1998L0057 — MT — 30.07.2006 — 001.001

Dan id-dokument ġie magħmul bil-ħsieb li jintuża bħala għodda ta’ dokumentazzjoni u l-istituzzjonijiet ma jassumu l-ebda responsabbiltà għall-kontenut tiegħu

Emendat bi:









▼B

ID-DIRETTIVA TAL-KUNSILL 98/57/KE

ta’ l-20 ta’ Lulju 1998

dwar il-kontroll tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.







IL-KUNSILL TA’ L-UNJONI EWROPEA, Wara li kkunsidra t-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, u partikolarment l-Artikolu 43 tiegħu, Wara li kkunsidra l-proposta mill-Kummissjoni ( 1 ), Wara li kkunsidra l-Opinjoni tal-Parlament Ewropew 4 ( 2 ), Wara li kkunsidra l-Opinjoni tal-Kumitat Ekonomiku u Soċjali ( 3 ), Billi l-organiżmu li jagħmel ħsara magħruf bħala Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kien magħruf qabel bħala Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; billi r-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. x’aktarx isir l-isem li jkun ġeneralment aċċettat għal dan l-organiżmu; billi d-Direttiva preżenti għandha tikkunsidra dan l-iżvilupp xjentifiku; Billi l-produzzjoni tal-patata u tat-tadam tokkupa post importanti fl-agrikoltura tal-Komunità; billi l-produzzjoni tal-patata u tat-tadam hija b’mod kostanti mhedda minn organiżmi li jagħmlu l-ħsara; Billi, permezz tal-protezzjoni tal-kultivazzjoni tal-patata u tat-tadam kontra dawn l-organiżmi li jagħmlu ħsara, mhux biss il-kapaċità produttiva għandha tinżamm iżda wkoll il-produttività agrikola għandha wkoll tiżdied; Billi l-miżuri protettivi biex jipprevjienu l-introduzzjoni ta’ l-organiżmi li jagħmlu ħsara fit-territorju ta’ Stat Membru probabbilment ikollhom biss effett limitat li kieku dawn l-organiżmi ma jkunux ikkontrollati simultanjament u metodikament fil-Komunità kollha u ma kellhomx jitħallew milli jixxerdu; Billi wieħed mill-organiżmi li jagħmlu ħsara lill-patata u lit-tadam huwa dak tar-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., l-aġent patoġeniku tal-marda tat-taħsir kannella fil-patata u ta’ nxif batterjoloġiku fil-patata u fit-tadam; billi l-epidemiji tal-mard ikkawżati minn dan il-patoġenu seħħew f’ċerti partijiet tal-Komunità u xi ftit sorsi limitati ta’ l-infezzjoni għadhom jeżistu; Billi hemm riskju konsiderevoli għall-kultivazzjoni tal-patata u tat-tadam fil-Komunità kollha jekk ma jittieħdux il-miżuri effettivi, fejn huma kkonċernati dawn il-ħxejjex, biex ikun lokalizzat dan l-organiżmu u tiġi stabbilita d-distribuzzjoni tiegħu, biex ma jħalluhx milli jibqa’ jeżisti u jinxtered, u, jekk jinstab, biex ma jħallux il-firxa tiegħu tkompli u jkun ikkontrollat bl-għan li dan jiġi meqrud; Billi, biex ikun assigurat dan, għandhom jittieħdu ċerti miżuri fi ħdan il-Komunità; billi l-Istati Membri għandhom, barra minnhekk, jieħdu miżuri addizzjonali jew aktar stretti fejn ikun meħtieġ, sakemm ma jkunx hemm ostaklu għall-moviment tal-patata u tat-tadam fil-Komunità, ħlief għal kif inhu stabbilit s’issa fid-Direttiva tal-Kunsill 77/93/KEE tal-21 ta’ Diċembru 1976 dwar il-miżuri protettivi kontra l-introduzzjoni fil-Komunità ta’ l-organiżmi li jagħmlu ħsara lill-pjanti jew lill-prodotti tal-pjanti u kontra l-firxa ta’ dawn fil-Komunità ( 4 ); billi miżuri bħal dawn għandhom ikunu nnotifikati lill-Istati Membri l-oħrajn u lill-Kummissjoni; Billi l-miżuri għandhom jikkunsidraw li stħarriġ uffiċjali sistematiku huwa meħtieġ biex jillokalizza l-patoġenu; billi dan l-istħarriġ għandu jinkludi proċeduri ta’ spezzjoni u, meta jkun xieraq, jekk taħt ċerti ċirkustanzi ambjentali l-marda tista’ tibqa’ moħbija u mhux osservata kemm fil-pjanta tal-patata ta’ meta qed tikber u kemm f’tuberi tal-patata maħżuna, għandu jinkludi proċeduri ta’ teħid ta’ kampjuni u ttestjar; billi l-firxa tal-patoġenu fil-pjanta li qed tikber mhuwiex l-iktar fattur importanti, iżda billi l-patoġenu jista’ jinfirex bl-ilma tal-wiċċ u b’ċerti pjanti solanini selvaġġi assoċjati, u għalhekk l-irrigazzjoni tal-pjanti tal-patata u tat-tadam bl-użu ta’ l-ilma kkontaminat jidher li joħloq riskju għall-infezzjoni ta’ dawn il-ħxejjex; billi wkoll il-patoġenu jista’ jeżisti fix-xitwa fi pjanti tal-patata u tat-tadam li jinżergħu weħidhom (voluntiera) u dawn jistgħu jkunu sors ta’ infezzjoni billi dawn jinġarru minn staġun għall-ieħor; billi l-patoġenu jinxtered ukoll bil-kontaminazzjoni tal-patata permezz ta’ kuntatt ma’ patata infettata u permezz ta’ kuntatt mat-tagħmir tal-kultivazzjoni, tal-ħsad u t-tħaddim jew inkella kontenituri tat-trasport u tal-ħażna li jkunu kkontaminaw ruħhom ma’ l-organiżmu permezz ta’ kuntatt minn qabel mal-patata infettata; Billi l-firxa tal-patoġenu tista’ titnaqqas jew ma titħalliex permezz tad-dekontaminazzjoni ta’ l-oġġetti bħal dawn; billi kwalunkwe kontaminazzjoni tal-patata taż-żriegħ tpoġġi riskju ikbar għall-firxa tal-patoġenu; b’mod simili l-infezzjoni moħbija taż-żriegħ tal-patata tpoġġi riskju akbar għall-firxa tal-patoġenu u dan jista’ ma jitħalliex bl-użu tal-patata taż-żriegħ prodotta fi programm approvat uffiċjalment meta l-patata taż-żriegħ tkun ġiet ittestjata u nstabet li hija ħielsa mill-infezzjoni; Billi l-għarfien preżenti tal-bioloġija u l-epidemoloġija tal-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. taħt kondizzjonijiet Ewropej mhuwiex komplut u huwa antiċipat li sejjer ikun meħtieġ li l-miżuri proposti jkunu riveduti f’diversi staġuni; b’mod simili it-titjib għall-proċeduri tat-test huma antiċipati fid-dawl ta’ aktar riċerka speċjalment dwar is-sensittività u l-ispeċifiċità tal-metodi tat-test biex jintgħażlu u jkunu standardizzati l-aħjar metodi tat-testijiet disponibbli; Billi, għad-determinazzjoni tad-dettalji ta’ dawn il-miżuri ġenerali, kif ukoll għal dawk il-miżuri addizzjonali jew aktar stretti meħuda mill-Istati Membri biex ma titħalliex l-introduzzjoni tal-patoġenu fil-konfini tagħhom, huwa meħtieġ għall-Istati Membri li jikkooperaw mill-qrib mal-Kummissjoni fi ħdan il-Kumitat Permanenti dwar is-Saħħa tal-Pjanti (minn issa ’il quddiem imsejjaħ ‘il-Kumitat’), ADOTTA DIN ID-DIRETTIVA:







Artikolu 1

Din id-Direttiva tikkonċerna l-miżuri li għandhom jittieħdu fl-Istati Membri kontra r-Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., magħrufa qabel bħala l-Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (minn issa ’il quddiem imsejħa ‘l-organiżmu’), biex, fejn huma kkonċernati l-pjanti ospitanti ta’ l-organiżmu elenkat fl-Anness I tas-Sezzjoni 1, (minn issa ’il quddiem imsejjaħ ‘il-materjal tal-pjanta elenkat fil-lista’):

(a) jillokalizzawh u jistabbilixxu d-distribuzzjoni tiegħu;

(b) jipprevjienu għall-iskoppjar u l-firxa tiegħu; u

(ċ) jekk jinstab, ma titħalliex il-firxa tiegħu u biex ikun ikkontrollat bl-għan li dan jinqered.

Artikolu 2

1. Ta’ kull sena l-Istati Membri għandhom iwettqu stħarriġ uffiċjali sistematiku għall-organiżmu fuq il-materjal tal-pjanti elenkat fil-lista li joriġina fil-konfini tagħhom. Biex ikunu identifikati sorsi possibbli oħra ta’ kontaminazzjoni li jheddu l-produzzjoni tal-pjanti li jidhru fil-lista, l-Istati Membri għandhom jagħmlu estimi tar-riskju u, sakemm ma jkun ġie identifikat l-ebda riskju ta’ firxa tal-organiżmu matul dawk l-estimi, dawn għandhom, fiż-żoni tal-produzzjoni tal-pjanti msemmija, imexxu stħarriġ uffiċjali mmirat apposta għall-organiżmu fuq pjanti oħrajn għajr dawk il-pjanti elenkati fil-lista, inkluż il-pjanti ospitanti solanini selvaġġi, kif ukoll fuq l-ilma tal-wiċċ li jintuża għall-irrigazzjoni jew għall-bexx tal-pjanti msemmija u fuq skart likwidu li joħroġ mill-bini ta’ l-ipproċessar jew ta’ l-ippakkjar industrijali li jittratta dawn il-pjanti u użat għall-irrigazzjoni jew għall-bexx tal-pjanti msemmija. Il-limitu ta’ dan l-istħarriġ għandu jiġi stabbilit skond ir-riskju li jkun ġie identifikat. L-Istati Membri jistgħu jmexxu wkoll stħarriġ uffiċjali għall-organiżmu fuq il-materjal, bħal ma huma l-medja tat-tkabbir, il-ħamrija u l-iskart solidu li joħroġ mill-bini ta’ l-ipproċessar u l-ippakkjar industrijali.

2. L-istħarriġ uffiċjali li hemm provvediment dwaru fil-paragrafu 1 għandu jitwettaq:

(a) għall-materjal tal-pjanti elenkati, skond id-dettalji stabbiliti fil-punt 1 tas-Sezzjoni II, ta’ l-Anness I; u,

(b) għall-pjanti ospitanti għajr dawk li hemm fil-lista, u għall-ilma inkluż l-iskart likwidu, b’konformità mal-metodi adatti u, meta jkun xieraq, għandhom jittieħdu kampjuni li jkunu suġġetti għal testijiet uffiċjali, jew li jkunu sorveljati uffiċjalment, fil-laboratorju;

(ċ) meta jkun xieraq għal materjal ieħor, b’konformità mal-metodi adatti.

Għal dan l-istħarriġ, dettalji oħra tal-proċeduri ta’ l-ispezzjoni u n-numru, l-oriġini, l-istratifikazzjoni u t-teħid tal-ħin għall-ġbir tal-kampjuni għandhom ikunu deċiżi mill-korpi uffiċjali responsabbli fi ħdan it-tifsira tad-Direttiva 77/93/KEE ibbażata fuq prinċipji xjentifiċi u statistiċi b’saħħithom u l-bioloġija ta’ l-organiżmu u li jikkunsidraw fl-Istat Membru kkonċernat, is-sistemi tal-produzzjoni partikolari tal-materjal tal-pjanti elenkati fil-lista u, kif inhu xieraq, ta’ pjanti ospitanti oħra ta’ l-organiżmu.

3. Id-dettalji u r-riżultati ta’ l-istħarriġ uffiċjali li hemm provvediment dwaru fil-paragrafu 1 għandhom ikunu nnotifikati kull sena lill-Istati Membri l-oħra u lill-Kummissjoni b’konformità mad-disposizzjonijiet tal-punt 2 tas-Sezzjoni II, ta’ l-Anness I. Dawn in-notifiki għandhom jingħataw sal-1 ta’ Ġunju ħlief għall-patata użata bħala zerriegħa mfaddla-tar-razzett li għaliha n-notifika għandha tingħata sal-1 ta’ Settembru. Id-dettalji u r-riżultati għall-uċuh tar-raba’ għandhom ikunu mqabbla mal-produzzjoni tas-sena ta’ qabel. Id-dettalji ta’ dawn in-notifki jistgħu jingħataw lill-Kumitat.

4. Id-disposizzjonijiet li ġejjin għandhom ikunu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE:

— il-metodi adatti għall-istħarriġ u t-testijiet li jsiru fil-laboratorju li hemm provvediment dwarhom fil-paragrafu 2, l-ewwel subparagrafu, (b).

5. Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jiġu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE:

— il-metodi adatti għall-istħarriġ li hemm provvediment dwarhom fil-paragrafu 2, l-ewwel subparagrafu, (c),

— id-dettalji l-oħrajn ta’ l-istħarriġ li hemm provvediment dwarhom fil-paragrafu 2, it-tieni subparagrafu, bil-ħsieb li jkunu assigurati livelli kumparabbli ta’ l-assigurazzjoni bejn l-Istati Membri.

Artikolu 3

L-Istati Membri għandhom jassiguraw li l-preżenza suspettata jew il-konferma ta’ l-organiżmu fit-territorju tagħhom għandha tiġi rrappurtata lill-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom.

Artikolu 4

1. F’kull każ ta’ preżenza suspettata, il-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat(i) Membru(i) kkonċernat(i) għandhom jassiguraw it-tkomplija tat-testijiet uffiċjali, jew sorveljati b’mod uffiċjali, li jsiru fil-laboratorju billi jintuża, għall-materjal tal-pjanti li jidhru fil-lista, il-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II u b’konformità mal-kondizzjonijiet speċifikati fil-punt 1 ta’ l-Anness III, jew, fil-każi l-oħrajn kollha, kwalunkwe metodu ieħor approvat uffiċjalment, biex jikkonferma jew jirrifjuta l-preżenza suspettata. Fil-każ ta’ konferma, il-kriterji stabbiliti fil-punt 2 ta’ l-Anness III għandhom ikunu applikabbli.

2. Sakemm iddum biex tkun ikkonfermata jew miċħuda l-preżenza suspettata permezz tal-paragrafu 1, f’kull każ ta’ preżenza suspettata meta, jew:

(i) sintomi dijagnostiċi tal-marda kkawżati mill-organiżmu jkunu dehru u għalhekk jinkiseb riżultat pożittiv mit-test(ijiet) ta’ l-istħarriġ rapidu, kif speċifikat fl-Anness II, is-sezzjoni I, il-punt 1 u s-sezzjoni II; jew,

(ii) riżultat pożittiv fit-test(ijiet) ta’ l-istħarriġ kif speċifikat fl-Anness II, is-sezzjoni I, il-punt 2 u s-sezzjoni III ikun miksub, il-korpi uffiċjali reponsabbli ta’ l-Istati Membri għandhom, b’relazzjoni mal-produzzjoni tagħhom stess: (a) jipprojbixxu l-moviment tal-pjanti u t-tuberi mill-uċuh kollha tar-raba’, mil-lottijiet jew mill-konsenji li minnhom ikunu ttieħdu l-kampjuni, ħlief jekk dawn ikunu taħt il-kontroll tagħhom u sakemm ikun ġie stabbilit li ma jkun hemm l-ebda riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu; (b) jieħdu l-miżuri meħtieġa biex jidentifikaw l-oriġini tal-preżenza suspettata; (ċ) jintroduċu miżuri adatti ta’ prekawzjoni addizzjonali bbażati fuq il-livell ikkalkolat tar-riskju, partikolarment b’relazzjoni mal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti elenkati u l-moviment tal-lottijiet tal-patata taż-żriegħ għajr dawk riferiti fil-punt (a), prodotti fuq il-post tal-produzzjoni li minnu l-kampjun riferit fil-punt (a) ikun ittieħed, biex jipprevjienu kwalunkwe firxa ta’ l-organiżmu.

