01991R2568 — MT — 04.12.2016 — 031.005

Dan it-test hu maħsub purament bħala għodda ta’ dokumentazzjoni u m’għandu l-ebda effett legali. L-istituzzjonijiet tal-Unjoni m'għandhom l-ebda responsabbiltà għall-kontenut tiegħu. Il-verżjonijiet awtentiċi tal-atti rilevanti, inklużi l-preamboli tagħhom, huma dawk ippubblikati fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea u disponibbli f’EUR-Lex. Dawk it-testi uffiċjali huma aċċessibbli direttament permezz tal-links inkorporati f’dan id-dokument

Emendat bi:





Ikkoreġut b'







(*) Dan l-att qatt ma ġie ppubblikat bil-Malti.









▼B

IR-REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KEE) Nru 2568/91

tal-11 ta’ Lulju 1991

dwar il-karatteristiċi taż-żejt taż-żebbuġa u l-fdal taż-żejt taż-żebbuġa u dwar il-metodi ta’ analiżi rilevanti







▼M20

Artikolu 1

1. Iż-żjut, li l-karatteristiċi tagħhom jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punti 1 u 2 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandhom jitqiesu bħala żjut verġni taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 1(a) u (b) ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

2. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 3 ta' l-Anness I ma' dan ir-Rgolament, għandu jitqies bħala żejt lampante taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt (ċ) ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

3. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 4 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt irraffinat taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 2 ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

4. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 5 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt taż-żebbuġa kompost minn żjut irraffinati taż-żebbuġa u żjut verġni taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 3 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

5. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 6 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt krud taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 4 ta' l-Anness mar-Rgolament 136/66/KEE.

6. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 7 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt irraffinat taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 5 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

7. Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 8 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 6 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

▼M26

Artikolu 2

1. Il-karatteristiċi taż-żjut stabbiliti fl-Anness I għandhom jiġu stabbiliti skont il-metodi ta’ analiżi li ġejjin:

(a) biex jiġu stabbiliti l-aċidi xaħmin liberi, mogħtija bħala perċentwali ta’ aċidu olejku, il-metodu stabbilit fl-Anness II;

(b) biex jiġi stabbilit l-indiċi tal-perossidu, il-metodu stabbilit fl-Anness III;

(c) biex jiġi stabbilit l-ammont ta’ xama’, il-metodu stabbilit fl-Anness IV;

(d) biex jiġu stabbiliti l-kompożizzjoni u l-kontenut tal-isteroli u d-dialkoħol tat-triterpen permezz tal-kromatografija b’fażi gassuża f’kolonna kapillari, il-metodu stabbilit fl-Anness V;

(e) biex tiġi stabbilita l-perċentwali ta’ 2-gliċeril monopalmitat, il-metodu stabbilit fl-Anness VII;

(f) għall-analiżi spettrofotometrika, il-metodu stabbilit fl-Anness IX;

▼M28

(g) biex tiġi stabbilita l-kompożizzjoni tal-aċidi xaħmin, il-metodu stabbilit fl-Anness X;

▼M26

(h) biex jiġu stabbiliti s-solventi aloġenati volatili, il-metodu stabbilit fl-Anness XI;

(i) biex jiġu evalwati l-karatteristiċi organolettiċi taż-żejt taż-żebbuġa verġni, il-metodu stabbilit fl-Anness XII;

(j) biex jiġu stabbiliti l-istigmastadini, il-metodu stabbilit fl-Anness XVII;

(k) biex jiġi stabbilit l-ammont ta’ trigliċeridi b’ECN42, il-metodu stabbilit fl-Anness XVIII;

▼M28

(l) biex jiġi stabbilit l-ammont ta' alkoħol alifatiku u triterpeniku, il-metodu stabbilit fl-Anness XIX;

▼M26

(m) biex jiġi stabbilit l-ammont ta’ xama’, ta’ esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin u ta’ esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin, il-metodu stabbilit fl-Anness XX.

▼M28 —————

▼M26

2. L-awtoritajiet nazzjonali jew ir-rappreżentanti tagħhom għandhom iwettqu l-verifika tal-karatteristiċi organolettiċi taż-żjut taż-żebbuġa verġni permezz ta’ bordijiet li jduqu ż-żjut approvati mill-Istati Membri.

Il-karatteristiċi organolettiċi taż-żejt imsemmija fl-ewwel subparagrafu għandhom jitqiesu li jkunu konformi mal-kategorija ddikjarata jekk il-bord approvat mill-Istat Membru jikkonferma din il-klassifikazzjoni.

Jekk il-bord ma jikkonfermax il-kategorija tal-karatteristiċi organolettiċi ddikjarata, l-awtoritajiet nazzjonali jew ir-rappreżentanti tagħhom għandhom iwettqu żewġ kontrovalutazzjonijiet permezz ta’ bordijiet approvati oħrajn mingħajr dewmien, fuq talba tal-parti kkonċernata, u mill-inqas waħda minn dawn il-kontrovalutazzjonijiet trid titwettaq minn bord li jkun approvat mill-Istat Membru kkonċernat fejn ikun ġie prodott iż-żejt. Il-karatteristiċi kkonċernati għandhom jitqiesu li jkunu konformi mal-karatteristiċi ddikjarati jekk iż-żewġ kontrovalutazzjonijiet jikkonfermaw il-klassifika ddikjarata. Jekk dan ma jkunx il-każ, il-parti interessata jkollha tħallas l-ispejjeż tal-kontrovalutazzjonijiet.

3. Meta l-awtoritajiet nazzjonali jew ir-rappreżentanti tagħhom iwettqu l-verifiki tal-karatteristiċi organolettiċi kif previst fil-paragrafu 1, il-kampjuni għandhom jittieħdu skont l-istandards internazzjonali EN ISO 661 u EN ISO 5555 għat-tħejjija tal-kampjuni għat-testijiet u għat-teħid tal-kampjuni rispettivament. Madankollu, minkejja l-punt 6.8 tal-istandard EN ISO 5555, fil-każ tal-lottijiet tat-tali żjut f’pakketti għall-konsum, il-kampjun għandu jittieħed skont l-Anness Ia ta’ dan ir-Regolament. Fil-każ taż-żjut bl-ingrossa li għalihom il-kampjuni ma jistgħux jittieħdu skont l-istandard EN ISO 5555, il-kampjuni għandhom jittieħdu skont l-istruzzjonijiet mogħtija mill-awtorità kompetenti tal-Istat Membru.

Mingħajr ħsara għall-istandard EN ISO 5555 u għall-Kapitolu 6 tal-istandard EN ISO 661, il-kampjuni meħudin għandhom jitpoġġew kemm jista’ jkun malajr f’post fid-dlam’ il bogħod mis-sħana qawwija u għandhom jintbagħtu lil-laboratorju għall-analiżi mhux aktar tard mill-ħames jum tax-xogħol wara li jittieħdu, inkella l-kampjuni għandhom jinżammu b’tali mod li ma tonqosx il-kwalità tagħhom jew li ma jsofrux ħsara waqt it-trasport jew il-ħażna qabel ma jintbagħtu lil-laboratorju.

4. Għall-għanijiet tal-verifika prevista fil-paragrafu 3, fil-każ tal-prodotti fil-pakketti, l-analiżi msemmija fl-Annessi II, III, IX, XII u XX u, fejn ikun applikabbli, kull kontroanaliżi meħtieġa skont il-liġijiet nazzjonali, għandha titwettaq qabel id-data minima tad-durabbiltà. Fil-każ tat-teħid ta’ kampjuni taż-żjut bl-ingrossa, dawn l-analiżi għandhom jitwettqu mhux aktar tard minn sitt xhur wara x-xahar li fih ikun ittieħed il-kampjun.

M’għandu japplika l-ebda limitu taż-żmien għall-analiżi l-oħra previsti f’dan ir-Regolament.

Sakemm il-kampjun ma jkunx ittieħed inqas minn xahrejn qabel id-data minima tad-durabbiltà, jekk ir-riżultati tal-analiżi ma jkunux jaqblu mal-karatteristiċi tal-kategorija taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ iddikjarata, il-parti kkonċernata għandha tiġi nnotifikata b’dan mhux aktar tard minn xahar qabel ma jintemm il-perjodu stabbilit fl-ewwel subparagrafu.

5. Sabiex jiġu stabbiliti l-karatteristiċi taż-żjut taż-żebbuġa bil-metodi previsti fl-ewwel subparagrafu tal-paragrafu 1, ir-riżultati tal-analiżi għandhom jitqabblu direttament mal-limiti stabbiliti f’dan ir-Regolament.

▼M25

Artikolu 2a

1. Għall-fini ta’ dan l-Artikolu, “żejt taż-żebbuġa kummerċjalizzat” tfisser kwantità totali ta’ żejt taż-żebbuġa u żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ta’ Stat Membru rilevanti li jiġi kkunsmat f’dak l-Istat Membru jew esportat minn dak l-Istat Membru.

2. L-Istati Membri għandhom jiżguraw li l-verifiki tal-konformità jitwettqu selettivament, skont analiżi tar-riskju, u bil-frekwenza x-xierqa, sabiex jiżguraw li ż-żejt taż-żebbuġa kkumerċjalizzat huwa konsistenti mal-kategorija ddikjarata.

3. Il-kriterji biex jiġi vvalutat ir-riskju jistgħu jinkludu:

(a) il-kategorija taż-żejt, il-perjodu tal-produzzjoni, il-prezz taż-żjut fir-rigward ta’ żjut veġetali oħra, l-operazzjonijiet ta’ taħlit u ppakkjar, il-faċilitajiet u l-kundizzjonijiet tal-ħżin, il-pajjiż tal-oriġini, il-pajjiż destinatarju, il-mezz tat-trasport u l-volum tal-lott;

(b) il-pożizzjoni tal-operaturi fil-katina tal-kummerċjalizzazzjoni, il-volum u/jew il-valur ikkumerċjalizzat minnhom, il-firxa ta’ kategoriji ta’ żejt li jikkumerċjalizzaw, it-tip ta’ negozju mwettaq minnhom bħat-tħin, il-ħżin, ir-raffinar, it-taħlit, l-ippakkjar jew il-bejgħ bl-imnut;

(c) sejbiet li saru waqt verifiki preċedenti inklużi l-għadd u t-tip ta’ difetti misjuba, il-kwalità tas-soltu taż-żjut ikkummerċjalizzati, il-prestazzjoni tat-tagħmir tekniku użat;

(d) l-affidabbiltà tas-sistemi tal-operaturi għall-iżgurar tal-kwalità jew tas-sistemi ta’ awtoverifika marbuta mal-konformità mal-istandards tal-kummerċjalizzazzjoni;

(e) il-post fejn tkun saret il-verifika, partikolarment jekk ikun l-ewwel punt ta’ dħul fl-Unjoni, l-aħħar punt ta’ ħruġ mill-Unjoni jew il-post fejn iż-żjut jiġu prodotti, ippakkjati, mgħobbija jew mibjugħa lill-konsumatur aħħari.

(f) kwalunkwe tagħrif ieħor li jista’ jindika riskju ta’ nuqqas ta’ konformità.

4. L-Istati Membri għandhom jistabbilixxu minn qabel:

(a) il-kriterji biex jiġi vvalutat ir-riskju tan-nuqqas ta’ konformità tal-lottijiet;

(b) abbażi tal-analiżi tar-riskju għal kull kategorija tar-riskju, l-għadd minimu ta’ operaturi jew lottijiet u/jew kwantitajiet li se jkunu soġġetti għall-verifika tal-konformità.

Għandha ssir kull sena mill-inqas verifika tal-konformità waħda għal kull elf tunnellata ta’ żejt taż-żebbuġa kkumerċjalizzat fl-Istat Membru.

5. L-Istati Membri għandhom jivverifikaw il-konformità billi:

(a) iwettqu, fi kwalunkwe ordni, l-analiżijiet ipprovduti fl-Anness I; jew

(b) billi tiġi segwita l-ordni ddikjarata fl-Anness Ib fuq is-sensiela tad-deċiżjonijiet sakemm tintlaħaq waħda mid-deċiżjonijiet li jidhru fis-sensiela tad-deċiżjonijiet.

▼M19 —————

▼M25

Artikolu 3

Meta jinstab li l-karatteristiċi organolettiċi ta’ xi żejt ma jaqblux mad-deskrizzjoni tal-kategorija tiegħu, l-Istati Membri kkonċernati għandhom, mingħajr preġudizzju għal xi penalitajiet oħra, japplikaw penalitajiet effettivi, proporzjonati u disswassivi li jiġu stabbiliti fid-dawl tal-gravità tal-irregolarità misjuba.

Fejn il-verifiki juru irregolaritajiet sinifikanti, l-Istati Membri għandhom iżidu l-frekwenza tal-verifiki b’rabta mal-istadju tal-kummerċjalizzazzjoni, il-kategorija taż-żejt, l-oriġini u kriterji oħra.

▼M5

Artikolu 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Meta xi Stati Membri jiltaqgħu ma’ tfixkil fit-twaqqif tal-panels fit-territorju tagħhom, dawn jistgħu isejħu lil xi panel ieħor ta’ dewwieqa approvat f’ xi Stat Membru ieħor.

3. Kull Stat Membru għandu jagħmel lista ta’ panels ta’ dewwieqa mwaqqfa minn organizzazzjonijiet professjonali jew ta’ l-istess qasam skond il-kondizzjonijiet preskritti fil-paragrafu 1 u għandhom jaraw li dawk il-kondizzjonijiet jiġu mħarsa.

▼M19 —————

▼B

Artikolu 6

1. Il-kontenut ta’ żejt tal-għaġna ta’ żejt u fdalijiet oħra miksuba mill-estrazzjoni taż-żejt taż-żebbuġa (Kodiċi NM 2306 90 11 u 2306 90 19 ) għandu jiġi determinat billi jintuża l-metodu stabbilit f’Anness XV.

2. Il-kontenut ta’ żejt imsemmi fil-paragrafu 1 għandu jiġi espress bħala perċentwali tal-piż ta’ żejt għall-piż ta’ materjal niexef.

▼M20

Artikolu 7

Għandhom japplikaw id-dispożizzjonijiet Komunitarji li jirrigwardaw il-preżenza tal-kontaminanti.

Rigward is-solventi aloġenati, il-limiti għall-kategoriji kollha taż-żjut taż-żebbuġa huma kif ġej:

— il-kontenut massimu ta' kull solvent aloġenat mikxuf: 0,1 mg/kg,

— il-kontenut massimu tas-solveni aloġenati mikxufa: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikolu 7a

Persuni naturali jew legali u gruppi ta’ persuni li huma detenturi taż-żejt taż-żebbuġ u żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ mill-estrazzjoni fil-mitħna sal-istadju tal-ibbottiljar inkluż, għal liema jkun l-għan professjonali jew kummerċjali, għandu jkun meħtieġ iżomm reġistri tal-ħruġ u tal-irtirar għal kull kategorija ta’ żjut bħal dawn.

L-Istat Membru għandu jiżgura li jkun hemm il-konformità xierqa mal-obbligu stipulat fl-ewwel paragrafu.

▼M25

Artikolu 8

1. L-Istati Membri għandhom jgħarrfu lill-Kummisjoni bil-miżuri meħuda għall-implimentazzjoni ta’ dan ir-Regolament. Huma għandhom jinformaw minnufih lill-Kummissjoni bi kwalunkwe emenda sussegwenti.

2. Sa mhux aktar tard mill-31 ta’ Mejju ta’ kull sena, l-Istati Membri għandhom jittrażmettu lill-Kummissjoni rapport dwar l-applikazzjoni ta’ dan ir-Regolament matul is-sena kalendarja preċedenti. Ir-rapport għandu jkun fih mill-inqas ir-riżultati tal-verifiki tal-konformità mwettqa fuq iż-żjut taż-żebbuġa skont il-mudelli stipulati fl-Anness XXI.

3. In-notifiki msemmija f’dan ir-Regolament għandhom isiru skont ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 792/2009 ( 1 ).

▼B

Artikolu 9

Ir-Regolament (KEE) Nru 1058/77 huwa b’dan il-mezz revokat.

