil-kontrolli u f're ċipjent wie ħed 
li jkollu l-og ħla konċentrazzjoni. L-ossi ġnu u is-salinità (jekk 
relevanti), g ħandhom jitkejlu minimament tliet darbiet (fil-bidu, 
fin-nofs u fl-a ħħar tat-test). Huwa rakkomandat, li f'testijiet semi- 
statiċi, l-ossiġnu dissolt ji ġi mkejjel aktar spiss, preferibiliment 
qabel u wara kull ti ġdid ta' l-ilma, jew almenu darba fil- ġimgħa. 
Il-pH, f'testijiet semi-stati ċi, għandha tiġi mkejla fil-bidu u fl-a ħħar 
ta' kull ti ġdid ta' l-ilma u ta' l-inqas darba fil- ġimgħa fil-każ ta' 
testijiet b' ċirkolazzjoni kontinwa. L-ebusija g ħandha tkun imkejla 
darba f'kull test. It-temperatura g ħandha titkejjel kuljum u preferi ­
bilment g ħandha tkun osservata kontinwament almenu f'kompar ­
tament wie ħed tat-test.  
1.7.5.  Osservazzjonijiet  
1.7.5.1.  Stadju ta' żvilupp embrijoniku  
L-istadju embrijoniku (i.e. embriju fl-ewwel stadju ta' żvilupp) fil- 
bidu ta' l-espo żizzjoni tas-sustanza ittestjata, g ħandu jkun verifikat 
kemm jista' jkun bi pre ċiżjoni. Dan jista' jsir billi jintu ża kampjun 
rappreżentattiv tal-bajd li jkun pre żervat u separat kif jixraq. G ħal 
deskrizzjoni u xbiehat ta' l-istadji embrijoni ċi wieħed jista' jirreferi 
għall-letteratura (2) (5) (10) (11).  
1.7.5.2.  Tfaqqis u sopravvivenza.  
Ta' l-inqas darba kuljum, g ħandhom isiru oservazzjonijiet, kif ukoll 
jiġu dokumentati ċ-ċifri tat-tfaqqis u tas-sopravivenza. Jista' jag ħti l- 
każ li jkunu jridu jsiru osservazzjonijiet aktar frekwenti fil-bidu tat- 
test (eż. kull 30 minuta matul l-ewwel tliet sig ħat) billi f' ċerti każi 
dawn jista' jkollom aktar relevanza milli n-numru ta' mwiet biss (e ż. 
meta hemm effetti tossi ċi qawwijin). Embirijoni u larva mejta 
għandhom jitne ħħew hekk kif ji ġu innutati billi dawn jit ħassru 
malajr. Wie ħed għandu joqg ħod ferm attent meta jkunu qed 
jitneħħew individwi mejta li ma jitlaqqg ħux jew issir xi ħsara lill- 
bajd/larva ta' ħdejhom billi dawn huma delikati ħafna. Ir-ra ġunijiet 
tal-mewt ivarjaw skond f'liema stadju ta' ħajja jkunu:  
— għal bajd: partikolarment fl-istadji tal-bidu, nuqqas notevoli ta' 
trasluċidità u bidla fil-kulur, kaw ża ta' koagulazzjoni li twassal 
għal dehra bajda m ċajpra,  
— għal embrijoni: nuqqas ta' ċaqliq tal-ġisem u/jew nuqqas ta' ta ħbit 
tal-qalb u/jew tidnis im ċajpar tal-kulur fi spe ċi li l-embrijoni 
tagħhom huma normalment trasparenti,  
— għal larva: immobilità u/jew nuqqas ta' movement respiratorju 
u/jew nuqqas ta' ta ħbit tal-qalb u/jew is-sistema ta' nervituri 
ċentrali ssir ta' kulur abjad im ċajpar u/jew nuqqas ta' reazzjoni 
fl-istimolu mekkaniku.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Aspett anormali  
In-numru ta' larva li juru anormalitajiet fil-forom tal- ġisem u/jew 
pigmentazzjoni, u l-istadju ta' assorbiment tal-membrana li tag ħlaq 
ġo fiha l-isfar ta' bajda, g ħandhom ikunu dokumentati f'inetrvalli 
adekwati skond it-tul tat-test kif ukoll in-natura ta' l-anormalità desk ­
ritta. Ta' min jinnota li embrijoni u larva anormali huma fenomenu naturali u fil-kontroll(i) ta' xi spe ċi jsitgħu jlaħħqu ħafna punti 
perċentwali. Annimali anormali g ħandhom jitne ħħew mir-re ċipjenti 
tat-test, meta jmutu biss.
 
1.7.5.4.  Imġieba anormali  
Anormalitajiet, b ħal per eżempju te ħid tan-nifs mg ħaġġel ħafna, 
għawm mhux koordinat, u inattività atipiku g ħandhom ji ġu doku­
mentati f'intervalli adekwati skond it-tul tat-test. Dwan l-effetti, 
għalkemm diffi ċli biex ji ġu kwanitifikati, meta jkun osservati, 
jistgħu jgħinu fl-interpretazzjoni ta' l-informazzjoni fuq l-imwiet, ji ġi­
fieri, jipprovdu informazzjoni fuq il-mod ta' azzjoni tossika tas- 
sustanza.  
1.7.5.5.  Tul  
Fi tmiem it-test, huwa rakkomandat li jitkejlu it-tulijiet ta' kull 
individwu u jistg ħu jintużaw qisien standard, mifrudin jew tat-tul 
totali. Madankollu, jekk il- ġewnaħ tad-denb tit ħassar jew tit ħaffer, 
għandhom jintu żaw qisien standard. Ġeneralment, f'testijiet 
immexxija tajjeb, il-koeffi ċjent tal-varjazzjoni fit-tul fost ir-repliki 
fil-kontrolli g ħandu jkun ≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Piż 
Fl-aħħar tat-test, jistg ħu jitkejlu il-pi żijiet individwali; il-pi żijiet xotti 
(24 siegħa f60  o C) huma preferuti minn dawk umdu żi (wara li jkunu 
ġew ixxuttati). Ġeneralment, ftestijiet immexxija tajjeb, il-ko-effi ċjent 
tal-varjazzjoni fil-pi ż fost ir-repliki fil-kontrolli g ħandu jkun ≤ 20 %.  
Dawn l-osservazzjonijiet iwasslu sabiex l-informazzjoni mog ħtija 
hawn tkun g ħad-dispożizzjoni ta' statistika analitika:  
— mwiet kumulattiv,  
— numru ta' larva b'sa ħħita fl-aħħar tat-test,  
— ħin biex jibda u jispi ċċa it-tfaqqis (i.e. 90 % ta' tfaqqis fir- 
repliki),  
— numru ta' larva li jfaqqsu kuljum,  
— tul (u qies) ta' annimali li baqg ħu ħajjin fi tmiem it-test,  
— numru ta' larva li huma deformati jew b'apparenza anormali,  
— numru ta' larva li qed juru im ġieba anormali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DATA  U RAPPURTA ĠĠ 
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Huwa rakkomandat li l-istatistiku jkun involut kemm fid-disinn kif 
ukoll fl-anali żi tat-test billi il-metodu j ħalli lok g ħal varjazzjoni 
konsiderevoli fl-esperiment fid-disinn, per e żempju fin-numru ta' 
kompartamenti tat-test, fin-numru ta' kon ċentrazzjonijiet tat-test, in- 
numru ta' bajd fertilizzat li ser jibda bih u fil-parametri mkejla. Fid- dawl ta' dawn l-alternativi fid-disinn tat-test, gwisda spe ċifika fuq il- 
proċeduri statisti ċ i m'humiex mog ħtija hawn.
 
Jekk ser ji ġu kalkolati l-LOEC/NOEC allura jkun hemm b żonn li l- 
varjazzjonijiet ji ġu analizzati f'kull sett ta' repliki billi tintu ża l-analiżi 
tal-varjazzjoni (ANOVA) jew pro ċeduri ta' tabelli kontin ġenti. Il- 
metodu ta' Dunnett jista' jkun utli (12) (13) sabiex isir tqabbil bejn ir-riżultati f'kon ċentrazzjonijiet individwali u r-ri żultati fil-kontrolli. 
Huma wkoll disponibbli e żempji oħra utli (14) (15). Id-daqs ta' l- 
effett li ji ġi identifikat meta jintu ża l-metodu u pro ċeduri oħra, (i.e. 
il-qawwa tat-test) g ħandu jkun kalkolat u dokumentat. G ħandu jkun 
innutat li mhux kull osservazzjoni mni żżla f'taqsima 1.7.5.6 hija 
adattata g ħal analiżi ta' statsitika bil-metodu ANOVA. Per 
eżempju, mwiet kumulattiv u n-numru ta' larva b'sa ħħitha fit-tmiem 
tat-test, jistg ħu jiġu analizzati b'metodi ta' probit.
 
Jekk se jkunu kalkolati LC/EC  x s, iridu jkunu mda ħħla fid- data 
kurva(i) adattata(i) b ħall-kurva lo ġistika, billi jintu ża metodu stat ­
istiku bħal kaxxi minimi jew kaxxi minimi li mhux linejari. Il- 
kurva(i) g ħandha(hom) tkun(u) mqieghda f'parametri sabiex l- 
LC/EC  x interessata u l-i żball standard tag ħha jista' jkun kalkolat 
direttament. Dan i ħaffef ħafn aktar il-kalkoli tal-limiti ta' kunfidenza 
madwar l-LC/EC  x . Sakemm ma jkunx hemm motivi sabiex ji ġu 
preferiti livelli affidabbli differenti, g ħandha tiġi kwotata 95 % ta' 
kunfidenza b' żewġ livelli. Preferibilmet, il-pro ċedura ta' adattament 
għandha tipprovdi mezz biex ji ġi valutat is-sinifikat tan-nuqqas ta' 
addattament. Jistg ħu jintużaw metodi grafi ċi għal kurvi xierqa. 
Analiżi rigressiva hi adattata g ħall-osservazzjonijiet kollha mni żżla 
f'taqsima 1.7.5.6.  
2.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Ir-riżultati għandhom ikunu trattati b'kawtela fil-ka żijiet ta' meta fis- 
soluzzjonijiet tat-test jitkejlu kon ċentrazzjonijiet ta' sustanzi tossi ċi 
fil-limitu ta' osservazzjoni tal-metodu analitiku. L-interpretazzjoni tar-riżultati ta' ko ċentrazzjonijiet 'il fuq mil-livell ta' solubilità tas- 
sustanza, g ħandha ssir b'kawtela wkoll.
 
2.3. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi din l-informazzjoni:  
2.3.1.  Sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u l-karatteristi ċi fiżiċi relevant ital-kimika,  
— fejn relevanti, l-identifikazzjoni kimika tad- data, inklużi l-purità 
u l- metodu analitiku g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza ttestjata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Spe ċi ittestjati:  
— l-isem xjentifiku, il-purità, in-numru ta' ħut riproduttiv (ji ġifieri 
kemm intu żaw speċi femminili biex ġew prodotti in-numru ta' 
bajd fertilizzat li ġie użat fit-test), minn fejn ori ġinaw u l-metodu 
ta' kollezzjoni tal-bajd fertilizzat u manipulazzjoni su ċċessiva.  
2.3.3.  Kondizzjonijiet tat-test:  
— proċedura użata fit-test (e ż. semistatika jew b' ċirkolazzjoni 
kontinwa, perjodu ta' ħin mill-fertilizzazzjoni sal-bidu tat-test, 
manipulazzjoni, e ċċ), 
— fotoperjodu(i),  
— disinn tat-test (e ż. numru ta' kompartamenti tat-test u repliki 
tagħhom, numru ta' embrijoni replikati),  
— metodu ta' preparazzjoni ta' soluzzjonijiet ta' ħażna u l-frekwenza 
ta' tiġdid (l-aġent solubilizzanti u l-kon ċentrazzjonijiet tieg ħu 
għandhom jing ħataw meta ji ġu użati), 
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-valuri mkejla kif ukoll 
il-medja u d-devjazzjonijiet standard tag ħhom fir-re ċipjenti tat- 
test u l-metodu ta' kif dawn jintla ħqu u jekk is-sustanza 
ttestjata tin ħallx fl-ilma b'kon ċentrazzjonijiet inqas minn dawk 
ittsetjati, g ħandhom ji ġu provduti sabiex il-qisien jirreferu 
għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza ttestjata fis-soluzzjoni,  
— karatteristi ċi ta' l-ilma m ħallat: p pH, solidità, temperatura, kon ċ­
entrazzjoni ta' ossi ġnu dissolt, livelli ta' klorin residwu (jekk ġie 
mkejjel) karbon organiku totali, suspended solids, salinità tal- 
mezz ittestjat (jekk ġie mkejjel) u kwalunkwe qies ie ħor, 
— kwalità ta' l-ilma fil-re ċipjenti tat-test: pH, solidità, temperatura u 
konċentrazzjoni ta' ossi ġnu maħlul. 
2.3.4.  Ri żultati:  
— riżultati minn studji preliminary fuq l-istabilità tas-sustanza 
ittestjata,  
— xiehda li l-kontrolli jikkorrispondu ma' l-istandard ta' 
sopravivenza a ċċettabbli ta' l-ispe ċi ittestjati (Appendi ċi 2 u 3),  
— data fuq mortalità/sopravivenza fl-istadju ta' embrijun u larva kif 
ukoll mortalità u sopravivenza komplessiva,  
— ġranet biex ifaqqsu u kwantità  
— ġranet biex ifaqqsu u kemm faqqsu – data g ħal tul (u pi ż), 
— incidenza u deskrizzjoni ta' anormalitajiet morfolo ġiċi, jekk 
jeżistu, 
— incidenza u deskrizzjoni ta' effetti ta' m ġieba, jekk je żistu, 
— analiżi statistika u trattament tad-data,  
— għal testijiet li u żaw l-ANOVA, l-inqas kon ċentrazzjoni b'effetti 
sinjifikanti (LOEC) F'P=0,05 f' kon ċentrazzjoni massima 
mingħajr effetti sinjifikattivi (NOEC) g ħal kull risposta 
analizzata, inklu ż deskrizzjoni tal-pro ċeduri statisti ċi utilizzati u 
indikazzjoni ta' l-entità ta' l-effett li seta' ġie individwat,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— għal testijiet li u żaw it-teknika rigressiva, l-LC/ECx u intervalli 
ta' kunfidenza u deskrizzjoni grafika tal-mudell u żat għall-kalko­
lazzjoni tieg ħu, 
— spjegazzjoni g ħal kull devjazzjoni minn dan il-metodu ta' 
ittestjar.  
3. REFERENZI  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Comunities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
 
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research 
Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.  
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). it-temperatura Criteria 
for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature review. 
J. Biol. 10, pp. 121-173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328- 
330.
 
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology 
and Chemistry, 6, pp. 61-71.
 
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 
807-821.
 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout 
(Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.
 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Devel ­
opment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
 
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply 
Company, North Carolina. 36 pp.  
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist.. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Stat ­
istical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. 
Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, 
Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Test Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon jew 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
1/RM/28, December 1992, 81 pp.  
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio 
rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126-134.
 
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylo ­
genetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series 
B, 252: pp. 231-236.
 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and 
Environmental Safety 32, pp. 19-28.
 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 
1991, EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., 
Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seve n-day Fathead minnow (Pimephales 
promelas) larval survival and grow th test: an intra- and interlab ­
oratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.
 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
 
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New devel ­
opmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
 
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, 
Academic press, pp. 1-58.  
Tabella 1A  
Speċi ta' ħut rakkomandat g ħat-test  
Ilma Ħelu 
Oncorhynchus mykiss  
Rainbow trout (9)(16)  
Danio rerio  
Zebrafish (7)(17)(18)  
Cyprinus caprio  
Karpjun komuni (8)(19)  
Oryzias latipes  
Japanese ricefish/Medaka (20)(21)  
Pimephales promelas  
Fathead minnow (8)(22)  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabella 1B  
Eżempji ta' spe ċi oħra dokumentati tajjeb li ġew użati 
Ilma Ħelu Ilma Miela ħ 
Carassius auratus  
Goldfish (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23)(24)(25)  
Lepomis macrochirus  
Bluegill (8)  Clupea harengus  
Herring (24)(25)  
Gadus morhua  
Merluzz (24)(25)  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow (23)(24)(25)  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
ANNESS 1  
GWIDA FUQ IL-PRESTAZZJONI TA' TEST TA' TOSSI ĊITÀ FUQ 
EMBRIJONI U SAC-FRY TA' ZEBRAFISH ( BRACHYDANIO RERIO ) 
DAĦLA 
Iż-zebrafish tori ġina mill-kosta ta' Coromandel fl-Indja fejn tg ħix fi xmajjar 
b'kurrent mg ħaġġel ta' ilma. Hija ħuta komuni ta' l-akwarju li tappartjeni g ħall- 
familja tal-carp, u informazzjoni dwar il-pro ċeduri għal ħarsien u l-kultura tag ħha 
tista' tinstab f'kotba standard dwar ħut tropikali. Il-bijolo ġija u l-użu tagħha għal 
riċerka ta' sajd kienu riveduti minn Laale (1).  
Il-ħuta rari tkun itwal minn 45 mm. Il- ġisem hu ta' forma ċilindrika b' 7-9 strixxi 
orizzontali ta' lewn blu skur ar ġentat. Dawn l-istrixxi jkopru l- ġwienaħ tal-ġenb 
u ta' wara. Id-dahar huwa ta' lewn a ħdar kulur i ż-żebbuġa. L-irġiel huma rqaq 
min-nisa. In-nisa ileqqu aktar u żaqqhom hi aktar mitluqa partikolarment qabel 
ma jbidu.  
Il-ħut adult hu kapa ċi jittollera varjazzjonijiet kbar fit-temperatura, pH u ebusija. 
Madankollu, g ħandhom ikunu provduti kondizzjonijiet ottimali biex ikun hemm 
ħut f'saħħtu li jipprodu ċi bajd ta' kwalità.  
Waqt li l-mara tkun qed tbid, ir-ra ġel jiġri warajha u jtiha bir-ras, u l-bajd ikun 
fertilizzat hekk kif ikun ħiereġ. Il-bajd, li hu trasparenti u ma jwa ħħalx, jaqgħu 
fil-qigħ fejn jistg ħu jiġu mittiekla mill- ġenituri stess. Il-pro ċess ta' meta l- ħuta 
tbejjed jiġi influwenzat mid-dawl. Jekk id-dawl ta' filg ħodu jkun adattat, il- ħut 
ġeneralment ibejjed fis-sig ħat bikrin ta' wara s-seb ħ. 
Ta' kull ġimgħa, mara tista' tipprodu ċi lottijiet ta' diversi mijiet ta' bajd.  
KONDIZZJONIJIET TA' ĦUT RIPRODUTTIV, RIPRODUZZJONI U STADJI 
TAL-BIDU TAL- ĦAJJA  
Agħżel numru adegwat ta' ħut f'saħħtu u żommhom f'ilma adattat (e ż. Appendi ċi 
4) almenu g ħal ġimgħatejn qabel it-tqeg ħid ta' bajd pro ġettat. Il-grupp ta' ħut 
għandu jitħalla jirriprodu ċi ta' l-anqas darba qabel ma jipprodu ċu il-lott ta' bajd 
użat fit-test. Id-densità ta' ħut f'dan il-perjodu ma jridx ikun aktar minn gramma 
ta' ħut għal kull litru. Tibdil regolari ta' l-ilma jew l-u żu ta' sistemi ta' purifi ­
kazzjoni jippermettu li din id-densità tkun og ħla. It-temperatura fit-tankijiet li qed 
jinżammu fihom g ħandha tin żamm sa 25 ± 2  o C. Il-ħut għandu jkollu dieta 
varjata, li tista' tikkonsisti minn per e żempju ikel kummer ċjali niexef, Arthemia 
mfaqqsa friska, chironomids, Daphnia, dud abjad (Enchytraeids).  
Żewġ proċeduri li fil-prattika wasslu g ħal-lott suffi ċjenti ta' bajd f'sa ħħtu 
u fertiliizzat sabiex ikun kondott test huma spjegati hawn ta ħt: 
Tmien nisa u 16-il ra ġel huma mitfug ħa f'tank l-i fih 50 litru ta' ilma g ħat- 
taħlit, protett minn dawl dirett u mitluqa kemm jista jkun ming ħajr ma jiġu 
disturbati g ħal almenu 48 sieg ħa. Tilar biex fih isir it-tqeg ħid ta' bajd huwa 
mqiegħed fil-qig ħ ta' l-akwarju wara nofsinhar fil- ġurnata ta' qabel jibda t- 
test. Dan it-tilar jikkonsisti fi gwarni ċ (ħġieġ plexi jekk materjal adattat 
ieħor), għoli 5-7 ċm u b'xibka ħarxa ta' 2-5 mm mwa ħħla ma' fuq u xibka 
fina ta' 10-30 μm mal-qieg ħ. Max-xibka l- ħarxa nsibu diversi “si ġar tat- 
tqegħid ta' bajd”, mag ħmulin minn ħabel tan-najlon ma ħlul. Wara li l- ħut 
ikunu tħallew fid-dlam g ħal 12-il sieg ħa, jinxteg ħel dawl baxx biex 
jingħata bidu g ħat-tqegħid ta' bajd. 2-4 sig ħat wara it-tqeg ħid ta' bajd, it- 
tilar li fih ibidu jitne ħħa u jinġabru l-bajd. Dan it-tilar i ċaħħad il-ħut milli 
jieklu l-bajd u jiffa ċilita wkoll il- ġbir tal-bajd. Il-grupp ta' ħut għandhom 
ikunu biedu ta' l-inqas darba qabel it-tqeg ħid ta' bajd li jintu ża fit-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
5-10 ħutiet maskili u femminili huma mqieg ħda individwalment ta' l-inqas 
ġimgħatejn qabel it-tqeg ħid ta' bajd. Wara 5-10 ijiem, i ż-żaqq tan-nisa tkun 
tidher mitluqa u il-papillae ġenitali tag ħhom ikunu vi żibbli. Ħut maskili 
m'għandhomx papillae. It-tqeg ħid ta' bajd isir f'tankijiet apposta armati 
b'xibka falza fil-qieg ħ (kif deskritt hawn fuq). It-tank hu mimli b'ilma g ħat- 
taħlit, sabiex il-fond ta' l-ilma ‘il fuq mix-xibka jkun ta' 5-10 ċm. Mara wa ħda 
u żewġt irġiel huma mqieg ħda fit-tank ġurnata qabel it-tqeg ħid pjanat. It- 
temperatura ta' l-ilma ti żdied gradwalment bi grad wie ħed għola mit- 
temperatura akklimatizzanti. Id-dawl jintefa u possibilment it-tank jit ħalla 
mingħajr ma jkun disturbat kemm jista' jkun. Filg ħodu jinxteg ħel dawl 
baxx sabiex jinbed it-tqeg ħid ta' bajd. Sa 2-4 sig ħat wara il- ħut jitneħħa 
u l-bajd jin ġabar. Jekk ikun hemm b żonn ta' lottijiet ikbar ta' bajd minn 
dak l-ammont li tista' tipprodu ċi mara wa ħda, allura jistg ħu jiġu preparati 
numru suffi ċjenti ta' tankijiet g ħat-tqegħid ta' bajd fl-istess ħin. Meta is- 
suċċess tar-riproduzzjoni ta' nisa individwali qabel it-test (daqs tal-lott u l- 
kwalità)ji ġi dokumentat, dawk in-nisa bl-g ħola rata ta' su ċċess riproduttiv, 
jistgħu ikunu mag ħżula għar-riproduzzjoni.  
Il-bajd għandhom ikunu trasferiti g ħal ġor-reċipjenti tat-test permezz ta' tubi tal- 
ħġieġ (id-dijametru minn ġewwa m'g ħandux ikun inqas minn 4mm) fornuti bi 
flexible suction bulb. L-ammont ta' ilma li fih jitpo ġġew il-bajd biex ji ġu tras­
feriti għandu jkun minimu kemm jista' jkun. Il-bajd huma itqal mill-ilma 
u jistgħu joħorġu minn ġot-tubi. G ħandha ting ħata attenzjoni sabiex ji ġi evitat 
li l-bajd (u l-larva) ji ġu f'kuntatt ma' l-arja. G ħandu jsir e żami mikroskopiku tal- 
kampjun(i) tal-lott(ijiet) sabiex ji ġi żgurat li m'hemm l-ebda irregolarità fl-ewwel 
stadji ta' l-i żvilupp. Di żinfezzjoni tal-bajd mhux permess.  
Ir-rata ta' mwiet fost il-bajd tkun l-og ħla fl-ewwel 24 sieg ħa wara l-fertiliz ­
zazzjoni. Mortalità ta' 5-40 % hi normali f'dan il-perjodu. Il-bajd jidde ġenera 
bħala riżultat ta' falliment fil-fertilizzazzjoni jew fl-i żvilupp. Il-kwalità tal-lott 
jiddependi fuq il- ħut nisa billi certu nisa jipprodu ċu bajd ta' kwalità tajba 
filwaqt li o ħrajn qatt ma jipprodu ċu bajd ta' kwalità. Anke ir-rata ta' żvilupp 
u r-rata ta' tfaqqis tvarja minn lott g ħall-ieħor. Il-bajd fertilizzat b'su ċċess u l- 
membrana li tag ħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd jg ħixu sew, normalment ‘il fuq minn 
90 %. F'25  o C il-bajd ifaqqas 3-5 ijiem wara l-fertilizzazzjoni u l-membrana li 
tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd tkun assorbita bejn wie ħed u ieħor 13-il ġurnata 
wara l-fertilizzazzjoni.  
L-iżvilupp embrijoniku kien definit tajjeb minn Hisaoka u Battle (2). Min ħabba 
it-trasparenza tal-bajd u tal-larva wara it-tfaqqis, jista' ji ġri li l-iżvilupp tal- ħut 
ikun segwit minn pre żenza ta' malformazzjonijiet. Bejn wie ħed u ieħor erba' 
sigħat wara it-tqeg ħid ta' bajd, il-bajd mhux fertilizzat ikun jing ħaraf minn dak 
fertilizzat (3). G ħal dan l-e żami, il-bajd u l-larva jitpo ġġew f'kompartamenti 
b'volum baxx u studjati ta ħt mikroskopju.  
Il-kondizzjonijiet tat-test, li japplikaw g ħall-istadji ta' bidu tal- ħajja huma mni żżla 
f'Appendi ċi 2. Valuri ottimali tal-pH u ta' l-ebusija ta' l-ilma tat-ta ħlit huma 7,8 
u 250 mg CaCO  3 /l rispettivament.  
KALKOLAZZJONIJIET U STATISTIKA  
Hu propost metodu b' żewġ stadji. L-ewwel, id-data fuq il-mortalità, żvilupp 
anormali u l- ħin tat-tfaqqis huma analizzati statistikament. Wara, it-tul tal- 
ġisem ta' dawk il-kon ċentrazzjonijiet f'liema ma kien hemm l-ebda effett 
kuntrarju fuq l-ebda minn dawn il-parametri, hu evalwat statistikament. Dan l- 
approċċ huwa rakkomandat billi it-tossikant jista' joqtol ħut iżgħar, itawwal il- ħin 
għat-tfaqqis u jwassal g ħal malformazzjonijiet kbar u sussegwentement 
jinfluwenza il-kejl ta' tul. F Barra minn dan, ser ikun hemm bejn wie ħed 
u ieħor l-istess ammont ta' ħut biex ikunu mkejla g ħal kull trattament, sabiex 
tiġi assigurata il-validità ta' l-istatistika tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
DETERMINAZZJONIJIET TA' L-LC  50 U EC  50 
Il-persenta ġġ ta' bajd u larva sopraviventi huwa kalkolat u ti ġi koreġuta abbażi 
tal-mortalità fil-kontrolli skond il-formola ta' Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
billi, 
P = % ta' sopravivenza korretta  
P' = % ta' sopravivenza osservata fil-kon ċentrazzjoni tat-test  
C = % sopravivenza fil-kontroll  
Jekk hu possibbli, l-LC  50 tiġi determinata b'metodu adattat fi tmiem it-test.  
Jekk hi mixtieqa l-inklu żjoni ta' anormalitajiet morfolo ġiċi fl-istatistika ta' l-EC  5O , 
wieħed jista' jsib gwida g ħal dan fi Stephan (5).  
STIMA TA' LOEC U NOEC  
L-għan tat-test fuq il-bajd u s-sac-fry huwa li jqabbel kon ċentrazzjonijiet diversi 
miz-zero mal-kontroll, u allura ji ġi determinat l-LOEC. G ħalhekk għandhom ji ġu 
utilizzati diversi pro ċeduri ta' tqabbil (6) (7) (8) (9) (10).  
REFERENZI  
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio 
rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121- 
173. 
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173-181.
 
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.
 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statis. Assoc., 50, pp. 1096- 
1121.  
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with 
a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, pp. 103-117.  
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with 
a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
ANNESS 2  
KONDIZZJONIJIET TAT-TEST, DEWMIEN U KRITERJI TA' SOPRAVIVENZA G ĦAL SPEĊI RAKKOMANDATI  
Speċi Temp 
( o C) Salinità 
(0/00) Fotoper jod 
(sigħat) (hrs) Dewmien fl-istadji 
(ġranet) 
Dewmien tipiku tat-test Sopravivenza tal-Kontroll 
( % minimu) 
embrijo Sac-fry Suċċess fit- 
tfaqqis Perjodu ta' wara 
t-tfaqqis  
ILMA ĦELU  
Brachydanio rerio  
Zebrafish 25 ± 1 — 12 – 16 3 – 5 8 – 10 Appena wara l-fertilizzazzjoni (fil-bidu ta' 
l-istadju tal-gastrula) sa ħamest ijiem wara 
it-tfaqqis (8-10 ijiem) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Rainbow trout 10 ± 1 (  1 ) 
12 ±1 (  2 ) — 0 (  a ) 30 – 35 25 – 30 Appena possibbli wara il-fertilizzazzjoni 
(fil-bidu ta' l-istadju tal-gastrula) sa 20 
ġurnata wara t-tfaqqis (50-55 ġurnata) 66 70  
Cyprinus carpio  
Karpjun komuni 21 – 25 — 12 – 16 5 > 4 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (8-9 ġranet) 80 75  
Oryzias latipes  
Japanese ricefish/Medaka 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12 – 16 8 – 11 4 – 8 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 5 ijiem wara it-tfaqqis (13-16-il ġurnata) 80 80  
Pimephales promelas  
Fathead minnow 25 ± 2 — 16 4 – 5 5 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem 
wara it-tfaqqis (8-9 ġranet) 60 70
 
( 1 ) Għall-embrijoni. 
( 2 ) Għall-larvae . 
( a ) Dlam g ħall-embrijoni u g ħal-larvae  sa ġimgħa wara t-tfaqqis ħlief meta jkunu spezzjonati. Imbag ħad dawl baxxa matul it-test.
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
ANNESS 3  
Kondizzjonijiet tat-test, dewmien u kriterji g ħal sopravivenza ta' spe ċi oħra dokumentati tajjeb  
Speċi TEMP (  0 C) Salinità (0/00) Fotoperjod 
(sigħat) (hrs) Dewmien fl-istadji ( ġranet) 
Dewmien tipiku tat-test Sopravivenza tal-Kontroll ( % 
minimu) 
embrijo SAC-FRY TEST Suċċess tat- 
tfaqqis Wara t-tfaqqis  
ILMA ĦELU  
Carassius auratus  
Goldfish 24 ± 1 — — 3 – 4 > 4 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (7 ġranet) — 80  
Leopomis macrochirus  
Blugill sunfish 21 ± 1 — 16 3 > 4 | Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem 
wara it-tfaqqis (7 ġranet) — 75 
ILMA MIELA Ħ 
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22 -25 15 – 22 12 1,5 10 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 5 ijiem wara it-tfaqqis (6-7 ġranet) 80 60  
Clupea harengus  
Herring 10 ± 1 8 – 15 12 20 – 25 3 – 5 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 3 ijiem 
wara it-tfaqqis (23-27 ġranet) 60 80  
Gadus morhua  
Cod 5 ± 1 5 – 30 12 14 – 16 3 – 5 Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 3 ijiem 
wara it-tfaqqis (18-il ġurnata) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow 25 ± 1 15 – 30 12 — — Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni 
(kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4/7 ijiem wara it-tfaqqis (28 ġurnata) > 75 80
ANNESS 4  
XI KARATTERISTI ĊI KIMI ĊI TA' ILMA G ĦAT-TAĦLIT 
AĊĊETTABBLI  
Sustanza Kon ċentrazzjoni  
Materja ta' parti ċelli < 20 mg/l 
Karbonju organiku totali < 2 mg/l Ammonja mhix ionizzata < 1 μg/l 
Klorina residwali < 10 μg/l 
Pestiċidi organophosphorus totali < 50 ng/l 
Pestiċidi organophosphorus totali u polychlorinated 
biphenyls < 50 ng/l 
Klorina organika totali < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  NAĦAL – PROVA TA' TOSSI ĊITÀ ORALI AKUTA  
1. METODU  
Dan il-metodu ta' prova ta' tossi ċità akuta huwa replika ta' l-OECD 
TG 213 (1998).  
1.1. DA ĦLA 
Din il-prova ta' tossi ċità hija metodu li tintu ża fil-laboratorju, 
magħmul biex issir stima tat-tossi ċità orali akuta tal-prodotti g ħall- 
protezzjoni tal-pjanti u kimi ċi oħra, lin-na ħal adult li jkun qieg ħed 
jaħdem.  
Fl-istima u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi ta' tas-sustanzi, d- 
determinazzjoni ta' tossi ċità akuta orali fin-na ħal tista' tukun 
meħtieġa, e.ż. meta jkun probabbli li n-na ħal ġie espost g ħal xi 
kimika. Din il-prova ta' tossi ċità orali akuta ssir sabiex ti ġi deter­
minata it-tossi ċità intrinsika ta' pesti ċidi u kimi ċi oħra għan-naħal. Ir- 
riżultati ta' din il-prova g ħandhom jintu żaw biex ji ġi definit il-b żonn 
għal evalwazzjoni ulterjuri. B'mod partikolari, dan il-metodu jista' 
jintuża f'programmi mqassma f'aktar minn fa żi waħda sabiex ji ġu 
determinati il- ħsarat tal-pesti ċidi għan-naħal, ibbażat fuq sekwenza 
ta' provi ta' tossi ċità ġol-laboratorju g ħal-esperimenti fuq is-semi- 
kamp u fuq il-kamp (1). Il-pesti ċidi jistgħu jiġu ittestjati b ħala 
sustanzi attivi (s.a.) jew b ħala prodotti fformulati.  
L-istandard tossiku g ħandu jiġi stabbilit sabiex ti ġi vverifikata s- 
sensittività tan-na ħal u l-pre ċiżjoni tal-prova pro ċedurali.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Tossiċità orali akuta : hija l-effett avvers li jse ħħ f'perjodu massimu 
ta' 96 sieg ħa (s) ta' amministrazzjoni orali ta' dosa singola ta' 
sustanza sperimentali.  
Doża: hija l-ammont tas-sustanza ikkonsmata. Id-do ża hija espressa 
bħala l-massa ( μg) tas-sustanza sperimentali g ħal kull annimal speri ­
mentali ( μg/bee). L-ammont reali g ħal kull na ħla ma jistax ji ġi 
kkalkolat peress li n-na ħal jintema' kollettivament, imma tista' ssir 
stima tad-do ża medja (it-total tas-sustanza sperimentali kkonsmata/in- 
numru ta' na ħal sperimentali f'kull ga ġġa). 
LD 50 (doza letali medja) orali : hija do ża singola ta' sustanza 
miġjuba statistikament li tista' tikkaw ża l-mewt f'50 % ta' l- 
annimali meta ti ġi somministrata oralment. Il-valur ta' l-LD  50 huwa 
espress b ħala μg tas-sustanza sperimentali kull na ħla. Fil-ka ż tal- 
pestiċidi, is-sustanza sperimentali tista' tkun kemm sustanza attiva 
(s.a.) kif ukoll prodott formulat li jkunu fih wie ħed jew aktar 
sustanzi attivi.  
Mortalità:  annimal huwa registrat mejjet meta ikun kompletament 
immobbli.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAL-PROVA  
Naħal ħaddiema adulti ( Apis mellifera ) huma esposti g ħal firxa ta' 
dożijiet tas-sustanza sperimentali imferrxa f'soluzzjoni tas-sukrosju. 
In-naħal imbagħad jintema' bl-istess dieta, libera mis-sustanza speri ­
mentali. Matul mill-anqas 48 s il-mortalità ti ġi reġistrata kull jum u 
pparagunata mal-valur tal-kontroll. Jekk ir-rata tal-mortalità tkun qed 
tiżdied bejn 24 s u 48 s filwaqt illi l-mortalità tal-kontrolli tibqa' 
f'livell aċċettabbli, i.e. < = 10 %, ikun xieraq illi l-prova ti ġi estiża 
għal massimu ta' 96 s. Ir-ri żultati jiġu analizzati sabiex ji ġi kkalkulat 
l-LD  50 fl-24 s u t-48 s u, fil-ka ż li l-istudju ji ġi pprolongat, fit-72 s u 
fis-96 s.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDITÀ TAL-PROVA  
Sabiex prova tkun valida, japplikaw l-kondizzjonijiet li ġejjin:  
— il-mortalità medja g ħan-numru totali ta' kontrolli m'g ħandiex 
teċċedi 10 % fl-a ħħar tal-prova,  
— l-LD  50 ta' l-istandard tossiku jil ħaq il-firxa spe ċifikata.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL-PROVA  
1.5.1.  Kollezzjoni ta' na ħal 
Jintużaw naħal ħaddiema żagħżagħ adulti ta' l-istess razza, i.e. na ħal 
ta' l-istess età, mitmug ħa bl-istess mod, e ċċ. In-naħal għandu jinkiseb 
minn kolonji li g ħandhom re ġina, li huma mitmug ħin tajjeb, u 
sakemm dan ikun possibbli, li jkunu e żenti minn mard, bi storja u 
stat fiżjoloġiku magħruf. Jistg ħu jiġu miġbura filgħodu l-jum tal- 
prova jew filg ħaxija ta' qabel il-prova u mi żmuma fil-kondizzjonijiet 
tal-prova sal- ġurnata ta' wara. Jistg ħu jintużaw ukoll na ħal miġbura 
minn għamliet bla duqqajs. G ħandu jiġi evitat l- ġbir fil-bidu tar- 
rebbiegħa jew fl-a ħħar tal-ħarifa peress illi matul dan i ż-żmien n- 
naħal ibiddel l-istat fi żjoloġiku tiegħu. Jekk il-provi ikollom jsiru fil- 
bidu tar-rebbieg ħa jew fl-a ħħar tal-ħarifa, in-na ħal jistgħu jitqegħdu 
f'inkubatur u mrobbija g ħal gimgħa b'“ħobż tan-naħal” (pollinu 
miġbur mix-xehdiet) u soluzzjoni tas-sukrosju. In-na ħal li jiġi 
trattat b'sustanzi kimi ċi, bħal m'huma antibioti ċi, prodotti antivarroa, 
eċċ., m'għandux jintu ża għal provi ta' tossi ċità qabel erba' ġimgħat 
mit-tmiem ta' l-a ħħar trattament.  
1.5.2.  Kondizzjonijiet ta' manteniment u alimentazzjoni  
Jintużaw gaġġeġ li jitnaddfu fa ċilment u li g ħandhom ventilazzjoni 
tajjba. Kull materjal xieraq jista' jintu ża, e.ż. azzar stainless, xbieki 
tal-ħadid, plastik jew ga ġġeġ ta' l-injam disposable, e ċċ. In-numru 
idejali huwa ta' gruppi ta' g ħaxar naħliet f'kull ga ġġa. Il-qies tal- 
gaġġeġ sperimentali g ħandu jkun xieraq g ħan numru ta' na ħal, i.e. 
jipprovdi spazju adegwat.  
In-naħal għandu jinżamm fid-dlam ġewwa kamra sperimentali f'tem ­
peratura ta' 25 ± 2  o C. L-umdità relattiva, normalment madwar 50- 
70 %, għandha tiġi reġistrata matul il-prova kollha. Pro ċeduri ta' 
manipolazzjoni, inklu żi t-trattamenti u l-osservazzjonijiet jistg ħu 
jsiru fid-dawl (naturali). L-alimentazzjoni tikkonsisti f'soluzzjoni ta' 
sukrosju fl-ilma b'kon ċentrazzjoni finali ta' 500 g/l (50 % w/v). Wara 
li jingħataw id-do żii sperimentali, l-alimentazzjoni g ħandha ting ħata 
ad libitum . Is-sistema ta' alimentazzjoni g ħandha tħalli ssir re ġis­
trazzjoni ta' kemm ji ġi kkonsmat ikel f'kull ga ġġa (ara taqsima 
1.6.3.1). Tista' tintu ża pipetta tal- ħġieġ (madwar 50 mm twila u 
10 mm wiesg ħa bin-naħa l-miftu ħa li tidjieq g ħal djametru ta' 
madwar 2 mm).  
1.5.3.  Preparazzjoni tan-na ħal 
In-naħal miġbur jiġi allokat saltwarjament f'ga ġġeġ sperimentali, li 
mbagħad jitpoġġew saltwarjament fil-kamra sperimentali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Qabel ma tibda l-prova in-na ħal jista' jit ħalla bla ikel g ħal ħin 
massimu ta' 2 s. Huwa rakkomandat li n-na ħal jitħalla bla ikel 
qabel it-trattament sabiex fil-bidu tal-prova in-na ħal kollu jirri żulta 
ugwali f'termini tal-kontenut intestinali. Qabel ma tinbeda l-prova jeħtieġ illi jitne ħħa n-naħal li jkun qieg ħed imut u li ji ġi sostitwit 
b'naħal b'saħħtu.
 
1.5.4.  Preparazzjoni tad-do żi 
Meta s-sustanza sperimentali tkun wa ħda li tista' tit ħallat ma' ilma, 
din tista' tit ħallat direttament f'50 % soluzzjoni tas-sukrosju. G ħal 
prodotti u sustanzi o ħra tekniċi li ma jin ħallux daqshekk malajr fl- 
ilma, jistg ħu jintużaw vetturi o ħra bħal solventi organi ċi, emulsifiers 
jew dispersants li g ħandhom livell ta' tossi ċità baxxa g ħan-naħal (e.ż. 
acetone, dimethylformamide, dimethylsulfoxide). Il-kon ċentrazzjoni 
tal-vettura tiddependi fuq is- solubiltà tas-sustanza sperimentali li għandha tkun l-istess g ħal konċentrazzjonijiet kollha li ssirilhom il- 
prova. Madankollu, kon ċentrazzjoni tal-vettura ta' madwar 1 % hija 
ġeneralment xierqa u m'g ħandhiex tkun g ħola.
 
Sustanzi xierqa g ħall-kontroll g ħandhom jitlestew, i.e. meta solvent 
jew dispersant jintuza biex i ħoll is-sustanza sperimentali, g ħandhom 
jintużaw żewġ gruppi ta': soluzzjoni fl-ilma, u soluzzjoni ta' sukrosju 
li jkollha s-solvent/trasportatur bil-kon ċentrazzjoni u żata fis- 
soluzzjonijiet do żi. 
1.6. PRO ĊEDURA  
1.6.1.  Gruppi sperimentali u gruppi g ħall-kontroll  
In-numru ta' do żi u ta' repli ċi ttestjati g ħandhom ikunu konformi 
mar-rekwi żiti statisti ċi għad-determinazzjoni ta' l-LD  50 mal-limiti ta' 
affidabilità ta' 95 %. Normalment, g ħal-prova je ħtieġu ħames dożi 
f'serie ġeometrika, b'fatturi li ma jaqb żux 2.2, u li jkopru l-firxa 
għall-LD  50 . Madankollu, g ħandhom ji ġu determinati l-fattur tat- 
taħlit ma' l-ilma u n-numru ta' kon żentrazzjonijiet g ħad-dożi b're­
lazzjoni ma' kemm tkun immejla l-kurva tat-tossi ċità (doża kontra 
mortalità) u g ħandu jiġi ikkunsidrat il-metodu statistiku li ġie 
magħżul għall-analiżi tar-riżultati. Prova ta' ri ċerka fuq il-firxa 
tippermetti li jintg ħażlu l-konċentrazzjonijiet appropjati g ħad-dożi. 
Minimu ta' tlett gruppi ta' provi repetuti, kull wie ħed ta' tliet na ħliet, 
għandu jiġi dożat b'kull kon ċentrazzjoni sperimentali. Oltre s-serje 
sperimentali hu ne ċessarju li ji ġu analizzati minimu ta' tliet lottijiet 
ta' kontroll, kull wa ħda ta' 10 na ħliet. Huma me ħtieġa tliet gruppi ta' 
kontroll anke g ħal solventi/trasportaturi u żati (ara taqsima 1.5.4).  
1.6.2.  Sustanza tossika standard  
Fis-serje sperimentali g ħandha tiġi inkluża sustanza tossika standard. 
Jeħtieġ li jintgħażlu mill-anqas tlett do żi li jkopru l-valur mistenni ta' 
LD 50 . Għal kull do ża sperimentali jintu żaw mill-inqas tlett ga ġġeġ 
repliċi, kull wa ħdha fiha g ħaxar naħliet. Is-sustanza tossika standard 
preferuta hija d-dimethoate, fejn l-LD  50 -24 s orali rrapurtat huwa fil- 
firxa ta' 0,10- 0,35 μg s.a./naħla (2). Madankollu, huma ukoll a ċċet­
tabbli sustan żi tossiċi standard o ħra jekk data suffi ċenti tkun tista' 
tinġieb sabiex ti ġi vverifikata r-risposta mistennija rigward id- 
dożi(e.ż. parathion).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Espo żizzjoni  
1.6.3.1.  Somministrazzjoni tad-do żi 
Kull grupp sperimentali ta' na ħal għandu jirċievi 100-200 μl 
soluzzjoni tas-sukrosju ġo l-ilma ta' 50 %, li jkunu jinsabu fiha s- 
sustanza in e żami bil-kon ċentrazzjoni xierqa. G ħal dawk il-prodotti li 
jdumu ma jin ħallu fl-ilma, li g ħandhom livell ta' tossi ċità baxx jew li 
għandhom livell ta' kon ċentrazzjoni baxx fil-formulazzjoni, huwa 
meħtieġ volum akbar peress illi jkunu jridu jintu żaw proporzjonijiet 
għola fis-soluzzjoni tas-sukrosju. Il-monitora ġġ tal-kwantità ta' ikel 
trattat li ji ġi ikkonsmat minn kull grupp hu ne ċessarju. Ġaladarba 
jittiekel (normalment f'3-4 s), il-kontenitur ta' l-ikel g ħandu jitne ħħa 
minn ġol-gaġġa u mibdul b'kontenitur li jkun fih biss is-soluzzjoni 
tas-sukrosju. Is-soluzzjonijiet tas-sukrosju huma mbag ħad provduti  
ad libitum . Għal xi sustanzi li jkollhom kon ċentrazzjoni elevata hu 
possibbli li n-na ħal jirrifjuta l-ikel trattat. Wara ħin massimu ta' 6 s, 
l-ikel trattat li ma ji ġix ikkonsmat g ħandu jinbidel b'soluzzjoni ta' 
sukrosju biss. Stima ta' l-ikel trattat ikkonsmat hija ne ċessarja (e. ż. 
kejl tal-volum/pi ż ta' l-ikel trattat li jkun fadal).  
1.6.3.2.  Tul ta' żmien  
Preferibbilment, il-prova g ħandha ddum 48 s mill-mument meta s- 
soluzzjoni sperimentali ti ġi sostitwita b'soluzzjoni ta' sukrosju biss. 
Jekk il-mortalità tkompli tg ħola għal aktar minn 10 % wara l-ewwel 
24 s, d-durata tal-prova g ħandha tiġi estiża għal massimu ta' 96 s 
sakemm il-mortalità matul il-kontrolli ma jaqbi żx 10 %.  
1.6.4.  Osservazzjonijiet  
L-mortalità ti ġi reġistrata 4 s wara li tibda l-test u sussegwentement 
wara 24 s u wara 48 s (i.e. wara li ting ħata d-doża). F'każ li l-perjodu 
ta' osservazzjoni ji ġi pprolongat je ħtieġ li jkun hemm valutazzjonijiet 
oħra f'intervalli ta' 24 s sa ħin massimu ta' 96 s, CASemm il- 
mortalità matul il-kontrolli ma jaqbi żx 10 %.  
Għandu jkun hemm stima ta' l-ikel ikkonsmat minn kull grupp. 
Pargun bejn ir-rati ta' konsumazzjoni ta' ikel trattat u dak mhux 
trattat matul is-6 s imsemmija jista' jipprovdi informazzjoni dwar 
il-palatabiltà ta' l-ikel trattat.  
Hu neċessarju li ji ġu reġistrati l-anomaliji kollha fl-im ġieba osservata 
matul il-prova.  
1.6.5.  Prova limiti  
F'ċertu każijiet (e.ż. meta jkun mistenni illi sustanza sperimentali 
jkollha tossi ċità baxxa) tista' ssir prova limiti bl-u żu ta' 100μg s.a./­
naħla sabiex jintwera illi l-LD  50 huwa akbar minn minn dan il-valur. 
L-istess pro ċedura għandha tintu ża, inklużi t-tliet gruppi repli ċi, 
għad-doża sperimentali, g ħall-kontrolli rilevanti, g ħall-istima ta' l- 
ammont ta' ikel ikkonsmat, u g ħall-użu ta' l-istandard tossiku. Jekk 
iseħħu każijiet ta' mortalità, irid isir studju komplet. Jekk ji ġu 
osservati effetti subletali (ara taqsima 1.6.4), dawn g ħandhom ji ġu 
reġistrati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DATA  U RAPURTA ĠĠ 
2.1. DATA  
Id-data għandha tidda ħħal fil-qosor f'tabella li turi n-numru ta' na ħal 
użat kif ukoll il-mortalità f'kull osservazzjoni u n-numru ta' na ħal 
b'imġieba anomala g ħal kull grupp ta' trattament, ta' kontroll u 
relattiv għas-sustanza tossika standard. Sabiex ti ġi analizzata d- data 
tal-mortalità je ħtieġ li jintużaw metodi statisti ċi xierqa (e. ż. analiżi 
probit, medja mobbli, probbabiltà binomali) (3) (4). Je ħtieġ li jiġu 
mpinġija kurvi do ża-tweġiba għal kull żmien ta' osservazzjoni 
rakkomandat u li ti ġi kkalkolata l-mejla tal-kurvi u d-do żi letali 
medji (LD  50 ) b'limiti ta' affidabilità ta' 95 %. Il-korrezzjonijiet 
għall-mortalità bejn il-kontrolli jistg ħu jiġu effettwati skond il- 
metodu ta' Abbott (4) (5). Meta l-ikel trattat ma ji ġix ikkonsmat 
totalment, g ħandha tiġi determinata d-do ża tas-sustanza sperimentali 
kkonsmata f'kull grupp. Il-LD  50 għandha tiġi espressa f'ìg tas- 
sustanza sperimentali kull na ħla. 
2.2. RAPPORT TAL-PROVA  
Ir-rapport tal-prova irid jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
2.2.1.  Sustanza sperimentali:  
— natura fi żika u propjetà fi żjokimika rilevanti (e. ż. stabilità fl-ilma, 
pressjoni tal-fwar),  
— data kimika ta' identifikazzjoni, inklu ża formula ta' struttura, 
purezza (i.e. g ħall-pestiżidi, l-identità u l-kon ċentrazzjoni ta' 
sustanza(/i) attiva(/i).  
2.2.2.  Spe ċi sperimentali:  
— isem xjentifiku ta' l-ispe ċi, razza, età approssimattiva (f' ġimgħat), 
metodu u data tal- ġabra,  
— informazzjoni fuq kolonji u żati għall-ġbir tan-na ħal għall-isperi­
mentazzjoni inklu ż is-saħħa, eventwali mard ta' l-e żemplari 
adulti, eventwali pretrattamenti, e ċċ. 
2.2.3.  Kondizzjonijiet sperimentali:  
— temperatura u umdità relattiva tal-kamra sperimentali,  
— kondizzjonijiet tal-housing inklu żi t-tip, il-qies u l-materjal tal- 
gaġġa, 
— metodi tal-preparazzjoni tar-ri żerva u tas-sustanza sperimentali 
(meta jintu ża, is-solvent u l-kon ċentrazzjoni tieg ħu għandha ting ­ 
ħata), metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tar-ri żerva u l- 
frekwenza tat-ti ġdid (meta jintu ża, l-aġent li jħoll u l-kon ċen­
trazzjoni tieg ħu għandha ting ħata), 
— disinn sperimentali, e. ż. numru u kon ċentrazzjonijiet sperimentali 
użati, numru ta' kontrolli; g ħal kull kon ċentrazzjoni sperimentali 
u kontroll, numru ta' repli ċi ta' gaġġeġ u numru numru ta' na ħal 
f'kull gaġġa, 
— data tal-prova.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Ri żultati:  
— riżultati ta' l-istudju preliminari tar-ri ċerka tal-firxa, jekk 
magħmul, 
— data  primarja: mortalità g ħal kull do ża ttestjata f'kull ħin ta' 
osservazzjoni,  
— grafika tal-kurvi do ża-tweġiba fl-aħħar tal-prova,  
— valuri ta' l-LD  50 b'limiti ta' affidabilità with 95 %, g ħal kull ħin 
rakkomandat g ħall-osservazzjoni g ħas-sustanza tal-prova u g ħas- 
sustanza tossika standard,  
— proċeduri statisti ċi użati biex jistabilixxu l-LD  50 , 
— mortalità bejn il-kontrolli,  
— effetti o ħra bioloġiċi osservati jew imkejla e. ż. mġieba anomala 
tan-naħal (inkluż ir-rifjut tad-do ża sperimentali), rata tal-konsu ­
mazzjoni ta' l-ikel f'gruppi trattati u gruppi mhux trattati,  
— devjazzjoni eventwali mill-pro ċedura tal-metodu sperimentali 
hawn deskritti u informazzjoni eventwali o ħra rilevanti.  
3. REFERENZI  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  NAĦAL – PROVA TA' TOSSI ĊITÀ AKUTA MILL-KUNTATT  
1. METODU  
Dan il-metodu ta' prova ta' tossi ċità akuta huwa replika ta' l-OECD 
TG 214 (1998).  
1.1. DA ĦLA 
Din il-prova ta' tossi ċità huwa metodu li jntu ża fil-laboratorju, 
magħmul biex issir stima tat-tossi ċità mill-kuntatt akuta tal-prodotti 
għall-protezzjoni tal-pjanti u kimi ċi oħra, lin-na ħal adult li jkun 
qiegħed jaħdem.  
Fl-istima u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi ta' tas-sustanzi, d- 
determinazzjoni ta' tossi ċità akuta mill-kuntatt fin-na ħal tista' tukun 
meħtieġa, eż. meta jkun probabbli li n-na ħal jiġi espost g ħal xi 
kimika. Din il-prova ta' tossi ċità mill-kuntatt akuta jsir sabiex ti ġi 
determinata it-tossi ċità intrinsika ta' pesti ċidi u kimi ċi oħra għan- 
naħal. Ir-riżultati ta' din il-prova g ħandhom jintu żaw biex ji ġi 
definit il-b żonn għal evalwazzjoni ulterjuri. B'mod partikolari, dan 
il-metodu jista' jintu ża f'programmi mqassma f'aktar minn fa żi waħda 
sabiex jiġu determinati il- ħsarat tal-pesti ċidi għan-naħal, ibbażat fuq 
sekwenza ta' provi ta' tossi ċità ġol-laboratorju g ħal-esperimenti fuq 
is-semikamp u fuq il-kamp (1). Il-pesti ċidi jistgħu jiġu ittestjati b ħala 
sustanzi attivi (s.a.) jew b ħala prodotti fformulati.  
L-istandard tossiku g ħandu jiġi stabbilit sabiex ti ġi vverifikata s- 
sensittività tan-na ħal u l-pre ċiżjoni tal-prova pro ċedurali.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Tossiċità orali akuta : hija l-effett avvers li jse ħħ f'perjodu massimu 
ta' 96 sieg ħa ta' applikazzjoni topika ta' dosa singola ta' sustanza 
sperimentali.  
Doża: hija l-ammont tas-sustanza applikata. Id-do ża hija espressa 
bħala l-massa ( μg g) tas-sustanza sperimentali g ħal kull annimal 
sperimentali ( μg/bee).  
LD 50 (doza letli medja) mill-kuntatt : hija doża singola ta' sustanza 
miġjuba statistikament li tista' tikkaw ża l-mewt f'50 % ta' l-annimali 
meta tiġi somministrata mill-kuntatt. Il-valur ta' l-LD  50 huwa espress 
bħala μg) tas-sustanza sperimentali kull na ħla. Fil- ka ż tal-pestiċidi, 
is-sustanza sperimentali tista' tkun kemm sustanza attiva (s.a.) kif ukoll prodott formulat li jkunu fih wie ħed jew aktar sustanzi attivi.
 
Mortalità : annimal huwa registrat mejjet meta ikun kompletament 
immobbli.  
1.3. PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAL-PROVA  
Naħal ħaddiema adulti ( Apis mellifera ) huma esposti g ħal firxa ta' 
dożijiet tas-sustanza sperimentali ma ħlula f'trasportaturi xierqa, b'ap ­
plikazzjoni diretta mas-sider (taqtir). Il-prova ddum 48 s. Jekk ir-rata 
tal-mortalità tkun qed ti żdied bejn 24 s u 48 s filwaqt illi l-mortalità 
tal-kontrolli tibqa' f'livell a ċċettabbli, i.e. ≤ 10 %, ikun xieraq illi l- 
prova tiġi estiża għal massimu ta' 96 s. Il-mortalità g ħandha tiġi 
reġistrata kull jum u pparagunata mal-valur tal-kontroll. Ir-ri żultati 
jiġu analizzati sabiex ji ġi kkalkulat l-LD  50 fl-24 s u t-48 s u, fil-ka ż 
li l-istudju ji ġi pprolongat, fit-72 s u fis-96 s.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDITÀ TAL-PROVA  
Sabiex prova tkun valida, japplikaw l-kondizzjonijiet li ġejjin:  
— il-mortalità medja g ħan-numru totali ta' kontrolli m'g ħandux 
jeċċedi 10 % fl-a ħħar tal-prova,  
— l-LD  50 ta' l-istandard tossiku jil ħaq il-firxa spe ċifikata.  
1.5. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL-PROVA  
1.5.1.  Kollezzjoni ta' na ħal 
Jintużaw naħal ħaddiema żgħażagħ adulti, i.e. na ħal ta' l-istess età, 
mitmugħa bl-istess mod, ta' l-istess razza e ċċ. In-naħal għandu 
jinkiseb minn kolonji li g ħandhom re ġina, li huma mitmug ħin 
tajjeb, u sakemm dan ikun possibbli, li jkunu e żenti minn mard, 
b'storja u stat fi żjoloġiku magħruf. Jistgħu jiġu miġbura filgħodu l- 
jum tal-prova jew filg ħaxija ta' qabel il-prova u mi żmuma fil- 
kondizzjonijiet tal-prova sal- ġurnata ta' wara. Jistg ħu jintużaw ukoll 
naħal miġbura minn g ħamliet bla duqqajs. G ħandhu jiġi evitat l- ġbir 
fil-bidu tar-rebbieg ħa jew fl-a ħħar tal-ħarifa peress illi matul dan i ż- 
żmien n-na ħal ibiddel l-istat fi żjoloġiku tiegħu. Jekk il-provi jkollom 
jsiru fil-bidu tar-rebbieg ħa jew fl-a ħħar tal-ħarifa, in-na ħal jistgħu 
jitpoġġew f'inkubatur u mrobbija g ħal ġimgħa b' “ħobż tan-naħal” 
(pollinu mi ġbur mix-xehdiet) u soluzzjoni tas-sukrosju. In-na ħal li 
jiġi trattat b'sustanzi kimi ċi, bħal m'huma antibioti ċi, prodotti anti- 
varroa, eċċ., m'għandux jintu ża għal provi ta' tossi ċità qabel erba' 
ġimgħat mit-tmiem ta' l-a ħħar trattament.  
1.5.2.  Kondizzjonijiet ta' manteniment u alimentazzjoni  
Jintużaw gaġġeġ li jitnaddfu fa ċilment u li g ħandhom ventilazzjoni 
tajba. Kull materjal xieraq jista' jintu ża, e.ż. azzar stainless, xbieki 
tal-ħadid, plastik jew ga ġġeġ ta' l-injam disposable, e ċċ. Il-qies tal- 
gaġġeġ sperimentali g ħandu jkun xieraq g ħan numru ta' na ħal, i.e. 
jipprovdi spazju adegwat. In-numru idejali huwa ta' gruppi ta' g ħaxar 
naħliet f'kull ga ġġa. 
In-naħal għandu jinżamm fid-dlam ġewwa kamra sperimentali f'tem ­
peratura ta' 25 ± 2  o C. L-umdità relattiva, normalment madwar 50- 
70 %, għandha tiġi reġistrata matul il-prova kollha. Pro ċeduri ta' 
manipolazzjoni, inklu żi t-trattamenti u l-osservazzjonijiet jistg ħu 
jsiru fid-dawl (naturali). L-alimentazzjoni tikkonsisti f'soluzzjoni ta' sukrosju fl-ilma b'kon ċentrazzjoni finali ta' 500 g/l (50 % w/v) u 
għandha ting ħata ad libitum  matul iż-żmien tal-prova, permezz ta' 
kontenitur g ħall-ikel tan-na ħal. Dan jista' jkun pipetta tal- ħġieġ 
(madwar 50 mm twila u 10 mm wiesg ħa bin-naħa l-miftu ħa li 
tidjieq għal djametru ta' madwar 2 mm).
 
1.5.3.  Preparazzjoni tan-na ħal 
In-naħal miġbur jista' ji ġi illoppjat b'carbon dioxide jew nitrogen 
għall-applikazzjoni tas-sustanza sperimentali. L-ammont ta' loppju 
użat u l-ħin ta' espo żizzjoni g ħandu jiġi minimizzat. Qabel ma 
tinbeda l-prova je ħtieġ illi jitne ħħa n-naħal li jkun qieg ħed imut u 
li jiġi sostitwit minn na ħal b'saħħithom.  
1.5.4  Preparazzjoni tad-do żi 
Is-sustanza sperimentali g ħandha tiġi applikata b ħalha soluzzjoni ġo 
trasportatur, i.e. solvent organiku jew soluzzjoni bl-ilma b'a ġent li 
jxarrab, huwa preferibbli l-acetone imma jistg ħu jintużaw ukoll 
solventi organi ċi oħra li għandhom livell ta' tossi ċità baxxa g ħan- 
naħal (e.ż. dimethylformamide, dimethylsulfoxide). G ħal dawk il- 
prodotti formulati mitlufa fl-ilma u s-sostanzi organi ċi altament 
polari li ma jin ħallux f'solventi organi ċi jista' jirri żulta aktar fa ċli 
biex jiġu applikati jekk preparati f'soluzzjoni debboli ta' agent li 
jxarrab kummer ċjali (e.ż. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Sustanzi xierqa g ħall-kontroll g ħandhom jitlestew, i.e. meta solvent 
jew dispersant jintuza biex i ħoll is-sustanza sperimentali, g ħandhom 
jintużaw żewġ gruppi ta' gruppi ta' kontroll, wie ħed trattat bl-ilma, u 
wieħed trattat b'is-solvent/id-dispersant.  
1.6. PRO ĊEDURA  
1.6.1.  Gruppi sperimentali u gruppi g ħall-kontroll  
In-numru ta' do żi u ta' repli ċi ttestjati g ħandhom ikunu konformi 
mar-rekwi żiti statisti ċi għad-determinazzjoni ta' l-LD  50 mal-limiti ta' 
affidabilità ta' 95 %. Normalment, g ħall-prova je ħtieġu ħames dożi 
f'serie ġeometrika, b'fatturi li ma jaqb żux 2.2, u li jkopru l-firxa 
għall- LD  50 . Madankollu, g ħandhom ji ġu determinati n-numru ta' 
dożi b'relazzjoni ma' kemm tkun immejla l-kurva tat-tossi ċità (doża 
kontra mortalità) u g ħandu jiġi ikkunsidrat il-metodu statistiku li ġie 
magħżul għall-analiżi tar-riżultati. Prova ta' ri ċerka fuq il-firxa 
tippermetti li jintg ħażlu d-dożi appropjati.  
Minimu ta' tlett gruppi ta' provi repetuti, kull wie ħed ta' tlett na ħliet, 
għandu jiġi dożat b'kull kon ċentrazzjoni sperimentali.  
Oltre s-serje sperimentali hu ne ċessarju li ji ġu analizzati minimu ta' 
tlett lottijiet ta' kontroll, kull wa ħda ta' 10 na ħliet. Jekk jintu ża 
solvent organiku jew a ġent li jxarrab tlett gruppi ta' kontroll 
addizzjonali ta' 10 na ħliet kull wie ħed iridu ji ġu inklużi għas- 
solvent jew g ħall-aġent li jxarrab.  
1.6.2.  Sustanza tossika standard  
Fis-serje sperimentali g ħandha tiġi inkluża sustanza tossika standard. 
Jeħtieġ li jintgħażlu mill-anqas tlett do żi li jkopru l-valur mistenni ta' 
LD 50 . Għal kull do ża sperimentali jintu żaw mill-inqas tlett ga ġġeġ 
repliċi, kull wa ħdha fiha 10 na ħliet. Is-sustanza tossika standard 
preferuta hija d-dimethoate, fejn l- LD  50 - 24 s mill-kuntatt 
rrapurtat huwa fil-firxa ta' 0,10 - 0,35 μg s.a./naħla (2). Madankollu, 
huma ukoll a ċċettabbli sustan żi tossiċi standard o ħra jekk data 
suffiċenti tkun tista' tin ġieb sabiex ti ġi vverifikata r-risposta 
mistennija rigward id-do żi(e.ż. parathion).  
1.6.3.  Espo żizzjoni  
1.6.3.1.  Somministrazzjoni tad-do żi 
Naħal illoppjat ji ġi trattat individwalment permezz ta' applikazzjoni 
topika. In-na ħal huwa assenjat saltwarjament g ħad-dożi sperimentali 
u kontrolli differenti. Permezz ta' mikroapplikatur g ħandu jiġi 
applikat volum ta' 1 μl tas-soluzzjoni li jkun fiha s-sustanza speri ­
mentali bil-kon ċentrazzjoni xierqa fin-na ħa tad-dahar tas-sider ta' kull 
naħla. Jekk ġustifikati, volumi o ħra jistgħu jintużaw. Wara l-appli ­
kazzjoni, in-na ħal jiġu allokati ġol-gaġġeġ sperimentali u mitmug ħa 
b'soluzzjonijiet tas-sukrosju.  
1.6.3.2.  Tul ta' żmien  
Preferibbilment, il-prova g ħandha ddum 48 s. Jekk il-mortalità 
tiżdied għal aktar minn 10 % bejn 24 s u 48h, d-durata tal-prova 
għandha tiġi estiża għal massimu ta' 96 s CASemm il-mortalità matul 
il-kontrolli ma jaqbi żx 10 %.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Osservazzjonijiet  
L-mortalità ti ġi reġistrata 4 s wara l-applikazzjoni u sussegwentement 
wara 24 s u wara 48 s. F'ka ż li l-perjodu ta' osservazzjoni ji ġi 
pprolongat je ħtieġ li jkun hemm valutazzjonijiet o ħra f'intervalli ta' 
24 s sa ħin massimu ta' 96 s, sakemm il-mortalità matul il-kontrolli 
ma jaqbiżx 10 %.  
Hu neċessarju li ji ġu reġistrati l-anomaliji kollha ta' l-im ġieba 
osservata matul il-prova.  
1.6.5.  Prova limiti  
F'ċertu każijiet (e.ż. meta jkun preti ż illi sustanza sperimentali jkollha 
tossiċità baxxa) tista' ssir prova limiti bl-u żu ta' 100 μg s.a./naħla 
sabiex jintwera illi l-LD  50 huwa akbar minn minn dan il-valur. L- 
istess pro ċedura għandha tintu ża, inklużi t-tlett gruppi repli ċi, għad- 
doża sperimentali, g ħall-kontrolli rilevanti, u g ħall-użu ta' l-istandard 
tossiku.If mortalities occur, a full study should be conducted. Jekk jiġu osservati effetti subletali (ara taqsima 1.6.4), dawn g ħandhom 
jiġu reġistrati.
 
2. DATA  U RAPURTA ĠĠ 
2.1. DATA  
Id-data għandha tiġi mqassra ġo tabella li turi n-numru ta' na ħal użat 
kif ukoll il-mortalità f'kull osservazzjoni u n-numru ta' na ħal 
b'imġieba anomala g ħal kull grupp ta' trattament, ta' kontroll u 
relattiv għas-sustanza tossika standard. Sabiex ti ġi analizzata d- data 
tal-mortalità je ħtieġ li jintużaw metodi statisti ċi xierqa (e. ż. analiżi 
probit, medja mobbli, probbabiltà binomali) (3) (4). Il-kurvi g ħal plot 
dose-response  f'kull ħin ta' osservazzjoni rakkomandat (i.e. 24 s, 48 s 
u, jekk inhu relevanti, 72 s, 96 s) u kkalkula l-kurvi u l-medja tad- 
dożi letali (LD  50 ) b'95 % ta' limiti ta' kunfidenza. Il-korrezzjonijiet 
għall-mortalità bejn il-kontrolli jistg ħu jiġu effetwati skond il-metodu 
ta' Abbott (4) (5). Il- LD  50 għandha tiġi espressa f'ìg tas-sustanza 
sperimentali kull na ħla. 
2.2. RAPPORT TAL-PROVA  
Ir-rapport tal-prova irid jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
2.2.1.  Sustanza sperimentali:  
— natura fi żika u propjetà fi żjo-kimika rilevanti (e. ż. stabilità fl- 
ilma, pressjoni tal-fwar),  
— data  kimika ta' identifikazzjoni, inklu ża formula ta' struttura, 
purezza (i.e. g ħall-pestiżidi, l-identità u l-kon ċentrazzjoni ta' 
sustanza(/i) attiva(/i).  
2.2.2.  Spe ċi sperimentali:  
— isem xjentifiku ta' l-ispe ċi, razza, età approssimattiva (f' ġimgħat), 
metodu u data tal- ġabra,  
— informazzjoni fuq kolonnji u żati għall-ġbir tan-na ħal għall-esperi­
mentazzjoni inklu ż is-saħħa, mard eventwali ta' l-e żemplari 
adulti, eventwali pretrattamenti, e ċċ. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Kondizzjonijiet sperimentali:  
— temperatura u umdità relattiva tal-kamra sperimentali,  
— kondizzjonijiet tal-housing inklu żi t-tip, il-qies u l-materjal tal- 
gaġġa, 
— metodu ta' amministrazzjoni tas-sustanza sperimentali, e. ż. 
solvent trasportatur u żat, volum tas-soluzzjoni sperimentali 
applikat, loppju u żat, 
— disinn sperimentali, e. ż. numru ta' do żi sperimentali u żati, numru 
ta' kontrolli; g ħal kull do ża sperimentali u kontroll, numru ta' 
repliċi ta' gaġġeġ u numru ta' na ħal f'kull ga ġġa, 
— data tal-prova.  
2.2.4.  Ri żultati:  
— riżultati ta' l-istudju preliminari tar-ri ċerka tar-range, jekk 
magħmul, 
— data primarja: mortalità g ħal kull do ża ttestjata f'kull ħin ta' 
osservazzjoni,  
— grafika tal-kurvi do ża-tweġiba fl-aħħar tal-prova,  
— valuri ta' l- LD  50 b'limiti ta' affidabilità with 95 %, g ħal kull ħin 
rakkomandat g ħall-osservazzjoni g ħas-sustanza tal-prova u g ħas- 
sustanza tossika standard,  
— proċeduri statisti ċi użati biex jistabilixxu l- LD  50 , 
— mortalità bejn il-kontrolli,  
— effetti o ħra bioloġiċi osservati jew imkejla e. ż. mġieba anomala 
tan-naħal, 
— eventwali devjazzjoni mill-pro ċedura tal-metodu sperimentali 
hawn deskritti u eventwali informazzjoni o ħra rilevanti.  
3. REFERENZI  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORBIMENT/DESORBIMENT BL-U ŻU TAL-METODU TA' 
L-EKWILIBRIJU TA' GRUPPI  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika ta' l-OECD TG 106, g ħad-Deter­
minazzjoni ta' l-Assorbiment/Desorbiment tal- ħamrija, bl-u żu ta' 
Metodu ta' Eqwilibriju ta' Gruppi (2000).  
1.1. DA ĦLA 
Fl-elaborazzjoni tal-metodu pre żenti, ingħata każ tar-riżultati ta' 
sperimentazzjoni ċirkolari u ta' workshop g ħall-għażla tal-ħamrija 
għall-iżvilupp ta' prova ta' l-adsorbiment (1) (2) (3) (4) kif ukoll 
linji gwida e żistenti fuq livell nazzjonali (5) (5) (6) (7) (8) (9) (10).  
L-istudji fuq l-adsorbiment/desorbiment huma utli sabiex tinkiseb 
informazzjoni essenzali fuq il-mobilità tal-komposti kimi ċi u d-distri ­
buzzjoni tag ħhom fil-ħamrija, fl-ilma u fl-arja tal-biosfera (12) (13) 
(14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Din l-informazzjoni tista' tkun utli, pereżempju, sabiex wie ħed ikun jista' jobsor jew jag ħmel stima 
tad-disponibbiltà ta' prodott kimiku ta ħt aspetti varji: degredazzjoni 
(22) (23), trasformazzjoni u assimilazzjoni ta' l-organi żmi ħajjin (24); 
filtrazzjoni minn ġol-profil tal- ħamrija (16) (18) (19) (21) (25) (26) 
(27) (28); volatilità mill- ħamrija (21) (29) (30); passa ġġ mill-wiċċ ta' 
l-art għall-ilmijiet naturali (18) (31) (32). Id-data fuq l-adsorbiment 
tistà tintu ża għall-skopijiet ta' paragunar u ta' mudellar (19) (33) (34) 
(35).
 
Id-distribuzzjoni ta' prodott kimiku bejn il- ħamrija u fa żijiet li fihom 
l-ilma huwa pro ċess ikkomplikat li jiddependi fuq numru ta' fatturi 
differenti: in-natura kimika tas-sustanza (12) (36) (37) (38) (39) (40), 
il-karatteristi ċi tal-ħamrija (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) 
(46) (47) (48) (49), u l-fatturi klimati ċi bħal ma huma l-in żul tax- 
xita, it-temperatura, id-dawl tax-xemx u r-ri ħ. Għaldaqstant, il- 
fenomeni numeru żi u l-mekkani żmi involuti fil-pro ċess ta' l-adsor ­
biment tal- ħamrija ta' sustanza kimika ma jistg ħux jiġu definiti 
kompletament permezz ta' mudell simplifikat tal-laboratorju b ħal 
m'hu il-metodu pre żenti. Madankollu, anke jekk dan l-attentat ma 
jkunx jista' jkopri l-ka żijiet ambjentali kollha possibbli, jipprovdi 
informazzjoni ta' valur fuq ir-rilevanza ambjentali ta' l-adsorbiment ta' sustanza kimika.
 
Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali.  
1.2. AMBITU  
L-għan ta' dan il-metodu huwa li jivvaluta l-im ġieba ta' l- 
adsorbiment/desorbiment ta' sustanza fuq il- ħamrija. L-g ħan huwa 
li jinkiseb valur ta' sorbiment li jkun jista' jintu ża biex tinbasar 
partizzjoni ta ħt varjetà ta' kondizzjonijiet ambjentali; g ħal dan l- 
għan, għal kull prodott kimiku li ji ġi meqjus, ji ġu ddeterminati l- 
koeffiċjent ta' adsorbiment g ħall-ekwilibriju fuq tipi ta' ħamrija 
differenti b ħala funzjoni tal-karatteristi ċi tal-ħamrija stess (e. ż. 
kontenut karboniku organiku, kontenut ta' tafal u struttura tal- 
ħamrija u pH). Tipi differenti ta' ħamrija g ħandhom jintu żaw 
sabiex ikopru bl-aktar mog ħod wiesg ħa possibbli l-interazzjonijiet 
ta' sustanza mag ħrufa ma' ħamrija li ti ġri b'mod naturali.  
F'dan il-metodu, l-adsorbiment jirrapre żenta l-pro ċess ta' vinko ­
lazzjoni ta' sustanza kimika mal-wi ċċ tal-ħamrija; ma tiddistingwix 
bejn proċessi differenti ta' adsorbiment (adsorbiment fi żiku u kimiku) 
u proċessi oħra bħad-degredazzjoni katalitika fil-wi ċċ, l-adsorbiment 
bil-massa jew r-reazzjoni kimika. M'g ħandux jing ħata każ ta' l-adsor ­
biment li jse ħħ fuq il-parti ċelli kolloidali (djametru < 0,2 μìm) 
ġenerati mill- ħamrija.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Il-parametri tal- ħamrija meqjusa l-aktar importanti g ħall-adsorbiment 
huma: kontenut karboniku organiku (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) 
(44) (45) (46) (47) (48); kontenut ta' tafal u struttura tal- ħamrija (3) 
(4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) u pH g ħall-kompost 
ionizzabbli (3) (4) (42). Parametri o ħra tal-ħamrija li jista' jkollhom 
impatt fuq l-adsorbiment/desorbiment ta' sustanza partikolari huma l- 
kapaċità effettiva ta' l-iskambju katjoniku (ECEC), il-kontenut ta' 
ossidi amorphous tal- ħadid u tal-aluminjum, partikolarment g ħal 
ħamrija volkanika u tropikali (4), kif ukoll il-wi ċċ speċifiku (49).  
Din il-prova hija mag ħmula biex tevalwa l-adsorbiment ta' prodotti 
kimiċi fuq tipi differenti ta' ħamrija differenti b'rage ta' kontenut 
karboniku organiku, kontenut ta' tafal u struttura tal- ħamrija, u pH 
li jvarja. Dan jikkonsisti f'tlett stadji:  
Stadju 1 : Studju preliminarju sabiex ji ġi determinat:  
— ir-rapport ħamrija/soluzzjoni,  
— il-ħin ta' l-ekwilibriju g ħall-adsorbiment u l-ammont 
tas-sustanza sperimentali adsorbita f'l-ekwilibriju,  
— l-adsorbiment tas-sustanza sperimentali fl-u ċuħ tar- 
reċipjenti u l-istabilità tas-sustanza sperimentali 
matul il-perjodu sperimentali.  
Stadju 2 : Screening prova: l-adsorbiment huwa studjat f' ħames tipi 
differenti ta' ħamrija permezz ta' kinetika ta' adsorbiment 
ta' konċentrazzjoni singola u determinazzjoni tal-koef ­
fiċjenti K  d u K  oc . 
Stadju 3:  Determinazzjoni ta' l-i żotermi ta' adsorbiment ta' 
Freundlich biex ti ġi stabbilità l-influwenza tal-kon ċen­
trazzjoni fuq id-daqs ta' l-adsorbiment fuq il- ħamrija.  
Studju tad-desorbiment permezz tal-kinetika ta' 
desorbiment/ta' l-i żotermi ta' adsorbiment ta' Freundlich 
(Anness 1).  
1.3. DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET  
Simbolu Definizzjonijiet Unitajiet  
A t i persentaġġ ta' adsorbiment fil- ħin t  i % 
A eq persentaġġ ta' adsorbiment fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment %  
m s ads ðt i Þ massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il- ħamrija fil- 
ħin t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il- ħamrija 
matul l-intervall ta' ħin Δt i μg 
m s ads ðeqÞ massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il- ħamrija f'l- 
equilibriju ta' l-adsorbiment μg 
m 0 massa tas-sustanza sperimentali fil-pipetta, fil-bidu tal- 
prova ta' l-adsorbiment μg 
m m ads ðt i Þ massa tas-sustanza sperimentali mkejla f'alikwota ( v a A )fil- 
ħin t  i μg 
m aq ads ðeqÞ massa tas-sustanza fis-soluzzjoni f'l-ekwilibriju ta' l-assor ­
biment μg 
m soil kwantità tal-fa żi ħamrija, espressa f'massa ta' ħamrija xotta g  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Simbolu Definizzjonijiet Unitajiet  
C st konċentrazzjoni ta' massa tas-soluzzjoni ta' ri żerva tas- 
sustanza μg cm  -3 
C 0 konċentrazzjoni inizjali tal-massa tas-soluzzjoni speri ­
mentali f'kuntatt mal- ħamrija μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fa żi bl-ilma fil- 
ħin t  i , meta issir l-anali żi μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ kontenut tas-sustanza adsorbità fuq il- ħamrija fl-ekwilibriju 
ta' l-adsorbiment μg g -1 
C aq ads ðeqÞ konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fa żi bl-ilma fl- 
ekwilibriju ta' l-adsorbiment μg cm  -3 
V 0 volum inizjali tal-fa żi bl-ilma f'kuntatt ma' l- ilma matul il- 
prova ta' adsorbiment cm 3 
v a A volum ta' l-alikwota fejn ti ġi mkejla s-sustanza speri ­
mentali cm 3 
K d koeffiċjent ta' distribuzzjoni g ħall-adsorbiment cm  3 g -1 
K oc koeffiċjent ta' adsorbiment normalizzat g ħall-karbonju 
organiku cm 3 g -1 
K om koeffiċjent ta' distribuzzjoni normalizzat g ħas-sustanza 
organika cm 3 g -1 
K F ads koeffiċjent ta' adsorbiment skond Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g-1 
1/n esponenti ta' Freundlich  
D t i persentaġġ ta' desorbiment fil- ħin t  i % 
D Δt i persentaġġ ta' desorbiment matul l-intervall ta' ħin Δt i % 
K des koeffiċjenti apparenti ta' desorbiment cm  3 g -1 
K F des koeffiċjenti ta' desorbiment skond Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g-1  
m aq des ðt i Þ massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill- ħamrija fil- 
ħin t  i μg 
m m des ðΔt i Þ massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill- ħamrija 
matul l-intervall ta' ħin Δt i μg 
m m des ðeqÞ Il-massa tas-sustanza determinata b'mod analitiku fil-fa żi 
akwea f'ekwilibriju ta'  desorption  μg 
m aq des ðeqÞ Il-massa totali tas-sustanza g ħat-test li ġie desorbed  f'ek­
wilibriju ta'  desorption  μg 
m s des ðΔt i Þ massa tas-sustanza li tibqa adsorbita fuq il- ħamrija wara l- 
intervall ta' ħin Δt i μg 
m aq A massa tas-sustanza residwa mill-ekwilibriju ta' adsorbiment 
minħabba sostituzzjoni mhux kompluta tal-volum μg 
C s des ðeqÞ kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa' adsorbita fuq il- 
ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment μg g -1 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Simbolu Definizzjonijiet Unitajiet  
C aq des ðeqÞ konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza sperimentali 
preżenti fil-fa żi bl-ilma fl-ekwilibriju tad-desorbiment μg cm  -3 
V T volum totali tal-fa żi bl-ilma b'kuntatt mal- ħamrija matul l- 
edperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment mag ħmul bil- 
metodu serje cm 3 
V R volum tas-supernatant mne ħħi mil-pipetta wara li jintla ħaq 
ekwilibriju ta' adsorbiment u mibdul b'l-istess volum tas- 
soluzzjoni ta' 0,01 M CaCl  2 cm 3 
v a D volum ta' l-alikwota prelevata g ħal raġuni analitika mill- ħin 
(i), matul l-esperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment 
magħmul bil-metodu serje cm 3 
V ra i D volum tas-soluzzjoni prelevata mill-pipetta (i) biex titkejjel 
is-sustanza sperimentali, matul l-esperiment fuq il-kinetika 
tad-desorbiment (metodu paralleli) cm 3 
V r F volum tas-soluzzjoni prelevata mill-pipetta biex titkejjel is- 
sustanza sperimentali, fl-ekwilibriju tad-desorbiment cm 3 
MB bilan ċ tal-massa % 
m E massa totali tas-sustanza sperimentali estratta f' żewġ stadji, 
mill-ħamrija u mill- ħitan tar-re ċipjent μg 
V rec volum tas-supernatant mi ġbur wara li ntla ħaq l-fl-ekwi ­
libriju tad-adsorbiment cm 3 
P ow koeffiċjent tar-ripartizzjoni octanol/ilma 
pKa kostanti tad-diso ċjazzjoni 
S w solubilità fl-ilma g l  -1 
1.4. PRIN ĊIPJU TAL-METODU SPERIMENTALI  
Volumi mag ħrufa ta' soluzzjonijiet tas-sustanza sperimentali, mhux 
markata jew radjumarkata, b'kon ċentrazzjonijiet mag ħrufa 0,01 M 
CaCl  2 huma miżjuda ma' kampjuni ta' ħamrija ta' pi ż xott mag ħruf 
li kienu ekwilibrati qabel f'0,01 M CaCl  2 It-taħlita tiġi mħawwda 
għal żmien xieraq. Is-sospensjonijiet tal- ħamrija ji ġu mbagħad 
separati permezz ta' ċentrifugazzjoni u, jekk ikun mixtieq, filtrazzjoni 
u tiġi analizzata l-fa żi bl-ilma. L-ammont ta' sustanza sperimentali 
adsorbita fuq il- ħamrija tiġi kkalkolata skond id-differenza bejn l- 
ammont ta' sustanza sperimentali pre żenti fis-soluzzjoni mill-bidu u 
l-ammont li jibqa fl-a ħħar ta' l-esperiment (metodu indirett).  
Metodu ie ħor biex ti ġi determinata l-kwantità adsorbita tas-sustanza 
sperimentali huwa billi ti ġi analizzata direttament il- ħamrija (metodu 
dirett). Din il-pro ċedura li te ħtieġ estrazzjoni tal- ħamrija f'stadji 
suċċessivi permezz ta' solvent xieraq, hija rakkomandata f'ka żijiet 
fejn id-differenza fil-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni tas-sustanza ma 
tistax tiġi determinata pre ċiżament. E żempji ta' dawn il-ka żijiet 
huma: l-adsorbiment tas-sustanza sperimentali fil-wi ċċ tar-reċipjenti 
fejn isir l-esperiment, instabilità tas-sustanza sperimentali matul il- ħin 
ta' l-esperiment, adsorbiment debboli li jag ħti biss lok g ħal 
varjazzjonijiet żagħar ta' kon ċentrazzjoni fis-soluzzjoni; u adsor ­
biment qawwi li jwassal g ħal konċentrazzjonijiet baxxi li ma 
jistgħux jiġu determinati akkuratament. Jekk tintu ża sustanza radjum ­
arkata, l-estrazzjoni tal- ħamrija tista' ti ġi evitata permezz ta' anali żi 
tal-fażi ħamrija permezz tat-teknika tal-kombustjoni u l-g ħadd 
suċċessiv tax-xintillazzjoni fil-fa żi likwida. Madankollu, l-g ħadd 
tax-xintillazzjoni fil-fa żi likwida huwa metodu ta' teknika mhux 
speċifiku li ma jag ħmilx distinzjoni bejn prodotti pro ġenituri u 
dawk ta' trasformazzjoni; g ħaldaqstant g ħandu jintu ża biss jekk il- 
prodott kimiku sperimentali jibqa stabbli matul id-dewmien kollu ta' 
l-istudju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMAZZJONI FUQ IS-SUSTANZA SPERIMENTALI  
Ir-reattivi kimi ċi għandhom ikunu ta' livell analitiku. Huwa 
rakkomandat l-u żu ta' sustanzi li ma jkunux immarkati b'kompo ­
sizzjoni mag ħrufa u preferibbilment purezza mhux anqas minn 
95 % jew ta' sustanzi sperimentali radjumarkati li g ħandhom kompo ­
sizzjoni u radjupurezza mag ħrufa. Fil-ka ż ta' radjumarkaturi ta' nofs- 
ħajja qasira, g ħandhom ji ġu applikati korrezzjonijiet adegwati.  
Qabel ma ssir prova g ħall-adsorbiment-desorbiment, l-informazzjoni 
li ġejja dwar is-sustanza sperimentali g ħandha tkun disponibbli:  
(a) solubilità fl-ilma (A.6);  
(b) tensjoni tal-fwar (A.4) u/jew il-Kostanti tal-Li ġi ta' Henry;  
(ċ) degradazzjoni antibjotika: idrolisi b ħalha funzjoni tal-pH (C.7);  
(d) koeffi ċjent tar-ripartizzjoni (A.8);  
(e) bijodegrabilità ta' malajr (C.4) jew trasformazzjoni aerobika u 
anaerobika fil- ħamrija;  
(f) pKa tas-sustanzi ionizzabili;  
(g) fotoliżi diretta fl-ilma (i.e. spectrum ta' adsorbiment UV-Vis fl- 
ilma, rendiment quantum) u fotodegradazzjoni fil- ħamrija.  
1.6. APPLIKABBILITÀ TAL-PROVA  
Din il-prova hi applikabbli g ħas-sustanzi kimi ċi għal-liema jista' ji ġi 
applikat metoodu analitiku suffi ċjentement akkurat. L-istabbilità tas- 
sustanza sperimentali matul il- ħin neċessarju biex titwettaq il-prova 
huwa parametru importanti li jista' jinfluwenza l-affidabilità tar- riżultati, spe ċjalment meta ji ġi applikat il-metodu indirett. G ħaldaq­
stant, huwa ne ċessarju li din l-istabbilità ti ġi verifikata tramiti studju 
preliminari; jekk ti ġi osservata trasformazzjoni fil-perjodu ta' ħin tal- 
prova, huwa rakkomandat li l-istudju prin ċipali għandu jiġi eżegwit 
billi jiġu analizzati kemm il-fa żi ħamrija kif ukoll il-fa żi ta' l-ilma.
 
Jistgħu jinħolqu diffikultajiet meta din il-prova isir g ħal sustanzi li 
għandhom solubilità baxxa fl-ilma (S  w < 10  -4 g l -1 ), kif ukoll g ħal 
sustanzi ta' karika elevata, dovut g ħall-fatt illi l-kon ċentrazzjoni fil- 
fażi bl-ilma ma tistax ti ġi mkejla analitikament b'akkuratezza effi ċ­
jenti. F'dawn il-ka żijiet, iridu jittie ħdu passi addizzjonali. Il-mod kif 
wieħed jista' jaffronta dawn il-problemi jista' jinstab fit-taqsima 
relevanti ta' dan il-metodu.  
Fl-isperimentazzjoni fuq sustanzi li ji żvintaw, g ħandhom jittie ħdu 
prekawzjonijiet biex telf matul l-istudju ji ġi evitat.  
1.7. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.7.1.  Apparat u reattivi kimi ċi 
Apparat normali tal-laboratorju, spe ċjalment li ġej: 
(a) Pipetti jew kontenituri biex isir l-esperiment. Huwa importanti li 
dawn il-pipetti jew kontenituri:  
— joqgħodu direttament fi ċ-ċentrifuga sabiex ji ġi miniminizzat 
telf fil- manipolazzjoni u trasferiment,  
— jkunu mag ħmula minn materjal inert, li jimminimizza l- 
adsorbiment fil-wi ċċ tas-sustanza sperimentali.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
(b) Apparat g ħat-taħwid: overhead shaker jew apparat ekwvilenti; l- 
apparat g ħat-taħwid għandu jżomm il-ħamrija sospi ża matul it- 
taħwid. 
(ċ) Ċentrifuga: preferibbilment ta' velo ċità għolja, e.ż. forza 
ċentrifuga > 3 000 g, temperatur kontrollata, kapa ċi tneħħi 
partiċelli b'djametru akbar minn 0,2 μm minn soluzzjonijiet bl- 
ilma. Sabiex ji ġi evitat telf dovut g ħal volatilità jew ta' ilma, 
dawn il-kontenituri g ħandhom jin żammu mg ħottija matul i ċ- 
ċentrifugazzjoni u t-ta ħwid; biex ji ġi minimizzat l-adsorbiment 
fuq l-għotjien, dawn iridu ji ġu diżattivati pere żempju għotjin 
mgħottija bit-teflon.  
(d) Fakultattiv: apparat g ħall-filtrazzjoni; filtri ta' poro żità ta' 0,2 μm, 
sterili, għal użu wieħed. Kura spe ċjali għandha ting ħata għall- 
għażla tal-materjal g ħall-filtrazzjoni sbiex telf eventwali tas- 
sustanza sperimentali minn dan il-materjal ji ġi evitat; g ħal 
dawk is-sustanzi li ma jin ħallux malajr, mhux opportun li 
jintuża materjal g ħall-filtrazzjoni organiku.  
(e) Strumentazzjoni analitika, adatta biex titkejjel il-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza kimika sperimentali.  
(f) Forn tal-laboratorju, kapa ċi jżomm temperatura ta' 103  o C sa 
110  o C. 
1.7.2.  Karatterizzazzjoni u selezzjoni tal- ħamrija  
Il-ħamrija għandha tiġi karatterizzata minn tlett parametri li huma 
meqjusa ma ġġorment responsabbli g ħall-kapaċitaà ta' l-adsorbiment: 
karbonju organiku, kontenut f'tafal u struttura tal- ħamrija, u pH. Kif 
diġà msemmi (ara Skop) g ħandhom ji ġu meqjusa propjetajiet fi żiko- 
kimiċi oħra tal-ħamrija li jista' jkollhom impatt fuq l-adsorbiment/ ­
desorbiment ta' sustanza partikolari.  
Il-metodi u żati għall-karatterizzazzjoni tal- ħamrija huma importanti 
ħafna u jistà jkollhom influwenza sinifikattiva fuq ir-ri żultati. Għal­
daqstant, huwa rakkomandat illi l-pH tal- ħamrija għandha titkejjel 
f'soluzzjoni ta' 0,01 M CaCl  2 (iġifieri fis-soluzzjoni u żata għall- 
prova ta' l-adsorbiment/desorbiment) skond il-metodu ISO li jikkor ­
rispondi (ISO-10390-1). Huwa rakkomandat ukoll illi ji ġu deter­
minati l-popjetajiet rilevanti l-o ħra tal-ħamrija skond metodi 
standard (pere żempju ISO 'Manwal ta' l-Anali żi tal-Ħamrija'); dan 
jippermetti illi l-anali żi tad-data fuq is-sorbiment tkun ibba żata fuq 
parametri tal- ħamrija standardizzati globalment. Ir-refernzi (50-52) 
jagħtu xi indikazzjonijiet fuq il-metodi standard disponibbli g ħall- 
analiżi u għall-karatterizzazzjoni tal- ħamrija. G ħall-kalibrazzjoni tal- 
metodi sperimentali tal- ħamrija, huwa rakkomandat l-u żu ta' ħamrija 
ta' referenza.  
It-Tabella 1 tag ħti indikazzjoni g ħall-għażla tal-ħamrija g ħall- 
esperimenti ta' l-adsorbiment/desorbiment. Is-seba' kwalitajiet ta' 
ħamrija mag ħżula ikopru l-kwalitajiet li jinstabu f' żoni ġeografiċi 
temperati. Meta s-sustanzi sperimentali ikunu ionizzabbli, il-kwali ­
tajiet ta' ħamrija mag ħżula għandhom ikopru range wiesg ħa ta' pH, 
sabiex ikun jista' ji ġi evalwat l-adsorbiment tas-sustanza fil-forma 
ionizzata u dik mhux ionizzata. Indikazzjoni fuq kemm il-kwalità 
ta' ħamrija għandha tintu ża fl-istadji varji tal-prova tinstab ta ħt 
1.9. Eżekuzzjoni tal-prova.  
Jekk jiġu preferuti kwalitajiet o ħra ta' ħamrija, g ħandhom ji ġu 
karatterizzati permezz ta' l-istess parametri u g ħandu jkollhom 
varjazzjoni simili fil-propjetajiet g ħal dawk deskritti f'Tabella 1, 
anke jekk ma jaqblux e żattament mal-kriterji.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabella 1:  
Gwida għas-selezzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija g ħall-adsorbiment-desorbiment  
Kwalità ta' ħamrija Range ta' pH (f'0,01 M 
CaCl  2 ) Kontenut f'karbonju 
organiku ( %) Kontenut f'tafal ( %) Komposizzjoni tal- 
ħamrija (*)  
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65 – 80 tafal 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20 – 40 art taflija 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15 – 25 art imtajjna 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15 – 30 art tajba u 
għammiela 
5 < 4,0 - 6,0 < 0,5 - 1,5 < 10 – 15 art imrammla 6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 40 – 65 art taflija/tafal 7 < 4,5 > 10 < 10 ramel/art imrammla
 
(*) Skond il-FAO u s-sistema US (85). 
Il-varjabbli rispettivi g ħandhom juru preferebbilment il-valuri fil-medda mog ħtija. Jekk, madankollu, ikun hemm diffikul ­
tajiet fis-sejba tal-materjal ta' ħamrija xieraq, il-valuri ta ħt il-minimu indikat huma a ċċettati. 
Il-ħamrija b'inqas minn 0,3 % tal-karbonju organiku tista' tfixkel il-korrelazzjoni bejn il-kontenut organiku u ta' adsor ­
biment. G ħalhekk, huwa rakkomandat l-u żu tal-ħamrija li fiha kontenut minimu ta' karbonju organiku ta' 0,3 %.  
1.7.3.  Kollezzjoni u ħażna tal-kampjuni tal- ħamrija  
1.7.3.1.  Kollezzjoni  
Għall-kampjuna ġġ mhumiex rakkomandati tekni ċi jew strumenti 
speċifiċi; it-teknika tal-kampjuna ġġ tiddependi fuq il-finalità ta' l- 
istudju (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Għandu jitqies dan li ġej: 
(a) informazzjoni dettaljata fuq l-istorja ta' l-g ħalqa minn fejn sar il- 
kampjuna ġġ hija neċessarja; dan jinkludi l-lokalità, il-medda 
vegetali, trattamenti bl-u żu ta' pesti ċidi u/jew fertilizzanti, żidiet 
bioloġiċi jew kontaminazzjoni a ċċidentali. Rigward id-desk ­
rizzjoni tal-lokalità fejn sar il-kampjuna ġġ, għandhom ji ġu 
osservati r-rakkomandazzjonijiet ta' l-standard ta' l-ISO fuq il- 
kampjuna ġġ tal-ħamrija (ISO 10381-6);  
(b) il-lokalità fejn sar il-kampjuna ġġ trid tiġi definita skond il- 
metodu UTM (Pro ġettazzjoni Universali Tra żversali Merkatorja/ ­
Datum Orizzontali Ewropew) jew permezz tal-koordinati ġeografiċi tiegħu; dan jista' jippermetti rikollizzjoni ta' kwalità 
ta' ħamrija partikolari fil-futur jew jist' jg ħin jiddefinixxi l- 
ħamrija ta ħt sistemi varji ta' klassifikazzjoni u żati f'pajji żi 
differenti. Ukoll, jin ġabar biss l'orizzont A sa fond massimu ta' 
20 ċm. Speċjalment g ħal-kwalità ta' ħamrija n. 7 jekk il- ħamrija 
tagħmel parti minn orizzont O
 h , dan irid ji ġi miżjud fril-kamp ­
junaġġ. 
Il-kampjuni tal- ħamrija għandhom jin ġarrew permezz ta' kontenituri 
u taħt u f'kondizzjonijiet ta' temperatura li jiggarantixxu li l-propje ­
tajiet oriġinali tal-ħamrija ma ji ġux mibdula b'mod sinifikattiv.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Ħażna 
L-użu ta' ħamrija prelevata re ċentement huwa preferibbli. Biss meta 
dan ma jkunx possibbli l- ħamrija tista' ti ġi maħżuna f'temperatura 
ambjentali u g ħandha tin żamm niexfa bl-arja. G ħall-ħażna mhux 
rakkomandat l-ebda limitu ta' ħin partikolari, imma ħamrija 
maħżuna għal aktar minn tliet snin g ħandha tiġi rianalizzata qabel 
l-użu biex jiġi verifikat il-kontenut karboniku organiku, pH u CEC.  
1.7.3.3.  Manipolazzjoni u preparazzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija għall-prova  
Il-ħamrija trid ti ġi mnixxfa bl-arja f'temperatura ambjentali (prefer ­
ibbilment bejn 20-25  o C). Is-disgregazzjoni trid ti ġi magħmula bl- 
anqas forza possibbli, sabiex l-istruttura ori ġinali tal-ħamrija tinbidel 
mill-anqas possibbli. Il- ħamrija trid tintg ħarbel sa qies partikolari ≤ 
2 mm; skond ir-rakkomandazzjonijiet tan-norma ta' l-ISO fuq il- kampjuna ġġ tal-ħamrija (ISO 10381-6). Homogenità akkurata hija 
rakkomandata, peress li din tkabbar ir-reprou ċibilità tar-ri żultati. Il- 
kontenut ta' umdità f'kull kwalità ta' ħamrija hu determinat fuq tlett 
aliquoti msa ħħna sa 105
 o C CASemm ma jkun hemm l-ebda tibdil 
sinifikattiv fil-pi ż (approssimament 12 s). G ħall-kalkoli kollha il- 
massa tal- ħamrija tirreferi g ħall-massa xxottata fil-forn, i.e. il-pi ż 
tal-ħamrija kkore ġut għall-kontenut ta' umdità tieg ħu. 
1.7.4.  Preparazzjoni tas-sustanza sperimentali g ħall-applikazzjoni 
għall-ħamrija  
Is-sustanza sperimentali ti ġi maħlula f'soluzzjoni 0,01 M CaCl  2 
f'ilma distillat jew deionizzat; is-soluzzjoni ta' CaCl  2 , użata bħala l- 
fażi tas-solvent bl-ilma, tiswa biex titjieb i ċ-ċentrifugabilità u 
timminimizza l-iskambjar ta' katjoniku. Il-kon ċentrazzjoni tas- 
soluzzjoni ma ħżuna preferibbilment g ħandha tkun tlett ordini ta' 
kobor għola mil-limitu tas-sejba tal-metodu analitiku u żat. Dan il- 
parametru jissalvagwardja mi żuri akkurati fil- ka ż tal-metodolo ġija 
użata f'dan il-metodu; barra minn hekk, il-kon ċentrazzjoni tas- 
soluzzjoni ma ħżuna għandha tkun inferjuri g ħas-solubilità tas- 
sustanza sperimentali fl-ilma.  
Preferibbilment, is-soluzzjoni ma ħżuna għandha titlesta' immedja ­
tament qabel il- ħin ta' l-applikazzjoni g ħall-kampjuini tal- ħamrija u 
għandha tin żamm mag ħluqa fid-dlam f'4  o C. Il-ħin tal-ħażna 
jiddependi fuq l-istabbilità tas-sustanza sperimentali u l-kon ċen­
trazzjoni tag ħha fis-soluzzjoni.  
Sustanzi lijdumu biex jin ħallu biss (S  w < 10  -4 g l -1 ), jista' jkun 
neċessarju a ġent xieraq g ħas-solubilizazzjoni meta diffi ċilment 
tinħall is-sustanza sperimentali. Dan l-a ġent għas-solubilizazzjoni: 
(a) irid ikun jit ħallat ma l-ilma b ħal methanol jew acetonitrile; (b) 
il-konċentrazzjoni tieg ħu ma tridx taqbe ż 1 % tal-volum totali tas- 
soluzzjoni ma ħżuna u trid tikkostitwixxi anqas minn dan fis- 
soluzzjoni tas-sustanza sperimentali li ti ġi f'kuntatt mal- ħamrija (pre ­
feribilment anqas minn 0,1 %); u ( ċ) m'għandux ikun surfactant jew 
jagħti lok għal reazzjonijiet solvoliti ċi mas-sustanza kimika speri ­
mentali. L-u żu ta' aġent solubilizzani g ħandu jiġi msemmi u 
ġustifikat fir-rapurta ġġ tad-data.  
Alternattiva o ħra għal sustanzi li jin ħallu bil-mod tikkonsisti fi ż- 
żieda intenzjonali tas-sustanza sperimentali mas-sistema sperimentali: 
is-sustanza sperimentali ti ġi maħlula ġo solvent organiku, u minn 
dan alikwota ti ġi miżjuda mas-sistema tal- ħamrija u 0,01 M 
soluzzjoni ta' CaCl  2 f'ilma distillat jew deionizzat. Il-kontenut tas- 
solvent organiku fil-fa żi bl-ilma g ħandha tin żamm l-aktar baxxa 
possibbli, normalment li ma taqbi żx 0,1 %. I ż-żieda intenzjonali ta' 
soluzzjoni organika tista' tikkomprometti r-riprodu ċibilità mill-aspett 
tal-volum. G ħaldaqstant, żball addizzjonali jista' ji ġi introdott b ħala 
s-sustanza sperimentali u kon ċentrazzjoni tal-kosolvent ma jkunx l- 
istess fil-provi kollha.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. PREREQUI ŻITI GĦALL-EŻEKUZZJONI TAL-PROVA TA' L- 
ADSORBIMENT/DESORBIMENT  
1.8.1.  Metodu analitiku  
Fost il-paramentri ewlenin li jistg ħu jinfluwenzaw l-akkuratezza tal- 
miżuri tas-sorbiment hemm il-pre ċiżjoni tal-metodu analitiku fl- 
analiżi kemm tal-fa żi soluzzjoni, kif ukoll tal-fa żi ta' l-adsorbiment, 
l-istabilità u l-purezza tas-sustanza sperimentali, il-kisba ta' l-ekwi ­
libriju tas-sorbiment, l-ordni tal-kobor tal-varjazzjonijiet ta' kon ċen­
trazzjoni tas-soluzzjoni, ir-rapport ħamrija/soluzzjoni u il- 
varjazzjonijiet fl-istruttura tal- ħamrija matul il-pro ċess ta' ekwili ­
brazzjoni (35) (59-62). Xi e żempji, fokalizzati fuq il-pre ċiżjoni, 
jinstgħabu fl-Anness 2.  
L-attendibilità tal-metodu analitiku li jintu ża trid tiġi kontrollata fir- 
range ta' kon ċentrazzjoni li x'aktarx ise ħħ matul il-prova. Min 
jagħmel l-esperiment g ħandu jħossu ħieles li ji żviluppa metodu 
xieraq b'akkuratezza, pre ċiżjoni, riprodu ċibilità, limiti ta' rivelazzjoni 
u ġbir xierq. Gwida g ħall-eżekuzzjoni tal-prova hija mog ħtija fl- 
esperiment li ġej. 
Volum xieraq ta' 0,01 M CaCl  2 , e.ż. 100 ċm 3 , jitħawwad g ħal 4 s 
bil-piż ta' ħamrija, e. ż. 20 g, li g ħandha adsorbiment g ħoli, i.e. 
b'kontenut g ħoli ta' karbonju organiku u ta' tafal; dawn il-pi żijiet u 
volumi jistg ħu ivarjaw skond b żonnijiet analiti ċi, imma rapport 
ħamrija/soluzzjoni ta' 1:5 jista' jirrapre żenta punt ta' bidu konven ­
jenti. It-ta ħlita tiġi ċentrifugata u l-fa żi bl-ilma tista' ti ġi filtrata. 
Ma' din ta' l-a ħħar jiġi miżjud volum determinat ta' soluzzjoni 
maħżuna tas-sustanza sperimentali sabiex kiseb kon ċentrazzjoni 
nominali fil-kamp tar-range ta' kon ċentrazzjoni li x'aktarx ise ħħ 
matul il-prova. Dan il-volum m'g ħandux jaqbe ż 10 % tal-volum 
finali tal-fa żi bl-ilma, sabiex in-natura tas-soluzzjoni ta' preekwili ­
brazzjoni tinbidel mill-anqas possibbli. Is-soluzzjoni ti ġi analizzata.  
Sabiex jitqiesu s-sustanzi artifi ċjali użati fil-mod analitiku u l-effetti 
martiċi kkawżati mill- ħamrija irid ji ġi inkluż “blank run” li 
jikkonsisti f'sistema ta' ħamrija + soluzzjoni ta' CaCl2 (ming ħajr 
iż-żieda tas-sustanza sperimentali).  
Għall-miżuri ta' sorbiment jistg ħu jintużaw metodi analiti ċi, fosthom 
kromatografija gass-likwidu (GLC), kromatografija likwida ta' 
prestazzjoni g ħolja (HPLC), spettrometrija (e. ż. GC/spettrometrija 
tal-massa, HPLC/spettrometrija tal-massa) u kont tax-xintil ­
lazzjonijiet likwidi (g ħall-sustanzi radjumarkati). Indipendentement 
mill-metodu analitiku u żat, huwa meqjus adegwat jekk il- ġbir ikun 
bejn 90 % u 110 % tal-valur nominali. Sabiex tit ħalla l-identifi ­
kazzjoni u l-kwantifikazzjoni wara li ssir r-ripartizzjoni, il-limiti tar-rivelazzjoni tal-metodu analitiku trid tkun ta' l-anqas żewġ 
ordinjiet ta' kobor anqas mill-kon ċentrazzjoni nominali.
 
Il-karatteristi ċi u limiti ta' rivelazzjoni tal-metodu analitiku utilizzat 
biex isiru l-istudji fuq l-adsorbiment huma importanti biex ji ġu 
definiti il-kondizzjonijiet sperimentali u l-e żekuzzjoni s ħiħa tal- 
prova. Dan il-metodu jsegwi skema sperimentali ġenerali u 
jipprovdi rakkomandazzjonijiet u linji gwida g ħal soluzzjonijiet alter ­
nattivi fejn il-metodu analitiku u l-fa ċilitajiet tal-laboratorju jimponi 
limitazzjonijiet.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Għażla tar-rapporti ottimali ħamrija/soluzzjoni  
Fl-istudji tal-fenomeni fuq is-sorbiment, l-g ħażla tar-rapporti 
ħamrija/soluzzjoni tiddependi mill-koeffi ċjent tad-distribuzzjoni K  d 
u mill-grad relattiv ta' adsorbiment mixtieq. Il-varjazzjoni tal-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjoni tiddetermina l-pre ċiżjoni stat­
istika tal-mi żura li tiddependi mill-forma ta' l-ekwazzjoni ta' l-adsor ­
biment u, fil-ka ż ta' l-iskoperta tal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza kimi ­
kafis-soluzzjoni, tal-limitazzjoni tal-metodolo ġija analitika applikata. 
Għaldaqstant, fil-prattika ġenerali, ikun utli li ji ġu adottati numru 
limitat ta' rapporti fissi, fejn il-per ċentwali ta' adsorbiment tkun 
aktar minn 20 %, u preferibbilment > 50 % (62), fl-istess ħin kura 
trid tingħata sabiex il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fil- 
fażi bl-ilma tkun dejjem g ħolja biżżejjed li ti ġi mkejla bi pre ċiżjoni. 
Dan huwa partikolarment importanti meta il-per ċentwali ta' adsor ­
biment ikunu g ħolja. 
Approċċ konvenjenti biex jintg ħażlu r-rapporti ħamrija/ilma xierqa, 
jibbaża fuq stima tal-valur K  d permezz ta' studji preliminarji jew 
permezz ta' metodi ta' teknika ta' valutazzjoni stabbiliti (Anness 3). Ir-rapport xieraq jista' mbag ħad jintgħażel fuq il-ba żi ta' grafika tar- 
rapport ħamrija/soluzzjoni versus Kd g ħal persenta ġġi fissi ta' adsor ­
biment (Fig. 1). Tali grafika hija bba żata fuq il-pre żuppost li l- 
ekwazzjoni ta' l-assorbiment hija lineari (
 1 ). Ir-ralazzjoni applikabbli 
tinkiseb billi titran ġa l-ekwazzjoni (4) tal-K  d fil-forma ta' ekwazzjoni  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
jew fil-forma logaritmika tag ħha, billi tassumi li R = m  soil /V0 and 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
log R ¼ Älog K  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Fig. 1 . Relazzjoni bejn il-valur ta' K  d u r-rapporti varji ħamrija/ 
soluzzjoni fil-per ċentwali varji tas-sustanza sperimentali adsorbita  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d ·C aq ads ðeqÞ:
 Fig. 1 turi rapporti ħamrija/soluzzjoni me ħtieġa bħalha funzjoni K  d 
għal-livelli differenti ta' adsorbiment. Pe re żempju, g ħal rapport 
ħamrija/soluzzjoni ta' 1:5 u K  d ta' 20, l-adsorbiment g ħandu jkun 
ta' madwar 80 %. Biex jinkiseb 50 % adsorbiment g ħall-istess 
ammont ta' K  d , irid jintu ża rapport ta' 1:25. Dan l-appro ċċ, biex 
jintagħżlu rapporti xierqa ħamrija/soluzzjoni, joffri lill-investigatur 
il-flessibilità ne ċessarja biex ila ħħaq ma' l-e żiġenzi sperimentali.  
L-akbar diffikultajiet huma dawk fejn is-sustanza kimika ti ġi 
adsorbita b'do ża għolja ħafna jew baxxa ħafna. Meta jkun hemm 
adsorbiment baxx, hu rakkomandabbli l-u żu ta' rapport ħamrija/­
soluzzjoni ta' 1:1, g ħalkemm g ħal xi tipi ta' ħamrija ta' kontenut 
organiku g ħoli jistgħu jkunu ne ċessarji mi żuri iżar sabiex tinkiseb 
taħlita likwida. Fil-metodolo ġija analitika kura trid ting ħata biex 
jitkejjlu bidliet żgħar fil-kon ċentrazzjoni tas-soluzzjoni; inkella l- 
kejl ta' l-adsorbiment ma jkunx pre ċiż. Minn na ħa l-oħra, għal 
valuri għolja ħafna ta' Kd, tista' tasal g ħal rapporti ħamrija/soluzzjoni 
ta' 1:100 biex t ħalli fis-soluzzjoni kwantità sinifikattiva ta' sustanza 
kimika. Madankollu, kura trid ting ħata sabiex ta ħlit sew jiġi żgurat, 
ħin adegwat irid jit ħalla biex is-sistema til ħaq ekwilibriju. Biex 
issolvi dawn il-ka żijiet estremi meta metodolo ġija analitika tkun 
nieqsa, possibiltà o ħra hija dik li tipprevedi l-valur ta' K  d bl-użu 
ta' tekniċi ta' valutazzjoni bba żati, pereżempju, fuq valuri P  ow 
(Anness 3). Dan jista' jkun utli spe ċjalment g ħal sustanzi kimi ċi li 
għandhom adsorbiment baxx/polari b' P  ow < 20 u għal dawk lipofili/ ­
altament sorbitivi b' P  ow > 10  4 . 
1.9. E ŻEKUZZJONI TAL-PROVA  
1.9.1.  Il-kondizzjonijiet tal-prova  
L-esperimenti kollha iridu jsiru f'temperatura ambjentali u, jekk 
possibbli, f'temperatura kostanti bejn 20  o C u 25  o C. 
Il-kondizzjonijiet g ħaċ-centrifugazzjoni iridu jippermettu t-tne ħħija 
ta' partiċelli akbar minn 0,2 μm mis-soluzzjoni. Dan il-valur huwa 
l-iżar partiċella li hija kkunsidrata parti ċella solida, u jirrapre żenta l- 
limitu bejn parti ċelli solidi u kolloidali. Gwida biex ji ġu stabbiliti l- 
kondizzjonijiet ta ċ-ċentrifugazzjoni hija mog ħtija fl-Anness 4.  
Jekk il-fa ċilitajiet ta ċ-ċentrifugazzjoni ma jkunux jistg ħu jiggar­
antixxu t-tne ħħija ta' parti ċelli akbar minn 0,2 μm, kombinazzjoni 
ta' ċentrifugazzjoni u filtrazzjoni b'filtri 0,2 μm tista' tintu ża. Dawn 
il-filtri għandhom ikunu mag ħmula minn materjal inert xieraq biex 
jinevita telf tas-sustanza sperimentali fuqhom. F'kull ka ż, għandu jiġi 
ppruvat li ma jkun hemm l-ebda telf tas-sustanza sperimentali matul 
il-filtrazzjoni.  
1.9.2.  Stadju 1 – Studju preliminarju  
L-iskop ta' studju preliminarju di ġà ngħata fis-sezzjoni Skop. Gwida 
biex issir tali prova hija mg ħotija fl-esperiment su ġġerit hawn ta ħt. 
1.9.2.1.  Selezzjoni tar-rapporti ottimali ħamrija/soluzzjoni  
Jintużaw żewġ tipi ta' ħamrija u tlett rapporti ħamrija/soluzzjoni (sitt 
esperimenti). Tip ta' ħamrija għandha kontenut g ħoli ta' karbonju 
organiku u kontenut baxx ta' tafal, u l-o ħra għandha kontenut baxx 
ta' karbonju organiku u kontenut g ħoli ta' tafal. Ir-rapporti ħamrija/­
soluzzjoni huma su ġġeriti:  
— 50 g ħamrija u 50 ċm 3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza speri ­
mentali (rapport 1/1),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g ħamrija 50 ċm 3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza sperimentali 
(rapport 1/5),  
— 2 g ħamrija u 50 ċm 3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza sperimentali 
(rapport 1/25).  
L-ammont minimu ta' ħamrija li g ħandha tintu ża tiddependi mill- 
faċilitajiet tal-laboratorju u l-e żekuzzjoni tal-metodi analiti ċi użati. 
Madankollu, biex jinkisbu ri żultati affidabbli mill-prova, hu 
rakkomandat illi tintu ża mill-anqas 1 g, u preferibbilment 2 g.  
Sabiex ti ġi verifikata l-istabbilità tas-sustanza sperimentali fis- 
soluzzjoni ta' CaCl  2 u l-adsorbiment eventwali fuq il- ħitan tal- 
kontenituri, irid jitlesta' kampjun ta' riferiment li ma jkunx fi ħ 
ħamrija imma jkun fih biss is-sustanza sperimentali f'soluzzjoni ta' 
0,01 M CaCl  2 li jiġi sottopost e żattament g ħall-istess passi tas- 
sistemi sperimentali.  
Għal kull ħamrija jiġi preparat “blank run” bl-istess ammont ta' 
ħamrija u volum totali ta' soluzzjoni 50 ċm 3 0,01 M CaCl  2 
(mingħajr prova sperimentali) li ti ġi sottoposta g ħall-istess 
proċedura sperimentali. Dan iservi b ħala kontroll ba żiku matul l- 
analiżi biex ji ġu skoperti sustanzi li jinterfeixxu jew ħamrija 
kontaminata.  
L-esperimenti kollha, inklu żi kontrolli u “blanks”, g ħandhom isiru 
minn l-anqas darbtejn. In-numru totali ta' kampjuni li g ħandhom 
jitlestew g ħall-istudju g ħandhom ji ġu kalkolati skond il-metodolo ġija 
li tiġi segwita.  
Metodi g ħall-istudju preliminarju u l-istudju ewlieni huma 
ġeneralment l-istess, e ċċezzjonijiet imsemmija fejn rilevanti.  
Il-kampjuni tal- ħamrija mnixxfin bl-arja ji ġu ekwilibrati billi 
jitħawdu għal (12 s) lejl s ħih qabel jum l-eaperiment, b'volum 
minimu ta' 45 ċm 3 ta' 0,01 M CaCl  2 . Wara ji żdied ċertu volum 
tas-soluzzjoni ri żerva tas-sustanza sperimentali sa total ta' 50 ċm 3 . 
Il-volum tas-soluzzjoni ri żerva miżjud: (a) m'g ħandux ikun aktar 
minn 10 % tal-volum finali 50 ċm 3 tal-fażi bl-ilma sabiex issir l- 
anqas bidla possibbli lin-natura tas-soluzzjoni pre-ekwilibrata; u (b) 
għandu jirri żulta, preferibilment, f'kon ċentrazzjoni inizjali tas- 
sustanza sperimentali f'kuntatt mal- ħamrija (C  0 ) akbar b' żewġ 
ordnijiet ta' preferenza mill-anqas, ta' l-iskoperta tal-metodu analitiku, 
sabiex tiġi salvagwardjata l-kapa ċità biex isiru mizuri e żatti ankè 
meta l-adsorbiment ikun qawwi (> 90 %) u biex wara ji ġu stabbiliti 
l-iżotermi ta' l-adsorbiment. Hu rakkomandat ukoll, jekk possibbli, 
illi l-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza (C  0 ) ma taqbi żx in-nofs tal- 
limitu tas-solubilità tag ħha. 
L-eżempju li jmiss juri l-mod kif tikkalkula l-kon ċentrazzjoni tas- 
soluzzjoni ri żerva (C  st ). Tibda bil- ħsieb illi l-limitu ta' rivelazzjoni 
huwa 0,01 μg ċm -3 u l-adsorbiment huwa ta' 90 %; g ħaldaqstant, il- 
konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza sperimentali f'kuntatt mal- 
ħamrija trid tkun, preferibbilment, 1 μg ċm -3 (żewġ ordnijiet ta' 
kobor għola mil-limitu ta' rivelazzjoni). Jekk ji żdied il-massimu 
rakkiomandat tal-volum tas-soluzzjoni ma ħżuna, i.e. 5 sa 45 ċm 3 
tas-soluzzjoni ta' ekwilibrazzjoni ta' CaCl  2 0,01 M (= 10 % tas- 
soluzzjoni ma ħżuna għal volum totali ta' 50 ċm 3 tal-fażi bl-ilma), 
il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ma ħżuna għandha tkun ta' 10 μg 
ċm -3 ; jiġifieri ogħla bi tliet ordnijiet ta' kobor mil-limitu ta' rive ­
lazzjoni tal-metodu analitiku.  
Il-pH tal-fa żi bl-ilma g ħandu jitkejjel qabel u wara kuntatt mal- 
ħamrija peress li g ħandu rwol importanti fil-pro ċess kollu ta' l-adsor ­
biment, spe ċjalment g ħal sustanzi ionizzabbli.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
It-taħlita titħawwad CASemm jintla ħaq l-ekwilibriju ta' l-adsor ­
biment. Il- ħin ta' l-ewilibriju fil- ħamrija huwa varjabbli ħafna, 
skond is-sustanza kimika fil- ħamrija; perjodu ta' 24 s huwa 
biżżejjed normalment (77). Fl-istudju preliminari, kampjuni jistg ħu 
jinġabru b'sekwenza matul perjodu ta' ta ħlit ta' 48 s (pere żempju f'4, 
8, 24, 48 s). Madankollu, il- ħinijiet ta' l-anali żi iridu jiġu meqjusa bi 
flessibilità skond l-iskeda ta' xog ħol tal-laboratorju.  
Hemm żewġ alternattivi g ħall-analiżi tas-sustanza sperimentali fis- 
soluzzjoni bl-ilma: (a) il-metodu paralleli (b) il-metodu f'serje. 
għandu jing ħad illi, g ħalkemm il-metodu paralleli huwa aktar 
tedjanti fil-kamp sperimentali, it-trattament matematiku tas- soluzzjonijiet huwa aktar sempli ċi (Anness 5). Madankollu, l- 
għażla tal-metodolo ġija li għandha tintu ża, hija f'idejn il-persuna li 
tagħmel l-esperiment li tkun trid tqis il-fa ċilitajiet tal-laboratorju u r- 
riżorsi li huma disponibbli.
 