3. F’dawk il-każi ta’ preżenza suspettata fejn ikun hemm riskju ta’ kontaminazzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija jew ta’ l-ilma tal-wiċċ minn jew ġewwa Stat(i) Membru(i) ieħor(oħrajn), l-Istat Membru li fih il-preżenza suspettata tkun ġiet irrappurtata għandu javża minnufih, skond ir-riskju identifikat, id-dettalji tal-preżenza suspettata msemmija lill-Istat(i) Membru(i) l-ieħor(l-oħra) ikkonċernat(i), u għandu jkun hemm ko-operazzjoni xierqa bejn l-Istati Membri msemmija. L-Istat(i) Membru(i) hekk kif ikunu avżati, għandhom jintroduċu mużuri ta’ prekawzjoni b’konformità mal-paragrafu 2(c) u jieħdu kwalunkwe azzjonijiet oħra, skond kif ikun xieraq, b’konformità mal-paragrafi 1 u 2.

4. Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jkunu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE:

— il-miżuri riferiti fil-paragrafu 2(c).

Artikolu 5

1. Jekk test uffiċjali jew sorveljat b’mod uffiċjali li jsir f’laboratorju, li juża, għall-materjal tal-pjanti msemmija, il-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II jew, jew fil-każi l-oħrajn kollha, kwalunkwe metodu ieħor approvat uffiċjalment, jikkonferma l-preżenza ta’ l-organiżmu f’kampjun meħud skond din id-Direttiva, il-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat Membru, wara li jkunu kkunsidraw prinċipji xjentifiċi tajba, il-bioloġija ta’ l-organiżmu u l-produzzjoni partikolari, il-marketing, u s-sistemi ta’ l-ipproċessar tal-pjanti ospitanti ta’ l-organiżmu f’dak l-Istat Membru, għandhom:

(a) għall-materjal tal-pjanti msemmija; (i) jistabbilixxu investigazzjoni biex ikun stabbilit il-limitu u s-sors(i) primarju(i) tal-kontaminazzjoni b’konformità mad-disposizzjonijiet ta’ l-Anness IV, permezz ta’ testijiet oħra b’konformità ma’ l-Artikolu 4(1), fuq, minn ta’ l-inqas, il-lottijiet kollha tal-patata taż-żriegħ klonalment relatata, u, (ii) jiddikjaraw bħala kontaminati l-materjal tal-pjanti msemmija, il-konsenji u/jew il-lottijiet li minnhom il-kampjun ikun ittieħed, u l-makkinarju, il-vetturi, ir-reċipjenti, l-imħażen, jew l-unitajiet ta’ dawn, u kwalunkwe oġġetti oħra inkluż il-materjal ta’ l-ippakkjar li jkun ġie f’kuntatt mal-materjal tal-pjanti msemmija li minnhom ikun ittieħed il-kampjun; jiddikjaraw ukoll bħala kontaminati, meta ikun xieraq, l-għalqa (jew l-għelieqi), l-unitajiet tal-produzzjoni protetta ta’ l-uċuħ tar-raba’ u l-postijiet tal-produzzjoni li minnhom il-materjal tal-pjanti msemmija kien miġbur u li minnhom kien ittieħed il-kampjun; u għal dawk il-kampjuni li jkunu ttieħdu waqt l-istaġun tat-tkabbir, jiddikjaraw bħala kontaminati l-għelieqi, il-postijiet tal-produzzjoni, u, meta jkun xieraq, l-unitajiet tal-produzzjoni protetta ta’ l-uċuħ tar-raba’ li minnhom ikun ittieħed il-kampjun, u, (iii) jistabbilixxu, b’konformità mad-disposizzjonijiet tal-punt 1 ta’ l-Anness V, il-limitu tal-kontaminazzjoni probabbli permezz tal-kuntatt ta’ qabel jew ta’ wara l-ħsad, permezz ta’ rabtiet mal-produzzjoni, l-irrigazzjoni jew il-bexx, jew permezz tar-relazzjonijiet klonali mal-kontaminazzjoni iddikjarata, u, (iv) jiddemarkaw żona fuq il-bażi tad-dikjarazzjoni tal-kontaminazzjoni permezz tal-punt (ii), id-determinazzjoni tal-limitu tal-kontaminazzjoni probabbli taħt il-punt (iii), u l-firxa possibbli ta’ l-organiżmu, b’konformità mad-disposizzjonijiet tal-punt 2(i) ta’ l-Anness V;

(b) għal uċuħ tar-raba’ tal-pjanti ospitanti għajr dawk imsemmija fil-punt (a) meta l-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija tkun identifikata li tinsab f’riskju, (i) li jistabbilixxu investigazzjoni b’konformità mal-punt (a)(i); u (ii) jiddikjaraw bħala kontaminati l-pjanti ospitanti ta’ l-organiżmu li minnhom il-kampjun ikun ittieħed; u (iii) jistabbilixxu l-kontaminazzjoni probabbli u jiddemarkaw żona b’konformità mal-punti (a)(iii); u (iv), ripsettivament, f’relazzjoni mal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija;

(ċ) għall-ilma tal-wiċċ (inkużi l-emissjonijiet ta’ l-iskart likwidu mill-bini industrijali ta’ l-ipproċessar jew l-ippakkjar li jittratta l-materjal tal-pjanti msemmija) u pjanti ospitanti solanini selvaġġi assoċjati, fejn il-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti msemmija tkun identifikata li hija f’riskju permezz ta’ l-irrigazzjoni, il-bexx, jew it-tifqigħ ta’ l-ilma tal-wiċċ, (i) jistabbilixxu investigazzjoni li tkun tinkludi stħarriġ uffiċjali fi żminijiet addattati fuq kampjuni ta’ l-ilma tal-wiċċ u, jekk ikunu preżenti pjanti ospitanti solanini selvaġġi, biex jistabbilixxu l-limitu tal-kontaminazzjoni; u (ii) jiddikjaraw bħala kontaminat l-ilma tal-wiċċ li minnu l-kampjun(i) kien ittieħed, sal-limitu li hu xieraq u fuq il-bażi tal-investigazzjoni permezz tal-punt (i); u (iii) jistabbilixxu l-kontaminazzjoni probabbli u jiddemarkaw żona fuq il-bażi tad-dikjarazzjoni tal-kontaminazzjoni taħt il-punt (ii), u l-firxa possibbli ta’ l-organiżmu waqt li jikkunsidraw id-disposizzjonijiet tal-punti 1 u 2(ii) ta’ l-Anness V.

2. L-Istati Membri għandhom jinnotifikaw minnufih lill-Istati Membri l-oħra u lill-Kummissjoni, b’konformità mad-disposizzjonijiet tal-punt 3 tal-Anness V, dwar kwalunkwe kontaminazzjoni ddikjarata taħt il-paragrafi 1(a)(ii) u 1(ċ)(ii) u d-dettalji tad-demarkazzjoni taż-żona taħt il-pargrafu 1(a)(iv) u, meta jkun applikabbli, taħt il-paragrafu 1(c)(iii). Id-dettalji tan-notifika taħt dan il-paragrafu tista’ tkun ippreżentata lill-Kumitat.

L-Istati Membri għandhom fl-istess ħin jissottomettu lill-Kummissjoni n-notifika addizzjonali stabbilita fil-punt 4 ta’ l-Anness V. Id-dettalji tan-notifika taħt dan is-subparagrafu għandhom ikunu sottomessi minnufih lill-membri tal-Kumitat.

3. Bħala riżultat tan-notifika taħt il-paragrafu 2 u l-elementi msemmija fiha, l-Istati Membri l-oħrajn iddettaljati fin-notifika għandhom jistabbilixxu investigazzjoni b’konformità mal-paragrafu 1(a)(i) u, meta jkun applikabbli, il-paragrafu 1(ċ)(i) u jieħdu aktar azzjoni, kif ikun xieraq, b’konformità mal-paragrafi 1 u 2.

Artikolu 6

1. L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li l-materjal tal-pjanti msemmija u ddikjarati bħala kontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii) ma jistax ikun miżrugħ u li, taħt il-kontroll u l-approvazzjoni tal-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom, dan għandu jkun suġġett għal waħda mid-disposizzjonijiet tal-punt 1 ta’ l-Anness VI, b’tali mod li jkun stabbilit li ma jkunx hemm riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu.

2. L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li l-materjal tal-pjanti msemmija u stabbiliti bħala probabbilment ikkontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a) (iii) u (ċ)(iii) inkluż il-materjal tal-pjanti msemmija li għalihom ġie identifikat riskju, prodotti f’postijiet ta’ produzzjoni u stabbiliti bħala probabbilment ikkontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iii), ma jkunx jista’ jiġi miżrugħ u għandu, taħt il-kontroll tal-korpi uffiċjali responsabbli tagħhom, jitpoġġa għall-użu xieraq jew disponibbiltà kif speċifikat fil-punt 2 ta’ l-Anness VI, b’tali mod li jkun stabbilit li m’hemmx riskju identifikabbli tal-firxa ta’ l-organiżmu.

3. L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li kwalunkwe makkinarju, vettura, reċipjent, maħżen, jew unitajiet ta’ dawn, u kwalunkwe oġġetti oħra li jinkludu l-materjal ta’ l-ippakkjar, iddikjarati bħala ikkontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii) jew stabbiliti bħala probabbilment ikkontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iii) u (ċ)(iii), għandu jew jinqered jew ikun iddekontaminat billi jintużaw metodi adatti kif speċifikat fil-punt 3 ta’ l-Anness VI. Wara d-dekontaminazzjoni, kwalunkwe oġġetti bħal dawn m’għandhomx jitqiesu aktar bħala kkontaminati.

4. Mingħajr preġudizzju għall-miżuri implimentati taħt il-paragrafi 1, 2 u 3, l-Istati Membri għandhom jippreskrivu li, fiż-żona ddemarkata taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv) u (ċ)(iii), serje ta’ miżuri, kif speċifikat fil-punti 4.1 u 4.2 ta’ l-Anness VI, għandhom ikunu implimentati. Dettalji ta’ dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati ta’ kull sena lill-Istati Membri l-oħrajn u lill-Kummissjoni. Id-dettalji ta’ din in-notifika jistgħu jiġu ppreżentati lill-Kumitat.

Artikolu 7

1. L-Istati Membri għandhom jippreskrivu li l-patata taż-żriegħ għandha tilħaq il-kriterji tad-Direttiva 77/93/KEE u għandhom jiksbu f’linja diretta mill-patata l-materjal miksub taħt programm approvat uffiċjalment li jkun instab ħieles mill-organiżmu f’testijiet uffiċjali jew sorveljati b’mod uffiċjali billi jintuża l-metodu relevanti stabbilit fl-Anness II.

It-testijiet msemmija hawn fuq għandhom isiru minn Stat Membru:

(a) f’każi fejn ikun ġie kkonfermat li hemm preżenza ta’ l-organiżmu fil-produzzjoni tagħhom tal-patata taż-żriegħ, (i) billi jittestjaw il-propagazzjonijiet ta’ qabel, inklużi l-għażla klonali tal-bidu u l-ittestjar sistematiku ta’ kloni ta’ żerriegħa bażika tal-patata; jew (ii) fil-każi fejn ikun ġie stabbilit li m’hemm l-ebda relazzjoni klonali, bl-ittestjar tal-kloni kollha taż-żriegħ bażika tal-patata jew tal-propagazzjonijiet ta’ qabel, inkluża l-għażla klonali tal-bidu, u

(b) fil-każi l-oħra, jew fuq kull pjanta ta’ l-għażla klonali inizjali jew fuq il-kampjun rappreżentattiv taż-żriegħ bażika tal-patata jew tal-propagazzjonijiet ta’ qabel.

2. Id-disposizzjonijiet li ġejjin jistgħu jkunu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE:

— ir-regoli dettaljati ta’ l-applikazzjoni tal-paragrafu 1, it-tieni subparagrafu, il-punt (a),

— ir-regoli li jikkonċernaw il-kampjun rappreżentattiv li hemm provvediment dwaru fil-paragrafu 1, it-tieni subparagrafu, il-punt (b).

Artikolu 8

L-Istati Membri għandhom jipprojbixxu ż-żamma u l-immaniġġjar ta’ l-organiżmu.

Artikolu 9

Mingħajr preġudizzju għad-disposizzjonijiet tad-Direttiva 77/93/KEE, l-Istati Membri jistgħu jawtorizzaw derogi mill-miżuri msemmija fl-Artikoli 6 u 8 ta’ din id-Direttiva b’konformità mad-disposizzjonijiet stabbiliti fid-Direttiva 95/44/KE ( 5 ) għal għanijiet ta’ prova jew xjentifiċi, u għal xogħol fuq selezzjonijiet varjetali.

Artikolu 10

L-Istati Membri jistgħu jadottaw f’relazzjoni mal-produzzjoni tagħhom stess miżuri addizzjonali jew aktar stretti, skond kif ikun meħtieġ, biex ikun miġġieled dan l-organiżmu jew biex ma jħalluhx jinfirex, sakemm dawn ikunu b’konformità mad-disposizzjonijiet tad-Direttiva 77/93/KEE.

Id-dettalji ta’ dawn il-miżuri għandhom ikunu nnotifikati lill-Istati Membri l-oħrajn u lill-Kummissjoni. Id-dettalji ta’ din in-notifika jistgħu jingħataw lill-Kumitat.

Artikolu 11

Emenedi għall-Annessi għal din id-Direttiva, li għandhom isiru fid-dawl ta’ l-iżvilupp ta’ l-għarfien xjentifiku u tekniku, għandhom ikunu adottati b’konformità mal-proċedura stabbilita fl-Artikolu 16a tad-Direttiva 77/93/KEE. Fil-każ tal-metodi stabbiliti fl-Anness II u l-miżuri fil-paragrafi 4.1 u 4.2 ta’ l-Anness VI għal din id-Direttiva, għandu jitħejja rapport mill-Kummissjoni li fih ikunu riveduti dawn il-metodi u l-miżuri fid-dawl ta’ l-esperjenza miksuba, u r-rapport għandu jkun ippreżentat lill-Kumitat qabel l-1 ta’ Jannar 2002.

Artikolu 12

1. L-Istati Membri għandhom iġibu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regoli u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa biex dawn ikunu konformi ma’ din id-Direttiva b’effett mill-21 ta’ Awissu 1999. Huma għandhom jinfurmaw minnufih lill-Kummissjoni dwar dan.

Meta l-Istati Membri jadottaw dawn il-miżuri, dawn għandu jkollhom referenza għal din id-Direttiva jew inkella jkunu akkumpanjati b’tali referenza fl-okkażjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. Il-metodi ta’ kif issir tali referenza għandhom ikunu adottati mill-Istati Membri.

2. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw minnufih lill-Kummissjoni d-disposizzjonijiet tal-liġi nazzjonali li huma jadottaw fil-qasam irregolat b’din id-Direttiva. Il-Kummissjoni għandha tinforma lill-Istati Membri l-oħrajn dwar dan.