Artikolu 10

1. Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali ta l-Komunitajiet Ewropej.

Iżda, il-metodu stabbilit f’Anness XII għandu japplika mill- ►M1 1 ta’ Novembru 1992 ◄ , għajr sa fejn għandhom x’jaqsmu l-operazzjonijiet marbuta mas-sistema ta’ intervent.

▼M5

Dak il-metodu ma għandhux japplika għaż-żejt taż-żebbuġa verġni lest għas-suq qabel l-1 ta’ Novembru 1992.

▼B

2. Dan ir-Regolament ma għandux japplika għaż-żejt taż-żebbuġa u għaż-żejt tal-fdal taż-żebbuġa ppakkjat qabel id-dħul fis-seħħ ta’ dan ir-Regolament u mpoġġi fis-suq sal-31 ta’ Ottubru 1992.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u għandu japplika direttament fl-Istati Membri kollha.









ANNESSI

Sommarju







Anness I: Karatteristiki taż-żejt taż-żebbuġa Anness Ia: It-teħid ta’ kampjuni taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ mogħtija f’pakketti għall-konsum Anness Ib: Dijagramma tad-deċiżjonijiet biex jiġi vverifikat jekk kampjun taż-żejt taż-żebbuġa jkunx konsistenti mal-kategorija ddikjarata jew le Anness II: Determinazzjoni tal-aċidi grassi liberi, metodu fil-kiesaħ Anness III: Determinazzjoni tal-valur tal-perossidu Anness IV: Determinazzjoni tal-kontenut tax-xama’ permezz tal-kromatografija tal-gass b’kollona kapillari Anness V: L-istabbiliment tal-kompożizzjoni u l-kontenut tal-isteroli u d-dialkoħol tat-triterpen permezz tal-kromatografija b’fażi gassuża f’kolonna kapillari Anness VII: ►M21 Determinazzjoni tal-perċentwal ta’ 2-glyceryl monopalmitate ◄ ▼M20 ————— ▼B Anness IX: Investigazzjoni spettrofotometrika fl-ultravjola ▼M28 Anness X: Determinazzjoni tal-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża ▼B Anness XI: Determinazzjoni tas-solventi aloġenati volatili taż-żejt taż-żebbuġa Annex XII: Il-metodu tal-kunsill internazzjonali taż-żebbuġ għall-valutazzjoni organolettika taż-żejt taż-żebbuġa verġni ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Anness XV: Kontenut ta’ żejt tal-fdal taż-żebbuġa Anness XVI: Determinazzjoni tal-valur tal-jodju Anness XVII: Metodu għad-determinazzjoni tas-stigmastadienes fiż-żjut tal-ħaxix Annex XVIII: Id-determinazzjoni tad-differenza bejn il-kontenut attwali u teoretiku tat-triaċilgliċeroli mal-ECN 42 Annex XIX: ►M28 Determinazzjoni tal-kontenut tal-alkoħol alifatiku u triterpeniku permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari ◄ ▼M23 Anness XX: Metodu biex jiġi determinat il-kontenut ta' xema', esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin, u esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari ▼M28 ————— ▼M25 Anness ХХI: Riżultati tal-verifiki tal-konformità mwettqa fuq iż-żjut taż-żebbuġa msemmija fl-Artikolu 8(2)

▼M31









ANNESS I

KARATTERISTIKI TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA

Karatteristiki tal-kwalità







Kategorija Aċidità (%) (*) Indiċi tal-perossidu mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 jew K270 (*) Delta-K (*) Evalwazzjoni organolettika Esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin mg/kg (*) Valur medjan tad-difett (Md) (*) Valur medjan tat-togħma ta' frott (Mf) (*) 1. Żejt taż-żebbuġa straverġni ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Żejt taż-żebbuġ lampante > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Żejt taż-żebbuġa raffinat ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u minn żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ — — — — — — — — 7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Il-medjan tad-difett jista' jkun ta' 3,5 jew inqas meta l-medjan tat-togħma ta' frott huwa ta' 0.

Karatteristiki tal-purità







Kategorija Kontenut ta' aċidi xaħmin (1) Ammont totali ta' isomeri tranżolejċi (%) Ammont totali ta' isomeri tranżlinolejċi u isomeri tranżlinoleniċi (f'%) (%) Stigmastadieni mg/kg (2) ►C2 Differenza: ECN42 (HPLC) u ECN42 (kalkolu teoretiku) ◄ 2-gliċerilmonopalmitat (%) Aċidu miristiku (%) Aċidu linoleniku (%) Aċidu arakidiku (%) Aċidu ejkosenojku (%) Aċidu beħeniku (%) Aċidu linjoċeriku (%) 1. Żejt taż-żebbuġa straverġni ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' ≤ 14 % ≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14 % 2. Żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' ≤ 14 % ≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14 % 3. Żejt taż-żebbuġ lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' ≤ 14 % ≤ 1,1 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14 % 4. Żejt taż-żebbuġa raffinat ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' ≤ 14 % ≤ 1,1 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14 % 5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u minn żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' ≤ 14 % ≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14 % 6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C2 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Kategorija Kompożizzjoni tal-isteroli Ammont totali ta' steroli (mg/kg) Eritrodiol u uvaol (%) (**) Xama' (mg/kg) (**) Kolesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (3) (%) Stigmasterol (%) App β-sitosterol (%) (4) Delta-7-stigmastenol (3) (%) 1. Żejt taż-żebbuġa straverġni ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Żejt taż-żebbuġ lampante ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Żejt taż-żebbuġa raffinat ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u minn żejt taż-żebbuġa verġni ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Noti:

(a) Ir-riżultati tal-analiżijiet għandhom jingħataw bl-istess għadd ta' ċifri wara l-punt deċimali bħal dak użat għal kull karatteristika. L-aħħar ċifra trid tiżdied b'unità waħda jekk iċ-ċifra ta' warajha tkun ta' iktar minn 4.

(b) Jekk karatteristika waħda biss ma tkunx konformi mal-valuri ddikjarati, għall-għanijiet ta' dan ir-Regolament, il-kategorija taż-żejt tista' tinbidel jew iż-żejt jista' jiġi ddikjarat bħala żejt li mhuwiex pur.

(c) Jekk karatteristika tkun immarkata b'asterisk (*), dan ifisser dan li ġej b'referenza għall-kwalità taż-żejt: — għaż-żejt taż-żebbuġa lampante, jista' jkun li ż-żewġ limiti rilevanti jkunu differenti mill-valuri ddikjarati fl-istess ħin, — għaż-żjut taż-żebbuġa verġni, jekk mill-inqas wieħed minn dawn il-limiti jkun differenti mill-valuri ddikjarati, il-kategorija taż-żejt tinbidel, għalkemm iż-żjut xorta waħda jibqgħu kklassifikati f'waħda mill-kategoriji taż-żejt taż-żebbuġa verġni.

(d) Jekk karatteristika tkun immarkata b'żewġ asterisks (**), dan ifisser li, għat-tipi kollha ta' żejt mir-residwi taż-żebbuġ, iż-żewġ limiti rilevanti jistgħu jkunu differenti mill-valuri ddikjarati fl-istess ħin.









Appendiċi

DIJAGRAMMA TAD-DEĊIŻJONIJIET

Dijagramma tad-deċiżjonijiet għall-kampesterol għaż-żejt taż-żebbuġa verġni u ż-żejt taż-żebbuġa straverġni:

Il-parametri l-oħra għandhom ikunu konformi mal-limiti stabbiliti f'dan ir-Regolament.

Dijagramma tad-deċiżjonijiet għad-delta-7-stigmastenol:

— Żejt taż-żebbuġa straverġni u żejt taż-żebbuġa verġni —

Il-parametri l-oħra għandhom ikunu konformi mal-limiti stabbiliti f'dan ir-Regolament.

— Żjut mir-residwi taż-żebbuġ (raffinati u mhux) —

▼M26









ANNESS Ia

IT-TEĦID TA’ KAMPJUNI TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA JEW TAŻ-ŻEJT MIR-RESIDWI TAŻ-ŻEBBUĠ MOGĦTIJA F’PAKKETTI GĦALL-KONSUM

Dan il-metodu ta’ teħid ta’ kampjuni jintuża għal-lottijiet taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ imqiegħda fil-pakketti għall-konsum. Japplikaw metodi differenti tat-teħid tal-kampjuni, skont jekk il-pakkett għall-konsum ikunx jaqbeż il-ħames litri jew le.

“Lott” għandha tfisser sett ta’ unitajiet tal-bejgħ li jiġu prodotti, immanifatturati u ppakkjati f’ċirkustanzi li jkunu tali li ż-żejt li jkun f’kull unità tal-bejgħ jitqies li jkun omoġenju f’termini tal-karatteristiċi analitiċi kollha tiegħu. L-individwazzjoni ta’ lott trid issir skont id-Direttiva 2011/91/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill ( 8 ).

“Żieda” għandha tfisser il-kwantità ta’ żejt li tinsab f’pakkett għall-konsum u li tittieħed minn punt aleatorju tal-lott.

1. IL-KONTENUT TAL-KAMPJUN EWLIENI

1.1. Il-pakketti għall-konsum li ma jaqbżux il-ħames litri

Għall-pakketti għall-konsum li ma jaqbżux il-ħames litri, “kampjun ewlieni” għandha tfisser l-għadd ta’ żidiet meħudin minn lott, bi qbil mat-Tabella 1.







It-Tabella 1 Id-daqs minimu tal-kampjun primarju jrid ikun fih dan li ġej Meta l-pakkett għall-konsum ikollu kapaċità ta’ Il-kampjun ewlieni jrid ikun fih żejt (a) litru jew aktar (a) minn pakkett wieħed għall-konsum (b) inqas minn litru (b) mill-għadd minimu ta’ pakketti b’kapaċità totali ta’ mill-anqas litru

Kull Stat Membru jista’ jżid l-għadd ta’ pakketti msemmi fit-Tabella 1 li għandu jikkostitwixxi kampjun ewlieni skont il-ħtiġijiet tiegħu (pereżempju l-valutazzjoni organolettika minn laboratorju differenti minn dak li jkun wettaq l-analiżi kimika, il-kontroanaliżi, eċċ.).

1.2. Il-pakketti għall-konsum li jaqbżu l-ħames litri

Għall-pakketti għall-konsum li jaqbżu l-ħames litri, “kampjun ewlieni” għandha tfisser parti rappreżentattiva miż-żidiet kollha miksubin permezz ta’ proċess ta’ tnaqqis, bi qbil mat-Tabella 2. Il-kampjun ewlieni jrid ikun magħmul minn diversi eżempji.

“Eżempju” ta’ kampjun ewlieni għandha tfisser kull pakkett li jifforma l-kampjun ewlieni.







It-Tabella 2 L-għadd minimu ta’ żidiet li għandhom jintgħażlu L-għadd ta’ pakketti fil-lott L-għadd minimu ta’ żidiet li għandhom jintgħażlu Sa 10 pakketti 1 Minn … 11 sa 150 2 Minn … 151 sa 500 3 Minn … 501 sa 1 500 4 Minn … 1 501 sa 2 500 5 iktar minn 2 500 pakkett għal kull 1 000 pakkett żieda waħda żejda

Sabiex jitnaqqas il-volum tat-teħid tal-kampjuni tal-pakketti għall-konsum, il-kontenut taż-żidiet tat-teħid tal-kampjuni huwa omoġenizzat għat-tħejjija tal-kampjun ewlieni. Il-porzjonijiet taż-żidiet differenti jitferrgħu f’kontenitur wieħed biex jiġu omoġenizzati billi jitħawdu, sabiex il-kampjun jitħares bl-aħjar mod mill-arja.

Il-kontenut tal-kampjun ewlieni għandu jitferra’ f’sensiela ta’ pakketti ta’ kapacità minima ta’ litru, li kull wieħed minnhom ikun jikkostitwixxi eżempju tal-kampjun ewlieni.

Kull Stat Membru jista’ jżid l-għadd ta’ kampjuni ewlenin skont il-ħtiġijiet tiegħu (pereżempju l-valutazzjoni organolettika minn laboratorju differenti minn dak li jkun wettaq l-analiżi kimika, il-kontroanaliżi, eċċ.).

Kull pakkett irid jimtela b’tali mod li jitnaqqas kemm jista’ jkun is-saff tal-arja fil-wiċċ tiegħu u mbagħad irid jingħalaq u jiġi ssiġġillat kif xieraq biex ikun żgurat li ma jkunx jista’ jitbagħbas.

Dawn l-eżempji għandhom jiġu ttikkettati biex tkun żgurata l-identifikazzjoni korretta tagħhom.

2. L-ANALIŻI U R-RIŻULTATI

2.1. Kull kampjun ewlieni għandu jinqasam mill-ġdid f’kampjuni tal-laboratorju, skont il-punt 2.5 tal-istandard EN ISO 5555, u għandu jiġi analizzat fl-ordni mogħtija fid-dijagramma tad-deċiżjonijiet stabbilita fl-Anness Ib jew f’kull ordni aleatorja oħra.

2.2. Meta r-riżultati kollha tal-analiżi jikkonformaw mal-karatteristiċi tal-kategorija taż-żejt iddikjarata, il-lott kollu għandu jiġi ddikjarat bħala konformi.

Meta riżultat wieħed tal-analiżi ma jkunx jikkonforma mal-karatteristiċi tal-kategorija taż-żejt iddikjarata, il-lott kollu għandu jiġi ddikjarat bħala mhux konformi.

3. VERIFIKA TAL-KATEGORIJA TAL-LOTT

3.1. Sabiex l-awtorità kompetenti tivverifika l-kategorija tal-lott, hija tista’ żżid in-numru ta’ kampjuni ewlenin meħudin f’punti differenti tal-lott skont it-tabella li ġejja:







It-Tabella 3 L-għadd ta’ kampjuni ewlenin stabbilit skont id-daqs tal-lott Id-daqs tal-lott (f’litri) L-għadd ta’ kampjuni ewlenin Inqas minn 7 500 litru 2 Minn 7 500 litru sa inqas minn 25 000 litru 3 Minn 25 000 litru sa inqas minn 75 000 litru 4 Minn 75 000 litru sa inqas minn 125 000 litru 5 125 000 litru u iktar 6 + 1 għal kull 50 000 litru iktar

Kull żieda li tikkostitwixxi kampjun ewlieni trid tittieħed minn post kontinwu fil-lott; il-post ta’ kull kampjun ewlieni jrid jiġi nnutat u jrid jiġi identifikat mingħajr ambigwità.

Il-formazzjoni ta’ kull kampjun ewlieni trid titwettaq skont il-proċeduri msemmija fil-punti 1.1 u 1.2.

Kull kampjun ewlieni mbagħad isirulu l-analiżi msemmija fl-Artikolu 2(1).

3.2. Meta wieħed mir-riżultati tal-analiżi msemmija fl-Artikolu 2(1) ta’ mill-inqas kampjun ewlieni wieħed ma jkunx jikkonforma mal-karatteristiċi tal-kategorija taż-żejt iddikjarata, il-lott kollu tal-kampjuni għandu jiġi ddikjarat bħala mhux konformi.