(a) Metodu paralleli: kampjuni bl-istess relazzjoni ħamrija/soluzzjoni 
humw ppreparati, bl-istess numru ta' intervalli ta' ħin li hu 
mixtieq biex isir l-istudju tal-kinetika ta' l- adsorbiment. Wara 
ċentrifugazzjoni u, jekk mixtieq, filtrazzjoni, il-fa żi bl-ilma ta' l- 
ewwel pipetta ti ġi miġbura bl-aktar mod komplet possibbli u 
titkejjel wara, pere żempju, 4 s, dik tat-tieni pipettta wara 8 s, 
dik tat-tielet wara 24, e ċċ. 
(b) Metodu f'serje: g ħal kull rapport ħamrija/soluzzjoni ji ġi preparat 
biss kampjun kampjun doppju wie ħed. f'intervalli determinati ta' 
ħin it-taħlita tiġi ċentrifugata biex il- fa żijiet jiġu separati. 
Alikwota żgħira ta' riżorsi tiġi immedjatament analizzata g ħas- 
sustanza sperimentali; imbag ħad l-esperiment ikompli bit-ta ħlita 
oriġinali. Jekk l- filtrazzjoni ti ġi applikata wara ċ-ċentrifu­
gazzjoni, il-laboratorju g ħandu jkollu fa ċilitajiet biex issir l- 
filtrazzjoni ta' aliquoti bl-ilma żgħar. Huwa rakkomandabbli li 
l-volum totali ta' laliquoti me ħuda, ma jkunx aktar mjinn 1 % 
tal-volum totali tas-soluzzjoni, sabiex ir- rapport ħamrija/­
soluzzjoni ma jinbidilx b'mod sinifikattiv u biex titnaqqas il- 
massa tas- solute disponibbli g ħall-adsorbiment matul il-prova.  
Il-perċentwali ta' l-adsorbiment  A t i huwa kkalkolat f'kull punt ta' ħin 
(t i ) fuq il-ba żi tal-kon ċentrazzjoni inizjali nominali u l-kon ċen­
trazzjoni mkejla fil- ħin tal-kampjuna ġġ (ti), korrett g ħall-ħin tal- 
“blank”. Plots ta' l-  A  t i versus l- ħin (Fig. 1 Anness 5) huma 
magħmula sabiex ji ġi vvalutat jekk inkisbitx il-pjattaforma ta' l- 
ekwilibriju (  1 ). Il-valur K  d fl-ekwilibriju ji ġi kkalkolat ukoll. 
Ibbażat fuq dan il-valur K  d , u bl-użu tal-Fig.1 jintag ħżlu rapporti 
xierqa ħamrija/soluzzjoni, sabiex il-per ċentwali ta' l-adsorbiment 
taqbeż 20 % u preferibbilment > 50 % (61). L-ekwazzjonijiet u l- 
prinċipji tal-plotting kollha applikabbli huma mg ħotija fit-taqsima 
fuq id-Data u rapurta ġġ u fl-Anness 5.  
1.9.2.2.  Determinazzjoni tal- ħin ta' ekwilibrazzjoni ta' l-adsorbiment u ta' l- 
ammont sustanza sperimentali adsorbita fl-ekwilibriju  
Kif digà msemmi, plots ta'  A t i jew C aq ads versus il- ħin jippermettu 
stima tat-twettieq ta' l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment u l-ammont ta' 
sustanza sperimentali adsorbita fl-ekwilibriju. Il-figuri 1 u 2 fl- 
Anness 5 juru e żempji ta' tali plots. Il- ħin ta' l-ekwilibriju huwa 
dak neċessarju biex is-sistema til ħaq pjattaforma.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Plots  tal-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħat-test fil-fa żi akwea  C aq ads versus il- ħin jistgħu 
jintużaw ukoll g ħall-kalkolu tal-kisba tal- plateau  ta' l-ekwilibriju (ara Fig. 2 fl-Anness 5).
 Jekk, b'ħamrija partikolari, ma tintla ħaqx pjattaforma i żda issir żieda 
kontinwa, din tista' tkun dovuta g ħal fatturi ta' komplikazzjoni b ħal 
biodegredazzjoni jew diffu żjoni bil-mod. Biodegradazzjoni tista' 
tintwera' billi jirrepeta l-isperiment b'kampjun sterilizzat tal- ħamrija. 
Jekk anke f'dan il-ka ż ma tintla ħaq l-ebda pjattaforma, min qed 
jagħmel l-esperiment g ħandu jfittex fenomeni o ħra li jistg ħu ikunu 
involuti fl-istudji spe ċifiċi tiegħu; dan jista' jsir b'modifikazzjonijiet 
xierqa tal-kondizzjonijiet ta' l-esperiment (temperatura, ħin tat- 
taħwid, rapporti ħamrija/soluzzjoni). Ukoll, min qed jag ħmel l- 
esperiment irid jidde ċidi jekk ikomplix il-pro ċedura sperimentali 
malgrad ta' eventwali possibilità li jintla ħaq ekwilibriju.  
1.9.2.3.  L-adsorbiment fil-wi ċċ tal-kontenituri u l-istabilità tas-sustanza 
sperimentali  
Xi informazzjoni fuq l-istabliltà tas-sustanza sperimentali u l-adsor ­
biment tag ħha fil-wiċċ tal-kontenituri tag ħha tista' tinkiseb billi ssir 
analiżi tal-kampjuni tal-kontroll. Jekk ti ġi osservata deplezzjoni 
akbar minn l-i żball standard tal-metodu analitiku, tista' tkun 
kaużata minn degredazzjoni abiotika u/jew adsorbiment fil-wi ċċ 
tal-kontenitur sperimentali. Distinzjoni bejn dawn i ż-żewġ fenomeni 
tista' tintla ħaq billi jin ħaslu sew il- ħitan tal-kontenitur b'volum 
magħruf ta' solvent xieraq u billi ji ġi analizzat il-likwidu tal- ħasil 
għas-sustanza sperimentali. Jekk l-ebda adsorbiment ma jinstab fil- 
wiċċ tal-kontenituri sperimentali, il-fasda turi instabilità abiotika tas- 
sustanza sperimentali. Jekk jinstab adsorbiment, bdil tal-materjal tal- kontenituri sperimentali ikun ne ċessarju. Madankollu, data fuq l- 
adsorbiment tal-wi ċċ tal-kontenituri sperimentali mi ġbura minn dan 
l-esperiment ma tistax ti ġi estrapolata direttament lill-esperiment 
ħamrija/soluzzjoni. Il-pre żenza ta' ħamrija taffetwa l-adsorbiment.
 
Informazzjoni addizzjonali fuq l-istabilità tas-sustanza sperimentali 
tista' tinkiseb billi ji ġi stabbilit bilan ċ tal-massa pro ġenitriċi fiż- 
żmien. Dan ifisser illi l-fa żi bl-ilma, estratti ta' ħamrija u ħitan ta' 
kontenituri sperimentali ji ġu analizzati g ħas-sustanza sperimentali. 
Id-differenza bejn il-massa ta' kimika sperimentali mi żjuda u s- 
somma tal-massi kimi ċi sperimentali fil-fa żi bl-ilma, fl-estratti tal- 
ħamrija u fil- ħitan ta' kontenituri sperimentali huwa ugwali g ħal 
massa degredata u/jew volatilizzata u/jew mhux estratta. Sabiex 
issir determinazzjoni tal-bilan ċ tal-massa, l-ekwilibriju ta' adsor ­
biment trid tintla ħaq matul l-perjodu ta' l-esperiment.  
Il-bilanċ tal-massa jrid isir kemm fuq ħamrija kif ukoll fuq rapport 
ħamrija/soluzzjoni g ħal kull tip ta' ħamrija li fl-ekwilibriju tag ħti lok 
għal fasda g ħola minn 20 % u preferibbilment > 50 %. Meta l- 
esperiment g ħar-riċerka tar-rapporti jintemm bl-anali żi ta' l-aħħar 
kampjun tal- ħażi bl-ilma wara 48 s, il-fa żijiet iridu ji ġu separati 
permezz ta' ċentrifugazzjoni u, jekk mixtieqa, filtrazzjoni. Il-fa żi 
bl-ilma trid tin ġabar fl-akbar kwantità possibbli, bi ż-żieda ta' 
solvent ta' estrazzjoni adatt (koeffi ċjent ta' estradizzjoni mhux 
anqas minn 95 %) mal- ħamrija biex ti ġi estratta s-sustanza speri ­
mentali. Minn l-anqas żewġ estrazzjonijiet su ċċessivi huma rakkom ­
andati. L-ammont ta' sustanza sperimentali estratt mill- ħamrija u 
mill-kontenitur ji ġi determinat u l-bilan ċ tal-massa ji ġi kkalkolat 
(ekwazzjoni 10, data u rapurta ġġ). Jekk ikun anqas minn 90 %, is- 
sustanza sperimentali hija meqjusa instabbli fil-perjodu ta' ħin ta' l- 
esperiment. Madankollu, studji xorta jistg ġu jitkomplew, g ħalkemm 
l-instabilità tas-sustanza sperimentali trid ti ġi meqjusa; f'dan il-ka ż 
huwa rakkomandat biex ji ġu analizzati ż-żewġ fażijiet fl-istudju prin ­ 
ċipali. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4  Stadju 2 – Kinetika ta' l-adsorbiment g ħal konċentrazzjoni ta' 
sustanza sperimentali  
Jintużaw ħames kwalitajiet ta' ħamrija, selezzjonati minn Tabella 
1. Jekk dan ikun xieraq, huwa vanta ġġuż jekk tintu ża kull kwalità 
ta' ħamrija użata fl-istudju preliminari fost dawn il- ħames kwalitajiet 
ta' ħamrija. F'dan il-ka ż, Stadju 2 m'g ħandux jer ġa' jiġi repetut g ħall- 
kwalitajiet ta' ħamrija użati fl-istudju preliminarju.  
Il-ħin ta' l-ekwilibriju, ir-rapport ħamrija/soluzzjoni, il-pi ż tal- 
kampjun tal- ħamrija, il-volum tal-fa żi bl-ilma f'kuntatt mal- ħamrija 
u il-konċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni huma 
magħżula fuq il-ba żi tar-riżultati ta' l-istudji preliminarji. L-anali żi 
trid issir, bejn wie ħed u ieħor, 2, 4, 6, 8 (possibliment ankè 10) u 
24 s wara l- ħin tal-kuntatt; il- ħin tat-taħwid jista' ji ġi estiż sa 
massimu ta' 48 s fil-ka ż illi sustanza kimika tirrikjedi ħin itwal 
biex jintla ħaq l-ekwilibriju fil-ka ż tar-riżultati tar-ri ċerka fil-qasam 
tar-rapporti. Madankollu, il- ħinijiet ta' l-anali żi jridu jiġu kkunsidrati 
b'flessibilità.  
Kull esperiment ( ħamrija wa ħda u soluzzjoni wa ħda) isir doppju 
mill-inqas biex tkun tista' ti ġi vvalutata l-varjanza fir-ri żultati. 
F'kull esperiment isir wie ħed “blank”. Dan jikkonsisti fil- ħamrija u 
fis-soluzzjoni ta' CaCl  2 0,01 M, ming ħajr iż-żieda ta' sustanza speri ­
mentali, ta' pi ż u volum, rispettivament, identiku g ħal dak ta' l- 
esperiment. Sabiex ikun hemm salvagwardja g ħall-imprevvist, 
kampjun ta' kontroll bis-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni ta' CaCl
 2 0,01 M biss (ming ħajr ħamrija) ji ġi soġġett għall-istess 
proċedura sperimentali.  
Il-persenta ġġ ta' adsorbiment ji ġi kkalkolat f'kull punt ta' ħin A t i u/jew intervall ta' ħin A Δt i (skond il-b żonn) impin ġi kontra l- ħin. 
Jiġu ukoll ikkalkolati l-koeffi ċjent ta' distribuzzjoni K  d at equi­
librium, u l-koeffi ċjent ta' adsorbiment normalizzat tal-karbonju 
organiku K  oc (għall-komposti kimi ċi organiċi mhux polari).  
Riżultati tal-provi fuq il-kinetika ta' l-adsorbiment  
Il-valur linjari K  d hu ġeneralment pre ċiż biżżejjed biex tkun jista' ti ġi 
deskritta l-im ġieba relattiva g ħas-sorbiment fil- ħamrija (35) (78) u 
jirrapreżenta espressjoni tal-mobilità intrinsika tal-prodotti kimi ċi 
fil-ħamrija. Pere żempju, ġeneralment, kimi ċi b' K  d ≤ 1 cm  3 g -1 
huma meqjusa kwalititivament mobblì. Simili hija l-iskema ta' klas ­
sifikazzjoni tal-mobilità bba żata fuq valuri K  oc żviluppata minn 
MacCall  et al . (16). Addizzjonalment, je żistu skemi ta' klassifi ­
kazzjoni ta' filtrazzjoni li huma bba żati fuq ir-rela żżjoni bejn K  oc u 
DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Ukoll, skond studji fuq l-anali żi ta' l-iżbalji (61), valuri K  d anqas 
minn 0,03 cm  3 g -1 ma jistgħux jiġu vvalutati akkuratament minn 
tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni fil-fa żi bl-ilma, ankè meta jintu ża l-aktar 
rapport ħamrija/soluzzjoni favorevoli (mil-lat tal-pre ċiżjoni), i.e. 
1:1. F'dan il-ka ż l-analiżi taż-żewġ fażijiet, ħamrija u soluzzjoni, 
hija rakkomandata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: il- ħin tad-degradazzjoni g ħal 50 % tas-sustanza g ħat-test.
 Rigward l-osservazzjonijiet mag ħmula 'l fuq, huwa rakkomandat illi 
jitkompla l-istudju ta' l-im ġieba ta' l-adsorbiment ta' prodott kimiku 
fil-ħamrija u l-mobilità potenzali tieg ħu billi jiġu stabbiliti l-i żotermi 
ta' adsorbiment skond Freundlich g ħal dawn is-sistemi, g ħal liema, 
id-determinazzjoni ta' K  d hija possibbli bil-protokoll sperimentali 
segwit f'dan il-metodu sperimentali. Determinazzjoni akkurata tkun 
possibbli jekk il-valur li jirri żulta billi ssir multiplikazzjoni tal- K  d 
mar-relazzjoni ħamrija/soluzzjoni ikun > 0,3, meta l-mi żuri jkunu 
bbażati fuq tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni fil-fa żi bl-ilma (metodu 
indirett), jew > 0,1, meta ż-żewġ fażijiet jiġu analizzati (metodu 
dirett) (61).  
1.9.2.5.  Stadju 3 – I żotermi ta' adsorbiment u kinetika ta' desorbiment/ ­
iżotermi ta' desorbiment  
1.9.2.5.1. I ż o t e r m i t a ' a d s o r b i m e n t  
Jintużaw ħames kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza, li jkopru żewġ 
ordnijiet ta' kobor; fl-g ħażla ta' dawn il-kon ċentrazzjonijiet 
għandhom ji ġu meqjusa s-solubilità fl-ilma u l-kon ċentrazzjoni fl- 
ekwilibriju bl-ilma li jirri żulta. L-istess relazzjoni ħamrija/soluzzjoni 
għal kull kwalità ta' ħamrija għandha tin żamm għat-tul kollu ta' l- 
istudju. Il-prova ta' l-adsorbiment hija mag ħmula kif deskritt 'il fuq, 
bl-uniku differenza illi l-fa żi bl-ilma ti ġi analizzata darba biss fil- ħin 
neċessarju biex jintla ħaq l-ekwilibriju kif determinat qabel fl-Istadju 
2. Il-kon ċentrazzjonijiet ta' l-ekwilibriju fis-soluzzjoni ji ġu deter­
minati u l-ammont adsorbit ji ġi kkalkolat mill-fasda tas-sustanza 
sperimentali fis-soluzzjoni jew bil-metodu indirett. Il-massa 
adsorbita g ħall-unità tal-massa tal- ħamrija tiġi mpinġija grafikament 
bħala funzjoni tal-kon ċentrazzjoni fl-ekwilibriju tas-sustanza speri ­
mentali (ara Data u rapurta ġġ). 
Riżultati ta' l-esperiment g ħall-iżotermi ta' l-adsorbiment  
Fost il-mudelli matemati ċi ta' l-adsorbiment proposti s'issa, l- 
iżoterma Freundlich hija dik li tintu ża l-iktar biex tiddeskrivi l- 
proċess ta' l-adsorbiment. Informazzjoni aktar dettaljata fuq l-inter ­
pretazzjoni u l-importanza tal-mudelli ta' l-adsorbiment hija previst 
fir-referenzi (41) (45) (80) (81) (82).  
Nota : Għandu jiġi osserva illi, g ħal sustanzi varji, konfront bejn 
il-valuri ta' K  F (koeffiċjent ta' l-adsorbiment ta' Freundlich) hu 
possibbli biss jekk dawn il-valuri K  F huma espressi fl-istess unità 
(83).  
1.9.2.5.2. K i n e t i k a t a d - d e s o r b i m e n t  
L-għan ta' dan l-esperiment huwa illi ji ġi nvestigat jekk sustanza 
kimika ti ġix adsorbita riversibilment jew irriversibilment mill- 
ħamrija. Din l-informazzjoni hija mportanti, peress illi l-pro ċess ta' 
desorbiment g ħandu ukoll rwol importanti fl-im ġieba ta' sustanza 
kimika f' ħamrija ta' l-g ħalqa. Madankollu, id-data tad-desorbiment 
tikkontribwixxi utilment g ħall-mudellar kompjuterizzat tal-filtrazzjoni 
u għas-simulazzjoni tas-sustanza li tddewweb. Jekk studju ta' desor ­
biment ikun mixtieq, huwa rakkomandat li l-istudju rakkomandat hawn taħt isir fuq kull sistema fejn determinazzjoni akkurata ta' K
 d 
fil-esperiment tal-kinetika ta' l-adsorbiment pre ċedenti tkun possibbli.  
B'mod analogu ma' l-istudju tal-kinetika ta' l-adsorbimetnt, biex ti ġi 
studjata l-kinetika tad-desorbiment hemm żewġ metodi: (a) il-metodu 
paralleli u (b) il-metodu f'serje. L-g ħażla tal-metodolo ġija li għandha 
tapplika tit ħalla f'idejn min ikun qed jag ħmel l-esperiment li jkun irid 
jikkonsidra il-fa ċilitajiet disponibbli u r-ri żorsi tal-laboratorju.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
(a) Metodu paralleli: g ħal kull ħamrija mag ħżula għall-istudju fuq 
id-desorbiment, jitlestew kampjuni bl-istess relazzjoni ħamrija/­
soluzzjoni, daqs kemm hemm intervalli ta' ħin li fihom tixtieq 
tiġi studjata l-kinetika tad-desorbiment. Preferibilment, ji ġu 
applikati l-istess intervalli ta' ħin utilizzati g ħall-kinetika ta' l- 
adsorbiment; madankollu, il- ħin totali jista' ji ġi estiż skond in- 
neċessità sabiex is-sistema tkun tista' til ħaq l-ekwilibriju ta' 
desorbiment. F'kull esperiment ( ħamrija wa ħda, soluzzjoni 
waħda) isir wie ħed “blank”. Dan jikkonsisti fil- ħamrija u fis- 
soluzzjoni 0,01 M ta' CaCl  2 , mingħajr is-sustanza sperimentali, 
u ta' piż u valur, rispettivament, identiku g ħal dawk ta' l- 
esperiment. B ħala kampjun ta' kontroll, is-sustanza sperimentali 
fis-soluzzjoni 0,01 M ta' CaCl  2 (mingħajr ħamrija) hija so ġġetta 
għall-istess pro ċedura sperimentali. It-ta ħlit kollu tas-soluzzjoni 
mal-ħamrija jitħawwad sakemm jintla ħaq l-ekwilibriju ta' l-adsor ­
biment (kif determinat qabel fl-Istadju 2). Imbag ħad, il-fażijiet 
jiġu separati permezz ta' ċentrifugazzjoni u l- fa żijiet bl-ilma, 
kemm ikun possibbli, jitne ħħew. Il-volum ta' soluzzjoni 
mneħħi jiġi sostitwit b'volum ugwali ta' 0,01 M CaCl  2 
mingħajr is-sustanza sperimentali u t-ta ħlit il-ġdid jiġi 
mħawwad mill- ġdid. Il-fa żi bl-ilma ta' l-ewwel pipetta ti ġi 
miġbura bl-aktar mod komplet possibbli u ti ġi mkejla, 
pereżempju, wara 2 s, dik tat-tieni pipetta wara 4 s, dik tat- 
tielet wara 6 s, e ċċ. CASemm jintla ħaq l-ekwilibriju tad-desor ­
biment.  
(b) Metodu f'serje: wara l-esperiment tal-kinetika ta' l-adsorbiment, 
it-taħlita tiġi ċentrifugata u l-fa żi bl-ilmam, sakemm ikun 
possibbli, titne ħħa. Il-volum tas-soluzzjoni li jitne ħħa jiġi 
sostitwit b'volum ugwali ta' CaCl  2 0,01 M, ming ħajr is- 
sustanza sperimenmtali. It-ta ħlita l-ġdida tiġi mħawwda 
CASemm jintla ħaq l-ekwilibriju tad-desorbiment. Matul dan il- 
perjodu ta' żmien, f'intervalli definiti ta' ħin, it-taħlita tiġi 
ċentrifugata biex ji ġu separati l-fa żijiet. Alikuota żgħira tal-fażi 
bl-ilma ti ġi immedjatament e żaminata g ħas-sustanza speri ­
mentali; imbag ħad, l-esperiment ikompli bit-ta ħlita oriġinali. Il- 
volum ta' kull alikwota individwali g ħandu jkun inqas minn 1 % 
tal-volum totali. Ti ġi miżjuda mat-ta ħlita l-istess kwantità ta' 
soluzzjoni friska ta' CaCl  2 0,01 M biex jin żamm l-istess 
rapport ħamrija/soluzzjoni, u tkompli ti ġi mġawda sa l-intervall 
ta' ħin li jmiss.  
Il-perċentwlai tad-desorbiment ji ġi kkalkolatf'kull punt ta' ħin ðD t i Þ 
u/jew intervall ta' ħin ðD Δt i Þ (skond l-e żiġenzi ta' l-istudju) u ti ġi 
mpinġija grafikament kontra l- ħin. Jiġi kkalkolat ukoll il-koeffi ċjent 
tad-desorbiment Kdes fl-ekwilibriju. L-ekwazzjonijiet applikabbli kollha huma msemmija f'Data u Rapurta ġġ u Anness 5.
 
Riżultati ta' l-esperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment  
Tpinġija grafika kommuni tal-persenta ġġ ta' desorbiment  D t i u l- 
adsorbiment  A  t i kontra l- ħinjippermettu stima tar-riversibilità tal- 
proċess ta' l-adsorbiment. Jekk l-ekwilibriju tad-desorbiment 
jintlaħaq ankè f'darbtejn il- ħin ta' l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment, u 
d-desorbiment totali ikun aktar minn 75 % ta' l-ammont adsorbit, l- 
adsorbiment huwa meqjus irriversibbli.  
1.9.2.5.3. I ż o t e r m i t a d - d e s o r b i m e n t  
L-iżotermi tad-desorbiment skond Freundlich huma determinati fuq 
ħamrija użata fl-esperiment fuq l-i żotermi ta' l-adsorbiment. Il-prova 
tad-desorbiment issir kif deskritta fit-taqsima Kinetika tad-desor ­
biment, bl-unika differenza illi il-fa żi bl-ilma ti ġi analizzata darba 
biss, fl-ekwilibriju tad-desorbiment. Ji ġi kkalkolat l-ammont ta' 
sustanza sperimentali desorbit. Il-kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa adsorbita fuq il- ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment ti ġi 
mpinġija grafikament b ħalha funzjoni tal-kon ċentrazzjoni ta' l-ekwi ­
libriju tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni (ara Data u rapurta ġġ u 
Anness 5).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DATA  U RAPURTA ĠĠ 
Id-data analitika ti ġi preżentata f'forma ta' tabella (ara Anness 6). 
Jingħataw il-mi żuri u l-medji individwali kalkolati. Jing ħataw 
rappreżentazzjonijiet grafi ċi ta' l-iżotermi ta' l-adsorbiment. Il- 
kalkoli jsiru kif deskritt hawn ta ħt. 
Għall-iskop tal-prova, huwa meqjus illi l-pi ż ta' 1 cm  3 ta' soluzzjoni 
bl-ilma huwa 1 g. Ir-rapport ħamrija/soluzzjoni jista' ji ġi espress 
f'unità ta' w/w jew w/vol g ħall-istess figura.  
2.1. ADSORBIMENT  
L-adsorbiment  A  t i ) huwa definit b ħala l-persenta ġġ tas-sustanza 
adsorbita fuq il- ħamrija relatata mal-kwantità pre żenti fil-bidu 
tal-prova, ta ħt il-kondizzjonijiet sperimentali. Jekk is-sustanza speri ­
mentali tkun stabbli u ma t'adsorbix b'mod sinifikattiv mal- ħajt tal- 
kontenitur A t i , tiġi kkalkolata f'kull punt ta' ħin t 1 , skond l-ekwazzjoni:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
meta:  
A t i = presenta ġġ ta' adsorbiment fil-punt ta' ħin t  i ( %);  
m s ads ðt i Þ = massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il- ħamrija 
fil-ħin t  i (μg); 
m 0 = massa tas-sustanza sperimentali fil-pipetta fil-bidu tal- 
prova (μg). 
Informazzjoni dettaljata fuq kif g ħandu jiġi kkalkolat il-persenta ġġ ta' 
adsorbiment  A  t i għall-metodi paralleli u f'serje hija mog ħtija fl- 
Anness 5.  
Il-koeffiċjent ta' distribuzzjoni K  d huwa r-relazzjoni bejn il-kontenut 
tas-sustanza fil-fa żi tal-ħamrija u l-kon ċentrazzjoni tal-massa tas- 
sustanza fis-soluzzjoni bl-ilma, ta ħt il-kondizzjonijiet tal-prova meta 
jintlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
meta:  
C s ads ðeqÞ = kontenut tas-sustanza adsorbita fuq il- ħamrija fl-ekwi ­
libriju ta' l-adsorbiment ( μg g -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = kon ċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fa żi bl-ilma 
fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment ( μg cm  -3 ). Din il-kon ċ­
entrazzjoni ti ġi analitikament determinata billi jitqiesu 
il-valuri mog ħtija mill-“blanks”  
m s ads ðeqÞ = massa tas-sustanza adsorbita fuq il- ħamrija fl-ekwi ­
libriju ta' l-adsorbiment ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = massa tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju ta' l- 
adsorbiment ( μg); 
m soil = kwantità tal-fa żi ħamrija, espressa f'massa xotta tal- 
ħamrija (g);  
V 0 = volum inizjali tal-fa żi bl-ilma f'kuntatt mal- ħamrija 
(cm  3 ). 
Ir-relazzjoni bejn A  eq u K  d hija mogħtija minn:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
meta:  
A eq = persenta ġġ ta' adsorbiment fl-ekwilibriju ta' 
l-adsorbiment, %.  
Il-koeffiċjent normalizzat ta' l-adsorbiment tal-karbonju organiku K  oc 
jirrelata l-koeffi ċjent ta' distribuzzjni Kd mal-kontenut ta' karbonju 
organiku tal-kampjun tal- ħamrija:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
:meta  
%OC = persenta ġġ tal-karbonju organiku fil-kampjun tal- ħamrija 
(g g  -1 ). 
Il-koeffiċjent K  oc jirrapreżenta valur singolu li jikkaratterizza l- 
partizzjoni tas-sustanzi kimi ċi organiċi li mhumiex polari bejn il- 
karbonju organiku li jinstab fil- ħamrija jew fis-sediment u l-ilma. 
L-adsorbiment ta' dawn il-kimi ċi huwa korrelatat mal-kontenut 
organika tas-solidu sorbeni (7); g ħalhekk, valuri K  oc jiddependu 
fuq karatteristi ċi speċifiċi tal-frazzjonijiet umi ċi li jvarjaw konsider ­
evolment fil-kapa ċità tas-sorbiment, dovut g ħad-differenzi fl-ori ġini, 
ġenesi, eċċ. 
2.1.1.  Iżotermi ta' l-adsorbiment  
L-ekwazzjoni ta' l-i żotermi ta' adsorbiment ta' Freundlich trirrelata l- 
ammont tal-prova sperimentali adsorbita mal-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza sperimentali fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju (ekwazzjoni 8).  
Id-data tiġi trattata kif deskritt f Adsorbiment' u, g ħal kull pipetta ji ġi 
kkalkolat il-kontenut tas-sustanza sperimentali adsorbit fuq il- ħamrija 
wara l-prova ta' l-adsorbiment ( C s ads ðeqÞ banda o ħra indikat 
bħal x/m). Jitlaq bl-idea illi l-ekwilibriju ntla ħaq u illi  
C s ads ðeqÞ jirrapreżenta l-valur ta' l-ekwilibriju:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ ½C 0 Ä C aq ads ðeqÞâ:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
L-ekwazzjoni ta' l-adsorbiment ta' Freundlich hija murija f (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
jew fil-forma linjari  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
meta:  
K F ads = Freundlich il-koeffi ċċjent ta' l-adsorbiment; id-dimensjoni 
tiegħu huwa ta' ċm 3 g -1 biss jekk 1/n = 1; fil-ka żi l-oħra 
kollha, is- slope  1/n huwa introdott fid-dimensjoni ta'  K F ads 
1-1/n 3 1/n - 1 ( μg (ċm) g);  
n = kostanti tar-regressjoni; 1/n ġeneralment ivarja bejn 0,7 - 
1,0, li jindika illi d-data ta' sorbiment frekwentement tvarja ftit mil-linearità.
 
Ekwazzjonijiet (8) u (9) huma mpin ġija grafikament u ji ġi kkalkolati 
l-valuri ta'  K F ads u 1/n permezz ta' anali żi ta' rigressjoni bl-appli ­
kazzjoni ta' -ekwazzjoni 9. Ji ġi kkalkolat il- koeffi ċjent tal-korre ­
lazzjoni r  2 ta' l-ekwazzjoni logartimika is also calculated. E żempju 
ta' tali grafika hia mog ħtija f'Fig. 2.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Fig. 2.  Grafika ta' adsorbiment skond Freundlich, normali u linear ­
izzata  
2.1.2.  Bilan ċ tal-massa  
Il-bilanċ tal-massa (MB) huwa definit b ħalha l-persenta ġġ tas- 
sustanza li tista' ti ġi analitikament mi ġbura wara prova ta' adsor ­
biment konta l-ammont nominali tas-sustanza fil-bidu tal-prova.  
It-trattament tad-data ma jkunx l-istess jekk is-solvent ikun jista' 
jitħallat kompletament ma' l-ilma. Fil-ka ż ta' solvent li jista' 
jitħallat ma' l-ilma, it-trattament ta' data deskritta ta ħt “Desorbiment” 
jista' jiġi applikat biex ji ġi stabbilit l-ammont ta' sustanza mi ġbura 
mill-estrazzjoni tas-solvent. Jekk is-solvent jit ħallat inqas fa ċilment 
ma' l-ilma, trid issir determinazzjoni ta' l-ammont mi ġbur. 
Il-bilanċ tal-massa MB g ħall-adsorbiment ji ġi kkalkolat kif ġej; huwa 
preżunt illi (m  E ) jikkorrispondi g ħas-somma tal-massa tal-prodotti 
kimiċi estratti mill- ħamrija u mill-wi ċċ tal-kontenitur permezz ta' 
solvent organiku:  
MB ¼ V rec · C aq ads ðeqÞ þ m  E Ê Ì  
· 100 
V 0 · C 0 ð%Þ (10) 
meta:  
MB = bilan ċ tal-massa( %)  
m E = massa totali tal-prova sperimentali estratta mill- ħamrija u 
mill-ħitan tal-kontenitur sperimentali f' żewġ stadji (μg); 
C 0 = konċentrazzjoni inizjali tal-massa tas-soluzzjoni speri ­
mentali f'kuntatt mal- ħamrija (μg cm  -3 ); 
V rec = volum tas-supernatant mi ġbur wara l-ekwilibriju ta' l- 
adsorbiment (cm  -3 ). 
2.2. DESORBIMENT  
Id-desorbiment (D) huwa definit b ħala l-persenta ġġ tas-sustanza 
sperimentali li ti ġi desorbita, b'referenza g ħall-kwantità tas-sustanza 
preċedentement adsorbita, fil- kondizzjonijiet sperimentali:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
meta:  
D t i = persenta ġġ ta' desorbiment f'punt ta' ħin t  i ( %);  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill- ħamrija 
f'punt ta' ħin (μg) 
m s ads ðeqÞ = massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il- 
ħamrija fl-ekwilibriju ta' -adsorbiment ( μg). 
Informazzjoni dettaljata fuq kif g ħandu jiġi kkalkolat il-persenta ġġ ta' 
desorbiment  D  
t i għall-metodi paralleli u f'serje hu mg ħoti fl- 
Anness 5.  
Il-koeffiċjent tad-desorbiment apparenti (K  des ), taħt il-kondizzjonijiet 
sperimentali, huwa r-rapport bejn il-kontenut tas-sustanza li tibqa fil- fażi ħamrija u l-kon ċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza desorbita fis- 
soluzzjoni bl-ilma, meta jintla ħaq l-ekwilibriju tad-desorbiment:
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
meta:  
K des = il-koeffi ċjent tad-desorbiments (cm  3 g -1 ); 
m aq des ðeqÞ = massa totali tas-sustanza sperimentali desorbita mill- 
ħamrija fl-ekwilibriju tad- desorbiment ( μg) 
V T = volum totali tal-fa żi bl-ilma f'kuntatt mal- ħamrija 
matul il-prova tal-kinetika tad-desorbiment (cm  3 ). 
Gwida biex ji ġi kkalkolat  m aq des ðeqÞ hija mog ħtija fl-Anness 5 ta ħt l- 
intestatura “Desorbiment”.  
Rimarka:  
Jekk il-pre ċedenti prova ta' adsorbiment, issir bil-metodu paralleli, il- 
volum V  T fl-ekwazzjoni 12 huwa meqjus ugwali g ħal V  0 . 
2.2.1.  Iżotermi tad-desorbiment  
L-ekwazzjoni ta' l-i żotermi tad-desorbiment ta' Freundlich 
jikkollegaw il-kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa adsorbita 
fuq il-ħamrija mal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fis- 
soluzzjoni fl-ekwilibriju tad-desorbiment (ekwazzjoni 16).  
Għal kull pipetta, il-kontenut tas-sustanza li jibqa adsorbit fuq il- 
ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment ji ġi kkalkolat kif ġej: 
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ jiġi definit b ħalha:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
fejn: 
C s des ðeqÞ = kontenut tas-sustanza sperimentali li jibqa' adsorbit 
fuq il-ħamrija fl-s ekwilibriju tad-desorbiment 
(μg g  -1 ); 
m m des ðeqÞ = il-massa tas-sustanza determinata b'mod analitiku fil- 
fażi akwea fl-ekwilibriju tad-desorbiment ( μg); ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = il-massa tas-sustanza g ħat-test im ħolli mill-ekwilibriju 
minħabba r-rimpjazzar inkomplet tal-volum ( μg); 
m aq des ðeqÞ = il-massa tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju ta' l- 
adsorbiment ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· Í V 0 Ä V R 
V 0 Î (15) 
V r F = volum tas-soluzzjoni me ħud mill-pipetta g ħall-kejl tas- 
sustanza sperimentali (cm  3 ); 
V R = volum tas-supernatant mne ħħi mill-pipetta wara li jkun 
intlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment u sostitwit bl-istess 
volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl  2 solution (cm  3 ); 
L-ekwazzjoni ta' desorbiment skond Freundlich hija mog ħtija f (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
jew fil-forma lineari  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  aq des ðeqÞ (17) 
meta:  
K F des = koeffiċjent ta' desorbiment skond Freundlich;  
n = kostanti ta' rigressjoni;  
C aq des ðeqÞ = kon ċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fa żi bl-ilma 
fl-ekwilibriju tad-desorbiment (ug cm-  3 ). 
L-ekwazzjonijiet 16 u 17 jistg ħu jitpinġew grafikament u il-valur ta'  
K F des u 1/n jiġu kkalkolati bl-anali żi tar-rigressjoni bl-u żu ta' l- 
ekwazzjoni 17.  
Rimarka:  
Jekk l-esponenti 1/n ta' adsorbiment jew desorbiment, skond 
Freundlich, huwa ugwali g ħal 1, il-vinkoli kostanti ta' l-adsorbiment 
jew tad-desorbiment skond Freundlich (KF u KF) ikunu ugwali, rispettivament, g ħal kostanti ta' l-ekwilibriju fl-adsorbiment jew fid- 
desorbiment (
K F ads u K F ads ), u it-tpin ġija grafika ta' C  s vs C  aq tkun 
lineari. Jekk l-esponenti ikunu differenti minn 1, it-tpin ġija grafika ta' 
C s vs C  aq ma tkunx lineari u l-kostanti ta' l-adsorbiment u d-desor ­
biment ivarjaw matul l-i żotermi.  
2.2.2.  Rapport tal-prova  
Ir-rapport tal-prova g ħandu jindika l-informazzjoni li ġejja: 
— Identifikazzjoni kompleta tal-kampjuni tal- ħamrija użat inkluż: 
— referenza ġeografika tal-lokalità (latitudni, lon ġitudni),  
— data meta jittie ħed il-kampjun,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— skema ta' impieg (e. ż. ħamrija agrikola, foresta, e ċċ.), 
— fond ta' fejn jittie ħed il-kampjun,  
— kontenut f'ramel/torba/tafal,  
— valuri tal-pH (b ħal CaCl2 0,01 M),  
— kontenut f'karbonju organiku,  
— kontenut f'sustanza organika,  
— kontenut f'nitro ġenu, 
— rapport C/N,  
— kapaċità ta' skambjar katjoniku (mmol/kg),  
— l-informazzjoni kollha dwar il-kollezzjoni u l- ħażna tal-kampjun 
tal-ħamrija,  
— meta approprjat, l-informazzjoni kollha rilevanti g ħall-interpre ­
tazzjoni ta' l-adsorbiment desorbiment tas-sustanza sperimentali,  
— referenza g ħall-metodi u żati għad-determinazzjoni ta' kull para ­
metru,  
— informazzjoni fuq is-sustanza sperimentali, kif xieraq,  
— temperatura ta' l-esperimenti,  
— kondizzjonijiet ta ċ-ċentrifugazzjoni,  
— proċedura analitika u żata biex ti ġi analizzata s-sustanza speri ­
mentali,  
— justifikazzjoni g ħall-użu ta' kwalsiasi a ġent solubilizzanti g ħat- 
tlestija tas-soluzzjoni ma ħżuna tas-sustanza sperimentali,  
— spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet mag ħmula fil-kalkoli, jekk 
rilevanti,  
— data skond il-formularju (Anness 6) u pre żentazzjonijiet grafi ċi, 
— l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jistg ħu ikunu utli 
għall-interpretazzjoni tar-ri żultati tal-provi.  
3. REFERENZI  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II.
 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. AND Vetter L., (1987). Selection of 
Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 
02045, Part I.  
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ ­
Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially 
dangerous to health jew especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agri ­
culture and Forestry, Braunschweig, Germany.  
(12) Calvet R., (1989), “Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), “Adsorption-Desorption Phenomena” in 
Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance 
ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.  
(14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), “The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), “An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), pp. 29-35.
 
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger 
H. J., (1981), “Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxi ­
cants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington 
DC.
 
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
“Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, pp. 185-190.
 
(18) Rhodes R. C., Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) “Deter ­
mination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.  
(19) Russell M. H., (1995), “Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), “Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901-932.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), “Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), “Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric., 18, pp. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), “Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45-52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), “Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avail ­
ability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.
 
(25) Osgerby J. M., (1973), “Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.  
(26) Guth J. A., (1972), “Adsorptions-und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.  
(27) Hamaker J. W., (1975), “The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C. S., (1971), “Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, pp. 732-210.  
(29) Hamaker J. W., (1972), “Diffusion and volatilization” in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring 
and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), “Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), “Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American 
Chemical Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D. I., (1989), “Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). “Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340-350.  
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), “Measured and 
simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
 
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), “Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101,
 
(36) Lambert S. M., (1967), “Functional relationship between 
sorption in soil and chemical structure”. J. Agri. Food 
Chem., 15, pp. 572-576.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R. J., (1969), “An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.  
(38) Briggs G. G. (1969), “Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G. G. (1981). “Theoretical and experimental rela ­
tionships between soil adsorption, octanol-water partition coef ­
ficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
 
(40) Sabljic A., (1984), “Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.  
(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), “Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), 
“Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. 
Amer. Proc. 32: pp. 222-234.
 
(43) Karickhoff S. W., (1981), “Semi-empirical estimation of 
sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), “Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1-17.
 
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), “Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil 
Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
 
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, “Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), “Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
 
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
“Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), “Methods for 
distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale 
Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural 
Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Docu ­
mentation, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. 
E., eds. “Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), “Precision in 
pesticide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc., 34, 
pp. 353-354.  
(60) Grover R., and Hance R. J. (1970), “Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109-138.
 
(61) Boesten, J. J. T. I, “Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.  
(62) Boesten, J. J. T. I. “Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), “Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur 
structure chimique”. Weed Res. 21, pp. 227-231.  
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), “Empirical prediction 
of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Environ.Qual., 10(3), pp. 382-386.
 
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
“Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), “Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
 
(67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C., (1987), “Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
 
(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). “Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water parti ­
tioning and concentration of chemicals in the biota” in 
Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp.78-115, 
ASTM STP 707, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), “A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds”. Science, Vol. 206, pp. 831-832.  
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C., 
(1981), “Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 
pp. 38-42.
 
(72) Karickhoff S. W., (1981), “Semi-empirical estimation of 
sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833-846.
 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), “Adsorption de 13 
herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reac ­
tivité”. Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W. (1996), “Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coef ­
ficients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), “HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373- 1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), “HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – comparison of different stationary phases”. Chemosphere 27 (12), pp. 2341-2352.
 
(77) Hance, R. J., (1967), “The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed 
Research, Vol. 7, pp. 29-36.  
(78) Koskinen W. C., and Harper S. S., (1990), “The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. 
(1984), “Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American 
Chemical Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C. H., (1970), “Interpretation and use of sorption 
isotherms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), “Studies in adsorption: XI A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc., pp. 3973-93.
 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C., (1980), “Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996), “Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the 
environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J. A., (1985), “Adsorption/desorption”, in Joint Inter ­
national Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
ANNESS 1  
Skema tal-prova
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
ANNESS 2  
INFLUENZA TA' PRE ĊIŻJONI TA' METODU ANALITIKU U BIDLA 
FIL-KON ĊENTRAZZJONI FUQ PRE ĊIŻJONI TA' RI ŻULTATI TA' 
L-ASSORBIMENT  
Mit-tabella li ġejja (84) jidher ċar li meta d-differenza bejn il-massa inizjali 
(m 0 =110 μg) u lads massa ta' l-ekwilibriju ( m aq ðeqÞ=100 μg) tas-sustanza 
għat-test fis-soluzzjoni hi ċkejkna ħafna, żball ta' 5 % fil-kejl tar-ri żultati tal- 
konċentrażżjoni ta' l-ekwilibriju fi żball ta' 50 % fil-kalkolu tal-massa tas-sustanza 
adsorbita fil- ħamrija ( m s ads ðeqÞ) u ta' 52,4 % fil-kalkolu ta' K  d . 
Lammont ta' ħamrija m  soil = 10 g 
Il-volum tas-soluzzjoni V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
GĦAL A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg jew 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 true value 10 1,00 true value 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
GĦAL A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg jew 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 Valur 
aawtentik ­
u 60,0 6,00 Valur 
awtentiku 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FOR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg jew 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 true value 108,9 10,89 true value 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = il-massa tas-sustanza g ħat-test fil-fa żi tal-ħamrija f'ekwilibriju, μg; 
m aq ads ðeqÞ = il-massa tas-sustanza g ħat-test fil-fa żi tal-ħamrija f'ekwilibriju, μg; 
C s ads ðeqÞ = il-kontenut tas-sustanza g ħat-test fil-fa żi tal-ħamrija f'ekwilibriju, 
μg g-  1 ; 
C aq ads ðeqÞ = kon ċentrazzjoni ta' massa tas-sustanza g ħat-test fil-fa żi akwea 
f'ekwilibriju, μg cm  -3 ; 
R = żball analitiku fid-determinazzjoni tal-  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = żball kalkkulat min ħabba l-iżball analitiku R.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
ANNESS 3  
METODI TA' TEKNIKA TA' STIMA G ĦAL K  D 
1. Tekniki ta' kalkolu jippermettu t-tbassir ta' K  d ibbażata fuq il-korrelazzjoni 
ma', pre e żempju, P  ow valuri (12)(39)(63-68), id- data tas-solubilità ta' l-ilma 
(12)(19)(21)(39)(68-73), jew id- data tal-polarità derivata bl-applikazzjoni 
ta' HPLC fuq il-fa żi reversed (74-76). Kif jidher fit-Tabelli 1 u 2, huwa 
K oc jew K  om li huma kkalkulati minn dawn l-ekwazzjonijiet imbag ħad, 
indirettament, il-K  d mill-ekwazzjonijiet:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Il-kun ċett ta' dawn il-korrelazzjonijiet huwa bba żat fuq żewġ 
suppożizzjonijiet: (1) hija l-materja organika tal- ħamrija li prin ċiparjament 
tinfluenza l-assorbiment ta' sustanza; u (2) l-interactions involuti huma 
prinċiparjament non-polari. B'ri żultat ta' dan, dawn il-korrelazzjonijiet: (1) 
m'humiex, jew huma biss sa ċertu punt, applikabbli g ħal sustanzi polari, 
u (2) m'humiex applikabbli f'ka żijiet fejn il-kontenut tal-materja organika 
tal-ħamrija hija żgħira ħafna (12). Barra dan, g ħalkemm instabu korre ­
lazzjonijiet sodisfa ċenti bejn P  ow u assorbiment (19), ma jistax jing ħad l- 
istess għar-relazzjoni bejn is-solubilità ta'l-ilma u mi żura ta' assorbiment 
(19) (21); s'issa l-istudji huma kontradittorji ħafna.  
3. Xi e żempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-koeffi ċjent ta' l-assorbiment u l-ko- 
effiċjent tat-taqsima ta' ilma-ottan, kif ukoll is-solubilità ta' l-ilma huma 
mogħtija f'Tabelli 1 u 2, ripettivament.  
Tabella 1.  
Eżempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-ko-effi ċjent tad-distribuzzjoni ta' assorbiment u l-ko-effi ċjent tat- 
taqsima ta' ilma-ottan; g ħal iktar e żempji (12) (68)  
Sustanzi Korrelazzjonijiet Awturi:  
Ureas sostituti log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Fihom il-kloru aromatiku log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Diversi pesti ċidi log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl and Mingelgrin (1984) (66) 
Idrokarbon aromatiku log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles and Mantoura (1987) (67)  
Tabella 2.  
Eżempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-ko-effi ċjent tad-distribuzzjoni ta' assorbiment u solubilità ta' l-ilma; 
għal iktar e żempji ara (68) (69)  
Kompost Korrelazzjonijiet Awturi  
Diversi pesti ċidi log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl and Mingelgrin (1984) (66) 
Sustanzi li fihom il-kloru, 
alifatiċi, u aromati ċi log K  om = (4,040 +/- 0,038) – (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α- naftal logK  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Sustanzi aromati ċi, alifatiċi u 
ċikliċi logK  oc = - 1,405 – 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Diversi komposti log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
ANNESS 4  
KALKOLI BIEX JI ĠU DEFINITI L-KONDIZZJONIJIET TA' 
L-AZZJONI ĊENTRIFUGA  
1. Il-ħin ta' azzjoni ċentrifuga jing ħata bil-formula li ġejja, jekk nassumu li 
hemm parti ċelli sferikali:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Għal skopijiet ta' simplifikazzjoni, il-parametri kollha huma deskritti f'uni ­
tajiet non-SI (g, cm).  
fejn: 
ω = velo ċità tar-rotazzjoni (=2 p rpm/60), rad s  -1 ; 
rpm = dawriet s ħaħ għal kull minuta  
η = visko żità tas-soluzzjoni, g s  -1 cm -1 ; 
r p = radju tal-parti ċella, cm  
p s = densità tal- ħamrija, g cm  -3 ; 
p aq = densità tas-soluzzjoni, g cm  -3 ; 
Rt = distanza mi ċ-ċentru ta' rotor ċentrifugu sal-wi ċċ tas- soluzzjoni 
fit-tubu ċentrifugu, cm;  
R b = distanza mi ċ-ċentru tar-rotor ċentrifuga sal-qieg ħ tat- tubu 
ċentrifugu, cm;  
R b -R t = l-għoli tal-ħamrija/taħlita tas-soluzzjoni fit-tubu ċentrifugu, cm.  
Fil-prattika ġenerali, ji ġu użati d-doppju tal- ħinijiet ikkalkulati biex ti ġi 
assigurata separazzjoni kompleta.  
2. L-ekwazzjoni (1) tista' ti ġi ssimplifikata iktar jekk nikkunisdraw il-visko żità 
(η) u d- densità ( ρ aq ) tas-soluzzjoni b ħala daqs il-visko żità u d-densità ta' 
ilma f 25  o C; għalhekk, n = 8,95 × 10  -3 g 1 cm-  1 up aq = 1,0 g.cm  -3 . 
Imbagħad, il-ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga ji ġi mogħti bl-ekwazzjoni (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Mill-ekwazzjoni 2 jidher ċar li ż-żewġ parametri huma importanti biex ti ġi 
definita l-kondizzjoni ta' l-azzjoni ċentrifuga, i.e. ħin (t) u velocità (rpm), 
sabiex tinkiseb is-separazzjoni tal-parti ċelli ta' daqs spe ċifiku (fil-ka ż tagħna 
radju ta' μm): (1) id-densità tal- ħamrija u (2) it-tul tat-ta ħlita fit-tubu 
ċentrifugu (R  b -R t ), i.e. id-distanza li parti ċella tal-ħamrija tiksi mill-wi ċċ 
tas-soluzzjoni sal-qieg ħ tat-tubu; ovvjament, g ħal volum fiss it-tul tat-ta ħlita 
fit-tubu sejjer jiddependi fuq ir-radi ċi kwadrata tar-radju tat-tubu.  
4. Fig. 1 jippre żenta varjazzjonijiet fil- ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga (t) versu 
veloċità ta' l-azzjoni ċentrifuga (rpm) g ħal densitajiet ta' ħamrija differenti 
(ρs) (Fig. 1a) u tulijiet differenti tat-ta ħlita fit-tubi ċentrifugi(p  s ) (Fig. 1b). 
Minn Fig. 1a l-influenza tad-densità tal- ħamrija tidher ovvja; per e żempju, 
għall-azzjoni ċentrifuga klassika ta' 3000 rpm il- ħin ta l-azzjoni ċentrifuga 
huwa bejn wie ħed u ieħor 240 min. g ħal 1,2 g cm  3 densità tal- ħamrija, 
waqt li huwa 50 min. biss g ħal 2,0 g cm  3 Bl-istess mod, minn Fig. 1b, 
għal azzjoni ċentrifuga klassika ta' 3000 rpm il- ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga 
huwa bejn wie ħed u ieħor 50 min. g ħal tul tat-ta ħlita ta' 10 cm u huwa ta' 
7 min. biss g ħal tul ta' 1 cm. Madankollu, huwa importanti li tinstab l-a ħjar 
relazzjoni bejn l-azzjoni ċentrifuga li te ħtieġ l-inqas tul possibbli u handling 
faċli għall-esperimentatur biex jissepera l-phases wara l-azzjoni ċentrifuga.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Barra dan, meta ji ġu definiti l-kondizzjonijiet esperimentali g ħas-separazzjoni 
ta' phases tal- ħamrija/soluzzjoni, huwa importanti li ti ġi kkunsidrata l-possibiltà 
ta' l-eżistenza tat-tielet “pseudo-phase”, il-kollojde. Dawn il-parti ċelli, ta' daqs 
inqas minn 0,2 μm, jista' jkollhom impatt importanti fuq il-mekkani żmu ta' l- 
assorbiment s ħiħ ta' sustanza f suspension tal- ħamrija. Meta l-azzjoni ċentrifuga 
tiġi esekwita kif spjegat hawn fuq, kollojde jibqg ħu fl-aqueous phase u huma 
suġġetti għal analiżi flimkien m' l-aqueous phase. G ħalhekk, l-informazzjoni 
dwar l-impatt tag ħhom tintilef  
Jekk il-laboratorju amministrattiv ikollu fa ċilitajiet ta' azzjoni ultra- 
ċentrifuga jew ultrafiltrazzjoni, l-assorbiment/desorption ta' sustanza fil- 
ħamrija tista' ti ġi studjata fiktar dettall, inklu ża informazzjoni dwar l-assor ­
biment tas-sustanza fuq il-kollojde. F'dan il-ka ż, azzjoni ultra- ċentrifuga 
b'60 000 rpm/min. jew ultrafiltrazzjoni b'poro żità tal-filtru ta' 100 000 
Daltons g ħandha ti ġi applikata sabiex ji ġu sseparati it-tliet phases, 
ħamrija, kollojde, soluzzjoni. Il-protokoll ittestjat g ħandu jiġi wkoll 
modifikat skond il-b żonn, sabiex it-tliet phases kollha jkunu su ġġetti għal 
analiżi tas-sustanza.  
Fig. 1a.
  
Varjazzjonijiet tal- ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga (t) versu l-velo ċità ta' l-azzjoni 
ċentrifuga (rpm) g ħal densitajiet ta' ħamrija differenti ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b 
-R t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 u ρ aq = 1,0 g.cm  -3 f 25  o C. 
Fig. 1b.
  
Varjazzjonijiet tal- ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga (t) versu velo ċità ta' l-azzjoni 
ċentrifuga (rpm) g ħal tulijiet differenti tat-ta ħlita fit-tubu ċentrifugu (Rb 
-Rt) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s  -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g.cm  -3 
f' 25  o C u ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
ANNESS 5  
KALKOLU TA' ASSORBIMENT A ( %) U DESORPTION D ( %)  
L-iskema tal- ħin tal-pro ċedura hija:
  
Għall-kalkoli kollha huwa meqjus li s-sustanza tat-test hija stabbli u ma tassorbix 
b'mod sinifikanti mal- ġnub tal-kontenitur.  
ASSORBIMENT A (A %)  
(a) Metodu parallel  
L-assorbiment per ċentwali huwa kkalkulat g ħal kull tubu tat-testijiet 
(i) f'kull punt ta' ħin (t  i ), skond l-ekwazzjoni:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
It-termini ta' din l-ekwazzjoni jistg ħu jiġu kkalkulati kif ġej: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
fejn: 
A t i = il-perċentwal ta' l-assorbiment ( %) f'dan il-punt tal- ħin t  i ; 
m s ads ðt i Þ = massa tas-sustanza ttestjata fuq il- ħamrija fil- ħin t  i li l-analiżi 
ġiet esekwita ( μg) 
m 0 = massa tas-sustanza tat-test fit-tubu tat-testijiet, fil-bidu tat-test 
(μg) 
C 0 = konċentrazzjoni tal-massa inizjali tas-soluzzjoni tat-test 
f'kuntatt mal- ħamrija (μg cm  -3 ); ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = kon ċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fl-aqueous phase fil- 
ħin t  i li fih ġiet esekwita l-anali żi (μg cm  -3 ); din il-kon ċen­
trazzjoni hija ffissata analitikament meta jitqiesu l-valuri mogħtija mill-
 
V 0 = volum inizjali tas-soluzzjoni ttestjata mal- ħamrija (cm  3 ). 
Il-valuri tal-persenta ġġ ta' l-assorbiment  A t i jew C aq ads ðt i Þ huma pplottjati 
versu ħin u huwa ddeterminat il- ħin li jittie ħed biex jintla ħaq l-ekwilibriju 
tas-sorption. E żempji ta' plots b ħal dawn huma mog ħtija f'Fig. 1 u Fig. 2 
rispettivament.
  
Fig. 1.  
Plot ta l-ekwilibriju ta' l-assorbiment
  
Fig. 2.  
Konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza ttestjata fl-aqueous phase (C  aq ) 
versu ħin ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
(b) Metodu serial  
L-ekwazzjonijiet li ġejjin jieħdu qies li l-pro ċedura ta' l-assorbiment hija 
mwettqa permezz ta' kejl tas-sustanza tat-test f'alikwoti żgħar ta' l-aqueous 
phase f'intervalli ta' ħin speċifiċi. 
— Matul kull intervall ta' ħin l-ammont tas-sustanza assorbita fuq il- 
ħamrija hija kkalkulata kif ġej: 
— għall-ewwel intervall ta' ħin Δt 1 = t 1 - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— għat-tieni intervall ta' ħin Δt2 = t2- t1  
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— għat-tielet intervall ta' ħin Δt3 = t3- t2  
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2·v a A 
v a A Î (6) 
— għall-nth intervall ta' ħin Δtn = tn – tn – 1  
m s ads ðΔt n Þ ¼ m m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Il-persenta ġġ ta' assorbiment g ħal kull intervall ta' ħin, A  Δt i , huwa 
kkalkulat permezz ta' l-ekwazzjoni li ġejja: 
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
waqt li l-persenta ġġ ta' assorbiment  A t i f' punt tal- ħin ti jingħata b'din l- 
ekwazzjoni:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Il-valuri ta' l-assorbiment  A t i jew A Δt i (dwar il-b żonnijiet ta' l-istudju) 
huma pplottjati versu ħin u huwa ddeterminat il- ħin li jittie ħed biex 
jintlaħaq l-ekwilibriju tas-sorption.  
— Fil-ħin ta' l-ekwilibriju t  eq : 
— il-massa tas-sustanza tat-test assorbita fuq il- ħamrija hija:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— il-massa tas-sustanza ttestjata fis-soluzzjoni hija:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m 0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— u l-persenta ġġ ta' assorbiment waqt ekwilibriju huwa:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Il-parametri u żati hawn fuq huma definiti b ħala: 
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = massa tas-sustanza assorbita fuq il- 
ħamrija matul l-intervalli tal- ħin 
Δ t1 , Δ t2 ,..., Δ tn rispettivament ( μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = mass of the substance measured in 
an aliquot  v a A at thetime points t  1 , 
t 2 ,t n respectively ( μg); 
m s ads ðeqÞ = massa tas-sustanza assorbita fuq il- 
ħamrija waqt ekwilibriju ta' l- 
assorbiment ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = massa tas-sustanza fis-soluzzjoni 
waqt ekwilibriju ta' l-assorbiment (μg);
 
v a A = volum ta' l-alikwot li fih ti ġi 
mkejla s-sustanza ttestjata (cm  3 ); 
A Δt i = persenta ġġ ta' assorbiment li 
jikkorrispondi f'intervall ta' ħin 
Δt i ( %);  
A eq = persenta ġġ ta' assorbiment waqt 
ekwilibriju ta' l-assorbiment ( %).  
DESORPTION D ( %)  
Il-ħin t  0 li fih jibda l-esperiment tal-kinetika tad-desorption, huwa kkunsidrat 
bħala l-mument li l-ikbar ammont ta' volum akkwistat tas-soluzzjoni tas- 
sustanza tat-test (wara dan jintla ħaq l-assorbiment ta' ekwilibriju) huwa mibdul 
b'volum ugwali ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl  2 . 
(a) Metodu parallel  
Fil-punt tal- ħin t i , il-massa tas-sustanza tat-test hija mkejla fl-aqueous phase 
meħuda mit-tubu i ( V i 
r ), u l-massa desorbed hija kkalkulata skond din l- 
ekwazzjoni:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Waqt l-ekwilibriju tad-desorption t  i = t eq , u għalhekk  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
Il-massa tas-sustanza tat-test desorbed matul intervall ta' ħin (At  i ) tingħata 
permezz ta' din l-ekwazzjoni:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Il-persenta ġġ ta' desorption huwa kkalkulat:  
fil-punt tal- ħin t  i mill-ekwazzjoni:  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
u matul intervall ta' ħin (Δt i ) mill-ekwazzjoni:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
fejn: 
D t i = il-persenta ġġ ta' desorption f punt ta' ħin t  i ( %);  
D Δt i = il-persenta ġġ ta' desorption li jikkorrispondi ma' intervall ta' 
ħin At  i ( %);  
m aq des ðt 1 Þ = il-massa tas-sustanza tat-test desorbed f punt tal- ħin t i , (μg); 
m aq des ðΔt 1 Þ = il-massa tas-sustanza tat-test desorbed matul intervall ta' ħin 
At i (μg); 
m m des ðt i Þ = il-massa tas-sustanza tat-test mkejla analitikament f ħin t  i 
fvolum tas-soluzzjoni  V r i , li jittieħed għall-analiżi (ug);  
m aq A = il-massa tas-sustanza tat-test li tibqa' mill-ekwilibriju ta' 
assorbiment dovut g ħall-bdil tal-volum inkomplet (ug);  
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = il-massa tas-sustanza tat-test fis-soluzzjoni waqt ekwilibriju 
ta' assorbiment ( μg) 
V R = il-volum tas-supernatant imne ħħi mit-tubu wara li jintla ħaq 
ekwilibriju ta' assorbiment u mibdul bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl
 2 solution (cm  3 ); 
V r i = il-volum tas-soluzzjoni me ħuda mit-tubu (i) g ħall-kejl tas- 
sustanza tat-test, fl-esperiment tal-kinetika tad-desorption 
(cm  3 ). 
Il-valuri ta' desorption  D t i jew D Δt i (skond il- ħtiġijiet ta' l-istudju) huma 
pplottjati versu ħin u huwa ddeterminat il- ħin li jittie ħed biex jintla ħaq l- 
ekwilibriju tad-desorption.  
(b) Metodu serial  
L-ekwazzjonijiet li ġejjin jieħdu qies li l-pro ċedura ta' assorbiment, li kienet 
ippreċeduta, kienet imwettqa permezz tal-kejl tas-sustanza tat-test f alikwoti 
żgħar ðv A 
a Þ ta' l-acqueous phase (metodu serial f1.9. Andament tat-test). 
Huwa meqjus li: (a) il-volum tas-supernatant imne ħħi mit-tubu wara l- 
esperiment ta' l-kinetika ta' l-assorbiment kien mibdul bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl
 2 solution (V  R ) u (b) u l-volum totali ta' l-aqueous 
phase fkuntatt mal- ħamrija (V  T )) matul l-esperiment tal-kinetika tad- 
desorption jibqa' kostanti u jing ħata b'din l-ekwazzjoni:  
V T ¼ V 0 Ä ∑ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Fpunt tal- ħin t  i : 
— il-massa tas-sustanza tat-test hija mkejla falikwot żgħir ðv a D Þ u l-massa 
desorbed hija kkalkulata, skond l-ekwazzjoni:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— waqt ekwilibriju ta' desorption t  i = t eq u għalhekk  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
— Il-persenta ġġ ta' desorption  D t i huwa kkalkulat, mill-ekwazzjoni li ġejja: 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
F'intervall ta' ħin (Δt i ): 
Matul kull intervall ta' ħin l-ammont tas-sustanza desorbed huwa kkalkulat 
kif ġej: 
— għall-ewwel intervall ta' ħin Δt 1 = t 1 -t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— għat-tieni intervall ta’ ħin Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
u 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— għall-nth intervall Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
u 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Finalment, il-persenta ġġ ta' desorption g ħal kull interval ta' ħin, D Δt i , huwa 
kkalkulat permezz ta' l-ekwazzjoni li ġejja: 
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
waqt li l-persenta ġġ ta' desorption  D t i f'punt tal- ħin t i jingħata permezz ta' l- 
ekwazzjoni:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
fejn il-parametri u żati hawn fuq huma definiti b ħala: 
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = il-massa tas-sustanza li tibqa' 
assorbita fuq il- ħamrija wara 
lintervalli tal- ħin Δt 1 , Δt 2 ,..., 
Δt n rispettivament ( μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = il-massa tas-sustanza tat-test 
matul l-intervalli tal- ħin rispetti ­
vament (μg); 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = Il-massa tas-sustanza mkejla 
f’aliquotðv D 
a Þ f'punti tal- ħin 
t 1 ,t 2 ,..., t  n , rispettivament ( μg) 
V T = il-volum totali ta' l-aqueous 
phase f'kuntatt mal- ħamrija 
matul l-esperiment tal-kinetika tad-desorptionesekwit 
bilmetodu serial (cm
 3 ); 
m A 
aq = il-massa tas-sustanza tat-test li 
jibqa' mill-ekwilibriju ta' lassor ­
biment dovut g ħall-bdil tal- 
volum inkomplet ( μg) 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = il-volum tas-supernatant 
mneħħi mit-tubu wara li 
jintlaħaq ekwilibriju ta' assor ­
biment u jinbidel bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl
 2 (cm  3 ) 
v D 
a = il-volum ta' l-alikwot me ħuda 
bħala kampjun g ħal skop 
analitiku mit-tubu (i), matul l- esperiment tal-kinetika tad- 
desorption mwettaq bil-metodu 
serial(cm
 3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
ANNESS 6  
ASSORBIMENT-DESORPTION FIL- ĦAMRIJA: KARTI G ĦAR-RAPPORT TAD-DATA  
Is-sustanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata:  
Il-kontenut ta'  dry mass  tal-ħamrija (105  o C,12h):……………………………………………… ..%  
it-temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
L-adattament tal-metodu analitiku  
Il-ħamrija mi żunal g 
Il-ħamrija:  dry mass  g 
Il-volum CaCl  2 sol. cm  3 
konk.nominali sol.finali μg cm  -3 
Konk. analitiku sol.finali μg cm  -3 
Il-prinċipju tal-metodu analitiku w żat: 
Il-kalibrazzjoni tal-metodu analitiku:  
Is-suststanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata  
Il-kontenut  dry mass  tal-ħamrija (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
it-temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Il-metodolo ġija analitika ta' wara: Indirett  □ Parallel  □ Serjali  □ 
Dirett □ 
It-test ta' ad żorbzjoni: il-kamjuni g ħat-test  
Simbolu Unitajiet Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni  
In-nru tat-tubu 
Il-ħamrija mi żuna — g 
Il-ħamrija:  dry mass  m  soil g 
Il-volum ta' l-ilma fil- ħamrija 
miżuna (kalkulat) V WS cm 3 
Il-volum 0,01 M CaCl  2 sol. 
Biex jekwilibrizza l- ħamrija cm 3 
Il-volum ta'  stock solution  cm  3 
Il-volum totali tal-fa żi akwea. 
F'kuntatt mal- ħamrija V 0 cm 3 
Is-soluzzjoni ta' kon ċentrazzjoni 
għat-test inizjali C 0 μg cm  -3 
Is-sustanza tal-massa g ħat-test 
fil-bidu tat-test m 0 μg ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Simbolu Unitajiet Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni Il-ħint'ekwili­
brazzjoni  
Wara l-a ġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni  
IL-METODU INDIRETT 
Il-metodu parallel 
Il-korrezzjoni tal-fa żi akwea 
imbjank tas-sustanza g ħat-test ta' 
konċentrazzjoni inkludiet  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Il-metodu serjali 
Il-massa tas-sustanzi g ħat-test 
imkejla f' aliquot  vaA m m ads ðt i Þ μg 
IL-METODU DIRETT 
Il-massa tas-sustanza g ħat-test 
adsorbita fil- ħamrija  m s ads ðt i Þ μg 
Il-kalkolu ta' l-ad żorbzjoni 
L-adżorbzjoni  A  t i % 
A Δt i % 
Il-medji 
Il-koeffiċjent ta' l-ad żorbzjoni K  d cm 3 g -1 
Il-medji 
Il-koeffiċjent ta' l-ad żorbzjoni K  oc cm 3 g -1 
Il-medji  
Is-sustanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata:  
Il-kontenut ta'  dry mass  tal-ħamrija (105  o C, 12)  
it-temperatura:……………………………………………… .…………………………………  o C 
It-test ta' ad żorbzjoni: l-imbjanki u l-kontroll  
Simb olu Unita jiet Imbjank Imbjank l-kontroll  
In-nru tat-tubu 
Il-ħamrija mi żuna g 0 0 
L-ammont ta' l-ilma fil- ħamrija mi żuna 
(ikkalkulata) cm 3 — — 
Il-volum ta' 0,01 M CaCl  2 is- 
soluzzjoni mi żjuda cm 3 
Il-volum ta' l-i stock solution  tas- 
sustanza tat-test mi żjuda cm 3 0 0 
It-total tal-volum tal-fa żi akwea 
(ikkalkulata) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Simb olu Unita jiet Imbjank Imbjank l-kontroll  
Il-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza 
għat-test fil-fa żi akwea μg cm  -3 
Wara l-a ġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni  
Il-konċentrazzjoni fil-fa żi akwea μg cm  -3 
Rimarka: Żid il-kolonni jekk inhume ħtieġ 
Is-sustanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata:  
Il-kontenut  dry mass  tal-ħamrija (105  o C 12 s):………………………………………………… %  
it-temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . … . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …….  o C 
Il-bilanċ tal-massa  
simbolu unitajiet  
Nru tat-tubu 
il-ħamrija mi żuna — g 
Il-ħamrija:  dry mass  ms  oil g 
il-volum ta' l-ilma fil- ħamrija mi żuna 
(kkalkulat) V WS ml 
il-volum 0,01 M CaCl2 sol, biex ti ġi 
ekwilibrizzata l- ħamrija ml 
Il-volum ta'  stock solution  cm  3 
Il-volum totali tal-fa żi akwea f'kuntatt 
mal-ħamrija V 0 cm 3 
is-soluzzjoni inizjali tat-test tal-kon ċen­
trazzjoni C 0 μg cm  -3 
il-ħin ta' ekwilibrazzjoni — h  
wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni  
Il-korrezzjoni tal-fa żi akwea imbjank tas- 
sustanza g ħat-test ta' kon ċentrazzjoni 
inkludiet  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
il-ħin ta' ekwilibrazzjoni t t  eq h 
l-ewwel  dilution  bis-solvent 
Il-volum imne ħħi tal-fażi akwea V  rec cm 3 
Il-volum mi żjud tas-solvent ΔV cm  3 
l-ewwel estrazzjoni bis-solvent 
Is-sinjal analizzat fis-solvent S  E1 var. 
konk. Sust. G ħat-test. fis-solvent C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
simbolu unitajiet  
Il-massa tas-sustanza me ħuda mill- 
ħamrija u minn mal- ġnub tar-re ċipjent m E1 μg 
It-tieni  dilution  bis-solvent 
Il-volum imne ħħi tas-solvent ΔV s cm 3 
Il-volum mi żjud tas-solvent ΔV' cm  3 
It-tieni estrazzjoni bis-solvent 
is-sinjal analizzat fil-fa żi tas-solvent S  E2 var. 
konk. test subst. in solvent C  E2 μg cm  -3 
il-massa tas-sustanza me ħuda mill- 
ħamrija u minn mar-re ċipjent m E2 μg 
Il-massa totali tas-sust. g ħat-test. me ħuda 
f'żewġ fażijiet m E μg 
il-bilanċ tal-massa MB %  
Is-sustanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata:  
il-kontenut  dry mass  tal-ħamrija(105  o C, 12h):……………………………… .………………… %  
it-temperatura:…………………………………………………… …………..………………..  o C 
L-adżorbzjoni ta' l-isotermi  
simbolu unitajiet  
Nru tat-tubu 
il-ħamrija mi żuna — g 
Il-ħamrija:  dry mass  E g 
il-volum ta' l-ilma fil- ħamrija 
miżuna (kkalkulat) V WS cm 3 
Il-volum 0,01 M CaCl  2 sol. 
Biex tiġi ekwlibrizzata l- ħamrija cm 3 
Il-volum ta' l-i stock solution  
miżjud cm 3 
Il-volum totali tal-fa żi akwea 
f'kuntatt mal- ħamrija (calcu ­
lated) V 0 cm 3 
Soluzzjoni ta' kon ċentrazzjoni C  0 μg cm  -3 
il-ħin ta' ekwilibrazzjoni — h  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
simbolu unitajiet  
wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni  
Il-korrezzjoni tal-fa żi akwea 
imbjank tas-sustanza g ħat-test ta' 
konċentrazzjoni inkludiet  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
it-temperatura  o C 
Il-massa ta' lad żorbzjoni kull 
unità ta' ħamrija  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
L-analiżi ta' rigressjoni:  
valur ta' K  F ads : 
valur ta' l/n:  
il-koeffiċjent tar-rigressjoni r  2 : 
Is-sustanza ttestjata:  
Il-ħamrija ttestjata:  
il-kontenut  dry mass  tal-ħamrija(105  o C, 12 s):……………………………………………… …..%  
it-temperatura:… ……………………………………………… .…………………………………  o C 
Il-metodolo ġija analitika ta' wara: Indirett  □ Parallel  □ Serjali  □ 
It-test ta' de żorbzjoni  
simbolu unitajiet Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni  
Nru tat-tubu ġej mill-fa żi ta' adżorbzjoni 
Il-massa tas-sustanza assorbita fuq il- 
ħamrija f'ekwilibriju ta' ad żorbzjoni  m s ads ðeqÞ μg 
Il-volum tal-fa żi akwea mne ħħija, rimp­
jazzat minn 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Il-volum totali tal-fa żi 
akwea F'kuntatt mal- 
ħamrija PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Il-massa tas-sustanza g ħattest imħollija fl- 
ekwilibriju ta' l-ad żorbzjoni min ħabba ir- 
rimpjazzament tal-volum inkomplut  m aq A μg 
Il-kinetiċi tad-deżorbzjoni  
Il-massa mkejla tas-sustanza disorbita 
mill ħamrija fil- ħin t  i m m des ðt i Þ μg 
Il-volum tas-soluzzjoni 
meħud mit-tubu (i) g ħal 
Il-kejl tas-sustanza g ħat- 
test PM V  f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Il-massa tas-sustanza disorbita mill- 
ħamrija fil- ħin t  i (ikkalkulat)  m aq des ðt i Þ μg 
Il-massa tas-sustanza disorbita mill- 
ħamrija il- ħin ta' l-intervall Δt i (ikkal­
kulat)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
simbolu unitajiet Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni Il-ħint'ek­
wili­
brazzjoni  
Il-perċentwal tad-de żorbzjoni  
Id-deżorbzjoni fil- ħin t  i D ti % 
Id-deżorbzjoni fl-intervall Δt i D Δt i % 
Il-koeffiċjent tad-de żorbzjoni apparenti K  des 
MP: Il-metodu parallel  
MS: Il-metodu serjali  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ESTIMAZZJONI TAL-KOEFFI ĊJENT TA' ADSORPTION 
(K OC ) FUQ IL- ĦAMRIJA U FUQ ĦAMA TAD-DRENA ĠĠ BL- 
UŻU TA' KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDU LI 
JIPPERFORMA G ĦOLI (HPLC)  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG121 (2001).  
1.1. DA ĦLA 
L-aġir ta' sorpzjoni tas-sustanzi fil- ħamrija u fil- ħama tad-drena ġġ 
jista' jkun deskritt permezz ta' parametri li jkunu determinati b'esperi ­
mentar permess tal-metodu tat-testjar C.18. Parametru importanti 
huwa l-koeffi żjent tal-assorbiment li huwa mfisser b ħala r-ratio 
bejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza fil- ħamrija/ħama u l-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza fil-fa żi akwatika fuq l-ekwilibriju tal-assor ­
biment. Il-koeffi ċjent tal-assorbiment normalizzat g ħall-kontenut 
karboniku organiku fil- ħamrija K  oc huwa indikatur utili g ħall- 
kapaċita vinkolanti ta' kimika fuq materja organika tal- ħamrija jew 
ħama tad-drena ġġ u jippermetti li wie ħed jikkompara bejn kimi ċi 
differenti. Dan il-parametru jista' jkun estimat minn korrelazzjonijiet 
mas-solubilita fl-ilma u in- n-octanol/koeffi ċjenta' divi żjoni ta' l-ilma 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
Il-metodu ta' esperimentar deskritt f'dan it-test ju ża' l-HPLC g ħall- 
estimu tal-koeffi ċjent tal-assorbiment K  oc fil-ħamrija u fil- ħama tad- 
drenaġġ (8). L-estimi huma aktar ta' min wie ħed jafdahom minn 
dawk tal-kalkolazzjoni QSAR (9). B ħala metodu ta' stima ma 
tistax tieħu post kompletament il-lott ta' esperimenti ta' ekwilibriju 
użati fil-metodu ta' test C18. Madankollu, il-K  oc estimata tista' tkun 
utili meta ti ġI biex tag ħżel paramentri ta' testijiet xierqa g ħal studji 
ta' assorbiment/desorpzjoni skond il-metodu ta' test C.18 billi 
tikkalkula l-K  d (koeffiċjent ta' distribuzzjoni) jew K  f (Koeffiċjent 
ta' assorbiment ta' Freundlich) skond l-equation 3 (ara taqsima 1.2).  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
K d : Il-koeffi ċjenti ta' distribuzzjoni huwa deskritt b ħala r-ratio tal- 
konċentrazzjonijiet ta' ekwilibriju C ta' test fuq sustanza li kien 
imdewweb permezz ta' sistema ta' żewġ fażijiet li tikkonsisti 
f'sorbent ( ħamrija jew ħama tad-drena ġġ) u fażi akwatika; hija 
valur ming ħajr dimensjoni fejn kon ċentrazzjonijiet fi ż-żewġ fażi 
huma espressi skond ba żi ta' piż/piż. Fil-każ illi l-kon ċentrazzjoni 
fil-fażi akwatika hija mog ħtija bħala bażi ta' piż/volum, hemmhekk 
il-units huma ml · g -1 . K d tista' tvarja skond il-kwalitajiet ta' sorbent u 
tista' tkun dipendenti fuq is-solubilità.  
K d ¼ C soil 
C aq or C slud 
C aq (1) 
meta:  
C soil = konċentrazzjoni ta' sustanza ta ħt prova fil- ħamrija f ekwi ­
libriju (μg· g 1 ) 
C slud = konċentrazzjoni ta' sustanza ta ħt prova fil- ħama f ekwi ­
libriju (μg· g 1 ) 
C aq = konċentrazzjoni ta' sustanza ta ħt prova fil-fa żi akwatika 
fekwilibriju ( μg· g -1 , μg· ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Il-Koeffi ċjent ta' assorbiment ta' Freundlich kon ċentrazzjoni ta' 
sustanza ta ħt prova fil- ħamrija jew ħama tad-drena ġġ (x/m) meta l- 
konċentrazzjoni tal-ekwilibriju C  aq fil-fażi akwatika hija ugwali 
għall-wieħed; units huma ng.g  1 sorbent. Il-valur jista' jvarja skond 
il-kwalitajiet tas-sorbent.  
log x 
m ¼ log K  f þ 1 
n · log C  aq (2) 
fejn: 
x/m = ammont ta' sustanza ta ħt prova x ( μg) assorbiti f ammont ta' 
sorbent m (g) f'ekwilibriju  
1/n = ni żla ta' isoterm ta' assorbiment ta' Freundlich  
C aq = konċentrazzjoni ta' sustanza ta ħt prova fil-fa żi akwatika f 
'ekwilibriju ( μg · ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; log K  f ¼ log  x 
m 
K oc : Distribution coefficient (K  d ) jew Koeffi ċjent ta' assorbiment ta' 
Freundlich (K  f ) normalizzat g ħall-kontenut ta' carbon organiku (f  oc ) 
ta' sorbent; partikolarment g ħall-kimiċi li mhumiex ionizzata, huwa 
indikazzjoni approssimattiva g ħall-estent ta' assorbiment bejn is- 
sustanza u s-sorbent u ja ċċetta li wie ħed ikun jista' jikkompara 
bejn kimi ċi different. Skond id-dimensjoni ta' K  d u K  f , K  oc tista' 
tkun ming ħajr dimensjoni jew ikollha l-units ml · g 1 jew μg.g 1 
materja organika.  
Koc ¼ Kd 
foc dimensionless or ml · g Ä1 Ê Ì  
or Kf 
foc μg · g Ä1 Ê Ì  (3) 
Ir-relazzjoni bejn K  oc u K  d mhijiex dejjem lineari u g ħalhekk valuri 
ta' K  oc jistgħu jvarjaw minn ħamrija għall-ħamrija imma l-varjabilita' 
tista' tkun ridotta drastikament meta kkomparata ma' valuri K  d jew 
K f . 
Il-Koeffiċjent ta' assorbiment (Koc) huwa mnaqqas mill-fattur ta' 
kapacita' (k') bl-u żu ta' plot ta' kalibrazzjoni ta' log k' kontra log 
K oc tat-taħlita magħżula bħala riferenza.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
fejn: 
t R = HPLC ħin ta' ritenzjoni tat-test u sustanza ta' riferenza 
(minuti)  
t 0 = HPLC ħin mejjet (minuti) (ara taqsima 1.8.2).  
P OW : Il-koeffi ċjenti tad-divi żjoni ta' octanol-ilma huwa deskritt b żala 
r-ratio tal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza mdewba f'n-octanol u ilma; 
huwa valur ming ħajr dimensjoni.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. SUSTANZI TA' RIFERENZA  
Il-formula ta' struttura, il-purita' u l-konstant tad-disso ċjazzjoni (jekk 
mixtieqa) g ħandha tkun mag ħrufa qabel jintu ża dan il-metodu. Inform ­
azzjoni dwar is-solubilita' fl-ilma u f'solventi organi ċi, f'diviżjoni ta' 
koeffiċjenza ta' octanol-ilma u l-karatteristi ċi ta' hydrolysis huma utili.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Sabiex tirrelata d-data ta' retezjoni tal-HPLC kif imkejla ta' sustanza 
taħt test bil-koeffi ċjenti tal-assorbiment tag ħha, graff ta' kalibrazzjoni 
ta' log K  oc kontra log k' g ħandha tkun stabbilita. Minimu ta' sitt punti ta' 
riferenza, mill-inqas wie ħed 'il fuq u wie ħed l-isfel mill-valur preti ż tas- 
sustanza ta ħt prova g ħandhom ikunu u żati. Ir-reqqa tal-metodu jkun 
aktar mtejjeb sinjifikament jekk ikunu w żati sustanzi ta' riferenza li 
huma relatati strutturalment mas-sustanza ta ħt prova. Jekk din id-data 
mhijiex disponibbli, sta g ħall-utent illi jag ħżel s-sustanzi ta' kali ­
brazzjoni xierqa. Sett aktar ġenerali ta' sustanzi strutturalment 
eteroġeniċi għandhom ikunu mg ħażula f'dan il-ka ż. Sustanzi u valuri 
ta' K  oc li jistgħu jkunu u żati huma mni żżla fl-Anness f'Tabella 1 g ħall- 
ħama ta' drena ġġ u f'Tabella 3 g ħall-ħamrija. L-g ħażla ta' sustanzi o ħra 
ta' kalibrazzjoni g ħandha tkunu ġustifikati.  
1.4. PRIN ĊIPJITAL-METODU TA' PROVA  
HPLC huwa mag ħmul fuq kolonni analiti ċI ippakkjati b'fa żi solida 
ta' cyanopropyl disponibbli kummer ċjalment li fih jinstabu bi ċċiet ta' 
ipofiliċi u polari. Fa żi stazzjonarja li hi moderalment polari bba żata 
fuq matrix ta' silica hija u żata: 
– O – Si – CH  2 – CH  2 – CH  2 – CN 
silica non-polar spacer polar moiety  
Il-prinċipju tal-metodu ta' prova huwa simili g ħall-metodu ta' testjar 
A.8 (koeffi ċjent ta' divi żjoni, metodu HPLC). Waqt li tg ħaddi mill- 
kolonna flimkien mall-fa żi mobbli, is-sustanza ta ħt prova g ħandha 
effett mall-fa żi stazzjonarja. B ħala riżultat divi żjoni o bejn fa żijiet 
mobbli u stazzjonarjiu s-sustanza ta ħt prova hija mdewwma. I ż-żewġ 
komposizzjonijiet tal-fa żi stazzjonarja li g ħandhom sites polari u 
mhux polari ja ċċettaw effett ma' gruppi polari u mhux polari ta' 
molekuli simili b ħal fil-każ ta' materji organi ċi f'matrices fil- 
ħamrija jew fi ħama tad-drena ġġ. Dan jag ħmel possibbli r-relazzjoni 
bejn il-ħin ta' ritenzjoni fil-kolonna u l-koeffi ċjent ta' assorbiment 
f'materji organi ċi li jista' jkun stabbilit.  
pH għandu influwenza sinjifikattiva fuq l-atte ġġjament ta' sorpzjoni 
partikolarment f'sustanzi polari. G ħall-ħamrija agrikola jew tankijiet ta' 
impjanti ta' trattament ta' drena ġġ il-pH normalment tvarja bejn pH 5,5 
u 7,5. G ħal sustanzi ionizzabbli, żewġ testijiet g ħandhom ikunu 
magħmula b' formi kemm ionizzati u kemm mhux ionizzati f'so ­
luzzjonijiet ta' buffer xierqa, imma dan biss f'ka żijiet fejn mill-inqas 
10 % tal-kompost ta ħt prova jkun disso ċjati bejn pH 5,5 u s-7,5.  
Billi r-relazzjoni biss bejn ir-ritenzjoni fuq il-kolonna ta' HPLC u l- 
koeffiċjent ta' ad żorbzjoni huwa u żat għall-evalwazzjoni, mhux 
rikjest li jkun hemm il-metodu ta' analizzar kwantitattiv u jkun 
biss neċessarju d-determinazzjoni tal- ħin ta' retention. Jekk ikun 
disponibbli sett ta' sustanzi ta' riferenza u jkunu jistg ħu jiġu wżati 
kondizzjonijiet standard ta' esperimentar, il-metodu jipprovdi mezz aktar mgħaġġla u effiċjenti sabiex ikun hemm estimu tal-koeffi ċjent 
K
 oc ta' assorbiment.  
1.5. APPLIKABBILITÀ TAT-TEST  
Il-metodu HPLC huwa applikabbli g ħal sustanzi kimi ċi (kemm jekk 
mingħajr tikketta u jekk bit-tikketta) g ħal xhiex sistema ta' skoperta 
xierqa (e ż. spectrofotometer, ta' radjoattività) hija disponibbli u li 
huma suffi ċjentament stabbli waqt il-lant tal-esperiment. Jista' jkun 
partikolarment b żonnjuż għall-kimiċi li huma diffi ċli illi jkunu 
studjati f'sistemi o ħra ta' esperimentar (i.e. sustanzi volatili; 
substanzi li ma jin ħallux fl-ilma f'kon ċentrazzjoni illi tista' ti ġi 
mkejla analitikament; substanzi li g ħandhom affinita qawwija g ħas- 
surface tas-sistemi ta' inkubazzjoni). Il-metodu jista' jkun u żat għat- 
taħlit illi jag ħtu elution bands mhux risolti. F'ka żijiet bħal dawn, 
limiti 'l fuq u 'l isfel tal-valuri tal-log Koc tal-kompost tat-ta ħlit 
taħt prova g ħandhom ikunu mag ħrufa. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Xi kultant impuritajiet jistg ħu jikkawżaw problemi fl-interpretazzjoni 
tar-riżultati tal-HPLC, imma dawn huma ta' imprtanza minuri kemm- 
il darba s-sustanza ta ħt prova tista' analitikament tkun identifikabbli 
kjarament u sseparata mill-impuritajiet.  
Il-metodu huwa validat g ħal sustanzi mni żżla f'Tabella 1 fl-Anness u 
kien ukoll applikat g ħal varjeta ta' kimi ċi oħra li jagħmlu parti mill- 
klassijiet ta' kimi ċi kif ġejjin:  
— amines aromati ċi (eż trifluralin, 4-chloroaniline, 3,5-dini ­
troaniline, 4-methylaniline, N-methylaniline, 1-naphthylamine),  
— carboxilic acid esters aromatic  (eżbenzoic acid methylester, 3,5- 
dinitrobenzoic acid ethylester),  
— hydrocarbons aromati ċi (eż toluene, xylene, ethylbenzene, nitro ­
benzene),  
— aryloxyphenoxypropionic acid esters (e ż diclofop-methyl, 
fenoxaprop-ethyl , fenoxaprop-P-ethyl ), 
— benzimidazole  u imidazole fungicides  (eż carbendazim, fuberi ­
dazole , triazoxide ), 
— carboxilic acid amides  (eż 2-chlorobenzamide, N,N-dimethylben ­
zamide, 3,5-dinitrobenzamide, N-methylbenzamide, 2-nitroben ­
zamide, 3-nitrobenzamide ), 
— chlorinated hydrocarbons  (eż endosulfan, DDT, hexachloro ­
benzene, quintozene, 1,2,3-trichlorobenzene),  
— organophosphorus insecticides  (eż azinphos-methyl, disulfoton, 
fenamiphos, isofenphos, pyrazophos, sulprofos, triazophos ), 
— phenols  (eż phenol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol, pentachlorop ­
henol, 2,4,6-trichlorophenol, 1-naphthol ), 
— phenylurea derivatives  (eż. isoproturon, monolinuron, pency ­
curon ), 
— pigment dyestuffs  (eż acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 
81), 
— polyaromatic hydrocarbons  (eż acenaphthene, naphthalene ), 
— 1,3,5-triazine herbicides  (eż prometryn, propazine, simazine, 
terbutryn ), 
— triazole derivatives  (eż tebuconazole, triadimefon, tradimenol, 
triapenthenol ). 
Il-metodu mhuwiex applikabbli g ħal sustanzi li jag ħmlu reazzjoni 
jew mall-eluent jew mall-fa żi stazzjonarja. Mhuwiex applikabbli 
wkoll għal sustanzi illi jag ħmlu reazzjoni b'mod spe ċifiku ma' 
taħlit inorganiku (e ż formażżjoni ta' gzuz kumplessi ma' minerali 
taċ-ċaqquf). Il-metodu jista' ma ja ħdimx għal sustanzi attivi li 
jitilgħu fil-wiċċ, kompost inorganiku u a ċidi jew ba żijiet moderati 
jew b'saħħithom. Valuri ta' Log K  oc bejn il-1,5 sal-5,0 jistg ħu jiġu 
ddeterminati. Sustanzi inonissabbli g ħandhom ikunu mkejla permezz 
ta' l-użu ta' fażi mmobbli buffered, imma wie'ed g ħandu jieħu ħsieb 
illi jevita l-pre ċipitazzjoni ta' komponimenti ta' buffer jew sustanza 
taħt prova.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KRITERJA TA' KWALITÀ'  
1.6.1.  Akkuratezza  
Normalment, il-koeffi ċjent ta' assorbiment ta' sustanza ta ħt prova 
jkun estimat bejn il-± 0,5 unit ta' log tal-valur determinat bil- 
metodu tal-ekwilibrju tal-grupp (ara Tabella 1 fl-Anness). Akku ­
ratezza og ħla tista' ti ġi milħuqa jekk is-sustanza ta' riferenza u żata 
hija strutturalment relatata mas-sustanza ta ħt prova.  
1.6.2.  Ir-rata tar-repetizzjoni  
Determinazzjonijiet g ħandhom isiru mill-inqas f'darbtejn. Il-valuri ta' 
log K  oc meħuda mill-kejl individwali g ħandu jkun bejn il-unit ta' 
0,25 log.  
1.6.3.  Riprodu ċibbilità  
Esperjenza mil ħuqa sa issa fl-applikazzjoni tal-metodu hija ta' sosten 
għall-validita' tag ħha. Investigazzjoni tal-metodu ta' HPLC, bl-u żu ta' 
48 sustanza (l-aktar minnhom pesti ċidi) għal liema kien hemm di ġa 
disponibbli data dwar K  oc ta' min wie ħed joqgħod fuqha tal-koef ­
fiċjent ta' korrelazzjoni ta' R = 0,95 (10) (11).  
Test ta' komparazzjoni mag ħmul f'laboratorju bil-parte ċipazzjoni ta' 
11-il laboratorju ġie magħmul sabiex jirran ġa u jivvalida il-metodu 
(12). Ir-ri żultati huma mog ħtija f'Tabella 2 fl-Anness.  
1.7. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' PROVA  
1.7.1.  Estimazzjoni preliminari tal-koeffi ċjent ta' assorbiment  
Il-koeffiċjent P  ow (= K  ow ) ta' divi żjoni ta' octanol-ilma u sa ċertu 
punt, is-solubilita fl-ilma jistg ħu jintużaw bħala indikaturi ai fini tal- 
assorbiment, partikolarment g ħal sustanzi li mhumiex ionizzati, u 
għalhekk jistg ħu jintużaw sabiex jinstab il-limitu preliminari. 
Varjeta' ta korrelazzjonijiet b żonnjużi ġew ippubblikati g ħall-diversi 
gruppi ta' kimi ċi (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
1.7.2.  Apparat  
Kromatograf likwidu, li mieg ħu ġie mwaħħal pompa pulse-free u 
mekkaniżmu xieraq ta' detection huwa me ħtieġ. L-użu ta' valv ta' 
injezzjoni b'loop ta' injezzjoni huwa rikkmandat. Resins mag ħmula 
minn kimi ċu ta' cyanopropyl mag ħquda kommer ċjalment fuq ba żi ta' 
silica għandhom ikunu u żati (eż Hypersil u Zorbax CN). Kolonna ta' 
gwida ta' l-istess materjal tista' tkun impo ġġija bejn is-sistema ta' 
injezzjoni u l-kolonna analitika. Kolonni minn fornituri differenti 
jistgħu jvarjaw konsiderevolment fl-effi ċjenza tas-separazzjoni 
tagħhom. Bħala gwida, il-fatturi ta' kapa ċita k' li ġejjin għandhom 
ikunu mil ħuqa: log k' > 0,0 g ħal log K  oc = 3,0 u log k' > 0,4 g ħal 
log K  oc = 2,0 meta tuza methanol/ilma 55/45 % b ħala fażi mobbli.  
1.7.3.  Fa żijiet mobbli  
Diversi ġew ittestjati, u it-tnejn li ġejjin huma rrikmandati:  
— methanol/ilma (55/45 % v/v),  
— methanol/0,01M citrate-buffer pH 6,0 (55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
HPLC grade methanol u ilma distillat jew citrate buffer huma u żati 
sabiex jiġi ppreparat is-solvent ta' elutar. It-ta ħlita hija iddigassjata 
qabel ma ti ġi użata. Eluzzjoni isokratika g ħandha tkun u żata. Jekk 
taħlit ta' methanol/ilma mhuwiex ritenut xieraq, ta ħlit organiku ie ħor 
ta' other solvent/ilma jista' ji ġi ppruvat, e ż. ethanol/ilma jew ta ħlita 
ta' acetonitrile/ilma. G ħal kompost ionizzabbli, l-u żu ta' soluzzjoni ta' 
buffer hija rrikmandata sabiex tkun stabilizzata l-pH. Wie ħed għandu 
jieħu ħsieb illi tkun evitata pre ċipitazzjoni ta' mel ħ u deterjorazzjoni 
ta' kolonni, li jista' ji ġri waqt it-ta ħlit ta' xi phase/buffer organi ċi. 
L-ebda addittiv b ħal reagents ta' ion pair jistg ħu jiġu użati minħabba 
li dawn jistg ħu jaffetwaw il-kwalifiki ta' sorpzjoni tal-fa żi 
stazzjonarja. Dawn il-kambjamenti fil-fa żi stazzjonarja jistg ħu 
jkunu irriversibbli G ħal din ir-ra ġuni, huwa obbligatorju illi 
esperimenti li fihom jintu żaw addittivi g ħandhom isiru f'kolonni 
separati.  
1.7.4.  Solutes  
Sustanzi ta ħt prova u ta' riferenza g ħandhom ikunu ma ħlulin fil-fa żi 
mobbli.  
1.8. PRESTAZZJONI TAT-TEST  
1.8.1.  Il-kondizzjoni tat-test  
Waqt il-kejl it-temperatura g ħandha tkun irrekordjata. L-u żu ta' 
kompartament ta' kolonna hija rrikmandata ħafna sabiex tiggarantixxi 
kondizzjonijiet stabbli waqt il-kalibrazzjoni u r-runs ta' estimi u kejl tas-sustanza ta ħt prova.
 
1.8.2.  Determinazzjoni dead time to  
Għad-determinazzjoni tal-dead time g ħaż-żewġ metodi differenti 
jistgħu jiġu użati (ara wkoll taqsima 1.2).  
1.8.2.1.  Determinazzjoni ta' ħin mejjet permezz ta' serje omologi  
Din il-pro ċedura wriet illi tag ħti valuri ta' min wie ħed joqgħod 
fuqhom u li huma standard. G ħad-detallji ara l-metodu tat-testjar 
A.8: koeffi ċjent ta' divi żjoni (n-octanol/ilma), metodu HPLC.  
1.8.2.2.  Determinazzjoni ta' ħin mejjet permezz ta' sustanzi inert li mhumiex 
miżmuma mill-kolonna  
Dan il-metodu ta' teknika huwa bba żat fuq injezzjoni ta' 
soluzzjonijiet ta' formamide, urea u nitrat tal-kubrit. Il-kejl irid ikun mag ħmul mill-inqas darbtejn.
 
1.8.3.  Determinazzjoni tad-drabi tar-ritenzjoni tR  
Sustanzi ta' riferenza g ħandhom ikunu mag ħżula kif deskritt 
f'taqsima 1.3. Jistg ħu jkunu injettati b ħala taħlita standard sabiex 
ikun stabbilit id-drabi tag ħhom tar-ritenzjoni, kemm-il darba jkun 
ikkonfermat illi l- ħin ta' ritenzjoni ta' kull standard ta' riferenza ma 
jkunx affetwat bil-pre żenza ta; standards o ħra ta' riferenza. Il-kali ­
brazzjoni g ħandha tkun mag ħmula f'intervalli regolari mill-inqas 
darbtejn kuljum sabiex jie ħdu konsiderazzjoni ta' xi kambjamenti 
mhux ma ħsuba fil-kolonna tal-prestazzjoni. G ħall-aħjar prattika, l- 
injezzjonijiet ta' kalibrazzjoni g ħandhom ikunu mag ħmula qabel u 
wara l-injezzjonijiet tas-sustanza ta ħt prova sabiex ikun ikkonfermat 
illi l-ħin ta' ritenzjoni ma kienx injorat. Is-sustanzi ta ħt prova huma 
injettati separatament fi kwantitajiet kemm jista' jkun żgħar (sabiex 
jevitaw overload ta' kolonni) u l- ħinijiet tag ħhom ta' ritenzjoni jkunu 
determinati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Sabiex ti żdied il-kunfidenza fil-kejl, mill-inqas żewġ deter­
minazzjonijiet g ħandhom ikunu mag ħmula. Il-valuri ta' log K  oc 
miġjuba mill-kejl individwali g ħandhom ikunu bejn il-0,25 log unit.  
1.8.4.  Evalwazzjoni  
Il-fatturi ta' kapa ċita' k' huma kkalkolati mill- ħin mejjet t  o u sal- 
ħinijiet ta' ritenzjoni t  R tas-sustanzi tar-referenza kif mag ħżula 
skond l-equation 4 (ara taqsima 1.2). Id- data tal-log k' tas-sustanzi 
ta' referenza huma mbag ħad ipplottjati kontra il-valuri tal-log K  oc 
tagħhom mill-esperimenti ta' ekwilibriju fil-gruppi mog ħtija 
f'Tabelli 1 u 3 tal-Anness. Bl-u żu ta' dan il-plot, il-valur ta' log k' 
tas-sustanza ta ħt prova hija mbag ħad użata sabiex ikun jista' ji ġi 
stabbilit il-valur ta' log K  oc tagħha. Jekk ir-ri żultati attwali juru illi 
l-log Koc tas-sustanzi ta ħt prova hija barra l-limitu ta' kalibrazzjoni, 
it-test għandhu jer ġa jiġi magħmul bl-użu ta' sustanzi differenti, aktar 
xierqa.  
2. DATA U RRAPURTAR  
Ir-rapport g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
— identita' tas-sustanzi ta ħt prova u b ħala riferenza u l-purita 
tagħhom, u l-valuri pK  a jekk rilevanti,  
— deskrizzjoni ta' apparat u kondizzjonijiet tal-operat e ż. tip u 
dimensjoni tal-kolonna analitika (u gwida), il-metodu ta' iden ­
tifikar, fa żi mobbli (ratio ta' komponimenti u pH), il-limiti ta' 
temperatura waqt il-kejl,  
— ħin mejjet u l-metodu u żat sabiex ikun determinat,  
— kwantitajiet ta' sustanzi ta ħt prova u b ħala riferenza introdotti fil- 
kolonna,  
— ħinijiet ta' ritenzjoni tal-kompost ta' riferenza u żat għall-kali­
brazzjoni,  
— dettalji tal-linja ta' rigressjoni kif mda ħħla (log k' vs log K  oc ) u l- 
graff tal-linja ta' rigressjoni,  
— medja tad- data ta' ritenzjoni u l-valur ta' d log K  oc estimat għall- 
kompost ta ħt prova.  
— chromatograms.  
3. REFERENZI  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of property estimation methods, Chap. 4, McGraw- Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adżorbzjoni coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemo ­
sphere, 17, 1 67.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental rela ­
tionships between soil ad żorbzjoni, octanol-water partition 
coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, p ġ. 1050-1059.
 
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic between soil organic matter and 
water. Sci. Technol., 17, p ġ. 227-231.  
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Sci. Health, B19, pp. 
297-312.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic, Science, 
106, pġ. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of 
sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, p ġ. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adżorbzjoni coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 
35(1/2), p ġ. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of ad żorbzjoni coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), p ġ. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the ad żorbzjoni coefficient 
in soil-comparison of different stationary phases, Chemo ­
sphere, 27(12), p ġ. 2341-2352.  
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD 
Guideline 106, Chemosphere, 22, p ġ. 285-304.
 
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the ad żorbzjoni coefficient 
on soil-results of a ring. Chemosphere, 30(7), p ġ. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
ANNESS  
Tabella 1  
Komparazzjoni ta' valuri ta' Koc g ħall-ħamrija u ħama tad-drena ġġ, u valuri ikkalkolati bil-metodu tal- 
iscreening tal-HPLC  ( 1 ), ( 2 ) 
Sustanza CAS Nr. Log Koc 
drenaġ 
ġ ħama log Koc 
HPL C Δ log Koc 
ħamri ja log Koc 
HPL C Δ 
Atrazine 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 
Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 
Phenanthrene 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 
Benzoic acid phenylester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamide 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-Nitrobenzamide 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilide 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Aniline 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloroaniline 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC screening method for the determination of the 
adżorbzjoni coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the ad żorbzjoni-coefficients of organic substances on sewage sludges. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107 – 119.  
Tabella 2  
Riżultati ta' testijiet inter-komparabbli f'laboratorji (11 –il laboratorju parte ċipanti) mag ħmula sabiex jag ħmlu 
aħjar u jivvalidaw il-metodu ta' HPLC  ( 1 ) 
Sustanza CAS Nr. log K  oc K oc log  K oc 
[OECD 106] [Metodu HPLC]  
Atrazine 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 
Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 
Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the ad żorbzjoni coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabella 3  
Sustanzi ta' riferenza rrikomandati g ħall-metodu tal-iscreening tal-HPLC ibba żat fuq id-data ta' assorbiment tal- 
ħamrija  
Sustanza ta' riferenza CAS Nr. Log K  oc mean 
valuri minn 
grupp ekwilibriju Numru ta' data 
ta' K  oc log S.D. Ejg ħun 
Acetanilide 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Phenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamide 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N.N-dimethylbenzamide 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Methylbenzamide 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Methylbenzoate 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazine 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamide 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Aniline 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamide 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazophos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naphthalene 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Methiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorobenzene 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenthion 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazophos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Phenanthrene 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (mix) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & 
D Report No. 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304. 
( c ) Id- data provduta mill-industrija.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  DAPHNIA MAGNA  REPRODUCTION TEST  
1. METODU  
Dan il-metodu ta' test tossiku tar-riprodu ċibilità huwa replika tal- 
OECD TG 211 (1998).  
1.1. DA ĦLA 
L-għan primarju tat-test huwa li jkun hemm stima tal-effetti tal- 
kimiċi fuq il-prodott riproduttiva tal- Daphnia magna . 
1.2. TIFSIR U UNITS  
Annimali ġenituri : huma dawk id- Daphnia  femminili illi huma 
preżenti fil-bidu tat-test u illi l-prodott riproduttiva tag ħhom huwa 
l-oġġettiv ta' l-istudju.  
Wild:  huma d- Daphnia  żġħar prodotti mill-annimali ġenituri waqt it- 
test. 
L-inqas effett ta' kon ċentrazzjoni osservata (LOEC) : hija l-inqas 
konċentrazzjoni pprovata meta s-sustanza hija osservata illi kellha 
effett statistikalment sinifikanti fuq ir-riproduzzjoni u mhux il- 
mortalita tal- ġenituri (fejn p < 0,05) meta komparata mall-kontroll, 
fi żmien espost stabbilit. Madankollu, il-kon ċentrazzjonijiet kollha 
taħt prova 'il fuq mill-LOEC g ħandhom ikollhom effett dane ġġuż 
ugwali jew aktar minn dak osservat fil-LOEC. Meta dawn i ż-żewġ 
kondizzjonijiet ma jkunux jistg ħu jiġu sodisfatti, trid ting ħata spje­
gazzjoni kompluta ta' kif ġiet magħżula l-LOEC (u b'hekk in- 
NOEC).  
L-ebda effett osservat tal-kon ċentrazzjoni (NOEC) : huwa t-test 
tal-konċentrazzjoni e żatt l-isfel mill-LOEC, li meta kkomparat 
mall-kontroll, m'g ħandu l-ebda effett statistikament sinjifikanti (p < 
0,05), fi żmien espost stabbilit.  
EC x : hija il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova illi dag ħbet fl- 
ilma b'riżultat f'riduzzjoni ta' x % f'riproduttiva tal- Daphnia magna  fi 
żmien espost stabbilit.  
Rata intrinsika ta' żieda: hija l-kejl fit-tkabbir tal-popolazzjoni li 
tintegra mall-prodott riproduttiva u mal-mortalità skond kif spe ċifikat 
skond l-età (20) (21) (22). F'popolazzjonijiet ta' pajji żi standard din 
tkun żero. Għall-popolazzjonijiet illi qeg ħdin jikbru din tkun 
posittiva u g ħall-popolazzjonijiet li qeg ħdin jonqsu din tkun 
negattiva. Kjarament, tal-a ħħar mhux sostitwibbli u fl-a ħħar mill- 
aħhar dan ji ġi estint.  
Limitu tal-g ħarfien : huwa l-inqas kon ċentrazzjoni illi jista' jkun 
nstabu iżda mhux ikkwantifikat.  
Limitu ta' determinazzjoni : huwa l-inqas kon ċentrazzjoni illi jista' 
jkun imkejjel kwantittivament.  
Moralità : annimali huwa re ġistrat bħala mejjet meta jkun immobbli, 
i.e. meta ma jkunx aktar kapaci illi jg ħum, jew jekk ma jkunx 
osservat ebda moviment tal-appendi ċi jew post-abdomen, fi żmien 
15-il sekonda minn meta jkun hemm a ġitazzjoni ġentili tal-kontenitur 
tat-test. (Jekk tintu ża definizzjoni o ħra, din għandha tkun irraportata 
flimkien mar-riferenza tag ħha) ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRIN ĊIPJUTAL-METODU TA' PROVA  
Daphnia  femminili żagħżugħa (l-annimal ġenitur), li g ħandhom eta' 
ta' inqas minn 24 sieg ħa fil-bidu tal-prova, huma esposti g ħas- 
sustanza ta ħt prova kif mi żjuda ma' l-ilma f'limitu ta' kon ċen­
trazzjonijiet. It-tul tal-prova huwa ta' 21 ġurnata. Fl-a ħħar tal- 
prova, in-numru totali ta' wild ħajj pprodott minn kull annimal ħajj 
ikun assessjat. Dan ifisser illi l-prodotti ġovanili mill-adulti li jmutu 
waqt il-prova huma esklu żi mill-kalkulazzjonijiet. Il-prodott tar-ripro ­
duzzjoni tal-annimali ġenituri tista' tkun espressa permezz ta' mog ħdi 
oħra (eż. numru ta' wild ħajj prodott minn kull annimal kull ġurnata 
mill-ewwel ġurnata minn meta l-wild ikun osservat) imma dawn 
għandhom ikunu rrapurtati flimkien man-numru totali tal-prodotti 
ġovanili minn kull ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova. Il-prodott tar-ripro ­
duzzjoni tal-annimali esposti g ħas-sustanza ta ħt prova hija kkom ­
parata ma' dak tal-kontroll (i) sabiex ikun jista ż jiġi stabbilit l- 
inqas effett ta' kon ċentrazzjoni osservat (LOEC) u wara stabbilit 
ukoll dik il-kon ċentrazzjoni illi li ma kinitx osservata (NOEC). 
Flimkien ma' dan, u kemm jista' jkun possibbli, id- data hija 
analizzata bl-u żu tal-mudell ta' rigressjoni sabiex tkun tista' tkun 
stmata l-kon ċentrazzjoni li tikkaw ża riduzzjoni ta' x % fil-prodott 
riproduttiv (i.e. the EC  50 , EC  20 , jew EC  10 ). 
Is-sovravivenza tal-annimali ġenituri u l- ħin sal-produzzjoni tal- 
ewwel grupp g ħandhu jkun irrapurtat. Effetti o ħra rrelatati mas- 
sustanza fuq il-parametri b ħall-kobor (e ż. it-tul) u possibilment ir- 
rata intrinsika tat-tkabbir, tista' wkoll tkun e żaminata.  
1.4. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TA Ħ TPROVA  
Riżultati tat-test ta' tossi ċita akuta (ara metodu C.2, Parti I) 
magħmula minn  Daphnia magna  għandha tkun disponibbli. Ir- 
riżultat jista' jkun ta' u żu fis-selezzjoni ta' limiti xierqa ta' kon ċen­
trazzjonijiet ta ħt prova fit-test tar-riproduzzjoni. Is-solubilita fl-ilma u 
l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza ta ħt prova g ħandhom ikunu 
magħrufa u metodu analitiku ta' min wie ħed joqgħod fuqu g ħall- 
kwantifikazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjonijiet ta ħt prova b'effi ċjenza 
ta' rkuprament rrapurtat u l-limiti ta' determinazzjoni g ħandhom 
ikunu disponibbli.  
Informazzjoni dwar is-sustanza ta ħt prova li tista' tkun ta' u żu sabiex 
ikunu stabbiliti l-kondizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula ta' struttura, il-purita' tas-sustanza, stabbilità fid-dawl, stabbilità ta ħt il- 
kondizzjonijiet tat-test, pKa, P
 ow u riżultati tat-test g ħall-biodegrad ­
abilità li di ħa kien hemm (ara metodu C.4).  
1.5. VALIDITÀ TAL-PROVA  
Sabiex il-prova tkun valida dawn il-kriterji ta' esekuzzjoni li ġejjin, 
għandhom ikunu mil ħuqa fil-kontroll(i):  
— il-mortalità tal-annimal ġenitur (Daphnia femminili) ma taqbi żx l- 
20 % fl-a ħħar tal-prova,  
— in-numru medju ta' wild ħaj prodott g ħal kull ġenitur li jissupera 
l-prova huwa ≥ 60. 
1.6. DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' PROVA  
1.6.1.  Apparat  
Vessili ta' prova u apparat ie ħor li jkun se ji ġi f'kuntatt mas- 
soluzzjonijiet ta ħt prova g ħandhom ikunu mag ħmula interament 
mill-ħġieġ u kimiċi oħra magħmula minn materjal inert. Il-vessili 
tal-prova normalment ikunu beakers tal- ħġieġ. 
Flimkien ma' dan, xi w ħud jew l-apparat kollu li ġej se huwa 
bżonnjuż: 
— meter tal-ossi ġenu (b'microelectrode jew apparat aktar xieraq 
gġall-kejl ta' ossi ġenu li kien ma ħlul f'kampjun ta' volum baxx),  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— apparatat adekwat g ħall-kontroll tat-temperatura,  
— pH meter,  
— apparat g ħad-determinazzjoni tat-toqol ta' l-ilma,  
— apparat g ħad-determinazzjoni tal-kon ċentrazzjoni tal-karbon 
organiku totali (TOC) ta' l-ilma jew apparat g ħad-determinazzjoni 
tad-domanda tal-ossi ġenu kemikali (COD),  
— pparat adegwat g ħall-kontroll fuq utenti tar-re ġim tad-dawl u l- 
kejl tal-intesita' tad-dawl.  
1.6.2.  Organismu ta ħt prova  
L-ispeċi li għandhom ikunu u żati fil-prova huma id- Daphnia magna  
Straus. Spe ċi ta' Daphnia  oħra jistgħu jkunu u żati sakemm dawn 
jilħqu l-kriterji ta' validita' kif xieraq (il-kriterju tal-validita' relatat 
mall-prodott tar-riproduzzjoni fil-kontrolli g ħandu jkun rilevanti 
għall-ispeċi ta' Daphnia ). Jekk spe ċi oħra ta'  Daphnia  jkunu u żati 
huma għandhom ikunu identifikati kjaramant u jkun ġustifikat l-u żu 
tagħhom.  
Preferibillment, il-klon g ħandu jkun ġie identifikat mill- ġenotipu. 
Riċerka (1) uriet illi l-prestazzjoni tar-riproduzzjoni ta' Klon A (li 
oriġina minn IRCHA fi Franza) (3) konsistentament la ħaq il-kriterju 
tal-validita' tal-medju of ≥ 60 wild ħal kull ġenitur annimal li jkun 
baqa' ħajj meta ġie mkabbar ta ħt il-kondizzjonijiet deskritti f'dan il- 
metodu. Madankollu, kloni o ħra huma a ċċettabbli jekk il-kultura tad-  
Daphnia  turi illi la ħqet il-kriterju tal-validita' g ħall-prova.  
Fil-bidu tal-prova, l-annimali g ħandhom ikollhom inqas minn 24 
siegħ u ma għandhomx ikunu pro ġeni tal-ewwel brood. G ħandhom 
ikunu me ħuda minn ħażna b'saħħitha (i.e. li ma juru l-ebda sinjal ta' 
stress bħal mortalita ż għolja, preżenza ta' r ġiel u ephippia, ritardjar 
fil-produzzjoni ta' l-ewwel grupp, annimali diskoloriti e ċċ.). L- 
annimali li jkunu ma ħżuna għandhom ikunu mi żmuma f'kon ­
dizzjonijiet ta' kulturi (dawl, temperatura, medium, g ħalf u 
annimali g ħall-kull unit ta' volum) simili g ħal dawk u żati fil-prova. 
Jekk il-medium tal-kultura ta'  Daphnia  li tkun se tintu ża fil-prova 
hija differenti minn dik u żata għall-kultura normali ta'  Daphnia , hija 
prattika tajba illi tinkludi pretest ta' perjodu ta' akklimazzjoni li normalment tie ħu tliet ġimgħat (i.e. ġenerazzjoni wa ħda) sabiex 
jkun evitat illi jikkaw ża stress fuq l-annimali ġenituri.
 
1.6.3.  Medium ta ħt prova  
Huwa rrikmandat illi medium li huwa kompletament definit huwa 
użat għall-prova. B'hekk ikun qieg ħed jiġi evitat l-u żu ta' addittivi 
(eż. alġi, estratt tal- ħamrija, eċċ.), li huma diffikultu żi biex jiġu kkar­
atterizzati, u g ħalhekk jirran ġa l-opportunitajiet g ġall-istandarizzar 
bejn il-laboratoji. Elendt ta' media M4 (4) u M7 (ara l-Anness 1) 
instabu illi huma adegwati g ħal dan il-g ħan. Madankollu, media o ħra 
(eż. (5) (6)) huma a ċċettabbli kemm-il darba l-prestazzjoni tal-kultura 
ta' Daphnia  turi illi til ħaq il-kriteju tal-validita' g ħall-prova.  
Jekk media huma u żati li jinkludu addittivi li mhumiex definiti, 
dawn l-addittivi g ħandhom ikunu spe ċifikati kjarament u l-inform ­
azzjoni g ħandha tkun ipprovduta fir-rapport tat-test dwar il-kompo ­
sizzjoni, partikolarment fejn tikkon ċerna l-kontenut ta' karbon 
għaliex dan jista' jikkontribwixxi g ħad-dieta kif previst. Huwa 
rikomandit illi il-carbon organiku totali (TOC) u/jew id-domanda 
ta' ossiġenu kemikali (COD) tal-preparazzjoni tal- ħażna tal-addittiv 
organiku huwa determinat u jkun mag ħmul estimu tal-kontribuzzjoni 
distributorja tal-TOC/COD fil-medium ta ħt prova. Huwa rikomandit 
illi l-livelli ta' TOC fil-medium (i.e. qabel l-addizzjoni tal-algi) jkunu 
taħt il-2 mg/l (7).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Meta jkunu qeg ħdin jiġu ttestjati sustanzi illi fihom hemm il-metalli, 
huwa importanti illi wie ħed jirrikonoxxi illi l-kwalitajiet tal-medium 
taħt prova (e ż. toqol, kapa ċita' ta' kilatar) jistg ħu jkollhom impatt fuq 
it-tossiċita tas-sustanza ta ħt prova. G ħal din ir-ra ġuni, huwa me ħtieġ 
medium illi huwa kompletament definit. Madankollu, fil-pre żent, l- 
unika medium illi huwa definit kompletament li huwa mag ħruf illi 
huwa adegwat g ħall-kultura ta'  Daphne  fuq medda twila ta' żmien 
huma l-Elendt M4 u M7. I ż-żewġ media fihom s-sustanza kilata 
EDTA. Ix-xog ħol wera (2) illi t-“tossi ċita apparenti” tal-cadmium 
hija ġeneralment inqas meta t-test tar-riproduzzjoni kien mag ħmul 
f'media ta' M4 u M7 milli meta kienu f'media li ma kienx fihom EDTA. M4 u M7 mhumiex, g ħalhekk, irrikmandati g ħat-testjar ta' 
sustanzi illi fihom il-metalli, u media o ħra illi hu mag ħruf illi fihom 
sustanzi kilati g ħandhom ikunu evitati. Wie ħed jista' jkun ta' parir ilii 
gġal sustanzi li fihom il-metall ikun u żat medium alternattiv bhal, per 
eżempju, ASTM rikonstitwit f'ilma frisk a ħrax (7), li fihom ma jkunx 
hemm EDTA, u li jkollhom mag ħhom estratti ta' al ġi (8). Din il- 
kombinazzjoni ta' ASTM rikonstitwit f'ilma frisk a ħrax u estratt ta' 
alġi huwa wkoll adegwat g ħal kulturi g ħal 
żmien twil u ttestjar ta' 
magna ta'  Daphne  (2), għalkemm xorta jo ħroġ azzjoni kilanti medja 
dovuta min ħabba l-komponent organiku tal-estratt ta' al ġi li ġew 
mgħaduda.  
Fil-bidu u waqt il-prova, l-l-kon ċentrazzjoni ta' ossi ġenu li ġie 
maħlul għandu jkun 'il fuq minn 3 mg/l. Il-pH g ħandha tkun bejn 
6-9, u normalment m'g ħandhiex tvarja aktar minn 1,5 units f'test 
wieħed. Ħruxija 'il fuq minn 140 mg/l (b ħal CaCO  3 ) huwa rikom ­
andat. Testijiet f'dan il-livell u 'il fuq minnhom urew prestazzjoni ripproduttiva flimkien mall-kriteju ta' validita' (9) (10).
 