Artikolu 13

Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fil-jum tal-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej.

Artikolu 14

Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri.









ANNESS I

SEZZJONI I

Lista ta’ pjanti ospitanti tar- Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al . msemmija fl-Artikolu 1







Pjanti (inklużi tuberi), apparti milli għal żerriegħa vera, tas-Sonanum tuberosum L. Patata Pjanti, apparti milli għall-frott u ż-żerriegħa, tal-Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. Tadam

SEZZJONI II

Stħarriġ

1. L-istħarriġ uffiċjali riferit fl-Artikolu 2(2)(a) għandu jkun ibbażat fuq il-bioloġija ta’ l-organiżmu u s-sistemi tal-produzzjoni partikolari fl-Istati Membri kkonċernati u għandu jikkomprendi: (i) fil-każ tal-patata, — fi żmien addattat, spezzjoni viżwali ta’ l-uċuħ tar-raba’ waqt li qed jikbru, u/jew teħid ta’ kampjuni kemm taż-żriegħ u kemm ta’ patata oħra waqt l-istaġun tat-tkabbir jew li tkunu maħżuna. Dawn il-kampjuni għandhom ikunu suġġetti għal spezzjoni viżwali uffiċjali jew sorveljata uffiċjalment bil-qtugħ ta’ tuberi, u — fil-każ ta’ żerriegħa tal-patata, u meta jkun xieraq għal patata oħra, testijiet uffiċjali jew sorveljati b’mod uffiċjali f’laboratorju bl-użu tal-metodi stabbiliti fl-Anness II, (ii) fil-każ tat-tadam, — spezzjoni viżwali, fi żmien addattat, ta’ mill-inqas il-pjanti li qed jikbru u li l-frott tagħhom huwa intiż biex ikun miżrugħ mill-ġdid għall-użu professjonali.

2. In-notifika ta’ l-istħarriġ uffiċjali riferit fl-Artikolu 2(3) għandu jinkludi: (i) fil-każ ta’ stħarriġ fuq il-patata, — estimi taż-żona kollha kkultivata, f’ettari, taż-żriegħ u patata l-oħra, — stratifikazzjoni skond il-kategorija taż-żriegħ u l-għamla, u meta jkun xieraq, skond ir-reġjun, — in-numru u t-teħid tal-ħin tal-ġbir tal-kampjuni meħuda għall-ittestjar, — in-numru ta’ l-ispezzjonijiet viżwali fl-għalqa, — in-numru (u l-qies tal-kampjun) ta’ l-ispezzjonijiet viżwali fuq it-tuberi; (ii) fil-każ ta’ stħarriġ fuq, minn ta’ l-inqas, l-uċuħ tar-raba’ tal-pjanti tat-tadam li qed jikbru u intiżi biex jinżergħu mill-ġdid għall-użu professjonali, — l-estimi tan-numru totali tal-pjanti, — in-numru ta’ spezzjonijiet viżwali; (iii) fil-każ ta’ stħarriġ fuq pjanti ospitanti apparti milli għall-patata u t-tadam, inklużi l-pjanti ospitanti solanini selvaġġi, — l-ispeċi, — in-numru u l-ħin tat-teħid tal-kampjuni li jkun inġabru, — żona/xmara li minnhom ikunu ttieħdu l-kampjuni, skond kif ikun xieraq, — il-metodu ta’ l-analiżi; (iv) fil-każ ta’ stħarriġ fuq l-ilma u l-emissjonijiet ta’ skart likwidu mill-bini industrijali ta’ l-ipproċessar u ta’ l-ippakkjar, — in-numru u l-ħin tat-teħid biex jinġabru l-kampjuni, — iż-żona/ix-xmara/il-post tal-bini minn fejn ikunu ttieħdu l-kampjuni, skond kif ikun xieraq, — il-metodu ta’ l-analiżi.

▼M1









ANNESS II

SKEMA TA’ TESTIJIET GĦAD-DIJANJOSI U IDENTIFIKAZZJONI TA’ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

SKOP TA’ L-ISKEMA TA’ TESTIJIET

L-iskema ppreżentata tfassal il-proċeduri varjati involuti għall-:

(i) Dijanjosi tat-taħsir kannella fil-patata u dbiel batterjoloġiku fit-tuberi tal-patata, fit-tadam u ċerti pjanti ta’ provenjenza oħra;

(ii) Għarfien ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi tal-patata, patata, tadam u pjanti ospitanti oħrajn fl-ilma u fil-ħamrija;

(iii) Identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

WERREJ







Prinċipji Ġenerali TAQSIMA I Applikar ta’ l-iskema ta’ testijiet 1. Skema ta’ għarfien għad-dijanjosi tat-taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku (R. solanacearum) fit-tuberi tal-patata, tadam jew pjanti oħra ta’ provenjenza li għandhom sintomi ta’ taħsir kannella jew dbiel batterjoloġiku 2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi 3. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, pjanti tat-tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi TAQSIMA II Metodi fil-fond għall-għarfien ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li jippreżentaw is-sintomi kollha ta’ taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku 1. Sintomi 2. Testijiet ta’ eżaminazzjoni qosra 3. Proċeduri ta’ iżolazzjoni 4. Testijiet ta’ identifikazzjoni għal R. solanacearum TAQSIMA III 1. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi 1.1. Preparazzjoni tal-kampjun 1.2. Testijiet 2. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi 2.1. Preparazzjoni tal-kampjun 2.2. Testijiet TAQSIMA IV 1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma 2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma 2.1. Preparazzjoni tal-kampjun 2.2. Testijiet TAQSIMA V 1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija 2. Skema għall-għarfien u identiofikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija 2.1. Preparazzjoni tal-kampjuni 2.2. Testijiet TAQSIMA VI: Protokoll ottimizzat għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum A) Testijiet ta’ dijanjosi u għarfien 1. testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk 2. Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate 3. Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination) 4. Iżolazzjoni selettiva 4.1. Pjastra selettiva 4.2. Proċedura ta’ trobbija f’ambjent favorevoli 5. Test ta’ l-immunofluworexxenza (Test IF) 6. Test tal-Polymerase chain reaction (Test PCR) 6.1. Metodi ta’ purifikazzjoni tad-DNA (a) Metodi skond Pastrik (2000) (b) Metodi oħra 6.2. PCR 6.3. Analiżi tal-prodott PCR 7. Test ta' l-ibridizzazzjoni fluwore67enti in situ (Test FISH) 8. Assay li huwa enzyme linked immuno sorbent (Tests ELISA) (a) Indirett ELISA (b) DASI ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect) 9. Test Bioassay B) Testijiet ta’ identifikazzjoni 1. Testijiet ta’ nutriment u identifikazzjoni permezz ta’ enzimi 2. Test IF 3. Test ELISA 4. Test PCR 5. Test FISH 6. Identifikazzjoni skond it-tip ta’ aċidi grassi (FAP) 7. Metodi ta’ karatterizzazzjoni tal-varjetà 7.1. Determinazzjoni Biovar 7.2. Teħid tal-marki tas-swaba Genomic 7.3. Metodi PCR C) Test ta’ Konferma Appendiċi 1 Laboratorji involuti fl-ottimizzazzjoni u l-validazzjoni tal-protokolli Appendiċi 2 Medji għall-iżolazzjoni u kultivazzjoni ta’ R. solanacearum Appendiċi 3 (A) Materjal ta’ kontroll standardizzat kummerċjalment disponibbli (B) Prepazzjoni ta’ kontrolli Appendiċi 4 Buffers għall-proċeduri tat-testijiet Appendiċi 5 Determinazzjoni tal-livell ta’ kontaminazzjoni fit-testijiet IF u FISH Appendiċi 6 Protokolli u reaġġenti tal-PCR validati Appendiċi 7 Reaġġenti validati għat-test FISH Appendiċi 8 Kundizzjonijiet ambjentali fit-trobbija għat-tadam u brunġiel Referenzi

PRINĊIPJI ĠENERALI

Protokolli ottimizzati għall-metodi kollha, sustanzi reaġġenti validati u dettalji għall-preparazzjoni tat-test u materjali li jservu ta’ kontroll jew tqabbil huma mfassla fl-Appendiċi. Lista tal-laboratorji li ġew inklużi fl-ottimizzazzjoni u validazzjoni tal-protokolli huma pprovduti f’Appendiċi 1.

La l-protokolli ser jinvolvu għarfien ta’ organiżmu fi kwarantena u ser jinkludu użu ta’ gruppi mrobbijja vijabilment ta’ R. solanacearum bħala materjal ta’ tqabbil, ser ikun hemm bżonn li jsiru ċerti proċeduri taħt kundizzjonijiet ta’ kwarantena siewja bi faċilitajiet adegwati ta’ skart u taħt kundizzjonijiet ta’ liċenzji approprjat kif imħarrġa mill-awtoritajiet uffiċjali tal-kwarantina tal-pjanti.

Parametri ta’ testijiet iridu jiżguraw livelli ta’ għarfien ta’ R. solanacearum li jkunu ripproduċibbli u konsistenti sal-limiti ta’ tali metodi magħżula.

Preparazzjoni ta’ kontrolli pożittivi preċiżi hija ta’ importanza primarja.

Testjar skond il-limiti meħtieġa tinkludi wkoll issettjar korrett, manutenzjoni u kalibrar tat-tagħmir, użu u preżervazzjoni bil-prudenza ta’ sustanzi reaġġenti u kull miżuri meħtieġa sabiex jiġu evitati kontaminazzjonijiet bejn kampjuni, eż. Separar ta’ kontrolli pożittivi minn kampjuni li qegħdin jiġu ttestjati. Miżuri ta’ kontroll fuq kwalità jridu jiġu implimentati sabiex jiġu evitati żbalji amministrattivi u żbalji oħra speċjalment fl-immarkar u dokumentazzjoni.

Okkorrenza sospetta kif imfassla f’Artikolu 4 (2) fid-Direttiva 98/57/KE tirriżulta riżulatat pożittiv fit-testijiet ta’ dijanjosi jew skrining fuq kampjun kif speċifikat fl-illustrazzjoni hawn isfel. Test ta’ skrining li jirriżulta pożittiv l-ewwel darba (test IF, PCR/FISH, iżolazzjoni selettiva) jrid jiġi kkonfermat permezz tat-tieni test ta’ skrining li huwa bbażat fuq prinċipju ieħor bijoloġiku.

Jekk l-ewwel test ta’ skrining huwa pożittiv, kontaminazzjoni bil-R. solancearum hija sosopettat għalhekk test ieħor ta’ skrining irid isir. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa pożittiv, is-sospett huwa kkonfermat (preżenza kkonfermata) u t-testijiet skond l-iskema jridu jitkomplew. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa negattiv, il-kampjun jiġi meqjus bħala mhux kontaminat bil-R. solanacearum.

Preżenza kkonfermata kif imfassal f’artikolu 5 (1) fid-direrttiva 98/57/KE tirriżulta iżolazzjoni u identifikazzjoni ta’ grupp safi ta’ R. solanacearum bil-konferma ta’ patoġeniċità.

TAQSIMA I

APPLIKAR TA’ L-ISKEMA TA’ TESTIJIET

1. Skema ta’ għarfien għad-dijanjosi tat-taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku (R. solanacearum) fit-tuberi tal-patata, tadam jew pjanti oħra ta’ provenjenza li għandhom sintomi ta’ taħsir kannella jew dbiel batterjoloġiku

Il-proċedura ta’ testjar hija mfassla għall-pjanti tal-patata u pjanti li jippreżentaw sintomi ċari jew sospetti ta’ taħsir kannella jew dbiel vaskulari. Din tinkludi skrining rapidu, iżolazzjoni tal-mikrobu patoġeniku mit-tessut vaskulari infettat fuq sustanza fejn huma biss jistgħu jikbru (selettiva) u, fil-każ ta’ riżultat pożittiv, identifikazzjoni tal-grupp ta’ organiżmi in kwestjoni bħala Ralstonia solanacearum.

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ pjanti ta’ patata li ma jurux sintomi

Prinċipju:

Il-proċedura tat-testjar hija intiża sabiex issir l-iskoperta ta’ infezzjoni moħbija fit-tuberi tal-patata. Riżultat pożittiv minn mill-inqas żewġ testijiet ta’ skrining3, ibbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti, għandhom isiru bl-iżolazzjoni ta’ l-organiżmi patoġeniċi; u dan għandu jiġi segwit, fil-każ ta’ iżolazzjoni ta’ kolonji tipiċi, mill-konferma ta’ kolonja safja ta’ R. Solanacearum. Riżultat pożittiv minn test ta’ skrining wieħed biss mhux biżżejjed sabiex il-kampjun jitqies bħala suspett.

Testijiet ta’ skrining u iżolazzjoni jridu jagħtu għarfien ta’ 103 sa 104 ċellula/ml ta’ residwu risospiż (resuspended pellet) inkluża bħala kontroll pożittiv f’kull serje ta’ testijiet.

3. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi

TAQSIMA II

METODI FIL-FOND GĦALL-GĦARFIEN TA’ RALSTONIA SOLANACEARUM F’KAMPJUNI TA’ TUBERI TA’ PATATA, TADAM U PJANTI OĦRA TA’ PROVENJENZA LI JIPPREŻENTAW IS-SINTOMI KOLLHA TA’ TAĦSIR KANNELLA U TA’ DBIEL BATTERJOLOĠIKU

1. Sintomi (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.)

1.1. Is-Sintomi fil-patata

Il-pjanta tal-patata. L-ewwel stadju ta’ infezzjoni fl-għelieqi hija innotata minħabba d-dbiel tal-weraq fin-naħa ta’ fuq tal-pjanta f’temperaturi għoljin matul il-ġurnata bl-irkuprar matul il-lejl. Fl-ewwel fażijiet ta’ dbiel il-weraq jibqgħu ħodor, iżda ’l quddiem nekrożi safra u kannella tiżviluppa. Issir ukoll epinastija. Jidbielu xtieli separati jew il-pjanta kollha tasal fi stat irreversibli li tirriżulta fil-kollass u l-mewt tal-pjanta. It-tessut vaskulari minn zkuk maqtugħin transversalment minn pjanti li dbielu, għandu apparenza kannella u jkollhom nixxa ta’ sustanza densa kawża tal-batterji jew wieħed jista’ jara dan billi jagħfashom. Meta zokk maqtugħ jitqiegħed pożizzjoni wieqfa fl-ilma, traċċi ta’ lgħab jinxterdu mill-organi vaskulari.

It-tuberu tal-patata. It-tuberi tal-patata għandhom jinqatgħu trasversalment qrib l-għarqub (il-parti ta’ l-istolon) jew lonġitudinalment il-fuq mill-parti ta’ l-istolon. L-ewwel stadji ta’ infezzjoni huma rikonoxxuti minn ċarar isfar fil-kannela tleqq tal-kulur taċ-ċirku vaskulari li minnu jnixxi krema batterika spontanjament wara ftit minuti. Il-quddiem dan it telf ta’ kulur vaskulari jsir iktar ċar u distint lewn kannella u nekrożi tista’ tinfirex fit-tessut taz-zokk madwar it-tessut vaskulari. Fi stadju avvanzat, l-infezzjoni tinfirex min-naħa ta’ isfel u l-imsiemer minn fejn inixxi il-lgħab ta’ batterji li jista’ jikkawża aderenza ta’frak ta’ ħamrija. Pjagi lewn aħmar lewn fuq il-kannella jistgħu jidhru fuq il-ġilda ta’ barra minħabba tkissir ta’ tessut vaskulari internament. Oħrajn infezzjonijiet sekondarji ta’ moffa u tħassir batterjoloġiku huma komuni fl-istadji avvanzati tal-marda.