ANNESS Ib

DIJAGRAMMA TAD-DEĊIŻJONIJIET BIEX JIĠI VVERIFIKAT JEKK KAMPJUN TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA JKUNX KONSISTENTI MAL-KATEGORIJA DDIKJARATA JEW LE

It-Tabella 1

It-Tabella 2

It-Tabella 3









Appendiċi 1







Tabella ta’ ekwivalenza bejn l-Annessi ta’ dan ir-Regolament u l-analiżi speċifikati fid-dijagramma tad-deċiżjonijiet — L-aċidità L-Anness II L-istabbiliment tal-aċidi xaħmin liberi, metodu bil-kesħa — Il-valur tal-perossidu L-Anness III L-istabbiliment tal-valur tal-perossidu — L-ispettrometrija tar-radjazzjoni ultravjola L-Anness IX L-analiżi spettrofotometrika — Il-valutazzjoni organolettika L-Anness XII Valutazzjoni organolettika taż-żejt taż-żebbuġa verġni — L-esteri etiliċi L-Anness XX Metodu biex jiġi stabbilit l-ammont ta’ xama’, ta’ esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin u ta’ esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin permezz tal-kromatografija b’fażi gassuża f’kolonna kapillari — 3,5-Stigmastadini L-Anness XVII Metodu għad-determinazzjoni tas-stigmastadienes fiż-żjut tal-ħaxix ▼M28 — L-isomeri trans tal-aċidi xaħmin L-Anness X Determinazzjoni tal-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża — Il-kontenut tal-aċidi xaħmin L-Anness X Determinazzjoni tal-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża ▼M26 — ΔECN42 L-Anness XVIII L-istabbiliment tal-kompożizzjoni tat-trigliċeridi b’ECN42 (id-differenza bejn id-dejta tal-HPLC u l-kontenut teoretiku) — Il-kompożizzjoni tal-isteroli u l-ammont totali ta’ steroli — L-eritrodiol u l-uvaol L-Anness V L-istabbiliment tal-kompożizzjoni u l-kontenut tal-isteroli u d-dialkoħol tat-triterpen permezz tal-kromatografija b’fażi gassuża f’kolonna kapillari — Ix-xama’ L-Anness IV Determinazzjoni tal-kontenut tax-xama’ permezz tal-kromatografija tal-gass b’kollona kapillari ▼M28 — L-alkoħol alifatiku u triterpeniku L-Anness XIX Determinazzjoni tal-kontenut tal-alkoħol alifatiku u triterpeniku permezz tal-kromatografija kapillari b'fażi gassuża ▼M26 — L-aċidi xaħmin issaturati fit-tieni pożizzjoni Anness VII L-istabbiliment tal-perċentwali ta’ 2-gliċeril monopalmitat

▼M29









ANNESS II

DETERMINAZZJONI TAL-AĊIDI GRASSI LIBERI, METODU FIL-KIESAĦ

1. KAMP U QASAM TAL-APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu jiddeskrivi d-determinazzjoni tal-aċidi grassi liberi fiż-żjut taż-żebbuġa u fiż-żjut mir-residwi taż-żebbuġ. Il-kontenut tal-aċidi grassi liberi huwa espress bħala aċidità kkalkolata bħala l-persentaġġ ta' aċidu olejku.

2. PRINĊIPJU

Jiddewweb kampjun f'taħlita ta' solventi u l-aċidi grassi liberi preżenti jiġu ttitrati billi tintuża soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju jew tal-idrossidu tas-sodju.

3. REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' kwalità analitika magħrufa u l-ilma użat għandu jkun distillat jew ta' purità ekwivalenti.

3.1 Etere dietiliku; 95 % etanol (v/v), taħlita ta' partijiet ugwali bil-volum. Innewtralizza preċiżament fil-mument tal-użu b'soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (3.2) billi żżid 0,3 ml ta' soluzzjoni ta' fenolftaleina (3.3) għal kull 100 ml ta' taħlita. Nota 1: L-etere dietiliku jieħu n-nar malajr ħafna u jista' jifforma perossidi splussivi. Meta jintuża, wieħed irid joqgħod attent ħafna. Nota 2: Jekk ma jkunx possibbli li jintuża l-etere dietiliku, tista' tintuża taħlita ta' solventi bl-etanol u t-toluwen. Jekk meħtieġ, l-etanol jista' jiġi sostitwit bil-propanol-2.

3.2 Soluzzjoni etanolika jew milwiema ttitrata tal-idrossidu tal-potassju jew tal-idrossidu tas-sodju, c(KOH) [jew c(NaOH)] madwar 0,1 mol/l jew, jekk meħtieġ, c(KOH) [jew c(NaOH)] madwar 0,5 mol/l. Huma disponibbli soluzzjonijiet kummerċjali. Il-konċentrazzjoni eżatta tas-soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (jew tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju) għandha tkun magħrufa u vverifikata immedjatamement qabel tintuża. Uża soluzzjoni li tkun ġiet ippreparata tal-inqas ħamest ijiem qabel l-użu u mferrgħa ġo flixkun kannella tal-ħġieġ b'tapp tal-gomma. Is-soluzzjoni għandha tkun mingħajr kulur jew lewn it-tiben. Jekk meta tintuża s-soluzzjoni milwiema tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) tiġi osservata separazzjoni f'fażijiet, ibdel is-soluzzjoni milwiema b'soluzzjoni etanolika. Nota 3: Soluzzjoni stabbli mingħajr kulur tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) tista' titħejja kif ġej. Għalli 1 000 ml ta' etanol jew ta' ilma flimkien ma' 8 g tal-idrossidu tal-potassju (jew ta' idrossidu tas-sodju) u 0,5 g ta' ċana tal-aluminju u kompli għalli bir-rifluss għal siegħa. Iddistilla minnufih. Dewweb il-kwantità meħtieġa tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) fid-distillat. Ħalli għal diversi jiem u ferra' l-likwidu supernatanti ċar mill-preċipitat tal-karbonat tal-potassju (jew tal-karbonat tas-sodju). Is-soluzzjoni tista' titħejja wkoll mingħajr distillazzjoni kif ġej: żid 4 ml ta' aluminju ta' butilat tal-aluminju ma' 1 000 ml ta' etanol u ħalli t-taħlita toqgħod għal diversi jiem. Ferra' l-likwidu supernatanti u dewweb il-kwantità meħtieġa tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju). Is-soluzzjoni hija lesta biex tintuża.

3.3 Soluzzjoni ta' 10 g/l ta' fenolftaleina f'bejn 95 % sa 96 % ta' etanol (v/v) jew blu alkalin 6B, jew soluzzjoni ta' 20 g/l ta' timolftaleina f'bejn 95 % sa 96 % ta' etanol (v/v). Fil-każ ta' żjut li għandhom kulur qawwi, għandu jintuża l-blu alkalin jew it-timolftaleina.

4. APPARAT

Tagħmir normali tal-laboratorju li jinkludi:

4.1 Miżien analitiku;

4.2 flask koniku ta' 250 ml;

4.3 buretta ta' 10 ml tal-klassi A, gradata f'0,05 ml, jew buretta awtomatika ekwivalenti.

5. PROĊEDURA

5.1 Tħejjija tal-kampjun għat-test

Il-kampjun għandu jiġi ffiltrat hekk kif jidher imċajpar.

5.2 Porzjon tat-test

Ħu kampjun skont l-aċidità preżunta f'konformità mat-tabella li ġejja:







Aċidità mistennija Aċidità olejka (g/100 g) Massa tal-kampjun (g) Preċiżjoni tal-użin (g) 0 sa 2 10 0,02 > 2 sa 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Iżen il-kampjun fil-flask koniku (4.2).

5.3 Determinazzjoni

Dewweb il-kampjun (5.2) f'bejn 50 sa 100 ml tat-taħlita nnewtralizzata minn qabel tal-etere dietiliku u l-etanol (3.1).

Ittitra filwaqt li tħawwad ma' soluzzjoni ta' 0,1 mol/l tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) (3.2) (ara n-Nota 4) sakemm l-indikatur jinbidel (il-kulur tal-indikatur kulurit jippersisti għal tal-inqas għaxar minuti).

Nota 4: Jekk il-kwantità tas-soluzzjoni ta' 0,1 mol/l tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) meħtieġa taqbeż 10 ml, uża s-soluzzjoni ta' 0,5 mol/l jew ibdel il-massa tal-kampjun skont l-aċidu libera mistennija u t-tabella proposta.

Nota 5: Jekk is-soluzzjoni ssir imċajpra matul it-titrazzjoni, żid biżżejjed solventi (3.1) biex tikseb soluzzjoni ċara.

Wettaq it-tieni determinazzjoni biss jekk l-ewwel riżultat ikun ogħla mil-limitu speċifikat għall-kategorija taż-żejt.

6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

L-aċidità bħala perċentwali ta' aċidu olejku bil-piż hija ugwali għal:

fejn:

V = il-volum tas-soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) titrata użata, f'millimetri;

c = il-konċentrazzjoni eżatta f'moli għal kull litru tas-soluzzjoni ttitrata tal-idrossidu tal-potassju (jew tal-idrossidu tas-sodju) użata;

M = 282 g/mol, il-piż molari fi grammi għal kull mol ta' aċidu olejku;

m = il-massa tal-kampjun fi grammi.

L-aċidità olejka hija rrappurtata kif ġej:

(a) sa żewġ punti deċimali għall-valuri minn 0 sa 1 (valur inkluż);

(b) sa punt deċimali wieħed għall-valuri minn 1 sa 100 (valur inkluż).

▼M30









ANNESS III

DETERMINAZZJONI TAL-VALUR TAL-PEROSSIDU

1. Kamp ta' applikazzjoni

Dan l-Anness jiddeskrivi metodu għad-determinazzjoni tal-valur tal-perossidu taż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali u tal-ħaxix.

2. Definizzjoni

Il-valur tal-perossidu huwa l-kwantità ta' dawk is-sostanzi fil-kampjun, espressa f'termini ta' milliekwivalenti ta' ossiġenu attiv għal kull kilogramma, li jossidaw il-jodur tal-potassju taħt il-kondizzjonijiet ta' operazzjoni deskritti.

3. Prinċipju

Trattament tal-porzjon tat-test, f'soluzzjoni fl-aċidu aċetiku u fil-kloroforma, b'soluzzjoni tal-jodur tal-potassju. Titrazzjoni tal-jodju meħlus b'soluzzjoni standardizzata tat-tijosulfat tas-sodju.

4. Apparat

It-tagħmir użat irid ikun ħieles minn sostanzi ta' riduzzjoni jew ossidanti.

Nota 1: Tidlikx l-uċuħ tal-qiegħ b'xi grass

4.1. Sassla tal-ħġieġ ta' 3 ml.

4.2. Flasks, bl-għonq u t-tapp immolati, ta' kapaċità ta' madwar 250 ml, imnixxfin minn qabel u mimlija b'gass pur, xott u inerti (nitroġenu jew, jekk jista' jkun, diossidu tal-karbonju).

4.3. Buretta ta' 5-ml, 10-ml jew 25-ml, gradata f'mill-inqas 0,05 ml, preferibbilment b'ebda aġġustament ta' livell żero awtomatiku, jew buretta awtomatika ekwivalenti.

4.4. Miżien analitiku.

5. Reaġenti

5.1. Kloroforma, kwalità ta' reaġent analitiku, meħlus mill-ossiġenu billi jitbaqbaq minn ġewwa fih kurrent ta' gass pur, xott u inerti.

5.2. Aċidu aċetiku glaċjali, kwalità ta' reaġent analitiku, meħlus mill-ossiġenu billi jitbaqbaq minn ġewwa fih kurrent ta' gass pur, xott u inerti.

5.3. Jodur tal-potassju, soluzzjoni milwiema saturata, ppreparata riċentement, ħielsa mill-jodju u mill-jodati. Ħoll approssimattivament 14-il g ta' jodur tal-potassju f'madwar 10 ml ilma f'temperatura ambjentali.

5.4. Tijosulfat tas-sodju, 0,01 mol/l (ekwivalenti għal 0,01 N) soluzzjoni milwiema standardizzata bi preċiżjoni, standardizzata eżatt qabel tintuża.

Ħejji kuljum soluzzjoni ta' 0,01 mol/l tat-tijosulfat tas-sodju frisk minn soluzzjoni standard ta' 0,1 mol/l tas-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju qabel l-użu, jew iddetermina l-molarità eżatta. L-esperjenza tgħallimna li l-istabbiltà hija limitata u tiddependi fuq il-valur tal-pH u l-kontenut ta' diossidu tal-karbonju ħieles. Uża biss ilma mgħolli frisk għad-dilwizzjoni, possibbilment imnaddaf bin-nitroġenu.

Il-proċedura li ġejja hija rrakkomandata biex tiġi determinata l-molarità eżatta tas-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju:

Iżen, sal-eqreb 0,001 g, 0,27 g sa 0,33 g ta' jodat tal-potassju (mKIO3) ġo flask volumetriku (250 ml jew 500 ml) u ħoll sal-marka b'ilma mgħolli frisk (V2), imberred sakemm jilħaq temperatura ambjentali. Permezz ta' pipetta, ittrasferixxi 5 ml jew 10 ml ta' din is-soluzzjoni tal-jodat tal-potassju (V1) fi flask tat-tip Erlenmeyer ta' 250 ml. Żid 60 ml ta' ilma mgħolli frisk, 5 ml ta' 4 mol/l aċidu idrokloriku, u 25 mg għal kull 50 mg ta' jodur tal-potassju jew 0,5 ml ta' soluzzjoni saturata ta' jodur tal-potassju. Ittitra din s-soluzzjoni b'soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (V3) li tiddetermina l-molarità eżatta tas-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju.

fejn:

mKIO3 hija l-massa tal-jodat tal-potassju, fi grammi

V1 huwa l-volum tas-soluzzjoni tal-jodat tal-potassju f'millilitri (5 ml jew 10 ml)

V2 huwa l-volum totali tas-soluzzjoni tal-jodat tal-potassju, f'millilitri (250 ml jew 500 ml)

V3 huwa l-volum tas-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju, f'millilitri

wKIO3 hija l-purità tal-jodat tal-potassju fi g/100 g

MKIO3 hija l-massa molekulari tal-jodat tal-potassju (214 g/mol)

T hija l-molarità eżatta tas-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (mol/l).

5.5. Dispersjoni milwiema ta' soluzzjoni ta' lamtu ta' 10 g/l, imħejjija riċentament minn lamtu naturali li jinħall. Reaġenti ekwivalenti jistgħu jintużaw ukoll.

6. Kampjun

Ara li l-kampjun jitneħħa u jinżamm il-bogħod mid-dawl, jinżamm kiesaħ ġewwa reċipjenti tal-ħġieġ mimlijin għal kollox, issiġillati ermetikament b'tappijiet tal-ħġieġ immolati jew tas-sufra.

7. Proċedura

It-test irid isir f'dawl diffuż jew f'dawl artifiċjali. Iżen f'sassla tal-ħġieġ (4.1) jew, fin-nuqqas tagħha, fi flask (4.2), sal-eqreb 0,001 g, massa tal-kampjun skont it-tabella li ġejja, skont il-valur ta' perossidu mistenni:







Valur ta' perossidu mistenni (meq) Piż tal-porzjon tat-test (g) 0 sa 12 5,0 sa 2,0 12 sa 20 2,0 sa 1,2 20 sa 30 1,2 sa 0,8 30 sa 50 0,8 sa 0,5 50 sa 90 0,5 sa 0,3

Neħħi t-tapp ta' flask (4.2) u daħħal is-sassla tal-ħġieġ li jkun fiha l-porzjon għall-ittestjar. Żid 10 ml ta' kloroform (5.1). Dewweb malajr il-porzjon għall-ittestjar billi tħawdu. Żid 15-il ml ta' aċidu aċetiku (5.2), u mbagħad 1 ml ta' soluzzjoni ta' jodur tal-potassju (5.3). Daħħal malajr it-tapp, ħawwad għal minuta, u ħallih għal ħames minuti eżatt, il-bogħod mid-dawl b'temperatura ta' minn 15-il °C sa 25 °C.

Żid bejn wieħed u ieħor 75 ml ta' ilma ddistillat. Ittitra l-jodju meħlus bis-soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (5.4) filwaqt li tħawwad sewwa u tuża soluzzjoni ta' lamtu (5.5) bħala indikatur.

Għamel żewġ determinazzjonijiet fuq l-istess kampjun tat-test.

Fl-istess ħin għamel ukoll test inbjank. Jekk ir-riżultat tat-test inbjank jaqbeż iż-0,05 ml tas-soluzzjoni ta' 0,01 N ta' soluzzjoni tat-tijosulfat tas-sodju (5.4), ibdel ir-reaġenti impuri.