1.6.4.  Soluzzjonijiet ta ħt prova  
Soluzzjonijiet ta ħt prova ta' kon ċentrazzjonijiet mag ħżula huma 
ġeneralment ippreparati billi jkun hemm ta ħlita ta' ilma mas- 
soluzzjoni ma ħżuna. Soluzzjonijiet ma ħżuna huma preferibilment 
ippreparati billi jkun hemm ta ħlita ta' ilma mas-soluzzjoni fil- 
medium ta ħt prova.  
L-użu ta' solventi organi ċi jew dispersanti jistg ħu jkunu me ħtieġa 
f'ċerti każijiet sabiex ikun hemm produzzjoni ta' ħażna ta' soluzzjoni 
konċentrata xierqa, imma g ħandu jsir hemm kwalsiasi sforz me ħtieġ 
sabiex jiġi evitat l-u żu ta' dawn il-materjali. E żempji ta' solventi 
xierqa huma acetone, ethanol, methanol, dimethylformamide u trie ­
thylene glycol. E żempji ta' dispersanti xierqa huma Cremophor 
RH40, methylcellulose 0,01 % u HCO-40. Fi kwalsiasi ka ż, is- 
sustanzi ta ħt prova g ħandhom ma jaqb żux il-limiti ta' solubilità tal- 
medium ta ħt prova.  
Is-solventi huma u żati sabiex jipprodu ċu ħażna ta' soluzzjoni li tista' 
tkun mħallta preċiżament mal-ilma. Fil-medium ta ħt prova finali, il- 
konċentrazzjoni tas-solvent rikomandita (i.e. ≤ 0,1 ml/l), is-solventi 
imniżżlin hawn fuq m'g ħandhomx ikunu tossi ċi u m'għandhomx 
iżidu is-solubilita' ta' sustanza.  
Dispersanti jistg ħu jassistu f'ta ħlit preċiż u disperzjoni. Fil-medium 
taħt prova finali, il-kon ċentrazzjoni tas-solvent rikomandita ( ≤ 0,1 
ml/l), id-dispersanti imni żżlin hawn fuq m'g ħandhomx ikunu tossi ċi 
u m'għandhomx i żidu is-solubilita' ta' sustanza.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. DISINN TA Ħ TPROVA  
It-trattamenti g ħandhom ikunu allokati g ħall-vessili tat-test u kull 
immaneġġjar sussegwenti tal-vessili tat-test g ħandhu jkun mag ħmul 
f'mod każwali. Fin-nuqqas li jsir dan jista' jirri żulta fi żbilanċ illi 
jista' jittie ħed bħala effett ta' kon ċentrazzjoni. Partikolarment, jekk 
units esperimentali huma immani ġjati f'ordni ta' trattament jew ta ż 
konċentrazzjoni, ji ġri illi xi effett relatat mall- ħin, bhħal għeja tal- 
operatur jew xi żball ieħor, jista' jwassal g ħall-effetti akbar f'kon ċen­
trazzjonijiet akbar. Barra minnhekk, jekk ir-ri żultati tat-test probabbli 
illi jkunu affettwati b'ambjent li jkun fih inizjalment jew bil- kondizzjoni ambjentali tal-prova, b ħal posizzjoni fil-laboratorju, 
hemmhekk mela g ħandu jittie ħed in konsiderazzjoni sabiex il-prova 
tkun imblukkata.
 
1.8. PRO ĊEDURA  
1.8.1.  Kondizzjonijiet ta' espo żizzjoni  
1.8.1.1.  Tul ta' żmien  
Id-durazzjoni tat-test hija ta' 21 ġurnata.  
1.8.1.2.  Tgħabija  
Annimali ġenituri huma mantenuti individwalment, wie ħed għal kull 
vessilu ta' prova, b'50-100 ml ta' medium f'kull vessilu.  
Volumi akbar jistg ħu xi kultant ikun ne ċessarji sabiex jil ħqu ir- 
rekwiżiti tal-pro ċedura analitika u żata sabiex tkun determinata l- 
konċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova, g ħalkemm il-pooling ta' 
repliki għall-analiżi kemikali hija wkoll a ċċettabbli. Jekk jintu żaw 
volumi akbar minn 100 ml, ir-ratio mog ħti lid -Daphnia  jista' jkollu 
bżonn illi ji żdied sabiex ikun assigurat illi jkun hemm provista 
adegwata ta' ikel u konformita mall-kriterju tal-validita'. G ħal 
testijiet ta' flow-through, disinji alternattivi jistg ħu jiġu kkunsidrati 
għal raġunijiet ta' teknika, (e. ż. erba' gruppi ta' 10 annimali f'volum 
akbar ta' prova), imma kwalsiasi kambjament g ħandu jkun irrapurtat.  
1.8.1.3.  Numru ta' annimali  
Għall-testijiet semi-stati ċi, mill-inqas 10 annimali mi żmuma individ ­
walment f'kull kon ċentrazzjoni ta' prova u mill-inqas 10 annimali 
miżmuma individwalment f'serje ta' kontrolli.  
Għal testijiet ta' flow-through, 40 annimal maqsuma f'erba gruppi ta' 
għaxar annimali g ħal kull kon ċentrazzjoni ta ħt prova ġie muri li 
jkunu adegwati (1). Numru i żgħar ta' organi żmi taħt prova jistg ħu 
jkunu użati u minimu ta' 20 annimali g ħal kull kon ċentrazzjoni 
maqsuma f' żewg repliki jew aktar b'numru indaqs ta' annimali (e. ż. 
erba' repliki kull wie ħed b' ħames daphnids) huma rakomandati. 
Għandu jkun innutat illi g ħall-testijiet fejn l-annimali huma 
miżmuma fi gruppi, mhux se jkun possibbli illi ji ġi espress r- 
riżultat ripproduttiv b ħala numru totali ta' wild ħajjin prodotti g ħal 
kull annimal ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova, jekk l-annimal ġenitur 
imut. F'dawn il-ka żijiet il-produzzjoni ripproduttiva g ħandha tkun 
espressa b ħala “in-numru totali ta' offspring ħajjin prodotti g ħal 
kull ġenitur prezenti fil-bidu tal-prova”.  
1.8.1.4.  Għalf 
Għal testijiet semi stati ċi, l-għalf għandu preferibbilment ikun 
magħmul kulljum, i żda mill-inqas tlett darbiet fil- ġimgħa (i.e. li 
jikkorrispondi mal-kambjamenti fil-media). Devjazzjonijiet minn 
dan (e.ż. għat-testijiet ta' flow-through) g ħandu jkun irrapurtat.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Waqt il-prova, id-dieta tal-annimal ġenitur għandha preferibbilment 
tkun ċelloli ta' algi ħajjin ta' wie ħed jew aktar minn dawn li ġejjin:  
Chlorella sp., Selenastrum capricornutum  (issa  Pseudokirchneriella 
subcapitata  (11)) u  Scenedesmus subspicatus . Id-dieta mog ħtija 
għandha tkun ibba żata fuq l-ammont ta' karbon organiku (C) 
previst f'kull annimal ġenitur. Ri ċerka (12) write illi, g ħall- 
Daphnia magna , livelli ta' razzjon bejn 0,1 u 0,2 mg C/ Daphnia /kull 
ġurnata huma bi żżejjed sabiex jintla ħaq in-numru rikjest ta' wild 
sabiex jintla ħaq il-kriteju tal-validita'. Ir-razzjoni jista' jkun mog ħti 
jew f'rata konsistenti matul il-perjodu ta' prova, jew, jekk mixtieq, 
rata aktar baxxa tista' tkun u żata fil-bidu u mbag ħad tkun mi żjuda 
waqt il-prova sabiex jittie ħed in konsiderazzjoni l-kobor tal-annimal 
ġenitur. F'dan il-ka ż, ir-razzjon g ħandu xorta jibqa' fil-limitu 
rakomandit ta' 0,1 - 0,2 mg C/ Daphnia /kuljum fi kwalsiasi ħin. 
Jekk miżuri surrogati, b ħan-numru ta' ċelloli ta' algi jew l-assor ­
biment tad-dawl, huma u żati sabiex ji ġu mitmug ħa il-livelli rikjesti 
tar-razzjon (i.e. g ħall-konvenjenza min ħabba il-kejl tal-kontenut ta' 
karbon jie ħu l-ħin), kull laboratorju g ħandu jipprodu ċi n-nomograff 
propju relatat mal-mi żura ta' surroga tal-kontenut ta' karbon fil- 
kulturi ta' algi (ara l-anness 2 g ħal pariri dwar il-produzzjoni ta' 
nomograff). Nomograffs g ħandhom ikunu i ċċekkjati mill-inqas kull 
sena jew aktar jekk il-kondizzjonijiet tal-kultura ta' l-algi jinbidlu. Ġie misjub illi l-assorbiment tad-dawl huwa surroga a ħjar għall- 
kontenut ta' karbon minn numru ta' ċelloli (13).
 
Suspension ikkon ċentrata ta' algi g ħandhom ikunu mitmug ħa lid-  
Daphnia  sabiex jitnaqqas il-volum ta' medium ta' kultura ta' algi 
trasferita fil-vessili ta' prova. Kon ċentrazzjoni ta' algi tista' tkun 
milħuqa b'centrifugazzjoni u wara b' resuspension f'ilma ddistillat, 
ilma deionizzat medium ta' kultura ta'  Daphnia.  
1.8.1.5.  Dawl  
16–il sieg ħa dawl f'intensità li ma taqbi żx il-15-20 μE· m -2 ·s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
It-temperatura tal-media ta ħt prova g ħandha tkun fir-range ta' 18- 
22 o C. Madankollu, g ħal kull prova, it-temperatura m'g ħandhiex 
tvarja, kemm jista' jkun possibbli, b'aktar minn 2  o C bejn dawn il- 
limiti (e.ż. 18-20, 19-21 jew 20-22  o C). Jista' ikun xieraq illi jintu ża 
vesseli ta' prova ie ħor sabiex it-temperatura tkun tista' ti ġi kkon­
trollata.  
1.8.1.7.  Aeration  
Il-vessili ta' prova m'g ħandhomx ikunu aerated waqt il-prova.  
1.8.2.  Kon ċentrazzjoni tal-prova  
Normalment, g ħandu jkun hemm mill-inqas ħames kon ċen­
trazzjonijiet tal-prova impo ġġijja f'serje ġeometrika b'fattur ta' separ ­
azzjoni preferibilment li ma je ċċedix 3.2, u n-numru xieraq tar- 
repliki għal kull kon ċentrazzjoni tal-prova g ħandhom ikunu u żati 
(ara taqsima 1.8.1.3). Ġustifikazzjoni g ħandha tkun ipprovduta jekk 
inqas minn ħames kon ċentrazzjonijiet ikunu u żati. Is-sustanzi 
m'għandhomx ikunu ittestjati 'il fuq mill-limitu tas-solubilita' 
tagħhom fil-medium tat-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Sabiex ikun stabbilit limitu tal-kon ċentrazzjonijiet, wie ħed ma jridx 
jinsa dawn li ġejjin:  
(i) Jekk l-g ħan ikun illi jinkiseb LOEC/NOEC, l-inqas kon ċen­
trazzjoni ta' prova g ħandha tkun baxxa bi żżejjed sabiex il- 
fekundita f'dik il-kon ċentrazzjoni mhijiex konsiderevolment 
aktar baxxa minn dik tal-kontroll. Jekk dan mhuwiex il-ka ż, 
it-test għandu jkun ripetut b'inqas kon ċentrazzjoni mnaqqsa;  
(ii) Jekk l-g ħan ikun illi jinkiseb LOEC/NOEC, l-og ħla konċen­
trazzjoni ta' prova g ħandha tkun g ħolja biżżejjed sabiex il- 
fekundita f'dik il-kon ċentrazzjoni hija konsiderevolment aktar 
baxxa minn dik tal-kontroll. Jekk dan mhuwiex il-ka ż, it-test 
għandu jkun ripetut bl-og ħla konċentrazzjoni mi żjuda;  
(iii) Jekk il-EC  X għall-effetti fuq ir-riproduzzjoni hija estimata, 
wieħed huwa ta' parir illi jkunu u żati konċentrazzjonijiet 
biżżejjed sabiex jag ħtu definizzjoni lill-EC  X b'livell xieraq ta' 
kunfidenza. Jekk il-EC  50 għall-effetti fuq ir-riproduzzjoni hija 
estimata, wie ħed huwa ta' parir illi l-og ħla konċentrazzjoni 
taħt prova tkun akbar minn din il-EC  50 . Inkella, g ħalkemm 
wieħed xorta jkun jista' jag ħti estimu g ħall-EC5O, l-interval ta' 
kunfidenza g ħall-EC  50 tkun wiesg ħa ħafna u jista' ma jkunx 
possibbli illi ikun stima sodifa ċenti jekk il-mudell kif 
magħmul kienx xieraq;  
(iv) Il-limitu tal-kon ċentrazzjoni tat-test g ħandu preferibilment ma 
jinkludix xi kon ċentrazzjonijiet illi g ħandhom effett statis ­
tikament sinjifikattiv fuq is-sovravivenza tal-adult billi dan 
ibiddel in-natura tat-test minn sempli ċiment test ta' riproduzzjoni 
għall-riproduzzjoni kkombinata u test tal-mortalita li jirrikjedu 
aktar analizzar kumpless statistikament.  
Informazzjoni minn qabel tat-tossi ċita' tas-sustanza ta ħt prova (e. ż. 
minn prova akuta u/jew studji sabiex jinstabu il-limiti) g ħandhom 
jgħinu fl-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet l-aktar xierqa g ħall-prova.  
Fejn solvent jew dispersant huwa u żat sabiex jg ħin fil-preparazzjoni 
tas-soluzzjonijiet tal-prova (ara taqsima 1.6.4), il-kon ċentrazzjoni 
finali tag ħha fil-vessili tal-prova g ħandhom ikunu akbar minn 0,1 
ml/l u għandhom ikunu l-istess b ħal tal-vessili tal-prova.  
1.8.3.  Kontrolli  
Serje ta' medium ta' prova wie ħed u jekk rilevanti serje ta' kontroll 
wieħed li fih solvent jew dispersant g ħandu jiġi magħmul ukoll ukoll 
għas-serje tat-test. Meta u żat, il-kon ċentrazzjoni tas-solvent jew tad- 
dispersant g ħandha tkun l-istess b ħal dik użata fil-vessili illi fihom 
ikunu jinsabu is-sustanzi ta ħt prova. In-numru xieraq ta' repliki 
għandhom jkun u żat (ara taqsima 1.8.1.3).  
Ġeneralment, fi prova mag ħmula tajba, il-koeffi ċjent tal-varjazzjoni 
madwar in-numru medju tal-wild ħajjin prodotti g ħal kull annimal 
ġenitur fil-kontroll(i) g ħandu jkun ta'  < 25 %, u dan g ħandu jkun 
irrapurtat g ħad-disinni tat-test bl-u żu tal-annimali u żati individ ­
walment.  
1.8.4.  Rinovazzjoni tal-medium tat-test  
Il-frekwenza tar-rinovazzjoni tal-medium jiddependi fuq l-istabbilita 
tas-sustanza ta ħt prova, imma g ħandha tkun mill-inqas ta' tlett darbiet 
fil-ġimgħa. Jekk, mill-prova preliminarja sabiex tkun tista' ti ġi stab­
bilita, (ara taqsima 1.4) il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova 
mhijiex stabbli (i.e. barra l-limitu 80-120 % tan-nominali jew li taqa' taħt it-80 % tal-kon ċentrazzjoni kif imkejla fil-bidu) fuq 
perjodu ta' rinovazzjoni massimu (i.e. tlett ijiem), wie ħed għandu 
jieħu in konsiderazzjoni ir-rinovazzjoni aktar frekwenti, jew g ħall- 
użu ta' test flow-through.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Meta il-medium huwa rinovat fi prova semi-statika, it-tieni serje ta' 
vessili tal-prova g ħandhom ikunu ppreparati u l-annimali ġenitur jiġu 
ttrasferiti fihom, b'pipetta tal- ħġieġ per eżempju li jkollha diametru 
xieraq. Il-volum ta' medium trasferit bid-Daphnia g ħandu jkun mini ­
mizzat.  
1.8.5.  Osservazzjonijiet  
Ir-riżultati tal-osservazzjonijiet mag ħmula waqt il-prova g ħandhom 
ikunu rre ġistrati fuq data sheets (ara e żempji fl-Appendi ċi 3 u 4). 
Jekk miżuri oħra huma b żonnjużi (ara 1.3 u 1.8.8) osservazzjonijiet 
addizzjonali jistg ħu jkunu me ħtieġa. 
1.8.6.  Wild  
Il-wild li huma prodotti minn kull annimal ġenitur għandu preferi ­
bilment ikun imne ħħi u jingħadd kuljum sad-dehra ta' l-ewwel grupp, 
sabiex tipprevenihom milli jikkunsmaw ikel li jkun inti ż għall-adulti. 
Għal dan il-metodu huwa biss in-numru ta' wild ħajj li hemm b żonn 
illi jiġu mgħaduda, iżda l-preżenza ta' bajd abbortit u ta' wild mejjet 
għandu jkun irrekordjat.  
1.8.7.  Mortalità  
Mortalità fl-annimali ġenituri g ħandha tkun irrekordjata preferi ­
bilment kuljum, mill-inqas fl-istess ħinijiet illi l-wild huma 
magħduda.  
1.8.8.  Parametri o ħra 
Għalkemm dan il-metodu huwa inti ż prinċiparjament sabiex ikun 
hemm stima fuq ir-riproduzzjoni, huwa possibbli illi effetti o ħra 
jistgħu jkunu kkwantifikati bi żżejjed li jippermettu anali żi statika. 
Kejl ta' kobor huwa desiderevoli ħafna min ħabba illi jipprovdi 
informazzjoni fuq effetti li possibilment jistg ħu jkunu subletali, li 
jistgħu jkunu aktar ta' u żu mill-kejl tar-riproduzzjoni wa ħedha; il- 
kejl tat-tul tal-annimali ġenituri (i.e. it-tul tal- ġisem minbarra l- 
ispina anali) fl-a ħħar tal-prova huwa rrakomandit. Parametri o ħra li 
jistgħu jiġu mkejla jew ikkalkolati jinkludu ż-żmien illi jie ħdu sabiex 
jipproduċu l-ewwel grupp (u gruppi o ħra), numbru u mi żura tal- 
gruppi għal kull annimal, numru ta' gruppi abbortiti, pre żenza ta' 
rġiel jew ephippia u r-rata intrinsika ta ż-żieda fil-popolazzjoni  
1.8.9.  Il-frekwenza tad-determinazzjonijiet analiti ċi u l-kejl  
Konċentrazzjoni ta' ossi ġenu, temperatura, ħruxija u l-valuri tal-pH 
għandhom ikunu mkejla mill-inqas darba fil- ġimgħa, fil-kontroll(i) u 
fl-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova.  
Waqt il-prova, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza ta ħt prova huma 
ddeterminati f'intervalli regolari.  
F'testijiet semi-stati ċi fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova 
hija maġsuba illi tibqa' bejn ± 20 % tan-nominali (i.e. fil-limitu 80- 
120 % – ara 1.4 u 1.8.4), huwa rrakomandit illi, b ħala minimu, l- 
ogħla u l-inqas kon ċentrazzjonijiet tat-testijiet huma anali żżati meta 
jkunu ppreparati ġodda u fil- ħin tar-rinovazzjoni f'okka żjoni ta' darba 
waqt l-ewwel ġimgħa tal-prova (i.e. l-anali żi għandhom ikunu 
magħmula fuq kampjun ta' l-istess soluzzjoni – meta tkun g ħadha 
kemm ġiet ippreparata u meta rrinovata). Dawn id-deter ­
minazzjonijiet g ħandhom ikunu irripetuti mill-inqas f'intervalli ta' 
ġimgħa u ta' ġimgħa wara ġimgħa wara dan.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Għal provi fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt prova mhijiiex 
maħsuba illi tibqa' fil-limiti ± 20 % tan-nominali, huwa ne ċessarju 
illi ssir anali żi tal-konċentrazzjonijiet tal-prova, meta ppreparata mill- 
bidu jew meta rrinovatai. Madankollu, g ħal dawk it-testijiet fejn il- 
konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza ta ħt prova mhijiex fil-± 
20 % tan-nominali imma jista' jkun hemm evidenza bi żżejjed illi turi 
illi l-konċentrazzjonijiet tal-bidu huma repetibbli u stabbli (i.e. fil- 
limitu ta' 80-120 % tal-kon ċentrazzjonijiet tal-bidu), id-deter ­
minazzjonijiet kimi ċi jistgħu jkunu mnaqqsa b' 2 ġimgħat u 3 tat- 
test sa l-og ħla u l-inqas kon ċentrazzjonijiet tal-prova. Fil-ka żijiet 
kollha, id-determinazzjoni tal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza ta ħt 
prova qabel ikunu rrinovati tista' ti ġi magħmula f'vessilu wie ħed ta' 
replika f'kull kon ċentrazzjoni ta ħt prova.  
Jekk prova ta' flow-through hija u żata, reġim ta' teħid ta' kampjuni 
simili għal dak deskritt fil-prova semi statika huwa xieraq (i żda l-kejl 
tas-soluzzjonijeit “qodma” mhuwiex applikabbli f'dan il-ka ż). 
Madankollu, wie ħed jista' jkun ta' parir illi ji żdiedu n-numri ta' 
okkażżjonijiet ta' te ħid ta' kampjuni waqt l-ewwel ġimgħa (e.ż. tlett 
gruppi ta' kejl) sabiex ikun assigurat illi l-kon ċentrazzjonijiet tal- 
prova għadhom stabbli. F'dawn it-tipi ta' testijiet, ir-rata tal-flow 
tad-diluent u s-sustanza ta ħt prova huma i ċċejkati kuljum.  
Jekk ikun hemm evidenza illi l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza li tkun 
qegħda tiġi ttestjata kienet ikkontrollata kif xieraq fl-± 20 % tan- 
nominali jew fil-kon ċentrazzjoni imkejla fil-bidu baqghet l-istess 
waqt it-test, mela r-ri żultati jistg ħu jkunu ibba żati fuq in-nominali 
u fuq il-valuri tal-bidu kif imkejla. Jekk id-devjazzjoni minn nominali jew mill-valuri tal-bidu kif imkejla hija akbar minn ± 
20 %, ir-ri żultati għandhom ikunu espressi ai termini tal-medju kif 
imkejjel skond il- ġin.(ara l-anness 5).
 
2. DATA  U RAPURTA ĠĠ 
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-għan ta' din il-prova huwa illi jkun stabbilit l-effett tas-sustanza 
taħt prova fuq in-numru totali ta' wild ħaj prodott g ħal kull annimal 
ġenitur li huwa ħajj fl-aħħar tal-prova. In-numru totali tal-wild g ħal 
kull annimal ġenitur għandu jkun ikkalkolat g ħall-kull vessilu ta' 
prova (i.e. repliki). Jekk, fi kwalsiasi replika l-annimal ġenitur imut 
waqt il-prova jew ji ġri illi jkun maskili, mela r-replika hija esklu ża 
mill-anali żi. L-anali żi mbagħad tkun ibba żata fuq in-numru ridott ta' 
repliki.  
Sabiex tkun stmata l-LOEC, u wara l-NOEC, g ħall-effetti tal-kimi ċi 
fuq il-prodott tar-riproduzzjoni, huwa ne ċessarju illi jkun ikkalkolat 
l-prodott mean tar-riproduzzjoni tul repliki g ħal kull kon ċentrazzjoni 
u d-devjazzjoni standard residwali kif mi ġmuha, u din tista' tkun 
magħmula bl-u żu tal-anali żi tal-varjant (ANOVA). Il-medju g ħal 
kull konċentrazzjoni g ħandu mbag ħad ikun ikkomparat mall-medju 
ta' kontroll bl-u żu ta' metodu ta' ikkomparar multipliku kif ikun 
xieraq. It-test ta' Dunnett jew ta' Williams jista' jkun ta' u żu (14) 
(15) (16) (17). Huwa ne ċessarju illi wie ħed jiċċekkja jekk l-assu ­
mazzjoni ANOVA tal-homogeneity tal-varjant huwiex validu. Huwa rrikomandit illi dan huwa mag ħmul graffikament, iktar milli 
bl-użu ta' prova sinjifikattivi formali (18); alternattiv xieraq sabiex 
jiġi magħmul it-test ta' Bartlett. Jekk din l-assumazzjoni ma tre ġix, 
hemmhekk wie ħed għandu jikkonsidra illi d-data tkun ittrasformata 
sabiex tkun omo ġinezzata il-varjanza qabel issir l-ANOVA, jew 
qabel issir ANOVA ta' ċertu saħħa. Il-kobor tal-effett kif dedott bl- 
użu tal-ANOVA (i.e. id-differenza l-inqas sinjifikanti) g ħandu jkun 
ikkalkolat u rrapurtat.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Għall-estimu tal-kon ċentrazzjoni illi jista' jikkaw ża riduzzjoni ta' 
50 % fil-prodott riproduttiv (i.e. l- EC  50 ), kurvatura xierqa, b ħall- 
kurvatura lo ġistika, għandha tkun xierqa g ħad-data bl-u żu ta' metodu 
ta' statistika b ħal l-inqas kwadri. Il-kurvatura tista' tkun parame ­
trizzata sabiex il- EC  50 u l-iżbalji standard tag ħha jistgħu jiġu 
estimati direttament. Dan jg ħin ħafna fil-kalkulazzjoni tal-limiti ta' 
kunfidenza tal-EC5O. Kemm-il darba ikun hemm ra ġuni validi g ħal 
xiex jintu żaw livelli ta' kunfidenza differenti, 95 % tal-limiti ta' 
kunfidenza ta' żewġ naħat għandhom ikunu kkwotati. Il-pro ċedura 
xierqa g ħandha preferibbilment tipprovdi mezz ta' kif wie ħed 
jagħmel stima tal-mankanza xierqa. Dan jista' jkun mag ħmul graffi ­
kament jew bid-divi żjoni tas-somma li tibqa' ta' kwadri fil-“lack of 
fit” u “pure error components” u li jag ħmlu test sinjifikattiv tal- 
mankanza xierqa. Billi trattamenti illi jag ħtu fekundita' g ħolja 
aktarx li g ħandhom varjanza g ħola fin-numru ta' prodotti ġovanili 
aktar mit-trattamenti li ja ħtu fekundita' baxxa, wie ħed għandu jagħti 
konsiderazzjoni lill-valuri osservati sabiex jirreflettu l-varjanzi 
differenti fi gruppi ta' trattament differeneti (ara b ħala riferenza l- 
informazzjoni fl-isfond (18).  
Fl-analiżi tad-data mill-a ħħar dawra ta' prova (2), kurvatura lo ġistika 
kienet mag ħmula permezz ta ż l-użu tal-mudell kif ġejj, għalkemm 
mudelli o ħra kkonsidrati b ħala xierqa jistg ħu jkunu u żati: 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
fejn: 
Y = in-numru totali ta' ġovanili g ħal kull annimal ġenitur ħajj fl- 
aħħar tal-prova (ikkalkolat g ħal kull vessilu)  
x = il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza  
c = in-numru preti ż ta' ġovanili meta x = 0  
x 0 = il EC  50 fil-popolazzjoni  
b = il-parametru tan-ni żla. 
Dan il-mudell huwa x'aktarx adegwat f'numru kbir ta' sitwazzjonijiet, 
imma jista' jkun hemm provi fejn mhuwiex adegwat. G ħandu jkun 
hemm ispezzjoni dwar il-validita' tal-mudell kif issu ġġerit hawn fuq. 
F'xi każijiet, mudell ta' hormesis li jag ħti konċentrazzjonijiet baxxi 
jista' jkun xieraq (19).  
Konċentrazzjonijiet o ħra ta' effett, b ħal EC  10 jew EC  20 jistgħu wkoll 
ikunu stmati, g ħalkemm ikun aktar preferibbli illi tintu ża parame ­
trizzazzjoni differenti tal-mudell minn dak uzat sabiex tkun stmata 
l-EC  50 . 
2.2. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi dan li ġej: 
2.2.1.  Sustanza ta ħt prova:  
— natura fi żika u kwalitajiet psikokemikali,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— data  ta' identifikazzjoni ta' kimi ċi, inkluż il-purita'.  
2.2.2.  Spe ċi tal-prova:  
— il-klon (jekk kienx tipati ġenetikament, il-fornitur jew l-eg ħjun 
(jekk hu mag ħruf) u l-kondizzjonijiet tal-kultura u żati. Jekk spe ċi 
differenti ta'  Daphnia  magna hija u żata, din g ħandha tkun irra ­
purtata u ġġustifikata.  
2.2.3.  Kondizzjonijiet ta' prova:  
— Proċedura ta' prova u żata (e.ż. semi-statika jew flow-through, 
volum, tg ħabija fin-numru ta'  Daphnia  għal kull litru),  
— photoperiod u intensita' ta' dawl,  
— disinn tal-prova (e. ż. numru ta' repliki, numru ta' ġenituri għal 
kull replika),  
— dettalji tal-medium tal-kultura u żat, 
— jekk u żati, addizzjonijiet ta' materjali organi ċi inkluż il-kompo ­
sizzjoni, eg ħjun, metodu tal-preparazzjoni, TOC/COD tal- 
preparazzjonijiet tal- ħażniet, estimu tal-TOC/COD kif ri żultanti 
fil-medium tal-prova,  
— informazzjoni dettaljata dwar g ħalf, inklu ż ammont (f'mg C/ ­ 
Daphnia /kull ġurnata) u skeda (e. ż. tip ta' ikel, inklu ż għall- 
algi b'ismijiet spe ċifiċi (speċi) u, jekk mag ħruf, it-tensjoni, il- 
kondizzjonijiet tal-kultura),  
— metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal- ħażna u l- 
frekwenza tar-rinovar (is-solvent jew dispersant u l-kon ċen­
trazzjoni tag ħha għandhom jing ħataw, meta u żati). 
2.2.4.  Ri żultati:  
— riżultati minn xi studji preliminari dwar l-istabilita' tas-sustanza 
taħt prova;  
— il-kon ċentrazzjonijiet tat-test nominali u r-ri żultati tal-anali żi 
kollha sabiex ikun stabbilit il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza ta ħt 
prova fil-vessili tal-prova (ara id- data sheets tal-e żempju fl- 
anness 4); l-effi ċjenza tal-irkuprar tal-metodu u l- limiti tad-deter ­
minazzjoni g ħandhom ikunu irrapurtati wkoll,  
— il-kwalità tal-ilma fil-vessili tal-prova (i.e. pH, temperatura u l- 
konċnetrazzjoni tal-ossi ġenu kif in ħall, u TOC u/jew COD u 
ħruxija fejn applikabbli ara id-data sheets tal-e żempju fl-anness 3),  
— ekord komplet tal-offspring ħajj minn kull annimal ġenitur (ara 
d-data sheets tal-e żempju fl-anness 3),  
— in-numru ta' mejtin fl-annimali ġenituri u d-data meta ti ġri (ara d- 
data sheets tal-e żempju fl-anness 3),  
— il-koeffi ċjent tal-varjazzjoni fuq il-fekundita' tal-kontroll (ibba żata 
fuq in-numru totali tal-wild ħajj għal kull annimal ġenitur ħajj fl- 
aħħar tal-prova),  
— plot tan-numru totali tal-wild ħaj għal kull annimal ġenitur (għal 
kull replika) fl-a ħħar tal-prova vs kon ċentrazzjoni tas-sustanza 
taħt prova,  
— l-inqas kon ċentrazzjoni ta' effett osservat (LOEC) g ħar-ripro­
duzzjoni, inklu ż deskrizzjoni tal-pro ċeduri statisti ċi użati u indi ­
kazzjoni ta' x' kobor jista' jkollu l-effett u l-kon ċentrazzjoni mhux 
osservata ta' effett (NOEC) g ħar-riproduzzjoni; meta approprjat, 
l-LOEC/NOEC g ħall-mortalita' tal-annimal ġenitur għandha 
wkoll tiġi rrapurtata,  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— meta approprjat, l-ECx g ħar-riproduzzjoni u l-intervalli ta' 
kunfidenza u graff tal-mudell kif xieraq u żat għall-kalkolazzjoni 
tagħha, in-niżla tal-kurvitura tad-dose-response u l-I żball standard 
tagħha, 
— effetti o ħra bijoloġiċi osservati jew imkejla: jkun irrapurtat effetti 
oħra biloloġiċi li kienu ossevati jew mkejla (e. ż. kobor tal- 
annimali ġenituri) inklu ż kwalsiasi ġustifikazzjoni me ħtieġa, 
— spjegazzjoni ta' xi devjazzjoni mill-metodu tal-prova.  
3. RIFERENZI  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257-265.
 
(4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, 775-782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 pp.
 
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. 
Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.  
(9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproduci ­
bility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1-8.  
(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185-196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a 
standard  Daphnia  juvenile production test. Environmental 
Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459- 466.
 
(14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121.  
(15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
(16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, 103-117.  
(17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, 510-531.  
(18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.  
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.  
(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs boo
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
ANNESS  
PREPARAZZJONI TA' ELENDT M7 U M4 MEDIA IMFISSRA 
KOMPLETAMENT  
Akklimazzjoni g ħal Elendt M7 u M4 media  
Xi laboratorji sabu xi diffikultajiet meta trasferixxew direttament id- Daphnia  għal 
M4 (1) u M7 media. Madankollu, kien hemm xi su ċċess b'akklimazzjoni 
gradwali, i.e. bilmixi mill-u żu tal-medium rikjest g ħal 30 % Elendt, wara g ħal 
60 % Elendt u mbag ħad għal 100 % Elendt. Il-perjodu ta' akklimazzjoni jistg ħu 
jieħdu sa sena.  
PREPARAZZJONI  
Elementi ta' tra ċċi 
Soluzzjonijiet separati ta' 1–istokk (I) ta' elementi individwali huwa 1–ewwel 
mitfugħa f'ilma safi, e ż. dejonizzat, distillat jew mir-rivers o żmożis. Minn 
dawn 1–istokkijiet diffrenti (I) soluzzjoni wa ħdanija (II) ti ġi ppreparata, li jkun 
fiha 1–elementi tra ċċabbli kollha (is-soluzzjoni kombinata). i.e.  
Soluzzjonijiet ta' ħażna I 
(sustanzi singoli) Ammont mi żjud 
ma' l-ilma 
(mg/l) Konċentr azzjoni 
(vis-a-vis il- 
medium M4) 
(fold) Sabiex tiġi ppreparata ħażna ta' 
soluzzjoni II kkombinata żid l-ammont 
li ġej ta' soluzzjoni I ta' ħażna mal-ilma 
(ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDT * 2 H  2 O A 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Kemm is-soluzzjonijiet ta' Na  2 EDTA u ta' FeSO  4 huma ppreparati singolarment, mferrg ħin flimkien u autoklavjata 
immedjatament. Dan jag ħti: 
Soluzzjoni ta' 21 Fe-EDTA 1 000-fold 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4 u M7 media  
M4 u M7 media huma ppreparati bl-u żu ta' soluzzjoni ta' ħażna II, il-macro- 
nutrijenti u l-vitamini li ġejjin:  
Ammont mi żjud 
ma' l-ilma 
(mg/l) Konċentraz zjoni 
(visa-vis il-medium 
M4) 
(fold) Ammont ta' soluzzjoni ta' ħażna miżjud 
sabiex ikun ippreparat medium 
(ml/l) 
M 4 M 7  
Soluzzjoni ta' ħażna II kkombinata ma' 
oligoelementi 20 50 50 
Soluzzjonijiet  macro-nutrient stock  (sustanza wa ħda) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO * 9  3 H 2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1  
Combined Vitamin stock  — 10 000 0,1 0,1 
Is-soluzzjoni ta' ħażna ta' vitamini kombinati hija ppreprata billi ji żdiedu 3 vitamini ma' 1 litra ilma kif muri hawn ta ħt: 
Thiamine hydrochloride 750 10 000 — — Cyanocobalamine (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotine 7,5 10 000 — —  
Il-ħażna ta' vitamini kombinati hija ma ħżuna ffriżata f'aliquots żgħar. Vitamini huma mi żjuda ftit qabel l-u żu. 
N.B. Sabiex tkun evitata l-pre ċipitazzjoni ta' mlu ħa meta tkun qed ti ġi ppreparat l-media kompleta, żid l-aliquots tas-soluzzjonijiet ta' 
ħażna ma' daqs 500-800 ml ilma dionizzat u wara mlieh sa litru.  
N.N.B.  L-ewwel pubblikazzjoni ta' M4 medium tista' tinstab f' Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructur al 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
ANNESS 2  
ANALIŻI TA' KARBON ORGANIKU (TOC) U TAL-PRODUZZJONI TA' 
NOMOGRAFF G ĦAL KONTENUT TA'TOC FL-IKEL TAL-ALGI  
Huwa rikonoxxut illi l-kontenut ta' karbon fl-ikel tal-algi mhuwiex normalment 
imkejjel direttament i żda minn korrelazzjonijiet (i.e. nomograffi) b'kejl surrogat 
bġal numru ta' ċelloli ta' algi u assorbiment ta' dawl).  
TOC għandu jkun imkejjel b'ossidazzjoni f'temperatura g ħolja aktar milli bil-UV 
jew metodi ta' persulphate. (Ara: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Għal produzzjoni ta' nomograff, l-algi g ħandhom ikumu isseparati mill-medium 
ta' kobor b'centrifugation u wara b'resuspension f'ilma ddistillat. Kejjel il- 
parametru ta' surrogate u l-kon ċentrazzjoni ta' TOC f'kull kampjun tliet darbiet. 
Blanks ta' ilma ddistillat g ħandu jkun analizzat u l-kon ċnetrazzjoni ta' TOC 
mnaqqas minn dak tal-TOC tal-kampjun tal-algi.  
Nomograffi g ħandu jkun lineari madwar limitu ta' kon ċetrazzjonijiet ta' karbon. 
Eżempji huma mhurija hawn isfel.  
NB: Dawn ma g ħandhomx ikunu u żati għall-konver żjonijiet; huwa essenzali illi 
l-laboratorji jippreparaw in-nomografi tag ħhom.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
ANNESS 3  
EŻEMPJU TA' DATA SHEET LI TIRRE ĠISTRA RINOVAR TA' MEDIUM, KONTROLL TA' DATA FI ŻIKALI/KEMIKALI, IKEL, RIPRODUZZJONI TA' DAPHNIA 
U MORTALITA FL-ADULTI  
Esperiment Nru°: Data starded: Clone: Medium: Tip ta' ikel: Sustanza tat-test: Konk. nominali: 
Day 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Tiġdid tal-medium 
(ittikkja) 
PH (  1 ) ġdid 
qadim 
O 2 mg/l (  1 ) ġdid 
qadim 
Temp (  o C) (  1 ) ġdid 
qadim 
Ikel provdut 
(ittikkja) 
In-nru ta' wild ħaj (  2 ) T o t a l 
Reċipjent 1 
2 
3 4 5
 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Esperiment Nru°: Data starded: Clone: Medium: Tip ta' ikel: Sustanza tat-test: Konk. nominali: 
Day 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Mortalità kumulattiva ta' l- 
adulti (
 3 ) 
( 1 ) Indika liema re ċipjent ġie wżat għall-esperiment 
( 2 ) Ir-rekord tal-mortalità ta' kwalunkwe annimal adult b ħala “M” fil-kaxxa relevanti 
( 3 ) Ir-rekord ta'  aborted broods  bħala “AB” fil-kaxxa relevanti
 ANNESS 4  
EŻEMPJU TA' DATA SHEET G ĦAR-REĠISTRAZZJONI TA' RI ŻULTATI TA' ANALI ŻI KIMIĊI 
(a) Il-kon ċentrazzjonijiet imkejla  
Konk. nominali Ġimgħa 1 kampjun Ġimgħa 2 kampjun Ġimgħa 3 kampjun 
Ġdid Qadim Ġdid Qadim Ġdid Qadim  
(b) Il-kon ċentrazzjonijiet imkejla b ħala perċentwali tan-nominali  
Konk. nominali Ġimgħa 1 kampjun Ġimgħa 2 kampjun Ġimgħa 3 kampjun 
Ġdid Qadim Ġdid Qadim Ġdid Qadim  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
ANNESS 5  
KALKOLU TA' L-INTERMEDJU KKALKULAT MA Ż-ŻMIEN  
L-intermedju kkalkulat ma ż-żmien  
Meta wie ħed iqis li l-kon ċentrażżjoni tas-sustanza li qieg ħda tiġi eżaminata tista' 
tonqos tul il-perjodu bejn it-ti ġdidiet medji, huwa ne ċessarju li ji ġi kkunsidrat 
liema kon ċentrazzjoni g ħandha ting ħażel biex tirrapre żenta s-sensiela ta' kon ċen­
trazzjonijiet esperjenzati mill-g ħajn Daphnia.  L-għażla għandha tkun ibba żata fuq 
konsiderazzjonijiet biolo ġiċi kif ukoll fuq dawk statisti ċi. Per eżempju, jekk huwa 
maħsub li r-riproduzzjoni hija l-aktar milquta mill-og ħla konċentrażżjoni esper ­
jenzata, allura g ħandha tintu ża l-ogħla konċentrazzjoni. Madankollu, jekk l-effett 
akkumulat jew l-effett fil-futur aktar imbieg ħed tas-sustan ża tossika huwa kkun ­
sidrat bħala aktar importanti, allura l-kon ċentrazzjoni medja hija aktar relevanti. 
F'dan il-ka ż, ikun approprjat li tintu ża l-medja tal-kon ċentrazzjoni tal-intermedju 
kkalkulat ma ż-żmien, peress illi din tikkonsidra l-varjazzjoni fil-kon ċentrazzjoni 
instantanja fuq medda ta' żmien.  
Figura 1:  
Eżempju tal-medja  time-weighted
  
Il-figura 1 turi e żempju ta' e żami (semplifikat) li jdum sebat ijiem b'ti ġdid medju 
fil-ġranet 0, 2 u 4.  
Il-linja rqiqa f'forma ta' żigżag tirrappre żenta l-kon ċentrazzjoni waqt 
kwalunkwe ħin. Wieħed għandu jassumi li l-waqg ħa fil-konċentrazzjoni 
issegwi l-pro ċess ta' tħassir esponenzali.  
Is-sitt punti mmarkati jirrappre żentaw il-kon ċentrazzjonijiet li ġew osservati 
imkejla fil-bidu u fit-tmien ta' kull perjodu ta' ti ġdid. 
Il-linja solida u ħoxna tindika l-posizzjoni ta' l-intermedju kkalkulat ma ż- 
żmien.  
L-intermedju kkalkulat ma ż-żmien huwa kkalkulat b'mod li l-erja ta ħt l- 
intermedju kkalkulat ma ż-żmien ikun daqs l-erja ta ħt il-kurva tal-kon ċentrazzjoni. 
Il-kalkolu g ħall-eżempju fuq imsemmi huwa muri fit-Tabella 1.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabella 1  
Kalkolu ta' l-intermedju kkalkulat ma ż-żmien  
Tiġdid Nru Ġranet Kon ċ0 Kon ċ1 Ln (Kon ċ0) Ln (Kon ċ1) Erja  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 
3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Total ta' ġranet: 7 Erja totali 50,091 
Intermedj 
u TW 7,156  
Ġranet  huwa n-numru ta' ġranet fil-perjodu ta' ti ġdid. 
Konċ0 hija l-kon ċentrazzjoni imkejla fil-bidu ta' kull perjodu ta' ti ġdid. 
Konċ1 hija l-kon ċentrazzjoni imkejla fit-tmiem ta' kull perjodu ta' ti ġdid. 
Ln(Konċ0) huwa l-logaritmu naturali tal-Kon ċ0. 
Ln(Konċ1) huwa l-logaritmu naturali tal-Kon ċ1. 
L-intermedju kkalkulat ma ż-żmien (“intermedju TW”) huwa l-“Erja totali” divi ża mit-“Total 
ta' ġranet”.  
Erja ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Ġranet  
Erja hija l-erja ta ħt il-kurva esponenzali g ħal kull perjodu ta' ti ġdid. Hija kkal ­
kulata hekk:  
Naturalment, g ħall-eżami ta' riproduzzjoni tad- Daphnia  it-tabella ikollha ti ġi 
estiża biex tkopri 21 ġurnata.  
Huwa ċar li meta jsiru osservazzjonijiet biss fil-bidu u fit-tmiem ta' kull perjodu 
ta' tiġdid, m'huwiex possibbli li ji ġi kkonfermat li l-pro ċess ta' tħassir huwa, fil- 
fatt, esponenzali. F'kalkolu differenti g ħall-“Erja” tirri żulta kurva differenti. 
Madankollu, il-pro ċess tat-tħassir esponenzali huwa plawsibbli u probabilment 
huwa l-aħjar kurva li tista' tintu ża fl-assenza ta' aktar informazzjoni.  
Madankollu, hemm b żonn li jsir xog ħol b'kawzjoni jekk l-anali żi kimika tonqos 
milli ssib xi sustanza fl-a ħħar tal-perjodu ta' ti ġdid. Kemm-il darba ma jkunx 
possibbli li ssir valutazzjoni ta' kemm is-sustanza tisparixxi malajr mit-ta ħlila, 
inkun impossibbli li tinkiseb erja realistika ta ħt il-kurva u g ħalhekk ikun impos ­
sibbli li jinkiseb intermedju ra ġonevoli kkalkulat ma ż-żmien.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MIKROORGANI ŻMI TAL- ĦAMRIJA: TEST TAT- 
TRASFORMAZZJONI TAN-NITRO ĠENU  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni g ħal OECD TG 216 (2000)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Dan il-Metodu tat-Testijiet jiddiskrivi metodu tal-laboratorju 
iddisinjat sabiex jinvestiga l-effetti fit-tul ta' kimi ċi, wara 
espożizzjoni wa ħda, dwar l-attività tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu 
fil-mikroorgani żmi tal-ħamrija It-test huwa prin ċipalment ibba żat fuq 
ir-rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni g ħall-Protezzjoni tal- 
Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida 
oħrajn, inklu żi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal- Ġermanja (2), 
il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4) u Inter ­
national Organization for Standardization (ISO) (5), kienu wkoll meqjusa. Laqg ħa ta' ħidma tal-OECD dwar is-Selezzjoni tal- ħamrija/­
sediment li kienet in żammet fi Belgirate, l-Italja, fil-1995 (6) qabel 
dwar in-numru u t-tipi tal- ħamrija għall-użu f'dan it-test. Rakkom ­
mandazzjonijiet dwar il- ġbir, it-tqandil u l- ħażna tal-kampjun tal- 
ħamrija huma ibba żati fus id-Dokument ta' Gwida ISO (7) u r- 
rakkommandazzjonijiet mil-Laqg ħa ta' Ħidma ta' Beligrate. Fl- 
assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi tas-sustanzi tat-test, 
determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal- ħamrija tista 
tkun meħtieġa, eż., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzali min- 
naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-u ċuħ fuq il-mikroflora tal- 
ħamrija huma me ħtieġa jew meta l-espo żixxjoni ta' mikroorgani
żmi 
tal-ħamrija lejn kimi ċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal- 
ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu 
huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimi ċi fuq il- 
mikroflora tal- ħamrija. Jekk l-agrikimi ċi (eż., il-prodotti talk- 
protezzjoni tal- ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimi ċi tal-foresterija) 
huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitro ġenu u wkoll it- 
testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimi ċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni 
tan-nitroġenu huwa suffi ċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC5O tat- 
test tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu għal tali kimi ċi jidħol fi ħdan 
il-medda miosjuba g ħal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummer ċjalment 
disponibbli (e ż. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu jista 
jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.
 
Il-ħamrija tikkonsisti minn komponenti ħajjin u mhux- ħajjin li jeżistu 
f'taħlitiet kumplessi u etero ġenji. Il-mikroorgani żmi għandhom parti 
ta' rwol impoprtanti fit-tfarrik u t-traformazzjoni tal-meterja organika 
f'ħamrija fertili b' ħafna speċje jikkontribwixxu g ħal diversi aspetti 
tal-fertilià tal- ħamrija. Kwalunkwe interferenza fit-tul ma dawn il- 
proċessi biokimi ċi jista jkollha l-potenzal li tinterferixxi ma ċ-ċiklu 
tan-nutrient u dan jista jibdel il-fertilità tal- ħamrija. It-trasformazzjoni 
tal-karbonju u n-nitro ġenu isse ħħ fil-ħamrija fertili kollha. 
Għalkemm il-kommunitajiet mikrobjali responsabbli g ħal dawn il- 
proċessi jiddifferixxu bejn ħamrija u o ħra, il-mezzi tat-trasform ­
azzjoni huma essenzalment l-istess.  
Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex ji żvela 
l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-pro ċess tat-tras ­
formazzjoni tan-nitro ġenu f'ħamrija erobika tal-wi ċċ. Dan il-Metodu 
tat-test jippermetti wkoll l-estimi ta' l-effetti tas-sustanzi fuq it-tras ­
formazzjoni tal-karbonju mill-mikroflora tal- ħamrija. Il-formazzjoni 
tan-nitrat isse ħħ sussegwentament g ħad-deġenerazzjoni tar-rabtiet 
karbonju-nitro ġenu. Għalhekk, jekk rati egwali tal-produzzjoni tan- 
nitroġenu jkunu misjuba f' ħamrija ittrattata u tal-kontroll, dan huma 
ferm probabbli min ħabba li l-passa ġġi tad-degradazzjoni ma ġġura 
tal-karbonju huma intatti u funzjonali. Is-substrata mag ħżulha għat- 
test (tagħsida luċerna fi trab) g ħandha telattività favorevoli ta' 
karbonju u nitro ġenu (normalment bejn 12/1 u 16/1). Min ħabba 
dan, in-nuqqas ta' karbonju huma a ġevolat matul it-test u jekk il- 
kommunitajiet mikrobjali huma bil = ħsara kinn xi kimika, dawn 
jistgħu jirkupraw fi żmien 100 jum.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
It-testijiet li minnhoma dn il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat 
kienu primarjament iddisinjati g ħal sustanzi li dwarhom l-ammont li 
jilħaq il-ħamrija setg ħa jkun anti ċipat. Dan hu l-ka ż, per eżempju, 
għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-appli ­
kazzjoni fl-g ħelieqi hija mag ħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' 
żewġ dożi relevanti g ħar-rata anti ċipata jew imbassra ta' l-appli ­
kazzjoni huma suffi ċjenti. L-agrokimi ċi jistgħu ikunu ittestjati 
bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, 
it-test mhux limitat g ħall-agrokimi ċi. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti 
tas-sustamnza tat-test applikata fil- ħamrija, u il-mod ta' kif l-inform ­
azzjoni hija evalwata, it-test jista wkoll ikunu u żat għal kimiċi li 
dwarhom l-ammont mistenni li jil ħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. 
Għalhekk, bil-kimi ċi apparti milli l-agrokimi ċi, l-effetti ta' serje ta' 
konċentrazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tan-nitro ġenu, huma 
determinati. L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija u żata 
sabiex tipprepara il-kurva tad-do ża-reazzjoni u tikkalkola il-valuri 
Ecx, meta x hija definita b ħala % effett.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Trasformazzjoni tan-nitro ġenu: Hija d-deghradazzjoni a ħħarija 
mill-mikroorgani żmi tal-materja organika li jkun fiha n-nitro ġenu, 
via l-pro ċess ta' l-ammonifikazzjoni u n-nitrifikazzjoni, lejn in- 
nitrat inorganiku tal-prodott finali rispettivament.  
Ec x (Konċentrazzjoni Effettiva):  Hija l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test fil- ħamrija li tirri żulta f'xi persenta ġġ inibizzjoni 
tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu lejn nitrat.  
EC 5O (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana):  Hija l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza tat-test fil- ħamrija li tirri żulta fi 50 persenta ġġ (50 %) 
inibizzjoni tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu lejn nitrat.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Xejn  
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Ħamrija mg ħarbla hija emendata ma tg ħasida tal-pjanti li ssir trab u 
jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew im ħollija mhux ittrattata (kon ­
troll). Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, minimu ta' żewġ konċen­
trazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u dawn g ħandhom ikunu 
magħżula b'reazzjoni ma l-g ħola konċentrazzjoni anti ċipata fl-għalqa. 
Wara 0, 7, 14-il jum u 28 jum ta' l-inkubazzjoni, kampjuni ta' 
ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma estratti bis-solvent xieraq, u l- 
kwantitajiet ta' nitrat fl-estratti huma determinati. Ir-rata tal-form ­
azzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittratti huwa paragunata mar-rata fil- 
Kontrolli, u d-fevjazzjoni per ċentwali ta' dik ittrattata mill-kontrol 
hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, fit-28 jum, id-differenzi bejn il- ħamrija ittrattata u dik mhux 
ittrattata huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa 
massimu ta' 100 jum. Jekk agrokimi ċi huma ittestjati, serje ta' kon ċ­
entrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma mi żjuda mal-kampjuni tal- 
ħamrija, u l-kwantitajiet tan-nitrat iffurmat fil-kampjuni ittrattati u 
tal-kontroll huma mkejla wara 28 jum ta' inkubazzjoni. Ir-ri żultati 
mit-testijiet b'kon ċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-u żu ta' 
mudell regressiv, u l-valuri Ecx huma ikkalkolati (i.e. EC
 50 , EC  25 
u/jew EC  10 ). Ara definizzjonijiet.  
1.5. IL-VALIDITÀ TAT-TEST  
L-evalwazzjonijiet tar-ri żultati tat-test ma l-agrokimi ċi huma bba żati 
fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn 
il-konċentrazzjonijiet nitri ċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, 
għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistg ħu jwasslu g ħal 
riżultati foloz. G ħalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjunu m ġedda tal- 
kontroll g ħandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Apparat  
Il-kontenituri tat-test u żati huma mag ħmula minn materjal kemi ­
kament inert. Dawn g ħandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità 
mal-proċedura użata għall-inkubazzjoni tal- ħamrija. i.e. l-inku ­
bazzjoni fil-massa jew b ħala serje individwai ta' kampjuni tal- 
ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija g ħandha 
tingħata sabiex ikun minimizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun im ħolli l- 
iskambju tal-gass matul it-test (e ż. il-kontenituri tat-test jistg ħu ikunu 
mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati 
sustanzi volatili, kontenituri li jistg ħu ikunu ssi ġġilati u li ma 
jgħaddix gass minnhom g ħandhom ikunu w żati. Dawn g ħandhom 
ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tag ħhom ikun mimli bil- 
kampjun tal- ħamrija.  
Apparat normali tal-laboratorju, inklu ż dan li ġej, huwa w żat: 
— apparat ta' l-a ġitazzjoni:: ċelċieka mekkanika jew apparat ekwi ­
valenti;  
— ċentrifuga (3 000 g) jew apparat tal-filtrazzjoni (bl-u żu tal-karta 
tal-filtru ħielsa min-nitrat);  
— strument ta' sensittivit adekwata u tar-riprodu ċċibbiltà għall- 
analiżi tan-nitrat.  
1.6.2.  L-g ħażla u n-numu ta' ħamrija  
Ħamrija wa ħda hija użata. Il-karatteristi ċi rakkommandati tal- ħamrija 
huma kif ġej: 
— kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar 
minn 75 %;  
— pH: 5,5 - 7,5;  
— kontenut tal-karbonju organiku: 0,5 – 1,5 %;  
— il-biomassa mikrobjali g ħandha tkun imkejla (8)(9) u l-pkontenut 
tal-karbonju tag ħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju 
organiku totali tal- ħamrija.  
F'bosta ka żi, ħamrija b'dawn il-karatteristi ċi tirrapreżenta l-għar każ 
ta' sitwazzjoni, la darba l-adsorbazzjoni tal-kimika tat-test hija l- minimu u d-disponnabbiltà tag ħha lejn il-mikroflora hija l- 
massimu. B'konsegwenza, it-testijiet b' ħamrija oħra huma, ġener­
alemnt, mhux me ħtieġa. B'dana kollu, f' ċerti ċirkostanzi, e ż. meta 
l-użu maġġuri antiċipat tas-sustanza tat-test f' ħamrija partikolari, 
bħal ma huma l- ħamrija a ċiduża tal-foresti, jew g ħal kimiċi 
ikkargati elettrostatikament, jista jkun me ħtieġ li tintuża ħamrija 
addizzjonali.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Il- ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal- ħamrija  
1.6.3.1.  Il-ġbir 
L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-g ħalqa minn fejn il- 
ħamrija tat-test hija mi ġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji 
jinkludu l-lokalità e żatta, il-kisi ve ġitali, id-dati tat-trattament bil- 
prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organi ċi, żidiet ta' materjali biolo ġiċi jew kontami ­
nazzjonijiet a ċċidentali. Is-sit mag ħżul għall-ġbir tal-ħamrija għandu 
jkun wieħed li jippermetti u żu f'terminu twil. Merg ħat permanenti, 
għelieqi b'u ċuħ annwali ta ċ-ċereali (apparti mill-qam ħ-ir-rum) jew 
dawk moghtija d-demel b' żergħat iffullata, huma tajbin. Il-g ħażla 
tas-sit tal-kampjunar m'g ħandhiex tkun ġiet trattata bil-prodotti tal- 
protezzjoni ta' l-u ċuħ għam mill-anqas sena qabel il-kampjunar. 
Ukoll, l-ebda fertilizzant organiku ma jkun ġie applikat g ħal mill- 
anqas sitt xhur. L-u żu ta' fertilizzant minerali huwa a ċċettabbli biss 
meta, b'konformità mal- ħtiġiet tal-kampjuni ta' l-u ċuħ u tal-ħ
amrija, 
m'għandhomx ikunu mi ġbura għal mill-anqas tlett xhur wara l-appli ­
kazzjoni tal-fertilizzant. L-u żu ta' ħamrija trattata bil-fertilizzanti li 
għandhom effetti bijo ċidali mag ħrufa (eż. is-sijanamid tal-kal ċju) 
għandu jkun evitat.  
Il-kampjunar g ħandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, 
perijodi twal (itwal minn 30 jum) ta' nixfa jew ta' stg ħadir bl-ilma. 
Għal ħamrija ma ħruta, il-kampjuni g ħandhom jin ġabru minn fond ta' 
1 sa 20 cm l-isfel. G ħall art tal-merg ħa (art fil- ħaxix) jew ħamrija 
oħra meta l- ħrit ma jse ħħx matul perijodi twal (f'mill-anqas sta ġun 
wieħed tat-tkabbir), il-fond massimu tal-kampjunar jista jkun kemm 
xejn aktar minn 20 cm (e ż. sa 25 cm).  
Il-kampjuni tal- ħamrija g ħandhom ikunu trasportati bl-u żu ta' 
kontenituri u skond kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal- ħamrija ma jkunux sinifikament mibdula.
 
1.6.3.2.  Ħażna 
L-użu ta' ħamrija mi ġbura friska mill-g ħelieqi huwa ippreferut. Jekk 
ħażna fil-laboratorju ma tistg ħax tkun evitata, il- ħamrija tista tkun 
maħżuna fid-dlam 4 ± 2  o C għal massimu ta' tlett xhur. Matul il- 
ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobi ċi għandhom ikunu 
assigurati. Jekk il- ħamrija tkun mi ġbura minn żoni ta' fejn din tkun 
iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il- ħażna għal sitt xhur fi 
– 18  o C sa – 22  o C tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali 
tal-ħamrija ma ħżuna hija mkejla qabel kull esperiment u l-karbonju 
fil-biomassa g ħandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal- 
karbonju organiku fil- ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).  
1.6.4.  Tqandil u l-Preparazzjoni tal- ĦAmrija g ħat-Test  
1.6.4.1.  Preinkubazzjoni  
Jekk il-ħamrija kienet ma ħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.3.2), preinku ­
bazzjoni hija rakkommandata g ħal perijodu ta' bejn 2 u 28 jum. It- 
temperatura u l-umidità tal-kontenut tal- ħamrija matul il-preinku ­
bazzjoni g ħandhom ikunu simili g ħal dik u żata fit-test (ara s- 
sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Karatteristi ċi fiżiko-kimiċi 
Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn o ġġeti kbar (e ż. ġebel, 
partijiet ta' pjanti, e ċċ.) u imbag ħad magħrbla fin-nieda ming ħajt 
tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' parti ċelli ta' anqas minn jew egwali 
għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal- ħamrija 
għandu jkun a ġġustat b'ilma distillat jew dejonizzat lejn valur ta' 
bejn 40 % u 60 % tal-kapa ċità massima ta ż-żamma ta' l-ilma.  
1.6.4.3  Amendi b'substrata organika  
Il-ħamrija għandha tkun emendata b'substrata organika xierqa, e ż. 
tgħasida mrammla lu ċerna-ħaxix-ħadranija (il-komponent ewlieni: 
Medicago sativa) b'relattività C/N ta' bejn 12/1 u 16/1. Ir-relattività 
rakkommandata tal- ħamrija lu ċerna hija ta' 5 g lu ċern kull kilo ­
gramma ta' ħamrija (piz xott).  
1.6.5.  Preparazzjoni tas-sustanza tat-test g ħall-applikazzjoni mal- 
ħamrija  
Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-u żu ta' trasportatur. 
It-trasportatur jista jkun ilma (g ħal sustanzi li jin ħallu fl-ilma) jew 
solidu inert b ħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-parti ċella: 
0,1 - 0,5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (e ż. solventi 
organiċi bħal ma huma l-a ċetun, il-kloroforma) g ħandhom ikunu 
evitati la darba dawn jistg ħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk 
ir-ramel ikunu u żat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis- 
sustanza tat-test imdewba jew sospi ża f'solvent xieraq. F'tali ka żi, 
is-solvent g ħandu jkun imne ħħi bl-evaporazzjoni qabel it-ta ħlit 
mal-ħamrija. G ħall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil- 
ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija 
(piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma 
ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.  
Meta jkunu ittestjati kemikali volatili, it-telf matul it-trattament 
għandu jkun evitat sa kemm dan ikun possibbli u tentattiv g ħandu 
jsir sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omo ġenja fil-ħamrija (eż. is- 
sustanza tat-test g ħandha tkun injettata fil- ħamrija minn diversi posti ­
jiet). 
1.6.6.  Kon ċentrazzjonijiet tat-test  
Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, mill-anqas żewġ konċentrazzjonijiet 
għandhom ikunu w żati. Il-kon ċentrazzjoni l-baxxa g ħandha tirrifletti 
mill-anqas l-ammont massimu mistenni li jil ħaq il-ħamrija waqt 
kondizzjonijiet pratti ċi, fil-waqt li l-kon ċentrazzjoni l-g ħolja 
għandha tkun mutiplu tal-kon ċentrazzjoni l-baxxa. Il-kon ċen­
trazzjonijiet ta' sustanza tat-test mi żjuda mal- ħamrija huma kkalkolati 
billi tkun pre żunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 5 cm u l- 
massa tal- ħamrija f'densità ta' 1.5. G ħall-agrokimi ċi li huma applikati 
direttament mal- ħamrija, jew g ħal kimiċi li dwarhom il-kwantità li 
tilħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-kon ċentrazzjonijiet tat-test 
irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concen ­
tration (PEC) (Kon ċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u ħames darbiet 
dik il-kon ċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija li jkunu 
applikati diversi drabi mal- ħamrija fi sta ġun wieħed għandhom 
ikunu ittestjati fil-kon ċemntrazzjonijiet derivati mill-multiplikazzjoni 
tal-PEC bin-numru massimu anti ċipat ta' l-applikazzjonijiet. L-g ħoila 
konċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, m'g ħandhiex te ċċedi għaxar 
darbiet il-massimu tar-rata ta' applikazzjoni wa ħda. Jekk dawk li ma 
humiex agrokimi ċi huma ittestjati, serje ġeometrikuta' mill-anqas 
ħames kon ċentrazzjonijiet g ħandu jkun u żat. Il-kon ċentrazzjonijiet 
ittestjati g ħandhom ikopru l-medda me ħtieġa tal-valuri EC  x . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. L-IM ĠIEBA TAT-TEST  
1.7.1.  Il-kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.7.1.1.  It-trattament u l-kontrol  
Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, il- ħamrija hija divi ża fi tlett porz ­
jonijiet ta' pi ż egwali. Żewġ porzjonijiet huma m ħallta mat-tras ­
portatur li jkun fih il-prodott, u l-ie ħor huwa m ħallat mat-trasportatur 
mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tliet repliki kemm g ħall- 
ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk 
dawk li ma humiex agrokimi ċi huma ittestjati, il- ħamrija hija divi ża 
f'sitt porzjonijiet ta' pi ż egwali. Ħamsa mill-kampjunu huma m ħallta 
mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa 
mħallat mat-trasportatur ming ħajr il-kimika. Tlett replikati ta ż-żewġ 
trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni g ħandha 
tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omo ġenja tas-sustanza 
tat-test fil-kampjunu tal- ħamrija ittrattata. Matul it-ta ħlit, l-ikkum ­
pattjar jew gerbubi mg ħaqqda għandhom ikunu evitati.  
1.7.1.2.  L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija  
L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija tista titwettaq b' żewġ modi: 
Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata 
jew f'serje ta' sub-kampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi 
volatili huma ittestjati, it-test g ħandu jkun imwettaq biss b'serje ta' 
sub-kampjuni individwali. Meta l- ħamrija tkun inkubata fil-massa, 
kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma 
ippreparati u s-sub-kampjuni g ħall-analiżi huma mi ġbura kif 
meħtieġ matul it-test. L-ammont inizjalment ippreparat g ħal kull 
trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in- numru ta' repliki u żati għall-analiżi u n-numru massimu anti ċipat 
tad-drabi tal-kampjunar. Il- ħamrija inkubata fil-massa g ħamndha 
tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l- ħamrija hija 
inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew 
mhux trattata fil-massa hija divi ża fin-numru me ħtieġ ta' sub- 
kampjuni, u dawn huma utilizzati kif me ħtieġ. Fl-esperimenti ta' 
meta tnejn jew aktar ħinijiet tal-kampjunar jistg ħu ikunu anti ċipati, 
sub-kampjuni bi ż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex ikun 
hemm abbastanza g ħar-replikati kollha u d-drabi tal-kampjunar 
kollu. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal- ħamrija tat-test 
għandhom ikunu inkubati permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi (ara 
s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it-testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wi ċċ
 suffiċjenti, għandhom ikunu u żati sabiex ikunu 
evitati l-kondizzjonijiet anerobi ċi. Meta sustanzi volatili huma 
ittestjati, it-test g ħandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni 
individwali.  
1.7.1.3.  Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet  
It-test huwa mwettaq fid-dlam f'temepratura tal-kamra ta' 20 ± 2  o C. 
Il-kontenut ta' l-umidità tal-kamjuni tal- ħamrija g ħandu jkun 
miżmum matul it-test g ħal bejn 40 % u 60 % tal-kapa ċità massima 
taż-żamma ta' l-ilma fil- ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.4.2) b'medda ta' ± 
5 %. Ilma distillat jew deonizzat jista jkun mi żjud kif me ħtieġ. 
It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk l-agrokimi ċi huma 
ittestjati, ir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittrattati u tal- kontroll huma mqabbla. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 
25 % fil-jum 28, it-test jitkompla sakemm differenza egwali g ħal, 
jew anqas minn 25 % tkun akkwistata, jew g ħal massimu ta' 100 
jum, liema minnhom ikun l-aqsar. G ħal dawk li ma humiex 
agrokimiċi, it-test ikun terminat wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwanti ­
tajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal- ħamrija ittrattata jew tal-kontroll 
huma determinati u l-valuri EC
 x ikunu ikkalkolati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Kamp ġjunaar u anali żi tal-ħamrija  
1.7.2.1.  Kampjunar skedat tal- ħamrija  
Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, il-kampjuni tal- ħamrija huma 
analiżżati għan-nitrat fil-jiem 0, 7, 14 u 28. jekk test imtawwal 
ikun meħtieġ, aktar kejl g ħandu jseħħ f'intervalli ta' 14-il jum, 
wara l-jum 28.  
Jekk dawk li ma humiex agrokimi ċi huma ittestjati, mill-anqas ħames 
konċentrazzjonijiet tat-test huma w żati u l-kampjuni tal- ħamrija 
huma anali żżati għan-nitrat fil-bidu (jum 0) u fit-tmiem tal-perijodu 
ta' l-espożizzjoni (28 jum). Kejl intermedju, e ż. fil-jum 7, jista jkun 
miżjud jekk dan ikun meqjus b ħala meħtieġ. L-informazzjoni 
akkwistata fil-jum 28 hija u żata għad-determinazzjoni tal-valux 
EC x dwar il-kimika. Jekk mixtieq, l-informazzjoni mill-jum 0 tal- 
kampjuni tal-kontroll jistg ħu ikunu w żati sabiex jirraportaw il- 
kwanitità inizjali tan-nitrat fil- ħamrija.  
1.7.2.2.  L-anali żi tal-kampjuni tal- ħamrija  
L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll 
huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. In-nitrat huwa estratt mill-ħamrija biċ-ċekċik tal-kampjun b'solvent xieraq ta' l-estrazzjoni, 
eż. taħlita ta' 0,1 M klorid tal-putassa. Relattività ta' 5 ml tat-ta ħlita 
KC1 kull gramma pi ż xott ekwivalenti tal- ħamrija huwa rakkom ­
mandat. Sabiex tkun imtejba l-estrazzjoni, il-kontenituri li jkunu bil-ħamrija u t-ta ħlita ta' l-estrazzjoni m'g ħandhomx ikunu aktar 
minn nofshom mimlija. It-ta ħlitiet huma m ċekċka fi 150 rpm g ħal 
60 minuta. It-ta ħlitiet ikunu ċentrifugati jew filtrati u l-fa żijiet likwidi 
huma anali żżati għan-nitrat. Estratti likwisi ħielsa minn parti ċelli 
jistgħu ikunu ma ħżuna qabel l-anali żi fi - 20 ± 5
 o C sa sitt xhur.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimi ċi, il-kwalità yan-nitrat 
iffurmat f'kull replika tal-kampjun tal- ħamrija għandha tkun irre ġis­
trata, u l-valuri medji tar-replikati kollha g ħandhom ikunu ipprovduti 
f'għamla tabulari. Ir-rati tat-trasformazzjoni tan-nbitro ġenu għandhom 
ikunu evalwati b'metodi xierqa u ġeneralment a ċċettabbli (e ż. Test-F, 
5 % livell sinifikanti). Il-kwantitajiet ta' nitrat iffurmat huma espressi fi mg nitrat/kg pi ż xott tal- ħamrija/kull jum. Ir-rata tal-formazzjoni 
tan-nitrat f'kull trattament hija mqabbla ma dik tal-kontroll, u l- 
persentaġġ tad-devjazzjoni mill-kontroll hija ikkaalkolata.
 
Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimi ċi, il- 
kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva 
doża-reazzjoni hija ippreparata g ħall-estimi tal-valuri EC  x . Il-kwanti ­
tajiet ta' nitrat (i.e. mg nitrat.kg pi ż xottv tal- ħamrija) misjuba fil- 
kampjuni ittrattati wara 28 jum huma mqabbla ma' dak misjun fil- 
kontroll. Minn din l-informazzjoni, il- % tal-valuri ta' l-inibizzjoni 
għal kull kon ċentrazzjoni tat-test huma ikkalkolati.Dawn il- 
persentaġġi huma mpin ġija kontra l-kon ċentrazzjoni, u l-pro ċeduri 
statistiċi huma mbag ħad użati għall-kalkolu tal-valuri EC  x . Limiti 
ta' l-affidabbilità (p = 0,95) g ħal ECx ikkalkolati huma wkoll deter ­
minati bl-u żu tal-proċeduri normali (10) (11) (12).  
Is-sustanzi tat-test li jkollhom kwantitajiet g ħoljin ta' nitro ġenu jistgħu 
jikkontribwixxu g ħall-kwantitajiet ta' nitrat iffurmat matul it-test. Jekk 
dawn is-sustanzi huma ttestjati f'kon ċentrazzjoni g ħolja (eż. kimika li 
hija mistennija li tkun u żata f'applikazzjonijiet repetuti) kontrolli xierqa 
għandhom ikunu inklu żi fit-test (i.e. il- ħamrija flimkien mas-sustanza 
tat-test imma ming ħajr it-tgħasida tal-pjanti). Dettalji minn dawn il- 
kontrolli g ħandhom ikunu nklu żi fil-kalkoli tal- EC  x . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Meta r-ri żultati mit-testijiet bl-agrokimi ċi huma evalwati, u d- 
differenza fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat bejn it-trattament baxx (i.e. il-massimu tal-kon ċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun 
egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt 
wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat b ħala li jkollu infuwenza 
f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tan-nitro ġenu fil-ħamrija. Meta 
r-riżultati mit-testijiet bil-kimi ċi apparti milli l-agrokimi ċi huma 
evalwatim il-valuri EC
 50 , EC  25 u/jew EC  10 huma wżati. 
3. RAPPORTA ĠĠ 
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Identifikazzjoni s ġiġa tal-ġamrija użata, inklu ż: 
— refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lon ġitudini);  
— informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta ve ġittiva, it- 
trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ, trattamenti bil- 
fertilizzanti, kontaminazzjoni a ċċidentali, e ċċ.); 
— is-sekwenza ta' l-u żu (eż. ħamrija agrikola, foresta, e ċċ.); 
— il-fond tal-kampjunar (cm);  
— il-kontenut ramel/ ħama'/tafal ( % tal-pi ż); 
— pH (fl-ilma);  
— kontenut tal-karbonju organiku ( % pi ż xott);  
— kontenut tan-nitro ġenu organiku ( % pi ż xott);  
— il-kon ċentrazzjoni inizjali tan-nitrat (mg nitrat kg pi ż xott);  
— kapaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);  
— biomassa mikrobjali f'termini ta' persenta ġġ tal-karbonju organiku 
totali;  
— referenza g ħall-metodi u żati għad-determinazzjoni ta' kull para ­
metru;  
— l-informazzjoni li tirrigwardja il- ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal- 
ħamrija;  
— Is-sustanza tat-test:  
dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal- ħamrija, jekk ikun hemm.  
— in-natura fi żika u, meta relevanti, il-propjetajiet fi żikokimiċi; 
— l-informazzjoni ta' l-identifikazzjoni kimika, meta relevanti, 
inkluża l-formula strutturali, il-purità (i.e. g ħall-prodotti tal- 
protezzjoni ta' l-u ċuħ il-persenta ġġ ta' l-ingredjent attiv), il- 
kontenut tan-nitro ġenu. 
Substrata : 
— is-sorsi tas- substrata  
— il-komposizzjoni (i.e. tg ħasida luċerna, it-tg ħasida luċerna-ħaxix- 
ħdura);  
— kontenut tal-karbonju u tan-nitro ġenu ( % pi ż xott);  
— id-daqs ta' l-img ħarbel (mm).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Kondizzjonijiet tat-test:  
— dettalji ta' l-emenda tal- ħamrija b' substrata  organika;  
— in-numru tal-kon ċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test u żata u, meta 
xieraq, ġustifikazzjoni tal-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula; 
— dettalji ta' l-applikazzjoni tas- substrata  tat-test fil- ħamrija;  
— temperatura ta' l-inkubazzjoni;  
— il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;  
— il-metodu u żat ta' l-inkubazzjoni tal- ħamrija (i.e. b ħala massa jew 
bħala serje ta' subkampjuni individwali);  
— in-numru ta' replikati;  
— id-drabi tal-kampjuna;  
— Riżultati:  
il-metodu u żat għall-estrazzjoni tan-nitrat mill- ħamrija.  
— proċedura analitika u l-apparat u żat fl-anali żi tan-nitrat;  
— dettalji tabulati, inklu żi il-valuri individwali u medji g ħall-kejl 
tan-nitrat;  
— il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;  
— spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk 
relevanti;  
— il-varjazzjoni per ċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull 
waqt tal- kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal- valur EC
 50 b'95 fil-mijja affidibbilità, EC  x oħrajn (i.e. EC  25 jew 
EC 10 ) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva do ża- 
reazzjoni;  
— riżultati statiti ċi tat-trattament;  
— l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' g ħajnuna 
fl- interpretazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological 
Methods.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on 
Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 
1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass -Part 1: Substrateinduced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass -Part 2: Fumigationextraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New - York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MIKROORGANI ŻMI TAL- ĦAMRIJA: TEST TAT- 
TRASFORMAZZJONI TAL-KARBONJU  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni g ħal OECD TG 217 (2000)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Dan il-Metodu tat-testijiet jiddeskrivi metodu tal-laboratorju iddisnjat 
sabiex jinvestiga l-effetti potenzjoni f'terminu fit-tul ta' espo żizzjoni 
singola tal-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ u possibbilment 
kemikali o ħrajn fuq l-attività tat-trasformazzjoni tal-karbomnju f'mik ­
roorgaiżmi tal-ħamrija. It-test huwa prin ċipalment ibba żat fuq ir- 
rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni g ħall-Protezzjoni tal- 
Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida oħrajn, inklu żi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal- Ġermanja (2), 
il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4), kienu 
wkoll meqjusa. Laqg ħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-G ħażla tal- 
Ħamrija/Sediment li n żammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (5) 
qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. 
Rakkommandazzjonijiet g ħall-ġbir, tqandil u l- ħażna tal-kampjun 
tal-ħamrija huma ibba żai fuq Dokument ta' Gwida ISO (6) u r- 
rakkomandazzjonijiet tal-Laqg ħa ta' Ħidma ta' Belgirate.
 
Fl-assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristi ċi tossiċi tas-sustanzi tat- 
test, determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal- ħamrija 
tista tkun me ħtieġa, eż., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzjali 
min-naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-u ċuħ fuq il-mikroflora tal- 
ħamrija huma me ħtieġa jew meta l-espo żizzjoni ta' mikroorgani żmi 
tal-ħamrija lejn kimi ċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal- 
ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu 
huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimi ċi fuq il- 
mikroflora tal- ħamrija. Jekk l-agrikimi ċi (eż., il-prodotti tal- 
protezzjoni tal- ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimi ċi tal-foresterija) 
huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitro ġenu u wkoll it- 
testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimi ċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni 
tan-nitroġenu huwa suffi ċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC5O tat- 
test tat-trasformazzjoni tan-nitro ġenu għal tali kimi ċi jidħol fi ħdan 
il-medda misjuba g ħal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummer ċjalment 
disponibbli (e ż. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu 
jista jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.
 
Il-ħamrija tikkonsisti minn komponenti ħajjin u mhux- ħajjin li jeżistu 
f'taħlitiet kumplessi u etero ġenji. Il-mikroorgani żmi għandhom parti 
ta' rwol impoprtanti fit-tfarrik u t- traformazzjoni tal-meterja organika f'ħamrija fertili b' ħafna speċi jikkontribwixxu g ħal diversi aspetti tal- 
fertilità tal- ħamrija. Kwalunkwe interferenza fit-tul ma' dawn il- 
proċessi bijokimi ċi jista' jkollha l-potenzal li tinterferixxi ma ċ-ċiklu 
tan-nutrient u dan jista jibdel il-fertilità tal- ħamrija. It-trasformazzjoni 
tal-karbonju u n-nitro ġenu sseħħ fil-ħamrija fertili kollha. G ħalkemm 
il-kommunitajiet mikrobjali responsabbli g ħal dawn il-pro ċessi jiddif ­
ferixxu bejn ħamrija u o ħra, il-mezzi tat-trasformazzjoni huma 
essenzjalment l-istess.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex ji żvela 
l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-pro ċess tat-tras ­
formazzjoni tan-nitro ġenu f'ħamrija erobika tal-wi ċċ. It-test huwa 
sensittiv g ħal kambju fid-daqs u l-attività tal-kommunitajiet 
mikrobjali responsabbli g ħat-trasformazzjoni tal-karbonju la darba 
jissuġġetti dawn il-kommunitajiet kemm lejn l-impenn kemikali u 
wkoll għal nuqqas gravi ta' karbonju. Ħamrija mramma baxxa 
f'materja organika hija u żata. Din il- ħamrija hija ittrattata bis- 
sustanza tat-test u inkubata permezz tal-kondizzjonijiet li jippermettu 
mataboliżmu mikrobjali m ħaffef. Permezz ta' dawn il-kondizzjonijiet, 
sorsi ta' karbonju fa ċilment disponibbli fil- ħamrija huma malajr 
eżawriti. Dan jikka ġuna skarzezza tal-karbonju li kemm jiqtol i ċ- 
ċelloli mikrobjali u wkoll jindu ċi rqad u/jew sporlazzjoni. Jekk it- 
test ikun imwettaq g ħal aktar minn 28 jum, is-somma ta' dawn ir- 
reazzjonijiet tista tkun imkejla bi ( ħamrija mhux trattata) kontrolli 
bħala telf progressiv tal-biomassa mikrobjali metabolikament attiva 
(7). Jekk il-biomassa tal- ħammrija m ċaħħda mill-karbonju, skond il- 
kondizzjonijiet tat-test, hija affettwata bil-pre żenza ta' kimika, jista 
jkun il-ka ż li din ma ter ġal lura lejn l-istess livell b ħal fil-kontroll. 
Għalhekk, disturnazi ikka ġunati bis-sustanza tat-test fi kwalunkwe 
hin matul it-test ta' spiss iddum sat-tmiem tat-test.  
It-testijiet li minnhom dan il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat 
kienu primarjament iddisinjati g ħal sustanzi li dwarhom l-ammont li 
jilħaq il-ħamrija setg ħa jkun anti ċipat. Dan hu l-ka ż, per eżempju, 
għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-appli ­
kazzjoni fl-g ħelieqi hija mag ħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' 
żewġ dożi relevanti g ħar-rata anti ċipata jew imbassra ta' l-appli ­
kazzjoni huma suffi ċjenti. L-agrokimi ċi jistgħu ikunu ittestjati 
bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, 
it-test mhux limitat g ħall-kimiċi b'konċentrazzjonijiet ambjentali 
prevedibbli. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti tas-sustamnza tat-test 
applikata fil- ħamrija, u l-mod ta' kif l-informazzjoni hija evalwata, 
it-test jista wkoll ikunu w żat għal kimiċi li dwarhom l-ammont 
mistenni li jil ħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. G ħalhekk, bil- 
kimiċi apparti milli l-agrokimi ċi, l-effetti ta' serje ta' kon ċen­
trazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tal-karbonju, huma determinati. 
L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija u żata sabiex tipprepara l- 
kurva tad-do ża-reazzjoni u tikkalkola l-valuri Ec  x , meta hija definita 
bħala % effett.  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Trasformazzjoni tal-karbonju : Hija d-degradazzjoni minn mikroor ­
ganiżmi ta' materja organika li tifforma il-prodott a ħħari inorganiku 
tad-diossidu tal-karbonju.  
EC x (Konċentrazzjoni Effettiva):  Hija l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test fil- ħamrija li tirri żulta fi x persenta ġġ inibizzjoni 
tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.  
EC 5O (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana):  Hija l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza tat-test fil- ħamrija li tirri żulta fi 50 fil-mijja inibizzjoni 
tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Xejn ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-ħamrija mag ħrbla hija jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew 
imħollija mhux ittrattata (kontroll). Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, 
minimu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u 
dawn għandhom ikunu mag ħżula b'reazzjoni ma l-g ħola konċen­
trazzjoni anti ċipata fl-g ħalqa. Wara 0, 7, 14 u 28 jum ta' inku ­
bazzjoni, kampjuni ta' ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma m ħallta 
bil-glukożju, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-gluko żju huma 
mkejla għal 12-il sieg ħa konsekuttivi. Ir-rate tar-respirazzjoni huma 
espressi b ħala diossidu tal-karbonju rilaxxat (mg diossidu tal- 
karbonju/kd ħamrija xotta/fis-sieg ħa) jew ossi ġenu ikkunsmat (mg 
ossiġenu/kg ħamrija/sieg ħa). Ir-rata medja tar-respirazzjoni fil- 
kampjuni tal- ħamrija ittrattata hima mqabbla ma dik fil-kontroll u 
d-devjazzjoni per ċentwali tal- ħamrija ittrattata minn dik tal-kontroll 
hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, 
fit-28 jum, id-differenzi bejn il- ħamrija ittrattata u dik mhux ittrattata 
huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa massimu ta' 100 jum. Jekk kimi ċi oħrajn apparti milli l-agrokimi ċi huma ittestjati, 
serje ta' kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma mi żjuda mal- 
kampjuni tal- ħamrija, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-gluko żju 
(i.e. il-medja tal-kwantitajiet tad-diossidu tal-karbonju iffurmat jew l- ossiġenu ikkunsm, at) huma imkejja wara 28 jum. Ir-ri żultati mit- 
testijiet b'kon
ċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-u żu ta' 
mudell regressiv, u l-valuri Ec  x huma kkalkolati (i.e. EC  50 , EC  25 
u/jew EC  10 ). Ara definizzjonijiet.  
1.5. IL-VALIDITÀ TAT-TEST  
L-evalwazzjonijiet tar-ri żultati tat-test ma l-agrokimi ċi huma bba żati 
fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn 
il-konċentrazzjonijiet nitri ċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, 
għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistg ħu iwasslu g ħal 
riżultati foloz. G ħalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjuni m ġedda tal- 
kontroll g ħandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.  
1.6. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.6.1.  Apparat  
Il-kontenituri tat-test u żati huma mag ħmula minn materjal kemi ­
kament inert. Dawn g ħandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità 
mal-proċedura użata għall-inkubazzjoni tal- ħamrija. i.e. l-inku ­
bazzjoni fil-massa jew b ħala serje individwai ta' kampjuni tal- 
ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija g ħandha 
tingħata sabiex ikun minimizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun im ħolli l- 
iskambu tal-gass matul it-test (e ż. il-kontenituri tat-test jistg ħu ikunu 
mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati 
sustanzi volatili, kontenituri li jitg ħu ikunu issi ġġillati u li ma 
jgħaddix gass minnhom g ħandhom ikunu w żati. Dawn g ħandhom 
ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tag ħhom ikun mimli bil- 
kampjun tal- ħamrija.  
Għad-determinazzjoni tar-respirazzjoni indotta mill-gluko żju, sistemi 
ta' inkubazzjoni u strumenti g ħall-kejl tal-produzzjoni tad-diossidu 
tal-karbonju jew tal-konsum ta' l-ossi ġenu huma me ħtieġa. Eżempji 
ta' tali sistemi u strumenti huma misjuba fil-letteratura (8) (9) (10) 
(11).  
1.6.2.  L-g ħażla u n-numu ta' ħamrija  
Ħamrija wa ħda hija użata. Il-karatteristi ċi rakkommandati tal- ħamrija 
huma kif ġej: 
— kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar 
minn 75 %.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5-7,5;  
— kontenut tal-karbonju organiku: 0,5-1,5 %;  
— il-biomassa mikrobjali g ħandha tkun imkejla (12)(13) u l- 
pkontenut tal- karbonju tag ħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % 
tal-karbonju organiku totali tal- ħamrija.  
F'bosta ka żi, ħamrija b'dawn il-karatteristi ċi tirrapreżenta l-għar każ 
ta' sitwazzjoni, la darba l-adsorbazzjoni tal-kimika tat-test hija l- 
minimu u d-disponnabbiltà tag ħha lejn il-mikroflora hija l- 
massimu. B'konsehwenza, it-testijiet b' ħamrija oħra huma, ġener­
alemnt, mhux me ħtieġa. B'dana kollu, f' ċerti ċirkostanzi, e ż. meta 
l-użu maġġuri antiċipat tas- sustanza tat-test f' ħamrija partikolari, 
bħal ma huma l- ħamrija a ċiduża tal-foresti, jew g ħal kimiċi 
ikkargati elettrostatikament, jista jkun me ħtieġ li tintuża ħamrija 
addizzjonali.  
1.6.3.  Il- ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal- ħamrija  
1.6.3.1.  Il-ġbir 
L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-g ħalqa minn fejn il- 
ħamrija tat-test hija mi ġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji 
jinkludu l-lokalità e żatta, il-kisi ve ġitali, id-dati tat-trattament bil- 
prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organi ċi, żidiet ta' materjali biolo ġiċi jew kontami ­
nazzjonijiet a ċċidentali. Is-sit mag ħżul għall-ġbir tal-ħamrija għandu 
jkun wieħed li jippermetti u żu f'terminu twil. Merg ħat permanenti, 
għelieqi b'u ċuħ annwali ta ċ-ċereali (apparti mill-qam ħ-ir-rum) jew 
dawk moghtija d-demel b' żergħat iffullata, huma tajbin. Il-g ħażla 
tas-sit tal-kampjunar m'g ħandhiex tkun ġiet trattata bil-prodotti tal- 
protezzjoni ta' l-u ċuħ għam mill-anqas sena qabel il-kampjunar. 
Ukoll, l-ebda fertilizzant organiku ma jkun ġie applikat g ħal mill- 
anqas sitt xhur. L-u żu ta' fertilizzant minerali huwa a ċċettabbli biss 
meta, b'konformità mal- ħtiġiet tal-kampjuni ta' l-u ċuħ u tal-ħ
amrija, 
m'għandhomx ikunu mi ġbura għal mill-anqas tlett xhur wara l-appli ­
kazzjoni tal-fertilizzant. L-u żu ta' ħamrija trattata bil-fertilizzanti li 
għandhom effetti bio ċidali mag ħrufa (eż. is-sijanamid tal-kal ċju) 
għandu jkun evitat.  
Il-kampjunar g ħandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, 
perijodi twal (itwal minn 30 jum) ta' nixfa jew ta' stg ħadir bl-ilma. 
Għal ħamrija ma ħruta, il-kampjuni g ħandhom jin ġabru minn fond ta' 
1 sa 20 cm l-isfel. G ħall art tal-merg ħa (art fil- ħaxix) jew ħamrija 
oħra meta l- ħrit ma jse ħħx, atul perijodi twal (f'mill-anqas sta ġun 
wieħed tat-tkabbir), il-fond massimu tal-kampjunar jista jkun kemm 
xejn aktar minn 20 cm (e ż. sa 25 cm). Il-kampjuni tal- ħamrija 
għandhom ikunu ittrasportati bl-u żu ta' kontenituri u skond 
kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal- ħamrija ma jkunus sinifikament mibdula.
 
1.6.3.2.  Ħażna 
L-użu ta' ħamrija mi ġbura friska mill-g ħelieqi huwa ippreferut. Jekk 
ħażna fil-laboratorju ma tistg ħax tkun evitata, il- ħamrija tista tkun 
maħżuna fid-dlam 4 ± 2  o C għal massimu ta' tlett xhur. Matul il- 
ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobi ċi għandhom ikunu 
assigurati. Jekk il- ħamrija tkun mi ġbura minn żoni ta' fejn din tkun 
iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il- ħażna għal sitt xhur fi 
– 18  o C tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali tal- ħamrija 
maħżuna hija mkejla qabel kull esperiment u l-karbonju fil-biomassa 
għandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal-karbonju organiku 
fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Tqandil u l-preparazzjoni tal- ħamrija g ħat-test  
1.6.4.1.  Pre-inkubazzjoni  
Jekk il-ħamrija kienet ma ħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.4.2 u 1.7.1.3), 
pre-inkubazzjoni hija rakkommandata g ħal perijodu ta' bejn 2 u 28 
jum. It-temperatura u l-umidità tal-kontenut tal- ħamrija matul il-pre- 
inkubazzjoni g ħandhom ikunu simili g ħal dik u żata fit-test (ara 
s-sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Karatteristi ċi fiżiko-kimiċi 
Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn o ġġeti kbar (e ż. ġebel, 
partijiet ta' pjanti, e ċċ.) u imbag ħad magħrbla fin-nieda ming ħajt 
tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' parti ċelli ta' anqas minn jew egwali 
għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal- ħamrija 
għandu jkun a ġġustat b'ila distillat jew dejonizzat lejn valur ta' 
bejn 40 % u 60 % tal-kapa ċità massima ta ż-żamma ta' l-ilma.  
1.6.5.  Preparazzjoni tas-sustanza tat-test g ħall-applikazzjoni mal- 
ħamrija  
Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-u żu ta' trasportatur. 
It-trasportatur jista jkun ilma (g ħal sustanzi li jin ħallu fl-ilma) jew 
solidu inert b ħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-parti ċella: 
0,1 - 0,5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (e ż. solventi 
organiċi bħal ma huma l-a ċetun, il-kloroforma) g ħandhom ikunu 
evitati la darba dawn jistg ħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk 
ir-ramel ikunu u żat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis- 
sustanza tat-test imdewba jew sospi ża f'solvent xieraq. F'tali ka żi, 
is-solvent g ħandu jkun imne ħħi bl-evaporazzjoni qabel it-ta ħlit 
mal-ħamrija. G ħall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil- 
ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija 
(piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma 
ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.  
Meta jkunu ittestjati kemikali volatili, it-telf matul it-trattament 
għandu jkun evitat sa kemm dan ikun possibbli u tentattiv g ħandu 
jsir sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omo ġenja fil-ħamrija (eż. is- 
sustanza tat-test g ħandha tkun injettata fil- ħamrija minn diversi posti ­
jiet). 
1.6.6.  Kon ċentrazzjonijiet tat-test  
Jekk il-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ jew kimi ċi oħrajn b'kon ċen­
trazzjonijiet ambjentali prevedibbli huma ittestjati, mill-anqas żewġ 
konċentrazzjonijiet g ħandhom ikunu w żati. Il-kon ċentrazzjoni l- 
baxxa għandha tirrifletti mill-anqas l-ammont massimu mistenni li 
jilħaq il-ħamrija waqt kondizzjonijiet pratti ċi, fil-waqt li l-kon ċen­
trazzjoni l-g ħolja għandha tkun mutiplu tal-kon ċentrazzjoni l-baxxa. 
Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanza tat-test mi żjuda mal- ħamrija huma 
ikkalkolati billi tkun pre żunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 
5 cm u l-massa tal- ħamrija f'densità ta' 1.5. G ħall-agrokimi ċi li huma 
applikati direttament mal- ħamrija, jew g ħal kimiċi li dwarhom il- 
kwantità li til ħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-kon ċentrazzjonijiet 
tat-test irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concentration (PEC) (Kon ċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u 
ħames darbiet dik il-kon ċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija 
li jkunu applikati diversi drabi mal- ħamrija fi sta ġun wieħed 
għandhom ikunu ittestjati fil-kon ċemntrazzjonijiet derivati mill-multi ­
plikazzjoni tal-PEC bin-numru massimu anti ċipat ta' l-appli
­
kazzjonijiet. L-g ħoila kon ċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, 
m'għandhiex te ċċedi għaxar darbiet il-massimu tar-rata ta' appli ­
kazzjoni wa ħda. 
Jekk dawk li ma humiex agrokimi ċi huma ittestjati, serje ġeome­
trikuta' mill-anqas ħames kon ċentrazzjonijiet g ħandu jkun u żat. Il- 
konċentrazzjonijiet ittestjati g ħandhom ikopru l-medda me ħtieġa tal- 
valuri EC  x . ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. L-IM ĠIEBA TAT-TEST  
1.7.1.  Il-kondizzjonijiet ta' l-espo żizzjoni  
1.7.1.1.  It-trattament u l-kontrol  
Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, il- ħamrija hija divi ża fi tlett porz ­
jonijiet ta' pi ż egwali. Żewġ porzjonijiet huma m ħallta mat-tras ­
portatur li jkun fih il-prodott, u l-ie ħor huwa m ħallat mat-trasportatur 
mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tlett repliki kemm g ħall 
ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk 
dawk li ma humiex agrokimi ċi huma ittestjati, il- ħamrija hija divi ża 
f'sitt porzjonijiet ta' pi ż ugwali. Ħmasa mill-kampjunu huma m ħallta 
mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa 
mħallat mat-trasportatur ming ħajr il-kimika. Tlett replikati ta ż-żewġ 
trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni g ħandha 
tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omo ġenja tas-sustanza 
tat-test fil-kampjunu tal- ħamrija ittrattata. Matul it-ta ħlit, l-ikkum ­
pattjar jew gerbubi mg ħaqqda għandhom ikunu evitati.  
1.7.1.2.  L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija  
L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal- ħamrija tista titwettaq b' żewġ modi: 
Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata 
jew f'serje ta' subkampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi 
volatili huma ittestjati, it-test g ħandu jkun imwettaq biss b'serje ta' 
sub-kampjuni individwali. Meta l- ħamrija tkun inkubata fil-massa, 
kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma 
ippreparati u s-sub-kampjuni g ħall-analiżi huma mi ġbura kif 
meħtieġ matul it-test. L- ammont inizjalment ippreparat g ħal kull 
trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in- numru ta' repliki u żati għall-analiżi u n-numru massimu anti ċipat 
tal-ħinijiet tal-kampjunar. Il- ħamrija inkubata fil-massa g ħamndha 
tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l- ħamrija hija 
inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew 
mhux trattata fil-massa hija divi ża fin-numru me ħtieġ ta' sub- 
kampjuni, u dawn huma utilizzati kif me ħtieġ. Fl-esperimenti meta 
tnejn jew aktar drabi tal-kampjunar jistg ħu ikunu anti ċipati, sub- 
kampjuni bi ż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex iqisu ir- 
replikati kollha u l-waqtiet kollha tal-kampjunar. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal- ħamrija tat-test g ħandhom ikunu inkubati 
permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi (ara s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it- 
testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wi ċċ suffiċjenti, 
għandhom ikunu u żati sabiex ikunu evitati l-kondizzjonijiet 
anerobiċi. Meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test g ħandu jkun 
imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali.  
1.7.1.3.  Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet  
It-test huwa mwettaq fid-dlam f'temepratura tal-kamra ta' 20 ± 2  o C. 
Il-kontenut ta' l-umidità tal-kamjuni tal- ħamrija g ħandu jkun 
miżmum matul it-test g ħal bejn 40 % u 60 % tal-kapa ċità massima 
taż-żamma ta' l-ilma fil- ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.4.2) b'medda ta' ± 
5 %. Ilma distillat jew deonizzat jista jkun mi żjud kif me ħtieġ. 
It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk agrokimi ċi huma 
ittestjati, il-kantitajiet tad-diossidu tal-karbonju rilaxxat jew ta' lk- ossiġenu ikkunsmat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma para ­
gunati. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 25 % fil-jum 28, it- 
test jitkompla sakemm differenza egwali g ħal, jew anqas minn 25 % 
tkun akkwistata, jew g ħal massimu ta' 100 jum, liema minnhom ikun 
l-aqsar. G ħal dawk li ma humiex agrokimi ċi, it-test ikun terminat 
wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwantitajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal- 
ħamrija ittrattata jew tal-kontroll huma determinati u l-valuri EC
 x 
ikunu ikkalkolati.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Kamp ġjunaar u anali żi tal-ħamrija  
1.7.2.1.  Kampjunar skedat tal- ħamrija  
Jekk l-agrokimi ċi huma ittestjati, il-kampjuni tal- ħamrija huma 
analiżżati għan-nitrat fil-jiem 0, 7, 14 u 28. jekk test imtawwal 
ikun meħtieġ, aktar kejl g ħandu jseħħ f'intervalli ta' 14-il jum, 
wara l-jum 28.  
Jekk dawk li ma humiex agrokimi ċi huma ittestjati, mill-anqas ħames 
konċentrazzjonijiet tat-test huma w żati u l-kampjuni tal- ħamrija 
huma anali żżati għan-nitrat fil-bidu (jum 0) u fit-tmiem tal-perijodu 
ta' l-espożizzjoni (28 jum). Kejl intermedju, e ż. fil-jum 7, jista jkun 
miżjud jekk dan ikun meqjus b ħala meħtieġ. L-informazzjoni 
akkwistata fil-jum 28 hija u żata għad-determinazzjoni tal-valux 
ECx dwar il-kimika. Jekk mixtieq, l-informazzjoni mill-jum 0 tal- 
kampjuni tal-kontroll jistg ħu ikunu w żati sabiex jirraportaw il- 
kwanitità inizjali tan-nitrat fil- ħamrija (12).  
1.7.2.2.  Kejl tar-rati tar-respirazzjoni indotti mill-gluko żju 
L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll 
huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. Il-kampjuni tal- ħamrija 
huma mħallta ma ammint suffi ċjenti ta' gluko żju sabiex i ħeġġeġ 
reazzjoni immedjata ta' respirazzjoni massima. L-ammont ta' 
glukożju meħtieġ sabiex i ħeġġeġ ir-reazzjoni respiratorja massima 
minn ħamrija partikolari jista jkun determinat b'test preliminarju li 
jutilizza serje ta' kon ċentrazzjonijiet ta' gluko żju (14). B'dana kollu, 
għal ħamrija mrammla bi 0,5-1,5 % karbonju organiku, 2 000 mg sa 
2 000 mg gluko żju kull kg pi ż tal-ħamrija xotta huwa normalment 
suffiċjenti. Il-gluko żju jistgħa jkun mit ħun fi trab mar-ramel kwarz 
nadif (10 gramel/kd pi ż tal-ħamrija xotta) u im ħallta b'mod 
omoġeniku mal- ħamrija.  
Il-kampjuni tal- ħamrija emendata bil-gluko żju hija inkubata f'apparat 
xieraq għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni, jew kontinwament, kull 
siegħa, jew kull sag ħtejn (ara s-sezzjoni 1.6.1) fi 20 ± 2  o C. Id- 
diossidu tal-karbonju rilaxxat jew l-ossi ġenu ikkunsmat huwa 
mkejjel g ħal 12-il sieg ħa konsekuttivi u l-kejl g ħandu jibda malajr 
kemm jista jkun possibbli, i.w. fi żmien 1 sa 2 sieg ħat wara s- 
supplement tal-gluko żju. Il-kwantitajiet totali tad-diossidu tal- 
karbonju rilaxxata jew l-ossi ġenu ikkunsmat matul it-12-il sieg ħa 
huma mkejla u r-rati medja tar-respirazzjoni huma determinati.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimi ċi, il-kwalità tad-diossidu 
tal-karbonju rilaxxat minn, jew l-ossi ġenu ikkunsmat f'kull replika 
tal-kampjun tal- ħamrija għandha tkun irre ġistrata, u l-valuri medji 
tar-replikati kollha g ħandhom ikunu ipprovduti f'g ħamla tabulari. 
Ir-riżultati għandhom ikunu evalwatu b'metodi statisti ċi xierqa u 
ġeneralment a ċċettabbli (e ż. Test-F, 5 % livell sinifikanti). Ir-rati 
tar-respirazzjoni indotti bil-gluko żju huma espressi fi mg diossidu 
tal-karbonju/kd pi ż tal-ħamrija xotta/sieg ħa jew mg ossi ġenu/piż 
tal-ħamrija xotta/sieg ħa. Il-medja tar-rata tal-formazzjoni tad- 
diossidu tal-karbonju jew il-medja tar-rata tal-konsum ta' l-ossi ġenu 
f'kull trattament huma mqabbla ma dawk tal-kontroll, u d-devjazzjoni 
perċentwali mill-kontroll hija ikkalakolata.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimi ċi, il- 
kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva 
doża-reazzjoni hija ippreparata g ħall-estimi tal-valuri EC  x Ir-rati tar- 
respirazzjoni indotta bil-gluko żju (i.e. mg diossidu tal-karbonju/kg 
piż tal-ħamrija xotta.sieg ħa jew mg ossi ġenu/piż tal-ħamrija 
xotta.sieg ħa) misjuba fil-kampjuni ittrattati wara 28 jum huma 
mqabbla ma dawk misjuba fil-kontroll. Minn din l-informazzjoni, il- % tal-valuri ta' l-inibizzjoni g ħal kull kon ċentrazzjoni tat-test 
huma ikkalkolati. Dawn il-persenta ġġi huma mpin ġija kontra l-kon ċ­
entrazzjoni, u l-pro ċeduri statisti ċi huma mbag ħad użati għall-kalkolu 
tal-valuri EC
 x . Limiti ta' l-affidabbilità (p = 0,95) g ħal EC  x ikkal­
kolati huma wkoll determinati bl-u żu tal-proċeduri normali (15) (16) 
(17).  
2.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Meta r-ri żultati mit-testijiet bl-agrokimi ċi huma evalwati, u d- 
differenza fir-rati tal-formazzjoni tar-respirazzjoni bejn it-trattament 
baxx (i.e. il-massimu tal-kon ċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun 
egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt 
wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat b ħala li jkollu infuwenza 
f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tal-karbonju fil- ħamrija. Meta 
r-riżultati minn testijiet b'kimi ċi apparti milli l-agrokimi ċi huma 
evalwati, il-Valuri EC  50 , EC  25 u/jew EC  10 huma wżati. 
3. RAPPORTA ĠĠ 
RAPPORTTAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Identifikazzjoni s ħiħa tal-ħamrija użata, inklu ż: 
— refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lon ġitudini);  
— informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta ve ġittiva, it- 
trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-u ċuħ, trattamenti bil- 
fertilizzanti, kontaminazzjoni a ċċidentali, e ċċ.); 
— is-sekwenza ta' l-u żu (eż. ħamrija agrikola, foresta, e ċċ.); 
— il-fond tal-kampjunar (cm);  
— il-kontenut ramel/ ħama'/tafal ( % tal-pi ż); 
— pH (fl-ilma);  
— kontenut karbonju organiku ( % pi ż xott);  
— kontenut tan-nitro ġenu organiku ( % pi ż xott);  
— kapaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);  
— biomassa mikrobjali f'termini ta' persenta ġġ tal-karbonju organiku 
totali;  
— referenza g ħall-metodi u żati għad-determinazzjoni ta' kull para ­
metru;  
— l-informazzjoni li tirrigwardja il- ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal- 
ħamrija;  
— dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal- ħamrija, jekk ikun hemm.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u, meta relevanti, il-propjetajiet fi żikokimiċi; 
— l-informazzjoni ta' l-identifikazzjoni kimika, meta relevanti, 
inkluża l-formula strutturali, il-purità (i.e. g ħall-prodotti tal- 
protezzjoni ta' l-u ċuħ il-persenta ġġ ta' l- ingredjent attiv), il- 
kontenut tan-nitro ġenu. 
Kondizzjonijiet tat-test:  
— dettalji ta' l-emenda tal- ħamrija b'substrata organika;  
— in-numru tal-kon ċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test u żata u, meta 
xieraq, ġustifikazzjoni tal-kon ċentrazzjonijiet mag ħżula; 
— dettalji ta' l-applikazzjoni tas-substrata tat-test fil- ħamrija;  
— temperatura ta' l-inkubazzjoni;  
— il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;  
— il-metodu u żat ta' l-inkubazzjoni tal- ħamrija (i.e. b ħala massa jew 
bħala serje ta' subkampjuni individwali);  
— in-numru ta' replikati;  
— id-drabi tal-kampjunar.  
Riżultati:  
— metodu u apparat u żat għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni;  
— dettalji tabulate, inklu żi l-valuri individwali u medji g ħall-kwanti ­
tajiet tad- diossidu tal-karbonju jew ta' l-ossi ġenu; 
— il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;  
— spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk 
relevanti;  
— il-varjazzjoni per ċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull 
waqt tal-kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal- 
valur EC  5 b'95 fil-mija affidibbilità, EC  x oħrajn (i.e. EC  25 jew 
EC 10 ) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva do ża- 
reazzjoni;  
— trattament statistiku tar-ri żultati, meta xieraq;  
— l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' g ħajnuna 
fl- interpretazzjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on 
Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in “Pesticide Effects on Soil Micro ­
flora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in “Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831- 871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a 
Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzen ­
schutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  TRASFORMAZZJONIEROBIKA UANEROBIKA FIL- 
ĦAMRIJA  
1. METODU  
Dan il-Metodu tat-Test huwa replika g ħal OECD TG 307 (2002)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Dan il-Metodu tat-test huwa ibba żat fuq linji ta' gwida e żistenti (1) 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Dan il-metodu deskritt f'dan il-metodu tat-test huwa iddisinjat g ħall-evalwazzjoni tat-trasformazzjoni erobika 
u anerobika tal-kimi ċi fil-ħamrija. L-esperimenti huma mwettqa 
sabiex ikun determinat (i) ir-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test, u (ii) in-natura u r-rata tal-formazzjoni u t-tnaqqis tat- traformazzjoni tal-prodotti li dwarhom il-pjanti u l-organi żmi fil- 
ħamrija jistg ħu ikunu esposti. Tali studji huma me ħtieġa għall- 
kimiċi li huma direttament applikati fil- ħamrija jew li huma 
pjuttost li jil ħqu l-ambjent tal- ħamrija. Ir-ri żultati ta' tali studji fil- 
laboratorju jistg ħu wkoll ikunu w żati sabiex ji żviluppaw il-protokolli 
tal-kampjunar u ta' l-anali żi fl-oqsma ta' studju relatati.
 
L-istudji erobi ċi u anerobi ċi ma tip wie ħed ta' ħamrija huma 
ġeneralment suffi ċjenti għall-evalwazzjoni tal-passa ġġi tat-trasform ­
azzjoni (8) (10) (11). Ir-rati tat-trasformazzjoni g ħandhom ikunu 
determinati f'mill-anqas tlett ħamrija addizzjonali (8) (10).  
Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-G ħażla tal-Ħamrija/Sediment li 
nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (10) qablet dwar in-numru u t- 
tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. It-tipi tal- ħamrija ittestjati 
għandhom ikunu rapre żentattivi tal-kondizzjonijiet ambjentali ta' 
fejn l-użu jew ir-rilaxx ikun sjjer ise ħħ. Per eżempju, il-kimi ċili 
jistgħu ikunu rilaxxati fi klimi subtropikali sa tropikali g ħandhom 
ikunu ittestjati bil-Ferrasoli jew in-Nitrasoli (sistema FAO). Il- Laqgħa ta' Ħidma kienet ukoll g ħamlet rakkommandazzjonijiet li 
jirrigawrjaw il- ġbir, it-tqandil u l- ħażna tal-kampjuni tal- ħamrija, 
ibbażari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (15). L-u żu tal-ħamrija mist ­
għadra (tar-ross) hija wkoll ikkunsidrata f'dan il-metodu.
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Is-sustanza tat-test : Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost 
oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.  
Prodotti tat-trasformazzjoni:  Is-sustanzi kollha li jirri żultaw mir- 
reazzjonijiet tat-trasformazzjoni bioti ċi jew abioti ċi tas-sustanza tat- 
test, inklu żi il-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.  
“Residwi marbuta” : “Residwi marbuta” tirrapre żemnta komposti 
fil-ħamrija, pjanti jew annimali, li jippersistu fil-matri ċi fil-għamla 
ta' sustanza ori ġinali jew tal-prodotti metaboliti/trasformazzjoni wara 
l-estrazzjoni. Il-metodu ta' l-estrazzjoni m'g ħandux sostanzjalment 
jibdel il-komposti nfushom jew l-istruttura tal-matri ċi. In-natura tar- 
rabta tista tkun kjarifikata parzjalment bil-metodi ta' l-estrazzjoni tat- tibdil-tal-matri ċi u b'tekni ċi analitiċi sofistikati. Sal-lum, per e żempju, 
ir-rabtiet kovalenti joni ċi u sorptivi, kif ukoll l-ingassar, kienu ġew 
identifikati b'dan il-mod. Ġeneralment, il-formazzjoni tar-residwi 
marbuta tnaqqas il-bioa ċċessibbiltà u l-biodisponabbiltà sinifikament 
(12) (Modifikati minn IUPAC 1984 (13)).
 
Trasformazzjoni erobika:  Reazzjonijiet li jse ħħu fil-preżenza ta' l- 
ossiġenu molekulari (14).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Trasformazzjoni anerobika : Reazzjonijiet li jse ħħu fl-esklu żjoni ta' 
l-ossiġenu molekulari (14).  
Ħamrija : Hija taħlita ta' kostitwenti kimi ċi minerali u organi ċi, dawn 
ta' l-aħħar ikun fihom komposti ta' kontenut g ħoli tal-karbonju u n- 
nitroġenu u ta' pi żijiet molekulari g ħoljin, animali b'organi żmi żgħat 
(l-aktar mikro-). Il- ħamrija tista tkun imqandla f' żewġ stati:  
(a) mhux disturbata, kif tkun żviluppat matul i ż-żmien, f'saffi 
karatteristi ċi tat-tipi tal-varjetà tal- ħamrija;  
(b) disturbata, kif normalment tinsab f'g ħelieqi ħarratija jew kif 
isseħħ meta l-kampjuni huma mi ġbura bit-t ħaffir u kif u żata 
f'dan il-metodu ta' test (14).  
Mineralizzazzjoni:  Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost 
organiku lejn CO  2 u H  2 O permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi, u 
CH 4 , CO  2 u H  2 O permezz tal-kondizzjonijiet anerobi ċi. Fil-kuntest 
ta' dan il-metodu taa' test, meta kompost bit-tikketta-  14 C ikun u żat, 
il-mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matulha atomu 
tal-karbonu ttikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta'
 14 CO 2 (14).  
Nofs-ħajja: t 0,5 , huwa l- ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas- 
sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil-kineti ċi 
ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-kon ċentrazzjoni.  
DT 50 (Għibien Ħin 50):  Huwa l- ħin li fih il-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %; din hija differenti min-nofs- 
ħajja t0,5 meta t-trasformazzjoni ma tkunx issegwi il-kineti ċi ta' l- 
ewwel ordni.  
DT 75 (Għibien Ħin 75):  Huwa l-ħin li matulu l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.  
DT 90 (Għibien Ħin 90):  Huwa l-ħin li matulu l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Is-sustanzi ta' referenza g ħandhom ikunu w żati għall-karetteriz ­
zazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil- metodi spektroskopi ċi u kromatografi ċi.
 
1.4. L-APPLIKABBILTÀ TAT-TEST  
Il-metodu huwa applikabbli g ħas-sustanzi kimi ċi kollha (mhux ittik ­
kettjati jew radjotikkettjati) li dwarhom metodu analitiku b'e żattezza 
u sensittività suffi ċjenti huma disponibbli. Dan huwa applikabbli 
għal komposti kemm xejn volatili, mhux volatili, li jin ħallu fl-ilma 
jew li ma jin ħallux fl-ilma. It-test m'g ħandux ikun applikat lejn 
kimiċi li huma ferm volatili minn ġewwa l-ħamrija (eż., fumiganti, 
solventi organi ċi) u għalhekk ma jistg ħux jinżammu fil- ħamrija 
skond il-kondizzjonijiet sperimentali ta' dan it-test.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMAZZJONI DWARIS-SUSTANZATAT-TEST  
Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun u żata 
sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni. Il-materjal tikkettjat huwa meħtieġ għall-istudju tal-passa ġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun 
stabbilit il-bilan ċ tal-massa. Tikkettjar-14C huwa rakkommandat 
imma l-u żu ta' iżotopi oħrajn bħal ma huma
 13 C, 15 N, 3 H, 32 P, 
jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm huwa possibbli, it-tikketta 
għandha tkun imqieg ħda fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekolu (  1 ) 
(10). Il-Purità tas-sustanza tat-test g ħandha tkun mill-anqas 95 %.  
Qabel ma jitwettaq test dwar it-trasformazzjoni eronika u amerobika 
fil-ħamrija, l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza tat-test g ħandha 
tkun disponibbli.  
(a) solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);  
(b) solubilità f'solventi organi ċi; 
(ċ) pressjoni tal-fwar (il-Metodu A.4) u l-li ġi kostanti Henry;  
(d) il-koeffi ċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);  
(e) stabbilità kimika fid-dlam (idrolisi) (il-Metodu C.7);  
(f) pKa jekk il-molekolu jkun probabbli g ħal protonazzjoni jew 
deportonazzjoni (OECD Linja ta' Gwida 112) (16).  
Informazzjhoni utili o ħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossi ċità tas- 
sustanza tat-test fuq il-mikro-organi żmi tal-ħamrija (il-Metodi tat- 
Testijiet C.21 u C.22) (16).  
Il-metodi analiti ċi (inklużi l-metodi ta' l-estrazzjoni u tat-tindif) g ħall- 
kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tat- traformazzjoni tal-prodotti tag ħha, għandhom ikunu disponibbli.
 
1.6. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-kampjuni tal- ħamrija huma ittrattati bis-sustanza tat-test u inkubati 
fid-dlam f'garafini tat-tip biometri ċi jew f'sistemi ta' nixxija kontinwa 
skond il-kondizzjonijiet kontrollati tal-laboratorju (f'temepratura u l- umidità tal- ħamrija kostanti). Wara intervalli ta' ħin xieraq, il- 
kampjuni tal- ħamrija huma estratti u analizzati mis-sustanza 
oriġinali u għall-prodotti tat-trasformazzjoni. Prodotti volatili huma 
wkoll, mi ġbura għall-analiżi bl-użu ta' apparati xierqa ta' l-assor ­
bazzjoni. Bl-u żu tal-materjal ittikkettjat-
 14 C, ir-rati varji tal-mineraliz ­
zazzjoni tas-sustanza tat-test jistg ħu ikunu mkejla bin-nassa evoluta  
14 CO 2 u l-bilanċ tal-massa, inklu ża l-formazzjoni ta' residwi marbuta 
mal-ħamrija, jisg ħu ikunu stabbiliti.  
1.7. KRITERJI TAL-KWALITÀ  
1.7.1.  Irkupru  
L-estrazzjoni u l-anali żi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati 
tal-ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tag ħti l-ewwel indi ­
kazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu nalitiku u ta' l-uniformità tal- proċedura ta' l-applikazzjoni g ħas-sustanza tat-test. L-irkupri fi 
stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mog ħtija bil-bilan ċi rispettivi 
tal-massa. L-irkupri g ħandhom ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 
110 % tal-kimi ċi ittikkettjati (8) u minn 70 % sa 110 % g ħal 
kimiċi mhux ittikkettjati (3).
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Per eżempju, jekk is-sustanza g ħat-test ikun fiha ċirku wieħed. L-ittikkettjar fuq dan i ċ- 
ċriku huwa me ħtieġ. Jekk is-sustanza g ħat-test ikun fiha żewġ ċrieki jew iktar, studji 
separati jistg ħu jkunu me ħtieġa biex tiġi evalwata x-xorti ta' kull ċirku ttikkettjat u biex 
tinkiseb informazzjoni adattata dwar il-formazzjoni tal-prodotti ta' trasformazzjoni.
 1.7.2.  Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku  
Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (esklu ża l-peffiċjenza ta' l- 
estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'anali żi 
dupplikata ta' l-istess estratt tal- ħamrija, inkubat g ħal tul ta' żmien 
biżżejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.
 
Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku 
għas-sustanza tat-test u g ħat-trasformazzjoni tal-prodotti g ħandu jkun 
mill-anqas 0,01 mg.kg-1 ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1& tad- 
doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifi ­
kazzjoni (limit of quantification (LOQ)) g ħandu wkoll ikun spe ċ­
ifikat.  
1.7.3.  L-e żatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni  
Analiżi regressiva tal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test b ħala 
funzjoni tal- ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità 
tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti 
affidabbli ta' nofs- ħajjiet (fil-ka ż ta' psewdo kineti ċi ta' l-ewwel 
ordni) jew il-valuri DT  50 u, jekk xieraq, il-valuri DT  75 u DT  90 . 
1.8. ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.8.1.  Apparat u rea ġenti kimi ċi 
Is-sistemi ta' l-inkubazzjoni jikkonsistu minn sistemi stati ċi magħluqa 
jew sistemi xierqa ta' nixxija kontinwa (7)(17). E żempji ta' l-apparat 
xieraq ta' nixxija kontinwa fil- ħamrija u l-garafina tat-tip-biometriku 
huma murija fil-Fihuri 1 u 2, rispettivament. I ż-żewġ tipi tas-sistemi 
ta' l-inkubazzjoni g ħandhom vanta ġġi u limitazzjonijiet (7)(17).  
Apparat normali tal-laboratorju huwa me ħtieġ, u speċjalment dan li 
ġej: 
— Strumenti analiti ċi bħal ma huma l-apparat GLC, HPLC, TLC, 
inklużi s-sistemi xierqa ta' sejbien g ħall-analiżi ta' sustanzi radjo- 
tikketta jew mhux-tikketta jew metodu tat-trattib ta' l-i żotopi 
inversi;  
— Strumenti g ħall-iskopijiet ta' l-identifikazzjoni (e ż. MS, GC-MS, 
HPLC-MS, NMR, e ċċ.); 
— Strument ta' l-g ħadd tal-likwidu xintillanti;  
— Ossidizzatur g ħall-kombustjoni tal-materjal radjo-attiv;  
— Ċentrifuga;  
— Apparat ta' l-estrazzjoni (per e żempju, tubi ta ċ-ċentrifuga g ħal 
estrazzjoni fil-kiesa ħ u apparat Soxhlet g ħal estrazzjoni 
kontinwa ta ħt ir-refluss);  
— Strumentazzjoni g ħall-konċentrazzjoni tat-ta ħlitiet u l-estratti (e ż. 
evaporator rotanti);  
— Banju ta' l-ilma;  
— Apparat mekkaniku tat-ta ħlit (eż. maagna li tag ħġen, ħallati 
rotanti).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Ir-reaġenti kimiċi użati jinklusu, per e żempju:  
— NaOH, grad analitiku, 2 mol. dm  -3 , jew bażi oġra xierqa (e ż. 
KOH, ethanolamine);  
— H  2 SO 4 , grad analitiku, 0,05 mol. dm  -3 ; 
— Ethylene glycol, grad analitiku;  
— aterjali solidi ta' l-assorbazzjoni b ħal ma huma l- ġir tas-soder u l- 
buqi tal-polyurethane;  
— Solventi organi ċi, grad analitiku, b ħal ma hu l-a ċetun, il-metanol, 
eċċ.; 
— Likwidu tax-xintillazzjoni.  
1.8.2.  L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test  
Għal żieda ma, u d-distribuzzjoni fil- ħamrija, is-sustanza tat-test tista 
tkun imdewwba fl-ilma (deonizzat jew distillat) jew, meta me ħtieġ, 
f'ammonti minimi ta' a ċetun jew solventi organi ċi oħrajn (6) li fihom 
is-sustanza tat-test tkun tin ħall u stabbli b'mod suffi ċjenti. B'dana 
kollu, l-ammont ta' solvent mag ħżul m'għandux ikollu influwenza 
sinifikanti fuq l-attività mikrobjali tal- ħamrija (ara s-sezzjonijiet 1.5 
u 1.9.2-1.9.3) L-u żu ta' solventi li jfixklu l-attività mikrobjali, b ħal 
ma huma l-kloroform, id-diklorometanju u solventi ħaloġenizzati 
oħrajn, għandu jkun evitat.  
Is-sustanza tat-test tista wkoll tkun mi żjuda bħala solidu, e ż. mħallta 
mar-ramel kwatrz (6) jek f'test żgħir ta' sub-kampjun tal- ħamrija li 
tkun ġiet imnixxfa fl-arja u sterilizzata. Jekk is-sustanza tat-test hija 
miżjuda bl-użu ta' solvent, is-solvent g ħandu jkun im ġolli li jevapora 
qabel ma s-sub-kampjun hekk mi żjud ikun im ħallat mal-kampjun 
oriġinali mhux-sterili tal- ħamrija.  
Għal kimiċi ġenerali, li r-rotta ma ġġura tad-dħul tagħhom fil-ħamrija 
hija matul l-applikazzjoni tal- ħama' tad-drena ġġ/mill-ħmieġ ta' l- 
annimali, is-sustanza tat-test g ħandha l-ewwel tkun mi żjuda mal- 
ħama' li imbag ħad tkun mi żjuda mal-kampjun tal- ħamrija. (ara s- 
sezzjonijiet 1.9.2 u 1.9.3)  
L-użu ta' prodotti formulati mhux, b ħala rutina, rakkommandat. 
B'dana kollu, e ż. għal sustanzi tat-test li ma tantx jin ħallu, l-użu ta' 
materjal; formulat jista jkun alternattiva xierqa.  
1.8.3.  Il- ħamrija  
1.8.3.1.  L-għażla tal-ħamrija  
Għad-determinazzjoni tal-passa ġġ tat-trasformazzjoni, ħamrija 
rapreżentattiva tista tkun u żata' ħamrija grassa mrammla jew 
ħamrija grassa bil- ħama' jew ħamrija grassa jew ramel grass 
(skond il-klassifikazzjoni FAO u USDA 18) bi pH ta' 5,5-8,0, kontenut karboniku organiku ta' 0,5-2,5 % u biomassa mikrobjali 
ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali hija rakkommandata 
(10).
 
Għall-istudji tar-rata tat-trasformazzjoni mill-anqas tlett żidiet tal- 
ħamrija għandhom ikunu w żati li jirrapre żentaw medda ta' ħamrija 
relevanti. Il- ħamrija għandha tvarja fil-kontenut karboniku organiku, 
pH, kontenut tat-tafal u l-biomassa mikrobjali (10).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Il-ħamrija kollha g ħandha tkun karatterizzata, mill-anqas, g ħal tiswir 
( % ramel, % ħama', % tafal) (skond il-klassifikazzjoni FAO u 
ESDA (18)), pH, kapa ċità ta' skambju tal-jonji, karbonju organiku, 
densità tal-massa, karatteristi ċi taż-żamma ta' l-ilma [2] (  1 ) u l- 
bijomassa mikrobjali (biss g ħal studju erobi ċi). Informazzjoni 
addizzjonali dwar il-propjetajiet tal- ħamrija jistg ħu ikunu utili fl- 
interpretazzjoni tar-ri żultati. Għad-determinazzjoni tal-karatteristi ċi 
tal-ħamrija, il-metodi rakkommandati fir-referenzi (19) (20) (21) 
(22) (23) jistg ħu ikunu w żati. Il-bijomassa mikrobjali g ħandha tkun 
determinata bl-u żu tar-respirazzjoni indotta-fis-sub-strata (substrate- 
induced respiration (SIR)) il-metodu (25) (26) jew metodi alternattivi (20).
 
1.8.3.2.  Ġbir, tqandil, u l- ħażna tal-ħamrija  
L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-g ħalqa minn fejn il- 
ħamrija tat-test hija mi ġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji 
jinkludu l-lokalità e żatta, il-kisi ve ġitali, id-dati tat-trattament bil- 
prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti 
organiċi u mhux-organi ċi, żidiet ta' materjali biolo ġiċi jew kontami ­
nazzjonijiet a ċċidentali. Jekk il- ħamrija tkun ġiet ittrattata bis- 
sustanza tat-test jew bl-analogi strutturali tag ħha matul l-erba' snin 
preċedenti, dawn m'g ħandhomx ikunu u żati għall-istudji tat-trans ­
formazzjoni (10) (15).  
Il-ħamrija għandha tkun mi ġbura friska mill-g ħalqa (mill-orizzont A 
jew mis-saff tal-wi ċċ f'20 cm) b'kontenut ta' l-ilma fil- ħamrija li 
jiffaċilita l-għarbiel. Għal ħamrija oħra apparti milli dik mistg ħadra, 
il-kampjunar g ħandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, 
perijodi twal (> 30 jum) ta' nixfa, ġlata jew mifqug ħa bl-ilma (14). 
Il-kampjuni g ħandhom ikunu trasportati b'manjera li tnaqqas it- 
tibdiliet fil-kontenut ta' l-ilma fil- ħamrija u g ħandhom jin żammi 
fid-dlam b'a ċċess liberu ta' arja, kemm jista jkun possibbli. Bor ża 
tal-plastik, kemm xejn marbuta, hija ġeneralment adekwata g ħal dan 
l-iskop.  
Il-ħamrija għandha tkun pro ċessata malajr kemm jista jkun possibbli 
wara l-kampjunar. Ve ġitazzjoni, fawna kbira tal- ħamrija u ġebel 
għandhom ikunu mne ħħija qabel ma l- ħamrija tkun mog ħddija 
minn għarbiel ta' 2 mm li jne ħħli ġebel żgħar, fawna u l-frak tal- 
pjanti. Tnixxif estensiv u t-tis ħiq tal-ħamrija, qabel l-g ħarbiel, 
għandhom ikunu evitati (15).  
Meta il-kampjunar fil-g ħalqa jkun diffi ċli fix-xitwa (il- ħamrija iffri żta 
jew koperta f'saffi ta' borra), din g ħandha tin ġabar mil-ħamrija tal-lott 
maħżuna f'serra b'koperta ta' pjanti (e ż. ħaxix jew ta ħlita ta' ħaxix u 
silla) L-istudji bil- ħamrija mi ġbura friska mill-g ħalqa huma ferm 
prefereuti, imma jekk il- ħamrija mi ġbura u ippro ċessata ikunu ti ġi 
maħżuna qabel il-bidu ta' l-istudju, il-kondizzjonijiet tal- ħażna 
għandhom ikunu adekwati u biss g ħal-limitu ta' żmien (4 ± 2  o C 
għal massimu ta' tlett xhur) sabiex jin żamm l-attività mikrobjali (  2 ) 
1. Struzzjonijiet dettaljati dwar il- ġbir, it-tqandil u l- ħażna tal- 
ħamrija, li g ħandha tkun u żata fl-esperimenti tal-biotrasformazzjoni, 
jistgħu jinstabu fi (8) (10) (15) (26) (27).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Il-karatteristika tar-ritenzjoni ta' l-ilma fil- ħamrija tista' titkejjel b ħala field capacity , bħala 
kapaċità taż-żamma ta' l-ilma jew b ħala water suction tension (pF).  Għall-ispjegazzjoni 
ara Anness 1. G ħandu jiġi r-rappurtat fir-rapport ta-test jekk il-karatteristi ċi tar-ritenzjoni 
ta' l-ilma u d-densità goffa tal- ħamrija ġew determinati fil-kampjuni ta' l-g ħelieqi  not 
disturbed  jew f'kampjuni  disturbed  (proċessati). 
( 2 ) Recent research results indicate that soils from temperate zones can also be stored at 
–20  o C for more than three months (28)(29) without significant losses of microbial 
activity.
 Qabel ma l- ħamrija ippro ċċessata tkun u żata f'dan it-test, din 
għandha tkun l-ewwel inkubata sabiex tippermetti l- ġerminazzjoni 
u t-tneħħija taż-żrieragħ, u sabiex ikun stabbilit mill- ġdid l-ekwi ­
libriju tal-metaboli żmu mikrobjali b ħala segwiment tal-kambju mill- 
kampjunar jew mill-kondizzjonijiet tal- ħażna lejn il-kondizzjonijiet 
ta' l-inkubazzjoni. Perijodu ta' qabel l-inkubazzjoni ta' bejn 2 u 28 
jum, li jqarreb it-temperatura u l-kondizzjonijiet ta' l-umidità tat-test attwali huma ġeneralment adekwati (15).I ż-żmien tal- ħażna u ta' 
qabel l-inkubazzjoni, flimkien, m'g ħandhomx je ċċedu t-tlett xhur.
 
1.9. L-IM ĠIEBA TAT-TEST  
1.9.1.  Kondizzjonijiet tat-test  
1.9.1.1.  Temperatura tat-test  
Matul il-perijodu kollu tat-test, il- ħamrija għandha tkun inkubata fid- 
dlam f'temperatura kostanti li tirrapre żenta l-kondizzjonijiet klimati ċi 
ta' fejn l-u żu jew ir-rilaxx ikun sejjer ise ħħ. Temperatura ta' 20 ± 
2 o C hija rakkommandata g ħas-sustanzi kollha tat-test li jistg ħu 
jilħqu t-temperatura klimatika tal- ħamrija. It-temperatura g ħandha 
tkun sorveljata.  
Dwar il-kimi ċi applikati jew rilaxxati fi klimi kes ħin (eż. pajjiżi tat- 
tramunta, matul il-perijodi tal- ħarifa/xitwa), kampjuni addizzjonali 
tal-ħamrija g ħandhom ikunu inkubati imma f'temperatura aktar 
baxxa (eż. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Il-kontenut ta' l-umidità  
Għat-testijiet tat-trasformazzjoni permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi, 
il-kontenut ta' l-umidità tal- ħamrija (  1 ) 2għandu jkun a ġġustat lejn u 
miżmum fi pF bejn 2,0 u 2,5 (3). Il- kontenut ta' l-umidità fil- ħamrija 
huwa espress b ħala massa ta' l-ilma g ħal kull massa ta' ħamrija xotta 
u għandu jkun ikkontrollat regolarment (e ż. f'intevalli ta' ġimgħatejn) 
bl-użin fil-garafini ta' l-inkubazzjoni u t-talf ta' l-ilma kumpensdat 
biż-żieda ta' l-ilma (preferibbilment ilma tal-vit sterilizzat mill-filtru). 
Attenzjoni g ħandha ting ħata sabiex ikunu prevenuti jew minimizzati 
t-telf tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni bil- 
volatilizzazzjoni u/jew il-fotodegradazzjoni (jekk ikun hemm) matul 
iż-żieda ta' l-umidità.  
Għat-testijiet tat-trasformazzjoni fil-kondizzjonijiet anerobi ċi u mist­
għadra, il-ħamrija tkun saturata bl-ilma mfawwar.  
1.9.1.3.  Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni erobika  
Fis-sistimi tan-nixxija kontinwa, il-kondizzjonijiet erobi ċi ikunu 
miżmuma bit-tla ħliħ intermittenti jew bil-ventilazzjoni kontinwa 
b'arja umidifikata. Fil-garafini biometri ċi, skambju ta' l-arja jkun 
miżmum b'diffu żjoni. 
1.9.1.4.  Kondizzjonijiet erobi ċi sterili  
Sabiex tkun akkwistat l-informazzjoni dwar ir-releavanza tat-tras ­
formazzjon abjotika tas-sustanza tat-test, kampjunu tal- ħamrija 
jistgħu ikunu sterilizzati (g ħall-metodi ta' l-isterilizzazzjoni ara r- 
referenzi 16 u 29), ittrattati bis-sustanza sterili tat-test (e ż. żieda ta' 
taħlita matul filtru sterili) u mog ħtija l-arja bl-u żu ta' arja sterili 
umidifikata kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.3, G ħal ħamrija mistg ħadra, 
ħamrija u ilma g ħandhom ikunu sterilizzati u l-inkubazzjoni g ħandha 
tkun imwettqa kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.6.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Il-ħamrija la g ħandha tkun imxarrba wisq u lanqas niexfa wisq sabiex tin żamm l- aeration  
adegwata u n-nutrizzjoni tal- ħamrija  microflora.  Kontenuti ta' umdità rakkomandati 
għall-medda tat-tkabbir mikrobbjali ottimali minn 40-60 % il-kapa ċità taż-żamma ta' l- 
ilma (WHC) u minn 0,1-0,33 bar (6). Il-medda ta' l-a ħħar hija ekwivalenti g ħall-medda 
pF-ta' 2,0 – 2,5. Il-kontenuti ta' umdità tipi ċi ta' tipi varji ta' ħamrija huma mog ħtija 
f'Anness 2.
 1.9.1.5.  Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni anerobika  
Sabiex ikunu stabbiliti l-kondizzjonijiet amerobi ċi, il-ħamrija 
ittrattata mis-sustanza tat-test u unkubata fil-kondizzjonijiet erobi ċi 
għal 30 jum jew g ħal “nofs-ħajja” waħda jew DT  50 (liema minnhom 
ikun l-iqsar) hija mbag ħad mistgħadra fl-ilma (saff ta' 1-3 cm ilma) u 
s-sistema ta' l-inkubazzjoni mla ħilħa b'gass inert (e ż. nitroġenu jew 
argonu) (  1 ) 3. Is-sistema tat-test g ħandha tippermetti l-kejl b ħal ma 
huma pH, kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu u l-potenzal redox u tinkludi 
l-apparati tan-nassa g ħal prodotti volatili. Sistema tat-tip biometrika 
għandha tkun mag ħluqha sabiex tevita id-d ħul ta' l-arja bid- 
diffużjoni. 
1.9.1.6.  Kondizzjonijiet ta' l-ikubazzjoni fil-mistg ħadar  
Sabiex tkun studjata t-trasformazzjoni tal- ħamrija fl-g ħelieqi mist ­
għadra tar-ross, il- ħamrija tkun mifquha fl-ilma b'saff ta' madwar 
1-5 cm u s-sustanza tat-test tkun applikata mal-fa żi ta' l-ilma (9). 
Ħamrija b'fond ta' mill-anqas 5 cm hija rakkomandabbli. Is-sistema 
hija ventilata bl-arja permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi, il-pH, il- 
konċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu u l-potenzal tar-redox fis-saff akweju 
għandhom ikunu sorveljati u irraportati. Perijodu ta' pre-inkubazzjoni 
ta' mil anqas ġimghatejn huwa me ħtieġ qabel ma jibdew l-istudji tat- 
trasformazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.3.2).  
1.9.1.7.  It-tul tat-test  
Ir-rata u l-passa ġġ ta' l-istudji g ħandhom normalment ma je ċċedux 
120 jum (  2 ) 4(3) (6) (8), min ħabba li wara dan, tnaqqis fl-attività 
mikrobjali tal- ħamrija mal-mog ħdija taż-żmien tkun mistennija 
f'sistema artifi ċjali tal-laboratorju li tkun i żolata mit-ti ġdid naturali. 
Meta meħtieġ għall-karatterizzazzjoni tat-tnaqqis fis-sustanza tat-test 
u fil-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni ma ġġuri, 
l-istudji jistg ħu ikomplu g ħal perijodi itwal (e ż. 6 jew 12 il-xahar) 
(8). Perijodi itwal ta' inkubazzjoni g ħandhom ikunu ġustifikati fir- 
rapport tat-test u akkumpanjati bil-kejl tal-biomassa matul u fit- 
tmiem ta' dawn il-perijodi.  
1.9.2.  It-twettieq tat-test  
Madwar 50 sa 200 g ħamrija (pi ż xott bażiku) ikun imqieg ħed f'kull 
garafina ta' l-inkubazzjoni (ara l-Figuri 1 u 2 fl-A Żnness 3) u l- 
ħamrija ittrattata bis-sustanza tat-test b'wie ħed mill-metodi deskritti 
fis-sezzjoni 1.8.2. Meta s-solventi organi ċi huma w żati għall-appli­
kazzjoni tas-sustanza tat-test, dawn g ħandhom ikunu mne ħħija mill- 
ħamrija bl-evaporazzjoni. Il- ħamrija tkun kompletament im ħallta bi 
spatula u/jew bi ċ-ċekċik tal-garafina. Jekk l-istudju jkun imwettaq 
fil-kondizzjonijiet ta' g ħalqa mistg ħadra, il- ħamrija u l-ilma 
għandhom ikunu m ħallta sewwa wara l-applikazzjoni tas-sustanza 
tat-test. Siltiet żgħar (eż. 1 g) tal- ħamrija ittrattata g ħandhom ikunu 
analizzati g ħas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni 
uniformi. G ħal metodu alternattiv, ara hawn ta ħt. ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Il-kundizzjonijiet ajrobi ċi huma dominanti fil- ħamrija tal-wi ċċ kif ukoll fis- sub-surface  
tal-ħamrija kif jidher fil-pro ġett ta' riċerka sponsorjat mill-UE. [K. Takagi et al. (1992). 
Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects 
Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Il-kundizzjonijiet 
ajrobiċi jistgħu jseħħu biss okka żjonalment meta il- ħamrija tinfaqa' bl-ilma wara xita 
qawwija jew meta jkun hemm kundizzjonijiet ta' ross li g ħadu fil-ħliefa fl-għelieqi tar- 
ross. 
(
 2 ) L-istudji ajrobi ċi jistgħu jintemmu ħafna qabel 120 jum sakemm l- ultimate trans ­
formation pathway  u l- ultimate mineralisation  jintlaħqu tajjeb sa dak i ż-żmien. It- 
terminazzjoni tat-test hija possibbli wara 120 jum, jew meta mill-inqas 90 % tas- 
sustanza g ħat-test jiġi trasformat, i żda biss jekk mill-inqas 5 % CO  2 jiġi ffurmat.
 It-trattament g ħandu jkun jikorrespondi g ħall-għola rata ta' l-appli ­
kazzjoni tal-prodott g ħall-protezzjoni ta' l-u ċuħ kif rakkommandat fl- 
istruzzjonijiet ta' l-u żu u l-inkorporazzjoni uniformi sa fond xieraq 
fil-għalqa (eż. is-saff ta' fuq,10 cm (  1 ) 5 tal-ħamrija). Per e żempju, 
għall-kimiċi tat-tħaddir jew tal- ħamrija applikati ming ħajr inkorpo ­
razzjoni, il-fond xieraq g ħall-kalkolazzjoni ta' kemm kimika g ħandha 
tkun miżjuda ma kull garafina huwa 2,5 cm. G ħal ħamrija inkor ­
porata bil-kimi ċi, il-fond xieraq huwa l-fond ta' l-inkorporazzjoni 
speċifikat fl-istruzzjonijiet ta' l-u żu. Għal kimiċi ġenerali, ir-rata ta' 
l-applikazzjoni g ħandha tkun ikkalkolata fuq il-ba żi tar-rotta l-aktar 
relevanti tad-d ħul; per e żempju, meta r-rotta ewlenija tal-d ħul fil- 
ħamrija hija mil- ħama' tad-drena ġġ, il-kimika g ħandha tkun do żata 
fil-ħama' f'kon ċentrazzjoni li tirrefletti l-kon ċentrazzjoni mistennija 
tal-ħama' u l-ammont ta' ħama' miżjud mal-ħamrija għandu jirrefletti 
t-tgħabija normali tal- ħama' mal- ħamrija agrikola. Jekk din il-kon ċ­
entreazzjoni ma tkunx g ħola biżżejjed sabiex tidentifika l-prodotti 
maġġuri tat-trasformazzjoni, inkubazzjoni separata tal-kampjunu tal- 
ħamrija li jkun fiha rati g ħoljinm jista jkun ta' g ħajnuna, imma rati 
eċċessivi li jinfluwenzaw il-funzjonijiet mikrobjali g ħandhom ikunu 
evitati (ara s-sezzjonijiet 1.5 u 1.8.2).  
B'mod alternattiv, lott kbit (i.e. 1 sa 2 kg) ta' ġamrija jista jkun 
ittrattat bis-sustanza tat-test, im ħalta bil-galbu f'magna xierqa tat- 
taħlit u imbag ħad trasferita f'porzjonijiet żgħat ta' 50 sa 200 g fil- 
garafini ta' l-inkubazzjoni (per e żempju bl-u żu tal-qsim tal-kampjun). 
Siltiet żgħar (eż. 1 g) tal- ħamrija ittrattata g ħandhom ikunu analizzati 
għas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni uniformi. 
Tali proċedura hija preferibbli la darba tippermetti g ħal aktar distri ­
buzzjoni uniformi tas-sustanza tat-test fil- ħamrija.  
Ukoll, kampjuni mhux trattati huma inkubati permezz ta' l-istess 
kondizzjonijiet (erobi ċi) bħall-kampjuni trattati bis-sustanza tat-test. 
Dawn il-kampjuni huma w żati għall-kejl tal-biomassa matul u fit- 
tmiem ta' l-istudji.  
Meta s-sustanza tat-test hija applikata mal- ħamrija mdewwba fl- 
solvent(i) organi ċi, kampjuni tal- ħamrija ittrattat bl-istess ammont 
ta' solvent(i) huma inkubati bl-istess kondizzjonijiet (erobi ċi) bħall- 
kampjuni ittrattati bis-sustanza tat-test. Dawn il-kampjuni huma w żati 
għall-kejl tal-biomassa, inizjalment, matul u fit-tmiem ta' l-istudji 
sabiex jivverifikaw l-effetti tas-solvent(i) fuq il-biomassa mikrobjali.  
Il-garafini li jkun fihom ħamrija ittratta huma jew imwa ħħla mas- 
sistema tan-nixxija kontinwa deskritta fil-Figura 1 jew mag ħluqa 
mal-kolobba ta' l-assorbozzjoni murija fil-Figura 2 (ara l-Anness 3).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Il-kalkolu tal-kon ċentrazzjoni inizjali fuq  area basis  bl-użu ta' l-ekwazzjoni li ġejja: 
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ · 10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ · 10  4 ½m 2=haâ · d kg  soil=m 3 h i  
C soil = Il-kon ċentrazzjoni inizjali fil- ħamrija [mg.kg  -1 ] 
A = Ir-rata ta’ applikazzjoni [kg.ha  -1 ]; 1 = il-ħxuna tas-saff ta’ ħamrija ta’ l-g ħalqa 
[m]; d =  dry bulk  density tal- ħamrija [kg.m  - 3 ]. 
Bħala regola, rata ta’ applikazzjoni ta’ 1 kg.ha  -1 tirriżulta f’kon ċentrazzjoni ta’ ħamrija ta’ 
bejn wieħed u ieħor 1 mg.kg  -1 f’saff ta’ 10 cm (jekk tassumi  bulk density  ta’ 1 g . cm  -3 ).
 1.9.3.  Kampjunar u kejl  
Garafini doppji ta' l-inkubazzjoni huma mne ħħija fl-intervalli xierqa 
tal-ħin u l-kampjuni tal- ħamrija estratti bis-solventi xierqa ta' polarità 
differenti u analizzati g ħas-sustanza tatA = Ir-rata ta' applikazzjoni 
[kg.ha  -1 ]; 1 = il- ħxuna tas-saff ta' ħamrija ta' l-g ħalqa [m]; d =  dry 
bulk density  tal-ħamrija [kg.m-  3 ]. Bħala regola, rata ta' applikazzjoni 
ta' 1 kg.ha  -1 tirriżulta f'kon ċentrazzjoni ta' ħamrija ta' bejn wie ħed u 
ieħor 1 mg.kg  -1 f'saff ta' 10 cm (jekk tassumi  bulk density  ta' 1 g 
. cm  -3 ). test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni. Studju iddisinjat 
sewwa jinkludi garafini suffi ċjenti hekk li żewġ garafini jkunu 
sagrifikati f'kull darba tal-kampjunar. Ukoll, it-ta ħlitiet ta' l-assor ­
bazzjoni jew il-materjali solidi ta' l-assorbazzjoni ikunu mne ħħija 
f'intervalli varji tal- ħin (intervalli ta' sebat ijiet matul l-ewwel xhar 
u intervalli ta' 17 il-jum wara xhar) matul u fit-tmiem ta' l-inku ­
bazzjoni ta' kull kampjun tal- ħamrija, u analizzati g ħall-prodotti 
volatili. Apparti mil-kampjun tal- ħamrija mi ġbur direttament wara 
l-applikazzjoni (jum 9 tal-kampjunar) mill-anqas 5 punti addizzjonali tal-kampjunar g ħandhom ikunu nklu żi. L-intervalli ta ż-żmien 
għandhom ikunu mag ħżula b'tali mod li l-g ħamla tat-tnaqqis tas- 
sustanza tat-test u l-g ħamla tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti 
tat-trasformazzjoni jistg ħu ikunu stabbiliti (e ż. 0, 1, 3, 7 tijiem; 2, 
3 ġimghat; 1, 3, 3 xhur, e ċċ.).
 
Meta jsir u żu mis-sustanza tat-test tikkettjata-  14 C, radjoattività mhux- 
estrattibbli tkun kwantifikata bil-kombustjoni u l-bilan ċ tal-massa 
tkun ikkalkolata g ħal kull intervall tal-kampjunar.  
Fil-każ ta' l-inkubazzjoni anerobika u mistg ħadra, il-fa żijiet tal- 
ħamrija u ta' l-ilma huma analizzati flimkien g ħas-sustanza tat-test 
u tal-prodotti tat-trasformazzjoni jew separatament bil-filtrazzjoni jew 
biċ-ċentrifugazzjoni qabel l-estrazzjoni u l-anali żi. 
1.9.4.  Testijiet Opzjonali  
L-istudju erobi ċi, mhux-sterili, f'temperaturi addizzjonali u umidità 
tal-ħamrija, jistg ħu ikunu utili g ħall-kalkolu ta' l-influwenza tat- 
temperatura u l-umidità tal- ħamrija fuq ir-rati tat-trasformazzjoni 
tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni tag ħha fil- 
ħamrija.  
Aktar karatterizzazzjoni tar-radjoattività mhux-estrattibbli tista tkun 
ipprovata bl-u żu ta', per e żempju, estrazzjoni superfi ċjali likwida.  
2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
L-ammonti tas-sustanza tat-test, tal-prodotti tat-trasformazzjoni, is- 
sustanżi volatili (fi % biss) u huma mhux-estrattibbli g ħandhom 
ikunu murija b ħala % tal-kon ċentrazzjoni inizjalment applikata u, 
meta xieraq, b ħala mg.kg  -1 ħamrija (ibba żata fuq il-pi ż tal-ħamrija 
xorra) għal kull interval tal-kampjunar. Bilan ċ tal-massa g ħandu jkun 
muri f'persenta ġġ tal-konċentrazzjoni inizjalmeent applikata g ħal kull 
intervall tal-kampjunar. Pre żentazzjoni grafika tal-kon ċentrazzjonijiet 
tas-susstanza tat-test kontra ż-żmien tkun tippermetti kalkolu tan- 
nofs-ħajja tat-trasformazzjoni tag ħha jew DT  50 . Prodotti ta' trasform ­
azzjoni ma ġġuri għandhom ikunu identifikati u l-kon ċentrazzjonijiet 
tagħhom għandhom ukoll ikunu pin ġuti kontra ż-żmien sabiex juru r- 
rati tal-formazzjoni t-tnaqqis tag ħhom. Prodott ta' trasformazzjoni 
maġġuri huwa kwalunkwe prodott li jirrapre żenta = 10 % tad-do ża 
applikataa fi kwalunkwe waqt matul l-istudju.  
Il-prodotti volatili kin ingastati jag ħtu xi indikazzjoni tal-potenzal 
volatili ta' sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni tag ħha 
mill-ħamrija.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Determinazzjonijiet aktar e żatti ta' nofs- ħajja jew tal-valuri DT  50 u, 
jekk xieraq, il-valuri DT  75 u DT  90 għandhom ikunu akkwistati bl- 
applikazzjoni xierqa tal-kalkoli bil-mudell kinetiku. Il-valuri ta' nofs- ħajja u DT
 50 għandhom ikunu irrappurtati flimkien mad-deskrizzjoni 
tal-mudell u żat, l-ordni tal-kineti ċi u l-koeffi ċjent tad-determinazzjoni 
(r 2 ). Kinetiċi ta' l-ewwel ordni huwa preferutu, sakemm r  2 < 0,7. 
Jekk xieraq, il-kalkoli g ħandhom ukoll ikunu applikati g ħall- 
prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni. E żempji ta' mudelli xierqa 
huma deskritti fir-referenzi 31 sa 35.  
Fil-każ ta' studji ta' rati mwettqa f diversi temperaturi, ir-rati tat- 
trasformazzjoni g ħandhom ikunu deskritti b ħala funzjoni tat- 
temperatura fi ħdan il-medda tat-temperatura sperimentali bl-u żu 
tar-relazzjoni Arrhenius, bil-formula:  
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
Meta 1n A u B huma kostanti regrassivi mill-inte ċessjoni u ż- 
żurżieqa, rispettivament, tal-linja ta' l-a ħjar posizzjoni ġenerata 
minn regressjoni lineari 1n k kontra 1/T, k hija r-rata kostanti fit- 
temperatura t u T hija t-temperatura fi Kelvin. Attenzjoni g ħandha 
tingħata għall-medda limitata tat-temperatura li fiha ir-relazzjoni 
Arrehenius tkun valida fil-ka ż tat-trasformazzjoni li tkun irregolata 
bl-azzjoni mikrobjali.  
2.2. EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Għalkemm l-istudji huma mwettqa f'sistema artifi ċjali tal-laboratorju, 
ir-riżultati jkunu jippermettu kalkolu tar-rata tat-traformazzjoni tas- 
sustanza tat-test u wkoll tar-rata tal-formazzjoni u tat-tnaqqis tal- 
prodotti tat-trasformazzjoni skond il-kondizzjonijiet fl-g ħalqa 
(36)(37).  
Studju tal-passa ġġ tat-trasformazzjonni tas-sustanza tat-test jipprovdi 
informazzjoni dwar il-mezz li bih is-sustanza aapplikata hija struttu ­
rament mibdula fil- ħamrija bir-razzjoni kimika u mikrobjali.  
3. RAPPORTA ĠĠ 
RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi:  
Is-sustanza tat-test:  
— l-isem komuni, l-isem kimiku, in-numru CAS, il-formula strut ­
turali (bl-indikazzjoni tal-posizzjoni tat-tikketti meta materjal 
radjo-tikkettjat ikun u żat) u l-propjetajiet fi żiċi-kemikali 
relevanti (ara s-sezzjoni 1.5);  
— il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;  
— il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività spe ċifika 
(meta xieraq);  
Sustanzi ta' referenza:  
— l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif u żati 
għall- karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat- 
trasformazzjoni;  
Ħamrija tat-test:  
— dettalji tas-sit tal- ġbir; 
— id-data u l-pro ċedura tal-kampjunar tal- ħamrija;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— il-proprjetajiet tal- ħamrija, b ħalma huma l-pH, il-kontenut 
karbonju organiku, it-  texture  ( % ramel, % ħama, % tafal),  
cation exchange capacity, bulk density , il- karatteristika tar- 
ritenzjoni ta' l-ilma, u l-bijomass mikrobjali;  
— it-tul tal- ħażna tal-ħamrija u l-kondizzjonijiet tal- ħażna (jekk 
maħżuna);  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— id-dati tat-twettieq ta' l-istudji;  
— l-ammont tas-sustanza tat-test applikata  
— is-solventi u żati u l-metodu ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat- 
test; 
— il-piż tal-ħamrija inizjalment ittrattata u kampjunata matul kull 
interval g ħall-analiżi; 
— deskrizzjoni tas-sistema u żata għall-inkubazzjoni;  
— rati tan-nixxijiet ta' l-arja (g ħal sistemi biss ta' nixxija kontinwa);  
— it-temperatura ta' l-apparat sperimentali;  
— il-kontenut ta' l-umidità tal- ħamrija matul l-inkubazzjoni;  
— il-biomassa mikrobjali inizjali, matul u fit-tmiem ta' l-istudji 
erobiċi; 
— pH, il-kon ċentazzjoni ta' l-ossi ġenu u l-potenzal inizjali redox, 
matul u fit-tmiem ta' l-istudji erobi ċi u tal-mistg ħadar;  
— metodu/i tal-estrazzjoni;  
— metodi g ħall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza 
tat-test u tal-prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni, fil- ħamrija u 
l-materjali ta' l- assorbazzjoni;  
— in-numru ta' replikati u n-numru ta' kontrolli.  
Riżultati:  
— riżultat tad-determinazzjoni ta' l-attività mikrobjali;  
— ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analiti ċi wżati; 
— ir-rati ta' l-irkupru ( % valuri g ħal studju validu huma mog ħtija 
fis-sezzjoni 1.7.1);  
— ir-riżultati tat-tabelli espresssi fi % tad-do ża inizjali applikata u 
bħala mg.kg  -1 ħamrija (fuq il-ba żi ta' piż xott);  
— il-bilan ċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;  
— il-karatterizzazzjoni ta' radjoattivita (marbuta) mhux strattibbli 
jew tar-residwi fil- ħamrija;  
— kwantifikazzjoni tal-CO  2 rilaxxat u ta' komposti volatili o ħrajn; 
— grafika tal-kon ċentrazzjonijiet tal- ħamrija versus is-sustanza tat- 
test u, meta xieraq, il-prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni;  
— in-nofs- ħajja jew DT  50 , DT  75 u DT  90 tas-sustanza tat-test u, meta 
xieraq, dwar il-prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni li huma 
inklużi fil-limiti ta' l-affidibilità;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— kalkolu tar-rata tad-degradazzjoni abjotika permezz ta' 
kondizzjonijiet sterili;  
— kalkolu tal-kineti ċi tat-trasformazzjoni g ħas-sustanza tat-test u, 
meta xieraq, il-prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni;  
— il-passa ġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;  
— diskussjoni u interpretazzjoni tar-ri żultati;  
— dettalji ġenerali (i.e. kromatogrammi tal-kampjun, kampjun tar- 
rati tal-kalkoli tat-trasformazzjoni u l-mezzi u żati għall-identifi ­
kazzjoni tal-prodotti tat-traformazzjoni).  
4. REFERENZI  
(1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and 
Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 
95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection 
products on the market. Annex II, Part A and Annex III, 
Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: 
Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzen ­
schutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metab ­
olismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on 
laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in 
soil – Part 1: Aerobic conditions.  
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic 
chemicals in soil under aerobic conditions.  
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil -Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on 
Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 
1995.  
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Inter ­
actions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 123-157.  
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in 
Soil (adopted 12 May 1981)  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(16) Annex V to Dir. 67/548/EEC  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochem ­
istry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Miner ­
alogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and 
Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. 
Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
– General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition.  
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geol ­
ogischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrol ­
ogischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial 
biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.  
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of 
soil microbial biomass -Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
 
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.
 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide trans ­
formation in the environment: Aerobic and bio-transformation 
of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16  th 
Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
 
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In 
Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical 
characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical 
modelling to the soil persistence and accumulation of 
pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insec ­
ticides and Herbicides, 181-199.  
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
“Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and 
V.H. Freed, Eds., 135-172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nach ­
richten Bayer 39, 188-204.
 
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 
47-60.
 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide 
dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
ANNESS I  
TENSJONI TA' L-ILMA, KAPA ĊITÀ TA' L-G ĦALQA (FC) U L-KAPA ĊITÀ TA Ż- 
ŻAMMA TA' L-ILMA (WHC)  ( 1 ) 
L-għoli tal-kolonna ta' l- ilma 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Rimarki  
10 7 7 10  4 Ħamrija xotta 
1,6 · 10 4 4,2 16 Il-punt tal-mitbiela 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Il-medda tal 
kapaċità ta' l-g ħalqa (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 
33 1,5  9 
> > > > > > > = 
> > > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (approsimazzjoni) 1 0 0,001 Ħamrija mistg ħadra bl- 
ilma
 
( a ) pF = log ta' cm kolonna ta' l-ilma. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Jikkorrispondi g ħal kontenut ta' ilma ta' bejn wie ħed u ieħor 10 % f'ramel, 35 % f'  loam  u 45 % f'tafal. 
( d ) Il-kapa ċità ta' l-g ħalqa mhix kostanti i żda tvarja bit-tip ta' ħamrija bejn pF 1,5 u 2,5.  
It-tenzjoni ta' l-ilma  hija mkejla fi cm tal-kolonna ta' l-ilma jew fi bar. Min ħabba il-medda kbira tat- 
tenzjoni tal- ġbid, din hija espressa sempli ċement bħala valur pF li huwa ekwivalenti g ħal-logaritmu 
ta' cm kolonna ta' l-ilma.  
Il-kapaċità ta' l-g ħalqa hija definita b ħala l-ammont ta' ilma li jista jkun ma ħżun kontra l-gravità 
minn ħamrija naturali, jumejn wara l-itwal perijodu ta' xita jew wara irrigazzjoni suffi ċjenti hija 
determinata f' ħamrija mhux imqallba, in situ fil-g ħalqa. Il-kejl hu b'hekk mhux applikabbli g ħall- 
kampjuni tal- ħamrija imqallba fil-laboratorju. Il-valuri FC li jkunu determinati f' ħamrija mqallba 
jistgħu juru varjazzjonijiet sistemati ċi kbar.  
Il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma  (Water holding capacity (WHC)) hija determinata fil-laboratorju 
b'ħamrija mqallba u mhux imqallba bis-saturazzjoni ta' kolonna ħamrija bl-ilma bit-trasport kapillari. 
Huwa partikolarment utili g ħal ħamrija mqallba u jista jkun sa 30 % akbar mill-kapa ċità ta' l-għalqa 
(1) Huwa wkoll, b'mod sperimentali, aktar fa ċli li jkunu determinati b'mod affidabbli l-valuri FC.  
Noti  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
ANNESS 2  
KONTENUTI TA' L-UMIDITÀ FIL- ĦAMRIJA (g ilma kull 100 g ħamrija xotta) 
TAD-DIVERSI TIPI TA' ĦAMRIJA MINN PAJJI ŻI VARJI  
Soil Umidità fil- ħamrija 
Kontenut fi Tip tal- ħamrija skond il-pajji ż 
WHC pF = 1,8 pF = 2,5  
Ramel Ġermanja 28,7 8,8 3,9 
Ramel Tafli Ġermanja 50,4 17,9 12,1 
Ramel Tafli Żvizzera 44,0 35,3 9,2 
Ħama' taflija Żvizzera 72,8 56,6 28,4 
Tafal biċ-ċappa Bra żil 69,7 38,4 27,3 
Tafal biċ-ċappa Ġappun 74,4 57,8 31,4 
Tafal imrammel Ġappun 82,4 59,2 36,0 
Ħama' taflija USA 47,2 33,2 18,8 
Tafal imrammel USA 40,4 25,2 13,3  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
ANNESS 3  
Figura 1  
Eżempju ta' apparat  flow-through  għall-istudju tat-trasformazzjoni tal-kemikali fil- 
ħamrija  ( 1 ) ( 2 )
 
Figura 2  
Eżempju ta' garaffina tat-tip  biometer  għall-istudju tat-trasformazzjoni tal-kemikali fil- 
ħamrija  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIS- 
SEDIMENT TAS-SISTEMI AKWATI ĊI 
1. METODU  
Dan il-Metodu tat-Test huwa replika g ħal OECD TG 308 (2002)  
1.1. INTRODUZZJONI  
Il-kimiċi jistgħu jidħlu fl-ilmijiet tal-wi ċċ, kemm baxxi u kemm fil- 
fond b'tali rotat b ħala applikazzjoni diretta, skular tat-tbexxix, skular, 
soffija, drena ġġ, disposizzjoni ta' l-iskart, industria, effluwent 
domestiku jew agrikolu u d-deposizzjoni atmosferika. Dan il- Metodu ta' test jiddeskrivi l-metodu tal-laboratorju sabiex jassessja 
t-trasformazzjoni erobika u anerobika tal-kimi ċi organiċi fis-sistema 
tas-sediment akwatiku. Dan il-Metodu tat-test huwa ibba żat fuq Linji 
ta' Gwida e żistenti (1) (2) (3) (4) (5) (6). Laqg ħa ta' Ħidma tal- 
OECD dwar l-G ħażla tal-Ħamrija/Sediment li n żammet f'Belgirate, 
l-Italja, fil-1955 (7) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall- 
użu f'dan it-test. Il-Laqg ħa ta' Ħidma kienet ukoll g ħamlet rakkom ­
mandazzjonijiet li jirrigarjaw il- ġbir, it-tqandil u l- ħażna tal-kampjuni 
tal-ħamrija, ibba żari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (8). Tali studji huma 
meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati fil- ħamrija jew li 
huma pjuttost li jil ħqu l-ambjent tal- ħamrija.
 
Il-kondizzjonijiet fis-sistemi tas-sedeiment akwatiku naturali ta' spiss 
huma erobi ċi fil-fażi ta' l-ilma tal-wi ċċ. Is-saff tal-wi ċċ tas-sediment 
jista jkun jew erobiku jew anerobiku, waqt li sediment aktar fond, 
normalment ikun anerobiku. Sabiex ikunu inklu żi dawn il-possibbil ­
tajiet kollha, i ż-żewġ testijiet erobi ċi u anerobi ċi huma deskritti f'dan 
id-dokument. It-test erobiku jistimula kolonna erobika ta' l-ilma fuq 
saff ta' sediment erobiku li jkun fil-qieg ħ b'xaqliba anerobika. It-test 
anerobiku jistimula sistema kompleta tas-sediment-ta'-l-ilma anerobiku. Jekk i ċ-ċirkostanzi jindikaw li huwa me ħtieġ li jkun 
hemm devjazzjoni sinifikanti minn dawn ir-rakommandazzjonijiet, 
per eżempju bl-u żu tal-qalba tas-sediment jew tas-sedimenti li 
jistgħu kienu ġew esposti g ħas-sustanza tat-test, metodi o ħrajn 
huma disponibbli g ħal dan l-iskop (9).
 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Standard International (SI) units (unitajiet tan-Norma Internazzjonali) 
għandhom ikunu w żati fi kwalunkwe ka ż. 
Is-sustanza tat-test : Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost 
oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.  
Prodotti tat-trasformazzjoni : Is-sustanzi kollha li jirri żultaw mir- 
reazzjonijiet tat-trasformazzjoni bioti ċi jew abioti ċi tas-sustanza tat- 
test, inklu żi iċ-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.  
Residwi marbuta : “Residwi marbuta” tirrapre żemnta komposti fil- 
ħamrija, pjanti jew annimali, li jippersistu fil-matri ċi fil-għamla ta' 
sustanza ori ġinali jew tal-prodotti metaboliti/trasformazzjoni wara l- 
estrazzjoni. Il-metodu ta' l-estrazzjoni m'g ħandux sostanzjalment 
jibdel il-komposti nfushom jew l-istruttura tal-matri ċi. In-natura tar- 
rabta tista tkun kjarifikata parzjalment bil-metodi ta' l-estrazzjoni tat- 
tibdil-tal-matri ċi u b'tekni ċi analitiċi sofistikati. Sal-lum, per e żempju, 
ir-rabtiet kovalenti joni ċi u sorptivi, kif ukoll l-ingassar, kienu ġew 
identifikati b'dan il-mod. Ġeneralment, il-formazzjoni tar-residwi 
marbuta tnaqqas il-bioa ċċessibbiltà u l-biodisponabbiltà sinifikament 
(10) (Modifikati minn IUPAC 1984 (11)).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Trasformazzjoni erobika : (ossidazzjoni): Reazzjonijiet li jse ħħu fil- 
preżenza ta' l-ossi ġenu molekulari (12).  
Trasformazzjoni anerobika : (tnaqqis): Reazzjonijiet li jse ħħu fl- 
esklużjoni ta' l-ossi ġenu molekulari (12).  
Ilmijiet naturali:  Huma l-ilmijiet tal-wi ċċ akkwistati min g ħadajjar, 
xmajjar, nixxijat, e ċċ. 
Sediment : Hija ta ħlita ta' kostitwenti kimi ċi minerali u organi ċi, 
dawn ta' l-a ħħar ikun fihom komposti ta' kontenut g ħoli tal- 
karbonju u n-nitro ġenu u ta' pi żijiet molekulari g ħoljin. Dan huwa 
depożitat b'ilma naturali u jifforma interfa żi ma dak l-ilma.  
Mineralizzazzjoni:  Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost 
organiku lejn CO  2 , H  2 O permezz tal-kondizzjonijiet erobi ċi, u 
CH 4 , CO  2 u H  2 O permezz tal-kondizzjonijiet anerobi ċi. Fil-kuntest 
ta' dan il-metodu tat-test, meta kompost bit-tikketta-14C ikun u żat, il- 
mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matula atomu tal- 
karbonu tikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta'  
14 CO 2 jew  14 CH 4 
Half-life  t 0,5 , huwa l- ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas- 
sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil- 
kinetiċi ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-kon ċentrazzjoni.  
DT 50 (Għibien Ħin 50):  Huwa l-ħin li matulu l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %.  
DT 75 (Għibien Ħin 75):  Huwa l-ħin li matulu l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.  
DT 90 (Għibien Ħin 90):  Huwa l-ħin li matulu l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.  
1.3. SUSTANZI TA' REFERENZA  
Is-sustanzi ta' referenza g ħandhom ikunu w żati għall-karetteriz ­
zazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil- metodi spektroskopi ċi u kromatografi ċi.
 
1.4. INFORMAZZJONI DWARIS-SUSTANZATAT-TEST  
Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun u żata 
sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni, g ħalkemm materjal tikkettjat 
huwa preferut. Il-materjal tikkettjat huwa me ħtieġ għall-istudju tal- 
passaġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun stabbilit il-bilan ċ tal-massa. 
Tikkettjar-14C huwa rakkomandat imma l-u żu ta' iżotopi oħrajn bħal 
ma huma  13 C, 15 N, 3 H, 32 P, jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm 
huwa possibbli, it-tikketta g ħandha tkun imqieg ħda fil-parti(jiet) l- 
aktar stabbli tal-molekolu (  1 ) 6. Il-Purità tal-kimika u/jew tar-radjo- 
kimika tas-sustanza tat-test g ħandha tkun mill-anqas 95 %.  
Qabel jitwettaq it-test, l-informazzjoni li ġejja, dwar is-sustanza tat- 
test, għandha tkun disponibbli:  
(a) solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);  
(b) solubilità f'solventi organi ċi; 
(ċ) pressjoni tal-fwar (il-Metodu A.4) u l-li ġi kostanti Henry;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Per eżempju, jekk is-sustanza jkun fiha ċirku wieħed, l-ittikketjar fuq dan i ċ-ċirku huwa 
meħtieġ. Jekk is-sustanza tat-test ikun fiha żewġ ċrieki jew iktar, studji separati jistg ħu 
jkunu me ħtieġa għall-evalwazzjoni tax-xorti ta' kull ċirku ittikkettjat u sabiex tinkiseb l- 
informazzjoni adattata fuq il-formazzjoni tal-prodotti tat-trasformazzjoni.
 (d) il-koeffi ċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);  
(e) koeffi ċjent ta' l-adsorbazzjoni (K  d , K f jew K  oc , meta xieraq) (il- 
Metodu C.18);  
(f) idrolisi 9il-Metodu C.7);  
(g) kostant tad-disasso ċjazzjoni (pKa) (Linja ta' Gwida OECD 112) 
(13);  
(h) struttura kemikali tas-sustanza tat-test u l-posizzjoni tat-tikketta ­
(i)-iżotpika, jekk applikabbli.  
Nota : It-temperatura li fiha dawn il-kejl kienu saru g ħandha tkun 
rappurtata.  
Informazzjoni utili o ħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossi ċità tas- 
sustanza tat-test fuq il-mikroorgani żmi, dettalji di ġa disponibbli 
u/jew biodegradabbiltà inerenti, u dettalji dwar trasformazzjoni 
erobika u anerobika fil- ħamrija.  
Il-metodi analiti ċi (inklużi l-metodi ta' l-estrazzjoni u tat-tindif) g ħall- 
kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tat- traformazzjoni tal-prodotti tag ħha, għandhom ikunu disponibbli.
 
1.5. IL-PRIN ĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST  
Il-metodu deskritt f'dan it-test jutilizza sistema tas-sediment akwatiku 
erobiku u anerobiku (ara l-Anness 1) li tippermetti:  
(i) il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test f'sistema 
ta' sediment ta' l-ilma,  
(ii) il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test fis- 
sediment,  
(iii) il-kejl tar-rata tal-mineralizzazzjoni tas-suistanza tat-test u/jew il- 
prodotti tat-trasformazzjoni tag ħha (meta tikkettjata-C14, is- 
sustanza tat-test hija u żata), 
(iv) l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti tat-trasform ­
azzjoni fil- fa żijiet ta' l-ilma u tas-sediment, inklu ż il-bilanċ 
tal-massa (meta sustanza tat-test, tikkettjata, tkun u żata), 
(v) il-kejl tad-distrubuzzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat- 
trasformazzjoni tag ħha bejn iż-żewġ fażijiet matul perijodu ta' l- 
inkubazzjoni fid-dlam (sabiex ikun evitat, per e żempju, it-tnibbit 
ta' l-alga) f'temperatur kostanti. Il-valuri nofs- ħajja, DT  50 , DT  75 
and DT  90 huma determinati meta l-informazzjoni hekk te ħtieġ, 
imma m'g ħandhiex tkun estrapolata wisq lura lejn perijodu 
sperimentali (ara s-sezzjoni 1.2).  
Mill-anqas żewġ sedimenti u l-imijiet asso ċċjati tagħhom huma 
meħtieġa għaż-żewġ studji erobi ċi u anerobi ċi rispettivament 97). 
B'dana kollu, jista jkun hemm ka żi meta aktar minn żewġ 
sedimenti g ħandhom ikunu w żati, per e żempju, dwar kimika li 
tista tkun pre żenti f'ambjenti ta' l-ilma frisk u/jew marini.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. L-APPLIKABBILTÀ TAT-TEST  
Il-metodu huwa applikabbli g ħas-sustanzi kimi ċi kollha (mhux ittik ­
kettjati jew radjotikkettjati) li dwarhom metodu analitiku b'e żattezza 
u sensittività suffi ċjenti huma disponibbli. Dan huwa applikabbli 
għal komposti kemm xejn volatili, mhux volatili, li jin ħallu fl-ilma 
jew li ma jin ħallux fl-ilma. It-test m'g ħandux ikun applikat lejn 
kimiċi li huma ferm volatili minn ġewwa l-ħamrija (eż., fumiganti, 
solventi organi ċi) u għalhekk ma jistg ħux jinżammu fil- ħamrija 
skond il-kondizzjonijiet sperimentali ta' dan it-test.  
Dan il-metodu kien ġie applikat, s'issa, sabiex jistudja t-trasform ­
azzjoni f'ilma frisk u sedimenti, imma l-prin ċipju jista wkoll ikun 
applikat g ħal sistemi estwarini/marini. Dan mhux adattat biex jistimu 
kondizzjonijiet f'ilma mexxej (e ż. xmajjar) jew fil-ba ħar miftuħ. 
1.7. KRITERJA TAL-KWALITÀ  
1.7.1.  Irkupru  
L-estrazzjoni u l-anali żi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati ta' 
l-ima u tal- ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tag ħti l-ewwel 
indikazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu analitiku u ta' l-uniformità 
tal-proċedura ta' l-applikazzjoni g ħas-sustanza tat-test. L-irkupri fi 
stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mog ħtija bil-bilan ċi rispettivi 
tal-massa (meta materjal tikkettjat ikunu w żat). L-irkupri g ħandhom 
ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 110 % tal-kimi ċi ittikkettjati (6) u 
minn 70 % sa 110 % g ħal kimiċi mhux ittikkettjati.  
1.7.2.  Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku  
Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (esklu ża l-peffiċjenza ta' l- 
estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'anali żi 
dupplikata ta' l-istess estratt tal- ħamrija, inkubat g ħal tul ta' żmien 
biż-żejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.
 
Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku 
għas-sustanza tat-test u g ħat-trasformazzjoni tal-prodotti g ħandu jkun 
mill-anqas 0,01 mg.kg  -1 ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1 % tad- 
doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifi ­
kazzjoni (limit of quantification (LOQ)) g ħandu wkoll ikun spe ċ­
ifikat.  
1.7.3.  L-e żatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni  
Analiżi regressiva tal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test b ħala 
funzjoni tal- ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità 
tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti affidabbli ta' nofs- ħajjiet (fil-ka ż ta' psewdo kineti ċi ta' l-ewwel 
ordni) jew il-valuri DT
 50 u, jekk xieraq, il-valuri DT  75 u DT  90 
1.8. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.8.1.  Sistema u apparat tat-test  
L-istudju g ħandu jkun jkun imwettaq fl-kontenuturi tal- ħġieġ (eż. 
flixkien, tubi ta ċ-ċentrifuga), sakemm informazzjoni preliminari 
(bħal ma huwa l-koeffi ċjent tal-qasmi n-oktanol-ilma, id-dettaltji 
tas-sopzjoni, e ċċ.) tkun tindika li s-sustanza tat-test tista tkun te ħel 
mal-ħġieġ, f'liema ka ż, materjal alternattiv (b ħala ma hu t-teflon) 
għandu mnejn ikun ikkonsidrat. Meta s-sustanza tat-test hija 
magħrufa li teħel mal-ħġieġ, jista jkun possibbli li titnaqqas din il- 
problema bl-u żu ta' wieħed jew aktar minn dawn il-metodi li ġejjin: ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— iddetermina l-massa tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-tras ­
formazzjoni kif sorbiti mal- ħġieġ; 
— assigura ħasla bis-solvent ta' l-o ġġetti kollha tal- ħġieġ fit-tmiem 
tat-test;  
— l-użu ta' prodotti formulati (ara wkoll is-sezzjoni 1.9.2);  
— uża ammont mi żjud tal-ko-solvent b ħala żieda tas-sustanza tat- 
test mas-sistema; jekk ko-solvent ikun u żat, dan għandu jkun ko- 
solvent li ma jkunx idewweb is-sustanza tat-test.  
Eżempji ta' apparat xieraq, i.e. sistemi tal- ħġieġ b'nixxija kontinwa u 
tat-tip biometriku, huma murija fl-Annessi 2 u 3, rispettivament (14). Sistemi utili o ħrajn ta' l-inkubazzjoni huma deskritti fir-referenza 
15. Id-disinn ta' l-apparat sperimentali g ħandu jippermetti l- 
iskambju ta' l-arja jew tan-nitro ġenu u tal-prodotti volatili li jkunu 
ġew maqbuda. Il-qisien ta' l-apparat g ħandu jkun tali li l- ħtiġiet tat- 
test ikun hemm konformità mag ħhom (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-venti ­
lazzjoni tista tkun ipprovduta jew bi b żieżaq ġentili jew bill-passa ġġ 
ta' l-arja jew tan-nitro ġenu minn fuq wi ċċ l-ilma. F'dan il-ka ż ta' l- 
aħħar, taħwid ġentili ta' l-ilma minn fuq jista jkun rakkommadabbli 
għal distribuzzjoni a ħjar ta' l-ossi ġenu jew tan- nitro ġenu fl-ilma. 
Arja ħielsa minn CO
 2 m'għandhiex tkun u żata minħabba li dan 
jirriżulta f'żidiet fil-pH ta' l-ilma. Fi kwalunkwe ka ż, it-tqallib tas- 
sediment mhux mixtieq u g ħandu jkun evitat, sa kemm ikun 
possibbli. Kimi ċi kemm xejn volatili g ħandhom ikunu ittestjati 
f'sistema tip-ta'-barometru b'ta ħwid ġentili tal-wi ċċ ta' l-ilma. 
Kontenituri mag ħluqa, bi spazju fil-wi ċċ ta', jew l-arja atmosferika 
jew tan-nitro ġenu, u fjali interni g ħal-qbil ta' prodotti volatili, jistg ħu 
wkoll ikunu w żati (16). Skambju regolari tal-gass fl-ispazju huwa 
meħtieġ fit-test erobiku sabiex jikkumpensa g ħall-konsum ta' l- 
ossiġenu mill-biomassa.  
Nasses xierqa g ħall-ġbir tal-prodotti volatili tat-trasformazzjoni 
jinkludu, imma mhux ristertti g ħal, 1 mol.dm  -3 taħlitiet ta' l- 
idrossidu tal-putassa jew ta' l-idrossidu tas-sodju, g ħad-diossidu tal- 
karbonju (  1 ) 7u tal-glikol etiliniku, l-etanolamin jew 2 % paraffin fi 
xilene g ħal komposti organi ċi. Volatili ffurmati permezz ta' 
kondizzjonijiet anerobi ċi, bħal ma huwa l-metanju, jistg ħu ikunu 
miġbura, per e żempju, b'g ħarbiel molekulari. Tali volatili jistg ħu 
ikunu ma ħruqa, per e żempju, iċ-CO  2 li jgħaddi mill-gass matul 
tubu tal-kwart mimli bi CuO f'temperatura ta' 900  o C u li ji ġbor 
iċ- CO  2 iffurmat f'assorbatur bl-alkali (17).  
Strumentazzjoni tal-laboratorju g ħal analiżi kimika tas-sustanza tat- 
test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni hija me ħtieġa (i.e. kromato ­
grafija likwida tal-gass (GLC), kromatografija likwida ta' m ġieba 
qawwija (HPLC), kromatografija tas-saff irqieq (TLC), spektroskopju tal-massa (MS), spektroskopju tal-kromatografija-tal-massa tal-gass 
(GC-MS), spektrometru tal-kromatografija tal-massa likwida (LC- 
MS), reżonanza manjetika nukleari (NMR), eyc.) inklu żi s-sistemi 
tas-sejbien g ħal kimiċi radjotikkettjati jew mhux tikkettjati, kif 
xieraq. Meta materjal radjo-tikkettjat ikun u żat bħala għadd tax- 
xintillazzjoni tal-likwidu u ossidizzatur tal-kombustjoni (g ħall- 
kombustjoni ta' kampjuni tas-sediment qabel l-anali żi tar-radjo- 
attività) ikun ukoll me ħtieġ.
 
Apparat normali ie ħor tal-laboratorju, g ħal determinazzjonijiet fi żiko- 
kimiċi u biolo ġiċi (ara s-sezzjoni Tabella 1, is-sezzjoni 1.8.2.2(l- 
oġġetti tal-ħġieġ, il-kimiċi u r-reaġenti huma me ħtieġa, kif xieraq.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Bħalma dawn is-soluzzjonijiet ta' ab żorpzjoni alkalini jassorbu wkoll id-dijossidju tal- 
karbonju mill-arja ta' ventilazzjoni u li iffurmati peremzz ta' respirazzjonni f'esperimenti 
ajrobiċi, għandhom ji ġu mibdula f'intervali regolari sabiex ti ħi evitata is-saturazzjoni 
tagħhom u b'hekk it-telf tal-kapa ċita' ta' l-ab żorpzjoni tag ħhom
 1.8.2.  L-g ħażla u n-numru ta' sedimenti akwati ċi 
Is-siti tal-kampjunar g ħandhom ikunu mag ħżula skond l-iskop tat- 
test, f'xi sitwazzjoni partikolari. Fl-g ħażla tas-siti tal-kampjunar, l- 
istorja fl-isfond, agrikola, indistriali jew domestika dwar il-wesg ħa 
tal-ġbir u ta' l-ilmijiet fin-na ħa ta' fuq, g ħandhom ikunu ikkunsidrati. 
Is-sedimenti m'g ħandhomx ikunu w żati jekk ikunu ġew kontaminati 
bis-sustanza tat-test jew bl-istrutturi analogi tag ħha matul l-4 snin 
preċedenti.  
1.8.2.1.  L-għażla tas-sediment  
Żewġ sedimenti huma normalment u żati għall-istudju erobi ċi (7). Iż- 
żewġ sedimenti mag ħżula għandhom ikunu differenti fir-rigward tal- 
kontenut tal-karbonju organiku u fil-formazzjoni tag ħhom. Sediment 
wieħed għandu jkollu kontenut g ħoli ta' karbonju organiku (2,5- 
7,5 %) u ta' formazzjoni fina, is-sediment l-ie ħor għandu jkollu 
kontut baxx tal-karbonju organiku (0,5-2,5 %) u formazzjoni rozza. 
Id-differenza bejn il-kontenuti tal-karbonu organiku g ħandha, norm ­
alment, tkun ta' mill-anqas 2 %. “Formnazzjoni fina” hija definita bħala (tafal + ħama') [10] (
 1 ) 8kontenut ta > 50 % u “formazzjoni 
rozza” hija definita b ħala (tafal + ħama') kontenut ta' < 50 %. Id- 
differenza fil-kontenut (tafal + ħama') għaż-żewġ sedimenti g ħandha 
normalment tkun mill-anqas 20 %. Fil-ka żi, meta l-kimika tista wkoll 
tilħaq l-ilmijiet marittimi, mill-anqas wa ħda mis-sistemi tas-sediment 
ta' l-ilma g ħandha tkun ta' ori ġini marittima.  
Għal studju strettament anerobiku, żewġ sedimenti (inklu żi l-imijiet 
assoċjati tagħhom) għandhom ikunu mi ġbura minn żoni anerobi ċi 
tal-partijiet ta' l-ilma tal-wi ċċ (7). Iż-żewġ fażijiet tas-sediment u ta' 
l-ilma għandhom ikunu mqanda u ittrasportati bir-reqqa bl-esklu żjoni 
ta' l-ossiġenu. 
Parametri o ħrajn jistgħu ikunu importanti fil-g ħażla tas-sedimenti u 
għandhom ikunu ikkunsidrati fuq il-ba żi ta' każ b'każ. Per eżempju, 
il-medda pH tas-sedimenti tkun importanti g ħall-kimiċi tat-testijiet li 
dwarhom trasformazzjoni u/jew sorpzjoni jistg ħu ikunu pH-dipen ­
denti. Id-dipendenza-pH tas-sorpzjoni tista tkun riflessa bil-pKa tas- 
sustanza tat-test.  
1.8.2.2.  Karatterizzazzjoni tal-kampjuni tas-sedimenti ta' l-ilma  
Parametri ewlenija li g ħandhom ikunu mkejla u inklu żi fir-rapport 
(b'referenza g ħall-metodu w żat) kemm g ħall-ilma u g ħas-sediment, u 
l-istadju tat-test li fih dawk il-parametri g ħandhom ikunu determinati, 
huma mi ġbura f'sommarju fit-Tabella ta' hawn ta ħt. Għall-inform ­
azzjoni, il-metodi tas-sejbin g ħad-determinazzjoni ta' dawn il- 
parametri huma mog ħtija fir-referenzi (18) (19) (20) (21).  
B'żieda, parametri o ħrajn jistħu li jkunu metie ġa li jkunu mkejla u 
nklużi fir-rapport fuq il-ba żi ta' każ b'każ (eż. għall-ila frisk: 
Partiċelli, alkalinità, toqol. Kondittività, NO  3 /PO  4 (relattività u 
valuri individwali); g ħas-sedimenti: Il-kapa ċità ta' l-iskambju tal- 
jonji, il-kapa ċità taż-żamma ta' l-ilma, Il-karbonat, in-nitro ġenu u l- 
fosfru totali; u g ħas-sistemi marittimi: Salinità). L-anali żi tas- 
sedimenti u l-ilma g ħan-nitrat, is-sulfat u l- ħadid bio-disponibbli, u 
l-ossibbiltà ta' a ċċettaturu elettroni o ħrajn tista tkun utili fl-assa ġġ tal- 
kondizzjonijiet redox, spe ċjalment b'relazzjoni mat-trasformazzjoni 
anerobika.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) Tafal u ħama) hija il-frazzjoni minerali tas-sediment bid-daqs tal-parti ċella ta' < 50 μm.
 Parametri tal-kejl g ħall-karatterizzazzjoni tal-kampjunu fis-sediment ta' l-ilma (7)(22)(23)  
Parametru Stadju tal-pro ċedura tat-test 
Kampjun ta' 
l-għalqa Wara t- 
tqandil Bidu ta' l- 
akklamit - 
azzjoni Bidu tat-test Matul it-test Tmiem tat- 
test 
Ilma  
Oriġini/sorsi x 
temperatura x pH x x x x x 
TOC x x x 
O
 2 konċentrazzjoni (*) x x x x x  
Potenzal Redox  (*) x x x x  
Sediment  
Oriġini/sorsi x 
Il-fond tas-saff x 
pH x x x x x 
Distribuzzjon i tad-daqs tal- 
partiċelli x 
TOC x x x x 
Biomassa mikrobjali (*) x x x Potenzal Redox (**) Osservaz 
zjonijiet 
(lewn/riħ 
a) x x x x
 
(*) Riżultati tar-ri ċerka riċenti wrew li il-kejl tal-kon ċentrazzjonijiet tal-  water oxygen  l-ossiġnu ta' l-ilma u tal-potenz ­
jalitajiet  redox  m'għandhomx valur la mekkanistiku u lanqas ta' tbassir fejn g ħandu x'jaqsam it-tkabbir u l-i żvilupp 
tal-popolazzjoni mikrobjali fl-ilmijiet tal-wi ċċ. (24) (25). 
(**) Id-determinazzjoni tad-domanda bijokemikali ta' l-ossi ġnu (BOD, fit-te ħid tal-kampjuni ta' l-g ħelieqi, fil-bidu u fi 
tmiem it-test) jistg ħu jkunu g ħodod aħjar għall-interpretazzjoni u l-evalwazzjoni tal-bijotrasformazzjoni ajrobika tar- 
rati u r-rotot ajrobi ċi (26), il-metodu ta' fumigazzjoni (27) jew  plate count measurements  (eż. il-batterja, l- actinomy­
cetes, fungi  u l-kolonji totali) g ħal studji ajrobi ċi; ir-rata tal- methanogenesis  ghal studji anajrobi ċi. 
1.8.3.  Ġbir, Tqandil u Ħażna 
1.8.3.1.  Il-ġbir 
L-abbozz tal-gwida ISO dwar il-kampjunar tas-sediment tal-qieg ħ 98 
għandu jkun u żat għall-kampjunar tas-sediment. Kampjuni tas- 
sediment g ħandhom ikunu mi ġbura mis-saff intier ta' fuq, 5 sa 
10 cm, tas-sediment. L-ilma asso ċjat għandu jkun mi ġbur mill- 
istess sit jew lokalità u fl-istess waqt b ħas-sediment. G ħal studju 
anerobiku, il- ġbir tal-kampjuni tas-sediment u ta' l-ilma asso ċjat u 
t-trasportazzjoni tag ħhom għandu jkun bl-esklu żjomni ta' l-ossi ġenu 
(28) (ara s-sezzjoni 1.8.2.1). U ħud mill-apparati tal-kampjunar huma 
deskritti fil-litteratura (8) (23).  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Tqandil  
Is-sediment huwa separat mill-ilma permezz tal-filtrazzjoni u s- 
sediment ikun mag ħrbel fl-undità minn g ħarbiel ta' 2 mm bl-u żu ta' l- 
ilma eċċessiv tal-lokalita, li imbag ħad ikunu mormi. Imbag ħad, 
ammonti mag ħrufa ta' sedimenti u ilma huma m ħallta fir-relattività 
mixtieqa (ara s-sezzjoni 1.9.1) f'garafini ta' l-inkubazzjoni u ippreparati għall-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.4). G ħal studju 
anerobiku, il-passi kollha tat-tqandil g ħandhom ise ħħu bl-esklu żjoni ta' 
l-ossiġenu (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Ħażna 
L-użu ta' kampjun frisk tas-sediment u l-ilma huwa ferm rakkom ­
mandabbli, imma jekk ħażna tkun me ħtieġa, Is-sediment u l-ilma 
għandhom ikunu mag ħrbla kif deskritt hawn fuq u ma ħżuna 
flimkien, mifqug ħa bl-ilma (6-10 cm saff ta' ilma), fid-dlam, fi 4 ± 
2 o C 4 għal massimu ta' [13] ġimghat (7)(8)(23). Il-kampjuni li huma 
ntiżi għal studji erobi ċi għandhom ikunu ma ħżuna b'aċċess liberu ta' 
arja 9eż. f'kontenituri mift ħa), waqt li dawk g ħal studji erobi ċi bl- 
esklużjoni ta' l-ossi ġenu. L-iffri żar tas-sediment u l-ilma u waqt l- 
inxif tas-sediment m'g ħandux ise ħħ matul it-trasportazzjoni u l- 
ħażna. 
1.8.4.  Preparazzjoni tal-kampjuni sediment/ilma g ħat-test  
Perijodu ta' akklamitazzjoni g ħandu jseħħ qabel iż-żieda tas-sustanza 
tat-test, b'kull kampjun ta' sediment/ilma jkun miqieg ħed fir-reċipjent 
ta' l-unkubazzjoni li g ħandu jkun u żat għat-test ewlieni, u l-akkla ­
mizzazzjoni tkun imwettqa skond l-istess kondizzjonijiet b ħal fit-test 
ta' l-inkubazzjoni (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-perijodu ta' l-akklimiz ­
zazzjoni huwa ż-żmien me ħtieġ għal stabbilità ra ġjonevoli tas- 
sistema kif rifless bil-pH, il-kon ċentrazzjoni ta' l-ossi ġenu fl-ilma, 
il-potenzal tar-redox tas-sediment u l-ilma, u l-fa żijiet tas-separ ­
azzjoni makroskopika. Il-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni g ħandu 
normalment idem bejn ġimgħa waħda u ġimgħatejn u m'g ħandux 
jeċċedi erba' ġimghat. Ir-ri żultati tad-determinazzjonijiet imwettqa 
matul dan il-perijodu g ħandhom ikunu nlku żi fir-rapport.  
1.9. L-IM ĠIEBA TAT-TEST  
1.9.1.  Kondizzjonijiet tat-test  
It-test għandu jkun imwettaq fl-apparat ta' l-inkubazzjoni (ara s- 
sezzjoni ċ.8.1) b'relattività tal-volum ta' l-ilma mas-sedimet ta' bejn 
3:1 u 4:1, u saff tas-sediment ta' 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ) 9. Ammont 
minimu ta' 50 g ta' sediment (ba żi ta' piż xott) kull re ċipjent ta' l- 
inkubazzjoni huwa rakkommandat.  
It-test għandu jkun imwettaq fid-dlam, b'temperatura kostanti fil- 
medda ta' 1- sa 30  o C. Temperatura ta' (20 ± 2)  o C hija xierqa. 
Meta xieraq, temperatura addizzjonali aktar baxxa (e ż. 10  o C) tista 
tkun meqjusha fuq il-ba żi ta' każ b'każ, jiddependi mill-informazzjoni 
meħtieġa mit-test. It-temperatura ta' l-inkubazzjoni g ħandha tkun 
sorveljata u nklu ża fir-rapport.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Studji ri ċenti wrew li il- ħżin f'temepratura ta' 4  o C jista' jwassal g ħal tnaqqis tal-kontenut 
tal-karbonju organiku tas- sediment li jista' jirri żulta fi tnaqqis ta' l-attivita' mikorbjali 
(34).
 1.9.2.  It-trattament u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test  
Konċentrazzjoni wa ħda tal-kimika tat-test hija u żata (  1 ) . Għall- 
kimiċi tal-protezzjoni ta' l-u ċuġ applikati direttament lejn is-saffi ta' 
l-ilma, id-do ża massima tat-tikketta g ħandha tkun meqjusa b ħala, ir- 
rata massima ta' l-applikazzjoni ikkalkolata fuq il-ba żi taż-żona tal- 
wiċċ ta' l-ilma fir-re ċipjent tat-test. Fil-ka żi l-oħrajn kollha, il-kon ċ­
emtrazzjoni li trid tkun u żata għandha tkun ibba żata fuq 
previżjonijiet mill-emissjonijiet ambjentali. Attenzjoni g ħandha 
tingħata sabiex tkun assigurata li kon ċentrazzjoni adekwata tas- 
sustanza tat-test tkun applikata sabiex tikkaratterizza r-rotta tat-tras ­
formazzjoni u tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasform ­
azzjoni. Jista jkun me ħtieġ li jkunu applikati do żi aktar għoljin (eż. 
19-il darba) f'sitwazzjonijiet meta l-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza 
tat-test ikunu qrib il-limitu tas-sejbien fil-bidu ta' l-istudji u/jew meta prodotti ta' trasformazzjoni ma ġġuri ma jkunux fa ċli li jkunu 
misjuba meta pre żenti fi 10 % tar-rata ta' l-applikazzjoni tas-sustanza 
tat-test. B'dana kollu, jekk kon ċentrazzjonijiet g ħola tat-test huma 
wżati, dawn m'g ħandhox ikollhom effett ħażin sinifikanti fuq l- 
attività mikrobjali tas-sistema ilma-sediment. Sabiex tkun akkwistat 
konċentrazzjoni kostanti tas-susstanza tat-test fir-re ċipjenti ta' qisien 
differenti, a ġġustament tal-kwantità tal-materjal applikat jista jkun 
meqjus b ħala xieraq, ibba żat fuq il-fond tal-kolonna ta' l-ilma fir- 
reċipjent b'relazzjoni mal-fond ta' l-ilma fl- g ħalqa (li huwa pre żunt li 
huwa 100 cm, imma fond ie ġor jista jkun u żat). Ara l-Anness 4 g ħal 
eżempju tal-kalkolazzjoni.  
Idealment, is-sustanza tat-test g ħandha tkun applikata b ħala taħlita 
akweja ġewwa l-fa żi ta' l-ilma tas-sistema tat-test. Jekk ma jkunx 
jista jsir mod ie ħor, l-użu ta' ammonti anqas ta' solventi li jit ħaltu 
ma l-ilma (b ħal ma huma l-a ċetun, l-etanol) huwa permisibbli g ħall- 
applikazzjoni u d-distribuzzjoni tas-sustanza tat-test, imma dan m'għandux jeċċedi 1 % v/v u m'g ħandux ikollu effeti ħżiena fuq l- 
attività mikrobjali tas-sistema tat-test. Attenzjoni g ħandha ting ħata 
fil-ġenerazzjoni tat-ta ħlita akweja tas-sustanza tat-test – l-u żu ta' 
kolonni ġenerati u t-ta ħlit minn qabel jista jkun xieraq sabiex tkun 
assigurata omo ġenità kompluta. B'segwiment ta ż-żieda tat-ta ħlita 
akweja mas-sistema tat-test, ta ħvid ġentili tal-fa żi ta' l-ilma huwa 
rakkommandat, li jqanqal is-sediment mill-anqas possibbli.
 
L-użu ta' prodotti formulati mhux normalment rakkommandat 
minħabba li l-ingredjenti tal-formulazzjoni jistg ħu jaffettwaw is- 
sustanza tat-test u/jew tal-prodotti tat-trasformazzjoni bejn il-fa żijiet 
ta' l-ilma u tas-sediment. B'dana kollu, e ż. għal sustanzi tat-test li ma 
tantx jinħallu, l-użu ta' materjal formulat jista jkun alternattiva 
xierqa.  
In-numru ta' re ċipjenti ta' l-inkubazzjoni jiddependi min-numru ta' 
drabi tal-kampjunar (ara s-sezzjoni 1.9.3). Numru suffi ċjenti tas- 
sistemi tat-test g ħandhom ikunu nklu żi sabiex żewġ sistemi jistg ħu 
ikunu sagrifikati f'kull waqt tal-kampjunar. Meta l-unitajiet tal- kontroll ta' kull sistema tas-sediment akwatiku jkunu w żati, dawn 
m'għandhomx ikunu ittrattati bis-sustanza tat-test. L-unitajiet tal- 
kontroll jistg ħu ikunu w żati għad-determinazzjoni tal-biomassa 
mikrobjali tas-sediment u tal-karbonju organiku totali ta' l-ilma u tas-sediment fit-tmiem ta' l-istudju. I ż-żewġ unitajiet tal-komntroll 
(i.e. unità tal-kontroll wa ħda ta' kull sediment akwatiku) jistg ħu 
ikunu wżati sabiex jissorveljaw il-parametri me ħtieġa fis-sediment 
u fl-ilma matul il-perjodu ta' l-akklamitizzazzjoni (ara t-Tabella fis- sezzjoni 1.8.2.2). Żewġ unitajiet addizzjonali tal-kontroll g ħandhom 
ikunu nklu żi fil-każ li sustanza tat-test tkun applikata permezz ta' 
solvent li jkejjel l-effetti ħżiena fuq l-attività mikrobjali tas-sistema 
tat-test.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Test bit-tieni kon ċentrazzjoni jista' jkun utili g ħall- kemikali li jil ħqu l-ilmijiet tal-wi ċċ 
permezz ta'  entry routes  differenti u dan jwassal g ħal konċentrazzjonijiet differenti b'mod 
sinifikattiv, sakemm l-iktar kon ċentrazzjoni baxxa tista' tkun analizzata b'kemm jista' 
jkun eżattezza.
 1.9.3.  It-tul ta ż-żmien u l-kampjunar tat-test  
It-tul ta' l-esperiment m'g ħandux normalment je ċċedi 100 jum (6), u 
għandu jkompli sa kemm il-passa ġġ tal-gradazzjoni u l-g ħamla tad- 
distrubuzzjoni ta' l-ilma/sediment tkun stabbilita jew meta 90 % tas- 
sustanza tat-test tkun dissipata fit-trasformazzjoni u/jew il-volatiliz ­
zazzjoni. In-numru ta' waqtiet tal-kampjunar g ħandhom ikunu mill- 
anqas sitta (inklu ż il-ħin żero), bi studju preliminarji voluntarju (ara 
s-sezzjoni 1.9.4) ikunu w żat sabiex tkun stabbilit r-regola xierqa tal- 
kampjunar u tat-tul tat-test, sakemm informazzjoni suffi ċjenti ma 
tkunx diġa disponibbli dwar is-sustanza tat-test minn studju pre ċen­
denti. Għal sustanzi tat-test idrofobi ċim punti addizzjonali tal- 
kampjunar matul il-perijodu inizjali ta' l-istudju jistg ħu ikunu 
meħtieġa sabiex tkun determinata r-rata tad-distribuzzjoni bejn il- 
fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment.  
Filwaqtiet xierqa tal-kampjunar, ir-re ċipjenti kollha ta' l-inkubazzjoni 
(dupplikat) huma mne ħħija għall-analiżi. Is-sediment u l-ilma tal- 
wiċċ huma analizzati separatament (  1 ) 1. L-ilma tal-wi ċċ għandu 
jkun imne ħħi bil-galbu b' ċaqlieq mill-anqas tas-sediment. L- 
estrazzjoni u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti 
tat-trasformazzjoni g ħandhom isegwu l-pro ċeduri analiti ċi xierqa. 
Attenzjoni g ħandha ting ħata għat-tneħħija tal-materjal li jkun jkun 
ġie assorbit mar-re ċipjent ta' l-inkubazzjoni jew mat-tibi ta' l-inter ­
konnessjoni w żati li jaqbdu l-volatili.  
1.9.4.  Test preliminarju voluntarju  
Jekk ir-regolazzjoni tat-tul u tal-kampjunar ma jistg ħux ikunu ikkal ­
kolati minn studju relevanti o ħrajn dwar is-sustanza tat-test, studju 
preliminari voluntarju jista jkun meqjus b ħala xieraq, li g ħandu jkun 
imwettaq bl-u żu ta' l-istess kondizzijonijiet tat-test proponuti g ħall- 
istudju definittiv. Kondizzjonijiet sperimentali relevanti u r-ri żultati 
mit-test preliminarju, jekk imwettaq, g ħandhom ikunu rraportati fil- 
qosor.  
1.9.5.  Kejl u anali żi 
Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u l-prodotti tat-trasformazzjoni 
f'kull waqt tal-kampjunar fl-ilma u fis-sediment g ħandhom ikunu 
mkejla u rraportati (b ħala konċentrazzjoni u b ħala persenta ġġ ta' l- 
applikat). Ġeneralment, il-prodotti tat-trasformazzjoni misjuba fl- 
≥10 % tar-radjoattività applikata fis-sistema totali ta' ilma-sediment 
fi kwalunkwe waqt tal-kampjunar g ħandhom ikunu identifikati, 
sakemm ma jkunx ra ġjonevolment ġustifikat mod ie ħor. Il-prodotti 
tat-trasformazzjoni li dwarhom il-kon ċentrazzjonjiet huma kontin ­
wament mi żjuda matul l-istudju g ħandhom ukoll ikunu ikkonsidrati 
għall-identifikazzjoni, anki jekk il-kon ċentrazzjonijiet tag ħhom ma 
jkunux je ċċedu l-limitu mog ħti hawn fuq, min ħabba li dan jista 
jindika persistenza. Dan ta' l-a ħħar għandu jkun ikkonsidrat fuq il- 
bażi ta' każ b'każ, bil-ġustifikazzjoni tkun ipprovduta fir-rapport.  
Ir-riżultati mis-sistemi tal-qbid tal-gassijiet/volatili (CO  2 u oħrajn, i.e. 
komposti organi ċi volatili) g ħandhom ikunu rrapurtati f'kull waqt tal- 
kampjunat. Ir-rati tal-mineralizzazzjoni g ħandhom ikunu rrapurtati. 
Residwi mhux estrattibbli (marbuta) fis-sediment g ħandhom ikunu 
irrapurtati f'kull punt tal-kampjunar.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) F'każijiet fein ir- re-oxidation  mgħaġġla tal-prodotti tat-trasformazzjoni anajrobika tista' 
sseħħ, il-kondizzjonijiet anajrobi ċi għandhom jin żammu waqt l-ikkampjunar u l-anali żi.
 2. DATA  
2.1. TRATTAMENT TAR-RI ŻULTATI  
Il-bilanċ jew l-irkupru tal-massa totali (ara s-sezzjoni 1.7.1) tar- 
radjoattività mi żjuda għandhom ikunu ikkalkolati f'kull waqt tal- 
kampjunar. Ir-ri żultati għandhom ikunu irrapurtati b ħala persenta ġġ 
tar-radjoattività mi żjuda. Id-distribuzzjoni tar-radjoattività bejn l-ilma 
u s-sediment g ħanda tkun irrapurtata b ħala konċentrazzjonijiet u 
persentaġġi, f'kull waqt tal-kampjunar.  
In-nofs-ħajja, il-DT  50 u, jekk xieraq, il-DT  75 u il-DT  90 tas-sustanza 
tat-test għandhom ikunu ikkalkolati flimkien mal-limiti ta' affidib ­
bilità tag ħhom (ara s-sezzjoni 1.7.3). L-informazzjoni dwar ir-rata 
tad-dissipazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma u fis-sediment tista tkun akkwistata mill-u żu ta' l-g ħodda xierqa ta' l-evalwazzjoni. 
Dawn jistg ħu ivarjaw mill-applikazzjoni tal-kineti ċi ta' psewdo-l- 
ewwel-ordni, tat-teknika li timxi mal-kurva emprika li tapplika 
għal soluzzjonijiet grafi ċi jew numeri ċi u l-assa ġġ aktar kumpless 
bl-użu, per e żempju, tal-mudelli ta' kompartiment singolu jew 
multiplu. N Aktar dettalji jistg ħu ikunu akkwistati mill-letteratura 
relevanti kif ippubblikata (35) (36) (37).
 
Ir-resqien kollu g ħandu s-sa ħħa u d-debbolizzi tieg ħu u jvarja 
konsiderevolment fil-komplessità, Pre żunzjoni tal-kineti ċi ta' l- 
ewwel ordni tista ssir b'simplifikazzjoni żejda tal-pro ċessi tad-degra ­
dazzjoni u tad-distribuzzjoni, imma meta possibbli li tag ħti terminu 
(ir-rata kostanti jew nofs- ħajja) li fa ċilment ikunu jifthiemu u l-valur 
fil-mudellar tas-simulazzjoni u l-kalkolu tal-kon ċentrazzjonijiet 
ambjentali previsti. Resqien empiriku jew trasformazzjonijiet lineari 
jistgħu jirriżultaw fi d ħul aħjar tal-kurvi mad-dettall u g ħalhekk 
jippermettu estimi a ħjar tan-nofs- ħajja, DT  50 u, jekk xieraq, il- 
valuri DT  75 u DT  90 . L-użu tal-kostanti derivati, b'dana kollu huwa 
limitat. Mudelli kumpartimentali jistg ħu jiġġeneraw numru ta' 
kostanti utili ta' valur fir-riskju ta' l-assa ġġ li jiddeskrivi r-rata tad- 
degradazzjoni f'kumpartimenti differenti u d-distribuzzjoni tal- kimika. Dawn g ħandhom ukoll ikunu w żati għall-estimi tal-kostanti 
tar-rata għall-formazzjoni u d-degradazzjoni ta' prodotti ma ġġuri tat- 
trasformazzjoni. Fil-ka żi kollha, il-metodu w żat għandu jkun 
ġustifikat u min jag ħmel l-esperiment g ħandu juri b'mod grafiku 
u/jew l-istatistika ta' d ħul aħjar.
 
3. RAPPORTA ĠĠ 
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Is-sustanza tat-test:  
— l-isem komuni, l-isem kimiku, in-numru CAS, il-formula strut ­
turali (bl-indikazzjoni tal-posizzjoni tat-tikketti meta materjal 
radjo-tikkettjat ikun u żat) u l-propjetajiet fi żiċi-kemikali relevanti;  
— il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;  
— il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività spe ċifika 
(meta xieraq);  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Sustanzi ta' referenza:  
— l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif u żati 
għall- karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat- 
trasformazzjoni;  
Sedimenti u ilmijiet tat-test:  
— il-lokalità u d-deskrizzjoni tas-sit(i) tal-kampjunar tas-sediment 
akwatiku, inklu ża, jekk possibbli, l-istorja tal-kontaminazzjoni;  
— l-informazzjoni kollha li tirrigwardja il- ġbir, il-ħażna (jekk ikun 
hemm) u l-akklamizzazzjoni tas-sistemi ta' l-ilma/sediment;  
— karatteristi ċi tal-kampjunar ilma-sediment kif elenkati fit-Tabella 
fis-sezzjoni 1.8.2.2.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— is-sistema tat-test u żata (eż. in-nixxija kontinwa, il-biometrika, il- 
mezz tal- ventilazzjoni, il-metodu tat-ta ħwid, il-volum ta' l-ilma, 
il-massa tas-sediment, il- ħxuna kemm tas-saff ta' l-ilma u tas- 
sediment, il-qisiem tar-re ċipjenti tat-test, e ċċ.); 
— l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test g ħas-sistema tat-test: Il-kon ċ­
entrazzjoni tat-test kif u żata, in-numri ta' repliki u l-modula tal- 
kontrolli ta' l-applikazzjoni tas-sustanzaa tat-test (e ż. l-użu tas- 
solvent jekk ikun hemm), e ċċ.; 
— temperatura ta' l-inkubazzjoni;  
— id-drabi tal-kampjuna;  
— il-metodi ta' l-estrazzjoni u l-effi ċċjenzi kif ukoll il-metodi 
analitiċi u l-limiti tas-sejbien;  
— il-metodi g ħall-karatterizzazzjoni/identifikazzjoni tal-prodotti tat- 
trasformazzjoni;  
— devjazzjonijiet mill-protokoll tat-test jew mill-kondizzjonijiet tat- 
test, matul l-istudju.  
Riżultati:  
— dettalji fi stat ori ġinali tal-figuri li jirrapre żentaw anali żi (id- 
dettalj kollha fi stat ori ġinali għandhom ikunu ma ħżuna fl- 
arkivji-GLP);  
— ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analiti ċi użati; 
— ir-rati ta' l-irkupru ( % valuri g ħal studju validu huma mog ħtija 
fis-sezzjoni 1.7.1);  
— tabelli tar-ri żultati espressi b ħala % tad-doza applikata u fi 
mg.kg-1 fl-ilma, sediment u s-sistema totali ( % biss) g ħas- 
sustanza tat-test u, jekk xieraq, g ħall-prodotti tat-trasformazzjoni 
u tar-radjoattività mhux-estrattibbli;  
— il-bilan ċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;  
— rapreżentazzjoni grafika tat-trasformazzjoni fl-ilma u l- 
frazzjonijiet tas- sediment u fis-sistema totali (inklu ża l-mineraliz ­
zazzjoni);  
— rati tal-mineralizzazzjoni;  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— in-nofs- ħajja, il- DT  50 u, jekk xieraq, il-valuri DT  75 u DT  90 tas- 
sustanza tat-test u, meta xieraq, il-proddotti tat-trasfirmazzjoni 
maġġuri inklużi fil-limiti ta' l-affidabbilità fl-ilma, fis-sediment 
u fis-sistema totali;  
— kalkolu tal-kineti ċi tat-trasformazzjoni g ħas-sustanza tat-test u, 
meta xieraq, il-prodotti ma ġġuri tat-trasformazzjoni;  
— il-passa ġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;  
— diskussjoni tar-ri żultati.  
4. REFERENZI  
(1) Linja ta' Gwida BBA g ħall-eżaminazzjoni tal-protetturi tal- 
pjanti fil-progress tar-re ġistrazzjoni. (1990). Parti IV, Sezzjoni 
5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/ ­
sediment system. Il- Ġermanja.  
(2) Kummissjoni g ħar-reġistrazzjoni tal-pesti ċidi: L-Applikazzjoni 
għar-reġistrazzjoni tal-pesti ċidi. (1991). Part G. Im ġieba tal- 
prodott u l-metabi żmi tiegħu fil-ħamrija, fl-ilma u fl-arja, 
Sezzjoni G.2.1 (a). L-Olanda.  
(3) MAFF Direttorat dwar is-Sigurtà tal-Pesti ċidi. (1992). Linja ta' 
Gwida prelimari g ħall-imġieba tat-testijiet dwar il-biodegrab ­
bilità tal-pesti ċidi f'sistemi naturali ta' sediment/ilma. Ref 
No SC 9046. Renju Unit.  
(4) Agrikoltura Kanada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.
 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, 
Anaerobic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 
631-637.  
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17th edition). American Public Health 
Association, American Water Works Association and Water 
Pollution Control Federation, Washington D.C.  
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038- 1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop “A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and 
marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.
 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations 
under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.  
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigationextraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic 
Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13- 
21. 
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegra ­
dation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499- 
1509.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for 
assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds 
under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on 
sediment characteristics and drying sediment on sorption coef ­
ficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nach ­
richten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of 
pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47-60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, pp 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
ANNESS 1  
LINJA TA' GWIDA DWAR IS-SISTEMI TAS-TEST EROBIKU 
U ANEROBIKU  
Sistema ta' test erobiku  
Is-sistema tat-test erobiku deskritta f'dan il-metodu tat-test tikkonsisti minn saff 
ilma erobiku (kon ċentrazzjoni tipika ta' l-ossi ġenu fil-medda bejn 7 u 10 mg · l -1 ) 
u saff tas-sediment, erobiku fil-wi ċċ u anerobiku ta ħt il-wiċċ (medja tipika tal- 
potenzali redox (Eh) fi ż-żona anerobika tas-sediment fil-medda minn –80 sa 
–190 mV). L-arja umida tkun mog ħddiha matul il-wi ċċ ta' l-ilma ta' kull unità 
ta' l-inkubazzjoni sabiex i żżomm ossi ġenu suffiċjenti fl-ispazju ta' fuq.  
Sistema ta' test anerobiku  
Għas-sistema tat-test anerobiku, il-pro ċedura tat-test hija essenzalment l-istess 
bħal dik elenkata g ħas-sistema erobika bl-e ċċezzjoni li nitro ġenu umidu jkun 
mogħddi minn fuq il-wi ċċ ta' l-ilma f'kull unità ta' l-inkubazzjoni sabiex 
jinżamm spaziu fil-wi ċċ bin-nitro ġenu. Is-sediment u l-ilma huma meqjusa 
bħala anerobi ċi la darba l-potenzal tar-redox (E  h ) ikun aktar baxx minn –100 mV.  
Fit-test anerobiku, l-assa ġġ tal-mineralizzazzjoni jinkludi l-kejl tad-diossidu tal- 
karbonu u tal-metanju evoluti.  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
ANNESS 2  
EŻEMPJU TA' L-APPARAT TAN-NIXXIJA KONTINWA TAL-GASS
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
ANNESS 3  
EŻEMPJU TA' L-APPARAT BIOMETRIKU
  ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
ANNESS 4  
EŻEMPJU TAL-KALKOLU G ĦALL-APPLIKAZZJONI TA' DO ŻA 
MAR-RE ĊIPJENTI TAT-TEST  
Diametru intern ta ċ-ċildru: = 8 cm 
Fond tal-kolonna ta’ l-ilma li ma jinkludix is- 
sediment: = 12 cm 
Iż-żona tal-wi ċċ 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Rata ta' l-applikazzjoni: 500 g sustanza tat- 
test/ha tikkorrespondi g ħal 5 μg/cm  2 
Total μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Aġġusta l-kantità b’relazzjoni mal-fond ta’ 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Kolonna tal-volum ta’ l-ilma: 50,3 × 12 = 603 ml Konċentrazzjoni fl-ilma 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml jew 50 μg/l
 ▼B 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  MINERALIZZAZZJONI LI TE ĦTIEĠ L-OSSI ĠNU FL-ILMA 
TAL-WI ĊĊ — TEST TAS-SIMULAZZJONI TAL- 
BIJODEGRADAZZJONI  
1. METODU  
Dan il-metodu hu ekwivalenti g ħall-OECD  TG 309 (2004) (1).  
1.1. INTRODUZZJONI  
L-iskop ta’ dan it-test hu li jkejjel i ż-żmien meħtieġ għall-bijodegra ­
dazzjoni ta’ sustanza u żata għat-test b’kon ċentrazzjoni baxxa fl-ilma 
naturali li jkun je ħtieġ l-ossiġnu u biex jikkwantifika l-osser ­
vazzjonijiet f’forma ta' espressjonijiet tar-rata tal-moviment. Dan it- test simulatorju huwa test li jsir fil-laboratorju billi ji ġi mħawwad 
vażett ħalli jkunu mag ħrufa r-rati ta’ bijodegradazzjoni li te ħtieġ l- 
ossiġnu ta’ sustanzi organi ċi f’kampjuni ta’ ilma naturali tal-wi ċċ 
(frisk, ftit miela ħ jew ilma ba ħar). Hu bba żat fuq l-ISO/DIS 
14592-1 (2) u jinkludi wkoll elementi mill-metodi tat-test Ċ.23 u 
Ċ.24 (3)(4). Hemm l-g ħażla li, b’ħinijiet twal tat-test, operazzjoni 
semi-kontinwa tie ħu post l-operazzjoni fuq grupp sabiex tipprevjeni 
d-deterjorament tal-mikrokosmu ta ħt test. L-g ħan prinċipali tat-test 
simulatorju hu biex tkun mag ħrufa l-mineralizzazzjoni tas-sustanza 
użata għat-test fl-ilma tal-wi ċċ, u l-mineralizzazzjoni hi l-ba żi ta' kif 
tiġi espressa d-di żintegrazzjoni tal-movimenti. Madankollu, it-test 
jista’ jkollu g ħan ieħor sekondarju biex tinkiseb informazzjoni 
dwar id-di żintegrazzjoni ewlenija u l-formazzjoni ta’ prodotti 
maġġuri ta' trasformazzjoni. L-identifikazzjoni ta’ prodotti ta’ tras ­
formazzjoni, u fejn hu possibbli l-kwantifikazzjoni tal-kon ċen­
trazzjonijiet tag ħhom, huma tassew importanti g ħal sustanzi li ji ġu 
mineralizzati bil-mod ħafna (eż. fil-każ ta' nofs ħajjiet għas-sustanzi 
totali li jifdal wara l-evaporazzjoni  14 C li jaqb żu is-60 ġurnata). 
Konċentrazzjonijiet og ħla tas-sustanza u żata għat-test (e ż., 
> 100 μg/l) għandhom jintu żaw normalment biex ikunu identifikati 
u kwantifikati prodotti ta’ trasformazzjoni ma ġġuri minħabba limi ­
tazzjonijiet analiti ċi. 
Konċentrazzjoni baxxa f’dan it-test tfisser kon ċentrazzjoni (e ż. inqas 
minn 1 μg/l sa 100 μg/l) li hi baxxa bi żżejjed biex ti żgura li l- 
movimenti tal-bijodegradazzjoni miksuba fit-test jirriflettu dawk li wieħed jistenna li jkun hemm fl-ambjent. Meta mqabbla mal-pi ż 
totali tas-sottostrati tal-karbonju bijodegradabbli li hemm fl-ilma 
naturali u żat għat-test, is-sustanza u żata għat-test b'kon ċentrazzjoni 
baxxa se sservi b ħala sottostrata o ħra. Dan jimplika li l-movimenti 
tal-bijodegradazzjoni anti ċipati huma tal-ewwel ordni (movimenti “li 
ma jikbrux”) u li s-sustanza u żata għat-test tista’ ti ġi ddegradata 
permezz ta’ “kometaboli żmu”. Movimenti tal-ewwel ordni 
jimplikaw li r-rata tad-di żintegrazzjoni (mg/L/kull ġurnata) hija 
proporzjonali mal-kon ċentrazzjoni tas-sottostrata li tonqos ma ż- 
żmien. Fil-ka ż tal-movimenti tal-ewwel ordni r-rata kostanti tad- 
diżintegrazzjoni spe ċifika, k, ma tiddependix fuq i ż-żmien u l-kon ċ­
entrazzjoni. Dan ifisser li, k ma tvarjax ħafna matul l-esperiment u 
lanqas tinbidel bil-kon ċentrazzjoni mi żjuda waqt l-esperimenti. Skont 
id-definizzjoni, il-kostanti tar-rata tad-di żintegrazzjoni spe ċifika 
hija ugwali g ħall-bidla relattiva fil-kon ċentrazzjoni bi ż-żmien: 
k = (1/C) · (dC/dt). G ħalkemm wie
ħed jistenna li l-movimenti tal- 
ewwel ordni jkunu normalment ta ħt il-kundizzjonijiet preskritti, jista’ 
jkun hemm ċerti ċirkustanzi fejn movimenti o ħra huma aktar 
addattati. Id-devjazzjonijiet mill-movimenti tal-ewwel ordni jistg ħu 
eż. jiġu osservati jekk il-fenomeni tat-trasferiment tal-pi ż bħar-rata 
tat-tifrix, aktar milli r-rata tar-reazzjoni bijolo ġika, tkun qed tillimita 
r-rata tal-bijotrasformazzjoni. Madankollu, id-data tista’ kwa żi dejjem 
tkun deskritta minn movimenti tal-ewwel ordni li jixxiebhu li 
jaċċettaw kostanti tar-rata ta’ kon ċentrazzjoni dipendenti.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Informazzjoni dwar il-bijodegradabbiltà tas-sustanza u żata għat-test 
f’konċentrazzjonijiet og ħla (eż. mit-testijiet standard ta’  screening ) 
kif ukoll informazzjoni dwar id-degradabbiltà li mhix ta’ natura bijoloġika, prodotti ta’ trasformazzjoni u karatteristi ċi fiżiko- 
kemikali relevanti g ħandhom ikunu disponibbli qabel it-test biex 
ikun jista' ji ġi stabbilit l-ippjanar esperimentali u ji ġu interpretati r- 
riżultati. L-u żu ta’ sustanzi g ħat-test imsemmija
 14 C u l-għarfien tal- 
fażi tat-tqassim ta’  14 C fl-aħħar tat-test, g ħandhom jg ħinu biex tkun 
magħrufa l-bijodegradabbiltà finali. Meta tkun u żata sustanza g ħat- 
test li ma ng ħatatx isem, il-bijodegradazzjoni finali tista’ tkun stmata 
biss jekk ti ġi ttestjata kon ċentrazzjoni og ħla u l-prodotti ta’ trasform ­
azzjoni ma ġġuri kollha jkunu mag ħrufa. 
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Bijodegradazzjoni primarja : Il-bidla strutturali (trasformazzjoni) ta’ 
sustanza kimika mill-mikroorgani żmi li twassal biex tintilef l- 
identità kimika.  
Bijodegradazzjoni funzjonali : Il-bidla strutturali (trasformazzjoni) 
ta’ sustanza kimika mill-mikroorgani żmi li twassal biex tintilef 
karatteristika spe ċifika.  
Bijodegradazzjoni li tkun te ħtieġ l-ossiġnu finali : Id-diżinte­
grazzjoni ta’ sustanza kimika mill-mikroorgani żmi meta jkun 
hemm l-ossi ġnu mal-karbonju diossidu, l-ilma u l-mel ħ minerali u 
xi elementi o ħra (mineralizzazzjoni) pre żenti u l-ħolqien tal-pi ż totali 
ta' l-organi żmi u prodotti organi ċi li fihom bijosinte żi tal-mikroor ­
ganiżmi ġodda.  
Mineralizzazzjoni : Id-diżintegrazzjoni ta’ sustanza kimika f’materja 
organika min ħabba l-mikroorgani żmi li hemm fl-ossi ġnu mal- 
karbonju diossidu, l-ilma u l-mel ħ minerali ta’ xi elementi o ħra 
preżenti. 
Fażi tad-dewmien : Il-ħin minn meta jibda test sakemm jintla ħaq l- 
addattament tad-degradar tal-mikro organi żmi u l-ammont ta' bijode ­
gradazzjoni ta' sustanza kimika jew materja organika żdied għal livell 
li jista' jkun mag ħruf (eż. 10 % tal-bijodegradazzjoni teoretika 
massima, jew inqas, jiddependi minn kemm hi pre ċiża t-teknika 
tal-kejl).  
Livell massimu ta’ bijodegradazzjoni : L-ammont ta’ bijodegra ­
dazzjoni ta’ sustanza kimika jew materja organika f’test, irrekordjata 
f’perċentwal, li ‘l fuq minnu ma ssirx aktar bijodegradazzjoni waqt 
it-test.  
Sottostrata primarja : Ġabra ta’ karbonju naturali u sorsi ta’ 
enerġija li jkabbru u j żommu l-pi ż totali tal-organi żmi mikrobjali.  
Sottostrata sekondarja : Komponent tas-sottostrata li hemm f’dik il- 
konċentrazzjoni baxxa, li bid-di żintegrazzjoni tieg ħu, ammonti żgħar 
ħafna ta’ karbonju u ener ġija jiġu mgħoddija lill-mikroorgani żmi 
kompetenti, meta mqabbla mal-karbonju u l-ener ġija mogħtija mid- 
diżintegrazzjoni tal-komponenti tas-sottostrata ewlenija (sottostrati 
primarji).  
Ir-rata tad-di żintegrazzjoni kostanti : Rata tal-moviment kostanti 
tal-ewwel ordni jew li tixba ħha, k (d  –1 ), li tindika r-rata tal- 
proċessi tad-di żintegrazzjoni. G ħal esperiment fuq grupp k hi 
stmata mill-parti tal-bidu tal-kurva tad-di żintegrazzjoni miksuba 
wara li tintemm il-fa żi tad-dewmien.  
Nofs ħajja, t  1/2 (d): Terminu u żat biex jikkaratterizza r-rata tar- 
reazzjoni tal-ewwel ordni. Hu l-intervall tal- ħin li jikkorrispondi g ħal 
tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni b'fattur 2. In-nofs ħajja u l-kostanti tar-rata 
tad-diżintegrazzjoni huma marbuta ma' l-ekwazzjoni t  1/2 = ln2/k.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Il-brejk tad-di żintegrazzjoni, DT  50 (d): Terminu u żat biex 
jikkwantifika r-ri żultat tat-testijiet tal-bijodegradazzjoni. Huwa l- 
intervall ta’ ħin, inkluż il-fażi tad-dewmien, me ħtieġ biex jintla ħaq 
valur ta’ 50 % bijodegradazzjoni.  
Il-limitu tal-g ħarfien ( LOD ) u l-limitu tal-kwantifikazzjoni 
(LOQ ): Il-limitu tal-g ħarfien ( LOD ) huwa l-kon ċentrazzjoni ta’ 
sustanza li ‘l isfel minnu l-identità tas-sustanza ma tkunx tista’ 
tintgħaraf mill-karatteristi ċi li dda ħħlu fil-preparazzjoni g ħall- 
analiżi. Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni (LOQ) huwa l-kon ċentrazzjoni 
ta’ sustanza li ‘l isfel minnu l-kon ċentrazzjoni ma tistax tkun 
magħrufa bi pre ċiżjoni aċċettabbli.  
Karbonju organiku ma ħlul fl-ilma ( DOC ): Dik il-parti tal-karbonju 
organiku f'kampjun ta' ilma li ma tistax titne ħħa b’fażi ta’ separ ­
azzjoni spe ċifika, per e żempju b’azzjoni ċentrifuga permezz ta’ 
magna f’40 000 ms  –2 għal 15-il min jew bl-iffiltrar tal-membrana 
billi jintużaw membrani li fihom pori b'dijametru ta' 0,2 μm-0,45 μm. 
L-attività organika  14 C totali ( TOA ): L-attività totali  14 C assoċjata 
mal-karbonju organiku.  
L-attività organika  14 C maħlula fl-ilma ( DOA ): L-attività totali 
organika  14 C assoċjata mal-karbonju organiku ma ħlul fl-ilma.  
L-attività organika  14 C f’forma ta’  partikuli  separati ( POA ): L- 
attività totali  14 C assoċjata mal-karbonju organiku f’forma ta’  
partikuli  separati.  
1.3. APPLIKABILITÀ TAT-TEST  
Dan it-test simulatorju japplika g ħal sustanzi organi ċi li ma jeva ­
porawx malajr jew jevaporaw xi ftit malajr ittestjati f’kon ċen­
trazzjonijiet baxxi. Permezz ta’ fliexken miftu ħa għall-arja (e ż. 
tajjar imdeffes), sustanzi bil-kostanti tar-regola ta’  Henry  inqas 
minn madwar 1 Pa·m  3 /mol (madwar 10  –5 atm·m  3 /mol) jistg ħu 
jitqiesu li ma jevaporawx malajr fil-prattika. Permezz ta’ fliexken 
magħluqa bl-ispazju fuq, hu possibbli li ji ġu ttestjati sustanzi li ma 
tantx jevaporaw malajr (bil-kostanti tar-regola ta’  Henry  < 100 Pa·m  3 /­
mol jew < 10  –3 atm·m  3 /mol) ming ħajr telf fis-sistema tat-test. Jista’ 
jkun hemm telf tas-sustanzi msej ħa 14 C, jekk ma jittie ħdux il- 
prekawzjonijiet ġusti, meta jitne ħħa s-CO  2 . F’dawk is-sitwazzjonijiet, 
jista’ jkun hemm b żonn li s-CO  2 jinqabad ġo assorbitur intern bl-  
alkali  jew li tintu ża sistema esterna li tassorbi s-CO  2 (għarfien dirett 
tal –14 CO 2 ; ara Anness 3). Biex ikunu mag ħrufa l-movimenti tal- 
bijodegradazzjoni, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza u żata għat-test 
iridu jkunu ta ħt meta tin ħall fl-ilma. Ta’ min jinnota, i żda, li l-valuri 
tal-letteratura ta’ meta jin ħall fl-ilma jistg ħu jkunu og ħla sew minn 
meta tinħall is-sustanza u żata għat-test fl-ilmijiet naturali. Hemm l- 
għażla li tiġi stabbilita s-solubilità ta’ sustanzi tat-test partikolari li 
ma tantx jin ħallu fl-ilma permezz tal-ilmijiet naturali li jkunu qed 
jiġu ttestjati.  
Il-metodu jista’ jkun u żat biex ti ġi simulata l-bijodegradazzjoni fl- 
ilma tal-wi ċċ li ma jkunx fih partikuli ħorox (“test li jsir fil-ba ħar 
miftuħ”) jew fil-wi ċċ tal-ilma mhux ċar, eż. li jista' jkun hemm ħdejn 
post fejn l-ilma jiltaqa' man-naqal (“test sospi ż tan-naqal”).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. IL-PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
It-test isir fi grupp billi s-sustanza u żata għat-test tiġi żviluppata fiha 
l-batteri jew mill-ilma tal-wi ċċ biss (“test li jsir fil-ba ħar miftuħ”) jew 
ilma miżjud b'solidi/naqal mi żmuma x’imkien bejn il-qieg ħ u fuq ta' 
0,01 sa lg/L u żin xott (“test sospi ż” tan-naqal biex ikun jixbah  body  
tal-ilma mi żmuma x’imkien bejn il-qieg ħ u fuq jew naqal li jer ġa’ 
jkun sospi ż bejn il-qieg ħ u fuq. Is-solidi mi żmuma x’imkien bejn il- 
qiegħ u fuq/il-kon ċentrazzjoni tan-naqal fil-firxa t'isfel ta' dan l- 
intervall hi tipika g ħal ħafna ilmijiet fil-wi ċċ. Il-fliexken tat-test 
tiżviluppata fihom batteri fid-dlam f’temperatura ambjentali ta ħt 
kundizzjonijiet li je ħtieġu l-ossiġnu u l-aġitazzjoni. Tal-inqas żewġ 
konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza tat-test g ħandhom jintu żaw 
sabiex jiġu ddeterminati l-movimenti tad-di żintegrazzjoni. Il-kon ċen­
trazzjonijiet g ħandhom ivarjaw minn xulxin b’fattur ta’ 5 sa 10 u 
għandhom jirrappre żentaw il-firxa mistennija ta’ kon ċentrazzjonijiet 
fl-ambjent. Il-kon ċentrazzjoni massima tas-sustanza tat-test 
m’għandhiex te ċċedi 100 μg/L, iżda l-konċentrazzjonijiet massimi 
tat-test ta ħt 10 μg/L jew inqas huma preferuti biex ikun żgurat li 
l-bijodegradazzjoni ssegwi l-movimenti tal-ewwel ordni. L-ibaxx 
konċentrazzjoni m’g ħandhiex te ċċedi 10 μg/L, iżda l-ibaxx kon ċen­
trazzjonijiet tat-test ta’ 1-2 μg/L jew inqas minn 1 μg/L huma 
preferuti. Normalment anali żi adegwata ta’ dik il-kon ċentrazzjoni 
baxxa tista’ tintla ħaq bl-użu ta’ sustanzi msej ħa 14 C li ssib tixtrihom. 
Minħabba l-limitazzjonijiet analiti ċi, ta’ spiss ikun impossibbli li 
titkejjel il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test bil-pre ċiżjoni 
meħtieġa, jekk is-sustanza tat-test hi applikata f’kon ċentrazzjoni 
ta’≤ 100 μg/L (ara t-tieni paragrafu f’sezzjoni 1.7.2.). Kon ċen­
trazzjonijiet og ħla ta’ sustanzi u żati għat-test (> 100 μg/L u xi 
kultant > 1 mg/L) jistg ħu jintużaw għall-identifikazzjoni u l-kwan ­
tifikazzjoni ta’ prodotti ta’ trasformazzjoni ma ġġuri jew jekk 
m'hemmx metodu ta’ anali żi speċifiku b’limitu baxx li jidditektja. 
Jekk ikunu ttestjati kon ċentrazzjonijiet g ħolja tas-sustanza tat-test, 
jista’ ma jkunx possibbli li r-ri żultati jintu żaw biex tkun stmata l- 
kostanti tad-di żintegrazzjoni tal-ewwel ordni u n-nofs ħajja, għax id- 
diżintegrazzjoni probabbilment ma ssegwix il-movimenti tal-ewwel 
ordni.  
Id-diżintegrazzjoni tkun segwita f’intervalli tal- ħin addattati, billi 
titkejjel jew is-sustanza li jkun fadal wara l-evaporazzjoni  14 C jew 
il-konċentrazzjoni li jkun fadal wara l-evaporazzjoni tas-sustanza tat- 
test meta tintu ża analiżi kimika spe ċifika. L-g ħoti tal-isem  14 C tal- 
aktar parti stabbli tal-molekula ji żgura li tkun determinata l-miner ­
alizzazzjoni totali, filwaqt li l-g ħoti ta' l-isem  14 C ta’ parti inqas 
stabbli tal-molekula, kif ukoll l-u żu ta’ anali żi speċifika, jagħti lok 
għal evalwazzjoni tal-bijodegradazzjoni primarja biss. Madankollu, l- 
aktar parti stabbli mhux ne ċessarjament tinkludi n-nofs funzjonali 
relevanti tal-molekula (li tista' tkun relatata ma' karatteristika 
speċifika bħat-tossiċità, il-bijoakkumulazzjoni, e ċċ.) Jekk hekk ikun 
il-każ, ikun xieraq li tintu ża sustanza tat-test, imsemmija  14 C, fil-parti 
funzjonali sabiex issegwi t-tne ħħija tal-karatteristika spe ċifika.  
1.5. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Kemm is-sustanzi tat-test li ġew immarkati permezz ta' ra ġġi (radio­
labelled )kif ukoll dawk li ma ġewx mog ħtija isem jistg ħu jintużaw 
f'dan it-test. It-teknika tal-g ħoti tal-isem  14 C hi rakkomandata u l- 
għoti tal-isem g ħandu jsir normalment fl-aktar parti(jiet) stabbli tal- 
molekula (ara anki sezzjoni 1.4.). G ħal sustanzi li fihom aktar minn 
ċirku li mhux saturizzat bl-umdità, karbonju wie ħed jew aktar f’kull 
ċirku għandu preferebbilment ikun mog ħti l-isem  14 C. Barra minn 
hekk, karbonju wie ħed jew aktar fuq i ż-żewġ naħat ta’ għaqdiet li 
jistgħu jiġu diżintegrati fa ċilment g ħandhom preferibbilment 
ikollhom l-isem  14 C. Il-purità kimika u/jew radjokimika tas- 
sustanza tat-test g ħandha tkun > 95 %. G ħal sustanzi mmarkati 
permezz ta’ ra ġġi, attività spe ċifika ta’ madwar 50 μCi/mg 
(1,85 MBq) jew aktar hi preferuta sabiex tiffa ċilita l-kejl  14 C f’tes­
tijiet li jsiru b’kon ċentrazzjonijiet baxxi fil-bidu. G ħandu jkun hemm 
l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza u żata għat-test:  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— is-solubilità fl-ilma [Metodu A6];  
— is-solubilità f’a ġent(i) organiku li jin ħall (sustanzi applikati bl- 
aġent li jinħall jew li ma tantx jin ħallu fl-ilma);  
— il-kostanti dikompost (pKa) jekk is-sustanza g ħandha tendenza 
għal protonation  jew deprotonation  [OECD TG  112] (5);  
— il-pressjoni tal-fwar [Metodu A.4] u l-li ġi ta’ Henry  kostanti;  
— stabbilità kimika fl-ilma u fid-dlam (idrolisi) [Metodu C.7].  
Meta sustanzi li ma tantx jin ħallu fl-ilma jkunu qed ji ġu ttestjati fl- 
ilma baħar, ta’ min ikun jaf il-kostanti tat-tne ħħija tal-mel ħ (jew “il- 
kostanti  Setschenow ”) K  s , li huma mfissra permezz tal-espressjoni: 
log (S/S’) = K  s C m , fejn S u S’ huma kemm tin ħall is-sustanza fl- 
ilma pur u l-ilma ba ħar, rispettivament, u C  m hija l-kon ċentrazzjoni  
molar  tal-melħ. 
Jekk it-test isir b ħala “test tan-naqal mi żmum xi mkien bejn il-qieg ħ 
u fuq” l-informazzjoni li ġejja għandha tkun disponibbli:  
— koeffi ċjent tad-divi żjoni n-octanol /ilma [Metodu A.8];  
— koeffi ċjent ta’ kemm il-molekuli j żommu fil-wi ċċ ta’ likwidu 
(absorption coefficient ) [Metodu C.18];  
Informazzjoni o ħra utli tista' tinkludi:  
— il-kon ċentrazzjoni ambjentali, jekk tkun mag ħrufa jew stmata;  
— it-tossi ċità tas-sustanza u żata għat-test g ħall-mikroorgani żmi 
[Metodu C.11];  
— bijodegraddibiltà lesta u/jew li te żisti fiha [Metodi C.4 A-F, C.12, 
C.9, OECD TG 302 (5)];  
— studji dwar il-bijodegradabbiltà li te ħtieġ l-ossiġnu fl-ilma jew li 
ma teħtieġx ossiġnu fil-ħamrija u fil-bidla tan-naqal/l-ilma 
[Metodi C.23, C.24].  
1.6. SUSTANZA U ŻATA BĦALA REFERENZA  
Sustanza, li tista’ tiddi żintegra fa ċilment f'kundizzjonijiet li jkunu 
jeħtieġu l-ossiġnu fl-ilma (e ż. l-aniline  jew  is-sodium benzoate ) 
għandha tintu ża bħala sustanza ta' referenza. L-intervall ta’ ħin 
mistenni g ħad-diżintegrazzjoni tal- aniline  u tas- sodium benzoate  
huwa normalment inqas minn ġimagħtejn. L-iskop tas-sustanzi 
użati bħala referenza hu li jkun żgurat li l-attività tal-mikroorgani żmi 
ta' l-ilma u żat għat-test hi f' ċerti limiti; ji ġifieri li l-ilma fih popo ­
lazzjoni attiva ta' mikroorgani żmi. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KRITERJI DWAR IL-KWALITA'  
1.7.1.  Irkuprar  
Hekk kif ti ġi miżjuda s-sustanza u żata għat-test, kull test tal-kon ċen­
trazzjoni tal-bidu g ħandu jiġi vverifikat billi titkejjel l-attività  14 C, 
jew permezz ta’ anali żi kimika fil-ka ż ta’ sustanzi li m’g ħandhomx 
isem, f’tal-inqas kampjuni doppji. Dan jag ħti informazzjoni dwar 
kemm għandu jkun applikat u kemm g ħandu jiġi mtenni l-metodu 
analitiku kif ukoll dwar kemm hu uniformi t-tqassim tas-sustanza 
użata għat-test. Normalment, l-attività  14 C inizjali jew il-kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza tat-test jintu żaw fl-anali żi sussegwenti tad- 
data aktar milli l-kon ċentrazzjoni nominali b ħala telf min ħabba s-  
sorption  u żbalji fid-daqs tad-do żi jiġu kumpensati. G ħas-sustanza 
tat-test imsemmija  14 C, il-livell ta’ irkuprar fl-a ħħar tal-esperiment hu 
mogħti bil-bilan ċ fil-piż (ara l-aħħar paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.4). 
Idealment, il-bilan ċ tal-piż immarkat permezz ta’ ra ġġi għandu 
jestendi minn 90 % g ħal 110 %, filwaqt li l-pre ċiżjoni analitika 
għandha twassal g ħal irkuprar tal-bidu bejn 70 % u 110 % g ħal 
sustanzi tat-test li m’g ħandhomx isem. Dawn il-firxiet g ħandhom 
ikunu interpretati b ħala miri u m’g ħandhomx jintu żaw bħala 
kriterji biex ji ġi aċċettat it-test. Il-pre ċiżjoni analitika tista’ ti ġi 
ddeterminata ukoll g ħas-sustanza tat-test f’kon ċentrazzjoni ibaxx 
mill-konċentrazzjoni tal-bidu u g ħall-prodotti ta' trasformazzjoni 
maġġuri. 
1.7.2.  Kemm g ħandu jiġi mtenni u kemm hu sensittiv il-metodu 
analitiku  
Kemm għandu jiġi mtenni l-metodu analitiku (inklu ż l-effiċjenza tal- 
estrazzjoni tal-bidu) biex ti ġi kwantifikata s-sustanza tat-test, u l- 
prodotti ta’ trasformazzjoni, jekk jixraq, g ħandu jkun i ċċekkjat billi 
jkun hemm ħames anali żi l-istess tal-estratti individwali tal-ilma tal- 
wiċċ. 
Il-limitu ta’ g ħarfien ( LOD ) tal-metodu analitiku g ħas-sustanza u żata 
għat-test u g ħall-prodotti ta’ trasformazzjoni g ħandu jkun tal-inqas 
1 % tal-ammont tal-bidu applikat lis-sistema tat-test jekk hu 
possibbli. Il-limitu ta’ kwantifikazzjoni ( LOQ ) għandu jkun daqs 
jew inqas minn 10 % tal-kon ċentrazzjoni applikata. L-anali żi 
kimika ta’ ħafna sustanzi organi ċi u l-prodotti tat-trasformazzjoni 
tagħhom ta' spiss je ħtieġu li s-sustanza u żata għat-test tkun 
applikata f'kon ċentrazzjoni kemm xejn g ħolja, jiġifieri > 100 μg/L. 
1.8. DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST  
1.8.1.  Tag ħmir 
It-test jista’ jsir fi fliexken forma ta’ lembut jew forma ta’ ċilindru 
tad-daqs addattat (e ż. li jesgħu 0,5 jew 1,0 litru) mag ħluqa b'tappijiet 
tas-silikon jew lastku, jew fi fliexken tas- serum  b'għotjien li ma 
joħroġx minnhom CO  2 (eż. b’għeluq tal-lastku sintetiku). Inkella t- 
test jista' jsir bl-u żu ta' ħafna fliexken u bl-osservazzjoni tal- 
konsegwenzi tal-fliexken kollha, ta' l-inqas darbtejn, f'kull intervall 
tal-kampjuni (ara l-a ħħar paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.1). G ħas- 
sustanzi tat-test li ma jevaporawx malajr u li mhumiex immarkati bir-raġġi, m’hemmx b żonn ta’ tappijiet jew g ħotjien li ma jo ħroġx 
gass minnhom; bi ċċiet tat-tajjar li ma jag ħtux lok li jkun hemm 
kontaminazzjoni mill-arja huma addattati (ara t-tieni paragrafu fis- sezzjoni 1.8.9.1.). Sustanzi li ma tantx jevaporaw malajr g ħandhom 
ikunu ttestjati f’sistema tat-tip tal- bijometer  billi jitħawwad bil-mod 
l-ilma tal-wi ċċ. Biex ikun żgurat li ma ssirx kontaminazzjoni mill- 
batterji, il-kontenituri jistg ħu jiġu sterilizzati billi jissa ħħnu jew ji ġu 
stimjati qabel ma jintu żaw. Barra minn hekk, it-tag ħmir standard tal- 
laboratorju li ġej huwa u żat:
 
— mejda li tittrieg ħed jew o ġġetti li jħalltu manjeti ċi biex ikun 
hemm ċaqliq kontinwu tal-fliexken u żati għat-test,  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— magna ċentrifuga,  
— pH meter,  
— turbidimeter  biex ikejjel kon ċentrazzjoni tal-frak tat-tajn,  
— forn jew majkrowejv biex ikun mag ħruf il-piż xott,  
— apparat li jissepara l-membrana,  
— sterilizzatur li ju ża’ stim bi pressjoni g ħolja jew forn biex 
jisterilizza bis-s ħana l-kontenituri tal- ħġieġ, 
— faċilitijiet biex jimmani ġġjaw is-sustanzi mmarkati  14 C, 
— tagħmir biex ti ġi kwantifikata l-attività  14 C f’kampjuni mit- 
taħlitiet li jaqbdu s-CO  2 u, jekk hemm b żonn, mill-kampjuni 
tan-naqal,  
— tagħmir analitiku biex tkun mag ħrufa s-sustanza u żata għat-test 
(jew is-sustanza ta’ referenza) jekk tintu ża' analiżi kimika 
speċifika (eż. dak li jifred il-gass f'ta ħlita, dak li jifred il- 
likwidu bi pressjoni g ħolja).  
1.8.2.  Ta ħlitiet tal-kwantità tas-sustanza tat-test  
Ilma ming ħajr ions  użat biex ji ġu ppreparati t-ta ħlitiet tal-kwantità 
tat-test u s-sustanzi ta’ referenza (ara l-ewwel paragrafu fis- sezzjoni 1.8.7). L-ilma ming ħajr ions  m’għandux ikun fih sustanzi 
li jistgħu jkunu tossi ċi għall-mikroorgani żmi, u l-karbonju organiku 
maħlul fl-ilma ( DOC ) m’għandux ikun aktar minn 1 mg/L (6).
 