1.2. sintomi fit-tadam

Il-pjanta tat-tadam. L-ewwel sintomu viżibbli hija l-apparenza mitluqa tal-weraq iż-żgħar. F’ambjent favorevoli għall-organiżmu patoġeniku (temperatura tal-ħamrija 25 °C; umdità saturizzata), epinastija u dbiel fuq parti waħda jew fuq il-pjanta kollha fi żmien ftit ġranet li jwassal għall-kollass tal-pjanta. Fi kundizzjonijiet inqas favorevoli (temeperatura tal-ħamrija inqas minn 21 °C), isi inqas tidbil, iżda numru kbir ta’ għeruq sekondarji jistgħu joħorġu miz-zokk. Huwa possibli li wieħed jinnota strixxi imxarrba ta’ għeruq min-naħa ta’ isfel taz-zokk li hija evidenza ta’ nekrożi fis-sistemna vaskulari. Meta z-zokk jinqatgħa dritt, tessut kannella ċar jidher toħroġ nixxa ta’ batterji safranija minnhom.

1.3. sintomi fuq pjanti oħra li huma soġġetti

Pjanti Solanum dulcamara and S. nigrum. Taħt kundizzjonijiet naturali, sintomi ta’ tidbil huma rarament osservati f’dawn il-pjanti ta’ ħaxix ħażin sakemm it-temperatura tal-ħamrija ma taqbiżx il-25 °C jew livelli ta’ inoklu huma għolja ħafna (eż. għal S. nigrum li jikber qrib ħafna ta’ pajnti tal-patata jew tat-tadam infettati. Meta jsir it-tidbil, is-sintomi huma kif imfassla għat-tadam. Pjanti ta’ S. dulcamara li ma jidbielux li jikbru bl-għeruq u zkuk ġewwa l-ilma jistgħu jippreżentaw iċċarar vaskulari intern lewn kannella ċar meta wieħed josserva z-zokk f’sezzjoni trażversali jew partijiet taz-zkuk taħt l-ilma. Nixxa ta’ batterji minn tessuti vaskulari maqtugħa jew għamla ta’ lgħab tinfirex fi ħjut żgħar miz-zokk meta jitqiegħed fl-ilma pożizzjoni wieqfa, huma osservati ukoll fl-assenza ta’ sintomi ta’ tidbil.

2. Testijiet ta’ eżaminazzjoni qosra

Testijiet ta’ dijanjosi rapida jiffaċilitaw dijanjosi preżunta iżda mhumiex essenzjali. Uża wieħed jew iktar minn dawn it-testijiet validati:

2.1. testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk

(Ara Taqsima VI.A.1.)

2.2. Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate

Qmuħ karatteristiċi ta’ PHB fiċ-ċelluli ta’ R. solanacearum jistgħu jingħarfu billi jittebbgħu kampjuni, li jiġu iffissati bis-sħana, tan-nixxa batterika minn tessut infettat fuq hġieġa taħt mikroskopju permezz tal-kuluri Nile Blu A jew Sudan Black (Ara Taqsima VI.A.2.).

2.3. Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination)

(Ara Taqsima VI.A.3.))

2.4. Testijiet oħra

Testijiet oħrajn approprjati ta’ skrining rapidu inkluż testijiet ta’ IF (ara Taqsima VI.A.5.), it-test FISH (ara Taqsima VI.A.7.), testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8.) u testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6).

3. Proċeduri ta’ iżolazzjoni

(a) Neħħi in-nixxa jew tessut iċċarat mid-dawra vaskulari fit-tuberu tal-patata jew mill-istrixxi vaskulari fiz-zkuk ta’ patata, tadam jew pjanti li jservu li fuqhom igħixu dawn l-organiżmi li qegħdin jidbielu. Ħoll f’volum żgħir ta’ ilma distilliżat u sterilizzat jew 50mM ta’ sustanza ta’ fosfat li żżomm il-kundizzjonijiet stabbli (buffer) (Appendiċi 4) u ħalli għall-5-10 minuti.

(b) Ipprepara serje ta’ taħlitiet dilwiti li jkunu għaxar darbiet iktar minn xulxin.

(c) Ittrasferixxi 50-100 µl tas-sospensjoni u d-dilwizzjonijiet fuq medju ta’ nutriment ġenerali (NA, YPGA or SPA; ara l-Appendiċi 2) u/jew fuq il-medju tat-terazolju selettiv Kelman (Appendiċi 2) u/jew medju selettiv validat (eż SMSA; ara Appendiċi 2). Ifrex jew agħmel strixxa permezz ta’ teknika ta’ kisja dilwita approprjata. Jekk huwa ta’ utilità, ipprepara kampjuni miksija separati ta’ taħlita dilwita ta’ R. solanacearum biovar 2 bħala kontroll biex wieħed iqisu bħala riżultat pożittiv.

(d) Żomm il-kisjiet taħt inkubazzjoni għal 2 – 6 ijiem fi 28 °C. — Fuq il-materjal ta’ nutrijent ġenerali, iżolati aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tal-lewn abjad kulur il-krema apparenza perla u kompożizzjoni fluwida b’dawriet karatteristiċi fin-nofs. Varjazzjonijiet oħra mhux aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tondi mhux konsistenza fluwida, butiriċi li għandhom lewn kompletament abjad kulur il-krema. — Fuq it-tetrażoljum ta’ Kelman u SMSA, iċ-ċirkji huma ħomor, kulur id-demm. Varjazzjonijiet oħra mhux aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tondi mhux konsistenza fluwida, butrici li għandhom lewn kompletament aħmar skur.

4. Testijiet ta’ identifikazzjoni għal R. solanacearum

Testijiet sabiex jiġu kkonfermati l-identità ta’ preżunti iżolati ta’ R. solanacearum huma mfassla f’Taqsima VI.B.

TAQSIMA III

1. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jippreżentawx sintomi

1.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota:

— Id-daqs standàrd tal-kampjun huwa ta’ 200 tuberu per test. Aktar ġbir ta’ kampjuni intesiv jitlob iktar testijiet fuq kampjuni ta’ dan id-daqs. Numri akbar ta’ tuberi fil-kamjun iwasslu għal tfixkil jew interpretazzjoni diffiċli tar riżultati. Iżda, proċeduri jistgħu jiġu applikati konvenjentament fuq kampjuni b’inqas minn 200 tuberu fejn hemm inqas numru ta’ tuberi disponibbli għall-użu.

— Validazzjoni għall-metodi ta’ l-iskoperta kif imfassla hawn isfel hija bbażata fuq kampjuni ta’ 200 tuberu.

— L-estratt mill-patata mfassal hawn isfel jista’ jintuża wkoll biex wieħed jivverifika l-preżenza tal batterju Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus li huwa kawża ta’ tħassir fil-patata.

Pre trattament mhux obbligatorju fuq il-kampjun qabel ma jiġi ppreparat:

(a) Inkubazzjoni tal-kampjuni f’temperatura ta’ 25-30 °C, għal żmien ta’ ġimgħatejn qabel ma jsir it-testjar, sabiex jitjiebu l-kundizjonijiet għat-tkattir tal-popolazzjoni ta’ R. solanacearum.

(b) Aħsel it-tuberi. Agħmel użu minn disinfettanti approprjati (komposti tal-kloru fejn ser isir it-test tal-PCR sabiex jinqered id-DNA eventwali ta’ organiżmu patoġeniku) u deterġenti bejn kull kampjun. Nixxef it-tuberi fl-arja. Din il-proċedura ta’ ħasil hija ta’ użu partikulari (iżda mhux obbligatorja) għall-kampjuni li jippreżentaw eċċess ta’ ħamrija u jekk test PCR jew iżolazzjoni diretta jridu jsiru.

1.1.1. Neħħi permezz ta’ xafra disinfettata jew sikkina tal-ħaxix il-qoxra fin-naħa ta’ l-għarqub (stolon) ta’ kull tuberu sabiex it-tessut vaskulari jiġi jidher. Aqta’ b’attenzjoni biċċa qalba tat-tessut vaskulari fin-naħa ta’ l-għarqub u żomm l-iktar ammont ta’ tessut mhux vaskulari kemm jista’ jkun. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Nota: Ifred mill-oħrajn it-tuberi (mħassra: erfa' (Petra Muller) it-tuberi li għandhom xi sintomi ta’ taħsir kannella sospetti u ttestja separatament. Jekk matul it-tneħħija ta’ l-għarqub jiġu osservati sintomi sospetti tat-taħsir kannella spezzjoni viżwali tat-tuberu għandha ssir u t-tuberu għandu jinqata’ min-naħa ta’ l-għarqub. Kull tuberu maqtugħ li għandu sintomi sospetti għandu jinħażen għall-jumejn temperatura ambjentali sabiex tista’ sir is-suberizzazzjoni u aħżen f’refriġerazzjoni fi (at 4 - 10 °C) f’kundizzjonijiet ta’ kwarantena xierqa. It-tuberi kollha inklużi dawk li għandhom sintomi sospetti jridu jinżammu skond m’hu imfassal f’Anness III.

1.1.2. Iġbor il-qlub meħudin minn-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu f’reċipjent mhux użati li jintrema’ (disposable) wara li jintuża u li jista’ jingħalaq u/jew jiġu ssiġillati (jekk reċipjenti jintużaw iktar minn darba jridu jitnaddaf sew u jiġi disinfettat permezz ta’ komposti bbażati fuq il-kloru). Jekk jista’ jkun, qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu jridu jiġu pproċessati mill-ewwel. Jekk dan ma jistax ikun, erfagħhom fil-kontenitur, mingħajr ma jiżdiedu sostanzi li jżommu l-kundizzjonijiet stabbli (buffer), ambjent refriġerat għal żmien ta’ mhux iktar minn 72 siegħa jew għal żmien ta’ mhux iktar minn 24 siegħa f’temperatura ambjentali. Ipproċessa l-qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin: (a) Poġġi l-qlub f’ammont (approssimativament 40ml) suffiċjenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli (Appendiċi 4) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erbgħa sigħat f’temperatura inqas minn 24 °C jew miżmuma għal 16 24 siegħa refriġerati. jew (b) Omoġenizza l-qlub b’ammont suffiċjenti (approssimativament 40ml) ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 4), f’apparat li jintuża għat-taħlit (eż Waring jew Ultra Thurax) jew billi jitgħaffġu f’borża għall-immaċerazzjoni li tintrema wara l-użu tagħha (eż Stomacher or Bioreba polyethene ta’ kalibru qawwi, 150 mm × 250 mm; sterilizzat bir-radjazzjoni) permezz ta’ mazza tal-lasktu jew apparat għat-taħna xieraq (eż Homex). Nota: Ir-riskju ta’ kontaminazzjoni huwa għoli meta l-kampjuni huma omogeniżżati permezz ta’ apparat għat-taħlit. Ħu prekawzjonijiet sabiex jiġu evitati generazzjoni ta’ taħlita ta’ particelli fl-arja waqt il-proċess ta’ estrazzjoni. Kun ċert li jintużaw xwabel ta’ l-apparat li jomoġenizza sterilizzati għal kull kampjun. Jekk it-test tal-PCR għandu jkun evitat, aħseb sabiex tevita li jkun hemm kontaminazzjoni ta’ DNA minn kampjuni oħra fil-kontenituri jew apparat li jintuża biex issir it-taħna. It-taħna f’boroż li jistgħu jintremew u l-użu ta’ tubi li jintremew wara l-użu huma kollha rrakkomandati fejn jintuża l-PCR.

1.1.3. Ferra l-likwidu li jibqa’ wara. Jekk jidher eċċessivament imniġġes, iċċarah jew permezz ta’ ċentrifugazzjoni lenta (mhux iktar minn 180 g għal għaxar minuti f’temperatura ta’ 4-10 °C) jew permezz ta’ filtrazzjoni fi vakwu (40-100 µm), il-filtri jinħaslu dejjem b’iktar (10 ml) kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli. (buffer)

1.1.4. Ikkonċentra l-parti batterika permezz ta’ ċentrifugazzjoni bi veloċità 7 000g għal ħmistax il-minuta (jew 10 000 għal 10 minuti) f’temperatura ta’ bejn 4-10 °C u armi l-likwidu residwu mingħajr ma tħarbat ir-residwu (pellet).

1.1.5. Qiegħed ir-residwu fi 1.5ml ta’ kimika apposta li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli (buffer) (Appendiċi 4). Uża 500 µl biex tittestja għal R. solanacearum, 500 µl għal Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus u 500 µl għal raġunijiet ta’ referenza.. Żid gliċerol sterilizzat sal-konċentrazzjoni finali ta’ 10-25 % (v/v) mal 500 µl ta’ l-alikwot ta’ referenza u lill-alikwot li jifdal tat-test, ħawwad u erfa’ fi 16 to 24 °C (ġimgħat) jew fi 68 sa 86 °C (xhur). Ippreżerva l-alikwoti tat-test taħt temperatura ta’ 4-10 °C waqt it-testing. Mhux affidabli li jsir iffriżar jew jinħallu ripetutament. Jekk hemm il-ħtieġa ta’ trasport għall-estratt, kun cert li jsir f’kontenitur li jżomm il-kesħa fi żmien ta’ 24 sa 48 siegħa.

1.1.6. Huwa imperattiv li kull kontroll pożittiv u kampjuni għall-R. solanacearum jiġu meqjusa separatament sabiex jiġi evitat il-kontaminazzjoni. Dan japplika fi pjastri ta’ l-IF u għat-testijiet kollha.

1.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

Iżolazzjoni selettiva (ara Taqsima VI.A.4.)

Test IF (ara Taqsima VI.A.5.)

Testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6)

Test FISH (ara Taqsima VI.A.7)

Testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8)

Il-Bioassay (Ara Taqsima VI.A.9.)

2. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota: Għall-kampjuni ta’ popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum huwa indikat li wieħed jittestja kampjuni komposti. Il-proċedura tista’ tiġi applikata faċilment għal kampjuni komposti minn ammont ta’ 200 parti ta’ zokk. Fejn isiru studji dawn iriddu jsiru fuq kampjun repreżentattiv statistikalment tal-popolazzjoni ta’ pjanti li qed tkun investigata.

2.1.1. Iġbor 1-2 cm biċċiet taz-zkuk f’kontenitur sterilliżżat skond dawn il-proċeduri ta’ ġbir ta’ kampjuni li ġejjin: Pjanti tat-tadam żgħar: B’sikkina nadifa u disinfettata, aqta’ biċċa fiha ċentimetru wieħed mill-bażi ta’ kull zokk, ftit iktar il-fuq mil-livell tal-ħamrija. Pjanti tat-tadam ta’ l-għelieqi jew tas-serrer: B’sikkina nadifa u disinfettata, aqta’ il-fergħa l-iktar baxxa minn kull pjanta billi taqta’ ftit iktar il-fuq mill-ġonta ta’ bejn iz-zokk priċipali. Aqta’ biċċa ta’ ċentimetru wieħed minn-naħa ta’ isfel minn kull fergħa. Pjanti ospitanti oħrajn: B’sikkina nadifa u disinfettata jew b’imqass taż-żabra, aqta’ bicca fiha ċentimetru wieħed mill-bażi ta’ kull zokk, ftit iktar il-fuq mil-livell tal-ħamrija. Fil-każ ta’ S. dulcamara jew pjanti oħra ta’ provenjenza li jikbru fl-ilma, neħħi biċċiet ta’1-2 cm miz-zkuk ta’ taħt l-ilma jew mill-fergħa orizzontali b’għeruq akkwatiċi. Meta jsir ġbir ta’ kampjuni minn post partikolari huwa indikabbli li jsir testjar fuq kampjun statistikament repreżentattiv għal mhux inqas minn 10 pjanti għal kull punt ta’ kampjunar ta’ kull ħaxixa li hija potenzjalment ta’ provenjenza. L-investigazzjoni ta’ l-organiżmu patoġeniku jkun iktar lajn tmiem ir-rebbiegħa, fis-sajf u fil-ħarifa, għalkemm infezzjonijiet naturali jistgħu jinstabu tul is-sena kollha fis-Solanum dulcamara perenni li tikber fil-korsijiet ta’ l-ilma. Pjanti li fuqhom jistgħu jikbru huma pjanti ta’ patata voluntiera Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium u membri oħra tal-familja Solanaceae. Pjanti oħra li jistgħu jservu ta’ mezz għall-għixien huma Portulaca oleracea. Ċertu speċi ta’ ħxejjex Ewropew li jistgħu potenzjalment iżommu popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum biovar 2/Razza 3 f’għeruq u/jew riżosferi f’kundizzjonijiet ambjentali speċifiċi jinkludu Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra u Urtica dioica. Nota: Eżaminazzjoni viżwali għal sintomi interni (tiġrif vaskulari jew nixxa batterika) tista’ ssir f’dan l-istadju. Ifred segmenti taz-zokk bis-sintomi u ttestja separatament (Ara Taqsima II).

