(A)

It-test ELISA li jibblokka jew kompetittiv għandu jsir skont il-protokoll li ġej: L-ELISA kompetittiv bl-użu tal-antikorp monoklonu 3-17-A3 huwa kapaċi jiddentifika antikorpi għas-serotipi kollha magħrufa tal-vajrus tal-bluetongue (BTV). Il-prinċipju tat-test huwa l-interuzzjoni tar-reazzjoni bejn l-antiġen BTV u l-antikorp monoklonu (3-17-A3) għall-grupp speċifiku permezz taż-żieda ta’ serum tal-ittestjar. Antikorpi għall-BTV preżenti fis-serum tat-test jibblukkaw ir-reattività tal-antikorp monoklonu (Mab) u jirrużultaw fi tnaqqis fl-iżvilupp mistenni tal-kulur wara iż-żieda tal-enżima mmarkata aċidu kontra l-ġrieden, u chromogen/sottostrat. Seri jistgħu jiġu ttestjati b’sustanza dilwita waħda ta’ 1 f’5 (spot test – Appendiċi 1) jew jistgħu jiġu ttitrati (titrazzjoni tas-serum – Appendiċi 2) biex jagħtu dilution end-point. Valuri ta’ inibizzjoni għola minn 50 % jistgħu jiġu meqjusa bħala pożittivi. Materjali u Reaġenti: 1. Pjanċi mikrotitrati adattati għall-ELISA. 2. Antiġen: fornit bħala konċentrat estratt minn ċellula, preparat kif deskrit aktar ‘l isfel, u maħżun jew f’temperatura ta’– 20 °C jew – 70 °C. 3. Buffer li jibblokka: soluzzjoni ta’ melħ immewwta bil-fosfat (PBS) li fiha 0,3 % BTV serum negattiv ta’ bovini adulti, 0,1 % (v/v) Tween-20 (fornit bħala għasel polyoxyethylene sorbiton monolaurate) fil-PBS. 4. Antikorp monoklonu: 3-17-A3 (fornit bħala hybridoma tissue-culture supernatant) dirett lejn polypeptide VP7 speċifiku għall-grupp, maħżun f’temperatura ta’ – 20 °C jew imnixxef iffriżat u ddilwat 1/100 b'buffer li jibblokka qabel l-użu. 5. Ikkonjuga: globulina tal-fenek kontra l-ġrieden (b'assorbiment u b'elużjoni) ikkonjugata għal peroxidise tal-għerq tal-mustarda u miżmuma fid-dlam f'temperatura ta’ 4 °C. 6. Chromogen u sottostrat: Orthophenylene diamine (OPD-chromogen) b'konċentrazzjoni aħħarija ta' 0,4 mg/ml f'ilma sterili ddistillat. Perossidu tal-idroġenu (30 % w/v-sottostrat) 0,05 % v/v miżjud immedjatament qabel l-użu (5μl H2O2 għal kull 10 ml OPD). (Uża l-OPD b’attenzjoni – ilbes ingwanti tal-lakstu – mutaġen issuspettat). 7. Aċidu sulfiriku ta’ massa 1 ta’sustanza: 26,6 ml ta’ aċidu miżjud ma’ 473,4 ml ta’ ilma ddistillat. (Ftakar dejjem żid l-aċidu mal-ilma u qatt l-llma mal-aċidu) 8. Orbital shaker. 9. Tagħmir għall-qari tal-pjanċi ELISA (it-test jista’ jinqara viżwalment). Format tat-test Cc: kontroll tal-konjugazzjoni (l-ebda serum/l-ebda antikorp monoklonu); C++: kontroll ta' serum posittiv b'saħħtu; C+: kontroll ta' serum posittiv dgħajjef; C-: kontroll ta' serum negattiv; cm: kontroll tal-antikorp monoklonu (l-ebda serum).