1.8.3.  Ġbir u ġarr tal-ilma tal-wi ċċ 
Il-post fejn jittie ħdu l-kampjuni g ħall-ġbir tal-ilma tal-wi ċċ għandu 
jintgħażel skont l-g ħan tat-test f’kull sitwazzjoni partikolari. Meta 
jintgħażlu l-postijiet fejn g ħandhom jittie ħdu l-kampjuni, g ħandha 
titqies l-istorja ta’ kontribut agrikolu, industrijali jew domestiku li 
jista’ jkun hemm. Jekk ikun mag ħruf li ambjent akwatiku ġie kkon­
taminat bis-sustanza tat-test jew l-analogu struttuturali tag ħha fl-erba’ 
snin ta’ qabel, m’g ħandux jintu ża’ għall-ġbir ta’ ilma g ħat-test, 
sakemm l-investigazzjoni tar-rati ta' di żintegrazzjoni f'postijiet li 
kienu esposti qabel huwa l-g ħan dikjatur ta' l-investigatur. Il- pH u 
t-temperatura tal-ilma g ħandhom ikunu mkejla fil-post tal- ġbir. Barra 
minn hekk, il-fond tat-te ħid tal-kampun u d-dehra tal-kampjun tal- 
ilma (eż. kulur u nuqqas ta’ ċarezza) g ħandhom ji ġu nnutati (ara 
sezzjoni 3). Il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu u/jew il-potenzjal tal-ossi ­
dazzjoni u t-tnaqqis fl-ilma u fis-saff tan-naqal tal-wi ċċ għandu 
jitkejjel sabiex juri l-kundizzjonijiet li je ħtieġu l-ossiġnu fl-ilma 
sakemm dan ma jkunx ovvju mid-dehra u mill-esperjenza storika 
tal-post. L-ilma tal-wi ċċ għandu jinġarr f’kontenitur li hu mnaddaf 
sew. Waqt il- ġarr, it-temperatura tal-kampjun m'g ħandhiex te ċċedi 
b’mod sinifikanti t-temperatura u żata fit-test. Hu rakkomandat li 
tiġi mkessħa għal temperatura ta’ 4 °C waqt il- ġarr jekk idum 
aktar minn 2 jew 3 sig ħat. Il-kampjun tal-ilma m’g ħandux ikun 
iffriżat. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Il- ħżin u l-preparazzjoni tal-ilma tal-wi ċċ 
It-test għandu jibda preferibbilment fi żmien ġurnata wara li jin ġabar 
il-kampjun. Il- ħżin tal-ilma, jekk hemm b żonn, għandu jkun mini ­
mizzat u g ħall-ebda ra ġuni m’għandu jaqbe ż massimu ta’ 4 ġimgħat. 
Il-kampjun tal-ilma g ħandu jinżamm f’temperatura ta’ 4 °C i ċċarġjat 
b’gas sakemm jintu ża. Qabel ma jintu ża, il-partijiet l-irqaq ħorox 
għandhom jitne ħħew, eż. billi jiġu iffiltrati minn ġo filter tan- 
najlon li x-xibka tieg ħu tkun daqs 100 μm jew b’filter tal-karta 
ħoxna, jew billi jit ħalla joqgħod ħalli n-naqal jin żel fil-qieg ħ. 
1.8.5.  Il-preparazzjoni tal-ilma mi żjud bin-naqal (mhux obbligatorja)  
Għat-test tan-naqal mi żmum x’imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ, in-naqal 
tal-wiċċ jiġi miżjud fil-fliexken li fihom ilma naturali (iffiltrat biex 
jitneħħew il-frak ħorox kif deskritt fis-sezzjoni 1.8.4.) biex tinkiseb 
is-sospensjoni; il-kon ċentrazzjoni ta’ solidi mi żmuma x’imkien bejn 
il-qiegħ u fuq g ħandha tkun bejn 0,01 u 1 g/L. In-naqal tal-wi ċċ 
għandu jkun ta' l-istess post minn fejn ittie ħed il-kampjun ta' l-ilma. 
Skont l-ambjent akwatiku partikulari, in-naqal tal-wi ċċ jista’ jew 
ikun karatterizzat minn kontenut g ħoli ta’ karbonju organiku (2.5- 
7.5 %) u konsistenza fina jew minn kontenut baxx ta' karbonju organiku (0.5-2.5 %) u konsistenza ħarxa (3). In-naqal tal-wi ċċ 
jista' jiġi preparat kif ġej: ħu diversi bi ċċiet min-nofs tan-naqal 
billi tuża tubu trasparenti tal-plastik, ne ħħilu s-saffi ta' fuq li 
jeħtieġu l-ossiġnu (mill-wi ċċ sa fond ta' massimu ta’ 5 mm) e żatt 
wara li jittie ħed il-kampjun u itfag ħhom flimkien. Il-kampjun li 
joħroġ tan-naqal g ħandu jinġarr ġo kontenitur li l-parti ta' fuq 
tiegħu hi kbira bi żżejjed għall-arja biex i żomm lin-naqal f'kun ­
dizzjonijiet li je ħtieġu l-ossiġnu (kessħu għal 4 °C jekk il- ġarr 
idum aktar minn 2-3 sig ħat). Il-kampjun tan-naqal g ħandu jinżamm 
bejn il-qieg ħ u l-wiċċ fl-ilma tat-test fi proporzjon ta’ 1:10 u 
jinżamm f’temperatura ta’ 4 °C i ċċarġjat bil-gass sakemm jintu ża. 
Il-ħżin tan-naqal, jekk hemm b żonn, għandu jkun minimizzat u 
m’għandux jaqbe ż massimu ta’ 4 ġimgħat. 
1.8.6.  Pro ċedura semi-kontinwa (mhux obbligatorja)  
L-inkubazzjoni fit-tul (diversi xhur) tista' tkun me ħtieġa jekk il- 
perjodu tad-dewmien isir qabel ma tkun tista' titkejjel di żinte­
grazzjoni sinifikanti tas-sustanza tat-test. Jekk din tkun mag ħrufa 
minn testijiet img ħoddija tas-sustanza, it-test jista’ jinbeda permezz 
tal-proċedura semi-kontinwa, li tag ħti lok għal tiġdid perjodiku ta’ 
parti mill-ilma tat-test jew mis-sospensjoni (ara Anness 2). Inkella, it- 
test normali fuq grupp jista’ jinbidel b’test semi-kontinwu, jekk id- 
diżintegrazzjoni tas-sustanza tat-test intla ħqet matul madwar 60 
ġurnata ta’ testjar billi ntu żat il-proċedura tal-grupp (ara t-tieni 
paragrafu fis-sezzjoni 1.8.8.3).  
1.8.7.  Żieda tas-sustanza tat-test (jew ta’ referenza)  
Għal dawk is-sustanzi li jin ħallu malajr fl-ilma (> 1 mg/L) u 
jevaporaw ftit (bir-regola ta'  Henry  kostanti < 1 Pa·m  3 /mol jew 
< 10  –5 atm·m  3 /mol), taħlita tal-kwantità tista’ ti ġi ppreparata fl- 
ilma ming ħajr ions  (ara sezzjoni 1.8.2); il-volum addattat tal- 
kwantità ji ġi miżjud fil-kontenituri tat-test biex tinkiseb il-kon ċen­
trazzjoni mixtieqa. Il-volum ta’ xi kwantità tat-ta ħlita għandu jkun il- 
minimu prattiku (< 10 % tal-volum tal-likwidu finali, jekk jista' jkun). Pro ċedura oħra hi li s-sustanza tat-test ti ġi maħlula f’volum 
akbar ta’ ilma tat-test, li tista’ tidher b ħala alternattiva g ħall-użu ta’ 
aġenti orġaniċi li jinħallu.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Jekk ma jkunx possibbli, it-ta ħlitiet tal-kwantità ta' sustanzi li ma 
jevaporawx malajr u li ma jin ħallux malajr fl-ilma g ħandhom ikunu 
preparati permezz ta’ a ġent organiku li jin ħall u li jevapora malajr, 
iżda l-ammont tal-a ġent li jin ħall miżjuda mas-sistema tat-test 
m’għandux je ċċedi il-1 % v/v u m’g ħandux iħalli effetti ħżiena 
fuq l-attività tal-mikroorgani żmi. L-aġent li jin ħall m’għandux 
jaffettwa l-istabbilità tas-sustanza tat-test fl-ilma. L-a ġent li jin ħall 
m’għandux jitne ħħa fi kwantità żgħira tant li ma żżidx b'mod sini ­
fikanti l-kon ċentrazzjoni  DOC  ta' l-ilma tat-test jew is-sospensjoni. 
Dan għandu jkun i ċċekkjat bl-anali żi tas-sustanza spe ċifika jew, jekk 
jista’ jkun, permezz ta’ anali żi DOC  (6). Għandha ting ħata attenzjoni 
biex jiġi llimitat l-ammont ta’ a ġent li jinħall trasferit g ħal dak li hu 
assolutament ne ċessarju, u biex ikun żgurat li l-ammont tas-sustanza 
tat-test tista' tin ħall fil-volum finali ta' l-ilma tat-test. Jistg ħu jintużaw 
tekniki oħra biex tidda ħħal is-sustanza tat-test fil-kontenituri tat-test 
kif deskritt f'(7) u (8). Meta a ġent organiku li jin ħall jintuża għall- 
applikazzjoni tas-sustanza tat-test, il-kontrolli tal-a ġent li jin ħall li 
fihom l-ilma tat-test (ming ħajr żidiet) u l-ilma tat-test bis-sustanza 
ta’ referenza mi żjuda għandhom ikunu ttrattati bl-istess mod b ħall- 
kontenituri attivi tat-test mi żjuda bis-sustanza tat-test f’dak li j ġorr l- 
aġent li jinħall. L-iskop tal-kontrolli tal-a ġent li jinħall hu biex ji ġu 
eżaminati xi effetti negattivi li jistg ħu jkunu kkaw żati mill-a ġent li 
jinħall fuq il-popolazzjoni tal-mikroorgani żmi kif indikat mid-di żin­
tegrazzjoni tas-sustanza ta’ referenza.  
1.8.8.  Kundizzjonijiet tat-test  
1.8.8.1.  Temperatura tat-test  
L-inkubazzjoni g ħandha ssir fid-dlam (preferibbilment) jew f'dawl 
batut b'temperatura kkontrollata (± 2 °C), li tista’ tkun it-temperatura tal-esperiment jew it-temperatura standard ta’ 20-25 °C. It- 
temperatura tal-esperiment tista’ tkun jew it-temperatura proprja 
tal-kampjun ta’ meta jittie ħed il-kampjun jew it-temperatura medja 
tal-esperiment fil-post fejn jittie ħed il-kampjun.
 
1.8.8.2.  Ċaqliq  
Iċ-ċaqliq permezz ta’ ċaqliq jew t ħawwid kontinwu g ħandu jsir biex 
il-partikuli ż-żgħar u l-mikroorgani żmi jkunu mi żmuma xi mkien 
bejn il-qieg ħ u l-wiċċ. Iċ-ċaqliq jgħin ukoll biex ji ġi trasferit l- 
ossiġnu mill-parti ta’ fuq g ħal-likwidu sabiex il-kundizzjonijiet fejn 
ikun meħtieġ l-ossiġnu jistgħu jinżammu b’mod adegwat. Qieg ħed il- 
fliexken fuq mejda li titrieg ħed (madwar 100 rpm ta’ ċaqliq) jew u ża 
xi ħaġa manjetika biex t ħawwad. I ċ-ċaqliq irid ikun kontinwu. I żda, 
iċ-ċaqliq jew it-t ħawwid g ħandu jsir bil-mod kemm jista’ jkun, 
filwaqt li jin żamm f’livell uniformi x’imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ. 
1.8.8.3.  Tul tat-test  
It-test m’g ħandux idum aktar minn 60 jum sakemm ma tkunx qed 
tiġi applikata l-pro ċedura semi-kontinwa bit-ti ġdid perjodiku tat-test 
ta' sospensjoni (ara sezzjoni 1.8.6 u Anness 2). Madankollu, il- perjodu tat-test g ħat-test tal-grupp jista’ jkun esti ż għal massimu 
ta’ 90 ġurnata, jekk id-di żintegrazzjoni tas-sustanza tat-test bdiet fl- 
ewwel 60 jum. Id-di żintegrazzjoni hi monitorjata, f’intervalli tal- ħin 
addattati, billi tkun mag ħrufa l-attività
 14 C tas-sustanza li jifdal wara 
l-evaporazzjoni jew  14 CO 2 evolut (ara sezzjoni 1.8.9.4) u/jew 
permezz ta’ anali żi kimika (sezzjoni 1.8.9.5). Il- ħin tal-inkubazzjoni 
għandu jkun twil bi żżejjed biex jevalwa l-pro ċess ta’ di żinte­
grazzjoni. L-ammont ta’ di żintegrazzjoni preferibbilment g ħandu 
jeċċedi 50 %; g ħas-sustanzi li jiddi żintegraw bil-mod, l-ammont ta’ 
diżintegrazzjoni g ħandu jkun bi żżejjed (normalment aktar minn 20 % 
diżintegrazzjoni) sabiex ji żgura li tiġi stmata r-rata kostanti ta’ di żin­
tegrazzjoni tal-moviment.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Kejl perjodu tal- pH u l-konċentrazzjoni tal-ossi ġnu fis-sistema tat- 
test għandu jsir sakemm dan ma jkunx me ħtieġ minħabba esperjenzi 
mgħoddija minn testi simili bil-kampjuni ta' l-ilma u n-naqal mi ġbura 
mill-istess post. Ta ħt xi kundizzjonijiet, il-metaboli żmu tas-sottostrati 
primarji f’kon ċentrazzjonijiet aktar g ħolja fl-ilma jew in-naqal jistg ħu 
jwasslu g ħall-evoluzzjoni bi żżejjed tas-CO  2 u t-tneħħija tal-ossi ġnu 
biex li jbiddlu b’mod sinifikanti l-kundizzjonijiet esperimentali waqt it-test.
 
1.8.9.  Il-Pro ċedura  
1.8.9.1.  Il-preparazzjoni tal-fliexken g ħat-test fil-ba ħar miftuħ 
Ittrasferixxi volum addattat ta’ ilma tat-test fil-fliexken tat-test, sa 
qisu terz tal-volum tal-flixkun u mhux anqas minn madwar 100 ml. Jekk jintu żaw diversi fliexken (biex ikunu jistg ħu jiġu 
magħrufa l-konsegwenzi tal-fliexken kollha kull meta jittie ħdu l- 
kampjuni), il-volum addattat tal-ilma tat-test hu kwa żi wkoll ta’ 
madwar 100 ml, g ħaliex volumi żgħar tal-kampjuni jistg ħu jinflu­
wenzaw it-tul tal-fa żi tad-dewmien. Is-sustanza tat-test hi mi żjuda 
mit-taħlita tal-kwantità kif deskritta fis-sezzjonijiet 1.8.2 u 
1.8.7. Tal-inqas żewġ konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza tat- 
test li jvarjaw b’fattur ta’ 5 sa 10 g ħandhom jintu żaw sabiex ikunu 
magħrufa l-movimenti tad-di żintegrazzjoni u biex ti ġi kalkolata r-rata 
kostanti tad-di żintegrazzjoni tal-moviment. I ż-żewġ konċen­
trazzjonijiet mag ħżula għandhom ikunu inqas minn 100 μg/L u 
preferibbilment inqas minn < 1-10 μg/L.
 
Agħlaq il-fliexken bit-tappijiet jew g ħotjien li minnhom ma tistax 
tgħaddi arja u CO  2 . Għall-kimiċi tat-test li ma jevaporawx ta’  14 C 
li m’għandhomx isem, bi ċċiet tat-tajjar huma addattati biex jintu żaw 
bħala tappijiet biex jevitaw kontaminazzjoni mill-arja (ara 
sezzjoni 1.8.1) dejjem jekk xi prodotti ma ġġuri ta' diżintegrazzjoni 
huma mag ħrufa li ma jevaporawx, u jekk tintu ża' determinazzjoni 
tas-CO  2 indiretta (ara Anness 3).  
Inkuba l-fliexken fit-temperatura mag ħżula (ara sezzjoni 1.8.8.1). 
Neħħi l-kampjuni g ħall-analiżi kimika jew il-kejl  14 C fil-bidu tat- 
test (jiġifieri qabel ma tibda d-di żintegrazzjoni; ara sezzjoni 1.7.1) 
u mbagħad f’intervalli tal- ħin addattati matul it-test. It-te ħid tal- 
kampjuni jista’ jsir billi jitne ħħew is-sotto kampjuni (e ż. 5 ml tal- 
kampjuni) minn kull repetizzjoni tal-esperiment jew permezz tal- 
esperjenza tal-konsegwenzi tal-fliexken kollha meta jittie ħdu l- 
kampjuni. Il-mineralizzazzjoni tas-sustanza tat-test tista’ tinstab diret ­
tament jew indirettament (ara Anness 3). Normalment, ikun me ħtieġ 
minimu ta’ ħames postijiet fejn jittie ħdu kampjuni waqt il-fa żi tad- 
diżintegrazzjoni (ji ġifieri wara li tintemm il-fa żi tad-dewmien) sabiex 
tkun stmata r-rata kostanti affidabbli, sakemm ma jkunx ġustifikat li 
tliet postijiet tat-te ħid ta' kampjuni huma bi żżejjed għas-sustanzi li 
jiddiżintegraw malajr. G ħas-sustanzi li ma jiddi żintegrawx malajr 
jista’ jsir fa ċilment aktar kejl waqt il-fa żi tad-diżintegrazzjoni u, 
għalhekk, g ħandhom jintu żaw aktar postijiet tad-data biex tkun 
stmata k. L-ebda skeda tal- ħin fissa g ħat-teħid ta' kampjuni ma 
tista' tkun stipulata, g ħaliex ir-rata ta' bijodegradabbiltà tvarja; 
madankollu hu rakkomandat li jittie ħed kampjun darba f’ ġimgħa 
jekk id-di żintegrazzjoni tkun baxxa. Jekk is-sustanza tat-test 
tiddiżintegra malajr, it-te ħid ta’ kampjuni g ħandu jsir darba kuljum 
fl-ewwel tlett ijiem u mbag ħad kull tieni jew tielet ġurnata. Ta ħt ċerti 
ċirkostanzi, b ħal b’sustanzi li jkollhom azzjoni kimika mg ħaġġla 
ħafna fl-ilma, ikun me ħtieġ li jittieħdu kampjuni f’intervalli ta’ 
siegħa. Hu rrikmandat li jsir studju preliminari qabel it-test sabiex 
ikunu mag ħrufa l-intervalli addattati tat-te ħid ta' kampjuni. Jekk il- 
kampjuni jridu jkunu disponibbli g ħal aktar anali żi speċifika, ta’ min 
jieħu aktar kampjuni u mbag ħad jintgħażlu dawk li jridu ji ġu 
analizzati fl-a ħħar tal-esperiment wara li tintu ża strateġija b’lura, 
jiġifieri l-a ħħar kampjuni ji ġu analizzati l-ewwel (ara t-tieni 
paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.5 g ħal gwida dwar l-istabbilità tal- 
kampjuni waqt il- ħżin). ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Numru ta’ fliexken u kampjuni  
Lesti numru bi żżejjed ta’ fliexken tat-test biex ikollok:  
— fliexken tat-test; tal-inqas fliexken doppji g ħal kull kon ċen­
trazzjoni tas-sustanza tat-test (preferibbilment minimu ta’ 3) jew 
diversi fliexken tat-test g ħal kull kon ċentrazzjoni, jekk fliexken 
tat-test sħaħ jiġu pproċessati kull darba li jittie ħdu l-kampjuni 
(simbolizzata F  T ), 
— fliexken tat-test g ħall-kalkolazzjoni tal-bilan ċ tal-piż; tal-inqas 
fliexken doppji g ħal kull kon ċentrazzjoni tat-test (simbolizzata 
F M ), 
— kontroll vojt, l-ebda sustanza tat-test; tal-inqas tal-flixkun tat-test 
vojt li fih biss l-ilma tat-test (simbolizzata F  B ), 
— kontroll ta’ referenza; flixkien doppji bis-sustanza ta’ referenza 
(eż. aniline  jew sodium benzoate  f’10 μg/l) (simbolizzata F  C ). L- 
iskop tal-kontroll tar-referenza hu li ji ġi kkonfermat minimu ta’ 
attività tal-mikroorgani żmi. Jekk hu konvenjenti, sustanza ta’ 
referenza mmarkata bir-ra ġġi tista’ tintu ża, anki meta d-di żinte­
grazzjoni tas-sustanza tat-test ti ġi mmonitorjata permezz ta’ 
analiżi kimika,  
— kontroll li ma fihx mikroorgani żmi; wieħed jew aktar mill- 
fliexken li fihom ilma tat-test ming ħajr mikroorgani żmi biex 
tkun eżaminata d-di żintegrazzjoni mhux ħajja li jista' jkun 
hemm jew xi tne ħħija oħra li mhix bijolo ġika tas-sustanza tat- 
test (simbolizzata F  S ). L-attività bijolo ġika tista’ titwaqqaf 
permezz ta’ sterilizzazzjoni bi pressjoni g ħolja taħt stim 
(121 °C; 20 min) tal-ilma tat-test jew billi ji ġi miżjud tossikant 
(eż. sodium azide  (NaN  3 ) f’10-20 g/l,  chloride  tal-merkurju 
(HgCl  2 ) f’100 mg/l jew  formalin  f’100 mg/l jew billi ti ġi 
esposta g ħar-raġġi gamma. Jekk jintu ża HgCl  2 , għandhom 
jiddisponu minnu b ħala skart tossiku. G ħall-ilma mi żjud bin- 
naqal f’ammont kbir, mhux fa ċli li jinkisbu l-kundizzjonijiet li 
ma jkunx fihom mikroorgani żmi; f’dan il-ka ż hu irrikkmandat li 
ssir aktar minn sterilizzazzjoni wa ħda bi pressjoni g ħolja tal-istim 
(eż. tliet darbiet). Ta’ min iqis li l-karatteristi ċi tas- sorption  tan- 
naqal jistg ħu jinbidlu meta ssir l-isterilizzazzjoni bi pressjoni 
għolja tal-istim,  
— kontrolli tal-a ġenti li jħollu, li fihom l-ilma tat-test u l-ilma tat- 
test bis-sustanza ta’ referenza; fliexken doppji trattati bl-istess ammont ta’ a ġent li jin ħall u bl-u żu tal-istess pro ċedura bħal 
dik użata għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. L-iskop hu li 
jiġu eżaminati xi effetti ħżiena tal-a ġent li jin ħall billi tkun 
magħrufa d-diżintegrazzjoni tas-sustanza ta’ referenza.
 
Fit-tfassil tat-test, l-investigatur g ħandu jqis l-importanza relattiva ta’ 
żjieda fir-repetizzjoni tal-esperiment kontra żjieda fin-numru ta’ 
ħinijiet tat-te ħid tal-kampjuni. In-numru e żatt ta’ fliexken me ħtieġa 
jiddependi mill-metodu u żat biex titkejjel id-di żintegrazzjoni (ara t- 
tielet paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.1.; sezzjoni 1.8.9.4 u Anness 3).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Għandhom jittie ħdu żewġ sotto kampjuni (e ż. 5 ml kampjuni) minn 
kull flixkun tat-test kull meta jittie ħdu l-kampjuni. Jekk jintu żaw 
diversi fliexken biex ikunu jistg ħu jiġu pproċessati fliexken s ħaħ, 
minimu ta’ żewġ fliexken g ħandu jkun issagrifikat kull meta 
jittieħdu l-kampjuni (ara l-ewwel paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.1).  
1.8.9.3.  Preparazzjoni tal-fliexken g ħat-test tan-naqal sospi ż [mhux obbliga ­
torju]  
Żid il-volumi me ħtieġa ta’ ilma tat-test u n-naqal, jekk hemm b żonn, 
fil-kontenituri tat-test (ara sezzjoni 1.8.5). Il-preparazzjoni tal- fliexken g ħat-test tan-naqal sospi ż huwa l-istess b ħal dak għat-test 
li jsir fil-ba ħar miftuħ (ara s-sezzjonijiet 1.8.9.1 u 1.8.9.2). Jekk jista' 
jkun uża' fliexken tas- serum  jew fliexken ta' g ħamla simili. Qieg ħed 
il-fliexken mag ħluqa mimduda fuq dak li jreg ħedhom. Ovvjament, 
fliexken miftu ħa għal sustanzi li ma jevaporawx ta’
 14 C mhux 
mogħtija isem, g ħandhom jitqeg ħdu fil-pożizzjoni wieqfa, f’dan il- 
każ hu rrikkmandat li jsir t ħawwid manjetiku u l-u żu ta’  bars  
manjetiċi miksija bil- ħġieġ. Jekk hemm b żonn, iċċarġja l-fliexken 
bil-gass biex i żżomm il-kundizzjonijiet xierqa li jkunu je ħtieġu l- 
ossiġnu. 
1.8.9.4.  Determinazzjonijiet radjokemikali  
Is –14 CO 2 evolut jitkejjel indirettament u direttament (ara Anness 3). 
Is –14 CO 2 jiġi magħruf indirettament permezz tad-differenza bejn l- 
attività  14 C inizjali fl-ilma tat-test jew is-sospensjoni u l-attività totali 
tas-sustanza li jifdal wara l-evaporazzjoni meta jittie ħdu l-kampjuni 
kif jitkejlu wara li l-kampjun ikun mimli bl-a ċtu għal ph 2-3 u 
jitneħħa s-CO  2 . Il-karbonju inorganiku g ħalhekk jitne ħħa u l- 
attività mkejla tas-sustanza li jifdal wara l-evaporazzjoni ti ġi minn 
materjal organiku. L-g ħarfien indirett tas  –14 CO 2 m’għandux jintu ża’, 
jekk il-prodotti tat-trasformazzjoni ma ġġuri li jevaporaw malajr 
jiffurmaw waqt it-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test (ara 
Anness 3). Jekk jista’ jkun, l-evoluzzjoni  14 CO 2 għandha titkejjel 
direttament (ara Anness 3) kull meta jittie ħdu l-kampjuni f’tal- 
inqas flixkun wie ħed tat-test, din il-pro ċedura tag ħti lok biex ikunu 
ċċekkjati l-bilan ċ tal-piż u l-proċess tal-bijodegradazzjoni, i żda hi 
ristretta g ħat-testijiet li jsiru fuq il-fliexken mag ħluqa.  
Jekk is  –14 CO 2 evolut jitkejjel direttament waqt it-test, aktar fliexken 
għandhom ji ġu ppreparati g ħal dan il-g ħan fil-bidu tat-test. Hu rrikk ­
mandat li tkun mag ħrufa b'mod dirett is  –14 CO 2 , jekk prodotti ta’ 
trasformazzjoni ma ġġuri li jevaporaw malajr ji ġu ffurmati waqt it- 
trasformazzjoni tas-sustanza tat-test. F’kull post ta’ kejl il-fliexken tat-test l-o ħra jimtlew bl-a ċtu għal pH2-3 u s
 –14 CO 2 jinġabar f’as­
sorbitur intern jew estern (ara Anness 3).  
Hemm ukoll l-g ħażla fejn il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test 
imsemmiija  14 C u prodotti ta’ trasformazzjoni ma ġġuri jistgħu jkunu 
magħrufa permezz tar-radjokromatografija (e ż. kromatografija ta’ saff 
irqiq,  RAD-TLC ) jew HPLC li taqbad ir-radjokimi ċi. 
Għażla oħra tista’ tkun il-fa żi tat-tqassim tar-radjoattività li fadal (ara 
Anness 1) u s-sustanza tat-test li jifdal wara l-evaporazzjoni u l- 
prodotti tat-trasformazzjoni jistg ħu jiġu ddeterminati.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Fl-aħħar tat-test il-bilan ċ tal-piż għandu jkun determinat permezz ta’ 
kejl dirett tas  –14 CO 2 bl-użu ta’ fliexken separati tat-test li minnhom 
ma jittieħdu l-ebda kampjuni waqt it-test (ara Anness 3).  
1.8.9.5.  Anali żi kimika spe ċifika 
Jekk ikun hemm metodu analitiku sensittiv spe ċifiku, il-bijodegra ­
dazzjoni primarja tista’ ti ġi evalwata billi titkejjel il-kon ċentrazzjoni 
totali li jkun fadal wara l-evaporazzjoni tas-sustanza tat-test minflok 
l-użu ta’ tekniki li jimmarkaw bir-ra ġġi. Jekk tintu ża’ sustanza tat- 
test immarkata bir-ra ġġi (biex titkejjel il-mineralizzazzjoni totali), 
analiżi kimiċi speċifiċi jistgħu jsiru fl-istess ħin biex jag ħtu inform ­
azzjoni o ħra utli u biex ji ċċekkjaw il-pro ċedura. Anali żi kimika 
speċifika tista’ tintu ża wkoll biex jitkejjlu l-prodotti ta’ trasform ­
azzjoni ffurmati waqt id-di żintegrazzjoni tas-sustanza tat-test, u dan 
hu rrikkmandat g ħas-sustanzi li huma mineralizzati b’nofs ħajjiet li 
jeċċedu 60 ġurnata. Il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u l- 
prodotti ta' trasformazzjoni kull meta jittie ħdu l-kampjuni 
għandhom ji ġu mkejla u jsir rapport dwarhom (b ħala konċentrazzjoni 
u bħala persenta ġġ ta’ dik applikata). Ġeneralment, il-prodotti tat- 
trasformazzjoni li jinstabu f’ ≥ 10 % tal-kon ċentrazzjoni applikata fi 
kwalunkwe ħin meta jittie ħdu l-kampjuni g ħandhom ikunu iden ­
tifikati sakemm ma jkunux hemm ra ġunijiet oħra ġustifikati biex 
isir mod ie ħor. Il-prodotti ta' trasformazzjoni li g ħalihom dejjem 
qed jiżdiedu l-kon ċentrazzjonijiet waqt l-istudju g ħandhom ukoll 
jitqiesu fl-identifikazzjoni, anki jekk il-kon ċentrazzjonijiet tag ħhom 
ma jeċċedux il-limitu msemmi hawn fuq, g ħaliex dawn jistg ħu 
jindikaw persistenza. L-anali żi tal-prodotti ta’ trasformazzjoni fil- 
kontrolli ta’ sterilizzazzjoni g ħandha titqies, jekk trasformazzjoni 
mhux ħajja mgħaġġla tas-sustanza tat-test (e ż. idrolisi) tista’ ti ġri. 
Il-bżonn ta’ kwantifikazzjoni u identifikazzjoni tal-prodotti tat-tras ­
formazzjoni g ħandhom jitqiesu ka ż b'każ, u jing ħataw ġustifi­
kazzjonijiet g ħalihom fir-rapport. Tekniki biex ji ġu estratti permezz 
tal-aġent organiku li jin ħall għandhom ikunu applikati skont id- 
direzzjonijiet mog ħtija fil-pro ċedura analitika rispettiva.  
Il-kampjuni kollha g ħandhom jin ħażnu f'temperatura ta' 2 sa 4 °C u 
jiġu ssiġġillati biex ma tid ħolx arja jekk l-anali żi ssir fi żmien 24 
siegħa (jekk hu possibbli). G ħal ħżin aktar fit-tul, il-kampjuni 
għandhom ikunu ffri żati taħt temperatura ta’ – 18 °C jew ippriservati 
kimikament. L-u żu ta' l-aċtu biex ji ġu ppriservati l-kampjuni mhux 
metodu rrikmandat, g ħaliex il-kampjuni bl-a ċtu jistgħu jkunu 
instabbli. Jekk il-kampjuni ma ji ġux analizzati fi żmien 24 sieg ħa 
u mhumiex so ġġetti għall-ħżin aktar fit-tul, g ħandu jsir studju dwar 
l-istabbilità tal- ħżin biex juru l-istabbiltà tal-kimi ċi li hemm interess 
fihom taħt temperatura tal- ħżin ta’ – 18 °C jew kundizzjonijiet ippri ­
servati. Jekk il-metodu analitiku jinvolvi jew li ji ġi estratt l-a ġent li 
jinħall jew il-fa żi li jiġi estratt is-solidu ( SPE), l-estrazzjoni g ħandha 
ssir mall-ewwel wara li jittie ħdu l-kampjuni jew wara li jin ħażen il- 
kampjun mi żmum fil-fri ġġ għal massimu ta’ 24 sieg ħa. 
Skont is-sensittività tal-metodu analitiku, jista’ jkun hemm b żonn 
volum ta' kampjuni akbar minn dawk indikati fil-paragrafu 1.8.1. It-test jista’ jsir fa ċilment bil-volumi tat-test ta’ litru fi 
fliexken b'volum ta' 2-3 litri, li bis-sa ħħa t'hekk ikunu jistg ħu 
jinġabru kampjuni ta' madwar 100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATA U RAPPURTAR  
2.1. KIF JI ĠU TRATTATI R-RI ŻULTATI  
2.1.1.  Il-Plot tad-data  
Qarreb il- ħinijiet tat-te ħid ta’ kampjuni g ħal numru s ħiħ ta’ sigħat 
(sakemm is-sustanza ma tiddi żintegrax ħafna fi ftit minuti jew sig ħat) 
iżda mhux g ħal numru s ħiħ ta' ġranet. Ipplottja l-estimi tal-attività li 
jifdal wara l-evaporazzjoni tas-sustanza tat-test (g ħas-sustanzi 
msemmija  14 C) jew il-kon ċentrazzjoni li jkun fadal wara l-evap ­
orazzjoni (g ħal sustanzi li mhux mog ħtija isem), kontra l- ħin 
kemm fi plot lineari kif ukoll semi-logaritmiku (ara Figuri 1a, 1b). Jekk saret id-di żintegrazzjoni, qabbel ir-ri żultati mill-fliexken F
 T ma’ 
dawk mill-fliexken F  S . Jekk il-medji tar-ri żultati mill-fliexken bis- 
sustanza tat-test (F  T ) u l-fliexken li ma fihomx mikro-organi żmi 
(F S ) jvarjaw b'inqas minn 10 %, wie ħed jista' jassumi li d-di żinte­
grazzjoni osservata hi l-aktar wa ħda mhux ħajja. Jekk id-di żinte­
grazzjoni fil-fliexken F  S hi ibaxx, il-figuri jistg ħu jintużaw biex 
isewwu dawk miksuba bil-fliexken F  T (billi jitnaqqsu minnhom) 
sabiex ikun stmat il-livell ta' bijodegradazzjoni. Meta jsiru anali żi 
mhux obbligatorji g ħall-prodotti ma ġġuri ta' trasformazzjoni, 
għandhom jing ħataw plots tal-formazzjoni u l-waqg ħa tagħhom 
flimkien ma' plot tal-waqg ħa tas-sustanza tat-test.  
Ħu stima tat-tul tal-fa żi tad-dewmien t  L mill-kurva tad-di żinte­
grazzjoni (plot semi-logaritmiku) billi tislet il-parti lineari tad-di żinte­
grazzjoni żero jew inkella billi tiddetermina l- ħin għal madwar 10 % 
diżintegrazzjoni (ara Figuri 1a u 1b). Mill-plot semi-logaritmiku, ħu 
stima tar-rata tal-ewwel ordni kostanti, k, u l-i żball standard tag ħha 
permezz ta’ rigress linear ta’ ln (attività  14 C li jifdal wara l-evap ­
orazzjoni jew il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test) kontra l- ħin. 
Bil-kejl  14 C b’mod partikolari, u ża biss data li tappartjeni g ħall- 
parti lineari tal-bidu tal-kurva wara li tkun intemmet il-fa żi tad- 
dewmien, u ag ħti preferenza biex tag ħżel ftit data u li tkun 
rappreżentattiva aktar milli tag ħżel numru akbar ta' data aktar 
inċerta. L-in ċertezza hawnhekk tinkludi żbalji interni fl-u żu dirett 
irrikmandat tal-attivitajiet  14 C imkejla li jifdal wara l-evaporazzjoni 
(ara hawn ta ħt). Xi kultant ikun relevanti li tikkalkula żewġ rati 
kostanti differenti, jekk id-di żintegrazzjoni ssegwi mudell f’ żewġ 
fażijiet. Għal dan il-g ħan huma mfissra żewġ fażijiet differenti tal- 
kurva tad-di żintegrazzjoni. Il-kalkolazzjonijiet tar-rata kostanti k, u 
n-nofs ħajja t  ½ = ln2/k, g ħandhom isiru g ħal kull wie ħed mill- 
fliexken individwali repetuti tal-esperiment, meta jittie ħdu sotto 
kampjuni mill-istess flixkun, jew billi jintu żaw il-valuri medja, 
meta l-fliexken kollha huma ippro ċessati kull meta jittie ħdu l- 
kampjuni (ara l-a ħħar paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.2). Meta tintu ża 
l-proċedura msemmija l-ewwel, ir-rata kostanti u n-nofs ħajja 
għandhom ikunu rrappurtati g ħal kull wie ħed mill-fliexken indi ­
vidwali repetuti tal-esperiment u b ħala valur medju bl-i żball 
standard. Jekk intu żaw konċentrazzjonijiet g ħolja tas-sustanza tat- 
test, il-kurva tad-di żintegrazzjoni tista’ tiddevja sew minn linja 
dritta (plot semi-logaritmiku) u l-movimenti tal-ewwel ordni jistg ħu 
ma jkunux validi. G ħalhekk ma jag ħmilx sens li ti ġi spjegata nofs 
ħajja. Madankollu, g ħal firxa limitata ta’ data, movimenti tal-ewwel 
ordni li jixxiebhu jistg ħu jiġu applikati u tkun stmata d-di żinte­
grazzjoni ta' nofs il- ħin DT  50 (ħin biex tintla ħaq 50 % di żinte­
grazzjoni). Madankolli, ta’ min i żomm f’mo ħħu, li t-tul ta’ ħin 
tad-diżintegrazzjoni lil hinn mill-firxa ta' data mag ħżula ma jistax 
ikun previst bl-u żu ta' DT  50 li hu sempli ċement dak li jiddeskrivi 
sett ta' data partikolari. Je żistu għodda analiti ċi li jiffaċilitaw il-kalko ­
lazzjonijiet statisti ċi u t-tpin ġija tal-kurva u l-u żu ta’ dan it-tip ta’  
software  hu irrikmandat.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Jekk isiru anali żi kimiċi speċifiċi, ħu stima tar-rata tal-kostanti u tan- 
nofs ħajjiet għad-diżintegrazzjoni primarja b ħal t’hawn fuq g ħal 
mineralizzazzjoni totali. Jekk id-di żintegrazzjoni primarja hi l- 
proċess li jillimita jistg ħu xi kultant jintu żaw punti tad-data mill- 
proċess kollu tad-di żintegrazzjoni. Dan ji ġri minħabba li l-kejl 
huwa dirett b’kuntrast mal-kejl tal-attività  14 C. 
Jekk jintu żaw sustanzi msemmija  14 C, bilanċ tal-piż għandu jkun 
imfisser f’persenta ġġ tal-konċentrazzjoni applikata tal-bidu, tal- 
inqas fl-a ħħar tat-test.  
2.1.2.  Attività li jifdal wara l-evaporazzjoni  
Meta l-parti msemmija  14 C ta’ sustanza organika tkun bijodegradata, 
il-parti l-kbira tal  –14 C tkun maqluba f’  14 CO 2 , filwaqt li parti o ħra 
tintuża' għat-tkabbir tal-pi ż kollu tal-organi żmi u/jew sintesi ta’ 
sustanzi extra- ċellulari me ħtieġa għall-metaboli żmu. Għalhekk, il- 
bijodegradazzjoni' finali' kompluta ta’ sustanza ma twassalx biex 
jiġi ikkonvertit 100 % tal-karbonju tag ħha f’  14 CO 2 . Il –14 C li hemm 
fil-prodotti ffurmati bil-bijosinte żi hi sussegwentement mer ħija bil- 
mod bħala 14 CO 2 minħabba “l-mineralizzazzjoni sekondarja”. G ħal 
dawn ir-ra ġunijiet il-plots tal-attività organika  14 C li jifdal wara l- 
evaporazzjoni (mkejla wara li jitne ħħa s-CO  2 ) jew tas-  14 CO 2 prodott 
kontra l-ħin juru “parti inferjuri” wara li tkun tlestiet id-di żinte­
grazzjoni. Dan jikkumplika l-interpretazzjoni kinetika tad-data u għal dan il-g ħan, il-parti inizjali tal-kurva biss (wara li tkun 
intemmet il-fa żi tad-dewmien u qabel ma tkun intla ħqet madwar 
50 % di żintegrazzjoni) g ħandha tintu ża' normalment biex tkun 
stmata r-rata kostanti tad-di żintegrazzjoni. Jekk is-sustanza tat-test 
tiġi diżintegrata, l-attività totali organika
 14 C li jifdal wara l-evap ­
orazzjoni hi dejjem og ħla mill-attività  14 C assoċjata mas-sustanza tat- 
test intatta li jifdal. Jekk is-sustanza tat-test hi di żintegrata bir- 
reazzjoni ta' l-ewwel ordni u frazzjoni kostanti α hi mibdula fil- 
minerali CO  2 , in-niżla inizjali tal  –14 C kurva li tisparixxi (organika 
totali  14 C kontra l- ħin) se tkun α immultiplikata bin-ni żla tal-kurva 
korrispondenti g ħall-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test (jew, biex 
inkunu pre ċiżi, il-parti tas-sustanza tat-test mog ħtija l-isem  14 C). Bl- 
użu tal-kejl tal-attività totali organika  14 C mhux ikkore ġuta, ir-rata 
kostanti tad-di żintegrazzjoni ikkalkulata se tkun g ħalhekk konser ­
vattiva. Pro ċeduri biex ikunu stmati l-kon ċentrazzjonijiet tas- 
sustanza tat-test mill-attivitajiet radjokimi ċi mkejla bba żati fuq 
diversi ipotesi ta’ simplifikazzjoni ġew deskritti fil-letteratura (2)(9) ­
(10)(11). Dawk il-pro ċeduri huma fa ċilment applikabbli g ħal sustanzi 
li jiddiżintegraw malajr.  
2.2. INTERPRETAZZJONI TAR-RI ŻULTATI  
Jekk jinstab li k hi indipendenti mill-kon ċentrazzjoni mi żjuda 
(jiġifieri jekk il-k ikkalkulata hi kwa żi l-istess f'kon ċentrazzjonijiet 
differenti tas-sustanza tat-test), wie ħed jista' jassumi li r-rata kostanti 
ta' l-ewwel ordni hi rappre żentattiva tal-kundizzjonijiet ta' l-ittestjar 
użati, jiġifieri s-sustanza tat-test, il-kampjun ta' l-ilma, u t- 
temperatura tat-test. Sa fejn jistg ħu jiġu ġeneralizzati r-ri żultati jew 
estiżi għal sistemi o ħra jrid ikun evalwat billi ji ġġudikahom espert. 
Jekk tintu ża’ konċentrazzjoni g ħolja tas-sustanza tat-test, u g ħalhekk 
id-diżintegrazzjoni ma ssegwix il-movimenti tal-ewwel ordni, id-data 
ma tistax tintu ża’ għal stima diretta tar-rata kostanti tal-ewwel ordni 
jew in-nofs ħajja korrispondenti. Madankollu, data me ħuda minn test 
li juża’ konċentrazzjoni g ħolja tas-sustanza tat-test tista' xorta tibqa' 
tajba biex ikun stmat l-ammont ta' mineralizzazzjoni totali u/jew biex 
ikunu misjuba u kwantifikati l-prodotti ta' trasformazzjoni.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Jekk ikunu mag ħrufa r-rati ta' pro ċessi oħra ta' telf barra l-bijodegra ­
dazzjoni (e ż l-idroliżi jew l-evaporazzjoni mg ħaġġla), huma jistg ħu 
jitnaqqsu mir-rata ta' telf netta osservata waqt it-test biex ting ħata 
stima approssimattiva tar-rata tal-bijodegradazzjoni. Id-data g ħall- 
idroliżi tista', eż. tinkiseb mill-kontroll li ma fihx mikro-organi żmi 
jew mill-ittestjar fl-istess ħin billi tintu ża’ konċentrazzjoni og ħla tas- 
sustanza tat-test.  
L-għarfien indirett u dirett tas  –14 CO 2 (sezzjoni 1.8.9.4 u Anness 3) 
jista’ jintu ża biss biex ikejjel sa fejn saret il-mineralizzazzjoni tas- 
sustanza tat-test f’CO  2 Ir-radjokromatografija ( RAD-TLC ) jew il-  
HPLC  jistgħu jintużaw biex janalizzaw il-kon ċentrazzjonijiet tas- 
sustanza tat-test imsemmija  14 C u l-iffurmar ta’ prodotti tat-trasform ­
azzjoni ma ġġuri (t-tielet paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.4). Biex tkun 
tista’ ssir stima diretta tan-nofs ħajja, jeħtieġ li ma jkun hemm l- 
ebda prodotti tat-trasformazzjoni ma ġġuri (mfissra b ħala ≥ 10 % tal- 
ammont applikat tas-sustanza tat-testJekk ikun hemm prodotti tat- 
trasformazzjoni ma ġġuri kif imfissra hawnhekk, je ħtieġ li jkun 
hemm evalwazzjoni dettaljata tad-dataDin tista’ tinkludi testjar imtenni u/jew identifikazzjoni tal-prodotti ta’ trasformazzjoni (ara l- 
ewwel paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.5) sakemm id-destin tal-prodotti 
ta’ trasformazzjoni ma jistax ikun evalwat sew mill-esperjenza (e ż. 
informazzjoni dwar ir-rotot tad-di żintegrazzjoni). Peress li l- 
proporzjon tal-karbonju tas-sustanza tat-test mibdul f’CO
 2 ivarja (l- 
aktar skont il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u sottostrati o ħra li 
jkun hemm, il-kundizzjonijiet tat-test u l-komunità tal-mikroor ­
ganiżmi), dan it-test ma jag ħtix lok biex issir stima fa ċli tal-bijode ­
gradazzjoni finali b ħal f'test dg ħajjef DOC ; iżda r-riżultat huwa 
simili għal dak miksub permezz ta' test respirometriku. L-ammont 
ta’ mineralizzazzjoni g ħalhekk ikun inqas minn jew ugwali g ħal- 
livell minimu ta’ bijodegradazzjoni finaliBiex tinkiseb stampa aktar sħiħa tal-bijodegradazzjoni finali (l-mineralizzazzjoni u l-inkorpo ­
razzjoni fil-pi ż ta' l-organi żmi), l-anali żi tal-fażi tat-tqassim ta’
 14 C 
għandha ssir fl-a ħħar tat-test (ara l-Anness 1). Il  –14 C fl-għadira tal- 
partikuli separati se tkun mag ħmula minn  14 C inkorporati fil-pi ż tal- 
mikroorgani żmi batteri ċi u 14 C iffurmati b’lura f’partikuli organi ċi. 
2.3. VALIDITÀ TAT-TEST  
Jekk is-sustanza ta’ referenza mhix di żintegrata fl-intervall tal- ħin 
mistenni (g ħal aniline  u sodium benzoate , normalment inqas minn 
ġimagħtejn), il-validità tat-test tkun suspettata u trid tkun ivverifikata 
aktar, jew inkella t-test g ħandu jiġi mtenni b’kampjun ġdid tal-ilma. 
F’ring test ISO tal-metodu fejn seba’ laboratorji li jinsabu madwar l- 
Ewropa ipparte ċipaw, il-kostanti tar-rata tad-di żintegrazzjoni 
addattati g ħall-aniline  varjaw minn 0,3 g ħal 1.7 ġurnata  –1 b’medja 
ta’ 0,8 d  –1 f’ 20  o C u żball standard ta’ ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0.9 ġranet). 
Ħinijiet tipi ċi tad-dewmien kienu 1 sa 7 ijiem. L-ilmijiet e żaminati 
ġew irrappurtati li kellhom pi ż totali tal-mikroorgani żmi batteri ċi li 
jikkorrispondi g ħal 10  3 -10 4 units  li jiffurmaw kolonja ( CFL) kull 
ml. Ir-rati tad-di żintegrazzjoni fl-ilmijiet Ewropej tan-Nofs li huma 
rikki fin-nutrienti kienu akbar minn dawk fl-ilmijiet Nordi ċi li huma 
relattivament neqsin min-nutrienti tal-pjanti, li jista’ jkun dovut 
għall-istat differenti tan-nutrizzjoni jew qabel kienu esposti g ħal 
sustanzi kimi ċi. 
L-irkuprar totali (bilan ċ tal-piż) fl-aħħar ta' l-esperiment g ħandu jkun 
bejn 90 % u 110 % g ħas-sustanzi immarkati bir-ra ġġi, filwaqt li l- 
irkuprar inizjali fil-bidu ta' l-esperiment g ħandu jkun bejn 70 % u 
110 % g ħas-sustanzi li mhumiex imsemmija. Madankollu, il-firxiet 
indikati g ħandhom ikunu interpretati biss b ħala miri u m’g ħandhomx 
jintużaw bħala kriterji biex ji ġi aċċettat it-test.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. RAPPORT TAT-TEST  
It-tip ta’ studju, ji ġifieri t-test f’ba ħar miftuħ jew it-test tan-naqal li 
jkun miżmum xi mkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ, għandu jkun dikjarat 
sew fir-rapport tat-test, li g ħandu jkun fih ukoll ta' l-inqas l-inform ­
azzjoni li ġejja: 
Is-sustanza tat-test u s-sustanza(i) ta' referenza:  
— ismijiet komuni, ismijiet kimi ċi (irrikmanda  IUPAC  u/jew 
ismijiet  CAS ), numri  CAS , formulas  strutturali) li jindikaw il- 
pożizzjoni ta’  14 C jekk tintu ża’ sustanza mmarkata bir-ra ġġi) u 
karatteristi ċi relevanti fi żiko-kimiċi tat-test u s-sustanza ta’ 
referenza (ara sezzjonijiet 1.5 u 1.6),  
— ismijiet kimi ċi, numri  CAS , formulas  strutturali (li jindikaw il- 
pożizzjoni ta’  14 C jekk tintu ża sustanza immarkata bir-ra ġġi) u 
karatteristi ċi fiżiko-kimiċi tas-sustanzi u żati bħala standards 
għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti ta’ tras ­
formazzjoni,  
— il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanzi tat-test u ta’ referenza,  
— il-purità radjokimika tal-attività kimika msemmija u spe ċifika 
(fejn jixraq).  
Ilma tal-wi ċċ: 
L-informazzjoni minima li ġejja għall-kampjun tal-ilma me ħud 
għandha ting ħata: 
— post u deskrizzjoni tas-sit fejn ittie ħdu l-kampjuni inklu ż, jekk 
jista' jkun, l-istorja tal-kontaminazzjoni,  
— id-data u l- ħin tal-ġbir tal-kampjuni,  
— in-nutrienti (N totali, l-ammonju, in- nitrite , in-nitrate , P totali,  
orthophosphate  maħlul fl-ilma),  
— il-fond tal- ġbir, 
— id-dehra tal-kampjun (e ż. il-kulur u kemm hu mdardar),  
— id- DOC  u t- TOC , 
— il- BOD , 
— it-temperatura u l- pH fl-istess post u ħin tal-ġbir, 
— l-ossiġnu jew il-potenzjal tal-ossidazzjoni u t-tnaqqis (obbli ­
gatorju biss jekk il-kundizzjonijiet fejn je ħtieġu l-ossiġnu 
mhumiex ovvji),  
— kemm fih mel ħ jew kemm jg ħaddi minnu (fil-ka ż tal-ilma ba ħar 
u ilma ftit miela ħ), 
— solidi mi żmuma x'imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ (fil-każ ta' 
kampjun mdardar),  
— jekk jista’ jkun xi informazzjoni o ħra relevanti dwar il-post fejn 
ittieħdu l-kampjunu fil- ħin meta ttie ħdu (eż. data vera jew storika 
dwar ir-rata tat-tgelgil tax-xmajjar jew il-kurrenti tal-ba ħar, 
postijiet ma ġġuri li jbattlu 'l barra li huma vi ċin il-post u t-tip 
ta' tbattil, il-kundizzjonijiet tat-temp qabel il- ħin li fih ittie ħdu l- 
kampjuni,  
u l-informazzjoni mhux obbligatorja li ġejja: 
— il-piż totali tal-mikroorgani żmi (eż. l-għadd dirett ta' l- acridine 
orange  jew il-units li jiffurmaw kolonji),  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— karbonju inorganiku,  
— konċentrazzjoni ta’  chlorophyll-a  bħala stima spe ċifika għall-piż 
totali tal-mikroorgani żmi ta' l-alka.  
Barra minn hekk, l-informazzjoni li ġejja dwar in-naqal g ħandha 
tingħata jekk isir it-test dwar in-naqal mi żmum xi mkien bejn il- 
qiegħ u l-wiċċ: 
— kemm hu fil-fond in-naqal mi ġbur, 
— id-dehra tan-naqal (b ħal ikkulurita, imtajna, imnaqqla, jew 
imramla),  
— il-konsistenza (e ż. ramel a ħrax, ramel fin, naqal u tafal),  
— użin xott f’g/l tas-solidi mi żmuma x’imkien bejn il-qieg ħ u l- 
wiċċ, il-konċentrazzjoni  TOC  jew it-telf fil-pi ż meta jinxteg ħel 
bħala kejl tal-kontenut ta’ materja organika,  
— il- pH, 
— l-ossiġnu jew il-potenzjal tal-ossidazzjoni u t-tnaqqis (obbli ­
gatorju biss jekk il-kundizzjonijiet fejn je ħtieġ l-ossiġnu 
mhumiex ovvji).  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— dewmien bejn il- ġbir u l-użu fit-test tal-laboratorju, il- ħżin tal- 
kampjun u t-trattament minn qabel tal-kampjun, id-data ta’ kif 
marru l-istudji,  
— l-ammont ta’ sustanza tat-test applikat, il-kon ċentrazzjoni tat-test 
u s-sustanza ta’ referenza,  
— il-metodu tal-applikazzjoni tas-sustanza tat-test inklu ż kull użu ta' 
aġenti li jin ħallu fl-ilma,  
— il-volum tal-ilma tal-wi ċċ użat u n-naqal (jekk intu ża) u l-volum 
użat għall-kampjuni f'kull intervall g ħall-analiżi, 
— deskrizzjoni tas-sistema tat-test u żata, 
jekk m’g ħandhomx jin żammu kundizzjonijiet mudlama, inform ­
azzjoni dwar il-kundizzjonijiet b' “dawl batut”,  
— informazzjoni dwar il-metodu(i) u żat(i) biex ikunu stabbiliti l- 
kontrolli li ma fihomx mikroorgani żmi (eż. it-temperatura, il- 
ħin u n-numru ta’ sterilizzazzjonijiet bi stim ta’ pressjoni g ħolja),  
— it-temperatura tal-inkubazzjoni,  
— informazzjoni dwar tekniki analiti ċi u l-metodu(i) u żati għal kejl 
radjokemikali u g ħall-bilanċ tal-piż u l-kejl tal-fa żi tat-tqassim 
(jekk sar),  
— numru ta’ repetizzjonijiet tal-esperiment.  
Riżultati:  
— persenta ġġi ta’ rkuprar (ara sezzjoni 1.7.1),  
— kemm g ħandhom ji ġu mtennija u kemm huma sensittivi l-metodi 
analitiċi użati inkluż il-limitu ta’ sejbien ( LOD ) u l-limitu ta' 
kwantifikazzjoni ( LOQ ) (ara sezzjoni 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— id-data kollha mkejla (inklu ż il-punti tal- ħin tat-teħid tal- 
kampjuni) u l-valuri kkalkulati f’forma ta’ tabelli u l-kurvi tad- 
diżintegrazzjoni; g ħal kull kon ċentrazzjoni tat-test u g ħal kull 
flixkun irrepetut g ħall-esperiment, irrapporta l-ko-effi ċjent tal- 
korrelazzjoni lineari g ħan-niżla tal-plot logaritmiku, il-fa żi tad- 
dewmien stmata u r-rata kostanti tal-ewwel ordni jew li 
tixxiebah (jekk jista’ jkun), u d-di żintegrazzjoni nofs ħajja korris ­
pondenti (jew il-perjodu nofs ħajja, t  50 ), 
— irrapporta l-valuri relevanti b ħala medji tar-ri żultati osservati fir- 
repetizzjonijiet individwali tal-esperimenti, e ż. it-tul tal-fazi tad- 
dewmien, ir-rata kostanti tad-di żintegrazzjoni u d-di żintegrazzjoni 
nofs ħajja (jew t  50 ), 
— qiegħed f’kategoriji s-sistema jew b ħala mhux addattata jew 
addattata kif ġudikati mid-dehra tal-kurva tad-di żintegrazzjoni u 
mill-influwenza li jista’ jkun hemm tal-kon ċentrazzjoni tat-test,  
— ir-riżultati tal-verifika tal-bilan ċ tal-piż finali u r-ri żultati fuq il- 
kejl tal-fa żi tat-tqassim (jekk hemm),  
— il-frazzjoni ta’  14 C mineralizzat u, jekk jintu żaw analiżi speċifiċi, 
il-livell finali tad-di żintegrazzjoni primarja,  
— l-identifikazzjoni, il-kon ċentrazzjoni tal-kon ċentrazzjoni  molar  u 
l-persenta ġġ tal-prodotti applikati u ma ġġuri ta' trasformazzjoni 
(ara l-ewwel paragrafu fis-sezzjoni 1.8.9.5), fejn jixraq,  
— mogħdija proposta tat-trasformazzjoni, fejn jixraq,  
— diskussjoni tar-ri żultati.  
4. LETTERATURA  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Il-kwalità tal-ilma — Evalwazzjoni tal- 
bijodegrabbiltà li te ħtieġ l-ossiġnu tal- compounds  organiċi 
b’konċentrazzjonijiet baxxi — Parti 1: Ħawwad il-flixkun tat- 
test tal-grupp li fih ilma tal-wi ċċ jew ilma tal-wi ċċ/naqal 
miżmuma x’imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ. 
3. Metodu tat-Testjar C. 23. Trasformazzjoni tal-organi żmi li 
jeħtieġu l-ossiġnu fl-ilma u li ma je ħtiġux ossiġnu fil-ħamrija.  
4. Metodu tat-Testjar C.24. Trasformazzjoni tal-organi żmi li 
jeħtieġu l-ossiġnu u li ma je ħtiġux l-ossiġnu biex jikbru fin- 
naqal akwatiku.  
5. OECD  (1993). Linji ta’ gwida biex ikunu Ittestjati l-Kimi ċi. 
OECD , Pariġi. 
6. ISO 8245 (1999). Kwalità tal-ilma — Linji ta’ gwida dwar l- 
għarfien tal-karbonju organiku totali ( TOC ) u karbonju organiku 
maħlul fl-ilma ( DOC ). 
7. ISO 10634 (1995). Il-kwalità tal-ilma — Gwida biex ji ġu ippre­
parati u trattati  compounds  organiċi li ma jin ħallux malajr fl-ilma 
għal evalwazzjoni sussegwenti tal-bijodegradabbiltà tag ħhom 
f'mezz li fih l-ilma.  
8. Abbozz tal- OECD  (2000). Dokument ta’ Gwida dwar l-ittestjar 
tat-tossiċità akwatika ta' sustanzi u ta ħlitiet diffi ċli. Pubbli ­
kazzjonijiet dwar is-Sa ħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Sensiela fuq 
l-Ittestjar u l-Evalwazzjoni. Nru 22 (biex ikun ippubblikat fis- 
sajf 2000).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. u Alexander, M. (1984). Mudelli g ħall-movimenti 
tal-mineralizzazzjoni bil-varjabbli tal-kon ċentrazzjoni tas- 
sottostrata u d-densità tal-popolazzjoni Mikrobijolo ġija 
Ambjentali Applikata 47, 394-401.  
10. Ingerslev, F. u N. Nyholm. (2000). Test dwar it-t ħawwid ta’ 
flixkun biex ikunu mag ħrufa r-rati tal-bijodegradazzjoni tal- 
kimiċi msejħa 14 C b'konċentrazzjonijiet baxxi fis-sistemi ta' l- 
ilma tal-wi ċċ. Sigurtà Ambjentali Ekotossika 45, 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999). Rapport tat-test tar- ring: Kwalità tal- 
Ilma — Evalwazzjoni tal-bijodegradabbiltà tal-organi żmi li 
jeħtieġu l-ossiġnu fil-wi ċċ tal-ilma tal- compounds  organiċi 
b’konċentrazzjonijiet baxxi parti 1 — rapport tat-test tar- ring 
1998/1999. Ħawwad il-flixkun tal-grupp tat-test li fih l-ilma 
tal-wiċċ jew l-ilma tal-wi ċċ/naqal mi żmum x’imkien bejn il- 
qiegħ u l-wiċċ. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Anness 1  
Fażi tat-tqassim tal-  14 C 
Sabiex ti ċċekkja l-pro ċedura, il-kejl tas-soltu tal-attività  14 C organika totali li 
jifdal wara l-evaporazzjoni ( TOA ) għandha tkun mi żjuda bil-kejl tal-bilan ċ tal- 
piż li jinvolvi g ħarfien dirett tal-  14 C 2 evoluta wara li tinqabad f’assorbitur (ara 
Anness 3). Fiha nnifsha, formazzjoni po żittiva  14 CO 2 hi evidenza diretta tal- 
bijodegradazzjoni kuntrarjament g ħad-diżintegrazzjoni mhux ħajja, jew 
mekkaniżmi oħra ta’ telf, b ħall-evaporazzjoni mg ħaġġla u s- sorption . Inform­
azzjoni o ħra utli li tikkaratterizza l-im ġiba tal-bijodegradabbiltà tista’ tinkiseb 
mill-kejl tat-tqassim tat- TOA  bejn l-istat ma ħlul fl-ilma (attività organika  14 C 
maħlula fl-ilma,  DOA ) u l-istat tal-partikuli separati (attività organika  14 C tal- 
partikuli separati,  POA ) wara l-firda tal-partikuli separati permezz ta' filtrar tal- 
membrana jew ta' pro ċess b'magna ta’ ċentrifuga. Il- POA  hu mag ħmul mis- 
sustanza tat-test  sorbed  fuq il-pi ż totali tal-mikroorgani żmi u fuq partikuli o ħra 
barra mill-karbonju tas-sustanza tat-test li ntu żaw għas-sinteżi tal-materjal ġdid 
ċellulari u ri żultat t'hekk inkorporti fil-frazzjoni tal-pi ż totali tal-partikuli separati 
tal-mikroorgani żmi. L-iffurmar ta’ materjal organiku  14 C maħlul fl-ilma jista’ 
jkun stmat b ħala DOA  fl-aħħar tal-bijodegradazzjoni (art g ħolja fuq id-di żinte­
grazzjoni kontra l-kurva tal- ħin). 
Ħu stima tal-fa żi tat-tqassim ta’  14 C li jifdal wara l-evaporazzjoni f'kampjuni 
magħżula bl-iffiltrar tal-kampjuni fuq 0,22 μm jew 0,45 μm jew filter tal- 
membrana ta' materjal li ma j żommx fil-wi ċċ ammonti sinifikanti tas-sustanza 
tat-test (filters  polycarbonate  jistgħu jkunu addattati). Jekk is- sorption  tas- 
sustanza tat-test fuq il-filter hi kbira wisq biex tkun injorata (biex ti ġi iċċekjata 
qabel l-esperiment) jista’ jintu ża’ proċess b’magna ta’ ċentrifuga (2 000 g, 
10 min) minflok l-iffiltrar.  
Ipproċedi bil-likwidu ffiltrat jew is-solidu mifrud mil-likwidu kif deskritt fl- 
Anness 3 g ħal kampjuni mhux iffiltrati. Ħoll il-filters tal-membrana fi fluwidu 
florexxenti addattat u g ħodd bħas-soltu, normalment billi tu ża’ biss il-metodu tal- 
proporzjon tal-istandards esterni biex titnaqqas l-illuminazzjoni, jew u ża kampjun 
li jitħallat ma' l-ossi ġnu. Jekk intu ża l-proċess b’magna ta’ ċentrifuga, er ġa’ 
ssospendi l-ballun żgħir iffurmat minn frazzjoni ta’ partikuli separati f’1-2 ml 
ta’ ilma distillat u ttrasferrixxih g ħal kontenitur żgħir tal-medi ċini li hu 
florexxenti. A ħsel sussegwentement darbtejn b'1ml ilma distillat u ittrasferixxi 
l-ilma tal- ħasil għall-kontenitur żgħir tal-medi ċini. Jekk hemm b żonn, is- 
sospensjoni tista’ ssir f’ ġel li jgħodd il-florexxenza tal-likwidu.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Anness 2  
proċedura semi-kontinwa  
Tista’ tkun me ħtieġa l-inkubazzjoni fit-tul g ħal diversi xhur sabiex tintla ħaq 
diżintegrazzjoni suffi ċjenti tas-sustanzi li ma jobdux. It-tul tat-test m’g ħandux 
jaqbeż normalment is-60 ġurnata sakemm il-karatteristi ċi tal-kampjun tal-ilma 
oriġinali ma jin żammux permezz ta’ ti ġdid tat-test ta’ sospensjoni. Madankollu, 
il-perjodu tat-test jista’ jkun esti ż għal massimu ta’ 90 jum ming ħajr tiġdid tas- 
sospensjoni tat-test, jekk id-di żintegrazzjoni tas-sustanza tat-test bdiet fl-ewwel 
60 ġurnata.  
Waqt l-inkubazzjoni g ħal perjodi twal, id-diversità tal-komunità tal-mikroor ­
ganiżmi tista’ titnaqqas min ħabba mekkani żmi diversi ta’ telf u min ħabba l- 
qerda possibbli tal-kampjun tal-ilma ta’ nutrijenti essenzjali u sottostrati primarji tal-karbonju. Hu g ħalhekk irrikmandat li jintu ża test semi-kontinwu 
biex tkun determinata bi żżejjed ir-rata ta’ di żintegrazzjoni tas-sustanzi li jiddi żin­
tegraw bil-mod. It-test g ħandu jinbeda permezz ta’ pro ċedura semi-kontinwa 
jekk, skont esperjenza mg ħoddija, hu mistenni li jkun me ħtieġ perjodu ta’ inku ­
bazzjoni ta’ tliet xhur biex tinkiseb 20 % di żintegrazzjoni tas-sustanza. Inkella, it- 
test normali tal-grupp jista' jinbidel f'wie ħed semi-kontinwu, jekk ma tkunx 
inkisbet di żintegrazzjoni tas-sustanza tat-test waqt madwar 60 ġurnata ta' testjar 
bl-użu tal-proċedura tal-grupp. Il-pro ċedura semi-kontinwa tista’ titwaqqaf u t-test 
jitkompla b ħala esperiment tal-grupp, meta tkun ġiet irrekordjata di żintegrazzjoni 
sostanzjali (e ż. > 20 %).
 
Fit-test semi-kontinwu, kull ġimagħtejn, madwar terz tal-volum tat-test tas- 
sospensjoni ji ġi mibdul b’ilma frisk mi ġbur bis-sustanza tat-test mi żjuda mal- 
konċentrazzjoni tal-bidu. In-naqal ji ġi miżjud bl-istess mod ma’ l-ilma mibdul 
mal-konċentrazzjoni tal-bidu (bejn 0,01 u 1 g/l), jekk isir it-test sospi ż tan-naqal 
mhux obbligatorju. Meta jsir it-test mas-solidi tan-naqal mi żmuma x’imkien bejn 
il-qiegħ u l-wiċċ, hu importanti li s-sistema sospi ża kollha tin żamm anki waqt li 
jitneħħa l-ilma, u l- ħin residenti jkun identiku g ħas-solidi u l-ilma, g ħax inkella 
x-xebħ maħsub ma’ sistema uniformi akwatika bl-ebda fa żijiet fissi tista’ tintilef. 
Għal dawn ir-ra ġunijiet, kon ċentrazzjoni inizjali tan-naqal mi żmum bejn il-qieg ħ 
u l-wiċċ fil-medda t’isfel tal-intervall spe ċifikat hi preferuta, meta tintu ża l- 
proċedura semi-kontinwa.  
Iż-żieda preskritta tas-sustanza tat-test tfisser li l-kon ċentrazzjoni inizjali tas- 
sustanza tat-test ma ti ġix maqbu ża bit-tiġdid parzjali tat-test ta’ sospensjoni u, 
għalhekk, l-addattament, li hu ta' spiss meqjus b'kon ċentrazzjonijiet g ħolja tas- 
sustanza tat-test, ikun evitat. Peress li l-pro ċedura tikkonsisti minn d ħul mill-ġdid 
tal-organi żmi u kumpens tan-nutrijenti meqruda u s-sottostrati primarji, id- 
diversità ori ġinali tal-mikroorgani żmi terġa' tinġab għal li kienet, u t-tul tat-test 
jista' jkun esti ż għal dejjem fil-prin ċipju. Meta tintu ża' l-istess pro ċedura semi- 
kontinwa, hu importanti li wie ħed jinnota l-kon ċentrazzjoni li jifdal wara l-evap ­
orazzjoni tas-sustanza tat-test g ħandha tiġi korretta g ħall-ammonti tas-sustanza 
tat-test mi żjuda u mne ħħija f’kull pro ċedura ta’ ti ġdid. It-total u l-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza tat-test ma ħlula fl-ilma tista’ tintu ża' b’mod alternat g ħall-compounds  
li jiffurmaw lura ftit. Il-formazzjoni lura hi insinifikanti (< 5 %) ta ħt il- 
kundizzjonijiet spe ċifikati (0,1-1g solidi/l) g ħas-sustanzi ta’  log Kow  < 3 
(validi għall-compounds  newtrali  lipophilic ). Dan jidher permezz tal-e żempju 
ta’ kalkolazzjoni li ġej. 0,1 g/l ta' solidi bejn wie ħed u ieħor jikkorrispondu 
għal 10 mg ta' karbonju kull litru (frazzjoni ta' karbonju, f  C = 0.01). Billi 
nassumu li;  
Log K  ow (tas-sustanza tat-test) = 3  
K oc = 0.42 × K  ow 
Koeffiċjent ta’ partizzjoni, K  d = f C × K  oc 
imbagħad, il-frazzjoni ma ħlula fl-ilma tal-kon ċentrazzjoni totali (C-ilma (C  w )/C- 
totali (C  t ) hija:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 × 
10 –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Anness 3  
Kif jiġi determinat il  –14 CO  2 
Għarfien indirett tal  –14 CO  2 
Għall-kejl tas-soltu, il-metodu indirett huwa normalment l-inqas wie ħed li jieħu 
ħin u l-aktar metodu pre ċiż jekk is-sustanza tat-test ma tevaporax malajr u ma 
tkunx trasformata f’prodotti tat-trasformazzjoni li jevaporaw malajr. Trasferiment 
sempliċi tal-kampjuni mhux iffiltrati e ż. daqs ta' 5 ml f’kontenituri żgħar flor­
exxenti u żati għall-mediċina. Attività addattata fil-kampjuni hija5 000 dpm- 
10 000 dpm (80-170 Bq) fil-bidu, u attività minima inizjali hi madwar 1 000 
dpm. Is-CO  2 għandu jitne ħħa wara li jinkesa bl-a ċtu għal pH 2-3 b'1-2 qatriet ta' 
H 3 PO 4 ikkonċentrat jew  HC1 . It-tneħħija tas-CO  2 tista’ ssir billi jidda ħħlu 
bżieżaq tal-arja g ħal nofs sieg ħa — sieg ħa. Inkella, il-kontenituri ż-żgħar użati 
għall-mediċina jistgħu jiġu mħawda bis-sa ħħa għal siegħa — sag ħtejn (per 
eżempju fuq  microplate shaker ) jew b’t ħawwid aktar ġentili li jit ħalla bil-lejl. 
L-effiċjenza tal-pro ċedura tat-tne ħħija tas-CO  2 għandha tkun i ċċekkjata (billi 
jittawwal il-perjodu ta' l-i ċċarġjar bil-gass jew tat-t ħawwid). Likwidu florexxenti, 
addattat biex ji ġu magħduda l-kampjuni akwati ċi għandu mbag ħad jiġi miżjud, il- 
kampjuni uniformi fuq mikser li jdur u r-radjoattività mag ħrufa permezz tal- 
għadd tal-likwidu florexxenti, titnaqqas l-attività tal-isfond misjub fit-testijiet 
vojta (F  B ). Sakemm l-ilma tat-test ma jkunx ikkulurit ħafna jew ikun fih kon ċen­
trazzjoni g ħolja tal-partikuli, il-kampjuni normalment juru florexxenza uniformi u 
se jkun bi żżejjed biex jitnaqqsu l-korrezzjonijiet bl-u żu ta' standard estern. Jekk l- 
ilma tat-test hu ikkulurit ħafna, jista’ jkun hemm b żonn li titnaqqas il-korrezzjoni 
permezz ta' żjieda ta’ standard intern. Jekk il-kon ċentrazzjoni tal-partikuli hi 
għolja jista’ ma jkunx possibbli biex tinkiseb ta ħlita jew ġel uniformi, jew il- 
varjazzjoni fit-tnaqqis bejn il-kampjuni tista’ tkun kbira. F’dak il-ka ż il-metodu 
tal-għadd deskritt hawn ta ħt għat-test tat-ta ħlitiet ta’ semi-likwidi jista’ jintu ża. 
Jekk it-test isir b ħala test tan-naqal mi żmum x’imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ, il- 
kejl tal  –14 CO 2 jista’ jsir indirettament billi jittie ħed kampjun uniformi ta’ 10 ml 
tal-ilma tat-test/sospensjoni tat-test u jinfirdu l-fa żijiet permezz ta’ pro ċess 
b’magna ta’ ċentrifuga b’velo ċità addattata (e ż. b’40 000 m/s  2 għal 15-il min.) 
Il-fażi akwatika g ħandha mbag ħad tkun trattata kif deskritt hawn fuq. L-attività  
14 C fil-fażi tal-partikuli separati ( POA ) għandha tkun determinata billi n-naqal 
jerġa’ jiġi miżmum x’imkien bejn il-qieg ħ u l-wiċċ f’volum żgħir ta’ ilma 
distillat, billi ji ġi trasferit f’kontenituri żgħar florexxenti u żati għall-mediċina, u 
billi jiżdied il-likwidu florexxenti ħalli jifforma ġel (jeżistu likwidi spe ċjali flor­
exxenti g ħal dan il-g ħan). Skont in-natura tal-partikuli (e ż. kemm fihom materjal 
organiku), jista' jkun jaqbel li l-kampjun ji ġi diġerit bil-lejl b' solubiliser  tat-tissue  
u mbagħad jiġi uniformi fuq mikser li jdur qabel ma ji żdied il-likwidu flor ­
exxenti. Inkella, il- POA  tista’ tinstab permezz ta’ kombustjoni mill-ossi ġnu bl- 
użu ta’ dak li j ħallat ma’ l-ossi ġnu l-kampjun. Meta tkun qed tg ħodd, l-istandards 
interni għandhom dejjem ikunu inklu żi, u jista’ jkun hemm b żonn li jsiru t- 
tiswijiet tat-tnaqqis billi ji żdied standard intern g ħal kull kampjun individwali.  
Għarfien dirett tal  –14 CO  2 
Jekk il  –14 CO 2 evoluta titkejjel direttament, g ħandha ssir billi ji ġu preparati aktar 
fliexken fil-bidu tat-test, ji ġu pproċessati l-fliexken tat-test f’kull punt tal-kejl billi 
l-fliexken tat-test jimtlew bl-a ċtu għal pH 2-3 u jin ġabar il  –14 CO 2 f’assorbitur 
intern (imqieg ħed f’kull flixkun fil-bidu tat-test) jew estern. B ħala mezz li 
jassorbi jista' jintu ża' jew l- alkali  (eż. taħlita 1 N NaOH , jew  NaOH pellet ), 
ethanolamine  jew ibba żata fuq l- ethanolamine . Għall-kejl dirett tal  –14 CO 2 , il- 
fliexken g ħandhom ikunu mag ħluqa per e żempju bl-g ħeluq tal-lastku sintetiku.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figura 1a  
Eżempju ta’ plot aritmetiku tad-data (l-attività li jifdal wara l-evaporazzjoni kontra l- ħin
 
Figura 1b  
Eżempju ta’ plot semi-logaritmika (ln g ħall-attività li jifdal wara l-evaporazzjoni kontra l- ħin).
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SP. TEST TAL-INIBIZZJONI TAT-TKABBIR  
1. METODU  
Dan il-metodu huwa ekwivalenti g ħall-OECD TG 221 (2006) (1). 
Kien hemm qbil wiesa' bejn l-awtoritajiet tal-UE li t-test tal- Lemna  
huwa alternattiva xierqa g ħal test tal-algal g ħal sustanzi li g ħandhom 
kulur qawwi (2)(3).  
1.1. DA ĦLA 
Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal biex ti ġi evalwata t-tossi ċità 
ta’ sustanzi g ħall-pjanti akkwati ċi tal-ilma ħelu tal-ġeneru  Lemna  
(ħażiż li jgħatti l-wiċċ tal-ilma qieg ħed jew duckweed). Dan huwa 
bbażat fuq linji gwida e żistenti (4)(5)(6)(7)(8)(9) i żda jinkludi 
modifikazzjonijiet ta’ dawk il-metodi sabiex jirrifletti r-ri ċerka u 
konsultazzjoni ri ċenti fuq g ħadd ta' kwistjonijiet importanti. Il- 
metodu propost ġie vvalidat permezz ta’ ring-test internazzjonali 
(10).  
Dan il-Metodu ta' ttestjar jiddeskrivi l-ittestjar g ħal tossiċità li juża 
Lemna gibba  u Lemna minor , li t-tnejn li huma ġew studjati fit-tul u 
li huma s-su ġġett tal-istandards imsemmija hawn fuq. It-tassonomija 
ta’ Lemna  spp. hija diffi ċli, peress li hija kkumplikata bl-e żistenza ta’ 
għażla wiesgħa ta’ fenotipi. G ħalkemm varjabilità ġentika bħala 
reazzjoni g ħal sustanzi tossi ċi tista’ tiġri fil-każ ta’ Lemna , bħalissa 
mhemmx dejta suffi ċjenti dwar dan is-sors ta’ varjabilità li jissu ġ­ 
ġerixxi klonu biex jintu ża f’dan il-Metodu ta' ttestjar. Ta’ min jinnota 
li dan it-test ma jsirx b’mod fejn ji ġi evitat kull kuntatt ma’ mikro- 
organiżmi oħra, iżda jittieħdu passi matul l-istadji tal-pro ċedura tat- 
test li jnaqqsu kemm jista’ jkun il-kontaminazzjoni minn organi żmi 
oħra. 
Dettalji dwar ittestjar b’ti ġdid (semi-statiku u flow-through) u 
mingħajr tiġdid (statiku) tas-soluzjoni tat-test huma deskritti. Skont 
ma jkunu l-g ħanijiet tat-test u r-rekwi żiti regolatorji, huwa rrak ­
komandat li ti ġi kkunsidrata l-applikazzjoni ta’ metodi semi-stati ċi 
u flow through, e ż. għal sustanzi li malajr jintilfu minn soluzzjoni 
bħala riżultat ta’ volatilizzazzjoni, fotodegradazzjoni, pre ċipitazzjoni 
jew bijodegradazzjoni. Iktar indikazzjonijiet huma mg ħotija fi (11).  
1.2. DEFINIZZJONIJIET  
Id-definizzjonijiet u l-abbrevjazzjonijiet li ġejjin huma u żati għall- 
għanijiet tal-Metodu tal-Ittestjar:  
Bijomassa : hija l-pi ż niexef ta’ materja ħajja preżenti f'popolazzjoni. 
F’dan it-test, surrogati g ħal bijomassa, b ħal ma huma g ħadd ta’ 
frondi u erja ta’ frondi, huma mkejla tipikament u l-u żu tat- 
terminu “bijomassa” g ħalhekk jirreferi g ħal dawn il-kejlijiet ta’ 
surrogati wkoll.  
Klorożi: huwa l-fenomenu ta’ meta jisfar it-tessut tal-frond.  
Klonu : huwa organi żmu jew ċellula mnissla minn individwu wie ħed 
permezz ta’ riproduzzjoni asesswali. Individwi mill-istess klonu 
huma, għalhekk, ġenetikament identi ċi. 
Kolonja : tfisser il-kollettiv tal-frond omm u l-frond bint (normalment 
2 sa 4) imwa ħħlin ma’ xulxin. Xi kultant issir referenza g ħaliha 
bħala pjanta.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : hija l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma ħlula ġo midjum 
tat-test li jirri żulta minn x % (e ż. 50 %) tnaqqis fit-tkabbir ta’  Lemna  
f’perjodu stabbilit ta’ espo żizzjoni (li trid tkun imsemmija esple ċi­
tament jekk devjanti mid-dewmien s ħiħ jew normali tat-test). Sabiex 
issir denotazzjoni li ma hijiex ambigwa ta’ valur ta’ EC li jidderiva 
mir-rata ta’ tkabbir jew rendiment, is-simbolu “E  r C” huwa u żat għar- 
rata ta’ tkabbir u “E  y C” huwa u żat għar-rendiment, segwit mill- 
varjabbli ta’ kejl u żat, eż. (għadd ta' frond).  
Flow-through : huwa test fejn is-soluzzjonijiet tat-test huma mibdula 
kontinwament.  
Frond : hija struttura f’g ħamla ta’ werqa individwali/wa ħda ta’ pjanta 
duckweed. Hija l-i żgħar unità, i.e. individwali, kapa ċi li tirriprodu ċi. 
Gibbożità: tfisser frondi li jidhru m ħattbin jew minfu ħin. 
Tkabbir : huwa żieda fil-varjabbli tal-kejl, e ż. l-għadd tal-frondi, il- 
piż niexef, pi ż bil-likwidu jew l-erja tal-frond, tul il-perjodu tat-test.  
Rata tat-tkabbir (rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku) : hija ż-żieda 
logaritmika fil-bijomassa waqt il-perjodu ta’ espo żizzjoni.  
Konċentrazzjoni Minima tal-Effett Osservat (LOEC) : hija l-iktar 
konċentrazzjoni baxxa ttestjata li fiha ji ġi osservat li s-sustanza 
għandha effett statistikament sinifikanti li jnaqqas it-tkabbir 
(b’valur p < 0.05) meta mqabbla mal-kontroll, f' ħin speċifiku ta’ 
espożizzjoni. Madankollu, il-kon ċentrazzjonijiet kollha tat-test 
b’valur og ħla mil-LOEC irid ikollhom effett daqs jew ikbar minn 
dawk osservati bil-LOEC. Meta dawn i ż-żewġ kundizzjonijiet ma 
jistgħux jiġu ssodisfatti, g ħandha spjegazzjoni s ħiħa tingħata 
għalfejn il-LOEC (u g ħalhekk l-NOEC) ġie magħżul. 
Varjabbli ta’ kejl : huma kull tip ta’ varjabbli li huma mkejla, biex 
jiġi espress il-punt ta’ tmiem tat-test, billi jintu ża varjabbli ta’ rispons 
wieħed jew iktar varjabbli differenti. F’dan il-metodu l-g ħadd tal- 
frondi, l-erja tal-frondi, il-pi ż frisk u l-pi ż niexef huma varjabbli 
ta’ kejl.  
Monokultura : hija kultura bi spe ċi waħda ta’ pjanta.  
Nekrożi: hija tessut tal-frond mejjet (i.e. abjad jew imxarrab bl-ilma)  
Konċentrazzjoni Bl-Ebda Effett Osservat (NOEC) : hija l-kon ċen­
trazzjoni tat-test immedjatament ta ħt il-LOEC.  
Fenotipa : hija l-karatteristi ċi osservabbli ta’ organi żmu determinati 
mill-interazzjoni tal- ġeni tagħha mal-ambjent tag ħha. 
Varjabbli ta’ rispons : huma varjabbli li jintu żaw għall-istima ta’ 
tossiċità derivata minn varjabbli mkejla li jiddeskrivu l-bijomassa 
b’metodi differenti ta’ kalkolu. G ħal dan il-metodu, ir-rati ta’ 
tkabbir u r-rendiment huma varjabbli ta’ rispons derivati minn varjabbli ta’ kejl b ħall-għadd ta' frondi, l-erja tal-frondi, il-pi ż frisk 
u l-piż niexef.
 
Test semi-statiku (ta’ ti ġdid): huwa test li fih s-soluzzjoni tat-test 
hija perjodikament mibdula f’intervalli spe ċifiċi matul it-test.  
Test statiku : huwa metodu tat-test ming ħajr it-tiġdid tas-soluzzjoni 
tat-test matul it-test.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Punt ta’ tmiem tat-test : jiddeskrivi l-fattur ġenerali li jinbidel bis- 
sustanza kimika relattiva g ħall-kontroll b ħala għan tat-test. F’dan il- 
metodu, il-punt ta’ tmien tat-test huwa l-inibizzjoni tat-tkabbir, li jista’ jiġi espress b’varjabbli differenti ta’ rispons li huma bba żati 
fuq varjabbli wa ħda jew iktar ta’ kejl.
 
Midjum tat-test : huwa l-midjum komplut ta’ tkabbir sintetiku li 
fuqu jikbru l-pjanti tat-test meta esposti g ħas-sustanza tat-test. Is- 
sustanza tat-test ti ġi normalment ma ħlula fil-midjum tat-test.  
Rendiment : huwa l-valur ta’ varjabbli ta’ kejl biex jesprimi 
bijomassa fit-tmiem tal-perjodu ta’ espo żizzjoni li minnu jitnaqqas 
il-varjabbli ta’ kejl fil-bidu tal-perjodu tal-espo żizzjoni  
1.3. PRIN ĊIPJU TAT-TEST  
Kulturi ta’ pjanti li jikbru b’mod esponenzjali, tal- ġeneru  Lemna  
jitħallew jikbru b ħala monokulturi f’kon ċentrazzjonijiet differenti 
tas-sustanza tat-test fuq perjodu ta’ sebat ijiem. L-g ħan tat-test 
huwa li tikkwantifika l-effetti relatati mas-sustanza fuq it-tkabbir veġetattiv fuq dan il-perjodu, bba żat fuq valutazzjoni ta’ varjabbli 
ta’ kejl mag ħżula. L-għadd tal-frondi huwa l-varjabbli primarju tal- 
kejl. Mill-inqas varjabbli wie ħed ieħor ta’ kejl (l-erja totali tal-frond, 
piż niexef jew pi ż frisk) hu mkejjel ukoll, peress li xi sustanzi jistg ħu 
jaffetwaw varjabbli o ħra ta’ kejl ħafna iktar minn numri tal-frond. 
Biex jiġu kkwantifikati l-effetti relatati mas-sustanza, it-tkabbir fis- 
soluzzjonijiet tat-test huwa mqabbel ma’ dak tal-kontrolli u l-kon ċen­
trazzjoni li twassal g ħal rata ta’ x % ta’ inibizzjoni spe ċifika ta’ 
tkabbir (e ż. 50 %) hija ddeterminata u espressa b ħala l-EC
 x (eż 
EC 50 ) 
Il-punt ta’ tmiem tat-test huwa l-inibizzjoni ta’ tkabbir, espress b ħala 
żieda logaritmika fil-varjabbli ta’ kejl (rata spe ċifika ta’ tkabbir 
medju) matul il-perjodu ta’ espo żizzjoni. Mir-rati medji ta’ tkabbir 
speċifiku rre ġistrati f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-kon ċen­
trazzjoni li twassal g ħal rata ta’ x % ta’ inibizzjoni spe ċifika ta’ 
tkabbir (e ż. 50 %) hija ddeterminata u espressa b ħala l-E  r C x (eż. 
E r C 50 ). 
Varjabbli ta’ rispons addizzjonali u żat f’dan il-Metodu ta' ttestjar hu 
r-rendiment, li jista’ jkun ne ċessarju biex ji ġu rispettati r-rekwi żiti 
regolatorji spe ċifiċi f’xi pajji żi. Jiġi ddefinit b ħala l-varjabbli ta’ kejl 
fit-tmiem tal-perjodu ta’ espo żizzjoni li minnhom jitnaqqsu l- 
varjabbli fit-tmiem tal-perjodu ta’ espo żizzjoni. Mir-rendiment irre ġ­
istrat f’serje ta’ soluzzjonijiet tat-test, il-kon ċentrazzjoni li twassal 
għal rata ta’ x % ta’ rendiment (e ż. 50 %) hija kkalkulata u 
espressa b ħala E  y C x (eż. E y C 50 ). 
Barra minn hekk, il-kon ċentrazzjoni minima tal-effett osservat 
(LOEC) u l-kon ċentrazzjoni bl-ebda effett osservat (NOEC) jistg ħu 
jiġu ddeterminati statiskament.  
1.4. INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST  
Metodu analitiku, b’sensittività xierqa g ħal kwantifikazzjoni tas- 
sustanza fil-midjum tat-test g ħandha tkun a ċċessibbli.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Informazzjoni fuq is-sustanza tat-test li tista’ tkun utli biex ji ġu 
stabbiliti l-kundizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula strutturali, 
purità, solubilità tal-ilma, stabbiltà fl-ilma u dawl, pK  a , K  ow , 
pressjoni tal-fwar u bijodegradabilità. Is-solubilità tal-ilma u l- pressjoni tal-fwar tista’ ti ġi użata biex ji ġi kkalkulat il-kostanti tal- 
Prinċipju ta’ Henry, li jindika jekk huwiex probabbli li jkun hemm 
telf sinifikanti matul il-perjodu tat-test. Dan juri jekk g ħandhomx 
jittieħdu passi sabiex dan it-telf ji ġi kontrollat. Meta l-informazzjoni 
dwar is-solubilità u l-istabbiltà tas-sustanza tat-test m’hijiex ċerta, 
huwa rrakkomandat li dawn ji ġu vvalutati ta ħt il-kundizzjonijiet 
tat-test, i.e. midjum ta’ tkabbir, temperatura, sistema ta’ dawl li għandha tintu ża fit-test.
 
Meta l-kontroll tal-a ċidità tal-midjum tat-test huwa partikolarment 
importanti, pere żempju. meta ji ġu ttestjati metalli jew sustanzi li 
huma idrolitikament instabbli, i ż-żieda ta’ buffer lill-midjum ta’ 
tkabbir huwa rrakkomandat (ara l-ewwel paragrafu fit-taqsima 
1.7.4.). Iktar indikazzjonijiet g ħal ittestjar ta’ sustanzi b’karatteristi ċi 
fiżikokemikali li jag ħmilhom diffi ċli biex ji ġu ttestjati huwa 
pprovdut fi (11).  
1.5. SUSTANZA TA’ REFERENZA  
Sustanza/i ta’ referenza, b ħal 3,5-dichlorophenol u żat fir-ring test 
internazzjonali (10), tista’/jistg ħu tiġi/jiġu ttestjat(i) b ħala mezz ta’ 
kontroll tal-pro ċedura tat-test. Huwa opportun li ti ġi ttestjata sustanza 
ta’ referenza mill-inqas darbtejn f’sena jew, meta l-ittestjar isir inqas frekwentement, b’mod parallel mad-determinazzjoni tat-tossi ċità tas- 
sustanza tat-test.
 
1.6. VALIDITÀ TAT-TEST  
Biex it-test ikun validu, il- ħin ta’ irduppjar tal-g ħadd tal-frondi fil- 
kontroll irid ikun inqas minn jumejn u nofs (60 sieg ħa), li jikko ­
rispondi ma’ żieda ta’ bejn wie ħed u ieħor seba’ darbiet f’sebat ijiem 
u rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku ta’ 0.275 d  –1 . Permezz tal- 
kundizzjonijiet tal-midja u t-test deskritti fil-Metodu tal-Ittestjar, dan il-kriterju jista’ jintla ħaq bl-użu ta’ sistema ta’ ttestjar statiku 
(8). Huwa wkoll ma ħsub li dan il-kriterju jista’ ji ġi milħuq taħt 
kundizzjonijiet ta’ ttestjar semi-statiku u flow-through. Kalkolu tal- ħin ta’ irduppjar huwa muri fit-taqsima 2.1.
 
1.7. DESKRIZZJONI TAL-METODU  
1.7.1.  Apparat  
Kull tagħmir f’kuntatt mal-midja tat-test g ħandu jkun mag ħmul minn 
ħġieġ jew materjal ie ħor li ma jag ħmilx reazzjoni kimika. Tag ħmir 
tal-ħġieġ użat għal-għanijiet tal-kultura u ittestjar g ħandu jiġi 
mnaddaf minn kull kontaminant kimiku li jista’ jipperkola fil- 
midjum tat-test u jrid ikun sterili. Il-kontenituri tat-test g ħandhom 
ikunu wiesg ħa biżżejjed sabiex il-frondi ta’ kolonji differenti fil- 
kontenituri tal-kontroll jikbru ming ħajr ma jirkbu lil xulxin fit- 
tmiem tat-test. Ma jimpurtax jekk l-g ħeruq imissu l-qieg ħan tal- 
kontenituri tat-test, i żda fond minimu ta’ 20 mm u volum minimu 
ta’ 100 ml f’kull kontenitur tat-test huwa rrakkomandat. L-g ħażla tal- 
kontenituri tat-test ma hijiex ta’ importanza kbira sakemm dawk ir- rekwiżiti jiġu mħarsa. Ġarar tal-ħġieġ, plattini ta’ kristalizzazzjoni u 
plattini petri tal- ħġieġ ta’ daqsijiet adatti kollha rri żultaw xierqa. 
Kontentituri tal- ħġieġ għandhom ikunu mg ħottija sabiex titnaqqas 
kemm jista’ jkun l-evoparazzjoni u l-kontaminazzjoni bi żball, 
waqt li tit ħalla l-bidla tal-arja ne ċessarja. Kontenturi tat-test xierqa, 
u partikolarment l-g ħotien, għandhom jevitaw dellijiet jew bidliet fil- 
karatteristi
ċi spettrali tad-dawl.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Il-kulturi u l-kontenituri tat-test ma g ħandhomx jin żammu flimkien. 
Dan l-aħjar li jsir permezz tal-u żu ta’ kmamar ambjentali ta’ tkabbir, 
inkubaturi, jew kmamar separati. L-illuminazzjoni u t-temperatura għandhom ikunu jistg ħu jiġu kkontrollati u mi żmuma f’livell 
kostanti (ara t-taqsima 1.7.8).
 
1.7.2.  Organi żmu tat-test  
L-organiżmu użat għal dan it-test huwa jew  Lemna gibba  jew Lemna 
minor . Deskrizzjonijiet qosra ta’ spe ċi ta’ duckweed li ġew użati għal 
ittestjar g ħal tossiċità huma mog ħtija fl-Appendi ċi 1. Materjal ta’ 
pjanti jista’ jinkiseb minn kollezzjoni ta’ kultura, laboratorju ie ħor 
jew mill-g ħalqa. Jekk mi ġbura mill-g ħalqa, il-pjanti g ħandhom ji ġu 
miżmuma fil-kultura fl-istess midjum b ħal dak u żat għall-ittestjar 
mill-inqas g ħal tmien ġimgħat qabel l-u żu. Siti ta’ g ħelieqi użati 
għal ġabra ta’ kulturi inizjali g ħandhom ikunu ħielsa minn sorsi 
ovvji ta’ kontaminazzjoni. Jekk mi ġjuba minn laboratorju ie ħor 
jew minn kollezzjoni ta’ kultura g ħandhom ji ġu miżmuma bl-istess 
mod mill-inqas g ħal tliet ġimgħat. Is-sors tal-materjal tal-pjanti jew 
tal-ispeċi jew klonu (jekk mag ħruf) użat għall-ittestjar g ħandu dejjem 
jiġi rrapurtat.  
Monokulturi, li huma vi żibilment ħielsa minn kontaminazzjoni minn 
organiżmi oħrajn bħal alga u proto żoa, għandhom ji ġu użati. Pjanti 
b’saħħithom ta’  L. minor  jikkonsistu f’kolonji li jkollhom bejn żewġ 
jew ħames frondi, waqt li kolonji b’sa ħħithom ta’  L. gibba  jista’ 
jkollhom sa seba’ frondi.  
Il-kwalità u l-uniformità tal-pjanti u żati għat-test ikollhom 
influwenza sinifikanti fuq ir-ri żultat tat-test u g ħalhekk għandhom 
jintgħażlu bil-ħsieb. Pjanti żgħar li jikbru malajr ming ħajr leżjonijiet 
li jidhru jew diskolorazzjoni (kloro żi) għandhom ji ġu użati. Kulturi 
ta’ kwalità tajba huma indikati b’in ċidenza għolja ta’ kolonji li fihom 
mill-inqas żewġ frondi. G ħadd kbir ta’ frondi wa ħedhom juri stress 
ambjentali, e ż. limitazzjoni ta’ nutrijenti, u materjal ta’ pjanti minn 
kulturi bħal dawn ma g ħandux jintu ża għal ittestjar.  
1.7.3.  Kultura  
Biex tnaqqas il-frekwenza ta’ manteniment ta’ kulturi (e ż. meta l- 
ebda  Lemna  test ma jkun ippjanat g ħal xi perjodu), il-kulturi jistg ħu 
jinżammu f’illuminazzjoni u temperatura (4-10 °C) mnaqqsa. Dettalji 
ta’ produzzjoni ta’ kulturi huma mog ħtija fl-Appendi ċi 2. Sinjali 
ovvji ta’ kontaminazzjoni b’alga jew organi żmi oħrajn jirrikjedu 
sterilizzazzjoni tal-wi ċċ ta’ sub-kampjun ta’ frondi  Lemna , segwit 
bi trasferiment f’midjum ġdid (ara l-Appendi ċi 2). F’dan il-ka ż, il- 
kultura kkontaminata li jibqa’ g ħandha tintrema.  
Mill-inqas sebat ijiem qabel l-ittestjar, kolonji suffi ċjenti huma tras ­
feriti asettikament f’midjum sterili ġdid u kkultivati g ħal 7-10 ijiem 
taħt il-kundizzjonijiet tat-test.  
1.7.4.  Midjum tat-test  
Midja differenti huma rrakkomandati g ħal Lemna minor  u Lemna 
gibba , kif deskritt hawn ta ħt. L-inklu żjoni ta’ buffer pH fil-midjum 
tat-test (MOPS (a ċidu sulfoniku 4-morpholinepropane, CAS No: 
1132-61-2; EINECS No: 214-478-5 f’midjum  L. minor  u NaHCO  3 
f’midjum  L. gibba ) għandha tiġi kkunsidrata akkuratament meta 
huwa suspettat li jista’ jag ħmel reazzjoni mas-sustanza tat-test u 
jinfluwenza l-espressjoni tat-tossi ċità tiegħu. Midjum Steinberg (12) 
huwa aċċettabbli wkoll sakemm jintla ħqu l-kriterji tal-validità.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Modifkazzjoni tal-istandard Svedi ż (SIS) midjum ta’ tkabbir  Lemna  
huwa rrakkomandat g ħal produzzjoni ta’ kulturi ta’  L. minor  u 
ttestjar tal-istess. Il-kompo żizzjoni ta’ dan il-midjum hija mog ħtija 
fl-Appendi ċi 3. 
Il-midjum ta’ tkabbir, 20X — AAP, kif deskritt fl-Appendi ċi 3, 
huwa irrakkomandat g ħal produzzjoni ta’ kulturi u ttestjar ta’  L. 
gibba . 
Il-midjum Steinberg, kif deskritt fl-Appendi ċi 3, huwa wkoll adattat 
għal L. minor , iżda jista’ jintu ża għal L. gibba  sakemm il-kriterji tal- 
validità jintla ħqu. 
1.7.5.  Soluzzjonijiet tat-test  
Soluzzjonijiet tat-test huma ġeneralment ippreparati bid-diluzzjoni ta’ 
soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata. Soluzzjonijiet b'kon ċen­
trazzjoni standardizzata tas-sustanza tat-test huma ġeneralment ippre ­
parati billi tin ħall is-sustanza fil-midjum tal-tkabbir.  
L-iktar kon ċentrazzjoni g ħolja ttestjata tas-sustanza tat-test norm ­
alment ma g ħandiex te ċċedi s-solubilità tal-ilma tas-sustanza ta ħt 
il-kundizzjonijiet tat-test. G ħandu jiġi kkunsidrat i żda li  Lemna  
spp. iżżomm fil-wi ċċ u tista’ ti ġi esposta g ħal sustanzi li jin ġabru 
bejn l-ilma u l-arja (e ż. sustanzi li ma tantx jin ħallu fl-ilma jew 
sustanzi idrofobi ċi jew sustanzi attivi fil-wi ċċ). F’ċirkustanzi b ħal 
dawn, l-espo żizzjoni tirri żulta minn materjal li ma huwiex fis- 
soluzzjoni u l-kon ċentrazzjonijiet tat-test, jistg ħu, skont il-karatter ­
istiċi tas-sustanza tat-test, je ċċedu s-solubilità tal-ilma. G ħal 
sustanzi tat-test li ma tantx jin ħallu fl-ilma, jista’ jkun hemm 
bżonn li tiġi ppreparata soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 
ħafna jew dispersjoni tas-sustanza bl-u żu ta’ solvent organiku jew 
dispersant sabiex tiffa ċilita ż-żieda ta’ kwantitajiet e żatt tas-sustanza 
tat-test lill-midjum tat-test u tg ħin f’dispersjoni u x-xoljiment tag ħha. 
Kull sforz g ħandu jsir sabiex ji ġi evitat l-u żu ta’ materjali b ħal 
dawn. Ma g ħandu jkun hemm ebda fitotossi ċità riżultanti minn u żu 
ta’ solventi jew dispersanti aw żiljarji. Pere żempju, solventi u żati 
ta’ spiss li ma jikkaw żawx fitotossi ċità f’kon ċentrazzjonijiet sa 
100 μl l –1 jinkludu acetone u dimethylformamide. Jekk jintu ża 
solvent jew dispersant, il-kon ċentrazzjoni finali tieg ħu għandha tiġi 
rrapurtata u minimizzata kemm jista’ jkun (100 μl·l –1 ), u kull trat ­
tament u kontroll g ħandu jkollu l-istess kon ċentrazzjoni ta’ solvent 
jew dispersant. Iktar indikazzjonijiet dwar l-u żu ta’ dispersanti huma 
mogħtija fi (11).  
1.7.6.  Gruppi tat-test u kontroll  
Tagħrif bil-quddiem dwar it-tossi ċità tas-sustanza tat-test lil  Lemna , 
eż. minn test li jsib il-gamma, jg ħin fl-għażla tal-kon ċentrazzjonijiet 
tat-test adattati. Fit-test definittiv ta’ tossi ċità, għandu jkun hemm 
mill-inqas ħames kon ċentrazzjonijiet tat-test irran ġati f’serje 
ġeometrika. Preferibbilment il-fattur ta’ separazzjoni bejn il-kon ċen­
trazzjonijiet tat-test ma g ħandux jeċċedi 3.2, i żda valur ikbar jista’ 
jintuża meta l-kurva ta’ rispons tal-kon ċentrazzjoni hija ċatta. 
Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni jekk inqas minn ħames kon ċ­
entrazzjonijiet huma u żati. Mill-inqas tliet repliki g ħandhom jintu żaw 
f’kull kon ċentrazzjoni tat-test.  
Meta tiġi ssettjata l-gamma ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test (g ħal sejba 
ta’ gamma u/jew g ħat-test definittiv ta’ tossi ċità), dawn li ġejjin 
għandhom ji ġi kkunsidrati:  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— biex tiddetermina EC  x , il-konċentrazzjonijiet tat-test iridu jsostnu 
l-valur EC  x sabiex ti żgura livell ta’ kunfidenza adegwat. 
Pereżempju, jekk tkun qed tikkalkula l-EC  50 , l-iktar kon ċen­
trazzjoni g ħolja għandha tkun ikbar mill-valur tal-EC  50 . Jekk il- 
valur EC  50 jinstab barra l-firxa ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test, 
intervalli ta’ kunfidenza asso ċjati jkunu kbar u valutazzjoni 
xierqa tal-fit statistiku tal-mudell tista’ ma tkunx possibbli,  
— jekk l-g ħan huwa li ji ġu vvalutati l-LOEC/NOEC, l-iktar kon ċen­
trazzjoni baxxa tat-test g ħandha tkun baxxa bi żżejjed sabiex it- 
tkabbir ma jkunx ħafna inqas minn dak tal-kontroll. Barra minn 
hekk, l-og ħla konċentrazzjoni tat-test g ħandha tkun g ħolja 
biżżejed sabiex it-tkabbir ikun ħafna iktar baxx minn dak tal- 
kontroll. Jekk dan ma huwiex il-ka ż, it-test irid ji ġi ripetut bl- 
użu ta’ firxa ta’ kon ċentrazzjoni differenti (sakemm l-og ħla konċ­
entrazzjoni ma hijiex fil-limitu ta’ solubilità jew il-kon ċen­
trazzjoni fil-limitu massimu rikjest, e ż. 100 mg·l  –1 ). 
Kull test g ħandu jinkludi kontolli li jikkonsistu f’midjum tal-istess 
nutrijent, l-istess g ħadd ta' frondi u kolonji, kundizzjonijiet 
ambjentali u pro ċeduri bħall-kontenituri tat-test i żda mingħajr is- 
sustanza tat-test. Jekk solvent jew dispersant aw żiljarju huwa u żat, 
trattament ta’ kontroll addizzjonali bis-solvent/dispersant pre żenti fl- 
istess kon ċentrazzjoni b ħal tal-kontenituri g ħandu jiġi inkluż. L- 
għadd ta' kontenituri ta’ kontroll ripetut (u kontenituri ta’ solvent, 
jekk applikabbli) g ħandu jkun mill-inqas daqs, u idealment id- 
doppju, tal-g ħadd ta' vetturi u żati għal kull kon ċentrazzjoni tat-test.  
Jekk determinazzjoni ta’ NOEC ma hijiex rikjesta, id-di żinn tat-test 
jista’ jinbidel biex ji żdied l-għadd ta' kon ċentrazzjonijiet u jnaqqas l- 
għadd ta' repliki ta’ kull kon ċentrazzjoni. Madankollu, l-g ħadd ta' 
repliki ta’ kontroll iridu jkunu mill-inqas tlieta.  
1.7.7.  Espo żizzjoni  
Kolonji li jikkonsistu minn 2 sa 4 frondi li jidhru huma trasferiti 
mill-kultura inoculum u huma mpo ġġija każwalment fil-kontenituri 
ta’ kontroll f’kundizzjonijiet asetti ċi. Kull kontenitur tat-test g ħandhu 
jkollu total ta’ bejn disa’ jew tnax-il frond. L-g ħadd ta' frondi u 
kolonji jridu jkunu l-istess b ħal dawk u żati f’kull kontenitur tat- 
test. Esperjenza miksuba b’dan il-metodu u dejta tar-ring-test indikaw li jekk tu ża tliet repliki g ħal kull trattament, b’kull replika 
jkollha minn disa’ sa’ tnax-il frond fil-bidu, dan huwa bi żżejjed biex 
tinduna b’differenzi fit-tkabbir ta’ ċirka 4 sa 7 % ta’ inibizzjoni 
kkalkulat bir-rata ta’ tkabbir (10 sa 15 % ikkalkulata skont ir- rendiment) bejn it-trattamenti (10).
 
Diżinn każwali għal post ta’ kontenituri tat-test fl-inkubatur huwa 
rikjest sabiex titnaqqas kemm jista’ jkun l-influwenza ta’ differenzi ta’ spazju fl-intensità tad-dawl jew it-temperatura. Di żinn ibblokkat 
jew ripo żizzjonament ka żwali tal-kontenituri meta jsiru osser ­
vazzjonijiet (jew ripo żizzjonament iktar frekwenti) hu rikjest ukoll.
 ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Jekk test preliminari ta’ stabbilità juri li l-kon ċentrazzjoni tas- 
sustanza tat-test ma tistax tin żamm (i.e. il-kon ċentrazzjoni imkejla 
taqa’ taħt 80 % tal-kon ċentrazzjoni inizjali mkejla) matul it-tul ta ż- 
żmien tat-test (sebat ijiem), l-u żu ta' sistema ta’ ttestjar semistatiku 
hu rrakkomandat. F’dan il-ka ż, il-kolonji g ħandhom ji ġu esposti g ħal 
soluzzjonijiet tat-test u kontroll preparati mill- ġdid f’mill-inqas żewġ 
okkażjonijiet matul it-test (e ż. ġranet 3 u 5). Il-frekwenza ta’ 
espożizzjoni g ħal midjum ġdid jiddependi mill-istabbilità tas- 
sustanza tat-test; frekwenza iktar g ħolja tista’ tkun ne ċessarja biex 
jinżammu kon ċentrazzjonijiet kwa żi-kostanti ta’ sustanzi instabbli 
ħafna u volatili. F’xi ċirkustanzi, pro ċedura flow-through tista’ 
tkun neċessarja (11)(13).  
Ix-xenarju ta’ espo żizzjoni minn applikazzjoni ta’ weraq (sprej) 
mhijiex koperta f’dan il-Metodu ta' ttestjar, i żda ara (14).  
1.7.8.  Kundizzjonijiet ta’ inkubazzjoni  
Dawl kontinwu fluworexxenti s ħun jew frisk g ħandu jintu ża biex 
jipprovdi intensità tad-dawl mag ħzula minn g ħażla ta’ 85- 
135 μE·m  –2 ·s –1 meta mkejjel f’radjazzjoni attiva fotosintetika (400- 
700 nm) f’punti fl-istess distanza mis-sors ta’ dawl b ħall-frondi  
Lemna  (ekwivalenti g ħal 6 500-10 000 lux). Kull differenza mill- 
intensità tad-dawl mag ħżula fuq l-erja tat-test ma tistax tkun iktar 
minn ± 15 %. Il-metodu ta’ rivelazzjoni u kejl ta’ dawl, partikol ­
arment it-tip ta’ sensur, jaffetwa l-valur imkejjel. Sensuri sferi ċi (li 
jirrispondu g ħal dawl mill-angli kollha ta’ fuq jew ta ħt il-pjan ta’ 
kejl) u sensuri “cosine” (li jirrispondu g ħal dawl mill-angli kollha 
fuq il-pjan ta’ kejl) huma a ħjar minn sensuri unidirezzjonali, u jag ħtu 
riżultati ogħla għal sors ta’ iktar minn punt wie ħed tat-tip deskritt 
hawn.  
It-temperatura fil-kontenituri tat-test trid tkun ta’ 24 ± 2 °C. Il-pH 
tal-midjum ta’ kontroll ma g ħandiex tiżdied b’iktar minn 1,5 unità 
matul it-test. Madankollu, devjazzjoni ta' aktar minn 1,5 unità ma 
tinvalidax it-test meta jkun jista' jintwera li l-kriterji ta' validità ġew 
issodisfati. Trid ting ħata kura addizzjonali g ħall-pH drift f'ka żijiet 
speċjali bħal meta ji ġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli jew 
metalli. Ara (11) g ħal iktar indikazzjonijiet.  
1.7.9.  Tul ta' żmien  
Dan it-test jintemm sebat ijiem wara li l-pjanti ji ġu ttrasferiti fil- 
kontenituri tat-test.  
1.7.10.  Kejl u determinazzjonijiet analiti ċi 
Fil-bidu tat-test, l-g ħadd ta' frondi fil-kontenituri tat-test jing ħadd u 
jiġi rrekordjat, b’attenzjoni li ti żgura li frondi spor ġenti li jidhru 
b’mod ċar, huma kkunsidrati. Numri ta’ frondi li jidhru normali 
jew anormali, g ħandhom ji ġu determinati fil-bidu tat-test, mill- 
inqas darba kull tlett ijiem matul il-perjodu ta’ espo żizzjoni (i.e. 
f’mill-inqas 2 okka żjonijiet matul il-perjodu ta’ 7 ijiem), u meta t- 
test jiġi mitmum. Tibdil fl-i żvilupp tal-pjanti, e ż. fid-daqs tal-frond, 
dehra, indikazzjoni ta’ nekro żi, klorożi jew gibbo żità, xoljiment ta’ 
kolonji u telf ta’ abilità li żżomm f’wi ċċ l-ilma, u fit-tul u dehra ta’ 
għeruq, għandhom ji ġu nnutati. Karatteristi ċi sinifikanti tal-midjum 
tat-test (e ż preżenza ta’ materjal li ma n ħallx, tkabbir ta’ alga fil- 
kontenitur tat-test) g ħandhom ji ġu nnutati.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Barra minn determinazzjonijiet tal-g ħadd ta' frondi matul it-test, l- 
effetti tas-sustanza tat-test fuq wa ħda (jew iktar) mill-varjabbli ta’ 
kejl li ġejjin huma vvalutati wkoll:  
(i) erja totali tal-frond,  
(ii) piż niexef,  
(iii) piż frisk  
L-erja totali tal-frond g ħandha l-vanta ġġ li tista’ ti ġi ddeterminata 
għal kull test u l-kontenitur tal-kontroll fil-bidu, matul u fit-tmiem 
tat-test. Pi ż niexef jew frisk g ħandu jiġi ddeterminat fil-bidu tat-test 
minn kampjun ta’ kultura ta’ inoculum rappre żentativ ta’ dak li jkun 
użat biex jinbeda t-test, u fit-tmiem tat-test bil-materjal ta’ pjanti 
minn kull kontenitur tat-test u kontroll. Jekk l-erja ta’ frond ma tkunx imkejla, pi ż niexef huwa preferut fuq pi ż frisk.
 