2.1.2. Iddisinfetta s-segmenti taz-zkuk permezz ta’ l-etanol 70 % u mill-ewwel nixxef permezz ta’ karta assorbenti Imbagħad ipproċessa s-segmenti taz-zkuk permezz ta’ waħda mill-proċeduri li ġejjin: (a) Poġġi s-segmenti f’ammont (approssimativament 40ml) suffiċjenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 4) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erba’ sigħat f’temperatura inqas minn 24 °C jew 16 24 siegħa f’refriġerazzjoni. jew (b) Ipproċessa mill-ewwel, billi ttaħħan is-segmenti f’borża tat-titħin ħoxna (eż Stomacher jew Bioreba) bi volum approprjat ta’ buffer għall-estrazzjoni (appendiċi 4) permezz ta’ mazza tal-lasktu jew tagħmir apposta (eż Homex). Jekk dan mhux disponibbli, erfa’ is-segmenti taz-zkuk għal-mhux iktar minn 72 siegħa jew għal mhux iktar minn 24 siegħa f’temperatura ambjentali.

2.1.3. Ferra l-likwidu li jifdal wara li jkun qagħad għal 15 il-minuta.

2.1.4. Iktar kjarifikazzjoni dwar l-estrazzjoni u konċentrazzjoni tal-parti batterika mhumiex dejjem neċessarji iżda jistgħu jsiru billi ssir filtrazzjoni u/jew ċentrifugazzjoni kif imfassal f’Taqsima III.1.3 – 1.1.5.

2.1.5. Aqsam fi tnejn il-kampjun pur jew ikkonċentrat f’żewġ partijiet indaqs. Poġġi nofs f’4-10 C waqt it-test u erfa’ il-parti l-oħra b’10-25 % (v/v) gliċerol sterilizzat fi 16 to 24 °C (ġimgħat) jew fi 68 to 86 C (ġimgħat) jekk ikun hemm mil-ħtieġa ta’ iktar testijiet.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

Iżolazzjoni selettiva (ara Taqsima VI.A.4.)

Test IF (ara Taqsima VI.A.5)

Testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6)

Test FISH (ara Taqsima VI.A.7)

Testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8)

Il-Bioassay (Ara Taqsima VI.A.9.)

TAQSIMA IV

1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma.

Prinċipju:

L-iskema validata ta’ għarfien, imfassla f’din it-taqsima, hija applikabli għall-għarfien ta’ organiżmu patoġeniku f’kampjuni ta’ ilma tal-wiċċ u jista’ jkun applikat ukoll għat-testing ta’ kampjuni ta’ materjal ipproċessat mill-patata jew derivati mid-dranaġġ. Iżda, huwa importanti li jingħaraf li s-sensitività tal-metodu ta’ għarfien ivarja skond il-materjal li qiegħed isir fuqu t-test. Is-sensitività tat-test ta’ iżolazzjoni huwa affetwat minn popolazzjonijiet ta’ batterji saprofitiċi kompetituri li ssoltu huwa ogħla f’materjal meħud minn proċessar ta’ patata u minn effluwent ta’ dranaġġ milli minn sors ta’ ilma tal-wiċċ. Fejn l-iskema mfassla hija mistennija li wieħed ikun jista’ jagħraf sa ftit daqs 103 cellula per litru minn ilma tal-wiċċ, is-sensittività minn materjal meħud minn proċessar ta’ patata jew effluwent ta’ dranaġġ huwa probabli li tkun iktar baxxa. Għal din ir-raġuni huwa indikat li jiġu ttestjati sostanzi effluwenti wara kull proċedura ta’ purifikazzjoni (eż sedimentazzjoni jew filtrazjoni) li jservu sabiex jitnaqsu l-popolazzjonijiet ta’ batterji saprofitiċi. Il-limitazzjonijiet fis-sensitività ta’ l-iskema ta’ testijiet trid tiġi kkunsidrata meta l-akkuratezza ta’ riżultati negattivi miksuba tkun assessjata. Minkejja li din l-iskema ġiet użata b’suċċess f’xogħol ta’ investigazzjoni biex tiġi vverifikata l-preżenza jew le ta’ l-organiżmu patoġeniku f’ilma tal-wiċċ, il-limitazzjonijiet tagħha jridu jiġu kkonsidrati meta użati f’investigazzjonijiet simili ta’ materjal minn proċessar ta’ patata jew effluwent ta’ dranaġġ.

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota:

— Għarfien ta’ R. solanacearum f’ilma tal-wiċċ hija l-iktar akkurata fl-aħħar tar-rebbiegħa, Fis-sajf u fil-ħarifa meta t-temperatura ta’ l-ilma taqbeż il-15 oC.

— Proċeduri ta’ ġbir ta’ kampjuni rrepetuti fiż-żminijiet imsemmija f’postijiet assenjati jżidu l-akkuratezza tal-metodu ta’ għarfien billi jitnaqqsu elementi ta’ varjazzjoni klimatiċi.

— Wieħed għandu jikkonsidra l-effetti ta’ xita qawwija jew tal-Ġeografija tal-kors ta’ l-ilma sabiex jiġu evitati effetti dilwenti estensivi li jistgħu jaħbu l-preżenza patoġenika.

— Għandhom jittieħdu kampjuni mill-wiċċ ħdejn il-pjanti ta’ provenjenza jekk dawn huma preżenti.

2.1.1. F’postijiet ta’ kampjunar magħżula, iġbor kampjuni ta’ ilma billi jintlew tubi li jistgħu jintremaw wara u li huma sterilizzati minn fond ta’ iktar minn 30 ċm u mhux iktar il-barra minn 2 m mit-tarf. Sabiex jiġu pproċessati l-effluwenti ta’ dranaġġ, iġbor il-kampjuni mill-punt ta’ skariku ta’ l-effluwent. Qisien tal-kampjuni ta’ mhux iktar minn 500ml għal kull post ta’ kampjunar huma indikati. Jekk wieħed jippreferi kampjuni iżgħar, huwa rrakkmandat li jittieħdu kampjuni għal mill inqas tliet okkażjonijiet għal kull punt ta’ kampjunar, fejn kull kampjun jikkonsisti minn żewġ sub kampjuni replikati ta’ mill-inqas 30 ml. Għal xogħol ta’ stħarriġ intensiv, agħżel mill inqas tliet punti ta’ kampjunar għal kull kilometru ta’ kors ta’ l-ilma u aċċerta li l-fergħat li jiżbokkaw fil-kors huma kkampjunati wkoll.

2.1.2. Trasport ta’ kampjuni jrid isir taħt kundizzjonijiet mudlama (4-10 °C) u ttestja qabel ma’ jgħaddu 24 siegħa.

2.1.3. Jekk hu meħtieġ, il-parti batterika tista’ tiġi kkonċentrata permezz ta’ wieħed minn dawn il-metodi li ġejjin: (a) Iċċentrifuga 30-50 ml sub-kampjuni veloċità ta’ 10 000 g għal 10 minuti (7,000 g għal 15 il-minuta) preferibbilment f’4-10 °C, armi l-likwidu li jibqa’ u żid 1ml tal-kimika li żżomm kundizzjonijiet stabbli (buffer) mar-residwu (Appendiċi 4). (b) Iffiltra permezz ta’ passatur (membrane filter)magħmul minn pori ta’ daqs minimu ta’ 0.45 µm jippreċedi l-ħasil tal-filtru fi 5-10ml kimika stabiliżżanti (pellet buffer) u jinżamm il-materjal maħsul. Dan il-metodu huwa indikat għal volum ikbar ta’ ilma li fih ammonti iżgħar ta’ organiżmi saprofitiċi. Metodu ta’ kkonċentrament mhux indikat għal kampjuni ta’ materjal meħud minn proċessar ta’ patata jew effluwenti ta’ dranaġġ għaliex popolazzjonijiet ippropagati ta’ batteri saprofitiċi huma ta’ tfixkil totali għall-għarfien ta’ Ralstonia solanacearum.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi rilevanti:

TAQSIMA V

1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija

Prinċipji

L-iskema validata ta’ għarfien, imfassla f’din it-taqsima, hija applikabli għat-tagħrif ta’ organiżmi patoġeniċi minn kampjuni ta’ ħamrija iżda tista’ tintuża wkoll għat-testjar ta’ skart solidu minn proċessar ta’ patata jew minn effluwent imtajjen ta’ dranaġġ. Iżda jrid jiġi kkonsidrat li tali metodi huma ta’ akkuratezza insuffiċjenti għal fini ta’ garanzija għall-għarfien ta’ popolazzjonijiet baxxi jew/u popolazzjonijiet imfirxa ta’ Ralstonia solanacearum li jistgħu jinstabu f’kampjuni infestati b’mod naturali fi kampjuni ta’ dawn is-sustrati.

Il-limitazzjonijiet fl-akkuratezza ta’ din l-iskema ta’ testijiet iridu jittieħdu in konsiderazzjoni meta l-akkeratezza ta’ tali testijiet negattivi jinkisbu kif ukoll meta użati f’investigazzjonijiet li l-għan tagħhom huwa li jistabilixxu l-preżenza jew nuqqas ta’ l-organiżmu patoġeniku fi ħamriji jew effluwenti mtajna. L-aktar test akkurat għall-preżenza ta’ l-organiżmu patoġeniku fi ħamrija ta’ l-għelieqi huwa li jitħawlu pjanti suxxettibli u jsir monitoraġġ għall-preżenza ta’ infezzjoni, iżda b’dan il-metodu wkoll livelli baxxi ta’ kontaminazzjoni mhumiex perċepibbli.

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

2.1.1. Ġbir ta’ kampjuni ta’ ħamrija ta’ l-għelieqi għandu jsegwi prinċipji ta’ kampjunar li japplika għall-organiżmi nematodi. Iġbor 0.5-1 kg ta’ ħamrija għal kull kampjun minn 60 firxa ta’ art per 0.3 ettaru minn fond ta’ 10-20 ċm (jew permezz ta’ kwadru ta’ 7 × 7 metru) Jekk huwa ssospettat il-preżenza ta’ l-organiżmu patoġeniku, żid in-numru ta’ żoni ta’ ġbir sa 120 per 0.3 ettaru. Żomm il-kampjuni f’temperatura ta’ 12-15 °C qabel it-testjar. Iġbor kampjuni meħudin minn materjal ta’ pproċessar ta’ patata u minn effluwenti mtajna ta’ dranaġġ billi tiġbor kilogram wieħed minn firxiet ta’ art li huma rappreżentattivi għall-volum totali ta’ effluwent li qiegħed jiġi ttestjat. Ħallat kull kampjun sew qabel it-testijiet.

2.1.2. Ħawwad sub-kampjuni ta’ 10–25 gm ta’ ħamrija jew effluwent permezz ta’ apparat rotatorju (250 rpm) fi 60-150 ml sustanza li żżomm kundizzjonijiet kimiċi stabbli għall-estrazzjoni (buffer) (Appendiċi 4) għal żmien sa sagħtejn. Jekk meħtieġ iż-żieda ta’ 0.02 % Tween-20 sterilizzat u 10-20 g ta’ żrar sterilizzat jistgħu jgħinu fid-dispersjoni.

2.1.3. Żomm it-taħlita ta’ likwidu u solidi f’4 °C waqt it-test.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

TAQSIMA VI

PROTOKOLL OTTIMIZZAT GĦALL-GĦARFIEN U IDENTIFIKAZZJONI TA’ R. SOLANACEARUM

A. TESTIJIET TA’ DIJANJOSI U GĦARFIEN

1. testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk

Il-preżenza ta’ R. solanacearum fi zkuk ta’ patata li qed tidbiel, tadam jew pjanti oħra jistgħu jiġu indikati permezz ta’ testijiet preżuntivi li ġejjin: Aqta’ z-zokk ftit ’il fuq mil-livell tal-ħamrija. Daħħal il-faxxa maqtugħa fi tubu ta’ ilma nadif. Osserva għall-preżenza ta’ hruġ ta’ sostanza batterika fi ħjut provenjenti mit-tessuti vaskulari wara ftit minuti.

2. Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate

1. Ċappas kampjun żgħir ta’ nixxa batterika minn tessut infettat jew minn kolonja ta’ l-organiżmu mrobbija in vitro għall 48 siegħa fuq sostanza tat-trobbija YPGA jew SPA (Appendiċi 2) fuq pjastra tal-mikroskopju.

2. Ipprepara kampjuni ta’ biovar 2 varjazzjoni ta’ R. solanacearum bħala control pożittiv u jekk ikkusidrat ta’ użu, kontroll negattiv ta’ speċi ta’ organiżmu li huwa ċert li jagħti riżultat negattiv.

3. Ħalli joqgħod ftit għall-arja, nixxef u webbes il-kampjun permezz ta’ sħana ta’ fjamma.

4. Tebba’ il-prepart bi Nile Blue jew Sudan Black u osserva mikroskopikament kif imfassal:

Test ta’ Nile Blue:

(a) Xarrab kull pjastra bi soluzzjoni ta’ 1 % ta’ Ikħal Nile A u inkuba kollox għal għaxar minuti f’55 °C.

(b) Neħħi l-materjal koloranti żejjed. Aħsel bi ftit ilma tal-vit. Neħħi ilma żejjed permezz ta’ karti assorbenti.

(c) Xarrab il-kampjun bi aċdu aċetiku 8 % u inkuba kollox għal minuta f’temperatura ambjentali

(d) Aħsel bi ftit ilma tal-vit. Neħħi ilma żejjed permezz ta’ karti assorbenti.

(e) Erġa xarrab ftit b’qatra ilma u għatti bi pjastra zgħira rqieqa.

(f) Eżamina t-tidlika li ġiet imtebbgħa taħt mikroskopju epifluworexxenti ta’ 450 nm taħt immersjoni fiż-żejt, bi manjifikazzjoni ta’ 600-1 000 permezz ta’ oġġettiv f’immersjoni taż-żejt u l-ilma.

(g) Osserva wkoll taħt emissjoni ta’ dawl normali sabiex taċċerta li l-qmuħ huma intraċellulari u l-għamla taċ-ċelluli hija tipikament ta’ R. solanacearum.