8. Preżentazzjoni tar-riżultati

Il-valur tal-perossidu (PV), espress f'milliekwivalenti ta' ossiġenu attiv għal kull kilogramma, jingħata bil-formula:

fejn:

V = in-numru ta' ml ta' soluzzjoni standardizzata tat-tijosulfat tas-sodju (5.4) użat għat-test, korrett sabiex jieħu inkusiderazzjoni t-test inbjank;

T = il-molarità eżatta tas-soluzzjoni tat-tijofsulfat tas-sodju (5.4) użata, f'mol/1.

m = il-piż fi g, tal-porzjon tat-test.

Ħu bħala riżultat il-medja aritmetika taż-żewg determinazzjonijiet magħmula.

Irrapporta r-riżultat tad-determinazzjoni sa punt deċimali wieħed.

▼M21









ANNESS IV

DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAX-XAMA’ PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA TAL-GASS B’KOLLONA KAPILLARI

1. SKOP

Dan il-metodu jiddeskrivi proċedura għad-determinazzjoni tal-kontenut ta’ xama’ fiż-żjut taż-żebbuġa. Ix-xama’ jinfired skond l-għadd ta’ atomi tal-karbonju. Dan il-metodu jista’ jintuża partikularment biex issir distinzjoni bejn iż-żejt taż-żebbuġ miksub permezz tat-tagħsir u bejn dak miksub permezz ta’ l-estrazzjoni (żejt tal-fdal).

2. PRINĊIPJU

Il-materja grassa, miżjuda b’livell standard intern xieraq, tiġi frazzjonata bil-kromatografija fuq kolonna ta’ ġell idratat tas-silika; l-ewwel frazzjoni miksuba fil-kondizzjonijiet ta’ prova (bil-polarità tiegħu tkun inqas minn dik tat-triglycerides) jiġi rkuprat, imbagħad jiġi analizzat direttament bil-kromatografija tal-gass fuq kolonna kapillari.

3. APPARAT

3.1. Flask Erlenmeyer ta’ 25 ml.

3.2. Kolonna tal-ħġieġ għall-kromatografija tal-gass, ta’ diametru intern ta’ 15,0 mm, twila bejn 30 u 40 cm, u mgħammra b’vit.

3.3. Apparat ta’ kromatografija tal-gass addattat għall-funzjonament bil-kolonna kapillari, mgħammar b’sistema għall-intoduzzjoni diretta fil-kolonna, u magħmul minn: 3.3.1. Kompartiment termostatiku għall-kolonni, mgħammar bi programmatur tat-temperatura. 3.3.2. Injettur kiesaħ għall-introduzzjoni diretta fil-kolonna. 3.3.3. Indikatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u konvertitur-amplifikatur. 3.3.4. Reġistratur-integratur adattat għall-konvertitur-amplifikatur (3.3.3.), b’rata ta’ rispons ta’ mhux aktar minn sekonda, u b’velocità tal-karta varjabbli. (Wieħed jista’ juża wkoll sistemi informatiċi li jippermettu l-ġbir tad-dejta tal-kromatografija bil-gass permezz ta’ kompjuter.) 3.3.5. Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tas-silika mdewba, twila bejn 8 u 12 m, ta’ diametru intern ta’ bejn 0,25 u 0,32 mm, miksija minn ġewwa b’likwidu, u bi ħxuna uniformi ta’ bejn 0,10 u 0,30 μm. (Likwidi għat-tifrix adattati għall-użu, tat-tipi SE52 jew SE54 fis-suq.)

3.4. Mikrosiringa għall-introduzzjoni diretta fil-kolonna ta’ 10 μl, mgħammra b’labra iebsa.

3.5. Vibratur ta’ l-elettriku.

3.6. Evaporatur ċirkolari.

3.7. Muffle furnace.

3.8. Miżien analitiku li jiggarantixxi preċiżjoni ta’ + 0,1 mg.

3.9. L-apparat tal-ħġieġ normali tal-laboratorju.

4. REAĠENTI

4.1. Ġell tas-silika tad-daqs ta’ fraka ta’ bejn 60 u 200 μm. Poġġi l-ġell fil-forn f’temperatura ta’ 500 °C għal talanqas erba’ sigħat. Kessħu mill-ġdid, imbagħad żidlu l-ilma fi kwantità ta’ 2 % tal-ġell tas-silika mtella’. Ħawwad sew it-taħlita omoġenizzata. Ħalli fid-dlam għal talanqas 12-il siegħa qabel l-użu.

4.2. n-hexane, għall-kromatografija.

4.3. Eter etiliku, għall-kromatografija

4.4. n-Heptane, għall-kromatografija.

4.5. Soluzzjoni standard ta’ lauryl arachidate, f’0,1 % (m/V) fil-hexane (skond il-livell standard intern). (Wieħed jista’ juża wkoll palmitate tal-palmitil jew inkella methyl stearate) 4.5.1. Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol)

4.6. Gass portatur: idroġenu jew elju pur għall-kromatografija tal-gass.

4.7. Gassijiet awżiljari: — idroġenu pur għall-kromatografija tal-gass; — arja safja, għall-kromatografija tal-gass.

5. PROĊEDURA

5.1. Tħejjija tal-kolonna kromatografika

Dendel 15 g ta’ ġell tas-silika (4.1) fl-n-hexane (4.2) u daħħlu fil-kolonna (3.2). Ħallih joqgħod spontanjament, u kompli t-tqegħid bl-għajnuna ta’ shaker elettroniku (3.5) biex is-saff kromatografiku jsir aktar omoġenju. Saffi 30 ml ta’ n-hexane biex tneħħi l-impuritajiet li jista’ jkun hemm. Iżen eżatt 500 mg mill-kampjun bl-għajnuna tal-miżien (3.8.) fl-Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1.), u żid il-kwantità meħtieġa ta’ standard intern (4.5.) skond il-kontenut previst ta’ xama’. Per eżempju, żid 0,1 mg ta’ lauryl arachidat fil-każ taż-żejt taż-żebbuġa, u minn 0,25 sa 0,5 mg fil-każ taż-żejt tal-fdal taż-żebbuġa. Ittrasferixxi l-kampjun hekk ippreparat għall-kolonna kromatografika bl-għajnuna ta’ żewġ porzjonijiet ta’ 2 ml ta’ n-hexane (4.2.).

Ħalli s-solvent inixxi sa 1 mm ’il fuq mill-ogħla livell ta’ l-assorbent, imbagħad saffi 70 ml addizzjonali ta’ n-hexane sabiex tneħħi l-n-alcanes li jkunu preżenti naturalment. Imbagħad ibda l-eluzzjoni kromatografika billi tiġbor 180 ml tat-taħlita n-hexane/eter etiliku, b’proporzjon 99:1, filwaqt li tinżamm rata ta’ madwar 15-il taqtira kull 10 sekondi. L-eluzzjoni tal-kampjun għandha ssir f’temperatura ta’ l-ambjent ta’ 22 °C + 4.

Noti:

— It-taħlita n-hexane/eter etiliku (99:1) għandha titħejja kuljum.

— Biex tikkontrolla viżwalment l-eluzzjoni korretta tax-xama’, tista’ żżid mal-kampjun fis-soluzzjoni 100 μl ta’ 1 % Sudan fit-taħlita ta’ l-eluzzjoni. Peress li l-kolorant għandu retenzjoni intermedjarja bejn ix-xama’ u t-triglycerides, malli l-kulur jilħaq il-fond tal-kolonna kromatografika, jeħtieġ li l-eluzzjoni tkun sospiża għax ix-xama’ kollu jkunu ġew eluti.

Nixxef il-frazzjoni hekk miksuba fl-evaporatur ċirkolari (3.6.) sakemm is-solvent prattikament ikun tneħħa għalkollox. Neħħi l-aħħar 2 ml tas-solvent bl-għajnuna ta’ kurrent dgħajjef ta’ nitroġenu; imbagħad żid 2-4 ml ta’ n-heptane.

5.2. Analiżi bil-kromatografija tal-gass

5.2.1. Proċeduri preliminari

Waħħal il-kolonna mal-kromatografu tal-gass (3.3.) billi tqabbad it-terminal ta’ dħul fis-sistema on-column u t-terminal ta’ ħruġ ma’ l-indikatur. Agħmel verifika ġenerali ta’ l-apparat ta’ kromatografija bil-gass (l-operazzjoni taċ-ċirkwiti tal-gass, l-effiċjenza ta’ l-indikatur u tas-sistema ta’ reġistrazzjoni, eċċ.).

Jekk il-kolonna tkun qiegħda tintuża għall-ewwel darba, l-ewwel għandu jsir il-kondizzjonament tagħha. Għaddi nixxija rqiqa ta’ gass fil-kolonna, imbagħad ixgħel l-apparat tal-kromatografija tal-gass. Saħħanha bil-mod sakemm wara xi 4 sigħat tilħaq temperatura ta’ 350 °C. Żomm din it-temperatura għal talanqas sagħtejn, imbagħad għaddi għall-aġġustament ta’ l-apparat biex ikun jista’ jitħaddem (l-aġġustar tar-rata ta’ ċirkolazzjoni tal-gassijiet, it-tqabbid tal-fjamma, it-tqabbid mar-reġistratur elettroniku (3.3.4.), l-aġġustar tat-temperatura ta’ l-ambjent għall-kolonna, għall-indikatur, eċċ.) u rreġistra s-sinjal għal sensibbiltà talanqas darbtejn ikbar minn dik prevista għat-twettiq ta’ l-analiżi. Il-linja bażilari għandha tkun lineari, mingħajr l-ebda tip ta’ quċċata, u ma jista’ jkollha l-ebda sinjal ta’ devjazzjoni.

Devjazzjoni rettilineari negattiva tindika li l-konnessjonijiet tal-kolonna mhumiex sew; devjazzjoni pożittiva tindika li l-kolonna ma ġietx ikkondizzjonata kif suppost.

5.2.2. Għażla tal-kondizzjonijiet tat-tħaddim

B’mod ġenerali, il-kundizzjonijiet tat-tħaddim li għandhom ikunu osservati huma dawn li ġejjin:

— it-temperatura tal-kolonna: —



20 °C/minuta 5 °C/minuta 20 °C/minuta fil-bidu 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— it-temperatura ta’ l-indikatur: 350 °C;

— il-kwantità tal-materjal injettat: 1 μl tas-soluzzjoni (2-4 ml) ta’ n-heptane;

— gass portatur: elju jew idroġenu bil-veloċità lineari l-aktar xierqa għall-gass magħżul (ara l-Appendiċi);

— sensittività ta’ l-istrument: livell xieraq skond il-kundizzjonijiet ta’ hawn isfel:

Dawn il-kundizzjonijiet jistgħu jkunu mmodifikati skond il-karatteristiċi tal-kolonna u ta’ l-apparat ta’ kromatografija tal-gass, bil-għan li jinfired ix-xama’ kollu u li jkun hemm riżoluzzjoni sodisfaċenti tal-qċaċet (ara l-figura); il-periodu ta’ retenzjoni ta’ l-standard intern C32 għandu jkun ta’ 18-il minuta + 3. L-aktar quċċata tax-xama’ rappreżentattiva għandha tidher f’talanqas 60 % ta’ l-iskala.

Il-parametri ta’ l-integrazzjoni tal-qċaċet għandhom jiġu ddeterminati b’tali mod li tinkiseb evalwazzjoni korretta tas-superfiċji tal-qċaċet ikkunsidrati.

Nota:Minħabba t-temperatura finali għolja, hija permessa devjazzjoni pożittiva ta’ mhux aktar minn 10 % ta’ l-iskala sħiħa.

5.3. Eżekuzzjoni ta’ l-analiżi

Tella’ 1 μl mis-soluzzjoni bl-għajnuna tal-mikrosiringa ta’ 10 μl; neħħi l-plunger tas-siringa sabiex il-labra tibqa’ vojta. Daħħal il-labra fl-injettur, u wara sekonda jew tnejn, injetta malajr; wara madwar 5 sekondi, oħroġ il-labra bil-mod.

Agħmel ir-reġistrazzjoni sa l-eluzzjoni totali tax-xama’.

Il-linja bażilari għandha dejjem tissodisfa l-kundizzjonijiet stipulati.

5.4. Identifikazzjoni tal-qċaċet

L-identifikazzjoni tal-qċaċet differenti għandha ssir abbażi tal-ħin ta’ retenzjoni, skond tqabbil ma’ taħlitiet ta’ xama’ b’ħinijiet ta’ retenzjoni magħrufin, analizzati fl-istess kundizzjonijiet.

Il-Figura turi kromatogramma tax-xama’ ta’ żejt taż-żebbuġa verġni.

5.5. Evalwazzjoni kwantitattiva

Ikkalkola s-superfiċji tal-qċaċet ta’ l-istandard intern, kif ukoll ta’ l-esters alifatiċi minn C40 sa C46, bl-għajnuna ta’ l-integratur.

Ikkalkola l-kontenut tax-xama’ ta’ kull wieħed mill-esters, f’mg/kg ta’ xaħam, skond il-formula:

Fejn:

Ax = is-superfiċje tal-quċċata ta’ kull ester, f’millimetri kwadri;

As = is-superfiċje tal-quċċata ta’ l-istandard intern, f’millimetri kwadri;

ms = il-massa ta’ l-istandard intern miżjud, f’milligrammi;

m = il-massa tal-kampjun meħud għall-analiżi, fi grammi.

6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Indika t-total tal-kontenut tat-tipi differenti ta’ xama’ minn C40 sa C46, fi mg/kg ta’ materja grassa (ppm).

Nota:Il-komponenti li għandhom jiġu kkwantifikati jirreferu għall-qċaċet b’numru biż-żewġ tal-karbonju, bejn l-estri C40 u C46, skond l-eżempju tal-kromatogramma tax-xama’ taż-żejt taż-żebbuġa indikat fil-figura li ġejja. Jekk l-ester C46 jidher darbtejn, biex jiġi identifikat, jaqbel li ssir analiżi tal-frazzjoni tax-xama’ f’żejt tal-fdal taż-żebbuġa fejn il-quċċata C46 huwa faċilment identifikabbli għax għandha maġġoranza ċara.

Ir-riżultati għandhom ikunu espressi sa punt deċimali wieħed.

FIGURA

Kromatogramma tax-xama’ f’żejt taż-żebbuġa ( 9 )

Tifsir:

I.S. = Lauryl arachidate

1. = Diterpenic esters

2 + 2′ = Esters C40

3 + 3′ = Esters C42

4 + 4′ = Esters C44

5. = Esters C46

6. = Sterol esters u alkoħol triterpenic









APPENDIĊI

Determinazzjoni tal-veloċità lineari tal-gass

Injetta minn 1 sa 3 μl metanu (jew propan) fl-apparat kromatografiku tal-gass, wara l-aġġustament tiegħu għall-kundizzjonijiet normali ta’ l-operazzjoni. Żomm kont tal-ħin li l-gass jieħu biex jgħaddi mill-kolonna, mill-mument li jiġi injettat sakemm tintlaħaq il-quċċata (tM).

Il-veloċità lineari f’ċm/sek. hija mogħtija bil-formula L/tM, fejn L huwa t-tul tal-kolonna f’ċm, u tM huwa l-ħin imkejjel f’sekondi.

▼M26









ANNESS V

L-ISTABBILIMENT TAL-KOMPOŻIZZJONI U L-KONTENUT TAL-ISTEROLI U D-DIALKOĦOL TAT-TRITERPEN PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA B’FAŻI GASSUŻA F’KOLONNA KAPILLARI

1. KAMP TA’ APPLIKAZZJONI

Il-metodu jiddeskrivi proċedura biex jiġi stabbilit il-kontenut tal-isteroli individwali, tal-isteroli kollha u tad-dialkoħol tat-triterpen fiż-żjut taż-żebbuġa u fiż-żjut mir-residwi taż-żebbuġ.

2. IL-PRINĊIPJU

Iż-żejt, li jkollu l-α-kolestanol miżjud bħala standard intern, jinbidel f’sapun bl-idrossidu tal-potassju f’soluzzjoni etanolika u s-sustanzi li ma jistgħux jinbidlu f’sapun jiġu estratti bl-etere etiliku.