L-erja totali tal-frond, pi ż niexef u pi ż frisk jistg ħu jiġu ddeterminati 
kif ġej: 
(i) Erja totali tal-frond : L-erja totali tal-frond tal-kolonji kollha 
tista’ tiġi ddeterminata permezz ta’ anali żi tal-imma ġini. Dell 
tal-kontenitur tat-test jista’ ji ġi miġbud permezz ta’ kamera 
tal-vidjo (i.e. billi l-kontenitur jitpo ġġa fuq kaxxa ta’ dawl) u 
l-immaġini li tirri żulta tinqaleb g ħal waħda diġitali. Bil-kali ­
brazzjoni ma’ forom ċatti ta’ erja mag ħrufa, l-erja totali tal- 
frond f’kontenitur tat-test tista’ ti ġi mbagħad iddeterminata. 
Għandha ting ħata attenzjoni biex ti ġi eskluża interferenza 
kkważata mill-bordura tal-kontenitur tal-vettura. Appro ċċ alter­
nattiv iżda li jieħu iktar xog ħol huwa li jittie ħdu ritratti tal- 
kontenituri tat-test u pjanti, taqta’ d-dell tal-kolonji li jirri żulta 
u tiddetermina l-erja tag ħhom permezz ta’ analizzatur ta’ erja ta’ 
weraq jew karti millimetrati. Tekniki o ħra (eż. ir-ratio ta’ toqol 
ta’ karta bejn l-erja ta’ dell tal-kolonji u l-erja ta’ unità) jistg ħu 
jkunu adegwati wkoll.  
(ii) Piż niexef : Il-kolonji kollha huma mi ġbura minn kull kontenitur 
tat-test u ma ħsulin b’ilma distillat jew dejonizzat. L-ilma żejjed 
tagħhom jitne ħħa billi ji ġi assorbit u mbag ħad huma ji ġu 
mnixxfa f’60 °C g ħal piż kostanti. Kull bi ċċiet ta’ g ħeruq 
għandhom ji ġu inklużi. Il-piż niexef g ħandu jiġi espress 
b’eżattezza ta’ mill-inqas 0,1 mg.  
(iii) Piż frisk : Il-kolonji kollha huma trasferiti g ħal ġo tubi li jkunu 
ntiżnu qabel, mag ħmula minn polistrene (jew materjal ie ħor li 
ma jagħmilx reazzjoni kimika), b’toqob żgħar (ta’ 1 mm) fil- 
qiegħan tondi. It-tubi huma mbag ħad ċentrifugati bi 3 000 rpm 
għal 10 minuti f’temperatura ambjentali. Tubi, li issa jkun fihom 
kolonji mnixxfa, huma mi żuna mill- ġdid u l-pi ż frisk huwa 
kkalkulat billi jitnaqqas il-pi ż tat-tubu vojt.  
1.7.10.1.  Frekwenza ta’ kejl u determinazzjoni analitika  
Jekk tintu ża sistema ta’ ttestjar statiku, il-pH g ħandha tiġi mkejla fil- 
bidu u fit-tmiem tat-test. Jekk tintu ża sistema ta’ ttestjar semistatiku, 
il-pH għandha tiġi mkejla f’kull lott ta’ soluzzjoni tat-test “ ġdida” 
qabel kull ti ġdid u f’soluzzjonijiet korrispondenti “u żati”. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
L-intensità tad-dawl g ħandha tiġi mkejla fil-kamra ta’ tkabbir, 
inkubatur jew kamra f’punti fl-istess distanza mis-sors ta’ dawl 
bħall-frondi  Lemna . Kejl irid isir mill-inqas darba matul it-test. It- 
temperatura tal-midjum fil-kontenitur sostitwit mi żmum fl-istess 
kundizzjonjiet tal-kamra ta’ tkabbir, inkubatur jew kamra 
għandhom ji ġu rreġistrati mill-inqas darba kuljum.  
Matul it-test, il-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma ddeter ­
minati f’intervalli xierqa. F’testijiet stati ċi, ir-rekwi żit minimu huwa 
li jiġu ddeterminati l-kon ċentrazzjonijiet fil-bidu u fit-tmiem tat-test.  
F’testijiet semi-stati ċi fejn il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma 
hijiex mistennija li tibqa’ fi ± 20 % tal-kon ċentrazzjoni nominali, hu 
neċessarju li f’kull ti ġdid jiġu analizzati s-soluzzjonijiet tat-test 
preparati ri ċentement u l-istess soluzzjonijiet (ara t-tielet paragrafu 
fit-taqsima 1.7.7). Madankollu, g ħal dawk it-testijiet fejn il-kon ċen­
trazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza tat-test mhix fi ± 20 % tan- 
nominali, i żda fejn evidenza suffi ċjenti tista’ ti ġi pprovduta biex 
turi li l-kon ċentrazzjonijiet inizjali huma ripetibbli u stabbli (i.e. 
fil-gamma 80-120 % tal-kon ċentrazzjoni inizjali), determinazzjonijiet 
kimiċi jistgħu jsiru biss fuq l-og ħla u l-iktar kon ċentrazzjonijiet baxxi 
tat-test. Fil-ka żijiet kollha, id-determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjonijiet 
tas-sustanza tat-test qabel it-ti ġdid hemm biss b żonn li ssir f’replika 
waħda f’kull kon ċentrazzjoni tat-test (jew il-kontenut tal-kontenituri 
miġbura skont ir-replika).  
Jekk jintu ża test flow-through, sistema ta’ te ħid ta' kampjuni simili 
għal dak deskritt g ħal testijiet semi-stati ċi, inkluż l-analiżi fil-bidu, 
fin-nofs u fit-tmiem tat-test, huwa adegwat, i żda l-kejl ta’ 
soluzzjonijiet “u żati” mhux idoneju f’dan il-ka ż. F’dan it-tip tat- 
test, ir-rata ta’ fluss ta’ dilwent u sustanzi tat-test jew soluzzjoni 
b'konċentrazzjoni standardizzata ta’ sustanza tat-test g ħadhom ji ġu 
ċċekjati kuljum.  
Jekk hemm evidenza li l-kon ċentrazzjoni tas-sustanza li qieg ħda tiġi 
ttestjata kienet mi żmuma b’mod sodisfa ċenti fi ± 20 % tal-kon ċen­
trazzjoni nominali jew dik imkejla inizjalment, matul it-test, anali żi 
tar-riżultati tista’ tkun ibba żata fuq il-valuri nominali jew inizjali 
imkejla. Jekk id-devjazzjoni mill-kon ċentrazzjoni nominali jew dik 
inizjali mkejla hija ikbar minn ±20 %, anali żi tar-riżultati għandha 
tkun imsejsa fuq il-medja ġeometrika tal-kon ċentrazzjoni matul l- 
espożizzjoni jew mudelli li jiddeskrivu t-tnaqqis tal-kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza tat-test (11).  
1.7.11.  Test tal-limitu  
F'għadd ta' ċirkustanzi, e ż. meta test preliminarju jindika li s-sustanza 
tat-test ma g ħandha ebda effetti tossi ċi fuq kon ċentrazzjonijiet sa 
100 mg l  –1 , jew sal-limitu tas-solubilità fil-midjum tat-test (liema 
minnhom huwa l-iktar baxx), jista’ jsir test tal-limitu li jinvolvi 
tqabbil ta’ reazzjonijiet fi grupp ta’ kontroll u grupp ta’ trattament (100 mg l
 –1 jew konċentrazzjoni daqs il-limitu tas-solubilità). Huwa 
rrakkomandat b’enfasi li dan ikun mg ħejjun b’anali żi tal-konċen­
trazzjoni ta’ espo żizzjoni. Il-kundizzjonijiet tat-test u l-kriterji ta’ 
validità kollha deskritti qabel japplikaw g ħat-test tal-limitu, bl- 
eċċezzjoni li l-g ħadd ta' repliki ta’ trattament irid ikun irduppjat. 
Tkabbir fil-grupp ta’ kontroll u trattament jista’ ji ġi analizzat 
permezz tat-test statistiku li jqabbel ir-ri żultati medji, e ż. Student’s 
t-test.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DEJTA U RAPPURTAR  
2.1. ĦIN TA’ RDUPPJAR  
Biex jiġi ddeterminat i ż-zmien ta’ rduppjar (T  d ) tal-għadd tal-frondi 
u l-aderenza ma’ dan il-kriterju ta’ validità bl-istudju (it-taqsima 1.6), 
il-formula li ġejja hija u żata flimkien ma’ dejta mi ġjuba mill- 
kontenituri tal-kontroll:  
T d = ln 2/μ 
fejn μ hija r-rata ta’ medja ta’ tkabbir spe ċifiku ddeterminat kif 
deskritt fl-ewwel u fit-tieni paragrafu fit-taqsima 2.2.1.  
2.2. VARJABBLI TA’ RISPONS  
L-għan tat-test hu li jiddetermina l-effett tas-sustanza tat-test fuq it- 
tkabbir ve ġetattiv ta’  Lemna . Dan il-Metodu ta' ttestjar jiddeskrivi 
żewġ varjabbli ta’ rispons, g ħax pajjiżi membri g ħandhom preferenzi 
u bżonnijiet regolatorji differenti. Sabiex ir-ri żultati tat-testijiet ikunu 
aċċettabli fil-pajji żi membri kollha, l-effetti g ħandhom ji ġu vvalutati 
billi jintu żaw kemm il-varjabbli (a) u kemm dik (b) li huma deskritti 
hawn taħt. 
(a) Ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku: dan il-varjabbli ta’ rispons 
huwa kkalkulat mhux biss fuq il-ba żi ta’ bidliet fil-logaritmi 
tan-numri tal-frond, i żda wkoll fuq il-ba żi ta’ bidliet fil- 
logaritmi ta’ parametru ie ħor ta’ kejl (erja totali tal-frond, pi ż 
niexef u pi ż frisk) fuq il- ħin (espress b ħala ġranet) fil-kontrolli u 
f’kull grupp ta’ trattament. Xi drabi issir referenza g ħal dan 
bħala rata relattiva ta’ tkabbir (15).  
(b) Rendiment: dan il-varjabbli ta’ rispons huwa kkalkulat mhux 
biss fuq il-ba żi ta’ bidliet fl-g ħadd tal-frondi, i żda wkoll fuq il- 
bażi ta’ bidliet f’parametru ie ħor ta’ kejl (erja totali tal-frond, pi ż 
niexef u pi ż frisk) fil-kontrolli u f’kull grupp ta’ trattament sat- 
tmiem tat-test.  
Għandu jiġi nnutat li l-valuri ta’ tossi ċità kkalkulati permezz tal-u żu 
ta’ dawn i ż-żewġ varjabbli ta’ rispons ma jistg ħux jiġu mqabbla u 
din id-differenza trid ti ġi rikonoxxuta meta r-ri żultati tat-test ji ġu 
użati. Valuri EC  x ibbażati fuq rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku 
(E r C x ) ikunu ġeneralment og ħla minn ri żultati bba żati fuq ir- 
rendiment (E  y C x ) jekk il-kundizzjonijiet tat-test ta’ dan il-Metodu 
ta' ttestjar ji ġu rrispettati, min ħabba l-ba żi matematika tal-appro ċċi 
rispettivi. Dan ma g ħandux ikun interpretat b ħala differenza fis- 
sensittività bejn i ż-żewġ varjabbli ta’ rispons, sempli ċement għax 
il-valuri huma differenti matematikament. Il-kun ċett ta’ rata medja 
ta’ tkabbir spe ċifiku huwa bba żat fuq il-mudell ġenerali ta’ tkabbir 
esponenzjali ta’ duckweed f’kulturi mhux limitati, fejn it-tossi ċità 
hija kkalkulata fuq il-ba żi tal-effetti fuq ir-rata ta’ tkabbir ming ħajr 
ma tkun dipendenti fuq il-livell assolut tar-rata spe ċifika ta’ tkabbir 
tal-kontroll, il-pendil tal-kurva kon ċentrazzjoni-rispons jew fuq id- 
dewmien tat-test. B’kuntrast, ri żultati bba żati fuq il-varjabbli ta’ 
rispons tar-rendiment huma dipendenti fuq dawn il-varjabbli l- 
oħrajn kollha. E  y C x hija dipendenti fuq ir-rata spe ċifika ta’ tkabbir 
tal-ispeċje tad-duckweed u żata fit-test u fuq ir-rata massima spe ċifika 
ta’ tkabbir li tista’ tvarja bejn spe ċi jew anki kloni differenti. Dan il- 
varjabbli ta’ rispons ma g ħandux jintu ża biex tqabbel is-sensittivita 
għal sustanzi tossi ċi fost l-ispe ċi tad-duckweed jew anki kloni 
differenti. Waqt li l-u żu ta’ rata medja spe ċifika ta’ tkabbir biex 
tikkalkula t-tossi ċita hija xjentifikament preferuta, kalkoli ta’ 
tossiċità bbażati fuq rendiment huma inklu żi wkoll f’dan il-Metodu 
ta' ttestjar biex jissodisfaw ir-rekwi żiti regolatorji f’xi pajji żi. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Kalkoli ta’ tossi ċità għandhom ikunu bba żati fuq l-g ħadd tal-frondi u 
fuq varjabbli ta’ kejl ie ħor addizzjonali (erja totali tal-frond, pi ż 
niexef u pi ż frisk), g ħaliex xi sustanzi jistg ħu jaffetwaw varjabbli 
oħra ta’ kejl ħafna iktar mill-g ħadd tal-frondi. Dan l-effett ma ji ġix 
rivelat billi tikkalkula l-g ħadd tal-frondi biss.  
L-għadd ta' frondi kif ukoll kull varjabbli ie ħor ta’ kejl re ġistrat, i.e. 
erja totali tal-frond, pi ż niexef jew pi ż frisk, huma mni żżlin f’tabella 
flimkien mal-kon ċentrazzjonijiet tas-sustanzi tat-test ta’ kull 
okkażjoni ta’ kejl. Anali żi tad-dejta sussegwenti e ż. biex tikkalkula 
LOEC, NOEC jew EC  x għandhom ikunu bba żati fuq il-valuri g ħar- 
repliki individwali u mhux fuq medji kkalkulati g ħal kull grupp ta’ 
trattament.  
2.2.1.  Ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku  
Ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku għal perjodu spe ċifiku tiġi kkal­
kulata fuq i ż-żjieda logaritmika fil-varjabbli ta’ tkabbir — numri ta’ 
frond u varjabbli ie ħor ta’ kejl (erja totali ta’ frond, pi ż niexef jew 
piż frisk) — billi tintu ża l-formula ta’ hawn ta ħt għal kull replika ta’ 
kontroll u trattamenti:  
μ iÄj ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
fejn: 
— μ i-j : rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku minn ħin i sa j  
— N  i : varjabbli ta’ kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f’ ħin i 
— N  j : varjabbli ta’ kejl fil-kontenitur tat-test jew kontroll f’ ħin j 
— t: perjodu ta’ ħin minn i sa j  
Għal kull grupp ta’ trattament jew kontroll, ikkalkula valur medju 
għar-rata ta’ tkabbir flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni.  
Ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku għandha tkun ikkalkulata g ħal- 
perjodu s ħiħ tat-test ( ħin “i” fil-formula ta’ hawn fuq huwa l-bidu 
tat-test u l- ħin “j” huwa t-tmiem tat-test). G ħal kull kon ċentrazzjoni 
tat-test jew kontroll, ikkalkula valur medju g ħar-rata medja ta’ 
tkabbir flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni. G ħandha tiġi wkoll 
stimata r-rata ta’ tkabbir sezzjoni b’sezzjoni sabiex ji ġu vvalutati 
effetti tas-sustanza tat-test li jivverifikaw ru ħhom matul il-perjodu 
ta’ espożizzjoni (e ż. billi jiġu eżaminati l-kurvi ta’ tkabbir trasformati 
f’logaritmi). Differenzi sostanzjali bejn ir-rata ta’ tkabbir sezzjoni 
b’sezzjoni u r-rata medja ta’ tkabbir jindikaw devjazzjoni mit- 
tkabbir esponenzjali kostanti u g ħandha issir e żaminazzjoni bir- 
reqqa tal-kurvi ta’ tkabbir. F’dan il-ka ż, approċċ konservattiv ikun 
li jiġu mqabbla r-rati ta’ tkabbir spe ċifiku minn kulturi ittrattati waqt 
il-perjodu ta’ ħin ta’ inibizzjoni massima ma’ kontrolli waqt l-istess 
perjodu ta’ ħin. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Persentaġġ ta’ inibizzjoni tar-rata ta’ tkabbir (I  r ) jista’ jiġi kkalkulat 
fuq kull kon ċentrazzjoni tat-test (grupp ta’ trattament) bil-formula li 
ġejja: 
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
fejn: 
— % I  r : persenta ġġ ta’ inibizzjoni fir-rata medja ta’ tkabbir 
speċifiku  
— μ C : valur medju g ħal μ fil-kontroll  
— μ T : valur medju g ħal μ fil-grupp ta’ trattament  
2.2.2.  Rendiment  
Effetti fuq ir-rendiment huma determinati fuq il-ba żi ta’ żewġ 
varjabbli ta’ kejl, g ħadd ta' frondi u varjabbli ie ħor ta’ kejl (erja 
totali ta’ frond, pi ż niexef u pi ż frisk) pre żenti f’kull kontenitur 
tat-test fil-bidu u fit-tmiem tat-test. G ħal piż niexef u pi ż frisk, il- 
bijomassa tal-bidu hija ddeterminata fuq il-ba żi ta’ kampjun ta’ 
frondi me ħud mill-istess lott u żat biex tlaqqam il-kontenituri tat- 
test (ara t-tieni paragrafu fit-taqsima 1.7.3). G ħal kull kon ċen­
trazzjoni tat-test jew kontroll, ikkalkula valur medju g ħar-rendiment 
flimkien mal-estimi tal-varjazzjoni. Il-persenta ġġ medju ta’ 
inibizzjoni f’termini ta’ rendiment (% I  y ) tista’ tiġi kkalkulata g ħal 
kull grupp ta’ trattament kif ġej: 
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
fejn: 
— % I  y : persenta ġġ tat-tnaqqis fir-rendiment  
— b  C : bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu 
għall-grupp ta’ kontroll  
— b  T : bijomassa finali li minnha titnaqqas il-bijomassa tal-bidu 
fil-grupp ta’ trattament  
2.2.3.  Ipplottjar ta’ kurvi ta’ rispons ta’ kon ċentrazzjoni  
Għandhom ji ġu pplottjati l-kurvi ta’ rispons ta’ kon ċentrazzjoni li 
juru l-persenta ġġ medju ta’ inibizzjoni tal-varjabbli tar-rispons (I  r , 
jew I  y ikkalkulat kif muri fl-a ħħar paragrafu tat-taqsima 2.2.1 jew 
fit-taqsima 2.2.2) u l-kon ċentrazzjoni logaritmika tas-sustanza tat- 
test. 
2.2.4.  Estimi ta’ EC  x 
Estimi ta’ EC  x (eż. EC  50 ) għandhom dejjem ikunu bba żati kemm fuq 
ir-rata medja ta’ tkabbir spe ċifiku (E  r C x ) kif ukoll fuq ir-rendiment 
(E y C x ), u t-tnejn li huma g ħandhom ikunu bba żati fuq l-g ħadd tal- 
frondi u varjabbli ie ħor ta’ kejl (erja totali ta’ frond, pi ż niexef, jew 
piż frisk). Dan g ħaliex hemm sustanzi tat-test li jinfluwenzaw l- 
għadd ta' frondi u l-varjabbli ta’ kejl o ħra b’mod differenti. Il- 
parametri ta’ tossi ċità mixtieqa huma g ħalhekk erba’ valuri EC  x 
għal kull livell ta’ inibizzjoni kkalkulat: E  r C x (għadd tal-frondi); 
E r C x (erja totali tal-frondi, pi ż niexef, jew pi ż frisk); E  y C x (għadd 
tal-frondi); u E  y C x (erja totali tal-frondi, pi ż niexef, jew pi ż frisk).  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. PRO ĊEDURA STATISTIKA  
L-għan huwa li tinkiseb relazzjoni kon ċentrazzjoni-rispons permezz 
ta’ analiżi ta’ regressjoni. Huwa possibbli li ti ġi użata regressjoni 
medja lineari wara li ssir trasformazzjoni linearizzanti tad-dejta ta’ 
rispons — pere żempju f’unità probit jew logit jew Weibull (16), i żda 
proċeduri non-lineari ta’ regressjoni huma ppreferuti g ħax jittrattaw 
aħjar l-irregolaritajiet inevitabbli ta’ dejta u d-devjazzjonijiet minn 
distribuzzjonijiet lixxi. Qrib l-inibizzjoni żero jew inibizzjoni totali, 
dawn l-irregolaritajiet jistg ħu jiġu mkabbra bit-trasformazzjoni, u dan 
ifixkel l-anali żi (16). G ħandu jiġi nnutat li l-metodi standard ta’ 
analiżi li jużaw trasformazzjonijiet probit, logit jew Weibull huma 
maħsuba għal użu fuq dejta ta’ natura quantal (e ż. mortalità jew 
sopravivenza), u g ħandhom ji ġu mmodifikati biex jag ħmlu tajjeb 
għal dejta tar-rata ta’ tkabbir jew rendiment. Pro ċeduri spe ċifiċi 
għad-determinazzjoni ta’ valuri EC  x minn dejta kontinwa jistg ħu 
jinstabu fi (17), (18), u (19).  
Għal kull varjabbli ta’ rispons li ji ġi analizzat, g ħandha tintu ża r- 
relazzjoni kon ċentrazzjoni-rispons biex ji ġu kkalkulati l-estimi ta’ 
punti ta’ valuri EC  x . Fejn huwa possibbli, il-limiti ta’ kunfidenza 
tal-95 % g ħal kull stima g ħandhom ji ġu ddeterminati. Il-livell ta’ 
kemm huwa tajjeb l-adattament tad-dejta ta’ rispons g ħall-mudell 
ta’ regressjoni g ħandu jiġi stmat grafikament jew statistikament. L- 
analiżi ta’ regressjoni g ħandha ssir bl-u żu ta’ risponsi ta’ repliki 
individwali, u mhux medji ta’ gruppi ta’ trattament.  
Stimi EC  50 u limiti ta’ kunfidenza jistg ħu wkoll jinkisbu bl-u żu ta’ 
interpolazzjoni lineari b’sekwenza ta’ istruzzjonijiet inizjali (20), jekk il-mudelli/metodi ta’ regressjoni a ċċessibbli mhumiex xierqa g ħad- 
dejta.
 
Għal stima tal-LOEC u g ħalhekk tal-NOEC, huwa ne ċessarju li ji ġu 
mqabbla l-medji ta’ trattament permezz ta’ u żu ta’ anali żi ta’ tekniki 
ta’ varjanza (ANOVA). Il-medja ta’ kull kon ċentrazzjoni g ħandha 
mbagħad tiġi mqabbla mal-medja ta’ kontroll billi jintu ża metodu 
xieraq ta’ paragun multiplu jew metodu tat-test trend. Test ta’ Dunnett jew Williams jista’ jkun utli (21)(22)(23)(24). Huwa 
neċessarju li tivvaluta jekk l-ipotesi ANOVA ta’ omo ġeneità ta’ 
varjanza tre ġix. Din il-valutazjoni tista’ ssir grafikament jew b’test 
formali (25). Testijiet adegwati huma dak ta' Levene jew Bartlett. Nuqqas li tintla ħaq l-ipotesi ta’ omo ġeneità ta’ varjanzi tista’ xi drabi 
tiġi kkoreġuta permezz ta’ trasformazzjoni logaritmika tad-dejta. Jekk 
l-eteroġeneità tal-varjanza hija estrema u ma tistax ti ġi kkoreġuta bi 
trasformazzjoni, anali żi b’metodi b ħal testijiet ta’ trend ’l isfel 
Jonkheere g ħandhom ji ġu kkunsidrati. Iktar indikazzjoni dwar id- 
determinazzjoni tal-NOEC tista’ tinstab f’ (19).
 
Żviluppi xjentifi ċi riċenti wasslu g ħal rakkomandazzjoni biex ji ġi 
abbandunat il-kun ċett tal-NOEC u minflok jinbidel bi stimi EC  x 
ta’ punti bba żati fuq regressjoni. Valur xieraq g ħal x ma ġiex 
stabbilit g ħal dan il- Lemna  test. Madankollu, sensiela ta’ minn 10 
sa 20 % tidher xierqa (tiddependi fuq il-varjabbli ta’ rispons magħżul), u preferibbilment l-EC
 10 u l-EC  20 għandhom ji ġu 
rrapurtati t-tnejn li huma.  
3. RAPPURTAR  
3.1. RAPPORT TAT-TEST  
Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi dawn li ġejjin:  
Is-sustanza tat-test:  
— in-natura fi żika u l-proprjetajiet fi żikokimiċi, li jinkludu l-limitu 
ta’ solubilità tal-ilma;  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— dejta ta’ identifikazzjoni kimika (e ż. In-Numru CAS), li tinkludi 
l-purità.  
Speċi tat-test:  
— isem xjentifiku, klonu (jekk mag ħruf) u sors.  
Kundizzjonijiet tat-test:  
— il-proċedura tat-test u żat (statiku, semi-statiku jew flow-through);  
— id-dejta tal-bidu tat-test u d-dewmien tieg ħu; 
— il-midjum tat-test:  
— deskrizzjoni tad-di żinn sperimentali: kontenituri tat-test u g ħata, 
volumi ta’ soluzzjoni, g ħadd ta' kolonji u frondi kull kontenitur 
tat-test fil-bidu tat-test;  
— konċentrazzjoniet tat-test (nominali u mkejla kif inhu xieraq) u 
għadd ta' repliki g ħal kull kon ċentrazzjoni:  
— metodi ta’ preparazzjoni ta’ materjal b'kon ċentrazzjoni standard ­
izzata u soluzzjonijiet tat-test li jinkludi l-u żu ta’ xi solventi jew 
dispersanti;  
— temperatura matul it-test;  
— sors ta’ dawl, intensità tad-dawl u omo ġeneità;  
— valuri ta’ pH tat-test u tal-midja ta’ kontroll;  
— konċentrazzjonijiet ta’ sustanzi tat-test u l-metodu ta’ anali żi 
b’dejta xierqa ta’ ivvalutar ta’ kwalità (studji ta’ validazzjoni, 
devjazzjonijiet standard u l-limiti ta’ kunfidanza ta’ anali żi); 
— metodi g ħal determinazzjoni tal-g ħadd tal-frondi u varjabbli ie ħor 
ta’ kejl e ż. piż niexef, pi ż frisk u erja ta’ frond;  
— kull devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta' ttestjar.  
Riżultati:  
— dejta mhux elaborata: g ħadd ta' frondi u varjabbli o ħra ta’ kejl 
f’kull test u kontenitur ta’ kontroll f’kull osservazzjoni u okkażjoni ta’ anali żi;
 
— medji u devjazzjonijiet standard g ħal kull varjabbli ta’ kejl;  
— kurvi ta’ tkabbir g ħal kull kon ċentrazzjoni (irrakkomandata ma’ 
varjabbli ta’ kejl logaritmikament trasformat, ara t-tieni paragrafu fit-taqsima 2.2.1);
 
— ħin ta’ rduppjar/rata ta’ tkabbir fil-kontroll ibba żat fuq l-g ħadd ta' 
frondi;  
— varjabbli ta’ rispons ikkalkulati g ħal kull replika ta’ trattament, 
b’valuri medji u varjazzjoni ta’ koeffi ċjent għar-repliki;  
— rappre żentazzjoni grafika tar-relazzjoni kon ċentrazzjoni/effett;  
— stimi ta’ punti ta’ tmiem tossi ċi għal varjabbli ta’ rispons e ż. 
EC 50 , EC  10 , EC  20 , u l-intervalli ta’ kunfidenza asso ċjati. Jekk 
ikkalukulati, l-LOEC u/jew l-NOEC u l-metodi ta’ statistika 
użati għad-determinazzjoni tag ħhom; ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— jekk ANOVA kienet u żata, id-daqs tal-effett li jista’ ji ġi indi­
vidwat (e ż. id-differenza l-inqas sinifikanti);  
— kull stimulazzjoni ta’ tkabbir misjuba f’kull trattament;  
— kull sinjal li jidher ta’ fitotossi ċità u kif ukoll osservazzjonijiet 
tas-soluzzjonijiet tat-test;  
— diskussjoni tar-ri żultati, li tinkludi kull influwenza fuq ir-ri żultat 
tat-test li ħarġet minn devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta' 
ttestjar.  
4. LETTERATURA  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test  
(2) The use of Lemna studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, 
at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals  
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; 
Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ 
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 
(Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, 
PA.
 
(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using 
Lemna spp., “Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.  
(6) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). 
XP T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor . 10pp.
 
(7) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , 
duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 pp
 
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Regis ­
tration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc — Environment Agency.  
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.
 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research 
Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353-359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481-483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.
 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.
 
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
 
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
 
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Appendiċi 1 
Deskrizzjoni ta’  Lemna  spp.  
Il-pjanta akkwatika li komunement tissejja ħ bħala ħażiż li jgħatti l-wiċċ tal-ilma 
qiegħed (duckweed), Lemna spp., hija parti mill-familja Lemnaceae li g ħandha 
għadd ta’ spe ċi madwar id-dinja f’erba’ ġenera. Id-dehra u t-tassonomija 
differenti tag ħhom ġew deskritti b’mod s ħiħ (1)(2).  Lemna gibba  u L. minor  
huma spe ċi rappreżentattivi ta’ postijiet b’temperatura moderata u huma 
komunement u żati għal testijiet ta’ tossi ċità. Iż-żewġ speċi għandhom werqa 
biz-zokk (frond) tonda li żżomm fil-wi ċċ jew taħt il-wiċċ tal-ilma, u g ħerq 
irqiq ħafna joħroġ minn nofs tal-wi ċċ l-iktar baxx ta’ kull frond. Lemna spp. 
rari tipprodu ċi fjuri u l-pjanti jitnisslu billi ve ġetattivament jipprodu ċu frondi 
ġodda (3). B’kuntrast ma’ pjanti ixja ħ, iż-żgħar għandhom it-tendenza li jkunu 
iktar ċari, li jkollhom g ħeruq iqsar u jikkonsisti minn tnejn sa tliet frondi ta’ 
daqsijiet differenti. Id-daqs żgħir ta’  Lemna , l-istruttura sempli ċi tagħha, ir-ripro ­
duzzjoni u l- ħin qasir ta’ ġenerazzjoni jag ħmlu pjanti ta’ dan il- ġeneru tajbin 
ħafna għal ittestjar fil-laboratorju (4)(5).  
Minħabba differenza probabbli bejn l-ispe ċi, fis-sensittività, paraguni ta’ sensit ­
tività fost spe ċi waħda biss huma validi.  
Eżempji ta’ spe ċi ta’ Lemna  li ġew użati għal ittestjar: Referenza g ħal Speċi 
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium 
strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
 
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., “Public draft”. 
EPA 712-C-96-156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (bl- 
Iżvediż). 
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733- 
742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., “Public draft”. EPA 
712-C-96-156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 
483. ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Sorsi ta’ spe ċijiet ta’  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel: +1-416-978-3641  
Fax:+1-416-978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
United States  
phone 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SWEDEN  
Tel: +46 8 674 7240  
Fax +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Germany  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Letteratura  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human util ­
ization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Appendiċi 2 
Manteniment ta’ kulturi b'kon ċentrazzjoni standardizzata  
Kulturi b'kon ċentrazzjoni standardizzata jistg ħu jiġu miżmuma f’temperaturi iktar 
baxxi (4-10 °C) g ħal ħinijiet itwal ming ħajr il-bżonn li jerġgħu jsiru mill- ġdid. Il- 
midjum ta’ tkabbir ta’ Lemna jista’ jkun l-istess b ħal dak użat għal ittestjar i żda 
midja oħra rikka fin-nutrijenti tista’ tintu ża għal kulturi b'kon ċentrazzjoni stan ­
dardizzata.  
Kull tant żmien, għadd ta' pjanti żgħar ta’ lewn a ħdar ċar jitpoġġew f’kontenituri 
ġodda ta’ kultura li fihom ikun hemm midjum ġdid b’teknika asettika. Skont il- 
kundizzjonijiet iktar kes ħin irrakkomandati hawn, sub-kultura tista’ ssir f’in ­
tervalli ta’ massimu ta’ tliet xhur.  
Kontenituri tal- ħġieġ ta’ kultura li huma kimikament nodfa (ma ħsulin bl-a ċidu) u 
sterili għandhom jintu żaw u tekniki asetti ċi ta’ mane ġġjar għandhom ji ġu impli­
mentati. F’ka ż ta’ kontaminazzjoni ta’ kultura b'kon ċentrazzjoni standardizzata e ż 
minn alga jew faqqieg ħ, għandhom jittie ħdu passi biex organi żmi ta’ kontami ­
nazzjoni ji ġu eliminati. Fil-ka ż ta’ alga u ħafna mill-organi żmi ta’ kontami ­
nazzjoni o ħrajn, dan jista’ jsir permezz ta’ sterilizzazzjoni. Kampjun tal- 
materjal ta’ pjanti kontaminat g ħandu jittie ħed u l-għeruq jinqatg ħu. Dan il- 
materjal ji ġi mbagħad imlaħlaħ b’saħħa f’ilma nadif, u mbag ħad mgħaddas ġo 
soluzzjoni 0,5 % (v/v) sodium hypochlorite g ħal bejn 30 sekonda u 5 minuti. Il- 
materjal ta’ pjanti huwa mbag ħad imlaħlaħ b’ilma sterili u trasferit, b ħala għadd 
ta' lottijiet, f’kontenituri ta’ kultura li fihom ikun hemm midjum ta’ tkabbir frisk. 
Ħafna frondi jmutu b ħala riżultat ta’ dan it-trattament, spe ċjalment jekk jintu żaw 
perjodi ta’ espo żizzjoni itwal, imma xi w ħud minn dawk li jsalvaw ikunu 
ġeneralment ħielsa minn kontaminazzjoni. Dawn jistg ħu mbagħad jintużaw 
biex jerġgħu jlaqqmu kulturi ġodda.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Appendiċi 3 
Midja  
Midja differenti ta’ tkabbir huma rrakkomandati g ħal L. minor u L. gibba . Għal 
L. minor , midjum ta’ Standard Svedi ż (SIS) modifikat huwa rrakkomandat waqt 
li għal L. gibba , midjum 20X AAP huwa rrakkomandat. Kompo żizzjonijiet ta ż- 
żewġ midja huma mog ħtija hawn ta ħt. Meta dawn il-midja ji ġu ppreparati, 
reagent jew sustanzi kimi ċi ta’ grad analitiku u ilma dejonizzat g ħandhom 
jintużaw. 
Standard Svedi ż (SIS) midjum ta’ tkabbir ta’ Lemna  
— Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata I-V huma sterilizzati b’awtok ­
lavazzjoni (120 °C, 15 minuti) jew b’tisfija minn membrana (b’daqs tal-pori ta’ ċirka 0,2 m).
 
— Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata VI (u VII b ħala għażla oħra) 
huma sterilizzati biss permezz ta’ tisfija minn membrana; dawn ma 
għandhomx ji ġu awtoklavati.  
— Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata sterili g ħandhom jin ħaznu 
f’kundizzjonijiet friski u mudlama. Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standard ­
izzata I-V g ħandhom jintremew wara sitt xhur waqt li soluzzjonijiet b'kon ċen­
trazzjoni standardizzata VI (u VII b ħala għażla oħra) jiskadu wara xahar.  
Soluzzjoni 
B'konċen­
trazzjoni stan ­
dardizzata Nru Sustanza Konċentrazzjoni 
fis-soluzzjoni 
b'konċentrazzjoni 
standardizzata (g 
l –1 ) Konċentrazzjoni 
fil-midjum 
ippreparat (mg 
l –1 ) Midjum ippreparat 
Element Konċentrazzjoni 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (buffer) 490 490 — —  
— Sabiex tipprepara litru ta’ midjum SIS, dawn li ġejjin jiżdiedu ma’ 900 ml ta’ 
ilma dejonizzat:  
— 10 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata I  
— 5 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata II  
— 5 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata III  
— 5 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata IV  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata V  
— 5 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata VI  
— 1 ml ta’ soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata VII (jekk trid)  
Nota: Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata VII o ħra (buffer MOPS) tista’ tkun 
neċessarja għal ċerti sustanzi tat-test (ara l-a ħħar paragrafu fit-taqsima 1.4).  
— Il-pH huwa a ġġustat għal 6,5 ± 0,2 b’0.1 jew 1 mol HCl jew NaOH, u l- 
volum aġġustat għal litru b’ilma dejonizzat.  
Midjum ta’ tkabbir 20X AAP  
Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata huma ppreparati f’ilma sterili 
distillat jew dejonizzat.  
Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata sterili g ħandhom jin ħaznu f’kun ­
dizzjonijiet friski u mudlama. F’dawn il-kundizzjonijiet is-soluzzjonijiet b'kon ċ­
entrazzjoni standardizzata ma jiskadux qabel 6-8 ġimgħat. 
Ħames soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata ta’ nutrijent (A1, A2, A3, 
B and C) huma ppreparati g ħal midjum 20X — AAP, bl-u żu ta’ sustan żi kimiċi 
ta’ grad reagent. 20 ml ta’ kull soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata ta’ 
nutrijent huma mi żjuda ma’ ċirka 850 ml ta’ ilma dejonizzat biex ji ġi prodott il- 
midjum ta’ tkabbir. Il-pH huwa a ġġustat għal 7,5 ± 0,1 b’0,1 jew 1 mol HCl jew 
NaOH, u l-volum a ġġustat għal litru b’ilma dejonizzat. Il-midjum ji ġi mbagħad 
imsaffi minn filtru ta’ membrana ta’ ( ċirka) 0,2 μm għal ġo kontenitur sterili.  
Il-midjum ta’ tkabbir ma ħsub għal ittestjar g ħandu jkun ippreparat minn jum sa 2 
qabel l-u żu sabiex il-pH jil ħaq joqgħod. Il-pH ta’ midjum ta’ tkabbir g ħandu 
dejjem jiġi kkontrollat qabel l-u żu u aġġustat mill- ġdid, jekk ne ċessarju, bi ż-żieda 
ta’ 0,1 jew 1 M NaOH jew HCl kif deskritt hawn fuq.  
Soluzzjoni kon- 
ċentrata Nru Sustanza Konċentrazzjoni 
fis-soluzzjoni 
b'konċentrazzjoni 
standardizzata (g 
l –1 ) ( 1 ) Konċentrazzjoni 
fil-midjum 
ippreparat (mg 
l –1 ) (*) Midjum ippreparat 
Element Konċentrazzjoni 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Sakemm mhux indikat  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Nota: Il-kon ċentrazzjoni finali ta’ bikarbonat teoretikament tajba (li tevita a ġġustament ta’ 
pH notevoli) hija ta’ 15 mg/l, mhux ta’ 300 mg/l. Madankollu, l-u żu storiku ta’ 
midjum 20X-AAP, inklu ż ir-ring test g ħal dan il-metodu, huwa bba żat fuq 
300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. 
R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
Midjum STEINBERG (skont l-ISO 20079)  
Konċentrazzjonijiet u soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata  
— Il-midjum Steinberg modifikat huwa u żat fl-ISO 20079 g ħal Lemna minor  
waħedha (għaliex  Lemna minor  biss hija permessa f’dan l-istandard) i żda 
testijiet urew li ri żultati tajbin jistg ħu jinkisbu b’ Lemna gibba  wkoll.  
— Meta dan il-midjum ji ġi ppreparat, g ħandhom jintu żaw sustanzi kimi ċi 
reagent jew sustanzi kimi ċi ta’ grad analitiku u ilma dejonizzat.  
— Ipprepara l-midjum ta’ nutrijent minn soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni stan ­
dardizzata jew il-midjum b'kon ċentrazzjoni standardizzata g ħal 10 darbiet li 
jippermetti kon ċentrazzjoni massima tal-midjum ming ħajr preċipitazzjoni.  
Tabella 1  
Midjum STEINBERG b’pH stabilizzata (modifikat skont Altenburger)  
Sustanza Midjum ta’ nutrijenti  
Makroelementi  pi ż mol mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelementi  pi ż mol μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA Disodium-dihydrate 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabella 2  
Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata (Makroelementi)  
1. Makroelementi (b'kon ċentrazzjoni standardizzata 50 
darba)  g/l 
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabella 3  
Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata (Mikroelementi)  
2. Mikroelementi (b'kon ċentrazzjoni standardizzata 1 000 
darba)  mg/l 
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA Disodium-dihydrate 1 500,00  
— Soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata 2 u 3 u separatament 4 u 7 
jistgħu jinġabru flimkien (b’kunsiderazzjoni g ħal-konċentrazzjonijiet rikjesti).  
— Biex ittawwal id-data ta’ skadenza, ittratta is-soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni 
standardizzata f’awtoklavi f’temperatura ta’ 121 °C g ħal 20 min jew inkella 
għamel tisfija sterili (0,2 μm). Għal soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standard ­
izzata 8, tisfija sterili (0,2 μm) hija rrakkomandata ħafna.  
Preparazzjoni tal-kon ċentrazzjoni finali ta’ midjum STEINBERG 
(modifikat)  
— Żid 20 ml ta’ soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata 1, 2 u 3 (ara 
tabella 2) ma’ ċirka 900 ml ta’ ilma dejonizzat sabiex tevita li sse ħħ preċipi­
tazzjoni.  
— Żid 1,0 ml ta’ soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata 4, 5, 6, 7 u 8 
(ara tabella 3).  
— Il-pH irid ikun 5,5 ± 0,2 (a ġġusta billi żżid volum minimizzat ta’ soluzzjoni 
NaOH jew HCl)  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Aġġusta bl-ilma g ħal 1 000 ml.  
— Jekk is-soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata huma sterilizzati u ilma 
tajjeb huwa u żat ma hemm b żonn l-ebda sterilizzazzjoni o ħra. Jekk steriliz ­
zazzjoni ssir bil-midjum finali, is-soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 
8 għandha tiżdied wara awtoklavazzjoni (f’temperatura ta’ 121 °C g ħal 
20 min).  
Preparazzjoni ta’ midjum STEIBERG (modifikat) 10 darbiet b'kon ċen­
trazzjoni standardizzata g ħal ħażna intermedja  
— Żid 20 ml ta’ soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata nri 1, 2 u 3 (ara 
t-tabella 2) ma’ ċirka 30 ml ta’ ilma sabiex tevita li sse ħħ preċipitazzjoni.  
— Żid 1,0 ml tas-soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata nri 4, 5, 6, 7 u 8 
(ara t-tabella 3). A ġġusta bl-ilma g ħal 100 ml.  
— Jekk is-soluzzjonijiet b'kon ċentrazzjoni standardizzata huma sterilizzati u ilma 
tajjeb huwa u żat ma hemm b żonn l-ebda sterilizzazzjoni o ħra. Jekk steriliz ­
zazzjoni ssir bil-midjum finali, is-soluzzjoni b'kon ċentrazzjoni standardizzata 
nru 8 għandha tiżdied wara l-awtoklavazzjoni (f’temperatura ta’ 121 °C g ħal 
20 min).  
— Il-pH tal-midjum (kon ċentrazzjoni finali) g ħandha tkun 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  TEST TAT-TOSSI ĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ SEDIMENT-ILMA 
BL-UŻU TA’ SEDIMENT IM ĦALLAT  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħall-Linja Gwida 
tat-Test (TG) 218 (2004) tal-OECD. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa 
nfassal biex jivvaluta l-effetti ta’ espo żizzjoni prolongata tal-kimi ċi għal- 
larvi li jg ħixu fis-sediment tad-dipteran tal-ilma ħelu Chironomus  sp. 
Huwa bba żat fuq protokolli e żistenti tat-test tat-tossi ċità għal Chironomus 
riparius  u Chironomus tentans  li ġew żviluppati fl-Ewropa (1)(2)(3) u 
fl-Amerika tat-Tramuntana (4)(5)(6)(7)(8) u sarilhom ir-ring test (1)(6)(9). 
Jistgħu jintużaw ukoll spe ċijiet oħra ta’ kironomidi iddokumentati sewwa, 
eż. Chironomus yoshimatsui  (10)(11).  
2. Ix-xenarju ta’ espo żizzjoni użat f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa sediment 
fortifikat bis-sustanza g ħall-ittestjar. L-g ħażla tax-xenarju adatt ta’ 
espożizzjoni tiddependi mill-applikazzjoni ma ħsuba tat-test. Ix-xenarju ta’ 
sediment fortifikat huwa ma ħsub li jissimula livelli akkumulati ta’ kimi ċi 
li jippersistu fis-sediment. Din is-sistema ta’ espo żizzjoni tinvolvi sediment 
fortifikat ta’ sistema ta’ ttestjar ta’ sediment-ilma.  
3. Sustanzi li je ħtiġilhom ikunu ttestjati g ħal organi żmi li jgħixu f’sediment 
is-soltu jippersistu f’dan il-kompartiment tul perjodi twal ta’ żmien. 
L-organiżmi li jgħixu f’sediment jistg ħu jkunu esposti permezz ta’ g ħadd 
ta’ rotot. L-importanza relattiva ta’ kull rotta ta’ espo żizzjoni u ta ż-żmien 
meħud għal kull wa ħda biex tikkontribwixxi g ħall-effetti tossi ċi globali, 
tiddependi mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika kon ċernata. G ħal 
sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log K  ow > 5) jew g ħal sustanzi 
magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-in ġestjoni ta’ ikel kontaminat 
tista’ tkun rotta sinifikanti ta’ espo żizzjoni. Biex it-tossi ċità ta’ sustanzi 
lipofiliċi ħafna ma tkunx sottovalutata, jista’ jitqies l-u żu ta’ ikel mi żjud 
mas-sediment qabel l-applikazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar. Biex jittie ħdu 
r-rotot potenzjali kollha ta’ espo żizzjoni l-fokus ta’ dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar ikun fuq espo żizzjoni fit-tul. It-testijiet idumu madwar 20 - 28 
jum għal C. riparius  u C. yoshimatsui , u 28 - 65 jum g ħal C. tentans . 
Jekk tkun me ħtieġa dejta għal żmien qasir g ħal għan speċifiku, pere żempju 
biex ikunu mist ħarrġa l-effetti ta’ kimika instabbli, replikati addizzjonali 
jistgħu jitneħħew wara perjodu ta’ g ħaxart ijiem.  
4. Il-punti ta’ tmiem imkejla huma l-g ħadd totali ta’ adulti li jkunu evolvew u 
ż-żmien li jkunu ħadu biex evolvew. Huwa rrakkomandat li l-kejl 
tas-sopravivenza u tat-tkabbir tal-larvi g ħandu jsir biss wara perjodu ta’ 
għaxart ijiem jekk tkun me ħtieġa dejta addizzonali g ħal żmien qasir, billi 
jintużaw replikati addizzjonali skont il-ka ż. 
5. Huwa rrakkomandat l-u żu ta’ sediment formulat. Sediment formulat g ħandu 
diversi vanta ġġi fuq sedimenti naturali:  
— il-varjabbiltà sperimentali titnaqqas min ħabba li jifforma “matri ċi stan­
dardizzata” riprodu ċibbli u l- ħtieġa li jinstabu sorsi ta’ sediment mhux 
kontaminati u nodfa tkun eliminata;  
— it-testijiet jistg ħu jibdew f’kull żmien ming ħajr ma jkun hemm 
varjabbiltà sta ġonali fis-sediment tat-test u ma jkunx hemm ħtieġa li 
s-sediment ikun ittrattat minn qabel biex titne ħħa fawna indi ġena; 
l-użu ta’ sediment formulat inaqqas ukoll l-ispi ża b’rabta mal- ġabra 
mill-post ta’ ammonti suffi ċjenti ta’ sediment g ħal testijiet ta’ rutina;  
— l-użu ta’ sediment formulat jippermetti li jsiru tqabbiliet ta’ tossi ċità u 
gradazzjoni ta’ sustanzi b’dan il-mod.  
6. Definizzjonijiet u żati jingħataw fl-Appendi ċi 1. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
7. L-ewwel fa żi ta’ larvi kironomidi jkunu esposti g ħal firxa ta’ kon ċen­
trazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar f’sistemi ta’ sediment u ilma. Is-sustanza 
għall-ittestjar tkun iffortifikata fis-sediment u l-larvi tal-ewwel fa żi mbagħad 
jiddaħħlu f’bekkijiet tat-test li fihom il-kon ċentrazzjonijiet ta’ sediment u 
ilma jkunu saru stabbli. Ir-rata ta’ evoluzzjoni u żvilupp ta’ kironomidi 
titkejjel fit-tmiem tat-test. Is-sopravivenza u l-pi ż tal-larvi jistg ħu jitkejlu 
wkoll wara 10 ijiem jekk ikun me ħtieġ (billi jintu żaw replikati addizzjonali 
skont kif ikun xieraq). Din id-dejta tkun analizzata jew billi jintu ża mudell 
ta’ rigressjoni biex tkun stmata l-kon ċentrazzjoni li g ħandha tikkaw ża x % 
tnaqqis fl-evoluzzjoni, fis-sopravivenza jew fit-tkabbir tal-larvi (e ż. EC  15 , 
EC 50 eċċ.), jew billi jintu ża ttestjar ta’ ipote żi ta’ statistika biex ikun 
iddeterminat NOEC/LOEC. Dan tal-a ħħar ikun je ħtieġlu tqabbil ta’ valuri 
ta’ effett ma’ valuri ta’ kontroll billi jintu żaw testijiet ta’ statistika.  
INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA G ĦALL-ITTESTJAR  
8. Is-solubilità fl-ilma tas-sustanza g ħall-ittestjar, il-pressjoni tal-fwar tag ħha, 
il-partizzjoni mkejla jew ikkalkulata f’sediment u l-istabbiltà fl-ilma u 
fis-sediment g ħandhom ikun mag ħrufin. Għandu jkun disponibbli metodu 
analitiku affidabbli g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar f’ilma 
ta’ fuq, f’ilma tal-pori u f’sediment b’akkuratezza mag ħrufa u rrapportata u 
b’limitu ta’ detezzjoni. Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali u 
l-purezza tas-sustanza g ħall-ittestjar. Dak li ji ġrilha kimikament is-sustanza 
għall-ittestjar (e ż. tixrid, degradazzjoni abijotika u bijotika, e ċċ.) ukoll huwa 
informazzjoni utli. Aktar gwida g ħall-ittestjar ta’ sustanzi bi proprjetajiet 
fiżikokimiċi li jagħmluha diffi ċli għalihom li jsirilhom it-test ting ħata fi (12).  
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
9. Kimi ċi ta’ referenza jistg ħu jkunu ttestjati perjodikament b ħala mezz li 
jiżgura li l-protokoll tat-test u l-kondizzjonijiet tat-test ikunu affidabbli. 
Eżempji ta’ sustanzi tossi ċi ta’ referenza u żati b’suċċess f’ring-tests u fi 
studji ta’ validazzjoni huma: lindane, trifluralin, pentaklorurfenol, klorur 
tal-kadmju u klorur tal-potassju (1)(2)(5)(6)(13).  
VALIDITÀ TAT-TEST  
10. Biex it-test ikun validu japplikaw il-kondizzjonijiet li ġejjin:  
— l-evoluzzjoni fil-kontrolli g ħandha tkun mill-anqas 70 % fit-tmiem 
tat-test. (1)(6);  
— l-evoluzzjoni ta’ C. riparius u C. yoshimatsui g ħal adulti minn re ċipjenti 
ta’ kontroll g ħandha sse ħħ bejn 12 u 23 jum wara li jkunu dda ħħlu 
fir-reċipjenti; g ħal C. tentans, ikun me ħtieġ perjodu ta’ 20 sa 65 jum.  
— fit-tmiem tat-test, il-pH u l-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu maħlul 
għandhom jitkejlu f’kull re ċipjent. Il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu 
għandha tkun mill-anqas 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV) 
fit-temperatura u żata, u l-pH tal-ilma ta’ fuq g ħandu jkun fil-firxa ta’ 6-9 
fir-reċipjenti kollha tal-ittestjar;  
— it-temperatura tal-ilma mhux suppost tvarja b’iktar minn ± 1,0 C. 
It-temperatura tal-ilma tista’ tkun ikkontrollata b’kamra i żotermika u 
f’dak il-ka ż it-temperatura tal-kamra g ħandha tkun ikkonfermata f’in ­
tervall xieraq ta’ ħin. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Reċipjenti tat-test  
11. L-istudju jitwettaq f’bekkijiet tal- ħġieġ ta’ 600 ml b’dijametru qies ta’ 8 cm. 
Reċipjenti oħra jkunu tajbin, i żda għandhom jiggarantixxu fond sewwa 
tal-ilma ta’ fuq u tas-sediment. Il-wi ċċ tas-sediment g ħandu jkun suffi ċjenti 
biex jipprovdi 2 sa 3 cm  2 għal kull larva. Il-proporzjon tal-fond tas-saff 
tas-sediment mal-fond tal-ilma ta’ fuq g ħandu jkun 1:4. Re ċipjenti tat-test 
u apparat ie ħor li jiġu f’kuntatt mas-sistema ta’ ttestjar g ħandhom ikunu 
magħmulin kollha mill- ħġieġ jew minn materjal ie ħor kimikament inerti 
(eż. Teflon).  
Għażla ta’ spe ċi 
12. L-ispe ċi li għandha tintu ża fit-test preferibbilment hija  Chironomus riparius . 
Chironomus tentans hija adatta wkoll i żda aktar diffi ċli biex tkun ittrattata u 
jeħtiġilha perjodu itwal ta’ test. Tista’ tintu ża wkoll Chironomus yohimatsui. 
Dettalji ta’ metodi ta’ kultura jing ħataw fl-Appendi ċi 2 għal Chironomus 
riparius. Informazzjoni dwar kondizzjonijiet ta’ kultura hija wkoll disponibbli g ħal speċijiet oħra, jiġifieri għal Chironomus tentans (4) u 
Chironomus yoshimatsui (11). L-identifikazzjoni ta’ spe ċijiet għandha tkun 
ikkonfermata qabel l-ittestjar i żda ma tkunx me ħtieġa qabel kull test jekk 
organiżmi jkunu ġejjin minn kultura interna.
 
Sediment  
13. Preferibbilment g ħandu jintu ża sediment formulat (msejja ħ ukoll sediment 
rikostitwit, artifi ċjali jew sintetiku). I żda, jekk jintu ża sediment naturali, dan 
għandu jkun ikkaratterizzat (huma wkoll irrakkomandati mill-anqas pH, 
kontenut ta’ karbonju organiku, determinazzjoni ta’ parametri o ħra bħal 
proporzjon ta’ C/N u granulumetrija), u g ħandu jkun ħieles minn kull 
kontaminazzjoni u organi żmi oħra li jistg ħu jikkompetu ma’, jew 
jikkunsmaw lill-kironomidi. Huwa wkoll irrakkomandat li, qabel ma jintuża f’test tat-tossi ċità tal-kironomidi, is-sediment naturali jkun ikkon ­
dizzjonat g ħal sebat ijiem ta ħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test 
sussegwenti. Huwa rrakkomandat li f’dan it-test jintu ża s-sediment formulat 
li ġej, ibbażat fuq il-ħamrija artifi ċjali użata fil-Metodu ta’ Ttestjar C.8 (14) 
(1)(15)(16):
 
(a) 4-5 % pit (pi ż fin-niexef): qrib kemm jista’ jkun pH 5,5 sa 6,0; huwa 
importanti li jintu ża pit f’għamla ta’ trab, mit ħun fin (parti ċelli ta’ daqs 
≤ 1 mm) u mnixxef bl-arja biss.  
(b) 20 % tafal tal-kawlina (pi ż fin-niexef) (kontenut ta’ kawlina preferib ­
bilment aktar minn 30 %).  
(c) 75-76 % ramel tal-quartz (pi ż fin-niexef) (g ħandu jippredomina ramel 
fin b’aktar minn 50 % tal-parti ċelli bejn 50 u 200 μm). 
(d) Jiżdied ilma dejonizzat biex jinkiseb kontenut ta’ rtuba tat-ta ħlita finali 
f’firxa ta’ 30-50 %.  
(e) Jiżdied karbonat tal-kal ċju ta’ kwalità kimikament pura (CaCO3) biex 
ikun aġġustat il-pH tat-ta ħlita finali tas-sediment g ħal 7,0 ± 0,5. 
Il-kontenut ta’ karbonju organiku tat-ta ħlita finali g ħandu jkun 2 % (± 
0,5 %) u g ħandu jkun a ġġustat b’ammonti xierqa ta’ pit u ramel, skont 
(a) u (c).  
14. Is-sors tal-pit, tafal tal-kawlina u ramel g ħandha tkun mag ħrufa. 
Il-komponenti tas-sediment g ħandhom ikunu e żaminati g ħan-nuqqas ta’ 
kontaminazzjoni kimika (e ż. metalli tqal, komposti tal-organokloru, 
komposti organofosforu żi, eċċ.). Eżempju g ħat-tħejjija tas-sediment 
formulat huwa deskritt fl-Appendi ċi 3. It-taħlit ta’ kostitwenti nixfin ikun 
ukoll aċċettabbli jekk jintwera li wara li jkun żdied l-ilma ta’ fuq ma sse ħħx 
separazzjoni tal-kostitwenti tas-sediment (e ż. biċċiet tal-pit fil-wi ċċ tal-ilma), 
u li l-pit jew is-sediment ikunu kkondizzjonati b’mod suffi ċjenti. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Ilma  
15. Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristi ċi kimiċi ta’ ilma dilwit b’mod 
aċċettabbli kif elenkat fl-Appendi ċijiet 2 u 4 ikun tajjeb b ħala ilma tat-test. 
Kull ilma tajjeb, ilma naturali (ilma tal-wi ċċ jew ta’ ta ħt l-art), ilma rikos ­
titwit (ara l-Appendi ċi 2) jew ilma tal-vit li jkun tne ħħielu l-kloru jkun 
aċċettabbli b ħala ilma ta’ kultura u ilma tat-test jekk kironomidi jibqg ħu 
jgħixu fih sakemm idumu l-kultura u t-testjar ming ħajr ma juru sinjal ta’ 
stress. Fil-bidu tat-test, il-pH tal-ilma tat-test g ħandu jkun bejn 6 u 9 u t-total 
ta’ melħ minerali fl-ilma ma jkunx og ħla minn 400 mg/l b ħala CaCO  3 . Iżda, 
jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-mel ħ minerali fl-ilma u 
s-sustanza g ħall-ittestjar, g ħandu jintu ża ilma b’anqas mel ħ minerali (u 
għalhekk, m’g ħandux jintu ża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni). 
Għandu jintu ża l-istess tip ta’ ilma tul l-istudju kollu. Il-karatteristi ċi 
tal-kwalità tal-ilma elenkati fl-Appendi ċi 4 għandhom jitkejlu mill-anqas 
darbtejn fis-sena jew meta jkun hemm suspett li dawn il-karatteristi ċi 
jkunu setg ħu nbidlu b’mod sinifikanti.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet - Sedimenti ffortifikati  
16. Sedimenti m ħalltin tal-kon ċentrazzjoni mag ħżula s-soltu jit ħejjew biż-żieda 
ta’ soluzzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar direttament mas-sediment. 
Soluzzjoni ta’ stokkijiet tas-sustanza g ħall-ittestjar ma ħlula f’ilma dejonizzat 
titħallat mas-sediment formulat b’mit ħan romblu, b’mikser tal-g ħalf jew billi 
titħallat bl-idejn. Jekk ftit tit ħallat fl-ilma, is-sustanza g ħall-ittestjar tista’ 
tinħall f’volum kemm jista’ jkun żgħir ta’ solvent organiku adatt (e ż. 
eżanu, aċeton jew kloroform). Din is-soluzzjoni mbag ħad titħallat ma’ 
10 g ta’ ramel fin tal-quartz g ħal reċipjent wie ħed tat-test. Is-solvent 
jitħalla jevapora u g ħandu jitne ħħa għal kollox mir-ramel; ir-ramel 
imbagħad jitħallat mal-ammont adatt ta’ sediment g ħal kull bekk tat-test. 
Jistgħu jintużaw biss a ġenti li jsiru volatili malajr biex i ħollu, ixerrdu jew 
jemulsifaw is-sustanza g ħall-ittestjar. Huwa mfakkar li g ħandu jitqies 
ir-ramel ipprovdut mis-sustanza g ħall-ittestjar u mit-ta ħlita tar-ramel meta 
jkun qed jit ħejja s-sediment (ji ġifieri s-sediment g ħandu, għalhekk, jit ħejja 
b’anqas ramel). G ħandha ting ħata attenzjoni biex ikun żgurat li s-sustanza 
għall-ittestjar mi żjuda mas-sediment titqassam sewwa u ma’ kullimkien 
fis-sediment. Jekk ikun me ħtieġ, jistgħu jkunu analizzati kampjuni 
sekondarji biex ikun iddeterminat il-grad ta’ omo ġeneità.  
DISINN TAT-TEST  
17. Id-disinn tat-test jirrelata mal-g ħażla tal-g ħadd u l-ispazjar 
tal-konċentrazzjonijiet tat-testijiet, mal-g ħadd ta’ re ċipjenti għal kull kon ċen­
trazzjoni u mal-g ħadd ta’ larvi g ħal kull re ċipjent. Huma deskritti disinji 
għal stima ta’ punti ta’ EC, g ħal stima ta’ NOEC u biex jitmexxa test ta’ 
limitu.  
Disinn għal analiżi b’rigressjoni  
18. Il-kon ċentrazzjoni ta’ effetti (e ż. EC  15 , EC  50 ) u l-firxa ta’ kon ċen­
trazzjonijiet, li g ħalihom l-effett tas-sustanza g ħall-ittestjar hija ta’ interess, 
għandhom jing ħaqdu bil-kon ċentrazzjonijiet inklu żi fit-test. Ġeneralment, 
l-akkuratezza u l-aktar il-validità, li bihom ikunu jistg ħu jsiru stimi ta’ 
konċentrazzjonijiet ta’ effetti (EC  x ), titjieb meta l-kon ċentrazzjoni ta’ 
effetti tkun fil-firxa ta’ kon ċentrazzjonijiet ittestjati. Estrapolazzjoni ħafna 
taħt il-konċentrazzjoni po żittiva l-aktar baxxa jew ‘il fuq mill-og ħla konċen­
trazzjoni g ħandha tkun evitata. Test preliminari biex jinstabu firxiet ikun utli 
biex tintg ħażel il-firxa ta’ kon ċentrazzjonijiet li jkollhom jintu żaw (ara 
l-paragrafu 27)).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Jekk g ħandu jkun stmat EC  x , għandhom ikunu ttestjati mill-anqas ħames 
konċentrazzjonijiet u tliet replikati g ħal kull kon ċentrazzjoni. Huwa rrak ­
komandat li jintu żaw konċentrazzjonijiet suffi ċjenti ta’ testijiet biex tit ħalla 
ssir stima tajba ta’ mudell. Il-fattur bejn kon ċentrazzjonijiet m’g ħandux ikun 
akbar minn tnejn (tista’ ssir e ċċezzjoni f’ka żijiet meta l-kurva ta’ rispons 
għad-doża jkollha anglu baxx). L-g ħadd ta’ replikati f’kull trattament jista’ 
jitnaqqas jekk l-g ħadd ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test b’risponsi differenti 
jiżdied. Iż-żieda fl-għadd ta’ replikati jew it-tnaqqis fit-tul tal-intervalli 
tal-konċentrazzjoni tat-test jittendu li jwasslu g ħal intervall idjaq ta’ 
kunfidenza g ħat-test. Ikunu me ħtieġa replikati addizzjonali jekk g ħandhom 
ikunu stmati s-sopravivenza u t-tkabbir tal-larvi g ħal 10-ijiem.  
Disinn għal stima ta’ NOEC/LOEC  
20. Jekk g ħandhom ikunu stmati LOEC jew NOEC, g ħandhom jintu żaw ħames 
konċentrazzjonijiet tat-test b’mill-anqas erba’ replikati u l-fattur bejn kon ċ­
entrazzjonijiet m’g ħandux ikun akbar minn tnejn. L-g ħadd ta’ replikati 
għandu jkun suffi ċjenti biex tkun żgurata qawwa adegwata ta’ statistika 
biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 
5 % (p = 0,05). Bir-rata ta’ żvilupp, Anali żi ta’ Varjanza (ANOVA) 
is-soltu tkun adatta, b ħat-test Dunnett u t-test Williams (17)(18)(19)(20). 
Fil-proporzjon ta’ evoluzzjoni jistg ħu jkunu u żati t-testijiet 
Cochran-Armitage, dak e żatt ta’ Fisher (bil-korrezzjoni ta’ Bonferroni), 
jew ta’ Mantel-Haenszel.  
Test ta’ limitu  
21. Ikun jista’ jsir test ta’ limitu (kon ċentrazzjoni ta’ test wie ħed u kontroll) jekk 
ma jkun osservat ebda effett fit-test preliminari ta’ detezzjoni ta’ firxa. 
L-għan tat-test ta’ limitu huwa li jitwettaq test f’kon ċentrazzjoni g ħolja 
biżżejjed biex dawk li jie ħdu deċiżjonijiet ikunu jistg ħu jeskludu effetti 
tossiċi li jista’ jkun hemm tas-sustanza g ħall-ittestjar, u l-limitu jkun 
stabbilit f’kon ċentrazzjoni li ma tkunx mistennija li tidher f’kull sitwazzjoni. 
Huwa rrakkomandat 1 000 mg/kg (pi ż fin-niexef). Is-soltu jkunu me ħtieġa 
mill-anqas sitt replikati kemm g ħat-trattament kif ukoll g ħall-kontroll. 
Għandha tintwera qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza 
ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). B’rispons 
metriku (rata ta’ żvilupp u pi ż), it-t-test huwa metodu ta’ statistika adatt jekk 
dejta tissodisfa l- ħtiġijiet ta’ dan it-test (normalità, varjanzi omo ġenji). Jista’ 
jintuża t-t-test ta’ varjanza inugwali jew test mhux parametriku, b ħat-test 
Wilcoxon-Mann-Whithey, jekk dawn il- ħtiġijiet ma jkunux sodisfatti. 
Bil-proporzjon ta’ evoluzzjoni, it-test e żatt ta’ Fisher ikun adatt.  
PROĊEDURA  
Kondizzjonijiet ta’ espo żizzjoni  
Tħejjija ta’ sistema ta’ sediment u ilma ffortifikati  
22. Hija rrakkomandata l-pro ċedura ta’ fortifikazzjoni deskritta fil-Metodu ta’ 
Ttestjar C.8: Tossi ċità għal Ħniex għal applikazzjoni tas-sustanza g ħall- 
ittestjar (14). Is-sedimenti ffortifikati jitqieg ħdu fir-reċipjenti u ji żdied ilma 
ta’ fuq biex jin ġieb proporzjon ta’ volum ta’ sediment-ilma ta’ 1:4 (ara 
l-paragrafi 11 u 15). Il-fond tas-saff tas-sediment g ħandu jkun fil-firxa ta’ 
1,5 - 3 cm.Biex ikunu evitati separazzjoni ta’ ingredjenti tas-sediment u 
sospensjoni mill- ġdid ta’ materjal fin matul i ż-żieda ta’ ilma tat-test 
fil-kolonna tal-ilma, is-sediment jista’ jitg ħatta b’diska tal-plastik waqt li 
jkun qed jitferra’ ilma fiha, u d-diska titne ħħa minnufih wara. Apparati 
oħra jistgħu wkoll ikunu adatti.  
23. Ir-re ċipjenti tat-test g ħandhom ikunu mg ħottijin (eż. bi platti tal- ħġieġ). Jekk 
ikun meħtieġ, matul l-istudju l-ilma jimtela sal-livell tal-volum ori ġinali biex 
dan jagħmel tajjeb g ħall-evaporazzjoni tal-ilma. Dan g ħandu jsir billi jintu ża 
ilma distillat jew dejonizzat biex ma jit ħalliex jiżdied melħ. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizzazzjoni  
24. Malli jkun t ħejja s-sediment iffortifikat bl-ilma ta’ fuq, tkun ħaġa mixtieqa li 
titħalla ssir partizzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar mill-fa żi milwiema g ħas- 
sediment (3)(4)(6)(13). Preferibbilment dan g ħandu jsir skont 
il-kondizzjonijiet ta’ temperatura u tirwi ħ użati fit-test. Żmien xieraq ta’ 
ekwilibrazzjoni huwa spe ċifiku għas-sediment u g ħall-kimika, u jista’ 
jieħu minn sig ħat sa jiem u f’ka żijiet rari sa diversi ġimgħat (4-5 
ġimgħat). Minħabba li dan i ħalli żmien għal degradazzjoni ta’ ħafna 
kimiċi, ma jkunx mistenni ekwilibriju i żda huwa rrakkomandat perjodu ta’ 
ekwilibrazzjoni ta’ 48 sieg ħa. Fit-tmiem ta’ dan il-perjodu ulterjuri ta’ 
ekwilibrazzjoni, il-kon ċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar g ħandha 
titkejjel fl-ilma ta’ fuq, fl-ilma tal-pori u fis-sediment, mill-anqas fl-og ħla 
konċentrazzjoni u f’wa ħda aktar baxxa (ara l-paragrafu 38). Dawn 
id-determinazzjonijiet analiti ċi tas-sustanza g ħall-ittestjar jippermettu ssir 
kalkulazzjoni tal-bilan ċ tal-massa u espressjoni ta’ ri żultati abba żi ta’ konċ­
entrazzjonijiet imkejla.  
Żieda ta’ organi żmi tat-test  
25. Minn erba’ sa ħamest ijiem qabel ma l-organi żmi tat-test ji żdiedu 
fir-reċipjenti tat-test, g ħandhom jittie ħdu kwantitajiet ta’ bajd mill-kulturi u 
jitqiegħdu f’reċipjenti żgħar f’midjum ta’ kulturi. Jista’ jintu ża midjum 
qadim mill-kultura ta’ stokkijiet jew midjum li jkun g ħadu kif tħejja. Jekk 
jintuża dan tal-a ħħar, ammont żgħir ta’ ikel e ż. alka ħadra u/jew ftit qatriet 
żgħar ta’ filtrat minn sospensjoni mit ħuna fin ta’ trofof ta’ ikel tal- ħut 
għandu jiżdied mal-midjum tal-kultura (ara l-Appendi ċi 2). Għandhom 
jintużaw biss kwantijiet ta’ bajd mi ġbur frisk. Normalment, il-larvi jibdew 
ifaqqsu ftit jiem wara li jkun hemm il-bajd (2 sa 3 ijiem g ħal Chironomus 
riparius  f’20 °C u 1 sa 4 ijiem g ħal Chironomus tentans  fi 23 °C u  
Chironomus yoshimatui  fi 25 °C) u jkun hemm tkabbir ta’ larvi f’erba’ 
fażijiet, kull fa żi ddum 4-8 ijiem. Fit-test g ħandhom jintu żaw larvi 
tal-ewwel fa żi (2-3 jew 1-4 ijiem wara li jkunu faqqsu). Il-fa żi ta’ 
pappamoski tista’ possibbilment tkun ivverifikata billi jintu ża l-wisa’ 
tal-iskutella tar-ras (6).  
26. Għoxrin larvi tal-ewwel fa żi jkunu allokati kif jinzertaw lil kull re ċipjent 
tat-test li jkun fih is-sediment im ħallat u l-ilma, billi tintu ża pipetta ming ħajr 
ponta. It-tirwi ħ tal-ilma g ħandu jieqaf waqt li l-larvi jkunu qed ji żdiedu 
fir-reċipjenti tat-test u jibqa’ hekk g ħal 24 sieg ħa oħra wara li jkunu 
żdiedu l-larvi (ara l-paragrafi 25 u 32). Skont it-tifsila tat-test u żat (ara 
l-paragrafi 19 u 20), l-g ħadd ta’ larvi u żati għal kull kon ċentrazzjoni jkun 
mill-anqas 60 g ħall-istima ta’ punti ta’ EC u 80 g ħal determinazzjoni ta’ 
NOEC.  
Konċentrazzjonijiet tat-test  
27. Test ta’ detezzjoni ta’ firxa jista’ jkun utli biex tkun iddeterminata l-firxa ta’ 
konċentrazzjonijiet g ħat-test definittiv. G ħal dan il-g ħan tintuża serje ta’ 
konċentrazzjonijiet spazjati fil-wisa’ tas-sustanza g ħall-ittestjar. Biex tkun 
ipprovduta l-istess densità tal-wi ċċ għal kull kironomidu, li jkollu jintu ża 
għat-test definittiv, kironomidi jkunu esposti g ħal kull kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar g ħal perjodu li jippermetti stima ta’ kon ċen­
trazzjonijiet adatti ta’ testijiet, u ma jkunx hemm ħtieġa ta’ replikati.  
28. Il-kon ċentrazzjonijiet tat-test g ħat-test definittiv ikunu de ċiżi abbażi 
tar-riżultat tat-test ta’ detezzjoni ta’ firxa. Mill-anqas g ħandhom jintu żaw 
u jintgħażlu ħames kon ċentrazzjonijiet kif deskritt fil-paragrafi 18 sa 20.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontrolli  
29. Reċipjenti ta’ kontroll ming ħajr sustanza g ħall-ittestjar i żda li jkunu jinkludu 
sediment g ħandhom ikunu inklu żi fit-test bl-g ħadd xieraq ta’ replikati (ara 
l-paragrafi 19-20). Jekk ikun intu ża solvent g ħal applikazzjoni ta’ sustanza 
għall-ittestjar (ara l-paragrafu 16), g ħandu jiżdied kontroll ta’ solvent ta’ 
sediment.  
Sistema ta’ ttestjar  
30. Jintu żaw sistemi stati ċi. Sistemi semistati ċi jew ta’ fluss kontinwu bl-ilma 
ta’ fuq ji ġġedded kull tant jew kontinwament jistg ħu jintużaw f’każijiet 
eċċezzjonali b ħal pereżempju jekk spe ċifikazzjonijiet tal-kwalità tal-ilma 
jisfaw ma jkunux adatti g ħall-organi żmu tat-test jew jaffettwaw 
l-ekwilibriju kimiku (e ż. livelli ta’ ossi ġnu maħlul jinżlu baxxi ħafna, 
il-konċentrazzjoni ta’ prodotti ta’ ekskreta tog ħla żżejjed jew minerali 
jlissu minn sediment u jaffettwaw il-pH u/jew il-mel ħ minerali fl-ilma). 
Iżda metodi o ħra biex titjieb il-kwalità tal-ilma ta’ fuq, b ħal tirwiħ, 
għandhom normalment ikunu bi żżejjed u jkunu ppreferuti.  
Ikel 
31. Ikun me ħtieġ li l-larvi jintemg ħu, preferibbilment kuljum jew mill-anqas tliet 
darbiet fil- ġimgħa. L-ikel tal- ħut (sospensjoni fl-ilma jew ikel mit ħun fin, eż. 
TetraMin jew TetraPhyll; ara d-dettalji fl-Appendi ċi 2) fl-ammont ta’ 0,25- 
0,5 mg (0,35-0,5 mg g ħal C. yoshimatui ) għal kull larva kuljum jidher li 
jkun adegwat g ħal larvi żgħar għall-ewwel 10 ijiem. Jista’ jkun me ħtieġ ftit 
aktar ikel g ħal larvi li jkollhom aktar żmien: 0,5 - 1 mg g ħal kull larva 
kuljum għandu jkun suffi ċjenti għall-bqija tat-test. Ir-razzjon tal-ikel g ħandu 
jitnaqqas fit-trattamenti kollha u l-kontrolli jekk ikun hemm tkabbir fungali 
jew jekk fil-kontrolli jkunu osservati mwiet. Jekk ma jkunx jista’ jitwaqqaf żvilupp fungali t-test g ħandu jittenna. Meta jkunu qed ji ġu ttestjati sustanzi 
li jassorbixxu ħafna (eż. b’log K
 ow > 5), jew sustanzi mag ħqudin b’mod 
kovalenti mas-sediment, l-ammont ta’ ikel me ħtieġ biex ikunu żgurati 
sopravivenza u tkabbir naturali tal-organi żmi jista’ ji żdied mas-sediment 
formulat qabel il-perjodu ta’ stabbilizzazzjoni. G ħal dan, g ħandu jintu ża 
materjal tal-pjanti minflok ikel tal- ħut, eż. tista’ tintu ża żieda ta’ 0,5 % 
(piż fin-niexef) ta’ weraq mit ħunn fin ta’ e ż. ħorrieqa tnigges ( Urtica 
dioica ), ċawsla ( Morus alba ), silla bajda ( Trifolium repens ), spinaċi 
(Spinacia oleracea ) jew ta’ materjal ie ħor tal-pjanti ( Cerophyl  jew 
ċelluloża alfa).  
Kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni  
32. Tirwi ħ bil-mod tal-ilma ta’ fuq f’re ċipjenti tat-test ikun ipprovdut preferib ­
bilment 24 sig ħat wara li ji żdiedu l-larvi u jitkompla matul it-test kollu 
(għandha ting ħata attenzjoni biex il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu maħlul ma 
tinżilx taħt 60 % ta’ ASV). Tirwi ħ ikun ipprovdut permezz ta’ pipetta 
Pasteur tal- ħġieġ imwaħħla 2-3 cm ‘il fuq mis-saff tas-sediment (ji ġifieri 
bużżieqa waħda jew ftit tal-ilma/sec). Meta jkunu qed ji ġu ttestjati kimi ċi 
volatili, jista’ jitqies li s-sistema tas-sediment-ilma ma titrewwa ħx. 
33. It-test jitmexxa f’temperatura kostanti ta’ 20 °C (± 2 °C). G ħal C. tentans  u 
C. yoshimatui  t-temperaturi rakkomandati jkunu ta’ 23 °C u 25 °C (± 2 °C), 
rispettivament. Jintu ża fotoperjodu ta’ 16-il sieg ħa u l-intensità tad-dawl 
għandha tkun 500 sa 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Durata tal-espo żizzjoni  
34. L-espo żizzjoni tibda bi ż-żieda ta’ larvi fir-re ċipjenti ffortifikati u ta’ kontroll. 
Id-durata massima tal-espo żizzjoni tkun ta’ 28 jum g ħal C. riparius u C. 
yoshimatsui, u 65 jum g ħal C. tentans . Jekk pappamoski jevolvu qabel, 
it-test jista’ jitwaqqaf wara minimu ta’ ħamest ijiem wara li jkun evolva 
l-ewwel adult fil-kontroll.  
Osservazzjonijiet  
Emerġenza 
35. Ikunu ddeterminati ż-żmien ta’ żvilupp u l-g ħadd totali ta’ pappamoski r ġiel 
u nisa evoluti g ħal kollox. L-ir ġiel ikunu identifikati fa ċilment mill-antenni 
tagħhom kollha pjumi.  
36. Ir-re ċipjenti tat-test g ħandhom ikunu osservati mill-anqas tliet darbiet 
fil-ġimgħa biex issir valutazzjoni vi żiva ta’ kull m ġiba mhux normali (e ż. 
tluq mis-sediment, g ħawm mhux tas-soltu), mqabbla mal-kontroll. Matul 
il-perjodu ta’ evoluzzjoni mistennija jkun me ħtieġ li jsir għadd kuljum ta’ 
pappamoski li jkunu evolvew g ħalkollox. Is-sess u l-g ħadd ta’ pappamoski 
evoluti g ħalkollox ikunu rre ġistrati kuljum. Wara identifikazzjoni 
l-pappamoski jitne ħħew mir-re ċipjenti. Kull kwantità ta’ bajd iddepo żitata 
qabel ma jintemm it-test g ħandha tkun irre ġistrata u mbag ħad titneħħa biex 
larvi ma jit ħallewx jer ġgħu jidħlu fis-sediment. Ikun irre ġistrat ukoll l-g ħadd 
ta’ pupae vi żibbli li jkunu naqsu li jevolvu. Gwida dwar kejl ta’ evoluzzjoni 
hija pprovduta fl-Appendi ċi 5. 
Tkabbir u sopravivenza  
37. Jekk g ħandha tkun ipprovduta dejta dwar sopravivenza u tkabbir ta’ larvi 
għal 10 ijiem, g ħandhom ikunu inklu żi reċipjenti addizzjonali tat-test 
mill-bidu, biex ikunu jistg ħu jintużaw wara. Is-sediment minn dawn 
ir-reċipjenti addizzjonali jintg ħarbel billi jintu ża għarbiel ta’ 250 μm biex 
iżomm il-larvi. Kriterji g ħal mewt huma immobbiltà jew nuqqas ta’ 
reazzjoni g ħal stimulu mekkaniku. Larvi li ma jkunux irkuprati g ħandhom 
jingħaddu wkoll b ħala mejtin (larvi li jkunu mietu fil-bidu tat-test setg ħu 
kienu ġew iddegradati minn mikrobi). Ikunu ddeterminat il-pi ż fin-niexef 
(mingħajr irmied) tal-larvi li jkunu baqg ħu ħajjin għal kull re ċipjent tat-test 
u l-medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull larva g ħal kull reċipjent. Ikun utli li jkun 
iddeterminat ta’ liema fa żi jkunu l-larvi li jkunu baqg ħu ħajjin; għal dak 
jista’ jintu ża l-kejl tal-wisa’ tal-iskutella tar-ras ta’ kull larva.  
Kejlijiet analiti ċi 
Konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar  
38. Qabel ma jibda t-test (ji ġifieri żieda ta’ larvi), jittie ħdu kampjuni 
tas-sediment kollu minn mill-anqas re ċipjent wie ħed għal kull trattament 
għad-determinazzjoni analitika tal-kon ċentrazzjoni tas-sustanza g ħall- 
ittestjar fis-sediment. Huwa rrakkomandat li, b ħala minimu, kampjuni 
tal-ilma ta’ fuq, tal-ilma tal-pori u tas-sediment ikunu analizzati fil-bidu (ara l-paragrafu 24) u fit-tmiem tat-test, fl-og ħla konċentrazzjoni u 
f’waħda aktar baxxa. Dawn id-determinazzjonijiet ta’ kon ċentrazzjoni ta’ 
sustanza g ħall-ittestjar jag ħtu tagħrif dwar l-im ġiba/il-partizzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar fis-sistema ilma u sediment.
 
39. Meta jittie ħdu kejlijiet intermedji (e ż. fis-7 jum) u jekk l-anali żi jkun 
jeħtiġilha kampjuni kbar li ma jkunux jistg ħu jittieħdu minn re ċipjenti 
tat-test ming ħajr ma tkun influwenzata s-sistema ta’ ttestjar, g ħandhom 
isiru determinazzjonijiet analiti ċi fuq kampjuni minn re ċipjenti addizzjonali 
tat-test ittrattati bl-istess mod (inklu ża l-preżenza ta’ organi żmi tat-test) i żda 
mhux użati għal osservazzjonijiet bijolo ġiċi. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Ċentrifugazzjoni pere żempju ta’ 10 000 g u 4 °C g ħal 30 min. hija 
l-proċedura rrakkomandata biex ikun i żolat ilma interstizjali. I żda jekk 
is-sustanza g ħall-ittestjar tkun turi li filtri ma jassorbuhiex, tista’ wkoll 
tkun aċċettabbli l-filtrazzjoni. F’xi ka żijiet jista’ ma jkunx possibbli li 
jkunu analizzati kon ċentrazzjonijiet fl-ilma tal-pori min ħabba li d-daqs 
tal-kampjun ikun żgħir wisq.  
Parametri fi żikokimiċi 
41. Il-pH u t-temperatura tat-re ċipjenti tat-test g ħandhom jitkejlu b’mod adatt 
(ara l-paragrafu 10). Mel ħ minerali fl-ilma u ammonja g ħandhom jitkejlu 
fil-kontrolli u f’re ċipjent wie ħed tat-test fl-og ħla konċentrazzjoni fil-bidu u 
fit-tmiem tat-test.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
42. L-għan ta’ dan it-test huwa biex ikun iddeterminat l-effett tas-sustanza g ħall- 
ittestjar fuq ir-rata ta’ żvilupp u fuq l-g ħadd totali ta’ pappamoski r ġiel u 
nisa evoluti g ħalkollox, jew fil-ka ż tal-effetti tat-test ta’ 10 ijiem fuq 
is-sopravivenza u l-pi ż tal-larvi. Jekk ma jkunx hemm indikazzjonijiet ta’ 
sensivitajiet differenti statistikament ta’ sessi, ri żultati dwar ir ġiel u nisa 
jkunu jistg ħu jinġabru għal analiżi ta’ statistika. Id-differenzi ta’ sensittività 
bejn is-sessi jistg ħu jkunu ġġudikati statistikament pere żempju b’test ta’ 
tabella χ 2 -r x 2. Sopravivenza tal-larvi u l-medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull 
larva għal kull re ċipjent għandha tkun ikkalkulata wara 10 jiem meta jkun 
meħtieġ. 
43. Konċentrazzjonijiet ta’ effetti espressi u bba żati fuq pi ż fin-niexef huma 
kkalkulati preferibbilment abba żi ta’ kon ċentrazzjonijiet ta’ sediment 
imkejla fil-bidu tat-test (ara l-pargrafu 38).  
44. Biex tkun ikkomputata stima ta’ punti g ħall-EC  50 jew għal kull EC  x oħra, 
tista’ tintu ża statistika g ħal kull re ċipjent bħala replika vera. Biex ikun 
ikkalkulat intervall ta’ kunfidenza g ħal kull EC  x għandha titqies 
il-varjabbiltà fost re ċipjenti, jew g ħandu jintwera li din il-varjabbiltà tant 
tkun żgħira li tista’ ma titqisx. Meta l-mudell jitqieg ħed minn Least 
Squares, g ħandha tkun applikata trasformazzjoni g ħall-istatistika g ħal kull 
reċipjent biex titjieb l-omo ġeneità ta’ varjanza. I żda, valuri EC  x għandhom 
ikunu kkalkulati wara li r-rispons ikun ġie ttrasformat u ttie ħed lura g ħall- 
valur oriġinali.  
45. Meta l-anali żi ta’ statistika jkollha l-g ħan li tiddetermina NOEC/LOEC b’it ­
testjar ta’ ipote żi, il-varjabbiltà fost re ċipjenti je ħtiġilha titqies, e ż. 
b’ANOVA f’aktar stadji. Alternattivament, aktar testijiet robusti (21) jistgħu jkunu adatti f’sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ksur 
tas-suppo żizzjonijiet tas-soltu ta’ ANOVA.
 
Proporzjon ta’ evoluzzjoni  
46. Proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni huma dejta alternattiva mhux kontinwa, u 
jistgħu jkunu analizzati bit-test ta’ Cochran-Armitage applikat b’mod 
devoluttiv fejn tkun mistennija do ża-rispons monotonika u din id-dejta 
tkun konsistenti ma’ din l-istennija. Jekk le, jistg ħu jintużaw test e żatt ta’ 
Fisher jew dak ta’ Mantel-Haenszel b’valuri ‘p’ ta’ Bonferroni-Holm aġġustati. Jekk ikun hemm evidenza ta’ varjabbiltà akbar bejn replikati 
fl-istess kon ċentrazzjoni milli distribuzzjoni binomja tkun tindika (sikwit 
irriferuta b ħala varjazzjoni “extrabinomja”), mbag ħad għandhom jintu żaw 
test robust ta’ Cochran-Armitage jew dak e żatt ta’ Fisher kif propost fi (21).
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
L-għadd ta’ pappamoski evoluti g ħal kull re ċipjent, ne, ikun iddeterminat u 
diviż bl-għadd ta’ larvi introdotti, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
fejn: 
ER = proporzjon ta’ evoluzzjoni  
n e = għadd ta’ pappamoski evoluti g ħal kull re ċipjent  
n a = għadd ta’ larvi introdotti g ħal kull re ċipjent  
47. Alternattiva li hija l-aktar adatta g ħal daqsijiet kbar ta’ kampjuni, meta jkun 
hemm varjanza extrabinomja, hija li l-proporzjon ta’ evoluzzjoni jkun 
ittrattat b ħala rispons kontinwu u li jintu żaw proċeduri bħat-test Williams 
meta tkun mistennija do ża-rispons monotonika u tkun konsistenti ma’ din 
id-dejta ta’ ER. It-test Dunnett ikun adatt fejn il-monotoni ċità ma tapplikax. 
Daqs kbir ta’ kampjun huwa ddefinit hawn b ħala l-għadd evolut, u l-g ħadd 
mhux evolut ukoll ikun aktar minn ħamsa, abba żi ta’ kull replika (re ċipjent).  
48. Biex ikunu applikati metodi ta’ ANOVA, valuri ta’ ER g ħandhom l-ewwel 
ikunu ttrasformati bit-trasformazzjoni arcsin-sqrt jew bit-trasformazzjoni 
Freeman-Tukey biex tinkiseb distribuzzjoni normali approssimata u biex 
varjanzi jsiru ugwali. Jistg ħu jkunu applikati t-testijiet Cochran-Armitage, 
dak eżatt ta’ Fisher (Bonferroni), jew it-test ta’ Mantel-Haenszel meta 
jintużaw il-frekwenzi assoluti. It-trasformazzjoni arcsin-sqrt tkun applikata 
billi jittie ħed l-inverse sine (sin  -1 ) tal-għerq kwadrat ta’ ER.  
49. Għal proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni, valuri EC  x ikunu kkalkulati billi tintu ża 
analiżi ta’ rigressjoni (jew e ż. probit (22), logit, Weibull, softwer 
kummerċjali adatt, e ċċ.). Jekk anali żi ta’ rigressjoni tfalli (e ż. meta jkun 
hemm anqas minn żewġ risponsi parzjali), jintu żaw metodi mhux para ­
metriċi oħra bħal medja mobbli jew interpolazzjoni sempli ċi. 
Rata ta’ żvilupp  
50. Il-ħin medju ta’ żvilupp jirrappre żenta t-tul medju ta’ żmien bejn id-d ħul ta’ 
larvi (jum 0 tat-test) u l-evoluzzjoni tal-koorti sperimentali ta’ pappamoski. 
(Għall-kalkulazzjoni ta ż-żmien reali ta’ żvilupp, g ħandha titqies l-età 
tal-larvi fil-waqt tad-d ħul). Ir-rata ta’ żvilupp hija r-re ċiproka ta ż-żmien 
tal-iżvilupp (unità: 1/jum) u tirrappre żenta dik il-parti tal-i żvilupp tal-larva 
li sseħħ kuljum. Ir-rata ta’ żvilupp hija ppreferuta g ħall-evalwazzjoni ta’ 
dawn l-istudji dwar tossi ċità ta’ sediment min ħabba li l-varjanza tag ħha 
hija aktar baxxa, u hija aktar omo ġenja u eqreb distribuzzjoni normali kif 
imqabbla ma’ żmien ta’ żvilupp. G ħalhekk, jistg ħu jintużaw proċeduri ta’ 
test parametriku qawwija ma’ rata ta’ żvilupp milli ma’ żmien ta’ żvilupp. 
Għal rata ta’ żvilupp bħala reazzjoni kontinwa, jistg ħu jkunu stmati valuri 
EC x billi tintu ża analiżi ta’ rigressjoni (e ż. (23), (24)).  
51. Għat-testijiet ta’ statistika li ġejjin, l-għadd ta’ pappamoski osservati f’jum 
ta’ spezzjoni x ikunu pre żunti li jkunu evolvew fil-medja tal-intervall ta’ 
żmien bejn jum x u jum x-l (l = tul tal-intervall ta’ spezzjoni, is-soltu jum 
1). Ir-rata medja ta’ żvilupp għal kull re ċipjent ( x) tkun ikkalkulata skont:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
fejn: 
x: rata medja ta’ żvilupp għal kull re ċipjent  
i: indiċi ta’ intervall ta’ spezzjoni  
m: għadd massimu ta’ intervalli ta’ spezzjoni  
ƒ i : għadd ta’ pappamoski evoluti fl-intervall ta’ spezzjoni i  
n e : għadd totali ta’ pappamoski evoluti fit-tmiem tal-esperiment (=  P ƒ i ) 
x i : rata ta’ żvilupp tal-pappamoski evoluti f’intervall i  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
fejn: 
day  i : jum ta’ spezzjoni (jiem min ħabba applikazzjoni)  
l i : tul ta’ intervall ta’ spezzjoni i (jiem, is-soltu jum wie ħed) 
Rapport tat-test  
52. Ir-rapport tat-test g ħandu mill-anqas jipprovdi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanza g ħall-ittestjar:  
— natura fi żika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi (solubilità 
tal-ilma, pressjoni tal-fwar, koeffi ċjent tal-partizzjoni fil- ħamrija (jew 
fis-sediment jekk ikunu disponibbli), stabbiltà fl-ilma, e ċċ.); 
— dejta ta’ identifikazzjoni ta’ kimi ċi (isem komuni, isem tal-kimika, 
formula strutturali, Numru tal-CAS, e ċċ.) inklużi l-purezza u l-metodu 
għall-kwantifikazzjoni ta’ sustanza g ħall-ittestjar.  
Speċi tat-test:  
— annimali u żati għat-test: spe ċi, isem xjentifiku, sors ta’ organi żmi u 
kondizzjonijiet g ħat-trobbija;  
— informazzjoni dwar mani ġġar ta’ kwantitajiet ta’ bajd u larvi;  
— l-età tal-annimali tat-test meta jkunu dda ħħlu fir-reċipjenti tat-test.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— sediment u żat, jiġifieri sediment naturali jew formulat;  
— għal sediment naturali, post u deskrizzjoni ta’ sit ta’ te ħid ta’ kampjuni 
ta’ sediment, inklu ża, jekk ikun possibbli, storja ta’ kontaminazzjoni; 
karatteristi ċi: pH, kontenut ta’ karbonju organiku, proporzjon ta’ C/N 
u granulumetrija (skont kif jixraq).  
— tħejjija tas-sediment formulat: ingredjenti u karatteristi ċi (kontenut ta’ 
karbonju organiku, pH, rtubija, e ċċ. fil-bidu tat-test);  
— tħejjija tal-ilma tat-test (jekk jintu ża ilma rikostitwit) u karatteristi ċi 
(konċentrazzjoni tal-ossi ġnu, pH, konduttività, mel ħ minerali fl-ilma, 
eċċ. fil-bidu tat-test);  
— fond tas-sediment u ilma ta’ fuq;  
— volum tal-ilma ta’ fuq u tal-pori; pi ż ta’ sediment imxarrab bi jew 
mingħajr ilma tal-pori;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— reċipjenti tat-test (materjal u daqs);  
— metodu ta’ fortifikazzjoni ta’ sediment: kon ċentrazzjonijiet ta’ testijiet 
użati, għadd ta’ replikati u u żu ta’ solvent jekk ikun hemm;  
— fażi ta’ ekwilibriju ta’ stabbilizzazzjoni tas-sistema ta’ sediment-ilma 
fortifikata: durata u kondizzjonijiet;  
— kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni: temperatura, ċiklu ta’ dawl u intensità, 
tirwiħ (frekwenza u intensità);  
— informazzjoni dettaljata dwar g ħalf inkluż tip ta’ ikel, t ħejjija, ammont u 
reġim ta’ għalf. 
Riżultati:  
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-kon ċentrazzjonijiet imkejla 
tat-testijiet u r-ri żultati tal-analizi kollha biex tkun iddeterminata 
l-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar fir-re ċipjent tat-test;  
— il-kwalità tal-ilma fir-re ċipjenti tat-test, ji ġifieri pH, temperatura, ossi ġnu 
maħlul, melħ minerali fl-ilma u ammonja;  
— bdil ta’ ilma evaporat tat-test, jekk ikun hemm;  
— għadd ta’ pappamoski evoluti r ġiel u nisa g ħal kull reċipjent u g ħal kull 
jum; 
— għadd ta’ larvi li jkunu naqsu li jevolvu b ħala pappamoski g ħal kull 
reċipjent;  
— medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull larva g ħal kull reċipjent, u g ħal kull fażi, 
skont il-ka ż; 
— perċentwali ta’ evoluzzjoni g ħal kull replika u kon ċentrazzjoni tat-test 
(pappamoski r ġiel u nisa mi ġburin flimkien);  
— rata medja ta’ żvilupp ta’ pappamoski żviluppati g ħalkollox g ħal kull 
replika u rata ta’ trattament (pappamoski r ġiel u nisa mi ġburin flimkien);  
— stimi ta’ punti ta’ tmiem tossi ċi eż. ECx (u intervalli asso ċjati ta’ kunfi ­
denza), NOEC u/jew LOEC, u l-metodi ta’ statistika u żati għad-deter­
minazzjoni tag ħhom;  
— diskussjoni tar-ri żultati, inklu ża kull influwenza fuq il-konklu żjonijiet 
tar-riżultati tat-testijiet minn devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar.  
LETTERATURA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Devel ­
opment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke u H.Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invert ­
ebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Kanada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invert ­
ebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ u Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Kanada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insec ­
ticides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
 
(13) Environment Kanada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a 
Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
(14) Test Method C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms.  
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a żero dose control. Biometrics, 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a żero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling 
continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Għall-fini ta’dan il-Metodu ta’ Ttestjar jintu żaw id-definizzjonijiet li ġejjin:  
Sediment ifformulat  jew sediment rikostitwit, artifi ċjali jew sintetiku, huwa 
taħlita ta’ materjali li jintu żaw biex jimitaw l-komponenti fi żiċi ta’ sediment 
naturali.  
Ilma ta’ fuq  huwa l-ilma li jitqieg ħed fuq sediment fir-re ċipjent tat-test.  
Ilma interstizjali  jew ilma tal-pori huwa l-ilma li jokkupa l-ispazju bejn 
sediment u parti ċelli tal-ħamrija.  
Sediment fortifikat  huwa sediment li mieg ħu tkun żdiedet sustanza g ħall- 
ittestjar.  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Appendiċi 2 
Rakkomandazzjonijiet g ħal kultura ta’  Chironomus riparius  
1. Larvi ta’  Chironomus  jistgħu jitkabbru f’dixxijiet ta’ kristallizzazzjoni jew 
f’kontenituri akbar. Ramel fin tal-quartz jitferrex f’saff irqiq ta’ madwar 5 as 10 mm fond fuq il-qieg ħ tal-kontenitur. Kieselguhr (e ż. Merck, Art 
8117) ukoll intwera li huwa substrat adatt (saff irqaq ta’ sa ftit ħafna 
mm ikun bi żżejjed). Wara ji żdied ilma adattat g ħal fond ta’ diversi cm. 
Il-livelli tal-ilma g ħandhom jimtlew kull meta huwa me ħtieġ biex jieħdu 
post it-telf li jirri żulta mill-evaporazzjoni, u jkun ta’ repevenzjoni kontra 
d-dessekazzjoni. L-ilma jista’ jinbidel jekk ikun me ħtieġ. Għandu jkun 
ipprovdut tirwi ħ bil-mod. Ir-re ċipjenti g ħat-tkabbir tal-larvi g ħandhom 
jinżammu f’ga ġġa apposta li ma t ħallix li l-adulti li jkunu qed jevolvu 
jaħarbu. Il-ga ġġa għandha tkun kbira bi żżejjed biex adulti evoluti ma jit ħ­
allewx jimir ħu fi qtajja kbar, g ħax inkella tista’ ma ssirx kopulazzjoni (il- 
minimu huwa ta’ madwar 30 x 30 x 30 cm).
 
2. Gaġeġ għandhom jin żammu f’temperatura ambjentali jew f’kamra ambjent ­
alment kostanti ta’ 20 + 2 °C b’perjodu fotografiku ta’ 16-il sieg ħa dawl 
(intensità madwar 1 000 lux), 8 sig ħat dlam. Kien irrapportat li umdità 
tal-arja ta’ anqas minn 60 % RH tista’ tfixkel ir-riproduzzjoni.  
Ilma ta’ dilwizzjoni  
3. Jista’ jintu ża kull ilma tajjeb naturali jew sintetiku. Komunement jintu żaw 
ilma tal-bir, ilma tal-vit li jkun tne ħħielu l-kloru u midja artifi ċjali (eż. 
il-midjum Elendt “M4” jew “M7”, ara hawn ta ħt). L-ilma g ħandu 
jitrewwaħ qabel ma jintu ża. Jekk ikun me ħtieġ, l-ilma tal-kultura jista’ 
jiġġedded billi l-ilma u żat jitferra’ jew jg ħaddi minn ġo sifun minn 
reċipjenti ta’ kultura b’attenzjoni ming ħajr ma jinqerdu t-tubi tal-larvi.  
Tmigħ tal-larvi  
4. Larvi ta’  Chironomus  għandhom jintemg ħu ikel ta’ trofof tal- ħut (Tet­
raMin  ® , TetraPhyll  ® jew marka simili o ħra ta’ ikel tal- ħut proprjetarju), 
f’bejn wie ħed u ieħor 250 mg g ħal kull re ċipjent kuljum. Dan jista’ 
jingħata bħala trab mit ħun niexef jew b ħala sospensjoni fl-ilma: 1,0 g ta’ 
ikel ta’ trofof ji żdied ma’ 20 ml ta’ ilma ta’ dilwizzjoni u jit ħallat biex 
jagħti taħlita omoġenja. Din it-t ħejjija tista’ tintema’ f’rata ta’ madwar 5 ml 
għal kull reċipjent kuljum (ixxejkja qabel ma tu ża). Larvi li jkollhom aktar 
żmien jistg ħu jirċievu aktar.  
5. It-tmig ħ jista’ jiġi aġġustat skont il-kwalità tal-ilma. Jekk il-midjum ta’ 
kultura ‘jissa ħħab’, it-tmig ħ għandu jitnaqqas. Żidiet ta’ ikel g ħandhom 
ikunu mmonitorjati b’attenzjoni. Ikel mill-anqas jikkaw ża tluq tal-larvi 
lejn il-kolonna tal-ilma, u ħafna ikel jikkaw ża aktar attività mikrobika u 
konċentrazzjonijiet tal-ossi ġnu mnaqqsin. I ż-żewġ kondizzjonijiet jistg ħu 
jġibu magħhom rati ta’ tkabbir imnaqqas.  
6. Xi ċelluli ta’ alka ħadra (eż. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) 
jistgħu wkoll ji żdiedu meta jitqieg ħdu f’reċipjenti ġodda ta’ kultura.  
Tmigħ ta’ adulti evoluti  
7. Xi w ħud minn dawk li jag ħmlu esperimenti ssu ġġerew li kuxxinett tat-tajjar 
mgħaddas f’soluzzjoni saturata tas-sukro żju jista’ jservi ta’ ikel g ħal adulti 
evoluti.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Emerġenza  
8. F’20 + 2 °C adulti jibdew jevolvu mir-re ċipjenti għat-tkabbir tal-larvi wara 
bejn wieħed u ieħor 13 - 15-il jum. L-ir ġiel jintgħarfu malajr g ħax ikollhom 
antenni kollha pjumi.  
Kwantitajiet ta’ bajd  
9. Malli l-adulti jkunu fil-ga ġġa tat-trobbija, ir-re ċipjenti kollha g ħat-tkabbir 
tal-larvi g ħandhom ikunu e żaminati tliet darbiet fil- ġimgħa għal tqegħid ta’ 
kwantitajiet ta’ bajd qisu ġelatina. Jekk ikun hemm, il-kwantitajiet ta’ bajd 
għandhom jitne ħħew b’attenzjoni. Il-bajd g ħandu jkun ittrasferit g ħal ġo 
dixx żgħir li jkun fih kampjun tal-ilma tat-trobbija. Kwantitajiet ta’ bajd 
jintużaw biex jinbeda re ċipjent ġdid ta’ kultura (e ż. 2 - 4 kwantitajiet ta’ 
bajd/reċipjent) jew biex jintu żaw għal testijiet tat-tossi ċità. 
10. Larvi tal-ewwel fa żi għandhom ifaqqsu wara 2 - 3 ijiem.  
Reċipjenti ġodda ta’ kultura  
11. Malli jkunu stabbiliti kulturi g ħandu jkun possibbli li jitqieg ħed reċipjent 
ġdid ta’ kultura tal-larvi kull ġimgħa jew anqas ta’ spiss skont ħtiġijiet ta’ 
ttestjar, billi jitne ħħew ir-reċipjenti aktar qodma wara li jkunu evolvew 
pappamoski adulti. Bl-u żu ta’ din is-sistema jkun hemm provvista 
regolari ta’ adulti b’anqas mani ġġar. 
Tħejjija ta’ soluzzjonijiet tat-testijiet “M4” and “M7”  
12. Elendt (1990) iddeskriva l-midjum “M4”. Il-midjum “M7” jit ħejja bħala 
l-midjum “M4” ħlief għas-sustanzi indikati fit-Tabella 1, li g ħalihom kon ċ­
entrazzjonijiet ikunu erba’ darbiet aktar baxxi f’“M7” milli f’“M4”. Qed titħejja pubblikazzjoni dwar il-midjum “M7” (Elendt, komunikazzjoni 
personali). Is-soluzzjoni tat-test ma g ħandhiex tkun ippreparata skont 
Elendt u Bias (1990) g ħall-konċentrazzjonijiet ta’ NaSiO3 5 H
 2 O, 
NaNO3, KH2PO4 u K2HPO4 mog ħtija għall-preparazzjoni 
tas-soluzzjonijiet stokk mhumiex adegwati.  
Tħejjija tal-midjum “M7”  
13. Kull soluzzjoni ta’ stokkijiet (I) tit ħejja waħda waħda u soluzzjoni ta’ 
stokkijiet flimkien (II) tit ħejja minn dawn is-soluzzjonijiet ta’ 
stokkijiet (I) (ara Tabella 1). Ħamsin ml mis-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
flimkien (II) u l-ammonti ta’ kull soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ makronu ­
trijenti li jidhru fit-Tabella 2 ikunu 1 litru ta’ ilma dejonizzat biex 
jitħejja l-midjum “M7”. Tit ħejja soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini billi 
jiżdiedu tliet vitamini mal-ilma dejonizzat kif indikat fit-Tabella 3, u ji żdied 
0,1 ml tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien ta’ vitamini mal-midjum “M7” finali ftit qabel ma jintu ża. (Is-soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini tin ħażen 
iffriżata f’alikwoti żgħar). Il-midjum jitrewwa ħ u jkun stabbilizzat.
 
LETTERATURA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabella 1  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ mikroelementi g ħall-midjum M4 u M7  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) Ammont (mg) 
magħmul minn 
sa 1 litru ta’ ilma 
dejonizzat Biex tħejji s-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
flimkien (II): ħallat l-ammonti li 
ġejjin (ml) ta’ soluzzjonijiet ta’ 
stokkijiet (I) u ag ħmel sa 1 litru ta’ 
ilma dejonizzat Konċentrazzjonijiet finali 
f’soluzzjonijiet tat-testijiet (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Dawn is-sustanzi huma differenti f’M4 u f’M7, kif indikat hawn ta ħt. 
( 2 ) Dawn is-soluzzjonijiet jit ħejjew wa ħda waħda, mbag ħad jitferrg ħu flimkien u ji ġu pproċessati minnufih f’awtoklav (re ċipjent li 
jingħalaq awtomatikament).  
Tabella 2  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ makronutrijenti g ħall-midjum M4 u M7  
Ammont mag ħmul 
minn sa 1 litru ta’ ilma 
dejonizzat 
(mg) Ammont ta’ soluzzjonijiet 
ta’ stokkijiet ta’ makronu ­
trijenti mi żjudin biex 
jitħejja midjum M4 and M7 
(ml/l) Konċentrazzjonijiet 
finali f’soluzzjonijiet 
tat-testijiet M4 u M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabella 3  
Soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini g ħall-midjum M4 u M7. It-tliet soluzzjonijiet kollha ta’ 
vitamini jing ħaqdu flimkien biex jag ħmlu soluzzjoni wa ħda ta’ stokkijiet ta’ vitamini.  
Ammont mag ħmul minn 
sa 1 litru ta’ ilma dejo ­
nizzat 
(mg) Ammont ta’ soluzzjoni ta’ 
stokkijiet ta’ vitamini 
miżjudin biex jit ħejja midjum 
M4 u M7 
(ml/l) Konċentrazzjonijiet 
finali f’soluzzjonijiet 
tat-testijiet M4 u M7 
(mg/l)  
Kloridrat tat-tijamina 750 0,1 0,075 
Ċjanokobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 
Bijotina 7,5 0,1 0,00075  
LETTERATURA  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25- 
33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Appendiċi 3 
TĦEJJIJA TA’ SEDIMENT FORMULAT  
Kompożizzjoni tas-sediment  
Il-kompożizzjoni tas-sediment formulat g ħandha tkun kif ġej: 
Kostitwent Karatteristi ċi % ta’ sediment 
piż fin-niexef  
Pit Pit ta’ ħażiż Sphagnum, qrib 
kemm jista’ jkun ta’ pH 5,5- 
6,0 mingħajr ma tibqa’ tidher 
il-pjanta, mit ħun fin (par ­
tiċelli ta’ daqs ≤ 1 mm) u 
mnixxef bl-arja 4 - 5 
Ramel tal-quartz Daqs ta’ ramla: > 50 % 
tal-partiċelli għandhom ikunu 
fil-firxa ta’ 50-200 μm 75 - 76 
Tafal tal-kawlina Kontenut ta’ kawlina ≥ 30 % 20 
Karbonju organiku A ġġustat biż-żieda ta’ pit u 
ramel 2 (± 0,5) 
Karbonat tal-kal ċju CaCO  3 ,pulverizzat, kemi ­
kament pur 0,05 - 0,1 
Ilma Konduttività ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Tħejjija  
Il-pit jitnixxef bl-arja u jinta ħan fi trab fin. Tit ħejja sospensjoni tal-ammont 
meħtieġ ta’ trab tal-pit f’ilma dejonizzat billi jintu ża apparat ta’ omo ġeneiz­
zazzjoni ta’ prestazzjoni g ħolja. Il-pH ta’ din is-sospensjoni ji ġi aġġustat sa 5,5 
± 0,5 b’CaCO  3 . Is-sospensjoni ti ġi kkondizzjonata g ħal mill-anqas jumejn billi 
titħawwad bil-mod f’20 ± 2 °C, biex il-pH isir stabbli u jistabbilixxi komponent 
mikrobiku stabbli. Il-pH jer ġa’ jitkejjel u g ħandu jkun 6,0 ± 0,5. Mbag ħad 
is-sospensjoni tal-pit tit ħallat mal-kostitwenti l-o ħra (ramel u tafal tal-kawlina) 
u ma’ ilma dejonizzat biex jinkiseb sediment omo ġenju b’kontenut ta’ ilma 
f’firxa ta’ 30-50 % tal-pi ż fin-niexef tas-sediment. Il-pH tat-ta ħlita finali jer ġa’ 
jitkejjel g ħal darb’o ħra u jiġi aġġustat għal 6,5 sa 7,5 b’CaCO  3 jekk ikun 
meħtieġ. Jittieħdu kampjuni tas-sediment biex ikun iddeterminat il-pi ż 
fin-niexef u l-kontenut ta’ karbonju organiku. Mbag ħad, qabel ma jintu ża 
fit-test tat-tossi ċità tal-kironomidi, huwa rrakkomandat li s-sediment formulat 
ikun ikkondizzjonat g ħal sebat ijiem ta ħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm 
fit-test sussegwenti.  
Ħżin 
Il-kostitwenti nixfin g ħat-tħejjija tas-sediment artifi ċjali jistgħu jinħażnu f’post 
niexef u frisk f’temperatura ambjentali. Is-sediment formulat (mxarrab) 
m’għandux jin ħażen qabel ma jsir u żu minnu fit-test. G ħandu jintu ża minnufih 
wara l-perjodu ta’ kondizzjonament ta’ 7 ijiem li jtemm it-t ħejjija tieg ħu. 
LETTERATURA:  
Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness. Tossi ċità għal Ħniex.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Appendiċi 4 
Karatteristi ċi kimiċi ta’ ilma ta’ dilwizzjoni a ċċettbbli  
Sustanza Kon ċentrazzjonijiet  
Materja partikulata < 20 mg/l 
Karbonju organiku totali < 2 mg/l Ammonja mhux jonizzata < 1 μg/l 
Ebusija b ħala CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Kloru residwali < 10 μg/l 
Pestiċidi organofosforu żi totali < 50 ng/l 
Pestiċidi organoklori ċi totali flimkien ma’ polikloro ­
bifenili < 50 ng/l 
Kloru organiku totali < 25 ng/l  
(*) Iżda għandu jkun innotat li jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-mel ħ 
minerali fl-ilma u s-sustanza g ħall-ittestjar, g ħandu jintu ża ilma b’anqas mel ħ minerali 
(u għalhekk, m’g ħandux jintu ża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Appendiċi 5 
Gwida għall-monitora ġġ tal-evoluzzjoni ta’ larvi kironomidi  
Sifuni ta’ evoluzzjoni jitqieg ħdu fuq il-bekkijiet tat-test. Dawn is-sifuni jkunu 
meħtieġa mill-20 jum sa meta jintemm it-test. E żempju ta’ sifun li jintu ża huwa 
pinġut hawn ta ħt:
 
A: l-iskrijn tan-nylon  
B: il-kikkri tal-plastik maqluba  
C: il-bekk ta’ espo żizzjoni ming ħajr xoffa  D: il-portijiet tal-iskrijn li jibdlu l-ilma  
E: ilma  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  TEST TAT-TOSSI ĊITÀ TA’ KIRONOMIDI TA’ SEDIMENT-ILMA 
BL-UŻU TA’ ILMA FORTIFIKAT  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħat-TG tal-OECD 219 (2004). 
Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa mfassal biex jivvaluta l-effetti ta’ 
espożizzjoni prolongata tal-kimi ċi għal-larva li tg ħix fis-sediment 
tad-dipteran tal-ilma ħelu Chironomus  sp. Huwa primarjament ibba żat fuq 
il-linja gwida BBA li tu ża sistema tat-test sediment-ilma bil- ħamrija 
artifiċjali, u x-xenarju ta’ espo żizzjoni tal-kolonna tal-ilma (1). Iqis ukoll 
protokolli e żistenti ta’ testijiet tat-tossi ċità għal Chironomus riparius  u 
Chironomus tentans  li kienu żviluppati fl-Ewropa u fl-Amerika ta’ Fuq 
(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) u kienu ring-tested (1)(6)(9). Jistg ħu jintużaw ukoll 
speċijiet oħra ta’ kironomidi iddokumentati sewwa, e ż. Chironomus 
yoshimatsui  (10)(11).  
2. Ix-xenarju ta’ espo żizzjoni użat f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ta’ ilma 
fortifikat. L-g ħażla tax-xenarju adatt ta’ espo żizzjoni tiddependi 
mill-applikazzjoni ma ħsuba tat-test. Ix-xenarju ta’ espo żizzjoni għall-ilma, 
li jinvolvi kolonna fortifikata ta’ ilma, huwa ma ħsub li jkun jixbah sprej ta’ 
pestiċidi meta jg ħaddi mal-kurrent, u jkopri l-kon ċentrazzjonijiet meta 
fil-bidu jil ħqu l-aqwa tag ħhom f’ilma tal-pori. Huwa wkoll utli g ħal tipi 
oħra ta’ espo żizzjoni (inklu ż tixrid kimiku) ħlief għal proċessi ta’ akkumu ­
lazzjoni li jdumu aktar mill-perjodu tat-test.  
3. Sustanzi li je ħtiġilhom ikunu ttestjati g ħal organi żmi li jgħixu f’sediment 
is-soltu jippersistu f’dan il-kompartiment tul perjodi twal ta’ żmien. 
L-organiżmi li jgħixu f’sediment jistg ħu jkunu esposti permezz ta’ g ħadd 
ta’ rotot. L-importanza relattiva ta’ kull rotta ta’ espo żizzjoni u ta ż-żmien 
meħud għal kull wa ħda biex tikkontribwixxi g ħall-effetti tossi ċi globali, 
tiddependi mill-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika kon ċernata. G ħal 
sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log K  ow > 5) jew g ħal sustanzi 
magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-in ġestjoni ta’ ikel kontaminat 
tista’ tkun rotta sinifikanti ta’ espo żizzjoni. Biex it-tossi ċità ta’ sustanzi 
lipofiliċi ħafna ma tkunx sottovalutata, jista’ jitqies l-u żu ta’ ikel mi żjud 
mas-sediment qabel l-applikazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar. Biex jittie ħdu 
r-rotot potenzjali kollha ta’ espo żizzjoni l-fokus ta’ dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar ikun fuq espo żizzjoni fit-tul. It-testijiet idumu madwar 20 - 28 
jum għal C. riparius  u C. yoshimatsui , u 28 - 65 jum g ħal C. tentans . 
Jekk tkun me ħtieġa dejta għal żmien qasir g ħal għan speċifiku, pere żempju 
biex ikunu mist ħarrġa l-effetti ta’ kimi ċi instabbli, replikati addizzjonali 
jistgħu jitneħħew wara perjodu ta’ g ħaxart ijiem.  
4. Il-punti ta’ tmiem imkejla huma l-g ħadd totali ta’ adulti li jkunu evolvew u 
ż-żmien li jkunu ħadu biex evolvew. Huwa rrakkomandat li l-kejl 
tas-sopravivenza u tat-tkabbir tal-larvi g ħandu jsir biss wara perjodu ta’ 
għaxart ijiem jekk tkun me ħtieġa dejta addizzonali g ħal żmien qasir, billi 
jintużaw replikati addizzjonali skont il-ka ż. 
5. Huwa rrakkomandat l-u żu ta’ sediment formulat. Sediment formulat g ħandu 
diversi vanta ġġi fuq sedimenti naturali:  
— il-varjabbiltà sperimentali titnaqqas min ħabba li jifforma “matri ċi stan­
dardizzata” riprodu ċibbli u l- ħtieġa li jinstabu sorsi ta’ sediment mhux 
kontaminati u nodfa tkun eliminata;  
— it-testijiet jistg ħu jibdew f’kull żmien ming ħajr ma jkun hemm 
varjabbiltà sta ġonali fis-sediment tat-test u ma jkunx hemm ħtieġa li 
s-sediment ikun ittrattat minn qabel biex titne ħħa fawna indi ġena; 
l-użu ta’ sediment formulat inaqqas ukoll l-ispi ża b’rabta mal- ġabra 
mill-post ta’ ammonti suffi ċjenti ta’ sediment g ħal testijiet ta’ rutina;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— l-użu ta’ sediment formulat jippermetti li jsiru tqabbiliet ta’ tossi ċità u 
gradazzjoni ta’ sustanzi b’dan il-mod: dejta dwar tossi ċità minn testijiet 
b’sediment naturali u artifi ċjali kienet komparabbli g ħal diversi kimi ċi 
(2). 
6. Definizzjonijiet u żati jingħataw fl-Appendi ċi 1. 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
7. L-ewwel fa żi ta’ larvi kironomidi jkunu esposti g ħal firxa ta’ kon ċen­
trazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar f’sistemi ta’ sediment-ilma. It-test jibda 
billi l-larvi tal-ewwel fa żi jitqiegħdu fil-bekkijiet tat-test li jkun fihom 
is-sistema ta’ sediment-ilma u sussegwentement is-sustanza g ħall-ittestjar 
tiġi ffortifikata mal-ilma. Ir-rata ta’ evoluzzjoni u żvilupp ta’ kironomidi 
titkejjel fit-tmiem tat-test. Is-sopravivenza u l-pi ż tal-larvi jistg ħu jitkejlu 
wkoll wara 10 ijiem jekk ikun me ħtieġ (billi jintu żaw replikati addizzjonali 
skont kif ikun xieraq). Din id-dejta tkun analizzata jew billi jintu ża mudell 
ta’ rigressjoni biex tkun stmata l-kon ċentrazzjoni li g ħandha tikkaw ża x % 
tnaqqis fl-evoluzzjoni, fis-sopravivenza jew fit-tkabbir tal-larvi (e ż. EC  15 , 
EC 50 , eċċ.), jew billi jintu ża ttestjar ta’ ipote żi ta’ statistika biex ikun 
iddeterminat NOEC/LOEC. Dan tal-a ħħar ikun je ħtieġlu tqabbil ta’ valuri 
ta’ effett ma’ valuri ta’ kontroll billi jintu żaw testijiet ta’ statistika.  
INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA G ĦALL-ITTESTJAR  
8. Is-solubilità fl-ilma tas-sustanza g ħall-ittestjar, il-pressjoni tal-fwar tag ħha, 
il-partizzjoni mkejla jew ikkalkulata f’sediment u l-istabbiltà fl-ilma u 
fis-sediment g ħandhom ikun mag ħrufin. Għandu jkun disponibbli metodu 
analitiku affidabbli g ħall-kwantifikazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar f’ilma 
ta’ fuq, f’ilma tal-pori u f’sediment b’akkuratezza mag ħrufa u rrapportata u 
b’limitu ta’ detezzjoni. Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali u l-purezza tas-sustanza g ħall-ittestjar. Dak li ji ġrilha kimikament is-sustanza 
għall-ittestjar (e ż. tixrid, degradazzjoni abijotika u bijotika, e ċċ.) ukoll huwa 
informazzjoni utli. Aktar gwida g ħall-ittestjar ta’ sustanzi bi proprjetajiet 
fiżikokimiċi li jagħmluha diffi ċli għalihom li jsirilhom it-test ting ħata fi (12).
 