Test bis-Sudan Black:

(a) Xarrab kull pjastra (slide) bi soluzzjoni ta’ 0.3 % ta’ Sudan Iswed B fi soluzjoini ta’ 70 % etanol u inkuba għal 10 minuti minuti fi temperatura ambjent.

(b) Neħħi l-materjal koloranti żejjed.

(c) Bill il-pjastri brevement f’soluzzjoni ta’ xylol u nixxef fuq karta ossorbenti. Attenzjoni: Il-Xylol huwa ta’ periklu, prekawzjonijiet meħtieġa jridu jittieħdu u aħdem fi vetrina li hi mgħammra b’ventilatur għall-estrazzjoni.

(d) Xarrab il-pjastri permezz ta’ % (w/v) safranin akweuu, u ħalli għal għaxar minuti fi temperatura ambjentali. Attenzjoni: Is-safranin huwa ta’ periklu, prekawzjonijiet meħtieġa jridu jittieħdu u aħdem fi vetrina li hi mgħammra b’ventilatur għall-estrazzjoni.

(e) Aħsel taħt ilma tal-vit nieżel bil-mod, nixxef b’karti assorbenti u poġġi pjastra żgħira fuqha.

(f) Eżamina l-kampjuni kkolorati permezz ta’ mikroskopju normali tad-dawl bi emissjoni ta’ dawl taħt immersjoni fiż-żejt b’qawwa ta’ magnifikazzjoni ta’ 1 000 permezz ta’ oġġettiv apposta.

(g) Fittex it-tbajja blu jew suwed ta’ qmuħ ta’ PHB f’ċelluli ta’ R. solanacearum bil-qxur taċ-ċelluli lewn roża.

3. Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination)

Tagħqid ta’ ċelluli ta’ R. solanacearum fi nixxa batterika jew estratti minn tessuti sintomatiċi jiġi osservat permezz ta’ antikorpi validati (ara Appendiċi 3) mmarkat bil-markaturi, kkuluriti approprjatament bħal ċelluli ta’ Staphylococcus aureus ħomor jew partiċelli tal-lattiċi. Jekk qed jintużaw settijiet li jistgħu jinkisbu kommerċjalment, segwi l-istruzzjonijiet tal-manufattur. Jekk le, segwi dawn il-proċeduri:

(a) Ħallat qattra tas sospensjoni ta’ antikorpi mmarkati u nixxa batterika (approssivativament 5 µl kull wieħed) fuq il-wiċċ ta’ pjastri b’ħafna ħofriet.

(b) Ipprepara kontrolli negattivi u pożittivi bi sospensjoni ta’ R. solanacearum biovar 2 u varjetà eterologa.

(c) Osserva għal tagħqid fi kampjuni pożittivi wara li jitħaltu bil-mod għal 15 -il sekonda.

4. Iżolazzjoni selettiva

4.1. Pjastra selettiva

Nota: Qabel ma jintuża dan il-metodu għall-ewwel darba, agħmel testijiet preliminarji sabiex tassigura għarfien ripproduċibbli ta’ 103 sa 104 ta’ unitajiet li jifformaw kolonji ta’ R. solanacearum għal kull ml miżjud ma’ l-estratti mill-kampjuni li ttestjaw negattivi qabel.

Uża medji selettivi validati approprjatament bħalma huma SMSA (kif immodifikat minn Elphinstone et al., 1996;. ara Appendiċi 2).

Attenzjoni trid tingħata sabiex ikun hemm differenzjazzjoni bejn R. solanacearum u batterji oħra kapaċi jIFformaw kolonji fuq tali sostanza għat-trobbija. Il-kolonji jistgħu saħansitra jkollhom morfoloġija atipika jekk il-pjastri huma Iffollati bil kolonji ta’ R. solanacearum jew jekk batterji antagonistiċi huma preżenti wkoll. Fejn hemm sospett ta’ kompetizzjoni jew antagopniżmu, il-kampjun irid jiġi eżaminat permezz ta’ test ieħor

L-ogħla akkuratezza ta’ dan il-metodu jista’ jinkiseb meta l-kampjuni użati huma friski. Dan il-metodu jista’ jiġi applikat ukoll fuq estratti li ġew miżmuma taħt il-gliċerol fi 68 sa 86 °C.

Bħala kontrolli pożittivi, ipprepara dilwizzjonijiet deċimali minn sospensjoni ta’ 106 għal kull varjetà bijovar 2 aggressiva ta’ R. solanacearum (e.ż. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857. Sabiex tevita kwalunkwe tip ta’ kontaminazzjoni, ipprepara kontrolli pożittivi separatament mill-kampjuni li jridu jiġu ttestjati.

Għal kull numru ta’ medju selettiv ippreparat ġdid il-konvenjenza tiegħu għat-tkabbir tal-patoġenu għandu jiġi ttestjat qabel ma jintuża sabiex jiġu ttestjati kampjuni ta’ rutina.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

4.1.1. Agħmel teknika ta’ kisi b’dilwizzjoni approprjata sabiex wieħed jaċċerta li kull kolonja saprofitika li tista’ tikber huma maħsulin il-barra. Ifrex 50 100 µl għal kull pjastra ta’ estratt mill-kampjun minn kull dilwizjoni.

4.1.2. Inkuba l-pjastri fi 28 °C. Aqra r-riżultat tal-pjastra wara 48 siegħa u għal kuljum wara għal sitt ijiem. Kolonji tipiċi ta’ R. solanacearum fuq materja SMSA huma bojod ċari konsistenza tal-ħalib, ċatti, irregolari u fluwidi u wara 3 ijiem inkubazzjoni juru kolorazzjoni roża sa aħmar kulur id-demm b’linji jew crieki interni. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) Nota: Kolonji atipiċi ta’ R. solanacearum jistgħu jifformaw fuq tali sostanza. Dawn jistgħu jkunu żgħar, tondi, kompletament ħomor u kostitwenza mhux fluwida jew parzjalment fluwida u għalhekk diffiċli sabiex wieħed jagħmel distinzjoni minn kolonji saprofitiċi ta’ batterji.

4.1.3. Oħroġ kolonji safja ta’ R. solanacearum wara tqegħid jew kisja b’metodi ta’ dilwizzjoni fuq sostanza ta’ trobbija (medju) ġenerali, sabiex jinkisbu kolonji iżolati. (ara Appendiċi 2).

4.1.4. Erfa’ il-kolonji għal żmien qasir f’ilma sterilizzat (pH 6-8, ħieles mill-kloru) fid-dlam, jew għal żmien twil f’sostanza protettiva għaċ-ċelluli fi 68 to 86 °C jew lijofiliżżat..

4.1.5. Identifika kolonji preżunti (ara Taqsima VI.B.) u agħmel test ta’ patoġeniċità.

It-test ta’ kisja selettiva joħroġ negattiv jekk ebda kolonja batterika tkun viżibli wara 6 ijiem jew jekk ebda kolonja preżunta, tipika tal-R. solanacearum tinstab, dejjem jekk ebda tfixkil huwa ssospettat minħabba kompetizzjoni jew antagoniżmu minn batterji oħra u li kolonji tipiċi ta’ R. solanacearum jinstabu fil-kontrolli pożittivi. Il-metodu ta’ kisi selettiv joħroġ pożittiv jekk kolonji preżunti ta’ R. solanacearum huma ssospettati.

4.2. Proċedura ta’ trobbija f’ambjent favorevoli

Uża sostanza għat-trobbija favorevoli li kun ivvalidata bħal brodu mmodifikat ta’ Wilbrink (Ara Appendiċi 2).

Din il-proċedura tista’ tintuża sabiex jiżdiedu selettivament il-popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum minn estratti ta’ kampjuni u tiżdied l-akkuratezza tal-metodu. Il-proċedura tiddilwixxi inħibituri tar-reazzjoni PCR (1:100). Għandu jittieħed in konsiderazzjoni li trobbija f’ambjent favorevoli ta’ R. solanacearum jista’ ma jirnexxix minħabba kompetizzjoni jew antagoniżmu minn organiżmi saprofitiċi li huma ta’ spiss benefiċjarji tal-kundizzjonijiet. Għal din ir-raġuni, iżolazzjoni ta’ R. solanacearum minn sostanzi li jinkoraġġixxu t-tkattir tal-kolonji jistgħu jkunu diffiċli. Ulterjurment, filwaqt li popolazzjonijiet ta’ organiżmi saprofitiċi relatati seroloġikament jistgħu jiżdiedu, l-użu ta’ antikorpi monklonali, speċifiċi ħlief antikorpi poliklonali huwa indikat meta ser isir it-test ELISA.

4.2.1. Għat-teknika ta’ PCR f’sustanzi ta’ faċilitazzjoni għat-trobija, trasferiment ta’ kamjun mill-estratt ta’ 100 µl fi 10 ml ta’ brodu ta’ sustanzi siewja għat-trobbija (Appendiċi 2) alikwotata minn qabel f’tubi jew reċipjenti li huma safja mid-DNA. Fit-teknika ELISA jistgħu jintużaw ammonti ogħla ta’ estratt mill-kampjun mqabbel mal-brodu(eż 100 µl fi 1.0 ml ta’ brodu).

4.2.2. Inkuba għal 72 siegħa f’temperatura ta’ 27 sa 30 °C f’sistema ta’ trobbija statika jew dinamika movimentata u bl-għotjien mhux issikkati sabiex issir arjazzjoni.

4.2.3. Ħawwad sew qabel ma jintuża fit-testijiet ELISA jew PCR.

4.2.4. Agħti l-istess trattament fil-brodu ssostanzjat bħal fil-kampjun(i) fit-testijiet hawn fuq. Nota: Jekk tfixkil fit-trobbija ta’ R. solanacearum permezz ta’ brodu ssostanzjat jiġi antiċipat, minħabba popolazzjonijiet għolja ta’ ċerti batterji saprofitiċi, ssostanzjar ta’ kampjun ta’ l-estratti qabel ma ssir iċ-ċentrifugazzjoni jew stadji oħra ta’ konċentrament jistgħu jagħtu riżultati aħjar.

5. Testijiet IF

Prinċipju:

L-użu tat-test IF bħala test prinċipali ta’ skrining huwa rrakmandat minħabba l-fatt li huwa ta’ min joqgħod fuqu sabiex jinkisbu l-livelli meħtieġa.

Meta jintuża t-test ta’ l-IF bħala metodu ta’ skrining prinċipali, u r-riżultat joħroġ pożittiv, l-iżolazzjoni, PCR jew FISH jridu jitwettqu bħala test ta’ skrining oħrajn. Meta t-test ta’ l-IF jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat ta’ l-IF joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri hija meħtieġa sabiex tkun kompluta l-analiżi.

Nota: Uża sors ta’ antikorpi validati ta’ R. solanacearum (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Huwa rrikmandat li d-dożar (titre) jiġi kkalkulat għal kull lott ta’ antikorpi. Id-dożar jissejjaħ bħala l-ogħla fattur ta’ dilwizzjoni fejn issir ir-reazzjoni ottimali meta tiġi ttestjata t-taħlita solida u likwida li fiha 105 sa 106 ċelluli per ml ta’ varjetà omologa ta’ R. solanacearum meta jintuża konjugat approprjat ta’ “fluorescein isothiocyanate” (FITC) skond ma’ jirrikmanda l-manufattur. L-antisjeri validati poliklonali kollha kellhom titru IF ta’ mill-inqas 1:2 000. Waqt it-test, l-antikorpi jridu jintużaw dilwiti f’dilwizzjoni(jiet) li toqrob(joqorbu) jew li taqbel (jaqblu) eżattament mat-titru.

It-test irid isir fuq estratti minn kampjuni friski. Jekk tinħass il-ħtieġa, jista’ jsir fuq kampjuni jew estratti miżmuma fi 68 sa 86 °C taħt il-gliċerol. Il-gliċerol jista’ jitneħħa mill-kampjun permezz ta’ l-addizzjoni ta’ ml wieħed ta’ sustanza li żżomm il-kundizzjonijiet stabbli (Appendiċi 4), jsir mill-ġdid proċess ta’ ċentrifugazzjoni għal 15-il minuta veloċità 7 000 g u jerġgħu jiħaltu fi volume indaqs ta’ buffer. Dan huwa sikwit meħtieġ, speċjalmet jekk il-kampjuni jiġu ffissati mal-pjastra permezz tas-sħana meta jinżammu fuq fjamma.

Ipprepara pjastri ta’kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà oħra bħala referenza ta’ R. solanacearum, imħallta f’estratt tal-patata, kif speċifikat f’Appendiċi 3 B u mhux obligatorjament fi buffer.

Tessut infettat naturalment (miżmum billi jkun lijofiliżżat jew iffriżat temperatura ta’ 16 to 24 °C) jrid jintuża fejn hu possibli bħala kontroll simili fuq l-istess pjastra.

Bħala kontrolli negattivi, alikwoti ta’ kampjuni ta’ l-estratt li qabel ħarġu bħala testijiet negattivi għal R. solanacearum jistgħu jintużaw.

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fi Appendiċi 3.

Uża pjastri tal-mikroskopju li fihom ħafna ħofor preferibbilment għaxar aperturi ta’ dijametru ta’ sitt millimetri.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

5.1. Ipprepara l-pjastri tat-test permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin:

(i) Għar-residwi (pellet) li għandhom relattivament kontenut żgħir ta’ sedimentazzjoni ta’ lamtu: Qattar volum meqjus stàndard ta’ dilwizzjoni (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura – kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal aperturi ikbar) ta’ 1/100 tar-residwu ta’ patata mħallat mill-ġdid, fl-ewwel apertura. Qattar volum simili ta’ residwu mhux dilwit (1/1) fuq l-aperturi li jifdal fuq il-filliera. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 1.

(ii) Għar-residwu ieħor: Ipprepara dilwizzjonijiet deċimali (1/10, 1/100) tar-residwu risospiża fil-buffer apposta. Qattar volum stàndard (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura – kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal apertura ikbar) tar-residwu ta’ patata mħallat (imħallat mill-ġdid) mill-ġdid (suspended/resuspended pellet) u kull dilwizzjoni fi filliera ta’ aperturi. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 2.

5.2. Nixxef il-qatriet f’temperatura ambjentali jew billi jissaħħan sa temperaturi ta’ 40 sa 45 °C. Iffissa ċ-ċelluli batteriċi mal-pjastra jew billi ssaħħan (15 il-minuta f’temperatura ta’ 60 °C), billi jinżammu fuq fjamma, permezz ta’ l-etanol 95 % jew skond istruzzjonijiet specifici mill-fornitur ta’ l-antikorpi. Jekk tinħass il-ħtieġa, pjastri ffissati jistgħu jintrefgħu f’kontenitur apposta għat-tnixxif (dessicated box) għal żmien qasir kemm hemm bżonn (l-iktar żmien ta’ tlett xhur) qabel ma jsir ittestjar oħrajn.

5.3. Proċedura IF (i) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat-test fi 5.1 (i): Ipprepara set ta’ dilwizzjonijiet doppji. L-ewwel ħofra jrid ikollha 1/2 id-dożar (T/2), l-oħrajn 1/4 tad-dożar (T/4), 1/2 tad-dożar (T/2), id-dożar (T) u d-doppju tad-dożar (2T). (ii) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat-test fi 5.1 (i): Ipprepara d-dilwizzjonijiet sabiex jinħadem it-test (WD) ta’ l-antikorpi fil-buffer ta’ l-IF. Id-dilwizzjoni li tintuża fit-tħarriġ tat-test taffetwa l-ispeċifiċità.