Il-frazzjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen tinfired minn mas-sustanzi li ma jistgħux jinbidlu f’sapun permezz tal-kromatografija b’saff irqiq fuq pjanċa bażika ta’ ġell tas-silika. Il-frazzjonijiet irkuprati mill-ġell tas-silika jinbidlu f’eteri tat-trimetilsilil u mbagħad jiġu analizzati permezz tal-kromatografija b’fażi gassuża f’kolonna kapillari.

3. L-APPARAT

L-apparat tas-soltu tal-laboratorju u b’mod partikulari dan li ġej:

3.1. Flask ta’ 250 ml b’kondensatur ta’ rifluss b’ġonot tal-ħġieġ żmeriljat.

3.2. Lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml.

3.3. Fliexken ta’ 250 ml.

3.4. Apparat komplut għall-analiżi bil-kromatografija b’saff irqiq bl-użu ta’ pjanċi tal-ħġieġ ta’ 20 ċm b’20 ċm.

3.5. Lampa tar-radjazzjoni ultravjola b’tul ta’ mewġa ta’ 254 nm jew 366 nm.

3.6. Mikrosiringi ta’ 100 μl u 500 μl.

3.7. Lembut b’filtru forma ta’ ċilindru b’septum poruż ta’ G3 (b’porożità ta’ 15-il μm sa 40 μm) li jkollu dijametru ta’ madwar 2 ċm u jkun fond 5 ċm, li jkun adattat għall-filtrazzjoni f’vakwu b’ġonta interna tal-ħġieġ żmeriljat.

3.8. Flask Erlenmeyer b’vakwu ta’ 50 ml b’ġonta esterna tal-ħġieġ żmeriljat, li jista’ jitwaħħal mal-lembut b’filtru (imsemmi fil-punt 3.7.).

3.9. Tubu tat-testijiet ta’ 10 ml bil-qiegħ li jidjieq u tapp tal-ħġieġ li jissiġilla.

3.10. Kromatografu b’fażi gassuża li jkun jista’ jintuża ma’ kolonna kapillari, li jkollu sistema ta’ injezzjoni maqsuma u li jkun magħmul minn:

3.10.1. kompartiment termostatiku għall-kolonni li jifilħu jżommu t-temperatura mixtieqa bi preċiżjoni ta’ ± 1 °C;

3.10.2. unità ta’ injezzjoni b’temperatura li tista’ tiġi adattata li jkollha element ta’ vaporizzazzjoni tal-ħġieġ persilanizzat u sistema maqsuma;

3.10.3. individwatur tal-jonizzazzjoni bi fjamma (FID);

3.10.4. sistema biex tinkiseb id-dejta li tkun tista’ tintuża mal-individwatur tal-jonizzazzjoni bi fjamma (imsemmi fil-punt 3.10.3.), li jkollha l-kapaċità tal-integrazzjoni manwali.

3.11. kolonna kapillari tas-silika mdewba li tkun twila bejn 20 u 30 m, li jkollha dijametru intern ta’ 0,25 mm sa 0,32 mm, u tkun miksija b’5 % difenil u 95 % dimetilpolisilossan (il-fażi stazzjonarja ta’ SE-52 jew SE-54 jew fażi ekwivalenti), hekk li jkollha ħxuna uniformi ta’ bejn 0,10 μm u 0.30 μm.

3.12. Mikrosiringa ta’ 10 μl għall-kromatografija b’fażi gassuża, b’labra mkaħħla li tkun adattata għall-injezzjoni maqsuma.

3.13. Dessikatur tad-diklorur tal-kalċju

4. REAĠENTI

4.1. Konċentrazzjoni minima ta’ idrossidu tal-potassju ta’ 85 %.

4.2. Madwar 2 N ta’ soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju.

Dewweb 130 g ta’ idrossidu tal-potassju (imsemmi fil-punt 4.1.) permezz tat-tkessiħ f’200 ml ta’ ilma ddistillat u mbagħad żidu bl-etanol (imsemmi fil-punt 4.10.) sa ma jkollok litru. Żomm is-soluzzjoni fi fliexken tal-ħġieġ skur magħluqin sewwa b’tapp u maħżuna għal mhux aktar minn jumejn.

4.3. Etere etiliku għall-kwalità tal-analiżi.

4.4. Madwar 0,2 N ta’ soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju.

Dewweb 13-il g ta’ idrossidu tal-potassju (imsemmi fil-punt 4.1.) f’20 ml ta’ ilma ddistillat u żidu bl-etanol (imsemmi fil-punt 4.10.) sa ma jkollok litru.

4.5. Sulfat tas-sodju anidru għall-kwalità tal-analiżi.

4.6. Pjanċi tal-ħġieġ (ta’ 20 ċm b’20 ċm) miksijin bil-ġell tas-silika, mingħajr indikatur tal-fluworexxenza, u li jkunu ħoxnin 0,25 mm (dawn jinsabu għall-bejgħ lesti għall-użu).

4.7. Toluwen għall-kwalità tal-kromatografija.

4.8. Aċeton għall-kwalità tal-kromatografija.

4.9. n-eżan għall-kwalità tal-kromatografija.

4.10. Etere etiliku għall-kwalità tal-kromatografija.

4.11. Etanol ta’ kwalità analitika.

4.12. Aċitat etiliku ta’ kwalità analitika.

4.13. Soluzzjoni ta’ referenza għall-kromatografija b’saff irqiq: kolesterol jew sterol tal-pjanti u soluzzjoni ta’ 5 % ta’ eritrodiol fl-aċitat etiliku (imsemmi fil-punt 4.11.).

4.14. 2,7-diklorofluworoxxina, 0,2 % f’soluzzjoni etanolika. Ġib ir-reaġent ftit iktar bażiku billi żżid xi qtar tas-soluzzjoni alkoħolika ta’ 2 N tal-idrossidu tal-potassju (imsemmija fil-punt 4.2.).

4.15. Piridina anidruża għall-kwalità tal-kromatografija (ara n-Nota numru 5).

4.16. Disilażan tal-eżametil ta’ kwalità analitika.

4.17. Trimetilklorosilan ta’ kwalità analitika.

4.18. Mudelli tas-soluzzjonijiet tal-eteri tat-trimetilsilil tal-isteroli.

Dawn għandhom jitħejjew fil-ħin tal-użu mill-isteroli u l-eritrodiol miksubin miż-żjut li jkun fihom dawn is-sustanzi.

4.19. α-kolestanol ta’ purità ta’ iktar minn 99 % (il-purità trid tiġi ċċekkjata permezz ta’ analiżi tal-kromatografija b’fażi gassuża).

4.20. soluzzjoni bl-α-kolestanol bħala standard intern, soluzzjoni ta’ 0,2 % (m/V) fl-aċitat etiliku (imsemmi fil-punt 4.11.).

4.21. Soluzzjoni tal-fenolftaleina, 10 g/l fl-etanol (imsemmi fil-punt 4.10.).

4.22. Gass trasportatur: l-idroġenu jew l-elju, pur għall-kromatografija tal-gass.

4.23. Gassijiet awżiljarji: l-idroġenu, l-elju, in-nitroġenu u l-arja, li jkunu puri għall-kromatografija tal-gass.

4.24. Taħlita ta’ 65:35 (V/V) ta’ n-eżan/etere etiliku (imsemmija fil-punti 4.9. u 4.10 rispettivament).

4.25. reaġent ta’ sililazzjoni, li tikkonsisti f’taħlita ta’ 9:3:1 (V/V/V) ta’ piridina/disilażan tal-eżametil/trimetilklorosilan.

5. PROĊEDURA

5.1. Tħejjija tas-sustanzi li ma jistgħux jinbidlu f’sapun 5.1.1. Filwaqt li tuża mikrosiringa ta’ 500 μl (imsemmija fil-punt 3.6), fil-flask ta’ 250 ml (imsemmi fil-punt 3.1) daħħal volum tas-soluzzjoni bl-α-kolestanol bħala standard intern (imsemmija fil-punt 4.20) li jkun fiha ammont ta’ kolestanol li jikkorrispondi ma’ madwar 10 % tal-kontenut tal-isteroli tal-kampjun. Pereżempju, żid 500 μl tas-soluzzjoni bl-α-kolestanol (imsemmija fil-punt 4.20) għal kampjun taż-żejt taż-żebbuġa ta’ 5 g u 1 500 μl għal kampjun taż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ. Ħallih jevapora f’banju ta’ ilma fietel permezz ta’ kurrent ħafif tan-nitroġenu sa ma jinxef, u wara li tkun berridt il-flask, iżen ħames ± 0,01 g tal-kampjun niexef iffiltrat fl-istess flask. Nota 1: Iż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali jew veġetali li jkun fihom kwantitajiet kbar ta’ kolesterol jistgħu juru quċċata li l-ħin ta’ żamma tagħha jkun jixbah lil dak tal-kolestanol. Jekk dan iseħħ, il-frazzjoni tal-isteroli jkollha tiġi analizzata darbtejn, bl-istandard intern u mingħajru. 5.1.2. Żid 50 ml ta’ 2 N ta’ soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju (imsemmija fil-punt 4.2) u xi ftit ħaffiefa, poġġi l-kondensatur ta’ rifluss u saħħan it-taħlita sakemm din tibda tagħli bil-mod u sa ma s-soluzzjoni ssir qisha sapun (sa ma ssir ċara). Kompli saħħan għal 20 minuta oħra mbagħad żid 50 ml ta’ ilma ddistillat mill-parti ta’ fuq tal-kondensatur, aqla’ l-kondensatur u kessaħ il-flask sa ma jkollu bejn wieħed u ieħor temperatura ta’ 30 °C. 5.1.3. Ittrasferixxi l-kontenut tal-flask b’mod kwantitattiv f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml (imsemmi fil-punt 3.2) billi tuża diversi porzjonijiet ta’ ilma ddistillat (ta’ 50 ml). Żid bejn wieħed u ieħor 80 ml ta’ etere etiliku (imsemmi fil-punt 4.10), ħawwad sew għal madwar 60 sekonda, filwaqt li tirrilaxxa l-pressjoni b’mod regolari billi taqleb il-lembut ta’ separazzjoni ta’ taħt fuq u tiftaħ it-tapp. Ħalli t-taħlita toqgħod sa ma jkun hemm separazzjoni kompluta taż-żewġ fażijiet (ara n-Nota 2). Imbagħad neħħi s-soluzzjoni tas-sapun b’mod kemm jista’ jkun komplut u poġġieħa f’lembut tas-separazzjoni ieħor. Bl-istess mod, agħmel żewġ estrazzjonijiet oħra tal-fażi tal-ilma u l-alkoħol billi tuża 60 sa 70 ml ta’ etere etiliku (imsemmi fil-punt 4.10). Nota 2: Kwalunkwe emulsjoni tista’ tiġi distrutta biż-żieda ta’ kwantitajiet żgħar ta’ etanol (imsemmi fil-punt 4.11). 5.1.4. Ħallat it-tliet estratti tal-etere f’lembut tas-separazzjoni wieħed li jkun fih 50 ml ta’ ilma. Kompli aħsel bl-ilma (50 ml) sakemm l-ilma tal-ħasil ma jibqax jagħti kulur roża meta tiżdiedlu qatra ta’ soluzzjoni tal-fenolftaleina (imsemmija fil-punt 4.12). Meta jkun tneħħa l-ilma tal-ħasil, iffiltra bis-sulfat tas-sodju anidru (imsemmi fil-punt 4.5) fi flask ta’ 250 ml li jkun intiżen minn qabel, filwaqt li taħsel il-lembut u l-filtru bi kwantitajiet żgħar tal-etere etiliku (imsemmi fil-punt 4.10). 5.1.5. Ħalli s-solvent jevapora permezz tad-distillazzjoni fuq evaporatur rotatorju fi 30 °C f’vakwu. Żid 5 ml ta’ aċeton u neħħi s-solvent volatili għalkollox f’kurrent ħafif tal-arja. Nixxef il-fdalijiet fil-forn f’temperatura ta’ 103 °C ± 2 °C għal kwarta, kessaħ f’dessikaturi u iżen sal-eqreb 0.1 mg.

5.2. Separazzjoni tal-frazzjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen (l-eritrodiol u l-uvaol) 5.2.1. Ipprepara l-pjanċi bażiċi tal-kromatografija b’saff irqiq. Għaddas il-pjanċi tal-ġell tas-silika (imsemmija fil-punt 4.6) madwar 4 ċm fis-soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju ta’ 0,2 N (imsemmija fil-punt 4.5) għal għaxar sekondi, imbagħad ħallihom sagħtejn jinxfu f’kabinett għad-dħaħen u fl-aħħar poġġihom f’forn f’temperatura 100 °C għal siegħa. Neħħihom mill-forn u żommhom f’dessikatur tal-klorur tal-kalċju sa ma jkun hemm bżonn jintużaw (il-pjanċi li jkunu għaddew minn din il-proċedura jridu jintużaw fi żmien ħmistax). Nota 3: Meta jintużaw il-pjanċi bażiċi tal-ġell tas-silika biex tiġi sseparata l-frazzjoni tal-isteroli, il-frazzjoni li ma tistax tinbidel f’sapun m’hemmx għalfejn tiġi ttrattata bl-ossidu tal-aluminju. B’dan il mod il-komposti kollha ta’ natura aċida (l-aċidi xaħmin u oħrajn) jinżammu fuq il-linja ta’ rilevament u l-faxxa tal-isteroli tinfired b’mod ċar mill-faxxa tal-alkoħol alifatiku u tat-triterpen. 5.2.2. Poġġi t-taħlita tal-eżan u tal-etere etiliku (imsemmija fil-punt 4.24) (ara n-Nota 4) fil-kamra tal-iżvilupp, f’fond ta’ madwar ċentimetru. Agħlaq il-kamra bl-għatu x-xieraq u ħalliha hekk għal mill-inqas nofsiegħa f’post kiesaħ sabiex jiġi stabbilit bilanċ bejn il-likwidu u l-fwar. Fuq in-naħa ta’ ġewwa tal-kamra jistgħu jitqiegħdu strixxi ta’ karta filtru li jkunu mgħaddsin fl-elwent. Dan inaqqas il-ħin tal-iżvilupp bejn wieħed u ieħor b’terz u jwassal għal elużjoni aktar uniformi u regolari tal-komponenti. Nota 4: It-taħlita li tkun qed tiżviluppa trid tinbidel għal kull test, sabiex jinkisbu kundizzjonijiet tal-elużjoni li jkunu perfettament riproduċibbli, u bħala solvent alternattiv tista’ tintuża t-taħlita ta’ 50:50 (V/V) ta’ n-eżan/etere etiliku. 5.2.3. Ipprepara soluzzjoni ta’ madwar 5 % tas-sustanzi li ma jistgħux jinbidlu f’sapun (imsemmija fil-punt 5.1.5) fl-aċitat etiliku (imsemmi fil-punt 4.12) u, bl-użu ta’ mikrosiringa ta’ 100 μl, poġġi 0.3 ml minn din is-soluzzjoni fi strixxa dejqa u uniformi fin-naħa t’isfel (2 ċm) tal-pjanċa kromatografika (imsemmija fil-punt 5.2.1). F’linja waħda mal-istrixxa qiegħed 2 sa 3 μl tas-soluzzjoni ta’ referenza tal-materjal (imsemmija fil-punt 4.13) sabiex il-faxxa tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen tkun tista’ tiġi identifikata wara li tiżviluppa. 5.2.4. Qiegħed il-pjanċa fil-kamra tal-iżvilupp imħejji kif speċifikat fil-punt 5.2.2. It-temperatura ambjentali għandha tinżamm bejn 15 u 20 °C (ara n-Nota 5). Agħlaq il-kamra mal-ewwel bl-għatu u ħalli l-proċess ta’ elużjoni jseħħ sa ma l-parti ta’ quddiem tas-solvent tasal madwar ċentimetru mit-tarf ta’ fuq tal-pjanċa. Neħħi l-pjanċa mill-kamra tal-iżvilupp u ħalli s-solvent jevapora f’kurrent ta’ arja sħuna jew billi tħalli l-pjanċa għal ftit ħin taħt għata. Nota 5: Temperatura ogħla minn hekk tista’ tgħarraq is-separazzjoni. 5.2.5. Sprejja l-pjanċa kemm kemm u b’mod uniformi bis-soluzzjoni ta’ 2,7-diklorofluworoxxina (imsemmija fil-punt 4.14) u mbagħad ħalliha ħa tinxef. Meta l-pjanċa tiġi osservata f’dawl ultravjola, il-faxex tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen ikunu jistgħu jiġu identifikati billi jiġu allinjati mat-tbajja’ miksubin permezz tas-soluzzjoni ta’ referenza (imsemmija fil-punt 4.13). Immarka l-limiti tal-faxex mat-truf tal-fluworexxenza b’lapes iswed (ara l-pjanċa tal-kromatografija b’saff irqiq mogħtija fil-figura 3). 5.2.6. Obrox il-ġell tas-silika minn fuq il-parti mmarkata billi tuża spatula tal-metall. Poġġi l-materjal mitħun b’mod fin li jkun tneħħa fil-lembut b’filtru (imsemmi fil-punt 3.7). Żid 10 ml ta’ aċitat etiliku sħun (imsemmi fil-punt 4.12), ħawdu bil-mod bl-ispatula tal-metall u ffiltrah f’vakwu, filwaqt li tiġbor il-filtrat fil-flask Erlenmeyer (imsemmi fil-punt 3.8.) li jkun imwaħħal mal-lembut b’filtru. Aħsel il-fdal fil-flask tliet darbiet bl-etere etiliku (imsemmi fil-punt 4.3) (madwar 10 ml kull darba), filwaqt li tiġbor il-filtrat fl-istess flask imwaħħal mal-lembut, evapora l-filtrat sa ma jintlaħaq volum ta’ 4 sa 5 ml, ittrasferixxi s-soluzzjoni li jibqa’ għal ġot-tubu tat-testijiet ta’ 10 ml li jkun intiżen minn qabel (imsemmi fil-punt 3.9), evaporah permezz tat-tisħin ħafif f’kurrent ħafif tan-nitroġenu sa ma jinxef, erġa’ oħolqu mill-ġdid billi tuża ftit qtar tal-aċeton (imsemmi fil-punt 4.8) u evaporah għal darb’oħra sa ma jinxef. Il-fdal li jibqa’ fit-tubu tat-testijiet irid ikun magħmul mill-frazzjonijiet tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen.