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
9. Kimi ċi ta’ referenza jistg ħu jkunu ttestjati perjodikament b ħala mezz li 
jiżgura li l-protokoll tat-test u l-kondizzjonijiet tat-test ikunu affidabbli. 
Eżempji ta’ sustanzi tossi ċi ta’ referenza u żati b’suċċess f’ring-tests u fi 
studji ta’ validazzjoni huma: lindane, trifluralin, pentaklorofenol, klorur 
tal-kamdju u klorur tal-potassju. (1)(2)(5)(6)(13).  
VALIDITÀ TAT-TEST  
10. Biex it-test ikun validu japplikaw il-kondizzjonijiet li ġejjin:  
— l-evoluzzjoni fil-kontrolli g ħandha tkun mill-anqas 70 % fit-tmiem 
tat-test. (1)(6);  
— l-evoluzzjoni ta’  C. riparius  u C. yoshimatsui  għal adulti minn re ċipjenti 
ta’ kontroll g ħandha sse ħħ bejn 12 u 23 jum wara li jkunu dda ħħlu 
fir-reċipjenti; g ħal C. tentans , ikun me ħtieġ perjodu ta’ 20 sa 65 jum.  
— fit-tmiem tat-test, il-pH u l-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu maħlul 
għandhom jitkejlu f’kull re ċipjent. Il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu 
għandha tkun mill-anqas 60 % tal-valur tas-saturazzjoni tal-arja (ASV) 
fit-temperatura u żata, u l-pH tal-ilma ta’ fuq g ħandu jkun fil-firxa ta’ 6-9 
fir-reċipjenti kollha tal-ittestjar;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— it-temperatura tal-ilma mhux suppost tkun differenti b’iktar minn 
± 1,0 °C. It-temperatura tal-ilma tista’ tkun ikkontrollata b’kamra 
iżotermika u f’dak il-ka ż it-temperatura tal-kamra g ħandha tkun ikkon ­
fermata f’intervall xierqa ta’ ħin. 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Reċipjenti tat-test  
11. L-istudju jitmexxa f’bekkijiet tal- ħġieġ ta’ 600 ml b’dijametru qies ta’ 8 cm. 
Reċipjenti oħra jkunu tajbin, i żda għandhom jiggarantixxu fond sewwa 
tal-ilma ta’ fuq u tas-sediment. Il-wi ċċ tas-sediment g ħandu jkun suffi ċjenti 
biex jipprovdi 2 sa 3 cm  2 għal kull larva. Il-proporzjon tal-fond tas-saff 
tas-sediment mal-fond tal-ilma ta’ fuq g ħandu jkun 1:4. Re ċipjenti tat-test 
u apparat ie ħor li jiġu f’kuntatt mas-sistema ta’ ttestjar g ħandhom ikunu 
magħmulin kollha mill- ħġieġ jew minn materjal ie ħor kimikament inerti 
(eż. Teflon).  
Għażla ta’ spe ċi 
12. L-ispe ċi li għandha tintu ża fit-test preferibbilment hija  Chironomus riparius . 
Chironomus tentans  hija adatta wkoll i żda aktar diffi ċli biex tkun ittrattata u 
jeħtiġilha perjodu itwal ta’ test. Tista’ tintu ża wkoll  Chironomus yohimatsui . 
Dettalji ta’ metodi ta’ kultura jing ħataw fl-Appendi ċi 2 għal Chironomus 
riparius . Informazzjoni dwar kondizzjonijiet ta’ kultura hija wkoll 
disponibbli g ħal speċijiet oħra, jiġifieri għal Chironomus tentans  (4) u  
Chironomus yoshimatsui  (11). L-identifikazzjoni ta’ spe ċijiet għandha tkun 
ikkonfermata qabel l-ittestjar i żda ma tkunx me ħtieġa qabel kull test jekk 
organiżmi jkunu ġejjin minn kultura interna.  
Sediment  
13. Preferibbilment g ħandu jintu ża sediment formulat (msejja ħ ukoll sediment 
rikostitwit, artifi ċjali jew sintetiku). I żda, jekk jintu ża sediment naturali, dan 
għandu jkun ikkaratterizzat (huma wkoll irrakkomandati mill-anqas pH, 
kontenut ta’ karbonju organiku, determinazzjoni ta’ parametri o ħra bħal 
proporzjon ta’ C/N u granulumetrija), u g ħandu jkun ħieles minn kull 
kontaminazzjoni u organi żmi oħra li jistg ħu jikkompetu ma’, jew 
jikkunsmaw lill-kironomidi. Huwa wkoll irrakkomandat li, qabel ma 
jintuża f’test tat-tossi ċità tal-kironomidi, is-sediment naturali jkun ikkon ­
dizzjonat g ħal sebat ijiem ta ħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm fit-test 
sussegwenti. Huwa rrakkomandat li f’dan it-test jintu ża s-sediment formulat 
li ġej, ibbażat fuq il-ħamrija artifi ċjali użata fil-Metodu ta’ Ttestjar C.8 (14) 
(1)(15)(16):  
(a) 4-5 % pit (pi ż fin-niexef): qrib kemm jista’ jkun pH 5,5 sa 6,0; huwa 
importanti li jintu ża pit f’għamla ta’ trab, mit ħun fin (parti ċelli ta’ daqs 
≤ 1 mm) u mnixxef bl-arja biss.  
(b) 20 % tafal tal-kawlina (pi ż fin-niexef) (kontenut ta’ kawlina preferib ­
bilment aktar minn 30 %).  
(c) 75-76 % ramel tal-quartz (pi ż fin-niexef) (g ħandu jippredomina ramel 
fin b’aktar minn 50 % tal-parti ċelli bejn 50 u 200 μm). 
(d) jiżdied ilma dejonizzat biex jinkiseb kontenut ta’ rtuba tat-ta ħlita finali 
f’firxa ta’ 30 - 50 %.  
(e) Karbonat tal-kal ċju ta’ kwalità kemikament pura (CaCO  3 ) jiżdied, 
aġġusta l-pH tat-ta ħlita finali tas-sediment g ħal 7,0 ± 0,5.  
(f) Il-kontenut ta’ karbonju organiku tat-ta ħlita finali g ħandu jkun 2 % (± 
0,5 %) u g ħandu jkun a ġġustat b’ammonti xierqa ta’ pit u ramel, skont 
(a) u (c).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Is-sors tal-pit, tafal tal-kawlina u ramel g ħandha tkun mag ħrufa. 
Il-komponenti tas-sediment g ħandhom ikunu e żaminati g ħan-nuqqas ta’ 
kontaminazzjoni kimika (e ż. metalli tqal, komposti tal-organokloru, 
komposti organofosforu żi, eċċ.). Eżempju g ħat-tħejjija tas-sediment 
formulat huwa deskritt fl-Appendi ċi 3. It-taħlit ta’ kostitwenti nixfin ikun 
ukoll aċċettabbli jekk jintwera li wara li jkun żdied l-ilma ta’ fuq ma sse ħħx 
separazzjoni tal-kostitwenti tas-sediment (e ż. biċċiet tal-pit fil-wi ċċ tal-ilma), 
u li l-pit jew is-sediment ikunu kkondizzjonati b’mod suffi ċjenti.  
Ilma  
15. Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristi ċi kimiċi ta’ ilma dilwit b’mod 
aċċettabbli kif elenkat fl-Appendi ċijiet 2 u 4 ikun tajjeb b ħala ilma tat-test. 
Kull ilma tajjeb, ilma naturali (ilma tal-wi ċċ jew ta’ ta ħt l-art), ilma rikos ­
titwit (ara l-Appendi ċi 2) jew ilma tal-vit li jkun tne ħħielu l-kloru jkun 
aċċettabbli b ħala ilma ta’ kultura u ilma tat-test jekk kironomidi jibqg ħu 
jgħixu fih sakemm idumu l-kultura u t-testjar ming ħajr ma juru sinjal ta’ 
stress. Fil-bidu tat-test, il-pH tal-ilma tat-test g ħandu jkun bejn 6 u 9 u t-total 
ta’ melħ minerali fl-ilma ma jkunx og ħla minn 400 mg/l b ħala CaCO  3 . Iżda, 
jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-mel ħ minerali fl-ilma u 
s-sustanza g ħall-ittestjar, g ħandu jintu ża ilma b’anqas mel ħ minerali (u 
għalhekk, m’g ħandux jintu ża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni). 
Għandu jintu ża l-istess tip ta’ ilma tul l-istudju kollu. Il-karatteristi ċi 
tal-kwalità tal-ilma elenkati fl-Appendi ċi 4 għandhom jitkejlu mill-anqas 
darbtejn fis-sena jew meta jkun hemm suspett li dawn il-karatteristi ċi 
jkunu setg ħu nbidlu b’mod sinifikanti.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet - Ilma fortifikat  
16. Konċentrazzjonijiet ta’ testijiet ikunu kkalkulati abba żi ta’ kon ċen­
trazzjonijiet ta’ kolonni ta’ ilma, ji ġifieri tal-ilma ta’ fuq is-sediment. 
Soluzzjonijiet tat-testijiet tal-kon ċentrazzjoni mag ħżula s-soltu jit ħejjew 
b’dilwizzjoni ta’ soluzzjoni ta’ stokkijiet. Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet għandhom preferibbilment jit ħejjew billi s-sustanza g ħall-ittestjar tin ħall 
fil-midjum g ħall-ittestjar. F’xi ka żijiet jista’ jkun me ħtieġ l-użu ta’ solventi 
jew aġenti ta’ tixrid biex tkun prodotta soluzzjoni ta’ stokkijiet kon ċentrata 
b’mod adatt. E żempji ta’ solventi adatti huma a ċetun, etanol, metanol, etere 
monoelitiku tal-glikol tal-etilen, etere tad-dimentil tal-glikol tal-etilen, formamidi tad-dimentil u glikol tat-trietilen. A ġenti ta’ tixrid li jistg ħu 
jintużaw huma Cremophor RH40, Tween 80, ċelluloża tal-metil 0,01 % u 
HCO-40. Il-kon ċentrazzjoni ta’ a ġent ta’ solubilità fil-midjum tal-ittestjar 
finali għandu jkun minimali (i.e. ≤ 0.,1 ml/l) u g ħandu jkun l-istess 
fit-trattamenti kollha. Meta jintu ża aġent ta’ solubilità, m’g ħandux ikollu 
effetti sinifikanti fuq sopravivenza jew effett ħażin viżibbli fuq il-larvi kiro ­
nomidi kif ikun żvelat minn kontroll ta’ solventi biss. I żda għandu jsir kull 
sforz biex l-u żu ta’ dawn il-materjali jkun evitat.
 
DISINN TAT-TEST  
17. Id-disinn tat-test jirrelata mal-g ħażla tal-g ħadd u l-ispazjar 
tal-konċentrazzjonijiet tat-testijiet, mal-g ħadd ta’ re ċipjenti għal kull kon ċen­
trazzjoni u mal-g ħadd ta’ larvi g ħal kull re ċipjent. Huma deskritti disinji 
għal stima ta’ punti ta’ EC, g ħal stima ta’ NOEC u biex jitmexxa test ta’ 
limitu. L-anali żi b’rigressjoni hija ppreferuta mill-appro ċċ ta’ ttestjar ta’ 
ipoteżi. 
Disinn għal analiżi b’rigressjoni  
18. Il-kon ċentrazzjoni ta’ effetti (e ż. EC  15 , EC  50 ) u l-firxa ta’ kon ċen­
trazzjonijiet, li g ħalihom l-effett tas-sustanza g ħall-ittestjar hija ta’ interess, 
għandhom jing ħaqdu bil-kon ċentrazzjonijiet inklu żi fit-test. Ġeneralment, 
l-akkuratezza u l-aktar il-validità, li bihom ikunu jistg ħu jsiru stimi ta’ 
konċentrazzjonijiet ta’ effetti (EC  x ), titjieb meta l-kon ċentrazzjoni ta’  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
effetti tkun fil-firxa ta’ kon ċentrazzjonijiet ittestjati. Estrapolazzjoni ħafna 
taħt il-konċentrazzjoni po żittiva l-aktar baxxa jew ‘il fuq mill-og ħla konċen­
trazzjoni g ħandha tkun evitata. Test preliminari biex jinstabu firxiet ikun utli 
biex tintg ħażel il-firxa ta’ kon ċentrazzjonijiet li jkollhom jintu żaw (ara 
l-paragrafu 27)).  
19. Jekk g ħandu jkun stmat EC  x , għandhom ikunu ttestjati mill-anqas ħames 
konċentrazzjonijiet u tliet replikati g ħal kull kon ċentrazzjoni. Fi kwalunkwe 
każ, huwa rrakkomandat li jintu żaw konċentrazzjonijiet suffi ċjenti ta’ 
testijiet biex tit ħalla ssir stima tajba ta’ mudell. Il-fattur bejn kon ċen­
trazzjonijiet m’g ħandux ikun akbar minn tnejn (tista’ ssir e ċċezzjoni 
f’każijiet meta l-kurva ta’ rispons g ħad-doża jkollha anglu baxx). L-g ħadd 
ta’ replikati f’kull trattament jista’ jitnaqqas jekk l-g ħadd ta’ kon ċen­
trazzjonijiet tat-test b’risponsi differenti ji żdied. Iż-żieda fl-g ħadd ta’ 
replikati jew it-tnaqqis fit-tul tal-intervalli tal-kon ċentrazzjoni tat-test 
jittendu li jwasslu g ħal intervall idjaq ta’ kunfidenza g ħat-test. Ikunu 
meħtieġa replikati addizzjonali jekk g ħandhom ikunu stmati 
s-sopravivenza u t-tkabbir tal-larvi g ħal 10-ijiem.  
Disinn għal stima ta’ NOEC/LOEC  
20. Jekk g ħandhom ikunu stmati LOEC jew NOEC, g ħandhom jintu żaw ħames 
konċentrazzjonijiet tat-test b’mill-anqas erba’ replikati u l-fattur bejn kon ċ­
entrazzjonijiet m’g ħandux ikun akbar minn tnejn. L-g ħadd ta’ replikati 
għandu jkun suffi ċjenti biex tkun żgurata qawwa adegwata ta’ statistika 
biex tinkixef differenza ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). Bir-rata ta’ żvilupp, Anali żi ta’ Varjanza (ANOVA) 
is-soltu tkun adatta, b ħat-test Dunnett u t-test Williams (17)(18)(19)(20). 
Fil-proporzjon ta’ evoluzzjoni jistg ħu jkunu u żati t-testijiet 
Cochran-Armitage, dak e żatt ta’ Fisher (bil-korrezzjoni ta’ Bonferroni), 
jew ta’ Mantel-Haenszel.
 
Test ta’ limitu  
21. Ikun jista’ jsir test ta’ limitu (kon ċentrazzjoni ta’ test wie ħed u kontroll) jekk 
ma jkun osservat ebda effett fit-test preliminari ta’ detezzjoni ta’ firxa. L-għan tat-test ta’ limitu huwa li jkun indikat li l-valur tossiku 
tas-sustanza g ħall-ittestjar ikun akbar mill-kon ċentrazzjoni ta’ limitu ttestjata. 
F’dan il-Metodu ta’ Ttestjar ma jistax isir su ġġeriment g ħall-konċentrazzjoni 
rakkomandata; dan jit ħalla fil-ġudizzju tar-regolatur. Is-soltu jkunu me ħtieġa 
mill-anqas sitt replikati kemm g ħat-trattament kif ukoll g ħall-kontroll. 
Għandha tintwera qawwa adegwata ta’ statistika biex tinkixef differenza 
ta’ 20 % mill-kontroll fil-livell ta’ sinifikat ta’ 5 % (p = 0,05). B’rispons metriku (rata ta’ żvilupp u pi ż), it-t-test huwa metodu ta’ statistika adatt jekk 
dejta tissodisfa l- ħtiġijiet ta’ dan it-test (normalità, varjanzi omo ġenji). Jista’ 
jintuża t-t-test ta’ varjanza inugwali jew test mhux parametriku, b ħat-test 
Wilcoxon-Mann-Whithey, jekk dawn il- ħtiġijiet ma jkunux sodisfatti. 
Bil-proporzjon ta’ evoluzzjoni, it-test e żatt ta’ Fisher ikun adatt.
 
PROĊEDURA  
Kondizzjonijiet ta’ espo żizzjoni  
Tħejjija ta’ sistema ta’ ilma u sediment fortifikati  
22. Ammonti adatti ta’ sediment formulat (ara l-paragrafi 13-14 u Appendi ċi 3) 
jiżdiedu fir-re ċipjenti tat-test biex jifformaw saff ta’ mill-anqas 1,5 cm. 
L-ilma ji żdied għal fond ta’ 6 cm (ara paragrafu 15). Il-proporzjon 
tal-fond tas-saff tas-sediment u l-fond tal-ilma ma g ħandux jaqbe ż 1:4 u 
s-saff tas-sediment ma g ħandux ikun iktar fond minn 3 cm. Is-sistema 
sediment-ilma g ħandha tit ħalla taħt tirwiħ ġentitli għal sebat ijiem qabel 
iż-żieda tal-organi żmi tat-test (ara l-paragrafu 14 u l-Appendi ċi 3). Biex 
ikunu evitati separazzjoni ta’ ingredjenti tas-sediment u sospensjoni mill-ġdid ta’ materjal fin matul i ż-żieda ta’ ilma tat-test fil-kolonna 
tal-ilma, is-sediment jista’ jitg ħatta b’diska tal-plastik waqt li jkun qed 
jitferra’ ilma fiha, u d-diska titne ħħa minnufih wara. Apparati o ħra jistgħu 
wkoll ikunu adatti.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Ir-re ċipjenti tat-test g ħandhom ikunu mg ħottijin (eż. bi platti tal- ħġieġ). Jekk 
ikun meħtieġ, matul l-istudju l-ilma jimtela sal-livell tal-volum ori ġinali biex 
dan jagħmel tajjeb g ħall-evaporazzjoni tal-ilma. Dan g ħandu jsir billi jintu ża 
ilma distillat jew dejonizzat biex ma jit ħalliex jiżdied melħ. 
Żieda ta’ organi żmi tat-test  
24. Minn erba’ sa ħamest ijiem qabel ma l-organi żmi tat-test ji żdiedu 
fir-reċipjenti tat-test, g ħandhom jittie ħdu kwantitajiet ta’ bajd mill-kulturi u 
jitqiegħdu f’reċipjenti żgħar f’midjum ta’ kulturi. Jista’ jintu ża midjum 
qadim mill-kultura ta’ stokkijiet jew midjum li jkun g ħadu kif tħejja. Jekk 
jintuża dan tal-a ħħar, ammont żgħir ta’ ikel e ż. alka ħadra u/jew ftit qatriet 
żgħar ta’ filtrat minn sospensjoni mit ħuna fin ta’ trofof ta’ ikel tal- ħut 
għandu jiżdied mal-midjum tal-kultura (ara l-Appendi ċi 2). Għandhom 
jintużaw biss kwantijiet ta’ bajd mi ġbur frisk. Normalment, il-larvi jibdew 
ifaqqsu ftit jiem wara li jkun hemm il-bajd (2 sa 3 ijiem g ħal Chironomus 
riparius  f’20  o C u 1 sa 4 ijiem g ħal Chironomus tentans  fi 23  o C u 
Chironomus yoshimatui  fi 25  o C) u jkun hemm tkabbir ta’ larvi f’erba’ 
fażijiet, kull fa żi ddum 4-8 ijiem. Fit-test g ħandhom jintu żaw larvi 
tal-ewwel fa żi (2-3 jew 1-4 ijiem wara li jkunu faqqsu). Il-fa żi ta’ 
pappamoski tista’ possibbilment tkun ivverifikata billi jintu ża l-wisa’ 
tal-iskutella tar-ras (6).  
25. Għoxrin larvi tal-ewwel fa żi jkunu allokati kif jinzertaw lil kull re ċipjent 
tat-test li jkun fih is-sediment im ħallat u l-ilma, billi tintu ża pipetta ming ħajr 
ponta. It-tirwi ħ tal-ilma g ħandu jieqaf waqt li l-larvi jkunu qed ji żdiedu 
fir-reċipjenti tat-test u jibqa’ hekk g ħal 24 sieg ħa oħra wara li jkunu 
żdiedu l-larvi (ara l-paragrafi 24 u 32). Skont it-tifsila tat-test u żat (ara 
l-paragrafi 19 u 20), l-g ħadd ta’ larvi u żati għal kull kon ċentrazzjoni jkun 
mill-anqas 60 g ħall-istima ta’ punti ta’ EC u 80 g ħal determinazzjoni ta’ 
NOEC.  
26. Erbg ħa u għoxrin sieg ħa wara li jkunu żdiedu l-larvi, is-sustanza g ħall- 
ittestjar tit ħallat fil-kolonna tal-ilma fuq, u jer ġa’ jingħata tirwiħ. Ikunu 
applikati volumi żgħar ta’ soluzzjonijiet ta’ sustanzi g ħall-ittestjar ta ħt 
il-wiċċ tal-ilma billi tintu ża pipetta. L-ilma ta’ fuq g ħandu mbag ħad 
jitħallat b’attenzjoni biex is-sediment ma jit ħarbatx.  
Konċentrazzjonijiet tat-test  
27. Test ta’ detezzjoni ta’ firxa jista’ jkun utli biex tkun iddeterminata l-firxa ta’ 
konċentrazzjonijiet g ħat-test definittiv. G ħal dan il-g ħan tintuża serje ta’ 
konċentrazzjonijiet spazjati fil-wisa’ tas-sustanza g ħall-ittestjar. Biex tkun 
ipprovduta l-istess densità tal-wi ċċ għal kull kironomidu, li jkollu jintu ża 
għat-test definittiv, kironomidi jkunu esposti g ħal kull kon ċentrazzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar g ħal perjodu li jippermetti stima ta’ kon ċen­
trazzjonijiet adatti ta’ testijiet, u ma jkunx hemm ħtieġa ta’ replikati.  
28. Il-kon ċentrazzjonijiet tat-test g ħat-test definittiv ikunu de ċiżi abbażi 
tar-riżultat tat-test ta’ detezzjoni ta’ firxa. Mill-anqas g ħandhom jintu żaw 
u jintgħażlu ħames kon ċentrazzjonijiet kif deskritt fil-paragrafi 18 sa 20.  
Kontrolli  
29. Reċipjenti ta’ kontroll ming ħajr sustanza g ħall-ittestjar i żda li jkunu jinkludu 
sediment g ħandhom ikunu inklu żi fit-test bl-g ħadd xieraq ta’ replikati (ara 
l-paragrafi 19-20). Jekk ikun intu ża solvent g ħal applikazzjoni ta’ sustanza 
għall-ittestjar (ara l-paragrafu 16), g ħandu jiżdied kontroll ta’ solvent ta’ 
sediment.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Sistema ta’ ttestjar  
30. Jintu żaw sistemi stati ċi. Sistemi semistati ċi jew ta’ fluss kontinwu bl-ilma 
ta’ fuq ji ġġedded kull tant jew kontinwament jistg ħu jintużaw f’każijiet 
eċċezzjonali b ħal pereżempju jekk spe ċifikazzjonijiet tal-kwalità tal-ilma 
jisfaw ma jkunux adatti g ħall-organi żmu tat-test jew jaffettwaw 
l-ekwilibriju kimiku (e ż. livelli ta’ ossi ġnu maħlul jinżlu baxxi ħafna, 
il-konċentrazzjoni ta’ prodotti ta’ ekskreta tog ħla żżejjed jew minerali 
jlissu minn sediment u jaffettwaw il-pH u/jew il-mel ħ minerali fl-ilma). 
Iżda metodi o ħra biex titjieb il-kwalità tal-ilma ta’ fuq, b ħal tirwiħ, 
għandhom normalment ikunu bi żżejjed u jkunu ppreferuti.  
Ikel 
31. Ikun me ħtieġ li l-larvi jintemg ħu, preferibbilment kuljum jew mill-anqas tliet 
darbiet fil- ġimgħa. L-ikel tal- ħut (sospensjoni fl-ilma jew ikel mit ħun fin, eż. 
Tetra-Min jew Tetra-Phyll; ara d-dettalji fl-Appendi ċi 2) fl-ammont ta’ 0,25- 
0,5 mg (0,35-0,5 mg g ħal C. yoshimatui ) għal kull larva kuljum jidher li 
jkun adegwat g ħal larvi żgħar għall-ewwel 10 ijiem. Jista’ jkun me ħtieġ ftit 
aktar ikel g ħal larvi li jkollhom aktar żmien: 0,5 -1 mg g ħal kull larva 
kuljum g ħandu jkun suffi ċjenti għall-bqija tat-test. Ir-razzjon tal-ikel 
għandu jitnaqqas fit-trattamenti kollha u jkun ikkontrollat jekk ikun hemm 
tkabbir fungali jew jekk fil-kontrolli jkunu osservati mwiet. Jekk ma jkunx 
jista’ jitwaqqaf żvilupp fungali t-test g ħandu jittenna. Meta jkunu qed ji ġu 
ttestjati sustanzi li jassorbixxu ħafna (eż. b’log K  ow > 5), jew sustanzi 
magħqudin b’mod kovalenti mas-sediment, l-ammont ta’ ikel me ħtieġ biex 
ikunu żgurati sopravivenza u tkabbir naturali tal-organi żmi jista’ ji żdied 
mas-sediment formulat qabel il-perjodu ta’ stabbilizzazzjoni. G ħal dan, 
għandu jintu ża materjal tal-pjanti minflok ikel tal- ħut, eż. tista’ tintu ża 
żieda ta’ 0,5 % (pi ż fin-niexef) ta’ weraq mit ħunn fin ta’ e ż. ħorrieqa 
tnigges ( Urtica dioica ), ċawsla ( Morus alba ), silla bajda ( Trifolium 
repens ), spinaċi (Spinacia oleracea ) jew ta’ materjal ie ħor tal-pjanti 
(Cerophyl  jew ċelluloża alfa).  
Kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni  
32. Tirwi ħ bil-mod tal-ilma ta’ fuq f’re ċipjenti tat-test ikun ipprovdut preferib ­
bilment 24 sig ħat wara li ji żdiedu l-larvi u jitkompla matul it-test kollu 
(għandha ting ħata attenzjoni biex il-kon ċentrazzjoni tal-ossi ġnu maħlul ma 
tinżilx taħt 60 % ta’ ASV). Tirwi ħ ikun ipprovdut permezz ta’ pipetta 
Pasteur tal- ħġieġ imwaħħla 2-3 cm ‘il fuq mis-saff tas-sediment (ji ġifieri 
bużżieqa waħda jew ftit tal-ilma/sec). Meta jkunu qed ji ġu ttestjati kimi ċi 
volatili, jista’ jitqies li s-sistema tas-sediment-ilma ma titrewwa ħx. 
33. It-test jitmexxa f’temperatura kostanti ta’ 20 °C (± 2 °C). G ħal C. tentans  u 
C. yoshimatui  t-temperaturi rakkomandati huma ta’ 23 °C u 25 °C (± 2 °C), 
rispettivament. Jintu ża fotoperjodu ta’ 16-il sieg ħa u l-intensità tad-dawl 
għandha tkun 500 sa 1 000 lux.  
Durata tal-espo żizzjoni  
34. L-espo żizzjoni tibda bi ż-żieda ta’ larvi fir-re ċipjenti ffortifikati u ta’ kontroll. 
Id-durata massima tal-espo żizzjoni tkun ta’ 28 jum g ħal C. riparius  u C. 
yoshimatsui , u 65 jum g ħal C. tentans . Jekk pappamoski jevolvu qabel, 
it-test jista’ jitwaqqaf wara minimu ta’ ħamest ijiem wara li jkun evolva 
l-ewwel adult fil-kontroll.  
OSSERVAZZJONIJIET  
Emerġenza 
35. Ikunu ddeterminati ż-żmien ta’ żvilupp u l-g ħadd totali ta’ pappamoski r ġiel 
u nisa evoluti g ħalkollox. L-ir ġiel ikunu identifikati fa ċilment mill-antenni 
tagħhom kollha pjumi.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Ir-re ċipjenti tat-test g ħandhom ikunu osservati mill-anqas tliet darbiet 
fil-ġimgħa biex issir valutazzjoni vi żiva ta’ kull m ġiba mhux normali (e ż. 
tluq mis-sediment, g ħawm mhux tas-soltu), mqabbla mal-kontroll. Matul 
il-perjodu ta’ evoluzzjoni mistennija jkun me ħtieġ li jsir għadd kuljum ta’ 
pappamoski li jkunu evolvew g ħalkollox. Is-sess u l-g ħadd ta’ pappamoski 
evoluti g ħalkollox ikunu rre ġistrati kuljum. Wara identifikazzjoni 
l-pappamoski jitne ħħew mir-re ċipjenti. Kull kwantità ta’ bajd iddepo żitata 
qabel ma jintemm it-test g ħandha tkun irre ġistrata u mbag ħad titneħħa biex 
larvi ma jit ħallewx jer ġgħu jidħlu fis-sediment. Ikun irre ġistrat ukoll l-g ħadd 
ta’ pupae vi żibbli li jkunu naqsu li jevolvu. Gwida dwar kejl ta’ evoluzzjoni 
hija pprovduta fl-Appendi ċi 5. 
Tkabbir u sopravivenza  
37. Jekk g ħandha tkun ipprovduta dejta dwar sopravivenza u tkabbir ta’ larvi 
għal 10 ijiem, g ħandhom ikunu inklu żi reċipjenti addizzjonali tat-test 
mill-bidu, biex ikunu jistg ħu jintużaw wara. Is-sediment minn dawn 
ir-reċipjenti addizzjonali jintg ħarbel billi jintu ża għarbiel ta’ 250 μm biex 
iżomm il-larvi. Kriterji g ħal mewt huma immobbiltà jew nuqqas ta’ 
reazzjoni g ħal stimulu mekkaniku. Larvi li ma jkunux irkuprati g ħandhom 
jingħaddu wkoll b ħala mejtin (larvi li jkunu mietu fil-bidu tat-test setg ħu 
kienu ġew iddegradati minn mikrobi). Ikunu ddeterminat il-pi ż fin-niexef 
(mingħajr irmied) tal-larvi li jkunu baqg ħu ħajjin għal kull re ċipjent tat-test 
u l-medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull larva g ħal kull reċipjent. Ikun utli li jkun 
iddeterminat ta’ liema fa żi jkunu l-larvi li jkunu baqg ħu ħajjin; għal dak 
jista’ jintu ża l-kejl tal-wisa’ tal-iskutella tar-ras ta’ kull larva.  
Kejlijiet analiti ċi 
Konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar  
38. Bħala minimu, kampjuni tal-ilma ta’ fuq, tal-ilma tal-pori u tas-sediment 
għandhom ikunu analizzati fil-bidu (preferibbilment sieg ħa wara appli ­
kazzjoni ta’ sustanza g ħall-ittestjar) u fit-tmiem tat-test, fl-og ħla konċen­
trazzjoni u f’wa ħda aktar baxxa. Dawn id-determinazzjonijiet ta’ kon ċen­
trazzjoni ta’ sustanza g ħall-ittestjar jag ħtu tagħrif dwar l-im ġiba/il-partizzjoni 
tas-sustanza g ħall-ittestjar fis-sistema ilma u sediment. Te ħid ta’ kampjuni 
ta’ sediment fil-bidu tat-test jista’ jinfluwenza s-sistema ta’ ttestjar (e ż. 
tneħħija ta’ larvi tat-test), g ħalhekk g ħandhom jintu żaw reċipjenti 
addizzjonali tat-test biex jitwettqu determinazzjonijiet analiti ċi fil-bidu u 
matul it-test jekk ikun jixraq (ara l-paragrafu 39). Kejlijiet fis-sediment jistgħu ma jkunx me ħtieġ jekk il-partizzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar 
bejn ilma u sediment tkun ġiet iddeterminata b’mod ċar fi studju dwar 
ilma/sediment f’kondizzjonijiet komparabbli (e ż. proporzjon ta’ sediment 
ma’ ilma, tip ta’ applikazzjoni, kontenut ta’ karbonju organiku ta’ sediment).
 
39. Meta jittie ħdu kejlijiet intermedji (e ż. fis-7 jum) u jekk l-anali żi jkun 
jeħtiġilha kampjuni kbar li ma jkunux jistg ħu jittieħdu minn re ċipjenti 
tat-test ming ħajr ma tkun influwenzata s-sistema ta’ ttestjar, g ħandhom 
isiru determinazzjonijiet analiti ċi fuq kampjuni minn re ċipjenti addizzjonali 
tat-test ittrattati bl-istess mod (inklu ża l-preżenza ta’ organi żmi tat-test) i żda 
mhux użati għal osservazzjonijiet bijolo ġiċi. 
40. Ċentrifugazzjoni pere żempju ta’ 10 000 g u 4  o C għal 30 min. hija 
l-proċedura rrakkomandata biex ikun i żolat ilma interstizjali. I żda jekk 
is-sustanza g ħall-ittestjar tkun turi li filtri ma jassorbuhiex, tista’ wkoll 
tkun aċċettabbli l-filtrazzjoni. F’xi ka żijiet jista’ ma jkunx possibbli li 
jkunu analizzati kon ċentrazzjonijiet fl-ilma tal-pori min ħabba li d-daqs 
tal-kampjun ikun żgħir wisq.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Parametri fi żikokimiċi 
41. Il-pH, ossi ġnu maħlul fl-ilma tat-test u t-temperatura tat-re ċipjenti tat-test 
għandhom jitkejlu b’mod adatt (ara l-paragrafu 10). Mel ħ minerali fl-ilma 
u ammonja g ħandhom jitkejlu fil-kontrolli u f’re ċipjent wie ħed tat-test 
fl-ogħla konċentrazzjoni fil-bidu u fit-tmiem tat-test.  
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
42. L-għan ta’ dan it-test huwa biex ikun iddeterminat l-effett tas-sustanza g ħall- 
ittestjar fuq ir-rata ta’ żvilupp u fuq l-g ħadd totali ta’ pappamoski r ġiel u 
nisa evoluti g ħalkollox, jew fil-ka ż tal-effetti tat-test ta’ 10 ijiem fuq 
is-sopravivenza u l-pi ż tal-larvi. Jekk ma jkunx hemm indikazzjonijiet ta’ 
sensivitajiet differenti statistikament ta’ sessi, ri żultati dwar ir ġiel u nisa 
jkunu jistg ħu jinġabru għal analiżi ta’ statistika. Id-differenzi ta’ sensittività 
bejn is-sessi jistg ħu jkunu ġġudikati statistikament pere żempju b’test ta’ 
tabella χ 2 -r x 2. Sopravivenza tal-larvi u l-medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull 
larva għal kull re ċipjent għandha tkun ikkalkulata wara 10 jiem meta jkun 
meħtieġ. 
43. Konċentrazzjonijiet ta’ effetti espressi b ħala konċentrazzjonijiet fl-ilma ta’ 
fuq huma kkalkulati preferibbilment abba żi ta’ kon ċentrazzjonijiet imkejla 
fil-bidu tat-test (ara l-paragrafu 38).  
44. Biex tkun ikkomputata stima ta’ punti g ħall-EC  50 jew għal kull EC  x oħra, 
tista’ tintu ża statistika g ħal kull re ċipjent bħala replika vera. Biex ikun 
ikkalkulat intervall ta’ kunfidenza g ħal kull EC  x għandha titqies 
il-varjabbiltà fost re ċipjenti, jew g ħandu jintwera li din il-varjabbiltà tant 
tkun żgħira li tista’ ma titqisx. Meta l-mudell jitqieg ħed minn Least 
Squares, g ħandha tkun applikata trasformazzjoni g ħall-istatistika g ħal kull 
reċipjent biex titjieb l-omo ġeneità ta’ varjanza. I żda, valuri EC  x għandhom 
ikunu kkalkulati wara li r-rispons ikun ġie ttrasformat u ttie ħed lura g ħall- 
valur oriġinali.  
45. Meta l-anali żi ta’ statistika jkollha l-g ħan li tiddetermina NOEC/LOEC b’it ­
testjar ta’ ipote żi, il-varjabbiltà fost re ċipjenti je ħtiġilha titqies, e ż. 
b’ANOVA f’aktar stadji. Alternattivament, aktar testijiet robusti (21) 
jistgħu jkunu adatti f’sitwazzjonijiet fejn ikun hemm ksur 
tas-suppo żizzjonijiet tas-soltu ta’ ANOVA.  
Proporzjon ta’ evoluzzjoni  
46. Proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni huma dejta alternattiva mhux kontinwa, u 
jistgħu jkunu analizzati bit-test ta’ Cochran-Armitage applikat b’mod 
devoluttiv fejn tkun mistennija do ża-rispons monotonika u din id-dejta 
tkun konsistenti ma’ din l-istennija. Jekk le, jistg ħu jintużaw test e żatt ta’ 
Fisher jew dak ta’ Mantel-Haenszel b’valuri ‘p’ ta’ Bonferroni-Holm 
aġġustati. Jekk ikun hemm evidenza ta’ varjabbiltà akbar bejn replikati 
fl-istess kon ċentrazzjoni milli distribuzzjoni binomja tkun tindika (sikwit 
irriferuta b ħala varjazzjoni “extrabinomja”), mbag ħad għandhom jintu żaw 
test robust ta’ Cochran-Armitage jew dak e żatt ta’ Fisher kif propost fi (21).  
47. L-għadd ta’ pappamoski evoluti g ħal kull re ċipjent, ne, ikun iddeterminat u 
diviż bl-għadd ta’ larvi introdotti, na:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
fejn: 
ER = proporzjon ta’ evoluzzjoni  
n e = għadd ta’ pappamoski evoluti g ħal kull re ċipjent  
n a = għadd ta’ larvi introdotti g ħal kull re ċipjent  
48. Alternattiva li hija l-aktar adatta g ħal daqsijiet kbar ta’ kampjuni, meta jkun 
hemm varjanza extrabinomja, hija li l-proporzjon ta’ evoluzzjoni jkun ittrattat b ħala rispons kontinwu u li jintu żaw proċeduri bħat-test Williams 
meta tkun mistennija do ża-rispons monotonika u tkun konsistenti ma’ din 
id-dejta ta’ ER. It-test Dunnett ikun adatt fejn il-monotoni ċità ma tapplikax. 
Daqs kbir ta’ kampjun huwa ddefinit hawn b ħala l-għadd evolut, u l-g ħadd 
mhux evolut ukoll ikun aktar minn ħamsa, abba żi ta’ kull replika (re ċipjent).
 
49. Biex ikunu applikati metodi ta’ ANOVA, valuri ta’ ER g ħandhom l-ewwel 
ikunu ttrasformati bit-trasformazzjoni arcsin-sqrt jew bit-trasformazzjoni 
Freeman-Tukey biex tinkiseb distribuzzjoni normali approssimata u biex 
varjanzi jsiru ugwali. Jistg ħu jkunu applikati t-testijiet Cochran-Armitage, 
dak eżatt ta’ Fisher (Bonferroni), jew it-test ta’ Mantel-Haenszel meta 
jintużaw il-frekwenzi assoluti. It-trasformazzjoni arcsin-sqrt tkun applikata 
billi jittie ħed l-inverse sine (sin-1) tal-g ħerq kwadrat ta’ ER.  
50. Għal proporzjonijiet ta’ evoluzzjoni, valuri EC  x ikunu kkalkulati billi tintu ża 
analiżi ta’ rigressjoni (jew e ż. probit (22), logit, Weibull, softwer 
kummerċjali adatt, e ċċ.). Jekk anali żi ta’ rigressjoni tfalli (e ż. meta jkun 
hemm anqas minn żewġ risponsi parzjali), jintu żaw metodi mhux para ­
metriċi oħra bħal medja mobbli jew interpolazzjoni sempli ċi. 
Rata ta’ żvilupp  
51. Il-ħin medju ta’ żvilupp jirrappre żenta t-tul medju ta’ żmien bejn id-d ħul ta’ 
larvi (jum 0 tat-test) u l-evoluzzjoni tal-koorti sperimentali ta’ pappamoski. (Għall-kalkulazzjoni ta ż-żmien reali ta’ żvilupp, g ħandha titqies l-età 
tal-larvi fil-waqt tad-d ħul). Ir-rata ta’ żvilupp hija r-re ċiproka ta ż-żmien 
tal-iżvilupp (unità: 1/jum) u tirrappre żenta dik il-parti tal-i żvilupp tal-larva 
li sseħħ kuljum. Ir-rata ta’ żvilupp hija ppreferuta g ħall-evalwazzjoni ta’ 
dawn l-istudji dwar tossi ċità ta’ sediment min ħabba li l-varjanza tag ħha 
hija aktar baxxa, u hija aktar omo ġenja u eqreb distribuzzjoni normali kif 
imqabbla ma’ żmien ta’ żvilupp. G ħalhekk, jistg ħu jintużaw proċeduri ta’ 
test parametriku qawwija ma’ rata ta’ żvilupp milli ma’ żmien ta’ żvilupp. 
Għal rata ta’ żvilupp bħala reazzjoni kontinwa, jistg ħu jkunu stmati valuri 
EC
 x billi tintu ża analiżi ta’ rigressjoni (e ż. (23), (24)).  
52. Għat-testijiet ta’ statistika li ġejjin, l-għadd ta’ pappamoski osservati f’jum 
ta’ spezzjoni x ikunu pre żunti li jkunu evolvew fil-medja tal-intervall ta’ 
żmien bejn jum x u jum x-l (l = tul tal-intervall ta’ spezzjoni, is-soltu jum 
1). Ir-rata medja ta’ żvilupp għal kull re ċipjent (x) tkun ikkalkulata skont:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
fejn: 
x: rata medja ta’ żvilupp għal kull re ċipjent  
i: indiċi ta’ intervall ta’ spezzjoni  
m: għadd massimu ta’ intervalli ta’ spezzjoni  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : għadd ta’ pappamoski evoluti fl-intervall ta’ spezzjoni i  
n e : għadd totali ta’ pappamoski evoluti fit-tmiem tal-esperiment (=  P ƒ i ) 
x i : rata ta’ żvilupp tal-pappamoski evoluti f’intervall i  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
fejn: 
day  i : jum ta’ spezzjoni (jiem min ħabba applikazzjoni)  
l i : tul ta’ intervall ta’ spezzjoni i (jiem, is-soltu jum wie ħed) 
Rapport tat-test  
53. Ir-rapport tat-test g ħandu mill-anqas jipprovdi l-informazzjoni li ġejja: 
Sustanza g ħall-ittestjar:  
— natura fi żika u, fejn ikun rilevanti, proprjetajiet fi żikokimiċi (solubilità 
tal-ilma, pressjoni tal-fwar, koeffi ċjent tal-partizzjoni fil- ħamrija (jew 
fis-sediment jekk ikunu disponibbli), stabbiltà fl-ilma, e ċċ.); 
— dejta ta’ identifikazzjoni ta’ kimi ċi (isem komuni, isem tal-kimika, 
formula strutturali, Numru tal-CAS, e ċċ.) inklużi l-purezza u l-metodu 
għall-kwantifikazzjoni ta’ sustanza g ħall-ittestjar.  
Speċi tat-test:  
— annimali u żati għat-test: spe ċi, isem xjentifiku, sors ta’ organi żmi u 
kondizzjonijiet g ħat-trobbija;  
— informazzjoni dwar mani ġġar ta’ kwantitajiet ta’ bajd u larvi;  
— l-età tal-annimali tat-test meta jkunu dda ħħlu fir-reċipjenti tat-test.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— sediment u żat, jiġifieri sediment naturali jew formulat;  
— għal sediment naturali, post u deskrizzjoni ta’ sit ta’ te ħid ta’ kampjuni 
ta’ sediment, inklu ża, jekk ikun possibbli, storja ta’ kontaminazzjoni; 
karatteristi ċi: pH, kontenut ta’ karbonju organiku, proporzjon ta’ C/N 
u granulumetrija (skont kif jixraq).  
— tħejjija tas-sediment formulat: ingredjenti u karatteristi ċi (kontenut ta’ 
karbonju organiku, pH, rtubija, e ċċ. fil-bidu tat-test);  
— tħejjija tal-ilma tat-test (jekk jintu ża ilma rikostitwit) u karatteristi ċi 
(konċentrazzjoni tal-ossi ġnu, pH, konduttività, mel ħ minerali fl-ilma, 
eċċ. fil-bidu tat-test);  
— fond tas-sediment u ilma ta’ fuq;  
— volum tal-ilma ta’ fuq u tal-pori; pi ż ta’ sediment imxarrab bi jew 
mingħajr ilma tal-pori;  
— reċipjenti tat-test (materjal u daqs);  
— metodu ta’ t ħejjija ta’ soluzzjonijiet ta’ stokkijiet u kon ċentrazzjonijiet 
ta’ testijiet;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— applikazzjoni ta’ sustanza g ħall-ittestjar: kon ċentrazzjonijiet ta’ testijiet 
użati, għadd ta’ replikati u u żu ta’ solvent jekk ikun hemm;  
— kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni: temperatura, ċiklu ta’ dawl u intensità, 
tirwiħ (frekwenza u intensità);  
— informazzjoni dettaljata dwar g ħalf inkluż tip ta’ ikel, t ħejjija, ammont u 
reġim ta’ għalf. 
Riżultati:  
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-kon ċentrazzjonijiet imkejla 
tat-testijiet u r-ri żultati tal-analizi kollha biex tkun iddeterminata 
l-konċentrazzjoni tas-sustanza g ħall-ittestjar fir-re ċipjent tat-test;  
— il-kwalità tal-ilma fir-re ċipjenti tat-test, ji ġifieri pH, temperatura, ossi ġnu 
maħlul, melħ minerali fl-ilma u ammonja;  
— bdil ta’ ilma evaporat tat-test, jekk ikun hemm;  
— għadd ta’ pappamoski evoluti r ġiel u nisa g ħal kull reċipjent u g ħal kull 
jum; 
— għadd ta’ larvi li jkunu naqsu li jevolvu b ħala pappamoski g ħal kull 
reċipjent;  
— medja tal-pi ż fin-niexef ta’ kull larva g ħal kull reċipjent, u g ħal kull fażi, 
skont il-ka ż; 
— perċentwali ta’ evoluzzjoni g ħal kull replika u kon ċentrazzjoni tat-test 
(pappamoski r ġiel u nisa mi ġburin flimkien);  
— rata medja ta’ żvilupp ta’ pappamoski żviluppati g ħalkollox g ħal kull 
replika u rata ta’ trattament (pappamoski r ġiel u nisa mi ġburin flimkien);  
— stimi ta’ punti ta’ tmiem tossi ċi eż. CEx (u intervalli asso ċjati ta’ kunfi ­
denza), NOEC u/jew LOEC u l-metodi ta’ statistika u żati għad-deter­
minazzjoni tag ħhom;  
— diskussjoni tar-ri żultati, inklu ża kull influwenza fuq il-konklu żjonijiet 
tar-riżultati tat-testijiet minn devjazzjonijiet minn dan il-Metodu ta’ 
Ttestjar.  
LETTERATURA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Devel­
opment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA 
Workshop held in the Netherlands.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invert ­
ebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Kanada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first 
edition dated June 1994.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invert ­
ebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Kanada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insec ­
ticides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and 
Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Kanada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
(14) Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità għal Ħniex,  
(15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a żero dose control. Biometrics 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a żero 
dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48:577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling 
continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Għall-fini ta’dan il-metodu jintu żaw id-definizzjonijiet li ġejjin:  
Sediment ifformulat  jew sediment rikostitwit, artifi ċjali jew sintetiku, huwa 
taħlita ta’ materjali li jintu żaw biex jimitaw l-komponenti fi żiċi ta’ sediment 
naturali.  
Ilma ta’ fuq  huwa l-ilma li jitqieg ħed fuq sediment fir-re ċipjent tat-test.  
Ilma interstizjali  jew ilma tal-pori huwa l-ilma li jokkupa l-ispazju bejn 
sediment u parti ċelli tal-ħamrija.  
Ilma fortifikat  huwa l-ilma tat-test li mieg ħu tkun ġiet miżjuda s-sustanza g ħall- 
ittestjar.  
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Appendiċi 2 
Rakkomandazzjonijiet g ħal kultura ta’  Chironomus riparius  
1. Larvi ta’  Chironomus  jistgħu jitkabbru f’dixxijiet ta’ kristallizzazzjoni jew 
f’kontenituri akbar. Ramel fin tal-quartz jitferrex f’saff irqiq ta’ madwar 5 as 10 mm fond fuq il-qieg ħ tal-kontenitur. Kieselguhr (e ż. Merck, Art 
8117) ukoll intwera li huwa substrat adatt (saff irqaq ta’ sa ftit ħafna 
mm ikun bi żżejjed). Wara ji żdied ilma adattat g ħal fond ta’ diversi cm. 
Il-livelli tal-ilma g ħandhom jimtlew kull meta huwa me ħtieġ biex jieħdu 
post it-telf li jirri żulta mill-evaporazzjoni, u jkun ta’ repevenzjoni kontra 
d-dessekazzjoni. L-ilma jista’ jinbidel jekk ikun me ħtieġ. Għandu jkun 
ipprovdut tirwi ħ bil-mod. Ir-re ċipjenti g ħat-tkabbir tal-larvi g ħandhom 
jinżammu f’ga ġġa apposta li ma t ħallix li l-adulti li jkunu qed jevolvu 
jaħarbu. Il-ga ġġa għandha tkun kbira bi żżejjed biex adulti evoluti ma jit ħ­
allewx jimir ħu fi qtajja kbar, g ħax inkella tista’ ma ssirx kopulazzjoni (il- 
minimu huwa ta’ madwar 30 x 30 x 30 cm).
 
2. Gaġeġ għandhom jin żammu f’temperatura ambjentali jew f’kamra ambjent ­
alment kostanti ta’ 20 + 2 °C b’perjodu fotografiku ta’ 16-il sieg ħa dawl 
(intensità madwar 1 000 lux), 8 sig ħat dlam. Kien irrapportat li umdità 
tal-arja ta’ anqas minn 60 % RH tista’ tfixkel ir-riproduzzjoni.  
Ilma ta’ dilwizzjoni  
3. Jista’ jintu ża kull ilma tajjeb naturali jew sintetiku. Komunement jintu żaw 
ilma tal-bir, ilma tal-vit li jkun tne ħħielu l-kloru u midja artifi ċjali (eż. 
il-midjum Elendt “M4” jew “M7”, ara hawn ta ħt). L-ilma g ħandu 
jitrewwaħ qabel ma jintu ża. Jekk ikun me ħtieġ, l-ilma tal-kultura jista’ 
jiġġedded billi l-ilma u żat jitferra’ jew jg ħaddi minn ġo sifun minn 
reċipjenti ta’ kultura b’attenzjoni ming ħajr ma jinqerdu t-tubi tal-larvi.  
Tmigħ tal-larvi  
4. Larvi ta’  Chironomus  għandhom jintemg ħu ikel ta’ trofof tal- ħut (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® jew marka simili o ħra ta’ ikel tal- ħut proprjetarju), 
f’bejn wie ħed u ieħor 250 mg g ħal kull re ċipjent kuljum. Dan jista’ 
jingħata bħala trab mit ħun niexef jew b ħala sospensjoni fl-ilma: 1,0 g ta’ 
ikel ta’ trofof ji żdied ma’ 20 ml ta’ ilma ta’ dilwizzjoni u jit ħallat biex 
jagħti taħlita omoġenja. Din it-t ħejjija tista’ tintema’ f’rata ta’ madwar 5 ml 
għal kull reċipjent kuljum (ixxejkja qabel ma tu ża). Larvi li jkollhom aktar 
żmien jistg ħu jirċievu aktar.  
5. It-tmig ħ jista’ jiġi aġġustat skont il-kwalità tal-ilma. Jekk il-midjum ta’ 
kultura ‘jissa ħħab’, it-tmig ħ għandu jitnaqqas. Żidiet ta’ ikel g ħandhom 
ikunu mmonitorjati b’attenzjoni. Ikel mill-anqas jikkaw ża tluq tal-larvi 
lejn il-kolonna tal-ilma, u ħafna ikel jikkaw ża aktar attività mikrobika u 
konċentrazzjonijiet tal-ossi ġnu mnaqqsin. I ż-żewġ kondizzjonijiet jistg ħu 
jġibu magħhom rati ta’ tkabbir imnaqqas.  
6. Xi ċelluli ta’ alka ħadra (eż. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) 
jistgħu wkoll ji żdiedu meta jitqieg ħdu f’reċipjenti ġodda ta’ kultura.  
Tmigħ ta’ adulti evoluti  
7. Xi w ħud minn dawk li jag ħmlu esperimenti ssu ġġerew li kuxxinett tat-tajjar 
mgħaddas f’soluzzjoni saturata tas-sukro żju jista’ jservi ta’ ikel g ħal adulti 
evoluti.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Emerġenza  
8. F’20 + 2 °C adulti jibdew jevolvu mir-re ċipjenti għat-tkabbir tal-larvi wara 
bejn wieħed u ieħor 13 - 15-il jum. L-ir ġiel jintgħarfu malajr g ħax ikollhom 
antenni kollha pjumi.  
Kwantitajiet ta’ bajd  
9. Malli l-adulti jkunu fil-ga ġġa tat-trobbija, ir-re ċipjenti kollha g ħat-tkabbir 
tal-larvi g ħandhom ikunu e żaminati tliet darbiet fil- ġimgħa għal tqegħid ta’ 
kwantitajiet ta’ bajd qisu ġelatina. Jekk ikun hemm, il-kwantitajiet ta’ bajd 
għandhom jitne ħħew b’attenzjoni. Il-bajd g ħandu jkun ittrasferit g ħal ġo 
dixx żgħir li jkun fih kampjun tal-ilma tat-trobbija. Kwantitajiet ta’ bajd 
jintużaw biex jinbeda re ċipjent ġdid ta’ kultura (e ż. 2 - 4 kwantitajiet ta’ 
bajd/reċipjent) jew biex jintu żaw għal testijiet tat-tossi ċità. 
10. Larvi tal-ewwel fa żi għandhom ifaqqsu wara 2 - 3 ijiem.  
Reċipjenti ġodda ta’ kultura  
11. Malli jkunu stabbiliti kulturi g ħandu jkun possibbli li jitqieg ħed reċipjent 
ġdid ta’ kultura tal-larvi kull ġimgħa jew anqas ta’ spiss skont ħtiġijiet ta’ 
ttestjar, billi jitne ħħew ir-reċipjenti aktar qodma wara li jkunu evolvew 
pappamoski adulti. Bl-u żu ta’ din is-sistema jkun hemm provvista 
regolari ta’ adulti b’anqas mani ġġar. 
Tħejjija ta’ soluzzjonijiet tat-testijiet “M4” u “M7”  
12. Elendt (1990) iddeskriva l-midjum “M4”. Il-midjum “M7” jit ħejja bħala 
l-midjum “M4” ħlief għas-sustanzi indikati fit-Tabella 1, li g ħalihom kon ċ­
entrazzjonijiet ikunu erba’ darbiet aktar baxxi f’“M7” milli f’“M4”. Qed 
titħejja pubblikazzjoni dwar il-midjum “M7” (Elendt, komunikazzjoni 
personali). Is-soluzzjoni tat-test ma g ħandhiex tkun ippreparata skont 
Elendt u Bias (1990) g ħall-konċentrazzjonijiet ta’ NaSiO3 5 H  2 O, 
NaNO3, KH2PO4 u K2HPO4 mog ħtija għall-preparazzjoni 
tas-soluzzjonijiet stokk mhumiex adegwati.  
Tħejjija tal-midjum “M7”  
13. Each soluzzjoni ta’ stokkijiet (I) tit ħejja waħda waħda u soluzzjoni ta’ 
stokkijiet flimkien (II) tit ħejja minn dawn is-soluzzjonijiet ta’ 
stokkijiet (I) (ara Tabella 1). 50 ml mis-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
flimkien (II) u l-ammonti ta’ kull soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ makronu ­
trijenti li jidhru fit-Tabella 2 huma mag ħmulin minn sa 1 l ta’ ilma dejo ­
nizzat biex jit ħejja l-midjum “M7”. Tit ħejja soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ 
vitamini billi ji żdiedu tliet vitamini mal-ilma dejonizzat kif indikat 
fit-Tabella 3, u ji żdied 0,1 ml tas-soluzzjoni ta’ stokkijiet flimkien ta’ 
vitamini mal-midjum “M7” finali ftit qabel ma jintu ża. (Is-soluzzjoni ta’ 
stokkijiet ta’ vitamini tin ħażen iffriżata f’alikwoti żgħar). Il-midjum 
jitrewwaħ u jkun stabbilizzat.  
Tabella 1  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ mikroelementi g ħall-midjum M4 u M7  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) Ammont (mg) 
magħmul minn 
sa 1 litru ta’ ilma 
dejonizzat Biex tħejji s-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
flimkien (II): ħallat l-ammonti li 
ġejjin (ml) ta’ soluzzjonijiet ta’ 
stokkijiet (I) u ag ħmel sa 1 litru ta’ 
ilma dejonizzat Konċentrazzjonijiet finali 
f’soluzzjonijiet tat-testijiet (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet (I) Ammont (mg) 
magħmul minn 
sa 1 litru ta’ ilma 
dejonizzat Biex tħejji s-soluzzjoni ta’ stokkijiet 
flimkien (II): ħallat l-ammonti li 
ġejjin (ml) ta’ soluzzjonijiet ta’ 
stokkijiet (I) u ag ħmel sa 1 litru ta’ 
ilma dejonizzat Konċentrazzjonijiet finali 
f’soluzzjonijiet tat-testijiet (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Dawn is-sustanzi huma differenti f’M4 u f’M7, kif indikat hawn ta ħt. 
( 2 ) Dawn is-soluzzjonijiet jit ħejjew wa ħda waħda, mbag ħad jitferrg ħu flimkien u ji ġu pproċessati minnufih f’awtoklav (re ċipjent li 
jingħalaq awtomatikament).  
Tabella 2  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet ta’ makronutrijenti g ħall-midjum M4 u M7  
Ammont mag ħmul 
minn sa 1 litru ta’ ilma 
dejonizzat 
(mg) Ammont ta’ soluzzjonijiet 
ta’ stokkijiet ta’ makronu ­
trijenti mi żjudin biex 
jitħejja midjum M4 and M7 
(ml/l) Konċentrazzjonijiet 
finali f’soluzzjonijiet 
tat-testijiet M4 u M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabella 3  
Soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ vitamini g ħall-midjum M4 u M7  
It-tliet soluzzjonijiet kollha ta’ vitamini jing ħaqdu flimkien biex jag ħmlu soluzzjoni wa ħda ta’ 
stokkijiet ta’ vitamini.  
Ammont mag ħmul minn 
sa 1 litru ta’ ilma dejo ­
nizzat 
(mg) Ammont ta’ soluzzjoni ta’ 
stokkijiet ta’ vitamini 
miżjudin biex jit ħejja midjum 
M4 u M7 
(ml/l) Konċentrazzjonijiet 
finali f’soluzzjonijiet 
tat-testijiet M4 u M7 
(mg/l)  
Kloridrat tat-tijamina 750 0,1 0,075 
Ċjanokobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 
Bijotina 7,5 0,1 0,00075  
LETTERATURA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Appendiċi 3 
TĦEJJIJA TA’ SEDIMENT FORMULAT  
Kompożizzjoni tas-sediment  
Il-kompożizzjoni tas-sediment formulat g ħandha tkun kif ġej: 
Kostitwent Karatteristi ċi % ta’ sediment 
piż fin-niexef  
Pit Pit ta’ ħażiż Sphagnum, qrib 
kemm jista’ jkun ta’ pH 5,5- 6,0 mingħajr ma tibqa’ tidher 
il-pjanta, mit ħun fin (par ­
tiċelli ta’ daqs ≤ 1 mm) u 
mnixxef bl-arja 4-5 
Ramel tal-quartz Daqs ta’ ramla: > 50 % 
tal-partiċelli għandhom ikunu 
fil-firxa ta’ 50-200 μm 75-76 
Tafal tal-kawlina Kontenut ta’ kawlina ≥ 30 % 20 
Karbonju organiku A ġġustat biż-żieda ta’ pit u 
ramel 2 (±0,5) 
Karbonat tal-kal ċju CaCO
 3 ,pulverizzat, kemi ­
kament pur 0,05 - 0,1 
Ilma Konduttività ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Tħejjija  
Il-pit jitnixxef bl-arja u jinta ħan fi trab fin. Tit ħejja sospensjoni tal-ammont 
meħtieġ ta’ trab tal-pit f’ilma dejonizzat billi jintu ża apparat ta’ omo ġeneiz­
zazzjoni ta’ prestazzjoni g ħolja. Il-pH ta’ din is-sospensjoni ji ġi aġġustat sa 5,5 
± 0,5 b’CaCO  3 . Is-sospensjoni ti ġi kkondizzjonata g ħal mill-anqas jumejn billi 
titħawwad bil-mod f’20 ± 2 °C, biex il-pH isir stabbli u jistabbilixxi komponent 
mikrobiku stabbli. Il-pH jer ġa’ jitkejjel u g ħandu jkun 6,0 ± 0,5. Mbag ħad 
is-sospensjoni tal-pit tit ħallat mal-kostitwenti l-o ħra (ramel u tafal tal-kawlina) 
u ma’ ilma dejonizzat biex jinkiseb sediment omo ġenju b’kontenut ta’ ilma 
f’firxa ta’ 30-50 % tal-pi ż fin-niexef tas-sediment. Il-pH tat-ta ħlita finali jer ġa’ 
jitkejjel g ħal darb’o ħra u jiġi aġġustat għal 6,5 sa 7,5 b’CaCO  3 jekk ikun 
meħtieġ. Jittieħdu kampjuni tas-sediment biex ikun iddeterminat il-pi ż 
fin-niexef u l-kontenut ta’ karbonju organiku. Mbag ħad, qabel ma jintu ża 
fit-test tat-tossi ċità tal-kironomidi, huwa rrakkomandat li s-sediment formulat 
ikun ikkondizzjonat g ħal sebat ijiem ta ħt l-istess kondizzjonijiet li jkun hemm 
fit-test sussegwenti.  
Ħżin 
Il-kostitwenti nixfin g ħat-tħejjija tas-sediment artifi ċjali jistgħu jinħażnu f’post 
niexef u frisk f’temperatura ambjentali. Is-sediment formulat (mxarrab) 
m’għandux jin ħażen qabel ma jsir u żu minnu fit-test. G ħandu jintu ża minnufih 
wara l-perjodu ta’ kondizzjonament ta’ 7 ijiem li jtemm it-t ħejjija tieg ħu. 
LETTERATURA:  
Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness. Tossi ċità għal Ħniex.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Appendiċi 4 
Karatteristi ċi kimiċi ta’ ilma ta’ dilwizzjoni a ċċettbbli  
Sustanza Kon ċentrazzjonijiet  
Materja partikulata < 20 mg/l 
Karbonju organiku totali < 2 mg/l Ammonja mhux jonizzata < 1 μg/l 
Ebusija b ħala CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Kloru residwali < 10 μg/l 
Pestiċidi organofosforu żi totali < 50 ng/l 
Pestiċidi organoklori ċi totali flimkien ma’ polikloro ­
bifenili < 50 ng/l 
Kloru organiku totali < 25 ng/l  
(*) Iżda għandu jkun innotat li jekk ikun hemm suspett ta’ interazzjoni bejn joni tal-mel ħ 
minerali fl-ilma u s-sustanza g ħall-ittestjar, g ħandu jintu ża ilma b’anqas mel ħ minerali 
(u għalhekk, m’g ħandux jintu ża l-midjum Elendt M4 f’din is-sitwazzjoni).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Appendiċi 5 
Gwida għall-monitora ġġ tal-evoluzzjoni ta’ larvi kironomidi  
Sifuni ta’ evoluzzjoni jitqieg ħdu fuq il-bekkijiet tat-test. Dawn is-sifuni jkunu 
meħtieġa mill-20 jum sa meta jintemm it-test. E żempju ta’ sifun li jintu ża huwa 
pinġut hawn ta ħt:
 
A: l-iskrijn tan-nylon  
B: il-kikkri tal-plastik maqluba  
C: il-bekk ta’ espo żizzjoni ming ħajr xoffa  D: il-portijiet tal-iskrijn li jibdlu l-ilma  
E: ilma  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  BIJODEGRADABBILTÀ FA ĊLI - CO  2 F’REĊIPJENTI 
SSIĠILLATI (TEST TA’ SPAZJU FUQ)  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħall-Linja Gwida 
tat-Test (TG) 310 (2006) tal-OECD. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa 
metodu ta’ tg ħarbil għall-evalwazzjoni tal-bijodegradabbiltà fa ċli ta’ kimi ċi 
u jipprovdi informazzjoni simili g ħas-sitt metodi ta’ ttestjar deskritti 
fil-kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness A sa F. G ħalhekk kimika li turi ri żultati 
pożittivi f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar tista’ titqies bijodegradabbli fa ċilment 
fl-ambjent.  
2. Il-metodu stabbilit sewwa tad-dijossidu tal-karbonju (CO  2 ) (1), ibba żat fuq 
it-test ori ġinali ta’ Sturm (2) g ħall-valutazzjoni tal-bijodegradabbiltà ta’ 
kimiċi organiċi, bil-kejl tad-diossidu tal-karbonju prodott minn azzjoni 
mikrobika, normalment kien l-ewwel g ħażla għall-ittestjar ta’ kimi ċi li ftit 
jinħallu u ta’ dawk li jassorbu ħafna. Il-metodu jintg ħażel ukoll g ħal kimiċi 
li jinħallu (iżda li mhumiex volatili), min ħabba li l-evoluzzjoni tad-diossidu 
tal-karbonju titqies minn ħafna li hija l-unika prova inekwivoka ta’ attività 
mikrobika. It-tne ħħija ta’ karbonju organiku ma ħlul tista’ ssir bi pro ċessi 
fiżikokimiċi - sorbiment, volatilizzazzjoni, pre ċipitazzjoni, idroli żi - kif ukoll 
b’azzjoni mikrobika, u ħafna reazzjonijiet mhux bijolo ġiċi jikkunsmaw 
ossiġnu; CO  2 rarament ikun prodott minn kimi ċi organiċi b’mod abijotiku. 
Fit-test ori ġinali u modifikat ta’ Sturm (1)(2) CO  2 jitneħħa mill-fażi likwida 
għal ġor-reċipjenti ta’ assorbiment b’tixrix (ji ġifieri arja kollha b żieżaq 
ittrattata biex tne ħħi CO  2 permezz tal-midjum likwidu), filwaqt li 
fil-verżjoni ta’ Larson (3)(4) CO  2 jiġi ttrasferit mir-re ċipjent ta’ reazzjoni 
għal ġor-reċipjenti ta’ assorbiment billi l-arja ming ħajr CO  2 tgħaddi 
mill-Ispazju Fuq u, addizzjonalment, ir-re ċipjent tat-test ji ġi xxejkjat kontin ­
wament. Fil-modifika ta’ Larson biss ir-re ċipjent ta’ reazzjoni ji ġi xxejkjat; 
it-taħwid huwa spe ċifikat biss g ħal sustanzi li ma jin ħallux f’ISO 9439 (5) u 
fil-verżjoni oriġinali tal-US (6), li t-tnejn li huma jispe ċifikaw it-tixrix milli 
l-bdil tal-Ispazju Fuq. F’metodu uffi ċjali ieħor ta’ EPA tal-US (7) ibba żat 
fuq il-metodu ta’ Gledhill (8), ir-re ċipjent ta’ reazzjoni xxejkjat jing ħalaq 
għall-atmosfera u CO  2 prodott jin ġabar f’sifun tal-aklalina direttament 
mill-fażi gassuża, bħal fi fliexken klassi ċi ta’ respiromiter ta’ Warburg/Bar ­
croft.  
3. Iżda karbonju inorganiku (IC) intwera li jakkumula fil-midjum matul 
l-applikazzjoni tat-test Sturm standard, modifikat g ħal għadd ta’ kimi ċi 
(9). Kienet instabet kon ċentrazzjoni ta’ IC g ħolja daqs 8 mg/l matul 
id-degradazzjoni ta’ 20 mg C/l ta’ anilina. G ħalhekk il- ġbir ta’ CO  2 
fis-sifuni tal-aklalina ma kienx jirrifletti verament l-ammont ta’ CO  2 
prodott mikrobijolo ġikament f’ ħinijiet intermedji matul id-degradazzjoni. 
Minħabba dan, l-ispe ċifikazzjoni li > 60 % tal-produzzjoni ta’ CO  2 
massimu teoretiku (ThCO  2 ) għandha tin ġabar f’“perjodu ta’ 10-d” (l-10 
ijiem li ji ġu minnufih wara li tinkiseb 10 % ta’ bijodegradazzjoni) biex 
kimika għall-ittestjar tkun ikklassifikat b ħala li tiddegrada malajr bijolo ġi­
kament, ma tit ħarisx għal xi kimi ċi li jkunu hekk ikklassifikati bl-u żu 
tat-tneħħija ta’ karbonju organiku ma ħlul (DOC).  
4. Meta l-per ċentwali ta’ degradazzjoni tkun valur aktar baxx milli mistenni, 
IC ikun possibbilment akkumulat fis-soluzzjoni tat-test. Mbag ħad 
id-degradabbiltà tista’ tkun ivvalutata mat-testijiet l-o ħra lesti 
tal-bijodegradabbiltà.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Żvantaġġi oħra tal-metodolo ġija Sturm (goffa, tie ħu ż-żmien, aktar suxxet ­
tibbli għal żbalji sperimentali u mhix applikabbli g ħal kimiċi volatili) aktar 
qabel kienu ġiegħlu li ssir tfittxija g ħal teknika ta’ re ċipjent issi ġillat, barra 
dak ta’ Gledhill, aktarx milli fluss ta’ gass kontinwu (10)(11). Boatman et al (12) eżaminaw mill- ġdid il-metodi ta’ qabel u adottaw sistema ta’ Spazju 
Fuq mag ħluq li biha CO
 2 tħalla joħroġ fl-Ispazju Fuq fit-tmiem ta’ inku ­
bazzjoni b’a ċidifikazzjoni tal-midjum. CO  2 tkejjel b’anali żi 
tal-kromatografija tal-gass (GC)/IC f’kampjuni me ħudin awtomatikament 
tal-Ispazju Fuq i żda ma tqisx il-karbonju inorganiku ma ħlul (DIC) fil-fa żi 
likwida. Ir-re ċipjenti użati wkoll kienu żgħar ħafna (20 ml) u kienu jesg ħu 
biss 10 ml ta’ midjum, li ħolqu problemi e ż. meta jiżdiedu l-ammonti bilfors 
żgħar ħafna ta’ kimi ċi għall-ittestjar li ma jin ħallux, u/jew meta jista’ ma 
jkunx hemm mikroorgani żmi biżżejjed jew ebda minnhom fil-midjum 
imlaqqam li jkunu jistg ħu jiddegradaw kimi ċi għall-ittestjar.  
6. Dawn id-diffikultajiet intg ħielbu mill-istudji indipendenti ta’ Struijs u Stol ­
tenkamp (13) u ta’ Birch u Fleccher (14), dawn tal-a ħħar kienu ispirati 
mill-esperjenza tag ħhom ma’ apparat u żat fit-test anaerobiku ta’ bijodegra ­
dazzjoni (15). Fl-ewwel metodu (13) CO  2 jitkejjel fl-Ispazju Fuq wara 
aċidifikazzjoni u ekwilibrazzjoni, filwaqt li f’tal-a ħħar (14) DIC kemm 
fil-fażi gassuża kif ukoll f’dik likwida tkejjel ming ħajr trattament; aktar 
minn 90 % ta’ IC ifformat kien jinsab fil-fa żi likwida. I ż-żewġ metodi 
kellhom vanta ġġi fuq it-test Sturm g ħaliex is-sistema ta’ ttestjar kienet 
aktar kompatta u mmani ġġabbli, kimi ċi volatili jistg ħu jiġu ttestjati u tkun 
evitata l-possibbiltà ta’ dewmien biex jitkejjel CO  2 prodott.  
7. Iż-żewġ approċċi ngħaqdu f’CO  2 Standard tal-ISO fl-Ispazju Fuq (16), li 
għadda mir-ringtest (17) u huwa dan l-Istandard li jifforma l-ba żi ta’ dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar. Bl-istess mod, i ż-żewġ approċċi kienu u żati fl-EPA 
tal-US (18). Kienu rrakkomandati żewġ metodi ta’ kejl ta’ CO  2 , jiġifieri 
CO 2 fl-Ispazju Fuq wara a ċidifikazzjoni (13) u ta’ IC fil-fa żi likwida wara 
ż-żieda ta’ alkali żejda. Dan l-a ħħar metodu kien introdott minn Peterson 
matul ir-ring test CONCAWE (19) ta’ dan il-Metodu ta’ Spazju Fuq modifikat biex ikejjel il-bijodegradabbiltà inerenti. Il-bidliet mag ħmulin 
fir-reviżjoni tal-1992 (20) tal-metodi fil-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness 
għal Bijodegradabbiltà Fa ċli kienu inkorporati f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar, 
biex il-kondizzjonijiet (midjum, durata, e ċċ.) ikunu xort’o ħra l-istess b ħal 
dawk fit-test Sturm rivedut (20). Birch u Fletcher (14) urew li kienu nkisbu 
riżultati jixxieb ħu ħafna b’dan it-test ta’ Spazju Fuq b ħalma kienu nkisbu 
bl-istess kimi ċi fir-Ring Test tal-OECD (21) tal-Metodi ta’ Ttestjar riveduti.
 
PRINĊIPJU TAT-TEST  
8. Il-kimika g ħall-ittestjar, normalment f’20 mg C/l, b ħala s-sors wa ħdani ta’ 
karbonju u ener ġija, tkun inkubata f’midjum ta’ lqug ħ ta’ melħ minerali li 
jkun tlaqqam bi kwantità m ħallta ta’ mikroorgani żmi. It-test isir fi fliexken 
issiġillati bi Spazju Fuq ta’ arja li jipprovdi ri żerva ta’ ossi ġnu għal bijode­
gradazzjoni aerobika. L-evoluzzjoni ta’ CO  2 li tiġi mill-bijodegradazzjoni 
aerobika finali tal-kimika g ħall-ittestjar tkun iddeterminata bil-kejl ta’ IC 
prodott fil-fliexken tat-test i żjed minn dak prodott f’re ċipjenti in bjank li 
jkun fihom biss midjum imlaqqam. Kemm ikun hemm bijodegradazzjoni 
jkun espress b ħala perċentwali tal-produzzjoni ta’ IC massimu teoretiku 
(ThIC), ibba żat fuq il-kwantità ta’ kimika g ħall-ittestjar (b ħala karbonju 
organiku) mi żjud fil-bidu.  
9. Tista’ wkoll titkejjel it-tne ħħija ta’ DOC u/jew kemm ikun hemm bijode ­
gradazzjoni primarja tal-kimika g ħall-ittestjar (20).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMAZZJONI DWAR IL-KIMIKA G ĦALL-ITTESTJAR  
10. Il-kontenut ta’ karbonju organiku (% w/w) tal-kimika g ħall-ittestjar je ħtieġlu 
jkun mag ħruf, mill-istruttura kimika tieg ħu jew mill-kejl, biex tkun ikkal ­
kulata d-degradazzjoni. G ħal kimiċi volatili ta’ ttestjar, il-kostant imkejjel 
jew ikkalkulat tal-li ġi ta’ Henry jkun utli biex ikun iddeterminat proporzjon 
adatt ta’ Spazju Fuq ma’ volum ta’ likwidu. Informazzjoni dwar it-tossi ċità 
tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal mikroorgani żmi tkun utli fl-g ħażla ta’ kon ċen­
trazzjoni adatta tat-test u g ħall-interpretazzjoni ta’ ri żultati li juru bijodegrad ­
abbiltà fqira: huwa rrakkomandat li jkun inklu ż il-kontroll tal-inibizzjoni 
sakemm ma jkunx mag ħruf li l-kimika g ħall-ittestjar ma tkunx inibitorja 
għal attivitajiet mikrobi ċi (ara l-paragrafu 24).  
APPLIKABBILTÀ TAL-METODU  
11. It-test ikun applikabbli g ħal kimiċi għall-ittestjar li ma jin ħallux, għalkemm 
għandu jkun żgurat tixrid sewwa tal-kimika g ħall-ittestjar. Bl-u żu 
tal-proporzjon rakkomandat ta’ Spazju Fuq ma’ volum ta’ likwidu ta’ 1:2, 
jistgħu jkunu ttestjati kimi ċi volatili bil-kostant tal-li ġi ta’ Henry ta’ sa 50 
Pa.m  3 .mol  –1 minħabba li l-proporzjon ta’ kimika g ħall-ittestjar fl-Ispazju 
Fuq ma jkunx aktar minn 1 % (13). Jista’ jintu ża volum i żgħar ta’ Spazju 
Fuq meta jkunu ttestjati kimi ċi, li jkunu aktar volatili, i żda d-disponibbiltà 
bijoloġika tista’ tillimita l-aktar jekk dawn ikunu ftit jin ħallu fl-ilma. I żda 
dawk li ju żawh għandhom ji żguraw li l-proporzjon tal-Ispazju Fuq ma’ 
volum ta’ likwidu u l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar ikunu hekk 
li jkun hemm ossi ġnu biżżejjed biex tit ħalla ssir bijodegradazzjoni aerobika 
sħiħa (eż. evita li tu ża konċentrazzjoni g ħolja ta’ substrat u volum żgħir ta’ 
Spazju Fuq). Gwida dwar dan tinsab fi (13)(23).  
KIMIĊI TA’ REFERENZA  
12. Biex tkun e żaminata l-pro ċedura tat-test, g ħandha tkun ittestjata kimika ta’ 
referenza ta’ bijodegradabbiltà mag ħrufa b’mod parallel. G ħal dan il-g ħan 
jistgħu jintużaw anilina, ben żoat tas-sodju jew glikol tal-etilen meta jkunu 
ttestjati kimi ċi għall-ittestjar li jin ħallu fl-ilma u ottanol-1 g ħal kimiċi għall- 
ittestjar li ftit jin ħallu (13). Il-bijodegradazzjoni ta’ dawn il-kimi ċi għandha 
tilħaq > 60 % ThIC fi żmien 14-il jum.  
RIPRODU ĊIBBILTÀ  
13. Fir-ring test tal-ISO tal-metodu (17), ir-ri żultati li ġejjin inkisbu bl-u żu 
tal-kondizzjonijiet irrakkomandati, inklu ż test C ta’ kimika/1 ta’ 20 mg.  
Kimika g ħall- 
ittestjar Perċentwali medju 
ta’ bijodegradazzjoni 
(28d) Koeffiċjent ta’ 
varjazzjoni 
(%) Għadd ta’ 
Laboratorji  
Anilina 90 16 17 
Ottanol-1 85 12 14  
Il-varjabbiltà (replikabbiltà) fit-test, bl-u żu tal-anilina, kienet baxxa b’koef ­
fiċjenti ta’ varjabbiltà mhux akbar minn 5 % f’kull test li sar. Fi ż-żewġ 
każijiet li fihom ir-replikabbiltà kienet ag ħar, il-varjabbiltà akbar aktarx 
kienet dovuta min ħabba produzzjoni g ħolja ta’ IC fl-in bjanki. 
Ir-replikabbiltà kienet ag ħar b’ottanol-1 i żda kienet g ħadha anqas minn 
10 % għal 79 % ta’ testijiet li saru. Din il-varjabbiltà akbar fit-test setg ħet 
kienet dovuta min ħabba żbalji fid-do żar, minħabba li kellu jkun injettat 
volum żgħir (3 sa 4 μl) ta’ ottanol-1 fi fliexken tat-test issi ġillati. Koef ­
fiċjenti ogħla tal-varjazzjoni jirri żultaw meta jintu żaw konċentrazzjonijiet 
iktar baxxi tal-kimika g ħall-ittestjar, spe ċjalment f’kon ċentrazzjonijiet li 
huma inqas minn 10 mg C/l. Dan jista’ jing ħeleb parzjalment billi 
titnaqqas il-kon ċentrazzjoni tal-karbonju inorganiku totali (TIC) fit-tilqima.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. F’ring-test tal-UE (24) ta’ ħames tensjoattivi mi żjudin f’10 mg C/l, nkisbu 
r-riżultati li ġejjin:  
Kimika g ħall-ittestjar Perċentwali medju 
ta’ bijodegradazzjoni 
(28d) Koeffiċjent ta’ 
varjazzjoni 
(%) Għadd ta’ 
laboratorji  
Tetrapropilin 
Sulfonat tal-ben żen 17 45 10 
Suċċinat ta’ di-iso-ottil 
sulfoniku 
(anjoniku) 72 22 9 
Klorur tal-ammonja 
eżadeċil-trimetil (*) 
(katjoniku) 75 13 10 
Iso-Nonilfenol 
-(etossilat)  9 
(mhux joniku) 41 32 10 
Sulfobetaina tal- 
Kako-amid-propil 
tal-idrossi tad-dimetil 
(amfoterika) 60 23 11  
(*) Kien mi żjud SiO  2 biex jinnewtralizza t-tossi ċità. 
Ir-riżultati juru li ġeneralment il-varjabbiltà kienet og ħla għall-aġenti tens­
joattivi anqas iddegradati sewwa. Varjabbiltà fit-test kienet anqas minn 15 % 
għal aktar minn 90 % tal-ka żijiet, bl-og ħla tilħaq 30-40 %.  
NOTA: Kwa żi l-aġenti tensjoattivi kollha mhumiex spe ċi molekulari 
waħda iżda huma ta ħlitiet ta’ isomeri, omologi, e ċċ. li jiddegradaw 
wara perjodi differenti ta’ intervalli karatteristi ċi u b’rati kineti ċi 
differenti li jirri żultaw f’kurvi “m ċajprin”, estenwati, biex is-60 % 
tal-valur ta’ pass ma jintla ħaqx “fil-perjodu ta’ 10-d”, anki jekk 
kull speċi molekulari g ħaliha waħidha tilħaq > 60 % fi żmien 10 
jiem jekk tkun ittestjata wa ħidha. Dan jista’ jkun osservat ukoll 
f’taħlitiet oħra kumplessi.  
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Apparat  
15. Apparat normali tal-laboratorju u:  
(a) Fliexken tas-serum tal- ħġieġ, issiġillati b’tappijiet tal-lastku tal-butil u 
siġilli tal-aluminju li je ħel. Id-daqs rakkomandat huwa 125 ml li jkollu 
volum totali ta’ madwar 160 ml (f’dan il-ka ż il-volum ta’ kull flixkum 
għandu jkun mag ħruf li huwa 160 ± 1 ml). Re ċipjent ta’ daqs i żgħar 
jista’ jintu ża meta r-ri żultati jħarsu l-kondizzjonijiet deskritti 
fil-paragrafu 66 u 67;  
(b) Analizzatur tal-karbonju jew strument ie ħor (eż. kromatografu tal-gass) 
għall-kejl ta’ karbonju inorganiku;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
(c) Siringi ta’ pre ċiżjoni kbira g ħal kampjuni gassu żi u likwidi;  
(d) Xejker orbitali f’ambjent ikkontrollat bit-temperatura;  
(e) Provvista ta’ arja ming ħajr CO  2 – din tista’ tit ħejja billi l-g ħarja tgħaddi 
minn granijiet tal- ġir tas-soda jew billi tintu ża taħlita ta’ gass ta’ 80 % 
N 2 /20 % 0  2 (fakultattiv) (ara l-paragrafu 28);  
(f) Apparat ta’ filtrazzjoni b’membrani ta’ poro żità ta’ 0,20 – 0,45 μm 
porożità (fakultattiv);  
(g) Analizzatur ta’ karbonju organiku (fakultattiv).  
Reaġenti 
16. Uża reaġenti ta’ grad analitiku g ħal kollox.  
Ilma 
17. Għandu jintu ża ilma distillat jew dejonizzat li jkun fih ≤1 mg/l b ħala 
karbonju organiku totali. Dan jirrappre żenta ≤ 5 % tal-kontenut ta’ 
karbonju organiku tal-bidu introdott bid-do ża rakkomandata tal-kimika 
għall-ittestjar.  
Soluzzjonijiet ta’ stokkijiet g ħall-midjum ta’ mel ħ minerali  
18. Is-soluzzjonijiet ta’ stokkijiet u l-midjum ta’ mel ħ minerali huma simili g ħal 
dawk ta’ ISO 14593 (16) u C.4 testijiet ta’ “bijodegradabbiltà fa ċli” (20). 
L-użu ta’ konċentrazzjoni g ħolja ta’ klorur tal-ammonju (2,0 g/l minflok 0,5 
g/l) għandu jkun ne ċessarju biss f’ka żijiet verament e ċċezzjonali, e ż. meta 
l-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar hija > 40 mg C/l. Soluzzjonijiet 
ta’ stokkijiet g ħandhom ikunu ma ħżuna fi friġġ u jintremew wara sitt xhur, 
jew qabel jekk ikun hemm evidenza ta’ pre ċipitazzjoni jew tkabbir 
mikrobiku. Ħejji dawn is-soluzzjonijiet ta’ stokkijiet li ġejjin:  
(a) Fosfat anidru tal-idro ġenu tal-potassju (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Fosfat tal-idro ġenu tad-dipotassju (K  2 HPO  4 ), 21,75 g  
Fosfat diidrat tal-idro ġenu tad-disodju (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
Klorur tal-ammonju (NH  4 Cl) 0,50 g  
Ħoll fl-ilma u ġib 1 litru. Il-pH ta’ din is-soluzzjoni g ħandu jkun 7,4 (± 
0,2). Jekk dan ma jkunx il-ka ż, allura ħejji soluzzjoni ġdida.  
(b) Klorur tal-kal ċju diidrat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; 36,40 g  
Ħoll fl-ilma u ġib 1 litru.  
(c) Eptaidrat tas-sulfat tal-magne żju (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Ħoll fl-ilma u ġib 1 litru.  
(d) Eksaidrat tal-klorur tal- ħadid (III) (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Ħoll fl-ilma u ġib 1 litru u żid qatra wa ħda ta’ HCl kon ċentrat.  
Tħejjija ta’ midjum minerali  
19. Ħallat 10 ml ta’ soluzzjoni (a) ma’ bejn wie ħed u ieħor 800 ml ilma 
(paragrafu 17), mbag ħad żid 1 ml ta’ soluzzjonijiet (b), (c) u (d) u ġib 1 
litru bl-ilma (paragrafu 17).  
Reaġenti oħra 
20. Aċidu ortofosforiku kon ċentrat (H3PO4) (> 85 % massa g ħal kull volum).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Soluzzjoni 7M ta’ idrossidu tas-sodju  
21. Ħoll 280 g ta’ idrossidu tas-sodju (NaOH) f’1 litru ta’ ilma (paragrafu 17). 
Iddetermina l-kon ċentrazzjoni ta’ DIC ta’ din is-soluzzjoni u qis dan il-valur 
meta tikkalkula r-ri żultat tat-test (ara l-paragrafi 55 u 61), l-aktar fid-dawl 
tal-kriterju tal-validità fil-paragrafu 66 (b). Ħejji soluzzjoni ġdida jekk 
il-konċentrazzjoni ta’ DIC tkun g ħolja żżejjed.  
Kimika g ħall-ittestjar:  
22. Ħejji soluzzjoni ta’ stokkijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar li tin ħall biżżejjed 
fl-ilma (paragrafu 17) jew fil-midjum tal-ittestjar (paragrafu 19) f’kon ċen­
trazzjoni preferibbilment ta’ 100 darba akbar mill-kon ċentrazzjoni finali li 
jkollha tintu ża fit-test; jista’ jkun me ħtieġ li jkun a ġġustat pH tas-soluzzjoni 
ta’ stokkijiet. Is-soluzzjoni ta’ stokkijiet g ħandha tiżdied mal-midjum 
minerali biex tag ħti konċentrazzjoni ta’ karbonju organiku finali ta’ bejn 2 
u 40 mg C/l, preferibbilment 20 mg C/l. Jekk jintu żaw konċentrazzjonijiet 
iktar baxxi minn dawn, il-pre ċiżjoni miskuba tista’ ma tkunx tajba. Kimi ċi 
likwidi li jin ħallu u li ma jin ħallux jistg ħu jiżdiedu fir-re ċipjenti billi 
jintużaw direttament siringi ta’ pre ċiżjoni kbira. Kimi ċi għall-ittestjar li ftit 
jinħallu u li ma jin ħallux jista’ jkun je ħtiġilhom trattament spe ċjali (25). 
L-għażliet huma:  
(a) żieda diretta ta’ ammonti mi żuna magħrufa;  
(b) tixrid ultrasoniku qabel żieda;  
(c) tixrid bl-g ħajnuna ta’ a ġenti emulsjonanti li jkunu me ħtieġa biex ikun 
stabbilit jekk ikollhomx xi effetti inibitorji jew stimulatorji fuq attività mikrobika qabel i ż-żieda;
 
(d) sorbiment ta’ kimi ċi likwidi tat-test, jew soluzzjoni f’solvent volatili 
adatt, għal fuq midjum jew sostenn inerti (e ż. filtru tal-fibra 
tal-ħġieġ), segwiti minn evaporazzjoni tas-solvent, jekk jintu ża, u 
żieda diretta ta’ ammonti mag ħrufin;  
(e) żieda ta’ volum mag ħruf ta’ soluzzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar f’solvent 
faċilment volatili f’re ċipjent tat-test vojt, segwita mill-evaporazzjoni 
tas-solvent.  
Aġenti jew solventi u żati f’(c), (d) u (e) g ħandhom ikunu ttestjati g ħal kull 
effett stimulatorju jew inibitorju fuq attività mikrobika (ara l-paragrafu 
42(b)).  
Kimiċi ta’ referenza  
23. Ħejji soluzzjoni ta’ stokkijiet tal-kimika ta’ referenza (li tin ħall) fl-ilma 
(paragrafu 17) f’kon ċentrazzjoni preferibbilment 100 darba akbar 
mill-konċentrazzjoni final li jkollha tintu ża (20 mg C/l) fit-test.  
Verifika ta’ inibizzjoni  
24. Kimi ċi għall-ittestjar sikwit ma juru ebda degradazzjoni sinifikanti ta ħt 
il-kondizzjonijiet u żati f’valutazzjonijiet ta’ bijodegradazzjoni fa ċli. Kawża 
waħda possibbli hija li l-kimika g ħall-ittestjar tkun inibitorja g ħat-tilqima 
fil-konċentrazzjoni li fiha tkun applikata fit-test. Verifika ta’ inibizzjoni 
tista’ tkun inklu ża fit-tifsila tat-test biex tit ħaffef l-identifikazzjoni (retro ­
spettivament) ta’ inibizzjoni b ħala kawża possibbli jew fattur kontributorju. 
Alternattivament, il-verifika ta’ inibizzjoni tista’ teskludi interferenzi b ħal 
dawn u turi li ebda jew ftit degradazzjoni tkun attribwibbli biss g ħall-fatt 
li ma tkunx so ġġetta għal attakk mikrobiku ta ħt il-kondizzjonijiet tat-test. 
Biex tinkiseb informazzjoni dwar it-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal 
mikroorgani żmi (aerobi ċi), ħejji soluzzjoni fil-midjum tal-ittestjar li jkun 
fiha l-kimika g ħall-ittestjar u l-kimika ta’ referenza (paragrafu 19), kull 
waħda fl-istess kon ċentrazzjonijiet kif mi żjuda, rispettivament (ara 
l-pargrafi 22 u 23).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Tilqima  
25. It-tilqima tista’ tkun ġejja minn varjetà ta’ sorsi: ħama attivat; effluwent 
tad-drana ġġ (mhux bil-kloru); ilmijiet tal-wi ċċ u ħamrija; jew minn ta ħlita 
ta’ dawn (20). L-attività bijodegradattiva tas-sors g ħandha tkun ivverifikata 
billi tintu ża kimika ta’ referenza. Ikun xi jkun is-sors, mikroorgani żmi li 
qabel kienu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar m’g ħandhomx jintu żaw jekk 
il-proċedura jkollha tintu ża bħala test g ħal bijodegradabbiltà fa ċli. 
Twissija: Ħama attivat, drana ġġ u effluwent tad-drana ġġ li jkun fih 
organiżmi patoġeniċi u għandhom ikunu ttrattati b’kawtela.  
26. Ibba żat fuq esperjenza, l-a ħjar volum g ħat-tilqima huwa dak li:  
— ikun suffi ċjenti biex jirrendi attività bijodegradattiva adegwata;  
— jiddegrada l-kimika ta’ referenza bil-per ċentwali stipulat (ara l-paragrafu 
66); 
— jagħti 10  2 sa 10  5 unitajiet ta’ formazzjoni ta’ kolonji g ħal kull millilitru 
fit-taħlita finali;  
— normalment jag ħti konċentrazzjoni ta’ 4 mg/l ta’ solidi sospi żi fit-taħlita 
finali meta jintu ża ħama attivat; jistg ħu jintużaw konċentrazzjonijiet sa 
30 mg/l i żda jistgħu jżidu b’mod sinifikanti l-produzzjoni ta’ CO  2 tal-in 
bjanki (26);  
— jikkontribwixxi anqas minn 10 % tal-kon ċentrazzjoni inizjali ta’ 
karbonju organiku introdott mil-kimika g ħall-ittestjar;  
— ikun ġeneralment 1-10 ml ta’ tilqima g ħal 1 litru tas-soluzzjoni tat-test.  
Ħama attivat  
27. Ħama attivat jin ġabar frisk mit-tank ta’ tirwi ħ ta’ impjant ta’ trattament 
tad-drana ġġ jew minn unità ta’ skala ta’ laboratorju li tittratta l-aktar 
dranaġġ domestiku. Jekk ikun me ħtieġ, partiċelli raffi g ħandhom 
jitneħħew billi jintg ħarblu (eż. billi jintu ża għarbiel b’xibka ta’ 1 mm  2 ) u 
l-ħama għandu jinżamm aerobiku sakemm jintu ża. 
28. Alternattivament, wara tne ħħija ta’ kull partikola raffa, ħalli l-ħama joqg ħod 
jew iċċentrifugah (e ż. 1 100 x g g ħal 10 minuti). Warrab il-likwidu super ­
natant. Il- ħama jista’ jin ħasel fis-soluzzjoni minerali. Issospendi l- ħama 
konċentrat f’midjum minerali biex jirrendi kon ċentrazzjoni ta’ 3-5 g solidi 
sospiżi/l. 
29. Ħama għandu jittie ħed minn impjant ta’ trattament konvenzjonali li ja ħdem 
sewwa. Jekk ħama jkollu jittie ħed minn impjant ta’ trattament ta’ rata 
għolja, jew jitqies li jkun fih inibituri, huwa g ħandu jinħasel. Ħallih 
joqgħod jew i ċċentrifuga l- ħama sospi ż mill-ġdid wara li jkun t ħallat 
sewwa, warrab il-likwidu supernatant u er ġa’ ssospendi l- ħama maħsul 
f’volum ulterjuri ta’ midjum minerali. Tenni din il-pro ċedura sakemm 
il-ħama jitqies li jkun ħieles minn substrat jew inibitur żejjed.  
30. Wara li tkun inkisbet sospensjoni kompleta, jew b’ ħama mhux ittrattat, irtira 
kampjun e żatt qabel l-u żu, għad-determinazzjoni tal-pi ż fin-niexef tas-solidi 
sospiżi. 
31. Alternattiva ulterjuri hija li ħama attivat ji ġi omoġeinizzat (3-5 g ta’ solidi 
sospiżi/l). Ittratta l- ħama fi blender Waring g ħal 2 minuti b’velo ċità medja. 
Ħalli l-ħama mħallat joqg ħod għal 30 minuta jew aktar jekk ikun me ħtieġ u 
ferra’ l-likwidu g ħal użu bħala tilqima bir-rata ta’ madwar 10 mg/l ta’ 
midjum minerali.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Tnaqqis ukoll ulterjuri tal-evoluzzjoni CO  2 in bjank jista’ jinkiseb billi 
l-ħama jitrewwa ħ matul il-lejl b’arja ming ħajr CO  2 . Uża 4 mg/l ta’ solidi 
ta’ ħama attivat b ħala l-konċentrazzjoni tat-tilqima f’dan it-test (13).  
Effluwent ta’ drana ġġ sekondarju  
33. Alternattivament, it-tilqima tista’ tori ġina mill-effluwent sekondarju ta’ 
impjant ta’ trattament jew unità ta’ skala ta’ laboratorju li tir ċievi l-aktar 
dranaġġ domestiku. Żomm il-kampjun f’kondizzjonijiet aerobi ċi u uża 
fil-jum tal- ġbir, jew ikkondizzjonah minn qabel jekk ikun me ħtieġ. 
L-effluwent g ħandu jkun iffiltrat permezz ta’ filtru raff biex titne ħħa 
materja partikolata ħoxna u jitkejjel il-valur tal-pH.  
34. Biex inaqqas il-kontenut ta’ IC tieg ħu, il-filtrat jitraxxax b’arja ming ħajr 
CO 2 (paragrafu 15-e) g ħal siegħa filwaqt li l-pH jin żamm f’6,5 billi 
jintuża aċidu ortofosforiku (paragrafu 20). Il-valur tal-pH jitre ġġa għall- 
valur oriġinali tiegħu bl-idrossidu tas-sodju (paragrafu 21) u, wara li jkun 
qagħad għal madwar sieg ħa, volum adatt tas-supernatant jittie ħed biex 
jitlaqqam. Din il-pro ċedura ta’ tixrix tnaqqas il-kontenut ta’ IC tat-tilqima. 
Pereżempju, meta l-volum massimu rrakkomandat ta’ effluwent imraxxax 
iffiltrat (100 ml) g ħal kull litru kien u żat bħala tilqima, l-ammont ta’ IC li 
kien hemm fir-re ċipjenti ta’ kontroll in bjank kien fil-firxa ta’ 0,4 sa 1,3 
mg/l (14), li tirrappre żenta 2-6,5 % tal-kimika g ħall-ittestjar C f’20 mg C/l u 
4-13 % f’10 mg C/l.  
Ilmijiet tal-wi ċċ 
35. Jittie ħed kampjun ta’ ilma tal-wi ċċ adatt. Għandu jinżamm f’kondizzjonijiet 
aerobiċi u jintuża fil-jum tal- ġbir. Il-kampjun g ħandu jkun ikkon ċentrat, jekk 
ikun meħtieġ, b’filtrazzjoni jew ċentrifugazzjoni. Il-volum ta’ tilqima li 
jkollha tintu ża f’kull re ċipjent tat-test g ħandha tħares il-kriterji mog ħtijin 
fil-paragrafu 26.  
Ħamrija  
36. Jittie ħed kampjun ta’ ħamrija adatta, mi ġbura f’fond ta’ sa 20 cm ta ħt 
il-ħamrija tal-wi ċċ. Ġebel, fdalijiet ta’ pjanti u invertebrati g ħandhom 
jitneħħew mill-kampjun ta’ ħamrija qabel ma jintg ħarbel b’xibka ta’ 2 mm 
(jekk il-kampjun ikun imxarrab wisq biex jintg ħarbel minnufih, f’dak il-ka ż 
għandu jitnixxef parzjalment bl-arja biex jit ħaffef it-tg ħarbil). G ħandu 
jinżamm f’kondizzjonijiet aerobi ċi u jintu ża fil-jum tal- ġbir (Jekk 
il-kampjun jin ġarr f’borża sewda tal-polietilen maqfula ħafif, ikun jista’ 
jinħżen f’2 sa 4 oC fil-bor ża sa xahar).  
Kondizzjonament minn qabel ta’ tilqima  
37. Tilqima tista’ tkun ikkondizzjonata minn qabel g ħall-kondizzjonijiet speri ­
mentali, i żda ma tkunx adattata minn qabel g ħall-kimika g ħall-ittestjar. 
Kondizzjonament minn qabel jista’ jnaqqas l-evoluzzjoni ta’ CO  2 in 
bjank. Kondizzjonament minn qabel jikkonsisti f’tirwi ħ ta’ ħama attivat 
wara dilwizzjoni f’midjum tal-ittestjar g ħal 30 mg/l b’arja niedja ming ħajr 
CO 2 għal sa 5-7 ijiem fit-temperatura tat-test.  
PROĊEDURA TAT-TEST  
Għadd ta’ fliexken  
38. L-għadd ta’ fliexken (paragrafu 15-a) me ħtieġa għal test ikun jiddependi 
mill-frekwenza ta’ anali żi u minn kemm idum it-test.  
39. Huwa rrakkomandat li fliexken tripli ċi jkunu analizzati wara g ħadd 
suffiċjenti ta’ intervalli ta’ żmien b’mod li l-perjodu ta’ 10-d ikun jista’ 
jiġi identifikat. Ukoll mill-anqas ħames fliexken tat-test (paragrafu 15-a) 
mis-settijiet (a), (b) u (c) (ara l-paragrafu 42) ikunu analizzati fit-tmiem 
tat-test, biex ikunu jistg ħu jiġu kkalkulati 95 % ta’ intervalli ta’ kunfidenza 
għall-valur medju ta’ per ċentwali ta’ bijodegradazzjoni.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Midjum imlaqqam  
40. It-tilqima tintu ża f’konċentrazzjoni ta’ 4 mg/l ta’ solidi nixfin ta’ ħama 
attivat. Ħejji minnufih qabel l-u żu midja mlaqqma b’mod suffi ċjenti billi 
żżid, pereżempju, 2 ml ħama attivat ittrattat sewwa (paragrafi 27 to 32) 
f’2 000 mg/l g ħal 1 litru ta’ midjum ta’ mel ħ minerali (paragrafu 19). 
Meta jkollu jintu ża effluwent ta’ drana ġġ sekondarju żid sa 100 ml 
effluwent (paragrafu 33) g ħal midjum ta’ 900 ml ta’ mel ħ minerali 
(paragrafu 19) u ddilwixxi 1 litru bil-midjum.  
Tħejjija ta’ fliexken  
41. Alikwoti ta’ midjum imlaqqam jitqieg ħdu fi fliexken replikati biex jag ħtu 
proporzjon ta’ Spazju Fuq ma’ likwidu ta’ 1:2 (e ż. żid 107 ml fi fliexken li 
jesgħu 160 ml). Jistg ħu jintużaw proporzjonijiet o ħra, iżda ara t-twissija 
mogħtija fil-paragrafu 11. Meta tu ża tilqima ta’ wie ħed miż-żewġ tipi, 
għandha ting ħata attenzjoni biex ikun żgurat li l-midjum imlaqqam 
jitħallat b’mod adegwat biex ikun żgurat li jitqassam b’mod uniformi 
fil-fliexken tat-test.  
42. Settijiet ta’ fliexken (paragrafu 15a) jit ħejjew biex jesg ħu dan li ġej: 
(a) Reċipjent tat-test (indikat F  T ) li jkun fih il-kimika g ħall-ittestjar;  
(b) Kontrolli in bjank (indikati F  B ) li jkun fihom biss il-midjum tal-ittestjar 
flimkien ma’ tilqima; g ħandhom ji żdiedu wkoll kull kimika, solventi, 
aġenti jew filtri tal-fibra tal- ħġieġ użati biex tidda ħħal il-kimika g ħall- 
ittestjar fir-re ċipjenti tat-test;  
(c) Reċipjenti (indikati F  C ) biex tkun ivverifikata l-pro ċedura li jkun fiha 
l-kimika ta’ referenza;  
(d) Jekk ikun me ħtieġ, reċipjenti (indikati F  I ) biex ikun i ċċekkjat jekk 
possibbilment ikunx hemm effett inibitorju tal-kimika g ħall-ittestjar li 
jkun fiha kemm il-kimika g ħall-ittestjar kif ukoll il-kimika ta’ referenza 
fl-istess kon ċentrazzjonijiet (paragrafu 24) b ħal fil-fliexken F  T u F  C , 
rispettivament;  
(e) Reċipjenti (indikati F  S ) biex ikun i ċċekkjat jekk possibbilment ikunx 
hemm degradazzjoni abijotika b ħal (a) 50 mg/l o ħra ta’ HgCl  2 jew 
sterilizzati b’xi mezzi o ħra (eż. b’għeluq awtomatiku).  
43. Kimi ċi għall-ittestjar li jin ħallu fl-ilma u kimi ċi ta’ referenza ji żdiedu bħala 
soluzzjonijiet ta’ stokkijiet milwiema (paragrafi 22, 23 u 24) biex jag ħtu 
konċentrazzjoni ta’ 10 sa 20 mg C/l.  
44. Kimi ċi li ma jin ħallux u kimi ċi ta’ referenza li jin ħallu jiżdiedu fi fliexken 
b’varjetà ta’ modi (ara l-paragrafu 22a-e) skont in-natura tal-kimika g ħall- 
ittestjar, qabel jew wara żieda tal-midjum imlaqqam, skont il-metodu ta’ 
trattament tal-kimika g ħall-ittestjar. Jekk tkun u żata waħda mill-pro ċeduri 
mogħtijin fil-paragrafu 22a-e, f’dak il-ka ż il-fliexken in bjank F  B (paragrafu 
42b) għandhom ikunu ttrattati b’mod simili i żda tkun esklu ża l-kimika g ħall- 
ittestjar jew il-kimika ta’ referenza.  
45. Kimi ċi volatili ta’ ttestjar g ħandhom ikunu injettati g ħal ġo fliexken issi ­ 
ġillati (paragrafu 47) billi tintu ża siringa żgħira. Id-do ża tkun ikkalkulata 
mill-volum injettat u mid-densità tal-kimika g ħall-ittestjar.  
46. Ilma g ħandu jiżdied f’reċipjenti, fejn ikun me ħtieġ, biex jag ħti l-istess volum 
likwidu f’kull re ċipjent. Għandu jkun żgurat li l-proporzjon ta’ Spazju Fuq 
ma’ likwidu (is-soltu 1:2) u l-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar ikunu 
tali li jkun hemm ossi ġnu biżżejjed fl-Ispazju Fuq biex tit ħalla ssir bijode ­
gradazzjoni kompleta.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Il-fliexken kollha mbag ħad jiġu ssiġillati, pere żempju b’septa tal-lastku 
tal-butil u b’g ħotjien tal-aluminju. kimi ċi volatili tat-testijiet g ħandhom 
jiżdiedu f’dan l-istadju (paragrafu 45). Jekk it-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni 
ta’ DOC tas-soluzzjoni tat-test ikollu jkun immonitorjat u jkollha ssir analiżi mingħajr ħin għal konċentrazzjoni tal-bidu ta’ IC (kontrolli sterili, 
paragrafu 42e) jew g ħal determinanti o ħra, erfa’ kampjun adatt mir-re ċipjent 
tat-test. Ir-re ċipjent tat-test u l-kontenut tieg ħu mbagħad jitwarrbu.
 
48. Il-fliexken issi ġillati jitqieg ħdu fuq xejker rotatorju (paragrafu 15d), b’rata 
ta’ xxejkjar suffi ċjenti biex i żżomm il-kontenut tal-fliexken im ħallat sewwa 
u f’sospensjoni (e ż. 150 għal 200 rpm), u inkubat fid-dlam f’20 °C, li 
għandu jinżamm f’± 1 °C.  
Teħid ta’ kampjuni  
49. Ix-xejra ta’ te ħid ta’ kampjuni tkun tiddependi mill-perjodu ta’ intervalli u 
mir-rata kinetika ta’ bijodegradazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar. Il-fliexken 
jintużaw għall-analiżi u jinqerdu fil-jum tat-te ħid tal-kampjuni, li g ħandu jsir 
mill-anqas darba fil- ġimgħa jew aktar sikwit (e ż. darbtejn fil- ġimgħa) jekk 
tkun meħtieġa kurva kompleta ta’ degradazzjoni. L-g ħadd meħtieġ għall- 
fliexken tar-replikati jittie ħed mix-xejker, u jirrappre żenta F  T , F B u F  C u, 
jekk jintu żaw F  I u F  S (ara l-paragrafu 42). It-test normalment idum 28 jum. 
Jekk il-kurva ta’ bijodegradazzjoni tindika li tkun intla ħaq livell kostanti 
qabel 28 jum, it-test jista’ jing ħalaq qabel 28 jum. Ħu kampjuni minn 
ħames fliexken ri żervati għat-28 jum tat-test g ħal analiżi u uża r-riżultati 
biex tikkalkula l-limiti ta’ kunfidenza jew il-koeffi ċjent ta’ varjazzjoni ta’ 
perċentwali ta’ bijodegradazzjoni. Fliexken li jirrappre żentaw il-verifiki g ħal 
inibizzjoni u g ħal degradazzjoni abijotika jistg ħu ma jitte ħdulhomx 
kampjuni sikwit daqs il-fliexken l-o ħra; 1 jum u 28 jiem ikunu suffi ċjenti.  
Analiżi ta’ karbonju inorganiku (IC)  
50. Il-produzzjoni ta’ CO  2 fil-fliexken tkun iddeterminata billi titkejjel i ż-żieda 
fil-konċentrazzjoni ta’ karbonju inorganiku (IC) matul inkubazzjoni. Hemm 
żewġ metodi rakkomandati disponibbli g ħall-kejl tal-ammont ta’ IC prodott 
fit-test, u dawn huma deskritti minnufih hawn ta ħt. Minħabba li l-metodi 
jistgħu jagħtu riżultati ftit differenti, wie ħed biss g ħandu jintu ża meta jsir 
test. 
51. Metodu (a) huwa rrakkomandat jekk il-midjum aktarx li jkun fih fdalijiet ta’, 
pereżempju, karta ta’ filtru tal- ħġieġ u/jew kimika g ħall-ittestjar li ma 
tinħallx. Din l-anali żi tista’ ssir billi jintu ża kromatografu tal-gass jekk ma 
jkunx hemm analizzatur tal-karbonju. Huwa importanti li l-fliexken ikunu fi jew qrib it-temperatura tat-test meta l-gass tal-Ispazju Fuq ikun analizzat. Metodu (b) jista’ jkun e ħfef għal laboratorji li ju żaw analizzaturi 
tal-karbonju biex ikejlu IC. Huwa importanti li s-soluzzjoni tal-idrossidu 
tas-sodju (paragrafu 21) u żata biex CO
 2 jinbidel f’karbonat tkun jew 
tħejjiet m’ilux jew li l-kontenut ta’ IC ikun mag ħruf, biex din tkun tista’ 
titqies meta jkunu kkalkulati r-ri żultati tat-testijiet (ara l-paragrafu 66-b.)  
Metodu (a): a ċidifikazzjoni g ħal pH < 3  
52. Qabel kull lott ta’ anali żi, l-analizzatur ta’ IC ji ġi kkalibrat billi jintu ża 
standard ta’ IC adattat (e ż. 1 % w/w CO  2 f’N 2 ). Aċidu ortofosforiku kon ċ­
entrat (paragrafu 20) ji ġi injettat tul is-septum ta’ kull flixkun li jkun 
itteħidlu kampjun biex ibaxxi l-pH tal-midjum g ħal < 3 (e ż. żid 1 ml 
għal midjum tal-ittestjar ta’ 107 ml). Il-fliexken jitre ġġgħu fuq ix-xejker. 
Wara li jkunu xxejkjati g ħal siegħa f’temperatura tat-test il-fliexken 
jitneħħew mix-xejker, alikwoti (e ż. 1 ml) tal-gass ikunu rtirati mill-Ispazju 
Fuq ta’ kull flixkun u injettati fl-analizzatur ta’ IC. Il-kon ċentrazzjonijiet 
imkejla ta’ IC ikunu rre ġistrati bħala mg C/l.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Il-prin ċipju ta’ dan il-metodu huwa li wara a ċidifikazzjoni g ħal pH < 3 u 
ekwilibrazzjoni f’20 C, il-kostant tal-ekwilibriju g ħad-distribuzzjoni ta’ CO  2 
bejn il-fa żijiet likwidi u gassu żi fil-fliexken tat-test ikun 1,0 meta mkejjel 
bħala konċentrazzjoni (13). Dan g ħandu jintwera g ħas-sistema tat-test 
mill-anqas darba kif ġej: 
Lesti fliexken li jkun fihom 5 u 10 mg/l b ħala IC billi tu ża soluzzjoni ta’ 
karbonat tas-sodju anidru (Na  2 CO 3 ) f’ilma ming ħajr CO  2 mħejji 
bl-aċidifikazzjoni tal-ilma g ħal pH 6,5 b’a ċidu ortofosforiku kon ċentrat 
(paragrafu 20), b’tixrix matul l-lejl b’arja ming ħajr CO  2 u billi tg ħolli 
l-pH għal newtralità b’alkali. Żgura li l-proporzjon tal-volum tal-Ispazju 
Fuq mal-volum ta’ likwidu jkun l-istess b ħal fit-testijiet (e ż. 1:2). Ag ħmel 
aċiduż u ekwilibra kif deskritt fil-paragrafu 52, u kejjel il-kon ċentrazzjonijiet 
ta’ IC kemm tal-Ispazju Fuq kif ukoll tal-fa żijiet likwidi. Ivverifika li ż-żewġ 
konċentrazzjonijiet ikunu l-istess fil-limitu ta’ żbalji sperimentali. Jekk ma 
jkunux, l-operatur g ħandu jeżamina mill- ġdid il-pro ċeduri. Din il-verifika 
tad-distribuzzjoni ta’ IC bejn fa żijiet likwidi u gassu żi tista’ ma ssirx kull 
darba li jsir it-test; pre żumibbilment tista’ ssir waqt li tkun qed issir 
il-kalibrazzjoni.  
54. Jekk it-tne ħħija ta’ DOC ikollha titkejjel (kimi ċi għall-ittestjar biss li jin ħallu 
fl-ilma), g ħandhom jittie ħdu kampjuni tal-fa żi likwida minn fliexken separati 
(mhux mag ħmulin aċidużi), iffiltrati b’membrana u injettati g ħal ġol- 
analizzatur ta’ DOC. Dawn il-fliexken jistg ħu jintużaw għal analiżi oħra 
daqs kemm ikun me ħtieġ, biex titkejjel bijodegradazzjoni primarja.  
Metodu (b): konver żjoni ta’ CO  2 għall-karbonat  
55. Qabel kull lott ta’ analizi, l-analizzatur ta’ IC ikun ikkalibrat billi jintu ża 
standard adattat - pere żempju, soluzzjoni ta’ sodju bikarbonat (NaHCO  3 ) 
f’ilma ming ħajr CO  2 (ara l-paragrafu 53) fil-firxa 0 sa 20 mg/l b ħala IC. 
Soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju (7M, paragrafu 21) (e ż. 1 ml għal midjum 
ta’ 107 ml) ti ġi injettata tul is-septum ta’ kull flixkun li jkun itte ħidlu 
kampjun u l-fliexken ji ġu xxejkjati g ħal siegħa fit-temperatura tat-test. 
Uża l-istess soluzzjoni ta’ NaOH g ħall-fliexken kollha li jintu żaw u 
jinqerdu f’jum partikolari, i żda mhux ne ċessarjament f’kull okka żjoni li 
jittieħed kampjun tul it-test kollu. Jekk ikunu me ħtieġa valuri IC assoluti 
in bjank fl-okka żjonijiet kollha ta’ te ħid ta’ kampjuni, ikunu me ħtieġa deter­
minazzjonijiet ta’ IC tas-soluzzjoni ta’ NaOH kull darba li tintu ża. 
Il-fliexken jitne ħħew mix-xejker u jit ħallew joqog ħdu. Volumi adatti (e ż. 
50 għal 1 000 μl) tal-fażi likwida f’kull re ċipjent jittie ħdu b’siringa. 
Il-kampjuni ji ġu injettati g ħal ġol-analizzatur IC u l-kon ċentrazzjonijiet ta’ 
IC jiġu rreġistrati. Għandu jkun żgurat li l-analizzatur u żat ikun mg ħammar 
sewwa biex ikun jista’ jittratta kampjuni alkalini prodotti b’dan il-metodu.  
56. Il-prin ċipju ta’ dan il-metodu huwa li wara ż-żieda ta’ alkali u xxejkjar, 
il-konċentrazzjoni ta’ IC fl-Ispazju Fuq tkun negli ġibbli. Dan g ħandu jkun 
ivverifikat g ħas-sistema ta’ ttestjar mill-anqas darba billi jintu żaw standards 
IC, biż-żieda ta’ alkali u ekwilibrazzjoni, u bil-kejl tal-kon ċentrazzjoni ta’ IC 
kemm fl-Ispazju Fuq kif ukoll fil-fa żijiet likwidi (ara l-paragrafu 53). 
Il-konċentrazzjoni fl-ispazju fuq g ħandha tersaq g ħal żero. Din il-verifika 
tal-assorbiment kwa żi sħiħ ta’ CO  2 ma jkunx me ħtieġ li ssir kull darba li jsir 
it-test.  
57. Jekk it-tne ħħija ta’ DOC ikollha titkejjel (kimi ċi għall-ittestjar biss li jin ħallu 
fl-ilma), g ħandhom jittie ħdu kampjuni tal-fa żi likwida minn fliexken separati 
(li ma jkunx fihom alkali mi żjuda), iffiltrati b’membrana u injettati g ħal ġol- 
analizzatur ta’ DOC. Dawn il-fliexken jistg ħu jintużaw għal analiżi oħra 
daqs kemm ikun me ħtieġ, biex titkejjel bijodegradazzjoni primarja.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Kalkolu tar-ri żultati  
58. Jekk wie ħed jassumi mineralizzazzjoni ta’ 100 % tal-kimika g ħall-ittestjar 
għal CO  2 , ThIC iżjed minn dak prodott fil-kontrolli in bjank ikun daqs TOC 
miżjud għal kull flixkun tat-test fil-bidu tat-test, ji ġifieri:  
ThIC ¼ TOC : 
Il-massa totali (mg) ta’ karbonju inorganiku (TIC) f’kull flixkun tkun: 
TIC ¼ ðmg C fil Ä likwidu þ mg C fl Ä ispazju fuqÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Ekwazzjoni [1]  
fejn: 
VL = volum ta’ likwidu fil-flixkun (litru);  
CL = kon ċentrazzjoni ta’ IC fil-likwidu (mg/l b ħala karbonju);  
VH = volum tal-ispazju fuq (litru);  
CH = kon ċentrazzjoni ta’ IC fl-ispazju fuq (mg/l b ħala karbonju).  
Il-kalkulazzjonijiet ta’ TIC g ħaż-żewġ metodi analiti ċi użati għall-kejl ta’ IC 
f’dan it-test huma deskritt fil-paragrafi 60 u 61. Per ċentwali ta’ bijodegra ­
dazzjoni (% D) f’kull ka ż tidher bħala: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Ekwazzjoni [2]  
fejn: 
TICt = mg ta’ TIC fi flixkun tat-test f’ ħin t; 
TICb = mg medja ta’ TIC fi fliexken in bjank f’ ħin t; 
TOC = mg ta’ TOC mi żjuda fil-bidu fir-re ċipjent tat-test.  
Il-perċentwali ta’ bijodegradazzjoni ta’ % ta’ D ikun ikkalkulat g ħat-test 
(F T ), referenza (F  C ) u, jekk ikun inklu ż kontroll ta’ monitora ġġ ta’ 
inibizzjoni (F  I ), għall-fliexken mill-ammonti rispettivi ta’ TIC prodotti sa ż- 
żmien ta’ kull te ħid ta’ kampjuni.  
59. Jekk kien hemm żieda sinifikanti fil-kontenut ta’ TIC tal-kontrolli sterili (F  S ) 
tul il-perjodu ta’ test, f’dak il-ka ż wieħed jista’ jikkonkludi li tkun se ħħet 
degradazzjoni abijotika tal-kimika g ħall-ittestjar u din g ħandha titqies 
fil-kalkulazzjoni ta’ D fl-Ekwazzjoni [2].  
Aċidifikazzjoni g ħal pH < 3  
60. Minħabba li l-a ċidifikazzjoni g ħal pH < 3 u l-ekwilibrazzjoni biex 
il-konċentrazzjoni ta’ TIC fil-likwidu u fil-fa żijiet gassu żi tkun indaqs, 
il-konċentrazzjoni biss ta’ IC fil-fa żi ta’ gass tkun je ħtiġilha titkejjel. 
Għalhekk, mill-ekwazzjoni [1]  TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , fejn 
V B volum ta’ flixkun tas-serum.  
Bdil ta’ CO  2 għal karbonat  
61. F’dan il-metodu jsiru kalkulazzjonijiet b ħal fl-Ekwazzjoni [1], i żda ma 
jitqisx l-ammont negli ġibbli ta’ IC fil-fa żi gassuża, jiġifieri  V H Ü C H ¼ 0, 
u TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Espressjoni ta’ ri żultati  
62. Kurva ta’ bijodegredazzjoni tinkiseb bl-ipplottjar tal-persenta ġġ ta’ bijo ­
degredazzjoni, D, kontra l- ħin tal-inkubazzjoni u jekk possibbli, il-fa żi ta’ 
intervalli, il-fa żi ta’ bijodegredazzjoni, il-perjodu ta’ 10-d u l-fa żi ta’ livell 
kostanti, il-fa żi li fiha d-degredazzjoni massima tkun intla ħqet u l-kurva 
tal-bijoddegredazzjoni llivellat, kif hemm indikat. Jekk jinkisbu ri żultati 
komparabbli g ħar-reċipjenti tat-test parallelli F  T (< 20 % differenza), ti ġi 
pplottjata kurva medja (ara l-Appendi ċi 2, Fig. 1); jekk le, il-kurvi ji ġu 
pplottjati g ħal kull re ċipjent. Ikun iddeterminat il-valur medju 
tal-perċentwali ta’ bijodegradazzjoni fil-fa żi ta’ livell kostanti jew ikun 
ivvalutat l-og ħla valur (e ż. meta l-kurva tonqos fil-fa żi ta’ livell kostanti), 
iżda huwa importanti li jkun ivvalutat li f’dan l-a ħħar każ il-valur ma jkunx 
erratiku. Indika dan il-livell massimu ta’ bijodegradazzjoni b ħala “grad ta’ 
bijodegradazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar” fir-rapport tat-test. Jekk l-g ħadd 
ta’ reċipjenti tat-test ma kienx bi żżejjed biex jindika fa żi ta’ livell kostanti, 
id-dejta mkejla tal-a ħħar jum tat-test tintu ża biex ikun ikkalkulat valur 
medju. Dan l-a ħħar valur, il-medja ta’ ħames replikati, iservi biex jindika 
l-preċiżjoni li biha l-per ċentwali ta’ bijodegradazzjoni kien iddeterminat. 
Irrapporta wkoll il-valur miksub fit-tmiem tal-perjodu ta’ 10-d.  
63. Fl-istess mod, ti ġi pplottjata kurva g ħall-kimika ta’ referenza F  C u, jekk 
inkluża għall-kontroll ta’ eliminazzjoni abijotika F  S u l-kontroll ta’ 
inibizzjoni F  I . 
64. L-ammonti ta’ TIC pre żenti fil-kontrolli in bjank (F  B ) jiġu repistrati kif 
inhuma rre ġistrati dawk fil-fliexken F  S (kontroll abijotiku), jekk dawn 
ir-reċipjenti kienu inklu żi fit-test.  
65. Ikkalkula D g ħar-reċipjenti F  I abbażi tar-rendiment IC teoretiku anti ċipat 
mill-komponent ta’ referenza tat-ta ħlita biss. Jekk, fit-28 jum, jirri żulta 
[(D FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] x 100 > 25 %, wie ħed ikun jista’ jassumi li 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun waqqfet l-attività tat-tilqima, u dan jista’ jkun 
il-kawża ta’ valuri baxxi ta’ D  FT miksubin ta ħt il-kondizzjonijiet tat-test. 
F’dan il-ka ż it-test jista’ jittenna billi tintu ża konċentrazzjoni tat-test aktar 
baxxa u preferibbilment jitnaqqsu DIC fit-tilqima u TIC ffurmat fil-kontrolli 
in bjank, min ħabba li kon ċentrazzjoni aktar baxxa xort’o ħra tnaqqas 
mill-preċiżjoni tal-metodu. Alternattivament, tista’ tintu ża tilqima o ħra. 
Jekk fi flixkun F  S (abijotiku) tkun osservata żieda sinifikanti (> 10 %) 
fl-ammont ta’ TIC, jistg ħu jkunu se ħħew proċessi ta’ degradazzjoni 
abijotika.  
Validità ta’ ri żultati  
66. Test jitqies validu jekk:  
(k) il-per ċentwali medju ta’ degradazzjoni f’re ċipjenti F  C li jkun fihom 
il-kimika ta’ referenza jkun > 60 % sal-14-il jum ta’ inkubazzjoni; u  
(l) l-ammont medju ta’ TIC li jkun hemm fil-kontrolli F  B in bjank fit-tmiem 
tat-test ikun > 3 mg C/l.  
Jekk dawn il-limiti ma jit ħarsux, it-test g ħandu jittenna b’tilqima minn sors 
ieħor u/jew il-pro ċeduri użati għandhom ikunu e żaminati mill- ġdid. 
Pereżempju, jekk il-produzzjoni g ħolja ta’ IC in bjank tkun problema, 
għandha tkun segwita l-pro ċedura mog ħtija fil-paragrafi 27 sa 32.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Il-perċentwali ta’ degradazzjoni f’Re ċipjenti F  C li jkun fihom is-sustanza ta’ referenza 
( 2 ) Il-perċentwali ta’ degradazzjoni f’Re ċipjenti F  I
 67. Jekk il-kimika g ħall-ittestjar ma til ħaqx 60 % ThIC u ma jkunx intwera li 
kienet inibitorja (paragrafu 65), it-test jista’ jittenna b’kon ċentrazzjoni og ħla 
ta’ tilqim (sa 30 mg/l ta’ ħama attivat u 100 ml ta’ effluwent/l) jew 
b’tilqimiet minn sorsi o ħra, l-aktar jekk id-degradazzjoni kienet fil-firxa 
ta’ 20 sa 60 %.  
Interpretazzjoni tar-ri żultati  
68. Bijodegradazzjoni > 60 % ThIC fil-perjodu ta’ 10-d f’dan it-test turi li 
l-kimika g ħall-ittestjar tkun bijodegradabbli fa ċilment f’kondizzjonijiet 
aerobiċi. 
69. Jekk il-valur ta’ pass ta’ 60 % ThIC ma jintla ħaqx, iddetermina l-valur pH 
f’midja fi fliexken li jkunux saru a ċidużi jew alkalini; valur ta’ anqas minn 
6.5 jista’ jindika li tkun se ħħet nitrifikazzjoni. F’ka ż bħal dan tenni t-test 
b’soluzzjoni bafer ta’ kon ċentrazzjoni og ħla. 
Rapport tat-Test  
70. Ikkompila tabella ta’ % ta’ D g ħal kull test (F  T ), referenza (F  C ) u, jekk ikun 
inkluż, flixkun ta’ inibizzjoni ta’ kontroll (F  I ) għal kull jum li fih ikunu 
ttieħdu kampjun. Jekk jinkisbu ri żultati komparabbli g ħal fliexken replikati, 
immarka kurva ta’ medja ta’ % ta’ D mal- ħin. Irreġistra l-ammont ta’ TIC 
fl-in bjanki (F  B ) u fil-kontrolli sterili (F  S ) DOC u/jew f’determinanti o ħra, u 
fil-perċentwali ta’ tne ħħija tagħhom.  
71. Iddetermina l-valur medju ta’ % ta’ D fil-fa żi ta’ livell kostanti, jew u ża 
l-ogħla valur jekk il-kurva ta’ bijodegradazzjoni tonqos fil-fa żi ta’ livell 
kostanti, u rrapporta dan b ħala ‘grad ta’ bijodegradazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar’. Huwa importanti jkun żgurat li f’dan l-a ħħar każ l-ogħla 
valur ma jkunx erratiku.  
72. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— isem komuni, isem tal-kimika, numru tal-CAS, formula strutturali u 
proprjetajiet fi żikokimiċi rilevanti;  
— purezza (impuritajiet) ta’ kimika g ħall-ittestjar.  
Kondizzjonijiet tat-test:  
— referenza g ħal dan il-Metodu ta’ Ttestjar;  
— deskrizzjoni tas-sistema ta’ ttestjar u żata (eż. volum tar-re ċipjent, 
proporzjon ta’ Spazju Fuq ma’ likwidu, metodu ta’ ta ħwid, eċċ); 
— applikazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar u kimika ta’ referenza g ħal 
sistema ta’ ttestjar: kon ċentrazzjoni tat-test u żata u ammont ta’ 
karbonju ddo żat f’kull flixkun tat-test, kull u żu ta’ solventi;  
— dettalji tat-tilqima u żat, kull trattament minn qabel u kondizzjonament 
minn qabel;  
— temperatura ta’ inkubazzjoni;  
— validazzjoni tal-prin ċipju ta’ anali żi ta’ IC;  
— karatteristi ċi ewlenin tal-analizzatur ta’ IC u żat (u kull metodu analitiku 
ieħor użat); 
— għadd ta’ replikati.  
Riżultati:  
— dejta mhux ma ħduma u valuri kkalkulati ta’ bijodegradabbiltà f’forma 
tabulari;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— il-grafika ta’ per ċentwali ta’ degradazzjoni mal- ħin għat-test u kimi ċi ta’ 
referenza, il-fa żi ta’ intervalli, fa żi ta’ degradazzjoni, perjodu ta’ 10-d u 
anglu;  
— perċentwali ta’ tne ħħija f’livell kostanti, fi tmiem ta’ test, u wara perjodu 
ta’ 10-d;  
— raġunijiet għal kull twarrib tar-ri żultati tat-testijiet;  
— kull fatt ie ħor li jkun rilevanti g ħall-proċedura segwita;  
— diskussjoni dwar ir-ri żultati.  
LETTERATURA:  
(1) Il-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness: Determinazzjoni ta’ Bijodegradabbiltà 
‘Faċli’ – Test ta’ Evoluzzjoni ta’ CO  2 (Metodu C.4-C).  
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159- 
167. 
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
(4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
(5) ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
(9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
 
(10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
(12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
 
(13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
 
(14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507-524.  
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegra ­
dation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemo ­
sphere 34: 1813-1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC.  
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An “inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235.
 