APPENDIX 1 Spot dilution (1:5) format (40 sera/plate) Kontrolli Seri għall-ittestjar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



APPENDIĊI 2 Format tat-titrazzjoni tas-serum (10 seri/pjanċa) Kontrolli Seri għall-ittestjar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protokoll tal-ittestjar: Kontroll ta’ konjugazzjoni (Cc) : Il-bjar 1A u 1B huma kontroll mingħajr kampjun tal-antiġen u l-konjugi tal-BTV. Dan jista’ jintuża biex riżultati fit-tagħmir għall-qari tal-ELISA jitneħħew u jibda’ jaqra mill-ġdid. Kontroll Mab (Cm) : Kolonni 1 u 2, ringieli G u H huma l-kontroll tal-antikorp monoklonu u fihom antiġen tal-BTV, antikorp monoklonu u konjugazzjoni. Dawn il-bjar jirrapreżentaw il-kulur massimu. Il-mejda tar-riżultati tad-densità ottika minn dan il-kontroll tirrapreżenta il-valur ta’ inibizzjoni 0 %. Kontroll pożittiv (C++, C+) : Kolonni 1 u 2, ringieli C-D-E-F. Dawn il-bjar fihom antiġen tal-BTV, antiserum pożittivi b’saħħtu u dgħajjef tal-BTV rispettivament, mab u konjugazzjoni. Kontroll negattiv (C-) : Il-bjar 2A u 2B huma l-kontrolli negattivi, li fihom antiġen tal-BTV, antiserum negattiv tal-BTV, mab u kongujazzjoni. Seri għall-ittestjar : Għal stħarriġ seroloġiku fuq skala kbira u għal screening mgħaġġel, seri jistgħu jiġu ttestjati f’sustanza dilwita waħda ta’ 1:5 (Appendiċi 1). Alternattivament, 10 seri jistgħu jiġu ttestjati fuq medda ta’ sustanzi dilwiti minn 1:5 sa 1:640 (Appendiċi 2). Dan jagħti indikazzjoni tat-titrat tal-antikorp fis-seri għall-ittestjar. Proċeduri: 1. Iddilwa l-antiġen BTV mal-konċentrazzjoni qabel it-titrazzjoni f’PBS, ivvibra għal ftit ħin ħalli l-vajrus aggregat jitħallat (jekk sonicator mhux disponibbli, traferixxi l-likwidu b’pipetta vigorożament) u żid 50 μl fil-bjar kollha tal-pjanċa tal- ELISA. Taptap fuq il-ġnub tal-pjanċa ħalli jitħallat l-antiġen 2. Inkuba b’temperatura ta’ 37 °C għal 60 minuta fuq orbital shaker. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet billi tfawwar u tbattal il-bjar b’PBS mhux sterili u nixxef b’karta assorbenti. 3. Bjar tal-kontroll: Żid 100 μl ta' buffer li jibblokka għall-bjar ta' Cc. Żid 50 μl ta' serum tal-kontroll pożittiv u negattiv, f'sustanza dilwita ta' 1:5 (10 μl serum + 40 μl buffer li jibblokka), għall-bjar rispettivi C–, C+ u C++. Żid 50 μl ta' buffer li jibblokka ml-bjar tal-kontroll tal-Mab. Metodu spot titration: Żid sustanza dilwita 1:5 ta’ kull serum għall-ittestjar fil-buffer li jibblokka sabiex jiġu duplikati l-bjar tal-kolonni 3 sa 12 (10μl seri + 40μl buffer li jibblokka), jew Metodu tat-titrazzjoni tas-serum: Prepara serje ta’ sustanzi dilwiti doppji għal kull kampjun għall-ittestjar (1:5 sa 1:640) fil-buffer li jibblokka fuq it-tmint ibjar tal-kolonni waħedhom minn 3 sa 12. 4. Immedjatment wara ż-żieda tas-seri għall-ittestjar, iddilwa mab 1:100 f’buffer li jibblokka u żid 50 μl mal-bjar kollha tal-pjanċa ħlief ma’ dawk għall-kontroll bla kampjuni. 5. Inkuba b’temperatura ta’ 37 °C għal 60 minuta fuq orbital shaker. Aħsel tliet darbiet b’PBS u nixxef b’materjal assorbenti. 