5.3. Tħejjija tal-eteri tat-trimetilsilil 5.3.1. Żid ir-reaġent ta’ sililazzjoni (imsemmi fil-punt 4.25) (ara n-Nota 6), bil-proporzjon ta’ 50 μl għal kull milligramma ta’ steroli u dialkoħol tat-triterpen, fit-tubu tat-testijiet li jkun fih il-frazzjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen, filwaqt li tevita kwalunkwe assorbiment tal-umdità (ara n-Nota 7). Nota 6: Wieħed jista’ jsib għall-bejgħ soluzzjonijiet lesti għall-użu. Wieħed jista’ jsib ukoll reaġenti ta’ sililazzjoni oħrajn bħal, pereżempju, il-bistrimetilsilil trifluwor aċetammid + 1 % trimetilklorosilan, li jrid jiġi dilwit bl-istess volum ta’ piridina anidruża. Minflok il-piridina jista’ jintuża l-istess ammont ta’ aċetonitril. 5.3.2. Sodd it-tubu tat-testijiet u ħawdu bil-galbu (mingħajr ma taqilbu rasu ’l isfel) sakemm il-komponenti jinħallu għalkollox. Ħallih joqgħod għal mill-inqas kwarta f’temperatura ambjentali u mbagħad ħawdu b’azzjoni ċentrifuga għal ftit minuti. Is-soluzzjoni ċara tkun lesta biex tiġi analizzata bil-kromatografija b’fażi gassuża. Nota 7: L-opalexxenza ħafifa li tista’ tirriżulta hija normali u ma toħloq l-ebda anomalija. Il-formazzjoni ta’ bjuda jew l-apparenza ta’ kulur roża jindikaw il-preżenza ta’ umdità jew deterjorament tar-reaġent. Jekk dan iseħħ, it-test irid jerġa’ jsir (jekk jintuża l-eżametildisilażan jew it-trimetilklorosilan biss).

5.4. Analiżi bil-kromatografija b’fażi gassuża 5.4.1. L-operazzjonijiet preliminari, il-kundizzjonament tal-kolonna kapillari. 5.4.1.1. Waħħal il-kolonna (imsemmija fil-punt 3.11) fil-kromatografu b’fażi gassuża billi tqabbad it-tarf ta’ ġewwa mal-apparat għall-injezzjoni maqsuma u t-tarf ta’ barra mal-individwatur. Wettaq kontrolli ġenerali fuq il-kromatografu b’fażi gassuża (għat-tnixxijiet miċ-ċirkwiti tal-gass, l-effiċjenza tal-individwatur, l-effiċjenza tas-sistema ta’ separazzjoni u s-sistema ta’ reġistrazzjoni, eċċ.). 5.4.1.2. Jekk il-kolonna tkun qed tintuża għall-ewwel darba, huwa rrakkomandat li din isirilha proċess ta’ kundizzjonament, jiġifieri li jingħadda kurrent ħafif ta’ gass mill-kolonna nnifisha, imbagħad li jitqabbad il-kromatografu b’fażi gassuża u jibda t-tisħin b’mod gradwali sa ma tintlaħaq temperatura li tkun mill-inqas 20 °C iktar mit-temperatura ta’ tħaddim (ara n-Nota 8). Żomm din it-temperatura għal mill-inqas sagħtejn, imbagħad qiegħed l-apparat kollu fil-modalità tat-tħaddim (l-aġġustament tal-kurrenti tal-gass u tas-sistema ta’ separazzjoni, it-tqabbid tal-fjamma, il-konnessjoni mas-sistema tal-kompjuter, l-aġġustament tat-temperatura tal-kolonna, tal-individwatur u tal-apparat għall-injezzjoni, eċċ.) u mbagħad irreġistra s-sinjal b’sensittività li tkun mill-inqas darbtejn iktar minn dik maħsuba għall-analiżi. Ir-rotta tal-linja ta’ referenza trid tkun lineari, mingħajr ebda quċċata, u m’għandhiex turi devjazzjonijiet. Devjazzjoni f’linja dritta negattiva tindika tnixxija mill-ġonot tal-kolonna, waqt li devjazzjoni pożittiva tindika li l-kundizzjonament tal-kolonna ma kienx biżżejjed. Nota 8: It-temperatura tal-kundizzjonament dejjem trid tkun mill-inqas 20 °C inqas mit-temperatura massima speċifikata għall-fażi stazzjonarja użata. 5.4.2. Għażla tal-kundizzjonijiet tat-tħaddim. 5.4.2.1. Il-kundizzjonijiet tat-tħaddim huma dawn li ġejjin: — it-temperatura tal-kolonna: 260 ± 5 °C; — it-temperatura tal-apparat għall-injezzjoni: 280 sa 300 °C; — it-temperatura tal-individwatur: 280 sa 300 °C; — il-veloċità lineari tal-gass trasportatur: l-elju - 20 sa 35 cm/s; l-idroġenu - 30 sa 50 cm/s; — il-proporzjon tas-separazzjoni: minn 1:50 sa 1:100; — is-sensittività tal-istrumenti: minn 4 sa 16-il darba l-attenwazzjoni minima; — is-sensittività tar-reġistrazzjonijiet: 1 sa 2 mV bi skala sħiħa; — ammont ta’ sustanza injettata: 0,5 sa 1 μl tas-soluzzjoni tal-eteri tat-trimetilsilil (TMSE). Dawn il-kundizzjonijiet jistgħu jinbidlu skont il-karatteristiċi tal-kolonna u tal-kromatografu b’fażi gassuża sabiex jinkisbu kromatogrammi li jilħqu r-rekwiżiti li ġejjin: — il-ħin ta’ żamma għall-quċċata tal-ß-sitosterol għandu jkun ta’ 20 minuta ± 5 minuti; — il-quċċata tal-kampesterol għandha tkun: għaż-żejt taż-żebbuġa (b’kontenut medju ta’ 3 %) 20 ± 5 % tal-iskala sħiħa; u għaż-żejt tal-fażola tas-sojja (b’kontenut medju ta’ 20 %) 80 ± 10 % tal-iskala sħiħa; — l-isteroli kollha li jkun hemm iridu jiġu sseparati. Barra milli jkunu mifrudin, il-qċaċet iridu jkunu wkoll maqtugħin għal kollox, jiġifieri l-linja tal-quċċata għandha tmur lura lejn il-linja ta’ referenza qabel ma titlaq għall-quċċata li jmiss. Madankollu, jista’ jkun hemm riżoluzzjoni mhux sħiħa, dejjem jekk il-quċċata f’RRT 1,02 (is-sitostanol) tkun tista’ tiġi kkwantifikata permezz tal-linja perpendikulari. 5.4.3. Il-proċedura analitika 5.4.3.1. Ħu 1 μl ta’ eżan billi tuża l-mikrosiringa ta’ 10 μl, iġbed għal ġo fiha 0,5 μl ta’ arja u mbagħad 0,5 μl sa 1 μl tas-soluzzjoni tal-kampjun. Għolli l-planġer tas-siringa iktar sabiex il-labra tiżvojta. Imbotta l-labra fil-membrejn tal-apparat għall-injezzjoni u wara sekonda jew tnejn injetta malajr, imbagħad neħħi l-labra bil-mod wara madwar ħames sekondi. Jista’ jintuża wkoll apparat awtomatiku għall-injezzjoni. 5.4.3.2. Irreġistra sakemm ikun hemm elużjoni sħiħa tal-eteri tat-trimetilsilil (it-TMSE) tad-dialkoħol tat-triterpen preżenti. Il-linja ta’ referenza trid tkompli tilħaq ir-rekwiżiti meħtieġa (ara l-punt 5.4.1.2). 5.4.4. L-identifikazzjoni tal-qċaċet Identifika l-qċaċet individwali fuq il-bażi tal-ħin ta’ żamma u billi tqabbel mat-taħlita tal-eteri tat-trimetilsilil (it-TMSE) tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen analizzati bl-istess kundizzjonijiet (ara l-Appendiċi). L-elużjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen isseħħ fl-ordni li ġejja: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metilin-kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol u uvaol. Il-ħinijiet ta’ żamma għall-ß-sitosterol għall-kolonni SE-52 u SE-54 jidhru fit-Tabella 1. Il-Figuri 1 u 2 juru l-kromatogrammi tipiċi għal xi żjut. 5.4.5. L-evalwazzjoni kwantitattiva. 5.4.5.1. Ikkalkula l-erjas tal-α-kolestanol u l-qċaċet tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen billi tuża s-sistema tal-kompjuter. Tagħtix każ tal-qċaċet għal kwalunkwe sustanza komposta li mhix inkluża fost dawk imniżżlin fit-Tabella 1 (l-ergosterol ma jridx jiġi kkalkulat). Il-fattur tat-tweġiba għall-α-kolestanol għandu jitqies li huwa ta’ 1. 5.4.5.2. Ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ kull sterol individwali f’mg/kg ta’ materjal xaħmi kif ġej: fejn: Ax = l-erja tal-quċċata tal-isterol x f’unitajiet tas-sistema tal-kompjuter; As = l-erja tal-quċċata tal-α-kolestanol f’unitajiet tas-sistema tal-kompjuter; ms = il-massa tal-α-kolestanol miżjud f’milligrammi; m = il-massa tal-kampjun użat għall-istabbiliment tal-karatteristiċi fi grammi.

6. L-ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1. Agħti l-konċentrazzjonijiet tal-isteroli individwali f’mg/kg ta’ materjal xaħmi u l-għadd totali tagħhom bħala “l-isteroli kollha”.

Il-kompożizzjoni ta’ kull sterol individwali u tal-eritrodiol u l-uvaol għandha tingħata bħala numru b’ċifra waħda wara l-punt deċimali.

Il-kompożizzjoni tal-isteroli kollha għandha tingħata bħala numru mingħajr ċifri wara l-punt deċimali.

▼M28

6.2. Ikkalkula l-perċentwal ta' kull sterol individwali mill-proporzjon tal-erja tal-quċċata rilevanti mal-arja totali tal-quċċata għall-isteroli:

fejn:

Ax = l-erja tal-quċċata għal x;

ΣA = l-erja totali tal-quċċata għall-isteroli.

▼M26

6.3. β-sitosterol evidenti: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Ikkalkula l-perċentwali tal-eritrodiol u l-uvaol:

fejn:

ΣA = l-erja totali tal-isteroli f’unitajiet tas-sistema tal-kompjuter;

Er = l-erja tal-eritrodiol f’unitajiet tas-sistema tal-kompjuter;

Uv = l-erja tal-uvaol f’unitajiet tas-sistema tal-kompjuter.









Appendiċi

L-istabbiliment tal-veloċità lineari tal-gass

Filwaqt li tissettja l-kromatografu b’fażi gassuża f’kundizzjonijiet normali tat-tħaddim, injetta 1 sa 3 μl ta’ metan (jew propan) u kejjel il-ħin li l-gass jieħu biex jgħaddi mill-kolonna mill-ħin tal-injezzjoni sal-ħin li fih tidher il-quċċata (tM).

Il-veloċità lineari f’ċm/s tinkiseb permezz tal-formola L/tM, fejn L huwa t-tul tal-kolonna f’ċentimetri u tM huwa l-ħin imkejjel f’sekondi.







It-Tabella 1 Il-ħinijiet relattivi ta’ żamma għall-isteroli Il-quċċata L-identifikazzjoni Il-ħin relattiv ta’ żamma Il-kolonna SE-54 Il-kolonna SE-54 1 Kolesterol Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Kolestanol 5α-kolestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassikasterol [24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 metil Δ5-7-22 kolestatrien 3β-ol 0,78 0,76 4 24-metilin-kolesterol 24-metilin-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Kampesterol (24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Kampestanol (24R)-24-metil-kolestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol (24S)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Klerosterol (24S)-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etil-Δ-5-kolesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-etil-kolestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-etilidin-Δ-kolesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-etilidin-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Eritrodiol 5α olean-12en-3β28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52

Il-Figura 1

Kromatogramma f’fażi gassuża tal-frazzjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen ta’ żejt taż-żebbuġa lampante (miżjud bl-istandard intern)

Il-Figura 2

Kromatogramma f’fażi gassuża tal-frazzjoni tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen ta’ żejt taż-żebbuġa raffinat (miżjud bl-istandard intern)

Il-Figura 3

Pjanċa tal-kromatografija b’saff irqiq ta’ żejt mir-residwi taż-żebbuġ, li turi l-parti li trid tinbarax biex jiġu stabbiliti l-isteroli u d-dialkoħol tat-triterpen

1 – Skwalin

2 – Alkoħol tat-triterpen u alkoħol alifatiku

3 – Steroli u dialkoħol tat-triterpen

4 – Aċidi xaħmin inizjali u aċidi xaħmin liberi

▼M26 —————

▼M21









ANNESS VII

DETERMINAZZJONI TAL-PERĊENTWAL TA’ 2-GLYCERYL MONOPALMITATE

1. SKOP U QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu jiddeskrivi l-proċedura analitika biex jiġi ddeterminat il-perċentwal ta’ l-aċidu palmitiku fit-2 pożizzjoni tat-triglycerides permezz ta’ l-evalwazzjoni tat-2-glyceryl monopalmitate.

Dan il-metodu huwa applikabbli għaż-żjut veġetali likwidi fit-temperatura ta’ l-ambjent (20 °C).

2. PRINĊIPJU

Wara t-tħejjija, il-kampjun ta’ żejt huwa sottomess għall-azzjoni tal-lipażi pankreatiku: idroliżi parzjali u speċifiku fil-pożizzjonijiet 1 u 3 tal-molekula ta’ triglyceride ġġib magħha id-dehra tal-monoglycerides fil-pożizzjoni 2. Il-preċentwal ta’ 2-glyceril monopalmitate fil-frazzjoni ta’ monoglyceride jiġi ddeterminat, wara silylation, permezz ta’ kromatografija tal-gass fuq kolonna kapillari.