Figura 1 Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 5.1(i) u 5.3(i) Dilwizzjoni ta’ residwi ri sospiżi 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Dilwizzjoni ta’ residwi ri sospiżi (T = dożar) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dilwizzjonijiet doppji ta’ antisjeru/antikorpi Kampjun 1 1 2 3 4 5 Duplikat ta’ kampjun 1 jew kampjun 2 6 7 8 9 10



Figura 2 Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 5.1(ii) u 5.3(ii) Dilwizzjoniji użati ta’ antisjeru/antikorpi 1/1 1/10 1/100 vojt vojt  Dilwizzjoni deċimali ta’ residwu ri sospiża Kampjun 1 1 2 3 4 5 Duplikat ta’ kampjun 1 jew kampjun 2 6 7 8 9 10 5.3.1. Irranġa l-pjastri fuq karta assorbenti niedja. Għatti kull apertura ta’ test komopletament permezz ta’ dilwizzjoni(jiet) ta’ antikorpi. Il-volum ta’ antikorpi fuq kull apertura jrid ikun mill-inqas il-volum ta’ l-estratt applikat. Il-proċedura li ġejja trid issir fl-assenza ta’ istruzzjonijiet speċifiċi mill-fornituri ta’ l-antikorpi. 5.3.2. Inkuba l-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’temperatura ambjentali (18 – 25 °C). 5.3.3. Neħħi l-qatriet minn kull pjastra u laħlaħ bil-galbu f’buffer IF. Aħsel billi tagħddas għal 5 minuti fi buffer-Tween IF (Appendiċi 4) u wara f’buffer IF. Evita li tagħmel kontaminazzjoni permezz ta’ arjusol jew qatriet żgħar. Neħħi bil-mod umdità eċċessiva permezz ta’ karti assorbenti. 5.3.4. Irranġa l-pjastri fuq karta niedja. Agħtti l-apertura tat-test bid-dilwit ta’ konjugat ta’ FITC użat fid-sejba tad-dożar. Il-volum tal-konjugat applikat fuq din l-apertura trid tkun identika għall-volum ta’ antikorpi użati. 5.3.5. Inkuba l-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’temperatura ambjentali (18 – 25 °C). 5.3.6. Neħħi il-qtar ta’ konjugat minn fuq il-pjastra billi ssir aġitazzjoni tal-pjastra. Laħlah u aħsel bħal qabel (5.3.3). Neħħi bil-mod kull umidità eċċessiva. 5.3.7. Qattar 5-10 µl ta’ 0.1M gliċerol ibbufferjat bil-fosfat (Appendiċi 4) jew sostanza montanti li ma tiċċarax, li tinbiegħ kummerċjalment, fuq kull apertura applika pjastra żgħira sabiex tgħatti.

5.4. Interpretazzjoni tat-test IF: 5.4.1 Eżamina l-pjastri taħt mikroskopju epifluworexxenti permezz ta’ filtri xierqa għall-eċitament ta’ l-FITC, taħt immersjoni fiż-żejt jew ilma manjifikazzjoni ta’ 500-1 000. Osserva l-apertura billi tħares ma’ żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin u mad-dawra perimetrika. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku. Ivverifika l-pjastra ta’ kontroll pożittiva l-ewwel. Ic-ċelluli jridu jkunu fluworexxenti u imtebbgħin komopletament fid-dożar ta’ antikorpi immarkat jew fid-dilwizzjoni li tintuża għat-taħriġ tat-test. It-test IF (Ara Taqsima VI.A.5.) irid isir mill-ġdid jekk issir abberrazzjoni tat-tebgħa. 5.4.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli jleqqu li għandhom morfoloġija karatteristika ta’ R. solanacearum fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L-intesità fluworexxenti trid tkun ekwivalenti għal dik tal-varjetà ta’ kontroll pożittiva fl-istess dilwizzjoni. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworexxenza dgħajfa ma jridux jiġu meqjusa. Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni it-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta l-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il-barra mill-apertura) fuq il-kisja tal-pjastra. 5.4.3. Hemm bosta problemi relatati mat-test ta’ l-immunofluworexxenza. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi reaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal R. solanacearum jistgħu jinstabu fil-qalba tan-naħa tal-għarqub u fi residwi meħudin minn segmenti taz-zkuk. 5.4.4. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti b’dimensjonijiet u morfoloġija tipika miksuba fid-dożar jew dilwizzjoni magħżula għat-test ta’ antikorpi kif imfassal fi 5.3. 5.4.5. Interpretazzjoni tat-test ta’ l-IF: (i) Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfoloġija karatteristika, ħu stima tan-numru ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula n-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid (Appendiċi 5). It-test IF joħroġ pożittiv għal kampjuni b’mhux inqas minn 5x 103 ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu risospiż. Il-kampjun huwa kkonsidrat potenzjalment ikkontaminat u testing ieħor irid isir. (ii) Ir-riżultat IF joħroġ negattiv għall-kampjuni b’inqas minn 5x 103: għal kull ml ta’ residwu risospiż u l-kampjun huwa meqjus bħala negattiv. Testing ieħor mhux meħtieġ.

6. Test PCR

Prinċipji

Meta jsir it-test tal-PCR bħala t-test ta’ skrining prinċipali u joħroġ pożittiv, l-iżolament jew l-IF jrid isir bħala t-tieni test ta’ skrining obligatorju. Meta l-PCR jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri huma meħtieġa sabiex tkun kompluta d-dijanjosi.

Użu komplet ta’ dan il-metodu bħala test ta’ skrining prinċipali huwa rrikmandat meta esperjenza speċjalizzata ġiet miksuba.

Nota: Testijiet preliminarji b’dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa 104 ċelluli ta’ R. solanacearum per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi. Testijiet ta’ ottimizzazzjoni jistgħu jinħtieġu sabiex livelli massimi ta’ sensittività jinkisbu u speċifiċità f’kull laboratorju.

Agħmel użu ta’ reaġġenti PCR u protokolli (ara Appendiċi 6). Jekk possibli agħżel metodi li fihom kontroll intern.

Ħu prekawzjonijiet approprjati sabiex tevita kontaminazzjoni ta’ kampjuni ma’ DNA li qed ikun investigat. It-test tal-PCR irid isir minn esperti tekniċi, f’laboratorji dedikati speċifikament għall-bijoloġija molekolari, ħalli wieħed inaqqas kemm jista’ jkun il-possibiltà ta’ kontaminazzjoni ma’ DNA li qed ikun investigat.

Kontrolli negattivi (għall-proċeduri ta’ estrazzjoni ta’ DNA u PCR) għandhom dejjem jiġu meqjusa bħala l-kampjun finali fil-proċedura, sabiex jaċċertaw il-preżenza ta’ DNA minn sors ieħor.

Il-kontrolli negattivi li ġejjin iridu jiġu inklużi fit-test tal-PCR:

— Estratt mill-kampjun li preċedentament ħarġu negattivi għal R. solanacearum,

— Kontrolli għall-buffer użati għall-estrazzjoni tal-batterju u tad-DNA mill-kampjun,

— Taħlita mir-reazzjoni PCR.

Il-kontolli pożittivi li ġejjin għandhom jiġu inklużi:

— Alikwoti ta’ residwi risospiżi li magħhom ġie miżjud il-R. solanacearum (għall-preparazzjoni ara Appendiċi 3 B).

— Sospensjoni ta’ 106 ċellula għal kull ml ta’ R. solanacearum fl-ilma minn iżolat ta’ varjetà aggressiva (eż NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ara Appendiċi 3 B).

— Jekk hu possibli uża wkoll DNA estratt minn kampjuni tal-kontrolli pożittivi fit-test tal-PCR.

Sabiex tiġi evitata l-posssibiltà ta’ kontaminazzjoni pprepara kontrolli pożittivi f’ambjent separat mill-kampjuni li ħa jkunu ttestjati.

Estratti mill-kampjuni jridu jkunu kemm jista’ jkun safja minn ħamrija. Għalhekk jista’ jkun aħjar li wieħed jipprepara estratti minn patata maħsula jekk ser jintużaw protokolli ta’ PCR.

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fl-Appendiċi 3.

6.1. Metodi ta’ purifikazzjoni tad-DNA

Uża kampjuni ta’ kontroll pożittivi u negattivi kif imfassal hawn fuq (ara Appendiċi 3)

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

Hemm bosta metodi li jistgħu jintużaw għall-purifikazzjoni ta’ DNA li qed jiġi ttestjat għalih minn sustrati tal-kampjun, b’hekk jitneħħew fatturi li jfixklu l-proċess PCR u reazzjonijiet enzimatiċi oħra u tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ DNA li qed tiġi ttestjatha fil-kampjun ta’ l-estratt. Il-metodu li ġej ġie ottimizzat għall-użu ma’ metodi PCR validati mfassla f’Appendiċi 6.

(a) Metodi skond Pastrik (2000)

1) Qattar 220 µl ta’ buffer li jintuża għall-iproċessar f’unitajiet żgħar (lysis buffer) (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) fi tubu Eppendorf ta’ 1.5 ml.

2) Żid 100 µl ta’ l-estratt tal-kampjun u qiegħed fuq blokka sħuna jew banjo sħun ta’ 95 °C għal 10 min.

3) Qiegħed it-tubu fis-silġ għal 5 min.

4) Żid 80 µl soluzzjoni ta’ stokk ta’ liżożimi (50 mg Liżożimi per ml fi 10 mM Tris HCl, pH 8.0) u inkuba fi 37 °C għal 30 min.

5) Żid 220 µl ta’ soluzzjoni A ta’ Easy DNA® (Invitrogen), ħallat sew permezz ta’ vortiċi u inkuba fi 65 °C għal 30 min.

6) Żid 100 µl ta’ Easy DNA® solution B (Invitrogen), ħallat permezz ta’ vortiċi bis-saħħa sakemm il-precipitate jimxi liberament fit-tubu u l-kampjun hu magħqud b’mod uniformi.

7) Żid 500 µl ta’ kloroform u vortex sakemm il-viskożità tonqos u t-taħlita hi omoġenja.

8) Għaddi minn ċentrifugazzjoni ta’ 15 000 g għal 20 min fi 4 °C sabiex jisseparaw il-fażijiet separate minn stat ta’ interfażi.

9) Ittrasferixxi l-fażi ta’ fuq ġo tubu Eppendorf ġdid.

10) Żid ml wieħed ta’ etanol 100 % (20 °C) ħallat b’vortiċi għal ftit u inkuba fuq silġ għal 10 minuti.

11) Iċċentrifuga b’15 000g għal 20 minuta fi 4 °C u neħħi l-etanol mir-residwu.

12) Żid 500 µl 80 % ethanol (20 °C) u ħallat billi taqleb it-tubu.

13) Iċċentrifuga b’15 000g għal 10 minuta fi 4 °C u neħħi l-etanol mir-residwu.

14) Ħalli r-residwu jinxef fl-arja jew f’DNA speed vac.

15) Erġa’ ħallat ir-residwu f’100 µl UPW sterili u ħalli f’temperatura tal-kamra għal mill-anqas 20 minuta.

16) Aħżen f’temperatura ta’ 20 °C sakemm ikun hemm bżonn għal PCR.

17) Dawwar l-isfel il-precipitate abjad permezz taċ-ċentrifugazzjoni u uża 5 µl tas-supernatant li fih id-DNA għal PCR.

(b) Metodi oħra

Metodi oħra ta’ estrazzjoni, eż Qiagen DNeasy Plant Kit, jistgħu jintużaw jekk jiġu pprovati li huma ugwalment effettivi fil-purifikazzjoni tad-DNA minn kampjuni ta’ kontrolli li fihom 103 sa 104 ċellula ta’organiżmu patoġeniku per ml.

6.2. PCR

6.2.1. Ipprepara mudelli ta’ testjar u kontroll għall-PCR skond il-protokolli validati (Ara Taqsima VI.A.6.). Ipprepara deċimal ta’ sostanza dilwita ta’ estratt ta’ kampjun tad-DNA (1:10 f’UPW).

6.2.2. Ipprepara t-taħlita ta’ reazzjoni PCR approprjata f’ambjent ħieles minn kontaminazzjoni skond protokolli ppublikati. (Appendiċi 6). Fejn hu possibli, huwa indikat li jintuża protokoll PCR multiplex li jinkorpora wkoll kontroll PCR intern.

6.2.3. Żid 2-5 µl ta’ DNA extratt per 25 µl ta’ reazzjoni ta’ PCR f’tubi sterilizzati apposta skond protokolli PCR (ara Appendiċi 6)

6.2.4. Inkorpora kampjun ta’ kontroll negattiv li fih taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR biss u żid l-istess sors ta’ UPW kif kien użat fit-taħlita tal-PCR minnflok il-kampjun.

6.2.5. Poġġi t-tubi fl-istess ċiklatur termali li intuża fl-ittestjar preliminari u ħaddem il-programm PCR ottimizzat kif xieraq (Appendiċi 6).

6.3. Analiżi tal-prodott PCR

6.3.1. Ifred l-amplikoni permezz ta’ l-elektrofloreżi agarose gel. Ħaddem mill-anqas 12 µl tat-taħlita ta’ reazzjoni tad-DNA amplIFikata minn kull kampjun imħallat b’3 µl loading buffer (Appendiċi 6) f’2.0 % (w/v) agarose gels f’tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendiċi 6) f’5-8 V għal kull ċm. Uża marker tad-DNA xieraq, eż. “100 bp ladder”.

6.3.2. Ikxef faxxi ta’ DNA billi ttebba’ fi etilju bromide (0.5 mg per L) għal 30-60 minuta bil-prekawzjonijiet adegwati għal-manipulazzjoni ta’ dan l-aġent mutanti.

6.3.3. Osserva l-ġel imtebba’ taħt UV banda qasira transillminazzjoni (λ = 302 nm) għal prodotti PCr amplifikati tad-daqs mistenni (Appendiċi 6) u iddokumenta kollox.

6.3.4. Għas-sejbiet/każijiet kollha ġodda ivverifika l-awtentiċità ta’ l-amplikon PCR billi twettaq analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi fuq kampjun tad-DNA amplifikat li fadal billi tinkuba fl-aħjar temperatura u ħin b’enzima u buffer xierqa (ara l-Appendiċi 6). Ifred il-frammenti diġeriti mill-elettroforeżi bil-ġel agarożu kif sar qabel u osserva d-disinn karatteristiku ta’ restrizzjoni tal-frammenti taħt il-UV transilluminazzjoni wara li jiġi mtebba’ bl-etidjum bromide u qabbel ma’kontrolli pożittivi diġeriti u mhux.

Interpretazzjoni tar-riżultat tat-test ta’ l-PCR:

It-test tal-PCR huwa negattiv jekk l-amplikon PCR speċifiku ta’ R. solanacearum -tad-daqs mistenni mhux osservat fil-kampjun in kwistjoni iżda jinstab għall-kontrolli pożittivi kollha (fil-każ ta’ multiplex PCR bi primers ta’ kontroll interni speċifiċ għall-pjanti: prodott PCR ieħor ta’ dimensjoni mistennija għandu jiġi amplifikat bil-kampjun in kwestjoni).

It-test PCR joħroġ pożittiv jekk l-ampiklon speċifiku PCR ta’ R. solanacearum tad-daqs mistenni u d-disinn ta’ restrizzjoni (meta meħtieġ) huwa misjub, proviż li ma jiġix amplifikat minn kampjuni ta’ kontroll negattivi. Konferma soda ta’ riżultat pożittiv jista’ jinkiseb ukoll billi it-test jerġa’ jsir b’sett ieħor ta’ primers PCR (Appendiċi 6).