6. Iddilwa l-konċentrat tal-aċidu tal-fenek kontra l-ġrieden għal 1/5 000 fil-buffer li jibblokka u żid 50 μl fil-bjar kollha tal-pjanċa. 7. Inkuba b’temperatura ta’ 37 °C għal 60 minuta fuq orbital shaker. Aħsel tliet darbiet b’PBS u nixxef b’materjal assorbenti. 8. Ħoll l-O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) u immedjatament qabel l-użu żid 5μl ta’ 30 % perossidu tal-idroġenu ma’ kull 10 ml ta’ OPD. Żid 50 μl fil-bjar kollha tal-pjanċa. Ħalli l-kulur jiżviluppa għal madwar 10 minuti u waqqaf ir-reazzjoni b’1 Molar ta’ aċidu sulfuriku (50 μl għal kull bir). Il-kulur għandu jiżviluppa fil-bjar tal-kontroll tal-mab u f’dawk il-bjar li fihom seri bl-ebda antikorp għall-BTV. 9. Eżamina u rreġistra l-iżvilupp tal-pjanċi jew viżwalment jew bl-użu ta’ tagħmir spettrofotometriku għall-qari. Analiżi tar-riżultati: Bl-użu tal-pakkett tas-softwer stampa l-valuri tad-densità ottika (OD), u l-persentaġġ tal-inibizzjoni (PI) għat-test u għas-serum tal-kontroll ibbażat fuq il-valur medju rreġistrat fil-bjar tal-kontroll tal-antiġen. Id-dejta espressa bħala valuri ta' OD u PI jintużaw biex jiġi stabbilit jekk t-test twettaq fil-limiti aċċettabbli. L-ogħla limiti tal-kontroll (UCL) u l-anqas limiti tal-kontroll (LCL) għall-kontroll tal-Mab (l-antiġen flimkien mal-Mab fl-assenza ta’ seri tal-kontroll) huma bejn il-valuri 0,4 u 1,4 tal-OD. Kull pjanċa li tonqos li tkun konformi mal-kriterji ta' hawn fuq trid titneħħa. Jekk mhux disponibbli pakkett ta’ softwer tal-kompjuter, stampa l-valuri tal-OD bl-użu ta’ printer tal-ELISA. Ikkalkula l-valur medju tal-OD għall-bjar tal-kontroll tal-antiġen, li huma ekwivalenti għall-valur ta' 100 %. Stabbilixxi l-valur ta' 50 % tal-OD u manwalment ikkalkula l-pożittività u n-negattività ta' kull kampjun. Il-valur tal-inibizzjoni f’persentaġġ (PI) = 100 - (OD ta' kull kontroll waqt l-ittestjar/medja tal-OD ta' cm) × 100. Il-bjar duplikati tas-serum tal-kontroll negattiv u l-bjar duplikati mingħajr kampjuni għandhom jirreġistraw valuri tal-PI ta' bejn + 25 % u – 25 %, u bejn + 95 % u + 105 %, rispettivament. Jekk dawn ma jkunux f'dawn il-limiti l-pjanċa ma titqiesx invalida iżda tissuġġerixxi li l-kulur fl-isfond qed jiżviluppa. Is-seri tal-kontroll pożittivi b'saħħthom u dgħajfa għandhom jirreġistraw valuri tal-PI ta' bejn + 81 % u + 100 %, u bejn + 51 % u + 80 %, rispettivament. Il-limitu dijanjostiku għal seri għall-ittestjar huwa 50 % (PI 50 % jew OD 50 %). Kampjuni li jirreġistraw valuri tal-PI > 50 % huma rreġistrati negattivi. Kampjuni li jirreġistraw valuri tal-PI 'il fuq u taħt il-limitu għal bjar duplikati jitqiesu dubbjużi; dawn il-kampjuni jistgħu jkunu ttestjati mill-ġdid fl-ispot test u/jew fit-titrazzjoni. Kampjuni pożittivi jistgħu wkoll jiġu ttitrati sabiex jipprovdu indikazzjoni tal-livell ta' pożittività. Qari viżwali: Kampjuni pożittivi u negattivi jintgħarfu faċilment bl-għajnejn; kampjuni pożittivi dgħajfa jew negattivi b'saħħithom jistgħu jkunu diffiċli aktar biex jiġu interpretati bl-għajnejn. Preparazzjoni tal-antiġen BTV għall-ELISA: 1. Aħsel 40-60 roux ta' ċelluli konfluenti BHK-21 tliet darbiet b’sustanza tal-Eagle libera mis-serum u infetta bis-serotip 1 tal-vajrus tal-bluetongue fis-sustanza tal-Eagle libera mis-serum. 