3. APPARAT U TAGĦMIR

3.1. Flask Erlenmeyer ta’ 25 ml.

3.2. Bikers ta’ 100, 250 u 300 ml.

3.3. Kolonna tal-ħġieġ għall-kromatografija, b’dijametru intern ta’ 21-23 mm, twila 400 mm, mgħammra bi pjanċa tal-ħġieġ sinterizzat u vit.

3.4. Provetti ta’ 10, 50, 100 u 200 ml.

3.5. Flaskijiet ta’ 100 u 250 ml.

3.6. Evaporatur ċirkolari.

3.7. Tubi għaċ-ċentrifuga bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml, b’tapp immolat.

3.8. Ċentrifuga għat-tubi ta’ 10 u 100 ml.

3.9. Termostat biex it-temperatura tinżamm f’ 40 ± 0,5 °C

3.10. Pipetti ggradwati ta’ 1 u 2 ml.

3.11. Siringa ipodermika ta’ 1 ml.

3.12. Mikrosiringa ta’ 100 μl.

3.13. Lenbut ta’ 1 000 ml

3.14. Kromatografu tal-gass għal kolonni kapillari, mgħammar b’injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna, u b’forn biex tinżamm temperatura ta’ madwar 1 °C.

3.15. Injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna.

3.16. Rilevatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u elettrometru.

3.17. Reġistratur-integratur adattat għall-elettrometru b’veloċità ta’ risposta ta’ mhux aktar minn sekonda, u b’veloċità tal-karta varjabbli.

3.18. Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tas-silika mdewba ta’ bejn 8 u 12-il metru, b’dijametru intern ta’ bejn 0,25 u 0,32 mm, miksija b’methylpolysiloxane jew b’phenyl methylpolysiloxane 5 %, bi ħxuna ta’ bejn 0,10 u 0,30 μm, li tista’ tintuża f’temperatura ta’ 370 °C.

3.19. Mikrosiringa ta’ 10 μl mgħammra b’labra iebsa, twila talanqas 7.5 cm, għall-injezzjoni diretta fuq il-kolonna.

4. REAĠENTI

4.1. Ġell tas-silika tad-daqs ta’ fraka ta’ bejn 0 063 u 0 200 mm (70/280 mesh), imħejji kif ġej: qiegħed il-ġell tas-silika ġewwa kapsula tal-porċellana, nixxef fil-forn f’temperatura ta’ 160 °C għal 4 sigħat, imbagħad kessaħ f’temperatura ta’ l-ambjent f’dessikatur. Żid volum ta’ ilma ewkivalent għal 5 % tal-piż tal-ġell tas-silika, kif ġej: ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 500 ml, iżen 152 g ġell tas-silika u żidlu 8 g ta’ ilma distillat, sodd it-tubu u ħawwad bil-mod sabiex l-ilma jinfirex b’mod uniformi. Ħalli joqgħod għal talanqas 12-il siegħa qabel l-użu.

4.2. n-hexane (għall-kromatografija).

4.3. Isopropanol.

4.4. Isopropanol, soluzzjoni milwiema 1/1 (V/V).

4.5. Lipażi pankreatika. Il-lipażi li tintuża għandu jkollha attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet ta’ lipażi għal kull mg (fis-suq jeżistu lipażi pankreatiċi b’attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet għal kull mg ta’ enżima).

4.6. Soluzzjoni stabbilizzanti ta’ trishydroxymethylaminomethane: soluzzjoni milwiema 1 M miġjuba sa pH 8 (kontroll potenzjometriku) permezz ta’ HCI kkonċentrat (1/1 V/V).

4.7. Sodju kolat, ta’ kwalità enżimatika, soluzzjoni milwiema 0,1 % (din is-soluzzjoni għandha tintuża sa 15-il jum wara l-preparazzjoni tagħha).

4.8. Klorur tal-kalċju, soluzzjoni milwiema 22 %.

4.9. Eter djetiliku għall-kromatografija.

4.10. Solvent ta l-iżvilupp: taħlita n-hexane/eter djetiliku (87/13) (V/V).

4.11. Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni ta’ 12 % fil-piż.

4.12. Phenolphthalein, soluzzjoni ta’ 1 % fl-etanol.

4.13. Gass portatur: idroġenu jew elju, għall-kromatorgrafija tal-gass.

4.14. Gassijiet awżiljari: – idroġenu, b’purità minima ta’ 99 %, mingħajr umidità jew sustanzi organiċi – u arja, għall-kromatografija tal-gass, bl-istess livell ta’ purità.

4.15. Reaġent ta’ silanizzazzjoni: taħlita pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (Fis-suq jeżistu soluzzjonijiet lesti għall-użu). Jistgħu jintużaw reaġenti oħrajn ta’ silylation, partikolarment bit-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilwiti ma’ l-istess volum ta’ anhydrous pyridine).

4.16. Kampjuni ta’ referenza: monoglycerides puri jew taħlitiet ta’ monoglycerides b’kompożizzjoni magħrufa tal-perċentwal, simili għal dik tal-kampjun.

5. PROĊEDURA

5.1. Tħejjija tal-kampjun

5.1.1. Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ inqas minn 3 % ma jeħtiġux jiġu newtralizzati qabel il-kromatografija tal-kolonna bil-ġell tas-silika. Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ aktar minn 3 % għandhom ikunu sottomessi għan-newtralizzazzjoni skond il-punt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Ferra’ 50 g żejt u 200 ml n-hexane fil-lenbut ta’ 1 000 ml (3.13). Żid 100 ml isopropanol u kwantità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 12 % (4.11) ekwivalenti għall-aċidità ħielsa taż-żejt, miżjuda b’5 %. Ħawwad sewwa għal minuta. Żid 100 ml ilma distillat, erġa’ ħawwad u ħalli joqgħod. Ferra’, imbagħad neħħi l-aħħar saff li fih is-sapun. Neħħi s-safef intermedji li jista’ jkun hemm (muċilaġni u sustanzi li ma jdubux). Aħsel is-soluzzjoni hexane taż-żejt newtralizzat b’porzjonijiet suċċessivi ta’ bejn 50 u 60 ml tas-soluzzjoni isopropanol/ilma 1/1 (V/V) (4.4) sakemm ma jibqax jidher il-kulur roża tal-phenolphthalein. Neħħi l-biċċa l-kbira mill-hexane permezz tad-distillazzjoni fil-vakwu (per eżempju, jista’ jintuża evaporatur ċirkolari) uttrasferixxi ż-żejt għal ġo flask ta’ 100 ml (3.5). Nixxef iż-żejt fil-vakwu sakemm is-solvent ikun tneħħa għal kollox. Fi tmiem din il-proċedura, l-aċidità taż-żejt għandha tkun inqas minn 0,5 %.

5.1.2. Ferra’ 1 g ta’ żejt ippreparat kif deskritt hawn fuq, ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1) u dewweb f’10 ml mit-taħlita ta’ l-iżvilupp (4.10). Ħalli s-soluzzjoni toqgħod għal talanqas kwarta qabel ma ssir il-kromatrografija fuq kolonna bil-ġell tas-silika. Jekk is-soluzzjoni tkun imċajpra, għaddiha miċ-ċentrifuga biex tiżgura l-aqwa kundizzjonijiet għall-kromatografija. (Jistgħu jintużaw skrataċ ta’ ġell tas-silika SPE ta’ 500 mg lesti għall-użu).

5.1.3. Tħejjija tal-kolonna kromatografika Ferra’ fil-kolonna (3.3) madwar 30 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), daħħal biċċa qoton fil-parti ta’ isfel tal-kolonna bl-għajnuna ta’ virga tal-ħġieġ; agħfas biex tneħħi l-arja. Ġo biker, ipprepara suspensjoni ta’ 25 g ġell tas-silika (4.1) f’madwar 80 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp, u ferragħ fil-kolonna bl-għajnuna ta’ lenbut. Iċċekkja li l-ġell kollu tas-silika jkun daħal fil-kolonna; aħsel bis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), iftaħ il-vit u ħalli l-livell tal-likwidu jilħaq madwar 2 mm ‘il fuq mil-livell superjuri tal-ġell tas-silika.

5.1.4. Kromatografija fuq kolonna Ġo flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1), iżen eżatt 1 g tal-kampjun imħejji skond il-punt 5.1. Dewweb il-kampjun f’10 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10). Ferragħ is-soluzzjoni fil-kolonna kromatografika mħejjija skond il-punt 5.1.3. Kemm jista’ jkun, tħarrikx is-superfiċje tal-kolonna. Iftaħ il-vit u ħalli s-soluzzjoni tal-kampjun tnixxi sakemm tilħaq il-livell tal-ġell tas-silika. Żviluppa b’150 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp. Aġġusta r-rata sa 2 ml/min (sabiex 150 ml inixxu fil-kolonna f’madwar 60-70 minuta). Irkupra l-eluzzjoni ġo flask ta’ 250 ml li jkun ġie mwieżen minn qabel. Evapora s-solvent fil-vakwu u neħħi l-aħħar traċċi tiegħu taħt kurrent ta’ nitroġenu. Iżen il-flask u ikkalkula l-estratt irkuprat. (Fil-każ li jkunu qed jintużaw skrataċ SPE tas-silika lesti għall-użu, ipproċedi kif ġej: Daħħal 1 ml mis-soluzzjoni (5.1.2.) ġo l-iskrataċ, imħejjija minn qabel b’3 ml ta’ n-hexane. Saffi s-soluzzjoni, u żviluppa b’4 ml ta’ n-hexane/eter djetiliku 1/1 (V/V). Irkupra s-soluzzjoni f’tubu ta’ 10 ml, u evapora taħt kurrent ta’ nitroġenu sakemm tkun nixfet. Esponi l-fdal niexef għal-lipażi pankreatika (5.2.). Huwa fondamentali li tivverifika l-kompożizzjoni ta’ aċidi grassi qabel u wara li jiġi mgħoddi mill-iskartoċċ SPE).

5.2. Idroliżi bil-lipażi pankreatika

5.2.1. Fit-tubu għaċ-ċentrifuga, iżen 0,1 g taż-żejt imħejji skond il-punt 5.1. Żid 2 ml mis-soluzzjoni stabbilizzanti (4.6.), 0,5 ml mis-soluzzjoni ta’ sodju kolat (4.7), u 0,2 ml mis-soluzzjoni ta’ klorur tal-kalċju, filwaqt li tħawwad sewwa wara kull żieda. Agħlaq it-tubu b’tapp li jissiġilla mħejji għal dan il-għan u qiegħdu fit-termostat f’temperatura ta’.

5.2.2. Żid 20 mg lipażi, ħawwad bil-galbu (filwaqt li tevita li jixxarrab it-tapp), u qiegħed it-tubu fit-termostat għal eżatt 2 minuti, imbagħad aqilgħu, ħawdu sewwa għal eżatt minuta, u ħallih jiksaħ.

5.2.3. Żid 1 ml ta’ eter djetiliku, agħlaq bit-tapp u ħawwad sew, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga, u ittrasferixxi s-soluzzjoni ta’ eter ġo tubu nadif u niexef, bl-għajnuna ta’ mikrosiringa.

5.3. Tħejjija tad-derivattivi silanizzati u tal-kromatografija tal-gass

5.3.1. Bl-għajnuna ta’ mikrosiringa, daħħal 100 μl mis-soluzzjoni (5.2.3.) ġo tubu bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml.

5.3.2. Neħħi s-solvent taħt kurrent dgħajjef ta’ nitroġenu, żid 200 μl ta’ reaġent ta’ silanizzazzjoni (4.15.), agħlaq bit-tapp u ħalli joqgħod għal 20 minuta.

5.3.3. Wara 20 minuta, żid bejn 1 u 5 ml n-hexane (skond il-kundizzjonijiet kromatografiċi): is-soluzzjoni li tirriżulta hija lesta għall-kromatografija tal-gass.

5.4. Kromatografija tal-gass

Il-kundizzjonijiet ta’ tħaddim huma dawn li ġejjin:

— Temperatura ta’ l-injettur (on column) inqas mit-temperatura tat-tgħollija tas-solvent (68 °C);

— Temperatura tar-rivelatur: 350 °C;

— Temperatura tal-kolonna: programmar tat-temperatura tal-forn: 60 °C għal minuta, b’żieda ta’ 15 °C kull minuta sa 180 °C, imbagħad ta’ 5 °C kull minuta sa 340 °C, imbagħad 340 °C matul 13-il minuta;

— Gass portatur: idroġenu jew elju, aġġustat għall-veloċità lineari xierqa sabiex tinkiseb r-riżoluzzjoni riflessa fil-Figura 1. Il-ħin tar-retenzjoni tat-triglyceride C54 għandu jkun ta’ 40 + 5 minuti (ara l-Figura 2); (Il-kundizzjonijiet ta’ tħaddim indikati hawn fuq jingħataw bħala proposta indikattiva. Kull operatur ikollu jaddattahom kif xieraq biex jilħqu r-reżoluzzjoni mixtieqa. It-tul tal-quċċata li tikkorrispondi għat-2-glyceryl monopalmitate għandu jkun ugwali għal talanqas 10 % mill-iskala tar-reġistratur).

— L-ammont ta’ sostanza injettata: 0,5-1 μl mis-soluzzjoni (5 ml) ta’ n-hexane (5.3.3.).

5.4.1. Identifikazzjoni tal-qċaċet

Il-monoglycerides individwali jiġu identifikati skond il-ħinijiet ta’ retenzjoni miksuba, u b’relazzjoni ma’ dawk miksuba bit-taħlitiet standard ta’ monoglycerides analizzati fl-istess kundizzjonijiet.

5.4.2. Evalwazzjoni kwantitattiva

Is-superfiċje ta’ kull quċċata tiġi kkalkulata permezz ta’ integratur elettroniku.

6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

Il-perċentwal ta’ glyceryl monopalmitate jiġi kkalkulat abbażi tar-relazzjoni bejn is-superfiċje tal-quċċata u t-total tas-superfiċji tal-qċaċet tal-monoglycerides kollha (ara l-Figura 2), skond il-formula:

Glyceril monopalmitate (%):

Fejn:

Ax = is-superfiċje tal-quċċata li tikkorrispondi għall-glyceryl monopalmitate

ΣA = it-total tas-superfiċji tal-qċaċet kollha tal-monoglycerides

Ir-riżultat għandu jingħata b’ punt deċimali wieħed.

7. RAPPORT TA’ L-ANALIŻI

Ir-rapport ta’ l-analiżi għandu jispeċifika:

— ir-referenza għal dan il-metodu;

— it-tagħrif kollu meħtieġ għall-identifikazzjoni kompleta tal-kampjun;

— ir-riżultat ta’ l-analiżi;

— kull devjazzjoni minn dan il-metodu, sew minħabba deċiżjoni tal-partijiet ikkonċernati sew minħabba raġuni oħra;

— id-dettalji ta’ l-identifikazzjoni tal-laboratorju, id-data ta’ l-analiżi u l-firma tal-persuni responsabbli għaliha.

Figura 1

Kromatogramma tal-prodotti tar-reazzjoni tas-silanizzazzjoni miksubin bl-azzjoni tal-lipażi fuq żejt taż-żebbuġa raffinat miżjud b’20 % ta’ żejt esterifikat (100 %).