(20) Il-Kapitolu C.4 ta’ dan l-Anness: Determinazzjoni ta’ Bijodegradabbiltà 
‘Faċli’. 
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report 
(M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
(22) Il-Kapitolu C.11 ta’ dan l-Anness: Test ta’ inibizzjoni ta’ respirazzjoni ta’ 
ħama attivat.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
 
(24) UE (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
 
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and 
treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent 
evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Appendiċi 1 
ABBREVJAZZJONIJIET U DEFINIZZJONIJIET  
IC: Karbonju inorganiku  
ThCO  2 : Id-dijossidu tal-karbonju teoretiku (mg) huwa l-kwantità ta’ dijossidu 
tal-karbonju kkakluat li g ħandu jiġi prodott mill-kontentu tal-karbonju mag ħruf 
jew imkejjel tal-kimika g ħall-ittestjar meta ji ġi minerallizzat kompletament; 
espress ukoll b ħala mg ta’ dijossidu tal-karbonju g ħal kull mg ta’ kimika 
għall-ittestjar.  
DOC:  Karbonju organiku ma ħlul huwa l-karbonju organiku li jkun hemm f’so ­
luzzjoni jew dak li jg ħaddi minn filtru ta’ 0,45 mikromiter jew jibqa’ 
fis-supernatant wara ċentrifugazzjoni f’madwar 4 000 g (dwar 40 000 m sec  -2 ) 
għal 15-il minuta.  
DIC:  Karbonju inorganiku ma ħlul. 
ThIC:  Karbonju inorganiku teoretiku  
TIC:  Karbonju organiku totali  
Bijodegradabbli fa ċilment:  Klassifikazzjoni arbitrarja tal-kimi ċi li għaddew ċerti 
testijiet spe ċifiċi tal-iskrining g ħall-bijodegredabbiltà ultima; dawn it-testijiet tant 
huma stretti li huwa assunt li tali kimi ċi se jibbijodegredaw malajr u komp ­
letament f’ambjenti akkwati ċi taħt kondizzjonijeit aerobi ċi. 
Perjodu ta’ 10-d:  L-10 ijiem li jsegwu immedjatament il-kisba t’a 10 % bijo ­
degredazzjoni.  
Bijodegradabbiltà inerenti:  Klassifikazzjoni tal-kimi ċi li għalihom hemm 
evidenza inekwivoka ta’ bijodegredazzjoni (primarja jew ultima) fi kwalunkwe 
test ta’ bijodegradabbiltà.  
Bijodegradazzjoni aerobika ultima:  Il-livell ta’ degradazzjoni miksuba meta 
il-kimika g ħall-ittestjar ti ġi totalment utilizzata minn mikroorgani żmi li jirriżultaw 
fil-produzzjoni tad-dijossidu tal-karbonju, l-ilma, imlu ħa minerali u kostitwenti 
ċellulari mikrobjali ġodda (bijomassa).  
Mineralizzazzjoni:  Mineralizzazzjoni hija d-degradazzjoni kompleta ta’ kimika 
organika g ħal CO  2 u H  2 O f’kondizzjonijiet aerobi ċi, u għal CH  4 , CO  2 u H  2 O 
f’kondizzjonijiet anaerobi ċi. 
Fażi ta’ intervalli:  Iż-żmien mill-bidu ta’ test sa akklimatazzjoni u/jew 
adattament tal-mikroorgani żmi qed jiddegradaw ikun intla ħaq u l-grad ta’ bijode ­
gradazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar jew ta’ materja organika jkun żdied sa livell 
li wieħed ikun jista’ jinduna bih (p. e ż. 10 % tal-bijodegradazzjoni teoretika 
massima, jew aktar baxxa, skont kemm tkun akkurata t-teknika tal-kejl).  
Fażi ta’ degradazzjoni:  Iż-żmien mit-tmiem tal-perjodu ta’ intervalli sa ż-żmien 
meta jkun intla ħaq 90 % tal-livell massimu ta’ degradazzjoni.  
Fażi ta’ livell kostanti:  Fażi ta’ livell kostanti hija l-fa żi li fiha d-degradazzjoni 
tilħaq l-aqwa tag ħha u l-kurva tal-bijodegradazzjoni tkun sabet il-livell tag ħha. 
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Appendiċi 2 
Eżempju ta’ kurva ta’ bijodegradazzjoni  
Figura 1  
Bijodegradazzjoni ta’ ottanol-1 fit-test ta’ Spazju Fuq ta’ CO  2 Glossarju
  
Biodegradation:  
Bijodegradazzjoni:  
Fażi ta’ degradazzjoni:  
Livell massimu ta’ bijodegradazzjoni:  
Fażi ta’ livell kostanti:  
Perjodu ta’ 10-d(jiem):  
Żmien tat-test (jiem):  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  AKKUMULAZZJONI BIJOLO ĠIKA TA’ OLIGOCHAETES 
TERRESTRI  
DAĦLA 
1. Dan il-Metodu ta’ Ttestjar huwa ekwivalenti g ħall-Linja Gwida 
tat-Test (TG) 317 (2010) tal-OECD. Fost il-Metodi ta’ Ttestjar relatati 
ma’ dak li jse ħħ fl-ambjent, il-Kon ċentrazzjoni Bijolo ġika: Test ta’ Fluss 
Kontinwu tal- Ħut (il-Kapitolu C.13 ta’ dan l-Anness (49)) u 
l-Akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ Oligochaetes tal-Qieg ħ li jgħixu f’sediment 
(53) kienu ppubblikati fl-1996 u fl-2008 rispettivament. L-estrapolazzjoni ta’ 
dejta dwar akkumulazzjoni bijolo ġika akwatika g ħal organiżmi terrestri b ħal 
ħniex hija diffi ċli, jekk possibbli wara kollox. Kalkulazzjonijiet mudelli 
bbażati fuq il-lipofili ċità ta’ kimika g ħall-ittestjar, e ż. (14) (37), b ħalissa 
jintużaw għall-valutazzjoni ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ kimi ċi 
fil-ħamrija, b ħal eż. fid-Dokument ta’ Gwida Teknika tal-UE (19). 
Il-ħtieġa ta’ metodu ta’ ttestjar spe ċifiku għal kompartiment di ġà kienet 
indirizzata, e ż. (55). Metodu b ħal dan huwa l-aktar importanti g ħall-eval­
wazzjoni ta’ vvelenar sekondarju f’katini terrestri tal-ikel (4). Diversi metodi 
ta’ testijiet nazzjonali jindirizzaw il-kwistjoni ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika 
f’organiżmi minbarra l- ħut, eż. (2) u (72). Metodu dwar il-kejl ta’ akkumu ­
lazzjoni bijolo ġika minn ħamrija kontaminata fi ħniex ( Eisenia fetida , 
Savigny) u f’dud abjad kien żviluppat mill-American Society for Testing 
and Materials (3). Metodu a ċċettat internazzjonalment g ħad-determinazzjoni 
ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika f’ħamrija m ħallta għandu jtejjeb 
il-valutazzjoni tar-riskju ta’ kimi ċi f’ekosistemi terrestri e ż. (25) (29).  
2. Invertebrati li jiddi ġerixxu l- ħamrija huma esposti g ħal kimiċi li jkunu 
fil-ħamrija. Fost dawn l-annimali, oligochaetes terrestri jaqdu rwol 
importanti fl-istruttura u l-funzjoni tal- ħamrija (15) (20). Oligochaetes 
terrestri jg ħixu fil-ħamrija u parzjalment fil-wi ċċ tal-ħamrija (l-aktar 
fis-saff ta ż-żibel); ta’ sikwit jirrappre żentaw l-ispe ċi l-aktar abbundanti 
f’termini ta’ bijomassa (54). Bit-taqlib bijolo ġiku tal-ħamrija u billi jservu 
ta’ priża dawn l-annimali jista’ jkollhom influwenza kbira biex bijolo ġi­
kament ikun hemm kimi ċi għal organi żmi oħra bħal invertebrati (e ż. 
araknidi predaturi u ħanfus; eż. (64)) jew predaturi vertebrati (e ż. volpijiet 
u gawwi) (18) (62). Xi spe ċijiet ta’ oligochaetes terrestri b ħalissa użati 
f’ittestjar ekotossikolo ġiku huma deskritti fl-Appendi ċi 5. 
3. Il-Gwida Standard ASTM biex Isiru Testijiet fil-Laboratorju g ħal Tossiċità 
fil-Ħamrija jew Akkumulazzjoni Bijolo ġika bil-Ħanex Lumbri ċida Eisenia 
fetida  u bil-Ħanex l-Abjad Enchytraeid  Enchytraeus albidus  (3) tipprovdi 
ħafna dettalji essenzjali u utli g ħal dak li jag ħmel bħalissal-Metodu ta’ 
Ttestjar dwar l-akkumulazzjoni bijolo ġika fil-ħamrija. Aktar dokumenti li 
ssir referenza g ħalihom f’dan il-Metodu ta’ Ttestjar huma l-Kapitolu C.13 
ta’ dan l-Anness, Kon ċentrazzjoni Bijolo ġika: Test ta’ Fluss Kontinwu 
tal-Ħut (49) u OECD TG 315: Akkumulazzjoni Bijolo ġika f’Oligochates 
tal-Qiegħ li jgħixu f’sediment (53). Esperjenza prattika fi studji u pubbli ­
kazzjonijiet mil-letteratura dwar akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ ħamrija, eż. 
(1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) hija wkoll g ħajn 
ewlenija ta’ informazzjoni g ħal dan il-Metodu ta’ Ttestjar.  
4. Dan il-metodu ta’ Ttestjar japplika l-aktar g ħal kimiċi organiċi stabbli u 
newtrali li jittendu li jassorbixxu mill- ħamrija. Ittestjar g ħal akkumulazzjoni 
bijoloġika f’komposti metallorgani ċi assoċjati mal-ħamrija, stabbli, jista’ 
jkun possibbli ma’ dan il-Metodu ta’ Ttestjar. Huwa wkoll applikabbli għal metalli u g ħal mikroelementi.
 
PREREKWI ŻIT 
5. Testijiet biex titkejjel il-akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ kimika f’oligochaetes 
terrestri saru b’metalli tqal (ara e ż. (63)) u b’kimi ċi persistenti, ogani ċi li 
għandhom valuri log Kow bejn 3.0 u 6.0 e ż. (40). Testijiet b ħal dawn 
japplikaw ukoll g ħal: 
— kimiċi li juru log K  ow ta’ aktar minn 6.0 (kimi ċi superidrofobi ċi); ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kimiċi li jappartienu lil klassi ta’ kimi ċi organiċi magħrufin li għandhom 
il-potenzjal jakkumulaw bijolo ġikament f’organi żmi ħajjin, eż. kimiċi 
attivi fil-wi ċċ jew li jassorbixxu ħafna;  
— kimiċi li jindikaw il-potenzjal g ħal akkumulazzjoni bijolo ġika minn 
karatteristi ċi strutturali, e ż. analogi ta’ kimi ċi b’potenzjal mag ħruf għal 
akkumulazzjoni bijolo ġika; u  
— Metalli.  
6. Informazzjoni dwar il-kimika g ħall-ittestjar b ħal isem komuni, isem 
tal-kimika (preferibbilment isem IUPAC), formula strutturali, numru tar-reġistru tal-CAS, purezza, prekawzjonijiet ta’ sikurezza, kondizzjonijiet 
ta’ ħżin adatti u metodi analiti ċi għandhom jinkisbu qabel ma jinbeda 
l-istudju. Barra minn dan, g ħandha tkun mag ħrufa l-informazzjoni li ġejja:
 
(a) solubilità fl-ilma;  
(b) koeffi ċjent tal-partizzjoni ottanol-ilma, K  ow; 
(c) koeffi ċjent tal-partizzjoni ħamrija-ilma, espress b ħala K  oc; 
(d) pressjoni tal-fwar;  
(e) degradabbiltà (e ż. fil-ħamrija, ilma);  
(f) metaboliti mag ħrufin.  
7. Jistg ħu jintużaw kimiċi għall-ittestjar b’tikketa radju jew mhux b’tikketta 
radju. Iżda biex l-anali żi titħaffef huwa rrakkomandat li tintu ża kimika 
għall-ittestjar b’tikketta radju. Id-de ċiżjoni ssir abba żi tal-limiti ta’ detezzjoni 
jew ta’ rekwi żit biex jitkejlu kimika g ħall-ittestjar u metaboliti prin ċipali. 
Jekk tintu ża kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radju u jitkejlu residwi 
radjuattivi totali, huwa importanti li r-residwi b’tikketta radju kemm 
fil-ħamrija kif ukoll fl-organi żmi tat-test ikunu kkaratterizzati g ħal 
perċentwali ta’ kimika prin ċipali tat-test u b’tikketta li ma jkunux prin ċipali, 
eż. f’kampjuni me ħudin fi stat regolari jew fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment, 
biex titħalla ssir kalkulazzjoni ta’ fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika (BAF) 
għall-kimika prin ċipali tat-test u g ħal metaboliti tal- ħamrija ta’ t ħassib (ara 
l-paragrafu 50). Il-metodu deskritt hawn jista’ jkollu ji ġi mmodifikat, e ż., 
biex jipprovdi bijomassa suffi ċjenti, biex ikejjel kimi ċi għall-ittestjar jew ta’ 
metalli ming ħajr tikketta radju. Meta jitkejlu residwi radjuattivi totali (billi 
tingħadd xintillazzjoni likwida wara estrazzjoni, kombustjoni jew ta ħlil ta’ 
tessuti), il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika jkun ibba żat fuq il-kimika 
prinċipali tat-test u tal-metaboliti. Il-kalkulazzjoni tal-BAF preferibbilment 
għandha tkun ibba żata fuq il-kon ċentrazzjoni tal-kimika prin ċipali tat-test 
fl-organiżmi u f’residwi radjuattivi totali. Sussegwentement, il-fattur ta’ 
akkumulazzjoni bijota- ħamrija (BSAF), normalizzat g ħall-kontenut ta’ 
lipidi ta’ kontenut ta’ dud u ta’ karbonju organiku (OC) ta’ ħamrija 
għandu jkun ikkalkulat mill-BAF g ħal raġunijiet ta’ tqabbil bejn ri żultati 
minn testijiet differenti ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika. 
8. It-tossi ċità tal-kimika g ħall-ittestjar g ħall-ispeċijiet użati fit-test g ħandha tkun 
magħrufa, eż. konċentrazzjoni ta’ effetti (ECx) jew kon ċentrazzjoni letali 
(LCx) għaż-żmien tal-fa żi ta’ assorbiment (e ż. (19)). Il-kon ċentrazzjoni 
magħżula tal-kimika g ħall-ittestjar preferibbilment g ħandha tkun madwar 
1 % ta’ LC  50 , asimptotika akuta tag ħha, u mill-anqas g ħaxar darbiet aktar 
ogħla mil-limitu tal-detezzjoni tag ħha fil-ħamrija bil-metodu analitiku u żat. 
Jekk ikunu disponibbli, g ħandha ting ħata preferenza lil valuri ta’ tossi ċità 
derivati minn studji fit-tul dwar punti ta’ tmiem subletali (51) (52). Jekk 
dejta bħal din ma tkunx disponibbli, test g ħal tossiċita akuta g ħandu 
jipprovdi informazzjoni utli (ara e ż. (23)).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Metodu analitiku adatt ta’ akkuratezza, pre ċiżjoni u sensittività mag ħrufa 
għall-kwantifikazzjoni tal-kimika fis-soluzzjonijiet tat-testijiet, fil- ħamrija, u 
fil-materjal bijolo ġiku għandu jkun disponibbli, flimkien ma’ dettalji dwar 
tħejjija u ħżin ta’ kampjuni, kif ukoll skedi materjali ta’ dejta ta’ sikurezza. 
Limiti analiti ċi ta’ detezzjoni tal-o ġġett tat-test fil- ħamrija u f’tessut ta’ dud 
ukoll għandhom ikunu mag ħrufin. Jekk tintu ża kimika g ħall-ittestjar 
b’tikketta 14C, ir-radjuattività spe ċifika (jiġifieri Bq mol-1) u l-per ċentwali 
ta’ radjuattività asso ċjat ma’ impuritajiet g ħandhom ikun mag ħrufa. 
Ir-radjuattività spe ċifika tal-kimika g ħall-ittestjar g ħandha tkun g ħolja 
biżżejjed biex tiffa ċilità anali żi, u l-kon ċentrazzjonijiet tat-test u żati 
m’għandhomx jirri żultaw f’effetti tossi ċi. 
10. It-test jista’ ssir b’ ħamrija artifi ċjali jew b’ ħamrija naturali. Informazzjoni 
dwar karatteristi ċi tal-ħamrija naturali u żata, eż. l-oriġni tal-ħamrija jew 
il-kostitwenti tag ħha, pH, kontenut ta’ karbonju organiku, distribuzzjoni 
ta’ daqsijiet ta’ parti ċelli (perċentwali ta’ ramel, fajd u tafal), u kemm 
tkun kapa ċi żżomm ilma (WHC), g ħandha tkun mag ħrufa qabel ma jibda 
t-test (3) (48).  
PRINĊIPJU TAT-TEST  
11. Il-parametri li jikkaratterizzaw il-akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ kimika g ħall- 
ittestjar jinkludu l-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika (BAF), il-kostant 
tar-rata ta’ assorbiment (k  s ) u l-kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni (k  e ). Defi­
nizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendi ċi 1. 
12. It-test jikkonsisti f’ żewġ fażijiet: il-fa żi ta’ assorbiment (espo żizzjoni) u 
l-fażi ta’ eliminazzjoni (wara espo żizzjoni). Matul il-fa żi ta’ assorbiment, 
gruppi replikati ta’ dud ikunu esposti g ħall-ħamrija, li tkun t ħalltet 
mal-kimika g ħall-ittestjar. Flimkien mal-annimali tat-test, gruppi ta’ dud 
ta’ kontroll jin żammu f’kondizzjonijiet identi ċi mingħajr il-kimika g ħall- 
ittestjar. Jitkejlu l-pi ż fin-niexef u l-kontenut ta’ lipidi tal-organi żmi 
tat-test. Dan jista’ jsir billi jintu ża dud tal-grupp ta’ kontroll. Jistg ħu 
jinkisbu valuri ta’ sfond analitiku (in bjank) billi jkunu analizzati 
kampjuni tad-dud ta’ kontroll u tal- ħamrija. G ħall-fażi ta’ eliminazzjoni, 
id-dud jiġi ttrasferit g ħal ħamrija ħielsa mill-kimika g ħall-ittestjar. Fa żi ta’ 
eliminazzjoni hija dejjem me ħtieġa sakemm l-assorbiment tal-kimika g ħall- 
ittestjar matul il-fa żi ta’ espo żizzjoni ma jkunx insinifikanti. Fa żi ta’ elimi ­
nazzjoni tipprovdi informazzjoni dwar ir-rata li biha l-kimika g ħall-ittestjar 
tinħareg ‘il barra b ħal ħmieġ mill-ġisem mill-organi żmi tat-test (e ż. (27)). 
Jekk ma jkunx intla ħaq stat regolari matul il-fa żi ta’ assorbiment, 
id-determinazzjoni tal-parametri kineti ċi – fattur BAFk ta’ akkumulazzjoni 
bijoloġika kinetika, kostant(i) ta’ rati ta’ assorbiment u eliminazzjoni – 
għandha preferibbilment tkun ibba żata fuq l-issettjar simultanju tar-ri żultati 
tal-fażijiet ta’ assorbiment u eliminazzjoni. Il-kon ċentrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar fid-dud u fuqu tkun immonitorjata t-tul kollu ta ż-żewġ 
fażijiet tat-test.  
13. Matul il-fa żi ta’ assorbiment, jittie ħdu kejlijiet ta’ te ħid ta’ kampjuni sa 14-il 
jum (enchytraeids) jew 21 jum ( ħniex) sakemm jintla ħaq l-istat regolari (11) 
(12) (67). L-istat regolari jse ħħ meta grafika tal-kon ċentrazzjoni f’dud 
mal-ħin tkun parallela mal-assi tal- ħin, u tliet anali żi suċċessivi ta’ kon ċen­
trazzjoni mag ħmulin fuq kampjuni me ħudin f’intervalli ta’ mill-anqas 
jumejn ma jvarjawx aktar minn ± 20 % wa ħda mill-o ħra abbażi ta’ tqab ­
biliet ta’ statistika (e ż. analiżi ta’ varjanza, anali żi ta’ rigressjoni).  
14. Il-fażi ta’ eliminazzjoni tikkonsisti fit-trasferiment tal-organi żmi tat-test g ħal 
reċipjenti li jkun fihom l-istess substrat ming ħajr il-kimika g ħall-ittestjar. 
Matul il-fa żi ta’ eliminazzjoni, jittie ħdu kejlijiet f’ ħinijiet ta’ te ħid ta’ 
kampjuni matul 14-il jum (enchytraeids) jew 21 jum ( ħniex) sakemm deter ­
minazzjoni analitika ta’ qabel tkun uriet tnaqqis ta’ 90 % tar-residwi 
tal-kimika g ħall-ittestjar f’dud. Il-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar 
fid-dud fit-tmiem tal-fa żi ta’ eliminazzjoni tkun irrapportata b ħala residwi  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
mhux eliminati. Il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika tal-istat regolari 
(BAFss) ikun ikkalkulat preferibbilment kemm b ħala l-proporzjon 
tal-konċentrazzjoni f’dud (Ca) kif ukoll fil- ħamrija (Cs) fi stat regolari 
apparenti, u b ħala fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika kinetika, BAFK, 
bħala l-proporzjon tal-kostant tar-rata ta’ assorbiment mill- ħamrija (ks) u 
l-kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni (ke) (ara l-Appendi ċi 1 għal defi­
nizzjonijiet) jekk wie ħed jassumi kinetika tal-ewwel ordni (ara l-Appendi ċi 
2 għal kalkulazzjonijiet). Jekk kinetika tal-ewwel ordni ovvjament ma tkunx 
applikabbli, g ħandhom jintu żaw mudelli o ħra. 
15. Il-kostant tar-rata ta’ assorbiment, il-kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni (jew 
kostanti, fejn kienu involuti mudelli o ħra), il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijo ­
loġika kinetika (BAFK), u meta jkun possibbli, il-limiti ta’ kunfidenza ta’ 
kull wieħed minn dawn il-parametri jkunu kkalkulati minn ekwazzjonijiet 
mudelli kompjuterizati (ara l-Appendi ċi 2 għal gwida). L-idoneità ta’ kull 
mudell tista’ tkun iddeterminata minn e ż. il-koeffi ċjent ta’ korrelazzjoni jew 
mill-koeffi ċjent ta’ determinazzjoni (koeffi ċjenti qrib ta’ wie ħed jindikaw 
idoneità) jew chi-kwadrat. Id-daqs ukoll tal-i żball standard jew il-limitu 
ta’ kunfidenza madwar il-parametri stmati jistg ħu jkunu indikattivi 
tal-idoneità tal-mudell.  
16. Biex titnaqqas il-varjabbiltà f’ri żultati ta’ testijiet g ħal kimiċi għall-ittestjar 
b’lipofiliċità għolja, fatturi ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika għandhom ikunu 
espressi b’rabta mal-kontenut ta’ lipidi u mal-kontenut ta’ karbonju organiku 
(kg ta’ karbonju organiku ta’ ħamrija (OC) kg-1 kontenut ta’ lipidi ta’ dud). 
Dan l-appro ċċ huwa bba żat fuq il-fatt li g ħal xi klassijiet ta’ kimika, hemm 
relazzjoni ċara bejn il-potenzjal g ħal akkumulazzjoni bijolo ġika u 
l-lipofiliċità; dan kien stabbilit sewwa g ħall-ħut (47). Hemm relazzjoni 
bejn il-kontenut ta’ lipidi ta’ ħut u l-akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ kimi ċi 
bħal dawn. G ħal organi żmi tal-qieg ħ, instabu korrelazzjonijiet simili, e ż. 
(30) (44). Bl-istess mod g ħal oligochaetes terrestri ntweriet din 
il-korrelazzjoni, e ż. (5) (6) (7) (14). Jekk ikun disponibbli tessut suffi ċjenti 
ta’ dud, il-kontenut ta’ lipidi tal-annimali tat-test jista’ jkun iddeterminat fuq l-istess materjal bijolo ġiku bħal dak u żat biex tkun iddeterminata 
l-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar. Alternattivament, jistg ħu 
jintużaw annimali ta’ kontroll biex jitkejjel il-kontenut ta’ lipidi.
 
VALIDITÀ TAT-TEST  
17. Biex test ikun validu g ħandhom jit ħarsu l-kriterji li ġejjin kemm g ħal 
kontrolli kif ukoll g ħal trattamenti:  
— Fit-tmiem tat-test, il-mortalità globali matul assorbiment u l-fa żi ta’ 
eliminazzjoni m’g ħandhomx ikunu aktar minn 10 % ( ħniex) jew 20 % 
(enchytraeids) tal-g ħadd totali tad-dud introdott.  
— Għal Eisenia fetida  u Eisenia andrei , it-telf medju ta’ massa kif imkejjel 
fit-tmiem tal-assorbiment u fit-tmiem tal-fa żi ta’ eliminazzjoni 
m’għandux ikun aktar minn 20 % mqabbel mal-pi ż ġdid inizjali (f.w.) 
fil-bidu ta’ kull fa żi. 
DESKRIZZJONI TAL-METODU  
Speċi tat-test  
18. Diversi spe ċijiet ta’ oligochaetes terrestri huma rrakkomandati g ħal ittestjar 
ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika. L-ispe ċijiet komunement l-aktar u żati Eisenia 
fetida jew Eisenia andrei (Lumbricidae), jew Enchytraeus albidus, 
Enchytraeus crypticus, jew Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) huma 
deskritti fl-Appendi ċi 5. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Apparat  
19. Għandha ting ħata attenzjoni biex ikun evitat l-u żu ta’ materjali, g ħall- 
partijiet kollha tat-tag ħmir, li jistg ħu jinħallu, jassorbixxu l-kimika g ħall- 
ittestjar jew ilissu kimi ċi oħra, u jkollhom effett ħażin fuq l-annimali 
tat-test. Re ċipjenti standard rettangolari jew ċilindriċi, magħmulin minn 
materjal kimikament inerti u ta’ kapa ċità adatta jistg ħu jintużaw b’kon ­
formità mar-rata ta’ tag ħbija, jiġifieri mal-g ħadd ta’ dud tat-test. Jistg ħu 
jintużaw azzar inossidabbli, plastik jew ħġieġ għal kull tag ħmir li jkollu 
kuntatt mal-midja tat-test. It-re ċipjenti tat-test g ħandhom ikunu mg ħottijin 
kif jixraq biex id-dud ma jit ħalliex jaħrab, filwaqt li tit ħalla provvista 
suffiċjenti ta’ arja. G ħal kimiċi b’koeffi ċjenti għoljin ta’ sorbiment, b ħal 
piretrojdi sinteti ċi, jista’ jkun me ħtieġ ħġieġ sinalizzat. F’dawn 
is-sitwazzjonijiet it-tag ħmir ikollu jitwarrab wara li jintu ża (49). O ġġetti 
tat-test u kimi ċi volatili b’tikketta radju m’g ħandhomx jit ħallew jaħarbu. 
Għandhom ikunu u żati sifuni (e ż. fliexken tal- ħġieġ għal ħasil bil-gass) li 
jkun fihom assorbenti adatti biex i żommu kull residwu milli jevapora 
mir-reċipjenti tat-test.  
Ħamrija  
20. Il-ħamrija tat-test g ħandha tkun ta’ kwalità li tippermetti s-sopravivenza u 
preferibbilment ir-riproduzzjoni tal-organi żmi tat-test g ħal kemm idumu 
l-akklimatazzjoni u l-perjodi ta’ testijiet ming ħajr dawn ma juru ebda 
dehra jew m ġiba mhux normali. Id-dud g ħandu jħaffer toqob fil- ħamrija.  
21. Il-ħamrija artifi ċjali deskritta fil-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness (48) hija 
rrakkomandata biex tintu ża bħala s-substrat fit-testijiet. It-t ħejjija 
tal-ħamrija artifi ċjali għal użu fit-testijiet ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika u 
rakkomandazzjonijiet g ħall-ħżin ta’ ħamrija artifi ċjali jing ħataw 
fl-Appendi ċi 4. Ħamrija artifi ċjali mnixxfa bl-arja tista’ tin ħażen f’tem­
peratura ambjentali sakemm tintu ża. 
22. Iżda ħamrija naturali minn siti mhux imni ġġsa tista’ sservi ta’ ħamrija ta’ 
test u/jew ta’ kultura. Ħamrija naturali g ħandha tkun ikkaratterizzata 
mill-anqas minn ori ġni (sit ta’ ġbir), pH, kontenut ta’ karbonju organiku, 
distribuzzjoni ta’ daqsijiet ta’ parti ċelli (perċentwali ta’ ramel, fajd u tafal), 
kapaċità ta’ żamma massima ta’ ilma (WHCmax), u kontenut ta’ ilma f’per ­ 
ċentwali (3). Anali żi tal-ħamrija jew tal-kostitwenti tag ħha għal mikro­
sustanzi li jni ġġsu qabel l-u żu għandha tipprovdi informazzjoni utli. Jekk 
tintuża ħamrija minn g ħelieqi ta’ art agrikola, m’g ħandhiex tkun ġiet 
ittrattata bi prodotti ta’ protezzjoni ta’ g ħelejjel jew b’demel ta’ annimali 
ttrattati bħala fertilizzanti g ħal mill-anqas sena u b’fertilizzanti organi ċi għal 
mill-anqas sitt xhur qabel ma jittie ħdu kampjuni (50). Pro ċeduri ta’ manipu ­
lazzjoni g ħal ħamrija naturali qabel ma tintu ża f’tests ekotossikolo ġiċi ma’ 
oligochaetes fil-laboratorju huma deskritti fi (3). G ħal ħamrija naturali ż- 
żmien ta’ ħżin fil-laboratorju g ħandu jinżamm qasir kemm jista’ jkun.  
Applikazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar  
23. Il-kimika g ħall-ittestjar tkun inkorporata fil- ħamrija. G ħandhom jitqiesu 
l-proprjetajiet fi żikokimiċi tal-kimika g ħall-ittestjar. Kimika g ħall-ittestjar li 
tinħall fl-ilma g ħandha tiġi maħlula kompletament fl-ilma qabel ma tit ħallat 
mal-ħamrija. Il-pro ċedura rrakkomandata li tiffortifika g ħal kimika g ħall- 
ittestjar li ftit tin ħall fl-ilma tinvolvi kisja wa ħda jew aktar tal-kostitwenti 
tal-ħamrija (artifi ċjali) mal-kimika g ħall-ittestjar. Pere żempju, ir-ramel 
tal-quartz, jew porzjon minnu, jista’ jitg ħaddas b’soluzzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar f’solvent organiku adatt, li wara ji ġi evaporat bil-mod  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
sakemm jinxef. Il-frazzjoni miksija mbag ħad tkun tista’ tit ħallat fil-ħamrija 
mxarrba. Il-vanta ġġ kbir ta’ din il-pro ċedura huwa li ebda solvent ma 
jiddaħħal fil-ħamrija. Meta tintu ża ħamrija naturali, il-kimika g ħall-ittestjar 
tista’ tkun iffortifikata billi porzjon ta’ ħamrija mnixxef bl-arja jit ħallat kif 
deskritt hawn fuq g ħall-ħamrija artifi ċjali, jew billi l-kimika g ħall-ittestjar 
titħawwad fil- ħamrija mxarrba, bi stadju wara ta’ evaporazzjoni jekk jintu ża 
aġent ta’ solubilità. In ġenerali, il-kuntatt ta’ ħamrija mxarrba ma’ solventi 
għandu jkun evitat kemm jista’ jkun. G ħandu jitqies dan li ġej (3):  
— Jekk jintu ża solvent minbarra ilma, huwa g ħandu jkun wie ħed li jitħallat 
mal-ilma u/jew li jkun jista’ jitne ħħa (pereżempju, evaporat), u tit ħalla 
biss il-kimika g ħall-ittestjar fuq il- ħamrija.  
— Jekk jintu ża kontroll ta’ solvent, ma jkunx hemm ħtieġa ta’ kontroll 
negattiv. Il-kontroll ta’ solvent g ħandu jkun fih ‘il fuq mill-og ħla konċ­
entrazzjoni ta’ solvent mi żjud mal- ħamrija u g ħandu juża solvent 
mill-istess lott u żat biex issir is-soluzzjoni ta’ stokkijiet. It-tossi ċità u 
l-volatilità tas-solvent, u s-solubilità tal-kimika g ħall-ittestjar fis-solvent 
magħżul għandhom ikunu l-kriterji ewlenin u żati għall-għażla ta’ aġent 
ta’ solubilità adatt.  
24. Għal kimiċi li ftit jin ħallu fl-ilma u f’solventi organi ċi, jistgħu jitħalltu 2,0 – 
2,5 g ta’ ramel quartz mit ħun fin għal kull reċipjent tat-test mal-kwantità ta’ 
kimika g ħall-ittestjar, e ż. billi jintu ża mehrie ż u lida, biex tinkiseb 
il-konċentrazzjoni tat-test mixtieqa. Din it-ta ħlita ta’ ramel tal-quartz u 
l-kimika g ħall-ittestjar ji żdiedu mal- ħamrija mag ħmula niedja minn qabel 
u mħawda sewwa b’ammont xieraq ta’ ilma dejonizzat biex jinkiseb 
il-kontenut me ħtieġ ta’ rtuba. It-ta ħlita finali titqassam fir-re ċipjenti 
tat-test. Il-pro ċedura tittenna g ħal kull kon ċentrazzjoni tat-test, u jit ħejja 
wkoll kontroll xieraq b’2,0 – 2,5 g ta’ ramel tal-quartz mit ħun fin għal 
kull reċipjent tat-test.  
25. Il-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fil- ħamrija għandha tkun iddeter ­
minata wara li tkun ġiet iffortifikata. Id-distribuzzjoni omo ġenja tal-kimika 
għall-ittestjar fil- ħamrija għandha tkun ivverifikata qabel ma jidda ħħlu 
l-organiżmi tat-test. Il-metodu u żat biex tkun iffortifikata, u r-ra ġunijiet 
għall-għażla ta’ pro ċedura li tiffortifika g ħandhom ikunu rrapportati (24).  
26. L-ekwilibriju bejn il- ħamrija u l-fa żi ta’ ilma mill-pori idealment g ħandha 
tkun stabbilita qabel ma ji żdiedu l-organi żmi; huwa rrakkomandat perjodu 
ta’ żmien ta’ erbat ijiem f’20 °C. G ħal ħafna kimi ċi organiċi li ftit jin ħallu 
fl-ilma ż-żmien me ħtieġ biex jintla ħaq ekwilibriju veru bejn frazzjonijiet 
sorbiti u ma ħlulin jistg ħu jingħaddu f’jiem jew xhur. Ikun jiddependi 
mill-għan tal-istudju, pere żempju meta l-kondizzjonijiet ambjentali 
għandhom ikunu imitati, jekk il- ħamrija fortifikata tkunx tista’ ‘tixxejja ħ’ 
għal perjodu itwal, e ż. tliet ġimgħat għal metalli f’20 °C (22).  
Kultura g ħall-organi żmi tat-test  
27. Dud g ħandu preferibbilment jin żamm f’kultura permanenti tal-laboratorju. 
Gwida dwar metodi ta’ kultura tal-laboratorju g ħal Eisenia fetida  u Eisenia 
andrei , u għall-ispeċi ta’ Enchytraeid, hija pprovduta fl-Appendi ċi 5 (ara 
wkoll (48) (51) (52)).  
28. Id-dud u żat fit-testijiet g ħandu jkun ħieles minn mard, anormalitajiet u 
parassiti osservabbli.  
PRESTAZZJONI TAT-TEST  
29. L-organi żmi tat-test ikunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar matul il-fa żi ta’ 
assorbiment. Il-fa żi ta’ assorbiment g ħandha tkun ta’ 14-il jum 
(enchytraeids) jew ta’ 21 jum ( ħniex) sakemm ma jintweriex li jkun 
intlaħaq stat regolari.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Għall-fażi ta’ eliminazzjoni, id-dud ikun ittrasferit g ħal ħamrija ħielsa minn 
kimika g ħall-ittestjar. L-ewwel kampjun g ħandu jittie ħed f’4 – 24 sieg ħa 
wara l-bidu tal-fa żi ta’ eliminazzjoni. E żempji ta’ skedi ta’ te ħid ta’ 
kampjuni g ħal fażi ta’ assorbiment ta’ 21 jum u g ħal fażi ta’ eliminazzjoni 
ta’ 21 jum jing ħataw fl-Appendi ċi 3. 
Organiżmi tat-test  
31. Għal ħafna speċijiet ta’ enchytraeids terresti l-pi ż ta’ kull wa ħda minnhom 
huwa baxx ħafna (eż. 5-10 mg pi ż fl-imxarrab g ħal kull wa ħda minnhom ta’  
Enchytraeus albidus  u anqas g ħal Enchytraeus crypticus  jew  Enchytraeus 
luxuriosus ); biex isiru l-kejlijiet tal-pi ż u l-analiżi kimika, jista’ jkun me ħtieġ 
li jinġabar id-dud tar-re ċipjenti replikati tat-test (ji ġifieri jintu ża d-dud kollu 
ta’ reċipjent replikat biex jinkiseb ri żultat ta’ tessut analitiku wie ħed). 20 
enchytraeids individwali ji żdiedu għal kull replikat, u g ħandhom jintu żaw 
mill-anqas tliet replikati. Jekk il-limitu analitiku ta’ detezzjoni tal-kimika għall-ittestjar ikun g ħoli, jista’ jkun me ħtieġ aktar dud. G ħal speċi tat-test 
b’piż ogħla ta’ kull spe ċi waħidha ( Eisenia fetida  u Eisenia andrei ), jistgħu 
jintużaw reċipjenti replikati li jkun fihom spe ċi wa
ħda. 
32. Il-ħniex użati f’test g ħandhom ikunu ta’ pi ż simili (e ż. Eisenia fetida  u 
Eisenia andrei  kull wa ħda minnhom g ħandu jkollha pi ż ta’ 250 – 600 
mg). Enchytraeids (e ż. Enchytraeus albidus ) għandu jkollhom tul ta’ bejn 
wieħed u ieħor 1 cm. Id-dud kollu u żat f’test partikolari g ħandu jiġi 
mill-istess sors, u g ħandhom ikunu annimali adulti bi clitellum (ara 
l-Appendi ċi 5). Min ħabba li l-pi ż u l-età ta’ annimal jista’ jkollhom effett 
fuq il-valuri tal-BAF (e ż. minħabba kontenut ta’ lipidi li jvarja u/jew g ħax 
ikun hemm bajd), dawn il-parametri g ħandhom ikunu rre ġistrati b’mod 
akkurat u jitqiesu fl-interpretazzjoni ta’ ri żultati. Barra minn dan, fosdqiet 
jistgħu jkunu ddepo żitati matul il-perjodu ta’ espo żizzjoni, li jkollu wkoll 
impatt fuq il-valuri tal-BAF. Huwa rrakkomandat li kampjun sekondarju tad-dud tat-test jinti żen qabel it-test biex ikunu stmati l-pi żijiet medji 
fl-imxarrab u fin-niexef.
 
33. Għandu jintu ża proporzjon g ħoli ta’ ħamrija ma’ dud biex ikun immini ­
mizzat it-tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fil- ħamrija 
matul il-fa żi ta’ assorbiment. G ħal Eisenia fetida  u Eisenia andrei  huwa 
rrakkomandat ammont minimu ta’ pi ż fin-niexef ta’ 50 g (d.w.) ta’ 
ħamrija għal kull dudu, u g ħal enchytraeids, minimu ta’ 10-20 g d.w. ta’ 
ħamrija għal kull re ċipjent tat-test. Ir-re ċipjenti għandu jkun fihom saff 
ħamrija ta’ 2-3 cm (enchytraeids) jew 4-5 cm ( ħniex).  
34. Id-dud u żat f’test jitne ħħa mill-kultura (e ż. enchytraeids billi jintu żaw 
pinzetti ta’ ġojjellier). Annimali adulti jkunu ttrasferiti g ħal ħamrija tat-test 
mhux ittrattata g ħal akklimatazzjoni, u mitmug ħa (ara l-paragrafu 36). Jekk 
il-kondizzjonijiet tat-test ikunu differenti mill-kondizzjonijiet tal-kultura, fa żi 
ta’ akklimatazzjoni ta’ 24-72 sieg ħa għandha tkun suffi ċjenti biex id-dud 
jadatta g ħall-kondizzjonijiet tat-test. Wara akklimatazzjoni, il- ħniex 
jitlaħalħu billi jkunu ttrasferiti g ħal dixxijiet tal- ħġieġ (eż. dixxijiet Petri) 
li jkun fihom ilma nadif, u wara jinti żnu qabel ma ji żdiedu mal- ħamrija 
tat-test. Qabel l-u żin, għandu jitne ħħa ilma żejjed mid-dud billi d-dud 
jintmess max-xifer tad-dixx jew ikun ixxugat bil-mod sakemm jinxef 
bl-użu ta’ xugaman tal-karta ftit niedi.  
35. Il-mod kif organismi tat-test i ħaffru toqob g ħandu jkun osservat u rre ġistrat. 
F’testijiet bi ħniex, l-annimali (kontroll u trattamenti) normalment itaqqbu 
toqob fil- ħamrija f’perjodu ta’ ftit sig ħat; dan għandu jkun ivverifikat mhux 
aktar tard minn 24 sieg ħa wara li ji żdied id-dud fir-re ċipjenti tat-test. Jekk 
il-ħniex jonqsu milli j ħaffru toqob fil- ħamrija (e ż. aktar minn 10 % g ħal ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
aktar min-nofs tal-fa żi ta’ assorbiment), dan jindika li jew il-kondizzjonijiet 
tat-test ma jkunux adatti jew li l-organi żmi tat-test ma jkunux f’sa ħħithom. 
F’każ bħal dan it-test g ħandu jitwaqqaf u jittenna. Enchytraeids jg ħixu 
l-aktar fil-pori interstizjali tal- ħamrija, u sikwit il-qoxra ta’ barra tag ħhom 
tista’ tkun parzjalment biss f’kuntatt mas-substrat tal-madwar; espo żizzjoni 
ta’ enchytraeids li j ħaffru toqob u dawk li ma j ħaffrux toqob tkun pre żunta li 
hija ekwivalenti u enchytraeids li ma j ħaffrux toqob mhux bilfors je ħti­ 
ġilhom li t-test jittenna.  
Tmigħ 
36. Tmig ħ għandu jkun ipprospettat meta tintu ża ħamrija b’kontenut ta’ 
karbonju organiku totali baxx. Meta tintu ża ħamrija artifi ċjali, hija rrakkom ­
andata rata ta’ tmig ħ darbtejn fil- ġimgħa (jiġifieri d-dud g ħandu jintema’ 
darba fil- ġimgħa) ta’ 7 mg ta’ rawt niexef g ħal kull g ħamrija piż fin-niexef 
għal ħniex, u rata kull ġimgħa ta’ 2-2,5 mg ta’ trofof ta’ ħafur mitħun għal 
kull g ħamrija piż fin-niexef g ħal enchytraeids (11). L-ewwel razzjon ta’ ikel 
għandu jitħallat mal- ħamrija minnufih qabel ma’ ji żdiedu l-organi żmi 
tat-test. Preferibbilment g ħandu jintu ża l-istess tip ta’ ikel b ħal dak 
fil-kulturi (ara l-Appendi ċi 5). 
Dawl u temperatura  
37. It-testijiet g ħandhom isiru ta ħt ċiklu kkontrollat ta’ 16/8 sig ħat dawl/dlam, 
preferibbilment ta’ 400 sa 800 lx fl-erja tat-re ċipjenti tat-test (3). 
It-temperatura tat-test g ħandha tkun 20 ± 2 °C matul it-test kollu.  
Konċentrazzjonijiet tat-test  
38. Tintu ża konċentrazzjoni wa ħda. Sitwazzjonijiet fejn kon ċentrazzjoni(jiet) 
addizzjonali tkun/ikunu me ħtieġa għandhom ikunu ġġustifikati. Jekk 
it-tossiċità (ECx) tal-kimika g ħall-ittestjar tkun qrib il-limitu ta’ detezzjoni 
analitika, huwa rrakkomandat l-u żu ta’ kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radju 
b’radjuattività spe ċifika għolja. Għal metalli, il-kon ċentrazzjoni g ħandha 
tkun ‘il fuq mil-livell tal-isfond fit-tessut u fil- ħamrija.  
Replikati  
39. Għal kejlijiet kineti ċi (fażi ta’ assorbiment u eliminazzjoni), l-g ħadd minimu 
ta’ reċipjenti replikati ttrattati g ħandu jkun tlieta g ħal kull punt ta’ te ħid ta’ 
kampjuni. L-g ħadd totali ta’ replikati m ħejjija għandu jkun suffi ċjenti biex 
ikopri l-ħinijiet kollha ta’ te ħid ta’ kampjuni matul l-assorbiment u l-fa żi ta’ 
eliminazzjoni.  
40. Għall-osservazzjonijiet u l-kejl bijolo ġiċi (eż. proporzjon ta’ pi ż minn 
fin-niexef g ħal fl-imxarrab, kontenut ta’ lipidi) u g ħall-analiżi ta’ kon ċen­
trazzjonijiet ta’ ba żi f’dud u fil- ħamrija, g ħandhom ikunu pprovduti 
mill-anqas 12-il re ċipjent replikat ta’ kontroll negattiv (erbg ħa li jkun 
itteħdilhom kampjun fil-bidu, erbg ħa fit-tmiem ta’ assorbiment, u erbg ħa 
fit-tmiem ta’ eliminazzjoni) jekk ma jkun u żat ebda solvent minbarra 
ilma. Jekk jintu ża xi aġent ta’ solubilità g ħall-applikazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar, g ħandu jsir kontroll ta’ solvent (erbg ħa reċipjenti replikati 
għandu jitte ħdilhom kampjun fil-bidu, erbg ħa fit-tmiem tal-fa żi ta’ assor ­
biment u erbg ħa fit-tmiem tal-fa żi ta’ eliminazzjoni) li jkun fih il-kostitwenti 
kollha ħlief għal oġġett tat-test flimkien mar-replikati ttrattati. F’dan il-ka ż, 
jistgħu wkoll ikunu pprovduti erbg ħa reċipjenti replikati addizzjonali ta’ 
kontroll negattiv (ebda solvent) g ħal teħid fakultattiv ta’ kampjuni 
fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment. Dawn ir-replikati jistg ħu jitqabblu bijolo ­ 
ġikment mal-kontroll ta’ solvent biex tinkiseb informazzjoni dwar 
influwenza li jista’ jkun hemm tas-solvent fuq l-organi żmi tat-test. Huwa 
rrakkomandat li jkun stabbilit g ħadd suffi ċjenti ta’ re ċipjenti replikati 
riżervati addizzjonali (e ż. tmienja) g ħal trattament u kontroll(i).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frekwenza ta’ kejl tal-kwalità tal- ħamrija  
41. Il-pH tal- ħamrija, il-kontenut ta’ rtuba fil- ħamrija u t-temperatura (kontin ­
wament) fil-kamra tat-test g ħandhom jitkejlu fil-bidu u fit-tmiem tal-fa żijiet 
ta’ assorbiment u eliminazzjoni. Darba fil- ġimgħa l-kontenut ta’ rtuba 
fil-ħamrija għandu jkun ikkontrollat billi jinti żnu r-reċipjenti tat-test u 
l-piżijiet attwali jitqabblu ma’ pi żijiet inizjali fil-bidu tat-test. Telf ta’ ilma 
għandu jkun ikkumpensat bi ż-żieda ta’ ilma dejonizzat.  
Teħid ta’ kampjuni u anali żi ta’ dud u ta’ ħamrija  
42. Eżempju ta’ skeda g ħall-fażijiet ta’ assorbiment u eliminazzjoni f’testijiet ta’ 
akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ ħniex u enchytraeid ting ħata fl-Appendi ċi 3. 
43. Il-ħamrija jitte ħdilha kampjun mir-re ċipjenti tat-test biex tkun iddeterminata 
l-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar qabel ma jidda ħħal id-dud, u 
matul il-fa żijiet ta’ assorbiment u eliminazzjoni. Matul it-test 
il-konċentrazzjonijiet ta’ kimika g ħall-ittestjar ikunu ddeterminati fid-dud u 
fil-ħamrija. In ġenerali, kon ċentrazzjonijiet totali ta’ ħamrija jitkejlu. B’mod 
fakultattiv, kon ċentrazzjonijiet f’ilma tal-pori jistg ħu jitkejlu; f’ka ż bħal dan, 
għandhom ikunu pprovduti motiv u metodi adatti qabel ma jinbeda studju, u 
jkunu inklu żi fir-rapport.  
44. Id-dud u l- ħamrija jitte ħdulhom kampjun mill-anqas f’sitt okka żjonijiet 
matul il-fa żijiet ta’ assorbiment u eliminazzjoni. Jekk tintwera l-istabbiltà 
ta’ kimika g ħall-ittestjar, l-g ħadd ta’ anali żi tal-ħamrija jista’ jitnaqqas. 
Huwa rrakkomandat li ssir anali żi mill-anqas ta’ tliet replikati fil-bidu u 
fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment. Jekk il-kon ċentrazzjoni fil- ħamrija 
mkejla fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment tmur lil hinn mill-kon ċentrazzjoni 
tal-bidu b’aktar minn 30 %, il-kampjuni tal- ħamrija me ħudin f’dati o ħra 
wkoll għandhom ikunu analizzati.  
45. Neħħi d-dud ta’ replikat partikolari mill- ħamrija f’kull ħin ta’ teħid ta’ 
kampjuni (e ż. wara li tkun ferrixt il- ħamrija tar-replikat f’dixx baxx u 
erfajt id-dud bl-u żu ta’ pinzetti rotob tal- ġojjellier), la ħlaħhom malajr 
bl-ilma f’dixx baxx tal- ħġieġ jew tal-azzar. Ne ħħi ilma żejjed (ara 
l-paragrafu 34). Ittrasferixxi d-dud b’attenzjoni g ħal ġo reċipjent li jkun 
intiżen minn qabel, i żinhom fil-pront, inklu ż il-kontenut tal-imsaren.  
46. Il-ħniex ( Eisenia  sp.) għandhom imbag ħad jitħallew inaddfu msarinhom 
matul l-lejl e ż. fuq filtru niedi tal-karta f’dixx Petri mg ħotti (ara 
l-paragrafu 34). Wara t-tindif, il-pi ż tad-dud g ħandu jkun iddeterminat 
biex ikun ivvalutat tnaqqis jekk jista’ jkun fil-bijomassa matul it-test (ara 
l-kriterji tal-validità fil-paragrafu 17). U żin u anali żi ta’ tessut ta’ 
Enchytraeids isir ming ħajr tindif, g ħax dan huwa teknikament diffi ċli 
minħabba d-daqs żgħir ta’ dan id-dud. Wara determinazzjoni finali tal-pi ż, 
id-dud għandu jinqatel minnufih, billi jintu ża l-metodu l-aktar adatt (e ż. billi 
jintuża nitroġenu likwidu, jew iffri żar taħt -18 °C).  
47. Matul il-fa żi ta’ eliminazzjoni, id-dud jissostitwixxi kontenut ta’ msaren 
kontaminati b’ ħamrija nadifa. Dan ifisser li kejlijiet ta’ dud mhux nadif 
(enchytraeids f’dan il-kuntest) li jkun itte ħidlu kampjun minnufih qabel 
il-fażi ta’ eliminazzjoni jinkludi ħamrija b’imsaren kontaminati. G ħal oligo­
chaetes akwati ċi huwa pre żunt li wara 4 – 24 sieg ħa inizjali tal-fa żi ta’ 
eliminazzjoni, il-kontenut kwa żi kollu ta’ msaren kontaminati jkun ġie 
sostitwit b’sediment nadif, e ż. (46). Sejbiet simili kienu rrapportati g ħal 
ħniex fi studji dwar l-akkumulazzjoni ta’ kadmju u żingu b’tikketta radju 
(78). F’enchytraeids mhux imnaddfin, il-kon ċentrazzjoni ta’ dan l-ewwel 
kampjun tal-fa żi ta’ eliminazzjoni tista’ titqies b ħala l-kon ċentrazzjoni ta’ 
tessuti wara t-tindif ta’ msaren. Biex titqies id-dilwizzjoni tal-konċentrazzjoni tal-o ġġett tat-test b’ ħamrija mhux kontaminata matul 
l-fażi ta’ eliminazzjoni, il-pi ż tal-kontenut ta’ msaren jista’ jkun stmat 
mill-piż ta’ dud fl-imxarrab/pi ż ta’ rmied ta’ dud jew pi ż ta’ dud 
fin-niexef/proporzjonijiet ta’ pi żijiet ta’ rmied tad-dud.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Il-kampjuni tal- ħamrija u d-dud g ħandhom preferibbilment ikunu analizzati 
minnufih wara tne ħħija (jiġifieri f’1-2 ijiem) biex ma jit ħalliex ikun hemm 
degradazzjoni jew telf ie ħor, u huwa rrakkomandat li jkunu kkalkulati r-rati 
approssimattivi ta’ assorbiment u eliminazzjoni hekk kif ikun g ħaddej it-test. 
Jekk l-anali żi tiddewwem, il-kampjuni g ħandhom jin ħażnu b’metodu adatt, 
eż. fil-friża (≤ -18 °C).  
49. Għandu jkun ivverifikat li l-pre ċiżjoni u riprodu ċibbiltà tal-anali żi kimika, 
kif ukoll l-irkupru tal-kimika g ħall-ittestjar mill- ħamrija u mill-kampjuni 
tad-dud ikunu sodisfa ċenti għall-metodu mog ħti; l-effiċjenza ta’ estrazzjoni, 
il-limitu ta’ detezzjoni (LOD) u l-limitu ta’ kwantifikazzjoni (LOQ) 
għandhom ikunu rrapportati. Bl-istess mod g ħandu jkun ivverifikat li 
l-kimika g ħall-ittestjar ma tkunx tista’ tinqabad fir-re ċipjenti ta’ kontroll 
f’konċentrazzjonijiet og ħla minn ta’ sfond. Meta l-kon ċentrazzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar fl-organi żmu tat-test Ca tkun > 0 fid-dud ta’ 
kontroll, din g ħandha tkun inklu ża fil-kalkulazzjoni tal-parametri kineti ċi 
(ara l-Appendi ċi 2). Il-kampjuni kollha g ħandhom ikunu ttrattati matul 
it-test kollu biex ikunu mminimizzati l-kontaminazzjoni u t-telf (e ż. li 
jirriżultaw minn sorbiment tal-kimika g ħall-ittestjar fuq l-apparat ta’ te ħid 
ta’ kampjuni).  
50. Meta jsir xog ħol fuq kimi ċi għall-ittestjar b’tikketta radju, ikun possibbli ssir 
analiżi ta’ kimi ċi prinċipali u metaboliti. Kwantifikazzjoni ta’ kimika prin ­ 
ċipali tat-test u metaboliti fi stat regolari jew fit-tmiem tal-fa żi ta’ assor ­
biment tipprovdi informazzjoni importanti. Il-kampjuni g ħandhom imbag ħad 
‘jitnaddfu’ biex il-kimika prin ċipali tat-test tkun tista’ ti ġi kkwantifikata 
separatament. Jekk metabolita wa ħedha taqbe ż 10 % tar-radjuattività totali 
fil-kampjun(i) analizzat(i), hija rrakkomandata l-identifikazzjoni ta’ dawn il-metaboliti.
 
51. L-irkupru globali, u l-irkupru ta’ kimika g ħall-ittestjar f’dud, fil- ħamrija, u 
jekk jintu żaw, f’sifuni li jkun fihom assorbenti biex i żommu kimika g ħall- 
ittestjar evaporata, g ħandhom ikunu rre ġistrati u rrapportati.  
52. Il-ġbir flimkien ta’ dawk li jitte ħdilhom kampjun minn re ċipjent partikolari 
tat-test huwa a ċċettabbli g ħal dud enchytraeid li jkunu i żgħar mill-ħniex. 
Jekk ġbir ikun jinvolvi t-tnaqqis tal-g ħadd ta’ replikati, dan jillimita 
l-proċeduri ta’ statistika li jistg ħu jkunu applikati g ħad-dejta. Jekk ikunu 
meħtieġa proċedura u poter spe ċifiċi ta’ statistika, f’dak il-ka ż għandu 
jkun inklu ż għadd adegwat ta’ re ċipjenti replikati tat-test fit-test biex 
jakkomoda l- ġbir, il-pro ċedura u l-poter mixtieqa.  
53. Huwa rrakkomandat li l-BAF ikun espress kemm b ħala funzjoni ta’ pi ż 
totali fin-niexef, kif ukoll, meta me ħtieġ (jiġifieri għal kimiċi idrofobi ċi 
ħafna), bħala funzjoni tal-kontenut ta’ lipidi. G ħandhom jintu żaw metodi 
adatti għad-determinazzjoni ta’ kontenut ta’ lipidi (xi metodi li je żistu 
diġà – eż. (31) (58) – g ħandhom ikunu adattati g ħal dan il-fini). Dawn 
il-metodi ju żaw teknika ta’ estrazzjoni tal-kloroform/metanol. I żda biex 
ikun evitat l-u żu ta’ solventi bil-klorur, g ħandha tintu ża modifika 
tal-metodu ta’ Bligh u Dyer (9) kif deskritta fi (17). Min ħabba li d-diversi 
metodi jistg ħu ma jag ħtux valuri identi ċi, huwa importanti li jing ħataw 
dettalji tal-metodu u żat. Meta jkun possibbli, ji ġifieri jekk ikun disponibbli 
tessut suffi ċjenti tad-dud, l-anali żi tal-lipidi g ħandha idealment issir fuq 
l-istess kampjun jew estratt b ħal dak u żat għal analiżi tal-kimika g ħall- 
ittestjar, min ħabba li l-lipidi sikwit ikollhom jitne ħħew mill-estratt qabel 
ma jkunu jistg ħu jiġu analizzati kromatografikament (49). Alternattivament, 
jistgħu jintużaw annimali ta’ kontroll biex jitkejjel il-kontenut ta’ lipidi, li 
mbagħad ikunu jistg ħu jintużaw biex jinnormalizzaw valuri tal-BAF. Dan 
l-aħħar approċċ inaqqas il-kontaminazzjoni ta’ tag ħmir mal-kimika g ħall- 
ittestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DEJTA U RAPPURTAR  
Trattament ta’ ri żultati  
54. Il-kurva ta’ assorbiment tal-kimika g ħall-ittestjar tinkiseb billi 
l-konċentrazzjoni tag ħha tiġi mmarkata fi/fuq id-dud matul il-fa żi ta’ assor ­
biment mal- ħin fuq skali aritmeti ċi. Meta l-kurva tkun la ħqet livell kostanti 
jew stat regolari (ara d-definizzjonijiet fl-Appendi ċi 1), il-fattur BAFss ta’ 
akkumulazzjoni bijolo ġika tal-istat regolari jkun ikkalkulat skont:  
C a fi stat regolari jew fi tmiem ta’ fa żi ta’ assorbiment ðmedjaÞ 
C s fi stat regolari jew fi tmiem ta’ fa żi ta’ assorbiment ðmedjaÞ 
C a huwa l-kon ċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fl-organi żmu tat-test  
C s huwa l-kon ċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fil- ħamrija  
55. Meta ma jintla ħaq ebda stat regolari, il-BAFK, ibba żat fuq il-kostanti ta’ 
rati, għandu jkun ikkalkulat minflok il-BAFss, kif deskritt hawn ta ħt: 
— Iddetermina l-fattur ta’ akkumulazzjoni (BAFK) b ħala l-proporzjon k  s /k e . 
— Rati ta’ assorbiment u eliminazzjoni preferibbilment ikunu kkalkulati 
simultanjament (ara l-Ekwazzjoni 11 fl-Appendi ċi 2) 
— Il-kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni (k  e ) is-soltu jkun iddeterminat 
mill-kurva ta’ eliminazzjoni (ji ġifieri grafika tal-kon ċentrazzjoni 
tal-oġġett tat-test tad-dud matul il-fa żi ta’ eliminazzjoni). Il-kostant 
tar-rata ta’ assorbiment k  s mbagħad ikun ikkalkulat skont ke u valur 
ta’ C  a li jidderiva mill-kurva ta’ assorbiment – ara l-Appendi ċi 2 għal 
deskrizzjoni ta’ dawn il-metodi. Il-metodu ppreferut biex jinkiseb BAF  K 
u l-kostanti tar-rati, k  s , u k  e , huwa li jintu żaw metodi mhux lineari ta’ 
stima ta’ parametri fuq kompjuter. Jekk l-eliminazzjoni ovvjament ma 
tkunx tal-ewwel ordni, f’dak il-ka ż għandhom jintu żaw mudelli aktar 
kumplessi.  
Rapport tat-test  
56. Ir-rapport tat-test g ħandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: 
Kimika g ħall-ittestjar:  
— Kull informazzjoni disponibbli dwar tossi ċità akuta jew fit-tul (e ż. EC  x , 
LC x „ NOEC) tal-kimika g ħall-ittestjar g ħal oligochaetes li jg ħixu 
fil-ħamrija;  
— purezza, natura fi żika u proprjetajiet fi żikokimiċi, eż. log K  ow , solubilità 
tal-ilma;  
— dejta ta’ identifikazzjoni ta’ kimi ċi; sors tal-o ġġett tat-test, identità u 
konċentrazzjoni ta’ kull solvent u żat; 
— jekk tintu ża kimika g ħall-ittestjar b’tikketta radju, il-po żizzjoni pre ċiża 
tal-atomi bit-tikketta, ir-radjuattività spe ċifika u l-purezza radjukimika.  
Speċi tat-test:  
— isem xjentifiku, razza, sors, kull trattament minn qabel, akklimatazzjoni, 
età, daqs-firxa, e ċċ.. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Kondizzjonijiet tat-test:  
— proċedura tat-test u żat; 
— tip u karatteristi ċi ta’ lluminazzjoni u żati u fotoperjodu/i;  
— disinn tat-test (e ż. għadd u daqs ta’ re ċipjenti tat-test, massa ta’ ħamrija 
u għoli ta’ saff ta’ ħamrija, għadd ta’ replikati, g ħadd ta’ dud g ħal kull 
replikat, g ħadd ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test, durata ta’ fa żijiet ta’ 
assorbiment u eliminazzjoni, frekwenza ta’ te ħid ta’ kampjuni);  
— motiv g ħall-għażla tal-materjal tar-re ċipjent tat-test;  
— metodu ta’ t ħejjija u applikazzjoni ta’ o ġġett tat-test, kif ukoll ra ġunijiet 
għall-għażla ta’ metodu spe ċifiku;  
— il-kon ċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-medji tal-valuri mkejla u 
d-devjazzjonijiet standard tag ħhom fir-re ċipjenti tat-test, u l-metodu li 
bih dawn il-valuri nkisbu;  
— sors tal-kostitwenti tal- ħamrija artifi ċjali jew – jekk jintu żaw midja 
naturali – l-ori ġni tal-ħamrija, deskrizzjoni ta’ kull trattament minn 
qabel, riżultati tal-kontrolli (sopravivenza, żvilupp ta’ bijomassa, ripro ­
duzzjoni), karatteristi ċi tal-ħamrija (pH, kontenut totali ta’ karbonju 
organiku, distribuzzjoni ta’ daqsijiet ta’ parti ċelli (perċentwali ta’ 
ramel, fajd u tafal)), WHC  max , kontenut ta’ ilma f’per ċentwali fil-bidu 
u fit-tmiem tat-test, u kejlijiet o ħra magħmulin);  
— informazzjoni dettaljata dwar it-trattament ta’ kampjuni tal- ħamrija u ta’ 
dud, inklu żi dettalji dwar t ħejjija, ħżin, proċeduri ta’ fortifikazzjoni, 
estrazzjoni u pro ċeduri analiti ċi (u pre ċiżjoni) għall-oġġett tat-test 
f’dud u fil- ħamrija, u kontenut ta’ lipidi (jekk imkejjel) u rkupri 
tal-oġġett tat-test.  
Riżultati:  
— mortalità tad-dud tal-kontroll u d-dud f’kull re ċipjent tat-test u kull 
mġiba mhux normali osservata (e ż., evitar ta’ ħamrija, nuqqas ta’ ripro ­
duzzjoni f’test ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika b’enchytraeids);  
— il-proporzjon ta’ pi ż fin-niexef g ħal piż fl-imxarrab tal- ħamrija u 
l-organiżmi tat-test (utli g ħal normalizzazzjoni);  
— il-piżijiet fl-imxarrab tad-dud waqt li jkunu qed jittie ħdu kampjuni; g ħal 
ħniex, il-pi żijiet fl-imxarrab fil-bidu tat-test u f’kull żmien ta’ te ħid ta’ 
kampjuni qabel u wara tindif ta’ msaren;  
— il-kontenut ta’ lipidi tal-organi żmi tat-test (jekk determinati);  
— kurvi, li juru l-kinetika ta’ assorbiment u eliminazzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar fid-dud, u ż-żmien għal stat regolari;  
— C  a u C  s (b’devjazzjoni u firxa standard, jekk ikun jixraq) g ħaż-żmijiet 
kollha ta’ te ħid ta’ kampjuni (C  a espressa f’g kg  –1 piż fl-imxarrab u 
fin-niexef tal-korp kollu, C  s espressa f’g kg  –1 piż fl-imxarrab u 
fin-niexef ta’ ħamrija). Jekk ikun me ħtieġ fattur ta’ akkumulazzjoni 
bijota-ħamrija (BSAF) (e ż. għal tqabbil ta’ ri żultati minn żewġ testijiet 
jew aktar mag ħmulin fuq annimali ta’ kontenut differenti ta’ lipidi), C  a 
tista’ addizzjonalment tkun espressa b ħala g kg  –1 ta’ kontenut ta’ lipidi 
tal-organi żmu, u C  s tista’ tkun espressa b ħala g kg  –1 ta’ karbonju 
organiku (OC) tal- ħamrija;  
— BAF (espress f’kg ta’ ħamrija kg  –1 ta’ dud), kostant k  s tar-rata ta’ assor ­
biment ta’ ħamrija (espress f’g ta’ kg  –1 ta’ ħamrija ta’ jum  –1 ta’ dud), u 
kostant ke tar-rata ta’ eliminazzjoni k  e (espressa f’jum  –1 ); BSAF (espress 
f’kg ta’ ħamrija ta’ OC kg  –1 kontenut ta’ lipidi ta’ dud) jistg ħu jkunu 
rrapportati addizzjonalment;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— jekk imkejjel: per ċentwali ta’ kimika prin ċipali, metaboliti, u residwi 
magħqudin (jiġifieri l-per ċentwali ta’ kimika g ħall-ittestjar li ma tistax 
tkun estratta b’metodi komuni ta’ estrazzjoni) misjuba fil- ħamrija u 
annimali tat-test;  
— metodi u żati għall-analiżi ta’ statistika ta’ dejta.  
Evalwazzjoni ta’ ri żultati:  
— konformità tar-ri żultati mal-kriterji ta’ validità kif elenkati 
fil-paragrafu 17;  
— riżultati mhux mistennija jew mhux tas-soltu, e ż. eliminazzjoni mhux 
kompleta tal-kimika g ħall-ittestjar mill-annimali tat-test.  
LETTERATURA:  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688-00a.  
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Inter ­
national, E1676-04: 26 pp.  
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. 
Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.  
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens 
J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms 
(Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154- 
165. 
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
 
(8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.  
(9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.  
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.  
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental 
Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
 
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioac ­
cumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  
Enchytraeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligo ­
chaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.  
(13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13-20.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.  
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, pp. 555-576.  
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1 000, EU, Standards, Measurement and Testing 
Programme.  
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, 
Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey 
following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. 
Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.  
(19) Ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 
tal-18 ta’ Di ċembru 2006 dwar ir-re ġistrazzjoni, il-valutazzjoni, 
l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta’ kimi ċi (REACH), li jistabbilixxi 
Aġenzija Ewropea g ħall-kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li 
jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) 
Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill 
u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE 
tal-Kummissjoni ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1).  
(20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
(21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris
 
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standard ­
isierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). 
Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt 
Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Jista’ jitni żżel minn: 
http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
(23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
 
(24) Environment Kanada (1995). Guidance document on measurement of 
toxicity test precision using control sediments spiked with a reference 
toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.  
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.  
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumu ­
lation. Chemosphere 29: 1501-1514.  
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, 
Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78-84.  
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.  
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099- 1105.
 
(32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701-707.  
(33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
 
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.  
(35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
(36) Jaenike J (1982). “ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6-8.  
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
 
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.  
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) 
in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 
22: 767-775.  
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.  
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). 
Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and 
function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.  
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.  
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumu ­
lation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.  
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
(48) Il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità għal Ħniex 
(49) Il-Kapitolu C.13 ta’ dan l-Anness: Kon ċentrazzjoni bijolo ġika: flow-through 
fish test.  
(50) Il-Kapitolu C.21 ta’ dan l-Anness: Mikroorgani żmi tal-Ħamrija: Test ta’ 
Trasformazzjoni ta’ Nitro ġenu. 
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
(52) Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), 
Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris.  
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris
 
(54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 
1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.  
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
 
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. 
Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.  
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
 
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on 
Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.  
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
 
(64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413-433.
 
(65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
(68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.  
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, 
Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm 
ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma 
(eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. 
Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, 
MN, March 2000.  
(73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277-285.  
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
(75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023-1033.  
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invert ­
ebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.  
(77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.  
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
 
(79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Appendiċi 1 
DEFINIZZJONIJIET  
Akkumulazzjoni bijolo ġika hija ż-żieda f’kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar fi jew fuq organi żmu relattiv g ħall-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar fil-midjum tal-madwar. Ri żultati ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika minn 
proċessi kemm ta’ kon ċentrazzjoni bijolo ġika kif ukoll ta’ tkabbir bijolo ġiku 
(ara hawn ta ħt). 
Konċentrazzjoni bijolo ġika hija ż-żieda f’kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall- 
ittestjar fi jew fuq organi żmu, li tirri żulta mill-assorbiment tal-kimika esklussi ­
vament mill-midjum tal-madwar (ji ġifieri permezz tal-wi ċċ tal-ġisem u ħamrija li 
tkun idda ħħlet), relattiv g ħall-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fil-midjum 
tal-madwar.  
Tkabbir bijolo ġiku huwa ż-żieda f’kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fi 
jew fuq organi żmu, li jirri żulta l-aktar minn assorbiment minn ikel jew pri ża 
kontaminati, relattiv g ħall-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fl-ikel jew 
fil-priża. Tkabbir bijolo ġiku jista’ jwassal g ħal trasferiment jew akkumulazzjoni 
tal-oġġett tat-test f’siti elettroni ċi tal-ikel.  
L-eliminazzjoni  ta’ kimika g ħall-ittestjar hija t-telf ta’ din il-kimika mit-tessut 
tal-organi żmu tat-test bi pro ċessi attivi jew passivi li jse ħħu indipendentement 
minn jekk ikun hemm jew ma jkunx hemm l-o ġġett tat-test fil-midjum 
tal-madwar.  
Il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika (BAF) f’kull żmien matul il-fa żi ta’ 
assorbiment ta’ dan it-test ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika huwa 
l-konċentrazzjoni ta’ kimika g ħall-ittestjar fi/fuq l-organi żmu tat-test (C  a fi 
g·kg -1 piż fin-niexef tad-dudu) divi ż bil-konċentrazzjoni tal-kimika fil-midjum 
tal-madwar (C  s bħala g·kg -1 tal-piż fin-niexef tal- ħamrija); il-BAF g ħandu 
l-unitajiet ta’ kg ħamrija·kg -1 dudu.  
Il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika ta’ stat regolari (BAF  ss ) huwa l-BAF fi 
stat regolari u ma jitbiddilx b’mod sinifikanti tul perjodu prolongat ta’ żmien, 
bil-konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar fil-midjum tal-madwar (C  s bħala 
g.kg  -1 tal-piż fin-niexef tal- ħamrija) tkun kostanti matul dan il-perjodu ta’ żmien.  
Fatturi ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika kkalkulati direttament mill-proporzjon 
tal-kostant tar-rata ta’ assorbiment ta’ ħamrija u l-kostant tar-rata ta’ elimi ­
nazzjoni (k  s u k  e , ara hawn ta ħt) jissejħu fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika 
kinetika (BAF  K ). 
Il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijota- ħamrija  (BSAF) huwa l-kon ċentrazzjoni 
normalizzata b’lipidi tal-kimika g ħall-ittestjar fi/fuq l-organi żmu tat-test divi ża 
bil-konċentrazzjoni organika normalizzata bil-karbonju tal-kimika g ħall-ittestjar 
fil-ħamrija fi stat regolari. C  a huwa mbag ħad espress b ħala kontenut ta’ lipidi 
g·kg -1 tal-organi żmu, u C  s bħala konenut organiku g ·kg -1 tal-ħamrija; il-BSAF 
għandu l-unitajiet ta’ lipidi kg OC ·kg -1 . 
Livell kostanti  jew  stat regolari  huwa ddefinit b ħala l-ekwilibriju bejn 
il-proċessi ta’ assorbiment u ta’ eliminazzjoni li jse ħħ fl-istess waqt matul 
il-fażi ta’ espo żizzjoni. L-istat regolari jintla ħaq fil-grafika ta’ BAF mal- ħin 
meta l-kurva ti ġi parallela mal-assi tal- ħin u tliet anali żi ta’ BAF wara xulxin 
magħmulin fuq kampjuni me ħudin f’intervalli ta’ mill-anqas jumejn ikunu qrib 
20 % waħda mill-oħra, u ma jkunx hemm differenzi sinifikanti ta’ statistika fost 
it-tliet perjodi ta’ te ħid ta’ kampjuni. G ħal kimiċi għall-ittestjar li jkunu 
kkunsmati bil-mod, intervalli aktar adatti jkunu ta’ sebat ijiem (49).  
Il-koeffiċjent ta’ partizzjoni organika karbonju-ilma  (K  oc ) huwa l-proporzjon 
ta’ konċentrazzjoni ta’ kimika fi/fuq il-frazzjoni ta’ karbonju organiku ta’ ħamrija 
u l-konċentrazzjoni tal-kimika fl-ilma f’ekwilibriju.  
Il-koeffiċjent tal-partizzjoni ottanol-ilma  (K ow ) huwa l-proporzjon ta’ solubilità 
ta’ kimika f’n-ottanol u f’ilma f’ekwilibriju, espress ukoll xi drabi b ħala P  ow . 
Il-logaritmu ta’ K  ow (log K  ow ) jintuża bħala indikazzjoni tal-potenzjal ta’ kimika 
għal akkumulazzjoni bijolo ġika minn organi żmi akwati ċi. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Il-fażi ta’ assorbiment jew ta’ espo żizzjoni  hija l-ħin li matulu l-organi żmi 
tat-test ikunu esposti g ħall-kimika g ħall-ittestjar.  
Il-kostant tar-rata ta’ assorbiment ta’ ħamrija  (k s ) huwa l-valur numeriku li 
jiddefinixxi r-rata ta’ żieda fil-kon ċentrazzjoni tal-o ġġett tat-test fi/fuq 
l-organiżmu tat-test li jirri żulta minn assorbiment mill-fa żi tal-ħamrija. k  s huwa 
espress f’g ħamrija kg  -1 ta’ dudu d  -1 . 
Il-fażi ta’ eliminazzjoni  hija l-ħin, wara t-trasferiment tal-organi żmi tat-test minn 
midjum kontaminat g ħal midjum ħieles mill-o ġġett tat-test, li matulha tkun 
studjata l-eliminazzjoni (jew it-telf nett) tal-kimika mill-organi żmi tat-test.  
Il-kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni  (k e ) huwa l-valur numeriku li jiddefinixxi 
r-rata ta’ tnaqqis fil-kon ċentrazzjoni tal-o ġġett tat-test fi/fuq l-organi żmu tat-test, 
wara t-trasferiment tal-organi żmi tat-test minn midjum li jkun fih l-o ġġett tat-test 
għal midjum ħieles minn kimi ċi; k  e hija espressa f’d  -1 . 
Kimika g ħall-ittestjar:  Kull sustanza jew ta ħlita ttestjata billi jintu ża dan 
il-Metodu ta’ Ttestjar.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Appendiċi 2 
Kalkulazzjoni ta’ parametri ta’ assorbiment u eliminazzjoni  
Il-punt ta’ tmiem ewlieni ta’ test ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika huwa l-fattur ta’ 
akkumulazzjoni bijolo ġika, BAF. Il-BAF imkejjel jista’ ji ġi kkalkulat 
bid-diviżjoni tal-kon ċentrazzjoni fl-organi żmu tat-test, C  a , bil-kon ċentrazzjoni 
fil-ħamrija, C  s , fi stat regolari. Jekk l-istat regolari ma jintla ħaqx matul il-fa żi 
ta’ espożizzjoni, il-BAF  K ikun ikkalkulat mill-kostanti ta’ rati minflok minn 
BAFss. I żda għandu jkun innotat jekk il-BAF ikunx ibba żat fuq kon ċen­
trazzjonijiet ta’ stati uniformi jew le.  
Il-mezzi tas-soltu g ħall-kisba tal-fattur ta’ akkumulazzjoni bijolo ġika kinetika 
(BAF  K ), il-kostant tar-rata ta’ assorbiment ta’ ħamrija (k  s ) u l-kostant tar-rata 
ta’ eliminazzjoni (k  e ) huwa li jintu żaw metodi ta’ stima ta’ parametri mhux 
lineari b’kompjuter, e ż., ibbażati fuq il-mudelli deskritti f’(68). Mog ħti sett ta’ 
dejta ta’ kon ċentrazzjoni ta’ sekwenza ta’ ħin u l-ekwazzjonijiet mudell: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ekwazzjoni 1]  
jew 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ekwazzjoni 2]  
fejn: 
C a = konċentrazzjoni ta’ kimika f’dud [g kg-1 pi ż fl-imxarrab jew fin-niexef]  
k s = kostant tar-rata ta’ assorbiment f’tessut [g ħamrija kg-1 ta’ dudu d-1]  
C s = konċentrazzjoni ta’ kimika fil- ħamrija [g kg-1 ta’ pi ż fl-imxarrab jew 
fin-niexef]  
k e = kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni [d-1]  
t c = ħin fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment,  
dawn il-programmi tal-kompjuter jikkalkulaw valuri g ħal BAF  K , k s u k  e. 
Meta l-kon ċentrazzjoni ta’ ba żi fid-dud mhux espost, e ż. fil-jum 0 tkun differenti 
b’mod sinifikanti minn żero (dan jista’ pere żempju jkun il-ka ż għal metalli), din 
il-konċentrazzjoni ta’ ba żi (C  a,0 ) għandha tkun inklu ża f’dawn l-ekwazzjonijiet, 
biex isiru jaqraw: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ekwazzjoni 3]  
u 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ekwazzjoni 4]  
F’każijiet fejn ikun osservat tnaqqis sinifikanti tal-kon ċentrazzjoni tal-kimika 
għall-ittestjar fil- ħamrija tul il- ħin matul il-fa żi ta’ assorbiment, jistg ħu 
pereżempju jintu żaw il-mudelli li ġejjin (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [ekwazzjoni 5]  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
fejn: 
C s = konċentrazzjoni ta’ kimika fil- ħamrija [g kg-1 pi ż fl-imxarrab jew 
fin-niexef]  
k 0 = kostant ta’ rata ta’ degradazzjoni fil- ħamrija [d-1]  
C 0 = konċentrazzjoni inizjali tal-kimika fil- ħamrija [g kg-1 ta’ pi ż fl-imxarrab 
jew fin-niexef] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ekwazzjoni 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [ekwazzjoni 7]  
fejn: 
C a = konċentrazzjoni ta’ kimika f’dud [g kg-1 pi ż fl-imxarrab jew fin-niexef]  
k s = kostant tar-rata ta’ assorbiment f’tessut [g ħamrija kg-1 ta’ dudu d-1]  
k 0 = kostant ta’ rata ta’ degradazzjoni fil- ħamrija [d-1]  
k e = kostant tar-rata ta’ eliminazzjoni [d-1]  
t c = ħin fit-tmiem tal-fa żi ta’ assorbiment,  
Meta jintla ħaq stat regolari matul il-fa żi ta’ assorbiment (ji ġifieri t = ∞), 
ekwazzjoni 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ekwazzjoni 1]  
tista’ titnaqqas g ħal: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
jew 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [ekwazzjoni 8]  
F’liema ka ż k s /k e x C  s ikun appro ċċ għall-konċentrazzjoni tal-o ġġett tat-test 
fit-tessut tad-dud fi stat regolari (C  a,ss ). 
Il-fattur ta’ akkumulazzjoni bijota- ħamrija (BSAF) jista’ jkun ikkalkulat kif ġej: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [ekwazzjoni 9]  
fejn f  oc huwa l-frazzjoni ta’ karbonju organiku ta’ ħamrija, u f  lip huwa l-frazzjoni 
ta’ lipidi ta’ dud, it-tnejn preferibbilment iddeterminati minn kampjuni me ħudin 
mit-test, u bba żati jew fuq pi ż fin-niexef jew fuq pi ż fl-imxarrab, rispettivament.  
Il-kinetika ta’ eliminazzjoni tista’ tkun immudellata bl-u żu tad-dejta mill-fa żi ta’ 
eliminazzjoni u bl-applikazzjoni tal-ekwazzjoni mudell u metodu ta’ stima ta’ parametri mhux lineari b’ba żi tal-kompjuter li ġejjin. Jekk il-punti tad-dejta 
mmarkati mal- ħin jindikaw tnaqqis esponenzjali kostanti tal-kon ċentrazzjoni 
tal-oġġett tat-test fl-annimali, ikun jista’ jintu ża mudell ta’ kompartiment 
wieħed (ekwazzjoni 9) biex jiddeskrivi l-perkors tal- ħin ta’ eliminazzjoni. 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [ekwazzjoni 10]  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Proċessi ta’ eliminazzjoni xi drabi jidhru li jkunu ta’ żewġ fażijiet, li juru tnaqqis 
mgħaġġel ta’ C  a matul il-fa żijiet bikrija, li jinbidel g ħal telf aktar bil-mod ta’ 
oġġetti tat-test fil-fa żijiet ta’ wara tal-eliminazzjoni, e ż. (27) (68). I ż-żewġ fażijiet 
jistgħu jkunu interpretati billi wie ħed jassumi li jkun hemm żewġ kompartimenti 
differenti fl-organi żmu, li minuu l-o ġġett tat-test jintilef b’velo ċitajiet differenti. 
F’dawn il-ka żijiet, għandha tkun studjata letteraura spe ċifika, eż. (38) (39) (40) 
(78).  
Bl-użu tal-ekwazzjonijiet mudelli ta’ hawn fuq, il-parametri kineti ċi (k  s u k  e ) 
jistgħu wkoll ikunu kkalkulati b’operazzjoni wa ħda bl-applikazzjoni fl-istess 
waqt tal-mudell ta’ kinetika tal-ewwel grad g ħad-dejta kollha mill-fa żi kemm 
ta’ assorbiment, kif ukoll ta’ eliminazzjoni. G ħal deskrizzjoni ta’ metodu li 
jista’ jippermetti kalkulazzjoni kon ġunta bħal din ta’ kostanti ta’ rata ta’ assor ­
biment u eliminazzjoni, jistg ħu jkunu kkonsultati r-referenzi, (181), (213) u 
(210). 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[ekwazzjoni 11]  
Nota:  Meta parametri ta’ assorbiment u eliminazzjoni jkunu stmati fl-istess waqt 
mid-dejta kon ġunta ta’ assorbiment u eliminazzjoni, “m” kif tidher 
fl-ekwazzjoni 11 hija deskrittri ċi li tħalli lill-programm tal-kompjuter 
jassenja t-termini sekondarji tal-ekwazzjoni lis-settijiet ta’ dejta tal-fa żi 
rispettiva u li jag ħmel l-evalwazzjoni b’mod korrett (m = 1 g ħal fażi 
ta’ assorbiment; m = 2 g ħal fażi ta’ eliminazzjoni).  
Madankollu, dawn l-ekwazzjonijiet mudelli g ħandhom jintu żaw b’kawtela, 
l-aktar meta bidliet fid-disponibbiltà bijolo ġika tal-kimika g ħall-ittestjar jew 
fid-degradazzjoni (bijolo ġika) iseħħu matul it-test (ara e ż. (79)).  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Appendiċi 3 
EŻEMPJI TA’ SKEDI G ĦAL TESTIJIET TA’ AKKUMULAZZJONI BIJO ­
LOĠIKA TA’ ĦAMRIJA  
Test tal-ħniex 
(a) Fażi ta’ espo żizzjoni bi 8 dati ta’ te ħid ta’ kampjuni u żati għal kalkulazzjoni 
ta’ kinetika  
Jum Attività  
– 6 Kondizzjonament tal- ħamrja mħejjija għal 48 sieg ħa; 
– 4 Il-frazzjoni tal- ħamrija li tkun iffortifikata mas-soluzzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar; evaporizzazzjoni ta’ kull solvent; ta ħlit 
tal-kostitwenti tal- ħamrija; distribuzzjoni tal- ħamrija 
mar-reċipjenti tat-test; ekwilibrazzjoni f’kondizzjonijiet tat-test 
għal 4 jiem (3 ġimgħat għal ħamrija fortifikata bil-metall); 
– 3 sa – 1 Separazzjoni tal-organi żmi tat-test mill-kultura g ħal akklima ­
tazzjoni; t ħejjija u rtib tal-kostitwenti tal- ħamrija; 
0 Kejl tat-temperatura, u l-pH tal- ħamrija; tne ħħija ta’ kampjuni 
tal-ħamrija minn re ċipjenti ttrattati u kontroll ta’ solventi g ħal 
determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; 
żieda ta’ razzjon ta’ ikel; u żin u distribuzzjoni ka żwali tad-dud 
fir-reċipjenti tal- ħniex; żamma ta’ kampjuni sekondarji suffi ċjenti 
ta’ dud g ħal determinazzjoni ta’ valuri analiti ċi bażiċi, piż 
fl-imxarrab u fin-niexef, u kontenut ta’ lipidi; u żin tar-reċipjenti 
kollha tat-test g ħall-kontroll tal-irtuba tal- ħamrija; kontroll 
tal-provvista tal-arja, jekk tkun mag ħluqa tintu ża s-sistema 
tat-test; 
1 Kontroll tal-provvista tal-arja, re ġistrazzjoni ta’ x’jag ħmlu d-dud 
u t-temperatura; te ħid ta’ kampjuni tal- ħamrija u tad-dud g ħal 
determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni ta’ o ġġett tat-test; 
2 L-istess b ħal jum 1; 
3 Kontroll tal-provvista tal-arja, x’jag ħmlu d-dud u t-temperatura; 
4 L-istess b ħal jum 1; 
5 - 6 L-istess b ħal jum 3; 
7 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel; ikkontrolla l-irtuba 
tal-ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti tat-test u kkumpensa 
għall-ilma evaporat; 
8 - 9 L-istess b ħal jum 3; 
10 L-istess b ħal jum 1; 
11 - 13 L-istess b ħal jum 3; 
14 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel; ikkontrolla l-irtuba 
tal-ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti tat-test u kkumpensa 
għall-ilma evaporat; 
15 - 16 L-istess b ħal jum 3; 
17 L-istess b ħal jum 1; 
18 - 20 L-istess b ħal jum 3;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Jum Attività  
21 L-istess b ħal jum 1; kejl tat-temperatura u l-pH tal- ħamrija; 
ikkontrolla l-irtuba tal- ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti 
tat-test; tmiem ta’ fa żi ta’ espo żizzjoni; ittrasferixxi d-dud 
mir-replikati esposti li jifdal g ħal ġo reċipjenti li jkun fihom 
ħamrija nadifa g ħal fażi ta’ eliminazzjoni (ebda tindif ta’ 
msaren); te ħid ta’ kampjuni ta’ ħamrija u ta’ dud minn 
kontrolli ta’ solventi. 
Attivitajiet ta’ espo żizzjoni minn qabel (fa żi ta’ ekwilibrazzjoni) 
għandhom ikunu skedati, meqjusin il-proprjetajiet tal-kimika 
għall-ittestjar. 
Attivitajiet deskritti g ħal jum 3 g ħandhom isiru kuljum (mill- 
anqas fil-jiem tax-xog ħol). 
(b) Fażi ta’ eliminazzjoni  
Jum Attività  
– 6 T ħejjija u rtib tal-kostitwenti tal- ħamrija; kondizzjonament 
tal-ħamrja mħejjija għal 48 sieg ħa; 
– 4 Ta ħlit tal-kostitwenti tal- ħamrija; distribuzzjoni tal- ħamrija 
mar-reċipjenti tat-test; inkubazzjoni f’kondizzjonijiet tat-test 
għal 4 ijiem; 
0 (tmiem ta’ fa żi ta’ 
assorbiment) Kejl tat-temperatura u l-pH tal- ħamrija; u żin u distribuzzjoni 
każwali tad-dud fir-re ċipjenti tal- ħniex; żieda ta’ razzjon ta’ 
ikel; ittrasferixxi d-dud mir-replikati esposti li jifdal g ħal ġo 
reċipjenti li jkun fihom ħamrija nadifa; te ħid ta’ kampjuni 
tal-ħamrija u tad-dud wara 4 – 6 sig ħat għal determinazzjoni 
ta’ konċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; 
1 Kontroll tal-provvista tal-arja, re ġistrazzjoni ta’ x’jag ħmlu d-dud 
u t-temperatura; te ħid ta’ kampjuni tal- ħamrija u tad-dud g ħal 
determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; 
2 L-istess b ħal jum 1; 
3 Kontroll tal-provvista tal-arja, x’jag ħmlu d-dud u t-temperatura; 
4 L-istess b ħal jum 1; 
5 - 6 L-istess b ħal jum 3; 
7 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel; ikkontrolla l-irtuba 
tal-ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti tat-test u kkumpensa 
għall-ilma evaporat; 
8 - 9 L-istess b ħal jum 3; 
10 L-istess b ħal jum 1; 
11 - 13 L-istess b ħal jum 3; 
14 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel; ikkontrolla l-irtuba 
tal-ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti tat-test u kkumpensa 
għall-ilma evaporat; 
15 - 16 L-istess b ħal jum 3; 
17 L-istess b ħal jum 1;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Jum Attività  
18 - 20 L-istess b ħal jum 3; 
21 L-istess b ħal jum 1; kejl tat-temperatura u l-pH tal- ħamrija; 
ikkontrolla l-irtuba tal- ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti 
tat-test; te ħid ta’ kampjuni ta’ ħamrija u ta’ dud minn kontrolli 
ta’ solventi. 
Tħejjija tal- ħamrija qabel ma tinbeda fa żi ta’ eliminazzjoni 
għandha ssir bl-istess mod b ħal qabel il-fa żi ta’ espo żizzjoni. 
Attivitajiet deskritti g ħal jum 3 g ħandhom isiru kuljum (mill- 
anqas fil-jiem tax-xog ħol). 
Test ta’ enchytraeid  
(a) Fażi ta’ assorbiment bi 8 dati ta’ te ħid ta’ kampjuni u żati għal kalkulazzjoni 
ta’ kinetika  
Jum Attività  
– 6 Kondizzjonament tal- ħamrja mħejjija għal 48 sieg ħa; 
– 4 Il-frazzjoni tal- ħamrija li tkun iffortifikata mas-soluzzjoni 
tal-kimika g ħall-ittestjar; evaporizzazzjoni ta’ kull solvent; ta ħlit 
tal-kostitwenti tal- ħamrija; distribuzzjoni tal- ħamrija 
mar-reċipjenti tat-test; ekwilibrazzjoni f’kondizzjonijiet tat-test 
għal 4 ijiem (3 ġimgħat għal ħamrija fortifikata bil-metall); 
– 3 sa – 1 Separazzjoni tal-organi żmi tat-test mill-kultura g ħal akklima ­
tazzjoni; t ħejjija u rtib tal-kostitwenti tal- ħamrija; 
0 Kejl tat-temperatura, u l-pH tal- ħamrija; tne ħħija ta’ kampjuni 
tal-ħamrija minn re ċipjenti ttrattati u kontroll ta’ solventi g ħal 
determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni tal-kimika g ħall-ittestjar; 
żieda ta’ razzjon ta’ ikel g ħall-ħamrija; u żin u distribuzzjoni 
każwali tad-dud fir-re ċipjenti tal- ħniex; żamma ta’ kampjuni 
sekondarji suffi ċjenti ta’ dud g ħal determinazzjoni ta’ valuri 
analitiċi bażiċi, piż fl-imxarrab u fin-niexef, u kontenut ta’ 
lipidi; użin tar-reċipjenti kollha tat-test g ħall-kontroll tal-irtuba 
tal-ħamrija; kontroll tal-provvista tal-arja, jekk tkun mag ħluqa 
tintuża s-sistema tat-test; 
1 Kontroll tal-provvista tal-arja, re ġistrazzjoni ta’ x’jag ħmlu d-dud 
u t-temperatura; te ħid ta’ kampjuni tal- ħamrija u tad-dud g ħal 
determinazzjoni ta’ kon ċentrazzjoni ta’ o ġġett tat-test; 
2 L-istess b ħal jum 1; 
3 Kontroll tal-provvista tal-arja, x’jag ħmlu d-dud u t-temperatura; 
4 L-istess b ħal jum 1; 
5 - 6 L-istess b ħal jum 3; 
7 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel g ħall-ħamrija; 
ikkontrolla l-irtuba tal- ħamrija billi ti żen mill-ġdid ir-reċipjenti 
tat-test u kkumpensa g ħall-ilma evaporat; 
9 L-istess b ħal jum 1; 
10 L-istess b ħal jum 3;  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Jum Attività  
11 L-istess b ħal jum 1; 
12 - 13 L-istess b ħal jum 3; 
14 L-istess b ħal jum 1; żieda ta’ razzjon ta’ ikel g ħall-ħamrija; kejl 
tat-temperatura u l-pH tal- ħamrija; ikkontrolla l-irtuba tal- ħamrija 
billi tiżen mill-ġdid ir-reċipjenti tat-test; tmiem ta’ fa żi ta’ 
espożizzjoni; ittrasferixxi d-dud mir-replikati esposti li jifdal 
għal ġo reċipjenti li jkun fihom ħamrija nadifa g ħal fażi ta’ 
eliminazzjoni (ebda tindif ta’ msaren); te ħid ta’ kampjuni ta’ 
ħamrija u ta’ dud minn kontrolli ta’ solventi. 
Attivitajiet ta’ espo żizzjoni minn qabel (fa żi ta’ ekwilibrazzjoni) 
għandhom ikunu skedati, meqjusin il-proprjetajiet tal-kimika 
għall-ittestjar. 
Attivitajiet deskritti g ħal jum 3 g ħandhom isiru kuljum (mill- 
anqas fil-jiem tax-xog ħol). ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Appendiċi 4 
Ħamrija artifi ċjali – rakkomandazzjonijiet dwar t ħejjija u ħżin 
Minħabba li ħamrija naturali minn sors partikolari tista’ ma tkunx disponibbli 
s-sena kollha, u organi żmi indiġeni, kif ukoll il-pre żenza ta’ mikrosustanzi li 
jniġġsu jistgħu jinfluwenzaw it-test, huwa rrakkomandat substrat artifi ċjali, 
il-ħamrija artifi ċjali skont il-Kapitolu C.8 ta’ dan l-Anness: Tossi ċità għal 
Ħniex (48) biex jintu ża f’dan it-test. Diversi spe ċijiet tat-test jistg ħu jibqgħu 
ħajjin, jikbru u jirriprodu ċu f’din il- ħamrija, u hija pprovduta standardizzazzjoni 
massima, kif ukoll komparabbiltà f’laboratorji u bejniethom ta’ kondizzjonijiet tat-test u ta’ kultura.
 
Ħamrija kostitwenti: 
Pit: 10 % Pit Sphagnum, skont skont il-Linja Gwida 
207 tal-OECD (48); 
Ramel tal-quartz: 70 % Ramel tal-quartz industrijali (mnixxef 
bl-arja); daqs ta’ ramla: aktar minn 50 % tal-partiċelli għandhom ikunu fil-firxa ta’ 
50-200 μm, iżda l-parti ċelli kollha 
għandhom ikunu ≤ 2 mm; 
Tafal tal-kawlina: 20 % Kontenut ta’ kawlina ≥ 30 %; 
Karbonat tal-kal ċju: ≤ 1 % CaCO
 3 ,pulverizzat, kemikament pur  
B’mod fakultattiv, il-kontenut ta’ karbonju organiku tal- ħamrija artifi ċjali jista’ 
jitnaqqas, e ż. billi jitnaqqas il-kontenut tal-pit g ħal 4-5 % ta’ ħamrija xotta u 
jiżdied il-kontenut ta’ ramel b’dan il-mod. Bi tnaqqis b ħal dan f’kontenut ta’ 
karbonju organiku, il-possibbiltajiet ta’ sorbiment ta’ kimika g ħall-ittestjar 
mill-ħamrija (karbonju organiku) jistg ħu jitnaqqsu u d-disponibbiltà tal-kimika 
għall-ittestjar g ħad-dud tista’ ti żdied (74). Intwera li  Enchytraeus albidus u 
Eisenia fetida  jistgħu jkunu jaqblu mal-kriterji ta’ validità dwar riproduzzjoni 
meta ttestjati f’ ħamrija ta’ g ħelieqi b’kontenut baxx ta’ karbonju organiku, e ż. 
2,7 % (33), (201), u mill-esperjenza dan jista’ jinkiseb f’ ħamrija artifi ċjali b’5 % 
pit. 
Tħejjija  
Il-kostitwenti nixfin tal- ħamrija jit ħalltu sewwa (e ż. f’mikser ta’ skala kbira 
f’laboratorju). Dan g ħandu jsir xi ġimgħa qabel ma jinbeda t-test. Il-kostitwenti 
nixfin im ħalltin tal- ħamrija għandhom jitrattbu b’ilma dejonizzat mill-anqas 48 
siegħa qabel l-applikazzjoni tal-o ġġett tat-test biex l-a ċidità tiġi ekwilibrata/stab ­
bilizzata. G ħad-determinazzjoni ta’ pH tintu ża taħlita ta’ ħamrija u 1 M KCl fi 
proporzjon ta’ 1:5. Jekk il-valur pH ma jkunx fil-firxa me ħtieġa (6,0 ± 0,5), 
jiżdied ammont suffi ċjenti ta’ CaCO  3 fil-ħamrija, jew jit ħejja lott ġdid ta’ 
ħamrija.  
Il-kapaċità massima g ħal żamma ta’ ilma (WHC) tal- ħamrija artifi ċjali tiġi ddeter­
minata skont ISO 11268-2 (35). Mill-anqas jumejn qabel ma jinbeda t-test, il-ħamrija artifi ċjali xotta titrattab billi ji żdied ilma bi żżejjed dejonizzat jew rikos ­
titwit biex jinkiseb bejn wie ħed u ieħor nofs il-kontenut finali ta’ ilma. 
Il-kontenut finali ta’ ilma g ħandu jkun minn 40 % sa 60 % tad-WHC 
massima. Fil-bidu tat-test, il- ħamrija mrattba minn qabel tinqasam f’tant 
lottijiet daqs kemm ikun l-g ħadd ta’ kon ċentrazzjonijiet tat-test u kontrolli 
użati għat-test, u l-kontenut ta’ rtuba jkun a ġġustat għal 40 – 60 % 
tad-WHC
 max billi tintu ża s-soluzzjoni tal-o ġġett tat-test u/jew billi ji żdied ilma 
dejonizzat jew rikostitwit. Il-kontenut ta’ rtuba jkun iddeterminat fil-bidu u fit-tmiem tat-test (f’105 °C). Huwa g ħandu jkun l-a ħjar għall-ħtiġijiet tal-ispe ċi 
(il-kontenut ta’ rtuba jista’ jkun i ċċekkjat kif ġej: meta l- ħamrija ting ħafas 
bil-mod fl-idejn, g ħandhom jo ħorġu qtar żgħir bejn is-swaba).
 ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Ħżin 
Il-kostitwenti nixfin tal- ħamrija artifi ċjali jistg ħu jinħażnu f’temperatura 
ambjentali sakemm jibdew jintu żaw. Il-ħamrija m ħejjija u mrattba minn qabel 
tista’ tinħażen f’post frisk sa tliet ijiem qabel ma tkun iffortifikata; wie ħed 
għandu joqg ħod attent li jara li l-evaporazzjoni tal-ilma tkun mill-anqas. 
Ħamrija fortifikata bl-o ġġett tat-test g ħandha tkun u żata minnufih sakemm ma 
jkunx hemm informazzjoni li turi li l- ħamrija partikolari tkun tista’ tin ħażen 
mingħajr ma jintlaqtu t-tossi ċità u d-disponibbiltà bijolo ġika tal-oġġett tat-test. 
Kampjuni ta’ ħamrija fortifikata jistg ħu mbag ħad jinħażnu skont 
il-kondizzjonijiet irrakkomandati g ħall-oġġett tat-test partikolari sakemm issir 
analiżi. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Appendiċi 5 
Speċi ta’ oligochaetes terrestri rrakkomandat g ħall-ittestjar ta’ 
akkumulazzjoni bijolo ġika minn ħamrija  
Ħniex 
L-ispeċi tat-test irrakkomandata hija  Eisenia fetida  (Savigny 1826), li hija 
tal-familja Lumbricidae. Mill-1972 ‘il hawn tinqasam f’ żewġ subspeċi (Eisenia 
fetida u Eisenia andrei  (10)). Skont Jaenike (36), huma mhumiex spe ċi veri, 
separati.  Eisenia fetida  tingħaraf malajr mill-faxex ta’ lewn isfar jg ħajjat inter ­
segmentali tag ħha, filwaqt li  Eisenia andrei  hija ta’ lewn a ħmar uniformi, skur. 
Aktarx jori ġinaw mir-re ġjun tal-Ba ħar l-Iswed, illum huma mifruxin mad-dinja 
kollha, l-aktar f’habitats immodifikati antropo ġenikament b ħal munzelli ta’ 
kompost. It-tnejn jistg ħu jintużaw għal testijiet ekotossikolo ġiċi, kif ukoll ta’ 
akkumulazzjoni bijolo ġika. 
Eisenia fetida u Eisenia andrei  jistgħu jinkisbu kummer ċjalment, pere żempju 
bħala lixka g ħall-ħut. Mqabbla ma’ dud o ħra tal-ħamrija ta’ lumbri ċidi, iċ-ċiklu 
ta’ ħajjithom huwa qasir u jimmaturaw f’madwar 2 – 3 xhur (f’temperatura 
ambjentali). L-a ħjar temperatura g ħalihom hija bejn wie ħed u ieħor 20 – 24 C. 
Jippreferu substrati relattivament niedja b’pH kwa żi newtrali u b’kontenut kbir 
ta’ materjal organiku. Min ħabba li dawn l-ispe ċijiet intużaw ħafna f’testijiet 
ekotossikolo ġiċi standardizzati g ħal madwar 25 sena, il-mod ta’ kultura 
tagħhom huwa stabbilit sewwa (48) (77).  
Iż-żewġ speċi jistgħu jitrabbew f’firxa wiesg ħa ta’ skart ta’ annimali. Il-midjum 
ta’ trobbija rrakkomandat minn ISO (35) huwa ta’ ta ħlita 50:50 ta’ demel ta ż- 
żiemel jew tal-baqar u pit. Il-midjum g ħandu jkollu valur ta’ pH ta’ madwar 6 sa 
7 (irregolat bil-karbonat tal-kal ċju), konduttività jonika baxxa (anqas minn 6 
mS/cm jew anqas minn 0,5 % ta’ kon ċentrazzjoni ta’ mel ħ) u m’għandux ikun 
ikkontaminat b’mod e ċċessiv b’ammonja jew b’awrina tal-annimali. Tista’ tintu ża 
wkoll ħamrija kummer ċjali għal xogħol tal-ġnien ħielsa minn addittivi, jew 
ħamrija artifi ċjali skont l-OECD (48), jew ta ħlita 50:50 tat-tnejn. Is-substrat 
għandu jkun niedi i żda mhux imxarrab ħafna. Kaxex g ħat-trobbija ta’ volum 
ta’ minn 10 litri sa 50 litru jkunu tajbin.  
Biex jinkiseb dud ta’ età u massa standard, l-a ħjar hu li l-kultura tinbeda 
b’fosdqiet. G ħalhekk, dud adult ji żdied f’kaxxa g ħat-trobbija li jkun fiha 
substrat frisk biex jipprodu ċi fosdqiet. L-esperjenza prattika wriet li kwantità 
densa ta’ bejn wie ħed u ieħor 100 dudu adult g ħal kull kg substrat (pi ż 
fl-imxarrab) twassal g ħal rati ta’ riproduzzjoni tajbin. Wara 28 jum id-dud 
adult jitne ħħa. Il-ħniex li jfaqqsu mill-fosdqiet jintu żaw għall-ittestjar meta 
jkunu maturi wara mill-anqas xahrejn (2) i żda anqas minn 12-il xahar.  
Dud tal-ispe ċi deskritta hawn fuq jista’ jitqies li jkun f’sa ħħtu jekk ji ċċaqlaq 
fis-substrat, ma jippruvax jitlaq mis-substrat u jirriprodu ċi kontinwament. 
Ċaqliq bil-mod ħafna jew tarf tal-warrani isfar (fil-ka ż ta’ Eisenia fetida ) 
jindikaw substrat e żawrit. F’dan il-ka ż, huwa rrakkomandat substrat ġdid u/jew 
għadd iżgħar ta’ annimali g ħal kull kaxxa.  
Referenzi mag ħżula addizzjonali  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, 
London. 331-338 pp.  
Enchytraeids  
L-ispeċi tat-test irrakkomandata hija  Enchytraeus albidus  Henle 1837 ( ħanex 
abjad).  Enchytraeus albidus  huwa wie ħed mill-akbar (sa 15-il mm) tal-ispe ċi 
Enchytraeidae tal-familja annelid oligochaete, u jinsab mifrux mad-dinja kollha, eż. (8).  Enchytraeus albidus  jinsab f’habitats marini, limni ċi u terrestri, l-aktar 
f’materja organika fi stat ta’ degradazzjoni (alka, kompost) u rarament f’merg ħat 
(42). Din it-tolleranza ekolo ġika wiesg ħa u xi varjazzjonijiet morfolo ġiċi 
jindikaw li jista’ jkun hemm razez differenti ta’ din l-ispe ċi.
 
Enchytraeus albidus  jista’ jinkiseb kummer ċjalment, u jinbieg ħ bħala ikel g ħall- 
ħut. Wieħed għandu jara jekk il-kultura tieg ħu tkunx ikkontaminata minn 
speċijiet oħra, is-soltu i żgħar (60). Jekk ikun hemm kontaminazzjoni, id-dud 
kollu għandu jinħasel fl-ilma f’dixx Petri. E żemplari kbar adulti ta’  Enchytraeus 
albidus  imbagħad jintgħażlu (bl-użu ta’ stereomikroskopju) biex tinbeda kultura 
ġdida. Id-dud l-ie ħor kollu jitwarrab. I ċ-ċiklu ta’ ħajtu huwa qasir min ħabba li 
l-maturità tintla ħaq bejn 33 jum (fi 18 °C) u 74 jum (fi 12 °C). Kulturi biss li 
jkunu nżammu fil-laboratorju g ħal mill-anqas 5 ġimgħat (ġenerazzjoni wa ħda) 
mingħajr problemi g ħandhom jintu żaw għat-test.  
Speċijiet oħra tal-ġeneru  Enchytraeus  huma adatti wkoll, l-aktar  Enchytraeus 
luxuriosus . Din l-ispe ċi tassew tg ħix fil-ħamrija, u kienet deskritta mill- ġdid 
f’(65). Jekk jintu żaw speċijiet oħra ta’  Enchytraeus , huma g ħandhom ikunu 
identifikati b’mod ċar u l-motiv g ħall-għażla tal-ispe ċi għandu jkun irrappurtat.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) hija spe ċi tal-istess grupp b ħal 
Enchytraeus luxuriosus . Ma nstabx li kienet te żisti b’ċertezza fil-qasam, 
minħabba li kienet deskritta biss minn kulturi ta’ ħniex u munzelli ta’ kompost 
(Römbke 2003). Il- ħtiġijiet oriġinali ekolo ġiċi tagħha mhumiex, g ħalhekk, mag ħ­
rufin. Iżda, studji re ċenti tal-laboratorju f’diversi oqsma ta’ ħamrija kkonfermaw 
li din l-ispe ċi għandha tolleranza wiesg ħa għal proprjetajiet tal- ħamrija bħal pH u 
sawra (Jänsch et al. 2005). F’dawn l-a ħħar snin din l-ispe ċi sikwit kienet u żata fi 
studi ekotossikolo ġiċi minħabba s-sempli ċità tat-trobbija u l-ittestjar tag ħha (eż. 
Kuperman et al. 2003). I żda hija żgħira: 3 – 12 mm; 7 mm b ħala medja 
(Westheide & Müller 1996), u dan jag ħmel l-immani ġġar aktar diffi ċli 
mqabbel ma’ dak ta’  Enchytraeus albidus . Meta tintu ża din l-ispe ċi minflok  
Enchytraeus albidus , id-daqs tar-re ċipjent tat-test jista’ i żda ma je ħtiġlux ikun 
iżgħar. Barra minn dan, g ħandu jitqies li din l-ispe ċi tirriprodu ċi b’mod mg ħaġġel 
ħafna billi g ħandha żmien ta’ ġenerazzjoni ta’ anqas minn 20 jum f’20 ± 2 °C 
(Achazi et al. 1999) u wkoll aktar malajr f’temperaturi g ħola. 
Enchytraeids  tal-ispeċi Enchytraeus albidus  (kif ukoll spe ċijiet Enchytraeus  oħra) 
jistgħu jitrabbew f’kaxex kbar tal-plastik (e ż. 30 × 60 × 10 cm jew 20 × 12 × 
8 cm li huma adatti g ħal kultura ta’ dud ta’ daqs żgħir) mimlijin b’ta ħlita ta’ 
ħamrija artifi ċjali u li jistg ħu jinkisbu kummer ċjalment u b’ ħamrija tal- ġnien 
mhux kontaminata, ħielsa minn addittivi. Materjal ta’ kompost g ħandu jkun 
evitat min ħabba li jista’ jkun fih kimi ċi tossiċi bħal metalli tqal. Il-fawna 
għandha titne ħħa mill-ħamrija tat-trobbija qabel ma tintu ża b’iffriżar għal tliet 
darbiet. Tista’ tintu ża wkoll ħamrija pura artifi ċjali iżda r-rata ta’ riproduzzjoni 
tista’ tkun aktar bil-mod mqabbla ma’ dik miksuba b’substrati m ħallta. Is-substrat 
għandu jkollu pH ta’ 6,0 ± 0,5. Il-kultura tin żamm f’inkubatur f’temperatura ta’ 
15 ± 2 °C ming ħajr dawl. F’kull ka ż għandha tkun evitata temperatura og ħla 
minn 23 °C. L-irtuba tal- ħamrija artifi ċjali/naturali g ħandha tkun niedja i żda 
mhux imxarrba. Meta l- ħamrija ting ħafas bil-mod bl-idejn, g ħandhom jo ħorġu 
biss ftit qtar ta’ ilma. F’kull ka ż, għandhom ikunu evitati kondizzjonijiet anossi ċi 
(eż. jekk jintu ża għatu, it-toqob tal-g ħatu għandhom ikunu g ħoljin biżżejjed li 
jipprovdu bdil suffi ċjenti ta’ arja). Il- ħamrija tat-trobbija g ħandha titrewwa ħ billi 
titħawwad b’attenzjoni darba fil- ġimgħa. ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Id-dud għandu jintema’ mill-anqas darba fil- ġimgħa sakemm jixba’ bi fjokki 
tal-ħafur li jitqieg ħdu f’ħofra fil-wi ċċ tal-ħamrija u jitg ħattew bil- ħamrija. Jekk 
fil-kontenitur ikun baqa’ ikel mill-a ħħar data ta’ tmig ħ, l-ammont ta’ ikel mog ħti 
għandu jkun a ġġustat b’dan il-mod. Jekk fuq l-ikel li jifdal jikber il-faqqieg ħ, 
huwa għandu jinbidel bi kwantità ġdida ta’ fjokki ta’ ħafur. Biex ir-riproduzzjoni 
tkun stimulata, il-fjokki tal- ħafur jistgħu jkunu ssupplimentati bi trab ta’ proteini, 
disponibbli kummer ċjalment, imtejjeb b’vitamini kull ġimagħtejn. Wara tliet 
xhur, l-annimali jkunu ttrasferiti g ħal kultura jew g ħal substrat ta’ trobbija 
mħejjin friski. Il-fjokki tal- ħafur, li jkollhom jin ħażnu f’reċipjenti ssi ġillati, 
għandhom jissa ħħnu f’awtoklav jew jissa ħħnu qabel jintu żaw biex ikunu evitati 
infezzjonijiet minn araknidi tad-dqiq (e ż. Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina) 
jew minn araknidi tal- ħtif (eż. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida, 
Acarina). Wara li jkun iddi żinfettat, l-ikel jinta ħan biex ikun jista’ jitferrex 
faċilment fuq il-wi ċċ tal-ħamrija. Sors ie ħor possibbli ta’ ikel huwa l- ħmira 
tal-furnar jew l-ikel tal- ħut TetraMin  ® . 
Inġenerali, il-kondizzjonijiet tal-mod ta’ kultura jkunu suffi ċjenti jekk id-dud ma 
jippruvax jitlaq mis-substrat, ma ji ċċaqlaqx malajr fil- ħamrija, ma jurix wi ċċ 
estern ileqq ming ħajr partiċelli ta’ ħamrija mwa ħħlin miegħu, ikun ftit jew 
wisq ta’ lewn bajdani u jekk ikun jidher dud ta’ etajiet differenti. Fil-fatt dud 
jista’ jitqies li jkun f’sa ħħtu jekk jipprodu ċi kontinwament.  
Referenzi mag ħżula addizzjonali  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.  
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
 
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of 
enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — MT — 24.08.2014 — 005.001 — 1467