2. Inkuba b’temperatura ta’ 37 °C u eżamina kuljum għall-effett ċitopatiku (CPE). 3. Meta s-CPE jkunu komplut f’90 % sa 100 % tal-folja taċ-ċelluli ta’ kull roux, neħħi l-vajrus billi ċċaqlaq kwalunkwe ċelluli li għadhom imwaħħla biex jinqalgħu minn mal-ħġieġ. 4. Dawwar b’2 000 sa 3 000 rpm biex iċ-ċelluli jiffurmaw fi griebeb. 5. Armi s-supernatant u ssospendi mill-ġdid iċ-ċelluli f’madwar 30 ml ta’ PBS li fih 1 % “Sarkosyl” u 2 ml phenylmethylsulphonyl fluoride (lysis buffer). Dan jista’ jikkawża l-formazzjoni taċ-ċelluli f’ġel u iżjed lysis buffer jista’ jiżdied ħalli jonqos dan l-effett. (NB: phenylmethylsulphonyl fluoride huwa perikoluż – uża b’attenzjoni kbira.) 6. Iddisturba ċ-ċelluli għal 60 sekonda bl-użu ta’ sonda ultrasonika b’wisa’ ta’ 30 microns. 7. Dawwar b’10 000 rpm għal 10 minuti. 8. Aħżen is-supernatant f’temperatura ta’ + 4 °C u ssospendi mill-ġdid iċ-ċelluli fil-forma ta’ griebeb li jifdal f’10 sa 20 ml ta’ lysis buffer. 9. Ivvibra u ċċara, aħżen is-supernatant f’kull stadju, total ta’ tliet darbiet. 10. Agħaqqad is-supernatants u dawwar b’24 000 rpm (100,000 g) għal 120 minuta f’temperatura ta’ + 4 °C fuq massa ta’ 5 ml ta’ 40 % zokkor tal-kannamieli (w/v f’PBS) bl-użu ta’ tubi ċentrifugi Beckmann tat-30 ml u rotor SW 28. 11. Armi s-supernatant, battal it-tubi sew u ssospendi mill-ġdid il-gerbuba fil-PBS permezz tal-vibrazzjoni. Aħżen l-antiġen f’alikwoti f’temperatura ta’ – 20 °C. Titrazzjoni tal-antiġen BTV għall-ELISA: Antiġen tal-ELISA għall-bluetongue jiġi ttitrat permezz ta’ ELISA indiretta. L-iddilwar doppju tal-antiġen huwa ttitrat kontra sustanza dilwita kostanti (1/100) tal-antikorp monoklonu 3-17-A3. Il-protokoll huwa kif ġej: 1. Ittitra s-sustanza dilwita 1:20 tal-antiġen BTV f’PBS tul pjanċa mikrotitrata f’serje ta’ sustanzi ddilwati doppji (50 μl/bir) bl-użu ta’ pipetta b’iżjed minn tubu wieħed. 2. Inkuba għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C fuq orbital shaker. 3. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet b’PBS. 4. Żid 50 μl tal-antikorp monoklonu 3-17-A3 (iddilwat 1/100) ma kull pjanċa mikrotitrata. 5. Inkuba għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C fuq orbital shaker. 6. Aħsel il-pjanċi tliet darbiet b’PBS. 7. Żid 50 μl ta’ globulin kontra l-ġrieden ikkonjugata għal peroxidase tal-għerq tal-mustarda, iddilwata għal konċentrazzjoni ottimali ittitrata minn qabel, f’kull bir tal-pjanċa mikrotitrata. 8. Inkuba għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C on fuq orbital shaker. 9. Żid sottostrat u chromogen kif deskritt qabel. Waqqaf ir-reazzjoni wara 10 minuti billi żżid 1 Molar ta’ aċidu sulfuriku (50 μl/bir). Fl-analiżi kompetittiva, għandu jkun hemm iżżejjed mill-antikorp monoklonu, għalhekk tintagħażel sustanza dilwita ta’ antiġen, li tinsab fuq il-kurva tat-titrazzjoni (mhux fuq ir-reġjun tal-parti stabbli) li tagħti madwar 0,8 OD wara 10 minuti.