Nota: “aċidi grassi liberi” = xaħmijiet ta' l-aċtu; “Żejt taż-żebbuġa raffinat + 20 % taż-żejt estratt” = żejt taż-żebbuġa raffinat + 20 % żejt esterifat; “1-2 monopalmitolein” = 1-2 monopalmitolein; “1-2 mono C18 insat.” = mhux saturat 1-2 mono C18

Figura 2

Kromatogramma ta’:

A) Żejt taż-żebbuġa mhux esterifikat, wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. Tifsir: 1 = Aċidi grassi liberi 2 = Monoglycerides 3 = Diglycerides 4 = Triglycerides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

Kromatogramma ta’:

B) żejt esterifikat wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. Tifsir: 1 = Aċidi grassi liberi 2 = Monoglycerides 3 = Diglycerides 4 = Triglycerides * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

8. NOTI

TĦEJJIJA TAL-LIPAŻI

Lipażi b’attività sodisfaċenti huma disponibbli fis-suq. Wieħed jista’ jippreparahom ukoll fil-laboratorju, kif ġej:

Kessaħ 5 kg ta’ frixa friska tal-majjal sa 0 °C. Neħħi x-xaħam solidu u t-tessut konnettiv ta’ madwarha, u itħan ġo blender sakemm issir pasta likwida. Ħawwad din il-pasta għal bejn 4 u 6 sigħat ma’ 2,5 litru ta’ anhydrous acetone, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga. Oħroġ il-fdal tliet darbiet oħra bl-istess volum ta’ anhydrous acetone, imbagħad darbtejn b’taħlita acetone/eter djetiliku (1/1) (V/V), u darbtejn bl-eter djetiliku.

Nixxef il-fdal matul 48 siegħa fil-vakwu biex jinkiseb trab stabbli li jżomm għal żmien twil fil-friġġ u protett mill-umdità.

KONTROLLAR TA’ L-ATTIVITA’ LIPAŻIKA

Ħejji emulsjoni ta’ żejt taż-żebbuġa kif ġej:

Ġo mikser, ħawwad għal 10 minuti taħlita magħmula minn 165 ml soluzzjoni ta’ gomma arabika f’100 g/l, 15 g silġ mitħun u 20 ml żejt taż-żebbuġa newtralizzat minn qabel.

Imbagħad daħħal 10 ml minn din l-emulsjoni f’biker ta’ 50 ml, imbagħad 0,3 ml minn soluzzjoni ta’ sodju kolat f’0,2 g/ml u 20 ml ilma distillat.

Qiegħed il-biker ġo termostat regolat għal 37 °C; daħħal l-elettrodi tal-miter tal-pH u l-aġitatur bl-iskrun.

Bl-għajnuna ta’ buretta, qattar soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N sakemm jintlaħaq livell pH ta’ 8,3.

Żid kwantità ta’ sospensjoni ta’ trab tal-lipażi fl-ilma (0,1 g/ml ta’ lipażi). Malli l-miter tal-pH jindika livell pH ta’ 8.3, qabbad il-kronometru u żid is-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju billi tqattarha bir-ritmu meħtieġ biex il-livell pH jinżamm f’8.3. Innota kull minuta l-volum tas-soluzzjoni li jkun ġie kkunsmat.

Irreġistra din l-informazzjoni fi grafika x/y, bil-ħin fuq l-assi x, u l-millilitri ta’ soluzzjoni ta’ alkali 0,1 N ikkunsmati biex jinżamm livell kostanti tal-pH fuq l-assi y. B’hekk għandha tinkiseb grafika lineari.

L-attività tal-lipażi, imkejla f’unitajiet ta’ lipażi għal kull mg, tiġi kkalkolata bil-formula li ġejja:

Fejn:

A hija l-attività f’unitajiet ta’ lipażi/mg;

V hija l-għadd ta’ millilitri ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N kull minuta (ikkalkulat abbażi tal-grafika);

N hija n-normalità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju;

m hija l-massa tal-lipażi tat-test f’mg.

L-unità ta’ lipażi hija ddefinita bħala l-kwantità ta’ enżimi li jeħilsu 10 mikro-ekwivalenti ta’ aċidu kull minuta.

▼M20 —————

▼M28









ANNESS IX

INVESTIGAZZJONI SPETTROFOTOMETRIKA FL-ULTRAVJOLA

DAĦLA

Eżaminazzjoni spettrofotometrika fl-ultravjola tista' tipprovdi tagħrif dwar il-kwalità ta' xaħma, l-istat ta' konservazzjoni tagħha, u t-tibdiliet miġjuba fiha minn proċessi teknologiċi. L-assorbiment tal-meded tat-tul ta' mewġa speċifikat fil-metodu huwa dovut għall-preżenza ta' sistemi konjugati ta' diene u triene, b'riżultat ta' proċessi ta' ossidazzjoni u/jew prattiċi ta' rfinar. Dawn l-assorbimenti huma espressi bħala estinzjonijiet speċifiċi

(l-estinzjoni ta' soluzzjoni ta' 1 % w/v tax-xaħam fis-solvent speċifikat, f'ċellola ta' 10 mm), konvenzjonalment indikata b'K (imsejħa wkoll “koeffiċjent ta' estinzjoni”).

1. KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Dan l-Anness jiddeskrivi l-proċedura għat-twettiq ta' eżaminazzjoni spettrofotometrika ta' żejt taż-żebbuġa fl-ultravjola.

2. PRINĊIPJU TAL-METODU

Kampjun jiddewweb fis-solvent meħtieġ, u l-assorbiment tas-soluzzjoni tiġi mbagħad titkejjel fil-meded tat-tul ta' mewġa speċifikati b'referenza għal solvent pur.

L-estinzjonijiet speċifiċi fi 232 nm u 268 nm fl-isoottan jew 232 nm u 270 nm fiċ-ċikloeżan huma kkalkulati għal konċentrazzjoni ta' 1 % w/v f'ċellola ta' 10 mm.

3. TAGĦMIR

3.1. Spettrofotometru xieraq għall-kejl f'meded tat-tul ta' mewġa tal-ultravjola (minn 220 nm sa 360 nm), bil-kapaċità li jaqra unitajiet nanometriċi individwali. Huwa rakkomandat li ssir verifika regolari għall-preċiżjoni u r-riproduċibbiltà tal-assorbiment u tal-iskali tal-medda tat-tul ta' mewġa, kif ukoll għad-dawl mhux iċċentrat. 3.1.1. Skala tal-medda tat-tul ta' mewġa: Din tista' tiġi ċċekkjata bl-użu ta' materjal ta' referenza li jkun jikkonsisti minn filtru ottiku tal-ħġieġ li jkun fih l-ossidu tal-olmju jew soluzzjoni li jkun fiha l-ossidu tal-olmju (siġillat jew le) li għandu faxex distinti ta' assorbiment. Il-materjali ta' referenza huma ddisinjati għall-verifika u l-ikkalibrar tal-iskali tal-medda tat-tul tal-mewġa ta' spettrofotometri viżibbli u ultravjola li għandhom wisa' nominali tal-faxxa spettrali ta' 5 nm jew inqas. Il-kejl isir kontra vojt tal-arja fil-firxa tat-tul ta' mewġa ta' bejn 640 u 240 m, skont l-istruzzjonijiet inklużi mal-materjal ta' referenza. Issir korrezzjoni ta' bażi b'beam path vojta ma' kull alterazzjoni tal-medda tat-tul. Il-meded tat-tul ta' mewġa tal-istandard huma elenkati fiċ-ċertifikat tal-materjal ta' referenza. 3.1.2. Skala tal-assorbenza: Din tista' tiġi ċċekkjata bl-użu ta' materjali ta' referenza siġillati u disponibbli fis-suq, li jkunu jikkonsistu minn soluzjonijiet ta' dikromat tal-potassju fl-aċidu, f'ċerti kunċentrazzjonijiet u valuri ċċertifikati ta' assorbiment fil-λmax tiegħu (ta' 4 soluzzjonijiet ta' dikromat tal-potassju fl-aċidu perkloriku siġillati f'erba' kuvetti UV tal-kwarz sabiex jitkejlu l-linearità u r-referenza tal-preċiżjoni fotometrika fl-UV). Is-soluzzjonijiet ta' dikromat tal-potassju jitkejlu kontra vojt tal-aċidu użat, wara l-korrezzjoni tal-bażi, skont l-istruzzjonijiet inklużi mal-materjal ta' referenza. Il-valuri ta' assorbiment huma elenkati fiċ-ċertifikat tal-materjal ta' referenza. Possibbiltà oħra biex jiġi vverifikat ir-rispons tal-fotoċellula u l-fotomultiplikatur hija li wieħed jipproċedi kif ġej: iżen 0,2000 g ta' kromat tal-potassju pur għall-ispettrofotometrija u dewweb f'soluzzjoni ta' 0,05 N ta' soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju fi flask gradat ta' 1 000 ml, u żid sal-marka. Ħu eżattament 25 ml tas-soluzzjoni miksuba, ferra' fi flask gradat ta' 500 ml u ddilwa sal-marka billi tuża l-istess soluzzjoni ta' idrossidu tal-potassju. Kejjel l-estinzjoni tas-soluzzjoni hekk miksuba f'275 nm, billi tuża s-soluzzjoni ta' idrossidu tal-potassju bħala referenza. L-estinzjoni mkejla permezz ta' kuvetta ta' 1 cm għandha tkun ta' 0,200 ± 0,005.

3.2. Kuvetti tal-kwarz rettangolari, bl-għotjien, xierqa għal kejl fil-meded tat-tul ta' mewġa ultravjola (bejn 220 u 360 mm), li jkollhom traġitt ottimu ta' 10 mm. Meta mimlijin bl-ilma jew solvent ieħor xieraq, il-kuvetti m'għandhomx juru differenzi ta' aktar minn 0,01 unità ta' estinzjoni bejniethom.

3.3. Flasks volumetriċi ta' marka waħda, b'kapaċità ta' 25 ml, il-klassi A.

3.4. Miżien analitiku, li jista' jaqra sal-eqreb 0,0001 g.

4. REAĠENTI

Matul l-analiżi, sakemm mhux speċifikat mod ieħor, uża biss reaġenti ta' grad analitiku rikonoxxut, kif ukoll ilma distillat jew demineralizzat, ta' purità ekwivalenti.

Solvent: Iso-ottan (2,2,4 trimetilpentan) għal kejl fi 232 nm u 268 nm jew ċikloessan għal kejl fi 232 nm u 270 nm, b'assorbiment ta' inqas minn 0,12 fi 232 nm u inqas minn 0,05 fi 270 nm b'riferiment għall-ilma distillat, imkejjel f'ċellola ta' 10 mm.

5. PROĊEDURA

5.1. Il-kampjun imsemmi għandu jkun perfettament omoġenju u mingħajr impuritajiet sospiżi. Jekk mhuwiex, għandu jiġi ffiltrat bil-karta, f'temperatura ta' madwar 30 °C.

5.2. Iżen bi preċiżjoni madwar 0,25 g (sal-eqreb 1 mg) tal-kampjun hekk imħejji fi flask gradat ta' 25 ml, żid sal-marka bis-solvent speċifikat u omoġenizza. Is-soluzzjoni miksuba għandha tkun perfettament ċara. Jekk ikun hemm opalexxenza jew torbidezza, iffiltra malajr bil-karta. NOTA: Ġeneralment, massa ta' 0,25-0,30 g tkun biżżejjed għall-kejl tal-assorbiment taż-żjut taż-żebbuġa verġni u straverġni f'268 nm u f'270 nm. Għall-kejl f'232 nm, is-soltu jkun jeħtieġ kampjun ta' 0,05 g, għalhekk is-soltu jitħejjew żewġ soluzzjonijiet distinti. Għall-kejl tal-assorbiment taż-żjut mir-residwi taż-żebbuġ, taż-żjut taż-żebbuġa raffinati, u taż-żjut taż-żebbuġa adulterati, is-soltu jkun jeħtieġ porzjon iżgħar tal-kampjun, eż. 0,1 g, minħabba l-assorbiment aħjar tagħhom.

5.3. Jekk meħtieġ, ikkoreġi l-linja bażi (220-290 nm) bis-solvent fiż-żewġ ċelloli tal-kwarz (il-kampjun u r-referenza), imbagħad imla ċ-ċellola tal-kwarz kampjun bis-soluzzjoni tat-test u kejjel l-estinzjonijiet f'232, 268 u 270 nm kontra s-solvent użat bħala referenza. Il-valuri tal-estinzjoni li jiġu rreġistrati għandhom jaqgħu fil-medda ta' bejn 0,1 u 0,8, jew fil-firxa tal-linearità tal-ispettrofotometru li għandha tiġi vverifikata. Jekk le, għandu jerġa' jsir il-kejl billi jintużaw soluzzjonijiet aktar konċentrati jew aktar dilwiti, kif ikun xieraq.

5.4. Wara l-kejl tal-assorbiment f'268 jew 270 nm, kejjel l-assorbiment fi λmax, λmax + 4 u λmax – 4. Dawn il-valuri ta' assorbiment jintużaw biex tiġi ddeterminata l-varjazzjoni fl-estinzjoni speċifika (ΔΚ). NOTA: λmax huwa meqjus ta' 268 nm għall-isoottan użat bħala solvent, u ta' 270 nm għas-cikloeżan.

6. ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1. Irreġistra l-estinzjonijiet speċifiċi (koeffiċjenti ta' estinzjoni) fuq it-tuliet tal-mewġa differenti ikkalkolati kif ġej: fejn: Kλ = estinzjoni speċifika fuq it-tul tal-mewġa λ; Eλ = estinzjoni mkejla fuq it-tul tal-mewġa λ; c = konċentrazzjoni tas-soluzzjoni fi g/100 ml; s = tul tat-traġitt taċ-ċellola tal-kwarz f'cm; espressi sa żewġ ċifri deċimali.

6.2. Varjazzjoni tal-estinzjoni speċifika (ΔΚ) Il-varjazzjoni tal-valur assolut tal-estinzjoni (ΔΚ) tinħadem hekk: fejn Km hija l-estinzjoni speċifika fil-medda tat-tul ta' mewġa għall-assorbiment massimu fi 270 mm u 268 mm, skont is-solvent użat. Ir-riżultati għandhom jiġu espressi sa żewġ ċifri deċimali.









ANNESS X

DETERMINAZZJONI TAL-ESTERI METILIĊI TAL-AĊIDI XAĦMIN PERMEZZ TAL-KROMOTOGRAFIJA B'FAŻI GASSUŻA

1. KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Dan l-Anness jagħti gwida dwar id-determinazzjoni tal-kromotografija b'fażi gassuża tal-aċidi xaħmin ħielsa u marbuta fix-xaħmijiet u ż-żjut veġetali, wara l-konverżjoni tagħhom f'esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin (FAME).

L-aċidi xaħmin marbuta tat-triaċilgliċeroli (TAGs) u, skont il-metodu ta' esterifikazzjoni, l-aċidi xaħmin ħielsa (FFA), jiġu kkonvertiti f'esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin (FAME), li jiġu ddeterimati permezz tal-kromotografija kapillari b'fażi gassuża.

Il-metodu deskritt f'dan l-Anness jippermetti d-determinazzjoni tal-FAME minn C12 sa C24, inklużi l-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin li jkunu saturati, ċismonoinsaturati u transmonoinsaturati, u ċispoliinsaturati u transpoliinsaturati.

2. PRINĊIPJU

Il-kromotografija b'fażi gassuża (GC) tintuża għall-analiżi kwantitattiva tal-FAME. Il-FAME jitħejjew skont il-Parti A. Imbagħad jiġu injettati u vaporizzati fl-injettur. Is-separazzjoni tal-FAME ssir fuq kolonni analitiċi ta' polarità u ta' tul speċifiċi. Jintuża Individwatur tal-Jonizzazzjoni bi Fjamma (FID) għad-detezzjoni tal-FAME. Il-kundizzjonijiet tal-analiżi jingħataw fil-Parti B.

L-idroġenu jew l-elju jistgħu jintużaw bħala l-gass trasportatur (il-fażi mobbli) fil-kromotografija b'fażi gassuża tal-FAME bil-FID. L-idroġenu jħaffef is-separazzjoni u jwassal għal qċaċet iktar akuti. Il-fażi stazzjonarja hija saff mikroskopiku ta' rita likwida rqiqa fuq wiċċ sod inerti magħmul mis-silika mdewba.

Hekk kif jgħaddu mill-kolonna kapillarja, il-komposti volatilizzati li qed jiġu analizzati jinteraġixxu mal-fażi stazzjonarja, u b'hekk jiksu l-wiċċ ta' ġewwa tal-kolonna. Minħabba din l-interazzjoni differenti ta' komposti differenti, jelwixxu f'ħin