Nota: Tfixkil ta’ PCR jista’ jkun sospettat jekk l-ampiklon mistenni jinkiseb mill-kontroll pożittiv li fih R. solanacearum fl-ilma iżda riżultati negattivi jinkisbu minn kontrolli pożittivi ta’ R. solanacearum minn estratt ta’ patata. F’protokolli tal-PCR multiplex b’kontrolli tal-PCR interni, inibizzjoni tar-reazzjoni hi indikata meta l-ebda miż-żewġ amplikons huma miksuba.

Il-kontaminazzjoni tista’ tiġi suspettata jekk l-amplikon mistennija hu miksub minn waħda jew aktar tal-kontrolli negattivi.

7. Test FISH

Prinċipju:

Meta jsir it-test tal-PCR bħala t-test ta’ skrining principali u joħrog pożittiv, Iżolazzjoni jew test IF jrid isir bħala t-tieni test ta’ skrining obligatorju. Meta t-test ta’ l-FISH jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri huma meħtieġa sabiex tkun kompluta d-dijanjosi.

Nota: Uża sondi validati R. solanacearum oligo speċifiċi. (ara Appendiċi 7). Testijiet preliminarji b’dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa 104 ċelluli ta’ R. solanacearum per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi.

Il-proċedura li ġejja trid issir fuq estratt mill-kampjun frisk iżda jista’ jsir ukoll b’suċċess fuq estratt ta’ kampjun li kien ġie miżmum fil-gliċerol fi 16 sa 24 jew 68 sa 86 °C.

Bħala kontrolli negattivi, alikwoti ta’ kampjuni ta’ l-estratt li qabel ħarġu bħala testijiet negattivi għal R. solanacearum jistgħu jintużaw.

Bħala kontroll pożittiv ipprepara sospensjonijiet li fihom 105 sa 106 ċellula per ml ta’ R. solanacearum biovar 2 (eż varjetà NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ara Appendiċi 3) fi 0.01M ta’ buffer fosfat (PB) minn kolonja ta’ 3-5 ijiem). Ipprepara pjastri ta’ kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà oħra bħala referenza ta’ R. solanacearum, imħallta f’estratt tal-patata, kif speċifikat f’Appendiċi 3 B u mhux obligatorjament fi buffer.

L-użu ta’ oligo sondi ewbatterjali immarkati FITC joffri kontroll għall-preżemza ta’ ibridizzazzjoni, la tali proċess itebba’ l-ewbatteri kollha li huma preżenti fil-kampjun.

Materjali ta’ kontroll standardiżżati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fi Appendiċi 3 A).

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

7.1. Fissaġġ ta’ l-estratt tal-patata

Il-protokoll li ġej huwa bbażat fuq Wullings et al. (1998):

7.1.1. Ipprepara taħlil fissanti (ara Appendiċi 7).

7.1.2. Qattar 100 µl ta’ kull estratt tal-kampjun fi tubu Eppendorf u ċċentrifuga għal 7 minuti, velocità 7 000 g.

7.1.3. Neħħi l-likwidu supernatanti residwu u ħoll ir-residwu fi 200 µl ta’ materjal fissativ ippreparat <24 siegħa minn qabel. Ħallat permezz ta’ vortiċi għal siegħa f’refriġerazzjoni.

7.1.4. Iċċentrifuga għal 7 minuti fi 7 000 g, neħħi l-likwidu residwu, supernatanti u erġa’ ħoll parzjalment ir-residwu fi 75 µl 0.01M PB (ara Appendiċi 7).

7.1.5. Qattar tikek tat-taħlita riżultanti li ġiet iffissata fuq pjastra multitest nadifa kif imfassal fi dijagrama 7.1. Qiegħed żewġ kampjuni differenti fuq kull pjastra, li mhumhiex dilwiti u uża 10 µl sabiex tagħmel dilwizzjoni ta’ 1:100 (fi 0.01 M PB). mit-taħlil li jifdal tal-kampjun (49 µl) tista’ tinżamm fi 20 °C wara ż-żieda ta’ volum wieħed ta’ 96 % etanol. Jekk l-assay FISH jinħtieġ jerġa’ jsir, neħħi l-etanol permezz ta’ ċentrifugazzjoni u żid volum ugwali ta’ 0.01 PB (ħallat f’apparat ta’ vortiċi).



Dijagramma 7.1 Organizzazzjoni tal-pjastra għall-FISH Kampjun 1 vojt vojt vojt Kampjun 2 apertura 1 apertura 2 apertura 3 apertura 4 apertura 5 Kampjun 1 vojt vojt vojt Kampjun 2 apertura 6 apertura 7 apertura 8 apertura 9 apertura 10 Pjastra 1 Pjastra 2

7.1.6. Nixxef il-pjastri fl-arja (jew fuq apparat apposta li jnixxef fi 37 °C) u ffissa fuq in-nar. F’dan l-istadju l-proċedura tista’ tiġi sospiża u l-ibridizzazzjoni titkompla l-ġurnata ta’ wara. Il-pjastri jridu jinżammu ħielsa mit-trab u f’temperatura ambjentali.

7.2. Ibridizzazzjoni

7.2.1. Iġbed l-ilma minn ġewwa ċ-ċelluli fi serje ta’ etanol fi gradi ta’ 50 %, 80 % u 96 % għal minuta kull wieħed. Nixxef il-pjastri fl-arja fuq holder apposta.

7.2.2. Ipprepara kompartiment ta’ inkubazzjoni niedi billi tiksi l-qiegħ ta’ kaxxa ssigillata b’karti assorbenti jew karta ta’ filtrazzjoni mgħaddsa fi 1x hybmix (Appendiċi 7). Inkuba l-kaxxa minn qabel f’forn ta’ l-ibridizzazzjoni temperatura ta’ 45 °C għal mhux inqas minn 10 minuti.

7.2.3. Applika 10 μl ta’ soluzzjoni ta’ ibridizzazzjoni (Appendiċi 7) fi 8 aperturi (aperturi 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 u 10; ara Dij 7.1) ta’ kull pjastra u ħalli żewġ aperturi tan-nofs vojta (3 u 8).

7.2.4. Poġġi l-għatu tal ħġieġa (24 × 24 mm) fuq l-ewwel u l-aħħar erba’ aperturi mingħajr ma tinqabad l-arja. Qiegħed il-pjastri fil-kompartiment niedi u msaħħan u ibridiżża għal ħames sigħat fil-forn temperatura ta’ 45 °C, fid-dlam.

7.2.5. Ipprepara 3 tazzi ta’ litru wieħed ta’ Milli Q ilma (grad molekolari), 1 l ta’ 1x hybmix (334 ml 3x hybmix u 666 ml Milli Q water) u 1 l ta’ 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix u 958. ml Milli Q water). Pre-inkuba kull wieħed fi banju temperatura ta’ 45 °C.

7.2.6. Neħħi l-coverslips mill-pjastri u qiegħed il-pjastri fuq holder tal-pjastri apposta.

7.2.7. Laħlaħ is-sonda żejjed permezz ta’ inkubazzjoni għal 15 il-minuta fit-tazza bi 1x hybmix temperatura ta’ 45 °C.

7.2.8. Poġġi l-holder tal-pjastri fi 1/8 hybmix taħlil u inkuba għal 15 il-minuta oħra.

7.2.9. Bill il-pjastri brevement fi Milli Q soluzzjoni u qiegħdhom fuq biċċa karta assorbenti. Neħħi l’ umdità żejda billi tgħatti l-wiċċ b’biċċa karta assorbenti. Qattar 5-10 μl ta’ taħlil montanti li ma tiċċarax (eż Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA jew ekwivalenti) fuq kull apertura u qiegħed coverslip kbir qies (24 × 60 mm) fuq il-pjastra kollha.

7.3. Interpretazzjoni tat-Test FISH

7.3.1. Osserva l-pjastri mill-ewwel permezz ta’ mikroskopju mgħammar b’mikroskopija epifluworexxenti, qawwa ta’ 630 jew 1 000 × immersjoni taħt iż-żejt. B’filtru addattat għal fluorescein isothiocyanate (FITC) ċelluli ewbatteriċi, (inkluż ċelluli gram negattivi) fil-kampjun huma mtebbgħin lewn aħdar fluworexxenti. Taħt filtru għal tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-ċelluli imtebbgħin ta’ R. solanacearum jidhru ħomor fluworexxenti. Qabbel il-morfoloġija taċ-ċelluli ma’ dik tal-kontrolli pożittivi. Iċ-ċelluli jridu jidhru fluworexxenti jgħajjat u kompletament imtebbgħin. (Taqsima VI.A.7.)It-test FISH jrid jerġa’ jsir jekk it-tebgħa hija aberrata. Osserva l-apertura billi tħares ma’ żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin u mad-dawra perimetrika. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku.

7.3.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli jleqqu li għandhom morfologija karatteristika ta’ R. solanacearum fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.). L-intensità fluworexxenti trid tkun daqs jew aħjar minn dik tal-varjetà fil-kontroll pożittiv. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworexxenza dgħajfa ma jridux jiġu meqjusa.

7.3.3. Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni t-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta l-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il-barra mill-apertura) fuq il-kisja tal-pjastra.

7.3.4. Hemm bosta problemi relatati ma’ l-ispeċifiċità tat-test ta’ l-FISH. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi reaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal R. solanacearum jistgħu jinstabu fil-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub u fi residwi meħudin minn segmenti taz-zkuk.

7.3.5. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika.

7.3.6. Interpretazzjoni tar-riżultat tat-test ta’ l-FISH: (i) Riżultati validi tat-test tal-FISH jinkisbu jekk ċelluli jleqqu ħodor fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika ta’ R. solanacearum huma osservati permezz tal-filtru FITC u ċelluli ħomor fluworexxenti bil-filtru rhodamine f’kull kontroll pożittivu mhux f’ebda kontroll negattiv. Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfoloġija karatteristika, ħu stima tan-numru ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula n-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid (Appendiċi 4). Kampjuni li fihom mill-inqas 5x 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid huma kkonsidrati potenzjalment ikkontaminati. Tetsijiet oħrajn mhux meħtieġa. Kampjuni li fihom inqas minn 5x 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid huma kkonsidrati negattivi.. (ii) It-test FISH huwa negattiv jekk ċelluli jleqqu ħomor fluworexxenti b’qisien u morfoloġija tipika ta’ R. solanacearum ma jidhrux bil-filtru rhodamine, dejjem jekk ċelluli jleqqu ħomor fluworexxenti tipiċi huma osservati fil-kontrolli pożittivi meta jintuża l-filtru rhodamine.

8. Testijiet ELISA

Prinċipju:

ELISA jista’ jintuża bħala test ottimali meta miżjud ma’ IF, PCR jew FISH minħabba sensitività relattivament baxxa ta’ dan it-test. Meta jintuża DAS ELISA kundizzjonijiet ta’ sostanzjament u antikorpi monoklonali huma obbligatorji. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Trobbija tal-kampjuni f’kundizzjonijiet ta’ sostanzjament huma meħtieġa sabiex is-sensitività tat-test jiżdied, iżda jista’ ma jirnexxix minħabba kompetizzjoni minn organiżmi oħra fil-kampjun.

Nota: Uża sors ta’ antikorpi validati ta’ R. solanacearum (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.). Huwa rrikmandat li d-dożar jiġi kkalkulat għal kull lott ta’ antikorpi. Id-dożar jissejjah bħala l-ogħla fattur ta’ dilwizzjoni fejn issir ir-reazzjoni ottimali meta jiġi ttestjat it-tahlita solida u likwida li fiha 105 sa 106 ċelluli per ml ta’ varjetà omologa ta’ R. solanacearum meta jintuża konjugat approprjat ta’ antikorpi sekondarji skond ma jirrikmanda l-manufattur. Waqt it-test, l-antikorpi jridu jintużaw dilwiti f’dilwizzjoni li toqrob jew li taqbel eżattament mal-formolazzjoni kummerċjali.

Sib id-dożar ta’ antikorpi f’sospensjoni ta’ 105 sa 106 ċellula per ml tal-varjetà omolga tar-R. solanacearum.

Inkludi kampjun ta’ l-estratt li qabel ħareġ negattiv għal R. solanacearum u sospensjoni ta’ batterji li ma jirreaġġux ma’ xulxin fi soluzzjoni ta’ phosphate buffered saline bħala kontroll negattiv.

Bħala kontrolli pożittivi uża alikwoti ta’ l-estratt tal-kampjun, li qabel ittestja negattiv, li jitħallat ma’ 103 sa 104 ċellula għal kull ml ta’ R. solanacearum bijovar 2 (eż varjazzjoni NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ara Appendiċi 2 A u B). Għat-tqabbil tar-riżultati fuq kull pjastra uża sospensjoni standard ta’ 105 sa 106 ċellula għal kull ml fi PBS ta’ R. solanacearum Aċċerta kontrolli pożittivi jinżammu separatai fuq pjastra mikrotitru mill-kampjun (i) li qed jiġi(u) ttestjat(i).

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi disponibbli għall-użu ma’ dan it-test huma elenkati fl-Appendiċi 3 A.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

Żewġ protokolli ELISA ġew validati.

(a) ELISA indirett (Robinson Smith et al., 1995)

1) Uża 100-200 µl alikwoti ta’ estratt tal-kampjun. (Tisħin f’temperatura ta’ 100 °C għal erba’ minuti banjumarija jew f’heating block jista’ f’xi każi jnaqqas ir-riżultati non-speċifiċi).

2) Żid volum indaqs ta’ double strength coating buffer (Appendiċi 4) u ħallat permezz ta’ vortiċi.

3) Applika 100 µl alikwoti lil kull wieħed minn mill-anqas 2 ħofor ta’ pjastra ta’ mikrotritazzjoni (eż Nunc-Polysorp jew l-ekwivalenti) u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C jew matul il-lejl f’temperatura ta’ 4 °C.

4) Oħroġ f’daqqa l-estratti mill-ħofor. Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4), billi tħalli l-aħħar sustanza tal-ħasil fil-ħofor għal mill-anqas 5 minuti.

5) Ipprepara s-sustanza dilwita ta’ antikorpi xierqa kontra r-R. solanacearum f’blocking buffer (Appendiċi 4). Għall-antikorpi kummerċjali validati, uża s-sustanza dilwita rrikmandata (normalment ikkonċentrata darbtejn aktar mid-dożar).

6) Żid 100 µl lil kull ħofra u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C.

7) Oħroġ f’daqqa t-taħlil ta’ l-antikorp mill-ħofor u aħsel bħal qabel (4.).

8) Ipprepara s-sustanza dilwita xierqa ta’ konjugati fosfati sekondarji ta’ antikorpi alkalini fil-blocking buffer. Żid 100 µl lil kull ħofra u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C.

9) Oħroġ f’daqqa l-antikorp konjugat mill-ħofor u aħsel bħal qabel (4.).

10) Żid 100 µl taħlil sustrat alkalin fosfat (Appendiċi 4) lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur fid-dlam f’temperatura ambjentali u aqra l-assorbenza f’405 nm f’intervalli regolari fi żmien 90 minuta.

(b) DASI ELISA

1) Ipprepara t-taħlila dilwita ta’ anti-R. solanacearum polyclonal immunoglobulins xierqa f’coating buffer pH 9.6 (Appendiċi 4). Żid 200 µl lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ 37 °C għal 4-5 sigħat jew f’temperatura ta’ 4 °C għal 16-il siegħa.

2) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4). Żid 190 µl ta’ l-estratt tal-kampjun lil mill-anqas 2 ħofor. Żid ukoll kontrolli pożittivi u negattivi f’żewġ ħofriet għal kull pjastra. Poġġi f’inkubatur għal 16-il siegħa f’temperatura ta’ 4 °C.

3) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4).

4) Ipprepara sustanza dilwita xierqa ta’ antikorpi monoklonali